(57)【要約】      （修正有）【課題】成熟した花粉にのみ特異的に遺伝子発現を誘導することができて組織特異性及び時期特性に非常に優れるため、雄性不稔植物の生産に非常に有用に利用できる花粉特異的遺伝子発現プロモータを提供する。【解決手段】特定の塩基配列、または特定のの塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、シロイヌナズナから分離した、花粉特異的遺伝子発現を誘導することが可能なプロモータと該プロモーターに作動可能に連結された外来遺伝子を含む組み換えベクター及び形質転換された植物細胞。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の塩基配列、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、花粉特異的遺伝子発現を誘導することが可能な、シロイヌナズナから分離したプロモータ。
【請求項２】
（ａ）配列番号１の塩基配列、または
（ｂ）配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、花粉特異的遺伝子発現を誘導することが可能な、シロイヌナズナから分離したプロモータと、
前記プロモータに作動可能に連結された外来遺伝子とを含む組み換えベクター。
【請求項３】
前記外来遺伝子が、花粉の稔性を低下させることが可能な遺伝子である請求項２記載の組み換えベクター。
【請求項４】
請求項２または３記載の組み換えベクターによって形質転換された植物細胞。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列を含むプロモータのＤＮＡ断片を増幅するための、配列番号４及び配列番号５で表示されるＰＣＲ用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)から由来した花粉特異的遺伝子を発現させることが可能なプロモータに係り、さらに詳しくは、雄性不稔を用いた雑種種子の生産に有用に利用できる、シロイヌナズナから分離した、組織特異性及び時期特異性に非常に優れた花粉特異的遺伝子発現プロモータに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの作物種において、系統或いは品種間の交配による雑種後代個体（Ｆ１）は雑種強勢を示す。これらの交雑種は、周囲の環境変化に対して適応力が高くて植物病及び環境ストレスの面で抵抗性が強く、農業的に有用な形質特性の面でそれらの両親より著しい優秀性を示す。このような理由から、種苗会社で生産・市販している大部分の野菜種子は交雑種（Ｆ１）である。
【０００３】
高等植物は、生殖方法が複雑であるため、自家受粉とならないようにしながら高純度の雑種種子を大量生産することが容易ではない。現在栽培中の多くの作物で前記の問題点を解決し且つ系統間の交配率を高めるために、母本系統の雄蕊を除去し、父本系統の雄蕊を人為的に入れる人工交雑法が長期間にわたって用いられてきた。
【０００４】
ところが、人工交雑法による一代雑種の生産は、除雄作業やラッピング(wrapping)などに時間と手間が多くかかり、手で雄蕊を除去する場合には雄蕊が完全除去できない時もたまに発生し、花が小さい場合には作業過程が難しいという欠点がある。
【０００５】
一方、前記人工交雑法の欠点を克服して効率的に一代雑種を育成するために、不和合性対立遺伝子または花粉の発達を抑制する優性の雄性不稔遺伝子を用いた雄性不稔系統を雑種種子の生産に利用している。
【０００６】
例えば、特定の作物において細胞質雄性不稔性の系統が交差育種に使用されたが、時々耐病性の低下など好ましくない副作用を伴い且つ形質が不安定であって、種子の大量生産に困るという問題点がある。
【０００７】
また、人為的突然変異を誘発させて雄性不稔性系統を選抜し、或いは化学薬品を処理して稔性を低下させる方法も研究されているが、前記方法の安定性評価及び作用機序に対する理解が不完全であって利用に限界があるという問題点もある。
【０００８】
したがって、最近は、雄性不稔の機序を分子生物学的に糾明し、雄性不稔を誘導する遺伝子を導入させて新しい品種を開発しようとする研究が引き続き行われている。交配に利用しようとする優れた品種の特性をそのまま保って雄性不稔を誘導するには、このような遺伝工学を用いた雄性不稔化技術が最も効果的である。
【０００９】
ところが、雄性不稔を誘発する遺伝子を導入したとき、この遺伝子が植物発育の初期から継続的に発現されると、良くない効果を示し或いは元々の良い特性に悪影響を及ぼすおそれがある。したがって、花粉の発育を抑制する遺伝子または花粉の発芽を抑制する遺伝子を花粉にのみ特異的なプロモータ（調節遺伝子部位）に付けて発現させると、植物体の発育と生長には全く影響を及ぼさずに雄性不稔を誘導することができて好ましい。
【００１０】
そこで、優れた品種の特性をそのまま保ちながら高効率の雄性不稔作物を容易に開発するために、植物の雄性組織に特異的なプロモータ、及び前記プロモータを含んだ雄性不稔化のための遺伝子構造物についての研究が行われている（特許文献１、非特許文献１参照）。
