(57)【要約】【課題】アミド基を持つゲルを用いて抗体結合分子の非特異的な吸着を抑えると共に、抗体結合分子を前記アミド基を持つゲル内に包接固定して抗体結合分子の抗体結合活性低下を抑制して、抗体分子をアミド基を持つゲルあるいは不溶性物質に敷設されたアミド基を持つゲルに固定することのできる抗体固定方法および抗体固定基板を提供する。【解決手段】不溶性物質で形成された基板上に、抗体結合分子を包接したアミド基を持つゲルを２次元または３次元状に固定し、前記抗体結合分子に抗体分子の根元部を固定する。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性物質で形成された基板上に、抗体結合分子を包接したアミド基を持つゲルを２次元または３次元状に固定し、前記抗体結合分子に抗体分子の根元部を固定することを特徴とする抗体固定方法。
【請求項２】
前記抗体結合分子は、プロテインＧを代表とする抗体結合活性を持つ生体高分子または高分子化合物であり、その抗体結合分子は前記アミド基に非共有結合的に包接されるように調製されたことを特徴とする請求項１に記載の抗体固定方法。
【請求項３】
前記不溶性物質として、金属、プラスチック、ガラスなどの不溶性高分子化合物が使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体固定方法。
【請求項４】
前記アミド基を持つゲルはポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の抗体固定方法。
【請求項５】
前記抗体結合分子は前記抗体分子と１点または多点で結合することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の抗体固定方法。
【請求項６】
前記不溶性物質の表面をメタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理し、その上に前記アミド基を持つゲルを塗布して重合させることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の抗体固定方法。
【請求項７】
抗体を固定化する基板であって、
前記抗体と結合する抗体結合分子を非共有結合的に包接するアミド基を持つゲルを、不溶性物質に敷設してなる抗体固定基板。
【請求項８】
前記抗体結合分子は、プロテインＧを代表とする抗体結合活性を持つ生体高分子または高分子化合物であり、その抗体結合分子は前記アミド基に非共有結合的に包接されていることを特徴とする請求項７に記載の抗体固定基板。
【請求項９】
前記不溶性物質として、金属、プラスチック、ガラスを含む不溶性材料を使用したことを特徴とする請求項７または８に記載の抗体固定基板。
【請求項１０】
前記アミド基を持つゲルはポリアクリルアミドゲルであることを特徴とする請求項７ないし９のいずれかに記載の抗体固定基板。
【請求項１１】
前記アミド基を持つゲルを、前記不溶性物質の表面をメタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理した上に塗布し重合させてなることを特徴とする請求項７ないし１０のいずれかに記載の抗体固定基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイや抗原の分画、精製などに使用可能な抗体を固定する方法およびその方法を用いて形成した抗体固定基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より良く知られているように抗体は抗原と特異的に結合する性質があり、イムノアッセイや抗原物質の分画、精製などに使用されている。その際、抗体はプラスチック、金属などの不溶性物質に固定した形で使用される。なお、これら不溶性物質の多くは生体高分子を非特異的に吸着する性質を持つ。
【０００３】
抗体の不溶性物質への固定化方法の一つとして、不溶性物質上の抗体結合分子を介して抗体を不溶性物質に固定化する方法がある。この場合、抗体結合分子は共有結合または静電相互作用などの非共有結合を介して不溶性物質に固定化される（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１４７２２９号公報（第４頁、第１図、第２図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記従来の方法では次のような課題がある。
（１）不溶性物質が生体高分子を非特異的に吸着するため、それらがイムノアッセイや分画、精製の妨げになる可能性がある。
