(57)【要約】【課題】  ターゲット塩基配列の濃度が極低濃度であっても、高い選択性及び精度をもってプローブとターゲット塩基配列のハイブリダイズが可能なハイブリダイゼーション方法を提供する。【解決手段】  固相担体に固定化されたペプチド核酸プローブに、該ペプチド核酸プローブと相補的な塩基配列を有するターゲット核酸を含有する溶液であって、該溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を更に含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整された溶液を接触させることにより、前記ペプチド核酸プローブと前記ターゲット核酸とをハイブリダイズさせることを特徴とするハイブリダイゼーション方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体に固定化されたペプチド核酸プローブに、
該ペプチド核酸プローブと相補的な塩基配列を有するターゲット核酸を含有する溶液であって、該溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を更に含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整された溶液を接触させることにより、
前記ペプチド核酸プローブと前記ターゲット核酸とをハイブリダイズさせることを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
前記親水性有機溶剤は、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、アセトアミド、ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、ベンズアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール及びグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも１つの親水性有機溶剤であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
前記溶液は、ポリビニルアルコールを更に含有することを特徴とする請求項１又は２記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記固相担体は、表面にアミノ基を有する固相担体であり、
前記ペプチド核酸プローブは、その末端にシステイン残基を導入したペプチド核酸プローブであり、
該ペプチド核酸プローブは、前記システイン残基において、アミノ基反応性基及びメルカプト基反応性基を備えたリンカーにより、前記固相担体に固定化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
前記ペプチド核酸プローブは、長さが８〜２０merのペプチド核酸プローブであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
微少量のターゲット核酸を検出する塩基配列検出方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション方法を実施するハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイズした前記ターゲット核酸を検出する検出工程と、を少なくとも備えることを特徴とする塩基配列検出方法。
【請求項７】
前記ハイブリダイゼーション工程において、蛍光色素で標識された前記ターゲット核酸を前記ペプチド核酸プローブとハイブリダイズさせ、前記検出工程において、該蛍光色素を検出することを特徴とする請求項６記載の塩基配列検出方法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーション工程において、前記ペプチド核酸プローブと相補的な配列領域を部分的に有する前記ターゲット核酸を前記ペプチド核酸プローブとハイブリダイズさせ、更に、前記ターゲット核酸における前記配列領域以外の配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する、蛍光色素で標識された検出用塩基配列をハイブリダイズさせて、前記検出工程において、該蛍光色素を検出することを特徴とする請求項６記載の塩基配列検出方法。
【請求項９】
固相担体にペプチド核酸プローブが固定化されてなる固相と、
前記ペプチド核酸プローブと相補的な塩基配列を有するターゲット核酸を添加すべき溶液であって、該溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整された溶液と、を含むことを特徴とする塩基配列検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のハイブリダイゼーション方法、塩基配列検出方法及び塩基配列検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
固液界面場を利用した遺伝子・核酸分析法はアレイ分析やバイオセンサーにおいて注目を集めている（例えば、以下の非特許文献１参照）。
