(57)【要約】【課題】野外でマツタケ菌根を人工合成する方法を提供すること。【解決手段】アカマツの根にマツタケ菌根を人工的に合成する方法であって、アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する工程と、洗浄された根をオーキシンで処理する工程と、オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させ、アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する工程と、誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を接種する工程と、マツタケの培養菌糸を接種された細根を、アカマツが生育する土壌から隔離された培養基質中で生育させる工程とを含むことを特徴とする方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する方法であって、
アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する工程と、
洗浄された根をオーキシンで処理する工程と、
オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記アカマツがアカマツ成木であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法により誘導された外生菌根菌フリー細根を有するアカマツ。
【請求項４】
アカマツの根にマツタケ菌根を人工的に合成する方法であって、
アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する工程と、
洗浄された根をオーキシンで処理する工程と、
オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させ、アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する工程と、
誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を接種する工程と、
マツタケの培養菌糸を接種された細根を、アカマツが生育する土壌から隔離された培養基質中で生育させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記アカマツがアカマツ成木であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マツタケ菌根を人工的に合成する請求項４または５に記載の方法であって、
誘導された外生菌根菌フリー細根にマツタケの培養菌糸を接種する工程が、誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を固定する工程であることを特徴とする方法。
【請求項７】
マツタケ菌根を人工的に合成する請求項４〜６の何れか１項に記載の方法であって、
マツタケの培養菌糸を接種された細根を生育させる培養基質が、黒色土およびアカマツ樹皮粉を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項４〜７の何れか１項に記載の方法により合成されることを特徴とするマツタケ菌根。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マツタケ菌根の人工合成方法に関する。本発明の方法により人工合成されるマツタケ菌根は、その子実体（きのこ）を人工的に生産するための材料として有用である。
【背景技術】
【０００２】
マツタケは外生菌根菌であるため、菌根の形成および子実体（きのこ）の形成には、生きたアカマツ（マツタケ菌の宿主）の根が必要である。
【０００３】
現在、腐生菌の純粋培養による子実体形成は、多くの種で確立されており、ほだ木や鋸屑を用いた人工栽培が一般的に行われている（非特許文献１（大森・小出 (2001) キノコ栽培全科 258pp. 農文協））。しかし、マツタケなどの共生菌である外生菌根菌の子実体形成においては、宿主植物が必要な場合が一般的であるため、外生菌根を人工的に構築することが人工栽培法を確立する上で重要な一歩となる。
【０００４】
