(57)【要約】【課題】  ゲットウ植物の有効利用を図り、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し副作用が少なく安全性が高い炎症疾患予防・治療剤を容易に調製することができ、抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材を容易に得る。【解決手段】  ゲットウ及び／又はその処理物を有効成分として含有し、好ましくは、処理物が、ゲットウの葉の抽出物であり、一酸化窒素産生抑制作用を有する。更に、ゲットウの葉の抽出物が、ピノシルビンモノメチルエーテルを含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲットウ及び／又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とする炎症疾患予防・治療剤。
【請求項２】
処理物が、ゲットウの葉の抽出物であることを特徴とする請求項１記載の炎症疾患予防・治療剤。
【請求項３】
一酸化窒素産生抑制作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の炎症疾患予防・治療剤。
【請求項４】
ゲットウの葉の抽出物が、ピノシルビンモノメチルエーテルを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の炎症疾患予防・治療剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の炎症疾患予防・治療剤を有効成分とすることを特徴とする抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、沖縄に生育する植物由来の生理活性物質を利用した炎症疾患予防・治療剤、これらを有効成分とする抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、沖縄に自生している植物について抗酸化活性作用等の有効成分を含有する優れた天然資源の開発が行われている。例えば、薬用されているウコンの根茎を適用し食味を改善した加工食品（例えば、特許文献１参照。）や、また、食材として利用されていない植物繊維を利用した抗酸化性植物繊維やその加工食品（例えば、特許文献２参照。）や、グアバの葉、月桃、ヨモギ、茶葉等を使用し発酵処理により薬効を増進し食味を改善した加工食品（例えば、特許文献３参照。）等が開発されている。また、ゲットウ 、アカメガシワ、ヒラミレモン、クダモノトケイソウおよびストレリチアからなる群から選ばれた１種類以上の植物の乾燥粉末または抽出物を有効成分とすることを特徴とするα−アミラーゼ活性を阻害するための物質（例えば、特許文献４参照。）等も報告されている。
【０００３】
他方、哺乳類の細胞内において、一酸化窒素（ＮＯ）は重要な作用を有することが分かっている。ＮＯ合成酵素（nitric oxide synthase、ＮＯＳ）の触媒作用によってＬ−アルギニンからＬ−シトルリンとＮＯが産生される。ＮＯＳは、恒常型（constitutive ＮＯＳ、ｃＮＯＳ）と誘導型（inducible ＮＯＳ、ｉＮＯＳ）に分類され、ｃＮＯＳは、血管内皮細胞や胃粘膜細胞において恒常的に低濃度のＮＯを産生する恒常型触媒作用を有し、他方、ｉＮＯＳは、マクロファージや好中球などの炎症に関与する細胞、肝細胞や血管平滑筋において、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、サイトカイン又は病原体等の刺激によって活性化されて非恒常的に多量のＮＯを産生する誘導型触媒作用を有する。例えば、生体内のマクロファージが病原体からの刺激を受けると、ｉＮＯＳの発現量が増加し、Ｌ−アルギニンからＮＯ産生が促進されることが明らかにされている。産生されたＮＯは、細胞のミトコンドリア系内の電子伝達系酵素に作用してその活性を阻害し（免疫応答調節作用）、感染を阻害する。生体内でのＮＯの他の有効な作用としては、血管を弛緩させ血圧を低下させたり、あるいは多核白血球や血小板の接着を阻止して血小板の凝集を妨ぐことが挙げられる。
【０００４】
しかしながら、腎炎、肝障害や潰瘍性大腸炎、または慢性関節リウマチ、更にはアレルギー性疾患等の炎症性疾患によって、マクロファージから高濃度のＮＯが産生されると、ＮＯによって周辺組織が傷害され、自己免疫現象と類似の症状が発現することがあり、例えば、敗血症を患っている場合には、大量のＮＯの産生により心筋収縮力によるショック症状（敗血症性ショック）が引き起こされる等、別の疾患の発症を誘発することもある。ＮＯの過剰産生による組織や細胞の傷害、又は誘発される疾患の発症を防ぐため、ＮＯが有効な濃度で生体内に存在するようにＮＯの産生を抑制する必要がある場合がある。