(57)【要約】【課題】  信頼性があり、かつ効果的な様式で異種ヘテロダイマーを産生する方法を提供する。【解決手段】  第１の核および第２の核を含有するヘテロカリオンの糸状菌類であって、該第１の核が異種ヘテロダイマーの第１のサブユニットコードする第１のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変されており、そして該第２の核が、該異種ヘテロダイマーの第２のサブユニットをコードする第２のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変されている、ヘテロカリオンの糸状菌類。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核および第２の核を含有するヘテロカリオンの糸状菌類であって、該第１の核が異種ヘテロダイマーの第１のサブユニットコードする第１のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変されており、そして該第２の核が、該異種ヘテロダイマーの第２のサブユニットをコードする第２のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変されている、ヘテロカリオンの糸状菌類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には糸状菌類における異種遺伝子の発現に関し、より詳細にはヘテロカリオンの糸状菌類宿主細胞によるヘテロダイマーのタンパク質をコードする遺伝子の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、酵母、および菌類における異種遺伝子のクローニングおよび発現は、種々の有用なタンパク質を産生するために実行可能な手段として認識されている。これらの微生物における異種遺伝子の発現は、一般に、プラスミドとして広範に知られる自律複製する染色体外エレメントの使用に依存している。例えば、1984年12月４日に発行されたLambowitzの米国特許第4,486,533号（特許文献１）は、ミトコンドリアのプラスミドDNAによる糸状菌類のためのDNAベクターの自律複製を開示している。このミトコンドリアのプラスミドDNAは、他の複製系につながれ、遺伝的操作の簡便さを増強するためのシャトルベクターを提供する。1989年３月28日に発行されたYeltonらの米国特許第4,816,405号（特許文献２）は、大量の所望の異種タンパク質を産生し分泌するための糸状子嚢菌類の重要な株の改変を可能にする手段および系を開示している。
【０００３】
1989年12月５日に発行されたBuxtonらの米国特許第4,885,249号（特許文献３）は、宿主A.niger細胞に取り込まれ得る選択マーカーを含有するDNAベクターによるAspergillus nigerの形質転換を開示している。このベクターはまた、タンパク質の発現を増強または改変するために必要とされる他の外来DNA配列を含有する。1990年６月19日に発行されたMcKnightらの米国特許第4,935,349号（特許文献４）は、Aspergillusおよび他の糸状菌類において異種遺伝子の発現を指示し得るプロモーターを含有するAspergillusで高等真核生物の遺伝子を発現する方法を開示している。類似した技術が、Neurosporacrassa (「N. crassa」)におけるアミノ酸輸送に関与するmtr遺伝子をクローン化し、インビボにおいてこの遺伝子に近接するゲノムマーカーへのクローン化されたDNAの緊密な連結を確認するために用いられた。Stuart,W.D.ら、Genome (1988) 30:198-203; Koo, K.およびStuart, W.D. Genome(1991) 34:644-651（非特許文献１）。
【０００４】
しかし、菌類宿主細胞における異種ダイマータンパク質（２つ以上の非同一のサブユニットを有する）の産生は、以下の２つの方法の内の一方による単一宿主細胞の形質転換が必要であるとされている：
（１）両方のサブユニットの配列を有する単一の大きな扱いにくいベクターによる方法；または
（２）形質転換された細胞の少なくともいくつかの部分は、両方の遺伝子の同時発現が可能であるように、空間的および機能的に互いに十分に密接した両方のサブユニットを保有するという想定の下に、それぞれがサブユニットの１つをコードするDNA配列を保有する、２つのより小さい別々のベクターによる方法。
【０００５】
1989年11月14日に発行されたBurkeら、米国特許第4,880,734号（特許文献５）は、２つの領域、すなわち第１の転写調節領域および第２の転写開始領域（この２つの領域は、異なる供給源から由来し得る）を含む転写制御領域を有するDNA構築物を開示している。この２つの部分の転写制御領域は、この転写制御領域と天然には関連しない遺伝子に連結された。終結領域もまた存在し、染色体外エレメントとして酵母宿主中に導入され得る発現構築物を提供した。構造遺伝子の転写を制御するための調節配列の使用は、構造遺伝子の発現がほとんどまたは全くなくても高密度にまで宿主細胞を増殖させる能力、および次いで環境条件（例えば、代謝物、温度など）を変化させることによって発現を誘導する能力を提供した。
【０００６】
1993年７月28日に発行された欧州特許第552,569号（特許文献６）は、（a）基礎培地中で増殖し得る動物細胞、および（b）有用な物質を産生する能力、および完全培地中で増殖するが基礎培地中では増殖しない能力を有する動物細胞を融合する方法を開示している。得られた融合細胞は、有用な物質を産生する能力および基礎培地中で増殖する能力の両方を有する（欧州特許第552,569号、第１欄、45〜53行）。
【特許文献１】米国特許第４，４８６，５３３号
【特許文献２】米国特許第４，８１６，４０５号
【特許文献３】米国特許第４，８８５，２４９号
【特許文献４】米国特許第４，９３５，３４９号
【特許文献５】米国特許第４，８８０，７３４号
【特許文献６】欧州特許第５５２，５６９号
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ  （１９８８）３０：１９８−２０３;
【非特許文献２】Ｇｅｎｏｍｅ  （１９９１）３４：６４４−６５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当該分野には、信頼し得、そして効果的な様式で異種ヘテロダイマーを産生する必要性が依然としてある。上記の開示はいずれも、そのようなことを実施する方法を提供していない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、少なくとも２つの非同一サブユニットを含有する異種ヘテロダイマーを産生し得るヘテロカリオンの糸状菌類に関する。ヘテロカリオンの菌類は、２つの相補的な菌類の株の融合の結果である。融合は、親株の各々が、培養条件下で他方の要求性を補う結果である。
