(57)【要約】【課題】  所望の機能または活性を有するたんぱく質複合体を、その機能または活性を損なわずに基体に固定化するための技術を提供すること。【解決手段】  所望の機能または活性を有するタたんぱく質複合体の複数のサブユニットの一部にリンカーを付与して、このリンカーを介して基体にたんぱく質複合体を固定する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ個のサブユニット（ｎは２以上である整数）からなるたんぱく質複合体であって、これらのサブユニットが、リンカーを有するｍ個のサブユニット（ｍは１以上ｎ−１以下である整数）と、リンカーを有さないｐ個のサブユニット（ｐ＝ｎ−ｍ）からなることを特徴とするたんぱく質複合体。
【請求項２】
前記ｎ個のサブユニットが同一であるか、あるいは前記ｎ個のサブユニットに２種以上の異なるサブユニットが含まれる（但し、リンカーを有するサブユニットの場合は、リンカー部分を除いた残りの部分を比較する）請求項１に記載のたんぱく質複合体。
【請求項３】
前記たんぱく質複合体は分子シャペロンである請求項１または２に記載のたんぱく質複合体。
【請求項４】
前記分子シャペロンがＧｒｏＥＬである請求項３に記載のたんぱく質複合体。
【請求項５】
前記たんぱく質複合体は、
（１）天然に存在するたんぱく質、
（２）天然に存在するたんぱく質のアミノ酸配列に対し、所望とする機能が維持または付与される範囲内で、アミノ酸の欠失、付加、及び他のアミノ酸残基による置換の少なくとも１種以上の変更を有する改変たんぱく質、及び、
（３）ランダムなアミノ酸配列からなるたんぱく質
のうち少なくとも１つから成る請求項１乃至４のいずれかに記載のたんぱく質複合体。
【請求項６】
前記リンカーが、前記たんぱく質複合体の基体への固定化用である請求項１乃至５のいずれかに記載のたんぱく質複合体。
【請求項７】
前記リンカーは、アミノ酸１分子以上の連なりからなるペプチドまたはたんぱく質である請求項１乃至６のいずれかに記載のたんぱく質複合体。
【請求項８】
前記リンカーは、前記サブユニットを構成するアミノ酸主鎖配列のアミノ基（Ｎ）末端またはカルボキシル基（Ｃ）末端に付加される請求項７に記載のたんぱく質複合体。
【請求項９】
前記ペプチドまたはたんぱく質が、ヒスチジン残基６ユニットを含む請求項７に記載のたんぱく質複合体。
【請求項１０】
変性たんぱく質の活性回復方法であって、
ｎ個のサブユニット（ｎは２以上である整数）の集合体として機能する分子シャペロンと前記変性たんぱく質とを接触させることにより、前記変性たんぱく質を回復する工程を有し、
前記分子シャペロンは、リンカーを有するｍ個のサブユニット（ｍは１以上ｎ−１以下である整数）とリンカーを有さないｐ個のサブユニット（ｐ＝ｎ−ｍ）から構成されることを特徴とする変性たんぱく質の活性回復方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサブユニットからなる複合体たんぱく質に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に必要不可欠な成分の一つであるたんぱく質は、既に食品工業、医薬品工業などさまざまな分野で利用されている。これは、たんぱく質は反応物に対する作用特性が非常に高いという特徴を有するためである。また、たんぱく質はもともと生体内に存在しているため、常温常圧といった穏和な条件下で効率よく機能を発現することから、省エネルギーという面からもたんぱく質の利用がこれまで以上に必要とされることが期待される。これらたんぱく質は３次元的な立体構造を成して初めて機能が発揮される。また、たんぱく質によっては複数のたんぱく質と自己組織的に会合し、複合体として機能を果すものも存在する。
【０００３】
複合体として機能を果すたんぱく質の一つに、分子シャペロンが挙げられる。分子シャペロンとは他のたんぱく質の正しい立体構造形成に関与するが、分子シャペロン自身は最終的な機能構造の構成成分とはならないたんぱく質ファミリーのことを指す。この分子シャペロンは細胞内においてたんぱく質の高次構造の形成・維持、たんぱく質の膜透過、細胞周期の調節、個体の発生・分化、免疫系など多くの生物種に共通する生理機能に関与していることが明らかになった（分子シャペロンによる細胞機能制御、永田和宏・森正敬・吉田賢右共編、シュプリンガー・フェアラーク東京、初版２００１年６月５日：非特許文献１）。また、分子シャペロンとして代表的なたんぱく質に、大腸菌内に存在するＧｒｏＥＬや葉緑体内のＲｕｂｉｓｃｏ結合たんぱく質、好酸好熱性古細菌ＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓのＴＦ５５たんぱく質など、多くの生物種に存在し共通した、たんぱく質の構造再形成を助ける等の役割を果すたんぱく質があり、これらは総称してシャペロニンと呼ばれている。
【０００４】
このうちＧｒｏＥＬは最も研究が進んでいる分子シャペロンの一つである。構造は７分子のサブユニットたんぱく質からなるリング構造が２組積み重なった１４量体の複合体であることが既に報告されている。また、細胞内で変性したたんぱく質やリボソームにて生成したたんぱく質の立体構造形成を助ける機能を有する事が知られている。この機能を生かし、例えば遺伝子組み替え技術等により生産されるたんぱく質が不活性型であった場合、活性型にするための手段のひとつとして有用ではないかと注目されている。
【０００５】
