(57)【要約】【課題】  安全で安価なプラスミドＤＮＡを効率よく定量的に導入する方法の提供。【解決手段】  パルス状の電圧を血管に印加するする一つあるいは複数の陰極及び陽極で構成する電極部２、該パルス状の電圧を発生するパルス発生器３、駆動用電力を供給する電源４及びパルスの印加条件を制御するコンピュータ５を含んで構成する遺伝子導入装置１において、導入すべきプラスミドＤＮＡを該血管内に注入し、前記電極部を該血管両側面に該血管を挟むように設置し、前記設置電極部に所定電圧パルスを所定回数印加し該血管壁細胞に遺伝子導入用親水性穴を開けることによりプラスミドＤＮＡを前記陰極のエッジ部に対応する位置の血管壁細胞に優先的に導入するようにした。【選択図】        図１
2005065561.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス状の電圧を血管に印加するする一つあるいは複数の陰極及び陽極で構成する電極部、該パルス状の電圧を発生するパルス発生器、駆動用電力を供給する電源及びパルスの印加条件を制御するコンピュータを含んで構成する遺伝子導入装置において、導入すべきプラスミドＤＮＡを該血管内に注入し、前記電極部を該血管両側面に該血管を挟むように設置し、前記設置電極部に所定電圧パルスを所定回数印加し該血管壁細胞に遺伝子導入用親水性穴を開けることによりプラスミドＤＮＡを前記陰極のエッジ部に対応する位置の血管壁細胞に優先的に導入するようにしたことを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記電圧パルスは１０〜５０Ｖ、組織に印加される最大電界強度に換算して１７〜８２ｋＶ／ｍで２０ミリ秒印加することを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記遺伝子導入装置にはさらに電源の極性を切換える装置を備え、該血管の両側から遺伝子導入を行えるようにしたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項４】
前記陰極を２枚の平行電極で構成し該陰極のエッジ部に対応する位置の血管壁細胞に遺伝子を線状に導入できるようにしたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入方法。
【請求項５】
前記陰極を複数の小電極で構成し該血管壁にほぼ一様に遺伝子が導入できるようにしたことを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管壁細胞への遺伝子の導入、特にエレクトロポレーションによる導入方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療の研究が進むにつれ、血管壁細胞への遺伝子導入法が種々開発されてきた。現在はアデノウィルス・ベクター法が効率が良いので広く用いられているが、ウィルスを高濃度で作用させなければならないのでその抗原性など副作用が問題となっている。一方プラスミドＤＮＡは安価で、品質が高く安全に用いることができるという利点があるが、導入効率が低い点が問題である。最近新しいプラスミドＤＮＡ導入法の一つとしてエレクトロポレーション法が検討されるようになった（例えば非特許参考文献１など）。Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等はウサギの頚動脈をＴ型電極で挟みパルス電圧（１０〜４０Ｖ）を繰り返し１０回印加し、血管壁への遺伝子の導入を試みている。その結果、パルス印加周期２０ｍｓＯｎ／８０ｍｓＯｆｆ、印加電圧が２０Ｖで最大の導入量となり、ＤＮＡ濃度は２００μｇ／ｍｌで最大の導入量となることが確認された。ＬａｃＺ遺伝子を用いての確認では、電極のほぼ全面に渉って導入されていることが確認された。
【非特許文献１】Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｒａｂｂｉｔ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｌｓｅ”  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ［２００１］  ８．  １１７４−１１７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述のＴ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等の方法では、エレクトロポレーション法による遺伝子の導入は確認しているが、効率的な遺伝子の導入及び定量的な遺伝子の導入までは追求しておらず、実用化までに到っているとは言えない。本発明は上記の問題点に鑑み、効率的且つ定量的な遺伝子導入方法を提供し、更に一層の普及を図ることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
下記の構成を備えた本発明により、効率的且つ定量的な遺伝子の導入を実現できる。
【０００５】
（１）パルス状の電圧を血管に印加するする一つあるいは複数の陰極及び陽極で構成する電極部、該パルス状の電圧を発生するパルス発生器、駆動用電力を供給する電源及びパルスの印加条件を制御するコンピュータを含んで構成する遺伝子導入装置において、導入すべきプラスミドＤＮＡを該血管内に注入し、前記電極部を該血管両側面に該血管を挟むように設置し、前記設置電極部に所定電圧パルスを所定回数印加し該血管壁細胞に遺伝子導入用親水性穴を開けることによりプラスミドＤＮＡを前記陰極のエッジ部に対応する位置の血管壁細胞に優先的に導入するようにしたことを特徴とする遺伝子導入方法。
