(57)【要約】【課題】新規な吸湿剤及び新規な保水剤の提供。【解決手段】（１）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞多糖からなる保水剤、（２）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる吸湿剤及び（３）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる増粘剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる保水剤。
【請求項２】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる吸湿剤。
【請求項３】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる増粘剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な保水剤、吸湿剤及び増粘剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
合成高分子からなるポリアクリル酸が、おむつなどを始めとし、各方面で吸水剤として繁用されているが、実際には、吸水剤として要求される吸湿力や保水力の性能は高くないことが知られている。微生物由来の吸水剤も知られているが、吸湿力、保水力は高くないことが知られている。
また、従来から、保水剤も知られている。これは水の含有量を保つ作用をするものである。ヒアルロン酸は、グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンが、１−３或いは１−４結合により結合され、繰り返し単位から形成される分子量５０，０００〜１３，０００，０００の多糖である。ヒアロン酸は、動物の結合組織内に存在し、組織に弾性を与え、関節液中では、潤滑剤として働くと言われる。これらの機能は、ヒアロン酸が多量の水と結合・保持する能力によると言われ、ヒアロン酸は保水剤としても、医療及び美容などへの応用が進んでいる。これまでは、鶏の鶏冠から抽出されていたが、乳酸菌による発酵生産も開始されている（特許文献１、特許文献２）。また、微生物を利用する方法も知られている（特許文献３）。しかしながら、高温（３７℃）で低湿な環境での吸湿力、保水力はそれほど高くはない。
吸湿剤（いわゆる乾燥剤）としては、従来、シリカゲルは室温（２５℃）以下で高湿な条件下で有効であると言われ、モレキュラーシーブ（合成ゼオライト）はシリカゲルに比べ、高温で低湿度の条件でも吸湿性が高いと言われている。クレイ（モリクロナイト）は、安定性が高いが吸湿性は劣る。しかしながら、いずれも保水力は低いと言われている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平０２−１０３２０４
【特許文献２】
特開平０７−０８７９６２
【特許文献３】
特開平１０−２３７１０５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、新規な保水剤、吸湿剤及び増粘剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
微生物である細菌を培養した後、菌体を回収し、菌体を生理食塩水に懸濁して得られる細胞懸濁液に、振とう、攪拌、超音波処理又は磨砕処理など物理的な手段を加えて、さらに菌体を分離除去して得られる上清には、細胞外多糖（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．以後ＥＰＳとも呼ぶ）と呼ばれる多糖を含有している。これは細菌などの微生物に共通して見られることがらである。
本発明者らは、原油などによる海洋汚染の解決にＥＰＳを利用するために細菌やＥＰＳを用いて種々の実験を行なった。その中で以下の実験を行なった。
細菌の細胞表面の疎水性を決定するために接触角の測定を行なった。細菌の細胞の表面を調べてみると、緩やかに結合している物質（ｌｏｏｓｅｌｙ  ｂｏｕｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．以下、ＬＢＭとも略す。）により囲まれていることが分かった。このＬＢＭは、攪拌などの物理的な手段により簡単に除去され、その結果、細菌の細胞表面は、予想されるより大きな接触角の値となり、疎水性であることを見いだした。
そこで、発明者らは、細菌の細胞の表面が、どの程度の疎水性を示すかを測定するために、ＬＢＭによる被覆法を新たに開発した。ＬＢＭによる被覆法により、細菌細胞がＥＰＳによって覆われる結果、数か月以上にわたり、細菌細胞は湿気を保持することができるということを見出した。
