(57)【要約】【課題】  アルギニン-X結合、リジン-X結合、チロシン-X結合、メチオニン-X結合及びグルタミン酸-X結合（但し、Ｘはアミノ酸を表す）を加水分解するセリンプロテアーゼの提供を課題とする。【解決手段】  以下のａ〜ｄの性状を有する新規なセリンプロテアーゼの発明である。ａ．ｐＨ：至適ｐＨ；7.5-11.0、安定ｐＨ範囲；4.5〜10.5ｂ．温度：至適温度;70℃、温度安定範囲10℃〜70℃ｃ．分子量：約29,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）ｄ．Ｎ末端アミノ酸からの１６残基の配列：   Ile Ile Gly Gly Ile Asp Val Ala Asn Gly Lys Phe Pro Phe Met Val【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ〜ｄの性状を有するセリンプロテアーゼ。
ａ．ｐＨ：至適ｐＨ；7.5-11.0、安定ｐＨ範囲；4.5〜10.5
ｂ．温度：至適温度;70℃、温度安定範囲10℃〜70℃
ｃ．分子量：約29,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
ｄ．Ｎ末端アミノ酸からの１６残基の配列：
Ile Ile Gly Gly Ile Asp Val Ala Asn Gly Lys Phe Pro Phe Met Val
【請求項２】
アルギニン-X結合、リジン-X結合、チロシン-X結合、メチオニン-X結合及びグルタミン酸-X結合（但し、Ｘはアミノ酸を表す）を加水分解する、請求項１記載のセリンプロテアーゼ。
【請求項３】
以下のａ〜ｌの性状を有し、且つ生育にメチオニン及びグルタミン酸を必要としない微生物を培養し、該培養物から採取することを特徴とするセリンプロテアーゼの製造方法。
ａ．形態：桿菌
ｂ．大きさ：0.7〜0.8×2.0〜3.0μm
ｃ．グラム染色性：陰性
ｄ．胞子：陰性
ｅ．運動性：陰性
ｆ．酸素に対する態度：好気性
ｇ．オキシダーゼ：陽性
ｈ．カタラーゼ：陽性
ｉ．Ｏ−Ｆテスト：陰性
ｊ．集落の色調：特徴的色素有せず又は薄い黄色系
ｋ．キノン系：Ｑ−８
ｌ．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量：70 mol％
【請求項４】
微生物がリゾバクター属に属する受託番号FERM P-16928のものである請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
セリンプロテアーゼが、以下のａ〜ｄの性状を有するものである、請求項３又は４記載の製造方法。
ａ．ｐＨ：至適ｐＨ；7.5-11.0、安定ｐＨ範囲；4.5〜10.5
ｂ．温度：至適温度;70℃、温度安定範囲10℃〜70℃
ｃ．分子量：約29,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
ｄ．Ｎ末端アミノ酸からの１６残基の配列：
Ile Ile Gly Gly Ile Asp Val Ala Asn Gly Lys Phe Pro Phe Met Val
【請求項６】
セリンプロテアーゼが、アルギニン-X結合、リジン-X結合、チロシン-X結合、メチオニン-X結合及びグルタミン酸-X結合（但し、Ｘはアミノ酸を表す）を加水分解するものである、請求項５記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なセリンプロテアーゼ並びにそのセリンプロテアーゼの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリンプロテアーゼは、ヒスチジン、アスパラギン酸、セリンの 3 つのアミノ酸が触媒活性の発現に関与し、一般に活性基のセリン残基を化学修飾するジイソプロピルフルオロリン酸 ( DFP ) によって不活性化されるエンドペプチダーゼである。動物由来の代表的なセリンプロテアーゼにウシやブタの膵臓由来トリプシンがあり、微生物では、ストレプトマイセスグリセウス、ストレプトマイセスフラジアエ、ストレプトマイセスエリスレウス 由来のトリプシン様セリンプロテアーゼが報告されており、その諸性質が報告されている ( 表6参照 )。これら従来から知られている酵素はペプチド基質に対してアルギニン(Arg)-X結合及びリジン(Lys)-X結合を切断するものであり、それらの結合以外の結合、例えばチロシン(Tyr)-X結合やメチオニン(Met)-X結合等をも切断する酵素については、その存在は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は上記課題を解決するために、アルギニン-X結合、リジン-X結合、チロシン-X結合、メチオニン-X結合及びグルタミン酸-X結合（但し、Ｘはアミノ酸を表す）を加水分解するセリンプロテアーゼの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、本発明者らが初めて見出した微生物について鋭意研究を重ねた結果、これを培養することによって新規なセリンプロテアーゼを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明は、以下のａ〜ｄの性状を有する新規なセリンプロテアーゼの発明である。
ａ．ｐＨ：至適ｐＨ；7.5-11.0、安定ｐＨ範囲；4.5〜10.5
ｂ．温度：至適温度;70℃、温度安定範囲10℃〜70℃
ｃ．分子量：約29,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
ｄ．Ｎ末端アミノ酸からの１６残基の配列：
Ile Ile Gly Gly Ile Asp Val Ala Asn Gly Lys Phe Pro Phe Met Val
尚、本発明は上記の新規なセリンプロテアーゼと生物学的に同等のプロテーゼをも包含する。即ち、生物学的に同等のプロテアーゼとは本発明の本発明の新規なセリンプロテアーゼであるトリプシン様プロテアーゼの一部又は当該プロテアーゼから１個又は複数個のアミノ酸が欠失、或いは付加され、及び／又は当該プロテアーゼ中の１個又は複数個のアミノ酸が他のアミノ酸と置き換えられているプロテアーゼであって、本発明のプロテアーゼの生物学的性質を有するものをいう。
【０００６】
また、本発明は、以下のａ〜ｌの性状を有し、且つ生育にメチオニン及びグルタミン酸を必要としない微生物を培養し、該培養物から採取することを特徴とするセリンプロテアーゼの製造方法の発明である。
ａ．形態：桿菌
ｂ．大きさ：0.7〜0.8×2.0〜3.0μm
ｃ．グラム染色性：陰性
ｄ．胞子：陰性
ｅ．運動性：陰性
ｆ．酸素に対する態度：好気性
ｇ．オキシダーゼ：陽性
ｈ．カタラーゼ：陽性
ｉ．Ｏ−Ｆテスト：陰性
ｊ．集落の色調：特徴的色素有せず又は薄い黄色系
ｋ．キノン系：Ｑ−８
ｌ．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量：70 ｍｏｌ％
尚、該微生物とは、本発明者らにより新たに土壌から単離され、同定されたものであり、本発明者らにより、Lysobacter sp IB-9374（以下、リゾバクター属IB-9374と略記する）と命名されており、ブダペスト条約の国際寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託されている（受託番号 FERM P-16928）。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のセリンプロテアーゼは、アルギニン-X結合、リジン-X結合、チロシン-X結合、メチオニン-X結合及びグルタミン酸-X結合を加水分解することができるものである（但し、Ｘはアミノ酸を表す）。このような加水分解機能を有するトリプシン様セリンプロテアーゼは、従来知られていないものである。
【０００８】
また、本発明の酵素は、酵素活性が既知のトリプシン様活性と比較して150〜1000倍高く、ペプシンの切断点であるチロシン-X結合も切断することから、カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等の食品タンパク質に用いることにより、これらのアレルゲン活性を減少させることができる等、既知のトリプシン様セリンプロテアーゼが有さない効果を有する、有効な酵素である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のセリンプロテアーゼは、リゾバクター属IB-9374を培養することにより採取されたものであるが、該培養は慣用の方法で行うことができる。即ち、培養温度は通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３５℃であり、培地のｐＨは通常は６〜８、好ましくは６.５〜７.５である。また、培養は、振とう或いは通気撹拌などの手段により好気的条件下で行うのが好ましく、培養時間は通常１５０〜２５０時間である。
【００１０】
リゾバクター属IB-9374の培地組成としては、通常この微生物が生育し得るものであれば天然培地及び合成培地の何れでもよく、培地は固体又は液体培地の何れでもよい。これらの培地には、例えば、炭素源としての、グルコース、マルトース、マンノース等の糖類、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源としてのペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸などの一般天然窒素源の他に、各種無機、有機アンモニウム塩などが含まれ、その他、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩などの無機塩類などが必要に応じて適宜添加される。
【００１１】
当該リゾバクター属IB-9374は以下のａ〜ｌの性状を有し、且つ生育にメチオニン及びグルタミン酸を必要としない微生物である。
