(57)【要約】【課題】本発明により、天然に存在するｍＲＮＡからえられる可溶性インターフェロンα−受容体１型および２型ならびにそれらをコードするＤＮＡ分子を提供する。【解決手段】哺乳動物の可溶性、膜非結合性型のインターフェロンα−受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子、前記受容体またはその類似体、それらの調製法、それらを含有する組成物ならびに薬剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
原核細胞または真核細胞宿主での発現によるポリペプチド産物をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、該産物が哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の一次構造コンフォーメーションのすべてまたは一部を有しかつ哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の生物学的活性を有するものであるＤＮＡ分子。
【請求項３】
ａ）哺乳動物の天然インターフェロンα−受容体遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローン、
ｂ）前記ａ）のクローンとハイブリダイズすることができ、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子ならびに
ｃ）遺伝コードの結果前記ａ）およびｂ）に定義されるＤＮＡ分子に対して縮重を有し、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子
からなる群より選ばれる請求項１または２記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号１で示されるスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体１型のアミノ酸残基１〜４３４の配列のすべてまたは一部と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする請求項１、２または３記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号２で示されるスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体２型のアミノ酸残基１〜４９６の配列のすべてまたは一部と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする請求項１、２または３記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項１、２、３、４または５記載のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含んでなる宿主細胞を培養することからなる、哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体またはその類似体の調製法。
【請求項８】
哺乳動物の可溶性、膜非結合型の生物学的に活性型であるインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分。
【請求項９】
ヒトが起源である請求項８記載の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分。
【請求項１０】
約５５キロダルトンの分子量、および配列番号１に示されるアミノ酸残基１〜４３４の配列のすべてまたは一部と約８０％より大きく類似するアミノ酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体１型である請求項９記載の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分。
【請求項１１】
約９５キロダルトンの分子量、および配列番号２に示されるアミノ酸残基１〜４９６の配列のすべてまたは一部と約８０％より大きく類似するアミノ酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体２型である請求項９記載の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分。
【請求項１２】
希釈剤、担体および／または賦形剤ならびに有効成分として均質で生物学的に活性な請求項８、９、１０または１１記載の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含んでなる組成物。
【請求項１３】
細胞または組織においてインターフェロン−βおよび／またはインターフェロン−αのサブタイプの活性を阻害、変更または修飾するための請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
有効成分として請求項１０記載のインターフェロンα−受容体１型、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有する請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
有効成分として請求項１１記載のインターフェロンα−受容体２型、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有する請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
生体内でまたは生体外でインターフェロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプの種類を質的および／または量的に診断判定するための請求項１２、１３、１４または１５記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１２、１３、１４または１５記載の組成物および薬学的に許容しうる希釈剤、担体および／または賦形剤から処方された薬剤であって、生体内でまたは生体外でインターフェロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプの活性を阻害、変更または修飾するための薬剤。
【請求項１８】
大量のインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βが与えられた結果または内在性に過剰のインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βが産生された結果もたらされる、インターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βの過剰状態を治療するための請求項１７記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な型のインターフェロンα−受容体（以下、ＩＦＮα−受容体またはＩＦＮＡＲともいう）をコードするＤＮＡ分子、前記受容体またはその類似体、それらの調製法およびそれらを含む組成物ならびに診断および治療に用いる組成物および薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンはサイトカインのファミリーに属し、標的細胞表面に存在する特異的な形質膜受容体を介して標的細胞に対して特徴的に作用する細胞分泌タンパク質である。これら受容体の一般的な性質は、細胞の外膜に受容体をつなぎ止める膜貫通（ＴＭ）ドメインを形成している疎水性アミノ酸の内部配列が存在することである（バザン、ジェー・エフ(Bazan, J.F.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)８７巻、６９３４〜６９３８頁（１９９０年））。ヒトタイプＩインターフェロン受容体（ＩＦＮα−受容体（ＩＦＮＡＲ）タンパク質と表される）は、そのｃＤＮＡをクローニングすることにより特性が明らかにされた（ウゼ、ジー(Uze, G.)およびグレッサー、アイ(Gresser, I.)、セル(Cell)６０巻、２２５〜２３４頁（１９９０年））。このｃＤＮＡは４３６のアミノ酸のＮ−末端細胞外（ＥＣ）ドメインと１００のアミノ酸のＣ−末端細胞内（ＩＣ）ドメインとを分ける２１アミノ酸長の疎水性膜貫通領域を有するＩＦＮＡＲタンパク質をコードする（図１ａ参照）。ＥＣドメインはリガンドの結合に関与していることが示されている（ベノイト、ピー(Benoit, P.)ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.)１５０巻、７０７〜７１６頁（１９９３年）；ノビック、ディー(Novick, D.)ら、フェブス・レターズ(FEBS Letters)３１４巻、４４５〜４４８頁（１９９２年））。
【０００３】
可溶性で膜非結合型の受容体の存在が認められている（フェルナンデス−ボトラン、アール(Fernandez -Botran, R.) 、ファセブ・ジャーナル(FASEB Journal) ５巻、２５６７〜２５７４頁（１９９１年））。このような受容体は細胞外ドメインと膜貫通領域との間で起こるタンパク質分解性切断によりしばしば形成され、それによる結果として切除された(truncated)受容体の脱離が生じる（ノファー、ワイ（Nophar, Y.)ら、エンボジャーナル(EMBO J.)９巻、３２６９〜３２７８頁（１９９０年）；ムルバーグ、ジェー(Mullberg, J.)ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Eur. J. Immunol.)２３巻、４７３〜４８０頁（１９９３年））。さらに細胞はまた、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを欠いたサイトカイン受容体の他の型を合成していることも見出されたが、これはタンパク質分解性切断の結果ではなく受容体遺伝子転写物の特異な(differential)プロセシングのために生じるものである（ラインズ、エム・エー(Raines,M.A.) ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー、８８巻、８２０３〜８２０７頁（１９９１年）；ルスト、ジェー・エー(Lust, J.A.)ら、サイトカイン(Cytokine)４巻、９６〜１００頁（１９９２年））。これらの非膜貫通型すなわち「可溶性」型は、Ｃ−末端における新規なアミノ酸配列により特徴づけられ、それによりおそらくは別個の機能を有する別個のタンパク質となる。これまでに非膜貫通型すなわち「可溶性」ＩＦＮα−受容体は記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明において、受容体遺伝子の転写物の特異なプロセシングにより産生される膜非結合型(non-membranal)のＩＦＮα−受容体が細胞に存在することが予測せぬことに見出された。したがって本発明は、ウゼ（前出）によりクローン化されたＩＦＮα−受容体とは異なるアミノ酸配列を有する新規なＩＦＮα−受容体タンパク質を提供することを目的とする。これらの受容体は、細胞の非膜画分(non-membranal compartment)におけるＩＦＮα−受容体に特異的なモノクローナル抗体によって認識される。これら可溶性ＩＦＮ受容体は、リガンド結合について細胞膜受容体と競合することにより、さもなければ細胞内でＩＦＮが媒介する機能を担うことによりヒト細胞のＩＦＮに対する応答を調節するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子、および原核細胞または真核細胞宿主での発現によるポリペプチド産物をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、該産物が哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の一次構造コンフォーメーションのすべてまたは一部を有しかつ哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体の生物学的活性を有するものであるＤＮＡ分子に関する。
【０００６】
前記ＤＮＡ分子は、好ましくはａ）哺乳動物の天然インターフェロンα−受容体遺伝子のコード領域に由来するヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローン、
ｂ）前記ａ）のクローンとハイブリダイズすることができ、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子ならびに
ｃ）遺伝コードの結果前記ａ）およびｂ）に定義されるＤＮＡ分子に対して縮重を有し、生物学的に活性な可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体をコードするＤＮＡ分子
からなる群より選ばれる。
【０００７】
