(57)【要約】【課題】発酵法に比べて副産物の生成が少なく、製造装置が簡便でエネルギー消費量も少ないε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法を提供する。【解決手段】ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物から得られた酵素液に、Ｌ−リジン、アデノシン三リン酸、並びにマグネシウムイオン及び／またはマンガンイオンを加えて混合することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物から得られた酵素液に、Ｌ−リジン、アデノシン三リン酸、並びにマグネシウムイオン及び／またはマンガンイオンを加えて混合することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項２】
酵素液がε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞抽出液からなる請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項３】
酵素液がε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分からなる請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項４】
酵素液が、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分を多水酸基化合物、還元剤、及び金属キレート剤を含有するｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁させてなる請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項５】
酵素液が、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分を多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤、及び界面活性剤を含有するｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁させてなる請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項６】
酵素液が、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分を多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤、及び界面活性剤を含有するｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁させた後、得られた懸濁液から細胞膜成分を分離除去し、細胞膜成分を分離除去した後の液を陰イオン交換体で処理してなる請求項１記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項７】
ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物が、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ  ）のＮｏ．３４６−Ｄ株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３８３４号）、Ａ１１０１１Ａ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−１１０９号）、５０８３３株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−１１１０号）、Ｂ２１０２１株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１９３号）、Ｂ１５２０８株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８２号）、Ｂ１６２０６株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８１号）、ストレプトマイセス・ノールセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−９７９７号）、及びストレプトマイセス  ｓｐ．  ＳＰ−７２株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８１０号）から選ばれた少なくとも１種である請求項１〜６のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、アミノ酸の一種であるＬ−リジンがε位のアミノ基とα位のカルボキシル基を介して直鎖状に連なった化合物で、現在食品添加物等に用いられている。ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法としては、放線菌のストレプトマイセス属に属するε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌株やその変異株を液体培地中で培養し、その培養液中からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する製造法が知られている（例えば、特許文献１、２及び３参照）。これらの方法は微生物の増殖を伴ういわゆる発酵法である。
また、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌の固定化菌体を用いる製造法も知られているが（例えば、特許文献４参照）、生きた菌体を用いるため、実質的には発酵法といえる。
【０００３】
発酵法によってε−ポリ−Ｌ−リジンを製造する場合、グルコースや硫酸アンモニウム等の比較的安価な原料から製造できる反面、微生物の生命活動に伴う数多くの副産物が生成する。実際の製造では、これらの副産物はイオン交換樹脂等を用いて除去することが可能であるが、副産物が少なければ少ないほどε−ポリ−Ｌ−リジンへの副産物の混入のリスクが低減され、ε−ポリ−Ｌ−リジンを製造する際の精製コストも低減することができる。
また、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌は主に放線菌で好気性菌であるため、培養には酸素または空気が必要不可欠で、通気と攪拌が必要となる。そのため、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌の培養には通気と攪拌が可能な培養槽が必要となる。
更に、放線菌やカビは培養液中で菌糸を伸ばして増殖するため培養液の粘度が上昇する。そのため培養液の攪拌には大きな攪拌動力をもつ攪拌装置が必要となり、このような攪拌装置の運転ではエネルギー消費量も大きくなる。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭５３−７２８９６号公報
【特許文献２】
特開平３−１４３３９８号公報
【特許文献３】
特開平９−１７３０５７号公報
【特許文献４】
