(57)【要約】【課題】Ｐ抗原以外の新規なヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを提供すること、及び、該ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを利用した、ヒトパルボウイルスＢ１９を測定用試薬、吸着用試薬及び感染抑制剤を提供すること。【解決手段】本発明により、Ｋｕ８０タンパクが、ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターであることが見出された。従って、本発明は、Ｋｕ８０から成る、ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを提供した。また、本発明は、Ｋｕ８０から成るヒトパルボウイルスＢ１９結合剤を提供する。さらに、本発明は、Ｋｕ８０とヒトパルボウイルスＢ１９の結合を阻害する物質又はその結合性断片を有効成分として含有するヒトパルボウイルスＢ１９の感染抑制剤を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は該配列において少数のアミノ酸残基が置換し若しくは欠失し、若しくは該配列に少数のアミノ酸残基が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有しヒトパルボウイルスＢ１９と結合するタンパク質から成る、ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプター。
【請求項２】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は該配列において１個ないし数個のアミノ酸残基が置換し若しくは欠失し、若しくは該配列に１個ないし数個のアミノ酸残基が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有しヒトパルボウイルスＢ１９と結合するタンパク質から成る、請求項１記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプター。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列番号１記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する請求項１記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプター。
【請求項４】
前記タンパク質は、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する請求項１記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプター。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプター又はそのウイルス結合性断片から成るヒトパルボウイルスＢ１９結合剤。
【請求項６】
請求項５記載の結合剤を含んで成るヒトパルボウイルスＢ１９測定用試薬。
【請求項７】
請求項５記載の結合剤を含んで成るヒトパルボウイルスＢ１９吸着剤。
【請求項８】
請求項５記載の結合剤を含んで成るヒトパルボウイルスＢ１９の感染抑制剤。
【請求項９】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターとヒトパルボウイルスＢ１９の結合を阻害する物質を有効成分として含有するヒトパルボウイルスＢ１９の感染抑制剤。
【請求項１０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターと抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する請求項９記載の感染抑制剤。
【請求項１１】
細胞に、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターの発現能を付与する工程、及び／又はＰ抗原を発現能を付与する工程を含んでなるヒトパルボウイルスＢ１９吸着性又は感染感受性細胞の製造方法。
【請求項１２】
細胞母集団から、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを発現する細胞を単離する工程、及びＰ抗原を発現する細胞を単離する工程を含んでなるヒトパルボウイルスＢ１９吸着性又は感染感受性細胞の製造方法。
【請求項１３】
細胞母集団から、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターが提示されている細胞を単離する工程を含むヒトパルボウイルスＢ１９吸着性又は感染感受性細胞の製造方法。
【請求項１４】
細胞母集団から、Ｐ抗原が提示されている細胞を単離する工程を含む請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒトパルボウイルスＢ１９レセプター及びその用途、並びに同レセプターを提示する細胞の製造方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
ヒトパルボウイルスＢ１９  （以下、単に「Ｂ１９」と略すことがある）  は小児の伝染性紅斑（非特許文献１），妊婦の感染による胎児水腫（非特許文献２），急性赤芽球勞（非特許文献３），成人の多発性関節炎（非特許文献４、５）など様々な病態の原因となる一本鎖ＤＮＡウイルスである。Ｂ１９の感染レセプターとして，赤血球膜上に発現する血液型糖脂質のＰ抗原  （Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）  が１９９３年Ｙｏｕｎｇらにより同定された（非特許文献６）。この事は，臨床的にＢ１９感染抵抗性を示す例では，Ｐ抗原発現を欠くＰｈｅｎｏｔｙｐｅを呈することでも支持され（非特許文献７），Ｐ抗原がＢ１９の感染レセプターであり，Ｐ抗原を高発現する赤芽球系細胞が感染標的細胞であると理解されるに至った。Ｂ１９感染症では，赤芽球系細胞への感染による貧血が主な症状となる。しかし，白血球減少症や血小板減少症（非特許文献８），自己抗体の出現などの免疫異常を示す現象が観察されること，Ｂ１９感染後に関節リウマチに進展する症例が報告されていること，末梢血中顆粒球や関節でＢ１９ＤＮＡが証明されるなど（非特許文献９、１０、１１），  Ｂ１９の赤芽球系細胞への感染のみでは理解することが困難な病態を呈する場合があり，Ｂ１９感染症ではＰ抗原を介した赤芽球細胞への感染以外の未知のＢ１９感染様式の存在も指摘されている。また，一方では，Ｂ１９感染感受性細胞株での研究より，Ｐ抗原発現量とＢ１９感染効率に相関を認めがたいことから，Ｐ抗原以外のＢ１９感染関連分子  （ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒなど）の存在が指摘されている（非特許文献１２）。このようにＰ抗原とは異なるＢ１９感染関連分子の存在が予測されているが，現時点では不明である。ウイルスの感染レセプターとして，しばしば複数の分子が関連し，それらがｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒとしてウイルス感染に関与する機能が報告されている。例えば，ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  （ＨＩＶ）  ではケモカインレセプターが（非特許文献１３），  エコーウイルスではｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２  （ＶＬＡ２）  が（非特許文献１４），ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ２  （ＡＡＶ２）  ではαＶβ５インテグリン（非特許文献１５）がそれぞれｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒとして機能し，これらの分子がウイルス感染感受性や感染特異性を決定する重要な役割を担っていることが証明されている。Ｂ１９においても他のウイルス同様にＰ抗原以外の感染レセプターまたはｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒを持つ可能性が推定される。Ｂ１９感染に関与する分子を明らかにすることは，Ｂ１９の感染メカニズムの解明に資するのみならず，Ｂ１９感染に伴う様々な病態の理解に貢献し，Ｂ１９感染症の診断・治療にも有用な情報となりうる。
【０００３】
本願発明者らはこれまでにＢ１９感染後関節リウマチへ進展していった患者の関節滑膜において，滑膜組織中に浸潤したＴ・Ｂリンパ球，樹状細胞，マクロファージ等の免疫細胞でＢ１９構造蛋白Ｂ１９−ＶＰ１蛋白が検出されることを見出し，免疫細胞がＢ１９の感染標的細胞となることを報告してきた（非特許文献１０）。これらの免疫細胞にはＢ１９のレセプターであるＰ抗原の発現は乏しいとされており，Ｐ抗原蛋白以外の分子を介した免疫細胞へのＢ１９感染の可能性が示唆された。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｌｕｍｍｅｒ  ＦＡ，  Ｈａｍｍｏｎｄ  ＧＷ，  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｋ，  Ｓｅｋｌａ  Ｌ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＬＭ，  Ｊｏｎｅｓ  ＳＥ，  Ｋｉｄｄ  ＩＭ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＭＪ：  Ａｎ  ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｓｕｍ−ｌｉｋｅ  ｉｌｌｎｅｓｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．    Ｎ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９８５，  ３１３：  ７４−９．
