(57)【要約】【課題】  ヒトの歯肉縁下歯垢に類似し、歯周疾患等に対する有効成分の探索、評価および口腔疾患予防剤等の開発などに有効なインビトロバイオフィルムを提供すること。【解決手段】  歯肉縁下に生息する生細菌の少なくとも１種以上を培養液中で連続培養し、少なくとも表面が細胞外マトリックス構成成分からなる付着担体上に連続培養した生細菌を付着させて形成されたインビトロバイオフィルム。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯肉縁下に生息する生細菌の少なくとも１種以上を培養液中で連続培養し、少なくとも表面が細胞外マトリックス構成成分からなる付着担体上に前記連続培養した生細菌を付着させて形成されたことを特徴とするインビトロバイオフィルム。
【請求項２】
前記細胞外マトリックス構成成分が、コラーゲンまたは非コラーゲン性タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のインビトロバイオフィルム。
【請求項３】
前記培養液中の総タンパク量が、１５ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１または２記載のインビトロバイオフィルム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロバイオフィルムを用いることを特徴とする薬剤評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続培養で作製されるインビトロバイオフィルムおよびこれを用いた薬剤評価方法に関し、さらに詳述すると、ヒト口腔内の歯周病誘発性歯垢と類似し、歯周疾患予防・治療を目的とした有効成分の探索、評価および口腔疾患予防剤等の開発などに有用なインビトロバイオフィルムおよびこれを用いた薬剤評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌が形成するバイオフィルムは、医学および歯学分野における各種疾病や、環境問題等を引き起こすことが知られている。バイオフィルムを構成している細菌は、同一細菌の浮遊性状態とは異なる性質を持ち、その薬剤耐性や表現型が異なることが指摘されている。このような背景から、実験室内でバイオフィルムを再現させるための培養法としては、連続培養法やシェアフォースをかける培養法など、種々の工夫がなされている。
ところで、口腔内に形成された歯垢（バイオフィルム）は、う蝕，歯周病，口臭等の口腔疾患の原因として捉えられ、これらの疾患予防または治療用の有効成分の探索、評価系にインビトロバイオフィルムを用いることが望まれている。
【０００３】
この有効成分の探索、評価を目的として、従来、ミュータンス連鎖球菌をショ糖含有培地でバッチ培養して得られたバイオフィルムが用いられている（非特許文献１参照）。
しかし、この方法では歯周病予防剤の評価ができないばかりでなく、実験系が単純すぎるため、該方法で有効性が認められた成分が、ヒト口腔内で有効性を示さない場合が多いという欠点がある。
したがって、ヒトの歯肉縁下歯垢に類似した再現性の良好なインビトロバイオフィルムの開発が望まれており、例えば、特許文献１（特開２００３−１１６５１６号公報）には、歯肉縁上歯垢のモデルとして、う蝕誘発性生細菌を含むインビトロバイオフィルムが開示されているものの、さらなる改良が求められているのが現状である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−１１６５１６号公報
【非特許文献１】ウィルソン  アール．エフ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｒ．Ｆ）、  ジャーナル  オブ  デンタル  リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）、４９巻、１８０頁、１９７０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、ヒトの歯肉縁下歯垢に類似し、歯周疾患等に対する有効成分の探索、評価および口腔疾患予防剤等の開発などに有効なインビトロバイオフィルムおよびこれを用いた薬剤評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、バイオフィルムが形成される付着担体の少なくとも表面を細胞外マトリックス構成成分から形成し、歯肉縁下に生息する細菌の少なくとも１種以上を培養液中、好ましくは、総タンパク量が１５ｇ／Ｌ以下の培養液中で連続培養し、付着担体に付着させて得られたインビトロバイオフィルムが、ヒトの歯肉縁下歯垢と類似性が高く、しかも、これを用いた薬剤評価においてインビボ評価と同等の有効性が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
１．歯肉縁下に生息する生細菌の少なくとも１種以上を培養液中で連続培養し、少なくとも表面が細胞外マトリックス構成成分からなる付着担体上に前記連続培養した生細菌を付着させて形成されたことを特徴とするインビトロバイオフィルム、
２．前記細胞外マトリックス構成成分が、コラーゲンまたは非コラーゲン性タンパク質であることを特徴とする１のインビトロバイオフィルム、
３．前記培養液中の総タンパク量が、１５ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする１または２のインビトロバイオフィルム、
４．１〜３のいずれかに記載のインビトロバイオフィルムを用いることを特徴とする薬剤評価方法
