(57)【要約】  【課題】  本発明は、取り扱いが容易で安価、かつ試料から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化できる分析チップ、およびそれを備えた小型・可搬の分析装置を提供する  【解決手段】遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部で捕獲された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、前記遺伝子抽出部の前記試料を含む液が導入される領域より前記注入口から離れた領域に、前記洗浄液保管部から前記洗浄液が導入される流路が連絡されていることを特徴とする遺伝子処理チップである。  【選択図】  図１
2005065607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
前記遺伝子抽出部で捕獲された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記遺伝子抽出部の前記試料を含む液が導入される領域より前記注入口から離れた領域に、前記洗浄液保管部から前記洗浄液が導入される流路が連絡されていることを特徴とする遺伝子処理チップ。
【請求項２】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子を結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
前記遺伝子抽出部で抽出された遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部に導入された前記洗浄液は前記遺伝子抽出部を経た後に前記注入口側に流れるよう形成されたことを特徴とする遺伝子処理チップ。
【請求項３】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記試料が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
前記遺伝子抽出部で抽出された遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記注入口と前記遺伝子抽出部と前記洗浄液保管部とが流路を介して直列に配置されたことを特徴とする遺伝子処理チップ。
【請求項４】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記注入口に供給された前記試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、
前記試料と前記溶解液とを混合した液が導入され、前記遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、
前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記注入口と前記遺伝子抽出部との間から分岐して前記反応部に連絡する流路を有することを特徴とする遺伝子処理チップ。
【請求項５】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、
前記試料と前記溶解液とを混合した液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、を備え、
前記溶解液保管部、前記洗浄液保管部或は溶離液保管部の何れかの保管部は、幅よりも長手方向の長さが長い流路が曲がり部を介して複数連絡されて形成され、
前記保管部の他端には前記保管された液体が保管部から排出される際に導入される流体の導入部を備えることを特徴とする遺伝子処理チップ。
【請求項６】
請求項５において、前記何れかの保管部を構成する流路は、前記保管部と注入口とを連絡する連絡流路の断面積に対して、１０倍以下の最大断面積を有することを特徴とする遺伝子処理チップ。
【請求項７】
請求項５において、前記何れかの保管部を構成する流路の断面構造が横／縦が１０以下であることを特徴とする遺伝子分析処理チップ。
【請求項８】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、
前記試料と前記溶解液とを混合した液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄保管部と、
前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、
前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記溶解液保管部の前記溶解液が保管された領域より前記注入口から離れた側に位置し、前記溶解液が前記注入口に導入される際に流体が前記溶解液保管部に供給される第一の流体導入部と、
前記遺伝子抽出部の前記試料及び前記溶解液が導入される領域より前記注入口から離れた領域に前記試料及び前記溶解液が導入される前に前記遺伝子抽出部内にある流体を前記遺伝子抽出部の外に排出する第一の流体排出部と、
前記洗浄液保管部の前記洗浄液が貯蔵された領域より前記遺伝子捕獲部から離れた側に前記洗浄液が前記注入口に導入される際に流体が供給される第二の流体導入部と、
前記溶離保管部の前記溶離液が貯蔵された領域より前記遺伝子捕獲部から離れた側に前記溶離液が前記注入口に導入される際に流体が供給される第三の流体導入部と、
溶離された前記遺伝子を含む前記液を前記遺伝子抽出部から前記反応部に導入される際に流体が供給される第四の流体導入部と、
を備えることを特徴とする遺伝子処理チップ
【請求項９】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子持担体を備える遺伝子抽出部と、
前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
前記遺伝子抽出部で捕獲された前記遺伝子が導入される反応部と、を備えた遺伝子処理チップが設置されるチップ設置部と、前記遺伝子処理チップに流体を導入する流体導入機構と、溶離した遺伝子を検出する検出機構と、を備え、
前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部に導入された前記洗浄液は前記遺伝子抽出部から前記注入口に流れるよう制御されることを特徴とする遺伝子処理装置。
【請求項１０】
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、
注入口に連絡して形成され、前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子持担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に連絡して形成される洗浄液保管部と、を有し、
前記注入口に対して遺伝子抽出部の下流側に外部と流体が連絡する遺伝子抽出部流体連絡部と、遺伝子抽出部に対して前記洗浄液保管部の下流側に外部と流体が連絡する洗浄液保管部流体連絡部と、を備えた遺伝子処理チップが設置されるチップ設置部と、前記遺伝子処理チップに流体を導入或は吸入する流体制御機構と、前記試料に含まれる遺伝子を検出する検出機構と、を備え、
前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間を流体が流れるようにし、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限するようにして、前記注入口から前記遺伝子抽出部に前記試料を含む液が導入されるよう制御し、
