(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便な方法で、且つ迅速に臨床に重要なブドウ球菌属の遺伝子群の配列や変異を効率良く解析できるブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供する。また、ブドウ球菌の遺伝子型を解析する際、好適に用いることができるプローブ、マイクロアレイ、及びハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法を提供する。【解決手段】ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、特定の塩基配列を含むことを特徴とするプローブ群。これらのプローブを搭載したマイクロアレイ。このようなプローブ又はマイクロアレイを用い、ブドウ球菌の遺伝子型を同定する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン７９及びコドン８０の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができるプローブであって、配列番号１で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブと相補的な配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項３】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン８４の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号３で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項４】
請求項３に記載のプローブと相補的な配列番号４で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項５】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４５１の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号５で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項６】
請求項５に記載のプローブと相補的な配列番号６で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項７】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン８４及びコドン８５の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができるプローブであって、配列番号７で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項８】
請求項７に記載のプローブと相補的な配列番号８で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項９】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン８８の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号９で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１０】
請求項９に記載のプローブと相補的な配列番号１０で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１１】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン４７の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１１で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプローブと相補的な配列番号１２で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１３】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｍｅｃＡの一部を検出することができるプローブであって、配列番号１３で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプローブと相補的な配列番号１４で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１５】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン１１６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１５で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプローブと相補的な配列番号１６で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１７】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４２２の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１７で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプローブと相補的な配列番号１８で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項１９】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４３２の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１９で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプローブと相補的な配列番号２０で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２１】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン１０６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号２１で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプローブと相補的な配列番号２２で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２３】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＢの点突然変異部分であるコドン４５６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号２３で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２４】
請求項２３に記載のプローブと相補的な配列番号２４で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２５】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｎｕｃの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２５で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２６】
