(57)【要約】      （修正有）【課題】種々の用途、特に臨床診断に用いることのできる、ＳＨ試薬に対する安定性の優れたアシルＣｏＡオキシダーゼの提供。【解決手段】以下の性質を有する酵素を見いだした。（１）１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７℃，４時間の処理で４０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼ。（２）１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７℃，４時間の処理で６０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼ。（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のアシルＣｏＡオキシダーゼ。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質。【効果】本発明によれば、ＳＨ試薬共存下において安定性の優れたアシルＣｏＡオキシダーゼが提供された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７℃，４時間の処理で４０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼ。
【請求項２】
１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７℃，４時間の処理で６０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のアシルＣｏＡオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項４又は５記載のアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からアシルＣｏＡオキシダーゼを採取することを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＨ試薬に対する安定性が優れたアシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びＳＨ試薬に対する安定性が優れたアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシルＣｏＡオキシダーゼは、アシルコエンザイムＡ（アシルＣｏＡ）を酸化し、トランス−２,３−デヒドロアシルコエンザイムＡ（エノイルＣｏＡ）及び過酸化水素に変換する酵素であり、ペルオキシソームにおける脂肪酸のβ酸化に関与する。本酵素は、哺乳動物、植物、微生物等天然に広く存在することが知られている。
例えば、哺乳類由来のものとしては、ラット由来（非特許文献１参照）、マウス由来（非特許文献２参照）、ヒト由来（非特許文献３参照）等の報告がある。
植物由来としては、カボチャ由来（非特許文献４参照）、キュウリ由来（非特許文献５参照）、シロイヌナズナ由来等が知られている。
また微生物由来としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来（特許文献１、非特許文献６参照）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来（非特許文献７参照）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ由来（非特許文献８参照）、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ  ｐｈａｓｅｏｌｉ由来（特許文献２参照）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｒｅｓｉｎａｅ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓ由来（特許文献２参照）、Ｍｏｎａｓｃｕｓ属由来（特許文献２参照）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来（特許文献２参照）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属由来（特許文献２参照）、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ由来、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来（特許文献３参照）等が知られている。これらの酵素のなかにはすでに遺伝子のクローニングに成功し、組み換え体によって生産されている例もある。
【０００３】
本酵素の産業上の有用性としては、例えば、遊離脂肪酸の測定あるいは脂肪酸のβ酸化系を利用する化学変換が挙げられる。特に臨床診断の分野においては、血清中の遊離脂肪酸が糖尿病、高脂血症、甲状腺機能亢進症、重症肝障害の診断の指標とされている。また、近年、遊離脂肪酸がオーファンＧタンパク質受容体の一つであるＧＰＲ４０に作用して、膵臓β細胞からのインスリン分泌を促進することが明らかとなり、遊離脂肪酸の生体内における機能性に注目が集まっている（非特許文献９参照）。
酵素を用いる遊離脂肪酸の測定方法は、いくつか知られている。
アシルＣｏＡオキシダーゼを用いる方法は、特異性が高く、簡便であることから広く一般的に用いられている（特許文献４，５参照）。
本測定は、まず血清中の遊離脂肪酸にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）及びアシルＣｏＡシンターゼ等を含有する第一試薬を添加し、アシルＣｏＡを生成させる。これにアシルＣｏＡオキシダーゼを含有する第二試薬を添加すると、アシルＣｏＡが酸化されて過酸化水素が発生する。第二試薬にペルオキシダーゼと発色試薬を共存させると、発生する過酸化水素により発色するので、これを測定することにより遊離脂肪酸を定量できる。以下に反応式を示す。
アシルＣｏＡシンターゼ
遊離脂肪酸＋ＣｏＡ＋ＡＴＰ  →  アシルＣｏＡ＋ＰＰｉ＋ＡＭＰ
アシルＣｏＡオキシダーゼ
アシルＣｏＡ＋Ｏ２  →  エノイルＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ２
