(57)【要約】【課題】  本発明は、メリアンサス属植物の培養細胞を利用したオレアナン型トリテルペンの簡便な製造方法を提供する事を目的とする。【解決手段】  メリアンサス属植物由来の培養細胞であって、該培養細胞を培養し、得られる培養物からオレアナン型トリテルペンを回収することを特徴とするオレアナン型トリテルペンの製造方法、及び該培養細胞をジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質の存在下に培養し、得られる培養物からオレアナン型トリテルペンを回収することを特徴とするオレアナン型トリテルペンの製造方法、及び培養を２段で行い、１段目において該培養細胞をカザミノ酸の存在下に培養を行った後に、２段目においてジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質の存在下に培養し、得られる培養物からオレアナン型トリテルペンを回収することを特徴とするオレアナン型トリテルペンの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メリアンサス（Melianthus）属植物由来の培養細胞を培養し、得られる培養物からオレアナン型トリテルペンを回収することを特徴とするオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項２】
オレアナン型トリテルペンが一般式（Ｉ）：
【化１】
2005130778.tif 000018
［式中、Ｒ1及びＲ4はいずれか一方が−ＯＸ1（ここで、Ｘ1は水素原子、アシル基又は糖残基を表す）であり、他方が水素であるか、又は一緒になってオキソを表し；Ｒ2は、−ＣＨ2ＯＸ2（ここで、Ｘ2はアシル基又は糖残基を表す）又はアルデヒド基を表し；Ｒ3は、水素原子又は代謝性エステル残基を表す。］から選ばれる少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項１記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項３】
メリアンサス属植物の培養細胞を一般式（ＩＩ）：
【化２】
2005130778.tif 000019
［式中、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e及びＲ5fは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ1−Ｃ2−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでもよく；Ｒ11は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4を表す。）、ＮＲ12aＲ12b（ここでＲ12a及びＲ12bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６アルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ13（ここで、Ｒ13は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し、前記五員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする請求項１又は２に記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で表されるジャスモン酸類を培養細胞の誘導期ないし対数増殖期に添加することを特徴とする請求項３記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項５】
培養を２段で行い、１段目の培養においてメリアンサス属植物の培養細胞をカザミノ酸の存在下で培養し、２段目でジャスモン酸類を添加した培養を行うことを特徴とする請求項４記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項６】
メリアンサス属植物の培養細胞を不定胚形成阻害物質の存在下に培養することを特徴とする請求項１又は２に記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項７】
不定胚形成阻害物質が４−ヒドロキシベンジルアルコールであることを特徴とする請求項６記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項８】
不定胚形成阻害物質を培養細胞の誘導期に添加することを特徴とする請求項６又は請求項７記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項９】
培養を２段で行い、１段目の培養においてメリアンサス属植物の培養細胞をカザミノ酸の存在下で培養し、２段目で不定胚形成阻害物質を添加した培養を行うことを特徴とする請求項６〜８の何れか一項記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【請求項１０】
メリアンサス属植物がメリアンサス  コモサス（Melianthus comosus）であることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メリアンサス（Melianthus）属植物の培養細胞を利用した新規なオレアナン型トリテルペンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オレアナン型トリテルペンは様々な化合物の製造中間体として利用できる。中でも、下記一般式（III）で示されるミリセロール或いは下記一般式（IV）で示されるミリセロンは、エンドセリン受容体アンタゴニストとして知られている下記化合物（Ｖ）又は下記一般式（VI）で示される化合物の製造中間体として大変有用な化合物である（特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
