(57)【要約】【課題】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を調節する。【解決手段】触媒活性を有する蛋白質の、その溝中に基質結合部位および／または活性中心を有している溝の周辺に位置する２つのドメインの近接部分の一方又は両方のドメインのアミノ酸配列に変異を導入することにより両ドメイン間の距離を大きく又は小さく又はズレを生じさせて、溝の大きさ又は形状を変化させて当該蛋白質の性質を変化させる方法。【選択図】図１
2005065540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒活性を有する蛋白質の、その溝中に基質結合部位および／または活性中心を有している溝の周辺に位置する２つのドメインの近接部分の一方又は両方のドメインのアミノ酸配列に変異を導入することにより両ドメイン間の距離を大きく又は小さく又はズレを生じさせて、溝の大きさ又は形状を変化させて当該蛋白質の性質を変化させる方法。
【請求項２】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」の近接部分のアミノ酸配列に変異を導入することにより当該ＤＮＡポリメラーゼの性質を変化させる方法。
（ただし、「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列上のヒスチジン残基（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの場合１４７番目のヒスチジン残基）への変異の導入は除外する）。
【請求項３】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列および/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端部分のアミノ酸配列に変異を導入する工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ループ配列の先端部分が(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Glyからなり、該先端部分に少なくとも１つのアミノ酸変異（アミノ酸の置換、付加、挿入、欠失）を導入することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Thumbドメイン先端部分が(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-
Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)からなり、該先端部分に少なくとも１つのアミノ酸変異（アミノ酸の置換、付加、挿入、欠失）を導入することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ループ配列の先端部分がTyr-His-Glu-Glyからなり、該先端部分の４個のアミノ酸の中から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を酸性アミノ酸、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
Thumbドメイン先端部分のアミノ酸配列が(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-
Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)からなり、該アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸を、酸性アミノ酸、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７の方法によって触媒活性、特に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性および/またはPCR効率が調節された改変された耐熱性DNAポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の触媒活性を向上または低下させる方法に関し、詳しくは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレアーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列および/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列に変異を導入することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を調節する方法、その変異導入によって得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、その製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＰＣＲは生化学、分子生物学および臨床病理分野における研究、検査において必須の技術の一つとなっている。ＰＣＲの特徴は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるところにあり、現在最も頻繁に利用されているＤＮＡポリメラーゼは主として、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）やサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Tth DNA polymerase)などのPolＩ型と呼ばれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼの特徴は、増幅効率が良く、条件設定が容易であるところにある。しかしながら、増幅の際に核酸の取り込みの正確性(fidelity)が悪いという問題があり、増幅された遺伝子をクローニングするような場合には適していないとされている。
【０００３】
一方、超好熱始原菌由来のα型と呼ばれるＤＮＡポリメラーゼ、例えばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ；特許文献１、特許文献２)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Vent)ポリメラーゼ、特許文献３）、パイロコッカス・コダカラエンシス (Pyrococcus kodakaraensis) ＫＯＤ１（旧名：Pyrococcus sp. KOD1）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ；特許文献４)なども知られている。これら、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(Proof reading活性)を有し、核酸の取り込み際の正確性は、Taq ＤＮＡポリメラーゼなどのpolI型ＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているという特徴を有する。
【０００４】
しかしながら、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅においては、その増幅効率が十分でないなどの問題が存在している。また、これらＤＮＡポリメラーゼには、ＰＣＲの反応時間、酵素量及びプライマー濃度等の至適条件の幅が狭いものが多い。
【０００５】
α型ＤＮＡポリメラーゼにおけるＰＣＲ増幅における上記問題点の原因として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の強さが関与していることが考えられる。すなわち、ＰＣＲ時にプライマーなどがその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって削られることにより、ＰＣＲにおける増幅効率が低下すると考えられている。また、α型ＤＮＡポリメラーゼは単一タンパク内に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す領域と、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す領域が存在するため、両活性はお互いに相互作用しており、それぞれの領域の核酸への親和性などの違いなどもＰＣＲ増幅に影響を及ぼしていると考えられる。
【０００６】
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の発現を担っているＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性発現に関与していると思われる高度に保存されたアミノ酸領域（EXOI（図１）, EXOII, EXOIII）が存在していることが知られている。EXO I領域にはXDXEXモチーフ(D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、X:任意のアミノ酸)が存在し、アスパラギン酸とグルタミン酸はエキソヌクレアーゼ活性の発現に必須であることが知られている。これらのアミノ酸配列におけるアスパラギン酸とグルタミン酸を中性のアミノ酸であるアラニンに置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減できることが報告されている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975）。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性を欠失又は1万分の1以下に低減させることにより、α型ＤＮＡポリメラーゼの特徴であるＤＮＡ複製時の正確性も同時に失われるという問題が存在した。
【０００７】
