(57)【要約】    【課題】  ＰＣＲ産物を二本鎖のまま特異的に検出しうる測定系を開発し、標的核酸を特異的に検出する方法を提供すること。    【解決手段】  検体中の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）プライマー対を用いて検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させ、ここで、前記プライマー対は、前記標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されており、そして（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて工程（ａ）で得られたＰＣＲ増幅産物を検出するの各工程を含む方法が開示される。ジンクフィンガー蛋白質としては、例えば配列５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’を認識するＺｉｆ２６８を用いることができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）プライマー対を用いて検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させ、ここで、前記プライマー対は、前記標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されており、そして
（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて工程（ａ）で得られたＰＣＲ増幅産物を検出する
の各工程を含む方法。
【請求項２】
ジンクフィンガー蛋白質が検出可能な標識により標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ジンクフィンガー蛋白質が担体上に固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ジンクフィンガー蛋白質がファージ上に提示される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８であり、ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’である、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸がSalmonella typhimuriumのｇｙｒＢ遺伝子である、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
検体中の標的核酸を検出するためのキットであって、前記標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含むキット。
【請求項８】
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をさらに含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
ジンクフィンガー蛋白質がファージ上に提示された形で提供される、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ジンクフィンガー蛋白質が担体上に固定化されている、請求項８記載のキット。
【請求項１１】
前記ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項７記載のキット。
【請求項１２】
ジンクフィンガー蛋白質がＺｉｆ２６８であり、ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’である、請求項７−１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
前記標的核酸がSalmonella typhimuriumのｇｙｒＢ遺伝子である、請求項７−１１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的とする遺伝子またはその中の特定の領域を検出するためには、ＰＣＲ法によりこの遺伝子または領域を増幅させた後に、ハイブリダイゼーションによりＰＣＲ増幅産物を検出する方法が一般に用いられている。ハイブリダイゼーションにより検出するためには、二本鎖であるＰＣＲ増幅産物を変性させて一本鎖とした後に、プローブＤＮＡとハイブリダイズさせる必要がある。しかし、ＰＣＲ増幅産物どうしが互いに相補鎖と塩基対を形成する確率が高いため、プローブＤＮＡのハイブリダイゼーション効率が低いこと、および、一旦解離した一本鎖が再び元の二本鎖に戻ってしまうためにハイブリダイゼーション効率が悪いという問題点があった。したがって、ＰＣＲ増幅産物を二本鎖のまま検出する方法が求められている。
【０００３】
二本鎖ＤＮＡを変性させずに分析する方法としては、支持体上に固定された二本鎖ＤＮＡ認識物質を用いて、検体中の二本鎖ＤＮＡを分析する方法が開示されている（特開２００２−１２５７００）。この方法は、二本鎖ＤＮＡ認識物質と検体中の二本鎖ＤＮＡとを結合させ、結合した二本鎖をインターカレーター、抗ＤＮＡ抗体、ＤＮＡ転写因子等を用いて検出することを特徴とする。しかし、この方法によっては、存在する二本鎖ＤＮＡの量を測定することは可能であっても、標的とする核酸を特異的に検出することは困難である。すなわち、インターカレーターまたは抗ＤＮＡ抗体を用いて検出する場合には塩基配列の選択性がほとんど得られず、ＤＮＡ転写因子を用いて検出する場合には、認識配列の長さが短いため特異性の高い検出を行うことができない。
