(57)【要約】      （修正有）【課題】ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および分析のための方法を提供する。【解決手段】薬剤標的とライブラリ化合物の間の結合の同定のための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および検査のための方法、結合に関する反応エンタルピーを測定する熱量計装置を用いた使用について開示される。この方法は、ライブラリ化合物を特定の溶媒と混合すること、および標的化合物溶液を第二の特定の溶媒とともに熱量計上で混合することを含む。ライブラリ化合物／溶媒は、標的化合物／溶媒溶液と併合され、ライブラリ化合物／溶媒溶液はまた第三の溶媒溶液と熱量計装置上で併合される。反応熱は併合された双方の溶液について検出され比較される。【選択図】図１１
2005156558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化合物とライブラリ化合物の間の結合を同定するための、かかる結合に関する反応エンタルピーを測定する装置を用いた使用のための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および検査のための方法であって、
一以上の選ばれたライブラリ化合物溶液を、前記装置上の第一の溶媒溶液に対して導入し、それらが混合して一以上のライブラリ化合物／溶媒溶液を形成するようにすることと、
一以上の標的化合物／第二の溶媒溶液を前記装置上に導入することと、
前記一以上のライブラリ化合物／溶媒溶液を、前記標的化合物／溶媒溶液と、前記装置の一以上の場所において併合することと、
前記一以上のライブラリ化合物／溶媒溶液を、第三の溶媒溶液と、前記装置の一以上の第二の場所において併合することと、
前記併合されたライブラリ化合物／溶媒溶液、および前記標的化合物／溶媒溶液について、第一の反応熱を検出することと、
前記併合されたライブラリ化合物／溶媒溶液、および前記第三の溶媒溶液について、第二の反応熱を検出すること、および
前記第一および第二の反応熱を比較すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および検査のための方法であって、熱量計がナノ熱量計装置であることを特徴とする方法。
【請求項３】
ナノ熱量計において使用するための、標的化合物とライブラリ化合物の間の結合を同定するための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および検査のための方法であって、前記ナノ熱量計が熱分離領域、参照領域、および測定領域を含んでおり、前記方法が、
一以上の参照領域内および一以上の測定領域内の各々に、一滴以上の第一の溶媒溶液をデポジットすることと、
一以上の測定領域内および一以上の参照領域内の各々に、一滴以上の第二の溶媒溶液をデポジットすることと、
前記測定領域内の一滴以上の標的化合物をデポジットして、前記一滴以上の標的化合物が、前記一滴以上の第二の溶媒溶液と接触および混合し、標的化合物／溶媒溶液を形成するようにすることと、
前記一以上の測定領域および一以上の参照領域に、一滴以上の選ばれたライブラリ化合物溶液をデポジットして、前記一滴以上の選ばれたライブラリ化合物が、前記一滴以上の第一の溶媒溶液と接触および混合し、ライブラリ化合物／溶媒溶液を形成するようにすることと、
前記ライブラリ化合物／溶媒溶液を、一以上の参照領域内の前記第二の溶媒溶液と併合することと、
前記ライブラリ化合物／溶媒溶液を、一以上の測定領域内の前記標的化合物／溶媒溶液と併合することと、
一以上の測定領域内で、第一の反応熱を、前記併合されたライブラリ化合物／溶媒溶液および前記標的化合物／溶媒溶液について検出することと、
一以上の参照領域内で、第二の反応熱を、前記併合されたライブラリ化合物／溶媒溶液および前記第二の溶媒溶液について検出すること、および
前記反応熱を、一以上の参照領域および一以上の測定領域について比較すること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
ナノ熱量計において使用するための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および分析のための方法であって、前記ナノ熱量計が熱分離領域および測定領域を含んでおり、前記方法が、
前記測定領域内に一滴以上の標的物質をデポジットすることと、
前記一以上の測定領域に、一滴以上の選ばれたライブラリ化合物溶液をデポジットすることと、
前記一以上の測定領域内で、前記ライブラリ化合物溶液を、前記標的物質溶液と併合すること、
前記一以上の測定領域内で、前記併合されたライブラリ化合物溶液および前記標的物質溶液の反応熱を検出すること、および
前記反応熱を、一以上の測定領域について測定すること
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および分析のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、研究者および企業は、新規化合物、材料、化学の合成、発見、開発のために、コンビナトリアル法およびその手法に注目している。例えば、薬剤の研究者は、医薬発見用の新規リード化合物のソースとして、コンビナトリアルライブラリに注目している。従って、コンビナトリアル的発見手法のニーズに適う、多くの小サンプルの反応および相互作用を測定できる装置に対する必要性が存在する。ユーザは、素早く、安価に測定することができ、コンタミネーションおよびクロスコンタミネーションの問題を最小限にすることができる装置を望んでいる。
【０００３】
