(57)【要約】      （修正有）【課題】神経細胞内Ｔ−型カルシウムチャンネル（T-Type Calcium channel）遮断剤として有用な３，４−ジヒドロキナゾリン（３，４−dihydroquinazoline）誘導体、その製造方法及び上記誘導体を含む組成物の提供。【解決手段】下記式の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。上記誘導体を含む製薬組成物は細胞膜のカルシウムチャンネルを抑制して狭心症、高血圧、心筋疾患、痛み、てんかんのような多数の疾患を治療及び予防するのに有用である。2005239708.tif 000016式中、Ｒ1はＨ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル等、Ｒ2はアルキル、シクロアルキル等、Ｒ3はアルキル、シクロアルキル等、Ｒ4はＸ−（ＣＨ2）l−Ｙ−（ＮＨ）o−Ｓ（Ｏ）m−Ｚであり、（Ｘは酸素又はＮＨ、Ｙはシクロアルキル、アリール等、ＺはＹと同じ、）等を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【化１】
2005239708.tif 000015
式中、ｎは１，２，３または４であり、
Ｒ1はそれぞれ独立的に水素、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、置換または非置換された、アリールまたはヘテロアリル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシ、（アリールまたはヘテロアリール）オキシ、Ｃ1−Ｃ6チオアルコキシ、Ｃ3−Ｃ6シクロチオアルコキシ、（アリールまたはヘテロアリール）チオオキシ及びアミノで構成された群の中から選ばれ；
Ｒ2はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシアルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル；置換または非置換された、アリール及びヘテロアリール；４−モルホリニル；４−位に任意置換基を有するピペラジニル；１−ピロリジニル；１−ピペリジニル；または−ＮＲ1aＲ2aであり、ここでＲ1aとＲ2aは独立的にＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、置換または非置換された、アリール及びヘテロアリールで構成された群の中から選ばれ；
Ｒ3はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシアルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシアルキル、置換または非置換された、アリール及びヘテロアリールで構成された群の中から選ばれ；
Ｒ4は一般式Ｘ−（ＣＨ2）l−Ｙ−（ＮＨ）o−Ｓ（Ｏ）m−Ｚであり、ここでＸは酸素またはＮＨであり；ｌは１〜４の整数であり；Ｙは置換または非置換された，Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；ｏは０または１の整数であり；ｍは０〜２の整数であり；Ｚは置換または非置換された、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールで構成された群の中から選ばれて、ここでｏが０である場合、−Ｓ（Ｏ）m−Ｚは水素を示す。
【請求項２】
４−（Ｎ−ベンジルアセトアミド）−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリンである請求項１に記載の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【請求項３】
４−（Ｎ−ベンジルアセトアミド）−３−フェニル−２−（モルホリン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリンである請求項１に記載の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【請求項４】
４−（Ｎ−ベンジルアセトアミド）−３−フェニル−２−（４−メチルピペラジニル）−３，４−ジヒドロキナゾリンである請求項１に記載の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【請求項５】
４−［Ｎ−（４−ニトロベンジル）アセトアミド］−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリンである請求項１に記載の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【請求項６】
４−｛Ｎ−［４−（４−メチルベンゼンスルホニルアミド）ベンジル］アセトアミド｝−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリンである請求項１に記載の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【請求項７】
４−｛Ｎ−［４−（４−フルオロベンゼンスルホニルアミド）ベンジル］アセトアミド｝−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリンである請求項１に記載の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞膜のカルシウムチャンネルを抑制して狭心症、高血圧、心筋疾患、痛み、てんかんのような疾患を治療及び予防するのに有用である３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩（特に、薬理上許容される塩）、それらの製造方法、及びそれらを含む製薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、神経細胞内カルシウムは神経細胞間の信号伝達において重要な役割をする。カルシウムは様々な流通経路が存在するが、末端刺激の伝達時には電圧−依存性カルシウムチャンネル（Voltage-dependent Ca2+channel）が重要な役割をする。即ち、膜タンパク質である電圧−依存性カルシウムチャンネルは細胞の外側からカルシウムイオンの流入を調節することによって、筋肉収縮、神経細胞発生及びシナプス可塑性、神経伝達物質及びホルモンの分泌、遺伝子発現等の多様な細胞内作用を調節する。
【０００３】
このような電圧依存性カルシウムチャンネルの機能的分類はその生物理学的な性質に基づいて低い電圧において活性化される低電圧−依存性カルシウムチャンネル（low voltage-activated Ca2+channel；以下、ＬＶＡと略称する）と、高い電圧で活性化される高電圧−依存性カルシウムチャンネル（high voltage-activated Ca2+channel；以下、ＨＶＡと略称する）に分けられる。ＨＶＡカルシウムチャンネルは誘発する電流の薬理学的性質によって再びＬ、Ｐ／Ｑ、Ｎ及びＲ−型に細分化され、ＬＶＡカルシウムチャンネルは非常に速く活性化及び非活性化される小さな伝導度が特徴であるので、Ｔ（transient）−型カルシウムチャンネルと更に広く呼ばれている（非特許文献１）。
【０００４】
現在までＴ−型カルシウムチャンネルの知られている機能としては神経細胞の多発性発火（burstingfiring）（非特許文献２）、心臓のペースメーカー活動（非特許文献３）、ホルモンアルドステロン分泌（非特許文献４）及び受精（非特許文献５）を調節するものと知られており、最近は痛みの緩和作用（非特許文献６）にも関与することが明らかになった。
【０００５】
このようなＴ−型カルシウムチャンネルが遺伝的または多様な原因によって過発現（over-expression）が生じる場合、てんかん（非特許文献７）、高血圧（非特許文献８）、心室肥大（非特許文献９）、痛み（非特許文献１０）、狭心症（非特許文献１１）のような疾患を誘発することができるものと知られている。Ｔ−型カルシウムチャンネルには、α１Ｇ、α１Ｈ、α１Ｉ三種類の遺伝子があることをクローニングして明らかになったが（非特許文献１２）、現在までミベフラジルとＺＤ７２８８（非特許文献１３）を除いて、このようなＴ−型カルシウムチャンネルを選択的に抑制する効果的な遮断剤が開発されずにいる。従って、Ｔ−型カルシウムチャンネルに選択的な遮断剤の開発はてんかん、高血圧、痛み関連疾患の画期的な治療剤の開発をもたらすことができるものである。
【０００６】
現在までＴ−型カルシウムチャンネルを抑制する代表的な薬物はホフマン・ラ・ロシュ社（Hoffman La Roche）のミベフラジル（登録商標名：ポジコール（Posicor））が挙げられる。この薬物は高血圧、狭心症及び脳卒中に効果がある物質であって主に高血圧治療を目的に１９９７年５月に市販されたが、肝のＣＹＰ３Ａ４の酵素抑制による薬物−薬物相互作用による副作用で市場投入１３ケ月目である１９９９年６月に医薬品市場から自主撤退した。
