(57)【要約】【課題】  病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がなく、生体内で分解吸収が可能である新規なポリペプチドおよびその製造方法を提供する。【解決手段】  本発明の新規なポリペプチドは、下記式(1)で表されるペプチドユニットと、下記式(2)で表されるペプチドユニットとを含む。              -Pro-X-Gly-                        (1)              -Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-               (2)（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す。）  前記ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（モル比）は、(1)／(2)＝９９／１〜３０／７０程度である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含む新規なポリペプチド。
-Pro-X-Gly-                          (1)
-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-                (2)
（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す。）
【請求項２】
ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（モル比）が、(1)／(2)＝９９／１〜３０／７０である請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
コラゲナーゼ分解性を有する請求項１又は２記載のポリペプチド。
【請求項４】
円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドの少なくとも一部が３重らせん構造を形成可能である請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
分子量５×１０3〜５００×１０4の範囲にピークを示す請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７】
コラーゲン組織を形成可能である請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１記載の式(1)に対応するアミノ酸又はペプチドフラグメントと、式(2)に対応するアミノ酸又はペプチドフラグメントとを少なくとも含むアミノ酸成分又はペプチドフラグメント成分を縮合させて、請求項１記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項９】
請求項１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）請求項１記載の式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも含むペプチド成分、又は（ｂ）前記式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと前記式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとを少なくとも含むペプチド成分を縮合させる方法。
【請求項１０】
少なくとも脱水縮合剤の存在下で縮合させる請求項８又は９記載の製造方法。
【請求項１１】
脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で縮合させる請求項８又は９記載の製造方法。
【請求項１２】
脱水縮合剤が、カルボジイミド系縮合剤、フルオロホスフェート系縮合剤、及びジフェニルホスホリルアジドから選択された少なくとも一種である請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
溶媒が非水系溶媒であり、脱水縮合剤の割合が、請求項８又は９に記載のペプチド成分の総量１モルに対して、０．７〜５モルである請求項１０記載の製造方法。
【請求項１４】
溶媒が水系溶媒であり、脱水縮合剤の割合が、請求項８又は９に記載のペプチド成分の総量１モルに対して、２〜５００モルである請求項１０記載の製造方法。
【請求項１５】
縮合助剤が、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類、トリアジン類及び２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルから選択された少なくとも一種である請求項１１記載の製造方法。
【請求項１６】
縮合助剤の割合が、請求項８又は９に記載のペプチド成分の総量１モルに対して、０．５〜５モルである請求項１１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な生体内分解吸収性を有するポリペプチドおよびその製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、病原体感染の危険性や好ましくない副作用が無く、安全性の高い生体材料又は生体適合材料、例えば、組織工学用の担体又は支持体、再生医療用の担体又は支持体、組織接着剤や癒着防止材、手術用縫合糸、止血材、コンタクトレンズなどの医療用材料、医薬品の製剤素材、化粧品の素材などとして有用な新規なポリペプチドおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、あらゆる多細胞動物にみられる繊維状蛋白質であり、皮膚や骨の主成分として哺乳類では全蛋白質の２５％を占める。典型的なコラーゲン分子は、３本のコラーゲンポリペプチド鎖が三重らせん構造と呼ばれるロープ状の超らせん構造をとる。コラーゲンには、プロリン（Pro）とグリシン（Gly）とが特に多く含まれ、両アミノ酸残基とも安定な３重らせん構造の形成に重要である。
【０００３】
コラーゲンの生体材料としての利用方法には、例えば、ブタの皮膚組織をそのままあるいは凍結乾燥した後、火傷などによる皮膚の損傷部位に移植する方法、酵素処理などによって細胞成分を除去して用いる方法、酸性溶液や酵素処理によって可溶化したコラーゲンを、所望の形態に再構成して用いる方法がある。一般的なコラーゲンの調製方法および定性方法は、「Methods Enzymol., Vol.82」（非特許文献１）, pp33-64, 1982に記載されている。
【０００４】
コラーゲンの利用について種々の提案がなされている。例えば、特開平０８−０２７１９２号公報（特許文献１）には、皮膚に潤いを与え、かつ皮膚をなめらかにするため、コラーゲンを含有する動物組織をアルコールでエステル化して修飾した後、修飾コラーゲンを抽出するコラーゲン誘導体の製造方法、およびそれを用いた化粧品基剤が提案されている。
【０００５】
特開平０７−０９７４５４号公報（特許文献２）には、可溶性コラーゲンを、メチレン鎖の両端にイミドエステル基を有するアルキレンジイミデート二価性架橋試薬で架橋処理することにより、熱変性後における三重らせん構造の再生率が高く、水に可溶性の架橋コラーゲンの製造方法が記載されている。
