(57)【要約】【課題】  適度な半減期を有し、安全性の高いＸ線造影剤ならびにその製造方法を提供することである。【課題を解決するための手段】  水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を含有するリポソームを含み、血中滞留時間が、半減期として０．２５〜４時間であることを特徴とするＸ線検査用造影剤である。  前記リポソームは、一枚膜リポソームであり、その中心粒径は50〜500nmであることを特徴としている。  特に該リポソームは、オキシエチレン単位が10〜3500のPEGを、リポソームを構成する脂質に対して0.1〜30質量％含んでなるPEG化リポソームであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を含有するリポソームを含み、造影物質の血中滞留時間が、半減期として０．２５〜４時間であることを特徴とするＸ線検査用造影剤。
【請求項２】
前記リポソームの中心粒径が50〜500nmであることを特徴とする請求項1に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項３】
前記リポソームが、実質的に一枚膜リポソームであることを特徴とする請求項1または２
に記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項４】
前記リポソームは、オキシエチレン単位が10〜3500のPEGを、該リポソームを構成する
脂質に対して0.1〜30質量％含んでなるPEG化リポソームであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＸ線検査用造影剤。
【請求項５】
リポソームを形成するリン脂質を超臨界二酸化炭素に溶解させて、非イオン性ヨウド系化合物が内部に含有されているリポソームを作製することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＸ線検査用造影剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非経口Ｘ線検査用造影剤に関し、詳しくは内部に造影物質を内包したリポソームを含むＸ線検査用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線単純撮影やＣＴ撮影法（コンピュータ断層撮影法）は、今日の画像診断の中核をなしている。骨、歯などのいわゆる硬組織はＸ線を良好に吸収するために容易に高コントラスト像を得ることができる。これに対し、軟組織間ではＸ線吸収の差が小さいため高いコントラスト像を得ることは困難である。このような場合、コントラストの高い像を得るために造影剤を使用することが一般に行なわれている。
現在実用化されているＸ線造影剤の大部分は、トリヨードフェニル基を含有し水溶性化した化合物を造影物質とするものである。これらの造影剤は、血管、尿管、輸卵管などの管腔部位に投与され、管腔の形状、狭窄などの診断に使用されている。しかしながら、造影物質は組織や疾患部位と相互作用をすることなく管腔部位から速やかに排出されるために、組織や疾患部位、特に癌組織をより詳細に診断する目的には役立たない。このため目標とする組織もしくは疾患部位に選択的に集積し、その周囲またはその他の部位と明瞭なコントラストで区別できる画像を提供するＸ線造影剤が望まれている。そのようなＸ線検査用造影剤であれば、微細な癌組織であっても精度良く検出することが可能となる。腫瘍発見のために開発された検査方法としては、Ｘ線撮影法だけでなく測定原理を異にする他の方法も開発されている。たとえばＭＲＩ（磁気共鳴造影法）では、癌組織、特に微小な癌組織を精度よく撮像するには感度の面から限界があり、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）では、被爆と稼動コストの点で一般的でなく、いずれも大規模な設備と高額な装置を必要としており、今のところ一般的に広く利用される検査法ではない。
国際公開ＷＯ98/46275、同ＷＯ95/31181、同ＷＯ94/19025、同ＷＯ96/28414、同ＷＯ96/00089、米国特許4873075号、同4567034号などには、疎水性ヨウド化合物を界面活性剤や油脂の存在下で水中に分散させ、腫瘍、肝臓、脾像、副腎皮質、動脈硬化巣、血管プール、リンパ系などを造影する方法が開示されている。これらの方法では、造影剤を微粒子化することにより体内での滞留時間を長くして疾患部位を選択的に造影しようとするものである。しかしながら、その目的のためには、提案された製剤方法は、造影の効率および選択性とも充分でない。さらに使用するヨウド化合物が疎水性であるために、造影後に体外への排出速度が遅く患者への負担が大きいという問題点もある。
一方、造影剤を微粒子状にする方法として、生体膜類似の脂質から構成され、低い抗原性のために安全性が高いとされているリポソームに造影性化合物を内包させる手法も検討されている。たとえば国際公開ＷＯ88/09165、同ＷＯ89/00988、同ＷＯ90/07491、特開平07-316079、特開2003-5596では、イオン性または非イオン性の造影物質を含有するリポソームが提案されている。これらの方法では、素材としての安全性が高く、生体内で適度な分解性を有するリポソームを用いるにもかかわらず、リポソームを構成するリン脂質の溶剤として、製造過程において有機溶媒、特にクロロホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤を使用する。したがって、どうしても残存する溶剤の毒性があるという理由で実用化に至っていない（たとえば、特許文献１参照）。