前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限するようにして、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間を流体が流れるようにして、前記洗浄液を前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部を経て前記注入口側に流れるよう制御されることを特徴とする遺伝子処理装置。
【請求項１１】
請求項１０において、前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内から前記チップ外に前記遺伝子処理チップ内の流体が流れるよう吸引し、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限して、前記注入口から前記遺伝子抽出部に前記試料を含む液が導入されるよう制御することを特徴とする遺伝子処理装置。
【請求項１２】
請求項１０において、前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間を流体が流れうるようにし、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限し、前記注入口に流体を供給して、前記注入口から前記遺伝子抽出部に前記試料を含む液が導入されるよう制御することを特徴とする遺伝子処理装置。
【請求項１３】
被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体から遺伝子を抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する遺伝子処理チップを冷却して冷凍する工程と、前記冷凍した遺伝子処理チップを搬送する工程とを有することを特徴とする遺伝子処理チップの使用方法。
【請求項１４】
被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体から遺伝子を抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する遺伝子処理チップを冷却して冷蔵する工程と、前記冷蔵した遺伝子処理チップを搬送する工程とを有することを特徴とする遺伝子処理チップの使用方法。
【請求項１５】
遺伝子を含む被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体から遺伝子を抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する遺伝子処理チップが、一旦、冷却して冷蔵或は冷凍されて保管された後に供給される工程と、
前記提供された分析チップを室温に戻す工程と、前記試料注入口に遺伝子を含む試料が導入され、前記試薬により遺伝子が抽出される工程と、前記遺伝子を検出する工程と、を有することを特徴とする遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、供給された試料中の遺伝子を処理する遺伝子処理チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子等の生体高分子の分析には極めて複雑な工程と数日の時間がかかるという問題があった。遺伝子分析は大きく分けて、血液等の検体から被験者の遺伝子を抽出する前処理工程と、遺伝子の配列等を分析する検出工程からなる。これらの工程を一つのカートリッジ上で自動化する手法が特表２００１−５２７２２０号公報に開示されている。ここでは、試薬を内包したカートリッジに試料を分注し、カートリッジ内を試薬が流れる工程で遺伝子が抽出され、ポリメラーゼ連鎖反応（遺伝子増幅）で遺伝子が増幅される例が示されている。
【０００３】
【特許文献１】特表２００１−５２７２２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記公知例に記載の分析カートリッジは、バルブ等の機械部品を多数搭載しているため、複雑な試薬との混合などの処理を効率的にカートリッジ上で実施するのは簡易ではない。或は、内蔵廃棄タンクが大きいためカートリッジ全体が大きくなり、小型化には制限が生じる。このため試験毎にカートリッジを使い捨てにする形態に適しているとは言えない。
【０００５】
また、試薬の流量が１〜１００ｍＬと試薬量が多いため、試薬と試料との混合機構が必要となり、分析装置が大きくなる。また、試薬や試料の温度制御を行う際、それらの容量の大きさゆえに熱応答性が悪く、結果的に分析時間が長くなる課題を有する。さらに試薬のコストも課題となる。
【０００６】
そこで、本願発明は、前記課題の少なくとも何れかを解決する遺伝子処理チップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、以下の形態を有する。これにより、微量の試薬で短時間に遺伝子処理がチップ上で簡易に行うことができる。
（１）遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部で捕獲された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記遺伝子抽出部の前記試料を含む液が導入される領域より前記注入口から離れた領域に、前記洗浄液保管部から前記洗浄液が導入される流路が連絡されていることを特徴とする遺伝子処理チップである。
【０００８】
なお溶離液保管部を備える場合は、これも前記遺伝子抽出部の注入口に対して離れた側から連絡することができる。
【０００９】
または、注入口側に遺伝子抽出部を経た洗浄液が排出されるように構成する。
具体的には、前記注入口と、前記溶解液保管部と、前記遺伝子抽出部と、前記洗浄液保管部と、前記反応部と、を備え、前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部に導入された前記洗浄液は前記遺伝子抽出部を経た後に前記注入口側に流れるよう形成されたことを特徴とする遺伝子処理チップである。
【００１０】
または、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記試料が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部で抽出された遺伝子が導入される反応部と、を備え、前記注入口と前記遺伝子抽出部と前記洗浄液保管部とが流路を介して直列に配置されたことを特徴とする遺伝子処理チップである。
【００１１】
なお、これらの形態において、試料に供給する溶解液を保管する溶解液保管部を備える場合は、溶解液保管部、前記注入口、前記遺伝子抽出部と前記洗浄液保管部とが流路を介して直列に配置されることができる。その場合、溶解液と試料との混合液が遺伝子抽出部に導入される。
【００１２】
なお、具体的形態の例としては、以下の形態を有することができる。
遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記注入口に供給された前記試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、前記試料と前記溶解液とを混合した液が導入され、前記遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、前記注入口と前記遺伝子抽出部との間から分岐して前記反応部に連絡する流路を有することを特徴とする遺伝子処理チップである。また、更に、前記反応部に導入する増幅液を保管する増幅液保管部を備えることが好ましい。
【００１３】
これらの形態にすることにより、遺伝子抽出部を経た洗浄液などの廃液タンクを不要或は小型にすることができ、全体を効果的に小型化することができる。
（２）また、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、前記試料と前記溶解液とを混合した液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、を備え、
