(57)【要約】【課題】  炭素数１０〜１４の直鎖アルカンに酸素を添加できる酵素をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】  アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株から得られ、４７１個のアミノ酸をコードするP450モノオキシゲナーゼ遺伝子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）、（b）、又は（c）に示すタンパク質をコードする遺伝子：
（a）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質、
（c）配列番号２記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のタンパク質であって、P450として機能するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を導入して得られる微生物であって、炭素数10〜14の直鎖アルカンを酸素添加反応により変換できる微生物。
【請求項３】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の微生物を、炭素数10〜14の直鎖アルカンを含む培地で培養し、培養物又は培養菌体からアルカン酸化物を得ることを特徴とする、アルカン酸化物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業上有用な有機低分子化合物を合成するのに必要な酵素遺伝子を提供するものであり、さらに、この遺伝子を導入した組換え微生物を利用した生変換反応によって、産業上有用な有機低分子化合物の製造法を提供するものである。より具体的には、本発明は、アルカンの変換に有用なP450をコードする遺伝子を提供し、この遺伝子を導入した組換え微生物による酸素添加反応により、変換されたアルカン酸化物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルカニボラックス（Alcanivorax）属細菌は海洋の流出油のバイオレメディエーション研究において、海水に原油を加えたときに微生物コンソーシア内で優占化する海洋細菌であり、石油分解細菌として重要な役割を果たしていると考えられている。これまでの研究から幅広い範囲の直鎖アルカンや分岐アルカンに対する分解能が高いことが明らかとなっている（Yakimov, M.M., Golyshin, P.N., Lang, S., Moore, E.R., Abraham, W.R.,Lunsdorf, H., and Timmis ,K.N., Alcanivorax borkumensis gen.nov., sp. nov., a new, hydrocarbon-degrading and surfactant-producing marinebacterium. Int. J. Syst. Bacteriol., 48, 339-348 (1998)； Yakimov, M.M.,Giuliano, L., Bruni, V., Scarfi, S., and Golyshin, P.N., Characterization ofAntarctic hydrocarbon-degrading bacteria capable of producing bioemulsifiers.Microbiologica, 22, 249-256 (1999)； Kasai, Y., Kishira, H., Sasaki, T.,Syutsubo, K., Watanabe, K., and Harayama, S., Predominant growth of Alcanivoraxstrains in oil-contaminated and nutrient-supplemented sea water. Environ.Microbiol., 4, 141-147 (2002)）。
【０００３】
アルカンに酸素添加（オキシゲネーション；oxygenation）反応を起こさせ、水酸化されたアルカンを得る酵素として、アルカンヒドロキシラーゼ（Alkanehydoroxylase；別名 Alkane monooxygenase）が 種々のアルカン分解細菌に存在することがよく知られている。アルカンヒドロキシラーゼが活性を発揮するには、NADHから電子を伝達してくるタンパク質として、ルブレドキシンレダクターゼ（rubredoxinreductase）とルブレドキシン（rubredoxin）の介在を必要とする。最もよく研究されたアルカンヒドロキシラーゼは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonasputida）GPo1株由来のもので、本酵素は、炭素数5〜12の直鎖アルカンを基質として、それらの1位に水酸基を付ける反応を触媒することが明らかにされている（Peterson,J.A., Basu, D., and Coon, M.J., Enzymatic ω-oxidation. I. Electron carriers infatty acid and hydrocarbon hydroxylation. J. Biol. Chem., 241, 5162-5164 (1966)）。アルカニボラックス属細菌からも最近、アルカンヒドロキシラーゼalkB1遺伝子が単離され、機能解析された（非特許文献1）。本alkB1遺伝子を、前述のシュードモナス・プチダのルブレドキシンレダクターゼとルブレドキシン遺伝子を有する大腸菌に導入し発現させると、組換え大腸菌は、炭素数8〜12の直鎖アルカン（n-アルカン）を炭素源として生育することができた。長鎖のn-アルカン資化菌であるアシネトバクター（Acinetobacter）属細菌からも、アルカンヒドロキシラーゼ遺伝子が単離され、炭素数16のn-アルカン（ヘキサデカン）の資化に本酵素遺伝子が必要であることが示された（Tani,A, Ishige, T., Sakai, Y., and Kato, N., Gene structures and regulation of thealkane hydoroxylase complex in Acinetobacer sp. strain M-1.  J. Bacteriol., 183, 1819-1823 (2001)）。前述の遺伝子はいずれも、グラム陰性細菌由来のものであるが、グラム陽性細菌のマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacteriumtuberculosis）やロドコッカス（Rhodococcus）属細菌においても、アルカンヒドロキシラーゼ遺伝子が単離され、n-アルカンの資化に必要であることが示されている（非特許文献1、及び、Whyte,L.G., Smits, T.H.M., Labbe, D., Witholt, B., Greer, C.W., and van Beilen, J.B.,Gene cloning and characterization of multiple alkane hydoroxylase systems in Rhodococcusstrains Q15 and NRRL B-16531, Appl. Environ. Microbiol., 68, 5933-5942 (2002)）。以上の知見は、細菌によるn-アルカンの資化に必要とされる、n-アルカンの最初の水酸化反応を行う酸素添加酵素はアルカンヒドロキシラーゼであることを示している。
