(57)【要約】【課題】  生化学解析アレイを、相対的に強い強度のシグナルが相対的に弱い強度のシグナルに影響を与える割合が少なく、生化学解析用データ中にノイズが生じにくいものとする。【解決手段】  互いに離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタを有する生化学解析アレイであって、リガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質を検出するシステムに用いられる生化学解析アレイにおいて、標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタ（黒丸）を、生化学解析アレイ１上にまとめて固定配置する。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタを有する生化学解析アレイであって、前記リガンドまたはレセプタにレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するシステムに用いられる生化学解析アレイにおいて、
前記標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが、生化学解析アレイ上にまとめられて固定配置されていることを特徴とする生化学解析アレイ。
【請求項２】
相対的に強いものと特異的に結合する前記まとめられたリガンドまたはレセプタが、前記生化学解析アレイの端部にまとめらて固定配置されていることを特徴とする請求項１記載の生化学解析アレイ。
【請求項３】
相対的に強いものと特異的に結合する前記まとめられたリガンドまたはレセプタが、相対的に弱いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタと間隔をあけて固定配置されていることを特徴とする請求項１または２記載の生化学解析アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学発光解析用データ等を取得するための生化学解析アレイに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイ解析システムやマクロアレイ解析システムにおいては、メンブレンフィルタなどの生化学解析用ユニットの表面の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタを含む溶液を滴下して多数のスポット領域を形成し、放射線標識物質、蛍光物質、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質などによって標識されたレセプタまたはリガンド（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質）を、スポット領域に含まれているリガンドまたはレセプタにハイブリダイズ等させてリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、多数のスポット領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの輝尽性蛍光体層を露光し、露光された輝尽性蛍光体層を励起光によって走査して、輝尽性蛍光体層に含まれている輝尽性蛍光体を励起し、輝尽性蛍光体から放出された輝尽光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数のスポット領域を励起光によって走査して多数のスポット領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数のスポット領域に選択的に含まれている標識物質を化学発光基質と接触させ、標識物質から放出される化学発光を光電的に検出して生化学解析用データを生成するシステムが開発されている（特許文献１）。
【０００３】
このシステムによれば、生化学解析用ユニット上に数多くのリガンドまたはレセプタを結合したスポット領域を高密度に形成して、標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズ等させることによって、短時間でレセプタまたはリガンドを解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
しかし、生化学発光解析用ユニットの細密化が進み、細密化された解析用ユニットから発せられる微弱な発光データを取得する場合において、スポットから発せられた化学発光や蛍光がメンブレンフィルタなどの担体内で散乱し、あるいは、スポットから発せられた化学発光や蛍光が散乱して隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光と混ざり合い、その結果、化学発光および／または蛍光を光電的に検出して生成した生化学解析用データ中にノイズを生成するという問題があった。
【０００５】
本出願人は、細密化された解析用ユニットから発せられる微弱な発光データを取得するために、光ファイバアレイを用いた発光解析用データ取得装置を提案している（例えば特許文献２）が、これによれば光ファイバによってそれぞれのスポット領域から個別に光を導光することができ、それぞれのスポット領域からの光が他のスポット領域から得られる光に影響されることなく導光することが可能である。このため、生化学解析用ユニットの表面上の隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光が散乱して隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光と混ざり合うことを防止することが可能である。
【０００６】
しかし、スポットから発せられた化学発光や蛍光の散乱は生化学解析用ユニットの表面のみで起こるものではなく、メンブレンフィルタなどの担体の内部でも起こるため、上記光ファイバアレイを用いた発光解析用データ取得装置では、生化学解析用ユニットの表面上の隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光が混ざり合うことを抑制することはできても、メンブレンフィルタなどの担体内部で起こる化学発光や蛍光の散乱は抑制することができないため、依然として生化学解析用データ中にノイズが生じるという問題は残っている。
【０００７】
メンブレンフィルタの内部で起こる化学発光や蛍光の散乱を抑制するものとして、特許文献３には、光を減衰させる性質を有する材料によって形成された板状部材に形成された複数の貫通孔に、吸着性材料によって形成された吸着性膜が埋め込まれ、板状部材の複数の貫通孔に対応する位置に、複数のスポット領域が形成され、隣り合ったスポット領域の間の吸着性膜内の吸着性膜内の厚さ方向において板状部材に隣接する領域に、光を減衰させる材料よりなる光減衰領域が形成された生化学解析用ユニットが提案されている。これによれば、メンブレンフィルタの担体内部で起こる化学発光や蛍光の散乱を抑制することが可能である。
