(57)【要約】【課題】工業的に大量製造する場合に必要なスケールアップに適した生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法の提供。【解決手段】密閉容器内に備えられた、各々回転する（Ａ）螺旋状構造構造およびスクリュー状構造からなる群から選ばれる構造と、（Ｂ）スリット状構造と、を有する吐出部の該（Ｂ）スリット状構造から、生理活性物質とリポソーム形成脂質とを、９．０Ｌ／ｓｅｃ以上の吐出流量、かつ９．４ｍ／ｓｅｃ以上の吐出流速で吐出させることを特徴とする生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
密閉容器内に備えられた、下記（Ａ）構造および（Ｂ）スリット状構造を有する吐出部の該（Ｂ）スリット状構造から、生理活性物質とリポソーム形成脂質とを、９．０Ｌ／ｓｅｃ以上の吐出流量、かつ９．４ｍ／ｓｅｃ以上の吐出流速で吐出させることを特徴とする生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
（Ａ）螺旋状構造およびスクリュー状構造からなる群から選ばれる少なくとも一つの軸を中心に回転する構造、
（Ｂ）軸を中心に回転するスリット状構造。
ここで、前記（Ｂ）スリット状構造は、前記（Ａ）構造と向かい合って配置されており、前記（Ｂ）スリット状構造は、前記（Ａ）構造の回転方向に対して、正方向または逆方向に回転する。
【請求項２】
前記（Ａ）構造の回転速度は、５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満であり、
前記（Ｂ）スリット状構造の回転速度は、５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満であることを特徴とする請求項１に記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項３】
前記スリット状構造におけるスリットの幅は、０．５ｍｍ〜５ｍｍであることを特徴とする請求項１または２に記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項４】
前記（Ａ）構造及び前記（Ｂ）スリット状構造は、その回転軸の軸封機構が、メカニカルシールであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項５】
前記密閉容器は、さらに熱交換器を内蔵しており、前記熱交換器を用いて該密閉容器内を冷却することにより、前記生理活性物質とリポソーム形成脂質とを吐出させる際の該密閉容器内の温度を５℃〜６０℃に保持することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項６】
前記吐出部のスリット状構造から前記生理活性物質とリポソーム形成脂質とを吐出させる際に、前記密閉容器内を０．１気圧以上２気圧以下で加圧することを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項７】
前記生理活性物質は、ヘモグロビンであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項８】
前記生理活性物質は、濃度３０ｗｔ％〜６０ｗｔ％の溶液として前記密閉容器に供給されることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載の方法により得られる生理活性物質を含有するリポソーム。
【請求項１０】
平均粒径が１５０ｎｍ〜２２０ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の生理活性物質を含有するリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質を含有したリポソームを工業的に大量製造する場合に必要なスケールアップに適した製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法によって得られる生理活性物質を含有するリポソームに関する。該リポソームは、所望の平均粒径を有し、かつ含有された生理活性物質が熱変成されないため、医療分野での使用に好適である。
【０００２】
【従来の技術】
生理活性物質や薬物をリポソームによりマイクロカプセル化してドラックデリバリーシステムとして医療分野で応用する試みは多く行われている。一般的なリポソームの製造方法としては薄膜法、逆相法、透析法、膜乳化法、高圧吐出法、高速攪拌法等が用いられている。これらの方法は、濃度及び粘度の低い薬物水溶液や熱変性を起こしにくい生理活性物質やタンパク溶液をリポソーム化することは可能であるが、リポソ−ムへの薬物含有率を上げることが難しく、さらに薬物含有率を上げるためには含有物を高い濃度でリポソ−ム化する必要がある。しかし、粘度が高く、熱変性を受けやすい生理活性物質をリポソーム化することは困難であった。
【０００３】
特許文献１には、高速攪拌型乳化機を用いて高粘度・高濃度のヘモグロビン水溶液をリポソーム化する方法が記載されている。しかしこの方法や前述の一般的に使用されているリポソームの製造方法では、数百ｍＬ程度のスケールで生理活性物質を含有するリポソームを調製することは可能であるが、商業化を目指した数十Ｌ〜数百Ｌへのスケールアップをするためには、それぞれのスケールでの製造パラメータの検討が必要である。したがって、リポソーム製造のスケールアップに伴う大きな無駄とリスクを伴う問題や、さらには機械的な強度や耐久性等の問題があり大型の装置設計や製作が非常に困難であった。また、特許文献１の方法は、カッター状或いは櫛状の攪拌羽による剪断力を乳化のエネルギーとしている。そのため、粘性の高い混合物では容器内に十分な流れが生じず、攪拌容器内において温度差が大きくなる点が指摘されていた。攪拌羽の先端部分では高熱が発生しており、熱による生理活性物質の変性を進行させないために、混合物の温度範囲を低温にする必要性があった。さらに温度の調整のためにリポソーム化の進行が遅く処理時間がかかるという問題点があった。
【０００４】
国内において、生理活性物質を含有する医療用リポソームを工業的に生産するためには、その製造量は年間数万Ｌ〜数十万Ｌになる。そうすると少なくとも１日あたりの生産量として数百Ｌのリポソームを製造する必要がある。生産性の問題から製造における乳化工程に要する時間を短縮するためには数十〜数百Ｌ／ｈｒ程度の処理速度が必要となる。従来の高速攪拌型乳化機を用いた方法では、十分に乳化するために数十Ｌから１００Ｌ程度の容量の乳化装置が必要である。しかしながら、小さな実験機から大型の機械へのスケールアップには、攪拌羽の周速、形状を元にした単なる相似形での予測ができないため、必要なパラメータを得ることが困難であった。そのために実際のスケールでの製造検討が必要となり、スケールアップに伴う大きな無駄とリスクを伴う。
【０００５】
【特許文献１】
特開平３−１７３８１３号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した要望を満たすためにスケールアップが可能な生理活性物質を含有するリポソームの製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この製造方法により得られる生理活性物質を含むリポソームを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を解決するため、本発明は次の構成（１）〜（１０）を有する。
