(57)【要約】【課題】  本発明は、特定の形態のヒトＳＰ−１８およびＳＰ−５由来のタンパク質。コードされた配列の類似体であるこれらのタンパク質のいくつかは、天然タンパク質に比べて凝集性が著しく減少、すなわち、分子内および分子間の相互作用、主に共有結合のジスルフィドに起因する凝集が減少している。本発明のＳＰ−５由来ペプチドは、天然ポリペプチドの生物学的活性のみならず化学的および物理的安定性もまた保持している。【解決手段】  ＡＳＰ活性を有し、かつ以下の配列を持つ精製ポリペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩あるいはアミド：X-AA28-AA29-AA30-AA31-AA32-AA33-AA34-AA35-Leu-Leu-Ile-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Leu-Ile-Z-Z-Z-Ile-Z-Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Y。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳＰ活性を有し、かつ以下の配列を持つ精製ポリペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩あるいはアミド：
X-AA28-AA29-AA30-AA31-AA32-AA33-AA34-AA35-Leu-Leu-Ile-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Leu-Ile-Z-Z-Z-Ile-Z-Gly-Ala-Leu-Leu-Met-Y,
ここで、ＡＡ28はCys、
ＡＡ29はCys、
ＡＡ30はProあるいはAla、
ＡＡ31はValあるいはGln、
ＡＡ32はHisあるいはLys、
ＡＡ33はLeuあるいはAla、
ＡＡ34はLysあるいはGln、
ＡＡ35はArgあるいはGln、
ＺはValあるいはIleのいずれか、
ＹはOH、Gly-OH、あるいはGly-Leu-OH、そして
ＸはＨ、あるいはＨ−ＡＡ27−、Ｈ−ＡＡ26−ＡＡ27−、およびＸ’−ＡＡ26−ＡＡ27−からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、
ここで、ＡＡ27はProあるいはAla、
ＡＡ26はIleあるいはSer、そして
Ｘ’は、ＨあるいはMet-Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Glu-Val-Leu-Met-Glu-Ser-Pro-Pro-Asp-Tyr-Ser-Ala-Ala-Pro-Arg-Gly-Arg-Phe-Glyのアミノ酸に相当する１〜２５個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；
ここで、条件として、ＸがPhe-Gly/Arg-Ile-Proであり、ＹはGly-Leu-OHであり、そして全てのＺはValであるならば、ＡＡ28−ＡＡ35は、-Cys-Cys-Pro-Val-His-Leu-Lys-Arg-（配列番号５）および（配列番号６）となり得ない、ポリペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩あるいはアミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の呼吸疾患の治療に有用な肺胞界面活性タンパク質（ＡＳＰ）一般に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの肺は多数の小さな嚢すなわち肺胞よりなり、この肺胞中で血液と肺の気室との間でガスが交換される。健康な個体では、この交換は、ＩＩ型の肺胞細胞のミクロソーム膜中で合成されるタンパク質含有界面活性複合体の存在により媒介される。この複合体が適正なレベルで存在しない場合には、肺は適切に機能し得ない。すなわち、肺胞が排気中に崩壊し、そして引き続く吸気により再膨張し得ない。従って、この複合体の合成不全を治療せずに放置すると、死または重度の身体的損傷を引き起こし得る。
【０００３】
界面活性複合体のレベルが不十分な例として最も多く報告された症例は、未熟児または複合妊娠（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ）後に生まれた乳児に起こり、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）として広く知られている。この症候群の広く公表されている形態はヒアリン膜症、または特発性ＲＤＳと呼ばれている。ＲＤＳは現在米国および他の先進国の幼児の死亡および罹患の最大の原因であり、診断および治療に向けて多大な努力がなされている。現在の治療は、機械的な（加圧）換気に集中しており、この方法は良くても侵襲性の一時しのぎの方法に過ぎず、肺の損傷および例えば気管支肺形状異常症、間質性気腫、および気胸症などの合併症を含む他の有害な副作用をもたらすことが多い。この治療を用いると、精神遅滞が起こる場合もある（Ｈａｌｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ（１９８２）２９：１０５７−１０７５。）。
【０００４】
界面活性物質の置換によりこの症候群を治療する試みが限定されたものであるがなされている。この方法は一般に、投与は１回だけでよいため優良な方法であり、損傷の可能性は低減する。例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｌａｎｃｅｔ（１９８０）１：５５は、ウシの肺由来のタンパク質欠損の界面活性物質調製物を使用し、一方、Ｈａｌｌｍａｎ，Ｍら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９８３）７１：４７３−４８２はヒトの羊水から単離した界面活性物質を使用して、限られた数の乳児の治療を行い、ある程度の成功を治めている。Ｃｌｅｍｅｎｔｓの米国特許第４，３１２，８６０号は、タンパク質を含有しない合成界面活性物質を開示し、データは示していないがこの方法に有用であるとしている。要約すると、界面活性物質置換は臨床的に広く使用されてはいない。
【０００５】
好適な界面活性置換物質は、肺の界面活性複合体自体である。この複合体、はアポタンパク質、大量に存在する２つのりん脂質（ジパルミトイルホスホコリン（ＤＰＰＣ）およびホスファチジルーグリセロール（ＰＧ））、極めて僅かな量で存在するいくつかの脂質成分、およびカルシウムイオンからなる。アポタンパク質は、分子量３２，０００ダルトンのタンパク質、および約１０，０００ダルトンの疎水性の強いタンパク質を含有する（Ｋｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏ１（１９７３）２２４：７８８−７９５）。この３２，０００ダルトンのタンパク質はグリコシル化され、ヒドロキシプロリンを含有する。
【０００６】
界面活性物質置換療法の進歩が制限されている主な理由は、複合体のタンパク質部分が入手し得ないためであった。置換療法は、脂質成分単独を使用する試みに集中しており、このような治療の成績は、アポタンパク質の添加により著しく向上し得るようである（Ｈａｌｌｍａｎ，Ｍら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ（１９８２）（前出））。しかし、現在のところ、これらのタンパク質は正常なヒト成人の肺から、および羊水からしか入手し得ない。効率的な単離方法によっても、十分な供給を提供し得ない。従って、単独でまたは複合体の飽和りん脂質部分との結合で使用するための、実用的な量のアポタンパク質を製造する方法の実現が望まれている。
【０００７】
関連するＰＣＴ特許出願第ＷＯ８６／０３４０８号は、約３２ｋｄのヒトＡＳＰタンパク質の組み換えによる製造、種々のイヌＡＳＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列の回収、および約１０ｋｄの分子量のヒトＡＳＰタンパク質グループの１つの代表例の回収を開示している。十分な治療に使用するために「１０Ｋ」グループの効率的な製造が必要であることが現在では明白である。
【０００８】
１９８７年１１月５日に公表された別の関連するＰＣＴ特許出願第ＷＯ８７／０６５８８号は、これら１０Ｋタンパク質およびこれらをコードするＤＮＡに関するさらなる記載を与えている。該出願の表１および２は、イヌおよびヒトのＳＰ−１８由来タンパク質の前駆体をコードする全長ｃＤＮＡを示している。成熟ヒトタンパク質は、この全長配列のコドン２０１でコードされるフェニルアラニン残基から開始されることが記載されている。哺乳類および細菌の細胞の両方の中での、ＳＰ−１８前駆体の発現のためのベクターの構築が詳細に記載されている。哺乳類の細胞中での全長前駆体の発現は、４３ｋｄおよび２５ｋｄの前駆体タンパク質を与えることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判明した。この２５ｋｄの生成物は、この配列内にコードされたＰｈｅ−２０１からＧｌｕ−３８１にわたる、１８１アミノ酸配列のグリコシル化した形態であると記載されている。
【０００９】
前駆体の成熟形態のより均一な製造に有用となり得る開裂部位を提供するためのヒトタンパク質の特定の改変した形態もまた記載されている。ＳＰ−１８  ｃＤＮＡの細菌による発現もまた記載されている。
【００１０】
ＰＣＴ特許出願第ＷＯ８７／０６５８８の図５および６は、ＳＰ−５と命名された５ｋｄ−８ｋｄの分子量が小さい方のタンパク質の前駆体をコードする２つのｃＤＮＡクローンのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示している。ＳＰ−１８
ｃＤＮＡと同様に、これらのクローンは、単離された５ｋｄ−８ｋｄの分子量が小さい方のタンパク質の前駆体をコードすることが開示されている。推定のＮ−末端は、この配列のコドン２４および２５のＰｈｅまたはＧｌｙであると述べられている。これらのタンパク質の成熟Ｃ−末端は、８ｋｄタンパク質ではＧｌｎ−１０８であり、そして５ｋｄタンパク質ではＧｌｕ−８０またはＴｈｒ−６５であると推定されている。哺乳類および細菌の細胞中でのこのｃＤＮＡの発現もまた記載されている。
【００１１】
上記の２つのＰＣＴ出願、ＷＯ８６／０３４０８およびＷＯ８７／０６５８８を本明細書では参考文献として援用する。
【００１２】
本出願は、肺胞界面活性タンパク質として有効な種々のＳＰ−５関連ペプチドを記載する。これらのＳＰ−５類似体および断片は、化学合成により、または組換法により調製し得、呼吸器疾患および徴候（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｉｅｓ）の治療に有用な肺胞界面活性タンパク質に属する特定の構成物を提供する。
【００１３】
本出願の親出願である米国特許出願第０７／１１７，００９号もまた、１０Ｋグループのタンパク質を幾分詳細に記載している。その出願の開示の全体を本明細書ではに参考文献として援用し、本明細書では明確に記載または説明していない物質は該出願を参考とされたい。本出願は、ヒトＳＰ−５タンパク質のさらなる研究に基づき、特に、ＡＳＰ活性を有することが判明したタンパク質の類似体に関する。本出願で記載し、特許請求した類似体は、天然ポリペプチドの安定性および生物学的活性を保持しているのに加え、天然の５ｋｄタンパク質よりも凝集しにくい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、特定の形態のヒトＳＰ−１８およびＳＰ−５由来のタンパク質を提供する。コードされた配列の類似体であるこれらのタンパク質のいくつかは、天然タンパク質に比べて、凝集性が著しく減少している。すなわち、分子内および分子間の相互作用、主として共有結合のジスルフィドに起因する凝集が減少している。そのため、これらの類似体の抽出および精製は、天然ポリペプチドと比べて非常に容易である。
