(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／または酵母の硫化水素産生能を低下させることである。【解決手段】  本発明は、SSU1遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物、特にSSU1遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物および／または内在性のSSU1遺伝子の発現量を増大させ得る遺伝的構築物を酵母に導入することによって、実用酵母、特にパン酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、シャンパン酵母、上面ビール酵母、下面ビール酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／またはこれらの酵母の硫化水素産生能を低下させる方法である。また、本発明は、SSU1遺伝子の転写量を増大させることによって前記実用酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／またはこれらの酵母の硫化水素産生能を低下させる方法でもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有する遺伝子の転写量を増大させることを特徴とする、酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／または酵母の硫化水素産生能を低下させる方法。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有する遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物を酵母に導入することを特徴とする、酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／または酵母の硫化水素産生能を低下させる方法。
【請求項３】
亜硫酸耐性が０より高く50ppmまでの亜硫酸に対する耐性であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有する遺伝子の転写量を増大させることを特徴とする、酵母の硫化水素産生量を低下させる方法。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子または前記ポリペプチドをコードする核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列を有する遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物を酵母に導入することを特徴とする、酵母の硫化水素産生量を低下させる方法。
【請求項６】
硫化水素産生量が対応する同種または同株の非形質転換体酵母に対して80%以下に低下することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
酵母が、サッカロマイセス・セレビシアエである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜硫酸耐性を有する酵母および／または硫化水素産生能の低下した酵母の造成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜硫酸はワイン製造を含む果実酒製造で雑菌の繁殖を抑えるために添加される物質である。酵母の亜硫酸耐性は菌株によって亜硫酸耐性の程度が異なり、特にワイン等の果実酒製造に用いられる酵母は菌株によって亜硫酸耐性の程度が大きく異なることが知られている。亜硫酸はまた酵母を用いた種々の醸造過程で存在または発生しえる物質でもある。しかしながら、酵母の亜硫酸耐性機構については十分に解明されているとは言えない。さらに、果実酒その他の酒類、パン等の製造において酵母が産生し得る硫化水素は生産物に好ましくない香気を与える点で問題とされている。
亜硫酸耐性酵母に関する報告としては、特開平７-95877「酵母交雑株及びそれを使用するワインの製造法」に、亜硫酸高含有培地で選抜して得られた酵母菌株と通常のワイン酵母の交雑により、醸造特性の優れたワイン酵母を育種し、それにより酒質の優れたワインを醸造する方法が記載され、特開平７-203951「酵母変異株およびそれを用いた酒類の製造方法」には、優れた性質を持つワイン酵母を亜硫酸高含有培地で生育させることにより、亜硫酸耐性ワイン酵母を取得したこと、およびこの酵母を用いて香気が優れ、有機酸生成量の多い清酒およびワインを製造する方法が記載され、特開平10-19163「NAD及びグルタチオン高含有酵母」にはグルタチオン高含有酵母の突然変異株から亜硫酸耐性株を取得することにより、グルタチオン高含有であり、かつ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）高含有の変異株を得たことが記載されている。また、X, Xu et al. Current Genetics Vol. 25, 488-496, 1994には実験室酵母S. cerevisiaeのSSU1遺伝子に変異があると亜硫酸耐性が低下することが記載されている。その後、このSSU1遺伝子は亜硫酸を細胞外に排出するポンプの役割を果たすと考えられる細胞膜タンパク質（SSU1タンパク質）をコードすることが明らかにされている（D.Avram and A.N. Bakalinsky: Journal of Bcteriology Vol.179, p5971-5974 (1997)）。
