(57)【要約】【課題】パーキンソン病の病態を詳細に理解するために有用なパーキンソン病の病変を再現するモデル動物を開発する。【解決手段】ユビキチンＣ末端水解酵素（ＵＣＨＬ１）変異体をコードする遺伝子、特にＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍ配列を組み込んだプラスミドを、マウスの受精卵に導入して、ＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍを発現する遺伝子導入マウスを作製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンＣ末端水解酵素変異体をコードする遺伝子配列を有する遺伝子導入動物。
【請求項２】
前記ユビキチンＣ末端水解酵素変異体は、９３位における変異であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入動物。
【請求項３】
前記遺伝子配列が、配列番号１の配列であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入動物。
【請求項４】
前記遺伝子導入動物がマウスであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入動物に関し、特に特定遺伝子を発現する遺伝子が導入された遺伝子導入動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、神経変性疾患としてはアルツハイマー病と並び頻度の高い疾患であり、中脳の黒質においてドーパミンを産生する神経細胞が進行性に脱落するために運動障害や感情障害をきたす疾患である。現在、ドーパミンの補充療法が主として用いられているが、これはあくまで対処療法であるため神経細胞死を留めることはできず、病状は進行してゆく。この疾患の病態を理解し、治療薬を開発又は治療の経過を見るためには、この病気のモデル動物、特にモデルマウスの開発が急務とされてきた。
【０００３】
一方、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病など神経変性疾患は、原因タンパク質の立体構造異常とそれに伴う不溶性亢進を共通の基盤として考えることができる。これらの異常状態は、βアミロイドタンパク質やアルファシヌクレインの変異、ポリグルタミンの異常慎重などによっても起こるが、これに拮抗するタンパク質構造維持機構としてのシャペロンタンパク質群とユビキチン・プロトテオソーム系の破綻によってもたらされると考えられている。この見解は、軸索変性マウス（gadマウス）の検証から導き出された（非特許文献１及び２参照）。このマウスは、ヒトのユビキチンＣ末端水解酵素１型（１ＵＣＨ−Ｌ１）のマウスホモログであり、軸索変性により生後９週頃から感覚失調、運動麻痺で発症し、２０集頃から衰弱死する自然発症神経変性マウスである。
一方、パーキンソン病の発症の解明と治療を目的として、中脳ドーパミン産生細胞を破壊する薬物を用いて病態を再現することが試みられている。
【０００４】
【非特許文献１】小坂仁、和田圭司著、「２４．特集神経細胞死の基礎、ユビキチン・プロテオソーム系と神経細胞死」、医学のあゆみ、198(5)、339-343、2001
【非特許文献２】小坂仁、和田圭司著、「特集拡大するユビキチンの世界、脱ユビキチン化酵素と神経異常マウス"gad"」、実験医学、18(11)、1491-1495、2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、パーキンソン病のモデルマウスは作出されていないため、早期の病因解明及び治療法の確立という要請に充分に応えているとは言い難い。一方、薬物を使用した再現も、薬物自体が非常に危険である上に各個体から得られる病変のばらつきが大きいためモデル系として利用することが難しい。その上、薬物で急激に神経細胞を破壊するプロセスが１０数年かけてゆっくり進行するヒトでの病態と大きくかけ離れている可能性が指摘されてきた。
本発明は、パーキンソン病の病態を詳細に理解するために有用なパーキンソン病の病変を再現するモデル動物を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の遺伝子導入動物は、ユビキチンＣ末端水解酵素変異体をコードする遺伝子配列を有することを特徴としている。