【０００９】
従って、１つの局面において、本発明は、異種ヘテロダイマーの１つのサブユニットをコードする第１のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変された第１の核およびヘテロダイマーのもう１つのサブユニットの産生のための発現系を含有するように改変された第２の核を含有するヘテロカリオンの糸状菌類を調製する方法に関する。このプロセスは、菌類の個々の株、すなわち第１の核を含む株および第２の核を含む株を融合することを包含する。この融合は、第１の核がまた、第２の核により与えられる第１の特徴により補正可能である、特定の条件下での増殖にネガティブに影響する第１の特徴を与え、そして逆に、第２の核はまた、第１の核により与えられる第２の特性により補正可能である、特定の条件下での増殖にネガティブに影響する第２の特徴を与えるために生じる。従って、両方の特性が増殖に要求されるような条件である場合、各々の核により与えられる特性は、他方により与えられる特徴を相補する。単純な例においては、各々の核は、異なる栄養素の非存在下での増殖をできないようにする変異体ゲノムを含み得る。１つの核のみを含有する核ではなく、両方の核を含有する菌類は、両方の栄養素の非存在下で増殖し得る。
【００１０】
従って、本発明のこの局面は、核の第１および第２の特徴の存在のために、ヘテロカリオンの菌類が形成されない限り、第１の菌類宿主細胞および第２の菌類宿主細胞株のどちらも生存し得ない条件下で、上記の第１および第２の菌類の株を一緒に培養することにより本発明のヘテロカリオンの菌類を調製する方法である。次いで、生じるヘテロカリオンの糸状菌類は、これらの同一の条件下で培養培地中に融合菌類を維持することによりヘテロカリオンの状態に保たれる。
【００１１】
これら同一の条件下で培養してヘテロカリオンの状態を維持した場合、その条件がまた、そのサブユニットをコードするヌクレオチド配列の発現について望ましい条件を包含する場合、所望のヘテロダイマータンパク質が回収され得る。従って、本発明の別の局面は、これらの条件下でヘテロカリオンの菌類を培養し、ヘテロダイマーを回収することによる異種ダイマーの産生である。
【００１２】
さらに他の局面において、本発明は、少なくとも２つの核を含有し、その一方が異種ヘテロダイマーの１つのサブユニットの産生に関する発現系を含み、そして他方がそのヘテロダイマーの他方のサブユニットの産生に関する発現系を含む糸状菌類ヘテロカリオンに関する。
【００１３】
より特定すれば、本発明は以下に関する。
【００１４】
（１）第１の核および第２の核を含有するヘテロカリオンの糸状菌類であって、該第１の核が異種ヘテロダイマーの第１のサブユニットコードする第１のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変されており、そして該第２の核が、該異種ヘテロダイマーの第２のサブユニットをコードする第２のヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変されている、ヘテロカリオンの糸状菌類。
【００１５】
（２）前記第１の核が、前記第２の核により与えられる第１の特性により補正可能である、特定の条件下で生育にネガティブに影響する第１の特徴を与え、そして該第２の核が、該特定の条件下で該第１の核により与えられる第２の特性により補正可能である、該特定の条件下で生育にネガティブに影響する第２の特徴を与える、項（１）に記載の菌類。
【００１６】
（３）前記第１の特徴が、第１の栄養素に対する要求性であり；前記第１の特性が該要求性の欠除であり；そして前記特定の条件が、該第１の栄養素を欠く培地における培養を包含する、項（２）に記載の菌類。
【００１７】
（４）前記第２の特徴が、第２の栄養素に対する要求性であり；前記第２の特性が該要求性の欠除であり；そして前記特定の条件が、前記第１および該第２の栄養素を欠く培地における培養を包含する、項（３）に記載の菌類。
【００１８】
（５）前記第１の特徴が、第１の毒性物質の存在下で成長し得ないことであり；該第１の特性が該第１の毒性物質に対する耐性を与え；そして前記特定の条件が、該第１の毒性物質を含有する培地における培養を包含する、項（２）に記載の菌類。
【００１９】
（６）前記第２の特徴が、第２の毒性物質の存在下で成長し得ないことであり；該第２の特性が該第２の毒性物質に対する耐性を与え；そして前記特定の条件が、前記第１および該第２の毒性物質を含有する培地における培養を包含する、項（５）に記載の菌類。
【００２０】
（７）前記第２の特徴が、第２の毒性物質の存在下で成長し得ないことであり；前記第２の特性が該第２の毒性物質に対する耐性を与え；そしてここで前記特定の条件が、前記第１の栄養素を欠き、そして該第２の毒性物質を含有する培地における培養を包含する、項（３）に記載の菌類。
【００２１】
（８）糸状菌類に対して異種のヘテロダイマーを産生する方法であって、前記第１および第２のサブユニットが産生されて該ヘテロダイマーが形成される条件下で請求項１に記載の菌類を培養する工程；および培養物からヘテロダイマーを回収する工程を包含する、方法。
【００２２】
（９）請求項１に記載のヘテロカリオンの菌類を調製する方法であって：第１の核を含有する第１の菌類を第２の核を含有する第２の菌類とともに培養する工程であって、ここで、該第１の核が、該第２の核により与えられる第１の特性により補正可能である、特定の条件下で生育にネガティブに影響する第１の特徴を与え、該第２の核が、該第１の核により与えられる第２の特性により補正可能である、該特定の条件下で生育にネガティブに影響する第２の特徴を与える工程；を包含し、該培養する工程が該特定の条件下で行われる、方法。
【００２３】
（１０）前記第１の特徴が、第１の栄養素の要求性であり；前記第１の特性が該要求性の欠除であり；そして前記特定の条件が該栄養素を欠く培地における培養を包含する、項（９）に記載の方法。
【００２４】
（１１）前記第２の特徴が、第２の栄養素の要求性であり；前記第２の特性が該要求性の欠除であり；そして前記特定の条件が前記第１および該第２の栄養素を欠く培地における培養を包含する、項（９）に記載の方法。
【００２５】
（１２）前記第１の特徴が、第１の毒性物質の存在下で生育し得ないことであり；前記第１の特性が該第１の毒性物質に対する耐性を与え；そして前記特定の条件が該毒性物質を含有する培地における培養を包含する、項（１１）に記載の方法。