【０００４】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（以下、単に、「P450モノオキシゲナーゼ」と記載する。）は、細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して1分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な脂溶性の有機低分子化合物(基質)に導入して、酸化生成物に変換する反応（一原子酸素添加反応）を触媒する鉄・イオウ酵素である。哺乳動物におけるP450モノオキシゲナーゼは非常によく研究されており、生体内に取り込まれた薬物や環境汚染毒物を酸化し水溶性を高め、体外への排出を促進する生体防御の役割を担う鍵酵素であり、また、生体内の二次代謝産物の生合成において水酸化反応等を担う鍵酵素でもある。P450モノオキシゲナーゼは、シトクロムP450本体タンパク質（CYP）以外に電子伝達タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、P450が活性を発揮するには、NAD(P)Hから電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアではフェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソームでは NADPH-P450レダクターゼの介在を必要とする。P450モノオキシゲナーゼは部分的な構造の変化により多彩な化合物の代謝に多様化された酵素で、バイオテクノロジーの分野において既存の方法では難しいと思われている化合物の酸化処理が可能になると考えられている。したがって、本酵素は、新しい有機低分子化合物（たとえば，位置/立体特異的に導入された水酸化物など）の合成や、分解処理が難しい環境負荷物質の処理への応用に期待されている。
【０００５】
細菌をはじめとする微生物のP450研究は哺乳動物に比べると遅れていたが、細菌のゲノム解析の進展と相まって、細菌のP450研究が今日、盛んになってきている。細菌で最もよく研究されているP450モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダ由来のP450camで、本酵素は、樟脳（camphor）を基質として、5位に水酸基を導入する反応を触媒することが明らかにされており、P450cam遺伝子を導入・発現した組換え細菌を用いた解析も広く実施されている（Poulos,T.L., Finzel, B.C., and Howard, A,J., High-resolution crystal structure ofcytochrome P450cam.  J. Mol. Biol.,195, 687-700 (1987)）。最近、ロドコッカス属細菌からもP450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）遺伝子が単離され、本遺伝子を発現した大腸菌が、7-エトキシクマリン（7-ethoxycoumarin）のO-脱アルキル化反応を触媒することが示された（Roberts,G.A., Grogan, G., Greter, A., Flitsch, S.L., and Turner, N.J., Identificationof a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp.  J. Bacteriol., 184, 3898-3908 (2002)）。また、アシネトバクター属EB104株からも、P450モノオキシゲナーゼ（CYP153）遺伝子が単離されたが、本遺伝子の機能解析は実施されていない（非特許文献2）。なお、現在までに単離された細菌由来のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子を用いて、n-アルカンの分解にP450が関与していることを証明した例は存在しない。ただ、アシネトバクター属細菌から精製されたP450が長鎖のn-アルカンを酸化する活性を有したという報告が1つ存在している（Asperger,O. and Kleber, H.P., Distribution and diversity of bacterial P450. “Microbialand Plant Cytochromes P450: Biochemcal characteristics, genetic engineeringand practical implications (Ruckpaul, K., ed), pp.1-53, Akademie Verlag, Berlin）。
【０００６】
【非特許文献１】Smits, T.H.M., Balada, S.B.,Witholt, B., and van Beilen, J. B., Functional analysis of alkane hydroxylases from gram-negative and gram-positive bacteria.  J. Bacteriol., 184, 1733-1742 (2002)
【非特許文献２】Maier, T., Forster, H.-H.,Asperger, O., and Hahn, U., Molecular characterization of the 56-kDa CYP153 from Acinetobacter sp. EB104. Biochem. Biophy. Res. Comm., 286, 652-658 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
炭素数10のデカン二酸（セバシン酸）、炭素数12のドデカン二酸、炭素数13のトリデカン二酸（ブラシル酸）は、ポリマー等の工業原料として、年間100億円以上の市場がある。これらは現在、石油化学工業によって合成されているが、環境にやさしい技術として、生物工学的製造法への代替が望まれている。これらの化合物を生物工学的方法により製造するためには、まず、それぞれの基質、すなわち、デカン、ドデカン、トリデカンを酸素添加反応により末端を酸化する必要がある。これらの反応を触媒する酸素添加酵素をコードする遺伝子を単離し提供することが本発明の課題であり、また、その遺伝子を導入・発現した組換え微生物の利用により、上記のアルカンを変換する方法を提供することが本発明の課題である。
【０００８】
なお、P450モノオキシゲナーゼは、その構造だけでなく 基質特異性や反応特異性に関しても非常に多様であるので、生変換反応による有用物質合成領域への応用、すなわち、産業利用可能な様々な有機低分子化合物の合成に利用されることが期待されている酵素である。今までに多数のP450モノオキシゲナーゼが単離され、機能解析が進められているが、デカン、ドデカン、トリデカンの酸素添加反応を可能にする細菌由来のP450は知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
「背景技術」で示したように、細菌によるn-アルカンの酸素添加反応には、アルカンヒドロキシラーゼが関与する例が数多く示されている。特に、発明者らが目的とする炭素数10、12、13を含む中鎖のn-アルカンの酸素添加反応に関与することを示す例が少なからず報告されている（非特許文献1）。一方、P450モノオキシゲナーゼが細菌によるn-アルカンの酸素添加反応に関与することを示す報告は1つの単行本のみである（Asperger,O. and Kleber, H.P., “Microbial and Plant Cytochromes P450: Biochemicalcharacteristics, genetic engineering and practical implications (Ruckpaul, K.,ed), pp.1-53, Akademie Verlag, Berlin）。これは、炭素数16以上の長鎖のn-アルカンの酸素添加反応にアシネトバクター属細菌のP450が関与することを酵素レベルでの実験により示したものであり、実際にそのP450をコードする遺伝子を用いた機能解析によって証明されたものではない。
【００１０】
本発明者らは、広い範囲のn-アルカンの資化能を有する海洋細菌であるアルカニボラックス属細菌から、炭素数10〜13のn-アルカンの資化に関与する遺伝子を取得するべく鋭意検討を行った。その結果、アルカニボラックス属細菌から単離された新規のP450遺伝子がこれらの炭素数のn-アルカンの資化に関与することを思いがけず突き止め、本研究を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を含む。
（1）以下の（a）、（b）、又は（c）に示すタンパク質をコードする遺伝子：
（a）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質、
