(57)【要約】【課題】任意の遺伝子を含むＤＮＡについて適応することができる、経済的且つ効率的なＤＮＡの固定化方法、タンパク質の合成方法及びキット、プロテインチップの作成方法及びキットを提供する。【解決手段】（１）一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡ部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡを用意する工程と、（２）別途、目的遺伝子を含み且つ一方の末端に前記アダプターＤＮＡ部が有する連結反応が可能な末端に連結することができる末端を有する目的ＤＮＡを用意する工程と、（３）前記固定化アダプターＤＮＡと、前記目的遺伝子を含むＤＮＡとを連結反応させることによって、前記基材に固定化されたＤＮＡを得る工程とを含む、ＤＮＡの固定化方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡ部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡを用意する工程と、
（２）別途、目的遺伝子を含み且つ一方の末端に前記アダプターＤＮＡ部が有する連結反応が可能な末端に連結することができる末端を有する目的ＤＮＡを用意する工程と、
（３）前記固定化アダプターＤＮＡと、前記目的遺伝子を含むＤＮＡとを連結反応させることによって、前記基材に固定化されたＤＮＡを得る工程とを含む、ＤＮＡの固定化方法。
【請求項２】
前記工程（１）において、前記連結反応が可能な末端が制限酵素消化末端であって、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ制限酵素認識配列を有するアダプターＤＮＡ前駆体部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡ前駆体を用意し、
前記認識配列を切断する制限酵素を用いて前記固定化アダプターＤＮＡ前駆体を処理することによって、前記固定化アダプターＤＮＡを用意する、請求項１に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項３】
前記固定化アダプターＤＮＡ前駆体を、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ制限酵素認識配列を有するアダプターＤＮＡ前駆体を用意し、
アビジンが表面に配置された基材上において、前記アダプターＤＮＡ前駆体を、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化させることによって得る、請求項２に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項４】
前記工程（１）において、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡを用意し、
アビジンが表面に配置された基材上において、前記アダプターＤＮＡを、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化させることによって、前記固定化アダプターＤＮＡを用意する、請求項１に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項５】
前記連結反応が可能な末端が制限酵素消化末端であって、
前記アダプターＤＮＡを、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ制限酵素認識配列を有するアダプターＤＮＡ前駆体を用意し、
前記認識配列を切断する制限酵素を用いて前記アダプターＤＮＡ前駆体を処理することによって得る、請求項４に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項６】
前記核酸の連結反応が可能な末端を有するように、核酸合成及び／又は相補鎖結合することによって前記アダプターＤＮＡを用意する、請求項４に記載のＤＮＡの固定化方法。
【請求項７】
（１）一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡ部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡを用意する工程と、
（２）別途、目的遺伝子を含み且つ一方の末端に前記アダプターＤＮＡ部が有する連結反応が可能な末端に連結することができる末端を有する目的ＤＮＡを用意する工程と、
（３）前記固定化アダプターＤＮＡと前記目的遺伝子を含むＤＮＡとを連結することによって、前記基材に固定化された鋳型ＤＮＡを得る工程と、
（４）前記固定化された鋳型ＤＮＡを転写してＲＮＡを合成する転写工程が行われる転写系、及び前記合成されたＲＮＡによってタンパク質を合成する合成工程が行われる無細胞タンパク質合成系により、タンパク質を合成する工程とを含む、タンパク質の合成方法。
【請求項８】
前記転写工程の後に前記転写系から前記基材を除去するか、又は
前記合成工程の後に前記無細胞タンパク質合成系から前記基材を除去する、請求項７に記載のタンパク質を合成する方法。
【請求項９】
前記無細胞タンパク質合成系は、少なくともリボゾーム、ＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰから選ばれる試薬を水性緩衝溶液中に含む、請求項７又は８に記載のタンパク質を合成する方法。
【請求項１０】
前記基材は、ガラス、石英、金属、樹脂、繊維、生物を構成する物質、及び半透性膜から選ばれる、請求項７〜９のいずれか１項に記載のタンパク質を合成する方法。
【請求項１１】
前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、及び化学的又は生物学的に目的物質を捕捉できる膜から選ばれる、請求項１０に記載のタンパク質を合成する方法。
【請求項１２】
前記固定化アダプターＤＮＡ、又は、
前記固定化アダプターＤＮＡを用意するための基材、ＤＮＡ、及び制限酵素から選ばれる少なくとも１つのアイテムを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質を合成する方法を行うためのタンパク質合成キット。
【請求項１３】
前記アイテムに、無細胞タンパク質合成を行うための試薬及び水性緩衝溶液から選ばれる少なくとも１つがさらに含まれる、請求項１２に記載のタンパク質合成キット。
【請求項１４】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質を合成する方法を用いてプロテインチップを作成する方法。
【請求項１５】
前記固定化アダプターＤＮＡ、又は、
前記固定化アダプターＤＮＡを用意するための基材、ＤＮＡ、及び制限酵素から選ばれる少なくとも１つのアイテムを含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質を合成する方法を用いてプロテインチップを作成するためのプロテインチップ作成キット。
