(57)【要約】【課題】骨欠損部に対して高い治癒能力を示す骨移植材料を提供する。【解決手段】骨形成性細胞を備えた細胞致死化処理骨からなる、骨形性能を有する骨移植材料。【選択図】図１ 
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成性細胞を備えた細胞致死化処理骨からなる、骨形性能を有する骨移植材料。
【請求項２】
前記骨形成性細胞が、新鮮骨髄細胞、その新鮮骨髄細胞の培養細胞、骨芽細胞及び前駆骨芽細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の材料。
【請求項３】
細胞致死化処理骨が、放射線処理された骨である請求項１又は２に記載の材料。
【請求項４】
細胞致死化処理骨が熱処理された骨である請求項１又は２に記載の材料。
【請求項５】
細胞致死化処理された骨が自家骨あるいは同種骨である、請求項１〜４のいずれかに記載の材料。
【請求項６】
細胞致死化処理骨が同種骨であり、骨形成性細胞の播種後さらに数日から数週培養を行って得られる請求項１〜５のいずれかに記載の骨移植材料。
【請求項７】
細胞致死化処理された骨に骨形成性細胞を播種し、必要に応じてさらに培養することを特徴とする骨移植材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨移植材料及びその製造方法に関する。本発明は、特に自家骨を骨移植材料として好ましく使用できる。本発明の骨移植材料は骨形性能を有する。
【背景技術】
【０００２】
従来骨移植材料としては腸骨などから採取した自家骨が使用されている。しかし、健常部を傷つけることとなり、採取部の疼痛を生じ、その欠点は明白である。また、骨腫瘍摘出時等に生じる大きな骨欠損には、自家骨では量が足りず用いる事ができない。
【０００３】
以上の自家骨採取を避けるために、他人の骨（同種骨）を使用することがあるが、自家でないため、通常移植免疫反応がおこり、移植部では生着しない。さらに、この他人の骨の移植により既知や未知の感染が生じる可能性がある。
【０００４】
これらの自家骨や同種骨の欠点を補うべく、骨欠損に対して各種セラミックや合金などが骨移植材料として使用されている。しかし人工材料による骨補填は骨形成能を有さず、治癒能力が十分ではない。さらに、これら人工材料は採形が困難であり、欠損部にうまく充填出来ないことが多い。すなわち、術中において、骨欠損部にうまくフィットする補填材料作製が困難で、手術操作を煩雑にする。また、これら人工材料の移植により、異物反応や感染を招くこともある。以上より、これら人工材料を用いての治療成績は満足できるものではない（特許文献１）。
【０００５】
また、正常の骨は表面が骨皮質と内部に軽石状の海綿骨と呼ばれる構造を有する。すなわち、骨は非常に優れた機械的特質をもつ皮質骨と内部に細胞や血管侵入が容易な海綿骨からなる２重構造である。また、皮質骨にはハバース管と呼ばれる微少管腔構造が存在する。さらに、骨はリン酸カルシウムの結晶のみならず、有機のコラーゲン線維を含み非常に弾力性に富んだ機械的特質を持つ。以上の機械的特質のため、骨は術中においても採型がしやすく、手術を容易にする。しかし、セラミックや金属材料等の人工材料では、このような構造を持たせることは不可能で、骨の様なすぐれた機械的特質を有さず、採型が困難である。以上のため、このような人工物を骨補填材料として用いるには限界がある。
【０００６】
骨腫瘍等の切除後の欠損には、骨そのものを欠損部に移植するのが最も良い方法である。しかし、上記のように、同種骨には感染等のリスクがあり、また健常部より採取された自家骨も採取に限りがあり、また、採取部の疼痛の問題もある。これらを考えると、切除された骨腫瘍から正常部分を残して腫瘍部分のみを取り出すのが理想であるが、腫瘍部分のみを取り出すのは現実には困難であり、腫瘍部分を取り出せても正常部分が少なく、骨移植を必要とする場合が多い。
【０００７】
一方、正常部と骨腫瘍部を一塊として摘出した後に腫瘍細胞の活性を失わせる事が可能なら、その摘出骨（正常部と腫瘍部を含む）を再度移植に用いることが可能となる。
【０００８】
