(57)【要約】      （修正有）【課題】複数レーザ線による、特に生物学試料の照射を行い細胞を傷付けずに観察するレーザー走査型顕微鏡の提供。【解決手段】ＵＶ領域、可視領域およびＩＲ領域の波長領域用に少なくとも４か所の別個の結合点を有し、色素および評価法の選択で最大のフレキシビリティを達成するための、好ましくは少なくとも２か所の個別に再配置可能なコリメータを有するレーザ走査型顕微鏡であって、主として、生きた組織内の細胞カルシウムおよびそれに相対するレセプタを、蛍光検出およびアンケージングの利用のもと、長時間（時間経過）にわたり赤外およびＵＶレーザにより表示すること、薬剤を遊離させる（アンケージング）こと、および透過検出を伴うＩＲ照明をすること、ＧＦＰおよびＣＦＰ／ＹＦＰ−ＦＲＥＴの光活性化を含む（Ｇ）ＦＰ種属としての蛍光蛋白質の適用を実現すること、および腫瘍研究のために暗赤領域（レーザ６７５ｎｍ）でＣＹ５．６色素を使用したレーザ走査型顕微鏡。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ領域、可視領域およびＩＲ領域の波長領域用に少なくとも４か所の結合点を有するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
レーザ光による照明目的のための少なくとも４か所の結合点、ならびに色素および評価法の選択で最大のフレキシビリティを達成するための少なくとも２か所の再配置可能なコリメータを有するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
生きた組織内の細胞カルシウムおよびそれに相対するレセプタを長時間（時間経過）にわたり赤外およびＵＶレーザに表示するためのレーザ走査型顕微鏡であって、ＵＶ，Ｖ，ＶＩＳ，ＦＲ，ＩＲ放射用に少なくとも４か所の結合点を有する、蛍光検出およびアンケージングが適用される顕微鏡。
【請求項４】
薬剤を遊離（アンケージング）させるためのＵＶレーザ、および透過検出を伴うＩＲ照明装置を有する、ＵＶ，Ｖ，ＶＩＳ，ＦＲ，ＩＲ放射用の少なくとも４か所の別個の結合点を有する顕微鏡レーザ走査型顕微鏡であって、ＧＦＰおよびＣＦＰ／ＹＦＰ−ＦＲＥＴの光活性化を含む（Ｇ）ＦＰ種属としての蛍光蛋白質の適用実現のための、ＵＶ，Ｖ，ＶＩＳ，ＦＲ，ＩＲ放射用の少なくとも４か所の別個の結合点を有するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
暗赤外領域（レーザ６７５ｎｍ）のＣＹ５．５色素を腫瘍研究用に使用するための、ＵＶ，Ｖ，ＶＩＳ，ＦＲ，ＩＲ放射用の少なくとも４つの結合点を有するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
以下の波長領域について少なくとも４か所の結合点を有する、先行請求項の１つに記載のレーザ走査型顕微鏡：
３５０ｎｍ３８０ｎｍ（ＵＶ）
４００ｎｍ４４５ｎｍ（Ｖ）
４５０ｎｍ６３５ｎｍ（ＶＩＳ）
６５０ｎｍ６８０ｎｍ（ＦＲ）
６９０ｎｍ１１００ｎｍ（ＩＲ）
【請求項７】
少なくとも１本の光ファイバを通じて結合が行われる、先行請求項の１つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
焦点位置の波長適合がさまざまな視準光学系を通じて行われる、先行請求項の１つに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
複数レーザ線による、特に生物学試料の照射を、ＩＲ光により細胞を傷付けずに観察し、同時に薬剤をＵＶ光により逐一遊離（アンケージング）させることが可能である。
観察は、この場合、レーザ走査型顕微鏡により透過検出でも投射蛍光検出でも行うことができる。
【背景技術】
【０００２】
これらの大きく離れた波長を組み合わせて使用することで、とりわけ生きた細胞および神経細胞の生理学、ならびに複雑な脳エリアの機能的な構成組織の研究に新しい科学的立証法が可能になる。
【０００３】
ライテ（Ｌｅｉｔｅ）外は、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００２  Ｆｅｂ；１２２（２）；４１５−２７に、赤外線レーザおよびＵＶレーザを持ち、蛍光検出およびアンケージングの適用できるレーザ走査型顕微鏡により長時間（時間経過）にわたって観察した、生きた組織中の細胞カルシウムおよびそれに相対するレセプタについて記述している。
【０００４】
