(57)【要約】【課題】  Ｇ因子系リムルス反応を利用する新しい測定系を提供する。【解決手段】  非プロトン性溶剤へ溶解させることによって1本鎖にしたβ-1,3-グルカンを1本鎖の核酸と水中で接触させることによって得られるβ-1,3-グルカンの2本鎖と核酸の1本鎖から成る3重螺旋構造の複合体にＧ因子系リムルス試薬を反応させることを特徴とするβ-1,3-グルカンまたは核酸の測定法。生体試料中に微量存在するβ-1,3-グルカンまたは核酸（特にmRNA）の測定を簡便かつ同一の原理で行なうことができる。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-1,3-グルカンの2本鎖と核酸の1本鎖から成る3重螺旋構造の複合体にＧ因子系リムルス試薬を反応させることを特徴とするβ-1,3-グルカンまたは核酸の測定法。
【請求項２】
β-1,3-グルカンが試料中の測定対象物であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
核酸が試料中の測定対象物であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項４】
核酸が、ポリ（A）、ポリ（C）、ポリ（dA）、およびそれらが結合している核酸より選ばれた１種または２種以上の混合物であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項５】
核酸がメッセンジャーRNAであることを特徴とする請求項４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-1,3-グルカンの検出方法として知られているＧ因子系リムルス反応の新規な活性化方法を提案するものであり、かつその活性化を応用することによって生体試料などに含まれる微量のβ-1,3-グルカンまたは核酸を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カブトガニの血球抽出物（リムルス・アメボサイト・ライセート：LAL）がエンドトキシンによって凝固することをLevinおよびBangが発見して以来、この現象を利用したリムルステスト（Ｃ因子系）がエンドトキシンの検出に適用されてきた。
【非特許文献１】Levin, J. and Bang, F.B. Bull. , Johns Hopking Hosp., 115, 265  (1964)
【０００３】
また、LAL中には、Ｃ因子系の外にβ-1,3-グルカンと反応する系（Ｇ因子系）も存在することが認められ、Ｇ因子系に特異的に反応するように調製されたリムルス試薬は、真菌感染症患者の血液中に見出されるβ-1,3-グルカンの検出・診断などの目的に使用されるようになってきた。
【非特許文献２】Kakinuma, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 101,434 (1981)
【非特許文献３】Morita, T., et al., FRBS Lett., 129, 318 (1981)
【非特許文献４】中村隆範ら、日本細菌学雑誌、38、781（1983）
【非特許文献５】ObayashiT. et al., Clin. Chim. Acta, 149, 55-65(1985)
【特許文献１】再表99/011671（真菌からの（1→3）-β-D-グルカンの調製法）
【特許文献２】特開平6-70796（（前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定キット及び感染症の診断法）
【特許文献３】特開2003-176304（アスペルギルス由来グルカン）
【０００４】
Ｇ因子系のリムルス反応を選択的に遂行するためには、共存するエンドトキシンなどの競合または妨害因子を除き、β-1,3-グルカンへの感応性を高めるための工夫が必要となる。β-1,3-グルカンは、通常、天然では３重螺旋構造で存在するが、Ｇ因子に対する反応性は、３重螺旋構造のままでは不活性で、１本鎖の螺旋構造をとる場合に活性であることが知られている。
【非特許文献５】Saito H.et al., Carbohydr. Res., 217, 181-190(1991)
【非特許文献６】Tanaka S.et al., Carbohydr. Res., 218, 167-174(1991)
【非特許文献７】Aketagawa J. et al., J.Biochem., 113,683-686(1993)
