(57)【要約】【課題】ホットスタートプロトコルを容易にし、同時にリアルタイム検出を可能にするために、代替の経済的なリアルタイムPCRの方法を提供すること。【解決手段】−標的核酸を、    −熱安定DNAポリメラーゼ、    −熱安定二本鎖依存性熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ、    −増幅プライマー対、    −デオキシヌクレオシド三リン酸、および    −適切な波長の光で励起される場合、蛍光レポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光レポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチドの存在下でリアルタイムPCR増幅反応に供する工程、ならびに−少なくとも複数の増幅サイクルの後に該蛍光レポーター実体の蛍光をモニターする工程を含む、標的核酸を増幅および検出するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−標的核酸を、
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対、
−デオキシヌクレオシド三リン酸、および
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
の存在下でリアルタイムPCR増幅反応に供する工程、ならびに
−少なくとも複数の増幅サイクルの後に該蛍光リポーター実体の蛍光をモニターする工程
を含む、標的核酸を増幅および検出するための方法。
【請求項２】
リポーター実体が検出用オリゴヌクレオチドの3'末端にある、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
検出用オリゴヌクレオチドが増幅プライマー対の１つのメンバーと同一である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、ならびに
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端のいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
を含む、標的核酸を増幅および検出するための組成物または試薬混合物。
【請求項６】
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対、ならびに
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、一方の標識が該オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ
を含む、標的核酸配列を増幅および検出するためのキット。
【請求項７】
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、および
−増幅プライマー対であって、該増幅プライマーのうちの一つが検出用オリゴヌクレオチドとして役立ち、該検出用オリゴヌクレオチドが、適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有し、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、増幅プライマー対
を含む、標的核酸配列を増幅および検出するためのキット。
【請求項８】
適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部に結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムPCRの分野に関する。より具体的には、本発明は、リアルタイムPCRのための新しい方法を提供し、適切に標識された蛍光性ハイブリダイゼーションプローブを、ホットスタートPCR効果を提供する特定の化学作用とともに用いるハイブリダイゼーションによって標的DNAの増幅がモニターされることを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNAの増幅は分子生物学にとって基礎的な技術である。PCRによる核酸解析は、試料調製、増幅および産物解析を必要とする。通常、これらの工程は逐次行なわれるが、増幅および解析は同時に行なわれ得る。DNA染料または蛍光性プローブを増幅前にPCR混合物に添加することができ、増幅中にPCR産物を解析するために使用することができる。試料解析は同じ機器内の同じチューブ内で増幅と同時に行なわれる。この組み合わせアプローチは、さらなる解析のために密閉容器から試料を取り出す必要がないため、試料の取り扱いを減らし、時間を節約し、後続の反応での産物汚染の危険性を大いに低下させる。増幅を産物解析と組み合わせる概念は「リアルタイム」PCRとして公知になっている。例えば、特許文献１を参照のこと。
【０００３】
リアルタイムPCR検出形式
動力学的リアルタイムPCRでは、PCR産物の形成はPCRの各サイクルにおいてモニターされる。通常、増幅は、増幅反応中の蛍光シグナルを測定するための追加装置を有するサーモサイクラーにおいて測定される。
【０００４】
a)  DNA結合染料フォーメート(formate)
二本鎖増幅産物の量は、通常、解析対象試料中にもともと存在する核酸の量を超えるので、適切な波長で励起されると二本鎖DNAに結合した場合にのみ増強された蛍光を示す二本鎖DNA特異的染料を使用し得る。好ましくは、SybrGreenI Iのような、例えば、PCR反応の効率に影響しない染料だけ使用し得る。
【０００５】
当該技術分野で公知の他のすべてのフォメート(fomate)は、標的核酸に結合した場合にのみ蛍光を発する蛍光性標識ハイブリダイゼーションプローブの設計を必要とする。
【０００６】
b)  分子ビーコン
また、これらのハイブリダイゼーションプローブは第１成分およびクエンチャーで標識され、標識は、好ましくは、プローブの両端に配置される。プローブの二次構造の結果、両成分は溶液中で空間的に近接する。標的核酸へのハイブリダイゼーション後、両成分は互いに分離され、適切な波長の光で励起された後に第１成分の蛍光発光が測定され得る(特許文献２)。
【０００７】
c)  FRETハイブリダイゼーションプローブ
FRETハイブリダイゼーションプローブ試験形式は、あらゆる種類の相同ハイブリダイゼーションアッセイ(非特許文献１)に特に有用である。それは、同時に使用され、かつ増幅標的核酸の同じ鎖の近接する部位に相補的である2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを特徴とする。両プローブは異なる蛍光性成分で標識される。適切な波長の光で励起すると、第１成分は、蛍光共鳴エネルギー移転の原理にしたがって吸収したエネルギーを第２成分に移転させ、その結果、両ハイブリダイゼーションプローブは検出対象の標的分子の隣接位置に結合した場合に第２成分の蛍光発光が測定され得る。FRETアクセプター成分の蛍光の増加をモニターする代わりに、ハイブリダイゼーション事象の定量的測定としてFRETドナー成分の蛍光の減少をモニターすることも可能である。
【０００８】
特にFRETハイブリダイゼーションプローブ形式は、増幅された標的DNAを検出するためにリアルタイムPCRにおいて使用され得る。リアルタイムPCRの技術分野で公知のすべての検出形式の中で、FRET-ハイブリダイゼーションプローブ形式は、非常に感度が高く、正確で、信頼性があることがわかっている(特許文献３；特許文献４；特許文献５)。２つのFRETハイブリダイゼーションプローブの使用の代わりとして、蛍光標識プライマーと標識オリゴヌクレオチドプローブ１つだけとを使用することも可能である(非特許文献２)。この点に関し、プライマーをFRETドナーで標識するかFRETアクセプター化合物で標識するかは任意に選択し得る。
【０００９】
d)  単一標識プローブ(SLP)形式
この検出形式は、単一の蛍光性染料により5'-または3'-末端のいずれかが標識された単一オリゴヌクレオチドから構成される(特許文献６)。オリゴ標識には２つの異なる計画: G-消光プローブおよびニトロインドール-脱消光(Dequenching)プローブが使用され得る。G-消光態様では、蛍光性染料をオリゴ5'-または3'-末端のCに結合する。２つのGがCと反対側の標的鎖および相補オリゴヌクレオチドプローブから離れた１位に位置する場合、プローブが標的にハイブリダイズすると蛍光が有意に減少する。ニトロインドール脱消光態様では、蛍光性染料を、オリゴヌクレオチドの5'-または3'-末端のニトロインドールに結合する。ニトロインドールは、遊離プローブの蛍光シグナル伝達をいくぶん減少させる。脱消光効果により、プローブが標的DNAにハイブリダイズすると蛍光が増加する。
【００１０】
