(57)【要約】  【課題】牛、特に黒毛和種牛の経済形質に関する遺伝子群と連鎖するDNAマーカーの特定を行い、これを用いた繁殖雌牛の選別手段を提供すること。  【解決手段】牛の遺伝子ＤＮＡを、制限酵素EcoRI、並びに、MseIまたはTaqIによる処理を行って得た、特定の18種類のAFLP多型マーカーにより、被験牛の遺伝子ＤＮＡを、好ましくは正準判別関数を用いて検討することにより、当該被験牛の肉質についての資質を鑑別することが可能であることを見いだし、本発明を完成した。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１〜１８で表される遺伝子増幅用プライマーセットのうち、１種以上のプライマーセットを用いて、被験牛の遺伝子ＤＮＡの増幅工程を行い、この増幅工程により得られる増幅産物の有無を指標として、当該被験牛の良否を選別する、繁殖雌牛の選別方法。
１.アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
２．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
３．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
４．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CTAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
５．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
６．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
７．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
８．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTa qI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
９．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CATが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
10．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
11．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AATが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CCTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
12．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AATが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
13．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
14．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
15．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGAが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
16．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CTGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
17．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
18．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CCCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【請求項２】
プライマーセット１〜18のうち、プライマーセット13と14の組、および/または、プライマーセット17と18の組を、同一の選別工程において用いない、請求項１記載の牛の選別方法。
【請求項３】
プライマーセットとして、プライマーセット１〜12および15〜16の全て、並びに、プライマーセット13と14のいずれか一方、および、プライマーセット17と18のいずれか一方を用いる、請求項１または２記載の牛の選別方法。
【請求項４】
各々のプライマーセットを用いて得た遺伝子増幅産物の有無を示す値に対して正準判別関数で重み付けを行い、当該重み付けを行った各々のプライマーセットについての値の統合値である、総合遺伝子型値を、被験牛の肉質の選別の指標とする、請求項１〜３のいずれかに記載の牛の選別方法。
【請求項５】
肉質の選別の対象形質が、枝肉の脂肪交雑度および/またはロース芯面積である、請求項１〜４のいずれかに記載の牛の選別方法。
【請求項６】
下記１〜１８で表される、牛の選別用遺伝子増幅用プライマーセット。
１.アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
２．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
３．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
４．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CTAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
５．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
