(57)【要約】【課題】  酵母由来の優れた発癌予防剤を提供する。【解決手段】  ハンセヌラ・アノマラの酵母細胞壁の多糖類または酵素処理して水溶性化した多糖類を用いる発癌予防剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハンセヌラ・アノマラの酵母細胞壁に含まれる多糖類を用いる発癌予防剤。
【請求項２】
ハンセヌラ・アノマラの酵母細胞壁を酵素処理して得られた水溶性多糖類を用いる発癌予防剤。
【請求項３】
請求項１および請求項２の酵母がハンセヌラ・アノマラＳＢ１０２０［ＰＥＲＭＰ−１８０７５］である請求項１および請求項２記載の発癌予防剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、酵母細胞壁に含まれる多糖類を酵素処理によって水溶性化して用いる発癌予防剤に関し、さらに詳しくはハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）ＳＢ１０２０［ＰＥＲＭＰ−１８０７５］（以下、ＳＢ１０２０と略す。）を用いる発癌予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  日本人の死亡原因の第一位は癌であり、癌予防は健康上極めて重要な課題である。このため多くの発癌予防効果を持つ物質の検索が行われている。発癌予防効果を持つ物質として例えば、カテキン、カロテノイド、フラボノイドなどの抗酸化活性物質やグリチルレチン酸などの配糖体、キノコや海藻の多糖類などが知られている（Ｈ．Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｔｏｋｙｏ，１９９７）。また、サッカロマイセス（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属やカンジダ（ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母多糖類を用いる方法（特許公報昭４７−１５７１２）などがある。しかし、これだけでは必ずしも有効な効果をあげているとは云い難い。
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明は、酵母細胞壁に含まれる多糖類を酵素処理により水溶性化した多糖類を用いる優れた発癌予防剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  発明者らは、酵母細胞壁に含まれる多糖類について発癌予防効果をエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）・ゲノム活性化抑制試験法を指標として、系統的な研究、実験を重ねた結果、ＳＢ１０２０の細胞壁に含まれる多糖類を酵素処理により水溶性化した多糖類が優れた発癌予防効果を示すという刮目すべき知見を得て本発明を完成した。
【０００５】  一般に発癌は、正常細胞を潜在的腫瘍細胞に変化させるイニシエーション過程とその細胞をさらに腫瘍細胞に変化させるプロモーション過程の２段階を経て起こると考えられている。イニシエーションは、放射線、紫外線、化学物質などによるＤＮＡの障害などによって起こる。イニシエーションのかかった細胞はすべて癌化するわけではなく、次のプロモーション過程を経て癌化していく。プロモーション過程は、イニシエーション過程で傷ついた細胞を活性酸素や種々のストレス、有害な化学物質などに長期間に渡り曝されることにより生じる。このプロモーション過程は可逆的であり、抗酸化物質や免疫機構により抑制されることが知られている（Ｈ．Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｔｏｋｙｏ，１９９７）。よって発癌予防には、このプロモーション過程の活性化を抑制する事が重要と考えられている。
【０００６】  発がんプロモーション抑制活性を持つ物質のスクリーニング方法として、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ウイルス（ＥＢＶ）活性化抑制試験が広く用いられている。本方法は、培養細胞系において、ＥＢＶのゲノムを内蔵するバーキットリンパ腫患者由来のＥＢＶ非生産培養細胞であるラジ細胞（ヒトＢリンパ球）にｎ−酪酸存在下、発がんプロモーターである１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）と披検物質を加えて４８時間培養し、細胞表面に誘発される初期抗原を間接抗体法で検出することにより、披検物質によるＥＢＶ活性化抑制効果を指標として用いる方法である（秋久俊博、徳田春邦、オレオサイエンス、２、３４７−３４５（２００２））。本方法は迅速かつ定量性があり、加えて微量で活性物質の検出が可能である。さらに、この方法で活性が認められた物質の多くは、動物を用いた発癌試験においても発癌プロモーションを抑制することが明らかにされている。このため、ＥＢＶゲノム活性化抑制作用を指標として、有用な発癌抑制剤の研究開発が行われている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  ＳＢ１０２０を自己消化して得られた水不溶性の細胞壁画分を、グルカナーゼを含む酵素剤によって処理をして水溶性多糖類を調整した。この水溶性多糖類の発癌予防効果をＥＢＶゲノム活性化抑制作用を指標に検討したところ、従来知られていたサッカロマイセス属やカンジダ属より得られた多糖類（特許公報昭４７−１５７１２）を上回る発癌抑制効果を示した。
【０００８】  以下、本発明の技術的構成及び実施形態について詳しく説明する。まず、本発明の酵母からの細胞壁多糖類の抽出方法、水溶性化方法ならびに分離方法について説明する。