（１）密閉容器内に備えられた、下記（Ａ）構造および（Ｂ）スリット状構造を有する吐出部の該（Ｂ）スリット状構造から、生理活性物質とリポソーム形成脂質とを、９．０Ｌ／ｓｅｃ以上の吐出流量、かつ９．４ｍ／ｓｅｃ以上の吐出流速で吐出させることを特徴とする生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
（Ａ）螺旋状構造およびスクリュー状構造からなる群から選ばれる少なくとも一つの軸を中心に回転する構造、
（Ｂ）軸を中心に回転するスリット状構造。
ここで、前記（Ｂ）スリット状構造は、前記（Ａ）構造と向かい合って配置されており、前記（Ｂ）スリット状構造は、前記（Ａ）構造の回転方向に対して、正方向または逆方向に回転する。
【０００８】
（２）前記（Ａ）構造の回転速度は、５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満であり、
前記（Ｂ）スリット状構造の回転速度は、５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満であることを特徴とする（１）の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【０００９】
（３）前記スリット状構造におけるスリットの幅は、０．５ｍｍ〜５ｍｍであることを特徴とする（１）または（２）の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【００１０】
（４）前記（Ａ）構造及び前記（Ｂ）スリット状構造は、その回転軸の軸封機構が、メカニカルシールであることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれかの生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【００１１】
（５）前記密閉容器は、さらに熱交換器を内蔵しており、前記熱交換器を用いて該密閉容器内を冷却することにより、前記生理活性物質とリポソーム形成脂質とを吐出させる際の該密閉容器内の温度を５℃〜６０℃に保持することを特徴とする（１）ないし（４）のいずれかの生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【００１２】
（６）前記吐出部のスリット状構造から前記生理活性物質とリポソーム形成脂質とを吐出させる際に、前記密閉容器内を０．１気圧以上２気圧以下で加圧することを特徴とする（１）ないし（５）の生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【００１３】
（７）前記生理活性物質は、ヘモグロビンであることを特徴とする（１）ないし（６）のいずれかの生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【００１４】
（８）前記生理活性物質は、濃度３０ｗｔ％〜６０ｗｔ％の溶液として前記密閉容器に供給されることを特徴とする（１）ないし（７）のいずれかの生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法。
【００１５】
（９）（１）ないし（８）のいずれかの方法により得られる生理活性物質を含有するリポソーム。
【００１６】
（１０）平均粒径が１５０ｎｍ〜２２０ｎｍであることを特徴とする（９）の生理活性物質を含有するリポソーム。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明をさらに説明する。但し、図面は説明を目的とするものであり、本発明はこれに限定されない。
図１は、本発明の方法に使用する装置の一例の概念図であり、内部の構成をわかりやすくするため密閉容器２が破線で示されている。
図１の装置１は、液体を収納可能な密閉容器２を有している。装置１は、一方の端部が密閉容器２内に存在し、軸を中心に回転可能な構造３を有している。該構造３の密閉容器２内にある端部には、螺旋状構造またはスクリュー状構造３１が設けられている。図２（ａ）〜（ｃ）は、構造３１の一例の部分拡大図であり、該構造３１は、円錐状スクリュー状構造として示されている。図２（ａ）は、該構造３１を側面視した図であり、図２（ｂ）は、該構造３１を下方から見た図であり、図２（ｃ）は、該構造３１を上方から見た図である。
図１において、構造３を軸を中心に回転させると、密閉容器２内で螺旋状構造またはスクリュー状構造３１が回転して、該密閉容器２内に液体の流れを生じさせる。構造３の反対側の端部３２は、密閉容器２の外側に位置し、密閉容器２の外部または表面に取り付けられたモータ（図示していない）等の動力装置と接続されている。
【００１８】
装置１は、一方の端部が密閉容器２内に存在し、軸を中心に回転可能な構造４を有している。該構造４の密閉容器２内の端部には、スリット４２を有する構造（スリット状構造）４１が設けられており、構造４の反対側の端部４３は、密閉容器２の外側に位置し、密閉容器２の外部または表面に取り付けられたモータ等の動力装置（図示していない）と接続されている。なお、図１では、構造３１を示すために、スリット４２が一部省略されているが、スリット状構造４１には、その全周にわたってスリット４２が形成されている。
【００１９】
図１において、螺旋状構造またはスクリュー状構造３１と、スリット状構造４１とは、向かい合って配置されている。より具体的には、スリット状構造４１は、螺旋状構造またはスクリュー状構造３１と対面する部分において、該螺旋状構造またはスクリュー状構造３１の一部または全部を包み込む形状を有している。構造３１と構造４１とがこのような関係で配置されて、装置１の吐出部を構成する。
【００２０】
構造３および構造４が、密閉容器２を貫通する部分には、軸封機構５が設けられている。
さらに、装置１には、密閉容器２内にリポソーム形成脂質や生理活性物質を供給するための原料供給口６、気体または液体により密閉容器内２を加圧するための加圧管７、密閉容器２内を冷却するための熱交換器８および製造されたリポソームを取り出すための試料採取管９が設けられている。
【００２１】
図１の装置１を用いて本発明のリポソームを製造する方法を実施するには、まず原料供給口６を介して密閉容器２内にリポソーム形成脂質および生理活性物質を供給する。
【００２２】
本発明で使用されるリポソーム形成脂質は、リポソームの脂質膜を形成し、内部に生理活性物質をカプセル化（内包）して、含有することができる物質である。リポソーム形成脂質は、リポソームを形成可能であれば特に制限はなく、天然または合成の脂質が使用可能である。これらの中でも、特にリン脂質が好適に使用され、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴエミリンおよびこれらを常法に従って水素添加した物からなる少なくとも一種のリン脂質を使用することができる。またこれらのリン脂質は一種または二種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００２３】