【非特許文献２】Ａｎａｎｄ，  Ａ．，  Ｇｒａｙ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｂｒｏｗｎ，  Ｔ．，  Ｃｌｅｗｌｅｙ  Ｊ．Ｐ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｂ．Ｊ：  Ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｓ  ｆｅｔａｌｉｓ．    Ｎ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  １９８７，  ３１６：  １８３−１８６．
【非特許文献３】Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｌｕｂａｎ，  Ｎ．Ｌ．，  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，  Ｐ．Ｐ．，  Ｋａｍｉｍｕｒａ，  Ｔ：  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ”ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ”：  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ａｐｌａｓｔｉｃ  ｃｒｉｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｓｐｈｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ．    Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  １９８３，  １０２：  ７２０−７２２．
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｅ  ＤＧ，  Ｗｏｏｌｆ  ＡＤ，  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  ＰＰ，  Ｃｏｈｅｎ  ＢＪ，  Ｂｌａｋｅ  ＤＲ，  Ｂａｃｏｎ  ＰＡ：  Ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ．    Ｌａｎｃｅｔ  １９８５，  ２３３：  ４１９−２１．
【非特許文献５】Ｒｅｉｄ  ＤＭ，  Ｒｅｉｄ  ＴＭ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｔ，  Ｒｅｎｎｉｅ  ＪＡ，  Ｅａｓｔｍｏｎｄ  ＣＪ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．    Ｌａｎｃｅｔ  １９８５，  Ｆｅｂ  ２３：  ４２２−５．
【非特許文献６】Ｂｒｏｗｎ，  Ｋ．Ｅ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｍ．，  ＆  Ｙｏｕｎｇ，  Ｎ．Ｓ：  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｐ  ａｎｔｉｇｅｎ：  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｂ１９  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．    Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，  ２６２：  １１４１１７．
【非特許文献７】Ｂｒｏｗｎ，  Ｋ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｌａｃｋ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｐ  ａｎｔｉｇｅｎ）．    Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  １９９４，  ３３０：  １１９２−１１９６．
【非特許文献８】Ｂａｒｌｏｗ，  Ｇ．Ｄ．，  ＆  ＭｃＫｅｎｄｒｉｃｋ，  Ｍ．Ｗ．    Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ｃａｕｓｉｎｇ  ｌｅｕｃｏｐｅｎｉａ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  ａ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔ．    Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ２０００，  ４０：  １９２−１９５．
【非特許文献９】Ｗｏｏｌｆ，  Ａ．Ｄ．，  Ｃａｍｐｉｏｎ，  Ｇ．Ｖ．，  Ｃｈｉｓｈｉｃｋ，  Ａ．，  Ｗｉｓｅ，  Ｓ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｋｌｏｕｄａ，  Ｐ．Ｔ．，  Ｃａｕｌ，  Ｏ．，  Ｄｉｅｐｐｅ，  Ｐ．Ａ：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ．    Ａｒｃｈ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  １９８９，  １４９：  １１５３−１１５６．
【非特許文献１０】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｍｕｒａｉ，  Ｃ．，  Ｓｈｉｂａｔａ，  Ｓ．，  Ｍｕｎａｋａｔａ，  Ｙ．，  Ｉｓｈｉｉ，  Ｔ．，  Ｉｓｈｉｉ，  Ｋ．，  Ｓａｉｔｏｈ，  Ｔ．，  Ｓａｗａｉ，  Ｔ．，  Ｓｕｇａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｔ：  Ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ａｓ  ａ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９８，  ９５：  ８２２７−８２３２．
【非特許文献１１】Ｓｔａｈｌ，  Ｈ．Ｄ．，  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，  Ｒ．，  ｖｏｎ  Ｓａｌｉｓ−Ｓｏｇｌｉｏ，  Ｇ．，  Ｅｍｍｒｉｃｈ，  Ｆ：  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｎｏ−  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏａｒｔｉｃｕｌａｒ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｍａｙ  ｅｖｏｌｖｅ  ｉｎｔｏ  ａ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ  ｆｕｌｆｉｌｌｉｎｇ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｏｒ  ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ．    Ｃｌｉｎ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  ２０００，  １９：  ５１０−５１１．
【非特許文献１２】Ｗｅｉｇｅｌ−Ｋｅｌｌｅｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ｙｏｄｅｒ，  Ｍ．Ｃ．，  ＆  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ａ：  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｐ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００１，  ７５：  ４１１０−４１１６．
【非特許文献１３】Ｄｏｒａｎｚ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｂｅｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｒｕｃｋｅｒ，  Ｊ．，  ＆  Ｄｏｍｓ，  Ｒ．Ｗ：  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  （ＨＩＶ−１）．    Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．  １９９７，  １６：  １５−２８．
【非特許文献１４】Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｓｈｅｐｌｅｙ，  Ｍ．Ｐ．，  Ｃｈａｎ，  Ｂ．Ｍ．，  Ｈｅｍｌｅｒ，  Ｍ．Ｅ．，  ＆  Ｆｉｎｂｅｒｇ，  Ｒ．Ｗ：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＶＬＡ−２  ａｓ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ  １．    Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９２，  ２５５：  １７１８−１７２０．
【非特許文献１５】Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，  Ｃ．，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，  Ｊ．Ｓ．，  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，  Ｒ．Ｊ：  ＡｌｐｈａＶｂｅｔａ５  ｉｎｔｅｇｒｉｎ：  ａ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．    Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １９９９，  ５：  ７８−８２．