ＧｒｏＥＬのようなたんぱく質複合体を利用する際の問題点として以下のことが挙げられる。即ち、たんぱく質は本来生物がその置かれた環境下で最も効率よく働くよう最適化されてきたものであり、工業的な利用面から見るとそのまま使用すれば、繰り返しの使用に不適であったり、反応後の生成物の分離精製が困難であったりと、必ずしも理想的なものではないということである。
【０００６】
そこで、たんぱく質の本来の機能を残しつつ、さらに利用しやすい形態に変えるべく考案されたものが固定化たんぱく質である。利用し得る固定化には共有結合、イオン結合などを利用して担体と結合させる担体結合法、高分子ゲルへの包含、限界濾過膜などに封じ込めなどによる包括法、グルタルアルデヒドなどの多官能性試薬でたんぱく質同士を架橋して全体として不溶化させる架橋法、さらにその複合形等を挙げることができる。このような、たんぱく質複合体を固定化する方法はこれまでにいくつか開発されてきている。次にＧｒｏＥＬを例としたその開発例を示す。
【０００７】
特開平７−４８３９８号公報（特許文献１）には、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から得られた、シャペロニン６０のサブユニットであるのシャペロニン６０モノマーをトレシル基を有する樹脂に固定化し、塩酸グアニジンにて変性させたウシミトコンドリアロダネースの活性を回復さる方法が開示されている。特表２００１−５１０８４８号公報（特許文献２）には、ヒト由来のＰＰＩ（ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ）に代表される、ポリペプチドの結合の再配列または異性化を触媒するフォルダーゼ中のアミノ基を利用し、ＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｃｉａ社製）と結合させ、サソリ毒ＣＮ５の活性を回復させる方法が開示されている。特開平１０−２６２６９３号公報（特許文献３）には、大腸菌由来のＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子を、ヒスチジンタグがＣ末端に結合するようデザインされたプラスミドｐＥＴ２１−ａ−ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に結合させ、遺伝子組換えされた大腸菌を培養することにより得たＧｒｏＥを、ヒスチジンタグとＮｉイオンを結合させた樹脂にて固定化し、さらに変性させたエノラーゼの活性を回復させる方法が開示されている。
【０００８】
特開平１０−１７９１５２号公報（特許文献４）には、大腸菌由来のＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳをコードする遺伝子をプラスミドに結合させ、これを導入した遺伝子組換え大腸菌を培養することにより得たＧｒｏＥを限外濾過膜内に閉じ込め、さらに変性させたＤｎａｓｅ  I連続的に反応させの活性を回復させる方法が開示されている。
【非特許文献１】分子シャペロンによる細胞機能制御、永田和宏・森正敬・吉田賢右共編、シュプリンガー・フェアラーク東京、初版２００１年６月５日
【特許文献１】特開平７−４８３９８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１０８４８号公報
【特許文献３】特開平１０−２６２６９３号公報
【特許文献４】特開平１０−１７９１５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、ＧｒｏＥＬを例とするたんぱく質複合体の固定化については既に検討がなされ、たんぱく質によっては既に工業的に利用されているものも有る。しかし、たんぱく質によっては生体内に本来存在しない担体やたんぱく質固定化時に担体との結合に供される部分であるリンカーの存在により、しばしばたんぱく質の高次構造の変形や活性中心の部分的な破壊による機能低下があることが知られている。特に、機能発現の際に大きな構造変化が起こるたんぱく質では固定化により構造変化が妨げられ、結果、機能の阻害が生じる場合がある。また、たんぱく質複合体ではリンカーの存在により、サブユニットが集合体を形成する時の阻害が生じる場合がある。また、サブユニット毎に存在するリンカーにより多点による固定が行われたんぱく質の高次構造の変形や活性中心の部分的な破壊による機能低下が懸念される。
【００１０】
このため、たんぱく質固定化時には所望とする活性をできるだけ保持できる方法が必要とされている。
【００１１】
本発明は前述のたんぱく質複合体の利用において、固定化時の阻害が軽減される効果を意図し、検討されたものである。具体的にはリンカーを有するサブユニットとリンカーを有さないユニットからなるたんぱく質複合体に関し、リンカーによる活性阻害の効果を軽減することを目的としてなされた発明である。また、本発明はたんぱく質複合体として機能を果す分子シャペロンを用い、これを基質となる変性たんぱく質と接触をさせ変性たんぱく質のより効率的な活性回復を目的としてなされた発明である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ｎ個のサブユニット（ｎは２以上である整数）からなるたんぱく質複合体であって、これらのサブユニットが、リンカーを有するｍ個のサブユニット（ｍは１以上ｎ−１以下である整数）と、リンカーを有さないｐ個のサブユニット（ｐ＝ｎ−ｍ）からなることを特徴とするたんぱく質複合体を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、
変性たんぱく質の活性回復方法であって、