ａ．形態：桿菌
ｂ．大きさ：0.7〜0.8×2.0〜3.0μm
ｃ．グラム染色性：陰性
ｄ．胞子：陰性
ｅ．運動性：陰性
ｆ．酸素に対する態度：好気性
ｇ．オキシダーゼ：陽性
ｈ．カタラーゼ：陽性
ｉ．Ｏ−Ｆテスト：陰性
ｊ．集落の色調：特徴的色素有せず又は薄い黄色系
ｋ．キノン系：Ｑ−８
ｌ．菌体内ＤＮＡのＧＣ含量：70 ｍｏｌ％
本発明のセリンプロテアーゼをリゾバクター属IB-9374を用いて取得する具体的な方法は、以下の通りである。
【００１２】
即ち、リゾバクター属IB-9374を培養し、培養液中のアミダーゼ活性が高値となった時点で培養液を濾過し、得られた培養濾液を、(1)硫安分画（0〜50％）、(2)等電点沈殿処理、(3)10〜100mM、好ましくは30〜50mMの硫酸アンモニウムによる分画、(4)50〜90％、好ましくは70〜80％のエタノールによる沈殿処理、(5)ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー処理(6)50〜90％、好ましくは70〜80％のエタノールによる沈殿処理(7)バッファー置換、(8)熱処理、(9)焦点電気泳動等の処理に付すことにより得られる。尚、これらの処理は、(1)〜(9)の順に逐次行うのが好ましい。
【００１３】
本発明の新規なセリンプロテアーゼの酵素化学的性質を以下に記載する。
ａ．ｐＨ：至適ｐＨ；7.5-11.0、安定ｐＨ範囲；4.5〜10.5
ｂ．温度：至適温度;70℃、温度安定範囲10℃〜70℃
ｃ．分子量：約29,000（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
ｄ．Ｎ末端アミノ酸からの１６残基の配列：
Ile Ile Gly Gly Ile Asp Val Ala Asn Gly Lys Phe Pro Phe Met Val
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００１４】
実施例１  キサントモナス属リゾバクター属IB-9374 の培養液からのセリンプロテーゼの精製
１．基質及び試薬
本実験においては、基質及び試薬は以下のものを用いた。
【００１５】
基質
Nα-ベンゾイル-L-アルギニン-ｐ-ニトロアニリド臭化水素酸塩
(以下 Bz-Arg-ｐNAと略記 )    ペプチド研究所
試薬
トリス塩基；和光純薬工業(株) 、 トヨパール HW-55F ； 東ソー(株)、
N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)；ナカライテスク(株)、
ブリージ35(Brij35)；ナカライテスク(株)、
ファーマライト； アマシャム ファルマシア 、
LMWエレクトロフォレシスキャリブレーションキットＥ ； アマシャム ファルマシア 、 エタノール( 99.5％ )；和光純薬工業(株)
尚、その他の試薬はすべて特級を使用した。
【００１６】
2. 実験方法
(1)リゾバクター属IB-9374 の培養
各種培地組成を検討した結果、リゾバクター属IB-9374 の培養液 1 mlにおけるBz-Arg-ｐNAに対する加水分解活性（アミダーゼ活性）が最も高くなる（0.102 unit）下記表１の培地組成で培養した。
【００１７】
【表１】
2005065556.tif 000002
【００１８】
培養液は pH 7.2 に調整し、あらかじめ加熱殺菌しておいた 500 ml 容坂口フラスコ 3 本に 100 ml ずつ分注した後、121℃ で20 分間殺菌し、 30℃、24 時間振盪培養したものを前培養液とした。この前培養液から 20 ml (5%) ずつを、新たに調製した培養液 400 ml を含む 1,000 ml 容坂口フラスコ 7 本 ( 2,800 ml ) に分注した後、30℃で培養し、培地中のアミダーゼ活性 ( 基質 ; Bz-Arg-ｐNA ) が最大となるように228 時間培養した。その結果を図1に示す。尚、図１にはトリプシン様酵素のUV吸収の変化も併せて示した。
【００１９】
培養後、連続式冷却遠心機 ( 日立製作所 ; HIMAC SCR20B 型、連続遠心ローター ; RPRC18-3 ) を用いて 4℃、31,000×g で菌体を除去し、上清液を粗酵素液 ( 2,565 ml ) とした。
【００２０】
尚、図１で示したアミダーゼ活性は、以下のようにして測定を行った。また、以下特に明記しない限りアミダーゼ活性は以下の方法に準じて測定を行った。
【００２１】
即ち、基質として Bz-Arg-ｐNA を使用し、酵素作用により遊離される ｐ-ニトロアニリンを 405 nm で測定する公知の方法（例えば、Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 329, 278 (1962)）を用いた。尚、Bz-Arg-pNAは、その 50 mg を純水に溶解して 25 mlとして、冷凍保存した(4.6 mM)ものを用いた。
【００２２】
具体的には、まず、試験管 (1.5× 13 cm) に4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml と 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.3 ml をそれぞれ分注し、30℃ の恒温水槽中に 5 分保った後、酵素溶液 0.05 ml を加えて反応させた。15-20 分後、45% 酢酸溶液 0.5 ml を加えて反応を停止し、405 nm における吸光度を測定した。尚、対照試料としては、基質水溶液 0.15 ml、200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.3 ml、45% 酢酸溶液 0.5 ml、酵素溶液 0.05 ml を順次添加し、すばやく混合したものを用いた。上記の条件で 1 分間に 1 μmol の p-ニトロアニリン(分子吸光係数 9,620)を遊離する酵素活性を 1 unit と定義し、吸光度の値からユニット数（アミダーゼ活性）を求めた。尚、酵素活性 1 (unit/ml)は、次式に従って算出した。
酵素単位(unit/ml)=OD 405nmの補正値/9,620×1,000×2/0.05×希釈倍率/反応時間(分)
【００２３】
２．リゾバクター属IB-9374 の培養液からの酵素の精製
図２に示す精製方法によりリゾバクター属IB-9374から酵素を精製した。各生成過程について以下に詳述する。尚、各精製過程における精製操作は、全て 4℃ で行った。
(1)培養濾液の硫安分画
228 時間培養した培養濾液 2,565 ml ( 223.0 ユニット ) に 50% 飽和度 (温度 0℃ ) になるように硫酸アンモニウムを加えた。4℃ で一晩静置後、バッチ式遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) により得られた沈殿を、最少量の 10% グルセロールを含む 25 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 7.0 ) に懸濁させた。
【００２４】
得られた懸濁酵素液を、遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) によってさらに分離した。得られた沈殿物中に存在する酵素タンパク質を抽出するため、氷上で充分冷やした乳鉢中で、10% グリセロールを含む 25 mM グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液 (pH 10.0、以下 A 緩衝液と略記する) を用いてよく擂り、得られた抽出液を再び遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) にかけた。該抽出液のBz-Arg-pNA に対するアミダーゼ活性を測定し、その活性が確認されなくなるまでこの操作を繰り返し、酵素液 400 ml ( 184.0 ユニット) を得た。
【００２５】
(2)等電点沈殿 
(1)で得られた褐色の酵素液 400 ml ( 184.0 ユニット ) を、10% グリセロールを含む 25 mM Na2HPO4-Citrate ( クエン酸一水和物 ) 緩衝液 ( pH 4.0 ) に対し充分透析した。その後、透析中に生じた懸濁状態の酵素液を遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) し、沈殿を得た。得られた沈殿物を A 緩衝液 ( pH 10.0 ) に完全に溶解させた後、同緩衝液に対して 4℃ で充分透析し、酵素液 52 ml ( 181.0 ユニット) を得た。
【００２６】
(3)0.86% ( 50 mM ) 硫安分画 
(2) で得られた酵素液 52 ml ( 181.0 ユニット ) に、終濃度が 50 mM ( 0.86% 飽和 ) になるよう硫酸アンモニウム ( ナカライテスク(株), 分子量 132.14, 生化学研究用特製試薬 ) を添加した。4℃ で一晩静置後、遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) により得られた沈殿を A 緩衝液 ( pH 10.0 ) に完全に溶解させ、同緩衝液に対して 4℃ で充分透析し、酵素液 25 ml ( 216.0 ユニット ) を得た。尚、本ステップにより総活性が上昇しているが、これは本ステップの硫酸アンモニウムによる酵素活性阻害により一時的に低下した酵素活性が、透析により該硫酸アンモニウムが排除され、(2)の等電点沈殿での値より上昇したものと考えられる。
【００２７】
(4)75% エタノール沈殿 