６．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
７．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
８．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
９．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CATが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
10．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
11．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AATが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CCTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
12．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AATが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
13．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
14．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
15．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGAが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
16．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CTGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
17．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
18．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CCCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の検出による、牛の選別方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
黒毛和種牛は、その肉質の良さから市場でも高く評価され、現在では繁殖雌牛頭数の約92%以上を占める、日本国固有の肉専用種である(福島,1972;並河,1972)。多くの外国種は、脂肪交雑と皮下脂肪厚の間の遺伝相関が正であるが、黒毛和種の場合は、０か小さいながらも負となっていることから、世界の牛品種の中で脂肪交雑、すなわち霜降り肉を作る遺伝的能力に優れ、かつ、余分な皮下脂肪の少ない特徴を持つ品種として世界的に認知されている(向井,1996)。しかし、1991年4月からの我が国の牛肉市場の自由化に伴い、外国からの牛肉の輸入量の増加のみならず、近い将来海外では黒毛和種の遺伝資源を活用した雑種による牛肉が逆輸入される可能性があることから、いっそうの肉質の改良と斉一化が緊急の課題となっている。
【０００３】
全国和牛登録協会では、枝肉格付規格が従来の一元評価から質と量の二元評価に改正された1988年から産肉調査報告事業と枝肉市場における格付け結果を活用した枝肉形質の遺伝的評価法の検討を始め、1991年度からアニマルモデルBLUP (Best Linear Unbiased Prediction, Henderson, 1973)法による枝肉形質の育種価評価事業を各生産県単位で開始した。しかしながら、育種価評価事業が開始された1991年度には全国で8県が参加しただけにすぎず、分析に供される枝肉記録数も少なかったため、新たに記録が追加されるたびに相加的遺伝分散や、予測育種価までも大きく変化するという問題点もみられた。
【０００４】
しかし、枝肉記録が産地の肥育地帯からまんべんなく収集されるに及び、種雄牛の後代のデータが多く蓄積され、種雄牛の予測育種価の正確さは増し、生産現場での理解も得られるようになってきた。これに加え、人工授精法の普及に従って特定のエリート種雄牛に限られた交配が顕著に行われるようになり、肉質の改良と斉一化が進むようになってきた(大山, 1997)。
【特許文献１】特開２００２−２０９５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、順風満帆にみえる育種価評価による黒毛和種の改良にも解決しなければならない問題が依然存在している。
【０００６】
すなわち、育種価は農家の効果などの環境効果を除いて推定される個体の能力値であり、遺伝率が高いことからある程度の正確さを有している。しかし、父親と母親が共通する全兄弟の個体の育種価は等しいことに表れるようにその分析能には限界が見られ、個体毎の厳密な評価ができない。また、育種価評価による種雄牛の選抜を行うと、特定の種雄牛に偏った交配のみが行われることになり、他の種雄牛が持つ貴重な遺伝子が失われることにも繋がる。すなわち、短い目で見れば改良効果が大きくなるが、改良速度はいずれ低下していくことが予想され、長い目で見ればたくさんの遺伝子を残すように選抜を行う方が好ましいと考えられる。
【０００７】
仮に、各繁殖年毎にDNA型で枝肉形質の遺伝的能力を評価できれば、より厳密な遺伝的能力の早期の評価ができ、特定の種雄牛に偏る交配を避け、能力の高い種雄牛を選抜することが可能となる。
【０００８】
