(57)【要約】【課題】不妊治療剤、体外受精促進剤及び不妊治療剤スクリーニング方法の提供【解決手段】ケモカイン阻害剤（ケモカイン及びケモカイン受容体のアンタゴニスト、ケアンチセンス核酸、siRNA、ケモカイン発現阻害剤など）又はその塩を有効成分とする不妊治療剤。ケモカイン阻害剤（ケモカイン及びケモカイン受容体のアンタゴニスト、ケアンチセンス核酸、siRNA、ケモカイン発現阻害剤など）又はその塩を含有する体外受精促進剤。ケモカインとケモカイン受容体との相互作用に対する被験物質の影響の有無を判定し、相互作用を阻害する被験体を選択する、不妊治療剤のスクリーニング方法。【効果】ケモカイン受容体と、当該受容体のリガンド（ケモカイン）との相互作用を阻害することによって、卵丘細胞エクスパンジョンの正常化、排卵数増加及び受精率向上が得られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケモカイン阻害剤又はその塩を有効成分とする不妊治療剤。
【請求項２】
ケモカイン阻害剤が、ケモカイン受容体アンタゴニスト、ケモカインのアンチセンス核酸、ケモカイン受容体のアンチセンス核酸、ケモカインのsiRNA、ケモカイン受容体のsiRNA、ケモカイン発現阻害剤及びケモカイン受容体発現阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である、請求項１に記載の不妊治療剤。
【請求項３】
ケモカイン受容体がCCケモカイン受容体であり、ケモカインが該受容体リガンドである請求項２に記載の不妊治療剤。
【請求項４】
CCケモカイン受容体が、CCケモカイン受容体1、CCケモカイン受容体2又はCCケモカイン受容体5であり、ケモカインが該受容体リガンドである請求項３に記載の不妊治療剤。
【請求項５】
ケモカインが、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ、RANTES、LEC、MCP-1、MCP-2又はMCP-3である請求項４に記載の不妊治療剤。
【請求項６】
ケモカイン受容体アンタゴニストが、ケモカインに対する抗体、ケモカイン受容体に対する抗体、ケモカイン抗体の抗原結合断片、ケモカイン受容体抗体の抗原結合断片、ケモカイン結合阻害剤及びケモカイン変異体からなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項２〜５のいずれかに記載の不妊治療剤。
【請求項７】
ケモカイン阻害剤又はその塩を含有する体外受精促進剤。
【請求項８】
ケモカインとケモカイン受容体との相互作用に対する被験物質の影響の有無を判定し、相互作用を阻害する被験体を選択する、不妊治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ケモカイン受容体とケモカイン（リガンド）との相互作用（主として結合）を阻害することにより、卵丘細胞のエクスパンジョンの正常化、排卵数の増加又は受精率の向上を図るものであり、不妊治療製剤、体外受精促進剤、及び不妊治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
排卵及び受精は脊椎動物の生殖生理の鍵となるプロセスであり、濾胞刺激ホルモン（FSH）、黄体化ホルモン（LH）によって制御されることが知られている。これらゴナドトロピンの働きにより排卵された卵は卵管に移行し、精子との相互作用によって受精が完遂される。このような一連のプロセスは、もちろんゴナドトロピンによって起始されるが、多くの局所メディエーターも関与していると考えられている。プロスタグランジン（PG）E2は、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼ（COX）により産生される生理活性物質であるが、排卵時にPGE2量が増大することや、アスピリンが排卵を阻害することなどから、排卵を促進する局所メディエーターとして考えられてきた。近年、COX-2欠損マウスやEP2の欠損（EP2-/-）マウスが、排卵数及び受精率の顕著な低下を示すことから、COX-2により産生されたPGE2がEP2に作用して、排卵ならびに受精を促進することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。実際に、卵を取り巻く卵丘細胞において、ゴナドトロピン処理によりCOX-2とEP2の発現が誘導され、この発現は排卵後も維持されることが報告されている（非特許文献３）。EP2欠損マウスの卵丘細胞では、PGE2によるエクスパンジョン作用が見られず、また卵管から回収した卵丘は凝集した形態を示す。さらにEP2欠損マウスの卵−卵丘複合体では、体外受精の効率が低いが、卵丘細胞を除いた場合には効率に差は見られないことが報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
ケモカインは、白血球に対する遊走活性を有する分子量約１万の小型サイトカインファミリーであり、システイン残基の位置により、CXC、CC、C、CX3Cの４つに分類される。CCケモカインとしては、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ、RANTES、LEC、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MIP-4、I-309などが報告されている。また、ケモカインは７回膜貫通Ｇ蛋白質受容体を介して作用を発揮し、CCケモカイン受容体としてCCR1〜11など、CXCケモカイン受容体としてCXCR1〜6などが報告されている。ケモカイン−受容体系が関与する反応としては、炎症、アレルギー、血管新生、癌転移などが知られているが、排卵や受精といった生殖機能への関与は未だ明らかにされていない。
【非特許文献１】Austin S, FitzGerald GA. Not a mouse stirring: deletion of the EP2 and love's labor's lost. J Clin Invest. 103: 1481-2. (1999)
