(57)【要約】【課題】細胞に対する侵襲性をできる限り低くしつつ、細胞内に物質を導入する技術を提供する。【解決手段】細胞と挿入物の位置関係を検出しながら挿入物を細胞に挿入する方法であって、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を測定することにより細胞と挿入物の位置関係を検出することを特徴とする方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と挿入物の位置関係を検出しながら挿入物を細胞に挿入する方法であって、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を測定することにより細胞と挿入物の位置関係を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
挿入物は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力顕微鏡（ＭＦＭ）のカンチレバー先端のプローブ上に固定され、カンチレバーの撓みを検知することで挿入物にかかる力を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
挿入物にかかる力の測定値をHertzモデルによって解析し、その挿入過程を予測すること
を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
挿入物の先端形状が円筒形である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
細胞に挿入される挿入物、挿入物の位置制御手段、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を連続的に測定する手段、挿入物にかかる力を解析して挿入物と細胞の位置関係を予測する手段を備えた、細胞と挿入物の位置関係を確認しながら細胞に挿入物を挿入するための装置。
【請求項６】
挿入物の先端形状が円筒形である請求項５に記載の装置。
【請求項７】
針状形状の本体と円筒型の先端部を有する細胞に物質を挿入するための挿入物。
【請求項８】
シリコンからなる請求項７記載の挿入物。
【請求項９】
本体の直径が100-200nm程度である請求項７記載の挿入物。
【請求項１０】
本体の先端の形状が円筒形である請求項７記載の挿入物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に物質を挿入する際に、その挿入過程を原子間力顕微鏡(AFM)を用いた
力学測定によって追跡する方法である。
【０００２】
また、本発明は、細胞への挿入に適した形状を有する挿入物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ある物質を細胞内に導入する効果を精確に評価したい場合には、細胞への物質の導入をできるだけ低侵襲的に行うのが望ましい
しかしながら、エレクトロポレーション、顕微注入、リン酸カルシウム沈殿法などの慣用方法により細胞にDNAなどの物質を導入する場合、細胞に対する侵襲性が非常に大きい
ため、物質を導入された細胞の機能が低下することがしばしばであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、細胞に対する侵襲性をできる限り低くしつつ、細胞内に物質を導入する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題に鑑み検討を重ねた結果、細胞への挿入物の挿入の前後において細胞にかかる力を計測することで、細胞と挿入物の相対的な状態を把握することができ、侵襲性の低い状態で挿入物を細胞に挿入できることを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の方法を提供するものである。
（１）  細胞と挿入物の位置関係を検出しながら挿入物を細胞に挿入する方法であって、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を測定することにより細胞と挿入物の位置関係を検出することを特徴とする方法。
（２）    挿入物は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）又は分子間力顕微鏡（ＭＦＭ）のカンチレバー先端のプローブ上に固定され、カンチレバーの撓みを検知することで挿入物にかかる力を測定することを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）  挿入物にかかる力の測定値をHertzモデルによって解析し、その挿入過程を予測
することを特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（４）挿入物の先端形状が円筒形である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）細胞に挿入される挿入物、挿入物の位置制御手段、挿入物が細胞内に挿入される前後において挿入物にかかる力を連続的に測定する手段、挿入物にかかる力を解析して挿入物と細胞の位置関係を予測する手段を備えた、細胞と挿入物の位置関係を確認しながら細胞に挿入物を挿入するための装置。
（６）挿入物の先端形状が円筒形である（５）に記載の装置。
（７）針状形状の本体と円筒型の先端部を有する細胞に物質を挿入するための挿入物。
（８）シリコンからなる（７）記載の挿入物。
（９）本体の直径が100-200nm程度である（７）記載の挿入物。
（１０）本体の先端の形状が円筒形である（７）記載の挿入物。
