(57)【要約】【課題】  十分に規則正しく組織化されたβシート構造を有する繊維状タンパク質及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  式（１）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを大腸菌プラスミドに組み込み、その大腸菌プラスミドを大腸菌の細胞内に導入してライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーから所定のＤＮＡを抽出してタンパク質発現ベクターに挿入し、タンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入し、大腸菌を培養して一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有する繊維状タンパク質を発現させる。【化１】2005065625.tif 000006［Ｒ１及びＲ２はプロリン残基又はＮ−アルキル置換アミノ酸残基、Ｘ１及びＸ２は親水性アミノ酸残基、Ｙ１及びＹ２は疎水性アミノ酸残基、Ｚはアミノ酸残基、ａ、ｃ及びｅは０又は１、ｂ、ｄ及びｎはそれぞれ０又は１以上の整数を表す。］【選択図】  図１
2005065625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
2005065625.tif 000005
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＮ−アルキル置換アミノ酸残基を表し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ親水性アミノ酸残基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、Ｚはアミノ酸残基を表し、ａ、ｃ及びｅはそれぞれ０又は１を表し、ｂ、ｄ及びｎはそれぞれ０又は１以上の整数を表し、ａ、ｃ及びｅが０のときｂ、ｄ及びｎはそれぞれ１以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２及びＺのそれぞれは相互に同一でも異なっていてもよい］
で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを大腸菌プラスミドに組み込む第１ステップと、
ＤＮＡが組み込まれた前記大腸菌プラスミドを大腸菌の細胞内に導入してライブラリーを作製する第２ステップと、
前記ライブラリーから所定のＤＮＡを抽出してタンパク質発現ベクターに挿入する第３ステップと、
ＤＮＡが挿入された前記タンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入し、該大腸菌を培養して前記一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有する繊維状タンパク質を発現させる第４ステップと
を含むことを特徴とする繊維状タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記一般式（１）で表されるアミノ酸配列が５０〜１５０個のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の繊維状タンパク質の製造方法。
【請求項３】
前記第１ステップにおけるアミノ酸配列は、前記一般式（１）中のＸ１及びＸ２がそれぞれグルタミン酸残基又はリジン残基であり、Ｙ１及びＹ２がそれぞれフェニルアラニン残基、イソロイシン残基又はバリン残基であるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の繊維状タンパク質の製造方法。
【請求項４】
前記第１ステップにおいて、疎水性アミノ酸残基Ｙ１及び／又はＹ２が異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡをデザインし、該ＤＮＡのそれぞれが組み込まれた複数種の大腸菌プラスミドを得ることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の繊維状タンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の繊維状タンパク質の製造方法により得られ、前記一般式（１）で表されるアミノ酸配列を反復単位として形成されたβシート構造を有することを特徴とする繊維状タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は繊維状タンパク質及びその製造方法に関する。なお、本発明でいう繊維状タンパク質には、いわゆる繊維状のものの他、テープ状のものも包含される。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の立体構造において、複数のアミノ酸残基がペプチド結合したペプチド鎖がとり得る二次構造としてαへリックス構造とβシート構造（あるいはβストランド構造）が知られている。このうち、βシート構造は繊維状タンパク質に多く見られるものであり、例えば絹糸の場合、１００以上のβシートが水素結合、静電的結合、疎水的結合等によって規則正しく組織化されて、安定した三次元構造を形成している。
【０００３】