このため、ＮＯの産生に関与するＮＯＳの作用を阻害するＮＯＳ阻害剤や、ＮＯ産生抑制剤の開発が進められており、代表的なＮＯＳ阻害剤としては、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）やＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）等のＬ−アルギニン誘導体（ここで、ＮＧは、グアニジノ基のＮ原子にニトロ基などが付いていることを表す。）等、基質であるＬ−アルギニンの構造式と類似の構造式を有する化合物が挙げられる。ｉＮＯＳ誘導阻害剤としては、コルチコステロイドやセリン・プロテアーゼ阻害剤、システイン・プロテアーゼ阻害剤等があり、あるいは天然物由来のｉＮＯＳ誘導阻害に基づくＮＯ産生抑制作用を有する、月桂樹由来セスキテルペンのコスツノライド（costunolide）やデヒドロコスツラクトン（dehydrocostus lactone）（例えば、非特許文献１参照。）、ルバーブ由来スチルベンのルハポンチゲニン（rhapontigenin）、ピシアタンノール（piceatannol）、リスベラトロール（resveratrol）（例えば、非特許文献２参照。）、タクシャ由来トリテルペンのアリソール（alisol）F（例えば、非特許文献３参照。）等も報告されている。
【０００５】
一方、ブドウに存在するヒドロキシスチルベンは、血管拡張剤（例えば、特許文献５参照。）として種々の心臓疾患の治療剤（例えば、特許文献６参照。）や、突然変異及び発癌阻害剤（例えば、特許文献７参照。）に用いられ、また、ヒドロキシスチルベンを含有するコラーゲン合成を刺激する薬剤や化粧品（例えば、特許文献８参照。）が知られている。ヒドロキシスチルベン化合物のうち、３，５，４'位に水酸基を有するリスベラトロールはブドウの皮又はワイン中に存在し、制癌作用、抗炎症作用を有することが知られており、これを含有する皮膚化粧料（例えば、特許文献９参照。）等も知られている。
【特許文献１】特開平１１−２８９９７３号公報
【特許文献２】特開２００２−２０４６７４号公報
【特許文献３】特開２００２−３３０７２５号公報
【特許文献４】特開２００１−３３３７３３号公報
【特許文献５】ＥＰ９６−８３０５１７
【特許文献６】ＣＡ２１８７９９０
【特許文献７】特開平６−２４９６７
【特許文献８】特開平１１−３２２５７７
【特許文献９】特開２００１−１９９８７０
【非特許文献１】Matsuda H., Kageura T., Toguchida I., UedaH., Morikawa T., Yoshikawa M.著 Life Sciences, 66巻, p. 2151−2157、2000年
【非特許文献２】Matsuda H., Kageura T., Morikawa T., Toguchida I., Harima S.,Yoshikawa M.著Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 10巻,p. 323−327、2000年
【非特許文献３】Matsuda H., Kageura T., Toguchida I., Murakami T., Kishi A., Yoshikawa M.著Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 9巻, p. 3081−3086、1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
九州南部から中国南部〜熱帯アジアに分布するゲットウ（Alpinia specios K. Schum）はショウガ科（Zingiberaceae）に属し、別名アルピニアといわれ、沖縄地方では葉に芳香があるので食物を包み，葉鞘は網や綱の原料として利用されているが、含有される有用な生理活性物質の充分な利用はなされていない。
【０００７】
本発明の課題は、生理活性を有するゲットウ植物の有効利用を図り、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し副作用が少なく安全性が高い炎症疾患予防・治療剤や、これらを用いた抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、沖縄に生育するゲットウ植物の有効活用を目的とし、その生理活性について鋭利研究をした結果、ゲットウの葉の抽出物が優れたＮＯ産生抑制活性を有することを見い出し、更に、ゲットウのＮＯ産生抑制活性の有効成分を探索したところ、少なくともピノシルビンモノメチルエーテルがＮＯ産生抑制活性に関与するとの知見を得た。ＭＳスペクトル等から、下記構造の３−メトキシ−５−ヒドロキシスチルベンとの予測を立てた。
【０００９】
【化１】
2005053862.tif 000002
【００１０】
かかる構造と表１に示す1ＨＮＭＲの測定値を文献値と比較し、顕著なＮＯ産生抑制活性を有する化合物がピノシルビンモノメチルエーテルであることを確認し、これら知見に基き本発明を完成するに至ったものである。
【００１１】
【表１】
2005053862.tif 000003
【００１２】
