(57)【要約】【課題】検体のＤＮＡがターゲットのＤＮＡであるかどうかを、ＤＮＡ複合体を用いて簡単に検出する方法を提供すること。【解決手段】（１）２本鎖ＤＮＡを１本鎖鋳型ＤＮＡ２本に乖離する熱変成工程、２本に乖離された１本鎖鋳型ＤＮＡと特異的な相補鎖を形成するオリゴＤＮＡとで２本鎖を形成するアニール工程、２本鎖を形成したプライマーの３′末端から鋳型の１本鎖ＤＮＡに沿ってＤＮＡ相補鎖を合成するＤＮＡの伸長の工程、これらを繰り返すＤＮＡの複製方法において、一方のプライマーが５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているプライマーであるＤＮＡ複合体の複製方法。（２）上記（１）で得られた複合体を複数個凝集した凝集体。（３）上記（２）の凝集体を用いた遺伝子診断方法。（４）５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているオリゴＤＮＡの３′末端を鋳型のＤＮＡを用いて伸長させたＤＮＡ複合体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖のＤＮＡを１本鎖の鋳型ＤＮＡ２本に乖離する熱変成工程、該２本に乖離された１本鎖の鋳型ＤＮＡと、それぞれ特異的な相補鎖を形成する配列を有するオリゴＤＮＡ（以下、プライマーと称する。）とで２本鎖を形成するアニール工程、２本鎖を形成した各々のプライマーの３′末端から鋳型の１本鎖ＤＮＡに沿ってＤＮＡ相補鎖を合成するＤＮＡの伸長の工程、これらを繰り返すことによりＤＮＡを複製するＤＮＡの複製方法において、前記の一方のプライマーが５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているプライマーであることを特徴とするＤＮＡ複合体の複製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の複製方法により得られた組成物中に、金属陽イオンを含有する水溶液を添加し、ポリマーの下限臨界共溶温度以上に加熱することにより該複合体を複数個凝集して形成されたことを特徴とする凝集体。
【請求項３】
請求項２に記載の凝集体の水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することにより検出するこを特徴とする遺伝子診断方法。
【請求項４】
５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているオリゴＤＮＡの３′末端を、鋳型のＤＮＡを用いて伸長させることにより得られるＤＮＡ複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡのポリマラーゼ連鎖反応を利用して増幅することにより、目的のＤＮＡ配列が存在するかどうかを、簡易な方法で検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を増幅する技術としてポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲ法と略す。）が一般的に行われている。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉらが開発した方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４（１９８５））で、ある特定のヌクレオチド配列領域（試料中のＤＮＡなど）を検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴＤＮＡを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料ＤＮＡに対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖ＤＮＡを再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた領域を検出できるまでに増幅させる方法である。
プライマーを適切に設計した反応系では、ＤＮＡが増幅できたかできなかったかを評価することにより、検体中にごく少量の、例えば、１個のウィルス、細菌、細胞が存在するかどうかでも検出できるようになってきた。しかしながら、ＤＮＡは水溶性が高く、増幅しても水溶液が透明であり目視で確認することができないという問題があった。
増幅産物を確認する方法としては、増幅産物をそのまま、直接、ポリアクリルアミドで電気泳動し、その泳動度の差から変異を検出するＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法がある。
この方法では変異による増幅産物の立体構造の変化を電気泳動度の差として検出するものである。又、ショットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング法などシークエンス技術や、ＤＮＡを制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に意図的にＰＣＲプライマーの３′末端を配置し、ＰＣＲが行われるか否かで判別するＰＣＲ−ＡＳＰ（ＰＣＲ−Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ）法や、変異部分をＰＣＲで増幅し、これが制限酵素で切断可能か否かで判別するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、変異部分をさらに蛍光標識プローブで検出するタックマンプローブ法などがある。しかしながらいずれも、高度な技術を習熟した者が高価な機器を用い、相当の時間的、金銭的な負担をかけてしかなし得ないものであり、このような開発しかなされていないのが現状である。
【０００３】
一方、前田等の特許出願（特開２００１−２５２０９８号公報）には、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体（ＤＮＡ複合体）と金属陽イオンを含有する水溶液に、遺伝子ＤＮＡを添加し、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することを特徴とする遺伝子診断方法が提案されている。このＤＮＡ複合体物質は、側鎖のＤＮＡと同じ長さで完全に相補鎖を形成するＤＮＡが存在したときにはじめて凝集を生じ、系が濁ることでＳＮＰＳのようにたった１つのＤＮＡの変異でもそれを検出できる優れた方法である。
しかしながら、この検出法を各種の遺伝子検査に用いるためには、検体のＤＮＡもしくはその増幅物を、ＤＮＡ複合体に合わせ、高価な制限酵素を用い、時間をかけて長さを調整し、さらにその一方のみを取り出し凝集を形成させなければならず、簡単に利用することは困難であった。
