(57)【要約】      （修正有）【課題】インターロイキン−１８の立体構造を解析することにより、新薬候補物質のスクリーニングなどに利用できるようにすること。また、インターロイキン−１８の生物学的活性を変化させた変異体を提供すること。【解決手段】インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩。特定のアミノ酸残基から選択される３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるインターロイキン−１８変異体タンパク質、該アミノ酸残基群に含まれるアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性が野生型インターロイキン−１８タンパク質よりも低いあるいは高いインターロイキン−１８変異体タンパク質【選択図】  図５
2005052021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、１３番目のアルギニン、１７番目のアスパラギン酸、３３番目のメチオニン、３５番目のアスパラギン酸及び１３２番目のアスパラギン酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のフェニルアラニン、４番目のリシン、５番目のロイシン、８番目のリシン、５８番目のアルギニン、６０番目のメチオニン及び１０４番目のアルギニンからなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のリシン、８４番目のリシン及び９８番目のアスパラギン酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるインターロイキン−１８変異体タンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、第１〜３のアミノ酸残基群に含まれるアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性が配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質よりも低いあるいは高いインターロイキン−１８変異体タンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項２記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からインターロイキン−１８変異体タンパク質を採取することを含むインターロイキン−１８変異体タンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩からなるインターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニスト。
【請求項７】
請求項１記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項１記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
【請求項９】
表Ａ及び／又は表Ｂに示す３次元構造座標の全部又は一部を使用して、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質又は請求項１記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質のアミノ酸配列において、１３番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、３３番目のアミノ酸、３５番目のアミノ酸及び１３２番目のアミノ酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のアミノ酸、４番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、５８番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸及び１０４番目のアミノ酸からなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のアミノ酸、８４番目のアミノ酸及び９８番目のアミノ酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と被験物質との相互作用を調べることを含む、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質を探索する方法。
【請求項１１】
配列番号１８の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン−１８変異体タンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロンγ誘導因子と呼ばれていたサイトカインであるインターロイキン１８  （ＩＬ−１８）は、ＩＦＮ−γ産生の増強、ナチュラルキラー細胞に対するＦａｓ媒介細胞傷害性、およびヘルパーＴリンパ球タイプ１の発生調節を含む多面発現性の免疫調節機能を有する（非特許文献１〜３）。
【０００３】
ＩＦＮ−γ産生という点でＩＬ−１２に機能的に類似しているＩＬ−１８は、重篤な炎症性疾患に関連している。ＩＬ−１８の異常発現は、自己免疫疾患、アレルギーまたは神経障害等の重篤な炎症性疾患に関連していると推論されている（非特許文献２〜４）。ＩＬ−１８を用いたマウスにおける腫瘍抑制等の治療的アプローチの成功が報告されている（非特許文献５）。ＩＬ−１８の生体内における機能は、ＩＬ−１２の機能と密接に関連している。したがって、ＩＬ−１８欠損マウスはＩＬ−１２欠損マウスの表現型に類似した表現型を示す。しかし、ＩＬ−１８およびその受容体は、ＩＬ−１２およびその受容体に対してそれぞれ構造的類似性を全く示さない（非特許文献２及び３）。対照的に、ＩＦＮ−γ産生という点で重要な機能的類似性を欠くにも関わらず、ＩＬ−１βとＩＬ−１８は中程度の配列類似性（１７％同一性）を示す。さらに、ＩＬ−１８およびＩＬ−１のポリペプチドプロセシング機構は共通の特徴、すなわち、両方とも前駆体のカスペース１開裂が成熟のために必須であるという特徴を共有する（非特許文献２及び３）。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８両者の受容体は、ＩＬ−１受容体ファミリーに属する。したがって、これらのサイトカインに応答するための細胞内シグナル伝達経路は、ＴＲＡＦ６およびＮＦ−κＢ２，３等の同一の下流メディエーターを共有する。これらの受容体の活性化のためには、２つの構造的に関連しているが別個の免疫グロブリン様鎖のヘテロ二量体化が必要とされる；ＩＬ−１８経路の開始にはＩＬ−１８受容体α（ＩＬ−１８Ｒα；以前にはＩＬ−１Ｒｒｐ１と呼ばれていた）および受容体β（ＩＬ−１８Ｒβ；  以前にはＩＬ−１ＡｃＰＬと呼ばれていた）が必要とされ（非特許文献２及び３）、ＩＬ−１経路の開始にはＩＬ−１受容体  Ｉ型  （ＩＬ−１ＲＩ）およびＩＬ−１アクセサリータンパク質  （ＩＬ−１ＡｃＰ）が必要とされる。ＩＬ−１とＩＬ−１ＲＩとの相互作用は、それらの複合体の結晶構造によって解明された（非特許文献６及び７）。しかし、ＩＬ−１によるＩＬ−１ＡｃＰの認識、およびそれゆえＩＬ−１経路の活性化機構は、いまだに不明である（非特許文献２及び３）。
【０００４】
また、インターロイキン１８の立体構造に関する報告はない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｏｋａｍｕｒａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７８，  ８８−９１  （１９９５）
【０００６】
【非特許文献２】
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  ＣＡ．  Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １１，  ４８３−６  （２０００）
【０００７】
【非特許文献３】
Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｔｓｕｔｓｕｉ  Ｈ．  ＆  Ｏｋａｍｕｒａ，  Ｈ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．  １２，  ５３−７２．  （２００１）
【０００８】
【非特許文献４】
Ｋｏｎｉｓｈｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９９：１１３４０−５．  （２００２）
【０００９】
【非特許文献５】
Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：４４６７−４４７４．  （２００２）
【００１０】
【非特許文献６】
Ｖｉｇｅｒｓ，  Ｇ．Ｐ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｃａｆｆｅｓ，  Ｐ．  ＆  Ｂｒａｎｄｈｕｂｅｒ，  Ｂ．Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８６，  １９０−１９４  （１９９７）
【００１１】
【非特許文献７】
Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８６，  １９４−２００  （１９９７）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、インターロイキン−１８の立体構造を解析することにより、インターロイキン−１８の生物学的活性（すなわち、ＩＬ−１８の受容体活性化）に対する理解を深め、新薬候補物質のスクリーニングなどに利用できるようにすることを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、インターロイキン−１８の生物学的活性を変化させた変異体を得ることを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＩＬ−１８の受容体活性化機構を理解するための第１のステップとして、ＩＬ−１８の溶液構造を決定した。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１のβトレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ、三つ葉形）構造に類似した構造に折り畳まれている。広範囲にわたる突然変異誘発は、受容体活性化にとって重要な３つの部位が存在することを明らかにした。そのうち２つは、ＩＬ−１８Ｒαの結合部位として機能し、ＩＬ−１のＩＬ−１ＲＩ結合部位に類似した場所に位置している。他方、第３の部位はＩＬ−１８β結合に関与している。これらの構造および突然変異誘発データは、ＩＬ−１８によって誘導される、受容体活性化に必要な受容体サブユニットのヘテロ二量体化を理解するための基礎を提供する。本発明は、これらの知見により、完成された。
【００１５】
本発明の要旨は以下の通りである。
