(57)【要約】      （修正有）【課題】葯および／または花粉において異種遺伝子を発現させるための発現カセットを提供すること。【解決手段】複数の配列で示される配列の一部の配列、または該一部の配列において少なくとも１つの置換、付加もしくは欠失を有する配列であって、該一部の配列と同等のプロモーター活性を有する配列を含むプロモーター；および異種遺伝子が該プロモーターと作動可能に連結されるように、該異種遺伝子を挿入するための部位、を含む、発現カセット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
葯において異種遺伝子を発現させるための発現カセットであって：
図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列、または該一部の配列において少なくとも１つの置換、付加もしくは欠失を有する配列であって、該一部の配列と同等のプロモーター活性を有する配列を含むプロモーター；および
異種遺伝子が該プロモーターと作動可能に連結されるように、該異種遺伝子を挿入するための部位、
を含む、発現カセット。
【請求項２】
請求項１に記載の発現カセットであって、該発現カセットが葯において特異的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【請求項３】
請求項１または２に記載の発現カセットであって、該発現カセットが葯において優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現カセットであって、該発現カセットが葯において最優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記一部の配列が、図１（配列番号１）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１１０９位〜−４９０位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜−１９８位の配列、図２（配列番号２）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−２９８位〜＋３４２位の配列、および図２（配列番号２）の−１９８位〜＋３４２位の配列からなる群より選択される、発現カセット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記異種遺伝子が葯の形成を阻害する機能を持つ、発現カセット。
【請求項７】
花粉において異種遺伝子を発現させるための発現カセットであって：
図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列、または該一部の配列において少なくとも１つの置換、付加もしくは欠失を有する配列であって、該一部の配列と同等のプロモーター活性を有する配列を含むプロモーター；および
異種遺伝子が該プロモーターと作動可能に連結されるように、該異種遺伝子を挿入するための部位、
を含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項７に記載の発現カセットであって、該発現カセットが花粉において特異的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【請求項９】
請求項７または８に記載の発現カセットであって、該発現カセットが花粉において優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の発現カセットであって、該発現カセットが花粉において最優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記一部の配列が、図１（配列番号１）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１１０９位〜−４９０位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜−１９８位の配列、図２（配列番号２）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−２９８位〜＋３４２位の配列、および図２（配列番号２）の−１９８位〜＋３４２位の配列からなる群より選択される、発現カセット。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記異種遺伝子が花粉の形成を阻害する機能を持つ、発現カセット。
【請求項１３】
葯において異種遺伝子を発現させるためのベクターであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１４】
花粉において異種遺伝子を発現させるためのベクターであって、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１５】
葯において異種遺伝子を発現させるための方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
花粉において異種遺伝子を発現させるための方法であって、
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
葯において異種遺伝子を発現する植物体であって、該植物体は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを有し、ここで該異種遺伝子は該発現カセットにおいて前記プロモーターと作動可能に連結されている、植物体。
【請求項１８】
前記植物体が単子葉植物体である、請求項１７に記載の植物体。
【請求項１９】
前記植物体が双子葉植物体である、請求項１７に記載の植物体。
【請求項２０】
花粉において異種遺伝子を発現する植物体であって、該植物体は、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを有し、ここで該異種遺伝子は該発現カセットにおいて前記プロモーターと作動可能に連結されている、植物体。
【請求項２１】
前記植物体が単子葉植物体である、請求項２０に記載の植物体。
【請求項２２】
前記植物体が双子葉植物体である、請求項２０に記載の植物体。
【請求項２３】
葯において異種遺伝子を発現する植物体を作製する方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記植物が単子葉植物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記植物が双子葉植物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
花粉において異種遺伝子を発現する植物体を作製する方法であって、
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記植物が単子葉植物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が双子葉植物である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、植物遺伝子のプロモーターを用いる、有用植物の育種に関する。さらに詳しくは、イネのカタラーゼＡ（以下、ＣａｔＡという）遺伝子に由来するプロモーターを用いる有用植物の育種に関する。
【背景技術】
【０００２】
品種間の交配で生じるＦ１ハイブリッド（雑種第一代）が両親よりも優れた特性を示すことがあることが知られており、作物の品種改良の方法として従来から注目されていた。イネなどの自家受粉を行う作物においては、この性質を利用するための必要な技術の一つとして、花粉が稔性を持たない雄性不稔系統の作出方法が研究されている。従来は、植物遺伝資源の中から雄性不稔系統を探したり、突然変異を誘発して雄性不稔系統を選抜したりしていたが、実用品種にその遺伝子を導入するのは容易ではなく、利用は限られていた。
【０００３】
最近になって、バイオテクノロジーを利用した方法として、葯および／または花粉で発現するプロモーターにこれらの器官の形成を阻害する機能を持つ遺伝子（例えば、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ等をコードする遺伝子）をつなげて植物に導入し、稔性のある花粉形成を阻止する方法が提案されている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。あるいは、葯および／または花粉で発現するプロモーターを利用して、これらの器官の形成時に発現する遺伝子のアンチセンスＲＮＡを転写させたり、これらのｍＲＮＡを分解するリボザイムを導入する方法が有望視されている。
【０００４】
葯および／または花粉で発現する遺伝子のプロモーターは、トマト、シロイヌナズナ、トウモロコシなどで数種類が知られている（例えば、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４を参照のこと）。しかし、その活性は、実用的に用いられるには低いという問題点がある。さらに、葯および／または花粉の形成を人為的に制御するためには、これらの器官の各発生段階のいずれかで機能するプロモーターを単離し、それぞれの特徴を明らかにした上で、高い活性を持ったプロモーター含有カセットを作製できれば、非常に有用である。
【０００５】
従って、イネの遺伝子から、活性が高く、実用的にも使用され得る葯および／または花粉用のプロモーターが取得できれば、イネ等の作物を含む有用植物の品種改良に大いに貢献できる。
【０００６】
ＣａｔＡ遺伝子の単離方法、およびＣａｔＡ遺伝子のプロモーター領域を含むＣａｔＡ遺伝子のゲノミックＤＮＡの塩基配列は、本発明者らによって非特許文献５および非特許文献６において発表されているが、ここで植物体内でのプロモーターの発現部位に関する解析は行われていない。さらに近年、プロモーターに関する大まかな解析が行われた（特許文献１を参照のこと）。
【特許文献１】国際公開第００／５８４５４パンフレット
【非特許文献１】Ｍａｒｉａｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４７：７３７−７４１（１９９０）
【非特許文献２】Ｔｗｅｌｌら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２７０−１２７４（１９８９）
【非特許文献３】Ｐａｕｌら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９：６１１−６２２（１９９２）
【非特許文献４】Ｇｕｅｒｒｅｒｏら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２４：１６１−１６８（１９９０）
【非特許文献５】日本農芸化学会１９９２年大会講演要旨集：日本農芸化学会誌  ６６（３），４８８（１９９２）
【非特許文献６】Ｈｉｇｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３０：５０５−５２１（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の解決しようとする課題は、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を誘導するプロモーターとして使用され得る、イネのＣａｔＡ遺伝子の−１５５９位〜＋３４２位の領域の中の一部の配列を同定し、その一部の配列をプロモーターとして利用した発現カセットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーター領域（−１５５９位〜＋３４２位の領域）が、全長配列でなくとも、その一部の領域のみでなお、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を誘導するプロモーターとして使用され得ることを見いだし、この知見に基づいて本願発明を完成したものである。
【０００９】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１０】
（１）葯において異種遺伝子を発現させるための発現カセットであって：
図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列、または該一部の配列において少なくとも１つの置換、付加もしくは欠失を有する配列であって、該一部の配列と同等のプロモーター活性を有する配列を含むプロモーター；および
異種遺伝子が該プロモーターと作動可能に連結されるように、該異種遺伝子を挿入するための部位、
を含む、発現カセット。
【００１１】
（２）項目１に記載の発現カセットであって、該発現カセットが葯において特異的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【００１２】
（３）項目１または２に記載の発現カセットであって、該発現カセットが葯において優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【００１３】
（４）項目１〜３のいずれか一項に記載の発現カセットであって、該発現カセットが葯において最優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【００１４】
（５）項目１〜４のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記一部の配列が、図１（配列番号１）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１１０９位〜−４９０位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜−１９８位の配列、図２（配列番号２）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−２９８位〜＋３４２位の配列、および図２（配列番号２）の−１９８位〜＋３４２位の配列からなる群より選択される、発現カセット。
【００１５】
（６）項目１〜５のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記異種遺伝子が葯の形成を阻害する機能を持つ、発現カセット。
【００１６】
（７）花粉において異種遺伝子を発現させるための発現カセットであって：
図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列、または該一部の配列において少なくとも１つの置換、付加もしくは欠失を有する配列であって、該一部の配列と同等のプロモーター活性を有する配列を含むプロモーター；および
異種遺伝子が該プロモーターと作動可能に連結されるように、該異種遺伝子を挿入するための部位、
を含む、発現カセット。
【００１７】
（８）項目７に記載の発現カセットであって、該発現カセットが花粉において特異的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【００１８】
（９）項目７または８に記載の発現カセットであって、該発現カセットが花粉において優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【００１９】
（１０）項目７〜９のいずれか一項に記載の発現カセットであって、該発現カセットが花粉において最優先的に異種遺伝子を発現させる、発現カセット。
【００２０】