前記溶解液保管部、前記洗浄液保管部或は溶離液保管部の何れかの保管部は、幅よりも長手方向の長さが長い流路が曲がり部を介して複数連絡されて形成され、前記保管部の他端には前記保管された液体が保管部から排出される際に導入される流体の導入部を備えることを特徴とする遺伝子処理チップである。
【００１４】
これにより、各試薬保管部内の液残りなどを効果的に抑制できるので、チップは液残り分の試薬を余分に備えることを抑制できるので小型のチップを構成することができ、それを使用する装置の小型化を図ることができる。保管部はいずれも前述の形態を有することが好ましい。
【００１５】
具体的構造の例としては、保管部を蛇行流路のような複数の曲がりを備えた流路となっていることができる。
【００１６】
例えば、この前記何れかの保管部を構成する流路の断面積は、前記保管部と注入口とを連絡する連絡流路の断面積に対して、１０倍以下の最大断面積を有する。
【００１７】
ただし、流路の損失が大きくならない程度の下限であることが好ましい。例えば０．５倍以上とする。
【００１８】
蛇行した流路状の貯蔵部において、貯蔵部を構成する細管流路状除像部の長手方向の幅に対して貯蔵部全体としての長手方向の長さは１０倍以上とすることが考えられる。例えば、５００倍以下程度にすることが圧力損失の観点から好ましい。また、その流路の断面構造が横／縦１０以下にすることが好ましい。
（３）遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、前記試料と前記溶解液とを混合した液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄保管部と、前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部と、を備え、
前記溶解液保管部の前記溶解液が保管された領域より前記注入口から離れた側に位置し、前記溶解液が前記注入口に導入される際に流体が前記溶解液保管部に供給される第一の流体導入部と、前記遺伝子抽出部の前記試料及び前記溶解液が導入される領域より前記注入口から離れた領域に前記試料及び前記溶解液が導入される前に前記遺伝子抽出部内にある流体を前記遺伝子抽出部の外に排出する第一の流体排出部と、前記洗浄液保管部の前記洗浄液が貯蔵された領域より前記遺伝子捕獲部から離れた側に前記洗浄液が前記注入口に導入される際に流体が供給される第二の流体導入部と、前記溶離保管部の前記溶離液が貯蔵された領域より前記遺伝子捕獲部から離れた側に前記溶離液が前記注入口に導入される際に流体が供給される第三の流体導入部と、溶離された前記遺伝子を含む前記液を前記遺伝子抽出部から前記反応部に導入される際に流体が供給される第四の流体導入部と、を備えることを特徴とする遺伝子処理チップである。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかのチップは更に以下の形態を有することが好ましい。
【００１９】
例えば、反応部を構成する反応槽の底部が圧電素子となっているものである。より好ましくは例えば、圧電素子の表面に、塩基配列が既知の様々なヌクレオチドが固定されている。
【００２０】
また、反応部に導入される遺伝子を含む液は１００μＬより少ない程度であることが好ましい。一方で少なくとも１０μＬ程度ある方が良い。より具体的には１０〜３０μＬが好ましい。また、１０〜２０μＬが処理効率を向上させる観点で好ましい。
【００２１】
また、分析効果を高めるためには、小型化を制限し反応部面積を試料導入部面積より大きくとることが好ましい（光を当てる方向から見て）。
【００２２】
なお、供給される試料は前処理されたもの（細菌の硬い殻を破砕したもの）であることができる。
（５）遺伝子処理チップを備える本体は、チップを支持する部材（この部材は、分析チップと連絡する流路、および吸着用の溝を構えているのがよい）、チップを前記支持部材に脱着可能に固定する固定機構、基板の流路と分析チップの流路とを通じて分析チップ内の試薬槽に流体を送ったり吸引したりすることで、試薬槽内部の試薬をチップ内で移動させる機構（ポンプ）、基板の流路を開閉する流体制御機構（バルブ）、チップの反応槽における遺伝子の検出を行う検出部（発光、蛍光、比色などの光学検出や、圧電素子の周波数変化測定）を備えることが好ましい。
【００２３】
具体的には、例えば、注入口側に遺伝子抽出部から洗浄液が流れるように制御する。具体的には、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子持担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部で捕獲された前記遺伝子が導入される反応部と、を備えた遺伝子処理チップが設置されるチップ設置部と、前記遺伝子処理チップに流体を導入する流体導入機構と、溶離した遺伝子を検出する検出機構と、を備え、前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部に導入された前記洗浄液は前記遺伝子抽出部から前記注入口に流れるよう制御されることを特徴とする遺伝子処理装置である。
【００２４】
または、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、注入口に連絡して形成され、前記試料を含む液が導入され、前記遺伝子を捕獲する遺伝子持担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に連絡して形成される洗浄液保管部と、を有し、前記注入口に対して遺伝子抽出部の下流側に外部と流体が連絡する遺伝子抽出部流体連絡部と、遺伝子抽出部に対して前記洗浄液保管部の下流側に外部と流体が連絡する洗浄液保管部流体連絡部と、を備えた遺伝子処理チップが設置されるチップ設置部と、前記遺伝子処理チップに流体を導入或は吸入する流体制御機構と、前記試料に含まれる遺伝子を検出する検出機構と、を備え、前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間を流体が流れるようにし、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限するようにして、前記注入口から前記遺伝子抽出部に前記試料を含む液が導入されるよう制御し、前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限するようにして、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間を流体が流れるようにして、前記洗浄液を前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部を経て前記注入口側に流れるよう制御されることを特徴とする遺伝子処理装置である。
【００２５】
また、例えば、前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内から前記チップ外に前記遺伝子処理チップ内の流体が流れるよう吸引し、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限して、前記注入口から前記遺伝子抽出部に前記試料を含む液が導入されるよう制御することにより注入口が開放していてもよい。
【００２６】
前記遺伝子抽出部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間を流体が流れうるようにし、前記洗浄液保管部流体連絡部を前記チップ内と前記チップ外との間の流体の流れを制限し、前記注入口に流体を供給して、前記注入口から前記遺伝子抽出部に前記試料を含む液が導入されるよう制御することにより、注入口は大気との間に大気の連通を妨げる壁を備える。
【００２７】