【請求項１６】
前記アイテムに、無細胞タンパク質合成を行うための試薬、水性緩衝溶液から選ばれる少なくとも１つがさらに含まれる、請求項１５に記載のプロテインチップ作成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成技術、及びプロテインチップ作成技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ゲノム研究においては、多数のＤＮＡを基材上に高密度に配列するマイクロアレイ技術を用い、ＤＮＡチップが数多く開発されている。近年のプロテオーム研究においては、ＤＮＡチップのマイクロアレイ技術を応用したプロテインチップの作成が実現可能となった。現在、プロテインチップとしては、スライドガラスや膜などの基材上にタンパク質をスポットすることによって高密度に配列し固定化したものが開発されている。
【０００３】
一方、タンパク質合成方法として、特公平７−１１０２３６号公報に記載のように、無細胞翻訳系においてタンパク質を合成する方法が知られている。
【０００４】
さらに、ＤＮＡの基材への固定化法として、ビオチンラベル化されたＤＮＡを用いて目的遺伝子をＰＣＲ増幅して得たＤＮＡを基材上に固定化する方法が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質はポリペプチドが絡み合った非常に不安定な構造を有しているため、基板上へスポットし固定化するためには高度な技術を要する。また、タンパク質は周囲のわずかな環境の変化によって変性が起こり、その反応性が変化するため、従来のプロテインチップは保存が極めて困難である。
【０００７】
そこで本発明の目的は、タンパク質を使用する際に簡便にタンパク質を合成する方法、及びプロテインチップを使用する際に簡便にプロテインチップを作成する方法を提供することにある。また本発明の目的は、タンパク質を使用する際に簡便にタンパク質を合成するためのキット、及びプロテインチップを使用する際に簡便にプロテインチップを作成するためのキットを提供することにある。
【０００８】
さらに、従来のＤＮＡの基材への固定化法においては、ビオチンラベル化されたＤＮＡを、目的の遺伝子ごとに作成する必要があり、コストがかかる。
【０００９】
そこで本発明の目的は、上述の目的に加え、目的の遺伝子ごとにビオチンラベル化ＤＮＡを作成しなくとも、一種のビオチンラベル化ＤＮＡによって任意の遺伝子を含むＤＮＡについて適応することができる固定化方法、及び、それを用いたタンパク質合成方法及びプロテインチップ作成方法を提供することにある。そして、一種のビオチンラベル化ＤＮＡによって、任意の遺伝子を含むＤＮＡについて適応することができるタンパク質合成キット、及びプロテインチップ作成キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の発明＜１＞〜＜１６＞を含む。
下記＜１＞〜＜６＞の発明は、ＤＮＡの固定化方法に向けられる。
【００１１】
＜１＞
（１）一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡ部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡを用意する工程と、
（２）別途、目的遺伝子を含み且つ一方の末端に前記アダプターＤＮＡ部が有する連結反応が可能な末端に連結することができる末端を有する目的ＤＮＡを用意する工程と、
（３）前記固定化アダプターＤＮＡと、前記目的遺伝子を含むＤＮＡとを連結反応させることによって、前記基材に固定化されたＤＮＡを得る工程とを含む、ＤＮＡの固定化方法。
【００１２】
下記＜２＞及び＜３＞は、上記＜１＞における固定化アダプターＤＮＡを用意する一例について記載する。
＜２＞
前記工程（１）において、前記連結反応が可能な末端が制限酵素消化末端であって、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ制限酵素認識配列を有するアダプターＤＮＡ前駆体部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡ前駆体を用意し、
前記認識配列を切断する制限酵素を用いて前記固定化アダプターＤＮＡ前駆体を処理することによって、前記固定化アダプターＤＮＡを用意する、＜１＞に記載のＤＮＡの固定化方法。
＜３＞
前記固定化アダプターＤＮＡ前駆体を、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ制限酵素認識配列を有するアダプターＤＮＡ前駆体を用意し、
アビジンが表面に配置された基材上において、前記アダプターＤＮＡ前駆体を、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化させることによって得る、＜２＞に記載のタンパク質の合成方法。
【００１３】
下記＜４＞〜＜６＞は、上記＜１＞における固定化アダプターＤＮＡを得る他の一例について記載する。
＜４＞
前記工程（１）において、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡを用意し、
アビジンが表面に配置された基材上において、前記アダプターＤＮＡを、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化させることによって、前記固定化アダプターＤＮＡを用意する、＜１＞に記載のタンパク質の合成方法。
＜５＞
前記連結反応が可能な末端が制限酵素消化末端であって、
前記アダプターＤＮＡを、
一方の末端にビオチニル基を有し且つ制限酵素認識配列を有するアダプターＤＮＡ前駆体を用意し、
前記認識配列を切断する制限酵素を用いて前記アダプターＤＮＡ前駆体を処理することによって得る、＜４＞に記載のタンパク質の合成方法。
＜６＞
前記核酸の連結反応が可能な末端を有するように、核酸合成及び／又は相補鎖結合することによって前記アダプターＤＮＡを用意する、＜４＞に記載のＤＮＡの固定化方法。
【００１４】
下記＜７＞〜＜１１＞の発明は、上記ＤＮＡの固定化法を用いた無細胞タンパク質合成方法に向けられる。
＜７＞
（１）一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するアダプターＤＮＡ部が、アビジンが表面に配置された基材上において、前記ビオチニル基と前記アビジンとの結合により固定化されている固定化アダプターＤＮＡを用意する工程と、
（２）別途、目的遺伝子を含み且つ一方の末端に前記アダプターＤＮＡ部が有する連結反応が可能な末端に連結することができる末端を有する目的ＤＮＡを用意する工程と、
（３）前記固定化アダプターＤＮＡと前記目的遺伝子を含むＤＮＡとを連結することによって、前記基材に固定化された鋳型ＤＮＡを得る工程と、
（４）前記固定化された鋳型ＤＮＡを転写してＲＮＡを合成する転写工程が行われる転写系、及び前記合成されたＲＮＡによってタンパク質を合成する合成工程が行われる無細胞タンパク質合成系により、タンパク質を合成する工程とを含む、タンパク質の合成方法。
