(57)【要約】      （修正有）【課題】不適切な保存または運搬条件の結果として、分析素子が使用不能である可能性を確実に示す内在コントロールシステムを提供する。【解決手段】有機N-オキシドまたはニトロソ化合物を含有する分析素子、特に試験ストリップのいわゆる内在コントロール用試薬系であり、検出反応用試薬系と、内在コントロール用試薬系とを含む分析素子である。  また、分析素子のストレスを示すことが可能な変化に対する測定機器を利用して、内在コントロール用試薬系を光学的または電気化学的に検査する分析素子の検査方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機N-オキシドまたはニトロソ化合物を含有する、分析素子の内在コントロール用試薬系。
【請求項２】
ストレスがかかると、光学的または電気化学的に検出できる変化を生じることを特徴とする請求項1に記載の試薬系。
【請求項３】
還元剤を含有することを特徴とする、請求項1または2に記載の試薬系。
【請求項４】
還元剤が糖、多価アルコール、グリシン、およびシステイン含有タンパク質よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の試薬系。
【請求項５】
還元剤がグリシンまたはグルコースであることを特徴とする、請求項4に記載の試薬系。
【請求項６】
N-オキシドがレザズリンであることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の試薬系。
【請求項７】
ニトロソ化合物が、置換されていてもよいp-ニトロソアニリンであることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の試薬系。
【請求項８】
分析素子の内在コントロールのための、請求項1から7のいずれか一項に記載の試薬系の使用。
【請求項９】
検出反応用の試薬系と、請求項1から7のいずれか一項に記載の内在コントロール用の試薬系とを含有する分析素子。
【請求項１０】
内在コントロールが、検出反応用試薬系に組み込まれていることを特徴とする、請求項9に記載の分析素子。
【請求項１１】
検出反応用試薬系が、血液凝固パラメータを決定するための試薬を含有することを特徴とする、請求項9または10に記載の分析素子。
【請求項１２】
分析素子のストレスを示し得る変化を測定する測定機器を利用して、内在コントロール用試薬系を光学的または電気化学的に検査する、請求項9から11のいずれか一項に記載の分析素子のコントロールのための方法。
【請求項１３】
ストレスが検出された分析素子が、検出反応用試薬系を利用して試料液を測定するための測定機器から放出されないことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
コントロール反応用試薬および検出反応用試薬を光学的に検査することを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
コントロール反応用試薬および検出反応用試薬を電気化学的に検査することを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１６】
コントロール反応用試薬を光学的に検査し、検出反応用試薬を電気化学的に検査することを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１７】
コントロール反応用試薬を電気化学的に検査し、検出反応用試薬を光学的に検査することを特徴とする、請求項12または13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に機能できる分析素子と機能できない分析素子の区別を可能にする、例えば試験ストリップ形態、特に、血液凝固(coagulation)パラメータを測定するための試験ストリップ形態の分析素子用のコントロール試薬系に関する。本発明は、また、対応する分析素子、およびそれらのコントロール方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体試料、特にヒトまたは動物の体液中の成分の定性および定量分析に、いわゆる担体結合試験がますます多く用いられている。そのような分析には分析素子(試験素子とも称する)が使用され、この分析素子には少なくとも1種の試薬が1つまたは複数の層から構成される試験領域に組み込まれており、この試験領域が試料と接触することになる。試料と試薬の反応により分析素子に変化が生じ、この変化は、目視で、または計測器(通常は反射測光計測器または電気化学計測器)を利用して評価することができる。試験を行った後、使用した分析素子は処分される。