すなわち本発明は、ゲットウ及び／又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とする炎症疾患予防・治療剤に関し、好ましくは、処理物が、ゲットウの葉の抽出物であることを特徴とする請求項１記載の炎症疾患予防・治療剤（請求項２）や、一酸化窒素産生抑制作用を有することを特徴とする請求項１又は２記載の炎症疾患予防・治療剤（請求項３）や、ゲットウの葉の抽出物が、ピノシルビンモノメチルエーテルを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の炎症疾患予防・治療剤（請求項４）に関する。
【００１３】
また、本発明は、請求項１〜４のいずれか記載の炎症疾患予防・治療剤を有効成分とすることを特徴とする抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材（請求項５）に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の炎症疾患予防・治療剤は、ゲットウ植物の有効利用を図り、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し副作用が少なく安全性が高い炎症疾患予防・治療剤を容易に調製することができ、抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材を容易に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の炎症疾患予防・治療剤はゲットウ及び／又はその処理物を有効成分として含有するものであれば、特に限定されるものではない。本発明の炎症疾患予防・治療剤に用いるゲットウ（Alpinia specios K. Schum）はショウガ科（Zingiberaceae）に属する植物であり、使用部位は、根、根茎等の地下部や、茎、樹皮、幹、葉、花、果実等の地上部であってもよく、また、これらの二種以上の混合物であってもよい。
【００１６】
ゲットウの処理物における処理としては、粉砕処理、切断処理、乾燥処理、抽出処理、焙煎処理、超音波ホモゲナイズ処理、凍結処理、加熱処理、酵素処理、発酵処理等を挙げることができ、これら処理を二以上組み合わせて行ってもよい。上記ゲットウの粉砕処理としては、例えば、粒径３ｍｍ以下、好ましくは０．５〜１．０ｍｍの粒径まで粉砕する処理が好ましい。３ｍｍ以下の粒径とすることにより、有効成分を容易に抽出することができ、０．５〜１．０ｍｍの範囲の粒径であれば、かかる効果がより顕著に得られる。また、植物の生体をそのまま粉砕してもよいが、あらかじめ切断処理、乾燥処理、凍結処理等を施した処理物に粉砕処理を行ってもよい。また反対に、植物を粉砕処理した粉砕処理物に、常温で風乾処理、４０〜６０℃前後での加熱乾燥処理、天日乾燥処理等の乾燥処理を施すこともできる。さらに、粉砕処理後の乾燥処理物や乾燥処理後の粉砕物に対して抽出処理を施すこともできる。
【００１７】
かかる抽出処理に使用する溶媒としては、例えば、水、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコールや、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコールや、ヘキサン等の非極性溶媒の一種又は二種以上を用いることができる。好ましい抽出方法としては、例えば、水濃度０〜１００容量％のメチルアルコール、エチルアルコール等を用い、０〜８０℃で３０分〜５日等、好ましくはエチルアルコール水溶液を用い、室温で２４時間抽出した後濾過する方法等を挙げることができる。
【００１８】
本発明の炎症疾患予防・治療剤としては、特に、生葉又は乾燥葉の粉砕処理物の抽出処理によって得られた抽出処理物をそのまま、あるいは溶媒を除去した後凍結乾燥した凍結乾燥処理物を有利に使用することができ、また、必要に応じてこれらの抽出物を複数種混合したり、溶媒と混合し混合液としたものも使用することができる。
【００１９】
また、本発明の炎症疾患予防・治療剤としては、上記ゲットウの葉又は乾燥葉の粉砕処理物の抽出処理によって得られた抽出処理物から、これに含有されるスチルベン化合物であるピノシルビンモノメチルエーテル（１−スチリル−３−ヒドロキシ−５−メトキシベンゼン）（ＰＭＥ）を更に分離・精製した精製処理物を使用することができる。かかる分離・精製処理としては公知の天然有機化合物類の分離・精製法を適用することができ、例えば、活性炭、シリカ等を用いた吸脱着、あるいはクロマトグラフィー、液−液抽出、分別沈殿等の手法によりピノシルビンモノメチルエーテルを分離・精製する処理等を挙げることができ、特に、逆層系（Ｃ１８ゲル）の中圧カラムクロマトグラフィーの使用による分離・精製処理が、クロロフィル系の夾雑物を効率よく除去することができるため、好ましい。ゲットウから分離・精製されるピノシルビンモノメチルエーテルは優れたＮＯ産生阻害活性を有し、ゲットウの乾燥葉（水分６．５重量％含有）１００ｇ中から２．６ｍｇを分離することができる。
