(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、血管中で未活性な血小板と凝集を起こして不要な血栓の生成や血液の血管内凝固を誘導しない、特異的な凝集作用を有する血小板代替物を提供すること。【解決手段】  フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれるドデカペプチドを結合させた結合体が、実質的に活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとのみ特異的に結合する、血小板代替物として好ましい性質を有することを見いだして、本発明を完成させた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
「（微粒子）−〔（リンカー）−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ〕ｎ」、
あるいは一般式
「（微粒子）−〔（スペーサー）−（リンカー）−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ〕ｎ」である結合体。
（式中、ｎは整数）
【請求項２】
微粒子が、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、合成高分子の何れか一から選ばれる請求項１記載の結合体。
【請求項３】
微粒子が、小胞体、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、生分解性高分子の何れか一から選ばれる請求項１または２に記載の結合体。
【請求項４】
微粒子の粒子径が、50nm以上である請求項１〜３の何れか一に記載の結合体。
【請求項５】
微粒子の粒子径が、10μｍ以下である請求項１〜４の何れか一に記載の結合体。
【請求項６】
リンカーが、片末端がSH基と反応し、もう片末端がOH基、COOH基、NH2基のいずれか一と反応する化合物である請求項１〜５の何れか一に記載の結合体。
【請求項７】
リンカーが、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか一から選ばれる請求項１〜６の何れか一に記載の結合体。
【請求項８】
リンカーが、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか１であり、かつ炭素鎖がＣ2〜10である請求項１〜７の何れか一に記載の結合体。
【請求項９】
スペーサーが、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン及び抗体から選ばれる１又はこれらの複数の組み合わせからなる請求項１〜８の何れか一に記載の結合体。
【請求項１０】
微粒子がラテックス粒子、スペーサーがアルブミン、リンカーがジチオカルボン酸である請求項１〜９の何れか一に記載の結合体。
【請求項１１】
微粒子が小胞体、スペーサーがポリエチレングリコール、リンカーがマレイミドカルボン酸である請求項１〜９の何れか一に記載の結合体。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む血小板代替剤。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか一に記載の結合体による血小板凝集の制御方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１の何れか一に記載の結合体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む診断薬又は試薬。
【請求項１６】
血小板機能異常症の診断薬、生物学的・医学的な試薬、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤のスクリーニング用の試薬、血管損傷部位及び血栓形成部位の検査用診断薬又は治療剤である請求項１５の診断薬又は試薬。
【請求項１７】
請求項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む薬物運搬体。
【請求項１８】
薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選択される請求項１７に記載の結合体を含む薬物運搬体。
【請求項１９】
請求項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選択される請求項１９に記載の結合体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
血管障害、血管損傷及び血栓症の予防又は治療のための請求項１９又は２０記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血小板代替機能を有するペプチド結合体に関する。特に、活性化した血小板を特異的に認識するオリゴペプチドの微粒子との結合体、該結合体を含む血小板代替物、該結合体による血小板凝集の制御方法、該結合体の製造方法、及び該結合体を含む診断薬からなる。
【背景技術】
【０００２】