【００１５】
本発明のＳＰ−５由来のペプチドは、ヒトＳＰ−５の長さおよびアミノ酸配列の両方を改変し得たものであるが、天然ポリペプチドの生物学的活性のみならず化学的および物理的安定性を保持している。
【００１６】
本発明の別の局面では、呼吸窮迫症候群の治療用の、ＳＰ−１８および／またはＳＰ−５関連ペプチドを含有するように処方された、薬学的組成物が提供される。本発明は、ＳＰ−１８および／またはＳＰ−５関連ペプチドの投与により呼吸窮迫症候群の治療方法をも包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＡＳＰ活性を有し、かつ以下の配列を持つ精製ポリペプチドまたは薬学的に許容され得るその塩あるいはアミド：
【００１８】
【化１】
2005053929.tif 000002
【００１９】
ここで、ＡＡ28はＣｙｓあるいはＳｅｒ、
ＡＡ29はＣｙｓあるいはＳｅｒ、
ＡＡ30はＰｒｏあるいはＡｌａ、
ＡＡ31はＶａ１あるいはＧｌｎ、
ＡＡ32はＨｉｓあるいはＬｙｓ、
ＡＡ33はＬｅｕあるいはＡｌａ、
ＡＡ34はＬｙｓあるいはＧｌｎ、
ＡＡ35はＡｒｇあるいはＧｌｎ、
Ｚは、ＶａｌあるいはＩｌｅのいずれか、
ＹはＯＨ、Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−ＯＨ、
あるいはＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｙ1、
ここで、Ｙ1は、図３の６０〜７４位のアミノ酸に相当する１〜１５個のアミ
ノ酸のＣ末端伸長配列、そしてＸは、ＨあるいはＨ−ＡＡ27−、Ｈ−Ａ
Ａ26−ＡＡ27−、あるいはＸ’−ＡＡ26−ＡＡ27−、
ここで、ＡＡ27は、ＰｒｏあるいはＡｌａ、
ＡＡ26は、ＩｌｅあるいはＳｅｒ、そして
Ｘ’は、Ｈあるいは図３の１〜２５位のアミノ酸に
相当する１〜２５個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；
ここで、条件として、ＸがＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏのとき、ＹはＨｉｓ−Ｙ1であり、ここでＹ1は６０〜６６位のアミノ酸のＣ末端伸長配列であり、そしてすべてのＺはＶａｌであり、ＡＡ28−ＡＡ35は−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（配列番号５）および（配列番号６）となり得ない、ポリペプチドまたはその塩あるいはアミドを提供する。
【００２０】
１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、上記ＹがＧｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨあるいはＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｙ1であり得る。
【００２１】
別の実施形態において、上記Ｘは、Ｈ、ＡＡ27−、ＡＡ26−ＡＡ27−、Ｇｌｙ−ＡＡ26−ＡＡ27−、あるいはＰｈｅ−Ｇｌｙ−ＡＡ26−ＡＡ27−であり得る。
【００２２】
さらに別の実施形態において、上記Ｘは、Ｈ、ＡＡ27−、ＡＡ26−ＡＡ27−、Ｇｌｙ−ＡＡ26−ＡＡ27−、あるいはＰｈｅ−Ｇｌｙ−ＡＡ26−ＡＡ27−であり得る。
【００２３】
なお別の実施形態において、上記ＡＡ28およびＡＡ29の両方は、Ｓｅｒであり得る。
【００２４】
なおさらに別の実施形態において、上記ＡＡ27およびＡＡ30の両方は、Ａｌａであり得る。
【００２５】
さらなる実施形態において、上記ＡＡ31はＧｌｎ、ＡＡ32はＬｙｓ、そしてＡＡ33はＡｌａであり得る。
【００２６】
本発明はまた、以下から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する：
【００２７】
【化２】
2005053929.tif 000003
【００２８】
。
【００２９】
１つの局面において、本発明は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（配列番号：３９）。
【００３０】
別の局面において、本発明は、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する：
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号４０）。
【００３１】
本発明はまた、哺乳類の呼吸逼迫症（ＲＤＳ）を治療するのに有効な製薬組成物であって、上記ポリペプチドを薬学的に許容され得る賦形剤との混合で含有する製薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、哺乳類の呼吸逼迫症（ＲＤＳ）を治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする哺乳類に上記ポリペプチドを有効量与えることを包含する。
【００３３】
本発明はまた、上記ペプチドをコードするＤＮＡから実質的になる、単離された形態の組換えＤＮＡを提供する。
【００３４】
本発明は、組換え宿主中に形質転換された場合に、上記ＤＮＡを発現し得る発現系を含むＤＮＡもまた提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、上記の発現系で形質転換された組換え宿主を提供する。
【００３６】
本発明は、以下の配列のペプチドまたはその塩あるいはアミドを産生する方法を提供し、この方法は、
【００３７】
【化３】
2005053929.tif 000004
【００３８】
ここで、ＡＡ28はＣｙｓあるいはＳｅｒ、
ＡＡ29はＣｙｓあるいはＳｅｒ、
ＡＡ30はＰｒｏあるいはＡｌａ、
ＡＡ31はＶａ１あるいはＧｌｎ、
ＡＡ32はＨｉｓあるいはＬｙｓ、
ＡＡ33はＬｅｕあるいはＡｌａ、
ＡＡ34はＬｙｓあるいはＧｌｎ、
ＡＡ35はＡｒｇあるいはＧｌｎ、
Ｚは、Ｖａ１あるいは１１ｅのいずれか、
ＹはＯＨ、Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−ＯＨ、
あるいはＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｙ1、
ここで、Ｙ1は、図３の６０〜７４位のアミノ酸に相当する１〜１５個のアミ
ノ酸のＣ末端伸長配列、そしてＸは、ＨあるいはＨ−ＡＡ27−、Ｈ−Ａ
Ａ26−ＡＡ27−、あるいはＸ’−ＡＡ26−ＡＡ27−からなる群から選択されるアミノ酸配列、
ここで、ＡＡ27は、ＰｒｏあるいはＡｌａ、
ＡＡ26は、ＩｌｅあるいはＳｅｒ、そして
Ｘ’は、Ｈあるいは図３の１〜２５位のアミノ酸に
相当する１〜２５個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；
ここで、条件として、ＸがＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏのとき、ＹはＨｉｓ−Ｙ1であり、ここでＹ1は６０〜６６のアミノ酸のＣ末端配列であり、すべてのＺはＶａｌであり、ＡＡ28−ＡＡ35は−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＬＹｓ−Ａｒｇ−となり得ず、
上記細胞を培養する工程、およびペプチドを回収する工程を含む。
【００３９】
本発明はまた、ＡＳＰ活性を有し、そして図３の２０１位から、２７５−２８１位のアミノ酸として示された配列を持つ、精製されたポリペプチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（定義）
本明細書で用いる用語、「肺胞界面活性タンパク質（ＡＳＰ）」は、肺胞界面活性複合体に関連し、以下に定義するＡＳＰ活性を有するアポタンパク質を意味する。試験したすべての種のＡＳＰは、本明細書で「３２Ｋ  ＡＳＰ」と呼ばれる、比較的高分子量（ほぼ３２ｋｄ）の１またはそれ以上の構成成分、および、本明細書で「１０Ｋ  ＡＳＰ」と呼ばれる、比較的低分子量（約５−２０ｋｄ）の疎水性の強い構成成分を１またはそれ以上包含するようである。（Ｋｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．ら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏ１（１９７７）４２：４８３−４９１；Ｐｈｉｚａｃｋｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９７９）１８３：７３１−７３６）。
【００４１】
哺乳類に存在することが知られている界面活性タンパク質の性質に関する、さらなる議論が、第ＷＯ８７／０６５８８号に見られる。それに記載されていることを要約すると、「１０Ｋ」グループのタンパク質は、２つの異なるＤＮＡによってコードされた前駆体に由来する。ＳＰ−１８と呼ばれるこれらのＤＮＡの一方のセットは、ゲル上の約１８ｋｄに現れる、タンパク質の前駆体をコードするが、還元条件下では、１０ｋｄの分子量を示す。ＳＰ−５と呼ばれるもう一方のＤＮＡは、ゲル上で８ｋｄまたは５ｋｄの分子量を示すタンパク質の前駆体をコードする。本出願の発明は、ＳＰ−１８およびＳＰ−５の前駆体タンパク質によって生成するペプチドに関連した特定のペプチドに関する。
【００４２】
あるタンパク質の「ＡＳＰ活性」は、脂質のみ、または、脂質および他のタンパク質と共に組み合わされた場合に、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｂ．，Ｌｕｎｇ（１９８０）１５８：５７−６８のインビボアッセイで活性を示す能力と定義される。このアッセイでは、評価すべき試料を、帝王切開術によって未熟児の状態で出産させたウサギの胎児または子羊の胎児に、気管内チューブを通して投与する。（これらの「未熟児」は自身のＡＳＰを欠き、人工呼吸器で維持されている。）肺の伸縮性、血液ガスおよび人工呼吸器の圧力の測定により、活性の指数を得る。例えば、Ｋｉｎｇ，Ｒ．Ｊ．ら，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏ１（１９７２）２２３：７１５−７２６に記載の、または、ＨａｗｇｏｏｄらのＰＣＴ出願第ＷＯ８７／０６５８８号に記載され、説明されているインビトロアッセイにより、活性の予備評価を行い得る。後者は、タンパク質をリン脂質小胞調製物と混合した時の、空気−水の界面の表面張力の直接測定を利用している。本明細書に記載し、特許請求した、ＳＰ−１８およびＳＰ−５由来ペプチドは、すべてＡＳＰ活性を示す。
【００４３】
本発明の「ｈＳＰ−５由来ペプチド」は、図１および２に示すヒトＳＰ−５  ＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列に基づくペプチド、特に、図３に示す前駆体アミノ酸配列の部分をコードし、且つ、上記で定義したＡＳＰ活性を有する部分を含む。これらのＳＰ−５ペプチドあるいは薬学的に許容され得るその塩あるいはアミドは以下のアミノ酸配列で定義される：
【００４４】
【化４】
2005053929.tif 000005
【００４５】
ここで、ＡＡ28はＣｙｓあるいはＳｅｒ、
ＡＡ29はＣｙｓあるいはＳｅｒ、
ＡＡ30はＰｒｏあるいはＡｌａ、
ＡＡ31はＶａｌあるいはＧｌｎ、
ＡＡ32はＨｉｓあるいはＬｙｓ、