更に、リポソーム形成脂質には所望によりコレステロール等のステロール類の膜安定剤、電荷付与物質（例えばステアリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、リノール酸、リノレイン酸等および末端基が塩であるもの）を添加することもできる。上記のリポソーム形成脂質は、粉末状または溶液状のいずれの形態で密閉容器２内に導入してもよい。リポソーム形成脂質には、他の添加剤を含有させてもよい。添加剤としては特に限定されないが、担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、酸化防止剤、膨化剤、等張剤、溶解補助剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤等が挙げられる。
【００２４】
リポソームに含有される生理活性物質は、リポソームの形成を損なわず、本発明の方法が適用可能である限り、特に制限されない。本発明の方法は、溶液状態での粘度が高く、熱変性を受けやすい生物学的または薬理学的に活性な物質を内包したリポソームを製造するのに好適に使用される。このような生理活性物質の具体例として、蛋白質などが挙げられる。リポソームに含有される蛋白質の具体例としては、例えば、ヘモグロビン、インターフェロン類、インターロイキン類、腫瘍壊死因子類、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子などのコロニー刺激因子類、幹細胞因子（ＳＣＦ）、形質転換成長因子類、肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子等のサイトカイン、成長因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ワクチン、抗体などが挙げられる。これらの蛋白質は、ヒト蛋白質またはヒトに投与可能な蛋白質であることが好ましい。
【００２５】
本発明の方法は、これらの生理活性物質の中でも、高粘度であって、かつ熱変性し易い高濃度蛋白質をリポソームに含有させるのに、より好ましく使用される。ここで、高濃度蛋白質とは、３０％（ｗ／ｗ）以上に濃縮された蛋白質を意味する。
【００２６】
また、これらの生理活性物質は、使用目的に応じて、一種類の生理活性物質のみをリポソームに含有させてもよいし、二種類以上の生理活性物質をリポソームに含有させてもよい。
生理活性物質は、粉末状、溶液状またはゲル状の形態で密閉容器２内に導入することができる。
【００２７】
これらの生理活性物質の具体例としては、医療分野において人工酸素運搬体として利用されるヘモグロビンが好ましく例示され、特に３０％（ｗ／ｗ）以上の高濃度ヘモグロビンがより好ましい。高濃度ヘモグロビンは、単独でリポソームに含有させてもよいし、他の生理活性物質と共にリポソームに含有させてもよい。高濃度ヘモグロビンは、赤血球を常法によって溶血し、分画分子量１０万の膜を利用して赤血球膜を除去して精製することで得ることができる（特開２００２−１６１０４７号公報）。その後、限外濾過により３０％（ｗ／ｗ）以上に濃縮したものが高濃度ヘモグロビンとして使用される（特開昭６３−２１１２３０号公報）。または、遺伝子操作により大腸菌や酵母等に産生させた、リコンビナントヘモグロビン（Ｎａｔｕｒｅ、（米国）、１９９２年３月、第３５６（１９）巻、第１９号、ｐ．２５８−２６０）を限外濃縮等で３０％（ｗ／ｗ）以上に濃縮したものを高濃度ヘモグロビンとして用いることも可能である。
【００２８】
生理活性物質は水溶液の形態で密閉容器２内に供給され、その濃度は３０〜６０％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、４０〜５０％（ｗ／ｗ）であることが特に好ましい。特に生理活性物質が高濃度ヘモグロビンである場合、上記の濃度で供給することが好ましい。人工酸素運搬体の機能である末梢組織への酸素運搬量は、リポソーム内のヘモグロビン濃度に依存して増大する。ヘモグロビンを上記の濃度で導入すれば、ヘモグロビンの濃縮と、リポソーム内へのヘモグロビンの含有とを両立できる範囲内で、ヘモグロビン濃度を最も高くすることができる。
【００２９】
ヘモグロビン等の生理活性物質を効率よくリポソームに含有させる目的において、できるだけ少ない量のリポソーム形成脂質で、できるだけ多くの生理活性物質を含有させることが重要な技術的課題となる。両者の関係において、リポソーム形成脂質の重量（Ｌ）と、リポソームに含有される生理活性物質の重量（Ｈ）との比（Ｌ／Ｈ比）は、なるべく小さい方が好ましいことが知られている。例えば、特開平２−８６８４１号公報では、Ｌ／Ｈ比を０．４０〜１．６７としている。本発明において、Ｌ／Ｈ比は０．４〜１．６７であることが好ましい。Ｌ／Ｈ比が上記の範囲であれば、リポソームが十分な強度を有し、生理活性物質の漏出のおそれがなく、また生理活性物質の投与量当たりで、必要以上の脂質成分の負荷を生体に与えるおそれもない。
【００３０】
生理活性物質とリポソーム形成脂質とは混合せずに、または混合物として密閉容器２内に導入される。これら混合されない状態または混合された状態の生理活性物質およびリポソーム形成脂質のことを本明細書において、以下、「原料」と称することがある。具体的には、生理活性物質とリポソーム形成脂質とを別々に一つの密閉容器２内に導入してもよいし、あらかじめ生理活性物質とリポソーム形成脂質とを部分的にまたは完全に混合し、混合物として調製した後、この混合物を密閉容器２内に導入してもよい。
【００３１】
生理活性物質およびリポソーム形成脂質が液状でない場合、それぞれ適宜溶媒に溶解させて、または溶媒中で生理活性物質とリポソーム形成脂質とを混合させて密閉容器２内に供給してもよい。この目的に使用される溶媒としては、例えば水系の溶媒（水、精製水、生理食塩水、緩衝液など）、有機系の溶媒（メタノール、エタノール、ブタノールなど）が挙げられる。
【００３２】
混合される前の生理活性物質およびリポソーム形成脂質、または一部または全て混合された生理活性物質とリポソーム形成脂質との混合物のｐＨは生理的な範囲であればよく特に限定されないが、生体内、特に血液中のｐＨ範囲であることが好ましく、具体的には、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲であることが好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲である。
【００３３】
原料を容器２内に導入した後、液体で満たした状態で容器２を密閉する。生理活性物質を含有するリポソームは主として医療用として使用されるため、無菌状態で原料を容器２に導入し、そのままの状態で密閉し、密閉された状態で製造されることが好ましい。
【００３４】
密閉容器２の内部形状は、液体で満たされ密閉した状態を維持することができ、かつその内部で、原料を吐出部のスリット４２から吐出させて、混合させることができる限り特に限定されず、立方体、長方体、楕円体、球体およびこれらを組合せた形状から適宜選択することができる。
【００３５】
密閉容器２の容量は、１Ｌ〜１００Ｌ程度であることが好ましく、より好ましくは１０Ｌ〜５０Ｌ程度である。密閉容器２の容量が１Ｌ〜１００Ｌ程度であれば、密閉容器２内に、十分な吐出量を有する吐出部を収容することができ、かつ現実的なエネルギーで十分な吐出量を得ることができる。
【００３６】