【非特許文献１６】Ｍｉｙａｇａｗａ，  Ｅ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｎａｇａｎｏ，  Ｔ．，  Ｋｉｒｉｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｏｋｏｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｓａｔｏ，  Ｈ：  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，  ＫＵ８１２Ｅｐ６  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ１９  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ．    Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，  ８３：  ４５−５４．
【非特許文献１７】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｋ，  Ｍｉｙａｇａｗａ  Ｅ，  Ｄａｎ  Ｍ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ，  Ｉｋｅｄａ  Ｈ：  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒｓ  （ＢＭＭＳ）  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃａｎ  ｔｒａｐ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  （Ｂ１９）．    Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ２００２，  ２：  １１５−１１６
【非特許文献１８】Ｍｕｒｙｏｉ，  Ｔ．，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｔ．，  Ｔａｍａｔｅ，  Ｅ．，  Ｔａｋａｉ，  Ｏ．，  Ｈａｒａｔａ，  Ｎ．，  Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，  Ｋ：  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＤＮＡ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．    Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．    １９８７，  １５２：  ２５３−２５８．
【非特許文献１９】Ｍｉｍｏｒｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ８０−ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  Ｋｕ  （ｐ７０／ｐ８０）  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ−ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９０，  ８７：  １７７７−１７８１．
【非特許文献２０】Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ２６／ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ＩＶ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９４，  ９１：  ３０８２−３０８６．
【非特許文献２１】Ｂｒｏｗｎ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｓａｌｉｍａｎｓ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｎｏｔｅｂｏｒｎ，  Ｍ．Ｈ．，  ＆  Ｗｅｉｌａｎｄ，  Ｈ．Ｔ：  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＶＰ１  ａｎｄ  ＶＰ２  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．    Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  １９９９，  １５：  １９７−２１１．
【非特許文献２２】Ｋａｊｉｇａｙａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｂ１９  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄｓ，  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，  ａｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｎａｔｉｖｅ  ｖｉｒｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９１，  ８８：  ４６４６−４６５０．
【非特許文献２３】Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｋｕ８０  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．    Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，  ３８２：  ５５１−５５５．
【非特許文献２４】Ｆｉｎｎｉｅ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｂｌｕｎｔ，  Ｔ．，  Ｊｅｇｇｏ，  Ｐ．Ａ．，  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｓ．Ｐ：  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ａｂｓｅｎｔ  ｉｎ  ｘｒｓ−６  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９５，  ９２：  ３２０−３２４．
【非特許文献２５】Ｌｙｎｃｈ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｍｏｒｅｌａｎｄ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｇｉｎｉｓ，  Ｉ．，  Ｐｅｒｒｉｎｅ，  Ｓ．Ｐ．，  ＆  Ｆａｌｌｅｒ，  Ｄ．Ｖ：  Ｈｙｐｏｘｉａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ＨＡＬ−１／１３  ｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  Ｋｕ８０  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．    Ａｍ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００１，  ２８０：  ８９７−９１１．
【非特許文献２６】Ｇｉｎｉｓ，  Ｉ．，  ＆  Ｆａｌｌｅｒ，  Ｄ．Ｖ：  Ｈｙｐｏｘｉａ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ＨＡＬ１／１３  （Ｋｕ８６  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）．    Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２０００，  １５４：  １６３−１７４．
【非特許文献２７】Ｔｅｏｈ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｔｈｅ  ８６−ｋＤ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  Ｋｕ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．    Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９８，  １０１：  １３７９−１３８８．
【非特許文献２８】Ｌｅ  Ｒｏｍａｎｃｅｒ  Ｍ，  Ｒｅｙｌ−Ｄｅｓｍａｒｓ  Ｆ，  Ｃｈｅｒｉｆｉ  Ｙ，  Ｐｉｇｅｏｎ  Ｃ，  Ｂｏｔｔａｒｉ  Ｓ，  Ｍｅｙｅｒ  Ｏ，  Ｌｅｗｉｎ  ＭＪ：  Ｔｈｅ  ８６−ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  Ｋｕ  ｉｓ  ａ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２Ａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４，  ２６９：  １７４６４−８．
【非特許文献２９】Ｍｏｓｔａｆａ  ＳＳ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＷＭ，  Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ  ＥＴ：  Ｏｘｙｇｅｎ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ２０００，  １１１：  ８７９−８９．
【非特許文献３０】Ｈｅｖｅｈａｎ  ＤＬ，  Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ  ＥＴ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＷＭ：  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｎ  ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅｓｉｓ．    Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２０００，  ２８：  ２６７−７５．