一方、遺伝子工学的手法により、大腸菌等の細胞で天然タンパク質やその一部を生産する技術が知られている。例えば、非特許文献１には、天然タンパク質のアミノ酸配列を参考にしてＤＮＡをデザインし、そのＤＮＡを大腸菌で発現させてアミロイド様タンパク質を得る方法が開示されている。かかる方法により得られるアミロイド様タンパク質は、親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基とが交互に結合してβシート構造が構成されたものである。
【非特許文献１】West, M. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11211-11216(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記非特許文献１に記載されているような方法においては、βシート又はβストランドの形状制御について十分な検討が行われておらず、形成されるβシート構造は必ずしも規則正しく組織化されていないため、繊維状タンパク質の製造方法として実用に供し得るものとは言い難い。
【０００５】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、十分に規則正しく組織化されたβシート構造を有する繊維状タンパク質及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明の繊維状タンパク質の製造方法は、下記一般式（１）：
【化１】
2005065625.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＮ−アルキル置換アミノ酸残基を表し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ親水性アミノ酸残基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、Ｚはアミノ酸残基を表し、ａ、ｃ及びｅはそれぞれ０又は１を表し、ｂ、ｄ及びｎはそれぞれ０又は１以上の整数を表し、ａ、ｃ及びｅが０のときｂ、ｄ及びｎはそれぞれ１以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２及びＺのそれぞれは相互に同一でも異なっていてもよい］
で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを大腸菌プラスミドに組み込む第１ステップと、ＤＮＡが組み込まれた大腸菌プラスミドを大腸菌の細胞内に導入してライブラリーを作製する第２ステップと、ライブラリーから所定のＤＮＡを抽出してタンパク質発現ベクターに挿入する第３ステップと、そのタンパク質発現ベクターを大腸菌の細胞内に導入し、該大腸菌を培養して一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有する繊維状タンパク質を発現させる第４ステップとを含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明の繊維状タンパク質の製造方法においては、一般式（１）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを大腸菌プラスミドに組み込んでライブリーを作製することによって、無作為に抽出した場合であっても、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得ることができる。
【０００８】
ここで、一般式（１）で表されるアミノ酸配列においては、親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基とが交互に結合することにより親水面及び疎水面が形成され、かかる親水面と疎水面とは所定部位で反転する。そして、このように親水面と疎水面が反転したユニット−Ｒ１−（Ｘ２）ａ−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−（Ｙ２−Ｙ２）ｃ−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−（Ｘ２）ｅ−Ｒ２−がβストランドとして、ユニット−（Ｚ）ｆ−がリンカーとしてそれぞれ機能することによって、βストランド間の静電的結合、疎水結合及び水素結合等の相互作用力は若干弱くなるが、その一方で自己修復力が大きくなり、全体としてはβストランド間の相互作用が制御されたβシート構造が形成される。βストランドの両端部に配置されるＲ１、Ｒ２はＮ−アルキル置換アミノ酸残基であり、βシート構造を切断する機能を有する。
【０００９】
従って、上記ライブラリーから抽出されたＤＮＡをタンパク質発現ベクターに挿入し、さらにそのタンパク質発現プラスミドを大腸菌の細胞内に導入し、その大腸菌を培養して一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有する繊維状タンパク質を発現させることによって、十分に規則正しく組織化されたβシート構造を有する繊維状タンパク質を得ることができる。
【００１０】
また、本発明の繊維状タンパク質の製造方法においては、上述の通り、大腸菌を利用して人工タンパク質を効率的に生産するという点で、化学合成法により繊維状ペプチドを製造する場合に比べて、低コスト・低汚染性のエネルギー変換系が実現されている。このような環境調和型の材料生産方法は、グリーンケミストリーの観点からも非常に有用である。
【００１１】
