(57)【要約】  【課題】  COPDの病態モデル動物として利用することができ、COPDの病態機序の解明および疾患の治療方法の検討、COPDの予防・治療剤のスクリーニングを行うことが可能な遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。  【解決手段】  CLCA遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を作出する。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを含有する非ヒト哺乳動物またはその一部。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物がマウスである請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項３】
カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子である請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項４】
カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子が、配列番号：１または配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項５】
（１）慢性閉塞性肺疾患を発症している、
（２）肺の気腫化が認められる、
（３）肺の肥大化が認められる、
（４）肺胞の拡大化が認められる、および
（５）粘液の過分泌が認められる
から選ばれる少なくとも一つの発現型を示す請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項６】
慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎および（または）肺気腫である請求項５記載の動物またはその一部。
【請求項７】
請求項１記載の動物またはその一部に被験物質を適用し、カルシウム依存性クロライドチャネルアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項５記載の動物またはその一部に被験物質を適用し、慢性閉塞性肺疾患、肺の気腫化、肺の肥大化、肺胞の拡大化、または粘液の分泌増加の改善効果を検定することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子またはその変異遺伝子を導入した非ヒト受精卵。
【請求項１０】
外来性カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、非ヒト哺乳動物において該遺伝子を発現し得るベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＬＣＡ遺伝子導入非ヒト哺乳動物およびその用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（COPD）など気道粘液の過分泌を伴う疾患についてはカルシウム依存性クロライドチャネル（CLCA）の関与が報告されている〔Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165巻、1132頁、2002年〕。
CLCAファミリーとしては、マウスgob-5（Biochem Biophys Res Commun, 255巻，347頁，1999年）、ヒトCLCA1（Genomics, 54巻, 200頁，1998年）、ヒトCLCA2（FEBS Letters, 455巻, 295頁，1999年）、ヒトCLCA4（FEBS Letters, 455巻, 295頁，1999年）、マウスCLCA4（WO 03/62426号公報）、マウスCLCA4A（WO 03/62426号公報）、ラットCLCA4（部分ペプチド；WO 03/62426号公報）、ラットCLCA1（WO 03/37927号公報）、マウスCLCA1（J Biol Chem, 273巻, 32096頁，1998年）、マウスCLCA2（Biochem Biophys Res Commun, 264巻, 933頁，1999年）などが報告されている。ヒトCLCA1やGob-5遺伝子の活性を阻害することとCOPDや喘息などの治療との関連が、WO 01/38530号公報（特許文献１）などに報告されている。
【特許文献１】WO 01/38530号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
gob-5遺伝子／タンパク質の発現は、通常、小腸、大腸、胃、平滑筋および子宮で高く、肺ではほとんど認められない。肺に特異的にgob-5をはじめとするCLCA遺伝子／タンパク質が高発現するCLCA遺伝子導入（トランスジェニック）非ヒト動物を見出し、COPDの疾患モデル動物を大量に生産する方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、gob-5遺伝子／タンパク質を、肺に特異的に高発現させたトランスジェニックマウスを作製したところ、COPDなどの表現型を示すことを見出した。本発明者は、これらの知見を基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）  カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを含有する非ヒト哺乳動物またはその一部、
（２）  非ヒト哺乳動物がマウスである上記（１）記載の動物またはその一部、
（３）  カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子である上記（１）記載の動物またはその一部、
（４）  カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子が、配列番号：１または配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である上記（１）記載の動物またはその一部、
（５）  （i）慢性閉塞性肺疾患を発症している、
（ii）肺の気腫化が認められる、
（iii）肺の肥大化が認められる、
（iv）肺胞の拡大化が認められる、および
（v）粘液の過分泌が認められる
から選ばれる少なくとも一つの発現型を示す上記（１）記載の動物またはその一部、
（６）  慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎および（または）肺気腫である上記（５）記載の動物またはその一部、
（７）  上記（１）記載の動物またはその一部に被検物質を適用し、カルシウム依存性クロライドチャネルアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする、カルシウム依存性クロライドチャネルアンタゴニストのスクリーニング方法、
（７ａ）  上記（７）記載のスクリーニング方法により得られうるカルシウム依存性クロライドチャネルアンタゴニスト、
（７ｂ）  上記（７ａ）記載のカルシウム依存性クロライドチャネルアンタゴニストを含有してなる慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤、
（８）  上記（５）記載の動物またはその一部に被検物質を適用し、慢性閉塞性肺疾患、肺の気腫化、肺の肥大化、肺胞の拡大化、または粘液の分泌増加の改善効果を検定することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法、
（８ａ）  上記（８）記載のスクリーニング方法を用いて得られる、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療のために用いられる物質、
（８ｂ）  上記（８ａ）記載の物質を含有してなる慢性閉塞性肺疾患の予防・治療用医薬、
（９）  カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子またはその変異遺伝子を導入した非ヒト受精卵、
（１０）  外来性カルシウム依存性クロライドチャネル遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、非ヒト哺乳動物において該遺伝子を発現し得るベクターなどに関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、COPDなどの疾患の予防・治療作用を有する物質の評価などに用いることができ、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物から採取した細胞などを培養し、CLCAアンタゴニストの評価に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
CLCA遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだDNAを含有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明の遺伝子導入動物と略記することもある）は、例えば、非ヒト哺乳動物の受精卵、未受精卵、精子およびその前駆細胞（例、始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）など〔好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）〕に、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、DEAE-デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とするCLCA遺伝子またはその変異遺伝子を導入することにより作出される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とする遺伝子のDNAを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることにより遺伝子導入動物を作出することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ES細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とする遺伝子のDNAを導入し、予め該DNAが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ES細胞を胚盤胞に注入するか、またはES細胞塊と8細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入遺伝子が伝達されたものを選択することによっても遺伝子導入動物を得ることが可能である。