【０００６】
特開平０８−０５３５４８号公報（特許文献３）には、コラーゲンを第１の合成親水性ポリマーと反応させてコラーゲン−合成ポリマーマトリックスを形成し、さらにコラーゲン−合成ポリマーマトリックスを、第２の合成親水性ポリマー、生物学的活性物質、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、化学的架橋剤、エステル化剤、アミド化剤、アシル化剤、アミノ酸、ポリペプチドなどと反応させることにより、免疫原性が低く、種々の医療用途で使用される生体適合性移植物の調製に有用なコラーゲン−合成ポリマーマトリックスが記載されている。
【０００７】
特開平０７−２７８３１２号公報（特許文献４）には、ｐＨ７で実質的に非繊維形態である化学的修飾コラーゲンと共有結合した親水性合成ポリマーを含む結合体が記載されている。この文献には、前記結合体が、特に眼科用デバイスにおいて有用であり、光学的に透明で生体適合性を有することが記載されている。
【０００８】
特開平０５−０００１５８号公報（特許文献５）には、コラーゲンマトリックスを砕断し、この砕断マトリックスを高遠心場で遠心し、沈殿を均質化してペーストとし、該ペーストを注型し、注型したペーストを３７℃以下の温度で乾燥するコラーゲン膜状物質の製法が記載されている。このコラーゲン膜状物質は、生体適合性で非炎症性、かつ人工移植物として組織の修復に有用であることも記載されている。
【０００９】
特開平０５−１２５１００号公報（特許文献６）には、魚鱗をそのまま若しくは脱灰した後、ペプシン処理することにより得られる高純度の可溶性魚鱗コラーゲンとその製造方法が記載されている。
【００１０】
特開平０６−２２８５０６号公報（特許文献７）には、７０〜９０％エタノール媒質中に、コラーゲン溶液をノズルより吐出して、糸状物あるいは膜状物を生成し、乾燥した後、裁断又は粉砕することにより、粒状又は粉状の可溶性コラーゲン乾燥物を製造する方法が記載されている。
【００１１】
特開平０８−２７６００３号公報（特許文献８）には、未焼成のヒドロキシアパタイト単結晶を、低抗原性化したコラーゲン線維の少なくとも一部に付着させ、骨などの生体硬組織を修復する材料として用いることが記載されている。
【００１２】
特開平０８−０４１４２５号公報（特許文献９）には、動物又は人間由来のコラーゲン中のプリオンを除去するために、コラーゲン溶液中の細胞および組織の断片を除去し、アルカリ処理する方法およびこの方法により得られるコラーゲンが記載されている。
【００１３】
また、コラーゲン類似物の化学合成の方法に関し、Pro-Ser-Glyのp-ニトロフェニルエステル、あるいはPro-Ala-Glyのp-ニトロフェニルエステルをジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンを加えて24時間静置することにより、分子量が16,000〜21,000の可溶性ポリアミドが得られることが報告されている（「J. Mol. Biol., Vol.63」（非特許文献２）、pp.85-99, 1972）。これらの可溶性ポリアミドは円二色性スペクトルから３重らせん構造をとることが推定されているが、得られたポリマーの性質に関する記述はない。
【００１４】
エラスチン由来のVal-Pro-Gly-Val-Gly配列を含む５０量体のペプチドをジメチルスルホキシドに溶解し、２当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと１当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、および１．６当量のＮ−メチルモルフォリンを加えて１４日間静置した後、分子量カットオフが５万の透析膜で透析してポリアミドを得る方法も報告されている（「Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46」（非特許文献３）, pp.453-463, 1995）。
【００１５】
一方、前記特許文献９に記載されているように、ヒツジの振戦病やウシの海綿状脳症の原因物質がプリオンと呼ばれる伝染性蛋白質であり、この伝染性タンパク質がヒトのクロイツフェルドーヤコブ病伝染の原因の一つと言われている。プリオンは、蛋白質であり、通常の滅菌、殺菌方法では失活し難く、しかも種を越えて感染することが指摘されている（「Nature Review, Vol.2」（非特許文献４）、 pp.118-126, 2001）。
【００１６】
一般に、医療用具や医薬品、化粧品ではウシやブタ由来のコラーゲンを原料として用いることが多い。そのため、通常の滅菌、殺菌方法では除去できないプリオンなどの病原体（又は病原性因子）の感染（又は伝達）の危険性が常に存在している。
【００１７】
また、天然のコラーゲン中には種々の細胞接着サイトが含まれているため、用途に応じた細胞選択性が発揮できない。例えば、神経の軸索誘導材料としてコラーゲンを用いると、軸索の伸長速度より周囲の繊維芽細胞の遊走、増殖速度が大きく瘢痕組織化して軸索が伸長することができない。このため、繊維芽細胞の遊走を防ぐ材料でコラーゲンの周囲を覆うことなどの措置が必要となる。
【特許文献１】特開平０８−０２７１９２号公報
【特許文献２】特開平０７−０９７４５４号公報
【特許文献３】特開平０８−０５３５４８号公報
【特許文献４】特開平０７−２７８３１２号公報
【特許文献５】特開平０５−０００１５８号公報
【特許文献６】特開平０５−１２５１００号公報
【特許文献７】特開平０６−２２８５０６号公報
【特許文献８】特開平０８−２７６００３号公報
【特許文献９】特開平０８−０４１４２５号公報
【非特許文献１】「Methods Enzymol., Vol.82」、pp33-64, 1982
【非特許文献２】「J. Mol. Biol., Vol.63」、pp.85-99, 1972
【非特許文献３】「Int. J. Peptide Protein Res., Vol.46」、pp.453-463, 1995
【非特許文献４】「Nature Review, Vol.2」、pp.118-126, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明の目的は、病原体の感染や病原性因子の伝達を生じる危険性や好ましくない副作用の虞がなく、生体内で分解可能な新規なポリペプチドおよびその製造方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、安全性の高い生体材料又は生体適合材料として有用な新規なポリペプチドおよびその製造方法を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、二量化や環化反応を抑制しつつ、前記のような特性を有するポリペプチドを効率よく製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は前記課題を解決するため鋭意検討の結果、特定のペプチド成分を縮合すると環化することなくコラーゲン様ポリペプチドが生成し、生体内で分解が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００２２】
