(57)【要約】      （修正有）【課題】GlcNAcヌクレオチド及びGalNAcヌクレオチドを工業的規模で大量かつ安価に生産できる方法を提供する。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、GalNAcヌクレオチド又はGlcNAcヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、GlcNAcヌクレオチド又はGalNAcヌクレオチドの生産方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質。（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、UDP-GalNAcをUDP-GlcNAcに変換する活性又はUDP-GlcNAcをUDP-GalNAcに変換する活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウリジン5'-二リン酸−N-アセチル-D-ガラクトサミンとウリジン5'-二リン酸−N-アセチル-D-グルコサミンとを相互に変換する活性を有する酵素をコードする遺伝子を挿入変異により破壊し、該破壊遺伝子を細菌に保持させることにより、機能を持った前記酵素を欠損させた細菌変異体。
【請求項２】
配列番号１記載の塩基配列中塩基番号61〜1086からなる塩基配列からなる遺伝子を挿入変異により破壊し、該破壊遺伝子を細菌に保持させることにより、かかる破壊される前の遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性を欠損させた細菌変異体。
【請求項３】
挿入変異が、前記酵素をコードする遺伝子内に薬剤耐性遺伝子を挿入することによってなされるものであることを特徴とする請求項２記載の細菌変異体。
【請求項４】
細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）であることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載の細菌変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、UDP-GalNAc（ウリジン5'-二リン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン）とUDP-GlcNAc（ウリジン5'-二リン酸-N-アセチル-D-グルコサミン）とを相互に変換する活性を有するタンパク質をコードしていることが知られているgalE遺伝子を破壊して、上記酵素活性を抑制又は欠損させた細菌の変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
Gal：ガラクトース
GalNAc：N-アセチルガラクトサミン
Glc：グルコース
GlcNAc：N-アセチルグルコサミン
UDP：ウリジン5'-二リン酸
DMAB：ジメチルアミンボラン
なお、本明細書中において、特記しない限り糖は全てD体を示す。
【０００３】
タンパク質糖鎖の構成成分であるGlcNAc及びGalNAcは、稀少糖であり、生体内ではGalNAc又はGlcNAcからUDP-GlcNAc C4-エピメラーゼによって可逆的に生合成される。これらを相互に変換する酵素としては、GalEと呼ばれる酵素が知られている（非特許文献１）。この酵素の遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は既に公知である（非特許文献２）。しかし、この酵素の生体内での機能の重要性については不明な点が多い。
【０００４】
【非特許文献１】2003年度日本農芸化学会大会講演要旨集第25頁
【非特許文献２】Schrogel,O.ら、“B.subtilis orfs 1,2,3,4, pepT and galE genes”、X99339、[online]、平成9年2月13日、NCBI、[平成15年8月13日検索]、インターネット＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=1429253&dopt=GenBank＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、GalEをコードする遺伝子（gal遺伝子）が破壊され、GalEの酵素活性が抑制又は欠損した株は、GalEの生体内での役割を精査する上で必須であり、そのような株の確立が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、galE遺伝子を制限酵素で処理し、外来遺伝子を挿入することによりgalE遺伝子を破壊することで、GalEの活性が抑えられており、且つ特定の培地で生育させることができる新たな株を得ることができることを見い出して、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）  ウリジン5'-二リン酸−N-アセチル-D-ガラクトサミンとウリジン5'-二リン酸−N-アセチル-D-グルコサミンとを相互に変換する活性を有する酵素をコードする遺伝子を挿入変異により破壊し、該破壊遺伝子を細菌に保持させることにより、機能を持った前記酵素を欠損させた細菌変異体。
（２）  配列番号１記載の塩基配列中塩基番号61〜1086からなる塩基配列からなる遺伝子を挿入変異により破壊し、該破壊遺伝子を細菌に保持させることにより、かかる破壊される前の遺伝子がコードするタンパク質の酵素活性を欠損させた細菌変異体。
（３）  挿入変異が、前記酵素をコードする遺伝子内に薬剤耐性遺伝子を挿入することによってなされるものであることを特徴とする（２）記載の細菌変異体。
