(57)【要約】【課題】  インフルエンザウイルスまたはその発現するタンパク質の存在、その型・亜型・株の同定のための新規な方法を提供する。【解決手段】  インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合するアプタマーを、インフルエンザウイルスを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることを含む、インフルエンザウイルスの存在または不存在の検出方法を提供する。【効果】  インフルエンザウイルスまたはその発現するタンパク質を特異的に認識する本発明のアプタマーは、遺伝子型識別試薬として有用である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合するアプタマーを、インフルエンザウイルスを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることを含む、インフルエンザウイルスの存在または不存在の検出方法。
【請求項２】
インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合し、他のウイルス及び／または該他のウイルスで発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
インフルエンザウイルスの特定の型及び／または該型で発現するタンパク質に結合し、他の型及び／または該他の型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／または該亜型で発現するタンパク質に結合し、他の亜型及び／または該他の亜型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
インフルエンザウイルスの特定の株及び／または該株で発現するタンパク質に結合し、他の株及び／または該他の株で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が膜タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
膜タンパク質がヘマグルチニンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に特異的に結合するアプタマー。
【請求項９】
インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合し、他のウイルス及び／または該他のウイルスで発現するタンパク質に結合しない、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスの特定の型及び／または該型で発現するタンパク質に結合し、他の型及び／または該他の型で発現するタンパク質に結合しない、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１１】
インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／または該亜型で発現するタンパク質に結合し、他の亜型及び／または該他の亜型で発現するタンパク質に結合しない、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスの特定の株及び／または該株で発現するタンパク質に結合し、他の株及び／または該他の株で発現するタンパク質に結合しない、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１３】
タンパク質が膜タンパク質である、請求項８〜１２のいずれか１項記載のアプタマー。
【請求項１４】
膜タンパク質がヘマグルチニンである、請求項１３記載のアプタマー。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか１項記載のアプタマーを含有する、インフルエンザウイルス
の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスの検出方法、及びその検出に用い得るアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスにはＡ、Ｂ、及びＣの３つの型があり、ヒトで広く流行を起こすのはＡ型とＢ型であることが知られている。インフルエンザウイルス粒子表面には糖タンパク質のヘマグルチニン（HA）やノイラミニダーゼ（NA）等が存在し、特にＡ型ウイルスではこのHA及びNAの抗原性がより多様であり、その組み合わせによって更に亜型に分類されている。亜型は、HA及びNAの種類により、例えばH1N1、H2N2、H3N2等と表現される。更にまた、同じ亜型に属するウイルスでも、HAとNAの抗原性が異なる場合があり、こうしたことから、ヒトの免疫機構を逃れた新たなウイルス株によるインフルエンザの流行が起こることが明らかとなっている。
【０００３】
また、最近、新型肺炎とも呼ばれる重症急性呼吸器症候群（Severe Acute Respiratory
Syndrome：ＳＡＲＳ）の流行が社会的な問題となっているが、この初期症状はインフル
エンザと識別しにくいものである。SARSを始め、症状が似通った他の疾患とインフルエンザとの識別のために、ウイルスの培養による検出等が行われている。
【０００４】
一方、近年進歩してきたアプタマー（核酸リガンド）の開発分野では、試験管内選択法によって、標的とする分子に対して高い親和性と特異性で結合をする核酸を分離することが可能になっている（最近の総説は例えば非特許文献１及び２を参照）。その戦略は、ランダムな核酸のプールの中から標的分子に高い親和性をもつ稀少な核酸分子を分離することと、その後、選別と増幅の循環を繰り返すことである。これまでにこの方法は、金属イオンや、糖類、ペプチド、タンパク質、あるいは細胞全体など、多様な標的に対して強固な結合をするアプタマーを分離するために著しく有用であることが立証されている。様々なアプタマーがその認識分子に対して示す結合親和性は、抗体と抗原の親和性に比較して、同程度であるか、あるいは勝っており、解析物の検出・定量やタンパク質の機能・活性の阻害など、In vitroやIn vivoでの様々な応用のためにアプタマーが開発されてきた。
さらに、アプタマーは抗体に比べて、近縁の分子どうしを識別する能力がより高い場合があることや、結合のためにより小さな領域しか必要としないことが知られている。例えば、テオフィリン（Theophylline）アプタマーは、テオフィリンとN7位のメチル基だけが異なるカフェインを１万４千倍の効率で識別することができる（非特許文献３参照）。
【０００５】
【非特許文献１】ブルグストラー（Burgstaller, P.）ら、「Current opinion in drug discovery & development」（英国）2002年９月発行、第５巻、第５号、p.690-700
【非特許文献２】クラーク（Clark S. L.）ら、「Electrophoresis」（ドイツ）2002年５月発行、第23巻、第９号、p.1335-1340
【非特許文献３】ジェニソン（Jenison, R. D.）ら、「Science」（米国）1994年３月１１日発行、第263巻、第5152号、p.1425-1429
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
インフルエンザは毎年流行を繰り返し、多数の患者が高熱等の重い症状で苦しみ、死に至ることも多い。更にＡ型インフルエンザは数十年の間隔で世界的大流行を引き起こすことがある。このため、現在ではワクチンが開発され、予防の上で効果を発揮しているが、上記のようにウイルスの型・亜型・株によって抗原性が異なることから、ワクチンの開発
や生産も流行株に合わせたものとする必要がある。また、Ａ型ウイルスの流行時にＢ型ウイルスによるインフルエンザ患者も発生する場合があるため、これらの型のいずれであるかを識別する必要がある。更に、臨床的に使用されている抗インフルエンザ薬の中には薬効がウイルスの型に依存するものがあることが知られている。このように、インフルエンザの予防対策や治療にとって、ウイルスの型・亜型・株の識別は非常に重要な課題である。
【０００７】
一方、インフルエンザウイルスの診断のために抗体を利用した診断キットが現在用いられているが、抗体の場合は、抗原あるいはタンパク質と相互作用するために、6から8残基の断片かそれ以上に大きな表面積を必要とし、非常にわずかな変異の検出は困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等のグループでは、これまでにヒト免疫不全ウイルス（HIV）とC型肝炎ウイルス（HCV）のウイルスタンパク質に対して高親和性のRNAアプタマーを開発している（Yamamotoら, Genes to Cells, 2000 May, 5(5):371-88; Kumarら, Virology, 1997 Oct 27, 237(2):270-82; Fukudaら, Eur. J. Biochem. 2000 June, 267(12), 3685-94参照）。抗TatアプタマーはHIVのTatタンパク質にKd値120pMで結合し、一方、抗NS3アプタマーはHCVのNS3タンパク質にKd値10nMで結合する。抗Tatアプタマーと抗NS3アプタマーはこれらのタ
ンパク質の機能をIn vitroでもIn vivoでも阻害することが見出されている（Yamamotoら,
Genes to Cells, 2000 May, 5(5):371-88; Kakiuchiら, Combinatorial Chemistry & High throughput screening, 2003, 6, 155-160; Nishikawaら, Nucleic Acids Res. 2003 Apr 1, 31(7), 1935-43参照）。一般的に、アプタマーは、標的のタンパク質への結合で
必要とするアミノ酸残基数が、抗体に比較して少ない。従って、アプタマーの高親和性モチーフは近縁のタンパク質どうしや、あるいは微生物の亜型や株どうしを識別するために大変価値のある道具として使える可能性がある。しかしながら、本発明者等の知る限りでは、今日までそのような識別は、例えばテオフィリンとカフェインの違いやリン酸化型と非リン酸化型の違いのように、2種類の近縁分子間以外ではまだなされたことがなく、イ
ンフルエンザウイルスにこうした手法を応用したという報告は現時点においてなされていない。
【０００９】
本発明者等は、アプタマーをさらに病原体やその株の同定のための遺伝子型識別 (genotyping) 試薬として応用することを目的にして、SELEX (systemic evolution of ligands
by exponential enrichment) 法によってA型ヒトインフルエンザウイルス亜型H3N2のウ
イルス粒子に特異的に結合するアプタマーの選別を行うことに成功した。その結果得たアプタマーPN30-10-16とPN30-10-1は、亜型H3N2に属するA/パナマ/2007/1999(H3N2)株に対
してそれぞれ解離定数（Kd）42 nM、及び71 nMという高い親和性で結合した。更により高感度の測定法では、アプタマーPN30-10-16とA/パナマ/2007/1999(H3N2)株の解離定数（Kd）は188pMと見積もられた。これらのアプタマーの結合は特異的で、A型の他の亜型やB型
に属するインフルエンザウイルスには結合しなかった。更に、本発明者等は、B型ヒトイ
ンフルエンザウイルスに特異的に結合するアプタマーの選別にも成功した。これらの結果に基づいて更に検討した結果、本発明を完成するに到った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１５）を提供する。
（１）インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合するアプタマーを、インフルエンザウイルスを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることを含む、インフルエンザウイルスの存在または不存在の検出方法。（２）インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合し、他のウイルス及び／または該他のウイルスで発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記（１）に記載の方法。