【非特許文献２】Sugimoto, Y., Narumiya, S., and Ichikawa, A.  Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.  Prog. Lipid Res. 39, 289-314. (2000)
【非特許文献３】Segi, E., Haraguchi, K., Sugimoto, Y., Tsuji, M., Tsunekawa, H., Tamba, S., Tsuboi, K., Tanaka, S., and Ichikawa, A.  Expression of messenger RNA for prostaglandin E receptor subtypes EP4/EP2 and cyclooxygenase isozymes in mouse periovulatory follicles and oviducts during superovulation. Biol. Reprod. 68, 804-811. (2003)
【非特許文献４】Hizaki H, Segi E, Sugimoto Y, Hirose M, Saji T, Ushikubi F, Matsuoka T, Noda Y, Tanaka T, Yoshida N, Narumiya S, Ichikawa A. Abortive expansion of the cumulus and impaired fertility in mice lacking the prostaglandin E receptor subtype EP(2).Proc Natl Acad Sci USA. 96: 10501-6. (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
EP2の欠損（EP2-/-）マウスにおける従来の実験結果から、EP2の欠損は卵丘細胞の機能に異常を有して生殖障害を呈するものと考察されるものの、その詳細については不明であった。従って、本願発明は、EP2の欠損に関与する因子について研究し、その因子を制御することによって、不妊治療のための新規な手段を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、EP2欠損マウス（不妊傾向マウス）の卵丘細胞における遺伝子発現解析を行った結果、野生型（WT）マウスに比べてケモカイン及びケモカイン受容体の発現が亢進していることを見出した。そこで、ケモカイン及びケモカイン受容体の発現の亢進を抑制することによって不妊傾向が改善されることを期待し、ケモカインとその受容体との相互作用を阻害する物質を投与すると、排卵数増加及び受精率向上することを確認し、本願発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本願発明は、下記の不妊治療剤、体外受精促進剤及び不妊治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
項１．ケモカイン阻害剤又はその塩を有効成分とする不妊治療剤。
項２．ケモカイン阻害剤が、ケモカイン受容体アンタゴニスト、ケモカインのアンチセンス核酸、ケモカイン受容体のアンチセンス核酸、ケモカインのsiRNA、ケモカイン受容体のsiRNA、ケモカイン発現阻害剤及びケモカイン受容体発現阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の阻害剤である、項１に記載の不妊治療剤。
項３．ケモカイン受容体がCCケモカイン受容体であり、ケモカインが該受容体リガンドである項２に記載の不妊治療剤。
項４．CCケモカイン受容体が、CCケモカイン受容体1、CCケモカイン受容体2又はCCケモカイン受容体5であり、ケモカインが該受容体リガンドである項3
に記載の不妊治療剤。
項５．ケモカインが、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ、RANTES、LEC、MCP-1、MCP-2又はMCP-3である項４に記載の不妊治療剤。
項６．ケモカイン受容体アンタゴニストが、ケモカインに対する抗体、ケモカイン受容体に対する抗体、ケモカインの抗原結合断片、ケモカイン受容体の抗原結合断片、ケモカイン結合阻害剤及びケモカイン変異体からなる群から選択される少なくとも１種を含む項２〜５のいずれかに記載の不妊治療剤。
項７．ケモカイン阻害剤又はその塩を含有する体外受精促進剤。
項８．ケモカインとケモカイン受容体との相互作用に対する被験物質の影響の有無を判定し、相互作用を阻害する被験体を選択する、不妊治療剤のスクリーニング方法。
【０００７】
本願発明は、ケモカインが排卵・受精などの生殖反応に関与することをはじめて見出した結果達成されたものである。具体的には、排卵、受精障害を示すＥＰ２欠損マウスの卵丘細胞においてケモカインおよびケモカイン受容体の発現が亢進していること、ケモカインにより卵丘細胞のエクスパンジョンが抑制されること、ケモカイン阻害剤（vMIP-II）によって卵丘細胞エクスパンジョンの正常化、排卵数増加及び受精率の向上という効果が認められること、等の新規知見に基づくものである。これらの知見は、ケモカイン受容体と当該受容体のリガンドとの相互作用を阻害することによって、卵丘細胞エクスパンジョンの正常化、排卵数増加及び受精率向上という効果をもたらし、不妊症を治療することや体外受精を促進することなどが可能であることを示す。
【０００８】
本願発明において、ケモカイン阻害剤は、ケモカイン受容体とそのリガンドとの相互作用を阻害するものであれば特に制限されない。なお、相互作用を阻害する、とは、ケモカイン受容体とリガンドとのシグナル伝達の成立を阻害するものである。従って、ケモカイン阻害剤は、ケモカイン受容体アンタゴニストだけでなく、損傷、変異、発現阻害などによってケモカイン受容体及び／又はそのリガンドを変質等させて結合能を除去することにより、ケモカイン受容体とリガンドとが結合不能になり、その結果シグナル伝達を成立させなくするもの（例えば、アンチセンス核酸、siRNA、発現阻害剤など）も包含する。
