(57)【要約】【課題】  アミロイド蛋白蓄積性疾患、例えばアルツハイマー病などの予防および治療に利用できる遺伝子および蛋白を提供する。【解決手段】  新規遺伝子ＢＦ５−２及びそのスプライスバリアントのＢＦ５−１とそれによってコードされる蛋白ＢＦ５−１。これらの遺伝子および蛋白はアミロイド蛋白の蓄積を抑制するので、アミロイド蛋白蓄積性疾患、例えばアルツハイマー病などの予防および治療用の医薬組成物等に使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１記載のＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
配列表の配列番号：２に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ。
【請求項５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項４記載のＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５記載のＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項７】
配列表の配列番号：３に記載のヌクレオチド１８４から２８２までの塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項７記載のＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７または８記載のＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ。
【請求項１１】
配列表の配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＢＦ５−１蛋白。
【請求項１２】
請求項１１記載の蛋白において１個もしくは数個のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、ＢＦ５−１蛋白と同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１〜３、７〜１０または１２のいずれか１項記載のＤＮＡまたはＲＮＡによりコードされるＢＦ５−１蛋白またはそれと同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白。
【請求項１４】
請求項１〜３、７〜１０または１２のいずれか１項記載のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１〜３、７〜１０または１２のいずれか１項記載のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは請求項１４記載のベクターを含有するＡβ蓄積性疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜３、７〜１０または１２のいずれか１項記載のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは請求項１４記載のベクターによりコードされるＢＦ５−１蛋白またはそれと同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白を含有するＡβ蓄積性疾患の治療用医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜３、７〜１０または１２のいずれか１項記載のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは請求項１４記載のベクターを、患者から得た細胞に導入し、該細胞を培養し、ついで、該細胞を該患者に導入することを特徴とする、Ａβ蓄積性疾患の治療方法。
【請求項１９】
アミロイドβ蛋白と直接あるいは蛋白ＢＦ５−１と相互作用を通して細胞死を抑制或いは促進する蛋白または低分子化合物。
【請求項２０】
アミロイドβ蛋白蓄積性疾患の予防または治療のための請求項１９記載の蛋白または低分子化合物を含有するキットまたは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規遺伝子ＢＦ５−２およびそのスプライスバリアントのＢＦ５−１、ならびにそれによってコードされる蛋白ＢＦ５−１に関する。これらの新規な遺伝子および蛋白ＢＦ５−１は、アミロイドβ蛋白（以下、「Ａβ」または「Ａβ蛋白」と略称することがある）によってヒト細胞、好ましくはヒト神経細胞で認められる細胞死を抑制する新規遺伝子および新規蛋白である。これらの遺伝子および蛋白はアミロイドβ毒性に関わる疾患、例えばアルツハイマー病において、アミロイドβ蛋白による毒性を抑制する。
【０００２】
また、本発明は、アミロイドβ毒性を抑制する医薬品組成物、上記遺伝子配列を用いた遺伝子治療に関する。さらに本発明は細胞死を惹起するＡβと直接あるいは蛋白ＢＦ５−１と相互作用を通して細胞死を抑制或いは促進する蛋白質及び低分子化合物または、それらを利用した診断、予防に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
近年、高齢化によるアルツハイマー病の罹患率が上昇している。アルツハイマー病は、患者だけではなく、介護する側にも多大な負担を強いる病であり、効果的な治療法または予防法の確立が期待されている。現在、市販されているアルツハイマー病治療薬は塩酸ドネペジル（アリセプト、エーザイ株式会社）がある。この薬物は脳内のコリンエステラーゼを阻害することにより、痴呆症状を改善する。しかしながら、アルツハイマー病の病因を改善する根本療法ではないため、病状の進行を止められないのが実状である（Drug 61, 41(2001)）。したがって、この根本的な治療を実現する薬剤の開発が期待されている。