また、本発明の遺伝子導入動物の一部も、本発明の遺伝子導入動物と同様の目的に用いることができる。
本発明の遺伝子導入動物の一部としては、例えば、
(i）CLCA遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだDNAを含有する細胞、組織、臓器など、
(ii）これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じ、継代したものなど、
(iii)該遺伝子導入動物から単離し得る各種タンパク質またはDNAなどが挙げられる。
該組織としては、例えば、脂肪組織、脳組織（例、偏桃、大脳皮質、海馬、視床下部、延髄、小脳など）、肺組織、下垂体、副腎、膵臓、脾臓、小腸、精巣、筋肉などが挙げられる。該細胞としては、例えば、脂肪細胞、神経細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞など）、上皮細胞、内皮細胞、表皮系細胞、筋細胞、肺胞細胞などが挙げられる。
【０００８】
本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどであり、さらに好ましくはマウス（例、Wistar、SDなど）である。
CLCA遺伝子としては、カルシウム依存性クロライドチャネルタンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、例えば、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と約４０％以上、好ましくは約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。
また、（i）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインをコードする遺伝子であってもよい。
具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（gob-5）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトCLCA1）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトCLCA2）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ヒトCLCA4）、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（マウスCLCA4）、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（マウスCLCA4A）、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ラットCLCA4）、配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質（ラットCLCA1）、マウスCLCA1、またはマウスCLCA2をコードする遺伝子などがあげられる。好ましくは、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：１６で表される塩基配列を含有するDNAを含む遺伝子が挙げられる。
CLCA遺伝子の変異遺伝子としては、CLCAをコードするDNAに変異（例、突然変異、部位特異的突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じた遺伝子が挙げられる。より具体的には、該塩基の付加、欠損、他の塩基への置換の結果、CLCAを構成するアミノ酸配列において、１ないし３０個、好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし５個、より好ましくは１または２個のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じるように変異させることが好ましく、CLCAの機能を失わない変異であれば何れの変異であってもよい。
【０００９】
本発明におけるCLCA遺伝子またはその変異遺伝子（以下、単にCLCA遺伝子と称することもある）は、導入または発現の対象とする非ヒト哺乳動物と同種哺乳動物または異種哺乳動物由来のものであってもよい。該遺伝子を対象動物に導入させるにあたっては、当該遺伝子を対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として用いるのが一般に有利である。
CLCA遺伝子を導入させる場合、CLCA遺伝子を有する哺乳動物（例、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど、好ましくはマウスなど）に由来し、CLCA遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、該遺伝子を連結したベクターを、対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵（例、マウス受精卵）へマイクロインジェクションすることによって、目的とするCLCA遺伝子を高発現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出できる。
CLCA遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
【００１０】
CLCA遺伝子の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、哺乳動物（例、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子（例、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、I型およびII型コラーゲン、サイクリックAMP依存蛋白キナーゼβIサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ-水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（EF1−α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイドPコンポーネント、レニンなど）のプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリアクチンプロモーターを含むCAGプロモーターなどを用いることができる。
さらに好ましくは、目的とする疾患モデルに応じて、標的組織でCLCA遺伝子を特異的または高発現させ得るプロモーター（例、肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（SAP）、アルブミン、トランスフェリン、アンチトロンビンIII、α1-アンチトリプシンなどの遺伝子プロモーター；心臓で高発現可能なαおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2などの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能なPTH/PTHrP受容体などの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能なACTH受容体などの遺伝子プロモーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合タンパク質などの遺伝子プロモーター；脳で高発現可能なミエリン塩基性蛋白、グリア線維性酸性蛋白などの遺伝子プロモーター等）を適宜選択することができる。例えば、本発明の遺伝子導入動物がCOPDモデルである場合、肺で高発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。
【００１１】
上記ベクターは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするmRNAの転写を終結する配列（ポリA、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアンウイルスのSV40ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3'下流に連結することも目的により可能である。
また、上記のベクターは、導入遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性などの薬剤耐性遺伝子など）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入遺伝子を組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なDNA配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。
【００１２】
CLCAの翻訳領域は、ヒトや各種非ヒト哺乳動物（例、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の小腸、大腸、胃、肺などに由来するDNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーに由来するゲノムDNAの全てまたは一部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動物の小腸、大腸、胃、肺などの臓器あるいは細胞に由来するＲＮＡから公知の方法により調製された相補DNAを原料として用いて、取得することが出来る。また、上記の細胞あるいは組織などから得られたCLCAの翻訳領域を用いて、点突然変異誘発法などにより変異した翻訳領域を作製することもできる。これらは何れも遺伝子導入動物に利用可能な材料である。