血小板減少症等の疾患、あるいは抗癌剤などの化学療法の使用に際して一時的に血小板数が減少する場合に、出血傾向及び出血した場合に血が止まり難い症状が現れる。この症状への処置法として、ヒト血小板製剤の投与が行われるが、ヒト由来であるためにウィルスや病原菌の感染リスクの問題があり、しかも血小板製剤の保存期間は室温で３日間と非常に短いために、これらを解決できる血小板代替物の開発が急務となっている。
【０００３】
ヒトより採取した血小板から成る血小板製剤は、血小板減少症などの処置に不可欠であるが、保存期間が短いこと、また、感染症リスクの問題等があることから、長期保存可能な血小板代替物の研究が行なわれてきた。
これまで、血小板代替物として、古くは、ヒト血小板をパラホルムアルデヒドで固定化し、凍結乾燥した物が知られている（特許文献１参照）。これは、血小板膜上のＧＰＩｂの活性のみを残しつつ、固定化処理によって血小板の代謝機能を失活させることにより長期保存を可能にした物である。最近では、血小板の膜上に存在し血小板の粘着または凝集に関与することが知られている糖タンパクである、ＧＰＩｂやＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａなどの機能性高分子を、何らかの微粒子の表面に結合させた物が知られている。これらのうち、ＧＰＩｂを有する物は、ＧＰＩｂとフォンビルブラント因子（ｖＷ因子）の相互作用に基づく粘着作用を有することによって血小板の代替物として働くことが期待され、一方、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを有する物は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリノーゲン及び／又はｖＷ因子の相互作用に基づく凝集作用を有することによって血小板の代替物として働くことが期待されている。
【０００４】
また、これらの機能性高分子を結合させる微粒子としては、小胞体（リポソーム）などの脂質膜、ヒトアルブミンまたはその重合体、あるいはヒト赤血球などが知られている。具体的には、小胞体（リポソーム）を微粒子としてＧＰＩｂを結合させた物（特許文献２参照）、ヒトアルブミン重合体を微粒子としてＧＰＩｂを結合させた物（特許文献３参照）、小胞体（リポソーム）を微粒子としてＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを結合させた物（非特許文献１参照）等が知られている。
【０００５】
また、上記の物は、機能性高分子を1種類のみ有する物であるが、ＧＰＩｂ及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの両方を有する血小板代替物も知られている。具体的には、血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを活性化させた後にパラホルムアルデヒドで固定化させた物（特許文献４参照）が知られている。
【０００６】
一方、これらのように、血小板上の機能性高分子を有することによって血小板代替物として働くのではなく、患者血液中に残存する血小板の活性を補助することにより血液の凝集を誘導する物も知られており、これらも血小板代替物とみなすことができる。例えば血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと相互作用を起こすことにより血液凝集を誘導する物が知られている。具体的には、小胞体（リポソーム）にＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を有するペプチド（配列表２）を結合させた物（非特許文献２参照）、ヒトアルブミン重合体にフィブリノーゲンを結合させた物（非特許文献３参照）、ヒトアルブミンにフィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれるドデカペプチド（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）を含むペプチドを結合させた物（特許文献５参照）等が知られている。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，２８７，０８７号
【特許文献２】特開平９−２０８５９９号、米国特許第６，１７７，０５９号及び欧州特許公開第０８９４８０７号各号公報
【特許文献３】特開２００１−１５１８００号公報
【特許文献４】特開２００１−１３１０７８号公報
【特許文献５】米国特許第４，６６１，４７１号
【非特許文献１】M. E. Rybak, Thrombosis and Haemostasis, 55, 240-245, 1986
【非特許文献２】T. Nishiya, and S. Sloan, Biochim. Biophys. Res. Commun., 224, 242-245, 1996
【非特許文献３】S. Takeoka et al., Biomacromolecules, 2, 1192-1197, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血小板代替物を製造するにあたり最も注意すべきことの一つは、製造した血小板代替物が、必要とされる場合以外にも血管中で凝集を起こすことにより血栓の生成あるいは血液の血管内凝固を誘導し、血管閉塞など重大な副作用を生じさせることがないよう、血小板代替物の凝集能力を制御することにある。事実、ヒト血小板においては、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは通常状態では未活性であり、必要に応じてのみ活性化される。この制御機構により、生体中では、不要な血栓の生成や血液の凝固が抑制されている。しかしながら、固定化血小板、あるいは担体にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを結合させた従来の血小板代替物において、このような制御機構を備えた物は知られていない。
