(57)【要約】【課題】本発明の目的は、肝線維化に対する有効な予防手段または治療手段を提供し、また当該治療手段となりうる肝線維化抑制剤、医薬組成物、食品および飲料を提供することである。【解決手段】本発明により、シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む、肝線維化抑制剤が提供される。また本発明により、肝線維化抑制効果を有し、シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む、肝臓保護剤も提供される。さらに本発明により、当該分画物を含む医薬組成物、食品、飲料などが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む、肝線維化抑制剤。
【請求項２】
シイタケ菌糸体抽出物の分画物を含む肝線維化抑制剤であって、当該分画物が
１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および
２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；
を含む方法により調製することができる、ポリフェノール類を含有する分画物である、請求項１に記載の肝線維化抑制剤。
【請求項３】
肝線維化を伴う疾患を治療または予防するための、請求項１または２に記載の肝線維化抑制剤を含む医薬組成物。
【請求項４】
肝線維化を伴う疾患が、線維症、肝炎または肝硬変である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載の肝線維化抑制剤を含む食品組成物。
【請求項６】
肝線維化抑制効果を有し、シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む、肝臓保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む肝臓保護剤、特に肝線維化抑制剤に関する。さらに本発明は、当該肝線維化抑制剤を含む経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変などの肝臓疾患において、肝線維化の進行が観察される。肝線維化は細胞外マトリックスの沈着により引き起こされ、慢性肝炎から肝硬変への移行における病因の一つでもある。
【０００３】
肝線維化における細胞外マトリックスの生産には、肝星細胞（伊東細胞、脂肪摂取細胞ともいう。）の活性化が関与している。すなわち、肝星細胞は、前記肝臓疾患に伴う炎症、薬物などのよる肝障害などに起因する肝細胞の壊死により産生される各種サイトカインにより活性化され、筋線維芽細胞へと変化し、この筋線維芽細胞が細胞外マトリックスを生産することにより、肝線維化が進行する。
【０００４】
肝星細胞の活性化を阻害する物質を探索するための実験動物を用いた肝線維化の病態モデルについて、いくつかの報告がなされている。例えば、肝細胞壊死に起因する一連の肝線維化の病態は、生体内でＣＣｌ3ラジカルを発生する四塩化炭素（ＣＣｌ4）を実験動物に長期間投与し、肝細胞の炎症性壊死を長期間持続することにより再現することができる（非特許文献１参照）。このような病態モデルにおいては、肝細胞の壊死の原因物質であるＣＣｌ3ラジカルの消去活性を有する抗酸化物質の投与により、各種サイトカインの生成およびそれに続く肝星細胞の活性化を抑制することができ、結果として肝線維化の進行を抑制することができると考えられている。
【０００５】
一方で、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）を実験動物に一定期間投与することにより、肝細胞壊死を伴わない肝線維化が発症することが知られている（非特許文献１参照）。このＤＭＮを用いる病態モデルにおいて肝線維化が進行する機序はＣＣｌ4を用いる場合と明らかに異なっており、ＣＣｌ4の場合は肝細胞の壊死に起因して肝線維化が進行するのに対し、ＤＭＮは静止期にある肝星細胞に働きかけ、活性化を促すことにより肝線維化を進行させるものと考えられる。したがって、肝星細胞の活性化を阻害する物質は、肝線維化症の予防および治療、さらには肝線維化を伴う肝疾患の予防および治療において有用であると考えられ、特に、ＤＭＮの投与による肝障害モデルにおいて肝線維化を抑制する物質は、肝星細胞に直接作用する肝線維化抑制剤となりうる可能性がある。
【０００６】
天然物由来の食品や漢方薬は、一般に副作用が少ないなどの利点を有することから、近年において発生が増加している各種難治疾患に対してのその有用性が注目されている。雨谷らは、実験動物に四塩化炭素を投与した肝障害モデル、およびＤＭＮを投与した肝障害モデルの双方において、生薬を有効成分とする漢方薬「小柴胡湯」が肝線維化抑制効果を有することを報告している（非特許文献１を参照）。しかし、小柴胡湯は漢方薬でありながら多くの副作用例が報告されている薬剤であり、死亡例も報告されている。また、医療用として使用されている小柴胡湯の使用禁忌として、肝硬変および肝癌の患者への投与が挙げられている。したがって、肝臓疾患の患者への投与において、より安全性の高い薬剤が強く求められている。
【０００７】
一方、日本、中国の代表的な食用キノコで、日本では３００年前から人工栽培が行われているシイタケ（椎茸）は、永年にわたって食品として摂取され続けられており、シイタケ由来の生理活性物質は、ヒトに投与した場合の安全性、特に長期間経口的に投与した場合の安全性に優れていると考えられる。シイタケの薬理作用についていくつかの報告がされており、例えば、ラットおよびマウスでの発癌実験において、実験動物の大腸、肝臓などの腫瘍形成および移植腫瘍細胞の増殖を抑制し、生存率を上昇させる作用（非特許文献２および３を参照）、抗体産生を増強し抗体を介するＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）による免疫学的肝細胞障害に抑制的効果を示す作用（非特許文献４を参照）、免疫調節作用（非特許文献５を参照）、シイタケ菌糸体抽出物が有する生体膜保護作用および抗酸化作用（非特許文献６を参照）、マクロファージの活性化作用（特許文献１および２を参照）、生体内における抗酸化機能増強作用（特許文献３を参照）ならびにエイズウイルスの感染阻止および増殖阻止効果（特許文献４を参照）についての報告がされている。しかし、シイタケ菌糸体抽出物の肝線維化に対する効果や、肝星細胞に対する作用については何らの報告もされていない。