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のインビトロバイオフィルムは、病原性ヒト歯肉縁下歯垢と類似性の高いものであるのみならず、これを用いた薬剤評価方法において、インビボ評価と同等の薬剤の効力が認められる。したがって、本発明のインビトロバイオフィルムは、歯周疾患等に対する有効成分の探索・評価および口腔疾患予防剤等の開発に有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に係るインビトロバイオフィルムは、歯肉縁下に生息する生細菌の少なくとも１種以上を培養液中で連続培養し、少なくとも表面が細胞外マトリックス構成成分からなる付着担体上に連続培養した生細菌を付着させて形成されたことを特徴とする。
細胞外マトリックスは主として、コラーゲン、糖タンパク質等の非コラーゲン性タンパク質、ムコ多糖類などから構成されるものであるが、本発明においてもこれらの細胞外マトリックス構成成分を適宜選択して用いることができ、それらの濃度および由来等も含めて特に限定されるものではない。
【００１０】
ここで、コラーゲンとしては、コラーゲンそのものに加え、変性コラーゲンであるゼラチン等が挙げられ、一方、非コラーゲン性タンパク質としては、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。
ムコ多糖類としてはプロテオグリカン，グリコサミノグリカン，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸，ヘパラン硫酸等が挙げられる。
これらの中でも、口腔内の細菌生育・定着環境が良好であるという点から、特にタンパク性の細胞外マトリックス構成成分を使用することが好ましく、上述したコラーゲン、ゼラチン、エラスチン等を好適に用いることができる。なお、これらタンパク性細胞外マトリックス構成成分のペプチド断片や、ポリ−Ｌ−リジン等の合成ペプチドも好適に使用することができる。
【００１１】
本発明において、その表面にバイオフィルムが形成される付着担体としては、少なくとも表面が細胞外マトリックス構成成分から形成されているものであれば特に限定されるものではない。また、「表面が細胞外マトリックス構成成分から形成されている」とは、表面の一部分が細胞外マトリックス構成成分からなる態様を包含する概念である。
例えば、上記細胞外マトリックス構成成分を、そのまま付着担体として用いてもよく、使用状態に合わせてゲル状等の性状に調製したものを付着担体として用いてもよい。さらに、ヒトエナメル切片、象牙質切片、ハイドロキシアパタイト板、ポリスチレン等の樹脂などの表面の一部（例えば、平板状である場合には片面等）または全部に上記細胞外マトリックス構成成分をコートした付着担体を用いることもできる。
この場合、細胞外マトリックス構成成分を樹脂等にコーティングする手法としては、特に限定されるものではなく、公知の種々の方法を採用でき、例えば、細胞外マトリックス構成成分を溶かした溶液を付着担体表面に噴霧または塗布し、乾燥させる方法などを採用することができる。
なお、付着担体の表面を、唾液、血清などで処理したものも好適に使用することができる。
【００１２】
歯肉縁下に生息する生細菌としては、歯垢から検出される細菌であれば特に限定はなく、例えば、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、キャプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）属、ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属等が挙げられ、さらに、象牙質う蝕に関連するストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属も用いることができる。
【００１３】
ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、以下Ｐと略記する。）属としては、例えば、ポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ポルフィロモナス  エンドドンタリス（Ｐ．  ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ）、ポルフィロモナス  アサカロリティカ（Ｐ．  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）等が挙げられる。
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、以下Ｂと略記する。）属としては、バクテロイデス  フォーサイサス（Ｂ．  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、バクテロイデス  オウロラム（Ｂ．  ｏｕｌｏｒｕｍ）、バクテロイデス  ズーグレオフォーマン（Ｂ．  ｚｏｏｇｌｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、バクテロイデス  グラシリス（Ｂ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）等が挙げられる。
【００１４】
プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、以下Ｐと略記する。）属としては、プレボテラ  インターメディア（Ｐ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プレボテラ  ニグレスセンス（Ｐ．  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）、プレボテラ  メラニノジェニカ（Ｐ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、プレボテラ  デンティコーラ（Ｐ．  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）等が挙げられる。
アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、以下Ａと略記する。）属としては、アクチノバチルス  アクチノミセテムコミタンス（Ａ．  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）等が挙げられる。
トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、以下Ｔと略記する。）属としては、トレポネマ  デンティコーラ（Ｔ．  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネマ  ビンセンティ（Ｔ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、トレポネマ  ペクチノボルム（Ｔ．  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）、トレポネマ  ソクランスキー（Ｔ．  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）等が挙げられる。
【００１５】
キャプノサイトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、以下Ｃと略記する。）属としては、キャプノサイトファガ  オクラセア（Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ）、キャプノサイトファガ  スプチゲナ（Ｃ．  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ）、キャプノサイトファガ  ジンジバリス（Ｃ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）等が挙げられる。
カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、以下Ｃと略記する。）属としては、カンピロバクター  レクタス（Ｃ．  ｒｅｃｔｕｓ）、カンピロバクター  スプトルム（Ｃ．  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）等が挙げられる。
フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、以下Ｆと略記する。）属としては、フゾバクテリウム  ヌクレアタム（Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）等が挙げられる。
レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、以下Ｃと略記する。）属としては、レプトトリキア  ブッカーリス（Ｌ．  ｂｕｃｃａｌｉｓ）等が挙げられる。
【００１６】
ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、以下Ｖと略記する。）属としては、ベイヨネラ  パルビュラ（Ｖ．  ｐａｒｖｕｌａ）、ベイヨネラ  ディスパー（Ｖ．  ｄｉｓｐａｒ）等が挙げられる。
アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、以下Ａと略記する。）属としては、アクチノマイセス  ネスランディ（Ａ．  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、アクチノマイセス  ビスコーサス（Ａ．  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、アクチノマイセス  イスラエリイ（Ａ．  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス  オドントリティカス（Ａ．  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）等が挙げられる。
【００１７】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、以下Ｓと略記する。）属としては、ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス  サングイス（Ｓ．  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス  ソブリヌス（Ｓ．  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス  サリバリウス（Ｓ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス  ゴルドニイ（Ｓ．  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）等が挙げられる。
なお、上記各生細菌は、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１８】
本発明のインビトロバイオフィルムは、例えば、以下のように作製することができる。
予め液体培地または寒天培地等の培地を用いて培養した歯肉縁下に生息する生細菌の細菌懸濁液を、付着担体を装着するとともに培養液を入れた培養槽に所定量加えて混合し、１時間あたり１〜３０ｖｏｌ％の置換率で同培養液を連続的に供給、排出しながら、３７℃、嫌気的条件下（例えば、９５％窒素、５％炭酸ガス雰囲気下）で２〜３０日間の所定の期間連続培養を行う。この際、バイオフィルムを形成させる付着担体の培養槽への装着方法は、特に限定されるものではないが、培養細菌の沈降による付着を防止するために、付着担体表面が培養槽側面と平行になるように装着してバイオフィルムを形成させる、または培養槽内に設けられた回転板に付着担体を装着して回転させながらバイオフィルムを形成させることが好ましい。
なお、インビトロバイオフィルムの作製は、上記のように培養槽内で培養した生細菌を付着担体に付着させて作製するほかに、培養槽から排出した培養液中で培養した生細菌を付着担体上に付着させて作製することもできる。さらに、本発明の連続培養としては、培養槽内に培地を供給する代わりに、一定時間ごと（例えば、３〜２４時間ごと）に培地交換をする方法を用いることもできる。
