(57)【要約】  【課題】感染症及び／又は敗血症を早期に検出できる方法の提供、並びに、敗血症の重篤度及び多臓器不全症候群の重篤度の評価方法の提供。  【解決手段】被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする感染症及び／又は敗血症の早期検出方法、並びに、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする敗血症の重篤度及び多臓器不全症候群の重篤度の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする感染症及び／又は敗血症の早期検出方法。
【請求項２】
患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする敗血症の重篤度の評価方法。
【請求項３】
患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする多臓器不全症候群の重篤度の評価方法。
【請求項４】
感染症及び／又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度の評価方法、又は、多臓器不全症候群の重篤度の評価方法に用いられる、血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定可能な低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は感染症及び／又は敗血症の早期検出方法に関する。また本発明は敗血症の重篤度の評価方法に関する。更には、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）の重篤度の評価方法に関する。更にまた、感染症及び／又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法等に用いられるための低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、感染を伴う全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）であり、感染を伴い、体温（＜３６℃  又は  ＞３８℃）、心拍数（＞９０回／ｍｉｎ）、呼吸（呼吸数＞２０回／ｍｉｎ  又は  ＰａＣＯ２＜３２ｍｍＨｇ）、白血球数（≧１２，０００／ｍｍ３  又は  ≦４，０００ｍｍ３、或いは、１０％以上の幼若球出現）の４項目の規定のうち、２つ以上の条件を満たすことと定義されている（非特許文献１参照）。非特許文献１には、敗血症に引き続く臓器の機能障害、血流低下、血圧低下及び組織循環障害等の規定により敗血症の重篤度が定義され、さらに複数の重要臓器が同時に機能障害を起こす症候群として多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）についても定義されている。
従来、感染症及び敗血症の診断は、被験者の血液を培養することにより感染菌の存在を確認することで行われてきた。しかし、この方法は培養にかなりの時間を要し、検出率も低いという根本的な欠点がある。また、敗血症の重篤度を反映する近年の指標として、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅ（非特許文献２参照）が提案され、ＭＯＤＳの重篤度の指標として、ＳＯＦＡ  ｓｃｏｒｅ（非特許文献３参照）等が提案され、臨床上汎用されている。しかしこれらの指標も、敗血症やＭＯＤＳの症状を評価する際に多くのパラメーターを測定し、特定の演算式により算出しなければならず、煩雑で測定自体にも手間と時間を要する。また感染後数日以内にその値が増加するＣ−反応性蛋白（ＣＲＰ）も臨床上測定されているが、急性炎症や組織崩壊がある患者に増加する因子であるため、敗血症に特異的に増加する因子ではないとされている（非特許文献４、非特許文献５）。
最近ではＳＩＲＳや敗血症を反映する他の血液マーカーとして、ＴＮＦα、ＩＬ−６等のサイトカイン又はエンドトキシン（ＥＴ）を指標とする方法が検討されているが、測定法の複雑さ、マーカーの不安定さ、測定の感度不足等の理由により、現在のところ確立した評価を得られておらず、研究試薬のレベルでしか活用されていない。この他にも、プロカルシトニンを指標とする測定法が提案されている（特許文献１参照）。しかしながら、敗血症におけるプロカルシトニンの役割と早期診断における有用性は確立されていない。
【０００３】
一方、血中可溶型ＣＤ１４分子と病態の関係について、Ｌａｎｄｍａｎｎらは、敗血症患者血清の可溶型ＣＤ１４のウエスタンブロット分析を行い、約５５ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が敗血症死亡例や発作性夜行性ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者で高値であり、健常人血清中にはこの分子が認められず、健常人には分子量の少し小さい４９ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が検出されたことを報告した（非特許文献６参照）。この分子量の異なるサブタイプについては、糖鎖の違いが関与していること、またＮ及びＯ結合型糖鎖を除去してもなお２種の異なる分子量の可溶型ＣＤ１４が血中に存在することをＳｔｅｌｔｅｒらが報告している（非特許文献７参照）。
抗ＣＤ１４抗体を用いた可溶型ＣＤ１４の測定系はＳｈｕｔｔら（特許文献２参照）により報告され、敗血症をはじめとして多くの疾患で可溶型ＣＤ１４の測定が行われている（非特許文献８、非特許文献９参照）。
しかし敗血症以外の疾患でも疾患の進行度に伴って、前述の約５５ｋＤａ、４９ｋＤａを含む可溶型ＣＤ１４（報告により、その分子量は異なるため、約５５ｋＤａ、４９ｋＤａに限定されるわけではない。これらを「高分子量ＣＤ１４」とも記す。以下同様。）の血液中濃度が上昇し、可溶型ＣＤ１４は敗血症特異的なマーカーではないことが明らかになった（非特許文献１０〜１２参照）。また、可溶型ＣＤ１４は、敗血症の重症化のマーカーとしても期待されていたが、敗血症性ショックとの相関が見られないこと（非特許文献１３参照）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）との相関が認められないことから（非特許文献１４参照）、敗血症の診断薬としてなり得なかった。
【０００４】
また、Ｌａｎｄｍａｎｎらが報告した上記約５５ｋＤａと４９ｋＤａの２種等の可溶型ＣＤ１４とは別に、約３６ｋＤａの可溶型低分子量ＣＤ１４（以下、「低分子量ｓ−ＣＤ１４」とも記載する。）が血中に存在すること、また該低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定方法（例えば、体液中の可溶型ＣＤ１４蛋白質の総量から体液中の高分子量ＣＤ１４蛋白質の量を差し引くことにより低分子量ｓ−ＣＤ１４蛋白質の量を測定する方法）、及びその測定が敗血症の診断に有用であることが提案されている（特許文献３参照）。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９４／０４９２７号パンフレット
【特許文献２】西独国特許出願公開第２８６８７６号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／２２０８５号パンフレット
【０００６】
【非特許文献１】「クリティカル  ケア  メディスン  （Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第２０巻、米国、１９９２年、ｐ．８６４−８７４
【非特許文献２】「クリティカル  ケア  メディスン  （Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第１３巻、米国、１９８５年、ｐ．８１８−８２９
【非特許文献３】「インテンシブ  ケア  メディスン  （Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第１３巻、米国、１９９６年、ｐ．７０７−７１０
【非特許文献４】「アメリカン  ジャーナル  サージェリー  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ）」、第１７５巻、米国、１９９８年、ｐ．３２５−３２７
【非特許文献５】河合忠、橋本信也編、「臨床検査のＡＢＣ」、日本医師会、１９９９年２月１５日、ｐ．１４６−１４８
【非特許文献６】「ザ  ジャーナル  オブ  インフェクショウス  ディジーズ  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、第１７１巻、米国、１９９５年、ｐ．６３９−６４４
【非特許文献７】「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  （Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２３６巻、独国、１９９６年、ｐ．４５７−４６４
【非特許文献８】「クリニカル  イムノロジー  アンド  イムノパソロジー  （Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、第８０巻、米国、１９９６年  ｐ．３０７−３１０
【非特許文献９】「臨床検査」、第３８巻、１９９４年、ｐ．３４１−３４４
【非特許文献１０】「インフェクション  アンド  イムニティー  （Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、第６７巻、米国、１９９９年、ｐ．４１７−４２０
【非特許文献１１】「クリニカル  アンド  イクスペリメンタル  イムノロジー  （Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第１２０巻、英国、２０００年、ｐ．４８３−４８７
【非特許文献１２】「クリニカル  アンド  イクスペリメンタル  イムノロジー  （Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｌｇｙ）」、第９６巻、英国、１９９４年、ｐ．１５−１９
【非特許文献１３】「ペディアトリック  アレルギー  アンド  イムノロジー  （Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第８巻、デンマーク、１９９７年、ｐ．１９４−１９９
