(57)【要約】【課題】血管新生作用を有する新規な遺伝子治療剤の提供。【解決手段】繊維芽細胞成長因子活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の双方を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子からなる医薬、該遺伝子を有するベクター、該ベクターからなる医薬。分泌シグナルのアミノ酸配列、繊維芽細胞成長因子活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の双方を有するポリペプチド、該ポリペプチドからなる医薬、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子からなる医薬、該遺伝子を有するベクター、該ベクターからなる医薬。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び繊維芽細胞成長因子活性を有するポリぺプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる医薬。
【請求項２】
細胞接着活性を有するポリペプチドが、フィブロネクチンに由来することを特徴とする請求項１記載の医薬。
【請求項３】
細胞接着活性を有するポリペプチドが、ＶＬＡ−５結合性ポリペプチドに由来することを特徴とする請求項２記載の医薬。
【請求項４】
細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該配列に１〜数個の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜３何れか１項に記載の医薬。
【請求項５】
細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号２で表される塩基配列、又は該配列の相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列であることを特徴とする請求項１〜４何れか１項に記載の医薬。
【請求項６】
繊維芽細胞成長因子活性を有するポリぺプチドのアミノ酸配列が、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列又は該配列に１〜数個の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来することを特徴とする請求項１〜５何れか１項に記載の医薬。
【請求項７】
繊維芽細胞成長因子活性を有するポリぺプチドをコードする遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号４で表される塩基配列、又は該配列の相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列であることを特徴とする請求項１〜６何れか１項に記載の医薬。
【請求項８】
配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる請求項１〜７何れか１項に記載の医薬。
【請求項９】
配列表の配列番号６で表される塩基配列を有する遺伝子からなる請求項１〜８何れか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
さらに、分泌シグナルのアミノ酸配列をコードする遺伝子が付加されてなる請求項１〜９何れか１項に記載の医薬。
【請求項１１】
分泌シグナルのアミノ酸配列が、配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列（＝  ＦＧＦ４シグナル）又は該配列に１〜数個の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１０記載の医薬。
【請求項１２】
分泌シグナルのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号８で表される塩基配列、又は該配列の相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列であることを特徴とする請求項１０または１１記載の医薬。
【請求項１３】
配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる請求項１０〜１２何れか１項に記載の医薬。
【請求項１４】
配列表の配列番号１０で表される塩基配列を有する遺伝子からなる請求項１０〜１３何れか１項に記載の医薬。
【請求項１５】
分泌シグナルのアミノ酸配列、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、及び繊維芽細胞成長因子活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
分泌シグナルのアミノ酸配列が、配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列又は該配列に１〜数個の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を有し、かつ分泌活性を有するものであることを特徴とする請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
細胞接着活性を有するポリペプチドが、フィブロネクチンに由来することを特徴とする請求項１５又は１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
細胞接着活性を有するフィブロネクチンに由来するポリペプチドが、ＶＬＡ−５結合性ポリペプチドであることを特徴とする請求項１５〜１７何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列又は該配列に１〜数個の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１５〜１８何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
繊維芽細胞成長因子活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列又は該配列に１〜数個の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも１つを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１５〜１９何れか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１５〜２０何れか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項２２】
分泌シグナルのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、配列表の配列番号８で表される塩基配列、又は該配列の相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイスする塩基配列であることを特徴とする請求項２１記載の遺伝子。
【請求項２３】
細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列表の配列番号２で表される塩基配列、又は該配列の相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイスする塩基配列であることを特徴とする請求項２１記載の遺伝子。
【請求項２４】
繊維芽細胞成長因子活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列が、配列表の配列番号４で表される塩基配列、又は該配列の相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイスする塩基配列であることを特徴とする請求項２１記載の遺伝子。
【請求項２５】
請求項２１〜２４何れか１項に記載の遺伝子を有するベクター。
【請求項２６】
ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドベクターの何れかであることを特徴とする請求項２５記載のベクター
【請求項２７】
ベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項２６記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２５〜２７何れか１項に記載のベクターからなる医薬。
【請求項２９】
請求項２５〜２８何れか１項に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項３０】