【００２０】
上記ゲットウ及び／又はその処理物を有効成分とする本発明の炎症疾患予防・治療剤は、ＮＯ産生抑制活性を有する。即ち、生体内で種々の要因により過剰に発現して過剰なＮＯを生産するｉＮＯＳの発現を抑制することによりＮＯ産生抑制するものであり、ＮＯ産生抑制を必要とする炎症疾患の治療および予防に有効であり、特に、マクロファージのＮＯ産生を抑制し、マクロファージのＮＯ産生に起因する炎症の治療に有用である。本発明の炎症疾患予防・治療剤が効能を有するＮＯ産生に起因する炎症としては、外因性の、例えば、細菌、ウイルス、寄生虫等の病原菌の感染による生物的因子による炎症や、熱、冷却、機械的外傷、紫外線、放射線等の物理的因子による炎症や、強酸、強アルカリ薬品、毒性物質などの化学的因子による炎症や、内因性の、例えば、体内で産生された免疫複合体の細胞、組織への沈着によるアレルギー性炎症や、体内に生じた異常代謝産物による、腎炎、肝障害や潰瘍性大腸炎、通風、関節炎、リウマチ性関節炎等の炎症を挙げることができる。
【００２１】
かかるＮＯ産生抑制作用は、化学発光法や電極法、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法、Ｇｒｉｅｓｓ法等により測定することができる。Ｇｒｉｅｓｓ法はＮＯの代謝物であるＮＯ2-とＧｒｉｅｓｓ試薬（スルファニルアミドとＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミン）とのジアゾ化カップリング反応により生成する赤色のアゾ化合物について吸光度を測定してその量を検出し、アゾ化合物の生成量からＮＯ2-量を算出し、コントロールにおけるＮＯ2-量の算出値を１００として換算してＮＯ2-量の生成率、即ち、ＮＯ生成率を求める方法であり、被検体のＮＯ産生作用の評価の指標とするものである。
【００２２】
更に、これと併用して、ＭＴＴ法等により生存細胞数を検出することにより、産生されたＮＯ産生量を検出することができ、ＮＯ産生抑制活性の程度を求めることができる。かかるＭＴＴ法とは、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）が細胞内のミトコンドリアの脱水酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるＭＴＴ量が多く、その結果生じる黄色〜赤色のホルマザン量が生存細胞数とよく対応することを利用した方法であり、生細胞のみを測定することができる方法であり、６３０ｎｍを参照波長とし５７０ｎｍの波長におけるサンプルの吸光度を測定し、以下の計算式によりサンプルの細胞生存率を求めることができる。
【００２３】
細胞生存率＝１００×Ｂ／Ａ
式中、Ａはコントロールの５７０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を除した値、Ｂはサンプルの５７０ｎｍの吸光度から６３０ｎｍの吸光度を除した値を示す。本発明のＮＯ産生抑制剤についてＭＴＴ法により検出した細胞生存率は、コントロールより高いものが多く、ＮＯ産生が抑制されたことにより細胞が増殖していることが明らかである。
【００２４】
本発明の炎症疾患予防・治療剤は、公知の医薬用担体と組合せ内服用製剤や、外用製剤とすることができる。かかる内服用製剤における医薬用担体としては、本発明の炎症疾患予防・治療剤のゲットウ及び／又はその処理物の有効成分を薬学的に許容できる液状または固体状の担体を適用することができ、また、本発明の炎症疾患予防・治療剤には必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤の製剤とすることができる。またこれら製剤は、経口又は非経口に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができるほか、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。かかる製剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。尚、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、後述する食品、食品素材として任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また、本発明の炎症疾患予防・治療剤を外用製剤とする場合は、エタノール等と乳剤、ゲットウ抽出物をワセリン等と混練し軟膏剤とすることができる。
【００２５】
本発明の炎症疾患予防・治療剤の調製方法としては、上記ゲットウや、凍結乾燥処理物等の処理物を、ミキサー等で粉末とし、得られた粉末を常法により顆粒化、カプセル化、錠剤化したり、溶剤に溶解、縣濁、分散等させて液剤を調製する方法等を具体例に例示することができる。
【００２６】
