(57)【要約】【課題】  卵母細胞の選別は人手に頼っており、均一性が保てなかった。【解決手段】  卵母細胞群を準備し、リソホスファチジン酸（LPA）に曝露して卵母細胞の電流応答を計測し、卵母細胞のGタンパク質共役型リセプター（GPCR）応答感度を求め、該応答感度に基づいて、所定の卵母細胞を選別する。【効果】  GPCR応答感度の均一性の高い卵母細胞を選別することができる。【選択図】  図１
2005117961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の母体から卵母細胞を摘出し、１つの母体から摘出された卵母細胞からなる卵母細胞群を準備し、
前記母体毎に、前記卵母細胞群の一部の卵母細胞に、LPA刺激を行い、LPAに対する電流応答強度を計測し、卵母細胞群毎のGタンパク質共役型リセプター（GPCR）応答感度を求める工程と、
前記応答感度に基づいて、前記卵母細胞群を選別することを特徴とする卵母細胞の選別方法。
【請求項２】
前記電流応答強度の計測は、LPA添加前の電流ピーク値とLPA添加後の電流ピーク値の差を求めることにより行われることを特徴とする請求項１記載の卵母細胞の選別方法。
【請求項３】
１の卵母細胞群につき複数個の卵母細胞について前記電流応答強度の計測を行い、該計測は、LPA添加前の電流ピーク値とLPA添加後の電流ピーク値との差を求めることにより行われ、GPCR応答感度は前記卵母細胞群毎の前記差の平均値として求められることを特徴とする請求項１記載の卵母細胞の選別方法。
【請求項４】
前記平均値が0.5μA以上を示す卵母細胞群を選別することを特徴とする請求項３記載の卵母細胞の選別方法。
【請求項５】
前記平均値が0.5μA以上3.0μA以下を示す卵母細胞群を選別することを特徴とする請求項３記載の卵母細胞の選別方法。
【請求項６】
前記平均値が他の母体に由来する卵母細胞群の該平均値より高い卵母細胞群を選別することを特徴とする請求項３記載の卵母細胞の選別方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により卵母細胞を選別し、選別された卵母細胞を用いてそのGPCRに対する応答を検出する方法。
【請求項８】
1種以上のGPCRを強制発現することを特徴とする請求項７記載のGPCRに対する応答を検出する方法。
【請求項９】
前記LPA刺激の前に、予め、目視または静止膜電位に基づいて、前記一部の卵母細胞を選別しておくことを特徴とする請求項１記載の卵母細胞の選別方法。
【請求項１０】
卵母細胞群の一部の卵母細胞について求めたGPCR応答感度に基づいて、選別された卵母細胞群。
【請求項１１】
１の卵母細胞群につき複数個の卵母細胞について前記電流応答強度の計測を行い、該計測は、LPA添加前の電流ピーク値とLPA添加後の電流ピーク値との差を求めることにより行われ、GPCR応答感度は前記卵母細胞群毎の前記差の平均値として求められ、該平均値が0.5μA以上である卵母細胞群を選別することにより選別された請求項９記載の卵母細胞群。
【請求項１２】
卵母細胞群の一部の卵母細胞について行われたLPA刺激電流応答強度の計測結果から求められた各卵母細胞群のGPCR応答感度に基づいて選別された卵母細胞群を準備し、
該卵母細胞群に属する卵母細胞に試料を導入する工程と、
前記試料が導入された卵母細胞それぞれに、複数の化合物を接触させる工程と、
前記化合物との接触による電流応答強度を計測する工程とを有することを特徴とする、化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記化合物は、GPCRを介したシグナル伝達経路に影響を与える化合物であることを特徴とする請求項１２記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記試料は核酸であり、前記核酸が導入された卵母細胞において、該核酸がコードするタンパク質が発現されることを特徴とする請求項１２記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記核酸がコードするタンパク質がGPCRの1種であり、該GPCRに対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることを特徴とする請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記卵母細胞群を準備する工程は、複数の卵母細胞群において、一部の卵母細胞についてLPA刺激による電流応答強度を計測し、その計測結果に基づいて、卵母細胞群毎のGPCR応答感度を求め、当該応答感度に基づいて卵母細胞群を選別する工程であることを特徴とする請求項１２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Gタンパク質共役型リセプターの応答性の検出に適した卵母細胞または卵細胞を選別するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフリカツメガエル卵母細胞は、特開2002-65240号に記載されている通り、遺伝子、色素、タンパク質、ペプチド、薬物等の試料を導入し、これらの作用の確認、遺伝子機能の解析、遺伝子産物としてのタンパク質の生産などの目的で広く使用されている。特に、遺伝子導入、および膜電位の計測が比較的容易であることから、Gタンパク質共役型リセプター（GPCR）を強制発現させて、薬物刺激等の外的刺激に対する該リセプターの応答を検出するという手法がよく用いられている。この手法においては、個々の卵母細胞のGPCR応答感度ができるだけ均一であり、かつ該感度が優れていることが望ましい。すなわち、薬物をGPCRの一定の応答感度を閾値としてスクリーニングする際に、用いる卵母細胞はその感度が均一なものの集団であることが好ましい。しかしながら、母体から摘出された卵母細胞は、GPCR応答感度が必ずしも一定ではない。そのもっとも大きな要因は、その親からの遺伝的素因にあると考えられる。同系の動物であっても形質に個体差があり、GPCR応答感度も例外ではないからである。
