(57)【要約】【課題】  光酸発生剤単量体の組成物、該組成物でコーティングされた基板、該光酸発生剤単量体の組成物を利用して基板上に化合物を合成する方法及び該方法によって製造されたマイクロアレイを提供する。【解決手段】  酸に不安定な保護基を有する第１分子層を固体基板上に結合させ、前記第１分子層上に前記単量体ＰＡＧの組成物層をコーティングする方法。次に、前記組成物層を露光させ、熱処理して露光された部分に対応する前記第１分子から酸に不安定な保護基を除去し、前記単量体ＰＡＧの組成物層を洗浄して除去する。活性化された前記第１分子に第２分子を結合させる。【選択図】            図１
2005099005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光酸発生剤単量体及び非イオン性界面活性剤を含む光酸発生剤単量体の組成物。
【請求項２】
前記光酸発生剤単量体は、スルホニウム系および／またはヨードニウム系光酸発生剤単量体であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記スルホニウム系光酸発生剤単量体は、下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一種の光酸発生剤単量体であることを特徴とする請求項２に記載の組成物；
【化１】
2005099005.tif 000010
ここで、Ｒ−はＣＦ３ＳＯ３−またはＣ４Ｆ９ＳＯ３−であり、Ｒ１はＣＨ３であり、
【化２】
2005099005.tif 000011
ここで、Ｒ−はＣＦ３ＳＯ３−またはＣ４Ｆ９ＳＯ３−であり、
【化３】
2005099005.tif 000012
ここで、Ｒ’−はＣＦ３ＳＯ３−、Ｃ４Ｆ９ＳＯ３−、ＣＦ３（ＣＦ２）３ＳＯ３−またはｐ−ＴＳＯ−であり、Ｒ２はヒドロキシル基または水素原子（Ｈ）であり、Ｒ３はヒドロキシル基または水素原子（Ｈ）である。
【請求項４】
前記ヨードニウム系光酸発生剤単量体は、下記式（ＩＶ）および／または（Ｖ）の光酸発生剤単量体であることを特徴とする請求項２または３に記載の組成物；
【化４】
2005099005.tif 000013
ここで、Ｒ−はＣＦ３ＳＯ３−またはＣ４Ｆ９ＳＯ３−であり、
【化５】
2005099005.tif 000014
ここで、Ｒ−はＣＦ３ＳＯ３−、Ｃ４Ｆ９ＳＯ３−、またはｐ−ＴＳＯ−である。
【請求項５】
前記非イオン性界面活性剤はフッ素系界面活性剤であることを特徴とする請求項１ないし請求項４のうち何れか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記フッ素系界面活性剤は、１００％のフルオロ脂肪族重合体エステル、または９５％のフルオロ脂肪族重合体エステルと５％のＮ−メチルピロピドン（ＮＭＰ）との混合物であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のうち何れか１項に記載の組成物でコーティングされた固体基板。
【請求項８】
前記固体基板はシリコン、ガラス、表面改質ガラス、ポリプロピレンまたは活性化されたアクリルアミドからなるものであることを特徴とする請求項７に記載の固体基板。
【請求項９】
（ａ）酸に不安定な保護基を有する第１分子の層を固体基板上に結合させる段階、
（ｂ）前記第１分子の層上に請求項１ないし請求項６のうち何れか１項に記載の前記光酸発生剤単量体の組成物の層をコーティングする段階、
（ｃ）前記組成物の層を露光させ、熱処理して、露光された部分に対応する前記第１分子から酸に不安定な保護基を除去する段階、
（ｄ）前記露光部分及び未露光部分から光酸発生剤単量体の組成物層を洗浄、除去する段階、および
（ｅ）露出された前記第１分子に第２分子を結合させる段階
を含む、基板上に化合物を合成する方法。
【請求項１０】
前記固体基板はシリコン、二酸化ケイ素、ガラス、表面改質ガラス、ポリプロピレンまたは活性化されたアクリルアミドであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は核酸または蛋白質であることを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２分子は核酸または蛋白質の単量体であることを特徴とする請求項９ないし請求項１２のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９ないし請求項１３のうち何れか１項に記載の方法によって製造されたマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光酸発生剤単量体を含む組成物、該組成物でコーティングされる固体基板、該組成物を利用して固体基板上に化合物を合成する（マイクロアレイを製造する）方法及び該方法によって製造されるマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、基板上に生体高分子を合成する方法は公知である。