(57)【要約】【課題】  簡易かつ確実に取り違え防止可能な細胞を培養する。【解決手段】  容器内に貯留された所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有するマイクロキャリアとを投入して（ステップＳ１）、培養する（ステップＳ２）細胞の培養方法を提供する。  また、細胞培養前に、細胞提供者の識別情報と識別可能な形態を有するマイクロキャリアの形態とを相互に関連づけて記録しておき、細胞提供者から提供された細胞とマイクロキャリアとを容器内に貯留した所定の培養液内に投入して培養した後に、容器内のマイクロキャリアの形態を検査する細胞の取り違え防止方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内に貯留された所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有するマイクロキャリアとを投入して培養する細胞の培養方法。
【請求項２】
前記マイクロキャリアが一容器内に複数投入され、全てのマイクロキャリアが同一の識別可能な形態を有する請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記マイクロキャリアの識別可能な形態が、形状、色または大きさの少なくとも１つからなる請求項１または請求項２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記マイクロキャリアが、培養液より大きい比重を有する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
細胞培養前に、細胞提供者の識別情報と識別可能な形態を有するマイクロキャリアの形態とを相互に関連づけて記録しておき、
細胞提供者から提供された細胞とマイクロキャリアとを容器内に貯留した所定の培養液内に投入して培養した後に、容器内のマイクロキャリアの形態を検査する細胞の取り違え防止方法。
【請求項６】
容器内に貯留した所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有する生体適合性のあるマイクロキャリアとを投入して培養し、得られた細胞およびマイクロキャリアの混合物を生体組織補填材に付着させる生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
容器内に貯留した所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有する生体適合性のあるマイクロキャリアと、生体組織補填材とを投入して培養する生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養方法、細胞の取り違え防止方法および生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより、骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
このような培養骨は、一般に、患者から採取した骨髄細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させた後に、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて細胞を培養容器から剥離する。そして、これを骨補填材に付着させて骨形成培地内に留置して二次培養を行うことにより製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
このような培養骨に代表される生体組織補填体は、製造後には、当該生体組織補填体を構成する細胞の元となった骨髄細胞の提供者である患者に戻されることが必要である。
【０００６】
このため、特に複数の提供者から提供された骨髄細胞を同時に培養する場合には、生体組織補填体の製造にあたって、その工程中に細胞の取り違えが生じないようにする必要がある。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、一次培養工程においては、骨髄細胞が十分な数に増殖させられるまでの培養期間にわたって、一貫して同一の培養容器が使用されるわけではなく、骨髄細胞の成長に適した大きさの複数の培養容器に骨髄細胞が移し替えられる。したがって、容器と細胞との対応付けにより取り違えを防止することは煩雑であるという不都合がある。
【０００８】
また、生体組織補填体をより確実に細胞提供者に戻そうとするならば、生体組織補填体に付着している細胞と細胞提供者のＤＮＡ鑑定を行い、両者が一致するか否かを照合する方法が考えられる。しかしながら、ＤＮＡ鑑定により照合を行うには比較的長時間を要するので、手術が差し迫っている場合には困難となる。また、培養工程全体を長期化させることにもなり、不都合である。
