(57)【要約】      （修正有）【課題】シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた糖リン酸と各種ピリミジン塩基誘導体からのピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法を提供する。【解決手段】リン酸化糖と下記一般式（Ｉ）で示されるピリミジン塩基誘導体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素の存在下で反応させるピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法。2005053896.tif 000008（式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基又は炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基、チオール基を示し、Ｒ２はアミノ基、チオール基、水酸基又は水素原子を示し、Ｒ３は水酸基置換であってもよい炭素数１〜３のアルキル基、アミノ基又は水素原子を示し、Ｒ４は水酸基又は水素原子を示す。但し、Ｒ１がアミノ基、Ｒ２が水酸基、かつ、Ｒ４が水素原子であって、Ｒ３が炭素数１〜３のアルキル基又は水素原子である場合を除く。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化糖とピリミジン塩基誘導体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素の存在下で反応させて、ピリミジンヌクレオシド化合物を得る工程を有することを特徴とするピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法において、ピリミジン塩基誘導体が下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2005053896.tif 000006
（式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基又は炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基、チオール基を示し、Ｒ２はアミノ基、チオール基、水酸基又は水素原子を示し、Ｒ３は水酸基置換であってもよい炭素数１〜３のアルキル基、アミノ基又は水素原子を示し、Ｒ４は水酸基又は水素原子を示す。但し、Ｒ１がアミノ基、Ｒ２が水酸基、かつ、Ｒ４が水素原子であって、Ｒ３が炭素数１〜３のアルキル基又は水素原子である場合を除く。）で表される化合物である、ピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の一般式（Ｉ）で表されるピリミジン塩基誘導体が、２−ハイドロキシ−４−メチルピリミジン、４−アセトアミドピリミジン、２，４−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン、４，５−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン、２−チオシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシンまたは４−チオウラシルである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
リン酸化糖が、リボース−１−リン酸、２−デオキシリボース−１−リン酸、２’，３’−ジデオキシリボース−１−リン酸である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素が大腸菌由来である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素が、該酵素を有する微生物の菌体、あるいは該菌体もしくはその培養液から得られた酵素調製物として供給される請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。    
【請求項６】
炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基を脱アシル化させる活性が失活または低減化処理されたシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体、または酵素調整物を用いて、一般式（Ｉ）中のＲ１が炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基である化合物とリン酸化糖を反応させる、ピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項７】
前記微生物の菌体または前記酵素調製物における脱アシル化活性の失活または低減化処理が、加熱または有機溶媒を含む水に接触させて、脱アシル化活性を選択的に失活または低減化したものである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
下記一般式（ＩＩ）：  
【化２】
2005053896.tif 000007
（上記一般式（Ｉ）中Ｒ５は、アミノ基又は水素原子を示し、Ｒ６は、アミノ基又は水素原子を示し、Ｒ７は、水酸基又は水素原子を示す。）で表されるピリミジンヌクレオシド化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品等の合成原料として有用なピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法およびピリミジンヌクレオシド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシドホスホリラーゼを用いるピリミジン塩基誘導体からのピリミジンヌクレオシド化合物の合成法としては特開昭５９−２１３３９７号公報（特許文献１）や特開平５−４９４９３号公報（特許文献２）などで報告されているが、何れも核酸塩基はウラシル塩基の誘導体である。上述のウラシル誘導体とはピリミジン塩基の４位がカルボニル基である構造の化合物であり、ウラシル、５−ハロゲン化ウラシル、チミン等から対応するヌクレオシド化合物の製造方法が知られている。
【０００３】
シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた糖リン酸とピリミジン塩基誘導体からのピリミジンヌクレオシド化合物の製造法としては、５−フルオロシトシン、アザシトシン、５−メチルシトシンからのシトシンヌクレオシド化合物の製造法がEP1254959A2（特許文献３）で開示されているがそれ以外は知られていない。
