(57)【要約】【課題】  生体組織補填材に細胞を効率的に播種することを可能とする。【解決手段】  ゾル状のゼラチン内に顆粒状の生体組織補填材を投入するステップＳ１と、ゼラチンをゲル化させることにより、補填材ゼラチン包埋体を構成するステップＳ２と、該補填材ゼラチン包埋体を培養容器に収容して上部に細胞を播種するステップＳ３，Ｓ４と、昇温させながらゼラチンをゾル化させるステップＳ５とを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゾル状のゼラチン内に顆粒状の生体組織補填材を投入するステップと、
ゼラチンをゲル化させることにより、補填材ゼラチン包埋体を構成するステップと、
該補填材ゼラチン包埋体を培養容器に収容して上部に細胞を播種するステップと、
補填材ゼラチン包埋体を昇温させながらゼラチンをゾル化させるステップとを備える生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成するいわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。この場合において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるには、例えば、デキサメタゾンのような分化誘導因子が有効であることが知られている。したがって、このような分化誘導因子とともに培養されることにより、骨芽細胞が骨補填材を足場にして増殖した状態の培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、患者の体内から採取可能な間葉系幹細胞は極めて微量であるため、培養骨を製造するために必要な細胞数まで効率的に増殖させる必要がある。
例えば、培養骨のような生体組織補填体を製造するには、リン酸カルシウム多孔体からなる生体組織補填材に細胞をしっかりと接着させる必要があるが、単に培養容器内において播種するだけでは、細胞の多くは培養容器の底面に付着してしまい効率的に生体組織補填材に付着させることは困難であった。
【０００５】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織補填材に細胞を効率的に播種することを可能とする生体組織補填体の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提案している。
請求項１に係る発明は、ゾル状のゼラチン内に顆粒状の生体組織補填材を投入するステップと、ゼラチンをゲル化させることにより、補填材ゼラチン包埋体を構成するステップと、該補填材ゼラチン包埋体を培養容器に収容して上部に細胞を播種するステップと、補填材ゼラチン包埋体を昇温させながらゼラチンをゾル化させるステップとを備える生体組織補填体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
この発明によれば、ゼラチンをゾル化させるステップにおいて、ゼラチンが流動化すると、ゼラチン包埋体の上部に播種された細胞が、ゼラチン内部に包埋されていた生体組織補填材に接触するようになる。このとき、細胞は、徐々に流動化するゼラチンによって保持され、比較的長期間にわたって生体組織補填材に接触状態に維持されるので、ゼラチンが完全にゾル化するまでの間に、生体組織補填材の表面に付着させられることになる。
したがって、細胞を生体組織補填材に効率的に付着させ、短期間で効率的に生体組織補填体を製造することができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、例えば、培養骨の製造方法であって、図１に示されるように、ゼラチン内に生体組織補填材を投入するステップＳ１と、補填材ゼラチン包埋体を構成するステップＳ２と、該補填材ゼラチン包埋体を培養容器１に移し替えるステップＳ３と、ゼラチン包埋体の上部に細胞を播種するステップＳ４と、ゼラチンをゾル化させるステップＳ５とを備えている。
【０００９】
さらに具体的には、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、その前提として、まず、図２（ａ）に示されるように、後述する培養容器５と比較して、底面積が比較的狭く、深さが比較的深い容器１内に、常温、例えば、３０℃に昇温した状態のゼラチン２を貯留する。この温度で、ゼラチン２はゾル状になっている。
【００１０】