請求項２９の形質転換体を培養し、該培養物より請求項１５〜２０何れか１項に記載のポリペプチドを採取することを特徴とする請求項１５〜２０何れか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項３１】
請求項１５〜２０何れか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
【請求項３２】
血管新生促進剤である請求項１〜１４、２８、３１記載の医薬。
【請求項３３】
動脈疾患治療剤である請求項１〜１４、２８、３１記載の医薬。
【請求項３４】
軟骨傷害治療剤である請求項１〜１４、２８、３１記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子治療等に用いられる医薬に関する。更に詳しくは、細胞接着活性及び繊維芽細胞成長因子活性を合わせ持つポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードする遺伝子からなる医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
虚血性心臓病や閉塞性動脈硬化症等の虚血性疾患における治療法はまず第１に血管形成手術が試みられる。これらの方法は確立された有効な治療法であるが、一定の確率（３０〜４０％）で拡張した血管の再閉塞がみられ、現在の臨床上の限界と考えられている。このような症例に対して虚血領域の周辺組織からの血管新生や側副血行の発達を人為的に促進し、虚血組織の傷害／壊死を軽減させ、本来の機能を回復させようとする治療的血管新生療法が試みられている。
基礎研究の場ではさまざまな成長因子を用いた血管新生療法が試みられており、例えばａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ等の効果が主に動物実験により確かめられている。臨床応用については１９９６年、米国タフツ大学のＩｓｎｅｒらの研究グループがＶＥＧＦ１６５遺伝子を含む発現プラスミドベクター（Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ）を下肢虚血患者の血管内にカテーテルを用いて投与し、有意な側副血行の改善を報告した〔Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．；ランセット（Ｌａｎｃｅｔ），第３４８巻，第３７０〜３７４頁（１９９６）〕のをはじめ、１９９８年にはドイツのＳｃｈｕｍａｃｈｅｒらのグループが狭心症患者の冠動脈バイパス手術の際、ｂＦＧＦタンパク質を吻合部付近に注入し、有意な血管新生、側副血行が観察された〔Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．；サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ），第９７巻，第６４５〜６５０頁（１９９８）〕等の報告がされている。しかしながら、十分な治療効果が見られた症例はまだ報告されておらず、さらに効果の高い血管新生因子が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術を鑑み行われたもので、本発明の目的は、血管新生療法に有用な新規な遺伝子治療用医薬を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、既にフィブロネクチンの細胞結合領域とｂＦＧＦを融合させた新たな機能性ポリペプチドＣ−ＦＧＦを開発し、該ポリペプチドがｂＦＧＦよりも強力な血管新生能を有することを明らかにしている（日本特許公報第２８２９４０５号、米国特許公報第５３０２７０１号）。今回、本発明者らは、鋭意研究の結果、  前記Ｃ−ＦＧＦをコードする遺伝子が、遺伝子治療用医薬として有用であることを見出した。さらに本発明者らは、分泌シグナル配列を付加することにより、さらに効果が高まることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明を概説すると、本発明の第１の発明は、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び繊維芽細胞成長因子活性を有するポリぺプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる医薬に関する。
【０００６】
本発明の第２の発明は、分泌シグナルのアミノ酸配列、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、及び繊維芽細胞成長因子のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明の第３の発明は、第２の発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【０００８】
本発明の第４の発明は、第３の発明の遺伝子を有するベクターに関する。
【０００９】
本発明の第５の発明は、第４の発明のベクターからなる医薬に関する。
【００１０】
本発明の第６の発明は、第５の発明のベクターで形質転換された形質転換体に関する。
【００１１】
本発明の第７の発明は、第６の発明の形質転換体を培養し、該培養物より第２の発明のポリペプチドを採取することを特徴とする第２の発明のポリペプチドの製造方法に関する。
【００１２】
本発明の第８の発明は、第２の発明のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とする医薬に関する。
【００１３】
本発明の第９の発明は、血管新生促進剤である第１、第５、第８の発明の医薬に関する。
【００１４】
本発明の第１０の発明は、動脈疾患治療剤である第１、第５、第８の発明の医薬に関する。
【００１５】
本発明の第１１の発明は、軟骨傷害治療剤である第１、第５、第８の発明の医薬に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（以下ＦＧＦを略記することがある）は、繊維芽細胞や内皮細胞等の増殖を促進する因子であり、生体内では血管新生、創傷治癒、発生等に関与していると考えられている。繊維芽細胞成長因子はファミリーを形成し、そのメンバーは少なくとも１８種類以上あると考えられている。
本発明に使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドとしては特に限定はなく、ＦＧＦファミリーに属する任意の成長因子が使用され、好適には、強い血管新生作用を有する塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ、ＦＧＦ２）が使用される。
ｂＦＧＦは１５５アミノ酸よりなるポリペプチドであるが、Ｎ末端側の２５アミノ酸が欠失した１３０アミノ酸からなるポリペプチドもＦＧＦ活性を有することが知られている。また、１５５アミノ酸のｂＦＧＦのＮ末側に、４１アミノ酸、４６アミノ酸又は５５アミノ酸が付加された、それぞれ１９６アミノ酸、２０１アミノ酸、２１０アミノ酸からなる高分子量型ｂＦＧＦが知られている。本発明においては、何れのｂＦＧＦも使用でき、好適には配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有する１５５アミノ酸からなるｂＦＧＦが使用される。
本発明に使用されるＦＧＦは、ＦＧＦ活性を有するものであれば、天然型のＦＧＦのアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたものであっても良い。かかる変異を有するＦＧＦとしては、例えば、日本特許公報第２８２９４０５号に記載のポリペプチド、即ち、本明細書の配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の１２８番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたものが挙げられる。
なお、ＦＧＦ活性は、公知の方法、例えば、細胞増殖促進の指標となる３Ｈ―チミジンの取込み活性を測定することにより測定可能であり、例えば、西川らの方法〔メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１４６巻、第１１〜２３頁（１９８７）〕に準じて測定することが出来る。
【００１７】
本発明に使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、特に限定はなく、上記した本発明で使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を使用することが出来る。例えば、配列番号の配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が使用され、その一例として、配列表の配列番号４に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
