(57)【要約】【課題】  副作用がなく、長期連用においても安全性の高い、かつ化粧料などのように日常的に用いるものに利用できるアレルギー疾患の治療、予防剤を提供すること。【解決手段】  ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも１種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する外用抗アレルギー剤を含む化粧料。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも１種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する外用抗アレルギー剤を含む化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも１種のポリフェノールを有効成分として含有する化粧料に関し、詳しくは即時型アレルギー改善を目的とする化粧料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、アレルギー疾患の増加がみられ、生まれる子供の１／３がアトピー性皮膚炎もしくは喘息を発症するとの報告がある。また、花粉症発症の劇的な増加も大きな社会問題となっている。
食習慣の欧米化、大気汚染、食品添加物、ストレス過多といった私たちを取り巻く環境の変化が、このようなアレルギー症状増加の原因であると考えられている。
【０００３】
アレルギー反応は、関与する免疫担当細胞や免疫グロブリンによりＩ型からIV型に分けられている。アレルギー性鼻炎，気管支喘息に代表される疾患はＩ型アレルギー反応に属しており，アレルゲンに曝露されることによりIgE 抗体が多量に産生され、そのIgE 抗体を介してマスト細胞や好塩基球からヒスタミン，ロイコトリエン，プロスタグランジン等のケミカルメディエータが産生・放出され、血管拡張，血管透過性亢進，気管支平滑筋の収縮，神経末端の刺激等が引き起こされることによる。そのため、Ｉ型アレルギー疾患の治療には、抗ヒスタミン剤とマスト細胞からのケミカルメディエータ遊離抑制作用をもつ抗アレルギー薬が使われている。
しかし、抗ヒスタミン剤や塩基性抗アレルギー薬には眠気，口渇，胃腸障害等の副作用があり、長期間に渡る連用が問題となる。
【０００４】
IV型アレルギー反応は、Ｔ細胞が関与する遅延型の反応で、ランゲルハンス細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞を介して抗原情報を受けたＴ細胞が、様々なサイトカインを産生・放出し、これにより好酸球やマクロファージの集積により遅延型の炎症反応が起こるものである。
アレルギー性接触皮膚炎は、IV型アレルギー反応に基づいて発症する代表的な疾患である。IV型アレルギー疾患の治療には、ステロイド剤が用いられるが、このステロイド剤は、Ｔ細胞のサイトカイン産生を抑制して、湿疹の治療では劇的な効果を示す。その反面、長期間の連用によって、副腎皮質機能の低下，皮膚紅潮，委縮，毛細血管拡張などの重篤な副作用を引き起こす可能性がある。
【０００５】
一方、茶は代表的な嗜好飲料であり、２０００年余にも渡り多くの人々に飲用されてきた。また、茶は様々な生理機能を有していることが判明しており、例えば抗酸化作用，抗腫瘍作用，発ガン抑制作用，抗菌作用，抗ウイルス作用，抗う触作用などが報告されている。
アレルギー作用に関しては、特許文献１において、ウーロン茶抽出物を主成分とする抗アレルギー剤としてマスト細胞からのヒスタミン遊離抑制作用を指標としてＩ型アレルギー反応に対する治療薬の例が、特許文献２において、天然カフェインのＩ型アレルギー症状の血管透過性亢進作用反応に有効な事例が、特許文献３および４において、ウーロン茶抽出物を有効成分とする抗アレルギー剤，抗炎症剤，抗アトピー性皮膚炎剤，抗乾癬剤とした治療薬の例が挙げられている。
さらに、エピガロカテキンガレート，エピカテキンガレートなどの緑茶カテキン類が、ラット腹腔内マスト細胞からのヒスタミン遊離を抑制することが報告されている（非特許文献１および２)。しかし、ストリクチニン等のポリフェノール類がアレルギー反応の起源となるＢ細胞によるIgE 産生を抑制するとの報告は行われていない。
【０００６】
【特許文献１】特開平３−２５８７２６号公報
【特許文献２】特開平７−１７８６５号公報
【特許文献３】特開平１０−７７２３１号公報
【特許文献４】特開平１０−１７５８７４号公報
【非特許文献１】日本食品科学工学会誌,Vol.42, No.11, pp 952-958, 1995
【非特許文献２】Allergy, Vol.52, No.1, pp 58-64, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アレルギー疾患に応じた医薬品が開発され、治療に用いられているが、これらは副作用を伴うため、長期連用が可能で、安全性が高く副作用のない、天然物由来の抗アレルギー剤の開発が強く望まれていた。
そこで、本発明の目的は、副作用がなく、長期連用においても安全性の高い、かつ化粧料などのように日常的に用いるものに利用できるアレルギー疾患の治療、予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、抗アレルギー作用を有する物質をIgE 産生抑制効果を指標にスクリーニングを行い、ストリクチニン等のポリフェノール類にこれらの効果があることを見出し、かかる知見に基づいて本発明に到達した。
