(57)【要約】      （修正有）【課題】転写制御因子としての新しいタンパク質、及びその製造方法を提供する。【解決手段】ヒト由来の特定のアミノ酸配列を有し、転写制御活性を有する組換えタンパク質。該タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）の、転写制御活性を有する組換えタンパク質。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項３】
前記タンパク質の精製用タグとなるペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項５】
形質転換体が大腸菌である請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、下記（ａ）又は（ｂ）の、転写制御活性を有する組換えタンパク質の製造方法。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は過剰な疾病遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ転写制御因子に関する。より詳細には、本発明は、転写制御因子としての新しいタンパク質、及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
機能を発現しているヒトの遺伝子の総数は３万２千個前後と推定され、そのうち、機能が解明されている遣伝子は５、６千個前後といわれ、まだ全体の２０％にすぎない。
近年、世界中の研究機関の協力によってヒトのゲノムの全塩基配列が決定され、同時に、約２万個におよぶ機能不明のｃＤＮＡの存在も報告され、その半数は塩基配列も明らかになっている。
今後、研究開発として、機能不明の遺伝子の機能の解明とこれらの遺伝子の発現制御機構の解明が要求されている。
【０００３】
現在、これらの遺伝子の研究を念頭に置いた観点から、各種薬物に対し感受性を有し、判別するレセプタータンパク質遺伝子の機能解明と該遺伝子の発現制御を司る転写制御因子の機能解明に関心が向かっている。
【０００４】
転写制御因子はそれぞれの遺伝子の発現に特有のものであり、ヒトの遺伝子には２、３千個の転写制御因子が存在すると推定されている。
これらが複雑に絡み合った機構によって約３万２千個の遺伝子の発現が制御されていると考えられている。
この発現機構の異常により癌の発症、糖尿病や高血圧症等の疾患が引き起こされることも知られている。
したがって、この機構の正常化が疾病治療の基本となることが想定され、転写制御因子の発見と特定は遺伝子発現制御機構の正常化に役立つものである。
いいかえれば、転写制御因子に関わる遺伝子の単離とその機能の解明は今後の医療技術の発展に大きく貢献することが期待される。
【０００５】
転写制御因子は一般に、ＤＮＡと結合する機能性タンパク質であり、そのために特別のタンパク質構造を有している。
この構造としてロイシンジッパー構造、Ｚｎフィンガー構造、ヘリックス−ターン−ヘリックス構造、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造、フォークヘッドドメイン構造が知られている。このうち、前２者が数も多く、よく知られている。
【０００６】
Ｚｎフィンガー構造を有している転写制御因子としては以下のものが知られている。
Ｓｐ１グループはヘモグロビンの構成タンパク質であるグロビンタンパク質の転写制御因子であり、ＧＡＴＡグループは赤血球や血小板への分化を司る転写制御因子であり、イカロスグループは造血、免疫系の分化を司る転写制御因子であり、Ｋｒｏｘ２０は末梢神経における髄鞘の発生に関わる転写制御因子であるといわれている（例えば、非特許文献１又は２参照。）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｍａｒｙ  Ｂ．  Ｂｒｅｓｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００２，  Ｖｏｌ．  ３０，  Ｎｏ．４，  ｐ．１０３８−１０４５
【非特許文献２】
Ｒｏｂｅｒｔ  Ｙ．  Ｌ．  Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｏｖ．  １９９８，  Ｖｏｌ．  １８，  Ｎｏ．  １１，  ｐ．６４４７−６４５６
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、転写制御活性を有する機能性タンパク質としての新しいタンパク質、及びその製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らがヒト染色体１４番ｑ１１領域より単離した遺伝子（配列番号２）によりコードされるタンパク質は、Ｚｎフィンガー構造を有している。
図１（配列番号１）の配列によりコードされる上記タンパク質（以下、単に「ＺＮＦ２１９タンパク質」という場合がある。）の配列を示す。
Ｚｎフィンガータンパク質であるこのタンパク質は７２２のアミノ酸を持ち、Ｃ２Ｈ２タイプのＺｎフィンガーモチーフをコードし、核に局在している。
１４．４％がプロリンで、特に図１において二重線で示した領域に集中していることがアミノ酸組成の特徴である。また、一重線の部分はＺｎフィンガーモチーフを示す。
転写活性化ドメインと予想される上記プロリンに富む領域を持つことから、転写制御因子としての機能を有することが期待される。
【００１０】
そこで、本発明者らは、配列番号１で表される配列を含む上記タンパク質の機能解析をおこなうために、上記タンパク質の発現・精製を試みた。
【００１１】
鋭意検討した結果、大腸菌を用いて、配列番号１で表される配列を含む転写制御活性を有するタンパク質を効率良く発現・精製できることを見い出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）  下記（ａ）又は（ｂ）の、転写制御活性を有する組換えタンパク質、
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（２）  （１）項に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えベクター、
（３）  前記タンパク質の精製用タグとなるペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、（２）項に記載の組換えベクター、
（４）  （２）又は（３）項に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体、
（５）  形質転換体が大腸菌である（４）項に記載の形質転換体、及び
（６）  （４）又は（５）項に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、下記（ａ）又は（ｂ）の、転写制御活性を有する組換えタンパク質の製造方法、
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
図２は、配列番号２で表わされる遺伝子の塩基配列と図１で示したアミノ酸配列との相関を示す図である。図２中、Ｚｎフィンガーモチーフは下線で示し、その下線の下にＺｎフィンガーモチーフの番号を示し、システインとヒスチジンを丸で囲んである。点線で示す下線はプロリンに富むドメイン、又はグルタミン酸に富むドメインを示す。
【００１４】
ｍＲＮＡを用いて調製したｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡとして、ヒト染色体１４番ｑ１１領域に存在する遺伝子（図２及び配列番号２）を含む配列を取り出し、これを用いて、本発明の組換えベクター（発現ベクター）を構築することができる。
まず、当該ｃＤＮＡをクローニングしたベクターから所定のプライマー（例えば、配列番号３及び４）を用いて、ＰＣＲ産物を得る。後にクローニングしやすいように両端のプライマー中に制限酵素部位（例えば、ＢａｍＨＩ部位、ＥｃｏＲＩ部位）をそれぞれ１ヶ所ずつ設定することが好ましい。さらに、それらのプライマー中には、発現タンパク質の精製を容易にするために６×Ｈｉｓ−タグ（ポリヒスチジンタグ）をコードする配列を含むことが好ましい。
