(57)【要約】【課題】  所望方向所望領域の１本鎖ＤＮＡを簡便かつ効率よく調製できるＤＮＡ増幅方法を提供する。【解決手段】  ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ増幅方法であって、標的塩基配列の３´末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の５´末端側と相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を３´末端側に有する第三プライマーとを用い、前記第一プライマーの融解温度Ｔｍ１、前記第二プライマーの融解温度Ｔｍ２、前記第三プライマーの融解温度Ｔｍ３が下式に示す関係を有し、（式）Ｔｍ１＜Ｔｍ３かつＴｍ２＜Ｔｍ３  アニール温度Ｔａ（但しＴａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２）でＰＣＲサイクルを行う第一過程と、アニール温度Ｔｂ（但しＴｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３）でＰＣＲサイクルを行う第二過程とを有することを特徴とするＤＮＡ増幅方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ増幅方法であって、
標的塩基配列の３´末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の５´末端側と相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を３´末端側に有する第三プライマーとを用い、
前記第一プライマーの融解温度Ｔｍ１、前記第二プライマーの融解温度Ｔｍ２、前記第三プライマーの融解温度Ｔｍ３が下式に示す関係を有し、
（式）Ｔｍ１＜Ｔｍ３かつＴｍ２＜Ｔｍ３
アニール温度Ｔａ（但し、Ｔａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２）でＰＣＲサイクルを行う第一過程と、アニール温度Ｔｂ（但し、Ｔｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３）でＰＣＲサイクルを行う第二過程とを有することを特徴とするＤＮＡ増幅方法。
【請求項２】
前記第三プライマーが、５´末端側に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、リン酸基、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ｇとｃの合計含有量が５０％以上のオリゴヌクレオチド、及びｇとｃの含有量が１５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる化合物を有する請求項１に記載のＤＮＡ増幅方法。
【請求項３】
前記第一過程におけるＰＣＲサイクル数を１０〜３０、前記第二過程におけるＰＣＲサイクル数を１０〜５０とする請求項１または２に記載のＤＮＡ増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野、環境衛生分野、食品衛生分野等における微生物の同定、臨床診断における遺伝子解析等においては、検体由来の２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡを調製し、これを塩基配列決定（シークエンシング）などに用いている。また、ある特殊な配列を持つＤＮＡを検出するために、検体の微量ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅法を行って得られた１本鎖ＤＮＡを用いる技術がある。
【０００３】
１本鎖ＤＮＡを調製する方法としては、非対称ＰＣＲ（ポリメレース・チェイン・リアクション）法が一般的である。
従来、非対称ＰＣＲ法として、例えば、フォワードのプライマー、リバースのプライマーの濃度に、互いに偏りを持たせる方法（例えば、非特許文献１参照）、ＲＮＡプライマーの増幅能力の方がＤＮＡプライマーの増幅能力よりも弱いことを利用し、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドプライマーを用いて、プライマー間の増幅能力の差を利用する方法（例えば、非特許文献２参照）、プライマーの融解温度（Ｔｍ）の差を利用する、いわゆるサーマルアシンメトリック法（例えば、非特文献３参照）、ＤＮＡ伸長反応に対するブロッカーを用い、鋳型２本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ１本鎖に対する伸長反応を阻害する方法（例えば、特許文献１、２参照）が提案されている。
【特許文献１】米国特許第５８４９４９７号明細書
【特許文献２】米国特許第５６２７０５４号明細書
【非特許文献１】「プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９８８年、第８５巻、ｐ．７６５２−７６５６