【０００３】
測定原理(例えば光学的または電気化学的)および使用する試薬、ならびに構成、特に試験層の配列および結合に関する構成が異なる多くの様々な種類の分析素子が知られている。ストリップ形状の分析素子は、特に実用上重要である。試験ストリップとも称するこれらの分析素子は、基本的には、プラスチック材料製の細長い支持層から構成され、この支持層の上に1つまたは複数の試験領域が結合されている。
【０００４】
分析素子は一次包装材料にパッケージングされており、使用するまで、すなわちユーザが取り出して試験を行った後に処分するまで、分析素子は一次包装材料の内部に保存されている。分析素子は、個別に各自の一次包装材料にパッケージングすることができる。複数の分析素子が共通の一次包装材料の内部に配置された分析素子包装ユニットが広く使用されている。一次包装材料は、通常は乾燥剤を含む。
【０００５】
一次包装材料の内部は、通常は実質的に気密封止されている。したがって、保存条件は、基本的には、保存時の一次包装材料内の環境条件によって決定される。
【０００６】
多くの分析素子は、一定の保存条件、例えば温度、湿度、酸素、光等によって劣化しうる試薬を含有し、劣化すると信頼できる試験の実施に使用できなくなってしまう。したがって、劣化を回避するためには、製造者が推奨する一定の適切な条件下で分析素子包装ユニットを保存する必要がある。製造者側では、適正に保存される場合の分析素子の保存寿命を一定期間保証している。
【０００７】
劣化した試薬を含む分析素子を使用すると、例えば人間の健康状態に対する深刻な誤解をもたらしうる誤った試験結果が得られる可能性がある。したがって、過去において、保存劣化を伴う分析素子を使用する危険性を低減するための様々な試みがなされてきた。
【０００８】
例えば、外的影響に比較的鈍感な試薬が開発されてきた。他の開発では、精巧な一次包装材料を使用することによって分析素子の試薬に対する外的影響を最小にすることが目的とされていた。どちらの解決手段も製造コストを実質的に引き上げるものである。安全上の理由により、比較的短い保存寿命が提示されている。その結果、保存寿命期限が切れた後は分析素子を使用することができなくなるが、試薬の劣化をもたらしうる条件が実際に存在していたかどうかを確認することは不可能である。
【０００９】
診断上の血液検査用試験ストリップは、販売に先立って広範囲な品質管理を受ける。試験ストリップが市場に出る前に、その好適な出荷および保存条件が広範囲に調査され、例えば包装材料上にまたは包装挿入物に記載される。しかしながら、有効期限までに商品を顧客に輸送する途中、または顧客による不適切な保存により試験ストリップが劣化すること、および使用時に誤った測定値が得られる危険性があることを完全には排除することができない。
【００１０】
不適正な輸送および/または保存条件は、液体コントロールを使用した測定によって発見することができる。この液体コントロールは、分散的に、すなわち特定の研究所以外、例えば医院、薬局、または患者の自宅で使用される大部分のいわゆるポイントオブケアシステム(PoCシステム)に対して、計測器および試験ストリップ以外に追加のシステム部材として供給されている。PoCシステムに対して(例えば血液凝固測定システムに対して)液体コントロールを使用することの欠点は、それらの取り扱いが幾分複雑であることと、通常2つの試験ストリップおよび2つのコントロール液(レベル1およびレベル2のコントロール液)を使用するのでコストがかかることと、通常は同じ製造ロットおよび包装の試験ストリップをコントロールの使用により測定するが、それらは必然的に患者の血液試料を実際に検査するためのもの以外の試験ストリップであること、である。
【００１１】
これらの欠点は、内在コントロール(on-board control;以降OBCと略する)によって回避される。この内在コントロールは、各々の試験ストリップに組み込まれており、追加の試験液を必要としない。内在コントロールを有するシステムは、コントロール液を必要とせず、その測定システムによって決定すべきパラメータを求めるための試料液とまさに同じ試料液で機能する。
【００１２】
当該内在コントロールについては、例えば、米国特許第5,504,011号明細書(ITC)（特許文献１）、米国特許第6,084,660号明細書(Lifescan)（特許文献２）および米国特許第6,060,323号明細書(Hemosense)（特許文献３）に記載されている。前記文献に開示されているコントロールシステムの共通の特徴は、血液試料が毛細管状のチャネルを通じて分析素子に導入され、毛細管力によって分析素子内の検査部位に運ばれることである。試料は、毛細管システムの1つまたは複数の枝によって分岐し、1つまたは複数のサイドチャネルに運ばれる。次いで、実際のOBCを構成するこれらのサイドチャネルに試薬が配置される。