ｎ個のサブユニット（ｎは２以上である整数）の集合体として機能する分子シャペロンと前記変性たんぱく質とを接触させることにより、前記変性たんぱく質を回復する工程を有し、
前記分子シャペロンは、リンカーを有するｍ個のサブユニット（ｍは１以上ｎ−１以下である整数）とリンカーを有さないｐ個のサブユニット（ｐ＝ｎ−ｍ）から構成されることを特徴とする変性たんぱく質の活性回復方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明におけるリンカーの使用形態によれば、たんぱく質複合体を担体などに固定化する際に、たんぱく質複合体の所望とする活性や機能の固定化による阻害を軽減することができる。また、本発明の変性たんぱく質回復方法により、変性たんぱく質の活性回復をより効率的に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、たんぱく質複合体であって、ｎ個のサブユニット（ｎは２以上である整数）のサブユニットからなる集合体であり、この集合体は、リンカーを有するｍ個のサブユニット（ｍは１以上ｎ−１以下である整数）と、リンカーを有さないｐ個のサブユニット（ｐ＝ｎ−ｍ）分子から構成される。リンカーを除いた構成に関して、このたんぱく質複合体を構成する複数のサブユニットは、すべて同一の構成を有していても良く、また、複数のサブユニットに２種以上の異なるサブユニットが含まれていても良い。なお、サブユニットは１つの分子から構成されているものであることは好ましい。
【００１６】
ｍの全サブユニット数に対する割合は目的とする基体への固定状態が得られるものであれば特に限定されないが、好ましくは、（全サブユニット数×０．２）＜ｍ＜（全サブユニット数×０．７）、特に好ましくは（サブユニット数×０．５）＝ｍを基準として設定することができる。
【００１７】
同一のサブユニットからなるタンパク質複合体としては、例えば、分岐鎖α−ケト酸脱水素酵素Ｅ２ｃ、グルタミン合成酵素、アルコールオキシダーゼ、グルコース脱水素酵素、トリプトファナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、オルチニントランスカルバミラーゼ、テイルスパイクたんぱく質、クエン酸合成酵素、乳酸脱水素酵素、りんご酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リブロース−２−リン酸カルボキシラーゼ、フィトクロム光レセプター、アクチビン、グリセルアルデヒド  ３−リン酸デヒドロゲナーゼなどを挙げることはできる。
【００１８】
異なるサブユニットを有するたんぱく質複合体としては、例えば、ＲＮＡ  ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、チューブリン、Ｇ蛋白質、ヘモグロビン、リブロース−ビスフォスフェート、チトクロムｃ酸化酵素、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどを挙げることができる。
【００１９】
本発明のたんぱく質複合体のうち特に好適なものは分子シャペロンであり、変性たんぱく質の立体構造回復機能を有するものであればいかなる分子シャペロンでも良い。例えば、Ｈｓｐ６０（シャペロニン）ファミリーのＨｓｐ６０、Ｃｐｎ６０、ｒｕｂｉｓｃｏ結合たんぱく質、ミトコンドリアＨＳＰ６０、Ｈｓｐ７０ファミリーのＤｎａＫ、Ｈｓｐ７０、Ｓｓｃｌ、Ｓｓａ１、Ｂｉｐ、Ｋａｒ２、Ｇｒｐ７８、Ｈｓｐ１００ファミリーのＣｌｐＢ、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０ファミリーのＨｔｐＧ、Ｈｓｐ９０、Ｇｒｏｐ９４、ＴＲｉＣファミリーのＴＦ５５、ＴＲｉＣ（ＴＣＰ１）、その他Ｈｓｐ２８、Ｈｓｐ４５などが挙げられる。また、変性たんぱく質の活性回復機能を有するならば生物種に依存しない。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｓｏｄａｌｉｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属などの細菌類、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母類、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓなどの哺乳類、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓなどの植物、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  などの昆虫類が挙げられるが、その中でも特に大腸菌由来のＧｒｏＥＬと呼ばれる分子シャペロンがより好適である。
【００２０】
また、本発明におけるたんぱく質複合体を構成するサブユニットの少なくとも一つは、
（１）天然に存在するたんぱく質、
（２）天然に存在するたんぱく質のアミノ酸配列に対しアミノ酸の欠失、付加、及び他のアミノ酸残基による変更の１以上を含有する改変たんぱく質、及び
（３）ランダムなアミノ酸配列からなるたんぱく質、
のいずれかから構成することができる。
【００２１】
このたんぱく質複合体を取得する手段として、後述の実施例では大腸菌への形質転換を利用した方法により目的たんぱく質の取得を採用したが、特にこの方法に限定されない。例えば、所望のたんぱく質をコードする遺伝子を作成して、それを用いて生物細胞を形質転換し、この形質転換体を培養して目的たんぱく質を発現させる技術；細胞抽出物から得られたたんぱく質成分を用いる技術；化学的な合成によってポリペプチドを得る技術；などが挙げられる。また、本発明のたんぱく質複合体は、それを構成するサブユニットが有するリンカーを介して基体に固定化されることを特徴とする。