【００１５】
上記得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理した後（当該ＰＣＲ産物にＢａｍＨＩ部位、ＥｃｏＲＩ部位を設けている場合、制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後）、プラスミドベクター（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１）のクローニング部位（例えば、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位）に挿入しクローニングを行うことにより、本発明の発現ベクターを構築することができる。
【００１６】
本発明に使用されるプラスミドベクターは、宿主菌内で発現可能なものである限り、任意のいかなるプラスミドベクターであってもよく、例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＥＴ、ｐＢＳ、ｐＢＣ、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２等を挙げることができる。上記の中でも、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１、ｐＥＴが好ましく、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１が特に好ましい。
【００１７】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１は、大腸菌内で発現可能であり、予めグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグの配列が組み込まれており、発現タンパク質の精製を容易に行なうことができる。クローニング部位は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ配列の下流に存在する。
宿主菌としては、本発明における発現ベクターが安定且つ自立的に増殖できるものであればいかなる微生物でもよいが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることが好ましい。大腸菌の中でも、ＢＬ２１−Ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  （ＤＥ３）−ＲＰ（商品名、ストラタジーン社製）、ＤＥ５α株が好ましく、プロテアーゼ欠損株であることからＢＬ２１−Ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  （ＤＥ３）−ＲＰ株が特に好ましい。
本発明において、上記得られた発現ベクターによる宿主菌の形質転換の方法としては、コンピテントセルを用いたヒートショック法、エレクトロポレーション法等任意の方法を使用することができる。
以上により、本発明のタンパク質を発現する形質転換体を得ることができる。
【００１８】
以下、本発明におけるタンパク質発現を説明する。
本発明のタンパク質は、上記形質転換された宿主菌を培養することにより発現することができる。その際、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えた後１５〜２５℃で培養することが好ましく、２０℃で培養することがさらに好ましい。
【００１９】
以下、本発明におけるタンパク質精製について説明する。
本発明において、発現したタンパク質の精製は、ニッケル（Ｎｉ２＋）キレート樹脂、コバルト（Ｃｏ２＋）べース樹脂、グルタチオン樹脂等任意のいかなる樹脂を用いてもよい。さらに精製度を高めるために、１つの上記樹脂を用いて精製した後、他の樹脂を用いて精製してもよい。そのような複数種の精製を組合せる例として、ニッケルキレート樹脂精製の後、グルタチオン樹脂精製を行なうことが挙げられる。
６×Ｈｉｓ（ポリヒスチジン）タグ及び停止コドンが付加されるようにタンパク質を発現した場合、ニッケルキレート樹脂、コバルトべース樹脂を用いることが好ましく、ニッケルキレート樹脂を用いることがさらに好ましい。
上記ニッケルキレート樹脂としてＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌアフィニティー樹脂（商品名、クロンテック社製）を用いてよい。
【００２０】
図３を参照してニッケルキレート樹脂によるタンパク質精製を説明する。図３ａは、ニッケルキレート樹脂１及びポリヒスチジンタグ３のついた組換えタンパク質２を示す図である。図３ｂは、ニッケルキレート樹脂及び組換えタンパク質からなる複合体を示す図である。
上記樹脂は、図３ａに示したような、ヒスチジン側鎖と固定化金属イオンの可逆的相互作用に基づき、耐久性のあるニッケルキレート樹脂１に、ポリヒスチジンタグ３のついた組換えタンパク質２が図３ｂのように結合し、洗浄バッファーにより不純物を除いた後、溶出バッファーに高濃度のイミダゾールを添加することによって競合的に溶出することにより精製するものである。上述の精製操作の間、タンパク質が変性しないことが好ましい。
【００２１】
本発明のタンパク質精製において、上記ニッケルキレート樹脂を用いた場合の洗浄・溶出液の組成それぞれの好ましい一例を以下に示すが、これに限定されるものではない。
ＴＡＬＯＮ洗浄液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭ  βメルカプトエタノール、０．１％  ＮＰ−４０（界面活性剤、商品名、カルビオケム社製）
ＴＡＬＯＮ溶出液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、５００ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭ  βメルカプトエタノール、０．１％  ＮＰ−４０
【００２２】
不純物を除くときの洗浄液としては、イミダゾールを１〜１５ｍＭ含むことが好ましく、５〜１０ｍＭ含むことが特に好ましい。
目的のタンパク質を遊離し、溶出させるときの溶出液としては、イミダゾールを３０〜１０００ｍＭ含むことが好ましく、２００〜５００ｍＭ含むことが特に好ましい。
【００２３】
本発明のタンパク質精製において、上記ニッケルキレート樹脂を用いた場合、大腸菌培養液２００ｍｌから得た菌体の破砕液４．０ｍｌの１／８、すなわち５００μｌあたり、上記ニッケルキレート樹脂の量は３０μｌ〜７０μｌであることが好ましく、４０μｌ〜６０μｌであることがさらに好ましく、５０μｌであることが最も好ましい。
【００２４】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグが付加されるようにタンパク質を発現した場合、グルタチオン樹脂（例えば、グルタチオン  セファロース  ４Ｂ樹脂（アマシャムバイオサイエンス社製））を用いることが好ましい。
例えば、上記樹脂は、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミドベクター（アマシャムバイオサイエンス社製）に配列が挿入され、且つＺＮＦ２１９タンパク質のＮ末端側に結合しているグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をタグとした精製に使用することができる。上述のように精製度を上げるために、ニッケルキレート樹脂精製の後、グルタチオン樹脂精製を行なうことができる。
【００２５】
本発明のタンパク質精製においてグルタチオン  セファロース  ４Ｂ樹脂を用いた場合の洗浄液、溶出液の組成それぞれの好ましい一例を以下に示すが、これに限定されるものではない。
ＧＳＴ洗浄液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．１％  ＮＰ−４０
ＧＳＴ溶出液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  グルタチオン、０．１％  ＮＰ−４０