以上の翻訳領域は、導入動物において発現しうる遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として前記のプロモーターの下流（好ましくは、転写終結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工学的手法により、CLCA遺伝子を組み込んだDNAを作製することができる。
具体的には、ニワトリアクチンプロモーターを含むCAGプロモーター、ウサギグロビンポリA付加シグナルを含む領域、SV40複製開始領域、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpCXN2に、CLCA遺伝子を挿入したベクターなどが用いられる。
【００１３】
好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られるCLCA遺伝子をコードするDNAを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはC57BL/6J系統（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）を用いる場合は、雌が約4〜約6週齢、雄が約2〜約8月齢程度のものが好ましく、また、約12時間明期条件（例えば7:00-19:00）で約1週間飼育したものが好ましい。
体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と1個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にPMSGと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にhCGと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはC57BL/6J系統（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約48時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約20〜約50IU/個体、好ましくは約30IU/個体、黄体形成ホルモンの投与量は約0〜約10IU/個体、好ましくは約5IU/個体である。
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して培地（例、M16培地、修正Whitten培地、BWW培地、M2培地、WM-HEPES培地、BWW-HEPES培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により5％炭酸ガス/95％大気下でDNA顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行い場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００１４】
一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例、TYH培地中で体外受精時まで微小滴培養法等により5％炭酸ガス/95％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により5％炭酸ガス/95％大気下で培養した後、2個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにDNAの顕微注入を行う場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００１５】
受精卵へのDNAの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてDNA溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入遺伝子はCsCl密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入遺伝子は制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００１６】
DNA導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により5％炭酸ガス/95％大気下で1細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ICR系の雌マウス（好ましくは約8〜約10週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ICR系の雄マウス（好ましくは約2月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にLHRHと略する）またはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。LHRH類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(
Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。LHRHまたはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはICR系のマウスなど）の場合には、通常、LHRHまたはその類縁体を投与した後、約4日目に雄マウスと交配させることが好ましく、LHRHまたはその類縁体の投与量は、通常、約10〜60μg/個体、好ましくは約40μg/個体である。
【００１７】
通常、移植される初期胚が8細胞期胚以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例、1細胞期〜4細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、2細胞期胚を移植するには偽妊娠後約0.5日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約2.5日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約5〜約10個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
移植胚が着床し、受胚雌が妊娠すれば、自然分娩または帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはICR系統の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００１８】
受精卵細胞段階におけるCLCA遺伝子の導入は、導入遺伝子が対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入遺伝子が染色体DNAに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（F0）の生殖系列細胞においてCLCA遺伝子が存在することは、その後代（F1）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてにCLCA遺伝子が存在することを意味する。
通常、F0動物は相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のF0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方にCLCA遺伝子を有するホモ接合体を得るためには、F0動物と非遺伝子導入動物とを交雑してF1動物を作出し、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。1遺伝子座にのみ導入遺伝子が組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
【００１９】
別の好ましい一実施態様においては、CLCA遺伝子を含む発現ベクターは、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ES細胞）に導入される。
ES細胞は胚盤胞期胚の内部細胞塊（ICM）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ICMの細胞は胚節を経て将来、胚体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ES細胞としては、既に樹立された細胞株ものを用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（Nature、第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスES細胞の場合、現在、一般的には129系マウス由来のES細胞が使用されているが、従来から機能解析によく用いられている純系で遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で、例えば、C57BL/6系統マウスやC57BL/6系統とDBA/2系統と交雑したBDF1系統マウス（C57BL/6系統とDBA/2系統とのF1）から樹立されるES細胞なども良好に用いることができる。BDF1系統マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6系統マウスを背景に持つので、これ由来のES細胞は疾患モデルマウスを作出したとき、C57BL/6系統マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をC57BL/6系統マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００２０】