他方、脂質可溶性の薬剤は容易にリポソーム中に封入されるが、その封入量は他の要因にも左右されることからそれほど多くはない。また水溶性電解質である薬剤は、その薬剤の電荷と荷電した脂質の電荷との相互作用を通じてリポソーム内部の水相に封入できるが、薬剤が水溶性の非電解質である場合には、そうした手段を採ることはできない。Ｘ線造影剤についても、一般にイオン性造影化合物よりも、実質的に毒性の低い非イオン性ヨウド化合物をリポソーム内に封入することが望まれるが、上記の理由から容易ではない。さらに形成されたリポソームは多重層になりやすく、ヨウド化合物の内包率も低いために効率
が悪くなる。このような水溶性の非電解質を効率的にリポソーム中に封入する手段として、逆相蒸発法、エーテル注入法が挙げられるが、有機溶剤を使用するためにやはり安全性の問題が残る。
特開2003-119120（特許文献２）では、リポソームを含有する化粧料、皮膚外用剤を、超
臨界二酸化炭素を用いて製造する方法が開示されており、親水性薬効成分や親油性薬効成分をリポソームに内包する皮膚外用剤の製造例が示されている。しかし、親水性薬効成分として、水溶性電解質の例は示されているが、同法により水溶性非電解質をリポソームに効率よく内包できるか不明であった。
【特許文献１】特開平7-316079号公報
【特許文献２】特開2003-119120号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
精度の高いＸ線検査および診断には、造影物質が適度な時間、血中に滞留することが必要である。すなわち、極めて長い半減期の滞留性は画像診断には不必要であり、生体への影響を考えると診断後は、速やかに体外へ排泄されることが望ましい。
本発明の目的は、リポソーム内に非イオン性である水溶性ヨウド系化合物を封入したＸ線造影剤であって、その造影物質が適度な半減期の血中滞留性を有し、安全性の高いＸ線造影剤ならびにその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決する本発明の構成は、以下のとおりである。
【０００５】
本発明は、水溶性かつ非イオン性のヨウド系化合物を含有するリポソームを含み、造影物質の血中滞留時間が、半減期として０．２５〜４時間であることを特徴とするＸ線検査用造影剤である。
【０００６】
前記Ｘ線検査用造影剤のリポソームの中心粒径は50〜500nmであることを特徴としてい
る。
【０００７】
また前記リポソームは、実質的に一枚膜リポソームであることを特徴している。
【０００８】
本発明のＸ線検査用造影剤に含まれるリポソームは、オキシエチレン単位が10〜3500のPEGを、該リポソームを構成する脂質に対して0.1〜30質量％含んでなるPEG化リポソーム
であることが好ましい。
【０００９】
さらに本発明による前記Ｘ線検査用造影剤の製造方法は、リポソームを形成するリン脂質を超臨界二酸化炭素に溶解させて、非イオン性ヨウド系化合物が内部に含有されているリポソームを作製することを特徴とする製造方法である。
〔発明の具体的説明〕
本発明のＸ線検査用造影剤は、診断的検査にとり好都合でしかも高精度撮像を可能とする血中滞留性を示す造影物質を有しており、その血中滞留性は半減期として０．２５〜４時間の範囲で規定される。
【００１０】
一般に循環系に投与された造影物質の血中濃度は、投与直後すぐにピークに達し、次いで短時間に造影物質の血管外遊出が起きるため、速やかな低下が起きる。この場合、造影物質は血管内から非特異的に組織の細胞間隙に分布するために正常組織と異常組織との濃度差がつかず、充分なコントラストが得られない。リポソームといった高分子系担体を使用した場合には、肝臓、脾臓などの細網内皮系細胞により捕捉されることも短時間での消失の一因となる。その後は、排泄に依存して造影物質血中濃度のゆっくりした低下が観察
される。
本発明のＸ線検査用造影剤では、リポソームにカプセル化されている造影物質が存在するために、血中の造影物質は単純な消失様式を示さない。本明細書でいう「血中滞留性」とは、血管内のＸ線造影物質が、一部は腎臓から排出され、または肝臓などにトラップされながらも、臓器組織に分布する造影物質と互いに入れ代わりながら一定時間、血管内で循環していることをいう。その血中滞留性の指標とする「半減期」とは、Ｘ線検査用造影物質の血中濃度に関し、そのピーク濃度が半減するまでの時間をいう。本明細書では、本Ｘ線検査用造影剤の造影物質とは、特にことわらない限りリポソームにカプセル化された造影化合物とカプセル化されていない造影化合物とを区別せず、それらの総称として言及する。造影化合物は、後記するように水溶性かつ非イオン性ヨウド系化合物である。
【００１１】
本発明のＸ線検査用造影剤は、比較的狭い粒径範囲に揃えたリポソーム中に水溶性の非イオン性ヨウド系化合物を内包させている。本発明はこの構成により、造影化合物が投与直後より一定時間、血管内に局在化してコントラスト性能の改善をもたらす血中動態となる半減期を規定している。すなわち、マイクロキャリヤーとしてのリポソームが赤血球類似の挙動することとその粒径を適切に標準化することにより好適な血中滞留性を実現している。さらに非抗原性とすることにより免疫系による捕獲損失を防止して標的部位へ効率よく送達することに加えて、良好なターゲティングを可能としている。その結果として、本発明のＸ線造影剤は優れた腫瘍描出性を実現し、Ｘ線造影による診断的検査の精度を高めることができる。本発明に係るＸ線造影剤は、結果的に従来のＸ線造影剤に比べて使用量が少量で済み、体内蓄積もほとんどないために毒性、副作用がはるかに軽減されている。以下、本発明を造影化合物、リポソーム、Ｘ線検査用造影剤の順に詳細に説明する。
造影化合物
