(57)【要約】【課題】  核酸中の所望の塩基の種類をさらに正確に且つ再現性よく判別するための塩基種判別方法ならびにそれに用いるプライマーおよびキットを提供すること。【解決手段】  標的核酸の一塩基の置換領域の塩基種を判別するためのプライマーであって、前記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が前記標的核酸の前記置換領域に対応するように、当該標的核酸にハイブリダイズすることが可能な一本鎖核酸からなり、当該一本鎖核酸は、３’末端に、前記標的核酸の前記置換領域の予想され得る塩基のいずれかと相補的である塩基からなる置換対応領域と、前記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して非相補的な２つの塩基からなる非相補領域と、前記非相補領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して相補的な５以上の塩基からなる相補領域とを含む、塩基種判別用プライマー。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸における一塩基の置換領域の塩基種を判別する方法であって、
（ａ）一塩基の置換領域を有する二本鎖の標的核酸と、塩基種判別用プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓとを含む溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記溶液中において、前記塩基種判別用プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズさせ、前記塩基種判別用プライマーを始点とするプライマー伸長反応を進行させる工程と、
（ｃ）前記プライマー伸長反応の進行の程度を解析することによって、前記置換領域の塩基種を判別する工程とを含み、
前記塩基種判別用プライマーは、前記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が前記標的核酸のいずれか一方の鎖の前記置換領域に対応するように当該一方の鎖にハイブリダイズすることが可能な第一の一本鎖核酸からなり、
当該第一の一本鎖核酸は、
前記標的核酸の前記一方の鎖の前記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である一塩基からなる３’末端に位置する置換対応領域と、
前記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸の前記一方の鎖に対して非相補的な２つの塩基からなる非相補領域と、
前記非相補領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸の前記一方の鎖に対して相補的な５以上の塩基からなる相補領域とからなる、塩基種判別方法。
【請求項２】
請求項１に記載の塩基種判別方法において、
前記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いことを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項３】
請求項１に記載の塩基種判別方法において、
前記第一の一本鎖核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項４】
請求項１に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ａ）では、前記溶液中に、前記二本鎖の標的核酸の他方の鎖にハイブリダイズ可能な一本鎖核酸からなるリバースプライマーをさらに含み、
前記工程（ｂ）では、前記プライマー伸長反応を、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＬＡＭＰおよびＴＭＡからなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列増幅方法を用いて進行させることを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項５】
請求項４に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ｃ）では、前記プライマー伸長反応の進行の差に基づいて、前記置換領域の塩基種を判別することを特徴とする、塩基種判別方法。
【請求項６】
請求項４に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ｃ）では、前記塩基配列増幅方法によって増幅された塩基配列の増幅量を、電気泳動法、質量分析法、および液体クロマトグラフィーからなる群から選択されるいずれか１つの方法で測定することによって、前記プライマー伸長反応の進行の程度を解析することを特徴とする、塩基種判別方法。
【請求項７】
請求項１に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ｃ）では、前記プライマー伸長反応によって生成するピロリン酸の量を測定することによって、前記プライマー伸長反応の進行の程度を解析することを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項８】
請求項４に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ｃ）では、前記プライマー伸長反応によって生成するピロリン酸の量を測定することによって、前記塩基配列増幅方法によって増幅された塩基配列の増幅量を測定することを特徴とする、塩基種判別方法。
【請求項９】
請求項４に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ｃ）では、前記塩基配列増幅法によって増幅された塩基配列の増幅量を定量的に解析することによって、前記置換領域の塩基種を判別することを特徴とする、塩基種判別方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の塩基種判別方法において、
前記ピロリン酸の量の測定は、
工程（ｂ）からの前記溶液の少なくとも一部を含む試料中で、ピロリン酸を無機リン酸に変換する工程、
前記試料を、グリセルアルデヒド３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程、および、
前記測定系において、生成される電流値を測定する工程を包含し、
前記電流値が、前記試料中のピロリン酸の濃度を示すことを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項１１】
前記電子メディエータが、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１０に記載の塩基種判別方法。
【請求項１２】
前記測定系がジアホラーゼをさらに含む、請求項１０に記載の塩基種判別方法。
【請求項１３】
前記ピロリン酸の無機リン酸への変換は、前記試料中でピロリン酸をピロホスファターゼと反応させることによって行われる、請求項１０に記載の塩基種判別方法。
【請求項１４】
請求項７に記載の方法において、
前記ピロリン酸の量の測定は、
工程（ｂ）からの前記溶液の少なくとも一部を含む試料を、Ｈ＋−ピロホスファターゼを保持し且つＨ＋を通しにくい膜によって区画された少なくとも２つの領域を有する測定系の一方の領域に配置させる工程、および
前記測定系において、前記少なくとも２つの領域のいずれかにおいてＨ＋濃度の変化を測定する工程を包含し、
前記Ｈ＋濃度の変化の程度が、前記試料中のピロリン酸の濃度を示すことを特徴とする、塩基種判別方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、
前記ピロリン酸の量の測定は、
工程（ｂ）からの前記溶液の少なくとも一部を含む試料を、Ｈ＋−ピロホスファターゼを膜内に有する人工または天然の膜小胞を含む測定系に供する工程、および
前記測定系において、前記膜小胞内側または前記膜小胞外側におけるＨ＋濃度の変化を測定する工程を包含し、
前記Ｈ＋濃度の変化の程度が、前記試料中のピロリン酸の濃度を示すことを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項１６】
前記Ｈ＋濃度の変化の測定は、Ｈ＋濃度の変化を光学的変化に変換して測定する方法または電気的に測定する方法のいずれかによって行われる、請求項１４に記載の塩基種判別方法。
【請求項１７】
前記光学的変化に変換して測定する方法は、ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素、または膜電位感受性色素を使用する、請求項１６に記載の塩基種判別方法。
【請求項１８】
前記電気的に測定する方法は、金属電極法、ガラス電極法、ＩＳＦＥＴ電極法、パッチクランプ法、およびＬＡＰＳ法からなる群から選択される方法である、請求項１６に記載の塩基種判別方法。
【請求項１９】
前記光学的変化に変換して測定する方法では、前記膜小胞内側のＨ＋濃度の変化を、ｐＨ感受性色素を用いて測定する、請求項１７に記載の塩基種判別方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の塩基種判別方法において、
前記工程（ａ）では、前記溶液中に、第二の塩基種判別用プライマーをさらに含み、
前記第二の塩基種判別用プライマーは、前記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が前記第一の塩基種判別用プライマーがハイブリダイズする場合と同じ側の鎖の前記置換領域に対応するように、前記標的核酸の前記鎖にハイブリダイズすることが可能な第二の一本鎖核酸からなり、
当該第二の一本鎖核酸は、
前記標的核酸の前記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である一塩基であって、かつ前記第一の前記一本鎖核酸の前記置換対応領域の前記塩基とは異なる一塩基からなる３’末端に位置する第二の置換対応領域と、
前記第二の置換対応領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸の前記鎖に対して非相補的な２つの塩基からなる第二の非相補領域と、
前記第二の非相補領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸の前記鎖に対して相補的な５以上の塩基からなる第二の相補領域とからなる、塩基種判別方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の塩基種判別方法において、
前記第一の一本鎖核酸と、前記第二の一本鎖核酸とは、長さが互いに異なることを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の塩基種判別方法において、
前記第一の一本鎖核酸と、前記第二の一本鎖核酸とは、互いに蛍光波長が異なる標識がなされていることを特徴とする塩基種判別方法。
【請求項２３】
標的核酸の一塩基の置換領域の塩基種を判別するためのプライマーであって、
前記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が前記標的核酸の前記置換領域に対応するように、当該標的核酸にハイブリダイズすることが可能な一本鎖核酸からなり、
当該一本鎖核酸は、
前記標的核酸の前記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である一塩基からなる３’末端に位置する置換対応領域と、
前記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して非相補的な２つの塩基からなる非相補領域と、
前記非相補領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して相補的な５以上の塩基からなる相補領域とを含む、塩基種判別用プライマー。
【請求項２４】
塩基種判別用プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓとを含む、標的核酸における一塩基の置換領域の塩基種を判別するための塩基種判別用試薬キットであって、
前記プライマーは、前記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が前記標的核酸の前記置換領域に対応するように、当該標的核酸にハイブリダイズすることが可能な一本鎖核酸からなり、
当該一本鎖核酸は、
前記標的核酸の前記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である一塩基からなる３’末端に位置する置換対応領域と、
前記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して非相補的な２つの塩基からなる非相補領域と、
前記非相補領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して相補的な５以上の塩基からなる相補領域とを含む、塩基種判別用試薬キット。
【請求項２５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いことを特徴とする、請求項２４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項２６】
前記一本鎖核酸はＤＮＡである、請求項２４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項２７】
リバースプライマーをさらに含む、請求項２４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項２８】
ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項２９】
グリセルアルデヒド３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータをさらに含む、請求項２８に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項３０】
ジアホラーゼをさらに含む、請求項２９に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項３１】
前記電子メディエータが、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項２９に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項３２】
Ｈ＋−ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項３３】
ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素、または膜電位感受性色素のいずれかをさらに含む、請求項３２に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項３４】
請求項２４に記載の塩基種判別用試薬キットにおいて、
第二の塩基種判別用プライマーをさらに含み、
前記第二の塩基種判別用プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が前記第一の塩基種判別用プライマーがハイブリダイズする場合と同じ側の鎖の前記置換領域に対応するように、前記標的核酸にハイブリダイズすることが可能な第二の一本鎖核酸からなり、
前記第二の一本鎖核酸は、
前記標的核酸の前記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である一塩基であって、かつ前記第一の前記一本鎖核酸の前記置換対応領域の前記塩基とは異なる一塩基からなる３’末端に位置する第二の置換対応領域と、
前記第二の置換対応領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して非相補的な２つの塩基からなる第二の非相補領域と、
前記第二の非相補領域の５’側に隣接し、かつ前記標的核酸に対して相補的な５以上の塩基からなる第二の相補領域とからなることを特徴とする、塩基種判別用試薬キット。
【請求項３５】
前記第一の一本鎖核酸と、前記第二の一本鎖核酸とは、長さが互いに異なることを特徴とする、請求項３４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【請求項３６】
前記第一の一本鎖核酸と、前記第二の一本鎖核酸とは、互いに蛍光波長が異なる標識がなされていることを特徴とする、請求項３４に記載の塩基種判別用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の塩基配列中の所望の塩基種を判別する方法およびそれに用いるプライマーおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年２月に、国際ヒトゲノムプロジェクトと米国のセレーラ社とから、ヒトゲノムのドラフトシークエンスが公開された。このことは、特に医療分野において非常に重要な出来事であった。しかし、ヒトゲノムのドラフトシークエンスが直ちに我々の生活や医療において活かされるわけではない。公開されたドラフトシークエンスは、あくまでもおおまかにヒトゲノムの塩基配列を決定した結果に過ぎず、個々の遺伝子の機能、およびそれらに基づく様々な病気のメカニズムの解明は今後の大きな課題である。そこで現在、最も注目されているのが、ＤＮＡのＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）である。
【０００３】
ＳＮＰは、同種個体間で最も多く観察される遺伝子多型であり、具体的にはゲノムＤＮＡの塩基配列中のある特定部位に観察される一塩基対の相違（置換）である。ＳＮＰは、数百〜一千塩基対に１箇所の割合で存在していると推測されている。
【０００４】
ＳＮＰは、病気のかかりやすさ、特定の薬剤に対する応答性、および副作用などに関連する遺伝子を探索する際の非常に有用な多型マーカーである。また、ＳＮＰの中には、遺伝子発現調節に影響を及ぼすものがある。例えば、ＤＮＡの塩基配列中のＳＮＰを含む部分に対応するタンパク質中のアミノ酸の変化は、そのタンパク質の働きに影響を与え、その結果、他の遺伝子産物の質的異常や量的異常につながることがある。このような場合、ＳＮＰそのものを、病気のかかりやすさ、特定の薬剤に対する応答性、および副作用などの個人差の判定に利用することができる。