【非特許文献１４】「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション  （Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、第２８巻、英国、１９９８年、ｐ．６７２−６７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かかる状況下において、感染症及び／又は敗血症を、その病態に罹患してからより早期に鑑別したいという要望が臨床現場に存在する。またその鑑別手法として臨床現場でより簡便に行える方法が望まれている。同様に敗血症或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法についても、より簡便な方法が望まれている。かかる重篤度の評価方法は、また、感染症や敗血症或いはＭＯＤＳに対して種々施される手術や薬物療法等の治療効果（以下、単に、「治療効果」と記す場合も同義とする。）を評価する上でも利用可能であり、臨床現場で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、鋭意研究の結果、血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４値（通常、「ｎｇ／ｍＬ」で表示される。）は、感染症及び／又は敗血症に罹患した後、速やかに上昇することを見出し、感染症及び／又は敗血症の早期検出方法として血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４値を測定することが極めて有用であることを実証した。また、患者の敗血症の重篤度に応じて血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４値が上下に推移すること、並びにその変化はＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅ等の従来の敗血症の診断パラメーターより早期に捉えられることを見出した。さらに、血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４値により感染症、敗血症、ＭＯＤＳ等における手術や薬物等の治療効果を評価することが可能であることを見出した。本発明者等は、上記知見に基づき本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法を提供する。
（１）被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする感染症及び／又は敗血症の早期検出方法。
（２）被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする上記（１）に記載の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法。
（３）前記閾値が、予め測定した健常人の平均値＋０．５ＳＤ〜健常人の平均値＋１２ＳＤの間に設定した閾値であることを特徴とする上記（２）に記載の感染症若しくは敗血症の早期検出方法。
（４）前記感染症が、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症若しくは寄生虫感染症であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の感染症の早期検出方法。
（５）前記敗血症が、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染若しくは寄生虫感染に起因する敗血症であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の敗血症の早期検出方法。
（６）被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法。
ここで、「血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定」とは、経時的に複数採取されたそれぞれの血液の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを意味する。
（７）被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を直接測定することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法。
【００１０】
また、本発明は、以下の敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法を提供する。
（８）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法。
（９）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする上記（８）に記載の敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法。
（１０）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、測定値の変化の程度により評価することを特徴とする上記（８）又は（９）に記載の敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法。
ここで、「血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定」とは、経時的に複数採取されたそれぞれの血液の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを意味する。
（１１）前記測定値の変化の程度が、１日あたりの変化量若しくは前記患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化量に基づいて算出されることを特徴とする上記（１０）に記載の敗血症の重篤度の評価方法。
（１２）前記測定値の変化の程度が、１日あたりの変化率若しくは前記患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化率を用いて表わされることを特徴とする上記（１０）に記載の敗血症の重篤度の評価方法。
（１３）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を直接測定することを特徴とする上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法。
【００１１】
さらに、本発明は、以下のＭＯＤＳの重篤度の評価方法を提供する。
（１４）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とするＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
（１５）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする上記（１４）に記載のＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
（１６）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、測定値の変化の程度により評価することを特徴とする上記（１４）又は（１５）に記載のＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
ここで、「血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定」とは、経時的に複数採取されたそれぞれの血液の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを意味する。
（１７）前記測定値の変化の程度が、１日あたりの変化量若しくは前記患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化量に基づいて算出されることを特徴とする上記（１６）に記載のＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
（１８）前記測定値の変化の程度が、１日あたりの変化率若しくは前記患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化率を用いて表わされることを特徴とする上記（１６）に記載のＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
（１９）前記ＭＯＤＳが敗血症に引き続くＭＯＤＳであることを特徴とする上記（１４）に記載のＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
（２０）患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を直接測定することを特徴とする上記（１４）〜（１９）のいずれかに記載のＭＯＤＳの重篤度の評価方法。
【００１２】
さらにまた、本発明は、以下の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの用途を提供する。
（２１）感染症及び／又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法に用いられる、血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定可能な低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キット。
（２２）被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を直接測定することを特徴とする上記（２１）に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キット。
（２３）サンドイッチ免疫法により低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することを特徴とする上記（２２）に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キット。
（２４）配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含むことを特徴とする上記（２３）に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キット。
（２５）感染症及び／又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度（若しくは治療効果）の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法に用いられることを特徴とする低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法。
（２６）被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を直接測定することを特徴とする上記（２５）に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法。
（２７）サンドイッチ免疫法により低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することを特徴とする上記（２６）に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法。
（２８）配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含むことを特徴とする低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの上記（２７）に記載の使用方法。
【００１３】
さらに、本発明は、以下の敗血症治療剤を提供する。
（２９）上記（１）に記載の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法により、陽性と判断された患者に２４時間以内に投与されることを特徴とする敗血症治療剤。
（３０）上記（２１）に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットにより感染症及び／又は敗血症或いはＭＯＤＳの重篤度のモニタリング下に投与されることを特徴とする敗血症治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
