(57)【要約】【課題】  微小物質からの蛍光を長時間安定に測定することが可能な微小物質の蛍光測定装置を提供する。【解決手段】  分子レベルの微小物質を含有する試料溶液をディッシュ１６に収容し、励起光を照射するとともに、底面上で分子レベルの蛍光測定を行なう微小物質の蛍光測定装置であって、ディッシュ１６の底面上の微小領域に対して複数回の励起光照射を行なう断続手段２４を有するエバネッセント照明装置１２と、ディッシュ１６に対して上下動可能な対物レンズ１５を有し、ディッシュ１６の内側底面に対物レンズ１５を合焦させることにより、ディッシュ１６の内側底面に固定又は浮遊する微小物質からの蛍光を長時間安定に測定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子レベルの微小物質を含有する試料溶液を所定の容器に収容し、この容器に励起光を照射するとともに、底面上で分子レベルの蛍光測定を行なう微小物質の蛍光測定装置において、
前記容器の底面上の微小領域に対して複数回の励起光照射を行なう光照射機構と、
前記容器に対して上下動可能な対物レンズの駆動機構とを有し、
前記駆動機構が前記容器の内側底面に前記対物レンズを合焦させることにより、前記容器の内側底面に固定又は浮遊する微小物質からの蛍光を長時間安定に測定することを特徴とする微小物質の蛍光測定装置。
【請求項２】
前記光照射機構が前記容器の底面付近に対して２次元走査可能に構成され、ビデオレート速度の測定を行なうことを特徴とする請求項１記載の微小物質の蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント波による蛍光を利用して微小物質の蛍光測定を行う微小物質の蛍光測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば、蛋白質やＡＴＰ（アデノシン３リン酸）などの１分子を観察する目的で、エバネッセント波による蛋白質やＡＴＰの分子ごとの発蛍光を観測する蛍光観察が用いられている。
【０００３】
この場合、これら蛋白質やＡＴＰなどの試料は、その試料粒子を蛍光ビーズに結合させてガラス基板により挟むか、ガラス基板上に固定して２次元（平面的）に分布した状態を実現し、この状態でエバネッセント波を励起し、蛍光が試料から発せられることを利用して、試料粒子の特異性を強調させる蛍光観察を行うようにしている。
【０００４】
ここで、試料粒子が結合される蛍光ビーズは、試料粒子と同等のサイズで、数ｎｍから数１０ｎｍのものが用いられる。また、エバネッセント照明は、レーザ光を例えばプリズム内で全反射させると反射面の反対側に励起される、いわゆるしみだし光を利用したもので、入射光の強さや入射角によってエバネッセントの場の強さを決定しているが、ここでは基板面上から試料粒子の高さに相当する領域にのみ蛍光励起能力を得られるようにしている。
【０００５】
ところで、このような微小物質検鏡に用いられる蛍光観察では、蛍光剤の褪色があり、観察可能な時間には限界がある。この時間は、蛍光剤の量、励起光の強さ、観察に用いる顕微鏡の明るさによって決まるが、特に観察対象である試料粒子のサイズが大きければ、それだけ多くの蛍光剤で染色することができるので、発蛍光も明るく長時間持続できることにもなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、上述したように試料粒子のサイズが極めて小さいものの場合は、試料粒子に対する蛍光剤の量は極めて少なく、褪色によって短時間のうちに観察対象の蛍光が失われてしまう。
【０００７】
このような場合、観察対象を他のものに変更し、場合によっては合焦も取り直して観察を続けるようにしているが、これら観察場所の変更や合焦などの準備をする間にも、励起光の下では、他の観察対象についても蛍光剤の褪色も進んでいるため、安定した蛍光観察が得られないという問題があった。
【０００８】
一方、例えば、筋肉収縮の基本単位の一つであるアクトミオシン系の機構では、ミオシン（蛋白分子）のアクチンフィラメントを動かすエネルギーがＡＴＰの加水分解によるものとして、このＡＴＰの消費量を観測することが行われているが、この観測において、ミオシン分子をcy5 で染色したような場合、１個のミオシン分子を蛍光観察できる時間は、せいぜい６０秒程度とされており、これではＡＴＰ消費量の観測には不十分で、従来よりさらに長く蛍光を発し続ける方法の開発が望まれている。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、微小物質からの蛍光を長時間安定に測定することが可能な微小物質の蛍光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１記載の発明は、分子レベルの微小物質を含有する試料溶液を所定の容器に収容し、この容器に励起光を照射するとともに、底面上で分子レベルの蛍光測定を行なう微小物質の蛍光測定装置において、前記容器の底面上の微小領域に対して複数回の励起光照射を行なう光照射機構と、前記容器に対して上下動可能な対物レンズの駆動機構とを有し、
