(57)【要約】【課題】マイクロアレイの核酸プローブと、サンプル中に含まれる標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を行うための反応容器において、反応室内の流体の流れを均一にすることにより、ハイブリダイゼーション反応を均一化すること【解決手段】反応室の両端に設けた透孔を通してサンプルおよび反応溶液を含む流体を前記反応室に出し入れするし、導入された流体を前記反応室内で溶液の攪拌・置換および反応を行なう際に、これら透孔から導入された前記流体の流れの広がりを180°未満に限定するように、該透孔を挟んで180°未満の内角をなす流れ限定部材を設ける。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸または標的タンパク質を検出するために用いられるマイクロアレイ用の反応容器であって：
プレート状基板表面のスポット領域内に、前記標的核酸または標的タンパク質と特異的に結合する核酸プローブまたはタンパク質プローブを固定したマイクロアレイと；
少なくとも前記スポット領域を含む略長方形の領域取り囲んで、前記マイクロアレイの表面に液密に配置される弾性シーリング部材と；
底面に前記弾性シーリング部材が結合され、前記マイクロアレイの表面との間に前記弾性シーリング部材で限定された反応室を形成する蓋体と；
該蓋体を貫通して、前記反応室の長手方向に対向する両端のうち一方の端部に連通するように設けられた第一の透孔、および前記反応室の他方の端部に設けられた第二の透孔とを具備し、
前記第一および第二の透孔を通して、サンプルおよび反応溶液を含む流体を前記反応室に出し入れすることにより、導入された流体を前記反応室内において攪拌させて反応させ、または液体を置換する際に、前記第一および第二の透孔の少なくとも一方から導入された前記流体の流れの広がりを180°未満に限定するように、前記導入用の透孔について該透孔を挟んで180°未満の内角をなす流れ限定部材を設けたことを特徴とするマイクロアレイ用反応容器。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロアレイ用反応容器であって、前記弾性シーリング部材は略矩形のリング形状を有し、その内側の四隅に、前記弾性シーリング部材とは別の前記流れ限定部材を設けたことを特徴とするマイクロアレイ用反応容器。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロアレイ用反応容器であって、前記弾性シーリング部材は、該弾性シーリング部材が前記流れ限定部材を兼ねるように、長方形以外の形状を有していることを特徴とするマイクロアレイ用反応容器。
【請求項４】
請求項３に記載のマイクロアレイ用反応容器であって、前記弾性シーリング部材の形状が長円形である反応容器。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか１項に記載のマイクロアレイ用反応容器であって、前記流れ限定部材の内角が180°〜25°であるマイクロアレイ用反応容器。
【請求項６】
サンプル中の標的核酸または標的タンパク質を検出するために用いられるマイクロアレイ用の反応容器であって：
プレート状基板表面のスポット領域内に、前記標的核酸または標的タンパク質と特異的に結合する核酸プローブまたはタンパク質プローブを固定したマイクロアレイと；
少なくとも前記スポット領域を含む略長方形の領域取り囲んで、前記マイクロアレイの表面に液密に配置される弾性シーリング部材と；
底面に前記弾性シーリング部材が結合され、前記マイクロアレイの表面との間に前記弾性シーリング部材で限定された反応室を形成する蓋体と；
該蓋体を貫通して、前記反応室の長手方向に対向する両端のうち一方の端部に連通するように設けられた複数の第一の透孔、および前記反応室の他方の端部に設けられた複数の第二の透孔とを具備し、
前記第一および第二の透孔を通して、サンプルおよび反応溶液を含む流体を前記反応室に出し入れすることにより、導入された流体を前記反応室内において攪拌させて反応させることを特徴とするマイクロアレイ用反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸プローブまたはタンパク質プローブを固定したマイクロアレイを用いて標的核酸または標的タンパク質を検出する際に、マイクロアレイと標的核酸との特異的結合反応を行うために使用する反応容器の改良に関する。
【０００２】