【０００５】
したがって、Ｇ因子系リムルス反応を利用するβ-1,3-グルカンの測定においては、β-1,3-グルカンがＧ因子系リムルス反応を活性化し得ることが必要であり、そのための手段が講じられている。例えば、試料液の強アルカリ処理がβ-1,3-グルカンの活性増進に有効であることは、アルカリ液中でβ-1,3-グルカンが１本鎖構造へ変換されることと対応しているものと考えられる。
【特許文献４】特開平07-128337（（1→3）‐β‐D‐グルカンの測定法）
【０００６】
一方、生体試料中における微量の核酸を検出する方法には、ハイブリダイゼーションと一連の酵素反応によって生じる光のシグナルを検出するルシフェラーゼ定量法、PCR法など種々の方法が知られている。それらの方法は、一般に、検出感度や定量性において優れているが、高価な設備や特殊な技術が必要で、手軽に測定するには困難さを伴いがちである。そして、リムルス反応が核酸の測定に適用できることは、これまでに全く想到されていなかった。
【非特許文献７】Promega Corp.;Technical Bulletin No.282
【非特許文献８】Agilent Technologies.; ProductsBulletin
【特許文献５】特開平11-89596(RNA量の測定方法並びに測定キット）
【特許文献６】特開平11-299946(RNAの検出方法）
【特許文献７】特開2000-333699(リボ核酸の検出方法）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、Ｇ因子系リムルス反応を利用する新しいタイプの測定系を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、先に、天然で３重鎖の構造をとるβ-1,3-グルカンは、DMSO等の非プロトン性溶剤への溶解によっても１本鎖に解くことが可能であり、１本鎖になった状態で同じく１本鎖の核酸と水中で接触させることにより、β-1,3-グルカンの２本鎖と核酸の１本鎖から、３重螺旋構造状の複合体が生成することを見出している。
【非特許文献９】櫻井, 新海, J. Am. Chem. Soc., 122,4520（2000）
【非特許文献１０】木村, 甲元, 櫻井,新海, Chem. Lett., 1242（2000）
【特許文献８】PCT/JP00/02228
【０００９】
本発明者は、このたび、そのように生成したβ-1,3-グルカンと核酸の複合体は、Ｇ因子系リムルス反応に活性を呈し、かつβ-1,3-グルカン単独の場合より感度が高いことを発見して本発明を導き出した。
【００１０】
かくして、本発明は、β‐1,3-グルカンの2本鎖と核酸の1本鎖から成る3重螺旋構造の複合体にＧ因子系リムルス試薬を反応させることを特徴とするβ‐1,3-グルカンまたは核酸の測定法を提供するものである。
本発明の方法においては、β‐1,3-グルカンが試料中の測定対象物である場合のみならず、核酸を試料中の測定対象物とすることもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に従えば、比較的簡単なＧ因子系リムルス試薬との反応操作により、試料中に存在する微量のβ-1,3-グルカンを検出することが出来る。また本反応の別の応用として、試料中に存在する微量の核酸（特にmRNA）を検出することも出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明で用いるＧ因子系リムルス試薬とは、よく知られているように、カブトガニの血球抽出物から得られ、β-1,3-グルカンと特異的に反応するように調製された試薬であり、各種の市販の試薬を用いることができる。反応量の検出方法についてもゲル化転倒法、比濁時間分析法、合成基質法など通常よく用いられている方法を使って測定することができる。
【００１３】
Ｇ因子系リムルス試薬に反応するβ-1,3-グルカンは、主鎖がβ-1,3-グルコシド結合からなる、β-1,3-グルカンである。ただし、必ずしも完全なβ-1,3-グルコシド結合でなくて、部分的にβ-1,6-またはβ-1,4-グルコシド結合を有していてもかまわない。そのような多糖類の例として、カードラン、シゾフィラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン、スクレログルカン、リケナン、ザイモサンなどを挙げることができる。
【００１４】