敗血症患者、ＳＩＲＳ患者、若しくは敗血症の疑いのある患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することにより、感染症若しくは敗血症の感染の有無、敗血症の重篤度の評価、及び、多臓器不全症候群の評価を行うことができる。
また、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を経時的に測定することにより、その変化の程度から敗血症の重症度の推移、ＭＯＤＳの重症度の推移を判定することができる。
【００１５】
また、早期に敗血症であるか否か判断できるため、手術、投薬の開始・変更等の治療指針の策定ができ、さらに低分子量ｓ−ＣＤ１４の変化の程度から手術若しくは投薬等による治療効果を判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、より詳細に本発明を説明する。
本発明で記載する「低分子量ｓ−ＣＤ１４」とは、ヒト血中に存在する可溶型蛋白質であって、ゲル濾過における分子量は３５−４５ｋＤａの蛋白質である。また、当該低分子量ｓ−ＣＤ１４は、配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体と結合し、さらに、ヒト高分子量ＣＤ１４と結合する抗ＣＤ１４抗体の一部の抗体とも結合する蛋白質である。抗ＣＤ１４抗体の一部の抗体とは、例えば、３Ｃ１０等である。低分子量ｓ−ＣＤ１４の具体的な一例としては、国際公開第０１／２２０８５号パンフレットに記載の分子量約３６ｋＤａのヒト血中蛋白質を例示することができる。「低分子量ｓ−ＣＤ１４」は上記の通り示されるが、１種の蛋白質若しくは多種の蛋白質群として血中に存在する。
【００１７】
本発明で記載する「低分子量ｓ−ＣＤ１４量（「低分子量ｓ−ＣＤ１４値」という場合もある。）」とは、検体中、特に血液中に含まれる低分子量ｓ−ＣＤ１４の含量である。通常、「低分子量ｓ−ＣＤ１４量」を測定する場合は、検体の一定容量あたりの含量を測定する場合が多く、例えば、「ｎｇ／ｍＬ」等の濃度として「低分子量ｓ−ＣＤ１４量」を得る場合が多い。即ち、本発明において、「低分子量ｓ−ＣＤ１４量」には、検体中の「低分子量ｓ−ＣＤ１４濃度」の意味も含まれる。
また、本発明の早期検出方法により、非感染症のＳＩＲＳ患者と、感染症のＳＩＲＳ患者、即ち、敗血症患者とを判別することもでき、該判別する方法も本発明の早期検出方法に含まれる。
【００１８】
本発明の第一の態様は、被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする感染症及び／又は敗血症の早期検出方法である。
好ましくは、被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする感染症及び／又は敗血症の早期検出方法である。即ち、本発明の感染症の早期検出方法は、被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた感染症としての閾値と比較することを特徴とする方法であるのが好ましい。また、本発明の敗血症の早期検出方法は、被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた敗血症としての閾値と比較することを特徴とする方法であるのが好ましい。
また好ましくは、被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする感染症及び／又は敗血症の早期検出方法である。
【００１９】
本発明の感染症の早期検出方法の対象となる感染症は、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症若しくは寄生虫感染症が例示される。主には、細菌感染症若しくは真菌感染症である。また、本発明の敗血症の早期検出方法の対象となる敗血症は、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染若しくは寄生虫感染に起因する敗血症が例示される。主には、細菌感染若しくは真菌感染に起因する敗血症である。
【００２０】
本発明の早期検出方法としては、例えば、患者、特に熱傷、外傷のある患者等の敗血症の疑いのある患者、若しくはＳＩＲＳ患者等の被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することにより、好ましくは、測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４量（以下、単に「測定値」という場合がある。）を予め定めた閾値と比較して該測定値が閾値よりも高いときに、感染症又は敗血症と判定する方法が挙げられる。
本発明の第一の態様の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法において、「血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定」とは、経時的に複数回にわたって採取されたそれぞれの血液の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを意味する。
経時的測定の頻度としては、被験者の健康状態若しくは病状の安定の程度によるが、例えば、観察初期、病状の変化が激しいときは数時間おきに、通常は１〜２日に１回、病状が安定しているときには数日に１回測定することが例示される。
【００２１】
また、前値若しくはそれまでの該被験者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の平均値と比較して、１０〜４０ｎｇ／ｍＬ以上上昇した場合、若しくは２〜１０倍以上に上昇した場合には、測定頻度を増加することが例示される。
例えば、入院中の被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を１日１回、経時的に測定し続けていた時に、それまでは閾値よりもかなり低い値、例えば、１／５〜１／１０程度の値を維持していたところ、ある時点で閾値よりも低い値であるが急に高い値、例えば、前値の３倍〜８倍程度に上昇した場合には、測定頻度を増やし、例えば、８時間に１回の割合で血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量をモニターすることにより、被験者の感染症及び／又は敗血症が早期に検出できる。
本発明者等は、患者が細菌等に感染すると、該患者の血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量はすぐに増加することを知見し、後述する実施例６の症例の場合では細菌感染より２４時間以内に血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４が増加することを確認した。そこで、該知見を活かして、本発明の早期検出方法として、例えば、細菌等に感染した疑いのある患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することにより、好ましくは測定値を予め定めた閾値と比較することにより、感染症及び／又は敗血症に罹患したか否かを早期に検出する方法が挙げられる。
【００２２】
本発明の早期検出方法が適用される被験者は、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症若しくは寄生虫感染症を引き起こす細菌、真菌、ウイルス若しくは寄生虫等に接触又は感染した可能性のある患者、細菌感染、真菌感染、ウイルス感染若しくは寄生虫感染に起因する敗血症の可能性のある患者、或いは、ＳＩＲＳ患者若しくはＳＩＲＳの可能性のある患者であるが、これらの患者に限定されず、健常人であってもよい。
低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定するための被験者の血液は、全血、血漿、血清のいずれでもよく、測定系に応じた検体を用いればよい。好ましくは血漿、血清である。また、被験者の血液は、被験者より採取した方法により特に限定されることはなく、好ましくは通常行われる方法で採取した被験者の血液である。
【００２３】
本発明の好ましい方法に用いられ、被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量と比較される、感染症及び／又は敗血症を早期に検出（当該疾患の罹患を早期に判断）するための閾値は、予め使用する測定系に応じて設定しておくことが好ましい。
閾値の設定としては、当該閾値は、健常人、敗血症患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４値の統計により設定される。具体的には、当該閾値は、健常人の平均値＋０．５ＳＤ以上で健常人の平均値＋１２ＳＤ以下の間に設定される。例えば、健常人の平均値＋０．５ＳＤ以上で健常人の平均値＋ＳＤ以下の間、健常人の平均値＋ＳＤ以上で健常人の平均値＋２ＳＤ未満の間、健常人の平均値＋２ＳＤ以上で健常人の平均値＋３ＳＤ以下の間、健常人の平均値＋３ＳＤより大きく健常人の平均値＋５ＳＤ以下の間、健常人の平均値＋５ＳＤ以上で健常人の平均値＋１２ＳＤ以下の間に、当該閾値は設定される。好ましくは健常人の平均値＋ＳＤ以上で健常人の平均値＋２ＳＤ未満の間、健常人の平均値＋２ＳＤ以上で健常人の平均値＋３ＳＤ以下の間、健常人の平均値＋３ＳＤより大きく健常人の平均値＋５ＳＤ以下の間に、当該閾値は設定される。より好ましくは健常人の平均値＋ＳＤ以上で健常人の平均値＋２ＳＤ未満の間、健常人の平均値＋２ＳＤ以上で健常人の平均値＋３ＳＤ以下の間、当該閾値は設定される。より具体的な例として、健常人の平均値＋ＳＤ、健常人の平均値＋２ＳＤ又は健常人の平均値＋３ＳＤに、当該閾値は設定される。
【００２４】
後述する本発明の実施例５に記載した通り、標準品を用いたサンドイッチＥＩＡ系の定量測定では、健常人の平均値＋０．５ＳＤ〜健常人の平均値＋１２ＳＤ（「健常人の平均値＋０．５ＳＤ以上で健常人の平均値＋１２ＳＤ以下」を意味する。以下同様に記載する）は、３５〜２００ｎｇ／ｍＬであった。
即ち、上記閾値を、標準品を用いたサンドイッチＥＩＡ系の定量測定では、３５〜２００ｎｇ／ｍＬの間の値に設定することができる。例えば、３５、４０、５０、５７、６０、７０、１００、１３５、１７０、２００ｎｇ／ｍＬの値、若しくはその付近の値を閾値として設定することができる。好ましくは４０〜１００ｎｇ／ｍＬの間の値に設定することが、より好ましくは４０〜７０ｎｇ／ｍＬの間の値に設定することが、例示される。標準品はヒト低分子量ＣＤ１４、ヒト低分子量ＣＤ１４類似物質が挙げられる。ヒト低分子量ＣＤ１４類似物質とは、例えば、ヒトＣＤ１４のＮ末端１〜２８５番目のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、「ｓ−ＣＤ１４（１−２８５）」と記載する）及びヒトＣＤ１４のＮ末端１〜３０７番目のアミノ酸を有しかつ２８６番目のセリンをシステインに置換した組み換えポリペプチド（以下、「ｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ」と記載する）が例示される。しかし、サンドイッチＥＩＡ系においてヒト低分子量ＣＤ１４と同様に測定される限り、特に限定されない。ｓ−ＣＤ１４（１−２８５）及びｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃの調製法は、国際公開第０１／７２９９３号パンフレットに記載されている。
