(57)【要約】【課題】  細胞内の本来の状態における作用に一層近い作用に基づいて脱メチル化剤を高感度で検出できる系を提供する【解決手段】  内在性の、FLJ32130遺伝子のプロモーター、または、RIKEN 2210015F16遺伝子のホモログのプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するようにレポーター遺伝子が染色体に組み込まれているHCT 116細胞株に候補物質を作用させ、候補物質によるレポーター遺伝子の発現の変化を検出し、発現を減少させる候補物質を選択する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性の、FLJ32130遺伝子のプロモーター、または、RIKEN 2210015F16遺伝子のホモログのプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するようにレポーター遺伝子が染色体に組み込まれているHCT 116細胞株。
【請求項２】
リポーター遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子である請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞株に候補物質を作用させ、候補物質によるレポーター遺伝子の発現の変化を検出し、発現を減少させる候補物質を選択することを含む、脱メチル化剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項３に記載のスクリーニング方法により脱メチル化剤を選択し、選択された脱メチル化剤を製剤化することを含む医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAのCGアイランドにおけるメチル化状態を変化させる脱メチル化剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAのCpGアイランドのメチル化（以下、単にDNAメチル化ともいう）は、発生・分化・発がんに密接に関わっている。DNAメチル化の異常を誘発する化学物質は、発がんに関与している可能性があるのみならず、催奇形性・変性の誘発・免疫応答の修飾など、潜在的に健康被害を誘発している可能性もある。例えば、ヒト胃がん細胞でメチル化を受けて発現が減少する遺伝子が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
そのような化学物質を検出することは、実験動物個体を利用してある程度は可能である。しかし、ある化学物質について毒性が検出された場合、その毒性がメチル異常の誘発能によるものか否かの検討は極めて困難である。従って、簡易なin vitroでの脱メチル化剤の検出系が必要である。
【０００４】
特に、DNAの過剰メチル化は、発がんに関与している。したがって、異常にメチル化された領域のメチル化状態を戻すことが出来れば、抗がん剤としての活性が期待できる。そのような物質をスクリーニングすることは重要である。例えば、脱メチル化剤としては、5-アザ-2'-デオキシシチジン (5-aza-dC)が実験的に汎用される。本剤およびその誘導体は、骨髄異形性症候群に有効であり、現在、臨床試験が行われている。
【０００５】
脱メチル化剤のスクリーニング法に関しては、Biardらによる報告がある（非特許文献２）。本報告では、マウスメタロチオネイン1遺伝子のプロモーターにlacZ遺伝子を連結したプラスミドがヒト293細胞に導入された。プラスミドがゲノムDNAにインテグレートし、自然にメチル化されたクローンA4/4を利用し、脱メチル化剤のスクリーニングが行われた。
【非特許文献１】キャンサー・リサーチ(Cancer Research), 2002年, 第62巻, p.6645-6650
【非特許文献２】キャンサー・リサーチ(Cancer Research), 1993年, 第52巻, p.5213-5218
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献２に記載されたスクリーニング方法では、プロモーターを本来の場所とは異なるゲノム領域に挿入している。そのため、クロマチン構造が細胞内の本来の状態とは異なると予測されるため、スクリーニングされた脱メチル化剤の作用は、脱メチル化剤の実際の生体内での作用と異なる恐れがある。また、一般に、脱メチル化剤に対する反応に関して、どの程度の濃度で、どの遺伝子が反応するかは、細胞株毎に異なるため、内在性プロモーターを用いた場合に、脱メチル化剤のスクリーニングに適した細胞株が提供できるかどうか予測することは難しい。
【０００７】
本発明は、細胞内の本来の状態における作用に一層近い作用に基づいて脱メチル化剤を高感度で検出できる系を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、特定の細胞株における特定の内在性のプロモーター
を用いた場合に、高感度で脱メチル化剤のスクリーニングができることを見出し、本発明を完成した。本発明は以下のものを提供する。
【０００９】