例えば、フォードル（Ｆｏｒｄｏｒ）らは、紫外線に不安定な保護基を有する核酸及びアミノ酸を固体表面上に連結させ、フォトリソグラフィマスクを利用して固体表面の特定部分を露光させて保護基を除去した後、これを光に不安定な保護基を有する核酸またはアミノ酸と反応させて、特定位置で核酸またはアミノ酸を延ばしていく（重合する）新しい合成方法を発表した（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。前記方法は、特定位置に特定の配列及び長さを有するオリゴヌクレオチドプローブを選択的に合成できるので、所望の配列及び長さを有する様々なオリゴヌクレオチドプローブを所定の位置に合成するのに有用な方法である。また、前記方法は半導体製造工程に使われる極微細加工マスクを使用するので、オリゴヌクレオチドプローブの高集積合成に非常に有用である。上記文献では、従来のサンガー方法よりはるかに簡便でかつ速いオリゴヌクレオチドプローブを用いた配列決定方法は高集積のオリゴヌクレオチドプローブを作製するのに有用であることが提示された。しかしながら、光に不安定な保護基を除去する方法は、光源の光度に比例するため、チップの高集積化のための極微細加工に限界がある。
【０００３】
一方、半導体製造工程で微細パターンを形成するために使われるフォトレジスト（ｐｈｏｔｏｒｅｓｉｓｔ：ＰＲ）を利用したフォトリソグラフィ工程は、ＤＮＡチップの集積率を高めるための必須技術として注目されてきた。半導体チップのサイズや容量はフォトリソグラフィ工程での解像度に左右されるために、フォトリソグラフィ工程が半導体とマイクロエレクトロニクスの発展を左右してきたと見られる。フォトリソグラフィ工程はＰＲの溶解度が露光部位と非露光部位とによって異なることを利用するものである。露光部位の溶解度が減少するシステムをネガティブとし、逆の場合をポジティブとして、半導体チップの製造には主にポジティブが使用される。このようなフォトリソグラフィ工程を利用すれば、限られた面積のチップ上により多くの数のオリゴヌクレオチドプローブが配列できる。これまで、フォトリソグラフィ工程を適用した例としては、一般的なＰＲを利用した方法（例えば、特許文献３参照）及びマイクロミラーを利用した方法が挙げられる。このうち、ＰＲを利用したフォトリソグラフィ工程（以下、ＰＲ工程）は既に半導体産業のために広く開発、または商業化されている材料が使用できる長所がある。この方法によれば、光照射によりパターンが形成され、露光された部分を洗浄すれば、その表面に標準的な固相核酸合成反応が起きて、ヌクレオチドが結合する。この時、ＰＲの代表的な例としては、界面との接着力が優秀なジアゾキノン／クレゾール−ノボラックが挙げられるが、これは、ｉ−ライン（３６５ｎｍ）で優秀なパターン特性を示して、半導体の１６メガＤＲＡＭ工程に使われている。しかしながら、このようなＰＲはアルカリ水溶液（［ＯＨ−］＞０.１Ｍ）の条件で現像すると、この条件では塩基のアミノ基を保護するアミド結合が切断してしまうので、このような副作用を防止するために、ＰＲ下にプロテクトコーティングをして現像中の問題点を補完する方法が提案された（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
ＰＲ工程は３段階に大別されるが、第１段階は、主に、ＰＲのコーティング、露光及び現像によるＰＲパターンの形成段階であり、第２段階は、露光、エッチングされた部分の保護基及びＰＲの酸溶液による除去段階であり、第３段階は、核酸の順次結合と後処理段階である。しかしながら、前記したように、ＰＲ工程は工程が複雑であるという短所がある。
【０００５】
前記ＰＲ工程を改善するための方法として、ＰＰＡ(Photoacid Patterned Array)システムが報告された（例えば、特許文献３参照）。ＰＰＡシステムは、光酸発生剤（ＰＡＧ：Photoacid Generator）と混合されたポリマーマトリックスを使用する。ＰＰＡシステムでは、酸は露光された領域でだけ発生し、保護基は熱処理された後に除去される。したがって、前記ＰＲ工程の第１及び第２段階が１段階で行われうる。しかしながら、ＰＰＡシステムでも、やはり幾つかの問題が明らかになっている。例えば、ＰＡＡシステムによって発生した酸はポリマーマトリックスにそのまま残っているために、さらに多くのＰＡＧを使用せねばならないが、前記ＰＡＧが過量で使われる場合には、光を散乱させてマイクロパターン形成を妨害する短所がある。また、前記ポリマーマトリックス（ポリマーとＰＡＧとの混合物のフィルム）を除去するためにはアセトン及びメチルエチルケトン（ＭＥＫ）のような有機溶剤を使用しなければならないが、このような有機溶剤は再処理及び回収に高コストがかかる。
