(57)【要約】【課題】  スギ花粉症に関するＣｒｙ  j１、Ｃｒｙ ｊ２以外の新規アレルゲン、それらを用いたアレルギーの診断薬、予防薬、および治療薬等を提供する。【解決手段】  スギ花粉中に含まれ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約２５，０００〜４０，０００ダルトンを示し、等電点電気泳動法により測定すると４．０〜５．０付近に等電点を示すことを特徴とし、スギ花粉粗抗原を陽イオン交換クロマトグラフィーに供した画分から、コロイダルキチンを用いたアフィニティー精製で得られる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スギ花粉中に含まれるタンパク質で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約２５，０００〜４０，０００ダルトンを示し、等電点電気泳動法により測定すると４.０〜５.０付近に等電点を示すことを特徴とする、スギ花粉アレルゲン。
【請求項２】
部分アミノ酸配列として
-X-Y-Cys-Asp-Gly-Gly-Asn-Ala-Ala-Thr-Val-Ala-Ser-Z-(但し、Xは、PheまたはMet、Yは、GluまたはGln、 Zは、ArgまたはThr)の配列を有する請求項１に記載のスギ花粉アレルゲン。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載のスギ花粉アレルゲン。
【請求項４】
スギ花粉粗抗原から、キチンを用いたアフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、遠心分離、濃縮、透析から選ばれる２種以上の方法によって得られたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のスギ花粉アレルゲン。
【請求項５】
化学的な合成によって調製された請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質または少なくともその１部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質の全部またはその少なくとも１部のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号１に記載の塩基配列を有する請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
スギ花粉またはスギ雄花に由来する請求項６または７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項６または７に記載のＤＮＡで形質転換された宿主細胞において産生された請求項１〜４のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質またはその少なくとも１部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１０】
無細胞発現系によって調製された請求項１〜４のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質または少なくともその１部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１１】
アレルゲン性を有する請求項５または９〜１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
スギ花粉で感作された患者のＴ細胞を増殖させることが可能な請求項１〜５、９〜１１のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質のＴ細胞エピトープペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜５、９〜１２のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質またはその少なくとも１つのタンパク質断片に特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１〜４、９〜１１に記載のスギ花粉アレルゲンを用いた花粉症患者用の診断薬。
【請求項１５】
請求項１〜４、９〜１２に記載のスギ花粉タンパク質を用いた減感作用の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スギ花粉に由来する新規なアレルゲンタンパク質、およびこれを用いたアレルギーの診断、予防および治療等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー疾患の罹患率および死亡率は、食生活や居住環境の変化などに伴い、ここ１０年間で世界的にも増加傾向にある。民間調査（新薬開発の現状と将来展望  91年度版，（株）シードプランニング）によると、現在、我国で３人に１人は、スギ花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息などの典型的なＩｇＥ依存型（Ｉ型）アレルギー疾患の症状を示しており、このデータは、厚生省保険福祉動向調査（1991年）でも裏付けられている。アレルギー疾患は、直接生命に関わることがない反面、ごく若い世代に突然現れ、早い時期での自然治癒はまず期待できず慢性に経過することによって、本人や家族の負担は勿論のこと、長期に亘って社会的活動にも大きな影響を及ぼしていると考えられる。
