(57)【要約】      （修正有）【課題】精子の頭部膜に機械的な損傷を誘発するインジェクションピペットとこれを適用するICSI方法を提供する。【解決手段】インジェクションピペットの内径を精子の頭部の最大直径より小さく構成すると共に、該ピペットの先端に多数の短いスパイクを形成し、その先端で精子を捕獲した後に卵細胞質の中へ注入し、細胞質物質と混合した後に注入ピペットを回収した。【効果】精子の機械的な損傷を防止し、卵細胞質膜の通過を容易にすることにより受精率を高めることができた。【選択図】図３
2005074586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵細胞質内注入法に使用されるインジェクションピペットにおいて、
卵細胞質の中に注入しようとする精子頭部の最大直径より大きくないし精子尾部の最大直径よりは大きい内径の持つことを特徴とするインジェクションピペット。
【請求項２】
第1項において、上記のピペットの先端に多数のスパイクが形成される事を特徴とするインジェクションピペット。
【請求項３】
狭く引き伸ばした毛細管を望ましい直径の持つ地点までホールディングピペットの入り口に挿入した後、上記毛細管を曲げた切断する事を特徴にする請求項１または２のインジェクションピペットの製造方法。
【請求項４】
インジェクションピペットで精子を捕獲し卵細胞質内へ注入した後、インジェクションピペットを回収する過程で構成される卵細胞質内精子注入方法において、上記請求項第1項または第2項のインジェクションピペットを使用する事を特徴にする卵細胞質内精子注入方法。
【請求項５】
第4項において、上記のインジェクションピペットの先端部分で精子の頭部を捕獲する事を特徴にする卵細胞質内精子注入方法。
【請求項６】
第5項において、上記捕獲される精子の頭部の具体的な部分が赤道領域だという事を特徴にする卵細胞質内精子注入方法。
【請求項７】
第4項において、インジェクションピペットを回収する前に精子と卵細胞質とを混合する過程を含む 卵細胞質内精子注入方法。
【請求項８】
第7項において、上記混合する過程はインジェクションピペットの他端に加圧または減圧することを繰り返して適用することを特徴にする卵細胞質内精子注入方法。
【請求項９】
第7項において、上記混合する過程はインジェクションピペットの他端を口で調節して放出及び吸入を2−3回繰り返すことを特徴にする卵細胞質内精子注入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は卵細胞質内精子注入法(intracytoplasmic sperm injection, 以後 'ICSI'と略称)に付いてのものでより詳しくとは従来のICSIテクニックの問題点を解決できる改選されたICSI方法及びこれを可能にするICSI用のインジェクションピペットの作製に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ICSIは精子を卵細胞質の中に人為的に注入する方法で,雄性不妊を克服する目的あるいは受精の根本的なメカニズムに関する研究を目的とし人を含めた多くの動物で幅広く使われている。  始めてICSIが開発された[Palermo et al, Lancet. 340, 1992, p17]以来この方法を用い特に人で非常に高い受精成功率を得ている[Hsu et al, Fertil. Steril. 72, 1999, p679]。
【０００３】
ICSIは特定な刑の男性不妊を克服するための大変有効な道具になるだけでなくまた受精過程で必ず必要とする事と必要しないことを判別して研究するのに有用な手段になる[Yanagimachi, In:Knobil E., Neill D (eds.), The Physiology of Reproduction, 2nd ed., New York: Raven Press, 1994, p189]。その上、ICSIは精子−媒介遺伝子伝達（sperm-mediated gene transfer, 以後'SMGT'と略称）の有用な道具として使えている(Smith KR, Anim. Biotechnol. 10, 1998, p 1; US Patent No. 6,376,743)。
【０００４】