【００２６】
（１３）前記第２の特徴が、第２の毒性物質の存在下で生育し得ないことであり；前記第２の特性が該第２の毒性物質に対する耐性を与え；そして前記特定の条件が前記第１および該第２の毒性物質を含有する培地における培養を包含する、項（９）に記載の方法。
【００２７】
（１４）前記第２の特徴が、第２の毒性物質の存在下で生育し得ないことであり；前記第２の特性が該第２の毒性物質に対する耐性を与え；そしてここで前記特定の条件が前記第１の栄養素を欠き、そして該第２の毒性物質を含有する培地における培養を包含する、項（１３）に記載の方法。
【００２８】
（１５）前記ヘテロダイマーが、FSH、LH、hCG、TSH、インシュリン、および免疫グロブリンからなる群から選択される、項（１）に記載のヘテロカリオン宿主。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、少なくとも２つの核を含有するヘテロカリオンの糸状菌類に関し、少なくとも２つの核の１つが異種ヘテロダイマーの１つのサブユニットの産生に関する発現系を含み、そして少なくとも２つの核の他の核がそのヘテロダイマーの他方のサブユニットの産生に関する発現系を含むので、異種ヘテロダイマーが効果的な様式で産生される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明において、有利な点は、ヘテロカリオンを形成する糸状菌類の能力に由来する；次いでこのヘテロカリオンは、異種ヘテロダイマーを産生するために用いられ得る。
（糸状菌類の性質およびヘテロカリオン形成のための背景となる必要条件）
菌類は、糸状の複数核ストランドを産生する単一の単核細胞、酵母細胞、多種多様な胞子を有する結実体、および／または性的に分化した細胞で存在する。それらはまた、複数核形態でも存在する。カビとしての菌類の成長の形態の主要なエレメントは、菌糸、すなわち直径約２μm〜10μmの枝分かれした管状構造である。菌糸は、それらの先端で伸長すること（尖端成長）、および側枝を産生することにより成長する。従って、コロニーが成長するにつれ、その菌糸は、絡み合う糸の塊を形成する。
【００３１】
いくつかの菌糸は、培養培地中に浸入し、そこで菌類が栄養素を吸収するために成長するが、一方培地の表面上に突き出る菌糸は、「気中の菌糸」を構成する。ほとんどのコロニーは、不規則な、乾性の、糸状のマットとして液体または固体の培地の表面で成長する。ほとんどの種において、菌糸は、「隔壁(septa)」と呼ばれる交差した壁により分けられる。しかしこれらの隔壁は、微細な、中央の細孔を有する。従って、隔壁を有する菌糸でさえ細胞質の連続的な塊中に埋包される核を有し、そして実際、輸送可能な細胞質中にさまざまな核を含有する。
【００３２】
用語「糸状菌類」は、枝分かれした、絡み合う細糸の塊により菌糸を形成し得るが、横断する壁により遮られ、横断する壁中の穿孔により区画間の細胞質の通過が可能である菌類をいう。有性的に生殖する場合、これらの菌類の多くは、嚢の中に減数分裂の胞子を形成する。しかし、機構は完全には理解されていないが、適切な刺激により生殖は無性的に行われる。生殖のこの様式において、「分生子」として知られる胞子は、外見的には、フィラメントに沿った様々な位置に形成される発芽突出の先端において生じる。
【００３３】
本願発明の糸状菌類は一般に、Phycomycetes、Ascomycetes、Basidiomycetes、およびDeuteromycetesである。Phycomycetesは、全ての非隔壁糸状菌類およびいくつかの隔壁糸状菌類を含む。これらの無性胞子は、種々の種類から成り、そして特定の柄(stalk)の末端に形成される嚢内に含まれる胞子嚢胞子(sporangiospore)を包含する。異なる種は、異なる性サイクルを有する。
【００３４】
Ascomycetesは、子嚢、すなわち子嚢胞子として知られる性的胞子を含有する嚢様構造により他の菌類と区別される。子嚢胞子は、交配すなわち雄核および雌核の融合、２回の減数分裂、そして通常一回の最終体細胞分裂の最終産物である。Basidiomycetesは、特別な構造体の表面に形成される性的胞子により区別される。Deuteromycetesはしばしば、「不完全菌類」と呼ばれる。なぜなら、有性期(sexualphase)がまだ観察されていないからである。それらの菌糸は隔壁を有し、そして分生子の形態は、Ascomycetesの形態に類似している。
【００３５】
好ましいヘテロカリオン糸状菌類はAscomycetes属であり、より好ましくはNeurospora、Aspergillus、およびPenicillium属である。Neurospara由来の特に有用な種は、N.intermedia、N. crassa、N. sitopula、およびN. tetrasporaを含む。
【００３６】
Aspergillusの有用な種は、A.nidulans、A. niger、A.terreus、およびA. fumegatusである。
【００３７】
特に好ましい属は、Neurosporaであり、最も好ましい種は、N.crassaである。
【００３８】
糸状菌類の栄養成長(vegetative growth)は、細胞分裂をともなう核分裂（有糸分裂）を含む。このタイプの細胞分裂は、無性生殖（すなわち配偶子の関与および分生子による核の融合を伴わない新規のクローンの形成）からなる。例えば、Neurospora種は、７つの異なる染色体をそれらの核内に含み、それぞれがシングルコピーである。すなわち、栄養生物は、ハプロイドである。このハプロイド状態は、代表的には、菌糸体の成長の間、そして分生子の形成を通して無性生殖の間維持される。
【００３９】
有性生殖もまた起こり得、次いで異なる接合型の２つのハプロイド細胞（菌糸または分生子）が融合し、２つの別個の核を含有する二核細胞を形成する。従って、２つのハプロイド核は、同一の細胞質中に共存し、そして、当面の間、幾分同調して分裂する。しかし、細胞が子嚢胞子形成を開始する場合、２つの異なるハプロイド核は実際に融合してディプロイド核を形成し得、このディプロイド核は、相同染色体の組を含有する。次いでこのディプロイド細胞は減数分裂を開始する。
【００４０】
「ヘテロカリオン」は、２つ（またはそれより多い）の遺伝学的に異なる核を有する細胞である。本発明のヘテロカリオンは、全てのヘテロカリオン適合性対立遺伝子（tol遺伝子が存在する場合には接合型対立遺伝子を除く）が同型接合型である細胞由来の核を含有する。少なくとも10の染色体の遺伝子座が、ヘテロカリオンに非適合性であることが同定されている：het-c、het-d、het-e、het-i、het-5、het-6、het-7、het-8、het-9、およびhet-10、そしてより多くの遺伝子座が存在すると推量されている。Perkinsら、"ChromosomalLoci of Neurospora crassa" Microbiological Reviews (1982) 46:426-570の478。