【非特許文献２】「ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｅｃｈ）」、２０００年、第２８巻、第８号、ｅ３５
【非特許文献３】「ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｅｃｈ）」、１９９０年、第１９巻、第１７号、ｐ．４７８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、プライマーの濃度に偏りを持たせる方法では、プライマーの濃度比の設定など、実験条件の最適化が必要である。
プライマーの増幅能力の差を利用する方法では、ＲＮＡプライマーの増幅能力がＤＮＡプライマーのそれよりも弱いことを利用しているため、全体としての増幅効率を低下させてしまう。また、ＤＮＡ／ＲＮＡプライマーの合成が非常に高価である。
プライマーのＴｍの差を利用する方法では、増幅したい配列に対応し、かつ必要なＴｍ差を有する配列が必ずしも存在するとは限らないので、所望の配列の増幅に適用できない場合がある。
ブロッカーを用い、一方の伸長反応を阻害する方法では、片方の伸長反応を阻害するため全体としてＰＣＲの効率を低下させてしまう。また、ＰＣＲの開始後に、ブロッカーを別途添加する等の煩雑な操作が必要となる。さらに、ブロッカーとして使用する合成ＰＮＡ（ペプチド核酸）は非常に高価である。
【０００５】
本発明は前記課題を解決するためになされたもので、所望の方向の、所望領域の１本鎖ＤＮＡを、簡便かつ効率よく調製できるＤＮＡ増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のＤＮＡ増幅方法は、ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ増幅方法であって、
標的塩基配列の３´末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の５´末端側と相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を３´末端側に有する第三プライマーとを用い、
前記第一プライマーの融解温度Ｔｍ１、前記第二プライマーの融解温度Ｔｍ２、前記第三プライマーの融解温度Ｔｍ３が下式に示す関係を有し、
（式）Ｔｍ１＜Ｔｍ３かつＴｍ２＜Ｔｍ３
アニール温度Ｔａ（但し、Ｔａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２）でＰＣＲサイクルを行う第一過程と、アニール温度Ｔｂ（但し、Ｔｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３）でＰＣＲサイクルを行う第二過程とを有することを特徴とする。
【０００７】
前記第三プライマーが、５´末端側に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、リン酸基、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ｇとｃの合計含有量が５０％以上のオリゴヌクレオチド、及びｇとｃの含有量が１５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる化合物を有することが好ましい。
前記第一過程におけるＰＣＲサイクル数を１０〜３０、前記第二過程におけるＰＣＲサイクル数を１０〜５０とすることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＤＮＡ増幅方法によれば、所望の方向の、所望領域の１本鎖ＤＮＡを、簡便かつ効率よく調製することができる。しかも、ＤＮＡ増幅産物において、従来になく高い含有率および絶対量をもって、１本鎖ＤＮＡを生成させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＤＮＡ増幅方法は、ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ増幅方法であって、標的塩基配列の３´末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の５´末端側に相同な塩基配列を有する第二プライマーと、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を３´末端側に有する第三プライマーとを用いる。
標的塩基配列（以下、「標的配列」という）とは、本発明の方法により増幅しようとする領域であって、５´末端から３´末端まで特定順に配列された塩基からなる塩基配列をいう。この増幅される領域は、例えばその機能等に着目した場合、センス鎖であってもよいし、該センス鎖に相補的なアンチセンス鎖であってもよい。
以下、「塩基配列」を、単に「配列」と称する場合がある。
【００１０】