【０００３】
一方、山梨県のブドウ果汁から採取された亜硫酸耐性酵母Y-9株は、染色体の組換えを生じてSSU1遺伝子の転写が強化されていることが明らかにされた（J. Ferment. Bioeng., 86, 427 1998）。この論文の著者らは、ノーザン解析の結果に基づいてY-9株の亜硫酸耐性はSSU1遺伝子の発現が強化されたためであると結論付けている。また、SSU1遺伝子の高発現酵母も造成されている（2003年度日本農芸化学会大会講演要旨集 p159）。しかしながら、これらの報告のいずれにおいても、SSU1遺伝子単独の発現を強化することによって酵母が亜硫酸耐性を獲得するか否かについては必ずしも明らかにされておらず、SSU1遺伝子高発現酵母の亜硫酸酸耐性については明らかにされていない。
一方硫化水素低産生酵母についてはいくつか報告があるが（特開平05-244955、特開平05-192155、特開平07-303475）、SSU1遺伝子およびその発現レベルと硫化水素産生能との関連性は報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】特開平７-95877号公報
【特許文献２】特開平７-203951号公報
【特許文献３】特開平10-19163号公報
【特許文献４】特開平05-244955号公報
【特許文献５】特開平05-192155号公報
【特許文献６】特開平07-303475号公報
【非特許文献１】X, Xuら、Current Genetics、1994年、第25巻, 第488ページ〜496ページ
【非特許文献２】Nami Goto-Yamamotoら、"SSU1-R a Sulfite Resistance Gene of Wine Yeast, is an Allele of SSU1 with a Different Upstream Sequence"（「ワイン酵母の亜硫酸耐性遺伝子SSU1-Rは異なる上流配列を有するSSU1の対立遺伝子である」）、Journal of Fermentation Bioengineering、1998年、第86巻, 第427ページ〜433ページ
【非特許文献３】藤村ら、「ビール酵母のゲノム解析(4)  下面ビール酵母特有のSO2排出ポンプの機能解析」、2003年、2003年度日本農芸化学会大会講演要旨集 p159、演題番号3A06a07
【非特許文献４】Avram, D. と Bakalinsky、"Isolation and characterization of sulfite mutants of Saccharomyces cerevisiae"（「サッカロマイセス・セレビシアエの亜硫酸変異株の単離及び解析」）、A. T. J. Bacteriol.、1997年、第179巻、第5971ページ〜5974ページ
【非特許文献５】D.Avram and A.N. Bakalinskyら、Journal of Bcteriology、1997年、第179巻, 第5971ページ-5974ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
亜硫酸が存在しえる環境下において酵母を利用して醸造を行う場合、たとえばワイン製造工程においては使用する酵母には亜硫酸耐性が望まれる。醸造的に優れた性質を有しながら亜硫酸耐性が無いまたは非実用的なほど低いために醸造、たとえばワイン製造に利用できない場合も多く存在する。また、酵母は硫化水素産生能を有するが、硫化水素は一般に食品には望ましくない香気を有しており、特にワインを含む果実酒、ビール、清酒等の酒類においては極めて望ましくないと考えられている。
したがって、本発明の目的は、酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／または酵母の硫化水素産生能を低下させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、SSU1遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物、特にSSU1遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物および／または内在性のSSU1遺伝子の発現量を増大させ得る遺伝的構築物を酵母に導入することによって、実用酵母、特にパン、ワイン、清酒、シャンパン、上面ビール、下面ビールの製造に用いられるパン酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、シャンパン酵母、上面ビール酵母、下面ビール酵母に亜硫酸耐性を付与する、および／またはこれらの酵母の硫化水素産生能を低下させる方法である。