すなわち、本発明が解決すべき課題は、牛、特に黒毛和種牛の経済形質に関する遺伝子群と連鎖するDNAマーカーの特定を行い、これを用いた繁殖雌牛の選別手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、この課題を解決するために、繁殖雌牛の選別に有用な遺伝子マーカーについて鋭意検討を行った結果、特定のAFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)マーカーが、極めて有用であることを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記１〜１８で表される遺伝子増幅用プライマーセットのうち、１種以上のプライマーセットを用いて、被験牛の遺伝子ＤＮＡの増幅工程を行い、この増幅工程により得られる増幅産物の有無を指標として、当該被験牛の繁殖雌牛としての良否を選別する、牛の育種選抜の方法（以下、本選別方法ともいう）を提供する発明である。
【００１１】
１.アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１２】
２．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１３】
３．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１４】
４．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CTAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１５】
５．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１６】
６．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ATCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１７】
７．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１８】
８．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００１９】
９．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACTが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CATが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２０】
10．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２１】
11．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AATが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CCTが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２２】
12．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AATが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２３】
13．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２４】
14．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基ACGが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２５】
15．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGAが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CAAが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２６】
16．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したTaqI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CTGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２７】
17．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CGCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２８】
18．アダプターを付加したEcoRI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基CCCが付加された遺伝子増幅用プライマー、および、アダプターを付加したMseI制限サイトに相補的なオリゴヌクレオチドの３'末端に、３塩基AAGが付加された遺伝子増幅用プライマー、からなるセット。
【００２９】
AFLP法は、1995年にVosらによって開発されたフィンガープリント法であり、遺伝子ＤＮＡを制限酵素で切断して、その断片の長さや有無を個体間で比較する遺伝子判別法である。この方法は、標的サンプルの塩基配列の情報なしで、全遺伝子のＤＮＡ多型を包括的に調べることが可能であり、多型性が高く、再現性に優れていること、制限酵素の組み合わせで検出できる多型数を増やすことが可能である等の特徴が認められ、いわゆるアソシエーションスタディに必要な、多くの多型情報を得るのに適している。
【００３０】