アルツハイマー病罹患脳では老人斑が高頻度に観察される。この老人斑はＡβと呼ばれる蛋白質で構成される(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4245(1985))。このＡβはアミロイド前駆蛋白質（APP）の構成成分であり、2種類のセクレターゼの作用により切断され、フラグメントのひとつとして産生される（Science 286, 735(1999); Mol. Cell Neurosci. 14, 419(1999); Nature, 402,533(1999); Nature 405,689(2000); Nature Cell Biol. 2, 428(2000)）。この蛋白質は自己凝集する性質を有し、βシート構造を基本とする重合体を形成する。培養神経細胞を用いた実験では、この蛋白質の重合体が毒性を示すことが報告されている（Cell Mol. Life Sci. 57, 705(2000)）。また、家族性アルツハイマー病においては、APPまたはセクレターゼのアミノ酸配列の変異により、より凝集しやすいＡβ1-42（アミロイドβ蛋白１−４２）の産生が高まることが報告されている（Science 235,880(1987)；Science 235, 885(1987)）。このような背景から、Ａβはアルツハイマー病の病原物質として考えられており(非特許文献１、２等参照)、この蛋白質の神経細胞に対する毒性を軽減する方法が模索されている。
【非特許文献１】Trend Pharmacol. Sci. 12, 383(1991)
【非特許文献２】Ann. Neurol. 37, 287(1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ａβ毒性に関わる疾患、例えばアルツハイマー病において、アミロイドβ蛋白による毒性を抑制する新規遺伝子・新規蛋白を見出し、これらをＡβ毒性に関わる疾患、例えばアルツハイマー病の治療に応用することが、本発明が解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、我々はレチノイン酸とＢＤＮＦ（Brain derived neurotrophic factor）によって神経細胞に分化誘導させたヒト神経芽細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いて、ｃＤＮＡライブラリー由来のｍＲＮＡの発現のみを検出するｃＤＮＡライブラリーをターゲットとしたディファレンシャルディスプレイを行い、ヒト胎児の遺伝子ライブラリーよりＡβ毒性を抑制する蛋白質をコードする新規遺伝子ＢＦ５−２およびＢＦ５−１を見いだした。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記の（１）〜（２０）に記載のＤＮＡ、蛋白、ベクター、形質転換体、医薬組成物ならびにキット等を提供するものである。
（１）配列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ。
（２）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記（１）のＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ。
（３）上記（１）または（２）のＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
（４）配列表の配列番号：２に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ。
（５）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記（４）のＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ。
（６）上記（４）または（５）のＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
（７）配列表の配列番号：３に記載のヌクレオチド１８４から２８２までの塩基配列を有するＤＮＡ。
（８）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記（７）のＤＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡ。
（９）上記（７）または（８）のＤＮＡに対して７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載のＤＮＡに相補的なＲＮＡ。
（１１）配列表の配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＢＦ５−１蛋白。
（１２）上記（１１）の蛋白において１個もしくは数個のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、ＢＦ５−１蛋白と同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白をコードするＤＮＡ。
（１３）上記（１）〜（３）、（７）〜（１０）または（１２）のＤＮＡまたはＲＮＡによりコードされるＢＦ５−１蛋白またはそれと同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白。
（１４）上記（１）〜（３）、（７）〜（１０）または（１２）のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むベクター。
（１５）上記（１４）に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
（１６）上記（１）〜（３）、（７）〜（１０）または（１２）のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは上記（１４）のベクターを含有するＡβ蓄積性疾患の治療用医薬組成物。
（１７）上記（１）〜（３）、（７）〜（１０）または（１２）のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは上記（１４）のベクターによりコードされるＢＦ５−１蛋白またはそれと同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白を含有するＡβ蓄積性疾患の治療用医薬組成物。
（１８）上記（１）〜（３）、（７）〜（１０）または（１２）のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは上記（１４）のベクターを、患者から得た細胞に導入し、該細胞を培養し、ついで、該細胞を該患者に導入することを特徴とする、Ａβ蓄積性疾患の治療方法。