コンビナトリアルケミストリ法の使用、およびその改良法の必要性について、薬剤調査を例に挙げ、より詳細に説明する。薬剤の研究者は薬剤の発見のための新規リード化合物のソースとして、コンビナトリアルライブラリに注目している。コンビナトリアルライブラリは、化学的化合物の集合であり、それは、化学合成または生物学的合成の何れかにより、沢山の化学的な「構造ブロック」を試薬として結合することにより、生成される。例えば、コンビナトリアルポリペプチドライブラリは、与えられた化合物の長さ（即ち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）に対して可能なすべての組み合わせで、アミノ酸のセットが結合されて、形成される。多くの化学的化合物は、理論的に、そのような化学的構造ブロックのコンビナトリアル的な混合物を利用して合成することが出来る。
【０００４】
一旦、ライブラリが形成されると、それは、生物学的または薬学的活性を有する化合物を特定するためにスクリーニングされなければならない。例えば、公知の生物学的反応に加わり、または調製機能に含まれる特異的な生物学的分子（しばしばターゲット分子と言及される）でスクリーニングすることができる。ターゲットと反応するライブラリ化合物は、ターゲットの生物学的活性に影響を与える候補であり、治療薬の候補である。
【０００５】
コンビナトリアル法は沢山の化合物および反応を含んでいるので、沢山の小サンプルの反応と相互作用を速い速度で測定でき、コンビナトリアル的発見手法のニーズに適う装置が必要である。ユーザは、これらの装置が安価であり、コンタミネーションおよびクロスコンタミネーションが最小限の装置を望んでいる。
【０００６】
反応と相互作用を測定する方法の一つとして、熱量測定法がある。熱量測定法は、ラベル化（例えば、放射ラベルや蛍光ラベル）、または表面への固定化をすることなく、熱力学的および速度論的な反応を測定することが出来る。他の最近の測定方法の多くは、基質または補助因子の修飾を必要とする（蛍光ラベル、表面定着等）。〔Handbook of Drug Screening, R. Seethala and P.B. Fernandes, eds., Marcel Dekker Inc., 2001〕。これらの修飾は、工程やコストを増やし問題となっている。
【０００７】
いくつかの事例においては、研究用サンプルは高価であり、標準的な微小熱量計で一回の測定に要求される試料は比較的多く、間に合わない場合がある。例えば、研究用として、生物学的相互作用を有する天然物抽出物または合成化合物が必要とされるが、ある場合には、熱量測定用の充分な濃度の試料を利用できる量は、わずか数ミリリットルである。標準的な微小熱量計で測定を行う場合、例えば、市販されているMicroCal（登録商標）Inc.（モデル VP ITC）、Calorimetry Sciences Corporation（登録商標）（モデル CSC 4500）は、１ｍｌの試料が必要である。それは、おそらく、その大半またはすべての貴重な試料を、一度または少ないシリーズの測定のために使用しなければならない。より少ないサンプル量で熱量測定を可能とする手段があれば、このような制限の問題を克服するのに有用であろう。
【０００８】
リード化合物のためのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするのに種々の測定方法が用いられているが、そのなかの一つが競合的結合アッセイである。このアッセイでは、マーカーリガンド（しばしば生物学的反応中の天然リガンド）は、ターゲット分子と良く結合することが確認される。当該アッセイは、しばしば蛍光分子を化学的に結合する必要があり、蛍光分子がマーカーリガンドとターゲット分子との反応に影響を及ぼさないことが重要である。あるいは、リガンドを放射ラベルまたはケミルミネセンス分子でラベルすることができる。
【０００９】
ターゲット分子を利用する競合的結合アッセイをする一つのアプローチを例示すると、しばしばマイクロタイターウェル内で、テストリガンドおよびマーカーリガンドの混合物を曝すことが行われる。反応させた後、ウェルはすすがれ、遊離のマーカーリガンドは洗い流される。相対的に、マーカーリガンドの結合よりも、ターゲット分子とテストリガンドが強固に結合している場合、テストリガンドは、ターゲット分子の活性部位をブロックしているので、マーカーリガンドは結合せず、洗い流される。反対に、ターゲット分子とテストリガンドが、マーカーリガンドの結合に対して相対的に、強固に結合していない場合、マーカーリガンドはターゲット分子に結合し、少なくともある程度のものが、洗い流されないのである。テストリガンドが加えられていないコントロールのウェルと比較することで、蛍光が減少したウェルを観察できるので、洗浄後、蛍光の存在下、ウェルを調査するとテストリガンドとターゲット分子の反応を決定することができる。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，３８０，６０５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４５，３３４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、競合的結合アッセイは、時間とラベル試薬およびアッセイを開発する費用が要求される。開発に要求される典型的な要素は、マーカーリガンドの発見、およびターゲット分子との反応に影響を与えないような蛍光マーカーの付着である。マーカーリガンドを同定しようとすると、蛍光マーカーの付着に、しばしば、三ヶ月またはそれ以上の開発期間、および２５００００ドルまたはそれ以上を要する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、全般的にはハイスループットスクリーニングアッセイにおいて利用される標本調製および分析のための方法に関する。特に、本方法はナノ熱量計における使用のための、スクリーニングアッセイ用の標本組成物の調節における改良に向けられたものである。
【００１３】
開示された実施形態は、上記の背景議論およびそれに引用された技術における問題に対し、改良された解決法の実例を提供する。これらの実例においては、ケミカルライブラリの分配のための改良法、検査測定の単純化、および以下の特徴の一部またはすべてを提供することが可能な使用法が示される。
【００１４】
