(57)【要約】【課題】        細胞の形態および機能を生体内の細胞と同様に発現させることが可能な三次元細胞培養担体およびそれを用いる三次元高密度細胞培養方法ならびに該細胞培養方法により得られる三次元動物および植物細胞を提供することにある。【解決手段】    三次元細胞培養担体を収容したバイオリアクターによる細胞の三次元培養方法であって、該三次元細胞培養担体が、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料を含有する材料であることを特徴とするヒト由来細胞、動物細胞または植物細胞の三次元細胞培養方法。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元細胞培養担体を収容したバイオリアクターによる細胞の三次元培養方法であって、
該三次元細胞培養担体が、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料を含有する材料であることを特徴とするヒト由来細胞、動物細胞または植物細胞の三次元細胞培養方法。
【請求項２】
三次元細胞培養担体を収容したバイオリアクターによる細胞の培養方法であって、
該三次元細胞培養担体が、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料と細胞外マトリクス成分とを含有する材料であることを特徴とするヒト由来細胞、動物細胞または植物細胞の三次元細胞培養方法。
【請求項３】
前記フラーレンが、Ｃ60またはＣ70フラーレンまたはこれらの混合体である請求項１または２に記載の三次元細胞培養方法。
【請求項４】
前記フラーレンが、水酸化フラーレン（Ｃ60(ＯＨ)n）または多孔質フラーレンである請求項１または２に記載の三次元細胞培養方法。
【請求項５】
前記フラーレン、カーボンナノチューブまたはピーポットは、アミノ酸またはペプチドが塗布されてなる細胞培養担体である請求項１または２に記載の三次元細胞培養方法。
【請求項６】
前記細胞外マトリクス成分が、ラミニン、コラーゲン、フィプロネクチン、フィブリン、ヒドロネクチニン、マトリゲル、インテグリン、ビトロゲンおよびグリコサミノグリカンからなる群より選択される少なくとも一種の接着タンパク質である請求項１または２に記載の三次元細胞培養方法。
【請求項７】
三次元細胞培養担体を収容したバイオリアクターによる細胞の三次元培養方法であって、
該細胞担体が、前記フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料とシラン(TM)、ヒドロキシアパタイト、ポリビニルアルコール樹脂またはポリウレタン樹脂の顆粒との混合体であることを特徴とするヒト由来細胞、その他の動物細胞または植物細胞の三次元細胞培養方法。
【請求項８】
前記バイオリアクターがラジアルフロー型バイオリアクターまたは液体培地による培地流動型バイオリアクターである請求項１、２または７に記載の三次元細胞培養方法。
【請求項９】
動物細胞または植物細胞の三次元培養方法に用いられる細胞培養担体であって、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料を含有する材料および細胞外マトリクス成分を含有することを特徴とする三次元細胞培養担体。
【請求項１０】
請求項１または２に係る動物細胞または植物細胞の三次元培養により得られる三次元細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来細胞、動物細胞および植物細胞の三次元培養担体および三次元細胞培養方法ならびに該三次元細胞培養方法により得られる三次元動物および植物細胞に関するものであり、さらに詳しくは、フラーレン、カーボンナノチューブまたはピーポットを含有する細胞培養担体、およびそれを用いるヒト由来細胞、動物細胞および植物細胞の三次元高密度培養方法ならびに三次元細胞培養担体上に形成された三次元動物および植物細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過去４０年間、動物細胞の培養技術において、平底フラスコ等を用いた平面培養が一般化している。しかし、かかる二次元的、かつ人工的な方法で培養された細胞は、本来的に細胞のもつ酵素活性および生合成活性等を発揮し得ていないことが報告されるに至っている（Nature 424, 870(2003), Science 302, 46(2003)）。
【０００３】
