(57)【要約】【課題】アスコクロリン、その類縁物質及びその誘導体のアルデヒド残基を選択的にカルボン酸に酸化する。【解決手段】アスコクロリン、その類縁物質及びその誘導体のフェノール性水酸基をすべてアルキル化又はアシル化することにより保護し、芳香族アルデヒド基を酸化剤で選択的に酸化して相当するカルボン酸を合成する。合成されたカルボン酸はレチノイド受容体、レチノイド・オーファン受容体、パーオキシソーム増殖活性化因子受容体（ＰＰＡＲα）、ステロイド受容体（ＰＸＲ）等の核内受容体スーパーファミリーを活性化するリガンドであり、生活習慣病、慢性炎症及びガンなどの疾病に対する治療効果を有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基を選択的に酸化する方法であって：
（ａ）化合物を過剰のアシル化剤と反応させ、２位及び４位の水酸基の双方をアシル化し；そして
（ｂ）得られたジアシル体をそのまま酸化する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
オルシルアルデヒド部分であって２位又は４位の水酸基の一方がアルキル化又はアシル化された前記部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基を選択的に酸化する方法であって：
（ａ）化合物を過剰のアシル化剤と反応させ、アルキル化又はアシル化されていない２位又は４位の水酸基の他方をアシル化し；そして
（ｂ）得られたモノ又はジアシル体をそのまま酸化する
工程を含む、前記方法。
【請求項３】
オルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基を選択的に酸化する方法であって：
（ａ）化合物をアルキル化剤と反応させ、２位及び４位の水酸基の双方をアルキル化し；そして
（ｂ）得られたジアルキル体を酸化する
工程を含む、前記方法。
【請求項４】
化合物が、そのオルシルアルデヒド部分のアルデヒド基が生物的に酸化されないものである、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
化合物が、以下からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
【化１】
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【化２】
2005053780.tif 000015
【化３】
2005053780.tif 000016
【化４】
2005053780.tif 000017
及び、
【化５】
2005053780.tif 000018
【請求項６】
請求項５に記載された群より選択されるいずれか１つのアルデヒド化合物の、対応するカルボン酸。
【請求項７】
アスコクロリン、シリンドロクロリン、クロロネクチン、ＬＬＺ−１２７２ａ、ＬＬＺ−１２７２−ｄより選択されるいずれか１つに対応する、請求項６のカルボン酸。
【請求項８】
請求項６若しくは７のカルボン酸、又はその医薬として許容できる塩を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項９】
ＩＩ型糖尿病、動脈硬化、甲状腺機能障害、骨代謝障害、大腸ガン、自己免疫疾患、慢性炎症又はガンの治療又は予防のための、請求項８の医薬組成物。
【請求項１０】
血清コレステロール値を低下させるための、請求項８の医薬組成物。
【請求項１１】
肝臓の薬物代謝酵素ＣＹＰ７Ａ１遺伝子の転写を促進するための、請求項８の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本特許はオルシルアルデヒドの３位にテルペン側鎖が結合し、一般にプレニルフェノール系抗生物質と呼ばれる一群の微生物代謝産物及びそれらの誘導体、例えば、アスコクロリン、シリンドロクロリン、クロロネクチン、４−Ｏ−アルキル誘導体、２−Ｏ−アルキル誘導体、４−Ｏ−アシル誘導体、２−Ｏ−アシル誘導体等の芳香族アルデヒド基を有機合成的に相当するカルボン酸に酸化する方法に関する。本方法は高度に選択的であり、得られるカルボン酸は核内リセプターを活性化するリガンドとして生活習慣病、甲状腺機能障害、骨代謝障害及び悪性腫瘍などにかかわる遺伝子情報の発現を制御する作用を示す。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
アスコクロリンは本発明者等により１９６８年、抗ウイルス抗生物質をスクリーニングする過程で生産菌である不完全糸状菌Ａｓｃｏｃｈｙｔａ  ｖｉｃｉａｅ  Ｌｉｂｅｒｔの代謝産物として単離されアスコクロリンと命名された（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ２１：  ５３９−５４４，  １９６８）。アスコクロリンの絶対構造は本発明者らによりＸ線回折法で３−［５−［１（Ｒ），２（Ｓ），６（Ｓ）−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］−３−ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｄｉｅｎｙｌ−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅと決定されている（Ｎａｗａｔａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ２２：  １９６９）。その後、同じ化合物は、アメリカン・サイアナマイド（レダリー・ラボラトリーズ、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ３，５４６，０７３，  Ｄｅｃ．  ８，  １９７０）からＬＬＺ１２７２−Ｃなる名称で出願された真菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．の代謝産物、並びに１９６８年１０月２３日、出願番号Ｎｏ．５０３５４／６８でインペリアル・ケミカル・インダストリー社から出願され、さらに、化合物の構造が決定して追加出願が行われ、１９７２年４月１２日に完結した特許出願の化合物と同一であった。しかし、本発明者のグループは、１９６８年３月に日本特許を出願し、１９６９年、分子内に臭素原子を導入したＸ線回折法により疑問の余地なく絶対構造を解明したので、今日ではアスコクロリンと言う名称が一般名として定着している。
【０００３】
一方、アメリカのメルク社は、１９９４年、発ガン性タンパク質ｒａｓが細胞内でファルネシル化されて細胞膜に移動し、細胞をガン化させる過程を阻害する物質としてアスコクロリン系化合物を発見し、特許を取得した（Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ９４−２２２７７３  （Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ））。ｒａｓは生合成の場である細胞質に止まっている限り細胞をガン化させないが、ファルネシル・トランスフェラーゼによってファルネソールと結合し細胞膜に移動すると細胞をガン化させるのである。
【０００４】
