(57)【要約】【課題】本発明は、ｈＲＦＩの抗癌剤感受性を規定するスクリーニングマーカーとしての可能性を検証し、抗癌剤感受性予測方法や、腫瘍性病変の有無の判定方法、腫瘍性病変進行度評価方法、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法、及び抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法等を含む、医学上有効な臨床応用手段を提供する。【解決手段】抗癌剤感受性予測方法、腫瘍性病変の有無の判定方法、及び腫瘍性病変進行度評価方法は、ｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む。また、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法は、被験化合物を作用させた場合にｈＲＦＩ等の発現または活性が低下していることを、有効性を判断する指標の一つとする。抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法は、ｈＲＦＩの発現が上昇または低下している細胞において発現量が変化している遺伝子と、抗癌剤感受性の相関を検討する工程を含む。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤感受性予測の対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程と、
検討して得られたｈＲＦＩの発現から抗癌剤感受性を予測する工程と
を含む、抗癌剤感受性予測方法。
【請求項２】
前記試料は、消化器癌細胞を含む試料である、請求項１に記載の抗癌剤感受性予測方法。
【請求項３】
前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含む、請求項１または２に記載の抗癌剤感受性予測方法。
【請求項４】
ｈＲＦＩの発現量と抗癌剤感受性は逆相関関係にあることを、抗癌剤感受性を予測する指標の一つとする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗癌剤感受性予測方法。
【請求項５】
前記抗癌剤は代謝拮抗剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗癌剤感受性予測方法。
【請求項６】
前記代謝拮抗剤はフッ化ピリミジン系抗癌剤である、請求項５に記載の抗癌剤感受性予測方法。
【請求項７】
前記抗癌剤はプラチナ系抗癌剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗癌剤感受性予測方法。
【請求項８】
腫瘍性病変の有無の判定対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む、腫瘍性病変の有無の判定方法。
【請求項９】
前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含む、請求項８に記載の腫瘍性病変の有無の判定方法。
【請求項１０】
ｈＲＦＩが発現していることを、腫瘍性病変が存在していると判断する指標の一つとする、請求項８または９に記載の腫瘍性病変の有無の判定方法。
【請求項１１】
前記腫瘍性病変は、消化器における腫瘍性病変である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の腫瘍性病変の有無の判定方法。
【請求項１２】
腫瘍性病変進行度の評価対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む、腫瘍性病変進行度評価方法。
【請求項１３】
前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含む、請求項１２に記載の腫瘍性病変進行度評価方法。
【請求項１４】
前記腫瘍性病変は、消化器における腫瘍性病変である、請求項１２または１３に記載の腫瘍性病変進行度評価方法。
【請求項１５】
ｈＲＦＩの発現を検討するための、ｈＲＦＩタンパク質または核酸との親和性のある物質を含み、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗癌剤感受性予測方法、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の腫瘍性病変の有無の判定方法、及び請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の腫瘍性病変進行度評価方法のうちの、少なくともいずれか１つの方法に用いることができる、医療用キット。
【請求項１６】
前記物質は、抗ｈＲＦＩ抗体、ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するプライマーセットを含むプライマー、及びｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するＤＮＡまたはＲＮＡプローブのうちの少なくともいずれか１つである、請求項１５に記載の医療用キット。
【請求項１７】
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターで形質転換された形質転換体を含む抗癌剤感受性検査用組成物。
【請求項１８】
ｈＲＦＩを発現している細胞を担持した、抗癌剤感受性試験用モデル動物。
【請求項１９】
前記抗癌剤感受性試験用モデル動物が、担癌免疫不全モデル動物である、請求項１８に記載の抗癌剤感受性試験用モデル動物。
【請求項２０】
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、
癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【請求項２１】
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドと、前記被験化合物との結合を検出する工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、
癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【請求項２２】
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、
癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記核酸と、前記被験化合物との結合を検出する工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、
癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【請求項２４】
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合の前記レポーター遺伝子の発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合の前記レポーター遺伝子の発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、
癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法。
【請求項２５】
ｈＲＦＩの発現が上昇または低下している細胞における、１または２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
ｈＲＦＩの発現に操作を加えていない対照細胞における、１または２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
両者細胞間における前記遺伝子の発現量を比較する工程と、
両者細胞間で発現量が変化している遺伝子を認定する工程と、
前記発現量が変化している遺伝子の発現と、抗癌剤感受性の相関を検討する工程と
を含む、抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｈＲＦＩの発現または活性を指標とした抗癌剤感受性予測方法、腫瘍性病変の有無の判定方法、腫瘍性病変進行度評価方法、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法、及び抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ヒトの死因の第一位は癌であり、この癌を治療するために内視鏡的治療、外科治療、放射線治療、化学療法等さまざまな治療法が研究されている。
【０００３】
化学療法は、抗癌剤を用いて、癌病変の縮小、症状の緩和、延命等を目指す治療法である。
【０００４】
近年、癌の早期発見、早期手術あるいは術後管理の発展に伴う拡大手術の成績向上により、癌の治療成績は以前と比較して非常に向上したが、手術のみの治療では根治に至らないことも多く、抗癌剤や放射線等による治療が必要である。また、従来であれば手術は無理であると諦められていた進行癌についても、抗癌剤を用いて癌を縮小させることにより手術が可能になるケースも出てきている。これらの事実から、癌治療において抗癌剤の果たす役割は非常に大きいと考えられる。
【０００５】
抗癌剤は同じ腫瘍に対して多種類存在し、多くの場合、複数種類を組み合わせて使用される。例えばフッ化ピリミジン系抗癌剤は、胃癌、食道癌、大腸癌等の消化器癌の化学療法に利用されている代表的抗癌剤の一つであり、ＤＮＡ合成を抑制する作用を有することが知られている。また、その抗腫瘍効果を高めるために、しばしばロイコボリンと併用される。
【０００６】
抗癌剤はすべての人に一律の効果を示すものではなく、癌の進行状態や患者個々人の差によってその感受性が異なることが知られている。また、腫瘍細胞（癌細胞）の抑制に有効な反面、正常細胞にも同時に傷害を与えてしまう恐れがある。そのため、骨髄抑制、消化管の障害、脱毛、心臓・腎臓・膀胱・肝臓・神経の障害、不妊症、アレルギー反応等の副作用を伴うことが多く、これは患者の体力低下をまねき、患者は病気と同時に、抗癌剤の副作用とも闘うことを余儀なくされる。また、患者にとって効果が低い抗癌剤を投与した場合に、次に有効な抗癌剤を投与しても十分な腫瘍抑制効果を発揮できない可能性があることも知られている。従って、効果が低い抗癌剤の使用を避けるとともに、投与前に適切な抗癌剤を選択することは大変重要である。
【０００７】
上述の目的で、切除した癌細胞を用いて種々の抗癌剤に対する感受性を調べる抗癌剤感受性検査が行われている。しかしこれまでの検査方法は、効果に対する客観的、科学的根拠が乏しく、また検査結果と臨床効果が必ずしも一致しない場合がある。このため、より客観的かつ正確な抗癌剤感受性検査の確立が求められている。
【０００８】
また、現在、手術等によって採取した試料について腫瘍性病変の有無やその進行度の判定には、目視やＨＥ染色等による方法を用いるのが一般的である。このため、腫瘍性病変の有無やその進行度をより正確に、かつ客観的に判定することができるマーカーが同定できれば、従来よりも客観的な判定が可能になると考えられる。
【０００９】
これらの現状から、信頼性の高い抗癌剤感受性検査方法の確立や、前記検査方法に用いることができる抗癌剤感受性を規定するスクリーニングマーカーの同定、また腫瘍性病変の有無やその進行度を判定することができるマーカーの同定等が望まれている。しかし、これらマーカーの確立された同定方法はなく、これまでに同定された中で臨床応用上非常に有効なマーカーは希少である。
【００１０】
ｈＲＦＩ遺伝子（ｈｕｍａｎ  Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ））は、本発明者によって、アポトーシスを促進する機能を有するｈＴＩＤ−１Ｌをベイトとした酵母２−ハイブリッドスクリーニング（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）により同定された新規遺伝子である。これまでの研究によって、ｈＲＦＩは３７３アミノ酸からなる分子量約４６ｋＤａのタンパク質であり、ＴＮＦ−αによって誘導されるアポトーシスを阻害する機能があることが明らかにされている。
【非特許文献１】ササキ（Ｓａｓａｋｉ  Ｓ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．５０２４−５０３０
【非特許文献２】ササキ（Ｓａｓａｋｉ  Ｓ．）ら、「大腸腺腫から大腸癌に至るステップにおける、腺腫形成及び癌進行に係るｈＲＦＩの発現効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈＲＦＩ ｏｎ ａｄｅｎｏｍａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｍａ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  アンド  クリニカル  キャンサー  リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、印刷中
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ｈＲＦＩの抗癌剤感受性を規定するスクリーニングマーカーとしての可能性を検証し、ｈＲＦＩの発現や活性を指標とした抗癌剤感受性予測方法や、腫瘍性病変の有無の判定方法、腫瘍性病変進行度評価方法、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法、及び抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法等を含む、医学上有効な臨床応用手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【００１２】
（１）抗癌剤感受性予測方法
本発明の抗癌剤感受性予測方法は、
抗癌剤感受性予測の対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程と、