本測定では、過剰に添加するＣｏＡが発色を妨害することが知られており、これを回避するために、第二試薬中にＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ヨード酢酸、ヨード酢酸アミド等のＳＨ試薬を共存させ、第二試薬の添加と同時にＣｏＡを失活させる方法が報告されている（特許文献４，５参照）。しかしながら、同じく第二試薬に処方されるアシルＣｏＡオキシダーゼは、ＳＨ試薬共存下では安定性が著しく低下するために、長期間使用可能な液状化試薬の調製が困難であった。そこで、遊離脂肪酸測定用の液状化試薬を開発するために、ＳＨ試薬に対する安定性の優れたアシルＣｏＡオキシダーゼの開発が強く求められていた。
【０００４】
【特許文献１】特公昭５９−１５６２５号公報
【特許文献２】特公昭５８−４０４６６号公報
【特許文献３】特願２００３−２７６３９３号明細書
【特許文献４】特公昭５７−２９９９８号公報
【特許文献５】特公昭５７−３３９５５号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１７，４８２（１９９５）
【非特許文献２】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，１２５４（２０００）
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８，１１１３（１９９４）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，８３０１（１９９８）
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，８５７０（１９８６）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８，１４８１（１９８０）
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９１，１０８（１９７９）
【非特許文献８】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，３６５（１９８８）
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ  ４２２，１７３（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、種々の用途、特に臨床診断に用いることのできる、ＳＨ試薬共存下での安定性の優れたアシルＣｏＡオキシダーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意検討を重ねた結果、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１４０）由来のアシルＣｏＡオキシダーゼが、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７℃，４時間の処理で４０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼ。
（２）１０ｍＭのＳＨ試薬存在下、ｐＨ７．５において３７℃，４時間の処理で６０％以上の残存活性を示すことを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼ。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のアシルＣｏＡオキシダーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のアシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（６）項目（４）又は（５）記載のアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
（７）項目（６）記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
（８）項目（７）記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からアシルＣｏＡオキシダーゼを採取することを特徴とするアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＳＨ試薬共存下において安定性の優れたアシルＣｏＡオキシダーゼが提供された。
ＳＨ試薬共存下において安定性の優れた、本発明アシルＣｏＡオキシダーゼは、診断用酵素等として測定用キットに有利に利用でき、産業上有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
アシルＣｏＡオキシダーゼは、自然界に広く分布しており、本酵素の遺伝子は、種々の動物、植物、微生物等からクローニングが可能であり、その生物資源は、特に限定されないが、本発明では、例えば、微生物、さらに具体的にはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１４０）が用いられる。
目的とするアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子は、染色体遺伝子あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素を用いて合成したＤＮＡからクローニングすることができる。クローニングについては如何なる方法でもよく、例えば、単離したアシルＣｏＡオキシダーゼのアミノ酸配列解析結果や、既知のアシルＣｏＡオキシダーゼの塩基配列又はアミノ酸配列を基に混合塩基プライマーを作製してポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）を行うことにより目的の遺伝子又はその一部をクローニングすることができる。さらに、制限酵素処理した染色体遺伝子についてサザンブロット分析を行い、目的遺伝子断片を有する遺伝子断片群を単離し、これをベクターに挿入して大腸菌等を形質転換させて目的遺伝子をスクリーニングする方法あるいはセルフライゲーションさせたものを鋳型としてインバースＰＣＲを行う方法等も用いることができる。
次いで、得られた塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。このアミノ酸配列は、配列番号１で表されるとおりである。このようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺伝子が本発明のアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子である。
