(57)【要約】【課題】  高い比活性を有する骨形成タンパク質を生成および精製する方法を改善すること。【解決手段】  骨形成タンパク質の可溶性複合体形態上のエピトープを認識しそして結合する結合パートナーであって、可溶性複合体形態が哺乳類においてマトリックスに会合して移植される場合、哺乳類で軟骨内骨形成を誘導する能力のあるダイマー構造を定義するように会合したポリペプチド鎖サブユニット対を含むダイマータンパク質として特徴づけられ、２００アミノ酸未満であるサブユニットの少なくとも１つが、骨形成タンパク質サブユニットの前駆体形態のプロドメインを含むペプチドまたはそのアミノ酸配列変異体と非共有的に複合して非複合サブユニット対より可溶性である複合体を形成し、結合パートナーが骨形成タンパク質の成熟ダイマー形態またはサブユニットのいずれかの単離されたプロドメインに対して結合親和性を有さないとさらに特徴づけられる、結合パートナー。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質の可溶性形態上のエピトープを認識しそして結合する単離された結合パートナーであって、
該骨形成タンパク質の可溶性形態が、哺乳類においてマトリックスに会合して移植される場合、該哺乳類で軟骨内骨形成を誘導し得るダイマー構造を規定するように会合したポリペプチド鎖サブユニット対を含み、
該サブユニットの各々が２００未満のアミノ酸を有し、
該サブユニットの少なくとも１つが、骨形成タンパク質の前駆体形態に由来するプロドメインを含むペプチド、またはその対立遺伝子変異体、種変異体、もしくは保存的アミノ酸配列変異体と非共有結合により複合体化して、非複合体化サブユニット対よりも水性溶媒により可溶性である複合体を形成し、
該結合パートナーが、該骨形成タンパク質の成熟ダイマー形態に対しても、該ポリペプチド鎖サブユニットのいずれかの単離されたプロドメインに対しても、実質的に結合親和性を有さないとしてさらに特徴づけられる、
単離された結合パートナー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、1993年３月４日出願のUSSN第08/027,070号の一部継続出願であり、これは、1992年２月21日出願で現在は米国特許第5,266,683号となっているUSSN第07/841,646号の一部継続出願であり、その開示は本明細書中に参考として援用されている。
発明の分野
本発明は、一般的に骨形成タンパク質に関し、そしてさらに特定すると、それらを生成し精製するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨形成タンパク質は、当該分野において周知であり、そして記載されている。例えば、米国特許第4,968,590号；第5,011,691号；第5,018,753号および第5,266,683号、ならびに科学文献中に公開されている種々の専門的な論文を参照のこと。例えば、Ozkaynakら、(1990)EMBO J 9：2085-2093；Ozkaynakら、J.BIol.Chem. 267：13198-13205；Sampathら(1993) PNAS 90：6004-6008；Wozneyら (1988) ScIence 242：1528-1534；Wangら(1988) PNAS 85：9484-9488；Wangら (1990) PNAS 87：2220-2224、およびCelesteら(1990) PNAS 87：9843-9847を参照のこと。骨形成タンパク質を骨からどのようにして単離するか、およびこれらのタンパク質をコードする遺伝子を、どのようにして同定し、そして組換えDNA技術を用いてそれらをどのように発現するかが、当該分野において記載されている。
【０００３】
真の骨形成タンパク質のクラスを定義するタンパク質は、保存されている構造的特徴を多数共有するタンパク質の群を構成する。各タンパク質は、適切な立体配座を有するダイマー種を生成するために、適切に折りたたまれ、ダイマー化されそしてジスルフィド結合したときに、それ自体で哺乳動物において軟骨内の骨の形成を誘発し得、これには、他の骨形成または非骨形成タンパク質を添加する必要がない。代表的には、骨形成タンパク質は、哺乳動物において骨を誘発する部位に、遊走性の(mIgratIng)始原細胞の浸透、増殖、および分化を可能にする適切な立体配座を有する適切なマトリックスと結合して提供される。適切なマトリックスの表面に吸着した骨形成タンパク質の構築物は、一般的に当該分野においては、骨形成デバイスと呼ばれる。このタンパク質は、骨から単離され得、または、好ましくは、このタンパク質をコードする遺伝子は、適切な宿主細胞中で組み換え的に生成される。骨形成タンパク質の生成方法および骨形成デバイスの処方方法は、当該分野において詳細に記載されている。例えば、米国特許第5,011,691号、または第5,266,683号(これらの開示は、上記の通り本明細書中に参考として援用されている)を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
骨形成タンパク質を組換え発現するために、方法を改善する努力が、当該分野において継続して払われている。本発明の目的は、高い比活性を有する骨形成タンパク質を生成および精製するための方法を改善することであり、そしてこれらのタンパク質を含む骨形成デバイスを処方する方法を改善することである。さらに別の目的は、タンパク質の可溶性形態と骨形成デバイスを処方する際に代表的に利用される成熟骨形成タンパク質種とを区別する手段を提供することであり、そしてこれらのさまざまな種間を区別し得るポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供することである。別の目的は、タンパク質の両形態を認識し得る抗体を生成する方法を提供することである。さらに別の目的は、液体中(血清および生成培地を含む)で、タンパク質のこれらの形態のそれぞれおよびその全てをモニターする方法を提供することである。米国特許第4,857,956号およびUrIstら(1984) Proc. Exp. BIo.Med. 176：472-475には、骨形成活性を有するといわれるタンパク質を検出するための血清アッセイが記載されている。このタンパク質は、本明細書に記載した骨形成タンパク質ファミリーのメンバーではなく、分子量、構造上の特徴および溶解度が、これらのタンパク質とは異なる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１．骨形成タンパク質の可溶性複合体形態上のエピトープを認識しそして結合する単離された結合パートナーであって、
該可溶性複合体形態が、哺乳類においてマトリックスに会合して移植される場合、該哺乳類で軟骨内骨形成を誘導する能力のあるダイマー構造を定義するように会合したポリペプチド鎖サブユニット対を含むダイマータンパク質として特徴づけられ、各該サブユニットが200アミノ酸未満であり、
該サブユニットの少なくとも１つが、骨形成タンパク質サブユニットの前駆体形態のプロドメインを含むペプチド、またはそのアミノ酸配列変異体と非共有的に複合して、非複合サブユニット対より水溶液により可溶性である複合体を形成し、該結合パートナーが該骨形成タンパク質の成熟ダイマー形態または該サブユニットのいずれかの単離されたプロドメインに対して結合親和性を充分に有さないとさらに特徴づけられる、結合パートナー。
２．前記結合パートナーが抗体である、項目１に記載の結合パートナー。
３．前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
４．前記抗体がポリクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
５．前記ダイマー骨形成タンパク質の１つの前記サブユニットが、そのアミノ酸配列変異体を包含するOP-1ポリペプチド鎖である、項目１に記載の結合パートナー。
６．前記ダイマー骨形成タンパク質の他のサブユニットがOP1、BMP2、BMP3、またはBMP4からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択される、項目５に記載の結合パートナー。
７．前記ダイマー骨形成タンパク質の他のサブユニットがOP2、BMP5、BMP6、またはBMP9からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択される、項目５に記載の結合パートナー。
８．前記ダイマー骨形成タンパク質の他のサブユニットがDPP、60A、Vgl、Vgr-1からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択される、項目５に記載の結合パートナー。
９．前記ペプチドが前記プロドメインを定義するアミノ酸配列の少なくとも最初の18アミノ酸を含む、項目１に記載の結合パートナー。
１０．前記ペプチドが前記プロドメインの全長形態を含む、項目９に記載の単離した結合パートナー。
１１．前記ダイマータンパク質種に非共有的に会合したプロドメインペプチドが、OP1、OP2、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、DPP、Vgl、Vgr-1、60Aからなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の結合パートナー。
１２．前記骨形成タンパク質がCOP1、3、5、7、および16からなる群から選択される、項目１に記載の単離された結合パートナー。
１３．溶液中の骨形成タンパク質の可溶性形態を同定する方法であって、該可溶性骨形成タンパク質が、哺乳類においてマトリックスに会合して移植される場合、該哺乳類で軟骨内骨形成を誘導する能力のあるダイマー構造を定義するように会合したポリペプチド鎖サブユニット対を含むダイマータンパク質として特徴づけられ、各該サブユニットが200アミノ酸未満であり、