［１］  以下の（ａ）又は（ｂ）のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、１３番目のアルギニン、１７番目のアスパラギン酸、３３番目のメチオニン、３５番目のアスパラギン酸及び１３２番目のアスパラギン酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のフェニルアラニン、４番目のリシン、５番目のロイシン、８番目のリシン、５８番目のアルギニン、６０番目のメチオニン及び１０４番目のアルギニンからなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のリシン、８４番目のリシン及び９８番目のアスパラギン酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるインターロイキン−１８変異体タンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、第１〜３のアミノ酸残基群に含まれるアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性が配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質よりも低いあるいは高いインターロイキン−１８変異体タンパク質
［２］  ［１］記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
［３］  ［２］記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
［４］  ［３］記載の組換えベクターを含む形質転換体。
［５］  ［２］記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からインターロイキン−１８変異体タンパク質を採取することを含むインターロイキン−１８変異体タンパク質の製造方法。
［６］  ［１］記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩からなるインターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニスト。
［７］  ［１］記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物。
［８］  ［１］記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
［９］  表Ａ及び／又は表Ｂに示す３次元構造座標の全部又は一部を使用して、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質をスクリーニングする方法。
［１０］  配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質又は請求項１記載のインターロイキン−１８変異体タンパク質のアミノ酸配列において、１３番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、３３番目のアミノ酸、３５番目のアミノ酸及び１３２番目のアミノ酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のアミノ酸、４番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、５８番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸及び１０４番目のアミノ酸からなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のアミノ酸、８４番目のアミノ酸及び９８番目のアミノ酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と被験物質との相互作用を調べることを含む、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質を探索する方法。
［１１］  配列番号１８の塩基配列で表されるＤＮＡ。
【００１６】
本明細書において、「変異体タンパク質」とは、基準となるタンパク質と異なるが、基準となるタンパク質の不可欠な性質を保持しているタンパク質を意味する。典型的な変異体タンパク質は、基準となるタンパク質とアミノ酸配列が相違する。
【００１７】
「インターロイキン−１８タンパク質」とは、一般に、配列番号１のアミノ酸配列からなるインターロイキン−１８タンパク質（野生型）及びその変異体タンパク質を意味する。
【００１８】
「インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性」とは、インターロイキン−１８タンパク質の代謝的または生理学的機能を意味し、これには、ＩＦＮ−γ産生の増強活性、ナチュラルキラー細胞に対するＦａｓ媒介細胞傷害性、ヘルパーＴリンパ球タイプ１の発生調節を含む多面発現性の免疫調節機能の他、抗原としての活性、免疫原としての活性なども含まれる。
【００１９】
「アンタゴニスト」とは、生物学的活性を有する物質の活性を減少ないし消失させる物質をいう。
【００２０】
「抗体」とは、抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に誘導されるタンパク質で、免疫原（抗原）と特異的に結合する活性を有するものを意味し、これには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらには、Ｆａｂ又はＦａｂフラグメントなどが含まれる。
【００２１】
「スクリーニング」とは、目的とする物質を選択することを意味し、これには、目的とする物質の同定、検索、評価、設計などが含まれる。
【００２２】
「相互作用」とは、２つ以上の物体（例えば、原子、分子）の間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用などを例示することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
１．インターロイキン−１８変異体タンパク質
本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩を提供する。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列において、１３番目のアルギニン、１７番目のアスパラギン酸、３３番目のメチオニン、３５番目のアスパラギン酸及び１３２番目のアスパラギン酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のフェニルアラニン、４番目のリシン、５番目のロイシン、８番目のリシン、５８番目のアルギニン、６０番目のメチオニン及び１０４番目のアルギニンからなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のリシン、８４番目のリシン及び９８番目のアスパラギン酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるインターロイキン−１８変異体タンパク質
（ｂ）（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、第１〜３のアミノ酸残基群に含まれるアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性が配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質よりも低いあるいは高いインターロイキン−１８変異体タンパク質
（ａ）のインターロイキン−１８変異体タンパク質としては、配列番号１のアミノ酸配列において、１３番目のアルギニン、１７番目のアスパラギン酸、３３番目のメチオニン、３５番目のアスパラギン酸、１３２番目のアスパラギン酸、２番目のフェニルアラニン、４番目のリシン、５番目のロイシン、８番目のリシン、５８番目のアルギニン、６０番目のメチオニン、１０４番目のアルギニン、７９番目のリシン、８４番目のリシン及び９８番目のアスパラギン酸のうちの少なくとも１つのアミノ酸がアラニン、バリン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、ヒスチジン又はグルタミン酸のいずれかに置換されたものを例示することができる。
（ｂ）のインターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性が野生型インターロイキン−１８タンパク質よりも低いインターロイキン−１８変異体タンパク質は、インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストとして利用することができる。インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストは、インターロイキン−１８タンパク質に起因する疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、神経障害など）の予防及び／又は治療に用いることができる。
（ｂ）のインターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性が野生型インターロイキン−１８タンパク質より高いインターロイキン−１８変異体タンパク質は、インターロイキン−１８タンパク質のアゴニストとして利用することができる。「アゴニスト」とは、ある物質がその受容体に示す親和性及び／又は生物学的活性と同質のものを有する物質をいう。インターロイキン−１８タンパク質のアゴニストは、インターロイキン−１８タンパク質の投与により症状の改善が見られる疾患（例えば、Ｃ型肝炎、腫瘍など）の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００２４】
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質の塩としては、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。
【００２５】
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質及びその塩は、公知の方法によって製造することができる。例えば、後述の２に記載のようにしてインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、インターロイキン−１８変異体タンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、丸善株式会社  ：  原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００２６】
あるいはまた、本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質及びその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００２７】
２．インターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡ
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号３〜１７の塩基配列のいずれかで表されるＤＮＡを例示することができる。