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子は、全て本発明に含まれる。
そして、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつアシルＣｏＡオキシダーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去又は付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
これらのＤＮＡは、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性をもたらすポリペプチドをコードしている蓋然性が高く、形質転換体を作製し、活性を有するものを選択することができる。
【０００９】
本発明のアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子と実質的に同一な遺伝子を取得するためには、配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ若しくはその相補鎖、又はそれらの一部を含むプローブによりストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションし、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするものを選択することができる。ここでいうストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件である。このような条件は個々の生物種により若干異なるが、常法によりハイブリダイゼーションと洗いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみで容易に決定することができる。このような条件としては、例えば、後記実施例の項目（４）において特異的なシグナルが観察できることから、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７〜４２℃で一晩行う。洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。洗いの温度は、４５℃以上、好ましくは５２℃以上、更に好ましくは５７℃以上である。このような条件でハイブリダイズするようなＤＮＡは、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を有するペプチドをコードしている蓋然性が高いが、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を失うような変異を有するものも含まれる。そして配列番号１で表されるアミノ酸配列の７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列は本発明に含まれることとなる。そして配列番号２に示される遺伝子配列の７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子配列もまた本発明に含まれることとなる。
【００１０】
上記のようにして得られたアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を、大腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ，ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０を参照）を保有するベクターＤＮＡに挿入し、得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌等に形質導入してアシルＣｏＡオキシダーゼ高生産株を得る。
用いられるベクターＤＮＡは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ若しくはバクテリオファージＤＮＡ等でもよい。具体的には、特開平０８−２０５８６１号公報記載のｐＢＲ系ベクターであるｐＵＴＥ５００Ｋ’あるいはこれをｐＵＣ系に改良した実施例の項目（６）に示されるｐＵＴＥ３００Ｋ’等を用いることができる。得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）、ＤＨ５α（宝酒造社製）等を形質転換又はそれらに形質導入して夫々の菌株を得る。
【００１１】
上記のようにして得られたアシルＣｏＡオキシダーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入体、例えば、エッシェリシア属に属する菌株を用いてアシルＣｏＡオキシダーゼを生産するには、下記のようにして行うことができる。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
また、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液等、１種以上の窒素源に、リン酸２水素カリウム，リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、例えば、７〜９に調整するのが適当である。また培養は、例えば、３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で６〜２４時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物よりアシルＣｏＡオキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
【００１２】
培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からアシルＣｏＡオキシダーゼを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体からアシルＣｏＡオキシダーゼを採取するのが好ましい。
このようにして得られた粗酵素液からアシルＣｏＡオキシダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。
【００１３】
本発明の「ＳＨ試薬」とは、ＳＨ基と反応する試薬をいい、チオール試薬、スルフヒドリル試薬ともいう。例えば、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）等のマレイミド誘導体、ヨード酢酸、ヨード酢酸アミド、ｐ−メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）等が挙げられる。
