(57)【要約】【課題】  生産効率に優れたプレノール類の製造方法を提供する。【解決手段】  アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる条件下で、細胞を培養し、培養物中からプレノール類を回収する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養し、
培養物中からプレニルアルコールを回収する
プレニルアルコールの製造方法。
【請求項２】
アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤を培地に添加することで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項３】
上記アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤は、上記細胞の培養途中に培地に添加することを特徴とする請求項２記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項４】
アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項５】
アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項６】
脂肪酸を培地に添加することを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項７】
細胞の培養に際して、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下とすることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項８】
スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項７記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項９】
エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする請求項８記載のプレニルアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチルCo-Aとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレノールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
【０００３】
従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。しかしながら、グルコース等の炭素源からの変換率は著しく低く、殆どの炭素源はプレニルアルコールの生合成以外の代謝経路に使用されている。したがって、培地に含まれる炭素源をプレニルアルコールの生合成に効果的に使用できれば、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、現在そのような報告例はない。
【０００４】
すなわち、プレニルアルコールの生産性を向上させるため、簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコールの製造方法は確立されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法。
（２）アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤を培地に添加することで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（３）上記アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤は、上記細胞の培養途中に培地に添加することを特徴とする（２）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（４）アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
（５）アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させることを特徴とする（５）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（６）脂肪酸を培地に添加することを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（７）細胞の培養に際して、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下とすることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（８）スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする（７）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（９）エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする（８）記載のプレニルアルコールの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
以上、詳細に説明したように、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養することで、当該細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール、プレノール、ゲラニルリナロールを意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。
【０００９】
本発明においては、プレニルアルコールを生合成する代謝経路と、アセチルCo-Aカルボキシラーゼの作用によってアセチルCo-Aから脂肪酸を生合成する代謝経路とを併せ持つ細胞を対象としている。プレニルアルコールを合成する代謝経路では、図１に示すように、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチルCo-Aからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸が合成される。イソペンテニル二リン酸は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸に異性化される。また、図１に示すように、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸は、イソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸を基質として順次合成される。さらに、図１に示すように、プレニルアルコールであるファルネソール、ネロリドール及びゲラニルゲラニオールは、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸から合成される。一方、ファルネシル二リン酸からは、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンが生合成される。スクアレンは、ステロールの前駆体物質となり、最終的にエルゴステロールとなる。
