(57)【要約】【課題】  培養すべき付着性の細胞の培養容器底面への接着効率を向上して、培養初期における細胞数を増加させ、効率的かつ短期に所望の数の細胞を得ることを可能にする。【解決手段】    生体組織から採取した体液Ａ内に赤血球Ｃを凝集させる物質を投入し、凝集した赤血球Ｃを体液から除去する除去ステップＳ１，Ｓ２，Ｓ３と、赤血球Ｃを除去した残りの体液Ｂを培養容器２に投入して所定の培養条件下において培養する培養ステップＳ４とを備える培養方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織から採取した体液内に赤血球を凝集させる物質を投入し、凝集した赤血球を体液から除去する除去ステップと、
赤血球を除去した残りの体液を培養容器に投入して所定の培養条件下において培養する培養ステップとを備える培養方法。
【請求項２】
前記赤血球を凝集させる物質が、デキストランである請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記赤血球を凝集させる物質が、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体である請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記赤血球を凝集させる物質が、ポリスチレン粒子のようなマイクロパーティクルに抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体を物理吸着させた物質である請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記赤血球を凝集させる物質が、磁性粒子に抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体を物理吸着させた物質であり、外部から磁力を作用させて赤血球を凝集させる請求項１に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、培養方法、特に、間葉系幹細胞のような付着性の細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
付着性の細胞を培養するには、培養すべき細胞を所定の培地に混合してなる懸濁液を、培養容器内に貯留して静置することが行われる。培養すべき細胞は、静置状態に配される間に培養容器内を沈降し、培養容器の底面に接触すると、そこで底面に接着して成長を開始することが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、培地内に赤血球が存在すると、赤血球は比較的比重が大きいために培養容器内において最初に沈降し、培養容器の底面を覆うことにより細胞の接着を阻害する虞がある。
比重の違いを利用して、遠心分離機により赤血球を分離除去することも考えられるが、遠心回転数の微妙な調整が困難であるとともに、赤血球以外の組織も一緒に分離してしまうという不都合がある。
【０００４】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養すべき付着性の細胞の培養容器底面への接着効率を向上して、培養初期における細胞数を増加させ、効率的かつ短期に所望の数の細胞を得ることを可能にする培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、生体組織から採取した体液内に赤血球を凝集させる物質を投入し、凝集した赤血球を体液から除去する除去ステップと、赤血球を除去した残りの体液を培養容器に投入して所定の培養条件下において培養する培養ステップとを備える培養方法を提供する。
【０００６】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の培養方法において、前記赤血球を凝集させる物質が、デキストランである培養方法を提供する。
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の培養方法において、前記赤血球を凝集させる物質が、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体である培養方法を提供する。
【０００７】
請求項４に係る発明は、請求項１に記載の培養方法において、前記赤血球を凝集させる物質が、ポリスチレン粒子のようなマイクロパーティクルに抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体を物理吸着させた物質である培養方法を提供する。
請求項５に係る発明は、請求項１に記載の培養方法において、前記赤血球を凝集させる物質が、磁性粒子に抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体を物理吸着させた物質であり、外部から磁力を作用させて赤血球を凝集させる培養方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、除去ステップにおいて投入された、赤血球を凝集させる物質により体液内から赤血球が選択的に凝集されて除去されるので、培養容器底面への細胞の付着効率を向上することができる。その結果、培養の初期において、十分な数の細胞を培養容器の底面に付着させて成長を開始させることができるので、短期間の内に、所望の細胞数まで成長させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この発明の第１の実施形態に係る培養方法について図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養方法は、図１に示されるように、患者から採取した骨髄液Ａのような体液を所定の容器１に収容して、６％のデキストラン溶液を容器１内に注入する（ステップＳ１）。次いで、この容器１を４℃程度に維持しつつ約１時間静置する（ステップＳ２）。そして、容器１内から上澄み液Ｂを吸引し、培養容器２内に所定の培地とともに投入する（ステップＳ３）。その後、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％に維持されたＣＯ２インキュベータ内に投入し培養する（ステップＳ４）。
【００１０】