【０００７】
【非特許文献１】Tsien, R.W.等、TrendsNeurosci.1988, 11, 431-438。
【非特許文献２】Huguenard, J.R.等、Annu.Rev.Physiol.1996, 58, 329-348。
【非特許文献３】Zhou, Z等、J.Mol.Cell.Cardiol.1994, 26, 1211-1219。
【非特許文献４】Rossier, M.F.等、Endocrinology1996, 137, 4817-4826。
【非特許文献５】Arnoult, C.等、Proc.Natl.Acad.Sci.1996, 93, 13004-13009。
【非特許文献６】Ikeda, H.等、Science, 2003, 299, 1237-1240。
【非特許文献７】Tsakiridou, E.等、J.Neurosci.1995, 15, 3110-3117。
【非特許文献８】Self, D.A.等、J.Vacs.Res.1994, 31, 359-366。
【非特許文献９】Nuss, H.B.等、Circ.Res.1995, 73, 777-7825。
【非特許文献１０】Shin, H.S.等、Science, 2003, 302, 117-119。
【非特許文献１１】Van der Vring, J.A等、Am.J.Ther.1999, 6, 229-233。
【非特許文献１２】Talley, E.M.等、J.Neurosci.1999, 19, 1895-1911。
【非特許文献１３】Felix, R等、Biochem.Biophys.Res.Commun.2003, 311, 187-192。
【非特許文献１４】Wang, F.等、Tetrahedron Lett.1997, 38, 8651-8654。
【非特許文献１５】Wamhoff, H.等、Adv.Heterocycl.Chem.1995, 64, 159。
【非特許文献１６】Gololobov, Y.G.等、Tetrahedron, 1992, 48, 1353-1406。
【非特許文献１７】Gaucher, A.等、Tetrahedron:Asymmetry, 2001, 12, 2571-2580。
【非特許文献１８】Cribbs, L. L. et al., Circ. Res., 1998, 83, 103-109。
【非特許文献１９】Monteil, A.等、J.Biol.Chem.275, 6090-6100, 2000。
【非特許文献２０】Lee, J.-H.等、J.Neurophysiol.2002, 87, 2844-2850。
【非特許文献２１】Zhu等、J. Physiol. Lond. 1995, 489, 363-375。
【非特許文献２２】Hamil等、Pfluegers Arch. 1981, 391, 85-100。
【非特許文献２３】Lee, J.-H.等、J.Neurophysiol.2002, 87, 2844-2850。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ミベフラジルを代替することができる新たな構造の選択的なＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤が切実に要求されており、本発明の目的はミベフラジルより薬効に優れて副作用がない新たな骨格のＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は選択的なＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤として有用な式１の新規の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体またはその塩及びその製造方法を提供する。また、本発明は上記化合物及び製薬上許容される担体を含むＴ−型カルシウムチャンネル遮断のための製薬組成物を提供する。
【化２】
2005239708.tif 000002
式中、ｎは１，２，３または４であり、
Ｒ1はそれぞれ独立的に水素、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、Ｃ1−Ｃ8アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、置換または非置換された、アリールまたはヘテロアリル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシ、（アリールまたはヘテロアリール）オキシ、Ｃ1−Ｃ6チオアルコキシ、Ｃ3−Ｃ6シクロチオアルコキシ、（アリールまたはヘテロアリール）チオオキシ及びアミノで構成された群の中から選ばれ；
Ｒ2はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシアルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルケニル；置換または非置換された、アリール及びヘテロアリール；４−モルホリニル；４−位に任意置換基を有するピペラジニル；１−ピロリジニル；１−ピペリジニル；または−ＮＲ1aＲ2aであり、ここでＲ1aとＲ2aは独立的にＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、置換または非置換された、アリール及びヘテロアリールで構成された群の中から選ばれ；
Ｒ3はＣ1−Ｃ6アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシアルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルコキシアルキル、置換または非置換された、アリール及びヘテロアリールで構成された群の中から選ばれ；
Ｒ4は一般式Ｘ−（ＣＨ2）l−Ｙ−（ＮＨ）o−Ｓ（Ｏ）m−Ｚであり、ここでＸは酸素またはＮＨであり；ｌは１〜４の整数であり；Ｙは置換または非置換された、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり；ｏは０または１の整数であり；ｍは０〜２の整数であり；Ｚは置換または非置換された、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールで構成された群の中から選ばれて、ここでｏが０である場合、−Ｓ（Ｏ）m−Ｚは水素を示す。
【００１０】
本発明による化合物の薬理上許容される塩には無機酸塩、有機酸塩が含まれ得、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、アセテート、アジペート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、シトレート、カンファーレート、カンファースルホネート、ジホスフェート、エタンスルホネート、フマレート、グルタメート、マレエート、ラクテート、メタンスルホネート、スクシネート、タルトレート、ピクレート、トシレートに言及することができる。
また、式１を有する化合物における好ましくいものを以下に示す。
（１）ｎが、１、２または３であり、さらに、ｎが、１または２であり、特にｎが、１である化合物、
（２）Ｒ1が、それぞれ独立的に、水素、ハロゲン（フロロ、クロロ、ブロモ、ヨード等、特に、フロロまたはクロロ）、Ｃ1−Ｃ4アルキル（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル等、特に、メチルまたはエチル）またはＣ1−Ｃ4アルコキシ（メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブトキシ等、特に、メトキシまたはエトキシ）である化合物、さらに、Ｒ1が、それぞれ独立的に、水素、フロロ、クロロ、メチル、エチルまたはメトキシである化合物、特に、Ｒ1が、水素である化合物、
（３）Ｒ2が、Ｃ1−Ｃ4アルキル、置換または非置換されたフェニル［該置換基は、ハロゲン（特に、フロロまたはクロロ）、Ｃ1−Ｃ4アルキル（特に、メチルまたはエチル）またはＣ1−Ｃ4アルコキシ（特に、メトキシまたはエトキシ）である。］；４−モルホリニル；４−位に置換基を有するピペラジニル（該置換基は、Ｃ1−Ｃ4アルキル，特に、メチルまたはエチルである。）；１−ピロリジニル；１−ピペリジニル；または−ＮＲ1aＲ2bであり、ここでＲ1a及びＲ2bは、独立的に、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたは置換または非置換されたフェニル［該置換基は、ハロゲン（特に、フロロまたはクロロ）、Ｃ1−Ｃ4アルキル（特に、メチルまたはエチル）またはＣ1−Ｃ4アルコキシ（特に、メトキシまたはエトキシ）である。］である化合物、さらに、Ｒ2が、置換または非置換されたフェニル（該置換基は、フロロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシまたはエトキシである。）；４−モルホリニル；４−位に置換基を有するピペラジニル（該置換基は、Ｃ1−Ｃ4アルキルである。）；１−ピロリジニル；１−ピペリジニル；または−ＮＲ1aＲ2bであり、ここでＲ1aおよびＲ2bは、独立的に、Ｃ1−Ｃ4アルキルである化合物、さらにまた、Ｒ2が；フェニル；４−モルホリニル；４−位に置換基を有するピペラジニル（該置換基は、メチルまたはエチルである。）；１−ピロリジニル；１−ピペリジニル；または−ＮＲ1aＲ2bであり、ここでＲ1aおよびＲ2bは、独立的に、メチルまたはエチルある化合物、特に、Ｒ2が、４−モルホリニル；４−位に置換基を有するピペラジニル（該置換基は、メチルまたはエチルである。）；１−ピロリジニル；１−ピペリジニル；またはジメチルアミノである化合物、
