(57)【要約】 【課題】γ−アミノ酪酸取り込み能が低下した酵母を作出し、アミノ酸組成はほとんど変化なく、γ−アミノ酪酸含量が増加したアルコール飲料を提供することにある。 【解決手段】突然変異処理により、γ−アミノ酪酸の取り込み能が低下した酵母変異株が、育種、分離された。本新規酵母変異株は、各種酵母を変異処理し、γ−アミノ酪酸を単一窒素源とする最小培地で生育できない性質を有する。本発明によれば、この酵母を従来の醸造方法に適用して、アミノ酸組成はほとんど変化なく、γ−アミノ酪酸含量が増加したアルコール飲料を提供することができる。  【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母サッカロミセス・セレビシエを変異処理した後、γ−アミノ酪酸を単一窒素源とする培地での増殖能が著しく低下した酵母を選択することを特徴とした、γ−アミノ酪酸取り込み能低下酵母の育種方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって育種されたγ−アミノ酪酸取り込み能低下酵母。
【請求項３】
前記酵母が、ＧＡＢ７０１−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１９５６１）である請求項２に記載のγ−アミノ酪酸取り込み能低下酵母。
【請求項４】
請求項２または３に記載の酵母を用いて製造されたγ−アミノ酪酸高含有アルコール飲料ならびに製造過程で生じるγ−アミノ酪酸高含有副産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母サッカロミセス・セレビシエの変異株であるγ−アミノ酪酸取り込み能低下酵母およびこれを用いて製造されるアルコール飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−アミノ酪酸は、動植物界に広く分布するタンパク質非構成アミノ酸で、哺乳類の脳や髄に存在する抑制系の神経伝達物質であり、血圧上昇抑制、潰瘍等臓器炎症の治癒促進、利尿作用等、種々の生理作用を有することが知られている。
【０００３】
清酒、味噌、醤油等の製造に利用される麹菌はGABAを生成能を有することが知られており、清酒原料である米麹製造に利用される麹菌アスペルギルス・オリゼーを用いてγ−アミノ酪酸を製造する技術（特開平１０−１６５１９１号）や、麹菌アスペルギルス・オリゼーから得られたグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターを麹菌アスペルギルス・オリゼーに移入した形質転換体、この形質転換体を用いたグルタミン酸デカルボキシラーゼの高生産、及び、この形質転換体を用いたγ−アミノ酪酸の高生産する方法（特開２００１−５４３９０号）などが開示されている。
【０００４】
アルコール飲料のγ−アミノ酪酸濃度を高める方法としては、γ−アミノ酪酸を高生成させた食品素材の利用が考えられ、自己消化工程、γ−アミノ酪酸生成能を有する乳酸菌の培養工程、またはこれらの組み合わせ等により得られる麹の処理物を用いる方法（特開２００３−１６９６５９号）が開示されている。
【０００５】
また、天然食品素材におけるγ−アミノ酪酸含量を増加させる方法として、グルタミンを含有する原料にグルタミン酸脱炭酸酵素およびグルタミナーゼを作用させ、原料中に含まれるグルタミン酸のみならずグルタミンからγ−アミノ酪酸を生産せしめることにより、別途製造されたグルタミン酸を添加することなく、γ−アミノ酪酸を増加させる。さらに、グルタミン酸脱炭酸酵素として、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する微生物を作用させることにより、より効率的、かつ簡便に、通常の製造工程を用いてγ−アミノ酪酸を増加させる等（特開２００２−３００８６２号）が提案されている。
【０００６】
以上のようにアルコール飲料の製造過程でγ−アミノ酪酸を富化させることは可能であるが、その発酵工程において、酵母がγ−アミノ酪酸を取り込むため、富化したγ−アミノ酪酸は減少する。酵母によるγ−アミノ酪酸の取り込みを抑制できれば、さらにγ−アミノ酪酸含量を増加させることができ、アルコール飲料の多様性、販路拡大につながるので、そのようなアルコール飲料を簡便に製造できる酵母の開発が望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アルコール飲料の発酵工程における酵母によるγ−アミノ酪酸の取り込みに着目し、γ−アミノ酪酸の取り込み能が低下した酵母を育種し、これを用いてγ−アミノ酪酸を高含有するアルコール飲料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記した目的を達成するために鋭意研究を行なった結果、γ−アミノ酪酸を分解する酵素γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼをコードするUGA1遺伝子を破壊した酵母では、γ−アミノ酪酸取り込み能が低下していることを見いだした。
