(57)【要約】      （修正有）【課題】アミロイドβ蛋白質のβ−シート構造への転移を阻害することのできるＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を含む医薬組成物等を提供すること。【解決手段】本発明のＲＮＡが効果的分子は、特定のの塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ。該ＲＮＡはアミロイドβ蛋白質のβ−シート構造への転移を阻害することができ、該ＲＮＡはアミロイドβ蛋白質を含む医薬品は、アルツハイマー病の治療・予防に有効である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１５の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＲＮＡの塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されているＲＮＡ。
【請求項４】
アミロイド線維の形成を阻害する活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項９】
アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療又は予防するための請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ、又は請求項６に記載のベクターを投与することを特徴とする、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療・予防する方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療・予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβ蛋白質のβ−シート構造への転移を阻害することができ、アミロイド線維の形成を阻害することのできるＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ミスフォールディングしたタンパク質が凝集することにより形成されるアミロイド線維が種々の致死性疾患の原因であることが明らかにされつつある。
アルツハイマー病は、進行性の記憶障害、知能低下等を主症状とする脳の変性疾患であり、いくつかの要因が重なって発病する多因子性の病気である。アルツハイマー病も、上述したアミロイド線維が原因で発病する疾病の一つであり、アミロイド線維が脳内に沈着し、神経細胞に害を及ぼすことが発症の原因と考えられている。アルツハイマー病の最も特徴的な脳病理像である老人斑は、アミロイドβ蛋白質（以下、本明細書において、「Ａβ」という場合もある）が脳内に沈着したものであり（Biochem.Biophys. Res. Commun., 122, 1131 (1984)）、このＡβはアミロイド線維の主要な構成成分である。
【０００３】
Ａβは、通常はランダムコイル構造又はα−へリックス構造をとっているが、何らかの原因でβ−シート構造へと転移することによってアミロイド線維が形成されることが知られている。
現在、高齢化社会に伴い、アルツハイマー病患者の著しい増加が予想されることから、予防・治療法の開発が望まれている。しかしながら、アルツハイマー病は、その臨床・病理像から、発症機構が多様であり、多くの因子が関与することが予想され、脳の老化に伴い発病する複雑な病気であり、研究が困難である点が多いのが現状である。
【０００４】
アルツハイマー病の治療法については、従来、アミロイド線維化を阻害するため、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒や類似のタンパク質の部分ペプチドを利用して、同タンパク質の線維化を阻害しようという試みがなされている。また、アミロイド蛋白産生・分泌阻害剤等も開発されている（例えばＷＯ００／３１０２１）。上述した薬剤等によって、ある程度はアミロイド蛋白の産生、線維化は阻害されるが、アルツハイマー病等の治療に十分に効果を発揮し得るものではなかった。
【０００５】
一方、in vitroにおいてある標的物質と特異的に結合するＲＮＡ分子を選択する手段として、セレックス法と呼ばれる手法が開発されている（C.tuerk& L.Gold, Science 249:505-510, 1990）。セレックス法は、ＰＣＲプライマー用の配列を両端に含む適当な長さのランダム配列を有するＲＮＡを合成し、これを標的蛋白質と会合させて固相化する。結合しなかったＲＮＡを洗浄した後、結合したＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅させ、次のラウンドで用いるＲＮＡのテンプレートとする。これを１０ラウンド前後繰り返すことによって、標的蛋白質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを得る。この方法によれば、標的蛋白質の機能を促進又は阻害する生理活性を有するＲＮＡを得ることが可能である。このようにして、得られたアプタマーを医薬品として用いることが可能である。このようにして得られたアプタマーは医薬品として用いられ、従来の創薬として以下の点で優れている。
【０００６】
（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模のスクリーニングを行なうことができる。