（c）配列番号２記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のタンパク質であって、P450として機能するタンパク質。
（2）（1）に記載の遺伝子を導入して得られる微生物であって、炭素数10〜14の直鎖アルカンを酸素添加反応により変換できる微生物。
（3）微生物が大腸菌であることを特徴とする（2）に記載の微生物。
（4）（2）または（3）に記載の微生物を、炭素数10〜14の直鎖アルカンを含む培地で培養し、培養物又は菌体からアルカン酸化物を得ることを特徴とする、アルカン酸化物の生産方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、炭素数10〜14の直鎖アルカン（n-アルカン）の酸化反応を触媒する新規なP450が提供される。これらのアルカンの酸化物は、炭素数10のデカン二酸（セバシン酸）、炭素数12のドデカン二酸、炭素数13のトリデカン二酸（ブラシル酸）等のジカルボン酸を生物工学的に製造するための材料として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．アルカンヒドロキシラーゼ
アルカンに酸素添加（オキシゲネーション；oxygenation）反応を起こさせ、水酸化されたアルカンを得る酵素として、アルカンヒドロキシラーゼ（Alkanehydoroxylase；別名 Alkane monooxygenase）が 種々のアルカン分解細菌に存在することがよく知られている。アルカンヒドロキシラーゼが活性を発揮するには、NADHから電子を伝達してくるタンパク質として、ルブレドキシンレダクターゼ（rubredoxinreductase）とルブレドキシン（rubredoxin）の介在を必要とする。最もよく研究されたアルカンヒドロキシラーゼは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonasputida）GPo1株由来のもので、本酵素は、炭素数5〜12の直鎖アルカンを基質として、それらの1位に水酸基を付ける反応を触媒することが明らかにされている（Peterson,J.A., Basu, D., and Coon, M.J., Enzymatic ω-oxidation. I. Electron carriers infatty acid and hydrocarbon hydroxylation. J. Biol. Chem., 241, 5162-5164 (1966)）。アルカニボラックス属細菌からも最近、アルカンヒドロキシラーゼalkB1遺伝子が単離され、機能解析された（非特許文献1）。本alkB1遺伝子を、前述のシュードモナス・プチダのルブレドキシンレダクターゼとルブレドキシン遺伝子を有する大腸菌に導入し発現させると、組換え大腸菌は、炭素数8〜12の直鎖アルカン（n-アルカン）を炭素源として生育することができた。長鎖のn-アルカン資化菌であるアシネトバクター（Acinetobacter）属細菌からも、アルカンヒドロキシラーゼ遺伝子が単離され、炭素数16のn-アルカン（ヘキサデカン）の資化に本酵素遺伝子が必要であることが示された（Tani,A, Ishige, T., Sakai, Y., and Kato, N., Gene structures and regulation of thealkane hydoroxylase complex in Acinetobacer sp. strain M-1.  J. Bacteriol., 183, 1819-1823 (2001)）。前述の遺伝子はいずれも、グラム陰性細菌由来のものであるが、グラム陽性細菌のマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacteriumtuberculosis）やロドコッカス（Rhodococcus）属細菌においても、アルカンヒドロキシラーゼがn-アルカンの資化に必要であることが示されている（非特許文献1、及び、Whyte,L.G., Smits, T.H.M., Labbe, D., Witholt, B., Greer, C.W., and van Beilen, J.B.,Gene cloning and characterization of multiple alkane hydoroxylase systems in Rhodococcusstrains Q15 and NRRL B-16531, Appl. Environ. Microbiol., 68, 5933-5942 (2002)）。
以上の知見は、細菌によるn-アルカン（特に炭素数が10前後のn-アルカン）の資化に必要とされる最初の水酸化反応を行う酸素添加酵素は アルカンヒドロキシラーゼであることを示している。本発明者らも最初は、デカン、ドデカン、トリデカンの酸化反応を行う酵素は、アルカンヒドロゲナーゼであると考えた。そこですでに報告されているアルカニボラックス属細菌のアルカンヒドロキシラーゼalkB1遺伝子（前述）の配列を元に、アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivoraxborkumensis）DSM 11573株（SK2株）のゲノムより、alkB1遺伝子と そのホモログであるalkB2遺伝子を単離した。そして、これらの遺伝子の機能解析を行うため、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株におけるalkB1遺伝子破壊株、alkB2遺伝子破壊株、及び、alkB1/alkB2遺伝子両破壊株の3株を作製し、種々の長さのn-アルカンの資化能を試験した。その結果、alkB2遺伝子は、いずれの長さのn-アルカンの資化に対しても、あってもなくてもほとんど影響がないことがわかった。一方、alkB1遺伝子は、炭素数6のヘキサンの資化には必須であったが、炭素数8以上のn-アルカンの資化には必須でないことがわかった。これは、アルカニボラックス属細菌のAlkB1酵素が炭素数8〜12のn-アルカンの資化に関与するという前述の報告（非特許文献1）からは相反する結果であり、思いがけないものであった。
２．P450モノオキシゲナーゼ
P450モノオキシゲナーゼ（シトクロムP450モノオキシゲナーゼ）は、細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して1分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な脂溶性の有機低分子化合物(基質)に導入して、酸化生成物に変換する反応（一原子酸素添加反応）を触媒する鉄・イオウ酵素である。哺乳動物のP450モノオキシゲナーゼは非常によく研究されており、本酵素は、生体内に取り込まれた薬物や環境汚染毒物を酸化し水溶性を高め、体外への排出を促進する生体防御の役割を担う鍵酵素（肝臓ミクロソーム型P450）であり、また、生体内の二次代謝産物の生合成において水酸化反応等を担う鍵酵素（ミトコンドリア型P450）でもある。ゲノム配列の解析からP450は、ヒトでは約57種類、細菌では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriumtumefaciens）が5種類、放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）が18種類、ストレプトマイセス・エバーミチリス（S.avermitilis）が33種類、マイコバクテリウム・ツベルクロシスが20種類あることが知られている。なお、大腸菌はP450を有していない。
【００１４】