（２）不溶性物質と抗体結合分子が結合を形成するため両者が極めて近い位置に存在することになり、その結果引き起こされる２次的（非特異的）な不溶性物質−抗体結合分子間の相互作用により、抗体結合分子の抗体結合活性が失われる可能性がある。
【０００６】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、アミド基を持つゲルを用いて抗体結合分子の非特異的な吸着を抑えると共に、抗体結合分子を前記アミド基を持つゲル内に包接固定して抗体結合分子の抗体結合活性低下を抑制して、抗体分子をアミド基を持つゲルあるいは不溶性物質に敷設されたアミド基を持つゲルに固定することのできる抗体固定方法および抗体固定基板を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような課題を達成するために、本発明の請求項１に記載の抗体固定方法では、
不溶性物質で形成された基板上に、抗体結合分子を包接したアミド基を持つゲルを２次元または３次元状に固定し、前記抗体結合分子に抗体分子の根元部を固定することを特徴とする。
【０００８】
このように、アミド基を持つゲルに包接された抗体結合分子を介して抗体分子の根元部を基板に固定すると、次のような効果がある。
（１）アミド基を持つ分子はタンパク質を吸着しにくいため、非特異的吸着による抗原−抗体反応の阻害、アッセイ時の測定誤差または精製時の純度低下を引き起こす不純物の混入を避けることができる。
（２）アミノ基を持つゲルにより抗体結合分子を包接するため、担体との結合形成に起因する抗体結合活性の低下を抑制することができる。
（３）抗体分子の根元部が抗体結合分子に固定されるため、抗体の抗原と結合する抗原認識部位が基板面から上向きにフリーとなって抗体の配向性が向上し、抗原との特異的結合性が増大する。
【０００９】
この場合、抗体結合分子としては、請求項２のように、プロテインＧを代表とする抗体結合活性を持つ生体高分子または高分子化合物が使用できる。
また、不溶性物質としては、請求項３のように、金属、プラスチック、ガラスなどの不溶性高分子化合物が使用できる。
【００１０】
また、アミド基を持つゲルとしては、例えば、請求項４に記載のように、ポリアクリルアミドゲルが用いられる。
また、抗体結合分子と抗体分子は、請求項５のように、１点または多点で結合する。
また、アミド基を持つゲルは、請求項６のように、メタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理された不溶性物質の表面に塗布・重合される。
【００１１】
本発明の請求項７に記載の抗体固定基板では、
抗体と結合する抗体結合分子を非共有結合的に包接するアミド基を持つゲルを、不溶性物質に敷設してなることを特徴とする。
このような構成の基板によれば、請求項１の抗体固定方法における場合と同様に、非特異的吸着による抗原−抗体反応の阻害、アッセイ時の測定誤差または精製時の純度低下を引き起こす不純物の混入を避けることができ、担体との結合形成に起因する抗体結合活性の低下を抑制することができ、抗体の配向性が向上して抗原との特異的結合性が増大するなどの効果がある。
【００１２】
この場合、抗体結合分子としては、プロテインＧを代表とする抗体結合活性を持つ生体高分子または高分子化合物であり、その抗体結合分子は前記アミド基に非共有結合的に包接されており（請求項８）、不溶性物質としては金属、プラスチック、ガラスなどの不溶性材料が使用でき（請求項９）、アミド基を持つゲルにはポリアクリルアミドゲルが用いられ（請求項１０）、アミド基を持つゲルは不溶性物質の表面をメタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理した上に塗布し重合したものとすることができる（請求項１１）。
【発明の効果】
【００１３】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）アミド基を持つゲルに抗体結合分子を包接し、その抗体結合分子に抗体分子の根元部を固定するため、非特異的吸着が少なく、しかも抗体の配向性が向上して抗原との特異的結合性も増大する抗体固定方法および基板を容易に実現することができる。
（２）抗体結合分子を包接固定することで、担体との結合形成に起因する抗体結合活性の低下を抑制できる。
（３）上記（１）、（２）項により、高感度のイムノアッセイや抗原の分画、精製などに使用可能な抗体固定基板の調製が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明では、基板材料としてポリアクリルアミドゲルを用い、さらに抗体結合分子がポリアクリルアミドゲルに包接されるように基板を調製することで、担体との結合形成による抗体結合分子の活性低下が起きない状態を作り出している。