【００１９】
本発明において、連続培養に用いられる培養液としては、通常の微生物培養に用いられるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、一般細菌用培地、ペプトン類、糖タンパク類、アミノ酸類またはこれらの混合物等を適宜用いることができ、必要に応じて無機塩類などを添加することもできるが、グルコース等の遊離糖は含まないものであることが好ましい。
特に、培養液中における総タンパク量を１５ｇ／Ｌ以下、好ましくは０．０５〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜８ｇ／Ｌの範囲に調整した培養液を用いることが好適である。総タンパク量をこの範囲に調整することで、得られるインビトロバイオフィルム中において、歯周病の原因菌であると考えられているポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）等の定着量を増加させることができ、病原性ヒト歯肉縁下歯垢と類似性のより高いバイオフィルムとすることができる。
なお、培養液中の総タンパク量は、例えば、紫外部吸収法（２８０ｎｍ）、ビュレット法、ローリー法（比色法）、ビシンコニン酸法、色素結合法、加水分解法などの方法により測定することができる。
【００２０】
培養装置としては、特に限定されるものではなく、公知の連続培養装置などから適宜選択して用いればよいが、特に、培養液の排出を簡便に行える排出口や吸出管などのドレインが適宜な部位に設けられた培養槽を用いることが好ましい。また、培養液やガスを連続供給可能な供給口等を有するとともに、槽内に供給された培養液を攪拌できる装置を有する培養装置であることが好ましい。さらに、培養液のｐＨ調整が必要な場合には、ｐＨ測定装置およびｐＨスタットを接続してもよく、溶存酸素量の調整が必要な場合には、ＤＯセンサー等を接続することにより、その状態を把握することもできる。
【００２１】
以上で説明した本発明のインビトロバイオフィルムは、歯肉縁下に生息する生細菌の少なくとも１種以上を培養液中で連続培養し、少なくとも表面が細胞外マトリックス構成成分からなる付着担体上に連続培養した生細菌を付着させて形成されたものであるから、病原性ヒト歯肉縁下歯垢と類似性の高いものであり、例えば、歯周疾患等に対する有効成分の探索・評価および口腔疾患予防剤等の開発などにおける薬剤評価方法用のバイオフィルムとして、好適に利用することができ、この場合、インビボ評価と同等程度の薬剤の効果が認められるものである。
なお、薬剤評価方法としては、特に限定されるものではなく、口腔疾患予防剤の開発など、バイオフィルムを用いて行われている薬剤評価方法において、従来のバイオフィルムの代わりに、本発明のインビトロバイオフィルムを用いればよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例および比較例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
インビトロバイオフィルムの作製
［実施例１］
アクチノマイセス  ビスコーサス（Ａ．  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ４３１４６、ベイヨネラ  パルビュラ（Ｖ．  ｐａｒｖｕｌａ）ＡＴＣＣ１７７４５、フゾバクテリウム  ヌクレアタム（Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１０９５３、およびポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ＡＴＣＣ３３２７７を、培養液であるＢＨＩ培地（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｉｆｃｏ社製）中で嫌気的に対数増殖期後半まで培養し、同培養液に懸濁させた。この際、培養液中の総タンパク量をローリー法（比色法）にて定量したところ、２５．５ｇ／Ｌであった。
【００２４】
この細菌懸濁液を、予めＢＨＩ培地１０００ｍｌ（含ヘミン１ｍｇ／Ｌ、メナジオン０．２ｍｇ／Ｌ）を入れた培養槽に、上記各細菌の数が各々１×１０7になるように接種し、３７℃、嫌気的条件下（９５％窒素、５％炭酸ガス）で一晩培養を行った。その後、ＢＨＩ培地（含ヘミン１ｍｇ／Ｌ、メナジオン０．２ｍｇ／Ｌ）を１時間あたり１０ｖｏｌ％の置換率で連続的に供給するとともに、同置換率で培地を排出しながら、同条件で２１日間連続培養を行った。
この間、培養槽内の回転板（８０ｒｐｍで回転）に、付着担体であるコラーゲンをコートしたハイドロキシアパタイト板を装着し、その表面にバイオフィルムを形成させた。
なお、コラーゲンのハイドロキシアパタイト板へのコーティングは、直径７ｍｍ×厚さ３．５ｍｍのハイドロキシアパタイト板に、０．２％コラーゲン溶液（フナコシ社製）を、５０μｌ塗布し、３６℃で乾燥させることにより、行った。
【００２５】
［実施例２］
実施例１と同様の菌種および液体培地を用い、ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸をコートしたハイドロキシアパタイト板を付着担体としてバイオフィルムを形成させた。
なお、コンドロイチン硫酸のハイドロキシアパタイト板へのコーティングは、実施例１と同様のハイドロキシアパタイト板に、予め調製した０．１質量％のコンドロイチン硫酸水溶液を、５０μｌ塗布し、３６℃で乾燥させることにより、行った。
【００２６】
［実施例３］
実施例１と同様の菌種および培地を用い、糖タンパク質であるフィブロネクチンをコートしたハイドロキシアパタイト板を付着担体としてバイオフィルムを形成させた。