【０００５】
従って、ＳＮＰの探索や研究を行なうことは非常に重要である。現在わが国においても、五大疾患に関連するＳＮＰの探索・研究が特に盛んに行なわれている。これらのＳＮＰの探索・研究の結果は、３〜５年後に実際の医療に利用され始め、臨床の場等で我々自身のＳＮＰが診断されるようになると考えられる。そこで、各個人におけるＳＮＰパターンを解析する、いわゆるＳＮＰ部位の塩基種の判定技術（以下、ＳＮＰタイピング技術と称する）が非常に重要視されている。
【０００６】
またＳＮＰとは異なるが、ゲノムＤＮＡの塩基配列中のたった一塩基対の突然変異が重篤な疾病につながる例が知られている。従って、このような一塩基対の置換の有無を判定することもまた非常に重要になってきている。ＳＮＰタイピング技術は、このような一塩基対の置換の有無の判定においても有効な技術である。
【０００７】
現在、様々なＳＮＰタイピング技術が開発あるいは既に実施されている。それらの技術のうち、最も簡便な技術の１つでは、プライマー伸長反応を利用する。この技術では、標的核酸のＳＮＰ部位に隣接する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、標的核酸のＳＮＰ部位の塩基種に応じて伸長反応の進行に差を生じさせるプライマー（以下、タイピングプライマーと称する）を用い、プライマー伸長反応の進行の差を判定することによって、ＳＮＰタイピングを行なう。
【０００８】
多くの場合、上述のようなタイピングプライマーのプライマー伸長反応の進行の差の解析には、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＬＡＭＰおよびＴＭＡ反応等の標的の塩基配列を増幅する反応を利用する。上記の反応の後、電気泳動等の方法によって標的の塩基配列の増幅の程度を解析することによって、ＳＮＰ部位のタイピングを行なう。具体的には、以下に、標的の塩基配列を増幅する反応としてＰＣＲ反応を用い、その後電気泳動によってプライマー伸長反応の進行の差を解析する場合を、図１、図２および図３を参照しながら説明する。
【０００９】
まず、図１（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ１を有する標的のＤＮＡ１を含む試料溶液を調製する。続いて、ＤＮＡ１を含む試料溶液に、タイピングプライマー７ａ、リバースプライマー７ｂ、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（以下、ｄＮＴＰｓと略記（ここで、Ｎ＝Ａ（アデニン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン），Ｔ（チミン）)）を添加する。ここで、タイピングプライマー７ａおよびリバースプライマー７ｂは、二本鎖のＤＮＡ１を形成する互いに相補的な一本鎖のＤＮＡ３およびＤＮＡ４の一部に対して、それぞれ相補的である。一本鎖ＤＮＡ３上のＳＮＰ部位Ｓ１に位置する塩基はチミン（Ｔ）（相補鎖ＤＮＡ４の対応する塩基はアデニン（Ａ））である。同様に、図２（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ２を有する標的のＤＮＡ２を含む試料溶液を調製する。続いて、ＤＮＡ２を含む試料溶液に、タイピングプライマー７ａ、リバースプライマー７ｂ、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のｄＮＴＰｓを添加する。ここで、タイピングプライマー７ａおよびリバースプライマー７ｂは、二本鎖のＤＮＡ２を形成する互いに相補的な一本鎖のＤＮＡ５およびＤＮＡ６の一部に対して、ＳＮＰ部位Ｓ２を除き、それぞれ相補的である。一本鎖ＤＮＡ５上のＳＮＰ部位Ｓ２に位置する塩基はシトシン（Ｃ）（相補鎖ＤＮＡ６の対応する塩基はグアニン（Ｇ））である。なお、実際のゲノムＤＮＡ等では無数のＳＮＰ部位が存在するが、ここではＤＮＡ１およびＤＮＡ２のうちのタイピングプライマー７ａおよびリバースプライマー７ｂが結合する領域において、ＤＮＡ１のＳＮＰ部位Ｓ１を除く部分と、ＤＮＡ２のＳＮＰ部位Ｓ２を除く部分とは、全く同じ塩基配列であるものとする。
【００１０】
次に、図１（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ１を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ３および４とする。同様に、図２（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ２を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ５および６とする。
【００１１】
次に、図１（ｃ）に示す工程で、タイピングプライマー７ａおよびリバースプライマー７ｂが、一本鎖ＤＮＡ４および一本鎖ＤＮＡ３にそれぞれハイブリダイズするように温度調節を行なう。このとき、タイピングプライマー７ａは、一本鎖ＤＮＡ４のＳＮＰ部位Ｓ１（ここでは、アデニン（以下Ａと記す））から３’末端側の領域に完全にハイブリダイ
ズする。一方、図２（ｃ）に示す工程でも同様に、タイピングプライマー７ａおよびリバースプライマー７ｂが、一本鎖ＤＮＡ６および一本鎖ＤＮＡ５にそれぞれハイブリダイズするように温度調節を行なう。このとき、タイピングプライマー７ａは、その３’末端の
塩基Ｔ以外が、一本鎖ＤＮＡ６のＳＮＰ部位Ｓ２（ここでは、グアニン（以下Ｇと記す））よりも３’末端側の領域にハイブリダイズする。
【００１２】
次に、図１（ｄ）に示す工程で、プライマー伸長反応が進行するように温度調節を行なう。ＳＮＰ部位Ｓ１がＡである一本鎖ＤＮＡ４にタイピングプライマー７ａは完全にハイブリダイズしているので、プライマー伸長反応が進行し、ＤＮＡポリメラーゼ８によってｄＮＴＰｓが消費される。
【００１３】
一方、図２（ｄ）に示す工程でも同様に、プライマー伸長反応が進行するように温度調節を行なう。しかしながら、ＳＮＰ部位Ｓ２がＧである一本鎖ＤＮＡ６にタイピングプライマー７ａの３’末端の塩基Ｔのみハイブリダイズできない状態になっている。このため、プライマー伸長反応が正常に進行しにくい。
【００１４】
図３は、上記図１および図２に示した工程の後、それぞれの反応溶液に含まれるＤＮＡ断片を電気泳動によって解析した図である。図１の場合では、タイピングプライマー７ａからのプライマー伸長反応が良好に進行するため、所望の塩基配列を示すバンドが、図３のレーン１に示すように矢印Ａで示される位置に検出される。一方、図２の場合では、タイピングプライマー７ａからのプライマー伸長反応の進行が非常に悪いため、所望の塩基配列を示すバンドは、図３のレーン２に示すように矢印Ａで示される位置にほとんど確認されない。この結果から、ＳＮＰ部位Ｓ１の塩基種をタイピングすることができる。
【００１５】
上述のように、タイピングプライマーを用いたＳＮＰタイピング技術は、特に困難な操作や特殊な装置を必要としないので、現在知られているＳＮＰタイピング技術の中でも最も有効な技術の一つと考えられている。しかしながら、タイピングプライマーを用いたＳＮＰタイピング技術では、タイピングプライマーの設計が最も重要である。タイピングプライマーには、ＳＮＰ部位の塩基種に応じてプライマー伸長反応の進行の差が、明確かつ再現性よく現れるように設計されている必要がある。従って、プライマー伸長反応の進行の差が、より明確かつ再現性よく現れるタイピングプライマーの開発が盛んに行われている。
【００１６】
最も代表的なタイピングプライマーは、上記図１および図２に示したタイピングプライマー７ａのように、一本鎖の標的核酸のＳＮＰ部位の３’側に隣接する塩基配列と、完全にハイブリダイズし、且つ、タイピングプライマーの３’末端塩基の種類と、一本鎖の標的核酸のＳＮＰ部位の塩基の種類との関係によって、プライマー伸長反応の進行に差が生じるように設計されている。
【００１７】
しかし、上記図１および図２に示した方法で用いるタイピングプライマーは正確なＳＮＰタイピングにおいては十分ではない。図２（ｃ）に示すように、タイピングプライマーの３’末端の塩基が、ＳＮＰ部位Ｓ２にハイブリダイズできない状態となっていても、反応温度や時間の条件を厳密に制御しなければ、プライマー伸長反応が、タイピングプライマーが完全にハイブリダイズする場合と同様の効率で進行することがある。このような場合、正確なＳＮＰタイピングは不可能となる。
【００１８】
そこで、最近では、標的核酸の特定の配列の領域に相補的な配列を含み、その３’末端が標的核酸のＳＮＰ部位に対応し、３’末端から２塩基目に標的核酸配列と非相補的な塩基を有するタイピングプライマー（［０００７］段のタイピングプライマーと厳密には違うものだが、役割は同じものなので、これもタイピングプライマーと称する）が開発されている（例えば、特許文献１を参照）。この技術では、タイピングプライマーのＳＮＰ対応部位の塩基が、標的核酸のＳＮＰ部位の塩基と相補的である場合には、３’末端が標的核酸にハイブリダイズし得、プライマー伸長反応が進行する。一方、タイピングプライマーのＳＮＰ対応部位の塩基が、標的核酸のＳＮＰ部位の塩基と相補的でない場合には、タイピングプライマーの３’末端の塩基と３’末端から２番目の塩基という２つの塩基が、標的核酸と非相補的になるため、プライマー伸長反応が、上記図２（ｃ）で示した場合よりもさらに進行しにくい状況となる。そのため、プライマー伸長反応が進行する場合と、しない場合との区別がより明確になり、より正確なＳＮＰタイピングが可能となると報告されている。
【００１９】
さらに、最近開発されたタイピングプライマーとして、東洋紡績（株）によって開発されたＡＳＰ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ）がある（特許文献２を参照）。ＡＳＰの３’末端塩基は、標的核酸の標的のＳＮＰ部位の５’側に隣接する塩基と相補的であり、ＡＳＰの３’末端から２番目の塩基が標的核酸の標的のＳＮＰ部位に対応しており、さらにその３’末端から３番目の塩基が標的核酸の塩基に対して非相補的であるように設計されているプライマーである。ＡＳＰを、校正活性の強いα型ＤＮＡポリメラーゼとともに用いて、プライマー伸長反応を行なうことによって、上述の図１および図２に示した方法よりもＳＮＰ部位の塩基種の判別を正確に行なうことができると報告されている。
【００２０】
具体的には、図１および図２に示す方法において、タイピングプライマー７ａの代わりにＡＳＰを用い、ＤＮＡポリメラーゼ８として校正活性の強いα型ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行なう。このとき、図４（ａ）に示すように、ＡＳＰ１００の３’末端から２番目の塩基（Ｔ）と一本鎖ＤＮＡ４のＳＮＰ部位Ｓ１の塩基（Ａ）とが相補的である場合、良好にプライマー伸長反応が進行する。一方、図４（ｂ）に示すように、ＡＳＰ１００の３’末端から２番目の塩基（Ｔ）と一本鎖ＤＮＡ６のＳＮＰ部位Ｓ２の塩基（Ｇ）とが相補的でない場合には、ＡＳＰ１００の３’末端から２番目と３番目の塩基という２つの塩基が標的核酸に対して相補的でないことになり、プライマー伸長反応がほとんど進行しないとされている。その結果、プライマー伸長反応の進行の差が、上記図１および図２に示した方法に比べて大きくなると報告されている。
【特許文献１】特開２００２−１０１８９９号公報
【特許文献２】国際公開第０１／０４２４９８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、核酸中の所望の塩基の種類をさらに正確に且つ再現性よく判別するための塩基種判別方法ならびにそれに用いるプライマーおよびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、１つの局面において、標的核酸における一塩基の置換領域の塩基種を判別する方法を提供する。この塩基種判別方法は、（ａ）一塩基の置換領域を有する二本鎖の標的核酸と、塩基種判別用プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓとを含む溶液を調製する工程と、（ｂ）上記溶液中において、上記塩基種判別用プライマーを上記標的核酸にハイブリダイズさせ、上記塩基種判別用プライマーを始点とするプライマー伸長反応を進行させる工程と、（ｃ）上記プライマー伸長反応の進行の程度を解析することによって、上記置換領域の塩基種を判別する工程とを含み、ここで、上記塩基種判別用プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が上記標的核酸のいずれか一方の鎖の上記置換領域に対応するように当該一方の鎖にハイブリダイズすることが可能な第一の一本鎖核酸からなり、当該第一の一本鎖核酸は、上記標的核酸の上記一方の鎖の上記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である塩基からなる３’末端に位置する置換対応領域と、上記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸の上記一方の鎖に対して非相補的な少なくとも２つの塩基からなる非相補領域と、上記非相補領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸の上記一方の鎖に対して相補的な相補領域であって、少なくとも上記置換領域の塩基と上記置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合に当該第一の一本鎖核酸が上記プライマー伸長反応の可能な条件下で上記標的核酸の上記一方の鎖にハイブリダイズするのに十分な数の塩基からなる相補領域とからなることを特徴とする。なお、上記置換対応領域は、一塩基からなることが最も好ましく、上記非相補領域は、二塩基からなることが最も好ましく、そして上記相補領域は、５以上の塩基からなることが好ましい。
【００２３】
本発明の塩基種判別方法では、塩基種判別用プライマーを、塩基種が置換されている可能性のある置換領域を含む一本鎖の標的核酸に作用させた場合、相補領域は、一本鎖の標的核酸にハイブリダイズする。また、非相補領域は、一本鎖の標的核酸にハイブリダイズすることができない。置換対応領域の塩基が、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基に相補的である場合、置換対応領域は一本鎖の標的核酸の置換領域にハイブリダイズする。一方、置換対応領域の塩基が、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基に非相補的である場合、置換対応領域は一本鎖の標的核酸の置換領域にハイブリダイズできない。
【００２４】
一本鎖の標的核酸に対して、塩基種判別用プライマーの非相補領域が離間した状態となるものの、置換対応領域が一本鎖の標的核酸にハイブリダイズしている場合、３’末端から核酸を伸長させる酵素であるＤＮＡポリメラーゼが、塩基種判別用プライマーの３’末端に正常に作用できる状態となる。
【００２５】
これに対して、一本鎖の標的核酸に対して、塩基種判別用プライマーの非相補領域および置換対応領域がいずれもハイブリダイズできず、一本鎖の標的核酸に対して非相補領域および置換対応領域が離間した状態となった場合、ＤＮＡポリメラーゼが、塩基種判別用プライマーの３’末端に正常に作用できない。
【００２６】
このため、置換対応領域の塩基が、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基と相補的であり、一本鎖の標的核酸の置換領域にハイブリダイズする場合、プライマー伸長反応は良好に生じる。しかし、置換対応領域の塩基が、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基と非相補的であり、一本鎖の標的核酸の置換領域にハイブリダイズできない場合、プライマー伸長反応は良好に生じない。
【００２７】
従って、一本鎖の標的核酸の置換領域と塩基種判別用プライマーの置換対応領域とが相補的である場合と、一本鎖の標的核酸の置換領域と塩基種判別用プライマーの置換対応領域とが非相補的である場合との間での、プライマー伸長反応の進行の差が明確に生じる。
【００２８】
したがって、プライマー伸長反応の進行の差を解析することによって、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基の塩基種を正確に判別することができる。本発明はまた、標的核酸の置換領域において二塩基以上の置換が存在する場合にも、適用し得る。
【００２９】
上記ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いことが好ましい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いＤＮＡポリメラーゼを用いると、塩基種判別用プライマーの置換対応領域が、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基と非相補的な塩基を有しており、一本鎖の標的核酸の置換領域にハイブリダイズできない場合にも、置換対応領域および非相補領域のヌクレオチドを切断した後に、プライマー伸長反応を進行させてしまう、ということがなくなる。従って、標的核酸の置換領域の正確な塩基種の判別が不可能となるおそれが解消される。
【００３０】
上記塩基種判別用プライマーは、ＤＮＡであることが好ましい。ＤＮＡは、化学的に非常に安定であり、取り扱いも簡単で、入手も容易だからである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、上記工程（ａ）では、上記溶液中に、上記二本鎖の核酸のうちの他方にハイブリダイズ可能な一本鎖の核酸からなるリバースプライマーをさらに含み、上記工程（ｂ）では、上記プライマー伸長反応を、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＬＡＭＰおよびＴＭＡからなる群から選択されるいずれか１つの塩基配列増幅方法を用いて進行させてもよい。さらに、上記工程（ｃ）では、これらの塩基配列増幅方法を用いて進行させたプライマー伸長反応の進行の差に基づいて、前記置換領域の塩基種を判別し得る。
【００３２】
好ましくは、上記工程（ｃ）では、上記塩基配列増幅法によって増幅された塩基配列の増幅量を、電気泳動法、質量分析法および液体クロマトグラフィーからなる群から選択されるいずれか１つの方法で測定することによって、上記プライマー伸長反応の進行の程度を解析する構成としてもよい。