【０００９】
ケモカイン受容体は、CCケモカイン受容体（CCR）が好ましく、CCケモカイン受容体1（CCR1）、CCケモカイン受容体2（CCR2）、CCケモカイン受容体5（CCR5）がより好ましく、CCケモカイン受容体1、CCケモカイン受容体2がよりいっそう好ましい。ケモカインは、CCケモカインが好ましく、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1γ、RANTES、LEC、MCP-1、MCP-2、MCP-3がより好ましく、MIP-1α、MIP-1γ、RANTES、LEC、MCP-1、MCP-2、MCP-3がよりいっそう好ましい。
【００１０】
ケモカイン受容体アンタゴニストは、ケモカインと比較して、ケモカイン受容体に対する親和性が高く、ケモカインより優先的にケモカイン受容体と結合するものをいう。例えば、ケモカインに対する抗体、ケモカイン受容体に対する抗体、ケモカインの抗原結合断片、ケモカイン受容体の抗原結合断片、ケモカイン結合阻害剤、ケモカインの変異体などを使用することができる。
【００１１】
なお、塩としては、生理学的に許容される塩基（アルカリ金属等）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００１２】
ケモカインに対する抗体（ケモカイン抗体）はケモカインに特異的に結合し、ケモカイン受容体に対する抗体（ケモカイン受容体抗体）はケモカイン受容体に特異的に結合して、ケモカインとその受容体との相互作用を阻害する抗体であり、公知の抗体が包含される。例えば、活性不活化用抗ヒトMCP-1抗体 （#AF-279-NA、 R&D SYSTEMS）や、抗ヒトMCP-1ポリクローナル抗体（#0100-0109、Biogenesis）、抗ヒトMCP-3不活性化用抗体（#AB-282-NA、 R&D SYSTEMS）、抗ヒトMCP-3マウスIgG抗体（#905-119, Assay design, Inc.）、抗ヒトMCP-3モノクローナル抗体（生物活性抑制用）（#500-M73, Novus Biologicals）などが挙げられる。当該抗体には、温血動物の抗血清や鶏卵抗体等のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が包含される。このような抗体の製造法は公知であり、標的タンパク質、その変異体、これらのアミノ酸配列又は部分アミノ酸配列、これらを含む免疫抗原などを温血動物（ヒトを除く）に免疫することにより収得することができ、その方法乃至手法は、常法に従うことができる。例えば、免疫抗原を温血動物に免疫することによって、抗体を該温血動物の血液等の体液内又は該温血動物が産卵した卵内に産生させ、それらより取得することができる。
【００１３】
ケモカイン抗体の抗原結合断片、ケモカイン受容体抗体の抗原結合断片は、それぞれの抗体の抗原結合活性を有するフラグメントであり、ケモカイン又はケモカイン受容体に結合することによって、ケモカインがケモカイン受容体へ結合することを阻害する。ケモカイン抗体の抗原結合断片及びケモカイン受容体抗体の抗原結合断片は、常法により調製できる。
【００１４】
ケモカイン結合阻害剤は、ケモカイン及び／又はケモカイン受容体に特異的に結合し、ケモカインとその受容体との結合を阻害する物質である。例えば、vMIP-II（ウイルス性MIP-II；ケモカイン受容体であるCCR1、CCR2、CCR5、CCR8、CCR10、CXCR4、XCR1に結合する）、図１及び図２に示されたCCケモカイン受容体1拮抗薬、図３に示されたCCケモカイン受容体2拮抗薬を始め、ケモカインおよびケモカイン受容体の結合を阻害する作用に基づく、炎症、リウマチ、自己免疫疾患、腎炎、炎症を治療するための薬などが挙げられる。
【００１５】
ケモカインのアンチセンス核酸分子およびケモカイン受容体のアンチセンス核酸分子は、ケモカインのDNA、RNA、ケモカイン受容体のDNA、RNAの少なくとも１種に結合してケモカインおよびケモカイン受容体の発現を抑制するものである。アンチセンス核酸分子は、特定のヌクレオチド配列と結合し標的タンパク質の産生を抑制するようにデザインされた相補性核酸ヌクレオチド鎖である。これらの物質は単独または他の拮抗物質と併用して用いることができる。例えばケモカインのmRNAの翻訳を阻害するRNAである。具体的には、MCP-1-アンチセンス・オリゴヌクレオチド（配列番号１）（Okabe H. Moriwaki O. Kalluri R. Imai H. Ban S. Takahara T, and Suzuki H.  Inhibition of monocyte chemoattractant protein-1 expression in tubular epithelium attenuates tubulointerstitial alteration in rat Goodpasture syndrome  Kidney Intenational, 57, 927-936, 2000）や、MCP-1-アンチセンス・オリゴヌクレオチド（配列番号２）（Ghirnikar R. S., Lee Y. L., Li J.D., Eng L.F.Chemokine inhibition in rat stab wound brain injury using antisense oligodeoxynucleotides Neuroscience Letters, 247 21-24, 1998）などが例示される。アンチセンス核酸分子の調製方法はペプチド合成や遺伝子工学的手法を用いる常法に従って行うことができる。
【００１６】