（１１）項目７〜１０のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記一部の配列が、図１（配列番号１）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１１０９位〜−４９０位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜−１９８位の配列、図２（配列番号２）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−２９８位〜＋３４２位の配列、および図２（配列番号２）の−１９８位〜＋３４２位の配列からなる群より選択される、発現カセット。
【００２１】
（１２）項目７〜１１のいずれか一項に記載の発現カセットであって、前記異種遺伝子が花粉の形成を阻害する機能を持つ、発現カセット。
【００２２】
（１３）葯において異種遺伝子を発現させるためのベクターであって、項目１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【００２３】
（１４）花粉において異種遺伝子を発現させるためのベクターであって、項目７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【００２４】
（１５）葯において異種遺伝子を発現させるための方法であって、
項目１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【００２５】
（１６）花粉において異種遺伝子を発現させるための方法であって、
項目７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【００２６】
（１７）葯において異種遺伝子を発現する植物体であって、該植物体は、項目１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを有し、ここで該異種遺伝子は該発現カセットにおいて前記プロモーターと作動可能に連結されている、植物体。
【００２７】
（１８）前記植物体が単子葉植物体である、項目１７に記載の植物体。
【００２８】
（１９）前記植物体が双子葉植物体である、項目１７に記載の植物体。
【００２９】
（２０）花粉において異種遺伝子を発現する植物体であって、該植物体は、項目７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを有し、ここで該異種遺伝子は該発現カセットにおいて前記プロモーターと作動可能に連結されている、植物体。
【００３０】
（２１）前記植物体が単子葉植物体である、項目２０に記載の植物体。
【００３１】
（２２）前記植物体が双子葉植物体である、項目２０に記載の植物体。
【００３２】
（２３）葯において異種遺伝子を発現する植物体を作製する方法であって、
項目１〜６のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【００３３】
（２４）前記植物が単子葉植物である、項目２３に記載の方法。
【００３４】
（２５）前記植物が双子葉植物である、項目２３に記載の方法。
【００３５】
（２６）花粉において異種遺伝子を発現する植物体を作製する方法であって、
項目７〜１２のいずれか一項に記載の発現カセットを提供する工程；
該異種遺伝子を該挿入部位に挿入して、組換え発現ベクターを形成する工程；
植物細胞を、該組換え発現ベクターで形質転換する工程；ならびに
該形質転換された植物細胞を再分化させて、植物体を得る工程
を包含する、方法。
【００３６】
（２７）前記植物が単子葉植物である、項目２６に記載の方法。
【００３７】
（２８）前記植物が双子葉植物である、項目２６に記載の方法。
【発明の効果】
【００３８】
本発明により、ＣａｔＡ推定全長プロモーター（ＣａｔＡ遺伝子の−１５５９位〜＋３４２位の領域）の一部の領域を、葯および／または花粉において所望の異種遺伝子を発現誘導するためのプロモーターとして利用することが可能となった。本発明に従ってプロモーターとして用いられるこの一部の領域は、従来知られていたＣａｔＡ推定全長プロモーターよりも短いので、イネ等の植物の品種改良における遺伝子操作をより容易にするという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本願発明について、以下に、より詳細に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００４０】
本明細書中において、「カタラーゼＡ」または「ＣａｔＡ」とは、本発明者らにより非特許文献５および６において報告された、イネ植物から単離されるカタラーゼの１つのアイソザイムを意味する。ＣａｔＡをコードするイネのゲノミック塩基配列は、本発明者らにより発表されている（非特許文献５および非特許文献６）。本明細書中では、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位からＥｃｏＲＩ切断部位までの４６７０塩基の配列を、配列番号３として示す。この配列はまた、国際ＤＮＡ塩基配列データベースＤＤＢＪにおいて、アクセッション番号Ｄ２９９６６として登録されている。非特許文献６には、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＥｃｏＲＩ認識配列を前後に加えて、４６７６塩基の配列が発表されている。
【００４１】
本明細書中において、「プロモーター」とは、遺伝子の転写を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいう。プロモーター領域は、遺伝子がイントロンを有する場合は、構造遺伝子の５’上流域だけではなく、第１イントロン等の領域などにも存在し得る。ＣａｔＡ遺伝子の野生型の推定全長プロモーター領域は、例えば、本発明者らにより上記特許文献１に記載されたように、ＣａｔＡゲノミックＤＮＡの塩基配列をＣａｔＡ  ｃＤＮＡの塩基配列と比較することにより特定され得る。本明細書中において、ＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーター領域は、本発明者らにより上記特許文献１で同定された、ＣａｔＡ遺伝子のゲノミック塩基配列の−１５５９位〜＋３４２位の領域をいう（ここで、Ｍｏｒｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：９７３−９７６（１９９２）においてＣａｔＡ遺伝子のｃＤＮＡ開始部位として報告された位置を、＋１位とする）。このＣａｔＡ遺伝子の野生型の推定全長プロモーター領域の塩基配列を、図１および配列番号１に示す。この推定全長プロモーター領域は、野生型のＣａｔＡ遺伝子の第１エクソンの５’上流側の配列、第１エクソン、第１イントロン、および第２エクソンの一部から構成される。このＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーター領域は、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を特異的に誘導し得るプロモーターであることが、特許文献１に開示されている。本願発明の発現カセットおよびベクター、ならびにその利用方法、ならびに上記の発現カセットおよびベクターで形質転換して得られる組換え植物体では、図１および配列番号１に記載されたＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーター領域の中の一部の配列をプロモーターとして使用する。しかし、本願発明の発現カセットおよびベクター、ならびにその利用方法、ならびに上記の発現カセットおよびベクターで形質転換して得られる組換え植物体は、図１および配列番号１に記載されたＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーター領域の全長配列（すなわち、−１５５９位〜＋３４２位の領域）を含まないことに留意すべきである。
【００４２】
本明細書において、配列の「一部」、「部分」、「断片」または「フラグメント」は互換可能に使用され、そして全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列の長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約５４０、約６００、約６４０、約７００、約７５０、約８００、約８３０、約９００、約１０００、約１４５０およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００４３】
下記において説明するように、ＣａｔＡ遺伝子の野生型の推定全長プロモーター領域の塩基配列の中で、ＣａｔＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧをＡＣＧに変換することによって得られる配列（この改変型配列を、図２および配列番号２に示す）の中の一部の配列もまた、葯および／または花粉において発現を誘導し得るプロモーター、好ましくは、葯および／または花粉において発現を特異的、優先的または最優先的に誘導し得るプロモーターとして使用され得る。このＡＴＧからＡＣＧへの変換は、導入したプロモーター配列の制御下で発現される異種遺伝子のタンパク質中にＣａｔＡ由来のアミノ酸配列を導入しないので好ましい。同様にして、ＣａｔＡ開始コドンＡＴＧは、ＡＣＧのみならず、タンパク質合成を開始させない他の任意のコドンに変換され得、そして類似の効果を奏し得る。
【００４４】
遺伝子工学的な品種改良において、有用遺伝子を葯および／または花粉に発現させるプロモーターカセットに挿入して用いる際、プロモーター配列が短いことは大変有利である。なぜなら、短い配列の方がベクターやプラスミドに導入しやすく、また他のプロモーターなどの配列制御配列との併用がしやすくなるからである。特許文献１に開示された推定全長プロモーターは、１９０１ｂｐもの長さであるのに対して、例えば、本明細書の実施例においてプロモーター活性を有することが示されたプロモーターは、１４５１ｂｐ、８３２ｂｐ、６４０ｂｐ、または５４０ｂｐと非常に短い。従って、全長プロモーターの中の短い断片であっても、プロモーターとして機能し得ることを見出した本願発明は、非常に有益である。
【００４５】
本発明のプロモーターの長さは、通常１０ヌクレオチド以上であるが、好ましくは、２０ヌクレオチド以上、３０ヌクレオチド以上、４０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、６０ヌクレオチド以上、７０ヌクレオチド以上、８０ヌクレオチド以上、９０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２００ヌクレオチド以上、３００ヌクレオチド以上、４００ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、５４０ヌクレオチド以上、６００ヌクレオチド以上、６４０ヌクレオチド以上、７００ヌクレオチド以上、７５０ヌクレオチド以上、８００ヌクレオチド以上、８３０ヌクレオチド以上、９００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、１４５０ヌクレオチド以上の長さであり得る。
【００４６】
本発明において使用するＣａｔＡ遺伝子のプロモーターは、例えば、以下のようにして単離することができる。
【００４７】
（イネＣａｔＡ遺伝子プロモーターの単離）
ＣａｔＡ遺伝子の単離方法、および本願発明のプロモーター領域を含むＣａｔＡ遺伝子のゲノミックＤＮＡの塩基配列は、本発明者らにより上記の非特許文献５および非特許文献６で発表されている。
【００４８】
イネＣａｔＡ遺伝子プロモーターは、イネのゲノミックライブラリーからスクリーニングされ得る。米国クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が市販しているイネのゲノミックＤＮＡライブラリー（Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ）が用いられ得る。
【００４９】
スクリーニング用のプローブとしては、本発明者らが単離したイネＣａｔＡ  ｃＤＮＡが用いられ得る。イネＣａｔＡ  ｃＤＮＡの単離方法および塩基配列は、本発明者らにより既に発表されている（上記のＭｏｒｉら（１９９２）を参照のこと）。
【００５０】
まず、ファージλを用いて作製されたイネゲノミック遺伝子ライブラリーを大腸菌に感染させてプラークを形成させる。このプラークを常法に従って、ニトロセルロース等のメンブレンに移し、標識したスクリーニング用プローブでハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ終了後、洗浄し、オートラジオグラフィーにかけ、ハイブリダイズすることが確認されたファージからＤＮＡを調製する。
【００５１】
調製したファージＤＮＡを、適切な制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動で分離する。分離したＤＮＡ断片をナイロンメンブレンに移して、上記のスクリーニング用プローブをハイブリダイズさせ、シグナルの強さとバンドパターンの相違に基づいて、スクリーニングする。
【００５２】
最もシグナルの強いクローンはＣａｔＡ遺伝子を含み、弱いシグナルのクローンはＣａｔＡに類似しているがＣａｔＡではない遺伝子を含んでいると考えられる。また、バンドパターンの比較により、遺伝子の一部を欠損したクローンを識別できる。さらに、バンドパターンに基づく各クローンの物理地図を作製することにより、プロモーターを構成すると推定される、構造遺伝子の５’上流域の長さが約１．５Ｋｂｐ程度あるクローンを特定できる。
【００５３】
以上の様にして、完全なＣａｔＡゲノミックＤＮＡが、単離され得る。
【００５４】
ＣａｔＡゲノミックＤＮＡの塩基配列をＣａｔＡ  ｃＤＮＡの塩基配列と比較することにより、推定全長プロモーター領域が特定され得る。プロモーター配列としては、ゲノミック遺伝子がイントロンを有する場合は、構造遺伝子の５’上流域だけではなく、第１イントロン等の領域をも含み得る。
【００５５】
本発明により明らかにされたＣａｔＡ遺伝子プロモーター領域の情報に基づいて、適切な制限酵素を選択することにより、ＣａｔＡのプロモーター領域の一部を含む配列を調製することができる。この制限酵素としては、当該分野で公知の任意の制限酵素が利用され得る。制限酵素の種類、その反応部位および反応条件などは、当業者に明らかである。
【００５６】
さらに、図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の中の一部の配列を含む本願発明のＣａｔＡプロモーターは、図１および図２に示される塩基配列情報に基づいて、人工的に合成することによっても作製され得る。人工的に合成したヌクレオチド配列を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。好ましい実施形態では、自動化ヌクレオチド合成装置が、その製造業者の推奨に従って使用され得る。
【００５７】
このようにして得られた、ＣａｔＡ推定全長プロモーターの中の一部を含む本発明のＣａｔＡプロモーターがなお、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を誘導するプロモーター、好ましくは、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を特異的、優先的または最優先的に誘導するプロモーターとしての活性を有し得るか否かは、下記のＧＵＳ活性の測定のような、レポーター遺伝子を使用する方法などによって、確認され得る。
【００５８】
