(57)【要約】【課題】  ヤマノイモ属植物のえそモザイク病に対する有効かつ効率的な防除方法を提供し、これにより、農薬や資材、肥料、種苗費などの経費節減および作物管理労力の節減を図る。【解決手段】  ヤマノイモ属植物の葉にえそモザイク症状を生じさせないか、または軽微なえそモザイク症状しか生じさせないことを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルス。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマノイモ属植物の葉にえそモザイク症状を生じさせないか、または軽微なえそモザイク症状しか生じさせないことを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項２】
配列番号１記載の塩基配列（但し、配列中のTはUである。）で表されるRNAを有することを特徴とする請求項１記載のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予めヤマノイモ属植物に接種することを特徴とするヤマノイモえそモザイク病の防除方法。
【請求項４】
請求項１又は請求項２記載のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスをヤマノイモ属植物に接種することを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルス抵抗性植物の作出方法。
【請求項５】
請求項１又は請求項２記載のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスに感染したヤマノイモ属植物を、イモ、ムカゴまたは組織培養によって繁殖させることを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルス抵抗性植物の繁殖方法。
【請求項６】
配列番号１記載の塩基配列（但し、核酸がRNAの場合、配列中のTはUである。）で表される核酸。
【請求項７】
ヤマノイモえそモザイクウイルスのゲノムRNAにおいて特定の位置に存在する変異を検出することにより、前記ウイルスが弱毒株であるかどうかを識別する方法であって、前記特定の位置に存在する変異が、配列番号１記載の塩基配列における7321番目又は8154番目の位置に対応するゲノムRNA上の位置に存在する変異であることを特徴とする前記ウイルスの弱毒株の識別方法。
【請求項８】
ヤマノイモえそモザイクウイルスのゲノムRNAにおいて特定の位置に存在する変異を検出することにより、前記ウイルスが弱毒株であるかどうかを識別する方法であって、前記特定の位置に存在する変異が、配列番号１記載の塩基配列における7127番目から7426番目の領域に対応するゲノムRNA上の領域に含まれる変異であることを特徴とする前記ウイルスの弱毒株の識別方法。
【請求項９】
特定の位置に存在する変異を検出する方法が、SSCP法であることを特徴とする請求項７又は請求項８記載の弱毒株の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤマノイモ属植物に感染し病害をもたらすヤマノイモえそモザイクウイルス（以下「ChYNMV」と略す）に対する弱毒ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヤマノイモえそモザイク病は、主にナガイモに発症するウイルス病の一つであり、その原因ウイルスは、ChYNMVとされている。ナガイモは栄養繁殖性作物であるため、ウイルス病による被害が大きく、ChYNMV強毒株が感染した種イモを植付けた場合、30〜45%の減収になる。現状では、他の植物ウイルス病と同様に、その感染ウイルスの排除に有効な薬剤がない。この対策として、ナガイモでは茎頂培養によるウイルスフリー株の生産が行われているが、圃場では短期間のうちにアブラムシによってウイルスが再感染してしまう。そのため、ウイルス被害を減らすためには、ウイルス媒介昆虫であるアブラムシの農薬による駆除、および多大な労力をかけてのウイルス再感染株の抜き取りまたは高価なウイルスフリー株の頻繁な購入をしなければならず、安全で効率的なウイルス病の防除は困難であった。また、現在までウイルス抵抗性品種は見つかっていない。
【特許文献１】特許第3038433号公報