本発明において行うAFLP法の具体的な態様として、被験牛の遺伝子ＤＮＡ（出所は特に限定されず、血液、内臓組織、筋肉、リンパ節等を自由に選択することができる）を制限酵素[認識する塩基数が少なく、高頻度に遺伝子を切断する制限酵素（いわゆるフリークエントカッター）と、認識する塩基数が多く低頻度に遺伝子を切断する制限酵素（いわゆるレアカッター）を組み合わせて用いることが好適である]で分解して、用いた制限酵素により得られる断片の粘着末端に、アダプター（アダプター自体は、10〜25塩基程度の、配列を自由に設計することができるヌクレオチド鎖である）として用いるヌクレオチド鎖を結合させ、このアダプター（場合によっては、上記粘着末端の塩基を含む）に対して相補的な塩基配列を含む遺伝子増幅用プライマーセットを用いて繁殖雌牛の選別の指標となるAFLP断片を増幅させる（ここで用いる遺伝子増幅法は、これらのプライマーセットを用いることが可能な遺伝子増幅法であれば、限定されず、最も代表的な方法がＰＣＲ法である）。この場合、特に繁殖雌牛の選別に有用なAFLP断片を得ることができる遺伝子増幅用プライマーセットを絞り込むために、上記の遺伝子増幅用プライマーの３'末端に、１〜３個程度の塩基を付加して、これを遺伝子増幅用プライマーとして用いることができる。例えば、第１の増幅工程として１個の塩基を付加したプライマーセット同士を用いて増幅産物を得て、候補となる遺伝子増幅用プライマーセットを絞り、さらに、第２の増幅工程として３個程度の塩基（配列順はランダム）を付加したプライマーセットを用いて増幅産物を得て、さらに好適な遺伝子増幅用プライマーセットを絞り込むことができる。
【００３１】
本選別方法に係わる18種類のプライマーセットの定義において、「アダプターを付加した、EcoRI等の特定の制限酵素の制限サイトに相補的」とは、上述のように、主要な相補的部分は当該アダプター部分であることを意味している。
また、後述するが、本選別方法に係わる18種類のプライマーセット１〜18のうち、プライマーセット13と14の組、および/または、プライマーセット17と18の組は、これらの組により得られる遺伝子増幅産物の挙動が実質的に同一であり、互いに連鎖している遺伝子の部分を増幅しているものと考えられる。そして、これらの連鎖に係わるプライマーセットの組を同一の増幅工程において用いると、特定の遺伝子増幅産物が強調されてしまい、測定誤差を生じてしまう可能性が考えられる。よって、プライマーセット13と14の組、および/または、プライマーセット17と18の組は、同一の繁殖雌牛の選別工程において用いないことが好適である。
【００３２】
また、プライマーセットは、上記の18種から１種以上を選んで、本選別方法において用いることができるが、一般に、用いるプライマーセットの数が多い方が多面的な解析をするのに有利であり、可能な限り多数のプライマーセットを用いることが好適である。よって、上記の連鎖遺伝子のことを考慮すると、本選別方法においては、プライマーセット１〜12および15〜16の全て、並びに、プライマーセット13と14のいずれか一方、および、プライマーセット17と18のいずれか一方を用いることが、一般的には最適である。
【００３３】
ただし、それぞれのAFLPマーカーの有無が与える被験牛の判定への影響は、それぞれ異なることが想定される。よって、個体本来の性質により、予めグループ分けされている（例えば、高BMS育種価と、低BMS育種価のグループ分けや、高、中、低BMS育種価のグループ分け等が想定される）個体のデータを用いて、グループに最も適するように、それぞれのAFLPマーカーによる多型情報（例えば、特定の増幅用プライマーセットを用いて増幅される遺伝子産物の有無）に重み付けをすることが好適である。この重み付けは、各々のAFLPマーカーによる多型情報について正準判別関数（後述する）を用いて決定することができる。すなわち、上述した各々のプライマーセットを用いて得た遺伝子増幅産物の有無を示す値に対して正準判別関数で重み付けを行い、当該重み付けを行った各々のプライマーセットについての値の統合値である、総合遺伝子型値を、被験牛の良否の選別の指標とすることで、選別の精度を向上させることができる。上記統合値の態様は、特に限定されないが、一般的には、各々のプライマーセットについての値の総和である。
【００３４】
本発明では、黒毛和種が最も優れていると認識されている「さし」、すなわち、脂肪交雑評点(BMS：Beef Marbling Standard)、および/または、これとの相関が知られているロース芯面積を対象形質とすることができる。「さし」とは、筋肉内に脂肪が沈着しているもので、BMSは、「さし」の具合の指標とされる。和牛の脂肪は融点が低く、口の中でよく溶けて官能的にも優れており、美味しいとされていることから、この値の高いものは肉質が良いとされ、黒毛和種の枝肉形質の中でも、特に重要な経済形質となっている。また、「ロース芯面積」も、良質の牛肉を選別する際の重要な指標として知られている。ただし、「枝肉の重量」は、各々のAFLPマーカーの有無との相関が認められておらず、本選別方法の対象形質としては好適ではない。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、被験牛の肉質を簡便に、かつ、確度良く判定することが可能な、牛の選別方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
[AFLP法による黒毛和種の量的形質に関する遺伝子座近傍のマーカーの同定]
高BMS育種価の個体と低BMS育種価の個体の遺伝的差異を調べるため、AFLP法を行い、グループ間でバンド保有頻度に差がみられるAFLPバンドを選び、BMS(Beef Marbling Standard)のQTL(Quantitative Trait Loci)に連鎖したAFLPマーカーとした。
【００３７】
供試動物
黒毛和種繁殖雌牛約4000頭の中から、高BMS育種価牛を25頭、低BMS育種価牛を23頭、計48頭を供試雌牛とした。
【００３８】
ゲノムDNAの精製
ゲノムDNAは、常法により、上記の供試雌牛の血液より抽出、精製して得た。
