(57)【要約】【課題】  より高い自由度をもって特定の触媒活性保有蛋白質上に異種性の特異結合領域を導入し、それにより当該触媒活性保有蛋白質の活性を特異的に変調するための一般的手法と、当該方法により得られる高度に特異的なセンサー蛋白質を提供することを目的とする。【解決手段】  円順列変異（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）により天然型の触媒活性保有蛋白質を遺伝子工学的に改変する。すなわち、遺伝子工学的手法を用いて天然型蛋白質のＮ／Ｃ末端をリンカーでつなぎ、次いで活性部位近傍に新たなＮ／Ｃ末端を導入した変異体を作製する。当該変異体の新たなＮ／Ｃ末端のいずれか或いは両方に、他の蛋白質の特異的結合領域を付加する。これにより、極めて容易に、そしてセンサー蛋白質の活性部位周辺の所望の場所に、様々な異種蛋白質由来の特異的結合領域を導入して、ハイブリッド蛋白質を作製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能な触媒活性を有する天然型蛋白質の本来のＮ末端とＣ末端をリンカーにより結合し、該蛋白質の触媒活性部位周辺に新たなＮ末端およびＣ末端を生成させ、および該新たなＮ末端および／またはＣ末端に対して異種性特異結合領域を結合させることにより製造される、センサー蛋白質。
【請求項２】
前記検出可能な触媒活性を有する天然型蛋白質が酵素である、請求項１に記載のセンサー蛋白質。
【請求項３】
前記酵素がアルカリフォスファターゼである、請求項２に記載のセンサー蛋白質。
【請求項４】
前記異種性特異結合領域が他の蛋白質のエピトープである、請求項１乃至３のいずれかに記載のセンサー蛋白質。
【請求項５】
前記他の蛋白質のエピトープがオステオカルシンのエピトープである、請求項４に記載のセンサー蛋白質。
【請求項６】
サンプル中の被検物質の存在を同定および／または定量する均一アッセイ方法であって、該アッセイ方法は；
（１）検出可能な触媒活性を有する天然型蛋白質の本来のＮ末端とＣ末端をリンカーにより結合し、該蛋白質の触媒活性部位周辺に新たなＮ末端およびＣ末端を生成させ、および該新たなＮ末端および／またはＣ末端に対して被検物質由来の異種性特異結合領域を結合させることにより製造されるセンサー蛋白質を用い、
（２）被検物質を含むと推定されるサンプルを、前記異種性特異結合領域に対する少なくとも１以上の特異的結合パートナーの存在下で、前記センサー蛋白質と接触させ、および
（３）前記接触によるセンサー蛋白質の触媒活性の変調を測定すること、
を含む、前記均一アッセイ方法。
【請求項７】
前記均一アッセイが競合アッセイである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能な触媒活性を有する天然型蛋白質が酵素である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素がアルカリフォスファターゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種性特異結合領域が他の蛋白質のエピトープであり、前記特異的結合パートナーが該エピトープに対する抗体である、請求項６乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記他の蛋白質のエピトープがオステオカルシンのエピトープである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のセンサー蛋白質および該蛋白質上の異種性特異結合領域に特異的な結合パートナーを含む、均一アッセイのためのキット。
【請求項１３】
前記異種性特異結合領域が他の蛋白質のエピトープであり、前記特異的結合パートナーが該エピトープに対する抗体である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
（１）配列番号：９で表されるアミノ酸配列からなるか、または
（２）配列番号：９に対して１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列からなり且つアルカリフォスファターゼ活性を有する、
大腸菌アルカリフォスファターゼの円順列変異体蛋白質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
配列番号：８で示される請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
（１）配列番号：１１で表されるアミノ酸配列からなるか、または
（２）配列番号：１１に対して１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列からなり且つアルカリフォスファターゼ活性を有する、
大腸菌アルカリフォスファターゼ円順列変異体とオステオカルシンエピトープの融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項１７に記載の蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項１９】
配列番号：１０で示される請求項１８に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の特異性が付与されたセンサー蛋白質に関する。また、本発明は、当該センサー蛋白質の均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイへの使用に関する。更に、本発明は、当該センサー蛋白質を含む均一アッセイのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素に代表される特定の触媒活性を有する蛋白質、特に、容易に検出可能な生成物を生産する蛋白質は、バイオテクノロジーを利用した測定分野で多用されてきている。そのような測定の代表的な例として、いわゆる「均一イムノアッセイ」も広く用いられており、当該均一イムノアッセイでは、抗体の有する高い特異性と、酵素の示す高い検出感度に基づいて、極めて正確且つ鋭敏な検査が実現される。すなわち、均一イムノアッセイにおいては、酵素の活性が、特定の抗体との反応によって変調するように修飾される。例えば、ある酵素上に他の物質のハプテンが化学的に結合され、当該ハプテンに対する抗体と当該酵素上のハプテンの結合により、該酵素の活性が変調する。当該活性変調を通じて、サンプル中の被検物質の存在が、競合イムノアッセイのプロトコールに基づいて好適に同定または定量される。
【０００３】
上記のような酵素の例としては、アルカリフォスファターゼや西洋わさびペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）等が知られている。特に、アルカリフォスファターゼは、特異性の低いホスホモノエステラーゼであり、上記の均一イムノアッセイの他にも、臨床検査において肝胆道および骨疾患のマーカーとして、或いは免疫測定の酵素ラベルとして頻用されている。当該アルカリフォスファターゼの代表的な例である大腸菌酵素ＰｈｏＡは、熱やプロテアーゼに強い二量体酵素で，既往の研究でそのループ部分にエピトープペプチドを挿入しても安定かつ活性を保つことが知られている。活性部位近傍に存在するこのようなループ部分に他分子（例えば、抗体）と相互作用するエピトープを挿入することにより、該相互作用分子の存在下で活性部位が立体的にブロック、或いは変化して、酵素活性を制御する系が作製できることがわかっている。
【０００４】
