(57)【要約】【課題】癌遺伝子をｃＤＮＡライブラリーから網羅的に探索し取得する。【解決手段】人工的にＴＥＬのＰＮＴ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡの  下流にｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリーを作製し、宿主細胞で発現させるこ  とにより、ＴＥＬのＰＮＴ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとの融合ＤＮＡ  の中から新規な癌遺伝子を網羅的に探索することができる。探索により取得さ  れた癌遺伝子を発現する細胞は、癌の治療に有用な物質の探索に用いることが  できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、癌遺伝子の探索方法。
（ａ）ベクターのプロモーターの下流に、ＴＥＬのＰＮＴ領域をコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡが連結した構造を有するｃＤＮＡライブラリーを作製する
（ｂ）宿主の細胞に（ａ）で作製したｃＤＮＡライブラリーを導入し、ＴＥＬのＰＮＴ領域をコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡを発現させる
（ｃ）ｃＤＮＡライブラリーを導入した（ｂ）の細胞から、トランスフォームした細胞を選択する
（ｄ）（ｃ）で選択された細胞に導入された融合ＤＮＡの塩基配列を解析し、該融合ＤＮＡを癌遺伝子として同定する
【請求項２】
（ｂ）の工程において、宿主の細胞がサイトカイン依存性の細胞であり、かつ（ｃ）の工程において、サイトカイン非依存性の増殖を示す細胞を、トランスフォームした細胞として選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）の工程において、プロモーターが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの下流にＴＥＬのＰＮＴ領域をコードするＤＮＡを連結した構造を有するレトロウイルスベクター。
【請求項５】
配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末に配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが付加した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末に以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドが付加した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号６の１７９、１８９、１９１、１９９、２００、２０５、２１３、２２０、２２５、２２８、２３２および２３３番目のうちのいずれかの位置のアミノ酸から５１２番目のアミノ酸までのアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号７の４７、５５、１０２、１９４、２００および２２７番目のうちのいずれかの位置のアミノ酸から５０５番目のアミノ酸までのアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列
【請求項７】
配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドが配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項５または６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号１５〜３９のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡ。
【請求項１０】
宿主の細胞に請求項９に記載の組換え体ＤＮＡを導入することにより、トランスフォームした細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞の癌細胞に特有の形質を抑制する物質を探索する方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞の癌細胞に特有の形質を抑制する物質を選択することにより、該細胞に導入したＤＮＡがコードするキナーゼの活性を阻害する物質を探索する方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞の癌細胞に特有の形質を抑制する物質を選択することにより、癌の治療に有用な物質を探索する方法。
【請求項１４】
宿主の細胞がサイトカイン依存性の細胞である請求項１０に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞のサイトカイン依存性の増殖を抑制する物質を選択することにより、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を探索する方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を選択することにより、該細胞に導入したＤＮＡがコードするキナーゼの活性を阻害する物質を探索する方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を選択することにより、癌の治療に有用な物質を探索する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌遺伝子を効率的に探索する方法に関する。また、該方法により得られた癌遺伝子を導入した細胞株を用いる癌の治療に有用な物質を探索する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は細胞増殖、細胞死の制御が破綻した状態であり、その原因として細胞の増殖や細胞死等に関与する遺伝子の変異や発現異常などがあげられる。変異や発現異常を起こした癌遺伝子を同定することは発癌の原因を解明し、その治療にも役立つことからさまざまな方法が考案され工夫が重ねられてきた。癌遺伝子を探索する方法としては、癌細胞から得られた遺伝子を、他の細胞に遺伝子導入し、形質の変化した細胞に導入された遺伝子を解析し、同定する方法があげられる。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄらはレトロウイルスベクターに癌細胞から得た遺伝子を組み込み、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に遺伝子導入し、形質が変化した細胞を得ることによって効率良く癌遺伝子を同定することを報告している（非特許文献１参照）。しかし、これまでの方法では、遺伝子源とした癌細胞で実際に変異や遺伝子の転座がおきているような癌遺伝子しか単離できない。
【０００３】
ＴＥＬは、Ｅｔｓファミリーに属する転写因子である。ＴＥＬ遺伝子は、白血病などの癌細胞において、染色体転座により、さまざまな遺伝子と融合遺伝子を形成することが知られている（非特許文献２参照）。たとえば、ＴＥＬ遺伝子とＪＡＫ２（非特許文献３参照）、ＡＢＬ１（非特許文献４参照）、ＡＲＧ／ＡＢＬ２（非特許文献５参照）、ＳＹＫ（非特許文献６参照）、血小板由来増殖因子β受容体（ＰＤＧＦβＲ）（非特許文献７参照）、ニューロトロフィン３受容体ＴＲＫＣ（非特許文献８参照）、繊維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）（非特許文献９参照）等のチロシンキナーゼ遺伝子との融合遺伝子が報告されている。これらのＴＥＬとチロシンキナーゼとの融合タンパク質においては、ＴＥＬのｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ構造を有するポインテッド領域（以後、ＰＮＴ領域と略する）を介した、タンパク質のオリゴマー化が起こることによりチロシンキナーゼの恒常的活性化が生じ、細胞の癌化に関与すると考えられている。本知見に基づき、受容体型チロシンキナーゼであるＰＤＧＦβＲおよびＦＬＴ３それぞれの遺伝子とＴＥＬ遺伝子との融合遺伝子を作製し、この融合遺伝子を細胞に導入することにより、恒常的に活性化したチロシンキナーゼを発現する細胞を作製し、細胞の癌化の機序を解析する研究が報告されている（非特許文献１０および１１参照）。これまでに、ＴＥＬ遺伝子との融合遺伝子として見出されたキナーゼ遺伝子はいずれも、チロシンキナーゼファミリーに属する遺伝子であり、セリン／スレオニンキナーゼ遺伝子は報告されていない。
【０００４】
【非特許文献１】
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（米国），１９９５年，第１５巻，第２号，ｐ．７０４−７１０
【非特許文献２】
リューケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ），（イギリス），１９９９年，第１３巻，第１号，ｐ．６−１３
【非特許文献３】
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），（米国），１９９７年，第２７８巻，第５３４１号，ｐ．１３０９−１３１２
【非特許文献４】
キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），（米国），１９９５年，第５５巻，第１号，ｐ．３４−３８
【非特許文献５】
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），（米国），１９９９年，第９４巻，第１２号，ｐ．４３７０−４３７３
【０００５】
【非特許文献６】
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），（米国），２００１年，第９７巻，第４号，ｐ．１０５０−１０５５
【非特許文献７】
セル（Ｃｅｌｌ），（米国），１９９４年，第７７巻，第２号，ｐ．３０７−３１６
【非特許文献８】
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），（米国），１９９９年，第９３巻，第４号，ｐ．１３５５−１３６３
【非特許文献９】
キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），（米国），２００１年，第６１巻，第２３号，ｐ．８３７１−８３７４
【非特許文献１０】
エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ），（オランダ），２０００年，  第２８巻，第５号，ｐ．５８４−５９３
【非特許文献１１】
リューケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ），（イギリス），２００１年，第１５巻，第７号，ｐ．１００１−１０１０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の方法で見いだされてきた癌遺伝子は、遺伝子源とした癌細胞で、変異や転座を起こしている遺伝子に限定されてきた。本発明の目的は、癌遺伝子として、細胞をトランスフォームする機能を有するＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリーから網羅的に探索し取得する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、人工的にＴＥＬのＰＮＴ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡの下流にｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリーを作製し、宿主細胞で発現させることにより、新規な癌遺伝子として、ＴＥＬのＰＮＴ領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡを網羅的に探索する方法を考案し、また該探索方法により得られる癌遺伝子を用いる癌の治療に有用な物質を探索する方法を見出した。本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
【０００８】
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、癌遺伝子の探索方法。
（ａ）ベクターのプロモーターの下流に、ＴＥＬのＰＮＴ領域をコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡが連結した構造を有するｃＤＮＡライブラリーを作製する
（ｂ）宿主の細胞に（ａ）で作製したｃＤＮＡライブラリーを導入し、ＴＥＬのＰＮＴ領域をコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡを発現させる
（ｃ）ｃＤＮＡライブラリーを導入した（ｂ）の細胞から、トランスフォームした細胞を選択する
（ｄ）（ｃ）で選択された細胞に導入された融合ＤＮＡの塩基配列を解析し、該融合ＤＮＡを癌遺伝子として同定する
（２）（ｂ）の工程において、宿主の細胞がサイトカイン依存性の細胞であり、かつ（ｃ）の工程において、サイトカイン非依存性の増殖を示す細胞を、トランスフォームした細胞として選択する、（１）に記載の方法。
（３）（ａ）の工程において、プロモーターが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである（１）または（２）に記載の方法。
（４）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの下流にＴＥＬのＰＮＴ領域をコードするＤＮＡを連結した構造を有するレトロウイルスベクター。
（５）配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末に配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが付加した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０００９】
（６）配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＣ末に以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドが付加した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｉ）配列番号６の１７９、１８９、１９１、１９９、２００、２０５、２１３、２２０、２２５、２２８、２３２および２３３番目のうちのいずれかの位置のアミノ酸から５１２番目のアミノ酸までのアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号７の４７、５５、１０２、１９４、２００および２２７番目のうちのいずれかの位置のアミノ酸から５０５番目のアミノ酸までのアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号８〜１４のいずれかのアミノ酸配列
（７）配列番号４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドが配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである（５）または（６）に記載のＤＮＡ。
（８）配列番号１５〜３９のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ。
（９）（５）〜（８）のいずれか１項に記載のＤＮＡをベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡ。
（１０）宿主の細胞に（９）に記載の組換え体ＤＮＡを導入することにより、トランスフォームした細胞。
（１１）（１０）に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞の癌細胞に特有の形質を抑制する物質を探索する方法。
（１２）（１０）に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞の癌細胞に特有の形質を抑制する物質を選択することにより、該細胞に導入したＤＮＡがコードするキナーゼの活性を阻害する物質を探索する方法。
（１３）（１０）に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞の癌細胞に特有の形質を抑制する物質を選択することにより、癌の治療に有用な物質を探索する方法。
（１４）宿主の細胞がサイトカイン依存性の細胞である（１０）に記載の細胞。
（１５）（１４）に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を選択することにより、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を探索する方法。
【００１０】
（１６）（１４）に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を選択することにより、該細胞に導入したＤＮＡがコードするキナーゼの活性を阻害する物質を探索する方法。
（１７）（１４）に記載の細胞と試験物質とを接触させ、試験物質を接触させなかった場合と比較して、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を選択することにより、癌の治療に有用な物質を探索する方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
１．癌遺伝子を探索する方法
本発明の癌遺伝子の探索方法は、（１）適当な発現ベクターのプロモーターの下流に、ＴＥＬのＰＮＴ領域（以下、ＴＥＬ  ＰＮＴと略す）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとｃＤＮＡとを融合させたＤＮＡを連結した構造を有するｃＤＮＡライブラリーを作製し、（２）このｃＤＮＡライブラリーを宿主の細胞に導入して融合ＤＮＡを発現させた後、（３）トランスフォームした細胞を選択し、（４）選択した細胞に導入したＤＮＡの配列を解析し、癌遺伝子を同定する方法である。そのままでは細胞をトランスフォームできないが、オリゴマー化することにより恒常的に活性化し、細胞をトランスフォームできるようになるポリペプチドが、細胞には多数存在するが、従来の方法では、これらのポリペプチドの遺伝子を癌遺伝子として単離できなかった。本方法では、ｃＤＮＡ中のこれらのポリペプチドをコードするｃＤＮＡをＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡとの融合ＤＮＡとし、宿主細胞内で発現させることにより、これらのポリペプチドはオリゴマー化して恒常的に活性化し、細胞をトランスフォームできるようになる。本発明において「トランスフォームする」とは、細胞を、元の細胞の形質とは異なる、癌細胞に特有な形質を少なくとも一つ有するように変化させることを意味する。本発明において、「癌遺伝子」とは、宿主の細胞に導入し、発現させたときに、該細胞がトランスフォームするような機能を有するＤＮＡを意味する。「癌細胞に特有な形質」としては、例えば、サイトカイン非依存的な増殖、足場非依存性の増殖、増殖の接触阻害の喪失等があげられる。
【００１２】
したがって、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡとこれらのポリペプチドをコードするｃＤＮＡとの融合ＤＮＡを、癌遺伝子として網羅的に取得することが可能となる。以下、（１）〜（４）の各工程を説明する。
【００１３】
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーは、動物細胞用の発現ベクターのプロモーターの下流に、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入したベクターを調製し、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡの３’側に、適当な細胞から取得したｃＤＮＡを挿入することによって作製することができる。
【００１４】
動物細胞用の発現ベクターは、動物細胞で機能するプロモーター、ベクターを導入した細胞を選択するための、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を有していることが必要である。さらに、ベクターの調製が容易なように、宿主を大腸菌にしたときに、大腸菌で自立複製できるオリジンと、ベクターを導入した宿主大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子を有していることが好ましい。
【００１５】
ベクターとしては、通常のプラスミドベクターでもウイルスベクターでもよいが、種々の宿主細胞に効率よく、ＤＮＡを導入でき、導入後のＤＮＡが安定している、レトロウイルスベクターが好ましい。
ベクターに挿入したＤＮＡを発現させるための、動物細胞で機能するプロモーターとしては、宿主の細胞の種類によらず、下流につなげたＤＮＡを大量に発現させる強力なプロモーター活性を有するものが好ましい。このようなプロモーターとしては、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（以下、ＧＡＰＤＨプロモーターとよぶ）があげられる。レトロウイルスベクターにおいても、プロモーター活性を有する５’の長い末端反復配列（以下、ＬＴＲと略す）の他に、ＧＡＰＤＨプロモーターを有していることが好ましい。プロモーターの下流には、ＤＮＡを挿入するために、適当な制限酵素サイトを有することが好ましい。
このようなベクターとして、モロニーマウス白血病ウイルス（以下、ＭｏＭＬＶと略す）の５’  ＬＴＲおよび３’  ＬＴＲ、ＧＡＰＤＨプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１オリジンを有するｐＨＮＧＡＰをあげることができる。
【００１６】
ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドは、ＴＥＬのアミノ酸配列の５７〜１０８番目の配列（配列番号４０）を含むポリペプチドであればよく、該配列のＮ末またはＣ末にさらに１〜数十個のアミノ酸配列が付加してもよい。該ポリペプチドとしては、例えば、配列番号４１のアミノ酸配列からなる、ＴＥＬのＮ末端１５４アミノ酸のポリペプチド断片、該配列のＣ末にＥｃｏＲＩアダプター由来の５アミノ酸が付加した、配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等をあげることができる。また、このようなポリペプチドのＮ末にさらにＦｌａｇエピトープ（配列番号５５）、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン・エピトープ（以下、ＨＡエピトープと表す、配列番号５６）などのタグ配列を含むアミノ酸配列を付加したポリペプチドも、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドに含まれる。ＴＥＬのｃＤＮＡの配列から、ＰＮＴ領域を含む断片をコードする適当な領域を選択し、該領域の塩基配列に基づいたプライマーを用いてヒトｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを調製することができる。また、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドが、タグ配列を含むアミノ酸配列をＮ末に付加したポリペプチドの場合は、上記のＰＣＲにおいて、フォワードプライマーとしてＴＥＬのｃＤＮＡに基づく配列の５’側に、タグ配列を含むアミノ酸配列をコードする配列を付加したプライマーを用いることにより、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを調製することができる。あるいは、タグ配列をコードする２本鎖ＤＮＡを、化学合成やＰＣＲを利用して作製するか、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（コダック社製）等のタグ配列を含むベクターから制限酵素切断により単離し、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡに結合させることにより調製することができる。
【００１７】
得られたＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡを上記発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、得られたベクターに下記のｃＤＮＡを挿入することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。なお、上記のＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡの調製時に用いるリバースプライマーを、５’端にＮｏｔＩおよび別の適当な制限酵素の認識配列を有するものを用い、ｃＤＮＡを正しい方向で挿入できるようにすることが好ましい。
【００１８】
ｃＤＮＡは、適当な細胞あるいは組織から、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）に記載の方法によって、あるいはファーストトラック（ＦａｓｔＴｒａｃｋ）ｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン社製）等のキットを用いてｍＲＮＡを抽出する。抽出したｍＲＮＡをＧｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法〔Ｇｅｎｅ，  ２５，  ２６３  （１９８３）〕により、ｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素反応によりｃＤＮＡの第１鎖を合成した後、リボヌクレアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを用いた反応により２本鎖ｃＤＮＡを合成することができる。ｃＤＮＡをベクターのプロモーターに対して正しい方向で挿入するためには、オリゴｄＴプライマーの５’側に、ＮｏｔＩの認識配列を有することが好ましい。ｍＲＮＡを抽出する細胞や組織は、哺乳類のものであれば、いかなる細胞や組織でもよいが、ヒトの細胞や組織、細胞株が好ましい。癌患者から採取した癌細胞あるいは癌組織を用いることもできる。合成した２本鎖ｃＤＮＡの末端に、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡの下流の制限酵素サイトの突出末端となるような２本鎖ＤＮＡのアダプターを付加し、さらにＮｏｔＩで切断する。このｃＤＮＡを、ベクターのＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡの下流の制限酵素サイト−ＮｏｔＩ間に挿入することにより、ｃＤＮＡが正しい方向で挿入されたｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００１９】
（２）宿主細胞へのｃＤＮＡライブラリーの導入
宿主細胞としては、癌化していない細胞株を用いる。細胞株としては、サイトカイン依存性細胞、例えばＩＬ−３依存性の細胞である３２ＤおよびＢａ／Ｆ３、あるいはＮＩＨ３Ｔ３などをあげることができる。
【００２０】
宿主の細胞へのｃＤＮＡライブラリーの導入は、ライブラリーのベクターによって適切な方法で行う。通常のプラスミドベクターの場合は、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  ７４１３  （１９８７）〕等をあげることができる。
ウイルスベクターの場合は、ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質を発現するパッケージング細胞を樹立し、このパッケージング細胞にウイルスベクターを導入するか、ウイルス粒子形成に必要な蛋白質の発現ベクターを作製し、このベクターをヒト腎癌系細胞株２９３細胞等の細胞に共導入し、細胞を培養することにより、高濃度の組換えウイルスを含む培養上清（以下、ウイルス上清とよぶ）を得ることができる。得られたウイルス上清を、宿主の細胞に添加して培養することにより、宿主細胞にウイルスを感染させ、ｃＤＮＡライブラリーを導入することができる。ウイルスのパッケージングに必要な蛋白質としては、レトロウイルスベクターの場合にはＭｏＭＬＶなどのレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖや水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質などをあげることができる。
【００２１】
（３）トランスフォームした細胞の選択
ｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞を、選択培地で培養し、増殖してきた細胞のコロニーを単離することにより、トランスフォームした細胞を選択することができる。トランスフォームした細胞が有する癌細胞に特有の性質としては、サイトカイン非依存的な増殖、足場非依存性の増殖、増殖の接触阻害の喪失等をあげることができる。選択培地は、宿主の細胞が増殖できず、トランスフォームした細胞だけが増殖できるような培地であり、例えば、サイトカイン依存性の細胞を宿主とした場合は、そのサイトカインを含まない培地、足場非依存性の増殖をしない細胞を宿主とした場合は、軟寒天培地をあげることができる。増殖の接触阻害の喪失の場合は、特に選択培地を用いなくとも、癌遺伝子の発現により、トランスフォームした細胞が増殖を続け、増殖巣を形成するので、増殖巣を単離すればよい。
【００２２】
（４）融合ＤＮＡの配列の解析と、癌遺伝子の同定
（３）で選択した細胞は、ｃＤＮＡが染色体に挿入されているので、細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型にして、ベクターのＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡよりも上流の配列およびｃＤＮＡを挿入した制限酵素サイトよりも下流の配列にそれぞれ対応したプライマーを用いたＰＣＲにより、導入されたＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡを単離することができる。得られた融合ＤＮＡは、癌遺伝子と考えられるので、ジデオキシ法やＤＮＡシークエンサーにより、塩基配列を解析し、癌遺伝子の配列を明らかにすることができる。また、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡに融合したｃＤＮＡの配列をクエリーとして、塩基配列データベースを検索することにより、恒常的に活性化されたときに、細胞をトランスフォームする機能を有するポリペプチドをコードしている相手方の遺伝子を同定することができる。
【００２３】
上記の方法で得られる新規な癌遺伝子として、配列番号１５〜３９のいずれかの配列を含むＤＮＡをあげることができる。配列番号１５〜３９の配列は、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡにＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲ、ＳＹＫ、ＦＬＴ３、ＴＹＫ２、ＡＲＡＦ１のいずれかのｃＤＮＡのキナーゼドメインをコードする領域を含む断片が同じフレームで融合した融合ＤＮＡの塩基配列である。
【００２４】
これらの癌遺伝子のうち、配列番号１５〜３３、３８および３９の配列を含むＤＮＡのような、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲ、ＴＹＫ２またはＡＲＡＦ１遺伝子とＴＥＬ遺伝子との融合遺伝子は、これまでに知られておらず、本発明により初めて見いだされたものである。これらの５遺伝子とＴＥＬ遺伝子との融合遺伝子は、宿主細胞内で、コードするキナーゼがＰＮＴ領域を介してオリゴマー化し、その結果、恒常的に活性化し、細胞をトランスフォームすると考えられる。したがって、配列番号１５〜３３、３８および３９の配列だけでなく、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲ、ＴＹＫ２またはＡＲＡＦ１のキナーゼドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡと、ＴＥＬ  ＰＮＴをコードするＤＮＡとが同じフレームで融合しているＤＮＡは、細胞をトランスフォームする能力があると考えられる。
【００２５】