【００４１】
２つの株が１以上のhet遺伝子座で異なる対立遺伝子を保有する場合、それらは、安定なヘテロカリオンを形成し得ない。類似していない菌糸の融合の後、または類似していない株への細胞質または抽出物のマイクロインジェクションの後に原形質の死滅が生じる。重複（部分的なディプロイド）が、hetの１つ以上の対立遺伝子について異種接合型である場合、成長は阻害され、そして高度に異常である。多数のヘテロカリオン非適合性遺伝子座（特に、het-c、-d、-e、および-i）がヘテロカリオン試験により最初に検出された。Het-5〜-10遺伝子座は、het遺伝子座における差異が天然の集団において共通であるので、重複を用いることにより検出された。前出。
【００４２】
接合型対立遺伝子「A」および「a」はまた、N.crassaにおいてhet遺伝子として作用するが、幾分緩やかなヘテロカリオンの成長が生じ得る。マイクロインジェクション実験は、死滅反応に関係するタンパク質を含む。従って、反対の接合型もまた一般に、ヘテロカリオンの子嚢菌類菌糸の増殖に関係する複雑な事象にとって重要である。前出の436および478。しかし、tol遺伝子が存在する場合、反対の接合型対立遺伝子Aおよびaに関係する栄養（ヘテロカリオン）非適合性は、性的適合性が影響されることなく抑制される。従って、他のhet遺伝子座がホモカリオンであれば（tol;A + a; a）ヘテロカリオンは、十分に適合可能でありかつ安定であり得、そしてtol遺伝子が存在するとき、A/a重複は正常に成長する。
【００４３】
適合性遺伝子座について同型接合型である２つの異なる株に由来する菌糸が提供される場合、同一の培地中で生長するとき、特に融合が、以下に記載のように押し進められるときに融合し得る。得られた培養物は、次いで、共通の菌糸体のマットの共有された細胞質中を循環する両方の株に由来する核を含有する。
（親株の特性）
融合に用いられる親菌類の各々は、ヘテロダイマーのサブユニットのための発現系を提供するので、１方の親株は、所望の異種ヘテロダイマーの第１のサブユニットをコードするヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変された核を有し、そして第２の菌類の親は、所望の異種ヘテロダイマーの第２のサブユニット（第１のサブユニットと異なる）をコードするヌクレオチド配列のための発現系を含有するように改変された核を有する。関連するサブユニットのための発現系を含有するDNAを用いた各々の親株の形質転換は、以下にさらに記載するように、標準的な組換え技術を用いて行われる。
【００４４】
所望の発現系を含有するように改変されていることに加えて、親株の各々の核は、ヘテロカリオンを形成する融合のために提供される条件下での生存のために、菌類を第２の核の存在に依存させるような特徴を生じるゲノムを含有しなければならない。従って、各々の親の核は、第２の核が存在しない場合でも、その培養条件下で生存することを包含する菌類の不全の原因となる特性を与える。例えば、特定の栄養素を要求する親は、この要求性を有しない親とともにこの栄養素を欠失した培地で培養され得る。菌糸の融合が生じる場合、第２の親の核は、この栄養素の非存在下で生存する能力を与える。同様に、第２の親は、第１の親により要求されない異なる栄養素を要求し得る。従って、両方の栄養素が欠失している場合、両方の核を含有する菌類だけが生存し得る。
【００４５】
要求される栄養素は、菌類株の細胞が成長のために必要とするか、または非存在下では、菌類株が成長または生存する能力を深刻に損なう任意の物質であり得る。有用な栄養素要求性および関連する変異体の例は、以下を包含する：
（1）アミノ酸（例えば、ヒスチジン（his-1〜-7の変異体）、プロリン（aga変異体）、アルギニン（arg-11変異体）、シトルリン（arg-11変異体）、アスパラギン（asn変異体）、コリン（chol-1およびchol-2変異体）、システイン（cys-1変異体）、グルタミン（gln-1変異体）、ロイシン（leu-1〜-4）、リジン（lys-2、-4、および-5）、メチオニン（mac変異体およびmet-6、-9、および-10変異体）、およびスレオニン（thr-2および-3変異体））；
（2）芳香族アミノ酸の混合物（例えば、p-アミノ安息香酸、チロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンの混合物（aro-6、aro-7、およびaro-8以外のaro株により要求される）、トリプトファンおよびフェニルアラニンの混合物（aro-6変異体に要求される）、イソロイシンおよびバリンの混合物（ilv-1、-2、および-3に要求される）、ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの混合物（pt変異体に要求される）；
（3）ビタミン（例えば、パントテン酸（pan-1変異体）およびチアミン（thi-2およびthi-4変異体））；
（4）プリン塩基（例えば、アデニン（ad-2〜ad-4およびad-8変異体）、ヒポキサンチン（ad-2およびad-3変異体）、イノシン、およびグアニンまたはグアノシン（gua-1または-2変異体））；
（5）ピリミジン残基（例えば、ウラシル（pyr-1〜pyr-6））；
（6）飽和脂肪酸（cel変異体）または不飽和脂肪酸（例えば、9-または11-位のいずれかの位置でシス配座中に二重結合を有するC16またはC18脂肪酸、9-位のトランス配置中に二重結合を有する脂肪酸、およびメチレンブリッジにより中断された複数のシス二重結合を有する脂肪酸（ufa-1および-2））；
（7）生理学的に重要なイオン（例えば、カリウム（trk））；
（8）糖アルコール（例えば、イノシトール（acu変異体およびinl変異体））およびグリセロール；および
（9）他の有機物質（例えば、アセテート（ace変異体）、α-ケトグルタル酸、コハク酸、リンゴ酸、ギ酸塩、またはホルムアルデヒド（for変異体）、p-アミノ安息香酸（pab-1、-2、および-3変異体）、およびスルホンアミド（35℃におけるsfo変異体））。
【００４６】