P450モノオキシゲナーゼは、シトクロムP450本体タンパク質（CYP）以外に電子伝達タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、P450が活性を発揮するには、NAD(P)Hから電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアではフェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソームでは NADPH-P450レダクターゼの介在を必要とする。また、CYPそのものもきわめて多様である。すなわち、CYPファミリー間のアミノ酸配列の相同性は40％以下であり、共通部分は、ヘム鉄と結合するシステイン残基部分と両末端の共通配列部分である。P450モノオキシゲナーゼがdiversozymeと言われる所以である。P450モノオキシゲナーゼは部分的な構造の変化により多彩な化合物の代謝に多様化された酵素で、先端の生物工学（バイオテクノロジー）を活用することにより、既存の方法では難しいと思われている化合物の酸化処理が可能になると期待されている。したがって、本酵素は、新しい有機低分子化合物（たとえば，位置/立体特異的に導入された水酸化物など）の合成や、分解処理が難しい環境負荷物質の処理への応用に期待されている。また、作物植物に新たなP450モノオキシゲナーゼを導入して残留農薬の分解を促すことなども期待されている。
【００１５】
細菌をはじめとする微生物のP450研究は哺乳動物に比べると遅れていたが、細菌のゲノム解析の進展と相まって、細菌のP450研究が今日、盛んになってきた。細菌で最もよく研究されているP450モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダ由来のP450camで、本酵素は、樟脳（camphor）を基質として、5位に水酸基を導入する反応を触媒することが明らかにされており、P450cam遺伝子を導入・発現した組換え細菌を用いた解析も広く実施されている（Poulos,T.L., Finzel, B.C., and Howard, A,J., High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam.  J. Mol. Biol.,195, 687-700 (1987)）。最近、ロドコッカス属細菌から、新しい構造を持つP450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）遺伝子が単離され、本遺伝子を発現した大腸菌が、7-エトキシクマリン（7-ethoxycoumarin）のO-脱アルキル化反応を触媒することが示された（Roberts,G.A., Grogan, G., Greter, A., Flitsch, S.L., and Turner, N.J., Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp.  J. Bacteriol., 184, 3898-3908 (2002)）。また、アシネトバクター属EB104株からも、P450モノオキシゲナーゼ（CYP153）遺伝子が単離されたが、本遺伝子の機能解析は実施されていない（非特許文献2）。
【００１６】
本発明者らは、アシネトバクター属EB104株のP450モノオキシゲナーゼ（CYP153）遺伝子の配列を元にプローブを作製し、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株より、P450遺伝子を単離した。そして、この遺伝子の機能解析を行うため、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株におけるP450遺伝子破壊株を作製し、種々の長さのn-アルカンの資化能を試験した。その結果、P450遺伝子破壊株は、炭素数10〜12のn-アルカンではほとんど生育できないこと、炭素数13〜14のn-アルカンでは、コントロールの非破壊株と比べて、生育が遅くなることがわかった。なお、本破壊株は、炭素数8以下及び16以上のn-アルカンに対しては、コントロールの非破壊株と比較して、差は認められなかった。以上の結果は、Ｐ450遺伝子が炭素数10〜14のn-アルカンの資化に関与していることを示している。特に、炭素数10〜12のn-アルカン（デカン、ドデカン等）の資化には重要な役割を果たしていることを示している。したがって、本発明によるP450遺伝子が、工業原料として重要な炭素数10のデカン二酸（セバシン酸）、炭素数12のドデカン二酸、炭素数13のトリデカン二酸（ブラシル酸）を、デカン、ドデカン、トリデカンから作製するのに必要な酸素添加反応を行う酵素をコードすることが明らかとなった。
【００１７】
すなわち、本発明の遺伝子は、以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子である。
（a）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつP450として機能するタンパク質、
（c） 配列番号２記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のタンパク質であって、P450として機能するタンパク質。
【００１８】
(a)のタンパク質は、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株（SK2株）の持つP450モノオキシゲナーゼであり、炭素数10〜14のn-アルカンへの酸素添加反応を触媒する能力を有している。
【００１９】
(b)のタンパク質は、(a)のタンパク質において、P450としての機能が失われない程度にアミノ酸変異が起こっているタンパク質である。このような変異には、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異も含まれる。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、P450としての機能が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは10アミノ酸以内であり、更に好ましくは5アミノ酸以内である。
【００２０】
（c）のアミノ酸配列は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のP450としての機能を有するタンパク質である。(c)のタンパク質における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号２記載の塩基配列により表されるDNAと80％以上の高い相同性を有することが望ましく、さらには90％以上の相同性を有することが好ましい。
【００２１】
また、P450としての機能とは、酸素分子を還元して１分子の水分子を作るとともに、残りの酸素原子を有機低分子化合物に導入して酸化生成物に変換する一酸素原子添加反応を触媒する機能をいう。P450は、その種類により、基質となり得る有機化合物が異なっているが、本発明の遺伝子がコードするP450は、少なくとも炭素数10〜14のいずれかのn-アルカンを基質とすることができるものである。
【００２２】
本遺伝子は、例えば、アルカニボラックス属に属する細菌のDNAを鋳型とし、配列番号２で示される塩基配列の一部からなるプライマーを用いて核酸増幅反応を行うことにより、得ることができる。プライマーとしては、配列番号７及び配列番号８の塩基配列の一部又は全部を含むオリゴヌクレオチドを用いることができる。ただし、使用可能なプライマーは、これに限定されるものではない。核酸増幅反応は、当業者に周知の方法により行うことができる。また、核酸増幅反応の条件は、プライマーの長さ及び塩基組成に応じて、当業者であれば適宜設定することが可能である。
【００２３】
また、本遺伝子は、アルカニボラックス属に属する細菌から抽出されたDNAを用いてDNAライブラリーを作製し、配列番号２で示される塩基配列の一部又は全部を含むオリゴヌクレオチドをプローブとしてコロニー/プラークハイブリダイゼーションを行うことによっても得ることができる。DNAライブラリーの作製及びコロニー/プラークハイブリダイゼーションについては、当業者に周知の方法により行うことができる。プローブとしては、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのほか、アシネトバクター属又はファンジバクター属等に属する細菌の持つP450遺伝子の一部又は全部を使用してもよい。
【００２４】