以上から、本発明の探索方法により得られる癌遺伝子には、ＴＥＬ  ＰＮＴ（アミノ酸配列：配列番号４０）を含むポリペプチドのＣ末にＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲ、ＴＹＫ２、ＡＲＡＦ１のキナーゼドメインのアミノ酸配列（それぞれのアミノ酸配列を配列番号１〜５に示す）のいずれかを含むポリペプチドが付加した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドのＣ末に、（１）ＬＹＮのアミノ酸配列（配列番号６）の１７９、１８９、１９１、１９９、２００、２０５、２１３、２２０、２２５、２２８、２３２および２３３番目のうちのいずれかの位置のアミノ酸から５１２番目のアミノ酸までのアミノ酸配列、（２）ＨＣＫのアミノ酸配列（配列番号７）の４７、５５、１０２、１９４、２００および２２７番目のうちのいずれかの位置のアミノ酸から５０５番目のアミノ酸までのアミノ酸配列、（３）ＦＧＲのアミノ酸配列の２２１〜５２９番目のアミノ酸配列（配列番号８）、（４）ＳＹＫのアミノ酸配列の１１５または３６５番目のアミノ酸から６３５番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（配列番号９または１０）、（５）ＦＬＴ３のアミノ酸配列の６０２または６０５番目のアミノ酸から９９３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（配列番号１１または１２）、（６）ＴＹＫ２の７７６〜１１８７番目のアミノ酸配列（配列番号１３）、（７）ＡＲＡＦ１の３０３〜６０６番目のアミノ酸配列（配列番号１４）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドが付加した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、これらのＤＮＡにおいて、ＴＥＬのＰＮＴドメインを含むポリペプチドが、ＴＥＬの１〜１５４番目のアミノ酸配列（配列番号４１）を含むポリペプチドであるＤＮＡが含まれる。これらのＤＮＡは、ヒトｃＤＮＡからＰＣＲにより、上記のＤＮＡがコードするＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲ、ＳＹＫ、ＦＬＴ３、ＴＹＫ２またはＡＲＡＦ１のｃＤＮＡの部分断片を単離し、（１）で得られるＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡと結合させることによっても、得ることができる。
【００２６】
２．癌の治療に有効な物質を探索する方法
癌遺伝子をベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡを宿主の細胞に導入することによりトランスフォームした細胞を調製する。このような細胞は、１．（３）で選択したトランスフォームした細胞を用いることもできるし、それとは別に１．（４）で取得される癌遺伝子を、１．（１）に記載した動物細胞用の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製し、この組換え体ＤＮＡを、１．（２）に記載した、癌細胞に特有の形質を有しない宿主の細胞に導入することによって、新しく得ることもできる。
【００２７】
上記のトランスフォームした細胞に試験物質を接触させ、該細胞の癌細胞に特有の形質を観察または測定し、試験物質を接触させなかった場合の該形質と比較することにより、該形質を抑制する物質を探索することができる。癌遺伝子がキナーゼ遺伝子の場合は、トランスフォームした細胞が有する癌遺伝子のキナーゼ活性を阻害する物質を、この方法で探索することができる。このような物質は、癌細胞に特有の形質を抑制し、その増殖を抑制するので、癌の治療に有効な物質となる。したがって、この方法で癌の治療に有効な物質を探索することができる。
【００２８】
宿主の細胞が、サイトカイン依存性の細胞の場合は、トランスフォームした細胞はサイトカイン非依存性の増殖を示すので、トランスフォームした細胞に試験物質を接触させ、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を測定し、試験物質を接触させなかった場合のサイトカイン非依存性の増殖と比較することにより、該細胞のサイトカイン非依存性の増殖を抑制する物質を探索することができる。癌遺伝子がキナーゼ遺伝子の場合は、トランスフォームした細胞が有する癌遺伝子のキナーゼ活性を阻害する物質を、この方法で探索することができる。このような物質は、癌細胞の増殖を抑制するので、癌の治療に有効な物質となる。したがって、この方法で癌の治療に有効な物質を探索することができる。
【００２９】
生体内での毒性や副作用の点から、正常細胞の増殖には影響せず、癌細胞特異的に増殖を抑制する物質が、癌の治療薬としては好ましいが、上記のトランスフォームした細胞のサイトカイン非依存性の増殖の抑制と、癌遺伝子を導入しない宿主細胞のサイトカイン依存性の増殖の抑制の度合いを比較することにより、癌細胞特異的に増殖を抑制する物質を選択でき、非特異的な細胞毒性を示す物質などを選択からはずすことができる。また、各試験物質について、融合の相手遺伝子が異なる融合遺伝子をそれぞれ発現するトランスフォームした細胞間で、サイトカイン非依存性の増殖など、癌細胞特有の形質の抑制の度合いを比較することにより、それぞれの細胞に特異的に癌細胞特有の形質を抑制する物質、例えば、それぞれの細胞が発現するキナーゼを特異的に阻害する物質を選択できる。
【００３０】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００３１】
【実施例】
実施例１  癌遺伝子の探索方法
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
（ａ）レトロウイルスベクターｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴの構築
レトロウイルスベクターｐＬＲＮＬ〔Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６５，  １２０２  （１９９１）〕のＭｏＭＬＶ  ５’ＬＴＲの上流のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ間に、ｐＨＣＭＶ−Ｇ〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ９５６４  （１９９４）〕から切り出したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを挿入し、一過性の発現系で高コピーのレトロウイルスゲノムが転写されるようにした。このベクターをＥｃｏＲＩで切断後、末端を平滑化し、自己ライゲーションをして、ＥｃｏＲＩサイトを消失させたベクターｐＣＬＲＮＬを作製した。ｐＣＬＲＮＬをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、自己ライゲーションをしてラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを除き、ｐＣＬＮＬを作製した。
【００３２】
配列番号４３および４４の配列からなるプライマーＧＡＰＤＨＰＲＦおよびＧＡＰＤＨＰＲＲを用いて、健常人ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨプロモーター断片を増幅した。この断片をＢｓｔＢＩおよびＣｌａＩで切断し、ｐＣＬＮＬのＢｓｔＢＩ−ＣｌａＩ間に挿入した。さらにＧＡＰＤＨプロモーターの下流のＣｌａＩサイトに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）のＴ３プロモーター、マルチクローニングサイト（ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトを含む）およびＴ７プロモーターを含む断片を、Ｔ３プロモーターがＧＡＰＤＨプロモーター側になるように挿入し、ｐＣＬＮＧＡＰを作製した。
【００３３】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）から、アンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌ  Ｅ１オリジンを含むＳｓｐＩ−ＰｖｕＩＩ断片を単離し、以下のようにしてｐＣＬＮＧＡＰに導入することにより、高コピーのプラスミドが得られるように改善したベクターｐＨＮＧＡＰを作製した。すなわち、ｐＣＬＮＧＡＰから、ＣＭＶプロモーターからＧＡＰＤＨプロモーターまでを含むＳｓｐＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。また、ｐＣＬＮＧＡＰのＥｃｏＲＩサイトからＭｏＭＬＶ  ３’  ＬＴＲまでの断片をＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩサイトを切断した。これらの断片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のＳｓｐＩ−ＰｖｕＩＩ断片を結合させ、ｐＨＮＧＡＰを作製した。
【００３４】
配列番号４５および４６それぞれの配列からなるＤＮＡ（ＦＬＡＧＳＡＬＦおよびＦＬＡＧＨＩＮＤＲ）をプライマーおよび鋳型として用いてＰＣＲを行い、Ｆｌａｇエピトープタグ（配列番号５５）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅した後、末端のＳａｌＩサイトおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトで切断したＤＮＡ断片を得た。また、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドとして、ＴＥＬのＮ末端１５４アミノ酸（配列番号４１）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを、配列番号４７および４８それぞれの配列からなるプライマー（ＴＥＬＨＩＮＤＡＴＧおよびＴＥＬＥＣＯ４８６Ｒ）を用いてヒトｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅した後、末端のＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＥｃｏＲＩサイトで切断したＤＮＡ断片を得た。これら２つのＤＮＡ断片をｐＨＮＧＡＰのＧＡＰＤＨプロモーターの下流のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入し、ＦｌａｇエピトープタグおよびＴＥＬのＮ末端１５４アミノ酸を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含むレトロウイルスベクターｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴを作製した。配列番号４９にｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴのＳａｌＩサイトからＮｏｔＩサイト間の配列を示した。ｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴの、ＴＥＬのＮ末端１５４アミノ酸をコードするＤＮＡの直後のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間にｃＤＮＡを挿入することにより、ｃＤＮＡがコードするポリペプチドをＦｌａｇエピトープタグおよびＴＥＬのＮ末端１５４アミノ酸との融合ポリペプチドとして発現するためのレトロウイルスベクターとなる。
【００３５】
ＭｏＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌをＣＭＶプロモーター制御下で発現するベクターｐＣＭＶｇａｇ−ｐｏｌ〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ８０３３  （１９９３）〕のＣＭＶプロモーターの上流に、ＶＳＶのエンベロープ蛋白であるＧ蛋白質（以下、ＶＳＶ−Ｇと略す）発現ベクターｐＨＣＭＶ−Ｇ〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ９５６４  （１９９４）〕から切り出した、ＣＭＶプロモーターおよびＶＳＶ−Ｇ遺伝子の領域を挿入し、ｐＣＧＣＧＰを作製した。ｐＣＧＣＧＰは一つのプラスミド上から、ＭｏＭＬＶのｇａｇおよびｐｏｌとＶＳＶ−Ｇが同時に発現されるようにしたコンストラクトである。図１ＡにｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴおよびｐＣＧＣＧＰの構造を示した。通常のレトロウイルスベクター発現系では、組換えレトロウイルスを含む培養上清（以下、ウイルス上清とよぶ）を得るために、パッケージング細胞を樹立し、このパッケージング細胞にレトロウイルスベクターを導入する必要があったが、ｐＣＧＣＧＰを、ｐＨＮＧＡＰ、ｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴ等のＭｏＭＬＶのＬＴＲを利用したレトロウイルスベクターと共に、ヒト腎癌系細胞株２９３細胞に共導入することにより、パッケージング細胞を樹立する必要がなく、高力価のウイルス上清の作製が可能である。
【００３６】
（ｂ）本探索方法の有効性の検証
本発明の探索方法では、オリゴマー化することにより恒常的に活性化し細胞をトランスフォームするポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡと融合することにより、細胞をトランスフォームできる癌遺伝子となることが予想される。しかし、たとえ宿主の細胞に導入されたｃＤＮＡライブラリー中のＤＮＡがこのような融合ＤＮＡであったとしても、（１）ｃＤＮＡの読みとりフレームがＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡの読みとりフレームと一致していない場合、（２）ｃＤＮＡが５’非翻訳領域を含み、この領域にＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡの読みとりフレームと一致する終止コドンが存在する場合には、宿主の細胞はトランスフォームしないので、ポジティブクローンとして選択されない。したがって、本発明の方法で、癌遺伝子をクローン化できる確率は、ライブラリーの作製に用いたｃＤＮＡに含まれる、オリゴマー化することにより恒常的に活性化し細胞をトランスフォームするポリペプチドをコードするｃＤＮＡの割合よりも低くなることが予測される。細胞をトランスフォームできる癌遺伝子が、ｃＤＮＡライブラリーに、ごく低い割合である１／５００００しか含まれない場合でも、ポジティブクローンを検出できるかどうかを検証するため、以下のようなモデル実験を行った。
【００３７】
ポジティブコントロールの癌遺伝子として、細胞をトランスフォームする能力を有することが知られているＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ（ＴＥＬの１−１５４アミノ酸とＰＤＧＦβＲの膜貫通領域および細胞内領域を含む領域の融合ポリペプチド）をコードするＤＮＡ、およびネガティブコントロールとして、グリーン蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰと略す）をコードするＤＮＡをそれぞれｐＨＮＧＡＰのＧＡＰＤＨプロモーターの下流に組み込んだｐＨＮＧＡＰ／ＴＰおよびｐＨＮＧＡＰ／ＧＦＰを作製した。
【００３８】
また、ＧＡＰＤＨプロモーターの有用性を検証するため、ｐＨＮＧＡＰ／ＴＰのＧＡＰＤＨプロモーターをヒトリングフィンガー蛋白質（以下、ＲＦＰと略す）プロモーターに替えた構造を有するＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ発現レトロウイルスベクターｐＨＮＲＦＰ／ＴＰ、および（ａ）で作製したレトロウイルスベクターｐＣＬＲＮＬのＭｏＭＬＶの５’  ＬＴＲの下流にＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲをコードするＤＮＡを挿入し、ＭｏＭＬＶのＬＴＲの制御下でＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲを発現するレトロウイルスベクターｐＨＲＮＬ／ＴＰも作製した。これらのベクターの構造を図１Ｂに示す。
【００３９】
１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略す。三光純薬社製）を含むイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）培地（以下、ＩＭＤＭと略す）１０  ｍｌをいれた１０  ｃｍシャーレで、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）を５×１０５／ｍｌで培養した。２４時間後に、ＰＨＮＧＡＰ／ＧＦＰに対し、ｐＨＮＧＡＰ／ＴＰ、ｐＨＮＲＦＰ／ＴＰおよびｐＨＲＮＬ／ＴＰそれぞれを５万対１の割合（１０μｇ対０．０００２μｇ）で混合し、ｐＣＧＣＧＰ（１０μｇ）とともにリン酸カルシウム法で、２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後８時間、２４時間後に培地を新しい培地８ｍｌに交換し、４８時間後の培養上清（ウイルス上清）を回収した。得られたウイルス上清の１ｍｌを、５×１０５個のマウスＩＬ−３（以下、ｍＩＬ−３と略す）依存性細胞株３２Ｄ（ＤＳＭＺ番号：ＡＣＣ  ４１１）に添加して感染させた。培地は、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３を含む１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭを用いた。２４時間後に細胞をＰＢＳで２回洗い、１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭでｍＩＬ３非存在下に、９６穴プレートに約１×１０４／ウェルの細胞濃度で培養を開始し、２〜３週間後に細胞増殖が見られたウェルの数を数えた。なお、ウイルス上清に含まれる感染させるウイルスの数は、各ウイルス上清を用いて２０８Ｆ細胞に感染させ、ネオマイシン耐性となった細胞数から測定した。細胞の感染効率は、ＦＡＣＳ解析により示されるＧＦＰ陽性細胞の割合から算出した。細胞増殖の予測されるウェルの数は、（９６ウェルプレートで培養した細胞数）×（細胞の感染効率）×（導入したＤＮＡ中のＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ発現ベクターの割合）から算出した。
【００４０】
第１表に示すように、ｐＨＮＲＦＰ／ＴＰおよびｐＨＲＮＬ／ＴＰでは、この条件下では細胞増殖の見られるウェルは得られなかったが、ｐＨＮＧＡＰ／ＴＰでは、２ウェルに細胞増殖が見られた。また、これらのウェルで増殖した細胞にＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ遺伝子が発現していることを、ＰＣＲにより確認した。ＲＦＰプロモーターおよびＭｏＭＬＶのＬＴＲではプロモーターの強さがＧＡＰＤＨプロモーターに劣るため、増殖細胞が得られなかったものと考えられる。なお、細胞増殖が見られたウェルの数は、ＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ発現ベクターの割合から予測される数よりも少なかったが、この原因としては、ＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ遺伝子が導入されても、導入された細胞すべてが増殖できるとは限らないこと、ＧＦＰ遺伝子に比べＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲ遺伝子の方が大きいため、挿入遺伝子が大きいほうがレトロウイルスの力価が低下するためなどの理由が考えられた。
【００４１】
【表１】
2005052018.tif 000002
【００４２】
ＧＡＰＤＨプロモーターが、ＲＦＰプロモーターおよびＭｏＭＬＶのＬＴＲよりも強いプロモーターであることを確かめるため、ＧＦＰをリポーターとした以下の実験を行った。ｐＨＮＲＦＰ／ＴＰおよびｐＨＲＮＬ／ＴＰそれぞれのＴＥＬ−ＰＤＧＦβＲをコードするＤＮＡをＧＦＰをコードするＤＮＡに置換した構造を有するＧＦＰ発現レトロウイルスベクターを作製した。これらのベクターおよびｐＨＮＧＡＰ／ＧＦＰをそれぞれ、３２Ｄ細胞にトランスフェクションし、ＦＡＣＳ解析によりそれぞれの細胞のＧＦＰの発現の強さを解析し、比較した。培養は、２ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ−３を含む１０％ＦＣＳ含有ＩＭＤＭを用いた。その結果、ＧＡＰＤＨプロモーターはＲＦＰプロモーターの８〜１０倍の強さがあり、ＲＦＰプロモーターとＭｏＭＬＶのＬＴＲはほぼ同等であった。
【００４３】
以上から、本発明の癌遺伝子の探索方法においては、強力なプロモーター活性を有するＧＡＰＤＨプロモーターを有するレトロウイルスベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、たとえライブラリーに含まれる癌遺伝子の割合が低くても、十分に癌遺伝子を検出できると考えられた。したがってＧＡＰＤＨプロモーターを組み込んだレトロウイルスベクターであるｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴは、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、そこから網羅的に癌遺伝子を探索するのに有用である。
【００４４】
（ｃ）ｃＤＮＡライブラリーの作製
慢性単球性白血病患者からインフォームドコンセントによる同意のもとに癌細胞を採取し、ＲＮＡを抽出後、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法〔Ｇｅｎｅ，  ２５，  ２６３  （１９８３）〕を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成のプライマーには配列番号５０の配列からなるＮｏｔＩ  Ｔ１８プライマーを用いた。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、ＥｃｏＲＩアダプター（配列番号５１および５２の配列からなる２本鎖ＤＮＡ）を接続し、ＮｏｔＩで切断後、アガロース電気泳動法により、８００ｂｐ以上の長さのｃＤＮＡを切り出した。精製したｃＤＮＡは、前述のｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴベクターのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入することにより、一方向性のｃＤＮＡライブラリーを得た。得られたｃＤＮＡライブラリーは、エレクトロポレーション法により大腸菌に導入し、アガロースプレートにてライブラリーの力価（独立クローンの数）を測定した。また、この大腸菌を液体培養することにより、導入したｃＤＮＡライブラリーを増幅し、プラスミドとして回収した。
【００４５】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの宿主細胞への導入
実施例１（１）（ｃ）で回収したｃＤＮＡライブラリープラスミド１０μｇをｐＣＧＣＧＰ  １０μｇとともに、実施例１（１）（ｂ）と同様にして、リン酸カルシウム法で、１０  ｃｍシャーレ上で２９３細胞にトランスフェクションし、ウイルス上清を回収した。得られたウイルス上清８  ｍｌを、宿主細胞である１×１０６個の３２Ｄ細胞に感染させた。