(3) で得られた淡黄色の酵素液 25 ml ( 216.0 ユニット ) に終濃度が 75% になるように、20℃ でよく冷やしたエタノール ( 和光純薬工業(株), 特級 ) を加えた。4℃ にて 1 時間静置した後、遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) によってさらに分離した。得られた沈殿物を、10% グリセロールを含む 10 mM CAPS 緩衝液 ( pH 10.5、以下 B 緩衝液 ; 略記 ) に溶解させた後、同緩衝液に対して 4℃ で充分透析した。その後、限外濾過膜 ( アミコン ミリポア ウルトラフィルトレーション メンブレン、PLCC Dia、44.5 mm、0.7 kg/cm2 ) を用いて、10 ml ( 193.0 ユニット ) にまで濃縮した。
【００２８】
(5)トヨパール HW-55 カラムクロマトグラフィー
(4) で濃縮した酵素液 10 ml ( 193.0 ユニット ) を 5 回に分けて、トヨパール HW-55 カラムに供した。即ち、濃縮酵素液 ( 193.0 ユニット ) を 100 mM 塩化ナトリウム を含む B 緩衝液 ( pH 10.5 ) で平衡化した トヨパール HW-55 カラム ( 1.5×20 cm ) に供し、不純タンパク質の分離を行った。このとき、不純タンパク質のみが溶出され、目的とする酵素タンパク質は 200 mM 塩化ナトリウム 及び 0.5% Brij35 を含む B 緩衝液 ( pH 10.5 ) によって全く溶出されず、トヨパール HW-55 カラム上部に残ったままの状態であった。それゆえ、カラム上部から 5 cm ほど樹脂を採取し、0.5% Brij35 を含む B 緩衝液 ( pH 10.5 ) を適当量 ( 約 5.0 ml ) 添加し、30℃ にて 30 分間静置した後、上清を回収した。同様の操作を数回繰り返し、活性を完全に回収した酵素液を、同緩衝液に対して充分透析した。その後、限外濾過膜 ( アミコン ミリポア ウルトラフィルトレーション メンブレン、PLCC Dia、44.5 mm、0.7 kg/cm2 ) を用いて、16 ml ( 123.0 ユニット ) にまで濃縮した。
【００２９】
(6)75% エタノール沈殿 
(5) で濃縮した酵素液 16 ml ( 123.0 ユニット ) に、終濃度が 75% になるように、20℃ でよく冷やしたエタノール ( 和光純薬工業(株), 特級 ) を加えた。4℃ にて 1 時間静置した後、遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) によってさらに分離した。得られた沈殿物を、10% グリセロールを含む 20 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 7.0、以下 C 緩衝液 ; 略記 ) に懸濁させた後、その懸濁状態のまま同緩衝液に対して 4℃ で充分透析した。その後、限外濾過膜 ( アミコン ミリポア ウルトラフィルトレーション メンブレン、PLCC Dia、44.5 mm、0.7 kg/cm2 ) を用いて、16 ml ( 114.0 ユニット ) にまで濃縮した。
【００３０】
(7)バッファー置換
(6)で濃縮した酵素液 16 ml ( 114.0 ユニット ) において、目的とする酵素タンパク質は C 緩衝液 ( pH 7.0 ) に対して溶解せず、緩衝液中で目視できる状態にあるため、目的とする酵素タンパク質を遠心分離 ( 31,000×g、20 分、4℃ ) によってさらに分離し、得られたアミダーゼ活性を完全に含む沈殿物を B 緩衝液 ( pH 10.5 ) に完全に溶解させた。その後、同緩衝液に対して 4℃ で充分透析し、限外濾過膜 ( アミコン ミリポア ウルトラフィルトレーション メンブレン、PLCC Dia、44.5 mm、0.7 kg/cm2 ) を用いて、17 ml ( 104.0 ユニット ) にまで濃縮した。
【００３１】
(8)熱処理
(7) で濃縮した酵素液 17 ml ( 104.0 ユニット ) を45℃ にて 30 分間の熱処理を行った。本操作は、あらかじめ予備実験として行われた本酵素の温度安定性に基づいて行われた。即ち、酵素溶液中に存在すると考えられる目的酵素タンパク質以外のプロテアーゼ類を、熱処理によって変性させ、失活及び本酵素によって加水分解させるために行った。該操作による目的酵素の失活は全く認められなかった ( 104.0 ユニット/17 ml )。
【００３２】
(9)焦点電気泳動
(8) で熱処理された酵素液 17 ml ( 104.0 ユニット ) を焦点電気泳動に供した。即ち、両性電解質キャリアンファーマライト ( pH 2.5-5.0 ) を酵素溶液に混合し、110 ml のカラム中 ( LKB 社製 8,100 型 ) に両性電解質キャリアンファーマライト ( pH 2.5-5.0 ) を 0.5% 含む 0-50% ショ糖密度勾配を作製した。4℃ で 600V、48 時間泳動させた後、カラム内からの溶出を行った。各画分の pH、280 nm の吸光度及び酵素活性 ( アミダーゼ活性 ) を測定し、活性区分のピークpHを測定し、本発明の酵素の等電点を得た。その結果を図３に示す。
更に、得られた溶出液を、B 緩衝液に対して充分透析した後、限外濾過膜 ( アミコン ミリポア ウルトラフィルトレーション メンブレン、PLCC Dia、44.5 mm、0.7 kg/cm2 ) を用いて、12 ml ( 60.0 ユニット ) にまで濃縮した。
【００３３】
(10)各精製段階における活性収率、比活性
各精製段階における容量、総活性、吸光度測定値から換算した総タンパク質量、ブラッドフォード法による総タンパク質量、比活性、収率、精製度を 表2 に示した。尚、総活性は、(I)に記載されたアミダーゼ活性の測定方法と同様に操作して得られた値であり、比活性は、総活性をブラッドフォード法による総タンパク質量で割った値であり、収率は、培養濾液の総活性を100としたときの各精製段階の活性値の比率、精製度(精製倍率)は、培養濾液の特異活性を１としたときの各精製段階の比活性値の比率を夫々示す。
【００３４】
尚、ブラッドフォード法による総タンパク質の定量に於いては、標準タンパク質としてウシ血清アルブミン ( プロテインスタンダード II、バイオラッド社 ) を用いた。
【００３５】
【表２】
2005065556.tif 000003
【００３６】
この結果から、これらの精製操作により、アミダーゼ活性の収率は27%となり、比活性は約 380倍となることが分かった。また、(2)の等電点沈殿では、比活性を 15.5 倍に上昇することができ、この操作は、混在する不純タンパク質を除去するのに大変有効であることが分かった。(9)の焦点電気泳動は、 図3 の結果から、等電点 pH 4.04 の精製酵素標品を得るために有効な手段であることが確認された。
また、本酵素の等電点 ( pH 4.04 ) は、ストレプトマイセスエリセウス の等電点 ( pH 4.0 ) と近い値を示していることも分かった ( 図３参照 )。
以上の結果から、リゾバクター属IB-9374 由来の本酵素は、酸性タンパク質であることが確認された。
【００３７】
(11)(9)で得られた精製酵素のSDS-PAGE による均一性と分子量の測定
精製酵素標品の均一性ならびに分子量を、分離用ゲル 12.5%、濃縮ゲル 2.5% のアクリルアミドを用いる Laemmli の方法による電気泳動法で測定した。即ち、マーカーである BPB が濃縮ゲル内では 10 mA 定電流、分離ゲル進入後は 20 mA 定電流で、BPB のラインがゲル末端から 5 mm 上の位置にくるまで、約 2 時間泳動を行った。泳動後、0.1% CBB R-250 ( w/v )、30% メタノール (v/v) 及び 10% 酢酸 ( v/v ) の混合液で染色した。脱色は、メタノール : 酢酸 : 水 = 3 : 1 : 6 ( v/v ) を用いて行った。また、分子量推定用マーカーとして、LMWエレクトロフォレシス キャリブレーション キットE( ホスホリラーゼb ; 94,000、血清アルブミン ; 67,000、オブアルブミン ; 43,000、カルボニックアンヒドラーゼ ; 30,000、トリプシンインヒビター ; 20,100、α-ラクトアルブミン ; 14,400 ) を用いた。なお、酵素タンパク質の自己消化を防ぐために、本酵素は、あらかじめ 95℃ の沸騰水中で 3 分間の熱処理を行い完全に失活させたものを用いた。その結果を図４に示す。
【００３８】
この結果から、本精製酵素標品はSDS-PAGE で均一であると認められた。また、本酵素の分子量を、SDS-PAGE によって測定した結果、約 29,000 であると算出された(図5参照)。この値は、ストレプトマイセスグリセウス由来プロテアーゼ ( M.W. 20,000、pI = 9.0 )、ストレプトマイセスフラジアエ由来プロテアーゼ ( M.W. 16,500、pI = 9.0 )、ストレプトマイセスエリセウス由来プロテアーゼ ( M.W. 20,000、pI = 4.0 ) 及びウシやブタ の膵臓由来トリプシンの分子量 (ウシ；M.W. 24,000、ブタ；M.W. 23,300)に比べると、かなり大きいことが確認された。
以上のことから、本菌の培養液 2,565 ml から、9 段階の操作を経ることで、Bz-Arg-pNA に対するアミダーゼ活性の回収率が27%、比活性が約 380 倍に上昇した SDS-PAGE で均一な酵素を得られることが分かった。
【００３９】
実験例１  本発明の酵素の化学的諸性質
１．試薬
酵素は、実施例１で得られた電気泳動 ( SDS-PAGE ) 的に均一な酵素標品を、10% グリセロールを含む 10 mM CAPS 緩衝液 ( pH 10.5 ) 中で 4℃ に保存してあるものを使用した。
試薬は、以下のものを使用した。
EDTA・3Na・3H2O           ；   同仁科学研究所(株)
o-フェナントロリン              ；     ナカライテスク(株)
L-システイン              ；   東京化成(株)
2-メルカプトエタノール    ；   和光純薬工業(株)