＜８＞
前記転写工程の後に前記転写系から前記基材を除去するか、又は
前記合成工程の後に前記無細胞タンパク質合成系から前記基材を除去する、＜７＞に記載のタンパク質を合成する方法。
＜９＞
前記無細胞タンパク質合成系は、少なくともリボゾーム、ＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰから選ばれる試薬を水性緩衝溶液中に含む、＜７＞又は＜８＞に記載のタンパク質を合成する方法。
＜１０＞
前記基材は、ガラス、石英、金属、樹脂、繊維、生物を構成する物質、及び半透性膜から選ばれる、＜７＞〜＜９＞のいずれかに記載のタンパク質を合成する方法。
＜１１＞
前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、及び化学的又は生物学的に目的物質を捕捉できる膜から選ばれる、＜１０＞に記載のタンパク質を合成する方法。
【００１５】
下記＜１２＞及び＜１３＞の発明は、タンパク質合成キットに向けられる。
＜１２＞
前記固定化アダプターＤＮＡ、又は、前記固定化アダプターＤＮＡを用意するための基材、ＤＮＡ、及び制限酵素から選ばれる少なくとも１つのアイテムを含む、＜７＞〜＜１１＞のいずれかに記載のタンパク質を合成する方法を行うためのタンパク質合成キット。
＜１３＞
前記アイテムに、無細胞タンパク質合成を行うための試薬及び水性緩衝溶液から選ばれる少なくとも１つがさらに含まれる、＜１２＞に記載のタンパク質合成キット。
【００１６】
下記＜１４＞の発明は、プロテインチップ作成方法に向けられる。
＜１４＞
＜７＞〜＜１１＞のいずれかに記載のタンパク質を合成する方法を用いてプロテインチップを作成する方法。
【００１７】
下記＜１５＞及び＜１６＞の発明は、プロテインチップ作成キットに向けられる。
＜１５＞
前記固定化アダプターＤＮＡ、又は、前記固定化アダプターＤＮＡを用意するための基材、ＤＮＡ、及び制限酵素から選ばれる少なくとも１つのアイテムを含む、＜７＞〜＜１１＞のいずれかに記載のタンパク質を合成する方法を用いてプロテインチップを作成するためのプロテインチップ作成キット。
＜１６＞
前記アイテムに、無細胞タンパク質合成を行うための試薬及び水性緩衝溶液から選ばれる少なくとも１つがさらに含まれる、＜１５＞のに記載のプロテインチップ作成キット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、タンパク質を使用する際に簡便にタンパク質を合成する方法、及びプロテインチップを使用する際に簡便にプロテインチップを作成する方法を提供することができる。また本発明によると、タンパク質を使用する際に簡便にタンパク質を合成するためのキット、及びプロテインチップを使用する際に簡便にプロテインチップを作成するためのキットを提供することができる。本発明によって合成されたタンパク質及び本発明によって作成されたプロテインチップは、タンパク質の活性が高い状態で使用することができる。
【００１９】
さらに本発明によると、目的の遺伝子ごとにビオチンラベル化ＤＮＡを作成しなくとも、一種のビオチンラベル化ＤＮＡによって任意の遺伝子を含むＤＮＡについて適応することができる固定化方法、及び、それを用いたタンパク質合成方法及びプロテインチップ作成方法を提供することができる。また本発明によると、一種のビオチンラベル化ＤＮＡによって、任意の遺伝子を含むＤＮＡについて適応することができるタンパク質合成キット、及びプロテインチップ作成キットを提供することができる。本発明の方法及びキットを用いることによって、目的の遺伝子ごとにビオチンラベル化ＤＮＡを作成する必要がないため、タンパク質合成及びプロテインチップ作成のコスト削減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書においてタンパク質は、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む意味で用いる。
また本明細書においてプロテインチップとは、基材上にタンパク質を高密度に配置したものをいう。このようなプロテインチップは、配置されたタンパク質と相互作用するタンパク質、核酸等の物質を検出するために用いることができる。本明細書における基材とは、後述の素材からなる薄片（チップ、ウェル）や薄面（シート）等をいう。さらに、本明細書において基材上に「配置」するとは、基材上に単に載っている状態にすることと、基材に固定化されている状態にすることとの両方を含む意味で用いる。なお、必ずしも整然と配列された状態にすることを必要とする意味ではない。
【００２１】
さらに本明細書においてＤＮＡは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む意味で用いる。また、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡが含まれるが、特に断りのない場合は二本鎖ＤＮＡを指すものとする。
【００２２】
第１に、本発明はＤＮＡの固定化方法である。
本発明のＤＮＡ固定化法においては、基材上に固定化されたＤＮＡをアダプターとして用いる。そして、目的遺伝子を含むＤＮＡをこのアダプターに連結させることにより、固定化されたＤＮＡを得る。
具体的には、本発明のＤＮＡ固定化法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
【００２３】
（１）固定化アダプターＤＮＡを用意する。
ここで、「固定化アダプターＤＮＡ」は、その一部を構成する「アダプターＤＮＡ」が基材上に固定化された状態のものである。アダプターＤＮＡ部となるものは、一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するＤＮＡである。そして、基材にはアビジンが表面に配置されており、アダプターＤＮＡ部は、自身が有するビオチニル基と基材上のアビジンとの結合により、基材上に固定化されている。
【００２４】
（２）別途、目的ＤＮＡを用意する。
本発明において、「目的ＤＮＡ」とは、目的遺伝子を含み且つ一方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するＤＮＡである。目的ＤＮＡが有するこの末端は、（１）におけるアダプターＤＮＡが有する末端に連結することができるものであり、前記アダプターＤＮＡが有する末端と適合する形態のものが好ましい。
【００２５】
（３）固定アダプターＤＮＡと目的ＤＮＡとを連結させる。
両ＤＮＡが有する連結反応可能な末端同士を連結（ライゲーション）する。これによって、基材に固定化されたＤＮＡを得る。すなわち本発明の方法によって得られる固定化されたＤＮＡは、前記アダプターＤＮＡと前記目的ＤＮＡとの塩基配列を含んでおり、前記アダプターＤＮＡが連結された側の末端において、ビオチニル基と基材上のアビジンとの結合によって基材上に固定化されている。
【００２６】