e)  TaqManプローブ
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは２つの成分で標識される。第１成分を適切な波長の光で励起すると、蛍光共鳴エネルギー移転の原理にしたがって、吸収されたエネルギーは、いわゆるクエンチャーである第２成分に移転される。PCR反応のアニーリング工程中、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、後続の伸長段階でTaq ポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性により分解される。その結果、励起された蛍光性成分およびクエンチャーは、空間的に互いに分離され、したがって第１成分の蛍光発光が測定され得る。TaqManプローブアッセイは、特許文献７、特許文献８および特許文献９に詳細に開示されている。TaqManハイブリダイゼーションプローブおよび試薬混合物は、特許文献１０に開示されている。
【００１１】
f)  放出形式
さらに、対立遺伝子特異的検出に限定された２つの他の形式が最近開示され、これらは、その標的核酸への結合に関する対合または誤対合状態による標識3'末端ヌクレオチドの放出の特異的検出の原理に基づくものである。特許文献１１には、標的配列とプローブとの間で完全な対合が起こると、ハイブリダイゼーションプローブの3'末端ヌクレオチドが解重合酵素により放出されることを特徴とする方法が開示されている。同様に、特許文献１２には、リポーターおよびクエンチャー部分で標識されたプライマーであって、このプライマーと増幅標的との間で完全な対合が起こらない場合は3'-5'プルーフリーディング活性により一方の部分が除去されることを特徴とするプライマーを使用することが示唆されている。
【００１２】
PCR酵素学
インビトロ核酸合成は、通常、DNAポリメラーゼを追加のポリペプチドとともに、またはなしで用いて行なわれる。DNAポリメラーゼは、DNAの複製および修復に関与する酵素の一ファミリーである。大腸菌などの中温性微生物からのDNAポリメラーゼの単離に関して広く研究が行なわれている。例えば、非特許文献３および非特許文献４を参照のこと。
【００１３】
Thermus aquaticusなどの好熱菌からのDNAポリメラーゼの単離および精製に関する研究もまた行なわれている。非特許文献５には、Thermus aquaticus YT1株から至適温度80℃でのDNAポリメラーゼの単離および精製が開示されている。特許文献１３には、T. aquaticus由来の精製熱安定性DNAポリメラーゼである、約86,000〜90,000ダルトンの分子量を有するTaq ポリメラーゼが開示されている。また、特許文献１４には、PCRプロセスで使用に好ましい酵素としてのTaq ポリメラーゼが開示されている。
【００１４】
研究により、Taq DNAポリメラーゼは5'-3'ポリメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機能を有するのに対し、Taq DNAポリメラーゼは3'-5'エキソヌクレアーゼ機能を有しないことが示された（非特許文献６；非特許文献７）。DNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性は、通例「プルーフリーディング活性」と呼ばれる。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性により、プライマー-鋳型二本鎖の3'端でミスマッチしている塩基が除去される。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性の存在により、核酸鎖の複製の忠実度の上昇が導かれ、早くに終結した産物の伸長が導かれるので、有利であり得る。Taq DNAポリメラーゼはミスマッチしているプライマー末端を除去することができないので、塩基の取り込みエラーを起こしやすく、特定の応用での使用を好ましくないものにする。例えば、増幅した遺伝子をクローニングしようとすることは、遺伝子のコピーのいずれかがランダムな取り込み間違い事象によるエラーを含み得るために、不確かである。エラーの起こるサイクル（例えば早期複製サイクルで）に従って、複製されたDNA全体は、誤って取り込まれた塩基を含み得、そのため、変異遺伝子産物の元となる。
【００１５】
高忠実度DNA増幅に用いられる好熱性古細菌由来のB-型ポリメラーゼのような、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す当該分野で公知の熱安定性DNAポリメラーゼがいくつかある。3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示す熱安定性ポリメラーゼは、Pyrococcusから（Purified thermostable Pyrococcus furiosus DNA polymerase, Mathur E., Stratagene、特許文献１５、特許文献１６；Purified thermostable DNA polymerase from Pyrococcus species, Comb D. G.ら, New England Biolabs, Inc., 特許文献１７；Organization and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus, 非特許文献８）、Pyrodictium種から（Thermostable nucleic acid polymerase, Gelfand D. H., F. Hoffmann-La Roche AG, 特許文献１８；Purified thermostable nucleic acid polymerase and DNA coding sequences from Pyrodictium species, Gelfand D. H., Hoffmann-La Roche Inc., 特許文献１９）、Thermococcusから（例えばThermostable DNA polymerase from Thermococcus spec. TY, Niehaus F.ら特許文献２０；Purified Thermocccus barossii DNA polymerase, Luhm R. A., Pharmacia Biotech, Inc., 特許文献２１；DNA polymerase from Thermococcus barossii with intermediate exonuclease activity and better long term stability at high temperature, useful for DNA sequencing, PCR etc., Dhennezel O. B., Pharmacia Biotech Inc.、特許文献２１；A purified thermostable DNA polymerase from Thermococcus litoralis for use in DNA manipulations, Comb D. G., New England Biolabs, Inc., 特許文献２２、特許文献２３；Recombinant thermostable DNA polymerase from Archaebacteria, Comb D. G., New England Biolabs, Inc., 特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６；New isolated thermostable DNA polymerase obtained from Thermococcus gorgonarius, Angerer B.らBoehringer Mannheim GmbH, 特許文献２７）単離またはクローニングされ得る。
【００１６】
高い処理能力およびさらなるプルーフリーディング活性を有するPCR反応を始める一つの可能性は、Taqポリメラーゼおよび熱安定性の高い鋳型依存性エキソヌクレアーゼの混合である。この文脈では、特許文献２８は、Archaeoglobus fulgidusから得ることができ、二本鎖DNA中で、プライマーまたはポリヌクレオチドの、ミスマッチしている末端の3'から5'方向への分解を触媒する熱安定性酵素を開示している。Archaeoglobus fulgidusから得ることができる熱安定性エキソヌクレアーゼIIIをコードする遺伝子(Afu)がクローニングされ、大腸菌中で発現され、単離された。この酵素は、PCR反応で用いられる培養および温度条件下で活性がある。この酵素は、低いエラー率でDNA合成を行う際およびゲノムDNA上の3 kbより大きい産物−Taqポリメラーゼによって合成される産物の範囲の上の方−を反応混合物中のdUTPの存在ありまたはなしで良好な収量で合成する際にTaqのようなDNAポリメラーゼを助ける。好ましくは、最適なPCR性能を有するために、Taqポリメラーゼ2,5 UごとにAfuから得ることができるエキソヌクレアーゼIII 50〜500 ngが用いられた。さらに好ましくは、PCR反応におけるTaqポリメラーゼ2,5 UごとにAfuから得ることができるエキソヌクレアーゼIII67 ng〜380 ngの使用である。