【非特許文献３１】Ｓｙｌｖｉｅ  Ｐｉｌｌｅｔ，  Ｎａｔｈａｌｉｅ  Ｌｅ  Ｇｕｙａｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｙｐｏｘｉａ  ｕｐ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９．  ＩＸ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  （２００２  Ｉｔａｌｙ）
【特許文献３２】特開平１１−３２７５７号公報
【特許文献３３】Ｓａｋａｔａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．７７（４），  １９７−Ｂ２０３，１９９９）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｐ抗原以外の新規なヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを提供すること、及び、該ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを利用した、ヒトパルボウイルスＢ１９を測定用試薬、吸着用試薬及び感染抑制剤を提供することである。また、本発明の目的は、該ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターとヒトパルボウイルスＢ１９との結合を阻害することによりヒトパルボウイルスＢ１９の感染を抑制する手段を提供することである。さらに、本発明の目的は、該ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを提示する細胞の製造方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）例で認められる自己抗体の標的自己抗原として見いだされた８０ｋＤａのタンパク質であるＫｕ８０がヒトパルボウイルスＢ１９の感染レセプターであることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は該配列において少数のアミノ酸残基が置換し若しくは欠失し、若しくは該配列に少数のアミノ酸残基が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有しヒトパルボウイルスＢ１９と結合するタンパク質から成る、ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを提供する。また、本発明は、上記本発明のヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターから成るヒトパルボウイルスＢ１９結合剤を提供する。さらに、本発明は、ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターとヒトパルボウイルスＢ１９の結合を阻害する物質又はその結合性断片を有効成分として含有するヒトパルボウイルスＢ１９の感染抑制剤を提供する。また、本発明は、ヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターを提示する細胞の製造方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本願発明者らはＫｕ８０が、Ｐ抗原以外の新たなヒトパルボウイルスＢ１９に対するレセプターであることを見出した（以下ヒトパルボウイルスＢ１９をＢ１９と略す。）。Ｋｕ８０は、Ｋｕ８０はＳＬＥ例で認められる自己抗体の標的自己抗原として見いだされた８０ｋＤａの蛋白である。Ｋｕ８０は細胞内蛋白として局在し、機能することが知られている。Ｋｕ８０は，Ｋｕ７０とヘテロダイマーを形成し（非特許文献１９），細胞内でＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの調節因子としてＤＮＡ修復や組換えに関与するとされている（非特許文献２３、２４）。一方Ｋｕ８０は，低酸素環境下で血管内皮細胞やヒト筋肉腫細胞株ＲＤ細胞表面に発現が認められるようになり，リンパ球系細胞の接着に関係しているとの報告もある（非特許文献２５、２６、２７）。またヒト胃癌細胞株ＨＧＴ−１細胞表面に発現しているＫｕ８０はソマトスタチンレセプターとして機能し，シグナル伝達に関与することが報告されている（非特許文献２８）。以上の報告にみられるように、Ｋｕ８０は細胞表面で発現し，機能を有する場合が知られている。
【０００９】
Ｋｕ８０遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示し、そのアミノ酸配列のみを取り出して配列番号１に示す（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｍ３０９３８）。
【００１０】
なお、一般に、生理活性を有するペプチドでは、該ペプチドのアミノ酸配列において少数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者によって認められているところである。従って、配列番号１に示すＫｕ８０のアミノ酸配列において、少数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加されたペプチドあって、Ｂ１９との結合能を維持するものは、Ｋｕ８０と同様に利用することができ、本発明の範囲に含まれる。ここで、「少数」とは、１個ないし数個であることが好ましく、又は配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するものが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。
【００１１】
下記実施例で実験的に確認されたとおり、Ｋｕ８０はＢ１９と特異的に、すなわち、Ｋｕ８０がＢ１９の感染レセプターとして機能し、Ｂ１９がＫｕ８０のリガンドとして機能して両者は結合する。従って、Ｋｕ８０はＢ１９に対する特異的な結合剤として用いることができる。ここで、「結合剤」とは、Ｂ１９に特異的に結合させ、この特異的な結合を何らかの用途に利用するためのものであり、より具体的な用途の好ましい例としては、Ｂ１９測定用試薬、Ｂ１９吸着剤及びＢ１９感染抑制剤を挙げることができる。以下、これらについてさらに説明する。
【００１２】
本発明のＢ１９の感染レセプターは、Ｂ１９と特異的に結合するので、本発明のレセプターを用いてＢ１９を測定することができる。なお、「測定」には検出と定量の両者が包含される。これは、抗原と抗体との特異的結合（抗原抗体反応）を利用した免疫測定方法と同様に行うことができる。例えば、本発明のレセプターを固相化し、Ｂ１９を含む検体を固相化レセプターと接触させ、洗浄後、蛍光標識や酵素標識などの標識を付した抗Ｂ１９抗体と反応させ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中のＢ１９を測定することができる。本発明のレセプターは、タンパク質であるので、レセプターの固相化は、周知の方法、例えば、ポリスチレン製のマイクロプレートのウェルやニトロセルロースフィルター等への物理吸着や、官能基を有する担体へのアミノ基を介した共有結合等により容易に行うことができる。Ｂ１９感染レセプターを直製応用したＢ１９の検出法としてはＰ抗原をリガンドとしてＲｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（非特許文献３３）が開発され、輸血血液中のＢ１９のスクリーニングに用いられているが、Ｋｕ８０をＰ抗原に代えることにより新規なＲｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを確立することが可能でる。特にＰ抗原は糖鎖抗原であり化学合成が困難である一方、Ｋｕ８０はペプチドであり、コード遺伝子配列も明らかにされており、リコンビナント蛋白質として大量生産が可能であり、断片としての産生も容易である。
【００１３】
また、本発明のＢ１９の感染レセプターは、Ｂ１９と特異的に結合するので、本発明のレセプターはＢ１９の吸着剤としても用いることができる。Ｂ１９は、小型のウイルスであり、フィルターで除去するのが困難である。本発明のレセプターを固相化したフィルターや、本発明のレセプターを固相化した担体を充填したカラムに、Ｂ１９を含む試料を通すことにより、Ｂ１９を除去することができる。また、固相化レセプターに吸着されたＢ１９は、尿素処理、グアニジン処理、ｐＨ変化、塩濃度変化等の処理によって遊離されるので、上記固相化レセプターは、Ｂ１９の精製又は濃縮に利用することができる。
【００１４】
本発明のＢ１９に対するレセプターは、Ｂ１９と特異的に結合するので、本発明のレセプターとＢ１９の結合を阻害することで、Ｂ１９の感染を抑制することができ、Ｂ１９感染抑制剤として利用することができる。さらに、本発明のレセプターとＢ１９を用いて結合を阻害する物質を選択することにより、Ｂ１９感染抑制剤として利用する物質を見出すことができる。本発明のレセプターとＢ１９の結合を阻害する物質としては、本発明のレセプターに由来するポリペプチド及びそのウイルス結合性断片、本発明のレセプターに抗原抗体反応する抗体及びその抗原結合性断片、Ｂ１９に由来するポリペプチド及びそのレセプター結合性断片並びにＢ１９に抗原抗体反応する抗体及びその抗原結合性断片等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明のレセプターとＢ１９の結合を阻害する物質は、例えば以下の手順に従って選択することができる。精製されたＫｕ８０、遺伝子工学的手法により得られたＫｕ８０又はＫｕ８０発現細胞を固相化する。そこに、Ｂ１９又はｒＢ１９ＥＣＰとともに選択される物質を添加し反応させる。洗浄後、固相のＫｕ８０に結合したＢ１９又はｒＢ１９ＥＣＰを抗Ｂ１９抗体で定量的に測定することにより、Ｋｕ８０とＢ１９の結合を阻害する物質を見出すことができる。結合を阻害する物質としては、各種のランダムライブラリーから選択することもできるが、以下のような手順で、結合を阻害する可能性の高い物質を絞り込むことができる。例えば、Ｋｕ８０を固相化したカラムを作成し、Ｂ１９をプロテアーゼ等により断片化したペプチドを通過させ、洗浄後溶出する。ここで、得られたＫｕ８０に対して結合性を有するＢ１９由来のペプチドは、Ｋｕ８０とＢ１９の結合を阻害する可能性が高い物質である。また、さらにこのＢ１９由来のペプチドを常法に従って免疫することによって、Ｋｕ８０とＢ１９の結合を阻害する可能性が高い抗Ｂ１９抗体を得ることができる。