【０００３】
核酸分析では、検出対象となる核酸の塩基配列に相補的なプローブ分子を固相表面に固定化し、固定化された分子と検出対象配列間の特異的なハイブリダイゼーション反応を種々の方法で測定することが基本である。そして、この方法においては、固液界面場として、アミノ基含有シランカップリング剤により表面にアミノ基を導入（アミノシラン化）した石英ガラスが広く利用されている
【非特許文献１】LeProust,E.;Zhang,H.;Yu,P.;Zhou,X.;Gao,X. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 2171-2180
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これまで報告されたアミノシラン化を出発点としたプローブ核酸固定化法とそれに基づく核酸分析法には以下のような問題があった。
【０００５】
すなわち、従来の核酸分析法では、ハイブリダイゼーション反応によって検出される対象配列の濃度が比較的高く（多くの場合ｎＭ以上）、検出に用いるサンプル量を増加させなければならなかった。したがって、十分なサンプル量が確保できない場合には、核酸分析を行うことができない問題があった。特に、多くの検出対象配列を一度に検出するアレイ分析においては、このような問題点は致命的は欠点となっていた。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、固相担体に固定化されたプローブを用いたハイブリダイゼーション方法であって、ターゲット核酸（ターゲット塩基配列）の濃度が極低濃度であっても、高い選択性及び精度をもってプローブとターゲット核酸のハイブリダイズが可能なハイブリダイゼーション方法を提供することにある。本発明の目的はまた、このハイブリダイゼーション方法を用いた塩基配列検出方法及びそのための塩基配列検出用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、固相担体に固定化されたペプチド核酸プローブに、該ペプチド核酸プローブと相補的なターゲット核酸を含有する溶液であって、該溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を更に含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整された溶液を接触させることにより、上記ペプチド核酸プローブと上記核酸とをハイブリダイズさせることを特徴とするハイブリダイゼーション方法を提供する。
【０００８】
このように本発明のハイブリダイゼーション方法においては、固相担体に固定化されたプローブとしてペプチド核酸プローブを用いており、検出対象であるターゲット核酸を所定濃度の親水性有機溶剤と共に所定のｐＨで用いていることが特徴である。このような構成によりターゲット核酸の濃度が極低濃度であっても、高い選択性及び精度をもってプローブとターゲット核酸のハイブリダイズが可能になる。
【０００９】
なお、親水性有機溶剤の濃度が１．０mol/Lを下回る場合や３．０mol/Lを超す場合はハイブリダイゼーションが生じないか、著しい阻害を受ける。また、ｐＨが９．１未満の場合はハイブリダイゼーションは起こるもののターゲット核酸の非特異吸着が著しくなり、ｐＨが１１を超すとハイブリダイゼーションが阻害される。
【００１０】
親水性有機溶剤としては、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、アセトアミド、ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、ベンズアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール及びグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも１つを用いるとよく、ターゲット核酸を含む溶液は、ポリビニルアルコールを更に含有することが好ましい。このような構成により、非特異吸着がより確実に抑制され、更に高い選択性及び精度でハイブリダイゼーションが生じるようになる。
【００１１】
同様の効果が奏されることから、ペプチド核酸が固定された固相担体は、以下の構成を備えることが好ましい。すなわち、固相担体は、表面にアミノ基を有する固相担体であり、ペプチド核酸プローブは、その末端にシステイン残基を導入したペプチド核酸プローブであり、ペプチド核酸プローブは、上記システイン残基において、アミノ基反応性基及びメルカプト基反応性基を備えたリンカーにより、上記固相担体に固定化されているとよい。また、ペプチド核酸プローブは、長さが８〜２０mer（更には１０〜１８mer）であることが好ましい。ペプチド核酸プローブが８merより小さいと、ターゲット核酸検出の特異性が発揮できず、２０merより大きいとペプチド核酸プローブ自体の合成が困難となる。
【００１２】
このようなハイブリダイゼーション方法を用いれば、微少量のターゲット核酸を検出することが可能になる。すなわち、微少量のターゲット核酸を検出する塩基配列検出方法であって、上記本発明のハイブリダイゼーション方法を実施するハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイズしたターゲット核酸を検出する検出工程と、を少なくとも備えることを特徴とする塩基配列検出方法が提供される。
