(57)【要約】【課題】  簡便な手段により、アルコール耐性酵母のみを選択的かつ持続的に培養し、純粋なアルコール耐性酵母を選択的に分離取得する方法を提供すること。【解決手段】  澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖を含有させた固体培地を用いてアルコール耐性酵母を培養することにより、固体培地におけるアルコール成分が、アルコール耐性酵母以外の雑菌の生育を効果的に抑え、かつ、澱粉質原料からなるベースに発酵性糖を含有させた固体培地という培地の構造が、アルコール耐性酵母の培養を制御（コントロール）して、持続的な培養が可能となり、簡便な手段で、純粋なアルコール耐性酵母を選択的に培養取得することが可能となる。澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖に加えて、乳酸及び／又は乳酸菌を含有させることにより、雑菌の生育の抑制をより効果的に行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖を含有させた固体培地を用いることを特徴とするアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項２】
アルコール及び発酵性糖に加えて、乳酸及び／又は乳酸菌を含有させることを特徴とする請求項１記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項３】
澱粉質原料からなるベースが、穀類誘導製品からなるベースであることを特徴とする請求項１又は２記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項４】
穀類誘導製品からなるベースが、小麦及び／又は大麦からなるパン生地であることを特徴とする請求項３記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項５】
発酵性糖が、グルコース、マルトース、蔗糖、或いは、それらのいずれかを含む糖含有物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項６】
発酵性糖が、培地に澱粉分解酵素、或いは、澱粉分解酵素生成或いは含有微生物又は植物を含有させることにより生成される発酵性糖を含むものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項７】
澱粉分解酵素生成或いは含有微生物又は植物が、麹菌又は麦芽であることを特徴とする請求項６記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項８】
培地に含有させるアルコールが、エチルアルコールであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項９】
培地に含有させるアルコールの濃度が、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項１０】
培地に含有させるアルコールの濃度が、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上であり、かつ、培地中の乳酸成分濃度が１０００ｐｐｍ以上であることを特徴とする請求項９記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【請求項１１】
選択的に培養取得するアルコール耐性酵母が、固体培地の調製工程で、天然界から自然に培地に混入した酵母、或いは、酵母培養物を培地に添加した酵母であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形培地を用いたアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール耐性酵母は、古来より、アルコール含有飲料等のアルコール製造用酵母として利用されてきた。日本酒、ビール、ブドウ酒等のアルコール含有飲料の醸造用に用いられる酵母は、その殆どがSacchayomyces属に属する。著名な酵母としては、例えば、日本酒酵母S.sakeや上面ビール酵母は、S．cerevisiaeの部類に、ブドウ酒酵母は、S.ellipsoideusに属する。また、日本やドイツのビール酵母の大部分は、下面ビール酵母S.carlsbergensisの系統に属する。これらのアルコール醸造用酵母については、多くの優良な系統が分離され、利用されてきた。
例えば、清酒用酵母については、日本の醸造試験所で開発された清酒用酵母、醸造協会６号、７号が現在も広く利用されている（木下祝郎著「新版  発酵工業」大日本図書株式会社（昭和６１年２月２８日）Ｐ２４−２６）。また、日本やドイツで下面発酵ビールの製造に広く利用されているＳ.carlsbergensisも、Hansenがカールスベルヒのビール工場の下面酵母から分離したものであり（１８８１年）、ビール酵母の純粋培養の初めての例として知られている。