本発明のリポソームを製造する方法では、図１の装置の容器２内を原料で満たして密閉した後、構造３および構造４を軸を中心に回転させる。これにより、密閉容器２内にある螺旋状構造またはスクリュー状構造３１およびスリット状構造４１が回転する。螺旋状構造またはスクリュー状構造３１が回転することにより、該構造３１および該構造４１が対面している部分、すなわち該構造３１および該構造４１との間の、原料で満たされた空間内に原料の流れが形成される。構造３１の回転によって生じた原料の流れの一部または全ては、構造４１と衝突する。したがって、構造３１は、回転した際に構造４１の方向に原料の流れを形成する構造であれば、螺旋状構造またはスクリュー状構造以外であってもよい。但し、螺旋状構造またはスクリュー状構造であることが好ましく、特に構造３１が形成する原料の流れがすべて構造４１のスリット４２を通過するような構造であることが好ましい。このような構造としては、具体的には図２（ａ）〜（ｃ）に示す円錐状スクリュー構造や、プロペラ状構造が挙げられる。
【００３７】
構造４１と衝突した原料の流れは、構造４１に設けられたスリット４２を通過して吐出流を形成する。スリット４２を通過した吐出流は、密閉容器２内で急速に速度を失う。これにより流れの界面において液−液剪断力が働き、この剪断力が乳化エネルギーとして働き、生理活性物質とリポソーム形成脂質とが、混合されて、原料が乳化されて、リポソーム化（生理活性物質のカプセル化）が進行する。よって吐出流の界面における速度差がリポソーム化の重要なファクターとなる。
【００３８】
本発明の方法は、スリット４２を通過する吐出流の吐出流量が９．０Ｌ／ｓｅｃ以上であって、かつその吐出流速が９．４ｍ／ｓｅｃであることを特徴とする。吐出流のパラメータがこれらになる条件で、原料をスリット４２から吐出させることで効率的なリポソーム化が可能となる。
【００３９】
吐出流の吐出流量は、好ましくは９．９Ｌ／ｓｅｃ〜１０００Ｌ／ｓｅｃであり、より好ましくは９．９Ｌ／ｓｅｃ〜５００Ｌ／ｓｅｃであり、さらに好ましくは９．９Ｌ／ｓｅｃ〜２００Ｌ／ｓｅｃであり、９．９Ｌ／ｓｅｃ〜１００Ｌ／ｓｅｃがさらに好ましく、５０Ｌ／ｓｅｃ〜１００Ｌ／ｓｅｃが特に好ましい。吐出流の吐出流速は、好ましくは９．４ｍ／ｓｅｃ〜３０ｍ／ｓｅｃ、より好ましくは１２ｍ／ｓｅｃ〜２０ｍ／ｓｅｃである。吐出流の流速が９．４ｍ／ｓｅｃ未満であると、カプセル化が十分に進行しないため至適な粒径のリポソームが得られない。一方、流速が５０ｍ／ｓｅｃ以上であると、使用する熱交換器８の容量にもよるが、過剰の発熱が生じ、冷却が困難になるおそれがある。
【００４０】
吐出流の吐出流量は、上記の条件を満たす限り、密閉容器２の容量に応じて変更することができる。吐出流の吐出流量（Ｌ／ｓｅｃ）と密閉容器２の容量（Ｌ）との比は、特に限定されないが、５（１／ｓｅｃ）  以上であることが好ましく、より好ましくは５（１／ｓｅｃ）〜１０（１／ｓｅｃ）である。吐出流の吐出流量（Ｌ／ｓｅｃ）と密閉容器２の容量（Ｌ）との比が上記の範囲であると、吐出流による密閉容器２内での原料の攪拌が十分であり、容器２内での原料の攪拌が不十分であることに起因する密閉容器２内での熱の不均一化のおそれが解消される。また、所望の吐出流の流量（Ｌ／ｓｅｃ）と容器容量（Ｌ）との比を得るために必要な吐出部の大きさが密閉容器２の容量に対して現実的な大きさである。このような吐出流量と密閉容器２の容量との比を選択することで、前述した剪断力により発生する熱が密閉容器２内で迅速に、かつ均一に分散されて密閉容器２内における温度分布を小さくすることができる。
【００４１】
図１に示す装置１において、構造３１と構造４１との間の距離は、構造３１および構造４１の形状や構造４１に設けられたスリット４２の開口面積にもよるが、構造３１が回転することによって生じた原料の流れの一部または全部が構造４１と衝突して本発明の効果を発揮する限り特に限定されない。但し、構造３１が回転することによって生じた原料の流れが、構造４１に設けられたスリット４２から効率よく吐出されるためには、構造３１と構造４１との間の距離は、両者が構造的に接触しない限りなるべく小さいことが望ましい。構造３１と構造４１との間の距離は、０．１ｍｍ〜５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１ｍｍ〜２ｍｍである。
【００４２】
本発明の方法では、構造３１と構造４１の両方を回転させる。ここで、構造３１および構造４１の回転方向は、同一方向であってもよく、または逆方向であってよい。構造３１と構造４１とを同一方向で回転させた場合であっても、構造４１を回転させることで、吐出流の流れ方向が変わるため、吐出流の速度ベクトルを増加させ、乳化エネルギーを増大させる効果が期待できる。
但し、本発明の方法において、構造３１および構造４１の回転方向は逆方向であることが好ましい。構造３１と構造４１とを逆方向に回転させれば、上記の効果に加えて、スリット４２の開口時間が短くなることで吐出流の吐出流速が増大する。これもまた、吐出流の速度ベクトルを増加させ、乳化エネルギーを増大させる効果が期待できる。
【００４３】
構造３１の回転数（ｒｐｍ）は、構造３１の径や流体を形成する部分の形状あるいは密閉容器２の容量にもよるが、５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満であることが好ましく、より好ましくは１，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、さらに好ましくは４，０００ｒｐｍ〜７，０００ｒｐｍである。構造４１が後述する回転数で回転し、かつ構造３１が５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満の回転数で回転することで、密閉容器２の容量にそれほど制約されず、幅広い範囲の容量の密閉容器２で構造４１のスリット４２を通過する吐出流の吐出流量が９．０Ｌ／ｓｅｃ以上であって、かつその吐出流速が９．４ｍ／ｓｅｃ以上となる。構造３１の回転数が２０，０００ｒｐｍ以上であると、構造３１の軸受け部の機械的な破損が生じるおそれがあり、また軸受け部で発熱が起こり、リポソームを製造する際に生理活性物質が熱変成するおそれがある。
【００４４】
構造３１の大きさは、密閉容器２の容量により決定されるが、通常が直径２０ｍｍ〜３００ｍｍである。但し、吐出流の吐出流量を９．０Ｌ／ｓｅｃ以上にするのに至適な回転数を得るためには、直径が５０ｍｍ〜３００ｍｍであることがより好ましい。構造３１の材質は、特に限定されないが、スチール合金、アルミ合金、チタン合金、セラミック等が至適に用いられる。
【００４５】
構造４１の回転数（ｒｐｍ）は、構造４１の径や流体を形成する部分の長さ、形状、あるいは容器の容量にもよるが、５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満であることが好ましく、より好ましくは１，０００ｒｐｍ〜１０，０００ｒｐｍ、さらに好ましくは４，０００ｒｐｍ〜７，０００ｒｐｍである。構造３１が上記した回転数で回転し、かつ構造４１が５００ｒｐｍ以上２０，０００ｒｐｍ未満の回転数で回転することで、密閉容器２の容量にそれほど制約されず、幅広い範囲の容量の密閉容器２で構造４１のスリット４２を通過する吐出流の吐出流量が９．０Ｌ／ｓｅｃ以上であって、かつその吐出流速が９．４ｍ／ｓｅｃ以上となる。構造４１の回転数が２０，０００ｒｐｍ以上であると、構造４１の軸受け部の機械的な破損が生じるおそれがあり、また軸受け部で発熱が起こり、リポソームを製造する際に生理活性物質が熱変成するおそれがある。
【００４６】
上記したように、構造４１は、スリット４２を有し、対面する部分において構造３１の一部または全部を包み込む形状を有している。構造４１は、その内側に構造３１を収容可能な開口部を有する、円筒形状または円錐形状であることが好ましい。スリット４２は、構造４１が円筒形状の場合にはその側面または底面、構造４１が円錐形状の場合には底面に形成される。構造４１の大きさは、構造３１および密閉容器２の大きさにもよるが、円筒形状または円錐形状である場合、通常は直径２０ｍｍ〜３００ｍｍであり、より好ましくは５０ｍｍ〜３００ｍｍである。