請求項２５に記載のプローブと相補的な配列番号２６で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２７】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｅｔａの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２７で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプローブと相補的な配列番号２８で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項２９】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｅｔｂの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２９で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項３０】
請求項２９に記載のプローブと相補的な配列番号３０で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項３１】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ＴＳＳＴ−１の一部を検出することができるプローブであって、配列番号３１で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項３２】
請求項３１に記載のプローブと相補的な配列番号３２で表される塩基配列を含むことを特徴とするプローブ。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載のプローブのうち、少なくとも１つ以上のプローブを搭載したことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３４】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載のプローブ又は請求項３３に記載のマイクロアレイを用い、ブドウ球菌の遺伝子型を同定することを特徴とするブドウ球菌の遺伝子型解析方法。
【請求項３５】
ブドウ球菌の複数の遺伝子型を同時に同定するブドウ球菌の遺伝子型解析方法であって、請求項１又は２にプローブのうち少なくとも１つを含み、請求項３又は４に記載のプローブのうち少なくとも１つを含み、請求項５又は６に記載のプローブのうち少なくとも１つを含み、請求項７又は８に記載のプローブのうち少なくとも１つを含み、請求項９又は１０に記載のプローブのうち少なくとも１つを含むプローブセットを使用することを特徴とする請求項３４に記載のブドウ球菌の遺伝子型解析方法。
【請求項３６】
ターゲット核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーション又は該ハイブリダイゼーションの検出の際の反応温度、反応溶液の組成のうち少なくとも１つの条件を連続的又は段階的に変化させるカイネティックアッセイを含むことを特徴とする請求項３４又は３５に記載のブドウ球菌の遺伝子型解析方法。
【請求項３７】
ブドウ球菌の遺伝子型に起因する病原因子又は抗菌薬感受性を推定することを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のブドウ球菌の遺伝子型解析方法。
【請求項３８】
請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のブドウ球菌の遺伝子型解析方法を用いてブドウ球菌の遺伝子型を同定し、疫学解析を行うことを特徴とするブドウ球菌の遺伝子型解析方法。
【請求項３９】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３３及び／又は３４で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによりｇｒｌＡ及びｇｒｌＢを増幅させることを特徴とするハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法。
【請求項４０】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３５及び／又は３６で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによりｇｙｒＡ及びｇｙｒＢを増幅させることを特徴とするハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法。
【請求項４１】
ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３３〜３８で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲによりｇｒｌＡ、ｇｒｌＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、及びｍｅｃＡを増幅させることを特徴とするハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型解析方法、それに使用するプローブ、マイクロアレイ、及びハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ブドウ球菌属のうち黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌を識別する際には、ヌクレアーゼの存在の有無や卵黄反応により同定が行われてきた。また、黄色ブドウ球菌においては、各種毒素の有無をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法等によって検出している。また、ＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の同定には、直接メチシリン添加培地上で黄色ブドウ球菌を培養することによってメチシリン耐性を確認するということが行われている。ＭＲＳＡのフルオロキノロン抵抗性も、同様に、フルオロキノロンを添加した培地上での生育状況で抵抗性を判断するという手法が採られている。こうした毒素遺伝子の存在や抗生剤への抵抗性の他、例えば、コアグラーゼタンパクの型の違いによって株の区別が行われ、疫学解析に用いられている。
【０００３】
近年、こうしたブドウ球菌属における同定や型別に、遺伝子を用いた方法が報告されている。例えば、ＭＲＳＡの毒素の判定に、表皮剥離毒素遺伝子のｅｔａやｅｔｂ等の遺伝子をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で増幅し、それを電気泳動によって目的の増幅産物の長さを得ることによって、その遺伝子の存在を確認する方法が用いられている。敗血症などに関連するトキシックショック症候群毒素遺伝子もまた同様に、ＰＣＲと電気泳動で解析されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
一方、フルオロキノロンの抵抗性と、ジャイレース遺伝子やトポイソメラーゼＩＶ遺伝子中の特定の点突然変異部位との関係が解明されてきている。例えば、ＤＮＡシークエンサーによる塩基配列決定法を用いて、ジャイレース遺伝子やトポイソメラーゼＩＶ遺伝子中の特定の点突然変異部位を検出することにより、相互関係を解明するという方法がある（例えば、非特許文献１参照。）。