本発明における水溶性の非イオン性ヨウド系化合物は、造影性があれば特に規定されない。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物として、ヨウ化フェニルを含み、2,4,6−トリヨー
ドフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。
具体的には、そのような非イオン性ヨウド化合物として、イオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、N,N′−ビス〔
２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−2,4,6−トリヨード−1,3−ベンゼン−ジカルボキシアミド（イオパミドール）；メトリザミドなどが挙げられる。
【００１２】
これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。なお本明細書において、化合物は遊離形態の化合物の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。
【００１３】
本発明のＸ線検査用造影剤に使用する好適なヨウド系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールなどが好ましい。特にイオトラン、イオジキサノールといった二量体ヨウド化合物では、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体モル数が低いために浸透圧を低下させる利点がある。
本発明の造影剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影剤の性質、意図する最終製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物量は、典型的にはＸ線造影剤における全ヨウド化合物の5〜90質量％、好ましくは5〜70質量％、より好ましくは20〜70質量％である。特に、ヨウド化合物をカプセル化したリポソームの浸透圧効果による不安定化を充分に防止するには、リポソーム内に封入されたヨウド系化合物量は全ヨウド化合物の5〜25質量％
、より好ましくは5〜20質量％であることが望ましい。
リポソーム
本発明のＸ線検査用造影剤は、上記造影化合物を目標とする臓器、組織などに、すなわち
標的部位へ選択的に効率よく送達するためにリポソーム内に封入して使用される。本発明の造影剤は、マイクロキャリヤーとしてリポソームを使用し、血中滞留性の向上、効率的な薬物送達ならびにターゲティングの実現を図っている。特に優れた腫瘍描出性を獲得するために有効とされるＥＰＲ（Enhanced permeability and retention、透過性の亢進お
よび滞留）効果を生じさせるためには、リポソームがこれらの特性を有することが不可欠である。
【００１４】
本発明のＸ線造影剤は、造影化合物を内包するリポソームの粒径およびその表面設計を通じてターゲティング機能を実現することができる。本発明の造影剤では、受動的ターゲティングおよび能動的ターゲティングいずれも考慮される。前者は、リポソームの粒径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リポソーム粒径を狭い範囲に揃える調整は、後述する方法に基づき容易に行われる。リポソーム表面の設計は、リン脂質の種類を含む膜構成成分の組成を変えることにより所望の特性を得ることができる。
造影剤のより高度な集積性と選択性を可能とする能動的ターゲティングの採用もまた検討されるべきである。一例として、リポソーム表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を導入することは、標的部位までの誘導過程が制御し得るため、極めて有益である。本発明のＸ線造影剤では、リポソーム表面にＰＥＧを付加することにより血中滞留性が一層高められ、肝臓などの細網内皮系細胞に貪食されにくくなる。癌組織、疾患部位などに到達しなかったＸ線造影物質は、正常部位に集まることなく、副作用が発現する前にリポソームは分解されて体外に排泄される。このことはリポソームを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能である。造影物質として、水溶性のヨウド系化合物を使用するため、腎臓を経由して速やかに尿中に排泄され、徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。
本発明のＸ線造影剤における上記薬物送達システムに使用されるリポソームの設計、製造方法について、以下に詳述する。
リポソームは、通常、脂質二重膜から形成されている。その脂質膜の成分として、通常リン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。
【００１５】
本発明のリポソームにおける好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。これらは単独でも併用してもよい。
その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他、動植物に由来するホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスフ
ァチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などを挙げることができる。
【００１６】
これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、重量比として通常、２００：１〜３：１、好ましくは１００：１〜４：１、より好ましくは４０：１〜５：１である。
【００１７】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステ
ルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
必要に応じリポソームの膜構成成分として、上記の他に他の成分を加えることもできる。その例として、膜安定化剤またはポリアルキレンオキシド基導入用アンカーとしてコレステロール、コレステロールエステルなどのステロール類、荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなどが挙げられる。
【００１８】
本発明における好ましいリポソームの別の態様として、膜構成成分としてホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群より選ばれるリン脂質を用いることができ、両者を組み合わせてもよい。
【００１９】
本発明では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＸ線造影剤の意図する目的のためにリポソームの一成分として使用することができる。すなわちＰＥＧをリポソームに付けることにより、新たな機能を付与することができる。たとえば、造影剤の臓器特異性、リポソームが親水的傾向を有することになるか、免疫系から認識されにくくなる（いわゆる「ステルス化」された状態である）特性、あるいは血中安定性を増すなどの効果が期待できる。具体的には脂質成分は肝臓に貯まりやすいために肝臓の選択的な造影を目的とする場合には、ＰＥＧを使用しないか、あるいはＰＥＧ含有量の少ないリポソームを用いる。また粒径を200nm以上と大きくすると、肝臓の毛細血管網に存在するKupffer細胞の食作用により速やかに取り込まれる可能性が高くなり、肝臓の該部位に集積する。肝臓癌の撮像においては、その癌組織には正常組織に比べてKupffer細胞が少ないために、造影剤リポソ
ームの取込み量は相対的に少なくなり、コントラストが鮮明となる。脾臓においても同様である。
反対に他臓器の造影の場合、ＰＥＧを導入すればリポソームをステルス化して肝臓などに集まりにくくすることができるため、ＰＥＧ化リポソームの使用が推奨される。ＰＥＧの導入により、水和層が形成されるためリポソームは安定化し、血中滞留性も向上する。ＰＥＧのオキシエチレン単位の長さ、導入する割合を変えることにより、あるいはＰＥＧに何らかの修飾をさらに加えることによりその機能を調節することができる。ＰＥＧとして、オキシエチレン単位が10〜3500、好ましくは100〜1000のポリエチレングリコールが好
適である。またＰＥＧを使用する場合の使用量は、該リポソームを構成する脂質に対して0.1〜30質量％、好ましくは1〜15質量％程度含む。あるいは必要に応じてＰＥＧの他に、公知の各種ポリアルキレンオキシド基をリポソーム表面に導入してもよい。その長さおよび使用量はＰＥＧの場合と同様である。
【００２０】
リポソームのＰＥＧ化は、公知の技術を利用して調製することができる。ＰＥＧが結合するアンカー（たとえばコレステロールなど）を膜構成成分であるリン脂質と混ぜてリポソームを作製し、そのアンカーに活性化ＰＥＧを結合させてもよい。あるいは後述するリポソームの製造方法において、原料のリン脂質類の中に、ホスファチジルエタノールアミンなどのポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）誘導体などを含めてリポソームを製造する。これにはＤＳＰＥ−ＰＥＧなどが例示される。特開２００２−３７８８３号公報には、安全性の高い水溶性高分子修飾リポソーム用の高純度ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質およびその製造方法が開示されている。モノアシル体含量が低いポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を使用するとリポソーム分散液の保存安定性が良好であることが記載されている。
リポソームを作製する方法として、これまでに種々の方法が提案されて来ている。作製方法が異なると、最終的に出来上がったリポソームの形態および特性もまた著しく異なることが多い。所望するリポソームの形態、特性に応じてその製造方法を適宜選択することが行なわれている。一般的にはリポソームは、リン脂質、ステロール、レシチンといった脂質成分を有機溶媒、たとえばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭
素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなどとともに容器中で混合することにより調製されて
いる。揮発性物質を減圧下で蒸発せしめた後、脂質混合物を、所定量の封入物質を含有する緩衝液中に分散させる。次いで全体を数時間撹拌し（これがリポソームの形成を引き起こす）、そうして生成したリポソーム小胞内にその分散液の一部（封入物質を含む）を封入する。次に分散液を超音波処理によるか、界面活性化剤の使用による方法でそれらリポソームのサイズおよび分散液の粘度を減少させる。このようなリポソームの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒は完全に除去することが困難であり、生体に及ぼす悪影響が懸念される。
【００２１】
本発明に使用するリポソームを調製するには、上記の問題点を回避できる超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法を利用する。二酸化炭素の臨界温度（31.1℃）と臨界圧力（7.3  ＭＰａ）が比較的扱いやすく、不活性なガスゆえ残存しても人
