(57)【要約】【課題】  セル内又は振動子上の溶液の導電率及び誘電率が測定の際に変化しても、正確な測定が可能なセル、振動子及びこれらを備えるバイオセンサー装置並びに測定方法を提供する。【解決手段】  結晶板の各面に第１及び第２の円板形状の電極が配置された振動子を、溶液が注入される円筒形状の溶液保持部の底面となるように配置し、前記振動子の第１の電極側を前記溶液に接触させるようにして構成されたセルであって、前記第１の円板形状の電極の直径を、前記円筒形状の溶液保持部の底部の内径よりも大きくしたことを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶板の各面に第１及び第２の円板形状の電極が配置された振動子を、溶液が注入される円筒形状の溶液保持部の底面となるように配置し、前記振動子の第１の電極側を前記溶液に接触させるようにして構成されたセルであって、前記第１の円板形状の電極の直径を、前記円筒形状の溶液保持部の底部の内径よりも大きくしたことを特徴とするセル。
【請求項２】
請求項１に記載のセルを備えることを特徴とするバイオセンサー装置。
【請求項３】
結晶板の各面に第１及び第２の円板形状の電極が配置され、前記第１の電極上に円板形状の反応膜を設けた振動子であって、前記円板形状の反応膜の直径を、前記第１の円板形状の電極の直径よりも小さくして、前記反応膜にのみ溶液に接触させるようにしたことを特徴とする振動子。
【請求項４】
前記結晶板の片面全面に前記第１の電極が設けられていることを特徴とする請求項３に記載の振動子。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の振動子を備えることを特徴とするバイオセンサー装置。
【請求項６】
結晶板の各面に配置された第１及び第２の円板形状の電極を有する振動子の前記第１の電極側を溶液に接触させ、前記第１及び第２の電極間に交流信号を印加し、前記交流信号の周波数と前記振動子の電気的特性の関係から、前記振動子の重量変化を測定する方法であって、前記溶液を、前記第１の電極上、且つ、前記第１の電極の中央部に接触させるようにして測定することを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、医療及び食品分野における化学反応の追跡や状態分析等に使用されるセル、振動子及びこれらを備えるバイオセンサー装置並びに測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡやタンパク質等の生体物質の相互作用の測定や、抗原抗体反応を応用した測定等にＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）の原理が使われている。
この原理を使用したバイオセンサー装置は、センサーである圧電素子（水晶振動子等）を発振させて共振周波数を連続で測定するか、インピーダンスアナライザを用い共振点（インピーダンスが最小となる点）の周波数を連続で測定し、その周波数変化により、圧電素子表面へ吸着した物質の量を測定していた。
このようなバイオセンサー装置では、図６に示されるような円筒形状の溶液保持部３０の底面となるように、円板形状の振動子３１を設けたセル３２が使用されている。
振動子３１は、図７に示すように、水晶等の結晶を円板形状に形成した結晶板３３を有しており、各面には、円板形状に形成された第１及び第２の電極３４，３５が設けられている。尚、第１及び第２の電極３４，３５には、それぞれ、リード部３６，３７が第１及び第２の電極３４，３５と一体に真空蒸着により形成され、これらリード部３６，３７を介して外部回路から振動子３１を発振させるようにしている。また、第１の電極３４の表面には、反応膜３８が設けられており、この反応膜３８は、試料ＳＬ中の特定成分と反応又は特定成分を吸着する材料で構成されている。
【０００３】
上記セル３２を使用して、試料ＳＬ中の特定成分の濃度を測定するには、バッファー液ＢＬ（試料中の特定成分を溶解又は分散させる液体であって、その特定成分が含まれていない状態の液体で、一般的には、含有物としてＮａＣｌやＫＣｌ等を含んでいる。）をセル３２内に注入し、振動子３１の第１及び第２の電極３４，３５間に交流信号を印加し発振させて、周波数が安定した状態となるまで待つ。この状態で、試料ＳＬを添加する、或いは、複数回に分けて試料ＳＬを添加する。すると、試料ＳＬ中の特定成分が除々に反応膜３８と反応し又は反応膜３８に吸着し、反応膜３８の重量が増加する。この重量変化を、前記交流信号の周波数と前記振動子３１の周波数変化等の電気的特性の関係から測定する。
【０００４】