【００１５】
尚、本発明における感染抑制剤は、有効成分としての本発明のレセプターまたはその一部に結合する抗体、好ましくはヒト化抗体、またはモノクローナル抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体若しくはその一部と薬学的に許容され得る担体とからなる医薬品として有用な医薬組成物を意味する。このような薬学的に許容され得る担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤などが含まれる。投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物としての感染抑制剤に含有される活性成分（抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇの範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る液性担体中に０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。
【００１６】
このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ〜１００ｍｇの割合で、好ましくは５０μｇ〜５０ｍｇの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、滅菌フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００１７】
また、Ｂ１９の複製には、Ｋｕ８０が寄与しているので、Ｋｕ８０遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡやＲＮＡｉは、Ｂ１９の感染抑制に利用することができ、従って、上記感染抑制剤の場合と同様な疾患の治療又は予防に用いることができる。
【００１８】
本発明により、Ｋｕ８０がＢ１９のレセプターであることが明らかにされ、また、下記実施例に示すとおり、Ｂ１９は、Ｋｕ８０とＰ抗原の両者を提示する細胞によく感染してよく複製されることから、Ｋｕ８０とＰ抗原の両者を提示するＢ１９感染感受性細胞にＢ１９を感染させることにより、Ｂ１９を効率良く増殖させることができる。Ｂ１９の量産は、Ｂ１９の治療薬等の研究や、抗Ｂ１９抗体の作製に有用である。
【００１９】
本発明のＢ１９レセプター及びＰ抗原を提示するＢ１９吸着性又は感染感受性細胞は、生体内のリンパ系細胞、赤芽球細胞又は細胞バンク等より入手可能な株化された細胞から選別することができる。また、遺伝子工学的手法によりＢ１９レセプター及びＰ抗原を発現させた細胞から選別することもできる。なお、ここで、「吸着性」は、細胞がＢ１９を特異的に（すなわちレセプターとリガンドとして）吸着することを意味し、下記実施例に具体的に記載するようなＥＬＩＳＡ等の免疫測定により吸着が確認された場合に吸着性があると判定できる。また、「感染感受性」とは、Ｂ１９がその細胞内で増殖する、すなわち、ウイルスのコピー数が増大することを意味し、これは下記実施例に具体的に記載するような定量的ＰＣＲ法等により確認することができる。コピー数の増大が確認された場合に感染感受性があると判定できる。
【００２０】
Ｂ１９レセプター及びＰ抗原を発現する細胞は、例えば、Ｋｕ８０遺伝子及びＰ抗原関連遺伝子を細胞に導入し発現させることによって得ることができる。Ｋｕ８０遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列を有していることが知られているので、Ｋｕ８０の発現は、Ｋｕ８０遺伝子を常法である遺伝子工学的手法により細胞に導入し、細胞内で発現させることにより行うことができる。一方、Ｐ抗原は糖鎖抗原であるので、Ｐ抗原の生合成に必要な一連の糖転移酵素遺伝子を細胞に導入し発現させ、細胞内でＰ抗原を合成させることにより行うことができる。Ｋｕ８０とＰ抗原の両者を発現する細胞は、生体内若しくは培養条件下でＰ抗原を発現している細胞にＫｕ８０遺伝子を導入することによって、又は、Ｋｕ８０を発現している細胞にＰ抗原関連遺伝子を導入することによって製造することもできるし、Ｋｕ８０及びＰ抗原のいずれも有さない細胞に両者の遺伝子を導入することによっても製造することができる。導入する遺伝子数が少なく操作が簡便性であるという点で、Ｐ抗原を有する細胞にＫｕ８０遺伝子を導入するのが好ましい。
【００２１】
本発明のＢ１９レセプター及びＰ抗原を提示するＢ１９感染感受性細胞は、例えば、市販の抗Ｋｕ８０抗体及び抗Ｐ抗原抗体を用いて、蛍光抗体法又はフローサイトメーター等により識別、分離することができる。Ｂ１９感染感受性細胞を識別、分離する際には、抗Ｋｕ８０抗体若しくは抗Ｐ抗原抗体のいずれか一方を用いて識別、分離された細胞に対して、もう一方の抗体を用いて再度同じ操作を行うこともできるが、両者の抗体を同時に反応させることによりフローサイトメーターを用いて一工程で識別、分離することもできる。
【００２２】
上記の工程により得られたＢ１９レセプター及びＰ抗原を提示している細胞がＢ１９の感染における感受性を有しているか否かの確認は、以下のように行うことができる。通常の培養条件下で培養された上記の細胞に、Ｂ１９を添加し、一定期間培養した後、該細胞を回収する。Ｂ１９が細胞に感染したことの確認は、Ｂ１９の感染、増殖により細胞内で産生されるＢ１９抗原の発現を抗Ｂ１９モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法で定性的又は定量的に検出することにより行うことができる。又は、Ｂ１９の感染後、細胞内で複製されるＢ１９遺伝子を分子生物学的手法で検出することにより行うことも可能である。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２４】
１．  方法
１−１．  材料
（１）  細胞
ＫＵ８１２Ｅｐ６は慢性骨髄性白血病細胞株よりエリスロポエチン存在下でＫＵ８１２限界希釈法によりクローニングされたＢ１９易感染性の赤芽球系の細胞株である  （特開平１１−３２７５７、非特許文献１６）。ヒトＴリンパ球系細胞株Ｈ９はＡＴＣＣより，ヒト単球系細胞株Ｕ９３７，ヒト大腸腺癌細胞株ＳＷ６２０，ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４は東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより分与された。ＫＵ８１２Ｅｐ６は１０％  ウシ胎児血清  （ＦＢＳ），６  ＩＵ／ｍｌエリスロポエチン  （Ｋｉｒｉｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ）  を加えたＲＰＭＩ培地で，Ｈ９，Ｕ９３７，ＳＷ６２０は，１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ培地で，Ｔ２４は１０％ＦＢＳ加ＭＥＭ培地で培養した。
培養条件は３７  ℃，５  ％ＣＯ２とした。
【００２５】
骨髄血単核球細胞は発熱や貧血等の検査のため骨髄検査を受けた例  （造血器腫瘍を除く）  から被検者の同意を得て採取した。得られた骨髄サンプルからＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  のよる比重遠心法にて骨髄血単核球を分離し，１  ＩＵ／ｍｌエリスロポエチン  （Ｋｉｒｉｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ），１０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ培地で培養した。
【００２６】
（２）  ヒトパルボウイルスＢ１９
Ｂ１９ウイルスとして急性Ｂ１９感染患者から採取した血清を使用した。本血清は２×１０１４  コピーのＢ１９ウイルスを含むが，抗Ｂ１９−ＩｇＭ抗体，抗Ｂ１９−ＩｇＧ抗体はともに検出感度以下であった。対照にはＢ１９未感染者でＢ１９ＤＮＡ，抗Ｂ１９−ＩｇＭ抗体，抗Ｂ１９−ＩｇＧ抗体ともに検出されない健常人血清を使用した。血清は使用直前まで−８０  ℃にて保存した。
【００２７】
結合抑制実験で使用した精製Ｂ１９ウイルスは，Ｂ１９陽性血清からカラムクロマトグラフィーで精製し、感染性を保持することが確認されたインタクトな精製Ｂ１９ウイルスを用いた  （非特許文献１７）。
【００２８】
（３）  抗体
Ｂ１９の構造蛋白であるＶＰ１を認識する抗体ＰＡＲ３  （マウス，  モノクローナル）  は東北大学免疫学分野，菅村博士より供与された。Ｋｕ８０のＮ末端を認識する抗Ｋｕ８０抗体  （マウス，  モノクローナル）  はＯｎｃｏｇｅｎｅ社より，Ｃ末端を認識する抗Ｋｕ８０抗体  （マウス，  モノクローナル）  はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より得た。抗Ｋｕ７０抗体  （マウス，  モノクローナル），抗ＣＤ１０６抗体  （マウス，  モノクローナル）はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より，抗グロボシド  （Ｐ抗原）  抗体  （ウサギ，  ポリクローナル）  であるＧＬ４はＭａｔｒｅｙａ社より得た。１Ｆ５はヒト抗ＤＮＡ抗体のＯ８−１イディオタイプに対する抗イディオタイプモノクローナル抗体（非特許文献１８）で陰性コントロールとして用いた。ＰＥ標識抗ウサギ抗体，ＰＥ標識抗Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ  抗体，ＰＥ標識抗ＣＤ３  抗体，ＰＥ標識抗ＣＤ２０  抗体，ＰＥ標識抗ＣＤ１４  抗体，ＰＥ標識抗ＣＤ５６  抗体は日本ベクトン・ディッキンソン社より得た。
【００２９】
（４）  リコンビナント蛋白