（１）内在性の、FLJ32130遺伝子のプロモーター、または、RIKEN 2210015F16遺伝子のホモログのプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するようにレポーター遺伝子が染色体に組み込まれているHCT 116細胞株。
【００１０】
（２）リポーター遺伝子が、蛍光蛋白質をコードする遺伝子である（１）に記載の細胞株。
【００１１】
（３）（１）または（２）に記載の細胞株に候補物質を作用させ、候補物質によるレポーター遺伝子の発現の変化を検出し、発現を減少させる候補物質を選択することを含む、脱メチル化剤のスクリーニング方法。
【００１２】
（４）（３）に記載のスクリーニング方法により脱メチル化剤を選択し、選択された脱メチル化剤を製剤化することを含む医薬の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のスクリーニング法によれば、脱メチル化剤を高感度で検出することができる。内在性プロモーターが使用されているので、この方法でスクリーニングされた脱メチル化剤は、細胞内の本来の状態における作用を一層厳密に反映した作用に基づいてスクリーニングされたものと考えられ、この方法は、医薬またはそのリード化合物として一層有用な脱メチル化剤を提供できるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の細胞株は、内在性の、FLJ32130遺伝子のプロモーター、または、RIKEN 2210015F16遺伝子のホモログのプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するようにレポーター遺伝子が染色体に組み込まれているHCT 116細胞株である。
【００１５】
HCT 116細胞株は、ヒト大腸癌細胞株であり、ATCCから入手できるHCT 116株(ATCC番号:CCL−247)、及び、その株の上記プロモーターのメチル化に関する特性を維持しかつその株から誘導された改変株を包含する。このような改変株は、遺伝子操作並びに自然及び人工の突然変異により生じたHCT 116株の改変株について、上記プロモーターのメチル化の特性を測定することにより選択することができる。プロモーターのメチル化の特性の測定は通常の方法により行うことができる。
【００１６】
内在性のプロモーターとは、細胞株が固有に有するプロモーターであって、染色体の固有の位置に存在するプロモーターを意味する。
【００１７】
FLJ32130遺伝子のプロモーターは、例えば、GenBankアクセッション番号AC002310における塩基番号870〜2,580の塩基配列のCpGアイランド内に存在するものである。しかしながら、本発明で使用されるFLJ32130遺伝子のプロモーターは、HCT 116細胞株の染色体に存在するものであれば、この配列を有するものに限定されず、通常に予測される変異配列を有するものも包含する。
【００１８】
RIKEN 2210016F16遺伝子のホモログのプロモーターは、例えば、GenBankアクセッション番号AL354733における塩基番号158,000〜157,386の塩基配列のCpGアイランド内に存在するものである。しかしながら、本発明で使用されるRIKEN 2210016F16遺伝子のホモログのプロモーターは、HCT 116細胞株の染色体に存在するものであれば、この配列を有するものに限定されず、通常に予測される変異配列を有するものも包含する。
【００１９】
レポーター遺伝子とは、その発現が測定可能である遺伝子を意味する。レポーター遺伝子の例としては、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、薬剤耐性をもたらす遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００２０】
レポーター遺伝子は、励起光を照射するのみで蛍光を発する蛍光蛋白質をコードするものであることが好ましい。励起光を照射するのみで蛍光を発する蛍光蛋白質は、生きた細胞内での発現を測定するのに有利である。蛍光蛋白質の例としては、オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質（GFP）、イソギンチャク由来の蛍光蛋白質、サンゴ由来の蛍光蛋白質及びそれらの改変型蛍光蛋白質が挙げられる。GFPの改変型蛍光蛋白質の例としては、EGFP、ECFP、EYFP、EBFPなどが挙げられる。
【００２１】
内在性FLJ32130遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するようにレポーター遺伝子を染色体に組み込む方法は、特に限定されないが、通常には、遺伝子ターゲッティング法を用いることができる。遺伝子ターゲッティング法は、通常、ターゲッティングベクターの構築、ターゲッティングベクターの細胞株への導入、及び、相同組換え体の選択の工程からなる。各工程の条件は、対象とする遺伝子及び細胞株に応じて適宜設定することができる。
【００２２】
本発明の細胞株は、脱メチル化剤のスクリーニングに使用できる。すなわち、本発明の細胞株に候補物質を作用させ、候補物質によるレポーター遺伝子の発現の変化を検出し、発現を減少させる候補物質を選択することにより、脱メチル化剤をスクリーニングすることができる。