第１のステップＳ１は、図２（ｂ）に示すように、上述した容器１内に顆粒状の生体組織補填材３を投入し攪拌する。生体組織補填材３は、例えば、β−ＴＣＰ多孔体である。
第２のステップＳ２は、図２（ｃ）に示すように、上記のようにして製造されたゼラチン２と生体組織補填材３との混合物を、１５℃〜２０℃程度に冷却し、ゼラチン２をゲル化させる。これにより、補填材ゼラチン包埋体４が構成される。
【００１１】
次いで、第３のステップＳ３は、図２（ｄ）に示すように、このようにして構成された補填材ゼラチン包埋体４を培養容器５に取り出す。培養容器５は、前記第１のステップＳ１に使用した容器１よりも底面積が広く、深さが浅い容器であり、容器１よりも容量が大きいものである。
第４のステップＳ４は、図２（ｅ）に示されるように、このように培養容器５内に収容された補填材ゼラチン包埋体４の上部に、間葉系幹細胞６を付着させる。
そして、第５のステップＳ５は、図２（ｆ）に示されるように、ステップＳ４において間葉系幹細胞６を播種された補填材ゼラチン包埋体４を培養容器５ごと培養室２０内に収納し、所定の培養条件となるまで徐々に昇温していく。この際、補填材ゼラチン包埋体４が浸されるように、培養液９を培養容器５内に入れる。これにより、図２（ｇ）に示されるように、生体組織補填体８が製造される。
【００１２】
以上説明した本実施形態に係る生体組織補填体８の製造方法によれば、補填材ゼラチン包埋体４を構成しているゼラチン２が、昇温されていく過程において、溶解温度に達するので、徐々にゾル化して流動的になる。この場合において、補填材ゼラチン包埋体４の上部には間葉系幹細胞６が付着しているので、間葉系幹細胞６は、ゼラチン２の流動化とともに、補填材ゼラチン包埋体４内に配置されている生体組織補填材３と接触することになる。昇温速度を低く設定しておくことにより、ゼラチン２を急激に溶解させることなく、間葉系幹細胞６を生体組織補填材３に接触状態に保持することができる。
【００１３】
その結果、ゼラチン２が完全に溶解して、培養容器５内に貯留されると、ほとんどの間葉系幹細胞６が生体組織補填材３の表面に付着された状態となり、生体組織補填体８が製造されることになる。この場合において、播種された間葉系幹細胞６のほとんど全てが、生体組織補填材３の表面に付着させられるので、培養容器５の底面に付着してしまうことを防止して、効率的に生体組織補填体８を製造することができるという効果がある。
【００１４】
また、生体組織補填材３にはゼラチン２が付着した状態に残ることになるが、ゼラチン２は生体吸収性の材料であるため、付着させたままにしても問題はない。したがって、ゾル化したゼラチン２を培養容器５から外部に排出し、そのまま、ゼラチン２に代えて所定の培地を供給するとともに、培養室内において所定の培養条件に維持することにより、生体組織補填体８の間葉系幹細胞６を成長させることができる。
【００１５】
所定の培地は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）および抗生物質を適当な比率で混合することにより構成される。サイトカイン等の成長因子を混合してもよい。
所定の培養条件は、例えば、３７±０．５℃およびＣＯ２濃度５％である。
【００１６】
次に、多孔体であるブロック状の生体組織補填材１０を使用した場合の製造方法を図３に示す。図３に示す製造方法は、ブロック状の生体組織補填材１０に、ゼラチン膜１１を外周に染込ませた間葉系幹細胞６を播種する方法である。
図３（ａ）に示すように、ブロック状の生体組織補填材１０の外周にゼラチン膜１１を染込ませる。このゼラチン膜１１の染込ませ方として、ゾル化したゼラチンが入ったシャーレに、ブロック状の生体組織補填材１０の側面を浸漬させることにより、ゼラチン膜１１をつけることができる。好ましくは、高さ２〜３ｍｍ程度のゾル化したゼラチンの中に、ブロック状の生体組織補填材１０の側面をつけるのが良い。その際、ゼラチン膜１１は、１５℃未満、又は１５〜２０℃の温度で生体組織補填材１０の外周に各々、固化又はゲル化する。なお、この際、図３（ａ）に示すように、間葉系幹細胞６を播種するため、生体組織補填材１０の上面には、ゼラチン膜１１をつけないようにする。
【００１７】
次いで、図３（ｂ）に示すように、間葉系幹細胞６を播種する。即ち、ブロック状の生体組織補填材１０の上面に図示しないピペット等で、間葉系幹細胞６を含む細胞懸濁液１２を播種する。播種した際、細胞懸濁液１２は、生態組織補填材１０の多孔体の部分に入り込むが、ゼラチン膜１１によって生体組織補填材１０の外部に漏れないようになっている。