【００１１】
ところが、発現の組織特異性及び時期特異性がより高く、花粉稔性の制御に有用な新規遺伝子に対する要求がずっと存在してきた。
【特許文献１】韓国特許第０２７８８１９号明細書
【非特許文献１】キムヒョンウク著、「葯特異遺伝子分離及びそのプロモータを用いた雄性不稔の誘起」、ソウル大博士学位論文
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、雄性不稔を誘発する遺伝子を導入するときに有用に使用できる、組織特異性及び時期特異性の高い花粉特異的遺伝子発現新規プロモータを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記花粉特異的遺伝子発現新規プロモータを含んだ組み換えベクター及びこれにより形質転換された植物細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、（ａ）配列番号１の塩基配列、または（ｂ）配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、シロイヌナズナから分離した、花粉特異的遺伝子発現を誘導することが可能なプロモータを提供する。
【００１５】
本発明者は、研究によって、シロイヌナズナで花粉にのみ特異的に発現される遺伝子（ＴＡＩＲ第ａｔ４ｇ２９４７０号）を推定し、その遺伝子の花粉特異的発現を確認した（図１参照）。この遺伝子のプロモータが、花粉特異的な遺伝子が発現されるように調節しているものと結論を下し、この遺伝子のプロモータと推定される塩基配列を分離し、これを確認した（図２参照）。
【００１６】
本発明に係る花粉特異的なプロモータにレポーター遺伝子「ＧＵＳ」を融合させて発現様相を調査した結果、成熟した花粉でのみＧＵＳ遺伝子が発現されることを確認した（図５参照）。
【００１７】
したがって、前記シロイヌナズナから分離した本発明に係る新規のプロモータは、成熟した花粉にのみ特異的に遺伝子発現を誘導することができて組織特異性及び時期特性に非常に優れるため、雄性不稔植物の生産に非常に有用に利用できる。
【００１８】
前記配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する配列とは、図２（配列番号１）に示した塩基配列と若干の配列変異を有するが配列機能が同一であって、外来遺伝子の花粉特異的発現を誘導することが可能な塩基配列をいう。前記配列変異は、一つまたは複数の塩基が欠失、置換、または付加された場合などを意味する。
【００１９】
また、本発明は、（ａ）配列番号１の塩基配列、または（ｂ）配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、花粉特異的遺伝子発現を誘導することが可能な、シロイヌナズナから分離したプロモータ、前記プロモータに作動可能に連結された外来遺伝子を含む組み換えベクター、及び前記組み換えベクターによって形質転換された植物細胞を提供する。
【００２０】
前記外来遺伝子は、前記プロモータの発現を確認することが可能なレポーター遺伝子など目的に応じて様々な遺伝子が連結できるが、雄性不稔植物を製造するためには、花粉の稔性を低下させることが可能な外来遺伝子を連結させることができる。
【００２１】
上述した特徴の本発明に係る花粉特異的発現プロモータを用いると、外来遺伝子が所望の組織（花粉）でのみ、且つ所望の時期（花粉が成熟したとき）にのみ発現されるようにすることができる。したがって、植物の発生周期において発現時期などの発現特性の調節を向上させることができるため、外来遺伝子が、所望しない他の植物器官または組織で或いは所望しない時期に発現して発生するおそれのある問題点を防止することができる。
【００２２】
また、本発明に係る花粉特異的発現プロモータに、花粉稔性を低下させることが可能な外来遺伝子を作動可能に連結させた後、植物細胞に導入させて前記遺伝子を花粉特異的に発現させることにより花粉の発達を人為的に抑制することができる。したがって、蔬菜類の一代雑種種子の生産に利用可能な雄性不稔作物を容易に作ることができる。
【００２３】
前記花粉稔性を低下させることが可能な外来遺伝子としては、たとえばジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)から由来したＤＴｘ−Ａ遺伝子のような細胞毒素遺伝子を用いることができるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明に係る塩基配列を含む組み換えベクターを製造し、この組み換えベクターを植物細胞内に導入させるために、本発明の属する分野で通常の知識を有する者に知られている様々な技術を用いることができる（参考文献：Clough SJ and Bent AF, 1998. Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43）。例えば、アグロバクテリウム−媒介形質転換を用いることができる。
