(57)【要約】【課題】  ｐ５３タンパク質活性化調節剤のスクリーニング法の提供。【解決手段】  哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、（ａ）ＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、および（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進または抑制を検出する工程、を含んでなり、工程（ｂ）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、
（ａ）ＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、および、
（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進または抑制を検出する工程
を含んでなり、
工程（ｂ）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される、方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）において用いられる細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）が、細胞内のＧＡＤＤ３４のｍＲＮＡ量を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）が、細胞内のＧＡＤＤ３４タンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られる細胞におけるＧＡＤＤ３４遺伝子発現の強度と、候補化合物の不在下で培養された対照細胞におけるＧＡＤＤ３４遺伝子発現の強度とを比較することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、
（ａ）ＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに、
（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
を含んでなり、
工程（ｂ）において、前記相互作用の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ）において、前記相互作用の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される、方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）において用いられる細胞が哺乳動物細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）が、核内のＰＰ１αタンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
核内のＰＰ１αタンパク質量の減少が前記相互作用の促進を示すものであり、核内のＰＰ１αタンパク質量の増加が前記相互作用の抑制を示すものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）が、細胞質中のＰＰ１αタンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
細胞質中のＰＰ１αタンパク質量の増加が前記相互作用の促進を示すものであり、細胞質中のＰＰ１αタンパク質量の減少が前記相互作用の抑制を示すものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られる細胞における前記相互作用の強度と、候補化合物の不在下で培養された対照細胞における前記相互作用の強度とを比較することを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進する方法であって、目的とする哺乳動物細胞を、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤を用いて処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項１４】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤が、ＧＡＤＤ３４をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤および医薬上許容される担体を含んでなる、ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
前記疾患または障害が癌または腫瘍である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤が、ＧＡＤＤ３４をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤および医薬上許容される担体を含んでなる、ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
前記疾患または障害が炎症性疾患である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤が、ＧＡＤＤ３４遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤が、ＧＡＤＤ３４遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤が、ＧＡＤＤ３４遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ５３タンパク質活性化調節剤のスクリーニング法、ｐ５３タンパク質の活性化法、およびｐ５３タンパク質に関連する疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＤＤ３４は、成長停止およびＤＮＡ損傷によって発現量が増加するタンパク質のうちの一つである。ＧＡＤＤ３４は、ＧＡＤＤ４５およびＧＡＤＤ１５３と同様に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における紫外線（ＵＶ）誘導転写産物として発見されたものである（非特許文献１：Fornace A.J. Jr. et al., Mol. Cell Biol. 9, 4196-4203, 1989）。ＧＡＤＤ３４は、そのカルボキシル末端部分において、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）のγ１３４．５との間で高度に保存されたドメインを有する。このγ１３４．５は、ＨＳＶ１の感染した神経芽腫細胞においてタンパク質合成の成熟前での停止を遮断する病原性因子である（非特許文献２：Chou J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5247-5251, 1994）。γ１３４．５タンパク質のカルボキシル末端ドメインは、プロテインホスファターゼ１α（ＰＰ１α）に結合する。この複合体は、真核細胞翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）を特異的に脱リン酸化し、タンパク質合成停止が防止される（非特許文献３：He B. et al., J. Virol. 70, 84-90, 1996）。さらに、Novoaら（非特許文献４：Novoa I. et al., J. Cell Biol. 153, 1011-1022, 2001）およびKojimaら（非特許文献５：Kojima E. et al., FASEB J. 17, 1573-1575, 2003）では、ＧＡＤＤ３４ノックアウトマウスを用いる実験により、ＧＡＤＤ３４の機能の一つがＨＳＶ１のγ１３４．５タンパク質の機能に類似することが示されている。特に、Kojimaらの上記文献には、ＧＡＤＤ３４-/-マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）において、このＭＥＦを小胞体（ＥＲ）ストレスに曝すと、タンパク質合成停止からの回復が遅れることが記載されている。