この腫瘍細胞の活性を失わせる目的のためには放射線照射骨、熱処理（オートクレーブ、パスツール処理）骨、液体窒素処理骨などの各種処理骨が考えられる。処理時点では、これらの処理骨は骨皮質と海面骨の構造を持ち、機械的特質も保たれている。しかし、その処理過程でその中に存在した細胞は腫瘍細胞のみならず、正常細胞も致死（壊死）に陥るため、全体として生物活性を持たず、また骨形成能が非常に低い壊死骨となる。このため、この処理骨を移植しても、機械的特質は徐々に失われ、骨癒合不全や感染を招きやすく、これらの処理骨をそのまま用いるには問題がある。
【特許文献１】特開２００２−２８２２８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は骨髄細胞を用いることにより、放射線処理や温度処理等の種々処理をおこなった骨に骨形成能を付加し、処理骨全体が生物活性を発揮して、骨欠損部に対して高い治癒能力を示す骨移植材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
生体の有する構造体を持ち、機械的特質に優れ、易操作性の処理骨に、骨髄由来の培養幹細胞などに代表される将来骨芽細胞となりうる細胞、あるいは幹細胞のさらなる培養によりえられた前骨芽細胞あるいは骨芽細胞を搭載することで、高い骨形成能を付加し、大きな骨欠損に対しても治癒能力を有する骨移植材料が、本発明によって提供される。これらの細胞（骨形成性細胞）を搭載後さらなる培養をおこない、骨芽細胞ならびに新生骨基質を処理骨表面に形成させることができる。
【００１１】
構造体として優れ、さらに易操作性の細胞致死化処理された骨のような各種処理骨は骨そのものが壊死となり、これら処理骨には骨形成能を期待できない、あるいは生体に用いるには生物活性が無いことより、感染等のかえって有害な反応を引き起こす可能性がある。
【００１２】
本発明はこれら処理骨に骨形成細胞を播種等により搭載することにより、生物活性ならびに骨形成能を付加した骨移植材料及びその製造方法を提供することにある。
項１．  骨形成性細胞を備えた細胞致死化処理骨からなる、骨形性能を有する骨移植材料。
項２．  前記骨形成性細胞が、新鮮骨髄細胞、その新鮮骨髄細胞の培養細胞、骨芽細胞及び前駆骨芽細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載の材料。
項３．  細胞致死化処理骨が、放射線処理された骨である項１又は２に記載の材料。
項４．  細胞致死化処理骨が熱処理された骨である項１又は２に記載の材料。
項５．  細胞致死化処理された骨が自家骨あるいは同種骨である、項１〜４のいずれかに記載の材料。
項６．  細胞致死化処理骨が同種骨であり、骨形成性細胞の播種後さらに数日から数週培養を行って得られる項１〜５のいずれかに記載の骨移植材料。
項７．  細胞致死化処理された骨に骨形成性細胞を播種し、必要に応じてさらに培養することを特徴とする骨移植材料の製造方法。
【００１３】
本発明の好ましい具体例において、骨髄細胞を血清を含む種々培地上で初期培養をおこなう。この培養は新鮮骨髄細胞を培養皿にそのまま添加して培養するか、あるいは生理的食塩水や血清に含まれる種々イオンが生理的濃度に含まれた緩衝液に新鮮骨髄を混和して、遠心後赤血球が多く含まれる沈殿層を除いた上層の有核細胞画分を培養皿に添加して行うことができる。これらの場合、新鮮細胞と混和される液体成分には少量のヘパリン等の抗凝固剤が入っているのが望ましい。また、新鮮骨髄細胞に含まれる血球系細胞等を除去するために、フィコール等を用いた比重遠心や、種々抗体の付着したビーズを用いての分離等の処置をおこなった骨髄を培養皿に添加しても良い。あるいは、新鮮細胞を種々のフィルター等の濾過器を用いて血球系細胞を除去した新鮮骨髄を培養皿に添加しても良い。
【００１４】
上記の新鮮骨髄は、骨髄針を用いて腸骨等の骨内に刺入し、陰圧吸引をかけることにより得られる。通常、数ml〜30mlを採取する。場合によっては、骨を削る必要のある手術操作時に直接骨内の骨髄細胞を採取する場合もある。
【００１５】
新鮮骨髄細胞は、移植を受ける患者から採取した骨髄細胞が、拒絶反応と感染を避ける