ES細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物〔例、マウス（好ましくはC57BL/6J系統（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）を用いる場合は、約2ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約8〜約10週齢程度の雌マウス（妊娠約3.5日）〕の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは8細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例、マウスの場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞が望ましい）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するICMを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりES細胞が得られる。
【００２１】
ES細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その一例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数（約50個）で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとして、例えば、G-バンディング法による核型分析等により行うことができる。得られるES細胞の核型は100％正常であることが望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例、マウスでは染色体数が2n=40である細胞）に再びクローニングすることが可能である。
【００２２】
このようにして得られるES細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるLIF（1〜10,000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5％炭酸ガス/95％空気または5％酸素/5％炭酸ガス/90％空気）で、約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液（通常0.001〜0.5％トリプシン/0.1〜5mM EDTA、好ましくは約0.1％トリプシン/1mM EDTA）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1〜3日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Nature、第292巻、154頁、1981年； Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第78巻、7634頁、1981年；ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、CLCA遺伝子を導入されたES細胞を分化させて得られるCLCA発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおけるCLCAの細胞生物学的検討において有用である。
【００２３】
ES細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、DEAE-デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるES細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、106〜108細胞/mlとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、CLCA外来性ヒトSLTをコードするDNAを含むベクターを10〜100μg添加し、200〜600V/cmの電気パルスを印加することにより行うことができる。
【００２４】
導入遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、ES細胞を用いるトランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入ベクターは、CLCA遺伝子を含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子など）やレポーター遺伝子（例、β-ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子としてnptII遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のES細胞をG418などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをPCRまたはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入遺伝子の存在を確認する。
【００２５】
導入遺伝子の組込みが確認されたES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のICMに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。キメラ動物の中でES細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入遺伝子が遺伝的に固定された遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出することができる。
【００２６】
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ES細胞によるキメラ胚の作製においては従来から後者が広く行なわれているが、最近では、8細胞期胚の透明帯内へのES細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ES細胞塊と透明帯を除去した8細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのES細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ES細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ES細胞が129系統マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてC57BL/6系統マウス（毛色：ブラック）やICR系統マウス（毛色：アルビノ）を用い、ES細胞がC57BL/6系統もしくはDBF1系統マウス（毛色：ブラック）由来やTT2細胞（C57BL/6系統とCBA系統とのF1（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてICR系統マウスやBALB/c系統マウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
また、生殖系列キメラ形成能はES細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、129系統由来のES細胞に対してはC57BL/6系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、C57BL/6系統由来のES細胞に対してはBALB/c系統由来の宿主胚等が好ましい。
採卵用雌マウスは約4〜6週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約2〜約8カ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００２７】
胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例、マウスの場合、交配後約3.5日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは４細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にCLCAをコードするDNAが導入されたES細胞（約10〜約15個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
共培養法による場合は、例えば8細胞期胚（および桑実胚）（例、マウスの場合、交配後約2.5日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは4細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にCLCAをコードするDNAが導入されたES細胞塊（細胞数約10〜約15個）を入れ、さらに上記8細胞期胚（または桑実胚）（好ましくは2個または3個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００２８】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
生殖系列キメラの選択は、まずES細胞の雌雄が予め判別されている場合はES細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ES細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からES細胞の寄与率が高いキメラマウス（例、50％以上）を選択する。例えば、129系マウス由来の雄性ES細胞であるD3細胞とC57BL/6系統マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるF1動物の表現型に基づいて行うことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌C57BL/6系統マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるF1の毛色はアグーチとなる。
【００２９】
上記のようにして得られるCLCA遺伝子が導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のファウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方にCLCA遺伝子を有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるF1動物のうち相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばF1動物の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定することができる。1遺伝子座にのみ導入遺伝子が組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