【００４６】
上記ｃＤＮＡライブラリーの導入時には実施例１（１）（ｂ）に比べ、ウイルス量および細胞数を多く設定した。これは、（ｉ）ｃＤＮＡライブラリーにはポリＡシグナルが含まれているので、ウイルス力価が若干低くなること、（ｉｉ）挿入するｃＤＮＡが長いとウイルス力価が低くなるため、長い癌遺伝子検出するためには多くのウイルスをスクリーニングする必要があること、（ｉｉｉ）実施例１（１）（ｂ）では、ポジティブクローンを５万分の１という設定にしたが、実際のｃＤＮＡライブラリーの力価は大腸菌への１回のエレクトロポーレーションあたり１０−５０万クローンであるため、より多くのウイルスをスクリーニングする必要があるなどの理由による。
【００４７】
（３）癌遺伝子の解析と同定
レトロウイルス感染から、２４時間後に３２Ｄ細胞をＰＢＳで２回洗い、ｍＩＬ−３非存在下に９６穴プレートに約２×１０４細胞／ウェルの細胞濃度で培養を開始した。２〜３週間後に、細胞増殖が見られたウェルの細胞を選択し、２４穴プレート上で培養し、増殖させた。
【００４８】
選択した細胞から、ＤＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  ”Ｂ”社製）を用いて染色体ＤＮＡを抽出後、ベクターの融合ＤＮＡが挿入されたＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトの上流および下流の配列に対応するＴ３プライマー（配列番号５３）およびＴ７プライマー（配列番号５４）を用いたＰＣＲにより、染色体に挿入された融合ＤＮＡを増幅した。増幅したＤＮＡ断片は、蛍光色素標識を利用したジデオキシ法を用いて塩基配列を決定し、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡと融合する相手のｃＤＮＡおよび融合位置を同定した。力価として約２００万クローン分のｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞をスクリーニングし、２５クローンの融合ＤＮＡが単離された。
【００４９】
図３に示すように、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡと融合した相手遺伝子の種類は７種類で、さまざまな位置で融合していた。この中には、Ｓｒｃファミリーに属する非受容体型チロシンキナーゼであるＬＹＮ、ＨＣＫおよびＦＧＲ、ＪＡＫファミリーに属する非受容体型チロシンキナーゼであるＴＹＫ２、それ以外の非受容体型チロシンキナーゼであるＳＹＫ、受容体型チロシンキナーゼであるＦＬＴ３、セリン／スレオニンキナーゼであるＡＲＡＦ１のｃＤＮＡが含まれていた。これらの相手遺伝子の蛋白質翻訳のフレームはＴＥＬ  ｃＤＮＡの蛋白質翻訳のフレームと一致しており、融合した領域には細胞増殖機能をもつキナーゼをコードする領域が含まれていた。得られた癌遺伝子を、「ＴＥＬ／融合した相手遺伝子の名−相手遺伝子の融合位置にあたるアミノ酸の位置」として、ＴＥＬ／ＬＹＮ−１７９、ＴＥＬ／ＬＹＮ−１８９、ＴＥＬ／ＬＹＮ−１９１、ＴＥＬ／ＬＹＮ−１９９、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２００、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２０５、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２１３、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２２０、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２２５、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２２８、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３３、ＴＥＬ／ＨＣＫ−４７、ＴＥＬ／ＨＣＫ−５５、ＴＥＬ／ＨＣＫ−１０２、ＴＥＬ／ＨＣＫ−１９４、ＴＥＬ／ＨＣＫ−２００、ＴＥＬ／ＨＣＫ−２２７、ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、ＴＥＬ／ＳＹＫ−１１５、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０２、ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６、ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３と表記し、それぞれの塩基配列を配列番号１５〜３９に示した。これらの配列は新規な配列であった。
【００５０】
本探索方法により、２５種類もの新規な配列を有する癌遺伝子、特に、これまでＴＥＬ遺伝子との融合で細胞をトランスフォームすることが報告されたチロシンキナーゼ遺伝子とは異なる、ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲおよびＴＹＫ２の各チロシンキナーゼのｃＤＮＡとの融合ＤＮＡ、および、従来、ＴＥＬ遺伝子と融合する遺伝子として報告がないセリン／スレオニン型キナーゼ遺伝子として、ＡＲＡＦ１  ｃＤＮＡとの融合ＤＮＡが、それぞれ癌遺伝子として同定された。このことは、本探索方法が新規な癌遺伝子を同定する方法として、有用性が高いことを示している。図２に、本発明の癌遺伝探索方法の概略を示した。
【００５１】
実施例２  同定された癌遺伝子の機能解析
（１）トランスフォーム活性の確認
実施例１で得られた融合ＤＮＡから、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡと融合した７種類のｃＤＮＡ（ＬＹＮ、ＨＣＫ、ＦＧＲ、ＴＹＫ２、ＳＹＫ、ＦＬＴ３およびＡＲＡＦ１の各ｃＤＮＡ）ごとにそれぞれ１つ（ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＨＣＫ−２２７、ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６およびＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３）を選択した。これらの融合ＤＮＡを、ｐＨＮＧＡＰのＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイト間に組み込んだレトロウイルスベクターを作製し、これらのレトロウイルスベクター各１０μｇとｐＣＧＣＧＰ  １０μｇとを用いて、実施例１（１）（ｂ）と同様にして、ウイルス上清の取得および３２Ｄ細胞への遺伝子導入を行った。各融合ＤＮＡを導入した３２Ｄ細胞を、Ｇ４１８を含む培地で培養することによりそれぞれの融合ＤＮＡを発現する細胞株を樹立した。これらの細胞株を、ｍＩＬ３非存在下に培養を行い、サイトカイン非依存性の増殖が見られることを確認した（図４）。したがってこれらの融合ＤＮＡは、３２Ｄ細胞をｍＩＬ−３非依存性の細胞にトランスフォームできることが確認された。
【００５２】
（２）ＴＥＬのＰＮＴ領域の重要性
（１）で選択した融合ＤＮＡのうち、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５について、ＴＥＬ  ＰＮＴをコードする領域を欠失させた融合ＤＮＡ（それぞれ以下、ΔＴＥＬ／ＬＹＮ−２３１、ΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびΔＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５とよぶ）の発現用レトロウイルスベクターを、以下のようにして作製した。ｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴのＴＥＬ  ＰＮＴの大部分にあたる、配列番号４１のアミノ酸配列の６７−１４４番目のアミノ酸をコードする領域を欠失させたレトロウイルスベクターｐＨＮＧＡＰ／ＦΔＰＮＴを作製した。ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５から、それぞれＬＹＮ、ＳＹＫ、ＦＬＴ３のｃＤＮＡにあたるＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を単離し、ｐＨＮＧＡＰ／ＦΔＰＮＴのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入することにより、ΔＴＥＬ／ＬＹＮ−２３１、ΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびΔＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５それぞれの発現用レトロウイルスベクターを作製した。（１）と同様にして、これらの発現ベクターを導入した３２Ｄ細胞を樹立した。これらの細胞株を、ｍＩＬ３非存在下に培養を行ったところ、これらの細胞ではｍＩＬ−３非依存性の増殖が得られなかった（図４）。したがって、融合ＤＮＡのＴＥＬ  ＰＮＴをコードする領域が、融合ＤＮＡのトランスフォーム能に重要な役割を果たしていることが確認された。
【００５３】
（３）融合ＤＮＡがコードするポリペプチドの恒常的活性化
次に、融合ＤＮＡによる蛋白質の恒常的活性化が生じているかを調べる目的で、
（１）で樹立した融合ＤＮＡを発現する３２Ｄ細胞のうち、チロシンキナーゼｃＤＮＡとの融合ＤＮＡであるＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５の各発現細胞をｍＩＬ−３非存在下で培養し、リン酸化チロシン特異的抗体であるＰＹ２０（ＩＣＮバイオケミカル社製）を用いてウエスタンブロット法による解析を行った。その結果、各融合ＤＮＡがコードするポリペプチドの、チロシンの恒常的なリン酸化が確認された（図５）。ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５については、それぞれΔＴＥＬ／ＬＹＮ−２３１、ΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６７およびΔＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０４との比較を行った。これらのＤＮＡを発現する３２Ｄ細胞の細胞破砕液に対して、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫沈降を行った後、免疫沈降物についてＰＹ２０を用いたウェスタンブロットを行い、チロシンの恒常的なリン酸化を検出した。その結果、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５それぞれの発現細胞では、チロシンの恒常的リン酸化が検出できたが、ΔＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５およびΔＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５それぞれの発現細胞では検出できなかった（図６）。このことから、恒常的リン酸化には蛋白質のオリゴマー形成に関与するＰＮＴ領域が重要な役割を果たしていることが確認された。
