(57)【要約】【課題】Ｎ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素等を提供することを課題とする。【解決手段】以下の酵素学的性質を有するＮ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素（１）作用：Ｎ−置換ホルムアミドからアミンへの加水分解反応を触媒する、（２）基質特異性：少なくともＮ−ベンジルホルムアミド等に対する活性を有する、（３）分子量：約６１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、（４）至適温度：約３５℃、（５）至適ｐＨ：約７、（６）金属イオンの影響：Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ａｇ＋及びＨｇ２＋で阻害される、（７）ＳＨ基修飾試薬の影響：ｐ−クロロマーキュリベンゾエイトで阻害される、（８）キレート剤の影響：８−ヒドロキシキノリンで阻害される、（９）還元剤の影響：２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールで阻害される、等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するＮ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素。
（１）作用：Ｎ−置換ホルムアミドからアミンへの加水分解反応を触媒する、
（２）基質特異性：少なくともＮ−ベンジルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド、Ｎ−ホルミルアラニン、Ｎ−ホルミルリジン、Ｎ−ホルミルチロシン、アリルホルムアミド、Ｎ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミドに対する活性を有する、
（３）分子量：約６１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、
（４）至適温度：約３５℃、
（５）至適ｐＨ：約７、
（６）金属イオンの影響：Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ａｇ＋及びＨｇ２＋で阻害される、
（７）ＳＨ基修飾試薬の影響：ｐ−クロロマーキュリベンゾエイトで阻害される、
（８）キレート剤の影響：８−ヒドロキシキノリンで阻害される、
（９）還元剤の影響：２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールで阻害される
【請求項２】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物を、Ｎ−置換ホルムアミド類を含有する培地中で培養し、培養物から前記のＮ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を採取する工程を有することを特徴とするＮ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素の製造方法。
【請求項３】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）  ＦＫ１６４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４９５）であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
Ｎ−置換ホルムアミド類が、
一般式  Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯ
（式中、Ｒは置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い、アルキル基又はアリル基）で示されるＮ−置換ホルムアミド又はその塩であることを特徴とする請求項２又は３記載の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−置換ホルムアミド類が、Ｎ−ベンジルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド、Ｎ−ホルミルアラニン、Ｎ−ホルミルリジン、Ｎ−ホルミルチロシン、アリルホルムアミド及びＮ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミドからなる群から選択される化合物であることを特徴とする請求項２又は３記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の加水分解酵素、又は、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物をＮ−置換ホルムアミド類に接触させて、当該Ｎ−置換ホルムアミド類をアミン類に変換することを特徴とするＮ−置換ホルムアミド類からのアミン類の製造方法。
【請求項７】
アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物が、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）  ＦＫ１６４株であることを特徴とする請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
Ｎ−置換ホルムアミド類が、
一般式  Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯ
（式中、Ｒは置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い、アルキル基又はアリル基）で示されるＮ−置換ホルムアミド又はその塩であることを特徴とする請求項６又は７記載の製造方法。
【請求項９】
Ｎ−置換ホルムアミド類が、Ｎ−ベンジルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド、Ｎ−ホルミルアラニン、Ｎ−ホルミルリジン、Ｎ−ホルミルチロシン、アリルホルムアミド及びＮ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミドからなる群から選択される化合物であることを特徴とする請求項６又は７記載の製造方法。
【請求項１０】
アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ）ＦＫ１６４株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素、当該酵素の製造方法、及び当該酵素等を触媒として用いるＮ−置換ホルムアミド類からのアミン類の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
アミン類は生理活性物質製造の中間体として有用な化合物であり、その新たな製造方法（例えば、工業的に有利な製造方法等）の開発が望まれている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アミン類の製造方法を鋭意検討した結果、Ｎ−置換ホルムアミド類の１つであるＮ−ベンジルホルムアミドを分解する活性を有する微生物をスクリーニングして取得、当該微生物の産生するＮ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素を精製し、さらに、Ｎ−置換ホルムアミド類に当該微生物又は当該酵素を作用させることによりアミン類を生成させ、これを採取することによりアミン類を製造できることを見出し、本発明を完成した。
【０００４】
即ち、本発明は、
１．以下の酵素学的性質を有するＮ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素（以下、本発明酵素と記すこともある。）
（１）作用：Ｎ−置換ホルムアミド類からアミン類への加水分解反応を触媒する、
（２）基質特異性：少なくともＮ−ベンジルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド、Ｎ−ホルミルアラニン、Ｎ−ホルミルリジン、Ｎ−ホルミルチロシン、アリルホルムアミド、Ｎ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミドに対する活性を有する、
（３）分子量：約６１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、
（４）至適温度：３５℃、
（５）至適ｐＨ：７．０、
（６）金属イオンの影響：Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ａｇ＋及びＨｇ２＋で阻害される、
（７）ＳＨ基修飾試薬の影響：ｐ−クロロマーキュリベンゾエイトで阻害される、
（８）キレート剤の影響：８−ヒドロキシキノリンで阻害される、
（９）還元剤の影響：２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールで阻害される；
２．アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物（以下、本微生物と記すこともある。）を、Ｎ−置換ホルムアミド類を含有する培地中で培養し、培養物から前記のＮ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を採取する工程を特徴とするＮ−置換ホルムアミド類の加水分解酵素の製造方法；
３．アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）  ｓｐ．  ＦＫ１６４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４９５）であることを特徴とする前項２記載の製造方法；
４．Ｎ−置換ホルムアミド類が、一般式  Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯ
（式中、Ｒは置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い、アルキル基又はアリル基）で示されるＮ−置換ホルムアミド又はその塩であることを特徴とする前項２又は３記載の製造方法；
５．Ｎ−置換ホルムアミド類が、Ｎ−ベンジルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド、Ｎ−ホルミルアラニン、Ｎ−ホルミルリジン、Ｎ−ホルミルチロシン、アリルホルムアミド及びＮ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミドからなる群から選択される化合物であることを特徴とする前項２又は３記載の製造方法；
６．前項１記載の加水分解酵素、又は、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物をＮ−置換ホルムアミド類に接触させて、当該Ｎ−置換ホルムアミド類をアミン類に変換することを特徴とするＮ−置換ホルムアミド類からのアミン類の製造方法（以下、本発明アミン類製造方法と記すこともある。）；
７．アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物が、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）  ＦＫ１６４株であることを特徴とする前項６記載の製造方法；
８．Ｎ−置換ホルムアミド類が、
一般式  Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯ
（式中、Ｒは置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い、アルキル基又はアリル基）で示されるＮ−置換ホルムアミド又はその塩であることを特徴とする前項６又は７記載の製造方法；
９．Ｎ−置換ホルムアミド類が、Ｎ−ベンジルホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド、Ｎ−ホルミルアラニン、Ｎ−ホルミルリジン、Ｎ−ホルミルチロシン、アリルホルムアミド及びＮ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミドからなる群から選択される化合物であることを特徴とする前項６又は７記載の製造方法；
１０．アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ）ＦＫ１６４株；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明酵素は、Ｎ−置換ホルムアミド類からアミン類への加水分解反応を触媒する酵素である。本発明酵素は、以下のように、例えば、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物から単離精製することにより得ることができる。