【非特許文献１】日本植物病理学会報  第67巻  第2号  p155−156（平成13年8月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ヤマノイモ属植物に接種した場合、ウイルス症状が軽微であり、強毒ウイルスの感染に対して安定的に防除効果を示す弱毒ウイルスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、ウイルス症状が軽微で、イモおよびムカゴ等の栄養繁殖による増殖を経てもウイルス症状が安定して軽微な、ChYNMVの弱毒株を自然界より得ることに成功し、この弱毒ウイルスを利用することによりヤマノイモえそモザイク病の防除が可能となることを見いだし、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明の第一は、ヤマノイモ属植物の葉にえそモザイク症状を生じさせないか、または軽微なえそモザイク症状しか生じさせないことを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスである。
【０００６】
本発明の第二は、上記のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予めヤマノイモ属植物に接種することを特徴とするヤマノイモえそモザイク病の防除方法である。
【０００７】
本発明の第三は、上記のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスをヤマノイモ属植物に接種することを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルス抵抗性植物の作出方法である。
【０００８】
本発明の第四は、上記のヤマノイモえそモザイクウイルスの弱毒ウイルスに感染したヤマノイモ属植物を、イモ、ムカゴまたは組織培養によって繁殖させることを特徴とするヤマノイモえそモザイクウイルス抵抗性植物の繁殖方法である。
【０００９】
本発明の第五は、配列番号１記載の塩基配列（但し、核酸がRNAの場合、配列中のTはUである。）で表される核酸である。
【００１０】
本発明の第六は、ヤマノイモえそモザイクウイルスのゲノムRNAにおいて特定の位置に存在する変異を検出することにより、前記ウイルスが弱毒株であるかどうかを識別する方法であって、前記特定の位置に存在する変異が、配列番号１記載の塩基配列における7321番目又は8154番目の位置に対応するゲノムRNA上の位置に存在する変異、又は配列番号１記載の塩基配列における7127番目から7426番目の領域に対応するゲノムRNA上の領域に含まれる変異であることを特徴とする前記ウイルスの弱毒株の識別方法である。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）弱毒ウイルス（第一発明）
本発明の弱毒ウイルスは、ヤマノイモ属植物の葉にえそモザイク症状を生じさせないか、または軽微なえそモザイク症状しか生じさせないことを特徴とするものである。
【００１２】
本発明の弱毒ウイルスの一例として、KM3を挙げることができる。KM3は、以下のようにして得られたウイルス株である。1997年、ChYNMVが発生している青森県のナガイモ生産圃場4カ所から約400株のムカゴを採集した。これらを温室内で2年間栽培し病徴観察および遺伝子診断によるウイルス検定を行い、無病徴あるいは病徴の軽微な13株を選抜した。次にこれらを3年間圃場栽培し、並行してアブラムシ接種による強毒ウイルスに対する防除効果試験を行った結果、安定して病徴が軽微で、強毒ウイルスに対する防除効果の高い弱毒ウイルスKM3を得た。このウイルス株は、本出願人によって保存維持されており、特許法施行規則２７条の３の規定に準ずる分譲は本出願人が保証する。
【００１３】
KM3は、配列番号１記載の塩基配列（但し、配列中のTはUである）で表されるRNAを有している。
【００１４】
本発明の弱毒ウイルスは、KM3に限定されるものではなく、上述したヤマノイモ属植物の葉にえそモザイク症状を生じさせないか、または軽微なえそモザイク症状しか生じさせない、という性質を示すウイルスを広く含む。このようなKM3以外の弱毒ウイルスとしては、上記塩基配列において１若しくは複数個の塩基が置換、欠失若しくは付加した塩基配列で表されるRNAを有し、上述した弱毒性という性質を有するウイルスが含まれる。ここで、塩基の置換等する個数は、通常100以下であり、好適には50以下であり、更に好適には10以下であり、特に好適には5以下である。
【００１５】
（２）防除方法（第二発明）
本発明の防除方法は、上記の本発明の弱毒ウイルスを、予めヤマノイモ属植物に接種することを特徴とするものである。
【００１６】
ウイルス接種の対象とするヤマノイモ属植物は、ヤマノイモ（Dioscorea）属に属するものであれば特に限定されず、ヤマノイモ（Dioscorea japonica Thunb.）、ナガイモ（Dioscorea opposita Thunb.）、ダイジョ(Dioscorea alata L.)、トゲドコロ(Dioscorea esculenta (Lour.) Burk.)などを例示できる。