一方、患者血液中に残存する血小板の活性を補助することにより血液の凝固を誘導する血小板代替物は、血小板上の活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを利用したフィブリノーゲンの結合や血小板の凝集を必要とする。しかし、本発明者らの研究により、微粒子にＲＧＤ配列を有するペプチドを結合させた血小板代替物は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが未活性な状態である血小板に対しても、その未活性なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを介して血小板と結合する作用を有することが明らかとなった。これは、血小板の活性を補助する血小板代替物であっても、不要な血栓の生成や血液の血管内凝固などの副作用を有する可能性があることを示している。また、微粒子にフィブリノーゲンを結合させた物についても、活性化したＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのみとの特異的結合作用を有することが期待されるが、フィブリノーゲンの不安定性に問題があることが示唆されている（上記の非特許文献３参照）。そのほか、フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれるドデカペプチド部分を含むペプチドを結合させた物についても、従来技術においてその具体的な態様は十分明らかにされておらず、安定性などの性状及び具体的な作用効果については、何一つ明らかにされていない（上記の特許文献５参照）。
以上のことから、血管中で未活性な血小板と凝集を起こして不要な血栓の生成や血液の血管内凝固を誘導しない、特異的な凝集作用を有する血小板代替物が、現在も要求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特異的な凝集作用を有する血小板代替物について鋭意研究を行なった結果、フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれるドデカペプチドの合成体を微粒子に結合させたペプチド結合体が、実質的に活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとのみ特異的に結合する、血小板代替物として好ましい性質を有することを見いだして、本発明を完成させた。また、本発明の血小板代替物にはヒト由来の成分を用いておらず、それら成分の合成体及び遺伝子組換え体を用いているため、ウイルス等の感染リスクは回避される。
【００１０】
すなわち本発明の内容は、以下のとおりである。
１．一般式
「（微粒子）−〔（リンカー）−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ〕ｎ」、
あるいは一般式
「（微粒子）−〔（スペーサー）−（リンカー）−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ〕ｎ」である結合体。
（式中、ｎは整数）
２．微粒子が、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、合成高分子の何れか一から選ばれる前項１記載の結合体。
３．微粒子が、小胞体、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、生分解性高分子の何れか一から選ばれる前項１または２に記載の結合体。
４．微粒子の粒子径が、50nm以上である前項１〜３の何れか一に記載の結合体。
５．微粒子の粒子径が、10μｍ以下である前項１〜４の何れか一に記載の結合体。
６．リンカーが、片末端がSH基と反応し、もう片末端がOH基、COOH基、NH2基のいずれか一と反応する化合物である前項１〜５の何れか一に記載の結合体。
７．リンカーが、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか一から選ばれる前項１〜６の何れか一に記載の結合体。
８．リンカーが、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか一であり、かつ炭素鎖がＣ2〜10である前項１〜７の何れか一に記載の結合体。
９．スペーサーが、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン及び抗体から選ばれる１又はこれらの複数の組み合わせからなる前項１〜８の何れか一に記載の結合体。
１０．微粒子がラテックス粒子、スペーサーがアルブミン、リンカーがジチオカルボン酸である前項１〜９の何れか一に記載の結合体。
１１．微粒子が小胞体、スペーサーがポリエチレングリコール、リンカーがマレイミドカルボン酸である前項１〜９の何れか一に記載の結合体。
１２．前項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む血小板代替剤。