【特許文献１】特開昭６２−２７０５３２号公報
【特許文献２】特開平２−２３７９３４号公報
【特許文献３】特開平１１−２２８４４１号公報
【特許文献４】特開平２−１３４３２５号公報
【非特許文献１】雨谷ら、漢方医学、第１３巻、第８号、１９８９年
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１７巻、第１０９−１１４頁、１９８２年
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２７巻、１−６頁、１９８５年
【非特許文献４】肝胆膵、第１５巻、第１２７−１３５頁、１９８７年
【非特許文献５】和漢医薬学会誌、第８巻、第１６２−１６６頁、１９９１年
【非特許文献６】和漢医薬学雑誌、第１９巻（増刊号）、第１６１頁、２００２年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、シイタケ菌糸体の抽出物が肝線維化抑制作用を有することを発見して本発明を完成させた。
本発明の目的は、肝線維化抑制作用を有するシイタケ菌糸体由来の抽出物、および当該抽出物を含む肝線維化抑制剤、肝臓保護剤、経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物、食品および飲料を提供することである。
【０００９】
すなわち本発明の一つの側面によれば、シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む、肝線維化抑制剤が提供される。
さらに本発明の別の側面によれば、シイタケ菌糸体抽出物の分画物を含む、肝線維化抑制剤であって、当該分画物が
１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および
２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；
を含む方法により調製することができる、ポリフェノール類を含有する分画物である、上記の肝線維化抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明の他の側面によれば、肝線維化抑制効果を有し、シイタケ菌糸体抽出物またはその分画物を含む、肝臓保護剤が提供される。
本発明の別の側面によれば、肝線維化を伴う疾患を治療または予防するための、前記肝線維化抑制剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１１】
さらに本発明のその他の側面によれば、肝線維化を伴う疾患が、線維症、肝炎または肝硬変である、前記医薬組成物が提供される。
さらに本発明の別の側面によれば、前記肝線維化抑制剤を含む食品組成物が提供される。
【００１２】
以下、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明におけるシイタケ菌糸体は、食用にされる子実体の前段階の菌糸の状態のものであり、培養により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよい。例えば、シイタケ菌を固体培地で培養して得られる菌糸体を用いることができる。本発明において用いられるシイタケ菌糸体抽出物は、当該技術分野において公知の方法により調製することができるが、例えば、菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下に粉砕、分解して得られる抽出物を用いることができる。当該シイタケ菌糸体抽出物は、限定はされないが、例えば以下の方法により得られたものを使用することができる。すなわち、バガス（サトウキビのしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう解束し、この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５５℃の温度に保ちながら添加するとともに、前記固体培地を前記酵素の存在下に粉砕、すりつぶしてバガス繊維の少なくとも７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし、次いで９０℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させるとともに滅菌し、得られた懸濁状液をろ過することによってシイタケ菌糸体抽出液を得る。当該抽出液をシイタケ菌糸体抽出物として用いてもよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存し、使用時に種々の形態で使用するのが便宜的である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末で、吸湿性があり、特異な味と臭いをもつ。このようにして得られるシイタケ菌糸体抽出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を１５〜５０％、好ましくは２０〜４０％（ｗ／ｗ）、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質分析によりタンパク質を１０〜４０％、好ましくは１３〜３０％（ｗ／ｗ）、没食子酸を標準とするＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法によりポリフェノール類を１〜５％、好ましくは２．５〜３．５％（ｗ／ｗ）含む。シイタケ菌糸体抽出物にはそのほかに脂質約０．１％、繊維約０．４％、灰分約２０％を含むが、これに限定されない。
【００１３】
また、シイタケ菌糸体抽出物の構成糖組成（％）の一例は以下の通りであったが、この組成は培養条件などによって変動しうる：キシロース：１５．２；アラビノース：８．２；マンノース：８．４；グルコース：３９．４；ガラクトース：５．４；アミノ糖：１２．０；ウロン酸：１１．３。
【００１４】
