(57)【要約】【課題】      ポリマーの融点よりはるかに低い温度で、ポリマーを非晶化および／または可塑化できる環境負荷の低いポリマーの非晶化・可塑化方法を提供する。【解決手段】  生分解性ポリマーと相溶するタンパク質であって、少なくとも、該生分解性ポリマーの分解酵素の基質結合部位を有することを特徴とするポリマー相溶性タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性ポリマーと相溶するタンパク質であって、少なくとも、該生分解性ポリマーの分解酵素の基質結合部位を有することを特徴とするポリマー相溶性タンパク質。
【請求項２】
基質結合部位が、分解活性を有する酵素、活性部位を変性した失活酵素、および活性部位が欠如し、分解活性を示さないクローニング酵素からなる群より選択される酵素の基質結合部位である請求項１のポリマー相溶性タンパク質。
【請求項３】
生分解性ポリマーの結晶部の非晶化および／または非晶部の可塑化を行うための方法であって、請求項１または２のいずれかのポリマー相溶性タンパク質を、水存在下で、生分解性ポリマーと混合することを特徴とするポリマーの非晶化・可塑化方法。
【請求項４】
ポリマー相溶性タンパク質を、0℃〜100℃の温度範囲で生分解性ポリマーと混合する請求項３のポリマーの非晶化・可塑化方法。
【請求項５】
ポリマー相溶性タンパク質を、0.1 μg/mL〜50 mg/mLの濃度範囲で生分解性ポリマーと混合する請求項３または４のいずれかのポリマーの非晶化・可塑化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーと相溶するタンパク質と、これを用いてポリマーを非晶化および／または可塑化するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシアルカン酸等の脂肪族ポリエステルは、微生物や酵素によって分解される生分解性ポリマーとして知られており、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアセタール、ポリエチレンテレフタレート等のポリマーと同様に、固体状態において結晶部と非晶部からなる構造を有する熱可塑性の結晶性ポリマーである。このような生分解性ポリマーを成形、再成形するためには、固体状態のポリマーを非晶化または可塑化する必要がある。
【０００３】
従来、固体状態の結晶性ポリマーの結晶部を非晶化するには、該ポリマーを、結晶融点あるいは融点以上の温度まで加熱し、ポリマー分子鎖を溶融状態とするか、低分子の有機化合物に溶解させる方法が用いられていた。すなわち、固体状態の結晶性ポリマーの結晶構造を、融点よりはるかに低い温度、例えば室温付近の温度で、固体状態のまま非晶化する方法は知られていなかったのである。
【０００４】
一方、セルロースやその誘導体、絹タンパク質、羊毛タンパク質等の天然ポリマーは熱可塑性を有さず、加熱により熱分解するため、水溶液や有機溶剤に溶解する以外にその結晶構造や凝集構造を破壊する方法は知られていなかった。
【０００５】
さらに、非晶性ポリマーでは、ガラス転移温度を低下させて該ポリマーを可塑化するために、該ポリマーと相溶性のある可塑剤を溶融混練する方法が適用されている。しかし、非晶性ポリマーの可塑剤として知られている有機化合物の中には、一般に、内分泌撹乱物質として生態系への危険性が指摘されているものが多く、エネルギーおよび環境の両面から、このような可塑剤の使用は望ましくないと考えられてきた。
【０００６】
そこで、生分解性ポリマーの可塑剤として、生分解性のクエン酸エステル等の低分子有機化合物（特許文献１）や、合成ポリエステル（特許文献２）が提案されているが、これらの可塑剤をポリマーの溶融温度よりはるかに低い温度、例えば、室温付近で、ポリマーと相溶することは困難であったのが実情である。
【特許文献１】特開平９−１２４０５０号公報
【特許文献２】特開２０００−２６５００３号公報
【非特許文献１】International Symposium on Biological Polyhydroxyalkanoates '98, Abstract P84, Riken, Japan, 1998
【非特許文献２】エッセンシャル高分子科学、p.121、講談社サイエンティフィク、１９８８
【非特許文献３】Int. J. Biol. Macromol., 15, 361, 1993
【非特許文献４】International Journal of Biological Macromolecules 33, 221, 2003
【非特許文献５】International Journal of Biological Macromolecules, 19, 35, 1996
【非特許文献６】Macromolecules, 16, 589, 1983
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、ポリマーの融点よりはるかに低い温度で、ポリマーを非晶化および／または可塑化できる環境負荷の低いポリマーの非晶化・可塑化方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願の発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、生分解性ポリマーと相溶するタンパク質であって、少なくとも、該生分解性ポリマーの分解酵素の基質結合部位を有することを特徴とするポリマー相溶性タンパク質を提供する。