【０００９】
請求項１記載の本発明は、ストリクチニン及びそのメチル化誘導体の中から選ばれた少なくとも１種のポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とするIgEクラススイッチを抑制する外用抗アレルギー剤を含む化粧料である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗アレルギー剤を含有する化粧料は、アレルギー反応に基づく症状の予防，抑制又は軽減に有効である。さらに、この化粧料は、茶に含まれるストリクチニン等のポリフェノール類を有効成分としているため、安全性にも優れ、長期連用の場合にも人体に有害な副作用がなく、日常的に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係るストリクチニンは、下記の構造式で表される化合物であり、本発明には当該化合物の他、そのメチル化誘導体ポリフェノール類あるいはこれらの混合物も使用することができる。ポリフェノール類としては、例えばグルコースのＣ１〜Ｃ４及びＣ６の水酸基の少なくとも１つにガロイル基、ジガロイル基、トリガロイル基、ヘキサヒドロキシフェノイル基、３−Ｏ−メチルガロイル基、４−Ｏ−メチルガロイル基が導入されたもの等が挙げられる。
【００１２】
【化１】
2005179376.tif 000002
【００１３】
茶 (camellia sinensis)は、古来より飲用され、長期にわたって常飲されているが、人体に悪影響はなく、非常に安全性の高い飲料であることが認められている。そのため、本発明で使用するストリクチニン等のポリフェノール類を主体とする茶葉抽出物も、安心して摂取することが受け入れられるものである。
【００１４】
本発明に使用するストリクチニン等のポリフェノール類は、‘やぶきた’などの乾燥茶葉を水系溶剤で抽出して得られるポリフェノール画分から分離、採取することができる。抽出物が、最終的に化粧料等に利用されることを考えると、安全性の立場から、水，エタノールまたはこれらの混合物を溶剤として用いるのが好ましい。
【００１５】
抽出に際して、茶葉と溶剤との比率（重量比）は、特に限定されないが、茶葉１に対して溶剤５から１００倍の割合が好ましい。抽出温度についても、特に限定されるものではなく、通常は室温〜常圧下で溶剤の沸点の範囲が作業上都合がよい。抽出時間は、１０分から６時間の範囲とするのが好ましい。
【００１６】
本発明に係るストリクチニン等のポリフェノール類を主体とする茶葉抽出物は、水等で希釈し、濃縮し、あるいは粉末化または顆粒化して、既知の医薬用担体等と共に製剤化することにより、エアゾール剤，液剤，エキス剤，懸濁剤，乳剤，軟膏剤，パップ剤，リニメント剤，ローション剤などの形態とすることができる。あるいは、公知の化粧品，医薬部外品，医薬品に用いられる水性成分，界面活性剤，油性成分，可溶化剤，保湿剤，粉末成分，アルコール類，ｐＨ調整剤，防腐剤，酸化防止剤，増粘剤，色素，顔料，香料などを必要に応じて適宜選択して目的とする形態に調製される。
皮膚外用剤として、例えばローション状，ゲル状，乳剤，軟膏等の剤形とすることができ、柔軟性化粧品，収斂性化粧水などの化粧水類，エモリエントクリーム，モイスチャークリーム，マッサージクリーム等のクリーム類，エモリエント乳液，ナリンシング乳液，クレンジング乳液等の乳液類，洗顔料，皮膚洗浄剤，ファンデーション，アイカラー，チークカラー，口紅等のメイクアップ化粧料，シャンプー，リンス，ヘアートリートメント剤，ヘアークリーム，整髪剤，ヘアートニック，養毛剤，育毛剤などの毛髪化粧料，バスオイル，バスソルト，ファームバスなどの入浴料等の種々の形態の化粧料として提供することができる。
【００１７】
本発明において、ストリクチニン等のポリフェノール類は、使用目的などを考慮して適量を用いればよく、化粧料の場合は、有効成分であるストリクチニン等のポリフェノール類は、１日に５〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で用いる。なお、１日１回もしくは数回に分けて使用することができる。
【実施例】
【００１８】
次に、本発明を詳細に説明するための代表的な実施例や実験例等を示すが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
実験例１  各種茶葉からのポリフェノール画分の抽出（茶葉抽出物）
マイクロ波にて乾燥した茶葉１００ｇを５０％メタノールで抽出し、抽出画分を３０％クロロホルムで抽出した。その水相をさらに酢酸エチルで抽出した後の酢酸エチル層をＯＤＳカラムで分画した。ストリクチニンの精製方法の１例を図１に示す。分画したそれぞれの画分を、Ｆｒ．１〜５とした。Ｆｒ．１〜５は、すべて一度凍結乾燥し、それを各１ｍｇ／ｍＬとなるように、Ｆｒ．１〜２は水、Ｆｒ．３〜４は０．２％ＤＭＳＯ、Ｆｒ．５は０．１％ＤＭＳＯで溶解した。
【００１９】
実験例２  活性画分の同定
実験例１のＦｒ．１〜５について、それぞれ in vitro での抗アレルギー作用をヒトＢ細胞でのIgE 産生抑制（IgE クラススイッチ抑制）を調べる IgE重鎖胚型転写物発現法で評価した。ヒトＢ細胞をＩＬ−４で刺激して IgE産生を誘導すると、Ｉｇ遺伝子の定常部領域遺伝子のうちε領域（Ｃε）にあたる上流イントロンから転写が開始されて転写産物（ＣεＧＴ：胚型転写物）が発現し、その後ＤＮＡ組換えにより IgEのクラススイッチが引き起こされることを利用した方法である。ＣεＧＴは IgE産生が誘導される前に必ず発現するＲＮＡであり、ＣεＧＴ発現量と IgE遺伝子のクラススイッチ量は比例している。そのため、ＣεＧＴ発現量の程度を検出することにより、 IgEクラススイッチ量を推定することができる。