ところが、従来、試料ＳＬを添加した際に、ＤＮＡやタンパク質等の結合又は抗原抗体の結合等によって生じる振動子３１の電気的特性以外の原因によって、振動子３１の電気的特性が変化することがあったために正確な測定をすることができなかった。このような振動子３１の周波数等の電気的特性の変化は、振動子３１に接する溶液が数μｌというわずかな量であっても同様に生じていた。
【０００５】
この原因について、図８を用いて説明する。
通常、バッファー液ＢＬのみをセル３２内に注入した状態では、セル３２内の塩濃度、即ち、導電率及び誘電率が一定である。このため、図８に示されるように、振動子３１の第２の電極３５及びリード部３７からの電界Ｅが、セル３２内の溶液と交わっても、振動子３１等からの電界Ｅが振動子３１に与える負荷は一定となる。
しかしながら、測定の開始時又は測定の過程において、試料ＳＬを添加した際に、セル３２内の溶液の塩濃度が変化する。即ち、セル３２内の溶液の導電率及び誘電率が変化する。この状態で、セル３２内の溶液に、振動子３１からの電界Ｅが交わると、当初振動子３１にかかっていた一定の負荷が変化してしまう。
このような当初振動子３１にかかっていた一定の負荷の変化が、正確な測定を不可能にしていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、セル内又は振動子上の溶液の導電率及び誘電率が測定の際に変化しても、正確な測定が可能なセル、振動子及びこれらを備えるバイオセンサー装置並びに測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討の結果、測定対象を含む溶液に対して振動子から生じる電界が交わりづらくなるように構成することにより、上記課題を解決することができるという知見に基づき、下記の通り解決手段を見出した。
即ち、本発明のセルは、請求項１に記載の通り、結晶板の各面に第１及び第２の円板形状の電極が配置された振動子を、溶液が注入される円筒形状の溶液保持部の底面となるように配置し、前記振動子の第１の電極側を前記溶液に接触させるようにして構成されたセルであって、前記第１の円板形状の電極の直径を、前記円筒形状の溶液保持部の底部の内径よりも大きくしたことを特徴とする。
また、本発明のバイオセンサー装置は、請求項２に記載の通り、請求項１に記載のセルを備えることを特徴とする。
また、本発明の振動子は、請求項３に記載の通り、結晶板の各面に第１及び第２の円板形状の電極が配置され、前記第１の電極上に円板形状の反応膜を設けた振動子であって、前記円板形状の反応膜の直径を、前記第１の円板形状の電極の直径よりも小さくして、前記反応膜にのみ溶液に接触させるようにしたことを特徴とする。
また、請求項４に記載の振動子は、請求項３に記載の振動子において、前記結晶板の片面全面に前記第１の電極が設けられていることを特徴とする。
また、本発明のバイオセンサー装置は、請求項５に記載の通り、請求項３又は４に記載の振動子を備えることを特徴とする。
また、本発明の測定方法は、請求項６に記載の通り、結晶板の各面に配置された第１及び第２の円板形状の電極を有する振動子の前記第１の電極側を溶液に接触させ、前記第１及び第２の電極間に交流信号を印加し、前記交流信号の周波数と前記振動子の電気的特性の関係から、前記振動子の重量変化を測定する方法であって、前記溶液を、前記第１の電極上、且つ、前記第１の電極の中央部に接触させるようにして測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のセルによれば、溶液接触面側の円板形状の電極の直径を、円筒形状の溶液保持部の底部の内径よりも大きくしたので、振動子から生じる電界が溶液に到達しづらくなる。その結果として、測定の開始時又は測定の過程において、セル内の溶液の導電率及び誘電率が変化しても、測定に必要な振動子の電気的特性に対する影響を抑えることができる。そして、このようなセルを備えるバイオセンサー装置によれば、精度の高い測定が可能となる。
また、本発明の振動子によれば、振動子の溶液接触面側の電極上に、前記電極の直径よりも小さい直径を有する円板形状の反応膜を設けるようにしたので、振動子から生じる電界が反応膜上の溶液に対して到達しづらくなる。その結果として、測定の開始時又は測定の過程において、振動子上の溶液の導電率及び誘電率が変化しても、測定に必要な振動子の電気的特性に対する影響を抑えることができる。更に、溶液接触面側の電極を結晶板の全面に設けるようにすれば、振動子から生じる電界が溶液に更に到達しづらくすることができる。そして、このような振動子を備えるバイオセンサー装置によれば、精度の高い測定が可能となる。