本発明の推定全長プロモーター配列の一部の配列は、その一部の配列のプロモーターの活性を失わない限りにおいて、必要に応じて、少なくとも１つ以上の置換、付加もしくは欠失を有し得る。このような改変によって、プロモーター活性を高めたり、発現する組織について特異性または優先性を高めることも可能である。ヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失は、当業者に周知の技術によって作製され得る。例えば、部位特異的変異誘発技術などが、核酸配列においてヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失を作製するために使用され得る。当該分野において、当業者に公知の多くの部位特異的変異誘発技術が存在し、これらとしては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，第２版（１９８９）および第３版（２００１）などに記載される技術または市販のキットを使用するＰＣＲを利用した特異的変異誘発などが挙げられるが、これらに限定されない。本願発明に従う一部の配列において少なくとも１つの置換、付加もしくは欠失を有する配列がなお、本願発明に従う一部の配列と同等のプロモーター活性を有するか否か、すなわち、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を誘導し得るか否か、好ましくは、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を特異的、優先的または最優先的に誘導し得るか否かは、レポーター遺伝子を使用する方法などによって、置換も付加も欠失も有さない本発明の一部の配列からなるプロモーターと活性を比較することにより確認され得る。
【００５９】
好ましい実施形態において、本願発明においてプロモーターとして使用されるＣａｔＡプロモーターは、図１（配列番号１）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１１０９位〜−４９０位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜−１９８位の配列、図２（配列番号２）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−２９８位〜＋３４２位の配列、または図２（配列番号２）の−１９８位〜＋３４２位の配列を含む。
【００６０】
他の好ましい実施形態において、本願発明においてプロモーターとして使用されるＣａｔＡプロモーターは、図１（配列番号１）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１９８位〜＋３４２位の配列、図１（配列番号１）の−１１０９位〜−４９０位の配列、図１（配列番号１）の−２９８位〜−１９８位の配列、図２（配列番号２）の−１１０９位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−４９０位〜＋３４２位の配列、図２（配列番号２）の−２９８位〜＋３４２位の配列、または図２（配列番号２）の−１９８位〜＋３４２位の配列において少なくとも１つ以上の置換、付加もしくは欠失を有する配列を含む。
【００６１】
本発明のプロモーターは、ポリヌクレオチドから構成される。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。
【００６２】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子という。調節遺伝子の例として、例えば、プロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００６４】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明のプロモーター配列は、図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示されるヌクレオチド配列またはそれらの部分配列に対して、代表的には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００６６】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
また、配列相同性の高い２つのポリヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下におけるハイブリダイゼーションで互いとハイブリダイズし得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェント条件の一例としては、例えば、６×ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１００μｇ／ｍｌ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡのハイブリダイズ溶液中、ハイブリダイズ温度６５℃で一晩のハイブリダイゼーション、次いで２ｘ  ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳ中室温で５分プラス３０分、１×ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳ中６８℃で１時間の洗浄が挙げられ得るが、これに限定されない。ストリンジェントな条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。ストリンジェンシーは、代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭは、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨで）である。Ｔｍは、１％のミスマッチにつき約１℃低下する；従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例えば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴｍを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕ���ｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明のプロモーター配列は、図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示されるヌクレオチド配列またはそれらの部分配列に対して、上記のようなストリンジェント条件下におけるハイブリダイゼーションでハイブリダイズし得る配列であり得る。
【００６８】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｗｉｌｅｙ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら  （１９８７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００６９】
（ＧＵＳ活性の測定によるプロモーター活性部分の特定）
使用されるＣａｔＡプロモーター断片領域が特定されると、当該分野で周知の任意の技術により、その配列を切り出して、植物発現用ベクターにつなぎ込み得る。つなぎ込まれたプロモーター断片領域がなおプロモーターとしての活性を保持しているか否かを評価するために、そのプロモーターの下流にレポーター遺伝子、例えば、適切な酵素をコードする遺伝子を連結したベクターを作製し得る。このベクターを植物細胞中に導入し、遺伝子の発現を、例えば、酵素活性を測定して、観察する。植物を宿主とする場合には、例えば、ｐＢＩ２２１等のようなベクターを用いて、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現を指標として測定するのが一般的であり、本明細書の例示的な実施例においても、ＧＵＳの発現で測定する方法が適用され得る。
【００７０】
ＧＵＳ活性は、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：３９０１−３９０７（１９８７））に基本的に従って測定され得る。すなわち、タンパク質量にして５０μｇ相当のプロトプラスト抽出液と２５μｌの２０  ｍＭ  ４−ｍｅｔｈｙｌ  ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｒｙｌ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（４ＭＵＧ）、それに抽出バッファー、さらに植物組織内在性のＧＵＳ様活性を抑制するために１００μｌメタノール（Ｋｏｓｕｇｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７０：１３３−１４０（１９９０））を加えてから全量を５００μｌとし、３７℃でインキュベートする。２時間後に反応液から２００μｌを採取し、０．２  Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を０．８  ｍＬ加えて反応を停止させる。蛍光分光光度計により、３６５  ｎｍの励起光で４５５  ｎｍの蛍光を測定する。酵素活性を４−ＭＵ  ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎで表示する。
【００７１】
このようにして、ＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーター領域の中の種々の一部の配列（例えば、５’上流側からの欠失、３’下流側からの欠失、内部配列の欠失、またはそれらの組み合わせ、によって得られる配列）を含む配列、またはその配列において少なくとも１つの置換、欠失もしくは付加を有する配列をＧＵＳ遺伝子と融合させたベクターを用いてプロモーター活性を測定し、プロモーター活性をなお保持しているＣａｔＡプロモーター断片を特定し得る。
【００７２】
図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列をを含む本願発明のＣａｔＡプロモーターは、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を誘導するプロモーター活性を有する。好ましくは、本願発明のＣａｔＡプロモーターは、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を特異的、優先的または最優先的に誘導するプロモーター活性を有する。本明細書において、プロモーター活性について「同等」であるとは、活性の強度が、少なくとも、基準となるプロモーター領域（すなわち、図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列からなるＣａｔＡプロモーター）の活性の強度と同程度であると共に、活性の特異性も、少なくとも、その基準となるプロモーター領域の活性の特異性と同程度であることをいう。用語「同等」は、活性の強度および活性の特異性が、基準となるプロモーター領域と比較して、明らかに高い場合を除外する意図ではないことに留意すべきである。「図１（配列番号１）もしくは図２（配列番号２）に示される配列の一部の配列と同等のプロモーター活性を有する」とは、例えば、本明細書の下記実施例と同様の条件で葯および／または花粉においてＧＵＳ遺伝子を発現させたとき、少なくとも約６割、好ましくは少なくとも約７割、より好ましくは少なくとも約８割、最も好ましくは少なくとも約９割の確率で、葯および／または花粉において特異的にその活性を発現する個体が得られ得ることをいう。
【００７３】
本明細書において、葯および／または花粉において「特異的に」発現するとは、目的とする遺伝子産物を葯および花粉の少なくとも一方において、同じ植物体の他の組織または器官の少なくとも１種におけるよりも多く発現することをいう。例えば、遺伝子産物を、葯および花粉において、同じ植物体の任意の他の部位（例えば、葉身、葉鞘、根、穂の茎、雌蕊、柱頭、花弁など）におけるよりも多く発現することをいう。このような発現の特異性は、本明細書の下記実施例と同様の条件で形質転換植物を作製することにより評価し得る。
【００７４】
本明細書において、葯および／または花粉において「優先的に」発現するとは、目的とする遺伝子産物を葯および花粉の少なくとも一方において、同じ植物体の他の組織または器官の少なくとも１種におけるよりも多く発現し、かつ、同じ植物体中に、葯および花粉おけるよりも発現量の多い組織または器官が存在しないことをいう。このような発現の優先性は、本明細書の下記実施例と同様の条件で形質転換植物を作製することにより評価し得る。
【００７５】
本明細書において、葯および／または花粉において「最優先的に」発現するとは、目的とする遺伝子産物を葯および花粉の少なくとも一方において、同じ植物体の他のすべての組織または器官（すなわち、葯と花粉とを除く、すべての組織および器官）におけるよりも多く発現することをいう。花粉は葯の中に含まれる組織であり、本明細書において葯と花粉とは一体としてみなすことができることに留意すべきである。従って、葯と花粉の両方においてほぼ等しいレベルで、同じ植物体の他のすべての組織または器官におけるよりも多く発現する場合はなお、葯において「最優先的に」発現されるということができ、また花粉において「最優先的に」発現されるともいうことができる。このような発現の優先性は、本明細書の下記実施例と同様の条件で形質転換植物を作製することにより評価し得る。
【００７６】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物（たとえば、植物）のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本明細書において、プロモーターの発現が「時期特異性」であるとは、生物の発達段階（例えば、植物であれば生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数））に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。本明細書において、プロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレス（例えば、病害、乾燥、低温、高温ストレスなど）が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス抑制性」という。「ストレス抑制性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、上記のようにレポーター遺伝子を用いる方法によって、または、例えば、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することによって確認され得る。
【００７７】
（発現カセットおよび組換えベクターの構築およびその利用）
本明細書において、「発現カセット」とは、プロモーターと、そのプロモーターに作動可能に連結されるように異種遺伝子を挿入するための部位とを含む核酸配列をいう。本明細書において「作動可能に連結される」とは、所望の遺伝子の発現（作動）がある転写調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下にインフレームで配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、プロモーターと構造遺伝子との間に介在する配列が存在してもよいため、プロモーターと構造遺伝子とは必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００７８】