【００２８】
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。
【００２９】
健常なヒトの血液からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。成熟ｈＩＬ−１８のコード領域（１５７残基）をＰＣＲによって増幅する。得られたＰＣＲ産物が野生型ｈＩＬ−１８タンパク質をコードするＤＮＡである。野生型ｈＩＬ−１８タンパク質をコードするＤＮＡのアミノ酸配列および塩基配列の一例をそれぞれ配列番号１および２に示す。
【００３０】
ｈＩＬ−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、成熟ｈＩＬ−１８のコード領域（１５７残基）を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させた成熟ｈＩＬ−１８のコード領域（１５７残基）をＰＣＲによって増幅する。得られたＰＣＲ産物がｈＩＬ−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡである。ｈＩＬ−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の例を配列番号３〜１７に示す。配列番号３〜１７の塩基配列を有するＤＮＡは、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列において、２番目のフェニルアラニン、４番目のリシン、５番目のロイシン、８番目のリシン、１３番目のアルギニン、１７番目のアスパラギン酸、３３番目のメチオニン、３５番目のアスパラギン酸、５８番目のアルギニン、６０番目のメチオニン、７９番目のリシン、８４番目のリシン、９８番目のアスパラギン酸、１０４番目のアルギニン及び１３２番目のアスパラギン酸がアラニンに置換されているアミノ酸配列からなるインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードする。上記のｈＩＬ−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、野生型ｈＩＬ−１８遺伝子をもとに作製したものであるが、野生型ｈＩＬ−１８遺伝子の代わりに、最適化ｃＤＮＡを設計・合成し、これをもとにインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡを作製することもできる。最適化ｃＤＮＡの配列の一例を配列番号１８に示す。この最適化ｃＤＮＡを用いることにより、インターロイキン−１８タンパク質の発現・生産が大幅に改善される（５倍以上）ことが確認されている。
【００３１】
３．組換えベクター
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９に記載の方法）により、本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
【００３２】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【００３３】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを付加してもよい。
【００３４】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、ｐＧＥＸシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、ｐＥＴ  ＣＢＤ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３４ｂ−３８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＥＴ  Ｄｓｂ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３９ｂ  ａｎｄ  ４０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＥＴ  ＧＳＴ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４１  ａｎｄ  ４２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などを例示することができる。
【００３５】
４．形質転換体
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
【００３６】
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞、Ｓｆ細胞など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００３７】
組換えベクターを宿主に導入するには、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【００３８】
形質転換体を培地で培養し、培養物からインターロイキン−１８変異体タンパク質を採取することができる。インターロイキン−１８変異体タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からインターロイキン−１８変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。インターロイキン−１８変異体タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からインターロイキン−１８変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。
【００３９】
インターロイキン−１８変異体タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、因子Ｘａや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするインターロイキン−１８変異体タンパク質を得ることができる。
【００４０】
インターロイキン−１８変異体タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００４１】
５．インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストとしての利用
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質のうち、野生型インターロイキン−１８タンパク質と比較して、インターフェロンγ誘導活性が低く、かつ、インターロイキン−１８受容体のαサブユニット（ＩＬ−１８Ｒα）に対する結合活性が低くないものは、インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストとして利用できる。インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストは、インターロイキン−１８タンパク質に起因する疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、神経障害など）の予防及び／又は治療に用いることができる。現在までのところ、インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストとして利用可能な物質が見つかっていないので、本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質の産業的な利用価値は高い。
【００４２】
６．医薬組成物
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質及びその塩は、インターロイキン−１８タンパク質に起因する疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、神経障害など）あるいはインターロイキン−１８タンパク質の投与により症状の改善が見られる疾患（例えば、Ｃ型肝炎、腫瘍など）の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００４３】
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩は単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の過剰な免疫応答（例えば、花粉症）の予防・治療のために使用する場合には、インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩を１回量として通常０．１〜１０．０  μｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは１．０  μｇ／ｋｇ体重程度を、１週間に３回程度の頻度で、好ましくは２日に１回程度の頻度で、静脈注射により投与（好ましくは、連続または隔日投与）するとよい。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。
【００４４】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
【００４５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわちインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
【００４６】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられ、それぞれの投薬単位剤形当り通常０．１２５〜１．０００  ｍｇ、特に注射剤では０．１２５〜１．０００  ｍｇ、その他の剤形では０．１２５〜１．０００  ｍｇのインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩が含有されていることが好ましい。
【００４７】
また、上記の医薬組成物は、インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の有効成分を含有してもよい。
【００４８】
７．抗体
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩の検出及び／又は定量に利用することができる。
【００４９】
本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩またはそのエピトープを含む断片を動物に投与することにより得られる。
【００５０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。
【００５１】
ポリクローナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、動物に投与（免疫）を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。
【００５２】