ＡＡ33はＬｅｕあるいはＡｌａ、
ＡＡ34はＬｙｓあるいはＧｌｎ、
ＡＡ35はＡｒｇあるいはＧｌｎ、
Ｚは、ＶａｌあるいはＩｌｅのいずれか・
ＹはＯＨ、Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−ＯＨ、
あるいはＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｙ1、
ここで、Ｙ1は、図３の６０〜７４位のアミノ酸に相当する１〜１５個のアミノ酸のＣ末端伸長配列、そして
Ｘは、ＨあるいはＨ−ＡＡ27−、Ｈ−ＡＡ26−ＡＡ27−、あるいはＸ’−ＡＡ26−ＡＡ27−、
ここで、ＡＡ27は、ＰｒｏあるいはＡｌａ、
ＡＡ26は、ＩｌｅあるいはＳｅｒ、そして
Ｘ’は、Ｈあるいは図３の１〜２５位のアミノ酸に相当する１〜２５個のアミノ酸のＮ末端伸長配列；
ここで、条件として、ＸがＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏのとき、ＹはＨｉｓ−Ｙ1であり、ここでＹ1は６０〜６６位のアミノ酸のＣ末端伸長配列であり、そしてすべてのＺはＶａｌであり、ＡＡ28−ＡＡ35は−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−。
【００４６】
上記のグループ中ｈＳＰ−５由来ペプチドのＹの、好適な実施態様は、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、またはＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｙ1である。但しＹ1は、図３で６０−７４の番号を付した１５個のアミノ酸に対応するＣ末端伸張部である。Ｘの好適な実施態様は、Ｈ、Ｈ−ＡＡ27−、Ｈ−ＡＡ26−ＡＡ27−、Ｇｌｙ−ＡＡ26−ＡＡ27−または、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＡＡ26−ＡＡ27−である。
【００４７】
以下に述べるように、上記のグループ内の特に好適なＳＰ−５類似体は、ＡＡ28およびＡＡ29が両方Ｓｅｒのものである。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、これらの部位の、２つの天然Ｃｙｓ残基をＳｅｒで置換すると、分子内および分子間ジスルフィド結合が減少し、従って、タンパク質の凝集が減少することを本発明の発明者は実証した。
【００４８】
本発明の「ｈＳＰ−１８由来ペプチド」は、図４に示すアミノ酸配列を有するペプチドを含む。図４は、２０１位から２７５−２８１位のカルボキシ末端までにわたるヒトクローン＃３を示す。特に好適なものは、２０１−２７９位にわたるＳＰ−１８タンパク質である。
【００４９】
（タンパク質の生産）
本発明のｈＳＰ−１８およびｈＳＰ−５由来ペプチドの、より短い形態のものは、固相ペプチド合成、または、他の標準的ペプチド合成手段によって、調製し得る。これらのペプチドはまた、組換えベクターおよび宿主を用いて簡便に製造し得る。
【００５０】
ベクターの構築、細胞の形質転換、形質転換細胞中での発現、等に用いられる技術のほとんどは、当該分野で広く実施されており、ほとんどの当業者は、特定の条件および方法を記載した標準的な手引書を熟知している。本発明のペプチドに用いられる方法の例は、特に、第ＷＯ８６／０３４０８号および第ＷＯ８７／０６５８８号に実際的に記載されている。
【００５１】
特に哺乳類系および細菌系および酵母系を含む様々な宿主体系で、発現を行ない得る。加えて、他の細胞系も当該分野で使用可能になり、例えば、バキュロウィルスベクターが、昆虫の細胞内でタンパク質をコードする遺伝子を発現するために用いられている。以下に述べる発現系は、本発明の例示を目的とするものであり、当業者は、様々な発現系が使用され得ることを理解している。
【００５２】
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの回収、および／または合成方法の使用によって、様々なｈＳＰ−５およびｈＳＰ−１８由来ペプチドをコードするヌクレオチド配列が得られ、様々な系中で、これらのヌクレオチド配列を発現し得る。原核系が用いられる場合は、適切な対照配列と共にイントロンを含有しないコード配列を用いるべきである。上記のＡＳＰタンパク質のいづれに対応するｃＤＮＡクローンは、適切な制限酵素で切り出し、このような発現のための原核ベクターに連結され得るか、または、合成のコード配列が使用され得る。ＡＳＰゲノムＤＮＡを原核系で発現させるためには、部位特異変異誘発により、または、ｃＤＮＡの対応部分を回収し、それらをイントロン含有ゲノム配列で置換することにより、ＤＮＡからイントロンを除去する修飾をすべきである。イントロンを含有しないコードＤＮＡを次に、原核発現用の発現ベクターに連結する。
【００５３】
例示するように、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、または合成（または一部合成）ＡＳＰコード配列は、イントロンをプロセッシング可能な発現系、通常、哺乳類の宿主細胞培養系に、直接使用し得る。このような発現を実施するために、ゲノム配列または他の配列を、適合性のある細胞内でこれらの配列の発現を調節する制御可能な哺乳類プロモーターの下流に連結され得る。
【００５４】
組換え体産生に加えて、ＳＰ−５コードタンパク質に関連するタンパク質のような、長さの十分短い、本発明のタンパク質は、標準タンパク質合成方法によって調製し得る。
【００５５】
（タンパク質の回収）
ＡＳＰタンパク質は、成熟タンパク質もしくは融合タンパク質として産生され得、または分泌するためにシグナル配列をプロセシングし得る細胞中で、シグナル配列と共に産生され得る。タンパク質が分泌されると、精製の困難性が最小限になるため、時として有利な場合がある。従って、適切なプロセッシングをし得る細胞中で、天然のシグナル配列のコドンを含むヒトＡＳＰ遺伝子を発現させることが好ましい。培養された哺乳類細胞は、シグナル配列を有する異種の哺乳類タンパク質を開裂し、プロセシングし、それらを培地中に分泌することが示されている（ＭｃＣｏｍｉｃｋ，Ｆ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ１（１９８４）４：１６６）。
【００５６】
培地に分泌されると、ＡＳＰタンパク質は、標準タンパク質精製技術により回収される。比較的少数のタンパク質が、培地に分泌され、そこで分泌されたタンパク質の大部分は、すでにＡＳＰであるため、精製工程は簡略化される。方法はより困難であるが、融合または成熟の形態で細胞内に生産される細胞の音波処理物または溶解産物からこのタンパク質を精製することは、当該技術分野で公知の手段である。このような方法の１つを以下に例示する。
【００５７】
（ＡＳＰ活性のアッセイ）
表面張力を減少させる（表面圧力を増加させることと同義）ことにより、ＡＳＰタンパク質が水／空気の界面に膜を形成する能力を評価するインビトロの試験法が考案された。これらの方法を用いた研究が、単離された天然の１０ＫのイヌＡＳＰに関して行われた（Ｂｅｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｇ  Ｒｅｓｐ  Ｒｅｓ（１９８４）１８：８３−９２；Ｈａｗｇｏｏｄ、Ｓ．らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）２４：１８４−１９０）。
これらの方法はまた、個々の合成ペプチドおよび組み換えペプチドにも適用される。インビボでの界面活性物質複合体の機能は、表面張力を減少させるために、空気／水の界面に膜を形成することであるため、インビトロのモデルの表面で脂質またはリポタンパク質の拡がりにより生成する膜の形成を促進するＡＳＰタンパク質の能力は、明かにその有用性と関連している。
【００５８】
ＷＯ８７／０６５８８号のセクションＤ．１０に詳述されている、インビボのモデルもまた使用される。
【００５９】
（投与及び使用）
精製されたタンパク質および類似体は、小児または成人の呼吸窮迫症候群の治療のために投与されるのに適切な薬学組成物に、単独でおよび組み合わせて使用され得る。本発明の組成物はまた、肺炎および気管支炎のような関連の呼吸疾患を治療するのに有用である。この複合体は、約５０％からほぼ１００％（ｗｔ／ｗｔ）の脂質および５０％から１％未満のＡＳＰを含み、好ましくはＡＳＰが、複合体の５％から２０％である。脂質部分の７０％から９０％（ｗｔ／ｗｔ）がＤＰＰＣであり、その残りの部分が、不飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、トリアシルグリセロール類、パルミチン酸、パルミトイルオレイルホスホグリセリド（ＰＯＰＧ）、またはその混合物であるのが好ましい。複合体は、ＡＳＰ溶液と脂質リポソームの懸濁液とを混合させるか、または洗浄剤または有機溶媒の存在下に直接脂質タンパク質溶液を混合することにより形成される。次いで、洗浄剤または溶剤は、透析または蒸発により除去され得る。
【００６０】
複合体を構築するために肺洗浄物からの天然の脂質成分を用い、それに適切な量のＡＳＰタンパク質を補給することが可能であるが、合成脂質を使用することが明らかに好ましい。第１に、自明なことであるが、十分な供給が問題なためである。第２に、調製物の純度および、天然の脂質が単離される肺に存在し得る感染性のタンパク質を含む、外来タンパク質による汚染がないことは、合成調製物でのみ保証される。もちろん、有効な複合体の再構成は、合成成分を使用する方がより困難である。
【００６１】
好ましいＡＳＰ組成物は、単離された１０Ｋ混合物との複合体、ＳＰ−５−もしくはＳＰ−１８−がコードするタンパク質単独、単独または組合せた活性ＳＰ−５類似体、１０Ｋおよび３２Ｋ混合物の複合体、またはＳＰ−１８もしくはＳＰ−５−関連タンパク質と３２Ｋ混合物との複合体を含む。後者の場合、好ましいタンパク質比、すなわち３２Ｋ：１０Ｋもしくは３２Ｋ：ＳＰ−１８もしくは３２Ｋ：ＳＰ−５−は、通常、３：１から２００：１の範囲、好ましくは約１０：１から５：１の範囲である。３２Ｋタンパク質は、リン脂質小胞の水性懸濁液に水溶液で直接加え得る。１０Ｋタンパク質は疎水性が強いため、クロロホルムのような有機溶媒の溶液中の脂質に加えられ、溶媒を蒸発させ、次いで、水和により水小疱を再形成させる。
【００６２】
界面活性複合体を投与するために、１０Ｋタイプに３２Ｋタンパク質を添加すると、相乗効果があるように思われる。すなわち、３２Ｋおよび１０Ｋタイプのタンパク質を組み合わせると、１０Ｋタンパク質単独の場合に必要なタンパク質濃度よりも低い濃度で所望の活性を示す。従って、本発明の好ましい方法では、投与される界面活性複合体は、有効な量の１０Ｋ混合物または個々のＳＰ−５またはＳＰ−１８タンパク質、または本発明のｈＳＰ−５またはｈＳＰ−１８由来のペプチドと、３２ＫのＡＳＰとの混合物を含む。もちろん、個体のｈＳＰ−５またはｈＳＰ−１８由来のペプチド混合物が使用され得る。特に好ましい組成物は、全組成物の通常５０％からほぼ１００％の範囲の適切な量の脂質成分と共に、上記のような３２Ｋ：１０Ｋ比のタイプのタンパク質を含む。
【００６３】
複合体を含む組成物は、気管内投与に適切な、すなわち、一般に脂質懸濁液、乾燥粉末「ダスト」、またはエアロゾルが好ましい。直接気管内投与するためには、複合体は、例えば水、生理食塩水、デキストロースまたはグリセロール等の適切な賦形剤を含む液体中に懸濁される。組成物はまた、例えば酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム等のｐＨ緩衝剤のような無毒性補助物質を少量含み得る。「ダスト」を調製するために、上記のように任意に混合された複合体を、凍結乾燥し、次いで乾燥粉末として回収する。