【化３】
2005130778.tif 000002
【０００４】
【化４】
2005130778.tif 000003
【０００５】
【化５】
2005130778.tif 000004
［上記式中、Ｒ17は水素原子又は代謝性エステル残基を表し；Ｒ18は置換されていてもよいアリール又は置換されていてもよい芳香族複素環を表し；Ｒ14とＲ15の一方はヒドロキシで他方は水素原子であるか、あるいはＲ14とＲ15が一緒になってオキソであり、Ｒ16は酸素原子又は２個の水素原子を表す。］
【０００６】
【化６】
2005130778.tif 000005
［式中、Ｒ19は水素原子又は代謝性エステル残基を表し；Ｒ20は水素又は−Ｒ21−Ｒ22を表し；Ｒ21は、−ＳＯ3−、−ＣＨ2ＣＯＯ−、−ＣＯＣＯＯ−又は−ＣＯＲ23ＣＯＯ−（ここでＲ23は、低級アルキレン又は低級アルケニレンを表す。）を表し；Ｒ22は水素原子又は低級アルキルを表す。］
植物組織培養を利用してミリセロール或いはミリセロンを製造する手段として、メリアンサスコモサス（Melianthus comosus）から誘導した毛状根に２７−オキシーカフェオイルミリセロール或いは２７−オキシーカフェオイルミリセロンを産生させた後、該化合物群を加水分解する方法が開示されている（特許文献３参照）。しかしながら通気攪拌系を用いて大量培養した場合、毛状根は培養細胞とは異なり生長するに従い互いに絡み合って大きな塊を形成する。この為毛状根の塊の内部で酸素供給不足が生じ、組織の生育量及び目的二次代謝産物の生産量が増加しないケースがある。またスケールアップ時に別の培養槽に移送する際は、無菌状態を保ったまま大量の組織を裁断することが必要であり操作が煩雑である。以上の事から工業的生産の場面において、毛状根は望ましい形態であるとは言い難い。
【０００７】
ところで、植物組織培養を利用して目的二次代謝産物を効率的に生産させる手段として、植物ホルモンを始めとする生理活性物質やエリシターと呼ばれる生体成分（多くの場合、菌類由来の炭水化物を指す）を培養培地内に添加する方法が知られている。例えば植物ホルモンの１種であるジャスモン酸類は、マメ科、ミカン科、キョウチクトウ科、アカネ科、ナス科、ショウガ科及びイチイ科の各植物の組織培養物が生産する二次代謝産物（アルカロイド類、フラボン類、キノン類、ジテルペン類等）の生産を誘導する（特許文献４及び特許文献５参照）。しかしながらミリセロール或いはミリセロンを始めとするオレアナン型トリテルペンを生産するための培養においては、該化合物群の生産を誘導する物質の存在は現在に至るまで全く知られていない。
【特許文献１】国際公開第９２／１２９９１号パンフレット
【特許文献２】特開平７−５３４８４号公報
【特許文献３】国際公開第９７／２７３１４号パンフレット
【特許文献４】特開平５−１８４３５５号公報
【特許文献５】特開平８−３３４９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、培養細胞を用いる事によって毛状根で指摘した各種問題点を有さず、かつ効率的なオレアナン型トリテルペンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、メリアンサス属植物から培養細胞が作出可能である事、及び該培養細胞がオレアナン型トリテルペンを生産する事を見出した。また、該培養細胞の培地中にジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加して培養を行うことによって培養物中のオレアナン型トリテルペンの生産性が向上すること、更には培養を２段で行い、１段目の培養においてカザミノ酸を添加した培地で培養を行った後に、２段目の培養においてジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加した培地で培養を行う事によって、オレアナン型トリテルペンの産生量が更に増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明には、例えば、以下の各態様が含まれる。
１．  メリアンサス（Melianthus）属植物由来の培養細胞を培養し、得られる培養物からオレアナン型トリテルペンを回収することを特徴とするオレアナン型トリテルペンの製造方法。
２．  オレアナン型トリテルペンが一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化７】
2005130778.tif 000006
［式中、Ｒ1及びＲ4はいずれか一方が−ＯＸ1（ここで、Ｘ1は水素原子、アシル基又は糖残基を表す）であり、他方が水素であるか、又は一緒になってオキソを表し；Ｒ2は、−ＣＨ2ＯＸ2（ここで、Ｘ2はアシル基又は糖残基を表す）又はアルデヒド基を表し；Ｒ3は、水素原子又は代謝性エステル残基を表す。］から選ばれる少なくとも１種以上であることを特徴とする上記項目１記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
３.  メリアンサス属植物の培養細胞を一般式（ＩＩ）：
【００１２】
【化８】
2005130778.tif 000007