【００３３】
好ましくは、上記工程（ｃ）では、プライマー伸長反応によって生成するピロリン酸の量を測定することによって、上記プライマー伸長反応の進行の程度を解析する構成としてもよい。
【００３４】
好ましくは、上記工程（ｃ）では、プライマー伸長反応によって生成するピロリン酸の量を測定することによって、上記塩基配列増幅方法によって増幅された塩基配列の増幅量を測定する構成としてもよい。
【００３５】
好ましくは、上記工程（ｃ）では、上記塩基配列増幅法によって増幅された塩基配列の増幅量を定量的に解析することによって、上記置換領域の塩基種を判別する構成としてもよい。このような定量的な解析は、特に、置換領域の塩基が父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子とで同じである（ホモ）か、あるいは異なる（ヘテロ）かを判別するのに適している。
【００３６】
より好ましい実施形態では、上記ピロリン酸の量の測定は、工程（ｂ）からの上記溶液の少なくとも一部を含む試料中で、ピロリン酸を無機リン酸に変換する工程、上記試料を、グリセルアルデヒド３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程、および、上記測定系において、生成される電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値は、上記試料中のピロリン酸の濃度を示す。
【００３７】
好ましくは、上記電子メディエータは、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である。さらに好ましくは、上記測定系はジアホラーゼをさらに含む。
【００３８】
好ましくは、上記ピロリン酸の無機リン酸への変換は、上記試料中でピロリン酸をピロホスファターゼと反応させることによって行われる。
【００３９】
さらに別の好ましい実施形態では、上記ピロリン酸の量の測定は、工程（ｂ）からの上記溶液の少なくとも一部を含む試料を、Ｈ＋−ピロホスファターゼを保持し且つＨ＋を通しにくい膜によって区画された少なくとも２つの領域を有する測定系の一方の領域に配置させる工程、および上記測定系において、上記少なくとも２つの領域のいずれかにおいてＨ＋濃度の変化を測定する工程を包含し、上記Ｈ＋濃度の変化の程度が、前記試料中のピロリン酸の濃度を示すことを特徴とする。
【００４０】
さらに別の好ましい実施形態では、上記ピロリン酸の量の測定は、工程（ｂ）からの上記溶液の少なくとも一部を含む試料を、Ｈ＋−ピロホスファターゼを膜内に有する人工または天然の膜小胞を含む測定系に供する工程、および上記測定系において、上記膜小胞内側または前記膜小胞外側におけるＨ＋濃度の変化を測定する工程を包含し、上記Ｈ＋濃度の変化の程度が、上記試料中のピロリン酸の濃度を示すことを特徴とする。Ｈ＋−ピロホスファターゼを上記測定系に供する形態としては、上記膜小胞のような球状の膜に内包させて供する形態に限定されず、例えば、電極上に形成された平面膜のような平面状の膜を使用してもよい。
【００４１】
好ましくは、上記Ｈ＋濃度の変化の測定は、Ｈ＋濃度の変化を光学的変化に変換して測定する方法または電気的に測定する方法のいずれかによって行われる。
【００４２】
さらに好ましくは、上記光学的変化に変換して測定する方法は、ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素、または膜電位感受性色素を使用する。
【００４３】
さらに好ましくは、上記電気的に測定する方法は、金属電極法、ガラス電極法、ＩＳＦＥＴ電極法、パッチクランプ法、およびＬＡＰＳ法からなる群から選択される方法である。
【００４４】
より好ましくは、上記光学的変化に変換して測定する方法では、上記膜小胞内側のＨ＋濃度の変化を、ｐＨ感受性色素を用いて測定する。
【００４５】
上記塩基種判別用プライマーにおいて、置換対応領域に含まれる塩基数と非相補領域に含まれる塩基数との合計は、３塩基以上であることが好ましい。
【００４６】
好ましい実施形態では、上記塩基種判別用プライマーの置換対応領域は、上記一本鎖核酸の３’末端塩基のみからなる。
【００４７】
本発明の塩基種判別方法のさらに別の好ましい実施形態では、上記工程（ａ）において、上記溶液中に、第二の塩基種判別用プライマーをさらに含み、上記第二の塩基種判別用プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が上記第一の塩基種判別用プライマーがハイブリダイズする場合と同じ側の鎖の上記置換領域に対応するように、上記標的核酸の上記鎖にハイブリダイズすることが可能な第二の一本鎖核酸からなり、当該第二の一本鎖核酸は、上記標的核酸の上記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかと相補的である塩基であって、かつ上記第一の上記一本鎖核酸の上記置換対応領域の上記塩基とは異なる塩基からなる３’末端に位置する第二の置換対応領域と、上記第二の置換対応領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸の上記鎖に対して非相補的な少なくとも２つの塩基からなる第二の非相補領域と、上記第二の非相補領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸の上記鎖に対して相補的な第二の相補領域であって、少なくとも上記標的核酸の上記置換領域の塩基と上記第二の置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合に、当該第二の一本鎖核酸が上記プライマー伸長反応の可能な条件下で上記標的核酸の上記鎖にハイブリダイズするのに十分な数の塩基からなる第二の相補領域とからなることを特徴とする。上記第二の置換対応領域は、一塩基からなることが最も好ましく、上記第二の非相補領域は、二塩基からなることが最も好ましく、そして上記第二の相補領域は、５以上の塩基からなることが好ましい。
【００４８】
好ましくは、上記実施形態において、第一の一本鎖核酸と、第二の一本鎖核酸とは、長さが互いに異なる。
【００４９】
好ましくは、上記実施形態において、第一の一本鎖核酸と、第二の一本鎖核酸とは、互いに蛍光波長が異なる標識がなされている。
【００５０】
本発明は、別の局面において、標的核酸の一塩基の置換領域の塩基種を判別するためのプライマーを提供する。本発明の塩基種判別用プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が上記標的核酸の上記置換領域に対応するように、当該標的核酸にハイブリダイズすることが可能な一本鎖核酸からなり、当該一本鎖核酸は、上記標的核酸の上記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかに相補的である塩基からなる３’末端に位置する置換対応領域と、上記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して非相補的な少なくとも２つの塩基からなる非相補領域と、上記非相補領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して相補的な相補領域であって、少なくとも上記置換領域の塩基と上記置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合に、プライマー伸長反応の可能な条件下で上記プライマーが上記標的核酸にハイブリダイズするのに十分な数の塩基からなる相補領域とを含むことを特徴とする。上記置換対応領域は、一塩基からなることが最も好ましく、上記非相補領域は、２塩基からなることが最も好ましく、そして上記相補領域は、５以上の塩基からなることが好ましい。
【００５１】
本発明の塩基種判別用プライマーにおいて、置換対応領域に含まれる塩基数と上記非相補領域に含まれる塩基数との合計は、３塩基以上であることが好ましい。
【００５２】
本発明の塩基種判別用プライマーの好ましい実施形態では、上記置換対応領域は、上記一本鎖核酸の３’末端塩基のみからなる。
【００５３】
本発明は、さらに別の局面において、標的核酸における一塩基の置換領域の塩基種を判別するための塩基種判別用試薬キットを提供する。本発明の塩基種判別用試薬キットは、塩基種判別用プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓとを含む。本発明の塩基種判別用試薬キットにおいて、上記プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が上記標的核酸の上記置換領域に対応するように、当該標的核酸にハイブリダイズすることが可能な一本鎖核酸からなり、当該一本鎖核酸は、上記標的核酸の上記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかに相補的である塩基からなる３’末端に位置する置換対応領域と、上記置換対応領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して非相補的な少なくとも２つの塩基からなる非相補領域と、上記非相補領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して相補的な相補領域であって、少なくとも上記置換領域の塩基と上記置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合に、プライマー伸長反応の可能な条件下で上記一本鎖核酸が上記標的核酸にハイブリダイズするのに十分な数の塩基からなる相補領域からなる。上記置換対応領域は、一塩基からなることが最も好ましく、上記非相補領域は、二塩基からなることが最も好ましく、そして上記相補領域は、５以上の塩基からなることが好ましい。
【００５４】
好ましくは、上記キットにおいて、ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いことを特徴とする。
【００５５】
好ましくは、上記キットにおいて、一本鎖核酸はＤＮＡである。
【００５６】
好ましくは、上記塩基種判別用試薬キットは、リバースプライマーをさらに含む。
【００５７】
好ましくは、上記塩基種判別用試薬キットは、ピロホスファターゼをさらに含む。
【００５８】
好ましくは、上記塩基種判別用試薬キットは、グリセルアルデヒド３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータをさらに含む。より好ましくは、本発明の塩基種判別用試薬キットは、ジアホラーゼをさらに含む。
【００５９】
さらに好ましくは、上記電子メディエータは、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である。
【００６０】
好ましくは、本発明の塩基種判別用試薬キットは、Ｈ＋−ピロホスファターゼをさらに含む。より好ましくは、本発明の塩基種判別用試薬キットは、ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素、または膜電位感受性色素のいずれかをさらに含む。
【００６１】
本発明の塩基種判別用試薬キットは、さらに別の好ましい実施形態において、第二の塩基種判別用プライマーをさらに含み、上記第二の塩基種判別用プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が上記第一の塩基種判別用プライマーがハイブリダイズする場合と同じ側の鎖の上記置換領域に対応するように、上記標的核酸にハイブリダイズすることが可能な第二の一本鎖核酸からなり、上記第二の一本鎖核酸は、上記標的核酸の上記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかに相補的である塩基であって、かつ上記第一の上記一本鎖核酸の上記置換対応領域の上記塩基とは異なる塩基からなる３’末端に位置する第二の置換対応領域と、上記第二の置換対応領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して非相補的な少なくとも２つの塩基からなる第二の非相補領域と、上記第二の非相補領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して相補的な第二の相補領域であって、少なくとも上記標的核酸の上記置換領域の塩基と上記第二の置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合に、当該第二の一本鎖核酸が上記プライマー伸長反応の可能な条件下で上記標的核酸にハイブリダイズするのに十分な数の塩基からなる第二の相補領域とからなることを特徴とする。上記第二の置換対応領域は、一塩基からなることが最も好ましく、上記第二の非相補領域は、二塩基からなることが最も好ましく、そして上記第二の相補領域は、５以上の塩基からなることが好ましい。
【００６２】
好ましくは、上記第一の一本鎖核酸と、上記第二の一本鎖核酸とは、長さが互いに異なる。
【００６３】
好ましくは、上記第一の一本鎖核酸と、上記第二の一本鎖核酸とは、互いに蛍光波長が異なる標識がなされている。
【００６４】
好ましくは、本発明の塩基種判別用試薬キットは、当該試薬を用いて塩基種の判別を行うための手順その他の注意事項を示した指示書をさらに含んでいてもよい。さらに好ましくは、本発明の塩基種判別用試薬キットは、標的の塩基配列の増幅反応に使用するため、または増幅された塩基配列の定量的解析のために必要な他の試薬をさらに含んでいてもよい。
【００６５】
（用語の定義）
本明細書中で、「標的核酸」とは、解析の対象となる塩基（単数または複数）を有する一本鎖または二本鎖の核酸をいい、通常、ゲノムＤＮＡまたはその任意の断片であるが、ＲＮＡであってもよい。標的核酸の例としては、Alu配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが挙げられる。あるいは、遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病（高血圧、糖尿病等）に関連する遺伝子またはその断片が挙げられる。さらに、このような遺伝子の部分あるいは遺伝子に関わる領域以外のゲノムＤＮＡ中のその他の部分も本発明の標的核酸の例として含まれ得る。標的核酸は、生物学的液体（例えば、血液、血清、血漿、唾液、リンパ液、精液、膣粘膜、便、尿、髄液など）または生物学的組織（例えば、毛髪、皮膚など）などから抽出され得る。あるいは、細胞培養物、植物、食物、法医学サンプル（例えば、紙、繊維、スクラップ、水、下水、薬物など）などから抽出することもできる。そのような抽出方法は、当業者に周知である。
【００６６】
本発明についていう場合、「一本鎖の標的核酸」は、「二本鎖の標的核酸のいずれか一方の鎖」を含むものとする。
【００６７】
本明細書中で、標的核酸について「置換領域」という場合、主として標的核酸中の一塩基多型部位を意味するが、これに限定されず、広く突然変異等により一塩基または二塩基以上が置換されているか、または置換されている可能性がある標的核酸中の一塩基または二塩基以上の領域も含むものとする。
【００６８】
本明細書中で、「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、当該分野で通常使用される意味で用いられる。
【００６９】
本明細書中で、「アレル」または「対立遺伝子」は、当該分野で通常使用される意味で用いられる。
【００７０】
本明細書中で、「置換対応領域」とは、本発明の塩基種判別用プライマーにおいて、当該プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合に、標的核酸の置換領域の塩基に対向する当該プライマーの塩基が存在する領域のことをいう。本発明において、塩基種判別用プライマーの置換対応領域は、典型的には、当該プライマーの３’末端にあり、標的核酸の置換領域の予想され得る塩基種のいずれかに相補的な一塩基からなる。
【００７１】
本明細書中で、「非相補領域」は、本発明の塩基種判別用プライマーにおいて、置換対応領域の５’側に隣接し、そして当該プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合には、標的核酸の置換領域の３’側に隣接する領域に存在する塩基に対向する当該プライマーの塩基が存在する領域のことをいう。本発明において、塩基種判別用プライマーの非相補領域は、標的核酸の対応する塩基に対して非相補的な少なくとも２つ、最も好ましくは、２つのみの塩基からなる。
【００７２】
本明細書中で、「相補領域」は、本発明の塩基種判別用プライマーにおいて、非相補領域の５’側に隣接し、そして当該プライマーが標的核酸にハイブリダイズする場合には、標的核酸の対応する塩基とハイブリダイズする、当該塩基に対して相補的な領域のことをいう。本発明において、塩基種判別用プライマーの相補領域は、少なくとも標的核酸の置換領域の塩基と塩基種判別用プライマーの置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合には、当該プライマーが、プライマー伸長反応が進行する条件下で、標的核酸にハイブリダイズし得るに十分な長さを有する。典型的には、相補領域の長さは、５塩基以上である。
【発明の効果】
【００７３】
上記の特徴を有する本発明によれば、標的核酸における予め知られている塩基置換部位の塩基種を、正確にかつ再現性良く判別可能となる。特に、本発明は、標的核酸における一塩基多型部位の塩基種の判別、および突然変異等による一塩基の置換された部位の塩基種の判別に有用である。
【００７４】
本発明の塩基種判別用プライマーは、３’末端側に少なくとも２塩基からなる非相補領域を有するため、プライマーの置換対応領域が標的核酸の置換領域の塩基と非相補的な塩基からなる場合、プライマーの３’末端において合計少なくとも３塩基が、標的核酸とハイブリダイズし得ず離間した状態となる。この場合、後述するように、ほぼ確実にプライマー伸長反応が進行しないため、プライマーの置換対応領域が標的核酸の置換領域の塩基と相補的である場合（この場合、プライマー伸長反応が進行する）との差違が、一層明確になる。このように、本発明のプライマーを使用することにより、プライマー伸長反応が進まないはずの場合にしっかりと反応が抑えられ、核酸が増幅する場合と増幅しない場合との区別が非常に明確になる。そのため、本発明は、標的核酸における塩基種の置換されている領域または置換されていると予想される領域の塩基種を、より正確に、かつ再現性よく判別することができるという顕著な効果を有する。