【００１７】
弱毒ウイルスの接種は、例えば、ジャガイモヒゲナガアブラムシを2時間絶食させ、その後弱毒ウイルス感染ナガイモを5分間吸汁させ、直ちに健全ナガイモにアブラムシを移して再度1時間以上吸汁させればよい。
【００１８】
弱毒ウイルスの接種時期は特に限定されないが、幼苗期に接種するのが好ましい。
【００１９】
（３）ウイルス抵抗性植物の作出方法（第三発明）
本発明のウイルス抵抗性植物の作出方法は、本発明の弱毒ウイルスをヤマノイモ属植物に接種することを特徴とするものである。
【００２０】
ヤマノイモ属植物の種類、接種方法、接種時期は、上記防除方法と同様でよい。
【００２１】
（４）ウイルス抵抗性植物の繁殖方法（第四発明）
本発明のウイルス抵抗性植物の繁殖方法は、本発明の弱毒ウイルスに感染したヤマノイモ属植物を、イモ、ムカゴまたは組織培養によって繁殖させることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明の弱毒ウイルスが感染した種イモを、圃場あるいは施設内に植付け栽培することにより新たに得られるイモおよびムカゴは、既に組織内に移行している弱毒ウイルスにより、強毒ウイルスに対する抵抗性を持つ。同様に、弱毒ウイルスが感染したヤマノイモ属植物を、組織培養により増殖した個体についても、強毒ウイルスに対する抵抗性を持つ。ただしこの場合、生長点のような分裂組織のみの培養は除く。これら栄養繁殖によって、弱毒ウイルスの効果を持続することができるので、実際上生産者が栽培の度に弱毒ウイルスを接種する必要はなく、通常の栽培によりイモまたはムカゴを収穫することによって、弱毒ウイルスの防除効果を何シーズンにもわたって持続的に得ることができる。
【００２３】
（５）核酸（第五発明）
本発明の核酸は、配列番号１記載の塩基配列（但し、核酸がRNAの場合、配列中のTはUである。）で表されるものである。配列番号１記載の塩基配列で表されるDNAは、弱毒ウイルスKM3ゲノムの全塩基配列のcDNAである。この配列は、131〜133番のATGの読みとり枠で始まり、7991〜7993番のTAGで終了する一つの長大なオープンリーディングフレーム（ORF）を持ち、これにChYNMVがコードする全てのタンパク質が含まれる。
【００２４】
このDNAは、例えば、以下の方法により得ることができる。まず、弱毒ウイルスKM3が感染したナガイモからウイルス粒子を単離し、精製する。ウイルス粒子の精製は、常法に従っても良いが、Kondo, T. (2001) The 3'-terminal sequence of Chinese yam necrotic mosaic virus genomic RNA: a close relationship with macluravirus. Archives of Virology. 146: 1527-1535記載の方法に従って行うのが好ましい。次に、ウイルス粒子からRNAを抽出する。RNAの抽出は常法に従って行うことができる。抽出したRNAからcDNAを作製し、このcDNAを鋳型として、3'RACE法および5'RACE法に従って、特定のDNA断片を増幅する。このDNA断片を常法に従って繋ぐことにより、本発明のDNAを作製することができる。
【００２５】
本発明の核酸は、例えば、以下のような用途に利用することができる。
【００２６】
これまでに、植物ウイルスゲノムを利用した植物発現ベクターの開発がいくつか報告されている。ChYNMVが属するポティウイルス科のウイルスにおいても、植物で発現可能なプロモーター配列の下流にウイルスゲノムcDNAを連結し植物に接種することにより、植物内に自己増殖可能なウイルスを発現させることが可能であることが知られている（Takahashi, Y., Takahashi, T. and  Uyeda, I.(1997) A cDNA clone to clover yellow vein potyvirus genome is highly infectious. Virus Genes. 14: 235-243）。この方法を利用し、ウイルスゲノム配列内に有用なタンパク質の遺伝子を挿入し植物に接種することによって、有用なタンパク質を植物に生産させることが可能であることが知られている（Wang, Z.D., Ueda, S., Uyeda, I., Yagihashi, H., Sekiguchi, H., Tacahashi, Y., Sato, M., Ohya, K., Sugimoto,C. and Matsumura, T.