（３）インフルエンザウイルスの特定の型及び／または該型で発現するタンパク質に結合
し、他の型及び／または該他の型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記（１）に記載の方法。
【００１１】
（４）インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／または該亜型で発現するタンパク質に結合し、他の亜型及び／または該他の亜型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記（１）に記載の方法。
（５）インフルエンザウイルスの特定の株及び／または該株で発現するタンパク質に結合し、他の株及び／または該他の株で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記（１）に記載の方法。
（６）タンパク質が膜タンパク質である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
（７）膜タンパク質がヘマグルチニンである、上記（６）に記載の方法。
（８）インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に特異的に結合するアプタマー。
（９）インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合し、他のウイルス及び／または該他のウイルスで発現するタンパク質に結合しない、上記（８）に記載のアプタマー。
【００１３】
（１０）インフルエンザウイルスの特定の型及び／または該型で発現するタンパク質に結合し、他の型及び／または該他の型で発現するタンパク質に結合しない、上記（８）に記載のアプタマー。
（１１）インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／または該亜型で発現するタンパク質に結合し、他の亜型及び／または該他の亜型で発現するタンパク質に結合しない、上記（８）に記載のアプタマー。
（１２）インフルエンザウイルスの特定の株及び／または該株で発現するタンパク質に結合し、他の株及び／または該他の株で発現するタンパク質に結合しない、上記（８）に記載のアプタマー。
【００１４】
（１３）タンパク質が膜タンパク質である、上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のアプタマー。
（１４）膜タンパク質がヘマグルチニンである、上記（１３）に記載のアプタマー。
（１５）上記（８）〜（１４）のいずれかに記載のアプタマーを含有する、インフルエンザウイルスの検出用キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、インフルエンザウイルスまたはその発現するタンパク質の存在、その型・亜型・株の同定のための遺伝子型識別 (genotyping) 試薬としてアプタマーを利用できることが明らかになった。インフルエンザウイルスまたはその発現するタンパク質を特異的に認識する本発明のアプタマーは、遺伝子型識別試薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において、「アプタマー」とは、ある標的、例えばウイルス、タンパク質、ペプチド、糖類、金属イオン、小分子等に特異的に結合するように人工的に創製された核酸リガンドをいう。
【００１７】
本明細書において、「特異的に結合する」とは、標的となるウイルス及び／またはタンパク質等にのみ結合し、他のウイルス及びタンパク質等には全く、あるいはほとんど結合しないことを意味する。ここで、他のウイルス及びタンパク質と「結合しない」とは、通常のアッセイ条件下で検出できないことをいい、例えばモル濃度で10倍量の非特異的競合阻害剤の存在下において結合が検出されないことをいう。
【００１８】
本明細書において、「特異的に発現する」とは、天然において目的のウイルスでのみ発現し、他のウイルス及び細胞で天然に発現しないことをいう。本発明のアプタマーはタンパク質のわずかな変異による株間の識別も可能であり、こうした株間の識別においては、目的の株以外の株におけるわずかな変異を有するタンパク質の発現は「特異的に発現」した状態を意味しない。一方、インフルエンザウイルスと他のウイルス等との識別においては、本発明のアプタマーはインフルエンザウイルス内における変異を検出するのではなく、他のウイルス等との比較における差異を識別するため、インフルエンザウイルス内での変異を有するタンパク質群の発現は包括的に「特異的に発現」したことを意味する。
【００１９】
本発明は、インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合するアプタマーを、インフルエンザウイルスを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることを含む、インフルエンザウイルスの存在または不存在の検出方法を提供する。サンプルとしては、例えば、被験者の咽頭拭い液、鼻汁等の採取検体等や、それら検体を培養細胞やニワトリ受精卵に与えて感染・増殖の工程によって得た溶液等が挙げられる。本発明の方法により、サンプル中に目的のインフルエンザウイルスが存在すること、あるいは存在しないことが確認できる。
【００２０】
上記の本発明の方法の一態様は、インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合し、他のウイルス及び／または該他のウイルスで発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記方法である。この方法は、例えば、被験者の症状がインフルエンザウイルスによるものであるか、あるいはＳＡＲＳの原因ウイルスであるコロナウイルス等の他のウイルスによるものであるかの判定のために使用することができる。また、インフルエンザと類似の症状であって、細菌やマイコプラズマ等による症状、例えば感冒をインフルエンザウイルスによるものでないと判定することもできる。
【００２１】
上記の本発明の方法の別の態様は、インフルエンザウイルスの特定の型及び／または該型で発現するタンパク質に結合し、他の型及び／または該他の型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記方法である。この方法は、例えば流行しているインフルエンザの型がＡ型であるかＢ型であるかを判定するために使用することができる。Ａ型かＢ型かの判定を迅速に行うことができれば、治療のために用いる薬剤の選択を容易にすることができる。
【００２２】
上記の本発明の方法の更に別の態様は、インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／または該亜型で発現するタンパク質に結合し、他の亜型及び／または該他の亜型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記方法である。この方法は、例えば流行が発生する前に人間社会に存在するインフルエンザウイルスの亜型、及び実際に流行したウイルスの亜型をモニタリングし、将来の流行予測に使用することができる。
【００２３】
上記の本発明の方法の更に別の態様は、インフルエンザウイルスの特定の株及び／または該株で発現するタンパク質に結合し、他の株及び／または該他の株で発現するタンパク質に結合しないアプタマーを用いる、上記方法である。この方法は、例えば流行が発生する前に人間社会に存在するインフルエンザウイルスの株、及び実際に流行したウイルスの株をモニタリングし、将来の流行予測に使用することができる。
【００２４】
上記の本発明の方法において、検出のために選択されるタンパク質は標的となるウイルス及びそれ以外のウイルスで異なって発現するタンパク質であれば良く、特に限定するものではないが、好ましくはウイルス表面上で発現している膜タンパク質である。膜タンパク質としては、ヘマグルチニンやノイラミニダーゼ等が挙げられるが、好ましくはヘマグルチニンである。
【００２５】
本発明はまた、インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に特異的に結合するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーの標的は、インフルエンザウイルス、あるいはインフルエンザウイルスで発現するタンパク質である。目的のインフルエンザウイルスで特異的に発現するタンパク質であれば標的となり得るが、好ましくはタンパク質は膜タンパク質であり、特にヘマグルチニンが好ましい。
【００２６】
本発明のアプタマーの一態様は、インフルエンザウイルス及び／または該ウイルスで発現するタンパク質に結合し、他のウイルス及び／または該他のウイルスで発現するタンパク質に結合しないアプタマーである。
【００２７】
本発明のアプタマーの別の態様は、インフルエンザウイルスの特定の型及び／または該型で発現するタンパク質に結合し、他の型及び／または該他の型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーである。
【００２８】
本発明のアプタマーの更に別の態様は、インフルエンザウイルスの特定の亜型及び／または該亜型で発現するタンパク質に結合し、他の亜型及び／または該他の亜型で発現するタンパク質に結合しないアプタマーである。
【００２９】
本発明のアプタマーの更に別の態様は、インフルエンザウイルスの特定の株及び／または該株で発現するタンパク質に結合し、他の株及び／または該他の株で発現するタンパク質に結合しないアプタマーである。
【００３０】
本発明において用いられるアプタマーは、DNA、RNAのいずれでも良く、また修飾ヌクレオチドを含むものであっても良い。しかしながら、一般に、RNAはDNAに比較して、より多くの立体構造をとる柔軟性をもっており、標的分子に結合するような構造が実現される可能性もより高いと期待されるため、本発明のアプタマーは好ましくはRNAである。
【００３１】
更にまた、RNAseに対して耐性を有する修飾ヌクレオチドを含む修飾型アプタマーを作
成すれば、RNAse等の分解酵素が存在する系、例えば生体内においてもアプタマーを用い
ることができる。
【００３２】
本発明において用いるアプタマーは、特に限定するものではないが、SELEX (systemic evolution of ligands by exponential enrichment) 法による試験管内選別を用い、ランダムなRNAプールから、目的のウイルス及び／またはタンパク質に特異的に結合し得るア
プタマーを選別することによって得ることができる。
【００３３】
本発明のアプタマーの選別に用いるRNAプールは、特に限定するものではないが、ラン
ダムな配列がプライマー結合領域に挟まれるような配列として合成するとPCR等の操作上
簡便である。ランダムな配列の長さは特に限定するものではないが、目的とするタンパク質との結合特異性等を考慮すると２０〜８０塩基、好ましくは２５〜３０塩基の範囲である。プライマー結合領域はRNAの増幅に用いるPCR反応等のために使用され、その配列は特に限定するものではないが、それ自体は目的のタンパク質に対する結合性を有さないものが好ましい。プライマー結合領域の長さは通常１８〜３８塩基の範囲である。
【００３４】
RNAプールの調製のために、まず、上記の配列に対応するDNAを鋳型として合成し、PCR
反応によってこれを二本鎖DNAに変換する。次いで、場合によってこれを５’及び３’プ
ライマーを用いたPCR反応で増幅する。得られたDNAをRNAポリメラーゼによる転写反応に
かけることにより、目的のRNAプールを得ることができる。
【００３５】
in vitro選択は、基本的には先に報告されたようにして行う（Urvil, P.T.ら, Eur. J.
