(57)【要約】      （修正有）【課題】着臭剤、薬物及びピグメント等の化学物質を捕獲するための代替的選択枝を提供するバイオビヒクルを提供する。【解決手段】広範な化学物質を検出するためのバイオエレクトロニクスシステムは、質量検知電子デバイスによるリポカリンのリガンド結合親和性の組み込みによって達成される。バイオトランスデューサシステムは、リポカリンの固有のリガンド結合親和性と高感度の圧電性ベースのデバイスとを組み合わせる。このシステムは、「人工鼻」として、より信頼性が高く、経済的で、検知試験における多くの用途に柔軟に適用され、該適用例としては、大気環境モニタリング、化粧品および発酵産物の品質管理、呼気分析を介する医学的診断などが挙げられる。これらのタンパク質性のエレメントは、例えば、特定のリガンドを精製および送達するためのいくつかの潜在的な適用に拡大される可能性が高い。【選択図】図１
2005331357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のリガンドに結合するためのバイオビヒクルであって、
固体支持体と、
前記固体支持体によって受容され、かつ前記特定のリガンドに結合し得るタンパク質性基質とを備え、
前記タンパク質性基質は、リポカリンタンパク質およびその機能的な組み換えホモログをからなる群より選択されるタンパク質を含むバイオビヒクル。
【請求項２】
前記固体支持体が、ディスポーザブルバイオチップまたは耐久性容器である請求項１に記載のバイオビヒクル。
【請求項３】
前記特定のリガンドは、分子量が１０００ダルトン未満である請求項１に記載のバイオビヒクル。
【請求項４】
前記特定のリガンドが、着臭剤、薬物およびピグメントからなる群より選択されるリガンドである請求項１に記載のバイオビヒクル。
【請求項５】
前記特定のリガンドが、２−フェニルエチルアルコール、２−酢酸フェニルエチル、酢酸フェニル、酪酸プロピル、酪酸ヘキシル、酪酸ベンジル、チグリン酸プロピル、チグリン酸ヘキシルおよびチグリン酸ベンジルからなる群より選択されるリガンドである請求項１に記載のバイオビヒクル。
【請求項６】
前記タンパク質性基質が、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）を含む請求項１に記載のバイオビヒクル。
【請求項７】
特定のリガンドの結合を検出するためのバイオセンサであって、
機械的応力に応答して電荷を生成する圧電性ベースと、
前記圧電性ベース上に固定され、前記特定のリガンドの結合の際に、前記圧電性ベースに対して前記機械的応力を与えるタンパク質性基質とを備えるバイオセンサ。
【請求項８】
前記圧電性ベースが、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）または表面音波（ＳＡＷ）ベースである請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記タンパク質性基質が、リポカリンタンパク質およびその機能的な組み換えホモログからなる群より選択されるタンパク質を含む請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記タンパク質性基質が、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）を含む請求項９に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記特定のリガンドが、２−フェニルエチルアルコール、２−酢酸フェニルエチル、酢酸フェニル、酪酸プロピル、酪酸ヘキシル、酪酸ベンジル、チグリン酸プロピル、チグリン酸ヘキシルおよびチグリン酸ベンジルからなる群より選択されるリガンドである請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記特定のリガンドが、着臭剤、薬物およびピグメントからなる群より選択されるリガンドである請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
特定のリガンドに結合するためのタンパク質性基質と、
前記タンパク質性基質に対する前記特定のリガンドの結合を検出するために前記タンパク質性基質と組み合わされて、電子シグナルを生成し、前記特定のリガンドの存在を示す電子検出デバイスとを備えるバイオトランスデューサシステム。
【請求項１４】
前記特定のリガンドが、着臭剤、薬物およびピグメントからなる群より選択されるリガンドである請求項１３に記載のバイオトランスデューサシステム。
【請求項１５】
前記特定のリガンドが、２−フェニルエチルアルコール、２−酢酸フェニルエチル、酢酸フェニル、酪酸プロピル、酪酸ヘキシル、酪酸ベンジル、チグリン酸プロピル、チグリン酸ヘキシルおよびチグリン酸ベンジルからなる群より選択されるリガンドである請求項１３に記載のバイオトランスデューサシステム。
【請求項１６】
前記タンパク質性基質が、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）を含む請求項１５に記載のバイオトランスデューサシステム。
【請求項１７】
前記タンパク質性基質が、リポカリンタンパク質およびその機能的な組み換えホモログからなる群より選択されるタンパク質を含む請求項１３に記載のバイオトランスデューサシステム。
【請求項１８】
前記電子検出デバイスが、圧電性ベースのデバイスおよび記録計を備える請求項１３に記載のバイオトランスデューサシステム。
【請求項１９】
前記圧電性ベースのデバイスが、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）および表面音波（ＳＡＷ）デバイスからなる群より選択されるデバイスである請求項１８に記載のバイオトランスデューサシステム。
【請求項２０】
タンパク質性基質に対する特定のリガンドの結合を判断するための方法であって、
圧電性ベースを提供するステップと、
前記圧電性ベース上にタンパク質性基質を固定するステップと、
前記特定のリガンドが存在する環境に対して、前記タンパク質性基質および前記圧電性ベースを露出させるステップと、
前記圧電性ベースの共鳴周波数変動を検出して、前記特定のリガンドが前記タンパク質性基質に結合するか否かを判断するステップと、を包含する方法。
【請求項２１】
前記特定のリガンドを吸収、保存、精製、または送達するための請求項１に記載のバイオビヒクルの使用。
【請求項２２】
