(57)【要約】【課題】  従来の薬剤とは作用機序が異なる新規な抗ＨＩＶ化合物、並びにそれを用いた医薬、機能性食品を提供すること。【解決手段】  本発明の抗ＨＩＶ剤は、下記の式（１）により表される化合物を有効成分とするものである。本発明の抗ＨＩＶ剤は、ＨＩＶのＲｅｖ蛋白の核外移行を阻害・抑制するという新規作用機序で抗ＨＩＶ活性を示し、医薬品のほか、機能性食品としても有用である。2005179201.tif 000006【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）により表される化合物を有効成分とする抗ＨＩＶ剤。
【化１】
2005179201.tif 000005
【請求項２】
請求項１記載の式（１）により表される化合物を有効成分とするＨＩＶ由来蛋白核外移行阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載の式（１）により表される化合物を含有し、抗ＨＩＶ作用を有する食用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ＨＩＶ活性物質とその利用に関するものであり、より具体的には、新たなエイズ治療薬剤および発症予防薬剤として、さらには抗ＨＩＶ作用を有する食用組成物（機能性食品）等として利用し得るものである。
【背景技術】
【０００２】
エイズ患者、即ちＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）に感染し、発症した患者の数は発見以来世界規模で増え続けており、早急な治療法の確立が必須である。現段階での化学療法としては、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤を併用して用いる方法が一般に採られている。
【０００３】
逆転写酵素は、ウィルスＲＮＡをＤＮＡへと読み換える際に必要なＨＩＶが保有している酵素であり、その阻害剤としてはＡＺＴ等が挙げられる。
【０００４】
プロテアーゼは、ウィルス蛋白翻訳後に必要となる酵素で、その阻害剤としてはサキナビル等が用いられている。
【０００５】
ところでＨＩＶ遺伝子は、ＲＮＡ結合蛋白であるＲｅｖ蛋白をコードしている。このＲｅｖ蛋白は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を持ち、ウィルスｍＲＮＡの核外輸送に必要であり、ひいてはＨＩＶの複製・増殖に必須の蛋白といえる。このＲｅｖ蛋白の機能を阻害・抑制する物質として、これまでleptomycin Bおよびvaltrate等が報告されている（下記の非特許文献１・２参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Wolff, B. et al., Chem. Biol., 1997, 4, 139-147頁
【非特許文献２】Murakami, N. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 2807-2810頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、従来のエイズ治療においては、逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤が一般に使用されている。
【０００８】
しかしながら、ＨＩＶは変異の頻度が高く、薬剤耐性ウィルスが容易に出現することが知られている。そこで、このような従来の薬剤とは異なる新規作用機序に基づく抗ＨＩＶ剤開発の必要性が増大している。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、新規な抗ＨＩＶ化合物を提供すること、とりわけ従来の抗ＨＩＶ薬剤とは異なる作用機序に基づく新規な抗ＨＩＶ化合物、並びにそれを用いた医薬、機能性食品などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、天然物から単離・精製した化合物（即ち、1'-acetoxychavicol acetate）が細胞毒性も低く、ＨＩＶの複製に必須のＲｅｖ蛋白の核外移行を阻害・抑制するという新規作用機序で抗ＨＩＶ活性を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、医療上および産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｃ）の発明を包含するものである。
Ａ）  下記の式（１）により表される化合物を有効成分とする抗ＨＩＶ剤。
【化２】
2005179201.tif 000002
Ｂ）  上記の式（１）により表される化合物を有効成分とするＨＩＶ由来蛋白核外移行阻害剤。
Ｃ）  上記の式（１）により表される化合物を含有し、抗ＨＩＶ作用を有する食用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗ＨＩＶ化合物は、ＨＩＶ由来蛋白の核外移行阻害を抗ＨＩＶ作用の機構としており、既存薬と作用点を異にするため、既存薬に対する耐性ウィルスに対しても有効に作用する抗ＨＩＶ薬として効果がある。