こうしたブドウ球菌属のフルオロキノロンの抵抗性に関するジャイレース遺伝子やトポイソメラーゼＩＶ遺伝子中の特定の点突然変異部位を解析することは非常に重要である。また、メチシリン抵抗性遺伝子の存在や、トキシックショック症候群トキシン遺伝子、表皮剥離毒素遺伝子等の存在も同時に、確認し、臨床診断に役立てることも非常に重要である。
【特許文献１】特開平６−３０３９７６号公報
【非特許文献１】堀井他（Horii T., et al）著、「ダイアグノスティック  マイクロバイオロジー  アンド  インフェクシャス  ディジーズ（Diagnostic Microbiology and Infectious Disease）」２００３年、４６巻、ｐ．１３９−１４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の技術では、これらの毒素遺伝子や薬剤抵抗性遺伝子の配列の有無や突然変異部位を解析する場合、各遺伝子を別々にＰＣＲで増幅し、ある遺伝子では電気泳動を行い増幅産物の長さのみの判定を行い、また、もう一方の遺伝子では、ＤＮＡシークエンサーによる塩基配列の決定で点突然変異配列を解析することが必要であった。こうした検査を行うためには、非常に複雑な工程が必要であった。
ＰＣＲ後に電気泳動のみで毒素遺伝子の有無を確認する方法では、非特異的な増幅断片が、目的の増幅産物と類似した長さとなった場合、誤って擬陽性の判定をする可能性がある。そのため、塩基配列の決定を行う必要があるが、例えば、前述したＤＮＡシークエンサーを用いた塩基配列決定法の場合、サンプルの濃度調整によっては判定可能なピークを得ることができない場合もあり、配列によっては誤った判定をしてしまうことがあった。
【０００６】
したがって、本発明は、より簡便な方法で、且つ迅速に臨床に重要なブドウ球菌属の遺伝子群の配列や変異を効率良く解析できるブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供することを目的とする。また、ブドウ球菌の遺伝子型を解析する際、好適に用いることができるプローブ、マイクロアレイ、及びハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン７９及びコドン８０の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができるプローブであって、配列番号１で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
また、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号２で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン８４の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号３で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号４で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４５１の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号５で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号６で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン８４及びコドン８５の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができるプローブであって、配列番号７で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号８で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン８８の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号９で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号１０で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン４７の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１１で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号１２で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｍｅｃＡの一部を検出することができるプローブであって、配列番号１３で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号１４で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン１１６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１５で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号１６で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４２２の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１７で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号１８で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４３２の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１９で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号２０で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン１０６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号２１で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号２２で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＢの点突然変異部分であるコドン４５６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号２３で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号２４で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｎｕｃの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２５で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号２６で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｅｔａの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２７で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号２８で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｅｔｂの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２９で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号３０で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ＴＳＳＴ−１の一部を検出することができるプローブであって、配列番号３１で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、上記のプローブと相補的な配列番号３２で表される塩基配列を含むプローブを提供する。