すなわち、本発明の新規なポリペプチドは、下記式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットと、下記式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとを含む。
【００２３】
-Pro-X-Gly-                          (1)
-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-                (2)
（式中、ＸはProまたはHyp、ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAla、ＺはIleまたはLeuを表す。）
前記ペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)との割合（モル比）は、(1)／(2)＝９９／１〜３０／７０程度であってもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、コラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼで分解可能であり、したがって哺乳類動物の生体内でも分解可能である。そのため、生体内で分解し吸収可能である。前記ポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。このことは、ポリペプチドの少なくとも一部（一部または全部）が、３重らせん構造を形成していることを示している。本発明のポリペプチドは、分子量５×１０3〜５００×１０4の範囲にピークを示してもよい。また、本発明のポリペプチドは、コラーゲン組織（コラーゲン状の組織）を形成可能である。
【００２５】
本発明では、前記式(1)に対応するアミノ酸やペプチドフラグメントと、前記式(2)に対応するアミノ酸やペプチドフラグメントとを少なくとも含むアミノ酸成分やペプチドフラグメント成分を縮合させることにより、前記ポリペプチドを得ることができる。前記ポリペプチドは、例えば、（ａ）前記式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法や、（ｂ）式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法により製造してもよい。
【００２６】
前記ペプチド成分を縮合する方法において、反応は、通常、溶媒（水及び／又は有機溶媒）中、少なくとも脱水縮合剤（例えば、カルボジイミド系縮合剤、フルオロホスフェート系縮合剤、ジフェニルホスホリルアジドなど）の存在下で、前記ペプチド成分を縮合させることにより行うことができる。また、反応は、前記脱水縮合剤と縮合助剤（又は脱水助剤）（例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類など）、トリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなど）との存在下で行ってもよい。非水系溶媒（水を含まない溶媒）中で反応を行う場合、脱水縮合剤の割合は、前記ペプチド成分の総量１モルに対して、０．７〜５モル程度であってもよく、水系溶媒（水を含む溶媒）中で反応を行う場合、脱水縮合剤の割合は、前記ペプチド成分の総量１モルに対して、２〜５００モル程度であってもよい。縮合助剤の割合は、前記ペプチド成分の総量１モルに対して、０．５〜５モル程度であってもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明では、病原体感染の危険性や副作用の虞がなく、安全性が高く細胞親和性や生体適合性にも優れている。しかも、このポリペプチドは、生体内で分解性が高いため、生体内での吸収性にも優れることが期待できるので、生体内埋植材の基材として適している。さらに、二量化や環化反応を抑制しつつ、縮合反応という簡単な操作で、前記ポリペプチドを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
【００２９】
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Hyp ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Sar ：サルコシン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従って、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に位置させ、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて、ペプチド鎖のアミノ酸配列を記述する。
【００３０】
本発明の新規なポリペプチドは、-Pro-X-Gly-で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットを含むことが必要である。-Pro- X -Gly-で表される配列は、３重らせん構造の安定性に寄与するため、この配列の割合が少ないと３重らせん構造の安定性が減少する。さらに、このユニットは、３重らせん構造の安定性の点から、ポリペプチド中において、-(Pro-X-Gly)n-で表される繰返し構造（オリゴ又はポリペブチドユニット構造）を形成してもよい。この配列の繰返し数ｎは、例えば、１〜５０００、好ましくは２〜３０００程度である。Ｘは、ProまたはHypのいずれであってもよいが、３重らせん構造の安定性からHypであるのがより好ましい。なお、Hypは、通常、４Hyp（例えば、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）残基である。
【００３１】
また、本発明のポリペプチドは、-Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly-で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットを含むことが必要である。この配列を含まない場合や少なすぎる場合には、コラゲナーゼによる分解性が低下する。一方、この配列が多すぎると３重らせん構造の安定性が低下する。ＹはGln、Asn、Leu、Ile、ValまたはAlaのいずれであってもよいが、Gln、Asn、Leu、Val、Ala、特にGln、Leuがより好ましい。ZはIleまたはLeuのいずれでもよいが、Ileがより好ましい。ＹとＺとの組み合わせは、例えば、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）であり、ＺがIleであるペプチドや、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）であり、ＺがLeuであるペプチドなどが挙げられる。
【００３２】
ＸとＹとＺとの組み合わせは、ＸがHyp、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）、ＺがIle又はLeuであるペプチドや、ＸがPro、ＹがGln、Asn、Leu、Ile、ValおよびAlaから選択された一種（例えば、Gln又はLeu）、ＺがIle又はLeuであるペプチドなどが挙げられる。