【００１７】
ホットスタートPCR
核酸増幅、およびより具体的にはPCRにおける別の主な問題は、非特異的な増幅産物を生み出すことである。周囲温度では熱安定性DNAポリメラーゼもまた中程度に活性があるので、多くの場合、これは実際のサーモサイクリング手順自体に先立つ非特異的なオリゴヌクレオチドプライミングおよびそれに続くプライマー伸長事象による。例えば、最後に偶然起こるプライマー二量体化およびそれに続く伸長による増幅産物が、しばしば観察される。この問題を克服するために、当該分野ではいわゆる「ホットスタート」PCRを行うことが周知であり、増幅反応に欠かせない一つの成分が、反応混合物から分離されるか、または反応混合物の温度が初めて上がるまで非活性状態で保たれるかのいずれである。ポリメラーゼはこのような条件下で機能することができないので、プライマーが非特異的に結合し得る期間の間はプライマー伸長がない。この効果を得るために、いくつかの方法が利用されている。
【００１８】
a)  DNAポリメラーゼの物理的分離
物理的な分離は、例えばDNAポリメラーゼを含む区画を大部分の他の試薬を含む区画から分離する固形ワックスの障壁によって得ることができる。最初の加熱工程の間に、次いでワックスは自動的に融解し、液状の区画が混合される（非特許文献９）。あるいは、増幅反応に先立ってDNAポリメラーゼは親和性によって固相支持体に固定され、熱媒介放出によってのみ反応混合物中に放出される（非特許文献１０）。しかしながら、どちらの方法も時間がかかり、実施するのに不便である。
【００１９】
b)  DNAポリメラーゼの化学的修飾
このタイプのホットスタートPCRにおいて、DNAポリメラーゼは、化学的修飾によって可逆的に不活性化される。より正確には、熱不安定ブロッキング基が、Taq DNAポリメラーゼに導入され、室温で酵素を不活性化する。これらのブロッキング基は、酵素が活性化になるように、pre-PCR工程中に高温で除去される。かかる熱不安定修飾は、例えばシトラコン酸無水物またはアコニット酸無水物（Aconitric Anhydride）を、酵素のリジン残基に結合させることで得ることができる（特許文献２９）。一方、かかる修飾を有する酵素は、Amplitaq Gold (非特許文献１１)またはFastStart DNAポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals）として市販されている。しかしながら、ブロッキング基の導入は、酵素のすべての立体的に利用可能なリジン残基上に任意に起こる化学反応である。したがって、化学的に修飾された酵素調製の再現性および質は変化し得、ほとんど制御できない。
【００２０】
c)  核酸添加によるDNAポリメラーゼ阻害
非特異的にアニールしたプライマーの伸長は、短い二本鎖DNA断片を添加することで阻害されることが示されている（非特許文献１２）。この場合プライマー伸長は、短い二本鎖DNA断片の融点を下回る温度で阻害されるが、競争的DNA自体の配列からは独立している。しかしながら、競争的DNAの過剰により核酸増幅反応の収率にどの程度まで影響するかは知られていない。あるいは、規定された二次構造を生じる特異的配列を有するオリゴヌクレオチドアプタマーが用いられ得る。かかるアプタマーは、SELEX技術を用いて、DNAポリメラーゼに対する極めて高い親和性によって選択された（特許文献３０）、（非特許文献１３）。実際のサーモサイクリング工程自体の前の増幅混合物中のかかるアプタマーの存在により、再びDNAポリメラーゼへの親和性の高い結合を生じ、結果としてその活性の熱不安定阻害が生じる。しかしながら、選択工程によって、今までのところ入手できるすべてのアプタマーは、一つの特定の種類のDNAポリメラーゼと組み合わせてのみ用いられ得る。
【００２１】
d)  Taq DNA抗体
Taq DNAポリメラーゼの熱不安定阻害を達成する代替のアプローチは、精製された酵素に対して惹起されたモノクローナル抗体の添加である（非特許文献１４；非特許文献１５）。オリゴヌクレオチドアプタマーのように、抗体は、周囲温度で、高い親和性でTaq DNAポリメラーゼに阻害様式で結合する。複合体は、サーモサイクル工程自体の前の加熱前工程で溶解する。これによって、増幅にかかる実質的な時間が全体として、特に高速サーモサイクリングのプロトコールが用いられた場合、延長される（特許文献３１）。特許文献３２は、非特異的プライマー二量体の中間体を消化するためにTaqポリメラーゼの他に、例えば大腸菌由来のエキソヌクレアーゼIIIが増幅混合物への補充物として添加される、ホットスタート抗体を用いたPCRを行う特定の態様を開示している。上に開示されているように、エキソヌクレアーゼIIIは、例えば標的／プライマーハイブリッドまたは標的／プライマー伸長産物ハイブリッドのような基質として、二本鎖DNAを認識する。消化は、3'末端デオキシヌクレオチド残基の5'末端でのホスホジエステル結合の切断によって起こる。このタイプのエキソヌクレアーゼは周囲温度で活性があるので、したがって、すべての非特異的にアニールしたプライマーおよびプライマー伸長産物は消化される。これによって、増幅反応の特異性が一層高められた態様が生じる。さらに、プレインキュベーション時間の継続期間に依存した非特異的プライマーの消化は、プライマー濃度の実質的かつ制御されない減少をもたらし得、これは次いで増幅反応自体に影響を及ぼし得る。
【００２２】
e) エキソヌクレア−ゼの使用
増幅効率を増大させるための別の選択肢は、PCR 反応混合液における、エキソヌクレアーゼIIIと組み合わせたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドプライマーの使用である (特許文献３３)。この場合、通常二本鎖ならびに一本鎖DNA基質を許容する3'エキソヌクレアーゼは、一本鎖増幅プライマーを分解しないまま残す一方で、プライマーダイマーならびにキャリーオーバーアンプリコン (carry over amplicon) などの二重鎖人工物を分解する。このような状況において、非鋳型依存性のプライマー伸長を防止する手段として、二本鎖形成時に除去される3'結合リン酸基の使用もまた提案されている (特許文献３４)。同様に、無塩基修飾3'末端を有するプライマーの使用およびE.coli エンドヌクレアーゼIVによる鋳型依存性除去が提案されている (特許文献３５)。しかしながら、これらの方法にはいくつかの重大な欠点が存在する。
【００２３】
第１に、ホスホロチオエート残基を含有するオリゴヌクレオチドは立体異性学的に純粋な様式で合成され得ない。更に、これらのハイブリダイゼーション温度は同じ配列の非修飾オリゴヌクレオチドと比較して異なっており、非特異的ハイブリダイゼーション事象も頻繁に観察される。第２に、ホスホロチオエート残基を含有するプライマーは、その3'末端であっても、既に反応混合液中に存在するDNAポリメラーゼによって伸長され得る。言い換えると、エキソヌクレアーゼの影響は、ポリメラ−ゼそのものの存在により少なくとも部分的に補正される。第３に、E.coli エンドヌクレアーゼIVの酵素活性はMg++イオンの存在下で非常に低い (非特許文献１６)。さらに、特異的なタイプのアッセイに依存して、正確な、有意なMg++濃度はPCR増幅反応の成功に必要不可欠な条件であり、PCR試料におけるエンドヌクレアーゼIVの適用をかなり非効果的にする。第４の、最も重要なことは、E.coliエキソヌクレアーゼIIIまたはE.coliエンドヌクレアーゼIVなどの従来のヌクレアーゼは熱不安定性であり、そのため、その熱サイクル手順の前でのみ活性である。結果として、非特異的なプライマー結合および伸長は温度サイクル過程の前でのみ阻害され、熱サイクル過程中は阻害されない。
【００２４】
ホットスタート応用例のためのエキソヌクレアーゼコンセプトの更なる改良は特許文献３６に開示されており、増幅過程の前だけでなく、熱サイクル過程間の非特異的なプライマー結合の阻害およびプライマー伸長を可能にしている。これに関して、特許文献３６は、熱安定性DNAポリメラーゼ、熱安定性3'-5'エキソヌクレアーゼ、および、熱安定性DNAポリメラーゼにより伸長されない修飾3'末端残基を有する核酸増幅のための少なくとも１つのプライマーを含む、核酸増幅反応を実施するための組成物を開示している。この状況では、熱安定性3'-5'エキソヌクレアーゼは、37℃と72℃の間の温度でより活性であり、37℃以下の温度では活性が低い。熱安定性エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼIIIホモログか、または、ポリメラーゼ活性の無いもしくは減少した変異したDNAポリメラーゼのいずれかであり得る。
