(57)【要約】【課題】非環状一本鎖目的核酸断片を鋳型とし、鎖置換プライマー伸長反応により目的核酸断片と相補的な核酸断片を形成させ、増幅させる方法を提供すること。【解決手段】非環状一本鎖目的核酸断片を鋳型とし、かつ、前記目的核酸断片と相補的な配列を有する第１のプライマーを用いて、鎖置換プライマー伸長反応を行うことにより前記目的核酸断片と相補的な核酸断片を形成させることを含んでなる、核酸断片の増幅方法であって、前記目的核酸断片により形成される非連続配列を含む核酸配列に対して相補的な断片を、繰り返し配列として連続的に形成させることによって目的核酸断片を増幅させる、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非環状一本鎖目的核酸断片を鋳型とし、かつ、前記目的核酸断片と相補的な配列を有する第１のプライマーを用いて、鎖置換プライマー伸長反応を行うことにより前記目的核酸断片と相補的な核酸断片を形成させることを含んでなる、核酸断片の増幅方法であって、
前記目的核酸断片により形成される非連続配列を含む核酸配列に対して相補的な断片を、繰り返し配列として連続的に形成させることによって目的核酸断片を増幅させる、方法。
【請求項２】
第１のプライマーが、その５’末端側に、非環状一本鎖目的核酸断片の５’末端側と相補的な配列を有し、かつ、その３’末端側に、非環状一本鎖目的核酸断片の３’末端側と相補的な配列を有する、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】
非環状一本鎖目的核酸断片が、その両端に互いに相補的な配列を有して、ループ及びステム構造を形成するものであって、第１のプライマーが、そのプライマーの５’末端側に、前記ループ構造部分の５’末端側と相補的な配列を有し、かつ、その第１のプライマーの３’末端側に、前記ループ構造部分の３’末端側と相補的な配列を有する、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項４】
非環状一本鎖目的核酸断片がその両端に互いに同一の配列部分を有し、かつ、第１のプライマーが前記非環状一本鎖核酸断片と相補的である任意の配列からなる、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項５】
非環状一本鎖目的核酸断片が、その両端に、互いに同一の配列と、さらにそれを挟む形で両端に互いに相補的な配列とを有して、この相補的な配列によりループ及びステム構造を形成するものであり、かつ、第１のプライマーが前記非環状一本鎖核酸断片のループ形成部分と相補的である任意の配列からなる、請求項１に記載の増幅方法。
【請求項６】
非環状一本鎖目的核酸断片が鎖置換プライマー伸長反応により調製されたものである、請求項１〜５項いずれか一項に記載の増幅方法。
【請求項７】
請求項１〜６項いずれか一項に記載の増幅方法により得られた核酸断片を、非環状一本鎖目的核酸断片として用い、繰り返し増幅させることを含んでなる、核酸断片の増幅方法。
【請求項８】
非環状一本鎖目的核酸断片が、その両端に互いに相補的な配列を有して、ループ及びステム構造を形成するものである場合は、前記非環状一本鎖核酸断片のループ形成部分から選択される任意の配列を、鎖置換プライマー伸長反応における第２のプライマーとして用い、または、非環状一本鎖目的核酸断片がループ及びステム構造を形成しない場合は、前記非環状一本鎖核酸断片から選択される任意の配列を、鎖置換プライマー伸長反応における第２のプライマーとして用いる、請求項１〜７項のいずれか一項に記載の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、目的とする非環状一本鎖核酸断片を鋳型とした核酸断片の増幅方法に関する。
【０００２】
技術背景
ヒトゲノム配列のほぼ全容が明らかとなり、またＳＮＰ解析も巨大プロジェクトで進められている今日において、遺伝子検出またはＳＮＰ検出の簡易化もしくは低コスト化は、遺伝子診断を実用化するためにますます重要な課題となっている。
【０００３】
通常、遺伝子検出を行うにあたっては、検出しようとする微量の遺伝子を何らかの方法で増幅しなければならない。このような増幅の方法としては、一般的に、検出のためのシグナルを増幅する方法と、遺伝子そのものを増幅する方法とがあるが、現在のところ後者の方に実用的なものが多い。
【０００４】
