(57)【要約】【課題】光伝搬体を用いた化学センサーにおいて、励起光と蛍光を完全に分離し、励起光によるバックグラウンドをなくし感度を向上させる。【解決手段】  光伝搬体の一端から励起光が導光され、光伝搬体中を伝搬する励起光により、被検出物質が励起されて生じる蛍光と励起光とを、光伝搬体の他端に設けられた回折格子により分光することを特徴とする被検出対象の光学分析装置である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部で光を伝搬させる光伝搬体と、
前記光伝搬体の外側面部に被検出物質が付着したときに前記伝搬体の一端から導光され、前記光伝搬体中を伝搬する励起光により、前記被検出物質が励起されて生じる蛍光と前記励起光とを、前記光伝搬体の他端において分光するための分光手段と、
前記分光手段よって分光された前記蛍光を検知する検知手段と、を備えることを特徴とする被検出対象の光学分析装置。
【請求項２】
前記分光手段が、前記光伝搬体の前記出力端に設けられた回折格子である請求項１に記載の光学分析装置。
【請求項３】
前記入力端の側面から前記伝搬体に光を導光することを特徴とする請求項１または２に記載の光学分析装置。
【請求項４】
前記伝搬体を覆い、且つ、前記被検出物質を注入するための注入口と排出するための排出口とを有する流路を、更に有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光学分析装置。
【請求項５】
前記光伝搬体の前記一端は、前記励起光を前記光導波路と結合させるための手段を更に有し、
前記結合手段が、回折格子であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の光学分析装置。
【請求項６】
蛍光物質と結合した前記被検出対象を捕捉するための捕捉成分が、前記光伝搬体の外側に付着し得ることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の光学分析装置。
【請求項７】
前記被検出物質と前記捕捉成分との結合が、抗原抗体反応によるものであることを特徴とする請求項６記載の光学分析装置。
【請求項８】
前記被検出対象と前記捕捉成分との結合が、DNAのハイブリダイゼーション反応によるものであることを特徴とする請求項６記載の光学分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には化学および生化学分析のための光学的方法による分析装置に関し、特に、エバネッセント波を基本とした化学および生化学分析のための光学分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、ガンや肝炎など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際、平時より特定のタンパク質の濃度が増加する。これらを平時からモニターしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来るため、次世代の医療技術として期待されている。未加工で未精製のタンパク質を分析するための方法の１つは、生物学的なリガンド−受容体相互作用を利用して特定の化合物を識別するセンサーを基本としたものである。そのような手法を用いているものには、光ファイバーのエバネッセント波センサー、および表面プラズモン共鳴センサーが含まれる。
【０００３】
光ファイバーのエバネッセント波センサーは、エバネッセント波（電界）効果を利用するものである。バネセント波（電界）効果とは、ある物質中を通過して誘電性の界面で反射される電磁波は、その界面の反対側にある第２の物質中で指数関数的に減衰する電界を生じることを言う。第２の物質中への浸透深さであるエバネッセント波の生じる領域は波長のごく一部ではあるが、それでもサイズとしては光または蛍光を生じるレポーター分子、光吸収ないし散乱分子、およびコロイド粒子やミクロスフィアのような光学的ラベル物質よりも大きい。これらのラベルはエバネッセント波の生じる領域において光学的変化を発生またはモニターすること、あるいは隣接する誘電体における光の伝播を変更させるために使用することが可能であり、表面近傍にあるターゲット物質を、検出することができる。
【０００４】
光ファイバーを用いたエバネッセント波センサーとしては、特公平５−２１１８５号公報や特開２００２−２５７７３２号公報等に記載されている。
【０００５】
これらに記載されている、エバネッセント波センサーは、一端が反射面となっている光ファイバーの側壁に標識化した抗原抗体複合体を付着させ、光ファイバーの他端から励起光を軸方向に導光している。光ファイバーに導光された励起光のバネセント波効果により、光ファイバーの側壁に付着した抗原抗体複合体の標識は、励起され蛍光を発生する。発した蛍光の一部が、該光ファイバーに導光され、励起光の反射光とともに光学系に戻り、光センサーによって検出されている。