【００３３】
さらに、得られるポリペプチドの物理的および生物学的性質を損なわない限り、本発明のポリペプチドは他のアミノ酸残基やペプチド残基（ユニット）を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドが有用な物理的および生物学的性質を発揮するためには、例えば、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、His、Ala、Val、Leu、Arg、Pro、Tyr、Ileから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基、特に、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg、Pro、Valから選択された少なくとも一種のアミノ酸残基又はペプチド残基を有している場合が多い。具体的には、例えば、Gly、Sar、Ser、Glu、Asp、Lys、Arg-Gly-Asp、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Ile-Lys-Val-Ala-Val、Val-Pro-Gly-Val-Gly、Asp-Gly-Glu-Ala、Gly-Ile-Ala-Gly、His-Ala-Val、Glu-Arg-Leu-Glu、Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu、Arg-Ser-Arg-Lysで示されるアミノ酸残基やペプチド残基を含むのが好ましい。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、生理学的又は薬理学的に許容される塩であってもよく、例えば、無機酸（塩酸、硫酸、リン酸など）、有機酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属（ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムなど）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｔ−ブチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなど）との塩であってもよい。これらの塩形成化合物は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。これらの塩は、通常の塩形成反応によって得ることができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドにおいて、前記ペプチドユニット(1)と前記ペプチドユニット(2)との割合（モル比）は、(1)／(2)＝９９／１〜３０／７０、好ましくは９８／２〜４０／６０、さらに好ましくは９５／５〜５０／５０程度である。
【００３６】
前記ペプチドユニット(1)および前記ペプチドユニット(2)の合計量と、他のペプチドユニットとの割合（モル比）は、前者／後者＝１００／０〜５０／５０、好ましくは１００／０〜６０／４０、さらに好ましくは１００／０〜７０／３０程度である。
【００３７】
このようなポリペプチドは、環化により６員環を形成することなく、鎖状のポリペプチドを形成しており、溶媒（水、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリドンなどの親水性溶媒又はそれらの混合溶媒）に可溶である。本発明のポリペプチドは、水系ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）において、球状蛋白質換算で、例えば、分子量５×１０3〜５００×１０4、好ましくは分子量１×１０4〜３００×１０4、好ましくは３×１０4〜２００×１０4、さらに好ましくは５×１０4〜１００×１０4程度の範囲にピークを示す。
【００３８】
さらに、本発明のポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す。そのため、ポリペプチドの少なくとも一部（すなわち、一部または全部）が３重らせん構造を形成可能であり、コラーゲン様ポリペプチドを形成する。なお、コットン効果とは、旋光性物質において特定の波長で左右の円偏光に対する吸収係数が異なるために起こる現象をいう。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、コラーゲン組織（コラーゲン状の組織）を形成可能である。上記３重らせん構造を形成したポリペプチド鎖が自己集合して、数ｎｍ〜数十ｎｍの原線維を形成し、さらにこれらの原線維が配列して数μｍ〜数十μｍの繊維構造を形成することができる。これらは、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、あるいは原子間力顕微鏡により観察することができる。
【００４０】
本発明の新規なポリペプチドは、アミノ酸やペプチドフラグメント（又はセグメント）を縮合反応に供する慣用の方法により得ることができ、最終的にペプチドユニット(1)とペプチドユニット(2)とがポリペプチド中に含まれている限り特に制限されず、例えば、構成アミノ酸の縮合反応や、ペプチドフラグメントとアミノ酸との縮合反応を利用して得てもよいが、予め、式(1)及び／又は(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを調製し、このペプチドを含むペプチド成分を縮合する方法により得るのが好ましい。
【００４１】
予め調製したペプチド成分を縮合する方法において、ペプチド成分のペプチド鎖の合成は、通常のペプチド合成方法に従って行うことができる。ペプチドは、例えば、固相合成法または液相合成法によって調製できるが、固相合成法が操作上簡便である〔例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁参照〕。ペプチド合成には、慣用の方法、例えば、縮合剤を用いるカップリング方法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル（ONp）、ペンタフルオロフェニルエステル（Opfp）などのフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ONSu）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミドエステル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（Obt）など）、混合酸無水物法、アジド法などが利用できる。好ましい方法では、少なくとも縮合剤（好ましくは後述する縮合剤、特に後述する縮合剤と縮合助剤との組合せ）を用いる場合が多い。
【００４２】
