(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の培養方法、再構成された皮膚を得るための方法を提供する。【解決手段】ＬＩＦ(白血病阻害因子)、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量を使用し、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得る。あるいは、再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚を得る。また、再構成された表皮又は細胞のライブラリを作製するためのキット、ダメージを受けた皮膚を示す個人(第３度火傷を被った個人、及び皮膚に影響を及ぼす遺伝病を被った個人)の処置を意図した幹細胞又は再構成された表皮の調整方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ｉ)ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体の、インビトロにおける増殖を促進させると同時に、それらを未分化状態で維持させ；及び／又は(ｉｉ)多重層上皮を生成するそれらの能力を維持し及び／又は増大させるための、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用。
【請求項２】
ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得るための方法における、請求項１に記載のＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用。
【請求項３】
再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚を得るための方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用。
【請求項４】
ＬＩＦが、精製されたＬＩＦ、組換えＬＩＦ、ＬＩＦを含む粉砕細胞材料又は細胞抽出物、ＬＩＦを含有する細胞培養上清、又はそれらの混合物の形態で提供されることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ＬＩＦ類似体が、(ｉ)未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の、インビトロにおける増殖を促進させ、及び(ｉｉ)多重層上皮を生成するそれらの能力を維持し及び／又は増大させることができる、皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体においてＬＩＦ活性を有する、修飾されたＬＩＦポリペプチド、又はＬＩＦポリペプチド断片から選択されることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＬＩＦ模倣剤が、ｇｐ１３０及び／又はＪａｋ／Ｓｔａｔ及びＲａｓ／Ｍａｐキナーゼシグナル伝達経路、特にＳｔａｔ３の発現及び／又は活性を活性化可能な任意の活性剤又は細胞抽出物、又はＬＩＦレセプター(ＬＩＦ-Ｒ)の任意のアゴニストから選択されることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量を含有する培養培地において、ヒトのケラチノサイト調製物を増殖させる少なくとも一の工程を含む、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得るための方法。
【請求項８】
ヒトのケラチノサイト調製物が、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体にて、Ｉ型コラーゲン基質への急速な付着、及び付着した細胞の回収によりプレ濃縮されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞の回収が、０．０５％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡの存在下、剥離によって実施されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
増殖用培地に存在する、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量が、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項７ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下、前記増殖した細胞を低温保存する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
(ｉ)ヒトのケラチノサイト調製物、及び(ｉｉ)ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択され、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの化合物の有効量が補足されたヒトのケラチノサイト細胞用の培養培地を含む、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を生成するためのキット。
【請求項１３】
ａ）真皮支持体又は真皮等価物を調製することからなる工程；及び
ｂ）該支持体上に、ヒトのケラチノサイトの集合体を播種することからなる工程；
を含み、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量を、工程ａ）及びｂ）のいずれか、もしくは双方において、培地に添加することを特徴とする、再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の調製方法。
【請求項１４】
ａ）真皮支持体又は真皮等価物を調製することからなる工程；及び
ｂ）該支持体上に、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を播種することからなる工程；
を含む、再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の調製方法。
【請求項１５】
(ｉ)真皮支持体、(ｉｉ)ヒトのケラチノサイト調製物、及び(ｉｉｉ)ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択され、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの化合物の有効量を含む培養培地を含有する、表皮又は再構成された皮膚を生成するためのキット。
【請求項１６】
−  テストされる活性剤の存在下、及び成熟したケラチノサイト、又は皮膚付属物の構造の一部である任意の他の細胞型への分化及び／又は増殖が可能な条件で、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を培養し；
−  該活性剤の不在下における細胞の分化及び／又は増殖度合いと、活性剤の存在下における細胞の分化及び／又は増殖度合いとを比較する；
ことを含む、
ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の、成熟したケラチノサイト、又は皮膚付属物の構造の一部である任意の他の細胞型への分化及び／又は増殖を調節可能な活性剤をスクリーニング及び／又は評価するための方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用。
【請求項１７】
−  テストされる活性剤の存在下、多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成可能な条件で、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を培養し；
−  該活性剤の不在下における多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成する細胞の能力と、該活性剤の存在下における多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成する細胞の能力とを比較する；
ことを含む、
皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の、多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成する能力を調節可能な活性剤をスクリーニング及び／又は評価するための方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用。
【請求項１８】
皮膚の損傷を処置することを意図した、請求項１３又は１４の方法における再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚、又はヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を調製するための、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用。
【請求項１９】
未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体、又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚が、火傷の処置を意図したものであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１３又は１４の方法における再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚、又はヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体が、皮膚切除による、皮膚の損傷の処置を意図したものであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚、又はヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体が、遺伝病に関連した皮膚の損傷の処置を意図したものであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体が、皮膚に影響を及ぼす遺伝病を被った個人から得られることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
