(57)【要約】    【課題】  発酵法により、グルコース等の有機原料からアミノ酸の副生を抑制した状態で非アミノ有機酸を効率よく製造する。    【解決手段】  水性反応液中で、グルタミン酸要求性を示す細菌の菌体または該細菌の処理物と有機原料とを反応させることにより、リンゴ酸、フマル酸又はコハク酸等の非アミノ有機酸を製造する。より好ましくは、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化され、かつグルタミン酸要求性を示すコリネ型細菌または該細菌の処理物と有機原料とを反応させることにより、リンゴ酸、フマル酸又はコハク酸等の非アミノ有機酸を製造する。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性反応液中で、細菌の菌体または該細菌の処理物と有機原料を反応させて、該有機原料から非アミノ有機酸を製造する方法において、前記細菌がグルタミン酸要求性株であることを特徴とする方法。
【請求項２】
細菌が、コリネ型細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グルタミン酸要求性株が、グルタミン酸要求性を示すように改変された変異株である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記グルタミン酸要求性株が、さらにラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変されたグルタミン酸要求性株である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水性反応液が、炭酸イオン、重炭酸イオン及び／または炭酸ガスを含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
有機原料が、グルコースである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
非アミノ有機酸が、リンゴ酸、フマル酸又はコハク酸である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
非アミノ有機酸がコハク酸である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いた非アミノ有機酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノを発酵法により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられ検討されている（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１参照）。嫌気性細菌を用いた場合は、生産物の収率が高いが、一方で細菌が増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源の多量の添加は培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でなかった。
【０００３】
また、コリネ型細菌などの好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（例えば、特許文献３または４参照）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする非アミノ有機酸の生成量や菌体当たりの生産速度は未だ改善の余地があり、より優れた方法の確立が望まれていた。また、好気性細菌を用いた場合に、目的の非アミノ有機酸以外にアミノ酸が副生するということも、非アミノ有機酸の収量をさらに向上させる上での改善すべき点であった。
【０００４】
また、コリネ型細菌ではアミノ酸発酵を行うに際し、副生成物の低減化あるいは収率の向上を目的としてアミノ酸要求株を使用することが知られている。例えば、リジン生産においては、中山らによりC. glutamicumのホモセリン要求変異株（例えば、非特許文献２参照）の利用が、また佐野、椎尾らによりBrevi. Flavumのスレオニン要求性またはメチオニン要求性変異株（例えば、非特許文献３または４参照）の利用が報告されている。しかしながらリンゴ酸、フマル酸、コハク酸といった非アミノ有機酸の製造にアミノ酸要求株を用いることは、これまで報告されていなかった。
【特許文献１】米国特許第５，１４２，８３４号公報
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology, vol. 49, (1999), p207-216
【非特許文献２】J. Gen. Appl. Microbiol., vol. 7, (1961), p145
【非特許文献３】J. Gen. Appl. Microbiol., vol. 13, (1967), p349
【非特許文献４】J. Gen. Appl. Microbiol., vol. 15, (1969), p399
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、発酵法により、アミノ酸の副生を減少させてより効率よく非アミノ有機酸を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、非アミノ有機酸の製造にアミノ酸要求性変異株、特にグルタミン酸要求性変異株を用いることにより、副生アミ
ノ酸が減少するとともに、非アミノ有機酸の生成量が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、細菌の菌体反応により非アミノ有機酸を製造するに当たり、グルタミン酸要求性変異株を利用することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法に存する。
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
【０００９】
（１）  水性反応液中で、細菌の菌体または該細菌の処理物と有機原料を反応させて、該有機原料から非アミノ有機酸を製造する方法において、前記細菌がグルタミン酸要求性株であることを特徴とする方法。