本遺伝子を得るために用いられるアルカニボラックス属に属する細菌は、アルカニボラックス属に分類される菌株であれば、特に限定されるものではない。アルカニボラックス属に属する菌株は、DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH:Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)等のカルチャーコレクションから入手することができるほか、自然界から単離することも可能である。アルカニボラックス属に属する細菌は、海洋に広く分布しているため、海水あるいは海岸堆積物等から容易に単離することができる。アルカニボラックス属細菌は、アルカン存在下において優先化するため、石油汚染を受けた海水/海岸サンプルを用いることにより、あるいはアルカン存在下で集積培養を行うことにより効率的に単離することが可能になる。なお、本遺伝子を得るために用いられるアルカニボラックス属細菌としては、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM11573株（ATCC 700651株）が最も好ましい。
【００２５】
アルカニボラックス属に属する細菌の培養は、通常の海洋細菌培養用の培地を用いて行うことができる。そのような培地としては、たとえば、DIFCO マリンブロス2216等が挙げられる。また、必要に応じて、炭素源として、ピルビン酸ナトリウム、n-アルカン、分枝状アルカン等を添加してもよい。培養は、15〜30℃で行うことが好ましく、最適温度は25℃である。
３．アルカン変換能を有する微生物
本発明の遺伝子を微生物に導入することにより、炭素数10〜14の直鎖アルカンを酸素添加反応により変換できる微生物を作製することができる。
【００２６】
使用する微生物は、大腸菌が好ましいが、他の微生物でもよい。
【００２７】
アルカンの酸素添加反応には、本発明の遺伝子と共に、フェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼ遺伝子を発現させる必要がある。フェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼ遺伝子は、種々の細菌由来のものを利用することができ、たとえば、P450cam遺伝子を有するシュードモナス・プチダ由来のフェレドキシン（プチダレドキシン）とフェレドキシン（プチダレドキシン）レダクターゼ遺伝子を用いることができる。
【００２８】
大腸菌等の微生物での発現は遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning  A Laboratory Manual, 3rdEdition, CSHL Press, 2001; Hopwood, D. A., Bibb, M. J., Chater, K. F., Bruton,C. J., Kieser, H. M., Lydiate, D. J., Smith, C. P., Ward, J. M., Schrempf,H.  Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual, The John InnesInstitute, Norwich, UK, 1985）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
４．アルカン酸化物の生産
上述の微生物を、炭素数10〜14の直鎖アルカンを含む培地で培養し、培養物又は培養菌体から酸素添加反応によりアルカン酸化物を得ることができる。
【００２９】
培養条件は、使用する宿主微生物の種類に応じて適宜決めることができる。例えば、宿主が大腸菌であれば、直鎖アルカン以外に1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウムなどを含むを使用し、培養温度20〜37℃程度とし、半日〜４日間培養することにより、アルカン酸化物を得ることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕  P450モノオキシナーゼ遺伝子断片のPCRクローニング
PCR法によりP450モノオキシナーゼ遺伝子と相同性の高いDNAフラグメントを増幅させるために、既に報告されている長鎖のn-アルカン資化細菌であるアシネトバクター（Acinetobacter）属EB104株のP450モノオキシゲナーゼの配列をもとに3本のプライマー配列、配列番号3（5'-GCCGATGGAGTTTATGGGCAAT-3'）と配列番号4(5'-GTACCACATCACCACCTTGTCGCC-3')または、配列番号５のプライマー(5'-CAACTGCATCTCGGCCA-3')を合成し、アルカニボラックス（Alcanivorax）/ファンジバクター（Fundibacter）属細菌のゲノムDNAをテンプレートにPCR法で増幅した。アルカニボラックス属細菌としては、標準株のアルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivoraxborkumensis ）DSM 11573株を用いた。また、アルカニボラックス属細菌と同じグループに分類されているファンジバクター・ヤーデンシス（Fundibacter jadensis） T9株も用いた。アルカニボラックス属細菌の培養には、1/5MAプレート(DIFCO marine broth 2216 7.48 g/l, NaCl 15.6 g/l, agar powder 15.0 g/l)またはMB培地(DIFCOmarine broth 2216 37.4 g/l)を用いた。また、必要に応じ、炭素源としてピルビン酸ナトリウムを添加した（最終濃度 1%）。
【００３１】
アルカニボラックス属細菌からのゲノムDNA抽出には、PUREGENE DNAIsolation Kitを用いた。5 mlの培養液を15 mlのファルコンチューブへ移し、10,000 rpmで5分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のCellLysis Solution 3 mlに懸濁した。その後、キットの使用説明書に従い、DNAを抽出した。得られたDNAは、DNA HydrationSolution 500μlに溶解し、1μlをアガロース電気泳動して確認後、4℃または-20℃で保存した。PCRには、Invitrogen社のPCROptimizerキットを用い、16種類のバッファーで反応を行った。94℃で1分、55℃で2分、72℃で3分の条件で40サイクルの増幅を行った。また、増幅の確認は2%のアガロース電気泳動を行った。その結果、ファンジバクター・ヤーデンシスT9株から1種類のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子が増幅された（約250bp）。また、配列番号３と配列番号５のプライマーを用いたときに、ファンジバクター・ヤーデンシスT9株から別のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子（約400 bp）が1個増幅されたが、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株からは、用いたプライマーではクローニングできなかった。得られた遺伝子については、プラスミドにサブクローニング後、シークエンスを行った。約0.25 Kbの想定される長さのDNAをアガロースゲルから切出・精製（Qiagen Extraction kig、Qiagen社製）した。この精製DNAをpT7Blue(R)ベクター（Novagen製）にTAクローニングし、大腸菌（DH5α）に形質転換した。その後プラスミドを抽出し、シークエンスした。
〔実施例２〕  アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株のコスミッドライブラリー作製