検討して得られたｈＲＦＩの発現から抗癌剤感受性を予測する工程と
を含む。
【００１３】
本発明において、「ｈＲＦＩの発現」とは、特に記載を加えない限り、ｈＲＦＩの「ｍＲＮＡレベル」及び／または「タンパク質または部分ペプチドレベル」の発現を指すものとする。また、「ｈＲＦＩの発現を検討する」とは、特に記載を加えない限り、ｈＲＦＩの発現自体を同定することだけでなく、「発現量」及び／または「発現領域」を同定することも含むものとする。
【００１４】
本発明によれば、ｈＲＦＩの発現を、抗癌剤感受性を規定するスクリーニングマーカーとして用いることによって、試料の抗癌剤感受性を予測することができる。従って、特に、前記試料が癌患者の有する癌組織である場合は、本発明によって、患者にとって効果が低い抗癌剤の使用を予防することができると同時に、それによる医療費の削減等の効果が期待できる。また、癌患者ごとに適切な抗癌剤の選択を可能にする。
【００１５】
本発明において、前記試料は消化器癌細胞を含む試料であることができる。ｈＲＦＩは消化器癌細胞に発現することが明らかになっている。従って、消化器癌細胞を含む試料の抗癌剤感受性を予測することができる。また、同じ器官の消化器癌、例えば大腸癌に分類される腫瘍であっても、異型の進行度や発生形式の違いによってｈＲＦＩの発現が異なるため、実際にｈＲＦＩの発現を検討することによって、前記抗癌剤が奏功するか否かの判断をより高い精度で予測することが可能になる。
【００１６】
本発明において、前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含むことができる。これによれば、ｈＲＦＩの発現を、ｈＲＦＩタンパク質や核酸の発現量または発現領域をもって評価することができる。すなわち、ｈＲＦＩの発現を定量的にまたは発現パターンの状態に基づいて評価することができる。
【００１７】
本発明においては、ｈＲＦＩの発現量と抗癌剤感受性は逆相関関係にあることを、抗癌剤感受性を予測する指標の一つとすることができる。ここで、「ｈＲＦＩの発現量と抗癌剤感受性は逆相関関係にある」とは、ｈＲＦＩの発現量が高いほど抗癌剤感受性が低く、ｈＲＦＩの発現量が低いほど抗癌剤感受性が高いことをいう。これにより、患者にとって効果が低いと予測される抗癌剤の使用を予防することができるとともに、投与前に、患者にとって適切な抗癌剤を選択することにつながると考えられる。
【００１８】
本発明において、前記抗癌剤は、代謝拮抗剤やプラチナ系抗癌剤であることができる。この場合、前記代謝拮抗剤としては、例えばフッ化ピリミジン系抗癌剤であることができる。代謝拮抗剤やプラチナ系抗癌剤の感受性は、ｈＲＦＩの発現量と逆相関関係にある。これにより、抗癌剤感受性予測の対象となる試料のそれぞれの抗癌剤に対する感受性を予測することができる。
【００１９】
（２）腫瘍性病変の有無の判定方法
本発明に係る腫瘍性病変の有無の判定方法は、腫瘍性病変の有無の判定対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む。
【００２０】
ここで、腫瘍性病変とは、腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）及び癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）指す。
【００２１】
本発明に係る腫瘍性病変の有無の判定方法は、ｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む、新しい腫瘍性病変の有無の診断方法として単独で用いることができる。また、例えば従来から行われている目視やＨＥ染色等による病理診断方法の補助的手法としても用いることができる。「補助的手法」とは例えば、前記従来の手法に適宜組み合わせて用いることができる手法を指す。これにより、目視やＨＥ染色のみによる診断と比較してより高い精度を有し、より多くの情報が得られる腫瘍性病変の診断が可能になる。
【００２２】
本発明において、前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含むことができる。これによれば、ｈＲＦＩの発現を、ｈＲＦＩタンパク質や核酸の発現量または発現領域をもって評価することができる。すなわち、ｈＲＦＩの発現を定量的にまたは発現パターンの状態に基づいて評価することができる。
【００２３】
本発明においては、ｈＲＦＩが発現していることを、腫瘍性病変が存在していると判断する指標の一つとすることができる。これによれば、ｈＲＦＩの発現を確認することによって腫瘍性病変が存在していると診断することが可能となり、新しい腫瘍性病変の有無の診断方法として単独で用いることができる。また、例えば従来から行われている目視やＨＥ染色等による病理診断方法の補助的手法としても用いることができる。
【００２４】
本発明において、前記腫瘍性病変は、消化器における腫瘍性病変であることができる。これによれば、消化器における腫瘍性病変の有無を判定することができる。従って、消化器においてｈＲＦＩの発現を検討することによって、腫瘍性病変が存在するか否かを診断することができる。
【００２５】
（３）腫瘍性病変進行度評価方法
本発明の腫瘍性病変進行度評価方法は、腫瘍性病変進行度の評価対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む。
【００２６】
本発明において、「腫瘍性病変進行度評価」とは、前癌病変（腺腫（adenoma））から癌（carcinoma）への異型度の進行を判断することを指す。
【００２７】
本発明に係る腫瘍性病変進行度評価方法は、ｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む、新しい腫瘍性病変進行度の診断方法として単独で用いることができる。また、例えば従来の目視やＨＥ染色等による病理診断方法の補助的手法として用いることができる。これにより、目視やＨＥ染色のみによる診断と比較してより高い精度を有し、より多くの情報が得られる腫瘍性病変の進行度評価が可能になる。
【００２８】
本発明において、前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含むことができる。これによれば、ｈＲＦＩの発現を、ｈＲＦＩタンパク質や核酸の発現量または発現領域をもって評価することができる。すなわち、ｈＲＦＩの発現を定量的にまたは発現パターンの状態に基づいて評価することができる。
【００２９】
本発明において、前記腫瘍性病変は、消化器における腫瘍性病変であることができる。これによれば、消化器における腫瘍性病変進行度を判定することができる。例えば大腸において、後述の実験例２、３より、大腸腫瘍性病変におけるｈＲＦＩの発現は、腺腫の異型性の進行に伴い、フォーカル（ｆｏｃａｌ）な発現からディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）な発現に移行していくことが明らかになった。ここで、「フォーカル（ｆｏｃａｌ）」に染色されるとは限局性染色像、具体的には後述する図２Ｂ−Ｄに示すように染色される細胞と染色されない細胞が混在する染色像を示すことを指し、また、「ディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）」に染色されるとは瀰漫性染色像、具体的には後述する図２Ｅに示すようにほぼ全ての細胞が染色される染色像を示すことを指す。従って、本発明によれば、例えばｈＲＦＩの発現領域を検討することによって、大腸腫瘍性病変の進行度を診断することができる。
【００３０】
（４）医療用キット
【００３１】
本発明の医療用キットは、ｈＲＦＩの発現を検討するための、ｈＲＦＩタンパク質または核酸との親和性のある物質を含み、本発明に係る抗癌剤感受性予測方法、本発明に係る腫瘍性病変の有無の判定方法、及び本発明に係る腫瘍性病変進行度評価方法の少なくともいずれか１つの方法に用いることができる。
【００３２】
ｈＲＦＩの発現と、抗癌剤感受性、腫瘍性病変の有無、及び腫瘍性病変進行度との間には、一定の関連が認められる。従って、前記医療用キットに含まれる物質を用いて、ｈＲＦＩの発現を検討することによって、抗癌剤感受性を予測したり、腫瘍性病変の有無を判定したり、腫瘍性病変進行度を評価したりすることができる。また、キットの態様とすることによって、操作過程を単純化、簡便化したり、操作に要する時間を短縮したりすることが可能となる。
【００３３】
本発明において、前記物質は、抗ｈＲＦＩ抗体、ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するプライマーセットを含むプライマー、及びｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するＤＮＡまたはＲＮＡプローブのうちの少なくともいずれか１つであることができる。これらを用いることによって、ｈＲＦＩの発現を簡便かつ容易に検出することができる。
【００３４】
（５）ｈＲＦＩ形質転換体を含む組成物
本発明の組成物は、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターで形質転換された形質転換体を含む抗癌剤感受性検査用組成物である。
【００３５】
本発明に係る「抗癌剤感受性検査」とは、ある抗癌剤がどの程度奏功するかを検討する検査を指す。さらに前記抗癌剤は、他の化合物と組み合わせた態様で検査することも可能である。
【００３６】
これによれば、例えば前記組成物に、抗癌剤及び／または化合物を作用させることによって、前記抗癌剤及び／または化合物の効果を検討することや、癌治療に有効な化合物のスクリーニングを行うことができる。また、前記化合物の効果や有効性を検討するには、ｈＲＦＩの発現を低下させる作用を有することを指標とすることができる。
【００３７】
（６）モデル動物
本発明のモデル動物は、ｈＲＦＩを発現している細胞を担持した、抗癌剤感受性試験用モデル動物である。
【００３８】
本発明に係る「抗癌剤感受性試験」とは、ある抗癌剤がどの程度奏功するかを検討する試験を指す。さらに前記抗癌剤は、他の化合物と組み合わせた態様でモデル動物に投与することによって試験することも可能である。
【００３９】
これによれば、例えば前記モデル動物に、抗癌剤及び／または化合物を作用させることによって、動物体内の環境において前記抗癌剤及び／または化合物の効果を検討することや、癌治療に有効な化合物のスクリーニングを行うことができる。また、前記化合物の効果や有効性を検討するには、ｈＲＦＩの発現を低下させる作用を有することを指標とすることができる。
【００４０】
本発明において、前記抗癌剤感受性試験用モデル動物は、担癌免疫不全モデル動物であることができる。
【００４１】
これによれば、例えば前記担癌免疫不全モデル動物に、抗癌剤及び／または化合物を作用させることによって、前記抗癌剤及び／または化合物が、前記担癌免疫不全モデル動物が担持する癌に及ぼす効果について検討することができる。また、免疫不全動物は異種動物由来の細胞を拒絶することができないため、例えばヒト由来の癌、具体的には手術や生検によってヒトから得られた癌等を担持させることによって、前記抗癌剤及び／または化合物が、実際にヒトの癌に及ぼす効果を検討することができる。
【００４２】
また、本発明に記載の抗癌剤感受性試験用モデル動物や担癌免疫不全モデル動物を、癌治療法の開発・改良や、癌メカニズムの解析に利用することも可能である。
【００４３】
（７）癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法
（７−１）ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドを用いたスクリーニング方法
本発明の癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする。
【００４４】
本発明によれば、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに作用してｈＲＦＩの発現または活性を低下させることによって、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【００４５】
また、本発明の癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドと、前記被験化合物との結合を検出する工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする。
【００４６】
本発明によれば、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドと直接的または間接的に結合し、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【００４７】
（７−２）核酸を用いたスクリーニング方法
本発明の癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする。
【００４８】
本発明によれば、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に作用してｈＲＦＩの発現または活性を低下させることによって、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【００４９】
また、本発明の癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記核酸と、前記被験化合物との結合を検出する工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする。
【００５０】
これによれば、前記核酸と直接的または間接的に結合し、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【００５１】
また、本発明の癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合の前記レポーター遺伝子の発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合の前記レポーター遺伝子の発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする。