皮膚に影響を及ぼす遺伝病が、表皮水疱症、色素性乾皮症、層状魚鱗癬又はＸ-染色体関連魚鱗癬から選択されることを特徴とする、請求項２１又は２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明の技術分野は、ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の培養方法、及び多重層上皮、特に表皮等価物及び／又は皮膚等価物の調製におけるそれらの使用にある。
【０００２】
本発明は、(ｉ)ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体の、インビトロにおける増殖を促進させると同時に、それらを未分化状態で維持させ；及び／又は(ｉｉ)多重層上皮、特に多重層表皮、及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成するそれらの能力を維持し及び／又は増大させるための、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用に関する。
また、ＬＩＦの存在下で、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得るための方法、再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚を得るための方法、再構成された表皮又は細胞のライブラリを作製するためのキット、ダメージを受けた皮膚を示す個人(第３度火傷を有する個人、及び皮膚に影響を及ぼす遺伝病を被った個人)の処置を意図した幹細胞又は再構成された表皮を調製するための、ＬＩＦの使用に関する。
【０００３】
本発明において、「ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体」なる表現は、多重層上皮、特に多重層表皮、及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物(皮脂腺、毛髪の小胞、爪等)を生成し、自己再生及び／又は増殖可能な表皮の基底層に天然に存在する成人体細胞の幹細胞の集合体を意味する。ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のこの集合体は、例えば、成人の皮膚及び／又は新生児の皮膚のサンプルから得られたものであってもよい。
「細胞の自己再生能」なる表現は、少なくとも一方が母細胞と同一である、２つの娘細胞を付与するように分割可能な細胞を意味することを意図している。複雑型細胞の集合体の規模では、自己再生という概念は、連続的な細胞分割の間一定である表現型及び機能的特徴を有する細胞区画の維持を意味している。本発明において、このことは、強い増殖能と、多重層上皮、特に多重症表皮の生成能で特徴付けられる、未分化の皮膚の幹細胞及び／又は表皮前駆体を構成する区画の維持に関与している。
「細胞の増殖能」なる表現は、増殖して２つの娘細胞を付与可能な細胞を意味することを意図しており、母細胞の特徴及び能力は、必ずしも２つの娘細胞の少なくとも一方に伝達されるものではない。
自己再生現象を伴ってもそうでなくてもよい増殖は、増殖する細胞集合体において興味ある細胞区画の漸次的減少又は消失に帰する傾向がある。
本発明において、細胞増殖は、強い増殖能と、多重層上皮、特に多重症表皮の生成能で特徴付けられる、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の区画の漸次的減少及び／又は消失を伴う可能性がある。
この集合体は、特に未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を含む。
【０００４】
組織ヒエラルキーの最も上流に位置する幹細胞区画は、強い自己再生能(長期間にわたる増殖能)とまた多能性(特に、多重層上皮、特にケラチノサイト、及び／又は皮膚付属物の種々の細胞型、例えば毛髪の小胞、皮脂腺、爪等)により特徴付けられる。
前記幹細胞から派生した表皮前駆体は、かなりではあるが一般的に幹細胞の増殖能よりは低い増殖能を示し、また多重層上皮、特に多重層表皮を生成する能力によって特徴付けられる。
【０００５】
胚由来の幹細胞(ＥＳ細胞)は、先天的無制限に拡大する可能性を有する(Amitら, Dev Biol. 227：271-278, 2000；Odoricoら, Stem Cells. 19：193-204, 2001)。事実、それらは、未分化状態を保持しつつ、加齢の兆候なしに増殖することができる。
特にWO02/097068には、マウス胚の幹細胞のマウスケラチノサイトへの分化を誘発させる方法が記載されている。
【０００６】
他方、成人体細胞の幹細胞が拡大する可能性は、有糸分裂時計により制限される(Vaziriら, Proc Natl Acad Sci USA. 91：9857-9860, 1994；Changら, Proc Natl Acad Sci USA. 92：11190-11194, 1995)。この制限された拡大能力は、特に表皮の幹細胞及び前駆体に関係している(Ramirezら, Genes Dev. 15：398-403, 2001；Counterら, Lancet. 361：1345-1346, 2003；Fortunelら, J. Cell Sci. 116：4043-4052, 2003)。
制限された数、分割した後、成人組織から派生した幹細胞及び前駆体は分化を指向し、老化の兆候を示し、そして死亡する。これらの特徴は、細胞ライブラリの作製、及び細胞及び組織工学(例えば：皮膚等価物の調製)における制限因子を表す。
【０００７】
以前、本出願人は、WO03/038073(ロレアル／ＣＮＲＳ)において、細胞外マトリックス成分に、調製物を付着させることによって、ケラチノサイト調製物から、ケラチノサイト幹細胞の集合体を濃縮する方法を提案している。
よって、細胞培養法、特に細胞を増殖及び／又は分化させる方法は、成人体細胞の幹細胞と胚の幹細胞とに特異的な特徴を考慮すべきであり、それは、(ｉ)胚の幹細胞に対しては制限されず、成人の幹細胞に対しては制限されると認知されている、それらの拡大可能性、及び(ｉｉ)「全能性」の胚の幹細胞(個人の全ての組織及び器官型を生成可能)と比較して、皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体(皮膚組織を生成可能)にとってより進んだそれらの分化段階によって異なる。
【０００８】
よって、ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の増殖を促進可能であると同時に、それらを未分化の状態で維持可能で、それらの器官形成能、すなわち多重層上皮、特に多重層表皮、及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物(毛髪の小胞、皮脂腺、爪等)を生成する能力を維持、さらには増大可能とさせる薬剤を見出す必要がある。
【０００９】
今日、本出願人は、予期しないことに、白血病阻害因子(ＬＩＦ)を使用することにより：
(ｉ)ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体の、インビトロにおける増殖を促進可能であると同時に、それらを未分化の状態で維持可能であり；
(ｉｉ)天然の表皮(角質層、顆粒層、超基底層、及び基底層を有する)に匹敵する組織学的特徴を示す品質の、多重層の再構成された表皮を得るために必要なものを明らかにすることができる；
ことを見出した。事実、ＬＩＦの不在下で再構成された表皮は、ＬＩＦの存在下で再構成された表皮と比較して、構造的異常が見出されることが示されている。
【００１０】
ＬＩＦは骨髄性白血病細胞、例えばマウスＭ１細胞の増殖を抑制し、マクロファージの分化を促進させることが可能な因子として、US6261548に記載されており、それには、感染に対する反応性に関与するマクロファージの機能を変化させ、ある種の形態の骨髄性白血病を抑制させるための非増殖性の治療剤としての使用が示唆されている。
皮膚において、ＬＩＦは、インビボ及びインビトロで、ケラチノサイトにより自然に生成されるサイトカインであり(Pagliaら, Br J Dermatol. 134：817-823, 1996)、特にこの因子は、乾癬(Bonifatiら, Arch Dermatol Res. 290：9-13, 1998；Szepietowskiら, J Dermatol. 28：115-122, 2001)、又はある種のアレルギー(Szepietowskiら, Contact Dermatitis. 36：21-25, 1997)等の、種々の皮膚病に関連した炎症プロセスの制御に関与していることが知られている。
しかしながら、インビトロにおいて、胚の幹細胞と比較して制限された拡大可能性を有することが知られており、胚の幹細胞よりもより進んだ分化段階である、成人体細胞の幹細胞の増殖を促進させるために、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、又は内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物を使用すること、さらにインビトロにおいて、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の増殖を促進させるためにＬＩＦを使用することについては、記載も示唆もされておらず、皮膚(再構成された表皮及び再構成された皮膚)の器官型培養モデルを改善することについてもしかりである。
【００１１】
ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得るため、及び病変のある皮膚を有する個人(第３度火傷を被った個人、皮膚に影響を及ぼす遺伝病を被った個人)を処置することを意図した皮膚等価物を調製するためのに、この発見が重要であることが理解される。
【００１２】
皮膚は、生物体とその環境との間に物理的障壁を構成する。それは、２つの組織：表皮と真皮とからなる。
真皮は表皮に堅牢な支持部を付与している。真皮はまた表皮の栄養成分でもある。真皮は主として線維芽細胞と細胞外マトリックスとからなり、細胞外マトリックスは、特にコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、及び基底物質として公知の物質から構成され、これらの成分は本質的に線維芽細胞によって合成される。さらに、白血球、肥満細胞又は組織マクロファージ（tissue macrophage）もそこに見出される。また、真皮には血管と神経線維も含まれる。
【００１３】
表皮は、平均して１００μｍ厚の落屑する多重層上皮であり、皮膚幹細胞、未分化の表皮前駆体、さらに成熟／分化プロセスに関与する細胞を含む基底層、基底細胞上に配された数層の多面細胞からなる「有棘」層、細胞質封入体、ケラトヒアリン顆粒を含む扁平細胞からなるいわゆる「顆粒」層、そして最後に、角質細胞と称される分化の最終段階のケラチノサイトからなる角質層(horny layer)(又は角質層：stratum corneum)と称される上層に一般的に分割される。角質細胞は、ケラチノサイトから派生するミイラ化した無核の角質化細胞である。角質細胞の積層により、とりわけ、表皮の障壁機能として機能する角質層が構成される。
表皮分化は、基底ケラチノサイトが移動しながら変形し、完全に角質化した死亡細胞である角質細胞の形成を生じる、連続した指向性の成熟プロセスに続く。この分化は、完全に協調した現象の結果であり、結果として一定の厚みが維持され、よって表皮のホメオスタシスが確保される。このことは、分化プロセスに入る細胞の数と、落屑する細胞の数との厳密な調節が存在していることを意味する。正常な落屑プロセスの課程において、最も表面にある角質細胞のみが表皮表面から剥離する。
【００１４】
その暴露のために、皮膚は、様々なタイプの環境攻撃を受けるおそれがあり、その最も深刻なものは、結果的に死に至る場合もある。重度の火傷を被った患者は、体表面の８０％以上に皮膚組織の破壊がみられ、破壊された全ての領域上の皮膚を、十分再生可能とする程の量の皮膚等価物が成功裏に生成されることによってのみ、助けることができるであろう。
よって、皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の拡大可能性を制御すること、及びエキソビボで増幅された細胞から器官型の皮膚培養物を発育させることは、自己生成(Ronfardら, Burns. 17：181-184, 1991、及びTransplantation. 70：1588-1598, 2000)及び／又は異種生成(Heftonら, Lancet. 2：428-430, 1983；Brayeら, Med Biol Eng Comput. 38：248-252, 2002 )、第３度火傷を被った個人の処置を意図した皮膚組織グラフトにとってまさに重要な問題である。
【００１５】
皮膚移植片から派生し、エキソビボで増幅された細胞から生成された皮膚等価物は、母斑(Kumagaiら, Ann Plast Surg. 39：483-488, 1997)又は入れ墨(Kumagaiら, An Plast Surg. 33：385-391, 1994)の外科的切除の後に、皮膚組織を再生させるための自己グラフトを生成させるためにも使用される。
また皮膚は、その整合性を危うくさせる遺伝的原因のある種々の病気によっても影響を受けるおそれがある。これらは、例えば、真皮と表皮の間の結合性における永続的欠陥により特徴付けられる表皮水疱症(Eadyら, J. Dermatol. 28：638-640, 2001)；表皮の角質層の病的厚化を伴う魚鱗癬(DiGiovanna & Robinson-Bostom, Am J Clin Dermatol. 4：81-95, 2003)である。
【００１６】
皮膚に影響を及ぼす、他の種類の遺伝的病気、例えば色素性乾皮症により、結果として、環境からの「攻撃」に対するこの組織の反応性に機能障害が生じる。これらの病気は紫外線(UV)により誘発されるＤＮＡダメージを切除するメカニズムの欠陥により特徴付けられ、その臨床的結果、皮膚癌の発現頻度が増加する(Sarasin, Mutat Res. 428：5-10, 1999)。
よって、それらは重症の病変であり、現在までに、有効で便宜的な薬学的処置はなされていない。しかしながら、これらの病気のいくつかであると同定されている一遺伝子的起源のものは、遺伝子治療による処置の展望が開けている(Spiritoら, J Gen Med. 3：21-31, 2001：Magnaldo & Sarasin, Mutat Res, 509：211-220, 2002)。
【００１７】
事実、機能不全の回復は、影響を受けた個人から取り出された皮膚サンプルから派生したケラチノサイトにおいて得られ、それはエクスビボで培養され、いくつかの皮膚の遺伝病のケースにおいては、レトロウィルスベクターを使用する遺伝子移入により訂正されるものである。この種のアプローチを通して、特に層状魚鱗癬(Choateら, Hum Gene Ther. 7：2247-2253, 1996)、Ｘ-染色体関連魚鱗癬(Freibergら, Hum Mol Genet. 6：927-933, 1997)、及び種々のグループの色素性乾皮症(Carreauら, Hum Gene Ther. 6：1307-1315, 1995；Arnaudeau-Begardら, Hum Gene Ther. 14：983-996, 2003)の影響を受けたケラチノサイトの遺伝的訂正を得ることができる。
よって、皮膚に影響を及ぼす遺伝病を被った患者、及び／又は正常な個人から派生した皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を、エクスビボで「マニピュレートする」ための培養システムを有するようにすることは、これらの細胞から、できる限り生理的な表皮等価物及び／又は皮膚等価物を得るために重要であると理解される。
【００１８】
よって、本発明の第１の主題は、(ｉ)ヒトの皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体の、インビトロにおける増殖を促進させると同時に、それらを未分化状態で維持させ；及び／又は(ｉｉ)多重層上皮を生成するそれらの能力を維持し及び／又は増大させるための、白血病阻害因子(ＬＩＦ)、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用にある。
特に本発明は、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得ることを意図した方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用に関する。
また本発明は、多重層上皮、特に再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚を得ることを意図した方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量の使用に関する。
【００１９】
本発明においては、表皮等価物又は再構成された皮膚、及び皮膚等価物又は再構成された皮膚が参照される。
【００２０】
インビトロでの増殖における、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の増殖、及び／又は多重層表皮の分化及び／又は発育における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体又はＬＩＦ模倣剤の作用は、直接又は間接的であってよい。
それらは、皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の増殖、拡大及び／又は器官形成能を刺激することにより、直接的でありうる。また、特に、この因子に対して反応するＬＩＦ-反応性細胞により発せられ、これらと同様の細胞及び／又は隣接する細胞を有益に刺激することも可能な因子及び／又はシグナルを介して間接的になされてもよい。例えば、それらは細胞間の直接接触により伝達されるシグナル、及び／又はパラクリン調節経路に関与する因子である。皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の発現可能性の制御は、特に真皮の線維芽細胞と幹細胞及び／又は表皮前駆体との間の、この種の「ダイアログ」に関与している。従って、前記細胞は、外的刺激、及び／又は細胞環境から派生したシグナルに対し、より感受性がある。
【００２１】
表皮のホメオスタシスは、細胞分割を促進する分裂促進シグナルと、抗増殖シグナルとの間の微細なバランスの調節から生じる。これらのシグナルは、特にケラチノサイト及び／又はそれらの環境に存在する他の細胞型によって自然に生成される因子、特に真皮の線維芽細胞により分泌される因子の作用から生じる。
【００２２】
「表皮のホメオスタシスに関与することが知られている刺激剤及び／又はシグナル」の例としては、特に以下のものを挙げることができる：