【００２５】
また、本発明は、配列番号１の塩基配列を含むプロモータのＤＮＡ断片を増幅するための、配列番号４及び配列番号５で表示されるＰＣＲ用プライマーを提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係るプロモータは、成熟した花粉にのみ特異的に遺伝子を発現させる組織特異性及び時期特異性の非常に高いプロモータなので、これを用いると、優れた品種の特性をそのまま保ちながら雄性不稔を誘導することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。これらの実施例が、本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明を限定するものではないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者には自明である。
【実施例】
【００２８】
〔実施例１．推定ホスホリパーゼ(putative phospholipase)の発見〕
本発明者らは、植物では最初にカーネーションから推定ホスホリパーゼ(secretory putative phospholipase：ｓＰＬＳＡ２)をクローニングして報告したことがある。植物体におけるホスホリパーゼの役割については明らかになったことが殆どなく、研究初期段階と言える。但し、ホスホリパーゼが他の組織に比べて成熟した花組織で多量に発見され、花の組織において重要な役割をするものと推定されている。
【００２９】
これに基づき、出願人は、カーネーションから発見した推定ホスホリパーゼ(putative phospholipase)の塩基配列と定向性(ortholog)の遺伝子をシロイヌナズナから見出すために、ＴＡＩＲ(The Arabidopsis Information Resource)サイトに開示されたシロイヌナズナ配列データベースをカーネーションの推定ホスホリパーゼ遺伝子の塩基配列と比較調査した。その結果、推定ホスホリパーゼと推定される遺伝子をシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana ‘Col-O’ genome)から見出すことができた（ＴＡＩＲ第ａｔ４ｇ２９４７０号）。本遺伝子ａｔ４ｇ２９４７０はシロイヌナズナの４番染色体に存在するものと確認された。
【００３０】
〔実施例２．シロイヌナズナでＲＴ−ＰＣＲを用いたターゲット遺伝子（ＴＡＩＲ第ａｔ４ｇ２９４７０号）の組織別発現分析〕
ＴＡＩＲサイトで推定された推定ホスホリパーゼ遺伝子のＯＲＦ(open reading frame)が実際シロイヌナズナで転写されるかを調べるためにＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００３１】
ＲＴ−ＰＣＲに用いる標準ｃＤＮＡを合成するために、ヌクレオスピンＲＮＡプラントキット(Nucleospin RNA plant kit, Macherey-Nagel)を用いて、シロイヌナズナ(Arabidopsis thalina ecotype Columbia)の各組織、すなわち花(flower)、茎生葉(cauline leaves)、根生葉(rosette leaves)、茎(stem/inflorescences)、根(root)の全体ＲＮＡ(total RNA)を抽出した。
【００３２】
定量した全体ＲＮＡ４μｇと１０ｍＭのそれぞれｄＮＴＰ、１００Ｍのランダムデカマー(random decamer)とヌクレアーゼのない(nuclease-free)蒸留水(D.W)をよく混ぜた後、６５℃で５分間処理してチューブを氷に移し、その後ＲＴ−ＰＣＲバッファ(buffer)、ＲＮａｓｅ阻害剤(RNase inhibitor)、０.１Ｍ ＤＴＴを添加して４２℃で２分間処理した。
【００３３】
さらに氷に移した後、逆転写酵素(reverse transcriptase)２００ユニットを入れて４２℃で１時間処理した。この生成物を７０℃で１５分間不活性化させて組織別ｃＤＮＡプール(pool)を作り、このｃＤＮＡプールをＲＴ−ＰＣＲの鋳型(template)として使用した。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲに用いられたプライマーは、ＴＡＩＲサイトの塩基配列に基づいて遺伝子のエキソン(exon)連結部位で合成した。ＲＴ−ＰＣＲに用いられたターゲット遺伝子特異プライマーは、表１に具体的に示されている。
【００３５】
【表１】