特開平６−８６６８６号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、発酵法に比べて副産物の生成が少なく、製造装置が簡便でエネルギー消費量も少ないε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物から得られた酵素液に、Ｌ−リジン、アデノシン三リン酸、並びにマグネシウムイオン及び／またはマンガンイオンを加えて混合することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法によって前記課題が解決できることを見出し、その知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は、以下によって構成される。
（１）ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物から得られた酵素液に、Ｌ−リジン、アデノシン三リン酸、並びにマグネシウムイオン及び／またはマンガンイオンを加えて混合することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（２）酵素液がε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞抽出液からなる前記（１）項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（３）酵素液がε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分からなる前記（１）項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（４）酵素液が、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分を多水酸基化合物、還元剤、及び金属キレート剤を含有するｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁させてなる前記（１）項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（５）酵素液が、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分を多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤、及び界面活性剤を含有するｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁させてなる前記（１）項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（６）酵素液が、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物の細胞膜成分を多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤、及び界面活性剤を含有するｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁させた後、得られた懸濁液から細胞膜成分を分離除去し、細胞膜成分を分離除去した後の液を陰イオン交換体で処理してなる前記（１）項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（７）ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物が、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ  ）のＮｏ．３４６−Ｄ株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３８３４号）、Ａ１１０１１Ａ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−１１０９号）、５０８３３株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−１１１０号）、Ｂ２１０２１株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１９３号）、Ｂ１５２０８株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８２号）、Ｂ１６２０６株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８１号）、ストレプトマイセス・ノールセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−９７９７号）、及びストレプトマイセス  ｓｐ．  ＳＰ−７２株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８１０号）から選ばれた少なくとも１種である前記（１）〜（６）項のいずれか１項記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法は、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物から得られた酵素を用いる酵素反応により、Ｌ−リジンを重合させてε−ポリ−Ｌ−リジンを製造する方法である。具体的には、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物から得られた酵素液に、ε−ポリ−Ｌ−リジンの合成に必要なＬ−リジン、アデノシン三リン酸、並びにマグネシウムイオン及び／またはマンガンイオンを加えて混合し、酵素の触媒作用によって重合反応を生じさせε−ポリ−Ｌ−リジンを製造する。
【０００９】
前記の酵素反応に用いる酵素は、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物を培養し、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産途上にある微生物から得られる。
本発明で用いられるε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物に特に限定はない。好ましいε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ  ）のＮｏ．３４６−Ｄ株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３８３４号）、Ａ１１０１１Ａ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−１１０９号）、５０８３３株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＰＢ−１１１０号）、Ｂ２１０２１株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１９３号）、Ｂ１５２０８株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８２号）、Ｂ１６２０６株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８１号）、ストレプトマイセス・ノールセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−９７９７号）、及びストレプトマイセス  ｓｐ．  ＳＰ−７２株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８１０号）のようなε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌が挙げられる。また、これらの菌株の変異株、または遺伝子組み換えによる改変株、更に菌株のε−ポリ−Ｌ−リジン生産に関与する酵素の遺伝子を、他の微生物に導入して得られた微生物等も使用することができる。