モノクローナル抗体は、Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）  ２５６：  ４９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８０）  ２０８：  ６９２−に記載されている、Ｇ．  Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＣ．  Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞を調製する。さらに、インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩と特異的に反応するが、他の抗原タンパク質とは実質的に交差反応しない抗体を産生する細胞系を単離するとよい。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５３】
一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。
【００５４】
ヒト化抗体を作製する技法は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  １１２１−，  １９９２；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  １６９−，  １９９２に記載されている。
【００５５】
８．スクリーニング法
本発明は、野生型インターロイキン１８の３次元構造座標を提供する。野生型インターロイキン１８の３次元構造座標は表Ａ及び表Ｂに示される。表Ａ及び／又は表Ｂに示す３次元構造座標の全部又は一部を使用して、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質をスクリーニングすることができる。
【００５６】
インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質は、天然物又は合成品のいずれであってもよく、高分子化合物又は低分子化合物のいずれであってもよい。
【００５７】
インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質は、インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性を調節しうる。インターロイキン−１８タンパク質と結合することにより、インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性を減少ないし消失させる物質は、インターロイキン−１８タンパク質に起因する疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、神経障害など）の予防及び／又は治療に用いることができる。インターロイキン−１８タンパク質と結合することにより、インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性を維持ないし向上させる物質は、インターロイキン−１８タンパク質の投与により症状の改善が見られる疾患（例えば、Ｃ型肝炎、腫瘍など）の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００５８】
例えば、表Ａ及び／又は表Ｂに示す３次元構造座標の全部又は一部を利用して、コンピュータにより、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質を同定、検索、評価又は設計することができる。
【００５９】
スクリーニングに用いるコンピュータは特に限定されるものではなく、スクリーニングのプログラムが動作するものであればよい。
【００６０】
スクリーニングのプログラムとしては、ＤＯＣＫ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９２，  ２５７，  １０７８）、Ｇｏｌｄ４、  Ｇｌｉｄｅ、ＦｌｅｘＸ（Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ２６１，  ４７０）、ＡｕｔｏＤｏｃｋ（Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  １９，  １６３９）、ＩＣＭ（Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９４，  １５，  ４８８）、Ｌｕｄｉなどを例示することができる。
【００６１】
スクリーニングにより選択されたインターロイキン−１８タンパク質と結合する物質は、その物質の種類に応じて、公知の手法で製造するとよい。
【００６２】
次いで、生物学的活性（例えば、インターフェロンγ誘導活性など）、インターロイキン−１８タンパク質の受容体との相互作用（例えば、ＩＬ−１８Ｒαに対する解離定数）を調べるとよい。インターフェロンγ誘導活性及びＩＬ−１８Ｒαに対する解離定数を調べる方法は後述の実施例に記載されている。
【００６３】
９．インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質の探索法
配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質又は本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質のアミノ酸配列において、１３番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、３３番目のアミノ酸、３５番目のアミノ酸及び１３２番目のアミノ酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のアミノ酸、４番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、５８番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸及び１０４番目のアミノ酸からなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のアミノ酸、８４番目のアミノ酸及び９８番目のアミノ酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と被験物質との相互作用を調べることにより、インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質を探索することができる。
【００６４】
被験物質は、天然物又は合成品のいずれであってもよく、高分子化合物又は低分子化合物のいずれであってもよい。
【００６５】
インターロイキン−１８タンパク質と結合する物質は、インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性を調節しうる。インターロイキン−１８タンパク質と結合することにより、インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性を減少ないし消失させる物質は、インターロイキン−１８タンパク質に起因する疾患（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、神経障害など）の予防及び／又は治療に用いることができる。インターロイキン−１８タンパク質と結合することにより、インターロイキン−１８タンパク質の生物学的活性を維持ないし向上させる物質は、インターロイキン−１８タンパク質の投与により症状の改善が見られる疾患（例えば、Ｃ型肝炎、腫瘍など）の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００６６】
野生型インターロイキン−１８タンパク質又は本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質のアミノ酸配列における上記部位のアミノ酸残基と被験物質との相互作用は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、中性子回折などの立体構造解析、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などの複合体の形状を観察する方法、表Ａ及び／又は表Ｂに示すインターロイキン−１８タンパク質の立体構造（あるいは、公知の立体構造でもよい）に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシュミレートするドッキングスタディなどの手法などを用いることができる。
【００６７】
例えば、ＮＭＲシグナルを指標として、以下の（１）〜（４）の手順でインターロイキン−１８タンパク質と結合する物質を探索することができる。
（１）配列番号１のアミノ酸からなる野生型インターロイキン−１８タンパク質若しくはその断片又は本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質若しくはその断片のアミノ酸配列中の１３番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、３３番目のアミノ酸、３５番目のアミノ酸及び１３２番目のアミノ酸からなる第１のアミノ酸残基群、２番目のアミノ酸、４番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、５８番目のアミノ酸、６０番目のアミノ酸及び１０４番目のアミノ酸からなる第２のアミノ酸残基群、ならびに７９番目のアミノ酸、８４番目のアミノ酸及び９８番目のアミノ酸からなる第３のアミノ酸残基群からなる３つのアミノ酸残基群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をＮＭＲ観測可能な同位体（例えば、１３Ｃ、１５Ｎなど）で標識したものを用意する。
（２）（１）で用意した標識タンパク質又はその断片のＮＭＲシグナルを得る。（３）被験物質を（１）で用意した標識タンパク質又はその断片と接触させてから、ＮＭＲシグナルを得る。
（４）（２）で得られたＮＭＲシグナルと（３）で得られたＮＭＲシグナルの違いに基づいて、被験物質とインターロイキン−１８タンパク質との相互作用を評価する。
【００６８】
あるいはまた、野生型インターロイキン−１８タンパク質又は本発明のインターロイキン−１８変異体タンパク質のアミノ酸配列における上記部位のアミノ酸残基と相互作用する物質（化合物）を、化学構造のデータベース（例えば、”Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ”，  ”ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔなど）から選択することができる。この場合、本発明の野生型インターロイキン−１８タンパク質の３次元構造座標またはその一部を利用する。その立体構造において、インターロイキン−１８タンパク質と結合できる点を、１または２以上の官能基との相互作用の有利性に関して特徴化する。次いで、この特徴化に基づいてインターロイキン−１８タンパク質と有利な相互作用をしうる１または２以上の官能基を含む候補化合物を探すため、化学構造のデータベースを探索する。インターロイキン−１８タンパク質の立体構造との有利な相互作用の点に最もよく適合する構造を持つ化合物がこうして同定される。このような探索は、ＤＯＣＫ（Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８６）  ２９，  ２１４９−２１５３）、ＳＹＢＹＬ（トライポス社）などのソフトウェアを用いて、コンピュータ上で行うことができる。