【０００６】
フォトリソグラフィを利用してＤＮＡチップを製作する他の方式としては、マイクロミラーを利用したＤＮＡチップの製作が挙げられる。この方法は、ＰＲを利用して固体基板上にオリゴヌクレオチドと反応できる支持体を作って、ここにＰＡＧ溶液を入れた後、マイクロミラーを利用して特定部位だけを露光して酸を発生させ、この発生酸がオリゴヌクレオチドに結合している保護基を除去して、これによりオリゴヌクレオチドを反応させる。このような段階を繰り返すことこによって、所望のパターンのオリゴヌクレオチドが積層できる。この方法はＰＲ方法に比べてチップの製作方法が単純であるという利点はあるが、ＰＡＧを溶液中で反応させるため、高密度チップの製作が難しく、使われる装備が高価であるという短所がある。
【０００７】
前記の従来技術の問題点を解決するために、ポリマーマトリックス中にＰＡＧを使用する代わりに、重合体ＰＡＧを利用して固体基板上にペプチド核酸（ＰＮＡ：peptide nucleic acid）のアレイを製造する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。しかしながら、前記方法は重合体ＰＡＧを使用するために単量体化合物を重合する過程がさらに必要であるので、製造コストが高く、複雑である。したがって、以上のような従来技術によっても低コストで容易に製造でき、酸発生効率の高いＰＡＧが相変らず要求されている。
【特許文献１】米国特許第５,４４５,９３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５,７４４,３０５号明細書
【特許文献３】米国特許第５,６５８,７３４号明細書
【特許文献４】米国特許第６,３５９,１２５号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ｖａｃ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．，１９８９，Ｂ７（６），１７３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、基板上にコーティングされうる単量体ＰＡＧを含む組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記組成物でコーティングされた基板を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる他の目的は、前記組成物を用いて基板上に化合物を合成する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる別の目的は、前記方法によって製造されるマイクロアレイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行ない、容易に製造できかつ酸発生効率の高いＰＡＧを研究する中、単量体でもＰＡＧとして使われうる化合物を発見し、本発明を完成した。
【００１３】
上記目的は、光酸発生剤単量体（本明細書中では、単に「単量体ＰＡＧ」とも称する）及び非イオン性界面活性剤を含む光酸発生剤単量体の組成物によって達成される。
【００１４】
上記他の目的は、前記組成物でコーティングされた固体基板によって達成される。
【００１５】
上記さらなる他の目的は、（ａ）酸に不安定な保護基を有する第１分子の層を固体基板上に結合させる段階；（ｂ）前記第１分子の層上に前記光酸発生剤単量体の組成物の層をコーティングする段階；（ｃ）前記組成物の層を露光させ、熱処理して、露光された部分に対応する前記第１分子から酸に不安定な保護基を除去する段階；（ｄ）前記露光部分及び未露光部分から光酸発生剤単量体の組成物層を洗浄、除去する段階；および（ｅ）露出された前記第１分子に第２分子を結合させる段階を含む、基板上に化合物を合成する方法によって達成される。
【００１６】
上記さらなる別の目的は、前記方法によって製造されたマイクロアレイによって達成される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の単量体ＰＡＧの組成物は、重合工程を伴うことなく基板上に直接コーティングされうる。また、ＰＡＧは、このようにして組成物を直接コーティングし、基板を露光して、適当な単量体ＰＡＧとカップリング反応させることによって、基板上に合成できる。
【００１８】
本発明の単量体ＰＡＧの組成物がコーティングされた基板を使用することによって、簡便に基板上に化合物を合成できる。
【００１９】
