(57)【要約】【課題】哺乳類における腫瘤、特にＴｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、Ｔｈ３−Ｄにおける腫瘤形成抑制剤および腫瘤形成抑制方法を開発すること。【解決手段】インターフェロンγを主成分とする免疫反応性腫瘤形成抑制剤、およびこの腫瘤形成抑制剤を投与することを含む哺乳類の免疫反応性腫瘤形成抑制方法を提供した。本方法に係る方法は、特にＴｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、およびＴｈ３−Ｄによって誘導される腫瘤の形成抑制に有用であり、かかる疾患における腫瘤自体を縮小させることが可能となる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン−γを主成分とする哺乳動物の免疫反応性腫瘤形成抑制剤。
【請求項２】
前記腫瘤が、Ｔｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、またはＴｈ３−Ｄのいずれかの疾患において誘導される腫瘤である、請求項１に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤。
【請求項３】
前記腫瘤が、Ｔｈ１反応、Ｔｈ２反応またはＴｈ３反応のいずれかにより誘導される腫瘤である、請求項１に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤。
【請求項４】
前記腫瘤が慢性関節リウマチにおけるパンヌス、ネコ歯頚部吸収病巣における肉芽組織、またはイヌリンパ球プラズマ細胞性膝関節炎における肉腫のいずれかである、請求項１に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤。
【請求項５】
前記哺乳類がイヌまたはネコである、請求項１に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤。
【請求項６】
前記インターフェロン−γが、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列からなるイヌインターフェロン−γである、請求項５に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載された腫瘤形成抑制剤を投与することを含む、哺乳動物の免疫反応性腫瘤形成抑制方法。
【請求項８】
前記腫瘤形成抑制剤が病変局所に投与される、請求項７に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制方法。
【請求項９】
前記インターフェロン−γが少なくとも１日に、１病変局所あたり０．８〜２．０万単位投与される、請求項８に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の免疫反応性腫瘤形成抑制剤および免疫反応性腫瘤形成抑制方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチは、肉芽腫様組織（以下「パンヌス」という。）を病変の主座とする全身性免疫反応性疾患であり、臨床的には多関節の疼痛、腫瘤、機能障害の問題を招来し、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）を生涯に亘って著しく低下させる難治性疾患の一つとされている。全身性自己免疫疾患の一つとして位置付けられているが原因は明らかとなっていない。ヒトの慢性関節リウマチの診断は、臨床所見、血液検査、Ｘ線検査等の項目を総合的に判定するアメリカリウマチ学会の提唱する診断基準（１９８７年改訂）に沿って行われる。
【０００３】
慢性関節リウマチでは、Ｔｈ反応によって、パンヌスが増殖する。このパンヌスを形成するＴ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうちＴｈ１細胞であり、パンヌスを形成したＴｈ１細胞はＲＡＮＫＬを分泌するので、これによって二次的に骨吸収が誘導されるという悪循環に陥る。パンヌスの存在は、ＭＲＩによって診断できることが報告されている（杉村和郎監修：骨軟部のＭＲＩ、メジカルビュー社、６７−６８（２０００））。
【０００４】
ヒトの慢性関節リウマチの治療としては、薬物療法、リハビリテーション、外科療法などがある。薬物療法では、抗炎症作用および鎮痛作用を有する酸性非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とステロイドホルモン剤の２種類が用いられるが、どちらも対症療法であり、副作用が生じることもある一方で、十分な効果を得られない場合も多い。慢性関節リウマチにおける骨吸収は、インターフェロン−γの投与により改善される。しかし骨吸収の原因となるパンヌス自体は、早期であれば外科的手術により切除できるものの、ある程度以上に大きく成長すると患部の周囲にまで影響を与えるため切除できない。パンヌス自体を縮小させるための薬物はこれまで開発されていない。