遺伝子を増幅する方法としては、所謂ＰＣＲ法（Ｐｏｌｆｓ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＲ：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９２））が最も普及しており、ヒトゲノム配列の解析においても不可欠な技術となっている。しかしながら、従来のＰＣＲ法にはいくつかの改善が求められる点があり、そのような改善をするために種々の遺伝子増幅手段が考え出されている。なかでも、等温増幅法は温度調節を必要としないため注目を集めている。
【０００５】
等温増幅法として代表的な方法としては、例えば、ＮＡＳＢＡ法（Ｇａｂｒｉｅｌｌｅ，Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３９，  ２４２３−２４２９  （１９９３））、ＴＭＡ法（Ｋａｃｉａｎ，Ｄ．Ｌ．，  米国特許第５，３９９，４９１号）およびＳＤＡ法（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０，  １６９１−１６９６（１９９２））が挙げられ、これらは遺伝子診断法としても実用化されている。しかしながら、これらの方法は複数の酵素を使うため、反応系が複雑となり、またコストが高くなってしまう。
【０００６】
また、等温増幅法の別法として、例えば、ＲＣＡ法（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，  ２２５−２３２（１９９８））やＬＡＭＰ法（Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８，  ｅ６３（２０００））も開発されている。ＲＣＡ法は環状のＤＮＡプローブを鋳型として増幅する方法であり、リガーゼ反応と組み合わせることによりＳＮＰ検出に有効な方法であるとされている。また、ＬＡＭＰ法は単一の酵素で等温増幅できる方法であるが、本出願人の知る限り、現在までのところ一般には普及しておらず正確な特性については明らかでない。
【０００７】
一方、Ｈａｆｎｅｒらは、直鎖状の２本鎖ＤＮＡを鋳型としローリングサークルアンプリフィケーション様の反応が起こることを見出している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，  ８５２−８６７  （２００１））。しかしながら、この手法では、反応生成物は非特異的であるため、特定の配列を選択的に増幅することは困難である。
【０００８】
【発明の概要】
一般的に一本鎖環状ＤＮＡを鋳型とし、鎖置換活性のあるＤＮＡポリメラーゼでプライマー伸長反応を行うと、伸長反応により先に合成された鎖が解離するために環状ＤＮＡ配列の繰り返し構造をもつ直鎖ＤＮＡが得られることが知られている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６，  ５０７３−５０７８  （１９９８））。
【０００９】
本発明者等は、今般、プライマーを特定な位置に設定したり、目的核酸断片に特定の配列を導入することにより、非環状一本鎖ＤＮＡであっても同様な繰り返し構造が得られることを見出した。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼが図１に示したように鎖置換伸長反応に際し、鋳型となる鎖がニック様構造、すなわちリン酸ジエステル結合を形成していない構造であっても、鋳型に対応する塩基を付加して伸長反応が進むことを見出した。これにより、目的とする非環状の一本鎖核酸断片（以下において、目的核酸断片ということがある）を鋳型として、鎖置換プライマー伸長反応により目的核酸断片を連続的に繰り返し増幅することができた。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１０】
よって、本発明は、非環状一本鎖目的核酸断片を鋳型として、鎖置換プライマー伸長反応により目的核酸断片と相補的な核酸断片を形成させて、増幅させる方法の提供を目的とする。
したがって、本発明による核酸断片の増幅方法は、非環状一本鎖目的核酸断片を鋳型とし、かつ、前記目的核酸断片と相補的な配列を有する第１のプライマーを用いて、鎖置換プライマー伸長反応を行うことにより前記目的核酸断片と相補的な核酸断片を形成させることを含んでなる、核酸断片の増幅方法であって、
前記目的核酸断片により形成される非連続配列を含む核酸配列に対して相補的な断片を、繰り返し配列として連続的に形成させることによって目的核酸断片を増幅させる方法である。
【００１１】
【発明の具体的な説明】
【００１２】
