(57)【要約】 【課題】        抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を作製するにあたり、融合細胞の播種において１ウエル当たりの細胞数を低減させ、細胞のコロニー形成の最適化を図るために、各ウエルに対し、微細化した微量の細胞含有培地を均一に分注する方法および装置を提供する。【解決手段】    細胞融合装置において作製された融合細胞を細胞融合に使用した培地と同一または異なる培地と共にマルチウエルプレートに播種し、細胞コロニーを形成させるための融合細胞含有培地の分注方法であって、該融合細胞含有培地を培地供給部に装入し、該供給部内の発熱体または圧電素子に電圧をかけることにより、培地に対しパルス状圧力を加え、前記培地を直径１０μｍ〜１００μｍの細孔ノズルから各ウエルに微細な液滴として吐出させることを特徴とする融合細胞含有培地の分注方法、および分注装置。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞融合装置において作製された融合細胞を該細胞融合に使用した培地と同一または異なる二種以上の培地と共にマルチウエルプレートに播種し、細胞コロニーを形成させるための融合細胞含有培地の分注方法であって、
該融合細胞含有培地を培地供給部に装入し、該培地供給部内の発熱体または圧電素子に電圧をかけることにより、前記培地に対し高速のパルス状圧力を加え、前記培地を直径５０μｍ〜１００μｍの細孔ノズルから前記マルチウエルプレートの各ウエルに微細な液滴として吐出させることを特徴とする融合細胞含有培地の分注方法。
【請求項２】
融合細胞含有培地を微細化してマルチウエルプレートの各ウエルに供給する分注装置であって、
該融合細胞含有培地を循環させる培地供給部と、
該培地供給部底面に設けられた、直径５０〜１００μｍの細孔ノズルと、
該細孔ノズルの上方位置に備えられた微細化駆動手段と
からなることを特徴とする細胞を含有する培地の分注装置。
【請求項３】
前記微細化駆動手段が、圧電素子駆動方式、サーマル駆動方式またはバブルジェット（登録商標）方式を含む培地の吐出手段である請求項２に記載の培地の分注装置。
【請求項４】
前記微細化駆動手段が、培地供給部（２）と、該培地供給部（２）内の培地に圧力をかける圧電素子または発熱体（３）と、該圧力により培地を吐出する細孔ノズル（５）である請求項２に記載培地の分注装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞融合装置において作製された融合細胞をマルチウエルプレート上に播種し、細胞コロニーを形成させるための融合細胞を含有する培地の分注方法および分注装置に関するものであり、さらに詳しくは、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマからモノクローナル抗体産生細胞を選択するためのハイブリドーマ含有培地の分注方法および分注装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、モノクローナル抗体の作製方法として、抗体を産生する脾臓細胞とミエローマ細胞を融合し、得られた融合細胞から抗原に対する結合力の高い抗体を生産する細胞を数回にわたって選択する方法が採用されている。例えば、最も一般的なＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）法では、標的物質をプラスチック等の固相に吸着または共有結合せしめ、これと結合または非結合の特性を有する抗体が、融合細胞の培養上清中に存在するか否かを順次検定する。また、この検定結果によっては、その判定の確認検定及び融合細胞の抗体生産能力とその能力の安定性の分析を引き続き行なう。また、これらの検定は、個々のクローンに由来する融合細胞が、良好な培養状態でコロニーを形成し、培養液中に抗体を分泌している時期に行なう。
【０００３】
しかしながら、前記の如きモノクローナル抗体の作製方法は、すべて人手によるものであり、１ヶ月〜３ヶ月の長時間を要するものである。さらに、かかる作製方法によれば、長時間を要するばかりでなく、さらに次の如き難点が指摘されている。すなわち、
(1)長時間の間に雑菌の混入がしばしば起こる。
(2)人的な感覚に依存した融合細胞の選択のため効率が極めて悪い。
(3)融合細胞の産出する抗体の選択方法の精度が極めて低い。