具体的に、非特許文献１では、当該ＰｈｏＡのアミノ酸残基４０７と４０８との間に、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０蛋白質のエピトープ（１３アミノ酸残基）を挿入することで、当該挿入蛋白質が抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体に反応性になったこと、および当該抗体との結合により、該酵素の活性が変調されたことが記載されている。すなわち、前記のようなｇｐ１２０エピトープの挿入を有するＰｈｏＡ酵素は、抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体の不存在下では野生型と同等のフォスファターゼ活性を維持しているが、前記抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体と結合すると、その活性が４０乃至５０％も低下することが判った。そして、このような活性の変調は、前記モノクローナル抗体の結合による、改変ＰｈｏＡ酵素の活性部位に対する立体障害に基づく酵素基質の接近妨害、或いは当該抗体の結合による酵素自体の立体構造の揺らぎに基づく触媒の速度定数変化に起因するものと推測され、特に後者が極めて優勢であろうとされている。
【０００５】
とりわけ、当該文献に記載された他の２つの挿入体においては、ＰｈｏＡのアミノ酸残基９１と９３の間に、前記ｇｐ１２０のエピトープ（１３または１５アミノ酸残基）が置換的に挿入されているが、当該挿入体では、天然型の酵素活性と同程度の活性を示したものの、アミノ酸４０７と４０８の間への挿入とは異なり、抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体の結合によっても活性が変調しなかったとされている。ＰｈｏＡのアミノ酸残基９１−９３への置換的挿入は、アミノ酸残基４０７−４０８間への挿入同様、立体構造的には、当該酵素の活性部位周辺にｇｐ１２０エピトープを位置させるものであり、このように活性部位周辺で立体障害をもたらすエピトープ挿入によっても抗体の結合により活性変化しないことがあること、更には、前記アミノ酸残基４０７−４０８間への挿入の変わりに、挿入部位をＣ末端側に１または２残基動かすなどするだけで、その活性の変調が観察されなくなることから、非特許文献１の著者は、当該活性変調の主要な原因は、立体障害に基づくというよりは、むしろ酵素の立体構造変化に起因するであろうと結論している。
【非特許文献１】Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｂｒｅｎｎａｎ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．７、Ｎｏ．４、ｐｐ．５０９−５１４（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、より高い自由度をもって特定の触媒活性保有蛋白質上に異種性の特異結合領域を導入し、それにより当該触媒活性保有蛋白質の活性を特異的に変調するための一般的手法と、当該方法により得られる高度に特異的なセンサー蛋白質を提供することを目的とする。当該変調においては、特異結合領域−パートナー結合存依存的な触媒活性自体の変化のみならず、特異結合領域−パートナーの結合による触媒活性部位への基質接近に対する立体障害効果も好適に付与され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のセンサー蛋白質製造における一般的手法では、まず、円順列変異（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）により天然型の触媒活性保有蛋白質を遺伝子工学的に改変する。すなわち、遺伝子工学的手法を用いて天然型蛋白質のＮ／Ｃ末端をリンカーでつなぎ、次いで活性部位近傍に新たなＮ／Ｃ末端を導入した変異体を作製する。当該変異体の新たなＮ／Ｃ末端のいずれか或いは両方に、他の蛋白質の特異的結合領域を付加する。これにより、極めて容易に、そしてセンサー蛋白質の活性部位周辺の所望の場所に、様々な異種蛋白質由来の特異的結合領域を導入して、ハイブリッド蛋白質を作製する。
【０００８】
このようにして得られたセンサー蛋白質の触媒活性は、そこに導入された異種蛋白質由来の特異的結合領域と、当該領域に対する特異的結合パートナーとの相互作用に基づき、変調される。そして、当該変調に基づき、極めて特異的且つ高感度の生化学的なアッセイが達成される。
【０００９】
すなわち、本発明の第１の局面では、検出可能な触媒活性を有する天然型蛋白質の本来のＮ末端とＣ末端をリンカーにより結合し、該蛋白質の触媒活性部位周辺に新たなＮ末端およびＣ末端を生成させ、および該新たなＮ末端および／またはＣ末端に対して異種性特異結合領域を結合させることにより製造される、センサー蛋白質が提供される。検出可能な触媒活性を有する蛋白質は、酵素であることが好ましく、特にアルカリフォスファターゼが好適である。また、例えば、前記異種性特異結合領域が他の蛋白質のエピトープである場合、前記センサー蛋白質は、当該エピトープに対する抗体を用いた均一競合イムノアッセイプロトコールに好適に応用することができる。
【００１０】
従って、本発明の別の局面では、サンプル中の被検物質の存在を同定および／または定量する均一アッセイ方法であって、該アッセイ方法は；
（１）検出可能な触媒活性を有する天然型蛋白質の本来のＮ末端とＣ末端をリンカーにより結合し、該蛋白質の触媒活性部位周辺に新たなＮ末端およびＣ末端を生成させ、および該新たなＮ末端および／またはＣ末端に対して被検物質由来の異種性特異結合領域を結合させることにより製造されるセンサー蛋白質を用い、
（２）被検物質を含むと推定されるサンプルを、前記異種性特異結合領域に対する少なくとも１以上の特異的結合パートナーの存在下で、前記センサー蛋白質と接触させ、および
（３）前記接触によるセンサー蛋白質の触媒活性の変調を測定すること、
を含む、前記均一アッセイ方法、が提供される。
【００１１】
特異的結合パートナーは、抗体や受容体を含み得る。すなわち、センサー蛋白質上の異種性特異結合領域が、異種蛋白質のエピトープである場合には、当該パートナーは、そのエピトープに対する抗体であり、当該異種性特異結合領域が、ペプチドホルモンなどの場合には、該パートナーが当該ホルモンの受容体であってよい。
【００１２】
また、本発明は、前記アッセイに有用な、本発明のセンサー蛋白質と、特異的結合パートナーを含むキットも提供する。
【００１３】
最後に、本発明は、本発明のセンサー蛋白質を製造する上で重要な円順列変異体蛋白質の好適な例として、新規蛋白質である、大腸菌アルカリフォスファターゼの円順列変異体を提供し、更に本発明のセンサー蛋白質の例として、当該円順列変異体とオステオカルシンエピトープの融合蛋白質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
用語
本明細書において、「検出可能な触媒活性」は、特定の蛋白質、好ましくは酵素の示す任意の触媒活性を指す。すなわち、当該触媒活性は、蛋白質が特定の基質を化学的或いは物理的に変換し、該基質とは異なった構造或いは物理化学的性状を有する生成物を生じる活性を指す。従って、当該活性は、基質の化学構造の変化のほか、そのコンフォメーションやトポロジーを変換するものであり得る。当該触媒活性により生成物に対して付与される当該化学構造、コンフォメーションおよび／またはトポロジーの変化は、当該生成物の示す様々な物理化学的性状に基づいて、直接または間接的なシグナルとして検出され得る。さらに、特定の蛋白質においては、該触媒活性の発揮のために補酵素を要求することがある。当該補酵素の変化もまた、基質同様、検出可能な変化であり得、本発明のセンサー蛋白質においては当該補酵素の変化を検出可能なシグナルとしてもよい。
【００１５】