ために好ましい。
【００１６】
骨欠損は事故により起こることもあるが、骨腫瘍患者から腫瘍部を切除することにより生じる場合が多い。
【００１７】
なお、悪性骨軟部腫瘍患者においては、採取された骨髄に悪性腫瘍が混在する可能性がある。この場合はこれら悪性腫瘍に関連する遺伝子（融合遺伝子）の存在を採取された骨髄において、あらかじめ検索することで、この悪性腫瘍の混在を否定しても良い。これらの遺伝子は、例えばユーイング骨肉腫に関連する EWS-Fli1、EWS-ERG、EWS-ETV1、EWS-E1AF、EWS-FEV、クリアーセル肉腫に関連するEWS-ATF1、ミキソイド脂肪肉腫に関連するTLS-CHOP、ラーブドミオサルコーマに関連する PAX3-FKHR、PAX7-FKHR、滑膜肉腫に関連する
SYT-SSXなどが例示される。
【００１８】
これら新鮮骨髄を上記のように培養皿に添加する。培養皿に種々の培地を入れ、約１０日から２０日ほど５〜７％の炭酸ガスを含む３５〜３８℃の保温器の中で培養をおこなう。培地の交換は２〜３日の間隔でおこなう。この期間中に、培地を交換することにより、培地に浮遊している残存血球系細胞は除去され、培養皿に付着している骨形成性細胞が増殖する事になる。
上記で用いられる培地は、動物細胞培養によく使用される種々液体培地が使用可能である。この培地には自己血清あるいは牛、馬胎児由来血清が約15%〜20%添加される。あるいは、完全合成培地を用いることも可能であり、その合成培地に牛あるいは馬胎児血清を添加しても良い。このように、種々の培地に動物由来の血清を通常添加するが、ヒト血清を用いることも可能である。この場合、血清濃度は数パーセントから２０％の濃度を用いる。上記のように、この培養には培地と血清を用いるが、さらに培養に於ける細胞増殖効率を高めるために、塩基性線維芽細胞増殖因子（b-FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、肝
細胞増殖因子（HGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、インシュリン様成長因子（IGF）等種
々のサイトカインや増殖因子を添加してもよい。さらに、培養における細菌や真菌のコンタミネーションを防ぐために、種々の抗生物質や抗真菌剤を混和してもよい。
【００１９】
増殖した細胞をトリプシンやディスパーゼ等の酵素を用いて培養皿より回収する。この細胞の一部をさらに他の培養皿に添加して、付着細胞をさらに増殖させる。この操作を数回繰り返して、目的とする細胞数が得られるまで培養を継続して、付着細胞を増殖させても良い。
【００２０】
以上の培養により、間葉系細胞の増殖がみられた時期に、骨腫瘍や腫瘍類似疾患の骨部分を摘出する。摘出後の骨の処置は、例えば以下の条件で行うことができる：
(1)放射線処理(５０〜１００Ｇｙ、３０分〜１２０分)
(2)オートクレーブ処理（110℃〜130℃、１０分〜３０分）
(3)パスツール処理（骨を生理的食塩水あるいは緩衝液の含まれる生理的職エンス中で骨
を  ５０〜６０℃、２０〜４０分浸漬）
(4)液体窒素処理（骨を−１９６℃の液体窒素の中に２０分浸漬。その後室温にて１５分
間解凍、さらに３０℃の生食中で１５分間解凍、必要に応じて冷凍−解凍プロセスを繰り返す）
上記の摘出骨以外に同種骨を用いてもよい。例えば、採取された他人の骨を８０℃１０分または６０℃１０時間処理をおこない、その後、脱脂（メタノール、クロロホルム処理）、凍結乾燥、エチレンオキサイド滅菌（１１％から１２％のエチレンオキサイドを用いて５０℃から６０℃で２時間から４時間）をおこない、滅菌パックにいれて冷凍保存する。この同種骨を以下の操作に用いる。
【００２１】
あるいは、このような処理の施されていない同種骨を上記の骨腫瘍の処理条件に従い処
理しても良い。
【００２２】
また、動物由来の骨を上記の骨腫瘍又は他人骨の処理条件に従い処理してもよい。さらに、このような処理でなく、熱や脱脂の処理を経た動物由来の骨でも用いることは可能である。例えば、牛由来のキールボーンや焼成骨である。
【００２３】