ドット（Dｏｂｔ）他はＮｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ２００３  Ｍａｒ  ２４；１４（４）；６２３−７に、ラット皮質中のシナプシス化合物について記述しているが、その場合電気リーカンス（パッチ・クランプ）、薬剤遊離のためのＵＢレーザによるレーザ走査顕微鏡法および透過検出機能を持つＩＲ照明から成る混合法が適用されている。加えて、神経細胞の刺激に赤外線レーザも利用されている。
【０００５】
応用例Ｖ（可視光）
ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）はＪ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．２００１  Ａｐｒ；５２（３５６）；５２９−３９に、ＧＦＰおよびＣＦＰ／ＹＦＰ−ＦＲＥＴの光活性化（最適；４３２ｎｍ）を含む（Ｇ）ＦＰ種属の最新の利用可能性について記述している。
【０００６】
パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、リッピンコット―シュワルツ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ）はＳｃｉｅｎｃｅ  ２００２  Ｓｅｐ  １３；  ２９７（５５８８）；１８７３−７に、レーザ線４０５／４１３ｎｍにより光活性化できる新しいＧＦＰの細胞生物学および発生生物学への適用について記述している。
【０００７】
応用例ＦＲ（遠赤外領域）
ペトロフスキ（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ）他はＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３  Ａｐｒ  １５；６３（８）；１９３６−４２に、暗赤領域（レーザ６７５ｎｍ）のＣＹ５．５色素を腫瘍研究に使用することを記述しているが、その場合長波長が組織保護および光学的進入深度の点で有利である。
【０００８】
さまざまな波長による照明において最大３つの入力ポートを実現するレーザ走査型顕微鏡についての機器技術的解明が公知になっている。
ＤＥ  １９７０２７５３  Ａ１には２つの入力ポートを有するＬＳＭ光路が詳細に記述されている。
【０００９】
そのほか、現状技術に関しては、ＵＶからＩＲまでの全スペクトル領域にわたり色収差の修正されている顕微鏡対物レンズは提供されていない状態である。言いかえれば、異なるスペクトル領域についての焦平面は多かれ少なかれ異なるｚ平面にあるから、共焦点顕微鏡測定の要求を満たす結像は達成できない。
【００１０】
一般には共焦点レーザ走査型顕微鏡法に対しては、領域ＵＶからＩＲまでさまざまなレーザ光源を、偏波保持単一モードファイバを通じて機器内へ結合させることが要求される。
この場合ＬＳＭの応用帯域幅は広げられねばならない。
【非特許文献１】“Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ”１２２（２）；４１５−２７  Ｌｅｉｔｅ外、  ２００２年２月発行；
【非特許文献２】“Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ”１４（４）；６２３−７  Dｏｂｔ外、２００３．３．２４
【非特許文献３】“Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ”５２（３５６）；５２９−３９  Ｈａｎｓｏｎ、Ｋｏｈｌｅｒ著  ２００１．４
【非特許文献４】“Ｓｃｉｅｎｃｅ”２９７（５５８８）；１８７３−７  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ著、２００２．９．１３
【非特許文献５】“Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ”６３（８）；１９３６−４２  Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ外著、２００３．４．１５；
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述された応用から、全応用帯域幅をカバーするにはＵＶ，ＶＩＳおよびＩＲと並んで４０５／４１３／４３２ｎｍならびに６７５ｎｍのレーザ波長も利用可能とならなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ファイバ光学分野での従来技術に基づき、これらの波長は好ましくも以下に示した領域への分割により、偏波保持単一モードファイバを通じて伝送することができる。