本発明の好ましい「検出可能な触媒活性」を有する蛋白質は、容易且つ直接的に検出可能なシグナルを発生する生成物を与えるものである。当該蛋白質の非限定的な例として、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の、一般的酵素化学的検出に多用される酵素を挙げることができる。アルカリフォスファターゼは、ｐ−ニトロフェニル燐酸塩等をｐ−ニトロフェノールに変換する酵素であり、生成したｐ−ニトロフェノールの特徴的な発色に基づいて、当該酵素の活性が容易に検出される。さらに、当該酵素は、比較的高い安定性を有することから、本発明の蛋白質として特に有用である。
【００１６】
本明細書において用いられる、用語「天然型蛋白質」は、円順列変異を導入した蛋白質との対比においてのみ用いられることに特に留意するべきである。すなわち、本発明の「天然型蛋白質」との用語は、天然界に存在する「もとの」成熟蛋白質と実質的に同一なＮおよびＣ末端（本来のＮおよびＣ末端）を有する蛋白質を、円順列変異により作製した新たなＮおよびＣ末端を有する蛋白質から区別する目的においてのみ用いられる。従って、天然界に存在する「もとの」蛋白質と実質的に同一のＮおよびＣ末端を有する限り、その蛋白質の他の部位に対しての挿入、欠失、置換、或いは重複を有するような変異蛋白質も、本発明の「天然型蛋白質」に含まれる。たとえば、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼ（ＰｈｏＡ）においては、その活性部位近傍にある１０１番目のアスパラギン酸残基をセリン残基に置換することで、高活性変異体（Ｄ１０１Ｓ）が得られることが知られているが、そのような高活性変異体も、本発明に言う「天然型蛋白質」に含まれる。ただし、そのような変異が、もとの蛋白質の触媒活性を不可逆的に損失するような変異体が、本発明の天然型蛋白質に含まれ得ないことは言うまでもない。
【００１７】
本発明においては、まず、上記天然型蛋白質の「本来の」Ｎ末端およびＣ末端を遺伝子工学的手法で結合させる。当該結合には、適切な「リンカー」を用いる。該リンカーは、好ましくはペプチドであり、そのペプチドの長さは、天然型蛋白質の本来のＮ／Ｃ末端間の距離とほぼ等しいことが特に好ましい。また、当該ペプチドのアミノ酸配列は、天然型蛋白質の本来のコンフォメーションをできるだけ変化させないように選択されるべきである。すなわち、本発明のリンカーは、天然型蛋白質の本来のＮ／Ｃ末端を単に架橋する以外の作用を有さないように設計されるべきである。そのような設計は、公知の蛋白質の立体構造化学に基づいて容易に計算することができる。例えば、大腸菌ＰｈｏＡでは、当該立体構造に基づき、アミノＮ末端アミノ酸１とＣ末端アミノ酸４４９を結合するリンカーを（Ｇ４Ｓ）３と設計することができる。
【００１８】
次いで、本発明においては、円順列変異戦略に基づいて、前記のように本来のＮ／Ｃ末端をリンカーで架橋した天然型蛋白質の触媒活性部位周辺に、新たなＮ／Ｃ末端を導入する。ここで用いる「触媒活性部位」とは、天然型蛋白質がその基質および、必要とされる場合には、補酵素、エファクター分子を認識し、およびそれらに対して作用するアミノ酸残基を含む活性領域である。また、「触媒活性部位周辺」とは、前記活性領域の近傍の位置、好ましくは、円順列変異によりそこに新たに導入されるＮ／Ｃ末端に対して他の蛋白質のエピトープ等が付加され、そして当該エピトープに対する特異的抗体等が結合した場合に、該結合により前記活性領域に対してその基質、補酵素或いはエファクターが接近不能となるか、或いは、前記活性領域の活性自体を変化させ得る位置を指す。勿論、そこに新たに導入されるＮ／Ｃ末端により、前記活性領域の機能が回復不能に損傷される場合、当該位置は、前記「触媒活性部位周辺」から排除されるべきである。大腸菌ＰｈｏＡの例では、好ましい「触媒活性部位周辺」は、当該酵素のアミノ酸９０乃至９４およびその近傍であり得る。
【００１９】
本発明のセンサー蛋白質おいては、前記天然型蛋白質の円順列変異により形成された新たなＮ／Ｃ末端（新生Ｎ／Ｃ末端）のいずれか一方、若しくはその両方に「異種性特異結合領域」が付加される。当該「異種性特異結合領域」とは、前記天然型蛋白質以外の物質、好ましくは、蛋白或いはペプチド自体、またはそれらの部分、例えばエピトープを含んでなる領域を指す。特に、当該異種性特異結合領域が他の蛋白質／ペプチドのエピトープを含んでなる場合、本発明のセンサー蛋白質は、当該エピトープに対する特異的抗体を用いた均一競合イムノアッセイプロトコールに好適に応用することができる。また、当該特異結合領域がペプチドホルモン、或いはその受容体結合部位を含有するような場合には、当該ホルモンに対する受容体を用いても、本発明の均一アッセイを実施し得る。本発明の異種性特異結合領域の非限定的な例としては、オステオカルシンやインスリン、血清アルブミン等のエピトープを有してなる領域が挙げられる。なお、前記新たなＮ／Ｃ末端の両方に異種性特異結合領域が付加される場合、当該異種性特異結合領域を構成するペプチド等は、両末端において同一であってもく、また異なっていてもよい。すなわち、一の異種性蛋白質／ペプチドが一つ以上のエピトープを有する場合、Ｎ末端には一のエピトープを、Ｃ末端には他のエピトープを付加してもよい。また、前記新たなＮ／Ｃ末端への異種性特異結合領域の付加においては、適当な介在配列を介して両者を結合させることも好ましい態様である。
【００２０】
本発明の円順列変異体の好適な例として、大腸菌アルカリフォスファターゼ由来の円順列変異体ｃｐ９０をあげることができる。また、本発明の好適なセンサー蛋白質として、当該円順列変異体ｃｐ９０とオステオカルシンエピトープの融合蛋白質ＢＧＰ２−ｃｐ９０を例示することができる。ｃｐ９０は、大腸菌アルカリフォスファターゼｐｈｏＡ配列を基にして作製された、ｐｈｏＡ本来のＮ末端から９０と９４残基目を新たなＮおよびＣ末端とする円順列変異体であり、ｐｈｏＡ本来のＮおよびＣ末端は、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）３により結合されている。ＢＧＰ２−ｃｐ９０は、ｃｐ９０のＮ末端に対し、介在アミノ酸残基としてのＡｒｇを介して結合したオステオカルシンエピトープを含む、ｃｐ９０と該エピトープからなる融合蛋白質である。勿論、これらの蛋白質の機能的誘導体、例えば、前記蛋白質のアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入および／または置換を有するアミノ酸配列からなる蛋白質や、前記アミノ酸配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質も、本発明の蛋白質の特徴的な機能を保持している限りにおいて、本発明に利用可能である。なお、ここでいうアミノ酸配列の相同性は、プログラムのデフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして定義できる。また、前記の蛋白質をコードする核酸分子も、本発明のセンサー蛋白質の製造において有用である。なお、ここでいう核酸分子は、本明細書に具体的に例示されるものの他、遺伝子コードの縮重により、他の多くのヌクレオチド配列によりコードされることも可能であり、発現系によっては、その宿主において最も使用頻度が高いコドンなどが有利に用いられ得る。これら縮重配列を有するものも本発明の核酸分子に含まれることはいうまでもない。
【００２１】