マツタケ（Tricholoma matsutake (S.Ito et Imai) Sing.）の人工栽培に関する研究は、1900年代から行われている。Masuiは、マツタケがアカマツに外生菌根を形成することを実験的に示した（非特許文献２（Masui (1927) Mem. Coll. Sci. Kyoto Univ. B2: 152-279））。富永は、マツタケ菌糸の成長の最適条件について検討した（非特許文献３（Tominaga, Y. (1965) Bull. Hiroshima Agri. Coll. 2: 242-246））。小川・浜田は、純粋培養によるマツタケ子実体原基の形成を検討した（非特許文献４（Ogawa, M＆Hamada, M (1975) Trans. Mycol. Soc. Japan 16: 406-415））。最近、Guerin-Laguetteらは、無菌土または人工基質を用いてin vitroの条件においてマツタケの外生菌根を得ている（非特許文献５（Guerin-Laguette et al. (2000) Mycoscience 41: 389-393）、非特許文献６（Vaario et al. (2000) J. For. Res. 5: 293-297）、および非特許文献７（Yamada et al. (1999) Mycoscience 40: 455-463））。また、Guerin-Laguetteらは、無菌土や人工基質に界面活性剤あるいは天然植物油を添加して人工シロ（外生菌根と菌糸の集まり）を形成する手法を確立している（非特許文献８（Guerin-Laguette et al. (2003) Mycological Progress, Vol.2, 37-44））。しかし、無菌条件下以外（すなわち野外）においては、マツタケ菌根の人工合成法や人工シロの形成法は確立されていない。このため、現段階ではマツタケの人工栽培は困難であると考えられている。
【０００５】
近年、外生菌根菌であるアンズタケ、アカハツ、ショウロ、ホンシメジ、Lactarius deliciosusについて、その培養菌糸を外生菌根菌フリーの実生や苗木に接種して、人工的に外生菌根を形成させ、その子実体形成に成功している。アンズタケについては、非特許文献９（Danell (1997) Nature 385: 303）に記載され、アカハツ、ショウロについては、非特許文献１０（Yamada et al. (2001) Mycorrhiza 11: 59-66）に記載され、ホンシメジについては、非特許文献１１（Kawai (1997) Mycologia 89: 228-232）に記載され、Lactarius deliciosusについては、非特許文献１２（Guerin-Laguette et al. (2000) Can. J. Microbiol. 46: 790-799）に記載されている。
【０００６】
しかし、マツタケに関しては、その胞子や培養菌糸をアカマツ成木に接種して、マツタケのシロや子実体を形成する試みが全国各地で行われてきたが、成功した例はない。
【０００７】
枯木・川上は、既存の野外のマツタケのシロにアカマツ苗木を移植してマツタケ菌を自然感染させ、さらに、感染苗木を別のアカマツ林内へ移植することにより、マツタケの人工シロの形成を試みた（非特許文献１３（枯木・川上 (1985) 広島県林試研報20: 13-23））。その結果、感染苗木の移植６年後に、マツタケの子実体１本の発生が確認されている。しかし、野外のシロの数は限られており、しかも、感染苗木の作出の際に既存のシロを破壊してしまうため、この方法により大量の感染苗木を得ることは困難である。また、同様の試みが全国各地で行われているが、他の成功例はなく、この方法による再現性は非常に乏しい。
【０００８】
マツタケ菌のアカマツ成木への接種が困難である要因の一つは、アカマツが、自然条件下において既に常に多くの外生菌根を形成しているため、マツタケ菌の新たな感染部位がごく限られていることにある（非特許文献１４（太田 (1998) 日菌報 39: 111-112））。そのため、マツタケ菌の新たな感染部位を新たにつくりだすために、既存の根から、外生菌根菌フリーの新たな細根を誘導する試みがなされている。具体的には、客土を利用して、アカマツの根から細根を誘導する試み（非特許文献１５（浜田・小原 (1970) マツタケ−人工増殖の試み−143pp. 農文協））や、アカマツの根の切断とアゼシートの埋設により細根を誘導する試み（非特許文献１６（荒尾ら (1993) 高知県林試研報 22: 84-86））がなされている。しかし、マツタケ菌の感染に適した外生菌根菌フリーの細根を得る手法は確立されていない。
【非特許文献１】大森・小出 (2001) キノコ栽培全科 258pp. 農文協
【非特許文献２】Masui (1927) Mem. Coll. Sci. Kyoto Univ. B2: 152-279
【非特許文献３】Tominaga, Y. (1965) Bull. Hiroshima Agri. Coll. 2: 242-246