該サブユニットの少なくとも１つが、骨形成タンパク質サブユニットの前駆体形態のプロドメインを含むペプチド、またはそのアミノ酸配列変異体と非共有的に複合して、非複合サブユニット対より水溶液により可溶性である複合体を形成し、該方法が以下の工程を包含する、方法：
(ａ)該可溶性骨形成タンパク質を含有すると思われる溶液を、該タンパク質形態と該結合パートナーとの間の特異的な結合を促進し、タンパク質-結合パートナー複合体を形成する条件下で、該可溶性骨形成タンパク質を認識および結合する結合パートナーに曝す工程、および
(ｂ)形成された複合体を検出する工程。
１４．前記結合パートナーが抗体である、項目１３に記載の方法。
１５．前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１４に記載の方法。
１６．前記抗体がポリクローナル抗体である、項目１４に記載の方法。
１７．前記結合パートナーが検出手段を有する、項目１３に記載の方法。
１８．前記検出手段が酵素または放射性原子を含む、項目１７に記載の方法。
１９．前記複合体が前記可溶性骨形成タンパク質形態に対して特異性を有する第二の結合パートナーにより検出される、項目１３に記載の方法。
２０．前記既選択形態が前記タンパク質の他の形態との混合物中に存在する、項目１３に記載の方法。
２１．形成され複合体の量を定量するさらなる工程を包含する、項目１３に記載の方法。
２２．前記工程(ａ)において前記溶液が、前記可溶性骨形成タンパク質に対して特異性を有する第一の固定化した結合パートナーに、該第一の結合パートナーと前記骨形成タンパクの間の特異的な結合相互作用を促進するのに充分な条件下で曝されて、タンパク質-結合パートナー複合体を形成し、そして
前記検出工程(ｂ)が該複合体を該タンパク質または該結合パートナーに対して結合特異性を有する第二の結合パートナーに曝す工程を包含する、項目１３に記載の方法。
２３．前記第二の結合パートナーが前記骨形成タンパク質を認識および結合する、項目２２に記載の方法。
２４．前記ダイマータンパク質の前記サブユニットの少なくとも１つが、そのアミノ酸配列変異体を包含するOP-1特異的アミノ酸配列を含む、項目１３に記載の方法。
２５．前記他のサブユニットがOP1、BMP2、BMP3、またはBMP4からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
２６．前記他のサブユニットがOP2、BMP5、BMP6、またはBMP9からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
２７．前記他のサブユニットがDPP、60A、Vgl、Vgr-1からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
２８．溶液中の骨形成活性タンパク質の可溶性形態を検出するためのキットであって、該キットが以下を包含する、キット：
(ａ)該骨形成タンパク質を含有する液状試料を捕獲する手段、
(ｂ)該骨形成タンパク質の該可溶性形態を認識および結合する結合パートナー、および
(ｃ)既め選択した該骨形成タンパク質形態に結合した該結合タンパク質を検出する手段。
２９．前記結合パートナーが抗体である、項目２８に記載のキット。
３０．前記液状試料が培養培地である、項目２８に記載のキット。
３１．前記検出手段(ｃ)が前記骨形成タンパク質の前記可溶性形態を認識および結合する第二の結合パートナーを含む、項目２８に記載のキット。
３２．前記骨形成活性タンパク質がジスルフィド結合サブユニット対を含むダイマータンパク質であり、該サブユニットの少なくとも１つが、そのアミノ酸配列変異体を包含するOP-1特異的アミノ酸配列を含む、項目２８に記載のキット。
３３．前記他のサブユニットがOP1、BMP2、BMP3、またはBMP4からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択される、項目３２に記載のキット。
３４．前記他のサブユニットがDPP、60A、Vgl、Vgr-1からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択される、項目３２に記載のキット。
３５．前記他のサブユニットがOP2、BMP5、BMP6、またはBMP9からなり、そのアミノ酸配列変異体を包含する群から選択される、項目３２に記載のキット。
３６．前記結合パートナーが前記可溶性骨形成タンパク質形態および前記成熟ダイマー形態または前記プロドメインを認識および結合すると特徴づけられる、項目１３に記載の方法。
発明の要旨
本明細書で以下のように定義する骨形成タンパク質は、哺乳動物細胞から培養培地に分泌される場合、この分泌されたタンパク質のかなりの画分としてタンパク質の可溶性形態を含むこと、およびこの可溶性形態は、少なくとも１つの、そして好ましくは２つのプロドメインと非共有的に会合している成熟ダイマー種を含む(それらの切断形態を含む)ことが、現在発見されている。骨形成タンパク質または前駆体ポリペプチド鎖の上のエピトープに対して特異的な結合親和性を有する結合パートナーは、タンパク質のこれらの２つの形態間を識別するために用いられ得ることが、さらに発見された。好ましくは、この結合パートナーはタンパク質である。１つの好ましい実施態様において、結合タンパク質は抗体であり、それは、モノクローナル、ポリクローナルであり得るか、または生合成的に生成され得る。これらの結合パートナーは、タンパク質の成熟形態または可溶性形態を選択的に単離するための、ならびに生成された成熟形態および可溶性形態の量を定量するための、精製スキームの部分として用いられ得る。この抗体は、治療または他の臨床において適用するために、骨形成タンパク質の調製物の薬理学的純度をモニターする生成プロトコールの部分として用いられ得る。具体的に言えば、タンパク質の唯一の所望の形態のみが組成物中に存在することを確実にする方法が、本明細書中に提供されている。さらに、タンパク質の両形態を認識し、そして溶液中の全タンパク質量をモニターするために有利に用いられ得る結合パートナーが生成され得る。これらの結合パートナーはまた、体内の溶液中の骨形成タンパク質の濃度をモニターし、そしてタンパク質のさまざまな形態におけるその濃度の変動を検出するための、診断治療の一部として用いられ得る。
【０００６】
本発明の上述のおよび他の目的、特徴、および利点は、以下の発明の詳細な説明から、さらに明らかにされる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、高い比活性を有する骨形成タンパク質を生成および精製するための方法を改善すること、そしてこれらのタンパク質を含む骨形成デバイスを処方する方法を改善することが提供された。さらに、本発明によってタンパク質の可溶性形態と骨形成デバイスを処方する際に代表的に利用される成熟骨形成タンパク質種とを区別する手段を提供すること、そしてこれらのさまざまな種間を区別し得るポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供することが提供された。さらに、本発明によって、タンパク質の両形態を認識し得る抗体を生成する方法を提供された。さらに本発明によって、液体中(血清および生成培地を含む)で、タンパク質のこれらの形態のそれぞれおよびその全てをモニターする方法を提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
詳細な説明
真の骨形成タンパク質の可溶性形態が、現在では発見され、ここで、このタンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列から本質的に成る。この可溶性形態は、プロドメインまたはそのフラグメントを含む非共有会合した複合体であり、骨形成活性を有するダイマータンパク質種と非共有的に会合または複合化しており、このダイマーのそれぞれのポリペプチドは、200より少ないアミノ酸を有し、そして少なくともＣ末端の６アミノ酸を含み、そして好ましくは、配列番号１の残基335〜431および330〜431のそれぞれにより定義される、７システイン骨格を含む。好ましくは、このダイマー種のポリペプチド鎖は、これらの配列の成熟形態またはその切断形態を含む。好ましい切断形態は、完全なＣ末端ドメインおよびＮ末端伸長部配列の少なくとも10アミノ酸(例えば、好ましくは、少なくとも配列番号１の残基320〜330により定義される配列)を含む。これらの骨形成タンパク質の可溶性形態は、培養細胞培地、哺乳動物の体液から単離され得るか、またはインビトロにおいて処方され得る。
【０００９】
インビボの生理学的条件下で、プロドメインは、タンパク質の輸送能力を増強、および／またはプロテアーゼおよび抗体を含むスカベンジャー分子からのタンパク質の保護に役立ち得る。このプロドメインはまた、タンパク質の組織に対する(例えば、骨に対する)標的化を促進し得る。
【００１０】
本発明により意図され、そして本明細書中で「骨形成タンパク質」と呼ばれるこのタンパク質は、真の骨形成タンパク質であって、哺乳動物内に移植される場合、マトリックスと会合して、それ自体で軟骨内の骨の形成を誘発し得、これには、他の骨形成または非骨形成タンパク質を添加する必要がない。例えば、これらのタンパク質の詳細な説明は、米国特許第4968,590号、第5,011,691号、およびUSSN第B41,646号に載っており、そして現在までに同定されたタンパク質ファミリーのメンバーへの言及を含む。これらのファミリーのメンバーには、OP1、OP2、および当該分野で「骨形態形成タンパク質」と呼ばれるタンパク質(すなわち、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、およびBMP-9)、ならびにさまざまな既知の種の変異体(Vgr、Vg1、60A、およびDPPを含む)、および生合成骨形成構築物(COP１、３、５、７、および16を含む)が含まれる。