【特許文献１】特開２００２−１２５７００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＰＣＲ産物を二本鎖のまま特異的に検出しうる測定系を開発し、標的核酸を特異的に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、検体中の標的核酸を検出する方法を提供する。該方法は、
（ａ）プライマー対を用いて検体中の核酸をＰＣＲ反応により増幅させ、ここで、該プライマー対は、該標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されており、そして、
（ｂ）ジンクフィンガー蛋白質を用いて工程（ａ）で得られたＰＣＲ増幅産物を検出する、
の各工程を含むことを特徴とする。
【０００６】
好ましくは、ジンクフィンガー蛋白質はＺｉｆ２６８であり、ジンクフィンガー蛋白質認識配列が５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’である。また好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は検出可能な標識により標識されている。別の好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質はファージ上に提示される。また別の好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は担体上に固定化されている。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、検体中の標的核酸を検出するためのキットを提供する。該キットは、該標的核酸中に存在するジンクフィンガー蛋白質認識配列がＰＣＲ反応により増幅されるよう設計されたプライマー対を含むことを特徴とする。好ましくは、該キットは、ジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質、あるいはジンクフィンガー蛋白質認識配列に結合しうるジンクフィンガー蛋白質をコードする遺伝子をさらに含む。
【０００８】
本発明にしたがえば、ジンクフィンガー蛋白質は二本鎖に結合するため、ＰＣＲ増幅産物を変性させて一本鎖に解離させる必要がないため、より迅速な測定法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ジンクフィンガー蛋白質とは、ＤＮＡ配列に特異的に結合しうるジンクフィンガーモチーフを有する蛋白質であり、これまでに数百種類以上のジンクフィンガー蛋白質が同定されている。ジンクフィンガーモチーフは、典型的には２個のシステイン残基と２個のヒスチジン残基を含む長さ約３０アミノ酸のモチーフであり、逆平衡二本鎖β構造とαヘリックスから構成され、これらの４個の残基が亜鉛イオンに配位している立体構造を有している。ジンクフィンガーモチーフは特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡと特異的に結合することができる。例えば、マウス由来のジンクフィンガー蛋白質であるＺｉｆ２６８は、３連のジンクフィンガーモチーフを有し、５’−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３’の９個の連続するＤＮＡ配列を認識してこれに特異的に結合することができる。結合に際しては標的とする二本鎖ＤＮＡの主溝にαヘリックス部位を挿入するため、ジンクフィンガー蛋白質が認識するＤＮＡの配列は、ジンクフィンガー蛋白質のαヘリックスのアミノ酸配列により決定される。これまでに、それぞれ独特のＤＮＡ配列を認識する数千種類のジンクフィンガーモチーフが同定されている。αヘリックスのアミノ酸配列と認識されるＤＮＡ配列との関係をより詳細に解明することにより、目的とする特定のＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガー配列を設計することも可能となると考えられる。また、ファージディスプレイにより作製したジンクフィンガーペプチドのライブラリを用いて、目的とする特定のＤＮＡ配列を認識しうるジンクフィンガー配列を選択する方法が知られている。
【００１０】
本発明は、このようなジンクフィンガー蛋白質を用いて、標的とする二本鎖ＤＮＡを特異性をもって検出することを特徴とする。
【００１１】
本発明の方法においては、標的核酸中のジンクフィンガー蛋白質により認識される配列を増幅しうるよう設計されたプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行い、ジンクフィンガー蛋白質を用いてＰＣＲ増幅産物中のジンクフィンガー蛋白質認識配列を検出する。ジンクフィンガー蛋白質により認識される配列は、その長さが比較的短いため配列の出現頻度が高く、目的とする標的核酸配列中のみならず、検体中に存在しうる他の核酸中にも多数見いだされることが予測される。例えば、Ｚｉｆ２６８により認識される配列は９個の連続するヌクレオチドからなり、このような配列は約２６万塩基に１個の確率で存在する。したがって、検出の特異性を高めるためには、ジンクフィンガー蛋白質認識配列の周囲の配列についての広範囲な検索を行って、適切なＰＣＲプライマーを設計する必要がある。