N-エチルマレイミド(NEM)   ；   ナカライテスク(株)
ヨード酢酸                ；   ナカライテスク(株)
r-クロロマーキュリベンゾイックアシッド(PCMB)；  ナカライテスク(株)
ジイソプロピルフルオロホスフェート           ;  和光純薬工業 (株)
フェニルメタンスルホニルフルオライド         ;  ベーリンガー
N-トシル-L-リシルクロロメチルケトン(TLCK)    ;  和光純薬工業(株)
N-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK);ナカライテスク (株)
ジチオスレイトール(DTT)    ;  ナカライテスク (株)
トリス塩基                 ;  和光純薬工業 (株)
メタノール                 ;  和光純薬工業 (株)
酢酸                       ;  和光純薬工業 (株)
クーマシー ブリリアント ブルー R-250  (CBB R-250) ; ナカライテスク (株)
プロ ブロット メンブレン   ;  アップライバイオシステム
フィルターペーパー         ;  アドバンテック
ロイペプチン               ;  ペプチド研究所
キモスタチン               ;   ペプチド研究所
市販酵素としては、ウシ膵臓由来のTPCK処理されたトリプシンはウォーシントン バイオケミカル社製を、ブタ膵臓由来トリプシン結晶は和光純薬工業(株)製を用いた。
ウシ及びブタ膵臓由来トリプシンの酵素濃度は、紫外部吸収 280 nm におけるモル吸光係数を使用して求め、ウシトリプシンは E1cm1% = 16.0、及びブタトリプシンはE1cm1% = 15.0 を用いて求めた。
【００４０】
２．実験方法
(1)pNA基質を用いたアミダーゼ活性の測定
アミダーゼ活性は、基質としてBz-Arg-pNAを用いて、実施例１の２．に記載した方法に準じて測定した。
尚、アミダーゼ活性の測定は、酵素濃度 0.08 μg 以内、基質濃度 0.46 mM以下、吸光度 0.4 以下、反応時間 12 分以内で行った。
【００４１】
(2)本酵素の至適 pH
本酵素の Bz-Arg-pNA に対するアミダーゼ活性に及ぼす pH の影響を検討した。即ち、115 mM 各種緩衝液 ［ pH 2.0-4.5 ; グリシン塩酸緩衝液(−○−)、pH 3.0-6.0 ; クエン酸緩衝液(−×−)、pH 4.5-8.0 ; リン酸二水素カリウム-リン酸水素二カリウム緩衝液(−■−)、pH 7.0-9.0 ; トリス塩酸緩衝液(−△−)、pH 8.0-9.5 ; AMP-塩酸緩衝液(−●−)、pH 9.0-12.0 ; グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液(−□−) ］ 1.3 ml に、4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml を添加した混合溶液を 30℃ で 5 分間インキュベートした後、酵素 0.05μg を含む CAPS 緩衝液 ( pH 10.5 ) 0.05 ml を添加し、反応させた。15 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定した。
その結果を、図６ に示す。この結果から明らかなように、本酵素の Bz-Arg-pNA に対するアミダーゼ活性の至適 pH は、pH 7.5-11.0 であった。
【００４２】
(3)本酵素の至適温度
本酵素の Bz-Arg-pNA に対するアミダーゼ活性に及ぼす温度の影響を検討した。即ち、200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.3 ml に 4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml を添加した混合溶液を各種温度 ( 10-80℃ ) で 5 分間インキュベートした後、酵素 0.05μg を含む CAPS 緩衝液 ( pH 10.5 ) 0.05 ml を添加し、各種温度で反応させた。2-20 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定し、1 ml あたりの Unit 数から相対活性を算出した。その結果、図７ に示す。
この結果から、本酵素は 70 ℃において最大活性を示すことが分かった。
【００４３】
(4)本酵素のpH 安定性
各種 pH における本酵素の安定性について検討した。
即ち、酵素 0.1μg を含む 100 mM 各種緩衝液 ［ pH 2.0-4.5 ; グリシン塩酸緩衝液(−○−)、pH 3.0-6.0 ; クエン酸緩衝液(−×−)、pH 4.5-8.0 ; リン酸二水素カリウム-リン酸水素二カリウム緩衝液(−■−)、pH 7.0-9.0 ; トリス塩酸緩衝液、(−△−)pH 8.0-9.5 ; AMP-塩酸緩衝液(−●−)、pH 9.0-12.0 ; グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液(−□−) ］ 0.1 ml を 4℃ にて 24 時間静置後、この酵素溶液 0.05 ml ( 酵素 ; 0.05μg ) を、あらかじめ 30℃ で 5 分間インキュベートしておいた 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.3 ml と 4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml の混合溶液に添加し、反応を開始させた。15 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定した。その結果を図８ に示す。
この結果から、本酵素は pH 4.5-10.5 の領域で安定であることが分かった。
【００４４】
(5)本酵素の温度安定性
各種温度における本酵素の安定性について検討した。
即ち、酵素 0.1μg を含む 100 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) 0.1 ml を、各種温度 ( 10-80℃ ) に 30 分間放置後、氷上で充分冷却した。この酵素溶液 0.05 ml ( 酵素 ; 0.05μg ) を、あらかじめ 30℃ で 5 分間インキュベートしておいた 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.3 ml と 4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml の混合溶液に添加し、反応を開始させた。15 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定した。その結果を図９ に示す。
この結果から、本酵素は10℃〜50℃ までは最大活性とほぼ同程度の活性を有するほど安定しており、60℃で最大活性の90％程度、70℃でも最大活性の80％程度と安定していることが分かった。一方、80℃では、完全に失活することも分かった。
【００４５】
(6)本酵素の各種タンパク質変性剤による影響
本酵素のアミダーゼ活性に対する尿素、グアニジン塩酸塩及びドデシル硫酸ナトリウム ( SDS ) の影響を検討した。
即ち、尿素、グアニジン塩酸塩及び SDS の本酵素に対する影響は、各種濃度の変性剤と酵素 0.05μg を含む 40 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) 0.2 ml を 30℃ で 30 分間前処理した後、この処理液 0.1 ml ( 酵素 ; 0.025μg ) を、事前に 30℃ で 5 分間インキュベートしておいた各種濃度の尿素、グアニジン塩酸塩及び SDS を含む 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.25 ml と 4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml の混合溶液に添加し、反応を開始させた。15 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定した。
また、各種タンパク質変性剤に対する本酵素の影響を比較するため、ウシ及びブタの膵臓由来トリプシンを用いて、同じように影響を測定した。即ち、各種濃度の変性剤とウシ由来トリプシン ( 20.0μg ) あるいはブタ由来トリプシン ( 2.0μg ) を含む 40 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) 0.2 mlを 30℃ で 30 分間前処理した後、この処理液 0.1 ml ( ウシ由来トリプシン ; 10.0μg、ブタ由来トリプシン ; 1.0μg ) を用いて残存活性を測定した。
【００４６】
その結果を夫々図10 ( 尿素 )、図11 ( グアニジン塩酸塩 )、図12 ( SDS ) に夫々示す。尚、ウシ膵臓由来トリプシンの結果を−●−、ブタ膵臓由来トリプシンの結果を、−△−、本酵素の結果を−○−で夫々示した。
この結果から、40 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) で、本酵素を 1.0 M 尿素、0.1 M グアニジン塩酸塩及び 0.1% SDS にそれぞれ 30℃ で 30 分間前処理した場合、活性はそれぞれ 100%、30% 及び 35% が残存した。いずれの場合においても、ウシ及びブタの膵臓由来トリプシンのそれらより、高い残存活性を示していた。その中でも特に、本酵素の尿素に対する抵抗性は、ウシ及びブタの膵臓由来トリプシンのそれらより顕著であり、5.0 M 尿素の存在下において、ウシ及びブタの膵臓由来トリプシンはほぼ失活するのに対し、本酵素では 50% の残存活性が認められた。