また、本発明は、SSU1遺伝子の転写量を増大させることによって実用酵母、特にパン酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、シャンパン酵母、上面ビール酵母、下面ビール酵母、に亜硫酸耐性を付与する、および／またはこれらの酵母の硫化水素産生能を低下させる方法でもある。
本発明は、特に、SSU1遺伝子の転写量を増大させることによってSaccharomyces属に属する酵母、特にサッカロマイセス・セレビシアエ（S. cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（S. bayanus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（S. pastorianus）、サッカロマイセス・パラドキシウス（S. paradoxious）に亜硫酸耐性を付与する、および／またはこれらの酵母の硫化水素産生能を低下させる方法でもある。
【０００７】
本発明の方法によって得られる酵母は、50ppmまでの亜硫酸、特に、好ましくは10〜50ppm、特に好ましくは20〜50ppm、最も好ましくは40〜50ppmの亜硫酸に耐性となる。これらの亜硫酸濃度は、Uzukaらの方法（J. Ferment. Technol. Vol.64, p107-114, 1985）に従って測定した場合に明瞭な生育を示した濃度である。
本発明の方法によって得られる酵母は対応する同種または同株の非形質転換体酵母に対して80%以下、好ましくは約70％以下、特に好ましくは約60％以下まで硫化水素産生量が低下する。
特に、本発明において使用し得る遺伝的構築物は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子または前記核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸分子を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、酵母の亜硫酸耐性を増強することができる。また、酵母の硫化水素産生能を低下させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の目的は、酵母において細胞あたりのSSU1遺伝子産物の活性を増強することによって達成される。細胞あたりのSSU1遺伝子産物活性の増強は、タンパク質レベルでもmRNAレベルでも行うことができる。パン酵母サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のSSU1遺伝子産物のアミノ酸配列を配列番号２に記載した。またSaccharomyces cerevisiae パン酵母由来のSSU1遺伝子の配列全体を配列番号１に記載した(DDBJアクセッション番号U20254)。配列番号１の配列において、コード領域はヌクレオチド番号1016-2392（停止コドンを含む）である。本明細書において、SSU1遺伝子とは、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、すなわち、酵母において菌体内SO2の菌体外排出に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を言う。このような遺伝子には、サッカロマイセス・セレビシアエ由来のSSU1遺伝子と「相同な」遺伝子が含まれる。
より具体的には、本発明の目的はSSU1遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物、特にSSU1遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物および／または内在性のSSU1遺伝子の発現量を増大させ得る遺伝的構築物を酵母に導入することによって達成することができる。
【００１０】
本明細書において「遺伝的構築物」とは、何らかの形態で子孫へ遺伝し得る核酸分子をいい、特にポリペプチドまたはRNAをコードする核酸分子を含む場合は「遺伝子構築物」ということがある。また「発現を増大」には、細胞あたりのmRNA量の増加、細胞あたりのタンパク質量の増加、または転写速度若しくは翻訳速度の上昇が含まれる。従って、「SSU1遺伝子の発現を増大させ得る遺伝的構築物」には、SSU1遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物、たとえば酵母において機能する適切なプロモーターに機能可能に接続されたSSU1遺伝子、および、SSU1遺伝子の転写量を増大させ得る遺伝的構築物例えばエンハンサーを含む構築物が含まれる。
