(57)【要約】【課題】  新規な作用機序を有するＭＥＫ核外移行阻害剤、並びにそれを用いた医薬、機能性食品などを提供すること。【解決手段】  本発明のＭＥＫ核外移行阻害剤は、下記の式（１）又は式（２）により表される化合物を有効成分とするものである。本発明のＭＥＫ核外移行阻害剤は、新規作用機序でＭＥＫ核外移行阻害活性を示し、抗がん剤などの医薬品へ利用できるほか、機能性食品としても有用である。2005179202.tif 000010【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）により表される化合物を有効成分とするＭＥＫ核外移行阻害剤。
【化１】
2005179202.tif 000008
【請求項２】
下記の式（２）により表される化合物を有効成分とするＭＥＫ核外移行阻害剤。
【化２】
2005179202.tif 000009
【請求項３】
請求項１記載の式（１）又は請求項２記載の式（２）により表される化合物を有効成分とする抗がん剤。
【請求項４】
請求項１記載の式（１）又は請求項２記載の式（２）により表される化合物を含有する食用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な作用機序を有するＭＥＫ核外移行阻害剤とその利用に関するものであり、ＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼ・キナーゼ）およびＭＡＰキナーゼ系の働きが関係する様々な疾患に対する治療薬・予防薬として、さらには食用組成物（機能性食品）等として利用し得るものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、これまで不明であった核から細胞質へのタンパク質の輸送メカニズムの一端が解明され、核外移行シグナル（ＮＥＳ）を保有する蛋白は、輸送担体ＣＲＭ１と結合して核外へと移行することが判明した（例えば、下記の非特許文献１参照）。
【０００３】
また、大腸ガン、膵臓ガン、腎臓ガン由来の数種の腫瘍細胞で活性化を受けているＭＥＫ（「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ」、「ＭＡＰＫＫ」とも呼ばれる。）がＮＥＳを有しており、細胞質へ輸送された後に機能を発現することが明らかにされた。
【０００４】
これまで、ＭＥＫの核外移行阻害物質としてleptomycin Bのみが知られており、同物質は、ＣＲＭ１の５２９番目のシステイン残基に結合し、ＮＥＳとＣＲＭ１との結合を阻害することでＭＥＫの核外移行を阻害することが判明している。しかしながら、この作用機序とは異なるメカニズムでＭＥＫの核外移行を阻害する化合物は未だ見出されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Kudo, N. et al., Experimental Cell Research, 1998, 242, 540-547頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＭＥＫは、ＭＡＰキナーゼ系（ＭＡＰキナーゼカスケード）の一員としてＭＡＰキナーゼをリン酸化する。ＭＡＰキナーゼは、様々な転写因子を活性化することにより細胞内の情報伝達に重要な役割を果たし、細胞増殖促進のほか、細胞分化誘導、細胞運動性亢進など多岐にわたる細胞活動に関わっている。
【０００７】
このように、ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ系は生命活動に重要な役割を担っており、多くの疾患がＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きに関係していると考えられる。例えば、各種ガンにおいては、癌細胞の増殖はＭＡＰキナーゼ系の働きに依るところが大きいと考えられる。したがって、ＭＡＰキナーゼ系の一員であるＭＥＫの機能を阻害する物質は、各種ガンに対する治療薬（即ち、抗がん剤・制がん剤）としてガン治療に広く利用できる可能性がある。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、新規なＭＥＫ阻害物質を提供すること、とりわけ新規な作用機序を有するＭＥＫ核外移行阻害剤、並びにそれを用いた医薬、機能性食品などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、天然物から単離・精製した２つの化合物（即ち、ent-kaur-16-ene-3-olおよびent-kaur-16-ene-19-ol）が新規作用機序でＭＥＫ核外移行阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、医療上および産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｄ）の発明を包含するものである。
