(57)【要約】【課題】架橋後の膨潤がほとんどなく、製造に用いた型と同寸法、同形状で、複雑な形状でも容易に製造できる多糖架橋体及びその製造法を提供することであり、さらに、酵素による分解時間を調整することができ、薬剤等の機能性物質の徐放や再生医療の足場材料として有用な、多糖架橋体及びその製造法を提供すること。【解決手段】カルボキシル基を有する多糖の水溶液を凍結乾燥し、縮合剤により架橋する、多糖架橋体の製造法及びこの製造法により得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基を有する多糖の水溶液を凍結乾燥し、縮合剤により架橋する、多糖架橋体の製造法。
【請求項２】
カルボキシル基を有する多糖とカチオン性化合物との混合水溶液を凍結乾燥し、縮合剤により架橋する、多糖架橋体の製造法。
【請求項３】
カルボキシル基を有する多糖が、グリコサミノグリカンである請求項１または請求項２記載の多糖架橋体の製造法。
【請求項４】
グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸である請求項３記載の多糖架橋体の製造法。
【請求項５】
カチオン性化合物が、ポリリジンである請求項２記載の多糖架橋体の製造法。
【請求項６】
縮合剤が、水溶性カルボジイミドである請求項１または請求項２記載の多糖架橋体の製造法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の製造法によって得られる多糖架橋体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボキシル基を有する多糖を含有する多糖架橋体及びそれらの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多糖を主成分とするゲルは、三次元的な構造を有することから、医療、食品、化粧品等の分野への有効利用が期待されている。多糖からゲルを製造する方法は、ジビニルスルホン（例えば、特許文献１参照。）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（例えば、特許文献２参照。）等の架橋剤を用いる方法、水溶性カルボジイミド（例えば、特許文献３参照。）等の縮合剤を用いる方法等の様々な方法が知られている。
【０００３】
しかしながら、いずれの方法を用いても、得られた架橋体は、架橋反応後、さらに膨潤するため、製造に用いた型と得られた製品とでは寸法が大きく異なっていた。そのため、膨潤が安定した後に架橋体の成形を行うことや、安定後の膨潤度を見越した型の設計を行うことが必要とされていた。小型または複雑な形状の製品を作ろうとした場合や、架橋（製造）後、さらに膨潤する架橋体の場合には、例えば、１０倍膨潤する材料であれば１０分の１の型を設計するなど、安定後の膨潤を見越して型の設計をしなければならず、その作製にも限界があった。さらに膨潤が安定した後に成形するには製品が脆く成形が困難な場合が多かった。
このような理由から、多糖架橋体は、複雑な形状、正確な寸法が必要とされる用途には、不向きであると考えられてきた。
【０００４】
【特許文献１】
ＵＳＰ４，６０５，６９１号公報
【特許文献２】
特開平５−２２９９３４号公報
【特許文献３】
特開平７−１０２００２号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このようなことから、本発明の課題は、架橋後の膨潤がほとんどなく、製造に用いた型と同寸法、同形状で、複雑な形状でも容易に製造できる多糖架橋体及びその製造法を提供することである。さらに、酵素による分解時間を調整することができる、薬剤等の機能性物質の徐放や再生医療の足場材料として有用な、多糖架橋体及びその製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた。その結果、カルボキシル基を有する多糖の水溶液を凍結乾燥し、これを縮合剤により架橋して得られた架橋体は、架橋前後の体積変化がわずかであることを見出し、その知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下の構成を有する。
［１］カルボキシル基を有する多糖の水溶液を凍結乾燥し、縮合剤により架橋する、多糖架橋体の製造法。
［２］カルボキシル基を有する多糖とカチオン性化合物との混合水溶液を凍結乾燥し、縮合剤により架橋する、多糖架橋体の製造法。
［３］  カルボキシル基を有する多糖が、グリコサミノグリカンである前記［１］項または前記［２］項記載の多糖架橋体の製造法。
［４］  グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸である前記［３］項記載の多糖架橋体の製造法。
［５］  カチオン性化合物が、ポリリジンである前記［２］項記載の多糖架橋体の製造法。