【非特許文献４】Ogawa, M＆Hamada, M (1975) Trans. Mycol. Soc. Japan 16: 406-415
【非特許文献５】Guerin-Laguette et al. (2000) Mycoscience 41: 389-393
【非特許文献６】Vaario et al. (2000) J. For. Res. 5: 293-297
【非特許文献７】Yamada et al. (1999) Mycoscience 40: 455-463
【非特許文献８】Guerin-Laguette et al. (2003) Mycological Progress, Vol.2, 37-44
【非特許文献９】Danell (1997) Nature 385: 303
【非特許文献１０】Yamada et al. (2001) Mycorrhiza 11: 59-66
【非特許文献１１】Kawai (1997) Mycologia 89: 228-232
【非特許文献１２】Guerin-Laguette et al. (2000) Can. J. Microbiol. 46: 790-799
【非特許文献１３】枯木・川上 (1985) 広島県林試研報20: 13-23
【非特許文献１４】太田 (1998) 日菌報 39: 111-112
【非特許文献１５】浜田・小原 (1970) マツタケ−人工増殖の試み−143pp. 農文協
【非特許文献１６】荒尾ら (1993) 高知県林試研報 22: 84-86
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来不可能であった、野外でマツタケ菌根を人工合成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討を重ね、野外に生育するアカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導するために、根の洗浄とオーキシン処理が有効であることを見出した。これにより、野外に生育するアカマツの根から、マツタケ菌の感染部位となる外生菌根菌フリー細根を新たに誘導する手法を確立した。次いで、得られた外生菌根菌フリー細根を用いて、野外でマツタケ菌根を人工的に合成する方法を確立した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の手段を提供する。
【００１２】
(１)  アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する方法であって、
アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する工程と、
洗浄された根をオーキシンで処理する工程と、
オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【００１３】
(２)  前記アカマツがアカマツ成木であることを特徴とする(１)に記載の方法。
【００１４】
(３)  (１)または(２)に記載の方法により誘導された外生菌根菌フリー細根を有するアカマツ。
【００１５】
(４)  アカマツの根にマツタケ菌根を人工的に合成する方法であって、
アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する工程と、
洗浄された根をオーキシンで処理する工程と、
オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させ、アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する工程と、
誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を接種する工程と、
マツタケの培養菌糸を接種された細根を、アカマツが生育する土壌から隔離された培養基質中で生育させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
【００１６】
(５)  前記アカマツがアカマツ成木であることを特徴とする(４)に記載の方法。
【００１７】
(６)  マツタケ菌根を人工的に合成する(４)または(５)に記載の方法であって、
誘導された外生菌根菌フリー細根にマツタケの培養菌糸を接種する工程が、誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を固定する工程であることを特徴とする方法。
【００１８】
(７)  マツタケ菌根を人工的に合成する(４)〜(６)の何れか１に記載の方法であって、