【００１１】
このタンパク質ファミリーのメンバーは、タンパク質のTGF-βスーパーファミリーのサブクラスであり、図１にスキームとして示した構造上の特徴、ならびに保存された７システイン構造を含むそれらのＣ末端ドメインにおける相当のアミノ酸配列の相同性が共通している。図に示すように、このタンパク質は、前駆体ポリペプチド配列10として翻訳され、この配列は、代表的には約30より少ない残基のＮ末端シグナルペプチド配列12(すなわち、図中で網目により示される「プレプロ」領域)を有し、この配列には、図中で点描で示される「プロ」領域14が続き、そしてこの領域が切断されて、成熟配列16を生じる。この成熟配列は、保存されたＣ末端の７システインドメイン20と、本明細書中でＮ末端伸長部と呼ばれるＮ末端配列18との両方を含み、そしてこれらは、さまざまな骨形成タンパク質間の配列において、非常に変化する。システインは、垂直な線影をつけた線22で図中に示される。このポリペプチド鎖はダイマー化し、そしてこれらのダイマーは、代表的に、２つのポリペプチド鎖サブユニットを結合する少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合により、安定化される。哺乳動物細胞から産生した成熟サブユニットは、代表的には、グリコシル化およびＮ末端切断の程度に依存して、約15〜23kDの範囲の分子量を有する。次いで、このダイマー種は、代表的には、約30〜40kDの範囲における分子量を有する。
【００１２】
このシグナルペプチドは、翻訳中にまたはその直後に切断部位で切断され、その部位は、Von HeIjne((1986) NucleIc AcIdsResearch 14：4683-4691)の方法を用いて与えられた配列中に示され得る。図１におけるタンパク質サブユニットの「プロ」形態24は、共にペプチド結合したプロドメインおよび成熟ドメインの両方を含む。代表的には、このプロ形態は、タンパク質がまだ細胞の中にある間に切断され、そしてプロドメインは、サブユニットの成熟形態と非共有的に会合したままで、培養哺乳動物細胞から分泌された主要形態として生じる可溶性種を形成する。代表的には、以前の精製技術は、複合体を解離する変性条件を用いた。
【００１３】
哺乳動物細胞から分泌される骨形成タンパク質の他の可溶性形態には、これらのタンパク質のプロ形態のダイマー(ここで、このプロドメインは成熟ドメインから切断されない)、および「ヘミ(hemI)ダイマー」(ここで、一方のサブユニットは、ポリペプチド鎖サブユニットのプロ形態を含み、そして他方のサブユニットは、ポリペプチド鎖サブユニットの切断成熟形態(その切断形態を含む)を含み、好ましくは、切断プロドメインと非共有的に会合している)が含まれる。
【００１４】
単離プロドメインは、代表的に、配列分析と、溶液中のその特徴の特徴付けとの両方により決定されたように、疎水性領域を有している。この単離プロドメインのみでは、代表的には、水溶液中に充分に溶解しない。従って、いかなる学説に制限されることなく、この切断プロドメインと成熟骨形成タンパク質ダイマー種との非共有会合は、与えられたプロドメインの疎水性部分とダイマー種上の対応する疎水性領域との相互作用を含み得、その相互作用は、成熟ダイマーの別に曝された疎水性領域を、水を含む環境に曝することから効果的に保護または「隠し」、成熟ダイマー種の水溶液への親和性が増強される。
【００１５】
本明細書中に記載の骨形成タンパク質と同様に、TGF-βもまた、成熟TGF-βタンパク質形態と非共有的に会合するプロドメインを有する。しかし、本明細書中に記載の骨形成タンパク質とは異なり、TGF-βプロドメインは、多数のシステインを含み、そして特異的結合タンパク質とジスルフィド結合を形成する。このTGF-β１プロドメインはまた、１つまたはそれ以上のマンノース残基においてリン酸化されるが、骨形成タンパク質プロドメインは、代表的にはリン酸化されない。
【００１６】
上記のように、骨形成タンパク質の活性形態(本明細書の以下にOP-１として例示されている)は、成熟配列(例えば、配列番号１のアミノ酸293〜431)またはその切断形態から構成されるダイマー種を含むことが知られており、適切には、ジスルフィド結合により骨形成ダイマー種が生成される。これらの骨形成タンパク質は、その成熟形態で、塩基性タンパク質(例えば、約７〜８の範囲内のpI)に対して中性であり、そして種々の程度まで、生理学的条件下で比較的不溶性である。これらのタンパク質が、可溶性形態で哺乳動物細胞から分泌されること、およびこの形態は、１コピーまたはそれ以上のコピーのプロドメインと非共有的に会合している成熟ダイマー種(本明細書中では「精製種」とも呼ばれる)を含むことが、現在発見されている。おそらくこのタンパク質の形態は、血流中に存在する形態である。TGF-βの潜在形態とは異なり、骨形成タンパク質のこの形態は、活性を阻害しない。可溶性形態は、それ自体が活性であり得るか、またはタンパク質が標的組織(例えば骨組織)に到達したときに、解離して成熟ダイマー種を放出させ得る。
【００１７】
従って、目的の骨形成タンパク質を認識する抗体が産生され得、次いで、これらの抗体は、培養培地または体液(例えば、血清、全血液、または腹膜液)中の骨形成タンパク質の内因性レベルをモニターするのに用いられ得る。好ましくは、この抗体は、可溶性形態に対して結合特異性を有する。このような抗体は、プロドメインまたはその一部分を抗原として、または好ましくは、可溶性複合体それ自体を用いることにより産生され得る。このプロドメインは、好ましくは、可溶性複合体を単離すること、次いで、標準的手順を用いて(例えば、クロマトグラフィーの手段により、好ましくは、変性剤(例えば、６Ｍ尿素)の存在下で、イオン交換クロマトグラフィーにより、複合成分を分離することにより)、成熟ドメインから非共有的に会合したプロドメインを分離することにより得られ得る。あるいは、そのモノマー形態中のプロタンパク質は、成熟形態ではなく、目的のタンパク質のプロ形態または可溶性形態を認識する抗体に対して、ウエスタンブロットまたは他の標準的免疫アッセイによりスクリーニングされる抗原および候補的抗体として用いられ得る。このタンパク質の可溶性および成熟形態の両方を同定する能力を有する抗体が所望される場合、おそらくその複合体自体は、抗原源として用いられる。抗体生成および代表的な免疫アッセイの詳細が、以下に提供される。体液試料中の可溶性骨形成タンパク質を検出する例もまた、提供される。
【００１８】
本発明の方法および組成物において有用であると意図されるタンパク質は、さまざまなグリコシル化のパターンおよびさまざまなＮ末端を有する形態を含む。それらは、天然に生じるか、または生合成的に得られ得、そして前核または真核宿主細胞中で、組み換えDNAの発現により産生され得る。このタンパク質は、単一種として(例えば、ホモダイマーとして)活性であるか、または混合種として組み合わされている。有用な配列および真核および前核発現系が、当該分野において充分に記載されている。例えば、有用な発現系については米国特許第5,061,911号および第5,266,683号を参照のこと。有用な配列は、米国特許第4,968,590号；第5,011,691号；第5,018,753号、および第5,266,683号、ならびにOzkaynakら(1990) EMBO J 9：2085-2093；Ozkaynakら、J.BIol.Chem. 267：13198-13205；Sampathら(1993) PNAS 90：6004-6008；Wozneyら (1988) ScIence 242：1528-1534；Wangら(1988) PNAS85：9484-9488；Wangら (1990) PNAS 87：2220-2224,Celesteら (1990) PNAS 87：9843-9847 Weeksら (1987) Cell 51：861-867；Padgettら(1987) Nature 325 81-84；Whartonら (1991) PNAS 88：9214-9218；Lyonsら(1989) PNAS 86：4554-4558、ならびにOP1、OP2、DPP、60A、Vg1、Vgr-1、およびBMP-2-6、およびBMP-9タンパク質についてのPCT国際出願第WO93/00432号に列挙されている。従って、対立遺伝子の種、およびそれらの他の天然に生じる配列変異体、および生合成配列変異体を含むこれらのタンパク質は、本出願において有用であると意図される。他の有用な配列には、COP-1、-3、-5、-7、-16として米国特許第5,011,691号に引用されている任意の配列のいずれかを含むがそれらに限定されない生合成構築物；および２つまたはそれ以上の異なる骨形成タンパク質由来の配列を組み合わせることにより作り出されるキメラ構築物を含む。当業者により理解されるように、キメラ構築物は、新規な配列を作り出すために、異なる骨形成配列の種々の部分を組み合わせる標準的な分子生物学および突然変異誘発技術を用いることにより、容易に作り出され得、そしてこれらのタンパク質の形態もまた、本明細書中で意図されている。
【００１９】
本発明により意図されるタンパク質の特に好ましい実施態様は、システイン富化Ｃ末端ドメイン中のアミノ酸配列が、60％より多く同一であり、そして好ましくは、OPS(例えば、配列番号１の残基335〜431)のアミノ酸配列と65％より多く同一であるタンパク質を含む。
【００２０】
別の好ましい局面において、本発明では、本明細書中で「OPX」と呼ばれる属アミノ酸配列を有する、ポリペプチド鎖の種を含む骨形成タンパク質が意図され、この属アミノ酸配列により、骨形成OP1タンパク質の種々の同定された種とOP2タンパク質の種々の同定された種との間の相同性が調節され、そしてそれは、以下に掲載したアミノ酸配列および配列番号５のアミノ酸配列により記載されている。
【００２１】
【数１】