【０００９】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、簡易かつ確実に取り違え防止可能な細胞を培養する細胞の培養方法、細胞の取り違え防止方法および生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
【００１１】
本発明は、容器内に貯留した所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有するマイクロキャリアとを投入して培養する細胞の培養方法を提供する。
【００１２】
この発明によれば、マイクロキャリアに細胞が付着した状態で、培養液内において培養される。培養工程中に、細胞を収容する容器を入れ替えたり、培養液を交換したりしても、マイクロキャリアが細胞とともに容器内に残るので、培養開始から終了までの全期間にわたって、マイクロキャリアと細胞とを1対１で対応付けることが可能となる。マイクロキャリアは識別可能な形態を有しているので、その形態を目視、吸光度測定、散乱光測定などの方法により簡易に識別することができる。したがって、培養開始時に細胞提供者とマイクロキャリアの形態とを対応付けておくだけで、培養終了後にマイクロキャリアの形態から細胞の提供者を簡易かつ迅速に識別可能に細胞を培養することが可能となる。
【００１３】
また、上記培養方法においては、前記マイクロキャリアが一容器内に複数投入され、全てのマイクロキャリアが同一の識別可能な形態を有することが好ましい。
【００１４】
この発明によれば、培養工程中に、容器の入れ替えや培養液交換等によってマイクロキャリアの一部が失われても、残りのマイクロキャリアにより、培養中あるいは培養終了後に細胞提供者を簡易に識別可能に細胞を培養することができる。
【００１５】
また、上記発明において、前記マイクロキャリアの識別可能な形態が、形状、色または大きさの少なくとも１つからなることとしてもよい。
【００１６】
この発明によれば、目視、吸光度測定、散乱光測定などの方法により、時間をかけずに簡易に細胞提供者を識別可能に、細胞を培養することができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記マイクロキャリアが、培養液より大きい比重を有することが好ましい。
【００１８】
この発明によれば、マイクロキャリアが培養液内において沈降するので、培養液交換の際に、デカンテーションによって、マイクロキャリアを排出することなく、上澄みの培養液のみを吸引あるいは排出することができる。したがって、培養終了時までマイクロキャリアを細胞と一緒に残すことができ、培養終了後の細胞提供者の識別を容易に行うことが可能となる。
【００１９】
また、本発明は、細胞培養前に、細胞提供者の識別情報と識別可能な形態を有するマイクロキャリアの形態とを相互に関連づけて記録しておき、細胞提供者から提供された細胞とマイクロキャリアとを容器内に貯留した所定の培養液内に投入して培養した後に、容器内のマイクロキャリアの形態を検査する細胞の取り違え防止方法を提供する。
【００２０】
この発明によれば、培養前の段階において、細胞提供者の識別情報とマイクロキャリアの形態とを対応付けておくので、マイクロキャリアの形態を検査するだけで細胞提供者を特定することが可能となる。マイクロキャリアは、培養中には常に細胞とともに存在しているので、培養終了後においても細胞を取り違えることなく、細胞提供者に戻すことができる。
【００２１】
また、本発明は、容器内に貯留した所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有する生体適合性のあるマイクロキャリアとを投入して培養し、得られた細胞およびマイクロキャリアの混合物を生体組織補填材に付着させる生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００２２】
この発明によれば、生体組織補填体に付着しているマイクロキャリアの形態を検査することにより細胞提供者を特定することが可能となる。マイクロキャリアが生体適合性を有する材質により構成されているので、そのまま細胞提供者に移植することが可能な生体組織補填体を製造することができる。
【００２３】
また、本発明は、容器内に貯留した所定の培養液内に、培養すべき細胞と、識別可能な形態を有する生体適合性のあるマイクロキャリアと、生体組織補填材とを投入して培養する生体組織補填体の製造方法を提供する。
【００２４】
この発明によれば、生体組織補填体に付着しているマイクロキャリアの形態を検査することにより細胞提供者を特定可能で、かつ、そのまま細胞提供者に移植することが可能な生体組織補填体を製造することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、細胞の培養中あるいは培養終了後に、簡易かつ迅速に細胞提供者を特定可能な細胞を培養し、培養された細胞またはその細胞を含む生体組織補填体が、細胞提供者とは異なる患者に戻されることをより確実に防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、本発明に係る細胞の培養方法、細胞の取り違え防止方法および生体組織補填体の製造方法の一実施形態について、図面を参照して説明する。
