(57)【要約】【課題】  微生物を用いて光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールを高光学純度で効率的に製造する方法を提供する。【解決手段】  1-ベンジル-3-ピロリジノンにヤマダジマ（Yamadazyma）属、コンドア（Kondoa）属、クライシア（Kuraishia）属、ゴルドニア（Gordonia）属、アプシジア（Absidia）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ジオバチラス（Geobacillus）属、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属に属する微生物、またはロドトルラ（Rhodotorula）属、ジオトリカム（Geotrichum）属、ピライラ（Pilaira）属、キャンディダ(Candida)属に属する微生物を作用させ、精製する光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールを採取する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマダジマ（Yamadazyma）属、コンドア（Kondoa）属、クライシア（Kuraishia）属、ゴルドニア（Gordonia）属、アプシジア（Absidia）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ジオバチラス（Geobacillus）属、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属またはベイジェリンキア（Beijerinckia）属に属し、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する能力を有する微生物またはその処理物を1-ベンジル-3-ピロリジノンに作用させ、生成する(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを採取することを特徴とする(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールの製造方法。
【請求項２】
ロドトルラ（Rhodotorula）属、ジオトリカム（Geotrichum）属、ピライラ（Pilaira）属、またはキャンディダ(Candida)属に属し、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する能力を有する微生物またはその処理物を1-ベンジル-3-ピロリジノンに作用させ、生成する(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを採取することを特徴とする(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールの製造方法。
【請求項３】
ヤマダジマ（Yamadazyma）属に属する微生物がヤマダジマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）またはヤマダジマ・スティピティス（Yamadazyma stipitis）、コンドア（Kondoa）属に属する微生物がコンドア・マルビネル（Kondoa malvinell）、クライシア（Kuraishia）に属する微生物がクライシア・キャプスラタ（Kuraishia capsulata）、ゴルドニア（Gordonia）属に属する微生物がゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Gordonia rubripertincta）、アプシジア（Absidia）属に属する微生物がアプシジア・ラモサ（Absidia ramosa）、カニングハメラ（Cunninghamella）属に属する微生物がカニングハメラ・エキヌラータ（Cunninghamella echinulata）、ジオバチラス（Geobacillus）属に属する微生物がジオバシラス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属に属する微生物がベンジャミニエラ・ポイトラシ（Benjaminiella poitrasii）、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属に属する微生物がベイジェリンキア・インディカ サブエスピー・インディカ（Beijerinckia indica subsp. Indica）である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物が、ロドトルラ・インゲニオサ（Rhodotorula ingeniosa）、ロドトルラ・ジャバニカ（Rhodotorula javanica）、ロドトルラ・クレゾリカ（Rhodotorula cresolica）、ジオトリカム（Geotrichum）属に属する微生物が、ジオトリカム・キャピタタム（Geotrichum capitatum）、ピライラ（Pilaira）属に属する微生物が、ピライラ・アノマラ（Pilaira anomala）、キャンディダ(Candida)属に属する微生物が、キャンディダ・マリス（Candida maris）である請求項２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールの微生物を用いた効率的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールは抗生物質、ジヒドロピリジン系化合物など医薬品の原料として有用な化合物である。酵素および微生物菌体など用いる光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールの生化学的製造方法としては、リパーゼ、エステラーゼなどを用いて光学分割する方法が知られている（例えば特許文献１、特許文献２参照）。