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内的対照群(Internal control)として、１８Ｓ ｒＲＮＡ(Ambion)を使用し、ポリメーラゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は９５℃で１分間二重螺旋分離(変性、Denaturing)、３０秒間プライマー結合(Annealing)、７３℃で１分間重合反応(polymerizing)、そして７３℃で１０分間伸長(elongation)の条件で３５周期(cycle)を行った。プライマー結合の温度は、６４℃から５８℃まで５周期毎に２℃ずつ減少させ、５８℃で２０周期を行った。ターゲット遺伝子に該当する２５３塩基対(base pair)のＡｔｓＰＬＡ２−δ断片と内的対照群に該当する３１５塩基対の１８ｓ ｒＲＮＡ断片を一つの反応で同時に増幅したが、図１に示すように、他の組織ではターゲット遺伝子が発現されず、花でのみ発現されることを観察することができた。これはターゲット遺伝子が花のような組織で特定の役割を果たすことができることを暗示する。
【００３６】
〔実施例３．シロイヌナズナからのＡｔｓＰＬＡ２−δ遺伝子のクローニング〕
逆転写酵素(Superscript ＩＩTM reverse transcriptase, Invitrogen)と遺伝子重合酵素(Pyrobest（登録商標） DNA polymerase, TaKaRa)、そして２つの前記遺伝子特異プライマー(表１)を用いたＲＴ−ＰＣＲを行い、シロイヌナズナの成熟した花から分離した全体ＲＮＡを鋳型としてＡｔ４ｇ２９４７０遺伝子の断片を増幅した。
【００３７】
全体遺伝子塩基配列を含むｃＤＮＡは、MarathonTM cDNA Amplification Kit(Clontech)を用いてＲＡＣＥ(Rapid Amplification of cDNA Ends)技法で増幅し、転写体の５′末端は変形されたプライマー拡張方法であるｃＲＡＣＥ技法で確認した（Ｍａｒｕｙａｍａの外、１９９５）。全体Ａｔ４ｇ２９４７０のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ(Invitrogen)ベクターにクローニングしてＸＬ１−Ｂｌｕｅ菌株(Stratagene)に導入した。
【００３８】
この遺伝子をクローニングして正確なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)ジンバンク(GenBank)データベースに登録させ（ＮＣＢＩ承認番号第ＡＹ１４８３４７号）、シロイヌナズナの分泌性ホスホリパーゼ(Arabidopsis secretory PLA2-delta[ＡｔｓＰＬＡ２δ])と命名した。
【００３９】
〔実施例４．花粉特異的発現遺伝子（ＴＡＩＲ第ａｔ４ｇ２９４７０号）のプロモータ塩基配列の確認〕
ＲＴ−ＰＣＲの結果、前記遺伝子のプロモータが、花でのみ特異的に遺伝子が発現されるように調節しているものと結論を下した。前記遺伝子（ａｔ４ｇ２９４７０）の前部にある遺伝子（ａｔ４ｇ２９４８０）の３′ＵＴＲ(untranslated region)から前記遺伝子（ａｔ４ｇ２９４７０）の開始部分（ＡＴＧ）まで５５０塩基対をこの遺伝子のプロモータ部位と推定した。
【００４０】
まず、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、両末端にＨｉｎｄＩＩＩ（５′末端）とＢａｍＨＩ（３′末端）サイトを含んでいる配列番号４及び配列番号５で表示されるプライマーを合成した（表２参照）。前記ｇＤＮＡを鋳型として、合成した前記プライマーと校正(proofreading)機能を有するＤＮＡ重合酵素（ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）、ＴＡＫＡＲＡ）を用いてタッチダウン(touch-down)ＰＣＲ方法でプロモータ部位を増幅した。
【００４１】
【表２】
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ＰＣＲで得た産物の末端を各制限酵素で切った後、ｐＢＩ１０１ベクターにクローニングした。このクローンをシーケンシング(sequencing)した結果、正確な塩基配列がクローニングされたことを確認することができた（図２参照）。
【００４２】
このプロモータの塩基配列を植物遺伝子の発現制御領域の塩基配列モチーフのデータベース(Plant cis-acting regulatory DNA element database)であるＰＬＡＣＥ(http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE)とプラントケア(http://sphinx.rug.ac.be:8080/PlantCARE)を用いて重複的に比較した結果、花粉特異的発現を誘導する要素(element)が多数箇所に存在することを観察することができた（図２参照）。
【００４３】
〔実施例５．ＡｔｓＰＬＡ２−δプロモータの組織別及び時期別発現様相の確認〕
ターゲットプロモータクローニングに用いたｐＢＩ１０１ベクターは、レフトボーダ(left border)とライトボーダ(right border)との間にＧＵＳ(β-glucuronidase)レポーター遺伝子を持っており、形質転換させることが可能なバイナリーベクター(binary vector)である（図３参照）。図４は本発明に係るＡｔｓＰＬＡ２−δプロモータ、レポーター遺伝子「ＧＵＳ」及びＮｏｓ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む遺伝子発現カセットの塩基配列（配列番号６）を示す図である（ライン当り７５ヌクレオチド）。図４中、