さらに、本発明は、前述したプローブのうち、少なくとも１つ以上のプローブを搭載したマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、前述したプローブ又はマイクロアレイを用い、ブドウ球菌の遺伝子型を同定するブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供する。
さらに、本発明は、かかるブドウ球菌の遺伝子型解析方法において、ブドウ球菌の複数の遺伝子型を同時に同定するブドウ球菌の遺伝子型解析方法であって、配列番号１又は２で表されるプローブのうち少なくとも１つを含み、配列番号３又は４で表されるプローブのうち少なくとも１つを含み、配列番号５又は６で表されるプローブのうち少なくとも１つを含み、配列番号７又は８で表されるプローブのうち少なくとも１つを含み、配列番号９又は１０で表されるプローブのうち少なくとも１つを含むプローブセットを使用するブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供する。
さらに、本発明は、かかるブドウ球菌の遺伝子型解析方法において、ターゲット核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーション又は該ハイブリダイゼーションの検出の際の反応温度、反応溶液の組成のうち少なくとも１つの条件を連続的又は段階的に変化させるカイネティックアッセイを含むブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供する。
さらに、本発明は、かかるブドウ球菌の遺伝子型解析方法において、ブドウ球菌の遺伝子型に起因する病原因子又は抗菌薬感受性を推定するブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供する。
さらに、本発明は、前述したブドウ球菌の遺伝子型解析方法を用いてブドウ球菌の遺伝子型を同定し、疫学解析に用いるブドウ球菌の遺伝子型解析方法を提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３３及び／又は３４で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによりｇｒｌＡ及びｇｒｌＢを増幅させるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法を提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３５及び／又は３６で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによりｇｙｒＡ及びｇｙｒＢを増幅させるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法を提供する。
さらに、本発明は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３３〜３８で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲによりｇｒｌＡ、ｇｒｌＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、及びｍｅｃＡを増幅させるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法を用いれば、より迅速かつ簡便な解析方法によって、臨床に重要なブドウ球菌属の遺伝子群の配列や変異を、一度に解析することができる。また、ＤＮＡシークエンシングでは判別不可能な一塩基置換を、精度よく短時間の解析で正確に検出することも可能である。本発明のプローブ、マイクロアレイ、及びハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法は、上記のブドウ球菌の遺伝子型解析を行う際、好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
まず、本発明のプローブについて説明する。
本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン７９及びコドン８０の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができるプローブであって、配列番号１で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
また、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン８４の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号３で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号４で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４５１の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号５で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号６で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン８４及びコドン８５の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができるプローブであって、配列番号７で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号８で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン８８の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号９で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号１０で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン４７の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１１で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号１２で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｍｅｃＡの一部を検出することができるプローブであって、配列番号１３で表される塩基配列を含むことを特徴とする