【０００３】
近年においても、酵母の優良菌株の育種が進められている。アルコール飲料等の醸造のために用いる酵母についても、優良な性質を持つ酵母の開発が進められており、種々の選択培地を用いた酵母の培養分離法が用いられている。例えば、コンセント・マスト希釈果汁及び酢酸鉛含有選択培地を用いて、醸造酒を製造した場合に硫化水素臭非生産性の酵母を（特開平８−２１４８６９号公報）、トリコセシンやオレオバシジンＡを含有する選択培地を用いて、少酸性酒類を製造することのできる酵母を（特開平１０−１０８６６７号公報）、トリコセシン含有選択培地を用いて高アルコール生産酵母を（特開平１０−２１５８６０号公報）、オリゴマイシン含有選択培地を用いて、高濃度のアルコールを含有するもろみを製造する酵母を（特開２０００−６０５３８号公報）、２−フロオロエタノール含有選択培地を用いて、高アルコール生産酵母を（特開２００１−１２８６６４号公報）、ｐＨ２．７以下の選択培地を用いて、リンゴ酸、コハク酸、及び酢酸イソアミルがバランスよく高生成する酵母を（特開２００３−１６９６６６号公報）、培養分離する方法が開示されている。
【０００４】
酵母の改良が進められ、アルコール飲料の醸造等のための優良な酵母が種々分離される中で、アルコール飲料の醸造のために、醸造工場で使用する酵母は、原則的には優良な性質を持つ酵母の純粋培養であることが前提条件となっている。酵母の純粋培養は、優良な性質を持つ酵母の単一細胞の増殖を目的として行われる。これまでに知られている単一細胞の分離法としては、平板培養法、Lindner小滴培養法、マイクロマニピュレーター法などがあるが、いずれも、液体培地を想定したものであり、また、滅菌または無菌的な特別の環境で行う必要があった。更に、例えば、アルコール耐性酵母を選抜・評価するためには、酵母を培養して、アルコール耐性を評価して、該耐性を有する酵母を選抜するための手段が別に必要になるため、アルコール耐性酵母の純粋培養を簡易かつ効果的に行うことはできなかった。したがって、従来の方法では、環境を整備・作業するための労力やエネルギーが必要不可欠であった。
【０００５】
中国の白酎の発酵方法に、固体発酵モロミにアルコール蒸留の初留液と終留液を添加して高いアルコール濃度環境のなかで発酵させるというものがある。しかし、この方法では、蒸留酒が添加されており、蒸留酒を用いるということは、発酵性糖が存在しないので、酵母の培養を続けることができず、持続的なアルコール耐性酵母の純粋培養法に応用することはできなかった。したがって、アルコール飲料等の製造に際して、アルコール耐性酵母を醸造工場等で使用するに際して、アルコール耐性酵母を選択的に培養し、より純粋化する簡便な方法が望まれていた。
【０００６】
一方、アルコール飲料の醸造のために、醸造工場で使用する酵母は、酵母の純粋培養とともに、酵母の雑菌等による汚染からも、防御されていることが要求された。したがって、醸造に際しては、酵母のみの無菌状態を得る目的で、酸、アルカリ、蒸気および熱水などで発酵系内を充分に洗浄・殺菌する事が行われ、また、原料や副原料に関しても、澱粉のアルファ化を目的とする以外でも頻繁に加熱殺菌が行われ、無菌状態を保持することについて、注意が払われると共に、用いる酵母も雑菌に対して、純粋であることが要求された。
【特許文献１】特開平８−２１４８６９号公報。
【特許文献２】特開平１０−１０８６６７号公報。
【特許文献３】特開平１０−２１５８６０号公報。
【特許文献４】特開２０００−６０５３８号公報。
【特許文献５】特開２００１−１２８６６４号公報。
【特許文献６】特開２００３−１６９６６６号公報。
【非特許文献１】木下祝郎著「新版  発酵工業」大日本図書株式会社（昭和６１年２月２８日）Ｐ２４−２６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、アルコール耐性酵母を選択的に培養取得する方法、特には、簡便な手段により、アルコール耐性酵母のみを選択的かつ持続的に培養し、純粋なアルコール耐性酵母を選択的に分離取得する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を達成すべく、鋭意研究の結果、澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖を含有させた固体培地を用いてアルコール耐性酵母を培養することにより、固体培地におけるアルコール成分が、アルコール耐性酵母以外の雑菌の生育を効果的に抑え、かつ、澱粉質原料からなるベースに発酵性糖を含有させた固体培地という培地の構造が、アルコール耐性酵母の培養を制御（コントロール）して、持続的な培養が可能となり、簡便な手段で、純粋なアルコール耐性酵母を選択的に培養取得することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の方法においては、固体培地であるが故に、少ないアルコールの存在下、或いは、発生でも容易に高いアルコール濃度が得られて、効果的な雑菌の生育の抑制が可能であり、かつ、澱粉質原料からなるベースの固体培地を用いたために、そこから発酵性糖を供給しつづけることが可能となり、更に、発酵性糖が固体培地の中に分散して存在するために、発酵性糖の供給が調整され、アルコール耐性酵母の制御（コントロール）され、かつ、持続的な培養が可能となる。