上記遺伝子導入動物としては、マウスであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、パーキンソン病の病態を詳細に理解するために有用なパーキンソン病の病変を再現するモデル動物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ユビキチンＣ末端水解酵素Ｌ１（ＵＣＨＬ１）は、神経細胞特異的な脱ビキチン化酵素である。近年、優性遺伝形式をとる家族性パーキンソン病の１家族で、ユビキチンＣ末端水解酵素（ＵＣＨＬ１）の９３番目のアミノ酸のイソロイシンからメチオニンへの変異（Ｉ９３Ｍ変異）が報告された。本発明者らは、このＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍを有する遺伝子導入動物を作製し、この遺伝子導入動物が、黒質線状体ドーパミン産生細胞に対する選択的な病理を有するパーキンソン病のための研究ツールとして有用であることを見出し、本発明を完成させた。
ここで、「遺伝子導入動物」とは、特定遺伝子配列を強制的に発現させるために、遺伝子導入技術に基づいて特定の細胞へ遺伝子配列を導入して得られた動物及びその子孫をいい、この遺伝子導入動物及びその子孫は、導入された特定遺伝子配列を有している。
【０００９】
本発明においてユビキチンＣ末端水解酵素（ＵＣＨＬ１）とは、脳内水溶性タンパク質の数％を占め、ユビキチンと共にアルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患の凝集体に見出される分子であるが、生体内での役割は未だ不明である。このようなＵＣＨＬ１の配列は、好ましくはヒト由来のものであり、ヒトＵＣＨＬ１の配列は Larsen, C.N., Krantz, B.A. and Wilkinson, K.D. (1998) Substrate specificity of deubiquitinating enzymes: ubiquitin C-terminal hydrolases. Biochemistry, 37, 3358-3368.
等に記載されている。
【００１０】
本発明では、ＵＣＨＬ１の配列のうち、９３番目のアミノ酸のイソロイシンからメチオニンへの変異（Ｉ９３Ｍ変異）の配列が用いられる（配列番号：１）。配列番号１の配列のうち、機能を損なわない置換、欠損、変更を含む配列も同様に本発明において使用可能である。ＵＣＨＬ１についてはいくつかの多型が知られているが、Ｉ９３Ｍの変異体が、パーキンソン病の家系で報告されているため好ましい。また特にヒト固有の病態解析を行うことを目的とするためには、ヒト由来のＵＣＨＬ１とする。
【００１１】
このような変異体は、上記ＵＣＨＬ１の配列に対して点突然変異を起こさせたものであってもよく、合成したものであってもよく、ヒトなどのＤＮＡライブラリーなどからクローニングしてきたものであってもよい。
【００１２】
これらの各配列の発現には、この用途に通常用いられる発現系がそのまま適用可能である。例えば、ここで使用可能なベクターとしては、この用途に通常使用可能な、大腸菌などの細菌及び真菌由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルスなどの動物ウィルスが挙げられる。またＵＣＨＬ１の発現制御領域には、この用途に通常用いられているものをそのまま使用することができ、プロモータには、神経系での発現が十分に確認されているもの、すなわち血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）やプリオン蛋白等が挙げられ、さらに、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、などを含むものを適宜含むことができる。これらの配列は当業界で既知であり、容易に入手可能である。本発明におけるＵＣＨＬ１変異体遺伝子の発現ベクターは、当業界で周知の技術によって容易に作製することができる。
【００１３】
遺伝子の発現のために、上述のようにして作製されたＵＣＨＬ１変異体遺伝子の発現系を、適当な細胞に例えばマイクロピペットで注入することができる。発現系の細胞への導入方法は、当業界で周知の方法のいずれによっても行うことができる。導入対象となる細胞としては、例えば、対象動物の受精卵を挙げることができる。
本発明において、ＵＣＨＬ１変異体遺伝子が導入される対象動物としては、モデル動物として有用なものであればいずれでもよく、例えばマウス、ラット、マーモセットなどがあるが、マウスが特に好ましい。
【００１４】