本発明のＤＮＡ増幅方法における鋳型は、ＰＣＲにおいて１本鎖ＤＮＡを供給しうるものであれば、特に限定されず、２本鎖ＤＮＡであっても、１本鎖ＤＮＡであってもよい。このような鋳型（鋳型ＤＮＡ）として、例えば、検体から調製されたＤＮＡ画分、ＤＮＡ画分から予め公知のＰＣＲ法により増幅された２本鎖ＤＮＡや、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）の鋳型として用いられるｍＲＮＡ等から得られたｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）等が挙げられる。
後述の通り、鋳型ＤＮＡ中に、標的配列及び／又は標的配列に相補的な塩基配列が含まれると、本発明による標的配列の増幅が進行する。
【００１１】
本発明において、第一〜第三プライマーとしては、第一プライマーの融解温度Ｔｍ１、第二プライマーの融解温度Ｔｍ２、第三プライマーの融解温度Ｔｍ３が、下式（１）に示す関係を有するようなものを用いる。
（式）Ｔｍ１＜Ｔｍ３かつＴｍ２＜Ｔｍ３  ・・・（１）
融解温度とは、２本鎖核酸が熱変性して１本鎖になる温度である。プライマーの融解温度を求めるには、例えば下記（ａ）〜（ｃ）の測定方法が挙げられる。
（ａ）温度条件を変化させながら、プライマーの波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定する。得られた温度条件−吸光度関数における変曲点を、そのプライマーの融解温度Ｔｍとする。
（ｂ）計算値を測定値に代用する。例えば、中山広樹著、秀潤社、「別冊細胞工学  バイオ実験イラストレイテッド  ３＋  本当に増えるＰＣＲ」、ｐ．２５−２７に記載の計算式及び推定結果を用いることができる。
（ｃ）プライマーを含む１本鎖とその相補鎖からなる核酸２本鎖を形成させた後、２本鎖に入り込む物質（いわゆるインターカレーター；例えば、臭化エチジウム、「サイバーグリーンＩ」等）を加える操作を行う。この操作を各種温度条件下で行い、得られた温度条件−蛍光強度度関数における変曲点を、そのプライマーのＴｍとする。
本発明においては、Ｔｍを求める方法は制限されず、第一〜第三プライマーについて共通の方法を適用して得られたＴｍ１、Ｔｍ２、Ｔｍ３の値が上記式（１）を満たしていればよい。なお、上記に例示したうち（ｂ）の方法が簡便であり、また（ｃ）の方法が通常よく用いられる。また、第一過程及び第二過程で実際に用いる反応条件を再現した条件下で融解温度を求めることが好ましい。
【００１２】
本発明に用いられる第一プライマーは、標的配列の３´末端側に相補的である。すなわち、前記標的配列の３´末端側に位置する特定塩基配列に対し相補的な塩基配列を、少なくとも一部に有する。第一プライマーは、前記標的配列に対し相補的な塩基配列のみからなることが好ましい。
第二プライマーは、当該標的配列の５´末端側に相同な塩基配列を有する。すなわち、当該標的配列の５´末端側に位置する特定塩基配列と比較して、５´から３´に向けて同一順序の塩基配列を、少なくとも一部に有する。
第三プライマーは、その３´末端側に、前記第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側の一部塩基配列と相同な塩基配列を有する。この第三プライマーとして、前記第二プライマーの一部塩基配列と相同な塩基配列を有するものを用いるか、前記第一プライマーの一部塩基配列と相同な塩基配列を有するものを用いるかによって、後述のように、増幅される核酸鎖の方向を任意に制御することが可能である。
以下、第二プライマー又は第一プライマーの５´末端側と、第三プライマーの３´末端側とにそれぞれ位置する、第二プライマー又は第一プライマーと、第三プライマーとの互いに相同な配列を「共通配列」と称する。この共通配列は、標的配列、又は標的配列と相補的な配列に、ハイブリダイズし得る配列であっても、ハイブリダイズし得ない配列であってもよい。
このように、本発明においては、上記の共通配列が、標的配列、又は標的配列と相補的な配列にハイブリダイズし得ない配列であってもよいから、所望の標的配列の増幅に寄与し、かつ式（１）に示す関係を満たす第三プライマーの準備が容易である。
【００１３】
本発明のＤＮＡ増幅方法は、前記第一〜第三プライマーを用い、アニール温度Ｔａ（但し、Ｔａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２）でＰＣＲサイクルを行う第一過程と、アニール温度Ｔｂ（但し、Ｔｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３）でＰＣＲサイクルを行う第二過程とを有することを特徴とする。
具体的には、ＰＣＲ反応液に、後に詳述する第一過程および第二過程を行うことで実施できる。ＰＣＲ反応液は、鋳型ＤＮＡと、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド３リン酸）と、ＤＮＡポリメレースと、第一〜第三プライマーからなるプライマーセットを含有するものとして、公知の方法で調製することができる。ＤＮＡポリメレースとしては、耐熱性ポリメレースが好ましく、Ｔａｑポリメレースとして提供されているものが例示できる。
なお、不活性化されたＤＮＡポリメレースを使用する場合は、第一過程の前に、公知の条件でＤＮＡポリメレースの活性化ステップを行っておく。
【００１４】
（第一過程）