【０００３】
また、ＧＡＤＤ３４とＰＰ１αとの関連については、次のような報告がある。まず、Trinkle-Mulcahyら（非特許文献６：Trinkle-Mulcahy L et al., J. Cell Sci. 114, 4219-4228, 2001）には、内因性ＰＰ１αが主に培養細胞の核内に局在していることが示されている。さらに、Brushら（非特許文献７：Brush M.H. et al., Mol. Cell Biol. 23, 1292-1303, 2003）には、ＧＡＤＤ３４がＰＰ１αに結合すること、小胞体ストレスを誘導するツニカマイシン処理によってＧＡＤＤ３４遺伝子発現が増強されること、およびツニカマイシン処理によってＰＰ１αが小胞体に局在化することが示されている。しかしながら、ＤＮＡ傷害物質がＰＰ１αを小胞体に移行させることは、これまでに報告されていない。
【０００４】
プロテインホスファターゼとｐ５３との関連については、次のような報告がある。Takenakaら（非特許文献８：Takenaka I. et al., J. Biol. Chem. 270, 5405-5411, 1995）には、ＰＰ１／ＰＰ２Ａがｐ５３のＣ末端部位（プロテインキナーゼによるリン酸化部位）を脱リン酸化し、これによりｐ５３のＤＮＡ結合能に影響を与えることが示されている。一方で、ｐ５３のＮ末端部位におけるリン酸化は、転写調節能および安定化にとって重要であるとされているが、このＮ末端部位でのリン酸化とプロテインホスファターゼとの関係は解明されていない。
【０００５】
ＧＡＤＤ３４と細胞周期停止またはアポトーシスとの関連について、いくつかの報告がある。いくつかの研究により、電離性放射線照射またはアルキル化剤であるメチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）での処理の後に、所定の細胞系において、アポトーシスの開始がＧＡＤＤ３４の発現に相関することが示されている（非特許文献９：Adler H.T. et al., Mol. Cell Biol. 19, 7050-7060, 1999；非特許文献１０：Grishin A.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10172-10177, 2001）。ショウジョウバエトリソラックス（ｔｒｘ）遺伝子のヒト相同体であるＨＲＸ白血病性融合癌遺伝子は、ＧＡＤＤ３４に結合してアポトーシス応答を負に調節する（非特許文献９：Adler H.T. et al., Mol. Cell Biol. 19, 7050-7060, 1999）。結腸直腸癌ＳＷ４８０細胞株におけるＧＡＤＤ３４の発現は、電離性放射線照射により誘発されるアポトーシスを促進することが報告されている（非特許文献９：Adler H.T. et al., Mol. Cell Biol. 19, 7050-7060, 1999）。また、ヒトＧＡＤＤ３４は、黒色腫細胞および神経膠腫細胞の分化および増殖停止によって誘導されることが示されている（非特許文献１１：Jiang H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9160-9165, 1996；非特許文献１２：Su Z.Z. et al., Oncogene 22, 1164-1180, 2003）。ヒト黒色腫細胞においては、ＩＬ−２４がＧＡＤＤファミリーの遺伝子発現およびアポトーシスを誘発すること、およびアンチセンス法によるＧＡＤＤ３４の発現抑制によって前記アポトーシスが遮断されることが報告されている（非特許文献１３：Sarkar D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10054-10059, 2002）。
【０００６】
【非特許文献１】Fornace A.J. Jr. et al., Mol. Cell Biol. 9, 4196-4203, 1989
【非特許文献２】Chou J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5247-5251, 1994
【非特許文献３】He B. et al., J. Virol. 70, 84-90, 1996
【非特許文献４】Novoa I. et al., J. Cell Biol. 153, 1011-1022, 2001
【非特許文献５】Kojima E. et al., FASEB J. 17, 1573-1575, 2003
【非特許文献６】Trinkle-Mulcahy L et al., J. Cell Sci. 114, 4219-4228, 2001
【非特許文献７】Brush M.H. et al., Mol. Cell Biol. 23, 1292-1303, 2003
【非特許文献８】Takenaka I. et al., J. Biol. Chem. 270, 5405-5411, 1995
【非特許文献９】Adler H.T. et al., Mol. Cell Biol. 19, 7050-7060, 1999
【非特許文献１０】Grishin A.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10172-10177, 2001
【非特許文献１１】Jiang H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9160-9165, 1996
【非特許文献１２】Su Z.Z. et al., Oncogene 22, 1164-1180, 2003
【非特許文献１３】Sarkar D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10054-10059, 2002
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、細胞の増殖またはアポトーシスの阻害について、ＧＡＤＤ３４の機能解析を行なった。ＧＡＤＤ３４でのトランスフェクションにより、ｐ５３のリン酸化が誘導された。ＧＡＤＤ３４欠損ＭＥＦでは、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）によるｐ５３のリン酸化は、野生型ＭＥＦに比べて減少していた。ＧＡＤＤ３４は、主に核内に存在するプロテインホスファターゼ１α（ＰＰ１α）に結合することが知られている。ＭＭＳ処理により、ＰＰ１αは核から小胞体に移行した。なお、ＭＭＳ処理はｅＩＦ２αリン酸化を刺激せず、タンパク質合成停止を誘導しないことが示された。さらに、ＧＡＤＤ３４でのトランスフェクションにより、ＰＰ１αが小胞体に移行した。さらに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＴｅｔ ｏｎ−ｏｆｆシステムを用いて、細胞増殖について調べたところ、ＧＡＤＤ３４を誘導した（テトラサイクリン無し）細胞は増殖を停止し、ｐ２１／ＷＡＦ１のｍＲＮＡ発現量が増加した。これらの結果から、本発明者らは、ＧＡＤＤ３４が、ＰＰ１αを核から細胞質中に移行させることによりｐ５３リン酸化を促進する、との知見を得た。本発明は、この知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、ＧＡＤＤ３４の作用の調節能に基づくｐ５３タンパク質活性化調節剤のスクリーニング法、ｐ５３タンパク質の活性化法、およびｐ５３タンパク質に関連する疾患を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
そして、本発明によるスクリーニング法は、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、（ａ）ＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、および（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進または抑制を検出する工程、を含んでなり、工程（ｂ）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される方法である。