【０００９】
この出願の発明は、第２には、基質結合部位が、分解活性を有する酵素、活性部位を変性した失活酵素、および活性部位が欠如し、分解活性を示さないクローニング酵素からなる群より選択される酵素の基質結合部位であるポリマー相溶性タンパク質を提供する。
【００１０】
この出願の発明は、第３には、生分解性ポリマーの結晶部の非晶化および／または非晶部の可塑化を行うための方法であって、前記いずれかのポリマー相溶性タンパク質を、水存在下で、ポリマーと混合することを特徴とするポリマーの非晶化・可塑化方法を提供する。
【００１１】
さらに、この出願の発明は、第４には、ポリマー相溶性タンパク質を、0℃〜100℃の温度範囲でポリマーと混合する前記のポリマーの非晶化・可塑化方法を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、第５には、ポリマー相溶性タンパク質を、0.1 μg/mL〜50 mg/mLの濃度範囲でポリマーと混合する前記のポリマーの非晶化・可塑化方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
上記第１および２の発明のポリマー相溶性タンパク質は、加熱することなく熱可塑性ポリマーや熱分解性ポリマーと相溶できるものであり、これらのポリマーの結晶部を非晶化したり、室温より高いガラス転移温度を有する非晶性ポリマーを低温で可塑化したりできる。
【００１４】
また、上記第３〜第５の発明のポリマーの非晶化・可塑化方法では、前記のポリマー相溶性タンパク質を用いることにより、ポリマーを加熱することなく結晶部を非晶化したり、室温より高いガラス転移温度を有する非晶性ポリマーを低温で可塑化したりできる。前記のポリマー相溶性タンパク質は、自然界に存在するタンパク質であることから、有害な有機化合物を用いることなく生分解性ポリマーの非晶化や可塑化が可能となる。したがって、省エネルギー効果が大きく、環境負荷が小さいという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
この出願の発明者らは、生分解性ポリエステルの１種であるポリ-R-3-ヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ）フィルムの生分解機構を研究するために、リン酸緩衝液中、37℃において、Pseudomonas stutzeri YM1006菌から精製した酵素によるＰＨＢフィルムの分解を行い、水溶液からＰＨＢフィルムを取り出し、メタノール洗浄した後、乾燥した。そして、この酵素分解を受けたＰＨＢフィルムを四酸化ルテニウムを用いて染色し、フィルム中のＰＨＢのラメラ状結晶の透過電子顕微鏡観察を行ったところ、分解を受けた表面部分のラメラ状結晶の厚さが、分解を全く受けなかったフィルム内部のラメラ状結晶の厚さの約２倍になっていることを見出し、報告した（非特許文献１）。
【００１６】
このようなラメラ状結晶の厚化は、従来の学問的知見によれば、結晶性ポリマーの融点（ＰＨＢでは約178℃）近傍の高い温度においてのみ起こる現象であり、37℃水中でのラメラの厚化現象は、学問的に説明できるものではなかった。
【００１７】
このような状況下において、この出願の発明者らは、水中、37℃の環境下でＰＨＢラメラ状結晶が厚化するには、少なくとも、元の結晶構造が壊れる過程が存在すると考え、厚化の過程で結晶を構成しているＰＨＢ分子鎖の運動性が高くなっている、すなわち、非晶状態を経ているとの仮説を立てた。また、このような仮説が正しいとすれば、分解酵素あるいは該分解酵素の一部のタンパク質がＰＨＢ結晶と相溶しているものと考えた。
【００１８】
ＰＨＢ結晶は、融点以下（30℃）でクロロホルムに溶解（相溶）し、ＰＨＢポリマーは非晶化と同じ無秩序な構造に変化する。すなわち、ＰＨＢとクロロホルムは相溶性の高いポリマーと低分子の組み合わせである。しかし、これまで、分解酵素あるいは分解酵素の一部のタンパク質がＰＨＢ結晶と相溶するとの報告は全くなかった。
【００１９】
フローリ・ハギンス理論によれば、２種の物質が相溶するためには、混合の自由エネルギーが負でなければならず（非特許文献２）、具体的条件としては、混合のエントロピーが大きいことおよび／または混合のエンタルピーが小さいことが挙げられる。しかし、化学構造が全く異なるＰＨＢ（ポリエステル）と分解酵素（タンパク質）が相溶することは、化学的常識からは考え難いことであった。
【００２０】
そこで、この出願の発明者らは、生分解性ポリマーの分解酵素におけるタンパク質の作用について、鋭意、研究を重ねた結果、分解酵素の基質結合部位がポリマーと相溶し、ポリマーの結晶部を非晶化させ、さらに非晶部の可塑剤として作用することを見出し、本願発明を完成させた。
【００２１】
すなわち、この出願の発明は、少なくとも、生分解性ポリマーの分解酵素の基質結合部位を有するタンパク質を、生分解性ポリマーと相溶するポリマー相溶性タンパク質として提供する。
