(57)【要約】    【課  題】既知の挿入配列と異なる制御機構により染色体上に変異又は導入を可能とする新規な挿入配列を単離することである。また、新規な挿入配列が組み込まれたプラスミドを作成すること、又はコリネ型細菌の形質転換体を作成することである。    【解決手段】枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有し、コリネ型細菌内で複製可能なプラスミド、例えばプラスミドｐＭＶ５を用いて形質転換し、スクロースを含有するプレート上に塗抹し、生育してくるスクロース耐性株よりプラスミドを抽出することにより、挿入配列を分離取得する。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌内で機能する配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列を有することを特徴とする挿入配列。
【請求項２】
挿入配列内に少なくとも一つの薬剤耐性遺伝子を含むことを特徴とする請求項１記載の挿入配列。
【請求項３】
染色体上に転位させ、増幅させることを目的として、プラスミドに組み込まれていることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の挿入配列。
【請求項４】
コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６）、ＡＴＣＣ１３０３２株又はＡＴＣＣ３１８３１株の形質転換に使用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の挿入配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌由来の新規なＤＮＡ塩基配列を有する挿入配列（insertion sequence：ＩＳ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスポゾン、挿入配列のような転位因子は、原核細胞・真核細胞において見いだされている。また、微生物の挿入配列は、大腸菌由来のもの、赤痢菌由来のもの、酢酸菌由来のもの、マイコプラズマ由来のものなどにおいて広く研究されている（非特許文献１〜４参照）。
微生物における転位配列の１つである挿入配列には、いくつかの特徴がある。例えば、挿入配列はおよそ１〜２ｋｂの大きさを有しており、その両端にはインバーテッドリピート〔逆方向反復（塩基）配列：inverted repeat (sequence)；ＩＲ〕が存在している。また、微生物染色体に挿入配列が挿入されたときに、ターゲットＤＮＡ塩基配列（転位部位）での重複配列が生じる等である。
【０００３】
近年、コリネ型細菌においても、転位因子である挿入配列やトランスポゾンが相次いで報告されている。具体的には、ＩＳＬ３ファミリーに属するＩＳ３１８３１、ＩＳＣｇ１、ＩＳ１３８６９、ＩＳ７１９、ＩＳ７１４、ＩＳ３ファミリーに属するＩＳ１２０６、ＩＳ９０３、ＩＳ３０ファミリーに属するＩＳＣｇ２、ＩＳ１５１３、ＩＳ２５６ファミリーに属するＩＳ１２４９、ＩＳ１１３２などである（特許文献1〜５、非特許文献５〜１１参照）。
【０００４】
微生物由来の挿入配列などの転位因子を単離する手法としては、枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子産物を利用する方法が知られている（非特許文献１２、１３参照）。
すなわち、ｓａｃＢ遺伝子産物は培地中のスクロースによって誘導生産されるので、本遺伝子を有する大腸菌を、スクロースを含有する培地で培養すると、本遺伝子の発現により、大腸菌は溶菌し、生育阻害をおこすことが知られている（非特許文献１４参照）。
そこで、ｓａｃＢ遺伝子を有するプラスミドで大腸菌を形質転換し、スクロースを含有するプレート上に生育可能になった大腸菌からプラスミドを抽出すると、このプラスミド上のｓａｃＢ遺伝子が欠失もしくは挿入変異（失活）を起こしているものが得られる。この挿入変異（失活）をおこしたものより転位因子を単離することができる。
【０００５】
コリネ型細菌においても、ｓａｃＢ遺伝子は生育阻害を引き起こすことが知られている（非特許文献１３参照）。
【０００６】
微生物に関しては、既に１００株以上の全ゲノム解析が終了し、近年、コリネ型細菌に関しても全ゲノム配列があいついで決定されている（非特許文献１５〜１７参照）。
ゲノム情報からの発現機能を重要とするポストゲノム時代に入った現在、コリネ型細菌のような産業上重要な微生物に於いては、より効果的、効率的な遺伝子の組み換えを行なうべく、多数遺伝子導入法、多数遺伝子削除法、そして、繰り返しての染色体ＤＮＡに変異、削除、導入等の改質操作が一段と重要性を増している。
【０００７】
挿入配列を利用した形質転換法の場合に、２度目以降に同種の挿入配列を変異、削除又は導入に用いると、制御機構が同一なため１度目に導入した挿入配列が染色体上を再度転位する可能性があり、安定な染色体変異、削除又は導入株を得ることができない。従って、お互いに制御機構が異なる挿入配列を用いることが必要となる。
【特許文献１】特開平７− １０７９７６号公報
【特許文献２】特開平９−７０２９１号公報
【特許文献３】特開平９−７０２９１号公報
【特許文献４】特開平９−７０２９１号公報）
【特許文献５】欧州特許出願公開第０２５２５５８号公報
【非特許文献１】モル．ジェン．ジェネット（Mol. Gen. Genet），１９７３年，第１２２巻，ｐ．２６７−２７７
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J. Bacteriol），１９９０年，第１７２巻，ｐ．４０９０−４０９９