【００１０】
本発明の他の態様によるスクリーニング法は、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、（ａ）ＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用の促進または抑制を検出する工程、を含んでなり、工程（ｂ）において、前記相互作用の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ）において、前記相互作用の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される方法である。
【００１１】
さらに、本発明によるｐ５３タンパク質活性化法は、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進する方法であって、目的とする哺乳動物細胞を、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤を用いて処理する工程を含んでなる方法である。
【００１２】
さらに、本発明による医薬組成物は、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤および医薬上許容される担体を含んでなる、ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための医薬組成物である。
【００１３】
さらに、本発明の他の態様による医薬組成物は、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤および医薬上許容される担体を含んでなる、ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための医薬組成物である。
【００１４】
本発明によれば、生物学的研究、医療などの様々な分野において、ｐ５３タンパク質の活性化の調節が可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１５】
本明細書において、ＧＡＤＤ３４が、ｐ５３リン酸化、ｐ２１ｍＲＮＡ発現および細胞増殖停止を誘導することが実証されている。γ線照射、ＵＶ照射またはＭＭＳ処理などのＤＮＡ損傷ストレスにより、ヒトｐ５３のセリン１５におけるリン酸化およびマウスｐ５３のセリン１８におけるリン酸化が誘導される。ＧＡＤＤ３４欠損ＭＥＦでは、ＭＭＳ処理またはＵＶＣ処理の後におけるｐ５３のセリン１８でのリン酸化は、野生型ＭＥＦに比べて弱いものであった。また、ＧＡＤＤ３４ｃＤＮＡでのトランスフェクションにより、ヒトｐ５３のセリン１５におけるリン酸化が用量依存的に増加することが示された。これらの結果によれば、ＧＡＤＤ３４によりｐ５３のリン酸化が誘導されるものと結論づけられる。さらに、本明細書においては、ＭＭＳ処理によってＧＡＤＤ３４が誘導されること、ＧＡＤＤ３４が小胞体においてＰＰ１αと相互作用し、ＰＰ１αの核内への移行を阻害すること、核内のＰＰ１αの量が減少することによりｐ５３の脱リン酸化が抑制され、リン酸化されたｐ５３の量が増加することが示されている。
【００１６】
以上のような知見から、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法が提供される。この方法により同定される薬物は、好ましくはヒト細胞内におけるヒトｐ５３タンパク質の活性化、特にヒトｐ５３タンパク質の第１５番目のセリン残基のリン酸化による活性化、を促進または抑制するものとされる。
【００１７】
本発明の第一の態様による薬物同定法は、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現を調節する能力を指標とするものであり、よって、該方法により同定される薬物は、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進剤または抑制剤である。従って、この方法は以下の工程を含むものとされる：
（ａ１）ＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程；および
（ｂ１）工程（ａ１）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進または抑制を検出する工程。
【００１８】
本発明の第一の態様による薬物同定法では、工程（ｂ１）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ１）においてＧＡＤＤ３４遺伝子発現の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される。
【００１９】
工程（ａ１）においては、内因性ＧＡＤＤ３４遺伝子を有する細胞をそのままの形で用いることができるが、内因性ＧＡＤＤ３４遺伝子の有無にかかわらず、ＧＡＤＤ３４遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞を用いてもよい。ＧＡＤＤ３４タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：Ｕ８３９８１）に示されるヒトＧＡＤＤ３４の配列が挙げられる。当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法（例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと）を用いて、細胞を適切にトランスフェクトすることができる。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ１）において用いられる細胞は哺乳動物細胞とされる。このような哺乳動物細胞としては、様々なものが当技術分野において知られており、例えば、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＯＡＳ−２細胞等が挙げられる。また、哺乳動物細胞において用いられる発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなるものである。
【００２１】
工程（ａ１）における培養は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、候補薬物と前記細胞とをインキュベートすることによって行なうことができる。また、候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子を発現しうる条件は、γ線照射、ＵＶ照射、ＭＭＳ処理などの技術を用いてＤＮＡ損傷ストレスを与えることによって達成することができ、あるいは、トランスフェクションに用いた発現ベクター中のプロモーターを活性化することによって達成することもできる。培養における培地、温度、時間、候補薬物の量、細胞の量、添加物などは、当業者であれば適切に選択することができる。
【００２２】
工程（ｂ１）において、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現の促進または抑制は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、該遺伝子の発現の強度を測定することによって検出することができる。細胞内の遺伝子発現の強度を測定する方法としては、その発現産物、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質、の量を測定する方法が挙げられる。さらに、ＧＡＤＤ３４のｍＲＮＡ量は、これに特異的なプライマーペアを用いるＲＴ−ＰＣＲによる増幅の後に電気泳動を行なう方法等により測定することができる。また、ＧＡＤＤ３４タンパク質の量は、細胞から得られるタンパク質抽出物を電気泳動した後にＧＡＤＤ３４に特異的な抗体を用いてこれを検出するイムノブロット法等により測定することができる。さらに、本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｂ１）は、工程（ａ１）により得られる細胞におけるＧＡＤＤ３４遺伝子発現の強度と、候補化合物の不在下で培養された対照細胞におけるＧＡＤＤ３４遺伝子発現の強度とを比較することを含んでなる。対照細胞は、候補薬物を添加しないことを除き、工程（ａ１）と同一の方法によって得ることができる。