Biochem. 248, 130-138 (1997); Kumar, P.K.ら, Virology, 237, 270-282 (1997)）。
具体的には、上記のようにして得られた長さ３０塩基、あるいは長さ７４塩基のランダム配列（N30またはN74）を含むRNAプールを、結合用緩衝液中で目的のウイルスまたはタン
パク質と共にインキュベートする。インキュベートの際、RNAプールの濃度、及び標的と
なるウイルスまたはタンパク質の濃度は、各々１nM程度以上が適当である。また、両者の比は、モル比で１：１以上が適当である。緩衝液のpHは通常6.0〜8.5が適当である。
【００３６】
反応後、ニトロセルロースフィルターを通して濾過し、洗浄して標的となるウイルスまたはタンパク質に結合しないRNAを除去する。その後、溶出用緩衝液で溶出させる。得ら
れたRNAを逆転写反応によってDNAに変換し、PCR反応で増幅させた後、再度RNAに戻す。このサイクルを繰り返して特異的に結合するRNAを選択する。非特異的結合阻害剤として、
例えば大腸菌由来のtRNAを使用することが好ましい。ランダム配列を含むRNAプールの濃
度に対して阻害剤の濃度は１：１から１：１０の範囲が適当である。
【００３７】
本発明において用いる、識別のためのアプタマーは、上記の操作において、一方のタンパク質には結合せず、他方のタンパク質にのみ結合し得るものであることが必要である。このようなアプタマーを得るために、例えばＡ型インフルエンザウイルスとＢ型インフルエンザウイルスとを識別し得るアプタマーを得るためには、まずＡ型インフルエンザウイルス、またはＡ型インフルエンザウイルスに特異的に発現するタンパク質、例えばHAと共にインキュベートした後、未結合のRNAを回収してＢ型インフルエンザウイルス、または
Ｂ型インフルエンザウイルスに特異的に発現するHAタンパク質とインキュベートさせ、結合したものを選択する、という操作を行う。上記の操作を繰り返すことによって、特異性の非常に高いアプタマーを得ることができる。但し、このいわゆる対向選別法（counter selection strategy）は、選択のための上記サイクルの後半だけで行っても良い。最初から選別条件が厳しいと、好適なアプタマーとなり得る候補の配列を失ってしまう可能性もあり、選別の後半であれば各配列のコピー数が多くなってきているので、選別条件が厳しくなってもその配列を失う危険が小さいからである。あるいは、対向選別法を用いずに直接ターゲットとするウイルスタンパク質だけについての結合性によりRNAの選別を行い、
特異性の高いアプタマーを得ることも可能である。
【００３８】
上記の操作において、選別のために用いるウイルスまたはタンパク質を適宜選択することによって、種々の特異性を有するアプタマーを得ることができる。例えば、インフルエンザウイルスとそれ以外のウイルスとの識別に用い得るアプタマー、インフルエンザウイルスのＡ型とＢ型とを識別し得るアプタマー、Ａ型の種々の亜型の識別（例えばH1及びH3の識別、N1及びN2の識別等）に用い得るアプタマー、更に亜型の中での更なる変異を有するウイルス（例えば亜型H3N2に属するA/パナマ/2007/1999(H3N2)及びA/愛知/2/1968(H3N2)）を識別し得るアプタマー、を適宜作成することができる。本発明において、アプタマ
ーの長さは６０〜１３５塩基であることが好ましい。
【００３９】
得られたアプタマーは、比較的短い塩基配列を有するものであるため、一旦配列が決定されれば、その特異性を有する領域のみ、あるいは上記のようにプライマー結合領域等の配列と連結した状態で合成することが容易であり、抗体のようにハイブリドーマを保存する必要もない。更に、検出のために、放射性同位体、色素等の標識を結合させても良い。
【００４０】
本発明におけるアプタマーは、抗体に匹敵する特異性を有し、現在インフルエンザウイルスの検出のために使用されている抗体を用いた迅速診断キットと同様の用途に使用することができる。臨床上、インフルエンザであるか、感冒等のその他のかぜ症候群の疾患であるかを迅速に診断することは、治療上、また予防上においても非常に重要である。また、インフルエンザであっても、ウイルスの型により、また亜型により、症状が異なり、種
類が異なることでワクチンの効果が得られない場合もあり、治療に用いる医薬の決定、ワクチンの選択等においても、その識別は重要な意味を有する。更に、インフルエンザの流行状況をモニタリングすることで、将来の流行予測、ワクチンの製造の上でも有用な情報を得ることができ、更に研究用の試薬としても利用することができる。
【００４１】
使用の際には、上記のようにして得られた１種のアプタマーを単独で用いても良いが、場合によっては、同じウイルスまたはタンパク質に結合し得るアプタマー、または異なるウイルスまたはタンパク質に結合し得るアプタマーを複数混合して用いても良い。
【００４２】
本発明の一実施形態として、Ａ型ヒトインフルエンザウイルスの亜型H3N2に属する2つ
の株、A/パナマ/2007/1999(H3N2)とA/愛知/2/1968(H3N2)（以下、それぞれパナマ株、愛
知株と略す）の識別を挙げ、下記実施例において具体的に説明する。Ａ型インフルエンザウイルス粒子の表面には、それぞれ約900コピーのヘマグルチニン（HA）と約300コピーのノイラミニダーゼ（NA）が存在すると言われている。上記パナマ株と愛知株の間で、HAタンパク質のHA1鎖についてアミノ酸残基の相同性は84%程度である。同じ亜型に属するこれらのウイルス株の間でみられるHAの差異はアミノ酸３残基より短い範囲での変異に起因しており、一次配列上でそれ以上に長い範囲にわたる差異はみつからない。現在、製品として入手可能な抗体の中で、A型インフルエンザの同じ亜型に属する２つの異なる株を識別
できることを明確にしているものはない。
【００４３】
本発明者等は、アプタマーにはウイルスの遺伝子型を識別する能力、より具体的には、A型インフルエンザウイルスの株を識別する能力があることを示した。インフルエンザウ
イルスに特異的な臨床検査薬を開発するために、一例として本発明者等はA型インフルエ
ンザウイルスの亜型H3N2から2種の株、パナマ株と愛知株を用いて、試験管内選択法によ
ってこれら2株を識別できるようなアプタマーの探索を行った。1種類のウイルス株の方だけに特異的なRNAアプタマーを確保するために、対向選別法を実施した。合計で10サイク
ルの選別を行い、その結果得られた特異的なウイルスに結合するRNAプールについてクロ
ーニングを行った。選別を経たプールにはパナマ株ウイルスに特異的に結合するRNAアプ
タマーが含まれていた。このアプタマーのパナマ株に対する特異性は別の株、愛知株に比較して1,000倍以上であった。このパナマ株特異的なアプタマーは、同じウイルスから精
製したHAタンパク質に同様の親和性で結合した。このことは選別されたアプタマーがインフルエンザウイルス上のHAタンパク質に結合することを示唆する。
【００４４】
本発明の別の実施形態として、Ａ型ヒトインフルエンザウイルス及びＢ型ヒトインフルエンザウイルスの識別を挙げ、実施例において具体的に説明する。
【００４５】
インフルエンザの流行では、通常A型インフルエンザウイルスとB型インフルエンザウイルスの両方の流行が同時に発生する。個々の患者がA型ウイルスとB型ウイルスのどちらに感染しているかを判別することは臨床診断にとって重要であり、現在は抗体によるA-B型
識別の検査キットが用いられている。
【００４６】
A型インフルエンザウイルスに対するRNAアプタマー及びB型インフルエンザウイルスに
対するRNAアプタマーを開発すれば、インフルエンザウイルスのA-B型識別検査に有用である。
【００４７】
本発明は更に、上記の本発明のアプタマーを含有する、インフルエンザウイルスの検出用キットを提供する。
【００４８】
本発明のキットには、本発明のアプタマーの他、検出反応を行うための容器、標的とアプタマーの結合を検出するための試薬、陽性及び／または陰性対照サンプル等を含めるこ
とができる。アプタマーが放射性標識されている場合には、標的とアプタマーが結合した複合体の量を定量的に検出することができる。また、アプタマーが蛍光標識されている場合には、複合体からの蛍光を検出することができる。更に、アプタマーがアビジンやストレプトアビジンで標識されている場合には、検出するための試薬としてビオチンを用いることができる。当業者であれば、標的とアプタマーの結合を検出するための方法として、当分野で通常行われている方法を適宜利用することができる。
【実施例１】
【００４９】
インフルエンザA/パナマ株に特異的なアプタマーのIn vitroでの選別
インフルエンザウイルス、A/愛知/2/1968(H3N2)株の精製は既に報告されている方法と