本実施形態に係る培養方法によれば、骨髄液Ａとともに投入したデキストランの作用により、骨髄液Ａ中の赤血球Ｃが凝集させられて、ステップＳ２の静置の間に比重により沈降させられる。したがって、ステップＳ３において吸引した上澄み液Ｂ内からは赤血球Ｃが除去されている。そして、このようにして赤血球Ｃを除去された上澄み液Ｂを所定の培地とともに培養容器２内に投入すると、骨髄液Ａ内に含まれていた付着性の間葉系幹細胞が培地内を浮遊した後に沈降し、培養容器２の底面に付着して成長を開始する。
培地は、例えば、ＭＥＭ（Minimal Essential Medium：最小必須培地）と、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）と、抗生剤とを例えば８４：１５：１の割合で混合したものである。
【００１１】
この場合において、培地と混合される骨髄液内には、赤血球Ｃが含まれていないので、培養容器２内において、底面が赤血球Ｃによって覆われてしまうことがない。したがって、間葉系幹細胞が、赤血球Ｃによって阻害されることなく培養容器２の底面に容易に到達することが可能となる。
その結果、ステップＳ４においては、ＣＯ２インキュベータ内における培養の初期から、多くの細胞を培養容器２の底面に付着させて成長を開始させることができる。すなわち、開始培養数を増加させることができるので、所望の細胞数となるまでに要する培養時間を大幅に短縮することができる。
【００１２】
次に、本発明の第２の実施形態に係る培養方法について説明する。
本実施形態に係る培養方法は、第１の実施形態において骨髄液Ａ内に投入したデキストラン溶液に代えて、赤血球抗体を投入するものである（ステップＳ１１）。
本実施形態に係る培養方法によれば、骨髄液Ａ内に投入された赤血球抗体、例えば、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体または抗Ｈ抗体（もしくは抗Ｈレクチン）により、赤血球Ｃどうしが抗体を介して凝集させられることになる。
【００１３】
その結果、第１の実施形態に係る培養方法と同様に、培地に混合する前に赤血球Ｃを除去することができるので、間葉系幹細胞を培養容器２の底面に効率的に付着させ、培養期間を大幅に短縮することができるという効果を奏する。
【００１４】
次に、本発明の第３の実施形態に係る培養方法について、図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養方法は、第２の実施形態において骨髄液Ａ内に投入した赤血球抗体単体に代えて、マイクロパーティクルに、上記赤血球抗体を物理吸着させたものを投入する（ステップＳ１２）。マイクロパーティクルとしては、例えば、直径０．５〜５μｍ程度のポリスチレン粒子等、任意のものを採用してよいが、骨髄液Ａ中に含まれる他の成分よりも十分に比重の大きな材質により構成することが望ましい。
【００１５】
このように構成された本実施形態に係る培養方法によれば、赤血球抗体の作用により、赤血球Ｃどうしが凝集させられることになる。この場合に、赤血球抗体にはマイクロパーティクルが物理吸着されているので、赤血球Ｃの凝集塊は、上記第２の実施形態におけるよりも大きく形成されることになる。したがって、凝集塊は、容器１内において沈降しやすく、分離を容易にすることができる。さらに、マイクロパーティクルの比重を他の成分よりも十分に大きく設定しておくことにより、比重による分離をさらに容易にすることができ、静置時間を短縮することができる。
【００１６】
次に、本発明の第４の実施形態に係る培養方法について説明する。
本実施形態に係る培養方法は、第３の実施形態に係るマイクロパーティクルとして、磁性粒子を使用するものである。すなわち、磁性粒子に赤血球抗体を物理吸着させたものを骨髄液Ａ内に投入し（ステップＳ１３）、所定時間にわたって凝集させる（ステップＳ１４）。また、その後、凝集が行われるのに必要な時間をおいた後に、容器１の外部から磁石３を近付ける（ステップＳ１５）。
磁性粒子としては、例えば、磁性ゼラチン粒子（オリンパス光学工業製）や診断薬単体用磁性粒子「フェリスフェア」（日本ペイント製）等が挙げられる。
【００１７】
このように構成された本実施形態に係る培養方法によれば、赤血球抗体の作用により、赤血球Ｃどうしが凝集させられる際に、赤血球抗体に物理吸着されている磁性粒子も一体となって凝集される。その結果、大きな凝集塊が形成される点については、第３の実施形態と同様である。さらに、本実施形態によれば、凝集させられた状態で、容器１の外部から磁力を作用させることにより、容器１内の磁性粒子を容器１の内壁面に吸着させることができる。
【００１８】
すなわち、上記各実施形態におけるように、重力の作用および比重差に基づいて分離する方法と異なり、外部から作用させた磁力により分離するので、より確実かつ、静置時間より十分に短い時間で迅速に分離することができるという効果がある。また、磁力により容器１の内壁面に吸着状態としておけば、容器１を傾けることで赤血球Ｃのみを残して残りの上澄み液Ｂを容器１外に流出させることができる。
【００１９】
なお、体液としては、上述した骨髄液に限らず、末梢血、さい帯血でも良く、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の体細胞が含まれるものであれば良い。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】この発明の第１の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
【図２】この発明の第２の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
【図３】この発明の第３の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
【図４】この発明の第４の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００２１】
Ｓ１，Ｓ１１，Ｓ１２，Ｓ１３  赤血球を凝集させる物質を投入するステップ
Ｓ２，Ｓ３，Ｓ１４，Ｓ１５  凝集した赤血球を体液から除去する除去ステップ
Ｓ４  培養ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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