【００１３】
また、本発明の抗ＨＩＶ化合物は、医薬として有用であるのみならず、抗ＨＩＶ作用を有する食用組成物（機能性食品）としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１５】
前述のように、ＨＩＶのＲｅｖ蛋白は核外移行シグナル（ＮＥＳ）を持ち、このＮＥＳはＲｅｖ蛋白の核外移行に本質的な役割を有する。
【００１６】
本発明者は、天然物であるコウズク（別名ナンキョウソウ（Alpinia galanga））の抽出物から、上記ＮＥＳ含有蛋白に対する核外移行阻害活性を有する画分を得た。さらに、得られた画分に含まれる活性化合物について、その構造を1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル法、13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル法、および高速電子衝撃質量分析法により決定したところ、上記の式（１）に示される化学構造の1'-アセトキシシャビコール酢酸エステル（1'-acetoxychavicol acetate）であると同定した。
【００１７】
上記の活性化合物について、抗ＨＩＶ活性をｐ２４抗原測定法により測定した。その結果、同化合物には高い抗ＨＩＶ活性が認められた。また、同化合物のウィルス感染リンパ球細胞（ＭＴ−４）に対する細胞毒性をＭＴＴアッセイにより検討したところ、抗HIV活性の認められる濃度では細胞毒性は検出されなかった。なお、これら実験方法、実験結果の詳細は後述の実施例において説明する。
【００１８】
このように、本発明の抗ＨＩＶ化合物（即ち、上記1'-acetoxychavicol acetate）は細胞毒性もなく、ＨＩＶ由来蛋白であるＲｅｖ蛋白の核外移行を阻害・抑制するという新規作用機序で抗ＨＩＶ活性を示すものである。したがって、本発明の抗ＨＩＶ化合物は、新たな抗ＨＩＶ剤として医薬品への利用が可能である。なお、医薬品への利用には、本発明の抗ＨＩＶ化合物を医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することも含まれる。
【００１９】
本発明の抗ＨＩＶ化合物は、植物などから単離・精製したものであってもよいし、公知の化学合成法を用いて合成したものであってもよい。さらに、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施し、製造してもよい。
【００２０】
なお本明細書において、「抗ＨＩＶ剤」とは、広くエイズ治療またはその発症予防に使用される薬剤を意味し、例えば、ＨＩＶ感染症および感染に伴う各種症状（発熱、下痢、貧血など）に対する症状改善薬、ならびにその指標疾患（カンジダ症、侵襲性子宮頚癌、ＣＭＶ感染症、ＨＩＶ関連脳症、カポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、結核など）の治療薬として利用する場合も含まれる。
【００２１】
本発明の抗ＨＩＶ化合物の用途は、上記抗ＨＩＶ剤としての用途に限定されるものではない。本発明の抗ＨＩＶ化合物は、例えば、試験研究用の試薬として、あるいは、エイズ予防（改善）効果をもった機能性食品（食用組成物）の原材料として利用可能である。
【００２２】
本発明の抗ＨＩＶ化合物を抗ＨＩＶ剤として医薬品（医薬用組成物）に用いる場合の一例について説明する。本発明の抗ＨＩＶ化合物は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト（または動物）に投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２３】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００２４】
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００２５】
なお、公知のＤＤＳを利用し、例えば、本発明の抗ＨＩＶ化合物をリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明の抗ＨＩＶ化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００２６】
本発明の抗ＨＩＶ化合物を食品（食用組成物）に用いる場合は、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明の抗ＨＩＶ化合物を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や保健食品等として利用できる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２８】
生薬コウズク（別名ナンキョウソウ（Alpinia galanga））から、本発明の化合物をそのＨＩＶ蛋白由来ＮＥＳ（核外移行シグナル）含有蛋白の核外移行阻害活性を指標として以下のような手順で抽出、単離した。
【００２９】
（１）メタノールによる抽出
粉砕したコウズク２２ｇにメタノール２００ｍＬを加え室温で３時間抽出した。濾過し、残査にメタノール２００ｍＬを加え加熱還流下２時間抽出した。この加熱抽出を２回行った。全ての濾液を濃縮し、２．１ｇの固体（以下「メタノール抽出物」という。）を得た。