【００２５】
特許文献３６に開示されるコンセプトは主に、少なくとも１つのプライマーの3'末端に化学修飾を導入することによって、低い温度でのプライマー伸長を妨げる可能性に基づく。典型的なPCR伸長温度で利用しやすいプライマーを作製するために、このコンセプトは、周囲温度またはそれ以下で不活性であり、従って修飾プライマーはこれらの温度で影響を受けないままである、熱安定性エキソヌクレアーゼの使用を含む。温度の増加によりエキソヌクレアーゼは活性化し、プライマーの3'修飾を除去し、従ってプライマーは、増幅反応そのものに携さわることが可能となる。このコンセプトによれば、エキソヌクレアーゼ活性はかかるテンプレート−プライマーハイブリッドを基質として特に認識する3'-5'エキソヌクレアーゼである。これは、E.coliヌクレアーゼIIIおよび、他の生物からのホモログの場合であり、5'突出を有する二本鎖DNAを好ましい基質として認識し、特に基質の凹んだ3'末端を3'-5'方向に消化することができる。
【特許文献１】米国特許第6,174,670号明細書
【特許文献２】米国特許第5,118,801号明細書
【特許文献３】国際公開第97/46707号パンフレット
【特許文献４】国際公開第97/46712号パンフレット
【特許文献５】国際公開第97/46714号パンフレット
【特許文献６】国際公開第02/14555号パンフレット
【特許文献７】米国特許第5,210,015号明細書
【特許文献８】米国特許第5,538,848号明細書
【特許文献９】米国特許第5,487,972号明細書
【特許文献１０】米国特許第5,804,375号明細書
【特許文献１１】米国特許第6,391,551号明細書
【特許文献１２】欧州特許第0 930 370号明細書
【特許文献１３】米国特許第4,889,818号明細書
【特許文献１４】欧州特許第0 258 017号明細書
【特許文献１５】国際公開第92/09689号パンフレット
【特許文献１６】米国特許第5,545,552号明細書
【特許文献１７】欧州特許第0 547 359号明細書
【特許文献１８】欧州特許第0 624 641号明細書
【特許文献１９】米国特許第5,491,086号明細書
【特許文献２０】国際公開第97/35988号パンフレット
【特許文献２１】国際公開第96/22389号パンフレット
【特許文献２２】米国特許第5,322,785号明細書
【特許文献２３】欧州特許第0 455 430号明細書
【特許文献２４】米国特許第5,352,778号明細書
【特許文献２５】欧州特許第0 547 920号明細書
【特許文献２６】欧州特許第0 701 000号明細書
【特許文献２７】国際公開第98/14590号パンフレット
【特許文献２８】欧州特許出願公開第088891号明細書
【特許文献２９】米国特許第5,677,152号明細書
【特許文献３０】米国特許第5,693,502号明細書
【特許文献３１】国際公開第97/46706号パンフレット
【特許文献３２】米国特許第5,985,619号明細書
【特許文献３３】欧州特許第0 744 470号明細書
【特許文献３４】欧州特許第0 439 182号明細書
【特許文献３５】米国特許第5,792,607号明細書
【特許文献３６】欧州特許出願公開第277841号明細書
【非特許文献１】Matthews, J.A.およびKricka, L.J., Analytical Biochemistry 169 (1988) 1-25
【非特許文献２】Bernard, P.S.ら, Analytical Biochemistry 255 (1998) 101-107
【非特許文献３】Bessmanら, J. Biol. Chem. 223 (1957) 171-177
【非特許文献４】Buttin, G.およびKornberg, A., J. Biol. Chem. 241 (1966) 5419-5427
【非特許文献５】Chien, A.ら, J. Bacteriol. 127 (1976) 1550-1557
【非特許文献６】Lawyer, F.C.ら、J. Biol. Chem. 264 (1989) 6427-6437
【非特許文献７】Bernad, A.ら、Cell 59 (1989) 219-228
【非特許文献８】Uemori, T.ら, Nucleic Acids Res. 21 (1993) 259-265
【非特許文献９】Chou, Q.ら、Nucleic Acids Res. 20 (1992) 1717-1723
【非特許文献１０】Nilsson, J.ら、Biotechniques 22 (1997) 744-751
【非特許文献１１】Moretti, T.ら、Biotechniques 25 (1998) 716-722
【非特許文献１２】Kainz, P.ら、Biotechniques 28 (2000) 278-282
【非特許文献１３】Lin, Y.およびJayasena, S.D.、J. Mol. Biol. 271 (1997) 100-111
【非特許文献１４】Kellogg, D. E.ら、Biotechniques 16 (1994) 1134-1137
【非特許文献１５】Sharkey, D. J.ら、Biotechnology (N Y) 12 (1994) 506-509
【非特許文献１６】Siwek, Bら, Nucleic Acids Res. 16 (1988) 5031-5038
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
上記に論じた先行技術分野に鑑みて、ホットスタートプロトコルを容易にし、同時にリアルタイム検出を可能にするために、代替の経済的なリアルタイムPCRの方法を提供することが本発明の目的であった。言い換えれば、特別なホットスタート添加剤を必要としない改良されたリアルタイムPCRの方法を開発することが本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕−標的核酸を、
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対、
−デオキシヌクレオシド三リン酸、および
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
の存在下でリアルタイムPCR増幅反応に供する工程、ならびに
−少なくとも複数の増幅サイクルの後に該蛍光リポーター実体の蛍光をモニターする工程
を含む、標的核酸を増幅および検出するための方法、
〔２〕リポーター実体が検出用オリゴヌクレオチドの3'末端にある、前記〔１〕記載の方法、
〔３〕検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、前記〔１〕または〔２〕記載の方法、
〔４〕検出用オリゴヌクレオチドが増幅プライマー対の１つのメンバーと同一である、前記〔１〕または〔２〕記載の方法、
〔５〕検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合した標識がリン酸基を介して該オリゴヌクレオチドに連結されている、前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の方法、
〔６〕二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIIIおよびエンドヌクレアーゼIVからなる群より選択される、前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の方法、
〔７〕第２標識が検出用オリゴヌクレオチドの１つの残基の塩基に連結されている、前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の方法、
〔８〕第２標識が検出用オリゴヌクレオチドの無塩基性エレメントに連結されている、前記〔１〕〜〔６〕いずれか記載の方法、
〔９〕−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、ならびに
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端のいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
を含む、標的核酸を増幅および検出するための組成物または試薬混合物、
〔１０〕検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブである、前記〔９〕記載の組成物または試薬混合物、
