(57)【要約】【課題】  生産効率に優れたデヒドロファルネソールの製造方法を提供する。【解決手段】  ファルネソール生産菌を還元状態のもとで培養し、培養物からデヒドロファルネソールを回収する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファルネソール生産菌を還元状態のもとで培養し、
培養物からデヒドロファルネソールを回収する
デヒドロファルネソールの製造方法。
【請求項２】
培養物から回収するデヒドロファルネソールは、3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールであることを特徴とする請求項１記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【請求項３】
培地中に還元剤を添加することによって還元状態とすることを特徴とする請求項１記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【請求項４】
上記還元剤は、アセトアルデヒドであることを特徴とする請求項３記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【請求項５】
培地中にエタノール及び/又は酢酸を更に添加することを特徴とする請求項４記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【請求項６】
培地中に呼吸鎖関連酵素の阻害剤を添加することを特徴とする請求項１記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【請求項７】
上記阻害剤はアジ化ナトリウムであることを特徴とする請求項６記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からデヒドロファルネソールを回収するデヒドロファルネソールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチル-CoAとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレノールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な種々のテルペノイドの他、トコフェロール、カロチノイドをはじめとするビタミン類の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
【０００３】
ファルネソールは、分子内に３箇所の不飽和結合を有するプレニルアルコールである。これら不飽和結合を還元して得られるデヒドロファルネソールもまた、ファルネソールと同様に幅広い分野で応用することができる。例えば、ファルネソールをパラジウム触媒等に作用させることにより水素を不飽和結合に付加し、デヒドロファルネソールを合成することは考えられる。しかしながら、分子内に存在する３つの不飽和結合のうち、１つ又は２つの不飽和結合に対して選択的に水素を付加するには、例えば、保護基を用いることも考えられるが、複雑な化学反応を制御する必要があり非常に困難である。また、複数の複雑な化学反応を介して合成する場合には、最終生産物であるデヒドロファルネソールの収率が著しく低くなることも考えられる。
【０００４】
ところで、特許文献１には、培地に糖類、アルコール類、アルデヒド類及び有機酸類を加え、キシロースをキシリトールに還元する方法が開示されている。しかしながら、ファルネソールについて、不飽和結合に選択的に水素を付加し、高純度のデヒドロファルネソールを合成する手法は知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特願平10-258961号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、全く新規なデヒドロファルネソールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）ファルネソール生産菌を還元状態のもとで培養し、
培養物からデヒドロファルネソールを回収する
デヒドロファルネソールの製造方法。
（２）培養物から回収するデヒドロファルネソールは、3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールであることを特徴とする（１）記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
（３）培地中に還元剤を添加することによって還元状態とすることを特徴とする（１）記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
（４）上記還元剤は、アセトアルデヒドであることを特徴とする（３）記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
（５）培地中にエタノール及び/又は酢酸を更に添加することを特徴とする（４）記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
（６）培地中に呼吸鎖関連酵素の阻害剤を添加することを特徴とする（１）記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
（７）上記阻害剤はアジ化ナトリウムであることを特徴とする（６）記載のデヒドロファルネソールの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