本発明のセンサー蛋白質は、均一アッセイに好適に用いることができる。抗原抗体反応を利用した均一アッセイである、いわゆるホモジニアスＥＩＡは、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ（Rubenstein, K. E. et al: "Homogeneous" enzyme immunoassay. A new immunochemical technique.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 47: 846 (1972)）等により開発された方法である。具体的に、当該方法においては、まず、酵素と抗原を結合させた酵素標識抗原に抗体を結合させる。通常は、抗体の結合により、酵素の活性部位への基質の接近が立体的に阻止され、当該酵素の活性が阻害される。また、当該阻害は、立体障害の他、抗体の結合による酵素のコンフォメーション変化に起因する場合があるとも考えられている。さらに、特殊な例では、抗原を結合させた酵素ではその酵素活性が減少しているが、抗体との結合により酵素活性が回復する場合もある。いずれにせよ、ホモジニアスＥＩＡにおいては、抗原を結合した酵素を用いて、その抗原に対する抗体の結合によりもたらされる酵素（触媒）活性の変調を測定する。
【００２２】
また、当該原理から言えば、抗原抗体反応のみならず、特定の蛋白質／ペプチドとその特異的受容体の組み合わせにおいても、均一アッセイを行うことが可能であろう。その意味において、本発明の「特異的結合パートナー」は、本発明の新生Ｎ／Ｃ末端に付加される前記「異種性特異結合領域」が、他の蛋白質／ペプチドのエピトープである場合には、当該エピトープに特異的な抗体から、また、「異種性特異結合領域」がホルモンなどの機能性ペプチド／蛋白質である場合には、当該ペプチド／蛋白質の受容体から選択することができる。なお、本発明にいう抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほか、それら抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマー又はダイマー、Ｌ鎖モノマー又はダイマー、１個のＨ鎖及び１個のＬ鎖からなるダイマー等も含まれる。同様に、受容体には、当該受容体の可溶化体や該受容体の結合領域からなる部分ペプチド、それらの融合蛋白質も含まれ得る。このような各種の抗体や受容体の作製自体は、当業者にとって周知のいずれの方法によって行ってもよい。また、前記のとおり、新生ＮおよびＣ末端の双方に、同一或いは異なった「異種性特異結合領域」が付加される場合、その「特異的結合パートナー」は、「異種性特異結合領域」を認識する２種以上のパートナーであり得る。さらに、一のパートナーが、ＮおよびＣ末端の双方を同時に認識し、これを架橋するような例は、特に興味深い。
【００２３】
より具体的な本発明の均一アッセイの好ましい例は、いわゆる競合的均一イムノアッセイとして説明することができる。すなわち、本発明の競合的均一イムノアッセイでは、まず被検物質の有するエピトープをその新生Ｎおよび／またはＣ末端に付加したセンサー蛋白質を用意し、当該センサー蛋白質と、被検物質を含有すると疑われるサンプルを接触させる。当該接触は、前記エピトープに対して特異的な抗体の存在下において、当該抗体と前記エピトープの複合体が形成されるのに十分な条件下で行われる。その後、本発明のセンサー蛋白質の基質および、必要な場合には補酵素等を前記反応物に添加し、その触媒活性を測定する。
【００２４】
抗体の結合が本発明のセンサー蛋白質の触媒活性を阻害する例においては、サンプル中に存在する被検物質の量に比例関係で、増加した触媒活性が観測される筈である。つまり、サンプル中の被検物質が、サンプルに添加した抗体を消費することで、当該抗体と本発明のセンサー蛋白質の結合が減少し、それによりセンサー蛋白質の触媒活性が回復する。
【００２５】
好ましくは、対照として、被検物質を含まないか、既知の量の被検物質を含むサンプルについて測定を行い、検量線を予め作成しておいてもよい。当該検量線に基づいて未知サンプル中の被検物質の定量が可能となる。
【００２６】
本発明の均一アッセイを行うにあたって、そのアッセイに用いられる本発明のセンサー蛋白質や特異的結合パートナー等を、キットの形態で供給することが好ましいと思われる。当該キットには、本発明のセンサー蛋白質の他、その特異的結合パートナーに加えて、好適な緩衝溶液や、該センサー蛋白質の基質、補酵素等が含まれてもよい。そのようなキットの構成及びその製造方法は当業者にとって公知であろう。
【００２７】
更に説明せずとも、これまでの説明を与えられた当業者は、本発明を充分に活用し得る。以下、説明のみの目的で実施例を与える。
【００２８】
（実施例１）
Circular  Permutationを導入したベクターの構築
野生型ＰｈｏＡを鋳型として、ＰＣＲ法により１〜９０残基、９４〜４４９残基をコードする２本のＤＮＡ断片を調製した。次にｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲで本来のＮ／Ｃ末端を（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して結合させ、９０番目と９４番目が新たなＮ／Ｃ末端となる様に設計したＰＣＲ断片を調製した。これらをｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し配列を確認した後，Ｔ７プロモーターを持つ分泌発現ベクターｐＥＴ２０ｂに組み込み、発現ベクターとした。
【００２９】
（実施例１−１）
プライマーの設計
円順列変異を導入するためのプライマーを設計し合成した。具体的には新しいＮ／Ｃ末端とする部位で切断された２本のＤＮＡ断片をｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲを用いて本来の末端をリンカーでつなぐことにより、円順列変異体遺伝子を作製した。ここでは、本来のＮ末端から９０と９４残基目を末端とする変異体を作製するため、以下の４本のプライマーを合成した。リンカーのアミノ酸配列は、本来のＮ／Ｃ末端間距離よりやや長く、かつコンフォメーションへの影響が少ないと考えられる（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３とし、１ｒｅｖｅｒｓｅと４４９ｆｏｒｗａｒｄの５’末端に配置した。また、作製したＤＮＡ断片を挿入するための制限酵素切断部位として９４ｒｅｖｅｒｓｅの５’末端にＮｏｔＩ、９０ｆｏｒｗａｒｄの５’末端にＸｈｏＩを配置した。
【００３０】
１ｒｅｖｅｒｓｅ
５’−ＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＧＴＴＣ−３’  （配列番号：１）
（下線部はリンカーをコードする部分）
【００３１】
４４９ｆｏｒｗａｒｄ
５’−ＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＴＴ−３’  （配列番号：２）
（下線部はリンカーをコードする部分）
【００３２】
９４ｒｅｖｅｒｓｅ
５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＣ−３’  （配列番号：３）
（下線部はＮｏｔＩ切断部位）
【００３３】
９０ｆｏｒｗａｒｄ
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡＧＴＧＴＡＴＴＧＣ−３’  （配列番号：４）
（下線部はＸｈｏＩ切断部位）
【００３４】
（実施例１−２）
変異体遺伝子の作製
本来のＮ／Ｃ末端がリンカーで結合され、９０と９４残基目を新たなＣ／Ｎ末端とする変異体蛋白質遺伝子を作製した。まずはＰＣＲ法により、野生型ｐｈｏＡ遺伝子をコードするベクターｐＥＴ−ＡＰ（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｖｏｌ．１２２、ｐｐ．３２２−３２９（１９９７））を鋳型とし、Ｅｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼ（宝バイオ，京都）を用いて１〜９０残基、９４〜４４９残基をコードする２種類のＤＮＡ断片を作製した。５０ｐｍｏｌずつの２種類のプライマー、１０ｎｇ  ｐＥＴ−ＡＰ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１０μｌ  Ｅｘ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝バイオ）、５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑ  １μｌを混合して１００μｌの反応溶液とし、９４℃、５分の後に、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。この際用いたプライマーは以下の通りであった（表１）。