【０００３】
したがって、実際に実験に用いる卵母細胞は、事前に選別することが必要である。この選別基準としては、従来は、主に卵母細胞または卵細胞の外観によっていた。すなわち、顕鏡下での手作業により、細胞の大きさ、形状、色調および模様等により判断していた。
【０００４】
なお、The Journal of Biological Chemistry」 第276巻(2001)、15208-15215頁には、卵母細胞内にLPA1の受容体を発現させてクローニングすることが記載されている。しかし、選別に関することは全く記載されていない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−６５２４０（Ｐ２００２−６５２４０Ａ）(43)平成１４年３月５日（２００２．３．５）公開
【非特許文献１】Kimura, Y 他、「The Journal of Biological Chemistry」 第276巻(2001)、15208-15215頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような外観を基準とする選別は、実施者の熟練度、主観等に依存する部分が大きく、選別した卵母細胞の質が変動するという問題が生じていた。また、これら外観を基準とする選別では、GPCRに対する応答性を必ずしも反映しているとは言えず、この選別された卵母細胞にGPCRを強制発現させる等の後、GPCR誘導性シグナリングに影響を与える薬剤をスクリーニングするのに必ずしも適した選別法とは言えない。
【０００７】
すなわち、GPCRの応答性の検出に適した卵母細胞または卵細胞を選別するための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明においては、この母体の個体差による卵母細胞のGPCR応答感度の不均一さを低減し、GPCR応答感度のより高い卵母細胞を選別する方法、および該選別により得られたGPCR応答感度のより高い卵母細胞を提供する。
【０００９】
本発明は、GPCRの一種であるリソホスファチジン酸（LPA）リセプターが、卵母細胞に内因性に発現されていることに基づくものである。母体から摘出した一腹の卵母細胞群から一部の卵母細胞（好ましくは4〜10個）を抽出して、LPAにて刺激し、LPA刺激に対する電流応答強度を計測し、同腹の卵母細胞、すなわち卵母細胞群におけるその平均値を求め、一定の値以上、または一定範囲内の値を示す卵母細胞群を選別して、該群に属する卵母細胞を、さらなる実験に用いるという手法である。卵母細胞のGPCR応答感度を卵母細胞群ごとに検定し、遺伝的に実験に不適切なGPCR応答感度を示す卵母細胞を排除し、遺伝的に良好な形質を有する卵母細胞を選別する。かかる選別により選別された卵母細胞群に属する卵母細胞のみを、GPCR応答性検出試験等（GPCRのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングを含む）に用いればよい。
【００１０】
リソホスファチジン酸（LPA）は、ホルモンや増殖因子と同様な作用を有し、多くの細胞および組織に作用して、その細胞の増殖・分化を制御するリン脂質の１つである。かかる作用は、LPAリセプター（LPAR）を介してもたらされる。LPARはGPCRの１つであり、LPAによりLPARが活性化すると、Gタンパク質を活性化することによりイノシトールリン脂質代謝回転系の活性化を誘導する。GPCRは約2000種見つかっており、これらはGタンパク質共役型リセプターファミリーを形成しているが、かかるイノシトールリン脂質代謝回転系の活性化経路は、全てのGPCRのシグナリングに共通の機構であり、イノシトールリン脂質代謝回転系の活性化の強度は電流応答強度として測定することができる。
【００１１】
したがって、該強度が高い場合、すなわち電流応答強度が高い場合は、一般的にLPAR以外のGPCRに対する応答感度も高いと推測できる。このことを利用して、GPCRシグナリングに影響を与える分子（GPCRのアゴニストおよびアンタゴニストを含む）のスクリーニング等を行う際に、LPA刺激に対する電流応答強度を予め測定し、一定以上、または一定範囲内の感度を有する卵母細胞のみを利用することができる。
【００１２】
ここで、図１を用いて、具体的に説明する。まず、カエルA,B,Cからそれぞれ卵隗を取り出し、予め、外観や静止膜電位などにより、卵母細胞群を選別する。そして、各カエルA,B,Cから、無作為に一部の卵母細胞をそれぞれ抽出し、各母体由来の卵母細胞それぞれに、LPA刺激を行う。そして、LPA刺激に対する応答感度が高い（電流応答強度の高い）カエル由来の卵母細胞を、以降の実験に供するのである。例えば、LPA刺激を行った結果、カエルBの電流応答強度がカエルAおよびCの電流応答強度に比べて高かった場合、カエルB由来の卵母細胞群に属する卵母細胞を、以降の実験に供するのである。なお、同じ母体由来の卵母細胞は、電流応答強度におけるばらつきが小さいため、無作為に数個抽出してLPA刺激を行えば良い。