【００６４】
エアロゾル投与に用いる場合には、複合体は、付加的な界面活性剤および噴射剤と共に、微細に分割された形態で供給される。投与され得る典型的な界面活性剤は、脂肪酸およびエステルであるが、本発明の場合、界面活性剤複合体の他の成分のＤＰＰＣおよびＰＧを用いるのが好ましい。有用な噴射剤は、通常、通常条件で気体であり、加圧下で凝縮される。低級アルカンおよびフレオン（Ｆｒｅｏｎ）のようなフッ素化アルカンが使用され得る。エアロゾルは、適切なバルブを備えたコンテナー中に充填し放出されるまで、加圧下に成分を維持する。
【００６５】
界面活性複合体は、気管内挿入管、エアロゾル投与、または吸気中への懸濁液またはダストの噴霧による、等の投与形態に応じて適切に投与される。体重１ｋｇ当り約０．１ｍｇと２００ｍｇとの間、好ましくは５０−６０ｍｇの量の複合体が一回の投与で投与される。新生児に使用する場合は、一回の投与で一般に十分である。成人では、再構成された複合体が、示された欠損レベルを補うのに十分な量、投与される（Ｈａｌｌｍａｎ、Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９８２）７０：６７３−６８２）。
【００６６】
さらに、本願に記載のｈＳＰ−１８−およびｈＳＰ−５−由来のぺプチドを含む１つまたはそれ以上のＡＳＰタンパク質が、他の生物学的に活性で重要な分子を、肺および／または肺を通じて血管系に運搬するためのキャリヤーまたはビヒクルとして使用され得る。後者の場合、身体の他の器官にとって重要な物質の運搬がなされ得る。
【００６７】
本発明は、好ましい特定の実施態様に関連させて記載しているが、上記の説明および以下の実施例は、本発明を例示することを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の範囲内にある他の局面、利点および改変は、本発明が関連する当業者に自明である。
【実施例】
【００６８】
（調製Ａ）
（哺乳類ＡＳＰタンパク質の単離）
ＷＯ８６／０３４０８およびＷＯ８７／０６５８８に記載されているように、イヌ、ヒトおよびウシＡＳＰタンパク質を精製した形態で得たが、これらの出願願書には、ヒトおよびイヌの３２Ｋのタンパク質をコードするＤＮＡ、並びにヒトおよびイヌのＳＰ−１８タンパク質をコードするＤＮＡが回収され開示された。ヒトＡＳＰのＳＰ−５前駆体タンパク質をコードする、完全なｃＤＮＡ配列の２つの改変型が、ＷＯ８７／０６５８８に記載されているように回収されており、本願の図１および２に示すように再生される。
【００６９】
（実施例１：単離された１０Ｋタンパク質のＮ末端およびＣ末端の同定）
５ｋｄタンパク質：
１０Ｋ混合物中の５ｋｄタンパク質のカルボキシ末端は、このタンパク質が分子量約２０，５００ダルトンの大きな前駆体に由来しているため、確認が難しい。単離された、天然のイヌタンパク質の質量スペクトル分析では、図５のイヌタンパク質のアミノ酸配列において示したように、明らかにカルボキシ末端がＨｉｓ−５９であることが示された。ヒトの肺洗浄液から単離された天然ＳＰ−５タンパク質の、酵素開裂フラグメントのアミノ酸配列分析では、カルボキシ末端がＬｅｕ−５８にあることが示された（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２３２，  Ｎｏ．  １（１９８８），  ６１−６４参照）。イヌの天然型ＳＰ−５およびヒトの天然型ＳＰ−５を質量スペクトルによって再分析すると、観察される分子量は、Ｌｅｕ−５８にカルボキシ末端を有する種類と一致する。この種類は、（イヌではＡＡ−２８の、ヒトではＡＡ−２８，２９の）システイン残基がチオエステル結合を介してパルミチル化されている。パルミチル基を除去するために、還元剤によってこの天然型を処理し、次に質量スペクトル分析およびＨＰＬＣ分析を行って、これらの種類が存在することが確認された。従って、本発明の好ましいアナログは、図１、２および３に示すように、Ｌｅｕ−５８またはＨｉｓ−５９にカルボキシル末端を有し得る。組換え産生技術を用いて、本願の発明者らは、Ｌｅｕ−５８とＨｉｓ−５９の双方にカルボキシル末端を有するＳＰ−５アナログを生成し、本明細書に説明する、インビトロおよびインビボ両方のアッセイで、それらが本質的に同等であるということを示した。特に、比較して同等であるということが示されたアナログは、アミノ酸末端をＧｌｙ−２５に、Ｓｅｒ残基をＡＡ−２８およびＡＡ−２９に、そしてカルボキシル末端をＬｅｕ−５８またはＨｉｓ−５９に有するヒトＳＰ−５アナログタンパク質である。
【００７０】
ヒト５ｋｄタンパク質のＮ−末端は、アミノ酸の直接配列決定によってフェニルアラニン（図３に示すように、２４位において）であることがわかるが、２５位のグリシンおよび２６位のイソロイシンを代わりにＮ末端として有する先端切断型もまた見いだされた。
【００７１】
１８ｋｄタンパク質：
１０Ｋ混合物中の１８ｋｄタンパク質のカルボキシ末端を、アミノ酸組成定量と、Ｎ末端から始まるタンパク質のアミノ酸配列決定と、カルボキシペプチダーゼＹ消化（タンパク質のＣ末端からアミノ酸を開裂させる酵素）と、質量スペクトルとを用いて分析した。図６に、ヒトおよびイヌのタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００７２】
臭化シアンによるメチオニンでの開裂の後、イヌおよびウシ１８ｋｄタンパク質の配列分析を行うと、イヌタンパク質のＣ末端はＨｉｓ−２７９に、ウシタンパク質のＣ末端はＳｅｒ−２７８にあることが示された。カルボキシペプチダーゼＹを用いた酵素分析では、Ｌｅｕ−２７５が、イヌおよびウシタンパク質両方のＣ末端であった。イヌタンパク質の質量スペクトル分析では、Ｃ末端はＡｒｇ−２７６であり、臭化シアン開裂の後のアミノ酸配列決定によって予測されるところによると、小さな配列がＨｉｓ−２７９に伸びている。要するに、カルボキシ末端はイヌタンパク質においてはＨｉｓ−２７９に近く、類推すると、ヒト１８ｋｄタンパク質においてはＭｅｔ−２７９に近い。上記の結果に基づくと、特定の調製物および種類に応じて、タンパク質の先端切断型のＣ末端、および先端切断型またはゆらぎ型Ｎ末端が存在すると思われる。従って、本願の発明者らは、特定の種類について、おそらく多数のＣ末端が存在すると仮定する。図６に示すように、ヒトタンパク質の推定Ｎ−末端は、ＷＯ８７／０６５８８に記載されているように２０１位のフェニルアラニンである。カルボキシ末端は、同様に図６に示すように、２７９位のメチオニンコドンに近い。
【００７３】
（調製Ｂ）
（哺乳類発現のためのベクター構築）
本明細書に開示されるｈＳＰ−１８由来タンパク質およびｈＳＰ−５由来タンパク質は、組換え技術を用いて調製され得る。イントロンを含むＤＮＡをプロセシングすることもできる、哺乳類細胞中で様々なＡＳＰをコードする配列を発現させるのに適したベクターが構築された。これらのベクターにおいては、ＷＯ８７／０６５８８に記載されているように、メタロチオネインＩＩ（ｈＭＴＩＩ）コントロール配列によって発現が調節される。この公開出願では、宿主ベクターｐＭＴ、ｐＭＴ−Ａｐｏ、ｐＭＴ−ＳＶ（９）、ｐＭＴ−ＳＶ（１０）、およびｐＭＴ−Ａｐｏ１０の調製を詳細に記載している。これらのベクターはすべて挿入部位を有しており、メタロチオネインプロモーターの制御下にコードする配列を置くことができる。名称に”Ａｐｏ”のつくベクターは、挿入領域の下流のＡｐｏＡＩ遺伝子に伴う、３’末端調節シグナルをも含んでいる。名称に”９”または”１０”がつくベクターは、作動可能なＳＶ−４０ウイルスエンハンサーをも含んでいる。
【００７４】
上記公開出願に記載されているように、ｐＭＴＡｐｏ１０をＢａｍＨＩで消化し、平滑化し、ＳＰ−１８前駆体をコードする１２７５ｂｐのクローン＃３から得たｃＤＮＡ配列（平滑末端フラグメント）に連結した。このことは、ヌクレオチド６６３位のＢａｍＨＩ部位を避けつつ、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ（パーシャル）フラグメントをｃＤＮＡ＃３から単離し、これをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ９にサブクローニングすることによって行われた。所望のフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで取り出し、クレノウで平滑化し、そしてｐＭＴＡｐｏ１０に挿入した。得られたベクターであるｐＭＴ（Ｅ）：ＳＰ−１８−４０ｋを、ＣＨＯ細胞に形質転換した。これらの形質転換細胞の培養物中でプロモーターを誘導することにより、２５ｋｄおよび４３ｋｄタンパク質が産生された。これらのタンパク質はヒト１８ｋｄ  ＡＳＰに対する抗血清で免疫沈降される。前駆体の残基３３６−３５３に伸びるペプチドに対する抗血清を用いたウエスタンブロットにかけると、２５ｋｄおよび４３ｋｄタンパク質が検出された。２５ｋｄ生成物は、Ｎ結合グリコシル化部位を有する、Ｐｈｅ−２０１：Ｌｅｕ−３８１に伸びる、１８１個のアミノ酸配列を示すと考えられている。
【００７５】
さらにＷＯ８７／０６５８７に記載されているように、ＳＰ−１８をコードするＤＮＡを含有するアナログベクターを構築し、このベクターは、明らかにＣＨＯ細胞中で全長配列から産生された前駆体タンパク質の、インビトロでの開裂のための部位を提供する、標準部位特異的突然変異導入の技術を用いて作られた。このような構築物の１つにおいて、３８１個のアミノ酸前駆体を改変して、Ｇｌｎ−１９９：Ｇｌｎ−２００およびＡｒｇ−２８６：Ｓｅｒ−１８７のそれぞれを、Ａｓｎ：Ｇｌｙに置き換えて、（ＡｓｎとＧｌｙとの間を開裂する）ヒドロキシルアミンによって開裂可能な部位を得た。このようにして生成したヒドロキシルアミンによる前駆体の開裂部によって、推定される成熟形態が生じる。この成熟型は、アミノ末端に付加的ｇｌｙ残基を有し、Ａｓｎ残基に変換された推定カルボキシ末端Ａｒｇ−２８６を有する。別の構築物では、Ｐｈｅ−２０１およびＳｅｒ−８７がＡｓｐ残基に変換されている。酸を用いた（ＡｓｐとＰｒｏとの間の）開裂によって、Ｎ末端Ｐｈｅ−２０１がなく、カルボキシ末端に付加的Ａｓｐ残基を有する、ＳＰ−１８タンパク質の成熟形態が生じる。別の構築物では、Ｇｌｕ残基の後を開裂するＳｔａｐｈ  Ｖ８ペプチダーゼを用いて、インビトロで、前駆体をより緩やかな酵素工程によって処理することができる。Ｇｌｕ−２５１をＡｓｐに変換することによって、Ｇｌｕ−１９８およびＧｌｕ−２９１の天然Ｇｌｕ残基が利用される。４３ｋｄ前駆体は、Ｓｔａｐｈ  Ｖ８で開裂され、アミノ末端に付加Ｇｌｎ−Ｇｌｎを持ち、カルボキシ末端にＰｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕを有する推定の成熟ＳＰ−１８タンパク質が生ずる。さらに別の構築物では、Ｇｌｕ残基が２００位および／または２８７位に位置させられ得る。
【００７６】
同様の方法で、図１および図２に示す、ＳＰ−５クローンの平滑化ＥｃｏＲＩ挿入物をＢａｍＨＩ消化ｐＭＴ−Ａｐｏ１０内に入れ、ｐＭＴ（Ｅ）：ＳＰ−５ベクターを得、ＣＨＯ細胞に形質転換した。
【００７７】
（実施例２：ｈＳＰ−１８由来ペプチドおよびｈＳＰ−５由来ペプチドをコードするＤＮＡの哺乳類発現）
本明細書に説明する、本発明のｈＳＰ−５由来タンパク質およびｈＳＰ−１８由来タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ消化ｐＭＴ−Ａｐｏ１０に入れ、適切な発現ベクターが得られる。好ましくは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを、ＣＨＯ細胞において有効なシグナル配列へ、作動可能に連結する。挿入された配列のＣＨＯ細胞への形質転換および発現は、下記のように行われる。