簡単に述べれば、一実施形態においては、薬剤標的とライブラリ化合物との間の結合の同定のための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および検査のための一つの方法が、結合に関する反応エンタルピーを測定するための熱量計を用いた使用について開示される。この方法は、ライブラリ化合物を指定の溶媒と混合すること、また、標的化合物溶液を第二の指定の溶媒とともに熱量計上に供給することを含む。ライブラリ化合物／溶媒溶液は、標的化合物溶液と併合され、ライブラリ化合物／溶媒溶液の別の標本はまた、第三の溶媒溶液と熱量計上で併合される。併合の際に発生された熱は、双方の併合された溶液について検出され、比較される。
【００１５】
もう一つの実施形態においては、熱分離領域、参照領域、および測定領域を含む熱量計において使用するための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の標本調製および分析のための方法が開示される。この方法は、第一および第二の溶媒溶液の液滴を、熱量計の参照および測定領域内にデポジットすること、各々の少なくとも一滴が各領域内に置かれるようにすることを含む。標的化合物は、第二の溶媒溶液とともに測定領域にデポジットされ、二者は混合されて標的化合物／溶媒を形成する。選ばれたライブラリ化合物の溶液は、第一の溶媒溶液とともに測定および参照領域にデポジットされ、混合されてライブラリ化合物／溶媒溶液を形成する。ライブラリ化合物／溶媒溶液は、参照領域内において第二の溶媒溶液と併合され、反応熱が検出される。ライブラリ化合物／溶媒溶液は、測定領域内において標的化合物／溶媒溶液と併合され、反応熱が検出される。反応熱は次いで比較される。
【００１６】
さらにもう一つの実施形態においては、熱分離領域および測定領域を含むナノ熱量計における使用のための、ハイスループットスクリーニングアッセイ用の試料調製および分析のための方法が開示される。この方法は、標的物質および選ばれたライブラリ化合物溶液を、測定領域内の異なる区域内にデポジットさせることを含む。ライブラリ化合物溶液は、次いで標的化合物溶液と併合され、反応熱が検出および測定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本願において用いられるように、用語「リガンド」は標的化合物に結合する薬剤を指す。本願の目的のためには、リガンドは、標的分子の認識された機能領域、たとえば酵素の活性部位、抗体の抗原結合部位、受容体のホルモン結合部位、補因子結合部位、およびその他に結合する薬剤であることも可能である。本方法の実施においては、リガンドはまた、任意の表面または標的分子の構造ドメインに結合する薬剤であることも可能である。それゆえ、本方法のリガンドは、前文に述べた方式での標的化合物に対するその結合能を超えて、それら自身の中に、またはそれらについて、何ら見かけの、または既知の生物学的機能をもたなくてもよい薬剤を含む。
【００１８】
本願において使用されるように、用語「テストリガンド」は、標的化合物に対するその結合能が検査される、化合物、分子、または複合体を含む薬剤を指す。テストリガンドは、金属、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、核酸、有機低分子、およびそれらの組合せを含むがそれらに制限ない、事実上どのような薬剤でもよい。一つより多いテストリガンドを含有してもよい天然産物抽出物のような物質の複合混合物もまた検査されてよく、標的化合物に結合する成分は、次に続く段階において混合物から生成されることが可能である。
【００１９】
本願において使用されるように、「スクリーニング」は、多数の分子または化合物を、一つの標的化合物に結合する能力について検査することを指す。
【００２０】
本願において使用されるように、用語「標的化合物」は、ペプチド、タンパク質、核酸、タンパク質−核酸複合体、および他の受容体を含む。この用語は、酵素および酵素ではないタンパク質の双方を含む。この用語は、単量体および多量体のタンパク質を含む。多量体タンパク質は、ホモメリックまたはヘテロメリックなタンパク質でよい。この用語は、オリゴヌクレオチドのような、少なくとも二つのヌクレオチドを含んでなる核酸を含む。核酸は、一本鎖か、二本鎖、または三本鎖であることが可能である。この用語は、合成オリゴヌクレオチド、組換えＤＮＡ分子、または染色体ＤＮＡの一部、ならびにｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｃＲＮＡを含めたＲＮＡである核酸を含む。標的化合物という用語はまた、補因子、補酵素、補欠分子族、脂質、オリゴ糖、またはリン酸基を、これに制限されずに含めた置換基とともに、ペプチド、二次、三次、または、折りたたみによる四次構造の部分を含む。
【００２１】
本願において用いられるように、用語「温度変化」は、熱の状態のエネルギーの放出か、または熱の状態のエネルギーの吸収を含む。
【００２２】
本願において用いられるように、用語「標的化合物の併合」は、広義には、溶液中の標的化合物を結合のため、スクリーンされるべき分子とともに置くことを指す。やや広義には、併合は、標的化合物の溶液と、結合に関してスクリーニングされるべき分子とを、注ぐこと、渦巻くこと、振盪すること、または振動させることを指す。さらに明確には、併合は、標的化合物を、結合に関して検査されるべき分子とともに混合することを指す。混合は、たとえば、ピペットチップを通した吸上げおよび吐出しの反復によるか、またはロボット工学手段によるデポジションにより成就されることが可能である。併合は標的化合物と、結合について検査されるべき分子との間の結合の平衡を指してもよく、任意の多くの方法で成就されてよい。たとえば、拡散による混合には充分な時間が与えられてよく、あるいは混合は、滴下による併合、電気的力、およびその他の結果であってもよい。
【００２３】