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号１４で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＡの点突然変異部分であるコドン１１６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１５で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号１６で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４２２の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１７で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号１８で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｒｌＢの点突然変異部分であるコドン４３２の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号１９で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号２０で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＡの点突然変異部分であるコドン１０６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号２１で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号２２で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｇｙｒＢの点突然変異部分であるコドン４５６の野生型又は突然変異型を検出することができるプローブであって、配列番号２３で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号２４で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｎｕｃの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２５で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号２６で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｅｔａの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２７で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号２８で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ｅｔｂの一部を検出することができるプローブであって、配列番号２９で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号３０で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いられ、ＴＳＳＴ−１の一部を検出することができるプローブであって、配列番号３１で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
さらに、本発明のプローブは、上記のプローブと相補的な配列番号３２で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
【００１０】
上記のプローブの説明において、各遺伝子は、以下のように定義される：
ｇｙｒＡは、ＤＮＡジャイレースαサブユニット遺伝子のことを指す。
ｇｙｒＢは、ＤＮＡジャイレースβサブユニット遺伝子のことを指す。
ｇｒｌＡは、ＤＮＡトポイソメラーゼIVαサブユニット遺伝子のことを指す。
ｇｒｌＢは、ＤＮＡトポイソメラーゼIVβサブユニット遺伝子のことを指す。
ＴＳＳＴ−１は、毒素性ショック症候群毒素遺伝子のことを指す。
ｅｔａは、表皮剥離毒素Ａ遺伝子のことを指す。
ｅｔｂは、表皮剥離毒素Ｂ遺伝子のことを指す。
ｍｅｃＡは、ヌクレアーゼ遺伝子のことを指す。
【００１１】
以上説明したプローブは、遺伝子型が未知のブドウ球菌が有する遺伝子と各プローブとのハイブリダイゼーションを検出することによって、すなわち、シークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーション法によって、該ブドウ球菌の遺伝子型を同定することが可能となる。シークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーション法は、例えば、特異的ハイブリダイゼーションが可能なプローブをアレイ上に固相化して並べ、ターゲット核酸とプローブとのハイブリダイゼーションによって形成される、完全に相補的なハイブリッドを検出することによってターゲット核酸の配列を決定することができる。
【００１２】
上述のプローブは、塩基配列に特異的な検出が可能となるためｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、これらのプローブは、プローブが識別可能な状態でハイブリダイゼーションの検出を行うことができる種々の方法に適用することが可能である。具体的には、例えば、プローブを基板に固相化して用いることができる。基板としては、ガラス、シリコンウエハ、各種の多孔質基板、ゲル、マイクロタイタープレートやビーズ、中空糸等が挙げられる。これらの基材からなり、複数種類のプローブを固相化し得るマイクロアレイを使用し、後述するマルチプレックスＰＣＲによりサンプルを増幅させると、一度に多くの遺伝子型を検出可能であるので、好ましい。上記の基材のうち、特に、実質的に液体を保持・透過することのできる各種の多孔質基板やビーズ、中空糸等を基板として用いると、サンプル溶液とプローブが固相された基板を繰り返し接触させながら、後述するカイネティックアッセイを容易に行うことが可能となり、より好ましい。プローブを基板に固相化しない場合には、複数の標識、例えば蛍光標識によりプローブを区別することにより、液相系で検出することも可能である。
【００１３】
プローブの塩基長は、９〜３５ｂｐ程度であることが好ましい。９ｂｐ未満であると特異的な検出が困難になり、また、３５ｂｐより大きいとＴｍ値が高くなるために一塩基の違いによるＴｍ値の差が小さくなり、一塩基の違いを検出することが困難になるという不具合が生じやすくなるためである。
【００１４】
本発明のマイクロアレイは、前述したプローブのうち、少なくとも１つ以上のプローブを搭載したことを特徴とする。マイクロアレイを使用することによって、多数のプローブを用いたハイブリダイゼーションを一度に行うことが可能となり、ブドウ球菌の複数の遺伝子型を同時に同定するために好適に用いることができる。すなわち、マイクロアレイに前述したプローブを搭載することによって、ブドウ球菌の遺伝子型解析を効率よく行うことができ、且つ、マイクロアレイは再現性などにも優れている。また、同一種類のプローブを複数スポットに配してもよい。
【００１５】
マイクロアレイの基板としては、プローブを固相化し得る種々の基板であれば如何なるものでも使用できるが、マイクロアレイの再現性などを考慮すると、各種の多孔質基板を用いた３次元マイクロアレイを使用することがより好ましい。３次元マイクロアレイとしては、例えば、ＰａｍＣｈｉｐ（登録商標)などが挙げられる。プローブをこのようなマイクロアレイに固相化する方法としては、静電結合や共有結合を用いる方法などがある。