本発明の基板上での化合物の合成方法によれば、従来の合成過程はフォトレジスト組成物をコーティングする段階、露光する段階及び現像する段階よりなる複雑で手間のかかる方法であったが、本発明の方法によると、単量体ＰＡＧの組成物をコーティングする段階及び露光する段階のみであり、その合成過程がより単純化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の第一は、単量体ＰＡＧ及び非イオン性界面活性剤を含む単量体ＰＡＧ組成物を提供する。
【００２１】
本発明に使用される単量体ＰＡＧは、特に制限されないが、スルホニウム系及びヨードニウム系の単量体ＰＡＧが挙げられる。上記単量体ＰＡＧのうち、スルホニウム系単量体ＰＡＧは、特に制限されないが、好ましくは下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の単量体ＰＡＧである。
【００２２】
【化１】
2005099005.tif 000003
【００２３】
上記式（Ｉ）において、Ｒ−は、ＣＦ３ＳＯ３−またはＣ４Ｆ９ＳＯ３−であり、Ｒ１はＣＨ３である。
【００２４】
【化２】
2005099005.tif 000004
【００２５】
上記式（ＩＩ）において、Ｒ−は、ＣＦ３ＳＯ３−またはＣ４Ｆ９ＳＯ３−である。
【００２６】
【化３】
2005099005.tif 000005
【００２７】
上記式（ＩＩＩ）において、Ｒ’−は、ＣＦ３ＳＯ３−、Ｃ４Ｆ９ＳＯ３−、ＣＦ３（ＣＦ２）３ＳＯ３−またはｐ−ＴＳＯ−である。なお、本明細書において、「Ｃ４Ｆ９ＳＯ３−」は、ＣＦ３ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２ＳＯ３−を意味し、「ｐ−ＴＳＯ」は、ｐ−トシルオキシル基(p-Tosyl oxyl group)を意味する。また、上記式（ＩＩＩ）において、Ｒ２はヒドロキシル基（ＯＨ）または水素原子（Ｈ）であり、Ｒ３はヒドロキシル基（ＯＨ）または水素原子（Ｈ）である。
【００２８】
また、前記ヨードニウム系単量体ＰＡＧもまた、特に制限されないが、好ましくは下記式（ＩＶ）または（Ｖ）の単量体ＰＡＧである。
【００２９】
【化４】
2005099005.tif 000006
【００３０】
上記式（ＩＶ）において、Ｒ−は、ＣＦ３ＳＯ３−またはＣ４Ｆ９ＳＯ３−である。
【００３１】
【化５】
2005099005.tif 000007
【００３２】
上記式（Ｖ）において、Ｒ−は、ＣＦ３ＳＯ３−、Ｃ４Ｆ９ＳＯ３−、またはｐ−ＴＳＯ−である。
【００３３】
これらの単量体ＰＡＧは、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよいが、好ましくは単独で使用される。
【００３４】
本発明において、非イオン性界面活性剤は、特に制限されず、公知の非イオン性界面活性剤が使用できるが、フッ素系界面活性剤であることが望ましい。より望ましくは、前記フッ素系界面活性剤は、１００％のフルオロ（フッ素系）脂肪族重合体のエステル、または９５％のフルオロ（フッ素系）脂肪族重合体のエステルと５％のＮ−メチルピロリドン（N-metylpyrrolidone：ＮＭＰ）との混合物である。この際、フルオロ脂肪族重合体エステルとしては、特に制限されず、公知のフルオロ脂肪族重合体エステルが使用でき、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば、３Ｍ社製のＦＣ−４４３０やＦＣ−４４３２などが挙げられる。本発明において、非イオン性界面活性剤は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよいが、好ましくは単独で使用される。
【００３５】
本発明の前記光発生剤単量体及び界面活性剤は、そのままの形態で使用されてもあるいは溶剤に溶解されて使用されてもいずれでもよいが、適当な有機溶媒中に、５〜５０％（ｗ／ｖ）で溶解されたものが望ましい。この際、有機溶媒としては、光発生剤単量体及び界面活性剤を溶解できるものであれば特に制限されないが、ＮＭＰが特に好ましい。また、界面活性剤の量は、１,０００〜１,５００ｐｐｍが望ましい。また、前記単量体ＰＡＧの量は、１,０００〜１００,０００ｐｐｍが望ましい。単量体ＰＡＧと界面活性剤の混合比は、特に制限されないが、単量体ＰＡＧと界面活性剤の混合比（重量比）が、好ましくは５０：１〜１０００：１、より好ましくは１００：１〜１０００：１、最も好ましくは２５０：１〜７５０：１である。
【００３６】
本発明の組成物は、光、特に紫外線光に暴露されると、酸を発生できる。このため、本発明の組成物は、重合工程を必要とすることなく固体基板にコーティングされうる。
【００３７】
したがって、本発明の第二は、本発明の組成物でコーティングされた固体基板を提供する。
【００３８】
本発明において、固体基板の材質は、特に制限されないが、例えば、シリコン、二酸化ケイ素、ガラス、表面改質ガラス、ポリプロピレンまたは活性化されたアクリルアミドが含まれ、シリコン、ガラス、表面改質ガラス、ポリプロピレンまたは活性化されたアクリルアミドが好ましい。
