(57)【要約】【課題】本発明は優れた免疫抑制活性を有し、かつ副作用の少ない免疫抑制剤を提供することを課題とする。【解決手段】構造式（１）で表されるマクロスフェライドBを有効成分とする、免疫抑制剤が提供された。本発明の免疫抑制剤による免疫抑制効果は、従来の免疫抑制剤よりも強力であり、しかも抗体産生抑制作用がみられない。特に細胞性免疫に対する抑制作用が強いので、移植医療において有用である。【化３】構造式（１）2005231996.tif 000004【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で示されるマクロスフェライドBを有効成分として含有する免疫抑制剤。
【化１】
構造式（１）
2005231996.tif 000003
【請求項２】
細胞性免疫による免疫応答を抑制するための、請求項１に記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載の免疫抑制剤からなる、遅延型過敏症、および／または移植組織に対する拒絶反応を抑制するための治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
難治性疾患の多くは、自己免疫反応が関与していると考えられている。免疫系の破綻により、自己の成分に対して免疫反応が起こると様々な疾患が誘導される。これらは一般に自己免疫疾患と呼ばれる。自己免疫疾患の例として、慢性関節リウマチ、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症等が挙げられる。また、免疫系が関与する他の疾患としては、外来異物に対して免疫系が過剰な反応を起こして発症するアレルギー疾患等の過敏症が挙げられる。特に抗原感作を受けた後、時間を経てから再び同じ抗原に接触したときに、強い細胞性免疫が誘導され、時に宿主を危険な状態とする病的な免疫反応を遅延型過敏症と呼んでいる。この他、腎臓移植、骨髄移植等の臓器移植に伴う拒絶反応も、医療においては解決すべき課題である。拒絶反応は、本来は生体の持つ正常な異物排除機構に他ならないが、治療効果を妨げるという意味では明らかに病的な状態と言える。
【０００３】
こうした種々の自己免疫疾患、および過敏症等の治療のために、あるいは移植組織に対する拒絶反応を防ぐことを目的として、免疫応答を抑制する治療剤、いわゆる免疫抑制剤の開発が行われてきた。現在使用されている主な免疫抑制剤としては、ステロイド剤、副腎皮質ホルモン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アルカロイド等が知られているが、有効性、持続性、副作用などの点で必ずしも満足いくものではなかった。また、強力な免疫抑制剤として汎用されているシクロスポリンAや、FK506（タクロリムス）は、治療薬もしくは予防薬として有効であるが、投与に伴う腎毒性、抗体産生抑制など、副作用の面で重篤な問題が指摘されている。そこで、免疫抑制効果が高く、かつ副作用の少ない、従来とは異なる作用機序を持った新たな免疫抑制剤の開発が望まれている。
ところで、本発明のマクロスフェライドBは、本発明者により細胞接着阻害作用を有する物質として報告された（特開平8-325285）。該物質を有効成分として含む薬剤は、有効な制癌剤となりうることが期待された。しかし該物質を用いることによって、より副作用の少ない免疫抑制剤の提供が可能となることは知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は優れた免疫抑制活性を有し、かつ副作用の少ない免疫抑制剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に基づいて鋭意研究を重ねた結果、細胞接着阻害効果を有するマクロスフェライドB（特開平8-325285）が、免疫抑制作用を有することを新たに見出した。さらに、マクロスフェライドBの免疫抑制効果は、既に臨床的に用いられている免疫抑制剤のシクロスポリンよりも強く、加えて副作用として問題となっていた抗体産生抑制作用がみられないことを見出し、本発明を完成させた。マクロスフェライドBを有効成分とする薬剤は、従来の薬剤とは異なる作用機序を持った、有効性の高い免疫抑制剤となる。すなわち本発明は、下記構造式（１）で示されるマクロスフェライドBを有効成分として含有する免疫抑制剤に関する。
【化２】
構造式（１）
2005231996.tif 000002