【０００６】
本微生物は、天然から分離しても良いし、菌株保存機関等から購入しても良い。天然から分離する場合には、先ず、自然界から採集した土壌を直接又は滅菌水で希釈した後、Ｎ−置換ホルムアミド類（例えば、Ｎ−ベンジルホルムアミド）を単一窒素源又は炭素源とする液体培地に接種し、当該培地で生育可能な微生物を分離する。分離された微生物を常法に従って、シングルコロニーアイソレーションした後、Ｎ−置換ホルムアミド類、トリプトン、酵母エキス等を含有する液体培地中で培養する。生育してきた菌について、ＳＮＥＡＴＨ，  （Ｐ．Ｈ．Ａ．），  ＭＡＩＲ，  （Ｎ．Ｓ．）  ＳＨＡＲＰＥ，  （Ｍ．Ｅ．）  ａｎｄ  ＨＯＬＴ，  （Ｊ．Ｇ．）：  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．２．  １９８４，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．等に記載される通常の方法等に従って、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であるかを同定することにより、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を選抜すればよい。
次に選抜されたアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から、当該微生物の、例えば、Ｎ−ベンジルホルムアミド等のＮ−置換ホルムアミド類を加水分解してベンジルアミン等のアミン類に変換する能力の有無を、後述の実施例に記載されるような方法に準じて確認することにより、本発明に用いられるアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物（即ち、本微生物）を選抜すればよい。
【０００７】
尚、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｆ１６４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４９５の寄託番号が付与されている（受託日：平成１５年８月２２日）。菌学的性状は以下の通りである。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：桿菌
（２）グラム染色性：陽性
２．生理学的性質
（１）ＮＯ３還元：陰性
（２）ピラジンアミダーゼ：陽性
（３）ピロリドニルアリルアミダーゼ：陽性
（４）アルカリ性フォスファターゼ：陽性
（５）β−グルクロニダーゼ：陰性
（６）β−ガラクトシダーゼ：陽性
（７）α−グルコシダーゼ：陽性
（８）Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：陽性
（９）エスクリン加水分解：陽性
（１０）ウレアーゼ：陰性
（１１）ゼラチン加水分解：陽性
（１２）グルコース醗酵性：陰性
（１３）リボース醗酵性：陰性
（１４）キシロース醗酵性：陰性
（１５）マンニトール醗酵性：陰性
（１６）マルトース醗酵性：陰性
（１７）乳糖醗酵性：陰性
（１８）グリコーゲン醗酵性：陰性
（１９）生育温度  ４２℃：陰性
（２０）Ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓサイクル：有り
注）醗酵性＝微生物による炭水化物の無酸素的分解
以上の菌学的性質により、本菌はアースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）と同定された。
【０００８】
本微生物の培養は、当該微生物が利用し得る炭素源、窒素源、無機物等を含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
培養温度は、本微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常、約１０〜４０℃、好ましくは約２０〜３５℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本微生物を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
尚、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＦＫ１６４株が有するＮ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素は、Ｎ−置換ホルムアミド類を含有する培地中で培養することにより、主として菌体内に生成される誘導酵素である。
【０００９】
本発明酵素の製造は下記のように行えばよい。まず、本微生物を、Ｎ−置換ホルムアミド類を含有する培地中で培養する。次いで、例えば、遠心分離等により培養物の一つである本微生物を沈殿物として回収する。回収された前記沈殿物から後述するような通常の方法に準じてＮ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を採取すればよい。
【００１０】
本発明アミン類製造方法では、上記のようにして製造された本発明酵素、又は、本発明酵素を産生する微生物（即ち、本微生物）をＮ−置換ホルムアミド類に接触させて、当該Ｎ−置換ホルムアミド類をアミン類に変換する。
この場合、本微生物は、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞等の形態、又は、固定化された形態（固定化物）で利用してもよい。
【００１１】
固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本Ｎ−置換ホルムアミド類分解微生物を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本Ｎ−置換ホルムアミド類分解微生物を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００１２】
また本発明酵素は、本微生物の培養物から、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用して精製することができ、例えば、次のような方法等を挙げることができる。
【００１３】
