(57)【要約】【課題】光伝搬体を用いた化学センサーにおいて、励起光と蛍光を完全に分離し、励起光によるバックグラウンドをなくし感度を向上させる。【解決手段】  光源／光学系からの励起光を伝搬させるための光伝搬部となる円筒型光導波路に導光し、円筒型光導波路の外側の側壁に付着している蛍光色素を、円筒型光導波路中を伝搬する励起光により該励起光を伝搬させるための光伝搬部となる円筒型光導波路の外部に生じるエバネッセント光（電界）により励起し、この結果発光した蛍光を円筒型光導波路の外側でリフレクター（反射板）により反射させ、円筒型光導波路を介さずに、光センサーによって検出するものである。【選択図】  図１
2005180963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を光伝搬体の内部で伝搬させるための光伝搬体と、
前記光伝搬体の外側面部に被検出物質が付着したときに前記伝搬体を伝搬する励起光により、前記被検出物質が励起されて生じる蛍光を所定の方向に指向させるための指向手段と、
前記指向手段により所定方向に指向する蛍光を検知する光検知手段とを備えることを特徴とする被検出物質の光学分析装置。
【請求項２】
前記指向手段が、反射板であって、
前記反射板の反射面の断面形状が、下記式（１）で規定される放物形状であることを特徴とする請求項１記載の光学分析装置。
ｙ＝（１／４ｐ）ｘ2・・（１）
（ｐは、反射板の焦点位置であり、２次元座標系の原点からの距離として表される。原点は反射板の底部（極小点部）とする。）
【請求項３】
前記反射板の反射面の表面が、少なくとも金属または誘電体多層膜からなることを特徴とする請求項２記載の光学分析装置。
【請求項４】
前記光伝搬体の外側面は、蛍光物質と結合した被検出物質を捕捉するための捕捉成分が付着し得る外面を有する
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の光学分析装置。
【請求項５】
前記被検出物質と前記捕捉成分との結合が、抗原抗体反応によるものであることを特徴とする請求項４記載の光学分析装置。
【請求項６】
前記被検出物質と前記捕捉成分との結合が、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応によるものであることを特徴とする請求項４記載の光学分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には化学および生化学分析のための光学分析装置およびその分析方法に関し、特に、エバネッセント波（電界）を基本とした化学および生化学分析のための光学分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には、ガンや肝炎など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際、平時より特定のタンパク質の濃度が増加する。これらを平時からモニターしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来るため、次世代の医療技術として期待されている。未加工で未精製のタンパク質を分析するための方法の１つは、生物学的なリガンド−受容体相互作用を利用して特定の化合物を識別するセンサーを基本としたものである。そのような手法を用いているものには、光ファイバーのエバネッセント波センサー、および表面プラズモン共鳴センサーが含まれる。
【０００３】
光ファイバーのエバネッセント波センサーは、エバネッセント波（電界）効果を利用するものである。エバネッセント波（電界）効果とは、ある物質中を通過して誘電性の界面で反射される電磁波は、その界面の反対側にある第２の物質中で指数関数的に減衰する電界を生じることを言う。第２の物質中への浸透深さであるエバネッセント波領域は波長のごく一部ではあるが、それでもサイズとしては光または蛍光を生じるレポーター分子、光吸収ないし散乱分子、およびコロイド粒子やミクロスフィアのような光学的ラベル物質よりも大きい。これらのラベルはエバネッセント領域において光学的変化を発生またはモニターすること、あるいは隣接する誘電体における光の伝播を変更させるために使用することが可能であり、表面近傍にあるターゲット物質を、検出することができる。
【０００４】
光ファイバーのエバネッセント波センサーとしては、特公平５−２１１８５号公報や特開２００２−２５７７３２号公報等に記載されている。
【０００５】