生体の中で起こる正常な受精でha精子が透明帯(zona pellucida; 以後  'ZP'と略称)に結合した後ZPを通過し、卵膜と融合するために必要する細胞性エキソサイトーシスの1つの形態である先体反応が起る。実質的な融合部位は生体内条件で卵膜と通合する精子頭部の先体後域（postacrosomal region）である。第二極体が方出した後母界染色体は凝縮し雌性前核（female pronucleus; 以後  'FPN'と略称）を形成する。配偶子の膜融合は先体後域の前面で起こるに対し、精子頭部は外皮質の舌形過程（tongue-like process）によって陥入され食細胞作用で導入される。単精子受精では精子の頭部が先に結合し尻尾は一般的にジッパーのような方式（zipper-like fashion）で導入される[Sathananthan A.H. In: Handbook of in Vitro Fertilization. Trounso A. Gardner D.K. (eds). Boca raton, FL: CRC, p237]。実際に、紐帯類（eutherian mammal）で先体のequatorial region上部の精子細胞膜は卵細胞膜と優先的に融合し[Bredford et al. In: Poste G., Nicolson G.L., eds. Membrane Surface Reviews (Membrane fusion), Amsterdam: North-Holland. 5, 1978, p65]、融合後精子頭部が陥入され尻尾全体が卵細胞質の中へ導入される。
【０００５】
先に述べたように正常な受精メカニズムを明らかにしその過程を真似る補助生殖技術の研究が活発に進行され,その中の1つがICSIである。すなわち、ICSIは精子と卵子との認識、結合、通過及び融合過程を回避し一連の受精過程を任意的に変えることである。
【０００６】
生体での正常な受精過程を真似る従来のICSI方法は一般的に精子の尻尾を損傷させる過程、精子をインジェクションピペット中に完全に吸引し捕獲する過程及び精子と共に卵細胞質を混わし,その後再び卵細胞質中に注入する過程によって構成される。
【０００７】
また、従来のICSI方法で受精率を高めるための研究が続いて来て、主に精子に運動性を与える尻尾及び尻尾膜を適切に処理する事を中心として改選されて来た。すなわち、運動性の持っている精子の操作の容易性と卵細胞活性を誘導する精子内可溶性物質の放出のために精子の固定化と細胞膜の破壊は成功的な受精のために必要な事と考えられている[Svalander et al. Fertil. Steril. 63, 1995. p828; Vanderzwalmen et al. Hum. Reprod. 11, 1996, p540; Dozortsev et al. Hum. Reprod. 12, 1997, p2792]。すなわち、インジェクションピペットが精子の尻尾に機械的な損傷を与える場合尻尾の細胞膜は破壊されこれによって精子頭部の脱凝縮を誘導する卵子内細胞質性因子などが精子の中へ導入することができる[Flaherty et al. Reprod. Fertil. Dev. 7, 1995, p197]。
【０００８】
このように従来のICSIテクニックでは運動性の持っている精子の固定化と精子尻尾の細胞膜に損傷を起すために精子尻尾を物理的に切断,除去及び衝撃を与える方法、ピエゾパルス衝撃、吸引と放出の繰り返しなどの方法を使えて来た。その上多くの研究者は先に述べたような操作のため精子の運動性を減少させなければならなく、その良くない効果にもかかわらず精子の運動性を減らすポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone, 以後PVPと略称）を使用して来た。PVP溶液の粘性は精子の運動性を極的に減少し、インジェクションピペットの外部と内部への流体の移動を調節することを改選したため最近まで一般的に使われて来て多くの研究者達はPVPの使用をICSIの成功に大切な因子だと考えている。
【０００９】
また、従来のICSIテクニックで使用されているインジェクションピペットはピペットの内部と外部へ精子が自由に移動できる程の十分な直径を持っているため操作する精子頭部の直径より必ずもっと大きく作らなければならない。しかし、インジェクションピペットの直径が８μｍより大きい場合は精子を注入する間卵子の細胞質が破壊され易い問題点を持っている[Payne D., Reprod. Fertil. Dev. 7, 1995, p185]。
【００１０】
このように精子を卵細胞質の中に注入する補助生殖技術の1つであるICSIは1992年最初に開発された以来高い受精率を示し、人の不妊施術で広く活用されているが精子の運動性が微細操作の速度を凌駕するので精子の注入のためには精子の運動性を減少させる必要があるし、精子注入の前にインジェクションピペットから離れることを防止するためには精子の尻尾を無力化しなければならない。さらに、注入された精子の卵細胞質の中での脱凝縮を誘導する事と共に流入される培地の量を極小化させるために精子の尻尾の原形質膜を損傷したり尻尾を切ったりする事が必要である。
【００１１】
先に述べたように従来のICSIテクニックにおけるPVPの使用、尻尾のスコリング、尻尾切断などの操作は正常的な受精環境とは大きく異なりインジェクションピペットの直径が精子頭部の太さより大きいのでPVPの含む培地の注入量が多くなるし, 卵細胞の破壊を起す欠点がある。既に明らかになった研究結果によると従来のICSI方法で受精された受精卵の低い生存率の原因はインジェクションピペットが余りにも大きい事が挙げられている[Dozortsev et al., Zygote, 1998, 6, p143]。また、過多な培地の流入は精子頭部膜を取り囲むので精子頭部の中の物質との接触を妨害することが明らかになっている[Hsu et al.,  Fertil．Steril．1999，72，p679]。