【００２６】
不純物を除くときの洗浄液としては、グルタチオンを添加しないことが好ましい。
一方、目的のタンパク質を遊離し、溶出させるときの溶出液としては、グルタチオンを１〜２００ｍＭ含むことが好ましく、１０〜１８０ｍＭ含むことがさらに好ましい。
【００２７】
本発明のタンパク質精製において、上記グルタチオン  セファロース  ４Ｂ樹脂を用いた場合、大腸菌培養液２００ｍｌから得た菌体の破砕液４．０ｍｌの１／８、すなわち５００μｌあたり、上記グルタチオン  セファロース  ４Ｂ樹脂の量は２０μｌ〜２００μｌであることが好ましい。
【００２８】
上記精製操作後、ＳＤＳ電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法、銀染色法等の周知の方法により精製を確認してよい。
前述の発現の際の放射性標識等の周知の方法により精製後のタンパク質の定量を行ってよい。
【００２９】
以下、配列番号１で表される配列を含む目的のタンパク質が結合するＤＮＡコンセンサス配列を決定するために用いる方法について説明する。
本発明において、配列番号１で表される配列を含む目的のタンパク質が結合するＤＮＡコンセンサス配列を決定するために用いる方法として、（１）ゲルシフトアッセイを行って、シフトしたバンドをアクリルアミドから回収する方法、（２）タンパク質を認識する抗体を用いて免疫沈降によりタンパク質に結合したＤＮＡを回収する方法、（３）タンパク質をビーズなど（例えば、グルタチオン樹脂、ニッケルキレート樹脂等）に固定化した状態でＤＮＡに作用させ、洗浄後に残ったＤＮＡを単離する方法等任意のいかなる方法でもよいが、上記（３）の方法（以下、ランダムオリゴヌクレオチドセレクションという。）を用いることが好ましい。
【００３０】
上記ランダムオリゴヌクレオチドセレクションは、両末端にプライマー結合配列を持った二本鎖ランダムオリゴヌクレオチドの中から目的のタンパク質と結合する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのみを回収し、周知のＰＣＲ法により増幅させる方法である。
【００３１】
以下に示しているのは、この方法で使用した二本鎖にする前の一本鎖ランダムオリゴヌクレオチドである。
2005052017.tif 000002
【００３２】
上記一本鎖ランダムオリゴヌクレオチドは、両末端にプライマー結合配列を有し、ランダム塩基は１８ｂｐであってよい。上記一本鎖ランダムオリゴヌクレオチドは、化学合成法等任意のいかなる方法によって調製してもよいが、化学的方法により合成することが好ましい。また、後にクローニングしやすいように両端のプライマー配列に制限酵素サイトを２ヶ所設定することが好ましい。周知のＰＣＲ法により二本鎖ランダムオリゴヌクレオチドとして調製し、以下の工程に用いることができる。
【００３３】
本発明で用いるランダムオリゴヌクレオチドセレクションの手順の好ましい１例の概要を図４に示す。図４ａはグルタチオン樹脂４にグルタチオン５とＧＳＴタグ７との結合を介して結合したままのＧＳＴタグの付いた組換えタンパク質６を示す図である。図４ｂは、二本鎖ランダムオリゴヌクレオチドとの結合を示す図である。図４ｃは、目的のタンパク質と結合しなかったランダムオリゴヌクレオチドの除去を示す図である。図４ｄは目的のタンパク質及びオリゴヌクレオチドからなる複合体のグルタチオン  セファロース樹脂から遊離を示す図である。
【００３４】
図４ａに示したようなグルタチオン  セファロース樹脂に結合したままの目的のタンパク質（約１００ｎｇ）を、可変部分１８ｂｐを含む二本鎖ランダムオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌを含む以下に示す結合バッファー１ｍｌに加え、３０分かけて結合させる。
結合バッファー：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５），  １００ｍＭ  ＫＣｌ，  ５ｍＭ  ＤＴＴ，  ５％  グリセロール，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １００μＭ  ＺｎＣｌ２，  １００μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ），  １ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），  ０．１％  ＮＰ４０
【００３５】
その後、軽く遠心して上清を除き、ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）とＢＳＡを入れない結合バッファーを加え、軽く撹拌する。この洗浄操作を８回繰り返し、遠心後の沈殿に１００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、煮沸し、ＤＮＡを遊離し、次のＰＣＲの鋳型液を得ることができる。
【００３６】
このようにしてオリゴヌクレオチドを回収そしてＰＣＲで増幅するサイクルを５〜１０回行うことが好ましい。
最終的に得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｘｂａ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで３７℃、２時間処理し、その後、このＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−ベクター（商品名、タカラバイオケミカル社製）等任意のベクターにクローニングし、ついで、この断片挿入ベクターを大腸菌等の任意の宿主菌を用いて増幅、抽出し、プラスミドの挿入断片の塩基配列を決定することができる。
【００３７】
上記配列決定から得られた複数のオリゴヌクレオチドの共通配列から目的のタンパク質が結合するＤＮＡのコンセンサス配列を決定することができる。
得られたコンセンサス配列の確認及びコア配列の同定は、ゲルシフトアッセイ等任意のいかなる方法を用いてもよい。
【００３８】
本発明のタンパク質が結合するＤＮＡのコア配列は、Ｃが５個以上連続した配列、すなわちＣＣＣＣＣである。この認識コア配列は新規の配列である。
【００３９】
以下、配列番号１で表される配列を含む目的のタンパク質が転写制御因子であることを証明する方法について説明する。
本発明で用いる活性測定方法の好ましい１例の概要を図５に示す。
図５を参照しながら活性測定方法の手順を説明する。
プロモーター活性を調べたいＤＮＡ領域、具体的にはＨＭＧＮ１遺伝子のプロモーター（転写開始点を基準にして、−３４６〜＋１０１の領域）をＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＰＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ）により入手し、周知のＰＣＲ法で増幅したもの８、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を持つプラスミドｐＧＬＢベクター９（商品名、プロメガ社製）にクローニングし、このベクターを、予め本発明のタンパク質発現ベクター１１をエフェクチントランスフェクション試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ、商品名、キアゲン社製）法等の任意の方法によりトランスフェクションし、目的のタンパク質が発現している２９３細胞１２（２９３細胞：ヒト胎児腎細胞無限寿命化株）と、単に非挿入発現ベクター１３をトランスフェクションしただけの目的のタンパクが発現していない２９３細胞１４にそれぞれエフェクチントランスフェクション試薬を用いる方法等の任意の方法によりトランスフェクションする。その挿入した断片にプロモーター活性があれば、ルシフェラーゼが発現する。この蛍光の強さを調べることで、プロモーターの強さが測定できる。図６（ａ）は、上記活性測定法に用いた本発明のタンパク質を発現するベクターの１例を示し、図６（ｂ）は、上記活性測定法に用いたルシフェラーゼレポーターベクターを示す。
