(57)【要約】      （修正有）【課題】濃縮染料の古さによって変化することのないタンパク質画分の測定が可能な、タンパク質染色用アゾ染料、特に濃縮液状のアミドブラック染料を提供すること。【解決手段】  アミドブラック染料等のアゾ染料と、該染料のための溶媒であって非酸性で水混和性の溶媒とを含有してなる染色液とする。溶媒は好適にはエチレングリコール、水、グリセロール等から選択される。染色液を、酸性の水溶液又は水アルコール溶液等で即時希釈する染色組成物の調製方法、並びに濃縮染色液を含む染色用キットも提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゾ染料と、該染料のための溶媒であって非酸性で水混和性の溶媒とを含有してなり、上記溶媒中での上記染料の溶解限度まで、溶媒１００ミリリットル当たり約４ｇの染料を含有する染色液。
【請求項２】
アゾ染料が酸性媒体中で劣化し得ることを特徴とする請求項１に記載の染色液。
【請求項３】
アゾ染料が、ポンソーレッド、アシッドバイオレット、クーマシーブルー、及びアミドブラック染料から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の染色液。
【請求項４】
染料がアミドブラック染料であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の染色液。
【請求項５】
溶媒が、エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、水、グリセロール、ベンジルアルコール及びその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の染色液。
【請求項６】
溶媒が、エチレングリコール、水、及びグリセロール並びにその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の染色液。
【請求項７】
溶媒がエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の染色液。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の染色液を、酸性の水溶液又は水アルコール溶液で即時希釈するか、或いは水溶液又は水アルコール溶液で即時希釈し、酸を染色用液に即時に添加することを特徴とする、染色用液の調製方法。
【請求項９】
染色用液のｐＨを約２の値に調節する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酸が、クエン酸、酢酸、フマル酸、硝酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、及びリン酸並びにその混合物から選択される請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
酸をクエン酸又は酢酸とする請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質染色用液を調製するための、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の溶液の使用。
【請求項１３】
ゲル電気泳動後にタンパク質を染色することを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の少なくとも一の染色液、一定分量の酸希釈剤又は一定分量の濃酸、及び任意の希釈剤を含んでなる染色用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定した濃縮染色液と、ゲル電気泳動等の電気泳動により分析されるタンパク質を染色するための上記安定溶液の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動技術、特にゲル電気泳動を使用して、血清、血液、尿、頭脊柱液等の生物学的試料のタンパク質成分を分離することができる。ゲル等の電気泳動支持体上に付着したタンパク質は、電界の影響を受けて移動する。タンパク質の移動速度はそれぞれの電荷及び／又は分子量によって異なるので、電気泳動によりタンパク質を分離することができる。移動完了後、支持体、この場合はゲルは、乾燥させるか、又は固定剤を用いて固定する。或いは、膜等の別の支持体上にタンパク質を移すこともできる。