ケモカインsiRNA（short interfering RNA）およびケモカイン受容体siRNAは、ケモカインおよびケモカイン受容体の発現を調節するものである。siRNAとは、通常、mRNAに相同的な２１〜２５塩基程度のヌクレオチドで、両鎖の3'末端が突き出た短い二本鎖RNAである。siRNAは、細胞内に導入されると、標的mRNAを配列特異的に認識して切断することにより標的遺伝子の発現を抑制する。siRNAは、直接細胞内に導入するか、siRNA発現ベクターに組み込んで導入することができる。siRNAの調製はペプチド合成や遺伝子工学的手法を用いる常法に従って行うことができる。
【００１７】
ケモカイン発現阻害剤は、ケモカイン転写調節因子に作用しその発現を調節するものである。ケモカイン発現阻害剤の調製は常法により行うことができる。
【００１８】
ケモカイン阻害剤は、必要に応じて、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤と、常法に従って、適宜、適量混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤等の剤型に製剤化でき、経口的または非経口的に安全に投与することができる。
【００１９】
本明細書において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法等を含むものである。注射用調剤、例えば、無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物は、適当な分散化剤または湿化剤および懸濁化剤を用いて当該分野で知られた方法で調製されうる。その無菌注射用調剤は、また、例えば水溶液等の非毒性の非経口投与することのできる希釈剤あるいは溶剤中の無菌の注射のできる溶液または懸濁液であってもよい。使用することのできる担体あるいは溶剤として許されるものとしては、水、リンゲル液、等張食塩液等が挙げられる。さらに、通常溶剤または懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油も用いられうる。このためには、いかなる不揮発性油も脂肪酸も使用でき、天然あるいは合成あるいは半合成の脂肪性油または脂肪酸、そして天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類も含められる。
【００２０】
経口投与用の固形投与剤型としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等が挙げられる。そのような剤型において、活性成分化合物は、少なくとも一つの添加物、例えば、ショ糖、乳糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、寒天、アルギネート類、キチン類、キトサン類、ペクチン類、トラガントガム類、アラビアゴム類、ゼラチン類、コラーゲン類、カゼイン、アルブミン、合成または半合成のポリマー類またはグリセリド類と混合することができる。そのような剤型物はまた、通常の如く、さらなる添加物を含むことができ、例えば不活性希釈剤、マグネシウムステアレート等の滑沢剤、パラベン類、ソルビン酸等の保存剤、アスコルビン酸、α−トコフェロール、システイン等の抗酸化剤、崩壊剤、結合化剤、増粘剤、緩衝化剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パーフューム剤等が挙げられる。錠剤およびピル剤はさらにエンテリックコーティングされて製造されることもできる。経口投与用の液剤は、医薬として許容されるエマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤等が挙げられ、それらは当該分野で普通用いられる不活性希釈剤、例えば水を含んでいてよい。
【００２１】
本願発明の不妊治療剤の投与量は、投与対象、投与対象の年齢および体重、症状、投与時間、投与方法、剤型などにより、適宜選択することができる。ある特定の患者の投与量は、年令、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、患者のその時に治療を行っている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。例えば、成人（体重約６０ｋｇ）に経口投与する場合、通常１回量として、有効成分が約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜３０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度であり、これらの服用量を１日約１〜約３回程度投与するのが望ましい。当然ながら、これらの用量範囲は一日投与量を分割するために必要な単位ベースで調節できるが、前記のように用量は疾患の性質および程度、患者の年令、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
【００２２】
本願発明の体外受精促進剤は、ケモカイン阻害剤又はその塩を含有することを特徴とする。ケモカイン阻害剤及びその塩については上記の通りである。
【００２３】
体外受精は、畜産、食品、医療、製薬等の広範な分野において品種改良や不妊治療などを目的として利用されている。本願発明の体外受精は常法に従い行うことができる。例えば、哺乳動物の体外受精に使用される卵丘−卵複合体は、通常、卵巣又は卵管から回収され、回収後直ちに使用されるか、減数分裂を経ることによって成熟した後で使用される。
【００２４】
一方、哺乳動物の精子は、通常、精巣上体又は採取した精液から単離される。精子が受精能を獲得するためには、まず、精巣上体または精漿由来の受精能獲得阻止因子をサイクリックAMP分解酵素阻害剤等を用いて除き、その後、更に精子の細胞内のシグナル伝達系を活性させる。
【００２５】
これらの精子及び卵丘−卵複合体は、豚、牛、ウマ、羊、ヤギ等の家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、ヒトなどに由来する細胞を包含する。好ましくは、マウス、ラット、ヒトに由来する細胞であり、より好ましくはマウス、ラットに由来する細胞である。精子及び卵丘−卵複合体は、採取後直ぐのものであっても、凍結せずに短時間保存したものであっても、また凍結保存後に融解したものであっても良い。また、これらの細胞の採取方法は上述の方法を始めとして常法を用いることができ、これらの細胞の保存方法も常法を用いることが可能である。