【００５２】
本発明によれば、本発明における核酸がｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域を含むことによって、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域を含む核酸に作用して、癌治療に有効に作用する化合物を探索することができる。
【００５３】
ここで、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が「機能的に結合」しているとは、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に前記被験化合物が作用することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。また、前記レポーター遺伝子は、他の遺伝子と結合した融合タンパク質を発現する核酸の態様であってもよい。
【００５４】
本発明における核酸がレポーター遺伝子を含む場合、レポーター遺伝子の発現または活性を指標として、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に作用してｈＲＦＩの発現または活性を低下させる化合物を探索することができる。レポーター遺伝子を用いたスクリーニング方法は、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸を用いたスクリーニング方法よりも、発現や活性を評価しやすい場合や、発現や活性の変化を検討すると同時にセレクションを行うことが可能である場合がある。従って、このような場合は、本発明に係るスクリーニングの操作を簡便かつ容易に行うことができる。
【００５５】
（８）抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法
本発明の抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩの発現が上昇または低下している細胞における、１または２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
ｈＲＦＩの発現に操作を加えていない対照細胞における、１または２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
両者細胞間における前記遺伝子の発現量を比較する工程と、
両者細胞間で発現量が変化している遺伝子を認定する工程と、
前記発現量が変化している遺伝子の発現と、抗癌剤感受性の相関を検討する工程と
を含む。
【００５６】
これによれば、ｈＲＦＩの発現によってその発現レベルが変化し、抗癌剤感受性の規定に関わる因子としてｈＲＦＩの下流で機能する遺伝子を探索することができる。また、本発明によって、ｈＲＦＩの発現により抗癌剤感受性が変化するまでのシグナル伝達経路を解明することや、その制御を可能にすることにつながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【００５８】
１、抗癌剤感受性予測方法
本実施の形態に係る抗癌剤感受性予測方法は、抗癌剤感受性予測の対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程と、検討して得られたｈＲＦＩの発現から抗癌剤感受性を予測する工程とを含む。
【００５９】
本実施の形態において、抗癌剤感受性予測の対象となる試料は、その試料が前癌病変を含むか否かや癌病変を含むか否かによって特に限定されるものではないが、例えば、手術や生検によって得られた、抗癌剤を作用または投与する可能性のある各種組織や、１または２以上の遺伝子に変異を有することが知られている各種癌細胞であることができる。本実施の形態において前記試料は、好ましくは消化器癌細胞を含む試料である。前記消化器癌細胞を含む試料としては、例えば、大腸癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、または胆嚢癌細胞を含む試料等を挙げることができるが、本実施の形態において特に好ましくは、大腸癌細胞を含む試料である。
【００６０】
本実施の形態において、ｈＲＦＩの発現は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討することができる。前記核酸とは、例えばｍＲＮＡであることができる。ｈＲＦＩタンパク質または核酸を検討する方法は、その具体的な方法等について特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法をはじめとした種々の方法を用いることができる。
【００６１】
ｈＲＦＩの発現を検討する場合、ｈＲＦＩタンパク質または核酸の、発現量や発現領域について検討することができる。発現量を検討するとは、例えば濃度、総量、比率等の基準によって量的に発現を調べることをいい、発現領域を検討するとは、例えば発現の局在や発現場所、発現組織、発現パターン等について調べることをいう。
【００６２】
ｈＲＦＩタンパク質の発現量を検討するには、例えば、抗ｈＲＦＩ抗体を用いたウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＡＣＳ法等を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。また、前記抗体を用いた免疫染色法等を用いても、タンパク質の発現量を検討することが可能である。
【００６３】
ｈＲＦＩタンパク質の発現領域について検討するには、例えば、抗ｈＲＦＩ抗体を用いた免疫染色法等を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００６４】
本実施の形態において、抗ｈＲＦＩ抗体としては、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドを特異的に認識しうる抗体であれば特に限定されない。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、使用態様に合わせて好ましい方を選択することもできる。抗ｈＲＦＩ抗体の抗原としては、例えば、NCBI等のデータベースで公開されているｈＲＦＩタンパク質のアミノ酸配列やその部分的な配列を用いることができるが、具体的には例えば、発明者が以前に作製した、配列表の配列番号１に示すｈＲＦＩの全長ｃＤＮＡがコードするタンパク質を抗原としたウサギ抗ｈＲＦＩポリクローナル抗体（「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．５０２４−５０３０）を用いることができる。
【００６５】
ｈＲＦＩの核酸が例えばｍＲＮＡである場合、ｍＲＮＡの発現量を検討するには、例えば、ｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法等を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。また、ｍＲＮＡに対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等を用いても、ｍＲＮＡの発現量を検討することが可能である。
【００６６】
また、ｈＲＦＩの核酸が例えばｍＲＮAである場合、ｍＲＮＡの発現領域を検討するには、例えば、ｍＲＮＡに対するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００６７】
また、本実施の形態に係る抗癌剤感受性予測方法は、ｈＲＦＩの発現量と抗癌剤感受性は逆相関関係にあることを、抗癌剤感受性を予測する指標の一つとすることができる。すなわち、ｈＲＦＩの発現量が高いほど前記抗癌剤に対する感受性が低いと予測することができ、逆に、ｈＲＦＩの発現量が低いほど前記抗癌剤に対する感受性が高いと予測することができる。
【００６８】
本実施の形態において、前記抗癌剤は、代謝拮抗剤であることができる。前記代謝拮抗剤は、好ましくはフッ化ピリミジン系抗癌剤である。フッ化ピリミジン系抗癌剤とは、５−フルオロウラシルを基本骨格とする化合物であって、抗腫瘍効果を有する薬剤として用いうる化合物をいう。具体的には、例えば、５’−ＤＦＵＲ（フルツロン；ロッシュ（株）製、商品名）、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ（Ｃａｐｅ）（ゼローダ；中外製薬（株）製、商品名）、テガフール（フトラフール；大鵬薬品工業（株）製、商品名）、テガフール・ウラシル（ＵＦＴ、ＴＳ−１；大鵬薬品工業（株）製、商品名）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本実施の形態におけるフッ化ピリミジン系抗癌剤は、特に好ましくは５’−ＤＦＵＲ、Ｃａｐｅ、またはＵＦＴである。
【００６９】
また、本実施の形態において、前記抗癌剤は、プラチナ系抗癌剤であることもできる。プラチナ系抗癌剤とは、分子構造中に白金原子を含む化合物で、抗腫瘍効果を有する薬剤として用いうる化合物をいう。具体的には、例えば、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、ＣＢＤＣＡ（カルボプラチン）、ＮＤＰ（ＣＤＧＰ、ネダプラチン）、オキサリプラチン等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本実施の形態におけるプラチナ系抗癌剤は、特に好ましくはＣＤＤＰ（シスプラチン）である。
【００７０】
２、腫瘍性病変の有無の判定方法
本実施の形態に係る腫瘍性病変の有無の判定方法は、腫瘍性病変の有無の判定対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む。
【００７１】
本実施の形態において、前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含むことができる。ｈＲＦＩタンパク質または核酸を検討する方法は、その具体的な方法等について特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法をはじめとした種々の方法を用いることができ、例えば、本項目１に例示した方法を用いることができる。
【００７２】
また、本実施の形態に係る腫瘍性病変の有無の判定方法は、ｈＲＦＩが発現していることを、腫瘍性病変が存在していると判断する指標の一つとすることができる。例えば、後述の実験例２、３に示す大腸試料を用いたｈＲＦＩタンパク質の発現に関する実験結果より、ｈＲＦＩは、大腸正常組織で染色が認められず、大腸腫瘍性病変で染色が認められることが明らかになった。なお、大腸腫瘍性病変とは、大腸腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）及び大腸癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を指す。従って、ｈＲＦＩの発現が確認されれば、腫瘍性病変が存在する可能性が考えられる。
【００７３】
本実施の形態において、腫瘍性病変の有無の判定対象となる試料は、特に限定されるものではなくさまざまな試料を用いることができるが、例えば、腫瘍性病変が存在する疑いがある組織、器官の一部であることができる。本実施の形態において、前記腫瘍性病変は、好ましくは消化器における腫瘍性病変である。前記消化器としては、例えば、大腸、食道、胃、肝臓、膵臓、または胆嚢であることができるが、本実施の形態において特に好ましくは、大腸である。
【００７４】
本実施の形態に係る腫瘍性病変の有無の判定方法は、ｈＲＦＩの発現を指標とした明確かつ簡便な判定方法である。従って、本実施の形態に係る判定方法を、例えば腫瘍性病変の有無の診断方法として単独で用いることができる。また、例えば従来から行われている目視やＨＥ染色等による診断方法の補助的方法としても用いることができる。これらによって、腫瘍性病変の有無を正確かつ客観的に判定・診断することが可能になる。
【００７５】
３、腫瘍性病変進行度評価方法
本実施の形態に係る腫瘍性病変進行度評価方法は、腫瘍性病変進行度の評価対象となる試料についてｈＲＦＩの発現を検討する工程を含む。
【００７６】
本実施の形態において、前記ｈＲＦＩの発現を検討する工程は、ｈＲＦＩタンパク質または核酸に基づいて検討する工程を含むことができる。ｈＲＦＩタンパク質または核酸を検討する方法は、その具体的な方法等について特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法をはじめとした種々の方法を用いることができ、例えば、本項目１に例示した方法を用いることができる。本実施の形態において好ましいｈＲＦＩタンパク質または核酸を検討する方法は、ｈＲＦＩタンパク質またはｍＲＮＡの発現領域を検討する方法である。
【００７７】
本実施の形態において、腫瘍性病変進行度の評価対象となる試料は、腫瘍性病変を有する疑いがある試料であれば特に限定されるものではなく、さまざまな試料を用いることができる。本実施の形態において、前記腫瘍性病変は、好ましくは消化器における腫瘍性病変である。前記消化器としては、例えば、大腸、食道、胃、肝臓、膵臓、または胆嚢であることができるが、本実施の形態において特に好ましくは、大腸である。
【００７８】
例えば、後述の実験例２、３に示す大腸試料を用いたｈＲＦＩタンパク質の発現に関する実験結果より、大腸腫瘍性病変におけるｈＲＦＩの発現は、腺腫の異型度の進行に伴い、フォーカル（ｆｏｃａｌ）な染色像からディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）な染色像に移行していくことが明らかになった。この結果から、例えば大腸腫瘍性病変進行度の評価対象となる試料において、ｈＲＦＩの発現領域を検討し、フォーカル（ｆｏｃａｌ）からディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）への移行度を検討することによって、大腸腫瘍性病変の進行度を評価することができると考えられる。