【特許文献１】特公平５−２１１８５
【特許文献２】特開２００２−２５７７３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特公平５−２１１８５号公報や特開２００２−２５７７３２号公報に記載されたものでは、抗原抗体から発した蛍光と端面で反射された励起光とが一緒に光ファイバーから導出される。このために、蛍光の測定を行う場合、光ファイバー端から導出される光から、励起光と蛍光とを分離する必要がある。上記に開示されている手法では、励起光をカットし蛍光を通すようなフィルターを用いることにより分離をおこなっている。しかし、励起光を１００％カットし蛍光を１００％通すようなフィルターを製作することは実質的に困難である。
【０００７】
一般的に、励起光は蛍光に比べ光強度が高いので、励起光が大きなバックグラウンドノイズとして光センサーで検出される。開示されている手法では、バックグラウンド上の微小な変化として蛍光が検出される。このため、高感度に蛍光を検出しようとすると、バックグラウンドの発生源である励起光を極端に安定させることが必要となっていた。
【０００８】
さらに、従来技術では、励起光を光導波路内に導入する際、光ファイバー径の四分の一以下の径で点光源を作成して光ファイバーの端面導光にする必要がある。
【０００９】
位置合わせに厳密さが要求される為に、光源と光導波路とを一体化しておく必要があった。このために、検体が多くなると、大量の光源を準備する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記に挙げた課題は、以下に示す本発明によって解決される。内部で光を伝搬させる光伝搬体と、光伝搬体の外側面部に被検出物質が付着したときに伝搬体の一端から導光され、光伝搬体中を伝搬する励起光により、被検出物質が励起されて生じる蛍光と前記励起光とを、前記光伝搬体の他端に設けられた回折格子により分光する分光手段と、分光手段よって分光された前記蛍光を検知する検知手段と、を備えることを特徴とする被検出対象の光学分析装置である。
【００１１】
光伝搬体の一端は、励起光を光導波路と結合させるための手段を更に有し、前記結合手段が、回折格子であることが好ましく、蛍光物質を有する被検出対象を捕捉するための捕捉成分が、光伝搬体の外側に付着し得ることが好ましい。
【００１２】
更に、被検出物質と前記捕捉成分との結合が、抗原抗体反応あるいはDNAのハイブリダイゼーション反応によるものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、容易に構築できる光源から導波路に効率よく励起光を導入することが出来る。また、蛍光体を励起する励起光と蛍光体から発せられる蛍光を完全に分離することが出来、より高感度な蛍光免疫センサーを提供することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、光を伝搬する伝搬体となる光導波路を、流路を貫通するように形成し、該光導波路の一端から励起光を導光し、光導波路内を伝搬する励起光により、励起された光導波路の外部側壁に付着させた被検出物質が発する蛍光と励起光とを他端から出力される、蛍光と励起光とから、蛍光を分光し、分光された蛍光の強度により前記被検出物質の濃度を分析する光分析装置である。
【００１５】
以下、図を参照しながら本発明に関わる４つの実施形態につき述べる。ここでは本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明をおこなうが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【００１６】
本発明第１の実施形態について、図１を参照しながら説明する。
【００１７】
円筒型光導波路１１は、密封された流路２０内に設置される。円筒型光導波路１１の、流路２０から突出している端部には、回折格子１２、１３が形成されている。光源１５から照射される励起光は、コリメーターレンズ１４で並行光に変換され、円筒型光導波路１１の一端に全反射条件で回折格子１３により、カップリングさせ、円筒型光導波路１１内を、円筒型光導波路１１の壁面で反射しながら伝播する。円筒型光導波路１１の他端まで伝播した励起光は、円筒型光導波路１１の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された励起光は、集光レンズ１６により集光され、光センサー１８で検出される。
【００１８】