また、天然型のＦＧＦのアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子も使用することができる。例えば、日本特許公報第２８２９４０５号に記載のポリペプチドをコードする遺伝子、即ち、本明細書の配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の１２８番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたポリペプチドをコードする遺伝子が使用され、例えば、配列表の配列番号４に示す塩基配列の３８３番目のＡがＧに置換された配列を有するもの等が挙げられる。
また、本発明に使用されるＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、上記した塩基配列の相補鎖に、厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつＦＧＦ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア  ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．）に記載の方法により実施することが出来る。また、上記厳密な条件下とは、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
なお、縮重遺伝子を介して、前記遺伝子とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明に使用できる。
【００１８】
本発明の、細胞接着活性を有するポリペプチドとしては特に限定はなく、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、テネイシン等の細胞外マトリックス分子、あるいは該分子のフラグメントが挙げられ、好適にはフィブロネクチンの細胞接着ドメインに由来するポリペプチドが使用される。フィブロネクチンの細胞接着ドメインとしては、ＶＬＡ−５レセプター結合性リガンドであるＲＧＤＳ配列を含む領域、ＶＬＡ−４レセプター結合性リガンドであるＣＳ−１配列を含む領域が存在し、何れも本発明に使用でき、特にＶＬＡ−５結合性ポリペプチドが好適に使用される。
ＶＬＡ―５結合性ポリペプチドとしては、例えば、特公平８―２９０９８号に記載のＣ−２８３（Ａｌａ１２３５―Ｍｅｔ１５１７）、特許第２５６１１１３号に記載のＣ−２０６（Ｇｌｕ１３１２−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−２１９（Ｐｒｏ１２９９−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−２５８（Ｐｒｏ１２６０−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−２７９（Ｐｒｏ１２３９−Ｍｅｔ１５１７）、特許第２５６１１３１号に記載のＣ−２７４（Ｐｒｏ１２３９−Ａｓｐ１５１２）、特許第２５６１５２６号に記載のＣ−３８５（Ａｌａ１１３３−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−４２８（Ｐｒｏ１０９０−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−４７８（Ｇｌｙ１０４０−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−４８１（Ａｌａ１０３７−Ｍｅｔ１５１７）、Ｃ−５０４（Ｇｌｙ１０１４−Ｍｅｔ１５１７）、  特許第３１０４１７８号に記載のＣ−２７７（Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）等が挙げられ、好適には配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するＣ−２７７が使用される。
ＶＬＡ−４結合性ポリペプチドとしては、例えば特許第３１０４１７８号に記載のＣＳ１が挙げられる。
ＶＬＡ−５結合性ポリペプチドとＶＬＡ−４結合性ポリペプチドの融合タンパク質も本発明に使用でき、例えば、特許第３１０４１７８号に記載のＣ−ＣＳ１が使用できる。
本発明に使用される細胞接着活性を有するポリペプチドは、細胞接着活性を有するものであれは、天然型のポリペプチドのアミノ酸に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などの変異が導入されたものであっても良い。かかる変異を有するポリペプチドとしては、例えば特許第２５６２９５１号に記載のＣ−２７９（Ｓ→Ｖ）等が挙げられる。
なお、細胞接着活性は、公知の方法、例えばルオスラティ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）らの方法〔メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）〕にて測定することが出来る。
【００１９】
本発明の使用される細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には特に限定はなく、上記した本発明で使用される細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を使用することが出来る。例えば、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が使用され、その一例として、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
また、細胞接着活性を有する天然型のポリペプチドのアミノ酸に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入などの変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子も使用することが出来る。
また、本発明に使用される細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、上記した塩基配列の相補鎖に、厳密な条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ細胞接着活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
ハイブリダイゼーションは前記した方法に従って行なうことが出来、また厳密な条件とは前記した条件が挙げられる。
なお、縮重遺伝子を介して、前記遺伝子とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明に使用できる。
【００２０】
本発明の細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とＦＧＦ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いは該ポリペプチドをコードする遺伝子において、細胞接着活性を有するポリペプチドとＦＧＦ活性を有するポリペプチドの順序に限定はなく、Ｎ末側は細胞接着活性を有するポリペプチドであっても良く、またＦＧＦ活性を有するポリペプチドであっても良い。
細胞接着活性を有するポリペプチドとＦＧＦ活性を有するポリペプチドは直接結合していても良く、またスペーサーを介して結合していても良い。
かかる細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とＦＧＦ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＣ−２７７のＣ末側に配列番号３のアミノ酸配列からなるｂＦＧＦが結合したＣ−ＦＧＦ、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるＣ−２７７のＣ末側に配列番号３のアミノ酸配列の１２８番目のＬｙｓがＡｒｇに置換された点変異ｂＦＧＦが結合したＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）が挙げられ、特にＣ−ＦＧＦが好適に使用される。該Ｃ−ＦＧＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
なお、Ｃ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）は、配列表の配列番号５の４０５番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列を有する。