【特許文献１】特開昭５９−２１３３９７号公報
【特許文献２】特開平５−４９４９３号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第1254959号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ピリミジンヌクレオシド化合物を製造する場合、特に医薬品の原料として利用する場合は微量の副生物の混入は大きな問題となる。有機合成法によりピリミジンヌクレオシド化合物を製造した場合、一般的に異性体としてα体が生成する。そのため精製負荷が大きくなるとともに、ピリミジンヌクレオシド化合物の回収率を低下させることとなり工業的に製造する場合は大きな問題となる。
【０００５】
したがって、本発明はシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素を用いた糖リン酸と各種ピリミジン塩基誘導体からのピリミジンヌクレオシド化合物の合成方法およびピリミジンヌクレオシド化合物を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上述の課題を解決するためにシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素の存在下に各種ピリミジン塩基誘導体とリン酸化糖によるヌクレオシド化合物の製造を鋭意検討した結果、後記する一般式（Ｉ）に示すピリミジン塩基化合物から対応するヌクレオシド化合物を製造できる事を見出した。
【０００７】
さらに、本発明者等は、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物を用いて４−アセトアミドピリミジンとペントース−１−リン酸からピリミジンヌクレオシド化合物を生成する反応を検討する過程で、アセチル基が加水分解されたピリミジン塩基またはピリミジンヌクレオシド化合物が大量に生成し、反応収率を著しく低下させる事を確認した。
【０００８】
本発明者等は、この脱アセチル化反応が１）反応条件により化学的に起こる反応と、２）宿主の生産する脱アセチル化活性を有する酵素に由来する反応の両方が組み合わさって起こることが原因であることを突き止めるとともに、脱アセチル化反応を抑制する方法について鋭意検討した結果、反応液のｐＨを６から９好ましくは７から８の範囲に制御し、反応温度を２０℃から６０℃好ましくは３０℃から４０℃に制御する方法が化学的な脱アセチル化反応の進行の抑制に有効であること、微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物から脱アセチル化活性を有する酵素を低減化または除去する方法が該脱アセチル化活性を有する酵素に由来する脱アセチル化反応の進行の抑制に有効であることを見出した。
【０００９】
本発明者等は、以上の知見に基づき本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］リン酸化糖とピリミジン塩基誘導体とを、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素の存在下で反応させて、ピリミジンヌクレオシド化合物を得る工程を有することを特徴とするピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法において、ピリミジン塩基誘導体が下記一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2005053896.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基又は炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基又はチオール基を示し、Ｒ２はアミノ基、チオール基、水酸基又は水素原子を示し、Ｒ３は水酸基置換であってもよい炭素数１〜３のアルキル基、アミノ基又は水素原子を示し、Ｒ４は水酸基又は水素原子を示す。但し、Ｒ１がアミノ基、Ｒ２が水酸基、かつ、Ｒ４が水素原子であって、Ｒ３が炭素数１〜３のアルキル基又は水素原子である場合を除く。）で表される化合物である、ピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法、
【００１３】
［２］［１］記載の一般式（Ｉ）で表されるピリミジン塩基誘導体が、２−ハイドロキシ−４−メチルピリミジン、４−アセトアミドピリミジン、２，４−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン、４，５−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン、２−チオシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシンまたは４−チオウラシルである、［１］記載の製造方法、
［３］リン酸化糖が、リボース−１−リン酸、２−デオキシリボース−１−リン酸、２’，３’−ジデオキシリボース−１−リン酸である［１］または［２］に記載の製造方法、
［４］前記酵素が大腸菌由来である［１］〜［３］のいずれか一項に記載の製造方法、
［５］前記酵素が、該酵素を有する微生物の菌体、あるいは該菌体もしくはその培養液から得られた酵素調製物として供給される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の製造方法、
［６］脱アシル化活性が失活または低減化処理されたシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体、または酵素調整物を用いて、一般式（Ｉ）中のＲ１が炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基である化合物とリン酸化糖を反応させる、ピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法、
［７］前記微生物の菌体または前記酵素調製物における脱アシル化活性の失活または低減化処理が、加熱または有機溶媒を含む水に接触させて脱アシル化活性を失活または低減化したものである、［６］に記載の製造方法、
［８］下記一般式（ＩＩ）：  
【００１４】
【化２】
2005053896.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ５はアミノ基又は水素原子を示し、Ｒ６はアミノ基又は水素原子を示し、Ｒ７は水酸基又は水素原子を示す。）