以上、詳細に説明したように、本発明に係るデヒドロファルネソールの製造方法では、高純度なデヒドロファルネソールを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明に係るデヒドロファルネソールの製造方法は、ファルネソール生産菌を還元状態で培養し、培養物からデヒドロファルネソールを回収する方法である。ファルネソール生産菌とは、プレニルアルコールを合成できる条件下で培養したときにファルネソールを合成できる菌を意味する。例えば、ファルネソール生産菌としては、例えば、サッカロマイセス属の酵母、キャンディダ属の酵母、ロードツルラ属の酵母等を挙げることができる。より具体的に、Saccharomyces cerevisiae、Rhodotolula mucilaginasaをファルネソール生産菌として使用することができる。
【００１１】
また、ファルネソール生産菌としては、プレニルアルコールの生産能を向上させるように変異させた株、プレニルアルコール合成代謝経路に位置する中間生成物の生産能を向上させるように変異させた株或いは野生株を使用しても良い。特に、ファルネソールの生産能を公報させるように変異させた株を用いることで、優れた生産効率でデヒドロファルネソールを合成することができる。
【００１２】
ファルネソール生産菌において、ファルネソールは、図１に示すような代謝経路によって生合成される。すなわち、先ず、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチル-CoAからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸が合成される。イソペンテニル二リン酸は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸に異性化される。また、図１に示すように、1分子のジメチルアリル二リン酸と2分子のイソペンテニル二リン酸が縮合反応してゲラニル二リン酸が、さらに11分子のイソペンテニルニリン酸が反応してファルネシル二リン酸が、さらにこれに1分子のイソペンテニルニリン酸が反応してゲラニルゲラニル二リン酸が、イソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸を基質として順次合成される。プレニルアルコールであるファルネソールとネロリドールは、ファルネシル二リン酸より、またゲラニルゲラニオールはゲラニルゲラニル二リン酸から合成される。一方、ファルネシル二リン酸は、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンに変換される。スクアレンは、ステロイドの前駆体物質であり、酵母、カビ類の場合は最終的にエルゴステロールに変換される。
【００１３】
なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；GGOH）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；GGPP）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；FPP, ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；IPP）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；DMAPP）
ファルネソール（farnesol；FOH）
ネロリドール（nerolidol；NOH）
本発明に係るデヒドロファルネソールの製造方法では、先ず、上述したファルネソール生産菌を還元状態で培養する。
【００１４】
ここで、還元状態とは、ファルネソール分子中に存在する不飽和結合に水素を付加しうる条件下を意味する。還元状態を作出する手法としては、特に限定しないが、
１．還元剤を培地に添加する方法
２．ファルネソール生産菌が代謝の過程で生合成する還元剤（NADH等）量を増加させる方法
を挙げることができる。
【００１５】
１．還元剤を培地に添加する方法
培地に添加できる還元剤とは、還元力のある化合物を主成分とするものを意味する。還元剤としては、例えば、アセトアルデヒド、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオン、NADH2、NADPH2、システイン、還元糖、過酸化水素、鉄（II）イオン、フォルムアルデヒド、ブチルアルデヒド等を挙げることができる。これら還元剤は、単独で使用しても良いし、組み合わせて使用しても良い。
【００１６】
還元剤としてアセトアルデヒドを使用する場合には、培地中に1〜5重量％程度で添加することが好ましく、1〜2重量％で添加することがより好ましい。
【００１７】
また、還元剤は、ファルネソール生産菌の培養直後に培地に添加しても良いが、培養開始から24〜48時間程度経過した後に添加することが好ましい。培養開始から24〜48時間程度経過した後に、還元剤を添加することによって、ファルネソール生産菌の生育・増殖を阻害すること無く、デヒドロファルネソールを効率よく生産することができる。
【００１８】
さらに、還元剤としてアセトアルデヒドを使用する場合、培地に対して酢酸を更に添加することが好ましい。培地に酢酸を添加することによって、アセトアルデヒドから酢酸への還元反応が抑制され、還元剤であるアセトアルデヒド量の減少を抑制することができる。これによって、還元状態を維持することができ、デヒドロファルネソールの生産効率を向上させることができる。
【００１９】
２．ファルネソール生産菌が代謝の過程で生合成する還元剤（NADH等）量を増加させる方法