【００１２】
特に，正常な受精の場合精子の頭部が融合及び脱凝縮が起る部位にもかかわらず既存のICSIテクニックでは尻尾膜の創傷だけに限って集中的に研究して来た限界がある。
【００１３】
本発明者は従来のICSI方法の持つ問題点を解消し受精率を高めることの出来る新しい接近方法を試し、いい結果を得たのでその成果を明らかにする事によって本発明を完成することに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
先に述べたような従来のICSIテクニックの問題点を解消し受精率を高めるために本発明は改選された ICSI用のインジェクションピペットとこれを使用する新しいICSI方法を提供することを目的とする．すなわち、正常な受精過程にもっと近接する新しいICSI方法を提供する．
具体的に本発明は精子の頭部膜に機械的な損傷を誘発するインジェクションピペットとこれを適用するICSI方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の改選されたICSI方法は本発明の特徴的なインジェクションピペトを使用して修行する事が出来る。
【００１６】
具体的に、本発明のインジェクションピペトは卵子内へ注入される精子頭部の最大直径より 大きくない内径を持ち,先端に多数の小さいスパイクの存在するインジェクションピペットを形成し、インジェクションピペットの先端で精子を捕獲した後卵細胞質の中へ注入し卵細胞質の中で細胞質物質と混合する後、注入ピペットを回収する過程で構成される。
インジェクションピペット(injection pipette)
本発明のインジェクションピペットは従来のICSIに使用されものと同じく両端の開いた毛細管を加工し作製する。具体的に、本発明に使用されるインジェクションピペットは卵子内へ注入する精子をインジェクションピペットの先端で捕獲出来るくらいの内径を持つように構成させる。また、本発明のインジェクションピペットの精子を捕獲する先端には多数の短いし小さいスパイクが形成できる。
【００１７】
より具体的には、図3で示したように、インジェクションピペットの内径は操作する精子頭部の最大直径より大きくなく、これによって精子がインジェクションピペットの中へ完全に入らなくピペットの先端で捕獲される。特に、本発明のピペットの内径は精子頭部の赤道領域（equatorial region）がインジェクションピペットの先端に固定される程が望ましい。
【００１８】
いっぽう、他の一端は開放(open end)されるように形成されこれによってインジェクションピペット内部の毛細管現状で陰圧(negative pressure)が発生し、これで運動性の持つ精子の捕獲が出来るようになる。
【００１９】
本発明のインジェクションピペットは毛細管を利用して。詳しくは望ましいくらいの内径の出るように毛細管を長く引っ張り出してインジェクションピペットの先端から約１ｍｍ地点を望ましい角度に曲げた後精子注入直前に卵子の入っているドロップ中で作製できる(図１)。すなわち、狭く引っ張った毛細管をホールディングピペットの入り口の中に挿入し（図１、A） 望ましい直径を持つ地点でピペットを曲げ折ってインジェクションピペットの開口部を形成する（図１、B、C）。その後 ホールディングピペット内の折れている毛細管の破片をホールディングピペットの外に出して捨てる。本発明のインジェクションピペットの先端に多数の小さいスパイクを形成することができる。
【００２０】
本発明においってインジェクションピペットのこのような構成は精子の捕獲と精子注入に多い利点を提供する。インジェクションピペットの持つ陰圧で精子捕獲が容易になり、精子の運動性を減らすためにPVPという別の化学物質を使用する必要は無くなる。
【００２１】
また、精子をインジェクションピペットの内部に完全に入れないでピペット先端で固定できるような直径を持つことによって従来のICSIテクニックで使用されるインジェクションピペットよりその直径が小さくなるので卵細胞質の破壊を減らす事と同時に精子と一緒に流入され卵細胞質の中に入る培地の量を減らすことが出来る。また、流入される培地の量を減少するために精子の尻尾を切断しなくても良いで、これによって本発明のICSIテクニックは体内で起こる正常的な精子浸透と類似な環境を提供する。
【００２２】
また、インジェクションピペットの先端にあるスパイクは精子頭部膜の損傷と卵細胞質膜の通過を容易にする事が出来る。
【００２３】
特に、本発明のICSIテクニックのインジェクションピペットはその直径を適切に変更させ特定な種の精子の操作とか捕獲に制限されなく、広範囲に使用する事ができる。
本発明のICSIテクニック