(2003) Positional effect of gene insertion on genetic stability of a clover yellow vein virus-based expression vector. Journal of General Plant Pathology. 69: 327-334）。つまり、ポティウイルス科に属するウイルスのゲノム配列は、植物における発現ベクターの構成要素となり得ることを示している。本発明のDNA配列は、ChYNMVの全塩基配列からなることから、この配列を構成要素とするベクターを構築することにより、ヤマノイモ属植物における発現ベクターを作製することができる。また、この発現ベクターは、弱毒ウイルスを効率的に接種する場合にも利用できる。
【００２７】
また、遺伝子導入技術により植物ウイルス遺伝子を植物に導入し、ウイルス抵抗性を付与した植物も数多く報告されている（Dhaliwal, H.S. and Uchimiya, H.(1999) Genetic engineering for disease and pest resistance in plnats. Plant Biotechnology. 16: 255-261）。本発明のDNA配列は、ChYNMVの全塩基配列からなることから、これを全部或いは一部植物ゲノムに導入することにより、ChYNMV抵抗性植物の育種が可能となる。
【００２８】
（６）識別方法（第六発明）
本発明の弱毒株の識別方法は、ChYNMVのゲノムRNAにおいて特定の位置に存在する変異を検出することにより、前記ウイルスが弱毒株であるかどうかを識別する方法であって、前記特定の位置に存在する変異が、（Ａ）配列番号１記載の塩基配列における7321番目又は8154番目の位置に対応するゲノムRNA上の位置に存在する変異であること、又は（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列における7127番目から7426番目の領域に対応するゲノムRNA上の領域に含まれる変異であることを特徴とするものである。
【００２９】
（Ａ）の変異により弱毒株を識別できるとする根拠は以下の通りである。本発明者は、弱毒株KM3と日本各地及び韓国から集めたウイルス16株について、ゲノムRNAの3’末端側1098塩基を比較してみたところ、KM3のゲノムRNAの7321番目と8154番目の塩基に、この株に特異的な塩基の変異が検出された（KM3の7321番目の塩基はグアニンであるのに対し、他のウイルス株ではアデニンであり、KM3の8154番目の塩基はシトシンであるのに対し、他のウイルス株では、ウラシルであった。）従って、弱毒株かどうか識別しようとするウイルス株のゲノムRNA上の7321番目の位置又は8154番目の位置に変異があるかどうかを調べることにより、その株が弱毒株かどうかを知ることができる。
【００３０】
（Ｂ）の変異により弱毒株を識別できるとする根拠は以下の通りである。実施例５では、配列番号１記載の塩基配列における7127番目から7426番目の領域をPCRで増幅し、これをSSCP分析することにより、弱毒株に特異的な電気泳動パターンを検出している。このことから、上記領域中に弱毒株に共通する変異の存在が推定される。従って、ゲノムRNA上の7127番目から7426番目の領域に変異が含まれるかどうかを調べることにより、その株が弱毒株かどうかを知ることができる。
【００３１】
変異の検出は、識別対象とするウイルス株のゲノムRNAの配列を調べることによって行ってもよいが、一塩基多型の検出に常用される方法によって行うことが好ましい。一塩基多型の検出に常用される方法としては、例えば、SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism）、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)などを挙げることができ、これらの中でもSSCP法を用いるのが好ましい。
【００３２】
SSCP法による変異の検出は、例えば、以下のように行うことができる。
【００３３】
まず、識別しようとするウイルス株からゲノムRNAを抽出し、このゲノムRNAを鋳型としてRT-PCRを行う。このときプライマーは、上述の7321番目の位置又は8154番目の位置を含む断片、あるいは7127番目から7426番目の領域を含む断片が増幅されるように設計する。
【００３４】
次に、増幅DNA断片を変性剤等によって一本鎖DNAにし、各DNA鎖が、それらの塩基配列に依存した高次構造をとるようにする。その後、各DNA鎖の高次構造が維持された状態で電気泳動を行い、その泳動パターンから目的の部位に変異が存在したかどうかを判断する。