【００２０】
IgE 重鎖胚型転写発現法は、以下の手順で行った。
ヒトＢ細胞株ＤＮＤ３９（林原生物化学研究所より入手）を１×１０5 個／ｍＬに調製し、ＩＬ−４を終濃度２５Ｕ／ｍＬとなるように添加して刺激した。このとき、実験例１で得たＦｒ．１〜５を濃度１０μｇ／ｍＬにてＩＬ−４と同時に添加した。
一方、上記ヒト細胞株にＩＬ−４（終濃度２５Ｕ／ｍＬ）と２ｎｇ／ｍＬのトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−ｂｅｔａ、ペプロテック社製）を添加したものを、ＣεＧＴの発現を抑制するポジティブコントロールとした。
これらを４８時間培養後、遠心分離（３００×ｇ、３７℃）を行って細胞を集め、全ＲＮＡをＲＮＡ採抽出試薬（商品名：Trizol、ギブコ社製）１ｍＬで抽出した。
【００２１】
次いで、以下の手順によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。まず、抽出した全ＲＮＡの濃度を吸光光度計で測定し、１０μｇ分を０．６ｍＬチューブに取り、水を加えて１１．８μＬとなるようにした。これに０．５μｇ／μＬのオリゴｄＴプライマー及び２０μＭのＣεＧＴアンチセンスプライマーをそれぞれ１．０μＬ加えた。このチューブを７０℃で１０分間インキュベートした後、続いて氷中で１０分間急冷し、ｍＲＮＡとオリゴｄＴプライマー、ＣεＧＴアンチセンスプライマーをアニールさせた。これにＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（アマシャム社製）２．０μＬとＭＭＬＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（アマシャム社製）に付属の５×ｂｕｆｆｅｒ  ４．０μＬ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造製）０．１μＬ、ＭＭＬＶ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ０．１μＬ（終濃度２０−２００ｕｎｉｔ／チューブ）を混合した。これを３７℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは、ＰＣＲを行い増幅した。Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋに登録されているＣεＧＴ及びヒトＧＡＰＤＨの塩基配列をもとにセンス並びにアンチセンスプライマーを作成した。その構造を配列表に示す。すなわち、ＣεＧＴセンスプライマーを配列番号１に、ＣεＧＴアンチセンスプライマーを配列番号２に、ヒトＧＡＰＤＨセンスプライマーを配列番号３に、ヒトＧＡＰＤＨアンチセンスプライマーを配列番号４に、それぞれ示す。
【００２２】
当該プライマーを用いてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりＣεＧＴ−ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲの鋳型としてｃＤＮＡ原液を１μＬ用い、ＣεＧＴ検出の際には１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．８μＬ、センスプライマー０．５μＬ、アンチセンスプライマー０．５μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー社製）０．１μＬ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ付属の１０×ｂｕｆｆｅｒ  １μＬを混合し、蒸留水を加えて総量１０μＬとした。
ＧＡＰＤＨの検出の際には１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．８μＬ、ＭｇＣｌ2 １μＬ、センスプライマー０．５μＬ、アンチセンスプライマー０．５μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（ファーメンタス社製）０．１μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ付属の１０×Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  １μＬを混合し、蒸留水を加えて総量１０μＬとした。
ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００（パーキンエルマー社製）を用いて行い、その条件は次の通りである。ＣεＧＴ検出の際には、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１５サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。ＧＡＰＤＨ検出の際には、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１０サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。次に、得られたＰＣＲ産物について、分離用アガロースゲル（濃度１％、サワディーテクノロジー社製）で電気泳動を行った。電気泳動終了後、プラスチャージのナイロン膜（アマシャム社製）に転写した（サザントランスファー）。