【０００３】
光学分割の場合、原理上目的物の収率は50％以下であり、効率的なラセミ化法がないと安価に製造できないうえに、リパーゼあるいは光学活性マンデル酸などの分割剤も高価であり、容易に再使用できないと安価に出来ない問題点がある。
また、1-ベンジル-3-ピロリジノンを酵素あるいは微生物で不斉還元する方法も知られている（例えば特許文献３、特許文献４参照）。(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールに関しては得られる生成物の光学純度は非常に高いものの、通常反応液中の濃度が低く分離・精製が難しい問題点が挙げられる。また、(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールに関しては、これを生成する微生物自体がほとんど見当たらない。
【０００４】
特許文献５では (S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールの製造方法においては遺伝子組換え大腸菌による生成物濃度を高めた方法も記載されている。しかし、これらの方法でも、菌体を破砕した無細胞抽出液の使用、グルコース脱水素酵素の大量添加、高価なNADP+を加えての反応など、工業的に実施困難な点がある。また菌体そのものを使用した実施例も記載されているが、先と同じく高価なNADP+を添加している問題があり、使用した還元酵素活性、菌体の濃度が明確にされていないなど、記載に曖昧な点も見られる。
【０００５】
また、1-ベンジルピロリジンを微生物を用いて水酸化する方法も知られている（例えば非特許文献１、非特許文献２参照）。しかしこの方法は、生成物の光学純度は60％ｅｅ程度と低く、また、蓄積濃度も0.1％程度と低いなど実用レベルからは遠い。このように、光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールの実用的な製造方法は未だ確立されていない状況である。
【特許文献１】特開平５−２２７９９１号公報
【特許文献２】特開平１−１４１６００号公報
【特許文献３】特開平６−１４１８７６号公報
【特許文献４】特開平１０−１５０９９８号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ０２／１０３９９号パンフレット
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  オーガニック  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、  ６６（２５）、  ８４２４−８４３０（２００１）
【非特許文献２】テトラヘドロン  アシンメトリー（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）、  １０（７）、  １３２３−１３３３（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、これまで知られていない属の微生物により簡便かつ安価に光学活性1-ベンジル-3-ピロリジノールを高光学純度で製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討した結果、従来1-ベンジル-3-ピロリジノンより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成することが知られていなかったヤマダジマ（Yamadazyma）属、コンドア（Kondoa）属、クライシア（Kuraishia）属、ゴルドニア（Gordonia）属、アプシジア（Absidia）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ジオバチラス（Geobacillus）属、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属に属する微生物が、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成すること、およびロドトルラ（Rhodotorula）属、ジオトリカム（Geotrichum）属、ピライラ（Pilaira）属、キャンディダ(Candida)属に属する微生物が1-ベンジル-3-ピロリジノンより(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち本発明は、
ヤマダジマ（Yamadazyma）属、コンドア（Kondoa）属、クライシア（Kuraishia）属、ゴルドニア（Gordonia）属、アプシジア（Absidia）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ジオバチラス（Geobacillus）属、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属またはベイジェリンキア（Beijerinckia）属に属し、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する能力を有する微生物の菌体あるいはその処理物を1-ベンジル-3-ピロリジノンに作用させ、生成する(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを採取することを特徴とする(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールの製造方法、