【００１３】
なお、一旦、LPA刺激を行った卵母細胞は、使用済みとして処理され、同じ母体由来のLPA刺激を行わなかった卵母細胞を、以降の実験に供するとよい。
【００１４】
また、LPA刺激に対する電流応答強度の計測前に予め、実験目的に応じた特定のGPCRを卵母細胞に強制発現させておくこともできる。
【００１５】
以下、詳細に説明する。
本明細書および本願特許請求の範囲において、「卵母細胞群」とは、１つの母体に由来する同腹の卵母細胞の集合を指す。また、「LPA刺激に対する電流応答強度」とは、LPA刺激によりLPARを介したシグナル伝達経路の活性化によりもたらされる電流応答の大きさをいい、「卵母細胞のGPCR応答感度」とは、LPA刺激に対する電流応答強度より推定されるGPCR刺激に対する応答感度ということができ、GPCR応答感度が高いとはLPA刺激に対する電流応答強度が高いことを意味し、本発明においては、アフリカツメガエル卵母細胞に内因的に発現しているLPARに対するLPA刺激に対する電流応答強度の計測結果から求められる値をいう。これは、LPARがGPCRの1種であり、GPCRスーパーファミリーに属するリセプターはすべてその下流のシグナル伝達経路が共通であるという事実に基づいている。
【００１６】
母体から摘出した一腹の卵母細胞群を、これから一部の卵母細胞（好ましくは4〜10個）を無作為に抽出し、LPA刺激を行い、LPA刺激に対する電流応答強度を測定して１つの卵母細胞群に由来する卵母細胞における該電流応答強度の平均値を求め、各卵母細胞群の中で相対的に該平均値（すなわちGPCR応答感度）が高い細胞、または、一定の値以上もしくは一定範囲内の値を示す卵母細胞群に属する卵母細胞を、さらなる実験に用いるという手法である。一定の値以上とは、0.5μA、0.6μA、0.7μA、0.8μA、0.9μAまたは1.0μA以上であり得、一定範囲内の値とは、0.5〜3.0μA、0.6〜3.0μA、0.7〜3.0μA、0.8〜3.0μAまたは0.8〜2.5μAの範囲内の値であり得る。ただし、この一定の値および一定範囲内の値は、本発明を実施する技術者が、その実施目的等に応じて適宜設定することができ、任意の値であってよい。例えば、スクリーニングの性質上、高品質の卵母細胞群を得る必要がある場合には、LPA刺激による電流応答強度が高い群を選別すれば良く、上記範囲を高い値からなる範囲に設定すればよい。また、卵母細胞群の製造メーカーは、高品質用のセットとして上記電流応答強度が高い卵母細胞群を集めて、価格を高めに設定する一方、上記電流応答強度が高いが幅広い卵母細胞群を集めて、価格を安めに設定する等、ユーザの用途に合わせた販売形態が考えられる。卵母細胞のGPCR応答感度を母体ごと(すなわち、同じ母体に由来する卵母細胞群毎)に検定するため、遺伝的に実験に不適切なGPCR応答感度を示す卵母細胞を排除し、遺伝的に優れたGPCR応答感度を有する卵母細胞を選別することができる。
【００１７】
したがって、本発明は、LPA刺激に対する電流応答強度を指標としてGPCR応答感度が優れている卵母細胞を選別する方法、LPA刺激に対する応答の強度を指標にGPCR応答感度が優れている卵母細胞を選別することを含む、卵母細胞のGPCR応答性を検出する方法、LPA刺激に対する応答強度を指標としてGPCR応答感度が優れている卵母細胞を選別することを含む、GPCRのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法および該方法により選別されたGPCR応答感度が優れている卵母細胞を提供する。
【００１８】
ここで、「Gタンパク質共役型リセプター（GPCR）応答感度が優れている」とは、同一の卵母細胞群に属する卵母細胞において、LPA添加前の電流ピーク値とLPA添加後の電流ピーク値の差、または卵母細胞群毎の当該差の平均値が、他の卵母細胞群のそれと比較して高いか、上述のように、一定の値以上もしくは一定範囲内にあることをいう。このような卵母細胞は、GPCR刺激応答を検出することを含む実験に用いる場合に有利である。
【００１９】
このようにして選別された卵母細胞群およびそれに属する卵母細胞は種々の実験に適しており、本発明の範囲に包含される。
【００２０】
上記方法により選別された卵母細胞群に属する卵母細胞を、GPCRのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに用いることができる。かかるスクリーニングに用いる場合、上記選別により一定以上または一定範囲内のLPA応答感度を有し、GPCR応答感度が優れていると判断される卵母細胞群に属する卵母細胞を用いることは、大変有意義である。なぜならば、一定以上または一定範囲内のLPA応答感度を有するということは、GPCRによるイノシトールリン脂質代謝回転系の活性化の感度が一定以上または一定範囲内であることを意味するため、そのような卵母細胞群に属する卵母細胞を用いることで、遺伝的素因の揃った卵母細胞のみを用いてスクリーニング可能だからである。通常、卵母細胞を用いた特定のGPCRに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングは、該特定のGPCR刺激に対する電流応答強度を指標に行われるが、GPCRに対する応答感度は細胞それぞれで異なる場合が多く、特に遺伝的素因により該感度にばらつきが生じ易い。したがって、遺伝的素因が同じであり、かつ事前にLPA応答強度の測定により適切なGPCR応答感度を有することが分かっている卵母細胞群に属する卵母細胞を用いることで、GPCRによる電流応答の強弱の卵母細胞の遺伝的形質に由来するばらつきを低減することができる。したがって、このようにして得られた卵母細胞を上記スクリーニングに用いることで、データの信頼性が向上する。