β-1,3-グルカンの分子量は、小さすぎるとＧ因子系リムルス試薬に対する反応性の低下とともに、本発明で必要な、核酸との複合体の安定性が低下するため、2000程度以上の分子量のものが適当である。
【００１５】
一方、β-1,3-グルカンと安定な３重螺旋構造の複合体を形成しうる好適な核酸として、Poly(A)、Poly(C)およびPoly(dA)がある。また、それらの核酸の残基が結合したもの、例えば、Poly(A)テールを有するメッセンジャーRNA（mRNA）などが本発明のＧ因子系リムルス反応の促進剤として、ならびに測定対象の核酸として挙げられる。
【００１６】
本発明では、Ｇ因子系リムルス反応を行う前に、測定対象物質の複合体化処理を行う必要があり、このためには、既述のように、天然で3重鎖構造をとるβ‐1,3‐グルカンを非プロトン性溶媒（例えば、DMSO）に溶解して1本鎖にし、この状態で同じく1本鎖の核酸を水中で接触させるようにする。β-1,3-グルカンを測定対象とする場合、予め試料中に特定の核酸を添加し、存在するβ-1,3-グルカンの全量を複合体化するが、その際の核酸の添加量は、β-1,3-グルカンの推定存在量の少なくとも１当量が必要である。また、核酸が測定対象で、β-1,3-グルカンが添加される標準品である場合も同様に、β-1,3-グルカンの添加量は、核酸の推定存在量の少なくとも１当量が必要である。ここで、１当量とは、β-1,3-グルカンの２本鎖と核酸１本鎖が複合体を形成するという前提で計算される多糖類と核酸との当量関係を表すものである。例としてβ-1,3-グルカンにシゾフィランを、核酸にPoly(A)を用いるときの当量関係は、図１の複合体構造モデルにおいて繰り返し単位に含まれるグルコース残基とアデニン残基の比率が８/３のときを１当量と定める。
【００１７】
β-1,3-グルカンと核酸を複合体化する具体的条件を記述すると、例えば、β-1,3-グルカンのDMSO溶液と核酸、10mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）、滅菌水を混合し、水/DMSOの体積比が92／8となるように調製する。これを4℃で2日間以上静置し、複合体を形成させる。
【００１８】
複合体処理された試料液をＧ因子系リムルス試薬と反応させる際の条件および検出方法は、通常のβ-1,3-グルカンを測定する場合と原理的には変わらないが、リムルス試薬に対するβ-1,3-グルカン/核酸複合体の感度と、単独で存在するβ-1,3-グルカン（または核酸）の感度との差異がなるべく大きくなるような条件を選ぶため、市販のＧ因子系リムルス試薬の使用条件とは若干異なる部分が生ずる。β-1,3-グルカン/核酸複合体は高温になると解離するため、インキュベート温度は16℃で行い、反応量の検出は、例えば、一定時間経過後のＧ因子系リムルス反応で生成するｐ-ニトロアニリンの量を405 nmにおける吸光度の測定（マイクロプレートリーダー使用）によって行う。
【００１９】
インキュベート時間（測定までの経過時間）の選定については、特に限定されるものではないが、β-1,3-グルカン/核酸複合体の応答変化が最大となる付近（約40分）に設定するのは、β-1,3-グルカン/核酸複合体の応答とβ-1,3-グルカンが単独で存在する場合の応答との差異が最大となり、適当と考えられる。
【００２０】
本発明で、試料中に存在するβ-1,3-グルカンまたは核酸の量を定量する方法としては、通常の検量線法（外部標準法、標準添加法など）を使用することができる。
以下に本発明の特徴を更に具体的に示すために実施例を記すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
β-1,3-グルカン（シゾフィラン）の調製
β-1,3-グルカンとして３重螺旋構造のシゾフィラン（SPG）を文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ATCC（American Type Culture
Collection）から入手したSchizophyllum commune. Fries（ATCC 44200）を、最小培地を用いて7日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量45万の3重螺旋シゾフィランを得た。
【非特許文献１１】GregoryG. Martin, Michael F. Richardson, Gordon C. Cannon and Charles L. McCormick,Am. Chem. Soc. Polymer Prepr., 38(1),253-254(1997)