【００１０】
（２））  細菌が、コリネ型細菌である（１）の方法。
【００１１】
（３）  前記グルタミン酸要求性株が、グルタミン酸要求性を示すように改変された変異株である、（１）または（２）の方法。
【００１２】
（４）  前記グルタミン酸要求性株が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変されたグルタミン酸要求性株である、（１）〜（３）のいずれかの方法。
【００１３】
（５）  前記水性反応液が、炭酸イオン、重炭酸イオン及び／または炭酸ガスを含有することを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの方法。
【００１４】
（６）  有機原料が、グルコースである（１）〜（５）のいずれかの方法。
【００１５】
（７）  非アミノ有機酸が、リンゴ酸、フマル酸又はコハク酸である（１）〜（６）のいずれかの方法。
【００１６】
（８）  非アミノ有機酸がコハク酸である（１）〜（６）のいずれかの方法。
【００１７】
（９）  （８）の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、コリネ型細菌を用いた非アミノ有機酸の製造において、副生アミノ酸の低減化及びコハク酸などの非アミノ有機酸の収率の向上が期待できる。本発明の製造方法によれば、得られた非アミノ有機酸を精製する工程において、負荷の軽減化が期待できる。製造される非アミノ有機酸は食品添加物や医薬品、化粧品に直接、或は、中間体として有用である。さらに、ポリエステルやポリアミドといったポリマーの原料としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の製造方法は、水性反応液中、細菌の菌体または該細菌の処理物と有機原料を反応させて、該有機原料から非アミノ有機酸を製造する方法において、前記細菌がグルタミン酸要求性株であることを特徴とする方法である。本発明の製造方法において、得られる非アミノ有機酸は特に限定されないが、例えば、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、ピルビン酸、酢酸、乳酸及びクエン酸などのアミノ酸以外の有機酸が挙げられる。これらの非アミノ有機酸は、一般には混合物として製造されるが、特定の非アミノ有機酸を生成するように改変された細菌を用いるか、または培養条件を検討することによって、特定の非アミノ有機酸のみを製造することも可能である。
【００２１】
本発明に使用されるグルタミン酸要求性株の親株は、非アミノ有機酸の生産能を有する限り特に限定されないが、このうち、Bacillus属細菌、Rizobium属細菌、コリネ型細菌（coryneform bacterium）等の好気性細菌が好ましく、コリネ型細菌がより好ましい。コリネ型細菌として好ましくは、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち、より好
ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム  フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する微生物が挙げられる。
【００２２】
上記微生物の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム  フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ＡＢ−４１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２株、コリネバクテリウム  グルタミカム  ＡＴＣＣ３１８３１株、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムのＭＪ−２３３株、ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株、ＭＣＩ  ４０２１株、ＭＣＩ  ４４１０株（FERM P-19424）及びＭＣＩ  ４４１１株（FERM P-19425）はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムのＭＪ−２３３株、ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株、ＭＣＩ
４０２１株、ＭＣＩ  ４４１０株及びＭＣＩ  ４４１１株と同一の株であるものとする。
【００２３】
本発明の製造方法において用いられるグルタミン酸要求性変異株は、生育にグルタミン酸を要求するものである限り特に限定されず、上記微生物を親株として、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により得られる組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
【００２４】
本反応においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変されたグルタミン酸要求性変異株を用いるとより有効である。「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化された変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、本明細書実施例に記載のＳａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。本発明に用いるラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたグルタミン酸要求性変異株としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムMCI 4410（FERM P-19424）ならびにコリネバクテリウム・グルタミカムMCI 4411（FERM P-19425）が挙げられる。これらの菌株はコリネバクテリウム・グルタミカムMJ-233AB-41由来のラクテートデヒドロゲナーゼ欠損株であるコリネバクテリウム・グルタミカム MCI 4021株より、グルタミン酸要求株として、例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトローＮ−ニトリソグアニジン処理により作製されるものである。なお、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたグルタミン酸要求性変異株の作製においては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減化させる