検知試験、大気環境モニタリング、化粧品の品質管理、発酵産物の品質管理、または呼気分析を介する医学的診断の適用における請求項１３に記載のバイオトランスデューサシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオビヒクルに関し、特に、タンパク質性であって、かつ低分子量の化学物質、例えば、着臭剤、薬物およびピグメントを捕獲および保存し得るバイオビヒクルに関する。また、本発明はバイオセンサに関し、特に、タンパク質性バイオビヒクルを備え、かつ該バイオビヒクルに対する化学物質の結合を検出し得るバイオセンサに関する。さらに、本発明はバイオトランスデューサシステムに関し、特に、タンパク質性バイオビヒクルを備え、かつ電子シグナルを生成して、一方で該バイオビヒクルに対する化学物質の結合を検出するバイオトランスデューサシステムに関する。本発明はまた、上記装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日まで、人工嗅覚分野における市販の機器はかなり洗練されており、そしてそのほとんどが高価である。従来のアレイに基づく化学的検知は、１センサ１検体（ｏｎｅ−ｓｅｎｓｏｒ−ｏｎｅ−ａｎａｌｙｔｅ）のアプローチに従っており、これはいくつかの不利な点を被る、例えば、所望のリガンドのため選択性の高い結合材料は珍しく、見つけることが困難である。実際、現行のシステムの検出特異性は、少数のリガンドに限定される。さらに、出力はパーソナルコンピュータの様なハードウェアで処理されることが必要であり、多数の分析物が付与される場合、しばしば過度に複雑になる。いくつかの「人工鼻」システムは、主に化学的検知技術に基づいて実証される。しかし現行のプラットフォームにおける実際的な適用は、費用が高く、与えられる情報が限られているために妨げられる。検知のための別のパラダイムは、バイオセンサ（生物学的な検知エレメント、または生物学的に誘導される検知エレメントを組み込むセンサ）の活況に示されている生物学的システムを模倣することである。自宅での試験から業者のオンラインモニタリングに及ぶ、さらなる要求を満足させる第二世代のバイオセンサをデザインするためには、既に市場にあるポケットサイズのグルコースバイオセンサが重要な標準である。従って、現在（または予想される未来に）利用可能な携帯機器によって、ユーザは、検知エレメントのチップを置き換えることによって自分用のバイオセンサをデザインすることが可能になる。このようなパイオニアデバイスとしては、Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）製の「ＨＡＺＭＡＴＣＡＤ」、Ｃｙｒａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｃａｎａｄａ）が提供する「Ｃｙｒａｎｏｓｅ  ３２０」、およびＳａｎｄｉａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）が宣伝している「Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ」が例示される。それらにかかわらず、大量に製造され、かつ安価に販売することができる種々の検知エレメントのために、人工鼻の広範な適用は依然として制約される。
【０００３】
生物学的システムにおける臭いの認識は最初に、特別な器官または組織内の特定のタンパク質レセプターに着臭剤分子が結合する間に生じる。１つのアプローチにおいて、生物学的材料は、異なる検知技術に基づく電子的な鼻デバイスの一部として利用されなければならない。従って、生物学的材料の選択は、かなり多様である。好ましい生体材料は、精製された嗅覚受容体（Ｗｕ，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１４：９（１９９９））、抗体（Ｗｏｎｇら、Ｂｉｏｓｅｎｓ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１７：９（２００２））、鱗（ＬｕｎｄｓｔｒｏｍおよびＳｖｅｎｓｓｏｎ、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，１３：６８９（１９９８））、昆虫の触角（Ｓｃｈｒｏｔｈら、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４４：３８２１（１９９９））、および合成ペプチド（ＷｕおよびＬｏ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８０：６３（２０００））であり得る。残念ながら、費用およびバイアビリティを考慮すれば、これらのシステムの全てが、工業的な方式による産生は困難であると思われる。結果として、広範な検知適用のための理想的な生体材料を探す必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、着臭剤、薬物およびピグメント等の化学物質を捕獲するための代替的選択肢を提供するバイオビヒクルを提供することである。
【０００５】
本発明の他の目的は、大規模に製造しかつ安価に販売することができるバイオセンサを提供することである。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、広範な検知用途に適用可能であるバイオトランスデューサシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の局面は、特定のリガンドに結合するためのバイオビヒクルに関する。該バイオビヒクルは、固体支持体と、該固体支持体によって受容され、かつ特定のリガンドに結合し得るタンパク質性基質とを備える。タンパク質性基質は、リポカリンタンパク質およびその機能的な組み換えホモログからなる群より選択されるタンパク質を含む。
【０００８】
固体支持体は、例えば、ディスポーザブルのバイオチップ、または耐久性の容器であってよい。
【０００９】
本発明に係るバイオビヒクルは、分子量が１０００ダルトン未満のリガンドに結合するのに特に適切である。例えば、このリガンドは、着臭剤、薬物またはピグメントであってよい。例としては、２−フェニルエチルアルコール、２−酢酸フェニルエチル、酢酸フェニル、酪酸プロピル、酪酸ヘキシル、酪酸ベンジル、チグリン酸プロピル、チグリン酸ヘキシルおよびチグリン酸ベンジルが挙げられる。
【００１０】
タンパク質性基質の一例としては、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）がある。
【００１１】
本発明の第２の局面は、特定のリガンドの結合を検出するためのバイオセンサに関する。該バイオセンサは、機械的応力に応答して電荷を生成する圧電性ベースと、該圧電性ベース上に固定されて、特定のリガンドの結合の際に、圧電性ベースに対して機械的応力を与えるタンパク質性基質とを備える。
【００１２】
本発明の第３の局面は、バイオトランスデューサシステムに関する。該バイオトランスデューサシステムは、特定のリガンドに結合するためのタンパク質性基質と、該タンパク質性基質に対する特定のリガンドの結合を検出するためにタンパク質性基質と組み合わされて、電子シグナルを生成し、特定のリガンドの存在を示す電子検出デバイスとを備える。
【００１３】
タンパク質性基質は、好ましくは、リポカリンタンパク質およびその機能的な組み換えホモログからなる群より選択されるタンパク質を含む。電子検出デバイスは、好ましくは、圧電性ベースのデバイスおよび記録計を備える。
【００１４】
圧電性ベースのデバイスは、例えば、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）デバイスまたは表面音波（ＳＡＷ）デバイスであってよい。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、タンパク質性基質に対する特定のリガンドの結合を判断するための方法に関する。該方法は、圧電性ベースを提供するステップと、圧電性ベース上にタンパク質性基質を固定する工程と、特定のリガンドが存在する環境に対して、タンパク質性基質およびこの圧電性ベースを露出させるステップと、圧電性ベースの共鳴周波数変動を検出して、特定のリガンドがタンパク質性基質に結合するか否かを判断するステップとを包含する。
【００１６】
本発明の第５の局面は、特定のリガンドを吸着、保存、精製または送達するためのバイオビヒクルの使用に関する。
【００１７】
本発明の第６の局面は、検知試験、大気環境モニタリング、化粧品の品質管理、発酵産物の品質管理、または呼気分析を介する医学的診断の適用におけるバイオトランスデューサシステムの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、添付の図面を参照ながら以下の説明によって最良に理解することができる。