本発明の改選されたICSI方法は以上に述べたようなインジェクションピペットを使用することを特徴にする。
【００２４】
より詳しく,本発明の改選されたICSI方法は本発明の特徴的なインジェクションピペットを利用し運動性の持ったそのままの精子をインジェクションピペットの先端で捕獲し細胞質内へ注入後インジェクションピペットを回収する方法を含む。また、本発明の方法は注入される精子と卵細胞質を混合する過程も含んでいる。
【００２５】
以下、具体的にそれぞれの過程を詳細に説明する。
精子の捕獲
本発明のインジェクションピペットを運動性の持つ精子の尻尾とか頭に向けて近くに接近させることによって精子の捕獲が可能になる。あるいは、運動性の持つ精子がインジェクションピペットに近接する場合も可能になる。より望ましくは倒立顕微鏡及びマイクロマニピュレータで運動性の持つ精子とインジェクションピペットを近接させることによって精子の捕獲が可能になる。
【００２６】
このように精子の運動性を減少させなく精子を容易に捕獲できるのは毛細管現状での陰圧が発生する本発明のインジェクションピペットの特徴のである。
【００２７】
本発明では精子の動きが余り速くても 精子を容易に捕獲する事ができ、インジェクションピペットをドラップの境界部を早く遊泳する精子の尻尾近に接近したら精子頭部の先体赤道部がインジェクションピペットの先端に固定させるまで容易に吸引される。
【００２８】
インジェクションピペットの陰圧による精子の捕獲にはインジェクションピペットへ精子の頭部が先に吸引され（頭−先）捕獲される場合があるし尾部が先に 吸引され（尻尾−先）捕獲されることもある。
卵細胞質内精子注入
このようにインジェクションピペットに捕獲された精子は本発明のICSIテクニックで卵細胞質中へ注入できる。すなわち、捕獲された精子はインジェクションピペットと共に直接卵細胞質の中に注入される。具体的に精子の注入は図５で示したように卵子を固定しているホールディングピペットと精子を捕獲したインジェクションピペットと並んで遂行できる。特に、本発明のインジェクションピペットの先端に形成される多数のスパイクは卵細胞質膜を容易に通過することを可能にする。
【００２９】
インジェクションピペットで精子を卵細胞質中へ注入した後、口で圧力を調節しインジェクションピペットで陰圧と陽圧を順序的に 与える事によってインジェクションピペットから精子を出すことができる。
【００３０】
先に述べたように陽圧と陰圧を順序的に提供して精子を卵細胞質と混合させる。望ましい方法としては顕微鏡を見ながら口で吸引, 排出？？する方式で圧力を調節し2−3回繰り返し精子を卵細胞質と共に混合させることができる。
【００３１】
このように細胞質物質と混合された精子はインジェクションピペットを卵細胞質から除去したらインジェクションピペットから分離され精子だけ卵細胞質の中に残る. これは卵細胞質の粘性によって精子がインジェクションピペットと一緒に卵細胞質の外へ出ることが防止されるからである。
【００３２】
このように、捕獲された精子の卵細胞質の中への直接注入はZPと卵膜を通過する間の精子頭部膜の機械的な損傷と共に完成され、細胞質の中でインジェクションピペット内に陰圧と陽圧を口で適切に調節し細胞質中への過度な培地の流入やインジェクションピペット内への過度な細胞質物質の流入なくて損傷された精子と細胞質物質との混合を完成できる。
精子頭部膜損傷
本発明のこのような精子の注入方法は特徴的に精子頭部の損傷を起こす。言い換えれば、運動性の持つ精子がインジェクションピペットの鋭い先端に捕獲される場合頭部膜へ微細に機械的な損傷を与え、図3及び５で見るように、インジェクションピペットと一緒にZP及び卵細胞膜を通過しながら精子頭部膜にもっと多い損傷を与える事ができる。
【００３３】
これは体内での正常的な受精過程に類似な条件を提供し、卵細胞活性を誘導する精子内物質を放出し受精率を高めることができる。従来のICSIテクニックの使用でも精子の尻尾への機械的な損傷が酷ければ酷いほど受精率が高まれるという事実[Palermo et al. 1996, Hum Reprod. 11, p1023]から本発明の受精率向上の根拠になる。
【００３４】
先に述べたように本発明のインジェクションピペットはその陰圧によって運動性の持つ精子の捕獲を容易にするのでマイクロインジェクターや PVPなどの化学物質を使う必要がなく正常な受精にもっと近い環境を提供する。 また本発明のインジェクションピペットは従来のICSIテクニックに使用されるインジェクションピペットよりその直径が近いので卵細胞質の損傷を少なくし卵細胞質中へ注入される培養液などの異物質の量を減少させる利点もある。特に精子の注入過程で精子の頭部膜の機械的な損傷を誘発させることによって受精率を向上できる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の改選されたICSIのインジェクションピペット及びこれを利用するICSI方法は従来のICSI方法が持つ問題点を解消しもっとも高いMPN形成率と胚盤胞発生率を示すなどの向上された受精成功率を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下では,本発明の具体的な実施例を通じてその具現例について詳細に説明する。本実施例は本発明の技術的な思想を例示することで本発明の範囲が本実施例に限定されないことに有意しなければならない。