Ａ）  下記の式（１）により表される化合物を有効成分とするＭＥＫ核外移行阻害剤。
【化３】
2005179202.tif 000002
Ｂ）  下記の式（２）により表される化合物を有効成分とするＭＥＫ核外移行阻害剤。
【化４】
2005179202.tif 000003
Ｃ）  上記の式（１）又は式（２）により表される化合物を有効成分とする抗がん剤。
Ｄ）  上記の式（１）又は式（２）により表される化合物を含有する食用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物は、新規なＭＥＫ核外移行阻害物質であり、（１）ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きが関係する種々の疾患に対する治療薬・予防薬として、とりわけ（２）大腸ガン、膵臓ガン、腎臓ガンなど各種ガンにおいて癌細胞の増殖を抑制する抗がん剤（制がん剤）として、さらに、（３）抗がん作用等の効果を有する食用組成物（機能性食品）、（４）ＭＥＫ核外移行阻害による細胞応答を解析する生化学実験用試薬として効果が見込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１３】
本発明者は、バンレイシ科植物（Annona senegalensis）の抽出物から、ＭＥＫ核外移行阻害活性を有する画分を得た。さらに、得られた画分に含まれる２つの化合物について、その構造を1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル法、13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル法、および高速電子衝撃質量分析法により決定したところ、それぞれ、上記の式（１）に示される化学構造のent-kaur-16-ene-3-ol、および、上記の式（２）に示される化学構造のent-kaur-16-ene-19-olであると同定した。
【００１４】
上記２つの各化合物について、抗ＭＥＫ抗体を用いて更にＭＥＫ核外移行阻害活性を調べたところ、いずれの化合物についてもＭＥＫ核外移行阻害活性が認められた。なお、これら実験方法、実験結果の詳細は後述の実施例において説明する。
【００１５】
さらに、本発明の上記２つの化合物（即ち、上記ent-kaur-16-ene-3-olおよびent-kaur-16-ene-19-ol）は、非ＮＥＳアンタゴニスト作用を機序とし、つまり、ＮＥＳとＣＲＭ１の５２９番目のシステイン残基との結合阻害を作用機序とはしないと考えられる。このことは、以下の知見に基づくものである。即ち、ＮＥＳと競合してＣＲＭ１と結合する化合物をもとに合成したプローブ分子を用いて、細胞抽出物からＣＲＭ１をバンドとして可視的に検出することができるが、このとき、元の化合物を共存させることで競合作用が起き、ＣＲＭ１のバンドは消失する。しかし、本発明の上記２つの化合物（kaurenol類）を共存させてもＣＲＭ１のバンドは消失しないことから、上記２つの化合物は、元の化合物やプローブ分子とは作用機序を異にし、ＮＥＳ−ＣＲＭ１の結合を阻害するものではないと考察される。
【００１６】
過去報告されたＭＥＫ核外移行阻害物質は、ＮＥＳ−ＣＲＭ１の結合阻害を作用機序とするもののみであることから、本発明の上記２つの化合物は、新規な作用機序を有するＭＥＫ核外移行阻害物質と考えられる。また、生体由来物質であるため、薬として使用した場合に副作用も少ないと考えられる。
【００１７】
ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ系は、前述のように、細胞の増殖、分化など生命活動に重要な役割を担っており、多くの疾患がＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きに関係していると考えられる。したがって、本発明のＭＥＫ核外移行阻害物質は、このような様々な疾患に対する治療薬・予防薬として医薬品への利用が可能である。なお、医薬品への利用には、本発明のＭＥＫ核外移行阻害物質を医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することも含まれる。
【００１８】
とりわけ、本発明のＭＥＫ核外移行阻害物質は、癌細胞の増殖を抑制することで、各種ガンに対する治療薬（即ち、抗がん剤・制がん剤）としての効果が見込まれる。また、本発明の上記２つの化合物は、上述のように新規な作用機序を有することから、既存の抗がん剤に対する感受性の低い大腸、膵臓、腎臓ガンにおいて活性化されているＭＥＫの核外移行を阻害し、癌細胞の増殖を抑制することで、新規作用機序の抗がん剤としての効果が見込まれる。
【００１９】