【非特許文献１２】Kengo Tabata,Wataru Ito, TakemasaKojima, Shozo Kawabata andAkira Misaki, Carbohydrate Research, 89,121-135(1981)
【実施例２】
【００２２】
シゾフィランとポリ（A）との複合体の調製  実施例1で得られたSPGをDMSOに5mg/mlとなるように溶解させた（SPG stock）。また、poly(A)は1mg/mlとなるように滅菌水に溶解させた（poly(A)
stock）。滅菌水、10mMトリス緩衝液（pH8.0）、poly(A) stock、DMSOを表1に示すように種々の割合で混合した。そこへ表1に示すようにpoly(A)とSPGの当量比が1:1となるようにSPG
stockを添加し（SPG終濃度0.1mg/ml）、2日間以上4℃にて熟成させた。この方法で調製された溶液は全て透明で均一であった。また、コントロールとしてSPGのみ及びpoly(A)のみの溶液も調製した。
【００２３】
【表１】
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【実施例３】
【００２４】
Ｇ因子系リムルステストを利用したシゾフィランとポリ（A）複合体の検出
実施例2で調製した複合体溶液を2500倍希釈（SPG終濃度は40ng/ml、poly(A)濃度は33ng/ml）し、それらの溶液25μlを96-wellマイクロプレートに分注した。そこへＧ因子系リムルス試薬としてファンギテックGテストMK（生化学工業（株））主反応溶液（主剤＋蒸留水＋緩衝液）を100μl添加して16℃でインキュベートした。一定時間おきにマイクロプレートリーダー（大日本製薬製）で405nmと492nm（対照波長）を測定した。図２に405nmの吸光度の時間変化を示す。70分付近までは、コントロールのSPGのみ及びpoly(A)のみでは吸光度の上昇はあまりみられなかった。それに対してSPG/poly(A)複合体においては約10分後から時間経過につれて吸光度の大幅な上昇が見られ、70分付近でほぼ一定となった。
【実施例４】
【００２５】
SPGの濃度を固定し、poly(A)の濃度を変えた試料を調製して、実施例３と同じ方法によるリムルステストを行った。インキュベート40分後の吸光度とpoly(A)/SPG当量比との関係を図３に記載した。その結果によると、当量比が１付近まではほぼ直線関係が成立し、poly(A)の濃度を定量するための検量線作成が可能と判断される。
【実施例５】
【００２６】
RNAホモポリマーの種類を変えて、実施例３と同様なテストを行った。図４の結果に示すように、SPGと複合体を形成することが報告されているポリ（C）においてはポリ（A）の場合とほぼ同様の核酸濃度依存的な吸光度の上昇がみられる。それに対して複合体を形成しないポリ（G）及びポリ（U）においては吸光度の核酸濃度依存的な上昇は観測されない。
【非特許文献１３】Kazuo Sakurai, Masami Mizu, Seiji Shinkai, Biomacromolecules, 2, 641（2001）
【実施例６】
【００２７】
ポリ（A）の検量線作成  SPG濃度を固定してポリ（A）濃度を変化させ、検量線の作成を行った。サンプルの調製は実施例2と同様の操作で行い、4℃で3日間熟成した。調製したサンプルを適宜希釈していき、SPG濃度で100および40ng/mlの溶液を得た。ポリ（A）の濃度は図５のＸ軸上に示した濃度とした。これらの溶液25μlにファンギテックGテスト溶液100μlを添加し、インキュベート温度を16℃としてプレートリーダーにより測定を行った。インキュベート40分後の結果を図５（a）及び（b）に示す。どちらのSPG濃度においても特定のポリ（A）濃度領域においてポリ（A）濃度と吸光度の間に良好な直線関係が得られた。標準として添加するSPGの濃度を変化させることで異なる領域のポリ（A）濃度で検出が可能であり、SPG濃度を低くすることでより低濃度のポリ（A）を検出できる。
【実施例７】
【００２８】