【００１５】
また、本発明においては、抗体結合分子をポリアクリルアミドゲルにより包接するため、担体との結合形成に起因する抗体結合活性の低下が起きない。また、抗体結合分子が活性を持つ溶液状態に比較的近い状態で包接物質内に保持されることが期待される。なお、包接による固定化は抗体結合分子内の官能基に依存せず、包接物質が形成する孔のサイズ主に依存する。
【００１６】
このようにして調製した抗原結合分子を含むポリアクリルアミドゲルはそのまま、もしくは不溶性物質に敷設した形で抗体固定基板として供される。抗体固定化はポリアクリルアミドゲルまたはポリアクリルアミドゲルを敷設した不溶性物質を、抗体溶液中に浸漬することで行う。
【００１７】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る抗体分子結合方法の原理を説明する図、図２はポリアクリルアミドゲル基板上への抗体固定の態様を示す模式図である。
【００１８】
抗体分子の結合手順を以下に説明する。図１（ａ）に示すようにアミド基１と抗体結合分子２を混合し、同図（ｂ）に示すように不溶性物質３上に塗布後、重合反応を行わせる。不溶性物質３としては金属、プラスチック、ガラスなどの不溶性材料が使用される。この重合反応により、抗体結合分子２はアミド基を持つゲル（以下ポリアクリルアミドゲルを例にとって説明する）が形成する網目構造に包み込まれる形になる（同図（ｃ））。
【００１９】
抗体を固定する際には、同図（ｄ）に示すように抗体分子４を含む溶液を滴下する。抗体分子としてはモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が使用される。抗体分子４は自身の抗体分子結合部位５を介して、ポリアクリルアミドゲルに包接固定された抗体結合分子２と１点または多点で結合する。なお、抗体結合分子２は非共有結合的にポリアクリルアミドゲルに包接されるよう調整される。これにより、抗体分子４は、その根元部が抗体結合分子２に固定され、抗原と結合する部位が上向きにフリーの状態となる。
【００２０】
図２は、このような原理に基づいて抗体分子を固定化することのできる抗体固定基板の説明図である。図では、ポリアクリルアミドゲル１０に包接された抗体結合分子２により抗体分子４が固定された（異なる種類の抗体Ａ、抗体Ｂなどでアドレッシングされた）様子も示してある。
【００２１】
図において、２０は不溶性物質で、例えばガラス基板である。ガラス基板２０の表面をメタクリロキシプロピルトリメトキシシラン３０で処理し、その上にポリアクリルアミドゲル１０を塗布して重合させる。これにより、ポリアクリルアミドゲル１０をガラス基板２０に強く固定することができる。なお、ポリアクリルアミドゲル１０はガラス基板２０上に２次元または３次元状に敷設固定することができる。
【００２２】
ポリアクリルアミドゲル１０には、図１に示すように抗体結合分子（例えばプロテインＧ）２が非共有結合的に包接固定され、抗体分子４は図２に示すようにその根元部が抗体結合分子２に固定され、その抗原認識部位が溶液方向（図では上方）に向くように固定される。このように固定された抗体分子４の抗原認識部位には対応の抗原が結合する。すなわち、抗体Ａの抗体分子の抗原認識部位には抗体Ａの抗原が、抗体Ｂの抗原認識部位には抗体Ｂの抗原がそれぞれ結合する。
【００２３】
このように、ポリアクリルアミドゲル１０中に埋め込んだ抗体結合分子２を介して抗体分子を基板に固定すると、非特異的吸着は極めて少なく、抗体の抗原認識部位４ａが溶液方向に向いて配向性が向上し、抗体抗原の結合効率が一段と向上する。
【００２４】
以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。したがって本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る抗体分子結合方法の一例の原理を説明する図である。
【図２】ポリアクリルアミドゲル基板上への抗体固定の態様を示す模式図である。
【符号の説明】
【００２６】
１  アクリルアミド
２  抗体結合分子
３  不溶性物質
４  抗体分子
５  抗体分子結合部位
１０  ポリアクリルアミドゲル
２０  ガラス基板
３０  メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン
【図１】
2005180928.tif 000003
【図２】
2005180928.tif 000004