同様に行った（Kida及びYanagawa, J. gen. Virol. 1981 52:103-111参照）。A/パナマ/2007/1999(H3N2)株は組橋英明博士（阪大微生物研究会）より分与していただいた。
【００５０】
選別に用いたRNAプール（30N）は既に報告したようにして調製した（Fukudaら, Eur. J. Biochem., 267, 3685-3694 (2000)）。このRNAプールは次のようにプライマー結合領域ではさまれたランダムな30塩基のコアを含んでいる：5'-GGGAGAATTCCGACCAGAAG-N30-CCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3'（配列番号１）。RNAプールの増幅に用いたプライマーは：5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG-3'（配列番号２、以下39.N30と表記する。）
と5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号３、24.N30と表記する。）である。選別サイクルにおいては大腸菌tRNA（Boehringer-Mannheim）を非特異的な競争阻害剤として用
いた。
【００５１】
フィルターに吸着するRNAを除くため、選別サイクルの前ごとにRNAプールを"Pop-top"
フィルターホルダー（Nucleopore）に装着した湿潤済みニトロセルロース・アセテート・フィルター（HA WPフィルター, 0.45μm, 径13.0mm, Millipore）に3回通した。特異的な結合体を選別するために、選別過程の間ずっとtRNAを競争阻害剤として用いた。最初の選別サイクルでは、結合用緩衝液（20 mM Hepes-KOH,pH7.4, 105 mM NaCl）に溶かした（N30プール中の）約4 X 1013通りのRNA配列の異なるコンフォメーションの平衡を促進するために、90℃で2分間処理して変性させた後に、室温で10分間冷却させた（アニーリング）
。プールのRNAとtRNAを合わせてから、パナマ株ウイルスを加え、結合用緩衝液50μl中の最終的な混合液（20 mM Hepes-KOH, pH7.4, 105 mM NaCl, RNA pool 7.8 μM, 9.3 μgパナマ株ウイルス, 競争阻害剤として1.2 μM tRNA）を室温で30分間インキュベートした後、フィルターを通した。フィルターは1 mlの結合用緩衝液で洗浄した。フィルター上に残留したRNAは以前に記述したようにして（Kumarら, Virology, 1997 Oct 27, 237(2):270-82）流出させて回収した。回収したRNAは、50 mM Tris-HCl (pH8.0), 40 mM KCl, 6 mM MgCl2, 0.4 mM dNTPs, 2.5 μM プライマー（24.N30）と5 UのAMV逆転写酵素（生化学工業）を含む20 μlの反応液中で逆転写した。ヌクレオチドと酵素はアニーリングの段階（90℃で2分間処理後、室温で10分間）の後で加えた。逆転写は42 ℃で1 時間行った。
【００５２】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅のため、逆転写後の混合液（cDNA反応液）20 μlを80 μlのPCR用混合液（10 mM Tris-HCl (pH8.8), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 5UのTaq DNAポリメラーゼ（タカラ）, 0.4 μMずつの24.N30プライマーと39.N30プライマー） で希釈した。反応液は 94℃、1.15分間；‐50℃、0.45分間；‐72℃、1.15分間のサイクルを、適正サイズで産物のバンドが得られるまでの回数繰り返した。PCRの産物はエタノールで沈殿させて転写に用いた。試験管内転写反応はT7Ampliscribeキット（Epicentre Technologies）を用いて、37℃、2時間行った。RNA合成とDNase I処理
の後、反応液を10%非変性ポリアクリルアミドゲルで分画した。RNAをゲルから抽出し、次の選別と増幅のサイクルに使用した。
【００５３】
パナマ株ウイルスへの特異的で高親和性の結合体を確保するように、それぞれの選別サ
イクルを操作した。フィルターへの吸着物やバックグラウンドを除くために、最後の2サ
イクルの選別では96穴タイタープレート（Xenobind plates; XENOPORE Corp.）を使用し
た。タイタープレート選別では、最初に結合用緩衝液の存在下でタンパク質量9.75 μgのウイルスでウェルを表面処理し、残った非特異的吸着部位をBSA（0.1%のストック液）で
ブロックした。次にウェルは洗浄した後に選別に用いた。タイタープレート選別に用いるために、第8回目のサイクルで得られたRNAプールをアニーリングした。次にプールRNA（0.5 μM）とtRNA（50 μM）を200 μlの結合用緩衝液中で混合し、まずBSAのみで表面処理したウェルの中に入れ室温（25℃）で10分間反応させた。未吸着のRNAを回収し、愛知株
ウイルス（0.98 μg）で表面処理したウェルの中に入れ、また10分間反応させた。未吸着の分子を回収し、パナマ株ウイルス（0.98 μg）で表面処理したウェルの中に入れ、20分間の結合時間の後に300 μlの結合用緩衝液で3回洗浄し、未吸着のRNAを除いた。その後
結合したRNAを高温の7 M尿素液で回収した。回収した分子はエタノールで沈殿させ、逆転写、PCRと試験管内転写反応で再生した。第10回目のサイクルも上記の条件を用いて繰り
返したが、愛知株ウイルスへの結合体を除く段階だけをつけ加えて、ウェルからパナマ株への結合体を高温の7 M尿素液によって回収する前に愛知株ウイルス（0.42 μg）を加え
た。
【００５４】
最初の選別サイクルで、約1014通りの配列のRNAを結合用緩衝液の中、タンパク質とRNAのモル比13.5：1でインフルエンザウイルスに結合させた。この結合用緩衝液の条件では
、ウイルスやそのタンパク質の生物活性が損なわれないことがわかっている。その後の選別サイクルでは、ウイルスとRNA（N30プールとtRNA）のモル比は選別の厳しさが順次増していくように操作した（表１）。
【００５５】
【表１】
2005130855.tif 000003
【００５６】
パナマ株ウイルスに対する特異的なアプタマーを増やすために、サイクル6からは対向
選別法を行い、RNAプールをまず愛知株ウイルスに結合させてから、未結合のRNA分子をパナマ株ウイルスに再結合させた。パナマ株ウイルスに結合したRNA分子を溶出させた後、
逆転写、PCR、試験管内転写反応により再生してから次の選別サイクルに用いた。高親和
性の抗ウイルス・アプタマーが濃縮されていく進行状況とその特異性は、フィルター結合定量法で解析した。
【００５７】
第10回目のサイクルで得たアプタマーをクローニングし、17クローンについて配列を解読し、3種類の主要なグループが出現したことを見いだし、これらを以下のように分類し
た。
【００５８】
モチーフ１（PN30-10-2(配列番号６)、PN30-10-3(配列番号７)、PN30-10-12(配列番
号８)、PN30-10-16(配列番号９)、PN30-10-19(配列番号１０)、PN30-10-20(配列番号１１)、PN30-10-22(配列番号１２)、及びPN30-10-23(配列番号１３)）
モチーフ２（PN30-10-1(配列番号１４)、PN30-10-7(配列番号１５)、及びPN30-10-8(配列番号１６)）、及び
モチーフ３（PN30-10-4(配列番号１７)、PN30-10-9(配列番号１８)、PN30-10-10(配
列番号１９)、PN30-10-13(配列番号２０)、PN30-10-14(配列番号２１)、及びPN30-10-15(配列番号２２)）。
【００５９】
【表２】
2005130855.tif 000004
【００６０】
これらのうち、モチーフ１のグループはモチーフ２及び３のグループよりも高い頻度で現れた。これらのグループの代表的なアプタマーについて、パナマ株ウイルスへの特異的な結合をモル濃度で10倍過剰のtRNAの存在下で定量した（表１）。
【００６１】
個別のアプタマーを得るために、サイクル10でのPCR増幅の産物をpCRIIベクター（Invitrogen）にInvitrogen提供のプロトコールに従って直接ライゲートした。個々のクローンからalkaline-lysis 法によってDNAを分離し、Dye Terminator Sequencing kit（Applied