【特許文献１】特開２００１−２５２０９８号公報
【非特許文献１】特許庁標準技術集「核酸の増幅及び検出」（URL http://www.jpo.go.jp/shiryou/index.htm）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は以上の事情を鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ＤＮＡの簡単な検査方法を提供することにあり、さらに詳しくは、検体のＤＮＡがターゲットのＤＮＡであるかどうかを、ＤＮＡ複合体を用いて簡単に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記目的は
（１）２本鎖のＤＮＡを１本鎖の鋳型ＤＮＡ２本に乖離する熱変成工程、該２本に乖離された１本鎖の鋳型ＤＮＡと、それぞれ特異的な相補鎖を形成する配列を有するオリゴＤＮＡ（以下、プライマーと称する。）とで２本鎖を形成するアニール工程、２本鎖を形成した各々のプライマーの３′末端から鋳型の１本鎖ＤＮＡに沿ってＤＮＡ相補鎖を合成するＤＮＡの伸長の工程、これらを繰り返すことによりＤＮＡを複製するＤＮＡの複製方法において、前記の一方のプライマーが５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているプライマーであることを特徴とするＤＮＡ複合体の複製方法。
（２）上記（１）に記載の複製方法により得られた組成物中に、金属陽イオンを含有する水溶液を添加し、ポリマーの下限臨界共溶温度以上に加熱することにより該複合体を複数個凝集して形成されたことを特徴とする凝集体。
（３）上記（２）に記載の凝集体の水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することにより検出するこを特徴とする遺伝子診断方法。
（４）５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているオリゴＤＮＡの３′末端を、鋳型のＤＮＡを用いて伸長させることにより得られるＤＮＡ複合体。
により達成された。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、検体のＤＮＡがターゲットのＤＮＡであるかどうかを簡単に検出することができる。
【０００７】
以下、本発明について具体的に説明する。
まず、本発明の原理について説明する。５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されたオリゴＤＮＡは、下限臨界共溶温度を有するポリマーの転移温度以下では、すべての成分が鎖状に伸びた状態となり、鋳型のＤＮＡにハイブリダイゼーションしやすい構造となる。下限臨界共溶温度を有するポリマーがポリＮイソプロピルアミドの場合、この温度は３２℃であるので、例えば、２５℃あたりで、鋳型にアニールさせる。アニールが終わったときには、ポリメラーゼ酵素を用いて、オリゴＤＮＡを鋳型に沿って増幅する。一般的に用いられるポリマラーゼ酵素は、５５℃以上の温度でＤＮＡを増幅するため、５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーの転移温度以上となり、この部分は疎水化し、オリゴＤＮＡを親水性部位としたミセル構造となる。これがミセル構造をとるかどうかは、合成したＤＮＡ複合体の構造で決まる。つまり、重要なのは、ＤＮＡの長さと、複合体中のＤＮＡの含有量である。
ＰＣＲ法では、低温でアニールした場合にミスマッチが起きるためか異常な増幅が起きる場合があるが、このようなミセル構造をとるとミスマッチ部分は外れ、正常な増幅のみが進行しもう一方のプライマーがアニールした部分まで伸長する。これを熱変性すると、５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されたＤＮＡと、これとまったく完全に相補鎖を形成するＤＮＡが合成される。
従って、このＰＣＲが成功しているかどうかは、下限臨界共溶温度以上の温度とし、塩濃度を高めることによりＤＮＡ複合体が凝集するかどうかで検出することができるようになる。
【０００８】
次に、本発明の構成要素について順次説明する。
本発明において、一方のプライマーの５′末端には、下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結される。
ここで下限臨界共溶温度とは、水に対する溶解度が低温では高く、高温になるに従って低下する物質において、溶解度が１ｇ／Ｌとなる温度をいい、下限臨界共溶温度を有するポリマーとは、このような下限臨界共溶温度を示すポリマーをいう。
下限臨界共溶温度を有するポリマーとしては、ポリアクリルアミドやメタクリルアミドの誘導体が挙げられる。
ポリアクリルアミドやメタクリルアミドの誘導体の下限臨界共溶温度は、例えば、
ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）：７２℃
ポリ（Ｎ−エチル、Ｎ−メチルアクリルアミド）：５６℃
ポリ（Ｎ−ピロリジニルアクリルアミド）：５６℃
ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド）：４６℃
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）：３２℃
ポリ（Ｎ−ジエチルアクリルアミド）：２９℃
ポリ（Ｎ−メチル、Ｎ−イソロプロピルアクリルアミド）：２２℃
ポリ（Ｎ−プロピルアクリルアミド）：２１℃
ポリ（Ｎ−メチル、Ｎ−イソロプロピルアクリルアミド）：２０℃
ポリ（Ｎ−ピペリジニルアクリルアミド）：５℃
ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）：５９℃
ポリ（Ｎ−エチルメタリルアミド）：５０℃
ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）：４４℃
ポリ（Ｎ−プロピルアクリルアミド）：１３℃
であるが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（以下、ＰＮＩＰＡＡｍと称することがある。）が、その温度応答挙動もよく知られており（Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．Ｇ．，Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１７，１６３−２４９，（１９９２）、一本鎖ＤＮＡと複合体を形成した際には、応答温度範囲が比較的低く、扱いやすい上、入手しやすい（（株）興人より入手）ため、本発明においては、ＰＮＩＰＡＡｍを下限臨界共溶温度を有するポリマーとして用いるのが好ましい。
【０００９】