図１に、本発明の方法によるＤＮＡ固定化の一例を模式図で示す。図１の例においては、固定化アダプターＤＮＡと、目的遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を含む目的ＤＮＡとが、Hind IIIによる制限酵素消化末端同士でライゲーションされることによりＤＮＡが固定化される。
【００２７】
以下、工程（１）についてさらに説明する。
【００２８】
固定化アダプターＤＮＡは、前述のように基材上のアビジンに結合したビオチニル基と、核酸の連結反応が可能な末端とを有すること以外は特に限定されず、例えばＤＮＡ部分は比較的鎖長の短いオリゴヌクレオチドとすることができる。このような固定化アダプターＤＮＡは、後述する方法によって調製することができる。なお、本明細書において「アビジン」とは、アビジン、ストレプトアビジンなどのビオチニル基結合性タンパク質を総称していうものとする。また、核酸の連結反応が可能な末端は、共有結合により核酸が連結することが可能な末端として調製されたものであれば特に限定されない。例えば、制限酵素で切断することによって得られる末端（制限酵素消化末端）や、所望の制限酵素消化末端と同じ配列となるように、制限酵素処理以外の方法で人工的に調製した末端などが挙げられる。
【００２９】
固定化されている基材の素材としては、特に限定されない。例えば、ガラス、石英、金属、樹脂、繊維、生物を構成する物質、半透性膜等が挙げられる。前記生物を構成する物質としては、例えば、コラーゲン、キチン等が挙げられる。基材の形状としても、特に限定されない。例えば、薄片（チップ、ウェル）や、薄片に切り分けることができる薄面（シート）等が挙げられる。基材の表面には凹部や凸部が形成されていてもよい。この場合、形成された凹部又は凸部にＤＮＡが固定化されていると良い。この形態は、本発明のＤＮＡ固定化法を用いてタンパク質合成などを行う場合などに採用される。
【００３０】
工程（１）における固定化アダプターＤＮＡを用意する方法の一例を以下に説明する。
【００３１】
まず、固定化アダプターＤＮＡを得るための前駆体となるもの（固定化アダプターＤＮＡ前駆体）を用意し、次にこれを制限酵素によって処理する方法が挙げられる。ここで「固定化アダプターＤＮＡ前駆体」は、その一部を構成する「アダプターＤＮＡ前駆体」が基材上に固定化されている状態のものである。アダプターＤＮＡ前駆体部となるものは、制限酵素認識配列を有し且つ一方の末端にビオチニル基を有するＤＮＡである。そして、基材にはアビジンが表面に配置されており、アダプターＤＮＡ前駆体部は、自身が有するビオチニル基と基材上のアビジンとの結合により、基材上に固定化されている。
【００３２】
このような固定化アダプターＤＮＡ前駆体は、制限酵素による処理を受けることによって、自身の制限酵素認識配列において切断され、制限酵素消化末端を生じる。制限酵素としては、HindIII、BamHI、EcoRI、PstI、SacI、SacII、XhoI、及びその他の制限酵素が特に限定されることなく挙げられる。制限酵素による処理の方法は、公知の方法を用いることができる。このようにして、固定化アダプターＤＮＡを調製することができる。
【００３３】
図２に、固定化アダプターＤＮＡを調製する方法の一例を、図１における固定化アダプターＤＮＡを調製する方法として模式図で示す。
【００３４】
図２に例示される方法において用意する固定化アダプターＤＮＡ前駆体は、以下のようにして調製するとよい。例えば、アダプターＤＮＡ前駆体となるもの（すなわち制限酵素認識配列を有し且つ一方の末端にビオチニル基を有するＤＮＡで未固定のもの）を用意し、これを基材に固定化することによって調製する。基材としては、アビジンが表面に配置されたものが用いられる。すなわち、アダプターＤＮＡ前駆体を、自身の有するビオチニル基と基材上のアビジンとの結合により、基材上に固定化する。
【００３５】
アビジンが配置された基材としては、アビジンが基材の表面にコートされたものなどが挙げられる。基材の素材としては、すでに述べたとおりである。ビオチニル基とアビジンとの結合方法は、公知の方法によって行うことができる。たとえば、アダプターＤＮＡ前駆体を含むバッファーをアビジンが配置された基材に対して加え、３７℃程度で１時間程度放置することにより行うことができる。
【００３６】
図３に、固定化アダプターＤＮＡ前駆体を調製する方法の一例を、図２における固定化アダプターＤＮＡ前駆体を調製する方法として模式図で示す。
【００３７】
なお、図３に例示される方法において用意するアダプターＤＮＡ前駆体は、以下のようにして調製することができる。例えば、制限酵素の認識配列を含み且つ一方の末端がビオチニル化された一本鎖ＤＮＡ1と、前記ＤＮＡ1の全部又は一部の配列の相補配列を含み且つビオチニル化されていない一本鎖ＤＮＡ2とを相補鎖結合させることによって調製すると良い。
【００３８】
さらに、図２に例示される方法において用意する固定化アダプターＤＮＡ前駆体は、以下のようにして調製しても良い。例えば、アビジンが配置された基材上において、制限酵素の認識配列を含み且つ一方の末端がビオチニル化された一本鎖ＤＮＡ1が、ビオチニル基とアビジンとの結合により個定化されたものを用意し、これに対し、前記ＤＮＡ1の全部又は一部の配列の相補配列を含み且つビオチニル化されていない一本鎖ＤＮＡ2を相補鎖結合させることによって調製しても良い。
【００３９】
次に、工程（１）における固定化アダプターＤＮＡを用意する方法の他の一例を以下に説明する。
【００４０】
この例においては、まずアダプターＤＮＡとなるもの（すなわち一方の末端にビオチニル基を有し且つ他方の末端に核酸の連結反応が可能な末端を有するＤＮＡで未固定のもの）を用意し、次にこれを基材に固定化させる方法が挙げられる。基材としては、すでに述べたとおりであり、固定化の方法としても、前述の例に準じて行うことができる。
【００４１】
図４に、固定化アダプターＤＮＡを調製する方法の他の一例を、図１における固定化アダプターＤＮＡを調製する方法として模式図で示す。
【００４２】
図４に例示される方法において用意するアダプターＤＮＡは、以下のようにして調製すると良い。例えば、アダプターＤＮＡ前駆体となるもの（すなわち制限酵素認識配列を有し且つ一方の末端にビオチニル基を有するＤＮＡ）を用意し、これを制限酵素によって処理する。アダプターＤＮＡ前駆体は、制限酵素による処理を受けることによって、自身の制限酵素認識配列において切断され、制限酵素消化末端を生じる。制限酵素による処理の方法は、公知の方法を用いることができる。このようにして、アダプターＤＮＡを調製することができる。
【００４３】
図５に、アダプターＤＮＡを調製する方法の一例を、図４におけるアダプターＤＮＡを調製する方法として模式図で示す。
【００４４】
なおアダプターＤＮＡ前駆体は、すでに述べた方法によって調製することができる。
【００４５】
すでに述べたように、本発明において連結反応可能な末端とは、制限酵素で切断することによって得られる末端（制限酵素消化末端）や、所望の制限酵素消化末端と同じ配列となるように、制限酵素処理以外の方法で人工的に調製した末端などである。従って、工程（１）において用意されるＤＮＡの連結反応可能な末端は、制限酵素認識配列を有する二本鎖ＤＮＡを制限酵素で処理することによって、制限酵素消化末端として生じさせるというすでに述べた方法のほかに、そのような末端を有するように核酸合成及び／又は相補鎖結合することによって調製しても良い。
