(57)【要約】      （修正有）【課題】生薬の有効成分であるベルベリン、コプテイシンに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマに関して、複雑な前処理を必要とせず、高感度、再現性良好に、一度に多量の分析を可能とする競合的ＥＬＩＳＡを完成させる。【解決手段】ベルベリンを高温で加熱してベルベルビンとする。このものをモノクロロ酢酸と反応する。反応物を１-エチルー３-（３‘-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸（EDC）と反応し、さらにタンパク質を結合させたものを抗原として抗体を作成する抗体の製造方法。【選択図】図２
2005179288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベルベリン及び関連化合物に対する抗体。
【請求項２】
前記ベルベリン及び関連化合物はコプテイシンである請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ベルベリンを高温で加熱してベルベルビンとする。このものをモノクロロ酢酸と反応する。反応物を１−エチルー３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸(EDC)と反応し、さらにタンパク質を結合させたものを抗原として抗体を作成する抗体の製造方法。
【請求項４】
タンパク質と結合したベルベリン関連化合物を吸着させたウエルにベルベリン関連化合物溶液を添加し，更に請求項１に記載の抗体を加えてインキュベートした後にウエルを洗浄し，標識化免疫定量法を用いてベルベリン関連化合物溶液中のベルベリン関連化合物を定量する抗体を用いた抗原の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオウレン、オウバクその他の生薬の有効成分であるベルベリン、コプテイシンに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生産するハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Nature, 495-497頁、1975年）以来急速に発展した。哺乳動物の脾細胞と癌細胞であるミエローマ細胞を融合させた雑種細胞をハイブリドーマと称する。ハイブリドーマは用いた脾細胞が産生する抗体産生能を有することから、多くの蛋白質やペプチドの様な高分子化合物に対する抗体の生産に用いられてきた。
【０００３】
一方、本出願人は通常は抗原とは成りえないベルベリンに対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを作製する。生薬に含まれるベルベリン及び関連アルカロイド含量は産地や採取時期により品質的な変動が極めて大きいことが明らかとなった。このためオウレン、オウバクその他の関連生薬から製した生薬製剤や医薬品の一定した薬理効果を期待するためには、原料生薬の品質管理が不可欠となった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ベルベリンやコプテイシンの含有量は低く、また、多くの関連アルカロイドを含有するため、その定性、定量分析は容易ではない。従って含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を要する。このため前処理を必要とせず、再現性があり、かつ高感度なアッセイ系が要求される。これに対応出来うるのはＭＡｂ以外にない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上述の問題点を解決すべく研究を重ねた結果、細胞融合によりベルベリンに対する、ＭＡｂを産生するハイブリドーマを得、本ハイブリドーマを培養することによって抗ベルベリン抗体を大量に生産することに成功した。本抗体を用いることによって高感度、再現性良好な、かつ前処理を必要としないアッセイ系を完結した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
抗ベルベリンＭＡｂを生産するハイブリドーマは以下の様に作成する。すなわち、（１）抗原としてベルベリンーBSA複合体を免疫した動物の抗体産生脾臓細胞を作成する。（２）ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。（３）上記２種の細胞をポリエチレングリコールを媒体として融合する。（４）得られたハイブリドーマをHAT培地にて選抜する。（５）抗ベルベリンＭＡｂ生産ハイブリドーマを選抜する。（６）選抜ハイブリドーマをクローニングする。これらの行程について詳細に説明する。
【０００７】
（抗体産生細胞の調整）
ベルベリンーＢＳＡ複合体を動物に免疫する。免疫法としてはフロイントのコンプリートアジュバンドを併用する手法がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細胞としては脾臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細胞が使用される。
【０００８】
（骨髄腫細胞の調整）
細胞融合に使用する骨髄腫細胞は特に限定されず、各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生細胞の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ましい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増殖可能なようにすることによって、未融合細胞と融合細胞を選別することを考慮して、特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば８ーアザグアニン抵抗性の細胞は、HAT培地中で生育できない性質を有するため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞株、ＰＡＩ， Ｐ３?Ｘ６３?Ａｇ８， Ｐ３?Ｘ６３?Ａｇ８?ＵＩ， Ｐ３?ＮＳＩ／１?Ａｇ４?１， Ｘ６３?Ａｇ８?６．５．３，ＳＰ２１０?Ａｇ１４．ＦＯ，Ｓ１９４／５ＸＸＯ，Ｓ１９４／５ＸＸＯ，ＢＵ．１，ＭＰＣ１１?４５．６，ＴＧ．１．７等が用いられる。
【０００９】
（融合細胞）
細胞融合は通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地等のｅ?ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合（混合比は通常１：４ー１：１０）することにより行われる。融合促進剤としては平均分子量１０００ー６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０ー５０％である。
【００１０】
（ハイブリドーマの選択的増殖）
融合を終えた細胞は、１０％ＦＣＳ含有ｅ?ＲＤＦ培地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地（例えばHAT培地）で浮遊し、９６穴ウエルマイクロプレートに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞はハイブリドーマである。
【００１１】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養液を採取し、ベルベリンーＨＳＡと反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした２次抗体との反応により検索できる。
【００１２】
（クローニング）
抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウエル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行い、ＭＡｂ産生ハイブリドーマを得る。以上の操作により抗ベルベリンＭＡｂ産生ハイブリドーマＩＤ５−３Ｂ−７を得た。このハイブリドーマはベルベリンに対する特異的なＭＡｂを産生する新規な細胞である。
【００１３】
（抗ベルベリンＭＡｂの調整）
