(57)【要約】【課題】      より副作用が少なく、汎用性の高い免疫抑制、炎症抑制にも有用な新しい薬剤を提供する。【解決手段】  亜鉛もしくは亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とするカルシニューリン阻害剤とする。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛もしくは亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とするカルシニューリン阻害剤。
【請求項２】
錠剤、溶液、軟膏または座薬の剤型を有することを特徴とする請求項１のカルシニューリン阻害剤。
【請求項３】
亜鉛もしくは亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とする免疫抑制剤または抗炎症剤。
【請求項４】
他種の免疫抑制剤と併用として含有されていることを特徴とする請求項３の免疫抑制剤または抗炎症剤。
【請求項５】
錠剤、溶液、軟膏または座薬の剤型を有することを特徴とする請求項３または４の免疫抑制剤または抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明はカルシニューリン阻害剤と免疫抑制剤、抗炎症剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カルシニューリン(CN)は、プロテインフォスファターゼ2Bとも呼ばれ、Ca2+/カルモジュリン(CaM)依存性のセリン/スレオニン フォスファターゼである。セリン/スレオニン フォスファターゼとは、いろいろなタンパク質中のセリンあるいはスレオニン残基に結合したリン酸を除去する酵素であり、CaMとはCNなどの各種酵素（これらをCaM依存性酵素と言う）に結合して酵素活性を調節するタンパク質で、CaM自身もCa2+によって活性化される。CNは、触媒Aサブユニット(CN-A)と調節Bサブユニット(CN-B)からなり、CN-Aは、CaM結合ドメイン、CN-B結合ドメイン、C末端自己阻害ドメイン、およびFe2+-Zn2+を含有する触媒ドメインをもつこと、また、CN-Bは、EFハンドモチーフを有し、4つのCa2+と結合することが知られている。
【０００３】
そしてCNは、高等および下等真核生物のさまざまな細胞機能において、重要な役割を果たすことが示されている。例えば、CNは、神経細胞アポトーシス（非特許文献１）やアルツハイマー病におけるタウタンパク質の高リン酸化（非特許文献２）に関与している。また、CNは免疫細胞の活性化において重要な役割を果たしている。活性化された免疫系T細胞においては、CNは、遺伝子発現調節因子NFATを脱リンすることによって活性化し、インターロイキン-2(IL-2)などの発現を促進する（非特許文献３）。さらに、免疫抑制剤サイクロスポリンAやFK506は、イミュノフィリンというタンパク質に結合して、それを介してCNを阻害することが分かっている（非特許文献４）。CNは、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeや出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの細胞質分裂、細胞の形、およびイオンホメオスタシスに関与することも分っている。
【０００４】
CNの活性調節に関しては、通常の細胞内ではCa2+やCaMによって活性化されるが、in vitro（試験管内）ではMn2+やNi2+などの2価のイオンによって強く活性化されることが知られている（非特許文献５―６）。しかし、CNの活性調節における各種金属イオンの正確な役割は、未だ明らかにされていない。例えばZn2+の場合、ある報告では、Zn2+はCNを刺激するとされているが（非特許文献７)、Zn2+はCNに影響を及ぼさないとの報告もある（非特許文献５，８）。
【０００５】
一方、Zn2+はさまざまな生物に見られ、金属依存性酵素の構成成分としての活性調節機能、DNA結合タンパク質の亜鉛フィンガーモチーフによる遺伝子発現の調節、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のキャプシド形成など、多くの細胞機能に必須であることも報告されている。