次に、調製した染色液又は染色浴を用いて支持体を染色してタンパク質を染色し、よって分離されたタンパク質断片をより良いコントラストで可視化する。デンシトメータの読み取りによって、生物学的試料中の各分離及び染色タンパク質画分の割合を得ることにより、タンパク質画分の定性的並びに定量的分析を実施することができる。
【０００３】
通常、アミドブラック等のアゾ染料は、染色用液又は染色浴として酸性溶液として使用される。染色タンパク質分析の規則性、精度及び再現性のためには、使用する染色液の質が一貫しており、比較可能であることが重要である。
通常、染色に使用される染料は、液体媒体、通常は水性酸性媒体中に濃縮された状態で市販されている。通常、酸性媒体に濃縮された状態で市販されているアミノブラック染料は、約２又は３年の保存寿命である。希釈済みで直ぐに使用できる染色液はあまり安定ではないので、このような濃縮形態のものを使用前に希釈して染色用液を調製し、望ましくは調製後１ヶ月以内に使用する。
【０００４】
しかして、同じ試料について、濃度測定の結果、つまり染色されて検出された各分離タンパク質画分の割合は、染料の性質やその組成だけでなく、その濃度、特に染色用液の調製に使用した濃縮染色液の古さ、即ち劣化度によって変わり得ることが分かった。
デンシトメータを用いて得た分析結果により、画分の割合が濃縮染料の古さによって変化することが分かった。例えば、同一のヒト血清についてのアルブミンの割合は、新品の濃縮アミドブラックを希釈した希釈染料、つまり希釈染色用液を用いて測定した場合の６９％の値から、製造後３０ヶ月の濃縮アミドブラックから得た希釈染色用液を用いた場合の６３％の値まで変化しうる。また、染色したゲルに多少の色の変化が認められ、新品の濃縮液の希釈液を使用した場合は鮮やかな青色に染色されており、一方古い濃縮液を希釈した場合は暗い青色に染色された。
【０００５】
安定した質の測定を行い、且つ画分の割合のばらつきを避けるため、一方法では粉末状で提供され保存される染料を使用していた。タンパク質の染色に使用する時点で粉末を酸／水媒体又は酸／水／アルコール媒体中に溶解させて染料を調製する。このような染料も、調製後１ヶ月以内に使用することが望ましい。
しかしながら、粉末形態は次のような欠点を有する。すなわち、製造の段階において、粉末の搬送が困難である。さらに、この提供形態（粉末）に関連した欠点は、通常非常に微細であるため粉末の取り扱いが困難なことで、その結果、液状で提供される場合と比較して不安定さが増し、また溶解に要する時間がかなり長いことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
粉末に関する困難に鑑み、我々は、濃縮染料の古さに依存しない画分割合を、例えば後続の濃度測定工程で測定することを可能にする、液状の濃縮染料を提供することを探索した。
しかして、濃縮染料の古さによって変化することのないタンパク質画分の測定が可能な、タンパク質染色用アゾ染料、特に濃縮液状のアミドブラック系染料を提供することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アゾ染料と前記染料の溶媒を含む染色液に関し、その溶媒は非酸性で水と混和性である。
本発明の濃縮染色液により、染色力を劣化させることなく液状濃縮物の長期保存が可能である。つまり、本濃縮染色液は安定しており、希釈時点での保存濃縮物の古さに関係なく、必要な時に一定の品質の染色用液をつくることができる。
【発明の効果】
【０００８】
従って、実施例から明らかにするように、濃縮溶液の安定性に関する問題を解決することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下の詳細な説明及び添付図面により本発明に対する理解を深めることができる。
【００１０】
本明細書において、「染色液（stain solution）」という用語は、希釈されて使用される前の、保存濃縮溶液又は染色原液を意味し、「染色用液（staining solution）」という用語は希釈後にできる使用準備が整った溶液を意味する。
本発明においては、「アゾ染料」という用語は、この化学ファミリーに属する染料であって、通常はタンパク質を染色するのに使用され、より詳細には酸性媒体中で劣化し得る染料を指す。
【００１１】
従って、本発明の染料は、第一にアミドブラック染料であるが、アゾ染料は、例えばポンソーレッド、アシッドバイオレット、及びクーマシーブルーから選択可能である。