コスミッドライブラリー作製用のアルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株ゲノム抽出は以下のように行った。まず、定常期前半のアルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株の培養液を50 mlファルコンチューブに移し、10,000 rpmで5分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをSTE 30 mlに懸濁した。再度、遠心し（10,000rpm, 5分）、上清を捨て、STE 30 mlに懸濁した。68℃で15分間インキュベートし、DNaseを失活させた。遠心し（10,000 rpm, 5分）、上清を捨て、リゾチーム50mgと100μlの10 mg/l RNase Aを加えたI液に懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。最終濃度が10 mg/mlになるようにプロテイナーゼKをI液に溶かしたもの200μlを加え、ゆっくり混ぜた。37℃で10分間インキュベートした。100mgのN-ラウロイルザルコシン・Naを加え、ゆっくりと混合し、37℃で30分〜数時間インキュベートした。同量のフェノール/クロロホルムを加え、おだやかに5分間混ぜた後、遠心（10,000rpm, 15分）した。あらかじめ別の遠心管に同量のフェノール/クロロホルムを入れておき、上層を移した。この際、界面付近の白濁したタンパク質層をできるだけ取らないようにした。この操作をタンパク質層がなくなるまで、さらに数回繰り返した。回収した上層を20mlビーカーに移し、最終濃度が0.1〜0.2 Mになるように5M NaClを加えた。約2倍量のエタノールを少しずつ滴下しながら加えると同時に析出してきたDNAをガラス棒に巻き付けた。新しい50mlのファルコンチューブに70%エタノールを入れたものに、染色体DNAを巻き付けたガラス棒を入れ、かるくゆすいだ後、水分をよくきった。50 mlのファルコンチューブにTEバッファーを入れたものに染色体DNAを巻き付けたガラス棒を入れ、4℃で一晩以上放置し、染色体DNAを溶解した。染色体DNAの調製液からファージ粒子を得るところまでの実験法は、Stratagene社のSuperCos1 Cosmid Vector Kitの取り扱い説明書に従って行った。すなわち、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株から調製した染色体DNAを制限酵素Sau 3AIで部分分解し、コスミドクターSuperCos 1のBamHI サイトに連結し、LAMBDAINN (Wako, Osaka, Japan)を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、大腸菌（E. coli）XL1-BlueMR株に、そのファージを感染させ、抗生物質アンピシリン（Ampicillin）に耐性のコロニーをAmpicillinを含むLBプレート上に1,000個得た。得られたコロニーは新しいLBプレートに滅菌した楊枝を使って植えかえた。
〔実施例３〕  コロニーハイブリダイゼーション
作製したコスミッドライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションによるP450モノオキシナーゼ遺伝子のクローニングを行った。まず、大腸菌をプレートに植え、37℃で培養した。このとき、大腸菌は一枚のプレートあたり、48コロニーずつ植え付けた。一晩培養後、Hybond-N+メンブレン(82mm)をプレートにのせ、注射針で目印を付けた。メンブレンをはがし、アルカリ液をしみ込ませた3MMペーパーにのせ、5分間静置した。その後、メンブレンを中和液に3分間つけた（2回）。さらに500mlの2×SSCで2回洗浄した。このとき、細胞の破片を残さないように、（食器洗い用の）スポンジでメンブレンを強く擦った。メンブレンは、キムワイプ、キムタオル上で30分間風乾後、80℃で2時間bakingした。コロニーハイブリダイゼーションには、AlkPhosDirect Labelling and Detection System（Amersham Pharmacia Biotech製）を用い、添付のプロトコールに従って、コロニーハイブリダイゼーションを行った。コスミッドベクターには、SuperCosI（STRATAGENE製）を用いた。このベクターは、7.9 kbのベクターで30〜40 kbのDNA断片を挿入することができる。またcosサイトが二つあるので、コスミッドコンカテマーのパッケージングを防ぐための脱リン酸化が不要であり、挿入DNAを脱リン酸化することでサイズ分画の必要がない等の便利な特徴がある。実際の実験では、SK2株のゲノムDNAを使い、約2,000コロニーのコスミッドライブラリーを作製した。アルカニボラックス属細菌のゲノムサイズは、約2.9Mbと推定されているので、平均挿入長を30 kbとするとゲノムサイズの約30倍に相当するコスミッドライブラリーが完成したと考えられる。そこで、ファンジバクター・ヤーデンシスT9のP450遺伝子をプローブに用いて、このライブラリーをスクリーニングした結果、約10個のポジティブクローンが得られた。
〔実施例４〕  サザンハイブリダイゼーション
電気泳動は、サブセルGT泳動槽 (BioRad製 15´15 cmトレイ)を用い、1%アガロースゲルで100V、3.5時間行った。バッファーには、TBEバッファーを用いた。ゲルは、泳動後エチジウムブロマイドで10分間染色し、超純水で脱色後、UV照射下で写真撮影した。その後、20´SSCバッファーを用いてナイロンメンブレン（Hybond-N+）にトランスファーした。その後、AlkPhos DirectLabeling and Detection System（Amersham Pharmacia Biotech製）を用い、添付のプロトコールに従って、サザンハイブリダイゼーションを行った。また、サザンハイブリダイゼーションのプローブは、PCRで増幅することにより調製した。そこで、これらのクローンからコスミッドDNAを抽出し、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションで解析した。その結果、3クローンのDNAにP450モノオキシゲナーゼ遺伝子のプローブにハイブリダイズするバンドが検出され、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子の周辺領域を含むコスミッドのクローンが得られたことが確認された。また、サザン解析の結果、2クローンは、2種類あると考えられるP450遺伝子のうち、1種類を含むと考えられ、もう1クローンは残りの1種類を含むと考えられ、アルカニボラックス属細菌に2種類あると考えられる遺伝子を両方クローニングできた。
〔実施例５〕  P450モノオキシナーゼ遺伝子配列の解析
シークエンスするプラスミドをもつ大腸菌（DH5α）をLB液体培地1.6 mlに植え付け、プラスミドをQIAprepSpin Miniprep Kit（キアゲン製）で抽出した。シークエンス反応は、Takara PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）、Dyeterminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)を用い、96℃10秒、50℃ 5秒、60℃ 4分、25サイクルで行った。反応生成物のシークエンスは全自動シークエンサー ABI Prism 3700 DNAAnalyzer（PE アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。ファンジバクター・ヤーデンシスT9株からクローニングした約248塩基のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子断片のDNA配列を配列番号６に示す。その248塩基のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子断片のDNA配列は、既に報告されているアシネトバクター属EB104のP450モノオキシナーゼ遺伝子の配列（MaierT et al, Biochem Biophys Res Commun. (2001)286(3):652-8）のそれと70-80％程度の同一性を示した。そこで、得られたファンジバクター・ヤーデンシスT9のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子断片をプローブにして、SK2株のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子をハイブリ解析により二つのクローンを得たが、その二つのクローンの塩基配列を解析した結果、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子の周辺領域は全く違う配列でありながら、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子そのものは全く同一であった。