本発明の実施態様の一つにおいては、SSU1タンパク質を発現させ得る遺伝子構築物、特にSSU1タンパク質を高発現させ得る遺伝子構築物が酵母細胞に導入される。また、本発明の他の実施態様においては、転写活性因子の追加的に発現させることによってSSU1遺伝子の転写量が増大される。本発明の更なる態様においては、転写活性化シスエレメント、例えばエンハンサーの導入等により内在性SSU1遺伝子の転写量が増大される。また、本発明の別の実施態様においては、内在性SSU1遺伝子のコピー数が増大される。
【００１１】
本発明において発現が増大される遺伝子は配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子と同一またはこれと「相同な」遺伝子である。配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子と「相同な」遺伝子とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列と配列相同性の高い遺伝子、例えば70％以上、好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上の配列相同性を有する遺伝子である。配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは配列番号１に記載の核酸配列のヌクレオチド番号1016-2389よってコードされる。
相同性は、例えばFASTA等の当業者によく知られたプログラムを標準的なパラメーターと共に用いて計算することができる。配列相同性を計算するためのプログラムは国立遺伝学研究所  生命情報・DDBJ研究センター(DDBJ/CIB)（http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）等の世界各国の公共的機関からFASTA Ver.2.0, 3.0, 3.2, 3.3等が標準的パラメーターと共に提供されている。また、そのような相同性の高い核酸分子には、ストリンジェントな条件下で配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸分子とハイブリダイズし得る核酸分子が含まれる。
【００１２】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言う。例えば、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄条件が50℃、２ｘSSC、0.1％ SDS、好ましくは１ｘSSC、0.1％ SDS、より好ましくは0.1ｘSSC、0.1％ SDSに相当する条件が挙げられる。この条件と同等な条件は当業者によく知られたものであり、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York等にも記載されている。
本発明において発現が増大されるSSU1遺伝子は導入すべき酵母と同じ種または菌株由来であっても、他の種または菌株由来であっても良い。
【００１３】
SSU1遺伝子産物の活性の増大は、mRNAレベルでもタンパク質レベルでも行われ得る。より具体的には、遺伝子の転写レベル、翻訳レベル、翻訳後修飾レベルを含む種々のレベルでSSU1遺伝子産物の活性を増大させることができる。例えば、SSU1タンパク質を発現し得る遺伝子構築物を導入すること、SSU1遺伝子の転写調節因子、翻訳調節因子を制御すること、内在性プロモーターを改変すること、内在性SSU1遺伝子のコピー数を増大させること等によって酵母細胞あたりのSSU1遺伝子産物の活性を増大させることができる。より具体的には、以下に記載するようなSSU1タンパク質を高発現し得る遺伝子構築物を導入すること、あるいは、転写活性化エレメントであるエンハンサーを導入して、目的とする形質転換体を選抜することができる。
【００１４】
本発明において使用するSSU1遺伝子発現を増大させるための遺伝的構築物は当業者によく知られた方法を用いて作製することができる。例えば、SSU1遺伝子を発現させ得る遺伝子構築物において使用するプロモーターは酵母細胞内で機能し得るプロモーターであればよく、例えば、ADH1、GAL1、GAL10等のプロモーターを使用することができる。プロモーターは高発現プロモーターが好ましく、そのようなプロモーターには、ADH1プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPHD)、エノラーゼ等のプロモーターが含まれる。また、本発明において使用し得るベクターは特に限定されず、酵母の形質転換に使用し得るベクターであればよく、例えば、YIp、YRp、YEp、YCp型のベクターが利用できるが、遺伝的に安定であることが好ましく、特に酵母染色体への組込み用ベクター、例えばYIp型ベクターが好ましい。そのようなベクターは当業者によく知られており、容易に作製することができ、商業的にも入手可能である。
【００１５】