（２）試験管内で容易に大量に合成することができる。
（３）免疫による排除がない。
（４）容易に改良が可能である。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ００／３１０２１
【非特許文献１】Biochem.Biophys. Res. Commun., 122, 1131 (1984)
【非特許文献２】C.tuerk & L.Gold, Science 249:505-510, 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、Ａβが何らかの原因で、ランダムコイル構造又はα−へリックス構造からβ−シート構造へ転移することによってアミロイド線維が形成され、このアミロイド線維が脳内に沈着して神経細胞に害を及ぼしている。従って、Ａβのランダムコイル構造又はα−へリックス構造からβ−シート構造への転移を阻害することができれば、アミロイド線維の形成を阻害することができ、有用である。
従って、本発明の目的は、アミロイドβ蛋白質のβ−シート構造への転移を阻害することのできるＲＮＡ分子、該ＲＮＡ分子を含む医薬組成物等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アミロイドβ蛋白質のβ−シート構造への転移を阻害することのできるＲＮＡ分子の候補として、アミロイドβ蛋白質に対してセレックス法によりＲＮＡ分子アプタマーを作成した。すなわちＡβの１０〜３５位からなるペプチドを標的蛋白質としてセレックス法を実施し、得られたアプタマーの標的蛋白質との相互作用等を調べ、その有用性を示した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、配列番号１〜１５の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡを提供するものである。
また、上記ＲＮＡは、その塩基配列に変異を導入したものであってもよく、塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されたものであってもよい。
上記ＲＮＡは、アミロイド線維の形成を阻害する活性を有している。
また、本発明は、上記ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡを提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記ＤＮＡが挿入されたベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記ＲＮＡ又はベクターを含有する医薬組成物を提供するものである。
上記医薬組成物は、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療又は予防するために好適に用いられる。
また、本発明は、上記ＲＮＡ、又はベクターを投与することを特徴とする、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療・予防する方法を提供するものである。
また、本発明は、上記医薬組成物を投与することを特徴とする、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療・予防する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アミロイドβ蛋白質がβ−シート構造へ転移することを阻害し、線維化を阻害することのできるＲＮＡが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
アミロイド線維の形成を阻害する活性を有するＲＮＡ分子を得るために、セレックス法によってランダムなＲＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーから、Ａβの１０〜３５位からなるペプチドに対するＲＮＡアプタマーを作製した。セレックス法は、標的分子に対して特異的親和性を有する新規の核酸分子を創製する手法としてその有効性が認められている。
【００１４】
本発明において用いたセレックス法について図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明でＲＮＡアプタマーを作製するために用いた手法の概念図である。図１に示すように、４０塩基のランダム領域を有する１０８塩基のＤＮＡプールを転写して８９塩基のＲＮＡプールを合成する。このＲＮＡプールは、アニーリングすることによって多様な立体構造をとることができる。まず、このＲＮＡをニトロセルロースフィルターを通してフィルターに結合しないＲＮＡを回収する。ここに、ランダムコイル構造を有するＡβ（１０−３５）を混合し、４℃の温度で１時間インキュベートする。Ａβ（１０−３５）の製造法については後述する。インキュベート後に、反応系をニトロセルロースフィルターを通すことにより、Ａβと結合していないＲＮＡを除去し、ニトロセルロースフィルターに吸着したＲＮＡ−Ａβ複合体から、ＲＮＡ分子のみを抽出する。次いで、このＲＮＡを逆転写してＰＣＲ反応を行うことにより、新たなＤＮＡプールを作製する。このサイクルをインキュベーション時の濃度条件等を厳しくして１２サイクル行なう。結合の弱い分子はサイクルを繰り返すことによって淘汰され、最終的にＡβと強く結合する分子のみが残る。このようにして、Ａβと結合するＲＮＡアプタマーが得られる。