【００３９】
本発明において、本発明の組成物の固体基板上へのコーティング方法は、特に制限されず、基板の種類や化合物の種類などによって適宜選択される。例えば、スピンコーティング、スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング等、公知のコーティング方法が使用でき、特に好ましくはスピンコーティングである。また、本発明の組成物の固体基板上へのコーティング条件（組成物のコーティング量や温度、時間など）もまた、固体基板上に組成物が良好にコーティングできる条件であれば特に制限されず、公知の条件と同様の条件が使用できる。
【００４０】
また、本発明の第三は、下記段階を含む基板上に化合物を合成する方法を提供する：
（ａ）酸に不安定な保護基を有する第１分子の層を固体基板上に結合させる（コーティングする）段階、
（ｂ）前記第１分子層上に本発明の前記単量体ＰＡＧ組成物の層をコーティングする段階、
（ｃ）前記組成物の層を露光させ、熱処理して露光された部分に対応する前記第１分子から酸に不安定な保護基を除去する段階、
（ｄ）前記露光された部分と露光されていない部分から前記単量体ＰＡＧ組成物層を洗浄して除去する段階、および
（ｅ）露出された前記第１分子に第２分子を結合させる段階。
【００４１】
本発明の方法において、前記固体基板の材質は、特に制限されないが、例えば、シリコン、二酸化ケイ素、ガラス、特にホウケイ酸ガラス、表面改質ガラス、ポリプロピレン及び活性化されたアクリルアミドのような有機重合体ならびに不安定な保護基を有する分子の層を固定化するのに適した反応性部位を有する表面を有する当該分野において既知の他の固体基板が使われうる。なお、本発明において、固体基板は、予め洗浄溶液（アルカリ性のエタノール水溶液など）で洗浄・乾燥されることが好ましい。
【００４２】
また、本発明の方法により合成される化合物としては、特に制限されないが、好ましくは核酸または蛋白質である。前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ(peptide nucleic acid)またはＬＮＡ(locked nucleic acid)を含む。ここで、「ＰＮＡ」とは、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン繰り返し単位からなる骨格を有し、塩基がメチレンカルボニル結合によって前記骨格に連結されている核酸類似体をいう。具体的には、ＰＮＡの例としては、Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）−Ｎ−チミン−１−イルアセチル）グリシン、Ｎ−（Ｎ−４−（ベンジルオキシカルボニル）シトシン−１−イル）アセチル−Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（Ｎ−６−（ベンジルオキシカルボニル）アデニン−９−イル）アセチル−Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）グリシン及びＮ−（Ｎ−４−（ベンジルオキシカルボニル）グアニン−１−イル）アセチル−Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）グリシンなどがある。
【００４３】
本発明の方法の（ａ）段階では、酸に不安定な保護基を有する第１分子の層が固体基板に結合される。前記第１分子は、特に制限されず、固体基板の材質などによって適宜選択されるが、望ましくはリンカー分子（またはリンカー）である。例えば、ガラス基板に適するリンカーとしては、（ｉ）リンカーを基板の表面に付着（結合）できる官能基（例えば、アルコキシシラン基）と（ｉｉ）リンカーを他の分子に結合できる活性部位を有する官能基（例えば、ヒドロキシル基）を有する分子がある。前記リンカーの例としては、６−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノカプロン酸等のオメガ−アミノカプロン酸のようなアミノアルキルカルボン酸がある。また、本明細書において、「酸に不安定な保護基」とは、酸によって脱離されうる保護基をいう。このような保護基には、例えば、トリフェニルメチル（トリチル）及びジメトキシトリチル（ＤＭＴ）のような置換されたトリチル基が含まれる。しかしながら、酸に不安定な保護基は前記例に限定されるものではなく、当業者に知られた何れの酸に不安定な保護基でも使用されうる。
【００４４】