（１９）アミロイドβ蛋白と直接あるいは蛋白ＢＦ５−１と相互作用を通して細胞死を抑制或いは促進する蛋白または低分子化合物。
（２０）アミロイドβ蛋白蓄積性疾患の診断または予防のための上記（１９）の蛋白または低分子化合物を含有するキットまたは医薬組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、Ａβの毒性を抑制する蛋白質をコードする新規遺伝子ＢＦ５−２およびＢＦ５−１、ならびにそれらによりコードされる新規蛋白ＢＦ５−１が提供され、アミロイドβ毒性に関わる疾患、例えばアルツハイマー病の治療に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、１の態様において、配列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ、すなわち、ＢＦ５−１全長遺伝子に関するものである。本発明は、ＢＦ５−１全長遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡにも関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は多くの教科書や文献に記載されており、当業者によく知られているが、例えば、あるＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡのみがハイブリダイゼーションする条件が挙げられる。一例としては、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Denhardt's reagentおよび０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイダイズさせる条件が挙げられる。また本発明は、ＢＦ５−１全長遺伝子またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡにも関する。なお、本明細書において、ＢＦ５−１全長遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ、ならびにＢＦ５−１全長遺伝子またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡをまとめてＢＦ５−１遺伝子変種という場合がある。
【０００９】
本発明は、１の態様において、配列表の配列番号：２に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ、すなわち、ＢＦ５−２全長遺伝子に関するものである。本発明は、ＢＦ５−２全長遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡにも関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件については上記のとおりである。また本発明は、ＢＦ５−２全長遺伝子またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡにも関する。なお、実施例のセクションにて説明するように、ＢＦ５−１遺伝子はＢＦ５−２遺伝子のスプライスバリアントであることが判明した。本明細書において、ＢＦ５−２全長遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ、ならびにＢＦ５−２全長遺伝子またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡをまとめてＢＦ５−２遺伝子変種という場合がある。
【００１０】
さらに本発明は、実施例のセクションで示すように、ＢＦ５−１遺伝子をトランスフェクションした細胞がＡβ毒性に耐性になることから、特に、本発明は、ＢＦ５−１遺伝子、詳細には、後述のＢＦ５−１ＯＲＦによりコードされる新規蛋白ＢＦ５−１に関するものである。実施例セクションで説明するように、ＢＦ５−１蛋白はＡβ毒性を抑制する効果を有する。さらに実施例セクションで説明するように、蛋白ＢＦ５−１は配列番号：１に示すＢＦ５−１全長遺伝子のヌクレオチド１８４から２８２までのＤＮＡ配列によりコードされることがわかった。したがって、本発明は、配列番号：３のヌクレオチド１８４から２８２までの塩基配列を有するＤＮＡに関するものである。本明細書において、このＤＮＡをＢＦ５−１ＯＲＦ（ＯＲＦはオープンリーディングフレームの略）と称し、配列番号：３に記載する。また本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＢＦ５−１ＯＲＦとハイブリダイゼーションするＤＮＡにも関する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件については上記のとおりである。また本発明は、ＢＦ５−１ＯＲＦまたはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡにも関する。
【００１１】
また本発明は、配列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ、すなわち、ＢＦ５−１全長遺伝子、ＢＦ５−１全長遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ、あるいはＢＦ５−１全長遺伝子またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡによりコードされる蛋白（ポリペプチドを言う場合もある）にも関する。特に本発明は、配列番号：３に示すＢＦ５−１ＯＲＦ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＢＦ５−１ＯＲＦとハイブリダイゼーションするＤＮＡ、あるいはＢＦ５−１ＯＲＦまたはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡによりコードされる蛋白に関する。本明細書において、ＢＦ５−１全長遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡ、あるいはＢＦ５−１全長遺伝子またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡをまとめてＢＦ５−１ＯＲＦ変種という場合がある。