で表されるピリミジンヌクレオシド化合物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、従来有機合成法による製法しか知られていなかったピリミジンヌクレオシド化合物の酵素による合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明においてシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素とは、シトシンまたはシトシン誘導体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成する活性を有する酵素を指しており、この要件を満たす限り動物、植物、微生物の何れの起源であっても構わない。シトシンヌクレオシドホスホリラーゼなる酵素は当該分野においては一般的に知られていない。そのため、本発明においてのみかかる用語を上記の通り定義して用いる。
【００１８】
このようなシトシンヌクレオシドホスホリラーゼの具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとして知られている酵素でシトシンヌクレオシドホスホリラーゼ活性も有するものを好適な例として挙げることができる。具体的な例として、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼのＤＮＡ塩基配列を配列番号３に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号：４に例示した。また、近年の遺伝子工学の進歩により塩基配列の一部を失活、挿入、置換によりアミノ酸配列を改変することが容易となった。かかる技術水準に鑑み、該塩基配列の一部を、所望とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内、例えば酵素活性を維持または向上できる範囲内で、改変してアミノ酸配列を改変したものも本発明のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに包含されるものとする。例えば、配列番号：４に示したアミノ酸配列に、目的とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内で２〜３個のアミノ酸の欠失、置換または付加が行われたものや、配列番号：３の塩基配列に目的とする酵素活性に影響を及ぼさず、かつ、その相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内での欠失、置換または付加等の変異を生じさせた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列を有するものを用いることができる。
【００１９】
本発明におけるピリミジン塩基誘導体は、一般式（Ｉ）で表される。一般式（Ｉ）中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基又は炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基、炭素数１〜３のアルキル基、チオール基を示し、Ｒ２はアミノ基、チオール基、水酸基又は水素原子を示し、Ｒ３は水酸基置換であってもよい炭素数１〜３のアルキル基、アミノ基又は水素原子を示し、Ｒ４は水酸基又は水素原子を示す。但し、一般式（Ｉ）中におけるＲ１がアミノ基、Ｒ２が水酸基、かつ、Ｒ４が水素原子であって、Ｒ３が炭素数１〜３のアルキル基又は水素原子であることはない。
通常、ピリミジン塩基は、水性媒体中では互変異性体を形成することが知られており、例えば、代表的なピリミジン塩基であるシトシン、２−チオシトシン、６-ヒドロキシ−４−アミノピリミジンは、次に示すような互変異性体を形成し得る（化３）。
【００２０】
【化３】
2005053896.tif 000004
【００２１】
したがって、本発明に用いられる一般式（Ｉ）で表されるピリミジン塩基誘導体には、当然、これに対応する互変異性体を包含する。
一般式（Ｉ）で表されるピリミジン塩基誘導体として代表例を挙げると、例えば、２−ハイドロキシ−４−メチルピリミジン、４−アセトアミドピリミジン、２，４−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン、４，５−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン、２−チオシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシンまたは４−チオウラシルなどが挙げられる。
【００２２】
本発明におけるリン酸化糖とは、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンおよびその誘導体の１位にリン酸がエステル結合したもののことである。その好ましい代表例を挙げると、例えばリボース−１−リン酸、２´−デオキシリボース−１−リン酸、２´，３´−ジデオキシリボース−１−リン酸、アラビノース−１−リン酸などが挙げられる。
【００２３】
ここでいうポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンとは、天然物由来のものとしては、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソース、Ｄ−リボースのようなアルドペントース、Ｄ−キシルロース、Ｌ−キシルロース、Ｄ−リブロースのようなケトペントース、Ｄ−２−デオキシリボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボースのようなデオキシ糖類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
これらリン酸化糖は、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシド化合物の加リン酸分解反応を行って製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８４、４３７、１９５０）や、アノマー選択的な化学合成法等によっても調製することができる。また、ＷＯ  ０１／１４５６６に記載の酵素的なデオキリボースー１−リン酸の合成方法によっても調整することができる。
【００２５】
本発明におけるピリミジンヌクレオシド化合物の合成反応は、シトシン誘導体とリン酸化糖を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物の菌体、培養液それらの処理物を用い、適切なｐＨや温度などの反応条件を選べばよいが通常はｐＨ４〜１０、温度１０〜８０℃の範囲で水性媒体中で行うことができる。