【００１５】
セレックス法を行う際に用いたＡβ（１０−３５）の合成方法について説明する。４０残基からなるＡβ（１−４０）はアルツハイマー病患者に特異的に見られる脳内沈着物の主要構成物質である。本発明においては、Ａβ（１０−３５）という、疎水性残基を多く含む、Ａβの１０位から３５位のアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。このペプチドは、Ａβ（１−４０）よりも線維形成能が高いとされている。Ａβ（１−４０）のアミノ酸配列を配列番号１６に、Ａβ（１０−３５）のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
また、Ａβ（１０−３５）のアミノ末端に、蛍光色素、オレゴングリーン４８８（Oregon Green 488(OG)）を導入したＯＧ−Ａβを合成した。Ａβ（１−４０）、Ａβ（１０−３５）及びＯＧ−Ａβの構造を図２に示す。ＯＧ−Ａβを用いることにより、Ａβの構造転移、アミロイド線維形成を蛍光強度の変化によりモニタリングすることが可能である。
【００１６】
上述したセレックス法において、上記Ａβ（１０−３５）を用いることにより、配列番号１〜１５の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ分子が得られる。
上述のようにして得られたＲＮＡ分子は、配列番号１〜１５の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡである。このＲＮＡは、Ａβと結合する分子であり、Ａβのβ−シート構造への転移を防止し、アミロイド線維の形成を阻害する活性を有する。
上記ＲＮＡは、いったん塩基配列を決定すれば、既知の化学合成法によって合成することも可能である。
【００１７】
本発明のＲＮＡは、アミロイド線維の形成を阻害する活性を有するので、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療又は予防するための医薬として用いられる。すなわち、本発明は、上記ＲＮＡを含有する医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物としては、上記ＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡであってもよく、又は上記ＲＮＡの塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されているＲＮＡであってもよい。
【００１８】
上記ＲＮＡの塩基配列の少なくとも１個の塩基に変異を導入したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記ＲＮＡに対するテンプレートＤＮＡ配列に対して任意のプライマーを用いて高塩濃度やＭｎＣｌ２の存在下でmutagenesis PCRを行なうことによって作製することができる。又は、site directed mutagenesis法で変異の入ったテンプレートＤＮＡを作製し、これをＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の下流にクローン化し、invitroで転写、精製することにより作製することができる。
塩基配列の少なくとも１個に変異を導入したＲＮＡは、Ａβに対してより結合活性が高い及び／又はアミロイド線維の形成を阻害する活性が増強されているという利点を有する。
【００１９】
塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されているＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。すなわち、in vitroでＲＮＡアプタマーをテンプレートよりＲＮＡポリメラーゼで転写する時に、ある塩基のヌクレオシド三リン酸に代え、その塩基に修飾の入ったヌクレオシド三リン酸を用いて転写を行い、転写産物を精製することによって作製することができる。
修飾塩基を導入したＲＮＡ分子は、ＡβとＲＮＡ分子との結合の機能解析などに用いることができる。また、修飾塩基を導入することにより、変異を導入したＲＮＡと同様、Ａβに対してより結合活性の高い及び／又はアミロイド線維の形成を阻害する活性が増強されるものも得られる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、配列番号１〜１５の塩基配列からなる群より選択される塩基配列を有するＲＮＡ、該ＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡ、又は該ＲＮＡの塩基配列中の少なくとも１個の塩基が修飾されているＲＮＡを含有する。本発明の医薬組成物は、医薬的に使用可能な担体を含有してもよい。本発明の医薬組成物中のＲＮＡの含有量は、必要な患者に投与した際に、アミロイド線維の沈着、アミロイド線維の生成、又はアミロイド線維の増殖を阻害し得る量であると定義される。患者に投与すべき投与量は、一般に、患者の体表面積、体重、病状等に基づいて決定される。動物及びヒトにおける薬剤の投与量の相互関係は公知であり、また体表面積は、患者の身長及び体重から決定することができる。
【００２１】