【００４７】
構造４１において、個々のスリット４２の形状およびスリット４２の数等は特に制限されないが、構造３１および構造４１を上述した条件で回転させた際に、スリット４２を通過する吐出流の吐出流量が９．０Ｌ／ｓｅｃ以上であって、かつその吐出流速が少なくとも９．４ｍ／ｓｅｃ以上となるような総開口面積を有する。これにより、前述したように、流れの界面において液−液剪断力が働き、この剪断力が乳化エネルギーとして作用し、リポソーム化が進行する。
【００４８】
ここで、構造４１において個々のスリット４２の幅が広すぎると、吐出流の中心では速度差が小さくなり、リポソーム化に必要な液−液剪断力が十分に働かない。このため、スリット４２の幅は０．５ｍｍ〜５ｍｍ程度の範囲であることが好ましく、１ｍｍ〜３ｍｍ程度の範囲であることがさらに好ましい。スリット４２の幅が上記の範囲であると、吐出流中心部の速度差が十分であり、リポソーム化を進行させる上で好ましい。また、生理活性物質またはリポソーム形成脂質、あるいはこれらの混合物が高粘度である場合であっても、十分な吐出量が得られ、混合物全体を十分に攪拌することができ、リポソーム化が全体的に進行する。構造４１の軸方向におけるスリット４２の長さは特に限定されないが、１０ｍｍ〜３００ｍｍの範囲であることが好ましい。また、個々のスリット４２の形状も、特に限定されず長方形、台形、菱形、三角形、楕円形等であってよい。さらにまた、スリット４２の本数は、構造４１の径または形状にもよるが、１０本〜１００本であることが好ましく、より好ましくは２０本〜５０本である。
構造４１の材質は、特に限定されないが、スチール合金、アルミ合金、チタン合金、セラミック等が至適に用いられる。
【００４９】
また、密閉容器２内において、原料をスリット４２から吐出させて、乳化させるのに要する時間は、上述した目的を達成できる限り特に限定されないが、１分間〜６０分間であることが好ましく、より好ましくは３分間〜３０分間である。
【００５０】
本発明の方法は、図１に示すように、密閉容器２内に熱交換器８を内蔵する装置１を用いて実施することが好ましい。密閉容器２内に熱交換器８を内蔵することにより、原料をスリット４２から吐出して、乳化させる際に密閉容器２内を冷却することができる。これにより、密閉容器２内の温度が好適温度に保持される。ここで密閉容器２内の好適温度は、本発明の方法を用いてリポソームを製造する際に、生理活性物質が熱変性するおそれのない温度であり、具体的には５℃〜６０℃であることが好ましく、より好ましくは５℃〜４０℃である。
【００５１】
熱交換器８を配置する場所は、その目的が達成される限り特に限定されず、密閉容器２内のいずれの場所であってもよいが、密閉容器２内の吐出流の流路中に熱交換器８を配置することが好ましい。このような配置にすることで、熱交換器８での熱交換効率を上げることが可能である。容器２内の熱交換率を上げることにより、生理活性物質の熱変性を生じることなしに、リポソームをカプセル化することができ、カプセル化処理に要する時間を大幅に短縮することが可能である。
【００５２】
本発明の方法では、構造３１および構造４１を回転させて、スリット４２を通過する吐出流を形成する際に、密閉容器２内に低圧の圧力をかけることが好ましい。密閉容器２内が常圧の状態で、構造３１を高速で回転させた場合、回転する構造３１の後方にキャビテーションと呼ばれる真空の泡が生成し、乳化の制御が困難となるおそれがある。具体的には、キャビテーションの生成により、構造３１の回転エネルギーが、吐出流に十分に伝わらなかったり、このキャビテーション泡がつぶれる際に発生する衝撃波が乳化を過度に促進したり、また乳化物に気泡が混入したりするおそれがある。密閉容器２内に低圧の圧力をかけることにより、キャビテーションの過度の生成が抑制され、乳化の制御が容易となる。
【００５３】
本発明において「低圧」とは、上記したキャビテーションが過度に生じることがなく、キャビテーションに係る問題点を制御し得る圧力を意味する。従って、ここでいう「低圧」は、上記した問題が生じない圧力である限り特に限定されないが、０．１気圧〜２気圧であることが好ましく、より好ましくは０．３気圧〜１気圧である。密閉容器２内を上記圧力で加圧するには、密閉容器２内に原料を供給した後、加圧管７を通じて気体または液体により、密閉容器２内を加圧すればよい。
【００５４】
図１に示すように、密閉容器２の構造３および構造４の貫通部には、容器２内を密閉状態に保持するために、構造３および構造４の回転軸を密封するための軸封構造５が設けられている。このような軸封構造５としては、一般的には回転軸とそれに接する樹脂等のリング状シールによる軸封構造が用いられる。しかしながら、軸封構造５に樹脂等のリング状シールを用いた場合、回転軸とリング状シールの接触部分が高速で摺動するためシールが高温になる。そしてこの熱が密閉容器２内に伝わると、生理活性物質の熱変性の原因となるおそれがある。生理活性物質の熱変成は、生理活性物質を含有するリポソームを製造する上でそれ自体問題であるが、生理活性物質の熱変成が発生した場合、熱変成物が軸封構造に固着するおそれがある。熱変成物が軸封構造に固着すると、リング状シールが破壊され、容器２の密閉性を長期間にわたって保持することが困難になる。
【００５５】
本発明の方法において、軸封構造５は前記の問題を生じないものが好ましい。このような軸封構造５としては、具体的には例えばメカニカルシールが挙げられる。ここでいうメカニカルシールとは、上下２枚の平滑な金属板またはセラミック板の片方が密閉容器２に固定され、もう片方が構造３または構造４の回転軸に固定され、これらが接する密封構造である。上下二枚の板の間の数μｍから数十μｍの隙間に水等により液膜を作り、この液膜により軸封とシールの間の潤滑を行うものである。軸封構造５にメカニカルシールを使用することで、軸封構造での発熱が防止され、リポソーム製造時における生理活性物質の熱変成、さらにこれに伴う上記諸問題がおそれが解消される。
【００５６】
以上、図面を参照して本発明の方法について説明したが、本発明の方法は図示した態様に限定されない。例えば、図１に示す装置１では、密閉容器２内に、構造３１および構造４１の単一の組み合わせで示されているが、この組み合わせの数は特に限定されず、複数であってもよい。また、構造３１と構造４１との組み合わせにおいて、該構造３１、４１は、各々一つずつ含んだ組み合せに限定されず、組み合わせ中に、いずれか一方、若しくは両方を複数含んでいてもよい。
また、図１に示す装置では、構造３１と構造４１とが、それらの回転軸が同一直線上にあるように配置されているが、構造３１および構造４１の回転軸が同一直線上になく、一方に対して他方が偏心して配置されていてもよい。
【００５７】