まず、アニール温度Ｔａ（但し、Ｔａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２）でＰＣＲサイクルを行う第一過程を行う。
例えば、ＰＣＲ反応液に対し、下記（１）〜（３）のステップからなるＰＣＲサイクル（Ｉ）を、所望の回数行う。
（１）２本鎖ＤＮＡの変性温度に制御する変性ステップ、
（２）Ｔａ≦Ｔｍ１かつＴａ≦Ｔｍ２を満たすアニール温度Ｔａに温度制御するアニーリングステップ、
（３）ＤＮＡポリメレースによるＤＮＡ伸長反応に適した条件に温度制御する伸長ステップ。
なお、上記ステップ（２）および（３）に適した温度条件を設定し、ステップ（２）および（３）を同時に行ってもよい。
【００１５】
（第二過程）
ついで、アニール温度Ｔｂ（但し、Ｔｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３）でＰＣＲサイクルを行う第二過程を行う。
例えば、下記（４）〜（６）のステップからなるＰＣＲサイクル（ＩＩ）を、所望の回数行う。
（４）所望の変性温度に制御する変性ステップ、
（５）Ｔｍ１＜ＴｂかつＴｍ２＜ＴｂかつＴｂ≦Ｔｍ３を満たすアニール温度Ｔｂに温度制御するアニーリングステップ、
（６）ＤＮＡポリメレースによるＤＮＡ伸長反応に適した条件に温度制御する伸長ステップ。
なお、上記ステップ（５）および（６）に適した温度条件を設定し、ステップ（５）および（６）を同時に行ってもよい。
【００１６】
鋳型ＤＮＡに、標的配列及び／又は標的配列に相補的な塩基配列が含まれるとき、ＰＣＲサイクル（Ｉ）および（ＩＩ）を行うことにより、標的配列の増幅が進行する。
例えば、第三プライマーとして、前記第二プライマーとの共通配列を有するものを用いた場合、以下の反応が進行する。
鋳型が２本鎖ＤＮＡであり、標的配列を含むとき、ＰＣＲサイクル（Ｉ）を行うことにより、第一プライマーが、鋳型２本鎖ＤＮＡのうち標的配列の存在する方の片側１本鎖ＤＮＡにアニーリングする。また、第二プライマーのうち標的配列の５´末端に相同な領域が、他方の１本鎖ＤＮＡにアニーリングして、第一、第二プライマーをそれぞれ起点（５´末端）とするＤＮＡ伸長反応が進行し、第二プライマーを起点（５´末端）とする伸長ＤＮＡ鎖と、第一プライマーを起点とする伸長ＤＮＡ鎖とがそれぞれ生成する。
鋳型が１本鎖ＤＮＡであり、標的配列を含むとき、ＰＣＲサイクル（Ｉ）を行うことにより、まず第一プライマーが当該１本鎖ＤＮＡにアニーリングし、第一プライマーを起点とする伸長ＤＮＡ鎖が生成する。ついで、この伸長ＤＮＡ鎖に第二プライマーがアニーリングして、第二プライマーを起点とし、第一プライマーに相補的な配列を終点（３´末端）とする伸長ＤＮＡ鎖が生成する。
鋳型が１本鎖ＤＮＡであり、標的配列に相補的な塩基配列を含むとき、ＰＣＲサイクル（Ｉ）を行うことにより、まず第二プライマーが当該１本鎖ＤＮＡにアニーリングし、第二プライマーを起点とする伸長ＤＮＡ鎖が生成する。ついで、この伸長ＤＮＡ鎖に第一プライマーがアニーリングして、第一プライマーを起点とし、第二プライマーに相補的な配列を終点（３´末端）とする伸長ＤＮＡ鎖が生成する。
第二、第三プライマーの有する共通配列が標的配列、又は標的配列と相補的な配列にハイブリダイズし得ない場合は、ＰＣＲサイクル（Ｉ）開始時のＰＣＲ反応液には、第三プライマーがハイブリダイズしうるＤＮＡが存在しない。一方、前記共通配列が標的配列、又は標的配列と相補的な配列にハイブリダイズし得る場合は、ＰＣＲサイクル（Ｉ）開始時のＰＣＲ反応液中に、第三プライマーがハイブリダイズしうるＤＮＡは存在する。
いずれの場合も、ＰＣＲサイクル（Ｉ）を繰り返すと、５´末端に第一プライマーを有し、３´末端に、共通配列に相補的な配列を有する伸長ＤＮＡ鎖（Ｉ）を含んだＰＣＲ産物が得られる。
【００１７】
この伸長ＤＮＡ鎖（Ｉ）の３´末端配列には、第二プライマー中の共通配列と、第三プライマー中の共通配列の双方がハイブリダイズしうる。したがって、伸長ＤＮＡ鎖（Ｉ）が生成した後に、さらに変性、アニーリング、伸長ステップを含むＰＣＲサイクル（Ｉ）が行われることで、第一〜第三プライマーがＤＮＡ伸長反応に貢献し、第一プライマーと相同な配列（５´末端側）から、上記共通配列に相補的な配列（３´末端側）にいたる増幅断片が多量に蓄積される。
【００１８】
ＰＣＲサイクル（ＩＩ）において、アニール温度Ｔｂを上記範囲とすることにより、第一、第二プライマーはいずれも他のヌクレオチド鎖に対してアニーリングし得ない。一方、第三プライマーは、第一過程によって得られた第一プライマーと相同な配列から上記共通配列に相補的な配列にいたる増幅断片の３´末端側にアニーリングし、アニーリングした第三プライマーの３´末端にｄＮＴＰが付加するＤＮＡ伸長反応が進行する。
このようなＰＣＲサイクル（ＩＩ）を繰り返すことにより、第三プライマーを５´末端に有し、以下３´末端まで標的配列と相同な配列からなる１本鎖ＤＮＡが蓄積される。
【００１９】
以上では、第三プライマーとして、前記第二プライマーとの共通配列を有するものを用いた場合の反応を例示した。一方、第三プライマーとして、前記第一プライマーとの共通配列を有するものを用いれば、上記でいう標的配列と相補的な核酸鎖を生成させることができる。