【００１９】
本発明は、以下の実施形態を参照してより詳細に記載される。なお、本発明の好ましい実施形態に関する以下の説明は、例示および説明のみの目的で本明細書に提示される。これは網羅することも、開示された正確な形態に限定することも意図していない。
【００２０】
図１を参照すると、バイオトランスデューサシステムは、タンパク質性基質２０としてリガンド１０の広範な化学物質に結合し得るタンパク質性エレメントの１つ以上の群と、リガンドの特徴によって異なる電子シグナルを生成する電子検出デバイス３０とを備える。電子検出デバイス３０は、機械的応力に応答して電荷を生成する圧電性ベース３１と、圧電性ベース３１に電気的に接続された記録計３２とを備える。本システムは、検知試験のためのルーチン作業において使用することができる、簡易かつ携帯可能なデバイスを目的とするがそれに限定されない。
【００２１】
タンパク質性基質２０は、圧電性ベース３１上に固定される。（１または複数の）リガンドがこのタンパク質性基質２０に結合される場合、機械的応力を圧電性ベース３１に加えることにより、電荷を生成して、記録計３２は応じてこの電子シグナルを記録する。
【００２２】
検知試験、大気環境モニタリング、化粧品の品質管理、発酵産物の品質管理、または呼気分析を介する医学的診断への適用のために、バイオトランスデューサシステムは、好ましくは、着臭剤、薬物およびピグメントの（１または複数の）リガンド化学物質３０に結合され得る。
【００２３】
このタンパク質性基質２０に含まれる１または複数のタンパク質は、好ましくは、リポカリンタンパク質ファミリーおよびその機能的な組み換えホモログから選択される。リポカリンの深遠な概説は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １４８２（２０００）にみることができる。
【００２４】
リポカリンは、真正細菌および種々の真核生物細胞に見出される多産的な群のタンパク質（１４０より多い）である。それらの主な生物学的機能は、フェロモンのキャリア、ビタミンＡのトランスポーター、嗅覚および味覚タンパク質、着色ピグメント、プロスタグランジンＤのシンターゼ、光合成のための補助的酵素、免疫のモジュレータ、ストレスタンパク質、および細胞分化の調節因子である。全体的な配列類似性が低レベル（通常、２０％未満）であるにもかかわらず、リポカリンファミリーのメンバーは、８本鎖の逆平行の樽型であって、内部のリガンド結合ポケットを囲む反復型の＋１の位相幾何学を有する樽型という、共通の兆候を共有する（簡潔な紹介については：ｗｗｗ．ｊｅｎｎｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｌｉｐｏｃａｌｉｎ．ｈｔｍ）。
【００２５】
ほとんどのリポカリンは豊富であり、そして天然の供給源から単離可能であり、例えば、リポカリンの１つであるβラクトグロブリン（ＢＬＧ）は、ウシの乳に含まれる主要タンパク質である。リポカリンの組み換え形態が利用可能であり、そして当該分野で周知である。例えば、網膜結合タンパク質（Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  １３３（２）：２９１（１９９３））、涙リポカリン（Ｈｏｌｚｆｅｉｎｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９５（２〜３）：９５（１９９６））、ウシβラクトグロブリン（Ｃｈｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（２）：２６３（１９９４））、主要尿タンパク質（Ｆｅｒｒａｒｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０１（１）：７３（１９９７））、一酸化窒素輸送タンパク質（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（１０）：１３１５（１９９８））、および着臭剤結合タンパク質（Ｌｏｂｅｌら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：３１８（１９９８））。
【００２６】
リポカリンの一例としては、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）がある。ＭＵＰは、マウス尿の主要タンパク質成分（雄マウスの場合、１日あたり約５〜１０ｍｇ）であり、そしてフェロモントランスポータとして作用する（概説については、ＣａｖａｇｇｉｏｎｉおよびＭｕｃｉｇｎａｔ−Ｃａｒｅｔｔａ，ＢＢＡ  １４８２（２〜１）：２１８（２０００）参照）。組み換えＭＵＰを、当業者に周知の標準的な手順によって調製することができる。ＭＵＰは、低分子量、例えば、１０００ダルトン未満であり、かつ極めて揮発性の化合物を担持するために特に良好に機能する。
【００２７】
圧電性ベース３１の実施形態は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）である。
【００２８】
本発明の好ましい電子的鼻技術は、圧電性ベースである。圧電性材料、例えば水晶振動子上に固定された検知エレメント上の分析物（リガンド）の結合を検出することによって測定を実施する。リガンドの吸着は、遭遇したリガンドの質量に対する振動数の割合におけるシフトを誘導する。本発明の作動能力は以下の通りである。
ｉ）ＱＣＭチップの表面活性化
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）の金電極の表面を、１．２Ｎ  ＮａＯＨ、次いで１．２Ｎ  ＨＣｌに浸漬することによって清浄化する。洗浄および乾燥後、ＱＣＭ電極を、１ｍＭの２−アミノエタンチオール／ＤＭＳＯ溶液に１２時間浸して、２倍蒸留水によって１０分間洗浄する。次いで、ＱＣＭ電極をオーブン中で乾燥させ、４μｌの２．５％グルタルアルデヒドを用いて１時間点滴する。２μｌの１％ポリエチレンイミン／メタノール（ＰＥＩ／ＭｅＯＨ）溶液を、閉鎖したチャンバ中のＱＣＭの活性化表面に、室温で１２時間添加する。最終的に、ＱＣＭチップを２回洗浄してオーブン中で乾燥させる。
ｉｉ）活性化されたＱＣＭチップ上のＭＵＰの固定
活性化されたＱＣＭチップを２．５％グルタルアルデヒド溶液に１時間点滴し、次いでＭＵＰ溶液（２０μｇ／ｍｌ含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））を添加して、１時間保持する。１００ｍＭグリシンによって、ＱＣＭチップの活性化表面のブロックを実施する。
ｉｉｉ）リガンドの結合の決定
サンプルをそれぞれ、注射器に加えて、オーブン中で、５０℃で保持する。１０ＭＨｚの基礎的な共鳴周波数を有するＡＴカットＱＣＭデバイスを使用して、着臭剤蒸気の吸着を判断する。気化した着臭剤サンプルを、ＱＣＭの検出チャンバ中にポンピングして、共鳴周波数のシフトを記録する。
【００２９】
図２〜図５は、種々のサンプルの周波数対時間を示しており、これは、同一のバイオトランスデューサシステムが出力した電子シグナルを図示している。
【００３０】
図２におけるリガンド結合試験のためのサンプルは空気である。空気の流量によって特定のレベルの浮力が得られるので、ＱＣＭの共鳴周波数は増大する。
【００３１】