【発明の効果】
【００３５】
本発明は、ヤマノイモ属植物のえそモザイク病に対する有効かつ効率的な防除方法を提供する。これにより、農薬や資材、肥料、種苗費などの経費節減および作物管理労力の節減につながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００３７】
〔実施例１〕  アブラムシ接種による強毒ウイルス感染に対する弱毒ウイルスの防除効果
弱毒ウイルスKM3が感染しているナガイモ幼苗に対して、ジャガイモヒゲナガアブラムシにより強毒ウイルスを接種した。強毒ウイルスとしては、青森県産の強毒ウイルスYS117または県外産の強毒ウイルスIW5を用いた。接種は、以下のように行った。アブラムシを2時間絶食させた後、強毒ウイルス感染ナガイモ葉に移し、5分間獲得吸汁させた。その後直ちにアブラムシをナガイモ幼苗に移し、一晩接種吸汁させた後、アブラムシを殺虫した。1ヶ月後、RT-PCR-SSCP法により、弱毒ウイルスおよび強毒ウイルスの感染を識別した。その結果を表1に示す。ウイルスフリーナガイモに強毒ウイルスを接種した場合、高い確率（62.5〜100%）で強毒ウイルスが感染したが、弱毒ウイルス感染ナガイモに強毒ウイルスを接種した場合、強毒ウイルスの感染は全くみられなかった。このことから、弱毒ウイルスKM3は、強毒ウイルスのアブラムシ感染に対して防除効果を持つことが明らかとなった。
【００３８】
【表１】
2005341849.tif 000002
【００３９】
〔実施例２〕  圃場暴露栽培における弱毒ウイルスの防除効果
ChYNMVが発生している圃場において、予め弱毒ウイルスKM3が感染したナガイモを暴露栽培した。生育期間中は病徴観察を行い、また、RT-PCR-SSCP法によりウイルス感染を調査した。その結果を表2に示す。ウイルス無接種（ウイルスフリー）のナガイモでは、暴露1年で24.2%、暴露2年で100%の個体が圃場に発生しているChYNMVにより再感染したが、弱毒ウイルス感染ナガイモでは、暴露1年、2年とも、ChYNMVによる再感染は全く認められなかった。ウイルス無接種ナガイモでは、暴露1年の4個体及び暴露2年の全個体で再感染による明らかなえそモザイク症状がみられたが、弱毒ウイルス感染ナガイモでは、軽微な病徴を示すのみであった。このことから、弱毒ウイルスKM3は、圃場におけるChYNMVの再感染に対して防除効果を持つことが明らかとなった。
【００４０】
【表２】
2005341849.tif 000003
【００４１】
〔実施例３〕  弱毒ウイルス感染ナガイモの収量性
圃場栽培した弱毒ウイルス感染ナガイモの収量性を調査した。その結果を図1、図2、表3に示す。暴露1年では、弱毒ウイルス感染ナガイモはウイルス無接種（ウイルスフリー）ナガイモと同等のいも重を示したのに対し、強毒ウイルス（YS117）感染ナガイモでは約40％の減収となった（図１）。暴露2年では、ウイルス無接種ナガイモは全てChYNMVが再感染しており、強毒ウイルス（HK61）感染ナガイモとともに、弱毒ウイルス感染ナガイモに比べ約20％いも重が減収していた（図２）。いも長、いも径についても、それぞれ同様の傾向を示した。これらのことから、弱毒ウイルス感染ナガイモは暴露1年のウイルスフリーナガイモ並の収量性を保ち、強毒ウイルスに対して20〜40％程度の増収効果があることが明らかとなった。
【００４２】
【表３】
2005341849.tif 000004
【００４３】
〔実施例4〕  弱毒ウイルス感染ナガイモの粘度および糖度
弱毒ウイルスの感染によるナガイモ内部品質への影響を調べるため、弱毒ウイルス感染ナガイモのイモの粘度および糖度を調査した。粘度測定には、TV-10型粘度計（東機産業）を用い、ローターM3、回転数3rpmで測定した。糖度（Brix）測定には、手持屈折計I-500（井内盛栄堂）を用いた。その結果を表4に示す。ウイルス無接種、弱毒ウイルス感染、強毒ウイルス感染ナガイモともに粘度および糖度に大きな差は認められなかった。このことから、弱毒ウイルスKM3の感染がイモの粘度および糖度に影響しないことが明らかとなった。
【００４４】
【表４】
2005341849.tif 000005
【００４５】
〔実施例５〕  弱毒ウイルスの特異的識別方法
ChYNMVの弱毒ウイルス株と自然発生株を識別するために、RT-PCR-SSCP法を用いた。方法は以下のように行った。
【００４６】