前記駆動機構が前記容器の内側底面に前記対物レンズを合焦させることにより、前記容器の内側底面に固定又は浮遊する微小物質からの蛍光を長時間安定に測定することを特徴としている。
【００１１】
請求項２記載の発明は、前記光照射機構が前記容器の底面付近に対して２次元走査可能に構成され、ビデオレート速度の測定を行なうことを特徴としている。
【００１２】
この結果、請求項１記載の発明によれば、蛍光寿命の短い１分子程度の観察対象でも、その蛍光を長時間安定に測定することができる。
【００１３】
また、請求項２記載の発明によれば、測定対象に応じて試料の蛍光の高速な変化や移動にも追随することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、蛍光寿命の短い１分子程度の観察対象でも、その発蛍光を長時間安定に測定することができる。また、測定対象に応じて試料の蛍光の高速な変化や移動にも追随することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１６】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の微小物質検鏡装置を正立型顕微鏡に適用した例を示している。
【００１７】
図において、１１は正立型顕微鏡のステージで、このステージ１１には、エバネッセント照明装置１２を設けている。この照明装置１２は、枠体１３を有し、この枠体１３をステージ１１に対しガイド１４により紙面と垂直方向に移動可能にしている。
【００１８】
このエバネッセント照明装置１２の枠体１３は、その上面をステージ１１面と面一にしていて、後述する対物レンズ１５に対向する部分に透穴１３１を形成している。
【００１９】
そして、この透穴１３１上にディシュ１６を載置している。このディシュ１６には、蛋白質やＡＴＰなどの試料粒子が内側底面に固定または浮遊する水溶液１７を収容している。この場合、蛋白質やＡＴＰなどの試料粒子は、１個ごとにcy3 やcy5 などの蛍光剤で標識されている。
【００２０】
このディシュ１６は、ステージ１１のクレンメル３４に保持され、図示左右方向に移動できるようにしている。なお、ディシュ１６の代わりに試料粒子をスライドガラスとカバーガラスで挟むようにしたものを用いてもよい。
【００２１】
照明装置１２の枠体１３内で、透穴１３１に対応する位置にエバネッセント照明用のプリズム１８を保持している。この場合、プリズム１８とディシュ１６との間には、マッチングオイル１９を介在させている。このマッチングオイル１９は、プリズム１８に入射される後述するレーザ光の全反射をプリズム１８の上面またはディシュ１６の外側底面で発生させずに、ディシュ１６の内側底面でのみ発生するようにするためのものである。
【００２２】
また、エバネッセント照明装置１２の枠体１３内には、支持台２０上に半導体レーザ発振器２１を設けている。この半導体レーザ発振器２１は、所定のレーザ光を発振するもので、このレーザ発振器２１より出力されたレーザ光をレンズ２２を通しミラー２３で偏向させてプリズム１８に入射するようにしている。この場合、ディシュ１６がガラス製で、その屈折率Nd=1.42 、水溶液１７の屈折率naq=1.33とすれば、ディシュ１６の底面に対しプリズム１８を介して与えられるレーザ光の入射角度をθ＝２０度以下とすれば、全反射を起こすことが可能となり、これによって、ディシュ１６の内側底面付近にエバネッセント場を生成してエバネッセント照明をするようにしている。
【００２３】
なお、エバネッセント照明装置１２の枠体１３内部のプリズム１８から出たレーザ光が当たる部分には、表面処理層３５を形成していて、レーザ光が乱反射により迷光にならないようにしている。
【００２４】
レンズ２２とミラー２３の間のレーザ光路には、プリズム１８に入射されるレーザ光を断続するための断続手段２４を設けている。この断続手段２４は、図２（ａ）（ｂ）に示すように円周方向に等間隔に複数（図示例では２個）のスリット２４１を形成した導電性の円板ディスク２４２を軸２４４により支持台２４５に回転自在に支持している。この場合、軸２４４は、先端を尖らせたハブ２４３により支持台２４５に支持していて、円板ディスク２４２に摩擦抵抗の少ない滑らかな回転が得られるようになっている。また、円板ディスク２４２には、図２（ｃ）に示すようにディスク２４２面を挟むようにコ字形の電磁石２４６、２４７を配置し、これら電磁石２４６、２４７より円板ディスク２４２面を垂直に透過する磁束により生ずるディスク２４２面の渦電流により円板ディスク２４２に対する回転駆動力を得るようにしている。