等の問題が挙げられている。
【０００４】
また、融合細胞の播種においては、従来、１回の細胞融合で９６ウエルプレート８枚〜１２枚を使用しているが、この条件ではコロニー形成ウエルが８０％以上となり、平均約１．５細胞／ウエルとなる結果、モノクローンの確率が極めて低下することに由来して、有用細胞と非有用細胞の混在時に有用細胞の存在を確認できずに見のがしてしまうという問題がある。従って、かかる難点を解消するには０．６細胞／ウエル以下に制御することが好ましく、１回の細胞融合に少なくとも従来の３倍のウエルに播種する必要がある。
【０００５】
かかる状況下において、ウエル数の多いプレートを利用すると共に、培地の微細かつ、均一な分注が要求され、人的な作業では困難であることから、全自動化方法およびその装置の実現が切望されている。
【特許文献１】特開平１１−９２６１号公報
【特許文献２】特開平８−１７３４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の課題は、融合細胞の播種において、１ウエル当たりの細胞数を低減させ、細胞のコロニー形成の最適化を図ることにあり、各ウエルに対し、微量の細胞含有培地を微細化し、かつ均一に分注する方法および該方法を達成することができる分注装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは、前記開発の状況に鑑み、前記課題を解決するため種々検討を重ねたところ、電圧をかけると長さが変化する圧電素子を用いて密閉容器内に生ずる体積の変化を利用するかまたはヒーターに電圧をかけ発生するバブルの圧力を利用することにより微量の融合細胞含有培地を自動的に分注する方法および装置として有用であることに着目し、これらの知見に基いて本発明の完成に到達した。
【０００８】
かくして、本発明によれば、
細胞融合装置において作製された融合細胞を該細胞融合に使用した培地と同一または異なる一種以上の培地と共にマルチウエルプレートに播種し、細胞コロニーを形成させるための融合細胞含有培地の分注方法であって、
該融合細胞含有培地を培地供給部に装入し、該培地供給部内を循環させると共に該培地供給部内の発熱体または圧電素子に電圧をかけることにより、前記培地に対しパルス状圧力を加え、前記培地を直径１０μｍ〜１００μｍの細孔ノズルから前記マルチウエルプレートの各ウエルに微細な液滴として吐出させることを特徴とする融合細胞含有培地の分注方法
が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、
融合細胞含有培地を微細化してマルチウエルプレートの各ウエルに供給する分注装置であって、
該融合細胞含有培地を循環させる培地供給部と、
該培地供給部底面に設けられた、直径１０〜１００μｍの細孔ノズルと、
該細孔ノズルの上方位置に備えられた微細化駆動手段と
からなることを特徴とする細胞を含有する培地の分注装置
が提供される。
【００１０】
本発明は、融合細胞含有培地の新規な分注方法およびこれに用いられる新規な分注装置に関するものであるが、さらに好適な実施の態様として次の１）〜４）に掲げるものを包含する。
１）前記融合細胞含有培地の水に対する比粘度が、１．１〜１．４である前記融合細胞含    有培地の分注方法。
２）前記培地供給部および細孔部の内面の材質が、分注装置使用前および／または使用後    に、洗浄を目的として、水および／または界面活性剤溶液および／または水酸化ナト    リウム溶液を融合細胞含有培地の代わりに繰り返し用いることができる材質である前    記融合細胞含有培地の分注装置。
３）前記培地供給部および細孔部の材質が、分注装置使用前および／または使用後に、殺    菌を目的として、エタノールまたはイソプロパノールまたは次亜塩素酸ナトリウム水    溶液または電解水またはオゾン溶解水またはエチレンオキサイドガスを融合細胞含有    培地の代わりにくり返し使用可能な材料で形成されたものである前記融合細胞含有培    地の分注装置。
