(57)【要約】【課題】  (R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]−酪酸、及び(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸を効率よく高収量で製造する方法を提供すること。【解決手段】  クロコブタケHypoxylon truncatumを水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出し、この抽出物から分離することを特徴とする(R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]-酪酸、(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸又はこれらの塩もしくはエステルの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロコブタケHypoxylon truncatumを水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出し、この抽出物から分離することを特徴とする(R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]-酪酸、(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸又はこれらの塩もしくはエステルの製造方法。
【請求項２】
抽出溶媒が酢酸エチルである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
抽出物からの分離手段が、クロマトグラフィーである請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、3-ヒドロキシ酪酸類、特に3-ヒドロキシ酪酸及びそのオリゴマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キラル中心を有する3-ヒドロキシ酪酸は、ビタミン類、カルバペネムに代表される抗生物質等の生理活性物質の合成素子として有用である。また、3-ヒドロキシ酪酸のオリゴマーは、ケトン体レベルの調節用治療薬（例えば、特許文献１参照）、強心剤（例えば、特許文献２参照）、透析液の成分（例えば、特許文献３参照）などに応用されている。更に、ポリヒドロキシ酪酸は、微生物により分解可能な低毒性のバイオポリマーとして、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待されている。
【０００３】
(R)-3-ヒドロキシ酪酸((R)-HBA)、その2量体:(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]−酪酸((R,R)-HBBA)、及びその3量体:3-[3-(3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸(HBBBA)は、ヨーロッパに広く生息する蜘蛛Linyphiatriangularis (Clerck,1757)より、性フェロモンの活性成分として分離同定されている。
【０００４】
【化１】
2005065652.tif 000002
【０００５】
しかし、Linyphia triangularisより得られる(R)-3-ヒドロキシ酪酸の2量体は、蜘蛛の巣一つにつき5μgと少量であり、(R)-3-ヒドロキシ酪酸は、0.05μgと更に少ない。また、3量体については痕跡量しか得られないため、ヒドロキシ基が結合した炭素の絶対配置については決定されていない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
一方、Alcaligenes latus由来のポリヒドロキシアルカネート(PHA)生合成酵素及びRalstonia eutropha由来のPHAデポリメラーゼをコードする遺伝子を含有する組み換えプラスミドpSYL105Red-trcを大腸菌に導入し、プラスミド導入大腸菌を短時間培養することにより、(R)-3-ヒドロキシ酪酸が生産できることが知られている（例えば、特許文献４参照）。
【０００７】
【特許文献１】特表平2002-521330号公報
【特許文献２】米国特許第6323237 B1号明細書
【特許文献３】米国特許第5112865号明細書
【特許文献４】WO 01/88145
【非特許文献１】Science,Vol.26,11,1993.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、(R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]−酪酸、及び(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸を効率よく高収量で製造する方法を提供することにある。  