【００６９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
［実施例１］
大腸菌を用いてヒトインターロイキン１８  （ｈＩＬ−１８）を発現させ、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって精製した。栄養培地および最小培地における収量はそれぞれ１．１  ｍｇ／Ｌおよび０．８  ｍｇ／Ｌであった。
【００７１】
材料および方法
大腸菌中でｈＩＬ−１８を発現するプラスミドの構築
健常なボランティアから得た血液サンプルからｍＲＮＡを抽出し、そして逆転写酵素（ＭＭＬＶ）およびオリゴｄＴプライマーを用いて７２℃で６０分間ｃＤＮＡを合成した。成熟ｈＩＬ−１８のコード領域（１５７残基）をＰＣＲによって増幅し、増幅された断片をＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。ＢａｍＨＩ制限部位および因子Ｘａ開裂部位を成熟ｈＩＬ−１８配列の直前に、そしてＥｃｏＲＩ制限部位を終止コドンの後に挿入するためのプライマーを設計した。得られた増幅産物を再度Ｔベクター中にクローン化し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、次に電気泳動によって精製した。精製産物をｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にサブクローン化し、このクローンのＤＮＡ配列を両方向配列決定によって確認した。このクローンをｐＧＥＸ−４Ｔ−Ｘａ−ｈＩＬ−１８と名づけた（図１）。
【００７２】
発現
ＢＬ−２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者の指示にしたがってｐＧＥＸ−４Ｔ−Ｘａ−ｈＩＬ−１８によって形質転換した。以下に記述するようにタンパク質を発現させた。すなわち、形質転換された各コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５  ｍｌのＬＢ培地（培地１リットルあたりトリプトン１０  ｇ、酵母抽出物５  ｇおよびＮａＣｌ  １０  ｇ）中で培養し、６００  ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．５に達するまで３７℃で振とうした。次に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１  ｍＭで添加することよってタンパク質産生を誘導した。ＩＰＴＧを添加する前に、各培養物の１  ｍｌを別の滅菌試験管に移し、次のステップまで別々にインキュベートした。タンパク質を３時間誘導した後、各培養物の２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析用のサンプルとして用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定された最も高い発現レベルを有するコロニーを選択した。そして、インキュベートしておいた、ＩＰＴＧで処理していない１  ｍｌの培養物を次の一晩培養のための種子として用いた。５００  ｍｌのフラスコに入れた１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２００  ｍｌのＬＢ培地を用いて、３７℃で、１００  ｒｐｍで振とうしながら一晩（約１２時間）培養を実施した。得られた培地を５，０００  ｇで１０分間遠心にかけ、大腸菌ペレットを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２  ＬのＬＢ培地中に移した。この培養物を３７℃で、ＯＤ６００が０．４５に達するまでインキュベートし、氷水浴中で２５℃まで冷却した。ＯＤ６００が０．５に達した時、ＩＰＴＧ（最終濃度  １  ｍＭ）を培地に添加した。培養物を２５℃で、１００  ｒｐｍで振とうしながら、５時間インキュベートした。得られた培養物を５，０００  ｇで１０分間遠心にかけ、大腸菌ペレットを精製に用いるまで−８０℃で保存した。
【００７３】
精製
上記の細菌細胞ペレットを、該ペレット１グラムあたり１  ｍＭのＰｅｆａＢｌｏｃ  （Ｒｏｃｈｅ）を含有する１０  ｍｌの溶菌バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  ４００  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール  （２−ＭＥ），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）  に再懸濁した。融解した細胞を氷水浴中で１０分間超音波処理する（１０秒間処理し５０秒間間隔を置くサイクルで）ことによって完全に溶菌し、次に３００，０００  ｇで３０分間４℃で遠心した。透明な溶菌液を０．４５μｍフィルターおよび０．２μｍフィルター  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、濾液をＧＳＴアフィニティーカラム（床容量：１０  ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。次に、２００  ｍｌの溶菌バッファー、１０  ｍｌの洗浄１バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  ４００  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  ２−ＭＥ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）、１００  ｍｌの溶菌バッファー、１０  ｍｌ  の洗浄２バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  １Ｍ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  ２−ＭＥ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ）、および１００  ｍｌ  の溶菌バッファーを用いてカラムを洗浄した。１０  ｍｌの溶出バッファー  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  １０  ｍＭ  グルタチオン（ＧＳＨ））  を上記ＧＳＴカラムと共に１０分間インキュベートした後、ゆっくり溶出させた。この手順を５回繰り返した。回収した溶出液中のタンパク質の量を測定し、タンパク質含有画分をＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ−３０  （Ａｍｉｃｏｎ）を用いた遠心（３，０００  ｇ、４℃）により溶液量が１  ｍｌ未満になるまで濃縮した。高塩バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  １．５  Ｍ  ＮａＣｌ）および１００  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０）  をそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）  および  １％（ｖ／ｖ）の割合で濃縮タンパク質溶液に添加した。ヒト因子Ｘａ  （Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ）をタンパク質の最終重量に対して１％  （ｗ／ｗ）の割合で添加し、４℃で１２時間インキュベートしてＧＳＴ融合タンパク質を開裂した。製造者の指示にしたがって計算したところ、この融合タンパク質の量はＯ．Ｄ．２８０で０．５  ｍｇ／ｍｌであった。開裂したタンパク質を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ２６／６０  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  およびゲル濾過バッファー（５０  ｍＭ  リン酸，  ｐＨ  ６．０，  １５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  ２−ＭＥ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いてゲル濾過した。所望の画分を回収し、ＰｅｆａＢｌｏｃ（最終濃度１  ｍＭ）と混合し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０  （Ａｍｉｃｏｎ）  を用いた遠心（６，０００  ｇ、４℃）により容量が約３００μｌになるまで濃縮し、そしてさらなる実験に用いるまで４℃で保存した。ｈＩＬ−１８の吸光度定数（６１６０）を用いて、精製ｈＩＬ−１８タンパク質の濃度を推定した。
【００７４】
最小培地における発現
最小培地における発現は、以下の組成物を用いて実施した：０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）；  ９  ｍＭ  ＣａＣ１２，  １００  ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ５  ｍＭ  ＦｅＣｌ３  および  １５  ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる２価カチオン；  １０  ｍＭ  ＣｕＳＯ４，  ８０  ｍＭ  塩化マンガンおよび  １０  ｍＭ  硫酸亜鉛；  １．５  ｍｇ／ｍｌ塩酸チアミン、および１００  ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン。唯一の窒素源および炭素源として、塩化アンモニウム（１．９  ｍＭ）および０．２５％グルコースをそれぞれ添加した。水およびリン酸バッファーを最初にオートクレーブで処理し、次に残りの成分を濾過滅菌して加えた。発現および精製プロトコールは、ＬＢ培地における培養の項に記述したものと同一であった。
【００７５】
結果
発現および精製
典型的には、培養は２  Ｌの培養を３回実施し、合計６  Ｌ培養した。培地は、誘導の５時間後にＯＤ６００＝１．０を示した。そして、６  Ｌの培養物から１５  ｇの大腸菌ペレットが得られた。ＬＢ培地における融合タンパク質の産生は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、予想された分子量（４３  ｋＤａ）を有するバンドとして明確に観察された（図２ａ）。
【００７６】
融合タンパク質は大腸菌中に高度に発現されたが、３７℃で発現させた場合、該タンパク質の殆どは封入体として沈殿した（図２ｂ）。最大収量を得るため、いくつかの誘導温度が試された。１５℃等の低温では、封入体は全く形成されなかったが、発現レベルが非常に低かった。発現レベルと可溶性の間で妥協して、２５℃での誘導が最良の収量をもたらした。我々はこれ以降の実験ではこの温度を用いた（図２ｂ）。
【００７７】