及びロドトルラ（Rhodotorula）属、ジオトリカム（Geotrichum）属、ピライラ（Pilaira）属、またはキャンディダ(Candida)属に属し、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する能力を有する微生物の菌体あるいはその処理物を1-ベンジル-3-ピロリジノンに作用させ、生成する(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを採取することを特徴とする(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールの製造方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によればヤマダジマ（Yamadazyma）属、コンドア（Kondoa）属、クライシア（Kuraishia）属、ゴルドニア（Gordonia）属、アプシジア（Absidia）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ジオバチラス（Geobacillus）属、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属に属する微生物を1-ベンジル-3-ピロリジノンに作用させることにより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ジオトリカム（Geotrichum）属、ピライラ（Pilaira）属、キャンディダ(Candida)属に属しする微生物を、1-ベンジル-3-ピロリジノンに作用させることにより、 (R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを容易に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で使用する微生物は、(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノール製造に関しては、ヤマダジマ（Yamadazyma）属、コンドア（Kondoa）属、クライシア（Kuraishia）属、ゴルドニア（Gordonia）属、アプシジア（Absidia）属、カニングハメラ（Cunninghamella）属、ジオバチラス（Geobacillus）属、ベンジャミニエラ（Benjaminiella）属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属からなる群に属し、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する能力を有する微生物である。また、(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノール製造に関しては、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ジオトリカム（Geotrichum）属、ピライラ（Pilaira）属、キャンディダ(Candida)属からなる群に属し、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する能力を有する微生物を用いる。
【００１１】
なお、ロドトルラ属、キャンディダ属微生物については特開平6-141876号公報において、それぞれロドトルラ・ルブラ、キャンディダ・オレオフィラを用いて1-ベンジル-3-ピロリジノンより(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを製造する方法が開示されているが、本発明者らは注意深く検討した結果、ロドトルラ属およびキャンディダ属微生物に(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生産する微生物をも新たに見出した。
【００１２】
具体的には、(S)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する微生物としてヤマダジマ・ファリノサ（Yamadazyma farinosa）IFO 1163、IFO 0193、ヤマダジマ・スティピティス（Yamadazyma stipitis）IFO 1687、コンドア・マルビネル（Kondoa malvinell）IFO 1936、クライシア・キャプスラタ（Kuraishia capsulata）IFO 0721、ゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Gordonia rubripertincta）JCM 3199、アプシジア・ラモサ（Absidia ramosa）IFO 8083、カニングハメラ・エキヌラータ（Cunninghamella echinulata）CBS 134.27、ジオバシラス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）IFO 12550、ベンジャミニエラ・ポイトラシ（Benjaminiella poitrasii）CBS 158.60、ベイジェリンキア・インディカ サブエスピー・インディカ（Beijerinckia indica subsp. Indica）IFO 3744等を挙げることができる。