【０００３】
スギ花粉症は、国民の１５〜２０％、都市部ではそれ以上が罹患しているといわれているが、とくに、花粉の飛散する春には、多くの患者がこのアレルギー症状に苦しめられている。
【０００４】
スギ花粉の主要アレルゲンは、安枝らによって報告されている、分子量が４５，０００〜５０，０００ダルトン、等電点が約９．０であるＣｒｙ  ｊ１（例えば、非特許文献１参照。）と、坂口らによって報告された分子量が約３７，０００ダルトン、等電点が約９．５のＣｒｙ  ｊ２（例えば、非特許文献２参照。）の２つが知られており、患者血清中のＩｇＥがこれらのアレルゲンと高頻度に反応する。
【０００５】
花粉症の治療に最も有効な方法は、アレルゲンとの接触を避けることであるが、居住環境の至る所に遊離して存在するアレルゲンで感作、発症している患者では、抗ヒスタミン剤などの副作用もある、対症療法剤を用いた一時的な解決策に依存せざるを得ないのが実状である。このため、これを使用し続けない限り発症を繰り返すことになり、財政的にも、肉体的にも大きな負担を強いられ、使用を中止するとリバウンドによる症状の悪化も懸念されるという問題を抱えている。
【０００６】
一方、アレルギーの原因物質であるアレルゲン自体を、患者に繰り返し投与して根治しようとする、減感作療法の試みがなされてきている。ホヤ喘息における減感作治療では９０％以上の患者で症状の改善がみられたとの報告もあり（例えば、非特許文献３参照。）、欧米ではアレルギーの標準的な治療方法の１つとして確立されている（例えば、非特許文献４参照。）。しかしながら、使用抗原の選択を誤るとアナフィラキシーショックなどの副作用もあるため、患者個々に対する適切な診断が求められている。
【０００７】
スギ花粉症の減感作においては、上記主要アレルゲンＣｒｙ  j１とＣｒｙ  ｊ２のみでは、充分な治療効果が得られていない。治療のためには、まず、的確な診断が重要であるが、現状においては主要アレルゲン以外での診断は殆どなされていないため、近年、その他のアレルゲンタンパクの詳細な免疫化学的特性の解明が望まれている。
【０００８】
これまでに報告されているＣｒｙ  j１とＣｒｙ  ｊ２以外のスギ花粉アレルゲンとしては、河本らによる、イソフラボンレダクターゼと高い相同性を示すＣＪＰ−６（例えば、非特許文献５参照。）や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が５７，０００〜６７，０００ダルトンで等電点が７．０〜９．０の範囲にあるスギ花粉由来アレルゲン（例えば、特許文献１参照。）などがある。
【０００９】
【非特許文献１】Yasueda, H. et al.,J. Allergy Clin. Immunol. 71, 77-86, 1983
【非特許文献２】Sakaguti, M. et al., Allergy, 45, 309-312, 1990
【非特許文献３】Sigeta S. et al., Arerugi, 39(3), 313-21, 1990
【非特許文献４】Bousquet J, et al., J. Allergy Clin. Immunol. 102, 558-62, 1998
【非特許文献５】Kawamoto S. et al.,Clin. Exp. Allergy, 32(7), 1064-70, 2002
【特許文献１】特開２００１−１５１７９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のような従来技術に鑑み、本発明は、スギ花粉症に関するＣｒｙ  j１、Ｃｒｙ ｊ２以外の新規アレルゲン、それらを用いたアレルギーの診断薬、予防薬、および治療薬等を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、スギ花粉粗抗原のプロテオーム解析によって、花粉症患者血清中のＩｇＥ抗体と高頻度に反応するスポットを広く検索した。その結果、分子量が約２５，０００〜４０，０００ダルトンで、等電点が４．０〜５．０付近にあるタンパク質（ＣＪＰ−１６）に高いアレルゲン性があることを初めて見出した。さらに、タンパク質工学および遺伝子工学的手法による解析から、その免疫化学的特性を明らかにして、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち，本発明は以下のとおりである。
（１）スギ花粉中に含まれるタンパク質で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると分子量約２５，０００〜４０，０００ダルトンを示し、等電点電気泳動法により測定すると４.０〜５.０付近に等電点を示すことを特徴とする、スギ花粉アレルゲン。
（２）部分アミノ酸配列として