本明細書において、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸構築体をいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞、好ましくは植物細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、目的の異種遺伝子の転写に適した位置に本発明のプロモーターを含有しているものが例示される。
【００７９】
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。選抜のための選択マーカーとしては、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら（１９８２）Ｇｅｎｅ  １９：３２７）；抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｈｙｇ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ及びＤａｖｉｅｓ（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１７９）；及び除草剤ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ  ２４２２３６）；ストレプトマイシンフォスフォトランスフェラーゼをコードするｓｐｔ遺伝子；ストレプトマイシン耐性遺伝；スペクチノマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子（例えば、Ｈ．Ｓ．Ｃｈａｗｌａ、２００２、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ、ｐ．３６３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  単行本）；ならびにβ−グルクロニダーゼをコードするＧＵＳ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６：３９０１）及びルシフェラーゼ遺伝子（Ｏｗら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６）のようなスクリーン可能なマーカー遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明において選抜に使用され得る薬剤としては、カナマイシン、ハイグロマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
「組換えベクター」とは、目的の異種遺伝子を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、植物細胞、および植物個体等の宿主において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、目的の異種遺伝子の転写に適した位置に本発明のプロモーターを含有しているものが例示される。
【００８２】
植物細胞に対する「組換えベクター」としては、プラスミド（例えば、Ｔｉプラスミドなど）、タバコモザイクウイルスベクター、ジェミニウイルスベクターなどが例示されるが、これらに限定されない。
【００８３】
活性が確認された本願発明のプロモーター配列は、適切な植物発現ベクターに組み込まれ得る。この植物発現用ベクターには、適切なリンカー配列（例えば、マルチプルクローニングサイトを有するリンカー配列）も導入され得る。好ましくは、この植物発現用ベクターに組み込まれたプロモーター配列の３’末端側に、適切なリンカー配列を導入して、植物宿主に適した発現カセットが作製され得る。１つの実施形態では、上記植物発現用カセットのプロモーターの３’下流、例えばマルチプルクローニングサイトに、発現が意図される異種遺伝子が発現可能に接続されて、組換えベクターを生じる。本明細書中において「リンカー」とは、遺伝子の繋ぎ合わせに使われる制限酵素認識部位を含むＤＮＡ領域を意味する。
【００８４】
本明細書において「異種遺伝子を挿入するための部位」とは、リンカーまたはリンカーと同様に作用する配列を含む部位をいう。この発現カセットには、所望により他の調節エレメントが含まれ得る。例えば、発現効率を向上させるため等の目的で、ターミネーター配列やエンハンサーなどが含まれ得る。このターミネーター配列やエンハンサーなどは、上記マルチプルクローニングサイトを有するリンカー配列を介して、プロモーター配列と作動可能に結合され得る。
【００８５】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
【００８６】
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。植物において使用する場合、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【００８７】
本明細書において「異種遺伝子」とは、ＣａｔＡ遺伝子以外のイネもしくは他の植物において内因性の遺伝子、または植物に対して外来の遺伝子を意味する。本明細書中の異種遺伝子配列は、目的の生物において発現し得るものであれば、どのようなものでもよい。例えば、特定の植物において発現させることを目的とするのであれば、その特定の植物において発現し得るのであればよい。
【００８８】
１つの実施形態において、異種遺伝子配列は、タンパク質コード配列である。タンパク質コード配列は、発現されることが意図される有用なタンパク質をコードするものであれば、どのようなものでもよい。
【００８９】
１つの実施形態において、異種遺伝子配列は、マーカー遺伝子であり得る。マーカー遺伝子とは、選択遺伝子と同義であり、その選択マーカーがコードする産物の発現によって、選択マーカーが存在する細胞と存在しない細胞とを識別することができる、ヌクレオチドをいう。
【００９０】
１つの実施形態において、異種遺伝子配列は、アンチセンスコード配列であり得る。アンチセンスコード配列は、発現を抑制または阻止することが意図される特定の遺伝子のアンチセンス配列をコードし、かつ、アンチセンス活性を有するものであれば、どのようなものでもよく、そのようなものもまた、本発明の範囲内に含まれる。アンチセンス配列とは、コード配列（センス配列ともいう）に相補的な配列をいう。
【００９１】
本明細書において「アンチセンス活性」とは、標的となる遺伝子の発現を特異的に抑制または減少させることができる活性をいう。より具体的には細胞内に導入したあるヌクレオチド配列に依存して、その配列と相補的なヌクレオチド配列領域をもつ遺伝子のｍＲＮＡ量を特異的に低下させることで、タンパク発現量を減少させ得る活性をいう。手法としては、標的となる遺伝子からつくられるｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子を直接的に細胞に導入する方法と、細胞内に目的遺伝子と相補的なＲＮＡを発現させ得る構築ベクターを導入する方法に大別される。植物においては、後者が一般的である。
【００９２】
アンチセンス活性は、通常、発現を抑制または阻止することが意図される遺伝子のコード配列と相補的な、少なくとも約８ヌクレオチド長のヌクレオチド配列によって達成される。アンチセンスコード配列は、好ましくは少なくとも約９ヌクレオチド長であり、より好ましく約１０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約１１ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約１２ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約１３ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約１４ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約１５ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約２０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約２５ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約３０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約４０ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは約５０ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、目的とする遺伝子のコード配列と相補的な配列は、アンチセンスコード配列中にとびとびに存在するのではなく、連続して存在する。
【００９３】
本明細書全体において、ヌクレオチド配列の長さは、ヌクレオチドの個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００９４】
アンチセンスコード配列は、発現を抑制または阻止することが意図される遺伝子のアンチセンス鎖（コード鎖の相補鎖）の配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％同一な、より好ましくは少なくとも約８０％同一な、さらに好ましくは約９０％同一な、そして最も好ましくは約９５％同一なヌクレオチド配列を含む。アンチセンスコード配列は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。上述のようなアンチセンスコード配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた、アンチセンスコード配列に含まれる。本明細書において、「アンチセンス活性」には、遺伝子の発現量の減少が含まれるがそれらに限定されない。
【００９５】
一般的なアンチセンス技術については、教科書に記載されている（Ｍｕｒｒａｙ，ＪＡＨ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，１９９２）。さらに最新の研究でＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象が明らかになり、アンチセンス技術の発展をもたらした。ＲＮＡｉは、標的遺伝子に相同な配列をもつ短い長さの２本鎖ＲＮＡ（２０ベース程度）を細胞内に導入すると、そのＲＮＡ配列に相同な標的遺伝子のｍＲＮＡが特異的に分解されて発現レベルが低下する現象である。当初線虫において発見されたこの現象は、植物を含めて生物に普遍的な現象であることがわかってきている。アンチセンス技術で標的遺伝子の発現が抑制される分子レベルのメカニズムは、このＲＮＡｉと同様のプロセスを経ることが解明された。従来のアンチセンス技術では、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的である１つのＤＮＡ配列を適切なプロモーターに連結して、その制御下に人工ｍＲＮＡを発現させるような発現ベクターを構築して、細胞内に導入することが行われた。ＲＮＡｉを利用した最近のアンチセンス技術においては、細胞内に２本鎖ＲＮＡを構成できるようにデザインされた発現ベクターが用いられる場合が多い。ＲＮＡｉを利用したアンチセンス技術では、アンチセンスコード配列の基本構造は、ある標的遺伝子に相補的な１種のＤＮＡ配列をプロモーター下に１つを連結し、それと同じ物をさらに逆向きにもう１つ連結してつくられる。この基本構造を有するアンチセンスコード配列から転写された１本鎖のｍＲＮＡでは、逆向きにつながれた１種類のヌクレオチド配列部分が相補的な関係にあるため、この相補的な部分が対合してヘアピン様の２次構造を持つ２本鎖ＲＮＡ状態をとり、これがＲＮＡｉのメカニズムに従って標的遺伝子のｍＲＮＡ分解を引き起こすわけである。植物においてはシロイヌナズナで用いられた例が報告されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７．３１９−３２０，２０００）。またＲＮＡｉ全般については、最近の総説にまとめられている（森田と吉田、蛋白質・核酸・酵素４７、１９３９−１９４５、２００２）。これらの文献に記載された内容は、本明細書おいてその全体を参考として援用する。
【００９６】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００９７】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体を構成できるようにデザインされた発現ベクターが挙げられるがそれに限定されない。
【００９８】
好ましくは、異種遺伝子は、その遺伝子産物の発現が葯および／または花粉において所望される任意の遺伝子をいう。
【００９９】
形質転換のための組換えベクターの作製にあたって、本発明のＣａｔＡ遺伝子プロモーターは、例えば、細菌と植物の両宿主で発現可能なバイナリーベクターに組み込むことが可能である。このようなバイナリーベクターは当業者に周知である。例えば、アグロバクテリウムの発現系を含む、ｐＢＩ系などのベクターを用いると、微生物による植物への感染のシステムを利用し得る。適切な組換えベクターを用いることにより、イネ等の単子葉植物およびタバコ等の双子葉植物を含む任意の形質転換可能な植物に目的の異種遺伝子を導入し得る。
【０１００】
（形質転換植物の作製）
（植物の形質転換および再分化）
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、葉緑体、硬い細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。植物の種類は、例えば、「原色牧野植物大図鑑」（北隆館（１９８２））などにおいて広範に分類されており、そこに記載されるすべての種類の植物が、本発明において使用され得る。代表的には、植物は、細胞壁の形成・葉緑体による同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。単子葉植物としては、イネ科植物が挙げられる。好ましい単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、ソルガムなどのイネ科植物が挙げられる。双子葉植物としては、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマトなどのナス科植物、サツマイモ、アサガオなどのヒルガオ科、ダイズ、ソラマメ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイなどのマメ科植物、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、ダイコン、カリフラワーなどのアブラナ科植物、バラ、サクラ、ウメ、モモ、アーモンド、リンゴ、ナシ、ビワ、イチゴなどのバラ科植物、花卉植物（例えば、アサガオ、ペチュニア、カーネーション、キク、ラン、ダリア、ツツジ、ヒマワリなどが挙げられるが、これらに限定されない）などが挙げられるが、これらに限定されない。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、種子などのいずれをも意味する。本明細書中に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、茎、葉（葉身、葉鞘など）、花（葯、花粉、葯壁、花粉外殻、雄しべ、花糸、柱頭、花柱、雌しべ、花弁など）、種子、種子胚、種子籾、プロトプラスト、カルスおよび懸濁培養細胞など）は、当業者が通常理解し得る通りの構成物を表す。