【実施例】
【００３７】
〔実施例１〕：本発明の改選されたICSIのためのピペットの製作
ホールディング用ピペット
本発明で使われるホールディング用ピペットを製造するためのガラス管(G-1, 製造原：Narishige,  Tokyo,  Japan)は外部直径(outer diameter; 以下OD)１mm 及び内部直径(inner diameter; 以下ID)0.9 mmを持つものであった。 ホールディング用ピペットは約５mm長さのガラスピペット区間を約120 μｍの外部直径(OD)になるまでマイクロプ−ラ−(micropuller, PC-10, 製造原：Narishige, Tokyo, Japan)で引き伸ばした。使用するプログラムはシング−ルプ−リング(single pulling), 加熱101(heat 101)及び無分銅(no weight)であった。
【００３８】
ガラス管を狭く作った後、チープ(tip)の適合な地点で他の狭いガラス管の末断で優しく摩擦しガラス管のチープを切断した。切断された先端は垂直で平めでなければならない. 均質でないピペットや斜めに切断されたピペットは廃棄した。ホールディング用ピペットはマイクロフォージ(microforge, MF-900, 製造原：Narishige, Tokyo, Japan)のプラチナ−イリジウムフィラメントの熱であぶって丸めた。
【００３９】
ホールディング用ピペットの丸められた部分のIDは約30−40μｍで、確実に卵子を固定することが可能であった。以後、ホールディング用ピペットはフィラメントの上で約30の角度に曲げて使用した。
インジェクションピペット
1.0mmのOD及び0.9mmのIDを持つ薄い壁を持つガラス管(G-1, 製造原：Narishige, Tokyo, Japan)の約5mm長さのガラスピペット区間をマイクロプ−ラ−(micropuller, PC-10, 製造原：Narishige, Tokyo, Japan)で 引き伸ばした。使用するプログラムはダブルプ−リング(double pulling),加熱1; 67(heat1; 67), 加熱2;80(heat2; 80)で1つの軽い分銅(one light weight)であった。
引いたガラス管の鋭い先端を約30°の角度でマイクロフォージ(microforge, MF-900, 製造原：Narishige, Tokyo, Japan)のプラチナ−イリジウムフィラメントの熱で曲げた。
【００４０】
そして図１のように鋭いガラス管の先端をホールディング用ピペットの入り口の中に挿入し（図１、A）、挿入されたガラス管の先端を少しずつ曲げて（B,C）結局ピペットの先端が折れるまで曲げた。この過程は卵子の入っているドロップ内で行い、ホールディング用ピペットの内部に残ったガラス管の破片は廃棄した。
【００４１】
〔実施例２〕：運動性の持つ精子の選別
精液の準備
本実施例では凍結−解凍したブタの精液を使用した。精液ストローを一分間39℃で解凍した。精液100μｌを0.1%  ポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol, 以下  PVA)の含む1mlのDPBS(Gibco 141900-144, Grand Island, NY)が入っているエペンドルプチューブの下に静かに入れ、スウィムアプ(swim-up)過程のために蓋を閉めて39℃、５％、CO2                                                                                 インキュベーター中で定置した。五十分後 エペンドルプチューブの上層から培地0.5mlを取って2.5mlエペンドルプチューブに入れ三分間350Ｘｇで遠心分離した。上層液を除去して精子ペレトをICSI直前まで39℃状態に恒温漕で保管した。
運動性のある精子の選択
少量の精子ペレトを精子用ドロップの中心に気をつけて移動した。精子はディッシュ底部の中心からドロップの境界に向かって素早く移動した。ディッシュ内をmineral oilで満たす前にディッシュをテーブルの上で軽く叩いてドロップを薄くに作った。 これによって境界領域の狭い空間で上下に遊泳する精子を先発する事ができた。
【００４２】
〔実施例３〕体外成熟卵子の準備
特別な説明がない限り本源で使用する試薬はSigma製造原(Sigma-Aldrich Co., St.Louis, M.O., USA)の物を使用した。
未成熟卵子の体外成熟
卵巣は屠場で未経産豚から採取し35℃の0.9%(w/v)  食塩水の中で保管して実験室へ移動した。 卵巣を三回ワシングし 5mlの一回用注射器に18ゲージの皮下用注射用針を付け未成熟卵子を吸入した。図２のAのように、卵巣の皮層に多数の大小の卵胞が見える。
