(57)【要約】【課題】遺伝子恒温増幅法に使用できるプライマーの設計を支援するプライマー設計装置及びプログラムを提供すること。【解決手段】検査対象遺伝子の塩基配列から二次構造を計算によって予測し、予測された二次構造と、検査対象遺伝子の塩基配列とを画面上に表示し、所定の条件を満たすプライマーを塩基配列表示画面と、二次構造予測結果画面上に合わせて表示し、プライマーが検査対象遺伝子の二次構造上のどの位置にハイブリダイズするかを確認しつつ、プライマー設計を可能とする。本手段により、プライマー設計装置、あるいはプライマー設計プログラムが提供される。また、検査対象遺伝子に対して、恒温増幅法を用いた場合においても特異的かつ増幅効率の高いプライマーの設計を容易にすることが可能となる。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象遺伝子をコードする塩基配列と、塩基配列から予測される二次構造とを対応させたデータベースと、
前記検査対象遺伝子とプライマーをハイブリダイズさせる、前記検査対象遺伝子の任意の塩基配列とを指定する手段と、
前記指定する手段によって指定された前記検査対象遺伝子の二次構造と、前記二次構造における前記任意塩基配列の対応部位とについて、前記データベースで検索する手段と、
前記検索する手段によって検索された、前記検査対象遺伝子の二次構造を表示する手段と、
前記検索する手段によって検索された、前記検査対象遺伝子の二次構造における前記任意塩基配列の対応部位を表示する手段と、
前記対応部位で、前記プライマーを用いて相補鎖合成をするときの前記相補鎖の伸長方向を提示する手段とを有することを特徴とするプライマー設計装置。
【請求項２】
検査対象遺伝子配列を示す画面と検査対象遺伝子の二次構造予測結果を示す画面とにプライマー候補となる塩基配列の領域を表示する工程と、前記プライマー候補の塩基配列が対応する位置において前記検査対象遺伝子がとる二次構造を前記二次構造予測結果を示す画面に表示する工程と、前記検査対象遺伝子配列を示す画面と前記二次構造予測結果を示す画面とを比較する工程とを有することを特徴とする塩基配列表示方法。
【請求項３】
前記検査対象遺伝子が、複数の塩基配列をアライメントする際に変異や多型を有する塩基配列である塩基配列表示方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子増幅用プライマーの設計技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子増幅において、増幅反応の起点となるプライマー設計の良し悪しが遺伝子増幅の成否や増幅効率に関連しているため、プライマーの設計は非常に重要である。従来、プライマー設計を支援するプログラム（ソフトウェア）がいくつか知られている。これらのプログラム（ソフトウェア）では、特異的に検査対象遺伝子を増幅させるため、また遺伝子増幅の効率を向上させるため、煩雑な計算を自動的に行い、プライマー設計を支援している。具体的な設計の支援とは以下のようなものがある。
【０００３】
特異的な遺伝子増幅を支援するためには、プライマー3'末端の数塩基（5〜10塩基程度）の部分配列が検査対象遺伝子以外にハイブリダイズしない配列を選択するようにする。また、増幅効率を向上させるためには、プライマーと検査対象遺伝子間以外でのハイブリダイゼーションを抑えるようにする。より具体的には、プライマー分子内やプライマー分子間でハイブリダイズする配列を除外することである。プライマー配列の中で、ある部分配列に相補的な配列が存在すると分子内でハイブリダイズしてヘアピン構造を形成したり、プライマー同士でハイブリダイズしてプライマー二量体（プライマーダイマー）を形成したりする。検査対象遺伝子の増幅にはフォワードプライマーとリバースプライマーが必要である。プライマー分子間のハイブリダイゼーションを考慮する際には、フォワードプライマー同士のプライマーダイマー、リバースプライマー同士のプライマーダイマーだけでなく、フォワードプライマーとリバースプライマー間でのプライマーダイマーも考慮する必要がある。このような検査対象遺伝子の増幅に関与しないハイブリダイゼーションを抑えることにより、プライマーと検査対象遺伝子間以外でのハイブリダイゼーションが効果的に促進され、増幅効率が向上される。
【０００４】