上記のポリマーにおいて、下限臨界共溶温度が失われない限りにおいて、他のモノマーを共重合してもかまわない。
プライマーの５′末端に連結する下限臨界共溶温度を有するポリマーとしてＰＮＩＰＡＡｍを用いた場合、ＤＮＡ複合体は、一本鎖ＤＮＡ−ＰＮＩＰＡＡｍとなる。このような一本鎖ＤＮＡ−ＰＮＩＰＡＡｍの製造方法としては、種々の方法が適用されるが、好ましくは、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとメタクリロイルオキシスクシンイミド（ＭＯＳｕ）をカップリングさせ、末端ビニル化一本鎖ＤＮＡとした後、これをＮ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＮＩＰＡＡｍ）モノマーとラジカル共重合させて得る方法が挙げられる。このとき、カップリング反応や共重合の触媒はどのようなものであってもよく、反応条件もとくに限定されない。例えば、末端アミノ化一本鎖ＤＮＡとＭＯＳｕを、Ｎａ2ＣＯ3−Ｎａ2ＨＣＯ3下で、ｐＨを調整した反応系でカップリングし、生成物とＮＩＰＡＡｍを緩衝剤であるＴｒｉｓ−ＨＣｌ下でｐＨを調整し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを開始剤としてラジカル重合させてもよい。もちろん、これら以外の触媒や、助触媒、添加剤を用いてもよい。
なお、末端アミノ化１本鎖ＤＮＡは、特開昭５９−２７９００号公報、特開昭５９−９３０９８号公報、特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−９３１００号公報にその具体的な合成方法が記載されている。また、末端ビニル化ＯＤＮとする方法及びそれとＮＩＰＡＡｍとの共重合方法は、前田等の論文（ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．２，２６１−２６８及びｐｏｌｙｍｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１０，８３０−８３３）に詳しく記載されている。
【００１０】
次に、本発明で用いられるプライマーについて説明する。
本発明では、熱変性後の（＋）側のＤＮＡと（−）側のＤＮＡに用いるプライマーのいずれか一方がＤＮＡ複合体であればよく、その他のプライマーは、ＯＤＮ（末端にポリマーがついたオリゴＤＮＡ）でもかまわない。
本明細書においてデオキシリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことをいい、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば、鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本発明において使用されるプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドアナログから選択されるものである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。
本発明において使用されるプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、ＤＮＡ鎖の伸長に寄与することができる。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明において使用されるプライマーは当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドは、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）リボヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。
【００１１】
本発明において使用されるプライマーは、鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。これらの任意の核酸配列を持つプライマーは、例えば、アプライド  バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００１２】
次に、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼについて説明する。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定はなく、例えば、バチルス  カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｒｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ  フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであってもよい。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであってもよく、このような酵素の例として、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。
また、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えば、Ｍｎ2+の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明を実施することができる。すなわち、Ｍｎ2+を含有する緩衝液中で上記のＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼがＲＮａｓｅＨ活性を示すことができる。なお、上記の態様はＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、サーマス  サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。
【００１３】
次に、本発明の標的核酸の増幅方法について説明する。
本発明のＤＮＡ複合体の複製方法は、プライマー及びＤＮＡ複合体、ＤＮＡポリメラーゼを組合わせて実施することができる。当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド３リン酸としてＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。また、ｄＵＴＰを基質として用いてもよい。さらに、当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）のアナログ、例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を含んでいてもよい。また、ｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有する誘導体、例えば、アミノ基を有するｄＵＴＰを含んでいてもよい。当該プライマーは、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。