【００２２】
分解酵素は、生分解の過程で、まずポリマー上に吸着し、その後、触媒活性を有する部位がポリマーを加水分解することが知られている（非特許文献３）。「分解酵素の基質結合部位」とは、このような分解酵素のポリマーへの吸着に関与するタンパク質を指す。
【００２３】
なお、本明細書において、「生分解性ポリマー」とは、例えば、農業用フィルム、移植用苗ポット、釣り糸、漁網等の農業水産用資材、建築・土木用フィルム、植生ネット等の土木・建築資材、食品包装用フィルム、容器、医薬品・農薬・肥料等の被覆材、手術用縫合糸、医用不織布等の種々の分野で使用される微生物の分泌する菌体外酵素により加水分解される高分子を意味する。
【００２４】
したがって、このような生分解性ポリマーは、微生物や酵素によって加水分解しうるものであれば特に限定されない。具体的には、バイオポリエステル（ポリヒドロキシアルカン酸およびその共重合体）、微生物多糖（セルロース、プルラン、デキストラン等）、ポリアミノ酸（ポリ-γ-L-グルタミン酸、ポリ-ε-L-リジン）等の微生物産ポリマー；多糖類（デンプン、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸）、修飾化多糖（修飾デンプン、酢酸セルロース）、タンパク質（絹フィブロイン、コラーゲン、ケラチン）等の天然物由来ポリマー；ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、ポリリンゴ酸、ポリエステルアミド等の化学合成ポリマー；これらの共重合体およびブレンド物；ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の芳香族ポリエステル；ポリアミドエステル類；ポリウレタンが例示される。なかでも、バイオポリエステル、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、これらの共重合体およびブレンド物が好適なものとして挙げられる。
【００２５】
このような生分解性ポリマーと相溶するこの出願の発明のポリマー相溶性タンパク質としては、水溶性であって、該ポリマーの分解酵素の基質結合部位を構成するものであれば特に限定されず、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸の共重合体およびブレンド物に対しては、Pseudomonas lemoignei、Acidovorax delafieldii、Variovorax paradoxus、Comamonas sp.、Psuedomonas pickettii、Alcaligenes faecalis、Pseudomonas fluoresens、Comamonas testosteroni、Penicillium pinophilum、Pseudomonas stutzeri等の微生物から単離される分解酵素の基質結合部位タンパク質が、ポリ乳酸、乳酸共重合体およびブレンド物に対しては、Tritirachium albumから単離されるプロティネ−ス等の基質結合部位タンパク質が、セルロースに対しては、セルロース分解酵素であるセルラーゼの基質結合部位タンパク質が、キチンに対しては、キチン分解酵素であるキチナーゼの基質結合部位タンパク質が、キシランに対しては、キシラン分解酵素であるキシラーゼの基質結合部位タンパク質が、ポリエチレンテレフタレートに対しては、Arthrobacter sp.等の微生物から単離される分解酵素の基質結合部位タンパク質が、ポリエステルアミドに対しては、Cryptococcus laurentii等の微生物から単離される分解酵素の基質結合部位タンパク質が、ポリウレタンに対しては、コレステロールエステラーゼ等の基質結合部位タンパク質が、絹フィブロインに対しては、Amycolatopsis sp.等の微生物から単離される分解酵素の基質結合部位タンパク質が例示される。
【００２６】
これらの分解酵素は、一般に、基質結合部位タンパク質と触媒活性部位タンパク質が、リンカー部位タンパク質で結合された分子構造を有する高分子量タンパク質であり、前記のとおり、基質結合部位タンパク質がポリマー表面に吸着し、その後、触媒活性部位タンパク質によりポリマーを分解する機能を有するものであるが、この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質を構成する基質結合部位タンパク質は、分解酵素の触媒活性部位タンパク質が変性された触媒活性のない失活酵素であってもよい。また、この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質を構成する基質結合部位タンパク質は、分解酵素の触媒活性部位タンパク質が欠如した触媒活性のないクローニング酵素であってもよい。すなわち、この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質は、基質結合部位タンパク質を含有していることを必須要件とするものであり、分解酵素としての酵素活性を有することを必要としない。