【００５４】
（４）オリゴマー形成
ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２およびＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５については、ＰＮＴ領域を介した蛋白質のオリゴマー化が生じているか確認する実験を行った。ｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴのＦｌａｇエピトープタグをコードする領域をＨＡをコードする配列に変え、ネオマイシン耐性遺伝子をブラストサイジン耐性遺伝子に変えたｐＨＢＧＡＰ／ＨＰＮＴを作製した（図１Ｃ）。ｐＨＢＧＡＰ／ＨＰＮＴに、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２およびＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５から、それぞれＬＹＮおよびＳＹＫのｃＤＮＡにあたるＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を単離し、ｐＨＢＧＡＰ／ＨＰＮＴのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入することにより、ＨＡを含むＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２ポリペプチド（以下、ＨＴＬともよぶ）およびＨＡを含むＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５ポリペプチド（以下、ＨＴＳともよぶ）それぞれの発現用レトロウイルスベクターを作製した。（１）で樹立したＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２ポリペプチド（Ｆｌａｇエピトープタグを含む、以下ＦＴＬともよぶ）発現細胞および（３）で作製したΔＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２ポリペプチド（Ｆｌａｇエピトープタグを含む、以下ΔＦＴＬともよぶ）発現細胞に、上記で作製したＨＴＬ発現用レトロウイルスベクターを導入し、Ｇ４１８およびブラストサイジンを含む培地で培養することにより、ＦＴＬおよびＨＴＬを共発現する細胞３２Ｄ／ＦＴＬ／ＨＴＬならびにΔＦＴＬおよびＨＴＬを共発現する細胞３２Ｄ／ΔＦＴＬ／ＨＴＬを樹立した。同様に、（１）で樹立したＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５ポリペプチド（Ｆｌａｇエピトープタグを含む、以下ＦＴＳともよぶ）を発現する細胞および（３）で作製したΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５ポリペプチド（Ｆｌａｇエピトープタグを含む、以下ΔＦＴＳともよぶ）を発現する細胞に、上記で作製したＨＴＳ発現用レトロウイルスベクターを導入し、ＦＴＳおよびＨＴＳを共発現する細胞３２Ｄ／ＦＴＳ／ＨＴＳならびにΔＦＴＳおよびＨＴＳを共発現する細胞３２Ｄ／ΔＦＴＳ／ＨＴＳを樹立した。
【００５５】
それぞれの細胞から、細胞破砕液を調製し、蛋白質間の会合が保たれた条件下で、抗Ｆｌａｇ抗体により、Ｆｌａｇエピトープタグを含むＦＴＬ、ΔＦＴＬ、ＦＴＳおよびΔＦＴＳを免疫沈降した後、免疫沈降物について、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットを行い、免疫沈降物中のＨＡを含むポリペプチド（ＨＴＬまたはＨＴＳ）を検出し、ＨＴＬまたはＨＴＳが共沈しているかどうかを調べた。図７に示すようにＰＮＴ領域があるＦＴＬおよびＦＴＳでは、それぞれＨＴＬおよびＨＴＳも共沈するのに対し、ＰＮＴ領域を除いたΔＦＴＬおよびΔＦＴＳの場合はＨＴＬおよびＨＴＳは共沈しなかった。この結果によりＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２ポリペプチドおよびＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５ポリペプチドは、それぞれＰＮＴ領域を介してＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２ポリペプチド同士、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５ポリペプチド同士で会合し、オリゴマー化していることが確認された。
【００５６】
実施例３  癌遺伝子発現細胞を用いた、サイトカイン非依存的な細胞増殖を抑制する物質の探索方法
試験化合物を添加した培地およびコントロールとして試験化合物を添加しない培地で、実施例２（１）で樹立した、３２Ｄ細胞を宿主とする癌遺伝子ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＨＣＫ−２２７、ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６およびＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３をそれぞれ発現する細胞株ならびに遺伝子を導入していない３２Ｄ細胞を、９６ウェルプレートに、ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３発現細胞株は１００００細胞／ウェル、他の細胞株は５０００細胞／ウェルずつ培養した。培地は１０％  ＦＣＳ添加ＩＭＤＭを用い、遺伝子を導入していない３２Ｄ細胞ではさらに２  ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−３を添加した。試験化合物としては、チロシンキナーゼ阻害剤であるＡＧ１２９５、ＡＧ１２９６およびＰＰ２〔いずれも、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を用いた。ＡＧ１２９５およびＡＧ１２９６はＰＤＧＦβＲの阻害剤、ＰＰ２はＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤として知られており、ＡＧ１２９６はＦＬＴ３も阻害することが報告されている。各試験化合物の培地中の濃度は、ＡＧ１２９５およびＡＧ１２９６は０．３、１、３および１０μｍｏｌ／Ｌ、ＰＰ２は１、３、１０および３０μｍｏｌ／Ｌで行った。それぞれ７２時間培養した後の生細胞数を、培地にテトラカラー・ワン（ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ  ＯＮＥ、生化学工業株式会社製）を添加して３時間培養を続けた後の培地の４５０ｎｍの吸光度から測定した。試験化合物を含む培地で培養した場合の各生細胞数を、試験化合物を含まない培地で培養した場合の生細胞数を１００％としたときの割合で算出した。各培養条件につき３ウェルづつ培養を行い、結果はそれぞれの平均と標準偏差を用いて表した。
【００５７】
その結果、図８〜図１０に示すように、ＡＧ１２９５は、ほとんど増殖の抑制を示さなかったが、ＡＧ１２９６はＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５発現細胞に対してのみ、ＰＰ２は、ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２、ＴＥＬ／ＨＣＫ−２２７およびＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１をそれぞれ発現する細胞株に特異的に、濃度依存的な、ｍＩＬ−３非依存的増殖の抑制を示した。これらの結果は、ＡＧ１２９６がＦＬＴ３の阻害作用を有すること、ＬＹＮ、ＨＣＫおよびＦＧＲはＳｒｃファミリー属するチロシンキナーゼであり、ＰＰ２がＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼに特異的な阻害剤であることと、一致するものであった。３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存的な増殖に対しては、これらの物質では、１０μｍｏｌ／ＬのＡＧ１２９６がやや抑制した以外は、ほとんど増殖を抑制しなかった。
【００５８】
以上から、種々の物質を試験化合物として上記と同様に測定を行うことにより各細胞株のＩＬ−３非依存的な増殖を抑制する物質、例えば、各細胞株で発現しているキナーゼを阻害する物質を探索できることが確認された。生体内での毒性や副作用の点から、正常細胞の増殖には影響せず、癌細胞特異的に増殖を抑制する物質が、癌の治療薬としては好ましいが、各細胞株のＩＬ−３非依存的な増殖の抑制と、３２Ｄ細胞のＩＬ−３依存的な増殖の抑制とを比較することにより、癌細胞特異的に増殖を抑制する物質を選択でき、非特異的な細胞毒性を示す物質などを選択からはずすことができる。また、性質が異なるキナーゼを発現する細胞株での結果を比較することにより、各細胞株に特異的にＩＬ−３非依存的な増殖を抑制する物質、例えば、各細胞株で発現しているキナーゼを特異的に阻害する物質を選択できる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明によれば、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡとｃＤＮＡとの融合ＤＮＡのライブラリーから、癌遺伝子を探索することが可能である。また、探索の結果得られた癌遺伝子を導入した細胞を用いて、キナーゼ阻害剤等の癌の治療薬に有用な物質をスクリーニングすることが可能である。
【００６０】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−発明者：直江知樹；恵美宣彦；安部明弘
配列番号１５−ＴＥＬ／ＬＹＮ−１７９
配列番号１６−ＴＥＬ／ＬＹＮ−１８９
配列番号１７−ＴＥＬ／ＬＹＮ−１９１
配列番号１８−ＴＥＬ／ＬＹＮ−１９９
配列番号１９−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２００
配列番号２０−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２０５
配列番号２１−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２１３
配列番号２２−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２２０
配列番号２３−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２２５
配列番号２４−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２２８
配列番号２５−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３２
配列番号２６−ＴＥＬ／ＬＹＮ−２３３
配列番号２７−ＴＥＬ／ＨＣＫ−４７
配列番号２８−ＴＥＬ／ＨＣＫ−５５
配列番号２９−ＴＥＬ／ＨＣＫ−１０２
配列番号３０−ＴＥＬ／ＨＣＫ−１９４
配列番号３１−ＴＥＬ／ＨＣＫ−２００
配列番号３２−ＴＥＬ／ＨＣＫ−２２７