かかる状況下において、細胞の生着、増殖を促進させ、細胞機能を維持、向上させ、細胞形態を生体内に近い形態に保持できるような三次元形状に賦形化した糖鎖高分子からなる細胞培養基材が提案されている（特許文献１参照。）。
【０００４】
しかし、動物細胞を三次元的に高密度で培養するためには細胞群の内部に位置する細胞にも培養液を供給する必要のあることが指摘されているが、生体外では、生体内の血管系に相当する手段がないため各種の細胞培養基材を用いても培養液の供給が十分でなく、培養効率において改良すべき点が残されている。
【０００５】
また、従来、開発されている培養装置としては細胞を固定化させた担体が液体培地に浮遊状態に保つ流動層型バイオリアクターと細胞が固定化された担体を培養槽内に充填させた固定層型バイオリアクター等を挙げることができるが、これらのバイオリアクターについてもなお難点がある。
【０００６】
例えば、細胞の三次元培養に使用される装置として前記固定層型バイオリアクターの一種として中空系担体を使用する中空系型培養装置が利用されている。かかる培養装置は、ファイバー内に培養液を流通させ、ファイバー外の細胞に培養液を供給するものであるが、細胞が増殖すると、ファイバーから離れた細胞には十分な培養液が供給できない、という問題があり、また、細胞は下方に集積することもあり、全体に均一な培養を行なうことが困難であることも指摘されている。かかる状況から、細胞集合体の内部にまで培養液の供給が可能であり、細胞の均一培養が可能な三次元的でかつ高密度な細胞培養方法の開発が切望されてきた。
【特許文献１】特開２００１−３７４７２号公報
【非特許文献１】ネイチュアー（Nature）424, 870(2003)
【非特許文献２】サイエンス（Science）302, 46(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、細胞の形態および機能を生体内の細胞と同様に発現させることが可能な三次元細胞培養担体およびそれを用いる三次元高密度細胞培養方法ならびに該細胞培養方法により得られる三次元動物および植物細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、前記の如き従来からの三次元細胞培養に関する開発状況に鑑み、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、ラジアルフロー型バイオリアクターまたは培地流動型バイオリアクターによる細胞の培養方法において、該バイオリアクターに収容される細胞培養担体として、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットまたは該フラーレン等、特に水酸化フラーレンと細胞外マトリクス成分を用いることにより、高密度で高効率の細胞培養が達成できることに着目し、これらの知見に基いて本発明を完成した。
【０００９】
かくして、本発明によれば、
三次元細胞培養担体を収容したバイオリアクターによる細胞の三次元培養方法であって、
該三次元細胞培養担体が、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料を含有する材料であることを特徴とするヒト由来細胞、動物細胞または植物細胞の三次元細胞培養方法
が提供される。
【００１０】
また、本発明によれば、
三次元細胞培養担体を収容したバイオリアクターによる細胞の培養方法であって、
該三次元細胞培養担体が、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料と細胞外マトリクス成分とを含有する材料であることを特徴とするヒト由来細胞、動物細胞または植物細胞の三次元細胞培養方法
が提供される。
【００１１】
さらに、本発明によれば、
三次元細胞培養方法に用いられる細胞培養担体であって、フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料および細胞外マトリクス成分を含有する材料からなることを特徴とする細胞培養担体
が提供される。
【００１２】
また、本発明によれば、
前記三次元細胞培養方法により得られる三次元動物および植物細胞
が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、動植物細胞の三次元的でかつ高密度培養を可能とする培養方法および培養担体を提供することができ、ヒト由来細胞、動物細胞、植物細胞の有する生理活性の誘起および生理活性物質の産生が生体内でのそれらと生態的に、形態的に同様または近い量と質において実現することができる。