これらに記載されている、エバネッセント波センサーは、一端が反射面となっている光ファイバーの側壁に標識化した抗原抗体複合体を付着させ、光ファイバーの他端から励起光を軸方向に導光している。光ファイバーに導光された励起光のエバネッセント波効果により、光ファイバーの側壁に標識化した抗原抗体複合体は、励起され蛍光を発生する。発した蛍光の一部が、該光ファイバーに導光され、励起光の反射光とともに光学系に戻り、光センサーによって検出されている。尚、光ファイバーは、通信用の屈折率の高いコア層と低いクラッド層からなる光学繊維である必要はない。理由は、光ファイバーは、単一材料で形成されたファイバーがコア層となり、コア層よりも屈折率の低い液体と接しているので、この液体がクラッド層の機能を持つからである。
【０００６】
一方で、本発明と直接的な関係はないが、ＤＮＡの塩基配列を調べる手法として、特開平０９−１１９８０９号公報や特開２００３−３２９５９０号公報に示すような毛細管型電気泳動法が考案されている。これらの技術では、ＤＮＡ断片を質量によりキャピラリー中で分離し、検出部であるガラス部に導入し、標識された各塩基の色素を読み取ることにより、塩基配列を調べている。これら発明は、各毛管の中に存在する標識されたＤＮＡ断片を用い、毛管の中心位置を検出装置の焦点にあわせるという技術である。
【特許文献１】特公平５−２１１８５号公報
【特許文献２】特開２００２−２５７７３２号公報
【特許文献３】特開平０９−１１９８０９号公報
【特許文献４】特開２００３−３２９５９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特公平５−２１１８５号公報や特開２００２−２５７７３２号公報に記載されたものは、抗原抗体から発した蛍光と端面で反射された励起光とが一緒に光ファイバーから導出される。このために、蛍光を用いて測定を行う場合、光ファイバー端から導出される光から、励起光と蛍光とを分離する必要がある。上記に開示されている手法では、励起光をカットし蛍光を通すようなフィルターを用いることにより分離をおこなっている。しかし、励起光を１００％カットし蛍光を１００％通すようなフィルターを製作することは実質的に困難である。励起光は蛍光に比べ光強度が高いので、励起光が大きなバックグラウンドノイズとして光センサーで検出される。励起光の、発光強度が安定していないと、バックグラウンド上の微小な変化として蛍光が検出される。このため、これら構成で高感度に蛍光を検出しようとすると、バックグラウンドの発生源である励起光を極端に安定させることが必要となり、工業製品とする場合多大なコストがかかるという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、光を光伝搬体の内部で伝搬させる光伝搬体と、光伝搬体の外側面部に被検出対象が付着したときに伝搬体を伝搬する励起光により、被検出対象が励起されて生じる蛍光を所定の方向に指向させるための指向手段と、前記指向手段と対向し前記所定の方向に位置する光検知手段とを備えることを特徴とする検体の光検出装置である。前記指向手段が、反射板であって、
前記反射板の断面形状が、下記式（１）で規定される放物形状であることが好ましい。
【０００９】
ｙ＝（１／４ｐ）ｘ2・・（１）
（ｐは、反射板の焦点位置であり、２次元座標系の原点からの距離として表される。原点は、光導波路の中心軸とする）
反射板の表面が、少なくとも金属または誘電体多層膜であることが好ましく、光伝搬体の外側面は、蛍光物質を有する被検出対象を捕捉するための捕捉成分が付着し得る外面を有することが好ましい。
【００１０】
本発明の、被検出物質と捕捉成分との結合は、抗原抗体反応またはＤＮＡのハイブリダイゼーション反応によるものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、励起光から、測定対象となる蛍光を空間的に分離し、蛍光のみを検査することが可能となり、従来よりも高感度な、エバネッセント波（電界）を用いた光学分析装置を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、光源／光学系からの励起光を伝搬させるための光伝搬部となる円筒型光導波路に導光し、円筒型光導波路の外側の側壁に付着している蛍光色素を、円筒型光導波路中を伝搬する励起光により該励起光を伝搬させるための光伝搬部となる円筒型光導波路の外部に生じるエバネッセント光（電界）により励起し、この結果発光した蛍光を円筒型光導波路の外側でリフレクター（反射板）により反射させ、円筒型光導波路を介さずに、光センサーによって検出するものである。
【００１３】
リフレクターは、平行光を焦点に集光するタイプのリフレクターが好ましく、さらに、円筒型光導波路を焦点の位置に配することが好ましい。リフレクターは、焦点の位置ｐに対して、ｙ＝（１／４ｐ）ｘ2の関数形状で規定されているリフレクターを用いることがさらに好ましい。
（第１の実施の形態）