【００２５】
そして、このような断続手段２４は、レンズ２２とミラー２３の間のレーザ光路に円板ディスク２４２を配置し、円板ディスク２４２の回転にともなうレーザ光路へのスリット２４１の挿脱動作により、プリズム１８より全反射面に照射されるレーザ光を断続させ、ディシュ１６内側底面でのエバネッセント場励起を断続して発生させるようにしている。つまり、ディシュ１６内側底面でのエバネッセント励起光を断続して発生させることにより、単位時間当たりの励起強度を小さくできるようにしている。ちなみに、スリット２４１により９０％の時間をカットし、１０％の時間のみレーザ光を通過させれば、連続した場合に比べて、励起強度は１／１０になる。
【００２６】
図３は、レーザ発振器２１および断続手段２４の制御回路を示している。この場合、レーザ発振器２１には、コントローラ２５を接続している。このコントローラ２５は、電源２５１とレーザドライバ２５２を有していて、このレーザドライバ２５２によりレーザ発振器２１を起動してレーザ光を発生させるようにしている。また、コントローラ２５の電源２５１には、周波数変調器２６を接続し、この周波数変調器２６に断続手段２４の電磁石２４６、２４７を接続している。
【００２７】
この周波数変調器２６は、操作部２７の操作に応じて出力の周波数を可変できるようにしたもので、この時の出力周波数により円板ディスク２４２面を透過する磁束の時間変化率を可変することで、渦電流による円板ディスク２４２の回転数を可変できるようにして、レーザ光の断続周期を変えられるようにしている。
【００２８】
ここでは、周波数変調により円板ディスク２４２の回転数を変えるようにしたが、電磁石２４６、２４７に供給する電圧（電流）を可変することによって円板ディスク２４２の回転数を変えることも可能である。
【００２９】
図１に戻って、ディシュ１６の水溶液１７に対応して液浸タイプの対物レンズ１５を設けている。この対物レンズ１５は、ディシュ１６の内側底面でのエバネッセント励起光による試料粒子の蛍光の状態を、透過照明用光源３０よりコンデンサレンズ３１を通して与えられる透過照明光により観察像として取り込み、さらに鏡筒３２を通して撮像部３３に送り込み、試料粒子の蛍光反応を観察できるようにしている。
【００３０】
この場合、対物レンズ１５は、図示しないレボルバに各種倍率のものが複数個設けられていて、所望する倍率のものを選択できるようになっている。また、対物レンズ１５は、上下方向に駆動可能にして焦点を可変し、ディシュ１６の内側底面に合焦できるようにしている。なお、合焦を得には、ステージ１１を上下方向に駆動してもよい。
【００３１】
しかして、このようにすれば、レーザ発振器２１とプリズム１８との間にスリット２４１を形成した円板ディスク２４２を設け、この円板ディスク２４２を回転することにより、プリズム１８内の全反射面に照射されるレーザ光を断続させ、ディシュ１６内側底面でのエバネッセント励起光を断続して発生させるようにしたので、励起光の単位時間当たりの強度を小さくできるようになり、これにより、発光時間の短い１分子程度の観察対象でも、その発蛍光を長時間持続することが可能になって、長時間に渡っての試料観察を実現できる。
【００３２】
また、エバネッセント照明装置１２の枠体１３は、ステージ１１に対しガイド１４により紙面と垂直方向に移動可能になっており、さらにステージ１１のクレンメル３４にディシュ１６が保持され、図示左右方向に移動できるようになっているので、枠体１３の移動によりレーザ光のプリズム１８内での全反射位置を、対物レンズ１５の光軸を含む紙面と垂直な面に沿って存在させるようにすれば、その後は、クレンメル３４によるディシュ１６の左右の移動だけで試料を対物レンズ１５の光軸上に移動できるようになり、試料の観察位置である対物レンズ１５の光軸上への位置出しを簡単にできる。
【００３３】
なお、上述では、スリット２４１を有する円板ディスク２４２を回転させるようにしたが、スリット２４１をレーザ光の光路上に固定し、ミラー２３の反射面を照射角度が変わるように動かすようにしてもよい（揺動運動）。この場合、ミラー２３の揺動運動は、揺動運動機構を用いて自動的に行うようになる。また、ミラー２３の代わりに複数のミラーを外周面に配置したポリゴンミラーを用い、各ミラー面が図示のミラー２３と等価になるようにポリゴンミラーの回転軸を紙面に垂直にして回転させても同様な効果が得られる。さらに、スリット２４１を有する円板ディスク２４２の回転に代わるものとしては、液晶シャッタも考えられる。液晶シャッタでは、レーザ光を通過する時間と遮断する時間の比を変化できるので、単位時間の蛍光強度を制御して蛍光持続時間を可変できる。
【００３４】
（第２の実施の形態）
図４は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３５】