まず、本微生物を、Ｎ−置換ホルムアミド類を含有する培地中で培養する。次いで、例えば、遠心分離等により培養物の一つである本微生物を沈殿物として回収する。回収された前記沈殿物を超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明酵素を精製すればよい。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、カルボキシメチル（ＣＭ）基、フェニル基、若しくはブチル基等を導入したセルロース、デキストリン、又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済みカラムとしては、例えば、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＩＳＯ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明酵素を含む画分を選抜するには、例えば、例えば、Ｎ−ベンジルホルムアミド等のＮ−置換ホルムアミド類を加水分解してベンジルアミン等のアミン類に変換する能力の有無を指標にして選抜すればよい。
【００１４】
続いて、本発明アミン類製造方法における触媒反応について説明する。
本発明アミン類製造方法においてＮ−置換ホルムアミド類をアミン類に変換する反応は、Ｎ−置換ホルムアミド類に、本発明酵素、又は、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、Ｎ−置換ホルムアミド類を加水分解する能力を有する酵素を産生する微生物を接触させることによって開始、達成される。
当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量はＮ−置換ホルムアミド類１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。
当該反応に際しては、Ｎ−置換ホルムアミド類を反応系内に連続又は逐次加えてもよい。
【００１５】
反応温度としては、本微生物に含まれる本発明酵素の安定性、反応速度の点から約０〜５０℃程度をあげることができ、好ましくは１０〜４０℃があげられる。
反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、例えば、５〜９をあげることができる。
【００１６】
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
反応に使用する有機溶媒の量は、Ｎ−置換ホルムアミド類に対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
【００１７】
反応は、例えば、水、Ｎ−置換ホルムアミド類、本発明酵素又は本微生物、及び必要に応じて、有機溶媒等を混合し、攪拌、振盪することにより行うことができる。
【００１８】
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間の範囲をあげることができる。
【００１９】
反応終了後は、触媒として酵素を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行えばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【００２０】
Ｎ−置換ホルムアミドとは、例えば、Ｎ−置換部分の炭素原子数が１〜１５（好ましくは炭素原子数が１〜１０、より炭素原子数が１〜８）であるＮ−置換ホルムアミド又はその塩等を意味する。さらに、例えば、
一般式  Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯ
（式中、Ｒは置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い（好ましくは炭素原子数が１〜８の）、アルキル基又はアリル基）で示されるＮ−置換ホルムアミド又はその塩をあげることができる。
アミン類とは、前記のＮ−置換ホルムアミドを加水分解して得られるアミン又はその塩である。具体的には、本発明アミン類製造方法において原料化合物として一般式  Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯで示されるＮ−置換ホルムアミドを用いる場合には、これに対応するアミンである
一般式  Ｒ−ＮＨ２
（式中、Ｒは置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い（好ましくは炭素原子数が１〜８の）、アルキル基又はアリル基）で示されるアミン類が製造される。
ここで「置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い（好ましくは炭素原子数が１〜８の）、アルキル基又はアリル基」とは、置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い（好ましくは炭素原子数が１〜８の）アルキル基、又は、置換されていても良いフェニル基、カルボキシル基及びアミノ基からなる置換基群から選ばれる１つ以上の置換基で置換されていても良い（好ましくは炭素原子数が１〜８の）アリル基を意味するものである。
【００２１】
【実施例】
以下、製造例等により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  （本微生物の取得（その１））
Ｎ−置換ホルムアミド類としてＮ−ベンジルホルムアミドを単一炭素源とする液体培地（以下、ＮＧ培地と記すこともある。下記（１）参照）又はＮ−置換ホルムアミド類としてＮ−ベンジルホルムアミドを単一窒素源とする液体培地（以下、ＣＰ培地と記すこともある。下記（２）参照）を用いて、本微生物の単離を行った。微生物の分離源としては、つくば市近郊の土壌サンプルを用いた。まず、Ｎ−ベンジルホルムアミド濃度を０．０２％（Ｗ／Ｖ）に調製した前記各培地に、土壌サンプルの一部を添加した。これを２８℃で振盪培養しながら、１週間おきに１％（Ｖ／Ｖ）植菌を繰り返すことにより、６０株の菌株を単離した。
【００２３】
（１）ＮＧ培地
Ｎ−ベンジルホルムアミド（単一Ｎ源）：０．０２％（Ｗ／Ｖ）、
グリセロール：１．０、
Ｋ２ＨＰＯ４：０．０５、
ＫＨ２ＰＯ４：０．０５、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５、
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０００５、
蒸留水：１Ｌ、
ｐＨ：７．０
【００２４】
（２）ＣＰ培地
