(57)【要約】【課題】  本発明は、シイタケ栽培で生じる栽培廃液を有効利用して、人体や環境に安全であり、安価かつ簡便なフェノール性物質を分解するためのフェノール性物質分解剤およびその方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、シイタケ栽培の栽培廃液由来である、フェノール性物質分解剤である。かかる態様は、シイタケ栽培の栽培廃液のフェノール性物質分解剤としての使用、シイタケ栽培の栽培廃液を用いて、フェノール性物質を分解する方法、およびシイタケ栽培の栽培廃液のフェノール性物質分解剤を製造するための使用を包含する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シイタケ栽培の栽培廃液由来である、フェノール性物質分解剤。
【請求項２】
シイタケ栽培の栽培廃液が、シイタケ上面栽培で得られる栽培廃液であることを特徴とする、請求項１記載のフェノール性物質分解剤。
【請求項３】
ラッカーゼおよび植物細胞壁分解酵素からなる群より選択される1種以上の酵素を含有していることを特徴とする、請求項１または２に記載のフェノール性物質分解剤。
【請求項４】
シイタケ栽培の栽培廃液を用いる、フェノール性物質を分解する方法。
【請求項５】
メディエーターを用いないことを特徴とする、請求項４記載のフェノール性物質を分解する方法。
【請求項６】
メディエーターを添加することをさらに含む、請求項４記載のフェノール性物質を分解する方法。
【請求項７】
フェノール性物質がフェノール性色素化合物である、請求項４〜６のいずれか1項に記載のフェノール性物質を分解する方法。
【請求項８】
フェノール性色素化合物が、レマゾールブリリアントブルーR （RBBR）、アシッドグリーン５、リアクティブブルー２、ダイレクトブルーI、アシッドバイオレット７およびアシッドレッド106からなる群より選択される色素である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
シイタケ栽培の栽培廃液が、シイタケ上面栽培で得られる栽培廃液であることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
シイタケ栽培の栽培廃液を出発材料として、ラッカーゼ、植物細胞壁分解酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素を得る方法。
【請求項１１】
植物細胞壁分解酵素が、ポリガラクツロナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、酸性プロテアーゼおよびマンガンペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ラッカーゼ、植物細胞壁分解酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素がシイタケによって天然に産生されるものである、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シイタケ上面栽培の栽培液を利用するフェノール性物質を分解する方法に関する。また、ラッカーゼ、ポリガラクツロナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、酸性プロテアーゼ、マンガンペルオキシダーゼなどを含むシイタケ由来の酵素をシイタケ上面栽培等で得られる栽培液から精製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在、フェノール性物質は農薬合成反応、塗料・繊維等の染色色素合成産業、及び家庭廃棄物の焼却などによって生成されて、環境汚染物質として大気、土壌、河川など幅広く存在している。これらは化学的に安定であり、人体に対する影響も強く、社会的に大きな問題となっている。
【０００３】
従来から、木材腐朽菌が生産するリグニン分解酵素系を用いた色素やダイオキシン等の環境汚染物質を生化学的に分解する研究がなされている。これらの方法は、菌を培養する際に培地中に色素やダイオキシン等の環境汚染物質を入れる方法（非特許文献１〜５など）、または培養液を色素などのフェノール性環境汚染物質と反応させる方法（Pasti, et al., Can. J. Microbiol., Vol 37, 902-907, 1991）などである。これらの報告の多くは非食用のきのこを用いている。食用担子菌の酵素類を実験に用いることができれば、人体や環境により安全かつ安価な環境汚染物質処理方法の開発が期待される。