ファルネソール生産菌が代謝の過程で生合成する還元剤（NADH等）量を増加させるには、例えば、呼吸鎖の位置を阻害するような阻害剤を培地中に添加する。この阻害剤を培地に添加することによって、NADHが酸化してNADを生成する反応が阻害され、その結果、ファルネソール生産菌内におけるNADH量を増加させることができる。阻害剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、ロテノン、ピエリシジン、アミタール、アンチマイシン、シアン、オリゴマイシン、バリノマイシン等を挙げることができる。
【００２０】
阻害剤としてアジ化ナトリウムを使用する場合には、培地中に0.0002〜0.01重量％程度で添加することが好ましく、特に、0.001重量％で添加することがより好ましい。
【００２１】
阻害剤は、ファルネソール生産菌の培養直後に培地に添加しても良いが、培養開始から24〜48時間程度経過した後に添加することが好ましい。培養開始から24〜48時間程度経過した後に、阻害剤を添加することによって、ファルネソール生産菌の生育・増殖を阻害すること無く、デヒドロファルネソールを効率よく生産することができる。
【００２２】
また、ファルネソール生産菌が代謝の過程で生合成する還元剤（NADH等）量を増加させるには、例えば、培地中にグルコース、エタノールを加えても良い。グルコース及び/又はエタノールを培地に添加することによって、添加したグルコース及び/又はエタノールからアセトアルデヒドの合成が促進される結果、還元状態を作出することができる。
【００２３】
なお上記１．及び２．の方法をそれぞれ単独で使用して還元状態を作出しても良いし、組み合わせて使用して還元状態を作出しても良い。
【００２４】
また、ファルネソール生産菌を培養するための培地は、特に限定されず、ファルネソール生産菌の種類に応じて適宜選択することができる。また、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、デヒドロファルネソールの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノール  LG-109 (旭電化製)、アデカノールLG-294(旭電化製)、アデカノールLG-295S (旭電化製)、アデカノールLG-297 (旭電化製)、アデカノールB-3009A (旭電化製)、アデカプロニックL-61 (旭電化製)
【００２５】
油脂濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)であり、界面活性剤濃度は0.005〜1%(w/v)、好ましくは0.05〜0.5%(w/v)であり、テルペノイド濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)である。
【００２６】
一方、ファルネソール生産菌として、スクアレン合成活性酵素活性を低下させた菌株や、スクアレン合成酵素を破壊した菌株を用いることも好ましい。このようにスクアレン合成酵素活性を低減或いは破壊した菌株を用いることによって、ファルネソール生産菌において合成されたファルネソール（FOH）を、図１に示した代謝経路におけるスクアレン合成経路に消費することを防止できる結果、デヒドロファルネソールの生産効率を向上させることができる。
【００２７】
スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法が挙げられる。
【００２８】
スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、SQAD（特表平8-508245）、BSM-187745（Toxi. Appl. Pharm. 145, 91-98 (1987)）ER-27856(J. lipid. Res. 44, 128-135 (2002))などの合成品の他、カビの生産するzaragozic acid(Nat. Prod. Rep. 11, 279-302 (1994))などを挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを使用した場合、SQADの添加量は、細胞を培養する培地中に5〜200mg/Lとすることが好ましい。
【００２９】
また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、WO 02/053747に開示されている方法を、細胞に適用することができる。
【００３０】
さらに、スクアレン合成酵素を破壊した菌株としては、既存の菌株を使用しても良いし、スクアレン合成酵素遺伝子を公知の手法によって人為的に破壊して新規に作成した菌株を用いても良い。スクアレン合成酵素を破壊した既存の菌株としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae ATCC64031を使用することができる。
【００３１】
なお、ファルネソール生産菌としてスクアレン合成活性酵素活性を低下させた菌株やスクアレン合成酵素を破壊した菌株を用いる場合には、培地にエルゴステロールを添加する。これにより、エルゴステロールの欠乏によるファルネソール生産菌の生育・増殖阻害を防止することができる。
【００３２】
以上のように、ファルネソール生産菌を還元状態で培養した後、得られる培養物からデヒドロファルネソールを採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３３】