【非特許文献３】モル．マイクロバイオール（Mol. Microbiol），１９９３年，第９巻，２１１−２１８
【非特許文献４】モル．マイクロバイオール（Mol. Microbiol），１９９３年，第７巻，５７７−５８４
【非特許文献５】バーテス  エイ．エイ．（Vertes,A.A.），外４名，モル．マイクロバイオール（Mol.Microbiol），１９９４年，第１１巻，ｐ．７３９−７４６
【非特許文献６】ジャガー，ダブル．（Jager,W.），外３名，エフエーエムエス  マイクロバイオロジー  レターズ （FEMS Microbiol Lett.），１９９５年，第１２６巻，ｐ．１−６
【非特許文献７】ジーン（Gene），１９９６年，第１７０巻，ｐ．９１−９４
【非特許文献８】モル．マイクロバイオール（Mol. Microbiol），１９９４年，第１１巻，７３８−７４８
【非特許文献９】モル．ジェン．ジェネット（Mol. Gen. Genet），１９９９年，第２６２巻，ｐ．５６８−５７８
【非特許文献１０】モル．ジェン．ジェネット（Mol. Gen. Genet），２０００年，第２６３巻，ｐ．１−１１
【非特許文献１１】プラスミド（Plasmid），１９９５年，第３４巻，ｐ.１１９−１３１
【非特許文献１２】ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J. Bacteriol.），１９８５年，第１６４巻，ｐ．９１８−９２１
【非特許文献１３】ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（J. Bacteriol.），１９９２年，第１７４巻，ｐ．５４６２−５４６５
【非特許文献１４】モル．ジェン．ジェネット（Mol. Gen. Genet），１９８３年，第１９１巻，ｐ．１３８−１４４
【非特許文献１５】野中  寛，外７名，「Corynebacterium glutamicum R ゲノム解析」，日本農芸化学会2003年度大会講演要旨集，２００３年４月，ｐ．２０
【非特許文献１６】イケダ  エム．（IkedaM,），外１名，アプリ．ミクロバイオール．バイオテクノール．（Appl Microbiol Biotechnol.），２００３年，第６２巻，ｐ．９９−１０９
【非特許文献１７】ニシオ  ワイ．（Nishio Y），外１０名，ゲノム  リサーチ（Genome Res.），２００３年，第１３巻，ｐ．１５７２−１５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、既知の挿入配列と異なる制御機構により染色体上に変異又は導入を可能とする新規な挿入配列を単離することである。また、本発明の別の目的は、新規な挿入配列が組み込まれたプラスミドを作成すること、又はコリネ型細菌の形質転換体を作成することである。
なお、本発明において、「挿入配列」とは、コリネ型細菌染色体上に存在しており、染色体上もしくはプラスミド上に転位することが可能なＤＮＡ塩基配列を意味するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ｓａｃＢ遺伝子を利用する方法により、転位因子の１つである配列番号１に示される配列を有する新規な挿入配列を単離することに成功し、さらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）コリネ型細菌内で機能する配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列を有することを特徴とする挿入配列、
（２）挿入配列内に少なくとも一つの薬剤耐性遺伝子を含むことを特徴とする上記（１）記載の挿入配列、
（３）染色体上に転位させ、増幅させることを目的として、プラスミドに組み込まれていることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の挿入配列、および
（４）コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６）、ＡＴＣＣ１３０３２株又はＡＴＣＣ３１８３１株の形質転換に使用されることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の挿入配列、
に関する。
【００１０】
本発明の挿入配列は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の後記配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列を有することを特徴とする。
そして、本発明の挿入配列は、これまでコリネ型細菌から見出された挿入配列とはＤＮＡレベルで相同性を有さず、また、コリネ型細菌内で機能する既知挿入配列内に存在するトランスポザーゼ遺伝子（アミノ酸レベル）やインバーテッドリピート（ＤＮＡレベル）に対しても相同性を有さない新規なものである。
本発明の挿入配列は、後記実施例で示す如く、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)Ｒ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９７６）、ＡＴＣＣ１３０３２株およびＡＴＣＣ３１８３１株等の幾つかのコリネ型細菌に関して、これまで見出されてきた挿入配列とは異なるものである。
【００１１】