【００４７】
(7)本酵素の各種阻害剤による影響
本酵素のアミダーゼ活性に対する金属キレート試薬、SH 試薬及び還元剤による影響を検討した。
即ち、0.1-10 mM 各種阻害剤と酵素 0.05μg を含む 40 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) 0.2 ml を 30℃ にて 30 分間前処理した後、この前処理液 0.1 ml ( 酵素 ; 0.025μg ) を、事前に 30℃ で 5 分間インキュベートしておいた所定濃度の阻害剤を含む 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.25 ml と 4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml の混合溶液に添加し、反応を開始させた。15 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定した。その測定値から求めた相対活性を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2005065556.tif 000004
【００４９】
この結果から明らかなように、金属キレート試薬 ( EDTA、o-フェナントロリン )、還元剤 ( システイン、2-メルカプトエタノール(2-ME)、ジチオスレイトール(DTT) ) 及び SH 試薬 ( N-エチルマレイミド(NEM)、MIA(モノイオド酢酸)、r-クロロマーキュリベンゾイックアシッド(PCMB)) によって、本酵素の活性が阻害されないことから、メタルエンドペプチダーゼ及びシステインエンドペプチダーゼのいずれでもないと見なされた。また、ジイソプロピルフルオロリン酸(DFP) 及び フェニルメタンスルホニルフルオライド(PMSF) は、本酵素のアミダーゼ活性を強く阻害することから、本酵素はセリンエンドペプチダーゼであることが強く示唆された。さらに、本酵素はトリプシンの活性中心に存在するヒスチジン(His)残基に対して特異的に反応するN-トシル-L-リシルクロロメチルケトン(TLCK)及び放線菌由来のトリプシン阻害剤であるロイペプシンによって強く阻害されたが、キモトリプシンの His 残基に対して特異的に反応するN-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)及び放線菌由来のキモトリプシン阻害剤であるキモスタチンによって阻害されなかった。これらのことから、本酵素はトリプシン様セリンエンドペプチダーゼの一種であることが示唆された。
【００５０】
(8)本酵素の各種金属塩による影響
本酵素のアミダーゼ活性に対する金属塩の影響を検討した。
即ち、1.0 mM 濃度各種金属塩と酵素 0.05μg を含む 40 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 8.0 ) 0.2 ml を 30℃ で 30 分間前処理した後、この処理液 0.1 ml ( 酵素 ; 0.025μg ) を、事前に 30℃ で 5 分間インキュベートしておいた 1.0 mM 濃度各種金属塩を含む 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.25 ml と 4.6 mM Bz-Arg-pNA 溶液 0.15 ml の混合溶液に添加し、反応を開始させた。15 分後、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止させ、405 nm における吸光度を測定した。その測定値から求めた相対活性を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2005065556.tif 000005
【００５２】
この結果から、明らかなように本酵素のアミダーゼ活性は 1.0 mM Co2+、Hg2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Cd2+、Ni2+、Sr2+、Cu2+ 及び Fe2+ による影響を受けないが、1.0 mM Zn2+ によって弱く阻害された。
【００５３】
(9)本酵素のN-末端アミノ酸配列分析
)本酵素のN-末端アミノ酸配列は、既知の方法［岩松明彦：タンパク質実験ノート(下)、P.83、（株）羊土社発行(2001年)］に準じて16残基まで測定した。即ち、電気泳動的に均一に精製した本酵素をSDS−PAGE後のゲルからエレクトロブロッティング(セミドライ)法によりPVDF膜に転写し、気相プロテインシークエンサー(アップライドバイオシステム社494型)により分析した。その結果を、動物・微生物由来トリプシン様セリンプロテアーゼと比較して、表５に示す。
【００５４】
【表５】
2005065556.tif 000006
【００５５】
表５から明らかなように、本酵素の N-末端アミノ酸はイソロイシン(Ile)であった。さらに、N-末端残基のイソロイシン(Ile)をはじめ、3 残基、4 残基目のグリシン(Gly)、10 残基目のグリシン(Gly)、13 残基目のプロリン(Pro)、16 残基目のバリン(Val)は、どのトリプシン様セリンプロテアーゼと比較してもよく保存されていた。これらトリプシン様セリンプロテアーゼの中でも特に、N-末端 16 残基において、ストレプトマイセスグリセウス由来トリプシンとのアミノ酸レベルでの同一性は 56.3% であり、12 残基目のフェニルアラニン(Phe)から 16 残基目のバリン(Val)までは全く同じ配列が確認された。また、ウシ由来トリプシンとは 31.3%、ザリガニ由来トリプシンとは 50%、ブタ由来カリクレインとは 37.5%、ブタ由来トロンビン B とは 43.8%、ウシ由来 Facter Xa とは 43.8% の同一性を示した。その中でも特に、本酵素とヤギ由来アクロシンは、本酵素と 62.5% のアミノ酸レベルでの同一性を示した。
【００５６】
３．本発明の酵素の化学的諸性質の検討
上記結果を、その他のウシ由来のトリプシン、ストレプトマイセスグリセウス由来のプロテアーゼ、ストレプトマイセスエリセウス由来のプロテアーゼ及びストレプトマイセスフラジアエ由来のプロテアーゼと併せて表６に示す。
【００５７】
【表６】
2005065556.tif 000007
【００５８】
本酵素の至適 pH は、微生物由来の既知のトリプシン様プロテアーゼと比較して、中性域からアルカリ性側へ幅広い領域を有していた。更に、pH 安定性は、ストレプトマイセスフラジアエのそれ ( pH 4.0-9.0 ) と近い領域を示したが、他の微生物由来トリプシン様プロテアーゼのそれ ( pH 2.0-5.0 ) やウシ膵臓由来トリプシンのそれ ( pH 2.0-3.0 ) よりもアルカリ性側へ広い領域に存在していた。
温度安定性では、ウシトリプシンのそれ ( 40℃ ) よりも 10℃ 高い値を示し、至適温度においては、ウシトリプシンのそれ ( 40℃ ) よりも 30℃ 高い値を示した。
また、本酵素は DFP、PMSF、TLCK 及びロイペプシンによって阻害された。一方、金属キレート試薬 ( EDTA、o-フェナントロリン )、還元剤 ( システイン、2-メルカプトエタノール(2-ME)、ジチオスレイトール(DTT) ) 及び SH 試薬 ( N-エチルマレイミド(NEM)、MIA(モノイオド酢酸)、r-クロロマーキュリベンゾイックアシッド(PCMB))によって阻害されないことから、メタルエンドペプチダーゼ及びシステインエンドペプチダーゼのいずれでもないとみなされた。これらのことから、本酵素は基質のリジン残基またはアルギニン残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を特異的に切断するトリプシン様セリンプロテアーゼの一種であることが強く示唆された。
【００５９】
本酵素は、1.0 mM Co2+、Hg2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Cd2+、Ni2+、Sr2+、Cu2+ 及び Fe2+ によって影響を受けなかった。金属塩に対するトリプシン様セリンプロテアーゼの阻害現象は、1.0 mM 濃度の Co2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cd2+、Zn2+ によって 20% 活性化されることが報告されているが、本酵素の場合、上記のような活性化現象は見られなかった。また、本酵素は 1.0 mM Zn2+ によって弱く阻害されていることから、これまでに報告されているトリプシン様セリンプロテアーゼと性質が異なることが示唆された。なお、Zn2+ によって阻害されるトリプシン様セリンプロテアーゼにはアクロシンが知られている。
【００６０】
また、尿素、グアニジン塩酸塩、SDS などの変性剤に対して、本酵素は、ウシやブタの膵臓由来トリプシンのそれよりも強い抵抗性を示した。特に、尿素に対する抵抗性では、50% の残存活性が認められた濃度が、ウシやブタ由来トリプシンでは 2.0 M であったのに対し、本酵素では 5.0 M であった。また、SDS-PAGE から推定された本酵素の分子量約 29,000 は、他の微生物由来トリプシン様プロテアーゼの分子量 ( 分子量 16,500-20,000 ) と比較するとかなり高いことが明らかとなった。
【００６１】
さらに、N-末端アミノ酸配列 16 残基において、本酵素はヤギ由来アクロシンと62.5% の同一性を示した 。次いで、ストレプトマイセスグリセウス 由来トリプシン ( 56.3% )、ザリガニ由来トリプシン ( 50.0% )、ウシ由来 Factor Xa 及びブタ由来トロンビン B ( 43.8% )、ブタ由来カリクレイン ( 37.5% ) の順序で高い同一性を示した。しかしながら、ウシ由来トリプシンとの同一性は 31.25% であり、他のトリプシン様セリンプロテアーゼとの同一性と比較して、かなり低い結果であった。さらに、本酵素は、各種トリプシン様セリンプロテアーゼに共通して見られる N-末端 1 残基目のイソロイシン(Ile)をはじめ、3 残基、4 残基目のグリシン(Gly)、10 残基目のグリシン(Gly)、13 残基目のプロリン(Pro)、16 残基目のバリン(Val)は、どのトリプシン様セリンプロテアーゼと比較してもよく保存されていた。