Biosystems Inc. (ABI)）とDNAシークエンサー（Model 373A, ABI）を用いて配列を決定した。個々のアプタマーだけでなく、異なる選別サイクルにおけるプールRNAの結合活性
も調べるために、0.5 mCi/ml [α-32P]CTPを用いて内部標識されたRNAを調製した。結合
と試験管内転写反応の条件は、RNAのウイルスあるいはHAに対するモル比（20 nM RNAに対して200 nM ウイルスあるいはウイルスタンパク質）を変えた以外は選別に用いた条件と
同様であった。フィルターは1 mlの結合用緩衝液で洗浄し、風乾してから、放射活性を画像解析装置（BAS2000, 富士フイルム）で定量した。結合を確実に特異的とするために、
モル濃度で10倍過剰のtRNAを非特異的競争阻害剤として結合反応に加えた。
【００６２】
それぞれのグループを代表するアプタマーについて、結合用緩衝液の中でパナマ株ウイルスへの結合を直接に解析した。アプタマーの一次配列から、フリーウェアプログラム「RNAstructure」（version 3.7、http://rna.chem.rochester.edu/RNAstructure.htmlからダウンロードにより入手可能）を用いて二次構造を予測した。モチーフ３に属するアプタマー（例えばPN30-10-4）はフィルター上に残留したが、タンパク質依存的な結合はしな
かった。それに対して、他の2種類のアプタマー、モチーフ２（例えばPN30-10-1（配列番号１４）とPN30-10-8（配列番号１６））とモチーフ１（例えばPN30-10-16（配列番号９
））はパナマ株ウイルスに特異的に結合した。これらのアプタマーの中でもPN30-10-16は、他のアプタマーに比較してより高い親和性で結合を起こし、選別されたプール（サイクル10、配列を決めたクローンに基づく）内の分子種の半分近くを占めていた。アプタマーPN30-10-1とPN30-10-16の解離定数（Kd）は、それぞれ71 nMと42 nMであると算出され（
表３）、このことから、選別されたプールRNAの中でモチーフ１が高い出現率を示したこ
との説明ができる。
【００６３】
【表３】
2005130855.tif 000005
【実施例２】
【００６４】
ウイルスタンパク質へのアプタマーの結合
アプタマー（モチーフ２とモチーフ１）のパナマ株ウイルス上における結合部位を調べるために、愛知株とパナマ株のウイルスからそれぞれHAタンパク質を分離し、上記の実験に用いたのと同様なフィルター結合定量法によって解析を行った。
【００６５】
HAタンパク質（HA1鎖とHA2鎖からなる。）は、以下のようにしてウイルスから精製した。約30%ショ糖を含むウイルス保存試料をTris緩衝液（50mM Tris, 25 mM NaCl, pH7.5）
で1.5倍に希釈し、遠心分離（4℃、45,000 gにて30分間）することによってショ糖を除去し、ペレットを0.25mlのTris緩衝液に分散させた後、0.06mlの20% Triton X-100（wt/wt
）を加えて混合し、37℃で2時間静置した。4℃、45,000 gにて30分間遠心分離して得られた上清をイオン交換カラム（Vivapure spin column, type S mini H, Sartorius AG, Germany）に通した。カラムから流出したタンパク質を段階的ショ糖密度勾配（PBS中、重量
比20-60%）の上に重層し、4℃、160,000 gにて20時間遠心分離した。分画した試料をSDS-PAGEにて分析し、精製されたHAを含む分画を集めて実験に使用するまで-80℃にて保存し
た。
【００６６】
実験の結果は、どちらのアプタマーもパナマ株ウイルスの精製HAにウイルスに対してと同じ親和性と特異性で結合することを明確に示しており（例えばPN30-10-1、図1を参照）、これらアプタマーのパナマ株ウイルス上の結合部位はHAであることが示唆された。一方、これら2つのアプタマーは、既にウイルス粒子でも確認したように、愛知株の精製HAに
結合することはできなかった（図2）。このように、RNAモチーフ２とモチーフ１は同じ効率でパナマ株ウイルスを識別することができた。
【実施例３】
【００６７】
パナマ株ウイルス及びHAに結合するRNAモチーフ
高親和性のアプタマー（PN30-10-16）は74ヌクレオチドの長さがあり、様々な解析のためにはより短い方が良いので、ウイルスとHAへの結合を保持したまま、より短いアプタマーの誘導体を作製することを目標に設定した。最初にRNAstructure（version 3.7）でRNA分子の二次構造予測を行ったところ、RNAが長いステム-ループ構造に折りたたまれることを見いだした（図2）。ヌクレオチド番号1-16は別の短いヘアピン・ループに折りたたま
れ、またこの領域は総てのアプタマーでプライマー領域だったので、ウイルスの認識にとっては重要な部位ではないと考えられた。そこで、PN30-10-16アプタマーのヌクレオチド番号20-70からなるRNAを、この領域を含むDNAテンプレート（5'-AGTAATACGACTCACTATAGGGTTAGCAGTCGGCATGCGGTACGACGAACCTTTCCTCTCTCCTTCCTC-3'（配列番号４）、及びプライマー（5'-GAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3'（配列番号５））を用いて2本鎖DNAに転換し、PCRによる
増幅、およびα-32P-CTP存在下でのIn vitroの転写を用いることによって、調製した。
【００６８】
得られた放射性標識RNA産物について、フィルター結合定量法を用いてパナマ株ウイル
ス粒子やパナマ株のHAに対する結合の解析を行った。結合実験の結果は、PN30-10-16の20-70ヌクレオチド領域がパナマ株ウイルスやHAへの結合に十分であることを明確に示した
。このように得られたPN30-10-16-mini（51-mer、配列番号２３）は、インフルエンザウ
イルス（パナマ株）とそのHAタンパク質に高親和性で特異的結合をすることのできるより短いアプタマーである。
【実施例４】
【００６９】
アプタマーPN30-10-16-miniの結合特異性
実施例３で得られたアプタマーPN30-10-16-miniについて、実施例３と同様にして、フ
ィルター結合定量法により、パナマ株ウイルス及び他のインフルエンザウイルス株との結合を評価した。尚、A/ニューカレドニア/20/1999(H1N1)株及びB/ヨハネスブルク/05/1999株はいずれも組橋英明博士（阪大微生物研究会）より分与していただいた。
【００７０】
結果を図３に示すように、アプタマーPN30-10-16-miniは、A/パナマ株のHAタンパク質
に対しては、そのタンパク質量に依存した結合が見られたが、パナマ株と同じＡ型インフルエンザウイルスであっても亜型の異なるA/ニューカレドニアウイルス(H1N1)、及びＢ型インフルエンザウイルスのB/ヨハネスブルクのHAタンパク質とは有意な結合を観察できな
かった。
【実施例５】
【００７１】
表面プラズモン共鳴法によるアプタマーPN30-10-16の解離定数の測定。
表面プラズモン共鳴法ではフィルター結合測定より感度の高く、より精度の高い解離定数の測定が可能と期待されたので、RNAアプタマーPN30-10-16（配列番号９）とHAタンパ
ク質（A/パナマ/2007/1999(H3N2)株）の結合の解離定数を、表面プラズモン共鳴装置BIAcore 2000（Biacore社）によって測定した。
【００７２】
RNAアプタマーPN30-10-16の3'-端に24ヌクレオチド長のオリゴ・アデニン（A）を延長
させたRNAを作製し、次のようにして表面プラズモン共鳴法用のセンサーチップに固定化
した。まず、HBS-EP緩衝液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005%界面活性剤P20, pH 7.5）に解かした1μMのビオチン化したオリゴdT（24ヌクレオチド長）[5'-(dT)24-3']、約2μlを、ストレプトアビジンでコートされたセンサーチップ（センサーチップSA, Biacore社）に5μl/mlの流速で流して固定化し、緩衝液を20μl/mlの流速で20分間流して未結合のオリゴヌクレオチドを除いた。オリゴAを含むRNAアプタマーPN30-10-16をHBS-EP緩衝液に50nMの濃度で溶かし、その20μlをオリゴdTを固定化したチップに2μl/mlの流速で流してチップ表面上のオリゴdTに結合させた。このアプタマーのチップへの結合の際に表面プラズモン共鳴装置によって検出された応答の強度は、1,000応答単位（RU）であ
った。
【００７３】