【００７５】
本発明以前には、２塩基またはそれ以上からなる非相補領域（置換対応領域が標的核酸の置換領域に非相補的である場合を含まない。以下同様。）を有するプライマーを用いて塩基種判別用に用いるという例は、本発明者らの知る限りでは存在しない。これは、これまで、プライマーが標的核酸に対して２塩基以上の非相補領域を有する場合は、プライマー伸長が進行しにくいという考えが当該分野で一般的であったからであると考えられる。その意味で、本発明は新規であり、かつ予測し得ない効果を有する。
【００７６】
さらに、以下に詳述するように、本発明の塩基種判別用プライマーによれば、本発明のプライマーを用いて塩基配列増幅法により増幅された塩基配列の定量的解析を行うことによって、単数のみの本発明のプライマーを用いて、ＳＮＰ部位の塩基が父親由来のものと母親由来のもので同じである（ホモ）か、あるいは異なる（ヘテロ）かを判別することも可能であり得る。このような、１つのみの塩基種判別用プライマーを用いる塩基種の判別は、本発明者らの知る限り、これまでに開示されていない。このような増幅された塩基配列の増幅量の定量的な解析は、より正確な塩基種の判別を可能とする本発明のプライマーを使用することにより、その効果が一層顕著なものとなり得る。
【００７７】
このように、本発明によれば、核酸中の所望の塩基の種類を、正確に且つ再現性よく判別することができる。さらに、本発明により、プライマー伸長反応における温度、時間等の反応条件を厳密に制御する、あるいは用いるＤＮＡポリメラーゼの種類を変更する等の作業が極力不要となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
（実施形態１）
特許文献２に開示されるＡＳＰを用いても、ＳＮＰタイピングを正確に且つ再現性よく行なうためには十分ではない場合がある。たとえＡＳＰを用いても、本来プライマー伸長反応が進行しないはずの場合に、プライマー伸長反応が起きてしまう可能性が残されている。これを解決するために、温度、時間等の反応条件をより厳密に制御する、あるいは用いるＤＮＡポリメラーゼの種類を変更する等の作業が必要となる。さらに、そのような作業を繰り返してもなお、ＳＮＰタイピングが困難な場合もある。
【００７９】
そこで、本発明者らは、プライマー伸長反応が確実に進行しない条件を調査した。具体的にはＰＣＲ法を用いて、フォワードプライマーの３’末端の、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズできない状態となっている塩基の数と、プライマー伸長反応の進行の程度との相関関係を調査した。
【００８０】
調査方法を図５を参照しながら説明する。
【００８１】
まず、図５（ａ）に示す工程で、標的のＤＮＡ１１を含む試料溶液を調製する。続いて、ＤＮＡ１１を含む試料溶液に、フォワードプライマー１７ａ、リバースプライマー１７ｂ、ＤＮＡポリメラーゼ１８および４種類のｄＮＴＰｓを添加する。
【００８２】
次に、図５（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ１１を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ１３および１４とする。
【００８３】
次に、図５（ｃ）に示す工程で、フォワードプライマー１７ａおよびリバースプライマー１７ｂが、一本鎖ＤＮＡ１４および一本鎖１３にそれぞれハイブリダイズするように温度調節を行なう。
【００８４】
次に、図５（ｄ）に示す工程で、プライマー伸長反応が進行するように温度調節を行なう。
【００８５】
上述の図５（ｂ）〜（ｄ）に示す工程を繰り返し、フォワードプライマー１７ａとリバースプライマー１７ｂとに対応するＤＮＡ断片を増幅する。
【００８６】
なお、本調査において、ＤＮＡ１１としてλＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ１８として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造（株））を用いた。また、本調査において用いたフォワードプライマー１７ａおよびリバースプライマー１７ｂを表１および配列表に示す。リバースプライマー１７ｂ（配列番号９）は、表１に示すように配列番号１〜８に対して共通に用いられており、完全にλＤＮＡにハイブリダイズする塩基配列を有している。
【００８７】
また、プライマー伸長反応の進行の程度を表す電気泳動の結果を図６に示す。表１に示す配列番号１〜８と、配列表の配列番号１〜８と、図６に示すレーン番号１〜８とはそれぞれ対応している。
【００８８】
【表１】
2005065688.tif 000003
【００８９】
λＤＮＡに完全にハイブリダイズする塩基配列を有する番号１のフォワードプライマーを用いた場合、図６のレーン１に示すように矢印Ｂで示される位置にフォワードプライマーおよびリバースプライマーに応じたＤＮＡ断片が増幅された。
【００９０】
３’末端に位置する塩基のみλＤＮＡにハイブリダイズしない番号２および３のフォワードプライマーを用いた場合にも、図６のレーン２および３に示すように、レーン１と全く同じＤＮＡ断片が増幅された。
【００９１】
番号４および５のフォワードプライマーは共に、３’末端から数えて１つ目の塩基および２つ目の塩基（合計２つの塩基）がλＤＮＡにハイブリダイズしない塩基配列を有する。番号５のフォワードプライマーを用いた場合、図６のレーン５に示すように、レーン１と同じＤＮＡ断片は増幅されなかった。しかし、番号４のフォワードプライマーを用いた場合、レーン１と同じＤＮＡ断片が増幅された。これは、たとえタイピングプライマーの３’末端の塩基と３’末端から２つ目の塩基という合計２つの塩基が標的配列とハイブリダイズしない場合でも、プライマー伸長反応が進行してしまうことがあることを示している。また、これは特許文献１に開示されるタイピングプライマーにおいて、３’末端の塩基が標的核酸のＳＮＰ部位の塩基と相補的でない場合に相当しており、特許文献１においては、プライマー伸長反応が進行しないはずの場合に相当する。したがって、特許文献１に開示されるタイピングプライマーを用いても、未だにＳＮＰタイピングを正確かつ再現性よく行うためには十分でないことがわかる。
【００９２】
番号６〜８のフォワードプライマーはいずれも、３’末端に位置する３塩基がλＤＮＡにハイブリダイズしない塩基配列を有する。番号６〜８のフォワードプライマーを用いた場合、図６のレーン６〜８に示すように、レーン１と同じＤＮＡ断片はほとんど増幅されなかった。
【００９３】
以上の結果から、３’末端に位置する３塩基が標的核酸にハイブリダイズしないフォワードプライマーでは、プライマー伸長反応がほぼ確実に進行しないことが確認された。
【００９４】
本発明者らは、以上の結果から、タイピングプライマーを用いてＳＮＰタイピングを行なう際に、プライマー伸長反応がほぼ確実に進行しない条件は、タイピングプライマーの３’末端から数えて３つ以上の塩基が、標的核酸にハイブリダイズしないことであると考えた。
【００９５】
以下、上記考察に基づいて、本発明の実施形態を、図を参照しながら説明する。
【００９６】
図７（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、本実施形態の塩基種判別方法において用いられる塩基種判別用プライマー（［０００７］段のタイピングプライマーと厳密には違うものだが、役割は同じものなので、これもタイピングプライマーと称する）を模式的に示す図である。
【００９７】
本実施形態のタイピングプライマー１０は、塩基種が置換されている可能性のある置換領域を含む一本鎖の標的核酸に部分的にハイブリダイズ可能な一本鎖の核酸からなる。ここで、標的核酸における置換領域の存在する位置は、既知であるものとする。タイピングプライマー１０を構成する一本鎖の核酸は、図７（ａ）に示すように、置換対応領域Ｘと、非相補領域Ｙと、相補領域Ｚとを備えている。
【００９８】
置換対応領域Ｘは、タイピングプライマー１０を構成する一本鎖の核酸の３’末端塩基を含み、一本鎖の標的核酸の置換領域の予想され得る塩基種のいずれかに相補的な塩基を有する。
【００９９】
非相補領域Ｙは、置換対応領域Ｘの５’側に隣接し、一本鎖の標的核酸に対して非相補的な塩基配列を有する。好ましくは、非相補領域Yは、少なくとも２つの塩基からなり、最も好ましくは、２つの塩基からなる。
【０１００】
相補領域Ｚは、非相補領域Ｙの５’側に隣接し、一本鎖の標的核酸に対して相補的な塩基配列を有する。相補領域Ｚは、好ましくはタイピングプライマー１０が、プライマー伸長反応の可能な条件下で一本鎖の標的核酸にハイブリダイズするのを可能にするに十分な長さを有する。
【０１０１】
上記のような構成を有する本発明のタイピングプライマーは、当業者に周知の通常の技術により作製し得る。例えば、本発明のタイピングプライマーは、当業者が容易に入手可能な市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法のような当該分野で周知のＤＮＡの合成法により作製し得る。
【０１０２】
また、本明細書中で、「プライマー」とは、少なくとも８個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む、一本鎖のヌクレオチド配列であり、通常、プライマー伸長反応の進行する条件下で、標的核酸にハイブリダイズし得る程度に十分な長さと、標的配列に対する相補性とを有する。本発明において、プライマーの長さは、８〜１００塩基であることが好ましく、より好ましくは１０〜６０塩基、さらにより好ましくは１２〜４０塩基であり、さらにより好ましくは１４〜３５塩基、さらにより好ましくは１６〜３０塩基、そして最も好ましくは１８〜２５塩基である。
【０１０３】
本実施形態のタイピングプライマー１０を、塩基種が置換されている可能性のある置換領域を含む一本鎖の標的核酸３４および３５にそれぞれ作用させた場合、図７（ｂ）および図７（ｃ）に示す状態となる。なお、実際のゲノムＤＮＡ等では無数のＳＮＰ部位等のような塩基が置換された領域が存在するが、ここでは一本鎖の標的核酸３４および３５は、それらのうちのタイピングプライマー１０が結合する領域において、置換領域３４ｒおよび３５ｒの塩基配列の塩基種が互いに異なり、置換領域３４ｒおよび３５ｒを除いて互いに全く同じ塩基配列を有するものとする。
【０１０４】
図７（ｂ）および図７（ｃ）に示すように、相補領域Ｚは、一本鎖の標的核酸３４および３５にハイブリダイズする。また、非相補領域Ｙは、図７（ｂ）および図７（ｃ）に示すように、一本鎖の標的核酸３４および３５にハイブリダイズすることができない。置換対応領域Ｘの塩基配列が、一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒの塩基配列に相補的な塩基配列である場合、図７（ｂ）に示すように、置換対応領域Ｘは一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒにハイブリダイズする。一方、置換対応領域Ｘの塩基配列が、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒの塩基配列に非相補的な塩基配列である場合、図７（ｃ）に示すように、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒにハイブリダイズできない。
【０１０５】
図７（ｂ）に示すように、タイピングプライマー１０は、一本鎖の標的核酸３４に対して非相補領域Ｙが離間した状態となるものの、置換対応領域Ｘは一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒにハイブリダイズしている。このため、３’末端から核酸を伸長させる酵素であるＤＮＡポリメラーゼが、タイピングプライマー１０の３’末端に正常に作用できる状態となる。
【０１０６】
これに対して、図７（ｃ）に示すように、タイピングプライマー１０が作用する一本鎖の標的核酸３５に対して、タイピングプライマー１０は、非相補領域Ｙおよび置換対応領域Ｘがいずれもハイブリダイズできず、一本鎖の標的核酸３５に対して非相補領域Ｙおよび置換対応領域Ｘが離間した状態となる。このため、ＤＮＡポリメラーゼが、タイピングプライマー１０の３’末端に正常に作用できない。
【０１０７】
このため、図７（ｂ）に示すように、置換対応領域Ｘの塩基配列が、一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒの塩基配列と相補的な塩基配列であり、一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒにハイブリダイズする場合、プライマー伸長反応は良好に生じる。しかし、図７（ｃ）に示すように、置換対応領域Ｘが、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒの塩基配列と非相補的な塩基を有しており、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒにハイブリダイズできない場合、プライマー伸長反応は良好に生じない。
【０１０８】
従って、図７（ｂ）に示す、一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒとタイピングプライマー１０の置換対応領域Ｘとが相補的である場合と、図７（ｃ）に示す、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒとタイピングプライマー１０の置換対応領域Ｘとが非相補的である場合との間での、プライマー伸長反応の進行の差が大きくなる。
【０１０９】
そこで、両者の間で、プライマー伸長反応の進行の差を解析することによって、一本鎖の標的核酸３４および３５のそれぞれの置換領域３４ｒおよび３５ｒの塩基配列の塩基種を判別することができる。
【０１１０】
次に、上記タイピングプライマー１０を用いて、塩基種が置換されている可能性のある置換領域を含む二本鎖の標的核酸において、置換領域の塩基配列の塩基種を判別する方法を、図８（ａ）〜図８（ｄ）および図９（ａ）〜図９（ｄ）を参照しながら説明する。ここでもまた、標的核酸における塩基種が置換されている可能性のある置換領域の位置は予めわかっている。図８（ａ）〜図８（ｄ）および図９（ａ）〜図９（ｄ）は、本実施形態の二本鎖の標的核酸が有する置換領域の塩基配列の塩基種を、ＰＣＲ法を利用して判別する方法の各工程を表す図である。
【０１１１】
まず、図８（ａ）に示す工程で、置換領域３４ｒおよび４４ｒを有する標的の核酸３６を含む試料溶液を調製する。続いて、核酸３６を含む試料溶液に、タイピングプライマー１０、リバースプライマー２０、ＤＮＡポリメラーゼ３０および４種類のｄＮＴＰｓを添加する。同様に、図９（ａ）に示す工程で、置換領域３５ｒおよび４５ｒを有する標的の核酸３８を含む試料溶液を調製する。続いて、核酸３８を含む試料溶液に、タイピングプライマー１０、リバースプライマー２０、ＤＮＡポリメラーゼ３０および４種類のｄＮＴＰｓを添加する。なお、実際のゲノムＤＮＡ等では無数のＳＮＰ部位のような塩基が置換された領域が存在するが、ここでは標的の核酸３６および３８は、それらのうちのタイピングプライマー１０およびリバースプライマー２０が結合する領域においては、置換領域３４ｒおよび４４ｒと、置換領域３５ｒおよび４５ｒとを除いて互いに全く同じ塩基配列を有するものとする。
【０１１２】
次に、図８（ｂ）に示す工程で、核酸３６を熱変性などによって一本鎖の標的核酸３４および４４とする。同様に、図９（ｂ）に示す工程で、核酸３８を熱変性などによって一本鎖の標的核酸３５および４５とする。
【０１１３】
次に、図８（ｃ）に示す工程で、タイピングプライマー１０およびリバースプライマー２０が、一本鎖の標的核酸３４および一本鎖の標的核酸４４にそれぞれハイブリダイズするように温度調節を行なう。このとき、タイピングプライマー１０の相補領域Ｚが、一本鎖の標的核酸３４にハイブリダイズする。また、タイピングプライマー１０の置換対応領域Ｘが、一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒにハイブリダイズする。一方、図９（ｃ）に示す工程でも同様に、タイピングプライマー１０およびリバースプライマー２０が、一本鎖の標的核酸３５および一本鎖の標的核酸４５にそれぞれハイブリダイズするように温度調節を行なう。このとき、タイピングプライマー１０の相補領域Ｚのみが、一本鎖の標的核酸３５にハイブリダイズする。
【０１１４】
次に、図８（ｄ）に示す工程で、プライマー伸長反応が進行するように温度調節を行なう。このとき、タイピングプライマー１０の置換対応領域Ｘが一本鎖の標的核酸３４の置換領域３４ｒにハイブリダイズしているので、プライマー伸長反応が進行し、ＤＮＡポリメラーゼ３０によってｄＮＴＰｓが消費される。
【０１１５】
一方、図９（ｄ）に示す工程でも同様に、プライマー伸長反応が進行するように温度調節を行なう。しかしながら、置換対応領域Ｘが、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒにハイブリダイズできないので、プライマー伸長反応が正常に進行しにくい。
【０１１６】
本実施形態では、ＰＣＲ法の手順に基づいて、図８（ｂ）〜（ｄ）に示す工程、ならびに図９（ｂ）〜（ｄ）に示す工程をそれぞれ繰り返す。
【０１１７】
以上の工程を実施した後、プライマー伸長反応の進行の差（特に本実施形態では、増幅された核酸の量の差）を解析することによって、一本鎖の標的核酸の置換領域の塩基配列の塩基種を判別することができる。
【０１１８】
特に、上述のプライマー伸長反応がほぼ確実に進行しない条件の考察から、図９（ｃ）に示す工程において、タイピングプライマー１０のハイブリダイズしない塩基の数（すなわち、置換対応領域Ｘに含まれる塩基数と非相補領域Ｙに含まれる塩基数との合計）が３塩基以上とすることが好ましい。このことによって、置換対応領域Ｘが、一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒにハイブリダイズできない場合、プライマー伸長反応は、ほぼ確実に生じなくなる。従って、プライマー伸長反応の進行の差が非常に明確になる。
【０１１９】
プライマー伸長反応の進行の差が大きくなると、プライマー伸長反応の進行の差を解析した結果にも、非常に明確な差が現れる。従って、標的核酸が置換領域３４ｒおよび３５ｒのいずれの塩基配列を有するのかをより正確に判別することが可能である。
【０１２０】