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫抑制剤の有効成分であるマクロスフェライドB（本明細書中においてMSBと略する場合あり）は、本発明者らによって、土壌から単離した微生物（Microsphaeropsis sp. FO-5050; FERM P-14776）の培養物から、分離、精製された物質である。該微生物の形態的性質、生理的・生態的性状、および該物質の理化学的性質、分離・精製方法は、特許公報（特開平8-325285）に記載されている。以下に、本発明のマクロスフェライドBを実際に得るための分離・精製工程の例を示す。
【０００７】
（マクロスフェライドBの分離および精製工程）
試験管（φ2×20cm）にグルコース2.0%、酵母エキス0.2%、硫酸マグネシウム7水和物0.05%、ポリペプトン0.5%、リン酸二水素カリウム0.1%、寒天0.1%(pH5.6〜5.8)、10mlを滅菌し、これに酵母エキス0.4%、可溶性デンプン1.5%、リン酸一水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム7水和物0.05%、寒天2.0%(pH6.0)を含む寒天斜面培地上に27℃、6日間培養したMicrosphaeropsis sp. FO-5050の斜面培養から一白金耳を接種し、27℃で72時間振とう培養して種母を得た。
【０００８】
次に、500ml容三角フラスコに可溶性デンプン3.0%、グリセロール1.0%、キナコ2.0%、乾燥酵母0.3%、塩化カリウム0.3%、炭酸カルシウム0.2%、硫酸マグネシウム７水和物0.05%、リン酸二水素カリウム0.05%を含む液体生産培地(pH6.5)100ml（20本）を仕込み滅菌した後、上記の方法で得られた種母1.0mlを上記三角フラスコに無菌的の移植し、毎分220回転するロータリーシェーカーにより27℃で120時間振とう培養を行った。
【０００９】
得られた培養液を液体画分と菌体画分とに分け、液体画分については、酢酸エチルを加えて充分攪拌した後、分液操作により酢酸エチル抽出画分を得た。菌体画分については、これにメタノールを加え、充分攪拌した後、得られたメタノール画分を減圧濃縮してメタノールを留去後、酢酸エチルにより抽出した。液体および菌体の両画分より得た酢酸エチル画分を合わせ、減圧濃縮操作により酢酸エチル抽出画分379.4mgを得た。
【００１０】
この酢酸エチル抽出画分を薄層シリカゲル(20×20cm、厚さ0.5mm、メルク社製)二枚に吸着させ、クロロホルム-メタノール混合溶媒(9:1)で展開した。Rf値が0.5付近で、紫外線ランプ(254, 366nm)照射下で橙黄色の蛍光を示すバンドを分画し、クロロホルム-メタノール混合溶媒(1:1)で溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮してマクロスフェライド類を含む18.3mgの粗物質Iを得た。  この粗物質Iを少量のメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（センシューパック・ペガシル、φ20×250mm）にかけ、40%アセトニトリル溶液を移動相として活性画分を分取することによりマクロスフェライドBの純品5.2mgを得た。
【００１１】
本発明のマクロスフェライドBは、その構造的な情報に基づいて化学的に合成することもできる(Sunazuka T. et al. J. Am. Chem. Soc. 119: 10247-10248, 1997)。以下に合成工程の一例を示す。
マクロスフェライド(MS)は、2分子のtrans-(4R, 5S)-dihydroxy-2-hexenoic acidと、1分子の(3S)-hydroxybutyric acidを有している。合成方法として、1の2つの不斉炭素を(E,E)-hexa-2,4-dienoic acid esterの位置選択的不斉ジヒドロキシル化反応により一挙に導入し、さらに4位の水酸基を立体反転して1の分子骨格を構築し、さらに、2分子の1と2を順次縮合させ、最後にマロラクトン化によりMSを構築した。
出発原料に(E,E)-hexa-2,4-dienoic acid t-butyl esterを用いSharpressの不斉ジヒドロキシル化反応を行うことで、末端オレフィンのみジヒドロキシル化(85% ee)し、(4S,5S)-dihydroxy-2-hexenoic acid t-butyl esterを得た。続いて、このジオール体の5位の水酸基のみをTBDMS基で保護し、この物質の4位の水酸基を光延反応を用いて反転させ、アルコール体とした。この物質の4位の水酸基をMEM化し、続いて0.2N NaOHで加水分解してカルボン酸を得た。