１．３５０ｎｍ−３８０ｎｍ（ＵＶ）／レーザ線３５１ｎｍから３８０ｎｍまで
２．４００ｎｍ−４４５ｎｍ（Ｖ）／レーザ線４００から４４２ｎｍまで
３．４５５ｎｍ−６３５ｎｍ（ＶＩＳ）／レーザ線４５８から６３５ｎｍまで
４．６５０ｎｍ−６８０ｎｍ（ＦＲ）／レーザ線６５０，６７５ｎｍ
５．６９０ｎｍ−１１００ｎｍ（ＩＲ）／同調可能ＴｉＳａレーザ
波長領域間のスペクトルの間隙は、対応ビームスプリッタを通じてのスペクトル領域の分離を保証する上で有利である（ビーム結合器の最小縁峻度は１０ｎｍ〜２０ｎｍの領域にある）
【００１３】
これに対応して、適応上の要求を実現するために、特に５つまたはそれ以上のファイバ結合ポートＫ１−Ｋ５が使用される。同時に、各結合ポートは、各源点（各ファイバ終端平面）から発散するレーザ光を視準するため、および使用した顕微鏡対物レンズおよび使用した波長に従ってファイバ終端平面をできる限りただ１つの焦平面内に結像させるため、ｚ方向にシフト可能な視準光学系ＫＯ１−５とすることもできる。
【００１４】
さらに、記述された５スペクトル領域への分割は、それによって各種幅広対物レンズがさまざまな色補正により共焦点顕微鏡法に利用できるようになる限り有利である。提供可能な波長領域４００−６４０ｎｍのファイバにより、結合ポートの数もたとえば４個に削減できる。
しかしながら、３個以上の結合ポートを配置するのが有利である。それによって、それぞれ良好に色補正された光学系の使用が可能となるからである。
【００１５】
ここに記述された配置の５ファイバ結合ポートは、源点を適切な方法で一様に対物レンズ瞳内へ結像させ、また調整感度および安定度に関し最適条件に到達させるためには、すべての源点（ファイバ終端平面）について対物レンズ瞳までの距離が同一になるように配置するのが得策である。
【００１６】
対物レンズ瞳内への結像はさらに、コリメータをｚ方向にシフトする場合照明の大幅な変化を画像中にもたらさないという長所を持つ。
共通ビームへのビーム結合は、長時間安定するという理由から固定組み込みされた、調整不可能なダイクロイック層を通じて行われる。ビーム結合器は平行な光路内に、あるいは視準光学系のｚ位置に応じて軽度に収束または発散している光路内に置かれている。スペクトル領域はこの場合、ダイクロイック層が主として長波透過体もしくは短波透過体として形成され得るように配置されるべきであり、この方法で製造を簡易化することも、複雑さの少ない層構成により、単一もしくは多重バンドパスに比べて、環境条件変化に対するスペクトル特性の敏感性を最低限に保つことも必要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図１は、各ポートＫ１〜Ｋ５について、個々のコリメータＫＯにおける結合ポート配置、ならびにビームスプリッタＳＴおよびミラーＭを通じてのビーム結合を示している。
然るべき色補正のなされた顕微鏡対物レンズの場合も同様に、個別スペクトル領域の統合、およびスペクトル領域ＵＶ／Ｖ／ＲＧＢおよびＦＲ／ＩＲに対しそれぞれ全体として１つだけの視準レンズの使用も考え得る。
【００１８】
同様に考え得るのは、ファイバ技術分野での改良開発において、個別のファイバ結合ポート、たとえばＫ２とＫ３、またはＫ１とＫ３、またはＫ２とＫ５またはＫ２とＫ３とＫ５の統合である。
これはよりコンパクトな構成法およびより少ない機械的コストという長所を持つが、機能性が縮減されてしまう。この場合、ビーム結合器ＳＴを、ファイバ終端表面と移動可能な視準光学系ＫＯ１もしくはＫＯ２間の強発散性光路内に置く。
図２は、５ファイバ結合ポートについての配置を模式的に示している。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】各ポート配置ならびにビーム結合の模式図
【図２】５ファイバ結合ポート配置の模式図
【符号の説明】
【００２０】
Ｋ      ポート
ＫＯ    コリメータ
ＳＴ    ビームスプリッタ
Ｍ      ミラー
【図１】
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【図２】
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