４）前記培地供給部および細孔部への材質が、分注装置使用前および／または使用後に、    殺菌を目的として紫外線を繰り返し照射することに耐久性を有する材料で形成された    ものである前記融合細胞含有培地の分注装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、１回の細胞融合で同じ延べ人数で扱い得る細胞を含む培地を分注したウエルの数が少なくとも２倍になる。この結果、それぞれのウエルで増殖した融合細胞は、単一細胞に由来する集団である確率が向上し、抗体を通常利用するに好ましいとされるＩｇＧクラスのものを比較的好ましくないとされるＩｇＭクラスのものと当初から明確に分別できる。目的の物質に結合しない、あるいは目的以外の物質にも結合し得る抗体を分泌する不用な融合細胞の検出が、１回目の分析で容易に可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係る分注装置の微細化手段としては、例えば、印刷分野におけるインクジェットプリンティング方式の三種の機能を有するものの一部を利用することができる。インクジェットプリンティング方式は、すでに公知のものであり、例えば、米国特許第４２５１８２４、同第４５３２５３０、同第４６０１７７７号等で開示されている。
【００１３】
かかるインクジェットプリンティング方式は、プリンタヘッドに設けられたノズルからインクの小滴を飛び出させ、記録対象に付着させてドットを形成させるもので比較的簡単な構成により画像を形成するものとされている。かかるインクジェット方式は、インクを飛び出させる方式の相違によりバブルジェット（登録商標）駆動方式、圧電素子駆動方式（ピエゾ方式）、サーマル駆動方式、連続式帯電駆動方式等に分類される。
【００１４】
本発明に係る細胞含有培地の分注方法は、密閉状態の培地供給部に供給した該細胞含有培地を微細化してマルチウエルプレートの各ウエルに分注するに際し、該培地供給部内に設けた発熱体または圧電素子に電圧をかけることにより、前記培地をパルス状圧力を加え、前記培地を直径１０μｍ〜１００μｍの細孔ノズルから吐出させる方法として、例えば、圧電素子駆動方式、バブルジェット（登録商標）駆動方式およびサーマル駆動方式の基本的な技術思想を採用することができる。
【００１５】
細孔ノズルの直径については、含有する細胞の直径の少なくとも２倍以上が好適であるが、用いる培養液の表面張力によって駆動吐出時以外は、漏出しない限度以内でなければならない。
【００１６】
圧電素子駆動方式は、その概念図を図２に示すように、模式化した培地供給部２内の細胞３および培地４を圧電素子５１１に電圧をかけることにより圧電素子の長さが変化し、培地供給部２内の体積を変化させて細胞３および培地４を吐出させる。圧電素子の振動数は分注する融合細胞の密度に依存するので、細胞の種類に応じて適宜決定することができるが、通常０．５Ｈｚ〜１００Ｈｚ、好ましくは１Ｈｚ〜１０Ｈｚの範囲に制御すればよい。また、細胞不含の吐出に当たっては、通常、１０Ｈｚ〜１ｋＨｚの範囲に制御すればよい。
【００１７】
圧電素子の材料としては、圧電をかけることにより体積が変化するものから適宜選択することができるが、例えば、チタン酸バリウムやチタン酸ジルコン酸鉛等の圧電セラミクスを用いることが好適である。
【００１８】
バルブジェット駆動方式は、図３に示すように、発熱体５２１に電圧をかけることにより、培地供給部２内にバブルを発生させ、発生したバブルが拡張し、その圧力により細胞含有培地を細孔ノズルより吐出させる方式である。駆動条件は、１回の吐出液滴中に平均０．６個程度の細胞を含有することであるが、細胞周辺の培地の温度を４０℃以下に制御することが好ましい。
【００１９】
サーマル駆動方式は、図４に示すように、発熱体５３１に電圧をかけ、細胞含有培地の局所的な加熱を行なうことにより、培地供給部内に気泡を発生させ、この気泡がはじけることにより細胞含有培地を吐出させる。加熱温度は、融合細胞の種類により任意に決定することができるが、通常、細胞近傍の培地の温度が瞬間的には４０℃〜８０℃の範囲に納まることが好ましい。
【００２０】
融合細胞含有培地または融合細胞不含有培地の微細化手段として、連続式帯電駆動方式を採用する場合は、定量送液ポンプを用いて、細孔から融合細胞含有培地または融合細胞不含有培地を連続的に吐出させた直後に、この細液流に対して、図５に示すようにヒエゾ素子によって一定の振動を与えこれによって液流は小液滴を形成する。この小液滴を荷電電極５４１によって帯電せしめ、偏向電極５４２間に形成された電界を通過する際に吐出方向が変化して、目的のウエルに到達する。
【００２１】
圧電素子駆動方式の実施態様としてピエゾポンプを利用したものを用いることができる。ピエゾポンプとしては、株式会社日本計器製作所製の定量ポンプを性能、出力等から選択して用いることができる。