【非特許文献１】H.Wang, et a., Science 284(1999)339-343
【非特許文献２】C.X.Gong,et al., J.Neurochem.62(1994)803-806
【非特許文献３】G.R.Grabtree, Cell 96(1999)611-614
【非特許文献４】J.Liue, et al.,Cell 66(1991)807-815
【非特許文献５】H.C.Li, et al., J.Biodhem. 144(1984)447-452
【非特許文献６】C.J.Pallen, et al., J.Biol. Chem. 259(1984)6134-6141
【非特許文献７】M.H.Kinks, et al., Fed.Proc. 42(1983)2026
【非特許文献８】M.M.King, et al., Biochem-Biophys-Res.Commun.114(1983)955-961
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この出願の発明は、上記のような背景に鑑みなされたものであって発明者によるカルシニューリン（ＣＮ）の活性に対する金属イオンの影響の検討から生理的作用を有する新しい薬剤を提供することを課題としている。
【０００７】
特に、近年、臓器移植にともなう免疫抑制剤ＦＫ５０６やサイクロスポリンＡの有用性が注目されながらも、これら薬剤の副作用が問題になっており、また、免疫系の過剰反応によると考えられる多くの疾病、炎症に関しても有効な治療法が必ずしも確立されていない現状において、より副作用が少なく、汎用性の高い免疫抑制、炎症抑制にも有用な新しい薬剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、亜鉛もしくは亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とするカルシニューリン阻害剤を提供し、第２には、錠剤、溶液、軟膏または座薬の剤型を有することを特徴とするカルシニューリン阻害剤を提供する。
【０００９】
また、この出願の発明は、第３には亜鉛もしくは亜鉛化合物を有効成分として含有することを特徴とする免疫抑制剤、抗炎症剤を提供し、第４には、他種の免疫抑制剤と併用として含有されていることを特徴とする免疫抑制剤、抗炎症剤を、第５には、錠剤、溶液、軟膏または座薬の剤型を有することを特徴とする免疫抑制剤、抗炎症剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
上記のとおりのこの出願の発明によって、生体細胞の各種機能の発現において重要な役割を果たし、各種疾病や不全に深く係わっていると考えられるカルシニューリン（ＣＮ）活性を顕著に阻害し、免疫を抑制し、免疫過剰反応を抑えることが可能になる。また、炎症を抑えることも可能となる。
【００１１】
他種のＦＫ５０６やシクロスポリン系免疫抑制剤等との併用による相乗効果も実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１３】
まずなによりも特徴的なことは、この出願のカルシニューリン（ＣＮ）阻害剤、そして免疫抑制剤においては、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）（以後、「亜鉛」と表記）の作用を活用し、このことを必須としていることである。従って、この出願の発明では、このような亜鉛を生体内で作用させることのできる、亜鉛もしくは亜鉛化合物を有効成分として含有している。
【００１４】
この亜鉛の作用について根拠を説明すると、たとえば後述の実施例において図１として示されているように、試験管内（in vitro）においての実験で、生理的濃度の亜鉛は、濃度依存的にCN活性を顕著に阻害する。In vitro実験を行う際に、CNを活性化する薬剤としてニッケル（Ni2+）がしばしば使用されるが、亜鉛はニッケル存在下（図１A）においても非存在下（図１B）においても、CNを阻害するため、亜鉛は生体内でもCNを阻害するものと推察される。
【００１５】
図４に示すように、亜鉛（Ｚｎ2+）は、CN以外のカルモジュリン依存性酵素（PDE1, MLCK）や亜鉛依存性の酵素（AP）を全く阻害しなかったことから、亜鉛による活性阻害作用はCNに対して特異的なものであろうと思われる。