【００２１】
卵母細胞を用いてGPCRに対するアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするためには、対象とする特定のGPCRを卵母細胞で発現させる必要があり、通常、対象のGPCRをコードするmRNA、cRNAまたは発現可能な形の核酸をマイクロインジェクションすることにより実施される。そして、該GPCRを細胞膜上に発現した卵母細胞を用いて、スクリーニングを実施する。
【００２２】
ここで強制発現させるGPCRは、いかなる動物に由来するものでもよい。対象とするGPCRは、公知のGPCRスーパーファミリーに属するもののうちいずれでもよく、これをコードする核酸配列は、各種刊行物またはデータベースを検索することにより得られる。本明細書中で用いる「Gタンパク質共役型リセプター（GPCR）」とは、卵母細胞に強制発現させた場合その細胞膜に存在し、細胞外からのリガンド刺激により、Gタンパク質を活性化して、イノシトールリン脂質代謝回転系の活性化を誘導するタンパク質をいう。したがって、野生型としてクローニングされたGPCRでもよく、また実験目的に応じて適宜改変させたものでもよい。改変の例としては、例えば、上記イノシトールリン脂質代謝回転系の活性化誘導能を完全に喪失しないような、アミノ酸残基の欠失、置換、付加を含んでいてもよい。また、特定のリセプター（GPCR以外の受容体を含む）の細胞外ドメインと、既知のGPCRの細胞内ドメインとを遺伝子工学的に連結させたキメラタンパク質（トランスメンブランドメインは、いずれのリセプターに由来してもよい）もまた、細胞外ドメインが由来するリセプターに対するリガンド刺激により、細胞内ドメインが活性化されイノシトールリン脂質代謝回転系の活性化を誘導し得る場合があり、このようなキメラタンパク質もまた、GPCRに包含される。
【００２３】
また、別の態様においては、所定のGPCRを強制発現させた後に、上記の方法によりLPA応答感度を指標に、実験に適した卵母細胞を選別してもよい。
【００２４】
さらに、LPA刺激に対する応答強度の計測結果からGPCR応答感度が高い卵母細胞は、その生物学的活性が高いと考えることもできるので、上記選抜により選抜された卵母細胞群に属する卵母細胞はその後のあらゆる実験（化合物のスクリーニングを含む）に有用である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、卵母細胞を用いたGPCRシグナリングを指標として用いる実験において、GPCR応答感度が、一定以上または一定範囲内にある、卵母細胞を用いることができる。これにより、GPCR応答感度を指標として行う実験、特にGPCRアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング等における、精度および確実性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
まず、通常の手法に基づき、母体の雌アフリカツメガエルより卵隗を摘出し、摘出した卵隗から酵素処理などにより卵母細胞を単離し、顕鏡観察により細胞の大きさ、形状、色調および模様等の外観により、実験に不適切な細胞を除去する。残りの卵母細胞群より、数個、好ましくは3〜10個、より好ましくは4〜7個、最も好ましくは6個を無作為に抽出する。抽出した卵母細胞を二電極膜電位固定法またはパッチクランプ法等の公知の方法（新パッチクランプ実験技術法  岡田泰伸編  吉岡書店  序論・イオンチャネル  ｐ1〜P14等を参照のこと）により、膜電位を一定に、例えば、100ｍV〜-40ｍVまたは+20ｍV〜+60ｍV好ましくは-60ｍVに固定する。膜電位を固定することにより、チャネルや起電性トランスポーターを流れる抵抗性イオン電流のみを計測することが可能となり、またイオンチャネルの多くは膜電位依存性を示すため、本発明のようなGPCR応答としてのClチャネル活性を検出したい場合、Clチャネルが最も活性化する電位で計測を行うことにより、感度高く事象を検出できる。
【００２７】
該固定後の卵母細胞に、約1pM〜10μM、好ましくは100pM〜100nM、最も好ましくは10nMのLPAを添加し、卵母細胞の電流応答強度を計測し、LPA添加前の電流値とLPA添加後の電流ピーク値の差をLPA刺激による電流応答強度として、測定した卵母細胞群についての平均値を求め、該同腹の卵母細胞からなる卵母細胞群のGPCR応答感度とする。GPCR応答感度が、所望の一定の値以上、または一定範囲内にある卵母細胞群を選別する。このようにして選別された卵母細胞群に属する卵母細胞は、同腹に由来するものであるため、それぞれが遺伝的に同程度のGPCR応答感度を有しており、GPCR応答性が優れているということができる。
【００２８】