上述のように、培養細胞をトリプシンあるいはディスパーゼを用いて骨形性能を有する培養細胞回収し、生理的食塩水や血清に含まれる種々イオンが生理的濃度に含まれた緩衝液に細胞濃度を1x105細胞/ミリリッター(cells/ml)〜1x107細胞/ミリリッター(cells/ml)となるように調整した後、この細胞懸濁液を上記処理骨あるいは処理同種骨に塗布するか、あるいは、上記の細胞懸濁液にこれら処理骨を浸漬し、細胞を骨表面ないし内部に播種する。このような細胞の播種は、遠心力などの圧力の存在下に行い、より多くの骨形成性細胞を骨内部に保持させることもできる。
これら細胞と混和された処理骨はただちに、骨腫瘍等の掻爬または切除部位に充填されてもよいが、可能なら細胞懸濁液中に１０分〜１時間浸漬するのが好ましい。充填された後は通常の方法により内固定あるいは外固定をおこなう。
【００２４】
以上のように、処理骨に培養細胞を保持させるが、培養されていない新鮮骨髄細胞を採取して、その新鮮細胞に処理骨を上記の方法で浸漬して用いてもよい。
【００２５】
また、上記のように、処理骨に培養細胞を搭載後に移植手術をおこなうが、この細胞を保持した処理骨をさらに数日から数週間培養をおこなってから移植手術をおこなっても良い。この培養により、細胞数をさらに増殖するのみならず、骨芽細胞を有する骨移植材料を得ることが可能となる。
【００２６】
上記骨形成性細胞を備えた処理骨の培養に用いられる液体培地には骨髄細胞の培養に用いられる上記物質が添加されうるが、用いられる液体培地に10-6 mM 〜10-8 mM デキサメタゾン, 1mM 〜50mM β-グリセロリン酸, 0.02 mM 〜0.1 mM アスコルビン酸を添加して
もよい、この場合、細胞は骨芽細胞へ分化し、さらに骨基質も産生することが可能となり、新生骨形成にすぐれた移植材料となりうる。
以上の細胞を搭載した移植材料は腫瘍摘出部への充填を想定していて、他の人工物の使用は行う必要はない。しかし、場合によっては、人工関節や人工骨等の人工材料を使用せざるを得ない場合がある。この時、人工物と既存骨との間に空間が生じる場合があり、この空間に以上のべた細胞を搭載した処理骨を充填して使用しても良い。
【発明の効果】
【００２７】
以下の実施例より、新鮮骨髄細胞ならびに培養細胞などの骨形成性細胞を処理骨に搭載することで、移植材料に骨形成能を有する骨芽細胞の出現ならびに新生骨が、移植部位で形成されることが確認された。さらに、その骨芽細胞活性やその新生骨量は、ハイドロキシアパタイトのような人工物に比して処理骨が数倍から数十倍高く、細胞を搭載する処理骨の有用性が確認された。また、このような細胞を搭載された処理骨をそのまま用いて移植してもよいが、さらに培養をおこない、高い骨芽細胞活性と骨基質を誘導した上での移植も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明する。
実施例１：ラットより腸骨を採取し１２０℃２０分の加熱処理をした後、同系ラットの新鮮骨髄液を添加したものと、添加しなかったものをそれぞれラットの皮下に移植し、７週後に取り出して組織学的に検討した。また、コントロールとして多孔性のハイドロキシアパタイトセラミックと新鮮骨髄を混和したものも皮下に移植して７週後に摘出した。
その結果、骨髄液を添加しないものでは新生骨形成は認められなかったが、新鮮骨髄液を添加したものでは骨形成が認められた（図１，図２、図３）。すなわちオートクレーブ処理骨では壊死骨しかみられず、この処理骨を細胞と混和すると、壊死骨のうえに新生骨が形成された。また、セラミックに細胞を混和すると、わずかであるが新生骨が形成された。
【００２９】
これらの組織像より、表１にみられるように、顕微鏡視野あたりの骨の量をはかると、それぞれ20%（壊死骨のみ：図１）、24%（壊死骨と新生骨：図２）および1.4%（新生骨のみ：図３）であった。図２に見られるように、細胞の搭載によりオートクレーブ処理骨にさらなる新生骨が23%も形成された。この事は、細胞の搭載により、処理骨の機械強度が
２割〜３割増加することを示している。
【００３０】