一般式（１）で表されるアミノ酸配列は、５０〜１５０個のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列であることが好ましく、５０〜１５０個のアミノ酸残基で構成されるアミノ酸配列であることがより好ましい。一般式（１）で表されるアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基の個数を５０〜１５０個とすることにより、大腸菌の形質転換を安定的に行うことができる。
【００１２】
また、第１ステップにおけるアミノ酸配列は、一般式（１）中のＸ１及びＸ２がそれぞれグルタミン酸残基又はリジン残基であり、Ｙ１及びＹ２がそれぞれフェニルアラニン残基、イソロイシン残基又はバリン残基であるアミノ酸配列であることが好ましい。これにより、繊維状タンパク質を生成させる際の構造安定性を向上させることができる。
【００１３】
本発明においては、一般式（１）で表されるアミノ酸配列の所定のアミノ酸残基を可変アミノ酸残基としてＤＮＡをデザインし、当該ＤＮＡに対応する大腸菌プラスミドを用いてライブラリーを作製することによって、アミノ酸配列の自由度を増大し、大腸菌に対するＤＮＡの毒性を回避して安定的な繊維状タンパク質の製造を行うことができる。ここで、ライブラリー化の効率の点からは、第１ステップにおいて、疎水性アミノ酸残基Ｙ１及び／又はＹ２が異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡをデザインし、該ＤＮＡのそれぞれが組み込まれた複数種の大腸菌プラスミドを得ることが好ましい。
【００１４】
また、本発明の繊維状タンパク質は、上記本発明の繊維状タンパク質の製造方法により得られ、一般式（１）で表されるアミノ酸配列を反復単位として形成されたβシート構造を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、十分に規則正しく組織化されたβシート構造を有する繊維状タンパク質及びその製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
図１は本発明の繊維状タンパク質の製造方法の好適な一実施形態を示すフロー図である。
【００１８】
図１に示した製造方法においては、先ず、一般式（１）：
下記一般式（１）：
【化２】
2005065625.tif 000004
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＮ−アルキル置換アミノ酸残基を表し、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ親水性アミノ酸残基を表し、Ｙ１及びＹ２はそれぞれ疎水性アミノ酸残基を表し、Ｚはアミノ酸残基を表し、ａ、ｃ及びｅはそれぞれ０又は１を表し、ｂ、ｄ及びｎはそれぞれ０又は１以上の整数を表し、ａ、ｃ及びｅが０のときｂ、ｄ及びｎはそれぞれ１以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２及びＺのそれぞれは相互に同一でも異なっていてもよい］
で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡがデザインされる（ステップ１０１）。
【００１９】
一般式（１）で表されるアミノ酸配列は、親水性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基とが交互に結合することにより親水面及び疎水面が形成されたもので、かかる親水面と疎水面とは所定部位で反転する。例えば、ｃが０である場合には、−Ｒ１−（Ｘ２）ａ−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−及び−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−（Ｘ２）ｅ−Ｒ２−のそれぞれに親水面及び疎水面が形成され、−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−と−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−との間で親水面と疎水面とが反転する。また、ｃが１である場合には、−Ｒ１−（Ｘ２）ａ−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−Ｙ２−及び−Ｙ２−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−（Ｘ２）ｅ−Ｒ２−のそれぞれに親水面及び疎水面が形成され、−Ｒ１−（Ｘ２）ａ−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−Ｙ２−と−Ｙ２−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−（Ｘ２）ｅ−Ｒ２−との間で親水面と疎水面が反転する。そして、このように親水面と疎水面が反転したユニット−Ｒ１−（Ｘ２）ａ−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−（Ｙ２−Ｙ２）ｃ−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−（Ｘ２）ｅ−Ｒ２−がβストランドとして、ユニット−（Ｚ）ｆ−がリンカーとしてそれぞれ機能することによって、βストランド間の静電的結合、疎水結合及び水素結合等の相互作用力は若干弱くなるが、その一方で自己修復力が大きくなり、全体としてはβストランド間の相互作用が制御されたβシート構造が形成される。