【００１０】
さらに、図１に示すように、培地中の炭素源から合成されたアセチルCo-Aは、上述した代謝経路とは別に、脂肪酸合成代謝経路の基質となる。すなわち、この脂肪酸合成代謝経路によって細胞内に脂肪酸を蓄積することとなる。アセチルCo-Aが脂肪酸合成代謝経路の基質として使用される場合、先ずアセチルCo-Aに対してアセチルCo-Aカルボキシラーゼが作用する。
【００１１】
なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；GGOH）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；GGPP）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；FPP, ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；IPP）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；DMAPP）
ファルネソール（farnesol；FOH）
ネロリドール（nerolidol；NOH）
【００１２】
本方法においては、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養する。ここでアセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる方法としては、
１．アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤を培地に添加する
２．アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する
３．アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
【００１３】
１．アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤を培地に添加する方法
アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤としては、例えば、セレウニン（Methods in Enzymology, 72, 512 (1981）、1,3-ジブロモ-2-プロパノン（PNAS 77 4544-4548(1980)）、チオラクトマイシン（J. Bac., 174, 508-513(1992)）、デカノイルACP（planta 198, 271-278(1996)）、デカノイル-CoA（planta 198, 271-278(1996)）、IAA; 2-iodoacetoamide（PNAS 77 4544-4548(1980)）、Arsenite（J.B.C., 267, 20992-20998 (1992)）、NEM; N-ethylmaleiimide（J.B.C., 267, 20992-20998 (1992)） PCMB; p-choromercuri benzoic acid（Arch. Biochem. Biophys., 220, 39-45 (1983)）を挙げることができる。なかでも、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤としては、アセチルCo-Aカルボキシラーゼに対する特異性の観点から、セレウニン、1,3-ジブロモ-2-プロパノン、チオラクトマイシン、デカノイルACP及びデカノイル-CoAを使用することが好ましく、さらにセレウニン、1,3-ジブロモ-2-プロパノン及びチオラクトマイシンを使用することがより好ましい。
【００１４】
これらアセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤は、細胞を培養する培地に単独で添加しても良いし、複数を組み合わせて添加しても良い。アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤としてセレウニンを使用する場合、添加量は、特に限定されないが、0.1〜1ｍｇ／Ｌが好ましい。
【００１５】
また、本方法では、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤を、細胞を培養する培地に予め添加していても良いし、細胞の培養途中に培地に添加してもよい。特に細胞の種類によっては、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤によって生育阻害が生ずる場合もあり、この場合には、細胞が十分に生育（増殖）した後、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ阻害剤を培地に添加することが好ましい。
【００１６】
また、細胞としては、特に限定されないが、脂肪酸合成能が高い微生物を使用することが好ましい。脂肪酸合成能が高い微生物（酵母、糸状菌）としては、例えば、Candida lipilytica、Candida curvata、Mortierella、Lipomyces starkey IFO 10382、、Rhodosporidium toruloides、Trichosporum cutaneum等を挙げることができる。また、本方法においては、微生物に限定されず、例えば、ヒト脂肪細胞、ニワトリ脂肪細胞、マウス脂肪細胞等の脂肪酸合成能の高い細胞を使用することができる。
【００１７】
また、本方法においては、脂肪酸合成能が比較的低い細胞であっても、プレニルアルコールの生産効率を向上させることができる。すなわち、本発明によれば、脂肪酸合成能が比較的低い細胞であっても、プレニルアルコールの生産効率の向上を達成することができる。
【００１８】
また、本方法においては、これら細胞に対して、プレニルアルコール合成の律速酵素であるHMG-CoA還元酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、フォスファチジン酸フォスファターゼ等の遺伝子を強化し、プレニルアルコールの生産能を向上させた変異型細胞を使用しても良い。これら遺伝子を強化する方法としては、遺伝子の発現制御領域（プロモーター等のシス領域）を置換したり、遺伝子に変異を導入して酵素活性を増強させたりする方法が挙げられる。
【００１９】
細胞を培養する培地としては、特に限定されず、上述した細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。細胞としてCandida lipilyticaを用いる場合、例えば、グルコース及び大豆油を添加したYM培地を使用することができる。
【００２０】
また、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコールの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノール  LG-109 (旭電化製)、アデカノールLG-294(旭電化製)、アデカノールLG-295S (旭電化製)、アデカノールLG-297 (旭電化製)、アデカノールB-3009A (旭電化製)、アデカプロニックL-61 (旭電化製)