図２および図３におけるリガンド結合試験のためのサンプルは、それぞれ４０μｌおよび４μｌの酢酸フェニルである。図示するとおり、リガンドの吸着によって、遭遇したリガンドの質量に比例する振動数のシフトが誘導される。希釈されたサンプルもまた、本システムによって検出することができることが示されている。
【００３２】
図４におけるリガンド結合試験のためのサンプルは、順に４μｌの酢酸フェニル、空気および４０μｌの酢酸フェニルである。このサンプルは同様に吸着され、かつ脱離され得ることが示される。従って、本システムは再使用可能であり、かつ定量的解析およびオンライン判定において可能性を有する。
【００３３】
生化学的蒸気試験のために、１０ｃｍ３の酵母培養物露出に相当する気体サンプルを、本発明によって解析する。Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  Ｌ−５を、０．６ｖｖｍ（１分あたりのタンク容積あたりの空気容積）で曝気された１．６Ｌの作業容積を有する４Ｌのファーメンタ中、４００ｒｐｍで培養する。最初の培地は、フェニルアラニン（２０００ｐｐｍ）、グルコース（１００ｇ／Ｌ）、および５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含む。このような培養露出において期待される着臭剤としては、２−フェニルエチルアルコールおよび酢酸２−フェニルエチルなどが挙げられる。
【００３４】
図６および図７は、それぞれ、初期段階および中期段階におけるタンパク質性基質上への着臭剤の結合を示す。定量的分析およびオンライン判定における可能性は顕著である。
【００３５】
種々のリガンドを上記の手順によって調査する。表１は、酢酸フェニル、酪酸プロピル、酪酸ヘキシル、酪酸ベンジル、チグリン酸プロピル、チグリン酸ヘキシルおよびチグリン酸ベンジルを含む異なるリガンドの結合の際の周波数におけるシグナルの変化を挙げている。
【００３６】
【表１】
2005331357.tif 000003
【００３７】
ＱＣＭに加えて、本システムにおいて用いられる電子検出デバイスはまた、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）デバイスまたは表面音波（ＳＡＷ）デバイスであってよい。このデバイスの原理および操作は、当業者に周知であるので、本明細書には重複して記載しない。
【００３８】
バイオセンサまたはバイオトランスデューサシステムにおける適用に加えて、タンパク質性基質を、特定のリガンドを吸着、保存、精製または送達するためのバイオビヒクルとして用いることができる。タンパク質性基質は、固体支持体（図示せず）に固定されるか、あるいは受容されるが、この固体支持体は、ディスポーザブルのバイオチップまたは耐久性の容器であってよい。
【００３９】
本発明は、現在最も実際的でかつ好ましい実施形態であると考えられるものに関して記載してきたが、本発明が、開示された実施形態に限定される必要は無いことが理解されるべきである。逆に、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に包含される種々の改変および同様の構成であって、このような改変および同様の構造の全てを包含するような最も広範な解釈と一致するものを包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】トランスデューサシステムの主要部分を示す模式的なブロック図である。
【図２】本発明の好ましい実施形態に係るバイオトランスデューサシステムが出力する電子シグナルを示す周波数対時間のグラフであって、ここで、ブランク試験のためにシステム中に空気を導入している。
【図３】図１のバイオトランスデューサシステムと同じシステムが出力する電子シグナルを示す周波数対時間のグラフであって、ここで、高濃度のリガンドサンプルを結合試験のためにシステム中に導入している。
【図４】図１のバイオトランスデューサシステムと同じシステムが出力する電子シグナルを示す周波数対時間のグラフであって、ここで、低濃度のリガンドサンプルを結合試験のためにシステム中に導入している。
【図５】図１のバイオトランスデューサシステムと同じシステムが出力する電子シグナルを示す周波数対時間のグラフであって、ここで、低濃度のリガンドサンプル、次いで高濃度のリガンドサンプルを結合試験のためにシステム中に導入している。
【図６】本バイオトランスデューサシステムの例の周波数対時間のグラフであって、発酵の初期段階で酵母培養物によって産生された気化着臭剤の結合を示す。
【図７】本バイオトランスデューサシステムの例の周波数対時間のグラフであって、発酵の中期段階で、図５と同じ酵母培養物によって産生された気化着臭剤の結合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
Title of Invention
BIO-VEHICLE, BIOSENSOR AND BIOTRANSDUCER SYSTEM
FIELD OF THE INVENTION
[0001]    The present invention relates to a bio-vehicle, and more particularly to a bio-vehicle which is proteinaceous and capable of capturing and preserving chemicals of low molecular weight, e.g. odorants, drugs, and pigments. The present invention also relates to a biosensor, and more particular to a biosensor comprising a proteinaceous bio-vehicle and capable of detecting the binding of chemicals to the bio-vehicle. The present invention further relates to a biotransducer system, and more particularly a biotransducer system comprising a proteinaceous bio-vehicle and generating an electronic signal while detecting the binding of chemicals to the bio-vehicle. The present invention also relates to the uses of the above devices.
BACKGROUND OF THE INVENTION