【００７９】
本実施の形態に係る腫瘍性病変進行度評価方法は、ｈＲＦＩの発現を指標とした、斬新な評価方法である。従って、本実施の形態に係る評価方法を、例えば腫瘍性病変の進行度の診断方法として単独で用いることができる。また、例えば従来から行われている目視やＨＥ染色等による診断方法の補助的方法としても用いることができる。これらによって、腫瘍性病変の進行度を正確かつ客観的に評価・診断することが可能になる。
【００８０】
４、医療用キット
本実施の形態に係る医療用キットは、ｈＲＦＩの発現を検討するための、ｈＲＦＩタンパク質または核酸との親和性のある物質を含み、本実施の形態に係る抗癌剤感受性予測方法（本項目１）、本実施の形態に係る腫瘍性病変の有無の判定方法（本項目２）、及び本実施の形態に係る腫瘍性病変進行度評価方法（本項目３）のうちの、少なくともいずれか１つの方法に用いることができる。
【００８１】
ｈＲＦＩタンパク質または核酸との親和性のある物質としては、ｈＲＦＩの発現を検出する目的に用いることができる物質であれば特に限定されない。また、検出対象として、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチド、あるいはｈＲＦＩの核酸、例えばｍＲＮＡについての、発現量や発現領域等を挙げることができる。本実施の形態において好ましい前記物質としては、抗ｈＲＦＩ抗体、ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するプライマーセットを含むプライマー、及びｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するＤＮＡまたはＲＮＡプローブのうちの少なくともいずれか１つを挙げることができる。
【００８２】
本実施の形態に係る医療用キットを用いた、前記物質を用いたｈＲＦＩの発現の具体的検討方法を以下に例示する。なお、医療用キットに含まれる物質及びｈＲＦＩの発現の検討方法等は、無論以下の例に限定されるものではない。
【００８３】
本実施の形態に係る医療用キットに、例えば抗ｈＲＦＩ抗体が含まれる場合は、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ＦＡＣＳ法等によりｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドの発現量を検討したり、免疫染色法等によりｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドの発現領域を検討したりすることができる。前記抗ｈＲＦＩ抗体としては、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドを特異的に認識しうる抗体であれば特に限定されない。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、使用態様に合わせて好ましい方を選択することもできる。抗ｈＲＦＩ抗体の抗原としては、例えば、NCBI等のデータベースで公開されているｈＲＦＩタンパク質のアミノ酸配列やその部分的な配列を用いることができるが、具体的には例えば、発明者が以前に作製した、配列表の配列番号１に示すｈＲＦＩの全長ｃＤＮＡがコードするタンパク質を抗原としたウサギ抗ｈＲＦＩポリクローナル抗体（「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．５０２４−５０３０）を用いることができる。
【００８４】
本実施の形態に係る医療用キットに、例えばｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するプライマーセットを含むプライマーが含まれる場合は、ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ法等によりｈＲＦＩのｍＲＮＡの発現量を検討することができる。前記ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するプライマーセットとしては、ｈＲＦＩのｍＲＮＡの発現を特異的に検出及び／または定量することができ、ＰＣＲ産物がアガロースゲル電気泳動等によって検出可能な長さのものであれば、特に限定されない。前記プライマーセットとしての正向きと逆向きの２本のオリゴヌクレオチド配列は、例えば、NCBI等のデータベースで公開されているｈＲＦＩタンパク質をコードする塩基配列や配列表の配列番号１に示した塩基配列等、及びこれらの相補配列より選択することができ、好ましくは、１５塩基以上の長さを有する配列である。具体的には、配列表の配列番号２と配列番号３に示したオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００８５】
本実施の形態に係る医療用キットに、例えばｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するＤＮＡまたはＲＮＡプローブが含まれる場合は、ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法やノーザンブロッティング法等を用いて、ｈＲＦＩのｍＲＮＡの発現量や発現領域を検討することができる。前記ｈＲＦＩのｍＲＮＡに対するＤＮＡまたはＲＮＡプローブとしては、ｈＲＦＩのｍＲＮＡの発現を特異的に検出及び／または定量することができるプローブであれば、特に限定されない。前記プローブが有する塩基配列としては、例えば、NCBI等のデータベースで公開されているｈＲＦＩタンパク質をコードする塩基配列や配列表の配列番号１に示した塩基配列等の相補配列より選択することができる。具体的には例えば、配列表の配列番号１に記載した塩基配列を有する核酸を鋳型とし、配列番号２と配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを得ることができる。
【００８６】
５、ｈＲＦＩ形質転換体を含む組成物
本発明の組成物は、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターで形質転換された形質転換体を含む抗癌剤感受性検査用組成物である。
【００８７】
本実施の形態に係るｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸は、例えば、配列表の配列番号１に示された塩基配列の全部または一部や、NCBI等のデータベースで公開されているｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む塩基配列の全部または一部を含むことができる。また、前記核酸の塩基配列の全部または一部には、そのコードするアミノ酸配列を変更しない塩基配列に変更した塩基配列を用いることや、１または２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／または挿入されたアミノ酸配列を有するｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードするように変更した塩基配列を用いることもできる。
【００８８】
本実施の形態に用いうるベクターとしては、形質転換した細胞の中で前記ベクターに組み込んだ塩基配列がコードするタンパク質や部分ペプチド、またはその核酸、例えばｍＲＮＡ等を発現することができれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクターやウィルスベクター等を用いることができる。
【００８９】
本実施の形態における組換えベクターからのｈＲＦＩタンパク質や部分ペプチド、またはその核酸、例えばｍＲＮＡ等の発現は、一時的な発現であっても恒常的な発現であってもよい。また、その発現は、用いたベクターが有する特性を利用して制御することが可能である。例えば、本実施の形態に係る形質転換体は、トランスフェクション数時間後からｈＲＦＩタンパク質を徐々に発現しはじめる形質転換体や、テトラサイクリン等を用いた遺伝子発現調節システムによってｈＲＦＩタンパク質の発現のオン／オフを転写レベルで制御できる形質転換体であることができる。また、本実施の形態に係る組換えベクターは、形質転換する細胞のゲノムに組み込まれるものであっても、ゲノムに組み込まれないものであってもよい。前者のゲノムに組み込まれたクローンを選抜する場合には、例えば、用いた組換えベクターが有する薬剤耐性遺伝子の発現を、選択マーカーとして利用することができる。具体的には、例えばｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社製）を用いた場合、前記ベクターはネオマイシン耐性遺伝子を有するため、培地にＧ４１８を適当濃度になるように添加することよって、生き残ったクローン、すなわち前記ベクターがゲノムに組み込まれたクローンを選別することができる。
【００９０】
形質転換する細胞としては、核酸を導入しうる細胞であれば特に限定されるものではなく、原核細胞でも真核細胞でもよい。具体的には、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等を用いることができる。また、例えば株化細胞でも初代培養細胞でもよく、例えば上皮細胞でも線維芽細胞でもよい。動物細胞としては、例えば、癌細胞を用いることができる。癌細胞としては、種々の癌細胞を用いることができるが、本実施の形態における癌細胞は、消化器癌細胞であることが好ましい。消化器癌細胞としては、大腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌等の細胞を用いることができるが、本実施の形態において特に好ましくは、大腸癌細胞である。例えば、株化された大腸癌細胞としては、具体的には、Ｃ１０、Ｃ３２、Ｃ７０、Ｃ８０、Ｃ８４、Ｃ９９、Ｃ１０６、Ｃ１２５、ＣＡＣ０２、ＣＯＬＯ２０１、ＣＯＬＯ２０５、ＣＯＬＯ３２０、ＣＯＬＯ６７８、ＣＯＬＯ７４１、ＣＸ１、ＤＬＤ１、ＧＰ２Ｄ、ＨＣＡ４６、ＨＣＡ７、ＨＣＴ８、ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６、ＨＲＡ１９、ＨＴ２９、ＨＴ５５、ＪＷ、ＬＩＭ１８６３、ＬＯＶＯ、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１８０、ＬＳ４１１、ＬＳ１０３４、ＰＣ、ＳＫＣ０１、ＳＷ４８、ＳＷ４０３、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＷ８３７、ＳＷ９４８、ＳＷ１１１６、ＳＷ１２２２、ＳＷ１４１７、ＶＡＣＯ４Ａ、ＶＡＣＯ４Ｓ、ＶＡＣＯ５、ＶＡＣＯ１０、ＷｉＤｒ等を用いることができるが、無論これらに限定されるものではない。本実施の形態における好ましい大腸癌細胞として例えば、ＴＮＦ−α等の刺激によるアポトーシス感受性が高い細胞株として知られるＨＣＴ１１６を挙げることができる。前記大腸癌細胞としてＨＣＴ１１６を用いた場合は、本実施の形態に係る形質転換体は、例えば、ｈＲＦＩタンパク質をステイブルに発現するＨＣＴ１１６であることができる。これによれば、ｈＲＦＩタンパク質をコードする核酸がゲノムに組み込まれているため、ｈＲＦＩを安定して発現することができる。
【００９１】
組換えベクターを用いて形質転換する方法としては、細胞に核酸を導入しうる方法であれば特に限定されず、例えば、当業者に公知の手法を利用することができる。具体的には、例えば、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、アデノウィルスベクター法、レトロウィルスベクター法、アデノ随伴ウィルス（ＡＶＶ）ベクター法等を用いることができる。
【００９２】
本実施の形態に係る抗癌剤感受性検査用組成物に含まれる形質転換体においてｈＲＦＩの発現が高い場合は、前記形質転換体は、ｈＲＦＩの発現と逆相関関係を有する抗癌剤に対して抵抗性を示すことができる。前記抗癌剤としては、例えば、本項目１に例示した抗癌剤であることができる。そこで、例えば、前記組成物に、前記抗癌剤と化合物を組み合わせて作用させることによって、癌治療に有効な化合物のスクリーニングを行うことができる。前記化合物は、例えば、ｈＲＦＩの発現を低下させることによって抗癌剤感受性を高める作用を有する化合物であることができる。
【００９３】
以下に、本実施の形態に係る抗癌剤感受性検査用組成物の使用態様の具体例を示す。本具体例では、抗癌剤感受性検査用組成物に含まれる形質転換体として、ｈＲＦＩタンパク質をステイブルに発現するＨＣＴ１１６を用いる。なお、本実施の形態に係る抗癌剤感受性検査用組成物の用途や使用態様は、無論本具体例に限定されるものではない。
【００９４】
まず、種々の化合物データベースやソフトウェアを用いた立体構造のモデリング等によって、ｈＲＦＩタンパク質との結合が予想される化合物を予想、選択する。
【００９５】
次に、抗癌剤感受性検査用組成物に、前記化合物及び本項目１に具体的に例示したいずれかの抗癌剤を作用させる。
【００９６】
この結果、前記抗癌剤感受性検査用組成物中のｈＲＦＩタンパク質をステイブルに発現するＨＣＴ１１６が示す抗癌剤抵抗性が、親株が示す抗癌剤抵抗性と比較して低下した場合は、前記化合物は、前記抗癌剤感受性を高める効果を有すると判断できる。なお、前記化合物は、例えばさらに化学的に修飾されることによって、より効果が高く安全性等に優れた化合物に改善されることもできる。
【００９７】
６、モデル動物
本実施の形態に係るモデル動物は、ｈＲＦＩを発現している細胞を担持した、抗癌剤感受性試験用モデル動物であることができる。
【００９８】
本実施の形態に係るモデル動物としては、例えば、マウス、ゼブラフィッシュ、キイロショウジョウバエ、センチュウ等を挙げることができるが、本実施の形態における好ましいモデル動物は、マウスである。マウスを用いた場合は、旺盛な繁殖力を持ち、遺伝子レベルでヒトと非常に近い関係にある等の研究上の利点を利用することができる。
【００９９】