具体的には、従来の平面培養に比較して約１００〜２００倍効率を上げることができ、また、これら細胞の正確かつ資質的な性状を明確に把握することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、前記の如く、
第一の発明は、細胞培養担体を収容したラジアルフロー型バイオリアクターまたは培地流動型バイオリアクターによる動物細胞および植物細胞の三次元的培養方法を提供するものであり、
第二の発明は、該培養方法に用いられる細胞培養担体であって、炭素フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料を含有する材料または該フラーレン、カーボンナノチューブおよびピーポットからなる群より選択される少なくとも一種の炭素ナノ材料と細胞外成分となる細胞培養担体を提供するものであるが、さらに好ましい実施態様として次の１）〜１２）に掲げるものを包含する。
【００１５】
１）Ｃ60フラーレンとラミニンとの混合体であって、重量比で該フラーレン１に対しラミニンが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
２）Ｃ60フラーレンとＣ70フラーレンとの混合体およびラミニンとの混合体であって、重量比で該フラーレン混合体１に対し０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
３）多孔質フラーレンとラミニンとの混合体であって、重量比で該多孔質フラーレン１に対しラミニンが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
４）Ｃ60フラーレンとマトリゲルとの混合体であって、重量比で該フラーレン１に対しマトリゲルが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
５）Ｃ60フラーレンとフィブロネクチンとの混合体であって、重量比で該フラーレン１に対しフィブロネクチンが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
６）Ｃ60フラーレンとコラーゲンとの混合体であって、重量比で該フラーレン１に対しコラーゲンが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
７）Ｃ60フラーレンとインテグリンとの混合体であって、重量比で該フラーレン１に対しインテグリンが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
８）水酸化フラーレンにラミニンの細胞結合部位ペプチドであるＩＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ、ＰＤＳＧＲまたはＲＧＤが化学的に結合してなる三次元細胞培養担体。
９）水酸化フラーレンにフィブロネクチンの結合部位ペプチドであるＲＧＤ、ＣＳ−１、ＣＳ−５またはＳＡＳが化学的に結合してなる三次元細胞培養担体。
１０）カーボンナノチューブとラミニンおよび/またはマトリゲルとの混合体であって、重量比で該フラーレン１に対しラミニンが０．１０〜０．５０の割合の三次元細胞培養担体。
１１）ラミニンおよび/またはマトリゲルにより処理してなるカーボンナノチューブからなる三次元細胞培養担体。
１２）Ｃ60フラーレンとカーボンナノチューブの混合体であってＣ60フラーレン１に対し重量比でカーボンナノチューブが１：０．１〜１：０．５である三次元細胞培養担体。
【００１６】
本発明に係る細胞の培養方法において用いられる動物細胞としては、具体的には間質細胞、肝ガン細胞、ＨｅｐＧ２、同ＦＬＣ細胞、膵細胞等の増殖性をもち従来の平面培養では生物活性を発現できない細胞を、また、植物細胞としても同様に、ニンジン、シイタケ等を挙げることができる。また、本発明において、「細胞」とは、細胞、タンパク合成能、ＤＮＡ合成能等を有する無細胞系を包含するものをいう。
【００１７】
また、三次元細胞培養担体は、フラーレン、カーボンナノチューブまたはピーポットが必須の成分であり、該成分と細胞外マトリクス成分とからなる混合体を含有する材料である。
【００１８】