また前記ＤＮＡ分子は好ましくは、配列番号１で示されるスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体１型のアミノ酸残基１〜４３４の配列のすべてまたは一部と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする前記ＤＮＡ分子、および配列番号２で示されるスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体２型のアミノ酸残基１〜４９６の配列のすべてまたは一部と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする前記ＤＮＡ分子である。
【０００８】
さらに本発明は前記ＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターに関する。
【０００９】
本発明はまた、前記ベクターを含んでなる宿主細胞を培養することからなる、哺乳動物の可溶性、膜非結合型のインターフェロンα−受容体またはその類似体の調製法に関する。
【００１０】
さらに本発明は哺乳動物の可溶性、膜非結合型の生物学的に活性型であるインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分に関する。
【００１１】
前記インターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分において、インターフェロンα受容体は好ましくはヒトが起源であり、約５５キロダルトンの分子量、および配列番号１に示されるアミノ酸残基１〜４３４の配列のすべてまたは一部と約８０％より大きく類似するアミノ酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体１型であり、もしくは約９５キロダルトンの分子量、および配列番号２に示されるアミノ酸残基１〜４９６の配列のすべてまたは一部と約８０％より大きく類似するアミノ酸配列を有するスプライス欠失されたインターフェロンα−受容体２型である。
【００１２】
また本発明は希釈剤、担体および／または賦形剤ならびに有効成分として均質で生物学的に活性な前記の型のインターフェロンα−受容体、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含んでなる組成物に関する。
【００１３】
前記組成物は好ましくは、細胞または組織においてインターフェロン−βおよび／またはインターフェロン−αのサブタイプの活性を阻害、変更または修飾するために用いられ、有効成分として前記インターフェロンα−受容体１型、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有するか、あるいは有効成分として前記インターフェロンα−受容体２型、そのムテイン体、融合タンパク質、塩、機能性誘導体または活性画分を含有し、好ましくは生体内でまたは生体外でインターフェロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプの種類を質的および／または量的に診断判定(diagnostic determination)するために用いられる。
【００１４】
本発明はさらに、前記組成物および薬学的に許容しうる希釈剤、担体および／または賦形剤から処方された薬剤であって生体内でまたは生体外でインターフェロン−αまたはインターフェロン−βのサブタイプの活性を阻害、変更または修飾するための薬剤に関する。
【００１５】
前記薬剤は好ましくは、大量のインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βが与えられた結果または内在性に過剰のインターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βが産生された結果もたらされる、インターフェロン−αおよび／またはインターフェロン−βの過剰状態を治療するために用いられる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、天然に存在するｍＲＮＡからえられる可溶性インターフェロンα−受容体１型および２型ならびにそれらをコードするＤＮＡ分子を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、択一的スプライシング(alternative splicing)機構によってヒト細胞において合成されることにより特徴づけられる、新規な型のヒトＩＦＮα−受容体のｍＲＮＡおよびタンパク質に関する。新規な型のＩＦＮα−受容体のｃＤＮＡに対して確立された配列により、対応するｍＲＮＡが膜貫通領域を欠いたタンパク質を特定する新規なポリペプチド配列をコードすることが示唆された。このような膜非結合型ＩＦＮＡＲの存在がヒト細胞の可溶性細胞質画分内に示された。前記タンパク質は細胞から細胞外の空間へも分泌されうるが、他の可溶性受容体の型、すなわちタンパク質分解性切断によりその細胞外ドメインを遊離する膜結合型の受容体に由来するものとは区別される。
【００１８】
サイトカイン活性の調節剤(regulators)としての可溶性受容体の潜在的な機能が報告されている（フェルナンデス−ボトラン、１９９１年、前出）。細胞が２つの膜非結合型すなわち可溶性型のＩＦＮα−受容体をコードするｍＲＮＡを産生する機構が存在することは、その２つの型がそれぞれ細胞に対する何らかの機能を有することを示唆している。これらの型は膜につなぎ留められず、細胞外に分泌されうるかまたはサイトゾル（可溶性細胞画分）内に見出されうる。細胞内−細胞質ドメインが膜貫通（ＴＭ）ドメインなしに直接続いている、リガンドが結合する細胞外（ＥＣ）ドメインを含む１つの型（図１ｃ）は、たとえば細胞内部でサイトカインの結合により発生するようなシグナルトランスダクションにおいて機能することがなお可能であろう。ＥＣドメインにＳ（可溶性）−ドメインが続き膜貫通ドメインおよび細胞内−細胞質ドメインの両方を欠く他の型（図１ｂ）は、シグナルトランスダクションにおいて機能しないであろう。ＩＦＮＡＲのＥＣドメイン（残基２２〜４２７）に、ＩＦＮ結合活性が含まれることが知られている（ベノイト、ピーら、（１９９３年）、ノビック、ディーら（１９９２年）、いずれも前出、参照）。したがって、本発明の細胞ｍＲＮＡにおいてコードされる可溶性ＩＦＮＡＲ型は、ＩＦＮと結合して細胞表面上のＩＦＮ結合活性について競合しＩＦＮ拮抗剤として作用するか、または多種多様のＩＦＮサブタイプの活性を他の経路で調節することができるであろう。細胞内で合成されて、これらのタンパク質はＩＦＮへの生物学的応答に関与する他の細胞性タンパク質とも相互作用することもできる。このようなことは、正常の膜結合受容体の細胞形質膜の外側でタンパク質分解性切断されることにより産生された可溶性ＩＦＮα−受容体のばあいにはないであろう。
【００１９】
本発明の新規な可溶性型のＩＦＮＡＲは、細胞、組織および生物体においてＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−βのサブタイプの活性を阻害、変更または修飾するために適用されうる。ＩＦＮは、抗ウイルス、抗増殖および免疫調節機能を有する（バロン、エス(Baron, S.)ら（編）、インターフェロン(Interferon)；プリンシプルズ・アンド・メディカル・アプリケーションズ(Principles and Medical Applications)、ザ・ユニバーシティ・オブ・テキサス・メディカル・ブランチ・アット・ガルベストン(The University of Texas Medical Branch at Galveston)、（１９９２年））。ＩＦＮはウイルス性疾患（たとえばパピロマトーゼ(papillomatoses)、肝炎など）、悪性疾患（たとえば白血病、ホルモン依存性癌など）および免疫学的機能不全（たとえば多発性硬化症）を処置するために臨床的に用いられる。ＩＦＮのこれらの有益な効果は、本発明の型のＩＦＮα−受容体などの異なる型のＩＦＮα−受容体によって自然に変えられうる。他方、ＩＦＮの過剰は有害でありえ、ある自己免疫疾患に、（移植組織拒絶および造血系欠陥(hematopoietic deficiences)に）関わっている（前出のバロン、エス）ら（編）、インターフェロン；プリンシプルズ・アンド・メディカル・アプリケーションズ参照）。このような状態においては、ＩＦＮの作用の阻害剤が有益でありうる。さらに、細胞はＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−βのサブタイプへの応答において異なることがありえ（ローゼンブラム、エム、ジー(Rosenblum, M.G.)ら、ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ(J. Interferon Res.)１０巻、１４１〜１５１頁（１９９０年））、ＩＦＮサブタイプに対する細胞の応答が、細胞で合成された可溶性ＩＦＮＡＲ型のいくつかによって変えられる。本発明の新規なＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの単離および同定によって、細胞で合成される天然の可溶性ＩＦＮα−受容体型の組換えＤＮＡ技術による製造が可能となり、またトランスフェクトされた細胞における過剰発現によりまたは細胞培養物への添加によりそれらの機能を研究することが可能となるであろう。
【００２０】
本発明の可溶性ＩＦＮＡＲ型は、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−βサブタイプの活性を阻害、変更または修飾するための医薬組成物（薬剤）を調製するのに用いることができうる。このような医薬組成物は、たとえば前記したような、治療において大量のＩＦＮが与えられた結果もしくはＩＦＮが内在的に異常に高く産生された結果として患者が過剰のＩＦＮを有するような種々の障害(disorders)の治療のために用いられることができうる。前記医薬組成物は既知のいかなる方法によって調製されてよく、その方法において、有効成分である可溶性ＩＦＮＡＲが薬学的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤と混合される。前記医薬組成物の実際の投与量および投与の態様は、専門の実務者により決定されるであろう。
【００２１】
本発明の可溶性ＩＦＮＡＲは、たとえば生体内でのまたは生体外での診断分析においてＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βのサブタイプの種類を定性的におよび／または定量的に決定するための、診断目的用の組成物を調製するために用いられうる。これらの組成物において可溶性ＩＦＮＡＲは、たとえば放射ラベル、蛍光ラベル、酵素結合、抗体結合などの確立されたラベリング法のいかなるものによってラベルされてもよい。前記組成物の調製ならびに前記組成物の診断分析における適用は、すでに確立されているいかなる方法によってもよい。
【００２２】
また、本発明の可溶性ＩＦＮＡＲはＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−βのサブタイプの精製のためのアフィニティークロマトグラフィー法においても適用しうる。このような適用においては、たとえば化学的交差結合(chemical cross-linking)などの標準法のいずれかを用いて、既知のアフィニティークロマトグラフィー支持マトリックスのいずれかに可溶性ＩＦＮＡＲが付けられるとよい。
【００２３】
本明細書で用いられる「ムテイン体」の語は、えられる産物の活性を大いに変えることなく、天然の可溶性ＩＦＮＡＲの１または複数のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換されたかもしくは欠失した、または可溶性ＩＦＮＡＲの天然の配列に１または複数のアミノ酸残基が加えられた、可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質の類似体をいう。これらムテイン体は既知の合成技術によりおよび／または部位特異的変異誘発技術によって、もしくはそれに好適ないかなる他の既知の技術によっても調製されうる。
【００２４】
「融合タンパク質」の語は、たとえば体液中での滞留時間が長い他のタンパク質と融合された本発明の可溶性ＩＦＮＡＲを含んでなるポリペプチドまたはそのムテイン体をいう。可溶性ＩＦＮＡＲはこのように他のタンパク質、ポリペプチドなど、たとえば免疫グロブリンまたはその断片と融合されうる。
【００２５】
本明細書における「塩」の語は、可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、そのムテイン体および融合タンパク質のカルボキシル基の両方の塩ならびにアミノ基の酸付加塩をいう。カルボキシル基の塩は当該技術分野で知られている手段で形成されてもよく、無機塩、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩など、ならびにたとえばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンなどと形成された有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩には、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩ならびにたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が含まれる。