Ｎ−ベンジルホルムアミド（単一Ｃ源）：０．０２％（Ｗ／Ｖ）、
グリセロール：１．０、
Ｋ２ＨＰＯ４：０．０５、
ＫＨ２ＰＯ４：０．０５、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５、
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０００５、
蒸留水：１Ｌ、
ｐＨ：７．０
【００２５】
実施例２  （本微生物の取得（その２））
単離された各菌株をＮＧ−１及びＣＰ−１培地（上記のＮＧ培地及びＣＰ培地のＮ−ベンジルホルムアミド濃度を０．０５％（Ｗ／Ｖ）に変更した培地）１０ｍＬに植菌して２８℃、３日間振盪培養した後、培養液を遠心分離することにより休止菌体を得た。得られた休止菌体を、１０ｍＭ  Ｎ−ベンジルホルムアミドを含む０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、これを２５℃で２時間放置した後、当該反応系におけるＮ−ベンジルホルムアミドの減少を下記条件での高速液体クロマトグラフィー法により定量することにより、Ｎ−ベンジルホルムアミド分解活性を求めた。
【００２６】
（高速液体クロマトグラフィー条件：Ｎ−ベンジルホルムアミド分析）
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ  （４．６×１５０ｍｍ）（ナカライ社）、
キャリアー：１０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．０）：アセトニトリル＝１：１（Ｖ／Ｖ）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、
温度：４０℃、
検出：１９８ｎｍ、
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：Ｎ−ベンジルホルムアミド（２．２ｍｉｎ）
【００２７】
上記のＮ−ベンジルホルムアミド分解活性の測定結果では、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＦＫ１６４株が最も高い活性を有していることが明らかとなった。
【００２８】
実施例３  （本発明酵素の精製）
アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＦＫ１６４株を１２ＬのＮＧ−１培地中で３０℃、２４時間培養した後、１３，０００ｘｇ、１５ｍｉｎ、４℃遠心分離することにより菌体を集めた。次いで、得られた菌体約４０ｇを、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した後、約４８０ｍＬの同じ緩衝液に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕装置（ｍｏｄｅｌ  ２０１Ｍ、ＫＵＢＯＴＡ）を用いて２００Ｗ、６０ｍｉｎ処理することにより、菌体超音波破砕液を得た。得られた菌体超音波破砕液を、１３，０００ｘｇ、２０ｍｉｎ、４℃で遠心分離して残渣を除き、無細胞抽出液を得た。次いで、得られた無細胞抽出液に硫酸アンモニウムを加え、４０−５０％飽和の濃度において析出した画分を遠心処理によって回収し、少量の１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析された粗酵素液を１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（５．８×７．６ｃｍ）に吸着させた。タンパク質の溶出は、ＫＣｌを含む１Ｌの１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、ＫＣｌ濃度を０．２−０．５Ｍまで直線的に上昇させることにより行った。各画分の酵素活性は以下に示す方法によって測定した。下記の酵素活性測定反応液に各画分を適当量加え、２５℃、１０ｍｉｎインキュベートした後、これに等量のアセトニトリルを添加することにより反応を停止させた。次いで、前記反応液を遠心分離して得られる上清のうち４０μｌをＧＩＴＣ反応液（０．１３％ＧＩＴＣ（２，３，４，６−テトラアセチルグルコイソチオシアネート）、０．１３％トリエチルアミンを含むアセトニトリル）１２０μｌに添加することによりＧＩＴＣ誘導体化ベンジルアミンを調製し、得られたＧＩＴＣ誘導体化ベンジルアミンを下記の高速液体クロマトグラフィー条件で定量した。ここで、酵素活性の１ユニットを、１分間あたりに１μｍｏｌのベンジルアミンを生成する酵素量と定義した。
酵素活性を有する画分を回収し、これに硫酸アンモニウムを７０％飽和に達するまで添加した。析出した沈殿を遠心分離によって回収し、これを少量の１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させた。次いで当該溶解物を、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析（１２時間、４℃）することにより粗酵素液を得た。得られた粗酵素液に等量の５０％飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えた後、これを２５％飽和硫酸アンモニウム１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＩＳＯカラム（１ＣＶ＝６ｍｌ）に吸着させた。タンパク質の溶出は、カラムの平衡化に用いた緩衝液１８０ｍｌにより、硫酸アンモニウム濃度を２５％飽和から１５％飽和まで直線的に低下させることで行った。各画分の酵素活性を上述の方法と同様な方法で測定した。
酵素活性を有する画分を回収し、これに硫酸アンモニウムを７０％飽和に達するまで添加した。析出した沈殿を遠心分離により回収し、これを少量の１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させた。次いで当該溶解物を、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析（１２時間、４℃）することにより粗酵素液を得た。得られた粗酵素液を、０．２Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ジチオスレイトール及び１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１ＣＶ＝１ｍｌ）に吸着させた。タンパク質の溶出は、カラムの平衡化に用いた緩衝液６０ｍｌにより、ＫＣｌ濃度を０．２Ｍから０．４Ｍまで直線的に上昇させることで行った。各画分の酵素活性を上述の方法と同様な方法で測定した。