フラーレンは、基本的には炭素原子のみから構成される安定炭素同素体であり、５員環１２個と６員環からなる多面体球状構造を有するものである。実験的に単離、精製、同定された最小サイズのフラーレンはＣ60であり、安定的に単離されるフラーレンとしてはＣ60フラーレン、Ｃ70フラーレン以外にも多くの高次フラーレンが知られている。サイズの増大と共に内部の自由空間が大きくなり、また、高次フラーレンでは同一のサイズでも同形またはチューブ状の構造の異なる構造異性体が得られる。本発明の培養方法において用いられる細胞培養担体としては、かかるフラーレンは特に限定されるものではなく、Ｃ60フラーレン、Ｃ70フラーレン、Ｃ79フラーレン、Ｃ96フラーレン等を挙げることがきるが、特にＣ60、Ｃ70等のフラーレンが好適である。
【００１９】
フラーレン分子は、黒鉛から希ガス（主としてＨｅ、Ａｒ等）でアーク放電、パルスレーザー照射等により炭素蒸気を調製し、そのガスを冷却する際に生成する炭素スス中から収得することができるが、市販品として、例えば、三菱化学社製品「ＭＳ−Ｆ」等を採用することができる。                            
かかるフラーレンは、細胞培養担体として単体、化学修飾、塗布処理、連結形、異形型の形態で用いることが好ましい。
【００２０】
また、三次元細胞培養担体を調製するには、細胞とフラーレンおよび／またはカーボンナノチューブを重量比で１：１〜１：４の割合で混合し、同時に該細胞と前記細胞外マトリックス成分との割合を１：０．１〜１：０．５の割合で混合し、次いでフラーレン・マトリックス複合体等の方法により立体構造に賦形化することができる。
【００２１】
さらに、フラーレンとしては、水酸化フラーレン（Ｃ60(ＯＨ)n)が好適であり、水酸化フラーレンは、一般式Ｃ60(ＯＨ)n(式中、ｎは、１０〜２０）で表わされる化合物であり、その水酸基との化学反応により細胞外マトリクス成分その他の有機成分を化学修飾したものを挙げることができる。
例えば、本発明者が作製したＣ60水酸化フラーレンにラミニン活性部位ＩＫＶＡＶペプチドをエステル結合により導入した細胞培養用分子スカフォルド（支持体）のモデル（実際には１個のフラーレンに１０個のＩＫＶＡＶが結合。）を図１に示す。
【００２２】
また、カーボンナノチューブは、フラーレンと同様に炭素原子の５員環と６員環のネットワークから構成されたものであり、フラーレンと同程度の直径をもち、長さは１ｍｍにもなる超極細の一方が閉鎖されたチューブ状分子である。本発明に係る三次元細胞培養担体にとっては、単層ナノチューブまたは複層ナノチューブのいずれでもよく、特に限定されるものではない。ナノチューブを分子スカフォルド（支持体）として機能する際には図２に示すように、人工的な手法によりナノチューブにナノチューブ・フラーレン結合により結合したＩＫＶＡＶ水酸化フラーレンに細胞が吸着するものと推定される。
【００２３】
また、図３によれば、ＩＫＶＡＶ水酸化フラーレンが細胞の周囲に分散し、培養液が立体的に供給され、三次元培養が可能になるのに対し、図４によれば、従来の平面培養が模式的に示されている。
【００２４】
さらに、本発明においては、フラーレンとカーボンナノチューブとの複合体「ピーポット」（Peapod）、例えば、フラーレンを内包したカーボンナノチューブを用いることもまた、本発明の三次元培養方法によれば、前記炭素ナノ材料のほか、金属内包カーボンナノチューブ等も用いることができる。
【００２５】
フラーレン、カーボンナノチューブ等が、細胞の培養に有効な理由は、これら炭素化合物が不活性であり、未だ十分解明されていないが、本発明者の検討によればフラーレン、カーボンナノチューブが内部に有する微細な自由空間内にイオン電解質、栄養成分および培養液を流動状態で保持できることが一つの要因と推定することができる。また、細胞分子スカフォルド（支持体）として１μｍ〜１０ｎｍのサイズが１００μｍ〜２００μｍの細胞の立体培養を維持するのに生物学的に適していると推定される。さらにフラーレンが生物活性をもたず、不活性であること、かつ水溶性でないことが担体としての利点である。
【００２６】
本発明に係る細胞培養担体の構成成分としての細胞外マトリクス成分は、動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物であり、細胞が合成し分泌した蓄積物であり、特に、ラミニン、コラーゲン、フィブリオネクチン、フィブリン、ビトロネクチニン、マトリゲル、インテグリン、ビトロゲン、グリコサミノグリカン等の糖タンパク質を含むものであり、細胞接着活性を有するものである。
かかる細胞外マトリクス成分は、ベクトン・ディキンソン社のマトリゲル、フィブロネクチン、旭テクノガラス社のラミニンとして入手することができる。