栄養素の要求性に基づく１つの特定の例は、酵素オルニチントランスカルバミラーゼをコードするArg B+遺伝子である。この酵素は、野生型A.niger.に存在する。この酵素を欠失した変異体（Arg B-株）は、通常の特別でない技術（例えば、紫外線照射による処理、それに続く最小培地において生育できないことおよびアルギニン含有培地において生育できることとの組み合わせに基づくスクリーニング）により調製され得る。このゲノムを含有する菌類は、それらがArgB+核をも含有する場合、最小培地において生育し得る。
【００４７】
種々の細胞傷害性薬剤の任意の１つに対して耐性を与える遺伝子もまた、ヘテロカリオン形成を押し進めるのに有用である。例えば、別の実施態様において、親の１つは、栄養素の要求性、および有害な化学薬品により誘導される毒性効果、抗生物質またはウイルス、あるいは厳しい環境条件（例えば、もう一方の親が感受性である所定の温度範囲）に対する耐性を有し得る。
【００４８】
毒性効果を及ぼし得る有害な化学薬品の特定の例は、アクリフラビン（耐性は、一般にacrにより与えられ、acr-4およびacr-6による耐性に必要とされるshg遺伝子の存在をともなう。）；3-アミノ1,2,4-トリアゾール（耐性は、acr-2、atr-1、cpc、leu-1、またはleu-2により与えられる）；マラカイトグリーン（耐性は、acr-3によって与えられる）のような色素；カフェイン（耐性は、caf-1により与えられる）；プリンアナログ（8-アザアデニンおよび2,6-ジアミノプリンに対する耐性はaza-1により与えられる；8-アザアデニンおよび8-アザグアニンに対する耐性は、aza-2により与えられる；8-アザグアニンおよび6-メルカプトプリンに対する耐性は、aza-3により与えられる；6-メチルプリンに対する耐性は、mep(3)およびmep(10)により与えられる；シアニド（非感受性は、生育の最初の24時間中にcni-1により与えられる）；テトラゾリウム（耐性は、cya-6およびcya-7により与えられる）；シクロヘキシミド（耐性は、cyh-1、-2、および-3により与えられる）；クロム酸塩（耐性は、cys-13により与えられる）；2-デオキシ-D-グルコース（耐性は、dgr-により与えられる）；エデイン（耐性は、edr-1および-2により与えられる）；エチオニン（耐性は、eth-1により、p-フルオロフェニルアラニンの存在下でnapにより、そしてエチオニンがD形である場合、oxDにより与えられる）；フルオロ化合物（例えば、5-フルオロデオキシウリジン、5-フルオロウラシル、および5-フルオロウリジン)（３つ全てに対する耐性は、fdu-2により与えられる；5-フルオロウラシルに対する耐性は、アンモニア非含有最小培地中でuc-5により与えられる；5-フルオロデオキシウリジンおよび5-フルオロウリジンに対する耐性は、ud-1により与えられる）、そしてフルオロフェニルアラニン（耐性は、所定の条件下でfpr-1〜-6により与えられる）；8-アザアデニン（耐性は、mtsにより与えられる）；メチルメタンスルホン酸塩（upr-1のために非感受性または僅かに感受性である）；界面活性剤（例えば、塩化デカリニウム、セチルトリメチル臭化アンモニウム、および塩化ベンザルコニウム（耐性は、sur-1により与えられる））；および金属イオン（例えば、バナジン酸（耐性は、vanにより与えられる））を含む。
【００４９】
毒性の影響を及ぼす代表的な抗生物質の例は、ベノミル[メチル-1-(ブチルカルバモルベンズイミダゾール-2-イルカルバメート]（耐性は、Bmlにより与えられる）；アンチマイシンA（非感受性は、生育の最初の24時間の間、cni-1により与えられる）；ポリエン抗生物質（例えば、ナイスタチン（耐性は、erg-1および-3により与えられる）；およびオリゴマイシン（耐性は、oliにより与えられる）を含む。
【００５０】
様々な環境条件における窮境（例えば、高温または低温、酸素の欠乏（耐性は、anにより与えられる）、恒光（耐性は、lis-1、-2、および-3により与えられる）または光の欠乏、UV放射線、電離放射線、および高浸透圧または低浸透圧）に対する耐性を与える遺伝子もまた有用である。特に好ましい実施態様において、毒性の影響に対する耐性は、アンピシリンのような抗生物質に対する耐性である。
【００５１】
本発明において一般に有用な株は、株の表現型に依存して加えられる補充物（例えば、ヒスチジン、アルギニン、および／またはイノシトール）を有する、綿栓試験管中の1×Vogelの最小培地（N培地）で生育され得る。代表的な株は、例えば、Fungal Genetics Stock Center (「FGSC」)およびStanfordUniversityのD.D.Perkins、から入手され得る。有用であると考えられる他のN.crassa株は、M246-89601-2A（Universityof Georgia, AthensのDr. Mary Caseから入手される）。この株は、野生型74Aの派生体であり、安定なqa-2変異（M246）、arom-9変異（M6-11）、およびinos（io601）変異を含有する。二重変異体qa-2、arom-9は、生合成および異化デヒドロキナーゼ活性の両方を欠失し、そして芳香族アミノ酸（例えば、約80μg/mlの濃度のフェニルアラニン）の補充なしには、最小培地において生育し得ない。
【００５２】
A.niger（ATCC 46951）の有用な株は、UV光を用いる変異誘起により調製され、規定された最小培地において、生育のためにオルニチンまたはアルギニンを要求する単離体を形成し得る。この株（オルニチンカルバモイル転移酵素を欠失している）は、argB（350(-)52）と呼ばれている。A.nigerまたはA.nidulansを生育させるための培地は、Cove,Biochim Biophys Acta (1966) 113:51-56に記載されている。
【００５３】
標準的な手順が、株の維持および分生子の調製に一般に用いられる（DavisおよびdeSerres, Methods Enzymol (1971) 17A:79-141）。菌糸は、代表的には、Lambowitzら、JCell Biol (1979) 82:17-31に記載のように、約14時間（25℃）液体培養で生長する。宿主株は、一般に、適切な栄養素(単一または複数の)（例えば、ヒスチジン、アルギニン、phe、tyr、および／またtrp(それぞれ約80μg/ml)；p-アミノ安息香酸（約２μg/ml)；およびイノシトール（約0.2mg/ml））を補充したVogelまたはFriesの最小培地のいずれかにおいて生育され得る。
【００５４】
所望の特性を有する多くの菌類の株は、公に入手可能である。しかし容易に入手可能でない場合、当業者は、所望の特性を提供する所望の変異体または加工された核のいずれかを分離するために当該分野で周知の選択技術を用い得る。例示の親の組み合わせを以下の表に示す。
【００５５】
【表１】
2005052152.tif 000002