15ｍｌのコニカールチューブに卵胞内容物を集me上層液を廃棄した。沈殿物の中の卵丘細胞−卵子複合体(cumulus-oocyte complex, COC)を0.01% PVAの添加したTyrode's Lactate Hepes(TLH)培地（表１）で三回ワシングした。均質な顆粒状の卵細胞質を持って3層以上の緻密な卵卵丘細胞によって囲まれているCOCを体外成熟（in vitro maturation, 以下  IVM）用に選択した。図２のBのように未成熟卵子が卵丘細胞で稠密に囲まれている事が見える。
IVM培地（表２）は26.2ｍM NaHCO3, 3.05 mM グルコース, 0.91 mM ピルビン酸ナトリウム, 0.57 mM L-cysteine, 75μｇ/ml カナマイシン, 20 ng/ml EGF, 5IU/ml PMSG/hCG (製造原：Gibco, Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA)を含む組織培養培地である。豚卵胞液(以下、pFF)は未経産豚卵巣の直径3−8mmの卵胞を吸入し、三十分間1900Ｘｇで遠心し1.2μｍ及び以後の0.45μｍシリンジフィルター（製造原：Gelman Sciences, Ann Harbor, MI, USA）を通じて濾過して使用するまで−30℃で保管した。
体外成熟は10% pFFの添加された成熟用培地に30 から50個の未成熟卵子を入れ39℃、5%  CO2 の飽和湿度下で初めの22時間はホルモンの添加した培養液が入っている4−ウェルディッシュで培養し、その後22時間はホルモン無しの培養液で培養した。 図２のCのように44時間のIVM後よく拡張された卵丘細胞を持つ成熟卵子が観察される。
【００４３】
【表１】
2005074586.tif 000003
【００４４】
【表２】
2005074586.tif 000004
インジェクションチェンバーの準備
体外成熟された卵子を0.1%（w/v）ヒアルロニダーゼ？に短く露出した後機械的な ピペッチングで卵丘細胞を除去した。第１極体及び正常な外観の持つ卵子を二回ワシングし0.01%  PVAの含む７μｌTLHドラップの中に移し精子ペレトを少しそのドラップへ加えた。
【００４５】
〔実施例４〕卵細胞質内への精子注入
倒立顕微鏡及びマイクロマニピュレータ(LABOVERT FS, Leitz, Germany)下で運動性の持つ精子の尻尾または頭の近くにピペット先端を接近し精子頭部の赤道領域まで自動的にインジェクションピペットの中へ吸入されるようにした。吸入された精子がインジェクションピペットの先端に捕獲された形態は図３で示した。 運動性の持つ精子だけがドラップの境界で容易に捕獲された(図４)。
【００４６】
図5のように、捕獲された精子を卵子のドラップに移し精子を細胞質へ直接注入した。その後開放されているチューブ(open end tube)を口で2-3回吸入と放出を繰り返し、精子を細胞質内成分と共に混合した(図６)。 混合が終わったらインジェクションピペットを卵子から除去した。
【００４７】
〔実施例５〕受精された卵子の培養
精子の注入された全ての体外受精卵子は0.4%  BSAの含むノースカロライナ州立大学−23(North Carolina State University-23, NCSU-23)培地(表３)に移しMPN形成及び精子頭部の脱凝縮の確認, 拡張胚盤胞への発生及び細胞数の観察のため39℃,  5%  CO2                                                                               ,  7%  O2及び88%  N2のインキュベーターでそれぞれ18時間及び168時間培養した。
【００４８】
【表３】
2005074586.tif 000005
〔実施例６〕MPNの平価及び胚盤胞細胞の計数
ICSI及びIVF18時間後全ての卵子をスライドグラスに移し34℃のマイクロワンプレの上で十分間固定液（アセト酸：エタノール＝1：3）で固定した。以後、45%(v/v)アセト酸溶液に1%(w/v)オルセイン(orcein)を溶かした溶液で染色し400倍率の光学顕微鏡下で精子の脱凝縮及びMPN形成を平価した（図７）。 図7の(A)で二つの前核及び二つの極体が見え、(B)では脱凝縮された精子の頭部及び雌性前核が見える。
【００４９】
生存した卵子を（１）1つの雌性前核 (female pronucleus, 以後FPN)と二つの極体(polar body, 以後PB)と共に存在する1つのMPN、（２）FPNの有無との関係なくて1つのMPNの存在、及び（３）FPNの有無との関係なくて1つのMPNまたは1つの脱凝縮された精子頭部（decondensed sperm head, 以後DSH）の三つのグルプに分類した。
【００５０】