また、本発明の測定方法によれば、測定対象を含む溶液を、前記第１の電極上、且つ、前記第１の電極の中央部に接触させるようにして測定することにより、振動子から生じる電界を、溶液と交わりにくくすることができる。その結果として、測定の開始時又は測定の過程において、振動子上の溶液の導電率及び誘電率が変化しても、測定に必要な振動子の電気的特性に対する影響を抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１０】
図１は、本発明のバイオセンサー装置用セル１の側断面図を示すもので、溶液保持部２、振動子３及び台座部４を主として構成されている。
溶液保持部２は、アクリル樹脂等により、内径Ｒの円筒形状となるように形成されている。この溶液保持部２の内側の底部には、前記円筒形状の内径方向に段差部が形成されている。
また、振動子３は、その中心が円筒形状の容器保持部２の軸上に位置するようにして、台座部４に立設されたスプリング６，７を介して支持されている。そして、振動子３の溶液接触面側は、上記段差部の段差面５にシール剤８を介して付勢された状態で設けられている。
また、台座部４には、第１及び第２の電極１４，１５にそれぞれ接続される端子ピン１１，１２が設けられている。これらの端子ピン１１，１２を介して振動子３は分析装置等の外部回路に接続されることになる。尚、台座部４は、接着剤により溶液保持部２の底部に固定されている。
【００１１】
振動子３は、図２（ａ）の平面図に示すように、水晶等により円板形状に形成された結晶板１３を有しており、表面と裏面には、結晶板１３と同心円状にそれぞれの直径がｒ1,ｒ2である円板形状に形成された第１及び第２の電極１４，１５が設けられている。
上記溶液保持部２の内径Ｒと第１の電極１４の直径ｒ1との関係は、Ｒがｒ1よりも小さくなっている。従って、溶液保持部２内に溶液を注入した場合には、溶液保持部２内の溶液は、第１の電極１４の外周部（幅ｄで示す。）とは、接触しない。尚、第１の電極１４の直径ｒ1と第２の電極１５の直径ｒ2は同じである。
また、前記第１及び第２の電極１４，１５には、それぞれ、リード部１６，１７が電極１４，１５とともに一体に蒸着等により設けられている。尚、リード部１７は、端子ピン１１に接続され、リード部１６は、結晶板１３の裏面側までまわりこむようにして形成されており、端子ピン１２と接続されている。
【００１２】
そして、セル１には、図３に示すように、バイオセンサー装置２０を構成するネットワークアナライザやインピーダンスアナライザ等の分析装置１８が接続される。尚、この分析装置１８には、制御装置１９が接続されており、この制御装置１９は、分析装置１８の動作を制御し、分析装置１８がセル１に出力する周波数等を変化させるとともに、周波数と測定結果とを対応させて演算結果とともに記憶するように構成されている。そして、分析装置１８から振動子３に交流信号を印加して、その周波数下でコンダクタンスＧを測定できるようになっている。
【００１３】
次に、具体的に上記構成のバイオセンサー装置２０を使用して測定する手順の一例について説明する。
バッファー液ＢＬを溶液保持部２内に注入する。そして、制御装置１９から分析装置１８に信号が送られると、分析装置１８は、振動子３に交流信号を送り発振させ、振動子３の周波数が安定する状態となるまで待つ。この状態で、溶液保持部２内に特定成分を含む試料ＳＬを注入する。この時、試料ＳＬ中の特定成分が第１の電極１４と反応し、第１の電極１４の重量が増加することになる。
制御装置１９では、交流信号の周波数を所定範囲で変化させながら、コンダクタンスＧの最大値を所定の間隔で測定し、共振周波数を求め、これを所定の間隔で記録する。尚、共振状態では、コンダクタンスＧは極値をとる。
そして、記録された共振周波数と共振周波数の初期値との差から得られる重量変動値に基づいて、試料ＳＬ中の特定成分の濃度を測定する。
【００１４】
上記セル１の溶液保持部２の溶液は、第１の電極の外周から幅ｄを除いた部分に接触することになる。従って、第２の電極１５及びリード部１７から生じる電界が、溶液保持部２内の溶液と交わりにくくなる。
このため、試料ＳＬを添加して溶液保持部２内の溶液の導電率及び誘電率が変化しても、振動子３にかかる負荷が変化しにくい。
【００１５】
上記した実施の形態及び以下に説明する他の実施の形態における電極は、導電性を有するものであれば特に制限はなく、例えば、結晶板を水晶板により構成する場合には、Ｔｉ又はＣｒ等の水晶と密着性が良い金属を使用することができる。また、その厚さについても、特に制限されるものではなく、例えば、５０ｎｍ〜３００ｎｍとすることができる。