本発明はまた、前述の方法により得られる生理活性物質を含有するリポソームを提供する。本発明のリポソームは、上記したヘモグロビンに代表される生理活性または薬理活性を有する生理活性物質を含有しており、医療用に使用可能である。得られるリポソームの平均粒径は特に限定されないが、１５０ｎｍ〜２２０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１５０ｎｍ〜２００ｎｍである。リポソームの平均粒径が１５０ｎｍ未満であると、リポソーム形成脂質の重量（Ｌ）が増加し前述のＬ／Ｈ比が大きくなり、好ましくない。またリポソームの平均粒径が３００ｎｍ超であると毛細血管等で塞栓を引き起こす可能性がある。本発明において至適な平均粒径である１５０ｎｍ〜２２０ｎｍ程度のリポソームを得るためには、スリット４２からの吐出流の吐出流量が９．０Ｌ／ｓｅｃ以上であって、吐出流速が９．４ｍ／ｓｅｃ以上であることが必要である。ここで、吐出流速は、より好ましくは１２ｍ／ｓｅｃ以上である。一方、吐出流量は、より好ましくは９．９Ｌ／ｓｅｃ以上であり、さらに好ましくは１４．８Ｌ／ｓｅｃ以上である。但し、吐出流の吐出流速または吐出流量が極端に大きすぎると、密閉容器２内で急激な熱の発生を伴い、生理活性物質の熱変成を引き起こす可能性があるのでこのような変成を起こさない範囲で行うのが望ましい。このためには、吐出流の吐出流速は３０ｍ／ｓｅｃ以下であることが好ましく、より好ましくは２０ｍ／ｓｅｃ以下である。また、吐出流の吐出流量は、１０００Ｌ／ｓｅｃ以下であることが好ましく、より好ましくは５００Ｌ／ｓｅｃ以下であり、さらに好ましくは２００Ｌ／ｓｅｃ以下であり、１００Ｌ／ｓｅｃ以下であることが特に好ましい。
【００５８】
得られた生理活性物質を含有するリポソームは、封入されなかった生理活性物質が常法に従って分離除去され、フィルトレーション、超遠心処理等によって採取される。調製されたリポソームに、凝集防止剤を添加して使用してもよい。この場合、凝集防止剤は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロリンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル、リン脂質等の疎水性化合物と結合させて使用する。凝集防止剤の脂質誘導体は、リポソームの構造安定を損なうものでなければ特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン等が挙げられる。これらのうち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリエチレングリコール脂質誘導体が好ましい。
【００５９】
本発明のリポソームは、患者に非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。投与対象の宿主としては、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。非経口的投与の経路としては、例えば点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。リポソームは、病気に既に悩まされる患者に、病気の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。例えばリポソームに封入される生理活性物質の有効投与量は、一日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから２０００ｍｇの範囲で選ばれる。該生理活性物質の有効投与量は、より好ましくは０．０１ｍｇから１００ｍｇである。しかしながら、本発明のリポソームはこれらの投与量に制限されるものではない。投与時期は、疾患が生じてから投与してもよいし、あるいは疾患の発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防的に投与してもよい。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００６０】
【実施例】
以下に、ヘモグロビンを生理活性物質として用いた実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
比較例１
水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）（日本油脂製）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）（日本油脂製）とステアリン酸（ＳＡ）（日本油脂製）からなる混合比、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＡ＝１／１／１（ｍｏｌ）の混合物６０ｇをｔ−ＢｕＯＨ（和光純薬工業製）２００ｍＬに溶解後、凍結乾燥しｔ−ＢｕＯＨを除去することで調製した。この脂質混合物に精製水６０ｇを加え８０℃、３０分加熱し十分に水和させた。この脂質水和物にヘモグロビン（４５ｗｔ％）溶液（特開２００２−１６１０４７号公報に開示されているもの）４００ｍＬを加え転倒混和したものを高速攪拌機（攪拌容量５００ｍＬ、カッター型攪拌羽径３３ｍｍ、ワーリング社製、ワーリングブレンダー）を備えた密閉可能な容器に供給して、該容器を密閉した。この状態から、該容器外側に設けた冷却ジャケットを−１０℃の冷媒で冷却しながら５℃以上１０℃以下の温度範囲で、該容器に装備された加圧管から空気で加圧して、該容器内に０．３気圧の圧力を加えながら、攪拌羽根の回転数を変えて（１００００ｒｐｍ（周速１７．２ｍ／ｓｅｃ）、１２０００ｒｐｍ（周速２０．７ｍ／ｓｅｃ）、１５０００ｒｐｍ（周速２５．９ｍ／ｓｅｃ）で３ｍｉｎ、３０回）、従来の高速攪拌法を用いて攪拌乳化させた。乳化後、それぞれの乳化条件で処理したヘモグロビン−脂質混合物３０ｇを採取し、生理食塩水を３０ｍＬ加えて、４万Ｇ、６０ｍｉｎで３回遠心洗浄して、カプセル化されなかったヘモグロビンを除去した。その後２０ｍＬの生理食塩水に分散し、凝集防止剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質（日本油脂製）を０．１ｗｔ％になるように加えて、ＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームを得た。同様の操作を３回繰り返した。
【００６１】
このように調製したＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームの各々の粒径を光散乱回折測定装置（ＬＳ２３０、ＣＯＵＬＴＥＲ社製）  で測定し、３回の操作で得られたリポソームの粒径の標準偏差（ＳＤ）を求めた。
【００６２】
比較例２
水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）とステアリン酸（ＳＡ）からなる混合比、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＡ＝１／１／１（ｍｏｌ）の混合物１８０ｇをｔ−ＢｕＯＨ  ６００ｍＬに溶解後、凍結乾燥しｔ−ＢｕＯＨを除去することで調製した。この脂質混合物に精製水１８０ｇを加え８０℃、３０分加熱し十分に水和させた。この脂質水和物にヘモグロビン（４５ｗｔ％）溶液１２００ｍＬを加え転倒混和したものを高速攪拌機（攪拌容量１５００ｍＬ、カッター型攪拌羽径９０ｍｍ、特殊機化製、アジホモミクサー）を備えた密閉可能な容器に供給して、該容器を密閉した。この状態から、該容器外側に設けた冷却ジャケットを−１０℃の冷媒で冷却しながら５℃以上１０℃以下の温度範囲で、該容器に装備された加圧管から空気で加圧して、該容器内に０．３気圧の圧力を加えながら、攪拌羽根の回転数を変えて（３６００ｒｐｍ（周速１７．０ｍ／ｓｅｃ）、４４００ｒｐｍ（周速２０．９ｍ／ｓｅｃ）、５４００ｒｐｍ（周速２５．４ｍ／ｓｅｃ）で３ｍｉｎ、３０回）攪拌乳化した。乳化後、それぞれの乳化条件で処理したヘモグロビン−脂質混合物３０ｇを採取し生理食塩水を３０ｍＬ加え、４万Ｇ、６０ｍｉｎで３回遠心洗浄し、カプセル化されなかったヘモグロビンを除去した。その後２０ｍＬの生理食塩水に分散し、ここに凝集防止剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質を０．１ｗｔ％になるように加え、ＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームを得た。同様の操作を３回繰り返した。