【００２２】
本発明において採用するに適した基体は、たんぱく質の機能を損なわずに担持できる基体であればいかなる基体でもよく、例えば、セルロース、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリマー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換樹脂、ビニルポリマー、光架橋性樹脂、ポリウレタン、硝子ビーズ、セラミック、シリカゲル、金属基板、金属酸化基板、シリコン基板、金コロイド、カーボン粉末、フェライト、マグネタイト等の有機材料、無機材料、あるいはそれらの複合材料が挙げられるが、その中で特にアガロースが好適である。
【００２３】
たんぱく質複合体の基体への担持は、基体そのものとたんぱく質複合体またはリンカーとの相互作用に基づくものであっても良いし、リンカーとの結合を目的とする、官能基やペプチド・たんぱく質などが基体に存在しても良い。なお、たんぱく質複合体のサブユニット部分と基体はリンカーを介して結合するが、付加的にサブユニットと基体との直接結合が存在していてもよい。
【００２４】
基体の形状は特に限定されず、たんぱく質を担時できる形態であればこの限りではない。例えば、微粒子状、膜状、板状、繊維状、管状、ゲル状の担体が挙げられる。本発明において基体とリンカーとの適した結合形態には、例えば共有結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、双極子相互作用、π−π相互作用、疎水性相互作用、酵素と基質との結合、抗体と抗原との結合、たんぱく質同士の自己組織化に基づく相互作用等を採用することができる。
【００２５】
本発明のたんぱく質複合体におけるリンカーは、少なくとも１以上のペプチド結合を含んでなる分子であることが好ましい。本発明においてリンカーを付加する部位は、所望とする効果が得られる範囲内で特に限定されないが、酵素の活性部位、化学物質((体内由来、体外由来問わず)ATP、ADP、補酵素、イオン、ペプチド、たんぱく質など)が酵素と結合する部位、酵素が活性を発揮するために構造変化を起こす部位、隣接するサブユニットとの結合部位などを除いた部位が好ましい。例えば、サブユニットを構成するアミノ酸主鎖配列のアミノ（Ｎ）末端またはカルボキシル（Ｃ）末端がリンカー付与位置として好ましい。
【００２６】
本発明において採用するに適したリンカーは、たんぱく質を担持する機能を有するものであればいかなるものも用いることができ、例えば、ストレプトアビジンとビオチンの結合の利用、チオレドキシンタグとフェニルアルシンオキシドの結合の利用、カルモジュリン結合ペプチドとカルモジュリンの結合の利用、マルトース結合たんぱく質とアミロースの結合の利用、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオンの結合の利用、インテイン−キチン結合ドメインとキチンの結合の利用、ＡＰＴＧ（ｐ−アミノ−β−チオガラクシド）とβ−ガラクトシダーゼの結合の利用、膵臓由来のＳたんぱく質と膵臓リボヌクレアーゼＡ由来の残基を用いたＳ−タグの結合の利用が挙げられ、また、任意のアミノ酸配列により任意の担体への親和性を有したポリペプチドリンカーの利用も挙げられるが、その中でもヒスチジンタグと、金属イオンとの配位結合を利用した担持方法が好適である。
【００２７】
本発明においてリンカーをたんぱく質に付加する方法としては、ヒスチジンタグ部分をコードする塩基配列を有するベクターを用いる方法が好適である。市販品の例としては、ｐＥＴ２１ａ−ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社製）等が挙げられる。また、ヒスチジンタグをコードする塩基配列部分を、ＤＮＡ合成器により合成してこれを有するベクターに、目的とするたんぱく複合体を構成するための少なくとも１つのサブユニットをコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターとして利用してもよい。
【００２８】
本発明においてリンカーを有さないたんぱく質を得る方法としては、リンカー部分が無いベクターを用いても良いが、精製操作の煩雑さを考慮すればリンカーを有し、かつプロテアーゼ切断部位をコードする塩基配列を有するベクターを用いる方法が便利である。市販品としてはｐＥＴ−１６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＱＥ３０Ｘａ（Ｑｉａｇｅｎ社製）等が挙げられる。また、リンカー部分とプロテアーゼ切断部位をコードする塩基配列を作成する方法を用いても良い。
【００２９】
ヒスチジンタグを基体表面に配置した金属イオンで捕獲してたんぱく質複合体を担時する方法としては、後述の実施例ではヒスチジン側鎖のイミダゾール基が２個所で配位するＮｉイオン−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）を採用したが、ヒスチジンが配位できる金属イオンを担持しているのであればこの限りではない。例えば同じく２箇所で配位するＣｏイオン−カルボキシメチルアスパラギン酸（Ｃｏ−ＣＭＡ）、３箇所で配位するＮｉ−イミノジ酢酸（Ｎｉ−ＩＤＡ）等が挙げられる。
【００３０】
