(57)【要約】【課題】        肝細胞の三次元培養方法を提供することにあり、また、肝細胞から誘起される血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、チトクロームＰ４５０、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、カルボキシラーゼ、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ−４α）等の生理活性物質を生体外で三次元的に、かつ大量に産生させる肝細胞の培養方法を提供することにある。【解決手段】    三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、培養液を連続供給することにより当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から生理活性物質を産生させることを特徴とする肝細胞の培養方法および前記肝細胞の樹立細胞株がＦＬＣシリーズ株である肝細胞の培養方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、培養液を連続供給することにより当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から生理活性物質を産生させることを特徴とする肝細胞の培養方法。
【請求項２】
前記生理活性物質が、
（１）血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、
（２）チトクロームＰ４５０ １Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４、
（３）プレグナンＸ受容体、
（４）カルボキシラーゼまたは該アイソザイム、
（５）肝細胞核因子４α  および
（６）薬物トランスポーター
からなる群より選択される生体成分である請求項１に記載の肝細胞の培養方法。
【請求項３】
前記肝細胞の樹立細胞株がＦＬＣシリーズ株である請求項１に記載の肝細胞の培養方法。
【請求項４】
前記三次元細胞培養担体が、シラン(TM)またはヒドロキシアパタイトである請求項１に記載の肝細胞の培養方法。
【請求項５】
前記三次元細胞培養装置が、ラジアルフロー型バイオリアクターまたは液体培地による培地流動型バイオリアクターである請求項１に記載の肝細胞の培養方法。
【請求項６】
肝細胞を、三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液の存在下において供給し増殖させることにより産生させてなる三次元生理活性物質。
【請求項７】
前記生理活性物質が、
（１）血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、
（２）チトクロームＰ４５０ １Ａ２、２Ａ６、２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４、
（３）プレグナンＸ受容体、
（４）カルボキシラーゼまたは該アイソザイム、および
（５）肝細胞核因子４α
からなる群より選択される生体成分である請求項６に記載の三次元生理活性物質。
（６）薬物トランスポーター
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来細胞、動物細胞および植物細胞の三次元的な立体培養により、生体内の細胞が有する本来的な生物活性を誘起し、かつ活性化することを可能にする細胞の三次元培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過去４０年間、動物細胞の培養技術において、平底フラスコ等を用いた平面培養が一般化しており、生体内の条件を再現した細胞の生体外における培養は行なわれていない。三次元的な立体培養は、いずれの細胞についてもほとんどが行なわれていない状況にあり、かかる平面培養技術による二次元的、人工的な方法で培養された細胞は、本来的に細胞のもつ酵素活性および生合成活性等を発揮し得ないことが報告されるに至っている（Nature 424, 870(2003)等）。
【０００３】
特に、肝細胞の如き特定の細胞の増殖により得られる医学的研究および治療に有用な生理活性物質を生体内における形態と同一の形態でしかも大量産生せる試みは皆無であり、生体内の生理活性物質の形態に関する知見は得られていない。しかも、肝細胞の三次元培養による生理活性物質の生体外での産生および産生量についても開示されたものがない。
【０００４】
かかる状況から、従来、生理活性物質を生体外で培養肝細胞を用いて大量に産生させ得ることについては、報告はなく、特に、生体外における肝細胞の増殖による血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、チトクロームＰ４５０、プレグナンＸ受容体、カルボキシラーゼ等の産生系は未だ提案されていない。
【非特許文献１】ネイチュアー（Nature）424, 870(2003)