【００２０】
このように、第一過程によって、第三プライマーが相補的に結合しうる鋳型が多量に蓄積され、さらに第二過程によって、プライマーのうち第三プライマーのみがＤＮＡ伸長反応に貢献するので、第三プライマーをフォワードプライマーとする１本鎖ＤＮＡの生成が非常に効率よく進み、標的配列が増幅されてなる１本鎖ＤＮＡが効率よく生成する。
【００２１】
第一および第二過程を行った後、ＰＣＲ反応液を所望の温度に制御することができる。なお本発明によれば、このとき比較的低温に制御しても、増幅された１本鎖ＤＮＡが２本鎖を形成するおそれは少ない。
【００２２】
図１、２を参照して、本発明の一実施態様による標的配列の増幅過程を例示する。この態様は、鋳型が標的配列を含む２本鎖ＤＮＡであり、標的塩基配列の３´末端側に相補的な第一プライマーと、当該標的塩基配列の５´末端側と相同な塩基配列からなる第二プライマーと、この第二プライマーの全域と相同な共通配列を３´末端側に有する第三プライマーとを用いた例である。図１、２において、矢印の矩形端はＤＮＡの５´末端を示し、尖端は３´末端を示す。
図１ａに示す鋳型１０は、その片側１本鎖ＤＮＡに標的配列１２を含む。
ＰＣＲサイクル（Ｉ）の実施により、図１ｂに示すように、第一プライマー１４が、鋳型２本鎖ＤＮＡのうち標的配列１２の存在する方の片側１本鎖ＤＮＡにアニーリングする。また、第二プライマー１６が、他方の１本鎖ＤＮＡにアニーリングする。
そして、図１ｃに示すように、第一、第二プライマーをそれぞれ起点（５´末端）とするＤＮＡ伸長反応が進行し、第二プライマー１６を起点（５´末端）とする伸長ＤＮＡ鎖１７と、第一プライマー１４を起点とする伸長ＤＮＡ鎖１８とがそれぞれ生成する。
ＰＣＲサイクル（Ｉ）を繰り返すと、図１ｄ、ｅに示されるように、５´末端に第一プライマー１４を有し、３´末端に、第二プライマーに相補的な配列１６０を有する伸長ＤＮＡ鎖１２０が生成する。
【００２３】
ＰＣＲサイクル（ＩＩ）の実施により、図２に示すように、この例では第二プライマーの全域と相同な共通配列１６を３´末端側に有する第三プライマー２０が、伸長ＤＮＡ鎖１２０の３´末端側にアニーリングし、ＰＣＲサイクル（ＩＩ）を繰り返すことにより、第三プライマー２０を５´末端に有し、以下３´末端まで標的配列１２からなる１本鎖ＤＮＡが蓄積される。
【００２４】
（ＤＮＡ増幅産物）
第一および第二過程を経て得られるＤＮＡ増幅産物は、標的配列を含む２本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合、標的配列を含む１本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合、及び標的配列に相補的な配列を含む１本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた場合のいずれにおいても、第一、第二、及び第三プライマーの組み合わせに対応した標的配列が増幅されてなる１本鎖ＤＮＡを、多量に含む。
ＤＮＡ増幅産物において、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡの生成比は、例えばＤＮＡ増幅産物に蛍光標識操作を行った後に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたバンドの蛍光強度を測定することで評価できる。なお、予め第三プライマーに蛍光標識物質を結合させておけば、上記標識操作が必要なく、また、所望の５´末端側配列を有する１本鎖ＤＮＡが実際に生成されたことを、容易に確認できる。
【００２５】
（第一プライマー）
第一プライマーの融解温度Ｔｍ１と、第二プライマーの融解温度Ｔｍ２の関係は、公知のＰＣＲ法で用いられるプライマーセットにおけるのと同様であり、特に限定されないが、Ｔｍ１≒Ｔｍ２を満たすことが好ましい。ここで、Ｔｍ１≒Ｔｍ２とは、ある特定のアニーリング温度でＰＣＲ反応を行ったときに、第一のプライマーおよび第二のプライマーが双方ともプライマーとして有効に機能する程度に、Ｔｍが近似していることを示す。
【００２６】
（第二プライマー）
第二プライマーは、前記標的配列の５´末端側に相同な塩基配列を、少なくとも一部に有する。
また、上述の通り、第二プライマー又は前記第一プライマーの５´末端側には、第三プライマーの３´末端側と相同な共通配列が存在する。
第二、第三プライマーの融解温度Ｔｍ２、Ｔｍ３は、Ｔｍ２＜Ｔｍ３の関係を満たす。このような関係を満たす第二プライマーを得るために、例えば、第二プライマーのＧＣ含量を増減させる、第二プライマーの全長を増減させる、これらの方式を組み合わせる等により、Ｔｍ２を調整することができる。
【００２７】
（第三プライマー）
【００２８】
第三プライマーは、第二プライマー又は前記第一プライマー５´末端側の一部塩基配列に相同な共通配列を３´末端側に有する。
第三プライマーは、第一、第二プライマーに対して、Ｔｍ１＜Ｔｍ３かつＴｍ２＜Ｔｍ３の関係を満たす。
このように第一、第二プライマーに対して高い融解温度を有し、かつ、これらに対して適度な融解温度差を示す第三プライマーを得るために、例えば、下記の方式でＴ３を調整することができる。