遺伝子等の特定の塩基配列を有する標的核酸を検出するために、該標的核酸に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応が古くから用いられている。近年では、スライドガラスまたはプラスチックチップ等の平坦な固相基板表面に、多数のプローブ核酸を植設固相化したマイクロアレイを用いて、一度に多くの標的核酸の検出が行われている。
【０００３】
ガラス基板を用いたマイクロアレイ上のプローブ核酸と、サンプル中の標的核酸との間のハイブリダイゼーション反応は、図１（Ａ）〜（Ｃ）に示すような反応容器を用いて行われている。同図において、１はスライドガラス基板を用いたマイクロアレイである。図１（Ｂ）に示すように、マイクロアレイ表面の所定のスポット領域２には、標的核酸を捕捉するための多くのプローブ核酸が植設されている。このマイクロアレイ１の上には、その外周に沿ったゴム製のＯ-リング３を介して、樹脂製の蓋体４が配置されている。こうして、マイクロアレイ１、蓋体４、およびＯ-リング３で限定された反応室５が形成される。また、蓋体４には、反応室５の両端に通じる透孔６ａ，６ｂが形成されており、これら透孔は、サンプルおよびハイブリダイゼーション反応のための反応溶液を反応室の中に導入し、また反応室から排出するための導入口および排出口として使用される。図１（Ｃ）は、蓋体４の底面図をあらわしている。図示のように、導入口および排出口６ａおよび６ｂは、Ｏ-リング３で限定された略矩形の領域における長手方向に対向する両短辺の中央に近接して形成されている。
【０００４】
サンプル中の標的核酸を検出する際には、サンプルおよび核酸ハイブリダイゼーションに必要なバッファー等の溶液を、導入口および排出口６ａ，６ｂを通して反応室５の中に出し入れし、スポット領域２上で均一な反応が生じるように攪拌する。これにより、サンプル中に含まれる標的核酸は、マイクロアレイ１のスポット領域２に固定された核酸プローブとハイブリダイズして捕捉される。更に、例えばサンドイッチハイブリダイゼーション等の公知の方法により、捕捉された標的核酸に蛍光標識等の適切なラベルを施し、乾燥等の後処理を行った後にマイクロアレイ１を取り外し、蛍光検出器のような公知の検出器により標的核酸上のラベルを検出する。
【０００５】
なお、プローブ核酸の代りに抗体等のタンパク質プローブを用い、抗原等の標的タンパク質を検出するプロテインマイクロアレイの場合にも、上記と同様の反応容器が用いられ、同様にして特異的結合反応が行われる。
【０００６】
しかし、上記のような従来のハイブリダイゼーション反応容器は、マイクロアレイ１におけるスポット領域２の全体に亘って均一な反応を得ることができず、同一のプローブをスポッティングにより固定してあるにもかかわらず、スポット領域２の場所によって、得られる検出信号の強度にばらつきが生じる問題があった。
【０００７】
この問題を、ミクロ流体工学の知見に基づいて解析した結果、サンプルおよび反応溶液を導入口および排出口６ａおよび６ｂを通して出し入れする際に、反応室５内の流れが均一ではないことが分った。即ち、図２に示すように、反応室２の中には、導入および排出口６ａおよび６ｂを結ぶ紡錘形の流れの速い領域１１と、それ以外の周辺領域における流れの遅い停滞領域１２が生じる。そして、停滞領域１２ではハイブリダイゼーション反応が過剰になる一方、流れの速い領域１１ではハイブリダイゼーション反応が不十分になったり、或いは、停滞領域１２では洗浄が不十分になる一方、流れの速い領域１１では洗浄が過剰になる結果、スポット領域２の中心部では弱い検出信号が生じ、周縁の隅部では強い検出信号が生じることになる。このミクロ流体工学による解析結果は、実際の実験結果と一致していた。
【０００８】
なお、上記の事情はプロテインマイクロアレイについても同様である。更に、流れの速い領域についても、導入口と排出口を結ぶ個々の軌跡の長さが異なるので、微妙な流速の違いを含むことがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、プレート状基板表面のスポット領域に核酸プローブまたはタンパク質プローブを固定したマイクロアレイと、サンプル中に含まれる標的核酸または標的タンパク質との特異的結合反応を行うための反応容器において、反応室内の流体の流れを均一にすることにより、前記スポット領域における特異的結合反応を均一化することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題は、サンプル中の標的核酸または標的タンパク質を検出するために用いられるマイクロアレイ用の反応容器であって：
プレート状基板表面のスポット領域内に、前記標的核酸または標的タンパク質と特異的に結合する核酸プローブまたはタンパク質プローブを固定したマイクロアレイと；