本発明においては、上記ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡが提供される。上記ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡは、当業界で周知の核酸の化学的合成法により、例えばＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて作製することができる。また、合成されたＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用して、該DNAを増幅することができる。ＰＣＲ技術は例えばJ. Sambrookら（MolecularCloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Secondedition., 1989）に記載されている。
【００２２】
上記ＤＮＡが挿入されたベクターを構築するためのベクターとしては、pUC19（宝酒造（株）製）、pGREENLANTERN（ライフテックオリエンタル（株）製）、pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY6:905-915 (July 1995))等のプラスミドベクター、遺伝子治療用ベクターとしてのアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルス等）等を使用できる。
【００２３】
上記ベクターにおいて、ＤＮＡ上流にはプロモーター配列を含むことができる。プロモーター配列は、該ＤＮＡの発現を調節する要素であり、ウイルスプロモーター（アデノウイルスVA1プロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスプロモーターなど）、ファージプロモーター（λPLプロモーターなど）、polIIIプロモーター（ヒトtRNAプロモーター（例えばtRNAvalプロモーター）など）、β−アクチンプロモーター等が使用可能である。さらに、転写因子としてプロモーターとエンハンサーの組合せを使用してもよい。エンハンサーとしては哺乳類由来、ウイルス由来のものが使用できる。
【００２４】
また、本発明のベクターにおいては、挿入した下流にターミネーター配列をさらに含有させてもよい。ターミネーターは、転写を終結させる配列であれば、いずれの配列も使用でき、ターミネーター配列としてＵＵＵＵＵが使用できる。ベクターは、必要に応じて抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子などの選択マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子を含んでもよい。
本発明のベクターは、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、アミロイド線維の増殖によって発症する疾病を治療又は予防するために用いることができる。すなわち、本発明は、上記ベクターを含有する医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明のＲＮＡを含む医薬組成物及びベクターを含む医薬組成物は、アルツハイマー病等の疾病の治療・予防に用いられ、投与する場合は、公知の方法に従って製剤化することができる。例えば、経口的又は非経口的に投与する。非経口的投与としては、例えば局所に静脈内、筋肉内、皮下、経皮的に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、そのままで投与してもよく、又は摂取促進のために補助剤等の生理学的に許容される担体とともに製剤化して投与してもよい。また、所望の組織を標的として医薬組成物を輸送するための手段や、標的細胞への導入を容易にするための手段、例えば薬理学的に許容されるカチオン性脂質等によるリポソームの利用等も可能である。
本発明の医薬組成物は、本発明のＲＮＡ、ベクター、又は医薬組成物を投与することにより、アミロイド線維沈着、アミロイド線維の生成、アミロイド線維の増殖によって発症する疾病の治療・予防することに効果的である。このような疾病としては、例えばアルツハイマー病が挙げられるが、同様な機構で起こる疾病である、プリオン病（狂牛病や人のヤコブ病等）やパーキンソン病等にも適用可能である。
【実施例】
【００２６】
実施例１
ＲＮＡアプタマーの取得
図２に示すＡβ（１０−３５）を、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相法により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、マトリクス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）により同定した。このＡβ（１０−３５）を以下のセレックス法に用いた。なお、Ａβ（１０−３５）のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
方法は、図１に概念図として示した方法により行った。なお、方法は、Molecular Diversity, 4, 75-89(1999)の方法に従った。
【００２７】