【００３５】
【表１】
2005065564.tif 000002
【００３６】
これらの２種類のＤＮＡ断片をＴＡＥ緩衝液を含む１％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のバンドを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン，東京）を用いて精製した。次にＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより、作製したＤＮＡ断片をリンカー部分で結合させた。２種類のＰＣＲ産物を約１００ｎｇずつ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１０μｌ  Ｅｘ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑを混合して１００μｌの反応溶液とし９４℃、５分の後に９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を１５サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させた。この際用いたＰＣＲ産物は、ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ１として上記１−９０を、ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ２として上記９４−４４９を用いた。このようにして作製した目的のインサートをｃｐ９０と命名した。
【００３７】
この後目的ＤＮＡのみを増やすため、この反応溶液に２種類のプライマーを５０ｐｍｏｌずつ、２．５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑを加え、９４℃で５分の後に、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で１分４５秒を３５サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させた。
この際加えたプライマーの組み合わせは、Ｐｒｉｍｅｒ  １として９４ｒｅｖｅｒｓｅ、Ｐｒｉｍｅｒ  ２として９０ｆｏｒｗａｒｄであった。
【００３８】
この溶液をアガロースゲル電気泳動し、目的サイズのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認し、ゲルを切り出しＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。
【００３９】
（実施例１−３）
ベクターへの組み込みおよび塩基配列の確認
Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより作製したＤＮＡ溶液を、ＰＣＲ産物クローニングに適したｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン，東京）に組み込み、塩基配列を確認した。
【００４０】
ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒを使ったキットで、Ｔａｑポリメラーゼで増幅した３’−ｄＡ突出末端を持つＰＣＲ産物をクローニング、シーケンスするのに適したＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒ１μｌに対し、等モル量のＰＣＲ産物を加え、さらにＳａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１μｌ加えて室温で３０分間放置した。このｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを氷上で溶かしたＤＨ５α（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−，ｍＫ＋），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，ｄｅｏＲ，Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９）に加え氷上で３０分放置した後４２℃で４５秒ヒートショックを与え、２００μｌのＳＯＣ培地（１Ｌあたり２０ｇ  ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ、５ｇ  ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ、２０ｍｌ  １Ｍ  グルコース、１０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、１０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４）を加え３７℃で３０分キュアリングして形質転換し、予め１０μｌの０．４Ｍ  ＩＰＴＧと２００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを撒いておいた１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースを含むＹＴ寒天培地プレート（１Ｌあたり８ｇ  ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ、５ｇ  ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ、１５ｇ  ａｇａｒ）にて３７℃で一晩培養した。翌日、白いコロニー、青いコロニー各数個のうち白いコロニーを竹串でつつき、Ｅｘ−Ｔａｑ  ポリメラーゼとＭ１３ｆｏｒｗａｒｄ、Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅの２本のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行なった。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルにて泳動し、目的の大きさのバンドがでたコロニーのみを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む滅菌ＬＢ液体培地（１Ｌあたり１０ｇ  ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ、５ｇ  ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ）に植菌、３７℃で一晩培養し、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （バイオラッド，東京）を用いてプラスミドを抽出し、ＡＢＩ３１０ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を確認した。
【００４１】