水性媒体とは水或いは水を主成分としてｐＨ緩衝能を有するような溶媒である。
【００２６】
反応に使用するリン酸化糖とピリミジン塩基誘導体の濃度は０．１〜１０００ｍＭ程度が適当であり、両者のモル比は添加するピリミジン塩基誘導体の比率をリン酸化糖またはその塩に対して０．１〜１０倍モル量で行える。反応転化率を考えれば０．９５倍モル量程度が好ましい。
【００２７】
本発明において生成するピリミジンヌクレオシド化合物としては、例えば、４-メチルピリミジンリボフラノシル、２’―デオキシ−４−チオウリジン、２−チオシチジン、５−ハイドロキシメチルシチジン、Ｎ−アセチル−２’−デオキシシチジン、一般式（ＩＩ）で表されるピリミジンヌクレオシド化合物などが挙げられる。
一般式（ＩＩ）中のＲ５はアミノ基又は水素原子を示し、Ｒ６はアミノ基又は水素原子を示し、Ｒ７は水酸基又は水素原子を示す。
【００２８】
尚、本発明において、微生物の菌体、培養液それらの処理物とは、微生物の菌体或いは培養液中の菌体を超音波、浸透圧ショック等で破壊して得られたもの、また、菌体及び該破壊物を固定化担体等で固定化したもの、或いは破壊物等から精製された酵素などが含まれる。
【００２９】
また、反応液中に生成するリン酸をトラップする目的でリン酸と難溶性の金属塩類を存在させたり、イオン交換樹脂等の担体を存在させることで反応収率を高めることも可能である。
【００３０】
炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基を脱アシル化する活性が失活または低減化された微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を用いて、一般式（Ｉ）中のＲ１が、炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基である化合物とリン酸化糖とを反応させることにより、対応するピリミジンヌクレオシド化合物を生成させることができる。
【００３１】
炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基を脱アシル化する活性は、加熱処理または低減化処理により失活または低減化することができる。
本発明でいう加熱処理とはシトシンヌクレオシドホスホリラーゼを失活させず、脱アシル化活性を失活または低減化させることができれば特に限定されないが、例えば、該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を水性媒体中でｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．０以下で、温度は通常５０℃以上、好ましくは６０℃以上８０℃以下で１０分間以上、より好ましくは３０分間以上静置または懸濁するような方法を挙げることができる。加熱時間は４０時間以下が更に好ましい。
また、処理液中にリン酸化糖を１ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下添加することにより、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼをより安定化させることができる。
【００３２】
本発明において、前記脱アシル化活性の低減化処理とは、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを失活させず、炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基の脱アシル化活性を失活または低減化させることができれば特に限定されないが、例えば、該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物を有機溶媒中にさらしたり、加熱処理を施すこと、或いは菌体を破砕した酵素液を有機溶媒や硫酸アンモニウム等でタンパク質を沈殿させて酵素を分画処理して脱アシル化活性を有する酵素のみを除去することを挙げることができる。
【００３３】
本発明において、有機溶媒とは、脱アシル化活性を失活させることが可能な溶媒であれば特に限定されないが、具体的にはメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン及びアセトン等の極性溶媒や１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、１−ノナノール等のアルコール類、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等のエステル類、ペンタン、ヘキサン、２−メチルヘキサン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ヘプタン、シクロヘプタン、オクタン、シクロオクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ドデカン、石油エーテル、石油ベンジン、リグロイン、工業ガソリン、灯油、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、クメン、メシチレン、ナフタレン等の炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、クレゾール、キシレノール等のフェノール類、メチルイソブチルケトン、２−ヘキサノン等のケトン類、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル等のエーテル類が挙げられ、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、トルエン、エチルベンゼン等の炭化水素類が挙げられる。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ホルムアミド、アセチルアミド、安息香酸アミド等のアミド化合物や、ウレア、Ｎ，Ｎ’−ジメチルウレア、テトラメチルウレア、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン等のウレア化合物が挙げられ、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、ジフェニルスルホキシド等のスルホキシド化合物が挙げられる。
【００３４】