一方で、MEM化した物質をTBAFを用いて脱TBDMS化し、アルコールを得た。ついで、先のカルボン酸体とアルコール体をDCC、DMPA、CSAを用いたKeck法により縮合させ、続いてAcOH酸性で脱TBDMS化してアルコールとした。このアルコールと(3S)-hydroxybutyric acid誘導体とを先の条件で縮合後、TFA、thioanisoleを用いた酸性条件でt-Bu基とTBDMS基を同時に脱保護してセコ酸を得た。次に、2,4,6-trichlorobenzoyl chlorideを用いる山口法によりマクロラクトン化を行い、トリラクトン体を得た。ついでTFAを用いてMEM基を除去しマクロスフェライドAを合成した。最後に、PDCにより8位の水酸基を酸化しマクロスフェライドBを合成した。マクロスフェライドBの器機データ(MS、1Hおよび13C-NMR、IR、[α]D、mp）は天然の物と一致した。
【００１２】
本発明のマクロスフェライドBは、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分であるマクロスフェライドBをこのような剤型とする製剤技術は公知である。
【００１３】
たとえば経口投与用の錠剤は、マクロスフェライドBに賦形剤、結合剤、崩壊剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール・ポリオキシエチレン・ブロックポリマー、メグルミンなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース・カルシウム等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられる。
【００１４】
本発明による免疫抑制剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
また注射用製剤を製造する際には、pH調整剤、溶解剤、等張化剤などと、必要に応じて溶解補助剤、保存剤、安定剤などを加えて、常法により製剤化する。
以下に、カプセル剤、軟膏剤および注射剤の場合の具体的な製剤化の方法を示すが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
（カプセル剤）
マクロスフェライドBをエタノールに溶解し、植物油と混和し、ソルビトールを加えたゼラチンで被包し、カプセル剤（軟カプセル剤）を製造する。ゼラチン皮膜液の組成、および軟カプセル剤の組成は以下の通りである。
・ゼラチン皮膜液の組成：
原料名                      処方量(kg)
ゼラチン                    220.00
グリセリン                   66.00
パラオキシ安息香酸メチル      0.44
パラオキシ安息香酸プロピル    0.11
精製水                      180.00
【００１６】
（軟膏剤）
乳剤性軟膏基剤を調製後、マクロスフェライドBを加えて混合し、軟膏剤（乳剤性軟膏剤）を製造する。乳剤性軟膏剤の組成は以下の通りである。
・乳剤性軟膏剤の組成：
原料名                                処方量(mg/g)
マクロスフェライドB                      1
白色ワセリン                           150
流動パラフィン                          60
サタノール                              70
ポリオキシエチレンアルコールエーテル    20
パラオキシ安息香酸ブチル                1.8
パラオキシ安息香酸メチル                0.2
精製水                                  適量
全量                                  1000
このようにして得られた軟膏剤は、１日あたり2〜4度、過敏症、特に遅延型過敏症を起こしている患部に塗布することにより、過敏症症状の緩和効果を期待できる。塗布する回数は、症状に応じて適宜調整することができる。
【００１７】
（注射剤）