【００２７】
本実施形態に係る細胞の培養方法は、図１に示されるように、固有の識別可能な形態を有するマイクロキャリアを選択し、当該マイクロキャリアの形態と、細胞提供者の識別情報とを対応付けて記録しておき、培養容器内に所定の培養液を貯留するとともに、培養液内に、細胞提供者から提供された細胞とマイクロキャリアとを投入し（ステップＳ１）、所定の培養条件下に配することにより細胞を培養する（ステップＳ２）方法である。培養途中においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し、また、細胞の増殖度合に応じて、培養容器を移し替える作業を行う。
【００２８】
本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法は、図２および図３に示すように、細胞の培養開始前に、マイクロキャリアの形態と細胞提供者の識別情報とを対応付けてデータベース（図３参照）に記憶し（ステップＳ１１）、細胞の培養終了後に、細胞に付着しているマイクロキャリアの形態を検査し（ステップＳ１２）、抽出されたマイクロキャリアの形態をキーとして、記憶されているデータベース内を検索して細胞提供者を特定する（ステップＳ１３）方法である。
【００２９】
細胞提供者の識別情報は、例えば、細胞提供者の氏名、住所、電話番号、生年月日等の個人情報の他、固有の識別番号や顔の画像データでよい。
【００３０】
前記細胞は、例えば、細胞提供者から採取した骨髄細胞を遠心分離して得られた骨髄間葉系幹細胞である。
【００３１】
培養条件は、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％である。
【００３２】
使用する培養液は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
【００３３】
前記マイクロキャリアは、付着性細胞を付着・増殖させるための微小粒子であり、直径約１００〜３００μm、表面積約３０００〜６０００ｃｍ２／ｇの球状粒子である。材質は、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゼラチン、ポリスチレン等の生体適合性材料である。これらのマイクロキャリアの表面には、細胞が付着しやすいように荷電基が付与されていることが望ましい。また、マイクロキャリアの比重は、約１．０３〜１．０５であり、培養液より若干大きい。
【００３４】
本実施形態の培養方法に使用されるマイクロキャリアは、色素溶液中において作成されることにより、その色素を含有して着色されている。すなわち、マイクロキャリアは、色という固有の識別可能な形態を有している。この場合、マイクロキャリアの形態は、例えば、色素記号等により特定される。マイクロキャリアの色は、細胞提供者ごとに固有の色が選択される。色素としては、食用色素あるいは天然色素のような生体適合性のある色素が選択される。
【００３５】
細胞提供者の識別情報とマイクロキャリアの形態とは、例えば、細胞提供者の識別情報とマイクロキャリアの色素情報とを相互に対応付けたデータベースとして記録媒体内に記録される。これにより、マイクロキャリアの色素情報を調べることにより、細胞提供者を特定することができるようになっている。
【００３６】
本実施形態に係る培養方法によれば、培養液内の細胞が、培養液内にともに投入されているマイクロキャリアの表面に付着して成長する。マイクロキャリアは、培養液の比重より若干大きな比重を有しているため、自然浮遊性を備えており、少し攪拌しただけで浮遊状態になる。これにより、細胞は、浮遊性細胞と同様に、付着面が培養容器の底面に限られることなく大量に培養されることになる。
【００３７】
また、この場合において、マイクロキャリアは培養液より若干大きな比重を有しているため、静置されることにより沈降し上澄み部分を生ずることになる。したがって、所定の培養液交換周期ごとに、マイクロキャリアおよび細胞を培養容器内において沈降させ、上澄み部分を形成することにより、デカンテーションによって、上澄みの培養液のみを廃棄し、新たな培養液と交換できる。
【００３８】
すなわち、マイクロキャリアは、細胞とともに培養容器の下方に沈降しているので、培養液交換の際にも廃棄されることなく、細胞とともに培養容器内に残り続けることになる。したがって、培養中および培養終了後のどの時点においても、培養容器内からマイクロキャリアを採取しさえすれば、そのマイクロキャリアの形態情報をキーとしてデータベースを検索し、細胞提供者を容易に特定することが可能となる。
【００３９】
培養容器内から採取したマイクロキャリアの形態、例えば、本実施例におけるマイクロキャリアの色は、色の種類が少なく、明らかに異なる色を用いることができる場合には目視により、色の種類が多い場合は、吸光度測定や散乱光測定のような測定方法によって、正確にその色を特定することができる。したがって、多数の細胞提供者から提供された多種の細胞を同時に同一の培養室内において培養する場合には、識別可能に異なる色の色素を用いた複数種のマイクロキャリアを、それぞれ細胞提供者に１種類ずつ対応付けて使用することにより、細胞の取り違えをより確実に防止することができる。