１３．前項１〜１１の何れか一に記載の結合体による血小板凝集の制御方法。
１４．前項１〜１１の何れか一に記載の結合体の製造方法。
１５．前項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む診断薬又は試薬。
１６．血小板機能異常症の診断薬、生物学的・医学的な試薬、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤のスクリーニング用の試薬、血管損傷部位及び血栓形成部位の検査用診断薬又は治療剤である前項１５の診断薬又は試薬。
１７．前項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む薬物運搬体。
１８．薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選ばれる前項１７に記載の結合体を含む薬物運搬体。
１９．前項１〜１１の何れか一に記載の結合体を含む医薬組成物。
２０．薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選ばれる前項１９に記載の結合体を含む医薬組成物。
２１．血管障害、血管損傷及び血栓症の予防又は治療のための前項１９又は２０記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれる合成ドデカペプチドを結合させた結合体は、実質的に活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとのみ特異的に結合し、血管中で未活性な血小板と凝集を起こすことにより血栓の生成あるいは血液の血管内凝固を誘導することがない。また、本発明のペプチド結合体にはヒト由来の成分を用いておらず、それら成分の合成体及び遺伝子組換え体を用いているため、感染リスクは回避される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のペプチド結合体は、一般式
「（微粒子）−〔（リンカー）−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ〕ｎ」、
あるいは一般式
「（微粒子）−〔（スペーサー）−（リンカー）−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ〕ｎ」である。式中、ｎは整数である。ドデカペプチドである「Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ」は、フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ/ＩＩＩａ認識部位に含まれるアミノ酸配列（配列表１）であり公知である。この配列は、自体公知の合成手段によって合成可能であり特に限定されるものではない（The  Peptides  Analysis,  Synthesis,  and  Biology  Vol.2,  pp.1-284, Academic  Press(1980))。末端のカルボキシル基はアミノ酸Ｖａｌ由来である。
【００１３】
式中、微粒子とは医療用の非経口投与が可能な担体を意味し、生体適合性を有する限りは特に限定されない。これまでに公知の好適な微粒子材料としては、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、合成高分子などが知られており、具体的には小胞体（リポソーム）、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、生分解性高分子等が例示される。
小胞体（リポソーム）は脂質人工膜で構成される粒子でリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から脂質二重層としてつくられる。その調製には、界面活性剤除去法、水和法、超音波法、逆相蒸留法、凍結融解法、エタノール注入法、押し出し法、及び高圧乳化法等広く公知方法が適用される。小胞体（リポソーム）の調製の詳細は上記特許文献２及び非特許文献２に詳しく記載されている。小胞体（リポソーム）は、本発明の実施例及び実験例で使用されたが、適宜生体適合性を有するものが選択され使用される。
【００１４】
組換えアルブミンは、既知の遺伝子工学的手法により製造されたものが利用でき特に制限されない。例えば、実用化レベルにある宿主として酵母を用いて生産される組換えアルブミンは好適である。アルブミンの微粒子化（重合）は公知であり、特開2001-151800号公報の本発明者等によるアルブミン重合体の調製法が好適である。また組換えアルブミンの調製法は以下のような方法に詳しく記載されており（特開平5-317079,同6-56883,同6-245789,同8-116985各号公報）、これらの方法で実施例１で使用するｒHSAを得た。
ラテックス粒子は、本発明の実験例で使用されたが、適宜生体適合性を有するものが選択され使用される。生分解性高分子は例えば、乳酸及び/又はグリコール酸を重合して得られる高分子を微粒子化して調製される。生体内ではこれらは経時的に分解又は溶解性の性質を持つように分子量・共重合体組成や配合比が決定され使用される。
【００１５】