【００３０】
（２）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分別
上記（１）で得たメタノール抽出物２．１ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別した。試料２．１ｇをSiO2（８０ｇ）を充填したガラスカラム（充填溶媒 n-hexane：EtOAc＝２０：１）に吸着させ、溶出溶媒としてn-hexane：EtOAc＝２０：１を通導させ、画分Ａ（３１ｍｇ）を得た。さらに、溶出溶媒をn-hexane：EtOAc＝１０：１、n-hexane：EtOAc＝１：１、CHCl3：MeOH＝１０：１、CHCl3:MeOH＝５：２、MeOHと順次変化させ、以下の各画分、即ち、画分Ｂ（１８ｍｇ）、画分Ｃ（３１７ｍｇ）、画分Ｄ（２１ｍｇ）、画分Ｅ（４７ｍｇ）、画分Ｆ（１５ｍｇ）、画分Ｇ（１０ｍｇ）、画分Ｈ（８１ｍｇ）、画分Ｉ（１．４ｇ）を得た。
【００３１】
（３）画分Ａ〜Ｉの核外移行阻害活性
上記画分Ａ〜ＩのＨＩＶ蛋白由来ＮＥＳ含有蛋白に対する核外移行阻害活性を次のようにして測定した。
【００３２】
上記ＮＥＳ、ＧＦＰ（蛍光蛋白）、ＮＬＳ（核移行シグナル）の融合蛋白を発現する酵母の培養液９０μＬを９６ウェルのプレートに分注した。被検薬物（上記画分Ａ〜Ｉおよびメタノール抽出物）をＤＭＳＯに溶解させ、培地を用いて適切な濃度に希釈した後、１０μＬの被検薬物溶液を先の９６ウェルプレートに添加して合計１００μＬとする。添加したＤＭＳＯの終濃度は１％である。続いて３０℃で３時間震盪培養し、培養液１０μＬを用いて作製したプレパラートを蛍光顕微鏡下で観察し、蛍光蛋白の局在を確認した。８０％以上の酵母が核のみ蛍光を発している場合に（＋）、５０％以上８０％未満の場合に（±）と判定し、核、細胞質ともに蛍光が観察されたものは（−）とする。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005179201.tif 000003
【００３４】
（４）画分Ｃの同定
上で得た画分Ｃについて1Ｈ ＮＭＲ、13Ｃ ＮＭＲ、およびＦＡＢ−ＭＳの測定を行い、文献報告値と比較して活性化合物１の構造を同定した。
【００３５】
その結果、活性化合物１は、前記の式（１）に示される化学構造の1'-アセトキシシャビコール酢酸エステル（1'-acetoxychavicol acetate）であると判断された。
【００３６】
（５）活性化合物１の抗ＨＩＶ活性
活性化合物１について抗ＨＩＶ活性を以下に示す方法で測定した。
【００３７】
ＭＴ−４細胞５×１０5 cells/mLを１０％量のＦＢＳ（fetal bovine serum）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、ＨＩＶ−１ ＮＬ４３株を添加し、５％ＣＯ2 の存在下、３７℃で２時間培養した。遠心後（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）、上清を除去し、さらにＭＴ−４細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄した。このようにして調製した ＨＩＶ−１感染ＭＴ−４細胞の懸濁液（４×１０5 cells/mL）１００μＬに、最終濃度の２倍の濃度の被験物質含有培地を１００μＬ添加（２％ＥｔＯＨ含有）し、上記と同じ条件下で７２時間培養した。その後、培養上清中のｐ２４の産生量を市販のHIV-antigen kit（Zeptometrix社製）を用いて定量することで、活性化合物１の抗ＨＩＶ活性を測定した。
【００３８】
また、ＭＴ−４細胞に対する活性化合物１の細胞毒性を以下の方法で検討した。ＨＩＶ−１ウィルスを感染させていない細胞の懸濁液１００μＬ（４×１０5 cells/mL）に、最終濃度の２倍の濃度の被験物質含有培地を１００μＬ添加（２％ＥｔＯＨ含有）し、上記と同じ条件下で７２時間培養した。続いて、MTT-PBS stock solution ２５μＬを添加し、同条件下で３時間培養後、上清を除去して生成した MTT formazan を２００μＬのＤＭＳＯ で溶解し、比色定量法（５４０ｎｍ）により生細胞数を定量することで、活性化合物１の細胞毒性を調べた。以上の実験結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2005179201.tif 000004
【００４０】
上記表２に示すように、活性化合物１、即ち本発明の化合物は、濃度２μＭおよび１μＭのいずれの場合も高い抗ＨＩＶ活性を示した。また、活性化合物１の細胞毒性は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上のように、本発明の抗ＨＩＶ化合物は細胞毒性もなく、ＨＩＶ由来蛋白であるＲｅｖ蛋白の核外移行を阻害・抑制するという新規作用機序で抗ＨＩＶ活性を示すものであり、前述したとおり、新たな抗ＨＩＶ剤として医薬品へ利用できるほか、食品材料への利用など産業上幅広く利用できるものである。