−  成長因子、例えば、分裂促進成長因子、表皮成長因子(ＥＧＦ)及びケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)(Cookら, J Cell Physiol. 146：277-289, 1991；Andreadisら, FASEB J. 15：898-906, 2001；Gamadyら, J Cell Biochem. 89：440-449, 2003)、又はトランスフォーミング成長因子-β１(ＴＧＦ-β１)、特にインビボ及びインビトロでのケラチノサイトに対する抗増殖効果が同定されている多機能成長因子(Glickら, Proc Natl Acad Sci USA. 90：6076-6080, 1993；Van Ruissenら, J Cell Sci. 107：2219-2228, 1994；Cuiら, Genes Dev. 9：945-955, 1995)。これらの因子は高度な相互作用的で相互に関連したオートクリン及びパラクリン調節ループに関与しており、増殖の制御及び分化の制御の双方を確実にし(Reiss & Sartorelli, Cancer Res. 47：6705-6709, 1987；Hertleら, J Invest Dermatol. 104：260-265, 1995；Edmonsonら, J Cell Physiol. 179：201-207, 1999；Yamasakiら, J Invest Dermatol. 120：1030-1037, 2003；Pasonen-Seppanenら, J Invest Dermatol. 120：1038-1044, 2003)、よって、ケラチノサイトの再生及び／又は成熟化の正確な調節が可能になる；及び／又は
−  特にＥＧＦ及びＴＧＦ-βの作用に対する細胞の感作メカニズムにより(Tongら, J Invest Dermatol. 94：126-131, 1990)、成長因子の作用を完了、調節及び／又は阻害可能な分子、例えばＫＦＧの分裂促進作用に対するケラチノサイト敏感度を増加させる能力について、ビタミンＤ及びその誘導体(Gamadyら, J Cell Biochem. 89：440-449, 2003)；ケラチノサイトの増殖及び／又は分化を調節する能力についてレチノイン酸(Choi & Fuchs, Cell Regul. 1：791-809, 1990；Gibbsら, Arch Dermatol Res. 288：729-738；1996；Chapellierら, EMBO J. 21：3402-3413, 2002)。
【００２３】
本発明で使用される「ＬＩＦ」は、特に精製されたＬＩＦ、組換えＬＩＦ、ＬＩＦを含有する粉砕細胞材料又は細胞抽出物、ＬＩＦを含有する細胞培養上清、又はそれらの混合物の形態で提供することができる。
ヒト由来のＬＩＦが好ましく使用される。
【００２４】
特に：
−  臓器、組織及び／又はＬＩＦを天然に発現する細胞から精製されたＬＩＦ[例えば：脳下垂体細胞(Ferraraら, Proc Natl Acad Sci USA. 89：698-702, 1992)、真皮線維芽細胞(Lorenzoら, Clin Immunol Immunopathol. 70：260-265, 1994)、肺線維芽細胞(Eliasら, Am J Physiol. 266：L426-435, 1994)、胎盤及び子宮粘膜(Kojimaら, Biol. Reprod. 50：882-887, 1994)、骨髄間質細胞(Lorgeotら, Cytokine. 9：754-758, 1997)、腎細胞(Morelら, Cytokine. 12：265-271, 2000)、心筋細胞(Anceyら. Cytokine. 18：199-205, 2001)]；
−  原核生物微生物(例えば：細菌、E. coli)又は真核生物微生物(例えば：酵母、Pichia pastoris、Saccharomyces)培養で得られる組換えＬＩＦ、場合によっては融合タンパク質の形態のもの(例えば：Chemicon International Inc.から販売されているヒト組換えＬＩＦ)；
−  ＬＩＦを発現する細胞の粉砕材料又は抽出物、特に粉砕材料、又はＬＩＦを発現する滋養細胞(例えば：３Ｔ３系のマウス線維芽細胞)、ＬＩＦが発現するように遺伝的に修飾された細胞、又はＬＩＦが発現するように刺激された細胞の抽出物；
−  ＬＩＦを含有する細胞培養上清、例えばＬＩＦを発現する３Ｔ３細胞の培養上清；
又はそれらの混合物を使用してよい。
【００２５】
「内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物」としては、例えばヒト肺の平滑筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞による、ＬＩＦの分泌及び合成を誘発する能力が記載されたサイトカイン、ＩＬ-１βを挙げることができる(Knightら, Am J Respir Cell Mol Biol. 20：934-841, 1999)。さらに、延髄ストロマから誘導されたマウス細胞系において、ＬＩＦプロモータを誘発するそれらの能力が研究されている、環状ＡＭＰ類似体、８-ブロモアデノシン３'：５'モノホスファート(８ＢｒｃＡＭＰ)、及びＴＮＦ-αを挙げることができる(Gollnerら, Cytokine. 11：656-663, 1999)。
【００２６】
別法として、逆に、特にＳｔａｔ５タンパク質を含み、ＬＩＦの抗-分化効果のアンタゴニストである、シグナル伝達経路の活性を抑制可能な任意の活性成分を使用してもよい。これらは、特にＳｔａｔ分子の活性化に関与した、キナーゼ及びホスファターゼ活性のモジュレータ、又は小ＲＮＡｓ(ｓｉＲＮＡ)を介した干渉方法及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
本発明において、「ＬＩＦ類似体」なる用語は、皮膚幹細胞、及び／又は表皮前駆体に対してＬＩＦ活性を有する、すなわち(ｉ)未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の自己再生能、及び／又はそれらの増殖能を促進させ、及び(ｉｉ)多重層表皮を生成するそれらの能力を維持し及び／又は増大させることができる、任意の修飾されたＬＩＦポリペプチド、又は任意のＬＩＦポリペプチド断片を意味することを意図している。
【００２８】
「ＬＩＦ活性を有する修飾されたＬＩＦポリペプチド」なる表現は、例えばその安定性を増大させるために、一又は複数の修飾を受けたＬＩＦポリペプチドを特に意味することを意図している。「修飾」なる用語は、一のアミノ酸、又は少数のアミノ酸の、特に天然のアミノ酸が非天然のアミノ酸又は疑似アミノ酸で、修飾がＬＩＦの生物学的活性に実質的に影響を及ぼさないような位置で置換されることによる、任意の置換、欠失及び／又は挿入を意味することを意図している。
【００２９】
修飾されたＬＩＦペプチドは、Genbank AAA59217配列(195aa)、GenBank AAA51699配列(202aa)、及び相同配列から選択される、ヒトＬＩＦペプチド配列から得られてもよい。
「相同配列」なる用語は、同じ種又は異なる種において、定義されたペプチド配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９５％同一である配列を意味することを意図しており；これは、オルソロガスペプチド配列と称される。
また、この修飾されたＬＩＦポリペプチドは、一般的なクローニング及び発現技術に従い、ヒトＬＩＦ遺伝子又はｃＤＮＡの配列(GenBank M63420、J05436、J03261、X13967)、又はマウスＬＩＦ遺伝子又はｃＤＮＡの配列(GenBank M63419、J05435、X06381、X12810、S73374)から得られてもよい。
【００３０】
「ＬＩＦ活性を有するＬＩＦポリペプチド断片」なる表現は、特にGenbank AAA59217配列(195aa)、GenBank AAA51699配列(202aa)、及び相同配列から選択される配列の断片を意味することを意図している。
前記断片は、ＬＩＦ-Ｒ-結合及びｇｐ１３０-結合部位を示すＬＩＦの３次構造が再構成される程、十分大きい。
また、このポリペプチド断片は、一般的なクローニング及び発現技術に従い、ヒトＬＩＦ遺伝子又はｃＤＮＡの配列(GenBank M63420、J05436、X13967、J03261)、又はマウスＬＩＦ遺伝子又はｃＤＮＡの配列(GenBank X06381、M63419、J05435、X12810、S73374)、特にコード化配列から得られてもよい。
【００３１】
例えば、本発明の実施に適したこのようなＬＩＦ類似体は、次の：
ａ）ケラチノサイト、又は未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の調製を、(ｉ)テスト用生成物の存在下、又は(ｉｉ)不在下で培養し；
ｂ）(ｉ)及び(ｉｉ)に従い培養された細胞を、顕微鏡下で観察し；
ｃ）未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の、インビトロにおける増殖を促進させる生成物の能力を、(ｉ)テスト用生成物の存在下、又は(ｉｉ)不在下で得られた未分化状態の細胞クローンの数と比較することにより測定し；
ｄ）該生成物の不在下における未分化状態の細胞クローンの数と比較して、該生成物の存在下で得られた未分化状態の細胞クローンの数を増加させる生成物を選択し；
ｅ）ついで、多重層表皮を再生させる該生成物の能力を、次の：
ａ．ケラチノサイトの調製を、(ｉ)テスト用生成物の存在下、又は(ｉｉ)不在下にある真皮支持体に播種し；
ｂ．(ｉ)及び(ｉｉ)において再構成された表皮の構造体を、顕微鏡下で観察し；
ｃ．該生成物の不在下における表皮の構造体と比較して、該生成物の存在下で得られる再構成された表皮の構造を改善する生成物を選択する；
工程に従いテストする；
工程を含む方法に従い選択され得る。
【００３２】
本発明において、「ＬＩＦ模倣剤」なる用語は、特に、ｇｐ１３０及び／又はＪａｋ／Ｓｔａｔ、及びＲａｓ／Ｍａｐキナーゼシグナル伝達経路、特にＳｔａｔ３の発現及び／又は活性を活性化可能な細胞抽出物又は細胞抽出物のフラクション、又は任意の活性剤、又はＬＩＦレセプター(ＬＩＦ-Ｒ)の任意のアゴニストを意味することを意図している。
例えば、ＬＩＦレセプターアゴニスト、ＬＩＦレセプターと相互作用及びそれらを活性可能な合成ペプチド、又はＬＩＦに対する反応性に関与するシグナル伝達経路の活性化、特にＳｔａｔ３の発現及び／又は活性化、又はヤヌス関連(Janus-associated)チロシンキナーゼ(ＪＡＫ)の活性化を誘発可能な任意の活性剤である抗体を使用してもよい。
特に、ＬＩＦと類似した強い３次構造を有する、カルジオトロフィン-１(ＣＴ-１)、毛様体神経栄養因子(ＣＮＴＦ)、サイトカインオンコスタチンＭ(ＯＳＭ)等の、ＬＩＦＲ-ｇｐ１３０ヘテロダイマーの形成を誘発可能な薬剤を使用してもよい。
本発明の実施に適したこのようなＬＩＦ模倣剤は、従来からのＬＩＦ-Ｒ-結合及びｇｐ１３０活性化アッセイにより選択され得る。