【００３０】
本発明の遺伝子導入動物は、（外来性）CLCAに対する被検物質の作用を定量的に測定可能な程度に（外来性）CLCAの発現量が確保される限り、内因性CLCAの発現については特に制限はない。しかしながら、本発明の遺伝子導入動物を外来性CLCAだけでなく内因性CLCAにも作用し得る薬剤の評価にも使用する場合は、内因性CLCAの発現を不活性化することが望ましい。内因性CLCAの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、公知の方法（例、Mol. Cell. Biol.、第15巻、第3012頁、1995年を参照）により選択されるCLCA遺伝子がノックアウトされたES細胞、または該ES細胞から上記の方法に従って作出されるCLCAノックアウト動物由来の初期胚もしくはES細胞に、上記の方法に従って外来性CLCA遺伝子を導入することによって得ることができる。CLCA遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のCLCA遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのエクソン部分に他のDNA断片（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、lacZ（β-ガラクトシダーゼ遺伝子）、cat（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポーター遺伝子等）を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか（この場合、前述のように導入遺伝子の組込みは薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を指標として選択され得る）、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いてCLCA遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、タンパク質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全なタンパク質の翻訳を不能にするか、あるいは転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるDNA配列（例えば、ポリA付加シグナルなど）を挿入して、完全なmRNAの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したDNA配列を有するDNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のCLCA遺伝子座に組み込ませる方法が好ましく挙げられる。
【００３１】
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたDNAは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内因性CLCA遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザン法またはPCR法による組み込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はHSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内因性CLCA遺伝子座にターゲッティングされた細胞はHSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００３２】
あるいは、内因性CLCAの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、相同組換えを用いた遺伝子ターゲッティングにより外来性CLCA遺伝子をコードするDNAで内因性CLCA遺伝子を置換したノックイン動物であってもよい。
ノックイン動物はノックアウト動物と基本的に同様の手法に従って作製することができる。CLCAのORFは第1エクソン〜第14エクソンに存在するので、例えば、対象非ヒト哺乳動物由来のCLCA遺伝子のこれらの領域を適当な制限酵素を用いて切除し、代わりに外来性CLCA遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られるDNAを含むターゲティングベクターを、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物由来のES細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内因性CLCA遺伝子座に外来性CLCA遺伝子が組み込まれたES細胞クローンを選択すればよい。クローン選択はPCR法やサザン法を用いて行うこともできるが、例えば、ターゲッティングベクターのCLCA遺伝子の3'非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用マーカー遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側にHSV-tk遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。
また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された外来性CLCAの発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にloxP配列もしくはfrt配列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期にCreもしくはFlpリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、Cre-loxP系やFlp-frt系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出してもよい。
【００３３】
また、本発明の遺伝子導入動物は、CLCA遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだDNAを有し、かつCLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデルであってもよい。
「CLCAの活性調節が関与する疾患」とは、CLCA活性の異常に起因するか、または結果的にCLCA活性の異常を生じる疾患だけでなく、CLCA活性を調節することにより予防・治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。例えば、CLCAの機能・活性を阻害することにより予防・治療可能な疾患としては、例えば、COPDなどが挙げられる。
「他の遺伝子改変」とは、CLCA遺伝子が導入される以外の遺伝子改変を意味し、自然突然変異により内因性遺伝子が改変された自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入されたトランスジェニック動物、内因性遺伝子を不活化されたノックアウト動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンスDNAや中和抗体をコードするDNAの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したトランスジェニック動物を含む）、変異内因性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異体などが含まれる。したがって、内因性CLCA遺伝子の改変もまた、本発明における「他の遺伝子改変」に該当する。
【００３４】
「CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、高脂血症または動脈硬化症モデルとしてWHHLウサギ（低比重リポタンパクレセプター（LDLR）に変異を有する；Watanabe Y.、Atherosclerosis、第36巻、第261頁、1980年）、SHLM（apoE欠損変異を有する自然発症マウス；Matsushima Y.ら、Mamm. Genome、第10巻、第352頁、1999年）、LDLRノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、J. Clin. Invest.、第92巻、第883頁、1993年）、apoEノックアウトマウス（Piedrahita J.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、第4471頁、1992年）、ヒトapoB導入マウス（Callow M.J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、第2130頁、1994年）等が、虚血性心疾患モデルとしてCD55 CD59ダブルトランスジェニックマウス（Cowan P.J.ら、 Xenotransplantation、第5巻、第184-90頁、1998年）等が、皮膚炎モデルとしてinterleukin 1トランスジェニックマウス（Groves R.W. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、11874頁、1995年）等が、免疫不全モデルとしてCD19ノックアウトマウス（Spielman J.ら、Immunity、第3巻、39頁、1995年）等が、低血糖モデルとしてSPC2ノックアウトマウス（Furuta M. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第94巻、6646頁、1997年）等が、脂肪肝モデルとしてob/obマウス（Herberg L.及びColeman D.L.、Metabolism、第26巻、第59頁、1977年）、KKマウス（Nakamura M.