マツタケの培養菌糸を接種された細根を生育させる培養基質が、黒色土およびアカマツ樹皮粉を含むことを特徴とする方法。
【００１９】
(８)  (４)〜(７)の何れか１に記載の方法により合成されることを特徴とするマツタケ菌根。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の「外生菌根菌フリー細根」誘導方法によれば、「外生菌根菌フリー細根」を再現性よく誘導することができる。これにより、野外で限られているマツタケ菌の感染部位を新たにつくりだすことができる。本発明の方法は、任意の齢のアカマツに適用可能であり、アカマツの齢に関係なく、マツタケ菌根を形成する場となる新たな根を誘導することが可能である点で優れている。本発明の方法に従って誘導された「外生菌根菌フリー細根」を利用すれば、野外のアカマツにマツタケ菌を直接接種することが可能となる。
【００２１】
また、本発明のマツタケ菌根合成方法によれば、アカマツが生育する野外において、従来合成不可能であったマツタケ菌根を人工的につくりだすことができる。本発明の方法により合成されたマツタケ菌根は、マツタケの人工栽培法を確立する基礎となるものであるため非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の記載は、本発明を説明するためのものであって本発明を限定するものではない。
【００２３】
１．アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する方法
アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する本発明の方法は、
アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する第一の工程と、
洗浄された根をオーキシンで処理する第二の工程と、
オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させる第三の工程と
を含む。
【００２４】
［第一の工程］
本発明において用いられるアカマツは、任意の齢の木であり、その根に、マツタケ菌根以外の菌根が既に形成されていてもよい。本発明において好適に用いられるアカマツは、成木（mature tree）であり、一般には５年齢以上の木、好ましくは１０年齢以上のアカマツの木をいう。なお、本発明においては、例えば６０〜８０年齢のアカマツを使用しても、その根から新たに発根を誘導することが可能であるため、本発明の効果を奏することができる。よって、本発明においてアカマツは、既存の根から新たに発根を誘導することが可能である限り、その齢は限定されない。
【００２５】
外生菌根菌フリー細根を誘導するために使用するアカマツの根としては、野外で生育するアカマツの根の少なくとも一部を、土壌を掘り起こすことにより露出させたものを使用することができる。使用するアカマツの根としては、任意の太さを有する根の部分であり、根の先端部分、根の途中部分の何れを使用してもよいが、発根効率の観点から、根の先端により近い方が好ましい。また、後述の工程においての取扱いが簡便であるように、直径０．５〜１ｃｍの太さの根が好ましく使用される。
【００２６】
第一の工程では、まず、アカマツが生育する土壌を掘り起こすことにより、アカマツの根の少なくとも一部を土壌から露出させる。例えば、根を５０ｃｍ前後の長さ分だけ土壌から露出させる。次いで、露出させたアカマツの根の表面を洗浄する。洗浄は、根の表面から夾雑物（根の周りの土や根に付着する菌根など）を取り除く程度に行われる。洗浄は、目で見て夾雑物が取り除かれたことが確認される程度で充分である。洗浄は、水道水を用いて行うことができる。
【００２７】
［第二の工程］
第二の工程において、先の工程で洗浄された根を、オーキシンで処理する。オーキシン処理は、根の内部にオーキシンを浸透させることが可能な処理であれば任意の処理であり得る。オーキシン処理は例えば以下のとおり行うことができる。オーキシンの根への浸透効率をよくするため、好ましくは洗浄した根に刃物で切れ込みを入れる。ここで切れ込みは、根の形成層に達する程度（深さ約１ｍｍ程度）に入れることが好ましい。切れ込みは、根の長さ方向に対して、例えば数ｃｍ間隔（２〜３ｃｍ間隔）で入れる。
【００２８】