さらに、ペプチドの合成では、アミノ酸又はペプチドセグメントの種類に応じて、アミノ基、カルボキシル基、他の官能基（グアニジノ基、イミダゾリル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、ω−カルボキシル基など）の保護基による保護と、接触還元や強酸処理（無水フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）による保護基の脱離・除去とが繰り返し行われる。例えば、アミノ基の保護基には、ベンジルオキシカルボニル基(Z)、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基(Z(OMe))、９−フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc)、ｔ−ブトキシカルボニル基(Boc)、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基(Npys)などが利用でき、カルボキシル基の保護基には、ベンジルオキシ基(OBzl)，フェナシルオキシ基(OPac)、ｔ−ブトキシ基(OBu)、メトキシ基(OMe)、エトキシ基(OEt)などが利用できる。なお、ペプチド合成には自動合成装置を利用してもよい。
【００４３】
より具体的には、前記ペプチド鎖の固相合成法による調製は、慣用の方法で行うことができる。固相樹脂（又は担体）としては、反応溶媒に不溶性の重合体、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、例えば、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが利用できる。
【００４４】
固相合成法では、通常、(i)前記重合体（樹脂）に対して、目的とするペプチドのＣ末端からＮ末端の方向に向かって、遊離のα−ＣＯＯＨ基を有するとともに官能基（少なくともＮ末端のα−アミノ基など）が保護基で保護されたアミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作と、(ii)結合したアミノ酸又はペプチド断片のうちペプチド結合を形成するα−アミノ基の保護基を除去する操作と、(iii)上記結合操作と除去操作とを順次繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させて目的ペプチドに対応するペプチド鎖を形成する工程と、(iv)ペプチド鎖を重合体（樹脂）から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより、目的とするペプチドを生成させ、生成したペプチドを精製することにより、ペプチドを製造できる。前記アミノ酸又はペプチド断片を結合させる操作(i)では、前記ペプチド鎖のＣ末端に対応し、かつ遊離のα−ＣＯＯＨ基を有するとともに少なくともＮ末端が保護基で保護されたアミノ酸（例えば、Fmoc−アミノ酸、Boc−アミノ酸など）が使用される。なお、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、生成したペプチドの精製は、逆相液体クロマトグラフィーやゲルパーミエイションクロマトグラフィーなどの分離精製手段を利用して行うことができる。
【００４５】
このようにして合成されたペプチドを含むペプチド成分を縮合する方法には、（ａ）式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチドを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法と、（ｂ）式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと、式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとを少なくとも含むペプチド成分を縮合する方法とが含まれる。
【００４６】
前者の方法（ａ）において、式(1)及び(2)で表される双方のアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニツトと式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドユニットとの双方のユニットを含むペプチド）は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。また、この方法において、ペプチド成分としては、前記双方のユニットを含むペプチドに加え、目的のポリペプチドに応じて他のペプチドを用いてもよい。他のペプチドとしては、例えば、前述の他のアミノ酸残基やペプチド残基を含むペプチドなどが挙げられる。これらの他のペプチドも、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。なお、この方法において、式(1)又は(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを共縮合することにより、ユニット(1)とユニット(2)との割合を容易に調整することができる。
【００４７】
後者の方法（ｂ）においても、式(1)で表されるアミノ酸配列を有するペプチド（オリゴ又はポリペプチドユニット）、式(2)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、それぞれ、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。また、この方法においても、ペプチド成分としては、これらのペプチド(1)及びペプチド(2)に加え、目的のポリペプチドに応じて他のペプチド、例えば、前述の他のアミノ酸残基やペプチド残基を含むペプチドなどを用いてもよい。これらの他のペプチドも、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００４８】
これらのペプチドの縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、上記ペプチド成分および化合物を溶解又は懸濁（一部または全部を溶解）可能であればよく、通常、水及び／又は有機溶剤が使用できる。溶媒としては、例えば、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミドなど）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシドなど）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンなど）、ニトリル類（アセトニトリルなど）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフランなど）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコールなど）、およびこれらの混合溶媒が例示できる。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが繁用される。
【００４９】
これらのペプチドの反応は、通常、少なくとも脱水剤（脱水縮合剤）又は縮合剤の存在下で行うことができ、脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、二量化や環化を抑制しつつ、円滑にポリペプチドを生成できる。