【００６２】
また、本酵素は、ヤギ由来アクロシンと N-末端 16 残基アミノ酸配列において高い同一性を示した。アクロシンは、受精の際、精子の卵膜通過に不可欠な酵素として、古くから哺乳類精子の尖体内膜に存在することが知られており、トリプシン類似の基質特異性を示すプロテアーゼとして、タンパク質中のペプチド結合のうち、アルギニン(Arg)-X 結合及び リジン(Lys)-X 結合を加水分解することが知られている。N-末端 16 残基アミノ酸配列において 62.5% の同一性が確認されたヤギ由来アクロシンは 2 つのポリペプチド鎖からなり、分子量が 40,000 の H 鎖と 3,700 の L 鎖で構成されている。このうち、本酵素と高い同一性を示したのは H 鎖であった。また、アクロシンはジイソプロピルフルオロリン酸 ( DFP )、トシルリシルクロロメチルケトン ( TLCK )及び亜鉛によって阻害されることが知られており、これらの性質は、本酵素とよく類似していた。
【００６３】
以上の結果から、本酵素は、DFP、PMSF、TLCK 及びロイペプシンによって阻害されるトリプシン様セリンプロテアーゼの一種であり、N-末端アミノ酸配列においても、動物及び微生物由来トリプシン様セリンプロテアーゼとの同一性が高いことが明らかとなった。それにもかかわらず、既知の市販されているウシ及びブタ由来トリプシンと比較して、尿素に対する抵抗性が高いこと、分子量が大きいこと、4.5-10.5と幅広い pH 安定性を示すこと、至適温度が 70℃ と高いことが異なっていることが明らかとなった。
【００６４】
実験例２  本酵素の基質特異性
１．実験材料
酵素は、実施例１で精製した電気泳動 ( SDS-PAGE ) 的に均一な酵素標品を、10% グリセロールを含む 10 mM CAPS 緩衝液 ( pH 10.5 ) 中で 4℃ で保存したものを使用した。また、ウシ及びブタ膵臓由来トリプシンはそれぞれ Worthington Biochemical corporation ( TRTPCK ) 及び和光純薬工業(株)製のものを用いた。
基質は、以下のものを用いた。
Bz-Arg-pNA    ； ペプチド研究所、   Bz-Lys-pNA ； 和光純薬工業 (株)、
Arg-pNA     ；  Bachem 社    、   Lys-pNA    ；    Merck 社 、
Ac-Asp-pNA  ； Bachem 社     、   Ac-Glu-pNA ； Bachem 社 、
Suc-Ala-pNA ； ペプチド研究所、   Ac-Phe-pNA ； Bachem 社、
Ac-Leu-pNA  ； Bachem 社     、   Bz-Tyr-pNA ； ペプチド研究所、
AMC（7-アミノ-4-メチルクマリン）      ； ペプチド研究所、
Bz-Arg-MCA(4-メチルクマリン-7-アミド) ；ペプチド研究所、
Z-Phe-Arg-MCA；ペプチド研究所、 Boc-Leu-Arg-Arg-MCA；ペプチド研究所、
Boc-Gln-Gly-Arg-MCA    ；  ペプチド研究所、
Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA；ペプチド研究所、
α-MSH (アルファメラノサイト刺激ホルモン)    ； ペプチド研究所、
アンジオテンシンII ( Human、4001-v )  ；  ペプチド研究所。
その他の基質は、通常知られている方法により調製したものを用いた。
【００６５】
また、試薬は、以下のものを用いた。
トリフルオロ酢酸 ( TFA )       ；  ペプチド研究所
ジメチルスルフォキシド ( アミノ酸自動分析用 )；和光純薬工業(株)
2-プロパノール ( HPLC 用 )     ；  和光純薬工業(株)
アセトニトリル ( HPLC 用)      ；  関東化学(株)
ニンヒドリン試液-L8,500 セット ；  和光純薬工業(株)
Polyoxyethylene Lauryl Alcohol Ether        ；   ナカライテスク(株)
b-チオジグリコール ( アミノ酸自動分析用 )   ；   和光純薬工業(株)
カプリル酸(アミノ酸自動分析用) ；  和光純薬工業(株)
クエン酸三ナトリウム二水和物   ；  和光純薬工業 (株)
クエン酸一水和物               ；  和光純薬工業 (株)
【００６６】
２．実験方法
(1)各種pNA基質に対する本酵素の作用
本酵素の各種pNA基質に対する基質特異性について検討した。即ち、0.25 mM 濃度の各種合成基質 ( Bz-Arg-pNA、Arg-pNA、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA、Boc-His-pNA、Ac-Asp-pNA、Ac-Glu-pNA、Suc-Ala-pNA、Ac-Phe-pNA、Ac-Leu-pNA、Z-Pro-pNA、Boc-Gln-pNA、Bz-Tyr-pNA、Z-Thr-pNA、Boc-Met-pNA ) を含む 200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.45 ml を 30℃ で 5 分間インキュベートした後、0.05μg の酵素を含む酵素溶液 0.05 ml を添加して、反応を開始させた。10〜1,500 分後、45% 酢酸 0.5 ml を添加して反応を停止させ、405 nm の吸光度を測定し、各種pNA基質に対する本酵素の基質特異性を検討した。その結果を、Bz-Arg-pNAに対する活性を100として表７に夫々示す。
【００６７】
【表７】
2005065556.tif 000008
【００６８】
表7から明らかなように、本酵素は、Bz-Arg-pNAに対するアミダーゼ活性が最も強く、次いでBz-Lys-pNAに対する活性が強い活性を有していた。また、Arg-pNA 及び Lys-pNA に対するアミダーゼ活性がわずかに認められた。このことは、本酵素がエンドペプチダーゼに属しながら、弱いエキソペプチダーゼ活性も有していることを示している。
以上の結果から、トリプシン様セリンプロテアーゼの一種であることが強く示唆された。
【００６９】
(2)各種合成基質に対する本酵素の動力学的定数について
各種合成基質に対する加水分解反応における本酵素の動力学的定数 ( Km、  kcat ) を Lineweaver-Burk プロットから求めた。
(ｉ)MCA(4-メチルクマリン-7-アミド)基質に対する本酵素の至適pH
各種MCA基質に対するアミダーゼ活性を測定する前に、Bz-Arg-MCA(4-メチルクマリン-7-アミド)基質に対する本酵素の至適pHを測定した。まず、各種緩衝液を用い、そのpHを変化させたときのBz-Arg-MCA基質に対する本酵素のアミダーゼ活性を測定した。
尚、MCA基質に対する酵素活性は以下のように行った。即ち、あらかじめ 所定 pHに調製した20 mMの各種緩衝液と、終濃度 100 nMになるように調製した各種 MCA 基質を、全量で 2,995 ml になるように調製し、30℃ で 5 分間インキュベートした。その後、酵素溶液 0.05 ml ( 酵素 ; 5 pg ) を加えて反応を開始した。正確に 5 分間、反応を 380 nm の励起波長、440 nm の蛍光波長でレコーダーでモニターし、遊離したAMC（7-アミノ-4-メチルクマリン）の蛍光強度を測定した。酵素作用によって遊離した AMC 量は、標準 AMC の標準曲線より算出した。
【００７０】
得られた結果を図１３に示した。尚、図１３は、最大活性値を100とした場合の各pHでの活性値を表したものであり、○は20mMトリス塩酸緩衝液を、×は20mMAMP塩酸緩衝液を、■は20mMグリシン塩酸緩衝液を用いた時の結果を表す。
その結果、pNA基質の場合と同様に、本酵素のMCA基質の至適pHは9.2であった。よって、以下MCA基質のアミダーゼ活性を測定する際にはpHを9.2として測定を行った。
【００７１】
(ii)pNA基質及びMCA基質に対する各種酵素のLineweaver-Burkプロット
加水分解反応の代表例として、Bz-Arg-pNA に対する本酵素、及びブタ膵臓由来トリプシンのLineweaver-Burkプロットを 図14（A:本酵素,B:ブタ膵臓由来トリプシン）に、Bz-Arg-MCA に対する本酵素及びブタ膵臓由来トリプシンのプロットを 図15（A:本酵素,B:ブタ膵臓由来トリプシン）に夫々示した。
尚、MCA基質に対する酵素活性測定は(i)に準じた方法で行い、pNA基質に対する酵素のアミダーゼ活性は以下のように測定した。即ち、試験管 ( 1.5×13 cm ) に、200 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 1.3 ml 及び各種濃度の基質 ( 0.01-0.40 mM ) 0.15 ml を添加し、30℃ で 5 分間インキュベートした後、酵素溶液 0.05 ml ( 0.05μg ) を加えて反応させた。正確に一定時間後 ( 10-135 分間 )、45% 酢酸 0.5 ml を加えて反応を停止し、酵素作用によって遊離した ｐ-ニトロアニリドを 405 nm の吸光度で測定し、アミダーゼ活性を得た。
【００７２】
(iii)各種基質に対する本酵素の基質特異性