このようにして調製される微粒子の粒子径は、表面認識部位の導入量とその機能発揮、および体内動態の面から、約50nm以上が好ましく、また、約10μｍ以下が好ましい。更に、好ましくは約50nm〜約500nm、より好ましくは約100nm〜約400nmである。
【００１６】
式中リンカーは微粒子とペプチド末端のSH基と架橋できるもので、公知の生体許容性があるものならば特に限定されないが、好ましくは片末端がSH基と反応し、もう片末端がOH基、COOH基、NH2基のいずれかと反応する化合物である。このようなリンカーとしては、例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチオカルボン酸及びマレイミドカルボン酸等が例示される。これらは炭素鎖がＣ2-10であることが好ましい。
式中スペーサーは、微粒子とリンカー間にあって微粒子表面とペプチド間の長さを調節できるものであり、生体適合性があれば特に限定されないが、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン、及び抗体から選ばれる１又はこれらの複数の組み合わせからなる物質を利用できる。アルブミンや抗体は組換体が利用できる。
【００１７】
微粒子上に結合されるドデカペプチドの分子数は、高密度であることが血小板との結合の可能性を高め、凝集塊の形成が迅速に進むことから好適である。式中ｎは整数を意味し、微粒子に結合するドデカペプチドの数を表す。その数は、適宜その所望凝集度及び凝集速度に応じて当業者は変異可能であり調整できる。例えば、実験例４に示すように小胞体（リポソーム）を使う場合は、ドデカペプチドによる修飾率の最適値（例えば0.3mol%-0.6mol%）が特定可能であり、同様に条件を変え、最適化が達成される。一定値以下の修飾率では効果が不十分であり、一定値以上の修飾率では効果に影響しなくなる。
【００１８】
微粒子、リンカー又はスペーサー−リンカー、及びドデカペプチドの結合体の調製は、微粒子の調製後、必要であれば微粒子表面の活性化によって化学結合可能にし、ついで必要なリンカー又はスペーサー−リンカーを結合させ、さらにはドデカペプチドを反応させることによって調製される。或は、予めリンカー又はスペーサー−リンカーとドデカペプチドの反応産物を調製しておき、最終的に活性化された微粒子と結合させてもよい。反応条件は、各微粒子に適合した自体公知の手法が適用可能である。ドデカペプチドと微粒子の混合比は、最終的な結合体におけるドデカペプチドの密度の所望値によって調節される。
小胞体の場合、脂質二重層の構成成分と成り得るドデカペプチドを結合させた両親媒性分子をあらかじめ小胞体を構成する脂質類と有機溶媒中で混合させておき、常法にて小胞体を調製することによって小胞体表面をドデカペプチドで修飾することができる。
【００１９】
次いで要すれば、本発明の結合体は、生理的に許容される水溶液で洗浄し、除菌濾過、分注を行い、液状製剤、ペレット状及び懸濁状製剤として調製する。製剤化は医薬品の製法において広く公知の方法に準ずる。また、本製剤は液状製剤を凍結させた後、減圧下で乾燥させ、凍結乾燥製剤としても提供される。なお、凍結乾燥する場合は保護剤として、単糖類（例えば、ブドウ糖等）、二糖類（例えば、蔗糖等）等を配合してもよい。本発明の製剤にはアルブミン、デキストラン、ビニル重合体、ゼラチン及びヒドロキシルエチル澱粉から選ばれた高分子物質を安定化剤として配合してもよい。当該安定化剤の添加量は脂質１重量部に対して、０．５〜１０重量部、好ましくは１〜５重量部である。
【００２０】
かくして調製された本発明の結合体を含む製剤は、活性化された血小板のＧＰＩＩｂ/ＩＩＩａと選択的な結合性をしめすことから、血管中で未活性な血小板とは凝集を起こすことはなく、血管損傷部位等の血小板の活性化した部位での血小板との凝集が期待でき、血小板凝集の制御手段を提供する。本発明の結合体はそれ自体で合成血小板の代替物となりうる。又本発明の結合体は、血管損傷部位等の血小板の活性化した部位への集積性を有するために、薬物含有組成物（薬物運搬体）としての態様を取ることもできる。このような薬物としては、血管損傷部位へ集積させることによって生理学的、薬理学的に有効であるものであれば特に制限はなく、例えば、止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤等が挙げられる。本発明の結合体は、ドデカペプチドとして、１日当たり０．００１〜１０００ｍｇ程度を投与することができる。その投与量は患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜増減できる。本発明の結合体は、より好ましくは非経口的に投与される。具体的には、血管内（動脈内・静脈内）への注射、持続点滴、皮下投与、局所投与あるいは筋肉内投与等が例示される。本発明の結合体を含む医薬組成物としては、血小板代替剤、血管障害、血管損傷及び血栓症等の予防・治療等の医薬品、あるいは血小板無力症などの血小板機能異常症の診断薬、生物学的・医学的な試薬、血小板凝集抑制剤・抗血栓剤のスクリーニング用の試薬等がある。さらに、血管損傷部位及び血栓形成部位の検査用診断薬あるいは治療剤としても有用である。
【００２１】
以下、製造例、実験例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
ドデカペプチド〔以下H12と記す。（配列表１）〕結合ラテックスビーズ（以下H12-LBと記す）合成法