【００１６】
そしてまた、Jurkat細胞におけるインターロイキン−2(IL-2)産生に対する亜鉛の効果として図５に示されているように、免疫系細胞におけるIL-2産生を阻害する。免疫系細胞におけるIL-2産生は免疫力の指標の１つであり、このことからも亜鉛は有効な免疫抑制効果を発現する。
【００１７】
以上のような顕著な作用を示すこの出願の発明のカルシニューリン（ＣＮ）活性阻害剤と免疫抑制剤については、その剤型は各種のものであってよく、錠剤や溶液剤は経口投与によって口腔、食道、胃などの表層に作用させることができ、軟膏剤は皮膚に塗り、また座薬とともに、肛門から直腸、大腸の表層に作用させることができる。
【００１８】
固体製剤の調製に使用できる成分としては、乳糖、デンプン、ショ糖、マンニトール、結晶セルロースなどの賦形剤、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴムなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン又はその架橋体、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどの崩壊剤、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ジメチルポリシロキサン、タルク、ポリエチレングリコール、硬化油などの滑沢調があり、このほか、必要に応じて着色剤、甘味剤等を使用することができる。また必要に応じてコーティングを施すこともでき、コーティング剤としてヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、オイドラギット、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート等があり、ショ糖、アラビアゴム、炭酸カルシウム、タルク、ゼラチンなどを主成分として糖衣を施すこともできる。液体製剤の調剤に使用できる成分としては、精製水、エタノール、グリセリン、ショ糖、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、メタ水酸化アルミニウム、寒天、トラガントガムなどがあり、このほか必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、保存剤、香料、着色剤、矯味剤等を使用することができる。
【００１９】
亜鉛は、体内必須元素であり、体内恒常性維持機能（ホメオスタシス）によって濃度制御されていると考えられ、この意味においては、この出願の発明の薬剤の投与量は多少多くてもほとんど問題はない。投与量の目安としては、栄養素としての上限摂取量の約３０mg/dayを考慮することができる。又、このことを考慮することで体内の毒性の問題も生じない。
【００２０】
そこで、以下に実験例、実施例を示し、さらに詳しく説明する。
【００２１】
もちろん、この出願の発明は以下の例によって限定されることはない。
【実施例】
【００２２】
〈材料および方法〉
試薬および精製タンパク質
ウシの脳のカルシニューリン(CN)、カルモジュリン(CaM)、CaM依存性の環状ヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ(PDE1)、p-ニトロフェニルフォスフェート(pNPP)、および抗CN-Aモノクローナル抗体は、Sigma（ミズーリ州セントルイス）から、子ウシの腸のアルカリフォスファターゼ(AP)は、New England BioLabs（マサチューセッツ州べバリー）から入手した。平滑筋ミオシンとMLCKは、以前に記述された方法に従ってニワトリの砂嚢から精製した。使用された酵素活性単位の定義は、製造業者の説明書に従っている。CNの1単位(U)はCN約6.5 pmolであり、CaMの1単位(U)はCaM約14-15 pmolである。
CN活性の測定