本発明における「分画物」は、本発明の属する技術分野において通常用いられる分画方法により、シイタケ菌糸体抽出物から得られるものであれば特に限定されない。分画方法の例には、任意の溶媒を用いての抽出による分画、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムを用いた分画、およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどが含まれる。分画方法は１種類の方法であってもよく、または複数の手段の組み合わせであってもよい。上記の分画方法のうち、任意の溶媒による抽出においては、例えば、エタノールを含む溶液、メタノールを含む溶液などを用いることができる。ここで、「メタノールを含む溶液」とは、溶媒中にメタノールを容積比で２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％、最も好ましくは４５〜５５％含む溶液を意味する。当該溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができ、好ましくは水を用いることができる。「エタノールを含有する溶液」とは、溶媒中にエタノールを容積比で２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％、最も好ましくは４５〜５５％含む溶液を意味する。当該溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができ、好ましくは水を用いることができる。当該溶液とシイタケ菌糸体抽出物との混合物は、例えば一定時間静置することにより、当該溶液に対する可溶性成分を含む画分を得ることができる。ここで静置する時間は、限定はされないが例えば６時間〜１００時間、好ましくは２４時間〜８４時間、より好ましくは６０時間〜８４時間とすることができる。また、調製に要する時間を短縮するために、必要に応じて当該混合物を加熱および／または攪拌してもよい。当該混合物における不溶物をろ過やデカンテーションなどの方法により取り除くことにより得られる可溶性画分は、そのまま溶液として使用することもできるが、必要に応じて濃縮および／または凍結乾燥などを行うことにより得られる濃縮液、粘稠物質または固体を可溶性画分として使用することができる。
【００１５】
上記の分画方法のうち、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーは、本発明の属する技術分野において知られている通常の方法により行うことができ、当該技術分野において通常使用される担体を用いて行うことができる。担体の具体例には、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲなどが含まれる。ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの溶出液としては、蒸留水、純水、超純水などの水、メタノールを含有する溶液、エタノールを含有する溶液などが用いられる。ここで、メタノールを含有する溶液とは、溶媒中にメタノールを容積比で５０〜１００％、好ましくは７０〜１００％、さらに好ましくは９０〜１００％含む溶液を意味し、好ましくは市販の９９．８％メタノール溶液を用いることができる。当該溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができ、好ましくは水を用いることができる。シイタケ菌糸体抽出物の分画物は、例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにおいて前記メタノールを含有する溶液の溶出画分として得られる。当該溶出画分を、例えば減圧濃縮、凍結乾燥、および透析などのさらなる精製などの処理を施して得られる濃縮液、粘稠物質および分画物として、本発明に用いることができる。本発明に含まれる分画物は、前記メタノールを含有する溶液の溶出画分として得られる。当該溶出画分を、例えば減圧濃縮、凍結乾燥、および透析などのさらなる精製などの処理を施して得られる濃縮液、粘稠物質および固体も本発明に含まれる。
【００１６】
本発明におけるゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製により、一般的には比較的低分子量の極性物質を含む分画物を得ることができるが、本発明に含まれる分画物は、そのような分画物に限定されない。本発明の肝線維化抑制剤に含まれる抽出物または分画物は、例えばポリフェノール類（フェノール類、フェノールを含む）、タンパク質、糖類を含みうる。本明細書で用いられる用語「ポリフェノール類」とは、既知のフェノール類検出方法であるＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により定量される全フェノール成分を意味し、フェノールを含む。また用語「フェノール」とは、芳香族炭化水素核の水素原子をヒドロキシル基で置換した化合物の総称を意味する。
【００１７】
本発明に含まれる分画物は、例えばカテキンを標準物質とするＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により定量されるポリフェノール類を１１〜３５％、好ましくは１２〜３０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは１３〜２０％（ｗ／ｗ）、例えば１２％以上含みうる。特に限定はされないが、例えばポリフェノール類には、５−ヒドロキシメチルフルフラール、プロトカテキュ酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）およびガリック酸メチルなどのフェノール類（ポリフェノールまたは多価フェノール）、ならびにシリンガ酸およびバニリン酸などのフェノールが含まれる。また当該分画物は、例えばＬｏｗｒｙ法によるタンパク質分析により定量されるタンパク質を６０〜８０％、好ましくは６５〜８５％（ｗ／ｗ）、例えばフェノール−硫酸法による糖質分析により定量される糖質を０〜２０％、好ましくは５〜１５％（ｗ／ｗ）含みうる。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「肝線維化抑制剤」とは、一般的には、肝星細胞の活性化を抑制し、コラーゲン産生を抑制したり、マトリックスの産生を阻害するなど、肝臓の線維化を抑制する働きを持つものを意味する。肝線維化を伴う疾患としては、限定はされないが、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および肝癌などの各種肝疾患を挙げることができる。例えば、本発明の肝線維化抑制剤は、上記各種肝疾患の予防および／または治療における効果、ならびに肝臓保護効果が期待できる。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「肝臓保護剤」とは、一般的には、薬物や有害物質による肝障害、免疫学的肝障害、ウィルス性肝障害、脂肪肝、肝癌、アルコール性肝障害、肝硬変などによる肝臓機能の低下を抑制するもの、肝臓を保護するもの全般を意味する。