【００２７】
本発明に係る細胞培養担体は、前記フラーレン（Ａ）とかかる細胞外マトリクス成分（Ｂ）とを、重量比として（Ａ）：（Ｂ）１．０〜０．１：１．０〜０．２、好ましくは、１．０〜０．２：１．０〜０．５の割合で混合してなるものである。
【００２８】
また、フラーレン上に塗布されるアミノ酸、ペプチドとしては、具体的にはＬ−アスパラギン塩酸塩、Ｌ−アラニン、アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタノメート、グリシン、グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、インシュリン等を挙げることができる。
さらに、フラーレンの比表面積を増大させるために多孔質化、またはフラーレン分子の連結による大型化、変形、カーボンナノチューブとの連結等の処理に供される。
【００２９】
本発明に係る細胞の培養方法において、細胞培養担体として、シラン(Siran)(TM)、ヒドロキシアパタイト、ポリビニルアルコール樹脂またはポリウレタン樹脂を炭素フラーレンとの混合体が提供される。
【００３０】
シラン(Siran)は、ドイツ国ショットグラスベック社の多孔質ガラスビーズの商品名である。また、ヒドロキシアパタイトは、Ａ10(ＭＯ4)5Ｘ2の化学組成をもつ六方晶系に属する結晶であり、Ｃａ10(ＰＯ4)5(ＯＨ)2の組成を有するリン酸カルシウム系の無機材料である。本発明においては、ヒドロキシアパタイトは繊維状または顆粒状としたものが用いられる。粒径０．６〜１．０ｍｍ、気孔率８０％程度のものが好ましい。市販品としてペンタックス社製「セルヤード２００」を入手することができる。
【００３１】
ポリビニルアルコール樹脂は、特に限定されるものではないが、気孔径；０．１〜０．２ｍｍ、気孔率；８０〜９０％のものが好ましい。市販品としては室町科学社製「ＭＰＶＡ」を利用することができる。
ポリウレタン樹脂としても、特に限定されるものではないが、気孔径；０．０５〜１．０ｍｍ、特に０．２〜０．５ｍｍのものが好ましい。市販品としてイノアック社製「ＩＰＵ」を利用することができる。
こられのシラン、ヒドロキシアパタイト、ポリビニルアルコール樹脂、ポリウレタン樹脂は顆粒状で用いられ、フラーレン１に対し、０．２〜１０、好ましくは１〜０．１４の割合（重量比）で混合される。
【００３２】
次に、細胞の培養方法に用いられるバイオリアクターについて説明する。
本発明に係る細胞の培養方法に用いられるバイオリアクターとしては、ラジアルフロー型バイオリアクターおよび培地流動型バイオリアクターを挙げることができる。
【００３３】
前記ラジアルフロー型バイオリアクターは、細胞が固定化された担体を培養槽内に充填した固定層型のものであれば、特に限定されるものではなく、従来、提案されている各種形式のもの、例えば、一例を挙げると、図７に示すラジアルフロー型バイオリアクターを用いることができる。すなわち、該ラジアルフロー型バイオリアクター１の円筒形の本体２内に三次元細胞培養担体３を充填して使用される。
【００３４】
この形式のバイオリアクターでは、タンク下端から上方へ培養液が供給され、上方出口から排出され、培養液は培養液貯蔵容器（図示なし。）に蓄えられる。
また、ラジアルフロー型バイオリアクターは、複数の酸素補強用パイプ、複数の培養液回収パイプが設けられ、担体の充填位置との関連で栄養分濃度、溶存酸素濃度がリアクター内に均一に分布するように配置される。
【００３５】
［実施例］
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。もっとも本発明は、下記実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
肝臓の生産する血清アルブミンは、肝細胞の機能をしめす重要な指標の一つであるが、アルブミンの生産性を用い、本発明によるフラーレンを分子スカフォルド（細胞培養支持体）の効用を実施した。ヒト由来の肝がん細胞ＨｅｐＧ２を用い、肝臓細胞の機能の一つである血清アルブミンの産生量を示した。本発明により、水酸化フラーレンの水酸基に、ラミニンの活性部位の一つであるＩＫＶＡＶペプチドを、この端末カルボン酸とのエステル結合により、フラーレンの一分子に平均ペプチド１０個を導入した。ＨｅｐＧ２細胞は、ＲＦＢ（ラジアル・フロー・バイオリアクター（以下本明細書において同じ。）。）培養中化学修飾されたフラーレンに吸着された。この結果、本発明による培養では、従来の平面培養よりも約１２倍の血清アルブミン生産量の増大が見られた。さらに、この収率は、シラン（ガラス）およびヒドロキシアパタイトなどの担体によるＲＦＢ培養よりも５０％以上の高収率が得られた。