これらの有機溶媒のなかでも、アセトンは好ましい有機溶媒として挙げることができる。本発明でいう脱アシル化活性の失活または低減化のための有機溶媒処理とは、シトシンヌクレオシドホスホリラーゼを失活させず、脱アシル化活性を失活または低減化させることができれば特に限定されないが、例えば該微生物の菌体、培養液またはそれらの処理物をｐＨは通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．０以下で、有機溶媒を水中濃度として、例えば１０容量％以上、好ましくは２０容量％以上、より好ましくは３０容量％以上の濃度で、通常０℃以上の温度、好ましくは２０℃、更には５０℃以上で、８０℃以下の温度で、通常１０分間以上で４０時間以下、より好ましくは１時間以上２０時間以下の時間で静置または懸濁するような方法を挙げることができる。
また、反応液中にこれらの有機溶媒を添加することによっても同様の効果を得ることが可能である。
【００３５】
前記の脱アシル化活性が低減化処理により失活または低減化された菌体または酵素調整物を用いて、一般式（Ｉ）中のＲ１が炭素数１〜３のアルキル基を有するアシル基で置換されたアミノ基である化合物とリン酸化糖とを反応させることにより得られるピリミジンヌクレオシド化合物としては、例えば、Ｎ−アセチル−２’−デオキシシチジンが挙げられる。
【００３６】
反応液よりピリミジンヌクレオシド化合物を採取する方法は、水等の溶媒に対する該誘導体と生成物の溶解度差を利用したり、イオン交換や吸着樹脂を用いる方法で行うことができる。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
【００３８】
なお、生成したピリミジンヌクレオシド化合物の同定は、反応液を限外ろ過し、シリカゲルカラムで精製後、生成物を抽出、真空乾燥してC13−NMR、及びH1−NMR分析により行なつた。
【００３９】
また、生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下のとおりである。
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＭＧ−５  ４．６×２５０ｍｍ（野村化学）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ、
溶離液；５０ｍＭリン酸１カリウム：メタノール＝８：１（Ｖ／Ｖ）
【００４０】
［参考例１］
（シトシンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の調製）
大腸菌染色体ＤＮＡを次のようにして調製した。
【００４１】
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌの
ＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００４２】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下ＰＮＰと表記する）をコードするｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００４３】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ  ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００４４】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。
【００４５】
このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。ｐＵＣ−ＰＮＰ７３に導入されたＤＮＡ断片の塩基配列を通常の塩基配列の決定法に従い塩基配列を確認した。得られた塩基配列を配列番号３に、塩基配列より翻訳されたアミノ酸配列を配列番号４に示した。本酵素のサブユニットの分子量は約２６０００であり、６量体として活性発現していることが知られている。本酵素の至適温度は約７０℃であり、至適ｐＨは約７．０から７．５である。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ  ＭＴ−１０９０５と名づけた。
【００４６】
エシェリヒア・コリ  ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を１０ｍＬの５０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁した。
【００４７】
［参考例２］
（精製シトシンヌクレオシドホスホリラーゼの調製）
参考例１で調製した菌体懸濁液を超音波破砕機で菌体を破砕した。７０℃、１０分間の加熱処理を行ない、次いで遠心分離により粗酵素液を調整し、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー）３ｃｍ×１０ｃｍのカラムに加え、５０ｍＭＮａＣｌから５００ｍＭＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出し、活性画分を回収した。溶離液を７０％硫安飽和で沈殿として回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（３ｃｍ×１５ｃｍ）に透析液を加え、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）から５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、活性画分を回収した。酵素液を７０％硫安飽和で沈殿として回収し、１ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析し精製酵素２ｍＬを得た。こうして得た精製酵素はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により単一のバンドであることを確認した。
【００４８】
［実施例１］
５０ｍＭのリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、１０ｍＭの２−ハイドロキシ−４−メチルピリミジン（東京化成製）、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例１で得られた菌体懸濁液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で１時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、６．９ｍＭの対応するピリミジンヌクレオシド化合物が生成していた。
【００４９】
［実施例２］