【００１６】
本発明のハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３３及び／又は３４で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによりｇｒｌＡ及びｇｒｌＢを増幅させることを特徴とする。
また、本発明のハイブリダイゼーション用サンプルの調整方法は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号３５及び／又は３６で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによりｇｙｒＡ及びｇｙｒＢを増幅させることを特徴とする。
さらに、本発明のハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法は、ブドウ球菌の遺伝子型を特定するために用いるハイブリダイゼーション用サンプルの調製方法であって、配列番号８１〜８６で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲによりｇｒｌＡ、ｇｒｌＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、及びｍｅｃＡを増幅させることを特徴とする。
【００１７】
以下、本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法について順を追って説明する。本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法は、前述したプローブ又はマイクロアレイを用い、ブドウ球菌の遺伝子型を同定することを特徴とする。本実施形態においては、プローブをマイクロアレイに固相し、マルチプレックスＰＣＲを用いてハイブリダイゼーション用サンプルを調製し、さらに、カイネティックアッセイを行う場合を例示して説明する。
【００１８】
本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法において、前述したようにプローブはｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドであることが好ましいため、このようなプローブと特異的にハイブリダイズし得るサンプルを用意することが好ましい。ここで、解析の対象となるブドウ球菌の遺伝子をターゲット核酸とも呼ぶ。
また、ターゲット核酸を予め標識することによって、後段で述べるターゲット核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションを検出することが容易になり好ましい。標識方法は、蛍光標識法など公知の技術を用いればよい。
【００１９】
まず、解析の対象となるブドウ球菌であるが、生体などから得たブドウ球菌は、例えば、ＰＣＲによって増幅させると、少ない試料を元に解析を行うことが可能となり望ましい。また、ＰＣＲのうち、一度に複数のターゲット遺伝子を増幅させることができるマルチプレックスＰＣＲがより好ましい。
マルチプレックスＰＣＲにおいて、一度にターゲットとする遺伝子は前述したプローブ群の検出対象の配列を全て網羅することが望ましいが、特には、３〜１０種類が好ましい。効率良く同時に多数の対象を検出するためには、３種類以上が好ましく、ターゲット核酸が多い場合にはプライマーの設計が難しくなるので、１０種類以下が好ましい。特には、配列番号３３〜３８で表される塩基配列を有するプライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲによりｇｒｌＡ、ｇｒｌＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、及びｍｅｃＡの所定のコドンを増幅させることが望ましい。これらの遺伝子は、ブドウ球菌の抗菌薬感受性に関連する遺伝子であり、臨床応用上重要だからである。更に、これらの遺伝子を複数のセットとして解析を行うと、より詳細にブドウ球菌の遺伝子型を決定することができるので、より正確に病原因子又は抗菌薬感受性を推定することが可能となる。
【００２０】
上記のマルチプレックスＰＣＲを行う際の、変性、アニーリング、エクステンショの各条件は、例えば、以下のように行うと、より多くの増幅産物を得られ、ハイブリダイゼーションシグナルがより強くなるので好ましい。
変性：９２〜９４℃；３０〜６０秒
アニーリング：５０〜５５℃；３０〜６０秒
エクステンション：６８〜７２℃；３０〜６０秒
また、マルチプレックスＰＣＲに用いるＤＮＡは、２０〜１００ｎｇが好ましく、これをサイクル数３０〜４０で、１００〜５００μｇに増幅するのが好ましい。具体的には、例えば、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を使用することができる。
【００２１】
ターゲット核酸とプローブ核酸をハイブリダイズさせ、次いで、塩基配列に特異的な結合を検出することが好ましい。プローブとターゲット核酸との間のハイブリダイゼーションは、完全にマッチする場合と、１塩基のミスマッチを含む場合とでは、ハイブリダイズ強度が異なったり、さらにシグナル強度の差異が生じたりすることが知られている。より具体的には、例えば、ターゲット核酸に完全マッチするプローブとのハイブリッドについてのＴｍ近傍の温度においては、ターゲット核酸と、これに完全にマッチしないプローブとの間のハイブリッドは、より不安定であるために、ターゲット核酸とプローブとが解離した状態側に平衡が傾いていると考えられる。
【００２２】
そのため、このＴｍ近傍の温度においては、ターゲット核酸と、これに完全にマッチするプローブとの間のハイブリッドが最も強くシグナルを発しているはずであり、一方、ターゲット核酸と、これに完全にはマッチしないプローブとの間のハイブリッドは、存在していたとしてもその量は非常に少なく、よって、シグナル強度は強くない。したがって、前述した本発明のプローブを使用し、これらのプローブと完全にハイブリダイズする塩基配列を有するターゲット核酸を検出すれば、互いに１塩基のみ異なる複数種の遺伝子を同定することが可能となる。
【００２３】
ところで、ターゲット核酸とプローブ間のハイブリッド形成は、配列情報に基づいた推定の最適条件において行われるものであり、従ってその条件が本当に最適条件であるかはわからないのが普通である。そのために、静的に前記ハイブリッドの形成や検出を行う方法では、最適ではない条件下でのデータ取得を行っている可能性が生じる。この場合、データの信頼性が十分ではなかったり、データのばらつきが存在したりするなどの問題が起こりやすい。
【００２４】
したがって、本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法において、ターゲット核酸とプローブを接触させる際、又は、次いで行う該ハイブリダイゼーションの検出の際に、カイネティックアッセイを行い、反応温度、反応溶液の組成のうち少なくとも１つの条件を連続的又は段階的に変化させることが好ましい。ここで、「反応温度を変化させる」とは、標的核酸とプローブ間でのハイブリダイズ反応が行われる系内の温度を変更することを意味し、「反応溶液の組成を変化させる」とは、反応溶液に含まれる塩や添加物等の組成やｐＨを変更することを意味する。
より好ましくは、カイネティックなデータ取得と連動して反応条件を変更することにより、複数の反応条件でハイブリダイズ反応を進行させ、それを経時的に測定することである。