さらに、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおける上記XDXEXモチーフのXで示されるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することにより、エキソヌクレアーゼ活性を段階的に減衰させる試みも行われている（特許文献５）。この方法によると、エキソヌクレアーゼ活性が低下するにつれてＰＣＲ効率の上昇と増幅における正確性(fidelity)の低下が同時に観察される。したがって、この方法を用いるには正確性が損なわれない程度にエキソヌクレアーゼ活性の低下したクローンを用いることが重要となる。しかしながら、この方法によって得られた酵素、例えばＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４２番目のイソロイシンをグルタミンに置換した変異体(ＩＱ)や、リジンに置換した変異体(ＩＫ)は、コピー数の低いＤＮＡからの増幅率が必ずしも良いとは言えないことが、優れたＰＣＲ効率を有する耐熱性ポリメラーゼ開発の障害となっていた。
【０００８】
また特許文献５によれば、この方法を用いる限りにおいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（proof reading活性）の上昇した変異体を得ることは困難である。このことは、この方法に従っては野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ以上に正確性に優れる酵素の取得が困難であることを示唆しているものと思われる。
【０００９】
これらの問題点を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体が作製され、EXOI領域中のXDXEXモチーフのグルタミン酸から数えて４つ目のヒスチジン残基（１４７番目；以下、Ｈとも示す）を種々のアミノ酸に置換することにより、様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、ＰＣＲ効率及び正確性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの取得が可能であることが報告されている（特許文献６）。しかし、このヒスチジン残基の置換がどのようなメカニズムで作用し、ポリメラーゼの性質が変化したのかは不明であり、更なる水平展開が困難な状況であった。
その一方で、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの立体構造が明かとなり（J Mol Biol.(2001)00,1-9）、１４７番目のヒスチジンのタンパク質中での位置が明確になったことから、メカニズム解明が進む可能性も浮上していた。また、他の幾つかのα型DNAポリメラーゼの立体構造も詳しく調べられるようになった。
【特許文献１】ＷＯ９２／９６８９号公報
【特許文献２】特開平５−３２８９６９号公報
【特許文献３】特開平６−７１６０号公報
【特許文献４】特開平７−２９８８７９号公報
【特許文献５】特開平１０−４２８７１号公報
【特許文献６】特開２００２−２５３２６５
【非特許文献１】J Mol Biol.(2001)00,1-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような理由から、立体構造情報を利用したＤＮＡポリメラーゼ改変が求められていた。
【００１１】
すなわち本発明の目的は、まず、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のヒスチジンの変異によるポリメラーゼ特性の変化のメカニズムを解明し、新しい性質を示すＤＮＡポリメラーゼを作り出す方法論を見出すことである。また、それら新たなＤＮＡポリメラーゼ候補を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは本課題を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異体EXOI領域中のXDXEXモチーフのグルタミン酸から数えて４つ目のヒスチジン残基（１４７番目；以下、Ｈとも示す)をグルタミン酸に置換した変異体（Ｈ１４７Ｅ）のＸ線構造解析を実施し、野生型酵素の構造と比較することで、「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸残基が静電的相互作用をすることにより、その二つの構造の間に形成されるEditing cleft（校正溝）の幅が狭まることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（Ａ）触媒活性を有する蛋白質の、その溝中に基質結合部位および／または活性中心を有している溝の周辺に位置する２つのドメインの近接部分の一方又は両方のドメインのアミノ酸配列に変異を導入することにより両ドメイン間の距離を大きく又は小さく又はズレを生じさせて、溝の大きさ又は形状を変化させて当該蛋白質の性質を変化させる方法。
（１）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソ  ヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」が近接した部分のアミノ酸配列に変異  を導入することによる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。ただし、「エキソヌクレ  ーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列上のヒス  チジン残基（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの場合１４７番目のヒスチジン残基）の改変  方法は除外する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソ  ヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列お  よび/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列に変異を導  入することにより得られる、（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（３）ループ配列が(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Glyからなることを特徴とする、（１）に記  載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（４）Thumbドメイン先端配列が(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-  Gly-(Val/Ile)
-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)であることを特徴とする、（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポ  リメラーゼの改変方法。
（５）ループ配列のLysもしくはPheを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性ア  ミノ酸に置換することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方  法。
（６）ループ配列のTyrを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換  することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（７）ループ配列のGluを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換  することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（８）ループ配列のGlyを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換  することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（９）ループ配列Tyr-His-Glu-Glyの複数のアミノ酸を酸性アミノ酸、または塩基性アミ  ノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡ  ポリメラーゼの改変方法。
（１０）Thumbドメイン先端配列が(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg  )-Gly-
(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)の一つまたは複数のアミノ酸を、酸性アミノ酸  、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする（１）に  記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが始原菌由来であることを特徴とする（１）に記載の  耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１２）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴と  する、（１）〜（１１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラー  ゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、9#N-7  ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とす  る、（１）〜（１１）記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１４）（１）〜（１３）の改変方法によって改変された耐熱性DNAポリメラーゼ。
（１５）（１４）に記載のタンパク質を発現させるため、その遺伝子をベクターに挿入さ  れてなる遺伝子組換えベクター。