染色用アミドブラックは、ナフトールブルーブラックとしても知られている。酢酸／イソプロパノール水溶液及び粉末は市販されている。
【００１２】
従って、本発明の一態様では、アゾ染料、特にアミドブラック染料を安定して濃縮液の状態で保存することができる。これは、通常該染料をその中で調製する酸性媒体から、保存段階では染料を分離しておくことにより達成される。本発明の染色液は、その酸性の影響により溶液中の染料を劣化せしめる成分を一切含んでいない。
本発明によれば、使用できる溶媒は染料用の非酸性の溶媒、つまり、染料を溶解させることができ、酸による劣化を防ぐものである。濃縮溶液のその後の使用のため、溶媒は水混和性溶媒から選択される。無水溶媒も使用できる。
染色液は常套的に溶媒中に染料粉末を溶解させることにより調製される。
【００１３】
好ましくは、溶媒は、エチレングリコール、ジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、水、グリセロール、ベンジルアルコール及びその混合物から選択され、一般には、溶媒の酸性により染料を変質させないあらゆる染料用溶媒から選択される。
好ましくは、溶媒は、エチレングリコール、水、及びグリセロールから選択され、さらに好ましくは、エチレングリコールが選択される。
【００１４】
濃度に関し、染色液は、選択した溶媒中での染料の溶解限度まで、１００ｍｌの溶媒に対し約４グラムの純粋な染料を含有する。
すなわちアミドブラックの場合、染色液は、溶媒１００ｍｌに対して４〜２０ｇの染料を含むことが好ましい。これらの値、及び実施例の値は、例示を目的に示しているのであって、染料に応じて他の割合で希釈を行うことが可能であり、最終的な目的は、使用に当たって一般的な濃度、つまり染色用液１リットルに対して少なくとも染料１グラムを有する染色用液を得ることである。溶媒１００ｍｌ当たり８〜２０ｇの染料を含有する染色液がまた簡便である。
【００１５】
染色用液は、使用の時点で即時に調製し、調製後数ヶ月以内に使用することができる。
染色用液は、濃縮溶液を酸性溶液で希釈することにより調製される。使用の時点で、濃縮染料を酸と水の混合物中に混ぜ、適切にタンパク質を染色する。
【００１６】
酸性溶液は、染色用液中に常套的に使用される、本来水性であるか、又は水アルコール溶液である。好ましくはクエン酸又は酢酸を使用するが、例えばフマル酸、硝酸、スルホサリチル酸、リン酸及びトリクロロ酢酸、並びにそれらの混合物を使用することもできる。
水アルコール混合物に使用できるアルコールは、例えばイソプロパノール、メタノール及びエタノールから選択される、通常のアルコールである。
【００１７】
染色用液を得るため、染色液を調製した酸性溶液で、又は該溶液中で希釈することができるか、或いは、染色液を水、又は水アルコール等の、濃縮酸又は純粋な酸を希釈し導入する別の溶媒混合物と混ぜ合わせることができる。希釈条件を調節し、酸の量を調節して、染色用液のｐＨを約２とする。ｐＨは場合によっては使用の時点で調節することもできる。
【００１８】
本発明はまた、タンパク質染色用液を調製するための上述の濃縮液の使用にも関する。例えば、そのような染色用液は、希酸の水溶液を用いて希釈するか、又は適当な分量の濃酸を染色用液と水等の希釈剤に混合することにより調製することができる。好ましくは、希釈剤は、水又はその他希釈剤混合物、水アルコール等の溶媒混合物で染料、水及び酸と適合するものである。
【００１９】
本発明はまた、電気泳動、特にゲル電気泳動後のタンパク質を染色する方法にも関する。
本発明はまた、少なくとも一の染色液、一定分量の酸希釈剤又は一定分量の濃酸、及び任意の希釈剤を含む染色用キットにも関する。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例では、記述する実施内容に本発明を限定することなく、本発明を例示的に説明する。
【００２１】
濃縮アミドブラック溶液の安定性の評価方法
電気泳動のためのアミドブラック染料は、クエン酸／水媒体中に濃縮された形態であった（１０％ｗ／ｖのクエン酸溶液７５ｍｌ中染料１．２ｇ）。次に、この濃縮染色液を使用の時点で水で希釈した（水２２５ｍｌで７５ｍｌの濃縮液を希釈した）。
ａ）以下の表１及び図１に示すように、画分の割合と染料の色の変動は同一の分析用試料について染料の古さの変化に応じることが分かった。試験には製造から１０ヶ月を経た２つのバッチを使用した。
【表１】
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【００２２】