［式中、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e及びＲ5fは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ1−Ｃ2−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでもよく；Ｒ11は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4を表す。）、ＮＲ12aＲ12b（ここでＲ12a及びＲ12bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜６アルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ13（ここで、Ｒ13は、炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し、前記五員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］で示されるジャスモン酸類の存在下に培養することを特徴とする上記項目１又は２に記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
４.  一般式（ＩＩ）で表されるジャスモン酸類を培養細胞の誘導期ないし対数増殖期に添加することを特徴とする請求項３記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
５．  培養を２段で行い、１段目の培養においてメリアンサス属植物の培養細胞をカザミノ酸の存在下で培養し、２段目でジャスモン酸類を添加した培養を行うことを特徴とする請求項４記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
６．  メリアンサス属植物の培養細胞を不定胚形成阻害物質の存在下に培養することを特徴とする上記項目１又は２に記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
７．  不定胚形成阻害物質が４−ヒドロキシベンジルアルコールであることを特徴とする上記項目６記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
８．  不定胚形成阻害物質を培養細胞の誘導期に添加することを特徴とする上記項目６又は７記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
９．  培養を２段で行い、１段目の培養においてメリアンサス属植物の培養細胞をカザミノ酸の存在下で培養し、２段目で不定胚形成阻害物質を添加した培養を行うことを特徴とする請求項６〜８の何れか一項記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【００１３】
１０．  メリアンサス属植物がメリアンサスコモサス（Melianthus comosus）であることを特徴とする上記項目１〜９の何れか一項記載のオレアナン型トリテルペンの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、メリアンサス属植物の培養細胞を培養する事によりオレアナン型トリテルペンを簡便に得ることが可能となった。また、該培養細胞の培地中にジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加して培養を行うことにより、培養物中のオレアナン型トリテルペンの生産性を高める事が可能となった。更には、培養を２段で行い、１段目の培養においてカザミノ酸を添加した培地で培養を行った後に、２段目の培養においてジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加した培地で培養を行う事によって、更に大量のオレアナン型トリテルペンを得る事が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明を詳細に説明する。本発明の製造方法の対象となるオレアナン型トリテルペンとしては、具体的には下記一般式（Ｉ）：
【００１６】
【化９】
2005130778.tif 000008
［式中、Ｒ1及びＲ4はいずれか一方が−ＯＸ1（ここで、Ｘ1は水素原子、アシル基又は糖残基を表す）であり、他方が水素であるか、又は一緒になってオキソを表し；Ｒ2は、−ＣＨ2ＯＸ2（ここで、Ｘ2はアシル基又は糖残基を表す）又はアルデヒド基を表し；Ｒ3は、水素原子又は代謝性エステル残基を表す。］で示される化合物を挙げる事が出来る。
【００１７】
ここでアシル基とは、直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基（好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜６、最も好ましくは炭素数１〜４）、直鎖もしくは分枝状のアルケニルカルボニル基（好ましくは炭素数２〜１０、さらに好ましくは炭素数２〜６、最も好ましくは炭素数２〜４）、置換されていてもよいシクロアルキルカルボニル基（好ましくは炭素数４〜９、さらに好ましくは炭素数４〜７）、置換されていてもよいアリールカルボニル基、置換されていてもよいヘテロ環カルボニル基を包含する。
【００１８】
アルキルカルボニル基またはアルケニルカルボニル基は任意の位置に１以上の置換基を有していても良い。置換基としてはヒドロキシ基、アルコキシ基およびアセチルオキシ基等から選択される１以上の基で置換されていてもよいフェニル基が挙げられる。
【００１９】
具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、プロピオロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、シクロプロピルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基、シクロオクチルカルボニル基、ベンゾイル基、
【００２０】
【化１０】