【００２７】
この出願の発明では、さらに、以上のとおりのポリマー相溶性タンパク質を用いて生分解性ポリマーを相溶させ、結晶部を非晶化する方法や、非晶部を可塑化する方法を提供する。すなわち、前記のポリマー相溶性タンパク質を、生分解性ポリマーと混合することにより、該ポリマーの結晶部を非晶化したり、非晶部を可塑化したりできるのである。
【００２８】
この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質を構成する基質結合部位タンパク質は、水存在下で用いることが好ましいことから、この出願の発明のポリマーの非晶化・可塑化方法では、生分解性ポリマーとポリマー相溶性タンパク質を水の存在下で混合するものとする。このとき、「水」とは、水そのものだけでなく、リン酸化合物等の塩の水溶液や血液等をも含むものとする。
【００２９】
また、前記のとおり、ポリマー相溶性タンパク質は、分解酵素の触媒活性部位を変性やクローニングによって失活させたものでもよいことから、水の温度は一般に分解酵素が活性を示す37℃でなくてもよい。水が液体状態にある0℃〜100℃の範囲であることが好ましく、10℃〜80℃であることがより好ましく、20℃〜60℃であることがさらに好ましい。
【００３０】
以上のとおりのこの出願の発明の生分解性ポリマーの非晶化・可塑化方法において、添加されるポリマー相溶性タンパク質の量はとくに限定されないが、好ましくは、該ポリマー相溶性タンパク質の生分解性ポリマーへの吸着量を考慮して決定する。
【００３１】
この出願の発明者らの研究より、ＰＨＢ分解酵素の１種であるComamonas acidovorans YM1609菌より単離した酵素の分子量が約50,000であることが明らかになっており（非特許文献４）、他のＰＨＢ分解酵素もほぼこの分子量に近いことが知られている。
【００３２】
また、この出願の発明者らは、ＰＨＢフィルムを用いてフィルム表面に吸着する酵素の最大吸着量を求め、最大吸着時に酵素分子１個当たりが占める表面積（占有面積）が約14 nm2であることを明らかにしている（非特許文献５）。
【００３３】
このフィルムに対する最大吸着量は、酵素濃度が3.0 μg/mLの時であるが、クロロホルム／エタノール溶液から結晶化したＰＨＢ単結晶の積層物の場合、ＰＨＢの単位重量当たりの表面積はフィルムよりはるかに大きく、酵素分子１個の占有表面積は同じであっても、最大吸着量はより大きくなることが予想される。一般的なＰＨＢ単結晶積層物の大きさは、厚さ約7 nm、幅約3 μm、長さ約13 μm程度であるので、例えば、ＰＨＢ単結晶20 mgを0.5 mLのリン酸緩衝液に分散させ、これに酵素を添加する場合、前記酵素の分子量、酵素１分子の占有面積を考慮して最大酵素濃度を求めると、約30 mg/mLと算出される。
【００３４】
さらに、前記占有面積の研究において、酵素濃度が1.0 μg/mL以下でも分解酵素は吸着活性を示したことから、この出願の発明においては、例えばポリマー相溶性タンパク質の濃度を0.1 μg/mL〜50 mg/mLとすることができる。好ましくは、1.0 μg/mL〜30 mg/mL、より好ましくは、3.0 μg/mL〜10 mg/mLとする。
【００３５】
この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質は、熱可塑性ポリマーにあっては、該ポリマーをその溶融温度まで加熱することなく相溶し、融点を持たない熱分解性ポリマーにあっては、室温付近の低温で相溶するものであり、該ポリマーを非晶化できるものである。また、この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質は、室温より高いガラス転移温度を有するポリマーを室温のような低温で可塑化できるものである。さらに、この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質は、自然界に存在するタンパク質であり、有機溶剤を用いることなく生分解性ポリマーの非晶化や可塑化を可能とするものである。したがって、省エネルギー効果が大きく、環境汚染も全くないものとして応用性が高い。
【００３６】
以下、実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】
【００３７】
＜準備＞
（１）試料の調製
（ａ）ＰＨＢ精製試料
ポリヒドロキシアルカン酸の１種であるポリ-R-3-ヒドロキシブタン酸（ＰＨＢ：化学式（Ｉ））粉末試料（ＩＣＩ社製、数平均分子量358,000）をヘキサン中で攪拌し、ろ過乾燥して脂質を除去した。これをクロロホルムに溶解し、ろ過により不純物を除去し、ろ液を大過剰のヘキサンに投入し、ＰＨＢを再沈殿した後、乾燥した。得られたＰＨＢ粉末をクロロホルムに溶解し、メタノールで再沈殿した後、乾燥してＰＨＢ精製試料とした。
【００３８】
【化１】
2005239895.tif 000002
【００３９】
（ｂ）ＰＨＢ単結晶
ＰＨＢ精製試料を、耐圧管中、73℃でクロロホルムに溶解し、同温度のエタノールを加え、60℃まで徐冷してＰＨＢを結晶化させた後、73℃に加熱して結晶を溶解し、再度60℃にて結晶化を行い、ＰＨＢ単結晶の懸濁液を得た。
