(57)【要約】    【課題】  ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌を用いた発酵法により、不飽和脂肪酸又はその誘導体を製造する場合に、不飽和脂肪酸又はその誘導体をより高濃度且つ高純度で、より有利な条件で培地中に生産できる方法を提供する。    【解決手段】  ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する不飽和脂肪酸生産菌を用いて、脂肪酸又はその誘導体から不飽和脂肪酸又はその誘導体を製造する方法であって、濃度０．１Ｍ以上でｐＨ７．０〜９．０のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体に定常期のシードを作用させることを特徴とする不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する不飽和脂肪酸生産菌を用いて、脂肪酸又はその誘導体から不飽和脂肪酸又はその誘導体を製造する方法であって、濃度０．１Ｍ以上でｐＨ７．０〜９．０のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体に定常期のシードを作用させることを特徴とする不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法。
【請求項２】
不飽和脂肪酸生産菌が、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ−Ｔ６４５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１８２）である請求項１項記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いる不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不飽和脂肪酸又はその誘導体は、香料、薬剤、塗料、界面活性剤、化粧品等として、或いはこれらの合成原料として広く利用されている。
従来、不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造には、エキノスポラジウム（Echinosporangium）属糸状菌、モルテイエレラ（Mortierella）属糸状菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌等の微生物を用いた発酵法が知られている。
【０００３】
このうち、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌を用いた発酵法は、不飽和脂肪酸又はその誘導体が菌体外に生産されることから回収が容易であるという点で好ましいが（特許文献１参照、特許文献２参照）、その生産性及び純度は十分であるとはいえなかった。
【０００４】
そこで、本発明者らは、不飽和脂肪酸又はその誘導体の生産条件を検討したところ、リン酸緩衝液の存在下で、ロドコッカス属細菌を作用させた場合に、当該細菌が増殖と連動して不飽和脂肪酸又はその誘導体を高濃度且つ高純度で培地中に生産できることを見出し、特許出願した（特許文献３参照）。
しかしながら、この方法においては、濃度０．２５Ｍ以上のリン酸緩衝液を用いることが必要であった。
【特許文献１】特公平２−６５１６号公報
【特許文献２】特公平４−１２７１８号公報
【特許文献３】特開２００２−２６２８９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌を用いた発酵法により、不飽和脂肪酸又はその誘導体を製造する場合に、不飽和脂肪酸又はその誘導体をより高濃度且つ高純度で、より有利な条件で培地中に生産できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、不飽和脂肪酸又はその誘導体を効率よく生産する条件を更に検討したところ、培養に供するロドコッカス属細菌として、シード培養において定常期に達したシードを用いることにより、不飽和脂肪酸又はその誘導体を高濃度且つ高純度で培地中に生産でき、また、より低濃度のリン酸緩衝液の存在下でも効率よく生産できることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する不飽和脂肪酸生産菌を用いて、脂肪酸又はその誘導体から不飽和脂肪酸又はその誘導体を製造する方法であって、濃度０．１Ｍ以上でｐＨ７．０〜９．０のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体に定常期のシードを作用させることを特徴とする不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、不飽和脂肪酸又はその誘導体を、より有利な条件で、微生物菌体外に極めて効率よく且つ高純度で製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の不飽和脂肪酸又はその誘導体の製造法は、濃度０．１Ｍ以上でｐＨ７．０〜９．０のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体にロドコッカス（Rhodococcus）属に属する不飽和脂肪酸生産菌の定常期のシードを作用させるものである。
ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する不飽和脂肪酸生産菌としては、飽和脂肪酸から不飽和脂肪酸を生産する能力を有するものであればよく、例えばロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ−Ｂ−３Ｍ株（ＦＥＲＭ ＢＰ１５３１）や、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ＫＳＭ−Ｔ６４５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１８２）等が挙げられる。このうち、不飽和脂肪酸又はその誘導体の生産量の点からロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｔ６４５株が特に好ましい。ロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｔ６４５株は、ロドコッカス・エスピーＫＳＭ−Ｂ−３Ｍ株に紫外線を照射して得られた変異株である。
【００１０】