-X-Y-Cys-Asp-Gly-Gly-Asn-Ala-Ala-Thr-Val-Ala-Ser-Z-(但し、Xは、PheまたはMet、Yは、GluまたはGln、 Zは、ArgまたはThr)の配列を有する前記（１）のスギ花粉アレルゲン。
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記（１）または（２）のスギ花粉アレルゲン。
（４）スギ花粉粗抗原から、キチンを用いたアフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、遠心分離、濃縮、透析から選ばれる２種以上の方法によって得られたことを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかのスギ花粉アレルゲン。
【００１３】
（５）化学的な合成によって調製された前記（１）〜（４）のいずれかのタンパク質または少なくともその１部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【００１４】
（６）前記（１）〜（４）のいずれかのスギ花粉タンパク質の全部またはその少なくとも１部のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（７）配列番号１に記載の塩基配列を有する前記（６）のＤＮＡ。
（８）スギ花粉またはスギ雄花に由来する前記（６）または（７）のＤＮＡ。
【００１５】
（９）前記（６）または（７）のＤＮＡで形質転換された宿主細胞において産生された前記（１）〜（４）のいずれかのスギ花粉タンパク質またはその少なくとも１部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１０）無細胞発現系によって調製された前記（１）〜（４）のいずれかのスギ花粉タンパク質または少なくともその１部のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（１１）アレルゲン性を有する前記（５）または（９）〜（１０）のタンパク質。
（１２）スギ花粉で感作された患者のＴ細胞を増殖させることが可能な前記（１）〜（５）、（９）〜（１１）のいずれかに記載のスギ花粉タンパク質のＴ細胞エピトープペプチド。
（１３）前記（１）〜（５）、（９）〜（１２）のいずれかのスギ花粉タンパク質またはその少なくとも１つのタンパク質断片に特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【００１６】
（１４）前記（１）〜（４）、（９）〜（１１）のスギ花粉アレルゲンを用いた花粉症患者用の診断薬。
（１５）前記（１）〜（４）、（９）〜（１２）に記載のスギ花粉タンパク質を用いた減感作用の治療薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の新規のスギ花粉アレルゲンは、アレルギーの診断薬、予防薬、および治療薬等に利用することができ、また、このアレルゲンタンパク質ならびにそのタンパク質断片は、Ｃｒｙ  ｊ１、Ｃｒｙ  ｊ２、およびその他のスギ花粉アレルゲンと組み合わせることによって、スギ花粉症の診断または減感作治療等に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に本発明を詳細に説明する。
スギ花粉アレルギーにおいては、Ｃｒｙ  ｊ１とＣｒｙ  ｊ２の主要抗原が同定され詳細に研究されているが、その他のアレルゲンに関しては、未だ充分なされていない。そこで、本発明者らは、スギ花粉中に含まれるアレルゲンの網羅的解析を目指して、スギ花粉粗抗原を２次元電気泳動により展開した後、イムノブロッティング法によって患者血清ＩｇＥと特異的に反応するスポットを検索した。その結果、塩基性域のＣｒｙ  ｊ１およびＣｒｙ  ｊ２以外に、ＩｇＥと反応するアレルゲンが酸性域にも存在することを見出した。その後、得られた陽性スポットのアミノ酸シークエンスをＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて行い、ホモロジー検索をしたところ、A. thaliana由来のclassＩ chitinaseと高
い相同性を示すことが明らかになった。これらと共通のアミノ酸構造を持つclassＩ chi
tinaseは、ラテックスアレルギーなどの原因抗原の１つとして知られている。しかしながら、スギ花粉症においてchitinaseが重要なアレルゲンであるという報告はないことからも、本タンパク質が新規のスギ花粉アレルゲン（ＣＪＰ−１６）であると考えられた。
【００１９】
また、本発明のスギ花粉アレルゲン（ＣＪＰ−１６）遺伝子を単離するため、スギ葯から精製したTotal RNAを用いてスギcDNAを構築した。chitinaseの保存配列から縮重プライマーを設計し、cDNAを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅した配列に対してシークエンス解析を行い、得られた塩基配列を基にさらにプライマーの設計を行い、ＲＡＣＥ法によってＣＪＰ−１６の全長遺伝子を取得した。得られた配列は、開始コドンおよび終始コドンを含みそのＯＲＦは８４６塩基であった。また、ＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳの解析で得られた配列と相同性を示す配列も確認された。