CN活性測定は、特に表記しない限り以下のごとく実施した。CN (約0.1 mM)およびCaM (約0.2 mM)それぞれ3Uを、30°Cで60分間、0.2 mM NiCl2の存在下または非存在下において、200 mlの反応緩衝液（100 mM Hepes-NaOH、pH 7.5、1 mM CaCl2、5 mM MgCl2、さまざまな濃度のZn2+、および3 mM pNPP）中で反応させた（実験によっては、条件を表示のとおり変更した）。反応は800 mlの1 M Na2CO3を加えて終了した。CN活性については、CNの基質であるpNPPが分解されて発色するため、反応混合物の吸光度(410 nm： A410)を測定して定量した。A410と加水分解されたpNPPの関係を決定するために、加水分解されたpNPPの生成物であるp-ニトロフェノール(NP)の既知濃度の溶液のA410を測定した。図２の反応速度論的分析は、ラインウィーバー・バークのプロットを用いて行った。
【００２３】
さらにNi2+非存在下でのCNの活性を評価するために、CNおよびCaMそれぞれ10 Uを、30°Cで60分間、10 mM ZnSO4の存在下または非存在下において、100 mlの反応緩衝液（100 mM Hepes-NaOH、pH 7.5、1 mM CaCl2、5 mM MgCl2、および3 mM pNPP）中で培養し、100 mlの1 M Na2CO3を加えて反応を終了した。CNの活性は、反応混合物の吸光度（A410）を測定して定量した。
AP活性の測定
AP (26 mU)を、37°Cで5分間、さまざまな濃度のZnSO4の存在下において、200 mlの反応液（0.3 M glycine-NaOH、pH 10.5、1 mM MgCl2、および6 mM pNPP）中で培養し、750 mlの1 M Na2CO3および50 mlの0.1 M EDTAを加えて反応を終了した。AP活性は反応混合物のA410を測定して定量した。
PDE1活性の検定
発明者は、CaM依存性のcAMP分解酵素であるPDE1活性の単純な検定系を確立した。PDE1 (10 mU)を、30°Cで30分間、CaM (100 U)の存在下において、400 mlの反応液（50 mM Tris-HCl、pH 8.0、5 mM MgCl2、0.2 mM CaCl2、および0.4 mM cAMP）中で、さまざまな濃度のZnSO4、2.5 mMのカルミダゾリウム、または50 mMのW-7の存在下で培養し、100 mlの1 N HClを加えて酵素反応を終了した。サンプルを中和し、放射線免疫検定法(RIA)によって、それぞれのサンプル中のcAMP含有量を測定した。PDE1の活性（つまり分解されたcAMP量）は、cAMPの出発量(0.4 mM)から、測定されたcAMP残量を差し引いて算出し、相対値として与えた。1 UのPDE1は、pH 7.5、30°Cで1分間に1 mmolのcAMPを5’-AMPに加水分解する。
ミオシン軽鎖キナーゼの検定
ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)はCaM依存性にミオシンをリン酸化する酵素である。精製ミオシン(3.7 mM)を0.086 mMのMLCKと0.3 mMのCaMと共に、10 mMのZnSO4またはカルミダゾリウムの存在下または非存在下において、反応液（20 mM Tris-HCl、pH 7.5、2 mM ATP、60 mM KCl、5mM MgCl2、0.1 mM CaCl2、および1 mMジチオスレイトール）中で25°Cで20分間培養した。6 Mの尿素、14 mMの2-メルカプトエタノール、および50 mMのTris-HCl (pH 6.8)を含有する同容量のサンプルバッファーを加えて反応を終了した後、標本を以前に記述された方法に従って尿素・グリセロールPAGEによって分析し、リン酸化されたミオシンの量を測定した。
CN-CaM相互作用の検定
二本のエッペンドルフチューブに、約100 mlのCaM-Sepharose 4B（Amersham-Pharmacia、英国）を分抽し、10 mMのZnSO4の存在下または非存在下において反応緩衝液（100 mM Hepes-NaOH、pH 7.5、0.1 M NaCl、1 mM CaCl2、0.2 mM NiCl2、および0.01% (w/v) BSA）を加えて平衡化させた。CN (約0.1 mM)をそれぞれのエッペンドルフチューブ（CaM-Sepharose）に加え３０分間撹拌しながら、CNとCaM-SepharoseをZnSO4存在下、非存在下で結合させた。遠心分離によってCaM-Sepharoseを沈澱させた後、上澄み(100 ml)を収集し、CaM-Sepharoseを100 mlの同緩衝液で2回洗浄すると同時に、上澄みをSDS-PAGEのために保存した。