(57)【要約】【課題】患者から採取した細胞を可溶化して得られる蛋白溶液中の癌マーカーの検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）に検出結果を得る事ができる癌マーカーの検出方法を提供すること。【解決手段】基板の表面に細胞を可溶化して得られる蛋白溶液中の癌マーカーを捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである癌マーカーを被捕捉物として特異的に捕捉し、該マーカーの由来細胞が癌細胞であるかどうかを識別する癌マーカーの検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の表面に細胞を可溶化して得られる蛋白溶液中の癌マーカーを捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである癌マーカーを被捕捉物として特異的に捕捉し、該マーカーの由来細胞が癌細胞であるかどうかを識別する癌マーカーの検出方法。
【請求項２】
捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含む請求項１記載の癌マーカーの検出方法。
【請求項３】
捕捉物である蛋白質が抗体である請求項２記載の癌マーカーの検出方法。
【請求項４】
癌マーカーがＣＥＡ、ＢＦＰ、ＴＰＡ、ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−II、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＤＵＰＡＮ−２、Span―１、ＮＣ
Ｃ−ＳＴ−４３９、エラスターゼ１、ＳＬＸ、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ５４／６１、ＳＣＣ抗原、ＮＳＥ、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＰＡＰ、ＰＳＡ、及びγ―Ｓｍからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１、２、又は３のいずれか記載の癌マーカーの検出方法。
【請求項５】
被捕捉物と抗癌マーカー抗体とを相互作用させる請求項１、２、３又は４のいずれか記載の癌マーカーの検出方法。
【請求項６】
抗癌マーカー抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、酵素標識されている請求項５記載の癌マーカーの検出方法。
【請求項７】
ビオチン標識された抗癌マーカー抗体と蛍光標識、又は、酵素標識されたアビジン又はストレプトアビジンと結合させる請求項６記載の癌マーカーの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
癌細胞は、誰にでも存在する一般的な蛋白質のほかに健康的な人体にはあまり存在しない特異的な蛋白質をもっていることがある。それらを総称して癌マーカー（若しくは腫瘍マーカー）と呼ぶ。本発明は、特異的にそれら癌マーカーを捕捉する物質を用いて、癌マーカーを捕捉し該マーカーの由来細胞が癌細胞であるかどうかを識別する検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の検診では、治療を受ける患者の病状を正確に把握する方法としてバイオプシー（生検）検査がある。すなわち病気診断や手術後の診断のために患者の生きた組織を内視鏡や注射針を用いて採取し検討する方法である。これは患者の組織より細胞を収集するので血液検査に比べて患者の負担が大きい。さらに診断室や手術室で採取した細胞サンプルより病気の指標となる蛋白質の有無を検査し、結果を得るには翌日以降にならなければ診断結果を確認することはできない。
【非特許文献１】「臨床外科」、医学書院 ５７、７３５−７３８（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、手術中に診断結果が得られ、結果が悪性の時、即座に診断状態の延長で悪性組織を除去でき患者の負担を軽減する事ができる癌細胞内癌マーカーの検出方法を提供することである。
また、できるだけ少ない組織の採取で診断でき、同様に患者の傷口を最小限に抑えられ負担を軽減できる癌細胞内癌マーカーの検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（１）基板の表面に細胞を可溶化して得られる蛋白溶液中の癌マーカーを捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである癌マーカーを被捕捉物として特異的に捕捉し、該マーカーの由来細胞が癌細胞であるかどうかを識別する癌マーカーの検出方法、
（２）捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含む（１）項記載の癌マーカーの検出方法、
（３）捕捉物である蛋白質が抗体である（２）項記載の癌マーカーの検出方法、
（４）癌マーカーがＣＥＡ、ＢＦＰ、ＴＰＡ、ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−II、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＤＵＰＡＮ−２、Span―１、ＮＣＣ−ＳＴ
−４３９、エラスターゼ１、ＳＬＸ、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ５４／６１、ＳＣＣ抗原、ＮＳＥ、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＰＡＰ、ＰＳＡ、γ―Ｓｍである（１）、（２）、又は（３）項のいずれか記載の癌マーカーの検出方法、
（５）被捕捉物と抗癌マーカー抗体とを相互作用させる（１）、（２）、（３）又は（４）項のいずれか記載の癌マーカーの検出方法、
（６）抗癌マーカー抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、酵素標識されている（５）項記載の癌マーカーの検出方法、
（７）ビオチン標識された抗癌マーカー抗体と蛍光標識、又は、酵素標識されたアビジン又はストレプトアビジンと結合させる（６）項記載の癌マーカーの検出方法、
である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の方法に従うと、患者から採取した細胞を可溶化して得られる蛋白溶液中の癌マーカーの検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）に検出結果を得る事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明に使用する検出方法は、固相基板表面の一部に捕捉物が固定化され、癌マーカーの検出ができることを特徴とする。
本発明の検出方法は、基板作製工程、基板表面修飾工程、捕捉物固定工程、ブロッキング工程、捕捉物／被捕捉物相互作用工程及び検出工程を含む。
基板表面処理工程は省いても使用可能であるが、より強固に捕捉物を固定化する為に用いる事が好ましい。
【０００７】
（基板の素材）