〔１１〕検出用オリゴヌクレオチドが増幅プライマーとして役立つ、前記〔１０〕記載の組成物または試薬混合物、
〔１２〕−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対、ならびに
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、一方の標識が該オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ
を含む、標的核酸配列を増幅および検出するためのキット、
〔１３〕−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、および
−増幅プライマー対であって、該増幅プライマーのうちの一つが検出用オリゴヌクレオチドとして役立ち、該検出用オリゴヌクレオチドが、適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有し、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、増幅プライマー対
を含む、標的核酸配列を増幅および検出するためのキット、
〔１４〕適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部に結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
に関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、ホットスタートプロトコルを容易にし、同時にリアルタイム検出を可能にするために、代替の経済的なリアルタイムPCRの方法を提供され得る。言い換えれば、特別なホットスタート添加剤を必要としない改良されたリアルタイムPCRの方法が開発され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の簡単な説明
本発明の基礎をなす原理は、図１および図２に図解で示される。
【００３０】
第一の局面において、本発明は、
−標的核酸を、
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対、
−デオキシヌクレオシド三リン酸、
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
の存在下でリアルタイムPCR増幅反応に供する工程、
−少なくとも複数の増幅サイクルの後に該蛍光リポーター実体の蛍光をモニターする工程
を含む、標的核酸を増幅および検出するための方法
に関する。
【００３１】
一つの主要な態様において、リポーター実体は検出用オリゴヌクレオチドの3'末端にある。代替の態様において、クエンチャー実体は検出用オリゴヌクレオチドの3'末端にある。
【００３２】
検出用オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブであるか、あるいは、増幅プライマー対の１つのメンバーと同一である。
【００３３】
好ましくは、検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合した標識はリン酸基を介して該オリゴヌクレオチドに連結される。
【００３４】
また好ましくは、第２標識は検出用オリゴヌクレオチドの１つの残基の塩基に連結される。あるいは第２標識は検出用オリゴヌクレオチドの無塩基性エレメントに連結される。
【００３５】
二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼは、好ましくは、エキソヌクレアーゼIII、エンドヌクレアーゼIVおよび3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼからなる酵素の群または真核生物、原核生物、原始生物、バクテリオファージまたはウイルス由来の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性もしくはプルーフリーディング活性を有する他の酵素より選択される。
【００３６】
第二の局面において、本発明は、
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端のいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
を含む、標的核酸を増幅および検出するための組成物または試薬混合物、
に関する。
【００３７】
検出用オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブであるか、または増幅プライマーとして役立ち得る。
【００３８】
第三の局面において、本発明は、
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対であって、該増幅プライマーのうちの一つが検出用オリゴヌクレオチドとして役立ち、該検出用オリゴヌクレオチドが、適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有し、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、増幅プライマー対
を含む、標的核酸配列を増幅および検出するためのキット
に関する。
【００３９】
発明の詳細な説明
既に先に概要を説明したように、本発明は、リアルタイムPCRの実施方法に関する。それは、蛍光がプローブ-標的ハイブリダイゼーションに応答して変化する標識オリゴヌクレオチドを用いることによる核酸配列の相同検出および解析のための方法に関する。本発明はまた、DNA鋳型にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの3'末端の分解に関し、リアルタイム核酸増幅における特定配列の定量のための方法に関する。主に、本発明は、検出用オリゴヌクレオチドが蛍光消光実体および蛍光リポーター実体を有することを特徴とする。TaqMan検出形式と同様に、蛍光シグナルは、増幅の各サイクル中に、前記検出用オリゴヌクレオチドから3'蛍光実体が除去されることによって生じる。
【００４０】
より明確には、本発明は、
−標的核酸を、
−熱安定DNAポリメラーゼ、
−熱安定二本鎖依存性熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ、
−増幅プライマー対、
−デオキシヌクレオシド三リン酸、および
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであって、一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、もう一方の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端でのいずれかで結合されることをさらに特徴とする、検出用オリゴヌクレオチド
の存在下でリアルタイムPCR増幅反応に供する工程、ならびに
−少なくとも複数の増幅サイクルの後に該蛍光リポーター実体の蛍光をモニターする工程
を含む、標的核酸を増幅および検出するための方法
に関する。
【００４１】
自身を熱サイクルする前に、蛍光消光実体による蛍光リポーター実体の消光により、わずかに基礎量の蛍光シグナル伝達が起こるか、または蛍光シグナル伝達は実質的に起こらない。検出用オリゴヌクレオチドが標的分子に結合するという条件下では、温度が上昇すると熱安定エキソヌクレアーゼは活性となり、3'末端標識の除去を開始する。その結果、増幅された標的DNAの濃度の増加により、蛍光シグナル伝達は各増幅サイクル中において変化する。
【００４２】
熱安定ポリメラーゼは、任意の種類のDNA依存性またはRNA依存性DNAポリメラーゼ、好ましくは、Thermus aquaticusに由来するTaqポリメラーゼであり得る。特定の態様において、熱安定ポリメラーゼの混合物が使用され、このとき、第1のポリメラーゼTaqポリメラーゼが高連続移動性を提供し、第２の酵素が3'-5'プルーフリーディング活性を提供する（例えば、ROCHEカタログ番号1732641）。
【００４３】
本発明の文脈において、用語「熱安定」は、70℃での60分間のインキュベーション後に、活性の50％より多く、好ましくは80％より多く、最も好ましくは90％より多くを保持する酵素と定義する。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「二本鎖依存性熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ」は、二本鎖DNAの3'末端退縮端を基質として認識し、かつ3'退縮端にて末端リン酸基の上流（5'）を直接切断できるヌクレアーゼと定義する。また、本発明の文脈において、かかるエキソヌクレアーゼは、付加的3'-5'プルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼとは明確に区別されることに言及しておく。