（１６）ベクターがpLED-MIもしくはpBluescript由来のベクターである（１５）の遺伝  子組換えベクター。
（１７）  （１５）または（１６）に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形  質転換した組換え細胞。
（１８）  宿主細胞がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である（１７）記載の組  換え細胞。
（１９）  （１８）記載の組換え細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを  採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
（２０）  ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰ、及び（１４）に記載の耐熱性ＤＮ  Ａポリメラーゼを反応させることによりプライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長  物を合成することを特徴とする核酸増幅方法。
（２１）プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長物に  相補的である（２０）記載の核酸増幅方法。
（２２）  加熱および冷却を繰り返す（２０）記載の核酸増幅方法。
（２３）  一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物である２種のプライ  マー、ｄＮＴＰ、および（１４）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１  価イオン及び緩衝液を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬。
（２４）  一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物である２種のプライ  マー、ｄＮＴＰ、（１４）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、  アンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオン、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、非  イオン性界面活性剤、及び緩衝液を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬。
（２５）  一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物である２種のプライ  マー、ｄＮＴＰ、（１）〜（１１）のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マ  グネシウムイオン、アンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオン、ＢＳＡ、非イ  オン性界面活性剤、緩衝液、及び該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性およ  び／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含有する  核酸増幅用試薬。
（２６）  （１４）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴  とするＤＮＡポリメラーゼ組成物。
（２７）  ＤＮＡを鋳型として、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び（１４）に記載の耐  熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることによりプライマーを伸長させてＤＮＡプライ  マー伸長物を合成することを特徴とする遺伝子変異導入方法。
（２８）  変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び（１４）のいずれかに記載の耐熱性ＤＮ  Ａポリメラーゼ含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬
（２９）  ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの近接した「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」において、
(i)該Ｔｈｕｍｂドメイン先端部分の塩基性及び／又は疎水性を増大させる；並びに／或      いは
(ii)該エキソヌクレーゼドメインの酸性及び／又は疎水性を増大させる
アミノ酸変異（置換、欠失、挿入又は付加）を行うことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下する方法。
（３０）  ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの近接した「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」において、
(i)       Thumbドメイン先端部分の塩基性及び／又は疎水性を減少させる；並びに／或いは
(ii)該エキソヌクレーゼドメインの酸性及び／又は疎水性を減少させる
アミノ酸変異（置換、欠失、挿入又は付加）を行うことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を増大させて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの増幅における正確性を向上する方法。
（３１）  野生型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼよりも「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」の間の距離が、0.1〜15Å、好ましくは0.3〜10Å、より好ましくは0.5〜5Å縮小している（２９）に記載の方法。、
（３２）  野生型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼよりも「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」の間の距離が、0.1〜15Å、好ましくは0.3〜10Å、より好ましくは0.5〜5Å拡大している（３０）に記載の方法。
【００１３】
２００１年にＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの立体構造が明らかとなり（J Mol Biol.(2001)00,1-9）、アミノ酸置換することで正確性を保ったままＰＣＲ効率を向上させることのできるＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のヒスチジンのタンパク質内での立体的位置関係が明らかになった。１４７番目のヒスチジン残基は、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造の先端に存在し、Ｔｈｕｍｂドメイン（正確にはThumb-2ドメイン）の先端にも近接していることが明かとなった。一方、Ｔｈｕｍｂドメインの先端はＸ線結晶解析ではディスオーダーしており、すなわち不安定で、明瞭な像が得られおらず、非常にフレキシビリティーに富んだ領域であることが窺えた。また、この領域は塩基性、疎水性に富む領域であることも非常に興味深い発見であった。
【００１４】
このＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とＴｈｕｍｂドメインの先端が作る溝は、Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｃｌｅｆｔ（Ｅ−Ｃｌｅｆｔ）と呼ばれ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性中心がその内部に存在することから、３’−５’エキソヌクレアーゼの発現制御に深く関わっていることが推察されている。
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ複製機構は以下のように考えられる。
（１）複製すべきＤＮＡを挟み込むようにして、ポリメラーゼ活性中心で５’から３’側  へ向けて伸長反応（DNA合成反応）が進む（合成モード）。
（２）伸長反応に対してある割合で校正モードへの切り換え（スイッチング）が行われ、  合成されつつある１本鎖核酸がＥ−Ｃｌｅｆｔ（校正溝：エキソヌクレアーゼドメイン  とＴｈｕｍｂドメインの隙間に形成される）に進入し、３’−５’エキソヌクレアーゼ  活性中心で３’側から５’側に数塩基から数十塩基削られる。この時、誤って取りこま  れた塩基は校正される。
（３）スイッチングが行われ、合成モードへ戻り合成が再開される。
【００１５】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のヒスチジン残基を酸性アミノ酸、すなわち負電荷を帯びたアミノ酸に置換することで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下し、ＰＣＲ効率が向上する傾向にある。一方、１４７番目のヒスチジン残基を塩基性アミノ酸、すなわち正電荷を帯びたアミノ酸に置換することで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が上昇し、ＰＣＲ効率が低下する傾向にある。さらに、一方、１４７番目のヒスチジン残基を疎水性アミノ酸に置換することで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が若干低下し、ＰＣＲ効率が若干向上する傾向にある（表１）。
【００１６】