本発明の挿入配列を、供給源微生物であるコリネ型細菌から調製するための基本操作の一例を述べれば次のとおりである。すなわち、本発明の挿入配列は、上記コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９株の染色体上に存在し、本菌株を、枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有し、コリネ型細菌内で複製可能なプラスミド、例えばプラスミドｐＭＶ５を用いて形質転換し、スクロースを含有するプレート上に塗抹し、生育してくるスクロース耐性株よりプラスミドを抽出することにより、分離取得することができる。
【００１２】
より具体的には、先ず、枯草菌、例えばマールバーグ(Marburg) 株〔Biochem. Biophys. Res. Commun., 第119巻, p.795-800 (1984年)〕の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、既知のｓａｃＢおよびｓａｃＲ（ｓａｃＢ遺伝子の発現制御遺伝子）遺伝子を含む領域をＰＣＲ法により増幅単離する。該増幅ＤＮＡ断片を大腸菌・コリネ型細菌のシャトルベクターに導入し、このベクターを用いて大腸菌（エシェリヒア・コリ；Escherichia  coli）ＪＭ１０９（宝酒造より市販）を形質転換し、形質転換体を取得する。
次いで、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、本プラスミドを用いてコリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９を形質転換し、スクロースを含有するプレート上に生育してくるスクロース耐性株よりプラスミドを抽出する。これらのプラスミドのうち、もとのプラスミドよりサイズが大きくなっているものを選択し、本プラスミドのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域に挿入されているＤＮＡ断片を単離することにより、挿入配列を分離取得することができる。
【００１３】
このようにして得られる挿入配列の一つとしては、上記コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９株の染色体ＤＮＡ上に存在し、大きさが約１．２ｋｂの断片を挙げることができる。
この約１．２ｋｂの挿入配列を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数および切断断片の大きさを下記第１表に示す。
【表１】
2005065649.tif 000002
【００１４】
上記表１において、制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを制限酵素で完全消化し、それらの消化物をそれ自体公知の方法に従って１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から決定した値を採用した。
また、「切断ＤＮＡ断片の大きさ」および「プラスミドの切断ＤＮＡの大きさ」は、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、大腸菌のラムダファージ（λphage）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、大腸菌のファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４phage）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片およびプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算出する。
なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさについては５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用することにより、より正確な断片の大きさを決定することができる。
プラスミドの大きさは、上記により得られた切断断片のそれぞれの大きさを加算して求めることができる。
【００１５】
一方、上記のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９の染色体ＤＮＡ由来の挿入配列の塩基配列は、プラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法〔dideoxy chain termination 法、Sanger, F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第74巻, p.5463 (1977年)〕により決定することができる。このようにして決定した上記約１．２ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を有する挿入配列は、後記配列表の配列番号１に示す配列を有するものである。
【００１６】
上記の塩基配列を包含する本発明の挿入配列は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ(Applied  Biosystems)社製３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよい。
【００１７】
また、前記の如くコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９の染色体ＤＮＡから取得される本発明の挿入配列は、前記挿入配列の機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これら置換、削除、挿入又は転位された塩基配列のいずれもが、本発明の挿入配列に包含される。