本発明において、細胞は、酵母、バクテリア、真菌、酵母等の微生物、植物細胞、動物細胞が広く例示され、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどの哺乳動物細胞、特にヒト細胞（肝、腎、肺、心臓、神経、表皮、真皮、血管内皮、癌、悪性腫瘍などの細胞、各種幹細胞、を含む）である。
【０００７】
挿入物の形状は、針状、筒状、円錐ないし角錐状、球状、楕円体状などの種々の形態があり得るが、細長い形状のものが好ましく、針状、筒状、円錐ないし角錐状の形状がさらに好ましく、特に先端が円筒状で、本体が針状である形状が好ましい。
【０００８】
挿入物の材質としては、例えばカーボンナノチューブ、シリコン、シリコン結晶、チタン、ジルコニウム等の金属結晶、ZnO等の金属酸化物、プラスチック、ガラス等が挙げら
れる。
【０００９】
挿入物の大きさは、長さが1〜100μｍ、好ましくは5〜20μｍ、幅（直径）は10ｎｍ〜10μｍ、好ましくは100ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは100ｎｍ〜500ｎｍ、特に好ましくは100〜200ｎｍである。
【００１０】
挿入物の先端が小さいほど細胞に対する侵襲性が小さくなるので好ましいが、あまりに先端部分が小さくなりすぎると十分な強度が保てなくなる。
【００１１】
挿入物は、通常支持体（例えばカンチレバー）に固定される。支持体上への固定は、接着剤の塗布、圧着、融着、支持体上での挿入物の形成（例えばＣＶＤ法など）などの任意の方法により行うことができる。
【００１２】
支持体を微小移動して挿入物を細胞内に導入する方法としては、例えばピエゾ素子を用いる方法が例示されるが、これらに限定されない。
【００１３】
挿入物にかかる力は、挿入物と細胞との接触、穿刺、挿入、さらに挿入物の細胞からの引き抜きまでを連続的に測定するのが望ましい。これには挿入物の細胞への接触、穿刺、挿入及び引き抜きの各状態において、細胞との相互作用により挿入物にかかる微少な力を測定しうるものであればよい。これには例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）あるいは分子間力顕微鏡（ＭＦＭ）における、プローブに及ぼされる力についての測定手段を利用することができる。具体的にはこれら手段におけるプローブ、プローブをその先端に設けたカンチレバー、及びカンチレバーの変位を検出する手段を挙げることができる。
【００１４】
挿入物は、このプローブ自身を利用することができ、あるいは挿入物をプローブに固定することができる。本発明においてこれら装置を利用する場合、これら装置におけるプローブに及ぼされる力の変動量測定機能を利用するものであって、原子間力あるいは分子間力そのものを測定するものではない。また、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）あるいは分子間力顕微鏡における、プローブないしプローブをその先端に設けたカンチレバーの移動手段及びこれらのその位置の検出あるいは制御手段も利用できる。また、これら装置としては、細胞を培養したシャーレをそのまま使用出来る上方から接触可能でカンチレバー駆動型の装置が好ましい。
【００１５】
以下、ＡＦＭのプローブ及びその付属手段を利用する場合を例に取り、本発明を説明する。
【００１６】
ＡＦＭの測定原理は、カンチレバー先端の微小プローブ（探針）を試料表面に近づけると、原子間力によってカンチレバーがたわみ、このカンチレバーの変異をレーザー反射光で検知し、試料表面の凹凸をナノメートルオーダーで画像化するものである
本発明においては、この原子間力顕微鏡のプローブ先端に、例えばカーボンナノチューブ、シリコン、シリコン結晶、チタン、ジルコニウム等の金属結晶、ZnO等の金属酸化物
等からなる挿入物を固定するか、あるいは、シリコン、窒化シリコン等からなるプローブ自身を挿入物として使用できる。
【００１７】
プローブに固定する上記針状物の直径はおおよそ10ｎｍ〜10μｍ程度が好ましく、より好ましくは100ｎｍ〜1μｍ程度、より好ましくは100ｎｍ〜500ｎｍ程度、特に好ましくは100〜200ｎｍ程度である。挿入物がこの程度の大きさであれば、細胞の大きさに比して充分小さく、このため細胞への挿入に対してダメージを与えない。
【００１８】
一方、挿入物の長さは特に限定されないが、例えば1〜100μｍ程度を例示でき、好ましくは5〜20μｍ程度である。この程度の長さであれば、細胞挿入において十分な長さを確
保できる。
【００１９】
また、カーボンナノチューブには、大きく分けて単層のものと多層のものがあるが、本発明においては横方向の曲げに対してある程度の強度を必要とするため、多層のカーボンナノチューブが好ましい。
【００２０】
プローブに挿入物を取り付けるには、上記カーボンナノチューブの場合、例えば、電子顕微鏡観察下に、基底部に固定されたカーボンナノチューブ先端部分とカンチレバー先端のプローブとを接触させ、該接触部に電子線を照射し、炭素化合物ガスをこの電子線のエネルギーによって分解し、非晶質のカーボンとして堆積させ、プローブとカーボンナノチューブを固着する。その後に、カーボンナノチューブを基底部より取り外す。また、ＣＶＤ法によりカンチレバー表面にカーボンナノチューブを成長させる方法により、カーボンナノチューブ付きカンチレバーを作製してもよい。
【００２１】
プローブ自身を挿入物として使用する場合において、プローブを種々の形状に加工するには、上記シリコン製プローブの場合、例えば、収束イオンビーム加工装置等を用いて、ビーム照射によるエッチングにより先端を針状に加工することが出来る。また、窒化シリコン製のプローブの場合は成型時に使用する型の窪み部分を針状の構造にしておき、針状のプローブを作製してもよい。
【００２２】
上記以外の材質の挿入物或いはプローブも同様の方法或いは公知の手段により所望の形状に加工することができる。