【００３３】
これらのＬＩＦ類似体又はＬＩＦ模倣剤は、天然又は合成由来であってよい。
「天然由来」なる用語は、天然由来の組織(皮膚等)、特にヒトの表皮、又は植物由来の抽出物から、種々の抽出方法で得られる、純粋な状態の化合物、又は種々の濃度の溶液を意味することを意図している。
「合成由来」なる用語は、化学的に、又はこの生成に必要な要素を生物体に挿入した後、該生物体内に生成されることにより得られる、純粋な状態の化合物、又は種々の濃度の溶液を意味することを意図している。
【００３４】
実際、ＬＩＦに対する細胞反応性には、低親和性レセプター(１９０ｋＤ、ｇｐ１９０の糖タンパク質)及び高親和性レセプター(１３０ｋＤ、ｇｐ１３０の糖タンパク質)(Taupinら, J Biol Chem. 276：47975-47981, 2001)、及びこれらのレセプターの下流、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ及びＲａｓ／Ｍａｐキナーゼシグナル伝達経路(Ernstら, J Biol Chem. 274：9729-9737, 1999；Burdonら, Trends Cell Biol. 12：432-438, 2002)が関与していることが知られている。Ｓｔａｔ３シグナル伝達タンパク質は、ＬＩＦに対する反応において、マウスＥＳ細胞を未分化状態に維持するといった主たる役割を担っており(Niwaら, Genes Dev. 12：2048-2060, 1998；Matsudaら, EMBO J. 18：4261-4269, 1999)、これに対し、Ｓｔａｔ５タンパク質の発現は、逆にこれらの細胞の分化への挿入に関連している(Nemetzら, Differentiation. 62：213-220, 1998)。
【００３５】
別法として、ＬＩＦレセプター(ＬＩＦ-Ｒ)又は内因性ＬＩＦ-Ｒの発現を刺激可能な生成物が、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、又はＬＩＦの発現を刺激可能な生成物と組合せて使用され得る。
【００３６】
また本発明は、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量を含有する培養培地において、ヒトのケラチノサイト調製物を増殖させる少なくとも一の工程を含む、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得るための方法に関する。
【００３７】
本発明において「細胞の培養」なる用語は、特に、インビトロで培養された天然組織から派生し、人工的条件下(エクスビボ、インビトロ)で生存している細胞の調製を意味することを意図している。
本発明において、「細胞のライブラリ」なる用語は、特に二次使用を目的として保存するために処理された細胞の調製物を意味することを意図している。例えば、細胞は凍結されていてもよく、アリコートの形態で保存されてもよい。細胞は天然組織から生じたものであってよく、例えば凍結した形態で直接保管するか、又は保管する前にインビトロで増幅されていてもよい。
本発明において、「ヒトのケラチノサイト調製物」なる表現は、皮膚サンプル、及び／又は表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成可能な、皮膚幹細胞及び／又は前駆体の任意の他の可能な源から得られる一組のケラチノサイトを、特に意味することを意図している。
前記幹細胞及び／又は前駆体の他の源として、特に毛髪の小胞を挙げることができる。
【００３８】
ケラチノサイト調製物は、従来からの細胞培養法に従い得ることができる。
特に、個人から取り出された皮膚移植片を使用する、次の：
−  外科用メスを使用し、皮下組織を取り除き；
−  皮膚サンプルを抗生物質処理(例えばゲンタマイシン処理)により除染し；
−  真皮をタンパク質分解処理(例えば：トリプシン及びディスパース(dispase))により表皮から分離させ、ついで切開し；
−  ついで、細胞の切開を、０．０５％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡの溶液の存在下で促進させ；トリプシンの効果を１０％の漿液を含有するＤＭＥＭ培養培地を添加することにより中和させ；
−  細胞懸濁液をホモジナイズし、ついで、ケラチノサイト用の培養培地(KGM, Bullet kit, Clonetics Corp.)で洗浄する；
手順が使用され得る。
【００３９】
ケラチノサイト調製物の増殖工程は、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、又は内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物を含有し、該細胞の増殖及びそれらを未分化状態で維持するのに適した培養培地において実施されてよい。
【００４０】
フィーダー線維芽細胞の不在下、及び低密度で(例えば２４００細胞／ｃｍ２で播種)、半定義された培養培地(KGM Bullet Kit, Clonetics, Cambrex Bio Science Inc.)を使用してもよい。
また、照射された線維芽細胞の存在下、及び低密度で(例えば２４００細胞／ｃｍ２で播種)、RheinwaldとGreen(Cell, 6：317-330, 1975)により記載された培地を使用してもよい。
【００４１】
さらに一般的には、ＬＩＦを含有し、皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の増殖を促進させ、及び／又は重層表皮を生成させることを意図した任意の培養培地は、本発明の一部でもあるであろう。
特に、このような培養培地は、ケラチノサイトの少なくとも一の分裂促進成長因子[例えば：表皮成長因子(ＥＧＦ)及び／又はケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)]、インシュリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質(例えば：ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ)を含有していてもよい。
有利には、前記培地は、下垂体抽出物、例えばウシ属由来のもの、エピネフリン、トランスフェリン及び／又は非必須アミノ酸をさらに含有していてもよい
前記培地は、漿液を含有していてもいなくてもよく、トランスフォーミング成長因子-β(ＴＧＦ-β)が補足されていてもよい。
【００４２】
前記細胞用の培養培地に存在する、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、又は内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、又はそれらの混合物の有効濃度は、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌであってよい。
ＬＩＦを含む粉砕細胞材料又細胞抽出物が使用される場合、該細胞の増殖工程用の培養培地に存在する該粉砕細胞材料又は抽出物の有効濃度は、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の１０ｐｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、有利には培養培地の１００ｍｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｌであってよい。
【００４３】
好ましい実施態様において、ヒトのケラチノサイト調製物は、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体で、特に細胞外マトリックス成分への急速な付着、及び付着した細胞の回収によりプレ濃縮される(Ａｄｈ＋＋＋と称される高い付着能力を有する細胞)。
「細胞外マトリックス成分」なる用語は、特にコラーゲン類、ラミニン類、フィブロネクチン又はプロテオグリカン類等の分子を示す。
WO03/038073(ロレアル／ＣＮＲＳ)に記載されたプレ濃縮工程を、特に使用することができる。
【００４４】
好ましくは、付着工程は、Ｉ型コラーゲンが吸着するプラスチック支持体上で実施され：この工程は３７℃で約１０分〜約２０分、特に１２〜１５分実施される。
さらに、剥離工程は、例えば０．０５％のトリプシン及び０．０２％のＥＤＴＡの存在下、短時間、好ましくは１０分未満、特に１〜２分間、穏和にトリプシン処理することによって実施することができる。
【００４５】
特定の実施態様において、細胞懸濁液を、２０００００細胞／ｃｍ２の密度で、Ｉ型コラーゲンで「被覆」された培養フラスコに配す(ＰＢＳで２倍に希釈されたコラーゲンＩの溶液(Sigma Chemical Co Ltd, Irvine, UK)を４５分間フラスコ内に付着させ、ついで余剰物を除去した後に乾燥させる)。１２分後、付着していないケラチノサイトをＰＢＳバッファーで洗浄することにより除去する。このようにして選択された付着細胞を、穏和にトリプシン処理(０．０５％のトリプシン-０．０２％のＥＤＴＡ(Biological Industries,  Kibbutz Beit Haemek, Israel)を用い、３７℃で３〜５分)することにより、支持体から剥離させる。トリプシンの中和を行った後(ＤＭＥＭ＋１０％のＳＶＦ)、細胞を回収し、洗浄し、ついでＫＧＭ培地に再懸濁させる。
この方法により選択された付着細胞フラクションは、表皮の全ケラチノサイトの約１０％である。
付着細胞のパーセンテージは、一般的に、ケラチノサイト調製物に含まれる細胞の５〜２０％、特に、ケラチノサイト調製物に含まれる細胞の１０％である。
【００４６】
このようにして選択された「Ａｄｈ＋＋＋」集合体は、付着能力が低い(Ａｄｈ−／＋)ことで特徴付けられるより成熟したケラチノサイトの集合体よりも約１０倍の付着能力を有する、未分化の表皮前駆体及び／又はクローン原性の皮膚幹細胞の頻度を示す。
このような濃縮プロセスにより、主として成熟したケラチノサイトからなる非付着細胞と比較して、高い拡大可能性を有する付着細胞の集合体を選択することができる。