【００２０】
本発明の肝線維化抑制剤は、シイタケ由来の生理活性物質を複数含むため、複数の作用機序による肝線維化抑制作用、およびそれに起因する肝保護作用を発揮することが期待される。当該作用機序の例としては、ｉ）炎症性の肝細胞の壊死を抑制し、肝臓組織内でのサイトカインの放出およびそれに起因する肝星細胞の活性化を抑制し、細胞外マトリックスの産生を抑制する；ｉｉ）肝星細胞に直接作用することにより当該細胞の活性化を抑制し、細胞外マトリックスの産生を抑制する；ｉｉｉ）産生された細胞外マトリックスの代謝を活性化する、などが考えられるが、本発明の肝線維化抑制剤の効果がその他の作用機序によるものであってもよい。一方で、本発明の肝線維化抑制剤は、主に単一の作用機序により、その効果を発揮するものであってもよい。
【００２１】
本発明の肝線維化抑制剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらには限定されない。当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
【００２２】
本発明の肝線維化抑制剤の投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、治療有効量および／または予防有効量の肝線維化抑制剤を含むことができる。例えば本発明のシイタケ菌糸体抽出物の分画物として、一般に１０〜５００００ｍｇ／日／成人、好ましくは１００〜５０００ｍｇ／日／成人の用量で使用される。当該医薬組成物の投与は、単回投与または複数回投与であってもよく、たとえば他の肝疾患治療剤、肝臓保護剤、肝線維化抑制剤などの他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【００２３】
本発明の食品組成物は、機能性飲料などの液体飲料を含む。当該食品組成物は、機能性食品として使用できるほか、医薬部外品、飲食物などの成分、食品添加物などとして使用することができる。また本明細書における経口摂取用組成物は、そのまま機能性食品として使用できるほか、医薬品、医薬部外品、飲食物等の成分、食品添加物などとして使用することができる。当該使用により、本発明の肝線維化抑制効果および肝臓保護効果を有する当該食品組成物または経口摂取用組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な肝線維化抑制効果および肝臓保護効果による体質改善、各種肝臓疾患の治療および発症の予防が可能となる。本発明の肝線維化抑制剤または肝臓保護剤を含む食品または飲料の例としては、肝線維化抑制効果もしくは肝臓保護効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが含まれる。本明細書における食品または飲料は、限定はされないが、シイタケ菌糸体抽出物または分画物の他に、鉄およびカルシウムなどの無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖およびキトサンなどの食物繊維、大豆抽出物などのタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖および乳糖などの糖類を含むことができる。
【発明の効果】
【００２４】
以下の実施例で示すように、本発明の肝線維化抑制剤は、肝線維化抑制作用を有する。したがって本発明により、肝線維化を伴う各種肝臓疾患に対する治療および／または予防のための有効な手段が提供される。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  シイタケ菌糸体抽出物の調製方法
バガス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、シイタケ菌糸を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇに、純水３．５Ｌを加え、４０℃に保ちながら精製セルラーゼ２．０ｇを加え培地含有混合物とした。次いで培地含有混合物を変速付ギヤーポンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分における粉砕およびすりつぶし作用を２００分間程度加え、バガス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕およびすりつぶしは、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。その後、培地含有混合物をさらに加熱して９０℃として３０分間放置し、酵素を失活せしめ、かつ殺菌を施した。得られた培地含有混合物を６０メッシュろ布を用いてろ過して、濃縮した後、凍結乾燥粉末をシイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）として得た。
【００２６】
［実施例２］  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の調製
２−１  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の調製
シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）を５０％エタノール水溶液に加え３日間静置し、抽出を行った。不溶画分を濾別し、可溶画分である抽出液を減圧ろ過した後の凍結乾燥により、シイタケ菌糸体抽出物に対して約９０重量％収率で茶褐色の５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）を得た。不溶画分は適量の蒸留水に分散させた後、凍結乾燥により褐色の５０％エタノール水溶液不溶画分（ＥＩ）を得た。得られたＥＳ画分を少量のエタノールで溶解し、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した。担体にはＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用い、移動相としてまず蒸留水を用い、その後メタノールを用いて溶出を行った。メタノールで溶出した画分を減圧濃縮、凍結乾燥し、シイタケ菌糸体抽出物に対して約１０重量％の収率でメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）を得た。
２−２  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の成分構成比の測定
得られた各画分の成分構成比を以下の定量分析法により算出した。即ち、糖はフェノール硫酸法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒ．Ｌ．ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＭ．Ｌ．Ｗｏｌｆｒｏｍ編、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第１巻、第３８８頁、１９６２年を参照。）、タンパク質はＬｏｗｒｙ法の改良法であるＢＣＡ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１５０巻、第７６頁、１９８５年を参照。）、ポリフェノール類はＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法（Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｔａｎｎｉｎｓ：  Ｃｏｎｓｅｑｕｗｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｍｅｄｉｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  第１３巻、１９８９年を参照。）により定量した。Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法の測定条件は以下の通りである。
【００２７】
標準物質：カテキン
検量線の作成：任意の濃度のカテキンの１点と原点とにより作成
測定波長：７６０μｍ
検液濃度：０．２％（Ｗ／Ｗ）
シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）、５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）についての成分測定結果の一例を表１に示す。表１に示される測定結果より、シイタケ菌糸体抽出物と５０％エタノール水溶液抽出画分はほぼ同一の成分構成比を有するが、メタノール溶出画分においてはタンパク質とポリフェノール類の構成比が著しく高いことが明らかとなった。ただし、この組成はシイタケ菌糸体培養条件などによって変動しうるものである。
【００２８】
表１．シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）、５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）についての成分比（重量％）
【００２９】
【表１】
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【００３０】
［実施例３］  ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）長期投与マウスを用いたＬ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅによる肝保護効果試験
６週齢、雄性、ＢＡＬＢ／ｃマウスにジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）１０ｍｇ／ｋｇを週の最初３日間ｉ．ｐ．投与で与え、それを４週間続け、肝線維化モデルを作製した。また、ＤＭＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）と、肝保護物質としてＬ．Ｅ．Ｍ．もしくは、ＥＳ−Ｍｅ（１０ｍｇ／ｋｇ）とを同時にｉ．ｐ．投与したモデルを作製した。４週目の終わりに眼底採血を行い、血清中ＡＳＴ、ＡＬＴの測定を行った。結果は図１および２で示すように、ＤＭＮ投与によりＡＳＴ、ＡＬＴはともに上昇し、Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅ投与によってその上昇が抑えられた。これより、Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−ＭｅはＤＭＮ障害マウスに対して保護効果を示すことが示唆された。
［実施例４］  肝臓より抽出したｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法
ＤＭＮ投与４週目の肝臓を採取し、その半分をホモジナイズし、セパゾールで処理することでｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ抽出後ＲＴ反応を行い、ｃＤＮＡとした。その後、ＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、肝線維化の指標であるＨＳＰ４７、α−平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ：α−ＳＭＡ）の発現を確認した。
【００３１】