【００１３】
これらの内在コントロールの一般的な欠点は、試験ストリップが、患者試料用の実際の測定チャネルに加えて、いくつかの(通常は2つの)追加的なチャネルを必要とすることである。同一の患者の血液を充填した後に、これらの追加的なチャネルにおいて、試験ストリップの保全性に関する情報を得るための測定が行われる。このコンセプトでは、個々のチャネルに異なる試薬を別々に供給しなければならないため、製造コストが高くなる。また、当該コントロールシステムは、実際の測定チャネルに加えて、少なくとも1つ、通常はさらにいくつかのコントロールチャネルに試料を充填しなければならないため、比較的大量の試料を必要とする。皮膚を刺して血液試料を採取することは苦痛であり、より多くの血液試料が必要とされるとさらに苦痛が増すため、患者が、例えばいわゆるホームモニタリングにおいて自分自身で定期的に試料を採取しなければならない場合、特に糖尿病患者、または自身の血液凝固値を監視しなければならない患者の場合は、大量の試料は特に不利であると見なされる。さらに、多チャネル内在コントロールシステムは、試料がいくつかのチャネルに自動的に浸透して、それらを充填しなければならないため、充填メカニズムが難しくなる。
【００１４】
独国特許出願公開第198 31 519号明細書（特許文献４）から、例えば過度の温度、大気湿度、光または酸素の影響による試験素子の劣化を示す不可逆的な水分または温度指示素子を試験素子またはその包装材料に取りつけることが可能であることが知られている。
【特許文献１】米国特許第5,504,011号明細書
【特許文献２】米国特許第6,084,660号明細書
【特許文献３】米国特許第6,060,323号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第198 31 519号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、特に製造コストおよび試料の量に関する前記欠点を有さず、特に不適正な保存または運搬条件の結果として試験素子が使用不能である可能性を確実に示す内在コントロールシステム(on-board control system)を開発することである。特に、本発明によるOBCを利用して、試験素子に対する有害な湿度および/または温度ストレスを検出する。また、目的とするOBCは、室温で製品を長く保存できるように、あまり早く反応しないものとし、正常な試験ストリップと欠陥のある試験ストリップとを高精度で正しく区別できるものとする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題は、本発明の主題によって解決される。
【００１７】
本発明は、有機N-オキシドまたはニトロソ化合物を含有する、分析素子の内在コントロール用試薬系を提供する。また、本発明は、分析素子の内在コントロールのための、前記内在コントロール用試薬系の使用を提供する。さらに、本発明は、検出反応用の試薬系と、前記内在コントロール用試薬系とを含有する分析素子を提供する。さらに、本発明は、分析素子のストレスを示し得る変化を測定する測定機器を利用して、内在コントロール用試薬系を光学的または電気化学的に検査する、本発明による分析素子のコントロールのための方法を提供する。
【００１８】
本発明は、以下の詳細な説明、図および例によってさらに明らかになる。
【００１９】
1チャネル内在コントロールと称することもできる本発明によるコンセプトは、好ましくは患者試料の実際の測定にも使用できる試験素子上の試薬領域に、ストレスがかかると変化する物質が含まれることを規定する。この物質の変化によって、好ましくは、目視、または試験ストリップを測定するために設けられている計測器によって検出できる劣化生成物が生じる。欠陥があることが認められた試験ストリップは、例えば、患者試料を測定するための測定機器によって放出されないようになされている。
【００２０】
本発明による試薬系は、分析素子の内在コントロールに適している。該試薬系は、少なくとも1種の化学物質、好ましくは化学物質の混合物を含む。これらの化学物質の少なくとも1種は、分析素子の信頼性を損なう可能性のある環境条件を直接的または間接的に示すのに適したものである。この特性は、内在コントロール特性と呼ばれる。この目的のため、温度、湿度、光、酸素などの有害な環境的影響を利用して、前記物質においてまたは前記物質とともに好ましくは不可逆的な変化が生じ、かかる変化により有害な影響のその後の検出が可能になる。これに関連して、通常は有害な影響の正確な種類を判断することは意味がなく、通常は有害な影響が生じているという事実を立証するだけで十分である。