組換えヒト血清アルブミン（以下rHSAと記す）溶液(50mg/mL, 1.5mL)に粒子径１μmのラテックスビーズ（以下LBと記す）分散液を混合し、振とうさせた(20℃, 2hr)。遠心分離(13000g, 5min, 4℃, 3times)によってLBを沈殿させ、未吸着rHSAを上清として除去後、phosphate-buffered saline (以下PBSと記す, 500μL)によって再分散させた。
HSA吸着LB 分散液〔以下(HSA)LBと記す〕（ 4.0x106particles/μL, 500μL）に、SPDP（N-スクシンイミジル 3,2-ピリジルジチオプロピオネート）エタノール溶液(5mM, 5μL)を添加し、振とうさせた(20℃, 30min.)。遠心分離(13000g, 5min, 4℃, 3times)によって未反応SPDPや副生成物を除去して、pyridyl disulfide(以下PDと記す)結合(HSA)LB 〔以下PD-(HSA)LBと記す〕を得た。このPD-(HSA)LB(4.0x106particles/μL, 500μL)にCys-H12（末端にCysが付加されたH12）(10mM, 8μL)を混合し、振とうさせた(20℃, 12hr)。遠心分離(13000g, 5min, 4℃, 3times)によって上清を除去後、H12-LB（2.0x106particles/μL, 1mL）を得た。LB表面のH12結合量はthiol-disulfide交換反応で生成される2-thiopyridone (以下2TP) の343nmの吸収から決定した(HPLC, TSK-GEL G3000SWXL column, 7.8mm o.d. x 300mm h, 1mL/min, PBS)。
【００２３】
（実施例２）
H12（配列表１）結合小胞体（以下H12-PEG小胞体と記す）合成法
H12-PEG-Glu2C18の対照として、PEG-Glu2C18を合成した。グルタミン酸 (2.96g, 20mmol)、p-トルエンスルホン酸一水和物 (4.56g, 24mmol) をベンゼン150mlに溶解させ、Dean-Stark装置をもちいて105℃で生成水を除去しながら、1時間還流させた。ステアリルアルコール（11.9mg, 44mmol） を加え、105℃で生成水を除去しながらさらに14時間還流させた。溶媒を減圧蒸留した後、残分をクロロホルム150mlに溶解させ、炭酸ナトリウム飽和水溶液150mlで2回、水150mlで2回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム5gで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を60℃でメタノール400mlに溶解させ、不溶成分があればろ過し、4℃で再結晶、濾過後乾燥して白色粉末Glu2C18(13.3g，収率85%)（化１参照）を得た。
このGlu2C18 (50.08mg, 76.8μmol)とMeO-PEG-COOH（α-カルボキシル-ω-メトキシポリエチレングリコール） (Mw=5150)(200mg, 38.4μmol)及びHOBT （1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール）(5.2mg, 38.4μmol) をジクロロメタン5ml中に溶解させた後、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）(9.58mg, 46.4 μmol) を加え、12時間撹拌した。不溶成分を濾過にて除去後、反応溶液をジエチルエーテル250mlに滴下し、不溶成分を回収した。回収物をベンゼンに溶解させて凍結乾燥をおこない、白色粉末PEG-Glu2C18 (204mg,収率83%) (n=115)（化１参照）を得た。化１にその合成概略を示す。
【化１】
2005239549.tif 000002
【００２４】
一方、本発明のH12-PEG-Glu2C18を以下のように調製した。クロロホルム5ml中にGlu2C18 (115.1mg, 176μmol) 、TEA（トリエチルアミン） (24.6μl, 176μmol) を加えた後に、MAL-PEG-NHS （α-マレイミジル-ω-N-ヒドロキシスクシンイミジルポリエチレングリコール）(Mw=3400)(300mg, 58.8μmol) を溶解させ、室温で12時間撹拌させた。反応溶液をジエチルエーテル250mlに滴下し、不溶成分を回収した。回収物をベンゼン中に溶解し凍結乾燥をおこない、白色粉末MAL-PEG-Glu2C18 (264.8mg, 収率64%) （化２参照）を得た。このMAL-PEG-Glu2C18 (n=71)(100mg, 25.37μmol)とCys-H12(32.8mg, 25.37μmol) をDMF5mlに溶解し、室温で12時間撹拌させた。反応溶液をジエチルエーテル250mlに滴下し、不溶成分を回収した。水250mlを加え不溶成分を除去後、凍結乾燥機にて溶媒を除去し、淡黄色粉末H12-PEG-Glu2C18 (62.8mg, 収率47%) （化２参照）を得た。化２にその合成概略を示す。
【化２】
2005239549.tif 000003
【００２５】