円筒型光導波路１１の外壁に付着した検体が有する蛍光体色素は、円筒型光導波路１１に全反射条件で導光された励起光のエバネッセント光により励起され蛍光を発する。この蛍光は、一部が円筒型光導波路１１に取り込まれ、円筒型光導波路１１を伝播して円筒型光導波路１１の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された蛍光は、集光レンズ１７により集光され、光センサー１９で検出される。
【００１９】
円筒型光導波路１１としては、励起光に対して伝搬ロスが少ない材料からなる光ファイバーであることが好ましく、そのような材料としては、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）を用いることが好ましい。  回折格子１２，１３としては、ブラッグ回折格子、ブレーズド回折格子、ホログラフィー回折格子を用いることができる。本構成では、ブラッグ回折格子を用いることが好ましい。ブラッグ回折格子は透過型の回折格子で、ホログラフィー回折格子、ブレーズド回折格子は反射型である。
【００２０】
コリメーターレンズ１４としては、平凸レンズ、セルフォックレンズ、非球面レンズ、両凸レンズを用いることができる。本構成では、平凸レンズ、セルフォックレンズ、非球面レンズを用いることが望ましい。両凸レンズは、光を平行化（コリメート）するためのレンズではないので、平行化の目的に使うには少し工夫が必要なので、好ましい形態からは外している。
【００２１】
光源１５としては、波長が２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のレーザーダイオードまたはガスレーザーを選択して用いる。本構成では波長が６７０ｎｍ以下のものを用いることが好ましい。
【００２２】
集光レンズ１６、１７としては、平凸シリンダーレンズ、平凹シリンダーレンズ、非球面レンズ、平凸もしくは両凸球面レンズ群、顕微鏡用対物レンズ、セルフォックレンズを用いることが出来る。本構成では平凸シリンダーレンズまたは平凹シリンダーレンズ、非球面レンズを用いることが好ましい。平凸、両凸では、レンズ群を構成する必要があるため構造が複雑になり、セルフォックレンズでは本構成では損失が大きくなり感度が低下する。
【００２３】
光センサー１８，１９としては、フォトダイオード、光電子増倍管を用いることができる。本構成では、検体の濃度によってフォトダイオード、光電子増倍管が適宜選択される。
【００２４】
流路２０としては、円筒型のキャピラリー、チューブが用いられるが円筒型のキャピラリーが好ましい。
【００２５】
注入口／排出口２１，２２については、流路２０に貫通孔を開けパイプを挿入し、チューブを伸ばした構成が好ましい。以下の実施の形態においても同様であるが、注入口／排出口は、図面では一ヶ所で説明しているが、注入口／排出口ともに複数設けることも、一方のみを複数にすることもできることは言うまでもない。
【００２６】
本発明の第２の実施形態について、図２を参照しながら説明する。第１の実施形態で示したものと同じ要素については、同じ符号で示してある。ただし、同じ構成要件であっても異なる形状や材料の要素である場合は、異なる符号をつけて説明する。
【００２７】
第１の実施の形態と異なっている点は、導波路を、円筒型光導波路１１に変えて平面型光導波路２３を用いた点である。
【００２８】
第１の実施の形態と同様に、光源１５から照射される励起光は、コリメーターレンズ１４で並行光に変換され、平面型光導波路２３の一端に全反射条件でカップリングさせ、平面型光導波路２３内を、平面型光導波路２３の壁面で反射しながら伝播する。平面型光導波路２３の他端まで伝播した励起光は、平面型光導波路２３の他端に形成された回折格子１２によって分光され平面型光導波路２３の外部に取り出される。外部に取り出された励起光は、集光レンズ１６により集光され、光センサー１８で検出される。
【００２９】
平面型光導波路２３の外壁に付着した検体が有する蛍光体色素は、平面型光導波路２３に導光された励起光による、エバネッセント光により励起し蛍光を発する。この蛍光は、一部が平面型光導波路２３に取り込まれ、平面型光導波路２３を伝播して平面型光導波路２３の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された蛍光は、集光レンズ１７により集光され、光センサー１９で検出される。
【００３０】
平面型光導波路２３としては、励起光に対して光ロスが少ない材料であることが好ましく、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）を用いることが好ましい。
【００３１】
本発明の第３の実施の形態について、図３を参照しながら説明する。第１の実施形態で示したものと同じ要素については、同じ符号で示してある。ただし、同じ構成要件であっても異なる形状や材料の要素である場合は、異なる符号をつけて説明する。