本実施の形態に係るｈＲＦＩを発現している細胞としては、ｈＲＦＩを一時的、または恒常的に発現することができる細胞であればその細胞の種類について特に限定されるものではなく、さまざまな細胞を用いることができる。例えば、正常細胞や癌細胞であることができ、また、ヒト由来の細胞やマウス由来の細胞、またはそれ以外の生物由来の細胞であることができる。
【０１００】
本実施の形態に係るｈＲＦＩを発現している細胞は、遺伝子組換え等の人工的な手法を用いてｈＲＦＩを発現させた細胞でも、人工的な手法を用いることなくｈＲＦＩを発現している細胞でもよい。前者の例としては、本項目５、ｈＲＦＩ形質転換体を含む組成物に含まれるｈＲＦＩ形質転換体、ｈＲＦＩ遺伝子をノックインすることによってｈＲＦＩを発現するようになった細胞、ｈＲＦＩ遺伝子以外の遺伝子をノックインまたはノックアウトすることによってｈＲＦＩを発現するようになった細胞等を挙げることができる。また、後者の例としては、ｈＲＦＩを発現していることを特徴とする株化細胞、初代培養細胞、手術や生検によって得られた組織から採取した細胞等を挙げることができる。本実施の形態に係るｈＲＦＩを発現している細胞は、無論これらの例に限定されるものではない。
【０１０１】
本実施の形態に係る抗癌剤感受性試験用モデル動物について、ｈＲＦＩの発現または活性について検討する場合は、その具体的な方法等について特に限定されるものではなく種々の方法を用いることができる。ｈＲＦＩの発現について検討する場合は、例えば、本項目１に例示したｈＲＦＩタンパク質または核酸を検討する方法を用いることができる。ｈＲＦＩの活性について検討する場合は、例えば、ｈＲＦＩの有する機能として知られている、ＴＮＦ−αによって誘導されるアポトーシスの阻害能の変化を検討する方法を用いることができる。
【０１０２】
本実施の形態に係る抗癌剤としては、例えば、本項目１に例示した抗癌剤であることができる。後述の実験例７より、本項目１に例示した抗癌剤感受性とｈＲＦＩの発現量との間には、逆相関関係があることが明らかになった。従って、本実施の形態に係るｈＲＦＩを発現している細胞を担持した抗癌剤感受性試験用モデル動物は、少なくともｈＲＦＩを発現している細胞を有する部位において、前記抗癌剤に対する感受性が低いと考えられる。そこで、本実施の形態に係る抗癌剤試験用モデル動物に、化合物を例えば前記抗癌剤と組み合わせた態様で投与することによって、前記化合物が抗癌剤感受性に及ぼす効果を検討することができる。
【０１０３】
また、本実施の形態に係る抗癌剤感受性試験用モデル動物の作製方法は、結果としてモデル動物にｈＲＦＩを発現している細胞を担持させることができれば特に限定されない。また、前記細胞を担持する部位は、モデル動物の体の一部分でも体全体でもよく、試験態様に合わせて好ましい方を選択することができる。体の一部分に担持させる手法としては、例えば、移植等の手法を用いることができる。移植の具体的方法は、移植片を移植針にて移植する方法、細胞懸濁液を注射針で移植する方法等、当業者に公知の手法を用いることができる。移植する部位としては特に限定されないが、例えば背部皮下であることができる。一方、体全体に担持させる手法としては、例えば、ノックアウト動物やトランスジェニック動物等の遺伝子改変動物の作製方法等を用いることができる。
【０１０４】
また、前記抗癌剤感受性試験用モデル動物は、好ましくは担癌免疫不全モデル動物であることができる。免疫不全動物は、異種生物由来の細胞を移植されても拒絶できず安定して保持することができる。また、担癌免疫不全モデル動物は、例えば、ヒト癌担癌免疫不全モデル動物であることができる。前記ヒト癌担癌免疫不全モデル動物は、ヒト癌細胞を担持した免疫不全動物である。これによれば、前記ヒト癌に対する抗癌剤感受性や、前記抗癌剤と組み合わせて投与した化合物が前記抗癌剤感受性に及ぼす効果を検討することができる。
【０１０５】
前記免疫不全モデル動物としては、ヌードマウスやスキッドマウス等のマウスを用いることが好ましい。これによれば、前述のように、旺盛な繁殖力を有することや、遺伝子レベルでヒトと非常に近い関係にあること等の研究上のマウスの利点を利用することができる。
【０１０６】
また、前記担癌免疫不全モデル動物が担持する癌としては特に限定されるものではないが、例えば、本項目１に例示した消化器癌であることができる。本実施の形態において、好ましくは大腸癌である。
【０１０７】
また、癌を免疫不全モデル動物に担持させる手段としては、結果として免疫不全モデル動物に癌を担持させることができれば特に限定されず、例えば、手術や生検によって得られた癌組織を移植する方法を用いることができる。癌組織の移植の具体的方法は、移植片を移植針にて移植する方法、癌細胞懸濁液を注射針で移植する方法等、当業者に公知の手法を用いることができる。移植する部位としては特に限定されないが、例えば背部皮下であることができる。また、癌組織ではなく、株化された癌細胞や遺伝子導入等によって癌化した細胞を免疫不全モデル動物に移植して癌を発生させる方法を用いることもできる。ここで、癌化した細胞とは、異常な分裂能、増殖能、浸潤能、または転移能等の性質を獲得した細胞を指す。これらの細胞の移植の具体的方法としては、癌細胞懸濁液を注射針で移植する方法等、当業者に公知の手法を用いることができる。
【０１０８】
これらの癌や癌細胞等を担持させる部位は、免疫不全モデル動物の体の一箇所でも複数箇所でもよく、試験態様に合わせて好ましい部位を選択することができる。
【０１０９】
また、本実施の形態に係る抗癌剤感受性試験用モデル動物が担持するｈＲＦＩを発現している細胞は、例えば、担癌免疫不全モデル動物が担持する癌に含まれる細胞であることができる。これによれば、ｈＲＦＩの発現または活性の変化を指標として、本実施の形態に係る抗癌剤感受性試験用モデル動物が担持する癌に対する抗癌剤感受性や、前記抗癌剤と組み合わせて投与した化合物が前記抗癌剤感受性に及ぼす効果を検討することができる。
【０１１０】
７、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法
後述の実験例７より、本発明者は、本項目１に例示した抗癌剤感受性とｈＲＦＩの発現量との間には、逆相関関係があることを明らかにした。すなわち、ｈＲＦＩの発現量が高いほど抗癌剤感受性が低く、ｈＲＦＩの発現量が低いほど抗癌剤感受性が高いことが明らかになった。
【０１１１】
これらの事実から、ｈＲＦＩの発現または活性を低下させる作用がある化合物は、抗癌剤感受性を高めることができ、癌治療に有効であると考えられる。従って、ｈＲＦＩの発現または活性を低下させる作用がある化合物をスクリーニングにより同定することにより、前記抗癌剤感受性を高め、癌治療に有効な化合物を同定することができる。また、このような癌治療に有効な化合物を同定することは、従来より効果的な抗癌剤治療の開発につながると考えられる。
【０１１２】
ここで、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法におけるスクリーニングの指標として、以下の２つが挙げられる。すなわち、（１）ｈＲＦＩの発現または活性が低下していることを指標の一つとするスクリーニング方法と、（２）ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流に機能的に結合したレポーター遺伝子の発現または活性が低下していることを指標の一つとするスクリーニング方法である。以下に、これらの指標を用いたスクリーニング方法を詳細に説明する。
【０１１３】
７−（１）、ｈＲＦＩの発現または活性が低下していることを指標の一つとするスクリーニング方法
本実施の形態に係るスクリーニング方法において、被験化合物を作用させる物質は、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドであることができる。
【０１１４】
すなわち、本実施の形態に係るスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法である。
【０１１５】
また、本実施の形態に係るスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドと、前記被験化合物との結合を検出する工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法である。
【０１１６】
本実施の形態に係る、上記のｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドを用いたスクリーニング方法によれば、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに作用させた後のｈＲＦＩの発現または活性の低下を指標の一つとして、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【０１１７】
本実施の形態に係るｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドは、細胞内で強制発現させたｈＲＦＩでも、細胞内に人工的操作を加えずに存在しているｈＲＦＩでもよい。細胞内で強制発現させたｈＲＦＩである場合、そのｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドが有するアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ等のデータベースで公開されているｈＲＦＩタンパク質のアミノ酸配列や配列表の配列番号４に示したアミノ酸配列の全部または一部を含むことができる。また、これらのアミノ酸配列から、１または２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／または挿入されたアミノ酸配列を有するｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドを用いることもできる。
【０１１８】
また、本実施の形態に係るスクリーニング方法において、被験化合物を作用させる物質は、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸であることができる。
【０１１９】
すなわち、本実施の形態に係るスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法である。
【０１２０】
また、本実施の形態に係るスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記核酸と、前記被験化合物との結合を検出する工程と、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合のｈＲＦＩの発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法である。
【０１２１】
本実施の形態に係る、上記核酸を用いたスクリーニング方法によれば、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸に作用させた後のｈＲＦＩの発現または活性の低下を指標の一つとして、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【０１２２】
本実施の形態に係る核酸は、外来性の核酸でも内在性の核酸でもよい。また、前記核酸は、ゲノムに組み込まれた態様で存在しても組み込まれない態様で存在してもよい。また、その塩基配列は、ＮＣＢＩ等のデータベースで公開されているｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む塩基配列や配列表の配列番号１に示した塩基配列の全部または一部を含むことができる。また、これらのｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域を含む塩基配列の全部または一部は、１または２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／または挿入された塩基配列や、プロモーター領域を含む塩基配列の一部分を複数回繰り返した塩基配列を用いることもできる。また、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む塩基配列の全部または一部は、そのコードするアミノ酸配列を変更しない塩基配列に変更した塩基配列を用いることや、１または２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／または挿入されたアミノ酸配列を有するｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードするように変更した塩基配列を用いることもできる。
【０１２３】
７−（２）、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流に機能的に結合したレポーター遺伝子の発現または活性が低下していることを指標の一つとするスクリーニング方法
本実施の形態に係るスクリーニング方法において、被験化合物を作用させる物質は、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した核酸であることができる。
【０１２４】
すなわち、本実施の形態に係るスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した核酸に、１または２以上の被験化合物を作用させる工程と、
前記被験化合物を作用させた場合の前記レポーター遺伝子の発現または活性の変化を検討する工程と
を含み、
前記被験化合物を作用させた場合の前記レポーター遺伝子の発現または活性が、前記被験化合物を作用させない場合と比較して低下していることを、前記被験化合物の癌治療における有効性を判断する指標の一つとする、癌治療に有効な化合物のスクリーニング方法である。
【０１２５】
レポーター遺伝子に機能的に結合しているｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域は、本来、ｈＲＦＩ遺伝子の発現を制御しているものである。従って、本実施の形態に係る、上記核酸を用いたスクリーニング方法によれば、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した核酸に作用させた後のレポーター遺伝子の発現または活性の低下を指標の一つとして、癌治療に有効に作用する化合物を検索することができる。