マクロスフェライドBを50 vol%エタノールに溶解し、注射剤の製法により製造する。使用に際しては、生理食塩水その他の輸液に混注して用いる。注射剤の組成は以下の通りである。
・注射剤の組成：
原料名                      処方量
マクロスフェライドB           2.5 mg
保存剤                        適量
安定剤                        適量
注射用水                      適量
全量                          10 ml
【００１８】
また、本発明のマクロスフェライドBを含有する免疫抑制剤の投与量は、投与方法（剤型）や投与対象の状態（体格、年齢、性別、症状）に応じて適宜選択される。一般的には、体重１kg当たり、非経口投与で0.01〜1 mg、より望ましくは0.05〜0.5 mg、経口投与で0.05〜5 mg、より望ましくは0.1〜1.0 mgである。
【００１９】
本発明による免疫抑制剤は、特に細胞性免疫によってもたらされる免疫反応の抑制に有効である。細胞性免疫とは、主として細胞障害性のT細胞によってもたらされる免疫反応で、抗体によってもたらされる液性免疫と対をなす免疫応答である。細胞性免疫によってもたらされる免疫応答には、遅延型過敏症や移植組織に対する拒絶反応のような免疫応答がある。したがって本発明の免疫抑制剤は、遅延型過敏症の治療剤や移植組織に対する拒絶反応の治療剤として利用することができる。これらの免疫応答は、医療現場において、しばしば宿主の生命に関わる重篤な症状をもたらすことから、効果的な治療剤を提供することの意義は大きい。特に本発明の免疫抑制剤は、重篤な症状の原因となる細胞性免疫の機能を強力に抑制する一方で、液性免疫機能に対する影響がほとんど見られない。このことは、本発明の免疫抑制剤が、生体の重要な防御機構の一つである液性免疫機能を維持しながら、問題となる症状を選択的に抑制可能なことを示している。
たとえば移植組織の生着率を高めるために持続的に使用される免疫抑制剤は、しばしば宿主の免疫機能全体を抑制し、その結果として感染症の原因となる恐れがある。現状では、移植医療は、拒絶反応と感染症との闘いと言って良い。本発明の免疫抑制剤によれば、拒絶反応のみを抑制しながら、液性免疫機能を維持できることから、移植医療の術後管理を飛躍的に容易にするものと考えられる。
本発明による免疫抑制剤は、心、腎、肝などの移植医療の際の免疫抑制に有効な他、リウマチ、全身性エリテマトージス、強皮症、潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患の治療に有効である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら制限されるものではない。
【００２０】
【実施例】
〔実施例１〕移植免疫に対する作用
ドナー８〜９週令のddy系雄性マウス(Billingham R. E. and Medawar P. B. J. Exp. Biol. 28: 385-402, 1951、Johnson L. L. （酒泉  満  訳）皮膚移植の方法とその応用 ”マウス免疫遺伝学”p.43-54, 1988, ソフトサイエンス社)を脱血死させ、尾皮膚を正中線に沿って尾根部より先端に向かって切開後剥離した。尾皮膚を約7 mm角に切り取り、移植までPBS(-)に浸し氷冷保存した。アクセプター側の８〜９週令のddy系雄性マウスをエーテル軽麻酔した。過大な出血を避けるため太い血管の無い部分の背部皮膚を7 mm角に切開し剥離した。切開部分にドナーの尾皮膚をはめ込み包帯を巻いて固定した。薬物投与は手術部への刺激を避けるためエーテル軽麻酔下に腹腔内に注射した。最初の７日間は連日、８日以降は隔日に投与した。
その結果、無治療群では写真（図１）に示すように、移植片拒絶は移植後10日目頃から顕著になり、無処置コントロール群（図１ａ）では皮膚が壊死を起こし、黒化して脱落が観察された。しかし、MSBの10〜20 mg/kg投与群（図１ｂ）では、移植皮膚の完全な正着が観察された。臨床的に用いられているシクロスポリンA(CPA)の100mg/kgを投与した群（図１ｃ）に比べ、より顕著な正着を示したことから、シクロスポリンAよりも優れた効果が期待される。
【００２１】
〔実施例２〕白血球遊走に対する作用
マウスの皮内にカゼインを投与することにより投与部位にカゼイン貪食のための好中球が集積し、炎症反応が惹起されることが知られている。このような皮内反応の利用は、抗炎症効果の評価系として一般的に用いられている。この評価系を利用して、MSBの白血球遊走に対する作用を調べた。