定常期のシードとは、シード培養において、増殖と死滅が平衡状態にある菌体又は菌体培養液を意味する。すなわち、生菌数の対数を時間に対してプロットした場合に、生菌数が一定数を保っている状態（定常期）（秦藤樹ら編，「微生物学」，修正１１版，廣川書店，昭和５０年２月１５日，ｐ．６９）、或いは生菌数を菌体の濁度で表示した菌体生育度が一定となっている状態（実施例１）にある菌体又は菌体培養液を意味する。
【００１１】
一般に、細菌を用いた発酵生産においては、主発酵（本培養）における誘導期を短縮するようなシードを調製するためにシード培養が行われるが、本発明においては、当該シードとして、シード培養の定常期にあるものを用いる。定常期のシードを用いることにより、指数期（対数増殖期）のシードを用いる場合に比べて不飽和脂肪酸又はその誘導体が効率よく且つ高純度で製造でき、また低濃度のリン酸緩衝液においても良好に製造できる（実施例２、実施例３）。
【００１２】
通常、工業的な微生物反応では指数期にある菌が最も盛んに分裂しているのでその生理活性が強いと考えられ、従って指数期にあるシードが移植や接種に用いられる。これにより、大型培養槽においても速やかに菌の増殖が継続され、反応を速やかに開始することができると考えられている（山根恒夫著，「生物反応工学」，初版，産業図書株式会社，昭和５５年２月２９日，ｐ．１５５）。
従って、シードとして指数期のものよりも定常期のものを用いた場合に良好に不飽和脂肪酸又はその誘導体が製造できたことは、全く意外なことである。
【００１３】
ここで、シード培養は、ロドコッカス（Rhodococcus）属の不飽和脂肪酸又はその誘導体生産菌が、十分に生育するものであればいずれの条件（培地、ｐＨ、温度、培養時間等）でもよく、培養法も通常の微生物の培養方法によればよいが、好ましくは、３０℃で１〜２日間、好気的に培養するのがよい。
例えば、Rhodococcus sp. KSM-T645株をＭＳＧ  ２２５ｇ、酵母エキス３０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4  ３０ｇ、グルコース  ２２５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ７．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２２５ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １８ｍｇ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ９ｍｇ、シリコン系消泡剤（信越化学工業株式会社製）３０ｇをイオン交換水１５Ｌに溶解した培地を入れた３０Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、３０℃、３５０ｒｐｍ、０．５ｖｖｍの条件でシード培養を行った場合には、培養約３０時間目より定常期に移行する（図１）。
また、シードの分離は、得られた培養液をそのまま、或いは培養液から菌体を遠心分離等の方法により回収すればよい。
【００１４】
原料として用いられる脂肪酸としては、炭素数１〜２２、好ましくは１４〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられ、その誘導体としては当該脂肪酸のアルキル（炭素数１〜１０、好ましくは炭素数２〜４）若しくはアリールエステル、第１級若しくは２級アンモニウム塩又はアルカリ金属塩が挙げられる。このうち、ｎ−ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ｎ−テトラデカン酸（ミリスチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）これら脂肪酸のメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等の各エステル、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が好ましい。
【００１５】
斯かる脂肪酸又はその誘導体は、本発明の反応によれば、脂肪酸の炭化水素鎖の特定の位置に不飽和結合が導入された不飽和脂肪酸又はその誘導体に変換される。例えば、パルミチン酸又はそのエステルを原料として用いれば、シス−６−ヘキサデセン酸又はそのエステルを主生成物として得ることができる。
【００１６】
上述した定常期のシード（菌体培養液又は菌体）を、濃度０．１Ｍ以上でｐＨ７．０〜９．０のリン酸緩衝液の存在下、脂肪酸又はその誘導体に作用させることにより本培養が行われる。
ここで、菌体培養液又は菌体は、反応液に対して０．１〜１０％、特に０．５〜５％用いることが好ましく、脂肪酸又はその誘導体は、１〜３０％、特に１０〜２５％であることが好ましい。
【００１７】
本発明において、リン酸緩衝液をｐＨ７．０以上或いは濃度を０．１Ｍ以上とするのは、効率よく不飽和化するためであり、ｐＨを９．０以下とするのは微生物の増殖を確保するためである。斯かる効果の点から、リン酸緩衝液の濃度は０．１Ｍ以上、特に０．１５Ｍ以上が好ましく、ｐＨは７．０以上で９．０以下が好ましい。特に濃度０．１Ｍ〜０．５Ｍで、ｐＨ７．０〜９．０であるものが好ましく、濃度０．１５Ｍ〜０．４Ｍで、ｐＨ７．０〜８．０であるものがより好ましい。
【００１８】
また、リン酸緩衝液としては、いずれの対イオンを有するものでもよいが、リン酸１ナトリウム−リン酸２カリウム又はリン酸１カリウム−リン酸２カリウムが好ましい。
【００１９】
当該反応液中には、菌体の増殖を妨げない限り、更に硫酸マグネシウム塩、硫酸鉄塩、硫酸銅塩、硫酸マンガン塩、窒素源、ビタミン類等を添加することができる。尚、この場合、硫酸マグネシウム塩は０．００５〜１％、好ましくは０．０１〜０．５％、硫酸鉄塩は１〜１００ppm、好ましくは５〜５０ppmで添加することが好ましい。
【００２０】
反応は２０〜３７℃、好ましくは２５〜３０℃の温度条件で、好気的条件下で４８〜１２０時間、特に６０〜９６時間行うことが好ましい。
【００２１】
かくして反応液中に生成した不飽和脂肪酸又はその誘導体は、天然有機化合物等で通常行われている抽出・単離方法により、容易に回収・分離できる。例えば反応液を遠心分離により菌体・油相・水相に分けて油相を分取したり、或いは反応液をそのまま有機溶剤で抽出することにより極めて簡便に目的物を回収できる。また、この反応により高純度の目的物が回収できるが、さらに精製する必要のある場合は通常のカラムクロマトグラフィー、分配抽出、溶媒晶析等により精製単離が可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１  シード培養における菌体生育度経時変化の測定