【００１２】
ＰＣＲプライマーは、ジンクフィンガー蛋白質により認識される配列を含む配列領域が特異的に増幅されるように設計する。このためには、まず検出すべき生物（例えば、微生物、細菌、ウイルスなど）のゲノム配列中のジンクフィンガー認識配列を検索する。例えば、ジンクフィンガー蛋白質としてＺｉｆ２６８を用いる場合には、その認識配列であるＧＣＧＴＧＧＧＣＧを含む遺伝子を同定する。次に、この認識配列の５’側および３’側の配列に基づいて、認識配列を増幅しうるプライマー対を選択する。プライマーの長さは、好ましくは１２−３０ヌクレオチド、より好ましくは１５−２５ヌクレオチドである。さらに、プライマーの選択においては、各プライマーが、分子内に二次構造を形成せず、融解温度がＰＣＲ反応に適した温度（例えば約５８−６３℃の範囲内）である等の、当該技術分野において知られるプライマー選定の基準も考慮すべきである。各プライマーとジンクフィンガー認識配列の間の距離は任意に選択することができ、ジンクフィンガー認識配列の５’側と３’側とでプライマーとの距離が同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、プライマーとジンクフィンガー認識配列との距離は０から５００ｂｐであり、より好ましくは０から３００ｂｐである。距離が０であるとは、後述の実施例において例示されるように、ジンクフィンガー認識配列に隣接してプライマーが配置されることを意味する。この距離が長いほど検出の特異性は高くなるが、検体中の核酸が分解・切断されていると検出されないため、糞便や生検組織切片を検体として用いる場合には、１５０ｂｐより短いことが好ましい。次に、ＰＣＲにより増幅される配列、すなわち、両方のプライマーとジンクフィンガー認識配列とを含む配列について、検体中に存在する可能性のある他の核酸中にこれと相同な配列が存在しないことを確認する。このことにより、標的核酸のみが特異的に検出されるようにすることができる。
【００１３】
このようにして設計されたプライマー対の各オリゴヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製  Model 394）を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られる他の方法のいずれかを用いて合成してもよい。
【００１４】
本発明の方法の１つの好ましい用途は、特定の細菌を近縁の細菌と区別して検出することである。例えば、Salmonella typhimuriumは、食中毒の原因菌として問題となるサルモネラの一種であり、食中毒の診断および予防のために、この細菌を他の細菌と区別して検出する必要がある。これまで、検出方法としては、制限培地による培養とその形態学的観察、血清学的検査、特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ増幅とハイブリダイゼーションとの組み合わせが用いられてきた。後述の実施例に詳細に説明されるように、本発明にしたがえば、Salmonella typhimuriumを他の細菌と区別して特異的に検出することができる。Salmonella typhimuriumを特異的に検出するためのＰＣＲ増幅の標的配列として好ましいものの１例は、ｇｙｒＢ遺伝子中のジンクフィンガー認識配列である。ｇｙｒＢはＤＮＡジャイレース（ＩＩ型トポイソメラーゼ）のβサブユニットをコードする遺伝子である。この遺伝子は様々な微生物に普遍的に存在し、かつほとんどの微生物についてその配列が明らかにされている。さらに、進化速度が早く各微生物で配列が異なり、トランスポゾンのように水平伝搬するものではないため種特異的である、という特徴を有するため、微生物の同定の指標として使用されている。したがって、このｇｙｒＢは、本発明においてジンクフィンガー蛋白質による検出の標的として用いるのに好適である。
【００１５】
本発明において用いられるジンクフィンガー蛋白質としては、認識部位が明らかにされている既知のいずれのジンクフィンガー蛋白質を用いてもよく、あるいは所望の認識部位を有するよう遺伝子工学的に改変されているジンクフィンガー蛋白質を用いてもよい。当該技術分野においては、ジンクフィンガー蛋白質の認識配列を変更する種々の方法が試みられている。ジンクフィンガー蛋白質は、適当な宿主中で組換え蛋白質として発現させてもよい。あるいは、ジンクフィンガー蛋白質は、組換えファージ中で発現させてファージ上に提示させることができる。このことにより、組換えジンクフィンガー蛋白質を精製することなく利用することができ、ファージに対する抗体を用いてジンクフィンガー蛋白質を容易に検出することができる。このようなファージディスプレイの手法は当該技術分野においてよく知られており、また、本明細書の実施例においても詳細に記載されている。
【００１６】
好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は検出可能な標識により標識されていてもよい。このことにより、PCR増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質を容易に検出することができる。このような標識としては、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、酵素標識等が挙げられる。ジンクフィンガー蛋白質は、検出可能な標識ポリペプチドとの融合蛋白質として製造してもよい。
【００１７】