配列番号３３−ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１
配列番号３４−ＴＥＬ／ＳＹＫ−１１５
配列番号３５−ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５
配列番号３６−ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０２
配列番号３７−ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５
配列番号３８−ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６
配列番号３９−ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３
配列番号４２−配列番号４１のＣ末にＥｃｏＲＩアダプター由来の５アミノ酸が付加したアミノ酸配列
配列番号４３−ＧＡＰＤＨプロモーター用のフォワードプライマーＧＡＰＤＨＰＲＦ
配列番号４４−ＧＡＰＤＨプロモーター用のリバースプライマーＧＡＰＤＨＰＲＲ
配列番号４５−ＦＬＡＧＳＡＬＦ
配列番号４６−ＦＬＡＧＨＩＮＤＲ
配列番号４７−ＴＥＬＨＩＮＤＡＴＧ
配列番号４８−ＴＥＬＥＣＯ４８６Ｒ
配列番号４９−ｐＨＮＧＡＰ／ＦＰＮＴのＳａｌＩサイトとＮｏｔＩサイト間の塩基配列
配列番号５０−ＮｏｔＩ  Ｔ１８プライマー
配列番号５１−ＥｃｏＲＩアダプター
配列番号５２−ＥｃｏＲＩアダプター
配列番号５３−Ｔ３プライマー
配列番号５４−Ｔ７プライマー
配列番号５５−Ｆｌａｇエピトープタグ
配列番号５６−ＨＡエピトープタグ
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いた各レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲと３’  ＬＴＲの間の構造を示す。ＡはｃＤＮＡライブラリーの作製に用いたベクター、Ｂは本発明の方法の有効性の検証に用いたベクター、Ｃは癌遺伝子の機能解析に用いたベクターである。
【図２】本発明の癌遺伝子の探索方法の概略を示す。
【図３】本発明の方法により単離された癌遺伝子において、ＴＥＬ  ＰＮＴを含むポリペプチドをコードするＤＮＡと融合していた相手遺伝子の構造の模式図と融合部位のアミノ酸の位置を示す。
【図４】本発明で単離された癌遺伝子、ＴＥＬ  ＰＮＴをコードする領域を除いた癌遺伝子を発現する３２Ｄ細胞のサイカイン非依存性の増殖を示す。横軸は培養時間、縦軸は、生細胞数（×１０５／ｍＬ）を示す。●：３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）ｍＩＬ−３添加、○（実線）：３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）ｍＩＬ−３非添加、黒四角：ＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、○（点線）：ΔＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、黒三角：ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、△（点線）：ΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、◆：ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、◇（点線）：ΔＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、×：ＴＥＬ−ＨＣＫ／２２７、＊：ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、＋：ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６、−：ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３の各遺伝子を発現する３２Ｄ細胞での結果を示す。
【図５】本発明で単離された癌遺伝子がコードするポリペプチドの恒常的活性化を示す。Ｃ：３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）、レーン１：ＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、レーン２：ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、レーン３：ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、レーン４：ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５の各遺伝子を発現する３２Ｄ細胞でのウェスタンブロットで、上段は抗Ｆｌａｇ抗体、下段は抗リン酸化チロシン抗体ＰＹ２０を用いた結果を示す。
【図６】単離された癌遺伝子がコードするポリペプチドの恒常的活性化がＴＥＬ  ＰＮＴ領域に依存的であることを示す。左から３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）、ΔＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、ＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、ΔＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、ΔＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５の各遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の抗Ｆｌａｇ抗体での免疫沈降物に対するウェスタンブロットを示す。上段は抗リン酸化チロシン抗体ＰＹ２０、下段は抗Ｆｌａｇ抗体を用いた結果を示す。
【図７】単離された癌遺伝子がコードするポリペプチドが細胞内でオリゴマー形成することを示す。左から３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）、ＦＴＬ、ΔＦＴＬおよびＨＴＬ、ＦＴＬおよびＨＴＬ、ＦＴＳ、ΔＦＴＳおよびＨＴＳ、ＦＴＳおよびＨＴＳをそれぞれ発現する３２Ｄ細胞の抗Ｆｌａｇ抗体での免疫沈降物に対するウェスタンブロットを示す。上段は抗ＨＡエピトープ抗体、下段は抗Ｆｌａｇ抗体を用いた結果を示す。
【図８】チロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１２９５による、本発明で単離された癌遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の増殖阻害を示す。横軸はＡＧ１２９５の濃度、縦軸は、阻害剤を添加しない場合の生細胞数に対する、それぞれの濃度での阻害剤添加時の生細胞数の割合（％）を示す。●：３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）、○：ＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、□：ＴＥＬ−ＨＣＫ／２２７、◇：ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、△：ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、×：ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、＊：ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６、＋：ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３の各遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の結果を示す。
【図９】チロシンキナーゼ阻害剤ＡＧ１２９６による、本発明で単離された癌遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の増殖阻害を示す。横軸はＡＧ１２９６の濃度、縦軸は、阻害剤を添加しない場合の生細胞数に対する、それぞれの濃度での阻害剤添加時の生細胞数の割合（％）を示す。●：３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）、○：ＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、□：ＴＥＬ−ＨＣＫ／２２７、◇：ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、△：ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、×：ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、＊：ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６、＋：ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３の各遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の結果を示す
【図１０】チロシンキナーゼ阻害剤ＰＰ２による、本発明で単離された癌遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の増殖阻害を示す。横軸はＰＰ２の濃度、縦軸は、阻害剤を添加しない場合の生細胞数に対する、それぞれの濃度での阻害剤添加時の生細胞数の割合（％）を示す。●：３２Ｄ細胞（遺伝子導入なし）、○：ＴＥＬ−ＬＹＮ／２３２、□：ＴＥＬ−ＨＣＫ／２２７、◇：ＴＥＬ／ＦＧＲ−２２１、△：ＴＥＬ／ＳＹＫ−３６５、×：ＴＥＬ／ＦＬＴ３−６０５、＊：ＴＥＬ／ＴＹＫ２−７７６、＋：ＴＥＬ／ＡＲＡＦ１−３０３の各遺伝子を発現する３２Ｄ細胞の結果を示す
【符号の説明】
ＣＭＶ：ＣＭＶプロモーター
ＬＴＲ：ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ
ＮＥＯ：ネオマイシン耐性遺伝子
ＧＡＰ：ＧＡＰＤＨプロモーター
ＦＥＴ：ｆｌａｇエピトープタグをコードするＤＮＡ
ｇａｇ−ｐｏｌ：ＭｏＭＬＶ  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子
ｐＡ：ポリアデニル化シグナル
ＴＥＬ：ＴＥＬのＰＮＴ領域を含むＮ末１５３アミノ酸をコードするＤＮＡ
ＲＦＰ：ＲＦＰプロモーター
ＲＳＶ：ＲＳＶプロモーター
ＢＳＤ：ブラストサイジン耐性遺伝子
ＨＡ：ＨＡエピトープタグをコードするＤＮＡ
ＳＨ２：Ｓｒｃホモロジー領域２ドメイン
ＳＨ３：Ｓｒｃホモロジー領域３ドメイン
ＴＭ：膜貫通ドメイン
Ｂ４：バンド４．１相同領域
ＣＲ：保存領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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