【００２２】
装置内の液体培地中で細胞が滞留せずに均一に分布させるという目的を達成するために装置内の細胞を含む液体培地を一方向に循環的に送液する。この場合、公知の技術である送液ポンプから適宜選択することができるが、例えば、図６に示すようにペリスタルティックポンプやモノーポンプを用いることが好適である。また、上記目的を装置内の細胞を含む液体培地を攪拌することで達成することも可能であり、図７に示すようにピストンを利用した往復運動および図８に示すように撹拌棒の機構を採用することができる。
【００２３】
また、本発明に係る分注装置の装置内部の培地に接する部分の材質は、適宜選択して使用すればよく、揆水性を有し、殺菌、洗浄を目的としたエタノール、イソプロパノール、希水酸化ナトリウム水溶液に耐性なものから適宜選択することができるが、例えば、テフロン（登録商標）やシリコンで内面が塗布されていることが好適である。
【実施例１】
【００２４】
エデスチンを免疫したマウスに由来する脾臓細胞と３．４×１０7 個のマウスミエローマ由来 Ｐ３×６３−Ａｇ.８.Ｕ−１をポリエチレングリコールとジメチルスルホキシドを用いて融合せしめ、ＨＡＴ培地で融合細胞を選択後、融合細胞を培地で１ｍｌ当り約５０個になるように希釈し、３８４ウエルプレート５枚に融合細胞を含む培地を圧電素子駆動方式（株式会社日本計器製作所製ピエゾポンプ）を用いて矩形波２ヘルツの条件で約１０μｌずつウエル中に分注した。次に、コロニーを形成した融合細胞の上清中にエデスチンに結合し、牛血清アルブミンに結合しない抗体を検出し、それらの大部分が既にモノクローナル抗体であることを検出した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によれば、細胞融合により得られたハイブリドーマ細胞から抗体を選抜するためのハイブリドーマ細胞を含有する培地のマイクロプレートへの分注方法および分注装置を提供するものであり、従来、すべて人手により手間と時間をかけて行なわれていた抗体を産生する脾臓細胞とミエローマ細胞との融合およびこの融合細胞からの感度の高い抗体産生細胞の選抜の自動化に寄与するものである。本発明により、融合細胞の作製作業が自動化され、有用な融合細胞の出現率を従来の方法と同一時間で比べた場合、約１００倍以上の効率を上げることができるなどバイオテクノロジー分野への寄与が極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に係る融合細胞含有培地の分注装置の模式図である。
【図２】図１の微細化手段５として圧電素子を利用した融合細胞培地の吐出を示す説明図である。
【図３】図１の微細化手段５としてバブルジェット（登録商標）方式を利用した融合細胞培地の吐出を示す説明図である。
【図４】図１の微細化手段５としてサーマル駆動方式を利用した融合細胞培地の吐出を示す説明図である。
【図５】図１の微細化手段５として連続式帯電方式を利用した融合細胞培地の吐出を示す説明図である。
【図６】液体培地の循環方式の実施態様を示す説明図である。
【図７】液体培地の循環方式の他の実施態様を示す説明図である。
【図８】液体培地の循環方式のさらに他の実施態様を示す説明図である。
【符号の説明】
【００２７】
１        分注装置
２        培地供給部
３        融合細胞
４        培地
５        微細化駆動手段
６        細孔ノズル
７        マルチウエルプレート
５１      圧電素子方式
５１１    圧電素子
５２      バブルジェット（登録商標）方式
５２１    ヒーター
５２２    気泡
５３      サーマル駆動方式
５３１    ヒーター
５４      帯電方式
５４１    荷電電極
５５      空気加圧ポンプ
５６      ピエゾポンプ
５７      エアフィルター
５８      ペリスタルティックポンプ
５９      ピストン
６０      撹拌棒
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005052125.tif 000007
【図６】
2005052125.tif 000008
【図７】
2005052125.tif 000009
【図８】
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