【０００５】
一方、パンヌスのような腫瘤は慢性関節リウマチに限られず、様々な疾患の患部において見られ、膿瘍、動脈瘤等の血管疾患、肝臓・脾臓・腎臓などの器官の拡大、良性および悪性腫瘍、結節、膿胞、浮腫等に分類される。これらのうち、腫瘍や結節は、パンヌス（肉芽腫組織）と同様に、凝集したコラーゲンにＴ細胞が付着することにより形成が開始される。Ｔｈ１細胞またはＴｈ１細胞に分泌されるサイトカインの反応（Ｔｈ１反応）により腫瘤の形成が誘導される疾患はＴｈ１−Ｄ（Ｔｈ１疾患）、Ｔｈ２細胞またはＴｈ２細胞に分泌されるサイトカインの反応（Ｔｈ２反応）により腫瘤形成が誘導される疾患はＴｈ２−Ｄ（Ｔｈ２疾患）、Ｔｈ３細胞またはＴｈ３細胞とトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βとの反応（Ｔｈ３反応）により腫瘤形成が誘導される疾患はＴｈ３−Ｄ（Ｔｈ３疾患）と呼ばれる。
【０００６】
ヒト以外の哺乳動物のＴｈ１−Ｄとしては、イヌ慢性関節リウマチ（Ｃａｎｉｎｅ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ＭＨＣＩＩ）、イヌの類結核、イヌ特発性リンパ球プラズマ細胞性大腸炎（ｃａｎｉｎｅ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ−ｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｓ：  ＬＰＣ）、慢性角膜炎のほか、レッドマウス（ｒｅｄ  ｍｏｕｔｈ）、ネコリンパ球プラズマ細胞性胃腸炎（ｆｅｌｉｎｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ＩＢＤ）、リンパ球プラズマ細胞性鼻炎、糖尿病などが挙げられる。
【０００７】
Ｔｈ２−Ｄとしては、イヌアトピー性皮膚炎（ｃａｎｉｎｅ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、ライ腫、イヌ（夏型）過敏性肺炎、ネコ歯頚部吸収病巣（Ｆｅｌｉｎｅ  Ｎｅｃｋ  Ｌｅｓｉｏｎ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）とその関節炎などが挙げられる。
【０００８】
Ｔｈ３−Ｄは、腫瘤を形成するＴｈ３細胞とトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）との作用によりナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）が抑制され、悪性腫瘍の形成を促進する。Ｔｈ３−Ｄとしては、イヌリンパ球プラズマ細胞性膝関節炎などが挙げられる。
【０００９】
【特許文献１】
特開平９−２３４０８５号
【発明が解決しようとする課題】
慢性関節リウマチの患部においてパンヌスを消退させることができれば、骨吸収を促進するサイトカインの分泌を抑制することができ、骨の吸収を防ぐことができる。
【００１０】
一方、Ｔｈ１−Ｄにおいて形成される腫瘤であるパンヌスの形成を抑制する方法が開発されると、同様の機序で形成されるＴｈ２−ＤやＴｈ３−Ｄにおける腫瘤の形成抑制にも当該方法を応用できる可能性がある。
【００１１】
即ち、本発明は、哺乳類における腫瘤、特にＴｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、Ｔｈ３−Ｄにおける腫瘤形成抑制剤および腫瘤形成抑制方法を見出すことにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記事情に鑑みて精力的に検討と研究を重ねた。その結果、予想外にも、（１）イヌの慢性関節リウマチの患部に遺伝子組換型イヌインターフェロン−γを投与することにより、患部に形成されたパンヌス自体が縮小されること、（２）Ｔｈ２−Ｄに分類される歯頚部吸収病巣（Ｎｅｃｋ  Ｌｅｓｉｏｎ）を罹患したネコにインターフェロン−γを投与することにより、患部の肉芽組織（腫瘤）が縮小され、その結果として骨再生すること、（３）Ｔｈ３−Ｄに分類されるイヌリンパ・プラズマ性膝関節炎においても、膝関節内のインターフェロン−γの投与により傍関節部に増殖した低形成線維肉腫が縮小され、症状に改善が見られることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