表中に見られるように、種々の相補的な特徴/特性の組み合わせが、種々の融合条件に適合するように選択され得る。一般に、栄養素の要求性は、変異株により証明されるが、その一方、特定の物質に抵抗する能力は、耐性遺伝子のための発現系を有する核の改変によってより都合よく与えられ得る。あるいは、栄養要求性は、形質転換ベクターを用いる相同的組換えのような組換え技術を用いてなされ得、そして耐性は、毒性条件が存在する条件下での変異により与えられ得る。
（異種ダイマーサブユニットのための発現ベクターの構築）
異種ヘテロダイマーのサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する発現系は、周知の技術を用いて、宿主ベクターに、そして最終的な糸状菌類宿主におけるそれらの発現をなし得る制御配列との作動可能な連結中にコード配列を挿入することにより構築される。
【００５６】
中間宿主が、最終的な菌類細胞を形質転換し得る中間ベクターを産生するためにときどき用いられる。次いで中間細菌形質転換体は、DNAの所望量を得るために増殖され得る。このDNAの所望量は、所望の糸状菌類宿主を形質転換するために使用され得る。中間ベクターとして働き得る一般に入手可能な細菌のベクターは、例えば、pBR322、pUC8、およびpUC9を含む。別の有用な中間ベクターは、pHY201、pKBY2、pTZ18R、pTZ182、およびpCVN2.9、pN807、pN846を含む。
【００５７】
あるいは、所望のサブユニットをコードする配列は、PCRのような標準的な増幅技術を用いて増幅され得る。次いでコード配列は、糸状菌類におけるそれらの発現に影響する制御配列に作動可能に連結された適切なベクターに挿入される。これらのベクターは、成功した形質転換体が容易に同定され得るように、選択マーカーを都合良く含有する。しかし、宿主株は、上記のような相補的な宿主株との融合を促進する特徴を有する。
【００５８】
従って、所望の異種ヘテロダイマーの特定のサブユニットをコードするDNAのための発現系を含有するように第１の菌類宿主株の核を改変するために、本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、および当該分野の技術の範囲内の組換えDNA技術を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Maniatisら、MolecularCloning: A Laboratory Manual (1982)；D.N. Goverら、DNA Cloning: APractical Approach (1985) Volumes IおよびII；Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編 1984)；Nuclei Acid Hybridization (Hamesら、編 1985)；Transcriptionand Translation (Hamesら、編 1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press 1986)；B. Perbal, APractical Guide to Molecular Cloning (1984)を参照のこと。
【００５９】
本発明を記載することにおいて、以下の用語法が以下に示される定義に従って用いられる：
「組換え宿主」は、組換え技術により調製されたDNA配列で形質転換されている、形質転換される、または形質転換され得る細胞をいい、そして当初形質転換される細胞および培養物ならびにその子孫を含む。
【００６０】
外来DNAが宿主細胞の膜中に導入されている場合、細胞は、このような外来DNAにより「形質転換」されている。細菌のような原核生物に関して、外来DNAは、プラスミドのようなエピソームのエレメント上に維持され得る。糸状菌類は、核を有するので（真核生物である）、ほとんどの安定に形質転換された菌類宿主細胞は、染色体中に組み込まれた外来DNAを含有し、その結果それは染色体複製を通じて娘細胞により受け継がれる。
【００６１】
DNA構築物の「異種」領域は、自然界のより大きな分子と関連していることが見い出されていない大きなDNA分子中の同定可能なDNAのセグメントである。従って、異種領域が遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常、供給源生物のゲノム中のゲノムDNAに隣接しないDNAにより隣接される。
【００６２】
本発明は、糸状菌類における「異種ヘテロダイマー」の産生を包含する。この文脈において、「異種」は、ヘテロダイマーが菌類により通常は産生されないことを意味する。「ヘテロダイマー」は、最終産物が少なくとも２つの異なるサブユニットから成ることを意味する。このダイマーは、免疫グロブリンの場合のように最終産物中で繰り返され得る。従って、ヘテロダイマーは、２つ以上の異なるサブユニット（「α」部分および「β」部分としばしば呼ばれる）を有する生物学的な物質を包含する。例としては、原核生物または真核生物の酵素、血液タンパク質、ホルモン、成長因子、ワクチンのための病原体由来の毒素および他のタンパク質、構造タンパク質、リンホカイン、膜表面タンパク質、免疫グロブリン、酵素調節因子、転写調節因子などが挙げられる。
【００６３】
好ましいヘテロダイマータンパク質は、α-およびβ-トランスフォーミング増殖因子、α'-およびβ'-アンチトリプシン、免疫グロブリン、インシュリン、ヘモグロビン、α-およびβ-キナーゼ、FSH、LH、hCG、およびTSHを含む。特に好ましいヘテロダイマータンパク質は、免疫グロブリン、インシュリン、FSH、LH、hCG、およびTSHを含む。
【００６４】
タンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適切な制御配列に作動可能に連結される場合に、転写産物が配列の一部分についてポリペプチドに翻訳されるその配列の一部分である。コード配列の境界域は、５'(アミノ)末端の開始コドンおよび３'（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。このコード配列は、例えば、原核生物の遺伝子、真核生物のmRNA由来のcDNA、真核生物（例えば、哺乳動物）のDNA由来のゲノムDNA配列に由来し得、または合成DNAを含み得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３'に位置される。
【００６５】
制御配列が、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を行う場合、コード配列は、制御配列に「作動可能に連結されている」。