【００２１】
該ポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明に好適に使用され、特にＣ−ＦＧＦをコードする遺伝子が好適に使用される。該Ｃ−ＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号６に示す。また、Ｃ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）をコードする遺伝子の塩基配列としては、配列表の配列番号６の１２１４番目のＡがＧに置換されたもの等が挙げられる。
なお、配列表の配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドＣ−ＦＧＦをコードするプラスミドを保持する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＹＭＨ―ＣＦ・Ａと表示し、独立行政法人産業技術総合研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ―５２７８として寄託されている。
また、配列表の配列番号５のアミノ酸配列の４０５番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）をコードするプラスミドを保持する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＹＭＨ―ＣＦと表示し、独立行政法人産業技術総合研究所にＦＥＲＭ  Ｐ―１２５５９として寄託されている。
【００２２】
本発明に使用される分泌シグナルに特に限定はなく、タンパク質を細胞外に分泌させることが出来る任意のシグナルを使用することが出来、例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーに属する成長因子の分泌シグナルが使用でき、特にＦＧＦ−４の分泌シグナルが好適に使用される。配列表の配列番号１にＦＧＦ−４の分泌シグナルのアミノ酸配列を、配列番号４に該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。ＦＧＦ−４をコードする遺伝子は既にクローニングされており、その分泌シグナルのアミノ酸配列、遺伝子配列は公知である〔ＴａｉｒａＭ．，ｅｔ  ａｌ．；プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ），第８４巻，第２９８０〜２９８４頁（１９８７）、ＢｏｖｉＰ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．；セル（Ｃｅｌｌ），第５０巻，第７２９〜７３７頁（１９８７）〕。
本発明の分泌シグナルをコードする遺伝子は、公知の方法で化学合成することが出来、また、培養細胞、組織より単離したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅することで得ることが出来る。
本発明の分泌シグナルは、本発明の細胞接着活性とＦＧＦ活性を有するポリペプチドに直接結合していても良く、またスペーサーを介して結合していても良い。
【００２３】
本発明の、分泌シグナルのアミノ酸配列、細胞接着活性を有するポリペプチドのアミノ酸及びＦＧＦ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド、或いは該ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に限定はないが、上記したＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）のＮ末端にＦＧＦ−４の分泌シグナルが付加したポリペプチドｓＣ―ＦＧＦ、ｓＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）及び該ｓＣ−ＦＧＦ、  ｓＣ−ＦＧＦ（Ｋ→Ｒ）をコードする遺伝子が好適に使用される。配列表の配列番号９にｓＣ−ＦＧＦのアミノ酸配列を、配列番号１０にｓＣ−ＦＧＦをコードする塩基配列を示す。
本発明の遺伝子、及びそれがコードするポリペプチドは、ＦＧＦ活性に加えて細胞接着活性を有し、生体内で発揮されるＦＧＦ活性、例えば血管新生作用が増強されている。
また、さらに分泌シグナルを付加することにより、細胞外への効率の良い分泌が可能となり、さらにその効果が発揮される。
【００２４】
本発明の遺伝子は、適当なプロモーターと連結し、その制御下で使用することが出来る。かかるプロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、α１ＡＴプロモーター、ｔｉｅプロモーター、ＡＦＰプロモーター、ＣＥＡプロモーター、ＰＳＡプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択すれば良い。
また、組織特異的プロモーターを使用することで、組織特異的な発現を行なうことが出来る。組織特異的なプロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、筋肉特異的プロモーターとして、α−アクチンプロモーター、γ−アクチンプロモーター、α−ミオシンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター等が挙げられ、血管特異的プロモーターとして、プレプロエンドセリン−１プロモーター、Ｅ−セレクチンプロモーター等が挙げられる。
【００２５】
本発明の遺伝子、ポリペプチドの管腔形成活性は、公知の方法によって測定することが出来、例えば、マトリゲル内におけるＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｃａｌ  ｃｅｌｌ、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）の管腔形成を指標に測定することが出来る〔Ｈｕｇｈｅｓ  Ｓ．Ｅ．；エクスペリメンタル  セル  リサーチ（Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．），第２５巻，第１７１〜１８５頁（１９９６）〕。
また、本発明の遺伝子、ポリペプチドの血管新生活性は、公知の方法によって測定することが出来、例えば、ニワトリ漿尿膜を用いたアッセイ方法〔Ａｕｓｐｒｕｎｋ  Ｄ．  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．；アメリカン  ジャーナル  オブ  パソロジー（Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．），第７９巻，第５８７〜６２８頁（１９７５）〕、ウサギ角膜を用いたアッセイ方法〔Ｇｉｍｂｒｏｎｅ  Ｍ．Ａ．  Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．；ジャーナル  オブ  ナショナル  キャンサー  インスティテューツ（Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．），第５２巻，第４１３〜４２７頁（１９７４）〕によって測定することが出来る。
【００２６】
本発明における医薬とは、本発明の遺伝子、ポリペプチドの有する薬理活性に基づいた疾患の治療剤、予防剤を言い、例えば、血管新生促進剤、動脈疾患治療剤、軟骨傷害治療剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明の遺伝子の細胞内への導入方法としては、公知の方法が使用され、ウイルスベクターによる導入方法、ウイルスベクターを使用しない導入方法の何れも本発明に使用でき、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択することができ、特にレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが好適に使用され、更に好適にはレトロウイルスベクターが使用される。
本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、特に限定はないが、例えば、ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７５４）、α−ＳＧＣベクター（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７５５）、ＬＸＳＮベクター（バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、第９８０〜９９０頁  （１９８９））、ｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）等が挙げれる。