【００２３】
候補物質を作用させる方法は、通常には、細胞株の培地に候補物質を添加して細胞株を培養することによって行う方法が用いられる。
【００２４】
レポーター遺伝子の発現の変化の検出は、レポーター遺伝子に応じて適宜選択される方法によって行うことができる。レポーター遺伝子の発現産物が蛍光や活性などの測定により検出可能である場合には、蛍光や活性の測定により発現の変化を検出することができる。あるいは、転写されたmRNAをRT-PCR法などにより測定することによって、発現の変化を検出することができる。
【００２５】
発現の変化の検出の結果、候補物質を作用させない場合と比べて発現を減少させた候補物質を、脱メチル化剤として選択することができる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法は、医薬の製造に使用できる。すなわち、本発明のスクリーニング方法で選択された物質を製剤化することにより医薬を製造できる。製剤化は、選択された物質の種類、製剤の形態等により適宜選択される通常の方法に従って行うことができる。
【００２７】
本発明の製造方法で製造される医薬は、内在性FLJ32120遺伝子のプロモーターのメチル化が病因となる疾患の治療に使用できる。このような疾患の例としては、がん（胃がん、乳がん、膵がん、肺がんなど）、腸上皮化生が挙げられる。また、過剰メチル化が発症のリスクになる疾患の場合には、予防薬として使用できる。
【００２８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
脱メチル化剤による発現再誘導の検討
十分なプロモーター活性をもち、HCT 116細胞株でサイレンシングされた遺伝子を検討するため、胃がんで見いだされた9個の遺伝子（非特許文献２）、および、乳がんで見いだされた3-OST-2遺伝子（Oncogene 22 (2003) 274-280）について、様々な濃度の5-aza-dCでの脱メチル化および発現再誘導を解析した。解析は以下のように行った。
【００３０】
細胞を10-cmディッシュに3 x 105 cells/dishとなるように播種し、24時間後、5-aza-dCを最終濃度0.1、0.5、1、5、10μMとなるように培地に添加した。5-aza-dC溶液は、使用直前にリン酸緩衝液に溶解した。5-Aza-dC添加の72時間後に細胞を回収し、ゲノムDNA及び全RNAを抽出した。後記実施例３に記載した方法と同様の方法でMSP解析を行った。使用したプライマー及びアニール温度は表1に示す通りであった。また、RT-PCRも、後記実施例３に記載した方法と同様の方法で表１に示したプライマー及びアニール温度を用いて行い、アガロースゲルでの電気泳動で増幅を確認した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
その結果、FLJ32130遺伝子およびRIKEN 2210016F16のホモログの2個の遺伝子について、きわめて低濃度（0.1μM）の5-aza-dCによるmRNA発現再誘導が認められた。
【実施例２】
【００３３】
細胞株の作成
FLJ32130遺伝子のエクソン3に、IRESを介してハイグロマイシン耐性遺伝子とEGFP遺伝子の融合遺伝子を導入するターゲティングベクター（耐性クローンのマーカーはNeo耐性）を構築し、内在性FLJ32130遺伝子のプロモーターの制御下にEGFP遺伝子が発現するようにEGFP遺伝子を染色体に相同組換えにより組み込んだ（図１）。以下、詳細を説明する。
【００３４】
(1) ターゲティングベクターの構築（１）
FLJ32130遺伝子のエクソン３の一部を、ハイグロマイシン耐性（Hygr）遺伝子及びEGFP遺伝子の融合遺伝子で置き換えた相同組み換え用ターゲティングベクターを構築した。Hygr-EGFP遺伝子の上流には、１種類のmRNAから２カ所のオープンリーディングフレームを翻訳することが可能となるように、IRES(Internal ribosomal entry site）配列を導入した。ターゲティングされたクローンの選択用薬剤マーカーには、ネオマイシン耐性（Neor）遺伝子を用いた。
【００３５】
pIRES2-EGFPベクター（Clontech）を制限酵素BamHI及びNcoIで消化後、Klenow処理によりDNA末端を平滑化し、約600bpのIRES配列断片を得た。このIRES配列を、ハイグロマイシン耐性蛋白質とEGFP蛋白質が融合蛋白質として発現するように構築されたpHygEGFPベクター（Clontech）のKpnI部位に導入した（図２; pIRES-HygEGFPベクター）。さらに、SV40プロモーターの下流にNeor遺伝子がついたDNA断片を、pIRES2-EGFPベクターのEco81I消化により得た。このプロモーターが付いたNeorは、Hygr-EGFP遺伝子の下流（pIRES-HygEGFPのNaeI部位）に、逆方向に発現するように導入した（図２; pIRES-HygEGFP-Neoベクター）。
【００３６】
(2) ターゲティングベクターの構築（２）