本願において用いられるように、用語「生物学的条件」は、物理的、化学的、または生物学的反応についての、任意の成分、熱力学的特性、または動力学的特性を含む。特に、この用語は、温度、気圧、タンパク質濃度、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、時間、電流、電位差、および補因子、補酵素、酸化剤、還元剤、界面活性剤、金属イオン、リガンド、緩衝成分、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含めた副溶剤、グリコール、および関連成分、エンハンサー、および阻害剤の濃度についての条件を指す。
【００２４】
本願において用いられるように、用語「ハイスループット」は、広義には多数の検査を用いた研究を指し、調製の段階および複雑化を最小限にしつつ、各々の個別の標本をフォーマットすること、および検査を平行して、または素早く連続して測定するようにすることが重要となる。ハイスループット検査は、一つの検査のための調製、実行、測定、およびデータ収集が、次の化合物（たとえば、第二のテストリガンド）が行なわれる前にすべて完了する、一人の個人による試験のような、徒手の、一度につき一つ（one-at-a-time）の検査を含まない。ハイスループットとは、たとえば、２４、９６、または３８４個のエレメントアレイが調製および測定される任意の検査を含むことを意図するが、それはそのようなアレイにおいて検査をフォーマットすることが、おそらくは自動化の助けにより、平行して、あるいは素早く連続して測定することを可能にすることで、検査プロセスを加速することを意味するためである。
【００２５】
本方法は、反応、相変化、分子構造の変化、溶媒和における変化などから生じるエンタルピー変化といった、エンタルピー変化の測定を可能にする、ナノ熱量計およびナノ熱量計アレイを含む。本文の目的のためには、ナノ熱量計はナノカロリーまたはそれより高い範囲、たとえば約０．０１ナノカロリー〜１００００ナノカロリーの範囲内における反応熱の測定を可能にする装置を指す。さらに、本方法は、新規の化合物、材料、化学的性質、および化学的プロセスの、研究、発見、および開発においてナノ熱量計を用いるコンビナトリアル法およびハイスループットスクリーニング法、ならびに、化合物または材料のハイスループットモニタリング、あるいは化合物または材料を合成または修飾するべく用いられるプロセスのハイスループットモニタリングを含む。本方法はまた、上記の方法によって同定される化合物または材料、およびそれらの治療的使用（診断、予防、または治療目的のため）、精製および分離法における使用、およびそれらの新規の物理または化学的特性に関連した使用に関する。
【００２６】
実例として、本方法は、標的化合物と結合するリガンドの同定のためのハイスループットスクリーニング法を含む。もし、テストリガンドがそれに結合する標的化合物が、疾病または症状と関連づけられるか、または原因となる場合には、そのリガンドはその疾病または症状の診断、予防、または治療にとり有用であることがある。本方法により同定されるリガンドはまた、混合物から標的化合物を精製または分離する結果となる方法などの、精製または分離において用いられるものであることも可能である。本方法はまた、本方法により同定されるリガンドおよび、それらの治療的使用（診断、予防、または治療目的のため）、ならびに精製および分離法における使用に関する。
【００２７】
本方法の実施においては、テストリガンドは標的化合物と組合わされ、もし結合が起こる場合には、混合物は適当な条件下に、テストリガンドと標的化合物との結合を可能にするべく充分な時間をかけて維持される。実験条件は、各々の標的化合物について経験的に決定される。多数のテストリガンドを検査する場合には、インキュベーション条件は通常、ほとんどのリガンド：標的化合物の相互作用が完了まで進行することが期待されるよう選択される。ハイスループットスクリーニングの適用においては、テストリガンドは、通常、標的化合物に対して相対的にモル過剰で存在する。標的化合物は可溶性の形状であることが可能であり、細胞膜、膜フラグメント、合成オルガネラ、またはオルガネラフラグメント、ミセル、または同等の不均一な環境にあることが可能であり、変法として固相マトリックスに結合されることが可能である。マトリックスは、ビーズ、膜フィルター、プラスチック表面、または他の適当な固形の支持体を含んでよいが、これに制限されない。
【００２８】
所与の標的化合物への結合は、該標的化合物の作用を直接的に修飾するべく意図された薬剤にとり、必要条件である。したがって、もしテストリガンドが、本方法の使用を通して、症状の原因を反映するかまたは影響を及ぼす標的化合物と結合することが示される場合には、そのことは、テストリガンドの、標的の機能を変えかつ有効な薬剤またはそのような薬剤の開発のための先導化合物であるという潜在能力を示すことがある。別法としてリガンドは、標的の機能を変える可能性をもつ付加的な成分を含有する、ハイブリッド化合物の構築のための基剤として役立つかもしれない。たとえば、関連酵素のファミリーの活性を阻害する既知の化合物は、本方法の方法によって同定されるリガンドでありかつ既知の化合物によって認識されるものとは異なる部位において該ファミリーの一員に対し特異的に結合するものに対してコンジュゲートすることにより、該ファミリーの一員に特異的にされてもよい。
【００２９】
本方法が、ほとんどの標的に共通した物理化学的性質に基づいているという事実は、広く一般への適用をそれに付与する。本方法は、何千ものテストリガンドについての費用効果の高いスクリーニングを可能にする、大量の系統的なハイスループット法に適用されることが可能である。本方法の方法により、ひとたびリガンドが同定されれば、それは、用いられた特定の標的に特異的な既知の方法を用いて、さらに詳細に分析されることが可能である。また、リガンドは、標的化合物の既知の生物活性に対しポジティブまたはネガティブに影響を及ぼす能力について、検査されることが可能である。
【００３０】
本願における議論のため、ナノ熱量計のいくつかの態様が、分析試料調製の操作および分析法を例証するべく用いられている。しかしながら、当業者には、この方法が他のナノ熱量計構造、ならびにミクロ熱量計構造に対しても有利に用いられてよいこと、それらのすべてが本明細書および本特許請求の範囲によって完全に検討されていることを容易に認識するであろう。