上記方法(i),(ii)により、各種Arg、及び Lys 含有pNA基質、並びに各種Arg、及び Lys 含有 MCA基質に対する各種酵素の動力学的定数 ( Km、kcat ) を算出した。尚、本酵素の各種pNAに対する触媒中心活性 ( kcat ) は、モル吸光係数 9,620を用い、本酵素の分子量を 29,000 として最大活性 ( Vmax ) より算出した。また、比較のために用いられた市販のウシ及びブタ膵臓由来トリプシンの分子量をそれぞれ、24,000 及び 23,300 として kcat を算出した。
各種 Arg 及び Lys 含有pNA基質に対する本酵素の動力学的定数(km及びkcat)の結果を表8に、また、各種 Arg 及び Lys 含有 MCA基質に対する本酵素のそれらを表9 に示した。
【００７３】
【表８】
2005065556.tif 000009
【００７４】
【表９】
2005065556.tif 000010
【００７５】
上記結果から、本酵素の Bz-Arg-pNA に対する kcat/Km 値は、1,920 であることが分かった。この値は、ウシ及びブタ由来トリプシンのそれら ( 約 2.0 及び 約 13.0 ) と比較して、約 960 倍 及び 約 150 倍であった。また、既に報告されている ストレプトマイセスグリセウス、ストレプトマイセスフラジアエ及びストレプトマイセスエリセウス由来のトリプシン様セリンプロテアーゼの Bz-Arg-pNA に対する kcat/Km 値 ( 約 260、約 170 及び約 90 )と比較しても、7-20 倍の高い値を示していた。
【００７６】
また、本酵素の Bz-Arg-MCA に対する kcat/Km 値 ( 13,800 ) は、ウシ及びブタ由来トリプシンのそれら (3.4 及び 3.8 ) と比較して、約 4,000 倍及び約 3,600 倍高い値を示した。また、Z-Phe-Arg-MCA、Boc-Leu-Arg-Arg-MCA、Boc-Gln-Gly-Arg-MCA 及び Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA に対する本酵素の kcat/Km 値 ( 約 41,000、約 32,000、約41,000 及び約 53,000 ) は、Bz-Arg-MCA と比較して 2-4 倍高い値を示した。これらの MCA基質において、P1 位から N-末端側に 3 残基延長した Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA の kcat/Km 値は、約 53,000 と最も高い値を示し、ウシ及びブタ膵臓由来トリプシンのそれら (  6,000 及び 3,500 ) と比較して、約 9 倍及び約 15 倍高い値を示した。
【００７７】
以上の結果から、本酵素は、Arg 含有のpNA基質及び MCA基質を特異的に切断し、また、ウシ・ブタ膵臓由来のトリプシンと比較しても両基質に対して非常に高い親和性を示した。このことから、本酵素はトリプシン様セリンプロテアーゼの一種であることが強く示唆された。
また、本酵素は、Arg-pNA 及び Lys-pNA を弱いながらも加水分解したことは、本酵素が、エンドペプチダーゼに属しながらも、弱いエキソペプチダーゼ活性も有していることも示された。
【００７８】
(3)アンジオテンシンII に対する本酵素の作用
アルギニルペプチド結合がペプチド鎖中に 1 ヶ所存在する アンジオテンシンII ( 8 残基 ) を用いて、本酵素の基質特異性を検討した。
即ち、アンジオテンシンII 100μg ( 95.6 nmol ) を 20 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 0.1 ml に溶解した ( 0.1% 濃度 )。次いで、モル比で基質の 1/2,000 相当量の酵素 ( 1.39μg、47.8 pmol ) を加えて、30℃ で 9 時間反応を行った。反応終了後、その分解物を 100℃ の沸騰水中で 3 分間加熱して反応を停止させ、凍結乾燥した。凍結乾燥した分解物は、0.05% TFA を含むミリキュー処理超純水 100μl に溶解させ、HPLC で分画し、精製した結果を 図16 に示した。尚、分画は以下のHPLC条件で行った。
HPLC機器：L-6300 型（日立社製）、固定相： 東ソー TSKgel Octyl-80Ts カラム ( 4.6 ID×25 cm )、移動相：A液 ;0.05% TFA 水溶液、B液;Isopropanol/Acetonitrile = 7/3 ( v/v )( 0.05% TFA を含む )
また、分画された 5 つのピーク ( AT-1、-2、-3、-4 及び -5 ) のアミノ酸組成、N-末端アミノ酸配列及び回収率を 表10 に示した。尚、表10中の()内の数字はペプチド中の既知のアミノ算配列数を表す。
【００７９】
尚、アミノ酸組成は以下のようにして分析した。即ち、定沸点 6 N塩酸溶液を加水分解用試験管 ( バキュームハイドロリシスチューブ、10×15.0 cm ) に移し、減圧封管後、110℃、22 時間酸加水分解した後、酸加水分解後放冷し、水酸化ナトリウム入りのデシケーター中で再び減圧乾固した。この乾固物に、0.02 N 塩酸アミノ酸分析用希釈液 ( pH 2.2 ) を 2 nmol/20μl となるように添加し、日立 L-8800 型アミノ酸分析計を用いて同定した。
【００８０】
また、N-末端アミノ酸配列分析法は、以下のようにして行った。即ち、HPLCで分画した各ペプチドをスピッチ型試験管 ( 1.3×10.5 cm ) に分取し、減圧乾固した後、1.0 nmol/ml になるようにミリキュー処理超純水で希釈し、アップライバイオシステム 494プロテインシークエンサーを用いて、N-末端アミノ酸配列を同定した。
【００８１】
【表１０】
2005065556.tif 000011
【００８２】
表１０から、AT-1、-2、-3、-4 及び -5 はそれぞれ、Asp1-Arg2、Val3-Tyr4、Asp1-Tyr4、Ile5-Phe8 及び Val3-Phe8 のペプチドであることが認められた。
【００８３】
以上の結果から、本酵素は、アンジオテンシンII 中のアルギニルペプチド結合である Arg2-Val3 結合に加えて、チロシルペプチド結合である Tyr4-Ile5 結合が、本酵素によって加水分解されたことを示している ( 図17参照 )。
【００８４】
即ち、ペプチド鎖中に 1 ヶ所存在する Tyr4-Ile5 結合が加水分解された AT-3 ( Asp1-Tyr4 ) 及びAT-4 ( Ile5-Phe8 ) の回収率はそれぞれ 25.29% 及び 29.59% と、５つのピークの中で最も高いこと、またほぼ同収率であることから、第１次的に加水分解されていることが示唆された。また、合成基質に対する特異性の結果 ( 表7参照 ) から推測されていた Arg2-Val3 結合の加水分解によって生じた AT-1 ( Asp1-Arg2 ) 及び AT-5 ( Val3-Phe8 ) の回収率は、11.92% 及び 6.17% と低く、AT-2 ( Val3-Tyr4 ) の回収率は 2.02% と最も低い回収率であった。これらの結果から、本酵素は アンジオテンシンII に対して、まず、Tyr4-Ile5 結合を優位に加水分解し、同時に Arg2-Val3 結合もまた加水分解していることが示唆された。次いで、生じた AT-3 ( Asp1-Tyr4 )ペプチド中のArg2-Val3 結合、或いはAT-5 ( Val3-Phe8 )ペプチド中のTyr4-Ile5 結合が本酵素によって弱く加水分解されて、AT-2 ( Val3-Tyr4 ) が生じたものと考えられた。
尚、本酵素は、合成基質 Bz-Tyr-pNA を加水分解しないにもかかわらず、ペプチド鎖中の Tyr4-Ile5 結合を切断した。この結果は、既知のトリプシンが、合成基質とペプチド基質の切断点が一致していることと異なっていた。
【００８５】
(4)α-MSH(メラノサイト刺激ホルモン) に対する本酵素の作用
アルギニルペプチド結合及びリジルペプチド結合がペプチド鎖中に一ヶ所ずつ存在する α-MSH ( 15 残基 ) を用いて、本酵素の基質特異性を検討した。
即ち、α-MSH 100μg ( 60.0 nmol ) を 20 mM トリス塩酸緩衝液 ( pH 9.2 ) 0.1 ml に溶解した ( 0.1% 濃度 )。次いで、モル比で基質の 1/2,000 相当量の酵素 ( 0.87μg、30.0 pmol ) を加えて、30℃ で 18 時間反応を行った。反応終了後、その分解物は 100℃ の沸騰水中で 3 分間加熱して反応を停止させ、凍結乾燥した。凍結乾燥した分解物は、0.05% TFA を含むミリキュー処理超純水 100μl に溶解させ、HPLC で分画し、精製した結果を 図18 に示した。分画された 8 つのピーク ( α-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7 及び -8 ) のアミノ酸組成、N-末端アミノ酸配列及び収率を 表11 に示した。尚、表11中の()内の数字は既知のアミノ算配列数を表す。
【００８６】
【表１１】
2005065556.tif 000012
【００８７】
表１１から、α-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7 及び -8 はそれぞれ、Pro12-Val13、His6-Arg8、Glu5-Arg8、Trp9-Lys11、Trp9-Val13、Ser1-Glu5、Ser1-Met4 及びSer1-Arg8のペプチドであることが認められた。
以上の結果から、本酵素は、α-MSH 中のアルギニルペプチド結合である Arg8-Trp9結合、及びリジルペプチド結合であるLys11-Pro12結合に加えて、存在するメチオニルペプチド結合である Met4-Glu5 結合及びグルタミルペプチド結合であるGlu5-His6 結合が、本酵素によって加水分解されたことを示された ( 図19参照 )。
【００８８】