【００２６】
本明細書に用いられる「機能性誘導体」の語は、可溶性ＩＦＮＡＲならびにその融合タンパク質およびムテイン体の誘導体をカバーし、残基またはＮ−もしくはＣ−末端基の側鎖として生じる官能基から当該技術分野において知られている手段によって調製されるとよく、またそれらが薬学的に許容しうるままである限り、すなわちタンパク質の活性を損わずそれを含む組成物に毒性を付与しない限り、本発明に包含される。これら誘導体は、たとえば抗原部位を遮蔽し、体液中での可溶性ＩＦＮＡＲの滞留を遅延させうるポリエチレングリコール側鎖を含んでいてもよい。他の誘導体としてはたとえばカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえばアルカノイル基または炭素環式アロイル基）とで形成されたアミノ酸残基のフリーのアミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分とで形成されたフリーの水酸基（たとえばセリンまたはスレオニン残基のフリーの水酸基）のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００２７】
可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質およびそのムテイン体の「活性画分」として、本発明はタンパク質分子単独またはそれに結合した分子またはそれに連結した残基（たとえば糖もしくはホスフェート残基）を含めたもののポリペプチド鎖のいかなる断片または前駆体も、あるいはタンパク質分子または糖残基の自己凝集物をもカバーする。ただし前記画分は可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質およびそのムテイン体と同様の生物学的活性および／または医薬活性を有するものである。
【００２８】
本発明にしたがう可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、その融合産物、断片およびムテイン体の組換え製造法を以下に説明する。
【００２９】
後述の実施例５（ａ）の部分において、可溶性ＩＦＮＡＲ１型および２型の遺伝情報を担うＳＶ−４０由来の発現ベクター（たとえば、ｐＳＶＬ）の特定の調製法を記載する。前記ベクターはＣＯＳ−７宿主細胞に導入された（トランスフェクションされた）ときに組換えＩＦＮＡＲ１型および２型の発現が成功する。標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のように他のベクター（およびそれでトランスフェクトされた宿主細胞）は組換え可溶性ＩＦＮＡＲ融合タンパク質、その断片およびムテイン体の製造のために生産されうる。
【００３０】
本発明の単離されたｃＤＮＡを、終止コドンおよびポリアデニレーション部位が可溶性ＩＦＮＡＲの最後の必須コドンの後に挿入されるように、適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発に供する。ついで、この構築物を当該技術分野においてよく知られている技術によってふさわしく構築された発現ベクターに挿入する（マニアチスら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、１９８２年）。合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端化(blunt-ended) 連結技術を用いることを含むホモポリマーテイリング(homopolymer tailing) または制限結合(restriction linking)によって、２本鎖ｃＤＮＡをプラスミドベクターに連結させる。ＤＮＡ分子を連結させるためにＤＮＡリガーゼを用い、アルカリホスファターゼを用いてＤＮＡ鎖を処置することにより望ましくない接合(joining)を回避する。
【００３１】
可溶性ＩＦＮＡＲおよび、たとえばＩｇＧ1重鎖の定常部とからなる融合タンパク質の製造は、以下のように行なう。コード配列の直後に特有な制限部位を導入するように、適切なオリゴヌクレオチドを用いて可溶性ＩＦＮＡＲのＤＮＡを部位特異的変異誘発に供する。ＩｇＧ1重鎖の定常部の遺伝情報を担うプラスミド、たとえばｐＲＫＣＯ４2Ｆｃ1（バイルン・アール・エーら(Byrn R.A.)ら、ネイチャー(Nature)、３４４巻、６６７〜６７０頁（１９９０年））を同様の部位特異的変異誘発に供し、融合タンパク質がイン・フェーズ(in-phase)に翻訳されうるようにＩｇＧ1重鎖のＡｓｐ２１６にできる限り近接して前記と同じ特有な制限部位を導入する。前記の特有な制限部位で消化することにより、５´非翻訳配列および可溶性ＩＦＮＡＲをコードする配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片を調製する。変異させたｐＲＫＣＤ４2Ｆｃ1を同様に消化し、プラスミドおよびＩｇＧ1配列を含む大きな断片をつくる。ついで２つの断片を連結させ、Ｎ−末端可溶性ＩＦＮＡＲおよびＩｇＧ1重鎖の約２２７のＣ−末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）からなるポリペプチド前駆体をコードする新しいプラスミドをつくる。融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切な制限酵素を用いた消化によりプラスミドから単離し、ついで効率のよい発現ベクターに挿入する。
【００３２】
可溶性ＩＦＮＡＲ、そのムテイン体または融合タンパク質を発現することができるために、発現ベクターはまた、遺伝子発現およびタンパク質の産生を可能とするような方法で所望のタンパク質をコードするＤＮＡに結合させた転写および翻訳調節情報を含む特異的なヌクレオチド配列を含む。まず、遺伝子が転写されるためには、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる、そしてそのポリメラーゼが結合しかくして転写プロセスが開始されるプロモーターが前記遺伝子の前になければならない。用いられる種々のこのようなプロモーターがあり、異なる効率で働く（強いおよび弱いプロモーター）。それらは原核細胞と真核細胞とで異なる。
【００３３】
本発明において用いられうるプロモーターは、たとえばバクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなどの構成性のものでも、またはバクテリオファージラムダの主たる右および左プロモーター（ＰLおよびＰR）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｏｍｐＦおよびｇａｌまたはｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーターなどを含む原核細胞性プロモーターなど（グリック、ビー・アール(Glick, B.R.)、ジェー・インド・ミクロバイオル（J.Ind. Microbiol.）１巻、２７７〜２８２頁（１９８７年）の誘導可能なプロモーターのいずれでもよい。
【００３４】
原核細胞における高レベルの遺伝子発現を達成するために、大量のｍＲＮＡをつくるように強いプロモーターを用いることに加えて、ｍＲＮＡが効率良く翻訳されることを確実にするためにリボソーム結合部位も用いることが必要である。１つの例は、概ね開始コドンに位置し、１６Ｓ  ＲＮＡの３´−末端配列に相補的なシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）である。
【００３５】
真核細胞宿主に対しては、宿主の性質に応じて異なる転写および翻訳調節配列を用いることができる。それらはアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどのウイルスソースから由来し、調節シグナルが高レベルに発現する特定の遺伝子に関係するものであることができる。例としてはヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどがあげられる。転写開始調節シグナルは、抑制および活性化を可能としその結果遺伝子の発現を変えうるものを選択することができる。
【００３６】
本発明の可溶性ＩＦＮＡＲ、その断片もしくはムテイン体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ分子ならびに作動可能に結合された転写および翻訳調節シグナルを、宿主細胞の染色体の中へと所望の遺伝子配列を組込むことができるベクター内に挿入する。細胞の染色体の中に導入されたＤＮＡが安定に組込まれた細胞を選択することができるように、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする１または複数のマーカーが用いられる。マーカーは、栄養要求性の宿主に栄養を供給するものでも、たとえば抗生物質、銅などの重金属などのような殺細胞物質への抵抗性(biocide resistance)を提供するものであってもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させることもまたは同じ細胞にコトランスフェクションにより導入することもできる。至適な合成のため、さらなるエレメントも要しうる。これらエレメントは転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルのみならず、スプライスシグナルも含みうる。このようなエレメントを組込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、たとえばオカヤマ、エイチ(Okayama, H.)（１９８３年）により記載されたもの（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol)３巻、２８０頁）が含まれる。
【００３７】
好ましい実施態様において、導入されたＤＮＡ分子はレシピエント宿主での自律的な複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターの中に組込まれる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際に重要な因子は以下のとおり：ベクターを含むレシピエント細胞が認識され前記ベクターを含まないレシピエント細胞から選択されるのが容易であること、特定の宿主において所望されるベクターのコピー数、ならびに異なる種の宿主細胞間でベクターが「シャトル」（“shuttle”）しうることが望ましいかどうか、である。
【００３８】
好ましい原核細胞ベクターには、たとえばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４などの大腸菌において複製可能なプラスミド（マニアチスら、前掲参照）、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などのバシラス(Baccillus)プラスミド（グリクザン、ティー(Gryczan, T.)、「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・バシリ」（“The Molecular Biology of the Bacilli”）、アカデミック・プレス(Academic Press)、ニューヨーク、３０７〜３２９頁（１９８２年）参照）、ｐＩＪ１０１を含むストレプトマイセス(Streptomyces)プラスミド（ケンダール、ケー・ジェー(Kendall, K.J.)ら、ジャーナル・オブ・バクテリオジー(J.Bacteriol.)１６９巻、４１７７〜４１８３頁（１９８７年））、φＣ３１などのストレプトマイセス・バクテリオファージ（チャター、ケーエフ(Chater, KF)ら、「シックス・インターナショナル・シンポジウム・オン・アクチノマイセタールス・バイオロジー」（“Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology”）、アカデミアイ・カイドー(Akademiai Kaido) 、ブダペスト、ハンガリー、４５〜５４頁（１９８６年）参照）、ならびにシュードモナス・プラスミド（ジョン、ジェー・エフ(John, J.F.)ら、レェブ、インフェクト、ディス(Rev. Infect. Dis.)８巻、６９３〜７０４頁およびイザキ、ケー(Izaki, K.)ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Jpn. J. Bacteriol.)３３巻、７２９〜７４２頁（１９７８年））が含まれる。
【００３９】