上述のような遺伝子構築物または遺伝的構築物を設計、作製、単離する方法を含む分子生物学的手段については、例えば、Sambrook ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版 (1989年) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、F.M. Ausubel ら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994年)等の文献を参照することができる。
【００１６】
本発明において遺伝的構築物を導入する方法は特に限定されず、一般に酵母に使用される方法を使用することができる。そのような方法には、例えば、酢酸リチウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明において、亜硫酸耐性が付与される、および／または硫化水素産生能が低下される酵母の生物学的分類上の属・種は限定されないが、特に、サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属する酵母、例えば、S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. paradoxiousに属する酵母が好ましい。酵母の用途から見ると、Saccharomyces属に属するパン酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、シャンパン酵母、上面ビール酵母、下面ビール酵母のいずれも本発明において使用することができる。また、選抜マーカーとの関連で言えば、例えばura3変異を持ち、2マイクロンDNAが複製され得る上述の酵母は本発明において使用するために適している。
【００１８】
形質転換された酵母は、使用する酵母の特性と導入する遺伝的構築物上のマーカーとの組合せによって選抜することができる。この組合せは、SSU1遺伝子を含む遺伝的構築物上のマーカーと、前記プラスミドを導入すべき酵母上のマーカーとの間で相同組換えが起こるこように選ばれる。選抜用のマーカーは特に限定されないが、食品製造に使用する酵母については栄養要求性マーカーが望ましい。そのようなマーカーにはウラシル要求性（ura3）、ロイシン要求性(leu2)、トリプトファン要求性 (trp1)、ヒスチジン要求性 (his3)マーカーが含まれる。例えば、ura3マーカーを有する酵母、受託番号FERM  P-19477によって特定される酵母は本発明においてSSU1遺伝子を導入するための宿主として適している。
本発明において遺伝的構築物が導入される酵母は、多くの場合原栄養体であって形質転換体を選抜するための適切な栄養要求性マーカーを有しないため、SSU1遺伝子発現を増大させるための遺伝的構築物を導入するに先立って特定のマーカーを導入しておくことが必要な場合がある。これらのマーカーは導入する遺伝的構築物上の選抜マーカーと一対で用いられ、そのようなマーカーは、上述した通りである。特にウラシル要求性変異株とURA3+マーカーをもつベクターを使用する場合は、得られる形質転換体が5-フルオロオロチン酸(5-FOA)を含む培地で生育できないため容易に形質転換体を選抜することができる。また、優性的に変異株を分離する方法としてはChattoらによって公知となっている方法（Genetics, Vol.93, p51 (1979), J. Bacteriol., Vol.162, p579 (1985)）で、lys2またはlys5変異分離する方法が知られており、これらの方法を使用することもできる。
【００１９】
遺伝的構築物が導入された酵母は、SSU1遺伝子産物（タンパク質）の量、SSU1 mRNAの量、亜硫酸耐性、硫化水素産生能について評価することができる。SSU1タンパク質の量は例えば、ウェスタンブロット等により、mRNA量は例えばノーザンブロット、定量的RT-PCR等によって評価することができる。亜硫酸耐性は、例えば、Uzukaらの方法(J. Ferment. Technol. Vol.63, p107-114, 1985)によって行うことができる。簡単に言えば、２%グルコース、0.67% Yeast nitrogenbase w/o amino acids (Difco)、0.15%酒石酸、pH3からなる培地に、該当する酵母を培養当初2×106 細胞/ml程度になるようにして培養を開始し、培養当初から亜硫酸水素ナトリウムを添加し、約25℃にて１日〜７日間培養し、亜硫酸の存在下でも明瞭な酵母の生育が見られた場合（例えば、107細胞/ml以上の酵母菌数まで生育した場合）にその酵母が亜硫酸耐性を有すると考えることができる。
また、培養液中の遊離の亜硫酸濃度は、Hennigの方法(JAKOB Untersuchungsmethoden fuer Wein und aehnliche Getraenke p87-89 (1973))を用いても測定することができる。たとえば、試料25mlに2%デンプン溶液を1ml加え、5N H2SO4を10ml加えた後、N/128 ヨウ素−ヨウ素酸溶液で滴定し、滴定量の10倍を亜硫酸量(ppm)とすればよい。