少なくとも前記スポット領域を含む略長方形の領域取り囲んで、前記マイクロアレイの表面に液密に配置される弾性シーリング部材と；
底面に前記弾性シーリング部材が結合され、前記マイクロアレイの表面との間に前記弾性シーリング部材で限定された反応室を形成する蓋体と；
該蓋体を貫通して、前記反応室の長手方向に対向する両端のうち一方の端部に連通するように設けられた第一の透孔、および前記反応室の他方の端部に設けられた第二の透孔とを具備し、
前記第一および第二の透孔を通して、サンプルおよび反応溶液を含む流体を前記反応室に出し入れすることにより、導入された流体を前記反応室内において攪拌させて反応させ、または液体を置換する際に、前記第一および第二の透孔の少なくとも一方から導入された前記流体の流れの広がりを180°未満に限定するように、前記導入用の透孔について該透孔を挟んで180°未満の内角をなす流れ限定部材を設けたことを特徴とするマイクロアレイ用反応容器によって達成される。
【００１１】
また、本発明の課題は、サンプル中の標的核酸または標的タンパク質を検出するために用いられるマイクロアレイ用の反応容器であって：
プレート状基板表面のスポット領域内に、前記標的核酸または標的タンパク質と特異的に結合する核酸プローブまたはタンパク質プローブを固定したマイクロアレイと；
少なくとも前記スポット領域を含む略長方形の領域取り囲んで、前記マイクロアレイの表面に液密に配置される弾性シーリング部材と；
底面に前記弾性シーリング部材が結合され、前記マイクロアレイの表面との間に前記弾性シーリング部材で限定された反応室を形成する蓋体と；
該蓋体を貫通して、前記反応室の長手方向に対向する両端のうち一方の端部に連通するように設けられた複数の第一の透孔、および前記反応室の他方の端部に設けられた複数の第二の透孔とを具備し、
前記第一および第二の透孔を通して、サンプルおよび反応溶液を含む流体を前記反応室に出し入れすることにより、導入された流体を前記反応室内において攪拌させて反応させることを特徴とするマイクロアレイ用反応容器によって達成される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のマイクロアレイ用反応容器によれば、マイクロアレイを使用して標的核酸または標的タンパク質を検出する際に、反応室内の流体の流れを均一にすることにより、スポット領域の全体に亘ってプローブと標的との特異的結合反応を均一化し、均一な検出信号を得ることができる等、顕著な効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面に示す実施例を参照して本発明を説明する。
【００１４】
図３は、本発明の一実施例を説明するための平面図であり、図１と同じ部分には同一の参照番号が付されている。図３は、蓋体４の平面図を示したものである。図示のように、矩形の蓋体４の底面外周に沿って、シリコーンゴム等の弾性材料からなる弾性シーリング部材（例えばＯ-リング５）が設けられている。このＯ-リング５は、略長方形の反応室を限定している。また、Ｏ-リング５で限定された略長方形の反応室領域の隅部には、一定の厚みを有するテフロン製シールからなる流れ限定部材７ａ，７ｂ，７ｃ，７ｄが設けられている。該流れ限定部材は、Ｏ-リング５よりも弾性が小さく，且つその厚みはＯ-リング５の厚みよりも若干薄い。これらの流れ限定部材は、図１（ｂ）に示したマイクロアレイ１の上に重ねたときに、該マイクロアレイの表面に水密に接合され、Ｏ-リング５と共に反応室の形状を限定する。ここで、Ｏ-リング５は、弾性変形により反応室を耐圧性にする。また、低弾性シートである流れ限定部材７は反応室の高さを一定に保つ。流れ限定部材７ａ，７ｂの間には、蓋体４を貫通する透孔６ａが設けられており、また流れ限定部材７ｃ，７ｄの間には、蓋体４を貫通する透孔６ｂが設けられている。流れ限定部材７ａ，７ｂの間の内角、および流れ限定部材７ｃ，７ｄの間の内角は90°である。しかし、この内角の有効範囲は、使用する反応液の種類、量、流速などの条件に応じて180°未満の適切な値に設定すればよく、好ましくは25°〜160°、更に好ましくは60°〜120°である。それ以外の構成は、図１（Ａ）〜図１（ｃ）に示した実施例と同様であり、図３の蓋体を図１（ｂ）のマイクロアレイ表面に重ね合わせて、ハイブリダイゼーション反応容器が形成される。一方、反応室の側壁部分は120°〜180°、好ましくは160°〜180°の直線または曲線状の形状である。この側壁部が上記有効範囲を超えるときは、流体に余分な衝突部分を与え、下回るときは上述したような流れの停留部分を生じ得る。