上記のSAチップへ6.6〜20 nMの濃度範囲のA/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質液60μlを20μl/mlの流速で流し、固定化されたRNAアプタマーとの結合反応曲線を測定した（図４）。これらの反応曲線から得られたRNAアプタマー・HAタンパク質結合の会合速度
定数（kon）と解離速度定数（koff）は、それぞれ2.6 X 105 M-1sec-1及び2.9 X 10-5 sec-1であった。その結果得られた解離定数（Kd）は188 pMであり、実施例１のフィルター
結合測定で求めた値42 μMの約220分の1であった。このことにより、RNAアプタマーPN30-10-16のA/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質への結合親和性はフィルター結合測定
で調べていた結果より約220倍高いことが判明した。
【００７４】
以上の表面プラズモン共鳴測定の対照実験として、RNAアプタマーPN30-10-16のランダ
ム配列領域の配列を相補的配列（小文字で表した。）に置き換えたPN30-10-16c（5'-GGGAGAAUUC CGACCAGAAG ccaaucguca gccguacgcc augucugucu CCUUUCCUCU CUCCUUCCUC UUC -3'：配列番号２４）を合成し、A/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質への結合性を表面プラズモン共鳴法によって調べた。上述のSAチップにおいて、PN30-10-16を固定化したチャネルとは別のチャネルに、同様の方法でビオチン化したオリゴdTとオリゴAの結合を介
して別のRNA、PN30-10-16cを固定化した。このチャネルでは、HAタンパク質濃度20 nMに
おいても表面プラズモン共鳴の応答はなく、HAタンパク質とPN30-10-16cの結合は全く検
出されなかった（図４）。このことから、表面プラズモン共鳴測定の特異性が確認されるとともに、RNAアプタマーPN30-10-16のランダム配列領域の重要性が確認された。
【００７５】
参考例１
HA-モノクローナル抗体とHAタンパク質の結合の解離定数
比較のため、A/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質とモノクローナル抗体との結合反応も表面プラズモン共鳴法によって解析した。A/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質に対するモノクローナル抗体（MAB8254, Chemicon International社）は、次のように
して表面プラズモン共鳴のセンサーチップ（センサーチップCM5, Biacore社）へアミノ共役法によって固定化した。まず、センサーチップに70μlのN-ハイドロキシスクシニミド
（N-エチル-N'-（ジメチルアミノプロピル））カルボジイミド（NHS/EDC）を流してから
、10 mM酢酸ナトリウム（pH 5.0）に溶解させた抗HA抗体溶液（20μg/ml）を7μl流し、
続いて70μlの1Mエタノールアミン・ハイドロクロリド（pH 8.5）を流してチップ表面の
未反応基をブロックした。以上の過程は全て、流速10 μl/minのもとで行った。このセンサーチップへ6.3〜100 nMの濃度範囲のA/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質液60 μlを20 μl/mlの流速で流し、固定化された抗HA抗体との結合反応曲線を測定した（図５）。これらの反応曲線から得られた抗HA抗体・HAタンパク質結合の会合速度定数（kon）と
解離速度定数（koff）は、それぞれ2.0 X 105 M-1sec-1及び6.3 X 10-4 sec-1であった。その結果得られた抗HA抗体とHAタンパク質の結合の解離定数（Kd）は2.3 nMであり、RNA
アプタマー・HAタンパク質結合の解離定数（Kd）の値188 pMの約12倍であった。すなわち、解離定数の比較から、A/パナマ/2007/1999(H3N2)株HAタンパク質に対して、RNAアプタ
マーPN30-10-16は抗HA抗体より12倍高い親和性を持つことが判明した。
【００７６】
この違いは、主として解離速度定数の違いによっている。RNAアプタマー・HAタンパク
質結合の解離速度定数（koff = 2.9 X 10-5sec-1）は、抗HA抗体・HAタンパク質結合の解離速度定数（koff = 6.3 X 10-4sec-1）より約22分の1であり、RNAアプタマーPN30-10-16は抗HA抗体よりも、HAタンパク質からの解離が遅いことがわかる。
【実施例６】
【００７７】
インフルエンザB/ヨハネスブルク/05/1999株に特異的なアプタマーの選別
B型インフルエンザウイルスに対するRNAアプタマーを得るために、次のような選別を行った。インフルエンザウイルス、B/ヨハネスブルク/05/1999株は組橋英明博士（阪大微生物研究会）より分与していただいた。このウイルス株のHAタンパク質（HA1鎖とHA2鎖からなる。）を実施例２と同様に次の方法で精製し、このタンパク質を選別の標的として用いた。約30%ショ糖を含むウイルス保存試料からショ糖を除去するために、試料をTris緩衝
液（50mM Tris, 25 mM NaCl, pH7.5）で1.5倍に希釈し、遠心分離（4℃、45,000 gにて30分間）した。ペレットを0.25 mlのTris緩衝液に分散させた後、0.06mlの20% Triton X-100（wt/wt）を加えて混合し、37℃で2時間静置した。4℃、45,000 gにて30分間遠心分離して得られた上清をイオン交換カラム（Vivapure spin column, type S mini H, Sartorius社）に通した。カラムから流出したタンパク質をショ糖密度勾配（PBS中、重量比20-60%
）の上に重層し、4℃、160,000 gにて20時間遠心分離した。分画した試料をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し（図６）、レーン4番から6番までの試料を精製されたHAタンパク質として集め、30%ショ糖を含む保存用緩衝液（50 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl,
1 mM CaCl2, pH 7.5）に対して透析し、実験に使用するまで-80℃にて保存した（図６）。
【００７８】
選別に用いたRNAライブラリーは、ランダムな配列を持つ中心領域（74塩基長）が、非
可変配列を持つ5'-端のプライマー領域（38塩基長）と3'-端のプライマー領域（20塩基長）で挟まれるように設計した。まず、一本鎖DNAライブラリーとして、5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC--N74--GGCACCACGGTCGGATCCAC-3'（配列番号２５）を合成した。5'-プライマーと3'-プライマーに用いた配列は、それぞれ5'-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC（配列番号２６、以下38.N74と表記する。）とGTGGATCCGACCGTGGTGCC-3'（配列番号２７、20.N74と表記する。）であり、5'プライマーにはT7プロモーターが含まれている。約1X1014分子のDNAランダムライブラリーに対して0.25μMずつの5'-プライマ
ーと3'-プライマーの存在下で8サイクルのPCRを行った。増幅されたDNAライブラリーは、T7 Ampliscribe kit（Epicentre Technologies社）を用いた転写（in vitro transcription）でRNAライブラリーに変換させた。
【００７９】
最初のRNAライブラリー（15μg, 約1 X 1014個のRNA分子）をRNA結合用緩衝液（50 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH7.5）に溶解させ、タンパク質とRNAの混合の分子比を20対1として選別を行った。各選別サイクルで用いた条件を表４に示す。
【００８０】
【表４】
2005130855.tif 000006
【００８１】
第2サイクル目以降の選別でのタンパク質-RNA混合分子比は20対1と5対1の間にした。選別の各ステップの前には、RNAの異なるコンフォメーションの平衡を促進するために、90
℃で2分間処理して変性させた後に室温で10分間冷却させた（アニーリング）。選別サイ