ナガイモの葉片（0.01g）からRNA抽出キット（SepaGene RV-R;三光純薬社）を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNAは40μlの超純水に溶かし、これを鋳型にして逆転写PCR（RT-PCR）を行った。RT-PCRは、Ready・To・Go RT-PCR Beads（Amersham社）を用いて行った。ビーズの入ったマイクロチューブに超純水42μl、−鎖プライマー（10μM）を2μl、＋鎖プライマー（10μM）を2μl、全RNA溶液を4μlを加え混合した後、42℃、15分；95℃、5分を1サイクル、95℃、1分；59℃、1分；72℃、1分を35サイクルの条件で反応させた。用いたプライマー配列は、−鎖プライマーが5'-CTGCGATGTCGTCGTGAATT-3'（配列番号５）、＋鎖プライマーが5'-ATGGACCTGAGCACTCCAGT-3'（配列番号６）であり、各々配列番号1の7407〜7426番目および7127〜7146番目に相当する配列である。
【００４７】
次に、RT-PCR産物3μlと変性溶液（95%ホルムアミド、0.05%キシレンシアノール）7μlを混合し、そのうち5μlをSSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism）分析に供試した。SSCP分析の電気泳動にはGeneGel Excel 12.5/24 Kit（Amersham社）を用い、5℃、600V、4時間泳動を行った。電気泳動後のゲルは、銀染色法により染色し、泳動像を分析した。結果の一例を図3に示す。弱毒ウイルス感染ナガイモを圃場暴露栽培した場合、いずれの個体も弱毒ウイルスのバンドパターンのみを示したのに対し、ウイルスフリーナガイモを圃場暴露栽培した場合、ChYNMV自然発生株が再感染し、弱毒ウイルスとは異なる様々なバンドパターンを示した。このことから、RT-PCR-SSCP法により弱毒ウイルスは他のChYNMV株から識別することが可能であることが示されたとともに、弱毒ウイルス感染ナガイモがChYNMV自然発生株に対して防除効果を持つことが示された。
【００４８】
〔実施例６〕  強毒ウイルスゲノムのcDNAクローニング
強毒ウイルス感染ナガイモ葉からのウイルスゲノムRNAの抽出は、SepaGene RV-R（三光純薬社）を用いて行った。このRNAを鋳型にして、3'RACE法、5'RACE法、degenerate PCR法及びRT-PCR法により強毒ウイルスゲノムcDNA断片を得た。3'RACE法、degenerate PCR法及びRT-PCR法は、RNA LA PCR Kit (AMV) Ver. 1.1（宝酒造社）を用いて行った。5'RACE法は、5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Life Technologies社)を用いた。それぞれのcDNA断片を得る際に用いたプライマーは、表５に示した。得られたcDNA断片は１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的サイズのDNAバンドを切り出した後、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen社)を用いて精製した。精製DNAをプラスミドベクターpGEM-T Easy（Promega社）に連結した後、大腸菌JM109を形質転換することによりクローニングした。得られたクローンは、図４に示した。
【００４９】
以下にcDNAクローン取得の順序を述べる。まず、既知のポティウイルス科ウイルスの遺伝子情報を基にディジェネレートプライマーを設計し、これを用いてpGEMCYVAIを得た。このクローンの塩基配列を決定し、その塩基配列情報を基に作製した＋鎖プライマーとChYNMVの既知配列[Kondo, T.(2001) The 3'-terminal sequence of Chinese yam necrotic mosaic virus genomic RNA: a close relationship with macluravirus. Archives of Virology. 146: 1527-1535]から作製した−鎖プライマーを用いてpGEMCYVCNを得た。これより3'側のゲノムは、更にプライマーを作製してRT-PCR及び3'RACEによりクローンpGEMCYVNR及びpGEMCYVRAを得た。また、pGEMCYVAIより5'側のゲノムは、順次プライマーを作製して5'RACEを繰り返すことにより、クローンpGEMCYVR1、pGEMCYVR2、pGEMCYVR3を得た。
【００５０】
【表５】
2005341849.tif 000006
【００５１】
〔実施例７〕  強毒ウイルスゲノム全塩基配列の解析