本発明の方法の（ｂ）段階では、（ａ）段階で結合された前記第１分子層上に、本発明の前記単量体ＰＡＧ組成物の層をコーティングする。単量体ＰＡＧ及び界面活性剤については、本発明の第一で説明したのと同様である。前記組成物のコーティング過程は、当業界に広く知られている技術のうち何れでも使われうる。前記（ｂ）段階におけるコーティング技術は、特に制限されず、例えば、スピンコーティング、スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング等、公知のコーティング方法が使用できるが、スピンコーティング法が好ましく使われる。コーティングされた前記単量体ＰＡＧ組成物層の厚さは、特に制限されないが、好ましくは約０.１〜１ミクロン、望ましくは約０.３〜０.５ミクロンである。
【００４５】
本発明の方法の（ｃ）段階では、（ｂ）段階で形成された前記組成物層を露光させ、熱処理して露光された部分に対応する前記第１分子から酸に不安定な保護基を除去する。前記露光する段階は、特に制限されず、公知の露光技術が同様にしてあるいは修飾されて使用できるが、望ましくは一定のパターンが描かれたマスクを通じて行なわれる。または、前記露光は、マスクの代わりにマイクロミラーを使用して行なってもよい。この際、具体的な露光方法は、例えば、米国特許第６,４２６,１８４号明細書に記載される方法が同様にして使用できる（当該公報は、援用によって本明細書に含まれる）。露光に使われる光の波長は、前記ＰＡＧに照射された時に酸を発生させうる波長の光であれば、何れでも使われうる。前記光は、望ましくは１５０〜４００ｎｍの波長、さらに望ましくは、３６５ｎｍの波長を有することである。また、露光時間もまた、これにより十分な酸が発生できる時間であれば特に制限されないが、好ましくは０．１〜２００秒、より好ましくは１〜１００秒である。前記熱処理段階は、露光によってＰＡＧから発生したＨ＋イオンの拡散を促進して、前記第１分子から酸に不安定な保護基を除去させるものであり、このような反応が十分行われる条件であれば、熱処理段階の条件は、特に制限されない。好ましくは、前記熱処理は、６０〜１００℃、より望ましくは８０℃の温度で、０.５分〜３分間、より望ましくは１〜２分間行われることが望ましいが、前記条件に限定されるものではない。
【００４６】
また、本発明の方法は、前記（ｃ）段階の前に、前記単量体ＰＡＧ組成物の有機溶媒を除去するために、ソフトベイク段階をさらに含みうる。前記ソフトベイクは、有機溶媒を除去できる条件であればいずれの条件で行なわれてもよいが、望ましくは、固体基板を、３０〜１１０℃、より望ましくは６０〜８０℃の温度で、０.５〜２分間、より望ましくは１分間ソフトベイクすることが望ましい。
【００４７】
本発明の方法の（ｄ）段階では、（ｃ）段階で露光された部分の前記単量体ＰＡＧ組成物層と露光されていない部分の前記単量体ＰＡＧ組成物層を、溶媒を使用して洗浄することによって除去する。洗浄用溶媒としては、単量体ＰＡＧ組成物層を十分洗浄・除去できるものであれば特に制限されないが、極性を有している有機溶媒が望ましく使用でき、より望ましくは、ＰＡＧを溶解できる極性有機溶媒が使用される。最も望ましくは、洗浄用溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のメタノール溶液である。
【００４８】
本発明の方法の（ｅ）段階では、（ｃ）段階で露光及び熱処理によって酸に不安定な保護基が除去された前記第１分子に、第２分子を選択的に結合させる。前記第１分子の結合部位は、所望の第２分子が選択できに結合できる部位であれば特に制限されないが、例えば、ホスホロアミダイトカップリング剤に反応性を示すヒドロキシル基（Ｒ−ＯＨ）である。さらに、他の結合部位の例としては、ポリペプチド合成に使われる第１級アミド基がある。または、第１分子の結合部位としては、結合反応のために保護または脱保護されうるケトン及びアルデヒド等の他の官能基が挙げられるが、これらの結合部位例に限定されるものではない。
【００４９】
前記第２分子は、特に制限されず、所望の用途によって適宜選択できるが、例えば、核酸または蛋白質の単量体でありうる。前記第２分子は、望ましくは、酸に不安定な保護基を有するのである。ここで、「単量体」とは、二量体、三量体及びオリゴマーを含む意味として使われる。適当な単量体としては、保護された形態及び活性化された形態のＬ及びＤアミノ酸、ヌクレオチド、単糖類、ペプチド及び合成ヌクレオチド類似体が含まれる。望ましい単量体は下記のヌクレオチドである：保護された形態及び活性化された形態のアデノシンホスフェート、グアノシンホスフェート、シチジンホスフェート、ウリジンホスフェート、デオキシアデノシンホスフェート、デオキシグアノシンホスフェート、デオキシチジンホスフェート及びデオキシチミジンホスフェート、ならびにそれらの摸写体(mimetic)。活性化された形態のヌクレオチドとしては、例えば、ホスホルアミダイトヌクレオチド分子がある。しかしながら、前記第２分子はこれらの例に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリペプチドを含む合成しようとする重合体によってこれらの単量体は当業者であれば、容易に利用できるものである。結合反応に使われる保護基及び活性基は、使われる具体的な合成反応によって異なり、当業者には既知である。前記第１分子に結合する第２分子の例及び結合過程の例は、特に制限されないが、例えば、援用によって本発明に含まれる、Ｆｏｒｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐ．７６７（１９９１）に開示されている。