次いで、切れ込みを入れた根の表面にオーキシンを塗布する。オーキシンは、粉剤で塗布してもよいし、液剤で塗布しても何れでもよい。オーキシンは、市販のオーキシン製剤を用いることが簡便である。本発明では、オーキシンとしての作用が公知の物質を有効成分とする任意のオーキシン製剤を使用することができ、例えばインドール絡酸（IBA）、インドール酢酸（IAA）を有効成分とした製剤を使用することができる。オーキシンの塗布は、発根促進効果を奏することが可能な濃度の製剤を適量塗布することにより行うことができる。例えば、粉剤の場合、有効成分含有量0.5重量％のオーキシン製剤（例えばIBA粉剤）を、根５０ｃｍに対し約１〜２ｇとすることができる。また液剤の場合は、有効成分含有量100ppmのオーキシン製剤（例えばIAA液剤）を、根５０ｃｍに対し１時間浸漬することができる。粉剤での塗布の方が、オーキシンが根の表面から土壌に流れ落ちることがないため好ましい。
【００２９】
［第三の工程］
第三の工程において、オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させる。ここで、「発根可能な状況」とは、発根に必要な水分を根に供給し続けることが可能な状況をいい、具体的には、通気性を有し水分保持可能な手段（例えば水分を含んだミズゴケや脱脂綿）で根が覆われている状況をいう。ただし、ここで用いられる手段は、発根に必要な水分を根に供給可能で、かつ通気性を有する適度な空隙を有する手段であれば例示したものに限定されない。
【００３０】
「アカマツが生育する土壌から隔離された状況」とは、オーキシン処理された根から新たに生じる根に土壌中の菌が付着しないように、オーキシン処理された根を土壌から物理的に隔離した状況をいい、例えば、オーキシン処理された根を、水不透過性シート（たとえばプラスチックシート）で覆って、土壌から隔離した状況をいう。水不透過性シートは、平板状のシートであっても筒状のシートであっても、根をくるむことが可能であればよい。
【００３１】
図１に、オーキシン処理された根が「アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況」に置かれた様子の一例を示す。図１において、オーキシン処理された根は、水分を保持したミズゴケで包まれ、さらにミズゴケのまわりがプラスチックシートで覆われている。
【００３２】
このような状況下で、オーキシン処理された根を土壌中に埋め戻すと、およそ６ヶ月後に、オーキシン処理された根から新たに分岐した根が観察される。新たに誘導された根は、外生菌根菌の付着が肉眼で観察されないため、本明細書において「外生菌根菌フリー細根」と称する。すなわち、「外生菌根菌フリー細根」は、既存の根から分岐した根であって、外生菌根菌が付着していない状態で誘導された根をいう（図２参照）。
【００３３】
以上説明した本発明の「外生菌根菌フリー細根」誘導方法によれば、「外生菌根菌フリー細根」を再現性よく誘導することができ、これによりマツタケ菌の感染部位を新たにつくりだすことができる。本発明の方法は、任意の齢のアカマツに適用可能であり、アカマツの齢に関係なく、マツタケ菌根を形成する場となる新たな根を誘導することが可能である点で優れている。本発明の方法に従って誘導された「外生菌根菌フリー細根」を利用すれば、野外のアカマツにマツタケ菌を直接接種することが可能となる。
【００３４】
２．アカマツの根にマツタケ菌根を人工的に合成する方法
アカマツの根にマツタケ菌根を人工的に合成する本発明の方法は、
アカマツが生育する土壌から露出させたアカマツの根を洗浄する第一の工程と、
洗浄された根をオーキシンで処理する第二の工程と、
オーキシン処理された根を、アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況下で生育させ、アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する第三の工程と、
誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を接種する第四の工程と、
マツタケの培養菌糸を接種された細根を、アカマツが生育する土壌から隔離された培養基質中で生育させる第五の工程と
を含む。
【００３５】
上記第一から第三の工程は、「アカマツの根から外生菌根菌フリー細根を誘導する方法」の第一から第三の工程と同様にして行うことができる。
【００３６】
［第四の工程］
第四の工程において、誘導された外生菌根菌フリー細根に、マツタケの培養菌糸を接種する。ここで接種される「マツタケの培養菌糸」は、マツタケ菌株の菌糸を増殖培地で培養することにより調製することができる。マツタケ菌株は、ＡＴＣＣ（American Type culture Collection）より市販されているもの、例えばATCC 34979、ATCC 34981、ATCC 34988などを使用することができる。増殖培地は、一般に共生菌の増殖維持に使用可能な培地を使用することができるが、マツタケ菌株の増殖効率の観点から、太田培地（後述の実施例に記載）が好ましく使用され、固体培地、液体培地の何れも使用可能である。