【００４０】
この懸濁液を遠心分離して上澄液を除去し、エタノールを加えて攪拌後、遠心分離する操作を数回繰り返し、ＰＨＢ単結晶のエタノール懸濁液を得た。さらに、このエタノール懸濁液に0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.0）を加えて攪拌後、遠心分離する操作を数回繰り返し、ＰＨＢ単結晶の0.1 Mリン酸緩衝液中に懸濁したＰＨＢ単結晶を得た。
【００４１】
（ｃ）分解酵素
ＰＨＢ分解活性を有するＰＨＢ分解酵素は、Pseudomonas stutzeri YM1006菌より単離、精製し、リン酸緩衝液を加えてＰＨＢ分解酵素溶液とした。なお、該ＰＨＢ分解酵素溶液は、使用するまで4℃で保存した。
【００４２】
（ｄ）失活酵素
ＰＨＢ分解酵素溶液にジイソプロピルフルオロホスフェ−トを加え、触媒活性部位を変性させることにより酵素活性を失活させ、これを失活酵素溶液とした。
【００４３】
なお、酵素の失活は、吸光度測定およびブラッドフォード法によるタンパク定量により確認した。
【００４４】
（ｅ）GST-SBDタンパク質
Comamonas acidovorans由来の触媒部位自体が欠如した合成酵素、すなわち、クローニング酵素を調製した。なお、このクローニング酵素は、Comamonas acidovoransの基質吸着部位タンパク質（配列番号１）にGlutathione S-transferaseというタンパク質を融合させたもの（GST-SBD）であった。
【００４５】
（ｆ）GST-CDタンパク質
分解活性を有するMarinobacter sp. NK-1由来のＰＨＢ分解酵素（非特許文献４）をコードする遺伝子から、基質結合部位およびリンカー部位をコードする遺伝子部分を削除し、触媒活性部位のみをコードする遺伝子を作製した。この遺伝子の上流を、Glutathione S-transferase遺伝子と融合させ、GST-CDタンパク質を大腸菌内において生産し、アフィニティーカラムを用いて精製した後、リン酸緩衝液を加えてGST-CDタンパク質溶液とした。
（２）相溶試験と評価
（ａ）1HパルスＮＭＲ測定
重水で調製した0.1 Mリン酸緩衝液0.5 mLに前記ＰＨＢ単結晶20 mgを加えて懸濁液とし、これにＰＨＢ分解酵素、失活酵素、GST-SBDタンパク質を各々3.0 μg/mLとなるように加えた。
【００４６】
日本電子（株）製JNM-MU25分光計を用い、重水で調製したリン酸緩衝液中で各酵素をＰＨＢ懸濁液に添加する前と、添加から２時間経過した後に、1H核のスピン−スピン緩和時間（T2）をソリッド−エコー法にて測定し、相溶試験前後のＰＨＢ単結晶中のポリマー鎖の運動性を調べた。
【００４７】
なお、活性酵素（ＰＨＢ分解酵素）のみは、測定中のＰＨＢ分解を防ぐために、ＮＭＲ測定前に、一旦、温度を60℃に上げ、10分間保持して酵素の活性を失活させた後、37℃に冷却してからＮＭＲ測定を行った。
【００４８】
この1HパルスＮＭＲ測定より、ＰＨＢ結晶中のポリマーの運動性の高い（すなわちT2が長い）成分である非晶成分、中間成分、最も運動性の低い（T2が短い）成分である結晶成分の各T2および含量を求めた。
【００４９】
中間成分は、結晶成分に近い低い運動性を有するので、結晶構造のわずかに乱れた部分、あるいは、結晶部と非晶部の界面で結晶構造がわずかに乱れた部分に相当するものとした。また、非晶性ポリマー鎖は、ガラス転移温度（Tg）より高い温度になるほど運動性が高くなるので、同一温度でポリマー鎖の運動性が高いほどTgが低く、可塑化しているものと判断した。
【００５０】
（ｂ）透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察
前記ＰＨＢ単結晶を懸濁させた0.1 Mリン酸緩衝液2 mLに、ＰＨＢ分解酵素、失活酵素、GST-SBDタンパク質を各々3.0 μg/mLとなるように加え、37℃にて２時間相溶試験を行った。その後、水存在下で、酵素の基質結合部位タンパク質がＰＨＢポリマーに吸着した状態でのＴＥＭ観察を行うためにリン酸緩衝液を水で置換し、カーボン支持膜上に懸濁液を滴下、乾燥した後、真空蒸着装置にて白金パラジウムでシャドウイングし、ＴＥＭ観察（Flat-on view）を行った。
【００５１】
また、前記相溶試験後のＰＨＢ単結晶の水置換懸濁液に四酸化ルテニウム水溶液を加え、60℃で３時間、液相で四酸化ルテニウム水溶液をルテニウム染色を行い、ポリマー結晶の非晶部の電子密度を高め、ＴＥＭ観察における結晶部と非晶部のコントラストを明確にした（非特許文献６）。
【００５２】
ルテニウム染色後は、非晶部の構造が固定されるため、懸濁液を乾燥しても非晶部が結晶化することはないので、ルテニウム染色したＰＨＢ単結晶を単離し、これをエポキシ樹脂包埋後、Reichert社製Ultracut Sウルトラミクロト−ムを用い、ダイアモンドナイフで厚さ約７０nmの超薄切片試料を作製した。この超薄切片試料を用いて、ＰＨＢ単結晶の側面からのＴＥＭ観察（Edge-on view）を行った。なお、ＴＥＭ観察は、日本電子（株）製JEM1200EX透過電子顕微鏡にて加速電圧80 ｋVで行った。