また、分析チップ内の反応槽の温度を制御する手段を備える。そして、所定の温度サイクルを加えて遺伝子を増幅させることが好ましい。
【００２８】
或は、６０〜６５℃の範囲内で遺伝子を増幅し、蛍光検出や副生成物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を吸光光度計により測定する形態を用いる。或は、塩基配列が既知のヌクレオチドを結合させた圧電素子の表面に遺伝子が結合したときに、圧電素子の発振周波数が変化する。この周波数変化を測定することで、固定したヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取りを行うようにすることができる。
（６）被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体から遺伝子を抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する遺伝子処理チップを冷却して冷凍する工程と、前記冷凍した遺伝子処理チップを搬送する工程とを有することを特徴とする遺伝子処理チップの使用方法である。または、冷凍でなく冷蔵であることも考えられる。
（７）  遺伝子を含む被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体から遺伝子を抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する遺伝子処理チップが、一旦、冷却して冷蔵或は冷凍されて保管された後に供給される工程と、前記提供された分析チップを室温に戻す工程と、前記試料注入口に遺伝子を含む試料が導入され、前記試薬により遺伝子が抽出される工程と、前記遺伝子を検出する工程と、を有することを特徴とする遺伝子検出方法である。
【００２９】
これらの形態を用いることにより、遺伝子処理チップは、バルブ等の機械部品を多数搭載しなくとも、複雑な試薬との混合などの処理を効率的にチップ上で実施することができる。あるいは、使用済みの廃液を注入口などに貯蔵することで全体の小型化を図ることがｄけいる。試験毎にカートリッジを使い捨てにする形態に適している。
【００３０】
また、試薬の流量を小さくすることにより、試薬と試料との混合が効果的に実施でき、分析装置の小型化が図れ、或は、試薬や試料の温度制御を行う際熱応答性が高く、分析時間の短縮化を図ることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、微量の試薬であっても短時間に遺伝子処理がチップ上で簡易に行うことができる遺伝子処理チップ或は遺伝子処理装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の実施例を以下に説明する。なお、本発明は、本明細書に開示した内容に限定するものではなく、公知技術に基づく変更を制限するものではない。
【００３３】
本発明の一実施例として、試料から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の遺伝子が存在するか否かを検出する例を説明する。ここで試料とは、血液、細菌、ウィルス等の液体であることができる。
【００３４】
（分析の原理）
遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ，次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。
・第１段階・・・細胞膜の溶解
試料にカオトロピックイオン（分子の直径が大きい−1価の陰イオン）を含む溶液を混合し、対象となる遺伝子を包んでいるウィルスや細胞の膜をカオトロピックイオンの働きにより破壊する。またカオトロピックイオンは、同時に試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。
・第２段階・・・結合
溶解後の混合物にシリカが加わると、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカが特異的に結合する。一般的には混合物をガラスフィルタに通す方法が用いられる。
・第３段階・・・洗浄
試料に含まれる蛋白質や、カオトロピックイオンが抽出物に混入すると、遺伝子増幅による遺伝子の検出を阻害するので、遺伝子−シリカを洗浄する操作が必要となる。ここでは高濃度のエタノールで洗浄する。遺伝子は高濃度のエタノールに溶解しにくい性質を持っているため、シリカに吸着している遺伝子はこの過程で溶離しない。
・第４段階・・・溶離
洗浄後、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカに加え、遺伝子をシリカから溶離する。
・第５段階・・・遺伝子検出
溶離した遺伝子にプライマー（目的とするＤＮＡ領域の両末端の20塩基ほどと同じ塩基配列をもつ一本鎖DNA）、DNA合成酵素（ポリメラーゼ）と四種類の基質（ｄＮＴＰ）等を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかけることで遺伝子は増幅する（ポリメラーゼ連鎖反応）。ここで上記試薬に加え、蛍光色素を予め注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出することができる。
【００３５】
（分析チップの構成）
遺伝子を処理する分析チップの構成を図１を用いて説明する。図１は分析チップ１０１の詳細図である。本実施例では、溶解液保管槽と遺伝子増幅試薬を備える形態について説明する。
分析チップ１０１は，細胞膜溶解液を保管する溶解液保管槽１１１と、試料注入口１０２（廃液槽としても使用される場合有）と、遺伝子結合担体を流路に充填した遺伝子抽出エリア１１２と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽１１３と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽１１４と、遺伝子の検出を行う反応槽１０３と、それぞれの槽を構成する流路において保管された液が位置するよりも流路の末端側に位置し、外部の流路との接点となるチップポート（１２１〜１２６）から構成される。ここでチップ内外の流体が連通される。流体とは例えば空気などの気体である。場合によっては水などの液体であってもよい。本実施例では、更に、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽１１５を備えた例を示している。これらのチップポートでチップ内と外部との間を流体が連通させることができる。これらチップ構成要素の大部分は、マイクロファブリケーション技術によりパターン転写された微細流路である。
【００３６】
ここで分析チップ１０１の作成方法を述べる。分析チップ１０１の材料として、加工費用が高くまた割れやすいガラスよりも、廃棄処理性に優れる樹脂のほうが好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、本実施例では以下の優れた特性を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ダウコーニングアジア社製，シルポット184）を使用した。本チップには以下の特性を備えることが好ましい。
・生体適合性良好（通常のシリコンゴムは生理的に不活性）
・サブミクロンの精度で型の転写が可能（硬化前は低粘度で流動性に富むため，複雑な形状の細部まで良好に浸透）
低コスト（８円／１グラム。従来の汎用マイクロデバイス材料であるパイレックスガラスは1ｋ円／１グラムであり１／１００以下）
・焼却により容易に廃棄可能
以下に樹脂基板（以下には一例としてＰＤＭＳを使用した場合を記載）を使用した分析チップ１０１作成の流れを図２に示す。分析チップは、分析チップの構成要素をかたどるパターンをフォトリソグラフィー技術により作製し、このパターンを樹脂に転写成形して成型することができる。プロセスは大きく分けて，〔１〕ＰＤＭＳに転写するパターンの成形，〔２〕ＰＤＭＳへのパターン転写，〔３〕ＰＤＭＳ同士の接合，からなる。