【００４０】
また、内部標準ベクター１０としてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を持つべクター（例えば、ｐＲＬ−ＳＶ４０（プロメガ社製））もぞれぞれの細胞にエフェクチントランスフェクション試薬を用いる方法等の任意の方法によりトランスフェクションする。
フルオロスキャンアセントＦＬ（商品名、ライフサイエンスインターナショナル社製）等任意の技術を用いてルシフェラーゼの活性を測定してよい。
【００４１】
上記活性測定の結果から、配列番号１で表わされる、本発明のタンパク質は、遺伝子（例えば、ＨＭＧＮ１遺伝子）の発現を抑制する転写制御因子であるか否かを評価できる。詳細には、プロモーター領域にＣが５個以上連続した配列を有する遺伝子（前記配列をより多く有する遺伝子であることが好ましい。）の発現を抑制する転写制御因子を特定することができる。
【００４２】
転写制御活性を有する、本発明の機能性タンパク質により抑制される遺伝子の具体例としては、ＨＭＧＮ１遺伝子がある。ＨＭＧＮ１遺伝子はＨＭＧ  タンパクのファミリーで、クロマチンを構成する非ヒストンタンパクの中でも、もっとも研究されているタンパクのひとつである。様々な研究により、ＨＭＧＮ１タンパクとそのアナログであるＨＭＧＮ２のヌクレオソームへの結合は、クロマチンを弛緩させて転写活性を上昇させることがわかっている  。そしてこのクロマチンの高次構造の変換はこれらタンパクがクロマチンを安定化させる主なターゲットであるヒストンＨ１とヒストンＨ３に結合して、クロマチンの高次構造を不安定化させることが原因であることが報告されている。
したがって、本発明のタンパク質は、ＨＭＧＮ１タンパク質によるゲノム転写活性の過剰な向上に起因する発癌等の疾病を誘発する過剰な遺伝子発現を抑制するのに有用である。
【００４３】
また、本発明のタンパク質は、プロモーター領域にＣが５個以上連続した配列を有する遺伝子の発現を抑制するので、そのような配列と相補的な配列、すなわちＧが５個以上連続した配列をプロモーター領域に有する遺伝子の発現も抑制することを示している。ところで、赤血球増殖の過剰な発現は赤血病に起因し、赤血球増殖因子は、Ｇが５個以上連続した配列に結合することが知られている（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｆ．  Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍａｒ．  １９９４，  Ｖｏｌ  １４，  ｐ．１７８６−１７９５）。
したがって、本発明のタンパク質は、赤血球増殖因子に対し競合的又は非競合的に赤血球増殖の過剰な発現を抑制することにより、赤血球増殖の過剰な発現である赤血病の治療にも有用であることが期待される。
【００４４】
上述したように、配列番号１で表される本発明のタンパク質はＨＭＧＮ１遺伝子の過剰な発現を抑制することができる。さらに、プロモーター領域にＣが５個以上連続した配列を有する遺伝子の疾病を誘発するような過剰な発現を抑制するのにも有用である。
また、本発明の転写制御活性を有するタンパク質の製造方法によれば、上記タンパク質を効率よく発現・精製することが可能である。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
実施例１
工程（１）大腸菌発現ベクターの構築
初めにＺＮＦ２１９のＮ末端にＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）タグ、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加したベクターを以下の操作により調製した。図２（配列番号２）に示す配列を含むクローンを鋳型に、ＰＣＲ装置（パーキンエルマー社製）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応に用いたプライマー配列中に、ベクターに組み込むための制限酵素部位の配列を導入しておいた。プライマーを以下に示す。
2005052017.tif 000003
ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオケミカル社製）を用いて行った。
得られたＰＣＲ産物をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（商品名、キアゲン社製）を用いて精製し、その後ＢａｍＨ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉで３７℃、２時間、制限酵素処理を行った。上記の制限酵素反応液を、同様に制限酵素処理をしたｐＧＥＸ６Ｐ−１（ＺＮＦ２１９遺伝子導入部位の５’上流にＧＳＴタグを導入してある。アマシャムバイオサイエンス社製）と混ぜ、ライゲーションハイ  （商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、１６℃、３時間ライゲーションを行った。ライゲーション反応液で大腸菌ＤＨ５αをトランスフォームし、アンピシリン入りのＬＢプレートにまき、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌のコロニーから培養液に植え継ぎ、３７℃で一晩培養した。培養液からアルカリＳＤＳ法を用いて大腸菌発現ベクターを回収した。以上により、本発明の発現ベクターを構築した。
【００４７】
工程（２）大腸菌を用いたタンパク質の発現
得られた大腸菌発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１−Ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ  （ＤＥ３）−ＲＰ  （ストラタジーン社製）をトランスフォームし、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール入りのＬＢプレートにまき、３７℃で一晩培養した。
得られた大腸菌のコロニーから培養液に植え継ぎ、２５℃で一晩培養した。この培養液を種菌としてグリセロール保存し、以後の発現実験ではこの種菌から発現に用いた。アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール及びＺｎＳＯ４をそれぞれ０．１ｍＭになるように加えた２ｘＹＴ（１．６％バクトトリプトン，  １．０％バクトイーストエキストラクト，  ０．５％  ＮａＣｌ）２００ｍｌに種菌を植菌し、２５℃で培養した。ＯＤ６００が０．５になった時点でＩＰＴＧを１ｍＭになるように加え、その後２０℃で１晩、培養した。
【００４８】
工程（３）目的のタンパク質の精製
培養液を遠心して菌体を回収し（約１．０ｇ）、菌体をＴＡＬＯＮ洗浄液に懸濁した後、超音波破砕機（ブランソン社製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心して不溶性画分（０．２ｍｌ）と可溶性画分（約４．０ｍｌ）に分離し、可溶性画分（約４．０ｍｌ）にニッケルキレート樹脂としてＴＡＬＯＮ  ｍｅｔａｌアフィニティー樹脂（５０μｌ）（クロンテック社製）を加え、４℃で１時間、緩やかに転倒混和しながら保温した。
軽く遠心して上清を除き、沈殿（ＴＡＬＯＮ樹脂）をＴＡＬＯＮ洗浄液で３回以上洗浄した。洗浄後、ＴＡＬＯＮ溶出液を加え、目的タンパクをＴＡＬＯＮ樹脂から遊離させ、回収した。
さらにグルタチオン  セファロース  ４Ｂ（２０μｌ）（アマシャムバイオサイエンス社製）の入ったＧＳＴ洗浄液（１０ｍｌ）にＴＡＬＯＮ樹脂によって粗精製された目的タンパクを加え、４℃で３０分間、緩やかに転倒混和しながら保温した。軽く遠心して上清を除き、沈殿（グルタチオン  セファロース  ４Ｂ）をＧＳＴ洗浄液で３回以上洗浄した。洗浄後、少量のＧＳＴ洗浄液（５００μｌ）に懸濁し、精製タンパク（濃度：数１００ｎｇ／μｌ；収率７０％）とした。
なお、ゲルシフトに用いるタンパクはＧＳＴ洗浄液の代わりに少量のＧＳＴ溶出液（５００μｌ）を加え、目的タンパクをグルタチオン  セファロースから遊離させ、回収した（濃度：数１００ｎｇ／μｌ）。