本発明のＤＮＡ複合体の複製方法に用いるプライマーとＤＮＡ複合体の使用量は、標的核酸の塩基配列、目的の増幅断片長及び使用する反応系組成により調整すればよく、例えば、増幅産物量を目安に調整することができるが特に限定はされない。本発明のＤＮＡ複合体の複製方法においては、使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。添加する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素であってもよい。すなわち、反応途中で添加することにより、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性質には何らの限定はない。
【００１４】
本発明のＤＮＡ複合体の複製方法において、鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であってもよい。該調製物としては、例えば、細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
【００１５】
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であってもよい。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点からは、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴＤＮＡの合成の観点からは、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えば、サーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。これらは特に限定されるものではないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。
【００１６】
上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。また、別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡをあらかじめ複製した後、本発明の方法の鋳型となる核酸として用いてもよい。該複製の方法としては、特に限定はされないが、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複製されるものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、宿主は、使用されるベクターを保持することができるものであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸菌等が例示される。さらに、上記複製の方法の別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼで該塩基配列を有するＲＮＡを転写した後、該ＲＮＡをそのまま、あるいは逆転写反応によりｃＤＮＡとして本発明の方法の鋳型に用いてもよい。
上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよいし、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を、上記のように配置されたＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、ＲＮＡの形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用いられるＲＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼあるいはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。
【００１７】
上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明において鋳型ＤＮＡとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）を施したものが好適に使用できる。
また、鋳型がＰＣＲ増幅産物のような直鎖状２本鎖ＤＮＡにおいては、本発明に用いるプライマーがアニーリングする位置を、該ＤＮＡの末端から約５０塩基程度内側に設定することにより、前述のデネーチャーの工程を行わなくても本発明の核酸の増幅方法を行うことができる場合がある。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸の増幅を目的とする場合には、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって得られたＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸を、ＲＮａｓｅＨを含有する本発明の増幅用反応液に加えることにより、ＲＮＡ鎖を分解して一本鎖ｃＤＮＡとし増幅反応を開始することができる。さらに、本発明のＤＮＡ複合体の複製方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生成したｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡ増幅反応とを１種類のＤＮＡポリメラーゼで行なうことができる。
上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列の十分な結合を提供するようなものがよい。本発明の方法では、特に限定するものではないが、鋳型ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合にはそれらを変性して一本鎖にすることにより鋳型ＤＮＡ鎖へのプライマーの結合を可能にさせることができる。二本鎖ＤＮＡが変性する温度、例えば、約９５℃で保持することは好ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、オリゴＤＮＡプライマーを標的物に結合させるためには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要がある。上記のような二本鎖を一本鎖ＤＮＡに変性する工程、もしくは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後、温度を変化させて核酸を増幅させる。この温度変化は、例えば、25℃でアニールを行い、55℃でＤＮＡを増幅し、９５℃で熱変性を行うこれを繰り返すことにより、連続的に核酸が増幅される。
