(57)【要約】【課題】種々の癌細胞に対して優れた細胞障害活性を有する新規なトリテルペン誘導体及び抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】下記一般式（１）：【化１】2005053860.tif 000008[式中、R1は水素原子又は低級アルキル基を示し；R2は水素原子又はメチル基を示し；R3及びR4は各々独立して水素原子、低級アルキル基又はβ-D-グルコシル基を示す。但し、R２が水素原子のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示し；R3がβ-D-グルコシル基のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示す。] で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
2005053860.tif 000007
[式中、R1は水素原子又は低級アルキル基を示し；R2は水素原子又はメチル基を示し；R3及びR4は各々独立して水素原子、低級アルキル基又はβ-D-グルコシル基を示す。但し、R２が水素原子のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示し；R3がβ-D-グルコシル基のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示す。] 
で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項２】
R1がメチル基；R2が水素原子；R3がβ-D-グルコシル基；R4がメチル基を示すものである請求項１記載の化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項３】
R1がメチル基；R2がメチル基；R3が水素原子；R4がβ-D-グルコシル基を示すものである請求項１に記載の化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた抗腫瘍活性を有する新規なトリテルペン誘導体に関する。  
【背景技術】
【０００２】
ヒユ科Achyranthes属の多年草であるヒナタイノコズチAchyranthes faurieiの根（生薬名:牛膝）は、古くから利尿、浄血、月経不順、浮腫、リュウマチ、脚気等の薬効を示すことが知られている。その成分としては、昆虫変態ホルモンであるエクジステロン類の他、多量のオレアノール酸配糖体が見出されている。具体的に知られているオレアノール酸配糖体は以下の通りである（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
【化１】
2005053860.tif 000002
【０００４】
化合物I   : X=H,X1=H,X2=Glc(β-D-グルコシル基)
化合物Ia  : X=Me,X1=Me,X2=Glc
化合物II  : X=H,X1=Glc,X2=H
化合物IIa : X=Me,X1=Glc,X2=H 
化合物III : X=H,X1=Glc,X2=Xyl(β-D-キシロシル基)
化合物IIIa: X=Me,X1=Glc,X2=Xyl
化合物IV  : X=H,X1=Glc,X2=Glc 
化合物IVa : X=Me,X1=Glc,X2=Glc
【０００５】
【化２】
2005053860.tif 000003
【０００６】
化合物V  : Y=H,Y1=Glc,Y2=H,Y3=Me
化合物Va : Y=Me,Y1=Glc,Y2=H,Y3=Me
化合物Vb : Y=Me,Y1=H,Y2=H,Y3=Me
化合物Vc : Y=Me,Y1=H,Y2=Ac,Y3=Me
化合物VI : Y=H,Y1=Glc,Y2=H,Y3=H
化合物VIa: Y=Me,Y1=Glc,Y2=H,Y3=H
化合物VIb: Y=Me,Y1=H,Y2=H,Y3=H
化合物VIc: Y=Me,Y1=H,Y2=Ac,Y3=Ac
【０００７】
これらの中で、アキラントシドAメチルエステル(achyranthoside A methyl ester,上記式Va)は、ヒト大腸癌細胞(HCT-116)及びマウスメラノーマ細胞(B16-F10)に対して優れた細胞障害活性を示すことが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
【非特許文献１】Planta Medica,Vol.60,pp.286-287,1994.