【０００９】
そしてUGA1破壊株がγ−アミノ酪酸を資化できないという性質を利用して、γ−アミノ酪酸低資化性酵母変異株を育種し、清酒を製造したところ、γ−アミノ酪酸の含量が増加することを見いだし、本発明に至った。
【発明の効果】
【００１０】
このようにγ−アミノ酪酸低資化性酵母の増殖特性を利用することにより、γ−アミノ酪酸取り込み能が低下した酵母を取得することができ、小仕込み試験により親株よりγ−アミノ酪酸含量が増加した清酒を製造することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明におけるγ−アミノ酪酸を高含有するアルコール飲料とは、アミノ酸組成はほとんど変化なく、γ−アミノ酪酸含量が増加したアルコール飲料である。また、アルコール飲料とは、清酒、ビール、ワインなどの醸造酒雑酒、リキュールなどである。
【００１２】
はじめにγ−アミノ酪酸低資化性を指標としたγ−アミノ酪酸取り込み能低下酵母の育種について述べる。協会７号酵母の泡なし変異株Ｋ７０１株のウラシル、トリプトファン要求性株であるUT-1株を用いてγ−アミノ酪酸分解酵素であるγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼをコードするUGA1破壊した株（Δuga1::URA3、Δuga1::TRP1）を作製し、総米２００ｇの清酒小仕込み試験を実施した。上槽した清酒に等量の１０％ＴＣＡを加え、ボルテックスにより攪拌後、０．４５μｍフィルターろ過をし、アミノ酸分析に供した。その結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
Ｋ７０１株では、γ−アミノ酪酸濃度が０．２６mMであったのに対し、UGA1破壊株では、０．４０ｍMとなり、１．５倍の濃度の増加が認められたことから、UGA1によりコードされるＧＡＢＡトランスアミナーゼの機能が低下した酵母を用いることによりγ−アミノ酪酸高含有清酒の製造が可能となることが明らかとなった。また、清酒製造工程で生じる清酒粕には、清酒が約５０％程度含まれるため、清酒粕中のγ−アミノ酪酸濃度も清酒のγ−アミノ酪酸濃度を反映して増加することになる。
【００１５】
酵母においてγ−アミノ酪酸はUGA1によりコードされるγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼによってコハク酸セミアルデヒドに変換された後にUGA2によりコードされるコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素によりコハク酸に変換され、細胞内で利用される。
【００１６】
UGA1やUGA2の機能が低下した実験室酵母変異株は、γ−アミノ酪酸を単一窒素源とする培地（以下「γ−アミノ酪酸培地」という）では増殖できないことが知られている（Ramos F, Guezzar ME, Grenson M, and Wiame JM（1985）Mutations affecting the enzyme involved in the utilization of 4-aminobutyric acid as nitrogen source by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem, 149, 401-404）。
【００１７】
図１からわかるように清酒酵母においても実験室酵母と同様にUGA1破壊株はγ−アミノ酪酸培地で増殖できないことが確認されたことから、硫酸アンモニウムを単一窒素源とする最小培地（以下「SD培地」という）では増殖できるが、γ−アミノ酪酸培地では増殖できないというγ−アミノ酪酸低資化性酵母の増殖特性を利用することにより、清酒醪におけるγ−アミノ酪酸取り込み能が低下した酵母の育種が可能となる。
【００１８】
（図１）
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【００１９】
すなわち、本発明を実施するには、変異処理（自然変異も含包される）した後、ＳＤ培地とγ−アミノ酪酸を単一窒素源とする最小培地（以後「γ−アミノ酪酸培地」という）にレプリカし、ＳＤ培地では生育できるが、γ−アミノ酪酸培地で生育できない菌株をスクリーニングすればよい。
【００２０】