【００３１】
そこで図１を参照すれば、本願の方法にしたがって利用されてよいナノ熱量計アレイの一実施例の一部である検出器１００の一つの態様の平面図が示されている。この実例態様は、この装置を用いて、組合わされたタンパク質、水、およびリガンド液滴の受動的な熱平衡を可能にし、結果として生じた温度変化が、温度感受装置により検出されるようにする。測定領域は、充分な小ささを保ち、かつアルミニウムまたは銅といった熱伝導性の層の組立てにより充分に熱伝導性であることから、受動的な平衡時間が短縮されることが可能である。ナノ熱量計のこの実例態様は、参考文献として前文に含まれている、米国特許出願第１０／１１４，６１１号、「化学反応を検出するためのナノ熱量計の装置および方法（Apparatus and Method for a Nanocalorimeter for Detecting Chemical Reactions）」においてさらに詳細に記述されている。
【００３２】
ナノ熱量計のこの態様のいくつかの特徴は、本願に提示された方法の理解を容易にするべく簡単に述べられるが、それは本文の方法の実施において使用される適当なナノ熱量計の一つの実例態様にすぎず、様々な形状のナノ熱量計を用いた種々の態様において有利に適用されてよいこと、それらのすべてが本明細書および本特許請求の範囲によって完全に考慮されていることが理解されよう。ナノ熱量計１００は、熱分離層１１０を含み、それは測定領域１６０および参照領域１７０を含む。領域１６０および１７０はまた、下文に述べられるように、別々の分離領域に含まれてよい。熱分離領域１１０、および測定および参照領域を囲む気相は、周囲の熱環境からの分離を提供し、したがって測定時間を増し、熱雑音を低減する。層１1０はこの実例態様においては、ナノ熱量計１００の反応および温度感受性構成要素を熱的に分離するべく用いられ、これらの構成要素を熱的に分離するどのような手段も、本方法の別の態様において使用されることが可能である。
【００３３】
測定領域１６０および参照領域１７０は、熱平衡領域１２０および１２５を各々含んでおり、それらは検出器の機械的支持体から熱的に隔離されている。この実例態様においては、熱平衡領域１２０は、反応温度を測定する二つの抵抗性熱量計１４０を含んでおり、一方、熱平衡量域１２５は、バックグラウンド温度における変動を測定する二つの熱量計１４０の第二のセットを含む。抵抗性熱量計は、リソグラフィーによる薄膜のパターン成形、マイクロエレクトロニクスによる製造技術（たとえば、スパッタリング、ケミカルエッチング、エバポレーションを含む）、およびプリント基板製造技術を態様に含むがそれに制限されない標準的な製造技術を用いて、熱平衡領域１２０内に置かれる。双方の熱平衡領域１２０および１２５は、ダイレクトプリンティングによってタンパク質およびリガンドの別々の液滴を受け取りかつ支持するべく、また、これら二つの液滴の、たとえば液滴併合装置１３０によってトリガーされる併合の後の組合せを支持するべく、充分な広さがある。たとえば、４００ｎＬの最終的な液滴サイズには、測定および参照領域を含む検出器は、３．７ｍｍx４．６ｍｍでよい。熱平衡領域１２０および１２５の各々は、熱放散に対し素早く平衡化するための領域について、充分な熱伝導を有する。態様では、この熱伝導は支持膜の片側の各々の領域にわたっている、高熱伝導薄膜により提供される。
【００３４】
前文において示唆されたように、熱平衡領域はその周囲から熱的に分離され、反応により引き起こされる温度差が放散するまでに比較的長い時間を必要とするようにしなければならない。この放散時間が長いほど、測定を通じてより長くシグナルが集積され、そのことが信号対雑音比を改善する。
【００３５】
熱平衡領域１２０および１２５の各々は、熱量計１４０および液滴併合電極１３０を含む。本文の目的のため、熱量計１４０は、各熱平衡領域１２０および１２５上の、より中心に位置する液滴併合電極１３０から空間的に離して示されているが、この構造は単に実例のための措置にすぎない。もし液滴併合装置１３０および熱量計１４０が高伝導薄膜と良好に熱接触していれば、熱量計１４０と液滴併合電極１３０との厳密な配置は熱の問題にとって重要ではない。
【００３６】
操作においては、熱平衡領域１２０内に位置する二つの抵抗性熱量計１４０は、熱平衡領域１２０内に置かれた任意の標的化合物とテストリガンドとの間の反応熱を検出する。この実例においては、反応熱は熱量計内の抵抗変化による、ブリッジ回路内の電圧変化の測定を通して検出され、それらはブリッジ回路内に配置される。熱平衡領域１２０内の抵抗性熱量計１４０は、テストリガンドと標的化合物との間の反応を検出する。熱平衡性領域１２５内の別の抵抗性熱量計１４５は、参照としての役割を果たす。
【００３７】
一つの実施形態として、本願において開示される方法は、標的−リガンド対の同定においてナノ熱量計を利用している。米国特許出願第１０／１１４，６１１号（Apparatus and Method for a Nanocalorimeter for Detecting Chemical Reactions）において記述されたようなナノ熱量計は、標的へのリガンドの結合に際して反応熱を直接検出することから、この目的のためには有用である。蛍光性、化学発光性、または放射能標識されたタグの付着、あるいはリガンドまたは標的についての他の特別なフォーマッティングまたは固定は何ら必要とされない。
【００３８】