また、ヒスチジンタグについても、ヒスチジンと金属イオンの結合を利用するものであればヒスチジンが８分子結合したタグ、１０分子結合したタグ、ヒスチジンを分散させたニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼに含まれる１９残基の配列由来のタグなどの採用もできるが、その中でもヒスチジンが６分子結合したタグが好適である。
【００３１】
ヒスチジンタグを有するたんぱく質の精製に用いる緩衝液としては、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０中でのｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度が、細胞懸濁用緩衝液では０〜５０ｍＭ、好適には１〜５０ｍＭ、洗浄緩衝液では０〜２００ｍＭ、好適には５〜１００ｍＭ、溶出緩衝液では５０ｍＭ〜２０００ｍＭ、好適には１００ｍＭ〜１５００ｍＭ、にて操作することが望ましい。
【００３２】
本発明のたんぱく質複合体を担持させた基体は、たんぱく質複合体が分子シャペロンである場合は、これを用いて機能性たんぱく質の活性の回復処理を行うことができる。すなわち、本発明にかかるたんぱく質を再生させる方法は、変性たんぱく質の活性回復方法であって、ｎ個のサブユニット（ｎは２以上である整数）の集合体として機能する分子シャペロンと前記変性たんぱく質とを接触させることにより、前記変性たんぱく質を回復する工程を有し、前記分子シャペロンは、リンカーを有するｍ個のサブユニット（ｍは１以上ｎ−１以下である整数）とリンカーを有さないｐ個のサブユニット（ｐ＝ｎ−ｍ）から構成されることを特徴とする変性たんぱく質の活性回復方法である。
【００３３】
分子シャペロンにより再生されるべきたんぱく質はこの分子シャペロンにより再生が行われるたんぱく質であればいかなるたんぱく質でも良く、例えば、大腸菌への組み換え遺伝子導入等人工的な方法により生産された不活性なたんぱく質、無細胞系にて生産されたたんぱく質、化学合成などにより生産された不活性たんぱく質、生物細胞から抽出されたたんぱく質、あるいは、熱・圧力・乾燥・電位変化などの物理的変性、変性剤、塩基性試薬、酸性試薬、有機溶媒、アルコール、塩、重金属イオン、添加などの化学的変性を受けたたんぱく質などを挙げることができる。
【００３４】
また、分子シャペロンにより再生されるべきたんぱく質の生物種の由来は問わない。例えば大腸菌、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ヒト、イネ、シロイヌナズナなどが挙げられる。
【００３５】
具体的にたんぱく質は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ＲＮａｓｅ、Ｄｎａｓｅ、ロダネーゼ、ルシフェラーゼ、免疫グロブリンＦａｂフラグメント、リゾチーム、分岐鎖α−ケト酸脱水素酵素Ｅ２ｃ、グルタミン合成酵素、アルコールオキシダーゼ、グルコース脱水素酵素、トリプトファナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、オルチニントランスカルバミラーゼ、クエン酸合成酵素、乳酸脱水素酵素、りんご酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ニトロゲナーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、血清アルブミン、チトクロムｃ、オボアルブミン、カゼイン、グリアジン、ミオシン、アクチン、抗体、補体、フィブリノーゲン、トロンビン、蛇毒、リシン、インシュリン、成長ホルモン、糖たんぱく質、コラーゲンなどが挙げられる。
【００３６】
分子シャペロンにより再生されるべきたんぱく質は、天然に存在するたんぱく質、天然に存在するたんぱく質のアミノ酸配列に対しアミノ酸の欠失、付加、及び他のアミノ酸残基による変更の１以上を含有する改変たんぱく質、ランダムなアミノ酸配列からなるたんぱく質のいずれでもよい。
【００３７】
上記分子シャペロン結合担体を用いた変性たんぱく質再生方法としては、分子シャペロンと変性たんぱく質が接触する工程を含めば特に限定されない。例えば、分子シャペロンを担持させた担体をカラムに充填し、そこへ変性たんぱく質溶解液を展開させ活性回復したたんぱく質を回収する方法、変性たんぱく質溶液と分子シャペロンを担持させた担体を混合し、接触させたのちに、担体を沈殿させ活性回復したたんぱく質を得る方法が挙げられる。
【００３８】
固定化された分子シャペロンと再生されるべきたんぱく質との反応条件は、双方のたんぱく質の活性を阻害しないことを考慮し、なおかつＮｉイオンとヒスチジンタグの結合などの分子シャペロンと基体との結合を失わないよう、設計された緩衝液にて実施されれば特に限定されない。例えば、再生緩衝液（例えば１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ  ＫＣｌ中、５０ｍＭリン酸ｐＨ  ６．０〜８．０、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．８〜１０）に再生されるべきたんぱく質を添加により実験を行うことができる。また、ＧｒｏＥＬのようにＡＴＰを要求するたんぱく質であれば、ＡＴＰを添加することにより反応が促進される。またＧｒｏＥＬの場合にはＧｒｏＥＳが挙げられるように、協調して働くたんぱく質があれば添加が望ましい。
【００３９】
