(57)【要約】【課題】 電位依存性カルシウムチャンネルにおける発現電流を自在に制御する。【課題解決手段】 タンパク質リン酸化酵素ＰＫＣ及び／又はタンパク質リン酸化酵素ＣＫ２の各酵素活性を活性化する薬剤あるいは阻害する薬剤を用いて電位依存性カルシウムチャンネルβサブユニットのリン酸化を制御することにより、電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットの発現電流量を制御する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電位依存性カルシウムチャネルの発現電流量を制御する方法であって、タンパク質リン酸化酵素ＰＫＣ及び／又はタンパク質リン酸化酵素ＣＫ２の各酵素活性を活性化する薬剤あるいは阻害する薬剤を用いて電位依存性カルシウムチャンネルβサブユニットのリン酸化を制御することにより、電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットの発現電流量を制御することを特徴とする上記方法。
【請求項２】
上記タンパク質リン酸化酵素ＰＫＣ及び／又はタンパク質リン酸化酵素ＣＫ２に対する活性化剤又は阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、電位依存性カルシウムチャネルの発現電流量を制御するための薬剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットのＮ末端のリン酸化部位を用いてα１サブユニットにより発生する電流量の増減を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性カルシウムチャネルは様々な細胞機能、特に神経伝達の調節に重要な役割を果たしている。そのα１サブユニットは哺乳類においては、現在少なくとも１０種に分子種が知られており、薬理学的にL-, N-, P/Q-, R-, またはT-型カルシウムチャネルとして分類されている(非特許文献１．２参照)。
【０００３】
電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットはアクセサリーサブユニットとして細胞質側からα１サブユニットに結合し、チャネルの不活性化過程やα1サブユニットの細胞膜への移行の制御などに関与していると考えられている（非特許文献3，４参照）。哺乳類において、β1a（非特許文献5参照）、β1b（非特許文献6参照）、β1c（非特許文献7参照）、β2a（非特許文献8参照）、β2b（非特許文献9参照）、β2c（非特許文献10参照）、β3（非特許文献11参照）、β4（非特許文献12参照）などの分子種が知られている。
【０００４】
哺乳類の心筋型のα１サブユニットのCav1.2は、そのＮ末端に２つのスレオニン残基を持ち、そのスレオニン残基がタンパク質リン酸化酵素ＰＫＣによりリン酸化されると電流発現が阻害されるが、哺乳類の脳型のα１サブユニットのCav1.2はこれらのスレオニン残基を欠いており、タンパク質リン酸化酵素ＰＫＣによる阻害は受けないことが知られている（非特許文献13参照）。
【０００５】
哺乳類のβ2aサブユニットは、そのＮ末端の第３番および第４番のシステイン残基がパルミチン酸化されることにより、α１サブユニットの細胞膜移行を促進することが知られている（非特許文献14参照）。また、β2aサブユニットの第478番目と第479番目のセリン残基がタンパク質リン酸化酵素ＰＫＡによりリン酸化されると発現電流が増大することが報告されている（非特許文献15参照）。
【０００６】
無脊椎動物において、他にはイエバエ（非特許文献16参照）、クラゲ（非特許文献17参照）、住血吸虫（非特許文献18参照）の電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットがクローニングされている。イエバエのβサブユニットは、そのcRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し卵母細胞内因性のカルシウムチャネルと共発現させることにより、機能的に発現することがわかった。クラゲのβサブユニットは、α１サブユニットとしてクラゲCyCav1またはヒトCav2.3と共にアフリカツメガエル卵母細胞で発現させ、不活性化からの回復特性について検討されている（非特許文献19参照）。住血吸虫のβサブユニットは、α１サブユニットとしてクラゲCyCav1または哺乳類のCav2.3と共にアフリカツメガエル卵母細胞で発現させると発現電流が減少するという特性が認められた。
【０００７】
無脊椎動物のヤリイカでは、神経系、特に星状神経節の巨大シナプスが神経伝達の研究に使われてきている。（非特許文献20参照）。KimuraとKuboは、ヤリイカ視神経節から２種のβサブユニットをクローニングし、その特性解析を行っている（非特許文献21参照）。
【非特許文献１】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:521-555(2000)