【００２０】
親水性アミノ酸残基Ｘ１及びＸ２としては、グルタミン酸残基、リジン残基、アスパラギン酸残基、アルギニン残基などが挙げられるが、繊維状タンパク質の構造安定性の点から、グルタミン酸残基又はリジン残基であることが好ましい。
【００２１】
また、疎水性アミノ酸残基Ｙ１及びＹ２としては、アラニン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、イソロイシン残基、バリン残基などが挙げられるが、繊維状タンパク質の構造安定性の点から、フェニルアラニン残基、イソロイシン残基又はバリン残基であることが好ましい。
【００２２】
また、リンカーとしてのユニット−（Ｚ）ｆ−を構成するＺは親水性アミノ酸残基、疎水性アミノ酸残基のいずれであってもよく、また、グリシン残基等の中性アミノ酸残基であってもよい。また、ユニット−（Ｚ）ｆ−に含まれるアミノ酸残基の個数を示すｆは、ユニット−（Ｚ）ｆ−がリンカーとしての十分な長さを有していれば特に制限されないが、好ましくは２〜１０であり、より好ましくは４〜６である。なお、ｆが２以上の場合、ｆ個のアミノ酸残基Ｚは相互に同一でも異なっていてもよい。
【００２３】
一般式（１）で表されるアミノ酸配列においては、上述の通り、親水面と疎水面が反転したユニット−Ｒ１−（Ｘ２）ａ−（Ｙ１Ｘ１）ｂ−（Ｙ２−Ｙ２）ｃ−（Ｘ１Ｙ１）ｄ−（Ｘ２）ｅ−Ｒ２−がβストランドとして、ユニット−（Ｚ）ｆ−がリンカーとしてそれぞれ機能する。ここで、βストランドの端部のＲ１、Ｒ２はプロリン残基などのＮ−アルキル置換アミノ酸残基である。βストランドの端部に配置されたＮ−アルキル置換アミノ酸残基は、βストランド構造を止めるブレーカーとしての機能を有し、これにより隣接するβストランド間の水素結合が弱められてβストランド同士の凝集が十分に抑制されるため、βストランドが整列しやすくなり、その結果、βシート構造の構造安定性をさらに高めることができる。
【００２４】
また、大腸菌の形質転換を安定的に行うためには、一般式（１）で表されるアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基の個数が５０〜１５０個であることが好ましく、５０〜８０個であることがより好ましい。換言すれば、ＤＮＡを構成する塩基数は１５０〜４５０塩基であることが好ましく、１５０〜２４０塩基であることがより好ましい。
【００２５】
一般式（１）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの合成方法は特に制限されず、例えば化学合成、酵素による合成などの方法により所望のＤＮＡを得ることができる。ＤＮＡは１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。なお、２本鎖のＤＮＡを合成する場合には、例えば、化学合成により１本鎖のＤＮＡを作製し、そのＤＮＡの相手としてのＤＮＡを酵素反応により伸長して２本鎖とすることができる。
【００２６】
次に、ステップ１０２において、一般式（１）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが大腸菌プラスミドに組み込まれる。プラスミドは、大腸菌の中で自律的に、且つ安定的に増殖するものであれば、いかなるものをも用いることができる。具体的には、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８などが挙げられる。
【００２７】
後述するステップ１０３（ライブラリー化）のためには、一般式（１）で表されるアミノ酸配列の所定部位を異なる種類のアミノ酸残基に変えて上記ステップ１０２及び１０３を行い、各ＤＮＡが組み込まれた複数種の大腸菌プラスミドを得ることが必要である。すなわち、一般式（１）で表されるアミノ酸配列の所定のアミノ酸残基を可変アミノ酸残基としてＤＮＡをデザインし、各ＤＮＡに対応する大腸菌プラスミドを用いてライブラリーを作製することによって、アミノ酸配列の自由度を増大し、大腸菌に対するＤＮＡの毒性を回避して安定的な繊維状ペプチドの製造を行うことができる。ここで、ライブラリー化の効率の点からは、疎水性アミノ酸残基Ｙ１及び／又はＹ２が異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡをデザインし、該ＤＮＡのそれぞれが組み込まれた複数種の大腸菌プラスミドを得ることが好ましい。可変アミノ酸残基の選択は、ＤＮＡの塩基配列にｍｉｘ塩基を導入することにより効率よく行うことができる。
【００２８】
なお、疎水性アミノ酸残基を可変アミノ酸残基としたのは、親水性アミノ酸残基を可変アミノ酸残基とした場合に比べて、繊維状タンパク質の形成に有効なアミノ酸残基のバリエーションが多いという本発明者らの知見に基づくものである。より具体的には、本発明者らは、上述の通り、繊維状タンパク質の構造安定性の点から、Ｘ１、Ｘ２として好ましい親水性アミノ酸残基がグルタミン酸残基及びリジン残基であり、Ｙ１及びＹ２として好ましい疎水性アミノ酸残基がフェニルアラニン残基、イソロイシン残基及びバリン残基であることを見出した。従って、Ｙ１及び／又はＹ２を、例えばフェニルアラニン残基及びイソロイシン残基の２種、あるいはフェニルアラニン残基、イソロイシン残基及びバリン残基の３種から選択することにより、大腸菌に対して至適なアミノ酸配列のバリエーションを広げつつ、ライブラリーにおけるアミノ酸配列を十分に多用化することができる。