塩基配列の決定は、ダイデオキシ法によって行った。反応は、ABI PRISM BigDye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PERKIN ELMER社)及びABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PERKIN ELMER社)を用いて行い、373 DNA Sequencer (PERKIN ELMER社)により塩基配列を決定した。その結果、強毒ウイルスAP5-4ゲノムの全長は8224塩基（配列番号３）であり、2620アミノ酸（配列番号４）をコードする一つの長大なオープンリーディングフレームを持っていた。コードされる長大なポリプロテインは、他のポティウイルス科のウイルスとの比較から推察すると、自己消化により8種の機能タンパク質になると予想された（図４ｂ）。
【００５２】
〔実施例８〕  弱毒ウイルスゲノムｃDNAのクローニング
弱毒ウイルス感染ナガイモ葉からのウイルスゲノムRNAの抽出は、SepaGene RV-R（三光純薬社）を用いて行った。このRNAを鋳型にして、3'RACE法、5'RACE法及びRT-PCR法により弱毒ウイルスゲノムcDNA断片を得た。3'RACE法及びRT-PCR法は、RNA LA PCR Kit (AMV) Ver. 1.1（宝酒造社）を用いて行った。5'RACE法は、5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Life Technologies社)を用いた。プライマーは、明らかになった強毒ウイルスの塩基配列を基に随時作製した。それぞれのcDNA断片を得る際に用いたプライマーは、表６に示した。得られたｃDNA断片は１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的サイズのDNAバンドを切り出した後、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen社)を用いて精製した。精製DNAをプラスミドベクターpGEM-T Easy（Promega社）に連結した後、大腸菌JM109を形質転換することによりクローニングした。得られたクローンは、図５に示した。
【００５３】
【表６】
2005341849.tif 000007
【００５４】
〔実施例９〕  弱毒ウイルスゲノム全塩基配列の解析
塩基配列の決定は、ダイデオキシ法によって行った。反応は、ABI PRISM BigDye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PERKIN ELMER社)及びABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PERKIN ELMER社)を用いて行い、373 DNA Sequencer (PERKIN ELMER社)により塩基配列を決定した。その結果、弱毒ウイルスKM3ゲノムの全長は強毒ウイルスと同様に8224塩基（配列番号１）であり、2620アミノ酸（配列番号２）をコードする一つの長大なオープンリーディングフレームを持っていた。コードされる長大なポリプロテインについても強毒ウイルス同様に、自己消化により8種の機能タンパク質になると予想された（図５ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】弱毒ウイルス感染ナガイモのいも重を示す図（曝露１年）。バーは標準偏差を示す。
【図２】弱毒ウイルス感染ナガイモのいも重を示す図（曝露２年）。バーは標準偏差を示す。
【図３】弱毒ウイルス感染ナガイモのRT-PCR-SSCP法による解析結果を示す図（1-13：弱毒ウイルス感染ナガイモ、14-21：ウイルスフリーナガイモにChYNMV自然発生株が再感染した個体）
【図４】ChYNMV強毒株cDNAクローンの位置を示す図（a）、ChYNMVゲノムの遺伝子構造を示す図（b）。
【図５】ChYNMV弱毒株cDNAクローンの位置を示す図（a）、ChYNMVゲノムの遺伝子構造を示す図（b）。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１５において、3番目のnはイノシンを表す。
【００５７】
配列番号１６において、18番目のnはイノシンを表す。
【００５８】
配列番号１７において、2、8及び14のnはイノシンを表す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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【配列表】
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