（４）Ｒ3が、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等）または置換または非置換されたフェニル［該置換基は、ハロゲン（特に、フロロまたはクロロ）、Ｃ1−Ｃ4アルキル（特に、メチルまたはエチル）またはＣ1−Ｃ4アルコキシ（特に、メトキシまたはエトキシ）である。］である化合物、さらに、Ｒ3が、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたは置換または非置換されたフェニル（該置換基は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ4アルキルまたはＣ1−Ｃ4アルコキシである。）である化合物、さらにまた、Ｒ3が、メチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたは置換または非置換されたフェニル（該置換基は、フロロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシまたはエトキシである）である化合物、特に、Ｒ3が、置換または非置換されたフェニル（該置換基は、フロロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシまたはエトキシである）である化合物、
（５）Ｒ4が、−Ｘ−（ＣＨ2）l−Ｙａ{ここで、Ｘは酸素またはＮＨであり；ｌは１〜２の整数であり；Ｙａは置換または非置換されたフェニル［該置換基は、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、ニトロ、アミノまたは式−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）m−Ｚ（ここで、ｍは１〜２であり、Ｚは、フェニルまたはハロゲン、Ｃ1−Ｃ4アルキルもしくはＣ1−Ｃ4アルコキシで置換されたフェニルである。）である。］である。}である化合物、さらに、Ｒ4が、−Ｘ−ＣＨ2−Ｙａ{ここで、Ｘは酸素またはＮＨであり；Ｙａは置換または非置換されたフェニル［該置換基は、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ニトロ、アミノまたは式−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）2−Ｚ（Ｚは、フェニルまたはフルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシまたはエトキシで置換されたフェニルである。）である。］である。}である化合物、さらにまた、Ｒ4が、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｙａ{ここで、Ｙａは，置換または非置換されたフェニル［該置換基は、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ニトロ、アミノまたは式−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）2−Ｚ（Ｚは、フェニルまたはフルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシまたはエトキシで置換されたフェニルである。）である。］である}である化合物、特に、Ｒ4が、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｙａ{ここで、Ｙａは，置換または非置換されたフェニル［該置換基は、フルオロ、クロロ、メチル、メトキシ、ニトロ、アミノまたは式−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）2−Ｚ（Ｚは、フェニルまたはフルオロ、クロロ、メチルまたはメトキシで置換されたフェニルである。）である。］である。}である化合物。
【発明の効果】
【００１１】
下記で説明する通り、本発明の式１の３，４−ジヒドロキナゾリン誘導体は細胞膜のカルシウムチャンネルを抑制する活性を示し、上記化合物を含む製薬組成物は細胞膜のカルシウムチャンネルを抑制して狭心症、高血圧、心筋疾患、痛み、てんかんのような多数の疾患を治療及び予防するのに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の望ましい化合物は、
４−（Ｎ−ベンジルアセトアミド）−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（ＫＹＳ０５００１）、
４−（Ｎ−ベンジルアセトアミド）−３−フェニル−２−（モルホリン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（ＫＹＳ０５０２６）、
４−（Ｎ−ベンジルアセトアミド）−３−フェニル−２−（４−メチルピペラジニル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（ＫＹＳ０５０２８）、
４−［Ｎ−（４−ニトロベンジル）アセトアミド］−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（ＫＹＳ０５０３４）、
４−｛Ｎ−［４−（４−メチルベンゼンスルホニルアミド）ベンジル］アセトアミド｝−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（ＫＹＳ０５０４１）、
４−｛Ｎ−［４−（４−フルオロベンゼンスルホニルアミド）ベンジル］アセトアミド｝−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（ＫＹＳ０５０４２）
であり、その構造式は次の通りである。
【化３】
2005239708.tif 000003
【００１３】
本発明の化合物は下記の代表的な反応式１と２の方法によって製造することができ、これは本発明を例示するもので実施例と共に本発明を制限するものではない。
【化４】
2005239708.tif 000004
本発明化合物の中間体であるカルボジイミド化合物（４）は公知の方法（非特許文献１４）を応用して合成が可能であるが、まず出発物質であるメチル２−ニトロシンナメート（1, methyl 2-nitrocinnamate）を７０℃の望ましい温度でＳｎＣｌ2処理してニトロ基をアミン基に還元する。一般にカルボジイミドはイミノホスホラン（iminophosphoranes）とヘテロクムレン（hetero-cumulenes：イソシアネートまたはチオイソシアネート）のアザ−ウィティッグ（aza-Wittig）反応により製造されるが（非特許文献１５）、フェニル環が３つであるイミノホスホランの製造よりは尿素（urea）形態の化合物を製造する過程が室温条件において定量的な収率で得られて反応条件が簡便であるため、本発明では尿素形態の化合物からカルボジイミドを合成する方法を採択した。
【００１４】
従って、得られたアミン化合物（２）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはベンゼン、望ましくはベンゼン溶媒に溶解させ、フェニルイソシアネートを加えて常温で攪拌して尿素形態の生成物（３）を容易に得ることができる。そして、このような尿素化合物は、ジブロモトリフェニルホスフィン（dibromotriphenylphosphine）とトリエチルアミンを利用した脱水過程を通じてカルボジイミド化合物（４）を容易に製造する(非特許文献１６)。この工程で、フェニルイソシアネートの代わりに異なるイソシアネートまたはチオイソシアネートを用いればジヒドロキナゾリンの３位に多様な置換体を導入することができる。
【００１５】
カルボジイミド化合物（４）をアルコール、チオアルコール及びアミン等のような多様なヘテロ原子親核体と、反応式１ではピペリジンとベンゼン溶媒下で反応させればカルボジイミド基の中心炭素にヘテロ原子が親核付加反応をし、形成された化合物（５）の分子内連続的な１，４−付加反応を通じて本発明の中間体化合物である３，４−ジヒドロキナゾリン（６）を製造する。
【００１６】
【化５】
2005239708.tif 000005
【００１７】