また、本発明の「ＳＨ試薬に対する安定性が優れた」とは、以下に述べる活性測定方法及び安定性測定方法に記載した反応条件下で、１０ｍＭのＳＨ試薬の存在下、ｐＨ７．５において３７℃、４時間処理した後の残存活性比が処理前の活性に対して４０％以上、好ましくは６０％以上残存していることをいう。ＳＨ試薬に対する安定性が優れたアシルＣｏＡオキシダーゼは、ＳＨ試薬を共存させた酵素含有製品等の保存性が著しく向上するため、産業上極めて有用である。
【００１４】
アシルＣｏＡオキシダーゼの活性の測定方法及び安定性の測定方法は、種々の方法を用いることができ、一例として、以下に、本発明で用いるアシルＣｏＡオキシダーゼ活性の測定方法及び安定性測定方法について説明する。
（アシルＣｏＡオキシダーゼ活性の測定方法）
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌ、０．１％  パルミトイルＣｏＡ溶液  ０．１ｍｌ、１５ｍＭ  Ｔｏｏｓ溶液  ０．０４ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌぺルオキシダーゼ溶液  ０．０４ｍｌ、１．７６％  ４−アミノアンチピリン溶液  ０．０２ｍｌの混合液を３７℃で５分間インキュベートし、アシルＣｏＡオキシダーゼサンプルを０．０５ｍｌ添加、混合した。全容１．１５ｍｌを３７℃で３分間反応させ、反応開始から３分間の、反応溶液の５５５ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。酵素１Ｕは、上記測定条件下において、１分間あたり１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量とした。
（ＮＥＭ安定性測定方法）
各種アシルＣｏＡオキシダーゼを０．１ｍＭ  ＦＡＤを含む２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて夫々約１０Ｕ／ｍｌの濃度とし、各酵素溶液に０．１ｍＭ  ＦＡＤ及び２０ｍＭ  ＮＥＭを含む２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を夫々等量添加し、ＮＥＭの濃度を１０ｍＭとした。本酵素液（約５Ｕ／ｍｌ）を３７℃にて４時間放置した。保存前及び保存後のサンプルの酵素活性を測定し、残存活性比を求めることで安定性を評価した。
【００１５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００１６】
実施例
アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子のクローニング
（１）Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１４０）染色体ＤＮＡの調製
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１４０）をＬＢ寒天培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ），酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ），ＮａＣｌ  ０．５％（Ｗ／Ｖ）及び寒天１．４％（Ｗ／Ｖ）〕に接種し、３７℃で培養した。培地表面に生育した菌体を集菌した。この菌体よりＧ ＮＯＭＥ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いて、染色体ＤＮＡを１００μｇ得た。
【００１７】
（２）アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の部分断片の取得１
次いで、日本ＤＮＡデータバンクの国際塩基配列データベースを用いて、各種アシルＣｏＡオキシダーゼのアミノ酸配列の相同性検索を行い、相同性が高いアミノ酸配列部分を基に、コドンが縮重している箇所を混合塩基とした複数個のＰＣＲ用プライマーを作製した。実施例項目（１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲマスターサイクラーグラジエント（エッペンドルフ社製）にて、熱変性９４℃，２分、アニール５８℃，３０秒、伸長反応７２℃，１分の条件下、３０サイクル行った。結果としてセンスプライマーが５’−ＴＴＹＧＣＮＡＴＧＡＣＮＧＡＲＡＴＨＧＧＮＣＡＹＧＧ−３’（２６ ｍｅｒ，Ａは、アデニン、Ｃは、シトシン、Ｇは、グアニン、Ｔは、チミン、Ｈは、アデニン、シトシン又はチミン、Ｎは、アデニン、シトシン、グアニン又はチミン、Ｒは、アデニン又はグアニン、Ｙは、チミン又はシトシンを示す。対応するアミノ酸配列：Ｐｈｅ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ）、アンチセンスプライマーが５’−ＴＧＹＴＧＣＡＴＮＡＲＮＡＣＮＧＴＲＴＴＲＴＣＮＣＣＹＴＣ−３’（２９ｍｅｒ，対応するアミノ酸配列：Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｇｌｎ  Ｇｌｎ）であるとき、０．９ｋｂｐ程度に相当する遺伝子断片が増幅された。
増幅したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。その結果、ＤＮＡ断片（８４１ｂｐ）が、ＰＣＲのプライマー設計に用いたペプチドのアミノ酸配列を正しくコードする塩基配列を両端に有していた。また、決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配列中には、既知のアシルＣｏＡオキシダーゼの内部アミノ酸配列と相同性が認められた。従って、得られた増幅ＤＮＡ断片は、本発明のアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の一部分（部分遺伝子）であることが判明した。
【００１８】
（３）アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の部分断片の取得２
先にクローニングしたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．２−３−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１８３）由来のアシルＣｏＡオキシダーゼ（特許文献３  特願２００３−２７６３９３号明細書）と部分遺伝子配列の相同性が極めて高かったことから、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．２−３−１由来のアシルＣｏＡオキシダーゼの遺伝子配列に基づいてプライマーを作製し、実施例項目（１）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、熱変性９４℃，３０秒、アニール５８℃，３０秒、伸長反応７２℃の条件下、３０サイクル行った結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．２−３−１由来アシルＣｏＡオキシダーゼの５’末端側の塩基配列情報をもとに設計したセンスプライマー  ５’−ＡＧＡＴＣＡＣＣＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧ−３’（２５ ｍｅｒ）及び実施例項目（２）の遺伝子配列をもとに作製したアンチセンスプライマー  ５’−ＧＧＣＣＧＴＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴ−３’（２６ ｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行った場合、増幅ＤＮＡ（約０．６ｋｂｐ）を得ることができた。
本増幅ＤＮＡ断片１％アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配列には、既知のアシルＣｏＡオキシダーゼの内部アミノ酸配列と高い相同性が認められた。また、推定されたアミノ酸配列の上流側には終止コドンの１０アミノ酸の後にメチオニンが存在していたことから、このメチオニンをコードするＡＴＧが本アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子の５’末端であると推定された。
【００１９】
（４）Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１４０）染色体ＤＮＡのサザンブロット解析
次に、実施例項目（１）で調製した染色体ＤＮＡ２μｇを、制限酵素ＳｍａＩを用い、３７℃で５時間消化した。得られた制限酵素消化ＤＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、サザンブロット法により、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、アマシャムファルマシアバイオテック社製）にＤＮＡを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例項目（２）で得られたプラスミド遺伝子を鋳型とし、実施例項目（２）で使用したプライマーを用いて、ＰＣＲ Ｄｉｇ ラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）存在下でＰＣＲ増幅させたものを使用した。ＰＣＲの反応条件等は、上記（２）と同様に行った。
上記のナイロン膜を２×ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）で洗浄後、ＤＩＧシステムを用い、ユーザーガイド（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションを行った後のナイロン膜の洗浄は、０．１％ ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ（１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）で室温にて５分間、２回ののち、０．１％ ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣで６８℃にて１５分間、２回行った。
その結果、約２．５ｋｂｐの位置にハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルが認められた。
【００２０】
（５）アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の部分断片の取得３
上記の結果に基づき、ＳｍａＩ消化した染色体ＤＮＡ１０μｇを１．０％アガロースゲル電気泳動で分離し、約２．５ｋｂｐの大きさに相当する位置のアガロースゲルを切り出した。ゲルからＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ ＩＩ（フナコシ社製）によりＤＮＡ断片を抽出精製し、該ＤＮＡ断片をＳｍａＩ処理したｐＵＣ１９ Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。本プラスミドを鋳型とし、（２）の部分遺伝子配列をもとに作製したセンスプライマー  ５’−ＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＴ−３’（２５ ｍｅｒ）及びｐＵＣ１９ Ｖｅｃｔｏｒの遺伝子配列をもとに作製したアンチセンスプライマー  ５’−ＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴ−３’（２５ ｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、熱変性９４℃，３０秒、アニール５８℃，３０秒、伸長反応７２℃，３分の条件下、３０サイクル行った。結果として増幅ＤＮＡ（約１．０ｋｂｐ）を得ることができた。
本増幅ＤＮＡ断片１％アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配列には、既知のアシルＣｏＡオキシダーゼの内部アミノ酸配列と高い相同性が認められ、終止コドンであるＴＡＧが含まれていることがわかった。結果として、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする遺伝子の３’末端まで及び３’末端より下流側１９３ｂｐの塩基配列情報を得た。
【００２１】
（６）全長アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子のクローニング及びアシルＣｏＡオキシダーゼ生産株の取得