【０００４】
食用きのこ栽培は大鋸屑を主たる炭素源として用いる固体培養法である菌床栽培法が用いられている。この栽培に使用される菌床を用いてフェノール性環境汚染物質を分解するという方法については報告があるが、その多くは、菌床の大鋸屑を粉砕・圧縮し、汚染土壌と混合・撹拌するか、または菌床を緩衝液などに懸濁し、その内部に生産されている酵素を抽出して使用している。従って、撹拌機や抽出機など、比較的大型な設備を必要とし、コストや労力を要するのが現状である（特許文献１参照のこと）。食用担子菌類のラッカーゼを用いるフェノール性環境汚染物質の分解には期待が持たれるものの、これら酵素の生産効率は必ずしも高くなく、酵素を大量生産し得る大規模な培養方法も確立されていない。また、きのこ採取後の廃培地（廃菌床）を酵素源とする方法もある。この場合は、きのこの採取と酵素の採取が可能となるが、酵素の生産量はきのこ採取前の菌床と比べるとかなり低いと考えられる。また、上記と同様、反応には撹拌機や抽出機など、比較的大型な設備を必要とし、酵素の抽出にコストや労力を要するのが現状である（特許文献２および３参照のこと）。
【０００５】
シイタケ由来の、ラッカーゼ、植物細胞壁分解酵素群およびプロテアーゼなどは産業的・工業的に利用価値が高いことは明白である。例えば微生物の生産するプロテアーゼ類は漂白剤や洗剤として利用されているし、セルラーゼは漂白剤や洗剤、パルピングに、ポリガラクツロナーゼはペクチンの抽出などに利用されている。これらの酵素類を食用担子菌に生産させる場合においても、上記ラッカーゼの場合と同じく、菌床の大鋸屑を粉砕、撹拌する方法や菌床を緩衝液などに懸濁し、その内部に生産されている酵素を抽出し、抽出液を得る方法が用いられる（特許文献４および５参照のこと）。従って、撹拌機や抽出機など、比較的大型な設備を必要とし、コストや労力を要するのが現状である。
【０００６】
従来技術においては、シイタケの栽培廃菌床あるいは栽培中の菌床を酵素源として用いる場合があるが、酵素の抽出または／同時に酵素と汚染物質との反応に撹拌機などの大型の施設を必要としている。また、栽培廃菌床ではそこに含まれる酵素の活性は低下しており、十分な酵素量を得ることは、要する労力および経費が過大となる。一方、十分な酵素量を得るために、栽培中の菌床を酵素源とすると、食用となる子実体の採取が継続できず、不経済となる。
【０００７】
近年、新しいしいたけ栽培方法として、菌床の上面から継続的にきのこを発生させる上面栽培法が開発された（特許文献６参照のこと）。かかる方法は、高品質なシイタケを効率よくかつ人手をあまりかけずに栽培できるため、注目を集めている。
【０００８】
【特許文献１】特開2000-343067号公報
【特許文献２】特開平11-319786号公報
【特許文献３】特開2000-167532号公報
【特許文献４】特開昭63-192385号公報
【特許文献５】特開平8-66185号公報
【特許文献６】特開平10−271913号公報
【非特許文献１】Krcmr, P.ら、 Folia Microbiol., 43, 79-84, 1998
【非特許文献２】Halden, Rら、 Appl. Environ. Microbiol., 65, 2246-2249, 1999
【非特許文献３】Takada, Sら、Appl. Environ. Microbiol., 62, 4323-4328, 1996
【非特許文献４】Gold, M. H.ら、Methods in Enzymology, 161, 74-78, 1988
【非特許文献５】Novotny, C.ら、J. Biotechnol., 89, 113-122, 2001