【００２５】
本発明の好ましい早期検出方法においては、測定された被験者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４値が、予め３５〜２００ｎｇ／ｍＬの間の値に設定された閾値を超えた場合は、感染症に罹患したと判定すればよく、また該被験者がＳＩＲＳ患者である場合は敗血症と判定すればよい。
【００２６】
低分子量ｓ−ＣＤ１４量の測定方法については、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することができる限り、特に限定されない。
低分子量ｓ−ＣＤ１４量を直接的に測定できる、配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を用いた免疫サンドイッチ測定法であるのが好ましく、その方法を以下に説明する。
【００２７】
配列番号１に記載の１６アミノ酸残基のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のヒトＣＤ１４の５３番から６８番までの１６アミノ酸残基に該当し、現在ヒト蛋白質においてヒトＣＤ１４以外に該配列を有する他の蛋白質は知られておらず、ヒトＣＤ１４に特異的に含まれる配列である。
【００２８】
以下に該測定法のためのキットの作製法の例示を記載する。
上記配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよく、配列番号１に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含むペプチドを抗原として公知技術を用いることにより作製できる（例えば、「免疫実験操作法」、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。
【００２９】
該抗体のポリクローナル抗体の作製方法を例示するが、該抗体の作製方法は以下の作製方法に限定されない。
抗原とする上記配列番号１に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含むペプチドは分子量が小さく免疫原性を持たないためキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて免疫原とすればよい。
上記のとおり調製して得られる免疫原２０〜１０００μｇをフロインド完全アジュバント等のアジュバントと混合し、ウサギ、ラット、マウス等の動物に免疫する。免疫方法として、例えば、皮下投与を行い、初回投与後１〜４週間間隔でフロインド不完全アジュバント等のアジュバントと混合した免疫原を同様に若しくは静脈内に投与することにより追加免疫を行う。抗血清は、免疫した動物から通常の採血方法、例えば、頚動脈等より血液を採取し、遠心等により血清を分離することにより調製する。得られた抗血清は硫酸アンモニウム等による塩析法により、γグロブリン分画を沈殿させ、適当な緩衝液に透析後、プロテインＡ等のγグロブリンを特異的に精製することができるアフィニティーマトリクスを用いて目的のペプチドに対するＩｇＧ画分の精製ポリクローナル抗体を調製する。また、上記免疫源としたペプチドと結合する抗体を選択することにより、特異精製することができる。
なお、免疫原とするペプチドの作成方法は、一般的に使用されるペプチド合成機（ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、パーキンーエルマージャパン）等を用いた方法で作製できる。
【００３０】
上記精製ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応用及び改良法については、例えば、石川栄治著、「超高感度酵素免疫測定法」、学会出版センター（１９９３年）；「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」、免疫測定法開発研究会、経営教育出版；石川栄治等編、「酵素免疫測定法（第３版）」、医学書院（１９８７年）に記載されている。
【００３１】
サンドイッチ免疫測定法に用いる第二の結合物質は、例示として低分子量ｓ−ＣＤ１４に結合する抗体が挙げられる。作製法は、例えば、高分子量ＣＤ１４、低分子量ｓ−ＣＤ１４、高分子量ＣＤ１４及び低分子量ｓ−ＣＤ１４の混合物若しくは組換体ＣＤ１４を抗原として、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体を作製すればよい。高分子量ＣＤ１４及び低分子量ｓ−ＣＤ１４の混合物を抗原とした第二の抗体の作製法の例示を後述する実施例２−（１）に示した。
【００３２】
また、低分子量ｓ−ＣＤ１４量を実際に測定する前に予備的に、後述する実施例２−（２）と同様に、配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体と第二の抗体の候補の抗体とサンドイッチ法の系を構成し、測定感度を確認して、第二の抗体を選択することが好ましい。
配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体及び第二の抗体を用いて、例えば、「配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−「ヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４」−「ヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４に結合する第二の抗体」の複合体を形成させることにより測定すればよい。
【００３３】
以下に、本発明に好適に用いられる低分子量ｓ−ＣＤ１４を直接的に測定できる測定方法を例示するが、本発明に用いられる測定方法は、以下に例示する測定方法に限定されない。
該測定方法は以下の手順を行う。
即ち、「配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」を熱吸着法等で固相化したイムノプレートを用意し、該イムノプレートに検体を添加して反応させる。次に過ヨーソ酸法等でペルオキシダーゼ等を標識した「ヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４に結合する第二の抗体」を添加して反応させる。その後、発色基質として３，３’，５，５’−テトラベンジジン等を添加して反応させ、硫酸溶液等で反応を停止した後、分光光度計で４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、標準品と比較して低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定する。
【００３４】
本発明においては、上記の直接的に低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定する方法の他に、国際公開第０１／２２０８５号パンフレットに記載の実施例１１に示される血中全ＣＤ１４量と高分子量ＣＤ１４量を測定し、全ＣＤ１４量から高分子量ＣＤ１４量を差し引く、間接的に低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定する方法も例示される。また、国際公開第０１／２２０８５号パンフレットに記載の実施例１０に示される低分子量ｓ−ＣＤ１４を電気泳動的に検出し、そのバンドを定量する方法も例示される。
【００３５】
本発明の第二の態様は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とする敗血症の重篤度（若しくは敗血症に対して施された手術や薬物の治療効果）の評価方法である。
以下、本発明の第一の態様の早期検出方法と異なる点について説明する。
好ましくは、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法である。即ち、本発明の敗血症の重篤度の評価方法は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする方法であるのが好ましい。また、本発明の敗血症の治療効果の評価方法は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とする方法であるのが好ましい。
【００３６】
より好ましくは、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、測定値の変化の程度により評価することを特徴とする敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法である。即ち、本発明の敗血症の重篤度の評価方法は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、測定値の変化の程度により評価することを特徴とする方法である。また、本発明の敗血症の治療効果の評価方法は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、測定値の変化の程度により評価することを特徴とする方法である。
【００３７】
さらに好ましくは、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、１日あたりの変化量若しくは該患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化量に基づいて算出される変化の程度により敗血症の重篤度を評価すること若しくは敗血症の治療効果を評価することを特徴とする方法である。また、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、１日あたりの変化率若しくは該患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化率を用いて表される変化の程度により敗血症の重篤度を評価すること若しくは敗血症の治療効果を評価する方法である。
【００３８】
つまり、本発明の第二の態様は、測定値を、予め定めた閾値と比較することにより評価するのが好ましい。算出された、又は、表される変化の程度を、予め定めた低分子量ｓ−ＣＤ１４量の変化量又は変化率と比較するのがより好ましく、これらを併用するのが特に好ましい。
【００３９】
臨床上、通常敗血症を診断するときには、感染の確認とは別に体温、心拍数、呼吸及び白血球に関する指標を測定し、診断している。必要な患者についてはさらにＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅ（非特許文献２）を計算し、重篤度の指標としている。本発明者等は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の変化が、体温、心拍数、呼吸及び白血球に関するＳＩＲＳの診断基準に適合する項目数や、若しくはＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅと、早期に若しくは同時期に、同じ傾向を示して変化することを知見した。即ち、後述する実施例７の症例の場合では敗血症の重篤度の良化により血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量が減少し、及び後述する実施例８の症例の場合では敗血症の重篤度の悪化により血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量が増加し、敗血症の重篤度の良化により血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量が減少することを確認した。これらの知見に基づいて、本発明者等は、敗血症患者において、その症状の重篤度に対応して、低分子量ｓ−ＣＤ１４値が変化しているので、低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することにより、好ましくは低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定することにより、敗血症の重篤度を評価することが可能であることを発明した。その一例を挙げると、例えば、敗血症患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定して、低分子量ｓ−ＣＤ１４量の変化の程度を確認することにより、その重篤度を評価することができる。