【００３７】
〔１〕ＰＤＭＳに転写するパターンの成形
パターンの材料として感光性厚膜レジスト２０７（Micro.Chem社製，ＮＡＮＯ ＳＵ−８）をシリコンウェハ２０８に塗布（ステップ２０１），フォトマスク２０９を感光性厚膜レジスト２０７の上に置いて露光（ステップ２０２），現像の行程（ステップ２０３）を経てマイクロパターンが成形される。従来のウェットエッチングによるフォトファブリケーションと異なり，短形断面を保持しながら曲線形状を成形できる長所を有する。
【００３８】
〔２〕ＰＤＭＳへのパターン転写
ＰＤＭＳ２１０と硬化剤を重量比10：１の割合で混合し，パターン上に塗布，１００℃で１時間加熱することによりＰＤＭＳ２１０は硬化する（ステップ２０４）。凸形状のマイクロパターンより，凹形状のＰＤＭＳ２１０が得られる（ステップ２０５）。
【００３９】
〔３〕ＰＤＭＳ同士の接合
パターンが転写されたＰＤＭＳ２１０の表面を酸素プラズマ処理し、2枚のＰＤＭＳ２１０を重ねあわせることで，２枚のＰＤＭＳ２１０は接合する。接合強度は，接合部位を剥がそうとするとＰＤＭＳ２１０が破断するほど充分なものである。なお一方をＰＤＭＳ２１０として、シリコン，ガラスと接合させてもよい。ＰＤＭＳの成形方法は上記の手法に限定されるものではなく、例えば押し出し成形によって加工することができる。
本分析チップ１０１のより詳細な構造を図１、図３を用いて説明する。図３は分析チップ１０１の断面図である。分析チップ１０１は２枚のＰＤＭＳがプラズマ処理により表面改質され、接合したものである。まずＰＤＭＳ第１層１３１には、試料注入口兼廃液槽１０２となる貫通穴が形成されている。試料注入口兼廃液槽１０２の体積は５０〜１００μＬで、大気開放である。ＰＤＭＳ第２層１３２には、様々な試薬槽（１１１〜１１５）となる微小流路１１０がパターン成形されている。微小流路１１０は断面形状が縦０．１ｍｍ、横０．５ｍｍで形成した。断面形状は特に限定されないが、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、ＰＤＭＳ第１層１３１がたわんで微小流路１１０の矩形構造が崩れる恐れがある。
【００４０】
さらにＰＤＭＳ第２層１３２には、微小流路１１０と外部装置の流路とを連通するチップポート１２０と、反応槽１０３となる貫通穴が形成されている。反応槽１０３に導入される遺伝子を含む液体の体積は１０〜３０μＬである。特に、反応槽１０３の体積が１０〜２０μＬとすることで、熱応答性が向上し、反応槽１０３の温度制御が迅速化する。これにより、反応槽１０３の温度を秒単位で変化させながら最適な条件下で反応を進行させることができる。また反応槽１０３の体積を微小化することで、反応槽１０３における溶離液と遺伝子増幅試薬との混合が短時間（例えば約１秒程度）で済むため、混合操作が容易となる。なお、反応槽１０３は、試料の注入口１０２よりもう厚さ方向から見た面積が大きい。従来技術（特表２００１−５２７２２０号）では超音波素子等を用いて混合を行っていたが、本実施例によれば、簡素化のためには混合操作を用いないことも考えられる。或は、用いるにしても簡易なものですむ。
【００４１】
なお、反応槽１０３の中で遺伝子の検出を行うので、当然底となる板が必要である。後述するが，分析チップ１０１の底板１４０は温度制御機構から反応槽１０３に熱を伝える媒体の役割も果たすことから，熱伝導性が良い材料であることが好ましい。さらに，底板１４０の表面が鏡面であれば，反応槽１０３内での蛍光が底板１４０に反射するから，遺伝子の検出感度が高くなる。底板１４０として好ましいのはクロムであり、最も好ましいのはシリコンである。シリコンは熱伝導性が良好であり，かつＰＤＭＳとの接合が酸素プラズマ処理のみで容易に行えるからである。
【００４２】
本分析チップ１０１には、４つの試薬槽（溶解液保管槽１１１、洗浄液保管槽１１３、溶離液保管槽１１４、遺伝子増幅試薬保管槽１１５）が内蔵されている。いずれの試薬槽も、流路形状が好ましい。試薬槽内の試薬を送液するために、試薬槽の背後から流体（空気や水）を試薬槽に送る。このとき、試薬槽が流路形状でなかった場合、流体の通り抜けやすい部位（液ぬれ性のよい部位）のみ試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬槽に残るためである。消費する試薬の量を減らすために、試薬槽を流路形状にするのは効果的である。
【００４３】
ここで、溶解液保管槽１１１の体積は１０〜２０μＬ、洗浄液保管槽１１３の体積は１０〜３０μＬ、溶離液保管槽１１４の体積は５〜１０μＬ、遺伝子増幅試薬保管槽１１５の体積は５〜１０μＬが好ましい。特に、溶離液（含遺伝子）と遺伝子増幅試薬との和が１０μＬ以下であると、前述のように反応槽１０３における溶離液と遺伝子増幅試薬との混合が迅速化し、かつ反応が均一となるため最適である。このように、試薬槽や反応槽の体積をマイクロ化することで、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。
【００４４】
遺伝子抽出エリア１１２に充填する遺伝子結合担体として、石英ウール、ガラスウール、ガラスファイバー、ガラスビーズが適用可能である。ガラスビーズ適用の際は、接触面積を大きくするためにビーズサイズを２０〜５０μｍとするのが好ましく、２０〜３０μｍが最適である。
【００４５】
また、遺伝子保持担体を堰きとめるために、エリアを構成する流路が１箇所以上狭まっていることが好ましい。
【００４６】
例えば、遺伝子結合担体を遺伝子抽出エリア１１２に保持するために、遺伝子抽出エリア１１２の微小流路中、２箇所の流路幅を１０μｍまで狭めると良い。すなわち、狭められた流路が遺伝子結合担体に対して堰となる。流路を１０μｍ未満にすると流体抵抗が大きく流体制御が困難になる。よって、堰としての流路幅は１０〜２０μｍが好適である。  （分析装置の構成）
分析チップ１０１をセットする分析装置の断面図を図４に示す。本分析装置には大きくわけて、流体系、温調系、そして光学検出系の３つから構成される。分析チップ１０１をセットする基板１００には、分析チップ１０１を吸着させるための吸着溝１５０、分析チップ１０１のポートに連通する装置内流路１６２、反応槽１０３の温度を最適化するための温度制御機構１７０が内蔵されている。分析装置には各制御を行う制御機構を備える。分析装置に、ポンプ１６０を制御するポンプ制御機構１６５、バルブ１６１を制御するバルブ制御機構１６６、光源１８０を制御する光源制御機構１８５、光検出器１８１を制御する光検出器制御機構１８６、光検出器の信号を変換する光信号変換機１８７および変換された光信号を表示するデータ表示画面１８７が搭載される。
【００４７】
分析チップ１０１を基板１００の上に置き、基板１００の吸着溝１５０を真空引きすることにより，分析チップ１０１は基板１００に吸着する。このように真空チャックを行うことで，チップポート１２０と装置内流路１６２が確実に接続され、流体の漏れを防止する一方で、分析チップ１０１は基板１００に対して容易に着脱可能となる。分析チップ１０１を使い捨てとするには、真空チャックによる分析チップ１０１の固定方式が極めて実用的である。
【００４８】
温度制御機構１７０としては、様々な発熱体が適用可能であるが、例えば、好ましいのはペルチェである。ペルチェを使用した場合、印加電流の向きを変えるだけで反応槽１０３の昇温・冷却操作を簡便に行うことができる。
【００４９】
装置内流路１６２は、それぞれバルブ１６１を介してポンプ１６０に接続される。ポンプ１６０は、送風・吸引の切り替えが可能なものがより好ましく、また複数個あると好ましい。ある試薬槽の試薬を送液したい場合には、バルブ１６１を切り替えてその試薬槽に連通するポートのみに送風を行う。