【００４９】
なお実験に用いた試薬類の組成は以下の通りである。
ＴＡＬＯＮ洗浄液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭ  βメルカプトエタノール、０．１％  ＮＰ−４０
ＴＡＬＯＮ溶出液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、５００ｍＭ  イミダゾール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、１ｍＭ  βメルカプトエタノール、０．１％  ＮＰ−４０
ＧＳＴ洗浄液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ＮＰ−４０
ＧＳＴ溶出液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  グルタチオン、０．１％  ＮＰ−４０
【００５０】
以上の工程によりＺＮＦ２１９のＮ末端にＧＳＴタグ、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加した状態で発現させ、２段階の精製を行った。
図７は、完全長ＺＮＦ２１９タンパク質が精製されたことを確認するために行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を表す。電気泳動後の染色にはＣＢＢ染色を用いた。レーン１は上述の２段階精製により得られたタンパク質である。レーン２に示すようにＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）を加えて、ＧＳＴとＺＮＦ２１９の境目を切断すると、ＧＳＴとＺＮＦ２１９のバンドがそれぞれ確認できることから、レーン１のバンドがＧＳＴ−ＺＮＦ２１９タンパクであることが確認できた。
【００５１】
以上の工程に従って、大腸菌を用いて、完全長の配列番号１で表される配列を含む目的のタンパク質の発現と精製を行うことができた。
【００５２】
工程（４）機能解析
４−１）配列番号１で表される配列を含む目的のタンパク質が結合するＤＮＡコンセンサス配列の決定
目的のタンパク質が結合するＤＮＡコンセンサス配列を決定するため、ランダムオリゴヌクレオチドセレクションを行った。
まず、二本鎖ランダムヌクレオチドを調製した。
具体的には、まず、以下に示すような一本鎖のランダムオリゴヌクレオチドを合成した。中央にランダムオリゴ１８ｂｐ（（Ｎ）１８で示す。）を配置し、プライマーが結合する領域の配列として、その上流側に配列番号５の配列を、その下流側に配列番号６の配列を配置した。その両端のプライマーが結合する領域には、後にクローニングしやすいようにＸｂａ  ＩサイトとＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトをそれぞれ配置した。
2005052017.tif 000004
そして、このランダムオリゴヌクレオチドを増幅させるためのプライマーを合成した。
プライマー  Ｒ２：  ＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＡＧＡＣＧ  （配列番号７）
合成した１本鎖ランダムオリゴヌクレオチドを以下の組成で調製し、ＰＣＲ装置を用いて、９５℃  ５分，  ６５℃  ２０分，  ７２℃  ２０分の処理を行って二本鎖ＤＮＡにした。
４００ｐｍｏｌ分の１本鎖ランダムオリゴヌクレオチド
１２００ｐｍｏｌ分のプライマーＲ２
１０  ｘ  Ｅｘ  ｔａｑ  ＰＣＲ  バッファー    １０μｌ
ｄＮＴＰ                          ８μｌ
ミリキュー水            ｕｐ  ｔｏ  １００μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ            １μｌ
得られたＰＣＲ反応液をランダムオリゴヌクレオチドとして、ランダムオリゴヌクレオチドセレクション法の１サイクル目に用いた。
【００５３】
以下、図４を参照してランダムオリゴヌクレオチドセレクションを説明する。
上記（１）、（２）及び（３）の工程に従い発現・精製したＧＳＴ精製樹脂に結合させたままのタンパク（約１００ｎｇ）と、上述のように調製した６６ｂｐの二本鎖ランダムオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌとを１ｍｌの結合バッファー中で、室温で３０分程度、緩やかに撹拌した（結合）。結合バッファーの組成は以下の通りである。結合バッファー：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．５），  １００ｍＭ  ＫＣｌ，  ５ｍＭ  ＤＴＴ，  ５％  グリセロール，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １００μＭ  ＺｎＣｌ２，  １００μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ），  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．１％  ＮＰ４０
その後、軽く遠心して上清を除き、ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）とＢＳＡを入れない結合バッファーを加え軽く撹拌した（洗浄）。この洗浄操作を８回繰り返し、遠心後の沈殿に１００μｌのＴＥを加え、煮沸させてＤＮＡを遊離させ、次のＰＣＲの鋳型液として用いた（増幅）。
【００５４】
ＰＣＲにより増幅されたランダムオリゴヌクレオチドを再度、上述の結合のサイクルに用い、結合→洗浄→増幅のサイクルを５回繰り返した。
最終的に得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｘｂａ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで３７℃、２時間処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−とライゲーションを行った。ライゲーション反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プレート上に形成されたコロニーのうち、白色のコロニーだけを選択して培養液に植菌し、３７℃で一晩培養した。抽出したプラスミドのインサート部位を塩基配列決定し、得られた配列データを比較しＺＮＦ２１９タンパクが結合する配列ＤＮＡの決定を試みた。
【００５５】
９０個ほど配列決定した結果、Ｃの連続が多くのオリゴヌクレオチドで認められ、約７０％のクローンが５連続以上のＣを含むオリゴヌクレオチドであることが分かった。その５連続以上のＣを含む塩基配列について図８に示す。図８中、下線はＣ連続が５以上の配列を示し、小文字の塩基配列はプライマーの部分を示す。
６０個ほど配列決定した５連続以上のＣを含む塩基配列のうちの多くは同じ塩基配列であり、図８にあるように、全部で１９種類の塩基配列が単離された。配列決定されてきた頻度は、Ｃが５連続であるだけでなく、その周囲もＣリッチであるものほど、高い傾向性があった。このようにＣの連続が多いという特徴は、セレクションを再度やり直したところ再現性があった。
【００５６】
そこで、図８及び表１に示したように、この１９種類のなかでも、最も頻度の高く認められたオリゴヌクレオチド（以下、Ａ１とする。）を基準として、ゲルシフトアッセイによって、ＺＮＦ２１９タンパクと結合する部分の同定を行った。
【００５７】
４−２）ＺＮＦ２１９に結合する塩基配列部分の同定