このように調製したＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームの各々の粒径を光散乱回折測定装置（ＬＳ２３０、ＣＯＵＬＴＥＲ社製）  で測定し、３回の操作で得られたリポソームの粒径の標準偏差（ＳＤ）を求めた。
【００６３】
比較例１及び２で得られたヘモグロビン含有リポソームの粒径を、それぞれの処理条件であるカッター型攪拌羽の周速をパラメータとして図３に示した。
比較例１及び比較例２の結果（図３）から、相似形のカッター型攪拌羽を持つ高速攪拌機を用いた場合、乳化のパラメータとして攪拌羽周速を用いた場合にはヘモグロビン含有リポソームの粒径に与える影響が異なり、さらなるスケールアップをした場合に乳化条件、攪拌機の設計が乳化に与える影響の予想が難しく、実スケールでの攪拌機設計や乳化条件設定が必要となることが明らかになった。
【００６４】
実施例１
水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）とステアリン酸（ＳＡ）からなる混合比、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＡ＝１／１／１（ｍｏｌ）の混合物１８０ｇをｔ−ＢｕＯＨ  ６００ｍＬに溶解後、凍結乾燥しｔ−ＢｕＯＨを除去することで調製した。この脂質混合物に精製水１８０ｇを加え８０℃、３０分加熱し十分に水和させた。この脂質水和物にヘモグロビン（４５ｗｔ％）溶液１２００ｍＬを加え転倒混和したものを、図１に示す装置１（攪拌容量１５００ｍＬ、螺旋状構造（螺旋状スクリュー状構造）３１の最大径８０ｍｍ、１回転吐出量１４８ｍＬ、スリット幅１．５ｍｍ、スリット長さ２２ｍｍ、スリット数３２本、エム・テクニック社製、クレアミックスＣＬＭ−５．５／１１Ｗ）の密閉容器２内に原料供給口６から供給して、容器２を密閉した。加圧管７から空気で加圧して、密閉容器２内に０．３気圧の圧力を加え、密閉容器２内に設けられた熱交換器８を−１０℃の冷媒で冷却して、密閉容器２内の液温を５℃以上６０℃以下の温度範囲に維持しながら、螺旋状構造３１およびスリット状構造４１を下記条件で各々回転させて、スリット状構造４１のスリット４２から原料を吐出させて、乳化させた。なお、吐出は、各吐出条件で３ｍｉｎ、５回実施した。
［吐出条件１］
螺旋状構造３１の回転数：４０００ｒｐｍ
（吐出量９．９Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速９．４ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１の回転方向：螺旋状構造３１と逆方向
スリット状構造４１の回転数：４０００ｒｐｍ
［吐出条件２］
螺旋状構造３１の回転数：５０００ｒｐｍ
（吐出量１２．４Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速１１．７ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１の回転方向：螺旋状構造３１と逆方向
スリット状構造４１の回転数：４０００ｒｐｍ
［吐出条件３］
螺旋状構造３１の回転数：６０００ｒｐｍ
（吐出量１４．８Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速１４．１ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１の回転方向：螺旋状構造３１と逆方向
スリット状構造４１の回転数：６０００ｒｐｍ
【００６５】
乳化後、それぞれの乳化条件で処理したヘモグロビン−脂質混合物３０ｇを採取し、生理食塩水を３０ｍＬ加え、４  万Ｇ、６０ｍｉｎで３回遠心洗浄してカプセル化されなかったヘモグロビンを除去した。その後２０ｍＬの生理食塩水に分散し、ここに凝集防止剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質を０．１ｗｔ％になるように加え、ＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームを得た。同様の操作を３回繰り返した。
【００６６】
このように調製したＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームの各々の粒径を光散乱回折測定装置（ＬＳ２３０、ＣＯＵＬＴＥＲ社製）  で測定し、３回の操作で得られたリポソームの粒径の標準偏差（ＳＤ）を求めた。
【００６７】
比較例３
水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）とステアリン酸（ＳＡ）からなる混合比、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＡ＝１／１／１（ｍｏｌ）の混合物６０ｇをｔ−ＢｕＯＨ  ２００ｍＬに溶解後、凍結乾燥しｔ−ＢｕＯＨを除去することで調製した。この脂質混合物に精製水６０ｇを加え８０℃、３０分加熱し十分に水和させた。この脂質水和物にヘモグロビン（４５ｗｔ％）溶液４００ｍＬを加え転倒混和したものを、図１に示す装置１（攪拌容量５００ｍＬ、螺旋状構造（螺旋状スクリュー状構造）３１の最大径３３ｍｍ、１回転吐出量１２．８ｍＬ、スリット幅１．１５ｍｍ、スリット長さ１１ｍｍ、スリット数３２本、エム・テクニック社製、クレアミックスＣＬＭ−１．５／２２Ｗ）の密閉容器２内に原料供給口６から供給して、容器２を密閉した。加圧管７から空気で加圧して、密閉容器２内に０．３気圧の圧力を加え、密閉容器２内に設けられた熱交換器８を−１０℃の冷媒で冷却して、密閉容器２内の液温を５℃以上６０℃以下の温度範囲に維持しながら、螺旋状構造３１およびスリット状構造４１を下記条件で各々回転させて、スリット状構造４１のスリット４２から原料を吐出させて、乳化させた。なお、吐出は、各吐出条件で３ｍｉｎ、５回実施した。
［吐出条件１］
螺旋状構造３１の回転数：１００００ｒｐｍ
（吐出量２．１Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速５．２ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１の回転方向：螺旋状構造３１と逆方向
スリット状構造４１の回転数：１００００ｒｐｍ
［吐出条件２］
螺旋状構造３１の回転数：１２０００ｒｐｍ
（吐出量２．６Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速６．３ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１の回転方向：螺旋状構造３１と逆方向
スリット状構造４１の回転数：１２０００ｒｐｍ
［吐出条件３］
螺旋状構造３１の回転数：１５０００ｒｐｍ
（吐出量３．２Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速７．９ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１の回転方向：螺旋状構造３１と逆方向