［６］  縮合剤が、水溶性カルボジイミドである前記［１］項または前記［２］項記載の多糖架橋体の製造法。
［７］前記［１］〜［６］のいずれか１項記載の製造法によって得られる多糖架橋体。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明では、特に断らない限り、％は、重量（ｇ）／容量（ｄｌ）×１００を示す。また、本発明では、純水とは連続イオン交換及び逆浸透によって精製された水をいう。
【０００９】
本発明に使用するカルボキシル基を有する多糖は、特に限定されるものではないが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸等のグリコサミノグリカン、カルボキシメチル化セルロース、セロウロン酸、カルボキシメチル化キチン等であることが好ましい。これらは、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよい。これらのなかでもヒアルロン酸が特に好ましい。本発明でヒアルロン酸を用いる場合、その平均分子量は、少なくとも１０ｋＤａであることが好ましく、より好ましくは５０ｋＤａ〜１５００ｋＤａである。なお、本発明では、ヒアルロン酸の場合の平均分子量は、粘度平均分子量を示し、粘度法により測定できる。
【００１０】
本発明で使用するカチオン性化合物は、特に限定されないが、本発明の多糖架橋体を医療、食品向けに使用するのであれば、生体適合性、生分解性があることが好ましい。具体的には、本発明に使用するカチオン性化合物は、ポリリジン、カチオン性を示すアミノ酸、ペプチド、タンパク質、キトサン等であり、好ましくはポリリジンである。なお、ポリリジンの場合の平均分子量は、重量平均分子量を示す。
【００１１】
本発明に使用する縮合剤は、特に限定されないが、具体的には、水溶性カルボジイミドである。その架橋反応は、水溶性カルボジイミドとアルコールとの混和水中で行われることが望ましい。
【００１２】
カルボキシル基を有する多糖から多糖架橋体を製造する方法を以下に例示する。
（１）カルボキシル基を有する多糖を純水に溶解させ、カルボキシル基を有する多糖の水溶液とする。このとき、カルボキシル基を有する多糖の水溶液の濃度は、１〜３０％が好ましく、特に好ましくは５〜１０％である。
（２）カルボキシル基を有する多糖の水溶液を任意の形状の型に注入し、凍結乾燥する。
（３）縮合剤を含むエタノール混和水に、この固体を浸漬させ、架橋させる。このとき、エタノール混和水中の縮合剤の濃度は、０．１〜１０％であることが好ましく、特に好ましくは０．５〜５％である。エタノール混和水のエタノール濃度は、５０〜９０容量％であることが好ましく、特に好ましくは７０〜８０容量％である。浸漬は、３０〜４０℃で５〜５０時間行うことが好ましい。さらには、３０〜４０℃で５〜３０時間振盪させることが好ましい。その後、残存する水溶性カルボジイミドを水洗することで、多糖架橋体が得られる。
ヒアルロン酸を用いる場合には、まずヒアルロン酸を純水で５〜１０％の濃度になるように溶解させ、この水溶液を任意の形状の型に注入し、−２０〜−１０℃で凍結乾燥することで、白色のスポンジ状の固体が得られる。この固体を、前記条件の縮合剤を含むエタノール混和水に前記条件で浸漬させ、架橋させることで、ヒアルロン酸架橋体が得られる。
【００１３】
カルボキシル基を有する多糖とカチオン性化合物との混合水溶液から多糖架橋体を製造する方法を以下に例示する。
（１）カルボキシル基を有する多糖とカチオン性化合物とを純水に溶解させ、混合水溶液とする。このとき、混合水溶液中のカルボキシル基を有する多糖の濃度は、１〜３０％が好ましく、特に好ましくは５〜１０％である。また、混合水溶液中のカチオン性化合物の濃度は、０．０１〜３０％が好ましく、特に好ましくは０．０５〜１０％である。
（２）混合水溶液を任意の形状の型に注入し、凍結乾燥する。
（３）縮合剤を含むエタノール混和水に、この固体を浸漬させ、架橋させる。このとき、エタノール混和水中の縮合剤の濃度は、０．１〜１０％であることが好ましく、特に好ましくは０．５〜５％である。エタノール混和水のエタノール濃度は、５０〜９０容量％であることが好ましく、特に好ましくは７０〜８０容量％である。浸漬は、３０〜４０℃で５〜５０時間行うことが好ましい。さらには、３０〜４０℃で５〜３０時間振盪させることが好ましい。このとき、この混和水により、カルボキシル基を有する多糖のカルボキシル基が活性化され、多糖に含まれる水酸基とエステル結合し、またカチオン性化合物が水酸基を有する場合はその水酸基とエステル結合し、さらにカチオン性化合物がアミノ基を有する場合はそのアミノ基とアミド結合することで不溶化し、その型と同形状・同寸法の多糖架橋体が得られる。その後、残存する水溶性カルボジイミドを水洗することで、多糖架橋体が得られる。