好ましい真核細胞プラスミドには、ＢＰＶ、ワクシニア(vaccinia)、ＳＶ４０、２−ミクロンサークルなど、またはそれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは当該技術分野においてよく知られている（ボットシュタイン、ディー(Botstein, D.)ら、マイアミ・ウイント・シンプ(Miami Wint. Symp.）１９巻、２６５〜２７４頁（１９８２年）、ブローチ、ジェーアール(Broach, JR.)「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・サッカロマイセス：ライフ・サイクル・アンド・インヘリタンス(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance）」中、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、４４５〜４７０頁（１９８１年）；ブローチ、ジェー・アール、セル２８巻、２０３〜２０４頁（１９８２年）；ボロン、ディー・ピー(Bollon, D.P.)ら、ジェー・クリニク・ヘマトル・オンコル(J. Clin. Hematol. Oncol.)１０巻、３９〜４８頁（１９８０年）；マニアチス、ティー、「セル・バイオロジー・ア・コンプリヘンシブ・トリティセ(Cell Biology:“A Comprehensive Treatise”）」中３巻、ジーン・エクスプレッション(Gene Expression)、アカデミック・プレス、ニューヨーク州、５６３〜６０８頁（１９８０年））。
【００４０】
ベクターすなわちＤＮＡ配列を含む構築物がいったん発現用に調製されれば、発現ベクターをたとえば形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどの種々の好適な手段のいかなるものによっても適切な宿主細胞の中に導入することができる。
【００４１】
本発明において用いられる宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。好ましい原核細胞宿主には、大腸菌、バシラス、ストレプトマイセス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア(Serratia)などが含まれる。もっとも好ましい原核細胞宿主は大腸菌である。とくに重大な細菌性宿主には、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ-、ラムダ-、原栄養性(prototropic)、（ＡＴＣＣ  ２７３２５））、およびサルモネラ  ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)またはセラチア  ナルセシェンズ(Serratia narcescens)などの他の腸内細菌ならびに種々のシュードモナス種が含まれる。このような条件のもとでは発現されるタンパク質はグリコシル化されないであろう。原核細胞宿主はレプリコンおよび発現プラスミド内の調節配列に適合可能でなければならない。
【００４２】
好ましい真核細胞宿主は、たとえばヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター子宮（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。なぜならそれら細胞は正しい部位でのグリコシル化のみならず正しい折り畳み、正しいジスルフィド結合形成を含むタンパク質分子への翻訳後の修飾を提供するからである。酵母細胞および昆虫細胞もまた高いマンノースグリコシル化を含む翻訳後のペプチド修飾を行なうことができる。酵母および昆虫細胞において所望のタンパク質を産生させるために利用されうる強いプロモーター配列ならびにプラスミドの多数のコピー数を利用する、多くの組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母細胞はクローン化された哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列をもつペプチドを分泌することができる。
【００４３】
ベクターを導入したのち、宿主細胞はベクターを含む細胞の成長について選択を行なう選択培地中で選択される。クローン化された遺伝子配列の発現の結果、可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質、ムテイン体または断片が産生される。発現されたタンパク質はついで単離し、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む通例の手法のいずれかによって、またはカラム内に入れたゲルマトリックス上に固定化された抗−可溶性ＩＦＮＡＲモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。可溶性ＩＦＮＡＲを含む粗調製物をカラムにとおし、ここで可溶性ＩＦＮＡＲが特異的な抗体によりカラムに結合され、一方不純物はカラムを通過する。洗浄ののちたとえばｐＨ１１またはｐＨ２などの高ｐＨまたは低ｐＨにてゲルからタンパク質を溶出させる。
【００４４】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に説明するが本発明はもとよりこれら実施例に限定されるものではない。とくに示さない限り、実施例に記載された方法は標準のよく確立された方法であって遺伝子工学において広く用いられるものであることは注意されるべきである。したがって、それら方法が充分に詳説された種々の報告(publications)が本明細書において参照され、それによって本明細書に組込まれる。さらに製造業者に関する詳細が提供されているばあい、関連する方法は製造業者のプロトコルにしたがうものであると理解されるべきである。
【実施例１】
【００４５】
複数のＩＦＮα−受容体遺伝子転写物
ヒトミエローマ細胞Ｕ２６６Sは成長阻害および（２´−５´）Ａシンセターゼの誘導についてＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βに対する感受性がある。Ｕ２６６S細胞を、前記ＩＦＮにより成長が阻害されないＵ２６６R変異体と比較した。グアニジンチオシアネート法（チャーウィン・ジェー・ジェー(Chirgwin J. J.)ら、バイオケミストリー(Biochemistry)、１８巻、５２９４〜５３００頁（１９７９年））により総ＲＮＡを調製した。ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡのヌクレオチド１７２９〜１７４９に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとして用い（このプライマーは図１ａの膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡのコーディングフレームの端部に近接しているものである）逆転写酵素によりＵ２６６SおよびＵ２６６R細胞のＲＮＡからｃＤＮＡを製造した。図１に、欠失によりつくり出された新しいジャンクションの位置とともに終止コドンの位置を示した。ついでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、確立された方法（エーリッヒ・エイチ・エー(Ehrich H. A.)、編者、ピー・シー・アール・テクノロジー(PCR Technology)、ストックトン・プレス(Stockton Press)、ニューヨーク、（１９８９年））にしたがい、前記ｃＤＮＡ産物のＤＮＡ断片を増幅した。膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの以下のヌクレオチド（番号づけについては図２ａを参照）に対応する、センス／アンチセンスプライマーの３種のペアを用いた：
・ＰＣＲ反応Ａ：１３４２〜１３６１／１４９８〜１５１５
・ＰＣＲ反応Ｂ：１３３１〜１３４２／１７３３〜１７５２
・ＰＣＲ反応Ｃ：１５２２〜１５４２／１７２９〜１７４９。
【００４６】
図２に、ＰＣＲ反応に用いたプライマーの位置、ならびに欠失および新しいジャンクションの位置を示した。
【００４７】
反応Ｂにおいて用いたセンスおよびアンチセンスプライマーは、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩサイトを含むテイルを有した。これらの制限酵素で消化したのち、えられる産物は予想されるより１０ｂｐ長いものであった。アガロースゲルでの電気泳動に続きエチジウムブロマイド染色によって分析したＰＣＲ産物を図３に示す。図３の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
【００４８】
レーン１および２：図２に記載のプライマー２の近傍のプライマーとプライマー３を用いた前記反応Ａの産物
レーン３および４：図２に記載のプライマー２と５を用いた前記反応Ｂの産物
（この産物に矢印を付した）
レーン５および６：図２に記載のプライマー４とプライマー５の近傍のプライマーを用いた前記反応Ｃの産物
反応Ａにおいて、Ｕ２６６S細胞からのＲＮＡを用いたばあい、予想された１７３ｂｐの産物が観察され（レーン１）、一方Ｕ２６６R細胞からのＲＮＡを用いたばあい産物は観察されなかった（レーン２）。この結果によりＵ２６６R細胞のＩＦＮ受容体の転写産物はヌクレオチド１３４２と１５１５とのあいだの領域に何らかの欠失があり、その欠失のためプライマーのうちの１つがＰＣＲ反応の開始を妨げることが示唆された。
【００４９】
反応ＢにおいてＵ２６６S細胞からのＲＮＡで、予想された４２０ｂｐのサイズの産物（図２のプライマー２および５で限定されるように）が観察された。加えて、サイズが２６０ｂｐであると見積もられる新しいＤＮＡのバンドが見出された（レーン３）。Ｕ２６６R細胞のＲＮＡでは、小さい方の産物は観察されたが大きい方のバンドはなかった（レーン４）。この結果によりＵ２６６S細胞およびＵ２６６R細胞の両方においておよそ１６０ｂｐ欠失した転写産物の存在が明らかになった。
【００５０】
反応ＣにおいてＵ２６６S細胞およびＵ２６６R細胞のＲＮＡの両方に同じ産物が観察され、図２のプライマー４およびプライマー５の近傍のあいだの領域では修飾がなされていないことが示唆された。
【００５１】
反応ＡおよびＢにおいて用いられたプライマーの位置を調べることにより、観察された欠失がＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの膜貫通領域に影響することが示唆された（図２参照）。
【実施例２】
【００５２】
スプライス欠失されたＩＦＮα−受容体１型
ＩＦＮＡＲの新規な型のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定するために、実施例１における反応Ｂと同様のＰＣＲ反応をＵ２６６S細胞からのＲＮＡを用いて行なった。用いたプライマー（図２のプライマー２および５）は、プライマー１３３１〜１３４２に対しＥｃｏＲＩ制限サイト（図４）およびプライマー１７３３〜１７５２に対しＢａｍＨＩサイトを含むテイルを有した。ＰＣＲ反応ののち、産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩとインキュベートし、アガロースゲル電気泳動により分離した。２６０ｂｐの小さい産物をゲルから切り出し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断しておいたブルースクリプト(Bluescript)ベクターＫＳ+（ストラタジーン・クローニング・システム(Stratagene Cloning System）社、（ラジョラ(Lajolla) 、カリフォルニア、製）に連結した(ligated)。連結されたプラスミドを、コンピテント大腸菌(E.Coli)細胞中へトランスフェクトし、トランスフェクトされたコロニーを単離しプラスミドＤＮＡを調製した。２６０ｂｐのＤＮＡが存在することをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断することによって証明した。切断しなかったプラスミドＤＮＡをブルースクリプトベクター（ストラタジーン・クローニング・システム社製、前出）のＴ３プライマーからダイデオキシヌクレオチド法により配列決定した。アンチセンスプライマー１６０１〜１６１９から相補的なストランドを配列決定した。図４にその小さいＰＣＲ産物に対してえられた配列を膜貫通ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの配列と比較して示す。図４において、番号が付された各ブロックの１列目に部分的な膜貫通型ＩＦＮα−受容体のｃＤＮＡを示し、そのプライマー部分に下線を、膜貫通ドメインの配列の上に線を付した。スプライス欠失された１型のｃＤＮＡに特有な７のＣ−末端残基を形成するクレーム番号が付された各ブロックの２列目においてフレームシフトが示される。エキソンの境界はすでに報告されている（ルトホーラ・ジー(Lutfalla, G.)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)２６７巻、２８０２〜２８０９頁（１９９２年））ように示している。図４中、膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ番号づけにしたがって配列を比較した。ヌクレオチド１３６２から１５１８まで（１５７ｂｐ）の欠失が観察され、膜貫通領域が完全に除去されていた（図２参照）。