この場合、レンズ２２とミラー２３の間のレーザ光路に、ＡＯＤ（Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ）４１上に圧電体４２を接着してなる走査手段４０を設け、圧電体４２を振動させて超音波を発生させ、ＡＯＤ４１の超音波の場の中でスポット状レーザ光の光路を曲げるようにすることで、プリズム１８に入射されるレーザ光を走査するようにしている。
【００３６】
この場合、圧電体４２による超音波の強さを制御可能とすれば、レーザ光の走査幅を変えることができるので、プリズム１８に入射されるレーザ光の断続周期を変えることができる。また、ＡＯＤ４１上の圧電体４２に対し直角方向に他の圧電体を接着させ、この他の圧電体からも超音波を発生させてレーザ光を走査させ、圧電体４２との走査を組み合わせて行うようにすれば、２次元のラスター走査を行うこともできる。
【００３７】
このようにしても、プリズム１８へのレーザ光を断続させ、ディシュ１６内側底面でのエバネッセント励起光を断続して発生させるようにできるので、エバネッセント光の単位時間当たりの励起を短くして蛍光の褪色を少なくすることができる。また、ＡＯＤ４１を使用することでレーザ光の走査を、２次元走査で１００回／秒程度の速さで行うことが可能になるので、試料の蛍光の高速な変化や高速の移動にも追随することができる。
【００３８】
従って、このようにしても第１の実施の形態と同様な効果を期待でき、例えばビデオレート速度の画像形成でも長時間に渡って観察を行うことができる。また、ＡＯＤ４０自身の振動が少ないので、このようなＡＯＤ４０を用いた断続手段４０が試料の近くに配置されても、試料への振動の影響を少なくすことができる。
【００３９】
以上、実施の形態について述べたが、本発明中には以下の発明も含まれる。
【００４０】
（１）エバネッセント波の励起光をスリットを通して断続させるようにしている。
【００４１】
このようにすれば、蛍光寿命の短い１分子程度の観察対象でも、その発蛍光を長時間持続することができる。
【００４２】
（２）（１）において、スリットは、円板ディスクに設けられ、該円板ディスクを回転することで励起光を断続するようにしている。
【００４３】
このようにすれば、安価な構成にして励起光を断続できる。
【００４４】
（３）エバネッセント波の励起光をミラーの反射角度を変えることで断続させるようにしている。
【００４５】
このようにすれば、安価な構成にして励起光を断続できる。
【００４６】
（４）（３）において、ミラーの反射角度の変更は、揺動運動機構を用いて自動的に行うようにしている。
【００４７】
このようにすれば、安価な構成にして励起光を断続できる。
【００４８】
（５）（３）において、ミラーはポリゴンミラーで、該ポリゴンミラーを回転駆動するようにしている。
【００４９】
このようにすれば、ミラーの回転機構を簡単にできる。
【００５０】
（６）エバネッセント波の励起光をスポット光の偏向断続により断続させるようにしている。
【００５１】
このようにすれば、蛍光寿命の短い１分子程度の観察対象でも、その発蛍光を長時間持続することができる。
【００５２】
（７）（６）において、スポット光の偏向走査にＡＯＤを用いるようにしている。このようにすれば、試料への振動の影響を少なくできる。
【００５３】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００５４】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の第１の実施の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態に用いられる断続手段の概略構成を示す図。
【図３】第１の実施の形態に用いられる制御部の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
【００５６】
１１…ステージ、１２…エバネッセント照明装置、
１３…枠体、１３１…透穴、
１４…ガイド、１５…対物レンズ、
１６…ディシュ、１７…水溶液、
１８…プリズム、１９…マッチングオイル、
２０…支持台、２１…半導体レーザ発振器、
２２…レンズ、２３…ミラー、
２４…断続手段、２４１…スリット、
２４２…円板ディスク、２４３…ハブ、
２４４…軸、２４５…支持台、
２４６、２４７…電磁石、２５…コントローラ、
２５１…電源、２５２…レーザドライバ、
２６…周波数変調器、２７…操作部、
３０…透過照明用光源、３１…コンデンサレンズ、
３２…鏡筒、３３…撮像部、３４…クレンメル、
３５…表面処理層、４０…走査手段、
４１…ＡＯＤ、４２…圧電体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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