【００１０】
ε−ポリ−Ｌ−リジン生産能を有する微生物が上記のε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌の場合、培養に用いる培地は炭素源、窒素源、無機物、ビタミンが含まれていれば特に限定はされない。炭素源としてグルコースもしくはグリセロール等、窒素源としては硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム、無機物としてはリン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を用いることができる。またビタミンの供給源としては酵母エキスが好ましい。
【００１１】
前記ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌の培養は好気的条件下で振盪培養、撹拌培養等により行うことができる。培養温度は２５〜３５℃が好ましい。培地のｐＨは中性付近（ｐＨ６〜８）が好ましい。培養開始後菌の生育とともにｐＨが低下していく場合はｐＨ４となった時点でアルカリを添加しｐＨを４に維持させる。添加するアルカリはアンモニア水が好ましいが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等でも差し支えない。
【００１２】
前記ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌培養中のε−ポリ−Ｌ−リジンの生成は、イツアキ（Ｉｔｚｈａｋｉ）らのアナリティカルバイオケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），５０，  ５６９．  （１９７２）に記載された方法により確認できる。すなわち、培養液を遠心分離して菌体を除いた後、上澄液２ｍｌと１ｍｍｏｌ／ｌメチルオレンジ水溶液２ｍｌを混合し、室温で３０分間放置後、生じたε−ポリ−Ｌ−リジンーメチルオレンジコンプレックスを遠心分離で取り除き、その上澄液の４６５ｎｍの吸光度を測定することにより、培養液中のε−ポリ−Ｌ−リジン濃度を測定する方法である。
【００１３】
上記のように培養したε−ポリ−Ｌ−リジン生産期における菌体から、本発明の酵素反応に用いる酵素液を得るためには、菌体を多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤を含んだｐＨ６から９の緩衝液に懸濁させ、破砕処理を行って破砕処理液を得、破砕処理液を遠心分離して、上澄液の細胞抽出液を得る。得られた細胞抽出液は、本発明のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法において、Ｌ−リジンの重合触媒となる酵素液として用いることができる。
このときの菌体の破砕方法としては、超音波破砕装置、フレンチプレス、ホモジナイザー等を用いた機械的破砕法、リゾチーム等を用いた酵素的破砕法を用いることができる。また多水酸基化合物としては、グリセロールやグルコース等を、還元剤としてはジチオトレイトールやメルカプトエタノール等、金属キレート剤としてはエチレンジアミン四酢酸等を用いることができる。また緩衝液にはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンや一連のグッドの緩衝液等を用いることができる。
【００１４】
更に、ε−ポリ−Ｌ−リジンの重合反応を触媒する酵素が、細胞膜結合型の酵素の場合は、上記の細胞抽出液から遠心分離によって細胞膜成分のみを回収することができる。遠心分離の条件は遠心加速度８０，０００×ｇで、１時間以上が望ましい。この細胞膜成分を上記と同様の多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤を含んだｐＨ６から９の緩衝液に懸濁させて得られた細胞膜成分懸濁液は、本発明のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法において、Ｌ−リジンの重合触媒となる酵素液として用いることができる。細胞膜成分懸濁液は、細胞抽出液に比べて活性の高い酵素液である。
【００１５】
また、この細胞膜成分を、多水酸基化合物、還元剤、金属キレート剤に更に界面活性剤を加えてｐＨ６から９に調整した緩衝液に懸濁させて得られた細胞膜成分の界面活性剤処理液は、細胞膜結合型の酵素の一部が緩衝液に可溶性となるため、基質との親和性が高まりより酵素活性の高い酵素液である。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤である一連のＢｒｉｊ（Ｒ）シリーズ（商品名、ＩＣＩアメリカ社製）やＴｗｅｅｎ（Ｒ）シリーズ（商品名、ＩＣＩアメリカ社製）のほか両性イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（Ｒ）（商品名、（株）同仁化学研究所製）やＣＨＰＳＯ（Ｒ）（商品名、（株）同仁化学研究所製）等を用いることができる。
【００１６】
また、界面活性剤を加えた緩衝液に細胞膜成分を懸濁させた界面活性剤処理液を、再度超遠心分離を行って、細胞膜成分を取り除き、界面活性剤で可溶化状態にある酵素を回収することができる。この可溶化状態にある酵素が負の電荷を帯びている場合は、陰イオン交換体に吸着させた後、溶出させることによって、正の電荷の物質が取り除かれた酵素活性の高い酵素液である陰イオン交換体処理液を得ることができる。この処理液を用いて酵素反応を行った場合、反応液中に存在する正の電荷を帯びた高分子が、ε−ポリ−Ｌ−リジンのみとなるため、陽イオン交換体を用いて精製することで、容易に純度の高いε−ポリ−Ｌ−リジンを得ることができる。
【００１７】
上記の方法で得ることのできる酵素液はそのまま酵素反応の触媒として用いることができるが、必要に応じて固定化して用いることもできる。
【００１８】
本発明のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法においては、Ｌ−リジンの重合触媒となる酵素液として、細胞抽出液、細胞膜成分懸濁液、界面活性剤処理液、または陰イオン交換体処理液が用いられる。
本発明の製造法においては、酵素液の他に、基質となるＬ−リジン、アデノシン三リン酸、並びにマグネシウムイオン及び／またはマンガンイオンを反応液中に加えることによって重合反応が進行し、ε−ポリ−Ｌ−リジンが生成する。反応液中に加えるアデノシン三リン酸の濃度は１〜２５ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。またマグネシウムイオンとしては硫酸マグネシウムや塩化マグネシウム等を用いることができ、またマンガンイオンを添加する場合は、塩化マンガン、硫酸マンガン等を用いることができる。その時の濃度はどちらの場合も１〜３０ｍｍｏｌ／ｌ程度が好ましい。また必要に応じて酵素液の成分にも含まれるジチオトレイトールやメルカプトエタノールを０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌ程度加えることが好ましい。また反応液中のｐＨの変化を最小限に抑えるために１００ｍｍｏｌ／ｌ程度の緩衝液を加えることもできる。