【特許文献１】特開２００２−３５５０３６号公報
【特許文献２】欧州特許出願公開第１２７１１３２号明細書
【特許文献３】特開２００３−２１５１２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記特許文献３に記載の生化学解析用ユニットは光を減衰させる材料よりなる光減衰領域が形成された特殊な生化学解析用ユニットであるためコストがかかる。また、生化学解析用ユニットの表面で起こる隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光の混ざり合いを抑制するためには、特許文献２に記載されているような光ファイバアレイを用いた発光解析用データ取得装置が必要であるため、このような装置がない場合には依然として生化学解析用データ中にノイズが生じるという問題は解決されない。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、特殊な生化学解析用ユニットや光ファイバアレイを用いた発光解析用データ取得装置を用いなくても、隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光が混ざり合うことが抑制され、生化学解析用データ中のノイズを減少させることが可能な生化学解析アレイを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の生化学解析アレイは、互いに離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタを有する生化学解析アレイであって、前記リガンドまたはレセプタにレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するシステムに用いられる生化学解析アレイにおいて、前記標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが、生化学解析アレイ上にまとめられて固定配置されていることを特徴とするものである。
【００１１】
標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものとは、生化学解析アレイ上に固定配置されたリガンドまたはレセプタのうち特に強いシグナル強度を有しているものであって、レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出する場合に、あるシグナル強度を基準として２つに分けたときに、より強いシグナル強度を有しているものである。基準となるシグナル強度は、生化学解析アレイ上に固定配置されたリガンドまたはレセプタの種類によっても異なるが、生化学解析アレイ上の一番弱いシグナルに対して３桁以上大きいシグナル強度であることが好ましい。
【００１２】
相対的に強いものと特異的に結合する前記まとめられたリガンドまたはレセプタは、前記生化学解析アレイの端部にまとめらて固定配置されていることが好ましい。
【００１３】
相対的に強いものと特異的に結合する前記まとめられたリガンドまたはレセプタは、相対的に弱いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタと間隔をあけて固定配置されていてもよい。
【００１４】
間隔をあけてとは、生化学解析アレイ上に互いに等間隔で離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタの間隔（基準間隔）よりも大きい間隔であることを意味する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の生化学解析アレイは、互いに離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタを有する生化学解析アレイであって、リガンドまたはレセプタにレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、このレセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するシステムに用いられる生化学解析アレイにおいて、標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが、生化学解析アレイ上にまとめられて固定配置されているため、相対的に強い強度のシグナルが相対的に弱い強度のシグナルに影響を与える割合を減らすことが可能となり、生化学解析用データ中のノイズを軽減することができる。
【００１６】
特に、本発明の生化学解析アレイは光ファイバを用いた発光解析用データ取得装置のような装置を用いなくても、生化学解析用ユニットの表面上の隣り合うスポットから発せられた化学発光や蛍光に影響を受けるスポットの割合を減らすことが可能となり、生化学解析用データ中のノイズを軽減することができる。
【００１７】
また、生化学解析アレイの基材がメンブレンフィルタのような場合には、通常はメンブレンフィルタの担体内部でもシグナルの散乱が起きるが、本発明の生化学解析アレイの場合は標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが、生化学解析アレイ上にまとめられて固定配置されているので、メンブレンフィルタなどの担体内部で起こる化学発光や蛍光の散乱に影響を受けるスポットの割合を減らすことが可能となり、生化学解析用データ中のノイズを軽減することができる。
【００１８】
なお、相対的に強いものと特異的に結合するまとめられたリガンドまたはレセプタが、生化学解析アレイの端部にまとめらて固定配置されている場合や、相対的に弱いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタと間隔をあけて固定配置されている場合には、より効果的に、相対的に強い強度のシグナルが相対的に弱い強度のシグナルに影響を与える割合を減らし、生化学解析用データ中のノイズを軽減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の生化学解析アレイは、互いに離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタを有する生化学解析アレイであって、リガンドまたはレセプタにレセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、このレセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するシステムに用いられる生化学解析アレイにおいて、標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが、生化学解析アレイ上にまとめられて固定配置されていることを特徴とする。