また、上記操作を複数の母体から摘出した卵母細胞群について行い、各卵母細胞群毎のGPCR応答感度を得、GPCR応答感度が他の卵母細胞群に比べて高い卵母細胞群を選別することにより、GPCR応答感度が相対的に優れている卵母細胞を選別してもよい。または、選別した卵母細胞を用いて実施したい実験に応じて該実験に適切なGPCR応答感度を経験的に取得しておき、同じ条件下でLPA応答感度を測定し、所望の応答感度、一定の値以上、または一定の範囲内の値の応答感度を示す卵母細胞群を選別することにより、実施する実験に適したGPCR応答感度を有する卵母細胞群を選別することができる。
【００２９】
かかる選別により選別された卵母細胞群に属する卵母細胞をGPCRに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに用いる。
【００３０】
外来性のGPCRを対象とするGPCRに選択する場合について、以下に述べる。
対象とするGPCRを選別した卵母細胞に強制発現させる。これは、該GPCRをコードするmRNAまたはcRNAをマイクロインジェクションにより細胞に導入することによるのが一般的である。mRNAまたはcRNAをマイクロインジェクション法については特許公開公報特開2002-065241号または特開2002-065240号を参照されたい。簡単に述べると、例えば、細胞刺入用ピペットの先端にmRNAまたはcRNAを充填し、該細胞刺入用ピペットを細胞に近づけ、所定の深度まで刺入する。油圧または空気圧などで一定量のmRNAまたはcRNAを吐出させることにより、mRNAまたはcRNAを細胞内に注入する。
【００３１】
スクリーニングの際には、例えば、該卵母細胞を二電極膜電位固定法等により、膜電位を一定に、好ましくは上記選別におけるLPA刺激時と同等の電圧下または-60ｍVに固定し、適切なバッファー、例えば96ｍM NaCl、2ｍM KCl、1ｍM MgCl2、1ｍM  CaCl2、5ｍM  HEPES  pH7.5中にて、適温（好ましくは15〜22℃）にてアゴニストの候補である対象とする試験化合物に曝露し、曝露前と曝露後の電流応答の差を測定するとよい。この差があれば、試験化合物はGPCRのアゴニストとして同定する。この判定の基準としては、LPA応答強度（すなわちLPA刺激前と刺激後の電流応答の差）、または該GPCRの既知リガンドに該卵母細胞を曝露した場合の電流応答の差を指標に一定のGPCR応答感度を設定し、該設定値以上の電流応答差を生じさせる試験化合物のみをGPCRアゴニストとして同定することもできる。また、GPCRのリガンドまたはアゴニストと共に、アンタゴニストの候補である対象とする試験化合物に曝露し、曝露前と曝露後の電流応答の差を測定することにより、GPCRのアンタゴニストのスクリーニングが可能である。かかる電流応答の差が、上記リガンドまたはアゴニスト単独で卵母細胞を曝露させた場合より小さければ(電流応答の差が認められない場合も含む)、該試験化合物はGPCRのアンタゴニストとして同定することができる。
【００３２】
また、卵母細胞に所望のGPCRを強制発現させた後、LPA応答強度を測定し、目的とする実験に適切なGPCR応答感度を有する卵母細胞を選別することができる。
【００３３】
この場合、上記と同様に、雌アフリカツメガエルから卵隗を摘出し、摘出した卵隗から酵素処理などにより卵母細胞を単離した後、顕鏡観察により細胞の大きさ、形状、色調および模様等の外観により、実験に不適切な細胞を除去し、残りの卵母細胞に対象とするGPCRのmRNAまたはcRNAをマイクロインジェクションし、一定時間培養する。培養後の卵母細胞を各バッチから無作為に数個（好ましくは、4〜10個）抽出して、上記と同様に、LPA刺激に対する電流応答強度を計測し、目的とする実験に適したGPCR応答感度を有する卵母細胞群を選別する。
【００３４】
このようにして選別した卵母細胞は、上記と同様にGPCRのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング等に用いることができる。
【００３５】
上記の手法により選別した卵母細胞に、対象とするGPCR（例えば、ヒスタミン受容体等）をコードするmRNAまたはcRNAを公知の手段により導入すると、遺伝子導入操作後、24時間以内で卵母細胞に該受容体が発現する。遺伝子導入操作後、24時間以上経て、受容体が発現したと考えられる卵母細胞の膜電位を二電極膜電位固定法により、例えば、-60mVに固定する。このような条件下において、卵母細胞に該受容体に対するリガンド（例えば、ヒスタミン1μMなど）を含んだサンプルを添加すると、サンプル中のリガンドと受容体が相互作用し、卵母細胞内の情報伝達系が活性化し、イオン流が発生するため、卵母細胞はリガンドに対して電気的応答を示す。すなわち、上記GPCRをコードする核酸を導入した卵母細胞にサンプルを添加し、その細胞応答の有無を指標にして、サンプル中のリガンドの有無、サンプル中のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を検出することができ、リガンド、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングが可能となる。
【００３６】
上記のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法においては、スクリーニングに先立ち、本発明によりGタンパク質共役型リセプターによる応答反応結果に基づいて、スクリーニングに適した卵母細胞群を選別しているため、個々の卵母細胞の個体差が小さい均質な系でスクリーニングすることができ、擬陽性または擬陰性を呈する確率が低減される。したがって、本発明によるスクリーニング方法は、データの信頼性が高く、スクリーニング実験の時間効率・労力・コストの面で有利である。