【００１３】
検出精度の観点から、検出は蛍光色素を用いて行うことが好ましい。すなわち、（１）ハイブリダイゼーション工程において、蛍光色素で標識されたターゲット核酸をペプチド核酸プローブとハイブリダイズさせ、検出工程においてこの蛍光色素を検出するか、（２）ハイブリダイゼーション工程において、ペプチド核酸プローブと相補的な配列領域を部分的に有するターゲット核酸をペプチド核酸プローブとハイブリダイズさせ、更に、ターゲット核酸における配列領域以外の配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する、蛍光色素で標識された検出用塩基配列をハイブリダイズさせて、検出工程においてこの蛍光色素を検出することが好適である。
【００１４】
そして、このような検出のために、固相担体にペプチド核酸プローブが固定化されてなる固相と、ペプチド核酸プローブと相補的な配列を有するターゲット核酸を添加すべき溶液であって、該溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整された溶液と、を含む塩基配列検出用キットが、適用できる。
【発明の効果】
【００１５】
固相担体に固定化されたプローブを用いたハイブリダイゼーション方法であって、ターゲット核酸（ターゲット塩基配列）の濃度が極低濃度であっても、高い選択性及び精度をもってプローブとターゲット核酸のハイブリダイズが可能なハイブリダイゼーション方法が提供される。また、このハイブリダイゼーション方法を用いた塩基配列検出方法及びそのための塩基配列検出用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について場合により図面を参照しつつ説明する。なお、同一の要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１７】
（固相）
図１は、本発明において適用可能な固相の第１実施形態を示す模式図である。図１に示す固相１は、固相担体２と、ペプチド核酸プローブ４と、ペプチド核酸プローブ４を固相担体２に固定するためのリンカー６とから構成されており、ペプチド核酸プローブ４にはこれと相補的な配列を有するターゲット核酸（ターゲット塩基配列）がハイブリダイズする。
【００１８】
図２は、本発明において適用可能な固相の第２実施形態を示す模式図である。図２に示す固相１は、固相担体２と、それぞれ配列が異なるペプチド核酸プローブ４ａ〜４ｅと、ペプチド核酸プローブ４ａ〜４ｅを固相担体２に固定するためのリンカー６とから構成されており、ペプチド核酸プローブ４ａ〜４ｅにはそれぞれ相補的な配列を有するターゲット核酸（ターゲット塩基配列）がハイブリダイズする。このように図２に示す固相１は、異なるペプチド核酸プローブを備えることから、多くの検出対象を一度に検出するアレイ分析に適用することができる。
【００１９】
固相担体２としては、ガラス（石英ガラス等）、ナイロン（登録商標）メンブレン（nylonTM membrane）、コントロールドポアグラス（controlled-pore glass）、アクリルアミドゲル、ポリスチレンマトリックス、アクチベーティッドデキストラン（activated dextran）、アビジンコートポリスチレンビーズ（avidin-coated polystyrene beads）等、さらには金（Ａｕ）等の金属が挙げられる。金属を固相担体として利用するものとして、電流検出方式のＤＮＡチップが知られている。これらのなかでは、透明且つ不純物が少なく強固で安価に入手することができることから、ガラスを用いることが好ましい。
【００２０】
このような固相担体２は表面にアミノ基を備え、このアミノ基をリンカー６との結合に用いることが好ましい。アミノ基は、例えば、固相担体２がガラスである場合は、固相担体２表面にシランカップリング剤を反応させることで導入できる。
【００２１】
シランカップリング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane, APTES）、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltriethoxysilane, EDA）、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン（trimethoxysilylpropyldiethylenetriamine, DETA）、ｍ，ｐ−（アミノエチル−アミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン（m,p-(aminoethyl-aminomethyl)phenetyltrimethoxysilane, PEDA）、Ｎ−（２−アミノデカノイル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（N-(2-aminodecanoyl)-3-aminopropyltriethoxysilane）が例示できる。