【００１８】
本発明の挿入配列の単離に用いる枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドとしては、例えばプラスミドｐＭＶ５（Vertes,A.A.,  Inui,M.,  Kobayashi,M.,  Kurusu,Y.  and  Yukawa,H.：Mol.Microbiol.,  第11巻,  p.739-746  (1994年)）が有利に使用できるが、同様の機能を有するプラスミドであれば、上記ｐＭＶ５に限定するものではない。上記ｐＭＶ５の外、ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域が導入可能な大腸菌・コリネ型細菌のシャトルベクターとしては、例えば、ｐＣＲ１（Kotrba,  P.,  Inui,  M.,  Yukawa,  H.： Biochem  Biophys  Res  Commun,  第289巻,  p.1307-1313  (2001年)）、特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１およびｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−２７６５７５号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３等を用いることができる。
【００１９】
上記枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドで形質転換しうる宿主コリネ型細菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  (Brevibacterium  lactofermentum)ＡＴＣＣ１３８６９；ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）およびその由来株；ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  (Brevibacterium  ammoniagenes)ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブレビバクテリウム・デバリカタム  (Brevibacterium  divaricatum)ＡＴＣＣ１４０２０等を好適に用いることができる。これらコリネ型細菌の中で、本発明の挿入配列の単離には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９を宿主として用いるのが最も好ましい。
【００２０】
上記宿主コリネ型細菌の前記組換えプラスミドによる形質転換は、それ自体公知の方法、例えばCalvin,  N.  M.  and  Hanawalt,  P.  C.,  Journal  of  Bacteriology,  第170巻,  p.2796  (1988年);  Ito,  K.,  Nishida,  T.  and  Izaki.  K.,  Agricultural  and  Biological  Chemistry,  第52巻,  p.293  (1988年)  等の文献に記載の方法により、例えば宿主微生物にパルス波を通電〔Satoh,  Y.  et  al.,  Journal  of  Industrial  Microbiology,  第5巻,  p.159  (1990年)参照〕することにより行うことができる。
【００２１】
かくして得られる形質転換体を、前記のとおり、スクロースを２〜１５％含有するプレート上に塗抹して培養し、生育してくる各スクロース耐性株を液体培養する。次いで、培養物よりそれ自体公知の通常用いられる方法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等によりプラスミドを抽出する。抽出したプラスミドを適当な制限酵素により解析し、もとのプラスミドよりサイズが大きいプラスミドを選択する。選択したプラスミドのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域に挿入されているＤＮＡ断片を単離することにより本発明の挿入配列を分離取得することができる。
【００２２】
上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素源、無機塩等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、スクロースが好適である。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることができる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を適宜培地に添加することができる。
【００２３】
培養は、通常、通気攪拌や振盪等（液体培養の場合）の好気条件下に、約２５℃〜約３５℃の温度で行うことができる。培養途中のpHは７〜８付近とすることができ、培養中のpH調整は酸又はアルカリを添加して行うことができる。培養開始時の炭素源濃度は、５〜１２容量％である。
かくして得られる培養物を、前記のとおりスクロースを２〜１５％含有するプレート上に塗抹して３３℃で１〜３日間培養することにより、挿入配列が導入されたスクロース耐性株を取得することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の挿入配列は、例えば、もともとコリネ型細菌染色体上に存在し、形質転換に用いたプラスミド上には存在しなかったＤＮＡ断片が、スクロース培地培養条件下（挿入配列の転位誘発は、一般的には栄養源や温度等に関するストレス環境下の培養条件にてなされる）、染色体上からプラスミド上に転位してくる現象を観察することによって証明できる。また逆に、プラスミド上に転位した挿入配列を染色体上に転位させることによって本発明の挿入配列の機能（形質転換機能）をさらに確認することができる。