【非特許文献２】Jpn. J. Phrmacol. 72:83-109 (1996))
【非特許文献３】J. Bioenerg. Biomembr.,30:357-375(1998)
【非特許文献４】Neuron 25；177-190(2000)
【非特許文献５】Science 245:1115-1118(1989)
【非特許文献６】FEBS Lett.291:253-258(1991)
【非特許文献７】Circ. Res. 72:1337-1344(1993)
【非特許文献８】Biol. Chem. 267:1792-1797(1992)
【非特許文献９】EMBO J.11:885-890(1992)
【非特許文献１０】J. Biol. Chem.276:47163-47170 (2001)
【非特許文献１１】J. Biol. Chem.268:3450-3455 (1993)
【非特許文献１２】J. Biol. Chem.268:12359-12366 (1993)
【非特許文献１３】Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97, 12334-12338 (2000)
【非特許文献１４】J. Biol. Chem.271:26465-26468 (1996)
【非特許文献１５】J. Biol. Chem. 274:33851-33854(1999)
【非特許文献１６】J. Biol. Chem.269:23668-23674 (1994)
【非特許文献１７】Receptor Channel6:375-386 (1999)
【非特許文献１８】J. Biol. Chem.276:36873-36876 (2001)
【非特許文献１９】FEBS Lett. 483:125-130(2000)
【非特許文献２０】The Squid GiantSynapse: a model for chemical transmission. Oxford University Press (1999)
【非特許文献２１】Neurosci. Res.46:105-117 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来知見から明らかなように、心筋型Cav1.2のリン酸化による電流の減少、β2aのパルミチン酸化による電流の増大やβ2aのリン酸化による電流の増大など、その制御は一方向性である。もし発現電流を増大、減少の双方向性に制御できれば、例えば、電位依存性カルシウムチャネルを発現している培養細胞系において、電位依存性カルシウムチャネルの発現電流を極小に制御し流入するカルシウムの毒性を最小にすることにより細胞を健康に培養することができるであろう。そして必要な時、電位依存性カルシウムチャネルの発現電流を極大に制御することにより、細胞内に流入するカルシウムなどの計測の感度を最大にすることが可能となる。本発明の課題は、電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットの発現する電流を増大、減少の双方向性に制御する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意研究の結果、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（LoCavβ1b）が、そのＮ末端に存在するタンパク質リン酸化酵素C（PKC）によりリン酸化されると考えられるセリン残基がリン酸化されることによりα１サブユニットにより発現する電流が減少すると共に不活性化が早まり、タンパク質リン酸化酵素CK2（CK2）によりリン酸化されると考えられるセリン残基がリン酸化されることによりα１サブユニットにより発現する電流が増大するという、βサブユニットによるα１サブユニットの発現する電流の減少、増大の双方向性に制御する機構が存在する可能性を発見した。アミノ酸配列の相同性比較から哺乳類のβサブユニット（例えばラットβ1bやヒトβ1b）にも同様のリン酸化部位が保存されていることが明らかとなり、この機構を利用すれば、電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットの発現する電流を増大、減少の双方向性に制御することが可能であると確信し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）、（２）に関するものである。
（１）  電位依存性カルシウムチャネルの発現電流量を制御する方法であって、タンパク質リン酸化酵素ＰＫＣ及び／又はタンパク質リン酸化酵素ＣＫ２の各酵素活性を活性化する薬剤あるいは阻害する薬剤を用いて電依存性カルシウムチャンネルβサブユニットのリン酸化を制御することにより、電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットの発現電流量を制御することを特徴とする上記方法。
（２）上記タンパク質リン酸化酵素ＰＫＣ及び／又はタンパク質リン酸化酵素ＣＫ２に対する活性化剤又は阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、電位依存性カルシウムチャネルの発現電流量を制御するための薬剤