【非特許文献２】サイエンス（Science）302, 46(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の課題は、肝細胞の三次元培養方法を提供することにあり、また、本発明の課題は、肝細胞から誘起される血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、チトクロームＰ４５０、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、カルボキシラーゼ、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ−４α）等の生理活性物質を生体外で三次元的に、かつ大量に産生させる肝細胞の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討を重ねたところ、特定の三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に肝細胞を含有する培養液を供給し、当該担体に担持させた当該肝細胞に培養液を連続的に供給することにより、肝細胞を増殖させ、生理活性物質の産生が生体内でのそれらと近似した量と質において発現し、平面培養に比較して著しく量産可能なことを見い出し、かかる知見に基いて本発明の完成に到達した。
【０００７】
かくして、本発明によれば、
三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、次いで、培養液を連続して供給することにより、当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から生理活性物質を産生させることを特徴とする肝細胞の培養方法
が提供される。
【０００８】
また、本発明によれば、
三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、次いで培養液を連続して供給することにより当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から産生させてなる生理活性物質
が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、本来的にヒト由来細胞、動物細胞、植物細胞、特に肝細胞のもつ生理活性の誘起や生理活性物質の産生が、生体内でのそれらと同様であり、または近い量と質において発現されることとなり、動物実験が不必要となる場合もある。さらに、これら細胞の正確、かつ資質的な性状を明確に把握できる。このことにより、今日までの平面培養による蓄積された細胞に関する知見を修正せざるを得ない状況にある。
【００１０】
チトクローム；ＣＹＰ３Ａ４は肝臓における薬剤代謝の約５０％に関与しているといわれ、本発明の方法に係るＲＦＢ（ラジアル・フロー・バイオリアクター（以下本明細書において同じ。）。）培養による肝細胞カルシノーマであるＦＬＣ−４またはＦＬＣ−５の立体培養によって、この活性が１００倍以上に増大することが明らかとなった。本発明により、肝機能の重要な働きである薬剤の代謝機構が、生体中の肝機能と同様の活性を持つことにより、本細胞培養により直接的に薬物動態のモデルとなることが可能となった。また肝臓の本来的な生産成分である血清アルブミンの生産量も、本発明により生体におけるアルブミン生産量に近い値が得られている。これは、肝機能が本来的な能力を発揮しうる培養条件であることを示している。肝機能のもう一つの重要な活性であるアンモニアの代謝活性もきわめて高く、ＲＦＢ培養開始４日に塩化アンモニア５ｍＭの負荷により、さらに４日後よりアンモニア濃度の低下と尿素濃度の上昇がみとめられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、培養液の供給を継続しながら当該肝細胞を増殖させ、生理活性物質を産生させる肝細胞の三次元培養方法に関するものであるが、さらに好ましい実施態様として、次の１）〜３）に掲げるものを包含する。
【００１２】
１）前記三次元細胞培養担体が、シラン(TM)またはヒドロキシアパタイトである肝細胞の培養方法。
２）前記三次元細胞培養装置が、前記三次元細胞培養担体が収容されたラジアルフロー型バイオリアクターである肝細胞の培養方法。
３）前記細胞が肝細胞ばかりでなく、膵細胞等、増殖性を持ち、従来の平面培養では生物活性を発現できない細胞の培養方法。
【００１３】
本発明に係る肝細胞の培養方法において用いられる肝細胞は、ヒトの肝臓から採取したものを平板培養法等による培養により増殖したものでよく、肝細胞の樹立細胞株が好ましい。特に好ましい細胞株として本発明者が提案したＦＬＣ−１、ＦＬＣ−２、ＦＬＣ−３、ＦＬＣ−４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６５）、ＦＬＣ−５、ＦＬＣ−６、ＦＬＣ−７、ＨｅｐＧ2 （ＡＴＣＣにより入手可）等を挙げることができる。肝細胞は、三次元細胞培養装置へ供給後、肝細胞の培養条件、５〜６％炭酸ガス気流中、３５〜３８℃、好ましくは、３６〜３７℃で通常７〜１４日間培養すると、肝細胞が十分に増殖して前記生理活性物質の産生を開始するに至る。
【００１４】