酵素活性を有する画分を回収し、これに硫酸アンモニウムを７０％飽和に達するまで添加した。析出した沈殿を遠心分離により回収し、これを１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させた後、当該溶解物を液体窒素により瞬間凍結後−８０℃で保存した。精製結果を表１に示した。
精製酵素標品は、無細胞抽出液の１１８倍まで精製され、その収率は８．３６％であった。
【００２９】
（酵素活性測定反応液組成）
Ｎ−ベンシルホルムアミド：１０ｍＭ、
リン酸カリウム緩衝液：０．１Ｍ、
酵素：適当量、
ｐＨ：７．５
【００３０】
（高速液体クロマトグラフィー条件：ＧＩＴＣ誘導体化ベンジルアミン分析）
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ  （４．６×１５０ｍｍ）（ナカライ社）、
キャリアー：１０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．０）：アセトニトリル＝１：１（Ｖ／Ｖ）、
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、
温度：４０℃、
検出：２５０ｎｍ、
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ：ＧＩＴＣ誘導体化ベンジルアミン（４．５ｍｉｎ）
【００３１】
【表１】
2005065514.tif 000002
【００３２】
実施例４  （本発明酵素の酵素学的性質）
実施例３で得られた精製酵素標品を用いてその酵素学的諸性質を調べた。
（１）分子量及びサブユニット構造
実施例３で得られた精製酵素標品を、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．  ：  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，  ６８０−６８５  （１９７０））によりゲル濃度１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動の結果を図１に示した。図１において、レーンＡは分子量マーカー、レーンＢは精製酵素標品である。分子量マーカーとの比較から、レーンＢの精製酵素標品の分子量は約６１，０００と見積られた。さらに、精製酵素標品をゲルろ過（カラム；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２ＨＲ  １０／３０  （１ＣＶ＝２４ｍｌ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）、移動相；０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ、４℃）に供した。その結果を図２に示した。図中の矢印が示すように、ネイティブ酵素の分子量は約１２１，０００と見積られた。以上の結果より、本酵素は分子量６１，０００のサブユニット２つからなる分子量約１２１，０００のホモダイマー構造を有することが推定された。
【００３３】
（２）基質特異性
本発明酵素の基質特異性を調べた。その結果、本発明酵素は、Ｎ−ベンジルホルムアミド（１００）、Ｎ−メチルホルムアミド（０．００１４）、Ｎ−ブチルホルムアミド（３．４）、Ｎ−シクロヘキシルホルムアミド（０．０００１）、Ｎ−ホルミルアラニン（０．００２４）、Ｎ−ホルミルリジン（０．００１０）、Ｎ−ホルミルチロシン（０．０００３）、アリルホルムアミド（０．２２）、Ｎ−（α−メトキシベンジル）ホルムアミド（０．１６）に対する活性を有することがわかった。尚、（）内の数字は、Ｎ−ベンジルホルムアミドに対する活性を１００とした時の相対活性を表す。
【００３４】
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
本発明酵素を様々なｐＨの緩衝液中で反応させ、至適ｐＨを求めた。その結果を図３に示した。本発明酵素の至適ｐＨは、約７であった。また、様々なｐＨの緩衝液中で２５℃、３０ｍｉｎインキュベートした後、本発明酵素の活性を測定することにより、本発明酵素の種々のｐＨにおける安定性（ｐＨ安定性）を求めた。その結果、本発明酵素はｐＨ７〜９（好ましくはｐＨ７．５〜８．５）において安定であった。
【００３５】
（４）至適温度及び安定温度範囲
本発明酵素を様々な温度の緩衝液中で反応させ、至適温度を求めた。その結果を図４に示した。本発明酵素の至適温度は、約３５℃であった。また、様々な温度の緩衝液（ｐＨ７．０）中で、３０ｍｉｎインキュベートした後、本発明酵素の活性を測定することにより、本発明酵素の種々の温度における安定性（温度安定性）を求めた。その結果、本発明酵素は４０℃付近から失活した。
【００３６】
（５）各種化合物の添加効果
酵素活性に及ぼす各種化合物の影響を調べた。その結果を表２に示した。本発明酵素の活性は、一部の金属塩（ＣｕＣｌ，  ＣｕＣｌ２，  ＡｇＮＯ３，  ＨｇＣｌ２）、ＳＨ試薬（ｐ−クロロマーキュリベンゾエイト）、キレート剤（８−ヒドロキシキノリン）、還元剤（２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール）により阻害を受けた。
【００３７】
【表２】
2005065514.tif 000003
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、生理活性物質製造の中間体として有用なアミン類を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明酵素の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。図中において、レーンＡは分子量マーカー、レーンＢは精製酵素標品である。
【図２】本発明酵素のゲルろ過による分子量測定結果を示す図である。
【図３】本発明酵素の至適ｐＨ及びｐＨ安定性を示す図である。左図は至適ｐＨを示し、右図はｐＨ安定性を示す。
【図４】本発明酵素の至適温度及び温度安定性を示す図である。左図は至適温度を示し、右図は温度安定性を示す。
【図１】
2005065514.tif 000004
【図２】
2005065514.tif 000005
【図３】
2005065514.tif 000006
【図４】
2005065514.tif 000007