【００５３】
Ｕ２６６R細胞のＲＮＡを用いてえられたＰＣＲ産物（図３、レーン４参照）を同様にブルースクリプトベクターにおいてクローニングし、ついで配列決定した。えられたプラスミドよりＵ２６６S細胞の小さいＰＣＲ産物のばあいと同じ配列がもたらされた。
【００５４】
えられた新規の配列から、膜貫通領域を含むエキソンＸ全体がスプライスされて除かれ、エキソンＩＸの最後の４つのコドンもまた失われていることが示唆された。この択一的スプライシングにより、細胞外ドメインのコドン４２７（Ｇｌｕ）の後でフレームシフトが起こりかつ、７のアミノ酸（Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ）をもつ（図５参照）、すでに知られていたＩＦＮＡＲタンパク質においては見出されなかった切除されたタンパク質が予測された。この新規な型のＩＦＮα−受容体をスプライス欠失された１型と表し、これは新しいＳドメインに端部が欠失したＥＣドメインが続くことで特徴づけられる。
【００５５】
Ｕ２６６S細胞のＲＮＡを用いてえられた大きいＰＣＲ産物（図３、レーン３の４２０ｂｐ）は、図４に示すように膜貫通ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの膜貫通領域および通常のエキソンＸ／エキソンＸＩ境界を含むことが証明された。
【実施例３】
【００５６】
スプライス欠失されたＩＦＮα−受容体２型
二重の欠失をともなうＩＦＮＡＲのもう１つの型が発見された。このスプライス欠失された２型は、ＩＦＮＡＲｃＤＮＡのヌクレオチド１２７０〜１２９０に対応する、さらに上流のプライマーを用いて行なわれたＰＣＲ反応において検出された（図６におけるプライマー１）。ＥｃｏＲＩサイトを含む５′テイルをもつこのセンスプライマーは、ＢａｍＨＩサイトをもつ１７３３〜１７５２のアンチセンスプライマーとともに用いた（図６におけるプライマー５）。Ｕ２６６R細胞のＲＮＡを用いてえられたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、およそ３００ｂｐで観察されるＤＮＡバンドをゲルから切り出した。実施例２におけると同様にブルースクリプトベクターにてクローニングしたのち、プラスミドＤＮＡを配列決定した。えられた配列（図７）により再度、膜貫通領域の欠失が示唆された。図７は、既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ（番号が付された各ブロックの１列目）と、択一的にスプライスされた、本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡ（番号が付された各ブロックの２列目）のヌクレオチド配列の一部を、膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡの番号づけにしたがって比較した図である。３列目に短くなったＩＣ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ酸配列を示す。空所は欠失された配列を示す。番号づけは膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡにしたがう。プライマーの位置には下線を付し、膜貫通型ドメインの配列の上に線を付す。図４におけると同様にエキソンの境界を示す。膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと比較して認められうるように、このスプライス欠失された２型はエキソンＩＸにおける１３１８から１３４１まで（２４ｂｐ）のヌクレオチドならびに１３６０から１５１８まで（１５９ｂｐ、すなわちエキソンＩＸの端部およびエキソンＸのすべて）のヌクレオチドにおいて２つのイン・フェーズの欠失を有していた。
【００５７】
図６に、既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ（ａ）と比べて短くなったＩＣ´ドメインを有する可溶性ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡ（ｂ）を示す。ＰＣＲ反応に用いられたプライマーの位置ならびに欠失および新しいジャンクションを示す。この新規なＩＦＮＡＲｃＤＮＡによりコードされるタンパク質において、膜貫通型の残基４１３（Ｇｌｕ）の次の８コドンが細胞外ドメインから失われており、６アミノ酸（依然としてエキソンＩＸ内の４２２〜４２７残基）で続き、さらにＴｙｒ−４８１からの細胞質内ドメインに５３アミノ酸（膜貫通領域を含む）の欠失が続いている。予測されたＩＣドメインは、膜貫通型における１００アミノ酸に代わって７７アミノ酸長である。
【００５８】
このスプライス欠失されたＩＦＮα−受容体２型のアミノ酸配列を図１０（本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ２カ所欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ酸配列を示す。２つの欠失の間で保持されている、システインを含む６アミノ酸長の細胞外領域に下線を付す。）に切除された１型（図９、スプライス欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ１型のアミノ酸配列を示し、新規のＳ−ドメインには下線を付す）、および膜貫通型（図８、既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのアミノ酸配列を示し、その膜貫通ドメインには下線を付す）と比較して示す。２型において２つの欠失の間に見出だされる６アミノ酸（図１０における下線部）が１つのシステインを含むことは注目に値する。膜貫通型およびスプライス欠失された１型の細胞外ドメインに見出される８システイン残基がそのシステインによって２型においても保存(conserve)される。
【００５９】
本発明の新規の型のＩＦＮα−受容体はそれぞれ４３４ならびに４９６アミノ酸からなるが、一方膜貫通型（図８）は５５７アミノ酸からなる。２つの新規の型は図１のｂおよびｃに示されている。
【実施例４】
【００６０】
膜非結合型ＩＦＮα−受容体タンパク質
ＩＦＮＡＲｃＤＮＡの新規の型によりコードされるタンパク質をＵ２６６R細胞において調べた。このＵ２６６R細胞はＩＦＮＡＲの膜貫通型に対するＲＮＡ転写産物を含まず択一的にスプライス欠失された型に対するＲＮＡ転写産物のみを含む。この目的のために組換え膜貫通型ＩＦＮＡＲタンパク質に対する種々のモノクローナル抗体（ＭｃＡＢ）を用いてイムノブロットを行なった。示した結果は２つの抗体すなわちＭｃＡＢ＃１すなわち６４Ｇ１２（ベノイトら、１９９３年、前出）、ならびにＭｃＡＢ＃２すなわち２１．４（ノビックら、１９９２年、前出）を用いてえられた。前記Ｕ２６６細胞からの総タンパク質は１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳ界面活性剤（３−｛（３−コラミド−プロピル）−ジメチル−アンモニオ｝−１−プロパン−スルフォネート）を含む緩衝液で抽出し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、ニトロセルロ−ス上にブロットし、さらに前記ＭｃＡＢと反応させ、引続きラベルされたヤギ抗マウス−イムノグロブリン抗体と反応させた。タンパク質の細胞内局在を決定するため細胞を低張性ショックにより溶解し細胞のサイトゾル画分（可溶性細胞質画分）を、報告されたように（チェバス、ジェー(Chebath J.)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６２巻、３８５２〜３８５７頁（１９８７年））調製された膜画分と比較した。比較の目的で、Ｕ２６６S細胞もまた溶解し、サイトゾルならびに膜画分を前記の方法で単離した。
【００６１】
図１１ａにＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃２と反応させたＵ２６６R細胞およびＵ２６６S細胞からの総ＣＨＡＰＳ抽出タンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を示す。左側の上部の矢印は１１０Ｋｄの膜貫通型ＩＦＮＡＲを示し、左側の下部の矢印は５５Ｋｄのタンパク質を示す。右側の矢印は９５Ｋｄのタンパク質を示す。
【００６２】
図１１ｂにはＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃２と反応させたＵ２６６R細胞およびＵ２６６S細胞からの総ＣＨＡＰＳ抽出タンパク質（ＴＯＴ）、可溶性細胞質画分（ＣＹＴ）タンパク質、細胞膜（ＭＥＭ）タンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を示す。左側の上部の矢印は１１０Ｋｄの膜貫通型ＩＦＮＡＲを示す。右側の矢印は９５Ｋｄの細胞質画分タンパク質を示す。Ｕ２６６RおよびＵ２６６S細胞タンパク質抽出物の比較によりＵ２６６SにおいてＭｃＡＢ＃１により認識される約１１０ＫｄのＩＦＮα−受容体タンパク質はＵ２６６R細胞ではまったく存在しないことが示された（図１１ａ，レーン１、２）。このタンパク質は、膜貫通型ＩＦＮＡＲｍＲＮＡの産物と予測されるように膜結合型（図１１ｂ、レーン３）であった。加えて、ＭｃＡＢ＃１は約５５Ｋｄのタンパク質を認識した。このタンパク質はＵ２６６R細胞に存在し（図１１ａ，レーン１、２）、したがってＵ２６６R細胞に見出される膜貫通領域を欠いたスプライス欠失されたｍＲＮＡの産物であると思われた。事実、５５Ｋｄタンパク質は膜に存在しないが、Ｕ２６６S細胞およびＵ２６６R細胞の両方のサイトゾルにのみ検出された（図１１ｂ、レーン２〜５）。
【００６３】
同様のイムノブロットで、ＭｃＡＢ＃２はおよそ９５Ｋｄタンパク質のところに移動しＵ２６６S細胞およびＵ２６６R細胞の両方に存在する、他の型のＩＦＮα−受容体を認識した（図１１ａ、レーン３、４）。この９５Ｋｄタンパク質はサイトゾル内に明瞭に多く存在し、膜には存在しなかった（図１１ｂ、レーン６〜１０）。この約９５Ｋｄのタンパク質をまずＭｃＡＢ＃２により免疫沈降して濃縮したばあいにイムノブロット上でＭｃＡＢ＃１によっても認識されることが証明された。このことによりこのサイトゾルのタンパク質はＭｃＡＢ＃１に対する方がＭｃＡＢ＃２に対するより低い親和性を有する型のＩＦＮα−受容体であることが示された。９５Ｋｄのタンパク質がスプライス欠失されたＩＦＮＡＲのｍＲＮＡの産物であることは、それがＵ２６６SおよびＵ２６６R細胞の両方に存在することならびに膜結合タンパク質でないという事実により支持された。
【００６４】
ＩＦＮＡＲタンパク質の異なる型が前記のＩＦＮＡＲに対するＭｃＡＢにより認識されうるという事実は、一方で異なる型が密接に関連している、すなわち配列の同一性を有していることを示し、さらに他方で受容体タンパク質に異型(heterogeneity)が存在することを示唆する。９５Ｋｄのサイトゾル型は実施例３に記載されたスプライス欠失された２型のｃＤＮＡの産物でありうる。このタンパク質は細胞質内でＵ２６６R細胞のＩＦＮに対する残余の応答(residual response)において機能しうる。細胞のＩＦＮに対する初期の応答は、ＩＦＮで活性化される多くの遺伝子のＩＦＮ反応性(responsive)エンハンサーに結合する転写因子ＩＳＧＦ３およびＩＲＦ−１の活性化である。（レビー、ディー・イー(Levy, D. E.)ら、ジーンズ・デブ(Genes Dev.)３巻、１３６２〜１３７１頁（１９８９年）；ハラダ、エイチ(Harada, H.)、セル、５８巻、７２９〜７３９頁（１９８７年））。ＩＦＮがＵ２６６S細胞におけると同様にＵ２６６R細胞においてもＩＲＦ−１を活性化することが観察された（アブラモビッチ・シー(Abramvich C.)、ピーエイチ・ディー・シーシス(Ph. D. Thesis）、ワイズマン・インスティテュート・オブ・サイエンス(Weizmann Institute of Science)（１９９３年））。ＩＦＮに対するこの応答は、Ｕ２６６R細胞中のスプライス欠失されたＩＦＮＡＲｃＤＮＡの産物により媒介されうる。対照的にＩＳＧＦ３はＵ２６６S細胞においてのみ誘導され、膜結合型ＩＦＮＡＲタンパク質を必要とすることが示唆される。
【００６５】
５５Ｋｄのタンパク質は実施例２に記載の切除されてスプライス欠失された１型の産物であるかもしれない。このより短い切除された型は細胞から分泌されるかもしれず、ＩＦＮ結合の競合的阻害剤として働きうる。
【実施例５】
【００６６】
可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、その融合タンパク質、断片およびムテイン体の組換えによる製造
（ａ）可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、１型および２型の組換えによる製造