本明細書において、配列番号：３に示すＢＦ５−１ＯＲＦによりコードされる蛋白（ポリペプチドという場合もある）をＢＦ５−１蛋白（ポリペプチドという場合もある）と称する。また、本明細書において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＢＦ５−１ＯＲＦとハイブリダイゼーションするＤＮＡ、ならびにＢＦ５−１ＯＲＦまたはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイゼーションするＤＮＡに対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するＤＮＡによりコードされる蛋白をまとめてＢＦ５−１蛋白変種という場合がある。上述のごとく、ＢＦ５−１蛋白およびＢＦ５−１蛋白変種は同等のＡβ毒性を抑制する効果を有する。例えば、ＢＦ５−１蛋白のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が挿入、欠失もしくは置換されており、ＢＦ５−１蛋白と同等のＡβ毒性抑制効果を有する蛋白もＢＦ５−１蛋白変種に包含される。ここでもストリンジェントな条件とは上で説明した例を包含し、当業者によく知られている。一般的には、かかるＢＦ５−１蛋白変種は、ＢＦ５−１蛋白に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性を有する。
【００１２】
したがって、上述のＢＦ５−１遺伝子およびＢＦ５−１遺伝子変種、特にＢＦ５−１ＯＲＦおよびＢＦ５−１ＯＲＦ変種によりコードされる蛋白あるいはポリペプチドはＡβ毒性を抑制する効果を有する。
【００１３】
さらに本発明は、上記ＤＮＡに相補的なＲＮＡにも関する。したがって、本発明のＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１変種はＢＦ５−１ＯＲＦまたはＢＦ５−１ＯＲＦ変種に相補的なＲＮＡによりコードされるものであってもよい。
【００１４】
上記ＤＮＡまたはＲＮＡの取得方法は当該分野で公知の方法を適宜組み合わせたものであってよく、例えば、本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリー（好ましくはヒトｃＤＮＡライブラリー）を哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）に導入し、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法を適宜組み合わせて取得することができる。その一例を実施例のセクションにて詳述する。ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の決定および推定法も一般的なものを用いることができる。
【００１５】
本発明のＤＮＡ、ＲＮＡあるいは蛋白のＡβ毒性抑制効果は、Ａβを与えられた細胞（好ましくはヒト細胞）と、試験すべきＤＮＡ、ＲＮＡあるいは蛋白を導入され、Ａβを与えられた細胞の細胞死との割合から調べることができる。例えば、本発明のベクターを導入した細胞と、導入しない細胞について、Ａβ（例えばＡβ１−４０）を与えた場合の細胞死の割合を調べてもよい。かかる試験についても実施例セクションで詳述する。
【００１６】
さらに本発明は、もう１つの態様において、ＢＦ５−１全長遺伝子、ＢＦ５−１遺伝子変種、ＢＦ５−１ＯＲＦ、あるいはＢＦ５−１ＯＲＦ変種のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、あるいはそれらのＤＮＡに相補的なＲＮＡを含むベクターを提供する。さらに本発明は、かかるベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
【００１７】
上記のいずれかのＤＮＡを挿入して神経細胞の形質転換に使用するベクターとしては、文献に記載された種々のベクターあるいは種々の市販ベクターを用いることができ、例えば、ｐＶｇＲＸＲ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１またはｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓまたはｐｃＤＮＡ３．１−ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（登録商標）、あるいはＬＮＣＸ２などのウイルスベクター等がある。形質転換法としては、リン酸カルシウム法、Super Fector試薬による方法、LipofectAMINE試薬などを用いたlipid-mediated法等が知られている。スクリーニングに使用する細胞としてはいずれの細胞でもよいが、神経細胞が好ましく、好ましい神経細胞の例としては、ＰＣ１２細胞、ＮＢ２ａ、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ、Ｂ１０４、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、初代培養神経細胞等が挙げられる。特にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が好ましい。上記ベクターの構築、細胞の形質転換、細胞培養の条件は個々の細胞に応じて決定され、当業者の知識の範囲内であるか、あるいは容易に決定できるものである。このような形質転換体も本発明に包含される。ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種の発現を容易にチェックできるように、発現されるべき蛋白に検出可能なタグを付しておくことが望ましい。タグはＤＮＡレベルで付加することができ、例えば、緑色蛍光蛋白ＤＮＡ、赤色蛍光蛋白ＤＮＡ、ｍｙｃ遺伝子等を、ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種をコードするＤＮＡ配列に融合させておいて発現させることができる。特に緑色蛍光蛋白との融合物が簡便で感度の高いものとして推奨される。発現細胞を選択した後、本明細書記載のスクリーニングアッセイにて細胞死抑制作用をチェックしておくことが必要である。
【００１８】
ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種を発現する細胞を当業者に公知の適当な手段（例えば、ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種特異的抗体による免疫沈降法等の使用）にて抽出し、次いで、精製（上記抗体を担体としたセファロースカラム等の使用）することにより、ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種を単離することができる。
【００１９】
さらに本発明は、ＢＦ５−１全長遺伝子、ＢＦ５−１遺伝子変種、あるいはこれらに相補的なＲＮＡ、あるいは上記ベクターを含有するＡβ蓄積性疾患の治療用医薬組成物を提供する。これらのポリヌクレオチドはそのまま患者の体内に投与してもよく、患者から得た細胞に導入し、培養後、患者に戻してもよい。
【００２０】
また、本発明は、上記ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはベクターによりコードされる蛋白、詳細には、ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種を含有する、Ａβ蓄積性疾患の治療用医薬組成物を提供する。
【００２１】
ここで、Ａβ蓄積性疾患とは、Ａβが組織に蓄積することにより引き起こされる疾患をいい、例えば、脳にＡβが蓄積した場合のアルツハイマー病やダウン症のような痴呆症、あるいはその他の痴呆症のほか、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性疾患、パーキンソン病等などがある。
【００２２】
本明細書におけるアミロイドβ蛋白はいずれの種類のものであってもよく、例えば、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２、Ａβ１−４３などがある。アミロイドβ蛋白の定義、およびこのようなアミロイドβ蛋白の表記法もまた当該分野においてよく知られている。
【００２３】
医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択して医薬組成物を得ることができる。
【００２４】
さらに本発明は、ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種の細胞死抑制作用を調節（促進または抑制、それぞれアゴニストまたはアンタゴニスト）する物質も提供する。このようなＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種の細胞死抑制作用を調節する物質としては天然または合成の蛋白、ペプチド、核酸等があるが、これらに限らず、天然または合成の低分子化合物であってもよい。このようなＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種のアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングは、例えば、Ａβのみを与えた細胞、およびＡβと試験物質を与えた細胞を用いて細胞死を比較することにより行なうことができる。
【００２５】
また例えば、ＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種のアゴニストをＢＦ５−１蛋白またはＢＦ５−１蛋白変種含有医薬組成物中に添加して細胞死抑制作用をさらに増強させ、アルツハイマー病等の細胞死関連疾病をより効果的に治療あるいは予防することもできる。
【００２６】
一方、本発明の細胞死を促進する物質は、例えば、細胞死系の確立、細胞死に関連した種々の研究に有用であり、例えば、神経細胞の細胞死に関連した疾病、例えば、アルツハイマー病の機構解明に有用である。さらに本発明の細胞死を促進する物質は、細胞の過剰増殖に起因する疾病、例えば、癌や自己免疫疾患などの治療および／または予防に有用である。
【００２７】
したがって、もう１つの態様において、本発明は、上記の細胞死促進物質を含有する、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防用の医薬組成物に関する。医薬組成物の製造法および剤形ならびに医薬上許容される担体または賦形剤は、対象の状態、治療部位、投与経路等に応じて選択され、当業者は容易に選択することができる。また本発明は、上記の細胞死促進物質を対象に投与することを特徴とする、対象における細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防方法にも関する。本発明は、細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防用の医薬の製造における上記の細胞死促進物質の使用にも関する。細胞の過剰増殖に起因する疾病の治療および／または予防においても、上記のような遺伝子治療を適用してもよい。
【００２８】
したがって、本発明は、Ａβと直接、あるいは蛋白ＢＦ５−１と相互作用を通して細胞死を抑制或いは促進する蛋白または低分子化合物を提供する。また本発明は、Ａβ蓄積性疾患の予防または治療のための上記蛋白または低分子化合物を含有するキットまたは医薬組成物も提供する。
【００２９】
以下に実施例を示して本発明をより具体的かつ詳細に説明するが、実施例はあくまでも本発明の例示説明のためのものであり、本発明を限定するものと解してはならない。
Ａ．実験方法
１．細胞死を評価するLDH活性測定法
培養液中のＬＤＨ活性をCytotoxicity Detection Kit(Roche)を用いて測定した。培養液を１００μｌ回収し、５，０００ｒｐｍ ｘ ３分の遠心後、上清５０μｌをサンプルとした。反応混合物５０μｌを添加し、室温で３０分間インキュベーションした。１Ｎ塩酸２５μｌを添加し反応を停止させた後、４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダー（Spectra Max 250、モレキュラーデバイス社）で測定した。
【００３０】