遺伝子が導入された細胞を用いて遺伝子導入動物を得るには、対象動物の雌を偽妊娠させ、その卵管に導入細胞を移植し遺伝子導入動物を作製する。この方法については、技術的に既に確立されており、例えばメディカルサイエンスインターナショナル出版社:ジーンターゲティング (1996)；ＭＥＤＳｉバイオ実験法シリーズ： Alexandra L. Joyner, 野田 哲生 (翻訳)に詳細に記載されている。
【００１５】
本発明の遺伝子導入動物では、脳内の黒質のドーパミン産生細胞が加齢に伴って脱落していくことが確認された。これはパーキンソン病の病態であるので、パーキンソン病のモデル動物として用いることができる。
モデル動物として使用することにより、パーキンソン病の病態解析および治療開発に資することができる。
【００１６】
例えばマイクロアレイ法により発現プロフィールを解析することによりヒトパーキンソン病の病態理解につなげることができる。特定遺伝子の発現経路が明らかとなれば、その経路をブロックすることによってパーキンソン病の進行を食い止める薬剤の開発を行うことができる。
また、各種遺伝子改変動物との掛け合わせ後に黒質のドーパミン産生細胞の脱落の程度を比較することによって、パーキンソン病における細胞死の経路を明らかにすることができ、その経路をブロックする薬剤がパーキンソン病治療薬の候補であると考えることができる。さらには、各種薬剤をこのマウスに投与することによって、治療薬のスクリーニングを容易に行うことができる。
【００１７】
ＵＣＨＬ１は遺伝性パーキンソン病のみならず弧発型パーキンソン病の発症因子となることが明らかとなっているので、遺伝性であるか弧発型であるかを問わずパーキンソン病に普遍的な病態理解と有効な治療方法開発にすることができる。従って、本発明の遺伝子導入動物は、パーキンソン病の治療薬の開発ツールとして使用することができる。
【実施例】
【００１８】
ヒトＵＣＨＬ１のクローニング
ヒトＵＣＨＬ１ ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋより入手し（受託番号：ＢＣ００６３０５）、以下のプライマーセットでヒト脳ｃＤＮＡ プールを使用したＰＣＲで増幅した(Stratagene, La Jolla, CA)：フォワードプライマー：5'GGGGCTCGAGCCGCGAAGATGCAGCTCAAGCCGATGGAGATCAACCCCGA GATGCTGA-３' (５'-GGGG-XhoI-CCGCGAAG-Met'-Gln-Leu-Lys-Pro-Met-Glu-Ile-Asn-Pro-Glu-Met-Leu１３-３')及びリバースプライマー：５'-GGGGGCGGCCGCTTAGGCTGCCTTGCAGAGAGCCA-3' (3'-Ala226-Leu-CysLys-Ala-Ala233-stop-NotI-GGGG-5')。最初の３分間を９５℃で変性した後、９５℃１０秒の変性、５３℃２０秒のアニーリング及び７２℃３０秒の伸長のサイクルを３０サイクル実施して増幅した。増幅フラグメントを、XhoIとNotIで切断し、ｐＣＩ−ｎｅｏ(Promega, Madison, WI)のXhoI−NotI部位でサブクローニングした。Ｉ９３Ｍ変異を含むヒトＵＣＨＬ１をコードするｃＤＮＡを、５'-GAATTCCTGTGGCACAATGGGACTTATTCACGCAG-３' 及び ５'−CTGCGTGAATAAGTCCCATTGTGCCACAGGAATTC-３'の変異オリゴヌクレオチドを用いてQuikChange（商品名）site-directed mutagenesis kit (Stratagene)により作製した。得られたプラスミドにおけるこの単ヌクレオチド変異を、常法の配列決定法により確認した。
【００１９】
キメラマウスの作製
野生型とＩ９３Ｍ変異型のヒトＵＣＨＬ１ ｃＤＮＡをＰＤＧＦβプロモータ下にクローニングし（図１参照）、それぞれの導入遺伝子を、マウス受精卵の前核（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス雄２匹、雌２５匹から得た）にマイクロピペットで導入した（処理卵数２５０）。それらの受精卵（１６０個）を偽妊娠雌マウス（８匹）の卵管に移植した。２週後に胎児を摘出し、プラグ確認のすんだ雌マウス（Ｊｃｌ：ＩＣＲ）に里親として育てさせた。離乳後のマウス尻尾の一部を切断し、常法に従ってＤＮＡを抽出後、ＰＣＲにより３匹の陽性マウスを得た。これらの遺伝子導入マウスをＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスとかけあわせ、繁殖させて、それぞれの系統を樹立した（＃５Ａ、＃５Ｃ）。