【００５０】
このように流体を制御するバルブ１６１を分析チップ１０１の内部ではなく、分析装置側に設けることが好ましい。これにより、分析チップ１０１には機械部品がなくなり、小型化・ディスポーザブル化を実現することができる。
【００５１】
光検出系は、反応槽１０３内の遺伝子に励起光を照射する光源１８０と、反応槽１０３内の蛍光を測定する光検出器１８１から構成される。例えば測定は経時的に測定する。光源１８０は様々な波長領域のものが使用可能であるが、蛍光色素として一般的なエチジウムブロマイドを用いた場合、紫外線ランプや紫外線レーザーを用いるのが好ましい。光検出器１８１は、光検出器１８１受光面が反応槽１０３の真上にくるよう配置する。光検出器１８１としてはＣＣＤカメラ、光電子倍増管、フォトダイオード等を使用できるが、装置を小型化するにはフォトダイオードが好ましい。
【００５２】
本発明では、従来技術のような大型の分析カートリッジが不要であり、機械部品を内蔵しない小型の分析チップを基板上に置いて簡便な光検出器を組み合わせるだけの、小型で可搬の分析装置を提供することが出来る。
【００５３】
（分析の手順）
分析チップ１０１を用いた分析の手順を、図４、図５、図６を参照しながら説明する。図５は分析方法の手順を示すフローチャート図である。図６は実施例１の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
【００５４】
分析の手順としては、主に以下の手順を有することができる。
【００５５】
試料の細胞壁を壊す溶解液を試料に供給した方が良い場合は、まず、試料の細胞壁を壊す溶解液を試料と混合する。本工程が不要の場合は試料を導入した後直接以下の手順を行う。
【００５６】
次に、前記溶解液と試料の混合液を、遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。
【００５７】
そして、試料に含まれる蛋白質等を洗浄する洗浄液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらにその廃液を試料が当初保持されていた槽に送液する。
【００５８】
次に、遺伝子保持担体に吸着された遺伝子を溶離する溶離液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらに遺伝子を検出する反応槽へと送液する。
【００５９】
その後、分析対象の遺伝子の有無を検出する。以下に一例を具体的に説明する。
【００６０】
初めに、４種類の試薬、すなわち細胞膜溶解液、洗浄液、遺伝子溶離液、遺伝子増幅試薬がそれぞれ溶解液保管槽１１１、洗浄液保管槽１１３と、溶離液保管槽１１４、遺伝子増幅試薬保管槽１１５に内蔵され、凍結保存しておいた分析チップ１０１を室温で解凍する。分析チップ１０１に予め１検査分のみの試薬を内蔵してユーザーに提供することで、分析チップ１０１を１検査の使い切りとしても試薬の無駄がなく、経済性が向上する。またユーザーは試薬を各試薬保存槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐことも出来る。さらに、この分析チップ１０１を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で分析チップ１０１を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。このように、使い捨て可能な分析チップ１０１に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、分析チップ１０１を冷蔵あるいは冷凍した状態でユーザーに提供することで、簡便な分析環境を作ることができる（ステップ３１１）。
【００６１】
次に、分析チップ１０１を基板１００の上に置き、チップポート１２０と装置内流路１６２が連通したのを確認したのち、吸着溝１５０を減圧する。このようにして真空引きし、真空チャックにより分析チップ１０１を基板１００に固定する（ステップ３１２）。
そして、試料注入口兼廃液槽１０２に試料を１０μＬ分注する。試料とは、遺伝子を含む試料であり、血液、細菌、ウィルス等の液体である（ステップ３１３）。
【００６２】
次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えて溶解液ポート１２１にのみポンプ１６０から流体を流す。（溶解液ポート１２１：開、他のポート１２２〜１２６：閉）ここで使用する流体は、水、アルコール、或いは空気など、試薬と接した時に試薬の活性が損なわれないものであればよい。溶解液保管槽１１１内の細胞膜溶解液２０μＬは流体によって試料注入口兼廃液槽１０２に注入され、試料注入口兼廃液槽１０２内の試料と混合される。これにより、試料の細胞膜が破壊され、試料の遺伝子が細胞外部に放出される。ここで細胞膜溶解液としては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩化水素、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウムといったカオトロピックイオンを含む溶液が好ましい（ステップ３１４）。
【００６３】
次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２からチップ内部を減圧するようポンプ１６０を吸引作動させる。（チップポートＡ１２２：開、他のポート１２１、１２３〜１２６：閉、なお、溶解液ポート１２１は開でも可。）これにより、試料注入口兼廃液槽１０２内の遺伝子懸濁液は遺伝子抽出エリア１１２に移動する。そして、試料注入口兼廃液槽１０２内の遺伝子懸濁液が全て遺伝子抽出エリア１１２に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。これにより、遺伝子抽出エリア１１２内の遺伝子結合担体に遺伝子が捕獲される（ステップ３１５）。
【００６４】
次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２を閉じ、さらに洗浄液ポート１２３にのみポンプ１６０から流体を流す。（洗浄液ポート１２３：開、他のポート１２１〜１２２、１２４〜１２６：閉、なお、溶解液ポート１２１は開でも可。）洗浄液保管槽１１３内の洗浄液２０μＬは流体によって遺伝子抽出エリア１１２に送液される。ここで洗浄液としては、ＴＲＩＳ塩酸が使用可能であり、５０％以上の高濃度エタノールがより好ましい。この洗浄液により、遺伝子抽出エリア１１２に残留する蛋白質やカオトロピックイオンは除去される。そして、遺伝子抽出エリア１１２を経た洗浄液が試料注入口１０２側に流れるようにする。例えば、遺伝子抽出エリア１１２を洗浄した洗浄液が試料注入口兼廃液槽１０２に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。従来例（特表２００１−５２７２２０号）では廃液だめが大きいため、結果的に分析カートリッジも大型となっていたが、本実施例のように廃液槽を試料注入口と兼ねさせることで、分析チップ１０１のサイズを小型化することができ、使い捨ての用途にはより好適である。このとき、試料注入口１０２の他に、または代りに、溶解液保管槽111に使用済みの洗浄液を導入するようにすることもできる。これにより、試料注入口１０２を大型化しなくとも廃液を蓄えられる。或は、試料注入口から外部へ廃液が漏れることを効果的に抑制することができる。この際、溶解液保管槽１１１と試料注入口兼廃液槽１０２と遺伝子抽出エリア１１２と溶離液保管槽１１４とが直列に配置されていることで、流体の制御手順が最も簡便で済み分析時間が最短となる（ステップ３１６）。
【００６５】