本発明の上記２つの化合物は、植物などから単離・精製したものであってもよいし、公知の化学合成法を用いて合成したものであってもよい。さらに、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施し、製造してもよい。
【００２０】
本発明の用途は、上記抗がん剤としての用途に限定されるものではない。本発明の化合物は、例えば、ＭＥＫ核外移行阻害による細胞応答を解析する生化学実験用試薬として、あるいは、抗がん作用等の効果を有する機能性食品（食用組成物）の原材料として利用可能である。また、本発明の化合物は、ＭＥＫ核外移行阻害剤として、抗がん剤以外の医薬品にも利用できる可能性がある。
【００２１】
本発明の化合物をＭＥＫ核外移行阻害剤として医薬品（医薬用組成物）に用いる場合の一例について説明する。本発明の化合物は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト（または動物）に投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２２】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００２３】
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００２４】
なお、公知のＤＤＳを利用し、例えば、本発明の化合物をリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明の化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００２５】
本発明の化合物を食品（食用組成物）に用いる場合は、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明の化合物を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や保健食品等として利用できる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２７】
バンレイシ科植物（Annona senegalensis）から本発明の化合物を、そのＭＥＫ核外移行阻害活性を指標として以下のような手順で抽出、単離した。
【００２８】
（１）メタノールによる抽出
粉砕したバンレイシ科植物（Annona senegalensis）１００ｇにメタノール６００ｍＬを加え室温で３時間抽出した。濾過し、残査にメタノール６００ｍＬを加え加熱還流下２時間抽出した。この加熱抽出を３回行った。全ての濾液を濃縮し、２３ｇの固体（以下「メタノール抽出物」という。）を得た。
【００２９】
（２）酢酸エチル／Ｈ2Ｏ処理
上記（１）で得たメタノール抽出物２３ｇを酢酸エチル／Ｈ2Ｏの６００ｍＬ／６００ｍＬ混合液に加え、良く攪拌し、両層に分配溶解させた。不溶物について同じ操作を繰り返した。層分離を行い、酢酸エチル層を絶乾して１３．６ｇの固体（以下「酢酸エチル抽出物」という。）を得た。
【００３０】
（３）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分別
上記（２）で得た酢酸エチル抽出物６．８ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別した。試料６．８ｇをSiO2（２００ｇ）を充填したガラスカラム（充填溶媒n-hexane：EtOAc＝１０：１）に吸着させ、溶出溶媒としてn-hexane：EtOAc＝１０：１を通導させ、画分Ａ（２．７ｇ）を得た。さらに、溶出溶媒をn-hexane：EtOAc＝１：１、EtOAc、MeOHと順次変化させ、以下の各画分、即ち、画分Ｂ（１８０ｍｇ）、画分Ｃ（４９０ｍｇ）、画分Ｄ（１８０ｍｇ）、画分Ｅ（２．７ｇ）を得た。
【００３１】
（４）画分Ａ〜ＥのＭＥＫ核外移行阻害活性
上記画分Ａ〜ＥのＭＥＫ核外移行阻害活性を次のようにして測定した。培地中に２×１０4 cell/mLの濃度に調製したＨｅＬａ細胞をセルデスクの入った２４穴プレートに１ｍＬずつ分注し、３７℃で２４時間前培養を行った。培地を除去し、被検薬物（上記画分Ａ〜Ｅ、メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物）をＤＭＳＯに溶解させ培地を用いて適切な濃度に希釈した後５００μＬ添加した。添加したＤＭＳＯの終濃度は１％である。３時間培養後、培地を除去し、氷冷したＤ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄、１０％ホルマリン溶液１ｍＬを添加し、３０分間室温で固定化した。氷冷したＤ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、MeOH １ｍＬで１０分間室温で脱脂し、再度洗浄した後、３％ＦＢＳ溶液で２０分間室温でブロッキングした。
【００３２】