【００１０】
本発明の方法においては、澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖に加えて、乳酸及び／又は乳酸菌を含有させることにより、雑菌の生育の抑制をより効果的に行うことができる。
【００１１】
本発明の方法においては、澱粉質原料からなるベースの固体培地に、澱粉分解酵素（アミラーゼ）、或いは、麹菌のような澱粉分解酵素生成微生物又は麦芽のような澱粉分解酵素含有植物を含有させることにより、澱粉質原料からなるベースからの発酵性糖をアルコール耐性酵母に供給することができる。本発明において、培地に含有させるアルコールとしては６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上で、アルコール耐性酵母の生育が阻害されない範囲の濃度が好ましく、アルコール濃度が６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上、乳酸成分濃度が１０００ｐｐｍ以上であると、雑菌の生育を完全に抑えることができる。なお、この濃度範囲の周辺（アルコール濃度６〜７ｖｏｌ／ｖｏｌ％、乳酸成分濃度１０００〜１５００ｐｐｍ）のものが、酵母の活性においても特に優れていることが確認された。
【００１２】
本発明で選択的に培養取得するアルコール耐性酵母の供給源としては、固体培地の調製工程で、天然界から自然に培地に混入した酵母、或いは、他のアルコール等の醸造において既に培養されていた酵母培養物を培地に添加した酵母等が挙げられる。
【００１３】
具体的には本発明は、澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖を含有させた固体培地を用いることを特徴とするアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項１）や、アルコール及び発酵性糖に加えて、乳酸及び／又は乳酸菌を含有させることを特徴とする請求項１記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項２）や、澱粉質原料からなるベースが、穀類誘導製品からなるベースであることを特徴とする請求項１又は２記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項３）や、穀類誘導製品からなるベースが、小麦及び／又は大麦からなるパン生地であることを特徴とする請求項３記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項４）や、発酵性糖が、グルコース、マルトース、蔗糖、或いは、それらのいずれかを含む糖含有物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項５）や、発酵性糖が、培地に澱粉分解酵素、或いは、澱粉分解酵素生成或いは含有微生物又は植物を含有させることにより生成される発酵性糖を含むものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項６）からなる。
【００１４】
また本発明は、澱粉分解酵素生成或いは含有微生物又は植物が、麹菌又は麦芽であることを特徴とする請求項６記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項７）や、培地に含有させるアルコールが、エチルアルコールであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項８）や、培地に含有させるアルコールの濃度が、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項９）や、培地に含有させるアルコールの濃度が、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上であり、かつ、培地中の乳酸成分濃度が１０００ｐｐｍ以上であることを特徴とする請求項９記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項１０）や、選択的に培養取得するアルコール耐性酵母が、固体培地の調製工程で、天然界から自然に培地に混入した酵母、或いは、酵母培養物を培地に添加した酵母であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載のアルコール耐性酵母の選択的培養取得方法（請求項１１）からなる。