【００３７】
また、上記のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法は、Gタンパク質共役型リセプターのリガンドであればいかなる物質のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングについても適用できる。さらには、リガンドが未知であるGタンパク質共役型オーファンリセプターをコードする核酸を導入し、そのリガンドとなる化合物も上記アゴニストのスクリーニング方法を適用することも可能である。さらには、本発明のスクリーニング方法は、適宜、当業者には容易に想到し得る変更および/または改変を加えて、あらゆるGタンパク質共役型リセプターの種々の細胞内シグナリング関連物質のスクリーニングに応用することが可能である。
【実施例】
【００３８】
実施例１
母体A、B、Cより卵隗を摘出し、定法に従い濾胞細胞を除去した。濾胞除去後の卵母細胞のうち、外観が実験に適したものを選別し、母体ごとに卵母細胞群を分別した（バッチA、B、C）。それぞれのバッチから、無作為に6個づつ卵母細胞を抽出した。
【００３９】
各細胞を二電極膜電位固定法により、-60ｍVに膜電位固定した。各細胞を1nMのLPAで刺激し、その際の電流応答強度を計測した。LPA刺激前の電流値とLPA刺激後の電流変化ピーク値の差分を求めたものが表１である。表１に示したように、バッチ間でLPA反応の大きさに違いが見られた。
【００４０】
各バッチの卵母細胞に、定法に従いGPCRのcRNAをマイクロインジェクションした。インジェクション後、2日間18℃で培養し、卵母細胞にGPCRを発現させた。その後、各バッチから無作為に6個づつ卵母細胞を抽出した。
【００４１】
各細胞を二電極膜電位固定法により、-60ｍVに膜電位固定した。各細胞をGPCRのリガンドで刺激し、その際の電流応答強度を計測した。リガンド刺激前の電流値とリガンド刺激後の電流変化ピーク値の差分を求めたものが表１である。表１に示したように、バッチ間で反応の大きさに違いが見られた。そして、この反応の大きさの違いは、LPA反応の大きさの違いと相関がみられた。
【００４２】
なお、ここでは、バッチの中で、６個の卵母細胞を抽出してその平均値をとったが、実験に適さない卵母細胞が含まれている可能性があるときは、電流応答強度値の最大値と最小値とを除いて平均値を出すと良い。
【００４３】
【表１】
2005117961.tif 000003
【００４４】
実施例２
上記実施例により、LPA反応の大きい卵母細胞群を用いて、以下のスクリーニングを行った。ここでは、表１から、バッチBの卵母細胞群の応答性が高いことがわかったので、バッチBの卵母細胞群を用いた。なお、LPA刺激を行った卵母細胞は使用済みとして処理し、バッチBのLPA刺激を行わなかった卵母細胞について、実験を行った。
【００４５】
該卵母細胞群の卵母細胞に、ヒスタミン受容体遺伝子を常法により導入し、24時間後に、該細胞を、二電極膜電位固定法により膜電位を-60ｍVに固定した。そしてヒスタミンを1μMの濃度で含むバッファー（96ｍM NaCl、2ｍM KCl、1ｍM MgCl2、1ｍM  CaCl2、5ｍM  HEPES  pH7.5）または含まない同バッファーを該細胞と接触させて、電流応答強度を計測した。上記遺伝子導入には、特許文献１に記載の装置および方法を用いた（図３参照）。
【００４６】
図３に、この装置の原理を示す。卵母細胞を整列配置させるトレイは、例えば水平方向に12個、直行方向に8個の計96個の深さ及び形状が均一な穴の開いたトレイが使用できるが、トレイの穴数は必ずしも96個には限定されない。両生類卵母細胞は一般に白面の重量が黒面に比して大きい。よってトレイの穴径を用いる卵母細胞より多少大きくすることで、トレイに整列した卵母細胞は回転等によって向きを変えることなく、平均して約８割の細胞は黒面を上にして保持され、他に特別な手段を用いることなく同一面への導入確率を上げることができる。卵母細胞を整列させるための穴の形状は、底面が円形の平面であって底面から開口部までの底面に平行な断面形状が一定である円筒形、又は底部が円錐形の形が好ましい。上記穴の開口部の直径は、用いる両生類卵母細胞の直径以上である必要がある。また上記した理由から生理食塩水等を満たした上記穴中で卵母細胞が回転できる程度の余地があることが望ましく、具体的には用いる卵母細胞直径の１０５−１５０％を穴の最大直径とすることが望ましい。例えばアフリカツメガエルの卵母細胞の直径が約1.3mm程度であることから、穴の直径を1.4〜2mm程度とすることにより、細胞を傷つけることなく、特定の方向に固定することが可能になる。本実施例に好適な穴の形状の例は、底の角度90°、直径1.4mm、円柱部分の深さ0.56mmのすり鉢型のものである。また、上記トレイを用いる他にスポイト等を使用して、同一面への導入確率をさらに上げたり、また特定の面、例えば白面が上になるように操作することもできる。
【００４７】