第１ステップにおいては、ＧＳＴアフィニティーカラムを用いてＧＳＴ−ｈＩＬ−１８融合タンパク質を捕獲した。溶出したタンパク質はＧＳＴ−ｈＩＬ−１８を約９０％の純度で含有していた。溶出したタンパク質の量は約２０  ｍｇであった（図２ｃ）。この融合タンパク質を濃縮し、２００μｇの因子Ｘａによって開裂した。還元剤は因子Ｘａの開裂能に影響を及ぼした。我々は使用する作用物質の濃度および種類を最適化した。ＧＳＨおよび２ＭＥはＤＴＴと比較して上記開裂を妨げなかった（図３）。開裂は４℃では約１６時間で完了した。
【００７８】
開裂したタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーにかけたところ、２つの主要なピーク（Ｐ１およびＰ２）を示した（図４ａ）。Ｐ１はＧＳＴタンパク質に対応し、Ｐ２はＩＬ−１８に対応していた（図４ｂ）。ＩＬ−１８タンパク質の収量は、６  Ｌの培養物から６．６  ｍｇであった（１．１  ｍｇ／Ｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推定したところ、このタンパク質はほぼ９８％の純度を有していた。
【００７９】
最小培地を用いた場合、誘導の５時間後にＯＤ６００＝０．８５を示した。最小培地における融合タンパク質の発現レベルは、ＬＢ培地における発現レベルに類似していた。その後に実施したタンパク質の精製は、ＬＢ培地に産生されたのとほぼ同じ量のタンパク質（０．８  ｍｇ／Ｌ）が産生されたことを示した。
【００８０】
［実施例２］
ＩＬ−１８による受容体活性化を理解するための第１ステップとして、本発明者らはＮＭＲ分光法を用いてヒトＩＬ−１８の溶液構造を決定した。その構造は、ＩＬ−１８のβトレフォイル折り畳みがＩＬ−１ファミリーメンバー（ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ＲＡ、等）のそれと類似しているが、表面残基は全く異なることを示している。本発明者らはまた、ＩＬ−１８の表面に暴露されている５０個の残基について点突然変異体を構築した。これらの突然変異体を用いた受容体結合および細胞応答分析は、３つの部位の存在を明らかにした；こららのうち２つの部位はＩＬ−１８Ｒα結合に重要であり、そして第３の部位は細胞応答に関与するがＩＬ−１８Ｒα結合には関与しない。ＩＬ−１８の構造および受容体結合部位をＩＬ−１ファミリーメンバーのそれらと比較して、本発明者らはＩＬ−１８とＩＬ−１８Ｒαとの相互作用のモデルを提案する。
【００８１】
ＩＬ−１８の構造
残基３４−４３の構造を除いて、ＩＬ−１８の構造は十分明らかになった。ＩＬ−１８は、３組の、１つの短いαヘリックス（Ｈ１）および１つの３１０ヘリックス  （Ｈ２）を有する捻られた４本鎖シートを形成する１２本の鎖（Ｓ１−Ｓ１２）からなる。これら３つのβシートは、βトレフォイル折り畳みを形成するように相互にパッキングされている（図５）。ループ（残基３４−４２）はタンパク質本体から外へ拡がっており、そして小さい異核ＮＯＥ（核オーバーハウザー効果）値（０．４９＋／−０．０２５）によって、及び長距離ＮＯＥの欠如によって特徴づけられるようにフレキシブルであるように思われる。
【００８２】
中程度の配列同一性（１７％）にかかわらず、ＩＬ−１８の全体的な構成は、疎水性残基の保存に基づいて以前に予測されたように、ＩＬ−１β（図６ａ）等のＩＬ−１ファミリーメンバーの構成と顕著な類似性を示す８。ＩＬ−１８とＩＬ−１βの間で二次構造エレメントにおける７０個のＣα原子の根平均二乗変位が１．６０Åであることは、ＩＬ−１８とＩＬ−１βが同一の構造クラスに属する関連するタンパク質であることを示している。しかし、鎖Ｓ３−Ｓ４、Ｓ４−Ｓ５、Ｓ７−Ｓ８およびＳ１１−Ｓ１２間の数個のセグメントの長さ及びコンホメーションは、ＩＬ−１８およびＩＬ−１の間で実質的に異なっている。
【００８３】
ＩＬ−１８受容体αの接触部位
ＩＬ−１８機能にとって重要な残基を同定するため、本発明者らは一連の突然変異体を作製し、そしてＩＦＮ−γ産生を誘導し、ＩＬ−１８Ｒαと結合するそれらの能力を分析した（表１）。本発明者らは、ＩＬ−１８の表面に暴露された残基の殆どをカバーする５０個の残基を選択した。作製した５０個の突然変異体タンパク質のうち１５個は、有意に低下したＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を示した。活性の実質的低下を示した突然変異体のそれぞれについて、１５Ｎで標識したタンパク質を調製し、１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトルを野生型ＩＬ−１８のそれと比較した。これらの突然変異体の全ては、突然変異によって天然の折り畳みが破壊された証拠を何ら示さなかった。
【００８４】
ＩＦＮ−γ産生誘導能の低下を示した１５個の突然変異体のうち１２個は、受容体結合活性においても有意な低下を示した（表１）。これらの残基は、部位Ｉおよび部位ＩＩと称する２つの別個の表面パッチを形成する（図６ｂ左）。５個の残基（Ａｒｇ１３、Ａｓｐ１７、Ｍｅｔ３３、Ａｓｐ３５およびＡｓｐ１３２）によって形成される部位Ｉは、βトレフォイル折り畳みのコアバレル（ｂａｒｒｅｌ、胴）の片側に位置し、他方、７個の残基（Ｐｈｅ２、Ｌｙｓ４、Ｌｅｕ５、Ｌｙｓ８、Ａｒｇ５８、Ｍｅｔ６０およびＡｒｇ１０４）によって形成される部位ＩＩはβバレルの頂部に位置する。最近、Ｋｉｍらは、Ｇｌｕ６またはＬｙｓ５３の電荷を逆にする突然変異がＩＬ−１８の生物学的活性を変化させることを示した９。これら２つの残基は、部位ＩＩとしての同一表面上に位置している。このことは、部位ＩＩを形成する残基が受容体結合に重要であることを示唆している。
【００８５】
ＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩ複合体の構造および突然変異データは、ＩＬ−１βがＩＬ−１ＲＩに対して２つの界面部位（部位Ａおよび部位Ｂ）をもつことを示した（図６ｄ）。部位Ａは、受容体の細胞外部分の２つのアミノ末端免疫グロブリンドメインと接しており、また部位Ｂは第３の免疫グロブリン部位と接している（図７ａ）。ＩＬ−１８およびＩＬ−１βの三次および一次構造の比較は、ＩＬ−１８の部位Ｉおよび部位ＩＩがＩＬ−１βの部位Ａおよび部位Ｂにそれぞれ対応することを示した。なぜなら、これらの部位は配列および三次構造から見て等価に位置しているからである。
【００８６】
これらの考察は、本発明者らがＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩ複合体（ＰＤＢコード：  １ＩＴＢ）およびＩＬ−１８の座標を用いて図７ｂに示すＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体のモデルを構築することを可能とした。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１８Ｒαの細胞外ドメインの間では配列同一性が２２％で、また特徴的アミノ酸（システイン等）が保存されているため、ＩＬ−１８Ｒαの三次構造のモデル化はかなり簡単に行なわれた。ＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体の得られたモデルは、ＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩの結晶構造に良く似ており、またＩＬ−１８のここに示す突然変異データに一致している。
【００８７】
静電相補性が、ＩＬ−１８およびＩＬ−１βの受容体結合の特異性を説明するかもしれない。ＩＬ−１８の部位Ｉおよびその周辺における分子表面は負に帯電している。他方、モデル中のこの部位に接しているＩＬ−１８Ｒαの分子表面は、高度に陽に帯電している（図６ｂ、ｃ）。突然変異試験は、ＩＬ−１８上の電荷が受容体結合に重要であることを示した：ＩＬ−１８のＡｓｐ１７、Ａｓｐ３５またはＡｓｐ１３２のアラニンとの置換は、受容体結合を顕著に抑制した。対照的に、ＩＬ−１βの部位Ａは陽に帯電しており（図６ｅ）、そしてＩＬ−１ＲＩの界面は負に帯電している。サイトカインの受容体結合部位の静電状態は、受容体識別に寄与するのかもしれない。
【００８８】
ＩＬ−１８受容体βの可能な結合部位
突然変異誘発試験は、残基Ｌｙｓ７９、Ｌｙｓ８４およびＡｓｐ９８は機能的に重要であるが、ＩＬ−１８Ｒαとの結合には密接な関係がないことをも明らかにした。これらの残基のそれぞれの突然変異体はＩＬ−１８Ｒαと結合可能であるが、ＩＦＮ−γ誘導活性を喪失していた（表１）。これらの残基はバレルの底部でクラスター化しており、部位ＩＩの反対側（部位ＩＩＩと称する）に位置する（図６ｂ）。ＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体のモデルにおいて、ＩＬ−１８の部位ＩＩＩは溶媒に暴露されていて、ＩＬ−１８Ｒαと反対の方向を向いている（図７ｂ）。したがって、部位ＩＩＩを形成する残基のアラニン置換がＩＬ−１８Ｒα結合に殆ど影響を及ぼさないという考察は、このモデルと一致する（表１、図７ｂ）。
【００８９】
では、部位ＩＩＩを形成する残基の機能は何であろうか？本発明者らは、これらの残基はＩＬ−１８Ｒβとの結合に重要であると推定する。ＩＬ−１８ＲβとＩＬ−１８Ｒαとの会合はＩＬ−１８受容体シグナル伝達の開始に必須である２，３。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８ＲαとＩＬ−１８Ｒβの会合を誘導し、そしてそれらの細胞質ドメインの同型的相互作用を容易にしてシグナル伝達プロセスを開始させるものと考えられる３。細胞質ドメインを欠く末端切断型ＩＬ−１８Ｒβは、ＩＬ−１８シグナル伝達を抑制することが示された１０。
【００９０】
部位ＩＩＩがＩＬ−１８ＲαとＩＬ−１８Ｒβの会合に関与しているかどうかを突き止めるため、本発明者らは表面プラズモン共鳴測定を実施した。ＩＬ−１８Ｒβのみでは、ＩＬ−１８ともＩＬ−１８Ｒαとも結合できない（図７ｃ、ｄ）。しかし、ＩＬ−１８の存在下では、ＩＬ−１８Ｒβはセンサー上に固定したＩＬ−１８Ｒαに結合することができ、ＩＬ−１８ＲβがＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体と会合して三次複合体を形成することを示す（図７ｄ）。次に、本発明者らは部位ＩＩＩを形成する残基の突然変異がＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα：ＩＬ−１８Ｒβ三次複合体の形成に及ぼす効果を調べた。Ｌｙｓ７９、Ｌｙｓ８４またはＡｓｐ９８のうちいずれかの突然変異は、ＩＬ−１８ＲβとＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体との会合度に大幅な低下を引き起こす。これは、部位ＩＩＩの残基が三次複合体の形成に重要であることを示唆している（図７ｄ）。ＩＬ−１８のこれらの残基は帯電した側鎖を有し、特徴的な陽および負に帯電した表面パッチを形成する（図６ｂ、ｃ）。ＩＬ−１８のＩＬ−１８Ｒαとの接触部位、およびＩＬ−１８の２つの受容体サブユニットの一次構造がＩＬ−１βのそれらと類似しているので、類推上、ＩＬ−１β残基であるＬｙｓ７７、Ｌｅｕ８２およびＧｌｕ９６（これらはＩＬ−１８の部位ＩＩＩを構成する残基に対応する）はＩＬ−１ＡｃＰと界面表面を形成しうる。そして、該表面はＩＬ−１ＡｃＰとＩＬ−１ＲＩ：ＩＬ−１β複合体との会合を媒介する。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