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、(R)-3-ヒドロキシ酪酸等の製造方法を鋭意検討した結果、日本産のクロコブタケHypoxylontruncatumから効率よくかつ高収量で、(R)-3-ヒドロキシ酪酸、その2量体及び3量体を得ることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、クロコブタケHypoxylon truncatumを水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出し、この抽出物から分離することを特徴とする(R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]-酪酸、(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸又はこれらの塩もしくはエステルの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法により、効率よく高収量で(R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]-酪酸及び(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸を製造することができる。このようにして製造される(R)-3-ヒドロキシ酪酸等は、医薬類、農薬類、医療材料、工業材料等の原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
クロコブタケHypoxylon truncatumは、子嚢菌類に属する黒色で硬い半球形の小さなこぶが寄り集まったきのこである。きのこから放出された子嚢菌がシイタケ菌が蔓延していない原木内に侵入することにより、原木表面に子座が形成される。
【００１２】
本発明において用いられるクロコブタケは、使用部位に特に制限はないが、半球形であるため、傘と柄の全部を使用することが好ましい。上記クロコブタケは、生もしくは乾燥したものを抽出操作に供するが、生もしくは乾燥の粉砕物を抽出操作に供することが好ましい。乾燥は、真空凍結乾燥、加熱乾燥などの慣用的な方法によって実施することができる。
【００１３】
抽出溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコール類；ジクロロメタン、1,4-ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン系炭化水素類；酢酸エチル等のエステル類；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等のグリコール類；ジエチルエーテル、石油エーテル等のエーテル類；アセトン、酢酸等の極性溶媒などを挙げることができる。尚、ベンゼン、n-ヘキサン等は抽出効率が低く好ましくない。これらの溶媒は、単独で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中で、低級アルコール類、ハロゲン系炭化水素類又はエステル類が好ましく、エステル類がより好ましく、酢酸エチルが特に好ましい。
【００１４】
抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、溶媒中にクロコブタケの乾燥粉砕物を浸漬する方法、加温下攪拌する方法等を挙げることができる。得られた抽出物は、必要に応じて濾過又は遠心分離によって固形物を除いた後、そのまま用いるか又は溶媒を濃縮してもしくは乾燥して用いることができる。
【００１５】
クロコブタケ抽出物から3-ヒドロキシ酪酸、その2量体及び3量体を分離するには、公知の天然有機化合物類の分離や精製に用いる方法を使用できる。例えば、活性炭、シリカゲル、ポリマー系担体等を用いた吸脱着、クロマトグラフィー、液−液抽出、分別沈殿などの手法を挙げることができるが、クロマトグラフィーが好ましい。
【００１６】
具体的には、クロコブタケの酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、必要に応じて更にセファデックスLH-20に付し、クロロホルムと酢酸エチルとの勾配溶離によって3つの主要分画を得ることができる。これら主要分画の内の2分画は、製造例１に示すように、それぞれ、(R)-3-ヒドロキシ酪酸、(R)-3-ヒドロキシ酪酸の2量体と3量体との混合物を含有していた。混合物を含有する分画については、更に、混合物をメチルエステルに導いた後、HPLC及びセファデックスLH-20に順次付すことにより、2量体のエステルと3量体のエステルとを分離することができる。
【００１７】
本発明の製造方法によって得られる(R)-3-ヒドロキシ酪酸等の塩としては、酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩等が挙げられ、(R)-3-ヒドロキシ酪酸等のエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル等のアルキルエステルが挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法により、効率よく高収量で、(R)-3-ヒドロキシ酪酸、その2量体及び3量体を得ることができるが、これらは、生物体の異なる蜘蛛Linyphiatriangularisの性フェロモンから得られる3-ヒドロキシ酪酸類と同一構造のものである。特に、(R)-3-ヒドロキシ酪酸の2量体については、性フェロモンを原料とする従来法に比較して、約100万倍以上の大量スケールで製造することができる。また、Linyphiatriangularisからは絶対構造が決定できなかった(R)-3-ヒドロキシ酪酸の3量体についても、(R)配置であることが確認された。
【００１９】