第三プライマーのＧＣ含量を増減させる方式。
第三プライマーの全長を増減させる方式。
また、第三プライマーの５´末端側に、後述の特定化合物群、特定塩基から選択される化合物を結合させることでＴｍ３を制御する方式も可能である。
また、これらの方式を組み合わせてもよい。
本発明において用いる第二プライマー又は前記第一プライマーと第三プライマーは共通配列を有するから、この共通配列の長さを増減させることで、第二又は第一プライマーと第三プライマーとの双方の全長が増減する。したがって、本発明においては、共通配列の長さを増減させることで、任意の標的配列に対応する第二又は第一プライマーと、この第二又は第一プライマーと所望のＴｍ差を有する第三プライマーという組み合わせを容易に得て、反応に供することができる。
【００２９】
第三プライマーは、５´末端側に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、リン酸基、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、及びＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１（以下、「特定化合物群」という）、並びに、ｇとｃの合計含有量が５０％以上のオリゴヌクレオチド、及びｇとｃの含有量が１５％以上で２塩基以上のオリゴヌクレオチド（以下、「特定塩基」という）からなる群より選ばれる化合物を有することが好ましい。
特定化合物群、特定塩基から選択される化合物を有することにより、第三プライマーのＴｍ３をさらに容易に調整することができる。なお、特定塩基は、標的配列に対して非特異的な配列であることが好ましい。
【００３０】
特定化合物群の表示において、ＤＩＧとはジゴキシゲニンであり、ＤＮＰとはジニトロフェニルであり、ＴＡＭＲＡとはカルボキシテトラメチルローダミンであり、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄとは１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−Ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ´ｊ´］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−［２（ｏｒ４）−［［［６−（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘｏｈｅｘｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−４（ｏｒ２）ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒｓａｌｔであり、ＲＯＸとはローダミンＸであり、ＸＲＩＴＣとはローダミンＸイソチオシアネートであり、ＦＩＴＣとはフルオレセインイソチオシアネートであり、６−ＦＡＭとは６−カルボキシフルオレセインであり、ＴＥＴとはテトラクロロフルオレセインであり、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−ｓｔｙｒｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３，５−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−（４−ｐｈｅｎｙｌ−１，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｙｌ）−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒである。
【００３１】
特定塩基の第一の態様は、ｇとｃの合計含有量（ＧＣ含量）が５０％以上のオリゴヌクレオチドである。ＧＣ含量は高い方が、ＤＮＡ増幅反応の効率が高くなる傾向があり、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、そして１００％とすることが可能である。ＧＣ含量をこれらの何れの割合で選択するかは、特定塩基自体の長さ、特定塩基自体と増幅する配列やプライマーとの間に相補性が生じないようにすること等を考慮することにより、当業者が適宜選択することができるものである。特定塩基が長くなりすぎると、ＤＮＡ増幅反応の効率は低下する場合もあるため、特定塩基は４０塩基以下であることが好ましい。また、プライマーダイマーを形成させにくくするため、ｇとｃの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合、ａとｔの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合で含まれることが好ましい。
【００３２】