前記Ａｄｈ＋＋＋付着細胞の集合体は、特に長期間にわたる拡大可能性、及び多重層上皮、特に多重層表皮、及び／又は皮膚等価物、及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成する可能性によって特徴付けられる、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を含む。
【００４７】
特定の実施態様においては、ＬＩＦ-反応性細胞、すなわちそれらの表面でＬＩＦレセプター(類)の発現を示す細胞(ＬＩＦ-Ｒ＋表現型の細胞)、及び／又はＬＩＦの存在下、未分化状態で増殖可能な細胞において、ケラチノサイト調製物、及び／又は皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を濃縮してもよい。ＬＩＦ-反応性のＬＩＦ-Ｒ＋細胞の選択は、例えば免疫磁気ビーズを使用したフローサイトメトリーにより局在化した生存細胞及び免疫表現型標識により、及び／又は抗-ＬＩＦ-Ｒ抗体が吸着した支持体上における免疫選択により実施される。
【００４８】
有利には、本発明の方法は、分化状態での維持を促進させる条件下で、前記増殖した細胞を低温保存する工程をさらに含む。
特に、細胞ライブラリを得るために使用されるこの低温保存工程は、二次使用の目的で、前記細胞を保管及び／又は保存可能とするために、ＬＩＦの存在下で拡大させた後に、液体窒素中で細胞を凍結させることからなる。
よって、ＬＩＦの存在下、インビトロで増殖させる本発明のこの方法により、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を得ることができる。
未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のこのライブラリ又は培養体は、特に、細胞がＬＩＦ-Ｒ＋と呼称される、ＬＩＦレセプター(ＬＩＦ-Ｒ)をその表面で発現し、及び／又はＬＩＦの作用に応答可能な細胞内で濃縮されることにより特徴付けられる。
それは液状形態、有利には凍結形態であってよい。
【００４９】
また、少なくとも、(ｉ)ヒトのケラチノサイト調製物、及び(ｉｉ)有効量のＬＩＦ、ＬＩＦ類似体又はＬＩＦ模倣剤が補足されたヒトのケラチノサイト細胞用の培養培地を含む、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体のライブラリ又は培養体を生成するための任意のキットは、本発明の一部でもあるであろう。
特に前記キットは、ＬＩＦの有効量が、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の０．１〜１００ｎｇ／ｍｌである培地を含むであろう。
ＬＩＦを含む粉砕細胞材料又は細胞抽出物が使用される場合、培養培地に存在する該粉砕材料又は抽出物の有効濃度は、培養培地の０．０１ｐｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは培養培地の１０ｐｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、有利には培養培地の１００ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであってよい。
【００５０】
また本発明は：
ａ）真皮支持体又は真皮等価物を調製することからなる工程；及び
ｂ）該支持体上に、ヒトのケラチノサイトの集合体を播種することからなる工程；
を含み、  ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物から選択される化合物の有効量を、工程ａ）及びｂ）のいずれか、もしくは双方において、培地に添加する、再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の調製方法に関する。
【００５１】
別法として、再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の調製方法は：
ａ）真皮支持体又は真皮等価物を調製することからなる工程；及び
ｂ）該支持体上に、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で培養された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を播種することからなる工程；
を含む。
特に、前記真皮支持体又は真皮等価物は、コラーゲン／線維芽細胞の格子、予め脱-表皮化された真皮、及び人工膜から選択されるであろう。
【００５２】
真皮等価物の調製例としては、特許出願(EP-A-285471、EP-A-285474、EP-A-789074、EP-A-502172、EP-A-418035、WO-A-9116010、EP-A-197090、EP-A-20753、FR-A-2665175、FR-A-2689904)に記載されているプロトコル、又は好ましくは、Asselineauら, 1987,(Models in dermato., Vol. III, Ed. Lower & Maibach, 1-7 )に記載されているプロトコルを挙げることができる。
表皮等価物及び／又は皮膚等価物を調製するためのプロトコルの例としては、特許又は特許出願EP285471、EP285474、EP418035、WO-A-9002796、WO-A-9116010、EP197090、EP20753、FR2665175、FR2689904に記載されているものを挙げることができる。
【００５３】
最も一般的には、再構成された皮膚モデルは、支持体上に、多くの場合は真皮等価物上に配され、表皮等価物の形成に帰する分化プログラムに入るような条件下で培養されてなる、ヒトのケラチノサイトからなる。
また、天然組織に類似した表皮及び／又は皮膚を再構成させるために、他の細胞種、例えばランゲルハンス細胞(EP0789074)又はメラノサイトを一体化させることもできる。
【００５４】
ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される少なくとも一の化合物を有効量含有する、表皮等価物及び／又は皮膚等価物を調製するための任意のキットは、本発明の一部でもあるであろう。
特にこのキットは、(ｉ)真皮支持体又は真皮等価物、(ｉｉ)ケラチノサイト調製物、及び(ｉｉｉ)ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の有効量を含んでいてもよい。
【００５５】
ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、又は内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物は、単独で又は混合物として培養培地に導入されてよく、該培養培地はケラチノサイトの増殖及び／又は分化に適したものである。
【００５６】
上述したように、このような培地は、特にケラチノサイトの少なくとも一の分裂促進成長因子[例えば：表皮成長因子(ＥＧＦ)及び／又はケラチノサイト成長因子(ＫＧＦ)]、インシュリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質(例えば：ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ)を含有していてもよい。
有利には、前記培地は、下垂体抽出物、例えばウシ属由来のもの、エピネフリン、トランスフェリン及び／又は非必須アミノ酸をさらに含有していてもよい
前記培地は、漿液を含有していてもいなくてもよく、トランスフォーミング成長因子-β(ＴＧＦ-β)が補足されていてもよい。
【００５７】
本発明の他の側面は、本発明で定義されたＬＩＦ、及びＬＩＦの存在下で増幅された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の多様な用途に関する。
特に本発明は、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の、成熟したケラチノサイト、又は皮膚付属物の構造の一部である任意の他の細胞型への分化及び／又は増殖を調節可能な活性剤をスクリーニング及び／又は評価するための方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用に関する。
【００５８】
特にこのスクリーニング方法は：
−  テストされる活性剤の存在下、及び成熟したケラチノサイト、又は皮膚付属物の構造の一部である任意の他の細胞型への分化及び／又は増殖が可能な条件で、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を培養し；
−  該活性剤の不在下における細胞の分化及び／又は増殖度合いと、活性剤の存在下における細胞の分化及び／又は増殖度合いとを比較する；
ことを含む。
【００５９】
また本発明は、皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の、多重層上皮、特に多重層表皮及び／又は皮膚等価物を生成する能力を調節可能な活性剤をスクリーニング及び／又は評価するための方法における、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用に関する。
特にこの方法は：
−  テストされる活性剤の存在下、多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成可能な条件で、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物、及びそれらの混合物から選択される化合物の存在下で増幅された、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体を培養し；
−  該活性剤の不在下における多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成する細胞の能力と、該活性剤の存在下における多重層表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成する細胞の能力とを比較する；