【００２２】
ペプチド核酸は図３に模式的に示される。図３に示すペプチド核酸１０におけるＢは塩基を表し（Ｂはそれぞれ異なっていてもよい。）、検出対象であるターゲット核酸と相補的になるようにデザインされる。また、ｎはペプチド核酸の長さを決めるものであり、８〜２０（更には１０〜１８）が好ましい。
【００２３】
図３に示すペプチド核酸はそれ自体ペプチド核酸プローブ４として用いることができるが、リンカー６との結合性の観点からその末端にシステイン残基を有するものが好ましい。ここで、システイン残基を導入する末端はＮ末端でもC末端でもよい。また、図３に示すペプチド核酸１０とシステイン残基の間には図４に示すようなスペーサー（二価の基）を導入することがハイブリダイゼーションの容易性から好ましい。
【００２４】
図５は、Ｃ末端にシステイン残基が導入された、スペーサーを備えるペプチド核酸プローブ４の実施形態を示す図である。図５においてスペーサーは「spacer」として示してあり、図４に示したような結合（二価の基）が適用される。なお、プローブ合成反応によりシステイン残基の−ＣＯＯＨ基は−ＣＯＮＨ２基となっている。
【００２５】
リンカー６は、固相担体２表面の官能基と反応性の官能基と、ペプチド核酸プローブの末端官能基と反応性の官能基とを備えた多官能性化合物である。固相担体２表面にアミノ基が存在する場合は、これと反応性の官能基（アミノ基反応性基）としては、チオシアネート基、アルデヒド基、サクシニミジル（succinimidyl）基、シアヌリッククロライド（cyanuric chloride）、エポキシ基等が挙げられる。ペプチド核酸プローブの末端にメルカプト基が存在する場合は、これと反応性の官能基（メルカプト基反応性基）としては、エポキシ基、イソシアネート基、マレイミド基が挙げられる。
【００２６】
アミノ基反応性基とメルカプト基反応性基とを備えたリンカー６としては、例えば、ＳＭＣＣ（succinimidyl-4-(N-maleimiomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）、ｓＳＭＣＣ（4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic-3-sulfo-n-hydroxysuccineimide）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amido-caproate)）が含まれる。
【００２７】
図６は固相担体２としてガラス、ガラス表面にアミノ基を導入するシランカップリング剤としてＡＰＴＥＳ、リンカー６としてＬＣ−ＳＭＣＣ、ペプチド核酸プローブ４として図５のペプチド核酸プローブをそれぞれ用いた場合の固相１を示す模式図である。なお、図６におけるＢ及びspacerは図５におけるのと同様である。
【００２８】
図１、２及び６に示されるような固相１は、ペプチド核酸プローブ４にリンカー６を結合させた後にこれを、固相担体２（好ましくは表面にアミノ基を備える固相担体）に結合させる方法や、固相担体２（好ましくは表面にアミノ基を備える固相担体）にリンカー６を結合させリンカー６とペプチド核酸プローブ４とを結合させる方法により製造できる。
【００２９】
例えば、図６に示す固相については、ＡＰＴＥＳ溶液に石英ガラスを浸漬した後、室温又は加温下で所定時間保持し、ＡＰＴＥＳのアルコキシ基と石英ガラスの表面シラノール基との間で−Ｓｉ−Ｏ−結合を生じさせ、石英ガラスの表面にアミノ基を導入する。次いで、リンカーであるＬＣ−ＳＭＣＣでアミノ基が導入された石英ガラスを処理することにより、石英ガラス表面にＡＰＴＥＳ残基を介してリンカーを結合させる。更に無水酢酸で処理することにより、ＬＣ−ＳＭＣＣと反応しなかったアミノ基をアセチル基でキャップングする。そして、これを、スペーサーを介してＣ末端にシステイン残基を導入したペプチド核酸プローブの溶液中に浸漬して、所定時間反応させることにより、ＬＣ−ＳＭＣＣのメルカプト基反応性基がシステイン残基のメルカプト基と反応して、固相担体である石英ガラス表面にペプチド核酸プローブが固定化される。
【００３０】
（溶液）
固相担体に固定化されたペプチド核酸プローブに接触させる溶液は、ペプチド核酸プローブと相補的な塩基配列を有するターゲット核酸を含有する溶液であって、この溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を含有し且つｐＨが９．１〜１０．６の溶液である。
【００３１】
親水性有機溶剤としては、上記に列記したものが好ましく、なかでも、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）が特に好ましい。また、溶液の濃度は１．９〜２．６mol/Lがより好ましい。ここで、１．９mol/L及び２．６mol/Lは、ＤＭＦの１５％及び２０％にそれぞれ相当する。溶液のｐＨは９．４〜１０であることが特に好適である。ｐＨの下限を９．４にすることにより非特異吸着をほぼ完全に防止することができる。
【００３２】