及びYamada K.、Diabetologia、第3巻、第212頁、1967頁）、FLSマウス（Soga M.ら、Lab. Anim. Sci.、第49巻、第269頁、1999年）、糖尿病モデルとしてNODマウス（Makino S.ら、Exp. Anim.、第29巻、第1頁、1980年）、BBラット（Crisa L.ら、Diabetes Metab. Rev.、第8巻、第4頁、1992年）、ob/obマウス、db/dbマウス（Hummel L.ら、Science、第153巻、第1127頁、1966年）、KKマウス、GKラット（Goto Y.ら、Tohoku J. Exp. Med.、第119巻、第85頁、1976年）、Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、Ann. NY Acad. Sci.、第131巻、第447頁、1965年）、OLETFラット（Kawano K.ら、Diabetes、第41巻、第1422頁、1992年）等が、肥満モデルとしてob/obマウス、db/dbマウス、KKマウス、Zucker fattyラット、OLETFラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとしてbeta SAD（beta S-Antilles-D Punjab）トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、 EMBO J.、第10巻、3157頁、1991年）等が、性腺障害モデルとしてSteroidogenic factor 1ノックアウトマウス（Zhao L.ら、Development、第128巻、147頁、2001年）等が、肝臓癌モデルとしてp53ノックアウトマウス（Kemp C.J. Molecular Carcinogenesis, 第12巻、132頁、1995年）等が、乳癌モデルとしてc-neuトランスジェニックマウス（Rao G.N.ら、Breast Cancer Res. Treat., 第48巻、265頁、1998年）等が、子宮内膜炎モデルとしてperforin, Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、J. Immunol. , 第161巻、7063頁、1998年）等が挙げられる。
これらの「他の遺伝子改変を有する」疾患モデル非ヒト哺乳動物は、例えば、市販のものを購入（例、米国のJackson研究所などから購入）するか、または周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作出することができる。
本発明の非ヒト哺乳動物は、「CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変」に加えて、同一もしくは他の疾患モデルを作製し得る非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味する。このような処理としては、例えば、高脂肪食負荷処理、糖負荷処理、飢餓処理、血管結紮／再灌流等が挙げられる。
【００３５】
上記「遺伝子改変を導入する方法」は特に制限はなく、例えば、外来性ヒトＳＬＴをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物と、CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する方法；CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル非ヒト哺乳動物の初期胚やES細胞に、上述の方法によりCLCA遺伝子を導入してトランスジェニック動物を得る方法；CLCA遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物の初期胚やES細胞に、上述の方法により、あるいはノックアウト技術により、CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変を導入する方法等が挙げられる。また、CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変が外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚やES細胞に、該外来遺伝子等とCLCA遺伝子とを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得てもよい。さらに、CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変が内因性遺伝子の破壊による場合は、外来性CLCA遺伝子を破壊すべき内因性遺伝子にターゲッティングされ得るようにデザインして野生型非ヒト哺乳動物のES細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクターは、内因性CLCA遺伝子を破壊されるべき内因性遺伝子に置換る以外は、上記のノックイン動物の作製に関して例示したものが好ましく使用され得る。
【００３６】
CLCA遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物と、CLCAの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる一以上の他の遺伝子改変を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、CLCA遺伝子が１遺伝子座に組み込まれたホモ接合体と、apoEホモ欠損高脂血症（動脈硬化）モデルとを交雑して得られるF1は両遺伝子についてヘテロである。このF1同士を兄妹交配して得られるF2個体の1/16はCLCAホモ導入・apoEホモ欠損となる。
【００３７】
さらに、本発明は、CLCA遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト哺乳動物に、他の病態モデル動物、例えば肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の病態モデル動物を交配することによって得られる動物またはその生体の一部を提供する。
他の病態モデル動物、例えば肥満症、摂食亢進症、インスリン抵抗性、情動障害、記憶障害または性機能障害の病態モデル動物を交配することによって得られる動物は、例えば、市販のものを購入（例、米国のJackson研究所などから購入）してもよく、あるいは周知の技術を用いて容易に作出することができる。
【００３８】
上記のようにして得られる本発明の非ヒト哺乳動物はCLCAを発現するため、CLCA（特に外来性CLCA）に対してアンタゴニストまたはアゴニスト活性を有する物質の薬効をインビボで評価することを可能にする。
本発明の非ヒト哺乳動物は、例えば、COPD〔慢性気管支炎および（または）肺気腫など〕などを発症している。また、本発明の非ヒト哺乳動物は、肺の気腫化、肺の肥大化、肺胞の拡大化、粘液の過分泌などが認められる。
本発明の非ヒト哺乳動物は、上記のような極めてユニークな特徴を有しているので、以下に示す有用な用途を有している。
【００３９】
（１）本発明の非ヒト哺乳動物は、(外来性)CLCA遺伝子が高発現させられているため、CLCAアンタゴニストまたはアゴニスト、好ましくはCLCAアンタゴニストの評価のために用いることができる。
すなわち、本発明は、
i）本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に被検物質を適用し、CLCAアンタゴニスト活性（またはアゴニスト活性）を検定することを特徴とする、CLCAアンタゴニストのスクリーニング方法、
ii）本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に被検物質を適用し、COPDなどの疾患の改善効果を検定することを特徴とする、COPDなどの予防・治療のために用いられるCLCAアンタゴニストのスクリーニング方法、
iii）本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に被検物質を適用し、肺の気腫化、肺の肥大化、肺胞の拡大化、粘液の過分泌などの改善効果を検定することを特徴とする、COPDなどの予防・治療のために用いられるCLCAアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
CLCAアンタゴニストの候補化合物は、CLCAとの結合実験により選定することができる。
【００４０】
具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。被検物質を投与しない場合に比べて、被検物質を投与した場合の、COPD、肺の気腫化、肺の肥大化、肺胞の拡大化、粘液の過分泌などが約10％以上、好ましくは約30％以上、さらに好ましくは約50％以上改善された場合、該被検物質をCLCAアンタゴニストとして選択する。
被検物質としては、合成化合物、ペプチド、タンパク質、DNAライブラリー、哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
CLCAアンタゴニスト活性としては、例えば、COPD、肺の気腫化、肺の肥大化、肺胞の拡大化、粘液の過分泌などの改善作用が挙げられる。
本発明の非ヒト哺乳動物が本来的に有するCLCAによる上記作用の変動は無視してよい。
【００４１】
このようにして選択されたCLCAアンタゴニストは、安全で低毒性な、例えばCOPD〔慢性気管支炎および（または）肺気腫など〕などの予防・治療剤として使用することができる。
選択されたCLCAアンタゴニストは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、予防・治療用医薬として選択された物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００４２】