【非特許文献２】Tetrahedron Letters,Vol.35,No.37,pp.6887-6890,1994.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、アキラントシドAメチルエステルは、特定の癌細胞に対してのみ細胞障害活性を示し、また他の公知のアキラントシド類についてはその細胞障害活性は弱いものであった。 従って、本発明は、種々の癌細胞に対して優れた細胞障害活性を有する新規なトリテルペン誘導体及び抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる実情に鑑み、抗腫瘍活性を有する化合物を種々探索した結果、イノコズチ類（Achyranthes属植物）に含まれる成分であるトリテルペン誘導体（１）に優れた抗腫瘍活性があり、抗腫瘍剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記一般式（１）：
【００１１】
【化３】
2005053860.tif 000004
【００１２】
[式中、R1は水素原子又は低級アルキル基を示し；R2は水素原子又はメチル基を示し；R3及びR4は各々独立して水素原子、低級アルキル基又はβ-D-グルコシル基を示す。但し、R２が水素原子のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示し；R3がβ-D-グルコシル基のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示す。] 
で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、一般式（１）で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬、及びこれらを含有する抗腫瘍剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のトリテルペン誘導体（１）は、強い抗腫瘍活性を有することから、大腸癌、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、子宮頸癌、胃癌等の治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の式（１）で表されるトリテルペン誘導体において、R1は、水素原子又は低級アルキル基を示す。ここで、低級アルキル基とは、炭素数1〜６のアルキル基を意味し、直鎖又は分岐鎖のいずれでもよい。低級アルキル基は、好ましくはメチル基である。R2は、水素原子又はメチル基を示し、好ましくはメチル基である。R3及びR4は、各々独立して水素原子、低級アルキル基又はβ-D-グルコシル基を示す。
但し、R２が水素原子のとき、R４は水素原子又は低級アルキル基を示し、好ましくはメチル基を示す。また、R3がβ-D-グルコシル基のとき、R4は水素原子又は低級アルキル基を示し、好ましくはメチル基を示す。
【００１６】
本発明のトリテルペン誘導体（１）の塩としては、アンモニア、低級アミン類の塩を挙げることができ、またナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属のイオンとの塩も挙げられる。本発明のトリテルペン誘導体（１）の溶媒和物又はその塩の溶媒和物としては、結晶の晶出等に用いた溶媒が付加した溶媒和物の他に、空気中の水分を吸収して形成されるものを含む。溶媒の例としては、メタノール、エタノール等の低級アルコールをはじめ、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、水等を挙げることができる。
【００１７】
本発明のトリテルペン誘導体（１）の好ましい具体例を以下に示す。
【００１８】
【化４】
2005053860.tif 000005
【００１９】
本発明のトリテルペン誘導体（１）は、日本から中国にかけて自生するヒユ科に属するイノコズチ（Achyranthes）属植物より、抽出・分離・精製することにより得ることができる（Tetrahedron Letters,Vol.35,No.37,pp.6887-6890,1994.）。また、通常用いられる合成方法又は半合成方法によっても得ることができる。
【００２０】
以下にトリテルペン誘導体を抽出法によって得る方法について説明する。抽出原料は特に限定されるものではなく、イノコズチ類の根、樹木、枝、葉、種子などの粉砕物 (生又は乾燥物) を、水あるいはメタノール、エタノールなどの低級アルコール、アセトンなどの水溶性有機溶媒、あるいは水とこれらの有機溶媒との混合溶媒を用いて室温または加熱下で抽出する方法、炭酸ガスを用いる超臨界抽出法などにより抽出することができる。特に、細切した根を原料として、含水アルコール類や含水アセトンを用いて12〜24時間抽出することが好ましい。
【００２１】
得られた抽出物を濃縮後、濃縮物をエーテル又は酢酸エチルと水で分配し、得られた水可溶部について、粉末セルロース、多孔性ポリマーゲル、化学結合シリカゲル、セファデックスLH-20などのカラムクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって目的物を分離・精製することができる。
【００２２】
具体的には、イノコズチ類の乾燥根をメタノール又は含水メタノールで温浸して得られた抽出エキスを多孔性ポリマーゲル (DAIAION HP-20) カラムに通して得た分画をメチル化体に誘導した後、このメチル化体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びODSカラムクロマトグラフィーを用いて順次分離し、特定の濃度のメタノール水溶液で溶出することによりメタノール分画を得ることができる。このメタノール分画は、本発明のトリテルペン誘導体（１）を含有しており、後記試験例1に示すように、種々の癌細胞に対して殺細胞活性を示した。