また、処理骨は骨芽細胞等の骨形成性細胞に適した環境を提供できるため多量の新生骨が再生されているが、ハイドロキシアパタイトでは、骨形成性細胞の増殖が困難であり、新生骨もわずかしか形成されていない。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
実施例２：ラットより腸骨を採取し、６０Ｇｙの放射線照射を行い、放射線処理骨を作成した。また同系の７週齢フィッシャー系ラットの一つの大腿骨より骨髄細胞を採取して、その新鮮細胞を15%牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むα-MEM（最小必須培養液）に添加して、
インキュベータ(37℃,5% 炭酸ガス)内で約１０日間培養をおこなった。培地は一週間に三度交換した。この交換時において、血球系細胞を含む浮遊系の細胞は除去され、培養皿に付着する付着性細胞が増殖する。約10日間で培養皿を覆い尽くすように細胞は増殖する（初期培養による培養付着細胞の増殖）。初期培養後、0.01%トリプシン溶液で処理するこ
とにより、75cm2ノ培養皿から5〜10 x 106個の培養付着細胞すなわち間葉系細胞が採取できる。この細胞を培養液で10 x 106/mlの濃度に調整した。この細胞浮遊液に上記の温度
処理骨を混和した。また、コントロールとして、多孔性のハイドロキシアパタイトセラミックを上記に細胞に混和した。これら細胞を混和していない放射線処理骨そのものと、細胞と混和した処理骨ならびにセラミックを同系ラットの皮下に移植して４週後摘出した。
【００３３】
組織学的検討で細胞を搭載した群では新生骨（生きた骨）の形成が認められたが、細胞を搭載していない群では、新生骨形成は認められなかった。
皮下移植後４週後に摘出した標本のアルカリフォスファターゼ活性について検討した。細胞搭載群では細胞非搭載群に比較して、アルカリフォスファターゼ活性は高値を示した（表２）。また、遺伝子発現についても検討した。細胞搭載群では細胞非搭載群に比較して、骨に特異的なオステオカルシンの遺伝子発現は高値を示した（表２）。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
なお、表２において、約5mm四方の処理骨あるいはセラミックを10 x 106/mlの濃度に調整したラット培養間葉系細胞に混和して、ラット皮下へ移植後４週で摘出し、アルカリフォスファターゼ活性を測定した。また、サンプルより総RNAを抽出してreal time PCR法により骨芽細胞に特異的なオステオカルシンの遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子に対する割合を求めた。
実施例３
実施例２によって得られた、培養間葉系細胞を培養液で1 x 106/mlの濃度に調整した。この細胞液に放射線処理骨ならびにハイドロキシアパタイトセラミック混和して移植することなく、さらに培養をおこなった。培養は15%牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むα-MEM（最
小必須培養液）に10-7mM デキサメタゾン, 10mMβ-グリセロリン酸, 0.07 mM アスコルビン酸を添加して37℃,5% 炭酸ガスで１４日間おこなった。この培養により、処理骨を配置されたシャーレの周囲には石灰基質が形成された。また、処理骨そのものが非常に高いアルカリフォスファターゼ活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】オートクレーブ処理骨の皮下移植後７週の組織像。見られる骨は全て壊死骨である。
【図２】新鮮骨髄細胞を搭載したオートクレーブ処理骨の皮下移植後７週の組織像。図２において白星印（☆）は放射線処理骨で壊死骨としてみられる。黒星印（★）は新たに形成された新生骨を示す。
【図３】新鮮骨髄細胞を搭載したハイドロキシアパタイトセラミックの皮下移植後７週の像。図３中、黒星印（★）は新たに出来た新生骨で壊死骨はみられないが、骨量は少ない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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