ための操作とグルタミン酸要求性を付与するための操作は、どちらを先に行ってもよい。
【００２５】
本発明の非アミノ有機酸の製造方法において、上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、該培地中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を、有機原料を含む水性反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。また、本発明の製造方法においては、細菌の菌体処理物、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等を用いてもよい。
【００２６】
本発明の非アミノ有機酸の製造反応に用いる有機原料としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用できる。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、非アミノ有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
【００２７】
上記有機原料を含む水性反応液としては、該反応液中で細菌が非アミノ有機酸生成反応を行いうるものであれば特に限定されないが、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。前記水性反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加するとよい。また、反応時の発泡を抑えるために、反応水溶液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００２８】
反応水溶液のｐＨは、通常、ｐＨ５〜10、好ましくはｐＨ６〜9.5に調整し、反応中も必要に応じて培養液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。非アミノ有機酸の生成にともなってpHが低下するため、反応水溶液中には炭酸イオン、重炭酸イオン及び／又は炭酸ガスが含まれることが好ましい。
【００２９】
本反応に用いる微生物の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、反応時は、通気、攪拌しても構わないが、通気せず、酸素を供給しなくても構わない。反応時間は、１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００３０】
本反応は、通常、反応液中のグルコース等の有機原料が消費された時点で反応終了とする。このとき、反応液中には、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸等の非アミノ有機酸が生成
している。このうち、コハク酸がもっとも蓄積度が高く生産物としては好ましい。
【００３１】
このようにして培養液中に蓄積した非アミノ有機酸は常法に従って、培養液より分離・精製される。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより非アミノ有機酸を分離・精製することができる。
【００３２】
近年、環境に配慮した工業製品が数を増し、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきていることもあって、本発明において製造される非アミノ有機酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーの原料として好適に用いられる。ポリエステルやポリアミドは本発明の製造法によって得られる非アミノ有機酸を重合させることによって得ることができる。
（実施例）
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
コリネバクテリウム・グルタミカム MJ-233AB-41（FERM BP-1498）株のラクテートデヒドロゲナーゼ欠損株の作成
（１）コリネバクテリウム・グルタミカム MJ-233AB-41(FERM BP-1498)株からのDNA抽出
コリネバクテリウム・グルタミカム MJ-233AB-41(FERM BP-1498)株を、尿素0.4%, 硫酸アンモニウム1.4%, リン酸１カリウム0.05%, リン酸２カリウム0.05%,硫酸マグネシウム・７水和物0.05%,硫酸第一鉄・７水和物0.002%,硫酸マンガン水和物0.002%, Ｄ−ビオチン200μg/L,塩酸チアミン200μg/L, 酵母エキス0.1%、カザミノ酸0.1%の組成の無菌液体培地（以下「Ａ培地」と称す）に対してグルコース２％、寒天２％を加えて調製したプレート（以下「Ａプレート」と略す）上で２日間培養し、得られたコロニーを１エーゼ掻き取り、Genetech社製Molecular griding resinを含む抽出バッファーに懸濁し、６５℃で３０分間加熱後、1500回転/分で５分間遠心し、上清をフェノール／クロロホルムで抽出してDNA粗抽出液を得た。
（２）LDH遺伝子のＰＣＲ増幅とTAクローニング