［１］インターフェロン−γを主成分とする哺乳動物の免疫反応性腫瘤形成抑制剤；
［２］前記腫瘤が、Ｔｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、またはＴｈ３−Ｄのいずれかの疾患において誘導される腫瘤である、前記［１］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤；
［３］前記腫瘤が、Ｔｈ１反応、Ｔｈ２反応またはＴｈ３反応のいずれかにより誘導される腫瘤である、前記［１］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤；
［４］前記腫瘤が慢性関節リウマチにおけるパンヌス、ネコ歯頚部吸収病巣における肉芽、またはイヌリンパ球プラズマ細胞性膝関節炎における肉腫のいずれかである、前記［１］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤；
［５］前記哺乳類がイヌまたはネコである、前記［１］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤；
［６］前記インターフェロン−γが、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列からなるイヌインターフェロン−γである、前記［５］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制剤；
［７］前記［１］から［６］のいずれか１項に記載された腫瘤形成抑制剤を投与することを含む、哺乳動物の免疫反応性腫瘤形成抑制方法；
［８］前記腫瘤形成抑制剤が病変局所に投与される、前記［７］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制方法；
［９］前記インターフェロン−γが少なくとも１日に、１病変局所あたり０．８〜２．０万単位投与される、前記［８］に記載の免疫反応性腫瘤形成抑制方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に、本願明細書において記載する記号、用語等の意義、本発明の実施の形態等を示して、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明に係る腫瘤形成抑制剤は、インターフェロン−γを主成分とする。本発明者らは、慢性関節リウマチを罹患するイヌの関節内にインターフェロン−γを注射投与することにより、患部に形成されたパンヌスが縮小されることをＭＲ画像により初めて確認した。インターフェロン−γは、パンヌス周辺においてＮＦ−κＢのアポトーシス抑制作用を抑制する。その結果、パンヌスにおけるアポトーシスが誘導され、腫瘤サイズが小さくなるものと考えられる。
【００１５】
なお、本明細書において腫瘤形成抑制とは、腫瘤が大きくなるのを抑制することと、すでに形成された腫瘤の大きさを縮小することとを含む。
【００１６】
本発明に係る腫瘤形成抑制剤は、慢性関節リウマチに限定されず、Ｔｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、Ｔｈ３−Ｄといった、腫瘤が形成される他の疾患にも有効である。当該腫瘤は、それぞれＴｈ１反応、Ｔｈ２反応、Ｔｈ３反応により誘導され、同時に悪化する。本発明者らは、これらの疾患においても、腫瘤周辺に本発明に係る腫瘤形成抑制剤を投与すると、当該腫瘤サイズが小さくなることをＭＲ画像により確認した。さらに、投与前後において、末梢血および関節液中のＣＤ４陽性細胞／ＣＤ８陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで測定することによって、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ３細胞それぞれの濃度を求めたところ、治療後にこれらの濃度のバランスが改善されていることを確認した。
【００１７】
本発明に係る腫瘤形成抑制剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル等）に用いることができるが、特にイヌまたはネコに用いられるのが好適である。ここで、「イヌ」はイヌ科のイヌ以外の動物、「ネコ」はネコ科のネコ以外の動物を含む。
【００１８】
本発明に係る腫瘤形成抑制剤に含まれるインターフェロン−γは、治療対象の哺乳動物にあわせて適宜選択することができる。治療対象がイヌまたはネコである場合には、イヌインターフェロン−γが特に有効である。イヌインターフェロン−γには、天然型や遺伝子組換型のものがあり、本発明の腫瘤形成抑制剤としてはいずれを用いることもできるが、遺伝子組換型のものがより好ましい。遺伝子組換型インターフェロン−γは、例えば特許文献１に方法により製造することができ、例えば配列番号：１に記載されるアミノ酸配列を有するものが公知である。