【００２０】
さらに、本発明者らは、スギ花粉粗抗原から天然型ＣＪＰ−１６アレルゲンの精製を試みた。ＣＪＰ−１６アレルゲンが酸性域に存在することから、SP-sepharose陽イオンカラムに供し、その素通り画分を採取した。この画分からchitinaseを特異的に取得するためコロイダルキチンを用いたアフィニティー精製を行った。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定すると分子量約３０，０００ダルトンを示すＣＪＰ−１６タンパク質が得られた。
【００２１】
得られた天然型ＣＪＰ−１６のアレルゲン性をELISA法によって評価した。花粉症患者血清を用いて、ＣＪＰ−１６特異ＩｇＥ抗体価を分析したところ、約５０％の患者血清で陽性反応を示した。
【００２２】
続いて、chitinaseがラテックスアレルギーの原因抗原の１つとして知られていることから、ラテックスアレルギーの患者血清を用いて、スギ花粉アレルゲンＣＪＰ−１６の交差反応性を調査した。その結果、分析した全ての患者血清（３検体）において陽性反応を示したことから、ＣＪＰ−１６がラテックスアレルギー患者血清と交差反応することが明らかになった。
【００２３】
また、ELISA inhibition assayによってスギ花粉粗抗原（ＣＪＰ）中のＣＪＰ−１６含量を調査した。９６ウェルプレートに粗抗原ＣＪＰをコートし、患者プール血清をＣＪＰ−１６、ＣＪＰおよびRnaseAとプレインキュベートすることによってその阻害能を調査したところ、５０％ inhibition rateを示す抗原量がＣＪＰ−１６では321.4 ng/ml、ＣＪＰでは7.72 ng/mlであったことからスギ花粉粗抗原（ＣＪＰ）中のＣＪＰ−１６含量は約2.4％であることが推察された。
【００２４】
本発明のＣＪＰ−１６は、タンパク質の全部、またはその少なくとも１つの断片をコードするcDNAを発現ベクターに組込み、大腸菌、酵母、昆虫、または動物細胞に導入し、培養することで取得することが可能である。ただし、大腸菌などの原核細胞を使う発現系は、糖鎖などの適切な修飾が行われないために、組換えＣＪＰ−１６の発現には酵母などの真核細胞を使用する方がよい場合がある。
【００２５】
本発明で得られた新規のスギ花粉アレルゲンＣＪＰ−１６は、スギ花粉症の診断試薬として利用ができる。また、その診断結果からラテックスなどの交差感作に関する情報提供も可能である。
【００２６】
また、本発明によってＣＪＰ−１６タンパク質の全アミノ酸配列が明らかにされたため、ＣＪＰ−１６タンパク質のＴ細胞エピトープ部位の同定が可能になった。そのため、それらのＴ細胞エピトープペプチドを用いたスギ花粉症の免疫療法が期待できる。
【００２７】
アレルギーの治療法の１つとして減感作療法があるが、アナフィラキシーなどの副作用も考えられることから、最近の治療においては、患者にアレルゲン全体を投与するのではなく、Ｔ細胞が特異的に認識するアレルゲンの最小領域、つまり、Ｔ細胞エピトープのみからなるペプチドを投与する、ペプチドワクチンが注目されている。
【００２８】
これまでに、主要抗原であるＣｒｙ  ｊ１およびＣｒｙ  ｊ２のＴ細胞エピトープが報告されているが（特開平7-118295，特開平8-47392）、それらを連結させる試みも開示されている（特開平10-259198）。
【００２９】
アレルゲンタンパク質のＴ細胞エピトープの同定方法は、既に確立された技術になっているので、ＣＪＰ−１６タンパク質のＴ細胞エピトープペプチドも容易に取得が可能である。
【００３０】
本発明で得られたＣＪＰ−１６タンパク質のＴ細胞エピトープペプチドは、それ単独、あるいは、Ｃｒｙ  ｊ１、Ｃｒｙ  ｊ２、およびその他のスギ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープペプチドと混在、もしくは結合させることによって、花粉症の免疫療法に用いることができる。
【００３１】
さらに、本発明は、ＣＪＰ−１６タンパク質、またはそのタンパク質断片に特異的に反応するモノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を提供することが可能である。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞  スギ花粉粗抗原のプロテオーム解析
スギ花粉粗抗原の調製
日本スギ花粉（広島県豊田郡豊町にて採取）８０ ｇに抽出バッファー（20 mM PBS＋3 mM EDTA pH 7.6）を3.0 L加えた後、４℃で４時間攪拌した。その後、遠心分離（7,000 rpm, 30 min）によって得た上清に対して、終濃度８０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩攪拌した。次に、遠心分離（7,000 rpm, 30 min）によって沈殿を採取し、ミリＱ水で一晩透析を行った。その後、遠心分離（10,000 rpm, 30 min）をすることで得られた上清の凍結乾燥を行い、スギ花粉粗抗原（CJP）を得た。