【０１０１】
上記のようにして得られる発現カセットまたは組換えベクターを用いて、植物を形質転換し得る。植物の細胞、組織、器官または個体の形質転換法は、当該分野で周知である。そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されている。核酸分子の生物細胞への導入は、一過的であっても恒常的であってもよい。一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。本発明において用いられる細胞を分化させて形質転換植物を作出する技術もまた当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されていることが理解される。形質転換植物から種子を得る技術もまた、当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに記載されている。
【０１０２】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、植物細胞が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【０１０３】
好ましい実施形態において、本発明の植物体には、本発明の核酸分子は、両側の染色体に導入され得るが、一対のみに導入されたものもまた有用であり得る。
【０１０４】
核酸分子と、目的細胞とを、該核酸分子による形質転換が生じ得る条件下に配置する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、本明細書において他の場所で詳述したように、いずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。これらの方法のうち、物理的手法の例としては、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、電子穿孔（エレクトロポレーション）法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法が挙げられる。これらの方法は、単子葉、双子葉の両植物体に適用できる点で有用性が高い。植物細胞のプロトプラストの作製は、例えば、Ｋｙｏｚｕｋａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：４０８−４１３（１９８７）に記載の方法に従って行い得る。
【０１０５】
特定の実施形態では、異種遺伝子を導入する方法として、アグロバクテリウム法、ウイルスベクター法、および近年開発されている、花粉をベクターとして用いる方法を使用する。これらの方法は、プロトプラストを用いず植物のカルス、組織または植物体を用いて遺伝子導入を行うため、培養が長期間に及ぶことがなく、またソマクローナル変異等の障害を受けにくいという長所を有している。これらのうち花粉をベクターとして用いる方法は、まだ実験例も少なく、植物の形質転換法としては未知数の部分が多い。ウイルスベクター法は、ウイルスに感染した植物体全体に導入すべき遺伝子が広がるという利点はあるものの、各細胞内で増幅されて発現されるだけで、次世代に伝えられるという保証がないという点、および長いＤＮＡ断片を導入できないという点に問題がある。アグロバクテリウム法は、約２０ｋｂｐ以上のＤＮＡを大きな再編成なしに染色体に導入できること、導入される遺伝子のコピー数が、数コピーと少ないこと、および再現性が高いこと等、多くの利点がある。イネ科植物等の単子葉植物にとってアグロバクテリウムは宿主範囲外であるため、イネ科植物への外来遺伝子導入は、従来は、先に述べたような物理的手法により行われてきた。しかしながら、近年、単子葉植物でもイネ等、培養系が確立されている植物においては、アグロバクテリウム法が適用されるようになっており、現在ではアグロバクテリウム法は好んで用いられている。さらに近年では、無傷の発芽種子に直接的にアグロバクテリウムを感染させて単子葉植物を形質転換し得る方法が開発されている（特許第３１４１０８４）。
【０１０６】
アグロバクテリウム法による外来遺伝子の導入では、ＴｉプラスミドＶｉｒ領域に植物が合成するアセトシリンゴン等の低分子フェノール化合物が作用すると、ＴｉプラスミドからＴ−ＤＮＡ領域が切り出され、幾つかの過程を経て植物細胞の核染色体ＤＮＡに組み込まれる。双子葉植物では、植物自身がそのようなフェノール化合物の合成機構を備えているため、リーフディスク法等により容易に外来遺伝子を導入することができ、再現性も高い。これに対し、単子葉植物では、そのようなフェノール化合物を植物自身が合成しないため、アグロバクテリウムによる形質転換植物の作出は困難であった。しかし、アグロバクテリウムの感染時にアセトシリンゴンを添加することで、単子葉植物への外来遺伝子導入も現在では可能となっている。
【０１０７】
より詳細には、アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌら（１９９０）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物に適切な発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−９６２を参照のこと）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【０１０８】
本発明において、形質転換体では、目的とする核酸分子（導入される異種遺伝子）は、染色体に導入されていても導入されていなくてもよい。好ましくは、目的とする核酸分子（導入される異種遺伝子）は、染色体に導入されており、より好ましくは、２つの染色体の両方に導入されている。
【０１０９】
形質転換処理をする際には、必要により、選択マーカー遺伝子が使用される。選択マーカーとその選択マーカーに適切な選択因子（例えば、抗生物質、色素など）とを組合せて用いることにより、形質転換処理が施された細胞の中から、本発明の核酸分子が導入された細胞をより効率よく選択することができる。しかし、この工程は、本発明において必ずしも必須というわけではない。このような選択方法は、導入された核酸分子が有する選択マーカーの特性によって変動し、例えば、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシンなど）に対する耐性遺伝子が選択マーカーとして導入された場合は、その特定の抗生物質を用いて目的の細胞を選択することができる。あるいは、選択マーカーとして標識遺伝子（例えば、グリーン蛍光遺伝子など）を用いれば、そのような標識を目安に目的の細胞を選択することができる。あるいは、外来遺伝子そのものが表現型に識別可能な差異を生じさせる場合は、そのような差異を目安に遺伝子導入細胞を選択してもよい。そのような識別可能な差異としては、例えば、色素の発現の有無などがあるがそれに限定されない。
【０１１０】
上記の任意の方法により形質転換された植物細胞、カルス、胚などを常法により再分化させて、形質転換された植物組織または植物器官とし、さらに植物体とすることができる。
【０１１１】
植物細胞、植物組織および植物体の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｂ５（Ｂ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ  ＆  Ｎｉｔｓｃｈ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適当量添加されて用いられる。
【０１１２】
本明細書において、植物の場合、その植物を「再分化」するとは、個体の一部分から個体全体が復元される現象を意味する。例えば、再分化により、細胞（葉、根など）のような組織片から器官または植物体が形成される。
【０１１３】
形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などに記載されるものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、当業者は、上記周知方法を目的とする形質転換植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。このようにして得られた形質転換植物には、目的の遺伝子が導入されており、そのような導入した異種遺伝子の存在は、サザンブロット法によって確認し得る。導入した異種遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、異種遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
【０１１４】
さらに、得られた形質転換植物体から種子が取得され得る。導入した異種遺伝子の存在は、サザンブロット法によって確認し得る。導入した異種遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、異種遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
【０１１５】
上述のように、本発明のＣａｔＡ遺伝子プロモーターは、代表的に、葯および／または花粉において異種遺伝子の発現を誘導し得、好ましくは、葯および／または花粉において特異的、優先的または最優先的に異種遺伝子の発現を誘導し得る。従って、異種遺伝子として、葯および／または花粉の形成を阻害する機能を持つ遺伝子を利用することにより、雄性不稔植物を作製することができる。本明細書において「葯および／または花粉の形成を阻害する機能を持つ遺伝子」とは、その遺伝子産物が稔性のある花粉の形成を阻止し得るもの（例えば、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ等をコードする遺伝子）と、その遺伝子自体が葯および／または花粉の形成を阻害する機能を示すもの（例えば、葯および／または花粉の形成時に発現する内因性遺伝子のアンチセンスＲＮＡ、およびそのような内因性遺伝子を分解し得るリボザイム）とを含んでいう。雄性不稔植物の選抜およびそれを用いる植物の品種改良のための手法は、当業者に周知である。
【０１１６】
上記の形質転換植物の作製はまた、雄性不稔以外の形質を植物に付与するためにも利用し得る。例えば、毒性タンパク質をコードする異種遺伝子を用いることにより、花粉を摂食する害虫などの制御を図ることができる。あるいは、栄養素となり得るタンパク質をコードする異種遺伝子を用いることにより、作物の栄養価を高めることができる。さらに、自家和合性／自家不和合性の制御に関与する異種遺伝子を用いることにより、所望の生殖特性を有する植物を得ることができる。葯および／または花粉での特異的な遺伝子発現を利用する、任意の有用植物の作製が、本願発明の範囲内にある。
【０１１７】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１：イネＣａｔＡゲノミックＤＮＡの単離：ゲノミックライブラリーからのスクリーニング）
ＣａｔＡ  ｃＤＮＡ（Ｍｏｒｉら，（１９９２；前出））の一部を、ＣａｔＡゲノミックＤＮＡのクローニングに用いた。ＣａｔＡ  ｃＤＮＡのクローニングの過程で得られた不完全長ｃＤＮＡ（全長１．８  ｋｂｐのうち、５’非翻訳領域及び若干のコード領域の合計約０．４５  Ｋｂｐを欠損する３’末端側の１．３５  Ｋｂｐ）を含むラムダファージ（クローンＮｏ．５１）のインサート部分をＰＣＲで増幅した。同ファージよりＤＮＡを調製してこれをテンプレートとし、プライマーとしてλｇｔ１１−Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ及びλｇｔ１１−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（東洋紡）を用いた。生成物をセントリコン−１００（Ａｍｉｃｏｎ）で精製し、濃度を２５ｎｇ／１０μｌにして、マルチプライムラベル法（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブとした。
【０１１９】
米国クローンテック社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したイネのゲノミックＤＮＡライブラリー（Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ）を用いてＣａｔＡ遺伝子をスクリーニングした。ゲノミックライブラリーを構成するファージλＥＭＢＬ−３を常法に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＭ５３８株に感染させ、ファージプラークを形成させた。このファージプラークをナイロンメンブレンに移し、下記の標準的条件で上記プローブとハイブリダイズさせた。なお、プローブは３２Ｐで標識した。
【０１２０】
ハイブリダイズ溶液：６×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，１００μｇ／ｍｌ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ；ハイブリダイズ温度：６５℃；ハイブリダイズ時間：一晩。
【０１２１】
次に、メンブレンを、以下の条件で洗浄した。洗浄条件：２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ；室温、５分プラス３０分；１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ；６８℃、１時間
洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブリダイズしたクローンを検出した。ハイブリダイズすることが確認されたファージからそれぞれＤＮＡを調製した。
【０１２２】
上記ファージのＤＮＡをＳａｌＩとＳｃａＩなどの２、３種類の制限酵素を組み合わせて消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。分離したＤＮＡ断片をナイロンメンブレンに移して、上述のＣａｔＡ  ｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。ハイブリダイズの条件は上記と同じであり、メンブレン洗浄は以下の条件で行った。洗浄条件：２×ＳＳＣ  室温  ５〜１０分  ２回；２×ＳＳＣ−０．１％  ＳＤＳ  ６５℃、３０分。
【０１２３】
洗浄後、常法に従って、ナイロンメンブレンをオートラジオグラフィーにかけ、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を検出した。
【０１２４】
シグナルの強さとバンドのパターンがほぼ同一の、従って同じ構造を持つと推定される一群のクローンと、バンドパターンが一部しか一致しないクローンがある。
【０１２５】
シグナルの強さとバンドのパターンがほぼ一致するクローンは、ＣａｔＡ遺伝子に対応する考えられる。バンドのパターンの一部が欠落しているクローンは、ＣａｔＡ遺伝子の一部が欠損しているクローンと考えられる。また、シグナルが弱いクローンは、ＣａｔＡに類似した構造を持つ別のカタラーゼ（アイソザイム）の遺伝子と考えられる。
【０１２６】