具体的には、約l0mlの全血を、3,000rpmで10分間遠心分離し、パスツールピペットを用いて白血球層を分取した。分取した白血球画分に、40mlの0.2%NaCl溶液を加えて、よく混和して血球を溶血させ、3,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除いた。その後、0.5mlの生理食塩水/EDTA (0.16M NaCl, 1mM EDTA)を加えてよく懸濁した後、20mlのザルコシル溶液 (0.5%N-lauroylsarcosine sodium salt, 10mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA)を加え、DNAを切断しないようにゆっくりと振盪し、DNAを溶出させた。そして、これにProteinase K溶液 (10mg/ml in water)200μlを加え、37℃で一晩インキュベートした。次いで、当量のTE−フェノール(フェノールを60℃で溶かし、0.1%になるように8-hydroxyquinolineを加え、TE buffer (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA)で水飽和したもの)を加え、10分間ゆっくりと混和した。3,000rpm で10分間遠心分離し、水層とフェノール層の間にできる蛋白質のかたまりを取らないように水層を分取した。この水層にフェノール・クロロフォルム・イソアミルアルコール (25:24:1, 0.05%の8-hydroxyquinoiineを含む)を加え、10分間遠心分離し、水層を分取した。この水層に、当量のクロロフォルム・イソアミルアルコール(24:1)を加え、10分間混和した後、3,000rpmで5分間遠心分離した。次に、水層を分取し、当量のジエチルエーテルを加え、白色になった水層が透明になるまでやや強めに振盪した後、3,000rpmで数秒間遠心分離し、エーテルを通風除去した。そして、10分の１量の3M酢酸ナトリウム溶液(酢酸でpH5.2に調整)を加え、冷却した100%エタノールを2倍量混合し、DNAを沈殿させた。そのDNAは70%エタノールで洗浄し、室温で乾燥させた後、2mlのTEに溶解して、4℃で保存した。
【００３９】
DNAの定量
DNAの定量は260nmの吸光度の測定により行った。OD260=1.00は、2本鎖のDNAが50μg/mlの濃度に相当する。また、同時に280nmの吸光度も測定し、OD260/OD280比が、1.8±0.1であれば、精製DNAを回収できたとみなした。
【００４０】
AFLP法
AFLP法における操作は、基本的には、Vosら(1995年)の方法に従い、以下の手順で行った。
【００４１】
1)制限酵素によるDNAの切断
500ngのDNAを、フリークェントカッターのMse IもしくはTaq Iと、レアカッターのEcoR Iを用いて切断した。
【００４２】
a)Mse IとEcoR Iの組み合わせによるDNAの切断
まず、DNA 500ngを、超純水で20μlに調節した後、10×制限酵素buffer 2.5μl, 10×BSA 1.0μl、Mse I(5unit/μl)1.5μlを加えてよく混和し、37℃で1時間インキュベートした。その後、超純水12.5μl, 10×制限酵素buffer 1.5μl、EcoR I(10unit/μl)1.0μlを加えてよく混和し、37℃で1時間インキュベートした。
【００４３】
b)Taq IとEcoR Iの組み合わせによるDNAの切断
まず、DNA500ngを超純水で17.0μlに調節した後、10×制限酵素buffer2.0μl、Taq I (10unit/μl)1.0μlを加えてよく混和し、65℃で1時間インキュベートした。その後、超純水17.0μl, 10×制限酵素buffer2.0μl, EcoR I(10unit/μl)1.0μlを加えてよく混和し、37℃で１時間インキュベートした。
【００４４】
2)アダプターの付加
制限酵素で処理したバンドにMse IアダプターもしくはTaq IアダプターとEcoR Iアダプターを付加した。アダプター配列については、表１に示した。各アダプターは、一本鎖のDNAをアニーリングさせて、二本鎖にすることにより作成した。一本鎖DNAの溶液100pmol/μlを等量ずつよく混和し、65℃に設定したウォーターバスに入れた後、電源を切り一晩放置させた。制限酵素処理後のDNA溶液40μlに、10×ligase buffer1.0μl、1mM ATP1.0μl、Mse Iアダプター(もしくはTaq Iアダプター)50pmol、EcoR Iアダプター5.0pmol, T4 DNA ligase (4.0unit/μl)0.25μlを含む10μlの溶液を加えて全量を50μlとし、37℃で3時間インキュベートした。その後、10mM Tris-HCl/0.1mM EDTA (pH8.0)で10倍に希釈し、これをPCRのためのテンプレートとした。また、得られた産物は−20℃で保存した。
【００４５】
3)1st PCR (Pre-amplification)
アダプターを付加した鋳型DNA5.0μlに、10×PCR buffer (100mM Tris-Hα、15mM MgCl,500mM KCl；pH8.6)5.0μl, dNTP Mixture (2.5mM each)4.0μl, Takara EX-TaqTM Hot Start Version (5unit/μl)0.2μl, １つの塩基を付加させたMse I(もしくはTaq I)とEcoR Iのプライマーを、それぞれ75ng加え、全量を50μlとして反応を行った。反応は、サーマルサイクラーを用いた。条件は、以下のように設定した。すなわち、94℃・30秒、56℃・１分、72℃・１分を１サイクルとして、30サイクル繰り返した後、72℃・10分の伸長反応を行った。また、PCR後の産物は超純水で10倍希釈し、−20℃で保存した。1stプライマーの配列、および、後述する2ndPCRプライマーの配列は、表1に示した。
【表１】
2005130821.tif 000002
Nには、A・C・G・Tのいずれかの塩基が入り、EcoR IとMse I(Taq I)のプライマーセットで43×43=4,096とおりの組み合わせが存在する。
なお、表１において記載したアダプターおよびプライマーの配列の配列番号は、上の欄から順番に、配列番号１〜１２とする。
【００４６】
4)2nd PCR (Selective-amplification)
1st amplificationで得られた産物に、3つの塩基を付加させたMse I(もしくはTaq I)とEcoR Iのプライマーを加えて増幅した。PCR産物5.0μl、10×PCR buffer 2.0μl、dNTP Mixture 1.6μl、Takara EX-TaqTM Hot Start Version 0.08μl、3つの塩基を付加させたMse Iプライマー30ngとEcoR Iプライマー5ngをそれぞれ加え、超純水で全量を20μlとして反応を行った。反応はサーマルサイクラーを用いた。条件は、以下のように設定した。まず、94℃・30秒、65℃・30秒、72℃・１分を１サイクルとして１３サイクル繰り返した。アニーリング温度は、１サイクルごとに65℃から0.7℃ずつ減少させた。さらに94℃・30秒、56℃・30秒、72℃・１分のサイクルを２３サイクル繰り返した。そして、反応後は、Stop/Loading buffer (100ml中に95% Formamid 95ml、1M EDTA 2ml、超純水 3ml、Bromophenol Blue 0.1g、Xylen Cyanol FF 0.1g)を8μl加え混合した。