溶液はターゲット核酸（ターゲット塩基配列）及び親水性有機溶剤を含み、ｐＨが上記範囲であればよいが、これら以外にもリン酸エステル（phosphate）バッファー、ジエタノールアミンバッファー、炭酸水素ナトリウムバッファー等のバッファーを１０ｍＭ程度含むことが好ましい。また、ポリビニルアルコールを０．５％（ｗ／ｖ）程度含有させることで非特異吸着を効果的に抑制できる。その他含有可能な成分としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等がある。
【００３３】
（ハイブリダイゼーション方法及び塩基配列検出方法）
固相担体にペプチド核酸プローブが固定化されてなる固相に、このペプチド核酸と相補的な塩基配列を有するターゲット核酸（ターゲット塩基配列）を含む溶液（１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を更に含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整されている。）を接触させることにより、ペプチド核酸プローブとターゲット核酸間でハイブリダイゼーションが生じる。具体的には、上記固相をターゲット核酸（ターゲット塩基配列）を含む上記溶液に浸漬して、好ましくは室温で８〜１２時間そのまま保持又は震盪・撹拌させるとよい。
【００３４】
図７は、固相担体２にリンカー６により固定化されたペプチド核酸プローブ４に、蛍光色素１０で標識したターゲット核酸８をハイブリダイズさせた状態の模式図である。このようなハイブリダイゼーションの後、ターゲット核酸８が有する蛍光色素１０を公知の検出手段を用いて検出することにより、標的とした塩基配列の検出が可能なる。この場合において、上述した溶液を用いてハイブリダイゼーションを行っているために、ターゲット核酸の濃度が極低濃度であっても、高い選択性及び精度をもってプローブとターゲット核酸とがハイブリダイズし、ターゲット核酸（ターゲット塩基配列）を微少量しか含まない被検体であっても高精度の検出が可能になる。
【００３５】
図８は、固相担体２にリンカー６により固定化されたペプチド核酸プローブ４に、ターゲット核酸８をハイブリダイズさせ、更に蛍光色素で標識した検出用塩基配列１２をターゲット核酸８にハイブリダイズさせた状態の模式図である。
【００３６】
ここで、ターゲット核酸８はペプチド核酸プローブ４と相補的な配列領域を部分的に有しており、検出用塩基配列１２はターゲット核酸８における上記配列領域以外の配列の一部と相補的な配列を有している。このようなハイブリダイゼーションを生じさせることによっても、ターゲット核酸（ターゲット塩基配列）を微少量しか含まない被検体に対して高精度の検出が可能になる。
【００３７】
なお、蛍光色素をevanescent励起し，発する蛍光を「Sutherland, R.M.; Daehne, C.  In Biosensors: Fundamentals and Applications; Turner, A.P.F.;  Karube, I.; Wilson, G.S. Eds.;  Oxford University Press: Oxford, 1987, pp 655-678.」の記載に基づいて計測・定量することが可能である。
【００３８】
（核酸検出用キット）
上述したハイブリダイゼーション方法及び塩基配列検出方法を簡便に実施するために、以下の（ａ）及び（ｂ）を含む塩基配列検出用キットを用いることができる。
（ａ）固相担体にペプチド核酸プローブが固定化されてなる固相、
（ｂ）上記ペプチド核酸プローブと相補的な塩基配列を有するターゲット核酸を添加すべき溶液であって、該溶液基準で１．０〜３．０mol/Lの親水性有機溶剤を含有し、ｐＨが９．１〜１０．６に調整された溶液。
【００３９】
（ｂ）の溶液における親水性有機溶剤としては、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、アセトアミド、ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、ベンズアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール及びグリセロールからなる群より選ばれる少なくとも１つの親水性有機溶剤が好ましく、なかでもジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）が特に好ましい。また、溶液の濃度は１．９〜２．６mol/Lがより好ましい。溶液のｐＨは９．４〜１０であることが特に好適である。
【００４０】
（ｂ）の溶液には上述したバッファーを５０ｍＭ程度含有させることができ、ポリビニルアルコールを０．５％（ｗ／ｖ）程度含有させるも可能である。その他含有可能な成分としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（固相の作製）
石英ガラスを固相担体に用い（18×18×0.15mm）、これにアミノ基を導入するために、１% 3-aminopropyltriethoxysilane（APTES）in 95% acetone/waterに上記固相担体を室温下浸漬させた。１時間保持した後、十分量のacetoneで洗浄し乾燥させた。そして、アミノシラン化を安定化させるために、得られた固相担体を110℃で2時間加熱した。次に、1mM LC-SMCC (succcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate))のdimethylsulfoxide（DMSO）溶液に基板を浸漬させ、室温下、2時間処理した。