本実施形態では、タイピングプライマー１０からのプライマー伸長反応を、ＰＣＲ法を利用して行なったが、これに限定されず、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＬＡＭＰおよびＴＭＡ反応等の特定の塩基配列の核酸を増幅する方法を利用することができる。プライマー伸長反応の進行の差を解析する方法は、上記の方法により増幅された核酸を電気泳動等の方法で解析する方法、上記の方法の過程で生成されるピロリン酸等の量を解析する方法が挙げられる。
【０１２１】
なお、ここではリバースプライマー２０を添加する方法を説明したが、これに限られない。例えば、リバースプライマー２０を添加せずに、タイピングプライマー１０からのプライマー伸長反応のみを行ない、プライマー伸長反応の過程で生成されるピロリン酸等の量を解析してもよい。
【０１２２】
また、上述の方法に特に限られることはなく、正確にプライマー伸長反応の進行の差を解析できる方法であれば用いることが可能である。
【０１２３】
なお、タイピングプライマー１０を構成する核酸としては、ＤＮＡが好ましい。ＤＮＡは、化学的に非常に安定であり、取り扱いも簡単で、入手も容易だからである。勿論、必要に応じてチオールＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いてタイピングプライマー１０を作製してもよい。
【０１２４】
プライマー伸長反応においてｄＮＴＰｓを用いる場合、核酸ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼを用いる必要がある。ＤＮＡポリメラーゼには、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するものと有さないものがあるが、本実施形態ではＤＮＡポリメラーゼとして３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無い（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない、あるいは有していてもその活性が非常に弱いため測定上無視し得る。以下同様。）ものを用いることが好ましい。その理由としては、本実施形態におけるタイピングプライマー１０を用いた場合、前述の通り、置換対応領域Ｘが一本鎖の標的核酸３５の置換領域３５ｒとが非相補的であるので、タイピングプライマー１０の置換対応領域Ｘおよび非相補領域Ｙのヌクレオチドが一本鎖の標的核酸に対してハイブリダイズできずに浮いたような状態となる。このような場合、通常、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いＤＮＡポリメラーゼは正常なプライマー伸長反応を起こせない。しかし、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の強いＤＮＡポリメラーゼを用いると、その活性により、置換対応領域Ｘおよび非相補領域Ｙのヌクレオチドを切断した後に、プライマー伸長反応を進行させてしまうことがある。従って、一本鎖の標的核酸の置換領域の正確な塩基種の判別が不可能となるおそれがあるからである。
【０１２５】
そこで具体的には、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造（株）製）、やｒＴａｑ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（東洋紡（株）製）、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、Ｔｆ１  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（ｐｒｏｍｅｇａ製）、Ｈｏｔ  Ｔｕｂ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、Ｔｔｈ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（東洋紡（株）製）、ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（ＴＯＹＯＢＯ，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ（アプライドバイオシステムズ製等のＤＮＡポリメラーゼ）のような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。このことによって、上述のようなおそれが無くなり、一本鎖の標的核酸の置換領域のより正確な塩基種の判別を行なうことができる。これらの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼを使用するさらなる利点としては、これらが安価であるということが挙げられる。さらに、ここに挙げたように、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼは、種類も豊富で入手も容易である。
【０１２６】
本発明により、プライマー伸長反応における温度、時間等の反応条件を厳密に制御する、あるいは用いるＤＮＡポリメラーゼの種類を変更する等の作業が極力不要となる。例えば、本発明のタイピングプライマーによれば、ＰＣＲサイクルにおいてアニーリング温度を、約５０℃〜約６０℃の範囲のいずれに設定しても、プライマー伸長反応が進行する場合としない場合とで、進行の差が非常に明確に表れることが本発明らにより確認されている。
【０１２７】
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１で説明したタイピングプライマー１０のうち、特にＳＮＰタイピングに適したタイピングプライマーを説明する。
【０１２８】
ＳＮＰは、ゲノムＤＮＡの塩基配列中のある特定部位に観察される一塩基対の相違（置換）である。置換対応領域Ｘが３’末端塩基のみであるタイピングプライマー１０を用いることによって、正確なＳＮＰタイピングが可能である。
【０１２９】
ここで具体的に、ＳＮＰタイピングに用いるタイピングプライマーを、図１０（ａ）〜図１０（ｃ）を参照しながら説明する。図１０（ａ）〜図１０（ｃ）は、ＳＮＰタイピングに用いるタイピングプライマーの構成を表す図である。
【０１３０】
ＳＮＰタイピングに用いるタイピングプライマー１０’は、一本鎖の核酸からなる。核酸としては、ＤＮＡが好ましい。ＤＮＡは、化学的に安定であり、取り扱いも簡単で、入手も容易だからである。勿論、必要に応じて、チオールＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いてタイピングプライマー１０’を作製してもよい。タイピングプライマー１０’では、その３’末端に位置する塩基（図中Ｎ１）が、一本鎖の標的核酸５４および５６のＳＮＰ部位の塩基Ｓ１およびＳ２に対応する。ここで、標的核酸５４および５６のＳＮＰ部位は予め分かっているものとする。また、タイピングプライマー１０’の３’末端から数えて２番目（図中Ｎ２）および３番目（図中Ｎ３）の塩基は、それぞれ一本鎖の標的核酸５４および５６のＳＮＰ部位から３’方向に数えて２番目および３番目の塩基に対して必ず非相補的であり、さらに、タイピングプライマー１０’の３’末端から数えて４番目から５’末端までの塩基配列は、一本鎖の標的核酸５４および５６のＳＮＰ部位から３’方向に数えて４番目から３’側への塩基配列に対して相補的であるように設計されている。
【０１３１】
ここで、塩基Ｎ１と塩基Ｓ１とが相補的であり、塩基Ｎ１と塩基Ｓ２とは非相補的であると仮定する。また、プライマー伸長反応においてｄＮＴＰｓを用いる場合、核酸ポリメラーゼとしてＤＮＡポリメラーゼを用いる。
【０１３２】
図１０（ｂ）に示すように、ＳＮＰ部位の塩基がＳ１である一本鎖の標的核酸５４に対して、タイピングプライマー１０’の３’末端から数えて２番目および３番目の塩基Ｎ２およびＮ３はハイブリダイズできないが、３’末端塩基Ｎ１は、一本鎖の標的核酸５４のＳＮＰ部位の塩基Ｓ１にハイブリダイズする。このため、ＤＮＡポリメラーゼ２８が、タイピングプライマー１０’の３’末端に正常に作用できる。従って、プライマー伸長反応が良好に進行する。
【０１３３】
一方、図１０（ｃ）に示すように、ＳＮＰ部位の塩基がＳ２である一本鎖の標的核酸５６に対して、タイピングプライマー１０’の３’末端塩基Ｎ１、３’末端から数えて２番目および３番目の塩基Ｎ２およびＮ３の全て、ハイブリダイズできない。このため、ＤＮＡポリメラーゼ２８が、タイピングプライマー１０’の３’末端に正常に作用できず、プライマー伸長反応が正常に進行しにくい（表１および図６もまた参照のこと）。
【０１３４】
すなわち、図１０（ｂ）に示すように、タイピングプライマー１０’の３’末端塩基と、一本鎖の標的核酸５４のＳＮＰ部位の塩基とが相補的な関係であればプライマー伸長反応は良好に起こるが、図１０（ｃ）に示すように、タイピングプライマー１０’の３’末端塩基と、一本鎖の標的核酸５６のＳＮＰ部位の塩基とが非相補的であればプライマー伸長反応はほとんど進行しない。
【０１３５】
タイピングプライマー１０に代えて、上記のように設計されたタイピングプライマー１０’を用いて、上記実施形態１で述べた置換領域の塩基配列の塩基種を判別する方法について記載したものと同様の手順でプライマー伸長反応を行なった後、プライマー伸長反応の進行の差を解析すれば、正確なＳＮＰタイピングが可能となる。従って、プライマー伸長反応の進行の差を解析することによって、一本鎖の標的核酸のＳＮＰ部位の塩基配列の塩基種を判別することができる。
【０１３６】
また、本実施形態におけるタイピングプライマーを用いればＳＮＰタイピングのみならず、突然変異等による一塩基変異の解析やあるいはそれらに限られず所望の一塩基の種類を決定することも可能である。
【０１３７】
（実施形態３）
ヒトなどの高等生物のゲノムは、父親由来のものと母親由来のものから成っている。このような父親から受け継ぐ遺伝子と母親から受け継ぐ遺伝子からなる一対の遺伝子を対立遺伝子（アレル）という。このため、ＳＮＰタイピングにおいて、ＳＮＰ部位の塩基が父親由来のものと母親由来のもので同じである（ホモ）か、あるいは異なる（ヘテロ）かを判別することも非常に重要となっている。このようなＳＮＰタイピングにも、上記実施形態２のタイピングプライマーを用いることができる。
【０１３８】
例えば、ヒトから採取された試料において、一本鎖の標的核酸におけるＳＮＰ部位の塩基がチミン（以下、Ｔと記す）かシトシン（以下、Ｃと記す）であることが予め分かっている場合を説明する。
【０１３９】
このとき、上記のように倍数体のゲノムをもつヒトのような高等生物では、子供が両親から受け継いだ遺伝子の考えられるＳＮＰパターンはＴ／Ｔのホモ、Ｃ／Ｃのホモ、そしてＴ／Ｃのヘテロの３通りである。これらを判別するために、ＳＮＰ部位の塩基がＴの場合のみにプライマー伸長反応が進行するタイピングプライマー（タイピングプライマーＡとする）と、Ｃの場合のみにプライマー伸長反応が進行するタイピングプライマー（タイピングプライマーＢとする）とを用いて、それぞれＰＣＲ反応を行なう。なお、このとき、タイピングプライマーＡおよびＢは、いずれも上記実施形態２に示したタイピングプライマー１０’と全く同様に設計されており、リバースプライマーは上記実施形態２に示したものと同一のものが用いられる。
【０１４０】
次に、それぞれのＤＮＡ断片について電気泳動等による解析を行えば、ＳＮＰパターンのタイピングが可能となる。
【０１４１】
具体的には、タイピングプライマーＡを用いたときにのみＤＮＡ断片の増幅が認められた場合のＳＮＰパターンはＴ／Ｔ、タイピングプライマーＢを用いたときにのみＤＮＡ断片の増幅が認められた場合のＳＮＰパターンはＣ／Ｃ、両方のタイピングプライマーを用いてＤＮＡ断片の増幅が認められた場合のＳＮＰパターンはＴ／Ｃと判別することができる。
【０１４２】
また、上記のタイピングプライマーＡおよびタイピングプライマーＢのそれぞれの相補領域Ｘの長さを互いに異なるように設計すれば、タイピングプライマーＡとリバースプライマーとから増幅されるＤＮＡ断片と、タイピングプライマーＢとリバースプライマーとから増幅されるＤＮＡ断片とは、互いに異なる長さとなる。このため、両者のＤＮＡ断片は、同時に電気泳動を行なっても重複することがない。従って、タイピングプライマーＡとタイピングプライマーＢとを同時に混合し、リバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なった後、同時に電気泳動等により解析を行なうことによって、迅速にＳＮＰパターンのタイピングが可能となる。
【０１４３】
あるいは、上記のタイピングプライマーＡおよびタイピングプライマーＢのそれぞれに互いに蛍光波長が異なる標識を行なえば、タイピングプライマーＡとリバースプライマーとから増幅されるＤＮＡ断片と、タイピングプライマーＢとリバースプライマーとから増幅されるＤＮＡ断片とは、異なる波長の蛍光を発する。このため、それぞれのＤＮＡ断片を個別に検出することができる。従って、タイピングプライマーＡとタイピングプライマーＢとを同時に混合し、リバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を行なった後、電気泳動等によって増幅されたＤＮＡ断片を単離し、その蛍光波長を解析することによって、迅速にＳＮＰパターンをタイピングすることができる。そのような互いに蛍光波長が異なる標識の例としては、Ｃｙ３（登録商標）（Amersham Life Science, Inc.）およびＣｙ５（登録商標）（Amersham Life Science, Inc.）の組み合わせ、あるいはＪＯＥ（５５０ｎｍに発光ピークを有する）、ＲＯＸ（６００ｎｍに発光ピークを有する）、ＦＡＭ（５２０ｎｍに発光ピークを有する）、およびＴＡＭＲＡ（５８０ｎｍに発光ピークを有する）の中から選択されるいずれかの標識の任意の組み合わせなどが挙げられる。これらの標識試薬は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）やフナコシ株式会社などの当業者に周知の供給業者から市販品として容易に入手可能である。
【０１４４】
さらに、上記のタイピングプライマーＡのみを用いて、同様にＳＮＰパターンのタイピングを行なうことも可能である。
【０１４５】
具体的には、タイピングプライマーＡとリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行ない、その後電気泳動等で解析する。ＳＮＰパターンがＴ／Ｔの場合とＴ／Ｃの場合はＤＮＡ断片の増幅が確認されるが、Ｃ／Ｃの場合はＤＮＡ断片の増幅がほとんど確認されない。そしてさらに、ＳＮＰパターンがＴ／Ｔの場合は、ＳＮＰパターンがＴ／Ｃの場合と比べて、ＰＣＲ反応における鋳型となるＳＮＰ部位の塩基がＴである一本鎖の標的核酸の量が２倍となるので、ＤＮＡ断片が増幅の程度が明らかに大きくなる。従って、ＤＮＡ断片の増幅量を解析することによって、ＳＮＰ部位のＳＮＰパターンをタイピングすることが可能となる。このような核酸増幅量の定量的な解析によるホモとヘテロの判別は、ＤＮＡ断片が増幅する場合と増幅しない場合との差違が明確に表れる本発明のプライマーを使用することにより、有利に行うことができる。
【０１４６】
また、ＳＮＰ部位の塩基種が３種類あるいは４種類の可能性がある場合でも、それに対応して、３’末端に位置する塩基Ｎ１が３種類あるいは４種類の上記実施形態２のタイピングプライマーを用いれば、ＳＮＰタイピングすることが可能である。
【０１４７】
（実施形態４）
さらに、上記実施形態１〜３と同様にゲノムＤＮＡおよびタイピングプライマーを用いて、ＰＣＲ反応のような塩基配列増幅法により核酸を増幅した後、その増幅反応液を、Ｈ＋−ピロホスファターゼを膜内に有する膜小胞を含む測定系に供し、その膜小胞の内外で生じるＨ＋濃度の変化を測定することによって、核酸の増幅量を解析し、塩基種の判別を行うこともできる。
【０１４８】
Ｈ＋−ピロホスファターゼは、通常、植物の液胞膜内に存在する膜タンパク質であり、１分子のピロリン酸から２分子のリン酸を生成する加水分解反応に伴って、液胞膜の外側から液胞膜の内側に向けＨ＋を輸送する性質を有する。この性質を利用して、Ｈ＋−ピロホスファターゼを内包する天然または人工の膜小胞を、増幅された核酸を含む試料に供し、膜内外でのＨ＋濃度の変化を、例えば、ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素（例えば、アクリジンオレンジなど）、膜電位感受性色素（例えば、ＤｉＢＡＣ４（３）（Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol）、ＤｉＢＡＣ４（５）（Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)pentamethine oxonol;）、ＤｉＳＢＡＣ２（３）（Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol）、ｄｉ−４−ＡＮＮＥＰＳ、ＤｉＯＣ６（３）（dihexaoxacarbocyanine iodide）、オクソールＶなど）等を用いる光学的方法により、あるいは、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法など）、ガラス電極法、ＩＳＦＥＴ電極法、パッチクランプ法、ＬＡＰＳ法等の電気化学的方法により測定して、核酸の増幅反応により生じるピロリン酸を定量的に測定することができる。このようにして測定したピロリン酸の量に基づいて、ゲノムＤＮＡ中のＳＮＰ部位のタイピングを含む標的核酸中の置換領域の塩基種の判別を行うことができる。なお、H＋−ピロホスファターゼは、膜小胞のような球状の膜に限らず、平面膜（例えば、電極上に形成された平面膜）内に内包させてもよい。
【０１４９】
例えば、図１７に示すような、容器２０４、電極２０５、及び容器２０４内に設けられた内部槽２０６を備えるピロリン酸測定装置２００において、Ｈ＋−ピロホスファターゼが内在している平面状の膜２０７を使用してもよい。ピロリン酸測定装置２００の内部槽２０６の底部には、Ｈ＋感受性電極２０８が設けられ、Ｈ＋−ピロホスファターゼのピロリン酸を加水分解する活性部位は、内部槽２０６の外部に露出している。容器２０４内に試料溶液２０２が注入されると、試料溶液２０２中にピロリン酸が存在する場合、Ｈ＋−ピロホスファターゼの酵素反応が生じて、膜２０７によって隔てられた内部槽２０６の内部領域２０９ではＨ＋濃度が増大し、内部槽２０６の外部ではＨ＋濃度が減少する。このため、電極２０５とＨ＋感受性電極２０８とを用いて、電気的にＨ＋濃度の変化を測定することによって、ピロリン酸の量を測定することができる。本実施形態では、予め容器２０４及び内部領域２０９内に試料溶液２０２を注入するが、これに限定されない。例えば、膜２０７を予め内部槽２０６内のＨ＋感受性電極２０８上に配置しておき、試料溶液２０２を容器２０４中に添加してもよい。このことによって、容器２０４内に試料溶液２０２を注入すると、試料溶液２０２のうちの膜２０７を透過する成分（つまりピロリン酸を含まない溶液）が内部領域２０９を満たし、電極２０５とＨ＋感受性電極２０８とを用いて、電気的にＨ＋濃度の変化を測定することが可能になる。