５０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、１０ｍＭの４−アセトアミドピリミジン（ＡＬＤＲＩＣＨ製）、１００ｍＭの酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた酵素液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で１時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、４．４ｍＭの対応するピリミジンヌクレオシド化合物が生成していた。
【００５０】
［実施例３］
特開２００２−２０５９９６号公報記載の方法で製造した２´-デオキシリボースー１リン酸ジアンモニウム塩を２．５ｇ、２，４−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン（ＡＬＤＲＩＣＨ製）を０．６３ｇ、炭酸マグネシウムを１．５ｇに蒸留水を１５ｇ加え反応液を調整した。参考例２で得られた酵素液５ｍｌを加え、３０℃で２０時間反応した。反応液を用い、ＥＳＩ（＋）法にてＬＣ−ＭＳ分析を行った。
ＬＣ条件
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＵＧ５
２．０ｘ１５０ｍｍ（野村化学）
移動相：  Ａ：０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸／Ｈ２Ｏ
Ｂ：０．１％（Ｖ／Ｖ）酢酸／ＣＨ３ＣＮ
Ａ／Ｂ＝９０／１０
流速：  １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：  ２５４ｎｍ
生成物の溶出時間は５．２５分であり、ＭＳの測定結果は次のとおりであった。
質量数（強度ピーク）：１２７（８０）、２４３（１００）、４８５（２０）
【００５１】
［実施例４］
特開２００２−２０５９９６号公報記載の方法で製造した２´デオキシリボースー１リン酸ジアンモニウム塩を２．５ｇ、４，５−ジアミノ−６−ハイドロキシピリミジン（ＬＡＮＣＡＳＴＥＲ製）を１．５ｇ、炭酸マグネシウムを１．５ｇに蒸留水を１５ｇ加え反応液を調整した。参考例２で得られた酵素液５ｍｌを加え、３０℃で２０時間反応した。      
【００５２】
反応液を用い、ＥＳＩ（＋）法にてＬＣ−ＭＳ分析を行った。ＬＣ条件は実施例３と同じ条件で行った。
【００５３】
生成物の溶出時間は６．６８分であり、ＭＳの測定結果は次のとおりであった。
質量数（強度ピーク）：１２７（４０）、２４３（１００）、４８５（１０）
反応液からろ過により沈殿物を除き、ｐＨを塩酸にて２．０に調整した。約５ｇまで濃縮し、イソプロピルアルコールを３倍量加えて晶析した。ろ別した結晶を同量のイソプロピルアルコールで洗浄したのち真空乾燥し、生成物の結晶約０．６ｇを得た。
1H NMRおよび13C NMRの測定結果を以下に示す。
【００５４】
1HNMR (D2O, 400 MHz, 20.1 °C):
δ 8.29(s, 1H), 6.31(t, J = 6.3 Hz, 1H),4.48 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 3.4 & 12.5 Hz, 1H), 3.77(dd, J=5.1 & 12.5 Hz, 1H), 2.54 (m,1H), 2.42 (m, 1H)
13CNMR(D2O)δ(ppm):
160.38, 156.12, 147.22, 102.61, 89.80,88.60, 72.99, 63.74, 42.58
【００５５】
［実施例５］
５０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、１０ｍＭの２−チオシトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた酵素液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で１時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、０．３ｍＭの対応するヌクレオシド化合物が生成していた。
【００５６】
［実施例６］
５０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、１０ｍＭの５−ヒドロキシメチルシトシン（ＳＩＧＭＡ製）、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた酵素液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で１時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、０．１ｍＭの対応するヌクレオシド化合物が生成していた。
【００５７】
［実施例７］
５０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、１０ｍＭの４−チオウラシル（ＡＬＤＲＩＣＨ製）、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、参考例２で得られた酵素液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で１時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、４．２ｍＭの対応するヌクレオシド化合物が生成していた。
【００５８】
［実施例８］
（脱アセチル化活性の除去操作）
参考例１で得られた菌体液を６０℃で６時間加熱した。この菌体液を加熱菌体液とした。参考例１で得られた菌体にアセトンを７０％Ｖ／Ｖとなるように加え、３０℃にて１時間攪拌した。遠心分離により菌体を回収した。自然乾燥により菌体を乾燥しアセトン処理菌体とした。
【００５９】
参考例１で得られた菌体を超音波破砕し粗酵素液を調製した。粗酵素液にアセトンを５０％Ｖ／Ｖとなるように加え、沈殿物を遠心分離により除いた。更にアセトンを８０％Ｖ／Ｖとなるように加え沈殿物を遠心分離より回収し、乾燥して酵素粉末をアセトンパウダーとした。
【００６０】
［実施例９］
（脱アセチル化活性を除去した酵素による反応）
２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）１．３ｇと４−アセトアミドピリミジン（ＡＬＤＲＩＣＨ製）０．６ｇに蒸留水１６．５ｇを加え、酢酸マグネシウムを１．３ｇ加えた溶液に１）加熱処理菌体を４ｇ、２）アセトン処理菌体を１．２ｇ、３）アセトンパウダーを０．４ｇ加えてそれぞれ３０℃で６時間反応した。反応中のｐＨは約７．０となるようにＮａＯＨまたは酢酸にて調製した。比較例として参考例１で得られた菌体懸濁液４ｇを加えて反応した。
結果を表１に示した。
【００６１】
【表１】
2005053896.tif 000005
【配列表】
2005053896000001.app