詳細なサザン分析、部分塩基配列の解析、ＣａｔＡ  ｃＤＮＡ塩基配列に基づくＰＣＲ解析などから、ＣａｔＡ  ｃＤＮＡに対応する遺伝子と、その５’上流にプロモーター領域と推定される約１．５Ｋｂｐからなる配列を含むクローンλＥＭ７４／８１を得た。
【０１２７】
クローンλＥＭ７４／８１の挿入部分をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ消化で切り出し、シーケンス解析用のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋あるいはＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に挿入した。５’側からおよび３’側側から段階的欠損プラスミドを多数作製し、塩基配列決定を行った。４６７０ｂｐの配列が決定された。配列番号３にその全配列を示す。
【０１２８】
ゲノミックＣａｔＡ遺伝子の塩基配列は、本発明者らにより発表されている（日本農芸化学会誌（１９９２；前出））、およびＨｉｇｏら（１９９６；前出）。国際ＤＮＡ塩基配列データベースＤＤＢＪには、図１に示したと同じく、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位からＥｃｏＲＩ切断部位までの４６７０塩基の配列を登録した（アクセッション番号Ｄ２９９６６）。Ｈｉｇｏら（１９９６；前出）には、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列とＥｃｏＲＩ認識配列を前後に加えて、４６７６塩基の配列を発表した。
【０１２９】
（実施例２：ＣａｔＡ遺伝子プロモーターを有する組換えベクターの作製）
上記実施例１．で得られたＣａｔＡ遺伝子は、４６７０ｂｐであった。そして、配列番号３の１５６０番目から１６０５番目に第１エクソン、１８９４番目から２６９４番目に第２エクソン、２７８１番目から３３８０番目に第３エクソン、３７３０番目から４１１７番目に第４エクソンが存在すること、および、それぞれのエクソンの間に、第１イントロン、第２イントロン、および第３イントロンが存在することがわかった。
【０１３０】
この配列情報および本明細書で開示された内容に基づいて、プロモーターとしての機能を有すると推定される領域を切り出すことができる。
【０１３１】
一例として、配列番号１の１位〜１９０１位（これは、図１の−１５５９位〜＋３４２位に対応する）の塩基配列によってコードされるイネＣａｔＡ遺伝子プロモーターを有するベクター、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０の作製を図３に示す。
【０１３２】
クローンλＥＭ７４／８１をＥｃｏ５２Ｉで消化し、平滑末端化処理し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロース電気泳動により約１．９Ｋｂｐの断片を回収した。クローンλＥＭ７４／８１挿入配列の１番目から１９０１番目までの配列を有する断片が得られた。この断片には、第１エクソンの上流側の配列、第１エクソン、第１イントロン、第２エクソンの一部が含まれていた。断片の５’末端側は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位であり、３’末端は平滑末端である。
【０１３３】
植物細胞用発現ベクターｐＢＩ２２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コーディング領域およびノパリンシンターゼのターミネーター（ＮＯＳ−Ｔ）を有している。このｐＢＩ２２１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで消化し、大断片を回収した。この大断片は、ｐＢＩ２２１からＣａＭＶの３５Ｓプロモーター領域が削除された断片である。この断片と、上記クローンλＥＭ７４／８１挿入配列の１番目から１９０１番目までの配列を有する断片を連結させ、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０を作製した。この方法は、ＣａｔＡ遺伝子の塩基配列とともに、既に本発明者によって公表されている（Ｈｉｇｏら（１９９６；前出））。
【０１３４】
（実施例３：ＰＣＲ法による開始コドンの塩基改変およびＣａｔＡＤ１プロモーターを有する組換えベクターの作製）
ＰＣＲ法により開始コドンに点変異を導入させたイネＣａｔＡ遺伝子の５’上流ＤＮＡ断片を作製した。この作製手順を図４に示す。
【０１３５】
ＣａｔＡＤ１断片（配列番号２の４５１位〜１９０１位（これは、図２の−１１０９位〜＋３４２位に対応する））は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０をテンプレートとし、プライマーＤ１−Ｆ（５’−ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  Ｇ−３’（配列番号４）、得られるＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）およびプライマーＤ−ＭＲ（５’−ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＡＧ−３’（配列番号５）、ＣａｔＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧのＴをＣに置換するプライマー）、ならびにＰｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅させた。上記のようにＣａｔＡ遺伝子の開始コドンに点変異を導入することにより、このＣａｔＡ由来のアミノ酸配列は、導入したプロモーター配列のプロモーター活性で発現される異種遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子など）のタンパク質中に含まれなくなる。
【０１３６】
増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  ２（宝酒造）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理したベクターＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０（このＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでの処理によって、このベクターから図１の−１５５９位〜＋３４２位に対応する導入配列は取り除かれている）のＧＵＳ遺伝子の上流に組み込んだ。このようにして得られたベクターを、形質転換用の大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５ａｌｐｈａ（東洋紡績）に導入した。
【０１３７】
大腸菌から精製したベクターは塩基配列を決定して確認した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片とＧＵＳ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）  （ＮＯＳ−ｔｅｒ）を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理したバイナリーベクターｐＴＮ２（Ｆｕｋｕｏｋａら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９  ：  ８１５−８２０  （２０００））に組み込み、組換えベクターを得た。このベクターを「ＣａｔＡＤ１−ＧＵＳ−Ａ１／ｐＴＮ２」と称する。このベクターに含まれるＣａｔＡＤ１断片の模式図を、図５（Ａ）に示す。
【０１３８】
（実施例４：ＰＣＲ法による開始コドンの塩基改変およびＣａｔＡＤ２プロモーターを有する組換えベクターの作製）
ＰＣＲ法により開始コドンに点変異を導入させたイネＣａｔＡ遺伝子の５’上流ＤＮＡ断片を作製した。この作製手順を図４に示す。
【０１３９】
ＣａｔＡＤ２断片（配列番号２の１０７０位〜１９０１位（これは、図２の−４９０位〜＋３４２位に対応する））は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０をテンプレートとし、プライマーＤ２−Ｆ（５’−ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’（配列番号６）、得られるＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）およびプライマーＤ−ＭＲ、ならびにＰｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅させた。上記のようにＣａｔＡ遺伝子の開始コドンに点変異を導入することにより、このＣａｔＡ由来のアミノ酸配列は、導入したプロモーター配列のプロモーター活性で発現される異種遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子など）のタンパク質中に含まれなくなる。
【０１４０】
増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  ２（宝酒造）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理したベクターＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０（このＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでの処理によって、このベクターから図１の−１５５９位〜＋３４２位に対応する導入配列は取り除かれている）のＧＵＳ遺伝子の上流に組み込んだ。このようにして得られたベクターを、形質転換用の大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５ａｌｐｈａ（東洋紡績）に導入した。
【０１４１】
大腸菌から精製したベクターは塩基配列を決定して確認した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片とＧＵＳ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）  （ＮＯＳ−ｔｅｒ）を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理したバイナリーベクターｐＴＮ２（Ｆｕｋｕｏｋａら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９  ：  ８１５−８２０  （２０００））に組み込み、組換えベクターを得た。このベクターを「ＣａｔＡＤ２−ＧＵＳ−Ａ２／ｐＴＮ２」と称する。このベクターに含まれるＣａｔＡＤ２断片の模式図を、図５（Ｂ）に示す。
【０１４２】
（実施例５：ＰＣＲ法による開始コドンの塩基改変およびＣａｔＡＤ３プロモーターを有する組換えベクターの作製）
ＰＣＲ法により開始コドンに点変異を導入させたイネＣａｔＡ遺伝子の５’上流ＤＮＡ断片を作製した。この作製手順を図４に示す。
【０１４３】
ＣａｔＡＤ３断片（配列番号２の１２６２位〜１９０１位（これは、図２の−２９８位〜＋３４２位に対応する））は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０をテンプレートとし、プライマーＤ３−Ｆ（５’−ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ−３’（配列番号７）、得られるＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）とＤ−ＭＲ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅させた。上記のようにＣａｔＡ遺伝子の開始コドンに点変異を導入することにより、このＣａｔＡ由来のアミノ酸配列は、導入したプロモーター配列のプロモーター活性で発現される異種遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子など）のタンパク質中に含まれなくなる。
【０１４４】
増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  ２（宝酒造）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理したベクターＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０（このＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでの処理によって、このベクターから図１の−１５５９位〜＋３４２位に対応する導入配列は取り除かれている）のＧＵＳ遺伝子の上流に組み込んだ。このようにして得られたベクターを、形質転換用の大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５ａｌｐｈａ（東洋紡績）に導入した。
【０１４５】
大腸菌から精製したベクターは塩基配列を決定して確認した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片とＧＵＳ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）  （ＮＯＳ−ｔｅｒ）を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理したバイナリーベクターｐＴＮ２（Ｆｕｋｕｏｋａら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９  ：  ８１５−８２０  （２０００））に組み込み、組換えベクターを得た。このベクターを「ＣａｔＡＤ３−ＧＵＳ−Ａ３／ｐＴＮ２」と称する。このベクターに含まれるＣａｔＡＤ３断片の模式図を、図５（Ｃ）に示す。
【０１４６】
（実施例６：ＰＣＲ法による開始コドンの塩基改変およびＣａｔＡＤ４プロモーターを有する組換えベクターの作製）
ＰＣＲ法により開始コドンに点変異を導入させたイネＣａｔＡ遺伝子の５’上流ＤＮＡ断片を作製した。この作製手順を図４に示す。
【０１４７】
ＣａｔＡＤ４断片（配列番号２の１３６２位〜１９０１位（これは、図２の−１９８位〜＋３４２位に対応する））は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０をテンプレートとし、プライマーＤ４−Ｆ（５’−ＣＣＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ−３’（配列番号８）、得られるＤＮＡ断片の５’末端付近にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入するプライマー）とＤ−ＭＲ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅させた。上記のようにＣａｔＡ遺伝子の開始コドンに点変異を導入することにより、このＣａｔＡ由来のアミノ酸配列は、導入したプロモーター配列のプロモーター活性で発現される異種遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子など）のタンパク質中に含まれなくなる。
【０１４８】