【００５０】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に制限されず、例えば、カルボジイミド系縮合剤［ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド(EDC=WSCI)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)など］、フルオロホスフェート系縮合剤［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP)など］、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)などが例示できる。これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩］である。
【００５１】
縮合助剤は、上記縮合剤の反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類［例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド(HONSu)、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（HONB）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類］、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類［例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)などのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類］、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン(HOObt)などのトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルなどが例示できる。これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類［HONSuなど］、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類［HOBtなど］である。
【００５２】
前記脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用できる。前記脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、DCC-HONSu（HOBt又はHOObt）、WSCI-HONSu（HOBt又はHOObt）などが例示できる。
【００５３】
脱水縮合剤の使用量は、前記ペプチドの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）程度である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、前記ペプチドの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル（例えば、２〜５０モル）、好ましくは５〜２５０モル（例えば、５〜２５モル）、さらに好ましくは１０〜１２５モル（例えば、１０〜２０モル）程度である。縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、前記ペプチドの総量１モルに対して、例えば、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モル程度である。
【００５４】
本発明の縮合反応において、反応系のｐＨを調節してもよく、反応に関与しない塩基を添加してもよい。ｐＨの調節は、通常、無機塩基［水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど］、有機塩基、無機酸［塩酸など］や有機酸を用いて行うことができ、通常、反応溶液が中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）にｐＨ調整される。前記反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、ペプチドの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。
【００５５】
本発明のポリペプチドが３重らせん構造を形成することは、通常、ポリペプチドの溶液について、円二色性スペクトルを測定することにより立証できる。特に、円二色性スペクトルにおいては、３重らせん構造を形成する天然のコラーゲンおよびペプチド鎖が、波長２２０ｎｍ〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５ｎｍ〜２０５ｎｍに負のコットン効果を特徴的に示すことが報告されている（J. Mol. Biol., Vol.63 pp.85-99, 1972）。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、コラーゲン組織を形成可能であり、副作用を起こさない。さらに、病原体や病原性因子［例えば、病原性に転化したタンパク質（例えば、異常型プリオンなど）など］の感染や伝達の危険性がない。そのため、本発明のポリペプチドは、安全性が高い。また、細胞親和性や生体適合性にも優れている。そのため、生体材料又は生体適合材料、例えば、人工コラーゲンなどとして有用である。本発明のポリペプチドは、被検体（被験体）の組織（例えば、表皮組織及び真皮組織など）へ適用できる。被検体としては、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどの非ヒト動物）が例示できる。また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに由来して生じる感染又は伝達（例えば、ポリペプチドに存在する病原体又は病原性因子などの感染又は伝達）などを抑制又は予防するために使用できる。そのため、本発明のポリペプチドは、例えば、患部［例えば、疾病部や損傷部（例えば、擦傷および火傷などの損傷部）など］や、切開部［例えば、手術などの切開部など］において有効に利用できる。本発明のポリペプチドは、例えば、組織工学用の担体又は支持体、再生医療用の担体又は支持体（人工皮膚など）、組織接着剤や癒着防止材、手術用縫合糸、止血材、コンタクトレンズなどの医療用材料、医薬品の製剤素材（又は基剤）、化粧品の素材（又は基剤）、食品添加剤などとして利用できる。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、通常の公知の方法で種々の用途に応じて成形できる。そのため、ポリペプチドの利用形態は、液状（溶液又は懸濁液など）、粉粒状、二次元的形態（フィルムやシートなど）や三次元的形態であってもよい。例えば、ポリペプチドの溶液または懸濁液を、剥離性ベース（例えば、フッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン）シート）上に流延して、乾燥することにより、ポリペプチドのシートやフィルムが得られる。また、高濃度の塩を含む溶液またはポリペプチドを溶解しない溶剤中に、ポリペプチドの溶液または懸濁液をノズルから押し出すことにより繊維状物が得られる。さらに、ポリペプチドの水溶液または懸濁液をそのまま静置したり、必要により多価架橋性試薬（グルタルアルデヒドなど）を添加して静置することによりゲル状物を得ることができる。さらに、生成したゲル状物を凍結乾燥することによりスポンジ状の多孔質体を得ることができる。さらには、ポリペプチドの水溶液または懸濁液を撹拌発泡して乾燥することによっても多孔質体を得ることもできる。