基板の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する固相基板の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂であることが好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。たとえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等をさす。
基板上で効率よく反応させる目的で基板内に流路を設けてもよい。
【０００８】
（基板の表面修飾）
本発明に使用する基板の表面修飾方法としては、種々の方法が用いられるが、アルデヒド基を導入すると捕捉物が基板上で共有結合し、より強固に固定されるので該基を導入することが好ましい。アルデヒド基の導入方法として好適に用いられるのは、アミノ基導入の後に多官能性アルデヒドを反応させる方法である。アミノ基の導入手段としては、アミノ基含有シランカップリング剤による処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性の観点から、アミノ基含有シランカップリング剤による処理が好ましい。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒドが好ましい。
【０００９】
（捕捉物の固定化）
本発明に使用する捕捉物は、アルデヒド基との反応性を高めるため、予めアミノ基を導入しておくことが好ましい。捕捉物が核酸の場合は、アミノ基の導入位置は核酸の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。蛋白質、ポリペプチドの場合は、アミノ基を具備している為、アミノ基導入の必要性はない。固定化は通常、生理活性物質を溶解した溶液を基板上に点着した後、適宜処理を施すことにより行う。
反応効率を上げる為に、流路をもった基板を使用する場合は流路内を前述のように修飾した後、捕捉物を固定してもよいが、微小球などに捕捉物を外部で固定化した後、流路内に導入しても構わない。
【００１０】
（ブロッキング工程）
捕捉物を固定化し、該捕捉物と被捕捉物を相互作用させる前に基板表面上で捕捉物が固定化されていない部分と被捕捉物が非特異的に吸着するのを防止する事をブロッキングとよぶ。本発明でブロッキングに使用する物質はスキムミルク、アルブミン、抗体及び抗体のＦｃ部分よりなる群より選択された少なくとも１種であることが好ましい。これらの物質を純水或いはトリス酸緩衝液で０．１〜１０重量％に調製し、その溶液中に生理活性物質が固定化された基板を浸し、基板表面の官能基と１〜３時間反応させることにより行う。
流路をもった基板を使用する場合は流路に該溶液を流入する。
【００１１】
（捕捉物／被捕捉物相互作用工程）
捕捉物が固定化され、ブロッキングが施された基板上に目的の癌マーカーの有無を知りたい細胞を可溶化し得られた蛋白質即ち被捕捉物溶液を滴下する。
流路をもった基板を使用する場合は流路に該溶液を流入する。
癌マーカーとしては、ＣＥＡ、ＢＦＰ、ＴＰＡ、ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−II、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＤＵＰＡＮ−２、Span―１、ＮＣＣ
−ＳＴ−４３９、エラスターゼ１、ＳＬＸ、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＳＴＮ、ＣＡ７２−４、ＣＡ５４／６１、ＳＣＣ抗原、ＮＳＥ、ＣＡ１５−３、ＢＣＡ２２５、ＰＡＰ、ＰＳＡ、γ―Ｓｍ等が挙げられる。
【００１２】
（検出工程）
上述、被捕捉物に蛍光標識物質を結合させてそれを検出器で検出しても構わないが、被捕捉物と蛍光標識物質が結合する際に被捕捉物が構造変化を起こし捕捉物と特異的に結合しない場合がある。
その為、被捕捉物と特異的に結合する抗CEA抗体、抗ＣＡ１９−９抗体などの抗癌マーカー抗体水溶液を被捕捉物と結合した捕捉物が固相化された基板上に滴下し、被捕捉物と該抗癌マーカー抗体と結合させる事が好ましい。
更に好ましくは該抗癌マーカー抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、酵素標識されているとよい。
蛍光標識されていればそのまま、蛍光量を測定でき、酵素標識されていれば基質を基板上に滴下する事により発色させその発色量を検出すればよい。
更にビオチン標識されていれば蛍光標識されたアビジン、又はストレプトアビジンと該ビオチン基が特異的に結合するので、結合させた後その蛍光量を検出すればよい。
【００１３】
被捕捉物と標識された抗癌マーカー抗体との反応性が低い場合は非標識の抗癌マーカー抗体を使用し、次工程でビオチン、蛍光、又は、酵素などの標識を施された該抗癌マーカー抗体と結合させた後、上述同様に検出してもよい。
【実施例】
【００１４】
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより一次抗体、抗ＣＡ１９−９抗体をスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、ブロッキングの為に５％濃度になるようにスキムミルクを溶解させた２５ｍＭのトリス緩衝溶液に該基板を浸し室温で２時間静置した。その後、ＣＡ１９−９水溶液を一次抗体と抗原抗体反応を実施した。その後、二次抗体としてビオチン標識された抗ＣＡ１９−９抗体と抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させた。
同様に癌細胞から得られた蛋白質溶液と正常細胞から得られた蛋白質溶液を前述、ＣＡ１９−９水溶液の代わりに反応させた。
ＣＡ１９−９水溶液、及び癌細胞から得られた蛋白質溶液の場合は流出物が蛍光呈色したが正常細胞から得られた蛋白質溶液は呈色しなかった。
【００１５】
（実施例２）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。同様に該樹脂を一方の面に流路を設けたスライドガラス形状に加工した。
それら２枚を流路を設けた面が内側になるように重ね合わせ熱プレス機で接合させた。
一方、直径２０μｍのポリスチレン製ビーズを４℃に保温された抗ＣＥＡ抗体水溶液に２４時間浸漬させた後、３％濃度になるようにウシ血清アルブミンを溶解させた２５ｍＭのトリス緩衝溶液に該基板を浸し室温で２時間静置した。
該処理されたビーズを流路内に固定し、そのビーズと接触するようにＣＥＡ水溶液を流入した。その後、同様に、ペルオキシダーゼ標識された抗ＣＥＡ抗体を流入し、その後、過酸化水素水と3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（ 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）との混合溶液を流入した。
同様に癌細胞から得られた蛋白質溶液と正常細胞から得られた蛋白質溶液を前述、ＣＥＡ水溶液の代わりに流入した。
ＣＥＡ水溶液、及び癌細胞から得られた蛋白質溶液の場合は流出物が発色したが正常細胞から得られた蛋白質溶液は発色しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明の癌マーカーの検出方法は、検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）であり、手術中でさえ、患者が癌に対して陽性であるか否かを判断できる。