【００２６】
本願発明の体外受精促進剤は、通常、体外受精の系に存在させられるか、体外受精前の卵丘−卵複合体に作用するよう存在させられることによって使用される。例えば、体外受精時に体外受精用培地に添加されて使用されたり、体外受精させる前の卵丘−卵複合体の保存用培地に添加されて卵丘−卵複合体を前処理するために使用されてもよい。体外受精用培地及び卵丘−卵複合体保存用培地は、使用される卵丘−卵複合体及び精子の動物種に適した従来から使用されるいずれの培地も使用できる。また、受精の条件（温度等）や卵丘−卵複合体及び精子の保存条件（温度等）は、受精方法や動物種等に応じて適宜設定できる。本願発明の体外受精促進剤は、必要に応じて、体外受精用の培地成分、水などを含んでいてもよい。
【００２７】
本願発明の体外受精促進剤中のケモカイン阻害剤又はその塩の含有量は特に制限されない。一般的には、0.001〜100重量％である。当該体外受精促進剤の使用量は特に制限されない。一般的には、培地中の濃度が10 ng/ml〜10 μg/ml、好ましくは10 ng/ml〜1μg/mlである。
【００２８】
本願発明の不妊治療剤のスクリーニング方法は、ケモカインとケモカイン受容体との相互作用に対する被験物質の影響の有無を判定し、相互作用を阻害する被験体を選択することを特徴とする。本スクリーニング方法において使用される被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵生産物、海洋生物抽出液、植物抽出液、細胞抽出液、動物組織抽出液などが挙げられる。これらの被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。本スクリーニング方法では、スクリーニングに供された被験物質のうち、ケモカイン受容体とそのリガンドとの相互作用を阻害するもの（好ましくは受容体に親和性を有するもの）を選択する。なお、相互作用を阻害する、とは、ケモカイン受容体とリガンドとのシグナル伝達の成立を阻害するものであり、上記の通りである。選択の際、受容体に結合する被験物質であれば、当該受容体に対する親和性が、当該受容体のリガンドよりも高いものを選択することが望ましい。同様に、リガンドに結合する被験物質であれば、当該リガンドに対する親和性が、当該リガンドの受容体よりも高いものを選択することが望ましい。
【００２９】
以下、本願発明のスクリーニング方法を具体的に説明する。ケモカインおよびケモカイン受容体は、例えば当該ケモカインおよびケモカイン受容体を含有する細胞または該細胞から得られるケモカインおよびケモカイン受容体を含有する細胞膜画分から得ることができる。ケモカインおよびケモカイン受容体を含有する細胞としては、ケモカインおよびケモカイン受容体をコードするDNAを導入することにより宿主細胞を形質転換せしめて得られた、該DNAを含有しケモカインおよびケモカイン受容体を発現した形質転換体や、ケモカインおよびケモカイン受容体を含有する天然の細胞（例えば、ラットマクロファージなど）が挙げられる。上記の宿主細胞としては、例えば大腸菌、古草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。ケモカインおよびケモカイン受容体を含有する細胞膜画分とは、ケモカインおよびケモカイン受容体を含有する細胞を破砕した後に得られる細胞膜を多く含む画分をいう。細胞の破砕方法としては、例えばPotter-Elvehjem型ホモジナイザーで押しつぶす方法、超音波による破砕、凍結融解などが挙げられる。細胞膜を分画するには、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの方法が主として用いられる。
【００３０】
本願発明のスクリーニング方法において、ケモカインおよびケモカイン受容体をコードするDNAを導入することにより宿主細胞を形質転換せしめて得られた、該ＤＮＡを含有しケモカインおよびケモカイン受容体を発現した形質転換体（例えばラットケモカインおよびケモカイン受容体を含有するCHO細胞）を用いる場合は、該CHO細胞を生細胞のまま用いることができる。あるいは、該CHO細胞をそれ自体公知の方法に従ってグルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒドなどで固定化した後、用いることもできる。
【００３１】
本願発明のスクリーニング方法において使用されるケモカインおよびケモカイン受容体は、本願発明の不妊治療剤において使用されるケモカインおよびケモカイン受容体と同様である。ケモカインおよびケモカイン受容体は親和性の有無の判定を容易にするため、標識することが望ましい。標識は、ケモカインおよびケモカイン受容体に使用される公知の標識を使用できる。例えば、［125I］［35S］、［3H］、［14C］などによる標識、フルオレッセインなどによる蛍光標識、西洋ワサビペルオキシダーゼなどによる酵素標識、遺伝子工学的に作製したケモカインとアルカリフォスファターゼなどのタンパク質との遺伝子工学的に作製した融合タンパク質などを用いることができる。これらの標識体は自体公知の方法に従って作製することができる。例えば［125I］で標識されたヒトMIP-1αおよびヒトRANTESがデュポンより市販されているので、それらを利用できる。
【００３２】