【００１８】
本発明の核酸増幅反応は、例えば、クレノウ断片のような常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより常温（例えば、３７℃）でも実施できるが、耐熱性を有する酵素（エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して高温、例えば、５０℃以上で、さらに、例えば、６０℃以上で実施することができる。
さらに該方法においては、逆転写反応および核酸の増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡを増幅することができる。
本発明では、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法が提供される。当該鋳型交換反応においては、鋳型となる二本鎖核酸と、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的なプライマー及びＤＮＡ複合体のＯＤＮ部分がプライマー伸長鎖の合成の途中において、プライマー伸長鎖のそれぞれの鋳型から他方のプライマー伸長鎖への鋳型の交換が起こる。
ここで、鋳型交換反応とは、２本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際に、ＤＮＡポリメラーゼがその鋳型を交換し、他方のＤＮＡポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鋳型として、以降の相補鎖合成を行うことをいう。いい換えれば、鋳型となる２本鎖核酸をそれぞれのプライマー及び鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼで処理し、該鋳型に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応において、該伸長鎖を合成中に、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマー伸長鎖が当初の鋳型から、他方のプライマー伸長鎖へと能動的にスイッチングせしめる反応をいう。
本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、例えば、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＢｃａ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２０）より日本特許第２９７８００１号に記載の方法によって調製することもできる。
【００１９】
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、プライマー部分の３′末端から下流への伸長鎖合成に伴い、先に伸長されたＤＮＡ鎖の置換を行う必要がある。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノウ断片、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ由来の同様の断片（ニューイングランドバイオラブス社製）、Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．０およびシークエネース２．０（米国バイオケミカル社）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第９７巻、１３〜１９頁（１９９１）記載のＴ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９  ＤＮＡポリメラーゼも使用することができる。通常は５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであっても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、本発明のＤＮＡ複合体の複製方法に使用できる。
本発明では自動でサーマルサイクラーのような反応装置を使って増幅してもよいし、アニール工程、増幅工程、変性工程それぞれの温度に調整したヒートブロック中に順番に入れることで増幅を行ってもかまわない。本発明において、増幅は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜約７０℃である。鋳型となる核酸のＧＣ含量に応じて反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができる。例えば、鋳型となる核酸としてＧＣ含量の低いものを使用する場合には、伸長する鎖長やプライマーのＴｍ値にもよるが、５０〜５５℃で本発明の増幅反応を行うことができる。また、本発明において、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来の核酸の増幅を１種類の酵素のみで簡便に実施することができる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方法に鋳型ＤＮＡとして使用することもできる。
【００２０】
本発明のＤＮＡ複合体の複製方法は、核酸の増幅を利用した種々の実験操作、例えば、核酸の検出、標識、塩基配列の決定に使用することができる。
また、本発明のＤＮＡ複合体の複製方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ核酸増幅方法、ＤＮＡチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増幅方法として使用することができる。
上記方法は，試料中に存在する特定の遺伝子の検出に利用することができる。すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。前述の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。さらに、例えば、ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはその他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとすることにより、該遺伝子の存在の有無によって上記の微生物の存在を検出、定量等に利用することができる。特に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用である。さらに、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状態を調べるために本発明の方法を使用することもできる。特に疾病関連遺伝子、例えば、細胞の癌化に関連する遺伝子等の検出、発現状態の確認は医療分野において有用である。上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、ＲＮＡあるいはＤＮＡのいずれもが好適に使用できる。