【００４５】
本発明による方法はまた、蛍光化合物とオリゴヌクレオチド自体間の結合とは無関係に、3'で標識された任意のオリゴヌクレオチドに適用可能である。それにもかかわらず、検出用オリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオチド残基に結合した標識がリン酸基によって前記オリゴヌクレオチドに結合している場合が非常に好ましい。というのは、そのような結合は、それぞれのエキソヌクレアーゼによる切断を容易にするからである。リン酸基のない他のリンカーが使用される場合、切断は、該末端と末端隣接(proxyterminal)ヌクレオチド残基との間のリン酸結合にて最も好ましく起こる。
【００４６】
好ましくは、熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼは、37℃〜72℃の間の温度でより高活性であり、37℃未満の温度でより低活性である。換言すれば、37℃未満の任意の温度では該酵素の酵素活性は、いかなる場合においても、37℃〜72℃の間の任意の温度での酵素活性と比べて低い。酵素に最適な温度は、したがって、50℃〜85℃の間の範囲であり得る。
【００４７】
熱安定エキソヌクレアーゼは、好ましくは、任意の熱安定生物に由来し得るエキソヌクレアーゼIIIホモログである。本発明の文脈において、エキソヌクレアーゼIIIホモログは、5'突出端を有する二本鎖DNAを基質として認識し、かつ3'退縮端からヌクレオチド残基を除去できる酵素と定義する。Archaeoglobus fulgidusに由来する熱安定エキソヌクレアーゼIIIホモログ(Afu ExoIII)が最近開示され（EP-A-1088891）、これは、本発明によるホットスタートプロトコルに特に好適である。他の酵素と比較した場合のこの酵素の使用の利点は、
-  該酵素は、二本鎖DNA上で明らかに好ましく活性であり、かつ
-  37℃〜72℃の間の温度で非常に活性であるが、20℃〜37℃の間の温度で低い   活性を有する
ことである。
【００４８】
あるいは、熱安定性3'-5'エキソヌクレアーゼは、ポリメラーゼ活性がない、または実質的にポリメラーゼ活性が低下しているが、3'-エキソヌクレアーゼ活性はかなり高い変異DNAポリメラーゼであり得る。この場合、低下したDNAポリメラーゼ活性とは、DNAポリメラーゼ活性を示す酵素の50％未満の活性を意味する。あるいはまた、本発明における方法にはエンドヌクレアーゼIVが使用され得る。
【００４９】
本発明における二つの主要な態様は区別されなければならない。
【００５０】
一つ目の主要な態様では、検出するオリゴヌクレオチドのプローブは、同時に核酸増幅のプライマーとして働く。利点は、それぞれのアッセイが、２つの異なるオリゴヌクレオチド：第１二重標識増幅プライマーおよび第１プライマーの下流の標的DNAに反対向きにハイブリダイズする第２増幅プライマーのみを必要とする点である。さらなるハイブリダイゼーションプローブを必要としない。さらに重要なことに、蛍光実体によって3'末端を標識されたプライマーは、その標識が熱安定性エキソヌクレアーゼによって取り除かれないと、伸長されることができない。したがって、高温開始効果が達成される。
【００５１】
不利な点は、プローブがプライマーとして働くので、第２標識はPCRが負の影響を与えられないような方法でオリゴヌクレオチドに付加されなければならない点である。したがって、第２標識は、好ましくはハイブリダイゼーションに影響を及ぼさない位置で核酸塩基に付加される。
【００５２】
さらに、前述の第１プライマーの標識は、二回目およびそれに続くすべての増幅サイクルにおいてDNA合成の鋳型として働き得るような方法でなければならない。従って、この態様においては、無塩基性のリンカーを用いた内部標識はできない。
【００５３】
これに関して、二重標識プライマーを対立遺伝子特異的PCRに用いることもまた、本発明の目的である。異なる対立遺伝子間の識別は、第１標的配列バリアントと相補的だが他の配列バリアントとは塩基対合を行わない3'標識識別3'末端ヌクレオチド残基によって達成され得る。結果として、3'末端標識は、プライマーが前述の第１標的配列にハイブリダイズするが別の標的配列にハイブリダイズしない場合にのみ取り除かれる。つまり、対立遺伝子特異的な増幅が起こりうる。
【００５４】
二つ目の主要な態様では、検出するオリゴヌクレオチドは、それ自身はDNA重合反応の準備をすることによって増幅プロセスに関与はしないリアルタイムPCRモニタリングのハイブリダイゼーションプローブである。この場合、ほとんどあらゆる種類の標識が可能であり、さらに重要なことに、より高度な特異性が達成される。不利な点は、それぞれのアッセイについて少なくとも二つの増幅プライマー、およびさらなる二重標識ハイブリダイゼーションプローブが必要な点である。従って、このようなアッセイの複雑性が増す。
【００５５】
適切な高温開始効果を得るために、少なくとも一つまたは両方の増幅プライマーは、3'末端リン酸基または温度が上昇すると熱安定性エキソヌクレアーゼによって切断される他の修飾によって修飾され得る。
【００５６】
さらに、この態様においては、ハイブリダイゼーションプローブが、PCR中に熱安定性DNAポリメラーゼによって所望でない伸長から保護されている場合利益があるということが証明されている。これは二つの異なる方法で得ることができる：
【００５７】
i）3'末端標識がリン酸基を介してハイブリダイゼーションプローブに付加される場合、その3'末端のヌクレオチドはいわゆる「ポリメラーゼストッパー」、すなわちDNA重合反応によって伸長されることができないヌクレオチド残基を置換するヌクレオチド誘導体または任意の他の構造であり得る。推定上のポリメラーゼストッパーのリストには、塩基アナログ、修飾ヌクレオシド間結合および糖アナログが含まれる。このような修飾により、3'標識のさらなる切断が可能になるが、切断後は、ポリメラーゼは産生された「修飾」3'末端を認識することができない。
ii）3'末端標識がリン酸基を含まないリンカーを介してハイブリダイゼーションプローブに付加されている場合は、3'末端に隣接する残基が、「ポリメラーゼストッパー」に好ましい位置である。
【００５８】
さらに、上で開示された「ポリメラーゼストッパー」はまた、検出するオリゴヌクレオチドが熱安定性二本鎖従属3'-5'エキソヌクレアーゼの活性によって完全に分解されるのを防ぎ得る。
【００５９】
3'標識を用いた内部「ポリメラーゼストッパー」対立遺伝子特異的検出を用いると、3'末端残基の識別が達成され得る。この場合、本発明における二重標識オリゴヌクレオチドは、さらに内部標識と3'標識3'末端残基との間に誘導体化ヌクレオチド残基を含み、前述の誘導体化ヌクレオチドは熱安定性DNAポリメラーゼによって伸長されることができない。3'末端識別ヌクレオチド残基が標的DNAと適合すると、エキソヌクレアーゼによって標識が取り除かれることにより対立遺伝子独立増幅およびそれに続く対立遺伝子特異的シグナル発生が起こる。3'末端識別ヌクレオチド残基が標識DNAと適合しなかった場合、対立遺伝子独立増幅が起こるが、蛍光標識を有する3'識別ヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ除去はできず、結果として、検出シグナルが発生しない。
【００６０】
上で説明されたように、本発明における検出するオリゴヌクレオチドは、第１標識と第２標識を有する。第１標識は、適切な波長の光を用いて励起されたときに蛍光リポーター実体として働き得、前述の第２標識は、前述の蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として働き得る。原則として、蛍光リポーター実体または蛍光消光実体のどちらが検出するオリゴヌクレオチドの3'末端に結合するか、およびこれらの実体のうちどちらが、前述の検出するオリゴヌクレオチドの内部または5'末端のいずれかに結合するかは任意に選択され得る。当業者は、ここに示されたあらゆる代替に対する蛍光標識試薬の入手可能性によって、これに関する選択をし得るであろう。
【００６１】
3'末端修飾オリゴヌクレオチドプライマーの合成は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得る。蛍光染料は、特別なタイプの市販の制御孔ガラス粒子をオリゴヌクレオチド合成の開始マトリックスとして使用して導入され得る。フルオレセインは、例として、EP-A-1 186 613に開示されている。
【００６２】