また別の好ましい態様においては、ジンクフィンガー蛋白質は適当な担体上に固定化して用いられる。固定化ジンクフィンガー蛋白質に上述のＰＣＲ増幅産物を結合させ、結合した二本鎖ＤＮＡの量を測定することにより、標識核酸を検出することができる。このような態様においては、ＰＣＲ増幅産物が検出可能なように標識されていることが好ましい。
【００１８】
本発明の方法においては、まず試験すべきサンプルからＤＮＡを調製する。サンプルとしては、菌体の培養物、検査すべき農産物および食品、ならびに検査すべき動物およびヒトからの組織、体液、血液、糞便などを用いることができる。このようなサンプルからＤＮＡを調製する手法は当該技術分野においてよく知られている。あるいは、試験すべきサンプルからＲＮＡを調製し、定法によりｃＤＮＡを合成してもよい。次に、得られたＤＮＡをテンプレートとして、上述のプライマー対および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ増幅の条件および方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００１９】
次の工程においては、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物とジンクフィンガー蛋白質とを接触させ、ジンクフィンガー蛋白質が結合するか否かを検出する。ファージ上に提示されたジンクフィンガー蛋白質を用いる場合には、このファージに特異的な抗体を用いるＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。すなわち、適切に標識された抗ファージ抗体を結合させ、未結合抗体を洗浄除去した後に、酵素反応、蛍光反応などにより標識の量を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。あるいは、ファージを利用しない系を用いる場合には、共有結合または融合蛋白質等の手法により適切に標識したジンクフィンガー蛋白質を用いて、この標識の量を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物に結合したジンクフィンガー蛋白質の存在または量を測定することができる。あるいはＰＣＲ増幅産物を標識し、これとジンクフィンガー蛋白質との結合を検出することも可能である。このような標識は、ＰＣＲ反応に用いるプライマー対をあらかじめ標識しておくか、またはＰＣＲ増幅反応中に標識ヌクレオチドを取り込ませることにより行うことができる。標識の方法は当該技術分野においてよく知られており、標識としては、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン等のアフィニティー標識等を用いることができる。あるいは、インターカレーター法や蛍光偏光法を用いてジンクフィンガー蛋白質に結合した二本鎖ＤＮＡを検出してもよい。
【００２０】
本発明の方法にしたがえば、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖の変性工程を必要としないため、標的核酸を高い感度および高い特異性で簡便に検出することができる。
【００２１】
以下に、Salmonella typhimuriumの検出を例として、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
ジンクフィンガー提示Ｍ１３ファージ溶液の調製
ジンクフィンガー蛋白質としてはＺｉｆ２６８の変異体であるＺｉｆＭを用いた。ＺｉｆＭは、Ｚｉｆ２６８にＳｐｈＩ、ＢｓｉＷＩ部位を導入したものであり、アミノ酸配列および標的認識配列はＺｉｆ２６８と同じである。
【００２３】
ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７溶液は、以下のようにして調製した。大腸菌ＴＧ１を６ｍｌのＬＢ培地で３７℃でＯＤ＝０．５まで培養した。その後、３７℃で３０分間ゆっくり振盪しながら培養し、少量のヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を加え、３７℃で４−６時間培養した。これを１ｍｌずつに分け、室温で１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を採種した。これをヘルパーファージＭ１３ＫＯ７溶液とした。
【００２４】
ＺｉｆＭ遺伝子をコードするプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ−ＺｉｆＭ（ｐＣＡＮＴＡＢにコードされるgIIIタンパク質のN末端に存在する制限酵素サイトＳｐｈＩ、ＢｓｉＷＩの間にＺｉｆＭをコードする遺伝子を挿入することにより作製した）で大腸菌ＴＧ１を形質転換し、１０ｍｌの２ＹＴ培地×４でＯＤ＝０．５となるまで３７℃で振盪培養した。これに上述のヘルパーファージＭ１３ＫＯ７溶液を２００μｌずつ加え、３７℃で１時間振盪培養し、１０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、ペレットを得た。これを３０ｍｌの２ＹＴ培地（終濃度９０μＭＺｎＳＯ４、５ｍＭＤＴＴ、Ａｍｐ５０μｇ／ｍｌ）に懸濁し、３０℃で１８時間以上振盪培養した。これを２５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上清を得て、さらに３５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清に１／４量の５０％ＰＥＧ８０００を添加し、泡立てないように十分に撹拌し、２−３時間氷中で静置した。その後、１６５００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌのＰＢＳバッファー（９０μＭＺｎＳＯ4、５ｍＭＤＴＴを含む）に懸濁した。以上のようにしてＺｉｆＭ提示Ｍ１３ファージ溶液を得た。