【００２１】
油脂濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)であり、界面活性剤濃度は0.005〜1%(w/v)、好ましくは0.05〜0.5%(w/v)であり、テルペノイド濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)である。
【００２２】
２．アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法
アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる細胞におけるアセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型細胞を調製し、当該変化型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、GAL1遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
【００２３】
また、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、細胞におけるアセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型細胞を調製し、当該細胞を培養しても良い。
【００２４】
３．アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスRNAを用いる方法が挙げられる。すなわち、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子のmRNAに対するアンチセンスRNAを転写する遺伝子を、細胞ゲノムに組み込み、当該アンチセンスRNAを過剰発現させることで、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子のmRNAの翻訳が抑制される。アンチセンスRNAに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳類（マウス）、昆虫（ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Mizuno et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1966-1970; Aiba et al. (1987) J. Bacteriol, 169, 3007-3012; Green et al. (1986) Annu. Rev. Biochem., 55, 569-597; Harland et al. (1985) J. Cell. Biol., 101, 1094-1099; Coleman et al. (1984) Cell, 37, 429-36; Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 4313-4317; Hackett et al. (2000) Plant Physiol., 124, 1079-86）。
【００２５】
また、上記１〜３の方法に限定されず、例えば遺伝子組換え技術を用いてアセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子に変異を導入し、アセチルCo-Aカルボキシラーゼの活性を低下させることも本発明に含まれる。アセチルCo-Aカルボキシラーゼ遺伝子の遺伝子破壊によって、アセチルCo-Aカルボキシラーゼの活性を低下させることも可能である。
【００２６】
以上のように、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下した条件下で細胞を培養する際には、培地に脂肪酸を添加することが好ましい。脂肪酸としては、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などを挙げることができる。脂肪酸としてパルミチン酸を使用する場合、パルミチン酸の添加量は、0.1〜5％であることが好ましい。
【００２７】
培地に脂肪酸を添加することによって、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下することによる脂肪酸の欠乏を補うことができる。したがって、培地に脂肪酸を添加することによって、細胞の生育（増殖）阻害等を防止することができる。
【００２８】
また、本方法においては、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性とともに、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件で、細胞を培養することが好ましい。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したアセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法が挙げられる。
【００２９】
スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、SQAD（特表平8-508245）、BMS-187745(Taxi. Appl. Pharm., 145, 91-98(1987)), ER-27856(J. lipid. Res. 44, 128-135(2002))などの合成品の他、カビの生産するzaragozic acid(Nat, Prod, Rep., 11, 279-302(1994))などを挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを使用した場合、SQADの添加量は、細胞を培養する培地中に5〜200mg/Lとすることが好ましい。
【００３０】
また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、WO 02/053747に開示されている方法を、細胞に適用することができる。
【００３１】
本方法においては、細胞を、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を阻害する条件下で培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３２】
本方法においては、プレニルアルコールを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
【００３３】
図１に示した生合成経路から判るように、アセチルCo-Aカルボキシラーゼは、培地中の炭素源から合成されたアセチルCo-Aを基質として作用し、アセチルCo-Aを脂肪酸の生合成に消費する酵素である。したがって、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を低下させた場合、脂肪酸合成代謝経路におけるアセチルCo-Aの消費が抑制される。
【００３４】