[0002]    To date, commercially available instruments in the artificial-olfaction field are rather sophisticated and most of them are expensive. Conventional array-based chemical sensing has followed a one-sensor-one-analyte approach that suffers on several disadvantages, e.g., highly selective binding materials for wanted ligands are rare and difficult to find. In fact, the detecting specificity of current systems is limited to a small number of ligands. Moreover, the outputs need to be processed by a PC-like hardware and often become extremely complicated when multiple analytes are applied. Several ‘artificial-nose’ systems have been demonstrated mainly based on chemical-sensing techniques; however, practical applications in current platforms are prevented by the high cost and limited information given. An alternative paradigm for sensing is to mimic the biological system, which has been shown in the booming of biosensors (sensors incorporating a biological or biologically derived sensing elements). For designing the second-generation biosensor to satisfy more demands, ranged form home testing to the on-line monitoring in manufactories, the pocket-sized glucose biosensors already in market are considerable standards. Accordingly, portable instruments available at present (or in the expecting future) may allow users to design their own biosensors by replacing the chips of sensing elements. Such pioneer devices can be exampled by the “HAZMATCAD” manufactured by the Microsensor Systems Inc. (USA), the ”Cyranose 320” provided by the Cyrano Sciences Inc. (Canada), and the “Chem Lab on a Chip” announced by the Sandia National Laboratories (USA). Despite of that, extensive applications of artificial-nose are still constrained by the variety of sensing elements that can be fabricated in scale and sold in cheap.
[0003]    Odor perception in biological system first occurs during odorant molecules binding onto specific protein receptors within specialized organs or tissues. In one approach, biological materials have to be utilized as parts of electronic nose devices based on different sensing technologies; therefore, the selections of biological materials are quite diverse. Preferable biomaterials can be purified olfactory receptors (Wu, Biosens. Bioelectron. 14:9 (1999)), antibodies (Wong et al., Biosens. Bioelectron. 17:9 (2002)), fish scales (Lundstrom and Svensson, Biosens. Bioelectron. 13:689 (1998)), insect antennae (Schroth et al., Electrochimica Acta 44: 3821 (1999)), and synthetic peptides (Wu and Lo, J. Biotech. 80:63 (2000)). Unfortunately, all these systems seem have difficulties for production in the industrial manner, considering the cost and viability. Consequently, there is a need to seek the ideal biomaterials for a broad range of sensing applications. 
SUMMARY OF THE INVENTION
[0004]    An objective of the present invention is to provide a bio-vehicle that provides alternative options for capturing chemicals such odorants, drugs, and pigments.
[0005]    Another objective of the present invention is to provide a biosensor that can be fabricated in scale and sold in cheap.
[0006]    A further objective of the present invention is to provide a biotransducer system which can be applied to a broad range of sensing applications.
[0007]    A first aspect of the present invention relates to a bio-vehicle for binding a specified ligand. The bio-vehicle comprises a solid support; and a proteinaceous substrate received by the solid support, and capable of binding the specified ligand. The proteinaceous substrate includes a protein selected from a group consisting of lipocalin proteins and recombinant functional homologues thereof.
[0008]    The solid support, for example, can be a disposable biochip or a lasting container.