【０１２６】
本実施の形態に係るレポーター遺伝子は特に限定されるものではないが、例えば当業者に公知のレポーターアッセイに用いることができるルシフェラーゼ遺伝子や、顕微鏡観察によって発現の有無の判定が可能であるＧＦＰ遺伝子、また、酵母において発現または活性の検討と同時にセレクションを行うことができるヒスチジン栄養性機能遺伝子等であることができる。
【０１２７】
７−（３）、７−（１）及び７−（２）に係るスクリーニング方法における実施の態様
【０１２８】
本実施の形態に係る被験化合物は特に限定されるものではなく、どのような化合物でも用いることができ、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、低分子化合物、脂質等であることができる。
【０１２９】
また、前記被験化合物は、ライブラリーの態様であることもできる。これによれば、癌の治療に有効に作用すると考えられる化合物を網羅的にスクリーニングすることができる。
【０１３０】
前記被験化合物を得る手段としては特に限定されず、あらかじめ用意された化合物を用いることや、新たに作製した化合物を用いることができる。あらかじめ用意された化合物を用いる場合は、例えば、ウェブ上で公開されているさまざまな化合物情報データベースを利用することができる。前記データベースとしては、例えば、ＮＣＩ（米国国立がん研究所）等で公開されている化合物データベースを用いることができる。新たに作製した化合物を用いる場合は、例えば、特定の新薬開発目的で合成した独自の化合物群等を用いることができる。特定の新薬は、例えば、本項目１に例示した抗癌剤の補助剤であることができる。ここで、抗癌剤の補助剤とは、抗癌剤と組み合わせて用いることによってその抗癌剤感受性効果を高める作用がある化合物を指す。また、前記化合物群を合成するには、例えば、コンビナトリアル・ケミストリー等の技術を用いることができる。
【０１３１】
本実施の形態に係る被験化合物としては前述のようにあらゆる化合物を用いることができるが、活性等を予測されることによってあらかじめ選別されることも可能である。前記予測には、さまざまなデータベースに加えて、種々のソフトウェア等を利用することができる。ソフトウェアとしては、例えば、その化合物の薬理活性や、薬物動態、毒性等を事前に検証することができるソフトウェアや、化合物の体内での挙動をあらかじめ検証することができるソフトウェア等を挙げることができる。このような手段を利用することによって、コンピュータ上で大量の化合物を高速で検証することが可能になり、化合物のスクリーニング自体やその後の最適化ステップにかかる時間や労力、コスト等を削減できることが期待できる。
【０１３２】
本実施の形態において、前記ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチド、または、前記核酸は、例えば、細胞中または細胞抽出液中、あるいは、動物体内中に存在する態様であることができる。
【０１３３】
前記細胞または細胞抽出液は、例えば、消化器癌由来の細胞または細胞抽出液であることができる。これによれば、細胞中または細胞抽出液中の環境で癌治療に有効な化合物を探索することができる。前記消化器癌は、例えば、本項目１に例示した消化器癌であることができる。本実施の形態においては、好ましくは大腸癌である。
【０１３４】
前記動物は、例えば、本実施の形態に係る抗癌剤感受性試験用モデル動物であることができ、これによれば、動物の体内環境において癌治療に有効な化合物を探索することができる。また、前記化合物が生体に引き起こす副作用等についても検討することができる。
【０１３５】
本実施の形態において、前記被験化合物を作用させる方法は特に限定されない。前記被験化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作用させる場合は、例えば適切なバッファー中で、前記タンパク質または部分ペプチド自体、または、前記核酸自体と、前記被験化合物の一定量を、一定時間混合する方法を用いることができる。また、前記被験化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで作用させる場合は、例えば、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチド等を発現している細胞を培養している培地に前記被験化合物を一定濃度で一定時間添加する方法や、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチド等を発現している細胞を有する動物に前記被験化合物を注射等により投与する方法を用いることができる。
【０１３６】
ｈＲＦＩまたはレポーター遺伝子の発現または活性を検討する工程は、その具体的な方法等について特に限定されるものではなく種々の方法を用いることができる。ｈＲＦＩの発現について検討する場合は、例えば、本項目１に例示したｈＲＦＩタンパク質または核酸を検討する方法を用いることができる。また、ｈＲＦＩの活性について検討する場合は、例えば、ｈＲＦＩの有する機能として知られている、ＴＮＦ−αによって誘導されるアポトーシスの阻害能の変化を検討する方法を用いることができる。レポーター遺伝子の発現について検討する場合は、例えば、ＧＦＰ遺伝子等を用いて顕微鏡観察する方法を用いることができる。レポーター遺伝子の活性について検討する場合は、例えば、当業者に公知のルシフェラーゼ遺伝子等を用いたレポーターアッセイを用いることができる。
【０１３７】
本実施の形態に係るスクリーニング方法によって得られる癌治療に有効な化合物が、ｈＲＦＩまたはレポーター遺伝子の発現または活性を低下させる作用機序については特に限定されるものではない。
【０１３８】
本実施の形態に係るスクリーニング方法は、前記ｈＲＦＩタンパク質やペプチド、または、前記核酸と、被験化合物との結合を検出する工程を含むことができる。これによれば、前記タンパク質またはペプチド、または前記核酸に、前記被験化合物が直接的または間接的に結合するか否かを確認することができる。
【０１３９】
前記結合を検出する手法は特に限定されるものではなく、さまざまな手法を用いることができる。
【０１４０】
被験化合物を作用させる物質が、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドである場合は、適切なバッファー、例えば０．１％  ＮＰ−４０／ＰＢＳ中で、一定温度で一定時間混合するｉｎ  ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ法を用いて、例えば直接的に結合するか否かを検討することができる。また、抗ｈＲＦＩ抗体を用いた免疫沈降法を用いることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて直接的または間接的に結合するか否かを検討することができる。また、前記被験化合物が例えばｃＤＮAライブラリーの態様である場合は、当業者に公知の酵母２−ハイブリッドスクリーニング（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ-ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）等の手法を用いることによって、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドに相互作用を示す遺伝子を標的としてスクリーニングを行うことができる。
【０１４１】
被験化合物を作用させる物質が、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域、及び／または、ｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする領域を含む核酸である場合は、例えば、当業者に公知のゲルシフトアッセイ等を用いて、前記核酸に直接的または間接的に結合するか否かを検討することができる。また、前記被験化合物が例えばｃＤＮＡライブラリー等の態様である場合は、当業者に公知の酵母１−ハイブリッドスクリーニング（ｙｅａｓｔ  ｏｎｅ-ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）等の手法を用いることによって、前記核酸に相互作用を示す遺伝子を標的としてスクリーニングを行うことができる。また、前記被験化合物が、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に結合する化合物であることが確認された場合は、前記化合物は、例えば、ｈＲＦＩの上流で機能しｈＲＦＩの発現を制御する転写因子である可能性や、ｈＲＦＩの転写因子がｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に結合するのを阻害する作用を有する化合物である可能性等が考えられる。また、前記被験化合物がｈＲＦＩタンパク質または部分ペプチドをコードする核酸、例えばｍＲＮＡに結合する化合物であることが確認された場合は、前記化合物は、例えばｈＲＦＩタンパク質の発現を阻止する作用を有する化合物、例えばアンチセンスＲＮＡやｓｉＲＮＡである可能性等が考えられる。
【０１４２】
被験化合物を作用させる物質が、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合した核酸である場合は、前記被験化合物が、前記ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に直接的または間接的に結合するか否かを検討する。具体的な方法としては、例えば、当業者に公知のゲルシフトアッセイ等を用いることができる。また、前記被験化合物が、ｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に結合する化合物であることが確認された場合は、前記化合物は、例えば、ｈＲＦＩの上流で機能しｈＲＦＩの発現を制御する転写因子である可能性や、ｈＲＦＩの転写因子がｈＲＦＩ遺伝子のプロモーター領域に結合するのを阻害する作用を有する化合物である可能性等が考えられる。
【０１４３】
本実施の形態において、癌治療における癌の種類は特に限定されるものではなく、種々の癌治療に有効な化合物を探索するために本実施の形態に係るスクリーニング方法を用いることができるが、前記癌は、例えば、消化器癌であることができる。前記消化器癌としては、例えば、本項目１に例示した消化器癌であることができ、本実施の形態において好ましくは大腸癌である。
【０１４４】
また、本実施の形態に係るスクリーニングによって得られた化合物は、抗癌剤の補助剤であることができる。前記化合物が抗癌剤の補助剤である場合、これまで前記抗癌剤の効果が低かった癌に対して抗癌剤感受性を高めるために用いることができる。また、前記化合物を用いて研究を進めることによって、ｈＲＦＩの詳しい機能や前記抗癌剤の作用機序の解明につながる可能性がある。なお、前記抗癌剤としては、例えば、本項目１に記載の抗癌剤であることができる。
【０１４５】
８、抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法
本実施の形態に係るスクリーニング方法は、
ｈＲＦＩの発現が上昇または低下している細胞における、１または２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
ｈＲＦＩの発現に操作を加えていない対照細胞における、１または２以上の遺伝子の発現量を検討する工程と、
両者細胞間における前記遺伝子の発現量を比較する工程と、
両者細胞間で発現量が変化している遺伝子を認定する工程と、
前記発現量が変化している遺伝子の発現と、抗癌剤感受性の相関を検討する工程と
を含む、抗癌剤感受性に関連する遺伝子のスクリーニング方法である。
【０１４６】
これによれば、ｈＲＦＩの発現によってその発現レベルが変化し、抗癌剤感受性の規定に関わる遺伝子を探索することができる。本実施の形態に係るスクリーニング方法によって得られた遺伝子が、抗癌剤感受性を高めるまたは低める作用を有していれば、前記遺伝子は、ｈＲＦＩ遺伝子の下流に位置し、ｈＲＦＩの発現から抗癌剤感受性の規定までのシグナル伝達経路に関わる遺伝子であると考えられる。従って、本実施の形態に係るスクリーニング方法によって、ｈＲＦＩの発現により抗癌剤感受性が変化するまでのシグナル伝達経路を解明することや、その制御を目的とした化合物のターゲットを選択することが可能になる。前記化合物は、例えば、抗癌剤としての候補化合物や、抗癌剤感受性を高める癌治療に有効な化合物であることができる。
【０１４７】
ｈＲＦＩの発現レベルが異なる細胞における１または２以上の遺伝子の発現量を比較検討、認定する具体的手法は特に限定されるものではなく、種々の方法を用いることができるが、例えば、当業者に公知のマイクロアレイやサブトラクション法等を用いることができる。
【０１４８】
ｈＲＦＩの発現レベルの変化によって発現量が変化すると認定された遺伝子の発現と、抗癌剤感受性の相関を検討する具体的手法としては特に限定されるものではなく、種々の方法を用いることができるが、例えば、Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｄ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（アフィメトリックス社製）、Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ法等によることができる。
【０１４９】
本実施の形態において、前記抗癌剤は、例えば、本項目１に例示の抗癌剤を用いることができる。これによれば、これらの抗癌剤に対する感受性の規定に関わる遺伝子をスクリーニングすることができる。
【実施例１】
【０１５０】
以下、本発明を実験例に基づき、図面を参照しながら具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されない。