表１は、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの１４７変異体の性質を示す。
【００１７】
【表１】
2005065540.tif 000003
【００１８】
本発明者等はこれら立体構造的知見と変異体での知見をもとに鋭意考察し、以下のような仮説に至った。すなわち、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とＴｈｕｍｂドメインの先端は近接しており、アミノ酸の性質に従って相互作用しており、特に、それぞれの配列の先端付近のアミノ酸が重要で、それぞれの電荷、疎水性などが深く、その相互作用に関与しているというものである。１４７番目のヒスチジン残基はＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造のほぼ先端に存在し、その相互作用に最も影響を及ぼしやすいと推察される。１４７番目のヒスチジンの変異体を例にとると以下のような推論が成り立つ。まず、ヒスチジンを酸性アミノ酸（負電荷）に置換した場合、Ｔｈｕｍｂドメインの先端部分が塩基性（正電荷）に富んでいることから、お互い引き合い、Ｅ−Ｃｌｅｆｔを押し縮めるように作用することが考えられる。このことにより、校正されるべき一本鎖ＤＮＡは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の活性中心に到達しにくくなり、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下するものと考えられる。また、特開２００２−２５３２６５では、Ｈ１４７ＥやＨ１４７Ｄなどの酸性アミノ酸への変異体は、同等の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の活性中心に変異を導入した変異体に比べＰＣＲ効率が向上していることを述べている。これは、活性中心に変異を導入した変異体では、校正されるべき一本鎖ＤＮＡが野生型酵素同様にＥ−Ｃｌｅｆｔに進入するのに対し、Ｈ１４７ＥやＨ１４７Ｄなどの酸性アミノ酸への変異体では、Ｅ−Ｃｌｅｆｔへの一本鎖ＤＮＡの進入が制御されることにより、無駄な動きが軽減されるためであると推察される。
また、Ｈ１４７AやＨ１４７Ｙなどの疎水性変異体においても、酸性アミノ酸への変異体ほど顕著ではないが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下とＰＣＲ効率の向上が認められる。これは、Ｔｈｕｍｂドメインの先端部分が疎水性に富んでいることから、疎水的相互作用を介して、二つのドメインが引き合った結果、Ｅ−Ｃｌｅｆｔを押し縮められたことに起因していると考えられる。
一方、Ｈ１４７ＫやＨ１４７Ｒなどの塩基性変異体に関しては、酸性変異体とは全く逆の結果が得られている。すなわち、これらの変異体においては、反発の作用が働きＥ−Ｃｌｅｆｔが開き、一本鎖ＤＮＡが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性中心に到達しやすい構造になっていると推察することが出来る。
本発明は上記の仮説を証明することにより、更に幅広い性質を有する変異体を作製することを可能にした。仮説の証明は、Ｈ１４７Ｅ変異体に焦点を当て、Ｘ線結晶解析を行い、野生型酵素との立体構造の比較を行うことによって実施した。Ｈ１４７Ｅは実施例３に示す条件で結晶化を行い、０．２０×０．０８×０．０８ｍｍの結晶を取得し（図３）、X線回折実験により約２．７５Åの分解能までの回折点を観測し、表２に示すような空間群と格子定数を決定することが可能であった。
【００１９】
表２は、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）の結晶のＸ線回折データを示す。
【００２０】
【表２】
2005065540.tif 000004
【００２１】
そのデータを元にプログラムDenzo,Scalepackを用い計算を行った後、立体モデルを構築した。その結果、図４に示すような像を得ることができ、野生型酵素同様に、Ｎ−ｔｅｒドメイン、Ｅｘｏドメイン、Ｆｉｎｇｅｒドメイン、Ｐａｌｍドメイン、Ｔｈｕｍｂドメインの５つのドメインからなることが分かった。また、ＥｘｏドメインとＴｈｕｍｂドメインを間の距離を比較するために、Ｅｘｏドメインを対照として、Ｈ１４７Ｅ変異体と野生型酵素を重ね合わせた結果、Ｈ１４７Ｅ変異体のＴｈｕｍｂドメインが相対的にＥｘｏドメイン側にシフトしていることが明らかになった（図５）。ただ、図をみて分かるようにＴｈｕｍｂドメインの先端部分で３箇所、構造がｄｉｓｏｒｄｅｒしている領域（点線部分）が存在した。Ｎ末端側から順にＤｉｓｏｒｄｅｒ領域Ｉでは、Ｔ６６７からＧ６
７７までの１１残基、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIでは、Ｒ６８９からＧ６９６までの８残基
、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIIでは、Ｋ７０５からＤ７１２までの８残基について構造が確認
できなかった。これらについては、野生型酵素の構造解析においても同様の結果が得られている。野生型酵素の研究からＴｈｕｍｂドメインは、温度要因が他のドメインに比べ非常に高く、フレキシブルであることが明かとなっており、このためにＴｈｕｍｂドメインの先端部分の電子密度が薄くなり、構造が欠落したのではないかと考えられている。ＴｈｕｍｂドメインのＥｘｏドメイン側へのシフトは、Ｔｈｕｍｂドメイン先端のへリックス領域（６７８−６８８）で、およそ１．５Åであった。当然、Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列であるＤｉｓｏｒｄｅｒ領域IIも、Ｅｘｏドメイン側へシフトしていると考えられる
。
【００２２】
更に、図６にＴｈｕｍｂドメインのｄｉｓｏｒｄｅｒしていない複数箇所からの１４７番目のアミノ酸までの距離、およびＥ−Ｃｌｅｆｔと推定される領域を示した。このように、１４７番目のアミノ酸を酸性アミノ酸であるグルタミン酸に置換することで、Ｅ−Ｃｌｅｆｔの大きさが変化することが示された。これは、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存
在するループ配列とＴｈｕｍｂドメインの先端配列が、相互作用しやすい位置に存在し、実際に静電的もしくは疎水的相互作用をしていることを意味していると思われ、今回試した他のアミノ酸への変異体においても同様の原理が働き、Ｅ−Ｃｌｅｆｔの大きさや形が変化することで、KOD DNAポリメラーゼの性質を変化させたことが示唆される。
【００２３】
Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列の電子密度が薄いということは、この領域が揺らいでいることを示しており、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインと容易に相互作用しやすい構造を取っていることを示している可能性も考えられる。
【００２４】
Ｈ１４７Ｅ変異体は酸性アミノ酸（負電荷）変異体であり、仮説では３’−５’エキソヌクレアーゼドメインとＴｈｕｍｂドメインの間隔を縮める、すなわちＥ−Ｃｌｅｆｔの幅を縮めると予想されていた変異体である。今回の、Ｘ線立体構造解析の結果、この仮説が証明される結果となり、本発明を明確なものとすることができた。
【００２５】
すなわち本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」が近接した部分のアミノ酸配列に変異を導入することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法である。ただし、既に報告されている「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列上のヒスチジン残基（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの場合１４７番目のヒスチジン残基）に変異を導入した変異体は本発明の範囲から除く。
【００２６】
ここでいう近接した部分とは、ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域を意味する。ドメイン間には数箇所そのような場所が存在する。KOD DNAポリメラーゼにおいてはエキソヌクレアーゼドメインのＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とThumbドメイン（詳しくはThumb-2）の先端領域にあたる領域である。
【００２７】
また、近接した領域の片方、もしくは両方は構造的に柔軟性（フレキシビリティー）に富んでいることが好ましい。KOD DNAポリメラーゼにおけるThumbドメインの先端はX線解析においてdisorderしていることが示唆されており、柔軟性が高いことが推察される。
【００２８】
ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域間の距離に関して、一般的に好ましい変異の戦略としては、酵素基質の反応部位（または触媒部位・結合部位など）への進入を妨げることが出来る程度に距離を近接させる、または、反対に進入しやすいように遠ざける、もしくはサブユニット同士をずらすことなどが挙げられる。  例えば、KOD DNAポリメラーゼにおいては、ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域間の距離が近づくと一本鎖ＤＮＡが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の活性中心に到達しにくくなり、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下し、PCR性能が向上する傾向がある。一方、距離が遠くなると、エキソヌクレアーゼ活性が向上して、PCR性能が低下する傾向があるが、正確性が向上するという利点がある。
【００２９】