リコンビナントＫｕ８０  （ｒＫｕ８０），リコンビナントＫｕ７０  （ｒＫｕ７０）  は三森博士（京都大学）より供与された（非特許文献１９）。Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ２６  （ｓＣＤ２６）  は森本博士  （東京大学）  より供与された（非特許文献２０）。リコンビナントＢ１９  ｅｍｐｔｙ  ｃａｐｓｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｒＢ１９ＥＣＰ）  はデンカ生研より分与された（非特許文献２１、２２）。
【００３０】
ビオチン化ｒＢ１９ＥＣＰは，ｒＢ１９ＥＣＰをスルホ−ＬＣ−ビオチン  （Ｐｉｅｒｃｅ）  で氷上２時間反応させ，ビオチン化した。ラベルされなかったスルホ−ＬＣ−ビオチンはＰＢＳによる透析で除いた。同様の方法で牛血清アルブミン  （ＢＳＡ）  もビオチン化し，対照とした。
【００３１】
ｒＢ１９ＥＣＰを結合したセファロース  （ｒＢ１９ＥＣＰ−セファロース）  はプロトコールに従いＣＮＢｒ  活性化セファロース  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）  とｒＢ１９ＥＣＰを用いて作製した。また対照としてＢＳＡ−セファロースも用意した。
【００３２】
１−２．  Ｂ１９のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感染
各種感染標的細胞浮遊液  （１×１０５細胞／１００  μｌ培養液）  に，２×１０１０  コピーのＢ１９ウイルスを添加して氷上で１時間吸着させた。過剰なＢ１９を４回洗浄除去した後，ＤＮＡ抽出を行い，定量ＰＣＲにてＢ１９コピー数を算出した。感染実験では３７  ℃，５  ％ＣＯ２下で２日間培養後にＤＮＡを抽出し，Ｂ１９ウイルス量を定量した。抑制実験においては各種抗体をＢ１９吸着前に氷上で１時間反応させた。
【００３３】
１−３．  Ｂ１９ＤＮＡの測定
まず，細胞と培養液に最終濃度が１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ７．６），１  ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＳＤＳとなるようにＤＮＡ抽出液を添加し，プロテアーゼＫ  （０．２μｇ／ｍｌ）  で３７℃，２４  時間処理後，フェノール‐クロロホルム法にてＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡは１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ７．６），０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で溶解した。
【００３４】
“ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ”  （ロシュ社）  を用いて，Ｂ１９ウイルスゲノムの構造蛋白遺伝子ＶＰ１領域  （ｎｔ．２５９８−２７５２）  に対する定量的ＰＣＲによりＢ１９のウイルス量を測定した。未知測定試料であるＤＮＡ  （０．５μｇ）  に，  ｄＵＴＰ  （４００  μＭ），  ｄＡＴＰ  （２００μＭ），  ｄＣＴＰ  （２００μＭ），  ｄＧＴＰ  （２００μＭ），  ＭｇＣｌ２  （３．５  ｍＭ），  ｆｏｒｗａｒｄ  プライマー  （２００  ｎＭ），  ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマー  （２００  ｎＭ），プローブ  （１００  ｎＭ），  Ａｍｐ  Ｅｒａｓｅ  ＵＮＧ  （０．０１  Ｕ／μｌ），  Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  （０．０２５  Ｕ／μｌ），更にＴａｑＭａｎ  バッファー  を加えて全量５０μｌとして反応させた。ｆｏｒｗａｒｄ  プライマーの塩基配列は５’−ｃｃｃｔａｇａａａａｃｃｃａｔｃｃｔｃｔｇｔｇ−３’であり，ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマーのそれは  ５’−ａｇｇｔｔｃｔｇｃａｔｇａｃｔｇｃｔａｃｔｇｇ−３’である。蛍光色素ＦＡＭで標識された検出用プローブとしてＶＰ１ゲノムのｎｔ．２６９２−２７１８を認識する５’−ｔｃａｔｇｇａｃａｇｔｔａｔｃｔｇａｃｃａｃｃｃｃｃａ−３を用いた。増幅条件は５０℃で２分間，  ９５  ℃  １０分間反応の後  ９５  ℃で１５秒，  ６０  ℃で１分間を４０  サイクル行い，すべての反応は  ＡＢＩ／ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。
【００３５】
１−４．  Ｂ１９結合分子の同定
（１）Ｂ１９の細胞結合
ＰＢＳで浮遊した細胞にビオチン化ｒＢ１９ＥＣＰを添加し，氷上で３０分間反応させた。細胞をＰＢＳにて洗浄後，アビチン−ＦＩＴＣ  （Ｓｉｇｍａ社）  を加え同様に反応させ，ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）  にて解析した。
【００３６】
（２）Ｂ１９結合蛋白の同定
約１×１０６のＨ９細胞にスルホ−ＬＣ−ビオチン  （Ｐｉｅｒｃｅ社）  を加え室温で３０分間反応させ，Ｈ９細胞表面をビオチン化した。ラベルされなかったビオチンを冷ＰＢＳで３回洗浄して取り除いた後，細胞溶解液  （１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，１  ％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，  １  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ７．６），２  ｍＭ  ＰＭＳＦ）  で細胞を浮遊し，４℃で９０分間反応後，遠心により核抽出成分を取り除き，細胞溶解液とした。細胞溶解液とセファロースを４℃で２４時間ゆるやかに撹拌しながら反応させ，セファロースに非特異的に結合する蛋白を取り除いた。遠心後，上清にｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースを加え，４  ℃で２時間ゆるやかに撹拌しながら反応させた。ｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースを冷洗浄液  （２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ７．６），  ０．１  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １  ｍＭ  ＣａＣｌ２）  で３回洗浄後，サンプルバッファー  （０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １０％  ２−メルカプトエタノール，４％ＳＤＳ，１０％ショ糖，  ０．００４％ブロムフェノールブルー）  を加え５分間ボイルした。
【００３７】
ｒＢ１９ＥＣＰに結合した蛋白は７．５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し，ＰＶＤＦ膜に転写した。１％  スキムミルクで室温１時間ブロッキングした後，アビジン−ＨＲＰを室温で１時間反応させ，ＥＣＬキット  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社）  によりビオチン化蛋白を検出した。
【００３８】
蛋白同定用には細胞表面をビオチン化せず，同様の方法にて細胞溶解液とｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースを反応させ，ｒＢ１９ＥＣＰ結合蛋白を分離した。７．５％  ゲルで電気泳動後，ＣＢＢ染色液  （０．１  ％ＳＤＳ，  ０．２５  ％クマシーブリリアントブルー  Ｒ２５０，  ４５  ％エタノール，１０  ％酢酸溶液）  にて蛋白染色を行い，目的蛋白のゲルを切り出し，リジルエンドペプチダーゼを用いて消化した後，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ解析に用いた。
【００３９】
（３）  ウエスタンブロッティング解析
上述した方法で分離したｒＢ１９ＥＣＰ結合蛋白または抗Ｋｕ８０抗体により免疫沈降した蛋白をＰＶＤＦ膜に転写し，１％  スキムミルクで室温１時間ブロッキングした。抗Ｋｕ８０抗体を最終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳで希釈し，ＰＶＤＦ膜に室温で１時間浸盪させながら反応させた。その後０．１％  ｔｗｅｅｎ２０入りＰＢＳにて膜を洗浄し，２次抗体のペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体  （１：２０００）  と室温で１時間反応させた。化学発光の検出はＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）  を用いて行った。
【００４０】
１−５．  ＥＬＩＳＡ法による結合抑制実験
酵素標識抗体測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ；ＥＬＩＳＡ）  はパルボＩｇＧ−ＥＩＡ”生研”キット  （デンカ生研）  中のｒＢ１９ＥＣＰを固相化したプレートを用いて行った。至適ビオチン化リコンビナントＫｕ８０を様々な競合物質存在下で室温４５分間反応させた後，ｋｉｔ付属の洗浄液で洗浄した。アビジン−ＨＲＰ  （１：１０００）  を添加し室温で４５分間反応させた後，基質を用いて検出した。陰性コントロールとして，ビオチン化ＢＳＡを用いた。
【００４１】
１−６．フローサイトメトリー解析
各種細胞株におけるＢ１９感染状態を把握するためにフローサイトメトリーで解析を行った。感染細胞標的細胞の培養液中にＢ１９陽性血清を１：１０００の割合で添加し，４８時間培養した後，感染細胞をＰＢＳで洗浄，４％パラホルムアルデヒドで固定し，０．１％サポニン，０．０５％ＮａＮ３を含むハンクス溶液にて細胞膜透過処理を行った。次に抗Ｂ１９−ＶＰ１抗体ＰＡＲ３を添加，氷上で３０分間反応後，ＰＢＳで洗浄し，ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ  抗体  （ＳＩＧＭＡ社）  を同様に反応させた。