ウイルスベクターを使用しない導入方法としては、特に限定はないが、例えば、Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法等が挙げられ、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
また、本発明の遺伝子は、Ｅｘ  ｖｉｖｏ法、Ｉｎ  ｖｉｖｏ法何れで投与しても良く、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
Ｅｘ  ｖｉｖｏ法で投与する場合は、常法に従って本発明の遺伝子の導入が望まれる細胞、例えば、造血幹細胞、リンパ球、血管内皮前駆細胞等を採取し、採取された細胞に本発明の遺伝子を上記した方法によって導入し、得られた細胞を生体内に戻すことにより本発明の遺伝子を投与することが出来る。
Ｉｎ  ｖｉｖｏ法で投与する場合、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内に投与、あるいは腎臓、肝臓、肺、脳、神経、心臓等の疾患の対象部位に直接投与することが出来る。製剤形態には、特に限定はないが、例えば注射溶剤とすることが出来る。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
実施例１：ＦＧＦ４分泌シグナルのクローニング及び、融合遺伝子の構築
１−１）ＦＧＦ４分泌シグナルをコードするＤＮＡの調製
ＦＧＦ４シグナルをコードするＤＮＡは以下のように、ヒトの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって調製した。鋳型として用いたヒトの染色体ＤＮＡは、ヒト由来２９３細胞由来より公知の方法によって調製したものを用いた。
このヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号１１で表される塩基配列のプライマーＦ４−２５１４及び配列表の配列番号１２に示される塩基配列のプライマーＦ４−２６６７を用いて１次ＰＣＲ反応を行い、ＦＧＦ―４のエクソン１の分泌シグナルを含む１５３ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲ反応はＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする３５サイクルの条件で行なった。
次に、このようにして得られた１次ＰＣＲ産物を鋳型として、配列表の配列番号１３で表される塩基配列のプライマーＦ４−２５４１Ｍ及び配列表の配列番号１４に示される塩基配列のプライマーＦ４−２６１６を用いて２次ＰＣＲ反応を行い、Ｎ末端側にＸｍａＩ部位を付加したＦＧＦ―４分泌シグナル配列を含む７５ｂｐを増幅した。ＰＣＲ反応はサイクル数を２５サイクルとした以外は１次ＰＣＲと同様の条件で行なった。
このようにして得られた２次ＰＣＲ断片をＴａＫａＲａ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＸｍａＩで切断し、ＦＧＦ―４分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片を得た。
【００２９】
１−２）Ｃ−ＦＧＦをコードするプラスミドＤＮＡの調製
Ｃ−ＦＧＦをコードするプラスミドｐＹＭＨ―ＣＦ・Ａ（特許第２８２９４０５号）を鋳型として、配列表の配列番号１６で表される塩基配列のプライマーＣＦＧＦ−１及び、配列表の配列番号１７で示されるプライマーＦＮＬ３を用いてＰＣＲを行ない、Ｎ末端側にＳｍａＩ部位が付加されたＣ−ＦＧＦの５’側領域をコードする８５８ｂｐの領域を増幅した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする２５サイクルの条件で行った。
このようにして得られた８５８ｂｐのＰＣＲ断片を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩにより切断し、その結果生じたＣ−ＦＧＦの５’側領域をコードする４３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
次にｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、その結果生じたＣ−ＦＧＦの３’側領域をコードする８９５ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
このようにして得られたＣ−ＦＧＦの５’側領域をコードする４３０ｂｐの断片及び３’側領域をコードする８９５ｂｐの断片を、制限酵素ＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させたプラスミドｐＵＣ１１９にＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入し、その結果得られたＣ−ＦＧＦ全長をコードするプラスミドをｐＵＣ１１９−ＣＦと命名した。
【００３０】
１−３）ＦＧＦ−４分泌シグナルを融合したＣ−ＦＧＦ（ｓＣ−ＦＧＦ）をコードするプラスミドＤＮＡの調製
１−２）で調製したプラスミドｐＵＣ１１９−ＣＦを鋳型として、配列表の配列番号１８で表されるプライマーＣＦ−２８９９及び、配列表の配列番号１９で示されるプライマーＣＦ−３３６６を用いてＰＣＲを行い、Ｃ−ＦＧＦの５’側の４６７ｂｐの領域を増幅した。ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする２５サイクルの条件で行った。このようにして得られたＰＣＲ断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＡｐａＬＩで切断し、開始コドンからＡｐａＬＩ部位までの３２２ｂｐのＣ−ＦＧＦをコードするＤＮＡ断片を得た。
次にプラスミドｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＡｐａＬＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、  Ｃ−ＦＧＦをコードする領域のＡｐａＬＩ部位から終始コドンまでの領域を含む９９９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
１−１）で調製したＦＧＦ４分泌シグナルをコードする７１ｂｐのＤＮＡ断片とＣ−ＦＧＦの開始コドンからＡｐａＬＩ部位までの３２２ｂｐのＤＮＡ断片及び、Ｃ−ＦＧＦのＡｐａＬＩ部位から終始コドンを含むＨｉｎｄＩＩＩ部位までの９９９ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＸｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩにより開裂させたプラスミドｐＵＣ１１９に挿入した。このようにして構築されたｓＣ−ＦＧＦをコードするプラスミドをｐＵＣ１１９−ｓＣＦと命名した。
【００３１】
１−４）ＦＧＦ−４分泌シグナルを融合したｂＦＧＦ（ｓｂＦＧＦ）をコードするプラスミドＤＮＡの調製
１−１）で調製したＦＧＦ４分泌シグナルをコードする１５３ｂｐの１ｓｔ  ＰＣＲ産物を鋳型として、配列表の配列番号１３で表されるプライマーＦ４−２５４１Ｍ及び、配列表の配列番号１５で示されるプライマーＦ４−２６２８Ｍを用いてＰＣＲを行い、５’側に制限酵素ＸｍａＩ部位及び、３’側に制限酵素ＮｃｏＩ部位を人為的に付加したＦＧＦ４分泌シグナルをコードする８７ｂｐの領域を増幅した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとする２５サイクルの条件で行った。
このようにして得られたＰＣＲ断片を制限酵素ＸｍａＩとＮｃｏＩにより切断し、その結果生じたＦＧＦ４分泌シグナルをコードする７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
次にプラスミドｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＸｍａＩとＮｃｏＩにより切断し、開始コドンからＮｃｏＩ部位までの８３８ｂｐを除去した後、ＦＧＦ４分泌シグナルをコードする７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて挿入した。このようにして得られたｓｂＦＧＦをコードするプラスミドをｐＵＣ１１９−ｓｂＦと命名した。
【００３２】
実施例２：動物細胞での発現ベクター構築