先ず、上記の操作で得られた塩基配列に基づき、アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の５’末端あるいは３’末端を含むオリゴヌクレオチド（計３０塩基のオリゴヌクレオチド、３’末端側は相補鎖）を設計した。このプライマー中にＮｄｅＩ部位を組み込んでおき、ＰＣＲで増幅した産物を、ＮｄｅＩを作用させて消化することにより、コーディング領域が得られるようにしておいた。すなわち、５’−ＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＡＴＧＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧ−３’（３０ ｍｅｒ）、アンチセンスプライマーとして５’−ＧＧＣＧＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＧＧＡＣＴＴ−３’（３０ ｍｅｒ）を合成した。実施例項目（２）で調製した染色体遺伝子を鋳型とし、合成プライマー及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、熱変性９４℃，１５秒、アニール５６℃，３０秒、伸長反応６８℃，４分００秒の条件下、３０サイクル行った。結果として増幅ＤＮＡ（約２．１ｋｂｐ）が得られ、これをＮｄｅＩで消化して、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする領域のＤＮＡを得ることができた。
得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ， ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０を参照）を保有するｐＢＲ系ベクターｐＵＴＥ５００Ｋ’（特開平０８−２０５８６１号公報記載）をｐＵＣ系に改良したｐＵＴＥ３００Ｋ’のＮｄｅＩ部位に挿入し、組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＡＣＯ−Ａ３００を得た。Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，ｐ．３２６−３３１，１９７９）に従い、組み換え体プラスミドＤＮＡ  ｐＡＣＯ−Ａ３００を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＡＣＯ−Ａ３００）を得た。菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組み換え体プラスミドｐＡＣＯ−Ａ３００を抽出して精製し、組み換え体プラスミドを１００μｇ得た。
該プラスミド中の挿入ＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。染色体ＤＮＡを鋳型とした複数ロットのＰＣＲを行うことにより、ｅｒｒｏｒが入っていないことを確認した。決定したアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号２に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に夫々示した。ｐＡＣＯ−Ａ３００に挿入されているアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子のＯＲＦは、２１０９ ｂｐ、７０３アミノ酸からなっていることが判明した。なお、ｐＡＣＯ−Ａ３００は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５６として寄託されている。
得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＡＣＯ−Ａ３００）を、ＬＢ−ＩＰＴＧ−ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ），酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ）,  ＮａＣｌ  ０．５％（Ｗ／Ｖ），イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（１ｍＭ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕にて３７℃で１０時間振とう培養した後、アシルＣｏＡオキシダーゼ活性を測定したところ、０．２Ｕ／ｍｌであった。
【００２２】
（７）アシルＣｏＡオキシダーゼの製造法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＡＣＯ−Ａ３００）を実施例項目（６）の方法にて５０ｍｌの培地で培養し、アシルＣｏＡオキシダーゼを生産させた。本培養液から、特公昭５８−４０４６６号公報記載の方法により、精製アシルＣｏＡオキシダーゼ溶液を得た。
【００２３】
（８）アシルＣｏＡオキシダーゼのＮＥＭに対する安定性の評価
実施例項目（７）にて調製した組み換えアシルＣｏＡオキシダーゼ及び市販の精製Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来アシルＣｏＡオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）及びＣａｎｄｉｄａ  ｓｐ．由来アシルＣｏＡオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を夫々０．１ｍＭ  ＦＡＤを含む２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）にて約１０Ｕ／ｍｌの濃度とし、各酵素溶液に０．１ｍＭ  ＦＡＤ及び２０ｍＭ  ＮＥＭを含む２００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を夫々等量添加し、ＮＥＭの濃度を１０ｍＭとした。本酵素液（約５Ｕ／ｍｌ）を３７℃にて放置し、保存前及び保存後のサンプルの酵素活性を測定して残存活性比を求めることで安定性を評価した。図１に示したとおり、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１４０）由来アシルＣｏＡオキシダーゼは、市販の２種のアシルＣｏＡオキシダーゼよりＮＥＭ共存下での安定性が高く、４時間放置後も約６５％の残存活性が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明アシルＣｏＡオキシダーゼのＮＥＭに対する安定性を示す図。
【図１】
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【配列表】
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