【００７８】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞を、１０％の胎児仔牛血清を添加した、クーンのＦ１２培地とＤＭＥ２１培地との１：１混合物からなる培地で増殖させる。成分細胞は、目的のベクターおよびｐＳＶ２：ＮＥＯ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｐ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ（１９８２）１：３２７−３４１）によって同時形質転換される。ｐＳＶ２：ＮＥＯは、ネオマイシンアナログＧ４１８に対する耐性を与える機能的遺伝子を含有している。一般的な形質転換においては、０．５μｇのｐＳＶ２：ＮＥＯおよび５μｇ以上の発現ベクターＤＮＡが、１００ｍｍディッシュの細胞に付与される。Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１６：７７７−７８５のプロトコルによる、リン酸カルシウムとＤＮＡの同時沈澱法では、ＤＮＡに４時間曝した後、１５％グリセロールを含むＰＢＳでの２分間の「ショック」が用いられる。
【００７９】
簡単に言うと、細胞を１／１０集密で接種し、１晩増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ＣａＰＯ4・ＤＮＡ同時沈澱を含有する０．５ｍｌのへペス緩衝生理食塩水内に１５分間置き、そして１０ｍｌの培地を加える。培地を吸引によって除去し、１．５〜３分間、１５％グリセロールを含むＰＢＳに置き換える。ショックを受けた細胞を洗浄し、培養培地を加える。ＭＴ−ＩＩ制御発現が誘導されるまで、培地は１０％のＦＢＳを有する１：１のＦ１２／ＤＭＥＭ２１を含有する。１日後、細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８に曝し、Ｇ４１８耐性のコロニーのプールを得る。所望のプラスミドの安定した遺伝形質も有する、うまく形質転換した細胞を、クローン単離の精製のために、低濃度で培養する。
【００８０】
所望のタンパク質の産生について、まずプールとして、その後多重ウェルプレートで単離されたクローンとして、形質転換細胞をアッセイする。培養アッセイレベルは、ある程度ウェルの大きさによる。例えば、２４ウェルプレートの結果を、９６ウェルプレートの結果とは直接には比較しない。プレートアッセイによって、満足のいくレベルでタンパク質を産生していることがわかったクローンを、次にローターボトルでの製造作業で成長させることができる。一般に、スケールアップを行うと、産生のレベルは上がる。このため、一般に１００〜２００以上の個々のクローンが、プレート上での様々なスクリーニング法によってアッセイされ、最も高い生成を示したもののうち５〜１０個が、製造条件下（ローターボトル）でアッセイされる。
【００８１】
形質転換された細胞のプールを多重ウェルプレートで成長させ、５ｘ１０-5から１ｘ１０-4の亜鉛イオン濃度に曝し、所望のＡＳＰタンパク質の産生を誘導する。
【００８２】
１０％ＦＢＳを含有する、マッコイの５Ａ培地で成長する個々の細胞株の半集密単層を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０％ＦＢＳと、１ｘ１０-4塩化亜鉛と、０．２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムとを含有するマッコイの培地でならす（ｒｅｆｅｄ）。（アスコルビン酸塩は、プロリン残基のヒドロキシル化に役立つ。）誘導後２４時間で、細胞をＰＢＳで洗浄し、塩化亜鉛およびアスコルビン酸塩を含有する、血清フリーのマッコイ培地でならす（ｒｅｆｅｄ）。１２時間後、馴化培地を回収する。
【００８３】
（調製Ｃ）
（細菌発現ベクター）
ＷＯ８７／０６５８８号に記載されたように、ＡＳＰタンパク質のグリコシル化されていない形態は、バクテリア中で生成され得る。ＳＰ−１８タンパク質では、遺伝子は、発現して例えばｍｅｔ−に続く２０１−３８１残基で表される１８１アミノ酸前駆体を生成するか、または１５個残基のβ−ガラクトシダーゼリーダーを有する、ヒドロキシルアミンで開裂し得る融合タンパク質前駆体として生成され得る。ＡＴＧに先立つ、ｃＤＮＡのアミノ酸２０１−３８１をコードする改変ｃＤＮＡ  ＃３は、Ｔｒｐ−調節ベクターｐＴｒｐ−２３３のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入し、ｐＴｒｐ−２０を得る。これはＷＯ８７／０６５８８号に記載されている。この構築物は分子量２０ｋｄのタンパク質を生成する。ｐＢＧａｌ宿主ベクターに類似した構築物であるｐＢＧａｌ−２０は、ヒドロキシルアミン感受性のＡｓｎ−Ｇｌｙのダブレットを通して１５個残基のβ−ガラクトシダーゼリーダーと融合した、ＳＰ−１８  ｃＤＮＡ  ＃３とおなじ配列を含有し、ＭＷ＝２２ｋｄの融合タンパク質を生成する。
【００８４】
ｐＴｒｐ−２０およびｐＢＧａｌ−２０プラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０をアンピシリン耐性に形質転換する。Ｍ９培地（１ｘＭ９塩、０．４％グルコース、２ｍｇ／ｍｌチアミン、２００μｇ／ｍｌのＭｇＳＯ4・７Ｈ2０、０．５％カザミノ酸）で速やかに増殖する、ｐＴｒｐ−２０／Ｗ３１１０またはｐＢＧａｌ−２０／Ｗ３１１０の培養物を、１００μｇ／ｍ１のＩＡＡ（３−β−インドールアクリレート、シグマＩ−１６２５）で処理してｔｒｐプロモーターを誘発する。
【００８５】
ＷＯ８７／０６５８８号はまた、バクテリアに発現させる開裂部位を提供する、改変されたＳＰ−１８タンパク質配列をコードするベクターを開示する。ｐＴｒｐ−２０において、Ａｒｇ−２８６：Ｓｅｒ−２８７をコードするコドンは、Ａｓｎ−Ｇｌｙをコードするように変化されて；ヒドロキシルアミン感受性の開裂部位を導入するか、またはＳｅｒ−２８７のコドンをＡｓｐのコドンに置き換えて、その結果、酸感受性のＡｓｐ−Ｐｒｏ開裂部位を生じるか、またはＧｌｕ−２５１のコドンがＡｓｐのコドンに置き換えられ、所定のタンパク質を開裂することなくＧｌｕ−２９１においてＳｔａｐｈ  Ｖ８で開裂されるようにした。これらの構築物は、２８７−３８１または２９１−３８１のアミノ酸配列を有するＳＰ−１８を生成することが予想された。また、ｐＴｒｐ−２０およびｐＢＧａｌ−２０の両方において、３’末端配列から推定されるカルボキシ末端Ａｒｇ−２８６までの配列を削除して停止コドンに置換されており、ＳＰ−１８コドンの２０１−２８６位を表すペプチドを生成すると推定された。しかしながら、どちらの構築物も、誘発後に適当なサイズの標識されたタンパク質を生成しなかった。
【００８６】
ＳＰ−５由来のタンパク質に関連して、ＷＯ８７／０６５８８号は、ｐＴｒｐ−２０と同様にＡＴＧに続くＧｌｙ−２５から、Ｓｐ−５「前駆体」のＩｌｅ−１９７まで伸びるｃＤＮＡ  ＃１８のフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＴｒｐ−２３３に挿入してｐＴｒｐ−５を作製すること、およびｐＢＧａｌ宿主ベクターに挿入してｐＢＧａｌ−５を作製することを記載している。ここでＳＰ−５配列は、ヒドロキシルアミン感受性のＡｓｎ−Ｇｌｙを通してβ−ガラクトシダーゼリーダーと融合している。これらのベクターは推定では、２５−１９７に及ぶＳＰ−５由来のタンパク質を生成する。同様に、この構築物から予想されるタンパク質のＳｔａｐｈ  Ｖ８による、Ｐｈｅ−２４に続くＧｌｕおよびＧｌｕ−６６での開裂は、２４−６６位置にわたるＳＰ−５由来のペプチドを生じるであろう。
【００８７】
これらの構築物はすべてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に変換され、上述のように発現される。
【００８８】
（実施例３：細菌におけるｈＳＰ−１８およびｈＳＰ−５誘導のタンパク質の生成）
ｈＳＰ−１８およびｈＳＰ−５由来のペプチドを、上流に安定化配列を有する開裂可能な融合タンパク質として発現することは有益である。１９８８年８月１１日に出願された、同一譲受人による米国特許出願番号２３１，２２４号には、引例としてここに包含されるが、ｈＳＰ−１８またはｈＳＰ−５ペプチドの特定部分をコードするＤＮＡと結合した、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子の一部を含有する数種のベクターの構築物が記載されている。ＳＰ−５由来のペプチドの３５個のアミノ酸をコードするベクター、すなわち、６個のアミノ酸リンカー、Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎを通してＣＡＴと結合したｈＳＰ−５（２４−５９）を例示している。上記に引用された出願に記載されているように、これらのベクターは以下のように調製される。
【００８９】
ＳＰ−１８由来のタンパク質およびＳＰ−５由来のタンパク質を有するベクターは、ヒト心房のナトリウム排せつ増加性ペプチド（ｈＡＮＰ）をコードする挿入部を用いて構築した宿主ベクターから得られる。この中間ベクター、ｐＣｈＮＦ１０９は以下のように構築される。
【００９０】
発現ベクターｐＣｈＮＦ１０９は、エンドプロテイナーゼのＧｌｕ−Ｃのタンパク質分解性開裂部位を含有する、２４１個のアミノ酸のＣＡＴ−ｈＡＮＰハイブリッドタンパク質をコードする。ＣＡＴおよびｈＡＮＰのＤＮＡおよびコードされたアミノ酸配列は、第７図に示されている。ＣＡＴ遺伝子の大部分（アミノ酸１−２１０）は、リンカー遺伝子（５個のアミノ酸）を通して、上述のようにｈＡＮＰ（１０２−１２６）遺伝子および開裂部位（２６個のアミノ酸）インフレームで結合している。このベクターは、プラスミドｐＴｒｐ２３３、ｐＣＡＴ２１、およびｐｈＮＦ７５から構築された。これらは、それぞれプラスミドバックボーンおよびｔｒｐプロモーター−オペレー夕ー、ＣＡＴ遺伝子、そしてｈＡＮＰ（１０２−１２６）遺伝子および開裂部位を提供した。
【００９１】
プラスミドｐＴｒｐ２３３は、ＷＯ８７／０６５８８号に記載された。プラスミドｐＣＡＴ２１は、ＣＡＴ遺伝子（トランスポゾンＴｎ９から、ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２：８６４−８６９）を、ｔｒｐプロモ一夕ー−オペレー夕ーのコントロール下になるように、ｐＴｒｐ２３３に挿入することによって構築された。プラスミドｐＡＬ１３ＡＴＣＡＴ（Ｔｎ９を含有するプラスミドであり、１９８７年９月１１日に出願された、同時係属中の米国出願番号０９５，７４２に開示され、引例としてここに包含されている）を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＡＴ遺伝子を（ＮｄｅＩ部位でコードされた開始Ｍｅｔ残基とともに）含む、およそ７５０ｂｐのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて精製した。ＣＡＴ遺伝子は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＴｒｐ２３３と結合し、その結果生じるプラスミドｐＣＡＴ２１を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１から単離した。
【００９２】