【発明の効果】
【００１５】
アルコール飲料の醸造のために、醸造工場で使用する酵母は、原則的には優良な性質を持つ酵母の純粋培養であることが前提条件となっており、醸造工場でのアルコール飲料の醸造に際しては、アルコール耐性に優れた純粋な酵母の調製が要求される。本発明の方法によれば、特別の設備や労力を要することなく、簡便な手段により、アルコール耐性酵母のみを選択的に培養した酵母を取得することができる。すなわち、本発明によれば、澱粉質原料からなるベースに、アルコールや乳酸を含有させることにより、一定濃度の乳酸とアルコール成分が共存する環境を持続できるので、大気開放の条件でも雑菌の生育を抑えることができ、容易に純粋な醸造用酵母を選択的に培養することができる。また、本発明の方法によれば、発酵性糖を持続的に供給することにより、アルコール耐性酵母の選択的な培養を、持続的に行うことが可能であり、酵母を活性な状態で、持続的に供給することができる。更に、本発明においては、固体培地のベースとして、澱粉質原料を使用したことから、本発明の方法により培養取得したアルコール耐性酵母は、アルコール飲料の醸造等に用いる種酵母として、或いはスターターとして、直接用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、澱粉質原料からなるベースに、アルコール及び発酵性糖を含有させた固体培地を用い、アルコール耐性酵母を選択的に培養取得する方法よりなる。本発明においては、該アルコール及び発酵性糖に加えて、乳酸及び／又は乳酸菌を含有させ、雑菌の生育をより効果的に行うことができる。
【００１７】
本発明で固体培地のベースとなる澱粉質原料としては、穀類及びその粉末等を挙げることができ、その穀類及びその粉末から調製される穀類誘導製品をベースとして用いることができる。特に、好ましい例として、小麦及び／又は大麦からなるパン生地（ドウ）を挙げることができる。更に、好ましい例として麦芽粉を用いることができる。また、固体培地のベースとしては、小麦又は大麦に酵母乳酸菌を含むサワードウやロシア・クワスのようなライ麦を使用したものであっても良い。
【００１８】
本発明で培地に含有させるアルコールとしては、エチルアルコールを挙げることができる。エチルアルコールは、培地に添加されたものと、酵母の成育に伴って、発酵によって生成されるアルコール成分とが挙げられる。発酵によって生成されるアルコール成分は、エチルアルコールを主成分とするものである。培地に含有させるアルコールの濃度は、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上が好ましく、アルコール耐性酵母の生育が阻害されない範囲の濃度（好気下約２３ｖｏｌ／ｖｏｌ％、嫌気下１３〜１５ｖｏｌ／ｖｏｌ％以下）であることが好ましい。
【００１９】
本発明においては、アルコールや乳酸或いは乳酸菌を含有させることにより、一定濃度の乳酸とアルコール成分が共存する環境を持続させて、雑菌の生育を抑制することができる。固体培地中、アルコール成分濃度が６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上であり、かつ乳酸成分濃度が１０００ｐｐｍ以上の環境を作り出すことで、酵母以外の雑菌は、完全に排除することが可能になる。但し、このとき、グルコースやマルトース等の発酵性糖を存在させておかなければならない。ここで、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上のアルコール成分濃度を液体培地中のアルコール成分濃度に置き換えると、少なくとも酢酸菌の生育不可能なアルコール成分濃度である１０ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上のアルコール成分濃度に相当することになる。
【００２０】
本発明においては、乳酸とアルコールの２成分の存在により、雑菌の生育を抑えてアルコール耐性酵母を選択的に培養しつつ、純粋化したアルコール耐性酵母を取得することできるが、本発明の培地が固体培地であることから、少ないアルコールの発生でも容易に高いアルコール濃度が得られる。すなわち、固体培地は、液体培地と比べて、雑菌の抑制効果に優れている。例えば、酵母による発酵で生じるアルコール成分の量は一定であったとしても、液体培地では、水等の液体の存在によってその濃度が薄められのに対して、固体培地の場合は、発酵で生じたアルコール成分はほとんど薄められることはないので、濃いアルコール成分濃度を維持することが可能になる。また、おそらく固体培地中では、グルコース分子等に存在する水酸基（−ＯＨ）と、もともと少ない水分子中の水酸基（−ＯＨ）が水素結合により結合して存在することにより、菌の生育抑制に実効性のある遊離したエタノールの割合が相対的に増し、液体培地に比べて実際のアルコール濃度が増大することも原因となると考えられる。したがって、液体培地で成育可能なアルコール耐性のない雑菌であっても、固体培地ではその成育が抑制されることになる。