[0009]    The bio-vehicle according to the present invention is especially suitable for binding the ligand having a molecular weight of less than 1000 daltons. The ligand, for example, can be an odorant, a drug or a pigment. Examples include 2-phenylethyl alcohol, 2-phenylethyl acetate, phenylacetate, propylbutyrate, hexylbutyrate, benzylbutyrate, propyltiglate, hexyltiglate, and benzyltiglate.
[0010]    One of the examples of the proteinaceous substrate is major urinary protein (MUP).
[0011]    A second aspect of the present invention relates to a biosensor for detecting the binding of a specified ligand. The biosensor comprises a piezoelectric base producing electrical charges in response to a mechanical stress; and a proteinaceous substrate immobilized on the piezoelectric base, and providing the mechanical stress to the piezoelectric base upon binding the specified ligand.
[0012]    A third aspect of the present invention relates to a biotransducer system. The biotransducer system comprises a proteinaceous substrate for binding a specified ligand; and an electronic detecting device in connection with the proteinaceous substrate for detecting the binding of the specified ligand to the proteinaceous substrate, and generating an electronic signal to indicate the presence of the specified ligand. 
[0013]    The proteinaceous substrate preferably includes a protein selected from a group consisting of lipocalin proteins and recombinant functional homologues thereof. The electronic detecting device preferably includes a piezoelectric-based device and a recorder.
[0014]    The piezoelectric-based device, for example, can be a quartz crystal microbalance (QCM) or surface acoustic wave (SAW) device.
[0015]    A further aspect of the present invention relates to a method for determining the binding of a specified ligand to a proteinaceous substrate. The method comprises steps of providing a piezoelectric base; immobilizing a proteinaceous substrate onto the piezoelectric base; exposing the proteinaceous substrate and the piezoelectric base to an environment where the specified ligand exists; and detecting a resonant frequency variation of the piezoelectric base to determine whether the specified ligand is bound to the proteinaceous substrate.
[0016]    A fifth aspect of the present invention relates to the use of the bio-vehicle for absorption, preservation, purification or delivery of the specified ligand.
[0017]    A sixth aspect of the present invention relates to the use of the biotransducer system in an application of sensory evaluation, air quality monitoring, quality control of cosmetic products, quality control of fermentation products or medical diagnosis via breath analysis.
DETAILED DESCRIPTION OF PREFERRED EMBODIMENT
[0018]    The present invention will now be described more specifically with reference to the following embodiments. It is to be noted that the following descriptions of preferred embodiments of this invention are presented herein for purpose of illustration and description only; it is not intended to be exhaustive or to be limited to the precise form disclosed.
[0019]    Referring to Fig. 1, a biotransducer system comprises one or more groups of proteinaceous elements capable of binding a broad range of chemicals of ligands 10 as a proteinaceous substrate 20, and an electronic detecting device 30 generating electronic signals varying with features of ligands. The electronic detecting device 30 includes a piezoelectric base 31 producing electric charges in response to a mechanical stress and a recorder 32 electrically connected to the piezoelectric base 31. This system is aimed at but not limited to a simple and portable device that can be used in routine works for sensing evaluation.
[0020]    The proteinaceous substrate 20 is immobilized onto the piezoelectric base 31. When the ligand(s) is bound to the proteinaceous substrate 20, a mechanical stress is applied onto the piezoelectric base 31 so that electric charges are generated and the recorder 32 records the electrionic signals accordingly. 
[0021]    For the application of sensory evaluation, air quality monitoring, quality control of cosmetic products, quality control of fermentation products or medical diagnosis via breath analysis, the biotransducer system is preferably capable of binding a ligand chemical(s) 30 of odorants, drugs, and pigments. 
[0022]    The protein or proteins included in the proteinaceous substrate 20 is prferably selected from a lipocalin protein family and recombinant functional homologues thereof. A profound review of lipocalin can be seen in Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Protein Structure and Molecular Enzymology 1482 (2000)).
[0023]    Lipocalins are a prolific group of proteins (more than 140) found in eubacteria and a variety of eukaryotic cells. Their major biological functions are pheromonal carriers, transporters for vitamin A, olfactory and gustatory proteins, colouration pigments, synthases of prostaglandin D, accessory enzymes for photosynthesis, modulators of immunity, stress proteins, and regulators of cell differentiations.  Despite of low levels of overall sequence similarity (usually below 20%), members of the lipocalin family share a common signature of an eight-stranded antiparallel ?-barrel with a repeated +1 topology enclosing an internal ligand-binding pocket (for a concise introduction: www.jenner.ac.uk/lipocalin.htm).
[0024]    Most of lipocalins are abundant and can be isolated from the natural sources, e.g., one lipocalin, beta-lactoglobulin (BLG), is the major protein contain of cow’s milk. Recombinant forms of lipocalins are available and well known in the art, e.g., retinal-binding protein (Wang et al., Gene 133(2):291 (1993)), tear lipocalin (Holzfeind et al., FEBS Lett. 395(2-3):95 (1996)), bovine beta-lactoglobulin (Cho et al., Protein Engineering 7(2):263 (1994)), major urinary protein (Ferrari et al., FEBS Lett. 401(1):73 (1997)), nitric oxide transport protein (Andersen et al., Structure 6(10):1315 (1998)), and odorant-binding protein (Lobel et al., European J. Biochem. 254(2):318 (1998)).