また、1-ベンジル-3-ピロリジノンより(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを生成する微生物としてロドトルラ・インゲニオサ（Rhodotorula ingeniosa）IFO 10002、ロドトルラ・ジャバニカ（Rhodotorula javanica） IFO 10285、ロドトルラ・クレゾリカ（Rhodotorula cresolica）JCM 10955、ジオトリカム・キャピタタム（Geotrichum capitatum）JCM 3908、ピライラ・アノマラ（Pilaira anomala）DSM 2083、キャンディダ・マリス（Candida maris）IFO 10003等を挙げることができる。これらの微生物は、野生株、変異株、または、細胞融合、もしくは遺伝子操作などの遺伝的手法より誘導される組換え株など、いずれの株も好適に用いることができる。
IFO番号の付された微生物は、財団法人・発酵研究所発行の微生物カタログ第11版（2000年）に記載されており、現在生物遺伝資源センター（NBRC）より入手することができる。JCM番号の付された微生物は、理化学研究所発行の菌株カタログ第8版（2002年）に記載されており、同研究所より入手することができる。CBS番号の付された微生物はセントラルビューロ・フォア・シメンカルチャーズ（Centraalbureau voor Schimmelcultures）発行のカタログ第35版（2001年）に記載されており、同機関より入手することができる。DSM番号の付された微生物はドイチェ・サムルング・フォン・ミクロオルガスメン・ウント・ツェルクルツーレン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）発行のカタログ第7版（2001）に記載されており、同機関より入手することができる。
【００１３】
本発明に用いる微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限はない。例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、ソルビトール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、トルエン、クレゾール、安息香酸などあるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００１４】
窒素源としては例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿素、などの無機有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。また、必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、あるいは培地のpH保持に有効なCaCO3などの物質も添加できる。
【００１５】
培養方法としては、培地pHは3〜11、好ましくは4〜8、培養温度は15〜60℃、好ましくは20〜45℃で、嫌気的あるいは好気的に、その微生物の生育に適した条件下5〜240時間、好ましくは12〜120時間程度培養する。
基質である1-ベンジル-3-ピロリジノンは酵素の基質阻害が起らない濃度範囲で、一括あるいは間欠的に、あるいは連続して添加すればよく、通常0.01から20％（wt/wt）程度添加する。基質は、そのまま水に溶解あるいは分散して、または水に溶解あるいは反応に影響を与えないような有機溶媒に溶解したり、界面活性剤などに分散させたりして添加すればよい。微生物の利用形態としては、1)培地に最初から基質を添加しておき、培養する方法、2)培養液をそのまま用い、該培養液に1-ベンジル-3-ピロリジノンを添加する方法、3)遠心分離などにより菌体を分離し、これをそのまま、あるいは洗浄した後、緩衝液、水などに再懸濁したものに、1-ベンジル-3-ピロリジノンを添加し、反応させる方法などがある。
【００１６】
また、菌体は生菌体のままでもよいし、菌体破砕物、アセトン処理、トルエン処理、凍結乾燥などの処理を施したものでもよい。微生物菌体はカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、セルロース、寒天などに公知の方法で固定化して行うことも可能であり、限外ろ過膜などを用いて反応器中で反応させることもできる。また、酵素還元反応に必要なNAD+やNADP+などの補酵素を添加することもできる。さらにその補酵素を還元型に再生するためにグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼなどを添加することもできる。
【００１７】
反応温度は5〜70℃、望ましくは15〜60℃で反応させる。反応pHは酵素が反応する範囲で適宜選択すればよいが、通常pH4〜10、望ましくはpH5〜8で緩衝液中あるいはpHスタットを用いて行う。反応は静置あるいは振とう、攪拌いずれでも行うことができる。反応に用いる溶媒は通常水であるが、反応に影響を与えない範囲でアルコールなどの有機溶媒を加えることができる。生成した1-ベンジル-3-ピロリジノールは限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽出、活性炭処理、蒸留など通常の方法を組み合せることで回収、精製できる。
【実施例】
【００１８】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。以下、実施例中では1-ベンジル-3-ピロリジノンはPNB、1-ベンジル-3-ピロリジノールはPOBと略す。本発明におけるPNB、POBの定量及び光学純度の測定は，以下の条件での高速液体クロマトグラフィーにより行った。