【００３７】
「マツタケの培養菌糸」は、例えば以下のとおり調製することができる。マツタケ菌株の菌糸を、まず太田寒天培地で培養して増殖させる。次いで増殖した菌糸を寒天ごと太田液体培地に接種し培養する。液体培地中で増殖した菌糸（塊）を、例えば１ｃｍ角に切り、「マツタケの培養菌糸」として使用することができる。
【００３８】
上述のとおり調製された「マツタケの培養菌糸」を、第三の工程で誘導された「外生菌根菌フリー細根」に接種する。接種は、「マツタケの培養菌糸」を「外生菌根菌フリー細根」と接触させて配置させることにより行うことができる。菌糸の接種効率を上げるために、好ましくは、マツタケの培養菌糸を「外生菌根菌フリー細根」に固定する。固定は、マツタケの培養菌糸を「外生菌根菌フリー細根」に糸で括りつけることにより行うことができる。誘導された「外生菌根菌フリー細根」に、マツタケの培養菌糸を接種した様子の一例を、図２に示す。
【００３９】
［第五の工程］
第五の工程において、マツタケの培養菌糸を接種された細根を、アカマツが生育する土壌から隔離された培養基質中で生育させる。
【００４０】
「培養基質」は、マツタケの菌糸とアカマツの根とが菌根をつくる場を提供するものであり、マツタケ菌糸とアカマツの根の両方の生育に適したものであれば特に限定されない。マツタケ菌糸とアカマツの根の両方の生育に適した基質として、黒色土とアカマツ樹皮粉を含むものを使用することができる。アカマツ樹皮粉は、菌糸の成長効率を高めるために培養基質に含有させることが好ましい。培養基質は、例えば、黒色土（本実施例では関東ローム層を母材とする黒色土）とバーミキュライトとアカマツ樹皮粉の混合物を用いることができる。培養基質は、使用前に滅菌し、マツタケ以外の菌の混入を防ぐことが望ましい。また、培養基質は、マツタケ菌糸とアカマツの根の生育のために水分を保持している必要があるが、滅菌前に水分を保持させても、滅菌後に水分を保持させても何れでもよい。
【００４１】
本工程において培養基質は、アカマツが生育する土壌から隔離された状況で、マツタケ菌根の合成のために使用される。すなわち、本工程では、アカマツが生育する土壌から隔離された培養基質中で、マツタケの培養菌糸を接種された細根を生育させる。ここで、培養基質を、アカマツが生育する土壌から隔離するのは、土壌中の菌が培養基質に混入してマツタケ菌根の合成を妨害しないようにするためである。
【００４２】
本工程は、例えば以下に記載のとおり行うことができる。水不透過性の袋内の上記培養基質に、マツタケの培養菌糸を接種された細根を埋め込む。さらに、水不透過性の袋のまわりを、上述の第三の工程で記載したようにミズゴケと水不透過性シートで包む。このとき、細根を分岐させた元の根（オーキシン処理した根）も包んでおく。
【００４３】
このように、アカマツが生育する土壌から細根を隔離して土中に埋め戻すと、およそ５週間後にマツタケ菌根の形成が観察される。
【００４４】
以上説明した本発明のマツタケ菌根合成方法によれば、アカマツが生育する野外において、従来合成不可能であったマツタケ菌根を人工的につくりだすことができる。このようにマツタケ菌根の野外での人工合成に成功したのは、本発明で「外生菌根菌フリー細根」を人工的に誘導できたことに基く。本発明の方法により合成されたマツタケ菌根は、マツタケの人工栽培法を確立する基礎となるものであるため非常に有用である。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
１）外生菌根菌フリー細根の誘導
外生菌根菌フリー細根の誘導は、広島県加計町 加計試験地のアカマツ天然林において2001年秋に行った。
【００４７】
アカマツ成木周辺の土壌を掘り、直径0.5〜1ｃｍのアカマツの根を約50ｃｍ露出させる。露出した根の表面を水道水で洗浄し、根の形成層に達する切れ込みをナイフを用いて２〜３ｃｍ間隔でつける。根の表面に0.5％ＩＢＡ粉剤（オキシベロン粉剤0.5、塩野義製薬）を１〜２ｇ塗布した後、根を、水で湿らせたミズゴケ（天然ミズゴケ、アイリスオーヤマ株式会社）で包む。さらにミズゴケのまわりをプラスチックシートで覆い、土中に埋め戻す（図１参照）。
【００４８】
この処理の結果、処理後６ヶ月以降、処理根からの発根が観察され、１年後には、50本の処理根の76％に、「外生菌根菌フリー細根」が認められた（図２参照）。また、水道水で洗浄した根の幾つかに対し、表面殺菌処理（有効塩素農度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に10分間浸漬）を行った。この殺菌処理の有無に関わらず、外生菌根の形成は認められなかったことから、マツタケ菌根の合成には根の洗浄処理のみで充分であると考えられた。また、オーキシン処理を行わなかったコントロールについては、発根が観察されなかった。以上の結果より、アカマツ成木の根から「外生菌根菌フリー細根」を誘導する新規方法が確立された。