2005002127.tif 000002
【００２２】
そしてここで、残基２のXaa＝(LysまたはArg)；残基３のXaa＝(LysまたはArg)；残基11のXaa＝(ArgまたはGln)；残基16のXaa＝(GlnまたはLeu)；残基19のXaa＝(IleまたはVal)；残基23のXaa＝(GluまたはGln)；残基26のXaa＝(AlaまたはSer)；残基35のXaa＝(AlaまたはSer)；残基39のXaa＝(AsnまたはAsp)；残基41のXaa＝(TyrまたはCys)；残基50のXaa＝(ValまたはLeu)；残基52のXaa＝(SerまたはThr)；残基56のXaa＝(PheまたはLeu)；残基57のXaa＝(IleまたはMet)；残基58のXaa＝(AsnまたはLys)；残基60のXaa＝(Glu、AspまたはAsn)；残基61のXaa＝(Thr、AlaまたはVal)；残基65のXaa＝(ProまたはAla)；残基71のXaa＝(GlnまたはLys)；残基73のXaa＝(AsnまたはSer)；残基75のXaa＝(IleまたはThr)；残基80のXaa＝(PheまたはTyr)；残基82のXaa＝(AspまたはSer)；残基84のXaa＝(SerまたはAsn)；残基89のXaa＝(LysまたはArg)；残基91のXaa＝(TyrまたはHIs)そして；残基97のXaa＝(ArgまたはLys)である。
【００２３】
さらに別の好ましい局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、OP1またはOP2のＣ末端７システインドメインをコードするDNAまたはRNA配列とハイブリダイズする核酸によりコードされる骨形成タンパク質を意図している。本明細書で用いるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、40％ホルムアミド、５×SSPE、５×デンハート溶液、および0.1％ SDS中、37℃で終夜のハイブリダイゼーション、そして、0.1×SSPE、0.1％ SDS中、50℃での洗浄と定義される。(例えば、MolecularClonIng：A Laboratory Manual, ManIatIsら編、第２版、Cold SprIng Harbor Press, ColdSprIng Harbor, 1989を参照のこと。)
有用なプロドメインは、以下に記載の全長プロドメインおよびそのさまざまな切断形態を含み、特に、タンパク質加水分解Arg-Xaa-Xaa-Arg切断部位で切断された切断形態を含む。例えば、OP-1において、可能なプロ配列は、残基30〜292(全長形態)；48〜292；および158〜292により定義される配列を含む。可溶性OP-1複合体の安定性は、プロドメインが48〜292切断形態のような切断形態よりむしろ全長形態を含む場合に増強され、ここで、残基30〜47が、他の骨形成タンパク質のＮ末端部分に配列相同性を示しており、そして全ての骨形成タンパク質に対する複合体安定性を増強する際に、特に有用性を有すると考えられる。従って、一般に好ましいプロ配列は、与えられたモルフォゲンに対するプロドメインの全長形態をコードするプロ配列である(以下を参照のこと)。有用性を有すると意図される他のプロ配列は、生合成プロ配列を含み、特に、１つまたはそれ以上の骨形成タンパク質プロ配列のＮ末端部分由来の配列を組み込んだプロ配列を含む。
【００２４】
OP-1の簡単な説明が、以下に記載されており、次いで、これらのタンパク質の可溶性形態をどのようにして単離するのか、そして成熟または「精製」形態に対して特異性を有する抗体、および可溶性または「培地」形態に対して特異性を有する抗体、あるいはタンパク質の両方の形態に対して特異性を有する抗体を、どのようにして生成および同定するのかを開示する実施例が記載されている。特に好ましい実施態様において、タンパク質の可溶性形態を認識する抗体または他の結合タンパク質は、プロドメインペプチドのみの前駆体形態を認識しない。当業者により理解されるように、本開示を用いることにより、培養培地中に存在する与えられた好ましい形態の組換え生成骨形成タンパク質を、今まで利用可能であった方法(例えば、タンパク質の成熟形態または可溶性形態上にのみ存在するエピトープに対して特異的な抗体に依存する方法)よりも、さらに正確に同定および／または定量し得る。現在では、タンパク質の所望形態を正確に単離することも可能である。例えば、プロドメイン形態に対してのみ結合特異性を有する結合抗体を有するアフィニティーカラムに、培養培地を通し、次いで、結合条件を改変する標準的な手順を用いて、結合タンパク質を選択的に脱着させ、それにより複合体を選択的に単離し得ることにより、可溶性複合体形態が優先的に単離され得る。例えば、結合条件は、低pH、変性剤を用いることにより、または抗体結合部位に対して特異的なペプチドと競合させることにより、改変され得る。この抗体およびプロトコールは、溶液中のタンパク質の両方の形態を、同定するために用いられ得ることもまた理解される。本発明の特に有用な適用は、臨床上適用するために用いられる、骨形成タンパク質組成物の薬理学的純度をモニターするためのプロトコールの一部である。
【００２５】
実施例では、例示のタンパク質のOP1により、本発明の有用性を説明しているが、他方、本明細書中に教示された方法および組成物は、過度に実験しなくても、骨形成タンパク質のファミリーの他のメンバーにおよび得ることが理解されるように意図されている。同様に、この実施例には、骨形成タンパク質上のエピトープに対して特異性を有する結合パートナーとしての抗体、および検出プロトコールとしての免疫アッセイが述べられているが、他方、あらゆる結合パートナー、特に、本明細書中に記載の抗体と同様の特徴的な能力を提供し得るあらゆる結合タンパク質が意図される。さらに、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のみが、詳細に記載されているが、他方、当該分野においては、「sFv」と呼ばれる一本鎖構築物のような生合成物を含む他の抗体形態もまた、本発明の範囲内にあると意図される。
OP1 − 一般的に、hOP1遺伝子の一部または全部が発現することにより生成される、骨形成活性タンパク質のファミリーのことを指す。関連出願において、「OPI」および「OP-1」とも言われる。
hOP1-PP − 配列番号１、残基１〜431のヒトOP1タンパク質(プレプロ形態)のアミノ酸配列である。関連出願において、「OP1-PP」および「OPP」とも言われる。
OP1-18Ser − 配列番号１、残基293〜431の成熟ヒトOP1タンパク質のアミノ酸配列である。Ｎ末端アミノ酸は、セリンである。最初は、COS細胞において、SDS-PAGE上で18kDaのところに移動するものとして同定された。種々の宿主細胞におけるタンパク質グリコシル化のパターンに依存し、SDS-PAGE上で23kDa、19kDa、および17kDaのところにもさらに移動する。関連出願において、「OP1-18」とも言われる。
OPS − 配列番号１の残基335〜431のＣ末端の６システインドメインとして定義されるアミノ酸配列。
OP7 − 配列番号１の残基330〜431のＣ末端の７システインドメインとして定義されるアミノ酸配列。
I．可溶性OP-1および成熟ダイマーOP-1の物理的および
抗原的構造
１ａ．成熟ダイマーOP-1の溶解度
精製成熟OP-1ダイマー(培地中に見出されるOP-1に対して、本明細書中では、「純粋OP-1」または「精製OP-1」とも呼ばれ、本明細書中では、可溶性または「培地」OP-1とも呼ばれる)の溶解特性が、広く研究されている。これらの研究により、成熟OP-1は、代表的に変性条件下のみで可溶性であるという結論が得られた。他方、哺乳動物細胞(CHO細胞)調整培地中に最初に分泌された組換え生成OP-1は、変性剤の非存在下でも依然として可溶性である。0.1％SDSおよびCHAPSを含有する低濃度の洗浄剤中で、および低イオン強度、低pH、または非イオン性洗浄剤(例えば、６Ｍ 尿素＋0.3％ Tween-80)の存在下のような穏和変性条件下で、および0.1％TFAを加えた50％ アセトニトリルのような酸性化有機溶媒の存在下で、成熟OP-1は可溶性であることが示されている。変性溶媒条件により、成熟領域からプロドメインが分離されること、および今までに開発された変性剤を含む精製プロトコールでは、複合した高い可溶性形態の単離が妨害されることが見出されている。以下に記載のように、この可溶性複合体の精製は、変性条件を用いずに行われなければならない。
１.ｂ  CHO細胞による分泌OP-1の産生
哺乳動物細胞が産生するOP-1は、いく分かの翻訳後改変の結果、合成されて可溶性ダイマー形態として分泌される。この改変には、適切な折りたたみ、ダイマー化、グリコシル化およびプロドメインおよび成熟ドメインの連結点における切断が含まれる。プロOP-1のなかには、切断されることなく分泌され、分泌プロOP-1として得られるものもある。
１.ｃ  可溶性OP-1(複合体化)の同定
CHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞、代表的なプロトコールについては米国特許第5,266,638号を参照のこと)により発現される組換えOP-1は、血清含有培地中へ分泌され、そして可溶性形態として存在する。このOP-1が見かけ上の可溶性は、OP-1が血清成分と会合することによるか、またはOP-1が、その最終精製状態よりもさらに可溶性形態で、CHO細胞から分泌されることにより生じ得る。
１.ｄ  39kDaのタンパク質のクリーブランドマッピング