【００５０】
本発明の方法は、上記（ａ）〜（ｅ）／（ｂ）〜（ｅ）の段階を１サイクル行なうものであってもあるいは望ましい数または長さの化合物が基板上で合成されるまで複数回繰り返されるものであってもよいが、通常、所定の数または長さの化合物が得られるまで、複数回、上記段階が繰り返される。
【００５１】
望ましい数または長さの化合物がアレイ形態に合成された後、前記化合物の保護基は除去されるのが望ましい。
【００５２】
また、本発明の上記方法は、特にマイクロアレイを製造するのに適する。したがって、。本発明の第四は、本発明の前記方法によって製造されたマイクロアレイを提供する。本発明の方法によって一定領域に一定数の化合物を合成することによって前記マイクロアレイは製造されうる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００５４】
実施例１：単量体ＰＡＧと界面活性剤を含む組成物のコーティング性の試験
本実施例では、単量体ＰＡＧと界面活性剤を含む複数の組成物を製造し、これらの固体基板上でのコーティング性を調べた。
【００５５】
まず、単量体ＰＡＧ（ジヒドロキシナフトルジメチルスルホントルエンスルホニウム塩）を、下記表１に示した各種界面活性剤と混合して、単量体ＰＡＧ組成物を調製した。この際、界面活性剤に対する単量体ＰＡＧの混合比（重量比）は、１００：１〜５００：１とした。次に、この単量体ＰＡＧ組成物を、それぞれ、ガラスまたはシリコンウェーハよりなる固体基板にコーティングした。この際、コーティングはスピンコーティングによって行った。また、ＰＡＧ組成物を基板に、２,０００ｒｐｍで２０秒間スピンコーティングした。
【００５６】
【表１】
2005099005.tif 000008
【００５７】
表１に示されたように、単量体ＰＡＧをフルオロ系の界面活性剤と混合した場合、組成物は固体基板上に特に良好なコーティング性を有することが分かった。
【００５８】
実施例２：本発明の単量体ＰＡＧ組成物を利用したＰＮＡのアレイの製造
（１）固体基板上への第１分子のコーティング
まず、ガラス基板を洗浄溶液（９５％のエタノール水溶液１Ｌ、水１２ｍＬ、水酸化ナトリウム１２０ｇ）に１２時間浸漬した後、数回水洗し、空気中で乾燥した。
【００５９】
次に、アミン基を固定するために、ガラス基板を次のように表面処理した。前記乾燥されたガラス基板を９５％のエタノール水溶液で洗浄し、０．１％（ｖ／ｖ）アミノプロピルトリエトキシシランのエタノール溶液に入れて、常温で５分間撹拌した。次に、前記基板をエタノールで３回洗浄し、真空オーブンで１２０℃で２０分間乾燥し、アルゴンガス雰囲気中で１２時間放置し、ＤＭＦに浸漬した後、ジクロロメタンで十分に洗浄した。
【００６０】
次に、前記表面処理されたガラス基板に、３０ｍＭの６−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアミノカプロン酸及び３ｇのジシクロカーボジイミド（ＤＣＣ）を含むＤＭＦ溶液０.５ｍｌを添加して、８０℃で１時間撹拌しながら反応させた。次に、未反応のアミン基は、１：３（ｖ／ｖ）の無水酢酸／ピリジン混合溶液で１時間撹拌しながら反応させることによって、アセチル基でキャッピングした。その結果、アミン基が酸に不安定な保護基で保護されたリンカー（第１分子層）が、ガラス基板に結合した（形成された）。
【００６１】
（２）本発明の単量体ＰＡＧの組成物のコーティング及びペプチド核酸の合成
０.０５ｇのジヒドロキシナフトルジメチルスルホントルエンスルホニウム塩（単量体ＰＡＧ）と０.００１ｇのＦＣ−４４３２界面活性剤（3M Company、米国）とを混合し、ＮＭＰに１０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解させ、単量体ＰＡＧの組成物を製造した。次に、前記組成物を、実施例２（１）で製造された前記リンカーが結合したガラス基板に、３,０００ｒｐｍでスピンコーティングした。
【００６２】