このような観点から、本発明においてDNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる、もしくはPCR性能向上させる場合、ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域間の距離として好ましいのは、変異を導入していない酵素よりも下限として０．１Å、より好ましくは０．３Å、さらに好ましくは０．５Å程度距離を近くした場合である。あるいは、変異を導入していない酵素よりも上限として１５Å、より好ましくは１０Å、さらに好ましくは５Å程度距離を近くした場合である。具体的な変異としては、エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を酸性アミノ酸もしくは疎水性アミノ酸、好ましくは酸性アミノ酸に変換することにより実現される。さらに好ましくは、既に効果の確認されているHisのAsp、Glu、Tyr、もしくはAlaへの変異を含む方が好ましいといえる。また、もう一つのアプローチとしては、Thumbドメイン先端部分のアミノ酸配列（(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)）の一つ以上のアミノ酸を置換することにより実現される。また、それぞれの変異は、デリーションもしくは挿入を含んでも良い。
【００３０】
一方、本発明においてDNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を増大させ、正確性を向上させるためには、変異を導入していない酵素よりも下限として０．１Å、より好ましくは０．３Å、さらに好ましくは０．５Å程度距離を遠くした場合である。あるいは、変異を導入していない酵素よりも上限として１５Å、より好ましくは１０Å、さらに好ましくは５Å程度距離を遠くした場合である。具体的な変異としては、エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を塩基アミノ酸もしくは親水性アミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸に置換することにより実現される。さらに好ましくは、既に効果の確認されているHisのLysもしくはArgへの変異を含む方が好ましいといえる。また、もう一つのアプローチとしては、Thumbドメイン先端部分のアミノ酸配列（(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)）の一つ以上のアミノ酸を置換することにより実現される。また、それぞれの変異は、デリーションもしくは挿入を含んでも良い。
【００３１】
また、図６に示したように、測定する領域で接近距離が異なる（１Åと３Å）ように、今回の事例においてもエキソヌクレアーゼドメインとThumbドメインの接近には「ズレ」の要素も含まれていることが予想される。よって、ドメインを近づける、もしくは遠ざける以外にも適度にずらすことによっても良い効果が得られる。「ズレ」を導入する場合、変異を導入していない酵素よりも下限として０．１Å、より好ましくは０．３Å、さらに好ましくは０．５Å程度のズレを生じさせる場合である。あるいは、変異を導入していない酵素よりも上限として１５Å、より好ましくは１０Å、さらに好ましくは５Å程度ズレを生じさせる場合である。ズレの方向は左右、上下どちらでも良く、また、近づけたり、遠ざけたりする変化と混合しても良い。具体的な方法としては、上に挙げたアミノ酸変異を組み合わせることが考えられる。
【００３２】
ただ、ドメイン間の距離が近づきすぎる、または、遠ざかりすぎると弊害が起きる可能性も考慮する必要がある。極端な場合、ポリメラーゼとして機能しなくなる可能性も考えなくてはならない。
【００３３】
また、二つのドメインのそれぞれに１つ以上のアミノ酸に変異を導入する場合も考えられる。ただ、その場合も、上に示した考え方、すなわち、ドメイン間の距離もしくはズレを電荷や疎水的相互作用から推測すれば良い。例えば、KOD DNAポリメラーゼの147番目のヒスチジンを負電荷のアスパラギン酸に置換した変異体の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をさらに低下させる、もしくはPCR性能向上させる場合、Thumbドメインの先端配列を更に塩基性のアミノ酸に変異させることなどが考えられる。
【００３４】
また、H147Y変異体のようにエキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性が共に向上しているクローンも存在する。このクローンにおいて、相対エキソヌクレアーゼ活性(EXO/POL)は0.9であり、ほとんど野生型と同等であるにも関らず、PCR効率の向上が確認されている。この結果は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が低下することと、PCR効率が向上することとはある程度独立して規定されていることを示していると思われる。この効果は、相対エキソヌクレアーゼ活性が同等であってもPCR効率が異なるクローンがある（H147DとI142K、H147EとI142Q）ことからも予想される。H147YではこのPCR効率を向上させる効果が顕著に出現した例であると推察される。すなわち、本発明の方法に従うと、このように総合評価的に良いDNAポリメラーゼも取得することが出来る。その方法としては、H147Yのように、エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することによって達成することができる。また、H147D、H147Eにおいても上に示したように3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が低下した効果以上に、PCR効率を高める効果が確認されていることから、(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を酸性性アミノ酸に置換することによっても達成されることが予想される。これらの効果は、エキソヌクレアーゼドメインとThumbドメイン間の距離を縮小させる、もしくは「ズレ」を導入する効果に加えて、Thumbドメインを安定化したことによる効果も含まれると思われる。ポリメラーゼの活性中心で合成された二本鎖DNAは、PalmドメインとThumbドメインに挟まれる形で安定化されることが知られている。上に示したように、特にKOD DNAポリメラーゼのThumbドメインの先端は柔軟性に富んでいることが知られていることから、この柔軟性をエキソヌクレアーゼドメイン-Thumbドメインの相互作用により安定化した結果、ポリメラーゼ活性へも影響が及びPCR効率が向上した可能性があると考えられる。これらの効果は複合的な現象として発現することが多いが、ほぼ上記の方法に従うことにより、意図した方向へ変異させることが可能である。
【００３５】
また、KOD DNAポリメラーゼ以外のポリメラーゼにおいては、野生型酵素におけるエキソヌクレアーゼドメインとThumbドメインの距離がKOD DNAポリメラーゼと異なるものも多く、それぞれの酵素の性質を規定していると推定される。よって、KOD DNAポリメラーゼ以外のDNAポリメラーゼのドメイン間の距離やズレをどの程度変化させるかについては、変異させるアミノ酸の、種類を検討することが望ましい。ただ、変異の方向性としては、KOD DNAポリメラーゼの例に倣えば良い。
【００３６】
さらに、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレアーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列および/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列に変異を導入することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法である。
【００３７】
本発明は、始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応用され得る。本発明の要となる「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列、およびそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列は、始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの間で驚くほど保存されている。エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の配列は全て、(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Glyからなっており、Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列は(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)で表すことができる。括弧内はどちらかのアミノ酸を採用することができるが、どれもほぼ同一カテゴリーに分類されるアミノ酸であり、化学的性質はほぼ同等であることが予想される。
【００３８】
特に、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列は高度に保存されており、既にヒスチジン残基を用いた検討で非常に効果的に様々な性質を有する変異体の創出に成功していることもあり、重要である。
【００３９】
本発明において、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列のチロシン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基は、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に好適に変異させうる。それぞれの効果は、１４７番目のヒスチジン残基の変異の場合と同様な効果を期待することができ、ＰＣＲ効率の向上には、酸性アミノ酸、もしくは疎水性アミノ酸への置換が好ましく行われる。複数のアミノ酸変異を伴っても良いが、ループ構造を壊さない程度の変異が好ましいといえる。
