(57)【要約】【課題】  比較的低温で増殖が可能で、かつ動植物脂質分解能及び脱窒能を有する微生物を提供することにある。【解決手段】  本発明は、４〜４０℃の範囲の温度で生育することができるシュードモナス  デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)株であって、油脂分解能力、及び脱窒能力を有することを特徴とする、高機能脱窒油脂分解菌を提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４〜４０℃の範囲の温度で生育することができるシュードモナス  デニトリフィカンス(Pseudomonasdenitrificans)株であって、油脂分解能力、及び脱窒能力を有することを特徴とする、高機能脱窒油脂分解菌。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４７６を有する、請求項１に記載の高機能脱窒油脂分解菌。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の高機能脱窒油脂分解菌を含有する、脱窒油脂分解用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の高機能脱窒油脂分解菌を固相担体に固定した、脱窒油脂分解用組成物。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の高機能脱窒油脂分解菌を、油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする、油脂及び窒素分を分解する方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の脱窒油脂分解用組成物を、油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする、油脂及び窒素分を分解する方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の高機能脱窒油脂分解菌を、油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする、廃水浄化方法。
【請求項８】
請求項３又は４に記載の脱窒油脂分解用組成物を、油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする、廃水浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高機能脱窒油脂分解菌等に関するものである。特には、比較的低温で増殖が可能で、かつ動植物脂質分解能及び脱窒能を有する高機能脱窒油脂分解菌等に関する。
【背景技術】
【０００２】
病院等の厨房施設、レストラン等の業務用の厨房施設からは大量の廃水が発生しているが、この廃水中には、調理に用いられた油脂に由来する多量の油脂が含まれている。現在、これらの廃水処理施設には、油脂分を処理するためのグリーストラップという設備の設置が義務づけられている。グリーストップは、上述したような厨房施設由来の廃水中に含まれる油脂分を分離し、油脂分が廃水管中に流入して管を詰まらせることを防ぐ役割を果たすものである。しかし、現実には、グリーストラップにおける油脂分の滞留時間は通常のシステムを適用しても十分ではなく、油脂分を処理しきれていないことは明らかである。また、グリーストラップからの悪臭の発生、真菌類の増殖、油脂分が分解しないことによる油脂分の滞留等の問題が常に起こっている。
【０００３】
近年、ある種の細菌や真菌類の微生物の菌体、又は混合液をグリーストラップ内に投入して、微生物によって油脂を分解させようとする方法が提案されている。しかし、投入する微生物株の脂質分解活性が十分に強力でない点や、グリーストラップ内の多様な環境に微生物自身が適応しきれない、また、グリーストラップにおける滞留時間が短すぎる等の問題があった。
【０００４】
また、上記廃水はアンモニア性窒素を含有していることが多い。このようなアンモニア性窒素は、亜硝酸や硝酸に変化した後、脱窒工程により窒素ガスに変換される。この脱窒工程が不十分であると、亜硝酸や硝酸が十分に脱窒されずに、処理水中に残留して放流されてしまうので、湖沼、河川等が、富栄養化を起こし環境汚染の原因となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
廃水を実際に処理する場合の温度条件は、通常の微生物が生育し、有効に酵素活性を発揮する温度よりも低い温度である。従って、１０〜２０℃程度の比較的低温の温度域で活性を発揮することが望まれる。従って、比較的低温で増殖が可能で、かつ動植物脂質分解能及び脱窒能を有する微生物が望まれている。
従って、本発明の目的は、比較的低温で増殖が可能で、かつ動植物脂質分解能及び脱窒能を有する微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、生ゴミ発酵試料中に、高機能脱窒油脂分解活性が観察されることを見出した。今回、本発明者らは、この生ゴミ発酵試料中から、高機能脱窒油脂分解菌単離することに成功した。単離した高機能脱窒油脂分解菌（Ｆ−１株と命名）の特徴を分析し、この菌株がシュードモナス  デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)株であるという知見を得、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、４〜４０℃の範囲の温度で生育することができるシュードモナス  デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)株であって、油脂分解能力、及び脱窒能力を有することを特徴とする、高機能脱窒油脂分解菌を提供するものである。