その後CaM-Sepharoseに結合したCNを、100 mlの溶出緩衝液（100 mM Hepes-NaOH、pH 7.5、0.1 M NaCl、20 mM EGTA、0.01% (w/v) BSA、および±10 mM ZnSO4）で2回溶出し、上澄みを保存した。収集したすべての上澄みの18 mlを、2倍に濃縮されたSDSサンプルバッファー12 mlと混合し、SDS-PAGE（10%ポリアクリルアミドゲル）で分離し、ニトロセルロース膜(NCM)上に移した。NCMを、5% (w/v)の脱脂粉乳を含有するTBS-T（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、137 mM NaCl、および0.1% (w/v) Tween 20）中で、抗CN-A抗体（希釈1 : 500）で1時間培養した。TBS-Tで洗浄後、NCMを、5%の脱脂粉乳を含有するTBS-T中で、西洋わさびのペルオキシダーゼを結合した抗マウス抗体（希釈1 : 1000）を用いて1時間培養した。TBS-Tで洗浄後、NCMを、化学発光発色(ECL)キットを用いて処理し、ECL用のHyperfilm（Amersham、英国）にさらしてCNのバンドを検出した。
〈実験結果〉
CNの活性に対するZn2+の影響
まず、基礎実験として、Ni2+を用いたCN活性のin vitro検定系を確立した（dataは省略）。Ni2+はCNの人為的活性化剤である。そして、その検定系を用いて、Ni2+存在下でのCN活性に対するZn2+の影響を調べた（図1A）。Zn2+が本酵素の反応中心の成分として必須であるにもかかわらず、10 nM-10 mMのZnCl2とZnSO4はともに、Ni2+によって刺激されたCN活性を濃度依存性に阻害した（図1A）。10 mMのZn2+は、CN活性をほぼ完全に阻害し、約50%の阻害は、0.25 mMのZn2+で得られた（図1A）。発明者は、Zn2+がCN活性をNi2+の非存在下でも阻害するかどうかも検討した。しかし、CN活性はNi2+非存在下では非常に低かったため（A410<0.025；図1A）、活性に対するZn2+の影響を評価することは困難であった（図1A）。このため、より多くの量のCNとCaMを検定に使用したところ、CN活性は投与量に依存して1-100 mMのZn2+で阻害され、IC50は7 mMであった（図1B）。これらの結果は、大変に重要であって、Zn2+はCN活性の強力な阻害剤であることを示している。
Zn2+の作用の速度論的分析
CN、Zn2+、およびpNPPまたはNi2+の間の相互作用を調べるために、CN活性をさまざまな濃度のZn2+とpNPP（図2A）またはNi2+（図2B）の存在下で測定した。データは、ラインウィーバー・バークの式に従ってプロットした。図2Aに示すように、Zn2+（0.1または0.3 mM）の非存在下および存在下におけるVmax値はさまざまで、CNに対するpNPPの見かけの親和性は、Zn2+の濃度の増加とともに減少した。この結果は、Zn2+はCNおよびCN-pNPP複合体に対して異なるKi値で結合でき、従ってpNPPと競合せずにCN活性を阻害することを示す。これに対して図2Bは、0.2または0.3 mMのZn2+の存在下および非存在下において、CNに対するNi2+の見かけの結合はZn2+の濃度の増加とともに減少するが、Vmax値はほぼ同じであることを示す。この結果は、Zn2+がNi2+と競合してCN活性を阻害することを示す。
CNとCaMの相互作用に対するZn2+の影響
CNはCaM依存性酵素であるため、CNとCaMの相互作用に対するZn2+の影響をCaM-Sepharoseを用いて検討した。図3に示すように、10 mM Zn2+の存在にもかかわらず、CNはCaM-Sepharoseによく結合し、EGTA含有緩衝液によって溶出され、Zn2+がCN-CaM相互作用に干渉しないことを示す。
PDE1、MLCK、およびAPに対するZn2+の影響
Zn2+が他のCaM依存性酵素あるいはまたフォスファターゼを阻害するかどうかを評価するために、CaM依存性環状ヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ(PDE1)（図4A）、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)（図4B）、およびアルカリフォスファターゼ(AP)（図4C）に対するZn2+の影響を調べた。Zn2+はPDE1およびMLCKの活性に影響を及ぼさなかったが、Zn2+依存性酵素APを活性化した。