【００１５】
なお、上記実施例において、マイクロアレイ１および蓋体４は何れもスライドガラスで形成されており、その大きさは25 mm×75 mmである。また、Ｏ-リング３で限定された長方形状の反応室の大きさは20 mm×75 mmであり、その厚さは約100μmである。また、マイクロアレイ１におけるスポット領域２の大きさは、17.5 mm×17.5mmであり、スポット領域２からマイクロアレイ１の短辺側端部までの距離のうち、短い方の距離は23 mmである。更に、スポット領域２の全域に、８スポット×８スポット（スポットのピッチ0.5 mm）のブロックを、４ブロック×４ブロック（ブロックのピッチ4.5 mm）で配置し、全てのスポットに35-merの同一の核酸プローブが合計1024スポットだけ点着されている。
【００１６】
上記実施例によれば、流れ限定部材７ａ，７ｂ，７ｃ，７ｄを設けた結果、透孔６ａまたは７ｂから注入されたサンプル溶液、緩衝溶液、乾燥空気などの流体は、これら限定部材７ａおよび７ｂ、または７ｃおよび７ｄによって限定されるため、従来のように両側に180°広がることはない。そのため、反応室の側壁を構成する反応室周縁のＯ-リング壁に対して従来のように90°ではなく、それよりも有意に小さい角度で衝突する。従って、衝突部分で流れが停滞することなく、図４に示すように、反応室内内に均一な流れが形成される。特に、流れ限定部材が反応室の側壁まで延在していることにより、反応室の側壁に向うにつれて流れを加速する作用を有するので、側壁付近での減速を有効に相殺して、結果的に流速のばらつきを低減できる。その結果、スポット領域２では、核酸プローブとサンプル中の標的核酸との間のハイブリダイゼーションが全体に均一に行われ、最終的な検出信号強度の均一性を改善することができる。
【００１７】
図３の実施例では、流れ限定部材７ａ，７ｂ，７ｃ，７ｄを用いたが、同様の効果は、反応室を限定するＯ-リング５の形状を変更することによっても達成することができる。このような変形例を図５に示す。
【００１８】
図５（Ａ）は、Ｏ-リング５の形状を細長い八角形とし、長手方向に対向する辺の長さを著しく短くして、その内側に透孔６ａおよび６ｂを設けた例である。
【００１９】
図５（Ｂ）は、Ｏ-リング５の形状を細長い六角形とし、長手方向に対向する鋭角をなす頂部の内側に、透孔６ａおよび６ｂを設けた例である。
【００２０】
図５（Ｃ）は、Ｏ-リング５の形状を細長い傾斜した平行四辺形とし、対向した鋭角をなす頂部の内側に、透孔６ａおよび６ｂを設けた例である。
【００２１】
図５（Ｄ）は、Ｏ-リング５の形状を細長い長円形とし、長軸方向の両端部内側に、透孔６ａおよび６ｂを設けた例である。
【００２２】
図５に示したような変形例においても、透孔６ａまたは６ｂから導入された流体は、Ｏ-リング５によって180°に広がるのを防止され、それよりも狭い範囲に限定されるため、図３の実施例と同様の効果を得ることができる。
【００２３】
更に、図６は、本発明の他の実施例になるマイクロアレイ用反応容器を示している。この実施例では、反応室の形状は図１に示した従来例と同じであるが、従来例では一対の透孔６ａ，６ｂを設けているのに対して、対向する二対の透孔２１ａ，２１ｂおよび２２ａ，２２ｂを設けている点で異なる。このような構成であっても、反応室内の流体の流れが均一になるという同様の作用を奏し、従って検出信号が均一になるという同様の効果を得ることができる。
【００２４】
なお、上記実施例では標的核酸を検出するためのハイブリダイゼーション反応容器について説明したが、当業者は、標的タンパク質を検出するための反応容器についても同様であることを理解するであろう。また、上述した実施例ではマイクロアレイ１および蓋体４を何れもガラス製としたが、これらは光透過性、耐熱性、耐圧性を有する任意の材料（例えばプラスチック）または表面形状、例えば多孔質、微小ウエル、繊維状、ピラー状（基板表面に同じ高さの微小な円柱並べて配置した形状）、微粒子状であり得る。また、マイクロアレイ１および蓋体４の何れか一方は光透過性に乏しい材料でもよく、反射性の高い部材（金属、酸化シリコン）を主成分とするか、或いはこれらを任意の材料に皮膜したものでもよい。また、マイクロアレイ１および蓋体４の接合を可逆的に剥離するように構成することもできる。例えば、マイクロアレイ１をステンレスなどの金属製とする一方、蓋体４を硬質プラスチック製として、適宜の押圧手段により接合を維持させながら反応を行なうようにすることにより、反応後に圧力を解除してマイクロアレイ１のみを剥離して適宜の測定装置に移送し、測定を行なうようにしてもよい。