【００２５】
シグナルデータの取得もまた、時間に関して定点ではなく、カイネティックに行う。より具体的には、カイネティックにデータ取得する時間は、ハイブリッド形成反応の反応条件に応じて異なるものであるが、概して、ハイブリッド形成反応開始後、合計で数分間から数時間程度にわたる。もっとも、反応条件いかんによっては、この範囲外の合計時間だけデータ取得を行うことも可能である。
ターゲット核酸とプローブ間のハイブリッド形成の時間的変化を追跡することにより、標的核酸についてのより多くの、より正確な、そしてよりばらつきの少ない情報を得ることが可能になる。即ち、カイネティックなデータ取得を行う場合には、反応状態の経過をモニタリングすることが可能になり、反応の進行状況を厳密に検出することが可能になる。そして、反応の経過全体から、より正確な核酸情報を入手できるようになる。
【００２６】
以下、ターゲット核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにおける反応温度を変化させながら前記ハイブリダイゼーションの検出を測定する場合を例示して、カイネティックアッセイについてより詳しく説明する。
反応温度の変更については、Ｔｍ値未満の温度から、Ｔｍ値を越える温度間の温度上昇が好ましいが、これを更に発展させて、Ｔｍ値未満の温度から、Ｔｍ値を越える温度間の温度上昇と温度下降からなる１回又は複数回の温度サイクルとすることにより、ハイブリダイゼーションのプロファイルを取得することが可能となる。これにより、更に信頼性の高いデータを取得することが可能となる。
【００２７】
反応温度の上昇を行う場合には、上昇中のシグナル強度の極大値を測定することにより、ハイブリッドのＴｍ値を定性的又は定量的に求めることが可能となる。温度上昇を段階的に行う場合は、おおよそのＴｍ値が決定でき、温度上昇をより細かく段階的に（たとえば１℃以下の間隔で）、又は連続的に行えば、より正確なＴｍ値を決定することも可能である。このＴｍ値の違いは、各核酸の配列における変異の有無や違いを反映しているものであるので、変異の検出をより厳密に行うことが可能となる。
また、ハイブリッドからのシグナルを検出するのみならず、シグナルの変化量を計測すれば、測定の精度を更に高めることも可能となる。
【００２８】
更に、別の好ましい実施形態として、ハイブリッドが発するシグナルを測定する温度を連続的又は段階的に上昇させ、当該ハイブリッドから発せられるシグナル強度の変化を測定し、その変化量が負に転じた時にその温度を維持する。
反応温度を連続的又は段階的に変化させる間のシグナル強度の変化を検出し、そのシグナル強度の変化量が負に転じたところで反応温度を維持すると、その温度よりも高い温度のＴｍ値を有するハイブリッド種からの信号は、その強度が保たれるか又は更に上昇するが、一方、維持された温度以下のＴｍ値を有するハイブリッド種からの信号は、徐々に減少していくと考えられる。従って、Ｔｍ値の違いを利用して、完全にマッチしたハイブリッド種と、完全にはマッチしていないハイブリッド種とをより精度良く区別することが可能となり、完全にマッチしたプローブの配列に基づいて、未知であった変異を同定できる。
【００２９】
以上、反応温度を変化させるカイネティックアッセイについて詳細に説明したが、反応温度以外の条件を変化させても同様の効果が得られる。
反応溶液の組成を変化させるとは、同じ種類の溶液の濃度を変更することや別の種類の溶液に変更することが含まれる。例えば、６×ＳＳＰＥでハイブリダイゼーションを行いシグナルを取得し、次に、３×ＳＳＰＥでハイブリダイゼーションを行いシグナルを取得し、その次に、１×ＳＳＰＥでハイブリダイゼーションを行いシグナルを取得するように、反応溶液の濃度を変化させることができる。
また、例えば、６×ＳＳＰＥでハイブリダイゼーションを行いシグナルを取得し、次に、２０％ホルムアミド６×ＳＳＰＥでハイブリダイゼーションを行いシグナルを取得し、その次に、４０％ホルムアミド６×ＳＳＰＥでハイブリダイゼーションを行いシグナルを取得するように、反応溶液の種類を変化させることができる。
【００３０】
以上説明したブドウ球菌の遺伝子型解析方法は、ブドウ球菌の病原因子や抗菌薬感受性の推定、並びに疫学解析に応用することができる。ブドウ球菌のうち、上述したｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｇｒｌＡ、ｇｒｌＢ、ＴＳＳＴ−１、ｅｔａ、ｅｔｂの特定のコドンにおける変異型は、各種抗生物質に対する抵抗性を有したり、トキシックショック症候群や表皮剥離を起こさせたりする原因菌となる。したがって、ブドウ球菌の遺伝子型解析を行い、これら悪性のブドウ球菌の有無を判断することは臨床において非常に重要であり、本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法を用いれば、より迅速、且つ簡便にブドウ球菌の遺伝子型解析を行うことが可能となる。
【実施例１】
【００３１】
２０種類のブドウ球菌株について、ｇｙｒＡのコドン８８、コドン８４、コドン８５部位、及びｇｒｌＡのコドン４７、コドン７９、コドン８０、コドン８４及びｇｒｌＢのコドン４５１の点突然変異の有無の決定とメチシリン抵抗性遺伝子の存在の有無を、以下の方法を用いて同時に確認した。
【００３２】
＜ブドウ球菌のＤＮＡ抽出＞
−８０℃で凍結保存してあるブドウ球菌株を、ブレイン・ハートインフュージョン培地（日水製薬（株）製）で１０時間培養し、この培養液１ｍｌを、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、２．５Ｋ×ｇ、４度で５分間遠心して得られた沈殿をＤＮＡ抽出キットＩＳＯＰＬＡＮＴ（日本ジーン製）にて抽出した。
前記沈殿にＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを３００μｌ添加し、１〜２秒間遠心した。さらに、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを１５０μｌ添加し、６秒間遠心した。これを、５０度で１５分間インキュベートし、次いで、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを１５０μl添加し２秒間遠心し、氷上で１５分静置した。これを、１２Ｋ×ｇ、４℃で１５分間遠心し、水相分を除去し、２．５倍量のエタノールを添加し、混合した。さらに、１２Ｋ×ｇ、４℃で１０分間遠心を行い、沈殿を得た。この沈殿を７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、１００μｌのＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解し、サンプル溶液とした。
【００３３】
＜マルチプレックスＰＣＲ＞
上記のように調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて、マルチプレックスＰＣＲを行った。
Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＯＬＩＧＯ  ｖｅｒ．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ製）を用い下記に示す配列番号で表される各プライマーを加えたマルチプレックスＰＣＲが可能なように設計した。
ｍｅｃＡ（１６３ｂｐ）増幅用：配列番号３７／配列番号３８
ｇｒｌＡ及びｇｒｌＢ（１４５７ｂｐ）：配列番号３３／ 配列番号３４
ｇｙｒＡ（１２５５ｂｐ）：配列番号３５／配列番号３６
【００３４】