ことを含む。
【００６０】
本発明の他の部分は、皮膚の損傷を処置することを意図した、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体、又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚を調製するための、ＬＩＦ、ＬＩＦ類似体、ＬＩＦ模倣剤、及び内因性ＬＩＦの発現を刺激可能な生成物から選択される化合物の使用にある。
特に、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体、又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚は、インビボにおいて、ダメージを受けた皮膚又はダメージを受けた皮膚領域上に正常な皮膚を生成させることを意図している。
【００６１】
皮膚の損傷には多くの原因があり、それは以下のようなものである：
−  偶発的原因、例えば顔又は体の広い表面上に火傷を被った皮膚(例えば：第３度火傷を被った個人)；
−  外科的原因、例えば母斑(Kumagaiら, Ann Plast Surg. 39：483-488, 1997)、又は入れ墨(Kumagaiら, An Plast Surg. 33：385-391, 1994)の処置のために切除を受けた皮膚；
−  遺伝的原因、例えば遺伝病に関連した変化を示す皮膚；特に真皮と表皮の間の結合性における永続的欠陥により特徴付けられる表皮水疱症(Eadyら, J. Dermatol. 28：638-640, 2001)；表皮の角質層の病的厚化を伴う魚鱗癬、例えば層状魚鱗癬(Choateら, Hum Gene Ther. 7：2247-2253, 1996)；Ｘ-染色体関連魚鱗癬(Freibergら, Hum Mol Genet. 6：927-933, 1997)；紫外線(UV)により誘発されるＤＮＡダメージを切除するメカニズムの欠陥により特徴付けられ、その臨床的結果、皮膚癌の発現頻度が増加するとされている色素性乾皮症(Sarasin, Mutat Res. 428：5-10, 1999)を挙げることができる。
【００６２】
皮膚が偶発的、又は外科的施術に続いてダメージを受けた場合、ダメージを受けた皮膚の処置は：
−  正常な個人(異種細胞)又はダメージを受けた皮膚のある個人の正常な領域(自己細胞)からの皮膚移植片を用い、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を調製し；
−  ＬＩＦの存在下で、該ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を増殖させ；
−  インビボで天然の表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成可能なヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の形態、又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の形態で、ダメージを受けた皮膚領域に該細胞を再移植する；
ことからなる。特に、細胞は、処理される領域に注射及び／又は適用されてよく、これに対し、再構成された表皮又は再構成された皮膚は処理領域にグラフトされるであろう。
【００６３】
例えば、本発明のＬＩＦの存在下で調製された再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚、又はＬＩＦの存在下で増幅された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用は、特に火傷の処置を意図している。
例えば、本発明のＬＩＦの存在下で調製された再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚、又はＬＩＦの存在下で増幅された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用は、皮膚切除、さらには外科由来のものに関連した皮膚の損傷(例えば：母斑、入れ墨)の処置を意図している。
【００６４】
遺伝病に関連した皮膚の損傷の処置は、特に、次の第１の方式：
−  皮膚に影響を及ぼす遺伝病を被った個人からの皮膚移植片を用い、未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を調製し；
−  特にレトロウィルスベクターを使用して、変異していない遺伝子移入により、遺伝病に関連した機能不全が回復するように、エクスビボで該細胞を処理し；
−  インビボで天然の表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成可能なヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の形態、又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の形態で、ダメージを受けた皮膚領域に該処理された細胞を再移植する；
ことからなる。特に、これらの細胞は、処理される領域に注射及び／又は適用されてよく、これに対し、再構成された表皮又は再構成された皮膚は処理領域にグラフトされるであろう。
【００６５】
別法として、遺伝病に関連した皮膚の損傷の処置は：
−  正常な個人(異種細胞)からの皮膚移植片を用い、ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を調製し；
−  ＬＩＦの存在下で、該ヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体を増殖させ；
−  インビボで天然の表皮及び／又は全て又はいくつかの皮膚付属物を生成可能なヒトの未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の形態、又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚の形態で、ダメージを受けた皮膚領域に該細胞を移植する；
ことからなる。特に、細胞は、処理される領域に注射及び／又は適用されてよく、これに対し、再構成された表皮又は再構成された皮膚は処理領域にグラフトされるであろう。
【００６６】
例えば、ＬＩＦの存在下で再構成された表皮及び／又はＬＩＦの存在下で再構成された皮膚、又はＬＩＦの存在下で増幅された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用は、表皮水疱症、色素性乾皮症、層状魚鱗癬及びＸ-染色体関連魚鱗癬等の、遺伝病に関連した皮膚の損傷の処置を意図している。
例えば、遺伝病を被った個人からの皮膚移植片を用いて調製され、ＬＩＦの存在下で培養された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体の使用は、遺伝子移入プロトコルの有効性を研究するためのインビトロモデルの構築に使用され得る。
このことは、遺伝的訂正の頻度を評価(導入遺伝子の挿入を示す細胞のパーセンテージ)、及び／又は機能的訂正の有効性を評価及び定量化(例えば、単層培養物及び／又は再構成された表皮及び／又は再構成された皮膚において、当初欠損のあった機能の訂正度合いを研究)するために、該細胞を使用することを含む。
【実施例】
【００６７】
本発明を、以下の非限定的実施例により例証する。
(実施例)
実施例１：ＬＩＦの存在下で最適化された未分化の幹細胞及び／又は表皮前駆体の成長性
ケラチノサイトを成人の皮膚サンプルから単離した(胸部形成外科)。
外科用メスを使用し、皮下組織を除去した後、皮膚サンプルを約５ｍｍｘ５ｍｍの断片に切断し、ついで、抗菌処理によって除染した[ゲンタマイシン(Life Technologies)、ＤＭＥＭ培養培地(Life Technologies)において１０分間、３回連続浴]。ついで、表皮から真皮を分離させるために、サンプルをタンパク質分解処理にかける[ディスパース(Boehringer, Roche Diagnostics)＋トリプシン(Gibco, Invitrogen)、４℃で一晩]。ついで、切開により、表皮を真皮から分離させる。真皮組織から分離された表皮断片を０．０５％のトリプシン-０．０２％のＥＤＴＡ溶液に配する(Gibco, Invitrogen)(３７℃で１５分間)。細胞の解離を促進させるため、調製物を定期的に攪拌する。ついで、トリプシンの効果を１０％の漿液を含有する培養培地(ＤＭＥＭ＋１０％の漿液)を添加することにより中和する。トリプシン(ＤＭＥＭ＋１０％の漿液)の中和後、細胞調製物を機械的にホモジナイズし(分注)、ついで濾過する。細胞懸濁液を洗浄し、ついでＫＧＭ培地(Clonetics)に再懸濁させる。懸濁液中の細胞を、マラセズ(Malassez)細胞を使用し、顕微鏡下で計測する。サンプルの生存度を、トリパンブルー(Life Technologies)排除法で評価する。
【００６８】
未分化の幹細胞及び／又は表皮前駆体における濃縮工程を、Ｉ型コラーゲン基質への急速な付着工程により実施した(高い付着能力を有する集合体、Ａｄｈ＋＋＋を選択)。
実際、未分化の幹細胞及び／又は表皮前駆体は、それらの急速な付着特性に基づき、より成熟したケラチノサイトから分離することができる。この工程により、未分化の幹細胞及び／又は表皮前駆体にて、調製物をプレ濃縮することができる。
コラーゲンへの付着による濃縮方法は、WO03/038073及び科学文献(Fortunelら, J Cell Sci, 116：4043-4052, 2003)に記載されている。
【００６９】
細胞懸濁液を１５００００〜２０００００細胞／ｃｍ２の密度で、Ｉ型コラーゲンで「コーティング」された[コラーゲンは、少なくとも４５分、ＰＢＳに２倍希釈されたコラーゲンＩ(Sigma Chemical)溶液の蒸着により、付着支持体上に吸着させる]培養フラスコに配する。１２〜１５分後、付着しなかったケラチノサイトを、ＰＢＳバッファーで洗浄することにより除去する。このようにして選択されたＡｄｈ＋＋＋と称される付着細胞を、穏和なトリプシン処理(０．０５％のトリプシン-０．０２％のＥＤＴＡ(Gibco, Invitrogen)、３７℃で３〜５分)により、支持体から剥離させる。トリプシンの中和後(ＤＭＥＭ＋１０％の漿液)、細胞を回収し、洗浄し、ついで培養培地(本ケースにおいては、ＫＧＭ培地)に再懸濁させる。付着細胞から構成され、この方法により選択されたフラクションは、表皮の全ケラチノサイトの約５〜１０％である。