2005130778.tif 000009
等が挙げられ、好ましくはアセチル基、シンナモイル基、クマロイル基、カフェオイル基またはフェルロイル基である。なお、上記式において、「Ｍｅ」はメチル基を、「Ａｃ」はアセチル基をそれぞれ表す。
【００２１】
糖残基とはグルコシル基およびオリゴ糖残基を包含する。
【００２２】
グリコシル基とは、単糖またはその誘導体の環状形からグリコシド性ヒドロキシ基を取り去ってできる基を包含し、例えばフルクトフラノシル基、グルコフラノシル基、リボフラノシル基、リブロフラノシル基、キシルロフラノシル基、アピオフラノシル基、アロピラノシル基、アルトロピラノシル基、グルコピラノシル基、マンノピラノシル基、イドピラノシル基、ガラクトピラノシル基、タロピラノシル基、プシコピラノシル基、フルクトピラノシル基、ソルボピラノシル基、タガトピラノシル基、アラビノピラノシル基、キシロピラノシル基およびリキソピラノシル基等が挙げられる。
【００２３】
また、これらのデオキシ体（例えば６−デオキシグルコピラノシル基、６−デオキシマンノピラノシル基、６−デオキシガラクトピラノシル基等）、置換フェニルオキソプロペニル体（例えば３−（４−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニルガラクトピラノシル基、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニルガラクトピラノシル基、１−オキソ−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−プロペニルガラクトピラノシル基等）もグリコシル基に包含される。
【００２４】
これらの中では、アピオフラノシル基、グルコピラノシル基、マンノピラノシル基、ガラクトピラノシル基、アラビノピラノシル基、キシロピラノシル基またはそれらのデオキシ体が好ましい。
【００２５】
オリゴ糖残基は、上記のグリコシル基から選択される２〜１０個、好ましくは３〜６個がグリコシド結合した基を包含する。また、それらのデオキシ体も包含する。
【００２６】
代謝性エステル残基とは、化学的または代謝的に分解されるエステル残基を意味する。好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキルエステル（メチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、ネオペンチルエステル、イソペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル等）、フェニルエステル及びベンジルエステルからなる残基を挙げることができ、さらに好ましくはメチルエステル及びエチルエステルからなる残基を挙げることができる。
【００２７】
アルデヒド基としては、−ＣＨＯを挙げることができる。
【００２８】
本発明の製造方法に用いられるオレアナン型トリテルペンを産生する植物としては、メリアンサス  コモサス（Melianthus comosus）、メリアンサス  エロンガタス（M. elongatus)、メリアンサス  メジャー（M. major)、メリアンサス  ビロサス（M. villosus)などのメリアンサス属植物を挙げることができる。中でもメリアンサス  コモサス（Melianthus comosus）が特に好ましい。
【００２９】
本発明において「培養細胞」とは、メリアンサス属植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片を、植物組織培養培地上で一定期間培養した後に誘導される直径が数μｍ〜数ｍｍの細胞塊の集合体であり、細胞塊の一部がシュートや根に分化せずに未分化の状態を保持する性質を持ち、細胞の生育速度が均質であるものをいう。この培養細胞は、固体培地又は液体培地で培養可能であるが、液体培地で培養した細胞を使用する事が特に好ましい。
【００３０】
オレアナン型トリテルペンの製造における前記培養細胞の培養は、目的とするオレアナン型トリテルペンの生産を可能とする培地及び培養条件を用いて行うことができ、培地としては公知のものを利用できる。更に、前記一般式（ＩＩ）で示されるジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加するか、或いは培養を２段で行い、１段目の培養においてカザミノ酸を含む培養培地中で培養を行った後に、２段目の培養において該培養物をジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加して培養することで、オレアナン型トリテルペンの生産を更に効率良く行うことができる。
【００３１】
本発明において、培養を２段で行う場合の「１段目」とは、該培養細胞をカザミノ酸が一定量含まれる培地で、少なくとも１代以上培養を行った状態を意味する。また、培養を２段で行う場合の「２段目」とは、該培養細胞を前記ジャスモン酸類又は前記不定胚形成促進物質の存在する培養環境下で、少なくとも１代以上培養を行った状態を意味する。なお本培養段階においては、培地中にカザミノ酸が含まれていても良い。更に、ジャスモン酸類及び不定胚形成促進物質の両方の存在下で培養を行っても良い。
【００３２】
本発明の対象となるジャスモン酸類は、前記一般式（ＩＩ）で示される化合物である。
【００３３】
前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e、Ｒ5f、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ12a、Ｒ12b又はＲ13で表される炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
【００３４】