本発明によって、酵母は一般には0より高く50ppmまでの亜硫酸、好ましくは10〜50ppm、特に好ましくは20〜50ppmの亜硫酸に耐性となる。さらには、40〜50ppmという高濃度の亜硫酸にも耐性となる。これらの亜硫酸濃度は、Uzukaらの方法（J. Ferment. Technol. Vol.64, p107-114, 1985）に従って測定した場合に明瞭な生育を示した濃度である。
【００２０】
酵母の硫化水素産生能は、例えば、酵母をSD培地（２％グルコース、0.67％Yeast nitrogenbase w/o amino acids (Difco)）中、約25℃にて１日間静置培養し、培養上清中に溶解している硫化水素量を測定することによって評価できる。液体中の硫化水素濃度の測定はNagataらの方法（J. Am. Chem. Soc. Brew. Chem., Vol.56, p47-51 (1998)）に従って、硫化水素センサーを用いて行うことができる。すなわち、培養上清に表面が疎水性・多孔質で内部が空洞状であるガス透過性チューブを投入し、空洞部分に透過してくるガス成分を硫化水素を除去した大気とともに検出器に送り込み、ガス性分中に含まれる硫化水素を金薄膜に吸着させ、変化した電気抵抗値を測定する。検量線は、硫化ナトリウム九水和物4mg/mlの溶液を調整し、試料に添加することで生じる硫化水素量をもとに作成すればよい。このような硫化水素センサーは商業的に入手可能である（JEROME 、Arizona Instrument社）。
【００２１】
本発明によってSSU1遺伝子発現を増大さえ得る遺伝的構築物が導入された酵母は対応する同種または同株の非形質転換体酵母に対して約80%以下、好ましくは約70％以下、特に好ましくは約60％以下まで単位時間あたりの硫化水素産生量が低下する。より具体的には、本発明によってSSU1遺伝子発現を増大さえ得る遺伝的構築物が導入された酵母は対応する同種または同株の非形質転換体酵母に対して少なくとも約45%〜80%、好ましくは少なくとも約40％〜70％、特に好ましくは少なくとも約45％〜60％程度まで硫化水素産生量が低下する。硫化水素産生量の低下は、上述した条件で酵母を１日程度培養した後に培養上清中に溶解している硫化水素量の減少を指標として評価することができる。
【００２２】
本発明によって得られる亜硫酸耐性となり、および／または硫化水素産生能が低下した酵母は、対応する同種または同株の非形質転換体酵母と同等の条件下で同等の用途に使用することができ、必要により亜硫酸濃度を増大させる、または硫化水素除去のための措置を省略することもできる。例えば、本発明によって亜硫酸耐性となり、および／または硫化水素産生能が低下したワイン酵母は、対応する同種または同株の非形質転換体ワイン酵母と同等の条件下でワイン製造に使用することができ、必要によって亜硫酸濃度を増大させることもでき、硫化水素除去のための手段を省略することもできる。本発明によって得られる亜硫酸耐性となり、および／または硫化水素産生能が低下した酵母は、対応する同種または同株の非形質転換体酵母と同等の条件下で同等の用途に使用したばあいでも、自身の有する性質により安定に発酵工程を終了させ、生産物、例えばワインの品質を改善し安定化させる。
【実施例１】
【００２３】
SSU1遺伝子の単離と強発現プロモーターADH1の接続
文献の情報（Avram, D. and Bakalinsky, A. T. J. Bacteriol. Vol.179, p5971-5974, 1997）をもとに酵母Saccharomyces cerevisiaeのSSU1遺伝子をPCRによって増幅、単離した。
研究用酵母X-2180-1A株(Rose, M. D. et al. Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course manual, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)から染色体DNAを抽出し、これを鋳型としてPCRを行った。SSU1遺伝子のオープンリ−ディングフレーム(ORF)を増幅するためのPCRプライマーとして5’-GAAGACAAGTACAAGAAAAAAATGGTTGCCAATTGG-3’（配列番号：３）及び5’-CTTGCCAATTATGTACGTATAAAACCAACAATTTTA-3’（配列番号：４）を使用した。得られた約1.4kbpの増幅DNA断片をプラスミドpCR2.1（インビトロジェン社製）に挿入して、プラスミドpCR-SSU1を得た。得られたSSU1遺伝子のEco RI断片を、酵母S. cerevisiaeの発現ベクターpYcDE-1に挿入し、プラスミドpYcDE-SSU1を得た（図１）。対象としたSSU1遺伝子のDNA塩基配列はSaccharomyces cerevisiaeのゲノムデータ−ベースであるSaccharomyces Genome Database(http://www.yeastgenome.org/)に記載されている。SSU1蛋白質をコードしている領域（ORF）のDNA塩基配列を図２に示す（配列番号５）。