本明細書において：
「酸性アミノ酸」は、Ｇｌｕ、Ａｓｐを含む。
「塩基性アミノ酸」は、Ａｒｇ，Ｌｙｓ、Ｈｉｓを含む
「疎水性アミノ酸」は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Tyrを含む
一方、正確性を向上させる用途では、塩基性アミノ酸への置換が好ましいといえる。この場合も、１４７番目のヒスチジン残基の変異の場合と同様な効果を期待することができる。複数のアミノ酸変異を伴っても良いが、上記同様、ループ構造を壊さない程度の変異が好ましいといえる。
また、本発明はＴｈｕｍｂドメインの先端配列を変異されることでも実現される。すなわち、(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)配列の一つまたは複数のアミノ酸を、酸性アミノ酸、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする。ただ、この配列は複雑で、Ｘ線結晶解析においても電子密度が薄く詳細な構造が決まっていないことから、明確にどのアミノ酸を変異されるべきかは、慎重に吟味して決定する必要がある。
【００４０】
先ほども述べたが、本発明は始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されない。ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、9#N-7  ＤＮＡポリメラーゼが好適に用いられ、特に、好ましくはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。
【００４１】
ただ、それぞれのポリメラーゼの野生型酵素のＥ−Ｃｌｅｆｔの幅は様々であり、それぞれの希望する性質に合わせて、変異させるアミノ酸を選択することが好ましい。例えば野生型酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を向上させたい場合はExoIモチーフのC末端側に存在するループ配列のいずれかを塩基性アミノ酸に変換すれば良い。または、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、もしくはPCR効率を向上させたい場合は、ExoIモチーフのC末端側に存在するループ配列のいずれかを酸性性アミノ酸もしくは疎水性アミノ酸に変換すれば良い。
【００４２】
また、本発明は上記の様々な方法によって作成された改変された３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにも関する。
【００４３】
さらに、本発明は、それらのタンパク質を発現させるために構築されたベクターにも及ぶ。特に、pLED-MIもしくはpBluescript由来のベクターが好適に使用される。
【００４４】
さらに、本発明は、これらベクターにより形質転換された宿主細胞にも及び、特に、大腸菌（Escherichia coli）が好ましく用いられる。
【００４５】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェートのα-ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００４６】
その活性測定法は、酵素活性が強い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl、滅菌水１０μl、及び酵素溶液５μlをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。その後氷冷し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)
１６mM 塩化マグネシウム
１５mM ジチオスレイトール
１００μg/ml ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５mM  ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴＰ)
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウム)
Ｅ：１０mg/ml  サケ精子ＤＮＡ
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とはＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。その活性測定は、５０μlの反応液（１２０mM Tris-塩酸緩衝液(ｐＨ８．８、２５℃)、１０mM ＫＣｌ、６mM 硫酸アンモニウム、１mM  ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100、０．００１％ ＢＳＡ、５μgトリチウムラベルされた大腸菌）を１．５mlのマイクロチューブに分注しＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡ ５０μlを加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液１００μlを加えて混合する。氷上で１５分放置した後、１２０００回転にて１０分間遠心分離し沈殿を分離する。上清１００μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００４７】
本発明において、ＤＮＡ合成速度とは単位時間あたりのＤＮＡ合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液(２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)、８mM 塩化マグネシウム、７．５mM ジチオスレイトール、１００μg/ml ＢＳＡ、０．１mM ｄＮＴＰ、０．２μCi[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ)を、プライマーをアニーリングさせたM13mp18 1本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液(５０mM 水酸化ナトリウム、１０mM ＥＤＴＡ、５％フィコール、０．０５％ブロモフェノールブルー)を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルされたλ/HindIIIを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによってＤＮＡ合成速度を求める。
【００４８】
本発明において、熱安定性とはポリメラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８；２５℃での測定値）、１０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウム、２ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に混合し、９５℃、６時間の処理での残存活性を意味する。
【００４９】
また、本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの正確性とはＤＮＡ複製時における塩基の取り込みの正確性をいう。本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（rpsL）遺伝子を指標として行う。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果(pleiotropic effect）を示すことが知られている。したがって、rpsL遺伝子をＰＣＲにより増幅し菌に形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。
【００５０】
プラスミドpMol21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850に記載)は、rpsL遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いるのが好ましい。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、MluI制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を様々な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、ストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素MluIを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換して、アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種し、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することにより遺伝子複製の正確性を求める。
【００５１】
これらの改変された酵素を製造する方法としては、野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある。
【００５２】
変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子が挙げられる。
【００５３】
野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などからタンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。
【００５４】
本発明で使用したQuickChange site-directed mutagenesisキット（ストラタジーン製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてPfu ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素DpnIを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成されたプラスミドにより大腸菌を形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