【００２３】
本発明の第二の態様による薬物同定法は、ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用を調節する能力を指標とするものであり、よって、該方法により同定される薬物は、前記相互作用の促進剤または抑制剤である。従って、この方法は以下の工程を含むものとされる：
（ａ２）ＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに、
（ｂ２）工程（ａ２）により得られる細胞において、ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用の促進または抑制を検出する工程。
【００２４】
本発明の第二の態様による薬物同定法では、工程（ｂ２）において、前記相互作用の促進が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程（ｂ２）において、前記相互作用の抑制が検出された場合には、その候補薬物がｐ５３タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される。
【００２５】
工程（ａ２）においては、内因性ＧＡＤＤ３４遺伝子および内因性ＰＰ１α遺伝子を有する細胞をそのままの形で用いることができるが、これら内因性遺伝子の有無にかかわらず、ＧＡＤＤ３４遺伝子および／またはＰＰ１α遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞を用いてもよい。ＧＡＤＤ３４タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：Ｕ８３９８１）に示されるヒトＧＡＤＤ３４の配列が挙げられる。また、ＰＰ１αタンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号３および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：Ｘ７０８４８）に示されるヒトＰＰ１αの配列が挙げられる。当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法（例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと）を用いて、細胞を適切にトランスフェクトすることができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ２）において用いられる細胞は哺乳動物細胞とされる。このような哺乳動物細胞としては、様々なものが当技術分野において知られており、例えば、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＯＡＳ−２細胞等が挙げられる。また、哺乳動物細胞において用いられる発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなるものである。
【００２７】
工程（ａ２）における培養は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、候補薬物と前記細胞とをインキュベートすることによって行なうことができる。また、候補薬物の不在下で前記細胞がＧＡＤＤ３４遺伝子およびＰＰ１α遺伝子を発現しうる条件は、γ線照射、ＵＶ照射、ＭＭＳ処理などの技術を用いてＤＮＡ損傷ストレスを与えることによって達成することができ、あるいは、トランスフェクションに用いた発現ベクター中のプロモーターを活性化することによって達成することもできる。培養における培地、温度、時間、候補薬物の量、細胞の量、添加物などは、当業者であれば適切に選択することができる。
【００２８】
工程（ｂ２）において、ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用の促進または抑制は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、該相互作用の強度を測定することによって検出することができる。ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用、すなわちこれらの結合により、核内のＰＰ１αタンパク質の量は減少し、一方で、細胞質中のＰＰ１αタンパク質の量は増加する。従って、ＧＡＤＤ３４タンパク質とＰＰ１αとの相互作用の強度を測定する方法としては、核内または細胞質中のＰＰ１αタンパク質の量を測定する方法が挙げられる。この場合において、核内のＰＰ１αタンパク質量の減少は前記相互作用の促進を示し、一方で、核内のＰＰ１αタンパク質量の増加は前記相互作用の抑制を示す。また、細胞質中のＰＰ１αタンパク質量の増加は前記相互作用の促進を示し、細胞質中のＰＰ１αタンパク質量の減少は前記相互作用の抑制を示す。さらに、核内または細胞質中のＰＰ１αタンパク質量は、当技術分野において周知の細胞分画法によって核内のタンパク質画分または細胞質中のタンパク質画分を得た後に、これを電気泳動し、その後、ＰＰ１αに特異的な抗体を用いてこれを検出するイムノブロット法等により測定することができる。さらに、本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ｂ２）は、工程（ａ２）により得られる細胞における前記相互作用の強度と、候補化合物の不在下で培養された対照細胞における前記相互作用の強度とを比較することを含んでなる。対照細胞は、候補薬物を添加しないことを除き、工程（ａ２）と同一の方法によって得ることができる。
【００２９】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤およびＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤は、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進することができる。従って、本発明によれば、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を促進する方法であって、目的とする哺乳動物細胞を、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤を用いて処理する工程を含んでなる方法が提供される。さらに、本発明によれば、ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤の使用が提供される。さらに、本発明によれば、治療上有効な量のＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤を被検者に投与することを含んでなる、ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害を治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤の使用が提供される。
【００３０】
ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害は特に制限されるものではないが、好ましくは癌または腫瘍とされる。また、治療または予防の対象となる被検者は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。