以上のように、従来のプライマー設計プログラム（ソフトウェア）では、プライマーが特異的に検査対象遺伝子にハイブリダイズするか否か、プライマーが分子内で二次構造を形成するか否か、プライマーダイマーを形成するか否かを、プライマーと検査対象遺伝子の塩基配列の情報から、配列のアライメント、ハイブリダイゼーションの結果生じる二本鎖核酸の自由エネルギー、Tm値などを計算し、表示することによって設計支援を行っている。これらの計算はいずれもプライマーと検査対象遺伝子がハイブリダイズする部分つまりプライマー配列について、あるいはプライマー内部やプライマー分子間でハイブリダイズする部分つまりプライマー配列の一部分について自由エネルギーやTm値を計算しているだけである。
【０００５】
PCR（Polymerase Chain Reaction）法はDNA鎖から増幅を行うため、検査対象である遺伝子のDNA鎖が二次構造を形成している場合が少ない。また、PCR法は増幅反応中に、約94℃、約50〜60℃、（場合によりさらに約72℃）の2つないし3つの温度ステップからなる温度サイクルが含まれるため、検査対象遺伝子が二次構造を形成している場合でも、二次構造は熱変性により解消される。以上のことから検査対象遺伝子の二次構造の有無は重要視されず、従来のプライマー設計プログラム（ソフトウェア）では検査対象遺伝子の二次構造を計算することはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように従来技術では、検査対象遺伝子の増幅のためのプライマーを設計する際に、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの両プライマー配列の一部または全部が関与する配列に関する二次構造や自由エネルギーを計算するだけで、検査対象遺伝子の全体や増幅領域全体の二次構造や自由エネルギーを予測、計算してプライマー設計支援を行うことは出来なかった。このため、遺伝子を恒温増幅するNASBA法(例えば〔非特許文献1〕)、TMA法(例えば〔特許文献1〕)、3SR法(例えば〔非特許文献２〕)、SDA法(例えば〔非特許文献３〕)、ICAN法(例えば〔特許文献２〕)、LAMP法(例えば〔非特許文献４〕)などでは検査対象遺伝子が二次構造を形成してプライマーがハイブリダイズしにくくなる場合があり、プライマー設計がPCR法に比べて困難であるといった問題が生じていた。とりわけ、RNA鎖を増幅対象とするNASBA法やTMA法や3SR法ではプライマー設計が大きな課題となっていた。
【０００７】
【特許文献１】特許3241717号公報
【０００８】
【特許文献２】国際公開2000-56877号パンフレット
【非特許文献１】Nature, 350, 91-92, 1991
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 1874-1878, 1990
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 392-396, 1992
【非特許文献４】Nucleic Acids Res., 28, e63, 2000
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、恒温反応による遺伝子増幅法において、プライマー設計を容易にするプライマー設計装置及びプライマー設計プログラム（ソフトウェア）を提供することである。
本発明によるプライマー設計装置は、検査対象遺伝子の塩基配列を取得し、記憶装置に格納する手段と、検査対象遺伝子の二次構造を計算により予測し、記憶装置に格納する手段と、所定の条件を満たすプライマーの情報を生成し、記憶装置に格納する手段とを含む。また、検査対象遺伝子が変異や多型を含む場合には、変異や多型の塩基種と位置の情報を取得し、記憶装置に格納する手段も含む。プライマーの情報を生成する際の所定の条件には、従来のプライマー設計で用いられるプライマーの塩基長、プライマー間の距離（つまり増幅される塩基長）、プライマー内部やプライマー同士で形成する二次構造の予測結果などの条件を含む。この他に、例えば所定の制限酵素認識部位を増幅産物に含まれるようにしたり、あるいは含まれないようにしたりなどの条件を設定して、より好ましいプライマーを設計するようにしても良い。
【００１０】
記憶装置に格納された検査対象遺伝子の塩基配列、二次構造予測結果、プライマー情報などを表示するプログラム（ソフトウェア）及びコンピュータなどの組み合わせでプライマー設計装置は構成される。
【００１１】
検査対象遺伝子の塩基配列を取得後、増幅する領域あるいは、増幅する領域よりも長大な塩基配列領域について二次構造を予測する。二次構造の予測には例えば〔非特許文献５〕、〔非特許文献６〕及び〔非特許文献７〕に記載のアルゴリズムを用いても良い。予測された二次構造のうち安定なものを記憶装置に格納し、予測構造のうちの一つをコンピュータ画面上に表示する。検査対象遺伝子の塩基配列もあわせてコンピュータ画面上に表示され、塩基配列と、二次構造予測結果とを見比べることが可能となる。