＜実施例１＞  ＰＨＢ分解酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化（1HパルスＮＭＲ測定）
上記の方法により、0.1 Mリン酸緩衝液中のＰＨＢ単結晶の懸濁液にＰＨＢ分解酵素を3.0 μg/mLとなるように加え、37℃にて２時間相溶試験を行い、相溶試験前後の懸濁液の1HパルスＮＭＲ測定から得られた運動性の異なる３成分の各T2および含量を求めた。
【００５３】
結果を表１に示した。
【００５４】
【表１】
2005239895.tif 000003
【００５５】
非晶成分のT2は、反応後に大きく増大したことから、非晶部の運動性の増大、すなわち、ＰＨＢの非晶部の可塑化が起こったことが確認された。一方、非晶成分の含量の増加は、主に結晶成分および中間成分が非晶化したことによるが、一部、ＰＨＢの分解物が非晶成分として観測された。
【００５６】
中間成分のT2は反応前後でほとんど変化が見られなかったが、反応後、その含量は大きく減少した。
【００５７】
さらに、結晶成分のT2は反応前後でほとんど変化はなかったが、反応後、その含量は大きく減少した。
【００５８】
反応後の結晶成分と中間成分の大きな含量の低下と非晶成分の含量の増加は、分解酵素とＰＨＢとの相溶性を示すものであり、相溶の結果、ＰＨＢ結晶が非晶化され、さらに、非晶成分が可塑化されたことが確認された。したがって、分解酵素は、ポリマー相溶性タンパク質として有効に作用するものであった。
＜実施例２＞  失活酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化
（１）1HパルスＮＭＲ測定
分解酵素として失活酵素を用いたこと、および相溶試験後の昇温による酵素の失活処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の方法により、ＰＨＢの相溶試験を行い、1HパルスＮＭＲ測定より評価した。
【００５９】
結果を表２に示した。
【００６０】
【表２】
2005239895.tif 000004
【００６１】
失活酵素添加により、ＰＨＢ単結晶中の非晶成分のT2および含量がいずれも増大した。T2の増大から、非晶部の運動性が増大したこと、すなわち、ＰＨＢの非晶部が可塑化したことが示された。また、含量の増加から、結晶成分および中間成分が非晶化したことが示された。
【００６２】
また、中間成分については、失活酵素の添加前後でT2に大きな変化は見られなかったが、失活酵素の添加により含量は18 %から14 %にわずかに減少した。
【００６３】
さらに、結晶成分についても、反応前後でT2の変化はなかったが、失活酵素の添加により含量は39 %から23 %に大きく減少した。反応後の結晶成分の含量低下と非晶成分の含量増加がほぼ同量であること、および中間成分の含量がほとんど変化しなかったことから、生分解性を有さないにもかかわらず、ＰＨＢの結晶部の構造が失活酵素によって破壊され、非晶化したことが示された。
【００６４】
したがって、ＰＨＢと失活酵素の基質結合部位タンパク質が相溶することが確認された。さらに、相溶の結果、ＰＨＢポリマー鎖は非晶化され、運動性が増大し、非晶成分の可塑化も続いて起こったことが示された。
（２）ＴＥＭ観察
ＰＨＢ単結晶を37℃にて0.1 Mリン酸緩衝液2 mLに懸濁させ、これに失活酵素を3.0 μg/mLとなるように加え、２時間相溶試験を行った。
【００６５】
失活酵素添加前後、すなわち、相溶前後のＰＨＢ単結晶の形態変化を調べるために、該失活酵素添加前後の該リン酸緩衝液を水で置換して塩を除き、ＴＥＭ観察（Flat-on view）を行った。
【００６６】
相溶前のＰＨＢ単結晶は、厚さ約4.8 μm、幅0.2 μm〜2.5 μm、長さ1 μm〜10 μmの典型的な折りたたみ鎖結晶（ラメラ状結晶あるいは板状結晶）であり、さらに、特徴として、図１のとおり、先端が鋭角状のラメラ状結晶が積層した形態を有するものであった。
【００６７】
一方、失活酵素により相溶試験を行った後のＰＨＢ単結晶では、分解反応が全く起こらないにも関わらず、図２に示すように、ラメラ状結晶の形態変化が認められた。
【００６８】
図１において見られた厚さ4.8 μmのラメラ状結晶の明瞭なステップが消失し、先端が鋭角状の結晶の形態もすべて消失し、積層ラメラ状結晶の幅は2.5 μm〜3 μmとなった。また、積層ラメラ状結晶の幅方向と平行に亀裂が発生していることが明らかになった。
【００６９】
融点約178℃のＰＨＢ結晶がこのような形態変化を起こすためには、結晶構造が破壊されて非晶化し、その後、ＰＨＢポリマー鎖が移動して再配列しなければならないことから、図２よりＰＨＢと失活酵素との相溶化が確認されたといえる。
＜実施例３＞  GST-SBDタンパク質を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化
（１）1HパルスＮＭＲ測定
酵素をGST-SBDタンパク質とした以外は、実施例２（１）と同様に相溶試験および評価を行い、結果を表３に示した。
【００７０】
【表３】
2005239895.tif 000005
【００７１】