【非特許文献６】Pastiら、Can. J. Microbiol., 37, 902-907, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、シイタケ栽培で生じる栽培廃液を有効利用して、人体や環境に安全であり、安価かつ簡便なフェノール性物質を分解するためのフェノール性物質分解剤およびその方法を提供することを目的とする。さらに、シイタケが生成する種々の有用な酵素を栽培廃液から得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、シイタケ（Lentinula edodes）の栽培に使用した後の栽培廃液が、フェノール性物質を分解し得ることを発見し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、食用シイタケを栽培する際の廃液を利用してフェノール性物質を分解する方法に関する。
【００１１】
本発明者等は、既に、シイタケ由来のラッカーゼを見出し、かかる酵素がフェノール性物質を分解し得ることを発見している。理論に拘束されるわけではないが、シイタケの栽培に用いた栽培液、すなわち栽培廃液中にラッカーゼが大量に存在し、該酵素の作用が、栽培廃液のフェノール性物質分解能の少なくとも一部を担っていると考えられる。また、該栽培廃液中には、ラッカーゼ以外にも、有用な他の植物細胞壁分解酵素が存在することを、本発明者らは確認しており、これらの酵素が栽培廃液のフェノール性物質の分解に寄与しているとも考えられる。
【００１２】
これらの知見に基づいて本発明者らはさらに鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、以下の態様：
１． シイタケ栽培の栽培廃液由来である、フェノール性物質分解剤；
２． シイタケ栽培の栽培廃液が、シイタケ上面栽培で得られる栽培廃液であることを特徴とする、上記１記載のフェノール性物質分解剤；
３． ラッカーゼおよび植物細胞壁分解酵素からなる群より選択される1種以上の酵素を含有していることを特徴とする、上記１または２に記載のフェノール性物質分解剤；
４． シイタケ栽培の栽培廃液を用いる、フェノール性物質を分解する方法；
５． メディエーターを用いないことを特徴とする、４記載のフェノール性物質を分解する方法；
６． メディエーターを添加することをさらに含む、４記載のフェノール性物質を分解する方法；
７． フェノール性物質がフェノール性色素化合物である、上記４〜６のいずれかに記載のフェノール性物質を分解する方法；
８． フェノール性色素化合物が、レマゾールブリリアントブルーR （RBBR）、アシッドグリーン５、リアクティブブルー２、ダイレクトブルーI、アシッドバイオレット７およびアシッドレッド106からなる群より選択される色素である、上記７記載の方法；
９． シイタケ栽培の栽培廃液が、シイタケ上面栽培で得られる栽培廃液であることを特徴とする、上記４〜８のいずれかに記載の方法；
１０． シイタケ栽培の栽培廃液を出発材料として、ラッカーゼ、植物細胞壁分解酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素を得る方法；
１１． 植物細胞壁分解酵素が、ポリガラクツロナーゼ、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、酸性プロテアーゼおよびマンガンペルオキシダーゼからなる群より選択される、上記１０記載の方法；
１２． ラッカーゼ、植物細胞壁分解酵素およびプロテアーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素がシイタケによって天然に産生されるものである、上記１０記載の方法；
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のフェノール性物質分解剤は、食用となる子実体と栽培廃液との両方を１回の栽培から採取することが可能であるため、菌床からフェノール性物質分解剤となる酵素液等を抽出するのに比べると、フェノール性物質の分解にかかるコストを抑制することができる。本発明で得られる栽培廃液は、メディエーターの非存在下において種々のフェノール性物質の分解を触媒するため、環境中のフェノール性環境汚染物質を容易に分解することが可能となる。
【００１５】
したがって、本発明によれば、人体および環境中においても安全性が高いと考えられるフェノール性物質分解剤を、食用担子菌であるシイタケの栽培時に生じる栽培廃液を利用することで簡単に採取できる。
【００１６】