次に配列を確認したサンプルを制限酵素処理して発現プラスミドベクターに移し替えた。発現プラスミドベクターとしては、目的蛋白をペリプラズムに分泌させ発現させることができるｐＥＴ２０ｂ（＋）（メルク、東京）をえらんだ。ｐＥＴ２０ｂ（＋）と、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにｃｐ９０遺伝子が組み込まれたプラスミド溶液２０μｌに対し、１０ｕｎｉｔ  ＮｏｔＩ、１０ｕｎｉｔ  ＸｈｏＩ、４μｌ  １０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ３（第一化学薬品，東京）、４μｌの０．１％  ＢＳＡ、１１μｌ滅菌水を加え、３７℃、１６時間処理した。制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い切り出し精製した挿入ＤＮＡ断片３μｌに、同じく制限酵素処理、切り出し精製したベクター２μｌとＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡，大阪）５μｌを加え、１６℃で３０分ライゲーション反応を行った。このうち５μｌを用いてＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（Ｔｅｔｒ，Δ（ｍｃｒＡ）１８３，Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３，ｅｎｄＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｌＡ，ｌａｃ，Ｔｈｅ，［Ｆ’，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｌｑＺΔＭ１５，Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ），Ｔｎ５（Ｋａｎｒ），Ａｍｙ］の１００μｌを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１％グルコースを含むＹＴ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。翌日、コロニーを竹串でつつき、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに植菌、３７℃で一晩培養し、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてｐＥＴ２０−ｃｐ９０のプラスミドベクターを抽出した。
【００４２】
（実施例１−４）
蛋白質の発現、精製
ｐＥＴ２０ｂ（＋）に組みこんだベクターｐＥＴ２０−ｃｐ９０の５μｌを用いてＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）（Ｆ−，ｏｍｐＴ，ｈｓｄＳＢ，（ｒＢ−，ｍＢ−），ｄｃｍ，ｇａｌ，λ（ＤＥ３），ｐＬｙｓＳ，Ｃｍｒ）の１００μｌを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと１％グルコースを含むＹＴ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。翌日、コロニーを竹串でつつき、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに植菌、３７℃で一晩培養したのち、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地２５０ｍｌに植菌、２７℃で培養し、Ｏ．Ｄ６００が約０．６に達したとき１Ｍ  ＩＰＴＧを２５μｌ加えて発現を誘導し、２７℃でさらに５〜６時間培養した。その後、培養液を６０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を廃棄、菌体を３０ｍｌのＳｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で再懸濁し、５０ｍｌチューブに移して再度６０００Ｇ、４℃で１０分間遠心、上清を廃棄したのち菌体を１０ｍｌのＳｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで再懸濁し１５ｍｌチューブに移した。こうして体積を減らした後にＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  （ＢＲＡＮＳＯＮ）にて菌体を破砕し、９０００Ｇ、４℃で１時間遠心した。上清に３００μｌのＴＡＬＯＮ金属アフィニティーカラム（クロンテック、東京）を加え、バッチ／重力方式カラム精製法により蛋白質を精製した。蛋白質の溶出にはＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を用いた。ＮａＨ２ＰＯ４は酵素活性を阻害するので、ＮａＨ２ＰＯ４の濃度が１ｎＭ以下になるようにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ミリポア、東京）を用いて保存用Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）にＢｕｆｆｅｒを交換した。
【００４３】
（実施例１−５）
活性測定
まずＢｒａｄｆｏｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｙ  （バイオラッド）により蛋白質濃度を測定した。活性測定用Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０μＭ  ＺｎＳＯ４）に基質としてｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｔｒｉｓ  ｓａｌｔ（シグマ）を溶かし、基質溶液とした。様々な濃度の基質溶液９５μｌに対し、酵素溶液を５μｌ加え、９６穴マイクロプレートにて吸光度の変化を測定した。各濃度に対する反応速度を測定し、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  ｐｌｏｔよりＶｍａｘ、Ｋｍを求めた。
【００４４】
（実施例１−６）
ｃｐ９０の確認
活性が認められたｃｐ９０が正しく調製できているかどうか確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端ペプチドシーケンス、遠紫外ＣＤスペクトル測定を行った。
【００４５】
（実施例１−７）
結果
発現、精製したｃｐ９０において、活性が確認された。ＷＴ−ＡＰ（野生型）およびｃｐ９０（円順列変異体）における基質濃度と反応速度の関係を図３および４に示す。Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  ｐｌｏｔ（図５および６）を行い、Ｖｍａｘ、Ｋｍを求めた。その結果を以下の表２に示す。
【００４６】
【表２】
2005065564.tif 000003
【００４７】
ＷＴ−ＡＰとｃｐ９０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真は図７に示す。ＷＴ−ＡＰとほぼ同様の位置にバンドが確認された。ＷＴ−ＡＰよりやや長めの位置にバンドが見えるのは、リンカー分長くなっているからである。Ｎ末端ペプチドシーケンスでは、Ｎ末端から２５残基をよみ、以下のような配列を得た。この結果，下線部分がｃｐ９０における９４〜９８残基目の配列となっていることを確認した。そのＮ末端側２０残基はベクターのマルチクローニングサイト由来の配列と一致した。更にＮ末端側にコードされるＰｅｌＢシグナル配列は切断されていることも確認できた。
【００４８】
Ｎ末端ペプチドシーケンス結果
Ｎ’−ＭＤＩＧＩＮＳＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡＧＫＰＤＹ−Ｃ’（配列番号：５）