【００５８】
さらに、本発明のポリペプチドは被覆剤として利用してもよい。例えば、前記ポリペプチドの溶液または懸濁液を、基材の表面に塗布又は散布した後、乾燥することにより、基材の表面を本発明のポリペプチドで被覆することができる。前記基材は、金属、セラミックス、プラスティック、天然高分子などの様々な材料で作られた成形体であってもよく、成形体の形態は、粉粒状、線状又は繊維状、フィルム又はシート状などの二次元的構造や三次元的構造を有していてもよい。さらには、多孔質体（粉粒状多孔質体、セルロース繊維紙、不織布や織布などの二次元的多孔質体、円筒状などの三次元的多孔質体）にポリペプチドの溶液または懸濁液を含浸させ、ポリペプチドを保持させてもよい。
【００５９】
本発明のポリペプチドを医療用途に用いる場合には、殺菌又は滅菌して用いることが好ましい。殺菌、滅菌方法としては、種々の殺菌・滅菌方法、例えば、湿熱蒸気滅菌、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、薬剤殺菌、紫外線殺菌などが用いられる。これらの方法のうち、ガンマ線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌は、滅菌効率と材料に与える影響が少なく好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、組織工学用の担体又は支持体、再生医療用の担体又は支持体（人工皮膚など）、組織接着剤や癒着防止材、手術用縫合糸、止血材、コンタクトレンズなどの医療用材料、医薬品の製剤素材（又は基剤）、化粧品の素材（又は基剤）、食品添加剤、被覆剤などに利用できる。
【実施例】
【００６１】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６２】
実施例１
式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：１）で示されるペプチド鎖を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎγ−トリチル−Ｌ−グルタミン〔Fmocグルタミン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Fmocアラニン〕、バッケム社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【００６３】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、ＰＤ１０カラム(アマシャム・バイオサイエンス（株）製)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをアマシャム・バイオサイエンス（株）製「AKTA explorer10XT」〔カラム：ミリポア（株）製「ノバパックＣ１８」  3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に付したところ、リテンションタイム12.4minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は2681.3であった(理論値：2679.9)。
【００６４】
2.5mg（0.0009mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OHを1mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.12mg（0.0009mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.34mg（0.0018mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で３倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、本発明のポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)と(2)の割合（(1)/(2)）は8/1（88.9/11.1）（モル比）であった。
【００６５】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が7万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００６６】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、223nmに正のコットン効果、198nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００６７】
実施例２
1.2mg（0.00045mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)と、1.2mg（0.00045mmol）の実施例１で得られた式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：１）で示されるペプチドを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、本発明のポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)と(2)の割合（(1)/(2)）は、18/1（94.7/5.3）（モル比）であった。
【００６８】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００６９】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７０】
実施例３
2.2mg（0.00081mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド((株)ペプチド研究所)と、0.24mg（0.00009mmol）の実施例１で得られた式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：１）で示されるペプチドを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、本発明のポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)と(2)の割合（(1)/(2)）は、98/1（≒99/1）（モル比）であった。
【００７１】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜40万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００７２】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７３】