２−１）  ｓＣ−ＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にｓＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―３）で得られたｐＵＣ１１９−ｓＣＦを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、ｓＣ−ＦＧＦ遺伝子全長を含む１３９６ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたｓＣ−ＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦと命名した。
【００３３】
２−２）  Ｃ−ＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、Ｃ−ＦＧＦ遺伝子全長を含む１３３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたＣ−ＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦと命名した。
【００３４】
２−３）  ｂＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にｂＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＮｃｏＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ｂＦＧＦ遺伝子全長含む４８８ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたｂＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−ｂＦＧＦと命名した。
【００３５】
２−４）  ｓｂＦＧＦをコードする動物細胞発現プラスミドベクターの作製
哺乳類細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３（インビトロージェン社製）にｓｂＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―４）で得られたｐＵＣ１１９−ｓｂＦを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理した後、制限酵素ＫｐｎＩで切断し、ｓｂＦＧＦ遺伝子全長を含む５６１ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶにより開裂させたプラスミドｐｃＤＮＡ３に挿入した。このようにして構築されたｓｂＦＧＦをコードする動物発現プラスミドベクターをｐｃＤＮＡ−ｓｂＦＧＦと命名した。
【００３６】
２−５）  ｓＣ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターの作製
レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）にｓＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―３）で得られたｐＵＣ１１９−ｓＣＦを制限酵素ＳｍａＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ｓＣ−ＦＧＦ遺伝子全長含む１３９２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＨｐａＩにより開裂させたプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩに挿入した。このようにして構築されたｓＣ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターをｐＤＯＮ−ＡＩ−ｓＣ−ＦＧＦと命名した。
【００３７】
２−６）  Ｃ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターの作製
レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）にｓＣ−ＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＳｍａＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、Ｃ−ＦＧＦ遺伝子全長を含む１３２６ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＨｐａＩにより開裂させたプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩに挿入した。このようにして構築されたＣ−ＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターをｐＤＯＮ−ＡＩ−Ｃ−ＦＧＦと命名した。
【００３８】
２−７）  ｂＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターの作製
レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）にｂＦＧＦ遺伝子をクローニングした。
実施例１の１―２）で得られたｐＵＣ１１９−ＣＦを制限酵素ＮｃｏＩ及び、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ｂＦＧＦ遺伝子全長を含む４８８ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、ＨｐａＩにより開裂させたプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩに挿入した。このようにして構築されたｂＦＧＦをコードするレトロウイルスベクターをｐＤＯＮ−ＡＩ−ｂＦＧＦと命名した。
【００３９】
実施例３：動物細胞での発現実験
３−１）  動物細胞へのＤＮＡトランスフェクションによる一過性発現の検討
３−１−１）動物細胞を用いたタンパク質発現
実施例２で構築したプラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−ｂＦＧＦ及びｐｃＤＮＡ−ｓｂＦＧＦ各々５μｇをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて、１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で６ｃｍ径のプレートにセミコンフルエントに増殖させた２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入して１２時間後、新しい培地に交換し、５９時間培養した後、５ｍｌの血清未添加培地に交換し、２４時間培養した。その後、培養上清を集め、０．４５μｍのメンブランフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを培養上清試料とした。また、培養上清を回収した後の細胞を５ｍｌの血清未添加培地に浮遊させ、細胞破砕器により細胞膜及び核膜を破壊後、３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを細胞抽出液試料とした。各試料は−８０℃で保存した。
【００４０】
３−１−２）ウエスタンブロッティングによる発現タンパク質の検出
上記細胞抽出液１２μｌをＰＡＧＥＬ  １２．５％（アトー社製）を用いてＳＤＳゲル電気泳動によりタンパク分画し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ミリポア社製）に転写した。抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−２（アップステート  バイオテクノロジー社製）を一次抗体に、ＨＲＰ標識済抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（アマシャム  ファルマシア社製）を二次抗体として、化学発光基質Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ（ＮＥＮ社製）を用いて発現タンパク質を検出した。結果を図１に示す。（図１の各レーンの説明。ｖｅｃｔｏｒ：ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、ｓＣ−ＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―ｓＣ−ＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、Ｃ−ＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―Ｃ−ＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、ｓｂＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―ｓｂＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、ｂＦＧＦ：ｐｃＤＮＡ―ｂＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の抽出液、Ｃ−ＦＧＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＹＭＨ―ＣＦ・ＡでトランスフォームしたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の抽出液）ｐｃＤＮＡ３をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−２と反応するタンパク質は検出されず、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では４７．５ｋＤａのタンパク質の発現が、ｐｃＤＮＡ−ｂＦＧＦ、ｐｃＤＮＡ−ｓｂＦＧＦをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞では１８ｋＤのタンパク質の発現が検出された。