代謝的に標識したタンパク質を用いると、培養培地由来のメチオニン標識39kDaタンパク質は、OP-1とOP-1依存様式で共沈殿する。タンパク質は、標準的な方法論を用いるクリーブランドマッピングにより、さらに特徴づけられた(例えば、Cleveland,D.W. (1977) J. BIol. Chem. 252：1102を参照のこと)。標準分子量マーカーとの比較に基づいた50、39、および19/17kDaの見かけ分子量を有するバンドを、PAGEゲルから単離し、ゲル薄片を、種々の量のエンドプロテイナーゼlys-Cと共に、20％アクリルアミドゲルのウェル中に置き、積み上げたゲルの中へ電気泳動し、そして30分間消化させた後、20％ゲル上で生じたフラグメントを分析した。50kDaのタンパク質が、切断されて２つのフラグメントを生じた。これらのうち、大きい方はまた、39kDaのタンパク質として生じ、他方、小さい方は19/17kDaのタンパク質として生じた。この証拠から、39kDaタンパク質がOP-1のプロドメインであることが強く示唆される。OP-1の分泌形態をさらに分析することは、CHO調整培地から可溶性複合体として成熟OP-1を単離することにより可能となった。
２．可溶性骨形成タンパク質の精製プロトコール
骨形成タンパク質を含む可溶性複合体は、簡単で、変性剤の非存在下で行われる、３工程からなるクロマトグラフィーのプロトコールを用いて、調整培地から単離され得る。このプロトコールには、培地(または体液)を、アフィニティカラム、続いて、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーに流す工程が含まれる。以下に記載のアフィニティカラムは、Zn-IMACカラムである。有用性を有すると考えられる別のプロトコールはまた、標準的な手順および、例えば、与えられた骨形成タンパク質プロドメイン(例えば、プロテインＡ結合セファロースカラムに複合化する)に対して特異的な抗体を用いて作られる免疫アフィニティカラムである。免疫アフィニティカラムを開発するためのプロトコールは、当該分野において充分に記載されている(例えば、GuIdetoProteIn PurIfIcatIon, M.Deutscher編、AcademIc Press,San DIego, 1990、特に、第VII節および第XI節を参照のこと)。
【００２６】
この実験において、OP-1を、上記のようにCHO細胞中で発現させた。0.5％ FBS含有のCHO細胞調整培地を、まず固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(ImmobIlIzedMetal-Ion AffInIty Chromatography)(IMAC)を用いて精製した。調整培地由来の可溶性OP-1複合体は、おそらくプロドメインとの会合により、Zn-IMAC樹脂に充分に選択的に結合し、そして結合した複合体を効果的に溶出するためには、高濃度のイミダゾール(50mMイミダゾール、pH 8.0)が必要である。このZn-IMAC工程により、素通り画分および35mM イミダゾール洗浄画分中に溶出される夾雑血清タンパク質のバルクから可溶性OP-1が分離される。このZn-IMAC精製可溶性OP-1を、次に、20mMNaPO４(pH 7.0)と50mM NaClとで平衡化したS-セファロースカチオン交換カラムにかける。このS-セファロース工程により、可溶性OP-1複合体は次のゲル濾過工程のための調製において、さらに精製され濃縮される。このタンパク質を、TBS中で平衡化された、セファクリルS-200HRカラムにかけた。実質的に同じプロトコールを用いて、可溶性骨形成タンパク質はまた、１種またはそれ以上の体液(血清、脳脊髄液、または腹膜液を含む)からも単離され得る。
【００２７】
IMACは、カラム体積の３倍の0.2M ZnSO４を充填した、キレートセファロース(PharmacIa)を用いて行った。調整培地をpH7.0まで滴定し、そして20mM HEPES(pH ７.0)と500mM NaClで平衡化した、ZN-IMAC樹脂に直接付与した。このZn-IMAC樹脂を、樹脂１mL当たり80mLの出発調整培地でロードした。ロード後のカラムを、平衡用緩衝液で洗浄し、そして夾雑タンパク質の大部分を、平衡用緩衝液中の35mMイミダゾール(pH7.0)で溶出した。次いで、可溶性OP-1複合体を、20mM HEPESおよび500mM NaCl中の50mM イミダゾール(pH 8.0)で溶出する。
【００２８】
可溶性OP-1複合体を含有する50mM イミダゾール溶出物を、９倍量の20mM NaPO４(pH 7.0)で希釈し、そして20mMNaPO４(pH 7.0)および50mM NaClの中で平衡化したS-セファロース(PharmacIa)カラムにかけた。このS-セファロース樹脂を、樹脂１mL当たり800mLの出発調整培地の等価物でロードした。ロード後、S-セファロースカラムを平衡用緩衝液で洗浄し、そして、20mMNaPO４(pH 7.0)中の100mM NaCl、続いて300mMおよび500mM NaClで溶出した。300mM NaClのプールを、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、さらに精製した。50mlの300mMNaCl溶出物を、トリス緩衝化生理食塩水(TBS)、50mM トリス、150mM NaCl(pH 7.4)中で平衡化した、5.0×90cmのセファクリルS-200HR(PharmacIa)にかけた。このカラムを、５mL/分の流速で溶出し、10mLずつの画分に採集した。可溶性OP-1の見かけ分子量を、タンパク質分子量標準物(アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH、150kDa)、ウシ血清アルブミン(BSA、68kDa)、カルボニックアンヒドラーゼ(CA、30kDa)、およびシトクロムＣ(cytＣ、12.5kDa))との比較により決定した(図３を参照のこと)。S-200カラム画分の純度を、クーマジーブルーで染色した標準的な15％ ポリアクリルアミドSDSゲル上で分離することにより決定した。成熟OP-1およびプロドメインの正体を、標準逆相C18HPLCを用いて、このプロドメインから成熟OP-1を分離した後、Ｎ末端配列分析により決定した。
【００２９】
図３は、280nmにおける吸光度プロフィールを示す。この可溶性OP-1複合体は、110kDaの見かけ分子量で溶出する。これは、２つのプロドメイン(それぞれ39kDa)と会合した１つの成熟OP-1ダイマー(35〜36kDa)との可溶性OP-1複合体の推定組成物と非常に一致する。最終複合体の純度は、適切な画分を還元15％アクリルアミドゲルに流すことにより確かめられ得る。
【００３０】
複合体の成分は、S-200またはS-200HRカラムからの複合体含有画分を、逆相C18 HPLCカラムに流し、そして標準的な手順を用いてアセトニトリルの濃度勾配(0.1％TFA中)をかけて溶出することにより確かめられ得る。この複合体は、この工程により解離され、そしてプロドメインおよび成熟種が、分離種として溶出する。次いで、これらの分離種は、標準的な手順を用いてＮ末端配列決定にかけられ得(例えば、GuIdeto ProteIn PurIfIcatIon, M. Deutscher編、AcademIc Press,San DIego, 1990、特に602〜613頁を参照のこと)、そして、単離された36kD、39kDaタンパク質の正体が、それぞれ成熟骨形成タンパク質および単離され切断されたプロドメインであると確認され得た。哺乳動物細胞が産生したOP-1由来の単離されたプロドメインのＮ末端配列決定により、プロドメインの２つの形態が明らかになり、この優勢形態は完全形態であり(配列番号１の残基30から始まる)、そして優勢ではない方の種は、切断形態である(配列番号１の残基48から始まる)。単離成熟種のポリペプチドサブユニットのＮ末端配列決定により、成熟配列に対するＮ末端の領域が明らかになり、ここで、成熟配列は、配列番号１の残基293、300、313、315、316、および318で始まり、これらの全ては、標準的骨誘発アッセイにより示されるように活性である。(例えば、標準的なラット骨誘発アッセイの記載について、米国特許第5,011,691号および第5,266,683号を参照のこと)。
II．骨形成タンパク質の検出
上記のように、本発明の方法および組成物は、溶液(例えば、培養培地または体液)中の骨形成タンパク質の好ましい形態を同定および／または定量することに関する。当業者により理解されるように、タンパク質を特異的に同定しそして定量するあらゆる手段が意図される。溶液中のタンパク質を同定するための現在の技術状態は、免疫アッセイによるものであり、ここで、目的のタンパク質と特異的に結合し得る抗体が、溶液中のタンパク質を同定するために用いられ、次いで、形成された結合複合体の量が決定される。
【００３１】
抗体の方法論は、充分に理解されており、そして文献中に記載されている。それらの調製についてのより詳細な記載が、例えば、PractIcalImmunology, Butt, W.R.編、Marcel Dekker, New York, 1984に見出され得る。大まかに言うと、抗体は、適切な動物を免疫原性調製物で、この動物中で抗体の産生を誘発するのに充分な条件下で免疫化することにより、骨形成タンパク質の１つまたはそれ以上の好ましい形態に対して生じ得る。次いで、モノクローナル抗体は、適切な抗体産生細胞(例えば、脾臓またはリンパ節細胞)を骨髄腫細胞と融合し、そしてこの融合生成物を、標準的な技術を用いて、免疫原源(例えば、細胞株または特定の細胞型決定基)に対する核の反応性についてスクリーニングすることにより得られ得る。
【００３２】
溶液中の骨形成タンパク質の検出および／またはそれらの定量のための現在の好ましい方法は、このタンパク質を、骨形成タンパク質特異的抗体を用いて検出することによる。この抗体は、由来はモノクローナルまたはポリクローナルであり得、そして標準的な方法論により産生され得る。免疫原として用いられる骨形成タンパク質は、上記のように調製され得る。すなわち、完全なダイマー種または可溶性複合体が、抗原(免疫原)として用いられ得る。あるいは、プロドメインペプチドは、有利に用いられ得、そして、例えば、可溶性複合体を解離し、そしてペプチドを単離することにより、または前駆体形態を酵素的に消化することにより得られ得る。あるいは、完全な前駆体形態が、免疫源として用いられ得る。
