(57)【要約】      （修正有）【課題】抗菌薬であるイミペネムは、広い抗菌スペクトラムを有し、感染症起炎菌の薬剤感受性測定に使用されている薬剤の一つである。感染症起炎菌の薬剤感受性測定には、操作の簡便性からフローズンプレートが広く利用されているが、イミペネムに代表されるカルバペネム系薬剤は不安定なことが知られており、−７０℃以下での保存を要するとされている。長期保存可能な、常温保存のできるドライ系のカルバペネム系薬剤を含有する薬剤感受性試験用プレート、および当該薬剤感受性試験用プレートを製造する方法の提供。【解決手段】カルバペネム系薬剤と特定の緩衝剤を含有するドライ系の薬剤感受性試験用プレート、および当該薬剤感受性試験用プレートを製造する方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルバペネム系薬剤およびＭＯＰＳＯを含有する、薬剤感受性試験用プレート。
【請求項２】
カルバペネム系薬剤がイミペネムである、請求項１記載の薬剤感受性試験用プレート。
【請求項３】
薬剤感受性試験用プレートが９６穴マイクロプレートである、請求項１または２記載の薬剤感受性試験用プレート。
【請求項４】
ＭＯＰＳＯが各穴に３３７〜１３５２μｇ含まれる、請求項３に記載の薬剤感受性試験用プレート。
【請求項５】
イミペネムが各穴に０．００１６〜３．２μｇ含まれる、請求項３または４に記載の薬剤感受性試験用プレート。
【請求項６】
乾燥固着法による薬剤感受性試験用プレートの製造方法であって、以下の工程、
カルバペネム系薬剤をＭＯＰＳＯ緩衝液に溶解する工程、
生成した溶解液を試験用プレートに分注する工程、および
該試験用プレートを乾燥する工程、
を含む、薬剤感受性試験用プレートの製造方法。
【請求項７】
カルバペネム系薬剤がイミペネムである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＭＯＰＳＯ緩衝液濃度が３０〜１２０ｍＭである、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
ＭＯＰＳＯ緩衝液のｐＨが６．２〜７．４である、請求項６乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
薬剤感受性試験用プレートが９６穴マイクロプレートである、請求項６乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、カルバペネム系薬剤を含有する長期保存可能な薬剤感受性試験用プレート、および当該薬剤感受性試験用プレートを製造する方法に関する。
従来の技術
日常微生物検査室における薬剤感受性検査は、ディスク拡散法及び微量液体希釈法に大別される。微量液体希釈法及びNCCLS準拠ディスク法での検査結果は、S（感性）、I（中程度感性）、R（耐性）の3段階で表示される。
【０００２】
カルバペネム系薬剤、特にイミペネム（Ｉｍｉｐｅｎｅｍ）は、広い抗菌スペクトラムを有する抗菌剤であり、感染症起炎菌の薬剤感受性測定に使用されている薬剤の一つである。
【０００３】
感染症起炎菌の薬剤感受性測定には、操作の簡便性からフローズンプレート（ＦＰ、栄研化学社製）が広く利用されている。しかし、イミペネムに代表されるカルバペネム系薬剤は不安定なことが知られており、−７０℃以下での保存を要するとされている。−７０℃以下での保存を要することは、例えば第１２回日本臨床微生物学会総会（２００１年２月３日〜４日）での三菱化学ビーシーエル化学療法研究室天野綾子らによる“感受性測定用フローズンプレート中におけるｉｍｉｐｅｎｅｍの安定性に関する検討”に示されている。また、同文献には、緩衝剤ＭＯＰＳ（３−モルフォリノプロパン硫酸）の添加が保存安定化に効果を有することが示されている。
【非特許文献１】“感受性測定用フローズンプレート中におけるｉｍｉｐｅｎｅｍの安定性に関する検討” 三菱化学ビーシーエル化学療法研究室天野綾子ら、第１２回日本臨床微生物学会総会（２００１年２月３日〜４日）
【０００４】