体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できる理由などにより好適である。さらにこの方法により作製されたリポソームは、後記するようにＸ線造影剤のヨウド化合物を内包するのに種々の好ましい特性および利点を有している。
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用してリポソームを作製する場合、上記脂質成分を、超臨界状態（亜臨界状態を含む）にある二酸化炭素に溶解、分散または混合することが必要となる。かかる超臨界二酸化炭素は、物質中に浸透しやすいため溶解性に優れている。その際、低級アルコール、グリコール、グリコールエーテルなどのアルコールを助溶媒として1種または2種以上併用することは、上記脂質成分の溶解性が一層向上するために望ましい。たとえばアルコール類を超臨界二酸化炭素の0.1〜10質量％、好ましくは、1〜8
質量％の割合で助溶媒として使用するのがよい。このうち、より好ましい溶解助剤としては、安全性の観点および除去の容易性からエタノールである。
【００２２】
本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の好適な圧力は、50〜500kg/cm2、好ましくは100〜400 kg/cm2である。また好適な臨界状態の二酸化炭素ガスの温度としては、25〜200℃、好ましくは31〜100℃、さらに好ましくは35〜80℃である。これらの範囲内で、温度および圧力を適宜選択して組み合わせることにより、超臨界状態（亜臨界状態を含む）を確立するのがよい。
【００２３】
本発明のＸ線造影剤に使用するリポソームの好適な調製方法は、具体的には以下のように行なわれる。上記の好適な圧力および温度のもとにある超臨界状態もしくは亜臨界状態の二酸化炭素に脂質成分さらに必要に応じてＰＥＧリン脂質を添加して、撹拌下、溶解する。その際、必要に応じて脂質の上記溶解助剤を併用することができる。続いてヨウド系化合物の水溶液を連続的に添加して、水相／二酸化炭素エマルジョンを形成する。このエマルジョン系において脂質成分はミセル状となり離合集散をしていると推定される。しばらく撹拌を続行してミセルを含むエマルジョンが安定化した後に、さらに二酸化炭素相と水相とが分離するまで水を連続的に添加する。水相の増大とともに系の相転移が起こり、水/炭酸ガスエマルジョン＋炭酸ガス/水エマルジョンの２相系を経て、過剰な炭酸ガスが炭酸ガス/水エマルジョンと分離する。リポソームは水相に転相しているため、系内を減
圧して二酸化炭素を排出すると、ヨウド系化合物を内包するリポソームが分散している水系分散液が生成する。この場合、該リポソームの内部以外の水相にヨウド系化合物が含まれていてもよい。リポソーム内部にも上記水溶液が封入されているため、ヨウド系化合物はリポソームの外部水相のほか、主としてリポソーム内部の水相に存在し、いわゆる「内包」の状態にある。さらに該リポソームを0.1〜0.4μの孔径を有する濾過膜を通す。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のＸ線検査用造影剤が調製される。
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する物質の内包率、封入物質のリポソーム内残存率が高いことが示されている（上記特許文献２参照）。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、実質的
に有機溶剤を使用せずに非イオン性かつ水溶性の物質を効率よくリポソームに封入することができる本法は、本発明のＸ線造影剤の製造に有用である。
本発明のリポソームは、実質的に1枚膜リポソーム、すなわちリン脂質二重層が1つの層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。ここで「実質的に
」とは、以下のフリーズレプリカ法による電子顕微鏡観察において、概ね1つの層として
認められるリン脂質二重層によりリポソームが構成されていることをいう。本発明のＸ線造影剤において、このような1枚膜リポソームを、造影剤中に含まれる全リポソーム量の
うち少なくとも８０％、好ましくは９０％含むものである。
このような一枚膜リポソームは、上記超臨界二酸化炭素を使用し、水による相分離方法により効率よく作製できる。これに対し、従来のリポソーム作製方法では、多重層膜（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）からなるリポソームがかなりの割合で存在することが多い。そのため、一枚膜リポソームの比率を高めるためには、超音波を照射するか、一定孔サイズのフィルターに通すなどの操作をさらに必要としていた。1枚膜リポソームは、ＭＬ
Ｖと比較して、リポソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点もある。
一枚膜リポソーム、特に大きい一枚膜リポソームであるＬＵＶ（Large unilamellar veislcles）は、多重層リポソームに比べて、大きい封入容量を提供するという利点がある。
本発明の造影剤に使用するリポソームは、粒径が200〜1000nmＬＵＶと、粒径が50nm未満
の小さい一枚膜リポソームであるＳＵＶ（Small unilamellar vesicles）との中間に位置する。このため、保持容積もＳＵＶより大きくなり、ヨウド系化合物、特に水溶性ヨウド系化合物のトラップ効率、換言すると内包効率も、後述するように格段に優れたものとなる。また、ＭＬＶ、ＬＵＶと違い、細網内皮系細胞に取り込まれて急速に血流から消失することもない。