前記一般式（ＩＩ）において、R5a、R5b、R5c、R5d、R5e又はR5fで表さ
れる炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００３５】
R11がＯＭである場合において、Ｍで表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げられる。R11がＮR12aR12bである場合において、R12a又はR12bで表される炭素数１〜６のアシル基は直鎖、分岐鎖のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基等が挙げられる。
【００３６】
Ｒ11がＮＲ12aＲ12bである場合において、Ｒ12a又はＲ12bで表されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。Ｒ11がＯＲ13である場合において、Ｒ13で表される炭水化物残基である場合における炭水化物残基としては、グルコピラノシル基が挙げられる。
【００３７】
また、前記一般式（ＩＩ）で示される化合物においては、五員環は、隣接する
環員炭素原子間で二重結合を形成しても良い。
【００３８】
更に、Ｃ2−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6の炭素鎖は、Ｒ6〜Ｒ10の置換基を有する飽和アルキル鎖であるか、あるいは、１または２以上の二重結合を有する不飽和アルキル鎖であることができる。二重結合を有する場合は、二重結合を持たない炭素は飽和している。また、二重結合を有する場合は、Ｃ3−Ｃ4のみに二重結合があるものが好ましい。
【００３９】
前記一般式（ＩＩ）で示される化合物の具体例としては、以下に示す化合物が
挙げられる。
（化合物Ａ）
Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e、Ｒ5f、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10：Ｈ、Ｃ3とＣ4間で二重結合形成、Ｒ11：−ＯＨ又は−ＯＣＨ3、ｎ：１〜３
（化合物Ｂ）
Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e、Ｒ5f、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10：Ｈ、Ｒ11：−ＯＨ又は−ＯＣＨ3、ｎ：１
前記一般式（II）で示される化合物において、五員環において隣接する環員炭素原子間で二重結合が形成された化合物であって、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e及びＲ5fの一つが水酸基であってもよい化合物の具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｃ）
【００４０】
【化１１】
2005130778.tif 000010
（化合物Ｄ）
【００４１】
【化１２】
2005130778.tif 000011
（化合物Ｅ）
【００４２】
【化１３】
2005130778.tif 000012
（化合物Ｆ）
【００４３】
【化１４】
2005130778.tif 000013
前記一般式（ＩＩ）において示される化合物の好ましいものとしては、R5a、R5b、R5c、R5d、R5e、R5f、R6、R7、R8、R9及びR10が水素原子であり、R11が水酸基又はメトキシ基であり、C1−C2−C3−C4−C5−C6からなる側鎖が、二重結合を含まないか、あるいはC1とC2、C2とC3、C3とC4の間の少なくとも１つにおいて二重結合を形成している化合物が挙げられる。
【００４４】
本発明で使用される前記一般式（ＩＩ）で示されるジャスモン酸類には種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）が存在するが、それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよい。
【００４５】
以上のジャスモン酸類の中でも前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e、Ｒ5f、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10が水素原子であり、Ｒ11がメトキシ基であり、ｎが１であり、Ｃ3とＣ4の間で二重結合を形成しているジャスモン酸のメチルエステルが生産性向上に対する効果の大きさの点から特に好ましい。
【００４６】
これらジャスモン酸類は、培養系外から添加するほかに、使用する培養細胞又は培養組織に自ら生産させることもできる。この内在性ジャスモン酸類の培養細胞又は培養組織による生産を促進する方法としては、微生物の培養物又はその抽出物、熱処理物或いは植物抽出物の培地への添加を例示することができる。さらに、使用する細胞又はカルスに、機械的に又は紫外線、熱などによって部分的に傷害を与えることによっても、内在性ジャスモン酸の生産量を高めることが可能である。
【００４７】
ジャスモン酸類は、水に難溶性の為、通常エタノール、メタノール等の有機溶媒、又は界面活性剤等に溶解した後、培地に添加する。また、遊離形のジャスモン酸類は、そのまま添加してもよいし、アルカリで中和して塩にして用いてもよい。
【００４８】
前記一般式（ＩＩ）で示される化合物は、五員環カルボニル基のα位が、酸、
アルカリ、熱によってエピマー化を起こす為、不安定なシス型より安定なトランス型になりやすい。天然又は合成ジャスモン酸を用いた平衡実験では、トランス型が９０％、シス型が１０％の状態で存在する。一般には、シス型の方が活性が強いとされているが、本発明で使用することができるジャスモン酸類は、前記一般式（ＩＩ）で示される全ての立体異性体化合物及びその混合物を包含する。