【００４７】
5)銀染色法によるバンドの検出
まず、銀染色用のゲルを作成した。ゲル板は長さ40cm×35cm、42cm×35cmのガラス板、スペーサーは0.25mmのものを用いた。ゲル溶液は、尿素35g、10×TBE (1L中に、Tris 108g、ほう酸 55g、Na3EDTA・2H2O 9.3g)8.4ml, Long Ranger(登録商標）Gel Solution 8.4ml、これに超純水を加えてよく撹幹し、尿素が完全に溶けた後、超純水を加えて全量を70mlにした。この溶液を0.45μmのフィルターで濾過し、10分間脱気した。
【００４８】
これに、10% APS(ペルオキソ硫酸アンモニウム)350μl、TEMED (N,N,N',N'-テトラメチルジアミン)35μlを加え、ゲル板にゆっくり流し込み、上部にコームを差し込み、2時間以上放置した。泳動用バッファーには、0.6×TBEを使用し、電気泳動はスラブ型電気泳動装置を用い、電圧1,800Vで2時間半行った。
【００４９】
電気泳動後、ゲル板をはがし、バンドの検出を行った。バンドの検出方法として、SILVER SEQUENCETM DNA Staining Reagents (Promega)を用い、銀染色を行った。具体的な方法は、プロトコールに従った。染色には、10%酢酸溶液 2L(停止液)、2g AgNO3 2L(染色液)、6g NaCO3 2L(現像液)を用いた。また、染色液は、使用する直前に37% Formaldehyde 3mlを加え、現像液は氷上に保存し、使用する直前に37% Formaldehyde 3mlとSodium Thiosulfate (10mg/ml)400μlを加えた。
【００５０】
ゲル板をトレイに入れ、停止液１Lを加え、20分間振盪した。その後、超純水で3回洗浄し、染色液にゲル板を浸し、30分間振盪した。染色が終わったゲル板は、銀が落ちすぎない程度に超純水に軽く浸し、すばやく現像液に浸し、バンドが現れるまで振盪した。適度な現像状態で停止液を加えて反応を止めた後、超純水で再び洗浄しバンドを観察した。
【００５１】
データ分析
（１）χ２検定による有意差検定
AFLP法により得られた多型バンドが、高BMS育種価のグループと低BMS育種価のグループにおいて、有意差がみられるかどうかを判断した。具体的には、AFLPバンドを所持する遺伝子型と所持しない遺伝子型のデータに対して、各マーカーの各遺伝子型に対する分離比を計算するためにχ２検定を行った。
【００５２】
このχ２値に対して自由度1と設定し、P値を算出した。P値がより小さいものが高BMS育種価のグループと低BMS育種価のグループ間で差がみられるとみなした。
（２）デンドログラムによる分析
得られた有意な多型バンドを用いて個体問の遺伝的距離をデンドログラムで表した。
【００５３】
1)Band Sharing値と遺伝的距離の算出
χ２検定においてグループ間で差が大きく見られるとみなされた多型バンドより、高BMS育種価の個体25頭と低BMS育種価の個体23頭におけるBand Sharing(BS)値を求めた。BS値は2個体間における共通バンドの割合であり、次の式で表される。
【００５４】
BS=2Nab/(Na十Nb)
ここでNab は、個体aと個体bに共通のバンドの数、NaとNbは、個体aと個体bにおけるそれぞれのバンド数を示す。
【００５５】
また遺伝的距離(GD)は次の式で表される。
【００５６】
GD=１−BS
2)デンドログラムの作成
上で求めたGD値から、MEGA Ver.2.1を用い、UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages)法により高BMS育種価の個体25頭と低BMS育種価の個体23頭のデンドログラムを作成した。
【００５７】
3)正準判別法を用いた集団の分類
個体本来の性質により事前にグループ分けがされている個体のデータを用いて、グループを最も適切に分類するようにそれぞれの多型情報に重み付けをした数値を正準判別関数と呼ぶ。高BMS育種価のグループと低BMS育種価のグループにおいて頻度差が大きく見られたAFLPバンドについて正準判別関数を決定し、分類能を評価した。
【００５８】
正準判別関数は以下のように算出される。
【００５９】
Xn×p：マーカーの行列(nは個体数、pはマーカー数)
Gn×g：グループの指標行列(nは個体数、gはグループ数)
Mg×p：グループの平均行列(gはグループ数、pはマーカー数)
【００６０】
【数１】
2005130821.tif 000003
【００６１】
以上のように算出された正準判別関数を用いて、全ての個体の総合遺伝子型値を算出し、BMSの予測育種価との相関を調べた。総合遺伝子型値はバンドを持つ場合にはそのバンドに関する準判別関数が加算され、バンドを持たない場合は正準判別関数が加算されないというようにして算出される。
【００６２】
結果
（１）上述の方法により、EcoR Iプライマー11種類とMse Iプライマー16種類を用いて156組、EcoR Iプライマー14種類とTaq Iプライマー32種類を用いて235組、合計391組のプライマーを用いてＢＭＳ育種価の高いグループと低いグループ間の遺伝的な相違を検討した。
【００６３】