【００３３】
スギ花粉粗抗原の２次元電気泳動
スギ花粉粗抗原（ＣＪＰ）２００ mgに4 mlのPBS＋ジチオトレイトール(DTT)60 mgを加えて懸濁し、PBSで６０％に調製したトリクロロ酢酸2 mlを加えた後、氷上で９０分間静置した。その後、遠心分離（3,500 rpm, 15 min）を行い、沈殿を回収した。この沈殿に冷アセトン10 mlを加えて懸濁し、洗浄した。さらに、遠心分離（3,500 rpm,20 min）を行った後、スピードバックで沈殿を乾燥させた。その沈殿にLysis Buffer（8 M 尿素，2 Mチオ尿素，2% CHAPS, 2% SB3-10, 1% DTT, 0.8% Ampholine）１ｍｌを加えて懸濁し、超音波破砕によって完全に溶解させた。その後、遠心分離（18,000 rpm, 20 min）を行い、その上清を２次元電気泳動用のサンプルに用いた。
【００３４】
pIレンジ３〜１０のドライストリップをLysis bufferで一晩膨潤させた後、ＣＪＰのサンプルをストリップにアプライして１次元目（等電点）の電気泳動を行った。
【００３５】
アクリルアミド濃度９〜１８％のグラジエンドゲルを作製し、その上に等電点電気泳動後のゲルをセットした。ゲルの上から低融点アガロースを重層し固化させた後、80 Ｖで一晩、２次元目（分子量）の電気泳動を行った。
【００３６】
２次元目の電気泳動が終了した後、ゲルを銀染色することによってタンパク質を検出した。その結果の一例を、図１に示した。スギ花粉粗抗原中には、主要抗原であるＣｒｙ  ｊ１とＣｒｙ  ｊ２以外にも多くのタンパク質が確認された。
【００３７】
ウェスタンブロッティング
２次元電気泳動後のタンパク質を、ブロッティングキット（Hoefer DALT）を用いて約６時間、６０Ｖの条件でメンブレンに転写した。その後、メンブレンをPBST(0.1% Tween20/PBS)で洗浄し、ブロッキング液（5% skim milk,1% BSA/PBST）で一晩振とうした。その後、PBSTで洗浄し、ブロッキング液で１０倍希釈した患者血清中で４時間振とうしながらインキュベートした。洗浄後、ブロッキング液で2,500倍希釈した抗ヒトＩｇＥ−ビオチン標識（Biosource）を加え、２時間振とうしながらインキュベートした。PBSTで洗浄した後、ブロッキング液で2,500倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ標識（ZYMED）と共に、１時間インキュベートした。その後、PBSTで洗浄した後、ECL Westernblotting detection reagents(Amersham Pharmacia Biotech)と共に５分間インキュベートを行い、Ｘ線フィルムに感光させて陽性スポットを検出した。
【００３８】
ウェスタンブロットによる解析の結果、スギ花粉粗抗原中にはＣｒｙ  ｊ１およびＣｒｙ  ｊ２以外にも陽性反応を示すスポットが多く存在することが明らかになった。１２名の患者血清ＩｇＥで調査した内、とくに強い陽性反応があったスポットを、図１に□の囲みで示した。
【００３９】
その中で、５０％以上の反応頻度を示したＣＪＰ−１６タンパク質のアミノ酸シークエンスをＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ ＭＳを用いて行った。その結果、-Phe-Glu-Cys-Asp-Gly-Gly-Asn-Ala-Ala-Thr-Val-Ala-Ser-Arg-の配列が得られ、ホモロジー検索をしたところ、A. thaliana由来のclassＩ chitinaseと高い相同性を示すことが明らかになった。
【００４０】
＜実施例２＞  ＣＪＰ−１６遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の決定
スギtotal RNAの精製
スギ葯（２ｇ）を液体窒素中で粉砕し、１０倍量（Ｗ／Ｖ）の２× CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)溶液に溶かした後、６５℃で１０分間インキュベートした。等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え攪拌し、室温で遠心分離（15,000 rpm,10 min）した後、水層を採取した。再度、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24：1）を加え攪拌し、室温で遠心分離（15,000 rpm,10 min）の後、水層を採取し、３／４倍量のイソプロパノールを加え室温で１０分間静置した。４℃で遠心分離（15,000 rpm,10 min）後、沈殿をTE bufferに溶解し、１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム液を加え、２時間氷上でインキュベートした。４℃で遠心分離（15,000 rpm,10 min）後、沈殿をTE bufferに溶解し、等量のTE飽和フェノール（pH 9.0）を加えて攪拌した。室温で遠心分離（15,000 rpm,10 min）後、水層を採取し、フェノール／クロロホルムを加えて攪拌し、室温で遠心分離（15,000 rpm,10 min）した。遠心分離後の上清に１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、更に２倍量の冷エタノール（-20℃）を加え、-80℃に１０分間静置した。４℃で遠心分離（15,000 rpm,10 min）し、ＲＮＡを沈殿させ、沈殿を７０％ エタノールで洗浄した。沈殿を真空乾燥した後、適量のTE bufferに溶解した。