【０１５０】
なお、ピロリン酸を加水分解する活性部位が、内部領域２０９に露出しているＨ＋−ピロホスファターゼが膜２０７に含まれていてもよい。但し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が内部領域２０９に露出しているＨ＋−ピロホスファターゼが含まれている膜２０７を用いる場合、内部領域２０９のピロリン酸の濃度は、内部槽２０６の外部のピロリン酸の濃度よりも低くしておくことが好ましく、内部領域２０９にはピロリン酸を含まないことが最も好ましい。このことによって、内部領域２０９から内部槽２０６の外部へのＨ＋の輸送が減少あるいは停止し、内部槽２０６の外部から内部領域２０９へのＨ＋の輸送が優勢となって、内部槽２０６の外部及び内部領域２０９のＨ＋濃度の変化が、試料溶液２０２中に含まれるピロリン酸によるものにほぼ限定される。従って、試料溶液２０２中に含まれるピロリン酸の量を正確に見積もることができる。
【０１５１】
また、膜２０７には、Ｈ＋−ピロホスファターゼ以外のタンパク質が含まれていてもよい。但し、これらのタンパク質は、ピロリン酸と反応しない、あるいは反応性の低いタンパク質であることが好ましい。すなわち、ピロリン酸が膜２０７中にあるＨ＋−ピロホスファターゼ以外のタンパク質と反応する場合、Ｈ＋−ピロホスファターゼと反応するピロリン酸の量が減少し、それに伴って、Ｈ＋の輸送量が減少するからである。また、ピロリン酸とは反応せず、且つピロリン酸以外の物質との反応によってＨ＋を輸送するタンパク質が膜２０７に含まれている場合、そのタンパク質が反応する物質が試料溶液２０２中にほとんど含まれていないことが好ましい。具体的には、膜２０７に、ピロリン酸とほとんど反応せず、且つＡＴＰとの反応によってＨ＋を輸送するタンパク質であるＡＴＰａｓｅが含まれている場合、試料溶液２０２中にＡＴＰをほとんど含まないようにすることが好ましい。
【０１５２】
また、ピロリン酸測定装置２００では、電極２０５とＨ＋感受性電極２０８とによって、電気的にピロリン酸の量を測定しているが、これに限定されない。例えば、ｐＨ感受性色素または膜電気感受性色素を含む溶液を内部槽２０６の内部領域２０９に添加してもよい。このことによって、内部のＨ＋濃度の増大に伴ってｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素の蛍光強度が変化する。この蛍光強度の変化を光学的に測定することによって、ピロリン酸の量を測定することができる。
【０１５３】
（実施形態５）
あるいは、上記実施形態１〜３と同様にゲノムＤＮＡおよびタイピングプライマーを用いて、ＰＣＲ反応のような塩基配列増幅法により核酸を増幅した後、その増幅反応液中のピロリン酸の量を、ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼの３種類の酵素を用いて電気化学的手法により解析することによって、核酸の増幅量を解析し、塩基種の判別を行うこともできる。
【０１５４】
具体的には、電気化学測定用の容器内において、増幅反応からの試料溶液に、まず、ピロホスファターゼを作用させ、核酸の増幅反応により生じたピロリン酸を無機リン酸に加水分解する。その電気化学測定用の容器は、内部に電流測定用の複数の電極を有し、それらは、市販の電気化学測定システム（例えば、北斗電工製）に接続されている。
【０１５５】
次いで、その無機リン酸に、グリセルアルデヒド３−リン酸および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、１，３−ビスホスホグリセリン酸および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換する。
【０１５６】
次いで、生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、電子メディエータ（例えば、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、メルドラブルー等）の酸化体とともに、ジアホラーゼと反応させ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび電子メディエータの還元体とする。
【０１５７】
最後に、生じた電子メディエータの還元体を、当該電気化学測定用の容器内の作用電極上で電気化学的に酸化し、それによって放出される電子を、上記電気化学測定システムによって電流値として測定することによって、当該電流値に基づいて核酸の増幅量を測定することができる。このような定量的な解析に基づいて、ＳＮＰ部位のタイピングなど、標的核酸の置換領域の塩基種の判別を行うことができる。
【０１５８】
（実施形態６）
（キット）
本発明の塩基種判別用プライマーは、プライマー伸長反応等のために必要な他の試薬等とともに、塩基種判別用試薬キットとしても提供され得る。代表的には、本発明の塩基種判別用試薬キットは、本発明の塩基種判別用プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓとを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いものが好ましい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いると、塩基種判別用プライマーの置換対応領域が、標的核酸の置換領域の塩基と非相補的な塩基を有しており、標的核酸の置換領域にハイブリダイズできない場合にも、当該ポリメラーゼにより置換対応領域および非相補領域のヌクレオチドが切断されてしまい、その後プライマー伸長反応が進行してしまうからである。したがって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に無いものを使用すれば、そのようなことが生じることを防止し得、標的核酸の置換領域の正確な塩基種の判別が不可能となるおそれが解消される。
【０１５９】
また、上記キットにおいて、上記プライマーはＤＮＡであることが好ましい。ＤＮＡは、化学的に非常に安定であり、取り扱いも簡単で、入手も容易だからである。
【０１６０】
本発明の塩基種判別用試薬キットは、ＰＣＲ等による塩基配列増幅反応に用いるための他の試薬をさらに含んでいてもよい。そのような試薬には、例えば、リバースプライマーが含まれる。
【０１６１】
また、本発明の塩基種判別用試薬キットは、増幅された核酸断片の量を測定するための試薬をさらに含んでいても良い。そのような試薬としては、一般的には、ピロホスファターゼが挙げられる。さらに、本発明の特定の実施形態では、グリセルアルデヒド３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含んでいてもよい。好ましくは、さらにジアホラーゼを含む。電子メディエータの例としては、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーなどが挙げられる。これらの試薬は、当業者にとって市販品として容易に入手可能である。
【０１６２】
本発明の塩基種判別用試薬キットのさらに別の特定の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定するための他の試薬として、膜小胞に内包されたＨ＋−ピロホスファターゼをさらに含んでいてもよい。さらに、ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素（例えば、アクリジンオレンジなど）、または膜電位感受性色素（例えば、ＤｉＢＡＣ４（３）（Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol）、ＤｉＢＡＣ４（５）（Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)pentamethine oxonol;）、ＤｉＳＢＡＣ２（３）（Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol）、ｄｉ−４−ＡＮＮＥＰＳ、ＤｉＯＣ６（３）（dihexaoxacarbocyanine iodide）、オクソールＶなど）のいずれかを含んでいることが好ましい。
【０１６３】
本発明の塩基種判別用試薬キットは、さらに別の好ましい実施形態において、第二の塩基種判別用プライマーをさらに含み、上記第二の塩基種判別用プライマーは、上記標的核酸にハイブリダイズする場合には、その３’末端が上記第一の塩基種判別用プライマーがハイブリダイズする場合と同じ側の鎖の上記置換領域に対応するように、上記標的核酸にハイブリダイズすることが可能な第二の一本鎖核酸からなり、上記第二の一本鎖核酸は、上記標的核酸の上記置換領域の予想され得る塩基種のいずれかに相補的である塩基であって、かつ上記第一の上記一本鎖核酸の上記置換対応領域の上記塩基とは異なる塩基からなる３’末端に位置する第二の置換対応領域と、上記第二の置換対応領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して非相補的な少なくとも２つの塩基からなる第二の非相補領域と、上記第二の非相補領域の５’側に隣接し、かつ上記標的核酸に対して相補的な第二の相補領域であって、少なくとも上記標的核酸の上記置換領域の塩基と上記第二の置換対応領域の塩基とが互いに相補的な場合に、当該第二の一本鎖核酸が上記プライマー伸長反応の可能な条件下で上記標的核酸にハイブリダイズするのに十分な数の塩基からなる第二の相補領域とからなることを特徴とする。上記第二の置換対応領域は、一塩基からなることが最も好ましく、上記第二の非相補領域は、二塩基からなることが最も好ましく、そして上記第二の相補領域は、５以上の塩基からなることが好ましい。
【０１６４】
上記第一の一本鎖核酸と、上記第二の一本鎖核酸とは、長さが互いに異なることが好ましい。それによって、増幅された塩基配列がどちらのプライマーに由来するものかを容易に判断することが可能となるからである。同様の理由から、上記第一の一本鎖核酸と、上記第二の一本鎖核酸とは、互いに蛍光波長が異なる標識がなされていることが好ましい。そのような互いに蛍光波長が異なる標識の例としては、Ｃｙ３（登録商標）（Amersham Life Science, Inc.）およびＣｙ５（登録商標）（Amersham Life Science, Inc.）の組み合わせ、あるいはＪＯＥ（５５０ｎｍに発光ピークを有する）、ＲＯＸ（６００ｎｍに発光ピークを有する）、ＦＡＭ（５２０ｎｍに発光ピークを有する）、およびＴＡＭＲＡ（５８０ｎｍに発光ピークを有する）の中から選択されるいずれかの標識の任意の組み合わせなどが挙げられる。これらの標識試薬は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）やフナコシ株式会社などの当業者に周知の供給業者から市販品として容易に入手可能である。
【０１６５】
好ましくは、本発明の塩基種判別用試薬キットは、試薬の使用方法、手順その他の注意事項を示した指示書をさらに含んでいてもよい。
【実施例１】
【０１６６】
実施例１では、ヒトの血液より抽出したゲノムＤＮＡ溶液を用いて、ＡＤＨ２遺伝子中に見られるＳＮＰのタイピングを試みた。本実施例において解析対象としたＳＮＰ部位およびその周辺のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に示す。ＳＮＰ部位は、配列番号１０の４６番目の塩基（ｒで記された部位）であり、ＡあるいはＧの可能性がある。このとき、考えられるＳＮＰパターンはＡ／Ａのホモ、Ｇ／Ｇのホモ、そしてＡ／Ｇのヘテロの３通りである。
【０１６７】
まず、上記のＳＮＰパターンがそれぞれＡ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ｇであることが予め分かっている３人の被験者の血液から、Ｇｅｎとるくん（登録商標）（血液用）（宝酒造（株）製）を用いて、ＳＮＰパターンがＡ／ＡのゲノムＤＮＡ（以下、Ａ／ＡゲノムＤＮＡと記す）、ＳＮＰパターンがＡ／ＧのゲノムＤＮＡ（以下、Ａ／ＧゲノムＤＮＡと記す）、ＳＮＰパターンがＧ／ＧのゲノムＤＮＡ（以下、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡと記す）を抽出した。
【０１６８】
次に、配列番号１１および１２に示した２種類のタイピングプライマーと、配列番号１３に示した１種類のリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応液１〜６を調製しＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応液の組成は表２〜７に記す通りである。また、ＰＣＲ反応の条件は、図１１に示すとおりであり、このときの繰り返し回数は２０回である。
【０１６９】
【表２】
2005065688.tif 000004
【０１７０】
【表３】
2005065688.tif 000005
【０１７１】
【表４】
2005065688.tif 000006
【０１７２】
【表５】
2005065688.tif 000007
【０１７３】
【表６】
2005065688.tif 000008
【０１７４】
【表７】
2005065688.tif 000009
【０１７５】
上記ＰＣＲ反応後、３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。
【０１７６】
目的のＤＮＡ断片の増幅が認められたのは、ＰＣＲ反応液１、３、４、６であった。一方、ＰＣＲ反応液２および５に関してはほとんど増幅は確認されなかった。つまり、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１のタイピングプライマーを用いたときにのみ増幅が確認された。逆に、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１２のタイピングプライマーを用いたときにのみ増幅が確認された。また、Ａ／ＧゲノムＤＮＡに関して、いずれのタイピングプライマーを用いた場合にも増幅が確認された。
【０１７７】
従って、上記の配列番号１１および１２のタイピングプライマーを用いることによって、ＳＮＰ部位の塩基を判別できることが確認できた。
【０１７８】
また、ＤＮＡ断片の増幅量は、ＰＣＲ反応液１および６がほぼ同程度であり、ＰＣＲ反応液３および４は、ＰＣＲ反応液１および６に比べ明らかに少ないという結果であった。このように、ＰＣＲ反応液１および３では、同じタイピングプライマーが用いられているにも関わらず、ＤＮＡ断片の増幅量に明らかな差が認められるのは、ＰＣＲ反応における鋳型となるＳＮＰ部位の塩基がＡであるゲノムＤＮＡの量がＰＣＲ反応液１の方がＰＣＲ反応液３の２倍であるからである。
【０１７９】
この結果は、ＤＮＡ断片の増幅量の差からも、ゲノムＤＮＡのＳＮＰパターンがホモであるかヘテロであるかを解析することが可能であることを示している。従って、本実施例において、仮に配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれか一方のみを用いたとしても、ＤＮＡ断片の増幅の有無だけでなく、増幅量も解析することによって、Ａ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ｇの三種類のＳＮＰパターンをタイピングすることが可能である。このような増幅量に基づく定量的なＳＮＰパターンの解析は、プライマー伸長反応が進む場合と進まない場合との区別が明確な本発明のタイピングプライマーにより、初めて可能となる。
【０１８０】
以上の結果は、本発明のタイピングプライマーを用いることでＳＮＰタイピングができることを示している。
【実施例２】
【０１８１】
本実施例では、上記実施例１と同じゲノムＤＮＡを解析対象とし、異なる長さの２種類のタイピングプライマーを用いてＳＮＰタイピングを試みた。解析するＳＮＰ部位は上記実施例１と同じである。
【０１８２】
本実施例では、タイピングプライマーとして、実施例１で用いた配列番号１１のタイピングプライマー１の５’末端が６ＦＡＭで標識されたタイピングプライマー（以下、標識プライマーＣと記す）、配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドの５’末端が６ＦＡＭで標識されたタイピングプライマー（以下、標識プライマーＤと記す）、および配列番号１５に示したリバースプライマーのそれぞれについて、プライマー溶液（各２０μＭ）を調製した。
【０１８３】
ここで、標識プライマーＣと、配列番号１５に示したリバースプライマーとの両プライマーからＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片の全長は６０ｂｐとなる。一方、標識プライマーＤと配列番号１５に示したリバースプライマーとの両プライマーからＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片の全長は６２ｂｐとなる。
【０１８４】
次に、標識プライマーＣおよびＤと、配列番号１５に示したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応液７〜９を調製しＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応液の組成は表８〜１０に記す通りである。また、ＰＣＲ反応の条件は、実施例１と同様に、図１１に示すとおりであり、このときの繰り返し回数は２０回である。
【０１８５】
【表８】
2005065688.tif 000010
【０１８６】
【表９】
2005065688.tif 000011
【０１８７】
【表１０】
2005065688.tif 000012
【０１８８】
上記ＰＣＲ反応後、各ＰＣＲ反応液についてジェネティックアナライザ  ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により解析を行った。
【０１８９】