複合体濃度に対する直線性  種々のSPG濃度に対してポリ(A)を1当量あるいは0.4当量となるように実施例2と同様の操作でサンプルを調製した。同様にポリ(A)を含まないサンプルも調製した。熟成は4℃で3日間行った。得られたサンプルを適宜希釈し、SPG濃度で100,60,40,20,10,2ng/mlとなる溶液を調製した。これらの溶液25μlにファンギテックGテスト溶液100μlを添加し、インキュベート温度を16℃としてプレートリーダーにより測定を行った。インキュベート40分後の結果を図６に示す。この図より、SPGに対してポリ(A)を1当量、0.4当量添加した場合の両方において複合体濃度と吸光度との間に良好な直線関係が見られた。また、ポリ(A)の添加量がSPGの0.4当量しかない場合は、同じSPG
濃度で1当量存在する場合のほぼ0.4倍の吸光度しか示さないことおよびポリ(A)不在下での吸光度はわずかであることから、吸光度は当量関係にある複合体の濃度に直線的に依存することがわかった。以上の結果から、少なくとも複合体を形成するに足る量のポリ(A)のような核酸を添加することによって、試料中に存在するシゾフィランのようなβ-1,3-グルカンの定量が本法によって可能と判明した。
【実施例８】
【００２９】
mRNAによる濃度勾配直線  マウス小脳由来total RNA（UNITECH. Co., Ltd.）からOligotex-MAG
mRNA Purification Kit（From Total RNA）（TAKARA）を用いてmRNAの精製を行った。この精製操作は2回行った。得られたmRNAをUV測定により定量し（11μg/ml）、実施例６と同様にmRNAとSPGを混合してサンプルの調製を行った。調製したサンプルを希釈し、SPG濃度100ng/mlとした。mRNA濃度は図７のＸ軸に示した濃度とした。これらの溶液25μlにファンギテックGテスト溶液100μlを添加し、インキュベート温度を16℃としてプレートリーダーにより測定を行った。図７にインキュベート40分後の結果を示す。この図より、mRNAの濃度と吸光度の間に良好な直線関係があることがわかった。
【００３０】
mRNAと同様にしてrRNA及びtRNAをサンプルとして用いた場合はmRNAの場合のようなRNA濃度依存的な吸光度の上昇は観察されなかった。従って本発明に従う測定系はmRNA特異的であると言える。表２に種々のRNAに対する本測定法の特異性を示す。
【００３１】
【表２】
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【実施例９】
【００３２】
total
RNAによる濃度勾配直線  マウス小脳由来total RNA（UNITECH. Co., Ltd.）を実施例5と同様の操作でSPGと混合した。このときのtotal RNA量は実施例８に示したmRNAの場合の100倍量とした。調製したサンプルを希釈し、添加SPGの濃度を100ng/mlとした。これらの溶液25μlにファンギテックGテスト溶液100μlを添加し、インキュベート温度を16℃としてプレートリーダーにより測定を行った。インキュベート40分後の結果を図８に示す。この図に示すように特定の濃度領域においてtotal
RNA量と吸光度の間に直線関係があることを確かめた。total RNA中の大部分を占めるrRNAとtRNAには実質的に応答を示さないことから、吸光度の上昇はtotal RNA中に1-3%含まれるmRNAによるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、真菌感染症患者の血液中に見出されるβ-1,3-グルカンの検出・診断などにおいて、また遺伝子工学分野における各種試料中の核酸（特にmRNA）の分析において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】SPG/Poly(A)複合体の構造モデルを示す。
【図２】リムルステストの吸光度経時変化におけるSPG/poly(A)複合体、SPG及びpoly(A)の比較（実施例３）を示す。
【図３】リムルステストの吸光度に及ぼすpoly(A)/SPG当量比の影響（実施例４）を示す。
【図４】RNAホモポリマーに対する特異性（実施例５）を示す。
【図５】ポリ（A）の検量線例（実施例６）を示す。
【図６】SPG/poly(A)複合体の濃度と吸光度の関係例（実施例７）を示す。
【図７】mRNAによる濃度勾配直線例（実施例８）を示す。
【図８】totalRNAによる濃度勾配直線例（実施例９）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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