【００４１】
スギｃＤＮＡの作製
得られたtotal RNAからcDNAを3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(#18373-019 Invitrogen)を用いて合成した。
Total RNA（５μｇ）溶液を５μl、アダプタープライマー １μl、DEPC処理水 ６μlを加え、インキュベート（70℃，10 min）した後、氷上に１分間静置した。反応液に10 × PCR Buffer 2 μl、MgCl2(25 mM)溶液 2 μl、dNTP MI×(2.5 mM each) 1 μl、DTT(0.1 M) 2 μlを加え４２℃で５分間プレインキュベートし、SUPERSCRIPT II (Life Technologies, Inc.Rockville, MD) を１μl加えた。インキュベート（42℃、50 min）の後、反応を停止（70℃，15 min）させた。氷上で静置後、遠心し反応液を集めRNase H １μlを加えインキュベート（37℃，20 min）した後、−８０℃で保存した。
【００４２】
ＣＪＰ−１６の全長遺伝子配列の決定
数種のchitinaseで高度に保存されているアミノ酸配列(EIAAFFAHV)をもとに縮重primer「5'- GARATHGCNGCNTTYTTYGC −3'」を設計し、作製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。増幅した配列に対してシークエンス解析を行ったところ、配列表の配列番号２に示す結果が得られた。得られた塩基配列（QGFGATI）を基に、再度primer「5'- ATNGTNGCNCCRAANCCYTG −3'」の設計を行い、PCR反応を行った。その結果、配列表の配列番号３に示す結果が得られた。これら２つの結果においては、２６１番目(配列番号２：A,配列番号３：T)，および３２２番目の塩基配列(配列番号２：G,配列番号３：C)において差がみられた。また３２６塩基以降の塩基配列にも差異が見られるが、３２６番目に１塩基挿入することにより他の植物chitinaseの塩基配列との相同性が高まり、配列番号２のアミノ酸配列とも一致する。これらのことから３２６番目の塩基はＰＣＲの増幅反応により欠損したと考えられた。また、これを考慮した場合、スギ花粉粗抗原のプロテオーム解析から明らかにされたＣＪＰ−１６の部分アミノ酸配列[FECDGGNAA]と相同性を示す配列がＣ末端の[MQCDGGNA]に存在する。これらのことからスギｃＤＮＡ中には少なくとも２種類のＣＪＰ−１６のisoformが存在することが示唆された。
また、配列番号２および配列番号３における保存配列からプライマーを設計し5'-RACEを行った。得られた５‘側の塩基配列をもとに、さらにプライマーを設計し3'-RACEを行いＣＪＰ−１６の全長遺伝子の取得を試みた。その結果、配列番号１に示すＣＪＰ−１６の塩基配列が得られた。得られた配列は開始コドンおよび終止コドンを含みそのORFは８４６塩基であった。また、TOF MS解析より得られた[FECDGGNAATVASR]と相同性を示す配列が[247 MECDGGNAATVAST 260]に存在することからも、得られた配列がＣＪＰ−１６の全長遺伝子配列であることが示された。
【００４３】
ＣＪＰ−１６遺伝子およびタンパク質の相同性検索
GenBankデータベースを用いたFASTA及びBLAST検索によって、得られたＣＪＰ−１６の遺伝子およびタンパク質の相同性を検索した。ＣＪＰ−１６のアミノ酸配列と他の植物由来chitinaseとの相同性について調査した結果を、図２に示す。＊は一致したアミノ酸配列を示す。ＣＪＰ−１６は、P.glauca chitinase proteinとアミノ酸レベルで65.2％、DNAレベルで62.4％，V.venifera class IV endochitinaseとアミノ酸レベルで59.1％、DNAレベルで60.1％の相同性を示した。また、A.thaliana class IV chitinaseとアミノ酸レベルで54.4％，DNAレベルで57.5％， D.carota class IV chitinaseとアミノ酸レベルで49.3％、DNAレベルで61.7％の相同性を示した。以上のようにＣＪＰ−１６が他種のchitinaseと高い相同性を保持していることが確認された。それらの全てのchitinaseがclass IV chitinaseであった事から、当ＣＪＰ−１６もclass IV chitinaseであると考えられた。