【００１９】
また、本発明は、本発明に係る腫瘤形成抑制剤を投与することを含む哺乳動物の腫瘤形成抑制方法も含む。本発明に係る腫瘤形成抑制方法は、特に、Ｔｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、Ｔｈ３−Ｄのいずれかの疾患において形成される腫瘤、またはＴｈ１反応、Ｔｈ２反応、Ｔｈ３反応により誘導ならびに増殖する腫瘤に有効である。
【００２０】
本発明に係る腫瘤形成抑制方法では、インターフェロン−γを病変局所、あるいは各Ｔｈ反応の発生母地に投与することが好ましい。こうすることによってインターフェロン−γが患部のＴｈ反応に直接作用することが可能となる。腫瘤の位置は、公知の方法またはそれに準じた方法によって確認することができ、例えばＭＲＩ法、Ｘ線、触診などによることができる。
【００２１】
また、本発明に係る腫瘤形成抑制方法では、インターフェロン−γを少なくとも１日に、１病変局所当たり０．８〜２．０万単位投与することが好ましい。この範囲であれば、血小板減少やサイトカイン血症等の副作用が生じることがない。
【００２２】
【実施例】
以下に示す本発明の実施例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例の様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【００２３】
以下の実施例において、ＭＲＩの撮像は、一般撮像はスピン・エコー法で、肉芽ならびに肉腫の評価はＳＴＩＲ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔ１  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）法およびダイナミックＭＲＩ法で実施した。
［実施例１］
Ｔｈ１−Ｄの代表例として、イヌ慢性関節リウマチを罹患するシェトランド・シープドッグ（雌、１１才、体重８Ｋｇ）を用いた（以下「症例１」という）。
【００２４】
配列番号：１に記載されるイヌインターフェロン−γを、１病変局所あたり２万単位として週２回、注射用蒸留水で希釈した当該薬剤を膝関節内（病変部）に注射投与した。
【００２５】
図１に、治療前後のパンヌスのＭＲ画像（Ｔ２強調像）を示す。治療開始前には膝関節部に白い高信号域としてパンヌスの存在が確認されたが（上）、治療開始後１４日目にはパンヌスはほとんど消失していた（下）。
【００２６】
次に症例１の関節液中のＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定した。さらに、ＣＤ４陽性細胞中のＴｈ１細胞とＴｈ２細胞の割合を以下の式で求めた。
【００２７】
Ｔｈ１／Ｔｈ２  ｒａｔｉｏ＝（ＣＤ４＋ＣＤ８−）／ＣＤ４Ｆ−（ＣＤ４＋ＣＤ８−）
結果を表１に示す。Ｔｈ１／Ｔｈ２比は著しく改善された。
【００２８】
【表１】
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治療開始前の患部の関節液中ではＣＴＬであるＣＤ８陽性細胞とｈＴＬであるＣＤ４陽性細胞の両方ともが正常の半分程度に低下していた。治療開始７日目からＣＴＬの割合が増加し始め、３０日目には正常の１．５倍近くになった。このことから関節内に投与されたインターフェロン−γがＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節することが示され、さらにＮＫ細胞ならびにＮＫＴ細胞活性も増強された。なお、ＣＤ８細胞は増加するので、免疫抑制剤ＦＫ５０６で治療したところ、ＣＤ４／ＣＤ８比は著しく改善された（Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ療法）。
［実施例２］
Ｔｈ２−Ｄの代表例として、ネコ歯頚部吸収病巣（Ｆｅｌｉｎｅ  Ｎｅｃｋ  Ｌｅｓｉｏｎ）を罹患する日本ネコ（雌、２才、体重２．２Ｋｇ）を用いた（以下「症例２」という）。
【００２９】
配列番号：１に記載されるイヌインターフェロン−γを、１病変局所あたり１万単位として週２回、患部に直接投与した。
【００３０】
図２に治療前後の患部（下顎）の肉眼写真（左）と単純Ｘ線像（右）を示す。治療開始前には肉眼でも単純Ｘ線像でも肉芽組織による歯牙の顕著な吸収が認められた（左上、および右上矢印）。しかし治療開始後９５日目には肉芽組織の縮小に伴う肉眼でも明らかな歯（ＭＰ３）の再生が見られ（左下）、また単純Ｘ線像でも治療前はほとんど黒色（空洞）であった歯の内部（右上矢印）の大部分が肉芽組織の消失後に再石灰化していることが確認された（右下矢印）。