原則として、第２標識は、当該分野で公知の方法によって、検出するオリゴヌクレオチドの5'末端に導入され得る。例えば、適切な発蛍光団であるホスホルアミダイトは従来のオリゴヌクレオチド合成の最後にオリゴヌクレオチドに結合され得る。
【００６３】
しかしながら、3'末端標識が取り除かれないかぎりは、蛍光リポーター実体と蛍光消光実体との間に密接な空間的近接を提供するために、好ましくは、第２標識はオリゴヌクレオチドの内部に付加される。
【００６４】
一つ目の態様では、前述の第２内部標識は、前述の検出するオリゴヌクレオチドの一つの残基の塩基に結合される。内部標識は内部dU（Glenn Research、フルオレセイン  dT10-1056-xx）の5位に付加され得る。あるいは、塩基標識は欧州出願番号第03007844.8号（5.4.03提出）にしたがって行われ得る。
【００６５】
前述の一つ目の態様とは互いに相容れない二つ目の態様では、前述の第２標識は前述の検出するオリゴヌクレオチドの適切な無塩基性エレメント（リンカー）に結合される。この場合、無塩基性エレメントは、近接するヌクレオチド残基が、標的核酸中の、自身が一つのさらなるヌクレオチド残基により互いに分離された二つの相補的なヌクレオチドと塩基対合し得るように設計される。例はWO 97/43451で開示されている。
【００６６】
同様に前述の一つ目と二つ目の態様と互いに相容れない三つ目の態様では、例えば適切なホスホチエートを用いて、標識はヌクレオチド鎖の骨格に付加される。
【００６７】
一般的に、本発明における適切な第１標識と適切な第２標識を提供するために、一組のFRETドナーとFRETアクセプターからなる、当分野で公知のあらゆる種類の蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）システムが用いられ得る。同様に、TaqMan検出フォーマットと同一でない場合は、適切な波長の光で励起され、適切な検出チャンネルで検出されるのは常にFRETドナー化合物である。本発明のためには、FRETドナーは「蛍光リポーター実体」と呼ばれる。したがって、本発明のためには、FRETアクセプター化合物は「蛍光消光実体」と呼ばれる。まとめると、本発明に使用され得る蛍光リポーター実体と蛍光消光実体は、当業者に周知である。FAM（530 nmで検出される）およびHEXまたはVIC（560 nmで検出される）といったすべての標準的なTaqManリポーター染料が用いられ得る。他の二つの特別な例は、フルオレセイン（リポーター）とLC-Red640（Roche Applied Science）（クエンチャー）、またはフルオレセイン（リポーター）とDabcyl（Molecular Probes）（クエンチャー）の組み合わせである。さらに特別な態様では、Black hole Quenchers（Biosearch Technologies）、またはニトロインドール（消光化合物として公知）までもが、様々な異なるリポーター実体と組み合わせて用いられ得る。
【００６８】
本発明はまた、本発明の方法を行うために特別に設計された組成物、キットおよびオリゴヌクレオチドに関する。
【００６９】
従って本発明は第一に、
−熱安定DNAポリメラーゼ
−37℃より高い至適温度を有する熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ
−適切な波長の光で励起される場合、蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識、および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであり、１つの標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、さらに他の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端のいずれかに結合されることを特徴とする検出用オリゴヌクレオチド
を含む、標的核酸を増幅および検出するための組成物または試薬混合物に関する。
【００７０】
検出される標的DNAを潜在的に含む試料がかかる組成物に曝露され、適切なサーモサイクルプロトコルが実行される場合、各標的DNAの増幅は、例えばLightCycler装置でリアルタイムにモニターされ得る。
【００７１】
組成物において、検出用オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブであり得るか、または、検出用オリゴヌクレオチドは増幅プライマーとして作用するか、のいずれかであり得る。
【００７２】
本発明はまた、本発明の組成物を提供するためおよび本発明のアッセイを行うために、直接使用され得るキットに関する。
【００７３】
標的核酸配列を増幅および検出するために適切な、かかる本発明のキットは、
−熱安定DNAポリメラーゼ
−37℃より高い至適温度を有する熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ
−増幅プライマー対
−適切な波長の光で励起される場合蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであり、１つの標識が該検出用オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの3'末端に結合されることを特徴とし、さらに他の標識が該検出用オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの内部にまたは5'末端のいずれかに結合されることを特徴とするオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ
を含む。
【００７４】
あるいは、標的核酸配列を増幅および検出するためのかかるキットは、
−熱安定DNAポリメラーゼ
−37℃より高い至適温度を有する熱安定二本鎖依存性3'-5'エキソヌクレアーゼ
−増幅プライマーの一つが、検出用オリゴヌクレオチド、適切な波長の光で励起される場合蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する該検出用オリゴヌクレオチドとして作用する増幅プライマー対であり、１つの標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、さらに他の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部にまたは5'末端のいずれかに結合されることを特徴とする増幅プライマー対
を含む。
【００７５】
該キットは、以下
ａ) 熱安定DNAポリメラーゼ
ｂ) 熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ
ｃ) 前記熱安定DNAポリメラーゼによって伸長されない修飾3'末端残基を有する核酸増幅のための少なくとも１つの検出用オリゴヌクレオチド
を含有する組成物を予め含み得る。
【００７６】
または、本発明のキットは、熱安定DNAポリメラーゼ、熱安定3'-5'エキソヌクレアーゼ、および前記熱安定DNAポリメラーゼによって伸長されない修飾3'末端残基を有する核酸増幅のための少なくとも１つの検出用オリゴヌクレオチド用の、独立した保存容器を含み得る。上記の３つの成分のうち２つが１つの保存容器内に維持される場合もまた、本発明の範囲内である。
【００７７】
更に、これらのキットはデオキシヌクレオシド三リン酸など、核酸増幅反応に適切な添加バッファーまたは試薬を含み得る。該キットはまた、増幅プライマーおよび/またはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブといった、増幅産物の検出のための試薬を含み得る。
【００７８】
更なる局面において、本発明は、適切な波長の光で励起される場合蛍光リポーター実体として作用し得る第１標識、および該蛍光リポーター実体の蛍光消光実体として作用し得る第２標識を保有する検出用オリゴヌクレオチドであり、１つの標識が該検出用オリゴヌクレオチドの3'末端に結合されることを特徴とし、他の標識が該検出用オリゴヌクレオチドの内部に結合されることをさらに特徴とする検出用オリゴヌクレオチドに関する。
【００７９】
本発明者らの知る限りでは、リアルタイムPCRなどいずれのDNAベースの分析アッセイに対しても、かかる検出用オリゴヌクレオチドはこれまでに開示されていない。
【００８０】
以下の実施例、引用文献、配列リストおよび図は本発明の理解を助ける目的で提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の意図から逸脱すること無しに、示された手順において修正がなされ得ると理解される。
【実施例】
【００８１】
実施例１