ゲルシフトアッセイに先だって、二本鎖の標識ＤＮＡを作製するため、得られた配列データ１つにつき、センス鎖及び対応するアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、アニーリングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ）２００μｌ中にそれぞれ２ｐｍｏｌ加えた。上記ＰＣＲ装置を用いて、９５℃  １０分間、保温した後、合成したオリゴマーの予想されるＴｍ値と同じ温度で２０分間保温し、ゆっくりと室温にまで下げた。二本鎖化したオリゴヌクレオチドを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオケミカル社製）を用いて３２Ｐで標識し、標識ＤＮＡとして以下のゲルシフトアッセイに用いた。
【００５８】
【表１】
2005052017.tif 000005
【００５９】
精製したタンパク（約５０ｎｇ）を結合バッファー２０μｌ中で、標識ＤＮＡ  ２００００ｃｐｍと混ぜて、室温で２０分保温してＤＮＡとタンパクの複合体を形成させた。コンペティターとしてモル量にして、Ａ１オリゴの５００倍量を添加した。結合バッファーの組成は以下の通りである。
結合バッファー：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５），  ７０ｍＭ  ＫＣｌ，  ５ｍＭ  ＤＴＴ，  １０％  グリセロール，  ２０μＭ  ＭｇＣｌ２，  ２０μＭ  ＺｎＣｌ２，  ０．１％  ＮＰ−４０，  ０．１  ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）
複合体を形成させた試料を０．５ｘＴＢＥ（５．４％  Ｔｒｉｓ，  ２．７５％  ホウ酸，  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０））に調整した５％非変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアクリルアミド、２９：１）で４℃、１５０Ｖで予備泳動を２０分行った後、サンプルをローディングして２時間程度電気泳動した。泳動後のゲルをラップ等でくるみ、イメージアナライザーＢＡＳ２０００  （富士写真フイルム（株）製）を用いて複合体形成の有無を確認した。
【００６０】
図９及び１０は、表１に示した最も頻度の高く認められたオリゴヌクレオチドＡ１を基準としたＺＮＦ２１９タンパクと結合する塩基配列の同定のため、ゲルシフトアッセイによる結果を示す。
図９は、Ａ１オリゴのどの塩基配列部分にＺＮＦ２１９が結合するかを、Ａ１オリゴをプローブにして、コンペティター実験を行うことで決定した結果を示す。
図９に示すようにＧＣＣＣＣＣＣＴの配列以外の場所に変異をいれたオリゴについてはプローブのＡ１オリゴをコンピートすることで、バンドが消失するが、ＧＣＣＣＣＣＣＴの配列の部分に変異を入れたオリゴ（Ａ１−Ｌ，  Ａ１−Ｍ，  Ａ１−ＴＴ）は、プローブのＡ１オリゴをほとんどコンピートしなかった。この実験結果により、ＧＣＣＣＣＣＣＴの配列の中に、ＺＮＦ２１９のＤＮＡ結合コンセンサス配列のコアがあることが明らかになった。
【００６１】
図１０は、Ｃの連続の数について、それぞれ変異を入れたオリゴをラベリングしたゲルシフトアッセイを示す。図１０から明らかなように、Ｃの連続を４つにしたものは、結合せず、Ｃの連続を５つ以上にすると結合し、この違いは極めてはっきりしたものであり、ＺＮＦ２１９の結合のコア配列はＣＣＣＣＣというＣ５連続の配列であることが明らかになった。なお、ａｌｌＣオリゴではバンドが２本見えていることから、ＺＮＦ２１９タンパクが２つ結合していることが示唆された。
【００６２】
現在知られている転写因子の中でＺＮＦ２１９のように、結合ＤＮＡコンセンサスのコア配列がＣ５連続であるものは転写因子のデーターベース（ＴＲＡＮＳＦＡＣ）（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／）に、これまで登録されていない。
【００６３】
４−３）目的のタンパク質の転写制御因子としての機能
目的のタンパク質の転写制御因子としての機能を解析するため、上記の工程で得られたコンセンサス配列を用い、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＰＤ）に登録されているプロモーター領域６００ｂｐの中に、より数多くのＣの５連続が存在するようなプロモーターをＥＰＤからＨＭＧＮ１遺伝子（クロマチンの高次構造を弛緩させて転写活性を上昇させる）のプロモーター（−３４６〜＋１０１）を選択することができた。
【００６４】
次に、活性評価を行なうための細胞内発現ベクターは以下のように構築した。
工程（１）で得られた配列番号２の配列を含むベクターを鋳型に、ＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応に用いたプライマー配列中に、ベクターに組み込むための制限酵素部位とコザック配列、ＦＬＡＧタグの配列を導入した。ＦＬＡＧタグは後で、細胞内での発現を確認するために組み込んだ。完全長ＺＮＦ２１９のｐｃＤＮＡ３発現ベクターを構築するために用いたプライマーを以下に示す。
プライマーＦ３（配列番号３６）：
2005052017.tif 000006
【００６５】
ＰＣＲはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（商品名、タカラバイオケミカル社製）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（商品名、キアゲン社製）を用いて精製し、その後ＢａｍＨ  ＩとＸｈｏ  Ｉで３７℃、２時間、制限酵素処理を行った。
上記の制限酵素反応液を、同様に制限酵素処理をしたｐｃＤＮＡ３（商品名、インビトロゲン社製）と混ぜ、ライゲーションハイ（商品名、ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、１６℃、３時間ライゲーションを行った。ライゲーション反応液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン入りのＬＢプレートにまき、３７℃で一晩培養した。得られた大腸菌のコロニーから培養液に植え継ぎ、３７℃で一晩培養した。培養液からのベクターの回収はプラスミド精製キット（キアゲン社製）を用いて行った。
また、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４  ＤＢＤ）のＣ末側に、様々にＺＮＦ２１９を断片化した融合タンパクを発現するベクターも構築した。その場合は、Ｇａｌ４  のＮ末端にＦＬＡＧタグを導入したものを最初にｐｃＤＮＡ３にクローニングし、さらに、ＺＮＦ２１９、またはこれを断片化したものを、フレームをあわせてこのベクターに組み込んだ。
【００６６】
Ｇａｌ４  ＤＢＤはｐＤＢＬｅｕベクター（商品名、インビトロゲン社製）をテンプレートにして、次に示すプライマーでＰＣＲを行なった。
2005052017.tif 000007
【００６７】
さらに、このベクターにクローニングするＺＮＦ２１９、またはこれを断片化したものを増幅するために用いたプライマーを以下に示す。ｐｃＤＮＡにクローニングするために下線で示すようにプライマーＦ（５￣７）にＢａｍＨ  Ｉ、プライマーＲ（５￣７）にＥｃｏＲ  Ｉを設定した。
・ＺＮＦ２１９全長（アミノ酸配列１−７２２）用
プライマーＦ５：ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＧＴＣＣ（配列番号４０）
プライマーＲ５：ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＧＣ（配列番号４１）
・Ｚｎ  ３４５６（アミノ酸配列１５４−３３４）用
プライマーＦ６：ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＴＣ    （配列番号４２）
プライマーＲ６：ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＧＧＧＧＣＡＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣ  （配列番号４３）
・Ｚｎ６−最後（アミノ酸配列  ２７３−７２２）用
プライマーＦ７：ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＧ  （配列番号４４）