タンパク質分解性開裂部位に後続する合成ｈＡＮＰ遺伝子を、プラスミドｐＢｇａｌ（Ｓｈｉｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８５：４５６）に挿入することによってプラスミドｐｈＮＦ７５を構築した。８個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを、エンドプロテイナーゼのＧｌｕ−Ｃ開裂部位に続く合成ｈＡＮＰ（１０２−１２６）遺伝子に組み込んだ。この合成遺伝子は、ＢａｍＨＩ消化したｐＴｒｐ２３３と結合した。ｈＡＮＰ遺伝子の３’末端において、隣接するＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を与える方向に挿入部を有するプラスミドｐｈＮＦ７３は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩとの消化によって生成したフラグメントのサイズによって同定した。プラスミドｐｈＮＦ７３をＥｃｏＲＩで消化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ｈＡＮＰ遺伝子を精製し、さらにその遺伝子を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＢｇａｌと結合して、ｐｈＮＦ７５を得た。
【００９３】
発現ベクターｐＣｈＮＦ１０９は、ＣＡＴ、ｈＡＮＰおよびタンパク質分解性開裂部位を含有するＤＮＡフラグメント、およびリンカー配列を、プラスミドｐＴｒｐ２３３へ挿入することによって構築した。プラスミドｐｈＮＦ７５を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｈＡＮＰを含む、約８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＴｒｐ２３３と連結してｐｈＮＦ８７を得た。ｐＣＡＴ２１はＳｃａＩで消化し、ＢａｍＨＩ合成リンカー（５’−ＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’）は平滑末端に結合した。その結合物をＢａｍＨＩで消化し、約７４０ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。ＢａｍＨＩカセットとＢａｍＨＩ消化したプラスミドｐｈＮＦ８７とを結合してｐＣｈＮＦ１０９を得た。このｐＣｈＮＦ１０９は、ｈＡＮＰ遺伝子に先行するエンドプロテイナーゼのＧｌｕ−Ｃ開裂部位にインフレームで融合したＣＡＴ遺伝子を有する。
【００９４】
ｐＣｈＮＦ１０９内のｈＡＮＰをコードする配列を、ＳＰ−５およびＳＰ−１８配列に置き換えることによって、ヒトＳＰ−５由来ペプチドおよびヒトＳＰ−１８由来ペプチドは、細菌のＣＡＴの一部との融合物として発現する。その界面活性ペプチドは、ヒドロキシルアミン感受性のアスパラギン−グリシン結合を通して、ＣＡＴ配列のカルボキシル末端と結合している。ＣＡＴ−界面活性物質融合物は、細菌のベクターｐＴｒｐ２３３のトリプトファンプロモー夕ーから発現される。
【００９５】
（発現ベクターｐＣ２１０ＳＰ−Ｂ）
ＳＰ−１８発現ベクターｐＣ２１０ＳＰ−Ｂは、ヒドロキシルアミン感受性開裂部位を含む７個のアミノ酸のリンカーを通してＣＡＴの２１０個のアミノ酸がＳＰ−１８の７６個のアミノ酸に結合している、２９３残基の融合タンパク質をコードする。ヒドロキシルアミンによる融合物の開裂によって、ＳＰ−１８の７６残基を含む７７個のアミノ酸のＳＰ−１８生成物、およびアミノ末端のグリシン残基が放出される。
【００９６】
ｐＣ２１０ＳＰ−Ｂを構築するために、ｈＡＮＰ配列を含む短いＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩセグメントをｐＣｈＮＦ１０９から除去し、ヌクレオチド（ｎｔ）６４３のＰｓｔＩ部位からｎｔ８０４のＳｐｈＩ部位まで伸長するヒトＳＰ−１８  ｃＤＮＡ  ＃３（表３）の一部分によって置換した。ＥｃｏＲＩ部位を、ヒドロキシルアミン感受性開裂部位および成熟ＳＰ−１８のアミノ末端残基をコードする２つの相補的オリゴヌクレオチド
ｏｌｉｇｏ  ＃２３０７：５’−ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＧＣＡ−３’
（配列番号：１８）
および
ｏｌｉｇｏ  ＃２３０８：  ５’−ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  Ｇ−３’（配列番号：１９）
を通してＰｓｔＩ部位に結合させた。ＳｐｈＩ部位を、ＳＰ−１８ペプチドのカルボキシ末端残基をコードする２組目のの相補的ヌクレオチド
ｏｌｉｇｏ  ＃３３１３：  ５’−ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＣＣＧ  ＧＡＧ
ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ
ＣＡＴ  Ｇ−３’
（配列番号：２０）
および
ｏｌｉｇｏ  ＃３３１４：  ５’−ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ
ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＴＡ−３’
（配列番号：２１）
を通して、ｐＴｒｐ２３３のＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させた。
【００９７】
この発現プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０をアンピシリン耐性に形質転換した。Ｍ９培地中で速やかに増殖するｐＣ２１０ＳＰ−Ｂ／Ｗ３１１０の培養物を、２５μｇ／ｍｌのＩＡＡ（３−βインドールアタリレート、シグマＩ−１６２５）とし、ｔｒｐプロモーターを誘導した。誘導から１時間後までに、まだ増殖し続けている細胞内部の位相差顕微鏡検査により、屈折性の細胞質封入体が認められた。誘導の５時間後、１  Ｏ．Ｄ．550に相当する細胞を遠心分離によってペレット化し、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動に用いるために、ＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間沸騰して、次にクマシーブルーで染色した。ＣＡＴ：ＳＰ−１８融合タンパク質の推定分子量は、４５，０００ダルトンである。ハイブリッドＣＡＴ：ＳＰ−１８タンパク質は、誘導した培養物中の１５−２０％の総細胞タンパク質のを含有すると推定された。
【００９８】
（ｐＣ２１０ＳＰ−Ｃ）
２５１残基の融合タンパク質のアミノ酸配列がプラスミドｐＣ２１０ＳＰ−Ｃ内にコードされている。ＣＡＴの２１０個のアミノ酸は、６個のアミノ酸のリンカーを通して成熟ＳＰ−５の３５個のアミノ酸に結合している。ＳＰ−５は総融合物の１４％を含む。
【００９９】
第８図に、ｐＣ２１０ＳＰ−Ｃの挿入部のヌクレオチド配列が示されている。このヌクレオチド配列では、ＳＰ−１８配列を含むｐＣ２１０ＳＰ−ＢのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが、ヌクレオチド１２３のＡｐａＬＩ部位からヌクレオチド１６１のＡｖａＩＩ部位まで伸長した、ヒトＳＰ−５  ｃＤＮＡ＃１８のセグメントによって置換されている。ＣＡＴベクターのＥｃｏＲＩ部位を、ヒドロキシルアミン感受性開裂部位、および成熟ＳＰ−５のアミノ末端残基をコードする２つの相補的オリゴヌクレオチド
ｏｌｉｇｏ  ＃２４６２：５’−ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＡＧ−３’
（配列番号：２２）
および
ｏｌｉｇｏ  ＃２４６３：５’−ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＣＧ  ＴＴＧ−３’
（配列番号：２３）
を通して、ＳＰ−５のＡｐａＬＩ部位に結合させた。ＳＰ−５のＡｖａＩＩ部位を、成熟ＳＰ−５のカルボキシ末端残基および停止コドンをコードする２組目の相補的ヌクレオチド
ｏｌｉｇｏ  ＃２８７１：５’−ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ−３’
（配列番号：２４）
および
ｏｌｉｇｏ  ＃２８７２：５’−ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＴＡ−３’
（配列番号：２５）
を通して、ｐＣ２１０ＳＰ−ＢのＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させた。
【０１００】
（ｐＣ１７９ＳＰ−Ｃ）
ｐＣ１７９ＳＰ−Ｃによってコードされる２１７残基の融合タンパク質のアミノ酸配列は、第８図に示す配列をわずかに改変したものである。ｐＣ１７９ＳＰ−Ｃにおいて、ＣＡＴの１７９個のアミノ酸を、３個のアミノ酸（Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ）のリンカーを通して成熟ＳＰ−５の３５個のアミノ酸に結合させる。ＳＰ−５は、総融合物の１６％を含む。
【０１０１】
ｐＣ１７９ＳＰ−Ｃを構築するために、ＣＡＴ配列の一部をｐＣ２１０ＳＰ−Ｃから除去した。ｐＣ２１０ＳＰ−Ｃから始めて、ｎｔ６０３のＮｃｏＩ部位（第８図）からｎｔ７２８のＥｃｏＲＩ部位まで伸長するＤＮＡフラグメントを除去し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩの粘着末端を、２つの相補的オリゴヌクレオチド
ｏｌｉｇｏ  ＃３０８３：５’−ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＧＣＡ  ＡＧ−３’
（配列番号：２６）
および
ｏｌｉｇｏ  ＃３０８４：５’−ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＣＣ−３’
（配列番号：２７）
によって再結合させた。要するに、ベクターｐＣ１７９ＳＰ−Ｃによってコードされる新しい融合タンパク質においてはＣＡＴの３１残基、およびリンカーポリペプチドの３残基が欠失している。
【０１０２】
（ｐＣ１４９ＳＰ−Ｃ）
ｐＣ１４９ＳＰ−Ｃによってコードされる１８７残基の融合タンパク質のアミノ酸配列は、図８に示される配列が僅かに改変されたものである。プラスミドｐＣ１４９ＳＰ−Ｃにおいて、ＣＡＴの１４９個のアミノ酸は３個のアミノ酸（Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ）からなるリンカーによってＳＰ−５の３５個のアミノ酸に結合させる。ＳＰ−５は総融合タンパク質の１８．７％を含む。
【０１０３】
ｐＣ１４９ＳＰ−Ｃを構築するために、ｎｔ５２３のＤｄｅＩ部位（図８）からｎｔ７２８のＥｃｏＲＩ部位へ伸長されたｐＣ２１０ＳＰ−ＣのＣＡＴセグメントの一部分を取り除き、２本の相補的オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ＃３０８２：５’−ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＣＣＣ  Ｇ−３’（配列番号：２８）ｏｌｉｇｏ＃３０８１：５’−ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＧＣ−３’（配列番号：２９））の１組で置換した。得られた配列を図９に示す。
【０１０４】
（ｐＣ１０６ＳＰ−Ｃ）
ｐＣ１０６ＳＰ−Ｃによってコードされる１４４残基の融合タンパク質のアミノ酸配列は、図８に示される配列が僅かに改変されたものである。プラスミドｐＣ１０６ＳＰ−Ｃにおいて、ＣＡＴの１０６個のアミノ酸は３個のアミノ酸（Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ）からなるリンカーによってＳＰ−５の３５個のアミノ酸に結合させる。ＳＰ−５は総融合タンパク質の２４％を含む。
【０１０５】