また、Arg8-Trp9結合が加水分解されて生じた α-8 ( Ac-Ser1-Arg8 ) 及び α-5 ( Trp9-Val13-NH2 ) の回収率は、それぞれ 33.33% 及び 21.08% と、HPLC によって得られた 8 つのペプチドの中で高く ( 表11参照 )、このアルギニルペプチド結合が、本酵素によって優位に加水分解されていることが示唆された。更に、ペプチド鎖中の Met4-Glu5 結合が加水分解されて生じる α-7 ( Ac-Ser1-Met4 ) 及び α-3 ( Glu5-Arg8) の回収率はそれぞれ、19.17% 及び 19.00% とほぼ等しいことから、まず、α-MSH の Arg8-Trp9 結合が加水分解されて、α-8 ( Ac-Ser1-Arg8 ) のペプチドが得られた後、このペプチド鎖中の Met4-Glu5 結合が加水分解されたと考えられた。また、同様に、α-MSH の Glu5-His6 結合が加水分解されて生じる α-6 ( Ac-Ser1-Glu5 ) 及び α-2 ( His6-Arg8 ) の回収率が、3.92% 及び 3.41% とほぼ等しく、かつ低いことから、この 2 つのペプチドの生成についても、α-MSH の Arg８-Trp９ 結合が加水分解されて、α-8 ( Ac-Ser1-Arg9 ) のペプチドが得られた後、このペプチド鎖中の Glu５-His６ 結合が加水分解されたと考えられた。しかしながら、α-6 ( Ser1-Ac1-Glu５ ) 及び α-2 ( His６-Arg８ ) の両ペプチドの回収率が、低いことから、本酵素のグルタミルペプチド結合に対する特異性は低いものと考えられた。
尚、本酵素は、合成基質 Boc-Met-pNA 及び Ac-Glu-pNA を加水分解しないにもかかわらず、ペプチド鎖中の Met４-Glu５ 結合及び Glu５-His６ 結合を切断していた。この結果は、既知のトリプシンが、合成基質とペプチド基質の切断点が一致していることと異なっていた。
【００８９】
このように、合成基質 Bz-Tyr-pNA、Boc-Met-pNA 及び Ac-Glu-pNA は加水分解しないにもかかわらず、ペプチド鎖中の Tyr-Ile 結合、Met-Glu 結合及び Glu-His 結合が本酵素によって加水分解されるという結果は、トリプシン様セリンプロテアーゼでは本酵素が初めてである。
【００９０】
また、以上の結果から、本酵素は、合成基質及びペプチド鎖中の Arg-X 結合、及び Lys-Pro 結合を含む Lys-X 結合を加水分解することが明らかとなった。更に、ペプチド基質では、既知のトリプシン様セリンプロテアーゼでは全く報告されていない Tyr-X 結合、Met-X 結合及び Glu-X 結合が加水分解された。従って、本酵素が既知のセリンプロテアーゼと比較して、その活性中心に広いサブサイトが存在していることが予想され、トリプシン様セリンプロテアーゼとしては、新規なプロテアーゼであることが強く示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明に係るリゾバクター属IB-9374 の培養曲線（吸光度660nm）とそのときのアミダーゼ活性を表した図である。
【図２】リゾバクター属IB-9374から酵素を精製する際の各ステップを説明した図である。
【図３】実施例１  ２．(9)で得られた泳動後の画分(フラクション)のpH、280nmの吸光度及び酵素(アミダーゼ)活性を表す。
【図４】実施例１  ２．(11)で得られた本酵素のSDS-PAGEによる泳動結果を表したものである。
【図５】SDS-PAGEによる、各種分子量のタンパク質とその相対異動度をグラフにしたものである。
【図６】各種緩衝液を用い、ｐＨを変化させたときの本酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図７】温度を変化させたときの本酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図８】各種緩衝液を用い、温度を変化させたときの本酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図９】温度を変化させたときの本酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図１０】尿素濃度を変化させたときの各種酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図１１】グアニジン塩酸塩濃度を変化させたときの各種酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図１２】ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)濃度を変化させたときの各種酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図１３】各種緩衝液を用い、Bz-Arg-MCAを基質とし、ｐＨを変化させたときの、本酵素のアミダーゼ活性の変化を表したグラフである。
【図１４】Bz-Arg-pNA に対する本酵素(A)及びブタ膵臓由来トリプシン(B)の Lineweaver-Burk プロットを夫々表す。
【図１５】Bz-Arg-MCA に対する本酵素(A)及びブタ膵臓由来トリプシン(B)の Lineweaver-Burk プロットを夫々表す。
【図１６】本酵素によるアンジオテンシンIIの分解物を液体クロマトグラフィーで分画したときの液体クロマトグラフを表す。
【図１７】本酵素のアンジオテンシンIIの切断部位を表した図である。
【図１８】本酵素によるα-MSH(メラノサイト刺激ホルモン)の分解物を液体クロマトグラフィーで分画したときの液体クロマトグラフを表す。
【図１９】本酵素のα-MSH(メラノサイト刺激ホルモン)の切断部位を表した図である。
【符号の説明】
【００９２】
図１における、−○−は、リゾバクター属IB-9374を培養したときの培養液を吸光度660nmで測定した値（培養曲線）を、−×−はリゾバクター属IB-9374を培養したときのアミダーゼ活性を表す。
【００９３】
図３において、−●−は、各画分(フラクション)の280nmにおける吸光度を、−○−は、各画分のpHを、−×−は各画分のアミダーゼ活性を表す。
【００９４】
図５における、１は分子量９４０００のホスホリラーゼＢの結果を、２は分子量６７０００の血清アルブミンの結果を、３は分子量４３０００のオブアルブミンの結果を、４は分子量３００００のカルボン酸アンヒドラーゼの結果を、５は分子量２０１００のトリプシンインヒビターの結果を、６は分子量１４４００のα-ラクトアルブミンの結果を、●は本酵素の結果を表す。
【００９５】
図６における、―○―はグリシン塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―×―はクエン酸緩衝液を用いた時の結果を、―■―はリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液を用いた時の結果を、―△―トリス塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―●―は2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMP)-塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―□―はグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を用いた時の結果を夫々表す。
【００９６】
図８における、―○―はグリシン塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―×―はクエン酸緩衝液を用いた時の結果を、―■―はリン二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液を用いた時の結果を、―△―トリス塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―●―は2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMP)-塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―□―はグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を用いた時の結果を夫々表す。
【００９７】
図10における、―○―は本酵素のアミダーゼ活性値を、―●―は、ウシ膵臓由来トリプシンのアミダーゼ活性値を、―△―はブタ膵臓由来トリプシンのアミダーゼ活性値を夫々表す。
【００９８】
図11における、―○―は本酵素のアミダーゼ活性値を、―●―は、ウシ膵臓由来トリプシンのアミダーゼ活性値を、―△―はブタ膵臓由来トリプシンのアミダーゼ活性値を夫々表す。
【００９９】
図12における、―○―は本酵素のアミダーゼ活性値を、―●―は、ウシ膵臓由来トリプシンのアミダーゼ活性値を、―△―はブタ膵臓由来トリプシンのアミダーゼ活性値を夫々表す。
【０１００】
図13における、―○―はトリス塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―×―は2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMP)-塩酸緩衝液を用いた時の結果を、―■―はグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を用いた時の結果を夫々表す。
【図１】
2005065556.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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