【００７０】
定量化可能な単離された細胞クローンを得るために、フィーダー線維芽細胞の不在下、及び低密度(２４００細胞／ｃｍ２で播種)で、Ａｄｈ＋＋＋細胞から開始した培養体を、半定義された培養培地(KGM Bullet Kit, Clonetics, Cambrex Bio Science Inc.)において調製した。第１の二次培養(経過１)において、培養体を、１）上述したものと同一の条件；２）１ｎｇ／ｍｌの濃度でＬＩＦ(Chemicon International Inc.から販売されているヒト組換えＬＩＦ)を添加した上述したものの２つのバッチに分割した。８日間培養した後、これら２つの培養条件下で得られた細胞クローンの特徴を分析するために、培養体を固定し(７０％のエタノール)、染色した(エオシン及びギームザ染色)(図１)。
【００７１】
ＬＩＦの不在下又は存在下で実施された培養体の比較分析により、この因子により、Ａｄｈ＋＋＋細胞の培養から誘導された、未分化の幹細胞及び／又は表皮前駆体の成長を、最適化可能であることが示された。
肉眼での観察により、かなり濃く染色された細胞クローンの数が増加していることが示された(図１Ａ、Ｂ)。顕微鏡での観察により、その発育が促進されるこれらのクローンは、本質的に、未分化の状態の幹細胞及び／又は表皮前駆体に関連した形態的特徴を示す小細胞からなり、その基準は、ＬＩＦで処理された培養体が「より若い」という事実を表している。ＬＩＦに反応してかなりの高密度クローンの数が増加していることが、図１Ｃに示されたヒストグラムに表されたように、コンピュータ画像分析により確認される。
よって、培養系においてＬＩＦを使用すると、ヒトの未分化の表皮の幹細胞及び／又は表皮前駆体の集合体の増殖を促進させることができる。
【００７２】
実施例２：表皮の再構成におけるＬＩＦの正の効果
我々は、３Ｔ３線維芽細胞からの粉砕材料が、インビトロで培養され、凍結された幹細胞及び／又は表皮前駆体から、表皮の再構成を促進させることを観察した。再構成された表皮は良質のものであり：それは天然の表皮と類似した、細胞組織及び層形成を示す(図２Ａ)。
ＬＩＦがこの特性に関与しているという仮説をテストするために、ＬＩＦを免疫沈降により枯渇させ、ついで、ＬＩＦ-フリーの粉砕材料の活性を、枯渇していない粉砕材料と比較した。
粉砕３Ｔ３材料のＬＩＦ-枯渇は、ウサギ内で生成されたポリクローナル抗体を使用することにより実施する(抗-ＬＩＦ Ａｂ, Santa Cruz, ref. SC-20087)。ＬＩＦをＡｂに正しく確実に結合させるために、数時間、４℃超で、粉砕３Ｔ３材料を抗-ＬＩＦ Ａｂと共にインキュベートする。ついで、フリー及びＬＩＦ-結合Ａｂを、タンパク質Ｇが吸着した(タンパク質ＧはＡｂｓのＦｃドメインに対し高い親和性を有する)セファロースビーズを添加することにより「捕捉」する。遠心分離により、ＬＩＦが枯渇した粉砕材料から、ＬＩＦが保持されたビーズを分離することができる。
【００７３】
凍結ライブラリから得られた表皮の幹細胞(乳房の皮膚サンプルから単離)の、再構成された皮膚を作製する能力を、ＬＩＦが枯渇していない３Ｔ３線維芽細胞からの粉砕材料の存在下(正の対照)、粉砕３Ｔ３材料の不在下(負の対照)、及びＬＩＦが枯渇した粉砕３Ｔ３材料の存在下(実験条件)で評価した。各条件下で得られた再構成された表皮の組織学的特徴を、固定し、染色された断面で比較した(図２)。
３Ｔ３線維芽細胞からの粉砕材料が補足された器官型培養(ＬＩＦは枯渇していない)により、良質(図２Ａ)、すなわち細胞組織及び層形成が天然の表皮と類似した、再構成された表皮を得ることができ、粉砕材料の不在下で調製された培養体では、必要な組織学的特徴を有さない表皮しか得ることができない(図２Ｂ)。
【００７４】
粉砕３Ｔ３材料の不在下で得られた表皮は、次の異常：
−  かなりの細胞間空胞及び間隙；
−  乏しい層形成；
−  少数の細胞を有する基底層；
−  非常に伸長した超基底細胞(superbasal cell)；
−  基底細胞の不正確な配向(マトリックスに並行)；
−  ほとんど又は全く顆粒層が存在しない；
−  薄い角質層；
を示す。
【００７５】
ＬＩＦが枯渇した粉砕３Ｔ３材料の存在下で培養するという実験条件での細胞は、粉砕材料の不在下で培養されたものと類似したように機能し(図２Ｃ)、これはＬＩＦの枯渇により、表皮再構成における粉砕材料の有益な特性が損なわれているという結果を示している。
よって、ＬＩＦを使用すると、実施例１で示したように、未分化状態の前記細胞の増殖を促進させる能力に加えて、該細胞の器官形成における潜在能力、すなわち天然の表皮に類似した特徴を示す、質の良い再構成された表皮を生成する能力を維持することができる。
【００７６】
実施例３：表皮等価物及び／又は皮膚等価物の調製
特に示さない限りは、実施例で使用される全ての培地及びバッファーは、Bellら, 1979(Proc Natl Acad Sci USA. 76：1274-1278, 1979)、Asselineau及びPrunieras, 1984(Br J Dermatol. 111：219-222, 1984)、又はAsselineauら, 1987(Models in dermato., Vol. III, Ed. Lowe & Maibach, 1-7, 1987)に記載されている。
真皮支持体又は真皮等価物は、次の割合：
ＭＥＭ培地(１．７６Ｘ)      ４５％
子ウシ胎児血清：              ９％
ＮａＯＨ(０．１Ｎ)：          ５％
酢酸(１／１０００)：          ４％
コラーゲン：                ２６％
線維芽細胞：                １１％
で、Asselineauら, 1985及び1987(Exp. Cell. Res. 159：536-539, 1985；Models in dermatology, Vol 3, pp 1-7, 1987)に記載されているようにして調製する。
【００７７】
使用したコラーゲンはＩ型コラーゲン(市販溶液)であるが、ＩＩＩ型又はＩＶ型コラーゲンを使用することもできる。酸加水分解によりラットの尾部又は子ウシの皮膚から抽出し、＋４℃で酸性培地において保管し；３７℃まで再加熱し、酸性度を低下させる(ｐＨは増加)ことにより自然に重合させる。予め、水＋酢酸の連続浴に対して、コラーゲンを透析する。
プロトコルは次の通りである：添加剤(１％のグルタミン、１％の非必須アミノ酸、１％のピルビン酸ナトリウム、１％のフンギゾン(fungizone)、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン)の存在下、１．７６ＸのＭＥＭ培地、子ウシ胎児血清、及び０．１ＮのＮａＯＨを、無菌ファルコンチューブに入れる。ついで、ヒトの皮膚の移植片から単離された線維芽細胞を、培養培地１ｍｌ当たり１．４ｘ１０５細胞の濃度で添加する。
ついで、１／１０００に希釈された酢酸に同容量のコラーゲンが入った混合物を、白みがかって曇った外観が観察されるように、チューブの壁面に対してゆっくりと添加する。
次に、全組合せを注意深く混合し、１ｃｍ２当たり０．５ｍｌの割合で混合物が入った１２-ウェル培養プレート(Costar型、参照番号3512)のウェルに分配する。ついで、培養プレートを、５％のＣＯ２にて、３７℃のインキュベータに配する。
【００７８】
第２工程は、ＬＩＦを含有する培地において増幅された未分化の皮膚幹細胞及び／又は表皮前駆体、又はＬＩＦの存在下でケラチノサイト調製物を、前記支持体に播種することからなる。
特定の実施態様において、真皮等価物を含有する培地は、播種工程の前に、ＬＩＦを補足する。
ついで、培養体は、Rheinwald及びGreen、(Cell, 6：317-330, 1975)により記載された培地、ケラチノサイトの増殖が可能な培地であってよい、３Ｆ栄養培地に浸漬して保持しておくことができる。
３〜１５日、好ましくは７〜９日のインキュベート時間の後、皮膚等価物を、例えば金属スクリーンに堆積させて、空気／液体の界面に保持しておく。液体は、好ましくは上述したものと同様の栄養培地からなる。
【００７９】
次に、皮膚の特徴を示す皮膚等価物、すなわち支持体上に、４つの通常の細胞層の種類、つまり基底、超基底、顆粒及び角質層を有する表皮等価物が得られるまで、インキュベートをし続ける。
例えば、５〜３０日、好ましくは７〜１０日、インキュベートをし続ける。
このようにして生成された再構成された皮膚は、２つの実体であり、物理的に互いに分離可能な支持体と表皮等価物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、幹細胞及び／又は表皮前駆体のクローン性増殖におけるＬＩＦの効果の分析を示す。経過１において細胞から得られた細胞クローンを、内因性ＬＩＦの不在下で８日培養し、ついで固定して、染色し(Ａ)；経過１においてケラチノサイトから得られた細胞クローンを、１ｎｇ／ｍｌの内因性ＬＩＦの存在下で８日培養し、ついで固定して、染色した(Ｂ)；対照条件及び内因性ＬＩＦの存在下で得られたクローン密度の半定量分析(Ｃ)。
【図２】図２は、ＬＩＦが枯渇した又は枯渇していない３Ｔ３線維芽細胞からの粉砕材料の存在又は不在下において得られた再構成された表皮の組織学的分析を示す。ＬＩＦが枯渇していない粉砕３Ｔ３材料の存在下で得られた再構成された表皮の組織学的断面(正の対照)(Ａ)；粉砕３Ｔ３材料の不在下で得られた再構成された表皮の組織学的断面(負の対照)(Ｂ)；ＬＩＦが枯渇した粉砕３Ｔ３材料の存在下で得られた再構成された表皮の組織学的断面(実験条件)(Ｃ)。
【図１】
2005341967.tif 000002
【図２】
2005341967.tif 000003
【外国語明細書】
2005341967000001.pdf
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2005341967000004.pdf