【００４１】
３―１―３）トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞抽出液中の各発現タンパク質量の定量
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞抽出液中の各発現タンパク質量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ  ｂａｓｉｃ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）により測定した（表１参照のこと）。
【００４２】
【表１】
2005052001.tif 000002
【００４３】
上清中に含まれる各発現タンパク質量を比較したところ、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦの培養上清におけるｓＣ−ＦＧＦはｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦの培養上清におけるＣ−ＦＧＦの２．５倍であった。更に各タンパク質の分布を検討すると、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦにおいては、培養上清に分泌されたＣ−ＦＧＦが細胞内に留まったＣ−ＦＧＦの８０分の１程度であった。一方、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦにおいては、培養上清に分泌されたｓＣ−ＦＧＦは細胞内に留まったｓＣ−ＦＧＦの半分であり、分泌シグナルが付加されることにより細胞外への分泌効率が４０倍近く向上したことが示された。
【００４４】
３−１−４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｓＣ−ＦＧＦとＣ−ＦＧＦの生物活性の検討
上記の細胞培養上清又は細胞抽出液２５０μｌで浮遊させた５×１０４個のＨＵＶＥＣ細胞を、２４ウエルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）上で固化したグロース・ファクター・レデュースド・マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン社製）に重層し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５〜６時間培養した。
その結果、コントロールのｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした細胞の培養上清、細胞抽出液では認められなかったＨＵＶＥＣの管腔形成が、ｐｃＤＮＡ−ｓＣ−ＦＧＦでトランスフェクトした細胞の培養上清、細胞抽出液、ｐｃＤＮＡ−Ｃ−ＦＧＦでトランスフェクトした細胞の培養上清、細胞抽出液では検出された。この管腔形成は内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２  Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ、バイオウイターカー社製）により検出されるものと同等であった。
このことは、導入された遺伝子から発現されたｓＣ−ＦＧＦおよびＣ−ＦＧＦが管腔形成活性を発揮することを示すものである。
【００４５】
３−２）レトロウイルスベクターをもちいたｓＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦ遺伝子の恒常発現細胞の作製
３−２−１）ｓＣ−ＦＧＦ−ＤＯＮ、Ｃ−ＦＧＦ−ＤＯＮ及びｂＦＧＦ−ＤＯＮレトロウイルス液の調製
実施例２に記載のｐＤＯＮ−ＡＩ−ｓＣ−ＦＧＦ、ｐＤＯＮ−ＡＩ−Ｃ−ＦＧＦ及びｐＤＯＮ−ＡＩ−ｂＦＧＦプラスミドをパッケージング細胞ＧＰ８６＋Ｅ細胞［ジャーナル  オブ  ウイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に遺伝子導入して作製したウイルスプロデューサー細胞を１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。上記プロデューサー細胞を１０ｃｍ径のプレートにセミコンフルエントに増殖させた後、培地を新しい培地５ｍｌに交換し、２４時間培養後、上清を０．４５μｍのメンブランフィルターでろ過したものをウイルス上清液とし、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４６】
３−２−２）ウイルス上清液の力価測定
ウイルス上清液の力価測定はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を使用して標準的な方法［ジャーナル  オブ  ウイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に従って測定した。６ウエルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の１ウエルあたり５×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、培地を除去し、各ウエルに系列希釈したウイルス上清液１ｍｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるよう加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養し、さらに培地１ｍｌを添加して１８時間培養した後、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地２ｍｌに交換し培養を続けた。３〜４日毎にＧ４１８含有培地を交換し、１３〜１４日後に生育したＧ４１８耐性コロニーを０．２％メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、そのコロニー数を計測した。計測されたコロニー数からウエル当たりの感染粒子数（ｃｆｕ／ｍｌ）を算出し、ウイルス力価とした。
ウイルス力価はｓＣ−ＦＧＦ−ＤＯＮ  ５．７×１０４  ｃｆｕ／ｍｌ、Ｃ−ＦＧＦ−ＤＯＮ  ５．９×１０３  ｃｆｕ／ｍｌ及びｂＦＧＦ−ＤＯＮ  ４．２×１０４  ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００４７】
３−２−３）レトロウイルスによる各種培養細胞へのｓＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦ遺伝子の導入
６ｃｍの組織培養用ディッシュに６×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、培地を除去し、新しい培地  １．１ｍｌと各ウイルス液  ９００μｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるよう加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養し、さらに培地２ｍｌを添加して１８時間培養した後、培地を８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含む培地４ｍｌに交換し培養を続けた。３〜４日毎にＧ４１８含有培地を交換し、Ｇ４１８耐性となった細胞をｓＣ−ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ及びｂＦＧＦ遺伝子の恒常発現細胞株（ｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３）とした。