また、大村等は男性ホルモンを生合成する際の律速段階であるアロマターゼの阻害剤を微生物代謝産物のなかにスクリーニングしたところ、真菌の代謝産物のなかに強力な阻害物質を単離した。同定したところ、アロマターゼ阻害物質はシリンドロクロリンであったと報告している（大村、高松等、Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ４２：  ９５３−９５６，  ９４年）。上記の化合物はいずれもオルシルアルデヒドの３位にセスキテルペン側鎖が結合した構造を持っている点で共通していて、本発明者等はこれらの化合物を総称しプレニルフェノールと呼んでいる。
【０００５】
プレニルフェノールの特徴は、多彩な生物活性を呈する点にある。例えば、本発明者等はアスコクロリンが核酸及びタンパク質の生合成に影響を与えないにもかかわらず、動物ウイルスの増殖を阻止することを発表している。一方、レダリーの研究者等は特許のなかで、プレニルフェノールが原生動物テトラヒメナの生育を阻害するとともに、マウス及びラットの血清コレステロールを低下させる作用があると述べている。とりわけ、アスコクロリンのシクロヘキサノン環を脱水素して生成するシリンドロクロリンは、強力な血清コレステロール低下作用を示す。
【０００６】
ＩＣＩの特許によれば、アスコクロリンは血清コレステロール低下作用とともに、齧歯類動物に対し強力な食欲抑制作用を示す。その食欲抑制作用は、４８時間絶食させ飢餓状態のマウスを被検動物として飼料摂取２時間前にアスコクロリンを極微量経口投与すると、摂食開始２時間以内における飼料摂取量を半分に抑制するほど強力である。さらに、ＩＣＩ特許はアスコクロリンが昆虫に対して殺虫作用を示すとともに、ラットの関節炎に対し、関節炎の発症を軽減する効果を示すと記述している。
【０００７】
本発明者等は、アスコクロリンの誘導体であるアスコフラノンを単離して構造決定を行い、この化合物に齧歯類動物に対する血清コレステロール低下作用及び抗ガン作用があることを見いだした（Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２５：  ３５−３９，  １９７５及びＪ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３５：  １５４７−５２，  １９８２）。さらに、プレニルフェノールの呈する薬理作用を検討したところ、アスコクロリン、アスコフラノン及び４−Ｏ−メチルアスコクロリンは、片側の腎臓を摘出したラットにミネラルコルチコイドであるデオキシコルチコステロン・酢酸エステルを投与し、飲料水として食塩水を与えて発症させる高血圧症を有意に抑制すること、血圧の上昇に伴って起こる高コレステロール血症を阻止すること、病理組織学的には腎臓糸球体に起こる硬化症を軽減し、腎不全状態に陥るのを予防することを明らかにした（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６９：  ４２９−４３８，  １９８１）。プレニルフェノールの作用のなかで最も興味深いのは、これらの物質が動物個体レベルにおけるインスリン抵抗性を解除し、インスリン作用を増強する効果である（Ａｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ４６：  ２８６５−６９，  １９８２，；  ＤＩＡＢＥＴＥＳ  ３４：  ２６７−２７４，  １９８５）。
【０００８】
アスコクロリン及び天然から分離されるその関連化合物、並びにオルシルアルデヒドの２位あるいは４位、さらに双方の水酸基をアルキル基ないしアシル基で置換したアスコクロリン誘導体は、本命者等の研究により細胞培養レベルにおいて核内リセプターＲＸＲ（レチノイドＸリセプター）、ＲＡＲ（オールトランス−レチノイン酸リセプター）、ＰＰＡＲ（パーオキシソーム増殖因子活性化リセプター）等を活性化し、動物個体レベルでは種々の疾病に関連する遺伝子の情報発現を制御する作用が知られている。しかし、上記のアスコクロリン及びその誘導体は高度に脂溶性であるため、結晶粒子から単分子が離れて水に溶け込む速度がきわめて遅いため大部分が吸収されずに消化管を通過するため吸収率が低く、実験の再現性に乏しかった。すなわち、バイオアベイラビリティの低さが実用化を阻む大きな障害になっていたのである。脂溶性であるため製剤化が難しく、食事摂取の有無（Ａｇｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；４６：７７５−７８１（１９８２））よってバイオアベイラビリティが大きく変動する欠点があった。
【０００９】
アスコクロリン系化合物は水に対する溶解度が１μｇ／ｍｌ以下である。水に対する溶解度が低い薬物の消化管吸収は、薬物粒子から単分子が水にとけ出す溶解速度によって支配されている。アスコクロリン系化合物の粒子は水をはじく性質があるため、水に溶解する速度がきわめて緩慢である。粒子を水に濡らし水への溶解を促進するためには、胆汁酸のように強力な界面活性剤の共存が必要である。従って、消化管に胆汁酸が存在しない空腹時に内服しても殆ど吸収されない、胆汁酸の分泌が少ない油脂含量が低い食事を摂取すると、消化管からの吸収率が低下する等の再現性よく薬効を発現させることが難しかった。
【００１０】
アスコクロリン系化合物の極性を上昇させ水に対する溶解度を増加させる方法の一つは、オルシルアルデヒドのアルデヒド基をカルボン酸に酸化することがあげられる。芳香環アルデヒド基がカルボン酸に酸化されれば、小腸のような弱アルカリ性環境下では水溶性になり、消化管からの吸収が容易になって製剤化が簡単になることが予想される。しかし、従来の技術ではアスコクロリンの側鎖構造を保存したまま、アルデヒド基をカルボン酸へ酸化することは困難であった。
【００１１】
アスコクロリン系化合物は、芳香環アルデヒド基が生物的に酸化され相当するカルボン酸を生ずるグループと、生物的にまったく酸化されないグループに二大別することができる。前者に属する代表的な関連化合物アスコフラノン及び誘導体４−Ｏ−カルボキシメチルアスコクロリンは、動物の肝臓磨砕物あるいは酢酸菌及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属最近等によって側鎖の構造を保持したまま、容易にアルデヒド基がカルボン酸に酸化される。また、これらの化合物は動物に投与すると、生体内で酸化されアルデヒドが酸化されカルボン酸を生ずる。つまり、これらの化合物は薬物代謝酵素の基質となって酸化される性質を持っており、生体に投与した場合、アルデヒド基がカルボン酸に転換された化合物が生体内における主要な代謝産物である。
【００１２】
【化６】
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【００１３】
すなわち、アルデヒドが酸化されたカルボン酸は、水に対する溶解度が増大した解毒排泄型の化合物と考えることができる。しかし、カルボン酸は母化合物の薬効を喪失したわけではない。例えば、４−Ｏ−カルボキシメチルアスコクロリンのカルボン酸型をｄｂ／ｄｂマウスに投与すると、母化合物の三倍量でほぼ同等の薬効を示す。
【００１４】