その結果、ＰＣＲ反応液７については６０ｂｐからなるＤＮＡ断片が優位に増幅されたことを示すピークが認められたのに対し、６２ｂｐからなるＤＮＡ断片の増幅を示すピークはほとんど認められなかった。逆に、ＰＣＲ反応液９に関しては６２ｂｐからなる塩基配列の増幅を示すピークが認められたが、６０ｂｐからなる塩基配列の増幅を示すピークはほとんど認められなかった。一方、ＰＣＲ反応液８に関しては６０ｂｐからなる塩基配列と６２ｂｐからなる塩基配列の両方のピークが確認された。
【０１９０】
従って、上記標識プライマーＣおよびＤを用いることによって、本実施例におけるＳＮＰ部位についてＡ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ｇの三種類のＳＮＰパターンを正確にタイピングすることが可能であることが確認された。
【実施例３】
【０１９１】
本実施例では、上記実施例１と同じゲノムＤＮＡおよびタイピングプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った後に、そのＰＣＲ反応液中のピロリン酸量をルシフェラーゼ反応を用いて解析することによって、ＳＮＰ部位の塩基種のタイピングを行なうことを試みた。
【０１９２】
そこでまず、実施例１と同様にＰＣＲ反応液１〜６を調製しＰＣＲ反応を行った。
【０１９３】
次に、ＰＣＲ後の各ＰＣＲ反応液中に含まれているピロリン酸量について、Ｍｏｓｔａｆａ  Ｒｏｎａｇｈｉらの方法（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ.，  Ｕｈｌｅｎ，Ｍ． ａｎｄ  Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９９８）Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，３６３−３６５．）に準じて解析した。ルシフェラーゼ反応による発光強度の解析については、ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ／ＶＩＭシステム（浜松ホトニクス（株）製）を用いて行った。その結果を図１２に示す。
【０１９４】
図１２では、ＰＣＲ反応液１の場合の発光強度を１００％とし、他の各ＰＣＲ反応液の発光強度を、ＰＣＲ反応液１の場合に対する割合（＝（各ＰＣＲ反応液の発光強度／ＰＣＲ反応液１の発光強度）×１００）で表している。
【０１９５】
図１２に示すように、ＰＣＲ反応液１と６とが、ほぼ同等の発光強度を示すことが認められた。またＰＣＲ反応液３および４についてもほぼ同等の発光強度が認められたが、ＰＣＲ反応液１および６と比較すると、明らかにその発光強度は小さかった。また、ＰＣＲ反応液２および５に関してはほとんど発光は認められなかった。
【０１９６】
つまり、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１のタイピングプライマーを用いたときだけ発光が認められ、逆にＧ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１２のタイピングプライマーを用いたときだけ発光が認められた。一方、Ａ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれを用いた場合においても発光が認められたものの、その強度は上記の２パターンの場合に比べ明らかに小さいものであった。
【０１９７】
従って、本実施例において、上記タイピングプライマーを用いてＰＣＲ反応およびルシフェラーゼ反応を介してその発光の有無を解析することで解析対象ＳＮＰ部位のタイピングをすることができた。
【０１９８】
また、上記のようにＡ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１および１２のタイピングプライマーを用いた場合の発光強度が、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して配列番号１１のタイピングプライマーを用いた場合や、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して配列番号１２のタイピングプライマーを用いた場合に比べて明らかに小さかった理由は、Ａ／ＡゲノムＤＮＡおよびＧ／ＧゲノムＤＮＡでは、ＰＣＲ反応における鋳型となるＳＮＰ部位の塩基がＡまたはＧであるゲノムＤＮＡの量が、Ａ／ＧゲノムＤＮＡの２倍であるからである。
【０１９９】
従って、発光の有無だけではなく、発光強度の定量的な解析を行なうことによって、配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれかを一方のみを用いた場合でも、ＳＮＰタイピングが可能であることが確認できた。このような定量的な解析によるＳＮＰパターンがホモかヘテロかの判別は、プライマー伸長反応が進行する場合としない場合とを、明確に区別することができる本発明により、初めて有利に実行可能となる。
【実施例４】
【０２００】
本実施例では、ヒトの血液より抽出したゲノムＤＮＡ溶液を用いて、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ２遺伝子中に見られるＳＮＰのタイピングを試みた。本実施例において、解析対象としたＳＮＰ部位およびその周辺のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１６に示す。ＳＮＰ部位は、配列番号１６の３７番目の塩基（ｓで記された部位）であり、ＧあるいはＣの可能性がある。
【０２０１】
まず、上記のＳＮＰパターンがそれぞれＧ／Ｇ、Ｇ／Ｃ、Ｃ／Ｃであることが予め分かっている３人の被験者の血液から、Ｇｅｎとるくん（登録商標）（血液用）（宝酒造（株）製）を用いて、ＳＮＰパターンがＧ／ＧのゲノムＤＮＡ（以下、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡと記す）、ＳＮＰパターンがＧ／ＣのゲノムＤＮＡ（以下、Ｇ／ＣゲノムＤＮＡと記す）、ＳＮＰパターンがＣ／ＣのゲノムＤＮＡ（以下、Ｃ／ＣゲノムＤＮＡと記す）を抽出した。
【０２０２】
次に、配列番号１７に示したプライマーと、配列番号１８に示したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応液１０〜１２を調製しＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応液の組成は表１１〜１３に示す通りである。また、ＰＣＲ反応の条件は、図１１に示すとおりであり、このときの繰り返し回数は３５回である。
【０２０３】
【表１１】
2005065688.tif 000013
【０２０４】
【表１２】
2005065688.tif 000014
【０２０５】
【表１３】
2005065688.tif 000015
【０２０６】
次に、上記ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１０〜１２のそれぞれを、ＳＵＰＲＥＣ（登録商標）−ＰＣＲ（宝酒造（株）製）を用いて精製した。これらについて、配列番号１９および２０に示したタイピングプライマーを用いてプライマー伸長反応液１〜６を調製し、プライマー伸長反応を行った。各プライマー伸長反応液の組成は表１４〜１９に示す通りである。また、プライマー伸長反応の条件は、図１３に示すとおりである。
【０２０７】
【表１４】
2005065688.tif 000016
【０２０８】
【表１５】
2005065688.tif 000017
【０２０９】
【表１６】
2005065688.tif 000018
【０２１０】
【表１７】
2005065688.tif 000019
【０２１１】
【表１８】
2005065688.tif 000020
【０２１２】
【表１９】
2005065688.tif 000021
【０２１３】
プライマー伸長反応後、各プライマー伸長反応液中に含まれているピロリン酸量について、実施例３と同様にルシフェラーゼ反応を介して解析した。その結果を図１４に示す。
【０２１４】
図１４では、プライマー伸長反応液１の場合の発光強度を１００％とし、他の各プライマー伸長反応液の発光強度を、プライマー伸長反応液１の場合に対する割合（＝（各プライマー伸長反応液の発光強度／プライマー伸長反応液１の発光強度）×１００）で表している。
【０２１５】
図１４に示すように、プライマー伸長反応液１と６とが、ほぼ同等の発光強度を示すことが認められた。またプライマー伸長反応液３および４についてもほぼ同等の発光強度が認められたが、プライマー伸長反応液１および６と比較すると、明らかにその発光強度は小さかった。また、プライマー伸長反応液２および５に関してはほとんど発光は認められなかった。
【０２１６】
つまり、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１９のタイピングプライマーを用いたときだけ発光が認められ、逆にＣ／ＣゲノムＤＮＡに関して、配列番号２０のタイピングプライマーを用いたときだけ発光が認められた。一方、Ｇ／ＣゲノムＤＮＡに関して、配列番号１９および２０のタイピングプライマーのいずれを用いた場合においても発光が認められたものの、その強度は上記の二パターンの場合に比べ明らかに小さいものであった。
【０２１７】
従って、本実施例において、上記タイピングプライマーを用いてプライマー伸長反応およびルシフェラーゼ反応を介してその発光の有無を解析することで解析対象ＳＮＰ部位のタイピングをすることができた。
【０２１８】
また、上記のようにＧ／ＣゲノムＤＮＡに関して、配列番号１９および２０のタイピングプライマーを用いた場合の発光強度が、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して配列番号１９のタイピングプライマーを用いた場合や、Ｃ／ＣゲノムＤＮＡに関して配列番号２０のタイピングプライマーを用いた場合に比べて明らかに小さかった理由は、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡおよびＣ／ＣゲノムＤＮＡでは、プライマー伸長反応液における鋳型となるＳＮＰ部位の塩基がＧまたはＣであるゲノムＤＮＡの量が、Ｇ／ＣゲノムＤＮＡの２倍であるからである。
【０２１９】
従って、発光の有無だけではなく、発光強度の定量的な解析を行なうことによって、配列番号１９および２０のタイピングプライマーのいずれかを一方のみを用いた場合でも、ＳＮＰタイピングが可能であることが確認できた。このような定量的な解析によるＳＮＰパターンがホモかヘテロかの判別は、プライマー伸長反応が進行する場合としない場合とを、明確に区別することができる本発明により、初めて有利に実行可能となる。
【実施例５】
【０２２０】
本実施例５では、実施例１と同じゲノムＤＮＡおよびプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った後に、そのＰＣＲ反応液中のピロリン酸をＨ＋−ピロホスファターゼを用いて解析することで実施例１と同じ解析対象ＳＮＰ部位のタイピングを行なうことを試みた。
【０２２１】
図１５は、Ｈ＋−ピロホスファターゼを模式的に表す図である。
【０２２２】
図１５に示すように、Ｈ＋−ピロホスファターゼは通常、植物の液胞膜内に存在する膜タンパク質であり、１分子のピロリン酸から２分子のリン酸を生成する加水分解反応に伴って、液胞膜の外側から液胞膜の内側に向けＨ＋を輸送する性質を有する。このため、Ｈ＋−ピロホスファターゼの酵素反応によって、液胞膜の内部ではＨ＋濃度が増大し、液胞膜の外部ではＨ＋濃度が減少する。すなわち、ピロリン酸を測定するには、ピロリン酸の測定を行いたい試料液を植物細胞等から単離してきた液胞膜に内在している状態のＨ＋−ピロホスファターゼに接触させ、その後、液胞膜の内側あるいは液胞膜の外側のＨ＋濃度変化を測定すればよい。このとき、Ｈ＋−ピロホスファターゼは必ずしも細胞から単離された液胞膜に結合した状態のままで用いられる必要はない。例えば、液胞膜よりＨ＋−ピロホスファターゼを単離した後、人工的に形成した脂質二重層膜などのＨ＋をほとんど通さない膜中にＨ＋−ピロホスファターゼを再構築して用いてもよい。なお、上記のＨ＋−ピロホスファターゼを膜内に内包した天然または人工の液胞膜の抽出および／または作製は、当業者の通常の技術である。
【０２２３】
Ｈ＋濃度の変化を測定する方法としては、代表的にはＨ＋濃度の変化を光学的変化に変換して測定する方法と電気的に測定する方法が挙げられる。Ｈ＋濃度の変化を光学的変化に変換して測定する方法としては、ｐＨ試験紙、ｐＨ感受性色素（例えば、アクリジンオレンジなど）、膜電位感受性色素（例えば、ＤｉＢＡＣ４（３）（Bis(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol）、ＤｉＢＡＣ４（５）（Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)pentamethine oxonol;）、ＤｉＳＢＡＣ２（３）（Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol）、ｄｉ−４−ＡＮＮＥＰＳ、ＤｉＯＣ６（３）（dihexaoxacarbocyanine iodide）、オクソールＶなど）等を用いる方法が挙げられる。電気的に測定する方法としては、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法がある）、ガラス電極法、ＩＳＦＥＴ電極法、パッチクランプ法、ＬＡＰＳ法（Ｌｉｇｈｔ−Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  Ｓｅｎｓｏｒ）等が挙げられる。これらＨ＋濃度の変化を測定する方法と、上記のＨ＋−ピロホスファターゼの反応を併用することによって、試料液中のピロリン酸を光学的シグナルあるいは電気的シグナルに変換して測定することができる。なおＨ＋濃度変化を解析する方法としては、上記Ｈ＋濃度変化解析方法に限られることはなく、他の解析方法であってもＨ＋濃度変化を解析し得るのであればよい。
【０２２４】
そこで本実施例においては、Ｓｈｉｚｕｏ  Ｙｏｓｈｉｄａ等の方法（Ｍａｓａｙｏｓｈｉ  Ｍａｅｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｚｕｏ  Ｙｏｓｈｉｄａ．（１９８９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（３３）、ｐ２００６８−２００７３）に準じて以下に示すようにヤエナリ由来の液胞膜からなるＨ＋−ピロホスファターゼ液を調製した。
【０２２５】
まず、ヤエナリ由来の液胞膜小胞体をＴｒｉｓ／Ｍｅｓ（濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０）、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、ＤＴＴ（濃度２ｍＭ）からなる溶液中に溶解し、液胞膜からなる膜小胞の懸濁液とした。
【０２２６】
次に、この懸濁液を、ＭｇＳＯ4（濃度１ｍＭ）、ＫＣｌ（濃度５０ｍＭ）、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、アクリジンオレンジ（ｐＨ感受性色素、３μＭ）、Ｈｅｐｅｓ／Ｂｒｉｓｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ（濃度２５ｍＭ、ｐＨ７．２）からなる反応液中に混合し、Ｈ＋−ピロホスファターゼ液とした。この様子を図１６に模式的に示す。このとき、膜小胞にはＨ＋−ピロホスファターゼが保持されており、膜小胞の内部および外部には一様にアクリジンオレンジが存在している。このＨ＋−ピロホスファターゼ液を６本のチューブに均等に分注した。
【０２２７】
次に、上記実施例１と同様に、ＰＣＲ反応を行なったＰＣＲ反応液１〜６を上記ピロホスファターゼ液の入ったチューブにそれぞれ添加し、Ｈ＋−ピロホスファターゼによる反応を開始した。 
【０２２８】
本実施例においては、ｐＨ感受性色素としてアクリジンオレンジを使用している。アクリジンオレンジは液胞膜を透過可能であり、酸性条件下において蛍光を消光するという性質を有する。従って、上記Ｈ＋−ピロホスファターゼ液に対してある一定量以上のピロリン酸を含む溶液を添加した場合、Ｈ＋−ピロホスファターゼによるＨ＋輸送が起こり、膜小胞内は酸性になる。このためアクリジンオレンジによる蛍光は失われる。この性質を利用して、ＰＣＲ反応によって生じるピロリン酸を定量することができる。
【０２２９】
本実施例では、各ＰＣＲ反応液を添加する前後のアクリジンオレンジの蛍光強度（励起光：４９３ｎｍ、蛍光：５４０ｎｍ）の変化を解析した。その結果を図１８に示す。
【０２３０】
図１８は、上記各ＰＣＲ反応液それぞれの場合における、５４０ｎｍの蛍光強度の変化を表すグラフである。ここでは、５４０ｎｍの蛍光強度の変化を、上記各ＰＣＲ反応液の添加１秒後における単位秒当たりの消光率で表している。なお、図１０では、ＰＣＲ反応液１の場合における単位秒当たりの消光率を１００％として、各ＰＣＲ反応液における単位秒当たりの消光率を換算している。
【０２３１】
これよりＰＣＲ反応液１と６がほぼ同等の消光率を示すことが分かる。またＰＣＲ反応液３および４についてもほぼ同等の消光率が認められたが１や６と比較すると明らかにその消光率は小さかった。またＰＣＲ反応液２および５に関してはほとんど消光は認められなかった。
【０２３２】
つまり、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１に示すタイピングプライマーを用いたときだけ消光が認められ、逆にＧ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１２に示すタイピングプライマーを用いたときだけ消光が認められた。一方、Ａ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１および１２に示すタイピングプライマーのいずれを用いた場合においても消光が認められたものの、その消光率は上記の２パターンの場合に比べて明らかに小さいものであった。
【０２３３】