本発明において、「目的核酸断片により形成される非連続配列」とは、前記したように相補鎖を形成させる鋳型配列が、ニック様構造、すなわち塩基配列としては連続して配置されているがそのある一部において隣り合う塩基間でリン酸ジエステル結合を形成していない構造を含んでいる配列のことをいう。具体的には例えば、非環状一本鎖目的核酸断片の５’末端と、３’末端が、近接することにより、該核酸断片が環状構造を形成するような場合における、該両末端の近接部分の配列が挙げられ、また、非環状一本鎖目的核酸断片がその両端に互いに相補的な配列を有してループ及びステム構造を形成している場合において、そのループ構造配列に着目した場合に、ステム形成部分との境界で生ずる、ループ構造配列における不連続部分が挙げられる。
本発明において、「繰り返し配列として連続的に形成させる」とは、非環状一本鎖目的核酸断片をタンデム状の繰り返し配列として生成させ、同じ核酸断片を連続的に形成させることをいう。したがって、例えば、後述するプライマーを特定な位置に設定する場合の好ましい態様（図２参照）ような場合には、非環状一本鎖目的核酸断片の５’末端と３’末端が近接して環状配列に類似した配列を形成し、これに相補的な配列が鎖置換伸長反応により形成されるが、このとき、形成される目的核酸断片は、環状配列に類似した配列に対してまず一つ分形成され、それに引き続いて、伸長反応が環状配列に類似した配列をトレースするように、次々に目的核酸断片が形成されると考えられる。このようにして形成された目的核酸断片は、一単位分の断片を繰り返し有するような形で連続して得られることとなる。なお、例えば後述する目的核酸断片に特定の配列を導入する場合における態様のような（図４参照）場合には、目的核酸断片は互いに同一の配列部分をその両端に有するが、核酸断片が増幅されるときには、この同一配列の一方のみは短絡されて残り配列が繰り返し形成されることとなる。
【００１３】
本発明において、適用可能な非環状一本鎖目的核酸断片としては、その塩基配列が判明しているものであれば特に限定されるものではなく、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれであっても良い。またこの目的核酸断片は、その由来によって制限されるものではなく、従って本発明は、真核生物、原核生物、ウイルス由来の核酸、さらには合成されたものに対しても適用可能である。
【００１４】
ＲＮＡを直接増幅のターゲットとする場合は、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ鎖を合成するリバーストランスクリプターゼや、ある種のＲＮＡを鋳型としてＤＮＡ合成可能なＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、目的のＲＮＡから相補的なＤＮＡを合成した場合や、最初からＤＮＡを増幅のターゲットとする場合はＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【００１５】
鎖置換プライマー伸長反応においては、使用されるポリメラーゼは、鎖置換活性を少なくとも有するものであれば、特に制限はなく、そのような活性を有する酵素であればいずれのものも使用可能である。
そのようなポリメラーゼとしては、ＲＮＡを直接増幅する場合は、例えば、鎖置換活性のあるリバーストランスクリプターゼであるＭ−ＭｕＬＶ  リバーストランスクリプターゼなどを用いることができる。また、ＤＮＡを増幅する場合は、例えば、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Φ２９  ＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖置換活性をもつＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたものが好ましい。なお、その活性の有無については酵素販売会社のカタログに記載されている。
【００１６】
本発明の非連続な鋳型に連続的な相補鎖を合成する反応においては、該反応と鎖置換活性は矛盾する反応とも考えられる（Ｃａｎｃｅｉｌｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ２７４８１−２７４９０  （１９９９））。すなわち、鎖置換反応が強すぎると該反応の効率が低下することが考えられる。そのような場合、反応温度または反応液中の塩濃度などにより鎖置換活性をコントロールすることもできる。また必要により、鎖置換活性の異なるポリメラーゼを複数同時に使用してもよい。
【００１７】
鎖置換プライマー伸長反応の反応温度は、使用する酵素に応じその最適な温度にしたがって、適宜選択可能であるが、通常は、プライマー伸長反応の特異性を高めるためには比較的高い温度が好ましい。そのような場合はその温度にふさわしい耐熱のＤＮＡポリメラーゼを使う必要がある。
【００１８】