【００１９】
本発明の製造法において、反応温度は通常２５〜３５℃であり、反応時間は通常５〜２０時間である。反応終了後、反応液は陽イオン交換樹脂により精製され、濃縮され、濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することによってε−ポリ−Ｌ−リジンが得られる。
【００２０】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はその趣旨を超えない限り、この実施例の範囲には限定されない。また、％の表示は特に断りのない場合は重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％を意味する。
【００２１】
（酵素液調製に用いる菌体の調製）
グルコース５％、酵母エキス０．５％、硫酸アンモニウム１％、Ｋ２ＨＰＯ４０．０８％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１３６％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００４％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００３％、ｐＨ６．８の培地２リットルを調製し、３リットル容ジャーに入れ、これにストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス  Ｂ２１０２１株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１９３号）の前培養液１００ｍｌを接種し、３０℃、７００ｒｐｍ、通気量３リットル／ｍｉｎで９６時間、好気培養を行った。ただしｐＨの調整は１０％アンモニア水を用いてｐＨ４に維持した。グルコース及び硫酸アンモニウムについては、残存濃度が低下した時点で逐次添加した。この培養液をハイマックＣＲ２１（商品名、日立工機（株）製）を使用して遠心分離し集菌して、酵素液調製用の菌体を取得した。
【００２２】
（細胞抽出液の調製）
上記のようにして得られた菌体８０ｇに、グリセロール４０％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２００ｍｍｏｌ／ｌ、ジチオトレイトール１０ｍｍｏｌ／ｌ、エチレンジアミン四酢酸２ｍｍｏｌ／ｌからなり、塩酸によりｐＨ８．０に調整した緩衝液２００ｍｌを加えて懸濁させた後、超音波破砕機ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ４５０（商品名、ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて氷上で破砕処理を行った。この破砕処理液を、ハイマックＣＲ２１（商品名、日立工機（株）製）を使用して、遠心加速度１５，０００×ｇで２０分間遠心分離した。この時の上澄液を細胞抽出液とした。
【００２３】
（細胞膜成分懸濁液の調製）
上記の方法で得られた細胞抽出液２００ｍｌを、ハイマックＣＰ−８５β（商品名、日立工機（株）製を使用して、更に遠心加速度８０，０００×ｇで１時間遠心分離し、沈殿約０．８ｇを得た。得られた沈殿を細胞膜成分とした。得られた細胞膜成分０．８ｇを、グリセロール４０％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２００ｍｍｏｌ／ｌ、ジチオトレイトール１０ｍｍｏｌ／ｌ、エチレンジアミン四酢酸２ｍｍｏｌ／ｌからなり、塩酸によりｐＨ８．０に調整した緩衝液２００ｍｌに懸濁させ、細胞膜成分懸濁液とした。
【００２４】
（界面活性剤処理液の調製）
上記の方法で得られた細胞膜成分０．８ｇを、グリセロール４０％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２００ｍｍｏｌ／ｌ、ジチオトレイトール１０ｍｍｏｌ／ｌ、エチレンジアミン四酢酸２ｍｍｏｌ／ｌ、Ｂｒｉｊ  ５８（商品名、ＩＣＩアメリカ社製）１％からなり、塩酸によりｐＨ８．０に調整した緩衝液２００ｍｌに懸濁させたのち、４℃の低温室内で２時間マグネチックスターラーを用いて撹拌処理した。得られた処理液を界面活性剤処理液とした。
【００２５】
（陰イオン交換体処理酵素液の調製）
上記の方法で得られた界面活性剤処理液２００ｍｌを、ハイマックＣＰ−８５β（商品名、日立工機（株）製を使用して、遠心加速度８０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上澄液約２００ｍｌを得た。この上澄液をグリセロール４０％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５０ｍｍｏｌ／ｌ、ジチオトレイトール１ｍｍｏｌ／ｌ、エチレンジアミン四酢酸１ｍｍｏｌ／ｌ、Ｂｒｉｊ  ５８（商品名、ＩＣＩアメリカ社製）１％からなり、塩酸によりｐＨ８．０に調整した緩衝液で平衡化されたＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  Ａ−５００ｍカラム（（商品名）、チッソ（株）製、カラムサイズ５ｃｍ×２０ｃｍ、ゲル体積約４００ｍｌ）に流速２００ｍｌ／ｈで吸着させた後、平衡化に用いた緩衝液で洗浄した。その後グリセロール４０％、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５０ｍｍｏｌ／ｌ、ジチオトレイトール１ｍｍｏｌ／ｌ、エチレンジアミン四酢酸１ｍｍｏｌ／ｌ、Ｂｒｉｊ  ５８（商品名、ＩＣＩアメリカ社製）１％、塩化ナトリウム０．１ｍｏｌ／ｌからなり、塩酸によりｐＨ８．０に調整した緩衝液で溶出させた。このときの溶出液をフラクションコレクターにより２５ｍｌずつ分画し、タンパク質を含むフラクション１００ｍｌを回収した。この回収した溶液を陰イオン交換体処理酵素液とした。
【００２６】
（酵素法によるε−ポリリジン合成反応）
酵素反応は酵素液２０％（容量／容量）、塩化マグネシウム５ｍｍｏｌ／ｌ、アデノシン三リン酸ナトリウム５ｍｍｏｌ／ｌ、ジチオトレイトール５ｍｍｏｌ／ｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｌ−リジン５ｍｍｏｌ／ｌからなる反応液を、３０℃で１５時間静置した。静置後の反応液の測定結果を表１に示す。
【００２７】
【発明の効果】
酵素反応は、発酵法と比較し、副産物の生成が少ないためε−ポリ−Ｌ−リジンの精製が容易となる。また本発明の酵素反応では酸素を必要としないため、通気をしなくても反応は進行する。また撹拌については溶液が混ぜ合わさる程度の撹拌でよいため製造段階においては多大なエネルギーを必要としない。また更に細胞破砕、細胞膜成分の分離、界面活性剤処理、イオン交換体処理等の処理工程を経た酵素液を用いることで、酵素液の活性を高めることができるためより効率的なε−ポリ−Ｌ−リジン合成反応が可能となり、また酵素反応液中からのε−ポリ−Ｌ−リジンの精製が容易になる。
【００２８】
【表１】
表  １  酵素反応液中のタンパク濃度及びε−ポリ−Ｌ−リジンの生成量
2005052010.tif 000002