【００４９】
本発明において、ジャスモン酸類は、培地における濃度を１０〜１０００μＭとすることが好ましく、より好ましくはジャスモン酸類の濃度を３０〜３００μＭ、更に好ましくは１００〜３００μＭの範囲に調整するとよい。
【００５０】
またジャスモン酸類の添加時期としては、該培養物の培養期間中であれば特に制限は無いが、誘導期ないしは対数増殖期、より好ましくは対数増殖期にある培養細胞またはカルスに添加することが好ましい。
【００５１】
本発明において不定胚形成阻害物質としては、例えば４−ヒドロキシベンジルアルコール、４−ヒドロキシ安息香酸、ツニカナマイシン、１，２−ベンズイソキサゾール−３−酢酸、ブレフェルジンＡ、アラビノガラクタンプロテインを例示する事ができるが、中でも４−ヒドロキシベンジルアルコールが、オレアナン型トリテルペン産生量の向上効果の点において特に好ましい。
【００５２】
本発明において、特に重要な化合物である４−ヒドロキシベンジルアルコールは、胚の形成に関わる制御物質の一つと定義されているが、一方で、該化合物を植物の二次代謝産物の生産を誘導する目的に使用した例は現在に至るまで全く報告されていない。従って、メリアンサス属植物の培養細胞にオレアナン型トリテルペンを生産させるにあたり、該化合物の存在下で培養を行う事によりオレアナン型トリテルペンの生産量が増大する事は全く予想外の事であった。
【００５３】
本発明において、不定胚形成阻害物質は、培地における濃度が０．０１〜１０００μＭとすることが好ましく、より好ましくは不定胚形成阻害物質の濃度を０．１〜１００μＭ、更に好ましくは１〜１０μＭの範囲に調整するとよい。
【００５４】
また不定胚形成阻害物質の添加時期としては、該培養物の培養期間中であれば特に制限は無いが、誘導期にある細胞に添加することが好ましい。
【００５５】
本発明の対象となるカザミノ酸は、市販品など一般に使用されるものであれば特に制限は無い。カザミノ酸の培地における濃度は、０．１〜１重量％の範囲であることが好ましい。また本発明においてカザミノ酸の添加時期は、後述の培地成分と共に培地調整時に添加することが特に好ましい。
【００５６】
カザミノ酸を含む培養培地を用いて前記培養細胞を培養すると、カザミノ酸を含まない培地で培養した細胞に比べ細胞収量が増加する。また、培養を２段で行い、１段目において該培養細胞をカザミノ酸の存在下で培養した後、２段目の培養において前記一般式（ＩＩ）で示されるジャスモン酸類又は前記の不定胚形成阻害物質の存在下に培養を行うと、オレアナン型トリテルペンの生産量は１段目においてカザミノ酸非存在下で培養した細胞に比べ更に増加する。
【００５７】
本発明における培養細胞又はカルスの培養に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ・スクーグ（１９６２年）〔Murashige & Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（１９６５年)〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・メディウ（１９８１年）  〔Woody Plant Medium〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等が挙げられる。
【００５８】
これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を添加することもできる。
【００５９】
炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。
【００６０】
無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。
【００６１】
植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。
【００６２】
ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。
【００６３】
アミノ酸類としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加できる。
【００６４】
一般に前記の各成分は、無機成分が約０．１μＭないし１００ｍＭ、炭素源が約１〜約３０ｇ／Ｌ、植物ホルモン類が約０．０１〜約１００μＭ、ビタミン類およびアミノ酸類がそれぞれ約０．１〜約１００ｍｇ／Ｌの濃度で用いられる。
【００６５】
なお、本発明には液体培地および寒天やゲランガム等を通常０．１〜１重量％含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。
【００６６】
本発明において、前記植物から誘導した培養細胞を上記の培地を用いて数代培養すると、オレアナン型トリテルペンを生産する培養細胞が得られる。また、該培養細胞を前記一般式（ＩＩ）で示されるジャスモン酸誘導体又は前記の不定胚形成阻害物質の存在下に培養すると、無添加または無処理の場合と比較して、オレアナン型トリテルペンの生産性が向上した培養細胞が得られる。更に、培養を２段で行い、１段目の培養において該培養細胞をカザミノ酸の存在下に培養を行い細胞収量を高めた後に、２段目の培養において前記ジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質が存在する培地にて培養すると、オレアナン型トリテルペンの生産性が更に向上した培養細胞が得られる。
【００６７】
以上のようにして得られた培養細胞のメタノール抽出物又は培地を、ＮａＯＨ等を用いてアルカリ加水分解処理した後、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒による抽出によってオレアナン型トリテルペンを分離することができる。