本発明第１の実施形態について、図１を参照しながら説明する。本実施の形態は、リフレクターが検体や洗浄液を流す流路の一部を兼ねる構成である。
【００１４】
支持体２０、リフレクター１１、検体もしくは洗浄液の注入口、または排出口２１、２２を設けたキャップ１６で構成された流路中に円筒型光導波路１７がキャップ１６間に配置されている。円筒型光導波路１７の一端には光源１９が配置され、光源１９から発せられる励起光は、レンズ１８で集光され円筒型光導波路１７に導光される。円筒型光導波路１７の円筒型光導波路の外側の側壁に付着した蛍光体色素は、円筒型光導波路１７に導光された励起光による、エバネッセント波により励起し蛍光を発する。蛍光は、リフレクター１１により集光され、支持体２０を透過して射出される。射出された透過光（蛍光）は、光学フィルター１２により不要な波長成分を除去後、集光レンズ１３、１４で集光され、光センサー１５に導光される。
【００１５】
リフレクター１１は、平行光を焦点に集光するタイプのリフレクターが好ましく、さらに、円筒型光導波路１７を焦点の位置に配することがより好ましい。リフレクター１１は、焦点の位置ｐに対して、ｙ＝（１／４ｐ）ｘ2の関数形状で規定されているリフレクターを用いることがさらに好ましい。
【００１６】
本実施の形態では、リフレクター１１の焦点に円筒型光導波路１７を設置し、光源／光学系１８、１９からの励起光を円筒型光導波路１７に導光し、側壁に付着している蛍光色素をエバネッセント光により励起し、この結果発光した蛍光をリフレクター１１により光学系１２、１３、１４で捕捉できない光を光学系１２、１３、１４側に反射させ光学系１２、１３、１４に効率よく集め、光学系１２、１３、１４を経て光センサー１５によって検出することを特徴としている。
【００１７】
励起光は、励起光は、光導波路内で全反射しながら伝播するので、光導波路の外側への漏れはほとんど生じない。
【００１８】
リフレクター１１としては、放物面型、半円筒型、平板型の形状が用いられ、ミラー面にはＡｌ、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｒのような金属膜または誘電体多層反射膜（多層膜の各界面での反射光の位相を一致させて干渉効果によって高い反射率を得る）を反射膜としてもうける。さらに、金属膜上に保護膜となる誘電体からなるパッシベーション膜を設けても良い。この場合、パッシベーション膜としては、１／２波長膜一酸化シリコン（ＳｉＯ）、または誘電体多層反射膜を設けることがさらに好ましい。
【００１９】
本構成では、ＡｌまたはＡｇの上にパッシベーション膜として、誘電体多層膜を蒸着した放物面型リフレクターもしくは全反射円筒凹面ミラーが好ましい。また本構成では、リフレクターが検体や洗浄液を流す流路の一部を兼ねる構成が好ましい。
【００２０】
光学フィルター１２としては色ガラスフィルター、ダイクロイックフィルター、ゼラチンフィルター、ロングパスフィルター、可視光ブロックフィルター、ＩＲパスフィルターを用いることが出来る。本構成ではダイクロイックフィルター、もしくは色ガラスフィルターを用いることが好ましい。ダイクロイックフィルターや色ガラスフィルターは、波長分離により優位であり工業製品としての耐久性供給に優れている。
【００２１】
集光レンズ１３、１４としては、平凸シリンダーレンズ、平凹シリンダーレンズ、非球面レンズ、平凸もしくは両凸球面レンズ群、顕微鏡用対物レンズ、セルフォックレンズを用いることが出来る。本構成では、集光された蛍光が、平行光になるので、蛍光を面で集光できる平凸シリンダーレンズまたは平凹シリンダーレンズを用いることが好ましい。
【００２２】
光センサー１５としては、フォトダイオード、光電子増倍管を用いることができる。本構成では、検体の濃度によってフォトダイオード、光電子増倍管が適宜選択される。キャップ１６としては、プラスチックの樹脂、半導体、金属などの材料を加工して用いることができる。本構成では、黒に着色したプラスチックの樹脂、もしくは半導体を加工して用いることが好ましい。
【００２３】
円筒型光導波路１７としては、励起光に対して光ロスが少ない材料であることが好ましく、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）を用いることが好ましい。
【００２４】
コリメートレンズ１８としては、非球面レンズ、セルフォックレンズ、平凸もしくは両凸レンズ群、顕微鏡用対物レンズなどを用いることが出来る。本構成ではセルフォックレンズまたは非球面レンズを用いることが好ましい。
【００２５】
光源１９としては、波長が２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のレーザーダイオードまたはガスレーザを選択して用いる。本構成では波長が６７０ｎｍ以下のものを用いることが好ましい。