このようにして得られる(R)-3-ヒドロキシ酪酸の用途としては、ビタミン類、抗生物質等の薬剤、バイオポリマー等の合成原料；強心剤組成物；透析液や浸透性剤の組成物：糖尿病やインシュリン抵抗性症状の栄養剤などが挙げられ、(R)-3-ヒドロキシ酪酸のオリゴマー、ポリマーの用途としては、ナルコレプシー、慢性精神分裂病、緊張型分裂病、非定型性精神病、慢性脳症候群、神経症、アルコール症、薬物嗜癖及び離脱症状、パーキンソン病及び他の神経薬理学的疾患、高血圧、虚血、循環虚脱、放射線暴露、癌、心筋梗塞等の治療薬；麻酔、鎮静、成長ホルモン産生、食欲不振改善、平滑筋弛緩、筋量産生、睡眠等の誘導剤などが挙げられる。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、もとより本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２１】
製造例１
１．クロコブタケHypoxylon truncatumの乾燥粉末の調製
生のクロコブタケ（519g）を真空凍結乾燥した後、粉砕してクロコブタケの乾燥粉末(173.2g)を得た。
【００２２】
２．クロコブタケの抽出
クロコブタケの乾燥粉末(173.2g)に酢酸エチル(3L)を加え、室温にて１週間静置した。不溶物を濾別後、酢酸エチルを減圧留去して、クロコブタケの酢酸エチル抽出物(16.6g)を得た。
【００２３】
３．分離・構造確認
化合物(1)〜(7)は、以下の(R)-3-ヒドロキシ酪酸類を意味する。  
【００２４】
化合物(1):(R)-3-ヒドロキシ酪酸
化合物(2):(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]−酪酸
化合物(3):(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸
化合物(4):(R)-3-ヒドロキシ酪酸メチル
化合物(5):(R)-3-[(R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ]−酪酸メチル
化合物(6):(R)-3-[(R)-3-((R)-3-ヒドロキシブチリルオキシ)-ブチリルオキシ]−酪酸メチル
化合物(7):(R)-3-アセチル酪酸メチル
【００２５】
クロコブタケの酢酸エチル抽出物(16.6g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに充填した後、クロロホルム:酢酸エチル=9:1〜8:2〜7:3〜6:4〜1:1〜0:1で各200mLずつ順次溶出した。溶出液を各50mLずつとり、減圧濃縮して、3つの分画fr.1〜3(以下、「Fr.I」とする)(667mg)、fr.4〜8(以下、「Fr.II」とする)(1690mg)及びfr.9〜13(以下、Fr.IIIとする)（880.2mg）を得た。
【００２６】
Fr.IIのGC分析を行ったところ、化合物(2)と(3)がメチルエステル体として2:1の割合で含まれていた。そこで、これらの化合物の構造を確認するために、Fr.IIの一部(68.8mg)をトリメチリシリルジアゾメタンでメチルエステル化し、HPLC(Waters5SL-IIカラム、n-ヘキサン:酢酸エチル=1:3)及びセファデックスLH-20に付し、化合物(5)(15.3mg)、化合物（5）と(6)の混合物(24.4mg)、化合物(6)（9.6mg）を得た。化合物(5)及び(6)の構造は、これらのNMR、MS及びIRスペクトルと、標品及び文献（Bulletin of chemical society of Japan 70,1887(1997)及び Bulletin of chemical society of Japan 71,1683(1998)）値との比較により決定した。
次いで、化合物（5）と(6)の混合物をKOH(20mg）-MeOH(1.5mL)でケン化後、1N HClで中和し、イオン交換クロマトグラフィー(Amberlite IR-120B/H+) に通し、溶出物を無水酢酸-ピリジンでアセチル化して、単量体である化合物(7)(17.2mg)を得た。
【００２７】
Fr.II（1620mg）をセファデックスLH-20(クロロホルム:メタノール=1:1)に付し、１フラクション20mLずつ分取し、fr.12〜20より化合物(3)(496mg)、fr.22〜31より化合物(2)(992mg）を得た。
【００２８】
化合物(6)の絶対配置については、化合物(6)のGC-MS (キラルカラム:β-DEX 120,30m×0.25mm,film thickness 0.25μm,Hewlett Packard mass selective detector 5971 A、gas chromatograph 5890 Series II)を測定し、上記文献記載のデータと比較した結果、(R)と決定した。
【００２９】
Fr.III（880.2mg）をセファデックスLH-20(クロロホルム:メタノール=1:1)に付し、純粋な化合物(1)(805mg)を得た。
また、Fr.IIIの一部(77.2mg)をとり、メチルエステル化した後アセチル化を行い、化合物(7)(29.4mg)に導いた。上記文献と比較したところ、化合物(7)のNMR、MS及びIRスペクトルは上記文献値とよい一致を示し、化合物(1)の構造を確認した。絶対配置は、化合物(7)のGC-MS(キラルカラム:β-DEX 120,30m×0.25mm,film thickness 0.25μm,Hewlett Packard mass selective detector 5971 A、gas chromatograph 5890 Series II)を測定することにより、上記文献値との比較により確認した。