なお、フィブロネクチンのハイドロキシアパタイト板へのコーティングは、０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ水溶液で溶解したフィブロネクチン０．０５％溶液を、０．１ｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．３）で中和した溶液を、実施例１と同様のハイドロキシアパタイト板に５０μｌ塗布し、３６℃で乾燥させることにより、行った。
【００２７】
［実施例４］
プロテオースペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、トリプチケースペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、ブタ胃ムチン、ＫＣｌおよびイオン交換水を下記の組成にて混合した溶液中に、ヘミン、メナジオンを実施例１と同量添加して液体培地を調製した。この液体培地を用い、実施例１と同様の方法で２１日間連続培養を行い、実施例１と同様の付着担体上にバイオフィルムを形成させた。
なお、培養液中の総タンパク量をローリー法（比色法）にて定量したところ、６．１６ｇ／Ｌであった。
【００２８】
液体培地組成：１リットル中の質量（ｇ）で表す。
プロテオースペプトン  ：２．０ｇ／Ｌ
イーストエキス        ：１．０ｇ／Ｌ
トリプチケースペプトン：１．０ｇ／Ｌ
ブタ胃ムチン          ：２．５ｇ／Ｌ
ＫＣｌ                ：２．５ｇ／Ｌ
イオン交換水          ：残（全量が１リットルになるようにメスアップした）
【００２９】
［比較例１］
実施例１と同様のＢＨＩ液体培地（含ヘミン１ｍｇ／Ｌ、メナジオン０．２ｍｇ／Ｌ）を用いるとともに、付着担体としてハイドロキシアパタイト板を用いて、実施例１と同様の方法で２１日間連続培養を行い、ハイドロキシアパタイト板上にバイオフィルムを形成させた。
【００３０】
（１）バイオフィルム細菌数測定
上記各実施例および比較例で作製したバイオフィルムをサンプリングし、超音波で分散後、寒天平板上で培養した。寒天平板上に生息してきた細菌のコロニー数をカウントして付着担体１ｍｍ2あたりの各構成生細菌数を算出した。結果を下記表１に示す。なお、表１においてｌｏｇＣＦＵ（ＣＦＵ：ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔの略）は生細菌数を表すものである。
【００３１】
【表１】
2005117926.tif 000002
【００３２】
表１に示されるように、細胞外マトリックス構成成分で表面コートしてなる付着担体上に形成された実施例１〜３のインビトロバイオフィルムは、比較例１のそれと比較して歯周病の原因菌であると考えられているポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の定着量が増加していることがわかる。また、液体培地の総タンパク量を６．１６ｇ／Ｌに調整した実施例４においては、実施例１〜３よりもさらにポルフィロモナス  ジンジバリス（Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の定着量が増加していることがわかる。
【００３３】
（２）バイオフィルム病原性の評価
実施例１および４について、形成されたバイオフィルムによる付着担体の分解活性を調べるため、培養期間中に付着担体を経時的にサンプリングし、残存する細胞外マトリックス構成成分の量を測定した。結果を表２に示す。
なお、残存量は、０．１％Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ社製）により、細胞外マトリックス構成成分を染色し、さらに、０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ水溶液で色素抽出し、波長５５０ｎｍで非職定量することで測定した。残存量は（％）は、培養初日の細胞外マトリックス構成成分の残存量を１００としたときの値で示した。
【００３４】
【表２】
2005117926.tif 000003
【００３５】
表２に示されるように、実施例１および実施例４において、付着担体表面に用いた細胞外マトリックス構成成分の明らかな分解が認められ、バイオフィルムの持つ病原性も評価可能であることがわかる。
【００３６】
［２］薬剤評価方法
［実施例５］インビトロバイオフィルムを用いた薬剤評価方法
実施例１と同様の方法で、１週間連続培養して付着担体上にバイオフィルムを形成させた後、１日１回、バイオフィルムを薬剤（塩化セチルピリジニウム、０．０５ｗ／ｖ％水溶液）で３分間処理し、この処理を１０日間連続して行った。実験終了時に付着担体上のバイオフィルムをサンプリングし、これを超音波で分散後、寒天平板上で培養し、上記と同様の生菌数算定法により総菌数を求めた。結果を表３に示す。
【００３７】
［比較例２］インビボ薬剤評価方法
シリアンハムスター５週齢  雄の下顎第一臼歯に木綿糸を結紮した後、アクチノマイセス  ビスコーサス（Ａ．  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ４３１４６（１×１０9個／ｍｌ）１００μｌを滴下し、菌の感染を行った。プラーク（バイオフィルム）を形成させるためＭＳ粉末（オリエンタル酵母社製）を食餌として与え、１週間の飼育の後、１日１回薬剤（塩化セチルピリジニウム、０．０５ｗ／ｖ％水溶液）を１０日間連続投与した。
実験終了時に結紮糸を取り出し、超音波で分散後、寒天平板上で培養し、上記と同様の生菌数算定法により細菌数を求めた。結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2005117926.tif 000004
【００３９】
表３に示されるように、実施例５のインビトロバイオフィルムに対する塩化セチルピリジニウムの効果は、比較例２のインビボ評価と同等レベルであることがわかる。このことから、本発明のインビトロバイオフィルムはインビボの代替評価法の一つとして有用であることが確認された。