アニーリングしたあと相同性領域を介して連結した２組の相補的オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ＃３０７９：５’−ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＧＴ−３’（配列番号：３０）を０ｌｉｇｏ＃３０８５：５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＣＧＧ−３’（配列番号：３１）とアニーリングし；ｏｌｉｇｏ＃３０８０：５’−ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＧＡＡ
ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  Ｇ−３’（配列番号：３２）をｏｌｉｇｏ＃３０７８：５’−ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＧＡＴ
ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＡ
ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＴＧＡ−３’（配列番号：３３）とアニーリングした）でｐＣ２１０ＳＰ−ＣのＥ．ｃｏＲＩフラグメントを置換することにより、ｐＣ１０６ＳＰ−Ｃを構築した。
【０１０６】
各ＳＰ−５発現ベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉのＷ３１１０株をアンピシリン耐性に形質転換した。発現株の急速な増殖培養物を上述のように誘導した。誘導より１時間後までに、さらに増殖を続ける細胞内で屈折性の細胞質封入体が位相差顕微鏡によって観察された。誘導の５時間後、１  Ｏ．Ｄ．550に相当する細胞を遠心によりペレット化し、次に１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用にＳＤＳサンプルバッファー中で５分間煮沸し、続いてクマシーブルーで染色した。これらのベクターから適切な分子量のタンパク質が得られた。各ベクターによって生産されたハイブリッドＣＡＴ：ＳＰ−５タンパク質は、誘導された培養物中の総細胞タンパク質の１５−２０％を含むと推定される。
【０１０７】
（ＳＰ−５ＤＮＡの改変）
ｈＳＰ−５アナログをコードする改変された配列を得るために、部位特異的変異誘発を使用し得る。例えば、ｐＣ１４９ＳＰ−Ｃを出発物質として、図９に示すＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを切り出し、ｍｐ８にクローニングした。この挿入断片について次に、図に示すようにプライマー５’−ＧＴＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−ＧＧＧ−ＡＡＴ−ＧＣＣ−３’（配列番号：３４）を用いて部位特異的変異誘発を行う。この結果、成熟タンパク質の２８位および２９位のシステインのコドンがこれらの位置でそれぞれセリンのコドンに改変される。次に、変異したＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離し、その後発現ベクターｐＴｒｐ２３３に連結しもどす。
【０１０８】
次に例えばＣ１４９ＳＰ−Ｃあるいは対応する変異ベクターのような構築物でＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、この形質転換細胞を標準的な技法を用いて培養する。培養物をＩＡＡで処理することによってｔｒｐプロモーターを誘導し、所望のＳＰ−５由来のペプチドをコードする遺伝子の発現が得られる。
【０１０９】
次に細菌細胞をホモジナイザーに通して溶解する。この処置によって放出される不溶性封入体を５０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって、あるいは０．１ミクロンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｄｕｒａｐｏｒｅメンブレンで濾過することによって回収する。得られる封入体を１％トリトンＸ−１００で、あるいは１．０Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０中で３回洗浄し、上述の遠心あるいは濾過によって１００ｍＭを回収する。封入体をｐＨ８．０の２０ｍＭトリス−塩酸、６Ｍの塩酸グアニジン、５０ｍＭのＤＴＴに１５−２５ｎｇ／ｍｌの濃度で溶解する。
【０１１０】
遠心によって不溶性物質を取り除いた後、ＳＰ−５−由来のペプチドを含む融合タンパク質を等量の６Ｍ塩酸グアニジン中等容量のヒドロキシルアミン（２Ｍ）、０．２Ｍ  Ｋ2ＣＯ3を含有する５０ｍＭ  ＤＴＴを加えることにより開裂する。開裂は４８時間行う。溶液を塩酸グアニジンの濃度が１．２Ｍになるように（５倍）、ｐＨ８．０の１０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＤＴＴで希釈する。このことにより開裂反応中のタンパク質が沈澱し、この沈澱物を遠心により集める。
【０１１１】
次にＳＰ−由来のペプチドを、多量の残りのタンパク質から１００ｍＭ  ＤＴＴを含むクロロホルム：メタノール（１：１  ｖ：ｖ）溶液を用いて抽出する。ＳＰ−５由来のペプチドが１ｍｇ／ｍｌになるようにこの溶液の十分量を沈澱物に加え、室温で６時間この物質を抽出する。次に不溶性物質を取り除くために抽出物を遠心する。
【０１１２】
次にこの遠心の上清を、抽出物中のＳＰ−５ペプチド１ｍｇあたりスルホ−プロピルセルロース（０．０４ｍｌのスルホ−プロピルセルロース）と混合する。塩酸を用いて抽出物を酸性にし、５ｍＭの濃度にする。一晩ＳＰ−５と結合させた後、スルホ−プロピルセルロースを１９部のクロロホルム、１９部のメタノール、および２部の０．１Ｎ塩酸を含むバッファー（洗浄バッファー）で徹底的に洗浄する。固体ＤＴＴで５０ｍＭのＤＴＴ濃度に調整し、２Ｍの酢酸ナトリウムバッファーのストック溶液を加えてｐＨ４の２０ｍＭの酢酸ナトリウムとした洗浄バッファー溶液でさらに洗浄する。次にＳＰ−５ペプチドを、５０ｍＭのＤＴＴを含みｐＨ６の２Ｍの酢酸ナトリウムのストック溶液を加えることにより５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６に調整した洗浄バッファーで溶出する。ＳＰ−セルロースを濾過によって取り除く。精製の最終工程は、溶出液として上述の洗浄バッファーを使用した、セファデックスＬＭ−６０でのゲル浸透クロマトグラフィーである。
【０１１３】
（実施例４：合成ペプチド）
ヒトＳＰ−５によりコードされた混合物に基づく種々の合成ペプチドが標準的な技法を用いて合成されている。図３に関しては、以下のペプチドが固相ペプチド合成を用いて合成されている：
（１）ｈＳＰ−５（２４−７４）、すなわち、２４位のＰｈｅで始まり７４位のＧｌｙで終わる；
（２）ｈＳＰ−５（３４−７４）、すなわち、３４位のＬｙｓで始まり７４位のＧｌｙで終わる；および
（３）ｈＳＰ−５（２４−６１）、すなわち、２４位のＰｈｅで始まり６１位のＳｅｒで終わる。
【０１１４】
ｈＳＰ−５（２４−７４）：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
（配列番号：５）および（配列番号：６）
ｈＳＰ−５（３４−７４）：
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
ｈＳＰ−５（２４−６１）：
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ。
合成ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａペプチド合成機を用いて、標準ｔ−ＢＯＣ固相ペプチド合成法により調製する。使用する保護基は：Ｃｙｓ−４−メチルベンジル、Ｈｉｓ−−Ｂｏｃ、Ｌｙｓ−−２−クロロＣＢＺ、Ａｒｇ−−トシルである。樹脂をＢｏｃ−Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）−Ｏ−ＰＡＭ樹脂上に構築した（０．５ｍｍｏｌ、０．７２ｍ当量／負荷ｇ）。Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを、左右対称形の無水物として用いて、すべての残基を二重に結合したＨＯＢＴエステルおよびＨｉｓ残基と単独で結合した。残基１２にＡｒｇを添加する前に樹脂を取り除いた。この樹脂は、ほとんどの側鎖が保護されておらず、真性ＰＴＨアミノ酸として働くので、この時点で気相シークエンサー中で配列決定し得る。配列がほぼ均一であることを確認した後、合成
を終了した。樹脂を開裂し、すべての保護基を標準的なＨＦ開裂条件を用いて取り除く。１ｇのペプチド樹脂に、１．５ｍｌのアニソール、０．２５ｍｌの硫化メチルエチルおよび１５ｍｌの蒸留したＨＦを加え、標準的なＫｅｌ−Ｆ  ＨＦ開裂装置で開裂を行う。開裂は３０分間１０３Ｃで行われ、次いで、０３Ｃでさらに３０分行った。凝集を最小限にするためＨｆを即座にすばやく除去した。しかしながら、開裂混合物から再溶解し得る選択されたペプチドはほんの少量であるので、ある程度の凝集はなお起こる。ＨＦ除去の後、樹脂−ペプチド混合物はエーテルおよびクロロホルムで交互に洗浄され乾燥された。ペプチドは標準水抽出を用いては可溶化され得ず、メタノール／クロロホルム／ＨＣｌで可溶化することにより樹脂から分離しなければならない。
【０１１５】
７５％トリフルオロ酢酸に溶解した後、各ペプチドを精製した。精製の好適な方法は、０．５％  ＨＣｌを含むクロロホルムおよびメタノール（１：１  ｖ／ｖ溶液でＬＨ−６０カラムを用いたゲル濾過である。各合成ペプチドは実施例５のようにインビトロおよびインビボ活性を試験した。
【０１１６】
（実施例５：合成ペプチドの活性）
ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０６５８８のセクションＤ．９およびＤ．１０でそれぞれ述べられている手順で、インビトロおよびインビボ活性が評価された。
【０１１７】
ペプチド３４〜７４は、インビトロでのリン脂質フィルム拡散で効果がなく、この結果から予想されるように、また未成熟ウサギ肺で効果がなかった。従って、活性を最大にするにはＮ末端アミノ酸が必要なようである。
【０１１８】
ペプチド２４〜７４は、Ｃ末端伸長ペプチドで、インビトロで空気−水界面の表面張力の低下および動物における適度な肺機能作用のいずれにおいても極めて有効でった。表１において、Ｐinsは、肺で表面張力を低下させることにおいて界面活性剤調合物がどの程度有効であるかの指標である。この張力低下は、吸気酸素圧の低下により示される。ペプチド２４〜７４は、対照生理食塩水溶液に比較して極めて効果的であり、ポジィティブ対照のウサギ界面活性剤とほぼ同じ効果である。天然５ｋｄタンパク質が、対照界面活性剤と同程度に効果的であることは注目すべきである。
【０１１９】
【表１】
2005053929.tif 000006
【０１２０】
１０、２０および３０分でのＰins値は、６−７ｍｌｓ／ｋｇ体重の肺の一回換気容量を維持するのに必要な吸気圧（ｃｍ  Ｈ2Ｏ）である。
（換気装置への圧力が低い程良い）
ペプチド２４〜６１は、インビボで天然界面活性剤と同程度に効果的であることが見い出された。事実、ある動物の実験で、Ｐinsは、２４〜６１で処理された動物では界面活性剤対照におけるより低かった。すべての場合で、リン脂質混合物は、ＤＰＰＣ：卵ＰＧ（７：３，ｗ／ｗ）であり、ＰＬ対タンパク質の比率は１０：１であった。ペプチドは、以下に述べるように別の脂質と共に投与されるのが好ましく、それ故、表２にまとめられた実験では、１０ｗｔ．％パルミチン酸が調合物中に取り込まれている。このように、調合物はＤＰＰＣ：ＰＧ：ペプチド：脂肪酸は重量比で約１０：１：１：１であった。