【００３１】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤は、本発明の第一の態様による薬物同定法によって同定することができる。また、ＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤は、本発明の第二の態様による薬物同定法によって同定することができる。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤は、ＧＡＤＤ３４をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターとされる。このような発現ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列などを参照して、当技術分野において周知の標準的な技術によって製造することができる。また、前記発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなることができる。さらに、前記発現ベクターとしては、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることもできる。
【００３３】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤およびＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤は、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を抑制することができる。従って、本発明によれば、哺乳動物細胞内におけるｐ５３タンパク質の活性化を抑制する方法であって、目的とする哺乳動物細胞を、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤を用いて処理する工程を含んでなる方法が提供される。さらに、本発明によれば、ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤の使用が提供される。さらに、本発明によれば、治療上有効な量のＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤を被検者に投与することを含んでなる、ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害を治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害を治療するための薬剤の製造における、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤の使用が提供される。
【００３４】
ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害は特に制限されるものではないが、好ましくは炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチとされる。また、治療または予防の対象となる被検者は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。
【００３５】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤は、本発明の第一の態様による薬物同定法によって同定することができる。また、ＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤は、本発明の第二の態様による薬物同定法によって同定することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤は、ＧＡＤＤ３４遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子とされる。アンチセンス法は、特定の遺伝子の発現を抑制するための周知の技術である。一つの具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＧＡＤＤ３４遺伝子の５’コード領域の配列に基づいて設計された、約１０〜４０塩基長のアンチセンスＲＮＡとされる。他の具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＧＡＤＤ３４遺伝子の転写に関与する領域の配列に相補的となるように設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとされる。このようなアンチセンス核酸分子は、配列番号１に示されるようなＧＡＤＤ３４遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤は、ＧＡＤＤ３４遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子とされる。本明細書において、「ｓｉＲＮＡ核酸分子」とは、ｓｉＲＮＡそのものだけでなく、標的細胞中にｓｉＲＮＡを導入しうる、より長い二本鎖ＲＮＡ分子をも意味する。ｓｉＲＮＡ核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって特定遺伝子の発現を抑制することができる、周知のツールである（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、１９〜２１塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる。上記の二本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、より長いヌクレオチド配列を含んでなる。このようなｓｉＲＮＡ核酸分子は、配列番号１に示されるようなＧＡＤＤ３４遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。さらに、前記ｓｉＲＮＡ核酸分子は、細胞中に送達された適切なベクターによって発現させることもできる。従って、前記ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤は、ＧＡＤＤ３４遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターとしてもよい。このようなベクターは、当技術分野において周知の標準的な手順により、容易に構築することができる（Bass, B.L., Cell 101, 235-238, 2000；Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet. 24, 180-183, 2000；Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998；Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000）。
【００３８】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤、ＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤およびＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤は、局所、静脈内、皮下、筋肉内、経口、直腸、粘膜など、治療または予防しようとする疾患または障害に応じて適切な経路で投与することができる。また、これらの治療上の有効量は、症状の重篤度、被検者の年齢、用いられる具体的な薬物の有効性、投与経路、投与の頻度などに従って、医師または獣医によって適宜決定される。一般的には、前記治療上有効量は、一日当たり、約０．００１〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。
【００３９】
ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤、ＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤およびＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤は、医薬上許容される担体とともに投与することができる。従って、本発明によれば、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤、および医薬上許容される担体を含んでなる、医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、ｐ５３タンパク質の活性化が治療上有効とされる疾患または障害を治療するために用いることができる。さらに、本発明によれば、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤、および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、ｐ５３タンパク質の活性化の阻害が治療上有効とされる疾患または障害を治療するために用いることができる。医薬上許容される担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、投与経路、用いられる具体的な薬物の性質などに応じて、当業者により適宜選択される。本発明による医薬組成物は、好ましくは、治療上有効量のＧＡＤＤ３４遺伝子発現促進剤、ＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用促進剤、ＧＡＤＤ３４遺伝子発現抑制剤またはＧＡＤＤ３４−ＰＰ１α相互作用抑制剤、ならびに医薬上許容される担体を含んでなるものとされる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００４１】
例１：ＧＡＤＤ３４とｐ５３のリン酸化との関連
１．材料および方法
細胞培養および試薬
ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から入手し、１０％ウシ胎児血清（GIBCO）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ, Sigma）中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で維持した。ＳＯＡＳ−２細胞は、理研バイオリソースセンター（RIKEN BioResource Center, Ibaraki, Japan）から購入し、１０％ウシ胎児血清（GIBCO）を補充したマッコイ５Ａ培地（GIBCO）中で増殖させた。ＵＶ−Ｃ照射のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、FUNA UV LINKER Fs1500（Funakoshi, Tokyo, Japan）を用いて培地の不在下で照射した。ＭＭＳおよびテトラサイクリンは、Sigma-Aldrichから購入した。シクロヘキサミドはCalbiochemから購入した。
【００４２】
ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞系の樹立および細胞培養
ＧＡＤＤ３４ ｔｅｔ−ｏｆｆ誘導可能細胞系を樹立するため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ｔＴＡ調節タンパク質を発現するｐＴｅｔ−ｏｆｆプラスミド（Clontech, Palo Alto, CA）でトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性コロニーを選択して増殖させた。次いで、ｔＴＡタンパク質を発現する細胞を、ｐＴＲＥプラスミド（Clontech）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にＧＡＤＤ３４遺伝子を挿入することにより調製したｐＴＲＥ−ＧＡＤＤ３４構築物でさらにトランスフェクトした。ｐＴＲＥ−ＧＡＤＤ３４プラスミドでトランスフェクトされた細胞を２１日間のハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）処理により選択し、各ハイグロマイシン耐性コロニーを別々に回収し、それぞれについてｔｅｔ−ｏｆｆシステムによるＧＡＤＤ３４タンパク質発現の検出を行なった。ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞を、１０％ウシ胎児血清（GIBCO）を補充したＤＭＥＭ培地中において、２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下で増殖させた。ＧＡＤＤ３４タンパク質の発現を誘導するため、テトラサイクリンを含有するＤＭＥＭ培地を除去し、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、その後、テトラサイクリンを含まない新鮮なＤＭＥＭ培地を細胞に加えた。ＧＡＤＤ３４タンパク質の誘導について調べるために、所定の時点で細胞を回収した。
【００４３】
一過性トランスフェクション
ＳＯＡＳ−２細胞を６ウェルプレート上に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種した。この細胞を、Effectene Transfection Reagent（Qiagen）を用いて、１００ｎｇ／ウェルのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液で溶解した。
【００４４】
マウス胚繊維芽細胞の調製
ＧＡＤＤ３４欠損マウスおよび野生型マウスに由来するマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を、１４．５日齢の胎児から調製した。全ての培養物は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変必須培地（Sigma）中で維持した。予備培養および実験のために、細胞を２×１０６細胞／１０ｃｍプレートの密度で播種した。
【００４５】
イムノブロット分析
溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、ならびに１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌロイペプチン、および１μｇ／ｍｌペプスタチン）を用いて、細胞を皿から取り出した。得られた抽出物を、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清をサンプリング緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１５０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、および１％ブロモフェノールブルー）中で５分間煮沸した。約２０μｇのタンパク質を９％または１２％のＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。得られたブロットを、５％スキムミルクを含有するＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充した１×ＰＢＳ）で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに室温で６時間または４℃で一晩インキュベートし、３回洗浄した後に、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に結合した二次抗体とともにインキュベートした。タンパク質は、化学発光ＥＣＬキット（Amersham）により、次の抗体のいずれかを用いて検出した：抗ホスホｐ５３（Ｓｅｒ１５）抗体（#9284, Cell Signaling Technology）、抗ホスホｅＩＦ２α（Ｓｅｒ５２）抗体（44-728, BIOSOURCE international）、抗ｅＩＦ２α抗体（sc7629, C-20）、抗ＰＰ１α抗体（sc-6104, C-19）、および抗ＧＡＤＤ３４抗体（sc-825, C-19, Santa Cruz）。
【００４６】
細胞分画