【００３３】
次いで、これらのタンパク質の１つまたはそれ以上に対する抗体を、標準的な方法を用いて生じさせる。次いで、この抗体を、抗体がその特異的なエピトープに特異的に結合し得るのに充分な条件下で、液体試料に曝し、次いで、形成された結合パートナー-骨形成タンパク質複合体(ここでは、抗体-骨形成タンパク質複合体)を検出する。
【００３４】
免疫アッセイ設計の考慮には、抗原に対して充分高い結合特異性を有する抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)の調製が含まれ、この特異的結合抗体-抗原複合体は、非特異的相互作用から確実に区別され得る。抗体の結合特異性が高くなればなるほど、検出され得る抗原の濃度が低くなる。骨形成タンパク質-抗体複合体形成を検出するために、標識を付ける際の選択はまた、所望の検出限界に依存する。酵素アッセイ(ELISA)により、代表的には、酵素付与複合体と酵素基質との相互作用により形成される着色生成物が検出され得る。別の標識には、放射性または蛍光標識が含まれる。現在までに最も高感度であると知られている標識は、化学発光付与であり、ここでは、反応物との相互作用により光が生成される。有用な標識には、化学発光分子(例えば、アクリジウムエステルまた化学発光酵素)が含まれ、ここで、反応物は、酵素基質である。例えば、アクリジウムエステルが、アルカリペルオキシド溶液と反応する場合、強烈な光の閃光が放たれ、その検出限界が他の標識により提供される検出限界の100〜10,000倍に増大し得る。加えて、この反応は速い。化学発光および免疫アッセイの詳細な検討は、Weeksら、(1983)Methods InEnzymology 133：366-387中に見出される。他にも、マイクロタイターウェルまたはカラムイムノアッセイの使用が考慮される。カラムアッセイは、急速に反応する標識(例えば、化学発光標識)が用いられる場合に、特に有用であり得る。この付与された複合体は、カラムの後にある検出器(反応物または酵素基質を含む)に溶出され得、続いて形成される生成物が、直ちに検出され得る。
【００３５】
免疫学的アッセイの設計、理論、およびプロトコールの詳細な検討が、PractIcal Immunology, Butt, W.R.編、MarcelDekker,New York, 1984を含む、当該分野の多数の文献中に見出され得る。利用可能な種々の免疫アッセイ形式の中で、最も高感度のアッセイの１つは、サンドウィッチ技術である。この方法では、目的の被検体と結合する能力を有する２つの抗体が用いられる：固体支持体の上に固定化された抗体、および溶液中で遊離しているが、容易に検出可能な化学化合物で標識されている抗体。上記のように、二次抗体について用いられ得る化学標識の例には、放射性同位体、蛍光化合物、および反応物または酵素基質に曝される場合に着色されるまたは電気化学的に活性な生成物を生じる酵素または他の分子が含まれる。被検体含有試料(例えば、与えられた形態での骨形成タンパク質)が、この系に入れられる場合、被検体は、固定化抗体および標識抗体の両方に結合する。支持体表面上に「サンドウィッチ」免疫複合体が生じる。被検体は、非結合試料成分および過剰に標識された抗体を洗い流し、そして支持体表面上の被検体に対して複合化した標識抗体の量を測定することにより検出される。このサンドウィッチ免疫アッセイは、検出限界が良好な標識物を用いれば、特異性が高くそして非常に高感度である。
【００３６】
免疫アッセイの他の有用な形態は、特にスクリーニング候補について有用である形態は、ウエスタンブロットである。ここで、目的のタンパク質は、ゲル電気泳動により分散させ、そしてニトロセルロース膜上に固定化する。次いで、候補的抗体を添加し、代表的には検出手段(例えば、上記のような放射性標識または酵素)と複合化し、そして複合体形成を生じさせ得る。次いで、膜を洗浄し、非特異的結合相互作用によってのみ相互作用するタンパク質を除去し、そして結合した状態にある複合体を検出する。詳細な標準的なプロトコールは、MolecularClonIng：A Laboratory Manual, Sambrookら編、第２版、Cold SprIng Harbor Press, ColdSprIng Harbor, 1989に提供されている。本明細書で用いられるように、代表的には、骨形成タンパク質を、還元および酸化の両条件下で電気泳動する。
２.ａ 抗体生産
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体産生についての標準プロトコールは以下に提供される。可溶性複合体形態のみを認識する抗体については、好ましくは、単離された複合体自身を抗原として用いる。あるいは、抗原は、単離されたプロドメインまたはそのペプチド断片を含み得る。成熟タンパク質に特異的な抗体が所望される場所で、抗原は、成熟ダイマー形態(例えば、「精製」形態)または少なくともＣ末端のドメインを包むダイマーのサブユニット、またはそのペプチド断片を好ましくは包含する。
２ａ．ポリクローナル抗体
次いで、抗体を本明細書中の以下に記載のとおり合成し、そして目的のタンパク質の種々の形態で交差反応についてインビトロで試験する。
【００３７】
ポリクローナル抗体は以下のとおり調製され得る。各ウサギを100μg/500μlの抗原、500μlの完全フロイントアジュバントで最初の免疫化を与える。与えられた抗原の可溶性は、アジュバントと合わせる前に、可溶化剤、例えば0.1％SDS中に抗原を合わせることにより必要なだけ増強され得る。抗原を動物の背中および横腹に多数の位置で皮下注射する。不完全フロイントアジュバントを用いて同じ方法で１ヶ月間後、ウサギを追加免疫する。試験採血は耳の静脈から７日後に行われる。さらに２回の追加免疫および試験採血を、骨形成タンパク質抗原に対する抗体がELISAアッセイを用いて血清中で検出されるまで、１ヶ月間おきに行う。次いで、ウサギを、100μgの抗原で毎月追加免疫し、そして追加免疫後、７日目および10日目に採血する(各15ml採血)。
【００３８】
２ｂ．モノクローナル抗体
与えられた骨形成タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、以下のとおり調製され得る。マウスに骨形成タンパク質抗原の２回の注射を行う。タンパク質またはタンパク質断片は好ましくは、組換え的に生成される。最初の注射は完全フロイントアジュバント中に100μgの抗原を含有させ、そして皮下で与える。２回目の注射は、不完全アジュバント中に50μgの抗原を含有させ、腹膜内で与える。次いで、マウスは長時間(例えば、１〜８ヵ月間)にわたる種々の時間での４回の腹膜内注射で合計230μgのOP-1を受容した。融合の１週間前に、マウスに抗原(例えば、100μg)を腹膜内で追加免疫し、そしてさらに適切な架橋剤を用いてウシ血清アルブミンに結合させたペプチド断片で追加免疫し得る。この追加免疫を、融合の前５日目(IP)、４日目(IP)、３日目(IP)および１日目(IV)に繰り返し得る。次いで、マウス脾臓細胞を、PEG1500(BoehrInger MannheIm, Germany)を用いて市販されているミエローマ細胞に1：1の割合で融合し、そして融合細胞を播き、そして抗原として骨形成タンパク質配列の適切な部分を用いて、成熟または可溶性の骨形成タンパク質特異性抗体についてスクリーニングする。細胞融合およびモノクローナルスクリーニング工程は、当該分野で広く入手可能な標準的なテキストに充分に記載される標準的な手順に従って容易に行われる。
２ｃ．抗体特異性
これらの標準的な手順により、抗プロドメイン抗血清を、抗原としてOP-1からの単離したプロドメインを用いてウサギから調製し、そして成熟ドメインに対するモノクローナル抗体(「mAb」)は、抗原としてE.colI生産切断形態のOP-1を用いて、マウスにおいて生産した。
【００３９】
本明細書中で上記のように還元条件下で行われる標準的なウエスタンブロット分析は、抗プロドメイン抗血清(「抗プロ」)はプロドメインのみに特異的であるが、成熟OP-1に対するmAb(「抗成熟OP-1」)はダイマーサブユニットに特異的であること、２つの抗体は交差反応しないこと、そして抗体は、例えば、調整培地または血清の試料中の可溶性タンパク質形態と成熟タンパク質形態との間を区別するために用いられ得ることを示す。ウエスタンブロットの結果を、以下の表Iに示し、そこで成熟OP-1に対するmAbの反応性は、「yy」により示し、そして抗プロ抗血清の反応性は「xx」により示す。
表I
精製       調整CHO    単離             精製タ゛イマー
抗体     可溶性OP1   細胞培地   フ゜ロドメイン   サフ゛ユニット    
「抗プロ」     xx        xx            xx                         
「抗成熟      yy        yy                         yy
OP-1」                                                          
第２シリーズでは、モノクローナル抗体は、以下の各抗原に対して生じた：可溶性複合体および非複合成熟ダイマー種。
【００４０】
次いで、クローンは上記のとおり、ELISAアッセイで種々の形態のOP1に対する反応性についてスクリーニングした。ここで、試験する種々の形態のOP-1を表面に固定化し、次いでスクリーニングされるべき抗体を添加し、そして結合した抗体をヤギ抗マウス抗体を用いて検出した。５つの異なる表現型または結合カテゴリーを同定した。これを以下に記載する。表中、「Ｓ」は可溶性複合体を意味し、「Ｍ」は成熟ダイマー種を意味し、そして「Ｐ」は単離プロドメインを意味する。
