(57)【要約】【課題】  入手し易く実用性の高い天然由来のエラスターゼ阻害剤およびこれを含有する組成物を提供する。【解決手段】  本発明のエラスターゼ阻害剤は、ザクロ（Punica granatum，ザクロ科）の花の粉末および／または抽出物を有効成分として含有することを特徴とし、これを含む組成物は、化粧品，皮膚外用剤や薬剤として利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロ（Punica granatum，ザクロ科）の花の粉末および／または抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項２】
ザクロの花の水および／またはエタノール抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のエラスターゼ阻害剤を含有することを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性に優れたエラスターゼ阻害剤および当該エラスターゼ阻害剤を含有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、肌のシワやタルミ（肌の張りや弾力の低下）の発生メカニズムが明らかにされつつあり、エラスチンというタンパク質が、肌の若さ維持に極めて重要な役割を有するとされている。即ち、エラスチンは真皮の構成成分であり、同じく皮膚の構造タンパク質であるコラーゲンを結び付け、肌の張りや弾力性を高め、若々しさを維持するという作用を示す。
【０００３】
ところが、紫外線や加齢その他の不明な原因によってエラスチンを分解する酵素（エラスターゼ）が過剰に誘導されると、エラスチンの存在量が減り、肌の若々しさが失われる結果となる。例えば、若者の肌に含まれるエラスチン量は１４〜１８％であるが、３５歳以上になると０．１〜２％まで減少するとのデータもある。従って、皮膚の繊維芽細胞が産生するエラスターゼの活性を阻害すれば、真皮でのエラスチン量を保つことができ、肌のシワやタルミを予防したり改善することが可能になると考えられる。
【０００４】
既に、エラスチンを意識した化粧料の有効成分として、ビタミンＡおよびその誘導体（レチノール誘導体）が広く研究されている。例えば特許文献１には、皮膚の老化を予防および改善する化粧料の有効成分としてのレチノール配糖体が開示されている。
【０００５】
しかし、レチノール誘導体には過剰投与による副作用もよく知られている。例えば、注射時のショックや、ビタミンＡ過剰症状様の脳神経系，胃腸系，肝臓への悪影響、および脱毛や掻痒感などである。しかも、肌に直接塗布等する化粧料などの場合には、合成化合物ではなく、より刺激の少ない天然由来の有効成分が好ましい。この様な天然由来のエラスターゼ阻害剤としては、ユキノシタの抽出物（特許文献２）や、グァバ葉等の抽出物（特許文献３）などが知られており、これら抽出物はシワの減少等に効果を示す。
【０００６】
また、エラスターゼは血中等にも存在し、アルコール性肝障害，胃癌等の癌，急性膵炎等の炎症性疾患などでは、エラスターゼの異常発現が観察されている。例えば非特許文献１には、急性肺障害惹起後の動物では、好中球の活性化に伴って好中球エラスターゼ活性が顕著に上昇し、肺組織を破壊する可能性が考えられている旨が記載されており、急性肺障害の治療薬として好中球エラスターゼ阻害剤（シベレスタット）が開示されている。
【０００７】
この様に、エラスターゼ阻害剤は炎症性疾患等の治療薬となる可能性をも有しているが、安全性等を考慮すれば、やはり合成化学品ではなく天然由来の薬剤が好ましい。
【０００８】
ところで、ザクロ（Punica granatum，ザクロ科）は古来より健康によいとされており、近年では、ザクロ種子中に女性ホルモンであるエストロンが含まれていると話題になっている。また、ザクロは古くから日本でも栽培されており、入手は容易である。しかし、ザクロに含有される活性物質の研究は専ら果実や種子に限られており、ザクロの花に含まれている活性物質に関しては、本発明者によるもの以外は殆どされていないのが実情である。
【０００９】