【００４０】
本発明の第二の態様の重篤度の評価方法において、経時的に測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が減少すれば、重篤度が改善したと評価することが可能である。また発明の第二の態様の重篤度の評価方法において、経時的に測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が減少し、さらに測定値が上記した閾値よりも低くなった時には症状が回復したと評価することが可能である。
【００４１】
本発明の第二の態様の重篤度の評価方法において、「血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定」とは、経時的に複数回にわたって採取されたそれぞれの血液の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを意味する。
【００４２】
患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を比較するための閾値、変化の程度（１日あたりの変化量、又は患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化量、或いは、１日あたりの変化率、及び、患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化率）は、予め使用する測定系に応じて設定しておくことが好ましい。
閾値、変化の程度の設定は、例えば、健常人、敗血症患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４値の統計や経験に応じて設定する。敗血症から回復したことに対する閾値は、本発明の第一の態様に説明したとおりである。
【００４３】
変化の程度も統計や経験的に診断の指標として設定することが可能である。敗血症の重篤度が増加した、及び／又は、治療指針を変更する必要がある等の判断基準としては、例えば、測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が、前回測定した低分子量ｓ−ＣＤ１４値に対して、約３０〜５０ｎｇ／ｍＬ／日以上の増加とすることができる。一方、敗血症が改善した及び／又は治療効果が認められる等の判断基準としては、例えば、測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が、入院後測定した低分子量ｓ−ＣＤ１４値の最大値よりも約１００〜４００ｎｇ／ｍＬ以上の減少、又は、該最大値の約２／３〜１／４以下の減少、或いは、前回測定した低分子量ｓ−ＣＤ１４値に対して、約５０〜２００ｎｇ／ｍＬ／日以上の減少とすることができる。
【００４４】
上記の閾値、変化の程度の指標は、本発明実施例より導き出した例示であり、測定キットの違い、測定環境等により異なるものである。また経験的に修正されてもよい。本発明における診断の指標は上記の閾値、変化の程度に限定されるものではない。
【００４５】
本発明の第二の態様の重篤度の評価方法においては、上記測定値の変化の程度と共に、上記本発明の第一の態様の早期検出方法で用いる「閾値」との比較により判断するのが好ましい。
【００４６】
本発明の第二の態様の重篤度の評価方法は、従前のパラメーターを用いた評価方法に比し、約２４時間〜４８時間程度早期に行うことができる場合があり、その有用性は大きい。
本発明の第二の態様の重篤度の評価方法において、経時的測定の頻度としては、病状の安定の程度によるが、例えば観察初期、病状の変化が激しいときは数時間おきに、通常は１〜２日に１回、病状が安定しているときは数日に１回測定することが例示される。
【００４７】
本発明の第二の態様においては、重篤度の評価方法の他に、治療効果を評価することもできる。治療効果の評価とは、例えば、手術後の患者の血液を用いて経時的に測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が減少すれば、手術の効果があったことが確認でき治療効果を評価できる。また、投薬後の患者の血液を用いて経時的に測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が不変若しくは増加した場合、該投薬はあまり効果がなかったことが確認でき治療効果を評価できる。
【００４８】
本発明の第二の態様においては、さらに次の治療指針を評価することも可能である。例えば、治療後の患者の血液を用いて経時的に測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が減少すれば、現在の治療を継続、薬剤投与量の減少、若しくは比較的効果の弱い薬剤への変更等を設定・評価することができる。さらに、測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が上記閾値よりも低下すれば、薬剤投与を終了することを評価することもできる。
反対に、患者の血液を用いて経時的に測定された低分子量ｓ−ＣＤ１４値が増加すれば、重篤度が増した、即ち病態が悪化したと評価することが可能である。この時には、例えば、保存療法（薬剤投与）から外科療法（手術）へ、薬剤の種類の変更若しくは追加、薬剤投与量の増加等を設定・評価することが可能である。また病状監視の程度の指針を決定することも可能である。例えば、一般病棟より集中治療室（ＩＣＵ）に転室する等の指針の決定が挙げられる。
【００４９】
低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定方法、低分子量ｓ−ＣＤ１４量の測定するための患者の血液、及び敗血症の起因について等、本発明の第一の態様に共通する説明は本発明の第一の態様に記載した通りである。また、以降の態様についても同様である。
【００５０】
本発明の第三の態様は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することを特徴とするＭＯＤＳの重篤度の評価方法である。
好ましくは、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定し、予め定めた閾値と比較することを特徴とすることを特徴とするＭＯＤＳの重篤度の評価方法である。
より好ましくは、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、測定値の変化の程度により評価することを特徴とするＭＯＤＳの重篤度の評価方法である。
【００５１】
さらに好ましくは、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、１日あたりの変化量若しくは該患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化量に基づいて算出される変化の程度により評価することを特徴とするＭＯＤＳの重篤度の評価方法である。また、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定し、１日あたりの変化率若しくは該患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の最大値との変化率を用いて表される変化の程度により評価することを特徴とするＭＯＤＳの重篤度の評価方法である。
【００５２】
本発明の第三の態様のＭＯＤＳの重篤度の評価方法の対象となるＭＯＤＳは、感染症や敗血症の発症ないしは関与が懸念される限りにおいて特定を要しないが、とりわけ敗血症に引き続くＭＯＤＳが例示される。
【００５３】
敗血症の病態と患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の関係は本発明の第一の態様及び第二の態様で説明した通りである。また、本発明のＭＯＤＳの重篤度の評価方法における予め定めた閾値との比較の仕方、及び、測定値の変化の程度による評価の仕方についても、本発明の第一の態様及び第二の態様で説明したことと同様である。
さらに、本発明者等は、患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量の変化は、患者のＳＯＦＡ  ｓｃｏｒｅ（非特許文献３）と、早期に若しくは同時期に、同じ傾向を示して変化することを知見した。即ち、後述する実施例８の症例の場合ではＭＯＤＳの重篤度の悪化により血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量が増加し、ＭＯＤＳの重篤度の良化により血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量が減少することを確認した。この知見に基づいて、本発明者等は、ＭＯＤＳ患者において、その症状の重篤度に対応して、低分子量ｓ−ＣＤ１４量が変化しているので、低分子量ｓ−ＣＤ１４量を測定することにより、好ましくは低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定することにより、ＭＯＤＳの重篤度を評価することが可能であることを発明した。その一例を挙げると、例えば、ＭＯＤＳ患者の血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４量を経時的に測定して、低分子量ｓ−ＣＤ１４量の変化の程度を確認することにより、その重篤度を評価することができる。特に敗血症に引き続くＭＯＤＳの重篤度の評価、さらに早期評価が可能である。
低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定方法等は本発明の第一の態様に記載したとおりである。
【００５４】
本発明の第四の態様は、感染症又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法に用いられる、血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定可能な低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットである。
本発明の第四の態様の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットを用いると、感染症又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法の指標となる血液中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することができる。
【００５５】