一方、アスコクロリン及び４−Ｏ−アルキルアスコクロリンのアルデヒド基は、動物あるいは微生物によって酸化されない。動物に投与すると、原構造を保持したままで糞中に排泄される。また、これらの化合物を微生物あるいは肝臓磨砕物によりアルデヒド基をカルボン酸に酸化しようとしても、原料が回収されるだけでカルボン酸に酸化されることはない。つまり、これらの化合物は薬物代謝酵素の基質になり得ないのである。
【００１５】
有機化学的な手法でアスコクロリン誘導体を合成している主要な論文及び特許は次の通りである。米国レダリー研究所はカビ、Ｆｕｓａｒｉｕｍからアスコクロリンを単離し、その構造を決定する過程で数種の誘導体を合成している（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  Ｅｌｓｔａｄ  Ｇ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ：  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２５：  １３２３−３４，  １９６９）。さらに、サファリン等（Ｓａｆａｒｙｎ  Ｊ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４２：  ２６３５−４２，  １９８６）並びに森等（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４１：  ３０４９−６２，  １９８５  ＆  ｉｂｉｄ  ４０：  ２７１１−２０，  １９８４）はアスコクロリンの全合成に挑戦して成功している。一方、前記のメルク社は発ガンタンパク質ｒａｓのファルネシル化酵素の阻害活性を上昇させることを目的として幾つかの誘導体を合成している。しかし、全合成あるいはプレニルフェノールを出発原料として用いる半合成的な手法によっても、オルセニルアルデヒド基を選択的に酸化してカルボン酸とする方法は報告されていない。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
アスコクロリンのアルデヒド基をカルボン酸に酸化するためには、２位及び４位のフェノール性水酸基の双方を保護する必要がある。保護しない場合にはテルペン側鎖が酸化され水酸基と反応し環状のクロマンを生成する。アスコクロリンをアシル化剤でフェノール性水酸基をアシル化すると、４位の水酸基が優先的に反応してアシル化される。しかし、過剰のアシル化剤の存在下に反応させると、得られるジアシル体と思われる反応生成物は油状で、種々の有機溶媒に溶かして結晶化を試みてもジアシル体は結晶化しない。この油状反応生成物をシリカゲル又はアルミナのカラムクロマトグラフィーによって精製を試みると、ジアシル体の２位に結合したアシル基は加水分解されるので、得られるのは４位がアシル化された４−Ｏ−ａｃｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎだけである。
【００１７】
本発明者らは、アスコクロリンのアルデヒド基をカルボン酸に酸化するための方法を鋭意検討した。その結果、アスコクロリンを過剰のアシル化剤存在下で反応させることにより、２位及び４位のフェノール性水酸基双方をアシル化することができ、そして得られたジアシル体を精製することなくそのまま酸化剤の存在下で反応させることにより意図したカルボン酸が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明の方法によれば、反応条件を適宜選択することで、ジアシル化されたアスコクロリンを９０％以上の収率で得ることも可能である。
【００１８】
すなわち、本発明は、オルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖（好ましくはセスキテルペノイド鎖）が結合した構造を有する）を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基を選択的に酸化する方法であって：（ａ）化合物を過剰のアシル化剤と反応させ、２位及び４位の水酸基の双方をアシル化し；そして（ｂ）得られたジアシル体をそのまま酸化する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１９】
また、本発明の方法に準じれば、オルシルアルデヒド部分であって２位又は４位の水酸基の一方がアルキル化又はアシル化された前記部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基をも、選択的に酸化することができ、また、オルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基をも、選択的に酸化することもできる。したがって、本発明は、オルシルアルデヒド部分であって２位又は４位の水酸基の一方がアルキル化又はアシル化された前記部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基を選択的に酸化する方法であって：（ａ）化合物を過剰のアシル化剤と反応させ、アルキル化又はアシル化されていない２位又は４位の水酸基の他方をアシル化し；そして（ｂ）得られたモノ又はジアシル体をそのまま酸化する
工程を含む、前記方法、並びにオルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、オルシルアルデヒド部分のアルデヒド基を選択的に酸化する方法であって：（ａ）化合物をアルキル化剤と反応させ、２位及び４位の水酸基の双方をアルキル化し；そして（ｂ）得られたジアルキル体を酸化する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
なお、本明細書では、オルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖が結合した構造を有する化合物の、アシル化を経た酸化方法を中心に記述することがあるが、そのような記述がオルシルアルデヒド部分であって２位又は４位の水酸基の一方がアルキル化又はアシル化された前記部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の酸化方法、並びにオルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物の、アルキル化を経た酸化方法にも当てはまることは当業者には自明である。
【００２１】
また、本明細書でいうアルキル化とは、特別な場合を除き、水酸基の水素をアルキル基で置換することをいう。アルキル基とは、直鎖、環状、又は分枝を有する飽和一価炭化水素原子団をいう。アルキル基の炭素数は、意図した置換の効果が発揮され、かつ化合物の本来の機能が著しく減じられなければいずれでもよいが、好ましくは、１〜１０、更に好ましくは１〜５（例えばメチル基、エチル基）である。また、本明細書でいうでいうアシル化とは、特別の場合を除き、水酸基の水素をＲＣＯ−で置換することをいう。Ｒ部分は、脂肪族又は芳香族炭化水素原子団を意味する。Ｒ部分の炭素数は、意図した置換の効果が発揮され、かつ化合物の本来の機能が著しく減じられなければいずれでもよいが、好ましくは、１〜２０、更に好ましくは１〜１０（例えば、１又は２）である。
【００２２】
本発明の方法で酸化される化合物は、好ましくは、そのオルシルアルデヒド部分のアルデヒド基が生物的に酸化されないものである。より好ましくは、化合物が、以下からなる群より選択されるものである。