前記実施例１〜４で述べたように、膜貫通領域を欠いたＩＦＮＡＲタンパク質の新規の型、１型および２型をコードする特異にスプライスされたｍＲＮＡの２つの型が存在する。組換えＤＮＡ技術の標準法を用いて（たとえばマニアチスら、前出；サンブルーク(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク（１９８９年））、それらｍＲＮＡからｃＤＮＡ分子をつくり、引続き単離した。これらｃＤＮＡは可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質の１型および２型をコードする。
【００６７】
可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質の１型および２型をコードする単離されたｃＤＮＡを、前記した標準法によりｐＳＶＥ３またはｐＳＶＬ構築物を提供するためにそれぞれ初期ＳＶ４０プロモーターまたは後期ＳＶ４０プロモーターをもつ発現ベクター内へと導入した。
【００６８】
２つの可溶性ＩＦＮＡＲの型の発現を、ｐＳＶＬ構築物でＣＯＳ−７細胞（サル腎細胞）にトランスフェクトすることにより実証した。これら発現実験の結果から、１型および２型タンパク質の異なる構造が大いにタンパク質産物の挙動に影響することが明らかになった。ＩＦＮＡＲタンパク質の４２７アミノ酸に７アミノ酸末端テールがつき、膜貫通および細胞内ドメインを欠く１型は、ＣＯＳ−７細胞培養の培地中に効率的に分泌されていることが見出された。これに対して膜貫通ドメインの欠失を有するが細胞内ドメインのほとんどすべてを保持している２型は、細胞内にとどまっていることが見出された。これら発現実験の結果を図１２ａおよびｂに示す。
【００６９】
図１２ａにＣＯＳ−７細胞の培養培地からえられたサンプルで行なった、免疫染色されたウェスタンブロットの結果を示す。この分析において可溶性ＩＦＮＡＲ１型タンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターにより形質転換されたＣＯＳ−７細胞を、標準培養培地中で成育させ、細胞により分泌された種々のタンパク質を含む培養培地のサンプルをとった。ついでこれらのサンプルを標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そののちこのようにして分離されたタンパク質を標準ウェスタンブロット法によってニトロセルロースフィルター上にブロットした。つぎにそのウェスタンブロットをモノクローナル抗体、ＭｃＡＢ＃１（ＭｃＡＢ６４Ｇ１２、実施例４参照）を用いて染色した。各ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対して、したがって各ウェスタンブロットについて以下のサンプルを分析した。
【００７０】
（ｉ）１型ＩＦＮＡＲの遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培養培地１２μｌから調製されたタンパク質（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬＳαＲ１型」）
（ｉｉ）陰性コントロールとなる、ｐＳＶＬベクターのみ（すなわち１型の配列を含まない）で形質転換されたＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培養培地１２μｌから調製されたタンパク質、（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬ」）
（ｉｉｉ）１型ＩＦＮＡＲの遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培養培地８μｌから調製されたタンパク質（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬＳαＲ１型」）
（ｉｖ）陰性コントロールとなる、ｐＳＶＬベクターのみ（すなわち１型の配列を含まない）で形質転換されたＣＯＳ−７細胞から分泌された、ゲルに付す前に２００倍に濃縮した培養培地８μｌから調製されたタンパク質（図１２ａにおけるサンプル「ｐＳＶＬ」）
（ｖ）ブロットのＭｃＡＢ＃１を用いた免疫染色について陽性コントロールとなり、またＩＦＮＡＲに対する分子量スタンダードとなる、細胞表面結合性ＩＦＮ受容体およびその可溶性型を産生しているダウディ（ＤＡＵＤＩ）細胞（ヒト  バーキット(Burkitt) リンパ腫細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２１３）から抽出したタンパク質（図１２ａにおけるサンプル「ＤＡＵＤＩ」）、ならびに
（ｖｉ）放射ラベルした分子量マーカータンパク質（図１２ａにおける最も右側のサンプル）。
【００７１】
このように図１２ａのウェスタンブロットの結果から、可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質１型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換したＣＯＳ−７細胞がこのタンパク質を首尾よく発現し分泌しうることが明らかであり、分泌されたタンパク質は予測されたように約７３Ｋｄの分子量を有していた。
【００７２】
図１２ｂにＩＦＮＡＲ１型および２型のタンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からえられたサンプルについて行なったウェスタンブロットの結果を示す。この分析において形質転換されたＣＯＳ−７細胞からえたサンプルは以下のとおりであった：
培養培地サンプル、すなわち細胞により分泌されたタンパク質を含むサンプル；
細胞膜サンプル、すなわち細胞により産生され膜内に取込まれたタンパク質；
サイトゾルサンプル、すなわち細胞により産生され細胞の細胞内画分（サイトゾル）に存在するタンパク質；ならびに
核サンプル、すなわち細胞により産生され核または核膜に結合しているタンパク質。これらサンプルのすべての調製は前記実施例４に記載されている。また核サンプルは、トライトンＸ−１００を用いた核サンプルの洗浄の工程をも含む標準法により細胞抽出サンプル（膜およびサイトゾルを分離し単離したサンプル）からえたことは注目されるべきである。つぎに前記サンプルすべてをＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準法により分離しさらに標準のウェスタンブロットを行なった。ウェスタンブロットはついで前記したようにＭｃＡＢ＃１を用いて免疫染色し、図１２ｂに示されるブロットをえた。図１２ｂにおけるサンプルは以下のとおりである：
レーン１：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクターのみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培養培地、陰性コントロール；
レーン２：ＩＦＮＡＲ１型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培養培地；
レーン３：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの培養培地；
レーン４：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクターのみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの膜、陰性コントロール；
レーン５：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの膜；
レーン６：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクターのみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からのサイトゾル、陰性コントロール；
レーン７：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からのサイトゾル；
レーン８：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクターのみを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの核、陰性コントロール；ならびに
レーン９：ＩＦＮＡＲ２型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いて形質転換されたＣＯＳ−７細胞からの核。
【００７３】
したがって図１２ｂより可溶性ＩＦＮＡＲ１型（約７３Ｋｄ）が首尾よく発現され、形質転換されたＣＯＳ−７細胞培養培地内へと分泌されていることが明らかであり、一方可溶性ＩＦＮＡＲ２型タンパク質はＣＯＳ−７細胞で首尾よく発現されているものの、培地中には分泌されておらず（おそらくゴルジ膜に存在）さらに細胞核により多く結合していることが明らかである。可溶性ＩＦＮＡＲ２型は可溶性ＩＦＮＡＲ１型より大きく、およそ８０および１００Ｋｄの２つの成分(components)として示される。１型および２型のｃＤＮＡ産物がこのように異なる局在性を示すことにより、細胞で産生されたこれらの可溶性受容体が別個の機能を有するという知見が支持される。たとえば実施例４に明示されるように、膜貫通型ＩＦＮＡＲタンパク質を欠くＵ２６６R細胞はＩＳＧＦ３の活性化能は喪失しているがＩＲＦ−１の活性化によりなお応答することができる。このように可溶性１型および２型タンパク質により演じられる役割は、シグナルトランスダクションを含めてさらに解明されよう。
【００７４】
１型タンパク質の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターにより形質転換（すなわち前記ベクターを用いてトランスフェクト）されたＣＯＳ−７細胞のさらなる実験においてこれら細胞で産生される１型タンパク質はＩＦＮに結合できることが示された。すなわち組換えにより産生されたタンパク質はそのＩＦＮ結合活性を保持していた。この実験においては、放射ラベルされたＩＦＮ−α−２（ジンザイム(Genzyme)社製）を可溶性ＩＦＮＡＲ１型に対するｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞からの濃縮培地と反応させた。交差結合(cross-linking) ののち、ＩＦＮ−αに対する抗体およびＩＦＮＡＲに対する抗体（ＭｃＡＢ＃２＝ＭｃＡＢ２１．４、実施例４参照）を用いて免疫沈降を行なった。この分析ではヒトＵ２６６R細胞（膜貫通型ＩＦＮＡＲを欠く、ＩＦＮＡＲ１型のｍＲＮＡを含む細胞、実施例４参照）から分泌されたタンパク質もまたコントロールサンプルとして調べた。この分析の結果を図１３に示す。図１３は前記したように免疫沈降され交差結合されたサンプルを分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。図１３に示すサンプルは以下のとおりである：
レーン１：可溶性ＩＦＮＡＲ１型の遺伝情報を担うｐＳＶＬベクターを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞からの培養培地、抗ＩＦＮ−α−２  モノクロナール抗体を用いて免疫沈降しついで［125Ｉ］−ＩＦＮα−２で交差結合させたもの；
レーン２：レーン１と同じサンプルで、ラベルされていない（コールドの）ＩＦＮ−α−２（×５０）存在下で交差結合させたもの；
レーン３：レーン１と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を用いて免疫沈降を行ないコールドのＩＦＮ−α−２（×５０）存在下で交差結合させたもの；
レーン４：レーン１と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を用いて免疫沈降を行なったもの；
レーン５：ＩＦＮＡＲ配列を含まないｐＳＶＬベクターのみを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞からの培養培地、抗ＩＦＮ−α−２  モノクロナール抗体を用いて免疫沈降をおこなったもの、陰性コントロール；
レーン６：レーン５と同じサンプルで、ＭｃＡＢ＃２を用いて免疫沈降を行なったもの、陰性コントロール；
レーン７：Ｕ２６６R細胞からの培養培地、ＭｃＡＢ＃２を用いて免疫沈降を行ないラベルした［125Ｉ］−ＩＦＮ−α−２を用いてコールドのＩＦＮα−２（×５０）存在下にて交差結合させたもの；ならびに
レーン８：レーン７と同じサンプルで、ラベルされたＩＦＮ−α−２のみで交差結合させたもの（レーン「Ｍ」はゲルに流した分子量スタンダードを示す）。
【００７５】