本発明の中間体化合物６のメチルエステル基をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と水の混合溶媒及び６０℃の望ましい温度条件下で、水酸化リチウムで加水分解して遊離カルボキシル酸化合物（７）を定量的に得る。次に、遊離カルボキシル酸化合物（７）に、１−［３−（ジメチルアミン）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）と、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢＴ）を用いて多様なアルコール及びアミン、反応式２の場合、４−ニトロベンジルアミンとのカップリング反応（coupling reaction）を通じてアミド化合物（８）を得ることができる（非特許文献１７）。アミド化合物（８）のニトロ基をメタノール溶媒とパラジウム（Ｐｄ）金属触媒下で、水素化反応を通じてアミノ基に還元した後、アミン化合物（９）と多様なスルホニルハライドとの結合反応、反応式２の場合、４−フルオロベンゼンスルホニルクロリドとの結合反応を通じて本発明の最終化合物であるスルホンアミド化合物（１０）を製造する。
【００１８】
本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。下記の実施例は単に本発明による化合物の製造方法に対する理解のためであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００１９】
メチル２−アミノシンナメート（２）の製造
メチル２−ニトロシンナメート（１，０．２０２ｇ，０．９７５mmol）をエチルアセテート（２０．０ml）に溶かし、ＳｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（１．１１ｇ，４．８７mmol）を加えた。この溶液を７０℃で６０分間加熱し、反応が終結すれば常温で冷却した。飽和した重炭酸ナトリウム水溶液を用いて溶液を弱塩基性にした後、微細な泥層（Celite 545）でろ過した。水層をエチルアセテートで３回抽出して集められた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エチルアセテート＝５：１）で精製して黄色固体の生成物（２）（０．１６１ｇ，９３％）を得た（ｍｐ６７℃）。
IR (KBr) 3365, 2364, 1704, 1622, 1330, 1198, 756 cm-1; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.86 (d, J=15.9 Hz, 1H, -CH=CH-CO2Me), 7.40 (d, J=7.5 Hz, 1H, aromatic), 7.19 (t, J=7.2 Hz, 1H, aromatic), 6.78 (t, J=7.8 Hz, 1H, aromatic), 6.72 (d, J=7.5 Hz, 1H, aromatic), 6.38 (d, J=15.9 Hz, 1H, -CH=CH-CO2Me) 4.02 (br, 2H, -NH2), 3.82 (s, 3H, -OCH3); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 168.0, 145.9, 140.6, 131.6, 128.3, 120.1, 119.2, 117.9, 117.0, 51.9.
【実施例２】
【００２０】
メチル３−［２−（３−フェニルウレイド）フェニル］アクリレート（３）の製造
メチル２−アミノシンナメート（２）（６．３５ｇ，３５．８mmol）をベンゼン（１５０ml）に溶かし、フェニルイソシアネート（５．１２ｇ，４３．０mmol）を常温でゆっくり滴加した。反応混合物を１２時間攪拌して生成された固体沈殿物をエーテルで洗浄した。白色の固体化合物（３）（１０．２ｇ，９６％）を得た（ｍｐ１８４℃）。
IR (KBr) 3346, 3278, 1724, 1650, 1548, 1322, 1172, 758, 672 cm-1; 1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 8.94 (s, 1H, -NH-CO-) 8.49 (s, 1H, -NH-CO-) 7.89 (d, J=15.9 Hz, 1H, -CH=CH-CO2Me), 7.76 (d, J=7.8 Hz, 2H, aromatic), 7.46 (d, J=8.4 Hz, 2H, aromatic) 7.39 (t, J=8.1 Hz, 1H, aromatic), 7.28 (t, J=7.8 Hz, 2H, aromatic) 7.12 (t, J=7.5 Hz, 1H, aromatic) 6.97 (t, J=7.8 Hz, 1H, aromatic), 6.58 (d, J=15.3 Hz, 1H, -CH=CH-CO2Me), 3.73 (s, 3H, -OCH3); 13C NMR (75 MHz, DMSO) δ 167.4, 153.5, 140.5, 140.3, 138.5, 131.4, 129.5, 127.8, 126.8, 124.6, 124.4, 122.7, 119.5, 118.9, 52.2.
【実施例３】
【００２１】
メチル３−［２−（フェニルイミノメチレンアミノ）フェニル］アクリレート（４）の製造
化合物（３）（６．０４ｇ，２０．４mmol）とトリエチルアミン（６．１９ｇ，６１．２mmol）をジクロロメタン（３０．０ml）に溶かした溶液にジブロモトリフェニルホスフィン（dibromotriphenyl-phosphine）（１２．９ｇ，３０．６mmol）を０℃でゆっくり加えた。この溶液を１時間攪拌した後、ジクロロメタンで３回抽出した。集められた有機層を無水硫酸ナトリウム（sodiumsulfate）で乾燥し、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エチルアセテート＝２０：１）で精製して白色の固体化合物であるカルボジイミド（carbodiimide）生成物（４）（４．２６ｇ，７５％）を得た（ｍｐ５４℃）。
IR (KBr) 2142, 1716, 1484, 1172, 756, 59 cm-1; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.18 (d, J=16.2 Hz, 1H, -CH=CH-CO2Me), 7.56 (d, J=7.8 Hz, 1H, aromatic), 7.36-7.29 (m, 3H, aromatic), 7.25 (d, J=7.8 Hz, 1H, aromatic), 7.20-7.13 (m, 4H, aromatic), 6.52 (d, J=16.2 Hz, 1H, -CH=CH-CO2Me), 3.80 (s, 3H, -OCH3); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 167.5, 140.5, 138.4, 138.0, 134.3, 131.3, 129.8, 129.0, 127.8, 126.1, 126.0, 125.9, 124.6, 119.6, 52.0.
【実施例４】
【００２２】
実施例４：４−メトキシカルボニルメチル−２−（１−ピペリジニル）−３−フェニル−３，４−ジヒドロキナゾリン（６）の製造
化合物（４）（０．６０５ｇ，２．１７mmol）をベンゼン（２０ml）に溶かし、ピペリジン（０．２２２ｇ，２．６０mmol）を常温でゆっくり滴加した。反応混合物を２時間攪拌した後、反応が終結すれば水と塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製して白色の固体化合物（６）（０．６３２ｇ，８０％）を得た（ｍｐ１０９℃）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.28-7.17 (m, 4H, aromatic), 7.09-7.01 (m, 3H, aromatic), 6.97-6.89 (m, 2H, aromatic), 5.10 (dd, J=4.5 and 10.8 Hz, 1H, -CH2-CH-N-), 3.79 (s, 3H, -OCH3), 3.42 (s, 4H, piperidinyl), 2.85 (dd, J=10.8 and 15.3 Hz, 1H, -CO-CH2-), 2.52 (dd, J=4.7 and 15.5 Hz, 1H, -CO-CH2-), 1.55-1.50 (m, 2H, piperidinyl), 1.43-1.40 (m, 4H, piperidinyl); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 172.2, 153.2, 146.3, 144.4, 129.4, 128.6, 126.1, 124.9, 124.1, 123.1, 122.6, 122.4, 61.2, 52.0, 47.0, 39.8, 25.7, 25.0; HRMS (FAB, M+H) Calcd for C22H26N3O2 364.2025, found 364.2019.