本発明の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットにおける低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定原理は、感染症又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法の指標となる低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することができれば、特に限定されない。
【００５６】
本発明の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットには、測定原理に応じた必要な試薬が含まれていればよく、測定原理に基づく測定結果を阻害しない限り、それに含まれるものは特に限定されない。
なお、低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定方法の測定原理の例示、及びその原理に応じた任意の構成要素については、本発明の第一の態様の説明で記載した通りである。
【００５７】
本発明の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットは、好ましくは、サンドイッチ免疫法により低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することを特徴とする、感染症又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度若しくは治療効果の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法に用いられる低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットである。
本発明の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットには、好ましくは、配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む。
【００５８】
低分子量ｓ−ＣＤ１４を直接測定するためのキットとしては、例えば、配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、及び低分子量ｓ−ＣＤ１４に結合する第二の抗体を含むことを特徴とするキットが挙げられる。ここで、「第二の抗体」とは、ヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４に結合すれば、他の血中可溶型蛋白質、例えば、高分子量ＣＤ１４に結合しても構わない抗体である。上記２つの抗体は、一方が不溶性担体に固定化した固相として、もう一方が標識抗体として含まれていてもよい。
さらに任意の構成要素として、検体若しくは標識抗体の緩衝液、標識抗体に酵素が使われる場合のその酵素に適した基質及び発色剤、ブロッキング剤、洗浄剤又は停止剤等が挙げられる。
【００５９】
上記固相に用いる不溶性担体としては、例えば、イムノプレート、マイクロタイタープレート、プラスチックビーズ、磁性粒子又はメンブラン等が挙げられる。
上記標識抗体は、例えば、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウロキナーゼ若しくはβガラクシダーゼ等による酵素標識、アクリジニウム若しくはエクオリン等による化学発光標識、又はＦＩＴＣ等による蛍光標識により標識された抗体が挙げられる。
上記酵素に適した基質は、例えば、ペルオキシダーゼにはテトラメチルベンジジン等、アルカリフォスフォダーゼにはｐ−ニトロフェニルフォスフェート等が挙げられる。
【００６０】
また、国際公開第０１／２２０８５号パンフレットに記載の間接的に低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定するためのキットも本発明のキットとして含まれる。
【００６１】
本発明の第四の態様には、上記した低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法を含む。
即ち、本発明の第四の態様は、感染症及び／又は敗血症の早期検出方法、敗血症の重篤度（若しくは治療効果）の評価方法、或いはＭＯＤＳの重篤度の評価方法に用いられることを特徴とする低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法である。
好ましくは、サンドイッチ免疫法により低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することを特徴とする低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法であり、より好ましくは、配列番号１に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含むことを特徴とする低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットの使用方法である。
これらの低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットは、例えば、上記本発明の第一の態様で説明した方法で使用される。
【００６２】
本発明の第五の態様は、敗血症治療剤を提供する。
即ち、上記本発明の第一の態様の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法により、陽性と判断された患者に２４時間以内に投与されることを特徴とする敗血症治療剤である。また、上記本発明の第四の態様に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットにより感染症及び／又は敗血症或いはＭＯＤＳの重篤度のモニタリング下に投与されることを特徴とする敗血症治療剤である。
【００６３】
上記本発明の第一の態様の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法により、陽性と判断された患者に２４時間以内に投与されることを特徴とする敗血症治療剤とは、主に抗生物質である。例えば、ペニシリン系及びセファロスポリン系のβラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、セフェム系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、カルバパネム系抗生物質等が挙げられる。
【００６４】
また、上記本発明の第四の態様に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットにより感染症及び／又は敗血症或いはＭＯＤＳの重篤度のモニタリング下に投与されることを特徴とする敗血症治療剤とは、上記の抗生物質に加えて、免疫グロブリン、血漿製剤及びフィブロネクチン等の免疫補充剤、ピシバニール、レバミゾール及びクレスチン等の免疫強化剤、アプロチニン、メシル酸ガベキサート、メシル酸ジャファモスタット、ウリナスタチン、抗ＰＡＦ抗体、抗ＴＮＦ抗体、αトコフェノール、アロプリノール及びＧ−ＣＦＳ等のメディエーターに対する薬剤、活性化プロテインＣ製剤、並びに抗ＣＤ１４抗体等が敗血症治療剤として挙げられる。
さらにこれらに加えて、臓器障害に対する薬剤として、ドパミン、エピネフリン、抗不整脈薬等の循環改善剤、アラキドン代謝阻害薬、ステロイド等の呼吸改善剤、ヘパリン、ＡＴＩＩＩ等の血液抗凝固剤等も敗血症治療薬として含まれる。
【００６５】
本発明の第五の態様の敗血症治療剤は、上記本発明の第一の態様の感染症及び／又は敗血症の早期検出方法により、陽性と判断された患者に２４時間以内に投与されることを特徴とする限り、若しくは、上記本発明の第四の態様に記載の低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キットにより感染症及び／又は敗血症或いはＭＯＤＳの重篤度のモニタリング下に投与されることを特徴とする限り、敗血症治療剤はすべて含まれ、上記に例示した薬剤に限定されるものではない。例えば、山口徹等編、「今日の治療指針  ２００３年版」、医学書院；戸田昇等編、「循環系治療剤の作用メカニズム」、南江堂（１９９８年）等が敗血症の治療剤の参考にできる。
また、本発明の第五の態様の敗血症治療剤は、単剤若しくは併用剤として適宜選択され、使用される。
【実施例】
【００６６】
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくものである。また、アミノ酸配列のアミノ酸の番号は配列表の配列番号１に記載の番号を記載した。
【００６７】
（実施例１）  Ｓ６８抗体の作製
１−（１）  免疫原とするペプチドの調製
配列番号１に記載の配列（配列番号２に記載の５３番目から６８番目の配列に該当）を有するペプチド（以下、Ｓ６８ペプチドと記載）を、Ｎ末端でＳＨ基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、Ｎ末端にシステインを挿入して合成した。即ち、ペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａ（アプライド）を用いて、アミノ酸配列に従ってアミノ酸カラムを並べ、Ｎ末端にシステイン用のアミノ酸カラムを設置し自動合成を行った。合成したペプチドは定法により樹脂より切り出し、エーテルで沈殿させ回収後、再度蒸留水で溶解し凍結乾燥した。得られた粗精製ペプチドは溶解後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いて５〜７０％のアセトニトリル濃度の直線グラジエントで溶出し、目的のペプチドを含む分画を回収した。回収した分画は凍結乾燥し、精製ペプチドとして２〜３ｍｇを得た。
【００６８】
１−（２）  合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の調製
１−（１）で調製したペプチドをそれぞれ蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、生理食塩水で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（アマシャム  バイオサイエンス）で脱塩し、Ｓ６８ペプチドキャリア抗原（以下、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨと記載）を１ｍｇ得た。以下の実施例に記載の蛋白質濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを使用した。
【００６９】
１−（３）  合成ペプチドを免疫原としたポリクローナル抗体の作製
１−（２）で調製したＳ６８ペプチド−ＫＬＨに対するポリクローナル抗体を作製するため、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨを用いてウサギに免疫を行った。即ち、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ各１００μｇを５００μＬの生理食塩水に希釈し、５００μＬのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、ニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）メス２．１−２．２ｋｇの背部皮下に投与した。その２週間後、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ各１００μｇを５００μＬの生理食塩水に希釈し、５００μＬのフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮下に投与した。さらにその２週間後、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ１００μｇを１ｍＬの生理食塩水に希釈し耳静脈内に投与した。