（１）で得られたDNAを鋳型として、公開特許公報(11-206385)に記載されているLDH（ラクテートデヒドロゲナーゼ）遺伝子の塩基配列(945塩基)データからデザインした、この遺伝子全体を増幅するためのプライマーを用いてLDH遺伝子をPCR増幅した。得られたDNA断片をプロメガ社製ＴベクターpGEMT-easyにクローニングし、得られたライゲーション産物をE.coli JM109株に形質転換した。LB-Amp-IPTG-Xgal培地に生育した白色コロニーから、LDH遺伝子断片が挿入されたプラスミドを有する株をコロニーＰＣＲ法により選択し、LB-Amp液体培地２ｍｌで培養後、目的プラスミド（pGEM-Teasy-CgLDH）を調製した。
（３）カナマイシン耐性遺伝子カセットの挿入
取得したプラスミドに載っているLDH遺伝子断片には６３０塩基目にXbaI認識サイトが存在することから、トランスポゾンTN09由来のカナマイシン耐性遺伝子の両端にXbaI認識サイトを連結するためのプライマーをデザインし、カナマイシン耐性遺伝子をＰＣＲ増幅した。（２）で調製したプラスミドpGEM-Teasy-CgLDH及びカナマイシン耐性遺伝子をXbaIで３７℃、１晩処理したのち、プラスミドを更にアルカリフォスファターゼで３７℃、２時間処理を行い、両者をQiaquick PCR purificationカラムで精製した。精製後、両者を混合し、TOYOBO社製Ligation highを用いて16℃、２時間処理して連結させた。本連結産物をE.coli JM109に形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地上の出現コロニーをpGEM-Teasy用のプライマーでコロニーPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子(866塩基)の挿入を
確認した。
（４）pHSG398へのLDH破壊用遺伝子断片の乗せ換え
（３）で得られた菌株をLB-Km液体培地２ｍｌで１晩培養し、目的のプラスミド(pGEM-Teasy-dLDH)を少量調製した。得られたプラスミドはクローニングサイトの両側２ケ所にEcoRIサイトを有するため、３７℃で１時間EcoRI処理後、1.5%アガロースゲルで電気泳動し、LDH遺伝子破壊用断片を回収した。更にこの断片を、EcoRIで消化し、アルカリフォスファターゼ処理を行ったクロラムフェニコール耐性プラスミドpHSG398と混合し、Ligation highを加えて連結させた。連結反応液はdam-(DNA adenine methylase欠損)、dcm-(DNA cytosine methylase欠損)遺伝子型の大腸菌JM110株に形質転換した。LB-Kmプレート上で生育したコロニーからpHSG398のマルチクローニングサイトの両端にデザインしたプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、目的とする遺伝子断片の挿入を確認した(pHSG398-dLDH、図１)。目的断片が確認されたコロニーをLB-Km液体培地６ｍＬで１晩培養し、約２μg/μLのプラスミド溶液５μLを調製した。
（５）Corynebacterium glutamicum  MJ-233AB-41（FERM BP-1498）株へのプラスミド導入とＬＤＨ遺伝子破壊株Corynebacterium glutamicum MCI4021株の作成
（４）で得られたプラスミド(pHSG398-dLDH)は、FERM BP-1498株中では複製不可能なプラスミドである。このプラスミドをFERM BP-1498株のコンピテントセル１２０μLに対して電気パルス法により導入した後、カナマイシンを含むAプレートで培養し、生育してきた菌株（ゲノムDNA上のLDH遺伝子とプラスミド間で相同組み換えを生じた菌株）を選択した。得られた菌株はLDH遺伝子の中にpHSG398由来の配列を含むsingle crossover株（一点相同組換え株、図２A）とカナマイシン耐性遺伝子カセットのみを含むdouble crossover株（二点相同組換え株、図２B）が混在しているため、Ｋｍを含むAプレートに生育したコロニーをCm（クロラムフェニコール）を含むAプレートにレプリカし、Ｋｍ耐性、Ｃｍ感受性を示すdouble crossover株を選択した（図２B）。このdouble crossover株（MCI4021株）からゲノムDNAを抽出し、（２）で用いたLDH遺伝子のプライマーでPCRを行った結果、本来の９４５塩基のバンドの代わりに、カナマイシン耐性遺伝子カセット８６６塩基が付加された１８１１塩基に相当するバンドのみが増幅された。また、このＰＣＲ産物のシークエンスを行い、カナマイシンカセットの挿入を確認した。
【実施例２】
【００３４】
Corynebacterium glutamicum MCI4021株由来グルタミン酸要求株の作製
実施例１で調製したMCI4021株を、カナマイシン２５ｍｇ/Ｌを含むAプレートで３０℃、２日間培養した。プレートに生育した菌を１白金耳掻き取り、グルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ/Ｌを含む無菌A培地１００ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容三角フラスコを用いて１６０回転/分に設定したロータリーシェーカーにて３０℃、一晩培養を行った。培養後の菌液から４０ｍＬを、ファルコン社製５０ｍＬ滅菌済み遠心チューブに移し、無菌的に調製した１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）４０ｍＬで２回洗浄を行った。洗浄後、菌体を無菌的に調製した１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）１０ｍＬに再び懸濁させた。本懸濁液に対し、無菌的に調製した１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）2.5ｍＬにＮ−メチル−Ｎ−ニトローＮ−ニトリソグアニジン２５ｍｇを溶解せしめた溶液0.5mＬを添加し、充分に攪拌した後、３０℃で３０分間恒温槽にて振とうした。振とう後、８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、無菌的に調製した１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）１０ｍLで２回洗浄を行った。洗浄後の菌全量を２％グルコースを含むA培地１００ｍｌに添加し、３０℃で４時間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。培養後、遠心分離を行って菌体を回収し、無菌的に調製した生理食塩水１０ｍｌで２回洗浄したのち、同量の生理食塩水１０ｍLに懸濁させた。本懸濁液に対し、無菌的に調製した５０％グリセロール水溶液同量を加えて混和せしめた懸濁液を調製し、適宜使用することとした。この菌懸濁液を、グルコース