しかし、０．０５Ｍ  ＭＯＰＳ添加系であっても、イミペネムの残存率は経時的に減少しており、保存安定性に問題がある。
【０００５】
発明が解決しようとする課題
上述のように、抗菌薬であるイミペネムは、広い抗菌スペクトラムを有し、感染症起炎菌の薬剤感受性測定に使用されている薬剤の一つであるが、その保存安定性に問題がある。フローズンプレートは−７０℃以下での保存を要するとされているが、実際に保存用深凍庫を保有する検査室は少ないのが実情である。
【０００６】
保存容易なドライ系とする場合は、薬剤の保存安定性の問題が致命的となる。何らかの物質を共存させることにより保存安定性を向上させるとしても、吸湿性の高い物質は使用できないという問題もある。
【０００７】
本発明は、常温保存容易なドライ系の薬剤感受性試験用プレートを提供するものであり、具体的には、カルバペネム系薬剤を含有する長期保存可能な薬剤感受性試験用プレート、および当該薬剤感受性試験用プレートを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
課題を解決するための手段
本発明者は、カルバペネム系薬剤を含有し、保存容易なドライ系の薬剤感受性試験用プレートを提供するため、乾燥固着法に着目し、詳細に検討した。その結果、特定の緩衝剤を用いることによりカルバペネム系薬剤を安定に乾燥固着でき、かつ保存安定性に優れた薬剤感受性試験用プレートを提供することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、カルバペネム系薬剤および緩衝剤ＭＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパン硫酸）を含有する、感受性試験用プレートを提供する。更に本発明は、該プレートを製造する方法を提供する。
【００１０】
薬剤感受性試験用プレート
本発明のカルバペネム系薬剤は、カルバペネム系に属し、抗菌活性を有するものであればいずれをも用いることができるが、限定的でない例としてイミペネムを用いることができる。イミペネムとは、（＋）−（５Ｒ，６Ｓ）−３−［［２−（ホルムイミドイルアミノ）エチル］チオ］−６−［（Ｒ）−１−ヒドロキシエチル］−７−オキソ−１−アザバイサイクロ［３．２．０］ヘプト−２−エン−２−カルボン酸モノハイドレート（(+)-(5R,6S)-3-[[2-(Formimidoylamino)ethyl]thio]-6-[(R)-1-hydroxyethyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid monohydrate）のことであり、例えば萬有製薬株式会社から入手することができる。
【００１１】
本発明のＭＯＰＳＯとは、２−ヒドロキシ−３−モルフォリノプロパン硫酸のことであり、例えば同仁化学社から入手することができる。本発明に用いるＭＯＰＳＯは、必ずしも高純度のものである必要はないが、純度９９％以上のものが好ましい。
【００１２】
本発明の薬剤感受性試験用プレートは、感染症起炎菌の薬剤感受性測定に使用することができる。薬剤感受性試験用プレートは、例えば９６穴マイクロプレートを使用することができる。
【００１３】
薬剤感受性試験用プレートとして９６穴マイクロプレートを用いる場合、ＭＯＰＳＯは各穴にカルバペネム系薬剤を安定化するのに必要な量存在すればよいが、各穴に３３７〜１３５２μｇ含まれるのが好ましい。カルバペネム系薬剤、特にイミペネムは、各穴に０．００１６〜３．２μｇ含まれるのが好ましい。
【００１４】
試験対象の感染症起炎菌は、いずれの感染性起炎菌であってもよい。披検試料には何ら制限はないが、例えば患者の体液を用いる。
薬剤感受性試験用プレートの精度管理は、精度管理菌株である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２９２１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＡＴＣＣ４９７６６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ４９６１９を使用して行うことができる。