１．第１「ＡＴＧ」はＡｔｓＰＬＡ２−δ遺伝子の開始コドン(start codon)である。
２．第２「ａｔｇ」はＧＵＳ遺伝子の開始コドンである。
３．第２「ｔｇａ」はＧＵＳ遺伝子の終結コドン(stop codon)である。
４．使用された制限酵素サイトには下線が付いている。
５．ＡｔｓＰＬＡ２−δプロモータの塩基配列は大文字で表示される。
６．ＧＵＳ遺伝子の塩基配列は小文字で表示される。
７．Ｎｏｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒの塩基配列は斜体で表示される。
このベクター(promoter::GUS binary vector)をアグロバクテリウム(Agrobacterium、ＧＶ３１０１)にフリーズソーメッソド(freeze thaw method)によって形質変換させた後、花浸漬(flower dipping)方法でシクロイヌナズナを形質転換させた。
【００４４】
形質転換させたシクロイヌナズナを３回にわたって選抜(screening)して２６個の独立的なＴ３系統を確保することができた。ＧＵＳ(β−glucuronidase)は特定の基質（Ｘ−ＧｌｃＡ）を分解させて青色を示すようにするので、ＧＵＳ遺伝子の導入された植物体をＸ−ＧｌｃＡ溶液に浸しておければ、この遺伝子が発現される組織でのみ青色を呈する。
【００４５】
このような特徴を有するＧＵＳ遺伝子に基づき、ＧＵＳの組織別染色をＸ−Ｇｌｕｃ溶液[1mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-glucuronide, 10mM Na2EDTA, 0.5mM K3Fe(CN)6, 0.5mM K4Fe(CN)6, 0.1% Triton X-100, 100mM potassium Phosphate buffer, pH7.0]で３７℃にて一日間処理した。染色後、組織内に含まれた葉緑素を一連のアルコール（５０％、７０％、８０％、９０％及び１００％）でそれぞれ２０〜３０分間処理して除去し、顕微鏡（ＳＺ４０４５ＴＲＰＴマイクロスコープ、ＯＬＹＭＰＵＳ）で観察した。
【００４６】
ＡｔｓＰＬＡ２−δの発現様相を観察したところ、たとえ一部の独立的形質転換体の他の組織で無視できる程度の点状「ＧＵＳ」が見られたが、大部分の形質転換体では花粉でのみ発現されることを観察することができた（図５参照）。図５の上段に、花の発達段階を示す(Smyth et al., 1990)。Ａの矢じり形のものは花粉が黄色に変わる初期段階の花を示す。ＣＰはカロース栓（Callose Plug）を示す。
【００４７】
花が発達するにつれてＧＵＳの発現度合いが増加し、花粉嚢(pollen sac)に少し転移されるようであったが、本遺伝子の発現時点と花粉が黄色に変わる時点は若干異なるようであった。
【００４８】
花粉嚢に転移されたＧＵＳは、花粉嚢構成細胞の枯死と共に発現量が減少した。一方、ＡｔｓＰＬＡ２−δの発現は分離された花粉で強力な発現を維持し（図５（ａ）〜図５（ｄ）参照）、しかも発芽した花粉管にも拡大された（図５（ｅ）〜図５（ｆ）参照）。
【００４９】
このような結果は、ＡｔｓＰＬＡ２−δが花粉の発達と花粉管の伸長に重要な役割をすることを暗示する。したがって、本遺伝子のプロモータは、成熟した花粉で特定の遺伝子を発現させるように調節する作用をして、組織特異性及び時期特異性に非常に優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明で発見された花粉特異的発現調節プロモータは、雄性不稔を用いた雑種種子の生産に有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明に係る花粉特異的遺伝子発現プロモータによって発現される遺伝子の転写発現様相を示す図である。
【図２】本発明に係る花粉特異的遺伝子発現プロモータの全体塩基配列を示す図である。
【図３】本発明に係る花粉特異的遺伝子発現プロモータのクローニングに使用されるｐＢＩ１０１ベクターの 遺伝子発現カセットを示す図である。
【図４】本発明に係るＡｔｓＰＬＡ２−δプロモータ、レポーター遺伝子「ＧＵＳ」及びＮｏｓ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを含む遺伝子発現カセットの塩基配列を示す図である。
【図５】本発明に係る花粉特異的遺伝子発現プロモータにレポーター遺伝子「ＧＵＳ」を融合させて発現様相を観察した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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