【００２１】
内在コントロール用試薬系は、実際の内在コントロール機能を有する物質に加えて、他の付随的な物質を含むことができる。そのような物質は、緩衝物質、充填剤、膜形成剤、および分析試験素子用試薬配合物に関連する多くの実施形態において当業者に知られているようなものであってもよい。
【００２２】
本発明において、分析素子(試験素子、分析試験素子、試験ストリップ、試験チップ、試験デバイスとも称する)は、好ましくは、液体試料、特に血液、血清、血漿、尿などの人間由来の液体試料におけるアナライトまたは他のパラメータを決定するのに適している。本発明において、分析素子は、常に、試料中の検査対象のアナライト、または検査対象の試料の特性に依存する検出可能な信号を生成する試薬または試薬系を支持体上に含む。当該分析素子は、多くの実施形態において当業者に知られている。例としては、血液または血液から得られる試料液における代謝産物を検出し、特にグルコース、コレステロール等を測定するための光学的または電気化学的試験ストリップが挙げられる。また、血液試料における血液凝固パラメータを測定するのに使用できる試験ストリップが知られている。
【００２３】
分析素子上に配置され、試料中のアナライトまたは試料の特性についての検出可能な検出信号の役割を担う試薬系は、好ましくは、光学的に検出可能かつ評価可能な測定信号、あるいは電気化学的に検出することができる信号をもたらすことができる。どちらの変形も多くの実施形態において当業者に知られている。
【００２４】
本発明による内在コントロール用試薬系は、検出反応用試薬系に組み込まれるのが好ましい。しかし、検出反応用試薬系と内在コントロール用試薬系とを、１つの分析素子上の空間的に分離された領域に収容することも考えられ、また可能である。
【００２５】
内在コントロール用試薬系が検出反応用試薬系に組み込まれている好適事例においては、試薬が互いに悪影響を及ばさないように注意する必要がある。
【００２６】
内在コントロール用試薬系、および検出反応用試薬系は、同一または異なる検出原理に基づくことができる。したがって、本発明によれば、内在コントロールを光学的または電気化学的に評価することが可能である。実際の検出反応を光学的または電気化学的に検出することも可能である。内在コントロールならびに検出反応を電気化学的に検出するのが特に好ましい。これに関連して、目視で、または光度計を利用した装置によって光学的検出を行うことができ、この場合、反射測定、吸収測定、透過測定、発光測定などの当業者によく知られたいずれかの方法を用いることができる。あるいは、電位差測定、電流測定、電量測定、定電位電解法等の電気化学的検出が好適である。
【００２７】
特に、内在コントロール領域または検出試薬領域の光学的変化は、測定機器を使用せずに裸眼で評価することができる。しかし、測定機器、例えば光度計または電気化学的測定機器を利用して、内在コントロールおよび検出領域を評価するのが好ましい。測定機器を使用せずに内在コントロールを評価し、測定機器を使用して検出反応を評価することもできる。
【００２８】
当業者に知られている任意の方法を用いて、内在コントロールおよび検出領域用試薬配合物を分析素子の支持体に適用することができる。これに関連して、同一または異なる方法を用いて、様々な試薬を適用することができる。いくつかの可能な方法としては、例えば、液体の形で適用し、続いて支持体上で乾燥するか、乾燥して指示体内に組み込むこと;ナイフコーティング、スロットノズルコーティングなどによるコーティング塊(coating mass)として適用すること;およびインクジェット印刷、スクリーン印刷、分散などの印刷法等がある。第1の支持体に既に塗布されている試薬を、その第1の支持体と一緒に、分析素子の実際の第2の支持体上に載せ、接着および溶着等でそれらを結合することも可能である。
【００２９】