【００１５】
本発明の薬剤感受性試験用プレートは、常温条件であっても保存安定性に優れているという特徴を有する。本発明の薬剤感受性試験用プレートは、常温付近にて長期保存可能であるが、１０℃以下での保存が好ましい。
【００１６】
薬剤感受性試験用プレートの製造方法
本発明は、乾燥固着法による薬剤感受性試験用プレートの製造方法であって、カルバペネム系薬剤をＭＯＰＳＯ緩衝液に溶解する工程、生成した溶解液を試験用プレートに分注する工程、試験プレートを乾燥する工程を含む、該薬剤感受性試験用プレート製造方法をも提供する。
【００１７】
本発明の方法に用いるカルバペネム系薬剤は、カルバペネム系に属し、抗菌活性を有するものであればいずれをも用いることができるが、限定的でない例としてイミペネムを用いることができる。
【００１８】
カルバペネム系薬剤を溶解する溶液は、通常ＭＯＰＳＯ緩衝液を用いる。また、カルバペネム系薬剤を少量の他の緩衝液に溶解後、当該溶解液をＭＯＰＳＯ緩衝液と混合してもよい。カルバペネム系薬剤を溶解する少量の緩衝液としては、生化学分野で使用される緩衝液であり、中性領域で緩衝能を有するものであれば何れも使用することができるが、例えばリン酸緩衝液が好ましい。いずれの場合であっても、次の工程に用いるカルバペネム系薬剤のＭＯＰＳＯ緩衝液中の濃度は、０．０１６〜３２μｇ／ｍｌが好ましい。カルバペネム系薬剤を溶解するＭＯＰＳＯ緩衝液の濃度は、１０〜２００ｍＭ、特に３０〜１２０ｍＭの範囲が好ましい。該希緩衝液のｐＨは６．２〜７．４が好ましい。
【００１９】
薬剤感受性試験用プレートは、例えば９６穴マイクロプレートを使用することができる。薬剤感受性試験用プレートとして９６穴マイクロプレートを用いる場合、カルバペネム系薬剤を溶解したＭＯＰＳＯ緩衝液の各穴への分注量は、５０〜１００μｌの範囲が好ましい。溶解液の試験用プレートへの分注は、当該分野で用いられる分注機により行うことができる。
【００２０】
乾燥固着は、例えば真空乾燥により行うことができ、真空乾燥機を使用することができる。
実施例
以下、本発明に関して、比較例および実施例を示して説明する。
【００２１】
実施例１  イミペネムの乾燥固着による薬剤感受性試験用プレートの作製
イミペネム原末は、萬有製薬株式会社から入手したものを使用した。イミペネム原末の溶解は、０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２（滅菌超純水使用）にて行った。プレートは９６穴マイクロプレートを使用した。種々の濃度のイミペネム溶解液を調製し、各穴に５０μｌ分注した。プレートの乾燥は、真空乾燥機を用い、可能固着した。
【００２２】
乾燥による劣化を、精度管理株を使用した性能評価により行った。菌株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２９２１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＡＴＣＣ４９７６６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ４９６１９を使用した。
【００２３】
結果を表１に示す（ｎ＝３での結果を示す。）。ＭＩＣとは、最小発育阻止濃度ことであるが、乾燥後のＭＩＣはレンジ外となる菌株があり、乾燥工程でイミペネムが劣化することが確認された。
【００２４】
【表１】
2005341827.tif 000002
【００２５】
また、表１には結果を示していないが、イミペネムの仕込み量を約３倍量としても、乾燥後のＭＩＣはレンジ外となる菌株があった。さらに、イミペネムの仕込み量を少なくし、乾燥時間を短縮することによっても、乾燥後のＭＩＣはレンジ外となる菌株があり、乾燥時間の短縮化では乾燥工程でのイミペネム劣化の問題は解決できなかった。
実施例２  安定化剤の検討
イミペネム原末は、萬有製薬株式会社から入手したものを使用した。イミペネム原末の溶解は、３０〜１２０ｍＭ  ＭＯＰＳＯ（滅菌超純水使用）にて行った。
【００２６】