【実施例２】
【００２５】
ジンクフィンガーの標的２本鎖ＤＮＡへの結合能の確認
標的および対照の二本鎖ＤＮＡの配列は以下のものを用いた（Ｂｉｏ＝ビオチン、下線はジンクフィンガー蛋白質認識配列）。
標的二本鎖ＤＮＡ
268-bio   5'-Bio-GATCCTGACTGT GCG TGG GCG GAGTGA-3'
268-C                  3'-TGACA CGC ACC CGC CTCACTAG-5'
1塩基変異二本鎖DNA
mut-bio   5'-Bio-GATCCTGACTGA GCG TTG GCG CAGTGA-3'
mut-c                  3'-TGACT CGC AAC CGC GTCACTAG-5'
ランダム変異二本鎖DNA
ran-bio   5'-Bio-GATCCTGACTGT ACT GAG CCT CAGTGA-3'
ran-c                  3'-TGACA TGA CTC GGA GTCACTAG-5'
【００２６】
５’末端をビオチンラベルした一本鎖ＤＮＡ（終濃度４ｐｍｏｌ／μｌ）、その相補鎖ＤＮＡ（終濃度６ｐｍｏｌ／μｌ）、およびＮａＣｌ（終濃度５０ｍＭ）を滅菌水に溶解した。プログラムテンプコントロールシステムを用いて９５℃から２５℃まで除冷し、二本鎖ＤＮＡを調製した。
【００２７】
ＥＬＩＳＡを用いて、調製したＺｉｆＭ提示Ｍ１３ファージ溶液がこの二本鎖ＤＮＡに結合するか否かを調べた。１５０μMのビオチン標識二本鎖ＤＮＡ溶液と４５０μｌの洗浄バッファー２（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，２６．８ｍＭ  ＫＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，１．４７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．４）を混合し、これを１００μｌずつストレプトアビジンコートマイクロタイタープレートのウエルに添加し、室温で２時間インキュベートして、二本鎖ＤＮＡを固定化した。２００μｌのＺｉｆＭ提示Ｍ１３ファージ溶液と、２００μｌの洗浄バッファー２を混合したものを、１００μｌ／ウエルで添加し、室温で２時間インキュベートした。２００μｌ／ウエルの洗浄バッファー１（９０μＭ  ＺｎＳＯ4，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４））で４回、２００μｌ／ウエルの洗浄バッファー２で２回洗浄し、４μｌの抗Ｍ１３抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（抗Ｍ１３ＨＲＰ）を３．２ｍｌのブロッキングバッファー（９０μＭ  ＺｎＳＯ4，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，２％スキムミルクを含むＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４））に加え、２００μｌ／ウエルでプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。次に２００μｌ／ウエルの洗浄バッファー１で４回、２００μｌ／ウエルの洗浄バッファー２で２回洗浄し、１００ｍｌのＡＢＴＳ溶液と２００μｌの過酸化水素水を混合したものを２００μｌ／ウエルで添加し、２０分後にマイクロプレートリーダーｍｏｄｅｌ５５０（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、各ウエルの４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】
標的二本鎖ＤＮＡを用いた場合、１塩基変異またはランダム変異二本鎖ＤＮＡと比較して有意に吸光度が高かった。このことは、Ｍ１３ファージにＺｉｆＭが提示されていること、およびＺｉｆＭ提示Ｍ１３ファージが標的ＤＮＡに結合する能力を有することを示す。
【実施例３】
【００２９】
Salmonella typhimuriumゲノム中のＺｉｆ２６８結合標的部位の選択
まず、ＢＬＡＳＴにより、S.typhimuriumのゲノム中からＺｉｆ２６８結合部位であるｇｃｇｔｇｇｇｃｇの９塩基の配列を検索した。S.typhimuriumのゲノム配列は先の報告にしたがった（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＥ００８８７８，ＡＥ００６４６８；McClelland et al., Nature 413(6858), 852-856 (2001)）。次に、この９塩基配列の５’側および３’側のそれぞれ２０塩基をプライマー領域として含む連続する４９塩基配列についてＢＬＡＳＴで検索し、他の細菌が類似した配列を有するか否かを調べた。さらに、その遺伝子の比較対照となる他の遺伝子配列の多さ、進化速度、水平移動能の有無、などを基準として、標的とすべき遺伝子を選択した。
【００３０】