周辺領域に関連遺伝子とみられる配列は見つからなかった。この結果からアルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株はゲノム上に同一遺伝子を二つ含むと考えられる。また、アシネトバクター属などでみられる遺伝子群（Cluster）を形成しないことと考えられる。アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株からクローニングしたP450モノオキシゲナーゼ遺伝子のDNA配列を配列番号２、アミノ酸配列を配列番号１に示す。このP450モノオキシゲナーゼ遺伝子は全長471アミノ酸（1413bp）であり、推定算出された分子量は53kDaであった。また、既存のアルカンの分解に関わっていると知られているアシネトバクター属細菌EB104株のP450モノオキシナーゼ遺伝子の配列（MaierT et al, Biochem Biophys Res Commun. (2001)286(3):652-8）のそれと65.2％の相同性を示した。アミノ酸配列では、アシネトバクター属細菌EB104株のP450モノオキシナーゼ遺伝子のそれと66.9%の同一性を示した。このP450モノオキシゲナーゼ遺伝子にはP450モノオキシゲナーゼ遺伝子ファミリーで一般的に報告されているHR2配列保存モチーフ（Phe410-X-X-Gly-X-Arg(His)--Cys-X-Gly419）およびhelixI配列保存モチーフ（Gly308-X-X-Thr401）が保存されていた。また、ヘム型P450モノオキシゲナーゼ遺伝子ファミリーで共通するヘムプロピオン酸結合アミノ酸残基であるArg156およびArg358を確認することができた。
〔実施例６〕  P450モノオキシナーゼ遺伝子の破壊ベクターの作製
アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株のDNAから配列番号７（5'-TAATCTCGCGTTGTTGATTGTTGGCGG-3'）と配列番号８のプライマー（5'-TCAGAAGCTGTGGAGAATTGAACGCGC-3'）を用いて、P450モノオキシナーゼ遺伝子とその下流領域を含む遺伝子（1963bp）をPCR法でクローニングした。このP450モノオキシナーゼ遺伝子をpT7 Blue(R)の EcoRＶサイトに導入したプラスミドをテンプレートに、２本のプライマー、配列番号９（5'-AAAGCTAGCAAAAACCGAGCATTACGAACCGCCG-3'）と配列番号１０（5'-GCATGCGGCCGCAGCCCCGCACAAAGTTCGATTGCACGCGC-3'）を用いて再度InversePCRを行い、500  bpのN末端側と480bpのC末端側を含んだP450モノオキシナーゼ遺伝子と下流領域内に各々NheI及びNotIサイトを導入した。また、カナマイシン耐性遺伝子(Kmr)を調製するために、SuperCosIプラスミド（STRATAGENE製）をテンプレートにPCRを行った。このとき、プライマーには配列番号11（5'-AGCATGCGGCCGCGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGG-3'）と配列番号12（5'-GCATGCTAGCCCGCTGCTGGTTTCCTGGATGCCG-3'）を用いたが、これらのプライマーもカナマイシン遺伝子の両末端に各々同様のNheI及びNotI部位を付加するように設計した。増幅した遺伝子は、pT7 Blue(R)に導入後、 大腸菌に形質転換しプラスミドを調製した。得られたプラスミドを各々NheI及びNotIで切断し、アガロース電気移動でKmr遺伝子を含むDNA断片を分離した。アガロースからのDNA断片の調製は、QIAquickGel Extraction Kit（キアゲン製）を用いて行った。その後、Kmr遺伝子を含むDNA断片を、Inverse PCR後アガロースからQIAquickGel Extraction Kit（キアゲン製）を用いて調製したP450モノオキシナーゼの両末端遺伝子を含んでるpT7 Blue(R)ベクターのNheI及びNotI部位へ導入した。さらに、得られたプラスミドをBamHIとSalで切断し、アガロース電気泳動で破壊カセットを含んだDNA断片を分離した。その後、その破壊カセットをpBR322のBamHI、SalI部位へ挿入し、P450破壊ベクターとした。
〔実施例７〕  P450モノオキシナーゼ遺伝子の破壊
アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株を10 mlのMB培地（1%ピルビン酸ナトリウム）に植え付け、25℃で3日間培養した。また、ヘルパープラスミドを保持する大腸菌（E.coli） (HB101, pRK2013)と破壊ベクターを保持する大腸菌(HB101)を10 mlのアンピシリンの入ったLB培地で37℃でそれぞれ一晩培養した。得られたアルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株の培養液100μlと大腸菌の培養液50μlずつをエッペンドルフチューブ内で混合し、1/5MA培地に全量まいた。室温で3日間培養後、1mlの10mM MgSO4をプレートに加え、コーンラージ棒でコロニーをかき取った。そのうち100μl を900μlの10 mM MgSO4を入れたエッペンドルフチューブに加え、1/10に希釈した。同様にして、10-4までの希釈列を作製した。それぞれの液から100μlずつを、抗生物質（カナマイシン）の入ったONR7aプレート（1%ピルビン酸ナトリウム）にまき3週間室温で培養した。得られたコロニーは、ベクターの配列の脱落を確認するため、プレートおよび抗生物質アンピシリンの入った1/5MB液体培地でアンピシリン感受性であることを確認した。また、サザン法で解析し、目的の遺伝子破壊株であることを確認した（図１）。
〔実施例８〕  P450モノオキシナーゼ遺伝子の破壊株の増殖測定
得られた遺伝子破壊株のアルカンを炭素源としたときの生育を調べた。このときアルカンには、Ｃ６からＣ１６の直鎖アルカンを用い、フラスコで液体培養し、OD600を測定することにより生育を調べた。この結果を図２〜図９に示す。ヘキサン、オクタンなど比較的短鎖のアルカンに対してP450モノオキシナーゼ遺伝子破壊株は、野生株のSK2株と同様に生育した（図２、図３）。また、ヘキサデカンなどの比較的長鎖のアルカンに対しても同様の結果がみられた（図９）。このことから、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株においては、P450モノオキシナーゼは短鎖および比較的長いアルカンの水酸化にはあまり重要な働きをしていないことが明らかになった。しかし、得られた遺伝子破壊株をドデカンなどのＣ10からＣ14程度の中鎖アルカンを炭素源としたときの生育を調べると、P450モノオキシナーゼ遺伝子破壊株は、生育が野生株のSK2株に比べ殆ど生育ができなくなった（図４〜図８）。シュードモナス属細菌においては、アルカンヒドロキシラーゼB１遺伝子を破壊するとアルカンで生育できなくなることから、アルカン分解細菌においてはアシネトバクター属などの一部のアルカン分解細菌を除き、アルカンヒドロキシラーゼB１（AlkB1）がアルカンの水酸化において主要な役割を果たしているとこれまで考えられてきた。しかしながら、ここで示してある結果から、アルカニボラックス・ボルクメンシスDSM 11573株においては、アルカンヒドロキシラーゼB１遺伝子は短鎖アルカンの分解の水酸化において重要な役割を果たしていることと考えられるが、中鎖アルカンの分解の水酸化においてはP450モノオキシゲナーゼが重要な役割を果たしていることが確認できた。
〔実施例９〕  アルカンヒドロキシナーゼ遺伝子の破壊ベクターの作製及び破壊
アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株のゲノムDNAから配列番号13（5'-CCAGGGTTCACGGCCTTTAATTTGATATAA-3'）と配列番号14のプライマー（5'-GAAGCCTCTGCCTTAGGTGGGGTGGTAGCA-3'）を用いて、アルカンヒドロキシラーゼB１遺伝子（2036 bp）をPCR法でクローニングした。この遺伝子をpT7 Blue(R)の EcoRＶサイトに導入したプラスミドをテンプレートに、配列番号15（5'-TCTCGAGCCCGAGTTCATGGCCTGTGTTGA-3'）と配列番号16のプライマー（5'-TCTCGAGTGAACACAATAAAGGGCATCATC-3'）を用いて再度PCRを行い、アルカンヒドロキシラーゼB１遺伝子内にXhoIサイトを導入した。また、クロラムフェニコール耐性遺伝子を調製するために、pAT5プラスミド（東洋紡製）をテンプレートにPCRを行った。このとき、プライマーには配列番号17（5'-AAGTCGACTTCGCAGAATAAATAAATCCTG -3'）と配列番号18のプライマー（5'-TGGTCGACACACGGTCACACTGCTTCCGGT-3'）を用いたが、これらのプライマーはクロラムフェニコール耐性遺伝子の両末端にSalIサイトを付加するように設計した。増幅した遺伝子は、 pT7Blue(R)に導入後、 大腸菌に形質転換しプラスミドを調製した。得られたプラスミドをSalIで切断し、アガロースゲル電気泳動でクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を分離した。アガロースからのDNA断片の調製は、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン製）を用いて行った。その後、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を、アルカンヒドロキシラーゼB１遺伝子のXhoIサイトへ導入した。さらに、得られたプラスミドをBamHIとSalIで切断し、アガロースゲル電気泳動で破壊カセットを含んだDNA断片を分離した。その後、その破壊カセットをpBR322のBamHI、SalIサイトへ導入し、アルカンヒドロキシラーゼB１破壊ベクターとした。アルカンヒドロキシラーゼB2遺伝子破壊ベクターの作製も上述と同様に行った。以下詳細について説明する。アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2株のゲノムDNAから配列番号18（5'-TTGCTAAGCCCATTGCGTTTGGCAA-3'）と配列番号19のプライマー（5'-TCCACCACTGACCTTCGACCCCTTG -3'）を用いて、アルカンヒドロキシラーゼB2遺伝子（2325 bp）をPCR法でクローニングした。得られたアルカンヒドロキシラーゼB2はpT7 Blue(R)のEcoRＶサイトに導入した。次にアルカンヒドロキシラーゼB2遺伝子内にBglIIサイトを導入するため、配列番号20（5'-TAAAGATCTTCCTCACTCATAGTGGGAACC-3'）と配列番号21のプライマー（5'-GTAGATCTCTATGCTGGTCATATTTTCATG-3'）を用いて、再度PCRを行った。また、カナマイシン耐性遺伝子(KmR)を調製するために、SuperCosIプラスミド（STRATAGENE製）をテンプレートにPCRを行った。このとき、プライマーには配列番号22（5'-GGGATCCGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAA-3'）と配列番号23のプライマー（5'-GCGGATCCCCGCTGCTGGTTTCCTGGATGC-3'）を用いたが、これらのプライマーはKmR遺伝子の両末端にBamHIサイトを付加するように設計した。増幅したKmR遺伝子は、BamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動で分離し、アルカンヒドロキシラーゼB2遺伝子のBglIIサイトに導入した。さらにられたプラスミドをBamHIとSalIで切断し、アガロースゲル電気泳動で破壊カセットを分離した。その後、その破壊カセットをpBR322のBamHI、SalIサイトへ導入し、アルカンヒドロキシラーゼB2破壊ベクターとした。また、アルカンヒドロキシラーゼ遺伝子の破壊については、サザン法で解析し、目的の遺伝子破壊株であることを確認した（図１０）。
【００３２】
〔実施例１０〕  アルカンヒドロキシラーゼ遺伝子の破壊株の増殖測定
アルカンヒドロキシラーゼ遺伝子の破壊株の増殖測定は、Ｃ６からＣ１２の直鎖アルカンを用い、フラスコで液体培養し、OD600を測定することにより生育を調べた。この結果を図１１〜図１４に示す。アルカンヒドロキシラーゼB2遺伝子破壊株は、実験に使用したいずれのアルカンにおいても、野生株のSK2株とほぼ同様に生育した（図１１〜図１４）。このことから、アルカニボラックス属細菌において、アルカンヒドロキシラーゼB2はアルカンの水酸化にはあまり重要な働きをしていないと考えられた。一方、アルカンヒドロキシラーゼB1遺伝子破壊株は、Ｃ８より長いアルカンでは野生株のSK2株とほぼ同様に生育できたが（図１２〜図１４）、ヘキサンを炭素源とした場合には生育できなかった（図１１）。このことから、アルカニボラックス属細菌において、アルカンヒドロキシラーゼB１遺伝子は、短鎖アルカンの水酸化において重要な役割を果たしていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】P450モノオキシゲナーゼ遺伝子の破壊をサザン法により確認した結果を示す図。
【図２】ヘキサンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図３】オクタンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図４】デカンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図５】ウンデカンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図６】ドデカンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図７】トリデカンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図８】テトラデカンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図９】ヘキサデカンを炭素源とした場合のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図１０】アルカンヒドロキシナーゼ遺伝子の破壊をサザン法により確認した結果を示す図。
【図１１】ヘキサンを炭素源とした場合のアルカンヒドロキシナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図１２】オクタンを炭素源とした場合のアルカンヒドロキシナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図１３】デカンを炭素源とした場合のアルカンヒドロキシナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図１４】ドデカンを炭素源とした場合のアルカンヒドロキシナーゼ遺伝子破壊株の生育状況を示す図。
【図２】
2005065618.tif 000002
【図３】
2005065618.tif 000003
【図４】
2005065618.tif 000004
【図５】
2005065618.tif 000005
【図６】
2005065618.tif 000006
【図７】
2005065618.tif 000007
【図８】
2005065618.tif 000008
【図９】
2005065618.tif 000009
【図１１】
2005065618.tif 000010
【図１２】
2005065618.tif 000011
【図１３】
2005065618.tif 000012
【図１４】
2005065618.tif 000013
【図１】
2005065618.tif 000014
【図１０】
2005065618.tif 000015
【配列表】
2005065618000001.app