【０１５１】
（実験例１）大腸癌細胞株におけるｈＲＦＩの発現と抗ｈＲＦＩ抗体の特異性の確認
（１）３種類の大腸癌細胞株、ＨＣＴ１１６、ＷｉＤｒ、Ｃｏｌｏ３２０におけるｈＲＦＩの発現を確認した。それぞれの細胞からＲＩＰＡバッファー（１％  ＮＰ−４０、１１．５ｍＭ  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）によりライセートを抽出し、その２０μｇを用い、当業者に公知のウェスタンブロット法によって、ｈＲＦＩの発現を確認した。一次抗体は、発明者が以前に作製したウサギ抗ｈＲＦＩポリクローナル抗体を用い（「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．５０２４−５０３０）、二次抗体は、ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイ（株）製）を用いた。
【０１５２】
（２）結果を図１に示す。図１より、用いた大腸癌細胞株３種類すべてにおいて、ｈＲＦＩのバンドが、分子量約４３ｋＤａの位置に特異的に検出されることがわかった。
【０１５３】
（実験例２）大腸ポリープにおけるｈＲＦＩの免疫組織学的染色
（１）ｈＲＦＩの発現を、大腸ポリープ、癌病変を用いて、免疫組織学的手法により検討した。大腸癌は、東京大学にて１９９８年から２０００年の間に外科手術をうけたものを、大腸ポリープは、１９９３年から１９９６年の間に内視鏡的切除されたものを用いた。サンプルは、ホルマリン固定してパラフィン包埋し、厚さ３μｍにスライスしてポリリジンコートしたスライドグラスにマウントした。切片の一枚は、当業者に公知のＨＥ染色法によって、組織化学的に検討した。
【０１５４】
（２）それぞれの切片を、実験例１で用いた抗ｈＲＦＩ抗体によって染色し、ｈＲＦＩの発現を検討した。染色は、次に記載するＳＡＢ法により、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイ（株）製）を用いて、付属のプロトコールに従い行った。まず、スライドを、キシレンによって１５分間脱パラフィン処理した後、一連の濃度勾配を有するアルコール槽に浸していき、その後ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。続いて、スライドを２１分間超音波処理し、再びＰＢＳで洗浄した。次に、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、１．５％Ｈ２Ｏ２含有メタノールでスライドを２５分間インキュベートし、続いてＰＢＳを用いて洗浄した。次に、ブロッキングバッファー（ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット：ニチレイ（株）製））を用いて非特異的結合領域をブロックし、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。続いて、切片を抗ｈＲＦＩ抗体液０．５μｇ／ｍｌを用いて４℃、２４時間インキュベートし、ＰＢＳで数回洗浄した。その後、二次抗体としてビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて常温で２０分間反応し、ＰＢＳで洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンによる酵素標識反応を常温で１０分間行い、ＰＢＳで洗浄後、ＤＡＢ錠にて発色反応を行った。また、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン液を用いて、室温で対比染色した。次いで、スライドを洗浄、脱水し、キシロールによる透徹、封入を行った。
【０１５５】
（３）ｈＲＦＩの免疫組織学的染色結果を図２に示す。Ａは過形成性ポリープ、Ｂは軽度異型を有する腺腫性ポリープ、Ｃは高度異型を有する腺腫性ポリープ、Ｄは、腺腫合併大腸粘膜内癌、Ｅは漿膜下層への浸潤を伴う大腸癌における染色像を示す。図２より、ＡはｈＲＦＩの染色が認められず、Ｂ、Ｃ、Ｄはフォーカル（ｆｏｃａｌ）な染色像が認められ、Ｅはディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）な染色像が認められた。また、本染色で用いたサンプルにおいて、正常組織ではいずれもｈＲＦＩの染色が認められなかった。これらの結果から、ｈＲＦＩは大腸腫瘍性病変特異的に発現を示すことがわかった。
【０１５６】
（４）また、大腸癌４８例におけるそれぞれの染色パターングループの臨床病理学的特徴を、表１に示す。なお、表１において、“ｍ”は「癌が粘膜内にとどまり、粘膜下層に及んでいない」、“ｓｍ”は「癌が粘膜下層にとどまり、固有筋層に及んでいない」、“ｍｐ”は「癌が固有筋層にとどまり、これを超えていない」、“ｓｓ”は「漿膜を有する部位で、癌が固有筋層を超えているが、漿膜表面に出ていない」、“ｓｅ”は「漿膜を有する部位で、癌が漿膜表面に露出している」、“ｓｉ”は「漿膜を有する部位で、癌が直接他臓器に浸潤している」、“ａ１”は「漿膜を有しない部位で、癌が固有筋層を超えているが、さらに深くは浸潤していない」、“ａ２”は「漿膜を有しない部位で、癌が筋層を超えてさらに深く浸潤しているが、他臓器に浸潤していない」、“ａｉ”は「漿膜を有しない部位で、癌が直接他臓器に浸潤している」を、それぞれ示す。なお、“ｍ”、“ｓｍ”、“ｍｐ”、“ｓｓ／ａ１”、“ｓｅ／ａ２”、“ｓｉ／ａｉ”の表記は、大腸癌取扱い規約（第６版）（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｔｕｍ，ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｒｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｌｏｎ ，Ｒｅｃｔｕｍ，ａｎｄ Ａｎｕｓ．６ｔｈ ｅｄ．Ｔｏｋｙｏ，Ｋａｎｅｈａｎａ‐ｓｈｕｐｐａｎ，１９９８）の組織学的壁深達度による。統計学的分析は、カイ二乗分析、フィッシャーの正確確率検定、マン・ホィットニー検定を用いた。Ｐ値は、Ｐ＜０・０５のときに、統計学的に有意であるとした。表１より、４８例の大腸癌のうち、３９例（８１．３％）の癌領域がディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）に染まり、９例（１８．７％）の癌領域がフォーカル（ｆｏｃａｌ）に染まることがわかった。従って、この染色パターンと臨床病理学的特徴の間には、相関関係が認められないことが示された。
【表１】
2005341862.tif 000003
【０１５７】
（実験例３）大腸ポリープと大腸癌におけるｈＲＦＩの発現パターンの解析
（１）７０例の大腸腺腫、６例の腺腫合併大腸粘膜内癌（本実験例において、単に「癌」ともいう。）、７例の過形成性ポリープを含む内視鏡的に切除された標本について、実験例２と同様の手法を用いてｈＲＦＩの免疫組織学的染色を行い、その染色パターンを表２にまとめた。また、ポリープと癌についてｈＲＦＩ発現パターンの割合を検討し、図３にまとめた。さらに、過形成性ポリープ（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔ ｐｏｌｙｐ）と腺腫（ａｄｅｎｏｍａ）／癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を対比したｈＲＦＩの発現パターンの違い、及び、腺腫と癌を対比したｈＲＦＩの発現パターンの違いを表３に示した。なお、表２、図３における“ｍ”、“ｓｍ”、“ｍｐ”、“ｓｓ／ａ１”、“ｓｅ／ａ２”、“ｓｉ／ａｉ”の表記は、表１におけるそれぞれと同様の意を示し、また、“ｍｉｌｄ”（＝ｍｉｌｄ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）は「軽度異型」、“ｍｏｄ”（＝ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）は「中度異型」、“ｓｅｖ”（＝ｓｅｖｅｒｅ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）は「高度異型」を示す。
【表２】
2005341862.tif 000004
【表３】
2005341862.tif 000005
【０１５８】
（２）表２より、軽度異型を有する１３例の腺腫のうち、１０例がフォーカル（ｆｏｃａｌ）なｈＲＦＩの染色像を示し、残りの３例は染色が検出されなかったことがわかった。また、中等度異型を有する５２例の腺腫のうち、４４例がフォーカル（ｆｏｃａｌ）な染色像を示し、５例は染色が認められなかった。また、高度異型を有する５例の腺腫のうち、１例がディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）に染まり、残りの４例はフォーカル（ｆｏｃａｌ）に染まった。６例の腺腫合併大腸粘膜内癌については、４例がディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）に染まり、２例がフォーカル（ｆｏｃａｌ）に染まった。一方、７例の過形成性ポリープにおいては、２例がフォーカル（ｆｏｃａｌ）に染まり、残りの５例は染色が認められなかった。これらの典型的な染色像は、図２のＡ〜Ｃに示すとおりである。
【０１５９】
（３）図３より、この実験で検討したすべての大腸の正常組織、及び、過形成性ポリープの７０％以上（７１．４％）は、ｈＲＦＩの染色が認められないことがわかった。また、正常領域よりも大腸癌領域において、ｈＲＦＩの発現が高いことがわかった。
【０１６０】
（４）さらに、表３より、腺腫と癌を含む大腸腫瘍の大部分では（９３．２％）、フォーカル（ｆｏｃａｌ）又はディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）であるｈＲＦＩの染色像が認められた（Ｐ＜０．００１）。また、癌においてｈＲＦＩがディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）に染色される割合（８１．３％）は、腺腫におけるその割合（５．７％）と比較して、統計的有意に高いことがわかった（Ｐ＜０．００１）。
【０１６１】
（５）本実験例３の結果から、大腸腺腫におけるｈＲＦＩの発現は、過形成性ポリープにおける発現よりも有意に高く、その発現パターンは、異型性の程度が大きくなるにつれて、フォーカル（ｆｏｃａｌ）な染色像からディフューズ（ｄｉｆｆｕｓｅ）な染色像に移行していくことがわかった。この結果から、ｈＲＦＩの発現は、大腸腺腫から大腸癌に至るステップ（ａｄｅｎｏｍａ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において、大腸腫瘍形成の初期段階と腺腫の異型性の進行を、明確に示す指標となる可能性が考えられた。
【０１６２】
また、癌ではない正常組織（ｎｏｒｍａl）でｈＲＦＩの染色が認められず、腺腫合併大腸粘膜内癌の２／３でディフューズな染色像が認められた。また、大腸癌の臨床病理学的特徴とｈＲＦＩの染色パターンには、相関関係がないことが確認された。これらの結果から、ｈＲＦＩの発現は、癌の進行ではなく、癌の形成に関与していると考えられた。また、ｈＲＦＩはアポトーシスに影響を与える腫瘍分子として機能しうることが示唆された。
【０１６３】
（実験例４）大腸癌細胞株におけるｈＲＦＩの発現の確認  
（１）   ８種類の大腸癌細胞株、Ｃｏｌｏ３２０、Ｃｏｌｏ２０５、Ｃａｃｏ２、ＳＷ４８０、ＷｉＤｒ、ＨＴ２９、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６におけるｈＲＦＩの発現を確認した。それぞれの細胞からＲＩＰＡバッファーによってライセートを抽出し、その２０μｇを用いて、当業者に公知のウェスタンブロット法でｈＲＦＩの発現を確認した。一次抗体は、発明者が以前に作製したウサギ抗ｈＲＦＩポリクローナル抗体を用い（「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、２００２年、第２１巻、ｐ．５０２４−５０３０）、二次抗体は、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を用いた。また、タンパク質チャージ量のコントロールとして、β−ａｃｔｉｎを用いた。β−ａｃｔｉｎの検出には、一次抗体としてマウス抗β−ａｃｔｉｎモノクローナル抗体（シグマ社製）、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を用いた。
【０１６４】
（２）結果を図４に示す。図４より、用いた大腸癌細胞株８種類すべてにおいて、２本のｈＲＦＩのバンドが特異的に検出されることがわかった。下のバンドは期待される分子量を示すバンドであり、上のバンドはこれより大きい分子量を示すバンドである。
【０１６５】
（実験例５）大腸癌細胞株におけるｈＲＦＩ発現量の比較
（１）実験例４における２本のバンドの発現量を比較検討するために、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェア（プラネトロン（株）製）を用いてデンシトメトリー解析を行い、各バンドの濃度を測定した。それぞれのｈＲＦＩのバンドの濃度を、β−ａｃｔｉｎの発現量で補正した。次に、ＨＣＴ１１６における２本のｈＲＦＩのバンドの濃度をそれぞれ１とし、これらのｈＲＦＩのバンドの濃度を基準として他の大腸癌細胞株のｈＲＦＩの発現量を数値化した。同時に、２本のバンドで示される発現量の合計についても同様に数値化した。
【０１６６】
（２）結果を図５に示す。この結果から、大腸癌細胞株におけるｈＲＦＩの発現量はさまざまであることがわかった。
【０１６７】
（実験例６）ｈＲＦＩの発現量とアポトーシス誘導量の相関