Rhodococcus sp. KSM-T645株を、グルタミン酸ナトリウム（以下、ＭＳＧと略記）５ｇ、酵母エキス（Deutsche Hefewerke GmbH & Co.oHG製；以下、単に酵母エキスと略記）２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4  ２ｇ、グルコース１０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２ｍｇ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．６ｍｇをイオン交換水１Ｌに溶解した培地３０ｍＬを入れた５００ｍＬ容ひだ付き三角フラスコに１白金耳接種し、３０℃にて１日間、２１０ｒｐｍにて振とう培養を行った。
【００２３】
この培養液すべてを、ＭＳＧ  ２２５ｇ、酵母エキス３０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4  ３０ｇ、グルコース  ２２５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ７．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２２５ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １８ｍｇ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ９ｍｇ、シリコン系消泡剤（信越化学工業株式会社製）３０ｇをイオン交換水１５Ｌに溶解した培地を入れた３０Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、３０℃にて２日間、３５０ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気撹拌培養（シード培養）を行った。
【００２４】
培養中、適当な時間にシード培養液を少量ずつ抜き取り、生理食塩水にて適当に希釈した溶液の吸光度（Ａ６００）を測定して菌体生育度（ＯＤ）を算出した。培養時間に対して菌体生育度を対数にてプロットした結果、本菌株は上記シード培養条件下では、対数増殖期を経た後、培養約３０時間目より定常期に移行することが判った（図１）。
【００２５】
実施例２  生産性及び比率に及ぼすシード培養液の影響
実施例１で適当な時間に抜き取ったシード培養液０．４ｍＬをそれぞれ、ＭＳＧ  ２５ｇ、酵母エキス３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ2Ｏ  １．２ｍｇ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．６ｍｇ、チアミン塩酸塩０．１７ｇを０．３５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに溶解した培地  ２０ｍＬ及びパルミチン酸イソプロピルエステル（以下、ＩＰＰと略記）４．０ｍＬを入れた５００ｍＬ容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０ｒｐｍにて振とう培養を行った。
【００２６】
培養後、培養液に含まれる主生成物、シス−６−ヘキサデセン酸イソプロピルエステル（以下、Ｆ１−ＩＰと略記）を酢酸エチルで抽出してガスクロマトグラフィーによる分析を行い、生産性（生成Ｆ１−ＩＰ量ｇ／培養液１Ｌ）及び比率 [（生成Ｆ１−ＩＰ量／生成Ｆ１−ＩＰ量＋残存ＩＰＰ量）×１００]を算出した。その結果、定常期（培養３０時間目以降）に移行したシード培養液を用いることにより、非常に高い比率（８０〜９０％）の培養液が得られることが明らかとなった（図２）。一方、従来用いていた対数増殖期のシード培養液では、４５〜６０％の比率であった。また、定常期のシード培養液を用いることにより、生産性も若干向上することが判った。
【００２７】
実施例３  生産性及び比率に及ぼす培地中のリン酸緩衝液濃度の影響
Rhodococcus sp. KSM-T645株を、ＭＳＧ  １５ｇ、酵母エキス２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4  ２ｇ、グルコース  １５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２ｍｇ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．６ｍｇをイオン交換水１Ｌに溶解した培地３０ｍＬを入れた５００ｍＬ容ひだ付き三角フラスコに１白金耳接種し、３０℃にて４１．５時間、２１０ｒｐｍにて振とう培養を行いシード培養液を得た。
【００２８】
この定常期に移行したシード培養液０．４ｍＬを、ＭＳＧ  ２５ｇ、酵母エキス３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １５ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  １．２ｍｇ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．６ｍｇ、チアミン塩酸塩０．１７ｇを各種濃度（０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、あるいは０．４Ｍ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに溶解した培地２０ｍＬ及びＩＰＰ  ４．０ｍＬを入れた５００ｍＬ容ひだ付き三角フラスコに接種し、２６℃にて４日間、２１０ｒｐｍにて振とう培養を行った。
【００２９】
培養後、培養液に含まれる主生成物、Ｆ１−ＩＰを酢酸エチルで抽出してガスクロマトグラフィーによる分析を行い、生産性及び比率を算出した。その結果、０．１０Ｍ以上のリン酸緩衝液を用いることにより高生産性（４５〜５０％）及び高比率（７０〜９０％）を有する培養液の調製が可能であることが明らかとなった（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１はシード培養における菌体生育度経時変化を示したグラフである。
【図２】図２は生産性及び比率に及ぼすシード培養液の影響を示したグラフである。
【図３】図３は生産性及び比率に及ぼす培地中のリン酸緩衝液濃度の影響を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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