リポソーム粒子のサイズおよびその分布は、本発明のＸ線造影剤が目指す、高い血中滞留性、ターゲティング性、送達効率と密接に関わっている。粒径はヨウド化合物を内包するリポソームを含む分散液を凍結し、その後破砕した界面をカーボン蒸着し、このカーボンを電子顕微鏡で観察すること（凍結破砕ＴＥＭ法）により測定することができる。ここで「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径を指している。粒径の調整は、処方またはプロセス条件で行なうことができる。たとえば、上記の超臨界の圧力を大きくすると形成されるリポソーム粒径は小さくなる。作製するリポソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリカーボネート膜で濾過してもよい。この場合、濾過膜として0.1
〜0.4μの孔径のフィルターを装着したエクストルーダーに通すことにより、1枚膜の中心粒径として 100〜300nm以下である最適寸法のリポソームを効率よく調製することができ
る。押出しろ過法については、たとえばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9ページ(1979)に
記載されている。このような「押出し」操作を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム外に存在するヨウド系化合物の濃度の調整、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去も併せて可能になるという利点もある。
上記のように受動的ターゲティング能力をリポソームに持たせるには、その粒径のサイジングが重要である。特２６１９０３７号公報には、粒径3000nm以上のリポソームを排除することにより、肺の毛細血管における不都合な保持が回避されると記載されている。しかし、150〜3000nmの粒径範囲のリポソームは、良好な向腫瘍性とはならない。
【００２４】
本発明の造影剤リポソームの中心粒径は、通常50〜500nm、好ましくは50〜300nm、より好ましくは50〜130nmである。Ｘ線撮像の目的に応じて、粒径を適切に設定することがで
きる。たとえば腫瘍部分の選択的撮像目的の場合には、特に110〜130nmが好ましい。リポソームの粒径を100〜200nm、より好ましくは110〜130nmの範囲に揃えることにより癌組織へ選択的にＸ線造影物質を集中させることが可能となる。これは「ＥＰＲ効果」として知られている。固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓（fenestra）の孔サイズ、30〜80nm未満に比べて異常に大きく、約100nm〜約200nmの大きさの分子でも
血管壁から漏れ出る。すなわちＥＰＲ効果は、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものである。
血管壁の孔から漏れ出た造影物質は、癌細胞の周辺にはリンパ管が充分に発達していないため、血管に再び戻らずその場に長く留まる。ＥＰＲ効果は、血流を利用する受動的な輸送であることから、それが有効に発現するための要件として、血中滞留性の向上が図られねばならない。すなわち造影物質粒子（ヨウド化合物を内包するリポソーム粒子）が、血中に長くとどまって、癌細胞近くの血管を何度も通過することが求められる。本発明のＸ線造影剤は、特に大きい粒子でもないため、細網系内皮細胞による捕獲の対象になりにくい。またリポソームがいわば赤血球類似の姿と挙動をしていて腎臓を経由して速やかに排出されることはなく、さらにステルス（隠蔽）化されている場合には細網系内皮細胞に貪食されることもなく、血流中に比較的長くとどまる。ＥＰＲ効果により、必然的に標的の臓器、組織への造影化合物の移行性が高まり、造影物質の癌組織への選択的集中と蓄積が達成される。造影化合物の腫瘍細胞／正常細胞集積比の上昇は、Ｘ線造影剤のコントラスト性能を高める。このような腫瘍描出性の改善は、これまで検出困難であった微小転移性癌の発見すらも可能とする。
Ｘ線検査用造影剤
検査および診断には、造影物質が適度な時間、血中に滞留することが必要である。従来のＸ線造影剤の造影物質は、静脈などに投与されると速やかに循環系に拡散し、造影物質は血管内から非特異的に組織の細胞間隙に分布して行く。そうした造影物質は目標とする組織部位と相互作用する間もなく急速に排出されてしまい、病巣の様態を正確に把握することは困難であった。逆に、極めて長い半減期は画像診断には不必要であり、生体への影響を考えると検査・診断後は、速やかに体外へ排泄されることが望ましい。血中滞留性が１０数時間〜数日となると生体毒性が問題となり、特に疎水性ヨウド化合物の場合には、脂質性部位への脂溶性蓄積が深刻になる。
本発明に係るＸ線造影剤は、上記リポソーム内に水溶性造影化合物を封入することにより、診断的検査にとり好都合な血中滞留性を実現する。具体的な血中滞留時間は、造影物質の半減期として０．２５〜４時間、より好ましくは０．５〜３時間を有する。そうした半減期が０．２５時間未満であると、詳細な検査・診断は困難となり、４時間を超える長さは通常の画像診断には必要とされない。体内の本発明造影物質は、撮像後は生体適合性かつ生分解性の担体に内包した水溶性造影物質であるために、その排泄も腎臓経由の尿中排泄により比較的速やかに除去される。半減期が最大でも４時間であることから、投与後２４時間経過すれば、1.5％しか血中に残存しないことになる（指数関数的減衰の場合）。