ICSIとIVF48時間または168時間後,それぞれ分割率とヘキスト33342染色による胚盤胞の生存率と細胞数を調査した（図８）。図8の（A）では多数の拡張胚盤胞が見え、（B）ではヘキスト33342で染色された拡張胚盤胞の核が見える。
【００５１】
〔実施例７〕統計分析
グルプ間のMPN形成及び発生の差異(%)を分散の均一性を維持するためにアクサイン(arcsine)変換後、ANOVAを使って分析した。LSD試験を使ってグルプ間の差異を確認するためにPost hoc分析を遂行した。多重比較のためDunn方法と共にWilcoxon試験を使用しグルプ間胚盤胞細胞数の有意差の存在有無を決定した。全ての分析はSAS(SAS Institute version 8.1)分析プログラムを使って遂行した。
比較実験
〔比較実施例１〕：精子及び卵子の準備と体外成熟
凍結−解凍された雄ブタの精液を体外成熟卵子の受精のために準備した。精子の準備とIVFのための培地としてはそれぞれカルシウム及びマグネシウム無しのPBS及びmodified Tris-buffered medium(mTBM)を使用した。精子のワシングためのPBS は136.9  mM/L NaCl, 2.7  mM/L KCl, 1.5  mM/L KH2PO4, 8.1  mM Na2HPO  4, 0.5mM/L プルビン酸ナトリウム, 5.6  mM/L グルコ-ス及び0.1%(w/v) BSA からなっている(表４)。
【００５２】
ｍTBM（表５）には113.1 mM/L NaCl, 3 mM/L KCl, 7.5 mM/L CaCl2, 20 mM/L Tris(T-1410, Trizma base), 11 mM/L グルコ-ス, 5 mM/L ピルビン酸ナトリウム, 4 mM/L 無水カペイン及び0.2％(w/v) BSA(A-3311, Fraction V, fatty acid free)を含まれ手入る。
【００５３】
凍結精液を一分間39℃で解凍させ10mlのPBSで希釈した。 精子希釈液は350Ｘｇで３分間二回遠心し最終精子ペレトを1Ｘ106 sperm/mlの濃度になるようにmTBMで再び希釈した。
【００５４】
いっぽ、IVMが終わった卵子を0.1%(w/v)のヒアルロニダーゼを含む成熟培地で優しくピペッチングし拡張した卵丘細胞を除去しmTBMで二回ワシングした。５μｌのmTBM液と共に20-30個の卵子をミネラルオイルで満たした40μｌの受精ドロップ中へ入れた。その後それぞれの受精ドロップ中に精子希釈液５μｌを添加し最終精子濃度が1Ｘ106sperm/mlになるようにしCO2インキュベーターで8時間培養した。
【００５５】
【表４】
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〔比較実施例２〕：ICSI方法の差による受精効果の比較
従来のICSIテクニックによる受精
従来のICSIのためのインジェクションピペットはヒュマゲン(Humagen, Inc.)(Charlottesville, VA; 10-MIC-S, 30°angled)から購入した。50Ｘ9 mmディッシュの蓋に二つの７μｌドロップを作製した。マイクロマニピュレーターが取り付けられた倒立顕微鏡（Olympus IX50, Melville, NY, USA）を使用しながら精子の尻尾をスコリングし運動性を減らしてインジェクションピペットの中に吸入し（図９のA）卵子を含んでいるドロップに移動した（図９のB）。
【００５６】
精子はホールディングピペットで固定された卵子へ六時か12時方向から注入し少しの細胞質と混合した[Martin, Biol.Reprod., 2000, 63, p109] (図９)。
本発明のICSIによる受精
本発明の改選されたICSIは〔実施例４〕で説明されたように卵子を受精した。
各ICSI方法による受精効果の差異の比較（実験１）
実験１では異なる方法で受精された卵子のMPN形成を比較した。各方法によって受精された受精卵を培養し受精18時間後にMPN形成率及び精子頭部の脱凝縮を評価した。また、IVFグルプでは多精子受精も調べた。
受精卵の生存、分割及び胚盤胞形成率を受精後24時間、48時間及び168時間別に観察し比較した。胚盤胞の細胞数は〔実施例６〕で説明したように観察した。
本発明のICSI方法で精子捕獲形態による効果の差異比較（実験２）
実験２では 精子捕獲タイプの差異によるMPN及び胚盤胞への発達を調べた。
本発明の改選されたインジェクションピペットの先端に捕獲される精子捕獲タイプは〔実施例４〕で説明したように二つの形態がある。すなわち、図10のAで見えるように尻尾が先に捕獲された精子が卵細胞質中に注入される場合（インジェクションピペットの外に精子頭部が見える、Ｘ200）と図10のBで見えるように頭が先に捕獲された精子の卵細胞質中に注入される場合（矢印は精子頭部を示して尻尾はインジェクションピペットの末端にある、Ｘ200）がある。運動性の持つ精子は何時も精子ドロップの境界で捕獲された（図４）。
比較実験結果