【発明の効果】
【００１１】
従来、電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットの発現する電流を制御する方法は、電流の増大または電流の減少の一方向性にしか制御できなかった。
【００１２】
それに対して、本発明は、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（LoCavβ1b）のＮ末端に存在するPKCおよびCK2によりリン酸化されるアミノ酸残基をリン酸化することにより、発現する電流を増大、減少の双方向性に制御することを可能にするものであり、しかも、後記する実施例の示すように、PKCおよびCK2の活性化剤あるいは阻害剤を用いて簡便に行うことができるとともに、これら薬剤量をコントロールすることにより、発現電流量を自在に制御可能なものであり、また、リン酸化を可逆的に制御することによっても可能となる。したがって、本発明により、例えば、電位依存性カルシウムチャネルを発現している培養細胞系において、電位依存性カルシウムチャネルの発現電流を極小に制御し流入するカルシウムの毒性を最小にすることにより細胞を健康に培養することができ、そして必要な時、電位依存性カルシウムチャネルの発現電流を極大に制御することにより、細胞内に流入するカルシウムなどの計測の感度を最大にすることが可能となるであろう。同様にして、株化が困難と言われる電位依存性カルシウムチャネルを導入した培養細胞を健康な状態で培養しクローン化することにより、株化細胞として培養できるようになり、一過性に電位依存性カルシウムチャネルを発現させた培養細胞を用いるより効率良く、作業を行えるようになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明において使用するヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβ1bサブユニット（LoCavβ1b）は、前記したようにヤリイカの視神経節からクローニングされたポリペプチドであり、その製法の概略および詳細は、Neurosci. Res.
46:105-117 (2003)により記載されている。このポリペプチドのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を配列番号、１、２に示す。
【００１４】
本発明において、そのアミノ酸配列の相同性比較からラットβ1bおよびヒトβ1bも使用可能である。これらのポリペプチドの製法の概略および詳細は、ラットβ1bについてはFEBS Lett. 291:253-258(1991)、ヒトβ1bについてはJ. Biol. Chem.
267:22967-22972 (1992)に記載されている。これらのポリペプチドのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を配列番号３，４、５、６に示す。
【００１５】
本発明において、そのＮ末端に同様のリン酸化部位が一部でも保存されているβサブユニットが利用できる。例えば、PKCによってリン酸化される部位が保存されているラットβ4、ヒトβ4サブユニット、クラゲβサブユニット（CyCavβ）、イエバエβサブユニット（βM）などであり、またCK2によってリン酸化される部位が保存されているウサギβ2b、ラットβ2c、ヒトβ2cなどである。これらのポリペプチドの製法の概略および詳細は、ラットβ4はJ. Biol. Chem. 268:12359-12366 (1993)、ヒトβ4はHum. Genet. 100:151-154
(1997)、 Genomics 50:14-22 (1998)、CyCavβはReceptor Channel
6:375-386 (1999)、βMはJ. Biol. Chem. 269:23668-23674 (1994)、ウサギβ2bはEMBO J.
11:885-890(1992)、ラットβ2cおよびヒトβ2cは、J. Biol. Chem.
276:47163-47170 (2001)に記載されている。これらのポリペプチドのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を配列番号７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０に示す。
【００１６】
本発明においては、これらのβサブユニット以外でもＮ末端のPKCおよびCK2によるリン酸化部位が保存されているβサブユニットを含む。
【００１７】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットに存在するPKCによりリン酸化されると考えられる第２４番目のセリン残基とCK2によりリン酸化されると考えられる第３７番目のセリン残基に点変異を導入し発現電流を測定したところ、第２４番目のセリン残基への点変異導入により発現電流が増大し、第３７番目のセリン残基に点変異を導入すると発現電流が減少することが知られている（Neurosci. Res.