本発明の高機能脱窒油脂分解菌の好ましい具体例としては、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４７６を有する菌株である。
【０００８】
また、本発明は、上記高機能脱窒油脂分解菌を含有する、脱窒油脂分解用組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記高機能脱窒油脂分解菌を固相担体に固定した、脱窒油脂分解用組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記高機能脱窒油脂分解菌、又は脱窒油脂分解用組成物を油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする、油脂及び窒素分を分解する方法を提供するものである。
また、本発明は上記高機能脱窒油脂分解菌、又は脱窒油脂分解用組成物を、油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする、廃水浄化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規な高機能脱窒油脂分解菌、及びそれを用いた油脂及び窒素分を分解する方法、廃水浄化方法が提供される。本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、固体培地のみならず、液体培地においても脂質分解活性を示す。また、その培養上清は培地中の基質に油脂が含まれない場合においても脂質分解活性を示し、界面活性剤を添加した時には、僅か培養1日で培養上清に著量の脂質分解を示した。また、本発明の高機能脱窒油脂分解菌は比較的低温で増殖できるので、比較的低温での廃水浄化が可能である。したがって、業務用厨房や食品工場から排出される油脂含有廃水や油脂に汚染された土壌の浄化および生ゴミの処理にも応用できる微生物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、本発明の高機能脱窒油脂分解菌について説明する。
本明細書において、「油脂」とは、動植物を起源とするあらゆる油脂を含むものとし、例えば、動植性食用油、不飽和脂肪酸、魚油等を含む油脂が挙げられる。
【００１１】
本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、４〜４０℃の範囲の温度で生育することができるシュードモナス  デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)株であり、例えば、シュードモナス  デニトリフィカンス  Ｆ−１株が挙げられる。これらの菌株は、変種又は変異株であってもよい。
【００１２】
本発明者らが単離した一例の菌株（Ｆ−１株）は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４７６として寄託されている。上記菌株は、牛の糞尿に有機物（生ゴミ）を加えて分解させたものから単離されたものである。Ｆ−１株の分離のために、オリーブオイル入りの寒天培地を使用し、ハロー形成能を指標として選択した。
得られたＦ−１株の細菌分類学的性質は以下の通りである。
【００１３】
〔１〕形態学的性質
（１）グラム染色：陰性
（２）芽胞：無し
（３）運動性：有り
（３）菌形：桿菌
【００１４】
〔２〕培地における生育特性
色調は白色であり、コロニーの形状は円形、であり、コロニーの表面は平滑である。
〔３〕化学分類学的特性
ＤＮＡのＧ＋Ｃモル含有量は６２．８％である。
【００１５】
〔４〕生理・生化学的特性
オキシダーゼ試験：陽性
カタラーゼ試験：陽性
尿素分解：陰性
ONPG試験：陰性
硫化水素の産生：陽性
メチルレッド試験：陰性
VP試験：陰性
インドール産生：陰性
硝酸塩の還元：陽性
オリーブ油分解：陽性
ラード分解：陽性
デンプン分解：陰性
ゼラチン分解：陰性
カゼイン分解：陰性
DNA分解：陰性
アルギン酸分解：陰性
Tween 20の分解：陽性
Tween 40の分解：陽性
Tween 60の分解：陽性
Tween 80の分解：陽性
【００１６】
各温度における生育
-1℃：−
4℃：＋
10℃：＋
25℃: ＋
40℃: ＋
45℃: −
50℃: −
【００１７】
本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フルクトース、ラクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、シュークロース、Ｄ−キシロース、ラフィノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、Ｌ−ラムノース、及びトレハロースから酸を産生しない。
【００１８】
本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、Ｄ−マルトース、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシン、及びＬ−プロリンを唯一の炭素源として資化する。
本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、グリセロール、ラクトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、シュークロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−セロビオース、イヌリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン、及びＬ−グリシンを唯一の炭素源として資化しない。