【００１２】
所定の条件を満たすプライマーを塩基配列表示画面と、二次構造予測結果画面上に合わせて表示し、プライマーが検査対象遺伝子の二次構造上のどの位置にハイブリダイズするかを確認できる。表示するプライマーは所定の条件を満たすプライマー以外に、所定の条件を満たすプライマーの長さやハイブリダイズする位置を数塩基ずらしたものであっても良い。単独のプライマーを表示しても良いし、複数のプライマーを表示し、比較しながらプライマー設計を行っても良い。設計の結果得られた単独あるいは複数のプライマーを記憶装置に格納され、必要な場合には呼び出して再設計を行うことが可能である。
【００１３】
プライマー設計にはプライマー伸長端である3'末端が増幅の特異性や増幅効率に大きく関わっている。プライマーを検査対象遺伝子の塩基配列や、二次構造予測結果に合わせて表示する場合には、プライマーの3'末端が、5'末端と区別できるように表示を行い、A,C,G,Tの塩基種や、ループ、ステム、バルジなどの二次構造のうち、どれに該当するかを判別できるようにする。二次構造予測結果のループ部分にハイブリダイズするようなプライマーの増幅効率が高いことが多いため、ループ部分にハイブリダイズし、所定の条件を満たすプライマーを探索し、設計することが容易になる。
【００１４】
【非特許文献５】M Zuker and P Stiegler, Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information, Nucl. Acids. Res., 1981 9, 133-148.
【非特許文献６】Dawson W, Suzuki K, Yamamoto K., A physical origin for functional domain structure in nucleic acids as evidenced by cross-linking entropy: I., J Theor. Biol. 2001, 213, 359-386.
【非特許文献７】Dawson W, Suzuki K, Yamamoto K., A physical origin for functional domain structure in nucleic acids as evidenced by cross-linking entropy: II., J Theor. Biol. 2001, 213, 387-412.
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、プライマー設計装置、あるいはプライマー設計プログラムが提供される。該装置によって検査対象遺伝子に対して、特異的かつ増幅効率の高いプライマーの設計を容易にすることが可能となる。特に、検査対象遺伝子がRNA鎖であり、二次構造を形成している場合や、遺伝子増幅反応をNASBA法やTMA法などの恒温増幅法で行う場合に、プライマー設計を容易にすることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図2はプライマー設計装置21の模式図である。プライマー設計装置21には、検査対象遺伝子の入力を行う塩基配列入力部23と、二次構造の予測計算を行う予測計算用塩基配列入力部25と、プライマーの情報を生成する際に、条件を入力あるいは選択するプライマー情報入力・選択部27と、二次構造予測計算やプライマーの生成に関する計算を行い、得られた計算結果を記憶装置に格納したりする計算処理部29と、計算結果を表示装置や印刷装置などの出力装置に出力する出力処理部31から構成される。
【００１７】
塩基配列入力部23は、検査対象遺伝子の塩基配列の情報を格納したファイルの指定または選択のための画面を表示したり、画面上から塩基配列を入力する画面を表示したりする。予測計算用塩基配列入力部25は検査対象遺伝子の塩基配列のうち、二次構造予測計算に用いる塩基配列の情報を格納したファイルの指定または選択のための画面を表示したり、画面上から二次構造予測計算に用いる塩基配列を入力する画面を表示したりする。プライマー情報入力・選択部27は、プライマーの塩基長やプライマー間の塩基長、Tm値などの情報を入力あるいは選択させるための画面を表示したり、プライマー配列を入力する画面を表示したりする。
【００１８】
図3にプライマー設計装置21の処理の流れを示す。ユーザー側入力部22から塩基配列入力、プライマー条件入力・選択が行われ、計算処理部29にてプライマーの位置などを計算し、出力処理部31により計算結果を表示する。また、二次構造の予測計算用塩基配列入力が行われ、計算処理部29にて二次構造の予測計算が行われ、出力処理部31により予測計算の結果を表示する。