本文において開示される方法は、高濃度の供給源からの溶液の液滴の調剤に備えている。ドラッグスクリーニングにおいては、多数（おそらく５００，０００〜１，０００，０００以上もの）のライブラリ化合物が、特定の標的に対してスクリーンされる。化合物は、水およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５０％〜１００％溶液中に含有する溶媒中で、典型的には高い（おそらく１００マイクロモル〜１０ミリモルの）濃度で貯蔵されるが、一方標的は一般に水性緩衝液中にある。次に図2に転じれば、より大きいテストアレイ構造の一部であってよい、実施例のテストセル２００の単一セル内での液滴付着について、一つの態様が示されている。この態様では、溶液の液滴２２０および２５０は、参照領域２３０および測定領域２４０の双方においてデポジットされる。溶液の液滴２２０よび２５０の組成および濃度は、検査状況に応じて変化してよい。たとえば、それらは同じ濃度であり、厳密に組成が一致してよく、あるいは溶液の液滴２５０は標的／溶媒の液滴２６０内の溶媒と同じ濃度であり、液滴２２０の双方とともに同じ濃度および組成である。さらに、標的／溶媒の液滴２６０が、測定領域２４０内にデポジットされる。参照領域２３０および測定領域２４０の双方は、熱分離領域２１０内にある。液滴サイズは、約１００ｐＬから約１００μＬまでの範囲でよい。本態様のナノ熱量計を用いる使用のためには、液滴サイズは約１００ｐＬ〜１μＬである。
【００３９】
濃縮ライブラリ化合物３７０の液滴は、図３に示されたように、テストセル３００の実施例を用いて、溶媒液滴３２０の上にデポジットされる。この態様のためには、ライブラリ化合物は、典型的には５０％〜１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）である溶媒内において、０．１〜１０ミリモルの濃度を有する。ここで組合わされた溶媒およびライブラリ化合物の液滴は、参照領域３３０および測定領域３４０内に置かれ、それらの双方は熱分離領域３１０内に位置する。濃縮ライブラリ化合物の液滴３７０がデポジットされた後、テスト化合物を拡散および混合させるべく充分な時間が割当てられる。ライブラリ化合物が溶媒内に混じた後、標的／溶媒液滴３６０および溶媒液滴３５０は、測定サイドと参照サイドの間に有意な差異加熱を導入しない、たとえば、代理人整理番号（Attorney Docket No.）Ｄ／Ａ１５７８Ｑ、米国特許出願第１０／１１５，３３６号「静電気力を用いて流体運動を引き起すための装置および方法（Apparatus and Method for Using Electrostatic Force to Cause Fluid Movement）」において記述されたような任意の既知の方法により、それら各自のライブラリ化合物／溶媒液滴と各々マージされ、測定領域における反応熱を検出するべく測定が行なわれ、それは、参照領域における、ライブラリ化合物／溶媒液滴と参照溶媒液滴との組合せについて得られた測定と比較される。
【００４０】
図１の態様の場合には、ブリッジ測定は測定および参照領域において発生された熱の差異を直接的に検出し、二者の測定後の比較の必要性を除外する。この態様のためには、標的および溶媒が検査装置上で混合されるが、当業者には、標的および溶媒が前混合されて、検査装置上に付着されてよく、そのことは本明細書および本特許請求の範囲によって完全に含まれることが認識されるであろう。
【００４１】
次に図４を参照すれば、検査用アレイの単一セル内における溶媒および標的液滴のデポジションを図示している、もう一つの態様の説明図が示される。測定領域４４０および参照領域４３０は、熱分離領域４１０内にある。操作の間に、修飾された溶媒４５０は参照領域４３０内にデポジットされ、未修飾溶媒４２０が、参照領域４３０および測定領域４４０内にデポジットされる。修飾された溶媒４５０は、濃縮ライブラリ化合物５７０の添加後の、未修飾溶媒４２０における変化に対応するべくデザインされ、最終的なテスト化合物液滴と標的液滴および、最終的なテスト化合物と参照溶媒液滴の間に、最終溶媒条件のより良い適合を得るようにする。特に、修飾された溶媒４５０は、溶媒４２０を、ライブラリ化合物５７０に含まれる異なる溶媒の量と組み合わせることにより創製されることが可能である。溶媒溶液４６０中の標的化合物の液滴は、測定領域４４０内にデポジットされる。ライブラリ化合物５７０と未修飾溶媒４２０および標的液滴中の溶媒の、混合の結果として生じる溶媒間の混合熱を最小限にするため、溶媒４６０は修飾された溶媒４５０と同一である。その結果、４つの液滴すべてにおける溶媒は、濃縮されたライブラリ化合物５７０の追加後にほとんど同じになるはずである。
【００４２】
濃縮されたライブラリ化合物５７０の液滴は、次いでテストセル５００の実施例を用いて図５に例示されているように、未修飾溶媒液滴５２０の上にデポジットされる。濃縮ライブラリ化合物５７０は、アレイの残りのセルが調製されているかまたは、もう一つのそのようなアレイが測定されている間に、拡散するための充分な時間を有する。図５に示されるように、濃縮ライブラリ化合物は、熱分離領域５１０内に置かれている参照領域５３０および測定領域５４０内の、修飾された溶媒５２０内に拡散される。この態様のためには、ライブラリ化合物は、典型的には５０％〜１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）である溶媒内において、０．１〜１０ミリモルの濃度を有する。化合物の貯蔵濃度は、典型的には、アッセイスクリーニングにおいて必要とされる濃度の１００倍であることから、化合物溶媒は、混合段階において実質的に希釈され（貯蔵された物質の濃度により１００：１〜１０，０００：１）、したがってこの二つの液滴内の溶媒は、せいぜい１％まで異なる程度である。
【００４３】
濃縮ライブラリ化合物５７０がデポジットされた後、テスト化合物を拡散および混合させるべく充分な時間が割当てられる。ライブラリ化合物を溶媒内で混じた後、標的／溶媒液滴５６０および修飾された溶媒液滴５５０は、任意の既知の手段により、各々のライブラリ化合物／溶媒液滴と併合され、測定領域内の反応熱を検出するべく測定が行なわれ、それは参照領域における、ライブラリ化合物／溶媒液滴と参照溶媒液滴との組合せについて得られた測定値と比較される。この単純化されたアプローチは、上文に取込まれた米国特許出願第１０／１１４，６１１号（Apparatus and Method for a Nanocalorimeter for Detecting Chemical Reactions）において開示されたナノ熱量計の操作に比べた改良である。この改良されたアプローチは、化合物ライブラリの測定装置への導入に先立って必要とされてきた、ライブラリ化合物と溶媒との中間混合段階を除外する。この方法により、化合物ライブラリは、貯蔵用に使用されたものと同じ濃度および同じ溶媒において導入されることが可能である。