【００７０】
投与終了１週間後、耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製した。まず抗血清に最終飽和濃度３３％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿を７６ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）と記載する）で溶解し、一夜透析した。透析液を濾過後、プロテインＡカラム（プロセップＡ、ミリポア）にアプライし、結合したＩｇＧ画分を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出し、精製抗体を得た。ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出した（吸光係数：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）。以降、得られた抗体をＳ６８ペプチドポリクローナル抗体と記載する。
【００７１】
１−（４）  特異精製ポリクローナル抗体の調製
Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体よりＳ６８ペプチドに対する抗体のみを精製するため、以下の方法により特異精製を行った。まず、システインを挿入したＳ６８ペプチド（以下、Ｃ−Ｓ６８ペプチドと記載）をＳＨ基を介して担体に結合させるため、マニュアルに従ってＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ）１ｍＬあたりＣ−Ｓ６８ペプチド２００μｇを混合し反応した。反応終了後残った活性基をブロッキングし、Ｓ６８ペプチド結合アフィニティーカラムを調製した。次に、１−（３）に記載の精製ＩｇＧ画分７．９２ｍｇをアプライし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ダルベッコ、以下、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と記載する）でカラムを洗浄し、次に０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で結合した抗Ｓ６８ペプチド抗体を溶出した。溶出後ｐＨを中性に戻しＰＢＳで透析後、蛋白質濃度を２８０ｎｍの吸光度より算出した（吸光係数：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）ところ、０．５２ｍｇの抗Ｓ６８ペプチド抗体（以下、Ｓ６８抗体と記載する）が得られた。
【００７２】
（実施例２）  低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定系の検討
実施例１に記載の抗体を用いて、サンドイッチＥＩＡ法によるヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定系を検討した。
【００７３】
２−（１）  抗ＣＤ１４モノクローナル抗体Ｆ１０３１−８−３の作製
Ｆ１０３１−８−３抗体は、国際公開第０１／２２０８５号パンフレットの実施例７に記載の方法を用いて作製した。簡単に記載すれば、本抗体はヒト血中のＣＤ１４蛋白質をマウスに免疫して作製した抗体であり、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定したサブタイプはＩｇＧ２ｂ・κであった。
Ｆ１０３１−８−３抗体の特異性を確認するため、国際公開第０１／７２９９３号パンフレットの実施例８及び実施例９に記載の方法を用いてＣＯＳ細胞により調製したｓ−ＣＤ１４（１−３５６）、ｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを用いて結合活性を測定した。まず、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  ｅｘｔｒａ（アマシャム  バイオサイエンス）にｓ−ＣＤ１４（１−３５６）、ｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ又はＢＳＡを各２５０ｎｇ／スポットでメンブレン上に固定化し、乾燥後０．０５ｇ／ｍＬのスキムミルク（明治乳業）を含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）でブロッキングした。室温で１時間静置後、０．５％ＢＳＡを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で３μｇ／ｍＬに希釈したＦ１０３１−８−３抗体を加え、室温で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で洗浄した。
【００７４】
次に１０％ウサギ血清を含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を添加し、３７℃で３０分間反応した後、同様に洗浄しＥＣＬキット（アマシャム  バイオサイエンス）で結合活性を確認した。その結果、第１表に示すようにＦ１０３１−８−３抗体はｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ、ｓ−ＣＤ１４（１−３５６）に結合したが、ＢＳＡとは結合せず、全てのタイプのＣＤ１４蛋白質を特異的に認識していることが明らかになった。
第１表の「＋」はＥＣＬによりフイルム上にスポットが検出された場合を示し、「−」はスポットが検出されない場合を示している。
【００７５】
【表１】
2005106694.tif 000002
【００７６】
２−（２）  低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定系の検討
低分子量ｓ−ＣＤ１４を特異的に検出可能な系を作製するため、実施例１、２−（１）に記載の抗体を用いてサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
［１］  ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
ペルオキシダーゼ標識抗体は中根らの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、２２巻、ｐ．１０８４、１９７４年）に従い４ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後、１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応させ１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。精製したＦ１１０６−１３−３抗体を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、４ｍｇに対して０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を７０μＬ添加して活性化した４ｍｇのペルオキシダーゼを抗体と等量に混合し２５℃で２時間反応した。次に４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析し、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１１０６−１３−３抗体（以下、Ｆ１１０６−１３−３−ＨＲＰと記載する場合がある）を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
【００７７】
［２］  サンドイッチＥＩＡ系の作製
固相抗体として実施例１で作製したＳ６８抗体を使用し、標識抗体として実施例２−（１）で作製した抗体を使用するサンドイッチＥＩＡ系を作製した。即ちＳ６８抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％の健常ヒト血清（３Ｃ１０を用いて可溶型ＣＤ１４を除去した血清、以下、ＣＤ１４吸収血清と記載）、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として、ヒト健常人血清及びヒト敗血症患者血清を２０倍に希釈した希釈検体を調製した。希釈検体をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７６ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で０．６μｇ／ｍＬに希釈したＦ１１０６−１３−３−ＨＲＰを各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、健常人血清では、吸光度は希釈液と同等の値を示し、敗血症患者活性では希釈液の４倍以上の吸光度を示した。このことから、本系では敗血症患者特異的に存在が確認できる血中可溶型蛋白質、即ち本発明で定義している低分子量ｓ−ＣＤ１４が測定できた。
【００７８】
（実施例３）  ヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４測定キット
３−（１）  サンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例
実施例２−（２）で敗血症患者の測定では高値を示し、健常人の測定で低値を示した固相抗体、標識抗体の組み合わせを用いた可溶型蛋白質キットの構成例を示す。
(1)固相抗体：Ｓ６８抗体を固相化したプレート
(2)標識抗体：ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体
(3)基質溶液（テトラメチルベンジジン溶液）
その他の付属品
プレート系構成例
(4)プレート洗浄液（０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液）
(5)試料希釈液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）
(6)反応停止液（０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液）
(7)標準品（ｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ）
上記の測定キットを用いて測定する場合の測定機器＜参考例＞
(8)プレート分光光度計（例えばＥ−Ｍａｘ（モレキュラデバイス社））
【００７９】
３−（２）    サンドイッチＥＩＡ系の測定キットの標準曲線
（１）の測定キットにより、実施例２−（２）と同様な方法で測定した。即ち、Ｓ６８抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％ＣＤ１４吸収血清、０．１％ＢＳＡを含む７６ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として０、３、２５、６０、１００、１５０ｎｇ／ｍＬのｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質標準品希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７６ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で０．６μｇ／ｍＬに希釈した希釈標識抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図１に作成した標準曲線を示した。測定感度０．６ｎｇ／ｍＬ（ブランク＋３ＳＤ）の高感度で簡便な測定系が実現された。