【００１９】
Ｆ−１株のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅して得られた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。その結果に基づき、類似した塩基配列と多重アラインメントを取り、得られた結果に基づき近隣結合法（Neighbor-Joining法）により系統樹を作成したところ、Ｆ−１株はシュードモナス（Pseudomonas）属細菌に分類されることが判明した。作成した系統樹を図1に示す。図１は、Pseudomonasdenitrificans F-1株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図であり、系統樹内の数字はブートストラップ値が５００以上を示す。バーは、０．１Kuncユニットを示す。
同属細菌の中でもシュードモナス  デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans） と高い相同性を示す（９９．４％）ことが示された。
【００２０】
上記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における相同性において最も相同性の高かったシュードモナス  デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）、 及びその次に相同性が高かったPseudomonaspertucinogena（３８．９％）について、菌株を保存機関より入手し、Ｆ−１株および入手した２菌株からＤＮＡを抽出し、Ｆ−１株のＤＮＡをフォトビオチンでラベルしプローブを作成し、ブラックマイクロプレートに被検ＤＮＡを固定し、相同性を蛍光測定により算出した。結果は、Ｆ−１株がP.denitrificansおよびP. pertucinogenaとそれぞれ９６％及び３９％の相同性を示した。ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験において７０％以上であると同一種と考えられることから、Ｆ−１株はシュードモナス  デニトリフィカンスと同一種であることが示された。
【００２１】
本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、動植物性油脂を分解すると同時に不要な窒素分を脱窒により除去するのに用いることができる。特に、廃水中および生ゴミ中の動植物油脂分および窒素分を分解するのに用いることができる。細菌そのものを油脂および不要窒素分を含む廃水に添加しても良いし、固相担体に菌体を固定してから用いても良い。この際、廃水の温度は４〜４０℃程度が望ましく、pHは６．５〜９．０が望ましい。本発明の高機能脱窒油脂分解菌は、４〜４０℃の範囲の温度で増殖することができるので、上記廃水の温度範囲で好ましく用いられる。
【００２２】
次に、本発明の脱窒油脂分解用組成物について説明する。本発明の高機能脱窒素油脂分解菌は、そのままで廃水の浄化に用いることもでき、またそのままで生ゴミ中の動植物油脂分及び窒素分を分解するのに用いることができる。しかし、本発明の高機能脱窒油脂分解菌を含有する脱窒油脂分解用組成物として用いてもよい。
このような脱窒油脂分解用組成物としては、例えば液状製剤や粉末製剤が挙げられる。
【００２３】
液状製剤とするには、例えば下記方法によって実施可能である。
高機能脱窒油脂分解菌を培養し、この培養物を遠心分離し、菌体を回収し、生理食塩水を加えて適当な濃度となるように懸濁し、脱窒油脂分解用組成物とする。また、この脱窒油脂分解用組成物に凍結乾燥などにより適度に濃縮してもよい。また、脱窒油脂分解用組成物には、必要に応じてｐＨ調整剤等を加えてもよい。
【００２４】
粉末製剤とするには、例えば下記方法によって実施可能である。
高機能脱窒油脂分解菌を培養し、この培養液を凍結乾燥等によって乾燥し、粉末製剤とする。また、培養液から菌体を遠心分離によって回収し、生理食塩水や新鮮な培地と懸濁した後、凍結乾燥等によって乾燥してもよい。また、凍結乾燥前にｐＨ調整剤等を加えてもよい。
【００２５】
また、本発明の脱窒油脂分解用組成物は、上記高機能脱窒油脂分解菌を固相担体に固定して製造することができる。高機能脱窒油脂分解菌を固定するための固相担体としては、微生物の固定に使用することのできるものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。例えば、アルギン酸、活性炭、珪藻土セラミック多孔体等があげられる。このような固相担体の形状としては、球状又は円柱状が好適であり、球状の場合、粒径は好ましくは０．３〜２．８ｍｍ程度であり、更に好ましくは０．３〜１．２ｍｍ程度である。
【００２６】
次に、本発明の油脂及び窒素分を分解する方法について説明する。本発明の油脂及び窒素分を分解する方法は、本発明の高機能脱窒油脂分解菌、又は脱窒油脂分解用組成物を、油脂及び窒素分を含有する廃水と接触することを特徴とする。
本発明の油脂及び窒素分を分解する方法は、油脂及び窒素分を含有する廃水（生ゴミも含む）に、本発明の高機能脱窒素油脂分解菌、又は脱窒油脂分解用組成物を投与するこおによって実施することができる。高機能脱窒素油脂分解菌、又は脱窒油脂分解用組成物の投与量に特に制限はなく、廃水中に含まれる油脂及び窒素分を分解することのできる量でよい。なお、廃水の温度は４〜４０℃の範囲が好ましく、ｐＨは６．５〜９．０の範囲が好ましい。本発明の油脂及び窒素分を分解する方法によれば、廃水を浄化することが可能となる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術範囲が限定されるものではない。なお、以下の実施例において、％は、特に断りのない限り質量％を表す。