FLJ32130遺伝子を含むヒトBACクローンCIT987SK-A-635H12は、California Institute of Technologyの静谷博士より分与して頂いた。BACクローンCIT987SK-A-635H12をHindIIIで切断し、FLJ32130遺伝子のエクソン３を含む15.6KbのDNA断片をpBluescript II-SK(+)（Stratagene）に導入した（図３; pBS-SK(+)-FLJ）。
【００３７】
pIRES-HygEGFP-NeoベクターをBspHI及びMluIで消化し、IRES、Hygr、EGFP及びNeorの全てを含んだ5.1KbのDNA断片として切り出した。このDNA断片を、pBS-SK(+)-FLJベクターのMluI及びNheI消化部位に導入し、FLJ32130遺伝子のエクソン３の途中にIRES、Hygr、EGFP及びNeorが導入されたpFLJ exon 3ベクターを構築した（図３）。pFLJ exon 3ベクターは、EcoRV及びXhoIで消化して直線化した後、トランスフェクションに用いた。
【００３８】
(3) HCT 116細胞株への導入
ヒト大腸がん細胞株HCT 116は、ATCCから購入し、10％胎児血清（JRH BIOSCIENCE）、ペニシリン・ストレプトマイシン（GIBCO BRL）及び1.5 mM L-グルタミン（GIBCO BRL）を含んだMcCOY'S 5A培地（Sigma Chemical Co.）で培養した。
【００３９】
トランスフェクションはリポソーム法により行った。HCT 116細胞を6 cmディッシュに4
x 105個播種し、翌日、制限酵素EcoRV及びXhoIで消化して直線化したpFLJ exon 3ベクター 1〜3 μgを、LipofectAMINE試薬（Life Technologies）24μg及びPLUS試薬（Life Technologies）8μLを用いて、細胞にトランスフェクションした。次の日、10 cmディッシュに2〜5 x 104個となるように継代し、その2日後、選択用抗生物質としてジェネティシン(GIBCO BRL)を最終濃度400μg/mLとなるように添加した。3〜4日毎に新しい抗生物質添加済みの培地と交換し、約2週間後、コロニーを形成した薬剤耐性クローンを得た。トランスフェクションを３回実施し、薬剤耐性クローンを最終的に合計407個分取した。全てのクローンについて、ゲノムDNAをフェノール/クロロホルム法、エタノール沈殿法により抽出した。
【００４０】
(4) 導入クローンの解析
＜PCR法による解析＞
表２に示したプライマーセットを用いて、相同組換えを起こしたと考えられる３カ所の領域を増幅した。407個の薬剤耐性クローンを解析した結果、期待される増幅が３カ所とも得られたクローンは25個だった。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
＜サザンブロット法による解析＞
PCR法による解析によって得られた25個のクローンについて、さらにサザンブロット法による解析を行った（図４）。２種類の制限酵素HindIII及びNcoIのいずれかを用いてゲノムDNAを消化し、0.5% アガロースゲルで電気泳動した。ナイロンメンブレンにトランスファーした後、図４に示す2種類のプローブ（FLJ5'(配列番号７)及びFLJ3'(配列番号８)）をMegaprime DNA labeling systems（Amersham biosciences）を用いてそれぞれ[32P]標識し、ハイブリダイゼーションを行った。得られたシグナルはイメージングプレート（FUJIFILM）に露光させ、バイオ・イメージングアナライザー BAS-2500（FUJIFILM）にて解析した。サザンブロット解析の結果、最終的に期待通りの相同組換えを起こしたクローンは１個であった（F117クローン）。クローンF117は、限界希釈法によりサブクローン（F117-47及びF117-123）を分取し、いずれもサザンブロット法により、アレルの状態を確認した（図４）。
【実施例３】
【００４３】
組換え体の、脱メチル化剤に対する感受性の確認
5-aza-dC処理を行い、脱メチル化剤に対する感受性を確認した。5-aza-dC処理は、以下のように行った。
【００４４】
細胞を10-cmディッシュに3 x 105 cells/dishとなるように播種し、24時間後、5-aza-dCを最終濃度0.1、0.5、1、5、10μMとなるように培地に添加した。5-aza-dC溶液は、使用直前にリン酸緩衝液に溶解した。5-Aza-dC添加の72時間後に細胞を回収し、ゲノムDNA及び全RNAを抽出、または、蛍光の観察を行った。
＜MSPおよびRT-PCRによる確認＞
クローン(F-117)及びサブクローンF117-47について、5-aza-dC処理を行ったところ、メチル化特異的PCR(MSP)によりプロモーターの脱メチル化を確認し、さらに、RT-PCRによりEGFP遺伝子mRNA発現を認めた（図５）。なお、MSP及びRT-PCRは以下のように行った。
（MSP）
ゲノムDNAを、制限酵素BamHIで消化した。20μLに溶解した500 ngのDNAに、用時調製し