具体的には、まず、ケモカインおよびケモカイン受容体を含有するCHO細胞または該CHO細胞から得られるケモカインおよびケモカイン受容体を含有する細胞膜画分、またはケモカインおよびケモカイン受容体を、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁することにより標品を調製する。緩衝液としては、結合を阻害しないものであればよく、例えばpH 6〜8のリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、PBS、HBSSなどが用いられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質、CHAPSやTween 80 、ジギトニンなどの界面活性剤を加えることもできる。さらに、タンパク質分解酵素によるケモカインおよびケモカイン受容体の分解を抑えるために、PMSF、ペプスタチン、ロイペプチンなどのタンパク質分解酵素阻害剤を添加することもできる。また、ケモカインおよびケモカイン受容体を含有するCHO細胞を培養器に接着させたままスクリーニングに用いることもできる。約0.01〜10 mlの該ケモカインおよびケモカイン受容体または該標品に、一定量（約5,000〜1,000,000 cpm）の標識体と約10-3〜10-10Mの濃度の合成化合物などの被験物質あるいは適宜に希釈した微生物発酵生産物などの被験物質とを同時に添加し、約0〜50℃（望ましくは約4〜37 ℃）で、約0.5〜24時間（望ましくは約0.5〜3時間）反応させる。反応後、適量の緩衝液で洗浄したのち該ケモカインおよびケモカイン受容体または該標品に残存する放射線量をガンマカウンター、液体シンチレーションカウンターなどで測定する。反応時に大過剰の非標識リガンドを共存させたときの残存放射線量を非特異的結合量とする。あるいは、ケモカインおよびケモカイン受容体を含有しないコントロールのCHO細胞または該CHO細胞から得られるケモカインおよびケモカイン受容体を含有しない細胞膜画分を用いたときの残存放射線量を非特異的結合量とすることもできる。共存物のないときの残存放射線量を総結合量とするとき、総結合量から非特異的結合量を差し引いた値が特異的結合量である。反応液に添加することにより、この特異的結合量を低下させる被験物質をケモカイン又はケモカイン受容体に親和性を有するものとして選択することができる。
【００３３】
また、別の態様では、ケモカインおよびケモカイン受容体を含有するCHO細胞を培養後、細胞懸濁液を調製し、ケモタキシスチャンバーを用いてリガンドに応答した該CHO細胞の遊走活性を測定できる。あるいは、該CHO細胞懸濁液にfura-2やfura-PE3などの蛍光指示薬を添加することによりCHO細胞にこれらの蛍光指示薬を付加し、蛍光分光光度計などを用いてリガンドの刺激による細胞内Ca2+濃度の変動を測定できる。
【発明の効果】
【００３４】
本願発明は、ケモカイン受容体と、当該受容体のリガンド（ケモカイン）との相互作用を阻害することによって、卵丘細胞エクスパンジョンの正常化、排卵数増加及び受精率向上という効果が得られるという新規知見に基づくものである。
【００３５】
本願発明の不妊治療剤では、ケモカイン阻害剤又はその塩を使用することにより、受容体とリガンド（ケモカイン）との相互作用を抑制するため、不妊の治療に有効である。
【００３６】
本願発明の体外受精促進剤も同様に、上記阻害剤を使用することにより、ケモカインを介した反応を抑制するため、卵丘細胞エクスパンジョンの正常化、受精率の向上という効果が得られ、体外受精に有効である。
【００３７】
本願発明の不妊治療剤のスクリーニング方法は、上記の優れた不妊治療剤を選択することができる優れた方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本願発明の実施例を使用してより詳細に説明する。
【実施例】
【００３９】
以下の実験においては、野生型マウスとして5週令のC57BL/6雌マウス（日本SLC）を用いた。EP2欠損マウスとしてC57BL/6雌マウス（日本SLC）に戻し交配した5週令のEP2受容体欠損雌マウスを用いた。
〔実験例１〕卵丘細胞における遺伝子発現解析
（１）卵丘細胞の回収
マウスに、妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）（5IU、帝国臓器製薬(株)）を腹腔内投与し48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）（5IU、帝国臓器製薬(株)）を腹腔内投与し、過排卵を誘導した。排卵はhCG投与の12時間後に観察された。hCG投与の3または9時間後において卵巣を摘出し、成熟卵胞を注射針で穿孔することで卵巣から卵−卵丘細胞複合体を回収し、実体顕微鏡下、ガラスキャピラリーを用いて卵細胞と卵丘細胞を剥離させ、卵丘細胞のみを回収した。また、hCG投与の14時間後においては卵管より卵−卵丘細胞複合体を回収し、0.1％ヒアルロニダーゼ（Sigma）処理により卵丘細胞を剥離させ、卵丘細胞のみを回収した。
（２）回収した卵丘細胞の全RNAの抽出
回収した卵丘細胞から、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を使用した、グアニジンイソチオシアン酸による核酸中からのRNA選択的溶解とRNAのシリカゲル吸着能を利用したカラム精製を利用した方法で全RNAを抽出した。
（３）Microarray解析
以下、hCG投与14時間後（H14）に回収した卵丘細胞のMicroarray解析について記載するが、hCG投与3時間後（H3）に回収した卵丘細胞及び9時間後（H9）に回収した卵丘細胞についても同様に処理した。