【００２３】
本発明のトリテルペン誘導体（１）を含有する医薬は、効果を低減させない範囲内で、分散補助剤、賦形剤等の通常製剤化に使用されるような担体と混合し、粉剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、リモナーデ剤等の内服、又は注射剤の剤形で使用することができる。
【００２４】
このような担体としては、例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等の水溶性の単糖類、オリゴ糖類又は多糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；結晶性セルロース、α-セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム及びそれらの誘導体の水吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導体の水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；アラビアゴム、トラガントゴム、グリコマンナン及びそれらの誘導体の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；ポリビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びそれらの誘導体の架橋ビニル重合体類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集合体を形成する脂質類等を挙げることができる。
【００２５】
本発明のトリテルペン誘導体（１）を有効成分とする医薬は、本発明のトリテルペン誘導体（１）を単独で用いることもできるが、２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２６】
本発明のトリテルペン誘導体（１）を医薬として使用する場合、投与量は、患者の年齢、性別、症状等に合わせて適宜調製すればよいが、成人1人当たり、トリテルペン誘導体（１）として、例えば0.01〜2000mg/日、好ましくは0.1〜500mg/日、特に好ましくは0.5〜200mg/日である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２８】
[製造例１]
ヒナタイノコズチ(Achyranthes fauriei)より化合物(1a)の単離
ヒナタイノコズチ乾燥根 (和牛膝, 5.0 kg) をメタノールで温浸し、メタノールエキス (1.80 kg) を得た。メタノールエキスをDIAION HP-20カラムクロマトグラフィーに付し、水およびメタノールで順次溶出した。メタノール溶出画分をCH2N2-Et2Oで徹底的にメチル化した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：CHCl3-MeOH-H2O=90:10:1〜70:30:5）及びODSカラムクロマトグラフィー（溶媒：50〜85% MeOH）で分離し、本発明の化合物(1a) (0.19 g)を得た。
【００２９】
化合物(1a): 
白色粉末  
[α]D +17.2° (c=0.70, MeOH)
HR-FAB-MS (m/z): 1035.5166 [M+Na]+(Calcd. for C51H80O20・Na1035.5141)
1H NMR (500 MHz, pyridine-d5, rt) δ : [Aglycone] 0.80, 0.81, 0.93, 0.94, 1.05, 1.21, 1.23 (3H each, s, CH3-26, 25, 29, 30, 24, 27, 23), 3.09 (1H, br. dd, J = 4.3, 13.4 Hz, H-18), 3.25 (1H, dd, J = 4.4, 11.8 Hz, H-3), 5.37 (1H, t, J = 3.5 Hz, H-12); [GluA] 5.01 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1), 4.49 (1H, t, J = 7.7, 9.9 Hz, H-2), 4.35 (1H, t, J = 9.9 Hz, H-3), 4.50 (1H, t, J = 9.9 Hz, H-4), 4.53 (1H, d, J = 9.9 Hz, H-5);  [Glc at GluA C-2] 5.63 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1), 4.18 (1H, dd, J = 7.6, 8.9 Hz, H-2), 4.28 (1H, t, J = 8.9 Hz, H-3), 4.22 (1H, dd, J = 8.9 Hz, H-4), 3.98 (1H, m, H-5), 4.39 (1H, br. d, J = 12.0 Hz, H-6a), 4.55 (1H, br. d, J = 12.0 Hz, H-6b);  [Functional Group at GluA C-3] 5.29 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2), 6.12 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-3), 4.62, 5.06 (ABq, J = 16.5 Hz, H2-4). 