【００４０】
このように本実施形態に係る細胞の培養方法によれば、培養中および培養終了後に、簡易かつ迅速に、細胞提供者を特定可能に、細胞を培養することができる。
【００４１】
また、本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法によれば、培養開始前に細胞提供者の識別情報と対応付けておいたマイクロキャリアの形態情報を用いて、培養中あるいは培養終了後に細胞提供者を特定できるので、簡易かつより確実に細胞の取り違えを防止することができる。
【００４２】
なお、上記実施形態においては、マイクロキャリアの識別可能な形態として色を例に挙げて説明した。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、マイクロキャリアの形状、大きさなどの他の形態を採用してもよい。すなわち、球状粒子を例に挙げて説明したが、例えば、円柱状、円筒状のような形状によりマイクロキャリアを識別することとしてもよいし、直径寸法の相違によりマイクロキャリアを識別することにしてもよい。また、これらを組み合わせて識別することにしてもよい。
【００４３】
また、上記実施形態においては、マイクロキャリアの材質として、生体適合性のある材料を採用した。したがって、培養された細胞はマイクロキャリアとともに細胞提供者の体内に移植することが可能である。そこで、このようにして培養された細胞をマイクロキャリアとともに、βリン酸三カルシウム多孔体からなる生体組織補填材に付着させることにより、生体組織補填体を製造してもよい。このようにして製造された生体組織補填材には、マイクロキャリアが含まれているので、移植前あるいは移植後においても、マイクロキャリアの形態を調べることにより、培養された細胞が元の細胞提供者のものか否かを容易に確認することができる。
【００４４】
この場合、細胞は培養したものを生体組織補填材に付着させてもよいが、マイクロキャリアとともに生体組織補填材に付着させた状態でさらに培養することにより、補填すべき生体組織、例えば、骨、皮膚等へと分化させることにしても、上記と同様、簡易かつ迅速に細胞提供者を特定可能な生体組織補填体を製造することができる。
【００４５】
なお、生体組織補填材としては、βリン酸三カルシウム多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン
酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。また、チタンのような金属であってもよい。また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を採用してよい。
【００４６】
また、マイクロキャリアをそのまま生体内へ移植することに代えて、移植直前に培養された細胞から分離することにしてもよい。マイクロキャリアと細胞との分離は、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いることにより行うことができる。
【００４７】
また、マイクロキャリアとしては、数１０〜数１００μｍの孔径を有する多孔性材料からなる多孔性マイクロキャリアを採用してもよい。これによれば、細胞が、マイクロキャリアの表面のみならず孔内においても３次元的に培養されるので、付着面積が大きく確保され、また、外部から物理的な衝撃が加わっても細胞が損傷することなく、健全に増殖される。
【００４８】
また、マイクロキャリアの表面に細胞を付着させることに代えて、カプセル状のマイクロキャリア（マイクロカプセル）を用意し、マイクロカプセル内面に細胞を付着させて培養する方法を採用してもよい。マイクロカプセルとしては、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、アガロースなどの材質からなるものを採用できる。
【００４９】
また、培養する細胞としては、付着性の細胞として、間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を培養することにしてもよい。また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞の培養方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る細胞の取り違え防止方法を示すフローチャートである。
【図３】図２の取り違え防止方法に使用されるデータベース例を示す図である。
【符号の説明】
【００５１】
Ｓ１  投入ステップ
Ｓ２  培養ステップ
Ｓ１１  記録ステップ
Ｓ１２  検査ステップ
Ｓ１３  検索ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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