例えば、本発明者は、ザクロ花の血糖降下作用を見出し、これと他植物との併用剤を抗糖尿病剤として特許出願しているが（特許文献４）、ザクロ花とエラスターゼ阻害作用との関係については、従来、全く認識されていなかった。
【特許文献１】特開平１０−１５８２９０号公報（請求項１等）
【特許文献２】特開平１１−２４６３８６号公報（請求項１等）
【特許文献３】特開平１２−７２６４９号公報（請求項１等）
【非特許文献１】川▲畔▼和一十，外２名，「日薬理誌」，第１２２巻，ｐ.１５１−１６０，２００３年（第１５１頁の要約）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した様に、これまでにも天然由来のエラスターゼ阻害剤は知られていたが、より入手し易く実用性の高いものが求められていた。
【００１１】
そこで、本発明が解決すべき課題は、天然由来のエラスターゼ阻害剤およびこれを含有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく、様々な植物についてスクリーニング試験を実施することにより、エラスターゼ阻害活性を示すものを選抜することから始めた。その結果、ツボクサ，カキドウシ，コロハ，沈香などにも活性が認められたが、ザクロ花が最も優れたエラスターゼ阻害活性を示すことを見出して、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明に係るエラスターゼ阻害剤は、ザクロの花の粉末および／または抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のエラスターゼ阻害剤としては、ザクロの花の水および／またはエタノール抽出物を有効成分として含有するものが特に好適である。後述の実施例によって、当該抽出物の高いエラスターゼ阻害活性と安全性が実証されているからである。
【００１５】
また、本発明の組成物は、上記エラスターゼ阻害剤を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、我国で入手し易いザクロ花を原料とする粉末或いは抽出物を含むものであり、後述の実施例で実証している通り、極めて高いエラスターゼ阻害活性と安全性を示す。従って、本発明のエラスターゼ阻害剤は、例えば化粧品等としてヒトへ直接塗布したり、また、薬剤として投与することができ、紫外線暴露や疾患等の原因により発現したエラスターゼの活性を阻害し、真皮におけるエラスチンの減少や臓器障害等を抑制することによって、皮膚のシワや特定疾患に伴う症状などを予防および改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係るエラスターゼ阻害剤が享有する最大の特徴は、優れたエラスターゼ阻害活性を示す上に、抗原性を示さないなど極めて高い安全性を有する点にある。
【００１８】
以下に、斯かる特徴を発揮する本発明の実施形態、及びその効果について説明する。
【００１９】
本発明のエラスターゼ阻害剤は、ザクロ（Punica granatum，ザクロ科）の花の粉末および／または抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２０】
「ザクロ」の花は石榴花とも呼ばれ、従来でも、アラビアやインドおよび中国医学では鼻血止めの特効薬として、また、日本でもこれを煎じて眼の洗浄剤として用いる地方があるが、学術的な研究は殆どされていないのが実情である。
【００２１】
本発明で用いられるザクロ花の種類は特に制限されるものではなく、一重や八重などは問わないが、落花する前に花冠部分から取ったものを使用することが好ましい。
【００２２】
本発明で有効成分としてザクロ花の粉末を使用する場合には、ザクロ花を乾燥した上で粉砕する。この「乾燥」の方法は特に制限されず、例えば日干し，半日干し，陰干し，加熱乾燥，常温乾燥，凍結乾燥，真空乾燥などを挙げることができるが、従来から生薬製造に用いられる日干し、半日干し、陰干しが好ましい。但し、ザクロ花は比較的肉厚であり、日本国内での開花時期は主に梅雨期に当たることから、製品とする前や使用する前には充分に乾燥する必要がある。また、乾燥の程度に関しては、カビの発生を考慮して、水分含有量を５％以内にすることが好ましい。