スリット状構造４１の回転数：１５０００ｒｐｍ
【００６８】
乳化後、それぞれの乳化条件で処理したヘモグロビン−脂質混合物３０ｇを採取し、生理食塩水を３０ｍＬ加え、４万Ｇ、６０ｍｉｎで３回遠心洗浄して、カプセル化されなかったヘモグロビンを除去した。その後２０ｍＬの生理食塩水に分散し、ここに凝集防止剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質を０．１ｗｔ％になるように加え、ＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームを得た。同様の操作を３回繰り返した。
このように調製したＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームの各々の粒径を光散乱回折測定装置（ＬＳ２３０、ＣＯＵＬＴＥＲ社製）で測定し、３回の操作で得られたリポソームの粒径の標準偏差（ＳＤ）を求めた。
【００６９】
比較例４
水素添加大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）とステアリン酸（ＳＡ）からなる混合比、ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＳＡ＝１／１／１（ｍｏｌ）の混合物６０ｇをｔ−ＢｕＯＨ、２００ｍＬに溶解後、凍結乾燥しｔ−ＢｕＯＨを除去することで調製した。この脂質混合物に精製水６０ｇを加え８０℃、３０分加熱し十分に水和させた。この脂質水和物にヘモグロビン（４５ｗｔ％）溶液、４００ｍＬを加え転倒混和したものを、図１に示す装置１（攪拌容量５００ｍＬ、螺旋状構造（螺旋状スクリュー状構造）３１の最大径３３ｍｍ、１回転吐出量１２．８ｍＬ、スリット幅１．１５ｍｍ、スリット長さ１１ｍｍ、スリット数３２本、エム・テクニック社製、クレアミックスＣＬＭ−１．５／２２Ｗ）の密閉容器２内に原料供給口６から供給して、容器２を密閉した。加圧管７から空気で加圧して、密閉容器２内に０．３気圧の圧力を加え、密閉容器２内に設けられた熱交換器８を−１０℃の冷媒で冷却して、密閉容器２内の液温を５℃以上６０℃以下の温度範囲に維持しながら、螺旋状構造３１およびスリット状構造４１を下記条件で各々回転させて、スリット状構造４１のスリット４２から原料を吐出させて、乳化させた。なお、吐出は、下記の条件で３ｍｉｎ、５回実施した。螺旋状構造３１の回転数：２００００ｒｐｍ
（吐出量３．４Ｌ／ｓｅｃ、吐出流速９．２ｍ／ｓｅｃ）
スリット状構造４１：固定（未回転）
【００７０】
乳化後、ヘモグロビン−脂質混合物３０ｇを採取し、生理食塩水を３０ｍＬ加え、４万Ｇ、６０ｍｉｎで３回カプセル化されなかったヘモグロビンを遠心洗浄した。その後２０ｍＬの生理食塩水に分散し、ここに凝集防止剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合リン脂質を０．１ｗｔ％になるように加え、ＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームを得た。同様の操作を３回繰り返した。
このように調製したＰＥＧで表面修飾されたヘモグロビン含有リポソームの各々の粒径を光散乱回折測定装置（ＬＳ２３０、ＣＯＵＬＴＥＲ社製）で測定し、３回の操作で得られたリポソームの粒径の標準偏差（ＳＤ）を求めた。
【００７１】
実施例１及び比較例３、４で得られたヘモグロビン含有リポソームの粒径を、それぞれの処理条件である吐出量をパラメータとして図４に示した。さらに実施例１及び比較例３、４で得られたヘモグロビン含有リポソームの粒径を、それぞれの処理条件である吐出流速をパラメータとして図５に示した。
実施例１及び比較例３、４の結果（図４、５）を比較すると、本発明の吐出流量および吐出流速を下回る吐出条件で実施した比較例３、スリット状構造４１を回転させずに実施した比較例４では、得られるリポソームの粒径のバラツキが大きく、かつ平均粒径が２７０ｎｍ以上であった。特に、スリット状構造を回転させずに実施した比較例４では、吐出流の吐出流量が実施例１とそれほど大きな差がないにもかかわらず、得られるリポソームの平均粒径が実施例１に比べて著しく大きく３７０ｎｍ程度であった。これは、実施例１では、螺旋状構造３１と対向するスリット状構造４１とを両方回転させることで、吐出流の速度ベクトルの増大が起こり、リポソーム型ヘモグロビンの微細化が進行したためと考えられる。
なお、比較例４では、得られたリポソームに含有されるヘモグロビンが部分的に変性していることが認められた。これは、２００００ｒｐｍ以上の回転数で螺旋状構造３１を回転させたことにより生じた熱で、ヘモグロビンが熱変性したと考えられる。
【００７２】
また、図４、５より、スリット状構造４１から吐出される高濃度ヘモグロビンとリポソーム形成脂質混合物の吐出量が、約９Ｌ／ｓｅｃ以上、吐出流速が９．４ｍ／ｓｅｃ以上から、吐出流量および吐出流速に依存してヘモグロビン含有リポソームの粒径が小さくなっていることが分かり、１５０〜２２０ｎｍの平均粒径を有するリポソームをスケールアップ製造するためには、上記の条件が必要であることが明らかとなった。よって本発明のリポソームの製造方法において、リポソームの製造パラメータとして、吐出流量および吐出流速に着目することによりリポソームの製造をスケールアップできることが示された。
【００７３】
【発明の効果】
以上、詳述したように本発明は、ヘモグロビン等の生理活性物質を含有したリポソームを工業的に大量製造する場合に必要なスケールアップに適した生理活性物質を含有するリポソームを製造する方法を提供する。本発明の方法を採用することにより、生理活性物質を含有するリポソームを工業的規模で大量製造するためのスケールアップ時に最適な構造を予測して製造設備を設計することが可能となる。本発明の方法により、リポソーム化によって発生する熱を局在化させず効率よく吸収することができる。これによって熱に不安定な生理活性物質を内部に取り込んだリポソームを製造することが可能となり、将来的に様々な分野において適用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法に用いる装置の一例を示した概念図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、図１の構造３１の一例の部分拡大図であり、（ａ）は構造３１を側面視した図であり、（ｂ）は構造３１を下方から見た図であり、（ｃ）は構造３１を上方から見た図である。
【図３】比較例１及び２における、攪拌容量及び攪拌羽の周速とヘモグロビン含有リポソームの粒径の関係を示すグラフである。
【図４】実施例１、及び比較例３、４における、吐出量とヘモグロビン含有リポソームの粒径の関係を示すグラフである。
【図５】実施例１、及び比較例３、４における、吐出流速とヘモグロビンリポソームの粒径の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１：装置
２：密閉容器（容器）
３：構造
３１：螺旋状構造またはスクリュー状構造
３２：端部
４：構造
４１：スリット状構造
４２：スリット
４３：端部
５：軸封構造
６：原料供給口
７：加圧管
８：熱交換器
９：試料採取管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2005002055.tif 000005
【図５】
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