Jurkat細胞におけるインターロイキン-2(IL-2)産生に対する亜鉛の効果
免疫系由来のJurkat細胞をコンカナバリンA(ConA)で刺激するとIL-2を産生する。この免疫系細胞によるIL-2産生能は、免疫力の指標の１つである。そこで、Jurkat細胞におけるIL-2産生に対する亜鉛の効果を検討した。Jurkat細胞をConA存在下、あるいは、ConAプラス0.03 mM-0.3 mMの亜鉛または1 mMの免疫抑制FK506存在下で３時間培養した。その後、全ての細胞を回収してそれぞれのサンプル細胞からRNAを抽出し、RT-PCR法と続く電位泳動法によりIL-2 mRNAとG3PDH（標準化マーカー）mRNAを検出した。この結果を図５に示す。
Jurkat細胞におけるIL-2産生に対する亜鉛と免疫抑制剤FK506の効果
亜鉛が他の免疫抑制剤と相加的効果を示すかどうかを検討するために、Jurkat細胞をConA存在下、あるいは、ConAプラス15 mM-0.1 mMの亜鉛と10 nM免疫抑制FK506の存在下で３時間培養した。その後、全ての細胞を回収してそれぞれのサンプル細胞からRNAを抽出し、RT-PCR法と電気泳動法によりIL-2 mRNAとG3PDH（標準化マーカー）mRNAを検出した。得られた電気泳動像をコンピューターに取込み、IL-2とG3PDHの量を数値化し、IL-2/G3PDH比を計算し、グラフ化した。これらの結果を図６に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】CN活性に対するZn2+の影響を示した図である。(A) Ni2+存在下でのCN活性に対するZn2+の効果を調べた。Ni2+ はCNの活性化剤で、一般にIn vitroでのCN活性測定時にしばしば添加される。CN (3 U)およびCaM (3 U)を、表示した濃度のZnCl2（三角印）またはZnSO4（丸印）を含有する反応液中で、0.2 mM NiCl2の存在下（塗りつぶした印）または非存在下（塗りつぶしていない丸印）において培養し（30°Cで60分間）、反応混合物の吸光度（A410）を測定してCN活性を求めた。データは、対照（＝Zn2+非存在下のNi2+誘導CN活性＝100）に比較した相対活性として与えられている。この実験の結果、ZnCl2あるいはZnSO4どちらの化合物として存在しても、亜鉛がCN活性（Ni2+存在下）を阻害することが分った。(B) Ni2+非存在下でのCN活性に対するZn2+の効果を調べた。Ni2+非存在下では、ベースのCN活性が低いため、少し多めのCNとCaMを使用して実験を行った。CN (10 U)およびCaM (10 U)を、表示した濃度のZnSO4を含有する反応液中で培養し（30°Cで60分間）、反応混合物の吸光度（A410）を測定してCN活性を求めた。データは、対照（＝Zn2+非存在下のCN活性＝100）に比較した相対活性に変換し、3回の独立した実験の平均値±SDとして与えられている。
【図２】Zn2+誘導によるCN活性の阻害の速度論的分析の結果を示した図である。CN (3 U)およびCaM (3 U)を、30°Cで60分間、(A) 反応液（1 mM CaCl2、5 mM MgCl2、0.2 mM NiCl2を含む）中で、さまざまな濃度のpNPPおよびZnSO4の存在下において、または(B) 反応液（1 mM CaCl2、5 mM MgCl2、および3 mM pNPPを含む）中で、さまざまな濃度のNiCl2およびZnSO4の存在下において培養し、CN活性を測定した。データは1/V 対 1/[pNPP](A)または1/[Ni2+](B)としてプロットし、最適な線は線形回帰分析によって求めた。ここで、Vは酵素反応速度を表し、[pNPP]は基質であるpNPP濃度を表している。y切片の値は、pNPP (A)またはNi2+ (B)存在下において得られる理論的最大速度(Vmax)を表す。(A) Vmaxは、Zn2+非存在下において0.31 nmol/tube/min、Km値は0.64 mMであると算出された。0.3 mM Zn2+の存在下において、VmaxIは0.18 nmol/tube/min、KmIは1.08 mMであった。Kiは0.16 mM、K’iは0.42 mMであった。結果は、Zn2+が基質に対して非競合的阻害剤であることを示す。(B)見かけのVmaxは、Zn2+の非存在下において0.28 nmol/tube/minであると算出された。これらの結果は、Zn2+はNi2+に対して競合的なCN阻害剤であることを示している。