13C NMR (125 MHz, pyridine-d5, rt) δ : [Aglycone] 38.5 (C-1), 26.3 (C-2), 89.5 (C-3), 39.5 (C-4), 55.7 (C-5), 18.4 (C-6), 32.9 (C-7), 39.6 (C-8), 47.8 (C-9), 36.8 (C-10), 23.6 (C-11), 122.8 (C-12), 144.1 (C-13), 41.8 (C-14), 28.0 (C-15), 23.3 (C-16), 46.9 (C-17), 41.7 (C-18), 46.0 (C-19), 30.8 (C-20), 33.9 (C-21), 32.7 (C-22), 28.0 (C-23), 16.7 (C-24), 15.4 (C-25), 17.1 (C-26), 26.1 (C-27), 178.0 (C-28), 33.1 (C-29), 23.6 (C-30), 52.1 (OCH3 at C-28); [GluA] 105.1 (C-1), 78.2 (C-2), 82.4 (C-3), 72.4 (C-4), 76.6 (C-5), 170.1 (C-6), 51.6 (OCH3); [Glc at GluA C-2] 103.6 (C-1), 76.2 (C-2), 78.2 (C-3), 72.3 (C-4), 78.2 (C-5), 63.1 (C-6); [Functional Group at GluA C-3] 172.3 (C-1), 72.6 (C-2), 104.0 (C-3), 64.3 (C-4), 171.0 (C-5), 51.8 ( OCH3at C-1), 51.3 (OCH3 at C-5).
【００３０】
[製造例２]
懐牛膝(Achyranthes bidentata)より化合物(1b)の単離
懐牛膝 (5.0 kg) を和牛膝と同様に抽出、分離し、メタノールエキス (1.25 kg) から化合物(1b) (0.40g)を得た。
【００３１】
化合物(1b): 
白色粉末
[α]D +9.3°(c=0.80, MeOH) 
HR-FAB-MS (m/z): 1013.5366 [M+H]+(Calcd. for C51H81O20 1013.5321)
1H-NMR (500 MHz, pyridine-d5, rt) δ : [Aglycone] 0.82, 0.90, 0.90, 0.92, 1.10, 1.24, 1.27 (3H each, s, CH3-25, 24, 30, 29, 26, 23, 27), 1.60 (1H, dd, J = 7.2, 10.5 Hz, H-9), 3.20 (1H, br dd, J = 4.0, 13.7 Hz, H-18), 3.31 (1H, dd, J = 4.3, 11.6 Hz, H-3), 5.43 (1H, t, J = 3.7 Hz, H-12); [GluA] at C-3 of OA, 4.90 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1), 4.00 (1H, dd, J = 7.6, 8.9 Hz, H-2), 4.32 (1H, dd, J = 8.9, 8.9 Hz, H-3), 4.42 (1H, overlapped, H-4), 4.53 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-5), 3.70 (3H, s, 6-OMe); Glc at C-28 of OA, 6.35 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1), 4.22 (1H, dd, J = 7.9, 8.5 Hz, H-2), 4.30 (1H, dd, J = 8.5, 8.5 Hz, H-3), 4.39 (1H, dd, J = 8.5, 9.2 Hz, H-4), 4.05 (1H, ddd, J = 2.6, 4.1, 9.2 Hz, H-5), 4.46 (1H, overlapped, H-6a), 4.48 (1H, overlapped, H-6b); [Functional Group at GluA C-3] 3.44 (3H, s, 2-OMe), 3.52 (3H, s, 5-OMe), 3.72 (3H, s, 1-OMe), 4.63 (1H, d, J = 3.4 Hz, H-2), 6.10 (1H, d, J = 3.4 Hz, H-3), 4.70, 5.19 (1H each, ABq, J = 16.5 Hz, 4-H2). 