このようにしてSalmonella typhimuriumのgyrBを標的遺伝子として選択した。gyrBはＤＮＡジャイレース（ＩＩ型トポイソメラーゼ）のβサブユニットをコードする遺伝子である。ほとんどの細菌がこの遺伝子を有しており、そのヌクレオチド配列は種特異的である。その配列は現在、16S rRNAと同じく種の同定に用いられている。Zif268の標的配列はgyrB遺伝子のN末端に存在する。図１は、種々のSalmonella 属の細菌のgyrB配列のN末端７０ｋｂの領域のアライメントの結果を示す。gyrB配列が非常によく保存された配列であることがわかる。Salmonella typhi以外ではZif268の結合領域に変異はなく、プライマー領域も良く保存されていることから、この領域の配列を標的とすることによってほとんどのSalmonella 属の細菌を検出することができると考えられる。
【００３１】
この配列を、食中毒原因菌として検出される代表的な細菌のgyrBと比較した（図２）。Salmonella以外のgyrBにはＺｉｆ２６８標的配列中に多くの変異が存在するため、Ｚｉｆ２６８はほとんど結合しないと予測される。また、プライマー領域にも多くの変異が存在し、ＰＣＲにより増幅されにくい。これらのことから、S.typhimurium gyrBを標的とすることにより、他の食中毒菌群の中からSalmonella 属の細菌のみを特異的に検出することが可能であると考えられる。
【００３２】
図３は、Salmonella typhimuriumのgyrBとCitrobacter属のgyrBとのアライメントを示す。Citrobacter属の細菌は、生化学的方法や免疫学的方法によるSalmonella検出の際に擬陽性を示すことで知られる。Citrobacter属の配列においては、プライマー領域、ｚｉｆ２６８結合領域ともに変異が見られるため、Citrobacter属とSalmonella属とを区別して検出することが可能であることが確認された。
【実施例４】
【００３３】
Ｚｉｆ２６８−Ｍ１３ファージによるSalmonella ＰＣＲ増幅産物の検出
Ｚｉｆ２６８が結合する連続する９塩基対の両端２０ｂｐの配列をプライマー結合部位としてプライマーを設計した。
フォワードプライマー：5'-AGTCTCCGGCGGTCTGCACG-3'
リバースプライマー：5'-CAGAGCGTTGACTACCGAGA-3'
【００３４】
Salmonella typhimuriumをＬＢ培地（１０ｇ  Ｂａｃｔｏトリプトン，５ｇ  ＮａＣｌ，１０ｇ  酵母エキス／１Ｌ）中で３７℃で一晩振とう培養を行い、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビオチン修飾プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅の条件は以下のとおりであった：９５℃６０秒間，５２℃６０秒間，７２℃６０秒間を３０サイクル。ゲル電気泳動により、目的とするビオチン標識４９ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。対照としてSalmonella enteritidisおよびE.coli DH5αのゲノムＤＮＡをテンプレートとして同様にＰＣＲ増幅を行った場合には、４９ｂｐのＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
【００３５】
次に、このようにして得られたビオチン修飾ＰＣＲ増幅産物、ならびに対照としてその一塩基変異である１塩基変異二本鎖ＤＮＡおよび標的配列を有しないランダム二本鎖ＤＮＡを、それぞれストレプトアビジンコーティングプレート上に固定化した（図４）。これらの二本鎖ＤＮＡとＺｉｆ２６８−Ｍ１３との結合を、実施例２に記載される方法にしたがって、ファージＥＬＩＳＡにより調べた。陽性対照としてはＺｉｆ２６８により認識される９塩基の合成二本鎖ＤＮＡを用いた。
【００３６】
図５に結果を示す。グラフから、gyrB PCR 産物は１塩基変異二本鎖、ランダム二本鎖と比べて高い吸光度を示し、Ｚｉｆ２６８−Ｍ１３が標的配列に特異的に結合することがわかる。すなわち、Ｚｉｆ２６８−Ｍ１３を用いてgyrB PCR 産物を特異的に検出することができることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、Salmonella typhimuriumのgyrB PCR 標的配列のヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図２】図２は、Salmonella typhimuriumのgyrBと、食中毒原因菌として検出される代表的な細菌のgyrBとのヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図３】図３は、Salmonella typhimuriumのgyrBと、Citrobacter属のgyrBとのヌクレオチド配列アライメントを示す。
【図４】図４は、ファージＥＬＩＳＡに用いた二本鎖ＤＮＡの塩基配列を示す。
【図５】図５は、ファージＥＬＩＳＡによるｇｙｒＢ遺伝子の検出を示す。
【図１】
2005052061.tif 000002
【図２】
2005052061.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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