【００４３】
その後、十分量のアセトンで洗浄後、乾燥させ、更に、1% acetic anhydride (無水酢酸)のクロロホルム溶液に基板を浸漬させ、室温下2時間処理した。次いで、十分量のアセトンで洗浄した後に乾燥させた。これによって，LC-SMCC処理後，残存するアミノ基の多くはアセチル基でキャッピングされた。
【００４４】
C末端にシステイン残基を導入したペプチド核酸プローブ（16mer。配列はＮ末端側からＣ末端側に向けて、ACG CCA TTG TAG CAC Gである。）の0.5mM〜1.0mM溶液（溶媒は10 mM MOPS, 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl buffer, pH 7.2）に、上記で得られた固相担体を浸漬し、一晩室温下で保持した。これにより、LC-SMCCのマレイミド基部分に上記ペプチド核酸プローブが導入された。最後に同一の緩衝液で十分に洗浄し、更に水で洗浄し、乾燥後、デシケータで保存した。
【００４５】
以上により、図１に示されるような固相が作製された。上記ペプチド核酸（PNA）プローブを導入した石英ガラスの気相下（PNA-glass in air）での吸収スペクトルを図９に示す。あわせて、中性水溶液中（PNA in soln）でのペプチド核酸プローブの吸収スペクトルを示す。
【００４６】
（ハイブリダイゼーション及び塩基配列検出）
１．ハイブリダイゼーションの選択性
上記ペプチド核酸プローブと相補的なＤＮＡ鎖（16mer。配列表の配列番号１記載の配列。）であって、FITCで標識した鎖（以下「FITC-Tgt」と記載する。）を、基本溶液2.0 ml（50 mM sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer, pH 9.5 containing 0.2 M NaCl, 0.5% (w/v) polyvinylalcohol (PVA), 20%(v/v) DMF）に添加した。これに上記で作製した固相１枚を浸漬して，一晩（8時間以上）室温下で振盪・攪拌した後，外液の蛍光スペクトルを取得し，浸漬前の蛍光スペクトルと比較することで石英ガラスへのFITC-Tgtの吸着量を求めた。
【００４７】
また、上記ペプチド核酸プローブと相補的でない16mer deoxyoligonucleotideであって（配列表の配列番号２記載の配列。）であって、FITCで標識した鎖（以下「FITC-unrelated sequence」と記載する。）、FITCで標識されていない上記ＤＮＡ鎖（配列表の配列番号１記載の配列。以下「Tgt」と記載する。）、上記ペプチド核酸プローブ自体（以下「capture probe」と記載する。）についても上記と同様にしてハイブリダイゼーションを試みた。その結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
2005065527.tif 000002
表１から明らかなように、ペプチド核酸プローブと相補的なFITC-Tgtは固相に吸着される（Assay No.1）。しかし、相補性のないFITC-unrelated sequenceはまったく固相表面に吸着されない（Assay No.5）。FITC-Tgt存在下、Tgt同じ配列を持つオリゴヌクレオチド（FITCでラベルされていない）を共存させるとFITC-Tgt吸着を競争的に阻害する（Assay No.2 & 3）。もちろん、このような競争阻害をFITC-unrelated sequenceは起こさせない（Assay No.4）。
【００４９】
２．ハイブリダイゼーションへのｐＨの影響１
FITC-unrelated sequenceを、種々のｐＨの基本溶液2.0 ml（50 mM sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer, containing 0.2 M NaCl, 0.5% (w/v) polyvinylalcohol (PVA), 20%(v/v) DMF）に添加した。これに上記で作製した固相１枚を浸漬して，一晩（8時間以上）室温下で振盪・攪拌した後，外液の蛍光スペクトルを取得し，浸漬前の蛍光スペクトルと比較することで石英ガラスへのFITC-unrelated sequenceの吸着量を求めた。結果を表２に示す。
【００５０】
【表２】
2005065527.tif 000003
表２から明らかなように、ｐＨが中性条件では，非特異吸着が起る。しかし，ｐＨを９．４にすることでほぼ完全に非特異吸着が抑制される。ただし，より完全な抑制には，0.5% PVAまたは20% DMF添加が好ましいことが表からわかる。非特異吸着抑制のｐＨに対する依存性をより詳細に検討した結果を図１０に示す。図１０より基本溶液のｐＨは9.1以上，好ましくは９．４以上が必要であることが判明した。
【００５１】
３．ハイブリダイゼーションへのｐＨの影響２