また、第１の電極１４の溶液接触面側には、試料中の特定成分と反応又は特定成分を吸着するＡｕ等の金属製の反応膜を設けるようにしてもよい。Ａｕ等の特殊な金属にのみ付着し易い試料を使用する場合には、少ない試料であっても均一に付着させることができるからである。尚、この反応膜は、第１の電極上に接着剤層や絶縁体層を介して設けるようにしてもよい。
【００１６】
次に、本発明の他の実施の形態について説明する。
本実施の形態の振動子２１は、図４に示されるように、直径ｒ3の円板形状の水晶結晶板２２を有しており、溶液接触面側に水晶結晶板２２と同径（直径ｒ3）の第１の電極２３、絶縁体２４が順に積層されている。そして、絶縁体２４には、水晶結晶板２２と同心円状となるように金属製薄膜により形成された直径ｒ5の反応膜２５が接着剤２６を介して積層されている。尚、反応膜２５の直径ｒ5は、図示の通り、第１の電極２３の直径ｒ3よりも小さい。また、水晶結晶板２２の溶液接触面とは反対面側には、接着剤２６を介して、Ａｕ等の金属製薄膜により形成された反応膜２５と同径（直径ｒ5）の第２の電極２７が中央部に積層されている。
振動子２１は、図３を用いて先に説明した振動子３と同様にして分析装置及び制御装置（図示せず）を接続してバイオセンサー装置を構成することになる。振動子２１の分析装置への接続は、第１の電極２３であれば、その周端縁を介して接続され、第２の電極２７であれば、水晶結晶板２２の半径方向にリード部２８を形成し、このリード部２８を介して接続される。
【００１７】
上記構成の振動子２１を用いたバイオセンサー装置による測定は、次のようにして行われる。
反応膜２５にのみに微量のバッファー液ＢＬを滴下し、振動子２１の第１及び第２の電極２３，２７間に交流信号を印加し発振させて、周波数が安定した状態となるまで待つ。そして、前記バッファー液ＢＬの液滴に対して試料ＳＬを添加し、先の実施の形態と同様にして、試料ＳＬ中の特定成分の濃度を測定する。
【００１８】
上記振動子２１の構成により、第２の電極２７及びリード部２８からの電界が、反応膜２５上の試料ＳＬが添加されたバッファー液ＢＬと交わりにくくなるために、振動子２１への周波数変化に対する影響を抑えることができる。
【００１９】
尚、第１の電極２３上に形成される絶縁体２４は、絶縁性を有するものであれば特に制限はなく、例えば、ＳｉＯ2、ポリイミド、ポリ尿素等を使用することができる。また、その厚さについても特に制限はなく、例えば、５０〜５００ｎｍの範囲で形成することができる。
また、絶縁体２４の中央部に接着層２６を介して設けられる反応膜２５は、測定に使用される試料に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｕ、Ｔｉ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ等を使用することができる。また、その厚さについても、特に制限はなく、例えば、１０〜３００ｎｍの範囲で形成することができる。
また、接着層２６としては特に制限はないが、例えば、ＴｉやＣｒ等を使用することができる。
【００２０】
次に、本発明の更なる他の実施の形態について説明する。
本実施の形態では、振動子に微量の液滴を接触させて測定する方法に関するものであり、ここでは、先に説明した図２に示される振動子３を用いて以下に説明する。
振動子３の第１の電極１４上には、微量のバッファー液ＢＬを滴下し、これに試料ＳＬを添加し、振動子３を発振させる。その際、バッファー液ＢＬ及び試料ＳＬの両方が、第１の電極１４の中央部に前記溶液を接触させるようにして測定するものである。
このように測定することにより、第２の電極１５及びリード部１７からの電界が、第１の電極１４上の試料ＳＬが添加されたバッファー液ＢＬと交わりにくくなるため、振動子３の周波数変化に対する影響を抑えることができる。
尚、本発明において、第１の電極１４の中央部とは、第１の電極１４の外周縁から中心に向かう幅ｄの範囲を除いた範囲をいうものとする。本発明において、この幅ｄの範囲は、第１の電極１４の直径ｒ1の１０〜４０％の範囲とする。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００２２】
（実施例１）
図４に示される構造の振動子２１を次のようにして作製した。