【００２１】
本発明によれば、一定濃度の乳酸とアルコール成分が共存する環境を持続できるので、大気開放の条件でも容易に醸造用酵母を選択的に培養することができる。また、アルコール成分濃度が１０％を越えると酢酸菌の生育を停止させることが可能になるので、固体培地に含有される乳酸菌や酢酸菌を、アルコール耐性酵母の固体培地中での発酵により、すばやくアルコール成分濃度を上げることで該乳酸菌や酢酸菌を加熱によらず効果的に排除することもできる。更に、本発明においては、乳酸とアルコール成分が共存する環境で培養を持続するので、例えば、アルコール成分濃度が低いときに存在する乳酸菌は、発酵によって乳酸を発生させるため、固体培地中のｐＨを低下させることが可能になる。これによって、低ｐＨで成育できない雑菌を抑制することが可能になる。
【００２２】
本発明において、澱粉質原料からなるベースに含有させる発酵性糖としては、酵母が利用できるグルコース、マルトース及び蔗糖を挙げることができる。また、発酵性糖としては、グルコースやマルトース或いは蔗糖等を含む糖含有物として添加されても良い。更に、発酵性糖が、培地に澱粉分解酵素、或いは、澱粉分解酵素を生成する或いは含有する微生物又は植物を含有させることにより、澱粉質原料からなるベースから生成されるものであっても良い。該澱粉分解酵素生成或いは含有微生物又は植物としては、麹菌又は麦芽粉のように活性酵素（アミラーゼ）を含有植物を挙げることができる。また、澱粉分解酵素としては、麦芽の活性酵素或いはカビ由来等の精製された酵素を挙げることができ、該酵素によりパン生地等の澱粉質を糖化させ、その糖化成分に含まれる発酵性の糖により酵母の成育を助長させる。
【００２３】
本発明において、澱粉質原料からなるベースに、アルコール成分や発酵性糖を含有させるには、アルコール成分については、初期の段階でエチルアルコールのようなアルコール成分を固体培地中に練り込むなどして培地中に分散・含有させておくことが必要になる。その後、酵母の発酵に伴って発生してくるアルコール成分が固体培地中に分散することになるため、アルコール成分が含有された環境を持続することが可能になる。また、発酵性糖については、予め、その成分を固体培地中に練りこむ等の方法により含有させておくことが有効になる。また、例えば、麦芽粉のような原料を固体培地に使用することで麦芽粉に含まれるアミラーゼ等の活性酵素が作用し、固体培地中の澱粉質を発酵性糖に分解することが可能になるため、発酵性糖が含有された環境を持続することが可能になる。
【００２４】
本発明においては、本発明の固体培地に、アルコール成分および発酵性糖を含有させるに際し、デーツワインで代表される果実酒のような醸造酒を、アルコール成分および発酵性糖の供給源として添加することもできる。つまり、醸造酒をパン生地のような固体培地に練りこむことによって、アルコール成分と残存する発酵性糖（グルコースなど）や乳酸が共存する環境を作り出すことができる。これにより、アルコール耐性がある酵母の死滅を防止することができる。特に、デーツなどの乾果を混ぜておけば、発酵性の糖が内部からゆっくり浸出して行き、麹がゆっくり澱粉を分解しているのと同様の効果によって、酵母の死滅を防ぐのと同時に発酵を持続させる効果を保持できるため、有効である。尚、このときデーツ乾果を刻むとすぐに発酵が終了し、高いアルコール度は得られないので、留意する必要がある。
【００２５】
本発明の方法において、選択的に培養され、純化されて取得されるアルコール耐性酵母としては、固体培地の調製工程（アルコール成分や発酵性糖等の練り込み作業時）で、天然界から自然に培地に混入した酵母を用いることができる。また、他のアルコール等の醸造において既に培養されていた酵母培養物を培地に添加して、アルコール耐性酵母の供給源として利用することができる。また、乳酸についても、添加した、或いは、天然界から自然に培地に混入した乳酸菌によって生成された乳酸を利用することができる。更に、酵母自体も乳酸を生成し、その生成した乳酸を利用することができる。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
［自然発酵試験］
乳酸菌、酵母及びその他の雑菌が含む環境で、アミラーゼ源として必要な小麦麦芽粉に０〜６ｖｏｌ／ｖｏｌ％のアルコール溶液を練り込み、自然発酵試験を行った。
【００２８】
図１は、小麦麦芽の自然発酵に及ぼすアルコール濃度の影響について試験した結果を示す。糖度は麦芽内のアミラーゼの力で一定に上昇する力がある。一方麦芽内微生物はそれぞれの分裂周期で２倍ずつに増殖するため糖度曲線を分裂周期にあわせて周期的に下方へ折り曲げる。また乳酸菌などはプロテアーゼで麦芽酵素を分解するのでアミラーゼ力価は時間とともに低下する。増殖周期は病原菌では１０分程度（腸炎ビブリオ）から酵母などは１０℃くらいの麦汁で３−４日である。澱粉質が尽きた場合それ以上の減少はないため曲線は水平になる。従って、図１よりほぼ平均的な分裂周期が読み取れる。