既知の方法に従って、細胞質抽出物および核抽出物を得た。概説すると、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳですすぎ、プロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、および０．５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド）を補充した２００μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中において、氷上でインキュベートした。細胞質抽出物を得るため、２．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ ｐｌｕｓプロテアーゼ阻害剤を含有する２５μｌの緩衝液Ａの添加によって細胞を溶解した。核をペレット化（３，５００ｒｐｍ、４℃、４分間）し、上清を回収し、この上清を５回凍結融解した後に遠心分離（３，５００ｒｐｍ、４℃、１０分間）した。核画分を調製するため、プロテアーゼ阻害剤を補充した抽出緩衝液Ｃ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．４５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で核ペレットをインキュベートし、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）を行ない、上清を回収した。全細胞溶解物は、上述のように調製した。
【００４７】
免疫組織化学実験
細胞を、ポリ−Ｄ−リシンでコーティングされたガラスカバー片上に播種した。２４時間後、ＭＭＳを最終濃度８０μｇ／ｍｌで添加し、カバー片を８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で１０分間固定化し、０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中で５分間浸透化した。次いで、得られた細胞を、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳを用いて、１時間ブロッキングした。免疫検出は、一次抗体（１：１００希釈）と、フルオレセイン結合型二次抗体および／またはローダミン結合型二次抗体（１：２００希釈）とを用いて行なった。タンパク質は、次の抗体のうちの一つまたは二つを用いて検出した：抗ｍｙｃ抗体（Invitrogen）、抗ＰＰ１α抗体（sc-6104, C-19）、ウシ抗ヤギ抗体ローダミン結合体（sc-2349, Santa Cruz）、およびウサギ抗マウス抗体フルオレセイン結合体（DAKO）。２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピディウム（ＰＩ）染色剤を用いて核（ＤＮＡ）を染色し、カバー片をガラススライド上に置いた。
【００４８】
統計解析
データは平均値±標準偏差として示した。グループ間の統計学的有意差は、two-way repeated-measures ANOVAによって評価した。ｐ＜０．０５の場合に、有意差があるものとした。
【００４９】
２．実験および結果
ＤＮＡ損傷により誘導されるｐ５３リン酸化のＧＡＤＤ３４による増強
ｐ５３とＧＡＤＤ３４の関連を分析するため、ＳＯＡＳ−２細胞（ｐ５３を有さない細胞系）を、２μｇ／ｍｌまたは０．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、変異型ｐ５３（１４３Ａ）の発現プラスミドでトランスフェクトし、さらに、ｐＴＲＥ−ＧＡＤＤ３４ベクターおよびｐＴｅｔ−ｏｆｆベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、テトラサイクリンを除いた。トランスフェクションの３６時間後に、細胞を冷却したＰＢＳで２回洗浄した。全細胞抽出物を調製し、ｐ５３タンパク質のリン酸化のレベルをイムノブロッティングによって決定した。その結果を図１に示す。図１によれば、ＧＡＤＤ３４の過剰発現により、用量依存的にｐ５３リン酸化が促進されることが示される。
【００５０】
次いで、ＧＡＤＤ３４がin vivoにおいてｐ５３リン酸化を促進するか否かを調べるため、ＧＡＤＤ３４欠損マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）におけるｐ５３タンパク質発現およびｐ５３リン酸化の分析を行なった。細胞を濃度８０μｇ／ｍｌのＭＭＳで処理した後、所定の時点でタンパク質溶解物を調製した。５０μｇの全タンパク質サンプルを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写し、上述した各種抗体を用いて染色した。結果を図２に示す。図２によれば、ＧＡＤＤ３４欠損ＭＥＦにおけるＭＭＳ処理後１２時間の時点でのｐ５３およびホスホ−ｓｅｒ１８ｐ５３の発現レベルは、野生型ＭＥＦに比べて低いことが示される。
【００５１】
ＭＭＳ処理後におけるＧＡＤＤ３４によるプロテインホスファターゼ１α（ＰＰ１α）の小胞体への移行
ＧＡＤＤ３４がｐ５３リン酸化を促進する際の作用機序を明らかにするため、ＧＡＤＤ３４に結合しうるＰＰ１αの挙動を調べた。
【００５２】
まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をパラホルムアルデヒド中で固定化し、ＰＩでの染色および抗ＰＰ１α抗体での染色を行ない、それぞれを顕微鏡で観察した。さらに、これらの画像を重ね合わせた。実験は、それぞれ少なくとも２回ずつ行なった。その結果、ＭＭＳで刺激していないＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＰＰ１αは、細胞質よりも核内に多く存在することが示された。
【００５３】
次いで、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＭＭＳで処理し、パラホルムアルデヒド中で固定化した後、ＰＩでの染色および抗ＰＰ１α抗体での染色を行ない、それぞれを顕微鏡で観察した。さらに、これらの画像を重ね合わせた。実験は、それぞれ少なくとも２回ずつ行なった。その結果、ＭＭＳ刺激により、高密度のＰＰ１αが細胞質の特定の部分に存在することが示された。
【００５４】
ＧＡＤＤ３４タンパク質に特異的な抗体が免疫染色に利用できないため、Ｍｙｃタグを有するＧＡＤＤ３４を発現する発現ベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞株にトランスフェクトした。完全長ＧＡＤＤ３４−ｍｙｃタグを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して、抗ＰＰ１α抗体および抗ｍｙｃ抗体での二重免疫染色を行なった。これらの細胞を、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。実験は、それぞれ少なくとも２回ずつ行なった。その結果、ＰＰ１αおよびＧＡＤＤ３４の両方が、主に細胞質中の特定の部分に存在することが示された。さらに、ＤｉＯＣ６（３）（ヨウ化３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニン）染色を行なったところ、ＧＡＤＤ３４およびＰＰ１αは小胞体中に共存していることが示された。
【００５５】
以上に示される結果をさらに確認するため、核および細胞質中のＰＰ１αの量をウェスタンブロッティングにより分析した。
【００５６】
まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を９０μｇ／ｍｌのＭＭＳで処理した。ＭＭＳ処理の２〜１２時間後に、細胞溶解物、細胞質抽出物および核抽出物を回収した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル上で電気泳動し、抗ＧＡＤＤ３４抗体または抗ＰＰ１α抗体でブロッティングした。結果を図３に示す。図３によれば、ＭＭＳ処理の８時間後において、細胞質中のＰＰ１αの量が増加するのに対し、核内のＰＰ１αの量が減少することが示される。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＰＰ１αの総量は、ＭＭＳ処理によって変化しないことが示される。
【００５７】
次いで、ＧＡＤＤ３４+/+ＭＥＦおよびＧＡＤＤ３４-/-ＭＥＦを９０μｇ／ｍｌのＭＭＳで処理した。ＭＭＳ処理の８時間後に、核抽出物を回収した。これらのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル上で電気泳動し、抗ＰＰ１α抗体でブロッティングした。結果を図４に示す。図４によれば、ＧＡＤＤ３４欠損ＭＥＦではＭＭＳ処理によって核内ＰＰ１α量が変化しないのに対し、野生型ＭＥＦではＭＭＳ処理によって核内ＰＰ１α量が減少することが示される。