特定塩基の第二の態様は、ＧＣ含量が１５％以上で、かつ２塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。ＧＣ含量が１５％未満のオリゴヌクレオチドを結合させると、ＤＮＡ増幅反応の効率が低下することもある。また、ｇとｃの合計の含有量に対するｇとｃのうち多い方の塩基の含有量が７０％以上、ａとｔの合計の含有量に対するａとｔのうち多い方の塩基の含有量が７０％以上であることが好ましい。
【００３３】
特定塩基として、具体的な好ましい塩基配列としては、例えば以下の２〜８塩基のものを例示することができる。また、９塩基以上の配列については、以下の２〜８塩基のものを適宜組み合わせればよい。なお、Ｓとはｃ又はｇを表し、Ｗとはａ又はｔを表す。
ＳＳ、ＳＷ、ＷＳ、ＳＳＳ、ＳＳＷ、ＳＷＳ、ＷＳＳ、ＳＳＳＳ、ＳＳＳＷ、ＳＳＷＳ、ＳＷＳＳ、ＷＳＳＳ、ＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＷＳ、ＳＳＷＳＳ、ＳＷＳＳＳ、ＷＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＳＷＳＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＷＷ、ＳＳＳＳＳＷＳＷ、ＳＳＳＳＷＳＳＷ、ＳＳＳＷＳＳＳＷ、ＳＳＷＳＳＳＳＷ、ＳＷＳＳＳＳＳＷ、ＷＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳＷＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳＷＳ、ＳＳＷＳＳＳＷＳ、ＳＷＳＳＳＳＷＳ、ＷＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＷＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳＷＳＳ、ＳＷＳＳＳＷＳＳ、ＷＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＷＷＳＳＳ、ＳＳＷＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳＷＳＳＳ、ＷＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＷＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＷＳＳＳＳ、ＷＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＷＳＳＳＳＳ、ＷＷＳＳＳＳＳＳ。
また、具体的には、ａｇｔｃ、ａａｇｔ、ｇｇａｃ又はｇｇｇｃの繰り返し単位からなる２０塩基までのオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００３４】
また、特定塩基は２次構造を形成して増幅反応を阻害しないような配列を有することが好ましいが、より具体的には配列間で塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形成がないことが特に好ましい。少なくとも、連続して塩基対が形成されないことが好ましい。さらに、第三プライマー中の他の配列に対しても、塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形成が無いことが特に好ましい。
【００３５】
第三プライマーに含有される化合物が前記特定塩基である場合、第三プライマーの５´末端（すなわち特定塩基の５´末端）には、標識物質として公知の放射性同位体、蛍光物質等が結合されていてもよい。
【００３６】
本発明では、第三プライマーの３´末端側と相同な領域をもつ第二プライマー又は第一プライマーと第三プライマーを併用することで、増幅したい標的配列に対応し、しかも、第一、第二プライマーよりも高いＴｍを有するプライマー（第三プライマー）が、第二プライマーの５´末端側に対して相同な共通配列を有したヌクレオチドとして、容易に準備できる。すなわち、上式（１）を満たすＴｍ３を有して第二過程において優先的に機能し、かつ所望の方向（５´側から３´側への配列順）を有する標的配列の増幅に貢献する第三プライマーが容易に提供される。よって、従来のいわゆるサーマルアシンメトリック法では困難であった、所望配列に対応し、かつ必要なＴｍを有するプライマーの提供が、容易に行える。さらには、第三プライマーの５´末端側に、任意の化合物、例えば上記特定化合物あるいは特定塩基を含有させうることから、所望の特性を有する第三プライマーの準備を特に容易に行える。
【００３７】
以上説明したように、本発明のＤＮＡ増幅方法によれば、全体としてのＰＣＲ効率を低下させる要因が必要とされず、第一過程、第二過程が、一方向の１本鎖ＤＮＡの増幅に貢献する。そして、鋳型が２本鎖ＤＮＡである場合、鋳型が１本鎖ＤＮＡである場合のいずれにおいても、第一、第二、及び第三プライマーの設定に対応して、鋳型ＤＮＡの方向に関らず所望の方向を有し、所望の領域に対応するような１本鎖ＤＮＡを効率よく得ることができる。
さらには、ＲＮＡプライマー、ＰＮＡ等の高価な試薬や、特別の装置を用いる必要がない。また、ブロッカーを別途添加する操作を必要とせずワンステップ操作で増幅産物を得ることができ、またプライマーの濃度比の検討などが不要であるため、簡便に全工程を終えることができる。したがって、本発明のＤＮＡ増幅方法は、簡便かつ安価に実施することができる。