まず、各グループそれぞれ8頭ずつを電気泳動し、約150bp以上のAFLPバンドを検出した。EcoR I/Mse Iでは1種類のプライマーセットで平均して約90本のAFLPバンドを検出し、5.5本の多型バンドが検出された。EcoR I/Taq Iでは1種類のプライマーセットで平均して約70本のAFLPバンドを検出し、5.3本の多型バンドが検出された。このようにして見つかったグループ間の多型バンドのうちで、形質に連鎖している多型バンドの頻度差を、5割以上として考えると、このような多型バンドは全プライマーセット391組から227本得られた。そのうちEcoR I/Mse Iで見られた多型バンドが141本で、出現頻度は1.7プライマーセットにつき1本の割合、EcoR I/Taq Iで見られた多型バンドは86本で、出現頻度は1.8プライマーセットにつき1本の割合であった。このことからEcoR I/Mse IよりもEcoR I/Taq Iの方が効率よく偏りの大きい多型バンドを検出てきたことが示された。また、泳動図もEcoR I/Mse IよりもEcoR I/Taq Iの方がバンドの数が少なく、多型を判別しやすいことから、牛においてAFLP法を行う際に用いるフリークェントカッターとしては、Mse IよりTaq Iが適していることが示唆された。
【００６４】
さらに、これら227本の多型バンドについて個体を増やし、高BMS育種価の個体25頭と、低BMS育種価の個体23頭で比較を行った。これらの偏りの大きさについては、χ２検定によるP値より判断し、より小さいPの値を示すものを偏りが大きいと判断した。このようにして、上記の多型バンド227本から、BMSに強く連鎖しているものとして、P値が0.003以下の18個のAFLPバンドを選んだ。これらを表2に示す。表２において、例えば、1番目の多型バンドでは、Selective-amplificationに、EcoR Iのプライマーの配列にACTの選択的塩基を付けたプライマーと、Taq Iのプライマーの配列にCGTの選択的塩基を付けたプライマーを用いたことを示している。バンドの頻度については、高BMS育種価の個体25頭中22頭、すなわち88%の頻度でバンド持っていることを示し、低BMS育種価の個体では23頭巾6頭、すなわち26%の頻度でバンドをもっていることを示している。この結果をもとに自由度1で算出したχ２検定のP値は0.000014である。ここに示した18個のAFLPバンドの中には48頭のバンドパターンが全く同じものが2種類見られた。すなわち、バンドNo.13,14と17,18である。これらはお互いに近傍にあるAFLPバンドであると考えることができる。
また、常法に従い、得られたバンドの塩基配列を確認した。具体的な塩基配列は、バンドNo.1〜18について、それぞれ、配列番号13〜30として対応させ、配列表に記載した。
【００６５】
【表２】
2005130821.tif 000004
プライマーセットに関して、E−はEcoR Iの3セレクテイブプライマー、T−はTaq Iの3セレクテイブプライマー、M−はMse Iの3セレクテイブプライマーを使用したことを示している。
【００６６】
（２）次に、この例において用いた48頭の牛の血統情報に基づき、UPGMA法を用いてデンドログラムを作成した（図示せず）。このデンドログラムにより、高BMS育種価を示す個体の血縁であっても、低BMS値を示す個体が少なからず存在することがわかった。よって、牛の血統情報のみで、BMSの善し悪しを判断することは困難であることが示された。
【００６７】
比較対照としてAFLPデータを用いてUPGMA法でデンドログラムを作成した。このデータには、上記のχ２検定でP値が0.003以下のAFLPバンドを選んだ。ただし、今回得られた18種のAFLPバンドの中で、2種類の連鎖していると考えられるもの（No.13と14、No.17と18）の中から1種ずつを用い、デンドログラム作成には、16種のAFLPデータを用いた（以下、「16種のAFLPマーカー」等、上記18種のプライマーセットに係わる事項が「16種」と表示されている場合は、上記の連鎖していると考えられる、No.13と14、No.17と18の中から1種ずつを用いて、「16種」であることを意味する）。同じパターンを示すマーカーのデータを同時に用いると、そのマーカーの効果が過大に評価されるおそれがあるからである。その結果（図示せず）、これらのAFLPマーカーは、牛をBMS育種価に応じてグループ分けするのに有用であることが示唆された。
【００６８】
（３）以上、今回見つかった1 6種のマーカーの有用性について、デンドログラムによる検討を行った。しかし、QTLには効果の大小があり、またAFLPバンドのQTLとの連鎖の程度も異なることが予測され、全てのAFLPバンドを一様の重み付けするだけでBMSの高い個体を、極めて効率的に選べるとは一概に言い難い。そこで、さらに、上述のAFLPマーカー毎に適切な重み付けを行う方法を検討した。
【００６９】
まず、16種のAFLPバンドについて、正準判別法を行い、それぞれの重み付け値である正準判別関数を算出した。その値を表３（48頭の欄）に示す。
【００７０】
【表３】
2005130821.tif 000005
【００７１】
表３において、正の値は、このAFLPマーカー陽性であれば、BMS値がプラスに動くと予測されるもので、負の値は、このマーカー陽性であれば、BMS値がマイナスに動くと予測されるものである。この正準判別関数から、16種のAFLPマーカーの有無で各個体のBMSに関する能力を予測し、その値を総合遺伝子型値とした。このようにして算出した各個体の総合遺伝子型値とBMS予測育種価との相関を検討したところ、BMSの予測育種価が高いものは総合遺伝子型値も高く、相関係数も0.92と高かった。よって、上記のAFLPマーカーに対する、正準判別関数を用いた重み付けは、適切であることがわかる。
【００７２】
[クローニングされたAFLPマーカーの選抜への適用]
次に、AFLPマーカーを同一集団の個体のBMS育種価による選抜に適用できるか否かを検討した。
【００７３】
供試動物
A県で供用中の黒毛和種繁殖雌牛約4000頭の中から121頭を新たに選び、試験に供与した。
【００７４】
実験操作法
前述の操作と同様に、AFLP法を用い、各個体についてAFLPバンドのパターンを調べた。
【００７５】
データ分析
1)正準判別関数の算出
前述と同様に正準判別法を行った。本分析では、前述と併せて169頭分のAFLPデータを対象とした。これらの個体のうち、予測育種価の上位から20頭、下位から20頭、中間を20頭選んだ。まず、上位、中間のグループと下位のグループを分類するための正準判別関数を求め、これをLD(Linear Discriminant)1とした。その値を基にLD1での各個体の総合遺伝子型値を算出した。次に、上位のグループを、さらに他のグループの個体と分けるための正準判別関数を求め、これをLD2とした。その値を基にLD2での各個体の総合遺伝子型値を算出した（表３の169頭の欄）。これらの2つの総合遺伝子型価をもとに2次元のグラフ上に各グループの個体をプロットした。