本方法においては、デヒドロファルネソールを高収率で生産することができる。なお、デヒドロファルネソールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、デヒドロファルネソールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりデヒドロファルネソールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、デヒドロファルネソールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からデヒドロファルネソールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
【００３４】
本発明に係るデヒドロファルネソールの製造方法によれば、ファルネソール分子内に存在する３箇所の不飽和結合（2位、6位及び10位）のうち、１の不飽和結合（2位）に対して選択に水素を付加することができる。したがって、本方法によれば、デヒドロファルネソールとして、下記式(I)で示す3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールのみを合成することができる。
【００３５】
【化１】
2005052097.tif 000002
【００３６】
例えば、精製したファルネソールをパラジウム触媒等に作用させることにより水素を不飽和結合に付加し、デヒドロファルネソールを合成するような方法では、上記式(I)のデヒドロファルネソール以外に、6位の不飽和結合や10位の不飽和結合に水素を付加して得られるデヒドロファルネソールを合成することとなり、上記式(I)のデヒドロファルネソールを高純度で得ることが不可能である。
【００３７】
本方法によれば、ファルネソールの2位の不飽和結合のみに水素を付加することができ、上記式(I)のデヒドロファルネソールを高純度で得ることができる。例えば、上記式(I)のデヒドロファルネソールを医薬品等に応用する場合には、他の構造を有するデヒドロファルネソールは不純物として排除する必要がある。しかしながら、本方法によれば、他の構造を有するデヒドロファルネソールを合成しないため、高純度な上記式(I)のデヒドロファルネソールを容易に収集することができる。
【００３８】
なお、本方法により生産されたデヒドロファルネソールは、培養物から回収した後に精製し、その後、例えば、マススペクトル、プロトンNMR、13C-NMR等によって構造を特定することができる。
【００３９】
また、本方法においては、ファルネソール生産菌におけるファルネソールの生産効率を向上させるような処理を施すことによって、デヒドロファルネソールの生産効率を向上させることができる。例えば、スクアレン合成活性酵素活性を低下させたファルネソール生成菌や、スクアレン合成酵素を破壊したファルネソール生産菌を用いることによって、デヒドロファルネソールの生産効率をより向上させることができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を用いて本発明に係るデヒドロファルネソールの製造方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４１】
〔実施例１〕
本例では、細胞として、スクアレン合成酵素遺伝子を破壊したSaccharomyces cerevisiae ATCC64031を使用した。
【００４２】
培地としては、4mg/Lエルゴステロールを含むYM培地（difico社製）を使用した。表１に示すように、種々の添加剤を添加し、30℃で４日間培養した。培養終了後、培養液2mlを採取し、これにメタノール1.2ml及びペンタン2mlを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン相を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製HP6890/5973 GC/MSシステムを用いた。
インレット温度：250℃
ディテクター温度：260℃
MSゾーン温度
MS Quad：150℃
MS Source：230℃
スキャンパラメーター
Low Mass：35
High Mass：200
Threshold：40
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：2μl
洗浄回数：メタノールで3回、ヘキサンで2回
スプリット比：1：20
カラム：ヒューレットパッカード社製HP-5MS(O.25mm×30M、フィルム厚O.25μm)
キャリアーガス：1ヘリウム1.0ml/min
ソルベントディレイ：2min
オ一ブン昇温条件：l15℃、1.5分保持→70/分で250℃まで昇温、2分保持→70/分で300℃まで昇温、7分保持
ポストタイム：O
内部標準：1-ウンデカノール/エタノール溶液(1μl/ml)を各バイアルに10μ1添加
注入口ライナー：スプリット/スプリットレス ライナー
解析：TICを取り込んだ後、69マスをセレクションし1ウンデカノール(RT=3.35min)、ネロリドール(RT=3.83min)、ファルネソール(RT=4.19min)、ゲラニルゲラニオ一ル(RT=5.72min)のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
【００４３】
【表１】
2005052097.tif 000003
【００４４】
表１に示すように、無添加のエルゴステロール含有YM培地において、Saccharomyces cerevisiae ATCC64031はファルネソールを生産している。そして、還元剤として、アセトアルデヒド、メルカプトエタノール又はジチオスレイトールを添加した場合には、デヒドロファルネソールの生産効率が大幅に向上していることが判る。
【００４５】