ついで上記調製されたPEG-Glu2C18及びH12-PEG-Glu2C18を使い小胞体の表面にH12を導入させた。 DPPC (100mg, 136μmol)及び コレステロール（52.7mg, 136μmol） に対してPEG-Glu2C18及び／又はH12-PEG-Glu2C18 を任意の比で加えた混合脂質をベンゼン5mlに溶解し、凍結乾燥を3時間行った。乾燥後、純水10mlを加え12時間撹拌したのち造粒装置（Extruder）を用いて貫通孔を有するフィルターを透過させて粒径制御を行った。フィルターは孔径
｛3000nm→800nm→650nm→450nm→300nm→220nm（x2）｝ の順番で通過させた。超遠心分離（33000rpm、30分）を2回おこない、PBS 5ml中に分散させ小胞体分散液とした。PEG-Glu2C18及び／又はH12-PEG-Glu2C18 の含有量について、PEG-Glu2C18 (4.74mg, 0.817μmol)のみを含む小胞体をPEG-小胞体、H12-PEG-Glu2C18 (4.34mg, 0.817μmol) のみを含む小胞体をH12-PEG小胞体、PEG-Glu2C18 (4.74mg, 0.817 mol) ・ H12-PEG-Glu2C18 (14.34-0.43mg, 2.72-0.0817 mol) を含む小胞体をH12-PEG(PEG)小胞体と定義した。
なお、調製されたリン脂質小胞体 (H12-PEG小胞体・1.8wt%) をPBSで30倍希釈し37℃で12時間振とう後、超遠心 (33000rpm,1h) にて小胞体を沈殿、分散させ、さらに凍結乾燥した粉末を1H-NMR測定した。DPPC、コレステロール、H12-PEG-Glu2C18のモル比はH12-PEG小胞体を37℃で12時間振とうさせても変化がなかったことからH12-PEG-Glu2C18はリン脂質小胞体からは脱離せず、安定担持されていることが確認できた。
【００２６】
（実験例１）
担体にラテックスビーズを使った場合の血小板との凝集試験
血小板減少モデル血液は、全血を重力落差で赤血球製剤用白血球除去フィルター(NEO1J, 日本ポール社)を通過させ、多血小板血漿(PRP)を添加して血小板濃度2.0×104/μLとなるように調製した(自動血球計測装置K-4500, Sysmex, Kobe)。
血小板減少モデル血液5mL中にH12-LB (1.0x105particles/μL)を添加し、静置後(37℃, 10min.)、コラーゲン固定化基板上にポンプを用いて流動させ(ずり速度150s-1)、蛍光顕微鏡あるいはCCDカメラを通して観察した。各基板に対する微粒子の粘着占有率〔surface coverage (以下SCと記す)〕は、画像解析装置(Argus-50、浜松フォトニクス)によって測定した。
血小板にのみ蛍光標識 〔3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide(DiOC6)〕をして経時的に粘着挙動を観察した。その結果、血小板の基板へのSCは時間経過と共に増大し、180秒後では3.1±0.4%であった〔図１：□、control〕。また、この傾向は、LBを添加しない系、即ち、血小板のみの系のそれとほぼ変わらないことから〔3.0±0.6%、図1：●〕、LBのみによる血小板粘着への影響は生じないことが示唆された。そこで、LBの代わりにH12-LBを添加したところ、血小板粘着はLB添加時よりも増幅され、180秒後では5.1±0.3%であり、controlよりも約1.7倍増幅された〔図1：○〕。
他方、FITCでLBを標識したH12-LB及びLBの粘着挙動を観察したところ、H12-LBの場合の初期粘着速度は図１に示した血小板のそれと比較して非常に緩やかであったが、SCは徐々に増大した〔図２：△〕。また、血小板濃度が0.2x104/μLのときH12-LBの基板への結合数は抑制され〔図２： ●〕、さらにLBではほとんど結合しなかった〔図２：□〕。
【００２７】
そこで、流動後の基板をSEM（Scanning Electron Microscope）観察したところ、コラーゲン基板上にまず血小板が粘着した後にH12-LBが結合し、さらに別の血小板によるH12-LBを巻き込んだ粘着が確認できた(図３)。
以上より、コラーゲン基板に対するH12-LBの粘着は血小板の存在によって誘導され、コラーゲンに粘着し活性化した血小板上にH12-LBが結合し、さらに流動血小板がそれを介して誘導・粘着し、次々と両者の積層が生じたことが確認できた。
【００２８】
（実験例２）
未活性血小板に対する結合性試験
未活性血小板(2.0×104/μL)に対して各LB、H12-LB、及びCGGRGDF-LB〔ＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を有するペプチドを結合したLB〕を1.0×105/μL混合し、振とう(37℃,30min) し、それぞれの膠着率をフローサイトメトリーによって評価した。その結果、LB、H12-LBは膠着率の上昇は見られなかったが、CGGRGDF-LBは2.9+1.3%であった(図４)。このことから、H12-LBは CGGRGDF-LBより未活性血小板に膠着しにくいことが確認できた。
【００２９】
（実験例３）
小胞体へのH12導入量と血小板凝集効果
クエン酸ナトリウム水溶液 (3.8%) を全血に1/9(v/v) 添加し、遠心分離(600rpm,15min)を行い、多血小板血漿(PRP) を得た。沈殿成分を更に遠心分離(2500rpm,10min) して、乏血小板血漿 (PPP) を得た。PRP、PPPを混合し血小板減少血漿 (180μl,[PLT]=10×104/μl) を調製した。これに小胞体分散液10μlを添加した後、ADP（アデノシン-5'-二リン酸）(300μM) 10μlを添加し、血小板を凝集させた。