次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えて洗浄液ポート１２３を閉じ、溶離ポート１２４とチップポートＢ１２６を開く。そしてポンプ１６０を駆動し溶離ポート１２４に流体を流す。（溶離ポート１２４、チップポートＢ１２６：開、他のポート１２１〜１２３、１２５：閉、なお、溶解液ポート１２１は開でも可。）溶離液保管槽１１４内の溶離液５μＬは流体によって遺伝子抽出エリア１１２に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡやＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。この溶離液により、遺伝子抽出エリア１１２の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。そして、遺伝子を含む溶離液が遺伝子抽出エリア１１２の末端に達した時に、チップポートＢ１２６から反応槽１０３を減圧するよう別のポンプ１６０を吸引作動させる。これにより、遺伝子を含む溶離液が試料注入口兼廃液槽１０２に送液されることなく、
反応槽１０３に導かれる。そして溶離液が反応槽１０３に全て移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。これにより、試料の前処理すなわち遺伝子の抽出が完了したことになる（ステップ３１７）。
【００６６】
ここで、抽出された試料について遺伝子検出装置によって検出を行う。
以下は遺伝子の検出手順の一例を示す。分析装置内のバルブ１６１を切り替えて溶離液ポート１２４とチップポートＢ１２６を閉じ、遺伝子増幅試薬ポート１２５にのみポンプ１６０から流体を流す。（遺伝子増幅試薬ポート１２５：開、他のポート１２１〜１２４、１２６：閉、なお、溶解液ポート１２１、チップポートＢ１２６は開でも可。）遺伝子増幅試薬保管槽１１５内の遺伝子増幅試薬５μＬは流体によって反応槽１０３に注入され、反応槽１０３内の遺伝子と混合される。ここで遺伝子増幅試薬は、２．５ｍＭ濃度の4種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、バッファ（１００ｍＭ濃度ＴＲＩＳ塩酸、５００ｍＭ濃度ＫＣｌ、１５ｍＭ濃度ＭｇＣｌ２）、２種類のプライマ、ＤＮＡ合成酵素（TaqＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼのいずれか）、蛍光色素（エチジウムブロマイド、SYBR  GREEN（Molecular  Probe製）のいずれか）から構成される（ステップ３１８）。
【００６７】
次に、分析チップ１０１の下部に設けた温度制御機構１７０を駆動し、底板１４０を介して反応槽１０３の温度が下記の２種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける（ステップ３１９）。
【００６８】
温度サイクル例としては、下記の程度を実施する
「90〜95℃10〜30秒⇔65〜70℃10〜30秒」×３０〜４５回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。
「94℃30秒⇔68℃30秒」×４５回
温度サイクルをかけながら、分析チップ１０１上部の光源１８０から励起光を反応槽１０３に照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると，吸収した光源１８０光のエネルギーを蛍光色素に渡す（エネルギー転移）。その結果，蛍光色素は励起されて蛍光を発する。すなわち、試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器１８１により反応槽１０３内の蛍光量をモニタすることで、図７に示されるように、目的遺伝子の有無をリアルタイムに検出可能となる（ステップ３２０）。
【００６９】
そして基板１００の吸着溝１５０の吸着力を下げた後に基板からチップを取り出す。例えば、分析が完了した時分析チップ１０１を分析装置から取り出し、廃棄する（ステップ３２１）。試料や試薬の後処理が必要ない上に、反応検出部の洗浄操作が必要ないため、簡便・迅速な分析を提供することができる。
【００７０】
本願発明の分析チップを使用することで、試料から遺伝子を抽出する工程が小型のチップ内で自動化される。分析チップ内にバルブ等の機械部品が含まれず、また廃棄槽が試薬注入口を兼ねるなど省スペースが実現された結果、使い捨て用途に好適な分析チップが提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。さらにディスポーザブルな分析チップに予め１検査分のみの試薬を内蔵し、分析チップを冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能となる。
【００７１】
なお、本実施例で説明したチップの反応槽１０３は大気との間に大気の連通を妨げる壁を備える形態であることができる。一方で、製造上の観点などから、反応槽１０３領域は大気開放となっていることもできる。また、反応槽の個数は1個の例を示した。しかし、検査する対象他に応じる等の観点で複数個であってもよい。
【００７２】
また、このように構成することにより、分析チップ内の流体がチップ外部の流体機器（ポンプ、バルブ）により流体や試薬などの流れが制御されているので、チップ内にポンプや多数のバルブを配置することを抑制することができる簡易なチップ構成にすることができる。
【００７３】
これにより、試料からの遺伝子抽出・分析までが簡便・迅速となり、試薬を予め貯蔵し分析後に試薬と共に処分しうる分析チップおよびそれを備えた分析装置を提供することができる。
【００７４】
また、本実施例では、蛇行流路状の液保管槽や遺伝子抽出エリアの細管の断面積は、これらの保管槽と他のエリア（例えば注入口や反応槽）をつなぐ連絡流路部より大きく形成することにより、試薬等の流体を保管槽などから排出する際の圧力損失を小さくことができる。
【００７５】
一方で、液が保管されている保管槽部の細管の断面積が大きすぎて液の排出時に液残りの発生を抑制する程度の小ささであることが好ましい。例えば、この連絡流路部の細管断面積に対して、１０倍以下程度にすることが考えられる。或いはさらに保管槽等と連絡流路との液流通の際の拡大・縮小損失を小さくする観点で、例えば５倍以下程度にすることが考えられる。
【００７６】
前記は断面積として規定したが、細管の高さは保管槽等の領域と連絡流路との差を同じかあまり変えずに、幅を前述の高さの差より大きく変えることが製造の観点で容易となり好ましい。例えば、前記の断面積として規定した数値を幅として規定されることができる。
【００７７】
また、前記保管槽或いは遺伝子抽出エリアと対応するポートとの間に、前記保管槽或いは遺伝子抽出エリアの細管断面積よりも狭くなっている領域を有することが、保管している液の漏洩などを抑制する点で好ましい。
［実施例２］
本実施例は、基本的には実施例１で説明した形態を備えることができるが、本実施例では、分析チップ１０１の試料注入口兼廃液槽１０２は大気開放でなく、少なくとも試料を試料注入口兼廃液槽１０２に分注した後には、試料注入口１０２には大気の連通を妨げる壁などのカバーが形成される。例えば、図８のように樹脂との密着性が良いガラス薄板（例えば顕微鏡用のカバーガラス）等の試料注入口兼廃液槽カバー１０４を試料注入口兼廃液槽１０２に被し、試料注入口兼廃液槽１０２を密閉することも出来る。試料注入口兼廃液槽１０２をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置側に試料注入口兼廃液槽カバー１０４を装着する機構が備わっているとより好ましい。なお、これらのカバーは予め大気の連通を妨げるよう覆われている形態であることが操作上の観点では効率的である。
【００７８】