【０１２１】
【表２】
2005053929.tif 000007
【０１２２】
すべての場合において、２４〜６１合成ペプチドは、重量比ＰＬ：パルミチン酸：合成ペプチド（１０：１：１）で混合した。リン脂質（ＰＬ）は、重量比でＤＰＰＣ：ＰＧ（７：３）である。
【０１２３】
（実施例６：追加のｈＳＰ−５由来のペプチド）
次のような本発明のＳＰ−５由来のペプチドが実施例３のＣＡＴ融合法または、固相合成により合成され、そしてＡＳＰ活性を試験した：
（１）ｈＳＰ−５（２８〜５９）、即ち、Ｃｙｓ−２８で始まりそしてＨｉｓ−５９で終わる；
（２）ｈＳＰ−５（３０〜５９）、即ち、Ｐｒｏ−３０で始まりそしてＨｉｓ−５９で終わる。
【０１２４】
（３）Ｄ５Ｋ＃１：（Ｓ28Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９））、即ち、ｈＳＰ−Ｃ（２４〜５９）に相当するが、２８位および２９位のシステインがセリンで置換されている（配列番号：３５）；
（４）Ｄ５Ｋ＃２：（Ａ27Ｓ28Ｓ29Ａ30−ｈＳＰ−５（２４〜５９））、即ち、Ｐｈｅ−２４で始まり、Ｈｉｓ−５９で終わり、２８位および２９位のシステインがセリンで、そして２７位および３０位のプロリンがアラニンで置換されている（配列番号：３６）；そして
（５）Ｄ５Ｋ＃３：（Ｓ26Ａ27Ｓ28Ｓ29Ａ30Ｑ31Ｋ32，Ａ33−ｈＳＰ−５（２５〜５９））、Ｇｌｙ−２５で始まり、Ｈｉｓ−５９でおわり、２６から３３のアミノ酸が置換されている（配列番号：３７）。
【０１２５】
可溶化の後、各ペプチドは上記で述べたように精製した。各合成ペプチドは上記の手順でインビトロおよびインビボ活性を試験した。
【０１２６】
図１０は対照を表し、ＤＰＰＣ：ＰＧおよびパルミチン酸塩と共にで処方された（ＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸：タンパク質の比は約７：３：１：０．５）完全な長さのヒト５ｋｄタンパク質に関して得られた、時間に対する表面圧のグラフ表示である。図１１は同様に同じ成分（７：３：１：１）で処方された完全な長さのヒト５ｋｄタンパク質でｐＨ７．５および３７℃で試験して得られた結果を表す。
【０１２７】
合成ペプチドｈＳＰ−５（２８〜５９）は、図１２に表された対照実験におけるようにＤＰＰＣ：ＰＧおよびパルミチン酸塩と共にで処方され、天然ペプチドで観察されたのと同じ初期拡散速度を示した。
【０１２８】
ＳＰ−５由来の合成ペプチドｈＳＰ−５（３０〜５９）は活性が減り（図１３）、この活性の喪失は特異的に２８位および２９位のシステイン残基の欠失よるものでないことは、これらシステイン残基がセリンで置換されたＤ５Ｋ＃１合成ペプチド（Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４−５９））が、完全な活性を示す（図１５）ことにより示唆される。この結果は特定残基の喪失よりむしろポリペプチド長さの減少が、ＡＳＰ活性の喪失になることを示している。
【０１２９】
Ｄ５Ｋ＃１ペプチド（Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９））は、実施例２で述べたように組み換え法により生産され、精製された。組み換えＳＰ−５ペプチド（Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９））は、インビトロアッセイの標準プロトコールに次のような修正を加えて試験した：リン脂質調合物を７部のＤＰＰＣ：３部ＰＯＰＧとした。ここでＰＯＰＧは（パルミトイル−オレオイルＰＧ）である。最終調合物は、２０重量部リン脂質混合物：１重量部タンパク質である。Ｓｅｒ−Ｓｅｒアナログは、インビトロで活性が高く、少なくともインビボで精製ウサギ界面活性剤と同定度に有効であった。
【０１３０】
Ｄ５Ｋ＃１合成ペプチド（Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９））ペプチドアナログもまた、以下に示されるように、ＷＯ８７／０６５８８で提示された手法に従って試験した時にインビボで活性であった。
Ｄ５Ｋ＃１  Ｓ28Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９）（ｃｙｓ−−＞ｓｅｒ変換）３０分でのＰins：
【０１３１】
【表３】
2005053929.tif 000008
【０１３２】
組み換えＳ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９）はまた、インビボで試験され、そして少なくとも精製ウサギ界面活性剤と同程度に効果的である。
【０１３３】
ペプチドＳ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２５〜５９）は、実施例３で述べたようにバクテリアを用いて組み換え法により生産され、そして精製された。部位特異的突然変異導入の標準手法を用いて、このペプチドのためのベクターがＨｉｓ（５９）のコドンを欠失するように改変された。ベクターはペプチドＳ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５８）を組み換え法により生産するのに使用された。組み換えペプチドＳ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９）、およびｈＳＰ−５（２４〜５９）、即ち、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ変異のないペプチドは、インビトロアッセイの標準プロトコールを次のように修正して用いて一緒に試験した：リン脂質調合物は、７部ＤＰＰＣ：３部ＰＯＰＧである。最終調合物は、２０重量部リン脂質混合物：１重量部タンパク質である。図１７に示された表面圧の重ねられたプロットは、Ｓｅｒ−Ｓｅｒアナログは、インビトロで、少なくとも天然配列を持つ対応組み換えタンパク質と同程度に有効であることを示す。
【０１３４】
Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９）はまた、同じ修正をしたインビトロアッセイで試験した。表面圧のプロットは、図１８に示すように、Ｈｉｓ（５９）の除去によってタンパク質の効力が変化しないことを示している。
【０１３５】
組み換え法により生産されたペプチドＳ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９）、Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２５〜５８）および、ｈＳＰ（２５〜５９）は、インビボで試験され、そして単離されたウザキ界面活性剤と比較した。
結果を以下に示す：
３０分でのＰins：
ウザキ界面活性剤                        １７．５  ｃｍ  Ｈ2Ｏ
Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２４〜５９）  １６．０  ｃｍ  Ｈ2Ｏ
Ｓ28，Ｓ29−ｈＳＰ−５（２５〜５８）  １６．０  ｃｍ  Ｈ2Ｏ
ｈＳＰ（２５〜５９）                  １６．０  ｃｍ  Ｈ2Ｏ
特定のアミノ末端配列が完全な活性のための必要条件ではないことがさらに、Ｄ５Ｋ＃２およびＤ５Ｋ＃３の分析により示唆された。これらのペプチドは、アミノ末端領域でより範囲の広い置換が行われており、インビトロで完全な活性を保持している（図１５および１６）。
【０１３６】
本発明者らが本発明の方法に有用であると信じる他のペプチドは、図３に示されるヒトＳＰ−５がコードするタンパク質の３１−６１、３０−６１、２８−６１および２６−６１ペプチドである。
【０１３７】
ヒトＳＰ−１８およびヒトＳＰ−５由来の様々な特定のペプチドが、肺胞界面タンパク質（ＡＳＰ）活性を有している。これらのペプチドは、合成法あるいは組換え技術によって調製される。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、ヒトＳＰ−５由来のタンパク質（配列番号：１）および（配列番号：２）をコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＳＰ−５由来タンパク質（配列番号：３）および（配列番号：４）をコードする類似のｃＤＮＡ変異体を示す。
【図３】図３は、印で示したＮ末端およびＣ末端を有する、ＳＰ−５ＤＮＡのコドン１−７４でコードされるアミノ酸配列（配列番号：５）および（配列番号：６）である。
【図４−１】図４は、ＳＰ−１８前駆タンパク質（配列番号：７）および（配列番号：８）をコードするヒトｃＤＮＡ＃３である。
【図４−２】図４は、ＳＰ−１８前駆タンパク質（配列番号：７）および（配列番号：８）をコードするヒトｃＤＮＡ＃３である。
【図５】図５は、印で示したＮ末端およびＣ末端を有する、イヌの５ｋｄタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：９）である。
【図６】図６は、１０Ｋ  ＡＳＰ混合物（配列番号：１０）および（配列番号：１１）中のヒトおよびイヌの１８ｋｄタンパク質の相関を示す。
【図７】図７は、クロラムフェニコールアミノトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびヒト心房性ナトリウム利尿タンパク質（ｈＡＮＰ）（配列番号：１２）および（配列番号：１３）のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、ｐＣ２１０ＳＰ−Ｃ（配列番号：１４）および（配列番号：１５）中への挿入物をコードするタンパク質を示す。
【図９】図９は、ＣＡＴ−ＳＰ−５融合タンパク質（配列番号：１６）および（配列番号：１７）をコードするｐＣ１４９ＳＰ−ＣのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物である。
【図１０】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１１】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１２】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１３】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１４】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１５】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１６】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１７】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１８】図１０から１８は、ＡＳＰ活性を調べる標準テストで種々のポリペプチドに関して得られたインビトロの試験結果をグラフで示したものである。図１０および１１は全長ヒト５ｋｄタンパク質を用いて行った対照試験の結果を示し、一方、図１２から１８は、タンパク質の種々の類似体により得られた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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