凝集計による測定はPPPを透過度100%、血小板減少血漿を透過度0%としたときの凝集による透過度の増大を測定し、PEG-小胞体を添加した場合に対して、同濃度のH12-PEG(PEG)小胞体を添加した場合の透過度の差を評価した。  
H12-PEG-Glu2C18を0.1mol%、0.2mol%、及び0.3mol%で含む小胞体いずれにおいても血小板凝集の促進が認められたが、小胞体へのH12導入量が増加するほど、血小板の凝集を促進した （図５）。
【００３０】
（実験例４）
担体に小胞体を使った場合の血小板との凝集試験
血小板をDiOC6にて蛍光標識し、血小板減少血液 ([血小板]=5.0×104/μL) 5mLにH12-PEG(PEG)小胞体(1.5wt%, 200μL) を添加し、静置後 (37℃, 10min)、コラーゲン基板上をずり速度150 s-1にて流動させ蛍光顕微鏡にて観察した。血小板の基板へのSCはArgus-20にて解析した。血小板減少血液 ([血小板]=5.0×104/μL) に、H12-PEG小胞体 (H12-PEG-Glu2C18 : 0.3mol%) あるいはPEG小胞体を添加し、コラーゲン基板上を流動させたところ、H12-PEG小胞体添加系はPEG-小胞体添加系と比較してSCが増大した (表１)。
（H12-PEG(PEG)小胞体 と H12-PEG小胞体の存在下での血小板凝集の促進）
【表１】
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【００３１】
これは、血小板がまずコラーゲン基板に粘着し、粘着した血小板にリン脂質小胞体が結合して流動している血小板との結合部位を増やし、リン脂質小胞体にさらに血小板が結合したためSCが増大したと考えられる。また、H12-PEG(PEG)小胞体について、同条件にて基板上を流動させたところ、H12-PEG(PEG)小胞体添加系についても同様にPEG小胞体添加系と比較してSCが増加した(表１)。これにより、血中滞留性向上のために小胞体表面へPEG脂質を導入してもH12の認識反応は阻害されないことが示された。
次にH12-PEGの修飾率の異なるH12-PEG(PEG)小胞体を血小板減少血液に添加した場合のコラーゲン基板上への血小板のSCは、図６のようになった。これは、H12-PEG-Glu2C18修飾率 0.1mol%以下では基板への血小板のSCがPEG小胞体とほぼ同じであり、修飾率0.3mol%以上では修飾率とともにその効果も現れることを示した。これは、コラーゲンにて活性化した血小板へのH12-PEG(PEG)小胞体の粘着数がH12-PEG-Glu2C18の修飾量につれて増加したためであると考えられた。
【００３２】
（実験例５）
担体に小胞体を使った場合の血小板との相互作用
血小板減少血漿([血小板]=5.0×104/μL)80μLを調製し、蛍光標識したH12-PEG(PEG)小胞体 (8.2μM, 20μL)、または蛍光標識した抗体とH12-PEG(PEG)小胞体 (0.082μM, 20μL) を添加後、撹拌 (30min, 37℃) した。続いてホルムアルデヒド (3.7%) 固定、10倍希釈後フローサイトメトリーを用いて計測した。    
H12-PEG(PEG)小胞体を添加した血小板について、表２より抗体の結合量がPBSやPEG小胞体を血小板に添加した系と変わらなかった。また、H12-PEG(PEG)小胞体そのものも血小板とほとんど相互作用していなかった。従って、血流中にてH12-PEG(PEG)小胞体は正常血小板と相互作用せず、活性化しないことを確認した。このことから、H12-PEG(PEG)小胞体は未活性血小板に膠着しにくいことが確認できた。
（血小板へのPAC-1の結合）
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３３】
フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれる合成ドデカペプチドを結合させた結合体は、実質的に活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとのみ特異的に結合し、血管中で未活性な血小板と凝集を起こすことにより血栓の生成あるいは血液の血管内凝固を誘導することがない。また、本発明のペプチド結合体にはヒト由来の成分を用いておらず、それら成分の合成体及び遺伝子組換え体を用いているため、感染リスクは回避される。従って、本発明のペプチド結合体は血小板代替物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】血小板のコラーゲン基板への粘着占有率の経時変化を示す。
【図２】ドカペプチド結合ラテックスビーズ（H12-LB）のコラーゲン基板への粘着占有率の経時変化を示す。
【図３】流動後の基板のSEM観察図を示す。
【図４】未活性血小板に対する結合性試験としての膠着率を示す。
【図５】小胞体へのH12導入量と血小板凝集効果を示す。
【図６】血小板のコラーゲン基板への粘着占有率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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