また、栽培廃液から煩雑な抽出工程を必要とせずにフェノール性物質分解液を安定して得ることができ、かつ該栽培廃液が酸性であるため、フェノール性物質分解の少なくとも一部を担っていると考えられるラッカーゼの反応至適 pH に近く、また、微生物汚染も少ないことから、簡便性、安定性などにおいて有利であることから、広く利用されることが期待される。
【００１７】
さらに、シイタケから栽培廃液中に分泌される酵素を、シイタケ栽培廃液から精製することができ、廃液の有効利用が促進され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一つの態様は、シイタケ栽培の栽培廃液である、フェノール性物質分解剤である。かかる態様は、シイタケ栽培の栽培廃液のフェノール性物質分解剤としての使用、シイタケ栽培の栽培廃液を用いて、フェノール性物質を分解する方法、およびシイタケ栽培の栽培廃液のフェノール性物質分解剤を製造するための使用を包含する。
【００１９】
「シイタケ栽培の栽培廃液由来である」フェノール性物質分解剤とは、栽培廃液そのものであってもよく、または、浮遊物、沈殿物等の除去、栽培廃液に含まれる特定成分の除去、濃縮もしくは精製等の処理を経たものであってもよく、シイタケ栽培の栽培廃液に元来含まれていた成分を有効成分として含むもの全てを包含し得る。さらに、例えばフェノール性物質の分解をより促進させるための薬剤（メディエーター等）、フェノール性物質分解活性の維持に有効な薬剤（酵素安定化剤等）、フェノール性物質分解活性を向上させるための薬剤（pH調整剤等）などを添加した栽培廃液をも包含する。
【００２０】
本発明において有用なシイタケの栽培廃液を得るためのシイタケの栽培方法は、菌床にシイタケ菌糸を接種後、シイタケの子実体を発生させた後またはその過程において、菌床容器内の水を回収できる方法であれば、任意の方法であってもよい。シイタケにより生産され、菌床内部に蓄積された水溶性タンパク質（特に、酵素類）が上記水の中に分泌され得るため、回収した水（以下、栽培廃液という）は、シイタケ由来の水溶性タンパク質を含み得るものと考えられる。後述の通り、より好ましい実施態様としては、上面栽培が挙げられるが、これに限定されることなく、従来法による栽培であってもよい。従来法による栽培の場合、菌床容器（通常は袋）中に溜まった水を回収することもでき、この回収された水にもシイタケにより生産された水溶性タンパク質が蓄積されている。また、本発明におけるシイタケは、通常の食用シイタケであってもよく、何らかの遺伝子操作等により改変されたシイタケでもよく、シイタケの系統、品種等は問わない。
【００２１】
本発明の有利な特徴の一つである、食用シイタケの栽培の副産物である栽培廃液を利用することによりコストおよび労力を削減するという観点から、該廃液が回収し易いという点で最も有利なシイタケ栽培方法の一つは、特開平10−271913号公報（特許文献６）に記載されているシイタケ栽培法（以下、上面栽培という）がある。通常の菌床栽培においては栽培袋を子実体発生処理において取り去ってしまうのに対し、該方法では、栽培袋の上面のみを切り取り、栽培袋と菌床との隙間に水を注水することで菌床上部のみから子実体を発生することを特徴とする栽培方法であり、近年普及しつつある。かかる上面栽培の方法の典型的なものについて以下に例示する。
【００２２】
ポリピレン製袋にフィルターが装着された栽培袋を使用し、例えば横20cm、縦12cm、高さ17cm重量約2500g程度の角型に培地を成形し、常法により殺菌、冷却を行った培地を菌床とする。菌床に用いる培地は、広葉樹の大鋸屑（シイタケの栽培に適した広葉樹が使用可能であるが、好ましくはコナラの大鋸屑）と栄養体（米糠、フスマ、専用の混合栄養体などが使用可能である）、水（シイタケの栽培に適した水分含量とするが含水率65％前後が好ましい）を混合した培地である。
【００２３】
上記で作成した菌床にシイタケ菌糸を摂取する。接種方法は当業者には容易に理解できる。
【００２４】
培養温度は菌が発育し、シイタケが各種酵素を生合成し得る範囲内で適宜変更可能であるが、好ましくは23℃程度である。
【００２５】
上記培養温度で一定期間、例えば約80日間管理し、菌床の上面の袋を切り取り、菌床を上下逆にして一定期間、例えば約5日間温度約25℃、湿度約80％以上に管理する。