【０００６】
（２）前記電圧パルスは１０〜５０Ｖ、組織に印加される最大電界強度に換算して１７〜８２ｋＶ／ｍで２０ミリ秒印加することを特徴とする（１）記載の遺伝子導入方法。
【０００７】
（３）前記遺伝子導入装置にはさらに電源の極性を切換える装置を備え、該血管の両側から遺伝子導入を行えるようにしたことを特徴とする（１）記載の遺伝子導入方法。
【０００８】
（４）前記陰極を２枚の平行電極で構成し該陰極のエッジ部に対応する位置の血管壁細胞に遺伝子を線状に導入できるようにしたことを特徴とする（１）記載の遺伝子導入方法。
【０００９】
（５）前記陰極を複数の小電極で構成し該血管壁にほぼ一様に遺伝子が導入できるようにしたことを特徴とする（１）記載の遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により安価で安全なプラスミドＤＮＡを効率的に且つ定量的に導入できるため遺伝子治療が更に促進されるという効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図１は本発明のエレクトロポレーションよる遺伝子導入装置の概略構成を示す。遺伝子導入装置１は血管壁へ電圧を印加するための電極部２、その電極部２への印加電圧を発生するパルス発生器３、装置への電力を供給する電源４及び後述するパルス発生周期、印加電圧及びその極性などを制御するコンピュータ５から構成されている。
【００１２】
図２に示すように血管を挟むように電極部２を設置し所定の電圧を印加する。本発明で用いているエレクトロポレーション法では電極部２からの電気パルスに起因する電場の作用によって細胞膜に親水性の穴を開け、その穴より遺伝子を細胞内に導入するようにしたものである。
【００１３】
遺伝子の導入は以下の手順で行った。まず細径のカテーテルを用いて血管内にプラスミドＤＮＡを注入し２０分間インキュベーションする。遺伝子導入装置の電極部２を図２に示すように血管を挟むように配置し、所定の電圧で２０ｍ秒間ずつ１０回パルスを印加することによって血管の細胞膜に上記親水性の穴を開けて遺伝子の導入を行う。十分な導入効果を得るため２日間放置した後、遺伝子導入の効果を測定した。
【００１４】
遺伝子の導入部位を特定するためプラスミドＤＮＡとしてｐＧＡＧＧＳ−ＬａｃＺ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを用い上記の導入操作を行った後、６−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅで染色し、プラスミドＤＮＡの発現部位を同定した。染色された発現部位を示す写真を図３に示す。この写真は電極のエッジ部（周辺部）に対応した部分が染色されており、そこに遺伝子が優先的に導入されたことを示している。
【００１５】
図２に示すような血管の回りに電極を配置した状態における電場のシミュレーション結果は図４に示すように、電極の周辺に相当する部分の電位が高くなっており上記の染色写真の結果と対応している。この観察事実から、図５（ａ）に示す平行な２つの電極を用いれば線状に遺伝子を導入することが可能で、図５（ｂ）のような多数の電極を用いれば、血管壁全体にほぼ均一な濃度で遺伝子を導入することが可能となる。
【００１６】
また図３の写真２に示される染色部位は陰極電極側にのみ認められた。従って、遺伝子導入装置の電源の極性を切換えることによりの電極を設置し直さなくても血管の両側から遺伝子が導入でき、簡単に２倍量の遺伝子を導入することが可能となる。
【００１７】
また遺伝子導入量を調べるためプラスミドＤＮＡとしてｐＧＡＧＧＳ−Ｌｕｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを用い上記の導入操作を行った後、プラスミドＤＮＡの導入量を測定した。測定された導入量と電圧の関係を図６に示した。この図から電極への印加電圧３０Ｖで導入量が最大となることが判る。電極への印加電圧５０Ｖでは血管に閉塞が観察され、細胞の一部が破損していると考える。従って導入対象の安全を考慮して印加電圧は４０Ｖ以下が好ましく、導入効率の点からは３０Ｖが最適である。
【００１８】
以上述べたように、本発明によるエレクトロポレーション法では電極印加電圧３０Ｖ（最大電界強度５０ｋＶ／ｍ程度に相当）で最大の導入効果が得られ、電極の形状を変えることにより導入量及び導入部位を制御できる。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
本発明によれば安全で安価なプラスミド遺伝子を効率良く、所定の部位に導入することが可能となるので、医療分野における遺伝子治療の促進に大いに貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明による遺伝子導入装置の概略の構成を示す図
【図２】遺伝子導入装置の電極の配置を示す図
【図３】遺伝子の血管における導入部位を示す染色図
【図４】図２の電極周辺の電位分布のシミュレーション結果を示す図
【図５】本発明による電極の形態を示す図で、（ａ）は２枚の平行電極を示し、（ｂ）は複数の小電極で構成する電極を示す図
【図６】電極への印加電圧と遺伝子導入量の関係を示す図
【符号の説明】
【００２１】
１  遺伝子導入装置
２  電極部
３  パルス発生器
４  電源
５  コンピュータ
【図１】
2005065561.tif 000003
【図２】
2005065561.tif 000004
【図４】
2005065561.tif 000005
【図５】
2005065561.tif 000006
【図６】
2005065561.tif 000007
【図３】
2005065561.tif 000008