また、選択された物質がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。当該ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、COPDの治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、一日につきCLCAアンタゴニスト活性を有する物質を約0.1mg〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、COPDの治療目的で噴霧剤の形で成人（体重60kgとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【００４３】
（２）また、本発明の非ヒト哺乳動物は、(外来性)CLCA遺伝子が高発現している場合、上記したCOPDなどを発症している。
したがって、本発明の非ヒト哺乳動物は、上記疾患の予防・治療剤の評価のために用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明の非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被検物質を適用し、上記疾患の改善効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防・治療のために用いられる物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。被検物質を投与しない場合に比べて、被検物質を投与した場合の、COPDなどが約10％以上、好ましくは約30％以上、さらに好ましくは約50％以上改善された場合、該被検物質をCOPDの予防・治療用医薬として選択する。
被検物質としては、合成化合物、ペプチド、タンパク質、DNAライブラリー、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
【００４４】
選択された物質は、上記（１）の場合と同様の方法で製剤化でき、経口的または非経口的に、安全にヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
上記予防・治療用医薬として選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、COPDの治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、一日につき該物質を約0.1mg〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、COPDの治療目的で注射剤の形で成人（体重60kgとして)に投与する場合、一日につき当該物質を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを患部に噴霧することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【００４５】
本発明の遺伝子導入哺乳動物を、組織培養のための細胞源として使用することも可能である。また、例えば、本発明の遺伝子導入哺乳動物の組織中のDNAまたはRNAを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現されたタンパク組織を分析することにより、核内レセプターの複雑な作用の転写因子との関連性について解析することもできる。あるいは、遺伝子を有する組織の細胞を、標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば脂肪組織を形成する細胞などの一般に培養が困難な組織に由来する細胞の機能を研究することもできる。さらに、その細胞を用いることにより、例えば細胞の機能を高めるような薬剤の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、CLCAを大量に単離精製すること、ならびにその抗体を作製することも可能である。
【００４６】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（selenocysteine）
【００４７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2-Bzl         ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００４８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
マウスgob-5タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトCLCA1タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒトCLCA2タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトCLCA4タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
マウスCLCA4タンパク質のアミノ酸配列を示す。（WO 03/62426号公報）
〔配列番号：６〕
マウスCLCA4Aタンパク質のアミノ酸配列を示す。（WO 03/62426号公報）
〔配列番号：７〕
ラットCLCA4タンパク質の部分アミノ酸配列を示す。（WO 03/62426号公報）
〔配列番号：８〕
ラットCLCA1タンパク質のアミノ酸配列を示す。（WO 03/37927号公報）
〔配列番号：９〕
マウスgob-5タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトCLCA1タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ヒトCLCA2タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒトCLCA4タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
マウスCLCA4タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
マウスCLCA4Aタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
配列番号：７で表される部分アミノ酸配列を有するラットCLCA4タンパク質の部分アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ラットCLCA1タンパク質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例１（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例１（１）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例１（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例１（２）で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例１（４）で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例１（４）で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例１（４）で用いられたFAM標識TaqManプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例４で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例４で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例４で用いられたFAM標識TaqManプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例５で用いられたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例５で用いられたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例５で用いられたFAM標識TaqManプライマーの塩基配列を示す。
【００４９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
実施例１
（１）gob-5発現ベクターの構築
肺での導入遺伝子の高発現に必要なCC10（Clara cell 10kDa protein）プロモーターはRat Genomic DNA (Clontech 6750-1. Lot. 705022) を鋳型にPCR増幅を行った。PCR増幅は文献（J. Biol. Chem., 267, 14703）で使用されているプロモーター領域のゲノム配列をもとにプライマーSA1（配列番号：１７）およびプライマーSA4（配列番号：１８）を設計し、開始コドンに隣接する2.3 kbpを、TaKaRa Pyrobest DNA polymerase（宝酒造; R005A）を使用し、98℃10秒、60℃20秒、72℃180秒、30サイクルにて増幅し、得られた2.3 kbp 断片をPCR TOPO Zero Blunt vector（Invitrogen 社; K280020）にBlunt subcloningし、塩基配列の確認を行った（プラスミド名：PCR-ratCC10）。このPCR-ratCC10より、pRL-TK (Promega 社; E2241）のHSV TK promoter BglII-HindIII 領域とPCR-ratCC10 の BamHI-HindIII promoter 断片と入れ換え、pRL-rCC10-Luciferaseを作製した。さらにpRL-rCC10-LuciferaseよりBamHIで消化したrCC10 promoter-Luciferaseを含む断片( 3.5 kbp)を切り出し、同じくBamHIで消化したpUC118に連結作製した（pUC118-CC10-Luciferase）。gob-5 cDNAはあらかじめpRL-TK にクローニングしてあったpRL-TK-mgob-5より切り出した2.9 kbp Csp45I-ClaI断片を使用した。pUC118-CC10-Luciferase （7.0 kbp）のCsp45I-ClaIサイトにpRL-TK-mgob-5より回収した2.9 kbp Csp45I-ClaI断片をTakara ligation kit（宝酒造）を用いてライゲーションし、発現ベクターの構築を完了した（プラスミド名：pUC118-CC10-mgob-5）。トランスジェニックマウス作製はCC10-mgob-5 を含むSalI-Kpn I ６kbp 断片を切り出し、マウス卵への導入に使用した（図１）。