クルにおいては大腸菌tRNA（Boehringer-Mannheimd社）を非特異的な競争阻害剤として用いた。RNAとHAタンパク質を室温で10分間反応させた後、「Pop-top」フィルターホルダー（Nucleopore社）に装着した湿潤済みニトロセルロース・アセテート・フィルター（HA W
Pフィルター, 0.45μm, 径13.0mm, Millipore社）に通し、タンパク質に結合したRNAをフィルター上に捕捉させて、フィルターを1 mlの結合用緩衝液で洗浄した。フィルター上にタンパク質と共に結合したRNAは溶出用緩衝液（0.4 M 酢酸ナトリウム, 5 mM EDTA, 7 M 尿素, pH5.5）により回収し、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Roche Diagnosis社）によって42 ℃で1 時間、逆転写した。得られたcDNAはPCR（6〜12サイクル）で増幅し、
次の選別サイクルで用いるRNAを調製するための鋳型とした。非特異的にフィルターに吸
着するRNAを除外するため、転写されたRNAプールは次の選別サイクルに用いる前にニトロセルロース・アセテート・フィルターに3回通した。特異性の高いRNAを選別するために、表２に示すように選別サイクルが進むにつれて精製HAタンパク質の濃度を段階的に下げた。第2サイクル目と第4サイクル目の選別では、フィルターの代わりにイオン交換カラム（Vivapure spin column, type S mini H, Sartorius 社）を用いた。第7サイクル目の選別では、フィルターへの吸着物を除くために96穴タイタープレート（Xenobind plate; XENOPORE Corp.社）を使用した。
【００８２】
第5サイクル目と第7サイクル目と第9サイクル目におけるRNAプールの結合活性を次のように解析した。PCR産物をα-32P-CTP（Amersham社）の存在下で転写することにより内部
標識されたRNAを作製した。結合反応では、モル濃度で10倍過剰の大腸菌tRNAを非特異的
競争阻害剤として加え、RNAとHAタンパク質を1対4のモル比で混合し結合させた後、フィ
ルターを通した。フィルターは1 mlの結合用緩衝液で洗浄し、フィルターに残留した標識RNAの放射活性を画像解析装置（BAS2000, 富士フイルム）で定量した。結合活性は、反応液に入れたRNA全量の内、フィルター結合したRNA量のパーセンテージで表した（表２）。第9サイクルの選別後では、RNAプールの約27%がHAタンパク質に結合した。
【００８３】
第9サイクル目の選別の産物をTAクローニング・ベクター（Invitrogen社）に導入し、
サブクローニングした後、大腸菌にトランスフォームした。プラスミドDNAの個々のクロ
ーンをプラスミド精製キット（Promega社）で単離し、DNA塩基配列をDye Terminator Sequencing kit（Applied Biosystems Inc. 社）とDNAシークエンサー（Model 373A, Applied Biosystems Inc. 社）を用いて配列を解読し、そのDNA塩基配列に相当するRNA塩基配列を求めた。配列が解読されたRNAのクローンは配列によって4つのクラスに分類され、存在比率の高い順番（42% > 33% > 17% > 8%）にクラスA、クラスB、クラスC、クラスDと名付けた（図７）。
【００８４】
クラスA（アプタマーJN74-9-A13、-A17、-A20、-A30、及び-A35：配列番号２８）
クラスB（アプタマーJN74-9-B11、-B16、-B18、及び-B40：配列番号２９）
クラスC（アプタマーJN74-9-C19及び-C25：配列番号３０）
クラスD（アプタマーJN74-9-D6：配列番号３１）
【００８５】
尚、クラスA〜Cに属する複数のクローンから得られるアプタマーの塩基配列は、それぞれいずれも同じ配列であったため、同じ配列番号で示すこととし、以下、各クラスを代表するアプタマーとして、便宜的にJN74-9-A13（クラスA）、JN74-9-B16（クラスB）、JN74-9-C25（クラスC）及びJN74-9-D6（クラスD）を用いる。
【００８６】
RNA塩基配列からフリーウェアプログラム「RNAstructure」（version 3.7、http://rna.chem.rochester.edu/RNAstructure.htmlからダウンロードにより入手可能）を用いて4つのクラスのRNA分子の二次構造予測を行ったところ、クラスごとに異なる二次構造の形成
が予測された（図８）。フィルター結合測定によって求めたRNA配列の4クラスとHAタンパク質（160nM）の結合効率は、それぞれ76%、48%、30%、16%であった（図９）。
【００８７】
存在比率の最も高かったクラスAについて着目し、特にB/ヨハネスブルク/05/1999株のHAタンパク質に対して親和性の高いクラスAのRNAアプタマー、JN74-9-A20（配列番号２８
）について、塩基配列の重要性や金属イオンの効果、異なる型のインフルエンザウイルスを識別する能力など、アプタマーとしての特異性や親和性をフィルター結合定量により解析を行った。
【００８８】
RNAアプタマーJN74-9-A20がHAタンパク質のポリペプチド領域を認識しているのか、HA
タンパク質に付加された糖鎖を認識しているのかを明らかにするために、糖加水分解酵素によってHAタンパク質の糖鎖を除去してRNAアプタマーの結合に対する影響を調べた。
【００８９】
約30%ショ糖を含むB/ヨハネスブルク/05/1999株ウイルス保存試料（体積6 ml、ウイル
スタンパク質量22 mg）からショ糖を除去するために、試料をリン酸緩衝液（20mM リン酸ナトリウム, pH6.5）3 mlを加え1.5倍に希釈し、遠心分離（4℃、45,000 gにて1時間）した。ペレットを1.5 mlのリン酸緩衝液に分散させた後、界面活性剤N-ドデシル-β-D-マルトシド（Calbiochem-Novabiochem Co.社）66 mgを含むリン酸緩衝液1.5 mlを加えて混合
し、37℃で2時間震盪した後、4℃、45,000 gにて1時間遠心して上清を回収した。糖質加
水分解酵素N-グリコシダーゼF（Roche Diagnosis社）250単位/250μlとエンドグリコシダーゼ（Endo Hf, New England BioLabs Inc.社）250,000単位/250μlを加えて、37℃で24
時間震盪した後、再度エンドグリコシダーゼ250,000単位/250 μlを追加してさらに37℃
で24時間震盪した。4 M NaCl水溶液を加えて、タンパク質溶液に含まれるNaCl濃度を300 mMに調整した後、限外ろ過膜（Amicon Centriprep, 50,000MWCO; Millipore Co.社）を用いて体積を約0.5 mlまで濃縮した。この試料を、ゲルろ過カラム（Superose 12 HR 10; Pharmacia Biotech社）に0.02%N-ドデシル-β-D-マルトシドを含む緩衝液（10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, pH 7.5）で流すことによってHAタンパク質と糖質加水分解酵素を分離し
た。分画した試料をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、HAタンパク質を含む分画を集めて、RNAアプタマーとの結合実験に用いた（図１０）。
【００９０】
RNAアプタマーとHAタンパク質の結合の解離定数は、一定濃度（20 nM）の内部標識RNA
に対してHAタンパク質濃度を変化させて（5〜140 nM）結合反応させ、フィルター結合測
定によって解析した。RNAとHAタンパク質の混合液をニトロセルロース・フィルターに通
した後、フィルターを1 mlの結合用緩衝液で洗浄し、HAタンパク質とともにフィルターに結合した内部標識RNAを画像解析装置（BAS2000, 富士フイルム）で定量した。この測定値を解析ソフトウェアPRISM（Graphpad Software Inc.社）で解析することによって、解離
定数を求めた（図１１）。RNAアプタマーJN74-9-A20の結合は、糖鎖を除去していないHA
タンパク質に対しても糖鎖を除去したHAタンパク質に対してもほぼ同等の解離定数（Kd 
〜45 nM）を表したので、HAタンパク質の糖鎖はこのRNAアプタマーとの結合には関与していないことが示された。
【００９１】
マグネシウムイオン（Mg2+）の存在下（濃度5 mM）と非存在下で、緩衝液50 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, pH 7.5中でのRNAアプタマーJN74-9-A20とB/ヨハネスブルク/05/1999株HAタンパク質の結合をフィルター結合測定で調べたところ、この結合はマグネシウムイオ