13C-NMR (125 MHz, pyridine-d5, rt) δ : [Aglycone] 38.6 (C-1), 26.5 (C-2), 89.2 (C-3), 39.4 (C-4), 55.7 (C-5), 18.4 (C-6), 33.05 (C-7), 39.9 (C-8), 48.0 (C-9), 36.9 (C-10), 23.7 (C-11), 122.8 (C-12), 144.1 (C-13), 42.1 (C-14), 28.2 (C-15), 23.4 (C-16), 47.0 (C-17), 41.7 (C-18), 46.2 (C-19), 30.8 (C-20), 34.0 (C-21), 32.5 (C-22), 28.1 (C-23), 16.8 (C-24), 15.5 (C-25), 17.4 (C-26), 26.1 (C-27), 176.4 (C-28), 33.13 (C-29), 23.6 (C-30); [GluA] 106.8 (C-1), 74.8 (C-2), 84.4 (C-3), 71.6 (C-4), 76.7 (C-5), 170.3 (C-6), 51.8 (OCH3); [Functional Group at GluA C-3] 170.3 (C-1), 82.7 (C-2), 103.2 (C-3), 63.6 (C-4), 170.9 (C-5), 52.1 (OCH3at C-1), 58.8 (OCH3 at C-2), 51.3 (OCH3 at C-5). 
【００３２】
[試験例１]
(1)癌細胞の培養
細胞約2 万個をディッシュ (12穴プレート) に播種し、24時間培養した。その後、上記製造例で製造した化合物(1a)、化合物(1b)（それぞれについて10μM）を加え、培養を継続した。
【００３３】
細胞培養条件
1)HCT116細胞;10% 牛胎児血清を含むMcCoy’s培地
2)U251、U937、Hela、MCF-7、TMK-1、Panc-1、T24、HepG2、IMR90細胞; 10% 牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地
3)FRO、A549細胞;10% 牛胎児血清を含むRPMI
4)37℃、5% CO2
【００３４】
HCT116:ヒト大腸癌細胞株
T24:ヒト膀胱癌細胞株
MCF7:ヒト乳癌細胞株
Panc-1:ヒト膵臓癌細胞株
U251:ヒト脳癌細胞株 
U937:ヒト白血病細胞株
Hela:ヒト子宮頸癌細胞株 
A549:ヒト肺腺癌細胞株
TMK-1:ヒト胃癌細胞株
FRO:ヒト甲状腺癌細胞株
HepG2:ヒト肝臓癌細胞株
TE-7:ヒト食道癌細胞株
IMR90:ヒト繊維芽細胞株
【００３５】
(2) 殺細胞活性の測定
24時間及び48時間培養したところでディッシュから培地を吸引除去し、PBS 1 mLを用いて細胞を洗浄した。洗浄後、PBSを吸引除去し、1×トリプシン溶液 100 μLを加えて5分間培養した。剥離した細胞をエッペンドルフチューブ (1.5 mL) に移し取り、1,500 rpmで5分間遠心して集めた。遠心後上清を除去、沈殿した細胞を新たな培地200μLに縣濁した。縣濁液40μLを96穴プレートに移し取り、これにトリパンブルー染色液 (0.4%トリパンブルー/PBS) 40μLを加え、細胞と混和した。混和後縣濁液10μLを血球計算盤に流し込み、顕微鏡下で全細胞数と青く染まった細胞 (死細胞) 数をそれぞれカウントし、次式に従って薬剤の殺細胞活性を測定した。尚、U937細胞についてはトリプシン処理を行わなかった。
【００３６】
殺細胞活性 (%) = 青色細胞数/全細胞数 × 100
【００３７】
結果を表１に示す。評価基準の記号において、左側の欄は24時間培養後の殺細胞活性評価を、右側の欄は48時間培養後の殺細胞活性評価を示す。
【００３８】
評価基準の記号
◎:80%,100%
○:50〜80%,60〜80%
△:50%
−:30%以下
【００３９】
【表１】
2005053860.tif 000006
【００４０】
表１より明らかなように、化合物(1b)は、HepG2及びIMR90を除く全ての癌細胞において、24時間培養後には80%、48時間培養後には100%の殺細胞活性を示した。また、化合物(1a)は、化合物(1b)と比較すると低度ながら殺細胞活性を示した。