本発明に係る肝細胞の三次元培養方法によれば、ヒト由来の肝細胞ＦＬＣ−４を用いることにより肝臓細胞の本来的な産生成分である血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン等生理活性物質を平面培養に比較して約１０倍産生させる培養方法を提供することができる。これは、生体内におけるアルブミン産生量に近似したものである。
従って、本発明に係る生体外における培養条件は、肝機能が本来的な能力を発揮できる条件に該当しているものといえる。
【００１５】
また、本発明に係る肝細胞の三次元培養方法によれば、ヒト由来の肝細胞ＦＬＣ−５を用いることにより、薬物代謝に重要なチトクロームＰ４５０（以下「ＣＹＰ」という。）１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４を平面培養に比較して数１００倍産生させる培養方法を提供する。
同様に、本発明によれば、ヒト由来の肝細胞ＦＬＣ−５を用いることにより、副腎ホルモン系のプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）を平面培養に比較して約２２倍産生させることが可能な肝細胞の三次元培養方法を提供する。
また、ＦＬＣ−５細胞を用いることにより、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ−４α）を平面培養に比較して約１．７倍産生可能な肝細胞の培養方法を提供する。
さらに、本発明によれば、ＦＬＣ細胞によれば、肝特異性酵素、カルボキシラーゼおよびそのアイソザイムを平面培養に比較して約２００倍産生させる肝細胞の培養方法を提供する。
また、本発明によれば、肝細胞における薬物代謝に係るトランスポーター、酵素の産生を平面培養に比較して数１０倍以上で行なう肝細胞の三次元培養方法を提供する。
【００１６】
本発明の肝細胞の培養方法において用いられる培養液は、肝細胞を増殖させることができるものであれば、如何なる組成のものでもよく、無機質、糖、アミノ酸、ペプチド、ビタミン、有機酸、核酸、ｐＨ調整剤、酵素等の細胞の培養に必要な成分を含有するものであればよい。
【００１７】
例えば、無機質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏなどが挙げられ、アミノ酸、ペプチドとしては、Ｌ−アスパラギン塩酸塩、Ｌ−アラニン、アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタメート、グリシン、グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、インシュリンなどが挙げられ、糖としては、糖や糖アルコール、配糖体などが挙げられ、例えばＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、イノシトールなどが挙げられる。有機酸としては、遊離の酸又はエステルなどの有機酸誘導体が挙げられ、例えばコハク酸、コリン二酒石酸（ｃｈｏｌｉｎｅ ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）、葉酸、ピルビン酸ナトリウム、グリセロリン酸などが挙げられる。ビタミン類としては、塩酸ピリドキサール、リボフラビンなどが挙げられる。核酸としては、ウリジンなどが挙げられる。ｐＨ調整剤としては、ＮａＯＨ、炭酸ガス、ＮａＨＣＯ３などが挙げられる。
【００１８】
培養液としては、市販の培養液を用いることもできる。市販の培養液の組成を例示すると次の如きものである（ｍｇ／Ｌ）。
【表１】
2005130758.tif 000003
【００１９】
次に、細胞の培養方法に用いられるバイオリアクターについて説明する。
本発明に係る細胞の培養方法に用いられるバイオリアクターとしては、ラジアルフロー型バイオリアクターおよび培地流動型バイオリアクターを挙げることができる。
前記ラジアルフロー型バイオリアクターは、細胞が固定化された担体を培養槽内に充填した固定層型のものであれば、特に限定されるものではなく、従来、提案されている各種形式のものを使用することができる。例えば、一例を挙げると、図５に示すラジアルフロー型バイオリアクター１は、円筒形の本体２内にＩＫＶＡＶ Ｃ60 フラーレンを含有する粒状の三次元細胞培養担体３が充填されたものである。
【００２０】
この形式のバイオリアクターでは、タンク下端から上方へ培養液が供給され、上方出口から排出され、培養液は培養液貯蔵容器（図示なし。）に蓄えられる。
また、ラジアルフロー型バイオリアクターは、複数の酸素補強用パイプ、複数の培養液回収パイプが設けられ、担体の充填位置との関連で栄養分濃度、溶存酸素濃度がリアクター内に均一に分布するように配置される。
さらに、他の形態のラジアルフロー型バイオリアクターとして、ＷＯ０１／０１４５１７号再公表公報の第１図に記載されている三次元的細胞培養担体が充填されたラジアルフロー型バイオリアクターを用いることができる。
【００２１】
［実施例］
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。もっとも本発明は、下記実施例により限定されるものではない。
なお、細胞は、次の方法で培養し、細胞培養装置、細胞培養担体、分析製造等は以下のものを用いた。
【００２２】