【００４６】
例えば制限酵素消化末端と同じ末端を人工的に調製する場合、その方法としては特に限定されないが、例えば、二本鎖ＤＮＡとしたときにその末端が所望の制限酵素消化末端と同じ配列になるようにあらかじめ一本鎖ＤＮＡをデザインし、そのようにデザインされた一本鎖ＤＮＡを相補鎖結合させることによって調製することができる。  
【００４７】
従って、図４に例示される方法において用意するアダプターＤＮＡは、以下のようにして調製しても良い。すなわち、二本鎖ＤＮＡとしたときに所望の制限酵素消化末端と同じ配列になるような配列を末端に有する一本鎖ＤＮＡ1’及び2’であって、このうちいずれかのＤＮＡの他方の末端がビオチニル化されているものを用意し、これらを相補鎖結合させることによって調製しても良い。
さらにこの方法に準じ、上述の一本鎖ＤＮＡ1’又は2’のいずれかにおける他方の末端が、アビジンが配置された基材上に固定化されたものを用いて相補鎖結合させると、工程（１）における固定化アダプターＤＮＡを調製することができる。
【００４８】
以下、工程（２）についてさらに説明する。
【００４９】
目的ＤＮＡは、前述のように目的遺伝子と、連結反応可能な末端（ただし（１）におけるアダプターＤＮＡが有する前記末端と連結することができるもの）とを有すること以外は特に限定されない。連結反応可能な末端としては、すでに工程（１）で述べたとおりである。工程（１）の固定化アダプターＤＮＡが有する連結反応可能な末端が制限酵素消化末端である場合、本工程の目的ＤＮＡは、通常、固定化アダプターＤＮＡの制限酵素消化末端と同じ末端を有する。このような目的ＤＮＡを用意するには、所望の遺伝子を有するＤＮＡを用意し、これに対して制限酵素処理を行えばよい。目的ＤＮＡの調製において用意する、所望の遺伝子を有するＤＮＡとしては、ラベルなどがされていない安価なＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅したものや、プラスミドＤＮＡ、及びその他のＤＮＡを特に制限なく選択することができる。
【００５０】
以下、工程（３）についてさらに説明する。
【００５１】
（１）で用意した固定化アダプターＤＮＡと（２）で用意した目的ＤＮＡとを用い、それぞれの連結反応可能な末端同士を連結（ライゲーション）する。ライゲーション反応の方法としては、公知の方法を用いればよい。これにより、基材に固定化されたＤＮＡを得ることができる。本工程において、（２）の工程で所望の遺伝子を含む目的ＤＮＡを用意することにより、あらゆるＤＮＡの固定化が可能となる。
【００５２】
本発明の方法は、ビオチン化ＤＮＡ（ビオチニル化ＤＮＡ）を、アダプターとして働くＤＮＡとして採用するため、以下の利点をもたらす。すなわち、従来は所望の遺伝子を含むＤＮＡの固定化のためにそのＤＮＡの種類の数だけビオチン化ＤＮＡを調製する必要があった。ビオチン化ＤＮＡの調製はコストがかかるため、所望の遺伝子を含むＤＮＡごとにビオチン化ＤＮＡを調製することはコストの面で問題があった。これに対し本発明では、一種類のビオチン化ＤＮＡすなわちアダプターＤＮＡを、所望の遺伝子を含むあらゆるＤＮＡに対して適用することができるため、経済的且つ効率的である。
【００５３】
また本発明の方法においては、固定化アダプターＤＮＡを再利用することが可能である。例えば、本発明のＤＮＡ固定化法で得られた固定化ＤＮＡを、後述のタンパク質合成などに使用した場合、以下のように再利用することができる。例えば制限酵素消化末端同士を連結してＤＮＡ固定した場合、使用後の固定化ＤＮＡを制限酵素消化すると、連結した目的ＤＮＡを簡単にはずすことができ、これと同時に固定化アダプターが再生する。そして、再生された固定化アダプターＤＮＡに対し、さらに別の目的遺伝子を含む目的ＤＮＡを連結することができる。このように、本発明のＤＮＡ固定化法は、一個のビオチン化ＤＮＡすなわちアダプターＤＮＡを、所望の遺伝子を含むあらゆるＤＮＡに対して再利用することができるため、さらに経済的且つ効率的である。
【００５４】
第２に、本発明はタンパク質の合成方法である。
本発明のタンパク質合成法においては、上述のＤＮＡ固定化法を用いて得られた固定化ＤＮＡを鋳型として用い、この鋳型からタンパク質を合成する。すなわち、本発明のタンパク質合成法は、以下の（１）〜（４）の工程を含む。
【００５５】
（１）固定化アダプターＤＮＡを用意する。
（２）別途、目的ＤＮＡを用意する。
（３）固定アダプターＤＮＡと目的ＤＮＡとを連結させる。
（４）基材上でタンパク質合成を行う。
【００５６】
工程（１）〜（３）については、すでにＤＮＡ固定化法で述べたとおりである。以下、工程（４）についてさらに説明する。
本工程では、（３）で得られた固定化ＤＮＡ（以下、単にＤＮＡと記載する。）を鋳型として用い、この鋳型から転写系と無細胞タンパク質合成系とによって、タンパク質を合成する。一方、このようなＤＮＡから転写によってＲＮＡまで合成し、このようなＲＮＡを翻訳によってタンパク質合成するための鋳型として用いることもできる。 
【００５７】
鋳型にＤＮＡを用いるときは、転写系においてＤＮＡの遺伝情報の転写によってＲＮＡが合成され、無細胞タンパク質合成系すなわち翻訳系においてＲＮＡによりタンパク質が合成される。ここでＲＮＡとしては、タンパク質合成に関わるｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等が含まれる。無細胞タンパク質合成系としては、少なくともリボゾーム、ＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰ等の試薬を水性緩衝溶液中に含む系を、特に限定することなく用いることができる。例えば、既知の胚芽、大腸菌、家兎網状赤血球、及びその他の植物、動物、昆虫等の真核細胞由来の無細胞抽出液による無細胞タンパク質合成系を用いることができる。これらは公知の方法によって、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物として調製することができる。
【００５８】
本発明の方法においてＤＮＡを鋳型とする場合、基材上にＤＮＡを固定化した後、固定化されたＤＮＡに対して転写系と無細胞タンパク質合成系とを構築することができる。固定化の方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。なお、本発明では二本鎖ＤＮＡが用いられる。基材上の位置によって異なるタンパク質を得ることができるように、複数の異なるＤＮＡを用いることができる。
【００５９】