希釈液は、表２に示すグッド緩衝液１０種を使用した。これらは、同仁化学研究所のカタログの生化学緩衝液（グッド緩衝液）２１種中、利用最適ｐＨが７．０付近のものである。プレートは９６穴マイクロプレートを使用し、分注量は５０マイクロＬ／ｗｅｌｌとした。乾燥は、真空乾燥機を用い、可能固着した。
【００２７】
乾燥による劣化を、精度管理株を使用した性能評価により行った。菌株は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２９２１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ２７８５３、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＡＴＣＣ４９７６６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ４９６１９を使用した。
【００２８】
【表２】
2005341827.tif 000003
【００２９】
結果を表３および表４に示す（ｎ＝３での結果を示す。）。ＭＯＰＳＯを含め、数種の緩衝液を使用した場合に、乾燥固着後においても全ての試験菌株でＭＩＣレンジ内となった。しかし、ＨＥＰＥＳ、ＢＥＳは吸湿性が高いという問題がある。
【００３０】
【表３】
2005341827.tif 000004
【００３１】
【表４】
2005341827.tif 000005
【００３２】
実施例３  保存安定性
保存安定性を高湿度下で検討した。プレートの調製は、実施例２の方法に準じて行った。尚、ＡＣＥＳ緩衝液の濃度は１０ｍＭ、ＭＯＰＳＯ緩衝液の濃度は３０ｍＭとし、ｐＨは７．２とした。保存は、高湿度条件下（低温保管庫内、２〜１０℃）にむき出しで2日間放置した。
【００３３】
保存による劣化を、精度管理株を使用した性能評価により評価した。結果を表５に示す。
また、比較例として、ＭＯＰＳ緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ７．２）にて調製したプレートにて保存による劣化を、精度管理株を使用した性能評価により評価した。その結果を表６に示す。
【００３４】
【表５】
2005341827.tif 000006
【００３５】
【表６】
2005341827.tif 000007
【００３６】
ＡＣＥＳ緩衝液およびＭＯＰＳ緩衝液の場合では、ＭＩＣが耐性側へとシフトしたが、ＭＯＰＳＯ緩衝液の場合ではイミペネムは安定であった。つまり、驚くべきことに、イミペネムはＭＯＰＳＯと共に乾燥固着することにより、高湿度下での保存においても安定であった。
実施例４  緩衝液ＭＯＰＳＯの固着濃度の検討
プレートの調製は、実施例２の方法に準じて行った。その際、ＭＯＰＳＯ緩衝液濃度を１０ｍＭ〜２００ｍＭ（ｐＨは７．２）の範囲で１５段階の濃度に調製して行った。劣化を、精度管理株を使用した性能評価により行った。
【００３７】
結果を表７および表８に示す。
【００３８】
【表７】
2005341827.tif 000008
【００３９】
【表８】
2005341827.tif 000009
【００４０】
ＭＯＰＳＯ緩衝液濃度１４０ｍＭ〜２００ｍＭおよび１０〜２０ｍＭの範囲で若干耐性側にシフトしたが、３０〜１２０ｍＭではレンジ中央値となり、極めて良好な安定性を示した。
実施例５  保存安定性試験
実施例４で調製したプレートの内、緩衝液ＭＯＰＳＯ濃度を４０ｍＭとしたプレートを用いて、保存安定性を調べた。保存は、シリカゲルを同封してチャック付きアルミ袋に密閉し、２〜１０℃の冷暗所に保存した。劣化を、精度管理株等を使用した性能評価により行った。
【００４１】
結果を表９に示す。
【００４２】
【表９】
2005341827.tif 000010
【００４３】
保存７ヶ月間の性能試験の結果、作製直後の性能評価成績を維持しており、７ヶ月間の保存安定性が確保されていた。
発明の効果
以上説明したように、本発明によりカルバペネム系薬剤を安定に乾燥固着でき、かつ保存安定性に優れた薬剤感受性試験用プレートを提供することが可能となる。