γ−アミノ酪酸低資化性酵母育種のための酵母サッカロミセス・セレビシエとしては1倍体あるいは2倍体いずれにおいても取得可能であり、また清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母、実験室酵母など、いずれの酵母であってもよい。
【００２１】
変異の方法としては、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法、自然変異法、遺伝子破壊法など、いかなる方法を用いてもよい。
【００２２】
また、γ−アミノ酪酸資化性が低下した酵母を効率よく得るために、活発な増殖を示す酵母に対して殺菌作用を有するナイスタチンを用いて、γ−アミノ酪酸培地でナイスタチン濃縮を行なうことが有効的である。
【００２３】
以下に、本発明をその実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
日本醸造協会７０１号酵母（以下、「Ｋ７０１」という）をYPD液体培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）で３０℃、一晩、振とう培養後、集菌、洗浄した。洗浄菌体を５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、エチルメタンスルホネート０．２５ｍｌを添加し、３０℃で１時間緩やかに振とうした。１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を５ｍｌ加え中和後、集菌、洗浄し、YPD液体培地５０ｍｌに懸濁した。３０℃、一晩、振とう培養後、集菌、洗浄し、無窒素最小培地（０．１７％ディフコ社イーストニトロゲンベース：アミノ酸と硫安を除いたもの、２％グルコース）５０ｍｌに懸濁した。３０℃、３時間振とう培養後、集菌、洗浄し、γ−アミノ酪酸培地（０．１７％ディフコ社イーストニトロゲンベース：アミノ酸と硫安を除いたもの、０．５％γ−アミノ酪酸、２％グルコース）９ｍｌにＯＤ６６０＝２０となるように懸濁した。３０℃、３時間３０分振とう培養後、１００μｇ／ｍｌナイスタチン溶液１ｍｌ添加し、さらに３０℃、１時間３０分、振とうした。このナイスタチン濃縮液を希釈せずにＳＤ寒天培地（０．６７％ディフコ社イーストニトロゲンベース：硫安を除いたもの、２％グルコース、２％寒天）に塗沫した。３０℃で３日間培養し、生育したコロニーを再びＳＤ寒天培地に植え継いだ後にＳＤおよびγ−アミノ酪酸寒天培地にレプリカした。３０℃、３日間培養後、ＳＤ培地では生育できるが、γ−アミノ酪酸培地では生育できないγ−アミノ酪酸低資化性株、ＧＡＢ７−１株を分離した。
【実施例２】
【００２５】
取得したγ−アミノ酪酸低資化性酵母について表２に記載の仕込み配合にしたがって総米２００ｇの小仕込み試験を行なった。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
発酵温度経過は、水麹１５℃、添１５℃、踊１５℃、仲１０℃、留９℃、以後１５℃まで１日１℃づつ上昇し、１５℃一定に保った。留１５日目に遠心分離により上槽を行なった。醪中の総アミノ酸およびγ−アミノ酪酸濃度の推移を図２に、生成酒の分析結果を表３に、清酒粕中のγ−アミノ酪酸濃度を表４に示した。
【００２８】
図２に示すように、酵母の増殖が活発な醪初期においては、アミノ酸が酵母に取り込まれるため、いずれの醪においてもアミノ酸濃度の増加は認められなかった。一方、ＧＡＢＡ濃度は、醪初期において、対照醪では濃度の増加は認められなかったが、ＧＡＢ７−１株を用いた醪では濃度の増加が認められ、酵母の増殖期におけるγ−アミノ酪酸の取り込み能が低下していることが明らかとなった。
【００２９】
（図２）
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【００３０】
表３に記載の結果からもわかるように、γ−アミノ酪酸濃度以外の分析項目では、γ−アミノ酪酸低資化性酵母と親株との間にほとんど差は認められなかったが、ＧＡＢ７−１株を用いた生成酒のγ−アミノ酪酸濃度は、対照酒に比べ、２．０倍となった。このＧＡＢ７−１株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１９５６１として寄託した。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
また、清酒粕中のγ−アミノ酪酸濃度は、表４に示すように清酒中のγ−アミノ酪酸濃度を反映し、ＧＡＢ−１株を用いた清酒粕では、γ−アミノ酪酸濃度が対照の約２倍に増加した。
【００３３】
【表４】
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