変性たんぱく質の所望とする活性回復効果を得ることができればこれに限らないが、反応に用いられる分子シャペロンは再生されるたんぱく質に対してのモル比が０．１〜１０００であることが望ましい。分子シャペロンの濃度はその活性がある限り特に限定されないが、０．０１μＭ〜１ｍＭが望ましい。変性たんぱく質の活性回復処理における温度は、分子シャペロンが変性せずかつ活性回復機能があり、変性たんぱく質が再び変性しない温度であれば特に限定されない。例えば大腸菌ＧｒｏＥＬであるならば、４℃〜５０℃、好ましくは４℃〜４０℃が望ましい。反応の終了は再生したたんぱく質の酵素活性等を測定することにより決定し得る。反応終了後、再生したたんぱく質を透析などのたんぱく質分離精製方法により回収、生成し得る。
【実施例】
【００４０】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
実施例１：ＧｒｏＥＬサブユニットへのヒスチジンタグの付加
分子シャペロンＧｒｏＥＬサブユニットをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより取得した。このＰＣＲではＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子を含む所望の細菌のＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡをＴｅｍｐｌａｔｅとし、その細菌のデータに基づきＧｒｏＥＬ遺伝子配列で切断されない制限酵素サイトを含有するｐｒｉｍｅｒを設計しＰＣＲを行うべきである。例えば、大腸菌由来ＧｒｏＥＬサブユニットの場合であるならば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株よりＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを取得、Ｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、ＧｒｏＥＬサブユニットのＮ末端をコードするヌクレオチド配列およびＳｐｈI部位を含むｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  （５’−ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  
ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＴ−３’：配列番号：１）、ＧｒｏＥＬサブユニットのＣ末端をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列およびＨｉｎｄIII部位を含むｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ−３’：配列番号：２）、およびＬＡ  ＰＣＲ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ社製）を使用し、９４℃１分加熱後、９８℃２０秒、５３℃１分、７２℃２分の条件で２サイクル、９８℃２０秒、７２℃２分の条件で２８サイクル、その後７２℃１０分加熱後に反応が終了する条件下でＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，  ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して配列決定を行い、ＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子であることを相同性解析から確認した。
【００４１】
ＧｒｏＥＬサブユニットをコードする遺伝子を、ヒスチジンタグをコードする塩基配列を有する発現ベクターｐＱＥ３０Ｘａ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にクローン化した。ｐＱＥ３０ＸａおよびＧｒｏＥＬ遺伝子を、ＳｐｈIおよびＨｉｎｄIIIで消化、精製後、両者を挿入物：ベクター（モル比）＝１：３でｌｉｇａｓｅと共に混合し１６℃６時間連結した。ついで、この連結混合物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｍ１５株（Ｑｉａｇｅｎ社製）コンピテント細胞を形質転換し、カナマイシン・アンピシリン耐性コロニーを選択した。ついで生じたいくつかのコロニーをｔｅｍｐｌａｔｅとしてヒスチジンタグ部分に由来するｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ−３’：配列番号：３）と前述のｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行い予想される長さ（１．６５ｋｂ）の断片を生じるクローンを選択して、以下（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬと記述するヒスチジンタグが付加されたＧｒｏＥＬサブユニットをコードするプラスミドｐＱＥ３０−ＥＧｒｏＥＬを得た。
【００４２】
実施例２：（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬの調製