固定化されたＤＮＡからは、転写系にてＲＮＡが合成される。得られたＲＮＡは、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成に携わる。例えばｍＲＮＡの場合、無細胞タンパク質合成系においてｍＲＮＡの情報がアミノ酸へ翻訳されることによりタンパク質が合成される。転写の工程は転写酵素等の転写用試薬の供給によって開始され、翻訳の工程は無細胞タンパク質合成用細胞抽出物等の翻訳用試薬の供給によって開始される。本発明の方法においては、例えば、転写の工程によってＲＮＡを調製した後に、翻訳の工程を開始することができる。また、転写の開始時から翻訳用試薬を共存させることにより、転写と翻訳とを連続して行うこともできる。なお、転写の工程及び翻訳の工程における反応条件は、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。
【００６０】
本発明の方法においてＲＮＡを鋳型とする場合、基材上にＲＮＡを固定化した後、固定化されたＲＮＡに対して無細胞タンパク質合成系を構築することができる。固定化の方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。基材上の位置によって異なるタンパク質を得ることができるように、複数の異なるＲＮＡを用いることができる。
【００６１】
固定化されたＲＮＡは無細胞タンパク質合成系に供され、タンパク質が合成される。例えばｍＲＮＡの場合、アミノ酸へ翻訳されることによりタンパク質が合成される。翻訳の工程は、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物等の翻訳用試薬の供給によって開始される。翻訳の工程における反応条件としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。
【００６２】
本発明において、基材上での無細胞タンパク質合成系を構築する全成分の量は微量であり、多くとも数μｌ程度のスケールである。このように極めて小さなスケールでタンパク質を合成するため、生成したタンパク質は基材と共にそのままプロテインチップとして扱うことができる。このようにして得られたプロテインチップを様々な解析に用いることにより、解析のスループットの向上、及びシステムのコンパクト化すなわち集積化を図ることができる。
【００６３】
本発明のタンパク質合成方法における基材は、上記ＤＮＡ固定化法で述べたように、例えば、ガラス、石英、金属、樹脂、繊維、生物を構成する物質、半透性膜等である。前記生物を構成する物質としては、コラーゲン、キチン等である。前記半透性膜は、透析膜、半透膜、限外濾過膜、限外濾過バリア、及び化学的又は生物学的に目的物質を捕捉できる膜から選ばれる。基材が半透膜である場合には、合成中に副生成物として生成する合成阻害因子を半透膜を介して排出したり、合成に必要なアミノ酸やエネルギー源を供給したりすることができ、タンパク質をより収量良く得ることができる。
【００６４】
本発明のタンパク質合成方法における基材の形状は、上記ＤＮＡ固定化法で述べたように、薄片（チップ、ウェル）や、薄片に切り分けることができる薄面（シート）等である。基材の表面には凹部や凸部を形成することができる。この場合、形成された凹部又は凸部にＤＮＡやＲＮＡを固定化し、無細胞タンパク質合成のための微小な反応の場として用いると良い。このような凹凸部を高密度に形成することは、タンパク質を基材と共にプロテインチップとして用いる場合、高密度にタンパク質が配置されたプロテインチップを得ることができる点で好ましい。
【００６５】
本発明の無細胞タンパク質合成方法の形態として図６と図７とを例に挙げて説明する。
図６は、本発明の実施形態の一例を表す図である。図６においては、基材1が断面として表されている。基材1の片面側に複数の凹部2が形成され、凹部2にタンパク質合成の鋳型3が固定化されている。鋳型3はＤＮＡでもＲＮＡでも良い。
【００６６】
鋳型3がＤＮＡである場合、ＤＮＡに対して転写用試薬が供給される。本明細書において鋳型3に対する試薬の供給には、以下の形態が含まれる。すなわち、鋳型3が固定化されている凹部2に試薬を分注等することによって供給する形態、又は、前記の形態とは別に、固定化された鋳型3とともに基材1を試薬に浸すことによって供給する形態である。構築された転写系は、公知の方法により適切な温度でインキュベートされ、ＲＮＡが合成される。これにより生成したＲＮＡは、翻訳用試薬をさらに供給することにより無細胞タンパク質合成系に供され、タンパク質が合成される。
【００６７】
或いは、前記ＤＮＡに対して転写用試薬と翻訳用試薬とを一緒に供給しても良い。これにより生成したＲＮＡは、すでに供給された翻訳用試薬によって無細胞タンパク質合成系に供され、タンパク質が合成される。
【００６８】
一方、鋳型3がＲＮＡである場合は、ＲＮＡに対して翻訳用試薬が同様に供給され、タンパク質が合成される。
【００６９】
図７は、本発明の実施形態の他の一例を表す図である。図７においては、第１の基材11と第２の基材14とがそれぞれ断面として表されている。基材11の上面11aには複数の凹部12が形成されており、基材14の下面14aには、基材11の各凹部12に対応する複数の凸部15が形成されている。各凸部15には鋳型13がそれぞれ固定化されている。鋳型13はＤＮＡでもＲＮＡでも良い。
【００７０】
鋳型13がＤＮＡの場合、例えば次のようにしてプロテインチップを作成すると良い。基材11の凹部12に、転写用試薬を分注等により供給する。次に、基材11の上面11aと、基材14の下面14aとを、凹部12と凸部15とが対応するように重ね合わせる。この際、凸部15に固定化されたＤＮＡ13が凹部12中の転写用試薬に対して供給される。すなわち、固定化されたＤＮＡ13が凹部12と凸部15との間に構築された転写系に供され、この転写系においてＲＮＡが合成される。凹部12及び凸部15は、ＲＮＡ合成のために必要なスケールの転写系の容積を確保することができるように形成されていることが好ましい。転写完了後、ＤＮＡ13が固定された基材14を引き上げ、前記転写系からＤＮＡ13を除去することができる。さらに、基材11の凹部12にて生成したＲＮＡに翻訳用試薬を分注等により供給し、タンパク質を合成する。
【００７１】
また例えば、基材11の凹部12に、転写用試薬と翻訳用試薬との両方を分注等により供給し、上記と同様に基材11の上面11aと基材14の下面14aとを重ね合わせ、凹部12と凸部15との間に転写系と翻訳系とを共存させても良い。この際、共存された系においてはＲＮＡの生成と同時にタンパク質合成が開始される。凹部12及び凸部15は、ＲＮＡ合成及びタンパク質合成のために必要なスケールの転写系及び翻訳系の容積を確保することができるように形成されていることが好ましい。基材14は、翻訳が完了した後に引き上げることができる。
以上の操作により、基材11上にタンパク質を得る。
【００７２】
鋳型13がＲＮＡの場合、例えば次のようにして行うと良い。基材11の凹部12に、翻訳用試薬を分注等により供給する。次に、上記と同様に基材11の上面11aと基材14の下面14aとを重ね合わせ、基材14の凸部15に固定化されたＲＮＡ13を凹部12中の翻訳用試薬に対して供給する。このことによって、ＲＮＡが凹部12と凸部15との間に構築された翻訳系に供され、タンパク質が合成される。凹部12及び凸部15は、タンパク質合成のために必要なスケールの翻訳系の容積を確保することができるように形成されていることが好ましい。翻訳完了後、ＲＮＡ13が固定された基材14を引き上げ、前記翻訳系からＲＮＡ13を除去する。以上の操作により、基材11上にタンパク質を得る。