【００２３】
「粉末」とするのは、例えば皮膚外用剤とする場合にその作用効果を十分に発揮せしめるためである。従って、皮膚外用剤とする場合にはできるだけ細かく粉砕するとよいが、製造時の利便性を考慮すれば、５０〜２００メッシュ程度にすることが好ましい。一方、経口剤とする場合にはそのまま経口で飲み下すことができればよく、その粒径は特に制限されない。従って、その粒径は均一である必要はなく、また、約１ｃｍ程度のものであってもよい。更に、一般的には「粉末」とはいい得ないものであっても、粒状化しさえすれば「乾燥粉末」となるものも本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
「抽出物」をザクロ花から抽出する方法は特に限定されるものではなく、例えばザクロ花をそのまま抽出してもよいし、すり潰す等したものから抽出してもよく、また、一旦乾燥したものから抽出してもよい。但し、抽出の効率を考慮すれば、より細かいものから抽出することが好ましい。
【００２５】
抽出するための溶媒としては、主として水系溶媒が使用される。抽出作業の利便性や、水系溶媒から抽出されたものであれば水溶性であるため安全であること、また、溶媒が残留した場合の安全性等を考慮したものである。斯かる水系溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ-ブチルアルコール等の低級アルコール；水と低級アルコールとの混合溶媒を挙げることができ、安全性を考慮すれば、水，エタノール，または水とエタノールとの混合溶媒が好ましい。
【００２６】
使用する溶媒量は、抽出素材が乾燥したものであれば素材質量の２〜５０倍、乾燥したものでなければ０.５倍〜３０倍が一般的である。また、抽出温度も特に制限されないが、有効成分が熱分解する可能性を考慮すれば、室温で行なうことが好ましい。
【００２７】
抽出時間は特に制限されないが、１日から１０日間が好ましい。また、抽出の際には静置したままでもよいし、攪拌してもよい。
【００２８】
抽出終了後の処理は、常法に従う。例えば、濾過後に残渣を使用溶媒で洗浄し、濾液と合わせた後、溶媒を減圧や加熱により留去すればよい。但し、過剰な加熱は好ましくなく、好適には室温〜５０℃程度で減圧濃縮する。
【００２９】
こうして得られた粉末および抽出物は、一般的には、適量の添加成分を加えて組成物とした上で化粧品，皮膚外用剤や薬剤等とする。当該組成物はエラスターゼ阻害活性を示すことから、紫外線による刺激等を原因とするエラスチンの減少を抑制して肌のシワやタルミの発生を予防或いは改善したり、また、特定疾患を治療できるものとして有用である。斯かる添加成分の種類は特に制限されないが、例えば、ミツロウやサラシミツロウ，ワセリン，パラフィン，マクロゴール，ラノリン等の軟膏或いは硬膏基剤，その他の基剤，香料，防腐剤，色素類，ビタミン類，賦形剤，界面活性剤，保湿剤，抗酸化剤，紫外線吸収剤などを挙げることができる。
【００３０】
上記組成物中に含まれるエラスターゼ阻害剤の含有量は、エラスターゼ阻害剤がザクロ花の粉末であるか或いは抽出物であるか、また、組成物の使用目的（化粧品であるか、薬剤とするか等）などに依存し、特に制限されないが、例えば、ザクロ花粉末の場合は０．１〜５．０質量％，抽出物の場合は０．０３〜１．５質量％とすることができる。
【００３１】
本発明において、エラスターゼの阻害活性を示す成分は特定されていない。しかしながら、斯かる有効成分は１つではなく、複数の有効成分が相加的に若しくは相乗的に相互作用することによって、優れたエラスターゼ阻害活性を発揮している可能性がある。
【００３２】
以下に、実施例を示すことにより本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）  ザクロ花の粉末の製造
落花前のザクロ花を花冠から採取し、天日で２〜３日乾燥した。乾燥ザクロ花の採取直後に対する収率は、約１５％であった。また、当該乾燥ザクロ花の水分含有量は、５％以下であった。これを粉砕機にかけ、１００〜１５０メッシュの粉末とした。