【００２９】
ここで、配列表の配列番号１に、一般式（１）で表されるアミノ酸配列の好ましい例を示す。配列番号１のアミノ酸配列は６１個のアミノ酸残基からなるものであり、一般式（１）中のａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅがそれぞれ１、ｆが４又は５、ｎが４のものである。当該アミノ酸配列中、親水性アミノ酸残基Ｘ１及びＸ２はそれぞれグルタミン酸残基（Ｅ）又はリジン残基（Ｋ）のいずれかに固定されている。一方、疎水性アミノ酸Ｙ１、Ｙ２の一部はフェニルアラニン残基（Ｆ）又はイソロイシン残基（Ｉ）に固定されているが、他部は可変アミノ酸残基となっている。より具体的には、配列番号１中の９番目、１０番目、２１番目、２６番目、３５番目、４０番目、５１番目及び５２番目のアミノ酸残基Ｘａａはフェニルアラニン残基（Ｆ）又はイソロイシン残基（Ｉ）のいずれかである、また、配列番号中の２３番目、２４番目、３６番目及び３７番目のアミノ酸残基Ｘａａはフェニルアラニン残基（Ｆ）、イソロイシン残基（Ｉ）又はバリン残基（Ｖ）のいずれかである。かかる可変アミノ酸残基の導入により、２０７３６通りのアミノ酸配列の組み合わせが実現可能となる。
【００３０】
また、配列表の配列番号２に、配列番号１のアミノ酸配列をコードする１８６ｂｐのＤＮＡの塩基配列を示す。配列番号２に示す塩基配列においては、配列番号１中の可変アミノ酸残基に対応するコドンにｍｉｘ塩基が用いられている。なお、末端の１〜３番目の塩基配列ｃａｔは制限酵素ＮｄｅＩの認識サイトとして付加したものである。
【００３１】
次に、ステップ１０３において、ＤＮＡが組み込まれた大腸菌プラスミドが大腸菌株の細胞内に挿入され、ライブラリー化される。ライブラリー化に使用される大腸菌株は、大腸菌プラスミドを発現するものであれば特に制限されないが、具体的には、ＤＨ５α株などが好適に使用される。ライブラリーを構成する大腸菌コロニーの個数は可変アミノ酸残基の組み合わせ数に対応するが、実際には、大腸菌により発現・翻訳されたタンパク質のうち大腸菌内で安定的に存在することが大腸菌内で選別される。
【００３２】
次に、ステップ１０４において、一般式（１）で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡが、ライブラリーから抽出され、タンパク質発現ベクターに挿入される。タンパク質発現ベクターとしては特に制限されないが、具体的には、ｐＥＴ２２ｂ（＋）などが好適に使用される。なお、本発明では上記ステップ１０１〜１０３を経てライブラリーを作製しているため、抽出されるＤＮＡは無作為抽出の場合であっても一般式（１）で表されるアミノ酸配列をコードするものである。
【００３３】
このようにしてＤＮＡが挿入されたタンパク質発現ベクターを大腸菌株の細胞内に導入し、その大腸菌株（形質転換体）を培養することにより、目的の繊維状タンパク質を生成させることができる（ステップ１０５及び１０６）。タンパク質発現ベクターが導入される大腸菌株は、繊維状タンパク質を生成可能なものであれば特に制限されないが、具体的には、ＢＬ２１株などが好適に使用される。また、大腸菌株の培養は、例えばバクトリプトン、酵母エキス、食塩などを所定濃度含有する液体培地において行うことができる。またこのとき、図１に示したように、発現誘導を行うことが有効である。発現誘導とは、プロモーターを活性化してＲＮＡを生成させる手法であり、例えば数μＭのイソプロプル−β−チオガラクトピラノシド溶液（ＩＰＴＧ溶液）を大腸菌の培養液に添加し、振とう培養することによって、大腸菌株による目的のタンパク質の分泌生産を効率よく実施することができる。培養温度は、大腸菌形質転換体が増殖できる温度であれば特に制限されないが、好ましくは２５〜３０℃である。
【００３４】
生産された繊維状タンパク質には所定の精製を施すことが好ましい（ステップ１０７）。精製方法としては、具体的には、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、硫安分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３５】
上記製造方法により得られる本発明の繊維状タンパク質は、一般式（１）で表されるアミノ酸配列を反復単位として、十分に規則正しく組織化されたβシート構造を有するものであり、その形状は、通常、ファイバー状又はテープ状となる。βシート構造は円二色性（ＣＤ）スペクトル等により確認することができ、また、組織化された繊維状タンパク質は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などにより確認することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づき本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３７】
［実施例１］
先ず、配列表の配列番号１に示す６１残基のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとして、配列表の配列番号２に示す１８６ｂｐのＤＮＡをデザインした。アミノ酸配列中の可変アミノ酸残基に対応するコドンにはｍｉｘ塩基を用いた。