46:105-117 (2003)）。
【００１８】
本発明は、上記した内容から、LoCavβ1bのＮ末端の第２４番目のPKCによってリン酸化されると考えられる部位がリン酸化されることにより電流発現が減少し、第３７番目のCK2によってリン酸化されると考えられる部位がリン酸化されることにより電流発現が増大すると考えられることに起因する。
【００１９】
ウサギ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットのCav2.3とウサギ電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットと共にLoCavβ1bをアフリカツメガエル卵母細胞中で発現させ、PKC活性化剤であるOAG（1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol）で処理したところ発現電流が減少した。また、CK2の阻害剤であるDRB（5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole）で処理したところ発現電流が減少した。
【００２０】
このことから、LoCavβ1bのＮ末端の第２４番目のPKCによってリン酸化されると考えられる部位がリン酸化されることにより電流発現が減少し、第３７番目のCK2によってリン酸化されると考えられる部位がリン酸化されることにより電流発現が増大するという考えが支持された。
【実施例】
【００２１】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に特に限定されるものではない。また、特に記載の無い限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、"Molecular
Cloning 2nd ed."（Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T. 著 Cold Spring
Harvor Laboratory Press 1989年発刊）に記載の方法に従った。
【００２２】
［アフリカツメガエル卵母細胞発現系の構築］
ウサギ電位依存性カルシウムチャネルα１サブユニットCav2.3（京都大学森教授より供与されるウサギ電位依存性カルシウムチャネルcDNAを含むプラスミドベクターpSPCBII-2（Receptor
Channel 2:303-314(1994) を使用）とヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（LoCavβ1b、DDBJ accession
No. AB069677）及びウサギ骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニット（東京医科歯科大学田邊教授より供与されるウサギ骨格筋電位依存性カルシウムチャネルcDNAを含むプラスミドベクターpSPCA1（Nature 340,
230-233 (1989)）を使用）を使用した。LoCavβ1bのcDNAの非翻訳領域は削除され翻訳開始領域に共通する配列（CCACCATG: Nucleic
Acid Res. 12:857-872 (1984)）に置き換えられた。
（１）LoCavβ1bの5’および 3’の非翻訳領域を削除するために次のプライマーを用いた。上流プライマーとして5’-GGTACCACCATGGCGCGACCCTCATCT-3’を用いた。太文字は翻訳開始部位、イタリック文字は導入した翻訳開始領域に共通する配列、２重下線はプラスミドに組み込むために導入したKpn
Iサイトである。下流プライマーとして5’-CTCGAGTTAAATATCTATACTGCC-3’を用いた。太文字は転写終了部位、２重下線はプラスミドに組み込むために導入したXho
Iサイトである。これらプライマーを用いLoCavβ1bのcDNAをテンプレートとしてPCRを行った。
（２）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットLoCavβ1bの第２４番目のPKCによりリン酸化されると考えられるコンセンサス部位のセリン残基をグリシン残基に、第３７番目のCK2によりリン酸化されると考えられるコンセンサス部位のセリン残基をグリシン残基にする点変異を導入した。詳細な方法はNeurosci.
Res. 46:105-117(2003)に記載されている。第２４番目に変異を入れたLoCavβ1bをLoCavβ1b-S24G、第３７番目に変異を入れたLoCavβ1bをLoCavβ1b-S37Gとする。
（１）の工程で得られたＰＣＲ産物をKpn
IとXho
Iで消化し、pSD64TRベクター(pSP64T
(Nucleic Acids Res. 12: 7057 (1984))にマルチクローニングサイトとカエルβグロビン遺伝子の5'及び3'非翻訳領域を加え、アフリカツメガエル卵母細胞での発現効率が上がるように改変されたベクター。T.