【００３４】
（実施例２）  ザクロ花の抽出物の製造
ザクロ花１００ｇを粗切りし、これに５０％エタノール水を２Ｌ加え、時々振り混ぜつつ８日間室温で放置した。その後、濾過により不溶成分を濾別し、得られた濾液を４５℃以下で減圧濃縮した。これをデシケーター内で乾燥させたところ、ザクロ花の抽出物３５ｇが得られた。
【００３５】
（実施例３）  エラスターゼ阻害活性の測定
実施例２で得たザクロ花の抽出物を１００ｍＭ トリス・塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、０．３〜１６．０μｇ／ｍｌの試験溶液を調製した。この際、溶解し難い場合には、１０％以内でＤＭＳＯを添加した。
【００３６】
この試験溶液とヒト白血球由来エラスターゼ溶液（シグマ社製，１００ｍＭトリスバッファーｐＨ７．５に溶解，約１０ｍＭ単位）５０μｌを混合し、３７℃で５分間予加温した。尚、対照として、当該エラスターゼ溶液に１００ｍＭトリス・塩酸バッファーとＤＭＳＯを加えたのみの混合液も、同様に処理した。
【００３７】
次に、基質としてN-サクシニル-トリアラニル-p-ニトロアニリドを含む溶液（基質を最小量のＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭ トリス・塩酸バッファーｐＨ７．５を加えて７００μｌＭとしたもの）５０μｌを各試験溶液に加え、反応を開始させた。エラスターゼの作用によって遊離してくるニトロアニリンを、分光光度計（Model 450 Microplate Reader）を用いて４０５ｎｍ波長光として１分，３分，５分および７分の時点で測定し、ＩＣ５０値を求め、エラスターゼ阻害活性を計算した。結果を図１に示す。
【００３８】
当該結果より、ザクロ花の抽出物が示すエラスターゼ阻害活性のＩＣ５０値は約２μｇ／ｍｌであり、本発明に係る抽出物の極めて高いエラスターゼ阻害活性が実証された。
【００３９】
（実施例４）  安全性試験（マウスに対する急性毒性試験）
ｄｄ-Ｙ系雄性マウスを１群６匹とし、実施例２で得たザクロ花エキスを物理的に投与可能な２０００ｍｇ／ｋｇ体重まで経口投与した。その後、餌と水を自由に与え、１週間にわたり外観の変化や生死の観察をしたが、死亡例や異常は全く見られなかった。従って、本発明に係るザクロ花抽出物は、高い安全性を示すことが明らかにされた。
【００４０】
（実施例５）  抗原性試験（Schultz-Dale試験）
ハートレー系雄性モルモット（体重：約８００ｇ）に、実施例２で得たザクロ花エキスを用量５００ｍｇ／ｋｇ体重で経口投与した。投与後２０時間で屠殺し、気管支を摘出して周辺の脂肪組織を丁寧に除去して気管支のラセン標本（幅：約２ｍｍ）を作成した。これをMagnus槽に装着し、１０−５Ｍの塩酸ヒスタミンで収縮させた上で十分に洗浄する操作を２回繰り返して安定化した後、ザクロ花エキスを５０μｇ／ｍｌ添加したが、収縮反応は全く認められなかった。また、更にザクロ花エキスを増量して１００μｇ／ｍｌとして試験したが、やはり変化は全くなかった。
【００４１】
当該結果より、本発明に係るザクロ花エキスには抗原性はなく、アナフィラキシーショック等を起こす可能性は極めて少ないことから、安全性が高いことが証明された。
【００４２】
（実施例６）  製剤例
実施例１で得られたザクロ花の粉末および実施例２で得られたザクロ花の抽出物は、例えば表１に示す配合により皮膚外用剤とすることができる（単位はｇ）。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
具体的には、ザクロ花の粉末または抽出物を秤量して乳鉢にとり、精製ラノリン２５ｇを加えてよく攪拌する。更に残量の精製ラノリンや他の基剤を加えて室温で攪拌混合し、均一な軟膏を得た。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明に係るザクロ花抽出物のエラスターゼ阻害活性の測定結果を示す図
【図１】
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