方法
サンプル調製。１５Ｎ標識化および１５Ｎ／１３Ｃ標識化野生型ＩＬ−１８タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。アフィニティークロマトグラフィーによる精製後、因子Ｘａを用いた消化によりＧＳＴタグを除去した。ＮＭＲ測定用のサンプルは、典型的には、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ６．０）中の１−２  ｍＭタンパク質、１５０  ｍＭ  ＫＣｌおよびＨ２Ｏ／２Ｈ２Ｏ  （９０％／１０％）または２Ｈ２Ｏ中の１０  ｍＭ  ＤＴＴからなった。
【００９３】
各アミノ酸がアラニンに置換された５０種類の突然変異体ＩＬ−１８タンパク質を、野生型タンパク質と同じ方法で調製した。突然変異させるべき残基は、ＩＬ−１／ＩＬ−１８ファミリーメンバーとの配列アライメント、ＩＬ−１８、ＩＬ−１β（ＰＤＢコード：  ２Ｉ１Ｂ）およびＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩ複合体（ＰＤＢコード：  １ＩＴＢ）の間の構造比較、および以前に報告されたＩＬ−１に関する突然変異誘発データに基づいて選択された。
ＮＭＲ分光測定。全てのＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ５００、ＤＲＸ５００またはＤＲＸ８００  ＮＭＲ分光計を用いて３０３Ｋで得た。主鎖および側鎖の１Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎ共鳴の帰属を決めるため、一連の三次元実験を実施した１２。ＶａｌおよびＬｅｕ残基のメチル基の立体特異的帰属の決定は、以前に記述されたように実施した１３。距離制限は、混合時間を１００  ｍｓとした１５Ｎ、１５Ｎ−、１５Ｎ、１３Ｃ−または１３Ｃ  １３Ｃ−分解４Ｄ  ＮＯＥＳＹ実験から得た１２。
構造計算。得られた主鎖共鳴の帰属は、鎖Ｓ３とＳ４の間のセグメント周辺にマイナーなコンホメーションの存在を示した。これは恐らくＡｌａ４２−Ｐｒｏ４３ペプチド結合のシス／トランス異性化のためであろう。主要な及びマイナーなコンホメーションの間の１Ｈおよび１５Ｎ化学シフトの差は、比較的小さい。本発明者らは主要なコンホメーションについてのみ構造制限を得た。最初に、プログラムＤＹＡＮＡ（バージョン１．５）を用いて、構造計算およびＮＯＥピークの帰属決定を反復的でかつ手作業による方法で実施した１４。主鎖ねじり角度制限は、ＨＮＨＡ１２およびＴＡＬＯＳプログラムの３ＪＨＮＨαから得た。Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐのねじり角度χ１は、３ＪＣ’Ｃおよび３ＪＮＣの結合定数から推定した１６。手作業によって全体的な折り畳みを決定した後、ＣＡＮＤＩＤアルゴリズムを用いて残りのＮＯＥピークの帰属を決定し１７、２２８９個の意味のあるＮＯＥ上部距離制限を得た。これらの制限を用いて、ＣＮＳのプログラム（バージョン１．１）によって最終構造を計算した１８。この段階で、ゆっくり交換しつつある（ｅｘｃｈａｎｇｉｎｇ）主鎖アミドに由来する水素結合制限を、Ｎ−Ｏ原子対には２．８−３．４Åの距離制限として、またＨＮ−Ｏ原子対には１．８−２．４Åの距離制限としてそれぞれ加えた。非立体特異的に割当てられたプロトンは、流動性（ｆｌｏａｔｉｎｇ）キラリティーおよびΣ（ｒ−６）−１／６総計として処理された。合計１００個の構造を精巧化し、そして２０個の最もエネルギーの低い構造をＭＯＬＭＯＬ１９、ＡＱＵＡおよびＰＲＯＣＨＥＣＫ−ＮＭＲソフトウエア２０を用いて分析した２０（表２）。
【００９４】
【表２】
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ＩＦＮ−γ誘導および受容体結合アッセイ。野生型および突然変異体ＩＬ−１８タンパク質を、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力について以前に記述されたように２１調べた。野生型および突然変異体ＩＬ−１８のＩＬ−１８受容体に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティーを、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００  （Ｐｈａｒａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を用いた表面プラスモン共鳴実験によって２５℃で測定した。すなわち、アミン結合法により抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体    （Ｒｏｃｋｌａｎｄ）をＣＭ５センサーチップに結合させることによって特異的結合表面を調製した。次に、組換えＩＬ−１８α／ＦｃまたはＩＬ−１８β／Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をチップ上に固定した。結合密度は２００共鳴単位（ＲＵ）までに制限した。ＩＬ−１８サンプルをＨＢＳ−ＥＰ  （１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４，  ＮａＣｌ  １５０  ｍＭ，  ３．０  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％  （ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０）で希釈した。野生型および突然変異体ＩＬ−１８タンパク質のＩＬ−１８Ｒαに対する解離定数分析のためには、異なる量のサンプルを平衡相が得られるまで２  μｌ／分の速度でセンサーチップ上に注いだ。０．２  Ｍ  グリシン−ＨＣｌ  （ｐＨ  １．５）を６０秒ずつ２回パルスすることによってセンサー表面を再生した。スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロットによって解離定数を測定した。三量体性複合体形成能を評価するため、最初にＩＬ−１８タンパク質をＩＬ−１８Ｒα結合部位が飽和するまでセンサーチップに注いだ。次に、同一量のＩＬ−１８タンパク質をＩＬ−１８Ｒβタンパク質（３．１２−１００  ｎＭ）と混合して注いだ。
モデル化。ＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体のモデル化は、ＩＬ−１８の構造およびＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩ複合体（ＰＤＢコード：  １ＩＴＢ）の結晶構造に基づいて行なわれた。モデルの構築および構造検証のためにＭＯＥ２２を用いた。ＩＬ−１８のＮＭＲ構造およびＩＬ−１８Ｒαのモデル化された構造の座標をＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩ複合体の上に重ね合わせた。ＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体モデルは、Ｃｏｒｎｅｌｌら２４によって記述された、全原子フォースフィールドを用いるＡＭＢＥＲ  ５．０パッケージ２３を用いた３００  Ｋにおける７０  ｐｓの分子力学計算によって精巧化された。最終構造をさらにエネルギー最小化した。
座標。座標をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託した（登録コード：１ＪＯＳ）。その座標を表Ａ及びＢに示す。表Ａには、２０回の構造計算によって出てきた構造の座標を示す。ＮＭＲによる構造計算では異なる計算によって発生した構造を複数提示し、その構造間の収束を精度と見なす。表Ｂには、表Ａの３次元構造座標の平均値に少し化学エネルギーを使っての補正をしたものを示す。
【００９５】
表Ａ
野生型ＩＬ−１８の３次元構造座標（２０回の構造計算によって出てきた構造）
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【００９６】
表Ｂ
野生型ＩＬ−１８の３次元構造座標（表Ａの３次元構造座標の平均値に少し化学エネルギーを使っての補正をしたもの）
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【００９７】
表Ａは、最初の行（すなわち、ＭＯＤＥＬ  Ｘ（Ｘは１〜２０のいずれかの整数）の表示）ならびに最後から１行及び２行（すなわち、ＴＥＲ及びＥＮＤＭＤＬの表示）を除いて、各原子の３次元座標を記述している。また、表Ｂは、最終行（すなわち、ＥＮＤの表示）を除いて、各原子の３次元座標を記述している。１列目のＡＴＯＭはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目は、その原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基等を、５列目はその原子を含むアミノ酸残基の番号を、６、７、８列目はその原子の座標（Å単位）を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。なお、本表は当業者にとって一般的に用いられている表記法であるプロテイン・データ・バンクの形式に従って記述している。（９、１０列目はデータベースの形式に合わせるための数字であり、本発明においては特に意味のある数字ではなく、９列目はすべて１．００を、１０列目はすべて０．００を使用した。）
【００９８】
引用文献
１．  Ｏｋａｍｕｒａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７８，  ８８−９１  （１９９５）
２．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  ＣＡ．  Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １１，  ４８３−６  （２０００）
３．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｔｓｕｔｓｕｉ  Ｈ．  ＆  Ｏｋａｍｕｒａ，  Ｈ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．  １２，  ５３−７２．  （２００１）
４．  Ｋｏｎｉｓｈｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９９：１１３４０−５．  （２００２）
５．  Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：４４６７−４４７４．  （２００２）
６．  Ｖｉｇｅｒｓ，  Ｇ．Ｐ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｃａｆｆｅｓ，  Ｐ．  ＆  Ｂｒａｎｄｈｕｂｅｒ，  Ｂ．Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８６，  １９０−１９４  （１９９７）