【実施例５】
【００２３】
４−カルボキシ−２−（１−ピペリジニル）−３−フェニル−３，４−ジヒドロキナゾリン（７）の製造
化合物（６）（０．２３５ｇ，０．６４５mmol）をテトラヒドロフラン／水（１：１，１０ml）に溶かし、水酸化リチウムの水化物（０．１３５ｇ，３．２３mmol）を常温で加えた後、６０℃で２時間攪拌した。反応が終結すればpHを３−４に合せてジクロロメタンで３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した後、白色の固体化合物（７）を定量的に得た（ｍｐ２３８℃）。
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 7.57 (d, J=7.8 Hz, 1H, aromatic), 7.45-7.26 (m, 7H, aromatic), 7.19 (m, 1H, aromatic), 5.29 (dd, J=6.3 and 9.3 Hz, 1H, -CH2-CH-N-), 3.36 (s, 4H, piperidinyl), 2.88 (dd, J=9.3 and 15.0 Hz, 1H, -CO-CH2-), 2.69 (dd, J=6.3 and 15.1 Hz, 1H, -CO-CH2-), 1.46-1.23 (m, 6H, piperidinyl); 13C NMR (75 MHz, CD3OD) δ174.6, 153.1, 143.7, 132.7, 130.1, 129.1, 127.5, 127.3, 126.3, 125.7, 124.7, 118.0, 62.8, 49.5, 42.6, 24.6, 23.3.
【実施例６】
【００２４】
４−［Ｎ−（４−ニトロベンジル）アセトアミド］−２−（１−ピペリジニル）−３−フェニル−３，４−ジヒドロキナゾリン（８）の製造
化合物（７）（０．２２ｇ，０．６３mmol）と、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢＴ）（０．１３ｇ，０．９４mmol）をジクロロメタン／テトラヒドロフラン（１：１，２０ml）に溶かし、０℃で４−ニトロベンジルアミン（０．１８mg，０．９４mmol）を滴加した。同じ温度で１時間攪拌した後、１−［３−（ジメチルアミン）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）（０．１４ｇ，０．７５mmol）を加えて室温で再び１２時間攪拌した。反応が終結すれば減圧下で溶媒を除去して反応混合物をジクロロメタンで溶解させた。その溶液を０．５Ｍ塩酸水溶液で２回、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で２回、そして水で１回抽出して塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製して白色の固体化合物（８）（０．２４ｇ，８０％）を得た。
IR (KBr) 3192, 2932, 2848, 1668, 1552, 1486, 1430, 1344, 1282, 756 cm-1; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.58 (br, 1H, -CO-NH-CH2-), 8.15 (d, J=8.7 Hz, 2H, -CH2-C4H4-NO2), 7.49 (d, J=8.1 Hz, 2H, -CH2-C4H4-NO2), 7.27-7.20 (m, 2H, aromatic), 7.15-7.02 (m, 4H, aromatic), 6.95-6.87 (m, 3H, aromatic), 5.23 (dd, J=6.0 and 8.7 Hz, 1H, -CH2-CH-N-), 4.67 (dd, J=6.7 and 12.1 Hz, 1H, -NH-CH2-), 4.58 (dd, J=5.7 Hz and 15.3 Hz, 1H, -NH-CH2-), 3.10 (br, 4H, piperidinyl), 2.58 (dd, J=9.0 and 14.7 Hz, 1H, -CO-CH2), 2.32 (dd, J=6.1 and 14.2 Hz, 1H, -CO-CH2-), 1.35 (br, 2H, piperidinyl), 1.13 (br, 4H, piperidinyl); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ170.9, 154.3, 147.4, 146.5, 145.9, 143.1, 129.5, 129.0, 128.5, 127.0, 125.4, 124.7, 124.0, 123.1, 123.0, 122.0, 60.8, 47.5, 43.2, 41.6, 25.2, 24.6; HRMS (FAB, M+H) Calcd for C28H30N5O3 484.2349, found 484.2341.
【実施例７】
【００２５】
４−［Ｎ−（４−アミノベンジル）アセトアミド］−２−（１−ピペリジニル）−３−フェニル−３，４−ジヒドロキナゾリン（９）の製造
化合物（８）（１．３９ｇ，２．８７mmol）と、１０％Ｐｄ(C)（０．２８ｇ）をメタノール（４０ml）に溶かして水素雰囲気下で２時間攪拌した。反応が終結すれば反応混合物をＣｅｌｉｔｅ５４５でろ過して減圧下で溶媒を除去した。反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製してアミン化合物（１．２６ｇ，９７％）を得た。
IR (KBr) 3218, 2930, 2850, 1648, 1550, 1480, 1430, 1350, 1282, 732 cm-1; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.26-7.22 (m, 2H, aromatic), 7.20-7.11 (m, 4H, aromatic), 7.07-7.02 (m, 3H, aromatic), 6.96-6.90 (m, 2H, aromatic), 6.60-6.56 (m, 2H, aromatic), 6.37 (br, 1H, -CO-NH-CH2-), 5.17 (dd, J=5.1 and 9.6 Hz, 1H, -CH2-CH-N-), 4.32 (d, J=5.7 Hz, 2H, -NH-CH2-), 3.51 (br, 2H, -C4H4-NH2), 3.26 (br, 4H, piperidinyl), 2.57 (dd, J=10.2 and 14.1 Hz, 1H, -CO-CH2), 2.31 (dd, J=5.4 and 14.1 Hz, 1H, -CO-CH2-), 1.43 (br, 2H, piperidinyl), 1.26 (br, 4H, piperidinyl); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ169.7, 153.3, 145.7, 145.2, 141.0, 129.5, 129.2, 128.2, 128.1, 126.7, 124.8, 124.6, 123.2, 123.1, 121.5, 115.0, 61.2, 47.6, 43.2, 41.7, 24.8, 24.2; HRMS (FAB, M+H) Calcd for C28H32N5O 454.2607, found 454.2654. 