増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理した後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  ２（宝酒造）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで処理したベクターＣａｔＡ−ＧＵＳ−△０（このＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでの処理によって、このベクターから図１の−１５５９位〜＋３４２位に対応する導入配列は取り除かれている）のＧＵＳ遺伝子の上流に組み込んだ。このようにして得られたベクターを、形質転換用の大腸菌ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ＤＨ５ａｌｐｈａ（東洋紡績）に導入した。
【０１４９】
大腸菌から精製したベクターは塩基配列を決定して確認した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで増幅させたＣａｔＡ  ５’上流ＤＮＡ断片とＧＵＳ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）  （ＮＯＳ−ｔｅｒ）を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで処理したバイナリーベクターｐＴＮ２（Ｆｕｋｕｏｋａら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９  ：  ８１５−８２０  （２０００））に組み込み、組換えベクターを得た。このベクターを「ＣａｔＡＤ４−ＧＵＳ−Ａ４／ｐＴＮ２」と称する。このベクターに含まれるＣａｔＡＤ４断片の模式図を、図５（Ｄ）に示す。
【０１５０】
（実施例７：イネ培養細胞プロトプラストの形質転換とＧＵＳ遺伝子の発現）
上記実施例２において得られたプラスミドを、Ｈｉｇｏら（１９９６；前出）に記載されているように、イネ培養細胞（Ｏｃ細胞）のプロトプラストに導入した。コントロールとして、ｐＢＩ２２１を用いた。
【０１５１】
イネ培養細胞（Ｏｃ細胞）からのプロトプラスト調製方法、エレクトロポレーションによるプロトプラストの形質転換、およびプロトプラスト抽出液を用いてのＧＵＳ遺伝子の発現の測定は、Ｈｉｇｏら（１９９６；前出）に記載されている方法で実施した。
【０１５２】
この結果を図６に示す。この結果は、ＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーターが、コントロールであるＣａＭＶの３５Ｓプロモーターの約１．５倍の高い活性を有することを示した。
【０１５３】
同様の手順を行うことによって、ＣａｔＡ遺伝子の５’上流域由来の他の種々のＤＮＡ断片のプロモーター活性が検定される。例えば、上記の実施例３〜６で得られた各ベクターを用いて、上記と同じようにして植物細胞の形質転換を行い、そして得られた形質転換体のＧＵＳ遺伝子の発現量を同じように調べることによって、ＣａｔＡＤ１〜４断片のプロモーター活性量を検定する。
【０１５４】
さらに、形質転換されたプロトプラストから再生した植物体（Ｔ０世代）の任意の組織（例えば、葯、花粉、葉身、葉鞘、根など）の抽出液、または形質転換されたプロトプラストから再生した植物体に由来する次世代以降（例えば、Ｔ１世代、Ｔ２世代など）の子孫である植物体の任意の組織の抽出液を用いても、同様の手順を行うことによって、ＧＵＳ活性が測定される。
【０１５５】
（実施例８：実施例２で得られたベクターを導入した形質転換イネ（Ｔ０世代）の作製）
上記の実施例７において、イネ培養細胞（Ｏｃ細胞）プロトプラストで高い活性を持つことが確認されたＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０ベクターを用いて、以下のようにイネを形質転換した。
【０１５６】
赤木らの方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：５０１−５０６（１９８９））に準じて、イネ（品種：キヌヒカリ）から懸濁細胞を確立し、次いでこの懸濁細胞を用いてプロトプラストを調製し、エレクトロポレーション法（Ｔａｄａら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４７５−４８０（１９９０）に準ずる）で各ベクターを導入し、再分化（Ｆｕｊｉｍｕｒａら．，Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．２：７４−７５（１９８５）に準ずる）させ、ＧＵＳ染色により選抜して形質転換イネを得た。詳細を、下記に示す。
【０１５７】
１）イネ胚盤からのカルス誘導
１．１）培地を以下のように調製した：
（１）ＭＳ基本培地に２ｐｐｍ  ２，４−Ｄ、０．１％  カゼイン加水分解物、３％  ショ糖を添加し、ｐＨ５．５に調整する。（２）培地に１％寒天を加え、オートクレーブする。（３）クリーンベンチ内で深型のφ９ｃｍシャーレに分注する（約４０ｍｌ／シャーレ）。
【０１５８】
１．２）種子の殺菌を以下のように行った：
（１）キヌヒカリの種子を剥皮し、玄米を取り出す。（２）玄米を５０ｍＬビーカーに入れ、７０％エタノールに３０秒間浸す。（３）水道水で３回すすぐ。（４）５％次亜塩素酸ソーダ（Ｔｗｅｅｎ２０を数滴添加）で２０分間殺菌する。（５）滅菌水で３回すすぐ。（６）ピンセットを用いて、寒天培地に置床する（９粒／φ９ｃｍシャーレ）。（７）約３００  ｌｕｘ、２６℃で約１カ月間培養する。
【０１５９】
２）サスペンションの確立
２．１）培地を以下のように調製した：
（１）Ｒ２無機塩とＢ５ビタミンの基本培地に、１ｐｐｍ  ２，４−Ｄ、３％  ショ糖、０．３％  カゼイン加水分解物を添加し、ｐＨを５．５に調整する。（２）１００ｍｌ培養フラスコに２０ｍｌの培地を分注、オートクレーブで滅菌する。
【０１６０】
２．２）サスペンションの確立を以下のように行った：
（１）完熟種子の胚盤由来のフライブルなカルスを液体培地に移植する。（２）移植したフラスコを、２６℃、弱光下、８０ｒｐｍで旋回培養する。（３）移植後３日目に、新鮮な培地に交換する。（４）さらに４日間培養を続ける。（５）カルス培養ピペットを用いて、カルスを分散させ、カルス部分のみを移植する。（６）１週間毎に新鮮な培地に移植する。
【０１６１】
３）プロトプラストへの遺伝子導入
３．１）酵素液を以下のように調製した：
（１）Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ  ４ｇ、Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｒ−１０  １ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、Ｍａｎｎｉｔｏｌ  ７．２８ｇを１００ｍＬビーカーに入れ混和する。水を加え、スターラーで撹拌、溶解する。（２）ｐＨ５．５に調整し、１００ｍＬにメスアップする。（３）３７℃で２０分間放置した後、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心する。（４）上清を１０ｍＬづつ遠心管に分注。パラフィルムでシールし、冷凍保存する。（５）湯浴で溶解し、濾過滅菌する。
【０１６２】
３．２）プロトプラストの単離を以下のように行った：
（１）培養４日目のサスペンションセルを用いる。（２）カルス培養ピペットでサスペンションセルのみを１０ｍＬの酵素液の入った１００ｍＬフラスコに移す。（約１０ｇ）（３）２７℃のインキュベータで５時間静置する。
【０１６３】
３．３）プロトプラストの精製を以下のように行った：
（１）フラスコを軽く廻し、底に沈んだセルを浮遊させる。（２）浮遊させたセルを素早く１５５μｍのメッシュにデカントする。（３）メッシュを軽く上下させ、酵素液が完全に落ちるのを待つ。（４）濾過した酵素液を７７μｍのメッシュにビーカーから直接デカント。（５）メッシュを軽く引き上げ、酵素液を落とす。（６）濾過した酵素液を、さらに３１μｍのメッシュにデカント。（７）メッシュを軽く引き上げ、酵素液を落とす。（８）酵素液をビーカーから遠心管にデカントで移す。（９）６００ｒｐｍで１分間遠心。（１０）ディスポピペットで上清を新しい遠心管に移す。（１１）９００ｒｐｍで３分間遠心。上清を捨てる。（１２）０．４Ｍグルコースを遠心管の壁面に沿って入れ、プロトプラストを懸濁。（１３）９００ｒｐｍで３分間遠心。上清を捨てる。（１４）ＡＡバッファーを遠心管の壁面に沿って入れ、プロトプラストを懸濁。（１５）９００ｒｐｍで３分間遠心。上清を捨てる。（１６）少量のＡＡバッファーを壁面を這わせて入れる。（１７）血球計算盤を用いて、プロトプラストをカウントする。（１８）プロトプラスト懸濁液の液量を計る。（１９）ＡＡバッファーを用いてプロトプラスト密度を１×１０７個／ｍＬに調整。ここで、ＡＡバッファーは：３５ｍＭ  Ｋ−Ａｓｐａｒａｔｉｃ  ａｃｉｄ，５ｍＭ  Ｃａ−Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ，５ｍＭ  Ｍｇ−Ａｓｐａｒａｔｉｃ  ａｃｉｄ，５ｍＭ  ＭＥＳ，０．４Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ，ｐＨ５．８（調整不要）である。
【０１６４】
３．４）遺伝子導入を以下のように行った：
（１）エレクトロポレーション用チャンバーを７０％エタノールで滅菌する。（２）プロトプラスト懸濁液にＴＥに溶解した各ベクター（各１μｇ／μＬ）を添加する。ここで、添加したベクターの最終濃度は、ＨＰＴ２（ハイグロ）が  ５０  μｇ／ｍＬ；各ベクター（すなわち、ＣａｔＡＤ１−ＧＵＳ−Ａ１、ＣａｔＡＤ２−ＧＵＳ−Ａ２、ＣａｔＡＤ３−ＧＵＳ−Ａ３、またはＣａｔＡＤ４−ＧＵＳ−Ａ４）が１００μｇ／ｍＬである。ハイグロマイシン選抜用ベクターＨＰＴの構造は報告されている（Ｔａｄａら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４７５−４８０（１９９０））。（３）試験管を氷上に立て、２０分間放置する。（４）チャンバーに移す。（５）コンデンサーに充電した電気を放電する。ここで、放電条件は：８８０μＦ、４７５Ｖ／ｃｍ、時定数は約３０ｍｓｅｃである。（６）１０秒以上放置後、遠心管に回収する。（７）室温で２０分間放置する。
【０１６５】
３．５）プロトプラスト培養を以下のように行った：
（１）９００ｒｐｍで３分間遠心。上清を捨てる。（２）ｃ−ｍｅｄを遠心管の壁面に沿って入れ、プロトプラストを懸濁する。  ｃ−ｍｅｄで１×１０６個／ｍＬに調整する。  ｃ−ｍｅｄは培養後３日目のサスペンションから培地のみを回収し、１２０００ｒｐｍで浮遊物を除去する。培地４０ｍＬに対して、２，４−Ｄ（１００ｐｐｍ）を２００μＬ、Ｂ５  ｖｉｔａｍｉｎｓを４００μＬ、ｓｕｃｒｏｓｅを５．４６ｇ添加し、ｐＨ４．３に調整する。冷凍して保存。使用直前に融解、濾過滅菌する。（３）コーティングシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ  ＃３００２）に７５０μＬを分注する。（４）コンラージ棒を用いてシャーレ全体に拡げる。（５）パラフィルムでシールする。（６）シャーレをタッパウエアに入れる。ここで、乾燥防止のため、水を入れたビーカー等を入れておく。（７）２７℃、暗所で培養する。
【０１６６】
４）形質転換植物の再生
４．１）形質転換細胞の選抜・増殖を以下のように行った：
（１）培養１４日後にＧＩ培地を６００μＬ添加する。ここで、ＧＩ培地は、Ｒ２培地に２ｐｐｍ  ２，４−Ｄ、０．４Ｍ  グルコースを添加し、ｐＨ４．９に調整したものである。（２）ハイグロマイシン耐性カルスを選抜するために、ＧＩ培地にハイグロマイシン５０μｇ／ｍＬを添加する。（３）ＧＩ培地添加２週間後、増殖してきたカルスをＧＩＩ寒天培地上に移植する。ここで、  ＧＩＩ寒天培地は、Ｒ２培地に２ｐｐｍ  ２，４−Ｄ、３％ショ糖を添加し、ｐＨ４．９に調整した後、１％寒天を添加し、オートクレーブし、φ９ｃｍ×１０ｍｍシャーレに１０ｍＬづつ分注したものである。
【０１６７】
４．２）形質転換植物の再生を以下のように行った：
（１）Ｎ６  無機塩、Ｂ５  ビタミン、３％  ショ糖、ＮＡＡ  １ｐｐｍ、カイネチン  ４ｐｐｍ、３％  ソルビトール、０．０３％  カゼイン加水分解物を含む培地のｐＨを５．８に調整し、１．５％  寒天を添加してオートクレーブする。（２）クリーンベンチ内でφ９０ｍｍ×２０ｍｍの深型プラスチックシャーレに培地を分注する（４０〜５０ｍＬ／シャーレ）。（３）直径が３ｍｍ程度に増殖したカルスを寒天培地上に移植する。（４）シャーレ当たり２０個程度のカルスを置床する。（５）２７℃、３０００ｌｕｘの連続光下で培養する。４週間程度で植物体が再生してくる。（６）分化培地上で分化した植物体で、シュートの長さが３ｃｍ程度に成長したものを根が付いた状態で、マジェンダボックスに移植する。ボックス当たり９本のシュートを移植する。培地は、１／２ＭＳ培地に１％ショ糖を添加し、ｐＨを５．８に調整する。０．１５％ゲルライトを添加、加熱溶解後、マジェンダボックスに５０ｍＬづつ分注してオートクレーブする。（７）２７℃、１００００ｌｕｘ連続光下で培養する。（８）１週間程度で、先端が完全に蓋で頭打ちとなる。場合により、培地中の２価カチオンが奪われ、培地が液状化することがある。
【０１６８】
以上のようにして得られた、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０ベクターを導入された再分化した形質転換個体（Ｔ０世代イネ）をポットに移植した。成長した個体の中から、葉をＧＵＳ組織染色し、ＧＵＳが発現している個体を選抜した。
【０１６９】
形質転換植物の選抜のためのＧＵＳ染色は、次の手順で行った：（１）１ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ，５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０），１０％Ｍｅ−ＯＨの染色液を調製する。（２）（１）の染色液５００μＬを２ｍＬのマイクロチューブに分注する。（３）再生した植物の葉の切片を入れる。（４）３７℃で２４時間インキュベート。（５）７０％Ｅｔ−ＯＨでクロロフィルを除去する。（６）ＧＵＳ染色されたイネを選抜する。
【０１７０】
このようにしてＧＵＳが葉で発現しているＴ０世代イネ１５個体を選び、その種子（Ｔ１世代種子）を採取した。
【０１７１】
（実施例９：実施例３〜６で得られた各ベクターを導入した形質転換イネ（Ｔ０世代）の作製）
上記実施例３〜６において得られた各ベクター（すなわち、ＣａｔＡＤ１−ＧＵＳ−Ａ１／ｐＴＮ２ベクター、ＣａｔＡＤ２−ＧＵＳ−Ａ２／ｐＴＮ２ベクター、ＣａｔＡＤ３−ＧＵＳ−Ａ３／ｐＴＮ２ベクター、またはＣａｔＡＤ４−ＧＵＳ−Ａ４／ｐＴＮ２ベクター）を用いて、以下のようにイネを形質転換した。
【０１７２】
イネ（品種；日本晴）への各ベクターの導入は、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２（１９９４））、Ｔｏｋｉ（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１６−２１（１９９７））の方法に従って、アグロバクテリウム（ＥＨＡ１０５系統）を介する方法によって行った。下記の実施例１３に詳述するＧＵＳ組織染色により選抜して、形質転換イネを得た。また、形質転換されたイネの選抜は、下記の実施例１０に詳述するＰＣＲ法によっても簡便に行われ得る。
【０１７３】
（実施例１０：ＰＣＲによる選抜）