（１）実験例５で得られた各大腸癌細胞株におけるｈＲＦＩ発現量と、以前にＭａｒｉａｄａｓｏｎ  ＪＭらによって報告されたこれらの大腸癌細胞株の抗癌剤５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）によるアポトーシス誘導の感受性データ（「キャンサー  リサーチ」（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００３年、第６３巻、ｐ．８７９１−８１２）との相関を、ＪＭＰソフトウェア（サスインスティテュート社製）による多変量解析を用いて検討した。
（２）結果を図６、７、８に示す。図６は相関係数、図７はノンパラメトリックによるスピアマンの順位相関係数、図８は散布図行列を示す。図６、７、８、において、“Ａｐｏｔｏｓｉｓ−Ｃ”は「コントロール細胞におけるアポトーシスの割合」、“Ａｐｏ−５”は「５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）５μＭにより誘導されたアポトーシスの割合」、“Ａｐｏ−５０”は「５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）５０μＭにより誘導されたアポトーシスの割合」、 “Ｓｐｅａｒｍａｎ”は「スピアマン」をそれぞれ示す。これらの結果から、ｈＲＦＩの発現量と、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）によるアポトーシス誘導能は、逆相関を示すことがわかった。
【０１６８】
（実験例７）組織マイクロアレイを用いた、ｈＲＦＩ発現と抗癌剤感受性の関連解析
（１）ヒト各種臓器癌由来ゼノグラフト（ヌードマウス皮下担癌モデル）３２株より作製した組織マイクロアレイを用いて、抗ｈＲＦＩ抗体、抗Ｋｉ−６７抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗ｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体、抗ＴＰ５３抗体にて免疫染色を行った。染色方法は、実験例２（２）に記載のＳＡＢ法を用いた。
【０１６９】
（２）ヒト各種臓器癌由来ゼノグラフトパネルにおける、抗ｈＲＦＩ抗体による免疫染色結果を図９に示す。図９において、１は胃癌株、２は大腸癌株、３は肺癌株、４は乳癌株、５は膵臓癌株を示す。左右のスポットは、２匹のマウスを用いて実験を行ったことを示す。この結果から、各種臓器癌由来ゼノグラフトにおける、ｈＲＦＩの発現量が明らかになった。
【０１７０】
（３）各種ゼノグラフトの各種抗癌剤感受性データとｈＲＦＩ発現の相関を、２ウェイヒエラルキカルクラスター解析（ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ；シリコンジェネティックス社製、商品名）により検討した結果を図１０に示す。各種ゼノグラフトの各種抗癌剤感受性データは、大鵬薬品工業株式会社がん研究所にて、当業者に公知の方法を用いて実施されたヌードマウス皮下担癌モデルにおける抗腫瘍効果検討実験の結果を用いた。図１０において、縦には既に各ゼノグラフトに対して感受性を検討した抗癌剤名、腫瘍の倍加時間（ＤＴ：ダブリングタイム）及び今回の実験で発現を調べたタンパク質ｈＲＦＩ（ＲＦＩ−Ｌ、ＲＦＩ−Ｒ、ＲＦＩ−Ｍはそれぞれ、図９の左のパネル、右のパネル、ＲＦＩ−ＬとＲＦＩ−Ｒの平均）を示し、横には３２の各種ゼノグラフトのサンプル名を示す。ここで、５’−ＤＦＵＲ、Ｃａｐｅ、ＵＦＴ、ＴＳ−１は代謝拮抗剤、ＣＤＤＰ（シスプラチン）はプラチナ系抗癌剤、ＴＡＸＯＬはタキサン系抗癌剤、ＣＰＴ−１１はトポイシメラーゼＩ阻害剤に分類される。また、図１０は、色が濃いほど、抗癌剤に対する感受性が高い、腫瘍の倍加時間が長い、ｈＲＦＩの発現が高いことを示している。この結果から、各種ゼノグラフトにおいて、ｈＲＦＩの発現量と、代謝拮抗剤である５’−ＤＦＵＲ、Ｃａｐｅ、ＵＦＴ感受性効果、及びプラチナ系抗癌剤であるＣＤＤＰ（シスプラチン）感受性効果は逆相関を示すことがわかった。
【０１７１】
（４）各種ゼノグラフトの各種抗癌剤感受性データと各遺伝子発現の相関を、ロジスティック回帰分析により検討した結果を図１１に示す。図１１において、縦には免疫染色を行った遺伝子を示し、横には各種抗癌剤を示す。また、図１２のＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ、図１１に示した、ｈＲＦＩの発現量と、ＵＦＴ、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、５’−ＤＦＵＲ抗癌剤感受性データの相関を、拡大して示した図である。また、図１３は、Ｋｉ−６７の発現量と、ＣＰＴ−１１抗癌剤感受性データの相関を、ロジスティック回帰分析により示した図であり、図１４はｈＲＦＩの発現量と、抗癌剤（ＡはＵＦＴ、ＢはＣＤＤＰ（シスプラチン））感受性データの相関を、一元配置分散分析によって解析した結果を示す図である。なお、図１２、１３において、“Ｌｏｇｉｓｔｉｃ  Ｆｉｔ”は「ロジスティック適合度」、“Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｄｅｌ  Ｔｅｓｔ”は「ホールモデルテスト」、“Ｍｏｄｅｌ”は「モデル」、“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ”は「差」、“Ｆｕｌｌ”は「全体」、“Ｒｅｄｕｃｅｄ”は「減算済み」、“ＲＳｑｕａｒｅ（Ｕ）”は「Ｒ二乗（Ｕ）」、“Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ（ｏｒ  Ｓｕｍ  Ｗｇｔｓ）”は「観測点（または重み合計）」、“Ｃｏｎｖｅｒｇｅｄ  ｂｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ”は「傾きによって収束された」、“−ＬｏｇＬｉｋｅｌｉｈｏｏｄ”は「−対数尤度」、“ＤＦ”は「自由度（ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｆｒｅｅｄｏｍ）」、“ＣｈｉＳｑｕａｒｅ”は「カイ二乗値」、“Ｐｒｏｂ＞ＣｈｉＳｑ”は「Ｐｒｏｂ＞ＣｈｉＳｑ」、“Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ”は「パラメータ推定値」、“Ｔｅｒｍ”は「項目」、“Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ”は「切片」、“Ｆｏｒ  ｌｏｇ  ｏｄｄｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ／ｌｏｗ”は「高／低の対数オッズに対する」、“Ｅｓｔｉｍａｔｅ”は「推定値」、“Ｓｔｄ  Ｅｒｒｏｒ”は「標準誤差」を、それぞれ示す。また、図１４において、“Ｏｎｅｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”は「一元分析」、“ｈｉｇｈ”は「高」、“ｌｏｗ”は「低」、“Ｏｎｅｗａｙ  Ａｎｏｖａ”は「一元配置分散分析」、“Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｆｉｔ”は「当てはめの要約」、“Ｒｓｑｕａｒｅ”は「Ｒ二乗」、“Ａｄｊ  Ｒｓｑｕａｒｅ”は「Ｒ二乗」、“Ｒｏｏｔ  Ｍｅａｎ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｅｒｒｏｒ”は「根平均平行誤差」、“Ｍｅａｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ”は「感受性の平均」、“Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ（ｏｒ  Ｓｕｍ  Ｗｇｔｓ）”は「観測点（または重み合計）」、“ｔ−Ｔｅｓｔ”は「ｔ−テスト」、“Ｅｓｔｉｍａｔｅ”は「推定値」、“Ｓｔｄ  Ｅｒｒｏｒ”は「標準誤差」、“Ｌｏｗｅｒ９５％”は「下位９５％」、“Ｕｐｐｅｒ９５％”は「上位９５％」、“Ａｓｓｕｍｉｎｇ  ｅｑｕａｌ  ｖａｒｉａｎｃｅｓ”は「等分散と仮定する」、“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ”は「差」、“ＤＦ”は「自由度」、“Ｐｒｏｂ＞｜ｔ｜”は「Ｐｒｏｂ＞｜ｔ｜」、“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｎｃｅ”は「分散の分析」、“Ｓｏｕｒｃｅ”は「ソース」、“Ｓｕｍ  ｏｆ  Ｓｑｕａｒｅｓ”は「二乗の合計」、“Ｍｅａｎ  Ｓｑｕａｒｅ”は「平均二乗」、“Ｆ  ｒａｔｉｏ”は「Ｆ比」、“Ｐｒｏｂ＞Ｆ”は「Ｐｒｏｂ＞Ｆ」、“Ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  ��ｎｅｗａｙ  Ａｎｏｖａ”は「一元配置分散分析に対する平均」、“Ｌｅｖｅｌ”は「レベル」、“ｈｉｇｈ”は「高」、“ｌｏｗ”は「低」、“Ｎｕｍｂｅｒ”は「数」、“Ｍｅａｎ”は「平均」、“Ｓｔｄ  Ｅｒｒｏｒ”は「準誤差」、“Ｓｔｄ  Ｅｒｒｏｒ  ｕｓｅｓ  ａ  ｐｏｏｌｅｄ ｅｓｔｉｍａｔｅ  ｏｆ  ｅｒｒｏｒ  ｖａｒｉａｎｃｅ”は「標準誤差は誤差分散の併合推定を使用する」を、それぞれ示す。
【０１７２】
まず、図１１、図１３から、Ｋｉ−６７の発現量と、ＣＰＴ−１１抗癌剤感受性効果は、Ｐ＜０．０５であり、統計学的に有意な正の相関を示していることがわかった。
【０１７３】
また、図１２Ａ、ＢにおいてＰ＜０．０５であり、さらに、図１１、図１４から、ｈＲＦＩの発現量と、ＵＦＴ、ＣＤＤＰ（シスプラチン）抗癌剤感受性効果は、統計学的に有意な負の相関を示すことがわかった。また、図１２Ｃに示す５’−ＤＦＵＲについては、同じくｈＲＦＩの発現量と負の相関傾向は示すものの、統計学的に有意な相関ではなかった（Ｐ＝０．０６７１）。
【０１７４】
この結果から、５’−ＤＦＵＲ、Ｃａｐｅ、またはＵＦＴ等の代謝拮抗剤、及びＣＤＤＰ（シスプラチン）等のプラチナ系抗癌剤感受性と、ｈＲＦＩの発現量との間に逆相関関係があることが明らかになった。
【０１７５】
（実験例８）ｈＲＦＩをステイブルに発現する細胞株（ＨＣＴ１１６）の確立
（１）ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社製）にｈＲＦＩ遺伝子を挿入したプラスミド（「ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ／ｈＲＦＩ」と命名する。）を、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ２（ジーンセラピーシステム社製）を用いて大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６にトランスフェクションし、培養した。培地は、１０％ＦＢＳを加えたＭｃＣｏｙ５Ａ（ギブコ／ビーアールエル社製）を用いた。
【０１７６】
（２）トランスフェクション１日後から、Ｇ４１８（ギブコ／ビーアールエル社製）１０００μｇ／ｍｌによってセレクションを開始した。
【０１７７】
（３）セレクション終了後シングルコロニーをピックアップし、継代した。
【０１７８】
（４）各細胞株からＲＩＰＡバッファーに溶解したライセートを回収し、実験例４（１）と同様にしてｈＲＦＩの発現を確認した。タンパク質チャージ量のコントロールは、同じくβ−ａｃｔｉｎを用いた。
【０１７９】
（５）結果を図１５に示す。これより、クローン４が最もｈＲＦＩの発現が高く、続いてクローン３、クローン１、クローン２の順にｈＲＦＩの発現が低くなるステイブル細胞株（ＨＣＴ１１６）が確立されたことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】ＨＣＴ１１６、ＷｉＤｒ、Ｃｏｌｏ３２０におけるｈＲＦＩの発現を示す図である。
【図２】ｈＲＦＩの免疫組織学的染色結果を示す図である。Ａは過形成性ポリープの染色像（２５０倍）、Ｂは軽度異型を有する腺腫性ポリープの染色像（２５０倍）、Ｃは高度異型を有する腺腫性ポリープの染色像（２５０倍）、Ｄは、腺腫合併大腸粘膜内癌の染色像（２００倍）、Ｅは漿膜下層への浸潤を伴う大腸癌の染色像（２００倍）を示す。
【図３】一連の大腸腺腫から大腸癌に至るステップ（ａｄｅｎｏｍａ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）における、ｈＲＦＩの各発現パターンの割合を示す図である。
【図４】８種類の大腸癌細胞株におけるｈＲＦＩの発現を示す図である。
【図５】大腸癌細胞株において２本のバンドに示されるｈＲＦＩ発現量の比較を示す図である。
【図６】相関係数を示す。
【図７】ノンパラメトリックによるスピアマンの順位相関係数を示す。
【図８】散布図行列を示す。
【図９】各種臓器癌由来ゼノグラフトパネルを用いた、抗ｈＲＦＩ抗体免疫染色を示す図である。１レーンは胃癌株７株、２レーンは大腸癌株６株、３レーンは肺癌株７株、４レーンは乳癌株６株（うち１株は２スポット）、５レーンは膵臓癌株６株を示す。
【図１０】各種ゼノグラフトの各種抗癌剤感受性データとｈＲＦＩ発現の相関を、２ウェイヒエラルキカルクラスター解析により示した図である。
【図１１】各種ゼノグラフトの抗癌剤感受性データと各遺伝子発現の相関をロジスティック回帰分析により示した図である。
【図１２】ｈＲＦＩの発現量と、抗癌剤（ＡはＵＦＴ、ＢはＣＤＤＰ（シスプラチン）、Ｃは５’−ＤＦＵＲ）感受性データの相関を、ロジスティック回帰分析により示した図である。
【図１３】Ｋｉ−６７遺伝子の発現量と、ＣＰＴ−１１抗癌剤感受性データの相関を、ロジスティック回帰分析により示した図である。
【図１４】ｈＲＦＩの発現量と、抗癌剤（ＡはＵＦＴ、ＢはＣＤＤＰ（シスプラチン））感受性データの相関を、一元配置分散分析によって解析した結果を示す図である。
【図１５】ｈＲＦＩをステイブルに発現する細胞株（ＨＣＴ１１６）におけるｈＲＦＩ発現の確認を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005341862.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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