２．細胞培養法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Animal Cell Cultures）より購入した。ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、カタログ番号：１５１４０−１４８、インビトロジェン）および血清（１５％ ｖ／ｖ、カタログ番号：２９１６７５４、Ｌｏｔ：３８４６Ｅ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（カタログ番号：１２４３０−０５４，インビトロジェン）（以下、培養培地）を用い、ＣＯ２インキュベーター（カタログ番号：ＭＣＯ−３４５、ＳＡＮＹＯ）中において、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養を行った。なお、プレートおよびディッシュはポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたものを使用した。Encinasらの方法（J Neurochem 75, 991, (2000)）に従い、神経細胞様に分化させた細胞を使用した。すなわち、ｃＤＮＡライブラリーまたはコントロールベクターを遺伝子導入したＳＨ−ＳＹ５Ｙを培養培地に懸濁後、２０万個／３ｍｌ／ウェルで６ウェルプレート（カタログ番号：３５６５１５、ベクトンディッキンソン）に２ウェルずつ播種した。
２４時間後、all-transレチノイン酸（１０μＭ、カタログ番号：Ｒ２６２５、Sigma）を含む培養培地に置換した。５日間の培養後、培養液を除去し、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、カタログ番号：１５１４０−１４８、インビトロジェン）および０．１％ ＢＳＡ（カタログ番号：Ａ−４５０３、シグマ）を含むＤ−ＭＥＭ培地（カタログ番号：１２４３０−０５４，インビトロジェン）（以下、無血清培地）を用いて、１ウェルあたり３ｍｌで２回の洗浄を行った。ＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ、カタログ番号：１０９０８−０１０、インビトロジェン）を含む無血清培地を添加し、さらに５日間の培養を行った。以上の過程で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は神経細胞様に分化した。
【００３１】
３．遺伝子導入法
ヒト胎児遺伝子ライブラリーはタカラ（Ｃｏｄｅ：９５４９）およびインビトロジェン（カタログ番号：１０６６２−０１３）より購入した。これらのｃＤＮＡライブラリーはそれぞれｐＡＰ３ｎｅｏベクターまたはｐＣＭＶｓｐｏｒｔ２ベクターで作製されており、哺乳類細胞で発現が可能となっている。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をポリ−Ｌ−リジンでコーティングされた６０ｍｍディッシュ（カタログ番号：３５６５１７、ベクトンディッキンソン）に２０万個／３ｍｌ／ディッシュで播種した。２４時間培養後、Effectene（登録商標） transfection reagent（Ｃａｔ．３０１４２５，キアゲン）を用いて遺伝子導入を行った。ｃＤＮＡライブラリー３μｇ、ＥＣバッファー１５０μｌ、Enhancer ８μｌ、Effectene ２５μｌを細胞に処置した。２４時間後に培地交換を行い、更に４８時間培養した。安定的遺伝子導入細胞を得るために、ジェネティシン（カタログ番号：Ｇ９５１６、シグマ）を６００μｇ／ｍｌで添加した。コロニーが出現するまで培養して細胞を得た。得られた細胞を細胞死実験を行うまで、凍結培地（１０％ ＤＭＳＯを含む培養培地）中において−８０℃で凍結保存した。
【００３２】
４．Ａβ１−４０による細胞死誘導と細胞死評価方法
この神経細胞に分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に、Ａβ１−４０（２０μＭ：３７℃で約２４時間インキュベーションし調整して用いた）を添加することにより８日後に見られる細胞死を測定した。細胞死はＭＴＴアッセイ法を用いて行った。この方法は、ＭＴＴ（臭化メチルチアゾイルジフェニル−テトラゾリウム，カタログ番号：Ｍ２１２８、シグマ）が生細胞に取り込まれると、ミトコンドリアでの還元反応により不溶性のホルマザン（青色）を生じることを利用した方法である（T. Mosmann. J Immunol. Methods 65,55(1983)）。ＭＴＴをＤ−ＰＢＳ（カタログ番号：１４１９０−１４４、インビトロジェン）で濃度が３ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。ろ過滅菌後、最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌになるように細胞に添加した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）内で４時間のインキュベーション後、培養液と同量のデタージェント（１ｍＭ ＮＨ４ＯＨを含む１０％ ＳＤＳ）を添加し、ＣＯ２インキュベーター内で、２４時間インキュベーションした。その後、５５０ｎｍでの吸光度をプレートリーダー（Spectra Max 250、モレキュラーデバイス社）にて測定した。
【００３３】
５．ｃＤＮＡライブラリーをターゲットとしたディファレンシャルディスプレイ法
Ａβ１−４０（カタログ番号：４３０７−ｖ、ペプチド研）０．５５ｍｇに０．１％ ＮＨ４ＯＨ １５０μｌおよびＤ−ＰＢＳ １５０μｌを添加し、３７℃で約２４時間インキュベーションした。無血清培地６ｍｌを添加し、Ａβ１−４０の濃度を２０μＭに調整した。コントロールには無血清培地６ｍｌに０．１％ ＮＨ４ＯＨ １５０μｌおよびＤ−ＰＢＳ １５０μｌを添加したものを用意した。２ウェルずつに播種し神経細胞様に分化させたＳＨ−ＳＹ５Ｙに、Ａβ１−４０またはコントロール培地を添加した。８日間の培養後、TRIZOl（登録商標） reagent（カタログ番号：１５５９６−０２６、インビトロジェン）を用いて全ＲＮＡを回収した。得られたＲＮＡを３０μｌのＤＥＰＣ水に溶解後、３μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）および８０μｌのエタノールを添加した。室温で１０分間のエタノール沈澱後、−８０℃で保管した。ディファレンシャルディスプレイには、このうちの１０μｌをサンプルとして用いた。
上記のＲＮＡ １０μｌ（コントロール群において約１μｇのＲＮＡに相当）について、アダプター配列を有するオリゴｄＴプライマーおよびSuperscriptTM II RNase H 逆転写酵素（カタログ番号：１８０６４−０１４，インビトロジェン）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを作成した。オリゴｄＴプライマーは下記の配列のものを使用した（シグマジェノシス）。