なお、細胞懸濁液１２を生体組織補填材１０に播種した後、ゼラチン膜１１で生体組織補填材１０の上面を覆っても良い。即ち、間葉系幹細胞６を含む細胞懸濁液１２を、ブロック状の生体組織補填材１０に封じ込めるようにしても良い。
【００１８】
間葉系幹細胞６の播種後、生体組織補填材１０を培養液９が浸された培養容器５内に入れると共に、該培養容器５を培養室２０内に収納させた後、例えば、３７℃まで徐々に昇温させると、図３（ｃ）に示すように、ゼラチン膜１１が溶け出し、間葉系幹細胞６が含まれる細胞懸濁液１２が、ブロック状の生体組織補填材１０の外周方向（外側）に染込み始める。
そして、図３（ｄ）に示すように、間葉系幹細胞６が、生体組織補填材１０の多孔に付着すると共に、ゼラチン膜１１が完全に溶解することで、間葉系幹細胞を含んだ生体組織補填体１３が製造される。
【実施例】
【００１９】
次に、上記図３に示す製造方法に基づいて、実際に間葉系幹細胞を含んだ生体組織補填体１３を製造した場合の実施例について図４を参照して説明する。なお、ゼラチン膜１１の溶解温度は３７℃としている。
図４に示すように、ブロック状の生体組織補填材１０の外周に、厚さ３０μｍ（０．０３ｍｍ）のゼラチン膜１１をつけた場合には、該ゼラチン膜１１は、７０秒で溶解した。
また、ブロック状の生体組織補填材１０の外周に、厚さ４０００μｍ（４ｍｍ）のゼラチン膜１１をつけた場合には、該ゼラチン膜１１は、１０８００秒（３時間）で溶解したことが確認された。
更には、上記図３に示す製造方法の場合、間葉系幹細胞６がブロック状の生体組織補填材１０の多孔に付着する時間が３時間程度であることが確認されている。
【００２０】
上記実施例の結果によれば、上記図３に示す製造方法において、ゼラチン膜１１の厚さを４０００μｍ（４ｍｍ）とすることが好ましい。こうすることで、ゼラチン膜１１は、完全に３時間程度でブロック状の生体組織補填材１０の隅々まで溶解すると共に、間葉系幹細胞６に対して最適な状態で接触する。
なお、ゼラチン膜１１を３時間で溶解させるためには、厚さが４ｍｍという結果が得られたが、ｐＨ濃度や水とゼラチンとの濃度によってゼラチン膜１１の溶解時間が変化するので、４ｍｍに限られるものではない。
【００２１】
なお、上記実施形態においては、顆粒状の生体組織補填材３又はブロック状の生体組織補填材１０を用いたが、これに限定されるものではなく、円筒状、円錐状、多角形状、或いは粉末状の生体組織補填材を用いてもよい。また、顆粒状の生体組織補填材３又はブロック状の生体組織補填材１０の多孔率は、４０％から９０％程度の範囲にすることが好ましい。
また、生体組織補填材として、β−ＴＣＰ多孔体を例示して説明したが、これに限定されるものではなく、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００２２】
また、播種する細胞として間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、間葉系幹細胞としては骨髄から採取したものの他、臍帯血や末梢血等の他の体液から採取したものでもよい。また、間葉系幹細胞の他、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞あるいは神経細胞等を採用してもよい。また、自家細胞に限らず、他家細胞でもよい。
また、補填材ゼラチン包埋体４を製造する容器１および培養容器５の形状には何ら限定されるものはなく、任意の形態のものを使用することができる。
【００２３】
また、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法の各工程の一例を説明する工程図である。
【図３】図１の製造方法の各工程の他の例を説明する工程図である。
【図４】ゼラチン膜の厚さと溶解時間との関係の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００２５】
２  ゼラチン
３  生体組織補填材（顆粒状）
４  補填材ゼラチン包埋体
５  培養容器
６  間葉系幹細胞（細胞）
８  生体組織補填体
１０  生体組織補填材（ブロック状）
１３  生体組織補填体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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