【００２３】
【化７】
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【００２４】
【化８】
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【００２５】
【化９】
2005053780.tif 000006
【００２６】
【化１０】
2005053780.tif 000007
【００２７】
及び、
【００２８】
【化１１】
2005053780.tif 000008
【００２９】
本発明の方法で酸化される化合物は、最も好ましくは、アスコクロリン、シリンドロクロリン、クロロネクチン、並びにＬＬＺ−１２７２ａ及びＬＬＺ−１２７２−ｄ（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ
３，５４６，０７３参照）である。
【００３０】
工程（ａ）においては、化合物は過剰のアシル化剤で処理される。
アシル化のためには、同様の目的のために用いられる常法を用いることができる。アシル化剤、溶媒、反応時間及び温度も、目的を達成することができれば特に限定されないが、例えば本明細書の実施例で用いているような条件を適用することができる。
【００３１】
用いられるアシル化剤の量は２位及び４位の水酸基の双方を充分にアシル化することができる量であり、例えば、化合物に対し、約１．１モル等量以上、より好ましくは約２．０等量以上、最も好ましくは約３．０等量以上使用することができる。
【００３２】
工程（ｂ）は、得られたジアシル体を、ジアシル体を分解してしまうような精製工程を経ることなく、そのまま酸化する工程である。
２位及び４位のフェノール性水酸基双方がアシル化されたアスコクロリンは通常は油状であるが、ジアシル体を精製することなくそのまま酸化剤の存在下で反応させ、アルデヒド基を選択的にカルボン酸に酸化する。酸化のためには、同様の目的のために用いられる常法を用いることができる。
【００３３】
酸化剤は、目的を達成することができれば特に限定されないが、好ましくは塩素酸ソーダを用いることができる。溶媒、反応時間及び温度も、目的を達成することができれば特に限定されないが、例えば本明細書の実施例で用いているような条件を適用することができる。
【００３４】
得られた酸化物は、脱保護し（例えば、アルカリ性の条件下でアシル基を加水分解することにより）フェノール性水酸基を再生することが可能である。
このようにして得られた、出発物質（オルシルアルデヒド部分及びオルシルアルデヒドの３位に結合したテルペノイド鎖を有する化合物）に対応するカルボン酸は、新規である。従って本発明は、上記群のアルデヒド化合物に対応するカルボン酸をも提供する。これらのうち、アスコクロリン、シリンドロクロリン、クロロネクチン、ＬＬＺ−１２７２ａ、ＬＬＺ−１２７２−ｄに対応するカルボン酸が特に好ましい。
【００３５】
得られたカルボン酸は、それ自身が動物細胞の核内リセプターに結合するリガンドであり、レチノイドＸリセプター（ＲＸＲ）、レチノイドリセプター（ＲＡＲ）、ステロイド・オーファンリセプター（ＰＸＲ）及びパーオキシソーム増殖応答因子リセプター（ＰＰＡＲ）等々の核内リセプターを活性化する新規リガンドを合成する際における母化合物としてきわめて有用である。これらは生活習慣病、甲状腺機能障害、骨代謝障害、慢性炎症及び悪性腫瘍等の発症と増悪に関与する遺伝子情報の発現を制御する機能を持っているからである。とりわけ、アスコクロリンカルボン酸及びシリンドロクロリンカルボン酸は、２位及び４位の水酸基をアルキル基あるいはアシル基で修飾することにより、新しい核内リセプターリガンドを合成する母化合物になりうるので、新しい医薬品の資源としてすこぶる有用である。アスコクロリン類縁化合物のオルシルアルデヒド基の２位及び／又は４位の水酸基の水素を置換した誘導体は、アスコクロリンが示す強い摂餌抑制作用が緩和される等の観点から好ましい。
【００３６】
【発明の実施の態様】
本発明の化合物を投与する場合、類似の用途に供される薬剤が許容されている任意の投与経路で純品の形又は適当な医薬組成物の形で製剤化して投与することができる。従って投与は、例えば錠剤、座剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ローション剤、エアゾール剤、軟膏剤、ゲル化剤などのような固体、半固体、凍結乾燥粉末又は液体投与形態で、例えば経口、鼻腔内、非経口又は局所的に、好ましくは正確な容量を１回に投与しうる適当な単位用量形態で実施することができる。この組成物は通常の製薬用単体又は賦形剤及び本発明の化合物からなり、さらにその他の医療用医薬品、担体及び吸収補助剤などを含有してもよい。一般に製剤上許容しうる組成物は、投与しようとする剤型に応じて、本発明の化合物を約１〜９９（重量）％含有し、適当な医薬添加物を約９９〜１％含有している。この組成物は、医療用医薬品として本発明の化合物を約５〜７５％含有し、残りは適当な医薬品用賦形剤を含有している。本発明の化合物が病態を改善するために有効な一日あたりの投与量は、成人の体重ｋｇあたりで０．１〜２０ｍｇ／ｋｇにあり、望ましくは０．２〜５ｍｇ／ｋｇである。
【００３７】
先に詳細に説明した疾患に対する好ましい投与形態は、疾患の程度に応じて調節可能に設定した投薬量を選定できるように製剤化することである。製剤化にあたって最も重要なことは、本発明の化合物が脂溶性であることに由来する制約である。核内リセプター・スーパーファミリーのリガンドは、脂溶性ホルモンないしビタミンであり、従って、本発明の化合物も脂溶性であることは当然である。経口投与用として製剤上許容できる添加物は、例えばマンニット、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、シュクロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用可能な任意の賦形剤を加えて調整する。そのような組成物は、液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤及び徐放製剤などの形態をとる。組成物は錠剤又は丸剤の形態が好ましいが、そのような組成物は本発明の化合物と一緒に乳糖、シュクロース、リン酸−２−カルシウムなどの希釈剤、でんぷん及びその誘導体のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどのような滑沢剤、及びでんぷん、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びそれらの誘導体のような結合剤、さらに高度に脂溶性で溌水性である本発明の化合物粒子表面を水で濡らす作用を示す界面活性剤、脂溶性の添加物、胆汁酸、リン脂質などを含有する。脂肪族系の合成界面活性剤又は有機溶媒可溶の高分子助剤を含有することはとくに好ましい。これらの例としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ハイドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ベントナイト、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０，ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０等がある。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明の実施例をあげるが、本発明がこれらの実施例に拘束されないことは言うまでもない。