本発明において使用されるプライマーとしては、一般のプライマー伸長反応、たとえばポリメラーゼチェーンリアクションに使用されている公知のものであればいずれのものを使用可能である。
使用されるプライマーの鎖長は、一般的な使用法に準じて適宜選択可能である。本発明においては、第１のプライマーの鎖長は、典型的には４〜１００塩基であり、好ましくは１０〜３０塩基である。
【００１９】
プライマーに非連続な目的核酸断片の５’末端側と３’末端側を近づける作用をもたせる時は、該反応条件下でその構造を安定に保持できるものであることが望ましい。また、目的核酸断片と相補的な配列を有するプライマーおよび目的核酸断片と同一の配列からなるプライマーの両方を使用する場合は、これら両方は必ずしも目的核酸断片の別の位置に相当する必要はなく、互いに相補的なものであってもよい。また、増幅反応の効率を高めるため、目的核酸断片と相補的な配列を有するプライマーおよび目的核酸断片と同一の配列からなるプライマーの両方、またはいずれか一方を複数種混合して使用してもよい。
【００２０】
以下、本発明による核酸断片の増幅方法を、プライマーを特定な位置に設定する場合と、目的核酸断片に特定の配列を導入する場合に分けて順に説明する。
【００２１】
プライマーを特定な位置に設定する場合
本発明の好ましい態様によれば、増幅させようとする目的核酸断片の５’末端側と３’末端側との双方に相補的なオリゴヌクレオチドを第１のプライマーとして用意し、これに鎖置換活性のあるポリメラーゼと伸長反応の基質を共存させて伸長反応を行うことにより、目的核酸断片の非連続な５’末端側と３’末端側はオリゴヌクレオチドを介して近くに配置されポリメラーゼによって、それに対応する連続した相補鎖として合成され、環状ＤＮＡを用いた時と同様の生成物を得ることができる（図２）。そのため、該反応に使用する第１のプライマーは、目的核酸断片の５’末端側と相補的な配列を該プライマーの５’末端側に有し、かつ、目的核酸断片の３’末端側と相補的な配列を該プライマーの３’末端側に有するように設計されていることが好ましい。
【００２２】
したがって本発明の好ましい第１の態様によれば、第１のプライマーは、その５’末端側に、非環状一本鎖目的核酸断片の５’末端側と相補的な配列を有し、かつ、その３’末端側に、非環状一本鎖目的核酸断片の３’末端側と相補的な配列を有する。
【００２３】
また、使用するプライマーによって互いに引き寄せられた目的核酸断片の非連続な５’末端側と３’末端側は、鎖置換伸長反応の条件によっては不安定となり、連続的な相補鎖が形成される前に解離する可能性がある。このため必要に応じて、目的核酸断片の両末端側に互いに相補的な配列を導入してループ及びステム構造を形成させてもよい（図３）。
すなわち、本発明の好ましい第２の態様によれば、非環状一本鎖目的核酸断片は、その両端に互いに相補的な配列を有して、ループ及びステム構造を形成するものであって、第１のプライマーは、そのプライマーの５’末端側に、前記ループ構造部分の５’末端側と相補的な配列を有し、かつ、その第１のプライマーの３’末端側に、前記ループ構造部分の３’末端側と相補的な配列を有する。
【００２４】
このようなステム構造はグアニンやシトシン塩基に富む配列にすることにより安定性を高めることができる。また、その様な構造を形成させるためには、目的核酸断片のなかで互いに相補的な配列を両末端側に見出してそれを利用するか、または予めプライマーにそのような配列を導入してこれを利用して得てもよい。さらには、核酸断片の相補鎖以外に、たとえばタンパク−タンパクの相互作用、あるいはタンパク−核酸の特異的な相互作用を利用することも可能である。したがって、使用する第１のプライマーは、ループ部分の５’末端側と相補的な配列を該プライマーの５’末端側に有し、かつ、ループ部分の３’末端側と相補的な配列を該プライマーの３’末端側に有するように設計されているものであることが好ましい。
【００２５】
目的核酸断片に特定の配列を導入する場合
本発明の別の好ましい態様によれば、非環状一本鎖目的核酸断片がその両端に互いに同一の配列部分を有し、かつ、第１のプライマーが前記非環状一本鎖核酸断片と相補的である任意の配列からなる、目的核酸断片の増幅方法が提供される。
すなわち、目的核酸断片の５’末端側と３’末端側とに互いに同一の配列を導入しておき、目的核酸断片と相補的な任意の配列（好ましくはオリゴヌクレオチド配列）をプライマーとして使用することにより、目的核酸断片と相補的な配列を有する核酸断片を連続的に繰り返し増幅させることができる。
【００２６】
この方法は上述した方法とは異なり、プライマーとなるオリゴヌクレオチドは必ずしも目的核酸断片の５’末端側と３’末端側とに相補的な配列である必要がなく、目的核酸断片の連続する部分に相補的な配列であってもよい。