【００５５】
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、pLED-MIもしくはpBluescript由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。次に３’−５ ’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、両者の活性比率を野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと比較することにより３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を測定することができる。
【００５６】
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスG-25（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロース、ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００５７】
また、得られた酵素を用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、その増幅の有無もしくは強度からＰＣＲ効率の評価を行うことができ、またＤＮＡ複製の正確性も評価することができる。
【００５８】
また、本発明の核酸増幅方法は、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰを反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を挙げることができる。プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオンを含むと共に、ＢＳＡ、例えばTriton X-100のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。緩衝剤としては、主にトリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが挙げられる。
【００５９】
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。
【００６０】
本発明の核酸増幅用試薬の別な態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。
【００６１】
本発明の遺伝子変異導入用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに上述したような２価イオン、１価イオン、緩衝液を含んでもよい。
【００６２】
また、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を化学的もしくは遺伝子工学的手法を用いて減衰もしくは失活させ、様々な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するものであってもよい。
【００６３】
また、本発明の実施態様としては、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物がある。具体的には、上述のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと別なＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼなどを混合せしめることによって、長鎖核酸を増幅する場合、例えばｌｏｎｇＰＣＲの際に有用な組成物を得ることができる。実際、長鎖核酸を増幅する方法として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｉポリメラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告されている（Barns, W.M.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220）。
【発明の効果】
【００６４】
上述したように、本発明により、様々な性質耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの効率的改変方法が明かとなった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や、更に正確性の高い増幅など様々な用途に使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
参考例１  超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
鹿児島県子宝島において単離した超好熱始原菌パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従ってＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを調製した。パイロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ)の保存領域アミノ酸配列に基づいて、２種のプライマー(5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' 及び5'-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3')を合成した。この２種のプライマーを使用して調製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
【００６６】
ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡをプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Kbp）。更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドpBluescript（ストラタジーン製）に挿入し、これらの混合物よりエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) JM109を形質転換してライブラリーを作製した。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライブラリーからＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(エシェリヒア・コリJM109/pBSKOD1)を取得した。
【００６７】
取得した上記クローン株よりプラスミド、pBSKOD1を回収し、定法に従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１)。
【００６８】
完全なポリメラーゼ遺伝子を作製するために、２箇所の介在配列(１３７４〜２４５３bp及び２７０８〜４３１６bp）をＰＣＲ融合法により取り除いた。ＰＣＲ融合法では、クローン株より回収したプラスミドを鋳型に３組のプライマーを組み合わせて各々ＰＣＲを行い、介在配列を除いた３断片を増幅した。この際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の断片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように設計した。また、両端には別々な制限酵素サイト（Ｎ末端側：EcoRV、Ｃ末端側：BamHI）が創出されるように設計した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中構造上中央に位置する断片とＮ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。また、同様に構造上中央に位置する断片と、Ｃ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。
【００６９】
このようにして得られた２種の断片を用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端側にEcoRV、Ｃ末端側にBamHIサイトを有するＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断片を取得した。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘導可能な発現ベクターpET-8cのNcoI/BamHIサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用してサブクローニングを行い、組換え発現ベクター、pET-pol）を得た。なお、エシェリヒア・コリ BL21(DE3)/pET-polは生命工学工業研究所へ寄託されている(FERM BP-5513)。
実施例１
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミドpET-polからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出し、pBluescriptにサブクローニングを行った。すなわち、pET-polを制限酵素XbaIとBamHI（東洋紡績製）にて切断し、約２．３kbのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片をライゲーションキット(東洋紡績製 Ligation high）を用いて、XbaIとBamHIで切断したプラスミドpBluescript SK(-)と連結し、コンピテントセル（東洋紡績製 competent high JM109）を形質転換した。１００μg/mlのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天；ギブコ製）で３５℃で１６時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。更に、部分塩基配列を確認してＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含むプラスミドpKOD1を得た。