【００３９】
［実施例１］
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（１）の調製：
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ  （０．４２８ｇ，  ０．９８９ｍｍｏｌ）にＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  （０．１５５ｇ，  ０．０９９３ｍｍｏｌ）と水（２．６ｍｌ）を加えて撹拌しリン酸塩を溶解した。次にｔｅｒｔ−ブチルアルコール（１０．４ｍｌ）と２−メチル−２−ブテン（０．４６０ｍｌ，  ４．３４ｍｍｏｌ）を加え、さらに９０％亜塩素酸ナトリウム（０．３０５ｇ，  ３．０４ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１５分間撹拌した。反応液を水で希釈してジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別した後、減圧濃縮し０．３９６グラムの粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー  （（Ｍｅｒｃｋ，  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  粒径６３−２００μｍ，  １０ｇ，  ジクロロメタン−エタノールで展開）により精製して、０．３８４ｇ  （８７％）の１を得た（無色粘稠油状物質，  ａｓ  ａ  ｃｏ１ｏｒ１ｅｓｓ  ｇｕｍ）。
【００４０】
ＩＲ（ＫＢｒ  ｄｉｓｃ）：    ３４４０，  １７１２。
ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，  ５００ＭＨｚ）：    ０．７０（３Ｈ，  ｓ），  ０．７９（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ），  ０．８２（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ），  １．  ６１（１Ｈ，  ｑｄ，  Ｊ＝１３．４，  ４．７Ｈｚ），  １．９２（３Ｈ，  ｓ），  １．９２−２．１０（２Ｈ，  ｍ），  ２．２４−２．２９（１Ｈ，  ｍ），  ２．３３（３Ｈ，  ｓ），  ２．５０−２．６２（２Ｈ，  ｍ），  ３．５３（２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝７．０  Ｈｚ），  ３．８０（３Ｈ，  ｓ），  ３．８１（３Ｈ，  ｓ），  ５．４６（１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．０  Ｈｚ），  ５．４８（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１５．８  Ｈｚ），  ５．９３（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１５．８  Ｈｚ）。
ＥＳＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，  ｎｅｇａｔｉｖｅ）  （ｍ／ｚ）：    ４４７［（Ｍ−Ｈ）−，  Ｃ２５Ｈ３３Ｏ５３５Ｃｌ−Ｈ＋］，  ４４９［（Ｍ−Ｈ）−，  Ｃ２５Ｈ３３Ｏ５３７Ｃｌ−Ｈ＋］、
【００４１】
【化１２】
2005053780.tif 000009
【００４２】
［実施例２］
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ（２）の調製：
ａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ（０．３００ｇ，  ０．７４１ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１．３ｍｌ）に溶解し、水浴で冷却しながら塩化アセチル（０．１５８ｍｌ，  ２．２２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応液を室温で４時間撹拌後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２ｍｌ）を加え、さらに２０分間撹拌した。反応液を水で希釈後、エーテル抽出し、エーテル層を飽和ＣｕＳＯ４水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別した後、減圧濃縮し０．３２０ｇ（８８％）の２を得た（無色粘稠油状物質、ａｓ  ａ  ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ｇｕｍ）。
【００４３】
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，  ５００ＭＨｚ）：    ０．７１（３Ｈ，  ｓ），  ０．８１（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ），  ０．８４（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ），  １．６３（１Ｈ，  ｑｄ，  Ｊ＝１３．０，  ５．５Ｈｚ），  １．８６（３Ｈ，  ｓ），  １．９０−１．９７（２Ｈ，  ｍ），  ２．３４（３Ｈ，  ｓ），  ２．３５（３Ｈ，  ｓ），  ２．３６−２．４３（３Ｈ，  ｍ），  ３．３５（２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝７．０Ｈｚ），  ５．２５（１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．０Ｈｚ），  ５．４１（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ），  ５．８７（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ），  １０．２７（１Ｈ，  ｓ）．
［実施例３］
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（３）の調製：