具体的には、プライマー伸長反応が目的核酸断片の５’末端側で一度停止し、合成された目的核酸断片の５’末端側と相補的な配列が目的核酸断片の３’末端側に存在する同一の配列とハイブリダイズして、伸長反応を再開すること考えられ、この反応を自発的に繰り返すことにより目的核酸断片を連続的に繰り返し増幅せることができると考えられる（図４）（なお、以上の記載は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない）。
そのため、前記同一の配列は、その一方は目的核酸断片の５’末端側に位置する必要があり、もう一方は３’末端側に位置する必要がある。好ましくは、両末端側に存在し、その鎖長は、典型的には２〜１０００塩基程度の長さがあればよい。好ましくは、前記同一の配列の鎖長は４〜１００塩基であり、より好ましくは、８〜３０塩基である。
【００２７】
本発明の別のより好ましい態様によれば、非環状一本鎖目的核酸断片は、その両端に、互いに同一の配列と、さらにそれを挟む形で両端に互いに相補的な配列とを有して、この相補的な配列によりループ及びステム構造を形成するものであり、かつ、第１のプライマーは前記非環状一本鎖核酸断片のループ形成部分と相補的である任意の配列からなる。
すなわち、目的核酸断片の両端にある同一の配列を挟む形で互いに相補的な配列を設け、ループ及びステム構造を形成させることにより、自発的な組換えの効率をさらに高めることができる（図５）。これらの配列は目的核酸断片の配列から選択することができるが、適切な配列が目的核酸断片に存在しない場合は、プライマーの末端側にそれらの配列を導入しておき、プライマー伸長反応を行うことによって目的核酸断片から同一の配列や互いに相補的な配列を含む生成物を合成し、それを鋳型とすることもできる。
【００２８】
以上のようにして、目的核酸断片を鋳型とし、また第１のプライマーを用いた鎖置換プライマー伸長反応によって、該目的核酸断片と相補的な核酸断片を連続的に繰り返し増幅することが可能であるが、必要により、その反応において目的核酸断片と同じ配列のオリゴヌクレオチドを第２のプライマーとして加えることにより、増幅効率を飛躍的に高めることができる。さらに自発的な組換えの効率を高める目的で、相同組換えに係るＲｅｃＡタンパクなどを加えることもできる。
【００２９】
非環状一本鎖目的核酸断片が、その両端に互いに相補的な配列を有して、ループ及びステム構造を形成するものである場合には、前記非環状一本鎖核酸断片のループ形成部分から選択される任意の配列を、鎖置換プライマー伸長反応における第２のプライマーとして用いることが好ましい。また、非環状一本鎖目的核酸断片がループ及びステム構造を形成しない場合には、前記非環状一本鎖核酸断片から選択される任意の配列を、鎖置換プライマー伸長反応における第２のプライマーとして用いることが好ましい。
【００３０】
本発明の一つの好ましい態様によれば、下記のように４種類のプライマー（プライマー１〜４）を用いて、本発明の方法を適用し核酸断片を増幅することができる（図６）。
まず目的核酸断片に互いに相補的な配列を導入するためのプライマーとして、プライマー２を用意し、該プライマーを用いて伸長反応を行うことにより目的核酸断片の５’末端側と３’末端側に互いに相補的な配列を導入する。その後、プライマー２の上流に位置するプライマー１により鎖置換反応が起こり、プライマー２の伸長生成物は１本鎖になった後、ループ及びステム構造を取る。さらにループ部分の５’末端側と３’末端側に相補的なプライマー３と目的核酸断片の一部であるプライマー４により、鎖置換反応を行うことにより、目的とするユニットを連続的に繰り返し増幅することができる。
【００３１】
また、目的核酸断片が非環状二本鎖であっても、これら４種類のプライマーを該目的核酸断片と混合して変性しアニーリングした後、伸長反応を行えば、同様にプライマー２からの伸長生成物はプライマー１からの伸長反応によって１本鎖核酸断片に遊離される。ここで遊離した１本鎖核酸断片は末端側に互いに相補的な配列をもち、自発的にステム構造を形成する。さらに、過剰に存在し遊離状態のプライマー３は、ステム構造を形成した一本鎖核酸断片のステム構造の両端部分にハイブリダイズしてその３’末端側から伸長反応を開始する。この伸長反応はプライマーの５’末端側まで到達すると、そこからは既に存在する相補鎖を押しのけながら（鎖置換）伸長反応を続行する。さらに伸長反応がステム部分に到達すると、伸長反応はステム部分には向かわないで、ステム部分を飛び越したかたちで（ステムを形成する相補鎖の５’側末端のすぐとなりの塩基に）相補的な塩基を付加する。その後、同様の反応を繰り返し、目的核酸断片を連続して生成する。ここで、生成した目的核酸断片はその大部分が１本鎖であり、プライマー４はこの目的核酸断片にハイブリダイズする。プライマー４は目的核酸断片を繰り返し含む１本鎖核酸断片の目的核酸断片すべてに相補的であり、ここでも鎖置換反応が開始され、目的核酸断片に相補的な１本鎖核酸断片が生成する。従って、プライマー３はこれらにも相補的であり、ここでも鎖置換を伴う伸長反応が開始され、結果として目的配列を含む伸長反応が爆発的に起こる。なお、ここでは順序だてて説明を行ったが、実際にはほとんど同時に反応は進行していると考えられる。