【実施例８】
【００２６】
４−｛Ｎ−［４−（４−フルオロベンゼンスルホニルアミド）ベンジル］アセトアミド｝−３−フェニル−２−（ピペリジン−１−イル）−３，４−ジヒドロキナゾリン（１０：ＫＹＳ０５０４２）の製造
化合物（９）（０．１１ｇ，０．２６mmol）をジクロロメタン（１０ml）に溶かし、ピリジン（０．０６ｇ，０．７６mmol）を加えた。そして、０℃でジクロロメタン（５ml）に溶かした４−フルオロベンゼンスルホニルクロリド（０．０６ｇ，０．３１mmol）をゆっくり滴加して室温で２４時間攪拌した。反応が終結すれば水を加えた後、ジクロロメタンを３回抽出して塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した後、反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製して白色の固体化合物（１０）（０．１１ｇ，７３％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.66-7.62 (m, 2H, aromatic), 7.28-7.23 (m, 2H, aromatic), 7.20-7.06 (m, 9H, aromatic), 7.04-6.90 (m, 4H, aromatic), 6.72 (br, 1H, -CO-NH-CH2-), 5.19 (dd, J=6.0 and 9.9 Hz, 1H, -CH2-CH-N-), 4.41 (dd, J=6.1 and 14.8 Hz, -NH-CH2-), 4.24 (dd, J=5.5 and 14.8 Hz, -NH-CH2-), 3.28 (br, 4H, piperidinyl), 2.74 (dd, J=9.6 Hz and 14.1 Hz, 1H, -CO-CH2), 2.44 (dd, J=6.0 and 14.1 Hz, 1H, -CO-CH2-), 1.39 (br, 2H, piperidinyl), 1.25(br, 4H, piperidinyl); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ170.1, 166.7, 153.9, 145.3, 141.7, 135.9, 135.0, 129.9, 129.7, 129.3, 128.9, 128.4, 126.7, 125.2, 124.8, 123.2, 121.5, 116.3, 116.0, 61.4, 47.9, 43.3, 42.0, 25.2, 24.6; HRMS (FAB, M+H) Calcd for C34H35FN5O3S 612.2445, found 612.2436.
【実施例９】
【００２７】
４−メトキシカルボニルメチル−２，３−ジフェニル−３，４−ジヒドロキナゾリンの製造
実施例３で得たカルボジイミド化合物（４，０．９１１ｇ，３．２７mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５０．０ml）に溶かして−７８℃でフェニルマグネシウムブロマイド溶液（３．０Ｍ溶液、２．６２ml，７．５８mmol)をゆっくり添加した。同じ温度で３０分の間攪拌して反応が終結した後、飽和した塩化アンモニア水溶液を加えてエチルアセテートで3回抽出した。
減圧下で溶媒を除去して反応混合物をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：エチルアセテート＝５：１）で精製して固体である白色の標題化合物（１）を８０％の収率で得た：1H NMR[300 MHz, CDCl3]δ7.77-7.74(m, 2H, aromatic)、7.50(d, J=7.2 Hz, 1H, aromatic)、7.31(t, J=7.8 Hz, 1H, aromatic)、7.24-7.21(m, 3H, aromatic)、7.15-7.03(m, 4H, aromatic)、6.96(d, J=7.8 Hz, 2H, aromatic)、6.90(t, J=7.2 Hz, 1H, aromatic)、5.38(t, J=7.2 Hz, 1H, -CH2-CH-N-)、3.67(s, 3H, -OCH3)、2.89(dd, J=8.1 Hz and 14.8 Hz, 1H, -CO-CH2-)、2.69(dd, J=6.6 Hz and 15.1 Hz, 1H, -CO-CH2-);13C NMR[75 MHz, CDCl3]δ 171.5、154.9、145.4、142.1、136.3、130.4、130.0、129.2、128.9、128.5、126.5、126.3、125.3、125.1、124.4、123.6、59.4、52.1, 40.8.
【００２８】
上記実施例３〜８までの反応を用いて製造される生成物と、実施例９で製造された化合物を用いて実施例４〜８までの反応を用いて製造される生成物の物理化学的性質は下記表１に整理した。
【００２９】
【表１−１】
2005239708.tif 000006
【表１−２】
2005239708.tif 000007
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
2005239708.tif 000012
【００３０】
生理活性検索
本発明では、Ｔ−型カルシウムチャンネルの効果的な遮断剤の開発のために製造された化合物について１次検索方法でＴ−型カルシウムチャンネル中のα１Ｈを発現させたカエル未受精卵を利用してチャンネル抑制効果を検索した。Ｔ−型カルシウムチャンネル遺伝子中の神経細胞に主に存在するα1Gのみを選択的に発現させた哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞株（人間腎臓癌腫細胞由来の米国バージニア州所在のバージニア大学のエドワードフェレズ−レイエス教授により確立された細胞株）を利用して本発明において合成された、１次検索で５０％以上の抑制効果を示すＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤の候補物質を電気生理学的全細胞パッチクランプ方法を用いてＴ−型カルシウムチャンネルの活性について検索し、その中から効能があると判断される候補物質に対して細胞毒性検索法である３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）分析法を用いて細胞毒性を検査した。その結果、本発明の化合物は優れたカルシウムチャンネル抑制効果を示すことが明らかになった。
【００３１】
試験例１−１：カエル未受精卵（Xenopus oocytes）の準備及びα１ＨＴ−型カルシウム通路のｃＲＮＡ合成
Ｔ−型カルシウムチャンネルα−１Ｈ（Ｃａv３．２）遺伝子(非特許文献18)をカエル未受精卵に発現させるために、上記チャンネルｃＤＮＡ（ＡＦ０５１９４６）が挿入されている pGEM-HEAの５’末端を制限酵素ＡｆｌＩＩで切った後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて相応するｃＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ会社の実験書に従って合成した（ｍＭＥＳＳＡＧＥ mMＡＣＨＩＮＥキット、Ambion, Austin, USA）。合成されたｃＲＮＡは、分光光度計でＯ．Ｄ．値を測定して計り取った。この時に未受精卵はアフリカツメガエル（Xenopus laevis, Xenopus I, USA）の雌から次の方法によって準備した。カエルの腹を１ｃｍ程度切開して３−４つの葉（lobes）をはさみで切り取った後、いくつかの卵が付いている小さな塊りに分離した。これらをコラゲナーゼタイプＩＡ（Sigma, USA）が入れられたＯＲ溶液（８２．５mM ＮａＣｌ，２．５mM ＫＣｌ，１mM ＭｇＣｌ2，５mM ＨＥＰＥＳ，pH７．６）で加水分解して卵胞を除去した（defolliculation）。健康な卵のみ解剖顕微鏡下で選び出した後、これらをＳＯＳ溶液（１００mM ＮａＣｌ，２mM ＫＣｌ，１．８mM ＣａＣｌ2，１mM ＭｇＣｌ2，５mM ＨＥＰＥＳ，２．５mMピルベート，５０μM／mlゲンタマイシン、pH７．６）で３〜４時間回復させた。ナノ注入基（Nano-injector）を用いて２〜５ngのｃＲＮＡを各未受精卵に注入した後、１８℃で維持させて、４〜５日後から発現されたチャンネルの電気的特性を研究した。