【図３】CN-CaM相互作用に対するZn2+の影響を示した図である。CNはCaMと結合することによって活性化される酵素であるため、Zn2+がCNとCaMの結合を阻害することによってCN活性を阻害するのかどうかを検討した。精製したCN (lane CN)を適当な緩衝液に溶かし、10 mM ZnSO4 (Zn2+)の非存在下（対照）または存在下において、試験管内でCaM-Sepharoseと結合させた。結合反応後の上澄みをウエスタンブロット用(lane S)に収集し、同緩衝液で2回洗浄後（lane W1およびW2）、CaM-Sepharoseに吸着したCNを溶出液で2回溶出し（lane E1およびE2）、それぞれのサンプルを電気泳動で展開し、含まれているCN量を抗CN-A抗体によるウエスタンブロット法で検出した。3回の独立した実験のうち代表的な結果を示す。この結果、Zn2+はCNとCaMの結合を阻害しないことが分った。
【図４】PDE1、MLCK、およびAPに対するZn2+の影響を示した図である。CNは、CaM依存性フォスファターゼである。そこで、Zn2+が他のCaM依存性酵素（PDE1, MLCK）やフォスファターゼ（AP）を阻害するかどうかを調べた。(A)cAMP分解酵素である PDE1とCaMを、30°Cで30分間、表示の濃度のZnSO4、カルミダゾリウム(CZM)、またはW-7を含有する反応液中で培養し、RIA法を用いて溶液中のcAMP含有量について検定した。PDE1の活性は、反応前のcAMP量(0.4 mM)から、反応終了時のcAMP残量を差し引いて算出した。データは、2回の独立した実験の相対活性（対照＝100）の平均値±SDとして与えられている。CZMとW-7は既知のCaM依存性酵素の阻害剤である。この結果は、Zn2+がPDE1活性を阻害しないことを示す。 (B)ミオシン、CaM、およびMLCKを、10 mMのZnSO4または10 mMのカルミダゾリウム(CZM)の存在下または非存在下において、25°Cで20分間反応液中で培養し、サンプルを尿素・グリセロールPAGEによって展開して、MLCLによってリン酸化されたミオシンのバンドを検出した。この結果は、Zn2+がMLCK活性を阻害しないことを示す。
【００２５】
(C) APを、表示した濃度のZnSO4の存在下において37°Cで5分間、反応液中で培養し、AP活性を評価した。2回の独立した実験の結果を示す。この結果は、Zn2+がAPを阻害するのではなくて、むしろ活性化することを示す。
【図５】Jurkat細胞におけるインターロイキン-2(IL-2)産生に対する亜鉛の効果を示した図である。免疫系のJurkat細胞をコンカナバリンA(ConA)で刺激すると３時間ほどでIL-2が産生される。しかし、培地中に亜鉛または免疫抑制FK560が存在するとIL-2産生は抑制される。IL-2産生は、RT-PCR法と電気泳動によりIL-2mRNAを検出した。G3PDHは標準化マーカー。
【図６】Jurkat細胞におけるIL-2産生に対する亜鉛と免疫抑制剤FK506の効果を示した図である。(A)亜鉛が他の免疫抑制剤と相加的効果を示すかどうかを検討するために、Jurkat細胞をConA存在下、あるいは、ConAと亜鉛あるいはまた少量の免疫抑制FK506の存在下で３時間培養した。その後、RT-PCR法と電気泳動法によりIL-2 mRNAとG3PDH（標準化マーカー）mRNAを検出した。(B)得られた電気泳動像をコンピューターに取込み、IL-2とG3PDHの量を数値化し、IL-2/G3PDH比を計算し、グラフ化した。亜鉛とFK506は、それぞれIL-2産生を抑制したが、亜鉛プラスFK506では、IL-2抑制効果が促進された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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