【００３２】
核酸断片の検出
本発明により増幅された目的核酸断片の検出は、核酸断片検出に利用されている一般的な技術であればいずれの方法であっても適用することができる（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．  Ｈ．，  Ｍａｎａｋ，  Ｍ．  Ｍ．  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９３））。増幅された目的核酸断片の検出法としては、例えば、増幅反応液の一部を電気泳動にかけ染色剤で増幅した核酸断片を検出する方法が挙げられる。また、目的核酸断片鎖に制限酵素の認識部位が存在する場合には、その制限酵素で消化し、同様に電気泳動で検出してもよい。さらに、電気泳動後プローブ法により増幅された核酸断片が目的配列を含むか否かを確認してもよい。
【００３３】
一般的に、核酸断片の増幅反応においては増幅生成物が次の反応に混入し、誤った結果を導く恐れがあるため、反応性生物は封じ込めた状態で検査する方法が好ましい。そのためには増幅反応液をそのままの状態で検出する方法が用いられる場合が多い。例えば、増幅反応液に核酸染色剤を共存させておき、核酸断片の増幅反応が起きるとそれに伴って染色剤が発色する原理に基づいた方法が挙げられる（Ｗｉｔｔｗｅｒ，  Ｃ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，  １７６−１８１  （１９９７））。また、モレキュラービーコン法のように配列特異的検出においても、あらかじめ特殊な標識を施したプローブを共存させておくことにより増幅物の生成を蛍光の発光として検出してもよい（Ｔｙａｇｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ３０３−３０８  （１９９６））。
【００３４】
核酸断片の増幅方法においては、増幅された核酸断片による汚染が深刻な問題を引き起こすことがある。それを克服する方法として、例えば増幅反応において伸長反応の基質の一つであるチミジン三リン酸の代わりにデオキシウリジン三リン酸を用い、増幅生成物のみを選択的にウラシルＤＮＡグリコシラーゼで分解する方法がある（Ｌｏｎｇｏ，  Ｍ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ９３，  １２５−１２８  （１９９０））。本発明においても、必要に応じて、このような増幅物による汚染を除去する方法をさらに適用しても良い。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３６】
本実施例において用いられるオリゴヌクレオチドは、日本バイオサービスより購入した。また、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．  より購入し、反応には添付の反応バッファーを使用した。塩基配列の決定は、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＃４３０３１５２１）を使用して反応し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。
【００３７】
反応に使用した鋳型およびプライマーオリゴヌクレオチドは、それぞれ以下の通りであった。
鋳型１：ＸＴ１
５’ＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＧＧＡＣＣＣＴＴＧＡＴＧ
鋳型２：ＸＴ２
５’ＣＡＴＣＡＡＧＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴ
鋳型３：ＸＴ３
５’ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＣＴＡＴ
プライマー１（鋳型に相補的）：ＸＰＡ１
５’ＣＡＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＡＧＡＣＴＣＡＣ
プライマー２（鋳型に相補的）：ＸＰＡ２
５’ＣＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣＡＧ
プライマー３（鋳型と同一鎖）：ＸＰＳ１
５’ＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡ
プライマー４（鋳型と同一鎖）：ＸＰＳ２
５’ＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧ
【００３８】
鋳型１は両末端側に１３塩基からなる逆行反復配列を含むものであり、また鋳型２は３’側の逆行反復配列を除いたものである。鋳型３は両方の逆行反復配列を除いたもので増幅しようとする配列のみからなるものである。
プライマー１とプライマー２は、鋳型に相補的な配列である。このうち、プライマー１は、増幅する断片の５’末端側と３’末端側に相補的であり、プライマー２は、鋳型の連続した部分に相補的である。プライマー３とプライマー４は、それぞれ鋳型の連続した部分の一部と同一の配列である。
下記表１に示したような組み合わせ（テストＮｏ．１〜１２）で、前記した鋳型（１ピコモル）とプライマー（１６ピコモル）のうちから任意のものを選択して混合し、そこに４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（２００マイクロモル）と反応バッファーとを加えた後、９４℃で３０秒間変成させた。次いで、６０℃で１分間アニーリングを行った。なお、ここで反応液の全量は６０μＬであった。ここでＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ４ユニットを加えた後、６０℃で２時間反応を行った。
【００３９】
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【００４０】
得られた各場合の反応液の一部を２％アガロース電気泳動で分析した。
結果は図７に示される通りであった。なお、図７はエチジウムブロミドで染色した結果である。ここでは、プライマーを２種類加えた場合のみ増幅物と思われる核酸断片のスメアーなバンドが見られた。プライマー１種類のみでは増幅が不十分で検出できないと思われた。
次に、バンドが見られた反応液に限り、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化反応を行って、それを１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した。
【００４１】
結果は図８に示される通りであった。
図８に示めされたように、テストＮｏ．２、Ｎｏ．６、およびＮｏ．１０でのみ目的の長さの断片がみられ（５２塩基）、また、テストＮｏ．４、Ｎｏ．８、およびＮｏ．１２ではそれより鎖長の長いもの、または鎖長の短いバンドが見られた。また、テストＮｏ．２、Ｎｏ．６、およびＮｏ．１０の間で比較すると、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６、Ｎｏ．１０の順に目的のバンドが薄くなり、ステム構造が増幅の効率を高める効果があることが確かめられた。また、目的の増幅物と思われるバンドの塩基配列を確認したところ、鋳型３の配列と一致した。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】鋳型となる鎖がニック様構造である場合の鎖置換伸長反応を模式的示した図である。
【図２】本発明の好ましい第１の態様の核酸断片の増幅方法の概略を示す図である。
【図３】本発明の好ましい第２の態様の核酸断片の増幅方法の概略を示す図である。
【図４】本発明の別の好ましい態様の核酸断片の増幅方法の概略を示す図である。
【図５】本発明の別のより好ましい態様の核酸断片の増幅方法の概略を示す図である。
【図６】本発明の一つの好ましい態様の核酸断片の増幅方法の概略を示す図である。
【図７】実施例における試験の結果を示し、２％アガロース電気泳動を行った結果を示す。なお、ここでＭはサイズマーカー（ｐＵＣ１９のＨａｐＩＩ消化物）を示し、各レーン番号はそれぞれ実施例におけるテスト番号に対応する。
【図８】実施例における試験の結果を示し、１０％ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果を示す。なお、ここでＭはサイズマーカー（１０塩基ラダー：ＧｉｂｃｏＢＲＬ  ＃１０８２１−０１５）を示し、各レーン番号はそれぞれ実施例におけるテスト番号に対応し、また、「→」は１００塩基に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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