２％、寒天２％、カナマイシン硫酸塩25mg/Lを含有する尿素0.4%, 硫酸アンモニウム1.4%, リン酸１カリウム0.05%, リン酸２カリウム0.05%,硫酸マグネシウム・７水和物0.05%,硫酸第一鉄・７水和物0.002%,硫酸マンガン水和物0.002%, Ｄ−ビオチン200μg/L,塩酸チアミン200μg/Lを含む寒天培地（以下「ＭＭＫ培地」と称す）にグルタミン酸ナトリウム1g/Lを添加した培地（以下「ＭＭＫＧ培地」と称す）に塗布し、３０℃にて４日間培養しコロニーを生じせしめた後、ＭＭＫ培地にレプリカを行い、ＭＭＫＧ培地では生育できるが、ＭＭＫ培地では生育できない株を分離した。本変異操作により得られたグルタミン酸要求性変異株Corynebacterium glutamicum MCI 4410（FERM P-19424）ならびにCorynebacterium glutamicum MCI 4411（FERM P-19425）はグルタミン酸要求性を示す事以外の菌学的性質に関しては、親株であるラクテートデヒドロゲナーゼ変異株Corynebacterium glutamicum MCI 4021と変わらなかった。なお、得られた２種類のグルタミン酸要求性株は、２００３年７月７日に、それぞれ受託番号FERM P-19424 及びFERM P-19425で産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。
【実施例３】
【００３５】
Corynebacterium glutamicum MCI 4410ならびにCorynebacterium glutamicum MCI 4411を、それぞれグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ/L、グルタミン酸ナトリウム1g/Lを含む無菌A培地１００ｍｌに一白金耳植菌し、５００ｍｌ容三角フラスコを用いて、１６０回転/分に設定したロータリーシェーカーにて３０℃、２４時間種培養を行った。対照として親株であるMCI4021株もグルタミン酸ナトリウムを含有しない培地にて同様に種培養を行った。
【００３６】
尿素：８ｇ、硫酸アンモニウム：２８ｇ、リン酸１カリウム：１ｇ、リン酸２カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸２ｇ、グルタミン酸ナトリウム２g、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍL及び蒸留水：１Ｌの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した２０％グルコース水溶液を１Ｌ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸ナトリウムで８．０に保ち、通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分３００回転で２４時間培養を行った。培養終了後、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収し、懸濁後６６０ｎｍで測定した吸光度が３０となるよう、以下に示す培地を無菌的に添加した。尿素：1.6ｇ、硫酸アンモニウム：5.6ｇ、リン酸１カリウム：0.2ｇ、リン酸２カリウム0.2ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：0.2ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：8ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：8ｍｇ、Ｄ−ビオチン：80μｇ、塩酸チアミン：80μｇ、酵母エキス0.8ｇ、カザミノ酸0.8ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：0.2ｍL,グルコース２０ｇ及び蒸留水：４００ｍｌの培地に菌体を懸濁させた後、１Ｌの発酵槽に入れ、３０℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸ナトリウムあるいは２Ｍ炭酸アンモニウムで8.0に保ち、通気は毎分１００ｍＬ、攪拌は毎分４００回転で２６時間反応を行った。グルコースは２６時間後にはほぼ消失した。２６時間後の培地（４００ｍｌ）中の各種有機酸および各種アミノ酸の生成量（ｇ）を表１に示す。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
表１から明らかなとおり、グルタミン酸要求性株では、親株に比して、副生した総アミノ酸量（主要副生アミノ酸である、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、グルタミン酸の生成量の和）が減少するとともに、生成した総有機酸量（主要生成非アミノ有機酸である、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酢酸、ピルビン酸の生成量の和）が増加することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】LDH遺伝子破壊用ベクターの構築を示す図。
【図２】相同組換えによるMJ233-ES株ゲノムDNA上のLDH遺伝子の破壊を示す図。
【図１】
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【図２】
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