5'- AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
（配列番号：５）
作成したcDNAについて、下記プロトコールにてPCRを行った。なおPCRには、Taq PCR CORE Kit （カタログ番号： 201223、キアゲン）を用いた。
PCR 反応液（１本あたり）
１）  10 X PCR バッファー          5 μl
２）  5  x Q 溶液                  10 μl
３）  d-NTP ミックス                1 μl
４）  Taq ポリメラーゼ              0.25 μl
５）  蒸留水                        30.75 μl
６）  プライマー１ (20 μM)          1 μl
７）  プライマー２ (20 μM)          1 μl
８）  鋳型                           2 μl（RNA 1 μl分に相当するcDNA）
プライマーセット1（タカラライブラリー用）
Primer 1：    5'- ACC GGG CCC TTA GGA CGC GTA ATA 3'
（配列番号：６）
Primer 2：    5'- AAG AAT TCG CGG CCG CAG GAA TTT TTT 3'
（配列番号：７）
プライマーセット２（インビトロジェンライブラリー用）
プライマー１:  5'- TGA CAC TAT AGA AGG TAC GCC TGC AGG TAC 3'
（配列番号：８）
プライマー２:  5'- AAG AAT TCG CGG CCG CAG GAA TTT TTT 3'
（配列番号：９）
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ＰＣＲ後、アガロース電気泳動を行い、コントロール培地処置群とＡβ１−４０処置群の間でバンドの比較を行い、同様の強度で発現しているバンドを候補遺伝子としてゲルより切り出した。
【００３４】
６．  ｃＤＮＡクローニング方法
上記の切り出したゲルに１００μｌのトリス・ＥＤＴＡバッファーを添加し、９５℃で１０分間加熱することにより、ゲルより遺伝子を抽出した。遺伝子を抽出した溶液の５μｌをサンプルとして次のＰＣＲを行った。ＰＣＲには、Pyrobest（登録商標） DNA Polymerase（カタログ番号：Ｒ００５Ａ、ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。
PCR反応液（１本あたり）
１）  蒸留水                          73 μl
２）  10 x バッファー                10 μl
３）  dNTP 混合物                    8 μl
４）  鋳型                            5 μl
５）  Pyrobest                        0.5 μl
６）  プライマー１ (100 μM)          2 μl
７）  プライマー２ (100 μM)          2 μl
なおプライマーには、cDNAライブラリーをターゲットとしたディファレンシャルディスプレイで用いたものと同様の配列で、5'末端をリン酸化したものを用いた。
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増幅したＤＮＡをアガロース電気泳動後精製し、ＥｃｏＲＶ処理ｐＡＰ３ｎｅｏベクターまたはＳｍａＩ処理ｐＣＭＶｓｐｏｒｔ２ベクター（両ベクターとも脱リン酸化処理済み）にライゲーションした。ライゲーションにはDNA Ligation Kit Ver II（カタログ番号：６０２２、タカラ）を用いた。作成したプラスミドを用いてシークエンスを行った。
【００３５】
７．ＢＦ５−１及びＢＦ５−２のｃＤＮＡ配列決定方法およびアミノ酸分析方法
５．で作成したプラスミドを用いてシークエンスを行った。プラスミド約３００ｎｇを使用説明書に従いBigDye（登録商標） Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit（カタログ番号：４３９０２４２、アプライドバイオシステムズ）の反応液に混合し、以下のＰＣＲ反応を行った。
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ＰＣＲ終了後、使用説明書に従いエタノール沈澱によりサンプルを精製し、Hi-Di ホルムアミド２５μｌに溶解した。その後、ABI PRISM（登録商標） 3100ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）によりシークエンスの解析を行った。ＰＣＲによる遺伝子変異補正の為、各遺伝子につき最低５クローンのシークエンスを行った。
【００３６】
Ｂ．実験結果
１．分化誘導後のＳＨ−ＳＹ５Ｙに対するＡβ１−４０の細胞毒性の確認
１）Ａβ１−４０による細胞死
図１は分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＡβ１−４０（２０μＭ）を添加４日後の細胞の顕微鏡像を示したものである。対照群（左側）と比較して、Ａβ１−４０添加群（右側）では細胞死を起こした細胞は原型をとどめず、円形に萎縮しているのが形態学的に観察された。
２）Ａβ１−４０による細胞毒性の時間経過
Ａβ１−４０（２０μＭ）を分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加して、１、２、４及び８日後の培養細胞のＭＴＴ活性及びＬＤＨ活性を指標としてＡβ１−４０の細胞毒性による細胞死を評価した。その結果、対照群と比較して、４日から８日でほぼ細胞死が完了し、８日では４０〜６０％の細胞が死滅することが明らかにされた（図２）。
これらの結果から、細胞形態変化ならびに培養細胞のＭＴＴ活性およびＬＤＨ活性を指標にしてＡβ１−４０の細胞毒性を調べることが可能であることがわかった。
【００３７】