図１３に示されるように、組換えにより産生された可溶性ＩＦＮＡＲ１型へのＩＦＮの結合が首尾よく起こっていることが明らかであり（レーン１および４）、組換え可溶性ＩＦＮＡＲ１型のＩＦＮ−結合活性が立証される。さらに、Ｕ２６６R細胞はこれら細胞に存在する対応するｍＲＮＡによりコードされるＩＦＮＡＲ１型を分泌することができることが明らかであり（レーン８）、少なくともこれらの細胞においては膜結合型受容体の切断から可溶性受容体が生じるのではなくむしろ、特異的にスプライスされたｍＲＮＡ（実施例４）から生じることが確認された。さらにＭｃＡＢ＃２は可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質を免疫沈降させることができるが、細胞表面膜から界面活性剤によって抽出された膜結合型受容体については沈降させえない（実施例４参照）。
【００７６】
可溶性ＩＦＮＡＲ１型がＩＦＮに結合する能力について、ＣＯＳ−７細胞が分泌した産物をダウディ細胞に添加しついでそれに対するヨウ素化したＩＦＮ−αの結合を測定することにより、ＣＨＯ細胞における可溶性ＩＦＮＡＲの発現のための可溶性ＩＦＮＡＲの遺伝情報を担う発現ベクターの調製も同様に、定量的な実験を含めて予備的に実験を行なっている（結果は本明細書には示さない）。
【００７７】
（ｂ）可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質、その融合産物、断片およびムテイン体の組換え製造法
前記（ａ）の部分において、可溶性ＩＦＮＡＲ１型および２型の遺伝情報を担うＳＶ−４０由来の発現ベクター（たとえば、ｐＳＶＬ）の特定の調製法が記載されている。前記ベクターはＣＯＳ−７宿主細胞に導入された（トランスフェクションされた）ときに組換えＩＦＮＡＲ１型および２型の発現が成功した。標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のように他のベクター（およびそれでトランスフェクトされた宿主細胞）は組換え可溶性ＩＦＮＡＲ融合タンパク質、その断片およびムテイン体の製造のために生産されうる。
【００７８】
本発明の単離されたｃＤＮＡを、終止コドンおよびポリアデニレーション部位が可溶性ＩＦＮＡＲの最後の必須コドンの後に挿入されるように、適切なオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的変異誘発に供した。ついで、この構築物を当該技術分野においてよく知られている技術によってふさわしく構築された発現ベクターに挿入した（マニアチスら、前出）。合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端化連結技術を用いることを含むホモポリマーテイリングまたは制限結合によって、２本鎖ｃＤＮＡをプラスミドベクターに連結させた。ＤＮＡ分子を連結させるためにＤＮＡリガーゼを用い、アルカリホスファターゼを用いてＤＮＡ鎖を処置することにより望ましくない接合を回避した。
【００７９】
可溶性ＩＦＮＡＲおよび、たとえばＩｇＧ1重鎖の定常部とからなる融合タンパク質の製造は、以下のように行なった。コード配列の直後に特有な制限部位を導入するように、適切なオリゴヌクレオチドを用いて可溶性ＩＦＮＡＲのＤＮＡを部位特異的変異誘発に供した。ＩｇＧ1重鎖の定常部の遺伝情報を担うプラスミド、たとえばｐＲＫＣＯ４2Ｆｃ1（バイルン・アール・エーら、ネイチャー、３４４巻、６６７〜６７０頁（１９９０年））を同様の部位特異的変異誘発に供し、融合タンパク質がイン・フェーズに翻訳されうるようにＩｇＧ1重鎖のＡｓｐ２１６にできる限り近接して前記と同じ特有な制限部位を導入した。前記の特有な制限部位で消化することにより、５´非翻訳配列および可溶性ＩＦＮＡＲをコードする配列からなる２本鎖ＤＮＡ断片を調製した。変異させたｐＲＫＣＤ４2Ｆｃ1を同様に消化し、プラスミドおよびＩｇＧ1配列を含む大きな断片をつくった。ついで２つの断片を連結させ、Ｎ−末端可溶性ＩＦＮＡＲおよびＩｇＧ1重鎖の約２２７のＣ−末端アミノ酸（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）からなるポリペプチド前駆体をコードする新しいプラスミドをつくった。融合タンパク質をコードするＤＮＡを適切な制限酵素を用いた消化によりプラスミドから単離し、ついで、遺伝子発現およびタンパク質の産生を可能とするような方法で所望のタンパク質をコードするＤＮＡに結合させた転写および翻訳調節情報を含む特異的なヌクレオチド配列を含む効率のよい発現ベクターに挿入した。
【００８０】
遺伝子が転写されるために、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる、そしてそのポリメラーゼが結合しかくして転写プロセスが開始されるプロモーターを前記遺伝子の前に挿入した。
【００８１】
細胞の染色体の中に導入されたＤＮＡが安定に組込まれた細胞を選択することができるように、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする１または複数のマーカーを用いた。マーカーは、栄養要求性の宿主に栄養を供給するものでも、たとえば抗生物質、銅などの重金属などのような殺細胞物質への抵抗性を提供するものであってもよい。
【００８２】
前記ベクターはレシピエント宿主での自律的な複製が可能である。
【００８３】
前記発現ベクターを形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどの好適な手段によって適切な宿主細胞の中に導入した。
【００８４】
前記ベクターを導入したのち、宿主細胞はベクターを含む細胞の成長について選択を行なう選択培地中で選択した。クローン化された遺伝子配列の発現の結果、可溶性ＩＦＮＡＲ、その融合タンパク質、ムテイン体または断片が産生された。発現されたタンパク質はついで単離し、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む通例の手法のいずれかによって、またはカラム内に入れたゲルマトリックス上に固定化された抗−可溶性ＩＦＮＡＲモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。すなわち、可溶性ＩＦＮＡＲを含む粗調製物をカラムにとおし、ここで可溶性ＩＦＮＡＲが特異的な抗体によりカラムに結合され、一方不純物はカラムを通過した。洗浄ののち約ｐＨ１１または約ｐＨ２にてゲルからタンパク質を溶出することにより前記タンパク質を製造した。
【００８５】
［配列の表示］
配列番号：１
配列の長さ：４３４
配列の型：アミノ酸
起源：ホモサピエンス
配列
Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala 
5                   10                  15 
Val Gly Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu 
20                  25                  30 
Lys Ser Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe 
35                  40                  45 
Ile Leu Arg Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr 
50                  55                  60 
Phe Ser Phe Asp Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys 
65                  70                  75 
Leu Ser Gly Cys Gln Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser 
80                  85                  90 
Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg 
95                 100                 105 
Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe 
110                 115                 120 
Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile Gly Pro Pro Glu Val His Leu 
125                 130                 135 
Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile His Ile Ser Pro Gly Thr 
140                 145                 150 
Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr 
155                 160                 165 
Ser Leu Leu Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val Glu Glu Arg Ile 
170                 175                 180 
Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu Ser Pro Glu 
185                 190                 195 
Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp 
200                 205                 210 
Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr Val 
215                 220                 225 
Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln 
230                 235                 240 
Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met 
245                 250                 255 
Thr Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro 
260                 265                 270 
Gly Asn His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn 
275                 280                 285 
Val Lys Thr Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys 
290                 295                 300 
Gly Ile Tyr Leu Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr 
305                 310                 315 
Ser Phe Trp Ser Glu Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala 
320                 325                 330 
Phe Leu Leu Pro Pro Val Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser 
335                 340                 345 
Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro 
350                 355                 360 
Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu 
365                 370                 375 
Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Lys Lys Thr Asp 
380                 385                 390 
Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr Val Tyr Cys Val Lys 
395                 400                 405 
Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Lys Leu Asn Lys Ser Ser Val 