ヒアルロン酸を用い、ポリリジンを用いる場合には、まずポリリジンを純水で０．０１〜３０％の最終濃度になるように溶解させ、同時にｐＨ７になるようにＨＣｌ水溶液で調整し、得られるポリリジン水溶液にヒアルロン酸を１〜３０％になるように溶解させる。この水溶液を任意の形状の型に注入し、−２０〜−１０℃で凍結乾燥することで、白色のスポンジ状の固体が得られる。この固体を、前記条件の縮合剤を含むエタノール混和水に浸漬させ、架橋させることで、ヒアルロン酸−ポリリジン架橋体が得られる。
【００１４】
本発明においてカルボキシル基を有する多糖とカチオン性化合物との構成比率を選ぶことで複合体の強度及び生体内での分解速度を調節することが可能になる。両者の構成比率において、カルボキシル基を有する多糖の比率が高ければ、分解速度は速くなり、カチオン性化合物の比率が高ければ、分解速度は遅くなる傾向にある。
【００１５】
本発明の多糖架橋体の製造法によって得られた多糖架橋体は、生体内の活性酸素や酵素により分解されるため、例えば手術時等の保湿剤、創傷被覆剤、ＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）等の医薬分野の用途に使用でき、さらに再生医療における足場材料に使用できる。特にカチオン性化合物にポリリジンを選択した場合には、多糖架橋体の分解に連動してポリリジンが放出され、抗菌性を発揮する材料となる。
【００１６】
カルボキシル基を有する多糖の水溶液の乾燥は、凍結乾燥以外の乾燥方法でも可能であるが、その場合、寸法が小さくなってしまい、型の寸法と同じ架橋体を製造することが困難である。特に電磁波で乾燥を行った場合には、ヒアルロン酸の分子量が低下する恐れがある。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明を詳細に説明する。
ＨＡ：チッソ（株）製ヒアルロン酸ナトリウム
ＥＰＬ：チッソ（株）製ε−ポリリジン
ＷＳＣ：水溶性カルボジイミド
粘度法：ヒアルロン酸ナトリウムの平均分子量は、極限粘度を薬局方粘度測定法または化粧品原料基準粘度測定法第１法によって測定し、その数値を用いて下記式（１）より算出した値である。なお、ＨＰＬＣにより求めた値も利用できる。
2005053974.tif 000002
ここで、［η］は、極限粘度（ｄｌ／ｇ）、Ｍは、平均分子量（×１０４Ｄａ）である。
凍結乾燥：所定の型にキャスト後、−２０〜−１０℃の冷凍庫内で凍結するまで静置した後、凍結乾燥機（東京理化機械（株）製  ＦＤ−８１）で凍結乾燥する。
【００１８】
実施例１
ＨＡ架橋体は、以下の方法で製造した。
純水１２．５ｍｌにＨＡ６２４ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ）を溶解させた。アスピレータで脱泡後、この溶液をテフロン（登録商標）製の型（直径１４ｍｍ、深さ２ｍｍの円盤状）に注入し、凍結乾燥を行った。得られた白色固体を５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＷＳＣエタノール８０容量％溶液に浸漬し、３７℃で２４時間振盪した。水洗いすることで残存したＷＳＣを除去し、直径１４ｍｍ、厚さ２ｍｍの円盤状のＨＡ架橋体を得た。
得られたＨＡ架橋体は、製造に用いた型と同寸法であることから、膨潤を起こしていないことがわかった。
【００１９】
実施例２
ＨＡ対ＥＰＬ、１対１（構成単位のモル比）のＨＡ−ＥＰＬ架橋体は、以下の方法で製造した。
ＥＰＬ（平均分子量３．８ｋＤａ）を最終濃度が１．６９％になるように純水に添加し、同時にｐＨ７となるように１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ水溶液で調整し、溶解させた。このＥＰＬ水溶液１１．９ｇ（ＥＰＬ１．５６ｍｍｏｌ）にＨＡ（平均分子量２３０ｋＤａ）６２４ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ）を溶解させた。アスピレータで脱泡後、テフロン（登録商標）製の型（直径１４ｍｍ、深さ２ｍｍの円盤状）に注入し、凍結乾燥を行った。得られた白色固体を５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＷＳＣエタノール８０容量％溶液に浸漬し、３７℃で２４時間振盪した。水洗いすることで残存したＷＳＣを除去し、直径１４ｍｍ、厚さ２ｍｍの円盤状のＨＡ−ＥＰＬ架橋体（ＨＡ−ＥＰＬ１）を得た。
得られたＨＡ−ＥＰＬ架橋体は、製造に用いた型と同寸法であることから、製造後、さらに膨潤を起こしていないことがわかった。
【００２０】
実施例３
ＨＡ対ＥＰＬ、１０対１（構成単位のモル比）のＨＡ−ＥＰＬ架橋体は、以下の方法で製造した。