[0025]    One of the examples of the lipocalins is the major urinary protein (MUP). MUP is the major protein component of mouse urine (about 5-10 mg per day for male) and acts as pheromone transporter (for review see Cavaggioni and Mucignat-Caretta, BBA 1482(2-1):218 (2000)). Recombinant MUP can be prepared by a standard procedure well known to those skilled in the art. MUP performs especially well for carrying compounds of lower molecular weight, e.g. less than 1000 daltons and very volatile.
[0026]    An embodiment of the piezoelectric base 31 is a quartz crystal microbalance (QCM). 
[0027]    The preferred electronic nose technology of the present invention is piezoelectric-based. Measurements are performed by detecting the binding of analytes (ligands) onto the sensing elements immobilized on piezoelectric materials, e.g., quartz crystal. The adsorption of ligand induces a shift in the oscillation frequency proportional to the mass of the encountered ligand. The operating performance of the present invention is described as bellow:
i) Surface activation of QCM chip 
Gold electrodes of quartz crystal microbalance (QCM) surface are cleaned by immersing in 1.2 N NaOH and then in 1.2 N HCl.  After rinsing and drying, the QCM electrodes are soaked in 1 mM 2-aminoethanethiol/DMSO solution for 12 hours and washed by double distilled water for 10 min.  Then the QCM electrodes are dried in oven and dripped with 4 ml of 2.5% glutaldehyde for 1 hour.  Two ml of 1% polyethylenimine/methanol (PEI/MeOH) solution are added onto activated surface of QCM in a closed chamber at room temperature for 12 hours.  Finally, the QCM chips are washed two times and dried in oven.
ii) Immobilization of MUP on activated QCM chips
Activated QCM chips are dipped in 2.5% glutaldehyde solution for 1 hour, and then MUP solution (20mg/ml in 10mM phosphate buffer, pH 7.4) are added and kept for 1 hour.  Blocking the activated surface of QCM chips is performed by 100 mM glycine.  
iii) Determining the binding of ligand
A sample is respectively applied in a syringe and kept in an oven at 50°C.  An AT-cut QCM device with basic resonant frequency of 10MHz is employed to determine the adsorption of odorant vapor.  The evaporated odorant sample is pumped into the detection chamber of QCM and the shift of resonant frequency is recorded.
[0028]    Figs. 2~5 illustrates the frequency vs. time diagrams of various samples illustrating the electronic signals outputted by the same biotransducer system.
[0029]    The sample for the ligand-binding test in Fig. 2 is air. Since a flow rate of air results in a certain level of buoyancy, the resonant frequency of QCM increases. 
[0030]    The samples for the ligand-binding test in Figs. 2 and 3 are 40 ml and 4 ml phenylacetate, respectively. As shown, the adsorption of ligand induces a shift in the oscillation frequency proportional to the mass of the encountered ligand. It is also shown that a diluted sample can also be detected by the present system.
[0031]    The samples for the ligand-binding test in Fig. 4 are 4 ml phenylacetate, air and 40 ml phenylacetate in sequence. It is shown that the samples can be adsorbed and desorbed as well. Therefore, the present system can be reused and has potential in quantitative analysis and on-line determination.
[0032]    For the biochemical vapor testing, gaseous samples corresponding to 10 cm3 of the yeast culture exposure are analyzed by the present invention. Pichia fermentans L-5 is cultured in 4 L fermentor with 1.6 L working volume aerated in 0.6 vvm (volume air/volume tank per minutes) at 400 rpm. The initial medium contains phenylalanine (2000 ppm), glucose (100 g/L), and 50 mM KH2PO4. The expected odorants in such culture exposure includes 2-phenylethyl alcohol and 2-phenylethyl acetate et al. 
[0033]    Figs. 6 and 7 shows the binding of the odorants onto the proteinaceous substrate at the early stage and middle stage, respectively. The potential in quantitative analysis and on-line determination is prominent.
[0034]    A variety of ligands are surveyed according to the above procedures. Table I lists the changes of signal in frequency upon the bindings of different ligands, including phenylacetate, propylbutyrate, hexylbutyrate, benzylbutyrate, propyltiglate, hexyltiglate, and benzyltiglate.
Table I
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[0035]    In addition to QCM, the electronic detecting device used in the present system can also be a field effect transistor (FET) device or surface acoustic wave (SAW) device. The principle and operation of the devices are well known to those skilled in the art, and will not redundantly described herein.
[0036]    In addition to the application in a biosensor or biotransducer system, the proteinaceous substrate can be used as a bio-vehicle for absorption, preservation, purification or delivery of specified ligands. The proteinaceous substrate is immobilized onto or received in a solid support (not shown) which can be a disposable biochip or a lasting container. 
[0037]    While the invention has been described in terms of what are presently considered to be the most practical and preferred embodiments, it is to be understood that the invention need not be limited to the disclosed embodiment. On the contrary, it is intended to cover various modifications and similar arrangements included within the spirit and scope of the appended claims which are to be accorded with the broadest interpretation so as to encompass all such modifications and similar structures.