このプラスミドを常法に従って実験室酵母S. cerevisiae YPH500（MATα, ade2, his3, leu2, lys2, trp1, ura3）に導入し、形質転換株を得た。プラスミドpYcDE-SSU1は、酵母S. cerevisiaeの核外プラスミドである2マイクロンDNAの複製開始部位を有し、選択マーカーとして、S. cerevisiaeのTRP1遺伝子を有する。
遺伝子の導入は酢酸リチウム法を用いた。すなわち、対数増殖期後期（酵母細胞数２〜５ｘ107細胞/ml）の培養液を遠心して集菌し、細胞を洗滌し、最終濃度0.2M酢酸リチウム溶液に30℃にて１時間接触させた。その後、この懸濁液200μlをプラスミドpYcDE-SSU1溶液20μl（DNA濃度200ng/μl）と30℃にて30分間接触させ、70％ PEG4000溶液に30℃、１時間接触させた。菌体液を滅菌水で洗滌し、選択培地（２％グルコース、0.67％Yeast nitrogenbase w/o amino acids (Difco)、２％寒天、20μg/mlアデノシン、ヒスチジン、oロイシン、ウラシル）に塗布した。形質転換体を30℃にて７日間培養後に選抜した。
【００２４】
得られた形質転換体について亜硫酸耐性をUzukaらの方法に従って測定した（J. Ferment. Technol. Vol.63, p107-114, 1985）。すなわち、2%グルコース、0.67% Yeast nitrogenbase w/o amino acids (Difco)、0.15%酒石酸、pH3からなる培地に、該当する酵母を培養当初2×106 細胞/ml程度になるように培養を開始し、培養当初から亜硫酸水素ナトリウムを添加することで、酵母の亜硫酸耐性を測定したものである。亜硫酸耐性の測定は、亜硫酸の存在下でも明瞭な酵母の生育が見られた場合（概ね、107細胞/ml以上の酵母菌数まで生育した場合）にそのような酵母が亜硫酸耐性を有するとした。
得られた形質転換株は親株と比較して強い亜硫酸耐性を示していた（表１）。
【００２５】
【表１】
2005065572.tif 000002
○：生育する      ×：生育しない
【００２６】
さらに、酵母の染色体DNAに挿入させるためのプラスミドpIYcDE-SSU1を作成した。プラスミドpIYcDE-SSU1は、酵母挿入型のプラスミドYIp5に強発現プロモーターであるADH1プロモーターを接続させたSSU1遺伝子を含むDNA断片を挿入させることによって作成した。その手順は図３に示したように以下の通りである。pYcDE-SSU1をKpnIで切断し、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化し、SalIリンカーをKpnI部位に導入した。次にSalI部位が導入されたpYcDE-SSU1をBamHIとSalIで消化し、SSU1遺伝子を含む断片を１％アガロース上の電気泳動を用いて単離した。この断片をYIp5のBaｍHI−SalI部位に導入してpIYcDE-SSU1を得た。
【実施例２】
【００２７】
ウラシル要求性変異株の分離
一般にワイン酵母は原栄養要求性であるため、プラスミドが移入されても形質が変わらないため形質転換株の検出ができないので、そのままでは形質転換の宿主として使用するには不便である。そこで、ワイン酵母に栄養要求マーカーを付与することとした。
遺伝マーカーの付与は5-フルオロオロチン酸（5-FOA）耐性を利用してBoekeらの方法（Mol. Gen. Genet. Vol.197, p345-346 (1984)）に従って、オロチジン-5'-リン酸脱炭酸酵素欠損変異株(ura3変異株)を分離した。
ワイン酵母Geisemhim74をエチルメタンスルホン酸で処理した。YPD培地中で対数増殖期後期（細胞数２〜５ｘ107細胞/ml）にあるワイン酵母Geisemhim74の培養液10mlを集菌し洗滌した。酵母細胞を0.1Mリン酸緩衝液(pH７)0.2mlに懸濁した。この懸濁液にエチルメタンスルホン酸を10μl〜200μl添加し、30℃にて45分間浸透した。その後、５％チオ硫酸ナトリウム溶液、続いて滅菌水で細胞を洗滌後、5-FOAを1000ppm含有している最少培地（SD培地  2% glucose, 0.67% Yeast nitorgenbase w/o amino acids (Difco)、２％寒天）に塗布し、5-FOA耐性変異株を分離した。分離された5-FOA耐性変異株のウラシル要求性を調べ、ウラシル要求性のワイン酵母Geisemhim74 ura3-1株を分離し、これを形質転換用の宿主とした。ウラシル要求性のワイン酵母Geisemhim74 ura3-1は、平成15年８月８日付けで独立行政法人、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM  P-19477が付与されている。なお、寄託者が付した識別のための表示は、G74-ura3-1である。
【実施例３】
【００２８】
SSU1遺伝子を高発現するワイン酵母の造成