このような可逆的な接合を可能にする押圧手段としては、従来のマイクロアレイを所定の台上に押し付けて反応を実行するあらゆる手段であり得る。押圧手段を有し、ポンプなどの液体処理機構と一体化した反応実行システムが好ましく、例えばアマシャム社から販売されている自動スライド処理装置（Automated Slide Processor）LUCIDEA（商標名）に適用するように、マイクロアレイ１および蓋体４を設計することができる。また、反応室における流れの方向は一方向に限らず、攪拌または洗浄等に有利なように双方向であってもよい。双方向の流れの場合、第一および第二の透孔に形成する流れ限定部材は、互いに対角同士が平行または均一距離とするのが更に好ましい。また、シーリング部材または流れ限定部材による内角は、上述した有効範囲において、徐々に大きくなるような多段階の角部を有していてもよい。また、多段階の角部を、各角部の頂点を曲率半径とするような連続した曲線に代えてもよい。なお、流れ限定部材の形状を曲線とする場合には、下流側の導入口または排出口から同一の半径となるような円周上に、上流側の流れ限定部材を形成するのが好ましい。また、サンプルおよび／または試薬を含む流体としては、ビーズや細胞のような粒状の固相を含んでいてもよい。
【００２５】
[実験例]
図３に示した実施例と、図１（Ａ）〜（Ｃ）に示した従来例を用い、下記の同じプロトコールを使用してハイブリダイゼーション実験を行った。
【００２６】
なお、標的核酸としてはＣｙ３で修飾した７５量体のＤＮＡを用い、プローブとしては、該標的に対してパーフェクトマッチングの３５量体ＤＮＡを用いた。また、標的核酸は、市販のハイブリダイゼーション溶液中200μL中に1 pmを溶解した溶液として用いた。
【００２７】
＜ハイブリダイゼーションプロトコール＞
１．ハイブリダイゼーション
40℃で30分間
攪拌時に吸引・送液した体積：30μL
標的溶液の攪拌（注入および排出）の速度：20μL／秒
攪拌サイクル：1サイクル／分
２．後洗浄
・1×SSCでフラッシュ（500μL）2回、速度20μL／秒
1×SSCで洗浄、10分間、室温
攪拌時に吸引・送液した体積：50μL
攪拌（注入および排出）の速度：20μL／秒
攪拌サイクル：0.5サイクル／分
・0.1×SSCでフラッシュ（500μL）1回、速度20μL／秒
0.1×SSCで洗浄、5分間、室温
攪拌時に吸引・送液した体積：30μL
攪拌（注入および排出）の速度：20μL／秒
攪拌サイクル：1サイクル／分
・0.1×SSCでフラッシュ（500μL）1回、速度20μL／秒
３．スライドの乾燥
イソプロピルアルコールでフラッシュ（500μL）2回、速度20μL／秒
空気でフラッシュ（1000μL）2回、速度20μL／秒
エアブロー乾燥：400秒
上記のプロトコールに従ってハイブリダイゼーション反応を行った後、常法に従ってマイクロアレイ１の蛍光測定を行った。各スポットについて測定された蛍光強度を統計的に処理して、信号強度のばらつきを求めたところ、下記の結果が得られた。
【００２８】
1024スポットからの信号
平均値      標準偏差      ＣＶ値（％）
従来例        37015        12724          34.4
本発明        39207         2840           7.2
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１（Ａ）は、従来のマイクロアレイ用反応容器を示す断面図である。図１（Ｂ）は、（Ａ）におけるマイクロアレイの平面図である。図１（Ｃ）は、（Ａ）における蓋体の底面図である。
【図２】図２は、図１に示した従来のマイクロアレイ用反応容器の問題点を示す説明図である。
【図３】図３は、本発明の位置実施例になるマイクロアレイ用反応容器を構成する蓋体の底面図である。
【図４】図４は、図３に示した実施例の作用を示す説明図である。
【図５】図５（Ａ）〜（Ｄ）は、図３の実施例の変形例を示す説明図である。
【図６】図６は、本発明の他の実施例になるマイクロアレイ用反応容器を構成する蓋体の底面図である。
【符号の説明】
【００３０】
１…マイクロアレイ、２…スポット領域、３…Ｏ-リング、４…蓋体、５…反応室、６ａ，６ｂ…透孔、７ａ〜７ｄ…流れ限定部材
【図１】
2005106739.tif 000003
【図２】
2005106739.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005106739.tif 000007
【図６】
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