特に、1重量％でアセトアルデヒドを培養開始24時間後に添加したサンプルでは、培養開始48時間後に同濃度のアセトアルデヒドを添加したサンプルと比較して、デヒドロファルネソールの生産効率がより向上していることが判った。なお、培養開始24時間後及び48時間後に同濃度のアセトアルデヒドを添加した場合には、培養開始24時間後に同濃度のアセトアルデヒドを添加した場合と比較して、デヒドロファルネソールの生産効率が同程度であった。
【００４６】
また、アセトアルデヒドに加えてエタノールや酢酸を添加したサンプルでは、デヒドロファルネソールの生産効率が更に向上していることが判った。
【００４７】
一方、還元剤を添加せずに、アジ化ナトリウムやエタノールを添加することで、Saccharomyces cerevisiae ATCC64031内の代謝の過程で生合成する還元剤（NADH等）量を増加させた場合にも、デヒドロファルネソールの生産効率が大幅に向上していることが判る。さらに、培地に大豆油を添加してSaccharomyces cerevisiae ATCC64031におけるファルネソールの生産効率を向上させた場合にも、デヒドロファルネソールを生産していることが判る。
【００４８】
また、本実施例で生産したデヒドロファルネソールが3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールであることを、以下のように、マススペクトルのフラグメントパターンを用いて確認した。なお、E1.Massフラグメントパターンは物質に固有のパターンを示し、未知物質を固定することが可能である。
【００４９】
先ず、図２（Ａ）にアセトアルデヒド無添加の場合のGC/MSのクロマトグラムを示し、図２（Ｂ）に1重量％でアセトアルデヒドを添加した場合のGC/MSのクロマトグラムを示す。アセトアルデヒドを添加することによりファルネソール（RT=4.19）のすぐ前に新しいピーク（RT=4.11）が生じることがわかる。図３（Ａ）にファルネソール（RT=4.19）のマススペクトルを示し、図３（Ｂ）に新しく生じたピーク（RT=4.11）のマススペクトルを示す。
【００５０】
図３（Ａ）と（Ｂ）を比較すると、新しく生じたピーク（RT=4.11）は、プレニルアルコールに特徴的なフラグメント41,55,69,81が認められファルネソールと構造がよくにていることがわかる。
【００５１】
次に、データベースWILEY275を検索し、ファルネリールの二重結合がすべて飽和した3,7,11-トリメチル-ドデカン-1-オール、ファルネリールの二重結合が一つ増えた4,5-デヒドロファルネソール、ファルネリールの二重結合のうち一ヶ所が飽和されたデヒドロファルネソールのフラグメントパターンを入手した。図４に本実施例で新しく生じたピーク（RT=4.11）のフラグメントパターンを示す。図５に3,7,11-トリメチル-ドデカン-1-オールのフラグメントパターンを示す。図６に4,5-デヒドロファルネソールのフラグメントパターンを示す。図７に3,7,11-トリメチル-2,10-ドデカジエン-1-オールのフラグメントパターンを示す。図８に3,7,11-トリメチル-2,6-ドデカジエン-1-オールのフラグメントパターンを示す。図９に3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールのフラグメントパターンを示す。
【００５２】
図７、８及び９を比較すると、いずれも特徴的なフラグメント41、55、69及び81が認められる。図５〜９に示したフラグメントパターンと、図４に示したフラグメントパターンとを比較すると、図９に示したフラグメントパターンが図４に示したフラグメントパターンとほぼ一致することが判る。このことより、本実施例で生産されたデヒドロファルネソール（RT=4.11）が3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールであることを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】細胞におけるプレニルアルコール生合成経路を模式的に示す図である。
【図２】（A）はアセトアルデヒド無添加の場合のGC/MSのクロマトグラムを示し、（B）は1重量％でアセトアルデヒドを添加した場合のGC/MSのクロマトグラムを示す。
【図３】（A）はファルネソール（RT=4.19）のマススペクトルを示し、（B）は新しく生じたピーク（RT=4.11）のマススペクトルを示す。
【図４】図２（B）に示したクロマトグラムにおけるRT=4.11のピークのフラグメントパターンを示す図である。
【図５】3,7,11-トリメチル-ドデカン-1-オールのフラグメントパターンを示す図である。
【図６】4,5-デヒドロファルネソールのフラグメントパターンを示す図である。
【図７】3,7,11-トリメチル-2,10-ドデカジエン-1-オールのフラグメントパターンを示す図である。
【図８】3,7,11-トリメチル-2,6-ドデカジエン-1-オールのフラグメントパターンを示す図である。
【図９】3,7,11-トリメチル-6,10-ドデカジエン-1-オールのフラグメントパターンを示す図である。
【図１】
2005052097.tif 000004
【図２】
2005052097.tif 000005
【図３】
2005052097.tif 000006
【図４】
2005052097.tif 000007
【図５】
2005052097.tif 000008
【図６】
2005052097.tif 000009
【図７】
2005052097.tif 000010
【図８】
2005052097.tif 000011
【図９】
2005052097.tif 000012