（４）  細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の細菌変異体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、GalEが欠損し、或いはGalEの酵素活性が抑制又は欠損した細菌株が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を、発明を実施するための最良の形態によって詳説する。
本発明変異体は、UDP−GalNAcとUDP-GlcNAcとを相互に変換する活性を有する酵素（UDP-N-アセチルグルコサミン4エピメラーゼ）をコードする遺伝子を破壊し、前記酵素活性を欠損させ、或いは前記酵素かっせを抑制又は欠損させた細菌変異体である。
【００１０】
本発明変異体における「UDP−GalNAcとUDP-GlcNAcとを相互に変換する活性を有する酵素」とは、前記機能を有した酵素である限りにおいて特に限定はされない。すなわち例えば更にGalとGlcとを相互に変換する活性などを有している酵素であっても良い。その中でも特にGalEとして知られている酵素が好ましくは例示される。従って、本発明変異体における「UDP−GalNAcとUDP-GlcNAcとを相互に変換する活性を有する酵素をコードする遺伝子」は、上記GalEをコードする遺伝子であることが好ましい。かかる遺伝子としては配列番号１中塩基番号61〜1086からなる塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００１１】
本発明変異体において「挿入変異」とは、遺伝子のコード領域に、他の遺伝子が挿入することにより、当初遺伝子にコードされていたタンパク質の機能が失われる変異をいう。
本発明変異体における「酵素を欠損させ」るとは、(i)遺伝子の塩基配列自体を変化させることにより、当初遺伝子にコードされていた酵素のタンパク質が活性を有しないようにする（抑制又は失活させる）こと、(ii)遺伝子の転写や翻訳を制限させて酵素のタンパク質自体が生じないようにすること、及び(iii)翻訳によって酵素のタンパク質自体は生ずるが、例えばスプライシングなどにより、かかる酵素のタンパク質が活性を有しないようにすることの全てを包含する概念である。しかし、本発明変異体においては特に(i)遺伝子の塩基配列自体を変化させることにより、当初遺伝子にコードされていた酵素のタンパク質が活性を有しないようにすることが好ましい。かかる好ましい方法としては、例えば上記遺伝子のコード領域を、制限酵素などの酵素を用いて消化し、消化によって生じた切断箇所に別の遺伝子を挿入する手法などを用いて、塩基配列への変化の導入を行うことができる。
【００１２】
本発明変異体において、前記酵素活性を持った前記酵素が欠損しているか否かは、例えば下記(a)及び(b)の各々の方法により確認することが可能である。
【００１３】
(a)DMABアッセイ
(i)被検変異体細菌の培養上清或いは破砕物（20mmol/l Tris-HCl(pH8.0)溶液）に終濃度1.0mmol/lとなるように基質であるUDP-GalNAc又はUDP-GlcNAcを17.1μg/35μlで添加して50μlとする。
(ii)37℃で20〜60分間インキュベートして酵素反応させた後、0.1mol/l HClを10μl添加し、次いで6分間煮沸することで酵素反応を完全に停止させた。その後、0.1mol/lのNaOHを10μl添加して中和する。
(iii)0.2mol/lの四ホウ酸ナトリウム（pH9.1）を140μl添加して、すぐに3分間煮沸する。
(iv)1050μlのDMAB試薬（氷酢酸/HCl=9/1(v/v)の溶液でDMABの10%溶液を調製し、このDMAB溶液を使用直前に更に氷酢酸で1/10に希釈する）を添加して、37℃で30分間インキュベートする。
(v)インキュベート後、595nmにおける吸光度を測定する。
【００１４】
(b)UDP-グルコースオキシダーゼ結合アッセイ（UDP-glucose oxidase-coupled assay）
(i)被検変異体細菌の培養上清或いは破砕物（20mmol/l Tris-HCl(pH8.0)溶液）に終濃度1.0mmol/lとなるように基質であるUDP-GalNAc又はUDP-GlcNAcを添加して44μlとする。
(ii)37℃で30分〜2時間インキュベートして酵素反応させた後、0.1mol/lのHClを添加し、次いで6分間煮沸することによって酵素反応を完全に停止させる。その後、0.1mol/lのNaOHを添加して中和する。
(iii)以下の試薬を50mmol/lの酢酸ナトリウムに溶解し、この溶液400μlを反応液に添加する。
22U/mlのグルコースオキシダーゼ
7U/mlのペルオキシダーゼ
0.3mgのo-ジアニシジン
(iv)37℃で30分間インキュベートした後、6mol/lのHClを600μl添加する。
(v)その後、540nmにおける吸光度を測定する。
【００１５】
本発明変異体における細菌とは、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌（Lactobacillus casei、Enterococcus faecalis、Bifidobacterium adolescentis等）、酢酸菌（Acetobacter xylinus等）等が例示されるが、その中でも大腸菌、枯草菌が好ましく、特に枯草菌が好ましくは例示される。
【００１６】