ンに依存的であり、マグネシウムイオンが存在しない状態では結合しなかった（図１２）。
【００９２】
RNAアプタマーJN74-9-A20は、精製したHAタンパク質だけでなく、インタクトなB/ヨハ
ネスブルク/05/1999株のウイルス粒子に対しても結合することがわかった（図１３）。このとき、JN74-9-A20はウイルス粒子表面のHAタンパク質に結合しているものと考えられる。
【００９３】
同時に、RNAアプタマーJN74-9-A20の結合特異性を調べるために、異なる型であるA/愛
知/2/1968(H3N2)株とA/パナマ/2007/1999(H3N2)株のそれぞれからHAタンパク質を精製し
、これらのHAタンパク質及びB/ヨハネスブルク/05/1999株ウイルス粒子に対する結合をフ
ィルター結合測定で調べた。その結果、RNAアプタマーJN74-9-A20はA型ウイルスのHAタンパク質とは結合を示さなかった（図１３）。
【００９４】
次に、RNAアプタマーJN74-9-A20塩基配列におけるランダム配列領域の重要性を調べる
ために、ランダム配列領域の配列をJN74-9-A20のものとは相補的にしたRNA、JN74-9-A20c（配列番号３２）を合成し、B/ヨハネスブルク/05/1999株のHAタンパク質との結合を調べた。JN74-9-A20cはHAタンパク質と結合する能力がなく、JN74-9-A20塩基配列のランダム
配列領域の重要性が示された。
【００９５】
選別されたRNAアプタマー上のHAタンパク質結合部位を調べるために、N-ニトロソ-N-エチルウレア（以下、ENUと略す。）によるリン酸結合部の修飾の効果を調べた。まず、RNAアプタマーJN74-9-A20の放射性標識を行った。RNAをウシ小腸フォスファターゼによって37℃で1時間処理した後、フェノールで抽出しエタノールで沈澱させ、 [γ-32P] ATPとT4
ポリヌクレオチド・キナーゼによって放射性標識し、8%ポリアクリルアミド／7 M尿素ゲ
ルで電気泳動してゲルから溶出させて回収した。標識RNAの三次構造の折れたたみを行わ
せるために、95℃2分間の過熱処理の後、ゆっくりと室温に冷却させた。このように調製
した5'-端標識RNA（1,100 Kcpm）は8μlの緩衝液（20 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 8.0）に溶解させ、2.5μgの大腸菌tRNA （0.8μl）とENUの飽和エタノール溶液5μlとを加えた。90℃で2分間の処理によって修飾反応を行った後、15μgの大腸菌tRNA（4.8 μl）を添加
して反応を停止させ、RNAをエタノール沈澱によって回収した。以上の反応条件によって
、ENUはRNAの1分子当たり約1ケ所のリン酸結合部を加水分解が容易なフォスフォトリエステルに修飾する。この過程でHAタンパク質との結合に不可欠なリン酸結合が修飾されているRNA分子は、HAタンパク質と複合体形成することができない。HAタンパク質と複合体形
成する修飾RNAの集団から失われているRNAのバンドを、ゲル電気泳動によるフットプリントから検出した。20 pmolの修飾RNAを25 μlの結合用緩衝液の中で92℃、2分間処理し室
温で10分間冷却させた後、RNAと HAタンパク質の複合体を形成させるために160 nMのHAタンパク質を加えて25℃で10分間静置した。複合体をニトロセルロース・フィルターに結合させた後、回収し、200 μlの緩衝液（100 mM Tris/HCl, pH 9.0）中で50℃、5分間処理
して部分的加水分解をさせた。切断されたRNAをエタノール沈澱で回収し、10%ポリアクリルアミド／7 M尿素ゲルの電気泳動で分析し、HAタンパク質の非存在下のときと挙動の異
なるRNAアルカリ加水分解物のバンドを調べた（図１４、レーン「-HA」とレーン「+HA」
の差。矢頭で示した。）。対照として、未修飾のRNAをRnase T1で分解した試料と、未修
飾のRNAをアルカリで部分的加水分解した試料も同時に電気泳動し、バンド同定に用いた
（図１４、それぞれ、レーン「T1」とレーン「OH」）。
【００９６】
その結果、RNAアプタマーJN74-9-A20の塩基配列上A63、G65、U66、U67の部位における
リン酸結合部の修飾はHAタンパク質との結合を強く阻害することがわかった。このことから、A63、G65、U66、U67の部位のリン酸結合はHAタンパク質との結合に重要と考えられる。これら部位は互いに近接しており、RNA分子JN74-9-A20の予測二次構造上で一ケ所の1本鎖ループ領域に並んでいる（図１４）。以上の結果は、RNAアプタマーとHAタンパク質の
結合には、最適化された塩基配列だけでなく、ランダム配列領域のリン酸結合にも重要な役割があることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】フィルター結合定量法で調べた抗インフルエンザRNAアプタマーのヒトインフルエンザウイルス粒子とHAに対する結合能力を示す。四角い点は結合定量に用いた全標識RNA（20 nM）。
【図２】選別された2種類のアプタマーの、ヒトインフルエンザウイルス2株から精製したHAに対する結合能力を示す。
【図３】アプタマーPN30-10-16-miniの結合特異性を示す。
【図４】表面プラズモン共鳴法によって測定したRNAアプタマーとHAタンパク質の結合の解離定数を示す。Kd：解離定数。
【図５】表面プラズモン共鳴法によって測定した抗HA-モノクローナル抗体とHAタンパク質の結合の解離定数を示す。
【図６】インフルエンザウイルスB/ヨハネスブルク/05/1999株のHAタンパク質の精製を示す。HAタンパク質はHA1とHA2の2本のポリペプチド鎖からなる。左端の数字はマーカータンパク質（分子量97,000、66,000、45,000、31,000）の泳動位置を示す。
【図７】インフルエンザウイルスB/ヨハネスブルク/05/1999株のHAタンパク質に結合するRNAアプタマーを塩基配列によって分類して示す。カッコ内の数字は、全体RNAに対するクラスごとのRNAの存在比率（%）を表す。
【図８】4つのクラスのRNAアプタマーについて塩基配列から予測された二次構造をそれぞれ示す。
【図９】選別されたRNAアプタマーのB/ヨハネスブルク/05/1999株HAタンパク質に対する結合能を示す。
【図１０】インフルエンザウイルスB/ヨハネスブルク/05/1999株HAタンパク質からの糖鎖除去を示す。レーン1：マーカータンパク質（分子量97,000、66,000、45,000、31,000、21,000、14,000）、レーン2：糖鎖未除去のHAタンパク質、レーン3：糖鎖を除去したHAタンパク質。
【図１１】RNAアプタマーJN74-9-A20がB/ヨハネスブルク/05/1999株HAタンパク質のポリペプチド領域を認識することを示す。B/ヨハネスブルク/05/1999株HAタンパク質の糖鎖を除去した場合と除去していない場合にについて、RNAアプタマーJN74-9-A20の結合効率をフィルター結合測定で調べた。
【図１２】RNAアプタマーJN74-9-A20とB/ヨハネスブルク/05/1999株HAタンパク質の結合のマグネシウムイオン依存性を示す。
【図１３】RNAアプタマーJN74-9-A20によるインフルエンザウイルスの型の識別を示す。
【図１４】HAタンパク質への結合にとって重要なRNAアプタマー上のリン酸結合部の同定を示す。（A）N-ニトロソ-N-エチルウレア（ENU）によって様々な個所のリン酸結合に修飾を施したRNAアプタマー（JN74-9-A20）を、HAタンパク質と複合体形成させた。その後の部分的加水分解で生じるフットプリントのパターンを、HAタンパク質と反応させなかった場合のものと比較し、HAタンパク質結合に重要なRNAアプタマー上のリン酸結合を同定した。矢頭は、HAタンパク質との複合体形成によって消失したバンドを示す。（B）HAタンパク質との結合に重要なリン酸結合の位置を、RNAアプタマーJN74-9-A20の予測二次構造上に矢頭で表示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005130855.tif 000018
【図１３】
2005130855.tif 000019
【図１４】
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【配列表】
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