【００２０】
互いに離間されて固定配置されたリガンドまたはレセプタを有する生化学解析アレイの担体の材質、構成は何ら限定されるものではなく、スライドガラス板やメンブレンフィルタのようにリガンドまたはレセプタを固定配置する箇所があらかじめ特定されていないようなものであっても、あるいは複数の孔を有する基板と、この複数の孔内に吸着性材料が充填され、複数の孔に対応する位置にそれぞれ吸着性領域が形成され、この吸着性領域にリガンドまたはレセプタを固定配置する、いわゆる生化学解析用ユニットのようなものであってもよい。
【００２１】
レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出する態様としては、例えば、リガンドまたはレセプタが固定配置された生化学解析アレイのリガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、この標識レセプタまたは標識リガンドを標識物質を利用して検出するものがあげられる。
【００２２】
固定配置されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。
【００２３】
標識レセプタまたは標識リガンドは、固定配置されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。
【００２４】
標識物質は、標識物質そのものが放射線、発光、発色あるいは光を照射することによって蛍光を放出するものであっても、標識物質に何らかの化学物質を接触させて、標識物質によって化学物質が分解あるいは反応する等して発光、発色あるいは蛍光を放出するものであってもよい。前者の標識物質としては、放射線物質にＲＩ（放射性同位体）、発光物質にアクリジニウムエステル等、発色物質に金コロイド粒子等、蛍光物質にフルオレセイン等を用いることができる。また、後者の標識物質としては、酵素を用いることができ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。これらの酵素は、化学発光基質あるいは色素基質あるいは蛍光基質を接触させることによってそれぞれ、化学発光、発色、蛍光を放出する。
【００２５】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。また、色素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合にはパラニトロフェノールリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の組合せ、ジアミノベンチジン、テトラメチルベンチジン、酵素がベータガラクトシダーゼの場合にはパラニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。蛍光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合４−メチルウンベリフェニルリン酸、酵素がペルオキシダーゼの場合には３（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸、酵素がベータガラクトシダーゼの場合には、４−メチルウンベリフェニルβ−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。
【００２６】
レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出する別の態様としては、リガンドまたはレセプタが固定配置された生化学解析アレイのリガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、このレセプタまたはリガンドに標識物質によって標識された標識体を特異的に結合させ、レセプタまたはリガンドを検出する方法、すなわち検出するレセプタまたはリガンドを、吸着性領域のリガンドまたはレセプタと標識体によって挟み込む、いわゆるサンドイッチ法と呼ばれる方法があげられる。ここでいう、レセプタまたはリガンドは、固定配置されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質である。
【００２７】
標識物質によって標識された標識体とは、前述の標識物質によって標識され、レセプタまたはリガンドの反応部位に特異的に結合することができる抗原、抗体の他、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものを意味する。
【００２８】
レセプタまたはリガンドを標識物質を利用して検出するさらに別の態様としては、リガンドまたはレセプタが固定配置された生化学解析アレイのリガンドまたはレセプタに、補助物質が結合された補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを特異的に結合させ、補助物質に特異的に結合可能な標識物質を補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドと特異的に結合させ、補助物質結合レセプタまたは補助物質結合リガンドを標識物質を利用して検出するものがあげられる。
【００２９】
補助物質は標識物質が結合する物質であって、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。また、ビオチンに対するアビジンのような生物学的結合パートナーであってもよい。結合可能な標識物質は、補助物質に特異的に結合可能であって前述の標識物質によって標識された物質である。
【００３０】
以下、リガンドまたはレセプタが固定配置された生化学解析アレイのリガンドまたはレセプタに、標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、この標識レセプタまたは標識リガンドを標識物質を利用して検出する場合を例にとり、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
【００３１】
図１は本発明の生化学解析アレイの第１の実施の形態を示す概略斜視図である。図１に示す生化学解析アレイ１には黒丸及び白丸で示すスポット領域にリガンドまたはレセプタが、互いに離間されて固定配置されている。黒丸及び白丸に固定配置されているリガンドまたはレセプタは、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合し、この標識物質によって検出される。ここで、黒丸で示すスポット領域に固定配置されているリガンドまたはレセプタは標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した場合に、この標識物質から発せられるシグナルが、白丸で示すスポット領域に固定配置されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質から発せられるシグナルよりも相対的に強いシグナルを発するものである。なお、図１では説明を簡単にするため、黒丸で示すスポット領域を９箇所としているが、基準とするシグナル強度によってこの数は変わるものである。