【００２６】
支持体２０としては、蛍光に対して光ロスが少ない材料であることが好ましく、プラスチック樹脂、各種ガラス、半導体などが適宜選択して用いられる。本構成では、プラスチック樹脂または各種ガラスを用いるのが好ましい。注入口／排出口２１、２２については、キャップ１６に貫通孔を開けパイプを挿入し、チューブを伸ばした構成が好ましい。
（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態について、図２を参照しながら説明する。本実施の形態は、流路とリフレクターとを分離したものである。
【００２７】
第１の実施形態で示したものと同じ要素については、同じ符号で示してある。ただし、同じ構成要件であっても異なる形状や材料の要素である場合は、異なる符号をつけて説明する。
【００２８】
本実施の形態では、流路２５の内部に、円筒型光導波路１７を配し、流路２５には、洗浄液の注入口、または排出口２６、２７を備えている。円筒型光導波路１７の一端は流路２５の外側に位置し、光源１９から発せられる励起光は、レンズ１８で集光され、該端部から励起光が、円筒型光導波路１１に導光される。
【００２９】
第１の実施の形態と同様に、リフレクター２３は、平行光を焦点に集光するタイプのリフレクターが好ましく、さらに、円筒型光導波路１７を焦点の位置に配することが好ましい。リフレクター１１は、焦点の位置ｐに対して、ｙ＝（１／４ｐ）ｘ2の関数形状で規定されているリフレクターを用いることがさらに好ましい。
【００３０】
第２の実施形態では、リフレクター２３の焦点位置に流路２５と一体化した円筒型光導波路１１を設置する。光源／光学系１８、１９からの励起光を円筒型光導波路１７に導光し、側壁に付着している蛍光色素をエバネッセント光により励起し、この結果発光した蛍光を、流路２５とは独立して設けられたリフレクター２３により光学系１２、１３、１４で捕捉できない光を光学系側１２、１３、１４に反射させ光学系１２、１３、１４に効率よく集め、光学系１２、１３、１４を経て光センサー１５によって検出することを特徴としている。
【００３１】
リフレクター２３としては、放物面型、半円筒型、平板型の形状が用いられ、ミラー面にはＡｌ、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｒのような金属膜または多層膜の各界面での反射光の位相を一致させて干渉効果によって高い反射率を得る、誘電体多層反射膜を反射膜としてもうける。さらに、金属膜上に保護膜となる誘電体からなるパッシベーション膜を設けても良い。この場合、パッシベーション膜としては、１／２波長膜一酸化シリコン（ＳｉＯ）、または誘電体多層反射膜を設けることがさらに好ましい。
【００３２】
本構成では、ＡｌまたはＡｇの上にパッシベーション膜として、誘電体多層膜を蒸着した放物面型リフレクターもしくは全反射円筒凹面ミラーが好ましい。キャップ２４としては、プラスチックの樹脂、半導体、金属などの材料を加工して用いることができる。本構成では、プラスチックの樹脂もしくは半導体を加工して用いることが好ましい。流路２５としては、円筒型のキャピラリー、チューブが用いられるが円筒型のキャピラリーが好ましい。注入口／排出口２６、２７については、流路２５に貫通孔を開けパイプを挿入し、チューブを伸ばした構成が好ましい。
【００３３】
本発明は、上記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の主旨を逸脱することなく種々の変更および修正を行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下本発明の実施例を述べるが、本発明はここに記述した内容だけに制限を受けるものではない。
（実施例１）
図１を参照しながら説明する。リフレクター１１は、ｙ＝（１／４ｐ）ｘ2の関数形状で規定されている。ｐはリフレクターの焦点位置であり、二次元座標系の原点からの距離として表される。ここではｐ＝５（ｍｍ）と設定し試作した。ガラスを放物面状に加工した後、表面を鏡面研磨しＡｌを蒸着しさらにＳｉＯ保護膜をコーティングした。１２の光学フィルターとしては、ダイクロイックフィルター（朝日分光、Ｃｙ５−Ｅｍｉｓｓｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）を用いた。１３、１４のシリンドリカルレンズとしては、平凸シリンダーレンズ（シグマ光機、２０ｍｍｘ４０ｍｍ：１枚、２０ｍｍｘ４０ｍｍ：１枚）を２枚用いた。１５の光センサーとしては、フォトダイオード（浜松ホトニクス、Ｓ２８３３−０１、平凸シリンダーレンズ）を用いた。１６のキャップとしては、黒色のＡＢＳ樹脂を用い外部から余計な迷光が入らないようにした。また、２０の支持体には透明なＰＳ製のものを用いた。