【００３２】
第３の実施の形態と第１の実施の形態との違いは、円筒型光導波路１１の励起光が導光される側の端部の回折格子１３に変えて、光源１５からの射出光が、円筒型光導波路１１に全反射条件で導光されるような角度でカットされ、ミラー２４が形成されている点である。
【００３３】
光源１５から照射される励起光は、コリメーターレンズ１４で並行光に変換され、円筒型光導波路１１の一端に形成されたミラー２４に全反射条件でカップリングさせ、円筒型光導波路１１内を、円筒型光導波路１１の壁面で反射しながら伝播する。円筒型光導波路１１の他端まで伝播した励起光は、円筒型光導波路１１の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された励起光は、集光レンズ１６により集光され、光センサー１８で検出される。
【００３４】
円筒型光導波路１１の外壁に付着した検体が有する蛍光体色素は、円筒型光導波路１１に導光された励起光による、エバネッセント光により励起し蛍光を発する。この蛍光は、一部が円筒型光導波路１１に取り込まれ、円筒型光導波路１１を伝播して円筒型光導波路１１の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された蛍光は、集光レンズ１７により集光され、光センサー１９で検出される。
【００３５】
ミラー２４としては、円筒型導波路１１を、光の伝搬方向に対して１０°〜５０°の範囲でカットし、端面を研磨した全反射ミラー、金属膜を蒸着したミラー、ミラーを張り合わせた構造、およびそれらの組み合わせを用いることができる。本構成では研磨面にＡｌ、Ａｇ、ＡｕまたはＣｒを蒸着し、ミラーにした構成が望ましい。
【００３６】
本発明の第４の実施形態について、図４を参照しながら説明する。第１の実施形態で示したものと同じ要素については、同じ符号で示してある。ただし、同じ構成要件であっても異なる形状や材料の要素である場合は、異なる符号をつけて説明する。
【００３７】
第４の実施の形態と第３の実施の形態との違いは、導波路を円筒型導波路１１に変えて、平面型光導波路２５に変えた点にある。平面型光導波路２３の励起光が導光される端面には、第３の実施形態の円筒型導波路１１と同様にミラー２５が形成されている。
【００３８】
光源１５から照射される励起光は、コリメーターレンズ１４で並行光に変換され、平面型光導波路２３の一端に形成されたミラー２５に全反射条件でカップリングさせ、平面型光導波路２３内を、円筒型光導波路１１の壁面で反射しながら伝播する。
【００３９】
平面型光導波路の平面に対し、１０°〜５０°の範囲でカットし、端面を研磨した全反射ミラー、金属膜を蒸着したミラー、ミラーを張り合わせた構造、およびそれらの組み合わせを用いることができる。平面型光導波路２３の他端まで伝播した励起光は、平面型光導波路２３の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された励起光は、集光レンズ１６により集光され、光センサー１８で検出される。
【００４０】
平面型光導波路２３の外壁に付着した検体が有する蛍光体色素は、円筒型光導波路１１に導光された励起光による、エバネッセント光により励起し蛍光を発する。この蛍光は、一部が円筒型光導波路１１に取り込まれ、円筒型光導波路１１を伝播して円筒型光導波路１１の他端に形成された回折格子１２によって分光され円筒型光導波路１１の外部に取り出される。外部に取り出された蛍光は、集光レンズ１７により集光され、光センサー１９で検出される。
【００４１】
平面型光導波路２３としては、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）を用いることができる。本構成では、ＰＳ，ＰＭＭＡまたはＰＣを用いることが好ましい。
【００４２】
本発明の、上記の第１〜第４の実施の形態では、光導波路に導光された励起光が、光の入射面に戻らないので、励起光の戻り光による、発光光源の出力変動が抑制され、本願発明の課題を解決するものである。出力端に回折格子を形成すると端面から出力させるよりも励起光が出力端で反射されなくなる。出力端に回折格子を形成し、更に、出力端の反射を抑制する為に出力端を、光を吸収する端面にすることがさらに好ましい。
【００４３】
また、光の入力端と出力端とはともに流路から突出し、側面から光を導光、導出するので、端面から光を導光する際の光の口径、位置合わせを従来技術ほど厳密にあわせる必要がないために、流路と光導波路とが組み合わせられた光分析用装置用チップを大量に用意し、光源と検出装置とからなる分析装置に光分析用装置用チップを配することで分析を行うことができる。
【実施例】
【００４４】
以下本発明の実施例を述べるが、本発明はここに記述した内容だけに制限を受けるものではない。
（実施例１）