体内蓄積もほとんどないために低毒性である。
【００２５】
なお、上記の血中半減期は、後記の実施例に示すように、Ｘ線造影剤の静脈注入後に経時的な血中放射能分布率を測定することにより算出できる。
Ｘ線造影のコントラスト性能を規定する標的臓器へのヨウ素の必要な送達量は、明らかにされている（たとえば特許２６１９０３７号公報）。本発明のようにヨウド系化合物をリポソームというマイクロキャリヤーに封入する場合には、造影物質の送達効率および保持安定性に加えて脂質の用量も考慮されねばならない。脂質量が多くなると造影剤の粘度が大きくなる。リポソーム内へのヨウド系化合物の封入量として、すなわちリポソーム内に封入された水溶液中に、ヨウド系化合物がリポソーム膜脂質重量に対して、1〜10、好ま
しくは3〜8、より好ましくは5〜8の重量比で含有されていることが望ましい。
リポソーム水相へカプセル化されたヨウド系化合物の重量比が１未満であると、比較的多量の脂質を注入することが必要となり、結果的に造影物質の送達効率が悪くなる。特許２６１９０３７号公報の記載によると、当該比が１でも当時の技術水準からは高い値とされていた。Ｘ線造影剤の粘度は、リポソームの脂質量にも左右されるため、保持容積および内包効率に優れる一枚膜リポソームの優位性は明らかである。反対に、リポソーム膜脂質重量に対するヨウド系化合物の封入重量比が10を超えると、リポソームが構造的にも不安定となり、リポソーム膜外へのヨウド系化合物の拡散、漏出は貯蔵中または生体内に注入
された後でも避けられない。またリポソーム懸濁薬剤が製造され、分離した直後は100％
の封入が達成されても、浸透圧効果による不安定化に基づき、早くも短時間に封入成分が減少していくことが記載されている（特表平９−５０５８２１号公報）。
本発明の造影剤は、投与後にリポソームが体内に安定に維持されるように、体内の浸透圧に対し、等張の溶液または懸濁液の形でリポソーム中に封入される。そうした溶液もしくは懸濁液の媒質として、水、緩衝液、たとえばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを使用することができる。
【００２６】
上記溶液もしくは懸濁液の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。Ｘ線造影剤が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場合、緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数を有する緩衝液
である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、特に好ましくはトリス（TRIS）である。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中のＸ線造影剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。この場合、ろ過滅菌のようにリポソーム粒径の微小化という制約も受けない。したがって、注射用無菌造影剤を製造するために、リポソーム調製物をオートクレーブ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。しかしオートクレーブ滅菌を適用できないリポソームには、ろ過滅菌を行なうのがよい。
【００２７】
等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提供する濃度で、造影物質を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。たとえば造影剤化合物の溶解性が低いために造影剤が単独では等張液を提供できない場合、等張の溶液もしくは懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、たとえば塩化ナトリウムのごとき塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添加してもよい。
本発明のＸ線造影剤は製剤化に際し、さらに製剤助剤として必要に応じて、生理学的に許容される安定化剤、キレート剤としてＥＤＴＡNa2−Caなど、抗酸化剤としてα‐トコフ
ェロール、粘度調節剤なども含めてもよい。投与直後より一定時間血管内に局在化させるには、Ｘ線造影剤の粘度は低いほうが、投与部位の血管から速やかに循環系に拡散しやすい。
【００２８】
本発明のＸ線検査用造影剤は、注射剤または点滴注入剤として、非経口的に、具体的には血管内投与、好ましくは静脈内投与により被験者に投与されＸ線照射により撮像される。その用量は、従来のヨウド系造影剤に準じる。リポソーム内のヨウド総量、またはそれとリポソーム外のヨウド総量の和が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。実際の診断的検査においては、本発明のＸ線検査用造影剤を、コンピュータ断層撮影装置（CT）との組み合わせたＸ線撮影装置に使用することにより、その造影剤性能をさらに有効に発揮することも期待される。
【００２９】
Ｘ線検査目的、標的臓器、組織の特性、Ｘ線撮像装置の種類などに応じて血中半減期として、０．２５〜４時間の範囲内から、適切な半減期を有する造影剤を調製することができる。これには、上述したようにリポソームの粒径、リポソーム表面の修飾などによる。
【００３０】
ＥＰＲ効果を通じて単回投与で腫瘍描出性を高めるには、血中滞留性を適切に長くする必要がある。反対に血管分布像の評価、血管の狭隘、狭窄部位を検出するアンジオグラフィー目的には、１時間ぐらいまでの半減期の方が好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係るＸ線造影剤の造影物質は、診断的検査にとり好都合な、血中半減期として、０．２５〜４時間の範囲にある血中滞留性を有する。また血中滞留性が良好であること