【００２１】
さらに、本発明のＤＮＡ複合体の複製方法によれば、標的核酸の検出方法により、標的核酸上の塩基配列の違いを判別することができる。この態様においては、プライマーの中間部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するように、例えば、該塩基とプライマーの中間部分の塩基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。このようなプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの中間部分の塩基配列と鋳型の塩基配列との間にミスマッチが存在する場合には標的核酸からの増幅が起こらず、増幅産物の生成が見られない。当該方法により、点突然変異、一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ、ＳＮＰ）のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
本発明を用いた標的核酸を検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば，２００ｂｐ以下、さらに好ましくは１５０ｂｐ以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴＤＮＡプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、この検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされない。
【００２２】
本発明の遺伝子診断方法に用いるＤＮＡ複合体物質においては、安定なミセル構造を形成できれば、１本鎖ＤＮＡの含有率は限定されない。あまり低い含有率では、相補的遺伝子の添加による光分散強度の変化が確認されにくいばかりでなく、ミセルが形成されないことも考えられるので好ましくない。また、１本鎖ＤＮＡ含有率が高すぎる場合には、ＤＮＡ複合体がミセルとなりにくく、ミセルが形成されても不安定となる場合が多いため好ましくない。したがって、０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下程度が好ましい。この範囲では添加された遺伝子と容易に二重らせんを形成できる安定なミセルが得られる。しかし、１本鎖ＤＮＡの含有率は、１本鎖ＤＮＡの鎖長や疎水性物質の構造に応じて変更することが望ましいため、上記の範囲に限定されない。
本発明の遺伝子診断方法では、増幅が終わった１本鎖ＤＮＡ複合体物質の水溶液中には、マグネシウムやナトリウムなどの金属陽イオンを共存させる。
イオン性界面活性剤のミセル形成や高分子ミセルでは、溶液中の対イオン濃度の増大に伴って、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の低下と会合数の増大が起こることが知られている。つまり、対イオンが増大すると、少量の界面活性剤でもミセルを形成できるようになったり、ミセルの粒子径が増大したりするのである。本発明の遺伝子診断方法において用いられる１本鎖ＤＮＡ複合体物質でも、１本鎖ＤＮＡ複合体物質の濃度が小さくてもミセルが形成されるようになる、ミセルの粒子径が大きくなり、光散乱の測定が容易になる等という理由からも金属陽イオンの共存が好ましい。しかし、そればかりでなく、発明者らの研究によれば、本発明の遺伝子診断方法では、金属陽イオンが共存しない場合、相補的遺伝子が添加されても、溶液の透明度に変化（つまり白濁）が見られないため、金属陽イオンの添加は必要となる。使用する金属陽イオンはとくに限定されないが、好ましくはマグネシウムイオン、またはナトリウムイオンである。マグネシウムイオンとしては、ＭｇＣｌ2等が考慮され、その濃度は、２０〜１００ｍＭとすることが好ましく、より好ましくは、３０〜５０ｍＭである。また、ナトリウムイオンとしては、ＮａＣｌ等が適用でき、その濃度は０．１〜２Ｍ、より好ましくは、０．５〜１．５Ｍとする。これらの金属陽イオンが１本鎖ＤＮＡの水溶液中に共存することにより、相補的遺伝子を添加した際に、ミセル表面のＤＮＡ鎖と二重らせんが形成され、ミセルどうしの凝集が円滑に生じるのである。
【００２３】
また、一般に、同じ物質濃度の溶液におけるミセル形成は、温度に左右されることが知られている。つまり、相転移温度より低い温度と、それ以上では、ミセルの挙動が異なるのである。本発明の遺伝子診断方法で使用されるＤＮＡ複合体物質でも同様のことが考慮されるが、この温度は、水溶液中の１本鎖ＤＮＡの濃度、対イオンの濃度等と関連するため、各系の相転移温度に応じて選択されるものである。例えば、前述のＤＮＡ含有率（０．１〜０．５ｍｏｌ％）の範囲において、Ｍｇ2+イオンを３０ｍＭ添加した、ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）の系では、水溶液の温度を相転移温度以上の３０℃以上とすることが好ましい。より好ましくは、３０〜４０℃である。  １本鎖ＤＮＡと相補鎖の二重らせん形成や光散乱強度の測定を妨げない範囲で、水溶液中に、１本鎖ＤＮＡ複合体と金属陽イオン以外の物質を添加してもよい。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 
【実施例】
【００２４】
ＤＮＡ（φＸ１７４  ＲＦ  Ｉ  ＤＮＡ：プラスイミド遺伝子（和光純薬））の配列を、ｇｅｎｅｂａｎｋにより調べ、ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして、“ＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡ”、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして“ＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴ”を用い、３４５６〜３４９１間の３６ｂｐをＰＣＲすることとした。
（５′末端をビニル化したｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒの合成方法）