【００２６】
その後、菌床を反転させ、栽培袋の肩口から2cmほど下の部分に輪ゴムをかけ、5日間程度、温度約23℃程度に保ち、栽培袋と菌床との隙間に水を注水し、１日に一回程度、散水処理をする。その後、温度を１日に１℃程度の割合で低下させ、約15℃にする。
【００２７】
以上の栽培方法によって、菌床上面から子実体の発生が認められる。ただし、菌床上面から子実体の発生が認められる方法であれば、上記の温度、時間等の培養条件は、当業者が適宜変更可能であり、本明細書中の「上面栽培」とは、上記の条件に限定されるものではないことは、理解されるであろう。
【００２８】
以上の栽培方法によって、栽培袋と菌床との間に注水した水には、発生処理の期間中にシイタケにより生産され、菌床内部に蓄積されたラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、キシラナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、アミラーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、アラビノフラノシダーゼなどの植物細胞壁分解酵素が含まれている。
【００２９】
約2週間の発生処理の後、栽培袋から注水した水を採取し、ろ過などにより菌体あるいは沈殿物を除去することで得られる液体を栽培廃液として用いることができる。本栽培廃液に含まれる上記植物細胞壁分解酵素類は、工業的／産業的に利用価値が高いものである。また、本栽培廃液から、これら酵素類のうち必要な酵素だけを単離・精製することは、当業者であれば容易に行うことができる。
【００３０】
子実体採取後、培養温度を23℃とし、数日間培養した後に再度子実体の発生を促すことが可能であるが、この際、再び栽培袋と菌床の間に水を注水する上面栽培の手法を用いることで、再び同様の栽培廃液を採取することが可能である。
【００３１】
本明細書において「シイタケ栽培の栽培廃液」とは、任意のシイタケ栽培法において、子実体発生時に菌床容器内に蓄積した液体であり、菌床容器内での蓄積日数等は問わない。かかる液体は、通常、シイタケ子実体形成および生育後に廃棄される。上記液体は、子実体形成までの栽培過程の途中の任意の時点で、菌床容器から、場合によっては段階的または部分的に、回収されたものであってもよい。
【００３２】
さらに、栽培容器から回収した該栽培廃液をそのまま、フェノール性物質の分解に用いることもできるが、浮遊物等を除くためのろ過等の処理等を施した後のものを用いることもできる。このようにして得られた栽培廃液のpHはおよそpH 4.0になっており、フェノール性物質の分解反応の最適pHに近い。また、このような酸性域では細菌類の生育も抑えられることから、該廃液は微生物により汚染されにくいという利点も有する。さらに、該栽培廃液から酵素類を含むタンパク質成分、あるいは特定のタンパク質成分を部分的または完全に精製して用いることもできる。本明細書中の栽培廃液とは、上記栽培廃液そのものの他、該廃液から抽出、精製等の処理を経た、シイタケ栽培廃液に由来する成分を含む溶液を包含する。抽出、精製の程度は問わない。さらには、フェノール性物質分解能を増大させるために、上記廃液に、さらにラッカーゼを添加したものであってもよい。添加されるラッカーゼは、シイタケ栽培廃液に由来するものであっても、他に由来するものであってもよく、またその純度も問わない。あるいはまた、メディエーターもしくは他の酵素等のフェノール性物質の分解に有利な物質、および/または廃液中の酵素の安定性を高めるための安定化剤等を添加して用いてもよい。
【００３３】
上記栽培廃液をフェノール性物質分解剤として利用することができるが、栽培廃液から部分的または完全に精製したラッカーゼを固定化酵素としてフェノール性物質分解剤に利用することもできる。
【００３４】
精製酵素をフェノール性物質の分解に用いる場合は、短時間で反応を実施できる、単位酵素当たりの反応効率がよいという利点だけではなく、一度に大量の標品を得てそれを長期間保存することが可能であることから、反応の度に培養を行う必要がなく、均一な反応条件を設定しやすく、極めて高い再現性を有する反応効率が得られるという利点もある。
【００３５】