【００７６】
2)正準判別関数による各個体のグループ分けで算出した正準判別関数をもとに全169頭のLD1とLD2の総合遺伝子型値を求め、これらの個体が上位、中問、下位のどのグループに分類されるかを分析した。また、各個体の予測育種価とLD1の総合遺伝子型値の相関を検討した。
【００７７】
結果
（１）この分析において、全169頭の被験牛におけるBMS育種価の上位、中間、下位のそれぞれ20頭を抽出し、各グループのBMS予測育種価の分散を示したものが図１であり、BMS育種価で個体を上位、中間、下位に区分し、それぞれをグループ1,2,3として示している。各グループのボックスの中に見られる線がグループ内の予測育種価の平均値を、平均値からのボックスの高さが標準偏差を、その上下に伸びる線が最大値、最小値を、それ以外に見られる点が各グループにおいて異常値を示した個体を示している。これら60頭をそれぞれのグループに分類するためには、1つの正準判別関数では難しいと考えられるので、本例ではLD1とLD2の2つの正準判別関数を算出した。その結果、算出された2つの正準判別関数をもとに各個体の総合遺伝子型値を算出し、プロットしたものを図２に示す。LD1は主にグループ1,2とグループ3を分類するように働き、LD2はさらにグループ1とグループ2を分類するように働く。この図からはグループ3に属す個体が離れた場所に集団を形成していることから、グループ1,2とグループ3はおおよそ分類できることがわかる。
【００７８】
次に、2つの総合遺伝子型値より、60頭の個体をグループ1,2,3に分類した結果を図３に示す。グループ1において、図１に示した数値より予測育種価に分散が認められるが、3グループ間で予測育種価の平均値、標準偏差には差が見られることから、全体としては3グループを分類できるといえる。
【００７９】
（２）次に、残りの個体に関して、算出された正準判別関数を用いた正しい分類が可能であるかについて検討した。まず、169頭全てに関して総合遺伝子型値を算出し、この数値をもとにこれらの個体を3つのグループに分類した。その結果、グループ1,2,3にはそれぞれ、72頭、49頭、48頭が含まれた。その結果、グループ内における予測育種価の範囲を示したものが図４である。この結果を見ると、グループ1とグループ2は標準偏差において明確性を若干欠いているものの、グループ1とグループ3は完全に分類できることが示された。さらに予測育種価の平均値においては、グループ間で明らかな差があることが分かる。さらに、LD1の総合遺伝子型値と予測育種価の相関を検討したが、これらの相関係数は0.70であった。
【００８０】
[ロース芯面積と枝肉重量との関係]
ロース芯面積と枝肉重量は、BMSとともに重要な黒毛和種の経済形質である。BMSとロース芯面積の間の遺伝相関は0.45と高く、BMSと枝肉重量とは遺伝相関が低いことが大山らの最近の研究によって報告されている。そこで、BMSに関して検出した16種類のAFLPマーカーを用いてロース芯面積や枝肉重量の予測育種価をとの関連を検討した。
【００８１】
（１）ロース芯面積についての結果
この検討においてもBMSと同様に、まず169頭の中から各形質における予測育種価の上位、中問、下位、各20頭を用いてLD1とLD2を決定し、3つのグループに分類した（表３）。選んだ個体のロース芯面積についての予測育種価の範囲を図５に、正準判別法により3つのグループに分類した結果を図６に示す。3つのグループで予測育種価の平均値および標準偏差の範囲にはっきりと違いが見られ、正確な分類ができた。
【００８２】
次に、全169頭についてこれらの正準判別関数を適用し、3つのグループに分類した。その結果、グループ1,2,3にはそれぞれ58頭、53頭、58頭が含まれグループ内における予測育種価の範囲を示したものが図７である。図７では、グループ1とグループ2で予測育
種価の平均値および標準偏差の範囲にはっきりとした違いが見られなかったが、グループ1とグループ3では予測育種価の平均値および標準偏差の範囲にはっきりと違いが見られた。
【００８３】
このことから、16種類のAFLPマーカーは、BMSのみならず、ロース芯面積についても優れた個体を選別する指標となり得ることが明らかとなった。
【００８４】
（２）枝肉重量との関係
次に枝肉重量に関しても同様の分析を行った。まず、枝肉重量における予測育種価
の上位、中問、下位、各20頭を用いてLD1とLD2を決定し、3つのグループに分類
した（表３）。ここで算出した正準判別関数を表3に示す。これらのグループに対し、上記のロース芯面積に対するのと同様の解析を行ったが、16種類のAFLPマーカーを枝肉重量の重い個体を選別するマーカーとし得る知見を得ることはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】全169頭の被験牛におけるBMS育種価の上位、中間、下位のそれぞれ20頭を抽出し、各グループのBMS予測育種価の分散を示した図面である。
【図２】算出された2つの正準判別関数をもとに各個体の総合遺伝子型値を算出し、プロットした図面である。
【図３】2つの総合遺伝子型値より、60頭の個体をグループ1,2,3に分類した結果を示す図面である。
【図４】169頭全てに関して総合遺伝子型値を算出し、この数値をもとにこれらの個体を3つのグループに分類し、グループ内における予測育種価の範囲を示した図面である。
【図５】ロース芯面積についての検討を行うために選んだ個体の予測育種価の範囲を示した図面である。
【図６】ロース芯面積についての検討を行うために選んだ個体を正準判別法により3つのグループに分類した結果を示した図面である。
【図７】全169頭について正準判別関数を適用して、3つのグループに分類して、グループ内における予測育種価の範囲を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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