本発明による内在コントロールは、ストレスがかかった試験素子を確実に検出できる。これに関連して、ストレスとは、試験素子が、実際の検出反応用試薬を劣化させ、または損ない得る環境的条件に曝されたことを意味するものと理解される。乾燥剤または不透湿性の箔を備えた密閉缶内に室温で保存される分析素子の場合は、ストレスは、例えば、密閉缶または箔内の高温化(例えば、顧客への輸送時、または日光が当たるガラスの背後にあるとき)、あるいは高湿保存(試験ストリップを取り出した後に缶を適切に密閉しなかった場合、または箔包装材料に欠陥がある場合)に曝されることであると理解される。勿論、湿気と高温に同時に曝されるといったストレス事象の組合せも劣化をもたらしうる。この場合、ストレスは、最終的に検出試薬系の減損または破壊をもたらすという点のみが重要である。これらは、実際に、様々な分析素子に対するそれぞれ異なる特定条件でありうる。当業者は、それぞれの試薬系に対する当該劣化事象をどのようにして識別できるかを把握している。
【００３０】
本発明によれば、分析素子、または内在コントロール用試薬系のストレスは、内在コントロールの試薬系において変化、好ましくは不可逆的変化をもたらす。これによって、環境的条件がその間に好ましい条件に変化した場合にも、有害な環境的影響が検出される。したがって、例えば、劣化をもたらした単一の有害な温度上昇、または単一の短期的な湿度の影響を確実に特定することができる。
【００３１】
驚いたことには、N-オキシドまたはニトロソ化合物を、特に糖、多価アルコール、システイン含有タンパク質、グリシン等の還元剤と組み合わせて含む試薬は、OBCが試験ストリップの望ましくない作用および負の変化を示すような条件および環境的影響の下で還元されうることが判明した。N-オキシドまたはニトロソ化合物の還元によって形成された劣化生成物は、好適な、好ましくは電気化学的または光学的方法によって試験ストリップにおいて検出することができる。特に、還元剤として糖を使用する場合は、酸化還元特性、および酸化還元反応の速度を試薬のpHによって調整することができる。
【００３２】
本発明によれば、N-オキシドレザズリンが、記載の指示薬反応に対して特に好適な分子であることがわかったため、好ましい。
【００３３】
試験ストリップを劣化させうる条件(高温、湿気および光)の下でストレスがかかると、青色レザズリンが還元されて赤色レゾルフィン(図1参照)が生成するが、ここで、この還元は、特に酸化還元パートナーの存在下、好ましくは試薬配合物からの酸化還元パートナーの存在下で生じる。変化、すなわちレザズリン濃度の減少と、それと同時に起こるレゾルフィン濃度の増加を測定機器における光学的検出器、または電気化学的センサによって目視で確認することができる。
【００３４】
レザズリンの場合は、驚いたことには、グリシンが極めて特異的な還元剤であることがわかった。OBC試薬における好適な量のレザズリンとグリシンの組合せは、本発明によれば特に好ましい。レザズリンの最小濃度は0.01g/lが好ましいことがわかった。その理由は、この濃度を下回るとレザズリンの検出が事実上極めて困難になるためである。レザズリンの最大量は、溶解性の問題が生じうるため、20mmol/lを超えるべきではない。上述したように、グリシンは、レザズリンを含むOBCの機能に必ずしも絶対に必要なものではない。グリシンの最大量は約250g/lの濃度であることが判明した。というのは、この量を超えると溶解性の問題が生じるためである。グリシンは、溶液から結晶化することができるが、このことは、試薬塊(reagent mass)をコーティングするときに問題を引き起こし、コーティング塊を不均一にする可能性がある。
【００３５】
残留レザズリンおよび/または生成したレゾルフィンは、OBC反応の電気化学的検出のために定量することができる。
【００３６】
レザズリンの定量は、濃度が大きく変化する場合に好ましく、例えば、Ag/AgClに対して-700mVの電位でのレザズリンの電気化学的還元によって行うことができる。この電位において、生成したレゾルフィンはさらに還元されてジヒドロレゾルフィンになる(図1参照)。
【００３７】
OBC試薬に主にレザズリンが存在する(したがって、試薬にストレスがかかっていないか、ほとんどかかっていない)場合には4電子遷移が引き起こされるので、主にレゾルフィン(その還元では2電子変換が生じるだけである)が存在する場合より電流が高くなる。したがって、所定の電位、特にAg/AgClに対して-700mVの好ましい電位において測定された電流または電荷から、試薬の温度および/または湿度ストレスの範囲について推定することが可能になる。
【００３８】
レザズリンからレゾルフィンへの還元は不可逆的であるため、レゾルフィンからレザズリンへの電気化学的(再)酸化によってレゾルフィンを定量することはできない。記載のOBCシステムにおける還元検出は、試薬中に存在しうるレザズリンの還元ではなく、レゾルフィンの還元を特異的に検出することを単に必要とする。これは、例えば、好ましくはAg/AgClに対して-450から-550mVの範囲にある特定の還元電位を用いることによって達成されうる。