【００３１】
図３に症例２の治療前後の患部（上顎）の肉眼写真（左）と単純Ｘ線像（右）を示す。肉眼では、治療開始前後でほとんど変化が認められなかった（左上、および左下）。しかし、単純Ｘ線像では治療開始前に見られた歯の内部の肉芽（線異種）（右上矢印）が、治療開始後９５日目には顕著に縮小し、内部が器質化により改善されていることが確認された（右下矢印）。
【００３２】
図４に症例２の治療前後の頭部の肉芽組織のＭＲ画像（Ｔ２強調像）を示す。治療開始前には歯の吸収が見られた部位に白い高信号域が生じ、Ｎｅｃｋ  Ｌｅｓｉｏｎの存在が確認された（上）が、治療開始９５日目にはこの高信号域が見られなくなり、肉芽腫が消失していた（下）。
［実施例３］
Ｔｈ３−Ｄの代表例として、Ｔｈ３反応によって誘導された傍関節部の肉腫（リンパ肉腫）を併発しているイヌリンパ球プラズマ細胞性膝関節炎を罹患したフラット・コーテッド・レトリバー（雄、７才）を用いた（以下「症例３」という）。
【００３３】
配列番号：１に記載されるイヌインターフェロン−γを１病変局所当たり２万単位として週２回ずつ２週間、両膝関節内に直接投与した。
【００３４】
図５に治療前後のダイナミックＭＲＩ像を示す。Ｇｄ投与により高信号（白色）に増強された範囲（生存細胞の存在部位）が治療開始前に比較して治療開始１４日目では縮小傾向を示した。膝関節内に薬剤投与されたにもかかわらず、Ｔｈ３反応を抑制しているので、膝関節の傍に位置する肉腫は退縮した。
【００３５】
図６に肉腫細胞の生残数のダイナミック・スタディによる評価の結果を示す。治療開始前（３．１４）では、病変部が高信号（白色）に増強されていた。しかし、治療開始１４日目（３．２８）では明らかに膝近傍ある肉腫は退縮した。造影剤による増強部位と程度は病変部における生存細胞の存在部位を表している。このことから治療開始前に比較し、治療開始１４日目では病変部の生存肉腫細胞が顕著に減少していたことがわかる。
【００３６】
続いて、フローサイトメトリーにより、末梢血および関節液中のＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞の割合を測定し、治療前後の免疫学的所見を得た。結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
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治療開始前、末梢血においては特に異常は認められなかった。関節液は治療開始前にはＣＤ８陽性細胞（ＣＴＬ）とＴｈ３細胞が顕著に増加し、ＣＤ４陽性細胞（ｈＴＬ）が低下していた。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２比も正常の五分の一程度にまで低下し、Ｔ細胞サブセットのバランスが明らかに崩れていた。治療開始後１４日目の関節液ではリンパ球のアポトーシスの抑制によりこれらの状況がさらに進行したので、クロス・トーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）療法としてＴｈ３反応を抑制すると、膝関節近傍の肉腫も退縮傾向が見られ、ＣＲＰは２１ｍｇ／ｄｌから７ｍｇ／ｄｌと著しく改善した。肉腫の退縮によりリンパ球の形態も正常に回復した。
【００３８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によって哺乳類の免疫反応性腫瘤形成抑制剤および腫瘤形成抑制方法を提供することができた。かかる抑制剤および方法は、特に、Ｔｈ１−Ｄ、Ｔｈ２−Ｄ、Ｔｈ３−Ｄによって誘導される腫瘤の治療に有用である。
【００３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、イヌ慢性関節リウマチのインターフェロン−γ治療前後の膝関節部のＭＲＩ画像（Ｔ２強調像）を示す。
【図２】図２は、ネコ歯頚部吸収病巣のインターフェロン−γ治療前後の患部（下顎）の肉眼写真（左）と単純Ｘ線像（右）を示す。
【図３】図３は、ネコ歯頚部吸収病巣の治療前後の患部（上顎）の肉眼写真（左）と単純Ｘ線像（右）を示す。
【図４】図４は、ネコ歯頚部吸収病巣の治療前後の頭部のＭＲ画像（Ｔ２強調像）を示す。
【図５】図５は、イヌのリンパ球プラズマ細胞性膝関節炎によって誘導された傍膝関節の肉腫に対する縮小効果を示す。
【図６】図６は、イヌのリンパ球プラズマ細胞性膝関節炎によって誘導された肉腫細胞の生残数の治療前後のダイナミック・スタディによる治療評価の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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