【００２３】
続いて、泳動パターンが転写したナイロン膜に、上記のＰＣＲにおいて１５回増幅したＣεＧＴ−ＤＮＡを蛍光標識したオリゴＤＮＡ（ヒトＣεＧＴの塩基配列をもとに、ＰＣＲに用いた前述のセンス及びアンチセンスプライマーに挟まれる領域からオリゴヌクレオチド（配列表の配列番号５）を選びだし、このオリゴヌクレオチドをオリゴラベリングキット（アマシャム社製）を用いて調製したもの）をプローブとして用いて、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、蛍光検出薬であるＣＤＰ−Ｓｔａｒ（アマシャム社製）と反応させ、その蛍光強度によりＣεＧＴの発現量を測定した。図２は、ヒトＢ細胞株ＤＮＤ３９におけるＩＬ−４によるＣεＧＴ誘導発現に対する各フラクションの影響を表したものである。図中、ＧＡＤＰＨはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を表し、□はコントロールを表している。
図２から明らかなように、Ｆｒ．３の画分において、ＣεＧＴの発現量は他の画分よりも抑制されていた。このことから、Ｆｒ．３の画分に活性成分があることが判明し、その後、ＯＤＳカラムを用いて細かく分画し、その中の１つの画分がストリクチニンのみを含む画分であることを確認した。
【００２４】
実験例３  ヒトＢ細胞株における抗アレルギー活性の測定
実験例２で活性成分と同定したストリクチニンを用いて、ヒトＢ細胞株における抗アレルギー活性の測定を、実験例２のIgE 重鎖胚型転写物発現法と同様に測定した。なお、ストリクチニンは、ＩＬ−４と同時に添加した。ストリクチニンの添加濃度は１，１０，２５μＭである。図３は、ヒトＢ細胞株ＤＮＤ３９におけるＩＬ−４によるＣεＧＴ誘導発現に対するストリクチニンの影響を示したものである。図中、ＧＡＤＰＨはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を表し、□はコントロールを表している。
図３に示した通り、ストリクチニンは、ヒトＢ細胞株においてＩＬ−４添加によるIgE クラススイッチを強く抑制することが明らかとなった。IgE はアレルギー反応に深く関与する免疫グロブリンであるため、IgE クラススイッチを抑制することは抗アレルギー活性を有することを意味する。
【００２５】
実験例４  ヒト末梢血正常細胞における抗アレルギー活性の測定
実験例３のヒトＢ細胞株ＤＮＤ３９の代わりに、ヒト末梢血正常細胞（単核球：ヒト健常人ボランティアより採血し、その血液から分離した）を用いて、抗アレルギー活性を実験例２のIgE 重鎖胚型転写物発現法と同様に測定した。この例においても、実験例２と同様に、ストリクチニンはＩＬ−４と同時に添加した。なお、ストリクチニンの添加濃度は２５μＭとした。図４は、ヒト末梢血正常細胞におけるＩＬ−４によるＣεＧＴ誘導発現に対するストリクチニンの影響を表したものである。図中、ＧＡＤＰＨはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素を表し、□はコントロールを表している。
図４に示した通り、ストリクチニンはヒト末梢血正常細胞において、ＩＬ−４添加によるIgE クラススイッチを強く抑制する作用を有しており、抗アレルギー活性を有することが認められた。
【００２６】
実施例１  入浴剤の製造
以下の材料を使用して、常法にしたがってストリクチニンを主体とする茶葉抽出物入り入浴剤を製造した。
乾燥硫酸ナトリウム                              ５３ｇ
炭酸水素ナトリウム                              ４０ｇ
軽質炭酸カルシウム                                １ｇ
無水ケイ酸                                        １ｇ
ストリクチニンを含有するポリフェノール画分        ５ｇ
香料                                              微量
色素                                              微量
合計                                １００ｇ
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ストリクチニンの精製方法の１例を示したフローチャートである。
【図２】分画した各画分のＩＬ−４によるＣεＧＴ誘導発現に対する影響を表したものである。
【図３】ヒトＢ細胞株ＤＮＤ３９におけるＩＬ−４によるＣεＧＴ誘導発現に対するストリクチニンの影響を表したものである。
【図４】ヒト末梢血正常細胞におけるＩＬ−４によるＣεＧＴ誘導発現に対するストリクチニンの影響を表したものである。
【図１】
2005179376.tif 000003
【図２】
2005179376.tif 000004
【図３】
2005179376.tif 000005
【図４】
2005179376.tif 000006
【配列表】
2005179376000001.app