【００３９】
驚いたことには、第1の工程において、試験ストリップに存在するレゾルフィンを電気化学的にジヒドロレゾルフィンに変換し(OBC調製と称する)、第2の工程(以降OBC試験と称する)において、原位置で生成したジヒドロレゾルフィンを再びレゾルフィンに電気化学的に酸化する(下記ではOBC試験と称する)場合に、記載のOBCシステムにおけるレゾルフィンの定量を特に良好に達成することができる。この酸化反応は、Ag/AgClに対して-100mVの電位で特に好ましく進行する。
【００４０】
OBC試験信号の強度および特異度はOBC調製段階の長さによって制御することができる。
【００４１】
特に好ましいレザズリン/レゾルフィンシステムに加えて、ニトロソ化合物、および特にp-ニトロソアニリンは、試験ストリップを劣化させうる条件下で試験ストリップの劣化の可能性を示す生成物に変換することが可能な一群の物質についての他の好ましい例である。p-ニトロソアニリンは、例えば、検出試薬中の試薬をも劣化させうる条件下で還元されうる。還元によって生成される(フェニレンジアミンのような)生成物も、光学的または電気化学的に検出することができる。本発明に従って使用できる他のニトロソ化合物は、米国特許第5,206,147号、米国特許第5,334,508号、米国特許第5,122,244号および米国特許第5,286,362号に記載されている。これら4つの米国特許に開示されているニトロソ化合物と、ヘテロポリ酸、特に、ストレスがかかると、還元剤の存在下で容易に可視的なヘテロポリブルーを形成する、米国特許第5,240,860号に記載の沈殿形態のヘテロポリ酸との組合せが特に好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
例として血液凝固測定(プロトロンビン時間試験またはPT試験)のための試験ストリップを使用する本発明によるOBCの利点および特性を説明する以下の例によって、本発明の特徴がより詳細に示される。血液凝固試験ストリップの例に基づいて提示される説明は、他の種類の試験ストリップ、特に血糖、コレステロールおよびHDLコレステロールのような脂質、トリグリセリド等の光学的または電気化学的測定、PTT、ACT、ECT、抗因子Xa試験のようなPT以外の血液凝固パラメータの測定に使用される試験ストリップ、ならびに免疫試験素子、特に光学的に評価し、それらに適用できるクロマトグラフィ試験ストリップにも適用される。
【実施例】
【００４３】
実施例１
光学的に評価することができる内在コントロール用の異なる還元剤を含有する2つの試薬配合物
【表１】
2005156544.tif 000002
【００４４】
表1に列記されている物質を均一に混合し、NaOHでpH7.4に調整する。このようにして得られた反応塊を、幅が20mmで厚さが10μmの試薬テープとして反射光度測定によって測定できる試験ストリップに塗布した。
【表２】
2005156544.tif 000003
【００４５】
各々の場合において、試薬塊のpHを水酸化ナトリウム溶液で既定値に調整した。
【００４６】
表2に列記されている物質を均一に混合する。このようにして得られた反応塊を、幅が20mmで厚さが10μmの試薬テープとして反射光度測定によって測定できる試験ストリップに塗布した。
【００４７】
OBC反応の反応率、すなわち環境的条件に依存するレザズリンからレゾルフィンへの変換率をpHによって調整することができる。pHをアルカリ側にするほど、この変換がより速くなるため、OBCの感度が高くなる。
【００４８】
実施例２
実施例1の表１の試薬配合物におけるストレス後の劣化生成物の質量分光測定
乾燥剤または不透湿性の箔を備えた密閉缶内に室温で保存される試験ストリップの場合は、これらの保存条件下で、劣化反応は生じないか、または非常にわずかしか生じない。
【００４９】
内在コントロールは、不適正な保存として特に以下の状態を検出する：
・密閉缶/箔内の高温化(例えば、顧客への輸送時、または日光が当たるガラスの背後にあるとき)、および
・高湿保存(試験ストリップを取り出した後に缶を適切に密閉しなかった場合、または箔包装材料に欠陥がある場合)。
【００５０】
これらの条件を以下のストレスモデルによってシミュレートした：
・50℃の密閉缶内で数週間保存する；
・50℃、高空気湿度(50%/75%)で数時間および数日間保存する；
・気候帯4の環境的条件(30℃、空気湿度70%)の下で開放したまたは欠陥包装材料内で数日間保存する。
【００５１】