本明細書における「フェノール性物質」とはフェノール基を含む化合物をいい、フェノール性環境汚染物質とは自然環境を汚染するフェノール性物質を指し、フェノール性色素も包含する。すなわち、アゾ系色素、ジアゾ系色素、アントラキノン系色素、ポリマー色素等の色素化合物やダイオキシン類、ポリ塩化ビフェニル類、ビスフェノールA、ノニルフェノール、4-t-オクチルフェノール、4-n-オクチルフェノール、DTT、ペンタクロロフェノール等、広く一般のフェノール性化合物を包含するが、これらに限定されるものではない。フェノール性汚染物質は、農薬合成反応、塗料・繊維の染色色素の合成、および家庭廃棄物の焼却などによって生成され、大気、土壌、河川などに幅広く存在し、環境を汚染している。さらに、ダイオキシン、PCB（ポリ塩化ビフェニル）、ビスフェノールA（ビス（4-ヒドロキシフェニル）ジメチルメタン）およびベンゾ[a]ピレン(6,7-ベンゾピレン)もまた、フェノール性物質に含まれ、これらは環境汚染物質である。従って、本明細書において、フェノール性物質の分解とは、フェノール性環境汚染物質の分解およびフェノール性色素の脱色を含む。「フェノール性色素」は、フェノール基を有する色素を指し、その例としては、レマゾールブリリアントブルーR（RBBR）、アシッドグリーン５、リアクティブブルー２、ダイレクトブルーI、アシッドバイオレット７、シカゴスカイブルー、ニュートラルレッド、リアクティブオレンジ16、アシッドブルー22、インディゴ、およびアシッドレッド106等が挙げられる。
【００３６】
本発明の態様の一つとして、栽培廃液または栽培廃液由来のラッカーゼ含有液にメディエーターを添加することにより、フェノール性物質の分解を促進することができる。
【００３７】
本明細書における「メディエーター」とは、ラッカーゼの触媒反応を促進する性質を有する水溶性低分子物質を指し、ラッカーゼと併用することにより、ラッカーゼ単独では分解されないフェノール性物質の分解が可能となり得、あるいはまた、フェノール性物質の分解速度を促進し得る。該メディエーターは電子移動性および適度な酸化還元ポテンシャルを有し、かつラッカーゼの基質となりうる性質を有していることが望ましい。具体的な例としては、2,2'-アジノビス-（3-エチルベンゾチアゾリン-6-硫酸）2アンモニウム塩、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、ビオルル酸を挙げることができるが、これらには限定されない。添加するメディエーターの量は、当業者であれば適宜決定することができる。フェノール性物質と栽培廃液とを混合する前に、メディエーターを添加してもよいが、フェノール性物質と栽培廃液とを混合して分解過程の途中で添加してもよく、添加のタイミングは当業者が適宜判断し得る。
【００３８】
本発明の態様において、上述の本発明に係るメディエーターを用いない方法では分解および／または脱色が困難な物質を対象とする場合には、反応液中にメディエーターをさらに添加することにより、フェノール性汚染物質を分解および／または脱色することもできる。
【００３９】
本発明の栽培廃液によるフェノール性物質の分解は、フェノール性物質を含む土壌、水などを採取してそれに栽培廃液を添加することにより行ってもよいし、フェノール性物質を含む土壌、水にその場で栽培廃液を散布することにより行ってもよい。また、本発明の栽培廃液にフェノール性物質を懸濁する方法も考えられる。
【００４０】
本発明の栽培廃液は、種々の酵素を含んでいるため、該栽培廃液を出発材料としてこれらの酵素を分離・精製することができる。分離・精製の方法は、当業者であれば任意の公知の方法で実施できる。例えば、ラッカーゼは、特開2004−159号公報の記載に基づいて、または該記載の方法に改変を加えた方法等により、精製することができる。
【００４１】