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ  （０．３２０ｇ，  ０．６５０ｍｍｏｌ）にＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．１０３ｇ，  ０．６６０ｍｍｏｌ）と水（１．８ｍｌ）を加えて撹拌してリン酸塩を溶解した。次に、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（７．２ｍｌ）と２−メチル−２−ブテン（０．３０９ｍｌ，  ２．９２ｍｍｏｌ）を加え、さらに９０％亜塩素酸ナトリウム（０．２００ｇ，  １．９９ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１５分間撹拌した。反応液を水で希釈してジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別した後、減圧濃縮し０．２９０ｇの粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（（Ｍｅｒｃｋ，  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０，  粒径  ６３−２００μｍ，  １０ｇ，  ジクロロメタン−イソプロピルアルコールで溶出）により精製して、０．２１１ｇ（６４％）の３を得た（無色粘稠油状物質，  ａｓ  ａ  ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ｇｕｍ）。
【００４４】
ＩＲ（ＫＢｒ  ｄｉｓｃ）：    ３４５０，  １７８１，  １７３５，  １７１２。
ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，  ５００ＭＨｚ）：    ０．７１（３Ｈ，  ｓ），  ０．８１（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ），  ０．８３（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ），  １．６２（１Ｈ，  ｑｄ，  Ｊ＝１３．０，  ４．８Ｈｚ），  １．８６（３Ｈ，  ｓ），  １．９３−１．９９（１Ｈ，  ｍ），  １．９９−２．０６（１Ｈ，  ｍ），  ２．２３（３Ｈ，  ｓ），  ２．２７（１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ＝１３．２，  ４．８，  ２．０Ｈｚ），  ２．２８（３Ｈ，  ｓ），  ２．４２（３Ｈ，  ｓ），  ２．５１−２．５８（２Ｈ，  ｍ），  ３．３３（２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  ５．２５（１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  ５．５０（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ），  ５．８９（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ）。
ＥＳＭＳ（ｅ１ｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，  ｎｅｇａｔｉｖｅ）  （ｍ／ｚ）：  ５０３［（Ｍ−Ｈ）−，  Ｃ２７Ｈ３３Ｏ７３５Ｃｌ−Ｈ＋］，  ５０５［（Ｍ−Ｈ）−］，  Ｃ２７Ｈ３３Ｏ７３７Ｃｌ−Ｈ＋］。
【００４５】
【化１３】
2005053780.tif 000010
【００４６】
［実施例４］
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ（４）の調製：
ａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ（０．５００ｇ，  １．２３ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２．５ｍｌ）に溶解し、イミダゾール（０．４２１ｇ，  ６．１８ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（０．５５９ｇ，  ３．７１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２．５時間撹拌後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１．２５ｍｌ）を加え、さらに２０分間撹拌した。反応液を水で希釈後、エーテル抽出し、エーテル層を水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水で順次洗浄後、無水炭酸カリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別した後、減圧濃縮し、０．９３６４ｇの粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル，  ２０：１で溶出）により精製して、０．７０７ｇ（９０％）の４を得た（無色粘稠油状物質，  ａｓ  ａ  ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ｇｕｍ）。
【００４７】
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，  ５００ＭＨｚ）：    ０．１３（６Ｈ，  ｓ），  ０．２６（６Ｈ，  ｓ），  ０．７０（３Ｈ，  ｓ），０．８１（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ），  ０．８３（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ），  １．０２（９Ｈ，  ｓ），  １．０３（９Ｈ，  ｓ），  １．６２（１Ｈ，  ｑｄ，  Ｊ＝１３．５，  ５．０Ｈｚ），  １．７９（３Ｈ，  ｓ），  １．８９−１．９６（２Ｈ，  ｍ），  ２．３２−２．４５（３Ｈ，  ｍ），  ２．６３（３Ｈ，  ｓ），  ３．４５（２Ｈ，  ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），  ５．３３（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ），  ５．４１（１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５．９Ｈｚ），  ５．８７（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ），  １０．２９（１Ｈ，  ｓ）．
［実施例５］
Ａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（５）の調製：