実施例1の表1に従って調製され、ストレスを掛けた試薬配合物の質量スペクトルは、ストレス後(50℃、75%相対空気湿度の条件下に6時間放置後)数パーセントのレザズリンがレゾルフィンに変換されたことを示している(図1参照)。228.17質量単位におけるレザズリンの質量スペクトルの主要ピークに加えて、レゾルフィンスペクトルの主要ピーク(212.20質量単位)が存在する。
【００５２】
実施例３
レザズリンおよびレゾルフィンの吸収スペクトル(図2)
図2に示されるレザズリン1(青色染料)およびレゾルフィン2(赤色染料)の吸収スペクトルは、基本的には、実施例2に示されるように試薬配合物にストレスをかけたときに生じるレザズリン1からレゾルフィン2への変換を光学的に(目視または反射光度測定で)検出することが可能であることを示している。
【００５３】
実施例４
ストレスのない試験ストリップおよびストレスがかかった試験ストリップの反射スペクトル
実施例1の表1の処方に基づいてその試薬膜を調製した試験ストリップに、0時間(ストレスなし;図3の曲線1を参照)、6時間(わずかなストレス;図3の曲線2を参照)および12時間(強いストレス;図3の曲線3を参照)にわたって50℃、75%空気湿度でストレスをかけた。対応する反射スペクトルの変化を測定した(図3)。ストレスが増すにつれて、620nmの波長における反射率の増加が観察され、これはレザズリンの量の減少に関連している。
【００５４】
実施例５
かかったストレスの度合が異なる試験ストリップにおける劣化生成物レゾルフィンの光学的検出
実施例1の表1の処方に基づいてその試薬膜を調製した試験ストリップに、50℃、75%空気湿度で、異なる時間にわたってストレスをかけ、次いでそのLEDが波長620nmの光で動作する単純な反射光度計で測定した。
【００５５】
図4は、ストレス時間t(時間)にわたる(反射率Rの増加によって認識可能な)劣化生成物の増加を示す図である。
【００５６】
試験領域の変化も目視で、すなわちユーザが裸眼で容易に検出できる。ストレス時間が長くなるに伴って、最初は青色であったストレスのない試験ストリップの試薬領域の色がピンクに変化する。
【００５７】
実施例６
組込み型(integrated)OBCおよび電気化学的検出によるPT血液凝固試験のための処方
【表３】
2005156544.tif 000004
【００５８】
表3に列記されている物質を均一に混合し、NaOHでpH7.4に調整した。このようにして得た試薬塊を、電流測定で測定される試験ストリップ上に、作用電極の全領域が試薬で被覆されるように、幅4mm、厚さが約90μm(ウェット)または約10μm(ドライ)で塗布した。対極としても機能するAg/AgCl電極を基準電極として使用した。
【００５９】
実施例７
かかったストレスの度合が異なる試験ストリップにおけるレザズリンおよび劣化生成物レゾルフィンの電気化学的検出
実施例6に従って調製した試験ストリップに、50℃、75%空気湿度で、異なる時間にわたってストレスをかけた。次いで、これらの試験ストリップを用いて、全血液を電流測定で測定した。
【００６０】
レザズリンおよびレゾルフィンを定量するために、以下の電位を加えた。
【００６１】
Ag/AgClに対して-700mV(3秒間)(いわゆるOBC調製段階);続いて
Ag/AgClに対して-100mV(1.5秒間)(いわゆるOBC試験段階);続いて
Ag/AgClに対して+200mV(90秒間)(実際の血液凝固測定)。
【００６２】
「OBC調製」および「OBC試験」信号を定量するために、電流・時間曲線による積分値を計算した。図5は、これらの積分値(Q700およびQ100と呼ぶ)が試験ストリップのストレスの増加とともに変化する様子を示す図である。
【００６３】
OBC信号に大きな変化があるが、ストレスをかけた試験ストリップによって測定された血液凝固時間は、極めて長時間のストレス期間にわたってほぼ安定している(表4参照)。
【表４】
2005156544.tif 000005
【００６４】
これは、OBCが、誤った血液凝固時間が導かれる前に試験ストリップの不適正な保存を示すことを保証するものである。
【００６５】
実施例８
無包装の試験ストリップを気候帯IVに保存した場合の電気化学的検出によるOBCの指示
その包装材料に欠陥があるか、または包装材料が再び閉じられていない試験ストリップの劣化の危険性が最も高くなるのは気候帯IV(高温高湿)に住む顧客の場合である。この気候帯について、湿度70%、温度30℃が、文献において「平均的な気候条件」として記載されている。
【００６６】
表5は、電気化学的検出によるOBCが、この条件下での保存による試験ストリップの変化を示唆することを示している。
【００６７】