また、この種のＥＰＳを精製して得られる精製標品の１Ｈ−ＮＭＲ分析時には、水由来の強いシグナルが観察される。
一方、通常の手順により調製された細菌細胞は、前記したようにＬＢＭは簡単に除去されてしまうので、室温で１時間もしないうちに、クラックがはいる。
この実験の結果を分析してみると、ＥＰＳは多量の水分を保持することができるのではないかということが考えられ、そうすると、細菌の細胞表面が、長期にわたり湿気を保持できるということが理解できる。
本発明者らはＥＰＳとその特性を比較してみたところ、従来から用いられたこれらの物質或いは化合物と比較して十分に保水力、吸湿力を有することを確認して、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる保水剤。
（２）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる吸湿剤。
（３）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌によって生産される細胞外多糖からなる増粘剤。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明では、ＥＰＳを利用するものである。このＥＰＳには、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から得られるものが用いられる。好ましい菌株としては、ロドコッカス・ロドクラウスＳ．１株、ロドコッカス・ロドクラウスＳ−２株、ロドコッカス・ロドクラウスＳＦ−３株、ロドコッカス・ロドクラウスＳＭ−１株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ５３９６８株、ロドコッカス・ロドクラウス１２６７４株などを挙げることができる。これらは通常知られている細菌である。
【０００８】
前記ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌を用いてＥＰＳを製造する方法は、以下の通りであり、既に知られている方法である。
前記ロドコッカス属の細菌の菌株、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）に属する細菌の菌株を寒天培地に植菌し、３０〜３７℃の温度下に４８時間以上培養する。培養終了後、菌体を回収して、生理的食塩水に懸濁させ、細胞懸濁液とする。これを激しく攪拌後、遠心分離を行ない、上清（菌体以外の成分）と沈殿物（菌体）に分け、得られた上清にＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅを作用させて３７℃で一晩反応させ、プロティナーゼ  Ｋを作用させ、３７℃で反応させ、得られた生成液に、フェノール、クロロホルムによる抽出を繰り返し行なう。得られた水層に、エタノールを添加し、沈殿を生成させて、多糖画分を回収後、再び前記酵素処理からの操作を繰り返し、蒸留水（Ｄ．Ｗ．）に対して透析を行なった。分光光度計を用いて、核酸、蛋白質の混入が無いことを確認した後、前記の透析を行なって得られる生成液を凍結乾燥して粗ＥＰＳを得ることができる。
炭素源としては、グルコースの他、ガラクトース、マンノース、メタノール、エタノール、フェノールなどを使用することができ、その内容についても検討した。
【０００９】
得られたＥＰＳについて、どのような成分から構成されるかについて、以下の手順により分析をおこなった。
（１）ＥＰＳを構成する糖についての分析
ＥＰＳを硫酸処理した後、抽出処理を行ない、加水分解させて、得られた生成物を中和、脱塩処理後、沈殿物を除去し、ガス液体クロマトグラフィで分析して糖の構成を明らかにする。
（２）ＥＰＳを構成する脂質の分析
ＥＰＳを、水酸化カリウムを含む液中で加水分解し、加水分解生成物を酸性にして、含まれる脂肪酸を抽出し、トリメチルシリルジアゾメタン試薬により、メチル化し、得られた試料は、ガスクロマトグラフィ／マススペクトログラフィ分析器により分析し、脂肪酸の含有量を明らかにする。
【００１０】
前記の手順に従って、ＥＰＳの分析をおこなうと、ＥＰＳの化学的組成を明らかにすることができる。例えば、一例を挙げると、ロドコッカス・ロドクラウスＳＭ−１株を、ＩＢ寒天上で培養して得られるＥＰＳは、脂質含有酸性多糖であり、凍結乾燥して得られ状態は、白色繊維状である。この脂質含有酸性多糖は、以下の通りである。