【００６８】
本発明における組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。
【００６９】
先ずメリアンサス属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、１０〜３５℃で１４〜６０日程度経過させて組織片の一部から脱分化した細胞を誘導する。このようにして得られた脱分化細胞を継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化した培養細胞が得られる。
【００７０】
この安定化した培養細胞を増殖に適した液体培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体培地に移して増殖させる。液体培地において培養細胞の生育速度が更に高められる。本発明では、この安定化した培養細胞は前記培地にてそのまま継代を続けるか、或いは一般式（ＩＩ）で示されるジャスモン酸誘導体又は不定胚形成阻害物質を含有する固体培地又は液体培地で培養される。
【００７１】
培養を２段で行う場合、１段目の培養においてカザミノ酸を含む前記培地で少なくとも１代以上継代を行い細胞収量を高めた後、２段目の培養においてジャスモン酸類又は不定胚形成阻害物質を添加して培養を行うが、その際、この２段目の培養に用いる培地中にカザミノ酸が含まれていても良い。また、２段目に移行する細胞の状態は増殖期ないし定常期であることが好ましい。
【００７２】
細胞培養の取得及びオレアナン型トリテルペンの生産のための組織培養の培養温度としては、通常は約１０〜約３５℃、特に約２３〜２８℃が増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、１４〜４２日間が好適である。
【００７３】
本発明における培養方法において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーションまたは濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞のメタノール抽出物又は培地をＮａＯＨ等を用いてアルカリ加水分解処理した後、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒による抽出によってオレアナン型トリテルペンを分離することができる。
【００７４】
本発明の方法によれば、一般式（Ｉ）で示される化合物の１種を、あるいはその２種以上の混合物、例えば、エステル化していないフリーのオレアナン型トリテルペン、エステル化したオレアナン型トリテルペンの１種、あるいはエステル化したオレアナン型トリテルペンの２種以上の混合物などを得ることができる。
【実施例】
【００７５】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
ナフタレン酢酸を１０-4Ｍの濃度になるように添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培地（ゲランガム０．２５重量％）に、２容量％アンチホルミン溶液および７０容量％エタノール溶液等で滅菌処理した種子から発芽させたメリアンサス  コモサスの胚軸の一部を置床し、２５℃で暗所にて静置培養してメリアンサス  コモサスの培養細胞を得た。次にこの培養細胞０．５ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウムの液体培地２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、２１日毎に植えつぎ、該培養細胞の生育速度を速めた。
【００７６】
このようにして得られた細胞１．５ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移した後、ジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステル（前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e、Ｒ5f、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10が水素原子であり、R11がメトキシ基であり、ｎが１であり、Ｃ3とＣ4の間のみに二重結合を含んでいる化合物、トランス型９０％、シス型１０％）をその終濃度が１０〜１０００μＭになるように添加し、さらに１４日間培養した。
【００７７】
培養終了後、メリアンサスコモサス培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求めた。次に、この乾燥カルスをメタノールで抽出し、抽出液を濃縮乾固した後水に再溶解して得られた抽出物の水溶液と、細胞を除去した後の培地に、それぞれＮａＯＨ溶液を終濃度が２Ｍになるよう加え、９０℃で３〜６時間加熱処理した。加熱処理終了後、各反応液にＨＣｌ溶液を加え反応液内ｐＨを酸性化し、これにジクロロメタンを加えて分配抽出した後、この抽出液を濃縮乾固することによりジクロロメタン抽出物を得た。
【００７８】
得られたジクロロメタン抽出物をメタノールで溶解した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品と比較定量することによってミリセロール収量を測定した。その結果を表１に示す。
【００７９】
（実施例２）
実施例１において、ジャスモン酸のメチルエステルに代えて４−ヒドロキシベンジルアルコールを終濃度が０．０１〜１０００μＭになるように添加した以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１に示す。