ＥＰＬ（平均分子量３．８ｋＤａ）を最終濃度が０．１７％になるように純水に添加し、同時にｐＨ７となるように１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ水溶液で調整し、溶解させた。このＥＰＬ水溶液１１．９ｇ（ＥＰＬ０．１６ｍｍｏｌ）にＨＡ（分子量２３０ｋＤ）６２４ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ）を溶解させた。アスピレータで脱泡後、テフロン（登録商標）製の型（直径１４ｍｍ、深さ２ｍｍの円盤状）に注入し、凍結乾燥を行った。得られた白色固体を５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＷＳＣエタノール８０容量％溶液に浸漬し、３７℃で２４時間振盪した。水洗いすることで残存したＷＳＣを除去し、直径１４ｍｍ、厚さ２ｍｍのＨＡ−ＥＰＬ架橋体（ＨＡ−ＥＰＬ２）を得た。
得られたＨＡ−ＥＰＬ架橋体は、製造に用いた型と同寸法であることから、製造後、さらに膨潤を起こしていないことがわかった。
【００２１】
実施例４
ＨＡ対ＥＰＬ、１００対１（構成単位のモル比）のＨＡ−ＥＰＬ架橋体は、以下の方法で製造した。
ＥＰＬ（平均分子量３．８ｋＤａ）を最終濃度が０．０１７％になるように純水に添加し、同時にｐＨ７となるように１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ水溶液で調整し、溶解させた。このＥＰＬ水溶液１１．９ｇ（ＥＰＬ０．０１６ｍｍｏｌ）にＨＡ（平均分子量２３万）６２４ｍｇ（１．５６ｍｍｏｌ）を溶解させた。アスピレータで脱泡後、テフロン（登録商標）製の型（直径１４ｍｍ、深さ２ｍｍの円盤状）に注入し、凍結乾燥を行った。得られた白色固体を５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＷＳＣエタノール８０容量％溶液に浸漬し、３７℃で２４時間振盪した。水洗いすることで残存したＷＳＣを除去し、直径１４ｍｍ、厚さ２ｍｍのＨＡ−ＥＰＬ架橋体（ＨＡ−ＥＰＬ３）を得た。
得られたＨＡ−ＥＰＬ架橋体は、製造に用いた型と同寸法であることから、製造後、さらに膨潤を起こしていないことがわかった。
【００２２】
ＨＡ−ＥＰＬ架橋体のヒアルロニダーゼ分解実験
実施例２〜４のＨＡ−ＥＰＬ架橋体１個をヒアルロニダーゼ（シグマ製  Ｈ３８８４牛睾丸由来Ｔｙｐｅ  ＩＶ−Ｓ）１０ｕｎｉｔ／ｍｌを溶解させたｐＨ４．５、０．１４ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液２５ｍｌに浸漬し、３７℃で、３０日間振盪した。ヒアルロニダーゼＰＢＳ溶液を２−３日毎に交換し、重量変化から浸漬３０日後の多糖架橋体の分解量を求めた。実施例２で得られたＨＡ−ＥＰＬ架橋体（ＨＡ−ＥＰＬ１）は６％の分解が認められた。実施例３で得られたＨＡ−ＥＰＬ架橋体（ＨＡ−ＥＰＬ２）は３０％の分解が認められた。実施例４で得られたＨＡ−ＥＰＬ架橋体（ＨＡ−ＥＰＬ３）は５０％の分解が認められた。
この結果から、架橋体中のカチオン性化合物の構成比率（モル比）によって、分解性が異なり、架橋体中の構成比率において、カチオン性化合物の比率が高ければ、分解速度が遅くなる傾向にあることがわかった。
【００２３】
比較例１
ＨＡ−コラーゲン架橋体は、以下の方法で製造した。
ＨＡ（平均分子量６４０ｋＤａ）１．２５％水溶液及びＩＩ型コラーゲン（新田ゼラチン製）１．２５％水溶液を体積比１対１の割合で混合し、０．４ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ水溶液を添加することで、混合水溶液を約ｐＨ５に調整した。水溶性カルボジイミド水溶液の濃度が混合液中で１００ｍｍｏｌ／ｌになるように混合液に滴下し、充分に攪拌し、さらに脱泡した後、テフロン（登録商標）製の型（直径１４ｍｍ、深さ２ｍｍの円盤状）に注入し、３０℃で２時間放置した。その後、得られたゲルを水洗し直径１８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍのＨＡ−コラーゲン架橋体を得た。
得られたＨＡ−コラーゲン架橋体は、製造に用いた型よりも直径で４ｍｍ、厚さで０．５ｍｍ、製造後、さらに膨潤を起こしていることがわかった。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の多糖架橋体は、製造後、さらに膨潤を起こさないことから、製造に用いた型とほぼ同じ寸法、形状の多糖架橋体製品が製造できる。さらに本発明の多糖架橋体の製造法を用いることで、複雑な形状の多糖架橋体製品が容易に製造できる。また、カチオン性化合物の構成比を選ぶことで、得られる多糖架橋体の酵素による分解時間を調節することができるため、薬剤等の機能性物質の徐放や再生医療の足場材料として有用な材料を提供することができる。このように、本発明によると、用いる型とほぼ同寸法の多糖架橋体を得ることができるため、同一の型で分解時間の異なる材料が得られる等、様々な用途に利用が可能である。