実施例１
牛の糞尿に生ゴミを加えて分解させた分解物を用いて高機能脱窒油脂分解菌を単離するための材料として用いた。
基礎培地（ペプトン、５ｇ; 酵母エキス、３ｇ;ＮａＣｌ、５ｇ; 寒天、１５ｇ; 蒸留水ｍ９００ｍｌ,ｐＨ７．８）、およびオリーブオイル入り寒天溶液（０．５％ 寒天溶液、４０ｍｌ; オリーブオイル、１０ｍｌ；Ｔｗｅｅｎ８０、０．５ｍｌ）をそれぞれ別滅菌する。滅菌後オリーブ油入り寒天溶液を超音波で乳化し、基礎培地と混合し、シャーレーに分注し固化して高機能脱窒油脂分解菌単離用培地とした。
【００２８】
上記高機能脱窒油脂分解菌を単離するための材料を上記高機能脱窒油脂分解菌単離用培地に接種し、２７℃の温度で培養した。３日培養した後、油脂を分解したことを示す透明帯がコロニー周辺部に観察された。そのコロニーを、新鮮な高機能脱窒油脂分解菌単離用培地に接種し、同様に培養を行った。この操作を５回繰り返し、高機能脱窒油脂分解菌を単離し、これをＦ−１と命名した。このＦ−１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４７６として寄託されている。
【００２９】
実施例２
実施例１で用いた培地にＦ−１株を接種し、２７℃の温度で培養した。３日間培養した後、油脂を分解したことを示す透明帯がコロニー周辺部に観察された。その結果を図２に示す。図２に示すように、Ｆ−１株のコロニー周辺部には透明帯が形成されており、Ｆ−１株がプレート中の脂質を分解する能力を有していることがわかる。なお、シャーレの周縁部の白く見える部分は、この近くに菌体が存在しないため、脂質分が分解されずに残っていることを示す。
【００３０】
実施例３
５００ｍｌのＬＢ培地（トリプトン,１０ｇ; 酵母エキス,５ｇ;ＮａＣｌ,１０ｇ; 蒸留水, １０００ｍｌ）に５ｍｌ（１％）のオリーブオイルを加え、培地量の１／１０００容のＦ−１株の前培養液を接種し、２７℃で１２０ｒｍｐの回転速度で、１日、３日及び７日培養した後、培養液を１ｍｌをとり、この培養液から脂質を定法により抽出した。この脂質の一部の一定量をシリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィーに供した。展開溶媒としてはヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸 （８０／３０／１  v/v/v）を用いた。
【００３１】
結果を図３に示す。図３は、Ｆ−１株を、オリーブオイル存在下で培養した後の抽出脂質の薄層クロマトグラムを示した図である。図３において、ＴＧはトリアシルグリセロールを示し、ＦＦＡは遊離脂肪酸を示す。図３は、左側からＦ−１株を培養していない培地、１日培養したもの、３日培養したもの、７日培養したものである。図３に示すように、Ｆ−１株を培養した培地においては、培地中に含まれるオリーブオイルの主成分であるトリアシルグリセロールの量が減少していることがわかる。
【００３２】
実施例４
５００ｍｌ のLB培地（Ｔｗｅｅｎ８０無添加）、及びＴｗｅｅｎ  ８０を１％添加したＬＢ培地を培地として用い、培地量の１／１０００容のＦ−１株の前培養液を接種し、２７℃の温度で１２０ｒｐｍの回転速度で１〜３日間培養した後、培養液を遠心分離により菌体を取り除き、上清を粗酵素液とした。得られた粗酵素液の脂質分解活性（リパーゼ活性）を、はｐ-ニトロフェニル  パルミテート（ｐ−ＮＰＰ）を基質として用い、反応量をp-ニトロフェノールの遊離と見なし分光学的な測定により測定した。
【００３３】
測定結果を図4に示す。図４は、Ｆ−１の培養上清を粗酵素液として脂質分解活性を試験した結果を示したものである。
図４において、横軸は反応時間であり、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度である。また、黒丸はＴｗｅｅｎ８０を添加した培地で１日培養したもの、黒三角はＴｗｅｅｎ８０を添加した培地で３日培養したもの、四角はＴｗｅｅｎ８０を添加しない培地で１日培養したもの、三角はＴｗｅｅｎ８０を添加しない培地で３日培養したものの結果である。図４に示すように、オリーブオイルやＴｗｅｅｎ８０を培地に添加しなくても時間が多少かかるものの酵素の誘導が起こることが示された。一方、Ｔｗｅｅｎ８０を添加することにより、僅か培養1日で酵素の誘導が起こることが示された。
【００３４】
実施例５
肉汁ブイヨン（肉エキス,１０ｇ; ペプトン, １０ｇ;ＮａＣｌ,５ｇ; 蒸留水, １０００ｍｌ）を２本の試験管に用意し、一方に１％濃度となるように硝酸ナトリウムを添加し、もう一方には硝酸ナトリウムを添加せずコントロールとした。Ｆ−１株培養菌体をそれぞれの培地が入った試験管にそれぞれ接種し、流動パラフィン：白色ワセリンを１：１（ｖ・ｖ）で混合したものを重層し、簡易的な嫌気条件で４℃、１０℃、及び２７℃の温度で培養した。その結果、それぞれの温度で脱窒反応が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Pseudomonas denitrificans F-1株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図である。
【図２】Ｆ−１株の脂質分解能を試験した結果を示す写真である。
【図３】Ｆ−１株を、オリーブオイル存在下で培養した後の抽出脂質の薄層クロマトグラムを示した図である。
【図４】Ｆ−１の培養上清を粗酵素液として脂質分解活性を試験した結果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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