上記で得られたハイブリドーマを適切な培地中で培養することにより、その培養上清から本発明ＭＡｂが得られる。大量に生産する方法としては骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与後、ハイブリドーマを接種する。接種後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作により抗ベルベリンＭＡｂを得る。また、無血清培地で培養し、通常の手法で抗ベルベリンＭＡｂを得る。
【００１４】
（抗ベルベリンＭＡｂのキャラクタリゼーション）
精製した抗ベルベリンＭＡｂのサブクラスはＩＧｇ１、軽鎖はκであることを、通常の方法で決定した。
【００１５】
（発明の効果）
抗原であるベリベリンの一つのメトキシル基を水酸基に変換し、そこへリンカーを結合しキャリアータンパクを結合したものを抗原としたため、本抗体はベルベリン、コプテイシンを強く認識し、さらに弱いながらもパルマチンをも認識することが明らかとなった。従って通常のＥＬＩＳＡに用いることにより、ベルベリン、コプテイシンの分析を再現性高く、高感度、かつ前処理が不要な方法で実施可能となった。
【実施例】
【００１６】
（抗ベルベリンＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造）
（抗原の調整）
ベルベリン３ｇを１９０℃で15分間加熱後、水を加えてクロロフォルムで3回抽出する。クロロフォルムを減圧下留去する。残渣をＬＨ２０カラムで精製してベルベルビンを得る。ベルベルビン１００ｍｇをクロロフォルムに溶解し、モノクロロ酢酸３００ｍｇを添加し室温下で反応する。反応物８ｍｇに１−エチルー３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド(EDC)８ｍｇのピリジン溶液を反応する。本溶液をＢＳＡの水溶液に少量ずつ添加し反応する。さらに3時間室温下で反応を続ける。反応終了後４℃で2日間水に対して透析を行う。なおＥＬＩＳＡで使用するベルベリン?ＨＳＡについても同様な方法で作製した。
【００１７】
（抗原中のハプテン数の検討）
得られたベルベリンーＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のシナピン酸を添加して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入れ、マルデイトフマスにて測定する（図１）。
【００１８】
（免疫脾細胞の調整）
ベルベリンーＢＳＡ抱合体５０μｇをフロイントーコンプリートーアジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇのベルベリンーＢＳＡ抱合体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にベルベリンーＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完結した。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【００１９】
（ハイブリドーマの調整）
単離した免疫脾細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニューム）を加えて赤血球を溶血した後、ｅ?ＲＤＦ培地で細胞を３回洗う。マウス骨髄腫細胞もe-RDF培地で３回洗浄した。両細胞数を計測し脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合として遠心をする。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポロエチレングリコール(ＰＥＧ)４、０００を培地で希釈した５０％液を１.０ml滴下して融合を行った。３７℃、３０秒間静置した後、ｅ?ＲＤＦ培地５mlを５分間かけて添加した。１、０００rpmで１０分間遠心した。沈殿を１０％FCS添加IMDMにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒポキサンチン１０ー２M、アミノプテリン４x１０−７Mおよびチミジン１.５x１０−５Mを加えた(HAT-)10%FCS添加e-RDF培地を用いて沈殿を再び浮遊させ、９６ウエルマイクロプレートに１００μlずつ分注した。３日毎に同一培地を５０μl追加し、細胞の増殖を確認した。
【００２０】
（抗体産生ハイブリドーマの検索）
ハイブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、ベルベリンーHSA抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接ＥＬＩＳＡによりベルベリンに対するＭＡｂ産生ハイブリドーマを検索した。即ち、９６ウエルマイクロプレートにベルベリンーＨＳＡ抱合体０．１μｇ／１００μｌ／ウエルを分注し、３７℃で１時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエルに培養上清を１００μlずつ分注し抗原抗体反応を行った。０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水（TーPBS）で３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇG抗体１０００倍希釈液をウエルあたり１００μl添加し、１時間後にTPBSで洗浄した。０.００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウエルの細胞を採取した。
【００２１】
（抗ベルベリンＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニング）
抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングしてクローンを得た。
【００２２】
（抗ベルベリンＭＡｂの調整）
上記の抗体産生ハイブリドーマを無血清培地（１０μｇ／ｍｌインスリン、３５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μMエタノールアミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅ?ＲＤＦ培地）で３７℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインGFFカラムを用いて精製した。即ち、上清をトリス緩衝液でpH７に調整し、カラムに付す。カラムを１０mＭリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を１００mＭクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液は水に対して４回透析し、最後に凍結乾燥して精製抗体をえた。
【００２３】
（競合的ELISAによる定量）
ベルベリンーHSA抱合体溶液（１μｇ／ｍｌ）を100μlウエルに添加し１時間反応し吸着させる。比特異的結合を除去するために５％スキムミルク添加PBS溶液３００μlを加え１時間反応してブロッキングする。５０μlの各種濃度の試料溶液を加え、さらに抗ベルベリンＭＡｂ溶液（１μｇ／ｍｌ）５０μｌを添加して１時間インキュベートした。TPBSで３回洗浄し、１０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体１００μｌを加え１時間反応した。１時間後にTPBSで洗浄した。０．００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０．３ｍｇ／ml含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃度のベルベリンの吸光度から検量線を作成した（図２）。
【００２４】
抗ベルベリンMAbを用いて通常の方法により各種関連化合物のクロスリアクションを検討して表の結果を得た。ベルベリンに１００％クロスリアクションを持つとともに、コプテイシンに対しても１４１％のクロスリアクションを持つことが明らかとなった。また、バプマチンにも５１％のクロスリアクションを持つものの、他の化合物にはアフィニテイーを持たないことが明らかとなった。
【００２５】
【表１】
2005179288.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例の抗原のハプテン数を調査したマススペクトログラフィー。
【図２】実施例のMAb抗体の検量線を示す片対数グラフ。
【図１】
2005179288.tif 000004
【図２】
2005179288.tif 000005