【００４４】
次に図６を参照すれば、より大きいアレイ構造の一部であってよい、例証検査用セル６００の単一セル内での、ライブラリ化合物液滴のデポジションを含む、本文の方法のもう一つの態様が例示される。この態様においては、ライブラリ化合物６２０の液滴が、参照領域６３０および測定領域６４０の双方にデポジットされる。この態様のためには、ライブラリ化合物は、典型的には５０％〜１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）である溶媒内において、１００マイクロモル〜１０ミリモルの濃度を有する。参照領域６３０および測定領域６４０の双方は、熱分離領域６１０内にある。
【００４５】
ライブラリ化合物の液滴は、次いで例証テストセル７００を用いた図７に例示されたように乾燥される。ここでは、乾燥ライブラリ化合物の液滴７２０は、参照領域７３０および測定領域７４０内に置かれ、それらの双方は、熱分離領域７１０内に位置する。リガンドライブラリ分子は強固であり、一般に用いられる溶媒、ＤＭＳＯはかなり揮発性であるため、液滴はいくつかの方法により乾燥されることも可能である。たとえば、液滴は濾過された清浄な空気、たとえば、ＨＥＰＡ濾過されたオーブン内で室温または高温において真空下にＨＥＰＡ濾過された空気の層流中で、周囲の温度において、あるいは溶媒および副溶媒の除去を可能にする任意の他の条件において乾燥されてもよい。濾過空気はコンタミネーションを防止するべく用いられるが、コンタミネーションが関係しない場合には、濾過は必要ではない。もし液滴が、中間の希釈段階を除くべく、貯蔵濃度においてディスペンスされる場合には、貯蔵濃度は１０ｍＭ程度にしばしば非常に高いため、液滴は２００ｐＬ程度に非常に小さくなり、周囲の温度において素早く乾燥するであろう。
【００４６】
次に図８を参照すれば、検査用アレイの単一セル内での、溶媒および標的液滴のデポジションを描いている説明図が示される。測定領域８３０および参照領域８４０は、熱分離領域８１０内にある。操作の間に、測定領域８３０および参照領域８４０の双方において、ライブラリ化合物を溶解するべく用いられる溶媒８２０は、プレデポジットされ乾燥されたライブラリ化合物８７０の上にデポジットされている。参照溶媒は、乾燥したライブラリ化合物を溶解する液滴８２０中の溶媒と同様である。溶媒溶液８６０中の標的物質は、測定領域８３０内にデポジットされる。この溶媒溶液は、溶媒溶液８５０および８２０と同一である。すべての溶媒が同一であることから、混合熱は液滴を混ぜたことからの結果ではないであろう。さらに、アレイを負荷するためにわずか二つの材料供給源が必要とされるのみであり、それらは８２０および８４０において用いられた溶媒と、溶解された標的物質である。材料供給源におけるこの減少は、より迅速なディスペンシングを可能にする。ライブラリ化合物のディスペンシングおよび、溶媒のディスペンシングに先立つ乾燥した形状におけるその貯蔵は、同一のライブラリ化合物の組合せを用いて、多数のアレイがデポジットされることを可能にすることができ、そのことはディスペンシング装置におけるデッドボリュームとして失われるかまたは未使用の、ライブラリ材料の量を減じることになるであろう。
【００４７】
プレデポジットされた乾燥ライブラリ化合物は、図９に示したように、アレイの残りのセルが調製されているかまたは、もう一つのそのようなアレイが測定されている間に、溶解するための充分な時間を有する。検出器表面に対する乾燥ライブラリの結合強度を最少化する表面コーティングの使用は、溶媒９２０中への乾燥ライブラリ化合物の溶解を引き起し、より迅速に進行することがある。そのような表面コーティングの実例は、フルオロカーボンおよびシロキサンコーティングを含む。コーティングの他の実例は、たとえば、ペプチドまたはタンパク質の強力な結合を最少化するためのパターン化されたＰＥＧ（ポリエチレングリコール）コーティングを含む。この実例においては、代理人整理番号（Attorney Docket No.）Ｄ／Ａ１５７８Ｑ、米国特許出願第１０／１１５，３３６号（Apparatus and Method for Using Electrostatic Force to Cause Fluid Movement）において記述されたように、親水性のＰＥＧコーティングは、液滴併合に必要とされる程度の、残りの表面領域の疎水性の性質を維持するため、小さな領域のみを覆うように型押しされ、そこにライブラリ化合物がデポジットされる。乾燥材料が溶媒液滴中に再溶解される時、液滴は型押しされたＰＥＧよりも広い領域を覆い、液滴の縁が確実に疎水性の被膜上にあるようにする。通常の疎水性表面に加えて、他の適当な表面の実例は、表面への溶液コートであってよいナノヘアのような、ナノテクスチャによるコーティングを含む。市販のナノテクスチャによるコーティングは、Nano-PEL（商標）コーティング（ナノテックス（Nano-Tex））を含む。
【００４８】
別法として、プレデポジットされた乾燥ライブラリ化合物は、市販のテクノロジーを用いて調製されることが可能である。実例として、カリパー・テクノロジー（Caliper Technologies）は、スポットされた乾燥ライブラリ化合物のついたアレイを創製する手段として、そのライブラリカード・リージェント・アレイ（LibraryCard Reagent Array）テクノロジーを、アッセイに使用するため他社に提供している。カリパー・テクノロジーによれば、彼らのテクノロジーを用いて調製された乾燥試薬は、溶媒中に容易に溶解される。
【００４９】