従って、本実施例において、配列番号１１および１２に示すタイピングプライマーを用いたＰＣＲ反応を行ない、それらについてＨ＋−ピロホスファターゼによる反応を利用して解析することでＳＮＰ部位のタイピングをすることができた。また上記のようにＡ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１または１２に示すタイピングプライマーを用いた場合の消光率が、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して配列番号１１に示すタイピングプライマーを用いた場合や、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して配列番号１２に示すタイピングプライマーを用いた場合に比べて明らかに小さかった理由は、Ａ／ＡゲノムＤＮＡおよびＧ／ＧゲノムＤＮＡでは、ＰＣＲ反応における鋳型となるゲノムＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基がＡまたはＧであるゲノムＤＮＡの量が、Ａ／ＧゲノムＤＮＡの２倍であるからである。
【０２３４】
従って、消光の有無だけではなく、消光率の定量的な解析を行うことによって、配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれか一方のみの場合でも、ＳＮＰタイピングを行なうことができる。このような定量的な解析によるＳＰＮパターンのホモかヘテロかの判別は、プライマー伸長反応が進行する場合としない場合とを、明確に区別することができる本発明により、初めて有利に実行可能となる。
【実施例６】
【０２３５】
本実施例６では、実施例１と同じゲノムＤＮＡおよびプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った後に、そのＰＣＲ反応液中のピロリン酸をピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼの３種類の酵素を用いて解析することで実施例１と同じ解析対象ＳＮＰ部位のタイピングを行なうことを試みた。
【０２３６】
この方法では、まず、この反応を触媒する酵素であるピロホスファターゼを用いて、ピロリン酸を加水分解して無機リン酸にする。
【０２３７】
次に、無機リン酸は、グリセルアルデヒド３−リン酸および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの触媒作用を受け、１，３−ビスホスホグリセリン酸および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換される。
【０２３８】
次に、生成された還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが、ジアホラーゼの触媒作用を受けて、電子メディエータ（例えば、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、メルドラブルー等）の酸化体とともに反応し、再び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに酸化する。この際、電子メディエータの酸化体は還元され、還元体となる。これらの電子メディエータは、当業者に周知のものであり、市販品として容易に入手可能である。
【０２３９】
最後に、生成された電子メディエータの還元体が、一定以上の電位が印加された作用極において電気化学的に酸化される。この酸化により、電子が放出され、このような電子の放出は、電流値として示され得る。このような電流の測定は、一般の電気化学的検出器を用いてなされ得る。好ましい電子メディエータとしては、フェリシアン化カリウム等を使用することができる。
【０２４０】
電流値は、最初のピロリン酸の存在に依存するので、この酸化電流値をもとにしてピロリン酸が検出され得る。
【０２４１】
以上に示される検出方法は、ピロリン酸の電気化学的な手法による検出を可能にする。その結果得られる電流値はまた最初のピロリン酸の量に依存するため、その検出は定量的なものである。
【０２４２】
そこで、本実施例では、まず以下の手順で反応溶液を作製した。３０ｍＭグリセルアルデヒド３−リン酸１７．５μｌ（終濃度１ｍＭ）、１０ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）５０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１０ｍＭフェリシアン化カリウム５０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１００ｍＭ塩化マグネシウム８μｌ（終濃度１．６ｍＭ）、１０００ｕｎｉｔ／ｍｌジアホラーゼ５μｌ（終濃度１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および２００ｕｎｉｔ／ｍｌピロフォスファターゼ１μｌ（終濃度０．４ｕｎｉｔ／ｍｌ）、を５０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液に溶解し、ｐＨ８．８に調整して総量を４００μｌとした。さらに上記実施例１と同様に、ＰＣＲ反応を行なったＰＣＲ反応液１〜６を５０μｌづつ上記容器にそれぞれ添加し、反応溶液を作製した。このようにして作製した反応溶液を図１９に示すように構成した測定装置系中に供した。本測定装置系は、次のような構成である。ガラスセル１０６を、内部に攪拌子１０７を入れて、スタラーマシン１１３上に固定した。ガラスセル１０６に、電極固定器具１０８により、測定極１０９、対極１１０、および参照極１１１をセットした。測定極１０９は直径１．６ｍｍの金電極で、また対極１１０は白金線でそれぞれ構成した。参照極１１１は、銀／塩化銀電極で構成し、表面に塩化銀がコートされた銀線と飽和ＫＣｌ溶液とを多孔性ガラスを介してガラスセルに接続した。これらの電極を、それぞれ電気化学測定システム（北斗電工製；図中、１１４で示される）に接続して、パソコン１１５で制御およびデータの記録を行った。上記ガラスセル１０６中に、上記の反応溶液を満たした。この反応溶液を攪拌子によって攪拌した。電気化学測定システムを用いて、参照極１１に対して＋６００ｍＶの電位を測定極１０９に印加した。電圧印加と同時に測定を開始し、その後に８００ｕｎｉｔ／ｍｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ ２０μｌ（終濃度３２ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加えることにより反応が開始させた。これにより、反応溶液中のメディエータが酸化し、この酸化による電子の放出により測定極１０９と対極１１０との間に流れた電流値を電気化学測定システムを用いて測定した。６０秒後の電流値を図２０に示す。
【０２４３】
図２０に示すように、ＰＣＲ反応液１と６とが、ほぼ同等の電流値を示すことが認められた。またＰＣＲ反応液３および４についてもほぼ同等の電流値が認められたが、ＰＣＲ反応液１および６と比較すると、明らかにその電流値は小さかった。また、ＰＣＲ反応液２および５に関してはさらに電流値は低かった。
【０２４４】
つまり、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１のタイピングプライマーを用いたときだけ酸化電流が認められ、逆にＧ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１２のタイピングプライマーを用いたときだけ酸化電流が認められた。一方、Ａ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれを用いた場合においても電流が認められたものの、その電流値は上記の二パターンの場合に比べ明らかに小さいものであった。
【０２４５】
従って、本実施例において、上記タイピングプライマーを用いてＰＣＲ反応およびそのＰＣＲ反応液中のピロリン酸をピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼの３種類の酵素を用いて解析することで解析対象ＳＮＰ部位のタイピングをすることができた。
【０２４６】
また、上記のようにＡ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１および１２のタイピングプライマーを用いた場合の電流値が、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して配列番号１１のタイピングプライマーを用いた場合や、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して配列番号１２のタイピングプライマーを用いた場合に比べて明らかに小さかった理由は、Ａ／ＡゲノムＤＮＡおよびＧ／ＧゲノムＤＮＡでは、ＰＣＲ反応における鋳型となるＳＮＰ部位の塩基がＡまたはＧであるゲノムＤＮＡの量が、Ａ／ＧゲノムＤＮＡの２倍であるからである。
【０２４７】
従って、電流値の定量的な解析を行なうことによって、配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれかを一方のみを用いた場合でも、ＳＮＰタイピングが可能であることが確認できた。このような定量的な解析によるＳＮＰパターンがホモかヘテロかの判別は、プライマー伸長反応が進行する場合としない場合とを、明確に区別することができる本発明により、初めて有利に実行可能となる。
【実施例７】
【０２４８】
実施例７では、実施例１と同じＳＮＰ部位を解析対象とし、まず配列番号２１と１３に示す二種類のプライマーによって解析対象ＳＮＰを含む領域をＰＣＲによって増幅させた後、配列番号１１および１２に示したタイピングプライマーと、配列番号１３に示したリバースプライマーによってタイピングを試みた。
【０２４９】
すなわちまず、実施例１と同じくＳＮＰパターンがそれぞれＡ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ｇであることが予め分かっている３人の被験者の血液から、Ｇｅｎとるくん（登録商標）（血液用）（宝酒造（株）製）を用いて、Ａ／ＡゲノムＤＮＡ、Ａ／ＧゲノムＤＮＡ、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡを抽出した。
【０２５０】
次に、配列番号２１および１３に示したプライマーを用いてＰＣＲ反応液１３〜１５を調製しＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応液の組成は表２０〜２２に記すとおりである。また、ＰＣＲ反応の条件は、図１１に示すとおりであり、このときの繰り返し回数は４０回である。
【０２５１】
次に、上記ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液１３〜１５のそれぞれを１０００倍に希釈したものについて、配列番号１１および１２のタイピングプライマーと配列番号１３に示したリバースプライマーを用いてＰＣＲ反応液１６〜２１を調製し、ＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応液の組成は表２３〜２８に記すとおりである。また、ＰＣＲ反応の条件は図１１に示すとおりであり、このときの繰り返し回数は２０回である。
【０２５２】
【表２０】
2005065688.tif 000022
【０２５３】
【表２１】
2005065688.tif 000023
【０２５４】
【表２２】
2005065688.tif 000024
【０２５５】
【表２３】
2005065688.tif 000025
【０２５６】
【表２４】
2005065688.tif 000026
【０２５７】
【表２５】
2005065688.tif 000027
【０２５８】
【表２６】
2005065688.tif 000028
【０２５９】
【表２７】
2005065688.tif 000029
【０２６０】
【表２８】
2005065688.tif 000030
【０２６１】
上記ＰＣＲ反応後、３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。
【０２６２】
目的のＤＮＡ断片の増幅が認められたのは、ＰＣＲ反応液１６、１８、１９、２１であった。一方、ＰＣＲ反応液１７および２０に関してはほとんど増幅は確認されなかった。つまり、Ａ／ＡゲノムＤＮＡに関して、配列番号１１のタイピングプライマーを用いたときにのみ増幅が確認された。逆に、Ｇ／ＧゲノムＤＮＡに関して、配列番号１２のタイピングプライマーを用いたときにのみ増幅が確認された。また、Ａ／ＧゲノムＤＮＡに関して、いずれのタイピングプライマーを用いた場合にも増幅が確認された。
【０２６３】
従って、上記の配列番号１１および１２のタイピングプライマーを用いることによって、ＳＮＰ部位の塩基を判別できることが確認できた。
【０２６４】
また、ＤＮＡ断片の増幅量は、ＰＣＲ反応液１６および２１がほぼ同程度であり、ＰＣＲ反応液１８および１９は、ＰＣＲ反応液１６および２１に比べ明らかに少ないという結果であった。このように、ＰＣＲ反応液１６および１８では、同じタイピングプライマーが用いられているにも関わらず、ＤＮＡ断片の増幅量に明らかな差が認められるのは、ＰＣＲ反応における鋳型となるＳＮＰ部位の塩基がＡであるゲノムＤＮＡの量がＰＣＲ反応液１６の方がＰＣＲ反応液１８の２倍であるからである。
【０２６５】
この結果は、ＤＮＡ断片の増幅量の差からも、ゲノムＤＮＡのＳＮＰパターンがホモであるかヘテロであるかを解析することが可能であることを示している。従って、本実施例において、仮に配列番号１１および１２のタイピングプライマーのいずれか一方のみを用いたとしても、ＤＮＡ断片の増幅の有無だけでなく、増幅量も解析することによって、Ａ／Ａ、Ａ／Ｇ、Ｇ／Ｇの三種類のＳＮＰパターンをタイピングすることが可能である。このような増幅量に基づく定量的なＳＮＰパターンの解析は、プライマー伸長反応が進む場合と進まない場合との区別が明確な本発明のタイピングプライマーにより、初めて可能となる。
【０２６６】
以上の結果は、本発明のタイピングプライマーを用いることでＳＮＰタイピングができることを示している。
【０２６７】
以上、本発明を詳細に説明してきたが、前述の説明はあらゆる点において本発明の例示にすぎず、その範囲を限定しようとするものではない。本発明の範囲を逸脱することなく種々の改良や変形を行うことができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０２６８】
本発明にかかる塩基種判別方法によれば、核酸中の所望の塩基の種類を正確かつ再現性良く判別することができ、医療機器や薬剤分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】図１は、従来のＳＮＰタイピング技術を説明する工程図
【図２】図２は、従来のＳＮＰタイピング技術を説明する工程図
【図３】図３は、従来のＳＮＰタイピング技術において得られたＤＮＡ断片を電気泳動によって解析した図
【図４】図４（ａ）および図４（ｂ）は、従来のタイピングプライマーの構造を表す図
【図５】図５（ａ）〜図５（ｄ）は、プライマー伸長反応が確実に進行しない条件を調査する方法を説明する工程図
【図６】図６は、プライマー伸長反応が確実に進行しない条件の調査において得られたＤＮＡ断片を電気泳動によって解析した図
【図７】図７（ａ）〜図７（ｃ）は、実施形態１の塩基種判別方法において用いられるタイピングプライマーを模式的に示す図
【図８】図８（ａ）〜図８（ｄ）は、実施形態１の一本鎖の標的核酸が有する置換領域の塩基配列の塩基種を判別する方法の各工程を表す図
【図９】図９（ａ）〜図９（ｄ）は、実施形態１の一本鎖の標的核酸が有する置換領域の塩基配列の塩基種を判別する方法の各工程を表す図
【図１０】図１０（ａ）〜図１０（ｃ）は、実施形態２のＳＮＰタイピングに用いるタイピングプライマーの構成を表す模式図
【図１１】図１１は、ＰＣＲ反応の条件を示す図
【図１２】図１２は、ＰＣＲ反応後の各ＰＣＲ反応液中に含まれているピロリン酸量と、発光強度との関係を表す図
【図１３】図１３は、プライマー伸長反応の条件を示す図
【図１４】図１４は、プライマー伸長反応後の各プライマー伸長反応液中に含まれているピロリン酸量と発光強度との関係を表す図
【図１５】図１５は、Ｈ+−ピロホスファターゼを模式的に表す図
【図１６】図１６は、膜小胞に内包したＨ+−ピロホスファターゼを含む溶液の様子を模式的に示す図
【図１７】図１７は、平面膜に内包したＨ＋−ピロホスファターゼを用いたピロリン酸の測定装置を表す図
【図１８】図１８は、ＰＣＲ反応後における各ＰＣＲ反応液それぞれの５４０ｎｍの蛍光強度の変化を表すグラフ
【図１９】図１９は、電流値を測定するための例示の測定装置系を示す模式図
【図２０】図２０は、ＰＣＲ反応後の各ＰＣＲ反応液中に含まれているピロリン酸量と、電流値との関係を表す図
【符号の説明】
【０２７０】
１，２    ＤＮＡ
３，４，５，６，５４，５６    一本鎖ＤＮＡ
７ａ    タイピングプライマー
７ｂ    リバースプライマー
８，１８，２８    ＤＮＡポリメラーゼ
１０，１０'    タイピングプライマー
１１    ＤＮＡ
１３，１４    一本鎖ＤＮＡ
１７ａ    フォワードプライマー
１７ｂ    リバースプライマー
２０    リバースプライマー
３０    核酸ポリメラーゼ
３４ａ，３４ｂ，４４ａ，４４ｂ    一本鎖の核酸
３５ａ，３５ｂ，４５ａ，４５ｂ    置換領域
３６，３８    二本鎖の核酸
１０６    ガラスセル
１０７    攪拌子
１０８    電極固定器具
１０９    測定極
１１０    対極
１１１    参照極
１１２    反応溶液
１１３    スタラーマシン
１１４    電気化学測定システム
１１５    パソコン
２００    ピロリン酸測定装置
２０２    試料溶液
２０４    容器
２０５    電極
２０６    内部槽
２０７    膜
２０８    Ｈ＋感受性電極
２０９    内部領域
【図１】
2005065688.tif 000031
【図２】
2005065688.tif 000032
【図３】
2005065688.tif 000033
【図４】
2005065688.tif 000034
【図５】
2005065688.tif 000035
【図６】
2005065688.tif 000036
【図７】
2005065688.tif 000037
【図８】
2005065688.tif 000038
【図９】
2005065688.tif 000039
【図１０】
2005065688.tif 000040
【図１１】
2005065688.tif 000041
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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