（１）ＧＬＣ分析に基づき分析された結果、ガラクトース３５．３％、グルコース１７．９％、フコース１１．５％、グルクロン酸２６．３％（％Ｗ／Ｗ）から構成され、含有されている脂肪酸が、メチル化された脂肪酸としてＧＬＣ分析された結果、１．２％のステアリン酸及び２．３％のパルミチン酸（いずれもＷ／Ｗ）、を含有しており、分子量が２００万以上である。
（２）水及びアルカリには溶解する。酸、メタノール、エタノール、アセトンには溶解しない。
（３）分光吸収は、２８０ｎｍ又は２５５ｎｍには観察されず、蛋白質や核酸を含有していない。
【００１１】
炭素源の相違が生成物に与える影響は以下の通りである。
炭素源としては、グルコースの他の、ガラクトース、マンノース、メタノール、エタノール、フェノールなどを使用した場合については、陰イオン交換カラムを用いて塩化ナトリウム濃度勾配を分析すると、グルコースを炭素源とした場合とＥＰＳの溶出パターンは、グルコースを炭素源とした場合と類似し、約０．３Ｍの塩化ナトリウムで溶出されるピークが主要な多糖であった。ステアリン酸やオレイン酸を炭素源とした場合には、陰イオン交換体に吸着されない小さなピークと、塩化ナトリウム濃度勾配を掛けた直後に溶出する主要なピークからなる溶出パターンを得る。各炭素源由来のＥＰＳについては、それぞれ、主要なピークを精製標品として用いた結果である。
【００１２】
得られたＥＰＳの保水力・吸湿力の測定は以下の手順により行なう。この測定方法により得られる結果は、保水・吸湿力の測定方法として、十分に信頼できる方法である。
保水力の測定は、以下の通りである。
得られたＥＰＳを、直接又は凍結乾燥後、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥する。同様に、比較対象となる標準物質についても、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥する。
正確に重量を測定後、その乾燥重量に対して２０％のＤ．Ｗ．を加え、相対湿度３２％又は１１％に設定されるデシケータ（３７℃）内に２４時間保持する。相対湿度３２％の環境は、デシケータ内に塩化マグネシウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整する。同様に、相対湿度１１％の環境は、デシケータ内に塩化リチウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整する。
前記比較対象とする標準物質としては、ヒアロン酸、尿素、グリセロール、シリカゲル、モレキュラーシーブ、市販の吸水材であるポリアクリルアミド系のポリマーを用いる。
このような相対湿度の条件下に試料を２４時間保持し、再度試料の重量を測定後、次式にしたがって、保水を算出する。
保水力は、以下の式による。
【数１】
2005002212.tif 000002
【００１３】
保水力の試験は、ＪＩＳ規格Ｋ７２２３による「ティーバック法」によるものである。
実施例で後述するように、本発明で用いられるＥＰＳは、前記標準物質と比較して、保水力を有することを確認している。
【００１４】
吸湿力の測定は以下の通りである。
得られたＥＰＳを、直接又は凍結乾燥後、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥する。同様に、比較対象となる標準物質についても、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥する。
正確に重量を測定後、相対湿度３２％又は１１％に設定されるデシケータ（３７℃）内に２４時間保持する。再度、重量を測定し、下記に示す計算式にしたがって、吸湿力の測定を行なう。
なお、相対湿度３２％の環境は、デシケータ内に塩化マグネシウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整する。同様に、相対湿度１１％の環境は、デシケータ内に塩化リチウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整するものである。
前記比較対象とする標準物質としては、ヒアロン酸、尿素、グリセロール、シリカゲル、モレキュラーシーブ、市販の吸水材であるポリアクリルアミド系のポリマーを用いる。
吸湿力の測定は、以下の計算により算出する。
【数２】
2005002212.tif 000003
実施例で後述するように、本発明で用いられるＥＰＳは、前記標準物質と比較して、吸湿力を有することを確認している。
【００１５】
ＥＰＳの精製標品の水溶液について、オストワルド粘度計を用いて粘度測定をおこなう。
その結果、粘性を有することを確認した。
測定結果によれば、デキストランの水溶液に比較して、高い還元粘度を示す。
カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースの水溶性の還元粘度と同等又はそれ以上の値を得ていることを確認している。
【００１６】
【表１】
2005002212.tif 000004
【００１７】
【実施例】
以下に参考例（ＥＰＳの製造分離、及びＥＰＳの分析結果）、及び実施例（ＥＰＳが保水及び吸湿効果を示す測定結果）により、本発明の内容を明らかにする。本発明の内容は、これに限定されるものではない。
【００１８】
参考例１（ＥＰＳの製造分離）
ロドコッカス・ロドクラウスＳ−２株（Ｓ−２と表示）、ロドコッカス・ロドクラウスＳＦ−３株（ＳＦ−３と表示）、ロドコッカス・ロドクラウスＳＭ−１株（ＳＭ−１と表示）、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ５３９６８株（ＡＴＣＣ５３９６８と表示）を用いて、ＥＰＳを製造した。
前記ロドコッカス・ロドクラウスの菌株をＩＢ平板培地に滅菌綿棒で植菌し、３７℃の温度下に３日間培養した。培養終了後、平板培地上に滅菌Ｄ．Ｗ．を少しづつ加えながら、先端を丸めたガラス棒で５０ｍｌ容滅菌プラスチック遠沈管に菌体を回収した。２５ｍｌとなるように滅菌Ｄ．Ｗ．を加え、激しく撹搾・懸濁した。
１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿した菌体に滅菌Ｄ．Ｗ．を加え、激しく攪拌・懸濁後、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を回収し、先の上清と合わせた。得られた上清にＤＮａｓｅＩ（７ユニット／ｍｌ；宝バイオ株式会社製）及びＲＮａｓｅＡ（２μｇ／ｍｌ；和光純薬株式会社製）を添加し、３７℃で１６時間にわたり、反応させた。次に、溶液をプロティナーゼ  Ｋ（２μｇ／ｍｌ；和光純薬株式会社製）を添加し、３７℃で２時間反応させた。得られた生成液に、フェノール・クロロホルムによる抽出を繰り返し行なった。得られた水層に、エタノールを添加し沈殿を生成させて、多糖画分を回収後、再び前記酵素処理からの操作を繰り返し、蒸留水（Ｄ．Ｗ．）に対して透析を行なった。分光光度計を用いて、核酸、蛋白質の混入が無いことを確認した後、前記の透析を行なって得られる生成液を凍結乾燥して粗ＥＰＳを得ることができた。必要な場合には、更に陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ・トヨパール６５０Ｍ  東ソー株式会社製）を用いた精製した。
【００１９】
参考例２（糖の構成について）
参考例１で得られたＥＰＳを、以下の手順により加水分解した。ＥＰＳｌ０ｍｇを、氷で冷却した８０％硫酸中に懸濁した。氷上で３０分間、次に３０℃で３時間にわたって、保温した。
次に、氷で冷却した純水６．５ｍｌで希釈し、１００℃で、２時間加熱し、炭酸カルシウム０．８ｇを添加して中和した。
反応生成物をろ過して、沈殿物を除去した。ろ液を乾燥させ、純水中に懸濁させ、アンバーライトＩＲ−１２０陽イオン交換樹脂によりカルシウムイオンを除去した。
加水分解された生成物を、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）により以下の手順にしたがって、分析した。
ＧＬＣ分析のために、ウロン酸及び中性糖を、ＤｏｗｅｘＩ−Ｘ８イオン交換クロマトグラフィにより分離した。
中性糖のトリフルオロアセチルアルジトール誘導体及びウロン酸のトリメチルシリル誘導体を、ＤＣ  ＱＦ−１及びＮＰＧＳＥカラムを用いたＧＬＣ（島津ＧＣ−６Ａ；株式会社島津製作所製）により別々に分析した。
Ｌ−ラムノース、Ｌ−フコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクツロン酸及びＤ−グルクロン酸（各１ｍｇ／ｍｌ）の混合物を上記にしたがって処理し、標準物質とした。
ゲルろ過カラムクロマトグラフィには、樹脂として、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００（８５０×１５ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫＬｉｍｉｔｅｄ、英国）を、溶出液として、０．１Ｍの食塩を含む１ｍＭのＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．０）を、サイズマーカーとしてＤｅｘｔｒａｎＴ  ２０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）を用いた。各菌株から得られるＥＰＳの糖についての分析結果は、表２に示すとおりである。