（実施例３）
実施例１において、ジャスモン酸のメチルエステルを添加しない以外は実施例１と同様に操作した。その結果を表１に示す。
（実施例４）
次に、培養を２段に分けて行った時の、オレアナン型トリテルペンの生産向上効果を調べた。すなわち、ナフタレン酢酸を１０-4Ｍの濃度になるように添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培地（ゲランガム０．２５重量％）に、２容量％アンチホルミン溶液および７０容量％エタノール溶液等で滅菌処理した種子から発芽させたメリアンサス  コモサスの胚軸の一部を置床し、２５℃で暗所にて静置培養してメリアンサス  コモサスの培養細胞を得た。次にこの培養細胞０．５ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウムの液体培地２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、２１日毎に植えつぎ、該培養細胞の生育速度を速めた。
【００８０】
このようにして得られた細胞０．５ｇ（新鮮重）を、先ず１段目の培養として前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移した後、カザミノ酸をその終濃度が０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加し、さらに２１日間培養した。
【００８１】
次に２段目の培養として、１段目の培養で得られた細胞１．５ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ジャスモン酸類としてジャスモン酸のメチルエステルをその終濃度が１０〜１０００μＭになるように添加し、さらに１４日間培養した。
【００８２】
以上の培養終了後、実施例１記載の方法と同様の操作により細胞を回収し、ミリセロールを抽出、定量した。その結果を表１に示す。
【００８３】
（実施例５）
実施例４において、２段目の培養でウッディー・プラント・メディウムにジャスモン酸のメチルエステルに代えて４−ヒドロキシベンジルアルコールを終濃度が０．０１〜１０００μＭになるように添加した以外は実施例４と同様に操作した。その結果を表１に示す。
（実施例６）
実施例４において、２段目の培養でジャスモン酸のメチルエステルを添加しない以外は実施例４と同様に操作した。その結果を表１に示す。
（実施例７）
実施例４において、1段目の培養でウッディー・プラント・メディウムにカザミノ酸を終濃度が０．１〜１％（ｗ／ｖ）になるよう添加したこと、及び２段目の培養でジャスモン酸のメチルエステルを１００μＭ添加した以外は実施例４と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2005130778.tif 000014
（*)：収量は総生産量（細胞中+培地中）により算出した。）
（実施例８）
実施例４において、１段目の培養終了後、該培養細胞を濾過により採取し細胞の生重量を測定した。同様の操作を３回繰り返して行った結果を表２に示す。
（実施例９）
実施例８において、ウッディー・プラント・メディウムにカザミノ酸を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表２に示す。
【００８５】
【表２】
2005130778.tif 000015
（実施例１０）
実施例４において、２段目の培養でジャスモン酸のメチルエステルを終濃度が３００μＭになるよう培養０日目（ここで、培養０日目とは、培養細胞を三角フラスコに移した直後の状態を示す）、又は培養１日目（ここで、培養１日目とは、培養細胞を三角フラスコに移した後、１日間旋回培養した後の状態を示す）、又は培養４日目（ここで、培養４日目とは、培養細胞を三角フラスコに移した後、４日間旋回培養した後の状態を示す）、又は培養７日目（ここで、培養７日目とは、培養細胞を三角フラスコに移した後、７日間旋回培養した後の状態を示す）、又は培養１０日目（ここで、培養１０日目とは、培養細胞を三角フラスコに移した後、１０日間旋回培養した後の状態を示す）にそれぞれ添加し、培養２１日目（ここで、培養２１日目とは、培養細胞を三角フラスコに移した後、２１日間旋回培養した後の状態を示す）に細胞を採取した以外は実施例４と同様に操作した。その結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
2005130778.tif 000016
（*)：収量は総生産量（細胞中+培地中）により算出した。）
（実施例１１）
実施例４において、２段目の培養でウッディー・プラント・メディウムにジャスモン酸のメチルエステルに代えてジヒドロジャスモン酸のメチルエステル（前記一般式（Ｉ）において、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c、Ｒ5d、Ｒ5e、Ｒ5f、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10が水素原子であり、Ｒ11がメトキシ基であり、ｎが１である化合物）を、その終濃度が１０〜１０００μＭになるよう添加した以外は実施例４と同様に操作した。その結果を表４に示す。
（実施例１２）
実施例１１において、２段目の培養でジヒドロジャスモン酸のメチルエステルを添加しない以外は実施例１１と同様に操作した。その結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
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（*)：収量は総生産量（細胞中+培地中）により算出した。）