したがって、本発明の挿入配列は、相互に独立した制御機構による染色体上へのトランスポゾン転位が可能となる結果、多重遺伝子組換え等の形質転換技術が効果的、効率的に実施できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来の挿入配列の単離：
（Ａ）ｓａｃＢ耐性株の単離
プラスミドｐＭＶ５（Vertes,  A.  A.,  Inui,  M.,Kobayashi,  M.,  Kurusu,  Y.  and  Yukawa,  H.  :Mol.Microbiol.,  第11巻,  p.739-746  (1994年)）をコリネ型細菌に導入し、該細胞を形質転換した。用いた宿主コリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９である。形質転換には電気パルス法を用いた。前記コリネ型細菌を１００ｍＬのＡ培地〔組成：尿素２ｇ、硫酸アンモニウム７ｇ、リン酸一カリウム０．５ｇ、リン酸二カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物  ０．５ｇ、硫酸マンガン・４〜６水和物  ６mg、硫酸鉄・７水和物  ６mg、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ、ビオチン２００μg、塩酸チアミン１００μgを脱イオン水に溶解して１リットルとする（pH７．４）〕で対数増殖初期まで培養した後、ペニシリンＧを１ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように添加してさらに２時間振盪培養した。培養菌体を遠心分離にて集め、２０ｍＬのパルス用溶液〔組成：２７２ｍＭスクロース、７ｍＭリン酸二水素カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム；pH７．４〕にて洗浄した。再度、遠心分離にて菌体を集め、５ｍＬのパルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍＬの細胞と上記プラスミドｐＭＶ５溶液２μL（１μｇ）とを混合し、氷中にて２０分間静置した。ジーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト２５μＦに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置した。全量を３０℃にて１時間培養した後、１０％スクロース、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地に塗抹した。３０℃で２日間培養した。
【００２７】
（Ｂ）挿入配列の単離
出現したスクロース耐性およびカナマイシン耐性株より、プラスミドを特開平１−９５７８５号公報記載の方法にて調製した。このプラスミドを各種制限酵素ＳｍａＩとＸｂａＩで切断し、その大きさを確認した。その結果、コントロールである形質転換に用いたプラスミドｐＭＶ５が１．９ｋｂで検出できるところが、２株において、３．１ｋｂのバンドが検出され、約１．２ｋｂ大きくなったプラスミドが存在することが判明した。なお、ｐＭＶ５の１．９ｋｂ  ＳｍａＩ・ＸｂａＩ遺伝子断片は、ｓａｃＢ遺伝子の中に存在しており、該大きさが約１．２ｋｂの挿入配列は、ｓａｃＢ遺伝子産物を不活性化していることが判明した。
【実施例２】
【００２８】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来の挿入配列の塩基配列決定：
実施例１で得られた大きさが約１．２ｋｂの挿入配列を特定するために、その塩基配列を、ｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド法により決定した。この結果、配列番号１に記載の配列が明らかとなった。本配列上には、３４３アミノ酸からなるオープンリーディングフレーム（open reading-frame；ＯＲＦ）が存在した。また、この挿入配列の両端には２２ｂｐ
5’側ＩＲ１；5’-TAGCTCCCCCAAAACAAAAGCT-3’  
3’側ＩＲ２；5’-TAGCTCTCCCAAATCAAAAGCT-3’  
からなるインバーテッドリピート（ＩＲ）、およびターゲット配列である２ｂｐ（5’-TA-3）のダイレクトリピートが存在した。この大きさが約１．２ｋｂの挿入配列を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数および切断断片の大きさは、前記第１表のとおりであった。その制限酵素切断点地図を図１に示す。
【実施例３】
【００２９】
挿入配列の存在と転位機能の確認
（Ａ）挿入配列の存在の確認