【００２０】
【表２】
2005002212.tif 000005
【００２１】
参考例３（脂肪酸含有量について）
参考例１で得られた各ＥＰＳ（３ｍｇ）を、１０％水酸化カリウムを含む３ｍｌメタノール中で加水分解した。
ｎ−ヘキサンで抽出処理し、加水分解生成物を、塩酸を添加して酸性とし、脂肪酸をｎ−ヘキサンにより抽出した。
脂肪酸を真空中で乾燥させ、トリメチルシリルジアゾメタン試薬（半井テスク株式会社  京都日本）を用いて、試薬供給もとの指示するところにしたがって、メチル化した。
得られた試料は、ガスクロマトグラフィ／マススペクトログラフィ分析器（ＧＬＣ−ＭＳ）に導き、分析を行なった。
（ＧＬＣ−ＭＳ）分析器は、溶融シリカ毛細管カラム（ＤＢ−１，３０ｍ×０．２５ｍｍ；アジレントテクノロジ社  ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を装備したＱＰ−５０５０装置（株式会社島津製作所）である。挿入及び連結部分の操作温度は、３００℃であった。カラム温度は、２分間にわたり１５０℃に保たれた後、１０℃／分の割合で３００℃に上昇させた。
得られた脂肪酸の分析結果は、表３のとおりである。
【００２２】
【表３】
2005002212.tif 000006
【００２３】
実施例１（保水力の測定）
得られたＥＰＳを、凍結乾燥後、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥した。同様に、比較対象となる標準物質についても、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥した。
正確に重量を測定後、その乾燥重量に対して２０％のＤ．Ｗ．を加え、相対湿度３２％又は１１％に設定されるデシケータ（３７℃）内に２４時間保持する。相対湿度３２％の環境は、デシケータ内に塩化マグネシウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整する。同様に、相対湿度１１％の環境は、デシケータ内に塩化リチウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整する。
前記比較対象とする標準物質としては、ヒアロン酸、尿素、グリセロール、シリカゲル、モレキュラーシーブ、市販の吸水材であるポリアクリルアミド系のポリマー（Ｓｕｍｉｆｌｏｃ  ＦＡ−７０）を用いた。
このような相対湿度の条件下に試料を２４時間保持し、再度試料の重量を測定し、次式にしたがって、吸湿度を算出した。
保水力は、以下の式による。
【数３】
2005002212.tif 000007
結果は、表４が示すとおりである。
本発明で用いられるＥＰＳは、前記標準物質と比較して、十分に保水力を有する結果となっている。
【００２４】
【表４】
2005002212.tif 000008
【００２５】
実施例２（吸湿力の測定）
得られたＥＰＳを、凍結乾燥後、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥した。同様に、比較対象となる標準物質についても、約１０ｍｇを秤量ビンに測り取り、１０５℃で１８時間乾燥した。
正確に重量を測定後、相対湿度３２％又は１１％に設定されるデシケータ（３７℃）内に２４時間保持した。再度、重量を測定し、下記に示す計算式にしたがって、吸湿力の測定を行なう。
なお、相対湿度３２％の環境は、デシケータ内に塩化マグネシウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整した。同様に、相対湿度１１％の環境は、デシケータ内に塩化リチウムの飽和水溶液を入れて、３７℃のインキュベータ内に放置することにより調整したものである。
前記比較対象とする標準物質としては、ヒアロン酸、尿素、グリセロール、シリカゲル、モレキュラーシーブ、市販の吸水材であるポリアクリルアミド系のポリマーを用いた。
吸湿力の測定は、以下の計算により算出する。
【数４】
2005002212.tif 000009
結果は、表５が示すとおりである。
本発明で用いられるＥＰＳは、前記標準物質と比較して、十分に吸湿力を有する結果となっている。
【００２６】
【表５】
2005002212.tif 000010
【００２７】
【発明の効果】
本発明のＥＰＳから得られる保水剤及び吸湿剤は、従来の保水剤又は吸湿剤と比較して、その作用の点で優れたものである。高温及び低湿度の環境下に、香粧品などで繁用されている保水・保水剤にくらべて保水力が高いこと、及び食品、工業製品などの保存に際して多用されている吸湿剤に比べて吸湿力が高いものであることを確認した。