FITC-Tgtを、種々のｐＨの基本溶液2.0 ml（0.1M sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer, containing 0.2 M NaCl, 0.5% (w/v) polyvinylalcohol (PVA), 15%(v/v) DMF。但し、ｐＨ11.4の調製には0.1M Na2HPO4/NaOH bufferを用いた。）に添加した。これに上記で作製した固相１枚を浸漬して，一晩（8時間以上）室温下で振盪・攪拌した後，外液の蛍光スペクトルを取得し，浸漬前の蛍光スペクトルと比較することで石英ガラスへのFITC-Tgtの吸着量を求めた。結果を図１１に示す。図１１により、基本溶液のｐＨは9.1以上10.6以下でなければならないことが判明した。
【００５２】
４．親水性有機溶剤の検討１
FITC-Tgtを、種々のDMF濃度(v/v)の基本溶液2.0 ml（50 mM Na2CO3/NaHCO3buffer, pH 9.5 containing 0.2 M NaCl, 0.5% (w/v) polyvinylalcohol (PVA)）に添加した（FITC-Tgt 10nM）。これに上記で作製した固相１枚を浸漬して，一晩（8時間以上）室温下で振盪・攪拌した後，外液の蛍光スペクトルを取得し，浸漬前の蛍光スペクトルと比較することで石英ガラスへのFITC-Tgtの吸着量を求めた。結果を図１２に示す。図１２により、15%以上，好ましくは15〜20%のDMF添加、したがって、1.0〜3.0mol/L、より好ましくは１．９〜２．６mol/LのDMFの添加が必要であると判断された。なお、DMFの15%溶液はモル濃度換算で1.9Mとなる。
【００５３】
５．親水性有機溶剤の検討２
上記「４．親水性有機溶剤の検討１」におけるDMFに代えて、同様のモル濃度になるように種々の親水性有機溶媒を用い，上記と同様にしてFITC-Tgtの吸着量を求めた。その結果，次に示す親水性有機溶媒はDMFと同等ないしはそれ以上の吸着を誘起できることが判明した：formamide, dimethylformamide, diethylformamide, dimethylsulfoxide, acetone, methanol, ethanol, ethylene glycol, acetamide, dimethylacetamide。
【００５４】
６．ハイブリダイゼーションの濃度限界
FITC-Tgtを、種々の濃度で基本溶液2.0 ml（50 mM sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer, containing 0.2 M NaCl, 0.5% (w/v) polyvinylalcohol (PVA), 20%(v/v) DMF）に添加した。これに上記で作製した固相１枚を浸漬して、一晩（8時間以上）室温下で振盪・攪拌した後、外液の蛍光スペクトルを取得し、浸漬前の蛍光スペクトルと比較することで石英ガラスへのFITC-Tgtの吸着量を求めた。結果を図１３に示す。図１３により50 pMのFITC-Tgtまで特異的な吸着が起ることが判った。本アッセイ法（つまり，FITC-Tgtの蛍光強度の減少からFITC-Tgt吸着量を求める）では、FITCの検出限界に近く、且つ、外液のFITC-Tgt減少量から吸着量を見積るために50 pM 未満の濃度については検討できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明において適用可能な固相の第１実施形態を示す模式図である。
【図２】本発明において適用可能な固相の第２実施形態を示す模式図である。
【図３】ペプチド核酸を模式的に示す図である。
【図４】スペーサーを示す図である。
【図５】Ｃ末端にシステイン残基が導入された、スペーサーを備えるペプチド核酸プローブの実施形態を示す図である。
【図６】固相担体としてガラス、ガラス表面にアミノ基を導入するシランカップリング剤としてＡＰＴＥＳ、リンカーとしてＬＣ−ＳＭＣＣ、ペプチド核酸プローブとして図５のペプチド核酸プローブをそれぞれ用いた場合の固相を示す模式図である。
【図７】固相担体にリンカーにより固定されたペプチド核酸プローブに、蛍光色素で標識したターゲット塩基配列をハイブリダイズさせた状態の模式図である。
【図８】固相担体にリンカーにより固定されたペプチド核酸プローブに、ターゲット塩基配列をハイブリダイズさせ、更に蛍光色素で標識した検出用塩基配列をターゲット塩基配列にハイブリダイズさせた状態の模式図である。
【図９】ペプチド核酸プローブを導入した石英ガラスの気相下での吸収スペクトルである。
【図１０】非特異吸着抑制のｐＨに対する依存性を示す図である。
【図１１】非特異吸着抑制のｐＨに対する依存性を示す図である。
【図１２】非特異吸着抑制の親水性有機溶剤に対する依存性を示す図である。
【図１３】ターゲット塩基配列の検出濃度限界を示す図である。
【符号の説明】
【００５６】
１…固相、２…固相担体、４，４ａ，４ｂ，４ｃ，４ｄ，４ｅ…ペプチド核酸プローブ、６…リンカー、８・・・ターゲット塩基配列、１０・・・蛍光色素、１２・・・検出用塩基配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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