【００２９】
なお、純粋な１００ｖｏｌ／ｖｏｌ％エチルアルコールは屈折計糖度では約６ｖｏｌ／ｖｏｌ％に相当する。５ｖｏｌ／ｖｏｌ％エチルアルコールでは０．３ｖｏｌ／ｖｏｌ％相当である。添加エチルアルコール濃度に応じて糖度が高いのはその影響もある。
【００３０】
図１から、曲線のグループは３種類にグループ分け出来る。（１）０ｖｏｌ／ｖｏｌ％、（２）３−５ｖｏｌ／ｖｏｌ％、および（３）６ｖｏｌ／ｖｏｌ％である。それぞれの群の周期を見るとおおよそ０ｖｏｌ／ｖｏｌ％→１日強、３−４ｖｏｌ／ｖｏｌ％→２日、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％が３−４日程度。６ｖｏｌ／ｖｏｌ％区では約３日ごとに糖度の曲線が曲がっている。いずれにせよ、アルコール３ｖｏｌ／ｖｏｌ％を越えると静菌効果は現れているようで、６ｖｏｌ／ｖｏｌ％では明らかな変化が見られる。０ｖｏｌ／ｖｏｌ％はあらゆる雑菌がありその中で最も増殖の早い菌種の効果であると判断できる。１−１.５日の周期で（平均的に）２回の分裂が行われたように見える。
【００３１】
上記のように、図１を見ると、アルコール３ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上のものでは、３−４日程度の範囲で、糖度曲線が平坦から下方へ折り曲がっている。アルコール６ｖｏｌ／ｖｏｌ％のものは、３−４日で変曲し、アルコールが残存するためしばらくは平坦に移行する。この変曲時間をみれば、アルコール３ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上のものの変曲は、酵母の分裂周期（３−４日）を表しており、このことからこのアルコール濃度のものは、酵母が増殖していることがわかる。一方、Blankを見れば、２日目程度で、糖度曲線が平坦から下方へ折り曲がっている。これから、酵母以外の雑菌が増殖していることが分かる。図１に示されるように、添加アルコール濃度に従って、その濃度で生存できる菌種が限られる。清酒の微生物の変遷からは当初Pseudomonus属の菌が成育したあと、次に野生酵母と乳酸菌が成育して最後に酵母が生育してくる。
【００３２】
図２は、小麦麦芽の自然発酵におけるｐＨに及ぼすアルコール濃度の影響について調べた結果について示している。ｐＨの変化では、３日後には０〜６ｖｏｌ／ｖｏｌ％区のいずれもｐＨ４以下になっている。溶液中のアルコール濃度が高いほうが、ｐＨは下がりにくいことが明らかである。３日後には、アルコール濃度によらず雑菌の抑制に必要なｐＨ値（約３．５以下）への低下が見られるので、アルコール濃度で微生物に対して選択圧をかけるとき、３日間置けば乳酸の選択圧も加味されて相乗的な効果が得られることが示されている。雑菌の死滅に要する期間は不明であるが、死滅に必要な条件を整える期間は３日間で充分である。この実施例における乳酸は、天然界から培地に混入した乳酸菌によって生成されるものと、酵母自身の生成する乳酸によるものである。
【００３３】
また、７日間の培養後、各サンプルについて顕微鏡による観察を行ったところ、アルコール濃度が６ｖｏｌ／ｖｏｌ％のサンプルについてだけ、純粋な酵母の存在が確認された。
【実施例２】
【００３４】
麦芽粉のサワードウにデーツ酒（アルコール成分濃度が６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上）を混ぜ込む事で酵母の選択培養を試みた。
【００３５】
デュラム小麦粉５０ｇに大麦麦芽粉５０ｇを加え、乾燥酵母、Saccharomyces cerevisiae（ビール酵母）を約２ｍｌ添加して、混練した後、これにデーツ酒（アルコール成分濃度が６ｖｏｌ／ｖｏｌ％以上）を混ぜ込み、同時に乳酸菌としてLactobacillus（bulgaricus）を約１０5のレベルで添加して、混ぜ込み、麦芽粉のサワードウを調製した。これを常温で、１１日間培養した後、顕微鏡により調査した。調査の結果、雑菌等の混入は認められなかった。更に、培養した酵母を培養試験に供したところ、ビール酵母のコロニーが認められ、雑菌の混入は検知できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施例において、小麦麦芽の自然発酵に及ぼすアルコール濃度の影響について試験した結果を示す図である。
【図２】本発明のの実施例において、小麦麦芽の自然発酵におけるｐＨに及ぼすアルコール濃度の影響について調べた結果について示す図である。
【図１】
2005052084.tif 000002
【図２】
2005052084.tif 000003