本発明の実施例においては、すべて細胞の培養培地は、無血清のＡＦＳ１０４（味の素製）、５％炭酸ガス気流中３７℃で４日間培養した。培養後、培地上清液中のアルブミン量を液体クロマトグラフィーで定量した。
【実施例２】
【００３７】
ヒト由来の肝がん細胞ＨｅｐＧ２または同様のＦＬＣ−４肝がん細胞を用い、薬物代謝に重要なチトクロームＰ４５０（以下ＣＹＰと略す）３Ａ４のｍＲＮＡをマーカーとして、本発明によるフラーレンを分子スカフォルドとするＲＦＢ培養と従来の平面培養における生産量の効果を比較した。フラーレン担体ＦＲＢ培養では、ＣＹＰ３Ａ４の生産量は平面培養の１２０倍高い生産量であった。さらに、シラン（ガラス）またはヒドロキシアパタイトを担体とするＦＲＢ培養よりも１．２倍の高収率であった。平面培養は、スミロン・シャーレ（φ１５ｃｍ、住友ベークライト社製）を使用した。
【００３８】
培養した細胞は、０．０２％のＥＤＴＡを添加したトリプシン２５ＵＳＰ単位／ｍｌ、ＤＩＦＣＯ製）で処理した。ＲＦＢ装置および附属機器はエイブル社製（ＲＡ−１５）を、ＲＦＢ用のフラーレン細胞担体は、５％ラミニン（旭テクノガラス社製）および２％マトリゲル（ＢＤ社製）の混合液で処理し、一旦クリーンベンチ内で乾燥した後用いた。また、ラジアルフローの担体用のチャンバーは、内部の外周と上部、底面をナノチューブのシートで完全に覆い、細胞の流出を防いであるが、このかご型ナノチューブもフィブロネクチン（ＢＤ社製）で塗布し、処理した。ＲＦＢ培養で比較のため、シラン（ショット社製）およびヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）をＲＦＢ培養担体として使用した。
【００３９】
ｍＲＮＡの同定と定量はＲＴ−ＰＣＲ法によった。ＰＣＲ装置（７７００型）および試薬キット（ＭＭＲ）はPerkin Elmer Applied Biosystems社製を使用した。ＰＣＲ用プライマーは５’末端１４マー、３’末端２８マーを設計、合成した。ミクロソーム分画は、１０００ｒｐｍ−５分、１００００ｒｐｍ−１０分の遠心処理の後、１０００００ｒｐｍ−６０分のペレット分画を使用した。ＣＹＰの誘発剤としてリンファンピシンを添加した。また、ＧＡＰＤＨのＲＮＡ量を用いてｍＲＮＡ値の補正を行なった。
【実施例３】
【００４０】
ヒト由来の肝がん細胞ＨｅｐＧ２を用い、表１に示す細胞外マトリックスにより処理したフラーレンを培養担体とし、ＲＦＢ培養による血清アルブミンの生産性を測定した。培養条件は実施例の条件と同一とし、測定結果を三次元培養効果とした。
【００４１】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、ヒト由来細胞、動植物細胞および植物細胞の三次元的かつ高密度培養方法および三次元細胞培養担体を提供するものであり、立体培養方法により、本来的な細胞活性を誘発するため、生体組織内に存在するのと同様な高い生物活性をもつ培養細胞を収得することができる。かかる観点から新規産業の育成にも貢献可能な点が極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る三次元細胞培養用担体として用いるＩＫＶＡＶ水酸化フラーレンのモデルを示す模式図である。
【図２】本発明に係る三次元細胞培養担体として用いるカーボンナノチューブ結合ＩＫＶＡＶ水酸化フラーレンによる細胞の吸着状況を示す模式図である。
【図３】本発明に係る三次元細胞培養担体としてフラーレンおよびカーボンナノチューブを用いる三次元培養方法の状態を示す模式図である。
【図４】従来のフラスコによる平面培養の状態を示す模式図である。
【図５】本発明によるアルブミンの産生量と平面培養による産生量を示す比較図である。
【図６】本発明に係る肝細胞の三次元培養によるチトクロムＰ４５０のｍＲＮＡの産生量と平面培養による産生量を示す比較図である。
【図７】ラジアルフロー型バイオリアクターを例示した解説図である。
【符号の説明】
【００４４】
１  ラジアルフロー型バイオリアクター
２  バイオリアクター本体
３  細胞培養担体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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