ランダムな配列を有する、８９塩基からなるＲＮＡを合成した。このＲＮＡプールは、アニーリングすることによって多様な立体構造をとることができる。このＲＮＡを９５℃の温度で５分間処理し、３０分以上かけてゆっくりと室温まで温度を下げて二次構造を取るようにした。このＲＮＡを、まずニトロセルロースフィルターに通し、フィルターに結合しないＲＮＡを回収した。このランダムコイル構造のＲＮＡとＡβ（１０−３５）との結合は、結合バッファー（５０ｍＭ  ２−〔４−（２−ヒドロキシメチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルフォン酸ナトリウム（ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ）（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  塩化マグネシウム）中で行った。ＲＮＡとＡβ（１０−３５）との複合体を、ニトロセルロース膜によって固相化した。この段階で、Ａβ（１０−３５）と結合していないＲＮＡはニトロセルロース膜に吸着しなかった。ＲＮＡとＡβ（１０−３５）との複合体が結合したニトロセルロース膜を結合バッファーで洗浄した後、複合体を、７Ｍ  尿素、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で溶出した。複合体を形成したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増殖を行い、得られたＲＮＡを再度上述の方法で選択を行った。なお、この操作を９ラウンド行った。また、１０〜１２ラウンドはＡβに結合するＲＮＡを溶出した後、さらにニトロセルロースフィルターに通し、フィルターに結合しないＲＮＡのみを回収した。
【００２８】
ラウンド毎に、ＲＮＡとＡβ（１０−３５）との比を変えた。サイクル毎のＲＮＡ及びＡβ（１０−３５）の使用量を表１に示した。
【００２９】
【表１】
2005065660.tif 000002
【００３０】
１２ラウンドの選択を行って得られたＲＮＡを大腸菌を用いてクローニングし、配列決定を行った。得られたＲＮＡの配列を、表２及び配列番号１〜１５に示す。得られたＲＮＡは、その共通配列に基づいて、表２に示すように８つのグループに分類することができた。
【００３１】
【表２】
2005065660.tif 000003
【００３２】
実施例２
ＲＮＡによるアミロイド線維形成の阻害
図２に示すＯＧ−Ａβを、Ｆｍｏｃ固相法により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより同定した。２０μＭのＡβ（１０−３５）、及び１００ｎＭのＯＧ−Ａβを結合バッファーで４℃でインキュベートした。溶液の蛍光強度を経時的に測定した。なお、蛍光強度の測定は、蛍光プレートリーダーＴｗｉｎｋｌｅ  ＬＢ９７０（ベルトールドジャパン製）により行った。
【００３３】
同様に、実験系に配列番号３及び配列番号９に示すＲＮＡを５μＭ加え、同様に実験を行った。結果を図３に示す。図３は、蛍光強度の変化を経時的に測定した結果を示すグラフである。図３において、横軸は時間、縦軸は蛍光強度を示す。
図３において、黒三角で示すものは、配列番号３で示すＲＮＡを加えたもの、黒四角で示すものは配列番号９で示すＲＮＡを加えたもの、×で示すものはＲＮＡを加えなかったものの結果である。図３に示すように、ＲＮＡを加えなかった場合、インキュベート開始６０時間までは蛍光強度の減少はわずかであったが、６０時間を過ぎてから蛍光強度は急激に減少し、１００時間で、開始時の３０％ほどになった。このことは、Ａβがβシート構造に構造転移し、線維化されたことを示す。
【００３４】
これに対し、実施例１で得られたＲＮＡを加えた場合、配列番号３の場合は１５５時間経過しても蛍光強度は開始時の７０％程度であり、配列場合９の場合は８０％程度であった。すなわち、ＲＮＡを加えない場合に比べ、実施例１で得られたＲＮＡを加えた場合、蛍光強度の減少が著しく小さくなった。このことは、実施例１で得られたＲＮＡを加えた場合、Ａβのβ−シート構造への転移、線維化が阻害されたことを示す。
また、１５５時間インキュベートした後の線維化の状態を電子顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。図４において、左側から、ＲＮＡを加えなかったもの、配列番号３で示されるＲＮＡを加えたもの、配列番号９で示されるものの結果である。図４から明らかなように、ＲＮＡを加えなかった場合、Ａβは線維化されていた。配列番号３で示されるＲＮＡを加えた場合、Ａβはわずかに線維化されており、ＲＮＡを加えない場合よりは、線維化の程度は低かった。配列番号９で示されるＲＮＡを加えた場合、Ａβはほとんど線維化されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明でＲＮＡアプタマーを作製するために用いた手法の概念図である。
【図２】Ａβ（１−４０）、Ａβ（１０−３５）及びＯＧ−Ａβの構造を示す図である。
【図３】蛍光強度の変化を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図４】線維化の状態を電子顕微鏡で観察した写真である。
【図１】
2005065660.tif 000004
【図２】
2005065660.tif 000005
【図３】
2005065660.tif 000006
【図４】
2005065660.tif 000007
【配列表】
2005065660000001.app