【００１９】
塩基配列入力部23には例えば図4に示すような塩基配列情報が入力される。塩基配列情報として、A、C、G、T、Uの文字が使用されるが、それぞれAはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミン、Uはウラシルである。塩基配列がDNAの時にはA、C、G、Tが用いられ、RNAの時にはA、C、G、Uが用いられる。RNAの場合にも表示上A、C、G、Tと表示し、DNA鎖かRNA鎖かを判別できる表示を別途するようにしても良い。ある塩基配列がAもしくはGの場合はR、CもしくはTの場合はY、GもしくはTの場合はK、AもしくはCの場合はM、GもしくはCの場合はS、AもしくはTの場合はW、CもしくはGもしくはTの場合はB、AもしくはGもしくはTの場合はD、AもしくはCもしくはTの場合はH、AもしくはCもしくはGの場合はV、AもしくはCもしくはGもしくはTの場合はNとユニバーサルコードに従って表記を行う。
【００２０】
複数の塩基配列に対して共通に使用できるプライマーを設計する場合、あるいはそれぞれに特異的に使用できるプライマーを設計する場合には、塩基配列を複数入力し、表示しても良い。図5(a)に示すように上段と下段のように上下に分割して複数の塩基配列をそれぞれ表示し、上段と下段で塩基種が同じ場合には下段に”−”を表示する。一方、上段と下段で塩基種が異なる場合には、下段の塩基種を変異があるという意味を示すために”＊”で表示したり、下段の塩基種を表示する。
【００２１】
また、図5(b)に示すように、1段で複数の塩基配列を表示しても良い。複数の塩基配列のうちの一つを選択して、選択された塩基配列を表示し、他の塩基配列と比較して変異がある箇所には、変異があるという意味を示すために”＊”を表示したり、あるいはユニバーサルコードを用いて表示を行う。
【００２２】
塩基配列入力後、プライマー情報入力・選択部27からの入力に従ってプライマーの塩基長、位置などが計算され、結果が表示される。プライマー情報入力・選択から計算結果表示までの処理は図6に示すような流れで行われる。まず、プライマー長、GC％、Tm値、プライマー間の距離、プライマー内部の二次構造の有無や二次構造の自由エネルギー、プライマーダイマーの有無や二次構造の自由エネルギーについて、範囲を入力あるいは選択する。検査対象遺伝子の塩基配列からプライマー候補の領域を生成させ、プライマー候補リストに追加する。生成した各プライマー候補について先に入力あるいは選択した条件を満たすかどうかの判断を行う。
【００２３】
判断の結果、条件を満たすプライマー候補はプライマー計算結果表示リストに追加し、満たさない候補はプライマー計算結果表示リストに追加しない。判断の終了したプライマー候補はプライマー候補リストから破棄する。プライマー候補リストに判断を行っていないプライマー候補があるかを調べ、未処理のプライマー候補が存在する場合には、条件を満たすかどうかの判断を行うステップへ戻る。未処理のプライマー候補が存在しない場合には、判断を行う処理を終了し、プライマー計算結果表示リストを表示する。
【００２４】
また、入力された塩基配列から二次構造予測を行う領域を入力あるいは選択し、二次構造予測を行い、得られた結果から一つを選択して表示する。図7に予測計算用塩基配列入力から結果表示までの流れを示す。まず、予測計算用塩基配列の範囲を入力あるいは選択し、二次構造予測を行う。予測には複数のアルゴリズムから予測に使用するものを選択できるようにする。予測計算の結果得られる二次構造は多数あるが、二次構造予測結果は自由エネルギーやエントロピーなどの熱力学的パラメータによってソートされた状態で、予測結果予備表示として示される。ソート順序はユーザーが任意に変更でき、ユーザーは予測結果予備表示の中から一つを選択して結果を表示する。結果表示は、予測結果一つだけでなく複数を任意に選択して表示することも可能である。
【００２５】
プライマー計算結果表示リストに表示されたある特定のプライマーを選択すると、図1に示すように結果表示画面1にて、選択されたプライマー5がハイブリダイズする位置が二次構造予測結果表示部2において、二次構造予測結果8にオーバーラップ表示される。プライマーの伸長端である3'末端6が、伸長方向が明確に区別できる形状（図7では矢じりで表記）で表示される。これにより、検査対象遺伝子の二次構造予測結果において、プライマー3'末端6がどの位置にハイブリダイズするのかを確認しながら、プライマー設計を行うことができる。選択されたプライマー5は塩基配列表示部3においても、塩基配列17にオーバーラップ表示される。
【００２６】