【００５８】
ＰＰ１阻害剤であるオカダ酸によるストレス誘導性ｐ５３リン酸化の増強およびｐ５３タンパク質分解の阻害
既報の研究により、化学的ＰＰ１阻害剤であるオカダ酸はｐ５３のリン酸化の状態に影響を与えるが、通常の条件下ではｐ５３のセリン１８は変化しないことが示されている（Merrick B.A. et al., Biochemistry 40, 4053-4066, 2001）。しかし、ストレス条件下においてｐ５３のリン酸化に変化が見られるか否かについては、これまでに報告されていない。ｐ５３リン酸化とＰＰ１αとの関連を調べるため、オカダ酸の存在下および不在下でのｐ５３のセリン１８におけるリン酸化の量を比較した。まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、６０ｍｍ培養皿中に１×１０６細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間増殖させた後、これらの細胞をＵＶＣ（５０Ｊ／ｍ２）に曝し、照射後４時間の時点で、シクロヘキサミド（１０μｇ／ｍｌ）を添加して新たなｐ５３タンパク質合成を阻害した。シクロヘキサミド処理の後、所定の時点において細胞を回収し、セリン１８においてリン酸化されたｐ５３のレベルを決定した。その結果を図５に示す。図５によれば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＵＶ処理によりｐ５３リン酸化が誘導されることが示される。ＵＶ処理によるｐ５３リン酸化のレベルは、オカダ酸処理によって明らかに促進されていた。また、興味深いことに、オカダ酸で処理した場合には、シクロヘキサミド処理を行なった後においてもｐ５３リン酸化のレベルが減少しなかった（例えば、シクロヘキサミド処理後１５分および３０分の時点でのデータを参照のこと）。
【００５９】
ＧＡＤＤ３４の発現誘導による細胞増殖の抑制
ＧＡＤＤ３４が細胞増殖を抑制するか否かを調べるため、ＧＡＤＤ３４タンパク質の発現がテトラサイクリン−誘導システムによって制御されるテトラサイクリン調節ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞系を樹立した。この実験では、上述の方法に従って樹立したＮＩＨ３Ｔ３−ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞系を用いた。
【００６０】
まず、細胞を１００ｍｍ培養皿中に４×１０５細胞の密度で播種し、２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させた。テトラサイクリンを除いた後、所定の時点において細胞を回収し、細胞内タンパク質を調製した。１００μｇの全細胞タンパク質を用いて、抗ＧＡＤＤ３４抗体によるイムノブロッティング分析を行なった。その結果を図６に示す。図６によれば、ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞は、テトラサイクリンの存在下では低レベルの内因性ＧＡＤＤ３４タンパク質を示すのに対し、テトラサイクリンを除いた後は、ＧＡＤＤ３４タンパク質が３倍以上に誘導されることが示される。
【００６１】
次いで、完全長ＧＡＤＤ３４タンパク質を発現するＴｅｔ−ｏｆｆ ＧＡＤＤ３４細胞系をパラホルムアルデヒド中で固定化し、抗ＰＰ１α抗体による免疫染色およびＰＩ染色を行なった。これらの細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに、免疫染色およびＰＩ染色の画像を重ね合わせた。実験は、それぞれ少なくとも２回ずつ行なった。その結果、テトラサイクリンの存在下（ＧＡＤＤ３４が誘導されない条件下）では、核内のＰＰ１αの量は細胞質における量に等しかったが、テトラサイクリンを除いた後（ＧＡＤＤ３４が誘導される条件下）では、高密度のＰＰ１αが細胞質の特定の部分に見られた。
【００６２】
次いで、ＧＡＤＤ３４の細胞増殖に関連する機能を調べた。まず、３×１０４個のＮＩＨ３Ｔ３−ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞を６０ｍｍ培養皿中に播種し、２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＤＭＥＭ培地またはテトラサイクリンを含まないＤＭＥＭ培地の中で増殖させた。細胞数を３日間にわたって毎日数えた。その結果を図７ａに示す。また、対照サンプルとして、上記の細胞に代えてＮＩＨ３Ｔ３−ルシフェラーゼ誘導可能細胞を用いて行なった実験の結果を図７ｂに示す。図７ａおよび図７ｂでは、３回の実験による平均値±標準偏差としてデータを示している。図７によれば、ＧＡＤＤ３４を誘導しない条件下（テトラサイクリンの存在下）に置いた細胞が７２時間で１．５倍に増殖したのに対し、ＧＡＤＤ３４を誘導する条件下（テトラサイクリンの不在下）に置いた細胞は増殖しなかったことが示されている。これに対し、対照実験においては、ルシフェラーゼを誘導しない条件下（テトラサイクリンの存在下）に置いた細胞とこれを誘導する条件下（テトラサイクリンの不在下）に置いた細胞との間で、細胞増殖の程度は相違しなかった。
【００６３】
以上の実験結果から、ＧＡＤＤ３４を誘導した細胞は細胞増殖能を失うものと結論づけられる。そこで、ＧＡＤＤ３４のｐ２１ｍＲＮＡ発現に対する影響を調べるため、ＧＡＤＤ３４誘導細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行なった。まず、ＧＡＤＤ３４誘導可能細胞を、６０ｍｍ培養皿中に播種し、２μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＤＭＥＭ培地中に置いた。２４時間後、テトラサイクリンを除いて、細胞を４８時間培養した。全ＲＮＡを抽出し、ｐ２１ｍＲＮＡおよびβアクチンｍＲＮＡのそれぞれについてＲＴ−ＰＣＲを行なった。その結果を図８に示す。図８において、１はＧＡＤＤ３４ Ｔｅｔ−ｏｎ細胞を示し、２はＧＡＤＤ３４ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞を示し、３はルシフェラーゼＴｅｔ−ｏｎ細胞を示し、４はルシフェラーゼＴｅｔ−ｏｆｆ細胞を示す。また、サイクル数は、ＲＴ−ＰＣＲにおけるサイクル数を示す。図８によれば、ＧＡＤＤ３４を誘導した細胞におけるｐ２１ｍＲＮＡの発現は、ＧＡＤＤ３４を誘導しなかった細胞よりも強いことが示されている。また、対照実験において、ＧＡＤＤ３４は、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのｍＲＮＡの蓄積に影響しないことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ＧＡＤＤ３４の発現量とｐ５３のリン酸化との関係を示す図である。
【図２】図２は、ＭＭＳ処理後の野生型マウス胚繊維芽細胞およびＧＡＤＤ３４欠損マウス胚繊維芽細胞におけるｐ５３タンパク質レベルおよびホスホｐ５３タンパク質レベルを示す図である。
【図３】図３は、ＭＭＳ処理による、核内および細胞質中のＰＰ１αの量の経時変化を示す図である。
【図４】図４は、ＭＭＳ処理後８時間の時点における、ＧＡＤＤ３４欠損マウス胚繊維芽細胞および野生型マウス胚繊維芽細胞の核内ＰＰ１αの量を示す図である。
【図５】図５は、オカダ酸による、ストレスにより誘導されるｐ５３リン酸化の増強、およびｐ５３タンパク質分解の阻害を示す図である。
【図６】図６は、ＧＡＤＤ３４誘導可能３Ｔ３細胞における、テトラサイクリンの不在下でのＧＡＤＤ３４の誘導を示す図である。
【図７】図７は、ＧＡＤＤ３４を誘導した細胞とＧＡＤＤ３４を誘導しなかった細胞との間の、細胞増殖能の相違を示す図である。
【図８】図８は、ＧＡＤＤ３４の誘導によるｐ２１タンパク質の増加を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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