【００２０】
導入遺伝子の発現
ＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍの導入は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルでの発現を確認した（図２）。ｍＲＮＡレベルでの発現量は、＃５Ａの発現量を１としたときに、＃５Ｃでは９０倍程度の発現量が認められた。
次に、ＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍを過剰発現していることが認められた＃５Ｃマウスと、遺伝子導入マウスの対照例として軸索変性マウス（ｇａｄ）と、野生型マウス（ＷＴ）との脳におけるＵＣＨＬ１の発現を、抗ＵＣＨＬ１抗体（ケミコン社製）を用いて免疫染色した。野生型及びｇａｄマウスの脳ではＵＣＨＬ１の発現の認められないところ、＃５Ｃマウスでは、視床、視床下部、線条体、海馬、黒質などでその発現が認められた（図３）。
【００２１】
ＴＨ陽性ドーパミン産生ニューロン数の変化
次に、黒質における中脳ドーパミン産生ニューロンの数を、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫染色によるＴＨ陽性ドーパミン産生ニューロンの数として調べることにより、各遺伝子導入マウスにおいて調べた。使用した抗ＴＨ抗体は、藤田保健衛生大学、永津博士より貸与されたものを使用した。結果を図４に示す。図４に示されるように、８週齢及び２０週齢のマウス（＃５Ｃ）では、野生型マウスと比較してそれぞれ〜１０％及び〜３０％の減少が認められた。このことは、＃５Ｃマウスは、黒質におけるＴＨ陽性ニューロンの数の進行性減少を示している。
【００２２】
本発明のマウスの利用方法
ここで得られた遺伝子導入マウスは、ＵＣＨＬ１がパーキンソン病の原因タンパク質であることの強力な証拠を確立した。パーキンソン病とＵＣＨＬ１との関連性が報告された後、パーキンソン病患者でＵＣＨＬ１解析が行われたが、この遺伝子中のこの変異を見い出せたのは、最初の家系のみであった。従って、ＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍは、パーキンソン病に関連するまれな多型であるかもしれないとの推測もなされた。我々はここにＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍの過剰発現がマウスにおいてドーパミン作動系に対して特異的な神経毒を引き起こし得ることを、明らかにした。従って、この遺伝子導入マウスは、ＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍがパーキンソン病を引き起こすことができるということを強く支持している。
【００２３】
また、このマウスは黒質ドーパミン作動系に対する選択的な神経毒を示す最初の遺伝子操作マウスである。種々のプロモータ下でのαシヌクレインのＴｇマウスは、ドーパミン作動系と無関係な病態を示しており、ドーパミン産生ニューロンの減少は証明されていない。Ｉ９３Ｍ変異を持つパーキンソン病は家族性（遺伝性）パーキンソン病のごく一部かもしれないが、ＵＣＨＬ１の1８位でのＳ／Ｙの多型は、孤発性パーキンソン病に対する感受性に影響するとの報告が相次いでいる。従って、ＵＣＨＬ１は家族性のみならず、孤発性のパーキンソン病発症にかかわる可能性があり、このため、本マウスに基づいて種々の解析を行うことによって、パーキンソン病の発症における共通の経路を明らかにする可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＵＣＨＬ１Ｉ９３Ｍ遺伝子導入マウスを作製するために用いた導入遺伝子構築物の構築図である。
【図２】定量的ＲＴ−ＰＣＲによる外来遺伝子特異的な遺伝子の発現量を、＃５Ａにおける発現量を１としたときの相対量として示したグラフである。
【図３】各マウスにおける脳でのＵＣＨＬ１の発現を確認した免疫染色像を示す図である。
【図４】８週齢及び２０週齢におけるマウスの黒質における抗ＴＨ抗体による免疫染色の相対量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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