５′末端をアミノ化したｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １μｍｏｌ（約３．２ｍｇ）に、炭酸ソーダと重炭酸ソーダをそれぞれ１００ｍｍｏｌ／Ｌが溶解した純水を加え、５００μＬに仕上げた。
この中に、アクリロイロキシサクシンイミド８．４６ｍｇを、１５０μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、先ほどの５′末端をアミノ化したｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ水溶液中に加えよく攪拌した後、室温で２４時間反応をつづけた。反応終了後、反応溶液をエタノール１０ｍＬ中にあけ、よく攪拌した後、遠心分離により、沈殿を回収した。これをエタノールで３回洗浄した後、３０℃の乾燥ボックスで４８時間乾燥した。得られた粉体を、逆相ＨＰＬＣで確認したところ、５′末端をアミノ化したｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、アクリロイロキシサクシンイミドおよびその分解物のピークが見当たらず、５′末端をビニル化したｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒが得られたことがわかった。
【００２５】
（ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒの５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーの連結）
１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液（和光純薬製）１ｍＬを純水で１０倍に希釈し１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液（以下緩衝液）を調整した。
過硫酸アンモニウム７４．１ｍｇを秤量し、２５ｍＬのメスフラスコに入れ先ほどの緩衝液で２５ｍＬに仕上げた。（以下、開始剤溶液と称す。）
Ｎ，Ｎ，Ｎ．Ｎテトラメチルエチレンジアミンを６．２３５ｇを秤量し、２５ｍＬのメスフラスコに入れ先ほどの緩衝液で２５ｍＬに仕上げた。（以下、添加剤溶液と称す。）
緩衝液８６０μＬ中に先ほど作製した５′末端をビニル化したｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒを１．７５ｍｇ（０．５μｍｏｌ）、ＮＩＰＡＮ（イソプロピルアクリルアミド：興人社製をヘキサンで再結晶したもの）を１５．８２ｍｇ（１４０μｍｏｌ）を溶解した。この中に１００μＬの開始剤溶液と４０ｍＬの添化剤溶液を加え内部に窒素をバブリングしたのち、２５℃で２時間反応した。
得られた反応液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６、ＭＷＣＯ＝１０００）で透析した後、ゲルろ過をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１００のカラムを用いて行い未反応物を除去し、ｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒの５′末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーを連結した。
得られたポリマーの収量は１２．３ｍｇであった。このポリマーの２６０ｎｍの吸収から、全ポリマーユニット中のｆｏｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒのユニットは、０．３５ｍｏｌ％であることが解かった。
【００２６】
次いで、以下の溶液を調整した。調整は、氷水で容器を冷やしながら低温で行った。
得られたポリマー１２．３ｍｇを滅菌蒸留水３．５ｍＬに溶解した。（溶液Ａ）
一方、ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして、ＡＴＴＣＴＧＧＣＧＴなるオリゴＤＮＡを、０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように滅菌蒸留水に溶解した。（溶液Ｂ）
φＸ１７４   ＲＦ  Ｉ  ＤＮＡ  １５μｇを、滅菌蒸留水７５０μＬに溶解した。（溶液Ｃ）
また，タカラ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのセットを準備した。
ＰＣＲチューブ内に、以下の順番で試薬を混合した。試薬は必要量混合後軽きピペッティングにより混合した。
滅菌蒸留水                                            ：  ２９．５μＬ
溶液Ｃ                                                ：  ５０．０μＬ
１０ＸＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ：    ０．５μＬ
１０ＸＰｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ２                ：  １０．０μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ                              ：    ８．０μＬ
溶液Ａ                                                ：    １．０μＬ
溶液Ｂ                                                ：    １．０μＬ
【００２７】
試薬を混合している間に、２５℃の温水バス、６８℃の温水バス、９８℃のオイルバスを用意し試薬が混合された容器を
ア．９８℃のオイルバスに１分間浸漬
イ．２５℃の温水バスに１分間浸漬
ウ．６８℃の温水バスに３０秒間浸漬
エ．９８℃のオイルバスに２秒間浸漬
を行い、更に、イ、ウ、エの浸漬を３０回繰り返した。
得られた反応液に、Ｍｇ2+が６０ｍｍｏｌ／Ｌの純水を１００μＬ混合し、容器を４０℃に加熱したところ、白濁し凝集が発生した。
一方、溶液Ａの代わりにＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡなるオリゴＤＮＡを、０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように滅菌蒸留水に溶解したものを添加して、同じ操作を行ったが、凝集が発生しなかった。
凝集が発生したものとしなかったものを、３０ｍｅｒと４０ｍｅｒのマーカーとともに電気泳動したところ、いずれもマーカーの間に帯が出たことから、両方ともにＰＣＲは成功していることが解かった。