【００４４】
これまでにアレルゲンとして報告されているchitinaseとＣＪＰ−１６のホモロジーについて検索した結果を、図３に示す。＊は一致したアミノ酸配列を示す。相同性の高いアレルゲンとしてラテックスアレルギーの主要アレルゲンとして報告されているHev b 11wとアミノ酸レベルで43.2％、DNAレベルで47.6％の相同性を示した。また、oral allergy syndromeにおけるアレルゲンとして報告されているavocado由来のPers a 1とアミノ酸レベル43.2％、DNAレベルで48.7％の相同性を示しており、これらのアレルゲンとの交差反応することが考えられた。
【００４５】
＜実施例３＞天然型ＣＪＰ−１６タンパク質の精製
コロイダルキチンの作製
粉末キチン２ｇを蒸留水５０mlに懸濁したものと濃硫酸５０mlを氷上で３時間、冷却した。その後、濃硫酸を氷上にて１滴づつキチン／蒸留水に全量滴下した。滴下後、グラスウールで濾過し氷上で蒸留水９０mlに加えた。混合液を遠心分離（2000 g,20 min,４℃）した後、沈殿したコロイダルキチンをMilliQ水及びPBSで遠心洗浄(2000 g,20 min,４℃)した。沈殿のpHを中性とした後、４℃で使用時まで保存した。
【００４６】
ＣＪＰ−１６タンパク質の精製
スギ花粉８０ｇをPBS(pH 7.6 ＋ EDTA)3 Lに溶解し、４℃で一晩攪拌した。攪拌後、遠心分離（7000 rpm,35 min,４℃）を行い、上清をプールし８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて一晩４℃で攪拌した。その後、遠心分離（7000 rpm,35 min,４℃）によって沈殿を集め、酢酸Buffer(pH 5.0)に溶解させたものを同酢酸Buffer(pH 5.0)に対して透析を行った。透析の後、遠心分離（10000 rpm,15 min,４℃）を行い、上清を0.8 μm pore-sizeで濾過した後、陽イオン交換クロマトグラフィー(SP-Sepharose)に供して素通り画分を回収した。素通り画分をエヴァポレーターにて１００〜２００mlにまで減圧濃縮し、コロイダルキチン５ｇ wet-weightを加えて４℃ で一晩攪拌した。その後、更に氷上でインキュベートを１時間行い、遠心分離（2000 g,30 min,４℃）によって沈殿を回収した。回収した沈殿を0.1％ Tween-20/PBSで洗浄し、得られた沈殿に３mlのPBSを加え６０℃湯浴中でインキュベートした。その後、遠心分離（2000 g,30 min,２５℃）を行って得られた上清を凍結乾燥し、それを１mlのPBSに溶解させ精製CJP-16タンパク質（キチナーゼ）とした。
【００４７】
天然型ＣＪＰ−１６タンパク質の精製過程を、図４に示す。スギ花粉粗抗原（図４レーン２）、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した後の素通り画分（図４レーン３）、および精製ＣＪＰ−１６タンパク質（図４レーン４）のサンプルを用いて、SDS-PAGE（Laemmli法）を行った。ポリアクリルアミド濃度11.5%の分離ゲルを用いて電気泳動した後、染色液（EtOH:AcOH:H2O=9:2:9 ＋ 0.25% CBB R-250）でタンパク質を染色した。その後、脱色液（EtOH:AcOH:H2O=25:8:65）で余分な染色を除いた。分子量が約３０，０００〜３５，０００ダルトン（図４レーン４）に単一のバンドが確認され、該タンパク質がＣＪＰ−１６であると考えられた。なお、図４のレーン１は分子量マーカーである。
【００４８】
＜実施例４＞天然型ＣＪＰ−１６タンパク質のアレルゲン性（ＩｇＥ結合能）
天然型ＣＪＰ−１６タンパク質のＩｇＥ結合能をELISA法により測定した。まず、マイクロタイタープレートのウェルに100 mM bicarbonate buffer(pH 9.3)で希釈した抗原溶液（250 ng/ml）を50 μlアプライした。また、human IgE standardをまず1000 ng/mlになるように希釈し、倍希釈系列をそれぞれのウェルに50 μl ずつ加え、室温で２時間静置した。PBSTにて洗浄した後、blocking buffer(PBS, 3 ％ skim milk, 1 ％ BSA)を300 μlアプライし、４℃で一晩静置した。洗浄後、同bufferで200倍希釈したスギアレルギー患者及び健常者血清を50 μlをアプライし、４℃で４時間静置した。洗浄後、同bufferで1,000倍に希釈したanti-human IgE EPSILON CHAIN BIOTIN CONJUGATE (Biosource International,Inc.)50 μlをアプライし、室温で２時間静置した。洗浄後、同bufferで1,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識Streptavidinを50 μlアプライし、室温で１時間静置した。充分洗浄した後、50 μlのAttoPhosTMを加えCytoFluorTMII（PerSeptive Biosyatems）にて蛍光強度を測定した。