1%カゼインをマウス外耳に皮内注射し、6時間後に注入部位の好中球量をmyeloperoxidase (MPO)活性を指標として測定した。投与スケジュールを図２に示した。
その結果、図３で示すように、MSBをカゼインと同時に腹腔内投与あるいはカゼイン投与3時間後に静脈投与した群において、MPO活性は有意に減少した。このことから、MSBは炎症性白血球遊走阻害効果を有することが明らかとなり、抗炎症剤としても機能することが示唆された。
【００２２】
〔実施例３〕遅延型過敏症に対する作用
遅延型過敏症、IV型アレルギーを指し、他のアレルギー反応とは異なり抗体産生を介さず、感作リンパ球を介する反応である。先に、液性免疫を抑制しないことが示唆されたため、遅延型過敏症に対する効果を検討した。
BDF1雌性マウス（6週令）をメチル化牛血清アルブミン（BSA）でFreund imcomplete adjuvantと共に感作した。一週間後に右足蹠にメチル化BSAを、左足蹠に生理食塩水をそれぞれ50μlずつ皮内投与し、24時間後に両足蹠の厚みを測定し、左右の厚みの差を評価した。またMSB10および20mg/kg/dayは、感作後、連日腹腔内投与した。陽性対照薬として臨床的に汎用されているFK506(30mg/kg/day)およびシクロスポリンA(100mg/kg/day)を用い、一次感作後、連日経口投与した。二次感作24時間後の右足蹠を写真で示した（図４）。メチル化BSAでの感作により、再感作を受けた際、足蹠に腫脹が認められる。これに対し、MSB10ないし20mg/kg/dayの投与により、腫脹は著明に減弱した。図５は右足蹠（メチル化BSA)と左足蹠（生理食塩水）の厚みの差を表している。腫脹はMSBの用量依存的に減少し、MSB 20mg/kg/dayは、FK506 30mg/kg/dayや、シクロスポリンA 100mg/kg/dayとほぼ同等の活性を示した。このことから、二次感作により惹起された足蹠の腫脹は、MSBによって完全に抑制されることが示された。
【００２３】
〔実施例４〕抗体産生系に対する作用
ddY雄性マウス（５週令）にヒツジ赤血球をpacked volume 5%にてPBSに懸濁させ、これを100μl/mouseにて静脈投与した（3匹/群）。MSBの5または20 mg/kg/dayで連日投与し、7日後に採血した。抗血清を分離後、ヒツジ赤血球に対する赤血球凝集素価を測定した。
結果を図６に示す。抗体価は、MSB投与群と無処置群とで同等であり、抗体産生系に対する影響はない事が示された。現在臨床で用いられているシクロスポリンAやFK506の作用機序は、いずれもIL-2の産生抑制であり、抗体産生抑制活性を有している。これに対してMSBは抗体産生抑制には影響せず主に細胞性免疫を抑制している点で、新規な作用機序を有していると考えられる。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のマクロスフェライドBの免疫抑制効果は、既に臨床的に用いられているシクロスポリンよりも強力であるため、少量の投与により有効な治療が期待でき、副作用を最小に抑えることができる。また、従来の薬剤で問題となっていた抗体産生抑制の副作用がみられないため、感染症等の危険性も少ない。本発明は優れた免疫抑制活性を有し、かつ副作用の少ない免疫抑制剤を提供する点において大きな意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
【図１】マクロスフェライドBの他家移植片拒絶抑制作用を示す写真。ａは対照、ｂはMSB投与、ｃはCPA投与における移植皮膚部位の写真である。
【図２】抗炎症効果の評価系においてカゼイン、およびMSBの投与スケジュールを示す図。
【図３】マクロスフェライドB投与によるMPO活性の減少を示すグラフ。
【図４】マクロスフェライドB投与による足蹠の腫脹の抑制効果を示す写真。
【図５】マクロスフェライドB投与による遅延型過敏症反応の抑制作用を示すグラフ。
【図６】マクロスフェライドB投与による抗体産生系に対する影響を示すグラフ。
【図１】
2005231996.tif 000005
【図２】
2005231996.tif 000006
【図３】
2005231996.tif 000007
【図４】
2005231996.tif 000008
【図５】
2005231996.tif 000009
【図６】
2005231996.tif 000010