マルチプレックスＰＣＲには、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のＢｕｆｆｅｒ、２００μＭｄＮＴＰ、２．５Ｕ  ＥＸ  Ｔａｑ、および、１００ｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ、０．５μＭずつの上記の６種類のＦＩＴＣ標識プライマーを用いて反応液を調整し、９４℃・１ｍｉｎ、５０℃・２ｍｉｎ、７２℃・１ｍｉｎ、４０サイクルのＰＣＲ増幅を行った。
その結果１４５７ｂｐ（ｇｒｌＡ及びｇｒｌＢは１つの増幅物で得られる）、１２５５ｂｐ（ｇｙｒＡ）、１６３ｂｐ（ｍｅｃＡ）は、電気泳動でも予想されたサイズの位置に明確なバンドで見られ、ハイブリダイゼーションに十分量の増幅産物が得られた。
【００３５】
＜マイクロアレイの作製＞
３次元型フロースルー構造をもつ多孔質基板から成るＰａｍＣｈｉｐ（登録商標)に、ブドウ球菌のｇｒｌＡにおけるコドン４７の野生型又は突然変異型のうち少なくとも１つを検出することができ、配列番号４３〜４６で表されるプローブ群をスポットした。同様に、コドン７９及びコドン８０については配列番号５１〜６２で表されるプローブ群、コドン８４については配列番号４７〜５０で表されるプローブ群を、また、ｇｒｌＢにおけるコドン４５１については配列番号３９〜４２で表されるプローブ群、ｇｙｒＡにおけるコドン８８については配列番号６３〜６６で表されるプローブ群、コドン８４又は８５については配列番号６７〜７４で表されるプローブ群をスポットした。さらに、ｍｅｃＡを検出する配列番号７５、７６で表されるプローブもスポットした。マイクロアレイにおけるそれぞれのプローブのスポット位置を図１に示す。
図１は、マイクロアレイを示す平面図であり、各升目はプローブスポットを表している。また、升目の中の数字は、そのプローブスポットに固相化されたプローブに対応する配列番号を示している。
【００３６】
＜ハイブリダイゼーション＞
マルチプレックスＰＣＲによって増幅反応と蛍光標識を行った上記サンプル溶液を熱変性（９５℃・３ｍｉｎ、４℃に急冷）させた後、サンプル溶液３５μｌを１５μの２０ x ＳＳＰＥと混合した（終濃度６ｘＳＳＰＥ）。これを、予め５０℃で２０分間ｐｒｅ−ｈｅａｔし、５０μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１サイクルの前洗浄を行ったマイクロアレイのウェルに添加し、一定速度（ポンプ駆動容量５０μｌ:速度２５μｌ  ｓｅｃ−１  ｈｏｌｄ  ５ｓｅｃ）で繰り返し透過させることによりハイブリダイゼーション（５０℃、３０サイクル）を行った。ハイブリダイゼーション後、５０μｌの６ｘＳＳＰＥで１サイクルの洗浄を行い、洗浄後のシグナルをＣＣＤカメラで２００ｍｓの露光時間で撮像した。
続いて、０．５ｘＳＳＰＥで５サイクルの洗浄を行い、２００ｍｓの露光時間で撮像した。ハイブリダイゼーション反応から画像取得まで、一連の作業工程は、ＰＡＭマイクロアレイシステムＦＤ１０（オリンパス株式会社製）によって行った。これらのデータを、変異画像解析ソフトＭＡｎａｌｙｓｉｓ（オリンパス株式会社製）にて解析した。
【００３７】
図２は、１つのブドウ球菌株（Ｓｔｒａｉｎ２２８）より抽出したＤＮＡを、上述のマイクロアレイにおいてプローブと反応させた後のマイクロアレイを示す平面図である。すなわち、図２においてマイクロアレイの各升目には、図１に示す各配列番号で表されるプローブが固相されている。また、図２（ａ）は、６ｘＳＳＰＥにおけるハイブリダイゼーション後を示し、図２（ｂ）は、０．５ｘＳＳＰＥにおけるハイブリダイゼーション後を示している。
【００３８】
図２（ａ）に示すように、６ｘＳＳＰＥにおいては、例えば、Ｓｔｒａｉｎ２２８のｇｒｌＡのコドン７９／８０の遺伝子型は、複数のプローブスポットにおけるシグナル強度が近似しているため、判別が困難である。しかしながら、図２（ｂ）に示すように、０．５ｘＳＳＰＥにおいては、配列番号５３で表されるプローブが固相化されたプローブスポットにおいてハイブリダイゼーションのシグナルが得られた。したがって、このブドウ球菌のｇｒｌＡのコドン７９／８０の遺伝子型は、配列番号５３で表されるプローブに対応することが分かった。同様に、６ｘＳＳＰＥではｇｙｒＡのコドン８４／８５、コドン８８、ｇｒｌＡのコドン４７、及びｇｒｌＢのコドン４５１について、また、０．５ｘＳＳＰＥでは、ｇｒｌＡのコドン７９／８０の他に、コドン８４についての遺伝子型解析ができた。このように、例えば、バッファー塩濃度を変えたカイネティックアッセイを行うことで、プローブとのパーフェクトマッチをより正確に判別できることが判明した。
【００３９】
Ｓｔｒａｉｎ２２８以外のブドウ球菌株から抽出したＤＮＡについても同様に遺伝子型解析を行った。これらの結果を表１に示す。表１において、例えば、ＨＵ−２０００−６２というブドウ球菌株より抽出された核酸の遺伝子型は、例えば、ｇｒｌＡのコドン４７は前述した遺伝子型解析結果より、ＴＡＴという塩基配列を持つことが分かった。また、各コドンの塩基配列の横に示す括弧書きは、そのコドンがコードするアミノ酸の種類を下記のように表している。
（Ｓｉ）＝Ｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ
（Ｗｔ）＝Ｗｉｌｄｔｙｐｅ
（Ｆ）＝Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
（Ｙ）＝Ｔｙｒｏｓｉｎｅ
（Ｋ）＝Ｌｙｓｉｎｅ
（Ｓ）＝Ｓｅｒｉｎｅ
（Ｌ）＝Ｌｅｕｃｉｎｅ
（Ｐ）＝Ｐｒｏｌｉｎｅ
【００４０】
【表１】
2005130722.tif 000002
【００４１】
（比較例１）
本発明のブドウ球菌の解析方法の精度を確認するため、実施例１において得られた解析結果を従来のＤＮＡシークエンサーによる塩基配列決定法による解析結果と比較した。ＤＮＡシークエンサーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＧｅｎｅＳｃａｎ３１０を用い、ダイターミネーター法で決定した。シークエンシングプライマーは、配列番号７７〜８４を用いた。その結果、ＰＡＭマイクロアレイ（実施例１）の結果と全て一致し、本発明のブドウ球菌の遺伝子解析方法を用いれば、簡便に精度よく抗生剤耐性遺伝子配列の有無や、点突然変異を解析できることが照明された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のブドウ球菌の遺伝子型解析方法は、臨床に重要なブドウ球菌属の遺伝子型を同定する際に好適に用いることができ、例えば病原因子や抗菌薬感受性の推定、並びに疫学解析に応用できる。また、本発明のプローブは、プローブが識別可能な状態でハイブリダイズの検出を行うことができる種々の方法に適用することが可能である。具体的には、例えば、プローブを基板に固相化して用いることができる。基板としては、ガラス、シリコンウエハ、各種の多孔質基板、ゲル、マイクロタイタープレートやビーズ、中空糸等が挙げられる。また、プローブを基板に固相化しない場合でも、複数の標識、例えば蛍光標識によりプローブを区別することにより、液相系で検出することも可能であり、その他種々の解析方法に適宜用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１に使用したマイクロアレイを示す平面図である。
【図２】ブドウ球菌株（Ｓｔｒａｉｎ２２８）より抽出したＤＮＡを、図１のマイクロアレイにおいてプローブと反応させた後のハイブリダイゼーションシグナル結果を示す平面図である。
【図１】
2005130722.tif 000003
【図２】
2005130722.tif 000004
【配列表】
2005130722000001.app