【００７３】
上述のようにして、タンパク質を合成することができる。本発明においては、タンパク質合成のための工程を自動制御することによって効率の向上を図ることも好ましい。
【００７４】
第３に、本発明は、上述のタンパク質合成を行うためのタンパク質合成キットである。本発明のタンパク質合成キットには、前記固定化アダプターＤＮＡ、又は、前記固定化アダプターＤＮＡを用意するための基材、ＤＮＡ、及び制限酵素から選ばれる少なくとも１つのアイテムが含まれる。本発明のタンパク質合成キットにおいて、上記ＤＮＡは、ＤＮＡ固定化法において述べた前記アダプターＤＮＡ、前記アダプターＤＮＡ前駆体、前記一本鎖ＤＮＡ1、2、1'、2'などから選ばれる。これらＤＮＡは、基材上に固定化されたものであっても良い。
【００７５】
さらに、前記アイテムに加えて、鋳型ＤＮＡを調製するための連結反応を行う試薬から選ばれる少なくとも１つが含まれていても良い。このような試薬としては特に限定されず、一般的に連結反応に用いられるものが挙げられる。
【００７６】
さらに、前記アイテムに加えて、無細胞タンパク質合成を行うための試薬及び水性緩衝溶液から選ばれる少なくとも１つが含まれていても良い。このような試薬としては、すでに述べたような、リボゾーム、ＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどが挙げられる。これらは、一般に知られている無細胞タンパク質合成用抽出液として含まれていても良い。試薬としては他に、転写用試薬、翻訳用試薬等が挙げられる。
【００７７】
無細胞タンパク質合成を行うにあたり、すでに述べたように、複数の基材を用いる場合は、ＤＮＡ固定化用の基材に加えて、別途タンパク質合成用の基材が含まれていても良い。
【００７８】
これらのアイテムはすべて保存が可能であり、タンパク質が必要となるときに随時、上述のタンパク質合成に用いることができる。従って、本発明のキットを用いると、タンパク質を使用する必要がある毎に、タンパク質を合成することができる。このため、必要なタンパク質を活性の高い状態で使用することができる。また、すでにＤＮＡ固定化法において述べたように、固定化アダプターを再生し別の目的遺伝子を含むＤＮＡを連結することで再利用が可能である。このため、本発明のタンパク質合成キットを用いることは大変経済的且つ効率的である。
【００７９】
第４に、本発明は、上述のタンパク質合成方法を用いたプロテインチップの作成方法である。例えば、上述のようにして得られたタンパク質を基材と共にプロテインチップとして使用することができる。このとき、プロテインチップは特別な精製工程を経ることなく使用することができる。例えば、目的タンパク質の活性のみを見る場合などは、特別な精製は必要としない場合がある。一方、ある程度の精製が行われるときもある。この場合は、例えば、次のように精製が行われる。まず、第１の基材と第２の基材とを用意する。次に、得ようとするタンパク質にタグが付されるようにタグ配列を有するＤＮＡを作成し、第１の基材を用いて上述の方法に用いる。これによって、タグ付きタンパク質が第１の基材上に生成する。さらに、第２の基材上に、前記タグを特異的に捕らえる物質を配置する。両方の基材を重ね合わせると、タグ付きタンパク質が、第２の基材上にタグを介して固定化される。すなわち、第１の基材から第２の基材へタンパク質のみが移される。移されたタグ付きタンパク質は、第２の基材とともにプロテインチップとして使用することができる。
【００８０】
また、本発明の方法においては、生成したタンパク質が基材に固定化されるようにプロテインチップを作成しても良い。固定化の方法は、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。例えば、基材にそのまま固定化する方法、上述のタグ付きタンパク質を合成する方法によって固定化する方法、基材に試薬溶液に関して透過性を有する膜を用い、タンパク質合成後に溶液を吸引することによって固定化する方法等が挙げられる。
【００８１】
上述のようにして、プロテインチップを作成することができる。本発明においては、プロテインチップを作成するための工程を自動制御することによって効率の向上を図ることも好ましい。
【００８２】
第５に、本発明は、上述のタンパク質合成法を用いてプロテインチップを作成するための基材を含む、プロテインチップ作成キットである。本発明のプロテインチップ作成キットには、前記固定化アダプターＤＮＡ、又は、前記固定化アダプターＤＮＡを用意するための基材、ＤＮＡ、及び制限酵素から選ばれる少なくとも１つのアイテムが含まれる。本発明のプロテインチップ作成キットにおいて、上記ＤＮＡは、ＤＮＡ固定化法において述べた前記アダプターＤＮＡ、前記アダプターＤＮＡ前駆体、前記一本鎖ＤＮＡ1、2、1'、2'などから選ばれる。これらＤＮＡは、基材上に固定化されたものであっても良い。
【００８３】
さらに、前記アイテムに加えて、鋳型ＤＮＡを調製するための連結反応を行う試薬から選ばれる少なくとも１つが含まれていても良い。このような試薬としては特に限定されず、一般的に連結反応に用いられるものが挙げられる。
【００８４】
さらに、前記アイテムに加えて、無細胞タンパク質合成を行うための試薬及び水性緩衝溶液から選ばれる少なくとも１つが含まれていても良い。このような試薬としては、すでに述べたような、リボゾーム、ＲＮＡ、基質のアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどが挙げられる。これらは、一般に知られている無細胞タンパク質合成用抽出液として含まれていても良い。試薬としては他に、転写用試薬、翻訳用試薬等が挙げられる。
【００８５】
プロテインチップ作成のための無細胞タンパク質合成を行うにあたり、すでに述べたように、複数の基材を用いる場合は、ＤＮＡ固定化用の基材に加えて、別途基材が含まれていても良い。またさらに、生成したタンパク質を固定化するための基材が含まれていても良い。
【００８６】
プロテインチップ作成のために、すでに述べたように、タンパク質をある程度生成する場合は、ＤＮＡ固定化用の基材に加えて、別途プロテインチップ作成用の基材が含まれていても良い。
【００８７】
これらのアイテムはすべて保存が可能であり、プロテインチップが必要となる時に随時、上述の無細胞タンパク質合成に用いることができる。従って、本発明のキットを用いると、プロテインチップの使用の必要がある毎に、プロテインチップを作成することができる。このため、プロテインチップをタンパク質活性の高い状態で使用することができる。また、すでにＤＮＡ固定化法において述べたように、固定化アダプターを再生し別の目的遺伝子を含むＤＮＡを連結することで再利用が可能である。このため、本発明のプロテインチップ作成キットを用いることは大変経済的且つ効率的である。