図１を参照しながら説明する。１１の円筒型光導波路としては、両端に導波用の回折格子１２と分光用の回折格子１３をそれぞれ設けてある直径が約１ｍｍ、長さが４０ｍｍのＰＳ製の棒を用いた。１４のコリメートレンズとしては、平凸レンズ（シグマ光機、５ｍｍφ）を用いた。１５の光源としては、レーザーダイオード（三洋電機、ＤＬ３０３８−０３３）を用いた。１６，１７の集光レンズとしては平凸レンズ（シグマ光機、１０ｍｍφ）を用いた。１８，１９の光センサーとしては、フォトダイオード（浜松ホトニクス、Ｓ２８３３−０１、平凸シリンダーレンズ）を用いた。２０の流路としては、黒色のプラスチック樹脂を用いた。
【００４５】
光導波路を濃度が１ｘ１０-7ｍｏｌ／ＬのＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米）製品の蛍光色素）溶液に浸漬したあと、完成した光学系に設置した。レーザーダイオードからレーザー光（波長：約６３８ｎｍ、実効強度：３ｍW、１３５Ｈｚの矩形波で変調）を導入したところ、光導波路表面の蛍光がエバネッセント光により励起され、回折格子により励起光と蛍光が分光され、フォトダイオードで高感度に検出されることが確認された。
次に、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡの検出を試みる。まず光導波路表面にストレプトアビジンを付着させる。それからビオチン修飾したＰＳＡ抗体を吸着させ、免疫センサーを用意し蛍光分析装置にセットする。そして次のプロトコールをおこなう。
（１）Ｃｙ５色素で蛍光標識した抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（２）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（３）抗原であるタンパク質が混入している溶液を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（４）抗原溶液を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（５）標識抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（６）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（７）リン酸緩衝液を流路に注入する。
【００４６】
（７）の操作のあとレーザー光を導入し、ＰＳＡたんぱく質の濃度を測定すると、０．１ｎｇ／ｍＬまで非常に感度よく測定されることが確認された。
【００４７】
（実施例２）
実施例１で使用した光学系を用いて、ＤＮＡのハイブリダイゼーション測定をおこなった。光導波路表面にストレプトアビジンを付着させ、ビオチン修飾した２０量体プローブＤＮＡを吸着し、免疫センサーを用意した。そして次のプロトコールをおこなった。
（１）塩基配列が固定ＤＮＡ（プローブ）と対応する捕捉ＤＮＡ（ターゲットＴ１，２０量体）にＣｙ５色素で蛍光標識した複合体と、塩基配列が一つだけ異なっている２０量体ＤＮＡ（ターゲットＴ２，２０量体）をＣｙ３色素で標識した複合体が混入している検体液を用意する。
（２）検体液を流路に導入した後、５分間インキュベートする。
（３）検体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）リン酸緩衝液を流路に注入する。
【００４８】
（３）の操作のあとレーザー光を導入し、蛍光強度を測定すると、ＤＮＡ（ターゲットＴ１，２０量体）の濃度１ｎＭまで感度よく測定されることが確認された。蛍光のスペクトルを分光器（不図示）で測定してみると６７０ｎｍ付近にピークをもつ色素のみが蛍光を発していることが確認され、Ｔ１のＤＮＡだけが特異的に結合していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の第１の実施の形態を示す概略図である。
【図２】本発明の第２の実施の形態を示す概略図である。
【図３】本発明の第３の実施の形態を示す概略図である。
【図４】本発明の第４の実施の形態を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５０】
１１  円筒型光導波路
１２、１３  回折格子
１４  コリメーターレンズ
１５  光源
１６、１７  集光レンズ
１８、１９  光センサー
２０  流路
２１、２２  注入口／排出口
２３  平面型光導波路
２４、２５  ミラー
【図１】
2005180964.tif 000003
【図２】
2005180964.tif 000004
【図３】
2005180964.tif 000005
【図４】
2005180964.tif 000006