【００３５】
リフレクター１１、キャップ１６と支持体２０は接着剤で張り合わされ、検体や洗浄液が漏れ出さないように工夫した。円筒型光導波路１７としては、長さが４０ｍｍ、直径１ｍｍφのＰＳ製の棒を用いた。また光の伝達ロスを低減するため、入射光の端面から長さ５ｍｍの範囲にテーパー形状を設けた。テーパーの形状は端面の直径が１．５ｍｍ、端面から５ｍｍの点で直径１ｍｍである。  円筒型光導波路１７はキャップ１６に設けられた穴から挿入され、Ｏリングとツバにより検体や洗浄液が漏れ出さないように工夫がなされている。光源１９としては、レーザーダイオード（三洋電機、ＤＬ３０３８−０３３）を用いた。コリメートレンズ１８としては、平凸レンズ２枚（シグマ光機、平凸レンズ５ｍｍφ）を組み合わせて用いた。
【００３６】
光導波路を濃度が１ｘ１０-7ｍｏｌ／ＬのＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製（米製品の蛍光色素））溶液に浸漬したあと、完成した光学系に設置した。レーザーダイオードからレーザー光（波長：約６３８ｎｍ、実効強度：３ｍＷ、１３５Ｈｚの矩形波で変調）を導入したところ、光導波路表面の蛍光がエバネッセント光により励起され、リフレクターによって効率よく集光され、フォトダイオードで高感度に検出されることが確認された。
【００３７】
次に、前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡ抗体（前立腺特異抗原）の検出を試みる。まず光導波路表面にストレプトアビジンを付着させる。それからビオチン修飾したＰＳＡ抗体を吸着させ、免疫センサーを用意し蛍光分析装置にセットする。そして次のプロトコールをおこなう。
（１）Ｃｙ５色素で蛍光標識したＰＳＡ抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（２）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（３）抗原であるタンパク質が混入している溶液を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（４）抗原溶液を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（５）標識抗体を流路に導入し、５分間インキュベートする。
（６）標識抗体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（７）リン酸緩衝液を流路に注入する。
【００３８】
（７）の操作のあとレーザー光を導入し、ＰＳＡたんぱく質の濃度を測定すると、０．１ｎｇ／ｍＬまで非常に感度よく測定されることが確認された。
（実施例２）
実施例１で使用した光学系を用いて、ＤＮＡのハイブリダイゼーション測定をおこなった。光導波路表面にストレプトアビジンを付着させ、ビオチン修飾した２０量体ＤＮＡを吸着し、免疫センサーを用意した。そして次のプロトコールをおこなった。
（１）塩基配列が固定ＤＮＡ（プローブ）と対応する捕捉ＤＮＡ（ターゲットＴ１、２０量体）にＣｙ５色素で蛍光標識した複合体と、塩基配列が一つだけ異なっている２０量体ＤＮＡ（ターゲットＴ２、２０量体）をＣｙ３色素で標識した複合体が混入している検体液を用意する。
（２）検体液を流路に導入した後、５分間インキュベートする。
（３）検体を抜き取り、リン酸緩衝液で洗浄する。
（４）リン酸緩衝液を流路に注入する。
【００３９】
（４）の操作のあとレーザー光を導入し、蛍光強度を測定すると、ＤＮＡの濃度１ｎＭまで感度よく測定されることが確認された。蛍光のスペクトルを分光器（不図示）で測定してみると６７０ｎｍ付近にピークをもつ色素のみが蛍光を発していることが確認され、Ｔ１のＤＮＡだけが特異的に結合していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施形態の一つを表す図である。
【図２】本発明の実施形態の一つを表す図である。
【符号の説明】
【００４１】
１１：リフレクター
１２：光学フィルター
１３、１４：集光レンズ
１５：光センサー
１６：キャップ
１７：円筒型光導波路
１８：レンズ
１９：光源
２０：支持体
２１、２２：検体もしくは洗浄液の注入口、または排出口
２３：リフレクター
２４：流路
２５：流路
２６、２７：検体もしくは洗浄液の注入口、または排出口
【図１】
2005180963.tif 000003
【図２】
2005180963.tif 000004