実施例１で得られたプラスミドｐＱＥ３０−ＥＧｒｏＥＬを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｍ１５株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地（ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ／ｌ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ）へ接種し１３０ｒｐｍ、３０℃で一晩振盪培養した。ついで、培養液を同じ培地で１００倍希釈し１３０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養した。ＯＤ600が０．４〜０．６に到達した時点でイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに２時間振盪培養した。たんぱく質の発現状態を確認するため、ＩＰＴＧ添加前後の細胞内のたんぱく質を１０％均一アクリロアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分析したところ、ＩＰＴＧ添加後約５７ｋＤａの（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬの産生が誘導されることが判明した。
【００４３】
得られた培養細胞を遠心分離により細胞を採集し細胞懸濁用緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ  ｐＨ  ８．０）中へ懸濁、ついでＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓにて菌体を破砕、遠心分離にて抽出液を得た。この抽出液に、ｉｍｉｄａｚｏｌｅを終濃度５ｍＭとなるように添加した後、（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬを精製するために、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を添加し、Ｎｉイオンと（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬとの配位結合を形成させた。次に、洗浄用緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ２０ｍＭ、ｐＨ８．０）にて３回懸濁を行い、Ｎｉイオンに結合する非特異的な吸着を取り除き、溶出用緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ２５０ｍＭ、ｐＨ８．０）にてＮｉイオンとヒスチジンタグの結合を解離させ（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬを含む画分を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、この画分が予想される分子量約５７ｋＤａでの単一バンドであることを確認した。この画分の媒体成分を透析にて反応用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2）へ交換した。
【００４４】
得られた（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬのうち、一部はタグを有するＧｒｏＥＬサブユニットとして残し、一部はタグを有さないＧｒｏＥＬへ調製する。所定量の（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬを含む反応ｂｕｆｆｅｒ（終濃度０．２５μｇ／μｌ）にＦａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）希釈液を添加（終濃度５Ｕ／ｍｌ）した溶液を１５℃で９時間振盪しヒスチジンタグの切断を行った。反応液に反応ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＸａ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を添加し、４℃で１時間振盪後Ｒｅｓｉｎを除去し、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを除去した。さらに未切断（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬを除去のためｂｕｆｆｅｒのｐＨを７．５とし、ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅをタグを有するＧｒｏＥＬサブユニットを除去するために添加し、４℃で１時間振盪後、ａｇａｒｏｓｅを除去し生成物を得た。１０％均一アクリロアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、この画分が（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬとほぼおなじ分子量約５７ｋＤａの単一バンドであることを確認した。
【００４５】
実施例３：ＧｒｏＥＬの調製
ヒスチジンタグを有するサブユニット（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬと有さないサブユニットＧｒｏＥＬを、モル比２対１２で、かつこれらを合計したたんぱく質終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるよう混合して、変性用緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）中に含有させ２５℃９０分の変性処理を行った。
【００４６】