【実施例】
【００８８】
本実施例においては、ＤＮＡを基材上に固定し、基材上にて無細胞（in vitro）タンパク質合成反応を行った。固定化したＤＮＡは転写制御配列を含んでいるため、大腸菌細胞抽出液を添加することにより目的タンパク質を合成することができる。
【００８９】
本実施例では、ＤＮＡの固定化については、図８に模式図として示される方法で行った。
【００９０】
以下のものを用意した。
・ストレプトアビジンコートプレート（Nalge-Nunc社製）
・オリゴヌクレオチド１：
bCTTTTCCCAGTCACGACAAGCTTCATGGAC（配列番号１）
ただし、bCはビオチン化されたシトシンを表す。さらに内部にHindIIIの認識配列を含む。
・オリゴヌクレオチド２：
GTCCATGAAGCTTGTCGTGACTGGG（配列番号２）
・無細胞タンパク質合成用抽出液：大腸菌抽出液RTS（ロシュ社製）
GFP（緑色蛍光タンパク質）合成用プラスミド：pIVEXコントロールベクターGFP（RTSキットに添付のもの、ロシュ社製）
・制限酵素HindIII、EcoRI
・ライゲーションキットver.2（宝酒造製）
・洗浄用バッファ（50mM HEPES-Na pH7.5, 0.5MNaCl, 1v/v%Tween 20）
【００９１】
［１．ビオチン化オリゴヌクレオチドのストレプトアビジンプレートへの結合］
オリゴヌクレオチド１（500pmol）とオリゴヌクレオチド２（500pmol）とを、洗浄用バッファで希釈することにより容量を60μlとした。オリゴヌクレオチドのアニーリングは、98℃、5分の処理後、0.1℃/秒で4℃まで温度を降下させることにより行った。次に、アニーリングした５´ビオチン化二本鎖ＤＮＡ断片（アダプターＤＮＡ前駆体）をストレプトアビジンコートプレートのウェルに加え、37℃で1時間吸着させた。未反応のオリゴヌクレオチドは、100μlの洗浄用バッファで5回洗浄することによりウェルから取り除いた。このようにして、ウェルに結合したオリゴヌクレオチド（固定化アダプターＤＮＡ前駆体）を得た。
【００９２】
［２．制限酵素処理］
ウェルに結合したオリゴヌクレオチド（固定化アダプターＤＮＡ前駆体）に、HindIII反応液（ミディアムバッファ、HindIII 10U）60μlを加え37℃で1時間切断反応を行った。反応後はウェルを100μlの洗浄用バッファで5回洗浄し、バッファを取り除き、ウェル上に固定化された制限酵素処理済のオリゴヌクレオチド（固定化アダプターＤＮＡ）を得た。
【００９３】
別途、GFPを含むコントロールベクター（pIVEXコントロールベクターGFP）5μgをHindIII反応液を用いて上記と同じ条件で切断反応を行った。反応後、フェノール・クロロフォルム抽出及びエタノール沈殿を行い、沈殿を15μlの純水に溶解し、制限酵素処理済ベクター（目的ＤＮＡ）の溶液を得た。
【００９４】
［３.固定化オリゴヌクレオチドとGFP遺伝子を含むベクターとのライゲーション］
制限酵素処理済のオリゴヌクレオチドが固定化されたウェル上に、上記制限酵素処理済ベクターの溶液15μlと、ライゲーションキットＩ液15μl及びII液30μlとを加え、撹拌した。このウェルを12℃で1時間放置することにより、ライゲーション反応を行った。反応後は、100μlの洗浄用バッファでウェルを5回洗浄した。その後、バッファを除去し、ウェル上に固定化されたライゲーションされたＤＮＡ（固定化ＤＮＡ）を得た。
【００９５】
［４．in vitroタンパク質合成反応］
ライゲーションされたＤＮＡが固定化されたウェル上に10μlの純水を加え、続いてRTSタンパク質合成システムの必要な試薬を添加した。試薬の組成などはロシュ社のマニュアルに従った。また、陽性対照は、0.5μgのpIVEXコントロールGFPベクターを固定化されていない鋳型として、RTSシステムによりGFPを合成したものとした。陰性対照は、鋳型ＤＮＡを加えない以外は同じ条件で処理したものとした。30℃、6時間の合成反応後、マイクロプレートリーダー（TECAN社製、GENios）により生成物の蛍光強度を測定した（励起波長395nm、放射波長504nm）。
【００９６】
［結果］
それぞれの蛍光強度(相対蛍光強度；RFU)は以下のとおりである。
陽性対照・・・・・2421
固定化ＤＮＡ・・・1561
陰性対照・・・・・225
【００９７】
この結果が示すように、本発明の方法によるものは、陽性対照と比較して60％程度の蛍光が見られたことから、プレートに固定化したＤＮＡからもGFPが合成されることが明らかとなった。本発明の方法は、他の遺伝子にも反応できると考えられる。なお、RTSのマニュアルによると、直鎖化したコントロールベクターを使用した場合、250μg/ml前後のGFP合成が可能である。このことから、この手法で固定化したＤＮＡ鋳型からでも、100μg/ml以上のGFP合成が可能と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明のＤＮＡ固定化法の一形態を表した図である。
【図２】本発明のＤＮＡ固定化法の一形態において、固定化アダプターＤＮＡを調製する方法の一例を表した図である。
【図３】固定化アダプターＤＮＡを調製する方法の一例において、固定化アダプターＤＮＡ前駆体を調製する方法を表した図である。
【図４】本発明のＤＮＡ固定化法の一形態において、固定化アダプターＤＮＡを調製する方法の他の一例を表した図である。
【図５】固定化アダプターＤＮＡを調製する方法の他の一例において、アダプターＤＮＡを調製する方法を表した図である。
【図６】本発明のタンパク質合成方法の実施の一形態を表した図である。
【図７】本発明のタンパク質合成方法の実施の一形態を表した図である。
【図８】本実施例によるＤＮＡの固定化法を表した図である。
【符号の説明】
【００９９】
１      基材
２      凹部
３      鋳型
１１    基材
１１ａ  基材１１の上面
１２    凹部
１３    鋳型
１４    基材
１４ａ  基材１４の下面
１５    凸部
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１は、目的ＤＮＡをストレプトアビジンでコートされた基材に連結するための連結オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、上記配列番号１で特定されたオリゴヌクレオチドの一部の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【図１】
2005065694.tif 000003
【図２】
2005065694.tif 000004
【図３】
2005065694.tif 000005
【図４】
2005065694.tif 000006
【図５】
2005065694.tif 000007
【図６】
2005065694.tif 000008
【図７】
2005065694.tif 000009
【図８】
2005065694.tif 000010
【配列表】
2005065694000001.app