本明細書における「植物細胞壁分解酵素」とは、植物組織を加水分解、あるいは酸化する活性を有する酵素タンパク質を指し、例えば、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、アミラーゼ、アラビナナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼなどを挙げることができるが、これらには限定されない。さらにシイタケにより天然に産生されるもの、および遺伝子工学的技法を用いて形質転換体により産生された該タンパク質およびその活性を保持する変異型タンパク質をも含有する。本明細書中「天然に産生される」とは、遺伝子工学的技法を用いて人為的にそのタンパク質のシイタケ内での産生量を増加させたり、改変タンパク質を産生させることなく、元来の食用シイタケ染色体上に存在し、人為的改変を受けていない遺伝子からの発現により産生されることをいう。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの例により限定されるものではない。
【００４３】
[実施例１]上面栽培における栽培廃液の採取
下記第１表の組成の菌床を1 kgづつ栽培袋に詰めて形成した後、オートクレーブに入れ、120℃60分間加熱滅菌した後、シャーレに培養したシイタケ菌糸を菌床の内部に植菌し、栽培袋の口をテープで止め、23℃で90日間培養した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
培養終了後、菌床袋上部を切り取り、菌床を上下逆にして5日間温度25℃、湿度80％以上に管理した。
【００４６】
その後、菌床を反転させ、栽培袋の肩口から2cmほど下の部分に輪ゴムをかけ、5日間、温度23℃程度に保ち、栽培袋と菌床との隙間に水を注水し、１日に一回程度、散水処理をした後、温度を１日に１℃の割合で低下させ、15℃にすることで子実体の発生を誘導した。
【００４７】
この時、注水から10日目に栽培袋内の水（栽培廃液）を採取し、新しい水に入れ替えた。
栽培廃液を遠心分離し、沈殿物および浮遊物を除去した。
【００４８】
以上の工程により得られた栽培廃液を、以下の実施例に用いた。
まず、該廃液中に含まれる酵素活性を測定した。
【００４９】
(a)酵素活性の測定
ラッカーゼ活性の測定方法は 1 mM ABTS を含むpH4.0のマキルベイン緩衝液を反応液として用いて比色法で行った。
【００５０】
まず、反応液を30℃に10分間保ち、温度平衡に達した後、栽培廃液を加え、反応を開始させた。反応の液量は100μlとした。
【００５１】
基質(ABTS)の酸化に伴う420nmの吸光度の増加を測定し、ABTSのモル吸光係数を36000/M/cmとして、酸化されたABTSの量を算出した。
1分間に1μmolのABTSを酸化する酵素量を求め、これを1単位（ユニット(U)）とした。
【００５２】
キシラナーゼ活性の測定方法は0.1％燕麦キシランを含むpH4.0のマキルベイン緩衝液を反応液として、ソモギーネルソン法を用いた比色法で行った。
【００５３】
まず、反応液を40℃に10分間保ち、温度平衡に達した後、栽培廃液を加え、反応を開始させた。反応の液量は100μlとした。
【００５４】
基質（燕麦キシラン）の加水分解により生じた還元末端の量をソモギーネルソン法により定量した。この際、グルコースを用いて還元末端量の検量線を作成した。
【００５５】
1時間に1μmolのグルコースに相当する還元末端を生成する酵素量を求め、これを1単位（ユニット(U)）とした。
【００５６】
アミラーゼ活性、カルボキシメチルセルラーゼ活性、エンドポリガラクツロナーゼ活性はそれぞれ可溶性デンプン、カルモキシメチルセルロース、ポリガラクツロン酸を0.1％含むpH4.0のマキルベイン緩衝液を基質とし、キシラナーゼ活性測定方法と同様の方法で酵素活性測定を行った。
【００５７】
酸性プロテアーゼ活性の測定方法は2％ハマルステイン氏カゼインを含むpH3.0のマキルベイン緩衝液を40℃に10分間保ち、温度平衡に達した後、栽培廃液を加え、反応を開始した。反応の液量は300μlとした。
【００５８】
反応後、0.4Mのトリクロロ酢酸を300μl加え、反応を停止し、生じた沈澱物をろ紙によりろ過した。
【００５９】
得られたろ液100μlに500μlの0.4Mの炭酸ナトリウム溶液を添加し、さらに蒸留水で5倍希釈した市販のフェノール試薬を100μl添加して40℃で30分間発色させた。
上記反応により、酵素反応により生じた遊離チロシンの量を定量した。
【００６０】
1時間に1μgのチロシンを遊離する酵素量を求め、これを1単位（ユニット(U)）とした。
【００６１】
アラビノフラノシダーゼ活性の測定方法は、1 mM p-ニトロフェニル-α-L-アラビノフラノシドを含むpH4.0のマキルベイン緩衝液を30℃に10分間保ち、温度平衡に達した後、栽培廃液を加え、反応を開始した。反応の液量は100μlとした。