【００２３】
本発明の装置は、図２に部分的及び概略的に示されるように例えば、培養容器を載置する２次元ステージを設けた原子間力顕微鏡からなり、２次元ステージ上には、原子間力顕微鏡のカンチレバー（１）のプローブを切削加工したシリコン針（挿入物）が配置され、このシリコン針は、原子間力顕微鏡（１）のカンチレバー位置制御手段としてのピエゾ素子により、上下に移動可能に構成されており、また、挿入物にかかる力はカンチレバー（１）のたわみをレーザー反射光（破線の矢印）で検知し、画像によりモニター可能になっている。
【００２４】
挿入物（先端円錐形、先端円筒型）にかかる力（縦軸）と挿入物をおろした距離（横軸）の関係についての細胞と挿入物の位置関係のHertzモデルによる解析結果を図４（Ａ，
Ｂ）に示す。
【００２５】
Hertzモデルは、例えば図５で示される。
【００２６】
例えば先端の尖った挿入物を細胞に挿入する場合（図４Ａ，Ｂ）、挿入物が細胞と接触し、細胞表面が挿入物により凹む場合、最初は二次曲線に沿って挿入物にかかる力が増大するが、圧入深さが増大するにつれて一次曲線で近似されるようになり、この後挿入物の先端が細胞内に侵入するとともに、挿入物にかかる圧力が急速に低下して一定の値となる。従って、挿入物にかかる力が一次曲線に近づくと圧入深さを少しずつ増大させることに
より、細胞に対する侵襲性を最小限に抑制しつつ、細胞内に挿入物を挿入することが可能である。
【００２７】
挿入物にかかる力及びそのHertzモデルによる解析結果は、リアルタイムで詳細に知る
ことができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、挿入物と細胞との関係を詳細に知ることができるので、細胞への侵襲性を抑制にしながら、細胞内に異物である挿入物を挿入することが可能となり、挿入による細胞機能の変化を抑制することが可能になる。
【００２９】
本発明において、挿入物に種々の物質を固定化することで、細胞機能を維持しつつ細胞内に種々の物質を一時的に挿入でき、該物質の細胞に対する影響を精確に確認することができる。固定化される物質としては、遺伝子、タンパク質等が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
１  細胞に挿入する物質の作製
細胞にダメージを与えずに物質を挿入するために、挿入物質は直径が500 nm以下のものを用いる。ここでは、市販されているAFM用のシリコン製探針を切削したもの（直径100 -200 nm）を挿入物質として用いた（図１）。加工（切削）はFocused ion beam装置を用いたエッチングによって行った。先端の形状は、従来の円錐形のものに加え、円筒形のものを作製した。（図１）
２  力学測定方法
本手法では物質を有するシリコン探針にかかる力を測定することによって、挿入過程を解析する。そのため、測定には力学測定が可能なAFM、あるいは分子間力顕微鏡(MFP)を用いる。シリコン探針をAFM装置によって細胞に挿入するAFM装置の一部を図２に示した。AFM装置において、探針はピエゾ素子に固定されており、このピエゾ素子の延伸・収縮制御
によって上下に移動させることができる。探針はカンチレバーと呼ばれる板バネに取り付けられており、試料との間に力が働くことによって上方あるいは下方に反る。この反りをカンチレバーの背面に照射したレーザーの反射光の変位として力を検出することができる。ここでは、細胞としてメラノサイト細胞を用いた。細胞に挿入物質を下ろしていく際の顕微鏡像を図３に示す。
３  解析方法
先端の形状が円錐形の挿入物質をAFMのピエゾ素子によって細胞に近づけていったとき
に挿入物質にかかる力を測定した結果を図４Aに示す。この力学曲線において、縦軸は挿
入物質にかかっている力、横軸は挿入物質が圧入した深さを表す。図５にHertzモデルの
概要を示すが、圧入する物質の形状が円錐形ならば、物質にかかる力は圧入深さの２乗に比例し、圧入する物質が円筒形ならば、物質にかかる力は圧入深さに正比例することがわかる。すなわち、力が圧入深さに対してどのような変化を示すかによって、物質の挿入過程を予測するのである。先端の形状が円錐形の場合、物質にかかる力は二次曲線として上昇した後、一次直線として上昇する。その後物質が細胞内に挿入されて、かかっていた力が緩和される。一方、先端が円筒形の場合、図４Bに示したような一次直線で力が上昇し
、その後すぐに細胞内に挿入されて力が緩和される。この挿入過程は本発明の解析方法によって予測が可能である。それによれば、これら先端の形状の違う物質を細胞に挿入する過程において、円錐形の場合は２μｍ以上細胞を圧入した後にはじめて挿入されるが、円筒形の場合は１μm以下で挿入できている。すなわち、先端が円錐形のものに比べ、円筒
形のものは圧入による細胞の変形を最小限に抑えられる。細胞に対する物理的なストレスは種々の反応を惹起するため、円筒形状の物質を用いることによって細胞へのストレスを抑えることができる。
【００３１】
以上が、挿入する物質の挿入過程を物質にかかる力学測定から予測する手法である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、挿入物である、切削シリコン探針（先端は円錐形または円筒形）を示す。
【図２】図２は、AFMによる物質挿入の概観を示す。
【図３】図３は、挿入実験に用いた挿入物質とメラノサイト細胞の顕微鏡像を示す。
【図４】図４は、挿入物（先端円錐形、先端円筒形）を細胞に近づけていったときの力学曲線を示す。
【図５】図５は、円錐形又は円筒形の挿入物についてのHertzモデルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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