７．  Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８６，  １９４−２００  （１９９７）
８．  Ｂａｚａｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｔｉｍａｎｓ，  Ｊ．Ｃ．  ＆  Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，  Ｒ．Ａ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７９，  ５９１  （１９９６）
９．  Ｋｉｍ，  ＳＨ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  １０９９８−１００３  （２００２）
１０．  Ｂｏｒｎ，  ＴＬ．，  Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ，  Ｅ．，  Ｂｉｒｄ，  ＴＡ．  ＆  Ｓｉｍｓ，  ＪＥ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ２９４４５−２９４５０  （１９９８）
１１．  Ｅｖａｎｓ，  Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １１４７７−１１４８３  （１９９５）
１２．  Ｃａｖａｎａｇｈ，  Ｊ．，  Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，  Ｗ．Ｊ．，  Ｐａｌｍｅｒ，  Ａ．Ｇ．ＩＩＩ．  ＆  Ｓｋｅｌｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ
Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；１９９６）
１３．  Ｈｕ，  Ｗ．  ＆  Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ，  Ｅ．Ｒ．Ｐ．  Ｊ．  Ｍａｇｎ．  Ｒｅｓｏｎ．  Ｂ，  １１３，  ７０−７５  （１９９６）
１４．  Ｇｕｎｔｅｒｔ，  Ｐ．，  Ｍｕｍｅｎｔｈａｌｅｒ，  Ｃ．  ＆  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３，  ２８３−２９８  （１９９７）
１５．  Ｃｏｒｎｉｌｅｓｃｕ，  Ｇ．，  Ｄｅｌａｇｌｉｏ，  Ｆ．  ＆  Ｂａｘ，  Ａ．  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  ＮＭＲ．  １３，  ２８９−３０２．  （１９９９）
１６．  Ｈｕ，  Ｊ．−Ｓ．，  Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｂａｘ，  Ａ．  （１９９７）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１９，  １８０３−１８０４
１７．  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｔ．，  Ｇｕｎｔｅｒｔ，  Ｐ．  ＆  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１９，  ２０９−２２７．（２００２）．
１８．  Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ａ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇ．  Ｄ５４，  ９０５−９２１．（１９９８）
１９．  Ｋｏｒａｄｉ，  Ｒ．，  Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｗｕｅｔｈｒｉｃｈ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．  １４，  ５１−５５  （１９９６）
２０．  Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，  Ｒ．Ａ．，  Ｒｕｌｌｍａｎ，  Ｊ．Ａ．Ｃ．，  ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｋａｐｔｅｉｎ，  Ｒ．  ＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，  Ｊ．Ｍ．  Ｊ．
Ｂｉｏｍｏｌ．  ＮＭＲ  ８，  ４７７−４８６  （１９９６）
２１．  Ｓｈｉｋａｎｏ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ．  ３１，  １２６３−１２７０  （２００１）
２２．  ＭＯＥ  （Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ；  １９９９）
２３．  Ｃａｓｅ，  Ｄ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＡＭＢＥＲ  ５  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；  １９９７）
２４．  Ｃｏｒｎｅｌｌ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７，  ５１７９−５１９７  （１９９５）
【００９９】
【発明の効果】
本発明により、インターロイキン−１８タンパク質の新規な変異体が提供された。この変異体は、インターロイキン−１８タンパク質のアンタゴニストとして利用することができる。
【０１００】
また、本発明により、野生型インターロイキン−１８タンパク質の３次元構造座標が提供された。この座標を利用することにより、新規な薬剤のスクリーニングができるようになった。
【０１０１】
【配列表】
2005052021.tif 003679
2005052021.tif 003680
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【０１０２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１は、野生型ＩＬ−１８のアミノ酸配列を示す。
【０１０３】
配列番号２は、野生型ＩＬ−１８のＤＮＡ配列を示す。
【０１０４】
配列番号３〜１７は、ＩＬ−１８の変異体のＤＮＡ配列を示す。
【０１０５】
配列番号１８は、ＩＬ−１８の最適化ｃＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＧＳＴ−ｈＩＬ−１８融合タンパク質の発現ベクター（ｐＧＥＸ−４Ｔ−Ｘａ−ｈＩＬ−１８）を図式的に表わす。
【図２】図２は、ＧＳＴ−ｈＩＬ−１８の発現および精製を示す。ａ）  ＩＰＴＧによる誘導の５時間後のＧＳＴ−ｈＩＬ−１８融合タンパク質の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ｂ）  異なる発現温度における封入体の形成。ｃ）  ＧＳＴアフィニティーカラムを用いたＧＳＴ−ｈＩＬ−１８の精製。溶出したＧＳＴ−ｈＩＬ−１８  タンパク質は９０％以上の純度を有する。ｓｕｐ：細胞溶解物の上清；  ｐｅｌ：  該溶解物のペレット。矢印はＧＳＴ−ｈＩＬ−１８タンパク質を示す。
【図３】図３は、ＧＳＴ−ｈＩＬ−１８融合タンパク質の開裂を示す。種々の濃度のＧＳＨ、ＤＴＴまたは  ２−ＭＥを用いた開裂試験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（−）および（＋）は、それぞれ因子Ｘａの不存在および存在を示す。Ａ：  ＧＳＴ−ｈＩＬ−１８  タンパク質；Ｂ：  ＧＳＴ  タンパク質；Ｃ：  ｈＩＬ−１８  タンパク質。
【図４】図４は、ゲル濾過カラム  （Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００，  ２６／６０）による精製を示す。ａ）ゲル濾過カラムに流速２  ｍｌ／分で通液し、４  ｍｌごとにフラクションを回収したクロマトグラム。ｂ）  Ｐ１およびＰ２に由来する精製サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ａ：  ＧＳＴ  タンパク質；Ｂ：  ｈＩＬ−１８タンパク質。
【図５】ヒトＩＬ−１８の溶液構造。ａ．  ２０個の立体の最終構造の最も適した主鎖重ね合わせ。残基１−１５７の主鎖原子を重ね合わせている。ｂ．  ＭＯＬＭＯＬを用いて描いた、ＩＬ−１８の立体のＮＭＲ構造の模式的リボン図。
【図６】ＩＬ−１８の突然変異分析。ａ．  ヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１βの配列アライメント。その突然変異が生物学的活性の重大な低下を引き起こしたヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１βの残基を星印で示す。ヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１β（ＰＤＢコード：２Ｉ１Ｂ）の二次構造エレメントをそれぞれ最上部および最下部に示す。保存された残基を四角で囲んで黄色で示す。ｂ．  その突然変異が活性の重大な低下を引き起こしたＩＬ−１８残基の表面表示。部位Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの残基をそれぞれ赤色、橙色および青色で示す。ｃ．  溶媒が近づきうる表面上の静電ポテンシャルの分布。青色は陽性ポテンシャルに対応し、赤色は陰性ポテンシャルに対応する。両パネルとも、分子は図５の配向と同一の配向で（左）、および縦軸を中心として１８０度回転させて（右）示してある。ｄ．  ＩＬ−１βの構造。その突然変異が活性の重大な低下を引き起こしたＩＬ−１β残基の表面表示。部位ＡおよびＢの残基をそれぞれ赤色および橙色で示す。ｅ．  溶媒が近づきうる表面上の静電ポテンシャルの分布。
【図７】ＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体のモデル、ならびにＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβの相互作用。ａ．  ＩＬ−１β：ＩＬ−１ＲＩ複合体（ＰＤＢコード：  １ＩＴＢ）の結晶構造。部位ＡおよびＢのＩＬ−１β残基をそれぞれ赤色および橙色で示す。ｂ．  ＩＬ−１８：ＩＬ−１８Ｒα複合体のモデル化された構造。部位Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの残基をそれぞれ赤色、橙色および青色で示す。ｃ．  野生型ＩＬ−１８の固定化ＩＬ−１８ＲαまたはＩＬ−１８Ｒβに対する表面プラスモン共鳴の容量応答曲線。野生型ＩＬ−１８の濃度も示す。ｄ．  ＩＬ−Ｒβの、固定化ＩＬ−１８Ｒαと野生型ＩＬ−１８の複合体に対する、または部位ＩＩＩ突然変異体タンパク質に対する、表面プラスモン共鳴の応答曲線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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