２，４−Ｄｉ−Ｏ−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｎ（４）  （０．４５０ｇ，  ０．７１０ｍｍｏｌ）にＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．１１２ｇ，  ０．８１１ｍｍｏｌ）と水（３ｍ１）を加えて撹拌し、リン酸塩を溶解した。次に、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（１２ｍｌ）と２−メチル−２−ブテン（０．３３３ｍｌ，  ３．９６ｍｍｏｌ）を加え、さらに９０％亜塩素酸ナトリウム（０．２１９ｇ，  ２．１８ｍｍｏ１）を加えて、室温で４５分間撹拌した。反応液を飽和食塩水で希釈してジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別した後、減圧濃縮し油状生成物２を得た。これを無水テトラヒドロフラン（７ｍｌ）に溶解し、１Ｍフッ化水素酸（２．００ｍｌ，  ２．００ｍｍｏｌ）及び１Ｍフッ化ナトリウム水溶液（６．４０ｍｌ，  ６，４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で２日間撹拌後、反応液を水で希釈してジクロロメタンで抽出し、抽出液に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。乾燥剤を濾別した後、減圧濃縮し、０．４１４ｇの粗生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン−メタノール，  １０：１で溶出）により精製して、０．２７６ｇ（９２％）の５を得た（無色粘稠油状物質，  ａｓ  ａ  ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ｇｕｍ）。これにエーテルを加えて結晶化させ、０．１６３ｇ（５５％）の３を無色固体（ａｓ  ａ  ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｓｏｌｉｄ）として得た。
ｍ．ｐ．  １５６−１５８℃
ＩＲ（ＫＢｒ  ｄｉｓｃ）：    ３４３０，  １７０５，  １５９９，  １５６４。
【００４８】
ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，  ５００ＭＨｚ）：    ０．６９（３Ｈ，  ｓ），  ０．８０（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ），  ０．８２（３Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ），  １．６０（１Ｈ，  ｑｄ，  Ｊ＝１３．３，  ４．８Ｈｚ），  １．９１（３Ｈ，  ｓ），  １．９１−２．０３（２Ｈ，  ｍ），  ２．２６（１Ｈ，  ｄｄｄ，  Ｊ＝１３．３，  ４．８，  １．８Ｈｚ），  ２．５０−２．５８（２Ｈ，  ｍ），  ２．６６（３Ｈ，  ｓ），  ３．４９（２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ５．４０（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ），  ５．５３（１Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ５．９１（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１６．０Ｈｚ）。
ＥＳＭＳ（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ，  ｎｅｇａｔｉｖｅ）  （ｍ／ｚ）：    ４１９［（Ｍ−Ｈ）−，  Ｃ２３Ｈ２９Ｏ５３５Ｃ１−Ｈ＋］，  ４２１［（Ｍ−Ｈ）−，  Ｃ２３Ｈ２９Ｏ５３７Ｃｌ−Ｈ］。
【００４９】
【化１４】
2005053780.tif 000011
【００５０】
［実施例６］
遺伝性肥満糖尿病マウス、Ｃ５７ＢＬ／ｋｓｊ  ｄｂ／ｄｂ（ｄｂ／ｄｂマウス）に対する作用：
ジアセチル・アスコクロリンカルボン酸１０  ｇを約１５０ｍｌのアセトンに溶解した液を齧歯類動物の飼育用粉末飼料（日本クレア（株）製、ＣＥ−２）１  ｋｇに振りかけて充分混合した後、室内で風乾した。アセトンが飛散した後、粉末飼料、ＣＥ−２，９  ｋｇと混合し、飼料用ペレットに成型した。この飼料中におけるジアセチル・アスコクロリンカルボン酸の含量は約０．１％である。同様にして含量が０．０５〜０．０２５％のペレット型固形飼料を調製し実験に使用した。対照飼料は同じ粉末飼料にアセトンを振りかけて成型ペレット化した。２０頭の生後８週令雄性ｄｂ／ｄｂマウスをランダムに４群に分け、群ごとに採尿ケージに収容して、ジアセチル・アスコクロリンカルボン酸含有ないし対照飼料を与え２１日間飼育した。この間、飼料と飲料水は自由に摂取させ、表１に示す間隔で尿を採取し排泄された尿糖を酵素法で測定した。尿糖排泄量は１頭あたりの平均値で示した。
【００５１】
【表１】
2005053780.tif 000012
【００５２】
［実施例７］
健常マウスにおける血清コレステロール低下作用：
ＩＣＲ系の５週令雄性マウス５０頭を無作為に５群に分け、１群１０頭のマウスをポリカーボネイト樹脂製のケージに５頭ずつ分散収容した。１群は対照群としてマウス用標準飼料粉末のみをあたえ、他の４群には４種類のアスコクロリン・カルボン酸誘導体の粉末を０．０５％混合した上記飼料の粉末を１週間あたえた。実験期間中における各群の体重増加は、対照群と比べて有意差はなく、投薬による影響は認められなかった。１週間後に心臓から採血して血清総コレステロールを酵素法で測定した。
【００５３】
【表２】
2005053780.tif 000013
【００５４】
［実施例８］
ＰＸＲ応答エレメントによって発現が制御されるリポーター遺伝子プラスミドとＰＸＲ発現プラスミドをＣＯＳ−１細胞に導入した後、アスコクロリンを始めとする本発明の化合物で遺伝子導入細胞を処理すると、リポーター遺伝子の発現量が増加することを見出した。本発明の化合物によるＰＸＲのトランスアクチベーション活性は、プレグネノロンには及ばないもののプロゲステロンとほぼ同等であった。この結果は本発明の化合物がＰＸＲのアゴニストであり、これらの化合物がＰＸＲを介して遺伝子の発現を制御していることを示している。以下に実験例を示す。
【００５５】
＜ＰＸＲリポーター遺伝子導入＞
ＣＯＳ−１細胞にプラスミドを導入した。遺伝子導入はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて定法通りに行った。１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのダルベッコの最小培地（ＤＭＥＭ）に１×１０５の細胞を分散させて直径３５ｍｍのペトリ皿に流し込み、炭酸ガス孵卵器中で１７時間培養した。次に培地を除去し、ペトリ皿に接着している細胞をリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて遺伝子導入を行った。すなわち、ＰＸＲ応答エレメントによって発現が制御されるルシフェラーゼ遺伝子プラスミド（ｐＲＸＲＬ：ＲＸＲＥ−ＳＶ４０  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；ｐＲＸＲＬ；ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒにＲＸＲＥを接続し、その下流にこれらで発現が制御されるｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃＤＮＡが結合しているレポーター遺伝子プラスミド）、ＲＸＲα発現プラスミド（ｐＲＸＲα；ｐＲＸＲα；哺乳動物細胞でヒトＲＸＲαを発現させるためヒトＲＸＲαｃＤＮＡがサイトメガロウイルスのプロモーターの下流に結合しているプラスミド）及び遺伝子導入率をしらべるためβガラクトシダーゼ遺伝子プラスミド（ｐＣＨ１１０，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）をそれぞれ４ｍｇ，  ４ｍｇ，  ２ｍｇ含む最小培地、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社）５００ｍｌとＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ５０ｍｌを溶かしたＯｐｔｉＭＥＭ  ５００ｍｌをあらかじめ混合して、室温で１５分間保温した。この混合液１００ｍｌとＯｐｔｉＭＥＭ  ４００ｍｌを混合してペトリ皿に加え、炭酸ガス孵卵器中に三時間３７℃で保温した。遺伝子導入用培地をペトリ皿から吸引して除去し、被験物質を含む活性炭処理した血清１０％を含むＤＭＥＭ培地を加え、３７℃で２０時間培養した。