塩基配列表示部3と、二次構造予測結果表示部2どちらにも選択したプライマー5とプライマー3'末端6が表示されるため、塩基配列表示部3と、二次構造予測結果表示部2どちらもから、プライマーのハイブリダイズする位置を確認できる。塩基配列表示部3と、二次構造予測結果表示部2のどちらもからプライマー長、プライマーのハイブリダイズする位置を調節つまりプライマーの再設計することができる。ハイブリダイズする位置を確認して結果が良いもの、あるいはプライマー再設計の結果が良いものを設計の結果得られたプライマーとして、プライマー情報を記憶装置に格納する。
【００２７】
以上のような処理によって、検査対象遺伝子の二次構造を参照しながら、プライマー設計を行うことが可能となる。プライマー設計は、プライマー計算結果表示リストに表示されているプライマーが、検査対象遺伝子の二次構造のどの位置にハイブリダイズするかを確認しながら、設計を行っても良いし、二次構造の位置の適当な箇所をプライマー候補リストに追加して、条件を満たすかをチェックしても良い。
【００２８】
PCR法で使用するプライマー設計に比較すると、NASBA法やTMA法などの恒温増幅法に使用するプライマー設計は困難である。これは、RNA鎖の検査対象遺伝子から増幅を行うためである。RNA鎖はDNA鎖に比べて安定な二次構造を形成しやすく、安定な二次構造が一旦形成されればプライマーのハイブリダイゼーションが妨げられて増幅効率が落ちると考えられる。また、PCR法の場合は熱サイクルの度に検査対象遺伝子であるRNA鎖の熱変性過程があるのに対して、恒温増幅法であるため、RNA鎖の熱変性過程がなく、プライマーは安定な二次構造に対してハイブリダイゼーションしにくくなっていると考えられる。ここで、プライマーがハイブリダイゼーションしにくい安定な二次構造とは、ステム構造やバルジ構造を指す。
【００２９】
これは、ループ構造が1本鎖で構成されているために、プライマーが比較的ハイブリダイズしやすいのに対し、ステム構造では、検査対象遺伝子の分子内部で2本鎖を形成して、プライマーがハイブリダイズしにくくなっていると考えられるためである。バルジ構造についても、1塩基を除いて2本鎖を形成しているため、ステム構造と同様にプライマーが比較的ハイブリダイズしにくくなっていると考えられる。本発明によって、検査対象遺伝子の二次構造予測結果を参照しながらプライマー設計を行うことが可能になり、検査対象遺伝子がループ構造9、つまり1本鎖状態にある場所へのプライマー設計が容易にできるようになる。ステム構造10（2本鎖状態）やバルジ構造11（2本鎖状態のうち、1塩基のみが1本鎖状態）へのプライマーのハイブリダイゼーションに比べて、ループ構造（1本鎖状態）へのハイブリダイゼーションは起こりやすく、恒温増幅法においても増幅効率の良いプライマー設計が容易にできるようになる。
【００３０】
特に、検査対象遺伝子つまり増幅対象がRNA鎖の場合は、DNA鎖がB型の二重らせん構造を形成するのに対し、RNA鎖はA型の二重らせん構造を形成するため、二本鎖のステム構造やバルジ構造を避けるようにプライマー設計を行うことが重要になる。これはA型の二重らせん構造がB型の二重らせん構造よりも熱力学的に安定であるからである。
なお、本発明の適用は、NASBA法やTMA法などRNAを増幅する恒温増幅法に対して限定されるものではなく、PCR法などその他の遺伝子増幅法におけるプライマー設計において適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図1は、本発明による出力結果の画面の一例を示す。
【図２】図2は、本発明によるプライマー設計装置の構成を示す。
【図３】図3は、プライマー設計装置の処理の流れを示す。
【図４】図4は、入力される塩基配列情報の一例を示す。
【図５】図5は、複数の塩基配列を入力する場合の、塩基種が異なっている位置を示す情報を含む塩基配列情報の一例を示す。
【図６】図6は、プライマー情報入力・選択から計算結果表示までの処理の流れを示す。
【図７】図7は、予測計算用塩基配列入力から結果表示までの流れを示す。
【符号の説明】
【００３２】
1…結果表示画面
2…二次構造予測結果表示部
3…塩基配列表示部
5…選択されたプライマー
6…プライマー3'末端
8…二次構造予測結果
9…ループ構造
10…ステム構造
11…バルジ構造
17…塩基配列
21…プライマー設計装置
22…ユーザー側入力部
23…塩基配列入力部
25…予測計算用塩基配列入力部
27…プライマー情報入力・選択部
29…計算処理部
31…出力処理部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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