ゲットウ及び／又はその処理物を有効成分とする本発明の炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材は、ゲットウ及び／又はその処理物から選ばれた一種又は二種以上を飲食品原料の一部として用いたり、あるいは製造工程又は製造後に添加・配合することにより得ることができる。かかる機能性食品としては特に制限されるものではなく、過剰なＮＯ等に誘発される炎症の予防、改善には、毎日、適度のＮＯ産生抑制効果を有する物質を摂取することが望ましく、その方法として飲食品から摂取するのが望ましく、本発明の炎症疾患予防・治療剤を含有する抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材はその点で極めて有用である。本発明の抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材としては特に限定されるものではなく何れのものであってもよく、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、食用油、マーガリン、ラード、バター、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合して食品として使用することができる。配合量は、特に限定されるものではなく、食品によって適宜選択することができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
［サンプルの調製］
ゲットウの葉を粒径１ｍｍに粉砕し、６０℃で１〜２日乾燥させた。得られた乾燥体１ｇを１０ｍＬのクロロホルム溶液により、室温で１週間抽出後、濾過し抽出物を得た。その後、抽出物を減圧濃縮して、２０ｍｇ／ｍＬのジメチルスルフォキシド溶液を調製し、ジメチルスルフォキシドで希釈することにより最終濃度２０μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬのサンプルを調製した。
【実施例２】
【００２９】
［ピノシルビンモノメチルエーテル（ＰＭＥ）の分離］
逆層系（Ｃ１８ゲル）の中圧カラムクロマトグラフィーの使用によりピノシルビンモノメチルエーテルを分離した。分離されたピノシルビンモノメチルエーテル（ＰＭＥ）の１００μＭ、２０μＭ、４μＭ、０．８μＭの濃度のジメチルスルフォキシド溶液とし、サンプルを調製した。
【実施例３】
【００３０】
［ＮＯ産生抑制の測定］
２４穴マイクロプレートに２×１０5 ｃｅｌｌ／ウェルになるようにマウスマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞を加え、３７℃で１２時間前培養した。その後、ＰＢＳ１ｍＬで２回洗浄し、培地のＤＭＥＭを０．５ｍＬ加え、実施例１、２で調製した各濃度のサンプルを５μＬ加えた。コントロールにはＤＭＳＯ５μＬを用いた。これに、Ｌ−アルギニン１０μＬ（最終濃度を２ｍＭとした。）、ＬＰＳを１０μＬ（ブランクを除いた最終濃度を１００ｎｇ／ｍＬとした。）、ＩＦＮ−γ１０μＬ（ＩＦＮ−γのブランクを除いた最終濃度を１００Ｕ／ｍＬとした。）と、培地のＤＭＥＭ０．５ｍＬとを加え、プレートをよく振り混ぜ、３７℃で２４時間培養した。
［ＮＯ2-測定］
培養上清５００μＬに以下の組成のＧｒｉｅｓｓ試薬を５００μＬ加え、攪拌後、５４３ｎｍにおける吸光度を分光光度計（ＵＶ−２２００ＡＩ：島津社製）で測定した。吸光度を表２に示す。コントロールの場合の吸光度を０としてサンプルの吸光度からＮＯ2-生成量の割合を求め、ＮＯ産生抑制率として、下記の式により算出した。結果を表１に示す。
【００３１】
ＮＯ産生抑制率＝｛１−（Ｂ／Ａ）｝×１００
式中、Ａはコントロールの吸光度、Ｂはサンプルの吸光度を示す。
【００３２】
Ｇｒｉｅｓｓ試薬
１重量％サルファニルアミドを５重量％リン酸水溶液に溶解した溶液と、０．１重量％Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミドジヒドロクロライド溶液とを、同容量の割合で混合し用いた。
【００３３】
【表２】
2005053862.tif 000004
【００３４】
［ＭＴＴ法］
上清を取り除いた上記プレートの各ウェルに培地のＤＭＥＭ５００μＬと、ＭＴＴ試薬５０μＬを加え、３７℃で１．５時間培養した。その後、各ウェルにＤＭＳＯ１ｍＬを加え、超音波（超音波洗浄装置：東京理科器械（株）社製）にて細胞を壊した後、各ウェルに塩酸・２−プロパノール５００μＬを加えよく攪拌し、６３０ｎｍを参照波長として５７０ｎｍの波長における吸光度を分光光度計（ＵＶ−２２００ＡＩ：島津社製）で測定した。吸光度を表２に示す。吸光度から以下の計算式により、細胞生存率を求めた。結果を表３に示す。
【００３５】
細胞生存率＝１００×Ｂ／Ａ
式中、Ａはコントロールの吸光度、Ｂはサンプルの吸光度を示す。尚、吸光度は５７０ｎｍの波長における吸光度から６３０ｎｍの波長における吸光度を除した値とした。
【００３６】
【表３】
2005053862.tif 000005