hCG投与14時間後に回収した卵丘細胞の全RNA（100 ng）に100 pmol/mlの T7-オリゴ(dT)24プライマー（Amersham Bioscience）を添加し70 ℃で10分間インキュベーションした後、5x first-strand buffer（invitrogen）、0.1 M DTT（Invitrogen）、10 mM dNTP（Invitrogen）を添加して42 ℃で10分間インキュベーションし、その後Superscript RT II （Invitrogen）を添加して42℃で1時間インキュベーションを行い、first-strand cDNAを合成した。続いて、5x second-strand buffer（Invitrogen）、10mMのdNTP、E.coli DNA リガーゼ（Invitrogen）、E.coli DNA ポリメラーゼ（Invitrogen）、E.coli Rnase H（Invitrogen）を添加し16 ℃で2時間インキュベーションした後、T4 DNA ポリメラーゼ（Invitrogen）を添加して16 ℃で15分間インキュベーションを行いsecond-strand cDNAを合成し、エタノールで抽出した後、真空乾燥させ、-20 ℃に一晩静置した。続いて、MEGAscrit High Yield Transcription Kit（Ambion）を用いて、T7 RNA ポリメラーゼ存在下、37 ℃で4時間インキュベーションし1段階目のRNA増幅を行い、RNeasy Mini Kitを用いてアンチセンスRNA（aRNA）を精製した。次に250 ngのaRNAに1 μg/ml ランダムプライマー（Invitrogen）を添加し、上記と同様にfirst-strand cDNAを合成した後、RNase Hを添加して37 ℃で20分間のインキュベーションし、95 ℃で5分間インキュベーションを行った。続いて100 pmol/ml T7-oligo(dT)24 primerを添加して70 ℃で10分間インキュベーションした後、5x second-strand buffer、10mM dNTP、E.coli DNA polymerase Iを添加し16 ℃で2時間インキュベーションし、T4 DNA polymeraseを添加して16 ℃で15分間インキュベーションしてsecond-strand cDNAを合成し、エタノールで抽出した後、真空乾燥させ、-20 ℃に一晩静置した。次に、HighYield RNA Transcript Labeling Kit（ENZO）を用いて、ビオチン化標識されたリボヌクレオチド存在下、T7 RNA ポリメラーゼとともに、37℃、4時間インキュベーションしてaRNAを合成、増幅し、RNeasy Mini Kitで精製した後、ビオチン標識されたaRNA 20μgをアルカリ条件下、94℃で35分間インキュベートして断片化させた。断片化されたaRNAに、GeneChip Eukaryotic Hybridization Control Kit（AFFYMETRIX）とともに、10 mg/mlのHerring Sperm DNA、50 mg/ml BSAを加えて、99℃で５分間インキュベーションして変性させた後、GeneChip probe array MG-U74Av2（Affymetrix）に45℃で16時間ハイブリダイゼーションさせた。その後、non-stringent wash buffer（6x SSPE、0.01 % Tween 20）とstringent wash buffer（100 mMのMES、0.1 M[Na+]、0.01 % Tween 20）で洗浄し、R-phycoerythrin  Streptavidin（Molecular Probes）で染色して、GeneArrayスキャナー（Agilent Technologies）で蛍光を読み取った。データ解析はMicroarray Suite 4.0 software（AFFYMETRIX）で行った。
（４）リアルタイムPCR
以下、hCG投与14時間後に回収した卵丘細胞のPCRについて記載するが、hCG投与3時間後に回収した卵丘細胞及び9時間後に回収した卵丘細胞についても同様に処理した。
hCG投与14時間後に回収した卵丘細胞の全RNAより、SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen）を用いて逆転写反応を行い、first-strand cDNAを合成した。PCRにはLightCycler（Roche Diagnostics）を使用し、LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit（Roche Diagnostics）のプロトコールに従った。検量線の作成には、連続して希釈（10倍希釈−10000倍希釈）したマクロファージ由来のcDNAを用い、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現量で補正した相対値で、発現レベルを求めた。
（５）ケモカインの発現レベル
（４）で得られた結果を表１及び図４に示す。表１では、EP2欠損マウスの卵丘細胞におけるケモカインリガンド及びレセプターの発現量（上記の補正された相対値）を、野生型マウスの卵丘細胞におけるケモカインリガンド及びレセプターの発現量（上記の補正された相対値）に対する倍率で示した。EP2欠損マウス卵丘細胞における、CCケモカインリガンドであるMCP-1、MCP-3、MIP-1γ及びCCケモカインレセプターであるCCR-1、CCR-5の発現レベルが、野生型マウス卵丘細胞における同因子の発現レベルと比較して顕著に高かった。
図４では、MIP-1γの野生型マウス卵丘細胞における排卵後の発現は急激に増加するが、EP2欠損マウス卵丘細胞における排卵後の発現はさらに顕著に増加した。なお、排卵は12時間後である。一方、MCP-1及びMCP-3の野生型マウス卵丘細胞における排卵後の発現の増加はわずかであるが、EP2欠損マウス卵丘細胞における排卵後の発現は顕著に増加している。なお、hCG投与3時間後の発現レベルを１と、他の時間の発現レベルはその倍数で示した。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
〔試験例１〕インビトロにおける卵丘細胞のエクスパンジョンに対するケモカインの作用