図９に示されるように、溶媒は、熱分離領域９１０内に置かれた、参照領域９４０および測定領域９３０内に置かれたライブラリ化合物９２０を溶解している。ライブラリ化合物を溶解するべく用いられた溶媒は、乾燥化合物の双方の液滴について、および液滴８５０および８６０について、同一であることから、またライブラリ化合物は充分に低濃度であることから、何らの混合熱も生じない。この単純化されたアプローチは、上文に取込まれた、米国特許出願第１０／１１４，６１１号（Apparatus and Method for a Nanocalorimeter for Detecting Chemical Reactions）において開示されたナノ熱量計の操作を超えた改良である。この改良されたアプローチは、初期の適用においては測定が所望される反応熱を不明確にする可能性のあった混合熱の導入を避けるために必要とされた中間の混合段階を除去し、かつ液滴のディスペンシングを単純化する。
【００５０】
液滴のデポジションは、図１０では側面図において例示されており、熱分離領域１０１０および測定領域１０３０は、断面で示されている。理解しやすくするため、ライブラリ化合物／溶媒液滴、および参照領域内にデポジットされた参照溶媒の液滴は、この図には示されていない。溶媒液滴１０２０は、１％〜４％のＤＭＳＯ溶液でよく、プレデポジットされ、乾燥されたライブラリ化合物１０７０の上にデポジットされる。標的化合物および溶媒の液滴１０６０もまた、測定領域１０３０内にデポジットされている。ライブラリ化合物が、適用された溶媒中に溶解した後、標的／溶媒液滴１０６０、およびライブラリ化合物／溶媒液滴１０２０は、既知の手段により併合され、測定は反応熱を検出するべく行なわれ、それは参照領域において、ライブラリ化合物／溶媒液滴と参照溶液液滴との組合せについて得られた測定値と比較される。もしライブラリ化合物が標的化合物と反応すれば、測定領域において放散される反応熱が、その領域内に温度が、何ら結合反応の起きない参照領域の温度を超えるようにするであろう。温度変化は、反応が起きたことを意味している。反応のエンタルピーは、この温度変化に由来することが可能である。
【００５１】
次に図１１を参照すれば、本件の方法の一つの態様が、説明図に要約されている。ここでは、方法１１００は、前文において記述されたように、ナノ熱量計１１１０の参照および測定領域内の、溶媒のデポジションを含む。溶媒は液滴の形状でよく、各領域内に一滴以上がデポジットされる。初期の態様について本文に議論されたように、溶媒は修飾されたかまたは未修飾の形状でよく、溶媒の多数の液滴が参照または測定領域内にデポジットされてよい。１１２０においては、標的はナノ熱量計の測定領域内にデポジットされる。標的は、修飾されたかまたは未修飾の形状でもよい溶媒中に含有されている。ライブラリ化合物は、１１３０において測定および参照領域内にデポジットされる。ライブラリ化合物は、上文の図７〜９に関して記述されたように、液滴の形状であってよく、あるいは乾燥化合物の形状であってもよい。ライブラリ化合物が乾燥された形状にある態様においては、乾燥ライブラリ化合物は、溶媒のデポジションに先立って測定および参照領域に存在することになる。検査化合物は、溶媒中に溶解された乾燥ライブラリ化合物か、溶媒中に拡散された濃縮ライブラリ化合物を含めたテスト化合物により、１１４０において形成される。参照領域および測定領域内の物質は、各々１１５０において併合される。参照領域内の物質は、テスト化合物および参照溶媒を含んでおり、測定領域内の物質は、テスト化合物および標的化合物を溶媒中に含む。測定領域の反応熱は検出され、１１６０において測定される一方、参照領域の反応熱は、１１７０において同時に検出および測定されてよい。反応熱は１１８０において比較され、標的リガンドとライブラリ化合物との間に反応が起きたかどうかが決定される。
【００５２】
認識されるように、本文において開示された方法は、混合熱に関するエラーを低減または除去し、ディスペンスされることが必要な液滴数を減少させ、ディスペンスされることが必要な液滴中の異なる物質の数を減少させ、装置に対してライブラリを別々に送達する必要性を除去し、ディスペンス用具内のデッドボリュームに対して失われる物質の量を減少させ、さらに測定に先立ち、ライブラリがより効率的に、また別個にとらえられるようにする。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本文の方法の実施において利用されるナノ熱量計の一つの態様の構成要素を示すブロック図である。
【図２】本方法の一つの態様による、検査用アレイの単一セル内での、溶媒および標的液滴のデポジションを示す図である。
【図３】図２の態様による、検査用アレイの単一セル上への、ライブラリ化合物のデポジションを示す図である。
【図４】本方法のもう一つの態様による、検査用アレイの単一セル内での、溶媒、修飾された溶媒、および標的液滴のデポジションを示す図である。
【図５】図４の態様による、検査用アレイの単一セル上への、ライブラリ化合物のデポジションを示す図である。
【図６】検査用アレイの単一セル内での、ライブラリ化合物の液滴のデポジションを示す図である。
【図７】検査用アレイの単一セル上にデポジットされたライブラリ化合物の乾燥を示す図である。
【図８】図７の態様による、検査用アレイの単一セル内での、溶媒および標的液滴のデポジションを示す図である。
【図９】デポジットされた溶媒による、乾燥ライブラリ化合物の溶解を示す図である。
【図１０】図８による溶媒および標的液滴のデポジションの、側面図を示す図である。
【図１１】本文の方法の一つの態様を示す説明図である。
【符号の説明】
【００５４】
１００  ナノ熱量計、  １１０  熱隔離層、  １６０，２４０，３４０，４４０，５４０，６４０，７４０，８３０，９３０，１０３０  測定領域、  １７０，２３０，３３０，４３０，５３０，６３０，７３０，８４０，９４０  参照領域。
【図１】
2005156558.tif 000003
【図２】
2005156558.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005156558.tif 000009
【図８】
2005156558.tif 000010
【図９】
2005156558.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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