次に、氷冷した１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液１ｍＬにマウス抗ＭＥＫ１抗体１μＬ及びマウス抗ＭＥＫ２抗体１μＬの割合で添加した溶液を２００μＬ添加し、１時間室温で反応させた。続いて、氷冷したＤ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、氷冷した１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で３００倍に希釈したＦＩＴＣ標識マウス抗マウスＩｇＧ抗体２００μＬと３０分間室温で反応させた。氷冷したＰＢＳ（−）溶液および蒸留水で洗浄し、セルデスクに付着した細胞をスライドグラスにマウントし、顕微鏡下でＭＥＫの細胞内局在を観察した。ＭＥＫの核外移行が阻害され蛍光が細胞内に一様に分布しているＨｅＬａ細胞の割合が５０％以上の場合を（＋）、５０％以下のものを（±）、コントロールと差のないものを（−）として、ＭＥＫの核内への局在を３段階にして評価した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005179202.tif 000004
表１中、「ｎｄ」は非決定であることを、「＊」は細胞毒性が認められたことを示す。この実験の結果、画分Ｃに注目し、さらに分析検討を行った。
【００３４】
（５）画分ＣのＯＤＳカラムクロマトグラフィーによる分別
上記（３）で得られた画分Ｃ（４９０ｍｇ）のＯＤＳカラムクロマトグラフィーによる分別を次のように行った。
【００３５】
試料４８０ｍｇをＯＤＳ（２０ｇ）を充填したガラスカラム（充填溶媒 MeOH：Ｈ2Ｏ＝８：２）に吸着させ、溶出溶媒としてMeOH：Ｈ2Ｏ＝８：２を通導させ、画分Ｃ１（３８ｍｇ）を得た。さらに、溶出溶媒を変化させ、以下の各画分、即ち、画分Ｃ２（１７４ｍｇ、溶出溶媒MeOH）、画分Ｃ３（２９６ｍｇ、溶出溶媒CHCl3：MeOH＝１：１）を得た。
【００３６】
（６）画分Ｃ１〜Ｃ３のＭＥＫ核外移行阻害活性
上記画分Ｃ１〜Ｃ３のＭＥＫ核外移行阻害活性を、上記（４）と同様の方法により測定した。結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
2005179202.tif 000005
この実験の結果、画分Ｃ２に注目し、さらに分析検討を行った。
【００３８】
（７）画分Ｃ２のシリカゲルＨＰＬＣによる分別
上記（５）で得られた画分Ｃ２（１７４ｍｇ）のシリカゲルＨＰＬＣによる分別を次のように行った。試料２５ｍｇをカラム（cosmosil 5SL 10 mm i.d. x 250 mm）、移動相（n-hexane：EtOAc：CHCl3＝１８：２：１）、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ、ＲＩ検知器を用いて、分離精製し、画分ＡＳ−１（１１．５ｍｇ）、および画分ＡＳ−２（６．１ｍｇ）を得た。
【００３９】
（８）各画分の同定
上記（７）で得た画分ＡＳ−１、ＡＳ−２について、1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ、およびＦＡＢ−ＭＳの測定を行い、文献報告値と比較して化合物を同定した。
【００４０】
画分ＡＳ−１の化合物については、文献報告値とデータを比較し、下記の式（１）に示される構造を有する化合物ent-kaur-16-ene-3-olであると判断された。
画分ＡＳ−２の化合物については、文献報告値とデータを比較し、下記の式（２）に示される構造を有する化合物ent-kaur-16-ene-19-olであると判断された。
【００４１】
【化５】
2005179202.tif 000006
【００４２】
（９）各化合物のＭＥＫ核外移行阻害活性
上記の各化合物について、ＭＥＫ核外移行阻害活性を前記（４）と同様の方法により測定した。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
2005179202.tif 000007
表３中、「ＡＳ−１」は上記化合物ent-kaur-16-ene-3-olを、「ＡＳ−２」は上記化合物ent-kaur-16-ene-19-olを示す。この実験の結果、いずれの化合物についても、高いＭＥＫ核外移行阻害活性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上のように、本発明の新規ＭＥＫ核外移行阻害剤は、（１）ＭＥＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きが関係する種々の疾患に対する治療薬・予防薬として、とりわけ（２）大腸ガン、膵臓ガン、腎臓ガンなど各種ガンにおいて癌細胞の増殖を抑制する抗がん剤として、さらに、（３）抗がん作用等の効果を有する機能性食品、（４）ＭＥＫ核外移行阻害による細胞応答を解析する生化学実験用試薬などとして産業上幅広く利用できるものである。