単離した挿入配列をプローブとして、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９の染色体ＤＮＡに対して、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブは、実施例１で得られた約１．２ｋｂの挿入配列を用い、ランダムラベリングキット（宝酒造より市販）を用いて作製した。サザンハイブリダイゼーションは、常法〔“Molecular Cloning ”, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 〕の通り行った。コントロールとして、コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（FERM  P-18976）の染色体ＤＮＡを用いた。この結果、該挿入配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９由来の染色体とハイブリダイズしたが、コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（FERM  P-18976）由来の染色体ＤＮＡとはハリブリダイズしなかった。すなわち、本発明の挿入配列は、コントロールであるコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の染色体には存在しないが、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４９９９染色体中に存在し、染色体上からプラスミド上に転位することが可能であることを示している。
【００３０】
（Ｂ）転位機能検出プラスミドの作製
上記で得られた大きさが約１．２ｋｂの挿入配列を、決定した配列をもとに、両末端と相補的で、かつＥｃｏＲＶサイトを有するオリゴヌクレオチド（表２）を合成し、ＰＣＲ法により増幅した。
【表２】
2005065649.tif 000003
【００３１】
得られた１．２ｋｂのＰＣＲ断片に制限酵素ＥｃｏＲＶ  ５ｕｎｉｔを加え、３７℃で１時間反応させ完全消化後、６５℃で１５分間処理し、酵素を失活させた。一方、プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）は、ＨｉｎｄＩＩＩ  ５ｕｎｉｔで完全消化後、ＤＮＡ  Blunting  Kit（宝酒造製）で平滑末端処理を行い、上記ＥｃｏＲＶ１．２ｋｂＰＣＲ断片と混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（pH７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔J.  Mol.  Biol.,  第53巻,  p.159  (1970年)〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造より市販）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶解〕に塗抹した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により処理し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８の大きさが２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさが約１．２ｋｂの挿入断片が認められた。次に、構築したプラスミドを、本プラスミドを１ケ所で切断する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子カセット（ファルマシア製）を挿入し、クロラムフェニコールとカナマイシンの両薬剤に耐性で、かつ挿入配列を有するプラスミドｐＨＳＧ３９８−ＩＳ１４９９９−Ｋｍを作製した。
尚、該プラスミドにおいて、ＨｉｎｄＩＩＩサイトは、約１．２ｋｂの挿入配列の末端付近に存在し、約１．２ｋｂのＤＮＡ断片にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を破壊しない。従って、コリネ型細菌内で増殖可能な複製領域を有さない本プラスミドを用いて、コリネ型細菌を形質転換し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取得すると、本プラスミドがコリネ型細菌染色体に挿入された株が得られる。このうち、クロラムフェニコール感受性の株は、挿入配列部分のみが染色体上に転位し、ｐＨＳＧ３９８−ＩＳ１４９９９−Ｋｍ全体がはいったものではないと判断でき、本発明で得られた挿入配列が、染色体上へ転位可能であることを示す。
【００３２】
（ｃ）転位の確認
プラスミドｐＨＳＧ３９８−ＩＳ１４９９９−Ｋｍをコリネ型細菌に導入し、該細胞を形質転換した。用いた宿主コリネ型細菌は、本挿入配列をもたないコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（FERM  P-18976）である。形質転換には上記記載の電気パルス法を用いた。カナマイシン耐性株５０株が得られた。このうち、４株のみがクロラムフェニコール耐性を示したが、残りは、クロラムフェニコール感受性であった。このことは、プラスミドｐＨＳＧ３９８−ＩＳ１４９９９−Ｋｍ上に存在する挿入配列がカナマイシン耐性遺伝子と共に、染色体上に転位したことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のインサーションシクエンスは、染色体上のいろいろの部位に転位・挿入することが可能であるので、遺伝子解析の有効な手段として用いることができる。また、挿入変異株の作製、遺伝子マッピング、プロモーター検索、遺伝情報の挿入そして特定遺伝子の破壊等にも利用でき、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のインサーションシーケンスの制限酵素切断地点地図を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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