PMSG投与後48時間の成熟卵胞を注射針で穿孔し、未成熟な卵−卵丘細胞複合体を単離した。これを0.3％BSAを含むPBS中で３回洗浄した後、5％FBSを含むEagle's minimum essential medium（EMEM）中に、卵丘細胞エクスパンジョン誘導剤として1 μMのPGE2（Cayman CHEMICAL）または2mMのdibutyryl cyclic AMP（dbcAMP）（Sigma）を添加し、37℃、5％CO2条件下、18時間培養した。このとき、各100 ng/mlのMIP-1γ、MCP-1、MCP-3（PEPRO TECH）を同時添加した。また、viral MIP-II（vMIP-II）（Genzyme/Techne）処理の場合は、予め卵−卵丘細胞複合体を1 μg/mlのvMIP-IIを含むEMEM中で10分間培養した後、卵丘細胞エクスパンジョン誘導剤、ケモカイン、vMIP-IIを含む培地に交換し、18時間培養した。培養後、エクスパンジョンを起こした卵−卵丘細胞複合体の直径を測定した。培養後、エクスパンジョンを起こした卵−卵丘細胞複合体の様子を顕微鏡で観察し、顕微鏡観察結果を図５(A)に示した。また、培養後、エクスパンジョンを起こした卵−卵丘細胞複合体の直径を測定し、卵丘細胞エクスパンジョン誘導剤を加えずに培養した卵−卵丘細胞複合体の直径に対する増加率を図５(B)に示した。同様に、培養時にvMIP-IIを使用したサンプルについても増加率を図５(C)に示した。
MCP-3の添加によって、卵−卵丘細胞複合体のエクスパンジョンが顕著に抑制された。また、vMIP-IIの添加によって、MCP-3によるエクスパンジョン抑制作用が顕著に防止されることが確認された。
【００４２】
〔試験例２〕体外受精
マウスに妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）（5IU、帝国臓器製薬(株)）を腹腔内投与し48時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）（5IU、帝国臓器製薬(株)）を腹腔内投与して、過排卵を誘導し。卵管から卵−卵丘細胞複合体を採取した。また、卵のみで体外受精を行う際は、卵−卵丘細胞複合体を0.1％ヒアルロニダーゼで処理し、卵丘細胞を除去した。これら卵−卵丘細胞複合体および卵を0.3 % BSAを含むPBS中で3回洗浄後、0.3 % α-modification of Eagle's medium（α-MEM）で1回洗浄した。また、6-8週令の野生型雄マウスの精巣上体尾部より精子を得て、α-MEM中、37℃、5%CO2で1.5時間培養することにより受精能を獲得させた。卵−卵丘細胞複合体は、各100 ng/mlのMIP-1γ、MCP-1、MCP-3を含むα-MEM 中で30分間培養した後、2×105/mlの濃度の精子と反応させた。また、vMIP-II処理を行う場合は、1 μg/mlのvMIP-IIを含むα-MEM中で卵−卵丘細胞複合体を30分間培養した後、前述のケモカインとvMIP-IIを含むα-MEM中で30分間培養し、同様にして精子と反応させた。6時間培養した後、前核形成の見られた卵を受精卵として観察した。各サンプルの受精率を図６に示す。
図６(A)より、MIP-1γ、MCP-1、MCP-3が野生型マウス卵−卵丘細胞複合体の体外受精率を低下させることが示されている。図６(B)より、MCP-3による野生型マウスの卵−卵丘細胞複合体に対する受精率の低下作用がvMIP-II処理によって抑制されること、並びにEP2欠損マウスの卵−卵丘細胞複合体の受精率がvMIP-II処理によって向上することが示されている。
【００４３】
〔試験例３〕排卵数
野生型マウスおよびEP2欠損マウスに、PMSG（5IU）を腹腔内投与し、48時間後にhCG（5IU）を腹腔内投与し、3時間後に、各1μgのMIP-1γ、MCP-1、MCP-3あるいはvMIP-IIをそれぞれ皮下投与した。hCG投与後16時間に卵管を摘出し、排卵された卵−卵丘細胞複合体の数を調べた。結果を図７に示す。MIP-1γ、MCP-1、MCP-3の投与により野生型マウスの排卵数が低下し、vMIP-IIの投与によりEP2欠損マウスの排卵数が増加したことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、CCケモカイン受容体1（CCR1）の拮抗薬を示す。
【図２】図２は、CCケモカイン受容体1（CCR1）の拮抗薬を示す。
【図３】図３は、CCケモカイン受容体2（CCR2）の拮抗薬を示す。
【図４】図４は、EP2欠損マウス卵丘細胞及び野生型マウス卵丘細胞におけるMCP-1、MIP-1γ及びMCP-3の発現レベルの時間経過にともなう変遷を示すグラフである。なお、排卵はhCG投与12時間後である。
【図５】インビトロで卵丘細胞にケモカインを添加し、18時間培養後の卵丘細胞の顕微鏡観察結果を(A)として示し、培養後、エクスパンジョンを起こした卵−卵丘細胞複合体の直径を測定し、卵丘細胞エクスパンジョン誘導剤を加えずに培養した卵−卵丘細胞複合体の直径に対する増加率を(B)として示し、同様に、培養時にvMIP-IIを使用した卵−卵丘細胞複合体の直径の増加率を(C)として示す。
【図６】(A)は、卵及び卵−卵丘細胞複合体のインビトロ受精率に対するケモカインの影響を示すグラフである。(B)は、野生型マウス及びEP2欠損マウスの卵及び卵−卵丘細胞複合体のインビトロ受精率に対するvMIP-IIの影響を示すグラフである。
【図７】野生型マウス及びEP2欠損マウスにおけるゴナドトロピン誘導排卵に与えるケモカインの影響を示すグラフである。縦軸はマウス１匹あたりの排卵数（個）を表す。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１及び２は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。
【図１】
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【図２】
2005239584.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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【配列表】
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