ｂ）また、染料の古さによって変化する酸性媒体中の染料濃縮物（１０％ｗ／ｖのクエン酸溶液７５ｍｌ中染料１．２ｇ）を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により試験した。使用に当たり、酸性媒体中の濃縮染色液を、濃縮液１容積に対して３容積の水を加えることにより４倍に希釈し、ａ）に記載の染色用液と比較可能な染色用液を得た。
得られた結果は、染料の古さと、分光光度計を用いて得られたそのＵＶ可視スペクトルが独特でアミドブラックのものとは異なる付加帯域の出現又はその強度の増大との間に完全な相関関係があることを示している。
【００２３】
これらの観察結果を以下の表２にまとめ、図１（ＴＬＣ）及び図２Ａと２Ｂ（ＵＶ可視スペクトル）に示した。図１の矢印は付加帯域を示す。
【表２】
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【００２４】
ｃ）結論
上述のように酸／水を混合した溶液中で調製され、６０℃で保存された濃縮アミドブラック染料ｂ）は、同じようにして調製されたが、室温で３０ヶ月間保存された同じ染料ａ）と全く同じ劣化の徴候を示した。タンパク質画分の割合の変化、染料の色の変化、並びに、ＴＬＣにおいて付加帯域の出現が観察された（図３及び表１と対比させて表２を参照）。
図３の矢印は付加帯域を示す。
結論として、染料を６０℃で１４日間保存することは、同一染料を室温で３０ヶ月保存することと等価で、室温における自然なエイジングを例証するのにこのエイジング加速プロトコルを有効に使用できると言える。
【００２５】
実施例１
メルク（Ｍｅｒｃｋ）社が市販する粉末状アミドブラック１６ｇをエチレングリコール１００ｍｌに加え、完全に溶解するまで攪拌し、染色液を得た。
この染色液の８ｍｌを取り出し、１０％（ｗ／ｖ）のクエン酸溶液２９２ｍｌに希釈して使用準備の整った染色用液を得た。このｐＨは約２であった。
【００２６】
実施例２及び３
エチレングリコールを同じ割合のグリセロールと水に代えて実施例１の手順を繰り返し、染色液を得た。
ｐＨ約２の染色用液を同じ希釈条件下で得た。
【００２７】
実施例４：本発明の濃縮染料の安定性の評価
実施例１の濃縮染色液に関する表３に示す結果は上述の方法による条件下で得られた。
【表３】
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表３：エチレングリコール媒体中の濃縮染料の保存条件に応じたヒト血清中のアルブミンの割合の変化。図４にも示す。
矢印は付加帯域が無いことを強調している。
実施例１の濃縮染色液は、従来の酸性濃縮溶液と比較して安定していることが分かる。
【００２８】
実施例５
キットは実施例１の染色液８ｍｌと、濃クエン酸（５０％ｗ／ｖ）６０ｍｌを収容するフラスコを含むキットから構成した。この８ｍｌをフラスコの内容物と混合し、３００ｍｌまで水を加えることによって、約ｐＨ２の染色用液を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】従来の酸性媒体中のアミドブラック染料溶液の薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の結果を示す。右から左へ向かって、染料の古さは１から３０ヶ月に増加しており、一番右は対照を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、従来の染色用液（２Ａ）のＴＬＣにおいて出現した付加帯域に対応するＵＶ可視スペクトル、及びアミドブラック（２Ｂ）のＵＶ可視スペクトルを示す。
【図３】７日間（右）及び１５日間(左)のエイジング加速処理を行った後の、本発明による酸性媒体中のアミドブラック染色液の薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の結果を示す。一番右は対照を示す。
【図４】右から左へ、７、１４及び２４日間のエイジング加速処理を行った後の、本発明による酸性媒体中のアミドブラック染色液の薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の結果を示す。一番右は対照を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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