円板形状の石英製結晶板２２（直径８．９ｍｍ、厚さ６０μｍ）の上側全体に、真空蒸着により、第１の電極層２３（直径８．９ｍｍ、厚さ２００ｎｍのＣｒ膜層）及び絶縁体２４（直径８．９ｍｍ、厚さ３００ｎｍのＳｉＯ2膜層）を順に積層した。更に、絶縁体２４の上側に、結晶板２２と同心円状となるようにマスクを用いて真空蒸着により、接着剤２６（直径３ｍｍ、厚さ３０ｎｍＣｒ膜層）を介して反応膜２５（直径３ｍｍ、厚さ２００nmのＡｕ膜層）を積層した。また、結晶板２２の下側中央部には、真空蒸着により、結晶板２２と同心円状に第２の電極２７（直径３ｍｍ、厚さ２００ｎｍのＣｒ膜層）とリード部２８（幅１ｍｍ、長さ２．９５ｍｍ、厚さ２００ｎｍのＣｒ膜層）とを一体となるようにして、接着層２６（厚さ２００ｎｍのＣｒ膜層）を介して積層した。
【００２３】
（比較例１）
図７に示される構造の振動子３１を次のようにして作製した。
円板形状の石英製結晶板３３（直径８．９ｍｍ、厚さ６０μｍ）の上側に、真空蒸着により、結晶板３３と同心円状に第１の電極層３４（直径３ｍｍ、厚さ２００ｎｍのＡｕ膜層）とリード部３６（幅１ｍｍ、長さ２．９５ｍｍ、厚さ２００ｎｍのＣｒ膜層）とを、接着層３９（厚さ２００ｎｍのＣｒ膜層）を介して積層した。また、結晶板３３の下側にも、同様にして第２の電極３５とリード部３７とを、接着層３９を介して積層した。
【００２４】
実施例１と比較例１の振動子２１，３１を、それぞれ図１及び図６に示す構成のセル１，３２を作製した。そして、各セル１，３２にバッファー液ＢＬとして、濃度０．０３ＭのＮａＣｌ溶液を５００μｌ注入して振動子２１，３１を発振させて周波数が安定した状態となるまで待つ。そして、前記バッファー液ＢＬに対して、試料ＳＬとして濃度３ＭのＮａＣｌを５μｌずつ順次加えて、セル１，３２内の塩濃度を０．０３Ｍから０．２Ｍまで変化させた。この時の周波数変化を測定し、その結果を図５に示す。
尚、周波数変化の測定には、本出願人が先に（特願2003-120335）提案した、振動子２１，３１が直列共振状態にあるときのコンダクタンスの半分の大きさの半値コンダクタンスを与える半値周波数であって、前記直列共振状態を与える共振周波数に近く、且つ、共振周波数よりも大きな周波数である半値周波数を利用した。
【００２５】
上記測定の結果、図５に示されるように実施例１の振動子２１の場合には、ＮａＣｌの増加に伴う周波数変化の影響を受けることがなかった。これに対して、比較例１の振動子３１では、ＮａＣｌ濃度の増加にほぼ比例するように影響を受けることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施の形態であるセルの断面図
【図２】同セルに使用される振動子の説明図（（ａ）平面図（ｂ）側面図））
【図３】同実施の形態のバイオセンサー装置の構成図
【図４】本発明の他の実施の形態である振動子の説明図（（ａ）平面図（ｂ）側面図））
【図５】本発明の一実施例のバイオセンサー装置用振動子を使用した測定結果を示すグラフ
【図６】従来のセルの断面図
【図７】従来の振動子の説明図（（ａ）平面図（ｂ）側面図））
【図８】従来のバイオセンサー装置用振動子を使用して測定する際の溶液と電界との関係を説明するための図
【符号の説明】
【００２７】
１          セル
２          溶液保持部
３          振動子
４          台座部
５          段差面
６，７      スプリング
１１，１２  端子ピン
１３        結晶板
１４        第１の電極
１５        第２の電極
１６，１７  リード部
１８        分析装置
１９        制御装置
２０        バイオセンサー装置
２１        振動子
２２        結晶板
２３        第１の電極
２４        絶縁体
２５        反応膜
２６        接着層
２７        第２の電極
２８        リード部
３０        溶液保持部
３１        振動子
３２        セル
３３        結晶板
３４        第１の電極
３５        第２の電極
３６，３７  リード部
３８        反応膜
３９        接着層
ＳＬ        試料
ＢＬ        バッファー液
Ｅ          電界
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005156289.tif 000005
【図４】
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【図５】
2005156289.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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