（１）細胞培養方法
培養液調整槽に培養液を装入し、これに酸素、二酸化炭素および苛性アルカリ等を添加し、酸素濃度、二酸化炭素濃度およびｐＨを所定の範囲に調整し、培養装置（ラジアルフロー型バイオリアクター）に供給した後、別途、培養した肝細胞を培養後に添加し、当該バイオリアクターに供給し、バイオリアクター内の細胞培養担体に担持させた。
次いで、培養担体上の細胞に培養液を供給し、前記培養条件を制御しながら、循環させ、細胞を増殖させ、担体上および培養液上清中の生理活性物質の産生量を測定した。
（２）細胞培養装置
ラジアルフロー型バイオリアクター（以下、「ＦＲＢ装置」という。）（エイブル社製「ＲＡ−１５」）および附属装置を使用した。
（３）細胞培養担体
ヒドロキシアパタイト；ペンタックス社製「セルヤード２００」
（４）分析装置等
・ＰＣＲ装置および試薬キット；パーキンエルマー  アプライド  バイオシステムズ（PerkinElmer Applied Biosystems) 社製「７７００型およびＭＭＲキット」
・液体クロマトグラフィー装置等；「シマヅＬＣ’１０Ａ」
【実施例１】
【００２３】
ヒト由来の肝がん細胞ＦＬＣ−４を用い、培養液として無血清（味の素（株）製「ＡＦＳ１０４」）を用いた。５％炭酸ガス気流中３７℃で４日間培養した。
培養後、培地上清液中のアルブミン量を液体クロマトグラフィーで定量した。
本発明に係るＲＦＢ培養によれば、図１に示すように平面培養に比較して約７倍の産生量を得た。
【実施例２】
【００２４】
ヒト由来の肝がん細胞ＦＬＣ−５を前記培養方法により培養液として無血清ＡＦＳ１０４（味の素社製）を用い、５％炭酸ガス気流中３７℃で４日間培養した。培養後、培養液上清中および培養担体から分離したＣＹＰ３Ａ４の産生量についてｍＲＮＡをマーカーとして定量し、平面培養における産生量と比較したところ、図２に示すように本発明方法による培養方法は、１０８倍高い産生量を示した。
培養した細胞は、０．０２％のＥＤＴＡを添加したトリプシン（２５ＵＳＰ単位／ｍｌ、ＤＩＦＣＯ製）で処理した。ミクロソーム分画は、１０００ｒｐｍ−５分、１００００ｒｐｍ−１０分の遠心処理の後、１０００００ｒｐｍ−６０分のペレット分画を使用した。ＣＹＰの誘発剤としてリンファンピシンを添加した。また、ＧＡＰＤＨのＲＮＡ量を用いてｍＲＮＡ値の補正を行なった。
【実施例３】
【００２５】
ヒト由来の肝がん細胞ＦＬＣ−５を前記細胞培養方法により、培養液として無血清ＡＦＳ１０４（味の素社製）を用い、５％炭酸ガス気流中３７℃で４日間培養した。培養後、培養液上清中に産生した副腎ホルモン系のプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）の含有量についてｍＲＮＡをマーカーとして実施例２の条件と同一の条件でＰＴ−ＰＣＲ法により定量した。
ＰＸＲは、リンファンビシンの誘導により平面培養による産生量と比較したところ、図３に示すように約２２倍であった。
【実施例４】
【００２６】
ヒト由来の肝がん細胞ＦＬＣ−５を前記細胞培養方法により、培養液として無血清ＡＦＳ１０４（味の素社製）を用い、５％炭酸ガス気流中３７℃で４日間培養した。培養後、培養液上清中に含有する肝細胞核因子４α（ＨＮＦ−４α）についてｍＲＮＡをマーカーとしてＲＴ−ＰＣＲ法により定量した。定量条件は、実施例２の条件と同一とした。
肝細胞核因子の産生量は、図４に示すようにリファンピシンの誘導により平面培養に比較して約１．７倍であった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、肝細胞の三次元培養方法であって、生理活性物質を生体内における形態・量と同一の形態・量による産生を実現する肝細胞の三次元培養方法を提供するものである。
本発明によれば、従来の二次的・平面的培養では得られなかった形態・量の生理活性物質を得ることができ、動物実験が不必要となる機会を与え、さらに、細胞の正確かつ資質的な性状の明確な評価手段を提供する。
従って、本発明は、今日までの平面培養による蓄積された細胞の知見を根底からくつがえす機会を提供するものであり、新規理論に基づく生化学の確立と新規産業の創成に寄与するところ極めて大きいものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る肝細胞ＦＬＣ−４の培養方法（ＲＦＢ）と従来法の平面培養によるアルブミン産生量の比較図である。
【図２】本発明に係る肝細胞ＦＬＣ−５の培養方法（ＲＦＢ）と従来法の平面培養によるＣＹＰ３Ａ４の比較図である。
【図３】本発明に係る肝細胞ＦＬＣ−５の培養方法（ＲＦＢ）と従来法の平面培養によるＰＸＲαの比較図である。
【図４】本発明に係る肝細胞ＦＬＣ−５の培養方法（ＲＦＢ）と従来法の平面培養によるＨＮＦ−４αの量の比較図である。
【図５】ラジアルフロー型バイオリアクターを例示した解説図である。
【符号の説明】
【００２９】
１  ラジアルフロー型バイオリアクター
２  バイオリアクター本体
３  細胞培養担体
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図５】
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