その後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅを所定量添加、４℃で１時間振盪することによりＮｉイオンにヒスチジンタグを担持させた後、細胞懸濁時と同じ緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ５ｍＭ、ｐＨ  ８．０）にて１００倍に希釈し、さらに終濃度５ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2で添加することによりＧｒｏＥＬの巻き戻しを促し固定化されたＧｒｏＥＬを調製した。その後、洗浄用緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ２０ｍＭ、ｐＨ  ８．０）にて３回懸濁を行い非特異的な吸着を取り除き、Ｎｉ−ＮＴＡ固定化ＧｒｏＥＬを得た（Ｙｂａｒｒａ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，  Ｐ．  Ｍ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：  ２２１１３−２２１１５）。
【００４７】
解析は５％アクリロアミドゲルを用いたＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥより、市販のＧｒｏＥＬ（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ社製）とほぼ同じ位置にバンドが確認されたことから予想されるサブユニット１４量体の生成物であることが確認された。また、前記変性用緩衝液を添加しＮｉ−ＮＴＡ固定化ＧｒｏＥＬを再び変性、解離させ、溶出したＧｒｏＥＬサブユニットの濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を標準サンプルとして測定した。また、溶出用緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ２５０ｍＭ、ｐＨ  ８．０）にてＮｉイオンとヒスチジンタグの結合を解離させ（Ｈｉｓ）6−ＧｒｏＥＬの濃度を測定した。結果タグ有り：タグ無し＝２：１２であることが確認された。さらに１０％均一アクリロアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析を行ったところ、ヒスチジンタグの有無に関わらず予想される分子量約５７ｋＤａであることが確認された。
【００４８】
実施例４：ＧｒｏＥＬ１４ｍｅｒの機能確認
実施例３より得られた固定化ＧｒｏＥＬの活性回復機能を確認した。４Ｍ塩酸グアニジン中で変性させて活性を低下させたイーストエノラーゼ（Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を、再生用緩衝液（１０ｍＭ  Ｍｇ（ＣＨ3ＣＯＯ）2、２０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．８）中、終濃度が１５μｇ／ｍｌ、になるように添加し、固定化ＧｒｏＥＬ  １．７μＭと３０℃で３０分反応させた。反応終了後のエノラーゼの活性は、０．０４ｍｌのエノラーゼ溶液を０．９６ｍｌの基質溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ２−ＰＧＡ（２−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ））と混合し３７℃でのホスホエノールピルビン酸の生成による２４０ｎｍでの吸光度の増加を時間の関数として測定した。ヒスチジンタグをすべて持たないサブユニットから構成されたＧｒｏＥＬに対して、エノラーゼ活性能を比較したところ、９５％の活性回復能が確認された。比較としてヒスチジンタグがサブユニットすべてに付加したままのＧｒｏＥＬの活性回復能と比較したところ８０％であったことから、改善が確認できた。
【００４９】
実施例４−２：ＧｒｏＥＬ１４ｍｅｒの機能確認
実施例３より得られた固定化ＧｒｏＥＬの活性回復機能を確認した。４Ｍ塩酸グアニジン中で変性させて活性を低下させたＭＤＨ（ｍａｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：リンゴ酸脱水素酵素）をｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＡＴＰを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．８）中、終濃度が０．２μＭになるように添加し、固定化ＧｒｏＥＬと３０℃で３０分反応させた。酵素活性は０．０２ｍｌの酵素溶液を０．９８ｍｌの基質溶液（１００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５、０．２ｍＭ  ｏｘａｌａｃｔｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰ+）と混合し３４０ｎｍでの吸光度の増加を時間の関数として測定した。ヒスチジンタグをすべて持たないサブユニットから構成されたＧｒｏＥＬに対して、エノラーゼ活性能を比較したところ、９５％の活性回復能が確認された。比較としてヒスチジンタグがサブユニットすべてに付加したままのＧｒｏＥＬの活性回復能と比較したところ８０％であったことから、改善が確認できた。
【配列表】
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