【００６６】
「発現系」は、宿主生物における発現に必要な発現制御の領域に作動可能に連結されるコード配列を含有するDNAである。
【００６７】
本発明の１つの実施態様において、宿主細胞は、形質転換のためにスフェロプラストに変換される。スフェロプラストが用いられる場合、好ましい方法またはそれらを調製することは、細胞壁の酵素的な消化により、例えば、キチナーゼ/グルタマーゼ混合物を用いることによる。酵素的な消化のための適切な酵素の選択は、当該分野の技術の範囲内である。有用な酵素は、複合多糖類を消化し得る酵素であり、そして広範な種類の菌類種の菌類のスフェロプラストを調製することにおいて効果的であると知られる酵素の中で見い出される。適切な酵素の例は、Novozym234（酵素の不純な混合物）およびβグルクロニダーゼを含む。他の適切な方法が、スフェロプラストを形成するために用いられ得る。しかし、ベクターの使用による細胞壁貫通のための適切な方法が同定される場合、菌類宿主の細胞全体が、スフェロプラストとともに、またはその代わりに用いられ得る。
【００６８】
Neurosporaを形質転換するための一般的な手順は以下に提供される。
（N.crassaの形質転換のための一般的な手順）
一般に用いられるNeurospora crassaの株は、FungalGenetics Stock Centerから公に入手可能である株を含むが、独立に調製される株もまた使用され得る。変異体は、Stadlerら、Genetics(1966) 54:677-685およびHaasら、Genetics (1952) 37:217-26に説明されるように、デノボ単離され得る。有用な株はまた、StanfordUniversityのD.D.Perkinsから入手され得る。株は、代表的には、その株の表現型に依存して加えられる適切な補充物を有する、綿栓試験管中の1×Vogelの最小培地（N培地）で生育させる。
【００６９】
スフェロプラストは、形質転換の被検体として用いられる。分生子のスフェロプラストを形成するために、菌類は、４〜５の125ml Erlenmeyerフラスコ（綿で栓がなされている）中に適切な補充物を有する、25mlの固体N培地に接種される。この培養物を、5〜7日間室温で生育させる。
【００７０】
分生子は、各々のフラスコに対して10mlのN培地を添加し、綿栓をとり、そしてフラスコを回転することにより収集される。固形物を、数分間の間沈降させる。分生子の混合物を、Erlenmeyerフラスコの口に吊るされた加圧滅菌されたチーズクロスバッグに注ぎ、そして１つ以上のゴムバンドでしっかりと締めつける。濾液を回収し、そして分生子の濃度を、連鎖は１つとして計測して血球測定器の計数により測定する。
【００７１】
2×109の分生子の分量が、1.5％スクロースおよび適切な補充物を含有する150mlの液体N培地に加える。分生子は、75％以上が発芽するまで、5〜6時間室温で振盪しながら（150〜200rpm）、綿栓フラスコ中で発芽させ、そして発芽管は、長さが1〜4分生子の直径である。細胞を、約1500〜2000rpmで10分間の遠心分離により収集する。細胞ペレットを、水で３回リンスする。
【００７２】
次いでペレットを、10mlの1.0Mソルビトールに再懸濁し、そしてスフェロプラストを、スフェロプラストが形成されるときその「バースト」を防止するために、等張条件下で、酵素を用いて堅固な分生子の細胞壁の酵素的除去により調製される。このプロトコルは、VollmerおよびYanofsky,Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83:4869-73の方法を適応させる。
【００７３】
より詳細には、無菌の250ml Erlenmeyerフラスコ中に、分生子の懸濁物を、商標名Novozym234でNovo Laboratoriesにより販売される固体酵素の50mgに一般に添加する。細胞壁を消化するために、混合物を30℃で約１時間（±10分）振盪する（100rpm）。スフェロプラスト形成プロセスは、混合物の少量のアリコートをカバースリップ下顕微鏡で検査することによりモニターする。水がカバースリップの一端に加えられた場合、スフェロプラストが、浸透圧的に溶解するために検出され得る。このプロセスは、スフェロプラスト形成の後期に頻繁にモニターされるべきである。
【００７４】
スフェロプラスト混合物は、15mlの滅菌円錐形遠心チューブ中にデカントされ、そしてスフェロプラストは、スイングバケットテーブルトップ遠心分離により500rpm（10分）で遠心分離することにより回収される。得られるペレットを、10の1.0Mソルビトールで２回リンスし、次いで以下のSTC溶液で一回リンスする：
91g ソルビトール；
50mM Tris. Cl；
50mM CaCl2；
8.0にpHを調整するに十分なNaOH；および
500mlの容積にするに十分な水。
最終のスフェロプラストペレットを、16.0ml STC、200μl DMSO、および４mlの以下のPTC溶液に懸濁する：
200g の商標名「4000」でSigmaにより販売されるポリエチレングリコール；
50mM Tris. Cl；
50mM CaCl2；
8.0にpHを調整するに十分なNaOH；および
50mlの容積にするに十分な水。
得られるスフェロプラストの懸濁物は、直接用いられるか、または-80℃にて1.0mlのアリコート中で凍結保存されかのいずれかであり得る。
【００７５】
滅菌、15mlスクリューキャップチューブ中で、2.0μlの50mM スペルミジン溶液、5.0μlのトランスフェクトされるべきプラスミドDNA（ベノミル耐性（通常約1.0mg/mlの濃度で）のような選択マーカーとともに所望のヘテロダイマーのサブユニットのための発現系を含有するような）、および5.0μlの５mg/mlヘパリン溶液を、チューブを指で弾くことにより混合する。スペルミジン溶液は、1.0mlのTE中に12.73mgのスペルミジンを溶かし、そして8.0にpHを調整することにより調製され、そして-20℃にて保存され得る。ヘパリン溶液は、10mlのSTC中に50mgのヘパリンのナトリウム塩を溶かすことにより調製され、そして凍結アリコート中に保存され得る。
【００７６】
チューブの内容物は、卓上遠心分離器中で手短にスピン（パルス）され、次いで氷浴中に置かれる。約50〜100μlの融解したスフェロプラストをチューブに添加する。次いで氷上で約20分間のインキュベーション時間で十分であるが、混合物を約30分間氷上でインキュベートする。約１mlのPTCを加え、そしてチューブを指で弾くことにより十分に混合する。この混合物を、約20分間室温でさらにインキュベートする。