プライマーＲ７：ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＧＣ  （配列番号４５）
【００６８】
上述のようにして得られた細胞内発現ベクターを用いて、プロモーターに対する活性について以下の活性測定法により調べた。
ＺＮＦ２１９の機能的解析を行うために、初めにルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬＢベクター（商品名、プロメガ社製）にＨＭＧＮ１遺伝子のプロモーター（転写開始点を基準にして、−３４６〜＋１０１の領域）をＰＣＲで増幅し、挿入した。ｐＧＬＢへのクローニングを容易にするため、下に示すようにプライマーＦ８にＫｐｎ  Ｉ、プライマーＲ８にＨｉｎｄ  ＩＩＩを設定した。
2005052017.tif 000008
【００６９】
ついで、さきにＨＭＧＮ１遺伝子のプロモーターを挿入したｐＧＬＢベクターのさらに５’側上流にＧａｌ４  ＤＮＡ結合部位を挿入したものを用意した。この結合部位の領域は、ｐＦＲ−Ｌｕｃ  レポータープラスミド（商品名、ストラタジーン社製）  をテンプレートに、次に示すプライマー  を用いてＰＣＲで増幅した。ちなみにこの領域上には、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合部位がタンデムに５つ並んでいる。クローニングするために下線で示すようにプライマーＦ９にＫｐｎ  Ｉ、プライマーＲ９にＫｐｎ  Ｉを設定した。この増幅断片をｐＧＬＢ  ベクターに挿入した。
2005052017.tif 000009
【００７０】
他方、プロモーターの解析には、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ社製）を用いて行った。図６（ｂ）に示すように、プロモーター活性を調べたいＤＮＡ領域を、上述したようにｐＧＬＢベクター（プロメガ社製）  に導入する。その際に図６（ａ）に示すような、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインとＺＮＦ２１９タンパク質も発現するｐｃＤＮＡ３ベクターも同時に導入する。
【００７１】
各プラスミドはエフェクチントランスフェクション試薬（キアゲン社製）を用いて２９３細胞に導入した。  基本的に、細胞が、２４−ウェルプレートにおいて、約  ７０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅになった状態で、各ベクターを１００  ｎｇ  と内部標準ベクターであるウミシイタケルシフェラーゼ−ＳＶ４０  （ｐＲＬ−ＳＶ４０）  ベクター  ０．２  ｎｇ  をキアゲン社のプロトコルに従って、２９３細胞に導入した。すべてのプラスミドは、ミニ−プレップキット（キアゲン社製）を用いて、超純度精製してから導入に用いた。トランスフェクションしてから約３０  時間後にデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（商品名、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００７２】
トランスフェクションした細胞を  ＰＢＳ（−）（リン酸緩衝溶液；０．８％  ＮａＣｌ，  ０．０２％  ＫＣｌ，  ０．２９％  Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４）で２回洗浄し１００  μｌ  の  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  バッファー  を加えて  室温で１５  分振とうさせて細胞を破壊した。プレートに２０μｌの細胞懸濁液に１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（商品名、プロメガ社製）を加え発光量（ホタルルシフェラーゼ活性）を測定した後、１００μｌの１×Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬（商品名、プロメガ社製）を加え発光量（ウミシイタケルシフェラーゼ活性）を測定した。この測定は、フルオロスキャンアセントＦＬ  （ライフサイエンスインターナショナル社製）を用いて測定時間は１０秒で行った。アッセイプレートとしては９６ウェルＦｌａｔ  Ｂｏｔｏｍ，  Ｗｈｉｔｅ  （コースター社製）を用いた。各ウェルのプロモーター活性値は、ホタルルシフェラーゼ測定値をウミシイタケルシフェラーゼ測定値で除して得た。
【００７３】
ＺＮＦ２１９の転写抑制機能の証明と転写抑制ドメインの同定
図１１は、ＺＮＦ２１９タンパクのＨＭＧＮ１プロモーターに対する機能評価を示す図である。Ａは、発現ベクターに挿入されている配列を示し、Ｂは、それぞれの配列のときの活性測定値をコントロールベクターに対する相対値として示した。また、Ｂ中、黒塗りはＺＮＦ２１９タンパク１００ｎｇ添加したときの値を示す。
ｗｔの配列の結果から、ＺＮＦ２１９タンパクを２９３細胞において過剰に発現すると、ＨＭＧＮ１  遺伝子のプロモーター（−３４６〜＋１０１）がＺＮＦ２１９を発現しないときに比べて初めのプロモーター活性の約３０％ほどに減少することが明らかになった。
さらにこのＺＮＦ２１９の転写抑制効果を確認するため、Ｇｗｔ〜Ｇは、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合タンパク質と融合させたＺＮＦ２１９を細胞内で発現し、一方ＨＭＧＮ１遺伝子のプロモーター上流には、Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合部位を挿入して、ＺＮＦ２１９タンパクを強制的にＨＭＧＮ１遺伝子のプロモーターに接近させて、プロモーター活性の変化を調べた結果を示している。Ｇｗｔの配列の結果から明らかなように、さらなる抑制が観察され、初めのプロモーター活性はＺＮＦ２１９を発現しないときの約８％にまで抑制された。
また、ＺＮＦ２１９を断片化して、どのドメイン部分がこの転写抑制機構に関わっているかという構造的な解析を行った。ＺＮＦ２１９には上述したように、プロリンに富む領域があり、このドメインが特に転写の制御に関わっている可能性が高いと思われた。そこで、このドメインを含む領域と含まない領域とに断片化して、ＨＭＧＮ１遺伝子のプロモーター抑制効果を調べた（ＧＨ１〜ＧＨ４）。その結果、ＧＨ２の配列の結果から明らかなようにＺＮＦ２１９のプロリンに富む領域（１５４−３３４  アミノ酸残基）をＧａｌ４  ＤＮＡ結合タンパク質と融合させても、プロモーター活性がＺＮＦ２１９を発現しないときの約４０％に減少したことから、このプロリンに富むドメインが、転写抑制に関わっていることが示唆された。しかし、この領域だけでは全長ＺＮＦ２１９による抑制よりは弱いことや、この領域以外（２７３−７２２  アミノ酸残基）でもプロモーターの抑制効果が見られることからＧＨ１の配列の結果、このプロリンに富む領域だけが抑制に関わっているわけではないことがわかった。以上の結果から、ＺＮＦ２１９がＨＭＧＮ１  遺伝子のプロモーターに対して、抑制的に働くことが示唆された。
【００７４】
ウエスタンブロットによる発現の確認は以下のように行い、図１１Ｃはその結果を示している。
ＦＬＡＧタグ付きのＺＮＦ２１９発現ベクターを導入した２９３細胞中でこの融合タンパクの発現が正常に起こっていることを確認するため、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロティングを行った。
ＦＬＡＧ−ＺＮＦ２１９発現ベクター、ＦＬＡＧ−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＺＮＦ２１９、およびＦＬＡＧ−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＺＮＦ２１９の一部断片をエフェクチントランスフェクション試薬を用いて２９３細胞に導入した。なお、ネガティブコントロールとして何も組み込んでいない発現ベクターを、導入した細胞を用意した。