実施例２で分離したワイン酵母のウラシル要求性変異株Geisemhim74 ura3-1株に、常法に従って実施例１で作成したプラスミドpIYcDE-SSU1を導入した。挿入型の形質転換株は、プラスミドpIYcDE-SSU1のSSU1遺伝子をコードする領域内にあるXba I部位を用いておこなった。形質転換株は、プラスミドpIYcDE-SSU1内にあるURA3遺伝子を利用して、宿主のura3変異を相補させることによって分離した。対照株としては、ワイン酵母のウラシル要求性変異株Geisemhim74 ura3-1株にベクターであるYIp5を導入したものを用いた。対照株の形質転換は、プラスミドYIp5のURA3遺伝子をコードする領域内にあるNco I部位を用いておこなった。得られた対照株は、平成１５年８月８日付けで独立行政法人、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM P-19478が付与されている。なお、FERM P-19478に寄託者が付した識別のための表示は、G74-ura3-1/YIp5である。得られた形質転換株は、平成１５年８月８日付けで独立行政法人、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM  P-19479が付与されている。なお、FERM  P-19479に対して寄託者が付した識別のための表示は、G74-ura3-1/pIYcDE-SSU1である。
【００２９】
得られた形質転換株は対照株と比べて強い亜硫酸耐性を示すことが確認された（表２）。また、ワイン酵母のウラシル要求性変異株Geisemhim74 ura3-1株（FERM  P-19477）に、プラスミドpIYcDE-SSU1を導入した形質転換体（FERM  P-19479）は、対照株（FERM  P-19478）に比較して、80ppm(A)または160ppm(B)の濃度で亜硫酸が含有されている果汁で良好な発酵経過を示した（図４(A)、(B)）。培養液中の遊離の亜硫酸濃度は、Hennigの方法(JAKOB Untersuchungsmethoden fuer Wein und aehnliche Getraenke p87-89 (1973))を用いて測定した。すなわち、試料25mlに2%デンプン溶液を1ml加え、5N H2SO4を10ml加えた後、N/128 ヨウ素−ヨウ素酸溶液で滴定した。滴定量の10倍が亜硫酸量(ppm)である。発酵経過は、糖度を約17度に調整した亜硫酸無添加の果汁にピロ亜硫酸ナトリウムを添加し、所定の遊離の亜硫酸濃度となっていることを測定した後に、初発の酵母菌数を107細胞/ml程度に調整し、25℃で発酵させた際の糖度の低下をもって測定した。糖度はATAGO社のRX-5000を用いて、屈折率を測定することによって行った。
【００３０】
【表２】
2005065572.tif 000003
○：生育する    ×：生育しない
【実施例４】
【００３１】
SSU1遺伝子を高発現するワイン酵母の硫化水素産生量
本発明者らは、酵母における硫黄化合物代謝系（図５）を考慮し、さらにSSU1遺伝子を高発現したワイン酵母による硫化水素産生量をNagataらの方法に従って、硫化水素センサーを用いて測定した。
酵母をＳＤ培地（2% グルコース, 0.67% Yeast nitrogenbase w/o amino acids (Difco)）にて25℃で1日間静置培養し、酵母を遠心分離によって除いた後、培養上清中に溶解している硫化水素量を硫化水素センサー（JEROME、Arizona Instrument社）を用いて測定した。
その結果、ウラシル要求性ワイン酵母変異株Geisemhim74 ura3-1株（FERM  P-19477）に、プラスミドpIYcDE-SSU1を導入した形質転換体（FERM  P-19479）は、対照株（FERM  P-19478）に比較して、産生される硫化水素の量が少ないことが示された（表３）。
【００３２】
【表３】
2005065572.tif 000004
*  危険率５％で有意差あり
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】SSU1遺伝子高発現プラスミドpYcDE-SSU1の構築方法を示す。
【図２】サッカロマイセス・セレビシアエSSU1遺伝子のDNA配列（コード領域）を示す。
【図３】SSU1遺伝子高発現プラスミドpIYcDE-SSU1の構築方法を示す。
【図４】ワイン酵母Geisemhim74 ura3-1/YIp5とGeisemhim74 ura3-1/pIYcDE-SSU1の発酵過程の比較。(A):亜硫酸濃度80ppm、(B)：亜硫酸濃度160ppm。◆：Geisemhim74 ura3-1/YIp5、■：Geisemhim74 ura3-1/pIYcDE-SSU1。
【図５】酵母における硫黄化合物代謝過程の概略を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
配列番号３，４：PCRプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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