たNaOHを終濃度0.6 Nとなるように添加し、37℃で15分間保温した。用時調製した3.6 M 重亜硫酸（Sigma）120μLと10 mM ヒドロキノン（Sigma）9μLを添加し、95℃（30 sec）と50℃（15 min）を20サイクル行った。その後、Wizard DNA cleanup system (Promega)を用いて脱塩した後、0.6 N NaOHを添加、脱スルホン化した。処理後のDNAはエタノール沈殿後、20μLのTris/EDTA緩衝液に溶解した。
【００４５】
重亜硫酸処理を行ったDNA溶液1μLを、メチル化されたDNAから生成される塩基配列に特異的なプライマーセット（M）、及び、メチル化されていないDNAから生成される塩基配列に特異的にプライマーセット（U）、それぞれを用いてPCRにより増幅した。
【００４６】
メチル化されたDNAに特異的なプライマーの配列は、5'-TTAATCGAATTCGGAAGC-3' (センス；配列番号９)、5'-TCAACTCCTAACCGAACG-3' (アンチセンス；配列番号１０)である。反応条件は、95℃で10 min反応させた後、94℃（30 sec）55℃（1 min）、72℃（1 min）を35サイクル行った。
【００４７】
メチル化されていないDNAに特異的なプライマーの配列は、5'-TTTGGAGTGTGGGGGTGT-3' (センス；配列番号１１)、5'-AATCAACTCCTAACCAAACAC-3' (アンチセンス；配列番号１２)である。95℃で10 min反応させた後、94℃（30 sec）58℃（1 min）、72℃（1 min）を35サイクル行った。
（RT-PCR）
全RNAをDNase I (Life Technologies)で処理後、３μgの全RNAから、ランダムプライマー(Promega)とSuperscript II reverse transcriptase (Life Technologies)を用いて逆転写反応を行った。作製したcDNA 20μLのうち1μLを鋳型にし、下記のPCR用プライマー（200 nM）とSYBR Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems)を用いてPCRを行い、iCycler iQ 検出系(Bio-Rad Laboratories)を用いて、PCRでの増幅を観察した。既知の分子数（10,102,103,104,105,106,107）のEGFP cDNAを含有する試料の増幅と比較し、被験試料中のcDNA分子数を定量した。得られたEGFP cDNAの分子数は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)のcDNAの分子数で補正した。
【００４８】
PCRプライマーの配列は、EGFP、 5'-TGCCCGACAACCACTACCTG-3' (センス；配列番号１３)、5'-TCCATGCCGAGAGTGATCCC-3' (アンチセンス；配列番号１４)；GAPDH、5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (センス；配列番号１５)、5'-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3' (アンチセンス；段落番号１６)。PCRの条件は、50℃（3 min）、95℃（10 min）、94℃（30 sec）60℃（30 sec）72℃（30 sec）を40サイクル繰り返した。
＜FACSによる確認＞
さらに、サブクローンF117-47及びF117-123について、5-aza-dC処理により誘導された脱メチル化による蛍光の発現を、FACSにより以下のように解析した。
【００４９】
5-aza-dC処理した細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、トリプシン処理により細胞を回収した。細胞密度が約1 x 106 /mLとなるようにリン酸緩衝液に懸濁し、FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson)にて、蛍光をもった細胞の割合を測定した。得られた結果は、Cell Quest software (Becton Dickinson)にて解析した。
【００５０】
この結果、図６に示すように、5-aza-dC処理細胞では、明らかな蛍光の出現を認めた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例２におけるFLJ32130遺伝子へのターゲティング戦略を示す。
【図２】実施例２におけるターゲティングベクターの構築の概略を示す。
【図３】実施例２におけるターゲティングベクターの構築を概略を示す。
【図４】実施例２におけるサザンブロット法による組換え体の確認結果（電気泳動写真）を示す。
【図５】実施例３における5-aza-dCによるFLJ32130遺伝子プロモーターの脱メチル化、及び、導入遺伝子の発現誘導の結果（電気泳動写真）を示す。
【図６】実施例３におけるFACSによる蛍光出現の確認結果（電気泳動写真）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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