前記コーティングされたガラス基板を、８０℃で１分間ソフトベイクした後、さらに短波長の白色光でフォトマスクを利用して１０秒間露光させた。次に、前記露光されたガラス基板を８０℃で２分間ポストベイクし、酸を発生させて、露光部分の第１分子から保護基を選択的に除去した。さらに、残っている単量体ＰＡＧの組成物を、１％のトリアルキルアンモニウムヒドロキシドと有機溶媒（ＤＭＦ、ＭｅＯＨ）を使用して除去した。ここに、Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）−Ｎ−チミン−１−イルアセチル）グリシン、Ｎ−（Ｎ−４−（ベンジルオキシカルボニル）シトシン−１−イル）アセチル−Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）グリシン、Ｎ−（Ｎ−６−（ベンジルオキシカルボニル）アデニン−９−イル）アセチル−Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）グリシン及びＮ−（Ｎ−４−（ベンジルオキシカルボニル）グアニン−１−イル）アセチル−Ｎ−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル−アミノエチル）グリシンなど（Perseptive Biosystems社製、米国）のＰＮＡ単量体３ｇを溶解させたＤＭＦ ０.５ｍｌ及びＨＡＴＵ  １０ｍｇを添加して、６０℃で２時間撹拌しながら反応させた。前記ＰＮＡ単量体は、最終的に得られるヌクレオペプチドの塩基配列が配列番号１の配列になるように添加した。
【００６３】
次いで、未反応のアミン基を、１：３（ｖ／ｖ）の無水酢酸／ピリジン混合溶液中で１時間撹拌しながら反応させることによって、アセチル基でキャッピングした。
【００６４】
次に、前記単量体ＰＡＧの組成物のコーティング段階、フォトマスクを利用して基板を露光して保護基を除去する段階、露出された第１分子部分をアミン基が保護されたＰＮＡ単量体と反応させてキャッピングする段階を、所望の長さのＰＮＡが基板上に合成されるまで繰り返した。ガラス基板上の遊離アミン基は、１ｍＭのフロレシンイソチオシアネート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）とＤＭＦ中で常温で１時間反応させることによって蛍光標識した後、エタノール、水及びエタノールの順に洗浄した後、乾燥させて暗室に保管した。前記基板を分光蛍光計で形状を撮影して分析したところ、１０ミクロン（μｍ）スケールの微細形状が得られた。
【００６５】
前記過程を繰り返して、配列番号１のＰＮＡ配列と１つの塩基の異なった配列番号２の配列を有するオリゴペプチド核酸のプローブを、前記したのと同様にして基板上に合成し、前記オリゴペプチド核酸プローブのマイクロアレイを製作した。８０μｍサイズのＰＮＡを１０,０００スポットを有するマイクロアレイを製作した。５’位置に標識されたＣｙ３を有する配列番号３のＤＮＡを、ハイブリダーゼーション条件下で、前記マイクロアレイ上の前記ＰＮＡとハイブリッド形成させ、スキャナー(Axon scanner)でスキャンした。
【００６６】
その結果、図１に示す。図１に示されるように、エッジのない方形のスポットが各マイクロアレイ上に形成されていることを確認した。図１の上左側の図はプローブと標的とが完全マッチしていることを示し、上右側の図はこれを拡大した図である。一方、図１の下左側の図はプローブと標的とが１つの塩基においてミスマッチすることを示すものであり、下左側の図はこれを拡大した図である。これらの完全相補的な（完全にマッチする：下記表２におけるＰＭ）場合と１つの塩基が相補的でない（ミスマッチする：下記表２におけるＭＭ）場合とに観察された蛍光強度及びその比を下記表２に示す。
【００６７】
【表２】
2005099005.tif 000009
【００６８】
したがって、本発明の単量体ＰＡＧの組成物を重合せずに基板に直接コーティングし、露光した後、適当なＰＮＡ単量体をカップリングすることによって、基板上にＰＮＡが合成できた。
【００６９】
以上、本発明を具体的な実施例を通じて詳細に説明したが、本発明はこれに限定されず、本発明の技術的思想内で当業者によりその変形や改良が可能であることが明白である。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のＰＡＧ及び前記ＰＡＧコーティング層を有する基板は基板上で、核酸、蛋白質またはＰＮＡのような化合物を合成するのに有用である。このような合成過程はマイクロアレイを製造するのに使用可能である。
【００７１】
本発明の基板上で化合物を合成する方法はマイクロアレイを製造するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の方法によって合成されたオリゴヌクレオペプチドが正確に合成されたことを示す実験結果である。
【図１】
2005099005.tif 000015
【配列表】
2005099005000001.app