発現ベクター導入後、３７℃、５％ＣＯ２で３０時間培養した。
【００７５】
培養後の２９３細胞をＰＢＳで洗浄後、ラバーポリスマンを使って回収し、高塩濃度のバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  ４２０ｍＭ  ＮａＣｌ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁してから、凍結融解を５回繰り返して細胞を破砕した。遠心後、得られた上清を全細胞抽出液として以下の実験に用いた。得られた全細胞抽出液を６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ，  アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。
その後、１時間程ブロッキング液に浸してから、１５０００倍希釈した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  モノクローナル抗体（シグマ社製）と反応させた。未反応の抗体を洗浄液で洗い流し、７０００倍希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），  ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（プロメガ社製）と反応させた。再度、洗浄操作を行い、未反応の２次抗体を洗い流した後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色用基質（プロメガ社製）を用いて検出を行った。
【００７６】
その結果、インサートのない発現ベクターを導入した細胞の全細胞抽出液を泳動したレーンからはバンドは検出されなかった（データ不載）。このことから２９３細胞由来のタンパクと抗ＦＬＡＧ抗体の非特異的な反応は起こっていないことがわかる。一方、図１１Ｃから明らかなように、ＦＬＡＧ−ＺＮＦ２１９タンパク発現ベクターを導入した細胞の全細胞抽出液を泳動した結果からはおよそ大腸菌で発現、精製したバンドと同じ位置にバンドが検出された。ＦＬＡＧ−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＺＮＦ２１９、およびＦＬＡＧ−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＺＮＦ２１９の一部断片についても、それぞれのタンパクの大きさに合わせて、一つのバンドが確認できた。このことから、２９３細胞中で、それぞれ作製したベクターから、細胞内でＺＮＦ２１９タンパクが正常に発現されたことが確認できた。
【００７７】
ＨＭＧＮ１プロモーター配列断片に対するＺＮＦ２１９の結合の確認
図１２（Ａ）は、ＨＭＧＮ１プロモーター配列を示し、下線は本発明のタンパク質と結合が予想される配列を示す。図１２においてＧ５連続の配列はＣ５連続の配列と相補的であるので、ＨＭＧＮ１  プロモーターにはＺＮＦ２１９が結合すると予想される配列が多数存在する。このうち転写開始点に近い３つのＤＮＡ領域断片について、これらの配列を含む断片をプローブにして、ゲルシフトアッセイを行った。タンパクは完全長ＺＮＦ２１９を用いた。図１２（Ｂ）は用いた断片を示し、それぞれ（Ａ）中のＡ、Ｂ及びＣ部位と対応している。
図１３はＺＮＦ２１９がＨＭＧＮ１プロモーター配列に結合しているかどうかをゲルシフトによって確認した結果を示す。
図１３から明らかなように、３つの断片すべてでＺＮＦ２１９の結合が見られた。その強度はＡ断片で特に強かった。これは、図１２（Ｂ）について相補的配列で表わすと断片ＡがＣ５連続の右隣がＡであることや、またＣ５連続以上の配列を２コピー持つからではないかと思われる。これらの結果より、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の実験ではあるが、ゲルシフトによりＨＭＧＮ１プロモーター配列にＺＮＦ２１９タンパクが結合することが明らかとなった。
【００７８】
以上の結果から、配列番号１で表わされる、本発明のタンパク質は、一例としてＨＭＧＮ１遺伝子の発現を抑制することが分かり、転写制御因子であることが認識できた。したがって、本発明のタンパク質は、ＨＭＧＮ１タンパク質によるゲノム転写活性の過剰な向上に起因する発癌等の疾病を誘発する過剰な遺伝子発現を抑制するのに有用である。
また、本発明のタンパク質は、プロモーター領域にＣが５個以上連続した配列を有する遺伝子の発現を抑制するので、そのような配列と相補的な配列に結合する赤血球増殖因子による過剰な赤血球増殖の抑制、すなわち、赤血病の治療にも有用であることが期待される。
さらに、本発明の転写制御活性を有するタンパク質の製造方法に従って、上記タンパク質を効率よく発現・精製することが可能になった。
【００７９】
【発明の効果】
本発明の配列番号１で表される配列を有するタンパク質は、ＨＭＧＮ１遺伝子及びその他の遺伝子の発現を抑制する転写制御活性を有する。
また、本発明の転写制御活性を有するタンパク質の製造方法によれば、上記転写制御活性を有するタンパク質を大腸菌を用いて効率良く製造することができる。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、転写制御活性を有する目的のタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、ＺＮＦ２１９遺伝子の塩基配列（配列番号２）と図１で示したアミノ酸配列との相関を示す図である。
【図３】図３は、目的のタンパク質のニッケルキレート樹脂による精製法の概略を示す図である。
【図４】図４は、ランダムオリゴヌクレオチドセレクションの概略を示す図である。
【図５】図５は、本発明で用いた活性測定系の概略を示す図である。
【図６】図６（ａ）は、活性測定に用いた本発明のタンパク質発現ベクターの１例を示し、図６（ｂ）は、活性測定に用いたルシフェラーゼレポーターベクターを示す。
【図７】図７は、完全長ＺＮＦ２１９タンパク質が精製されたことを確認するために行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥ図を表す。
【図８】図８は、ランダムオリゴヌクレオチドセレクションによって単離された５連続以上のＣを含む塩基配列である。
【図９】図９は、最も頻度の高く認められたオリゴヌクレオチド（表１，  Ａ１）を基準としたＺＮＦ２１９タンパクと結合する塩基配列の同定のため、ゲルシフトアッセイによる結果を示す図である。
【図１０】図１０は、最も頻度の高く認められたオリゴヌクレオチド（表１，  Ａ１）を基準としたＺＮＦ２１９タンパクと結合する塩基配列の同定のため、ゲルシフトアッセイによる結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＺＮＦ２１９タンパクのＨＭＧＮ１プロモーターに対する機能評価を示す図である。
【図１２】図１２は、ＨＭＧＮ１プロモーター断片のゲルシフトアッセイの結果を示す図である。（Ａ）は、ＨＭＧＮ１プロモーターの塩基配列を示す。（Ｂ）は、ゲルシフトに用いたプローブの配列を示す。
【図１３】図１３は、ゲルシフトによる結合の確認の電気泳動図を示す。
【符号の説明】
１  ニッケルキレート樹脂
２  ６×Ｈｉｓタグの付いた組換えタンパク質
３  ６×Ｈｉｓタグ
４  グルタチオン樹脂
５  グルタチオン
６  ＧＳＴタグの付いた組換えタンパク質
７  ＧＳＴタグ
８  プロモーター領域をＰＣＲで増幅したもの
９  ホタルルシフェラーゼを含むｐＧＬＢベクター
１０  ウミシイタケルシフェラーゼを含む内部標準ベクター
１１  目的のタンパクをコードする配列を挿入した発現ベクター
１２  目的のタンパク高発現株
１３  非挿入発現ベクター
１４  目的のタンパクを発現していない株
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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