410                 415                 420 
Phe Ser Asp Ala Val Cys Glu Asn Ile Ser Leu Asn Ser His 
425                 430 
【００８６】
配列番号：２
配列の長さ：４９６
配列の型：アミノ酸
起源：ホモサピエンス
配列
Met Met Val Val Leu Leu Gly Ala Thr Thr Leu Val Leu Val Ala 
5                   10                  15 
Val Gly Pro Trp Val Leu Ser Ala Ala Ala Gly Gly Lys Asn Leu 
20                  25                  30 
Lys Ser Pro Gln Lys Val Glu Val Asp Ile Ile Asp Asp Asn Phe 
35                  40                  45 
Ile Leu Arg Trp Asn Arg Ser Asp Glu Ser Val Gly Asn Val Thr 
50                  55                  60 
Phe Ser Phe Asp Tyr Gln Lys Thr Gly Met Asp Asn Trp Ile Lys 
65                  70                  75 
Leu Ser Gly Cys Gln Asn Ile Thr Ser Thr Lys Cys Asn Phe Ser 
80                  85                  90 
Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile Lys Leu Arg Ile Arg 
95                 100                 105 
Ala Glu Lys Glu Asn Thr Ser Ser Trp Tyr Glu Val Asp Ser Phe 
110                 115                 120 
Thr Pro Phe Arg Lys Ala Gln Ile Gly Pro Pro Glu Val His Leu 
125                 130                 135 
Glu Ala Glu Asp Lys Ala Ile Val Ile His Ile Ser Pro Gly Thr 
140                 145                 150 
Lys Asp Ser Val Met Trp Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr 
155                 160                 165 
Ser Leu Leu Ile Trp Lys Asn Ser Ser Gly Val Glu Glu Arg Ile 
170                 175                 180 
Glu Asn Ile Tyr Ser Arg His Lys Ile Tyr Lys Leu Ser Pro Glu 
185                 190                 195 
Thr Thr Tyr Cys Leu Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp 
200                 205                 210 
Lys Ile Gly Val Tyr Ser Pro Val His Cys Ile Lys Thr Thr Val 
215                 220                 225 
Glu Asn Glu Leu Pro Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Ser Val Gln 
230                 235                 240 
Asn Gln Asn Tyr Val Leu Lys Trp Asp Tyr Thr Tyr Ala Asn Met 
245                 250                 255 
Thr Phe Gln Val Gln Trp Leu His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro 
260                 265                 270 
Gly Asn His Leu Tyr Lys Trp Lys Gln Ile Pro Asp Cys Glu Asn 
275                 280                 285 
Val Lys Thr Thr Gln Cys Val Phe Pro Gln Asn Val Phe Gln Lys 
290                 295                 300 
Gly Ile Tyr Leu Leu Arg Val Gln Ala Ser Asp Gly Asn Asn Thr 
305                 310                 315 
Ser Phe Trp Ser Glu Glu Ile Lys Phe Asp Thr Glu Ile Gln Ala 
320                 325                 330 
Phe Leu Leu Pro Pro Val Phe Asn Ile Arg Ser Leu Ser Asp Ser 
335                 340                 345 
Phe His Ile Tyr Ile Gly Ala Pro Lys Gln Ser Gly Asn Thr Pro 
350                 355                 360 
Val Ile Gln Asp Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Ile Ile Phe Trp Glu 
365                 370                 375 
Asn Thr Ser Asn Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Lys Lys Thr Asp 
380                 385                 390 
Val Thr Val Pro Asn Leu Lys Pro Leu Thr Val Tyr Cys Val Lys 
395                 400                 405 
Ala Arg Ala His Thr Met Asp Glu Ser Asp Ala Val Cys Glu Tyr 
410                 415                 420 
Phe Ser Glu Gln Pro Leu Lys Asn Leu Leu Leu Ser Thr Ser Glu 
425                 430                 435 
Glu Gln Ile Glu Lys Cys Phe Ile Ile Glu Asn Ile Ser Thr Ile 
440                 445                 450 
Ala Thr Val Glu Glu Thr Asn Gln Thr Asp Glu Asp His Lys Lys 
455                 460                 465 
Tyr Ser Ser Gln Thr Ser Gln Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Asn Glu 
470                 475                 480 
Asp Glu Ser Glu Ser Lys Thr Ser Glu Glu Leu Gln Gln Asp Phe 
485                 490                 495 
Val
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ａ）既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲ、ｂ）本発明の新規な可溶性（Ｓ）−ドメインをもつ切除された型のＩＦＮＡＲおよびｃ）本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ２カ所欠失された型のＩＦＮＡＲのための、実施例１に記載のｃＤＮＡの概略説明図である。
【図２】実施例１および２に記載のａ）既知の膜貫通ＩＦＮＡＲ１型のｃＤＮＡと、ｂ）本発明の新規なＳ−ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ１型のｃＤＮＡを比較した概略説明図である。
【図３】実施例１および２に記載のＵ２６６R細胞およびＵ２６６S細胞からのＰＣＲ産物のサイズを分析した、エチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図４】既知の膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと、本発明の新規なＳ−ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を比較した図である。
【図５】本発明の新規なＩＦＮＡＲ１型のｃＤＮＡに対するアミノ酸配列を部分的に示す図である。
【図６】実施例３に記載のａ）既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと、ｂ）本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡを比較した概略説明図である。
【図７】既知の膜貫通ＩＦＮＡＲのｃＤＮＡと、択一的にスプライスされた、本発明の短くなったＩＣ´ドメインをもつ可溶性ＩＦＮＡＲ２型のｃＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を比較した図である。
【図８】既知の膜貫通型ＩＦＮＡＲのアミノ酸配列を示す図である。
【図９】実施例３に記載のスプライス欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ１型のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】実施例３に記載の短くなったＩＣ´ドメインをもつ２カ所欠失された可溶性ＩＦＮＡＲ２型のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】ａ）実施例４に記載の、ＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃２と反応させたＵ２６６R細胞およびＵ２６６S細胞からの総抽出タンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を示す図である。ｂ）実施例４に記載の、ＭｃＡＢ＃１およびＭｃＡＢ＃２と反応させたＵ２６６R細胞およびＵ２６６S細胞からの総抽出タンパク質、可溶性細胞質画分タンパク質、細胞膜タンパク質のウェスタンイムノブロットの結果を示す図である。
【図１２】ａ）実施例５（ａ）に記載の、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から分泌された組換えにより製造された可溶性ＩＦＮＡＲタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す図である。ｂ）実施例５（ａ）に記載の、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞から分泌された、ならびに細胞膜、細胞内画分（サイトゾル）および細胞核に結合した、組換えにより製造された可溶性のＩＦＮＡＲタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１３】実施例５（ａ）に記載の組換えにより製造された可溶性ＩＦＮＡＲ１型と放射ラベルされたＩＦＮとの交差結合し、免疫沈降された産物を分離したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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