【００４９】
ＷＴ−ＡＰ、ｃｐ９０の遠紫外ＣＤスペクトル測定の結果を図８に示す。ｃｐ９０がＷＴ−ＡＰとほぼ同じ二次構造含量を持つことが確認された。
【００５０】
（実施例２）
オステオカルシンエピトープの挿入
ｃｐ９０Ｎ末端のオステオカルシンエピトープへの置換を以下のようにして行った。
【００５１】
（実施例２−１）
プライマーの設計、インサートの作製
ｃｐ９０をＴｅｍｐｌａｔｅとし、ＰＣＲ法によって５’末端に抗オステオカルシン抗体の認識部位（エピトープ）をコードするＤＮＡを導入するためのプライマーを設計した。この際ｃｐ９０のＮ末端に存在するマルチクローニングサイト由来配列を除くため、プライマー５’末端側に制限酵素切断部位としてＮｃｏＩを配置した。またオステオカルシンエピトープと９４番目の残基が直接結合していると、挿入エピト−プがアルカリフォスファターゼに埋もれてしまい、抗原抗体反応が阻害されるおそれがあると考えられるので、スペーサーとしてオステオカルシンエピトープのＣ末側残基Ａｒｇを１残基余分にコードするものとしないものの２種類のプライマーを作製した。
【００５２】
【化１】
2005065564.tif 000004
【００５３】
ｃｐ９０を鋳型とし、上記のプライマーＢＧＰ１、ＢＧＰ２と９０ｆｏｒｗａｒｄを用い、ＰＣＲ法によって５’末端にオステオカルシン抗体認識部位コード領域が挿入されたＤＮＡ断片を作製した。作製したＤＮＡ断片名とプライマーの組み合わせは以下の通りである（表３）。
【００５４】
【表３】
2005065564.tif 000005
【００５５】
このＰＣＲ産物の一部をアガロースゲル電気泳動し、目的サイズのＤＮＡ断片が作製されていることを確認した。これらのＰＣＲ産物にＮｃｏＩｌμｌ、１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）  ２μｌ、ＭｉｌｌｉＱ水  １７μｌを加え、３７℃、１６時間、制限酵素処理した。ＤＮＡ断片を組み込むベクターとしたｐＥＴ２０ｂ−ｃｐ９０についても、同様の酵素溶液を加え、さらにセルフライゲーションを防ぐために１０ｕｎｉｔ  ＣＩＡＰ（宝バイオ）を加えて３７℃で１６時間放置した。その後ゲルを切り出して精製した。
【００５６】
（実施例２−２）
ベクターの構築、インサートの配列確認
制限酵素処理し精製したＤＮＡ断片と発現ベクタープラスミドを定法によりライゲーションさせた。このｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを用いてＸＬ１０−Ｇｏｌｄを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースを含むＹＴ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。両端ともにＮｃｏＩで処理したＤＮＡ断片が逆向きに入っていないかどうかを確認するため、コロニーを竹串でつつき、Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒと４０７ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒを用いてコロニーＰＣＲを行った。正しくインサートが挿入されているものは、２３０ｂｐ付近にバンドがでるはずである。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、２３０ｂｐ付近にバンドがでたコロニーのみを竹串でつつき、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに植菌、３７℃で一晩培養し、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、ｃｐ９０のＮ末端にオステオカルシンエピトープが挿入されたｐＥＴ２０−ＢＧＰ１ｃｐ９０、ｐＥＴ２０−ＢＧＰ２ｃｐ９０の２種類のベクターを構築した。
【００５７】
このベクターが正しい配列をとっているかを確認するため、シーケンスを行った。抽出したプラスミドの濃度が低かったため、Ｔ７  ｐｒｉｍｅｒ  と４０７ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒを用い、Ｅｘ−ＴａｑによってＰＣＲを行って読みたいＤＮＡ断片を増幅した。その反応産物に５倍量のＱＧ  Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン）と等量のイソプロパノ−ルを加え、攪拌したのち、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン）のカラムに移し、遠心した。その後はゲルの切り出し精製同様に、５００μｌのＱＧ  Ｂｕｆｆｅｒと７５０μｌのＰＥ  Ｂｕｆｆｅｒで１回ずつＷａｓｈしたのちＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒにて溶出した。こうして精製したＤＮＡ断片をＴ７  ｐｒｉｍｅｒを用いてシーケンスを行った。
【００５８】
（実施例２−３）
蛋白質の発現、精製
上記「２−２」で構築したｐＥＴ２０−ＢＧＰ１ｃｐ９０、ｐＥＴ２０−ＢＧＰ２ｃｐ９０の２種類のベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１％グルコースを含むＹＴ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。翌日、コロニーを竹串でつつき、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地５ｍｌに植菌、３７℃で一晩培養したのち、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地２５０ｍｌに植菌、２７℃で培養し、Ｏ．Ｄ６００が約０．４〜０．６に達したとき１Ｍ  ＩＰＴＧを２５μｌ加えて発現を誘導し、２７℃でさらに８時間培養した。その後、培養液を６０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を廃棄、菌体を３０ｍｌのＳｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで再懸濁し、５０ｍｌチューブに移して再度、６０００Ｇ、４℃で１０分間遠心、上清を廃棄したのち菌体を１０ｍｌ  Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで再懸濁し１５ｍｌチューブに移した。このようにして体積を減らした後にＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒにて菌体を破砕し、９０００Ｇ、４℃で１時間遠心した。その後、上清にＴＡＬＯＮ金属アフィニティーカラムを加え、バッチ／重力方式カラム精製法により蛋白質を精製した。蛋白質の溶出にはＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた。
【００５９】
（実施例２−４）
活性測定
まずＢｒａｄｆｏｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｙにより蛋白質濃度を測定した。活性測定用Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０μＭ  ＺｎＳＯ４）に基質としてｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｔｒｉｓ  ｓａｌｔを溶かし、基質溶液とする。様々な濃度の基質溶液９５μｌに対し、酵素溶液５μｌ加え、９６穴マイクロプレートにて吸光度の変化を測定した。各濃度に対する反応速度を測定し、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  ｐｌｏｔよりＶｍａｘ、Ｋｍを求めた。