ＰＨＢ単結晶中の非晶成分について、GST-SBD添加により、T2および含量のいずれも増大した。T2が増大したことから、非晶部の運動性が増大したこと、すなわち、ＰＨＢの非晶部の可塑化が起こったことが示唆された。また、含量の増加から、結晶成分および中間成分が非晶化したことが示された。
【００７２】
中間成分では、反応前後でT2の大きな変化はなかったが、反応によってその含量はわずかに減少した。
【００７３】
さらに、結晶成分では、反応前後でT2の変化は見られなかったが、反応によりその含量は大きく減少した。
【００７４】
反応後の結晶成分含量の減少と非晶成分含量の増大がほぼ同量であること、および中間成分の含量にほとんど変化がなかったことから、生分解が起こることなく、結晶部が失活酵素によって構造破壊し、非晶化したことが確認された。
【００７５】
したがって、GST-SBDタンパク質がＰＨＢと相溶することが確認された。さらに、相溶の結果、非晶化されたＰＨＢポリマー鎖の運動性が増大し、非晶成分の可塑化も起こったことが示された。
（２）ＴＥＭ観察
酵素をGST-SBDタンパク質とした以外は、実施例２（２）と同様に相溶試験を行い、相溶前後のＰＨＢ単結晶の形態変化をＴＥＭによって調べた。
【００７６】
クローニング酵素による相溶試験前後のＰＨＢ単結晶には、実施例２の場合（図２）と同様のラメラ状結晶の形態変化が認められた。
【００７７】
したがって、ＰＨＢとGST-SBDタンパク質が相溶し、ＰＨＢ結晶部の非晶化が起こり、次いで非晶部が可塑化したことが確認された。
＜実施例４＞  ＰＨＢ分解酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化（側面からのＴＥＭ観察）
上記の方法により、0.1Mリン酸緩衝液にＰＨＢ単結晶を懸濁させた懸濁液2 mLに、ＰＨＢ分解酵素を3.0 μg/mLとなるように加え、37℃にて２時間相溶試験を行った。
【００７８】
相溶試験前後の懸濁液におけるリン酸緩衝液を水で置換し、液相でルテニウム染色を行った後、超薄切片試料を作製し、ＰＨＢラメラ状単結晶の側面からのＴＥＭ観察（Edge-on view）により、形態変化を調べた。
【００７９】
ＰＨＢ分解酵素を添加する前（反応前）のＰＨＢラメラ状単結晶の超薄切片のＴＥＭ写真（図３：Edge-on view）は、実施例１におけるＰＨＢ単結晶積層物（図１：Flat-on view）を側面から観察したものに相当し、図１と同様、ラメラ状結晶の厚さは約4.8 μmで、ラメラ状結晶の輪郭が明瞭であった。
【００８０】
一方、分解酵素を添加して２時間後、懸濁状態のままルテニウム染色を行い、酵素と水存在下のＰＨＢ試料の構造を保持したまま作製した超薄切片試料のＴＥＭ写真（図４：Edge-on view）では、組織１（図４-1）の結晶は厚さ約4.8 μmで図１や図３と類似していたが、結晶の輪郭が乱れていた。また、組織２（図４-2）および組織３（図４-3）の各部分は、結晶性が低いことを示す不明瞭な形態であり、その幅（厚さ）が組織１よりも厚かった。
【００８１】
この形態変化から、ＰＨＢ結晶が、ＰＨＢと分解酵素の基質結合部位との相溶により破壊され、非晶化したことが示唆された。
【００８２】
したがって、図４は、実施例１において、ＰＨＢ単結晶中のポリマー運動性から示唆されたとおり、分解酵素の基質結合部位により可塑化されたＰＨＢ非晶部を示しているといえる。
＜実施例５＞  失活酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化（側面からのＴＥＭ観察）
酵素を失活酵素とした以外は、実施例４と同様の方法により相溶試験と評価を行った。
【００８３】
相溶試験後のＴＥＭ観察から、図４と同様の組織が観察された。
【００８４】
したがって、失活酵素がＰＨＢを分解しないにも関わらず、ＰＨＢと相溶し、ＰＨＢ結晶を非晶化することが確認され、実施例２の結果と一致した。
＜実施例６＞  失活酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化における塩化合物の影響
ＰＨＢ単結晶の懸濁溶媒および酵素の溶媒を水とした以外は、実施例２（２）と同様の方法により相溶試験を行った。
【００８５】
ＴＥＭ観察より、相溶試験後のＰＨＢ単結晶において図２と同様の形態変化が確認された。この結果から、ＰＨＢと酵素の基質結合部位タンパク質の相溶には、必ずしもリン酸塩のような塩化合物が必要ではないことが確認された。
＜実施例７＞  失活酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化における温度の影響ａ
相溶試験の温度を２℃とした以外は、実施例２（２）と同様の方法により相溶試験を行った。
【００８６】
ＴＥＭ観察より、相溶試験後のＰＨＢ単結晶において、図２と同様の形態変化が認められた。
【００８７】
ＰＨＢのTgは４℃であることから、Tgよりも低い温度でもＰＨＢとタンパク質が相溶することが明らかとなった。
【００８８】
したがって、ポリマーの分解酵素の基質結合部位タンパク質は、該ポリマーの融点やガラス転移温度（Tg）以下においても、該ポリマーと相溶し、該ポリマーを非晶化させ、さらに可塑化させることが確認された。