【００４９】
２）マツタケ菌糸の接種源の調製
マツタケ菌株の保存菌糸（菌株名Ｔ２；発明者研究室にて保存）の一部を、太田寒天培地（Ohta (1990) Trans. Mycol. Soc. Japan 31: 323-334）で４週間培養する。以下に太田培地の組成を示す。
【表１】
2005052088.tif 000002
増殖させた菌糸を５〜10ｍｍ3角に寒天ごと切り取り、切り取った寒天20片を、100ｍＬ容三角フラスコ中の太田液体培地10ｍＬに接種する。４週間静置培養した後、増殖したマツタケ菌糸を滅菌水で洗浄する。得られた菌糸を１×１×１ｃｍ角に切り、「マツタケ菌糸の接種源」とする。上記方法により、残存培地の量が少ない接種源が調製された。
【００５０】
３）マツタケ菌根合成のための培養基質の調製
東京大学構内の植栽樹木下土壌を掘り取って、篩にかけ、土の顆粒サイズを３ｍｍ以下に調整する。サイズの揃った土とバーミキュライトを、それぞれ乾熱滅菌器で60℃、24時間乾燥させる。アカマツ成木から外樹皮を採取し、２ｍｍ幅に刻んだ後に、ミルで粉砕し、アカマツ樹皮粉を調製する。調製した土、バーミキュライトおよびアカマツ樹皮粉を、５：５：１（v/v/v）の割合で混合し、蒸留水を加えて最終的な含水率を30％にし、培養基質を調製する。調製した培養基質250ｍＬを、20×26ｃｍのポリプロピレン製（ＰＰ）の袋に詰め、オートクレーブで121℃、30分間の滅菌を行う。３日後に同条件でもう１回滅菌を行い、マツタケ菌根合成に使用される「培養基質」を調製する。上記方法により、マツタケ菌根の形成に適正な培養基質が調製された。
【００５１】
４）外生菌根菌フリー細根へのマツタケ菌糸の接種
上述の新たに発根した「外生菌根菌フリー細根」上に、上述のとおり調製した「マツタケ菌糸の接種源」を置き、細根と接種源をを木綿糸で縛り固定する（図２参照）。マツタケ菌糸を接種した接種部の細根を含む根（約20ｃｍ）を、上述のとおり調製したＰＰ袋中の「培養基質」に埋め込み、袋の口を閉じる。さらに、ＰＰ袋の周りをミズゴケとビニールシートで包み、土中に埋め戻す。
【００５２】
このようにしてマツタケ菌糸を接種した結果、５週間後に、外生菌根に特異的な微細構造であるハルティッヒネット(Hartig net)が観察された。
【００５３】
また、ＩＴＳ（internal transcribed spacer）領域のプライマー対
Forward primer：５’−ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ−３’（配列番号１）（Gardes and Bruns (1993) Mol.Ecol. 2: 113-118）
Reverse primer：５’−ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’（配列番号２）（White et al. (1990) PCR Protocols 315-322, Academic Press）
と、マツタケに特異的なＩＴＳ領域のプライマー対（Kikuchi et al. (2000) Mycol.Res. 104: 1427-1430）
Forward primer：５’−ＣＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＣＴＣＧＧＴ−３’（配列番号３）
Reverse primer：５’−ＧＡＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＡＣＣＴＡ−３’（配列番号４）
を用いたnested-ＰＣＲ法によるＤＮＡ解析により、観察された外生菌根が、マツタケのものであることが確認された。これにより、アカマツ成木を用いたマツタケ菌根の人工合成法が確立された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】オーキシン処理された根が「アカマツが生育する土壌から隔離された発根可能な状況」に置かれた様子の一例を示す写真。
【図２】誘導された「外生菌根菌フリー細根」に、マツタケの培養菌糸を接種した様子の一例を示す写真。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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