上記実施例８において得られた、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０ベクターを導入された形質転換体１５系統のうち、１０系統のＴ１種子の籾を１％アンチホルミンで１時間処理後、２日間水道水に浸漬し、粒状培土（ボンソル１号、住友化学）に播種した。幼苗の葉身からＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＦ１８１３（５’−ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＣＡＧＣ−３’（配列番号９）；ＣａｔＡ第１イントロン内の配列）とプライマーＲ２３６８（５’−ＣＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号１０）；ＧＵＳ遺伝子コード領域内の配列）とを用いてＰＣＲを行い、導入したＤＮＡ配列を含んでいるかどうか調べた。ＤＮＡポリメラーゼであるＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行った。反応条件は９４℃・１２分の処理後、９４℃・１分、５５℃・２分、７２℃・３分の処理を３５サイクル行った。反応液を１％アガロース中で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して紫外線で照射してＰＣＲ産物の有無とそのサイズを調べ、遺伝子が導入されているＴ１世代の植物体を選んだ。
【０１７４】
他のベクターを導入した形質転換体も、同様のＰＣＲ手順により選抜される。この場合、使用されるプライマーは、導入された塩基配列に依存して適宜変更される。ＰＣＲ反応条件は、使用されるプライマーの配列に依存して、上記の分子生物学的技術に関する指針などを参照して当業者によって容易に決定され得る。さらに、テンプレートとして使用されるＤＮＡを抽出する植物を適宜選択することによって、任意の世代（例えば、Ｔ０世代、Ｔ１世代、Ｔ２世代など）、任意の生育段階または任意の組織において、目的のベクターが導入された植物体を、ＰＣＲ法により選抜することができる。
【０１７５】
（実施例１１：実施例２で得られたベクターを導入した形質転換イネのＧＵＳ組織染色）
導入したＧＵＳ遺伝子が発現しているか確認するために、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０ベクターを導入した形質転換体において、下記のＧＵＳ組織染色法でＴ１植物の葉身のＧＵＳ活性を調べた。
【０１７６】
ＧＵＳ活性の観察のためのイネの葉身のＧＵＳ組織染色法として、「植物の細胞を観る実験プロトコール：遺伝子発現から細胞内構造・機能まで」；細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ６２−３；細胞レベルでＧＵＳ活性を観る方法（高橋美佐、森川弘道）ｐｐ．７１−７９（監修  福田裕穂、西村幹夫、中村研三）に記載の方法をもとに、一部改変した方法で行った。
【０１７７】
その手順は次の通り：（１）Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液［１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）、１ｍＭ  Ｘ−Ｇｌｕｃ，０．３ｍＭフェリシアン化カリウム、０．３ｍＭフェロシアン化カリウム、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００］を調製する。（２）Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液５００μＬを２４穴タイタープレートの各ウエルに分注する。（３）イネの各組織あるいは切片をウエルに入れ、２８℃、１６時間処理する。（４）Ｘ−Ｇｌｕｃ溶液を除去し、７０％エタノールを加えて脱色する。（５）７０％エタノールを除去し、組織・切片を５０％グリセロール溶液に浸す。（６）顕微鏡あるいは実体顕微鏡で観察する。
【０１７８】
Ｔ１世代植物を、葉におけるＧＵＳ遺伝子の発現の高さによりグループ分けし、高度に葉で発現している植物から種子（Ｔ２世代種子）を採取した。
【０１７９】
（実施例１２：実施例２で得られたベクターを導入した形質転換イネのＴ２種子の播種、形質転換体のＰＣＲによる選抜とＧＵＳ組織染色）
Ｔ２形質転換体の籾を上述のように処理し、播種した。幼苗の葉身から上述のようにＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行い、導入したＤＮＡ配列を含んでいるかどうか調べた。調べたＴ２植物のうち約半数が導入したＧＵＳ遺伝子を持つ形質転換体であることがわかった。
【０１８０】
また、導入したＧＵＳ遺伝子が発現しているか確認するために、上記の方法でＴ２植物の幼苗の葉身のＧＵＳ活性を調べた。ＰＣＲでＧＵＳ遺伝子の存在が確認されたすべてのＴ２形質転換体において、葉身でのＧＵＳ活性が観察された。葉身でＧＵＳ遺伝子の発現が確認された植物体は引き続き生育させ、開花期に葯を採集して、葯および花粉でのＧＵＳ活性を調べた。
【０１８１】
結果を図７および図８に示す。開花期に葯を採集してＧＵＳ活性を調べた結果、葉身よりも高いＧＵＳ活性がみられた。葯および花粉を顕微鏡で観察したところ、葯壁（図７）および花粉外殻の内部（図８）がＧＵＳ活性によって青く染色されていた。
【０１８２】
（実施例１３：実施例３〜６で得られたベクターを導入した形質転換イネ（Ｔ０世代）のＧＵＳ組織染色）
ＣａｔＡ遺伝子の５’ＤＮＡ断片を含む各ベクターを用いて形質転換を行った植物体（Ｔ０世代）を、通常の栽培条件下で、開花期まで生育させた。開花期まで生育させた植物体から、葯、花粉、葉身、葉鞘、根の各組織を採集した。これらの採取した各組織において、導入したＧＵＳ遺伝子が発現しているか確認するために、下記のＧＵＳ組織染色法で各組織のＧＵＳ活性を調べた。
【０１８３】
ＧＵＳ活性の観察のためのＧＵＳ組織染色手順は、上記の実施例１１に記載した手順と同じであった。
【０１８４】
導入したプロモーター配列と、形質転換イネとの対応を以下の表１に示す。
【０１８５】
【表１】
2005117944.tif 000002
それぞれ数個のＡ１〜Ａ４イネについて、各個体の各組織におけるＧＵＳ組織染色を調べた。この数個のＡ１〜Ａ４イネの各組織におけるＧＵＳ発現量を、以下の表２にまとめる。
【０１８６】
【表２】
2005117944.tif 000003
表２において、Ａ１〜Ａ４イネ（Ｔ０世代）の各個体における、各組織（葯（花粉を含む）、葉身、葉鞘、および根）での発現量は、以下の記号によって表される：＋＋＋；多量の発現が認められる、＋＋；中程度の量の発現が認められる、＋；少量の発現が認められる、−；発現が認められない。ここで、＋＋＋の発現量を約１００％とした場合、相対的に、＋＋は約５０％程度の発現量であることを示し、＋は約１０％程度の発現量であることを示し、そして−は約０％の発現量であることを示す。
【０１８７】
Ａ１〜Ａ４イネ（Ｔ０世代）の葯および花粉での代表的なＧＵＳ染色結果を示す写真を、図９に示す。ここで、Ａ１イネは、表２における個体１に対応し；Ａ２イネは、表２における個体９に対応し；Ａ３イネは、表２における個体３に対応し；そして、Ａ４イネは、表２における個体１にそれぞれ対応する。図９において青く染色された箇所が、ＧＵＳ活性を示した箇所である。図９の写真におけるＡ１イネおよびＡ３イネの個体の葯および花粉は、強いＧＵＳ染色を示し、図９の写真におけるＡ２イネの葯および花粉は、Ａ１イネおよびＡ３イネと比べて弱いＧＵＳ染色を示した。図９の写真におけるＡ４イネの葯および花粉は、ＧＵＳ染色を示さなかった。
【０１８８】
表２から明らかなように、Ａ１〜Ａ３イネでは、約８割以上の個体において、葯および花粉においてＧＵＳの発現が誘導され、そしてＡ４イネにおいても、約３割の個体において、葯および花粉でＧＵＳの発現が誘導された。
【０１８９】
さらに、Ａ１イネの８割以上の個体（Ａ１イネの個体１、２、３、４、５、６、７、８、１０および１１）、Ａ２イネの６割近くの個体（Ａ２イネの個体１、３、５、９、１０、１１および１２）、Ａ３イネの８割以上の個体（Ａ３イネの個体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３および１４）、およびＡ４イネの１個体（Ａ４イネの個体９）において、葯および花粉における特異的な発現が認められた。
【０１９０】
また、Ａ１イネの８割以上の個体（Ａ１イネの個体１、２、３、４、５、６、７、８、１０および１１）、Ａ２イネの約２．５割の個体（Ａ２イネの個体１、５および１１）、Ａ３イネの７割以上の個体（Ａ３イネの個体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３および１４）、およびＡ４イネの１個体（Ａ４イネの個体９）において、葯および花粉における優先的な発現が認められた。
【０１９１】
また、Ａ１イネの７割近くの個体（Ａ１イネの個体１、２、３、４、５、６、７および８）、Ａ２イネの１個体（Ａ２イネの個体１１）、およびＡ３イネの約６割の個体（Ａ３イネの個体１、２、３、４、５、６、７、８および９）では、葯および花粉における発現量が他の葉身、葉鞘、または根においてよりも有意に高く、従って、葯および花粉において最優先的に発現が誘導されたことが示された。
【０１９２】
表２で示されたＡ１〜Ａ４イネ（Ｔ０世代）におけるＧＵＳ染色の器官最優先的な発現を、以下の表３にまとめる。
【０１９３】
【表３】
2005117944.tif 000004
この表３において、「その他」とは、葯（花粉を含む）、葉身、葉鞘、または根のうちの２つ以上の器官で同等の量の発現が認められ、従って、特定の１つの器官での最優先的な発現が認められなかった個体を示す。「染色なし」とは、葯（花粉を含む）、葉身、葉鞘、および根のいずれの器官においてもＧＵＳ染色が認められなかった個体を示す。
【０１９４】
表２および表３から明らかなように、葯および花粉での最優先的な発現は主に、Ａ１イネおよびＡ３イネにおいて認められた。興味深いことに、Ａ１イネに導入したＣａｔＡＤ１プロモーター（−１１０９位〜＋３４２位）と、Ａ３イネに導入したＣａｔＡＤ３プロモーター（−２９８位〜＋３４２位）との間の長さであるＣａｔＡＤ２プロモーター（−４９０位〜＋３４２位）を導入したＡ２イネにおいては、葯および花粉での最優先的な発現率は低下することが明らかとなった。使用した４つのプロモーター断片のうちで最も短い長さを有するＣａｔＡＤ４プロモーター（−１９８位〜＋３４２位）を導入したＡ４イネでは、葯および花粉における最優先的な発現は認められなかった。
【０１９５】
以上の結果から、−４９０位〜−２９８位の間には、葯および花粉における最優先的発現を阻害するモチーフが存在することが推定された。さらに、この−４９０位〜−２９８位の間にあると推定される阻害モチーフを阻害するモチーフ、または、−４９０位〜−２９８位の間にあると推定される阻害モチーフの阻害効果を打ち消すくらい強い、葯および花粉における最優先的発現誘導効果のある第１の誘導モチーフが、−４９０位よりも上流（すなわち、マイナス（−）の数値が高い領域）に存在するために、Ａ１イネ（−１１０９位〜＋３４２位）は花粉および葯において高度に最優先的発現を示すことが示唆された。
【０１９６】
また、−２９８位〜−１９８位の領域中にも、葯および花粉における最優先的発現誘導効果のある、別の強い第２の誘導モチーフが存在することが推定された。この第２の誘導モチーフによる葯および花粉における最優先的発現誘導効果は、−４９０位〜−２９８位の間にあると推定される阻害モチーフが存在する場合には、ほぼ打ち消されるようである。−１９８位〜＋３４２位のプロモーターを導入したＡ４イネにおいては、−１１０９位〜−４９０位にあると推定される第１の誘導モチーフも、−２９８位〜−１９８位にあると推定される第２のモチーフも存在しないために、葯および花粉における最優先的な発現は認められなかったと考えられる。
【０１９７】
（実施例１４：実施例３〜６で得られたベクターを導入した形質転換イネ（Ｔ１世代）のＧＵＳ組織染色）
各ベクターを導入した形質転換体（Ｔ０世代イネ）を、通常の栽培条件下で生育させて、種子（Ｔ１世代種子）を採集した。次いで、このＴ１世代種子をポットに播種し、通常の栽培条件下で開花期まで生育させた。開花期まで生育させたＴ１世代の植物体から、葯、葉身、葉鞘、および根の各組織を採集した。これらの採取した各組織において、導入したＧＵＳ遺伝子が発現しているか否かを、上記の実施例１３に記載された手順と同様にしてＧＵＳ組織染色法により検定した。
【０１９８】
Ａ１イネの後代（Ｔ１世代）の１個体およびＡ３イネの後代（Ｔ１世代）の１個体において、各組織間でＧＵＳ発現量の比較した。この結果を図１０に示す。図１０のＡ１イネおよびＡ３イネの各々において、各組織における青色の濃淡は、ＧＵＳ発現量の指標となる。図１０の写真におけるＡ１イネの個体は、葯のみにおいてＧＵＳ組織染色を示した。図１０の写真におけるＡ３イネの個体は、葯において濃いＧＵＳ染色を示し、根においても弱いＧＵＳ染色を示した。図１０の写真におけるＡ３イネ個体の葉身および葉鞘におけるＧＵＳ染色は、極めて弱いものであった。
【０１９９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献はすべて、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
本願発明により、イネの遺伝子から、葯および／または花粉で活性が高く、従来知られていたＣａｔＡ推定全長プロモーターよりも短いので遺伝子操作しやすい、実用的なプロモーターの使用が提供される。従って、本願発明は、イネの品種改良のみならず、他の種々の植物の品種改良に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図１は、ＣａｔＡ遺伝子の−１５５９位〜＋３４２位領域に対応する野生型ＣａｔＡ遺伝子プロモーター領域の配列（ＤＤＢＪアクセッション番号Ｄ２９９６６）を示す。ＣａｔＡ遺伝子開始コドンに下線を付した。
【図２】図２は、ＣａｔＡ遺伝子の−１５５９位〜＋３４２位領域に対応するが、ＣａｔＡ遺伝子の開始コドンＡＴＧをＡＣＧに変換した、改変型ＣａｔＡ遺伝子プロモーター領域の配列を示す。ＡＣＧへの変換部位に下線を付した。
【図３】図３は、ベクターＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０の作製を示す模式図である。
【図４】図４は、ベクターＣａｔＡＤ１−ＧＵＳ−Ａ１／ｐＴＮ２、ＣａｔＡＤ２−ＧＵＳ−Ａ２／ｐＴＮ２、ＣａｔＡＤ３−ＧＵＳ−Ａ３／ｐＴＮ２、およびＣａｔＡＤ４−ＧＵＳ−Ａ４／ｐＴＮ２の作製を示す模式図である。
【図５】図５（Ａ）は、ＣａｔＡＤ１の模式図である。図５（Ｂ）は、ＣａｔＡＤ２の模式図である。図５（Ｃ）は、ＣａｔＡＤ３の模式図である。図５（Ｄ）は、ＣａｔＡＤ４の模式図である。
【図６】図６は、ＣａｔＡ遺伝子の推定全長プロモーターと各プロモーターの活性とを比較した図である。
【図７】図７は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０を導入した形質転換体の葯におけるＧＵＳ組織染色の結果を示す写真である。
【図８】図８は、ＣａｔＡ−ＧＵＳ−Δ０を導入した形質転換体の花粉におけるＧＵＳ組織染色の結果を示す写真である。
【図９】図９は、Ａ１〜Ａ４イネ（Ｔ０世代）の葯および花粉での代表的なＧＵＳ染色結果を示す。
【図１０】図１０は、Ａ１イネの１個体およびＡ３イネの１個体（ともにＴ１世代）において、各組織間でＧＵＳ発現量の比較した写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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