（PNB、POBの定量）
カラム：Luna 5u C18, φ2.0mm×150mm（フェノメネックス（phenomenex）社）
移動相：40mM リン酸緩衝液pH2.5/アセトニトリル[9:1]
（5mMヘキサンスルホン酸ナトリウムを含む）
カラム温度：40℃
流速：0.2ミリリットル/min
検出：254nm
保持時間：PNB 12.1分、POB 12.8分
（POB光学純度の測定）
カラム：キラルセル（Chiralcel）OB-H（ダイセル化学製）, φ4.6mm×250mm
移動相：n-ヘキサン/2-プロパノール/ジエチルアミン[960:40:1]
カラム温度：40℃
流速：1.0ミリリットル/min
検出：254nm
保持時間：R体 6.8分、S体 9.2分
また、以下の実施例で用いた菌体調製用培地の組成は以下の通りである。
（培地A）
グルコース10g、
酵母エキス（極東製薬）3g、
麦芽エキス（極東製薬）3g、
ポリペプトン（日本製薬）5g
を混合し、脱イオン水を加えて溶解し総容量1000ミリリットルとし、pH6.0に合わせる。
（培地B）
エールリッヒの肉エキス（ディフコ）5g、
ポリペプトン（日本製薬）3g、
塩化ナトリウム10g
を混合し、脱イオン水を加えて溶解し総容量1000ミリリットルとし、pH7.2に合わせる。
【００１９】
実施例1
表1に示した菌株のうち1)〜8)は培地A、9)〜11)は培地Bをφ21mmの試験管にそれぞれ5ミリリットル入れ、121℃、20分間殺菌後、保存スラントより一白金耳植菌し、24℃で24〜72時間振とう培養を行った。それぞれの培養液500マイクロリットルより遠心分離した菌体に下記組成の反応液500マイクロリットルを添加し、菌体を懸濁、25℃にて24時間振盪反応を行った。
（反応液組成）
PNB 50mM
NAD+ 0.1mM
NADP+ 0.1mM
グルコース
グルコースデヒドロゲナーゼ 1U/ミリリットル
50mM カリウム リン酸緩衝液,pH8.0
反応終了後、遠心分離により上清を分離し、上清を高速液体クロマトグラフィーにて分析し、POBの生成量を測定した。また、上清0.5ミリリットルに対し酢酸エチル2.0ミリリットルでPOBを抽出し、酢酸エチル層を分離、減圧下に酢酸エチルを留去した。残渣を高速液体クロマトグラフィーの移動相（n-ヘキサン/2-プロパノール/ジエチルアミン[960:40:1]）に溶かし、光学純度を測定した。結果を表1に示した。
【００２０】
【表１】
2005117905.tif 000002
【００２１】
実施例２
培地Aをそれぞれ5ミリリットルずつφ21mmの試験管に入れ、殺菌後、表2に示す12)〜17)の菌株を一白金耳植菌し、24℃で48〜72時間振とう培養を行った。実施例1と同様にして凍結乾燥菌体を調製し、同様に反応、分析を行った。結果を表2に示した。
【００２２】
【表２】
2005117905.tif 000003
【００２３】
実施例３
ヤマダジマ・ファリノサ(Yamadazyma farinosa) IFO 1163株を培地B50ミリリットルを入れたヒダ付き三角フラスコで25℃、48時間振盪し、前培養を行った。培地D1200ミリリットルを丸菱バイオエンジ製MDL-200型2.0L容ミニジャーに入れ、121℃、20分間滅菌後冷却した培地に、前述の培養液12ミリリットルを植菌し、600回転、25℃、0.5vvmで通気しながら48時間培養を行った。培養終了後、培養液全量を遠心分離にて菌体を集め、脱イオン水に懸濁し、1200ミリリットルとした。
これにグルコース20gを添加後、PNBを3時間まで2g/hr、3時間から1g/hrの速度で、合計12gを連続添加しながらpHを7.0に調整しつつ、25℃、24時間、300rpmで反応を行った。反応終了後、反応液中にはPOBが9.7g/リットル生成していた。反応終了後、遠心分離にて菌体を除去し、上清を分離した。次いで、1200ミリリットルの酢酸エチルで2回抽出し、有機層を集め、減圧下に濃縮し、粗(S)-POB 9.4gを得た。化学純度81％、光学純度99％ｅｅ、一貫収率62.7％。
【００２４】
実施例４
ジオトリカム・キャピタータム(Geotrichum capitatum) JCM 3908株を培地B50ミリリットルを入れたヒダ付き三角フラスコで25℃、48時間振盪し、前培養を行った。培地D1200ミリリットルを丸菱バイオエンジ製MDL-200型2.0L容ミニジャーに入れ、121℃、20分間滅菌後冷却した培地に、前述の前培養液12ミリリットルを植菌し、600回転、25℃、0.5vvmで通気しながら48時間培養を行った。培養終了後、培養液全量を遠心分離にて菌体を集め、脱イオン水に懸濁し、1200ミリリットルとした。
これにグルコース20gを添加後、PNBを4時間まで2g/hr、4時間から1g/hrの速度で、合計12gを連続添加しながらpHを7.0に調整しつつ、25℃、24時間、300rpmで反応を行った。反応終了後、反応液中にはPOBが 9.2g/リットル生成していた。反応終了後、遠心分離にて菌体を除去し、上清を分離した。次いで、1200ミリリットルの酢酸エチルで2回抽出し、有機層を集め、減圧下に濃縮し、粗(R)-POB 8.3gを得た。化学純度85％、光学純度R 99％、一貫収率58.1％。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によれば、1-ベンジル-3-ピロリジノンを出発物質として、抗生物質、ジヒドロピリジン系化合物など医薬品原料として重要な(R)-1-ベンジル-3-ピロリジノールを容易に得ることが可能になる。