表II
タンパク質形態
Ｍ    Ｓ    Ｐ 
カテゴリー
１            ＋    ＋
２                  ＋    ＋
３                  ＋
４                        ＋
５            ＋
カテゴリー＃１の結合の特徴を有する抗体は、非複合ダイマー種および可溶性形態の両方に存在するエピトープを認識する。
【００４１】
カテゴリー＃２の結合の特徴を有する抗体は、可溶性複合体およびプロドメインの両方に存在するエピトープを認識する。カテゴリー＃３の結合の特徴を有する抗体は、可溶性複合体形態のみを認識し、他の形態のタンパク質上に存在しないエピトープを作り出すのに充分な複合体形成において配座変化が生じることを確証する。この結合の特徴を有する抗体は、複合体の存在を確証するのに特に有用であり、インビトロでのその構成物からの可溶性複合体の形成を包含する(例えば、非複合ダイマーおよび単離されたプロドメインペプチド)。
【００４２】
カテゴリー＃４の結合の特徴を有する抗体は、プロドメイン上のエピトープのみを認識し、複合体形成が可溶性複合体上に存在するエピトープをマスクまたは破壊するのに充分なであることを確証する。同様に、カテゴリー＃5の結合の特徴を有する抗体は、成熟ダイマー非複合タンパク質形態(しかし、可溶性複合体でない)上のエピトープのみを認識する。
【００４３】
もちろん、与えられたカテゴリーの中の個々のメンバーは、異なるエピトープに結合し得る。従って、異なるタンパク質形態に関するそれらの結合の特徴は、アッセイ条件に依存して変化し得る。例えば、カテゴリー＃１の個々のメンバーは、成熟形態および可溶性形態を認識する一方で、カテゴリー＃１のメンバーが捕獲抗体を構成するようなサンドウィッチELISA条件下で、成熟形態よりも可溶性形態に優先的に結合親和性を示す。同様に、カテゴリー＃２の個々のメンバーは、ウエスタンブロット条件下で、プロドメインに対して可変性の結合を示す。
III．イムノアッセイ
溶液中での骨形成タンパク質の検出能力および可溶性ダイマー形態と成熟ダイマー形態との間の区別能力は、タンパク質生産系のための種々の道具を提供する。質的制御の考慮は、手段が溶液中のタンパク質の形態およびその量の両方を決定するために役立つことを必要とする。これは、臨床用途のために薬理学的に特定の形態が提供されねばならない生体治療法に特に当てはまる。この方法はまた、診断アッセイに役立つ道具を提供し、体内、例えば、血清および他の体液中の遊離骨形成タンパク質のレベルおよびタイプをモニターすることを可能にする。
【００４４】
培養物または体液を含む液体中の骨形成タンパク質のレベルを評価する現行の好ましい検出法は、抗体、または骨形成タンパク質と特異的に反応し得、そしてタンパク質との複合体の一部分として検出され得る他の適切な結合タンパク質を利用するイムノアッセイを包含する。イムノアッセイは、当該分野で公知の標準技術、およびタンパク質に対して生じ、そしてそのタンパク質に特異的な抗体を用いて行われ得る。
【００４５】
目的の骨形成タンパク質形態を認識する抗体は、本明細書の記載のとおり産生され得、そして次いで、これらの抗体を用いて、血清、全血液、または腹膜液のような体液を包含する液体中のタンパク質のレベルをモニターし得る。  
【００４６】
可溶性形態のタンパク質の内因性濃度をモニターするために、選択した抗体は、好ましくは可溶性形態に結合特異性を有する。内因性タンパク質について、これらの抗体は、プロドメインおよび／または可溶性複合体に特異性を有し得る(例えば、上記の結合カテゴリー１〜３)。このような抗体は、本質的に本明細書に記載のように、抗原としてプロドメインまたはその部分、または可溶性複合体それ自身を用いることにより産生され得る。抗原として用いる適切なプロドメインは、可溶性複合体を単離し、そして次いで標準手法を用いて成熟ドメインから非共有結合プロドメインを分離することにより得られ得る。例えば、上記のように、クロマトグラフィー手段(好ましくは変性条件(例えば、6M尿素)下でイオン交換カラムを用いる)によるか、またはゲル電気泳動による分離による。あるいは、また上記のように、タンパク質のモノマー形態でのタンパク質のプロ形態が、抗原として用いられ得、そしてその候補の抗体は、目的のタンパク質の可溶性形態のプロドメインを認識するが、成熟形態を認識しない抗体について、ウエスタンブロットまたは他の標準イムノアッセイによりスクリーニングされ得る。
【００４７】
モノマープロ形態は、CHO産生細胞の細胞ライゼートから、またはプロ形態をコードするDNAの前核生物発現系(例えばE.colI)から、または市販されている昆虫細胞でのバキュロウイルス発現系から得られ得る。次いで、哺乳動物細胞で約50kDaの見かけ分子量を有するプロ形態は、上記のように単離され得る。
【００４８】
溶液中に存在する骨形成タンパク質の量を検出および／または定量するために、そのタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を用いて骨形成タンパク質を検出するイムノアッセイが行われ得る。ここで、骨形成タンパク質の可溶性形態および成熟形態はまた、上記のように２つの形態のタンパク質の間を識別する抗体を用いて区別され得る。現行の好ましいアッセイは、ELISAおよびラジオイムノアッセイ(試料中の骨形成タンパク質の量を測定するために役立つ標準競合アッセイを含む)を包含する。ここで、未知の量の試料タンパク質を、抗骨形成タンパク質抗体と反応させ、そしてこの相互作用が既知の量の標識抗原と競合する。次いで、平衡した結合または遊離の標識抗原のレベルを、溶液中の非標識抗原の量を定量するために測定する。試料の抗原の量は遊離の標識抗原の量に比例している。これらのアッセイについての模範的なプロトコールを以下に提供する。しかし、当業者に理解されるように、これらのプロトコールおよびウエスタンブロットを包含する他のイムノアッセイの変型は、文献中および当該技術内で公知である。例えば、以下に提供されたELISAプロトコールで、可溶性OP-1は、ビオチン化抗プロ抗血清を用いて試料中で同定される。ビオチン化抗体は、以下に記載のように、呈色アッセイまたは化学発光アッセイで視覚化され得る。あるいは、抗体は、１２５Iのような適切な分子で放射性標識され得る。さらに他の用いられ得るプロトコールは、固相イムノアッセイであり、好ましくは、マトリックス表面と複合化する抗骨形成タンパク質抗体を有し、血清試料が通過し得るアフィニティカラムを用いる。プロトコールおよび一般的な考慮を包含する、有用なイムノアッセイの詳細な記載は、例えば、MolecularClonIng：A Laboratory Manual，Sambrookら編、Cold SprIng Harbor Press,NewYork, 1989、特に第18節に提供される。
【００４９】
血清アッセイのために、好ましくは、血清を最初に部分精製して、血清アルブミンのような、過剰な夾雑血清タンパク質のうち幾分かを除去する。好ましくは、血清を、複合体が沈殿するような、硫酸アンモニウム(例えば、45％)中での沈殿により抽出する。可溶性骨形成タンパク質複合体または成熟骨形成タンパク質の溶解度が、血清中に存在する他のタンパク質の溶解度と異なることを利用する精製ストラテジーを用いて、さらに精製を行い得る。当該分野において周知のクロマトグラフィー技術によっても、さらに精製を行い得る。
【００５０】
３ａ．アッセイ
可溶性OP-1は、この実験の以下に記載のように、ELISAにおいてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて検出され得る。OP-1プロドメインに対して特異的なポリクローナル抗体は、OP-1-プロに対して特異的な１μg/100μlのアフィニティ精製ポリクローナルウサギIgGであり、それを96ウェルのプレートの各ウェルに添加し、そして37℃で１時間インキュベートする。ウェルを、0.1％Tween 20含有の0.167M ホウ酸ナトリウム緩衝液および0.15M NaCl(BSB)、pH 8.2で４回洗浄する。非特異的な結合を最小化するために、このウェルをBSB中の１％ウシ血清アルブミン(BSA)で完全に満たし、そして37℃で１時間インキュベートすることによりブロックする。次いで、ウェルを、0.1％ Tween 20含有のBSBで４回洗浄する。細胞培養上清のテスト試料または血清試料のそれぞれの適切な希釈物の100μlのアリコートを、各ウェルに３回添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。インキュベート後、ウサギ抗プロ抗血清由来の100μlのビオチン化抗体(ストック溶液は約１mg/mlであり、そして使用前に１％BSA含有のBSB中で１:400に希釈する)を、各ウェルに添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。次いで、ウェルを、0.1％ Tween 20含有のBSBで４回洗浄する。100μlストレプトアビジン(strepavIdIn)-アルカリ(Southern BIotechnology AssocIates, Inc. BIrmIngham,Alabama、使用前に0.1％ Tween 20含有のBSB中で１:2000に希釈)を各ウェルに添加し、そして37℃で30分間インキュベートする。このプレートを、0.5Mトリス緩衝化生理食塩水(TBS)、pH 7.2で４回洗浄する。50μlの基質(ELISA AmplIfIcatIon System KIt, LIfeTechnologIes, Inc., Bethesda, MD)を、各ウェルに添加し、室温で15分間インキュベートする。次いで、50μl アンプリファイア(同じamplIfIcatIonsystem kItから得た)を添加し、そしてさらに15分間室温でインキュベートする。50μlの0.3M 硫酸を添加して、この反応を停止する。各ウェル中の溶液の490nmにおけるODを記録する。この試料中の可溶性OP-1のレベルを定量するために、テスト試料と平行に標準曲線を採る。この標準曲線では、精製OP-1-プロの既知量を増加しながら添加する。あるいは、例えば、基質としてLumI-phos530(AnalytIcal LumInescence LaboratorIes)、標準ルミノメーターにおいて300〜650nmでの検出を用いて、複合体を化学発光により検出し得、これは代表的には、視覚的な呈色変化による検出よりも、さらに高感度のアッセイを提供する。