比較例１
2.4mg（0.0009mmol）の式：H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH（配列番号：２）で示されるペプチド（（株）ペプチド研究所）を1mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、室温で撹拌した。この混合液に、0.12mg（0.0009mmol）のジイソプロピルエチルアミン、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、0.34mg（0.0018mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で３倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、ポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)と(2)の割合（(1)/(2)）は、100/0（モル比）であった。
【００７４】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が14万〜60万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００７５】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、196nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【００７６】
試験例１
実施例１〜３で得られたポリペプチド、および比較例１で得られたポリペプチドのそれぞれ0.025mgを、0.05mLの50mMのNaClと10mMのCaCl2を含む50mM Tris/HCl緩衝液（pH=7.5）に溶解した。さらに、同じ緩衝液0.05mLに溶解した200ngのコラゲナーゼ（MMP-1, human rheumatoid synovial fibroblast）を添加し、３７℃で２４時間静置した。その後、0.1M HCl水溶液を0.01mL添加して、酵素反応を停止した後、150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4）で希釈して、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））で分子量分布の変化を測定した。
【００７７】
その結果、実施例１のポリペプチドではコラゲナーゼを加えない場合のピーク分子量約100万が約54万に低下した。同様に実施例２，３のポリペプチドでも、それぞれ約80万が約40万、約70万が約30万に低下した。これに対して、比較例１では、コラゲナーゼの有無に関わらず、約54万であり、低下は認められなかった。
【００７８】
実施例４
式：H-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OH（配列番号：３）で示されるペプチド鎖を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65mmol/g(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕0.1mmolを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Fmocグリシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Fmocロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−イソロイシン〔Fmocイソロイシン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−アラニン〔Fmocアラニン〕、バッケム社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ1mmolずつ用いた。
【００７９】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸10mLで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物を、ＰＤ１０カラム(アマシャム・バイオサイエンス（株）製)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをアマシャム・バイオサイエンス（株）製「AKTA explorer10XT」〔カラム：ミリポア（株）製「ノバパックＣ１８」  3.9mmφ×150mm、移動相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で5容量％から50容量％に直線的に変化させた)、流速1.0mL/min〕に付したところ、リテンションタイム15minに単一のピ−クが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた精製ペプチドの分子量は2666.3であった(理論値：2664.9)。
【００８０】
1.2mg（0.00045mmol）のH-(Pro-Hyp-Gly)4-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-(Pro-Hyp-Gly)4-OHを0.25mLの10mMリン酸塩緩衝液（pH=7.4）に溶解し、0.12mg（0.0009mmol）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、15.7mg（0.082mmol）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を添加して、さらに20℃で２日間撹拌を続けた。得られた反応溶液を水で10倍に希釈し、水に対して３日間透析して、縮合剤などの試薬と未反応モノマーを除去し、本発明のポリペプチドを得た。ペプチドユニット(1)と(2)の割合（(1)/(2)）は、8/1（88.9/11.1）（モル比）であった。
【００８１】
得られたポリペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（アマシャム・バイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Superose 6 HR GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、分子量が8万〜100万の範囲にポリペプチドのピークが認められた。分子量はアマシャム・バイオサイエンス（株）製のGel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、算出した。
【００８２】
得られたポリペプチドの円二色性スペクトルを測定したところ、224nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を形成していることが確認された。
【配列表】
2005053878000001.app