一般に、アミノ酸を始めとする生育上極めて重要な一次代謝産物では、当該産物の合成反応に直接関与する遺伝子を強化又は抑制することによって、当該産物の生産性を向上させる試みが行われ成果を出している。しかしながら、プレニルアルコール等の二次代謝産物においては、その合成経路の強化又は抑制を行っても、原料物質が一次代謝産物等の合成に消費されることが多く、生産性を向上させることが困難である。すなわち、脂肪酸合成代謝経路におけるアセチルCo-Aの消費を抑制したとしても、プレニルアルコールの生合成が強化される蓋然性は低いといえる。
【００３５】
さらに、アセチルCo-Aは、脂肪酸合成代謝経路を始めとして様々な物質代謝経路に関与している。したがって、アセチルCo-Aが関与する物質代謝経路のうち、如何なる経路を強化又は抑制すれば、プレニルアルコールの生産性を向上できるのかは全く予測ができない。
【００３６】
本発明においては、アセチルCo-Aが関与する様々な代謝経路の中で、特に脂肪酸合成代謝経路におけるアセチルCo-Aの消費を抑制することで、プレニルアルコールの生産性を向上させることができることを実証した。
【００３７】
また、本方法においては、アセチルCo-Aカルボキシラーゼとともにスクアレン合成酵素活性を阻害する条件下で、細胞を培養することによって、プレニルアルコールの生産性をより向上させることができる。これは、図１に示す生合成経路において、スクアレン合成反応が抑制される結果、プレニルアルコールの合成反応が亢進するためであると考えられる。
【００３８】
スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、1〜100mg/Lとすることが好ましい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明に係るプレニルアルコールの製造方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１〕
本例では、細胞としてCandida lipilytica IFO 1209株、Molltiella ramanniana ver ramanniana IFO 8287及びLipomyces starkeyi IFO 10382株を使用した。これらの株は、IFOから購入した。培地は以下のように調製した。すなわち、6%グルコース、1%大豆油、20mg/lエルゴステロールを含有するYM培地（difico社製）に、20mg/lのSQAD（特表平8-508245号公報参照）、0.1%パルミチン酸及び0.45mgのセレウニンを添加した。なお、SQAD及びセレウニン以外の成分混合した後にオートクレーブによって培地を滅菌した。SQAD溶液は、当該水溶液をフィルターによって滅菌したのち、十分に冷えた培地に添加した。また、セレウニンの添加は、培養初日或いは培養開始２日目とした。両菌株ともに、30℃で9日間培養した。
【００４１】
培養終了後、培養液2mlを採取し、これにメタノール1.2ml及びペンタン2mlを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン相を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製HP6890/5973 GC/MSシステムを用いた。
インレット温度：250℃
ディテクター温度：260℃
MSゾーン温度
MS Quad：150℃
MS Source：230℃
スキャンパラメーター
Low Mass：35
High Mass：200
Threshold：40
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：2μl
洗浄回数：メタノールで3回、ヘキサンで2回
スプリット比：1：20
カラム：ヒューレットパッカード社製HP-5MS(O.25mm×30M、フィルム厚O.25μm)
キャリアーガス：1ヘリウム1.0ml/min
ソルベントディレイ：2min
オ一ブン昇温条件：l15℃、1.5分保持→70/分で250℃まで昇温、2分保持→70/分で300℃まで昇温、7分保持
ポストタイム：O
内部標準：1-ウンデカノール/エタノール溶液(1μl/ml)を各バイアルに10μ1添加
注入口ライナー：スプリット/スプリットレス ライナー
解析：TICを取り込んだ後、69マスをセレクションし1ウンデカノール(RT=3.39min)、ネロリドール(RT=3.86min)、ファルネソール(RT=4.23min)、ゲラニルゲラニオ一ル(RT=5.78min)のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2005052047.tif 000002
【００４３】
表１から判るように、油脂としてパルミチン酸を添加することにより各菌株全てにおいてプレニルアルコールの生産性が向上していることが判る。
【００４４】
さらにアセチルCoAカルボキシラーゼ阻害剤としてセレウニンを添加した場合、Molltiella ramanniana ver ramanniana IFO 8287及びSaccharomycopsis lipolytica IFO 1209においてプレニルアルコール生産がいっそう向上していることがわかる。Saccharomycopsis lipolyticaについては培養開始2日後にセレラニンを添加した場合と比較して培養初日よりセレウニンを添加した場合のほうがプレニルアルコールの生産性が向上していた。一方、Lipomyces starkeyc IFO 10382ではセレウニンの添加効果は見られない。セレウニンの添加により生育が阻害されることから、添加量を菌、培養状態に合わせ調整する必要があった。
【００４５】
〔実施例２〕
本例では、脂肪酸生合成能の低い菌株として、Saccharomyces cerevisiaeの組換え酵母（pRS435GGF/YH3 AHKU；PCT JP01/11214）を用いてプレニルアルコール生産性の向上を検討した。
【００４６】
本例では、セレウニンの無添加（サンプルNo.1〜4）、セレウニン添加量を0.45mg（サンプルNo.21〜24）、セレウニン添加量を0.045mg（サンプルNo.25,26）及びセレウニン添加量を0.0045mg（サンプルNo.27,28）とした以外は、実施例１と同様にして培養物の成分分析を行った。
【００４７】
なお本例では、培養後、以下のように菌数を測定した。すなわち、培養液100μlを生理食塩水で1〜20倍に希釈し、血球計(林理化学)で細胞数を計測した。0.06mm四方(最少グリット9つ分)の菌数を4平均し、以下の式から培養液1L当りの菌数を算出した。
菌数(109/培地1l)＝0.444×(0.06mm四方の菌体数)×希釈倍率
結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2005052047.tif 000003
【００４９】
表２から判るように、アセチルCo-Aカルボキシラーゼ活性を阻害した条件で、脂肪酸生合成能の低い菌株を培養した場合でも、菌体あたりのプレニルアルコール蓄積量が向上している。また、本例で用いた菌株においても、培養開始２日後にセレウニンを添加したほうがプレニルアルコールの生産性がより向上していることから、十分に生育した後にアセチルCo-Aカルボキシラーゼの活性を阻害することが好ましいことが判った。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】細胞におけるプレニルアルコール生合成経路を模式的に示す図である。
【図１】
2005052047.tif 000004