導入する試料としては、遺伝子、色素、タンパク質、ぺプチド、薬物等が挙げられ、特に限定されるものではない。また、下記の実施例ではヒトヒスタミン受容体cRNAを導入した卵母細胞について記載するが、導入に使用する遺伝子はcRNAに限定するものではなく、DNA及びRNA、合成したオリゴヌクレオチドなどあらゆる核酸であっても良い。試料を導入するための針は、ピペット様の針であることが好ましいが、特に限定するものではない。また、卵母細胞の向き等の細胞情報を収得するためにデジタルカメラ8を、導入針6が卵母細胞表面が接触したことを検知するための手段として、CCDカメラ7を通した視覚情報を例としているが、これらの情報を得るために必要な手段はデジタルカメラ8やCCDカメラ7に限定されるものではない。例えば、圧力、温度、電気、湿度、ｐＨ等の変化を感知するセンサーを導入装置にとりつけることで、これらの情報を基に細胞表面を検知することができる。
【００４８】
トレイ9の穴に試料導入前の卵母細胞を並べ、トレイ9に両生類用生理食塩水14を満たした後、直交移動台11と水平移動台12の上に設置する。この直交移動台11と水平移動台12の移動を制御装置１によりＸ軸方向及びＹ軸方向に制御することによって、導入針6から試料を導入する卵母細胞13の位置を決定することが好ましいが、図1の構成と逆に、トレイ9を固定し、導入針6を移動可能な構成とすることもできる。
【００４９】
トレイ9が破線の位置にあるとき、デジタルカメラ8で卵母細胞を撮影し、制御装置1にその撮影データを送ることにより、卵母細胞の良否及び向きなどの情報を蓄積することができる。
【００５０】
水平移動台12と直交移動台11を制御装置1の指示で動作し、トレイ9に並べられた卵母細胞のうち所定の位置にある最初の卵母細胞13の中心を遺伝子導入針6の下方位置に移動する。ここで導入針のＺ軸方向の移動のために導入針移動台4が制御装置1の指示で動作し、導入装置5に装着された導入針6の先端を卵母細胞の表面よりわずかに離れた位置、例えば数100mm手前まで下降させる。ここで、CCDカメラ7で撮影された画像をモニター3で観察しながら、制御補助装置2で指令を出し、導入針移動台4を低速で下降させる。視覚情報、圧力変化、温度変化、電気変化、湿度変化、pH変化等で卵母細胞13の表面に導入針6の先端が接触したことを検知し、この位置で導入針移動台4を止める。この位置が以降の遺伝子導入操作の基準点となる。この位置を制御装置1に記憶させ、以下の操作を実施する。すなわち、上記基準点から試料を導入する位置までの、トレイの置かれている面に対して垂直方向の導入針の移動距離、深度を設定し、上記設定された深度で導入針6を刺入して試料を一定量吐出させる。試料導入のためには、例えば上記の卵母細胞13表面に導入針6が接触した位置から0.2mm下方に導入針を下げるといったＺ軸制御を行うことができる。細胞への導入針6の最適な導入深度は、導入する試料の種類や導入の目的により異なり、適宜設定することができる。試料は導入深度が浅すぎると細胞中に広がらず、又深すぎると核を傷つけたり細胞を傷める確率が高くなる。よって、試料の導入にはほぼ一定の深度に導入することが発現効率の点からも望ましい。例えば、細胞質内にmRNAを導入し、タンパク質を発現させたい場合には、細胞表面から0.02〜0.1mmの深度に針を刺入することが望ましい。一方、核内にDNAを導入し、タンパク質を発現させたい場合には、細胞表面から0.05〜0.2mmの深度に針を刺入することが望ましい。但し、導入時に卵母細胞の形状が針の接触によりわずかにゆがむため、実際には設定した深度よりも浅い位置に試料が導入される。試料導入のための時間は、細胞への注入量等に応じて、針が細胞内に注入されている時間を設定することにより制御する。尚、導入効率を更に向上させるために、導入針6は複数個にすることもできる。この場合、装置の駆動部は、導入針とトレイの相対的位置を１次元又は２次元方向に移動させることで十分とすることもできる。
【００５１】
この後、最初の卵母細胞の3次元的な位置情報を基に、自動制御によりトレイ9内の２つ目以降の任意の数の卵母細胞に、指示された時間と速度及び導入深度で試料を自動的に導入する。また、卵母細胞の大きさにばらつきがある場合があるため、導入の都度表面位置検出を行う機能も備えさせることもできる。また、卵母細胞の細胞情報をコンピュータに記憶させ、必要時にそれを引き出すこともできる。
【００５２】
更に、試料導入時の上記導入針6及び卵母細胞13の動きや、導入時の卵母細胞の視覚情報等をコンピュータに記憶させ、導入操作終了後に試料導入位置、深度、細胞の特徴等を読み出すように設定することもできる。この場合、各卵母細胞に関する視覚情報は番号を付す等することによって上記トレイ上の位置と関連付けて行うことが望ましい。
【００５３】
また、両生類の卵母細胞には白面及び黒面があることが知られており、それぞれ機能が異なっていることが知られていたが、本発明者等は、卵母細胞にmRNAを導入した場合、卵母細胞の黒面にmRNAを導入した場合と白面にmRNAを導入した場合では、タンパク質の機能発現効率が異なることを既に見出している。したがって、ヒスタミン受容体mRNAを導入する場合には、黒面に導入した方が、白面に導入した場合よりも発現効率が高く、リガンド応答性の良い卵母細胞を得ることができる。一方、発色団を含むタンパク質、蛍光タンパク質、またはこれらの遺伝子、色素を導入する場合には、白面に導入した方が色や光の情報を感度高く得ることができる。上記したように上記トレイを用いることでトレイ上の細胞については約８割について黒面への導入が可能である。あるいは、細胞の特定面、例えば黒面のみ、または白面のみに試料を導入した細胞を得たい場合には、上記したように、試料導入前に予め特定の面のみが上になるように個々の細胞をスポイト等を用いて操作する。若しくは、試料を導入する際に視覚情報検出手段や白黒判別センサーにより細胞表面の試料導入位置情報を収得し、収得された情報から、目的の面が上になった細胞のみに試料が導入された細胞を収集することもできる。これにより導入位置の条件を実質的に同じくする卵母細胞が得られる。