【００３８】
より効率よく所望の１本鎖ＤＮＡを得るためには、ＰＣＲサイクル（Ｉ）のサイクル数を１０〜３０、ＰＣＲサイクル（ＩＩ）のサイクル数を１０〜５０とすることが好ましい。
【００３９】
本発明の方法で得られたＤＮＡ増幅産物は、１本鎖ＤＮＡを用いて遺伝子の１塩基多型（ＳＮＰｓ）を解析するため等に好適である。したがって、医療分野、環境衛生分野、食品衛生分野等における微生物の同定、臨床診断における遺伝子解析等に有利に用いられる。
【実施例】
【００４０】
（合成例１）鋳型ＤＮＡ
腸炎ビブリオのストレイン（整理番号；Ｖ８９−０５６、株式会社ニチレイ）から抽出した染色体ＤＮＡを、実施例における鋳型として用いた。
【００４１】
（合成例２）プライマー
配列番号１で示される塩基配列を有する腸炎ビブリオ毒素遺伝子（１５０塩基対）を標的配列とし、その増幅用として、以下のプライマーを合成した。
第一プライマー：塩基配列を配列番号２に示す。融解温度Ｔｍ１＝５０℃
第二プライマー：塩基配列を配列番号３に示す。融解温度Ｔｍ２＝５０℃
第三プライマー：配列番号４に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドに、Ｃｙ３を結合させたプライマー。融解温度Ｔｍ３＝６２℃
【００４２】
（ＰＣＲ装置）  
ＰＣＲ装置として、ＧｒａｄｉｅｎｔＢｌｏｃｋＭｏｄｕｌｅ（グラジエントブロックモジュール）を装着したＨＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲＥｘｐｒｅｓｓを用いた。
【００４３】
（実施例１）
合成例１で得た鋳型ＤＮＡと、合成例２で得た第一〜第三プライマーと、Ｔａｑポリメレース（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ」）と、このＴａｑポリメレースに付属のｄＮＴＰ（「Ａｍｐ  ｄＮＴＰ  ＭＩＸ」）とを、付属のＰＣＲバッファ（「Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  １０ｘＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ」）に溶解してＰＣＲ反応液を調整した。
このＰＣＲ反応液に、９５℃、１０分のポリメレース活性化ステップに引き続き、下記条件のＰＣＲサイクルを行った。
（１）変性：９５℃、４０秒
（２）アニーリング：４５℃、３０秒
（３）伸長：７２℃、１分
上記（１）〜（３）を２０サイクル繰り返した。
（４）変性：９４℃、４０秒
（５）アニーリング：４５℃〜６０℃の６段階グラジエント（グラジエントブロックモジュールのレーン番号１〜６）、３０秒
（６）伸長：７２℃、１分
上記（４）〜（６）を４０サイクル繰り返した。
その後、７２℃で１０分間保持の後、４℃まで冷却し、ＤＮＡ増幅産物を回収した。
【００４４】
（評価方法）
得られた増幅産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。解析条件は以下の通りとした。
泳動条件
ゲル濃度：５％、泳動条件：１ｘＴＢＥ、１００Ｖ、３０分
解析条件
使用機器：フルオロ・イメージアナライザー（「ＦＬＡ−８０００」、富士写真フィルム社製）、検出波長：５３２ｎｍ
ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の各々に対応する、検出波長５３２ｎｍにおける蛍光強度を、図３に示す。
実施例１では、多量の１本鎖ＤＮＡが得られた。その中でも、アニール温度４５℃で２０サイクルの後、アニール温度を約１０℃以上上昇させて４０サイクルＰＣＲを行った条件（レーン番号５〜６）において、特に２本鎖ＤＮＡよりも多い１本鎖ＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡに対する量比；１．５〜３程度）が得られた。
【００４５】
（比較例１）
第三プライマーを用いない以外は、実施例１と同様に行い、ＤＮＡ増幅産物を解析した。
増幅産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、銀染色を行ったところ、２本鎖ＤＮＡのサイズに相当するバンドは検出されたが、１本鎖ＤＮＡに相当するバンドは、いずれのアニール温度条件でも検出されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の一実施態様による増幅過程を示す概念図である。
【図２】本発明の一実施態様による増幅過程を示す概念図である。
【図３】実施例で得られたＤＮＡ増幅産物中の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対応する蛍光強度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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