本発明変異体は、以下の方法により調製することが可能である。すなわち、変異を起こさせる目的の細菌（UDP−GalNAcとUDP-GlcNAcとを相互に変換する活性を有する酵素（UDP-N-アセチルグルコサミン4エピメラーゼ）を保持し、同酵素が機能を有している細菌：例えば枯草菌(B. sutilis)等）に遺伝子を導入することが可能なプラスミドベクター（例えばpET（Novagen社製）、pUC19（タカラバイオ株式会社販売）、pTrcHis（インビトロゲン社製）、pGEX（アマシャム  バイオサイエンス株式会社販売）、pTrc99（アマシャム  バイオサイエンス株式会社販売）、pKK233-3（アマシャム  バイオサイエンス株式会社販売）、pEZZZ18（アマシャム  バイオサイエンス株式会社販売）、pCH110（アマシャム  バイオサイエンス株式会社販売）、pBAD（インビトロゲン社製）、pRSET（インビトロゲン社製）、及びpSE420（インビトロジェン社製）等が挙げられる）を選択し、かかるプラスミドベクターに常法を用いて「UDP−GalNAcとUDP-GlcNAcとを相互に変換する活性を有する酵素の遺伝子」（例えばgalE遺伝子：配列番号１記載の塩基配列又はそのうちの塩基番号61〜1086からなる塩基配列からなる遺伝子）を挿入する。その後、挿入された上記遺伝子に、100bp〜3kbp、好ましくは300bp〜2kbp、より好ましくは600bp〜1.5kbpの塩基配列からなる他の遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、グルタチオン硫酸基転移酵素遺伝子（GST）等の酵素遺伝子、好ましくは薬剤耐性遺伝子、特に好ましくは抗生物質耐性遺伝子）を挿入し、galE遺伝子が酵素活性を有したGalEを発現できないように破壊する。そして、このプラスミドの挿入断片が目的の細菌の遺伝子の相当領域に置換するように、目的の細菌にプラスミドを導入する。
【００１７】
プラスミド中の挿入断片が、目的の細菌の遺伝子と置換していることの確認は、上述の「他の遺伝子」の働きを確認することにより行うことが好ましい。例えば、抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、細菌の培地に抗生物質を添加し、耐性を獲得した細菌株を選択し、更にその遺伝子の塩基配列を確認したり或いはPCR法により生じた産物の大きさを対比することで、目的の遺伝子への置換の有無を確認することが可能である。
【実施例１】
【００１８】
galE遺伝子のクローニングと本発明変異体（破壊株）の調製
Bacillus subtilis 168（ATCC 27370）のgalE遺伝子を、常法に従ってPCR法で増幅した。なお、PCR法に用いたプライマーは3'プライマーが配列番号３記載の塩基配列からなるプライマー、5'プライマーが配列番号４記載の塩基配列からなるプライマーである。
1029bpのPCR増幅断片を常法に従って、pUC19（タカラバイオ株式会社販売）に挿入した後、シーケンスを確認した。このPCR増幅断片をpET（Novagen社製）のNde1-BamH1サイトに挿入して発現プラスミドpETgalEを構築した。さらに、このプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHIで消化し、1020bpの断片を回収した。かかる断片を常法に従って平滑化した後、HindIIIの粘着末端を結合させて、pUC19のHindIII領域に挿入してpUCgalEを調製した。さらに、pUCgalEを制限酵素NcoIで消化し、エリスロマイシン耐性遺伝子（Bacillus Genetic Stock Centerから購入したプラスミドpMucin4MCSから制限酵素NcoIにより切り出した約1200bpの断片）を挿入してpUCgalE::Emを調製した。pUCgalEにおける制限酵素NcoI領域は、挿入されたGalEの遺伝子のコード領域の5'末端から約300bp下流に存在するため、ここにエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入した遺伝子はgalE遺伝子の発現は正常に行われないこととなる。
【００１９】
この発現プラスミドでB. subtilis 168株（ATCC 27370）を形質転換し、GalE欠損株を作製した。株の選択は、培地に10μg/mlでエリスロマイシンを添加し、この培地で生育した株（GalE欠損株）を選択した。選択したGalE欠損株のゲノムDNAを常法に従って抽出し、配列番号３及び配列番号４の5'プライマー及び3'プライマーとを用いてPCR法により増幅を行なった。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離した（図１）。その結果、GalE欠損株（レーンΔgalE）は約2200bpにバンドが生じたのに対し、対照として使用したB. subtilis 168（野生株）を用いた増幅産物は約1000bpのバンドしか生じなかった（レーンWT）。このことから、本発明のGalE欠損株には、galE遺伝子にエリスロマイシン耐性の遺伝子が挿入されて遺伝子の破壊が起こり、それがゲノムDNAの相同領域と置換を起こしていることが明かとなった。
【実施例２】
【００２０】
GalE欠損株の生育の解析
本発明のGalE欠損株を500mlひだ付きフラスコを用いて、リン過剰条件及びリン制限条件で培養を行なった。リン過剰条件では、培地としてLB培地（日水製薬株式会社製）を用い、リン制限条件では、培地としてKH2PO4を0.065mmol/lで添加したPL培地（日水製薬株式会社製）を使用し、37℃でフラスコの回転数は170rpmで培養した。対照としてはB. subtilis 168（野生株）を用いた（図２）。
【００２１】
その結果、リン制限条件においては、GalE欠損株の生育曲線は、ほぼ対照と同様であるが、リン過剰条件においては、対照に比してGalE欠損株の生育は抑制されることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のGalE欠損株のgalE遺伝子にエリスロマイシン耐性遺伝子が挿入されていることを示す電気泳動像を示す図である。レーンΔgalEはGalE欠損株を示し、WTは対照を示す。
【図２】本発明のGalE欠損株のリン過剰条件及びリン制限条件における生育曲線を示す図である。黒丸はリン過剰条件での対照の生育曲線を示し、黒四角はリン過剰条件でのGalE欠損株の生育曲線を示す。白丸はリン制限条件での対照の生育曲線を示し、白四角はリン制限条件でのGalE欠損株の生育曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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