【００８０】
３−（３）  サンドイッチＥＩＡ系の特異性
ヒト血清中に存在する高分子量ＣＤ１４が、作製した測定系に及ぼす影響を検討するため、０〜４μｇ／ｍＬの濃度の健常人血清由来可溶型ＣＤ１４をｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ標準品に添加して、（２）と同様に測定を行った。その結果、図２に示すように健常人血清由来可溶型ＣＤ１４は４μｇ／ｍＬでも測定値に影響を及ぼさなかった。この結果より、本サンドイッチＥＩＡ系において高分子量ＣＤ１４との交差反応性は０．３％以下であることがわかった。即ち、本系はヒト血清高分子量ＣＤ１４を検出せず、敗血症患者の血清で高値を示す可溶型蛋白質特異的であることが確認された。
【００８１】
３−（４）  サンドイッチＥＩＡ系の測定キットの評価
（１）のキットの再現性を評価した。（２）と同様に３種類の検体を用いた同時再現性の変動係数（ＣＶ）は５．８、３．６、３．５％、測定間再現性は６．２、５．２、５．１％と良好な結果であった。また、添加回収試験の回収率は８８〜１０９％と良好であり、抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ）の影響も認められなかった。以上の結果より、本キットはヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定するのに十分な性能を有していることが示された。
【００８２】
（実施例４）  ヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４の検出
実施例３−（１）に記載の測定キットが検出する敗血症患者血清中の物質を解析するため、敗血症患者血清をゲル濾過クロマトグラフィーカラム  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＰＣ３．２／３０（アマシャム  バイオサイエンス）で分画し、各分画を実施例３−（１）に記載の測定キット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）を用いて測定した。分子量の算出はＬＭＷキャリブレーションキット及びＨＭＷキャリブレーションキット（アマシャムバイオサイエンス）のうちアルドラ−ゼ（１５８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシン（２５ｋＤａ）を用いてカラムをキャリブレートして行った。
【００８３】
その結果、図３に示すように市販ＣＤ１４−ＥＩＡキットでは分子量約５７ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が検出され、従来より報告のある４９〜５５ｋＤａの高分子量可溶型ＣＤ１４蛋白質であると判断された。一方、実施例３−（１）に記載のキットでは分子量３５〜４５ｋＤａ付近に敗血症患者で検出されたヒト低分子量ｓ−ＣＤ１４に由来するピークが検出され、また５７ｋＤａ付近にはピークが検出されなかったことから、実施例３−（１）に記載のキットは血中に存在する可溶型蛋白質のみを特異的に検出していることが確認された。
これらのことから低分子量ｓ−ＣＤ１４は、ヒトＣＤ１４のみに検出される配列を有するペプチドに特異的な抗体に結合し、及び一部の抗ＣＤ１４抗体に結合する。また、ゲル濾過で分子量は３５〜４５ｋＤａであり、健常人の血中に存在する高分子量ＣＤ１４（従来のｎａｔｉｖｅ  ＣＤ１４）よりも低分子量であることがわかった。
【００８４】
（実施例５）  敗血症患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定
敗血症患者５５例、及び対照として健常人７１例の血漿中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を、実施例３−（１）のキットを用いて実施例２−（２）と同様な方法で測定した。その結果、健常人群は２７．４±１４．４ｎｇ／ｍＬ（平均値±ＳＤ）であった。敗血症群の平均値は、２４８．２ｎｇ／ｍＬであり、健常人群の平均値＋２ＳＤである５７ｎｇ／ｍＬを敗血症の閾値として用いると、陽性率は９５．５％であった。また、非感染性のＳＩＲＳ患者群の平均値は、４１．４ｎｇ／ｍＬであり、陽性率は１６．３％であった。
この結果より、従来患者において血液培養等の感染の確認に基づき、敗血症の判定を行うため、判定までに数日要していたが、低分子量ｓ−ＣＤ１４の測定により、短時間で、簡便に判定できることがわかった。さらに、この敗血症の判定は、患者に対する抗生剤の投与の開始又は増量の指標となることがわかった。また非感染性のＳＩＲＳ患者群と敗血症群との判定にも用いることができることが判った。
【００８５】
（実施例６）  低分子量ｓ−ＣＤ１４の経時的測定（１）
下記の患者の血漿中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を経時的に測定した。患者は、交通事故による多臓器損傷で入院した。入院直後肝臓損傷に対する手術を行った。その後６日目に感染したことが腹水培養により判明した。抗生剤投与及びドレーン挿入による排膿で症状が軽減された。
低分子量ｓ−ＣＤ１４、ＣＲＰの経時変化を図４に示した。なお、ＣＲＰの測定は、感染症学雑誌  ７３巻  １９７頁（１９９９年）に記載の方法で行った。図４の左縦軸は低分子量ｓ−ＣＤ１４値を、右縦軸はＣＲＰ値を示す。
低分子量ｓ−ＣＤ１４値は、６日目に９０ｎｇ／ｍＬと実施例５で用いた閾値５７ｎｇ／ｍＬを超えた。なお、同時に測定したＣＲＰは３日後に上昇が確認された。このことから低分子量ｓ−ＣＤ１４値は、従来技術より敗血症を早期に検出できるパラメーターであることがわかった。このため低分子量ｓ−ＣＤ１４測定により、治療指針の決定に有用であることが理解される。
【００８６】
（実施例７）  低分子量ｓ−ＣＤ１４の経時的測定（２）
下記の患者の血漿中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を経時的に測定した。患者は大腸穿孔による腹膜炎であった。搬送後、大腸切除及び人工肛門造設の緊急手術を行い、ＩＣＵに収容した。病状の改善に伴い、一般病棟に移動をした。
低分子量ｓ−ＣＤ１４、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅ、ＣＲＰの経時変化を図５に示した。図５の左縦軸は低分子量ｓ−ＣＤ１４値を、右縦軸はＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅ及びＣＲＰ値（×１／２）を示す。
手術前低分子量ｓ−ＣＤ１４値は６００ｎｇ／ｍＬと高値を示していた。手術後、低分子量ｓ−ＣＤ１４値は減少し、５日目には実施例５で用いた閾値より低くなった。この値の変化の様子はＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅと同じ傾向であった。ＣＲＰも同様の傾向であったが、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ  ｓｃｏｒｅよりも遅れて変化していた。
以上より、低分子量ｓ−ＣＤ１４値は敗血症の重症度及びその治療効果判定に有用であることが確認できた。
【００８７】
（実施例８）  低分子量ｓ−ＣＤ１４の経時的測定（３）
下記の患者の血漿中の低分子量ｓ−ＣＤ１４を経時的に測定した。患者は十二指腸潰瘍穿孔による腹膜炎で入院した。当初は保存療法を行い、容態は安定していた。しかし８日目に腹痛の広がり、ＳＯＦＡ  ｓｃｏｒｅの上昇などで、腹膜炎増悪と判断し、穿孔部閉塞と腹腔内洗浄の手術を行った。術後経過は良好であった。
低分子量ｓ−ＣＤ１４、ＳＩＲＳの診断基準の適合項目数、ＳＯＦＡ  ｓｃｏｒｅ、ＣＲＰの経時変化を図６に示した。図６の左縦軸は低分子量ｓ−ＣＤ１４値を、右縦軸はＳＩＲＳの診断基準の適合項目数、ＳＯＦＡ  ｓｃｏｒｅ（×１／２）及びＣＲＰ値（×１／４）を示す。
入院時、低分子量ｓ−ＣＤ１４値は３５０ｎｇ／ｍＬと高値であった。その後低分子量ｓ−ＣＤ１４値は減少したものの実施例５で用いた閾値を超える値を維持し、腹膜炎の増悪時には４８０ｎｇ／ｍＬとさらに高値を示していた。病状の回復に伴い低分子量ｓ−ＣＤ１４値は減少を示した。そして、これらの経緯はＳＩＲＳの診断基準の適合項目数、ＳＯＦＡ  ｓｃｏｒｅも同様であった。この症例ではＣＲＰは病状に反映した推移を示さなかった。
【００８８】
以上より、低分子量ｓ−ＣＤ１４値は敗血症の重症度及びその治療効果判定、並びにＭＯＤＳの重症度の判定に有用であることが確認できた。
【００８９】
以上の実施例５から実施例８より、低分子量ｓ−ＣＤ１４は敗血症患者に特異的に増加しており、敗血症の判定に有用な閾値を導き出すことができた。また、敗血症患者、ＳＩＲＳ患者、若しくは敗血症の疑いのある患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することにより、感染症若しくは敗血症を早期に検出できることがわかった。さらに経時的に患者の低分子量ｓ−ＣＤ１４を測定することにより、その変化の程度から敗血症の軽減若しくは悪化等の重症度の推移、さらに敗血症から進展するＭＯＤＳの症状の改善若しくは悪化等の重症度の推移を判定することができることがわかった。そして早期に敗血症を検出、重症度の推移を判定することから、手術、投薬の開始・変更等の治療指針の策定ができることがわかった。さらに低分子量ｓ−ＣＤ１４の変化の程度から手術若しくは投薬等による治療効果を判定することができることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質を用いた本発明の低分子量ｓ−ＣＤ１４−ＥＩＡキットの標準曲線を示した図である。
【図２】ｓ−ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質を用いて本発明の低分子量ｓ−ＣＤ１４−ＥＩＡキットの測定値に健常人血清由来可溶型ＣＤ１４蛋白質が影響しないことを示した図である。
【図３】ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血中の低分子量ｓ−ＣＤ１４及び高分子量ＣＤ１４をそれぞれ低分子量ｓ−ＣＤ１４−ＥＩＡキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）により解析した結果を示した図である。
【図４】感染後すぐに血中低分子量ｓ−ＣＤ１４値が増加した臨床症例の低分子量ｓ−ＣＤ１４値及びＣＲＰの経時変化を示した図である。
【図５】血中低分子量ｓ−ＣＤ１４値が敗血症の重篤度を表すことを示す臨床症例の低分子量ｓ−ＣＤ１４値、ＡＰＡＣＨＥＩＩ値及びＣＲＰ値の経時変化を示した図である。
【図６】血中低分子量ｓ−ＣＤ１４値が敗血症の重篤度及びＭＯＤＳの重篤度を表すことを示す臨床症例の低分子量ｓ−ＣＤ１４値、ＳＩＲＳの診断基準の適合項目数、ＳＯＦＡ値及びＣＲＰ値の経時変化を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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