【００５０】
（２）gob-5遺伝子導入トランスジェニックマウスの作製
上記（１）において作製されたgob-5発現ベクターの直鎖状断片をElutip-dカラム（Schleicher & Schuell社製）を用いて精製した後、10倍希釈トリス塩酸・EDTAバッファーによって1μg/mlの濃度に調製した。次に常法の過排卵処理を行って得たBDF1系統（日本クレア株式会社）マウス受精卵前核に上記のDNA断片をマイクロインジェクション法によって導入した。インジェクションした受精卵は偽妊娠した仮親の卵管に移植した。妊娠後、仮親より産仔が得られた。
3週齢時に産仔の尾を切断し、プロティネースK処理を行った。ゲノムDNAはフェノール・クロフォルム抽出し、エタノール沈殿によって得た。これらのDNAをもとにgob-5センスプライマー（配列番号：１９）、gob-5アンチセンスプライマー（配列番号：２０）およびPCRキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてPCR溶液を調製した。調製したPCR溶液は、94℃、1分間反応させた後、94℃30秒、66℃20秒、72℃150秒のサイクルを30回反復させ、最後に72℃、7分間の処理によって導入遺伝子の検出を行った。反応産物を電気泳動した結果、約0.4Kbのgob-5 cDNA由来PCR産物が検出された。マイクロインジェクション実験において得られた産仔から5匹のPCR陽性個体が得られた。
【００５１】
（３）gob-5トランスジェニックマウスの系統化と維持繁殖
上記（２）で取得された5系統（雄4系統：172M, 176M, 178M, 192M, 雌１系統：196F）のTg陽性（hetero）のFo founder マウスと野生型 BALB/cA Jcl系マウス（日本クレア株式会社）との交配で各々 F l 個体を取得し、上記（２）で行ったPCR 法により Tg陽性（hetero）と野生型を判定した。各系統の F 1 hetero 個体について肺におけるgob-5遺伝子発現量を調べ、高い発現量を示した172Mおよび178Mの2系統を一次選抜した。次に、172Mおよび178Mの2系統についてF 1 hetero同士の交配で F 2 個体を取得し、上記（２）で行ったPCR 法によりホモの判定を行った。これらホモ個体の肺でのgob-5遺伝子発現量を調べ、発現量の高かった178M系を二次選抜した。この 178M系についてgob-5遺伝子の高発現個体を安定的に取得するために、Ｆ 3 以降は子孫を先に取得しておき、各々の両親のgob-5 遺伝子発現量を調べて、高発現を示した両親の子孫を兄妹交配する方法で維持繁殖を実施した。
【００５２】
実施例２
トランスジェニックマウスのgob-5 mRNAのTaqMan解析
実施例１（３）で維持繁殖して得た11週齢のトランスジェニックマウス（Ｆ5）から摘出した肺、約200mgをISOGEN（ニッポンジーン社製）中でホモジナイズし、常法によりtotal RNAを抽出した。total RNA 100ngを使用し、First strand cDNA synthesis kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてプロトコールに従ってcDNA合成を行い、テンプレートとした。2種のプライマー（配列番号：２１および配列番号：２２）、およびFAM標識TaqMan プライマー（配列番号：２３）のプライマーセットを用いてTaqMan解析（ABI PRISM7900、Applied Biosystems）を行った。内部標準であるGAPDHの検出には、rodent GAPDH control reagent (Applied Biosystems）を用いた。また、陰性コントロールとして、実施例１（２）で行ったPCRにより野生型と判断された個体を用いた。
gob-5遺伝子発現は、トランスジェニックマウスの肺で認められ、野生型マウスの約140倍の高い発現量を示した（図２）。
【００５３】
実施例３
トランスジェニックマウスにおけるgob-5タンパク質の発現
実施例１（３）で取得した178M系のF5個体の肺を、4％パラホルムアルデヒドにより灌流固定後摘出し、4℃で一晩固定した。その後スクロース-HBSS溶液にスクロース濃度を順次上げて置換し、最終的に18％スクロース-HBSS溶液で置換、ドライアイスにて凍結した。凍結した肺はクリオスタット内で-15℃、3時間静置後、8-10μlの厚さに切断し、APSコート済みのスライドガラスに貼り付けて-80℃で保存した。作製した肺切片スライドはドライヤーで乾燥後、1mM CaCl2含有TBSバッファー（TBS-Ca）にて3回洗浄し、0.3％の過酸化水素含有メタノールに1時間浸した。TBSバッファーで2回洗浄後、3％ FBS含有ブロックエース（雪印乳業）で1時間のブロッキングを行い、TBSバッファーで洗浄後、10μg/ml ウサギ血清由来の抗マウスgob-5抗体を室温で1時間反応させた。陰性コントロールには10μg/ml コントロールウサギIgG（ジャクソンイムノリサーチ）を使用した。TBSバッファーで3回洗浄後、ENVISION+ peroxidase（DAKO）を1時間反応させ、再度TBSバッファーで洗浄し、DAB基質を添加し、発色させた。ヘマトキシリンで核染色を行った後、封入して400倍率の光学顕微鏡にて観察した。
その結果、トランスジェニックマウスの肺で、gob-5タンパク質の発現を示す強い発色が観察された。そのgob-5タンパク質の発現部位は、形態学的な観察により、気道上皮細胞であると同定された。一方、コントロールとして用いた野生型マウスの肺では、gob-5タンパク質の発現は認められなかった。
【００５４】
実施例４
トランスジェニックマウスにおける粘液分泌の増加
gob-5遺伝子は気道過敏性亢進モデルマウスで気道上皮細胞の一種である杯細胞（goblet細胞）に発現し、杯細胞での粘液分泌に関与している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98巻、5175頁、2001年）。
気道上皮において、gob-5遺伝子の発現が粘液分泌を誘発しているか否かを、PAS染色により粘液タンパク質を染色して調べた。
実施例３の方法に準じて作製されたトランスジェニックマウスおよび野生型マウスの肺切片を10％ホルマリン溶液で10分間固定後、0.5％過ヨウ素酸水溶液で5分間酸化し、シッフ試薬で15分間、亜硫酸水で3分間処理し、エタノールで脱水、キシレンで透徹することによりPAS染色を行った。染色後のスライドガラスを光学顕微鏡で観察した結果、トランスジェニックマウスの気道上皮細胞で、粘液タンパク質の存在を示す赤紫色の発色が認められた。さらに、一部の末梢気道では、気道内を満たしている粘液タンパク質の存在も観察された。一方、コントロールとして用いた野生型マウスの気道内では、そのような過剰の粘液タンパク質は認められず、ごく一部の気道上皮細胞が染まったのみであった。
この気道上皮から分泌される粘液タンパク質は、ムチンと呼ばれる糖タンパク質によって構成される。トランスジェニックマウスで過分泌された粘液タンパク質を調べるため、気道上皮の杯細胞由来のムチンタンパク質であるMUC5ACのmRNAのTaqMan解析を行った。TaqMan解析は実施例２で記載した方法と同様の方法で行い、2種のプライマー（配列番号：２４および配列番号：２５）、およびFAM標識TaqManプライマー（配列番号：２６）のプライマーセットを用いた。内部標準であるGAPDHの検出には、rodent GAPDH control reagentを用いた。
その結果、トランスジェニックマウスのMUC5AC遺伝子発現は野生型マウスの約18倍に増加していることがわかった（図３）。gob-5遺伝子のトランスジェニック化により気道上皮で杯細胞が誘導され、その杯細胞でMUC5ACの発現が増加し、粘液の過分泌につながったと考えられる。
【００５５】
実施例５
トランスジェニックマウスにおける肺の肥大と肺気腫様病変
実施例１（３）で取得した178M系のF5個体では顕著に肺の肥大を示す個体がみられた。
上記肺を実施例３の方法にて摘出し、肺切片スライドを作製した。肺切片スライドをドライヤーで乾燥後、常法にてヘマトキシリン−エオジン染色を行い、200倍率の光学顕微鏡にて観察した。野生型マウスの肺では一つ一つの肺胞が細かい編み目のような構造を形成していたが、トランスジェニックマウスの肺では、この編み目構造が破壊され、一つ一つの肺胞領域が顕著に拡大していた。この肺胞の拡大は気腫化と呼ばれるヒトCOPD患者の肺で観察される症状と酷似していた。
この気腫化の原因を調べるため、肺胞マクロファージ由来のプロテアーゼであるMMP-12のmRNAのTaqMan解析を行った。TaqMan解析は実施例２で記載した方法と同様の方法で行い、2種のプライマー（配列番号：２７および配列番号：２８）、およびFAM標識TaqManプライマー（配列番号：２９）のプライマーセットを用いた。内部標準であるGAPDHの検出には、rodent GAPDH control reagentを用いた。
その結果、トランスジェニックマウスのMMP-12遺伝子発現は野生型マウスの約300倍の高い発現量を示すことがわかった（図４）。
gob-5遺伝子のトランスジェニック化により誘導されたMMP-12が、そのプロテアーゼ活性で、肺胞構造タンパク質を分解し、肺の気腫化および肺の肥大をもたらしたと考えられる。
以上より、gob-5トランスジェニックマウスは粘液分泌増加の慢性気管支炎様病態と肺胞拡大の肺気腫様病態を示し、COPDのモデル動物となりうることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】構築したgob-5発現ベクターを示す。
【図２】gob-5遺伝子の発現量を示す。
【図３】MUC5AC遺伝子の発現量を示す。
【図４】MMP-12遺伝子の発現量を示す。
【図１】
2005130748.tif 000002
【図２】
2005130748.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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