このリアルタイムPCR実験について、FRET法を使用して、内部LC-Red640標識（Roche Applied Scienceカタログ番号2 015 161）および3'末端フルオレセイン標識（Roche Applied Scienceカタログ番号3 138 178）を保有する本発明の二重標識プライマーを設計した。プライマーのハイブリダイゼーション後に末端標識をエキソヌクレアーゼIIIにより除去し、LCRed640シグナル伝達の減少および同時にフルオレセイン蛍光発光の増加を生じた。
【００８２】
プライマーは次の通りであった：
配列番号１：
「βActin5.2fd」：GGATTCCTATGTGGGCGACG
配列番号２：
「βActinHP25」：CCTGGGTCATCTTCT**(Red 640)CGCGG*U*TpFluos-3'
T**(Red640)=T-LCRed640（アミノ修飾T-ホスホルアミデートをオリゴヌクレオチド合成中に導入した。続いて、反応性アミノ基をLC-Red640 NHSエステルと反応させた）
U*:= 2'-O-メチル-U
G*= 2'-O-メチル-G
p=リン酸塩
Fluos=フルオレセイン
【００８３】
オリゴヌクレオチドの合成および標識を当該分野で公知の標準的なプロトコールに従って行った。
【００８４】
PCR反応を、2μl LightCycler FastStart Reaction Mix Hybridization Probes（Roche Applied Scienceカタログ番号3003248）、30ngのヒトゲノムDNA（Roche Applied Scienceカタログ番号1691112）、3mM MgCl2、500nMプライマー配列番号βActin5.2fd、400nMプライマー配列番号βActinHP25および2.5ユニットのTaqポリメラーゼを用いて、ならびにA. fulgidusエキソヌクレアーゼIIIを用いずに、およびA. fulgidusエキソヌクレアーゼIIIの量を減少して（１反応あたり33ng、20ng、12.5ngおよび5ng）添加して始めた。20μlの最終反応容積に蒸留水で調整した。PCR反応を、製造業者のユーザーマニュアルの指示に従ってプログラムされたLightCycler（Roche Applied Scienceカタログ番号2011468）上で行った。PCR条件は以下であった：
【００８５】
【表１】
2005052143.tif 000002
【００８６】
結果を図３、４および５に示す。図３で理解し得るように、チャンネルF2でモニターしたLCRed640シグナルはサイクル数の増加と共に減少した。影響は、反応混合物中のA. fulgidusエキソヌクレアーゼIIIの量に関して用量依存であった。エキソヌクレアーゼIIIの非存在下では、LC-red640蛍光には減少が観察されなかった。
【００８７】
フルオレセインの蛍光発光をチャンネルF1でモニターした。図４で理解し得るように、シグナルはサイクル数の増加と共に増加した。影響は、反応混合物中のA. fulgidusエキソヌクレアーゼIIIの量に関して用量依存であった。エキソヌクレアーゼIIIの非存在下では、フルオレセインシグナル伝達には増加が観察されなかった。
【００８８】
LightCycler分析の完了後、PCR産物を、エチジウムブロマイドで染色した3％ROCHE Agarose MSゲル上で分析した。結果を図５に示す。A. fulgidusエキソヌクレアーゼIIIの存在下でのみ、期待された214bpのPCR産物を検出することができた（レーン２〜５）。
【００８９】
実施例２
別のリアルタイムPCR実験において、内部フルオレセインおよび3'末端クエンチャー化合物としてDabcylを保有するオリゴヌクレオチドプローブを用いて反応をモニターした。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に末端クエンチャーをエキソヌクレアーゼIIIにより除去し、フルオレセインシグナルの脱消光（dequenching）を生じた。リポーター基は、プローブ（反応１、「Primer 300.1＋500rev＋ProbeHPQ15」）またはプライマー（反応２、「Primer 300.1＋ProbeHPQ15」）のいずれかとして使用したオリゴヌクレオチド上に位置していた。
【００９０】
プライマーおよびプローブ配列は以下であった：
配列番号：３
「Primer βAct300.1」  CACCCCGTGCTGCTGACCGAp
p=リン酸塩
配列番号：４
「β-Act 500 rev」  AGGGAGGCGGCCACCAGAAGp
p=リン酸塩
配列番号：５
「βActinHPQ15」  CCTGGGTCATCTTCT**(Fluos)CGCGGTTpZ
p=リン酸塩
Z=Dabcyl
T**(Fluos)=T-フルオレセイン、T-フルオレセイン-ホスホルアミダイトとしてオリゴヌクレオチド合成中に組込まれる。
【００９１】
PCR反応を、2μl LightCycler FastStart Reaction Mix Hybridization Probes（Roche Applied Scienceカタログ番号3003248）、30ngのヒトゲノムDNA（Roche Applied Scienceカタログ番号1691112）、3mM MgCl2、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ、33ngのA. fulgidusエキソヌクレアーゼIIIを用いて始めた。反応番号１は500nMのPrimer Seq 300.1、500nMのPrimer 500 revおよび500nMのProbe Sequ. No HPQ15を含有していた。反応番号２は500nMのPrimer 300.1および500nMのβActin HPQ15を含有していた。20μlの最終反応容積に蒸留水で調整した。PCR反応を、製造業者のユーザーマニュアルの指示に従ってプログラムされたLightCycler（Roche Applied Scienceカタログ番号2011468）上で行った。PCR条件は以下であった：
【００９２】
【表２】
2005052143.tif 000003
【００９３】
リアルタイムPCR反応をチャンネルF1でモニターし、PCR産物形成の増加に伴ってシグナルの増加を観察した。図６に示すように、本発明の二重標識プローブ（反応１、「Primer 300.1＋500rev＋ProbeHPQ15」）の使用および本発明の二重標識プライマー（反応２、「Primer 300.1＋ProbeHPQ15」）の使用は共に、増幅シグナル伝達の成功を生じた。
【００９４】
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブであることを特徴とする、本発明のリアルタイムホットスタートPCR反応方法の概略図。
【図２】検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブであることを特徴とする、本発明のリアルタイムホットスタートPCR反応方法の概略図。
【図３】実施例１に開示されるような、LCRed 640 FRETシグナル減少のリアルタイムモニタリング。プライマーは内部R640標識および3'末端フルオレセイン標識を有した。末端標識は、プライマーのハイブリダイゼーション後、エキソヌクレアーゼIIIにより除去された。
【図４】実施例１に開示されるような、フルオレセインの蛍光増加のリアルタイムモニタリング。プライマーは、内部R640標識および3'末端フルオルセイン標識を有する。末端標識は、プライマーのハイブリダイゼーションにおいてエキソヌクレアーゼIIIにより放たれ、蛍光シグナル変化を導く。
【図５】実施例１で得られた増幅産物のゲル染色。１．エキソヌクレアーゼIIIの非存在下でのPCR反応２．33 ngの存在下３．20 ngの存在下４．12.5 ngの存在下５．5 ngのエキソヌクレアーゼIIIの存在下６．Roche Applied Science, カタログ番号821705の分子量マーカーV
【図６】実施例２に開示されるようなリアルタイムPCR反応。「プライマー300.1＋500rev＋プローブHPQ15」：内部フルオレセインおよび3'末端にクエンチャー分子を有するプローブを用いた産物形成の検出。「プライマー300.1＋プローブHPQ15」：内部フルオレセインおよび3'末端にクエンチャー分子を有するプライマーの補助による、産物形成の検出。
【図１】
2005052143.tif 000004
【図２】
2005052143.tif 000005
【図３】
2005052143.tif 000006
【図４】
2005052143.tif 000007
【図５】
2005052143.tif 000008
【図６】
2005052143.tif 000009
【配列表】
2005052143000001.app
【外国語明細書】
2005052143000001.pdf