【００４８】
３−２−４）ｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞における目的タンパク質の発現確認
１６チェンバースライド（ヌンク社製）にチェンバーあたり５×１０３個の各遺伝子導入細胞を含む細胞浮遊液２００μｌを添加し、２４時間培養した。培地を除去した後、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）を添加し、室温で３０分間放置し細胞を固定した。固定終了後、ＰＢＳ（−）により細胞を３回洗浄し、０．１％トライトンＸ−１００を加えたブロックエース（雪印乳業社製）を添加し、室温で３０分間放置、抗体の非特異的吸着を阻止した。一次抗体反応は抗ｂＦＧＦ抗体ｂＦＭ−２（アップステート  バイオテクノロジー社製）を１０μｇ／ｍｌとなるようにブロックエース（雪印乳業社製）で希釈した後、この抗体と細胞を室温で１時間反応させることで行なった。一次抗体反応後、ＰＢＳ（−）により細胞を３回洗浄し、二次抗体反応を行なった。二次抗体反応は、抗マウスイムノグロブリン・オレゴングリーン５１４標識済抗体（モレキュラー  プローブ社製）を２μｇ／ｍｌとなるようブロックエースで希釈した後、この抗体と細胞を室温で１時間反応させることによって行なった。反応終了後、ＰＢＳ（−）により細胞を３回洗浄し、少量の９０％グリセロールを滴下後カバーグラスを載せ、スライド試料とした。
スライド試料を蛍光顕微鏡で観察するとコントロールのＮＩＨ／３Ｔ３細胞を除いてｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞のほとんどが標識抗体による蛍光を発し、レトロウイルスによる目的遺伝子の導入及び発現は良好であった。ｂＦＧＦは論文報告〔Ｐｏｗｅｌｌ  Ｐ．Ｐ．，ｅｔａｌ．；ジャーナル  オブ  セル  フィジオロジー（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．），第１４８巻，第２０２〜２１０頁（１９９１）〕にあるように核に集積した像を示した。Ｃ−ＦＧＦも同様に核に集積しており、細胞外への分泌は少ないことが推測された。これらに対してｓＣ−ＦＧＦは核にほとんど認められず、細胞質に局在することがわかった。即ち、ｓＣ−ＦＧＦは、付加した分泌シグナルによる細胞内輸送機構を介して、細胞膜外へ分泌されていると考えられた。
【００４９】
３−２−５）ｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞の培養上清と細胞抽出液に含まれる発現タンパク質の定量
１０ｃｍの組織培養用ディッシュにｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３及びｂＦＧＦ／３Ｔ３細胞をコンフルエントに増殖させた後、培地を１０％ウシ胎仔血清（バイオウイターカー社製）及び５０単位／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）と５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）５ｍｌに交換し、２４時間培養した。その後、培養上清を集め、０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを培養上清試料とした。また細胞を５ｍｌの同ＤＭＥＭ培地で集め、細胞破砕器により細胞膜及び核膜を破壊後、３０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過したものを細胞抽出液試料とした。
各発現タンパク質量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ  ｂａｓｉｃ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）により測定した（表２参照のこと）。
【００５０】
【表２】
2005052001.tif 000003
【００５１】
ＥＬＩＳＡの結果、培養上清中にはｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３においてのみ発現タンパク質が検出され、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３とｂＦＧＦ／３Ｔ３では検出されなかった。一方、細胞抽出液ではｓＣ−ＦＧＦ／３Ｔ３では発現タンパク質が検出されず、Ｃ−ＦＧＦ／３Ｔ３とｂＦＧＦ／３Ｔ３で多量の発現タンパク質が認められた。これらの細胞株については、３−２−４）の項で各々タンパク質の発現を確認しており、遺伝子導入の不良ではないことを示している。これらの結果からＣ−ＦＧＦ遺伝子に分泌シグナルを付加することにより、細胞内で産生されたｓＣ−ＦＧＦタンパク質は核に蓄積することなく、効率よく細胞外に分泌されることが示された。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によって、血管新生に有用な新たなポリペプチド、遺伝子、及び該遺伝子からなる医薬が提供された。
本発明は、従来よりも優れた血管新生促進作用を有する遺伝子治療剤を提供するものであり、血管新生促成、動脈疾患治療、軟骨傷害治療等に対して優れた効果を示す遺伝子治療を可能とするものである。
【００５３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１  Ｃ２７７のアミノ酸配列
配列番号２  Ｃ２７７をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３  ｂＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号４  ｂＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号５  Ｃ−ＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号６  Ｃ−ＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号７  ＦＧＦ−４分泌シグナルのアミノ酸配列
配列番号８  ＦＧＦ−４分泌シグナルをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号９  ｓＣ−ＦＧＦのアミノ酸配列
配列番号１０  ｓＣ−ＦＧＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１  ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  Ｆ４―２５１４
配列番号１２  ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  Ｆ４―２６６７
配列番号１３  ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  Ｆ４―２５１４Ｍ
配列番号１４  ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  Ｆ４―２６１６
配列番号１５  ＦＧＦ−４分泌シグナル遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  Ｆ４−２６２８Ｍ
配列番号１６  Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  ＣＦＧＦ―１
配列番号１７  Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  ＦＮＬ３
配列番号１８  Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  ＣＦ―２８９９
配列番号１９  Ｃ−ＦＧＦ遺伝子増幅用ＰＣＲプライマー  ＣＦ―３３６６
【００５４】
【配列表】
2005052001.tif 000004
【００５５】
2005052001.tif 000005
2005052001.tif 000006
【００５６】
2005052001.tif 000007
【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２９３Ｔ細胞で一過性発現させた各タンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図１】
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