【００５６】
被験物質としてはアスコクロリン・カルボン酸、２，４−ジアセチルアスコクロリン・カルボン酸、４−Ｏ−メチルアスコクロリン・カルボン酸及び２−Ｏ−メチルアスコクロリン・カルボン酸（それぞれ１０−８、１０−７，１０−６Ｍ）、対照としてａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、９−ｃｉｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ及びデキサメサゾンを加えた。さらに、対照としては被験物質の溶媒であるジメチルスルフォキシド（最終濃度０．１％）を培地に加えた。
【００５７】
＜ＲＡＲ又はＧＲ（グルココルチコイド）レポーター遺伝子導入＞
ＲＸＲ応答エレメントによって発現が制御されるルシフェラーゼ遺伝子（ｐＲＸＲＬ：  ＲＸＲＥ−ＳＶ４０  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）プラスミドとＲＸＲα発現プラスミド（ｐＲＸＲα）のかわりに、ＲＡＲ応答エレメントによって発現が制御されるルシフェラーゼ遺伝子プラスミド（ｐＲＡＲＬ：  ＲＡＲＥ−ＳＶ４０  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）とＧＲ発現プラスミド（ｐＲＡＲα）をＣＯＳ−１細胞に導入した。これらのプラスミドのトランスフェクタント及び本発明の化合物４種を濃度１０−４〜１０−７Ｍの範囲で培養液に加え、対照化合物としてａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（１０−８，１０−７、１０−６Ｍ）、９−ｃｉｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（１０−８，１０−７、１０−６Ｍ）、デキサメサゾン（１０−８，１０−７、１０−６Ｍ）等を加えた。
【００５８】
ペトリ皿の培地を吸引して除去した後、２５０ｍｌの培養細胞溶解液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ７．８）、２ｍＭ  １，２−ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、  １％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、ラバーポリスマンで細胞を剥離して集めた。凍結融解して細胞を完全に破壊した後、４℃で遠心分離（１５，０００  ｒｐｍ，  ２  ｍｉｎ）した上清を測定用の試料とした。２０ｍｌの上清に１００ｍｌのルシフェラーゼ基質溶液（２．１４ｍｇ  Ｃｏ−Ａ，  １００ｍｌ  ４７０ｍＭ  Ｄ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，  ２００ｍｌ  ５３０ｍＭ  ＡＴＰ，  ２ｍｌのＤＴＴ−Ｔｒｉｃｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ  ７．８）を添加し、ルミノメーター（ＡＴＴＯルミノセンサーＡＢ−２０００）で蛍光を測定した。導入効率測定用のβガラクトシダーゼ測定には、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ  （Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を用いて、蛍光をルミノメーターで測定した。結果は既に表２で示すように本発明の化合物は９−ｃｉｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄよりやや弱いが、ＲＸＲの特異的なリガンドであることが判明した。一方、ＲＡＲに対してもＲＸＲの約２５から４０％に相当する活性可能を示したが、ＧＲはまったく活性化しなかった。従って、本発明の化合物はＲＸＲの特異的なリガンドであることは明らかである。
【００５９】
［実施例９］
本発明の化合物によりＴｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ系で活性化される核内リセプター：
実施例９に示す方法に準拠して本発明の化合物によって活性化される核内リセプターを検索した。その結果、本発明に化合物が１０−４〜１０−６Ｍの範囲で存在する培地中ではＰＸＲ，  ＰＰＡＲαなどの核内リセプターが活性化されることが明らかになった。
【００６０】
［実施例１０］
胆汁酸生合成酵素遺伝子の転写促進活性：
肝ガン由来の細胞系ＨｅｐＧ２及びＨＬＥはガン化にともなって脱分化しており、胆汁酸生合成の初発段階を触媒するＣＹＰ７Ａ１遺伝子を転写したｍ  ＲＮＡを合成しない。肝細胞のＣＹＰ７Ａ１はコレステロール７α−水酸化酵素の遺伝子である。しかし、本発明の化合物１０−４〜１０−６Ｍを含む培地で培養すると、ＣＹＰ７Ａ１遺伝子がｍ  ＲＮＡに転写されることが確認された（図２）。従って、本発明の化合物が示す血清コレステロール低下作用は、肝臓における胆汁酸生合成の増大にともなう体内からのコレステロール排泄増加によることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法により合成されうる新規なアスコクロリンのカルボン酸誘導体（Ｉ〜Ｖ）を示す。
【図２】図２は、本発明の化合物によるＣＹＰ７Ａ１遺伝子の転写促進活性を確認した実験（実施例１０）の結果を示す。ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２の双方において化合物Ｉ及びＩＶを培地に添加することによりＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７α水酸化酵素）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡへの転写が促進されている。ＨＬＥ及びＨｅｐＧ２：肝臓ガンから樹立された細胞株。ＤＭＳＯ：ジメチルスルフォキサイド。９−ｃＲＡ：９−ｃｉｓレチノイン酸。Ｉ：化合物Ｉ、ＩＶ：化合物ＩＶ。レーン左から順に、Ｍａｒｋｅｒ、ＤＭＳＯ、９ｃＲＡ、Ｉ、ＩＶ、ＤＭＳＯ、９ｃＲＡ、Ｉ、ＩＶ、Ｍａｒｋｅｒを表す。
【図１】
2005053780.tif 000019
【図２】
2005053780.tif 000020