【００６０】
（実施例２−５）
ＢＧＰ２−ｃｐ９０の抗ＢＧＰ（オステオカルシン）抗体への結合
Ｎ末端にＢＧＰエピトープを持つ円順列変異体ＢＧＰ２−ｃｐ９０が、抗ＢＧＰ（オステオカルシン）抗体に対し結合できるかどうかを固相酵素免役測定法（ＥＬＩＳＡ）で確認した。ＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２）中に５μｇ／ｍｌに希釈したマウス抗オステオカルシン抗体（三菱化学ヤトロン、東京）或いは０．２μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ、インビトロジェン）或いはＰＢＳをＦａｌｃｏｎ３９１２マイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃、１６時間おいた。これに１％スキムミルクを含むＰＢＳ（ＭＰＢＳ）を加え、２５℃で２時間置き、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でこれを洗浄した後、５μｇ／ｍｌの精製ＢＧＰ２−ｃｐ９０を含む、或いは含まないＭＰＢＳを加え３７℃、１時間置いた。ここまでの操作で固相化されたアルカリフォスファターゼを検出するため、ＭＰＢＳで１／１０００に希釈したウサギ抗大腸菌アルカリフォスファターゼＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．）を加え２５℃で１時間置き、ＰＢＳ−Ｔで三回洗浄した後、ＭＰＢＳで１／５０００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを加え２５℃で１時間置いた。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、あらかじめ調製した酵素反応溶液（５０ｍｌ  ＥＬＩＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ、ＴＭＢＺ（ｉｎ  ＤＭＳＯ）５００μｌ、Ｈ２Ｏ２  １０μｌ）を各ｗｅｌｌへ１００μｌずつ添加して反応を開始した。暗所で１５分間反応させた後、３．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌずつ添加して反応を止め、プレートリーダーで吸光度を測定した（４５０ｎｍ、対照は６５５ｎｍ）。
【００６１】
（実施例２−６）
ＢＧＰ２−ｃｐ９０における特異抗体存在下での活性変化
さらに様々な抗体が作製した酵素の活性にどのような影響を与えるかを調べるため、酵素、基質溶液にさらにマウス抗オステオカルシン抗体或いは精製マウスミエローマＩｇＭ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）５μｇを加え、全体量が１００μｌとなるように調製したものについての酵素活性を、それぞれ、上記「２−４  活性測定」と同様にして測定した。
【００６２】
（実施例２−７）
結果
ＢＧＰ１−ｃｐ９０、ＢＧＰ２−ｃｐ９０の両方において蛋白質を発現、精製することができ、活性も認められた。ＢＧＰ２−ｃｐ９０についての酵素活性測定の結果を図９に示す。
【００６３】
また、ＢＧＰ２−ｃｐ９０の抗ＢＧＰ（オステオカルシン）抗体への特異的結合の結果を図１０に示した。図１０から、ＢＧＰ２−ｃｐ９０はＢＧＰ２−ｃｐ９０Ｃ末端に位置するＨｉｓ６タグに対する抗体を固定化した場合と同様に、抗オステオカルシン抗体の固定化の有無により顕著にそのマイクロプレートへの結合量が変化することがわかった。なおＢＧＰ２−ｃｐ９０を入れない場合の測定値はどちらの抗体を固定化した場合でもわずかであり、抗オステオカルシン抗体の非特異的吸着は少ないことがわかった。すなわち、この実験から抗オステオカルシン抗体がＢＧＰ２−ｃｐ９０のＮ末端側のタグに特異的に結合できることが示された。
【００６４】
最後に、ＢＧＰ２−ｃｐ９０においては抗オステオカルシン抗体特異的な活性変化がみられた。ＢＧＰ２−ｃｐ９０における基質濃度と反応速度の関係を図１１および１２に示す。これに基づきＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  ｐｌｏｔ（図１３）を行い、Ｖｍａｘ、Ｋｍを求めた。その結果を以下の表４に示す
【００６５】
【表４】
2005065564.tif 000006
【００６６】
これらの結果から、本発明のセンサー蛋白質が、均一アッセイにおいて有効に利用できることが示された。
【００６７】
以下に、前記大腸菌ｐｈｏＡの円順列変異体ｃｐ９０と、当該蛋白質とオステオカルシンエピトープとの融合蛋白質ＢＧＰ２−ｃｐ９０の塩基配列・アミノ酸配列を、それぞれ、示す。
【００６８】
【化２】
2005065564.tif 000007
【００６９】
【化３】
2005065564.tif 000008
【００７０】
【化４】
2005065564.tif 000009
2005065564.tif 000010
【００７１】
【化５】
2005065564.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、センサー蛋白質の活性部位周辺に、様々な異種蛋白質由来の特異的結合領域を導入して、ハイブリッド蛋白質を作製するための新たな手法が提供される。このようにして得られたセンサー蛋白質の触媒活性は、そこに導入された異種蛋白質由来の特異的結合領域と、当該領域に対する特異的結合パートナーとの相互作用に基づき、変調される。そして、当該変調に基づき、極めて特異的且つ高感度の生化学的なアッセイが達成される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、アルカリフォスファターゼ（2量体）の結晶構造を示す。
【図２】図２は、円順列変異を導入したアルカリフォスファターゼｃｐ９０（＋Ｈｉｓ  ｔａｇ）のＤＮＡ構造を模式的に示す。
【図３】図３は、ＷＴ−ＡＰ（野生型アルカリフォスファターゼ）における基質濃度と反応速度の関係を示す。
【図４】図４は、ｃｐ９０（アルカリフォスファターゼ円順列変異体）における基質濃度と反応速度の関係を示す。
【図５】図５は、ＷＴ−ＡＰのＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す。
【図６】図６は、ｃｐ９０のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す。
【図７】図７は、ＷＴ−ＡＰとｃｐ９０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの状況を示す図である。
【図８】図８は、ＷＴ−ＡＰとｃｐ９０の遠紫外ＣＤスペクトル測定結果を示す
【図９】図９は、本発明のセンサー蛋白質ＢＧＰ２−ｃｐ９０における基質濃度と反応速度の関係を示す。
【図１０】図１０は、ＢＧＰ２−ｃｐ９０への抗ＢＧＰ（オステオカルシン）抗体の特異的結合を示す。結果は、３サンプルの平均と標準偏差を表す。
【図１１】図１１は、抗ＢＧＰ抗体の存在下における、本発明のセンサー蛋白質ＢＧＰ２−ｃｐ９０の基質濃度と反応速度の関係を示す。
【図１２】図１２は、マウスミエローマＩｇＭ抗体の存在下における、本発明のセンサー蛋白質ＢＧＰ２−ｃｐ９０の基質濃度と反応速度の関係を示す。
【図１３】図１３は、ＢＧＰ２−ｃｐ９０、ＢＧＰ２−ｃｐ９０＋抗ＢＧＰ抗体およびＢＧＰ２−ｃｐ９０＋マウスミエローマＩｇＭ抗体のＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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