【００４９】
スギ花粉症患者血清１８検体(RAST Score≧2)および健常者血清３検体を用いて、ＣＪＰ−１６特異的IgE抗体価を分析した結果を、図５に示す。基準として健常者３人の平均値に標準偏差の３倍を足した値を破線で示した。破線以上のＩｇＥ値を示した検体を危険率５％以下で当ＣＪＰ−１６に対して陽性であると評価した。
その結果、１８検体中９検体(No.2,4,5,7,8,9,12,13,14)(50％)の患者血清で当ＣＪＰ−１６に対してＩｇＥ反応陽性であった。これらの結果は、２次元電気泳動のimmuno blottingによってアレルゲン反応頻度を評価した結果(反応頻度４０検体中２１検体(52.5％))とも良く一致しており、精製ＣＪＰ−１６タンパク質が強いアレルゲン性を有していることが示された。
【００５０】
天然型ＣＪＰ−１６によるＣＪＰの阻害能（ELISA inhibition assay）
ＣＪＰ中のＣＪＰ−１６含量の調査を目的としてELISA inhibition assayを行った。100 mM bicarbonate bufferで希釈したＣＪＰ溶液（1μg/ml）を50μlアプライし、室温で２時間静置した。洗浄後、blocking buffer(3％ skim milk,1％ BSA,0.1％ Tween 20 / PBS)を300 μlアプライし、４℃で一晩静置した。またblocking bufferで希釈した様々な濃度（10μg-0.001μg/mlの1/10希釈系列）となるよう抗原（ＣＪＰ−１６, ＣＪＰ, RNase）をblocking bufferで終濃度４０倍希釈した患者プール血清(１１検体,RAST値≧2)と４℃で一晩プレインキュベートした。プレートを洗浄後、抗原とプレインキュベートした患者血清溶液を50 μl/wellアプライし、４℃で４時間静置した。洗浄後、Blocking bufferで1,000倍に希釈したanti-human IgE EPSILON CHAIN BIOTIN CONJUGATE 50 μlをアプライし、室温で２時間静置した。洗浄後、同bufferで1,000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識Streptavidinを50 μlアプライし、室温で１時間静置した。充分洗浄した後、50 μlのAttoPhosTMを加えCytoFluorTMＩＩによって蛍光強度を測定した。
【００５１】
ELISA inhibition assay の結果を、図６に示す。なお、ネガティブコントロールとしてRnaseAを用いた。ＣＪＰ−１６がＣＪＰと患者血清ＩｇＥとの反応を阻害したことから、ＣＪＰ中にＣＪＰ−１６がアレルゲンとして存在していることが示された。また、50％ inhibition rateを示す抗原量をグラフより換算するとＣＪＰ−１６では321.4 ng/ml、ＣＪＰでは7.72 ng/mlである事からＣＪＰ中のＣＪＰ−１６の含量は約2.4％である事が示唆された。
【００５２】
天然型ＣＪＰ−１６とラテックスアレルギー患者血清との交差反応
ＣＪＰ−１６タンパク質がラテックスアレルギーの主要抗原であるHev b 11と高い相同性を有していた事から、該ＣＪＰ−１６がラテックスアレルギー患者血清ＩｇＥと交差反応を示すかELISAによって調査した。それらの結果を、図７に示す。健常者３人の平均値に標準偏差の３倍を足した値の合計値を破線で示し、破線以上の値を有意な値とした。その結果、分析したラテックスアレルギー患者血清３検体において全て該ＣＪＰ−１６に対し陽性を示した。これらの結果から、該ＣＪＰ−１６がラテックスアレルギー患者と交差反応性を有する事が明らかになった。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号2−人工配列の説明：chitinaseのアミノ酸配列をもとに作製したcDNA
配列番号3−人工配列の説明：chitinaseのアミノ酸配列をもとに作製したcDNA
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】スギ花粉粗抗原（CJP）の２次元電気泳動を示す図である。
【図２】スギ花粉アレルゲンＣＪＰ−１６と他の植物由来chitinaseとの相同性を示す図である。
【図３】スギ花粉アレルゲンＣＪＰ−１６とアレルゲン性を有する他種chitinaseとの相同性を示す図である。
【図４】天然型ＣＪＰ−１６アレルゲンの精製過程を、SDS-PAGEで解析した図である。
【図５】スギ花粉症患者血清18検体(RAST Score≧2)および健常者血清3検体を用いて、ＣＪＰ−１６特異的ＩｇＥ抗体価を分析した結果を示す図である。
【図６】精製ＣＪＰ−１６による患者血清ＩｇＥのＣＪＰ結合阻害能をELISA inhibitionによって分析した結果を示す図である。
【図７】精製ＣＪＰ−１６とラテックスアレルギー患者血清ＩｇＥとの交差反応をELISAによって調査した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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