＜実施例８＞  失活酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化における温度の影響ｂ
相溶試験の温度を80℃とした以外は、実施例２（２）と同様に相溶試験を行った。
【００８９】
ＴＥＭ観察より、相溶試験後のＰＨＢ単結晶において、図２と同様の形態変化が認められた。
【００９０】
したがって、酵素活性の有無に関係なく、基質結合部位タンパク質が広い温度範囲でＰＨＢと相溶し、ＰＨＢの結晶構造を破壊して非晶化することが確認された。
＜実施例９＞  失活酵素を用いたＰＨＢ単結晶の可塑化における濃度の影響
失活酵素濃度を3 mg/mLとした以外は、実施例２（１）と同様の方法により相溶試験を行い、1HパルスＮＭＲ測定より評価した。
【００９１】
失活酵素添加前（反応前）の非晶成分、中間成分、結晶成分のそれぞれのT2および含量は実施例２の場合と同じ値であったが、反応後の非晶成分のT2は1.2ｘ10-2秒となり、含量は92 %となった。一方、反応後の中間成分、結晶成分のT2は、それぞれ実施例２の反応後の値と同等であったが、含量はそれぞれ約3 %と約5 %と大きく減少し、ＰＨＢ単結晶がほとんど非晶化したことが確認された。
＜比較例１＞
ＰＨＢ単結晶を0.1 Mリン酸緩衝液中に懸濁し、酵素を添加せずに２時間保持した。その後、懸濁液を水で置換し、実施例２（２）と同様の方法によりＴＥＭ観察を行ったところ、ＰＨＢ単結晶は、図１と同様の形態を示した。
【００９２】
したがって、リン酸緩衝液には、ＰＨＢ単結晶を非晶化する作用はないことが確認された。
＜比較例２＞
ＰＨＢ単結晶を懸濁した0.1 Mリン酸懸濁液の一滴をカーボン膜をコーティングしたＴＥＭ用銅グリッド上に滴下し、乾燥した。また、過剰の懸濁液を吸収して除去するために、ＴＥＭ用グリッドをろ紙上に置いた。
【００９３】
これを常圧、80℃で乾燥した後、濃度3.0 μg/mLの失活酵素のリン酸緩衝液の一滴を該グリッド上に滴下し、過剰の失活酵素を含む液をろ紙で吸収し、直ちに常圧、８０℃の乾燥器中で２時間保持し、乾燥状態でのＰＨＢと失活酵素の基質結合部位タンパク質の相溶試験を行った。
【００９４】
その結果、試験後のＰＨＢ単結晶の形態は、図１のＴＥＭ写真と同様であった。したがって、失活酵素の基質結合部位タンパク質は、乾燥状態ではＰＨＢ結晶を非晶化できないことが示された。ポリマー相溶性タンパク質とＰＨＢを相溶化させ、ＰＨＢ結晶を非晶化するには、水中で両者を混合する必要があることが示唆された。
＜比較例３＞
酵素として、基質結合部位タンパク質が欠如したGST-CDタンパク質を用いた以外は、実施例２（２）と同様の方法により相溶試験およびＴＥＭ観察を行った。
【００９５】
ＰＨＢ単結晶が図１と同様の形態を示したことから、基質結合部位タンパク質が欠如した酵素では、ＰＨＢ単結晶との相溶が起こらず、非晶化作用が発揮されないことが確認された。
【００９６】
また、GST-CDタンパク質によるポリマー分解試験では、ＰＨＢ分解酵素を用いた場合と比較して分解速度が著しく低下したことから、ＰＨＢの酵素分解では、基質結合部位タンパク質こそがＰＨＢと相溶していること、それによりＰＨＢ結晶の破壊と非晶化、可塑化が起こっていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
以上詳しく述べたとおり、この出願の発明により、汎用性が高く、広い温度範囲においてポリマーと相溶するポリマー相溶性タンパク質が提供される。また、このようなポリマー相溶性タンパク質を使用することにより、該ポリマーの結晶あるいは凝集構造を破壊、非晶化し、さらに、それを可塑化できる。
【００９８】
この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質は、ポリマーの融点より低い室温付近での非晶化を可能とする上、ポリマーのガラス転移温度以下の温度における非晶部の可塑化も可能とする。
【００９９】
したがって、この出願の発明のポリマーの非晶化・可塑化方法は、従来公知の方法とは全く異なるものであるといえる。また、この出願の発明のポリマー相溶性タンパク質は天然物であり、水存在下で作用するものであることから、環境負荷が低く、環境関連分野、医用材料分野、医薬品分野等、多くの産業分野への応用が可能であり、有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ＰＨＢ単結晶のＴＥＭ写真（相溶前）を示した図である。
【図２】リン酸緩衝液中での失活酵素と反応させた後のＰＨＢ単結晶のＴＥＭ写真を示した図である。
【図３】ＰＨＢ単結晶の超薄切片試料（相溶前）のＴＥＭ写真を示した図である。
【図４】活性酵素による相溶試験後のＰＨＢ単結晶を酵素と水存在下でルテニウム染色して得られた超薄切片試料のＴＥＭ写真を示した図である。
【符号の説明】
【０１０１】
1  組織１
2  組織２
3  組織３
【図１】
2005239895.tif 000006
【図２】
2005239895.tif 000007
【図３】
2005239895.tif 000008
【図４】
2005239895.tif 000009
【配列表】
2005239895000001.app