【００４２】
細胞表面の抗原検出は，ＰＢＳに浮遊させた細胞に１次抗体  （５  μｇ／ｍｌ）  を加えて，氷上で３０分間反応させた後，細胞をＰＢＳで洗浄し，２次抗体であるＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体またはＰＥ標識抗ウサギ抗体  （Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）  を氷上で３０分間反応させた。
【００４３】
骨髄細胞は抗Ｋｕ８０抗体，ＦＩＴＣ抗マウス抗体で染色後，ＰＥ標識モノクローナル抗体を氷上で３０分間反応させて２重染色した。
【００４４】
すべての解析はＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）  により行った。
【００４５】
１−７．  蛍光抗体染色
（１）Ｂ１９の感染の検出
Ｂ１９陽性血清  （１：１０００）  存在下で４８時間培養した感染細胞をＰＢＳで洗浄してスライドガラスにマウントし風乾した。アセトン−メタノール  （１：１）  液で−２０℃，２０分間固定後，抗Ｂ１９−ＶＰ１抗体ＰＡＲ３で３７℃で３０分間反応させ，ＰＢＳで洗浄し，ビオチン標識抗マウスＩｇＧ  抗体  （ＳＩＧＭＡ社）  （１：５００）  を同様に反応させた。次にＡｖｉｄｉｎｅ−ＦＩＴＣ  （１：２００）  を３７℃で３０分間反応させた。蛍光顕微鏡で観察した。
【００４６】
（２）Ｂ１９ＥＣＰとＫＵ８１２Ｅｐ６との結合
Ｋｕ８１２Ｅｐ６細胞にビオチン化ｒＢ１９ｒＥＣＰを添加し，氷上で１時間反応させた。その後，ＰＢＳで細胞を洗浄後，抗Ｋｕ８０抗体  （５μｇ／ｍｌ）  を添加し，室温で３０分間反応させた。次に，ビオチン化ｒＢ１９ＥＣＰを検出するために，アビジン−ＦＩＴＣ  （１：１００）  を，抗Ｋｕ８０抗体を検出するためにＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体  （１：５０）  を添加し，室温で３０分間反応させた。染色後，細胞をスライドガラスにマウントし，蛍光顕微鏡にて観察した。
【００４７】
２  結果
２−１．  Ｂ１９の細胞株への吸着，感染実験
まず，免疫細胞を含む各種細胞株に対するＢ１９のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける感染状態を測るためにＢ１９陽性血清を細胞株培養液に添加し４８時間培養後，フローサイトメトリー法により細胞表面及び細胞内のＢ１９−ＶＰ１蛋白の検出を行った。従来よりＢ１９感染高感受性を示すことが知られているＫＵ８１２Ｅｐ６細胞株では抗ＶＰ１抗体にて強陽性を示す細胞集団と弱陽性を示す集団に分離表現されることが示された  （図１）。強陽性を示す細胞集団はＫＵ８１２Ｅｐ６でのみ観察され，マクロファージ系細胞株Ｕ９３７，Ｔリンパ球系細胞系細胞株Ｈ９では弱陽性を示す集団のみが観察された。一方，ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４，ヒト大腸腺癌細胞株ＳＷ６２０では弱陽性も強陽性も観察することはできなかった。また，蛍光抗体法でこれらの細胞株におけるＢ１９構造蛋白ＶＰ１を検出すると，ＫＵ８１２Ｅｐ６のみで強陽性細胞が観察された  （図１）。
【００４８】
細胞株を使用してＢ１９の吸着，感染についてＰ抗原発現との関連で検討した。ＫＵ８１２Ｅｐ６，Ｕ９３７，Ｈ９の細胞株ではそれぞれ，１細胞あたり１３，９，８コピーのＢ１９の吸着がみられた。しかしＴ２４，ＳＷ６２０では０．２コピーのＢ１９ＤＮＡが検出され，Ｂ１９の吸着に各細胞間で著明な差が認められた。一方，感染実験ではＫＵ８１２Ｅｐ６でのみ著明なＢ１９複製が観察されたが，他の細胞株では有意なコピー数の増加は認め難かった  （表１）。
【００４９】
【表１】
2005053787.tif 000002
【００５０】
これらの細胞株におけるＰ抗原の発現をフローサイトメトリーにより解析したところ，ＫＵ８１２Ｅｐ６，Ｔ２４，ＳＷ６２０では細胞表面上にＰ抗原の発現が認められた。しかし，Ｈ９，Ｕ９３７ではＰ抗原の発現は認められなかった  （図２）。Ｂ１９複製はＰ抗原の発現が認められるＫＵ８１２Ｅｐ６，Ｔ２４，ＳＷ６２０のうちＫＵ８１２Ｅｐ６でのみ観察され，Ｐ抗原の発現とＢ１９複製が必ずしも一致しないこと，一方，Ｐ抗原発現が検出されないＨ９，Ｕ９３７細胞においてもＢ１９吸着が観察されることからＢ１９吸着，感染に関与するＰ抗原以外の分子の存在が示唆された。
【００５１】
２−２．  リコンビナントＢ１９  エンプティカプシドプロテイン（ｅｍｐｔｙ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ；ｒＢ１９ＥＣＰ）  のＨ９細胞表面への結合
Ｐ抗原の発現が認められないにもかかわらず，ＫＵ８１２Ｅｐ６と同等のＢ１９吸着を示すＴリンパ球系細胞株Ｈ９を用いて，ｒＢ１９ＥＣＰ結合蛋白の同定を試みた。ビオチン化ｒＢ１９ＥＣＰはＨ９細胞表面に濃度依存性に結合した。一方，対照であるビオチン化ＢＳＡのＨ９細胞表面への結合は観察されなかった  （図３）。
【００５２】
２−３．  ｒＢ１９ＥＣＰ結合蛋白の分離と同定
まずＨ９細胞表面をビオチン化して，方法４．４（２）に基づき細胞溶解液を作製した。これをｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースと反応させ，ｒＢ１９ＥＣＰと結合する蛋白の分離と同定を試みた。ｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースに結合，沈降した蛋白はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により，８０ｋＤａ付近に観察された  。一方，対照のＢＳＡ−セファロースではこの蛋白を認めなかった。この８０ｋＤａの蛋白をリジルエンドペプチダーゼを用いてゲル内消化し，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法にて解析した（図４）。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔとＮＣＢＩｎｒの２つのデータベースとホモロジー検索をしたところ，８０ｋＤａの蛋白はＫｕ８０である可能性が高いとされた。
【００５３】
２−４．  ウェスタンブロッティング解析によるｒＢ１９ＥＣＰ結合蛋白の確認
ｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースで沈降した８０ｋＤａの蛋白はウェスタンブロッティング解析にて抗Ｋｕ８０抗体と反応した。またこの蛋白はＨ９細胞溶解液から抗Ｋｕ８０抗体で免疫沈降してきた蛋白と一致しており，ｒＢ１９ＥＣＰ−セファロースに結合し沈降した８０ｋＤａの蛋白がＫｕ８０抗原であることが証明された  （図５）。
【００５４】
２−５．  Ｂ１９とＫｕ抗原の結合に関する確認実験
１）リコンビナント蛋白による結合抑制実験
ビオチン化ｒＫｕ８０は固相化ｒＢ１９ＥＣＰに濃度依存性に結合した  （図６）。またこの結合は非標識ｒＫｕ８０により特異的に抑制され，対照であるｒＫｕ７０，可溶化ＣＤ２６での抑制は観察されなかった  （図７）。
【００５５】
２）精製Ｂ１９ウイルスによる結合抑制実験
ビオチン化ｒＫｕ８０の固相化ｒＢ１９ＥＣＰへの結合はＢ１９急性感染血清から精製したＢ１９ウイルスでも濃度依存性に抑制された  （図８）。
【００５６】
３）各種抗体による結合抑制実験
ビオチン化ｒＫｕ８０の固相化ｒＢ１９ＥＣＰへの結合は抗Ｋｕ８０抗体では抑制されたが，抗Ｋｕ７０抗体，抗ＣＤ１０６抗体では抑制されなかった  （図９）。また抗Ｋｕ８０抗体による抑制は濃度依存性であった  （図１０）。
【００５７】
２−６．  各細胞株表面におけるＫｕ８０抗原の発現
フローサイトメトリー解析により，ＫＵ８１２Ｅｐ６，Ｈ９，Ｕ９３７細胞株の細胞表面上にＫｕ８０抗原の発現が観察された。一方，Ｔ２４，ＳＷ６２０では細胞表面上のＫｕ８０発現は認められなかった  （図１１、表２）。
【００５８】
【表２】
2005053787.tif 000003
【００５９】
２−７．  ＫＵ８１２Ｅｐ６細胞へのＢ１９  の結合とＫｕ８０の発現
蛍光抗体染色を用いて，ＫＵ８１２Ｅｐ６細胞へのｒＢ１９ＥＣＰの結合と細胞表面上のＫｕ８０発現の検出を試みた。共焦点にて，ｒＢ１９ＥＣＰとＫｕ８０の局在が一致している細胞が観察された  （図４のＢ）。
【００６０】
２−８．  Ｂ１９感染におけるＰ抗原とＫｕ抗原
同定されたＫｕ抗原のＢ１９感染における役割を検討するためにＰ及びＫｕ抗原を発現し，Ｂ１９複製能を有するＫＵ８１２Ｅｐ６を用いて，Ｂ１９吸着と感染実験で特異抗体の作用を検討した。Ｋｕ８１２Ｅｐ６へのＢ１９吸着は，抗Ｋｕ８０抗体により有意な抑制が認められたが，抗グロボシド抗体での抑制は明らかでなかった  （図１２）。一方，２日間培養した後，細胞内でのＢ１９複製を定量ＰＣＲにて検出したところ，抗Ｋｕ８０抗体，抗グロボシド  （Ｐ抗原）  抗体存在下で，共にＢ１９の複製は抑制された。また，両抗体同時存在下では，Ｂ１９複製の抑制率は高められた  （図１３）。
【００６１】
２−９．  骨髄血中でのＫｕ８０抗原の発現
Ｋｕ８０抗原がｉｎ  ｖｉｖｏでＢ１９の増殖細胞を含む骨髄細胞で発現しているか，骨髄血中の細胞表面Ｋｕ８０の発現をフローサイトメトリーにて解析した。その結果Ｋｕ８０はＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａを発現している赤芽球系の細胞で強い発現が認められた。さらにＢ細胞，Ｔ細胞，単球の細胞表面マーカーである，ＣＤ２０，ＣＤ３，ＣＤ１４陽性細胞においてもＫｕ８０の発現が認められた  （図１４）。
【００６２】
２−１０．  骨髄細胞でのＢ１９感染とＰ及びＫｕ抗原
骨髄サンプルを用いて，細胞株と同様にＢ１９感染によるＫｕ８０及びＰの関与様式を求めた。抗Ｋｕ８０抗体，抗グロボシド抗体存在下で，それぞれ，９９．０％，９９．９％のＢ１９ウイルスの複製が抑えられた。なお抗Ｋｕ８０抗体，抗グロボシド抗体の両抗体を同時に添加しても，抗Ｋｕ８０抗体，抗グロボシド抗体単独時に比べて，複製の抑制率に有意な相乗効果は認められなかった  （表３）。