【００５１】
３ｂ．プレート基盤ラジオイムノアッセイ
骨形成タンパク質(可溶性または成熟形態)は、標準的なプレート基盤ラジオイムノアッセイにより以下のように検出し得る。抗骨形成タンパク質抗体の経験的に決定した限界レベル(例えば、抗OP-1、代表的には50〜80ng/ウェル)を、例えば、50μlのPBSリン酸緩衝化生理食塩水中で、PVCプレートのウェルに結合させる。結合させるために室温で充分に(代表的には１時間)インキュベートした後、このプレートをホウ酸緩衝化生理食塩水/Tween20溶液(「洗浄緩衝液」)中で洗浄し、そして200μl ブロック(３％ BSA、１×BSB中の0.1M リシン)を各ウェルに添加し、そして１時間インキュベートさせ、その後このウェルを洗浄緩衝液中で再度洗浄する。連続希釈した血漿(好ましくは、上記のように部分精製した)または骨形成タンパク質標準(例えば、OP-1)からなる試料の40μlを、ウェルに３回添加する。好ましくは、試料を、PTTH(15mMKH２PO４、８mM Na２PO４、27mM KCl、137mMNaCl、0.05％ Tween 20、１mg/ml BSA、0.05％ NaN３、pH 7.2)中で希釈する。好ましくは、10μlの標識競合抗原を、好ましくは100,000〜500,000cpm/試料で添加し(例えば、標準的な手順を用いて放射性標識した１２５IOP-1)、そしてプレートを終夜４℃でインキュベートする。次いで、プレートを洗浄緩衝液中で洗浄し、そして乾燥させる。ウェルを切り離し、結合標識OP-1を標準ガンマカウンターで計測する。次いで、試料の存在下および非存在下で測定した結合標識抗原(例えば、１２５IOP-1)の量を比較すると、その差は、この試料溶液中に存在する試料抗原(骨形成タンパク質)の量と比例している。
【００５２】
３ｃ．生成モニターの考察
タンパク質の生成レベルをテストするための試料には、定期的に採集し、そしてイムノブロットによりOP-1生成について評価した培養上清または細胞ライゼート(Sambrookら編、1989、MolecularClonIng, Cold SprIng Harbor Press, ColdSprIng Harbor, NY)、または定期的に採集し、そしてmRNA分析のためのポリＡ＋RNAを調製するために用いた細胞培養物自体の一部分が含まれる。新規な(denovo)OP-1合成をモニターするために、いくつかの培養物を、従来の手順に従って、３５Ｓ-メチオニン/３５Ｓ-システイン混合物で６〜24時間標識し、次いで、従来の免疫沈殿法によりOP-1合成を評価する。
３.ｄ  可溶性骨形成タンパク質複合体に対する抗体を用いる
診断
本発明の抗体はまた、体内の可溶性タンパク質のレベルをモニターするために用いられ得る。次いで、血流中または腹膜液中に存在する骨形成タンパク質のレベルの変動が、組織の生育能力を評価するために用いられ得る。例えば、骨形成タンパク質は、再生組織と会合して検出され、および/または死細胞から周囲の腹膜液に放出され得る。
【００５３】
血清試料は、標準的な静脈穿刺により得られ得、そして血清は、3,000RPMで10分間の遠心分離により調製され得る。同様に、腹膜液試料は、標準的な液抽出方法論により得られ得る。次いで、血清または腹膜液中に骨形成タンパク質が存在することを、標準的なウエスタンブロット(イムノブロット)法、ELISA法またはRIA法により査定した。簡単に言えば、例えばELISAを用いて、試料を適切な緩衝液(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水)中で希釈し得、そして50μlのアリコートを、可溶性骨形成タンパク質特異的抗体で前もってコーティングしたマイクロタイタープレート中の平底ウェルに吸収させ、そして４℃で18時間インキュベートさせる。次いで、プレートを標準緩衝液で洗浄し得、そして検出試薬(例えば、ビオチン)に結合した二次骨形成タンパク質特異的抗体の50μlのアリコートと、適切な緩衝液中で、室温で90分間インキュベートする。次いで、骨形成タンパク質-抗体複合体を、標準的な手順を用いて検出し得る。
【００５４】
あるいは、骨形成タンパク質特異的アフィニティーカラムを、例えば、カラムマトリックスに吸着した可溶性骨形成タンパク質特異的抗体を用いて作製し得、そしてマトリックスに液体試料を通過させて目的のタンパク質を選択的に抽出する。次いで、このタンパク質を溶出する。適切な溶出緩衝液を、まずコントロール(例えば、精製組換え生成タンパク質)との適切な結合および溶出条件を決定することにより、経験的に決定し得る。次いで、画分を、標準的なイムノブロットにより可溶性形態タンパク質の存在についてテストする。次いで、血清中または他の液体試料中のタンパク質濃度を、標準的なタンパク質定量技術を用いて決定し得る。これには、分光光度測定吸光度による、あるいはELISAまたはRIA抗体アッセイによる定量による決定が含まれる。この手順を用いて、OP-1は、血清中で同定された。
【００５５】
以下のアッセイを用いて、OP-1をヒト血清中で検出した。当該分野において充分に記載され、そして本明細書中に一般的に記載されている標準的な免疫学的技術を用いて、哺乳動物の組換え生成OP-1に対して生じたモノクローナル抗体を、活性化アガロースゲル(例えば、BIo-RadLaboratorIes、RIchmond, CAから入手し、製造者の指示に従って調製したAffI-GelＴＭ)にこの抗体を通すことにより固定化し、そして血清からOP-1を精製するために用いた。次いで、ヒト血清をこのカラムに通し、そして3MＫ-チオシアネートで溶出した。次いで、Ｋ-チオシアネート画分を6M 尿素、20mM PO４、pH 7.0中で透析し、C8 HPLCカラムにかけ、そして20分間、25〜50％アセトニトリル/0.1％ TFAの濃度勾配で溶出した。成熟組換え生成OP-1ホモダイマーは、20〜22分の間に溶出する。従って、アフィニティー精製ヒト血清試料由来のこれらの画分を採集し、そしてOP-1-特異的抗体を用いる標準的なイムノブロットにより、OP-1の存在についてテストし、このタンパク質の正体を、Ｎ末端配列決定により確認した。
【００５６】
本発明は、その本質または不可欠な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において実施し得る。従って、本実施態様は、説明的であるが限定的ではなく、全ての点において考慮され得、本発明の範囲は、上述の記載よりはむしろ添付の請求の範囲により示され、従って、この請求の範囲と同等の意図および範囲内に入る全ての変更は、その中に含まれるように意図されている。
【００５７】
【数２−１】
2005002127.tif 000003
【００５８】
【数２−２】
2005002127.tif 000004
【００５９】
【数２−３】
2005002127.tif 000005
【００６０】
【数２−４】
2005002127.tif 000006
【００６１】
【数２−５】
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【００６２】
【数２−６】
2005002127.tif 000008
【００６３】
【数２−７】
2005002127.tif 000009
【００６４】
【数２−８】
2005002127.tif 000010
【００６５】
【数２−９】
2005002127.tif 000011
【００６６】
【数２−１０】
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【００６７】
【数２−１１】
2005002127.tif 000013
【００６８】
【数２−１２】
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【００６９】
【数２−１３】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、骨形成タンパク質ポリペプチド鎖の配列をコードする核酸から発現されるペプチド鎖をスキームとして示しており、ここで、網目領域は、シグナル配列を示す；点描領域は、プロドメインを示す；綾目領域は、成熟タンパク質配列のＮ末端(「Ｎ末端伸長部」)を示す；そして白地領域は、保存された７つのシステインドメインを定義する成熟タンパク質配列のＣ末端領域を示し、保存されたシステインは垂直線影により示される；
【図２】図２は、さまざまな骨形成タンパク質の成熟形態のＮ末端伸長部の配列を挙げている；そして
【図３】図３は、哺乳動物細胞から産生され、IMAC、S-セファロース、およびTBS(トリス緩衝化生理食塩水)中でS-200HRクロマトグラフィーにより精製した可溶性骨形成タンパク質(OP-1)のゲル濾過カラム溶出プロフィールであり、ここで、ＶＯはボイド体積である；ADHはアルコールデヒドロゲナーゼ(MW150kDa)である；BSAはウシ血清アルブミン(MW 67kDa)である；CAはカルボニックアンヒドラーゼ(MW 29kDa)であり、そしてCytCはシトクロムＣ(MW12.5kDa)である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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