実施例２  改変型遺伝子(Ｈ１４７Ｅ）の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例１で得られたプラスミドpKOD1を用いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつプラスミドを作製した(pKOD HE)。該プラスミドの作製はQuickChange site directed mutagenesis kit（ストラタジーン製）を用いた。方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号４及び５に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。選られたプラスミドによりエシェリヒア・コリJM109を形質転換し、エシェリヒア・コリJM109(pKOD HE)を得た。
【００７０】
得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μg/mlのアンピシリンを含有するＴＢ培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μg/mlのアンピシリンを含有する５０mlのＬＢ培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリJM109(pKOD HE）(５００ml坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃にて１２時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００mlの破砕緩衝液(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、８０mM ＫＣｌ、５mM ２−メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁後、フレンチプレス処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(５０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、５０mM 塩化カリウム、１mM ジチオスレイトール、０．１％ Tween20、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＥ)を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合は保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。
（試薬）
Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)
１６mM 塩化マグネシウム
１５mM ジチオスレイトール
１００μg/ml ＢＳＡ
Ｂ： ２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５mM ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴＰ)
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウム)
Ｅ： １０mg/mlサケ精子ＤＮＡ
（方法）
Ａ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl及び滅菌水１０μlをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μlを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
実施例３  変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ）の結晶の作製
結晶化の条件を以下に示す。
方法：              Hanging drop vapor diffusion法
タンパク質溶液組成：    6.0mg/ml KOD DNAポリメラーゼ（H147E）
50mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
1.0mM DTT
0.001% Tween20
50% Glycerol
リザーバー溶液組成：    3% Polyethylene glycol 1450
10mM NiCl
Glycine-NaOH
17.5% Glycerol
Drop:               タンパク質溶液  2μl+リザーバー溶液2μl
結晶化温度:         20℃
この条件を用いて数日後には図３に示すような良好な結晶（0.2ｃｍ×0.08ｃｍ×0.08ｃｍ）をえることができ、次の実験に用いた。
実施例４  変異型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ）の結晶のＸ線回折データ測定
Ｘ線照射による結晶の損傷を抑えるため、１００Ｋの液体窒素蒸気下で回折強度データの測定を行った。この際、抗凍結剤としてタンパク質溶液とリザーバー溶液を等量混合した溶液にＭＰＤ（和光純薬製）を１２％になるように加えた溶液を用いた。その結果、0.20×0.08×0.08mmの結晶を取得することができた（図３）。その結晶を用いてX線回折実験を行ったところ、約２．７５Åの分解能までの回折点が観測でき、表２示すような空間群と格子定数を決定することができた。このようにして収集されたデータの処理は、プログラムDenzo,Scalepackを用いることにより行った。その結果、図４に示すような像をえることができ、野生型酵素同様に、Ｎ−ｔｅｒドメイン、Ｅｘｏドメイン、Ｆｉｎｇｅｒドメイン、Ｐａｌｍドメイン、Ｔｈｕｍｂドメインの５つのドメインからなることが分かった。また、ＥｘｏドメインとＴｈｕｍｂドメインを間の距離を比較するために、Ｅｘｏドメインを対照として、Ｈ１４７Ｅ変異体と野生型酵素を重ね合わせた（図５）。その結果、Ｈ１４７Ｅ変異体のＴｈｕｍｂドメインが相対的にＥｘｏドメイン側にシフトしていることが明らかになった。ただ、図５を見て分かるようにＴｈｕｍｂドメインの先端部分で３箇所、構造がｄｉｓｏｒｄｅｒしている領域（点線部分）が存在した。Ｎ末端側から順にＤｉｓｏｒｄｅｒ領域Ｉでは、Ｔ６６７からＧ６７７までの１１残基、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIでは、Ｒ６８９からＧ６９６までの８残基、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIIでは、Ｋ７０５からＤ７１２までの８残基について構造が確認できなかった。これらについては、野生型酵素の構造解析においても同様の結果が得られている。野生型酵素の研究からＴｈｕｍｂドメインは、温度要因が他のドメインに比べ非常に高く、フレキシブルであることが明かとなっており、このためにＴｈｕｍｂドメインの先端部分の電子密度が薄くなり、構造が欠落したのではないかと考えられている。ＴｈｕｍｂドメインのＥｘｏドメイン側へのシフトは、Ｔｈｕｍｂドメイン先端のへリックス領域（６７８−６８８）で、およそ１．５Åであった。このことより、Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列であるＤｉｓｏｒｄｅｒ領域IIも、Ｅｘｏドメイン側Ｎシフトしていると考えられる。
更に、図６にＴｈｕｍｂドメインのｄｉｓｏｒｄｅｒしていない複数箇所から、１４７番目のアミノ酸までの距離、およびＥ−Ｃｌｅｆｔと推定される領域を示した。このように、１４７番目のアミノ酸配列を置換することで、Ｅ−Ｃｌｅｆｔの大きさが変化することが示された。これは、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列とＴｈｕｍｂド
メインの先端配列が、相互作用しやすい位置に存在し、実際に静電的もしくは疎水的相互作用をしていることを意味していると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】様々なＤＮＡポリメラーゼのＥｘｏＩ領域（下線）及びそれに隣接するループ構造（太字）を示す図である。
【図２】様々なＤＮＡポリメラーゼのＴｈｕｍｂドメイン先端部分の配列を示す図である。太字は塩基性アミノ酸を示す。
【図３】ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）の結晶を示す図である。
【図４】ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）のＸ線結晶解析から得られた立体構造像を示す図である。
【図５】ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）と野生型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの立体構造像をエキソヌクレアーゼドメインを中心として重ね合わせた像を示す図である。
【図６】ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）と野生型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のアミノ酸からＴｈｕｍｂドメインの先端の距離を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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