【００３２】
試験例１−２：電位固定法によるα１ＨＴ−型カルシウムチャンネルの電気生理学的特性把握
電位固定法（Two-electrode voltage clamping）を用いてカエル未受精卵に発現されたカルシウムチャンネルの電流を測定した。電流は１０mM Ｂａ2+溶液（１０mM Ｂａ（ＯＨ）2，９０mM ＮａＯＨ，１mM ＫＣｌ，０．１mM ＥＤＴＡ，５mM ＨＥＰＥＳ，メタンスルホン酸でpHを７．４に調整する）で測定した。この時に未受精卵用増幅器（モデルＯＣ−７２５Ｃ，Warner Instrument Corp., USA）を通じて電位固定（voltageclamp）及び電流測定を調節し、この時にアナログ信号はDigidata2000A（Analog-Digital converter, Axon Instrument）を用いてデジタル信号に変えて、全てのデータの獲得、格納、分析はｐＣＬＡＭＰ８を通じてPentium（登録商標）IVコンピュータに記録した。データは主に５KHzで集めて、１KHzでろ過した（モデル９０２フィルター；米国メリーランド州ハーバーヒル所在のフリクエンシーデバイシス社（Frequency Devices））。Ｔ−型電流の発生は一般に未受精卵を−９０mVで固定した状態で、毎１５秒ごとに−２０mVのテスト電位を加えて引き起こし、この時に薬物の処理前と後とを比較して遮断パーセントを計算した。その結果を下記表２に示した。
【００３３】
試験例２：ＨＥＫ２９３細胞培養法及び電気生理学的方法を利用したＴ−型カルシウムチャンネル活性測定法
培養溶液はドゥルベッコ改質イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM）に１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（v/v）を入れて作って、使用し、細胞は９５％空気／５％ＣＯ2の湿っぽい条件のインキュベーターで温度３６．５℃で培養した。培養溶液は３〜４日に一度ずつ変えて、細胞は一週間ごとに２次培養（sub-culture）し、Ｇ−４１８（０．５mg/ml）溶液を用いてα1GＴ−型カルシウムチャンネルを発現させたＨＥＫ２９３細胞のみを育つようにした。Ｔ−型カルシウムチャンネル活性測定法に使われた細胞は毎回２次培養する時にポリ−Ｌ−リシン（０．５mg/ml）でコーティング処理したカバースリップに培養した後、２〜７日後に記録した。単一細胞水準でＴ−型カルシウムチャンネルの電流測定のためにＥＰＣ−９増幅器（HEKA, German）を用いて電気生理学的全細胞パッチクランプ方法で測定した。Ｔ−型カルシウムチャンネル活性測定法の溶液組成では、細胞外部溶液に１４０mM ＮａＣｌ，２mM ＣａＣｌ2，１０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．４）を用いて細胞内部溶液ではＫＣｌ １３０mM，ＨＥＰＥＳ １０mM，ＥＧＴＡ １１mM，ＭｇＡＴＰ５mM（pH７．４）を用いた。低い電圧で活性化されるＴ−型カルシウムチャンネル活性プロトコルでは上記で作った細胞内部溶液を入れた３〜４ＭΩ抵抗の微細ガラス電極を単一細胞に刺して全細胞記録（whole-cellrecording）モードになるようにした後、細胞膜電位を−１００mVに固定した後、毎１０秒ごとに−３０mV（５０ms持続期間）で低分極させた時のＴ−型カルシウムチャンネル活性による内向電流の大きさを測定した。
【００３４】
試験例３：電気生理学的方法を利用したＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤検索法
本発明の試験例２で使われた細胞及び測定法がＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤検索に適当な検索システムであるか確認するために、公知文献に発表された（非特許文献１9）α1GＴ−型カルシウムチャンネル研究結果と比較分析した。図１のように１）−３０mVの低い電圧で最大に活性化される性質（図１）、２）活性化された電流の速い活性−非活性である特徴（図２）、３）既存のＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤として知られていたＮｉ2+とミベフラジル（mibefradil）に対するＩＣ50値の比較（図３及び図４）等で本発明のＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤検索法として適当であると判断して遮断剤の効能を選別検索した。各化合物は１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、１０mMストック溶液を作って１０００倍希釈濃度である１０μM（０．１％ＤＭＳＯ含む）でＴ−型カルシウムチャンネル電流に対する影響を検査した。各化合物は細胞外部溶液と共に３０〜６０秒間１０μM濃度で細胞に処理され、化合物によるピーク電流の抑制程度を百分率で計算して図５に示した。
【００３５】
試験例４：ＭＴＴ分析法を利用したＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤細胞毒性検索
ＨＥＫ２９３細胞で選別、検索されたＴ−型カルシウムチャンネル遮断剤の細胞毒性（cytotoxicity）如何を測定するために、ＭＴＴ分析を施行した。培養したＨＥＫ２９３細胞に各化合物を１０μM及び１００μM濃度で処理して各分析の陰性対照群に溶媒で使われた０．１％ＤＭＳＯ、陽性対照群に細胞毒性があると知られたＨ2Ｏ2（１２５μM）を用いた。薬物処理６時間後にＰＢＳに溶かしたＭＴＴ（１mg/ml）を５０μLずつ直接培養した細胞に処理し、４時間後上澄液を除去して代謝されたホルマザンをＤＭＳＯ１００μLに溶解させた。自動分光光度計プレート読み出し基（automated spectrophotometric plate reader）を利用して５６０nmの波長で吸光度を測定した。その結果、本発明で検索されたＨＥＫ２９３細胞で５０％以上の抑制効果を示す化合物は全部１０μM濃度では細胞毒性が検索されず、その中の一部のみ高濃度（１００μM）で細胞毒性を示した（図６）。
本発明の製造化合物のＴ−型カルシウムチャンネル抑制効果の結果をカエル未受精卵（α１Ｈ）とＨＥＫ２９３細胞（α１Ｇ）に対して下記表２に整理した。
【００３６】
【表２】
2005239708.tif 000013
【００３７】
本発明の対照物質として用いたミベフラジルのカルシウムチャンネル抑制効果を本発明の活性検索法に測定した結果、表２でのようにカエル未受精卵（α１Ｈ）では、８６％の抑制効果（１００μMの濃度）を示し、ＨＥＫ２９３細胞（α１Ｇ）では９５．９％（１０μMの濃度、ＩＣ50＝０．８４μM）の抑制効果を示している。一方、本発明の化合物の中のＫＹＳ０５００１はカエル未受精卵（α１Ｈ）では、７７％抑制（１００μMの濃度）の効果を、ＨＥＫ２９３細胞（α１Ｇ）では、９０．１％の抑制効果（１０μMの濃度、ＩＣ50＝０．９μM）を示した。一方、ＫＹＳ０５０４１とＫＹＳ０５０４２の２つの化合物はカエル未受精卵（α１Ｈ）を利用した活性検索ではそれぞれ８４．７％、８０．５％の抑制（１００μMの濃度）の効果を、ＨＥＫ２９３細胞（α１Ｇ）では、それぞれ８９．９％、８９．０％の抑制（１０μMの濃度）効果を示しており、ＩＣ50で換算した結果、ＫＹＳ０５０４１はＩＣ50＝０．２５μM，ＫＹＳ０５０４２はＩＣ50＝０．２０μMの値を示している。従って、ＩＣ50値を基準にして見れば、本発明の化合物の中でＫＹＳ０５００１は対照物質であるミベフラジルとほぼ類似のカルシウムチャンネル抑制効果を示し、ＫＹＳ０５０４１はミベフラジルよりも約３．４倍、ＫＹＳ０５０４２は約４．２倍以上の優れたチャンネル抑制効果を示した。