【００６３】
【表３】
2005053787.tif 000004
【００６４】
３．  考察
本研究で，Ｂ１９の細胞表面結合に関連してＰ抗原とは異なるＢ１９感染関連分子としてＫｕ８０を特定した。Ｋｕ８０は，Ｂ１９の吸着が観察されるもののＰ抗原発現が認められないＴリンパ球系細胞株Ｈ９からリコンビナントＢ１９  エンプティカプシドプロテイン（ｅｍｐｔｙ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ；ｒＢ１９ＥＣＰ）に結合する分子として沈降し，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法解析にて特定した。Ｈ９細胞におけるＢ１９吸着は抗Ｋｕ８０抗体５  μｇ／ｍｌ存在下で６０％抑制され（成績提示せず），また抗Ｋｕ８０抗体を用いたウエスタンブロット法においてｒＢ１９ＥＣＰ結合分子は抗Ｋｕ８０抗体と反応した。さらに，ｒＢ１９ＥＣＰとｒＫｕ８０を用いた競合ＥＬＩＳＡ法の結果より，ｒＢ１９ＥＣＰへの結合分子がＫｕ８０であり，Ｂ１９とＫｕ８０の結合が特異的であることが示された。
【００６５】
Ｋｕ８０はＳＬＥ例で認められる自己抗体の標的自己抗原として見いだされた８０ｋＤａの蛋白である。Ｋｕ８０は細胞内蛋白として局在し、機能することが知られている。Ｋｕ８０は，Ｋｕ７０とヘテロダイマーを形成し（非特許文献１９），細胞内でＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの調節因子としてＤＮＡ修復や組換えに関与するとされている（非特許文献２３、２４）。一方Ｋｕ８０は，低酸素環境下で血管内皮細胞やヒト筋肉腫細胞株ＲＤ細胞表面に発現が認められるようになり，リンパ球系細胞の接着に関係しているとの報告もある（非特許文献２５、２６、２７）。またヒト胃癌細胞株ＨＧＴ−１細胞表面に発現しているＫｕ８０はソマトスタチンレセプターとして機能し，シグナル伝達に関与することが報告されている（非特許文献２８）。以上の報告にみられるように、Ｋｕ８０は細胞表面で発現し，機能を有する場合が知られている。
【００６６】
本研究では，Ｂ１９の吸着が観察されたＫｕ８１２Ｅｐ６，Ｈ９，Ｕ９３７のいずれにおいても細胞表面にＫｕ８０の発現が認められた。Ｈ９，Ｕ９３７ではＢ１９レセプターＰ抗原は検出されなかったことから，これらの細胞株でのＢ１９吸着にはＫｕ８０が重要な役割を担っていると推定された。さらに，生体由来血液細胞でのＫｕ８０の発現を解析したところ，末梢血単核細胞では細胞表面に抗Ｋｕ８０抗体で検出可能なＫｕ８０の発現を確認できる細胞集団は確認できなかった（成績提示せず）。しかし，骨髄由来細胞ではそれぞれ，赤芽球，単球，Ｔ細胞，Ｂ細胞，のマーカーであるＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ陽性細胞，ＣＤ１４陽性細胞，ＣＤ３陽性細胞，ＣＤ２０陽性細胞などで細胞表面にＫｕ８０の発現を認めた。これらの細胞表面でＫｕ８０が発現しているのは骨髄細胞が存在する生理環境が低酸素環境であることと関連があるのかもしれない。骨髄内での酸素分圧は５〜７％Ｏ２  （３７〜５２ｍｍＨｇ）の状態とされている（非特許文献２９、３０）。最近，Ｂ１９の感染複製が低酸素環境下で亢進するとの事実も報告されている（非特許文献３１）。また，低酸素下でのＢ１９感染複製亢進のメカニズムは現時点で不明であるが，骨髄などの低酸素環境で，本来細胞内に局在するＫｕ８０が細胞表面に表出されるためにＢ１９感染効率が増加しＢ１９の複製亢進に至る可能性があげられる。
【００６７】
細胞内蛋白であるＫｕ８０がどのような条件下で，どのようなメカニズムで細胞表面に表出されるようになるかは未だ，不明な部分が多く，細胞表面へのＫｕ８０発現メカニズムを理解することはＢ１９感染を理解するうえで重要であり，さらなる研究が必要である。
【００６８】
さらにＢ１９感染感受性細胞株Ｋｕ８１２Ｅｐ６を用いたＢ１９吸着，感染抑制実験によりＢ１９感染におけるＫｕ８０の役割を検討した。抗Ｋｕ８０抗体存在下でのみＢ１９吸着の抑制が観察された。Ｂ１９複製抑制効果は抗Ｋｕ８０抗体，抗グロボシド抗体存在下で，各々約２０％，４０％であった。抗グロボシド抗体の作用の相違が観察されたが，この理由として抗グロボシド抗体量がＢ１９とグロボシドの結合を充分に抑制し得る濃度に達していなかった可能性があげられる。しかし，競合ＥＬＩＳＡ法によりＢ１９とＫｕ８０の結合はグロボシドでは抑制されず，Ｋｕ８０とグロボシドにつきＢ１９は結合部位が異なると考えられる。このことから，抗グロボシド抗体によりグロボシドと結合し得なかったＢ１９がＫｕ８０と結合したため，見かけ上，Ｂ１９吸着コピー数に変化が認められなかった可能性も考えられる。一方，感染実験では抗グロボシド抗体によるＢ１９複製抑制が認められている。これはグロボシドを介したＢ１９感染効率がＫｕ８０を介した感染効率に比して高いことを示すものと推定される。また，抗Ｋｕ８０抗体及び抗グロボシド抗体の両存在下ではＢ１９複製抑制効果は，約６０％にまで高められ，抗Ｋｕ８０抗体が抗グロボシド抗体に対して相乗的抑制効果を示した。
【００６９】
骨髄細胞を用いたＢ１９感染実験においては，抗Ｋｕ８０抗体単独でのＢ１９複製抑制は９９．０％であった。この抑制率は抗グロボシド抗体を加えた時と同程度であった。細胞株を用いて実験で認められた抗グロボシド抗体，抗Ｋｕ８０抗体の両抗体存在下でのＢ１９増殖抑制相乗効果は観察されなかったが，これは骨髄細胞におけるグロボシド，Ｋｕ８０抗原の発現量の違い，さらにグロボシド，Ｋｕ８０各々のＢ１９感染効率の違いによる可能性があげられる。骨髄赤芽球系細胞はグロボシドを高発現している。また図４のＣ，図４のＤの結果からグロボシドを介したＢ１９感染効率はＫｕ８０を介した感染より高いことが示唆されることから，骨髄細胞を用いた感染実験の結果は主にグロボシドを介した赤芽球細胞へＢ１９感染を反映したものと考えられる。従って，抗グロボシド抗体下では，赤芽球細胞への主なＢ１９感染が効率よく抑制され，Ｋｕ８０のＢ１９感染への関わりを観察し難い条件になったものと考えられる。
【００７０】
表１の結果から，Ｂ１９がＫｕ８０単独陽性細胞に吸着し，グロボシド陽性細胞でもＫｕ８０発現陰性の場合ではＢ１９吸着が少ないこと，かつ細胞株を用いた実験において，抗Ｋｕ８０抗体単独でＢ１９吸着抑制が観察されることより，Ｋｕ８０はＢ１９吸着に重要な役割を果たすと考えられる。さらに細胞株及び骨髄細胞を用いた感染実験において抗Ｋｕ８０抗体単独でＢ１９複製抑制が観察されたこと，抗Ｋｕ８０抗体は抗グロボシド抗体に対して相乗的抑制効果として作用しうることなどから，細胞表面上のＫｕ８０発現はＢ１９感染に影響を及ぼし，Ｂ１９感染を規定する可能性がある。つまりＫｕ８０はＢ１９感染関連分子として機能し，Ｂ１９感染レセプターあるいは感染効率を高めるｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒの役割を果たすものと推定される。
【００７１】
本発明ではＫｕ８０が生体内で骨髄中の赤芽球系細胞以外にも，Ｔ細胞，Ｂ細胞，単球表面上に発現されることを示した。我々はこれまでに，関節リウマチ例の関節滑膜組織中の免疫細胞で，Ｂ１９ＤＮＡ，ＲＮＡ，Ｂ１９−ＶＰ蛋白が検出できることを報告してきた１０。これらの細胞ではＰ抗原の発現は乏しいとされているので，Ｂ１９の免疫細胞への感染にはＫｕ８０が重要な役割を担っている可能性がある。Ｋｕ８０を介したＢ１９感染様式の存在はこれまで赤芽球とＢ１９の関連のみでは理解が困難であったＢ１９感染症の様々な病態の理解に貢献するのみならず，Ｂ１９感染症の診断・治療にも有用な情報をもたらすものと期待される。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、新規なＢ１９レセプターが提供された。本発明のＢ１９レセプターは、Ｂ１９と特異的に結合するので、Ｂ１９測定用試薬やＢ１９吸着剤としての用途を有する。さらに、Ｂ１９レセプターと抗原抗体反応する抗体は、Ｂ１９の複製を抑制するので、Ｂ１９の感染抑制剤として用いることができる。
【００７３】
【配列表】
2005053787.tif 000005
【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各種細胞株におけるＢ１９感染状態を表すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図２】各種細胞株におけるＰ抗原の発現状態を表すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図３】Ｈ９細胞へのリコンビナントＢ１９カプシド（ｒＢ１９ＥＣＰ）の結合を表すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】ｒＢ１９ＥＣＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合蛋白のマススペクトルを示す図である。
【図５】ｒＢ１９ＥＣＰ結合蛋白のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析の結果を示す図である。
【図６】ｒＢ１９ＥＣＰとビオチン化ｒＫｕ８０の結合実験の結果を示す図である。
【図７】ｒＢ１９ＥＣＰとビオチン化ｒＫｕ８０の結合抑制実験（１）の結果を示す図である。
【図８】ｒＢ１９ＥＣＰとビオチン化ｒＫｕ８０の結合抑制実験（２）の結果を示す図である。
【図９】ｒＢ１９ＥＣＰとビオチン化ｒＫｕ８０の結合抑制実験（３）の結果を示す図である。
【図１０】ｒＢ１９ＥＣＰとビオチン化ｒＫｕ８０の結合抑制実験（４）の結果を示す図である。
【図１１】各種細胞株における細胞表面Ｋｕ８０の発現状態を表すフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１２】ＫＵ８１２Ｅｐ６細胞株へのＢ１９吸着抑制実験の結果を示す図である。
【図１３】ＫＵ８１２Ｅｐ６細胞株へのＢ１９複製抑制実験の結果を示す図である。
【図１４】骨髄細胞表面のＫｕ８０の発現状態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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