【００６２】
反応後、500mMの炭酸ナトリウム溶液を100μl加え、反応を停止し、酵素反応で生じたp-ニトロフェノールの量を比色法で定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する酵素量を求め、これを1単位（ユニット(U)）とした。
【００６３】
(b)タンパク質の定量
タンパク質の定量はBCAプロテインアッセイキット（PIERCE製）を用いて行った。標準タンパク質として牛胎児血清アルブミンを用いた。
【００６４】
(c)pHの測定
得られた栽培廃液のpHをガラス電極pHメーターを用いて常法に従い、測定した。
この栽培廃液に含まれる酵素活性、タンパク質量、pHを下記表２に示した。
【００６５】
【表２】
2005341882.tif 000003
【００６６】
シイタケラッカーゼの反応最適pHは4.0である（Nagai et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 60, 327-335, 2002）から、本栽培廃液はラッカーゼが作用するのに適したpHを有していると言える。さらに、本栽培廃液には少なくとも酸性プロテアーゼ、キシラナーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、アミラーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼが含有されていることがわかる。これら植物細胞壁分解酵素類は工業的／産業的に利用価値が高く、その使用方法は当業者であれば容易に理解し得る。
【００６７】
[実施例２]上面栽培で得られた栽培廃液による色素化合物の脱色
第3表に示す色素化合物をそれぞれの吸光度が1.0付近になるようにマキルベイン緩衝液(pH4.0)に溶解した色素溶液100μlに栽培廃液を20μl加え、30℃で90分間反応させた後、吸光度をそれぞれ測定し、下記第３表に反応前後の吸光度を示した。
なお、ここでは栽培廃液として実施例１で得られる栽培廃液をそのまま用いた。
【００６８】
【表３】
2005341882.tif 000004
【００６９】
[実施例３]メディエーターを用いた栽培廃液による色素化合物の脱色
実施例２の方法では脱色が困難な色素について、第4表に示す色素化合物をそれぞれの吸光度が1.0付近になるようにマキルベイン緩衝液(pH4.0)に溶解した色素溶液100μlに栽培廃液を20μl加え、30℃で酵素反応を行った。またメディエーターとしてビオルル酸を１mMとなるように加えた。
【００７０】
【表４】
2005341882.tif 000005
【００７１】
[実施例４]上面栽培で得られた栽培廃液による環境ホルモン類の分解
実施例1で得られた栽培廃液900μlに10 ppmのビスフェノールAと4-t-オクチルフェノールを50μlづつ添加し、40℃で23時間振盪反応を行った。反応後、常法に従い環境ホルモン類を抽出し、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー(GC/MS)によって反応液中のビスフェノールAと4-t-オクチルフェノール量を測定した。GC/MSの条件は常法に従った。コントロールには、栽培廃液を煮沸処理したものを用いた。
【００７２】
本発明の栽培廃液は用いた環境ホルモン類を減少させた（図1）。総量での計算結果を下記第5表に示す。本実施例においてはメディエーターを用いていない。メディエーターを用いることにより分解反応が促進されることが期待される。
【００７３】
【表５】
2005341882.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】上面栽培で生じる水による環境ホルモン類（ビスフェノールAと4-t-オクチルフェノール）の減少を調べたものである。コントロールは煮沸した栽培廃液に環境ホルモンを加えたもので上面水処理は栽培廃液に環境ホルモンを加えたものある。実験はそれぞれ3区で行い、図にはそれぞれの数値と平均値を示した。
【図１】
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