表5は、ストレス時間t(時間)に対する実測電荷Q(nAs)に基づいて、Ag/AgClに対する-700mV(Q700)における3秒間の測定段階およびAg/AgClに対する-100mV(Q100)における1.5秒間の測定段階を通じての電気化学的測定可能信号の変化を、異なる試料物質(正常血液(N)1および2;Marcumar(M)で処理した提供者の血液1および2)について示している。
【表５】
2005156544.tif 000006
【００６８】
したがって、いわゆるOBC調製段階(実施例7参照)、ならびにいわゆるOBC試験段階(実施例7参照)を通じて得られた測定データに基づいて、「ストレスがかかった」分析素子を識別することができる。
【００６９】
表6に示すように、血液凝固時間もこの条件下ではるかに安定しているため、誤った血液凝固測定値が導かれる前に、ストレスがかかった試験ストリップをOBCにより確実に検出することができる。
【表６】
2005156544.tif 000007
【００７０】
実施例９
レザズリンに特異的な酸化還元パートナーとしてのグリシン
実施例6の配合物を含む試験素子を25℃で48時間保存すると、「OBC反応」によってレザズリンがレゾルフィンに変換されるため、レゾルフィンとレザズリンの比率が変化する。以下の表7は、この反応の反応率がグリシンの存否に影響されることを示している。OBCは、グリシンが存在しない場合も可能であるが、OBCの感度はグリシンの存在によって著しく高められる。
【表７】
2005156544.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】還元によりレゾルフィン2に変換され、さらなる還元によりジヒドロレゾルフィン3に変換されるレザズリン1の構造式を示す図である。
【図２】レザズリン1およびレゾルフィ2の吸収スペクトル(波長λ(nm)に対してプロットした相対的吸収率A)を示す図である。
【図３】かかったストレスの度合が異なる(1:ストレスなし、2:わずかなストレス、3:強いストレス)試験素子試薬領域の反射スペクトル(波長λ(nm)に対してプロットした相対的反射率R(%))を示す図である。
【図４】ストレス時間t(時間)に対する相対的反射率R(%)(波長620nmにて測定)の増加に基づく、レザズリン含有試薬膜における劣化生成物(レゾルフィン)の増加を示す図である。
【図５】ストレス時間t(時間)に対する実測電荷Qの依存性に基づく、Ag/AgClに対して-700mV(Q700)において3秒間継続する第1の測定段階(下方の2曲線)、およびAg/AgClに対して-100mV(Q100)おいて1.5秒間継続する第2の測定段階(上方の2曲線)を通じて電気化学的に測定することができる信号の変化を示す図である。
【図１】
2005156544.tif 000009
【図２】
2005156544.tif 000010
【図３】
2005156544.tif 000011
【図４】
2005156544.tif 000012
【図５】
2005156544.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月14日(2004.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機N-オキシドまたはニトロソ化合物を含有する、分析素子の内在コントロール用試薬系。
【請求項２】
ストレスがかかると、光学的または電気化学的に検出できる変化を生じることを特徴とする請求項1に記載の試薬系。
【請求項３】
還元剤を含有することを特徴とする、請求項1または2に記載の試薬系。
【請求項４】
N-オキシドがレザズリンであることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の試薬系。
【請求項５】
分析素子の内在コントロールのための、請求項1から4のいずれか一項に記載の試薬系の使用。
【請求項６】
検出反応用の試薬系と、請求項1から4のいずれか一項に記載の内在コントロール用の試薬系とを含有する分析素子。
【請求項７】
内在コントロールが、検出反応用試薬系に組み込まれていることを特徴とする、請求項6に記載の分析素子。
【請求項８】
検出反応用試薬系が、血液凝固パラメータを決定するための試薬を含有することを特徴とする、請求項6または7に記載の分析素子。
【請求項９】
分析素子のストレスを示し得る変化を測定する測定機器を利用して、内在コントロール用試薬系を光学的または電気化学的に検査する、請求項6から8のいずれか一項に記載の分析素子のコントロールのための方法。
【外国語明細書】
2005156544000001.pdf