結果を図３に示す。ＤＭＮ投与によりＨＳＰ４７、α−ＳＭＡの両方とも発現が増加した。さらに、Ｌ．Ｅ．Ｍ．投与においてα−ＳＭＡ、ＥＳ−Ｍｅ投与においてＨＳＰ４７、α−ＳＭＡの両方の発現が抑制されていた。このことから、ＤＭＮによる肝線維化をＬ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅの両方が抑制することが示唆された。
［実施例５］  Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅによる肝星細胞活性化抑制効果試験
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄性ラットを用い、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ・Ｐｒｏｎａｓｅ消化法により肝星細胞を単離した。単離した肝星細胞を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でプラスチックシャーレに播種し、１０％血清入りＤＭＥＭ培地で４時間培養した後、着床しない細胞をピペットで取り除き、培養液を、肝保護物質としてＬ．Ｅ．Ｍ．（１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ）、ＥＳ−Ｍｅ（１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ）を加えた各検体培養液に交換した。検体培養液にて培養開始後、約７日間、肝星細胞の形態変化を位相差顕微鏡で観察した。
【００３２】
１回の試験はラット１匹より単離した星細胞を用いて実施し、数回繰り返し試験を行い、再現性を確認した。結果の代表例を図４および図５に示す。Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅ共に肝星細胞の変態を抑制し、肝線維化抑制効果を示した。
［実施例６］  Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅによる肝星細胞ＤＮＡ合成抑制効果試験
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系雄性ラットを用い、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ・Ｐｒｏｎａｓｅ消化法により肝星細胞を単離した。単離した肝星細胞を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でプラスチックシャーレに播種し、１０％血清入りＤＭＥＭ培地で４時間培養した後、着床しない細胞をピペットで取り除き、培養液を肝保護物質としてＬ．Ｅ．Ｍ．（１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ）、ＥＳ−Ｍｅ（１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ）、小柴胡湯（１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ）を加えた各検体培養液に交換した。検体培養液にて４日間培養後ＢｒｄＵを添加、２４時間培養し、ＢｒｄＵのＤＮＡ取り込み能を測定することにより、肝星細胞のＤＮＡ合成抑制効果を確認した。
【００３３】
１回の試験はラット１匹より単離した星細胞を用いて実施し、２回繰り返し試験を行い、再現性を確認した。２回の試験データの平均値に基づく結果を図６に示す。Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅ、小柴胡湯共に肝星細胞におけるＤＮＡ合成を抑制し、肝星細胞の活性化抑制効果を示した。特にＥＳ−Ｍｅにおいては、医療用医薬品として使用されていた小柴胡湯に比べ、より低濃度で効果を発現し、ＥＳ−Ｍｅの肝線維化に対する高い効果が確認された。
【００３４】
なお、本試験に用いた検体にて細胞毒性を確認したところ、いずれの検体・濃度においてもその毒性は確認されず、本結果は細胞毒性によるものではないことを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）の長期投与による肝線維化モデルマウスの血清中のＡＳＴの測定結果の一例であり、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）が肝線維化抑制効果を発現することを示すものである。
【図２】ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）の長期投与による肝線維化モデルマウスの血清中のＡＬＴの測定結果の一例であり、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）が肝線維化抑制効果を発現することを示すものである。
【図３】ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）の長期投与による肝線維化モデルマウスの肝臓のＨＳＰ４７およびＳＭＡの発現量を示すＲＴ−ＰＣＲの結果の一例であり、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）が肝線維化抑制効果を発現することを示すものである。
【図４】肝星細胞に対するＬ．Ｅ．Ｍ．の活性化抑制効果（変態抑制効果）結果の一例であり、Ｌ．Ｅ．Ｍ．が肝星細胞の活性化を抑制し、肝線維化抑制効果を発現することを示すものである。
【図５】肝星細胞に対するＥＳ−Ｍｅの活性化抑制効果（変態抑制効果）結果の一例であり、ＥＳ−Ｍｅが肝星細胞の活性化を抑制し、肝線維化抑制効果を発現することを示すものである。
【図６】肝星細胞に対するＬ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−ＭｅのＤＮＡ合成抑制効果結果の一例であり、Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ−Ｍｅが肝星細胞のＤＮＡ合成を抑制し、その活性化を抑え、肝線維化抑制効果を発現することを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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