これに伴って、実施例２の流体ハンドリングのプロファイルの例を図９に示す。実施例１におけるステップ３１１から３１４までは実施例２も同様である。ステップ３１５以降を説明する。分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２を開き、溶解液ポート１２１に引き続きポンプ１６０から流体を流す。（溶解液ポート１２１、チップポートＡ１２２：開、他のポート１２３〜１２６：閉。）これにより、試料注入口兼廃液槽１０２内の遺伝子懸濁液は遺伝子抽出エリア１１２に移動する。そして、試料注入口兼廃液槽１０２内の遺伝子懸濁液を遺伝子抽出エリア１１２に移行終了した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１５）。
次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２を閉じ、溶解液ポート１２１は開いたまま洗浄液ポート１２３に流体を流す。（溶解液ポート１２１、洗浄液ポート１２３：開、他のポート１２２、１２４〜１２６：閉。）洗浄液保管槽１１３内の洗浄液が流体によって遺伝子抽出エリア１１２に送液される。そして、遺伝子抽出エリア１１２を洗浄した洗浄液が全て試料注入口兼廃液槽１０２に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１６）。
【００７９】
次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えて溶解液ポート１２１と洗浄液ポート１２３を閉じ、溶離ポート１２４とチップポートＢ１２６を開く。（溶離ポート１２４、チップポートＢ１２６：開、他のポート１２１〜１２３、１２５：閉。）そしてポンプ１６０を駆動し溶離ポート１２４に流体を流す。溶離液保管槽１１４内の溶離液は流体によって遺伝子抽出エリア１１２に送液される。この溶離液により、遺伝子抽出エリア１１２の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離し、チップポートＢ１２６が開いている反応槽１０３へと導かれる。そして溶離液が反応槽１０３に全て移行した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１７）。
【００８０】
このように、試料注入口兼廃液槽１０２を密閉することで、ポンプによる流体（ここでは例えば空気）の流入操作で処理を効果的に行うことができる。実施例１のような吸引操作が不要とすることも考えられる。さらに、試料注入口兼廃液槽１０２が大気開放ゆえ起こりうる大気からの汚染や、試薬類の漏れを防止することができる。
［実施例３］
本実施例は基本的には実施例１で説明した形態を用いることができるが、本実施例では温度を一定に保ったまま遺伝子の増幅を行う。
【００８１】
試料から遺伝子を抽出するまでの工程は実施例１と同じである。この場合、遺伝子増幅試薬の成分が異なる。すなわち遺伝子増幅試薬は１０ｍＭ濃度の4種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、バッファ（２ｍＭ濃度ＭｇＳＯ４）、４種類のプライマ、１００ｍＭ濃度のＭｇＳＯ４、４Ｍ濃度のＢＥＴＡＩＮＥ、ＤＮＡ合成酵素（４Ｕｎｉｔ／μＬのＢｓｔポリメラーゼ）、蛍光色素（エチジウムブロマイド、SYBR  GREEN（Molecular  Probe製）のいずれか）の混合物とする。また温度制御機構１７０による反応槽１０３の温度調整は６０〜６５℃の範囲とする。そして目的遺伝子が存在した場合、温度制御開始１時間ほどで蛍光量が増加する。また、蛍光検出を行うのではなく、副生成物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を吸光光度計により測定してもよい。
【００８２】
４種類のプライマーの設計がやや困難であるが、温度のサイクルが必要ないのでペルチェより簡便なヒーターで温度調節が可能である。
分析装置の構成要素を簡素化できる長所を有する。
［実施例４］
本実施例は、基本的には実施例１で説明した形態を用いることができるが、分析チップ１０１の底板１４０として、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を適用する。圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定する手法として広く利用されている。そこで、所定の予め塩基配列が既知の様々なヌクレオチドをチップ底板１４０としての圧電素子に固定しておく。固定方法は下記の如くが好ましい。まず圧電素子の電極上にスパッタリング、蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいSiO2を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（APS）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ0.1〜1μｍであることが好ましい。双方の厚みが1μｍを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、UVクロスリンカーを用いて６０mJ/cm2の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。
【００８３】
試料から遺伝子を抽出するまでの工程は実施例１と同じである。そして反応槽１０３に送液された遺伝子を温度制御機構１７０により９４℃付近まで昇温すると、遺伝子は熱変性して一本鎖となる。この一本鎖遺伝子と底板１４０上に固定されたヌクレオチドが結合したとき、圧電素子の発振周波数が変化する。よって、この周波数変化を測定することにより、固定したヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取りが可能となる。
【００８４】
液中で圧電素子を使用した場合、液温が1℃変化すると周波数は15〜30Hz変化するため液温の正確な制御が必須となるが、本実施例では、遺伝子増幅試薬が不要となり、また温度サイクルが要らないため検出時間が短くなる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】分析チップの構成を示す拡大図である。
【図２】反応チップの作成手順を示すフローチャート図である。
【図３】実施例１の分析チップの断面図である。
【図４】分析装置の構成を示す断面図である。
【図５】実施例１の分析手順を示すフローチャート図である。
【図６】実施例１の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
【図７】実施例１の実験結果の一例である。
【図８】実施例２の分析チップの断面図である。
【図９】実施例１の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
１００…基板、１０１…分析チップ、１０２…試料注入口兼廃液槽、１０３…反応槽、１０４…試料注入口兼廃液槽カバー、１１０…微小流路、１１１…溶解液保管槽、１１２…遺伝子抽出エリア、１１３…洗浄液保管槽、１１４…溶離液保管槽、１１５…遺伝子増幅試薬保管槽、１２０…チップポート、１２１…溶解液ポート、１２２…チップポートＡ、１２３…洗浄液ポート、１２４…溶離液ポート、１２５…遺伝子増幅試薬ポート、１２６…チップポートＢ、１３１…ＰＤＭＳ第１層、１３２…ＰＤＭＳ第２層、１４０…底板、１５０…吸着溝、１６０…ポンプ、１６１…バルブ、１６２…装置内流路、１６５…ポンプ制御機構、１６６…バルブ制御機構、１７０…温度制御機構、１８０…光源、１８１…光検出器、１８５…光源制御機構、１８６…光検出器制御機構、１８７…光信号変換機、１８７…データ表示画面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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