【０００９】  ＳＢ１０２０を例えばＯｔａｋａら（Ｋ．Ｏｔａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．２，６４−７４（２００２））記載の方法で培養し、培養液を遠心分離して菌体を集め生理食塩水で洗浄した。その後、菌体を４５℃で４８時間自己消化させ、遠心分離によって得られた水不溶性区分にグルカナーゼを含む酵素（ＸＰ−４１５、ナガセケムテックス）を添加して３５℃で４時間反応させた。反応物を遠心分離して得られた水溶性区分をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画して得た高分子画分を凍結乾燥して多糖類を得た。
【００１０】  この多糖類は、大塚電子ダイナミック光散乱光度計ＤＬＳ−７０００による測定より、重量平均分子量は約１２０万であることが明らかになった。また、構成糖は主にグルコースとマンノースであり、その構成糖比はグルコース：マンノース（１３：２８）であった。さらに１３Ｃ−ＮＭＲからα−１，３，α−１，６，β−１，３およびβ−１，６結合を含んだ多糖類であることが判明した。
【００１１】  本発明に用いたＳＢ１０２０は、本発明者らが土壌から分離した酵母である（特開２００２−１２５６００）。本発明に用いた酵母の培養は、特開２００２−１２５６００やＯｔａｋａら（Ｋ．Ｏｔａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．２，６４−７４（２００２））に記載されている方法を用いることができるが、他に通常市販されている培地でも培養することができる。
【実施例】
【００１２】  次に、本発明を実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００１３】ＳＢ１０２０の培養
酵母を培養する培地は、通常市販されている培地、酵母が利用することのできる糖類や生育に必要な窒素源、ミネラル類、その他微量金属類、必要に応じて酵母エキスなどを配合した合成培地など、培地の種類は、酵母が生育できる培地であれば使用できる。本発明に例示される酵母菌体は、安価な糖源であるシトラスモラセスを炭素源（Ｂｒｉｘ１２）とし、塩化アンモニウム０．９％、第一リン酸カリウム０．１％、第二リン酸カリウム０．１％、および酵母エキス０．１％を添加した培地を用いて、通気攪拌培養（温度２８℃、通気量１ＶＶＭ）を行った。【００１４】水溶性多糖類の調整
前記に記載した培養方法で得られた酵母菌体を生理食塩水で洗浄した後、水懸濁液にして４５〜５０℃の水浴中に静置し、４８時間自己消化させた。その後、自己消化処理を行った酵母菌体濁液を８０℃以上の温度で加熱し、自己消化反応を停止させ、遠沈、洗浄して得られた水不溶性区分に、グルカナーゼを含む酵素剤（ＸＰ−４１５、ナガセケムテックス）を添加して３５℃で４時間反応させた。反応終了後、７０℃以上で加熱し、酵素反応を停止させ、遠沈、洗浄して得られた水溶性画分をＪＡＩＧＥＬＧＳ３２０（日本分析工業）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって、オリゴ糖および単糖を除く画分を分画した。この画分を凍結乾燥して多糖類を得た。【００１５】ＥＢＶ活性化抑制効果の測定
バーキットリンパ腫患者由来のＥＢＶ非産生培養細胞（ＥＢＶ潜在感染ヒトリンパ芽球様細胞）であるラジ細胞を指示細胞として用いた。培養液としてＲＰＭＩ１６４０に４％胎仔血清及び抗生物質（ペニシリン２００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン  ０．２５ｍｇ力価／ｍｌ）を含有したものを使用した。この条件下においては、ラジ細胞での自然誘発率（上記培養液のみでのＥＢＶの活性化率）は、０．１％以下であった。この基礎培地中にラジ細胞を１×１０６細胞／ｍｌの濃度に調整し、ｎ−酪酸（４ｍｍｏｌ／ｌ）とＴＰＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）のＤＭＳＯ溶液を加え、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で４８時間培養する。塗抹標本を作成し、ＥＢＶ早期抗原と特異的に結合する上咽頭癌患者血清により処理し、さらに蛍光抗体ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを加える間接蛍光抗体法にてＥＢＶ早期抗原を染色し、蛍光顕微鏡により、陽性細胞をカウントし、これを発現率１００とする（陽性コントロール）。基礎培地に、１００、１０、１μｇ／ｍｌの被験物質の水溶液をｎ−酪酸（４ｍｍｏｌ／ｌ）とＴＰＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに加え、同様に培養後ＥＢＶ早期抗原発現細胞数を陽性コントロールと比較し、相対的発現率として算出する。この際、同実験を二度繰り返し、毎回５００個以上の細胞について早期抗原の発現率を算出し、その平均値を陽性コントロールと比較する。なお、トリパンブルーを用いてラジ細胞を染色し、本試験におけるラジ細胞の生死を判別し、生存率として評価した。【００１６】ＥＢＶ活性化抑制効果の測定結果
ＳＢ１０２０（ＨＡ）およびカンジダ・ギリエルモンデイー（ＣＧ）とサッカロマイセス・セルビシエ（ＳＣ）を上記の方法で処理して得られた細胞壁由来の水溶性多糖類とデキストラン（ＤＸ）のＥＢＶ活性化抑制効果の測定結果を表１に示した。【００１７】
【表１】
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【００１８】  前記表１に示されるように、ＳＢ１０２０の細胞壁に由来する水溶性多糖類のＥＢＶ活性化抑制効果は１００μｇ／ｍｌで９１．１％、１０μｇ／ｍｌで４３．９％、１μｇ／ｍｌで３．９％であり、従来知られていたサッカロマイセス・セルビシエ（抑制効果１００μｇ／ｍｌで８８．１％、１０μｇ／ｍｌで３９．１％、１μｇ／ｍｌで０％）やカンジダ・ギリエルモンデイー（抑制効果１００μｇ／ｍｌで８９．８％、１０μｇ／ｍｌで３９．９％、１μｇ／ｍｌで０％）の細胞壁由来の水溶性多糖類の効果を上回っていた。特に１μｇ／ｍｌの低濃度では他の酵母の多糖類は抑制効果を示さないが、ＳＢ１０２０由来の多糖類だけは３．９％の抑制効果を示した。
【発明の効果】
【００１９】  本発明により、酵母由来の水溶性多糖類を用いる優れた発癌予防剤が提供される。