Snutch博士より供給される。図１)のKpn IサイトとXho IサイトにLigation High（東洋紡社）を用いて接続し、5’および3’非翻訳領域を削除したLoCavβ1bを組み込んだベクター、pSD64TR-LoCavβ1b（図２）得た。形質転換した大腸菌XL1Blue(Stratagene社)よりプラスミドを調製した(Wizard,
Promega社)。LoCavβ1bを含むプラスミドは、Xba
Iにより消化し線状化した。ウサギ神経系電位依存性カルシウムチャネルCav2.3サブユニットを含むプラスミドは、XbaIにより切断し線状化した。ウサギ骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを含むプラスミドは、Sal
Iにより切断し線状化した。これら線状化したプラスミドをテンプレートとし、キャップアナログ（アンビオン社）を添加した反応液を用い、SP6
RNAポリメラーゼ（MEGA
Script SP6 Kit; アンビオン社）によりキャップ構造を持つcRNAを合成し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入するサンプルとした。
【００２３】
アフリカツメガエルは業者より購入した。成熟したメスのアフリカツメガエルをTricaine
(0.5 g/l)を用いて麻酔し、腹腔より外科的にステージＶ−ＶＩの卵母細胞を採取した。採取した卵母細胞を、1
mg/ml のコラゲネース(S-1型、新田ゼラチン社)を含むMBS(-Ca2+)液中で３０分間処理し、濾胞細胞を除去した。濾胞細胞を除去した卵母細胞をMBS(-Ca2+)で１０分間６回洗浄し、コラゲネースを完全に洗い流した。翌日、ガラス針を用いて卵母細胞にｃRNAを注入した。注入したcRNAの濃度は、Cav2.3:
100ng/μl, α2/δ: 100ng/μl, LoCavβ1b:
33ng/μlである。cRNAを注入した卵母細胞はMBS(+Ca2+)液中で１日から４日間培養した。
【００２４】
［発現電流の測定］
（１）発現した電流は、２本電極電位固定法にて測定した。電極はガラス電極を引き伸ばして作製し、電極内部を3M KClで満たした。電極抵抗が0.4-2MΩである電極を使用した。テストプロトコールはソフトウェアpClamp8
(Axon Instruments社)を用いて作製した。発現した電流はOC-725C増幅器(Warner
Instruments社)を用いて増幅し、DIGIDATA
1321 A/D変換機(Axon
Instruments社)によりデジタル化しコンピュータに取り込んだ。卵母細胞は-80
mVに膜電位固定された。リーク電流はP/4
protocolによりオンラインで差し引いた。通常は、40
mM Ba(OH)2, 50 mM NaOH, 1 mM KOH, 0.5 mM Niflumic acid, 0.1 mM EDTA,
5 mM HEPES, pH をmethanesulfonic acidで7.4に合わせてある溶液を測定溶液として用いた。カルシウムによって活性化されるクロライド電流の混入を最小化するため、卵母細胞は電流測定前に、100
μMのBAPTA-AM
(同仁堂社)を含むMBS(+)中で、少なくとも２時間インキュベーションした。また、薬剤で処理する場合、BAPTA-AMで処理すると同時にOAGまたはDRBをMBS(+)中に加え、２時間インキュベーションした。
（２）ウサギ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット、ウサギ骨格筋α2/δサブユニットおよびヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットLoCavβ1bの組み合わせた場合に発現する電流に対し、薬剤で処理しない場合とOAGまたはDRBで処理した場合の電流発現量を測定した。全てのデータは一匹のカエルから採取した卵母細胞を使用して測定したもので、cRNA注入後２日目に電流を測定した。測定においては膜電位を-80mVに固定し100msecの+20mVへのパルスを与えて刺激した。結果を図＊に示す。なお、データは平均±SEMで示している。
これによれば、PKCによるリン酸化を促進するOAG（10μM）で処理すると電流が減少していることがわかる。また、CK2によるリン酸化を阻害するDRB（25μM）で処理すると電流が減少することがわかる（図３、例数＝１１〜１２）。
（３）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットLoCavβ1bの第２４番目のPKCによりリン酸化されると考えられるセリン残基をグリシン残基にしたLoCavβ1b-S24Gは電流が増大するが、CK2の阻害剤であるDRBで処理すると増大した電流が減少することがわかる。またLoCavβ1b-S24GをOAGで処理しても増大した電流量は不変である。第３７番目のCK2によりリン酸化されると考えられるセリン残基をグリシン残基にしたLoCavβ1b-S37Gは電流が減少するが、OAGやDRBで処理しても減少した電流は不変である（図４、例数＝６）。
（４）以上のことから、LoCavβ1bの第２４番目のセリン残基はPKCによりリン酸化され発現電流を減少させ、第３７番目のセリン残基はCK2によりリン酸化され発現電流を増大させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】プラスミドベクターpSD64TRの構造を示す図である。
【図２】LoCavβ1bを組み込んだプラスミドベクターpSD64TR-LoCavβ1bの構造を示す図である。
【図３】Cav2.3およびα2/δよびLoCavβ1bを組み合わせて発現した電流とその電流に薬剤を作用させた時の影響を示す図である。
【図４】Cav2.3およびα2/βおよびLoCavβ1b-S24GまたはLoCavβ1b-S37Gを組み合わせて発現した電流に薬剤を作用させた時の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005117969.tif 000004
【図４】
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【配列表】
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