【００３８】
次に、上記ＤＮＡを大腸菌プラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）に挿入し、プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株の細胞内に導入して、２０７３６通りのアミノ酸配列を発現し得るライブラリーを作製した。
【００３９】
このようにして作製したライブラリーから、ｍｉｘ塩基を含んだタンパク質をコードするＤＮＡを抽出し、大腸菌のタンパク質発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に組み込んだ。さらに、このタンパク質発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１株に導入し、１ｍＭのＩＰＴＧ溶液を添加して振とう培養することによって、形質転換体の発現誘導を行った。
【００４０】
タンパク質が特に高発現している大腸菌株に導入されている発現プラスミドについて、その塩基配列をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０）を用いて解析した。その結果、高発現タンパク質として、配列表の、以下、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を「Ｆ４Ｉ４Ｖ４」、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を「Ｆ２Ｉ７Ｖ３」、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を「Ｆ６Ｉ４Ｖ２」という。高発現タンパク質Ｆ４Ｉ４Ｖ４では、可変アミノ酸残基の種類及びその塩基配列は、９番目のＸａａから順に、Ｉｌｅ（ａｔｃｔ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｔ）、Ｖａｌ（ｇｔｔ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｔ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｖａｌ（ｇｔｔ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｔ）、Ｉｌｅ（ａｔｔ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）であった。また、高発現タンパク質Ｆ２Ｉ７Ｖ３では、可変アミノ酸残基の種類及びその塩基配列は、９番目のＸａａから順に、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｔ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｔ）であった。また、高発現タンパク質Ｆ６Ｉ４Ｖ２では、可変アミノ酸残基の種類及びその塩基配列は、９番目のＸａａから順に、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｔ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｔ）、Ｖａｌ（ｇｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｐｈｅ（ｔｔｃ）、Ｉｌｅ（ａｔｃ）であった。
【００４１】
次に、大腸菌の全菌体タンパク質についてＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、高発現タンパク質Ｆ４Ｉ４Ｖ４のバンドを確認した。高発現タンパク質Ｆ４Ｉ４Ｖ４はゲルから切り出すことで精製し（ＰＡＧＥ精製）、シングルバンドとした。このときのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを図２に示す。図２中、レーンＭは分子量マーカーであり、レーン１は全菌体タンパク質、レーン２はタンパク質をコードするＤＮＡが導入されていない大腸菌を用いたコントロール、レーン３は高発現タンパク質Ｆ４Ｉ４Ｖ４についての結果を示している。
【００４２】
次に、ＰＡＧＥ精製後の高発現タンパク質Ｆ４Ｉ４Ｖ４を水に懸濁して濃度１００ｎＭ程度の溶液とし、リン酸タングステンによるネガティブ染色の後で走査型電子顕微鏡（ＴＥＭ、日立製作所社製、Ｈ−７５００、リン酸タングステンによるネガティブ染色）による観察を行った。その結果、図３に示すように、数十ｎｍの太さを有する繊維状タンパク質が確認された。
【００４３】
また、高発現タンパク質Ｆ２Ｉ７Ｖ３及びＦ６Ｉ４Ｖ２について上記と同様の操作を行ったところ、繊維状タンパク質が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の繊維状タンパク質の製造方法の好適な一実施形態を示すフロー図である。
【図２】実施例１で得られた繊維状タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す電気泳動図である。
【図３】実施例１で得られた繊維状タンパク質を示すＴＥＭ写真である。
【図１】
2005065625.tif 000007
【図２】
2005065625.tif 000008
【図３】
2005065625.tif 000009
【配列表】
2005065625000001.app