【００３２】
相対的に強いシグナルを発するスポット領域が生化学解析アレイ上に分散していた場合、その１つのスポット領域の周りの８箇所のスポット領域が相対的に強いシグナルを発するスポット領域から発せられた化学発光や蛍光の影響を受けることになり、相対的に強いシグナルを発するスポット領域が９箇所ある生化学解析アレイ上では７２箇所のスポット領域が強いシグナルを発するスポット領域からのシグナルに影響を受けることになる。
【００３３】
しかし、図１に示すように強いシグナルを発する標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが固定配置されているスポット領域（黒丸）を、生化学解析アレイ上の端部の一列にまとめて固定配置すると、この強いシグナルからの影響を受けるスポット領域は図１の枠で囲んだスポット領域（白丸）となり、その数は１１箇所であって、相対的に強いシグナルを発するスポット領域からのシグナルに影響を受けるスポット領域を格段に減らすことが可能となる。
【００３４】
図２は本発明の生化学解析アレイの第２の実施の形態を示す概略斜視図である。図２では強いシグナルを発する標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合するリガンドまたはレセプタが固定配置されている黒丸で示すスポット領域を生化学解析アレイ上の端部の一角にまとめて固定配置している。この場合には、相対的に強いシグナルを発するスポット領域からのシグナルに影響を受けるスポット領域は図２の枠で囲んだスポット領域（白丸）であって、その数は７箇所となり、影響を受けるスポット領域をさらに減らすことが可能となる。
【００３５】
図３及び図４は本発明の生化学解析アレイの第３の実施の形態及び第４の実施の形態を示す概略斜視図である。図３及び図４の生化学解析アレイの相対的に強いシグナルを発するスポット領域のまとめかたはそれぞれ図１、図２に対応したものであるが、図３及び図４の枠で囲んだ部分にはリガンドまたはレセプタが固定配置されていないものである。このように、相対的に強いシグナルを発するスポット領域（黒丸）を、相対的に弱いシグナルを発するスポット領域（白丸）と間隔をあけて、すなわち、生化学解析アレイのスポット領域の基準間隔よりも大きい間隔をあけてリガンドまたはレセプタを固定配置することによって、相対的に強いシグナルを発するスポット領域からのシグナルに影響を受けるスポット領域（白丸）をさらに減らすことが可能となる。
【００３６】
第１〜第４の実施の形態（図１〜図４）ではある１つのシグナル強度に基づいて、標識物質から発せられるシグナルを相対的に強いものと、弱いものの２つに分けて、シグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタを生化学解析アレイの端部にまとめて配置する場合を示しているが、この場合に基準となるシグナル強度は、生化学解析アレイ上に固定配置されたリガンドまたはレセプタの種類によっても異なるが、生化学解析アレイ上の一番弱いシグナルに対して３桁以上大きいシグナル強度とすることが好ましい。
【００３７】
標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタは、解析をする対象サンプルがどのようなものかによって異なるため一概には言えないが、例えば、生化学解析アレイがマウスの脾臓細胞における免疫関係遺伝子の発現解析を対象としている場合には、エネルギー代謝、複製など細胞の生存に必要な基本的なタンパクをコードしている、いわゆるハウスキーピング遺伝子（β−ａｃｔｉｎ、ＤＨＦＲ、α−ｔｕｂｌｉｎ、１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ、ＧＡＰＤＨなど）が、標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタのひとつとしてあげられる。
【００３８】
なお、第１〜第４の実施の形態（図１〜図４）ではある１つのシグナル強度に基づいて、標識物質から発せられるシグナルを相対的に強いものと、弱いものの２つに分ける場合を示しているが、いくつかのシグナル強度に基づいて、生化学解析アレイ上のリガンドまたはレセプタをクラス分けし並べてもよい。図５はその実施の形態を示す生化学解析アレイの概略斜視図である。図５に示す生化学解析アレイでは、３つの基準となるシグナル強度を設定し、生化学解析アレイ上に固定配置されるリガンドまたはレセプタを４つのクラスに分け、一番強いシグナル強度を示すものを生化学解析アレイの端部ａに、その次に強い強度を示すものをその隣りのｂに、その次に強い強度を示すものをｃに、残りをｄに固定配置したものである。このように配置することによって、一番強いシグナルを発するスポット領域からのシグナルに一番大きく影響される、一番弱いシグナルを発するスポット領域の影響をより小さいものとすることができる。なお、図５ではａ、ｂ、ｃ、ｄのそれぞれの間隔を基準間隔よりも大きくとって示しているが、ａｂ間、ｂｃ間、ｃｄ間は基準間隔であってもよい。
【００３９】
以上のように、本発明の生化学解析アレイは、標識物質から発せられるシグナルの相対的に強いものと特異的に結合するリガンドまたはレセプタを、生化学解析アレイ上にまとめて固定配置しているので、光ファイバを用いた発光解析用データ取得装置や、特殊な生化学解析用ユニットを用いなくても、相対的に強い強度のシグナルが相対的に弱い強度のシグナルに影響を与える割合を減らすことができ、生化学解析用データ中のノイズを軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の生化学解析アレイの第１の実施の形態を示す概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析アレイの第２の実施の形態を示す概略斜視図
【図３】本発明の生化学解析アレイの第３の実施の形態を示す概略斜視図
【図４】本発明の生化学解析アレイの第４の実施の形態を示す概略斜視図
【図５】本発明の生化学解析アレイの第５の実施の形態を示す概略斜視図
【符号の説明】
【００４１】
１    生化学解析アレイ
【図１】
2005106657.tif 000003
【図２】
2005106657.tif 000004
【図３】
2005106657.tif 000005
【図４】
2005106657.tif 000006
【図５】
2005106657.tif 000007