からＥＰＲ効果が発揮され、その結果、目的とする疾患部位または組織、とりわけ癌組織に選択的に集中し蓄積して撮像の高精度解像を可能とする。造影後は、該ヨウド化合物が水溶性であるため、比較的速やかに体外へ排泄される。
【００３２】
本発明に係るＸ線造影剤は、従来のＸ線造影剤に比べて使用量が少量で済み、体内蓄積もほとんどないために毒性、副作用がはるかに少ない。したがって、その投与を受ける患者の負担は軽減されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
〔実施例〕
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）と二酸化炭素とをステンレス製オートクレーブにエタノールとともに仕込み、オートクレーブ内を60℃、300kg/cm2にして撹拌し
、超臨界二酸化炭素中にDPPCを溶解させた。この超臨界二酸化炭素溶液を撹拌しながら、イオメプロール溶液（イオメプロール816.5mgを注射用水にて加温溶解し、これに20mMと
なるようにアスコルビン酸を加えて溶解し、さらにトロメタモールを1mg加えて溶解した
。希塩酸にてｐＨを生理的ｐＨに調整した。最後に注射用水を加えて1.0mlに仕上げた溶
液）を定量ポンプで連続的に注入した。その後系内を減圧して二酸化炭素を排出し、イオメプロールを含有するリポソームの分散液を得た。
【００３５】
さらに得られた分散液をガラスバイアル中に入れ、121 ℃、20分間オートクレーブ滅菌し造影剤とした。
【００３６】
得られた造影剤中のリポソームの粒径を凍結破砕ＴＥＭ法により測定し、粒子径分布で最も出現頻度の高い粒径を中心粒径とした。造影剤中のリポソームの粒径は130nmであっ
た。また同法による形態観察によると、出来上がったリポソームは、一枚膜のリポソームであった。これをサンプル１とする。
【実施例２】
【００３７】
サンプル１の造影剤を等張グルコース液で希釈して、50mgヨウ素／mlの濃度とした。この液をラットに静脈内注射したところ、比較のため注射したリポソーム内に封入されていない同量のヨウ素を含む造影剤溶液と比較して、特に肝臓に集中して分布することがＸ線画像で観察された。また時間経過とともに肝臓中の造影レベルは、その他すべての器官造影レベルと並行して減少し、イオメプロールの大部分は尿中に排泄されたことが認められた。
【実施例３】
【００３８】
実施例１で得られた造影剤サンプル１を等張グルコース液で希釈して、50mgヨウ素／mlの濃度とした。この液を多数の肝癌転移を有するラットに静脈注射した。腫瘍転移部分は造影レベルが高く、直径約5mmの腫瘍が観察された。さらに腫瘍部分造影レベルの低下は
、時間経過とともにその他の器官の造影レベルより遅かった。
【実施例４】
【００３９】
圧力および温度をコントロールして、粒径が70nm、180nm、220nmのリポソームを作製した以外は実施例1と同様に造影剤を作製した。粒径の小さい順に、サンプル２、３、４と
する。
【実施例５】
【００４０】
オキシエチレン単位が2000のPEGを40g添加した以外は実施例1と同様に造影剤を作製し
た。その粒径は120nmであった。これをサンプル５とする。
【実施例６】
【００４１】
実施例４で作製した造影剤サンプル２〜４を実施例２と同様にして評価した。実施例４で作製した造影剤は、粒子径にかかわらず、非リポソーム造影剤と比べて注射後、特に肝臓に集中して分布することがＸ線画像で観察された。
【実施例７】
【００４２】
実施例４および５で作製した造影剤サンプル２、３、５を実施例３と同様にして評価した。
粒径70nmのリポソームを含む造影剤サンプル２は、腫瘍部分造影レベルが実施例３の造影剤と比較して造影レベルの低下速度が速かった。
粒径180nmのリポソームを含む造影剤サンプル３は、腫瘍部分造影レベルが実施例３の造
影剤と比較して造影レベルの低下速度が遅くなった。
実施例５で作製した造影剤サンプル５は、腫瘍部分造影レベルが高く、造影レベルの低下速度が遅かった。
【実施例８】
【００４３】
サンプル１、サンプル２およびサンプル４の造影剤をラット静脈内に投与し、一定時間経過後に、種々の器官におけるヨウ素含量について調べた。
【００４４】
Sprague-Dawley系雌性ラット（体重145〜171ｇ）に、各造影剤サンプル液をkgあたり250mgの全ヨウ素投与量を注入した。比較のためにリポソーム内に封入されていない造影剤
溶液をラットのkg当たりのヨウ素量が同量になるように注入した。注入後、0.15、0.25、0.5、１、4および24時間において、該動物を脱血犠死せしめ、血液の他に肝臓、脾臓および肺を採取した。ＦＥＡ（Ｘ線蛍光分光法）を用いてそれらのヨウ素含有量について検査した。その結果（投与量に対する％）を表１〜４および図1に示す。
【００４５】
図１より、本発明のＸ線造影剤の造影物質の血中半減期は、サンプル１が約0.35、サンプル２が約0.8、サンプル４が約3.5であることが分かった。
【００４６】
【表１】
2005179214.tif 000002
【００４７】
【表２】
2005179214.tif 000003
【００４８】
【表３】
2005179214.tif 000004
【００４９】
【表４】
2005179214.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、Ｘ線造影剤投与後の血中ヨウ素含量の経時変化を示す。
【図１】
2005179214.tif 000006