２．ｃＤＮＡライブラリー３〜７をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に遺伝子導入した安定的発現細胞を用い、all-transレチノイン酸（１０μＭ）とＢＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で神経細胞様に分化させた。この細胞に３７℃で約２４時間インキュベーションしたＡβ１−４０添加し、８日後に細胞死を誘導した細胞からｃＤＮＡライブラリー由来のｍＲＮＡをターゲットにディファレンシャルディスプレイを行い、発現ベクター由来のｍＲＮＡの発現のみを検出した。ＢＦ５−１およびＢＦ５−２を含むｃＤＮＡライブラリー５がトランスフェクションされた細胞群でのみＡβ１−４０に対する細胞死耐性を示した（図３）。ＢＦ５−１及びＢＦ５−２の全長遺伝子を再び発現ベクターｐＡＰ３ｎｅｏにライゲーションし、それぞれを細胞にトランスフェクション後、Ａβ毒性に対する影響を検討した。その結果、ＢＦ５−１遺伝子をトランスフェクションした細胞はＡβ毒性に耐性になることが示された（図４）。
【００３８】
３．ＢＦ５−１遺伝子はＢＦ５−２遺伝子の中央約１２０塩基が欠失した配列で、ＢＦ５−２遺伝子のスプライシングバリアントである（図５）。これらの遺伝子は上流にＡＴＧＴＡＧという配列を有し、下流のリーディングフレームが翻訳不可能な遺伝子配列だったが、スプライスサイト検索（Splice Site Prediction by Neural Network、http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html）を行うと、このＡＴＧＴＡＧを含む領域はスプライシングにより除外されることが予測された。また、ＢＦ５−２遺伝子配列から予測されるスプライス産物のひとつは、ＢＦ５−１遺伝子に完全に一致した。（ＢＦ５−１全長遺伝子配列を配列番号：１に、ＢＦ５−２の全長遺伝子配列を配列番号：２に示す）。ＢＦ５−１およびＢＦ５−２  の遺伝子配列の解析より、蛋白がコードされているリーディングフレームを予測した。更にＢＦ５−１遺伝子上のスプライシングサイトを考慮し、９９塩基で３２個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＢＦ５−１ＯＲＦ）を決定した（配列番号：１のヌクレオチド１８４〜２８２、および配列番号：３）。
【００３９】
４．予測したＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）が実際に蛋白として発現するか解析するため、全長遺伝子を用いて予測したＯＲＦの３'側にＧＦＰ塩基配列を結合させたプラスミドを作成し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にトランスフェクション後、ＧＦＰの発現を観察した。その結果、ＢＦ５−１およびＢＦ５−２ともにＧＦＰの発現が観察され、予測したＯＲＦは蛋白として翻訳されることが示唆された（図６）
【００４０】
５．上記のＧＦＰ融合蛋白を発現させた細胞より総蛋白を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＧＦＰ抗体（カタログ番号：８３６２−１、クロンテック）を用いてウエスタンブロッティングを行った。ＧＦＰ融合ＢＦ５−１遺伝子を発現した細胞では、予測した位置（ＧＦＰ融合ＢＦ５−１蛋白，ＭＷ：２７ｋＤ）にバンドが観察され、ＢＦ５−１がコードする蛋白質は安定して発現することが確認された。一方、ＢＦ５−２遺伝子がコードする蛋白は、相当するサイズにバンドが確認されず、非常に不安定な蛋白である（ＧＦＰ融合ＢＦ５−２蛋白，ＭＷ：３３ｋＤ）（図７）。
【００４１】
６．予測したＯＲＦにコードされた配列が実際に効果を示すか確認するために、この部分が発現するようにデザインしたフラグメントを作成し、細胞にトランスフェクション後、Ａβ１−４０毒性に対する作用を検討した。その結果、予測したＯＲＦがＡβ１−４０毒性抑制に機能することを確認した。またＯＲＦだけでなく、下流の塩基配列の有無によって発現の安定性が異なり、とくに下流の配列は、ＢＦ５−１ ｍＲＮＡの安定性に必要であることが示唆された（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、アミロイド蛋白蓄積を抑制する新規遺伝子および新規蛋白等を提供するものであり、アミロイド蛋白蓄積性疾患、例えばアルツハイマー病などの予防および治療に利用できる。したがって、本発明の遺伝子および蛋白等はアミロイド蛋白蓄積性疾患の予防および治療用医薬の製造等に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】分化誘導後のＳＨ−ＳＹ５Ｙに対するＡβ１−４０の細胞毒性を示す図である。スケールバーは１００ミクロンである。
【図２】Ａβ１−４０添加後の細胞毒性の時間経過を示す図である。
【図３】ｃＤＮＡライブラリーをターゲットとしたディファレンシャルディスプレイの結果を示す図である。ＡはＡβ１−４０（２０μＭ）、Ｂは対照（ビヒクル）のレーンである。
【図４】分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＡβ毒性に対するＢＦ５−１およびＢＦ５−２の影響を示す図である。ＭＴＴ活性はＡβ１−４０処置８日後に測定した。統計処理はＡＮＯＶＡを用いて行なった。ＡはＡβ１−４０（２０μＭ）、Ｂは対照（ビヒクル）を示す。
【図５】ＢＦ５−１あるいはＢＦ５−２を遺伝子導入した細胞におけるｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図６】ＧＦＰ融合ＢＦ５−１およびＢＦ５−２蛋白のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における発現を示す図である。左に発現させるＧＦＰ融合遺伝子を示し、右にＧＦＰ融合蛋白の蛍光像を示す。
【図７】ＢＦ５−１およびＢＦ５−２とＧＦＰの各融合蛋白のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】ＢＦ５−１の各フラグメントの発現と細胞死抑制作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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