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS
[0038]    The present invention may best be understood through the following description with reference to the accompanying drawings, in which:
[0039]    Fig. 1 is a schematic block diagram showing the main portions of a transducer system;
[0040]    Fig. 2 is a frequency vs. time diagram illustrating the electronic signals outputted by the biotransducer system according to a preferred embodiment of the present invention, wherein air is introduced into the system for blank test;
[0041]    Fig. 3 is a frequency vs. time diagram illustrating the electronic signals outputted by the same biotransducer system as that of Fig. 1, wherein a high concentration of ligand sample is introduced into the system for binding test;
[0042]    Fig. 4 is a frequency vs. time diagram illustrating the electronic signals outputted by the same biotransducer system as that of Fig. 1, wherein a low concentration of ligand sample is introduced into the system for binding test;
[0043]    Fig. 5 is a frequency vs. time diagram illustrating the electronic signals outputted by the same biotransducer system as that of Fig. 1, wherein a low and then a high concentration of ligand samples are  introduced into the system for binding test;
[0044]    Fig. 6 is a frequency vs. time diagram of an example of the present biotransducer system, which demonstrates the binding of an evaporated odorant produced by a yeast culture at the early stage of fermentation and
[0045]    Fig. 7 is a frequency vs. time diagram of an example of the present biotransducer system, which demonstrates the binding of the evaporated odorant produced by the same yeast culture as in Fig. 5 at the middle stage of fermentation .
1. A bio-vehicle for binding a specified ligand, comprising:
a solid support; and
a proteinaceous substrate received by said solid support, and capable of binding said specified ligand;
wherein said proteinaceous substrate includes a protein selected from a group consisting of lipocalin proteins and recombinant functional homologues thereof.
2. The bio-vehicle according to claim 1 wherein said solid support is a disposable biochip or a lasting container.
3. The bio-vehicle according to claim 1 wherein said specified ligand has a molecular weight of less than 1000 daltons.
4. The bio-vehicle according to claim 1 wherein said specified ligand is one selected from a group consisting of odorants, drugs, and pigments.
5. The bio-vehicle according to claim 1 wherein said specified ligand is one selected from a group consisting of 2-phenylethyl alcohol, 2-phenylethyl acetate, phenylacetate, propylbutyrate, hexylbutyrate, benzylbutyrate, propyltiglate, hexyltiglate, and benzyltiglate.
6. The bio-vehicle according to claim 1 wherein said proteinaceous substrate includes major urinary protein (MUP).
7. A biosensor for detecting the binding of a specified ligand, comprising:
a piezoelectric base producing electrical charges in response to a mechanical stress; and 
a proteinaceous substrate immobilized on said piezoelectric base, and providing said mechanical stress to said piezoelectric base upon binding said specified ligand.
8. The biosensor according to claim 7 wherein said piezoelectric base is a quartz crystal microbalance (QCM) or a surface acoustic wave (SAW) base.
9. The biosensor according to claim 7 wherein said proteinaceous substrate includes a protein selected from a group consisting of lipocalin proteins and recombinant functional homologues thereof.
10. The biosensor according to claim 9 wherein said proteinaceous substrate includes major urinary protein (MUP).
11. The biosensor according to claim 10 wherein said specified ligand is one selected from a group consisting of 2-phenylethyl alcohol, 2-phenylethyl acetate, phenylacetate, propylbutyrate, hexylbutyrate, benzylbutyrate, propyltiglate, hexyltiglate, and benzyltiglate.
12. The biosensor according to claim 7 wherein said specified ligand is one selected from a group consisting of odorants, drugs, and pigments.
13. A biotransducer system, comprising:
a proteinaceous substrate for binding a specified ligand; and
an electronic detecting device in connection with said proteinaceous substrate for detecting the binding of said specified ligand to said proteinaceous substrate, and generating an electronic signal to indicate the presence of said specified ligand. 
14. The biotransducer system according claim 13 wherein said specified ligand is one selected from a group consisting of odorants, drugs, and pigments.
15. The biotransducer system according claim 13 wherein said specified ligand is one selected from a group consisting of 2-phenylethyl alcohol, 2-phenylethyl acetate, phenylacetate, propylbutyrate, hexylbutyrate, benzylbutyrate, propyltiglate, hexyltiglate, and benzyltiglate.
16. The biotransducer system according to claim 15 wherein said proteinaceous substrate includes major urinary protein (MUP).
17. The biotransducer system according to claim 13 wherein said proteinaceous substrate includes a protein selected from a group consisting of lipocalin proteins and recombinant functional homologues thereof.
18. The biotransducer system according to claim 13 wherein said electronic detecting device includes a piezoelectric-based device and a recorder.
19. The biotransducer system according to claim 18 wherein said piezoelectric-based device is one selected from a group consisting of a quartz crystal microbalance (QCM) and surface acoustic wave (SAW) device. 
20. A method for determining the binding of a specified ligand to a proteinaceous substrate, comprising steps of:
providing a piezoelectric base;
immobilizing a proteinaceous substrate onto said piezoelectric base; 
exposing said proteinaceous substrate and said piezoelectric base to an environment where said specified ligand exists; and
detecting a resonant frequency variation of said piezoelectric base to determine whether said specified ligand is bound to said proteinaceous substrate.
21. The use of the bio-vehicle of claim 1 for absorption, preservation, purification or delivery of said specified ligand.
22. The use of the biotransducer system according to claim 13 in an application of sensory evaluation, air quality monitoring, quality control of cosmetic products, quality control of fermentation products or medical diagnosis via breath analysis.
ABSTRACT OF THE DISCLOSURE
A bio-electronic system for detecting a broad range of chemicals is achieved by the incorporation of ligand-binding affinities of lipocalins with a mass-sensing electronic device. A biotransducer system combines the unique ligand-binding affinities of lipocalins with the high sensitivity of piezoelectric-based devices. As “artificial-nose”, this system is more reliable, cost-effective, and flexible for a number of applications in sensory evaluation, including air quality monitoring, quality control of cosmetic and fermentation products, medical diagnosis via breath analysis et al. These proteinaceous elements are likely to be extended to several potential applications, e.g., for the purification and delivery of specific ligands.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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