【００３８】
試験例５：本発明の化合物の他のイオンチャンネルに対する選択性確認
本発明の化合物の他のイオンチャンネルに対する選択性を確認するために、本発明の化合物の中のＫＹＳ０５００１，ＫＹＳ０５０４１及びＫＹＳ０５０４２に対して公知の方法（非特許文献２０）を利用してＭＰＧ（majorpelvicganglion，主骨盤神経節）を用いてＮａ+チャンネル及び高電圧−依存性カルシウムチャンネル（highvoltage-activated Ca2+channel：ＨＶＡ）の抑制効果を測定した。
【００３９】
実験動物としては、２５０ｇ前後の雄スプラーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ネズミを用いた。ペントバービタルナトリウム（pentobarbital natrium; 50mg/kg, i.p.）でネズミを麻酔させた後、直ちに開腹して前立腺の外側に位置した主骨盤神経節を摘出して、これを冷たい（４℃）ハンクス塩溶液（Hank's balancedsaltsolution, HBSS, GibcoBRL）に移した。神経節を取り囲む連結組織を剥がして鋭利なナイフで注意深く小さな傷孔を作った後、これを０．７mg/mLコラゲナーゼ（タイプＤ）、０．３mg/mLトリプシンと０．１mg/mLのＤＮＡｓｅタイプＩが入っている１０mLの改質アールス塩溶液（modified Earle's balancedsaltsolutin，EBSS, pH7.4, GibcoBRL）で１時間３５℃で培養した（非特許文献２1）。この時にＥＢＳＳには３．６ｇ／Ｌのグルコースと１０mMのＨＥＰＥＳを含めた。培養後に培養フラスコを振って単一神経細胞に分離した後、臨床用遠心分離機（International Equipment Company, MA, USA）を利用して１０００rpmの速度で遠心分離した。分離された単一神経細胞を１０％牛胎児血清、１％グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシンが含まれたＭＥＭ（GibcoBRL）に再浮遊（resuspend）させた後、ポリ−Ｌ−リシンにコーティングされているポリスチレン培養皿（３５mm）に塗抹した。これを３７℃細胞培養器（humidifiedincubator；９５％空気−５％ＣＯ2）で培養し、分離した後、２４時間以内に実験に用いた。
【００４０】
電圧依存的カルシウム及びナトリウム電流はパッチクランプ増幅器（patch clamp amplifier, Axopatch 1D, Axon Instruments, Foster city, CA, USA）を用いて典型的なパッチクランプ方法で全細胞破裂形態（whole-cell ruptured configuration）で記録した（非特許文献２2）。電極はホウケイ酸塩ガラス毛細管（外径；１．６５mm、内径；１．２mm、Corning7052, GarnerGlassCo., Claremont, CA, USA）でＰ−９７フレミング−ブラウン自動微量分周器（Flaming-Brown micropipette puller）（Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA）を用いて作った。作られた電極はマイクロフォージ（microforge）で熱処理して整えて、電極内部に溶液を満たした時に抵抗が１〜３MΩになることを用いた。神経細胞が入っている培養皿を倒立顕微鏡（inverted microscope）上に載置して、細胞外液を重力により約１〜２ml/min速度で貫流されるようにした。細胞膜の電気容量（membrane capacitance）と直列抵抗（series resistance）は増幅器で８０％以上補正した。電圧生成及びカルシウム電流の記録はアナログ／デジタル転換器（Digidata1200, Axon Instruments Co.）が連結されたマッキントッシュコンピュータに装着されたＳ４（米国National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, NIHのStephen R. Ikeda博士提供）のソフトウェアを利用した。カルシウム電流は２〜５ｋＨｚであって低域通過フィルター（low band pass filter）を通過させた後、マッキントッシュコンピュータに格納し、ＩＧＯＲＰＲＯ（Wave-Metrics, Lake Oswego, OR, USA）で分析した。全ての実験は室温（２０〜２２℃）で施行した。
【００４１】
カルシウム電流測定のために使われた電極内溶液の組成は１２０mM Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＧ）メタンスルホネート（ＭＳ）、２０mMテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）−ＭＳ，２０mM ＨＣｌ，１１mM ＥＧＴＡ，１０mM ＨＥＰＥＳ，１mM ＣａＣｌ2，４mM ＭｇＡＴＰ，０．３mM Ｎａ2ＧＴＰ，１４mMトリス−ホスホクレアチン（pH７．２，２９０mOsm）とした。細胞外貫流液の組成は１４０mM ＭＳ，１４５mM ＴＥＡ−ＯＨ，１０mM ＨＥＰＥＳ，１５mMグルコース、１０mM ＣａＣｌ2，０．０００３mMテトロドトキシン（tetrodotoxin，ＴＴＸ，pH７．４，３２０mOsm）とし、実験した。一方、ナトリウム電流測定に使われた電極内溶液の組成は３０mM ＮａＣｌ，１４０mM ＮＭＧ−ＭＳ，１１mM ＥＧＴＡ，１０mM ＨＥＰＥＳ，１mM ＣａＣｌ2，４mM ＭｇＡＴＰ，０．３mM Ｎａ2ＧＴＰ，（pH７．２，２９０mOsm）とした。細胞外貫流液の組成は５０mM ＮａＣｌ，９０mM ＴＥＡＣｌ，１０mM ＨＥＰＥＳ，１５mMグルコース、１０mM ＣａＣｌ2，１０mM ＭｇＣｌ2（pH７．４，３２０mOsm）として実験した。
【００４２】
その試験結果を下記表３に整理した。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
表３から分かるように、ＫＹＳ０５００１，ＫＹＳ０５０４１及びＫＹＳ０５０４２はＮａチャンネルと比較時にカルシウムチャンネルに対して優れた選択性を示している。一方、カルシウムチャンネルのサブタイプに対する選択性の場合、ＫＹＳ０５０４１及びＫＹＳ０５０４２はＴ−型（ＬＶＡ）とＮ−型（ＨＶＡ）カルシウムチャンネルを抑制して選択性が弱い反面、ＫＹＳ０５００１はＴ−型（ＬＶＡ）のみを選択的に抑制する優れた選択性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】Ｔ−型カルシウムチャンネルの−３０mVの低い電圧で最大活性化性質を示すグラフである。
【図２】Ｔ−型カルシウムチャンネルの活性化された電流の速い活性−非活性特徴を示すグラフである。
【図３】Ｎｉ2+によるＴ−型カルシウムチャンネルの抑制効果を示すグラフである。
【図４】ミベフラジルによるＴ−型カルシウムチャンネルの抑制効果を示すグラフである。
【図５】本発明の化合物のＴ−型カルシウムチャンネルの抑制効果を示すグラフである。
【図６】本発明の化合物の細胞毒性結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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