実験１：受精方法による差異
二つのICSI方法及びIVF によるMPN形成率は表６に示された。IVFグルプでは22個の卵子から多精子受精が発見され、これは二個以上の雄前核または精子の頭が見えた（表６に示さない）。
【００５７】
改選されたICSI方法の正常受精（46.7%）及びMPN形成率（50.7%）は従来のICSI方法（21.3%及び27.9%）に比べ有意的に高い値を示した（P〈0.001〉。また、本発明の改選されたICSI方法に置いてMPNを含む精子頭部の脱凝縮形成（80.0%）はIVFグルプでの多精子受精を除外したら従来のICSI(55.7%)及びIVFグルプ（63.5%）より有意に高いの値であった（P〈0.001〉。
【００５８】
【表５】
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他の２種類のICSI方法及びIVFでの受精卵の生存率、分割率及び胚盤胞形成率は表７に示してある。本発明の改選されたICSI方法による卵子の生存率（71.7%）は従来のICSI方法による生存率（48.1%）に比べて有意的に高い値を示した(P〈0.001〉。また、本発明の改選されたICSI方法による分割率（60.6%）は従来のICSI方法（48.7%）及びIVFグルプ（53.2%）に比べ有意に高い値であった（P〈0.001〉。
IVFグルプでの拡張胚盤胞への発達率（19.4%）が従来のICSI10.5%）及び 改選されたICSI（17.5%）に比べ有意に高い値を示しているが（P〈0.001〉、 多精子受精卵子の胚盤胞への発達を考えると本発明の改選されたICSI方法はIVFグルプとほぼ同じいかやや高い率と考えられる。また、グルプの間で胚盤胞の細胞数には有意差が観察されなかった。
【００５９】
【表６】
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実験２．精子捕獲形態
本発明の改選されたICSI方法に置いて、頭部が先に捕獲された場合と尾部が先に捕獲される場合の二つグルプ間のMPN形成率は表８に示した。 尾部が先に捕獲された場合(55.4, 59.8, 78.3%)は頭部が先に捕獲された場合(45.1, 54.9, 74.4%)の間に正常受精、MPN形成及び脱凝縮では有意差が無かった。
【００６０】
【表７】
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また、本発明のICSI方法に置いて二つのグルプ間の生存率、分割率及び胚盤胞形成率を表９に示した。尾部が先に捕獲された場合と頭部が先に捕獲されたグルプ間で生存率に差は無かった（79.8及び73.7%）。改選されたICSIでは精子と共に注入される培地の最小量は精子の注入される卵子の生存に影響を与えなかった。
分割率にも有意差が観察されなかった。拡張胚盤胞への発達は頭が先に捕獲された場合が尻尾の先に捕獲された場合より高い（66.2及び57.1%，4.3及び12.5%）値を示したが有意差は無かった。拡張胚盤胞の細胞数では有意差が無かった(39.5 及び32.8)。
【００６１】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は本発明のインジェクションピペットの作製過程を示す。
【図２】図２はブタ未成熟卵子の変化を示す。
【図３】図３はインジェクションピペットの先端に捕獲された精子を示す。（A）尻尾が先に捕獲された場合。（B）頭が先に捕獲された場合。
【図４】図４は本発明のインジェクションピペットの先端に運動性の持っている精子が捕獲されたことを示す。
【図５】図５は本発明のインジェクションピペットを利用し捕獲した精子を成熟卵子中に注入することを示す。
【図６】図６は細胞質の真中でインジェクションピペットの圧力を調節して注入された精子を細胞質と共に混ぜる過程を示す。
【図７】図７は本発明の改選されたICSIテクニックで受精した後アセト−オルセインで染色した受精卵を示す。（A）二つの前核と二つの極体が見える。（B）脱凝縮された精子頭部と雌性前核が見える。
【図８】図８は本発明の改選されたICSIテクニックで受精され受精１６８時間後に発生した胚盤胞を示す。（A）多数の拡張胚盤胞が見える。（B）Bisbenzimideで染色された拡張胚盤胞の蛍光核。
【図９】図９は従来のICSIテクニックで成熟卵子の中に精子を注入する方法を示す。（A）インジェクションピペットの先端の下で精子の尻尾がスコリング（scoring）される。（B）インジェクションピペット内の精子が卵細胞質内へ注入される。
【図１０】図１０は本発明のインジェクションピペットで精子を捕獲し成熟卵子内に注入する二つの方法を見せる。（A）精子の尻尾が先に捕獲される場合。（B）精子の頭が先に捕獲される場合。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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