【００５４】
上記の構成の装置を使用することにより、両生類卵母細胞の特定位置及び深度に試料を導入することができ、導入された試料の機能発現効率（導入効率）がほぼ同品質の卵母細胞を、迅速に、かつ大量に生産することができる。
【００５５】
当該装置を使用することにより、試料導入効率は次のように向上する。すなわち、手動操作による試料導入の経験がない初心者の場合、25個の細胞に試料を導入するために約30分程度かかり、導入効率は、遺伝子を試料とした場合の発現率で約30％であるが、当該装置の使用により、25個の細胞に試料を導入するための時間はわずか３分間となり、導入効率は80％程度にまで達する。手動操作による試料導入の熟練者の場合には、導入のためにかかる時間にそれ程の短縮は見られないが、導入効率は、例えば手動で80％である場合には装置の使用により更に上昇して90％にまで達することができる。
【００５６】
以下、上記導入する試料の例として、ヒスタミン受容体遺伝子を用いて、本発明により選別された卵母細胞に導入してヒスタミンのアゴニストとして作用する薬剤のスクリーニングの例について記載する。
【００５７】
上記の方法を用いてヒトヒスタミン受容体遺伝子15を卵母細胞13に導入し、導入された細胞を回収した。かかる導入は上記の方法に限定されるわけではないことは当業者には理解されよう。該卵母細胞13を、適切な条件下（例えば、96mM NaCl、2mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、5mM HEPESバッファー（pH7.5）中）におき、遺伝子導入の24時間後のヒトヒスタミン受容体タンパク質16を発現した該細胞13を、二電極膜電位固定法により膜電位を-60ｍVに固定した。複数のヒスタミンのアゴニストの候補化合物17を適切な最終濃度（例えば100μMなど）になるよう、上記バッファー中に添加した。なお、ここで候補化合物の濃度は、実施者が適宜決定することができ、かつ、0.1〜100倍程度の濃度範囲内で希釈列を構成するよう調製して用いてもよい。当該化合物の添加前と添加後の細胞の電流応答の差を検出した。添加した化合物がヒスタミンアゴニストである場合17、電流応答のシグナルが検出され18（図４(a)）、ヒスタミンアゴニストではない化合物19であった場合、電流応答は検出されない20（図４(b)）。このようにして、電流応答に基づいて、ヒスタミンアゴニストとして作用する薬剤をスクリーニングすることができた。
【００５８】
次に、本発明により選別された卵母細胞に導入してヒスタミンのアンタゴニストとして作用する薬剤のスクリーニングについて記載する。
【００５９】
上記と同様に、ヒスタミン受容体遺伝子を導入した卵母細胞を、膜電位固定した。ヒスタミン(例えば、最終濃度１μM)とともに、ヒスタミンのアンタゴニストの候補化合物を適切な最終濃度（例えば100μMなど）になるよう、バッファー中に添加した。なお、ここで候補化合物の濃度は、実施者が適宜決定することができ、かつ、0.1〜10倍程度の範囲内で希釈列を構成するよう調製して用いてもよい。当該化合物の添加前と添加後の細胞の電流応答の差を検出した。添加した化合物がヒスタミンアンタゴニストである場合23、電流応答のシグナルがヒスタミンのみ添加した場合に比べて小さいか、または全くシグナルが得られず24（図５（b））、添加した化合物がヒスタミンアンタゴニストではない場合21、ヒスタミンのみ添加した場合と同様の電流応答が検出される22（図５(a)）。このようにして、電流応答強度に基づいて、ヒスタミンアンタゴニストとして作用する薬剤をスクリーニングすることができた。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図1は、本発明の概念図である。
【図２】図２は表１をグラフ化したものである。誤差棒は、各バッチ内の個々の細胞から得られたデータの標準偏差をしめす。
【図３】図３は、本発明における遺伝子導入および電流応答計測装置の構成図である。
【図４】図４は、ヒスタミン受容体に対するアゴニストのスクリーニングの概念図を示す。
【図５】図５は、ヒスタミン受容体に対するアンタゴニストのスクリーニングの概念図を示す。
【符号の説明】
【００６１】
１：制御装置、２：制御補助装置、３：モニター、４：導入針移動台、５：導入装置、６：導入針、７：CCDカメラ、８：デジタルカメラ、９：トレイ、１０：光源、１１：直交移動台、１２：水平移動台、１３：卵母細胞、１４：使用する卵母細胞に適したバッファー、１５：ヒスタミン受容体遺伝子、１６：ヒスタミン受容体、１７：ヒスタミンアゴニストである化合物、１８：電流応答あり、１９：ヒスタミンアゴニストではない化合物、２０：電流応答なし、２１：ヒスタミン＋ヒスタミンアンタゴニストではない化合物、２２：電流応答あり、２３：ヒスタミン＋ヒスタミンアンタゴニストである化合物、２４：電流応答なし
【図１】
2005117961.tif 000004
【図２】
2005117961.tif 000005
【図３】
2005117961.tif 000006
【図４】
2005117961.tif 000007
【図５】
2005117961.tif 000008