【００７７】
再生「上層」寒天は以下を混合することにより調製される：
20ml 50×Vogelの最小培地；
825mlの水；
182gソルビトール；および
28g Bacto-Difcoの商標名で販売される寒天。
【００７８】
上層寒天を高圧滅菌し、そして100mlの10×FIGS溶液（５g/lフルクトース、２g/lイノシトール、２g/lグルコース、および200ソルボースを含有する）を加える。15mlの上層寒天を、50〜55℃でインキュベートし、そしてスフェロプラストおよびプラスミドDNAを含有するチューブ中に注ぐ。内容物を、チューブを指で弾き、2〜3回反転することにより迅速に混合し、次いで「下層」寒天をプレートした層上に均一に注ぐ。
【００７９】
「下層」寒天は、１×N培地に任意の要求される補充物を混合し；高圧滅菌し；そしてそれぞれ１×および0.5μg/mlの最終濃度まで10×FIGSおよびベノミル（ベノミル耐性がマーカーとして用いられる場合）を添加することにより調製される。25mlの体積の「下層」寒天は、ペトリプレートに注がれ、そして硬化する。
【００８０】
上層寒天が下層寒天上に注いだ後に、気泡を、炎であぶることにより除去する。プレートを、上層寒天が固化するまで（約５分間）上向きに保たれる。上層寒天が早まって硬化する傾向がある場合、下層寒天プレートは、予熱され得る。一旦上層寒天が固化すると、プレートを、30℃にてして、反対向きにしてインキュベートする。
【００８１】
N. crassa形質転換体の選択のために、宿主を、適切な培地（形質転換された細胞だけが利用し得る組成物を有するか、または形質転換された細胞だけが耐性である抗生物質を含有する）上でこのように培養され、そして約34℃にてインキュベートする。上首尾な形質転換の徴候は、プレーティング後、約24〜36時間で見られ得る。安定な形質転換体は、一般に、生育の３日後に記録する。形質転換体を検出するためのインキュベーション期間は、宿主株および表現型マーカーに依存して変化する。
【００８２】
選択された形質転換体は、標準的な方法（例えば、適切なELISA、コロニーブロット免疫アッセイ、制限酵素分析、フィルターハイブリダイゼーション、ネスト欠失サブクローニングなど）により、所望のタンパク質サブユニットの発現についてスクリーニングされ得る。
【００８３】
本発明において、上記の組換え技術は、以下を生産するために用いられる：
（１）特定の条件下で生育にネガティブに影響するが、第２の核により与えられる性質により補正され得る第１の特徴を有する第１の菌類；今やこの第１の菌類は第１のヘテロダイマーサブユニットをコードするヌクレオチド配列のための発現系を含有するように今回形質転換される；および
（２）特定の条件下で生育にネガティブに影響するが、第１の核により与えられる性質により補正され得る第２の特徴を有する第２の菌類；今やこの第２の菌類は第２のサブユニット（これは第１のサブユニットと異なる）をコードするヌクレオチド配列のための発現系を含有する。
【００８４】
得られる第１および第２の株は、本発明のヘテロカリオンを形成するために用いられる親株である。
（ヘテロカリオンの産生）
第１の菌類株および第２の菌類株は、全てのヘテロカリオン適合性対立遺伝子に関して同型接合型であるように選択されるので（上記に説明されるようにtol遺伝子が存在する場合、交配対立遺伝子を除く）、第１および第２の菌類が第１および第２の菌類のいずれも単独では生存し得ない条件下で共に培養される場合、この菌類は、本発明のヘテロカリオン菌類が形成されるように融合される。菌糸の融合により、第１および第２の菌類の異なるハプロイド核は、共通の細胞質中に共存するようになる。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、出願人は、膜融合は、各々の細胞内の膜内粒子の凝集から生じ、タンパク質非含有領域間で起こりうる細胞接触を作成すると考える。
【００８５】
２つの親のそれぞれは、所望のヘテロダイマータンパク質の異なるサブユニットの産生を行う核を含有するので、得られるヘテロカリオンは、両方のサブユニットを含有する完全なヘテロダイマーを産生し得る。
【００８６】
本発明のヘテロカリオンは、ほぼ同じ速度で分裂する２つの核を有して安定である。２つ（またはそれ以上）の核を有するヘテロカリオンが形成される場合、核が、それらが融合するのとほぼ同時に有糸分裂期に入る場合、いくつかの単一核のハイブリッド細胞を形成することもまた可能である。このタイプの核の融合は、それが生じる場合異型接合ディプロイド核を生じるが、それは稀であり、そして形成されるディプロイド核は、通常、ハプロイド核よりもかなり数が少ない。
（ヘテロダイマーの産生のための培養条件）
融合した、ヘテロカリオン菌類は、第１および第２の菌類のいずれも生存できない条件下で維持される。例えば、融合する菌類株のそれぞれが、他方と異なる栄養要求生を保有する場合、両方の栄養素が存在しない培養培地で生育し得る細胞のみが、ヘテロダイマータンパク質のサブユニットをまた発現し得る相補的なヘテロカリオンである。例えば、ある株は、アルギニンのようなアミノ酸を要求し得、その一方他の株は、アデニンのような塩基を必要とし得る。各々の株は、いずれも最小培地上では、単独で生存できないが、適切な余分の代謝産物を補充した培地上で個別に維持され得る。しかし、ヘテロカリオンは、それぞれの核が他方の要求性を相補するために最小培地で生存する。
【００８７】
代表的な最小培地を以下に示す：
最小培地
１リットルあたり：     ブドウ糖        5.0g
塩溶液（以下）  50.0ml
微量成分（以下）        1.0ml
±寒天（Difco） 12.5g
pH 6.5に調製；高圧滅菌15分。
【００８８】
【表２】
2005052152.tif 000003
順次構成成分を溶かし、煮沸し、冷却し、KOHで6.5にpHを調製する。
【００８９】
従って、ヘテロカリオン状態にヘテロカリオンの糸状菌類を維持するために、外力が維持される。最小培地上でヘテロカリオンの菌類細胞を生育させることは、この株に一緒にされることを「強いる」。接合型が反対である場合、tol遺伝子の存在が、安定な（A + a）ヘテロカリオンを維持するために用いられ得る。
【００９０】
異種のダイマータンパク質は、タンパク質を産生するために都合の良い条件下で本発明のヘテロカリオンを培養することにより産生される。このヘテロダイマーは、培養物から回収され、そして適合された（勿論、ヘテロダイマーの構造を保存するために必要なように適合された）標準的な技術に従って精製され得る。
【００９１】
好ましくは、ヘテロカリオンの糸状菌類は、最少増殖培地中に所望のヘテロダイマータンパク質が直接分泌されるように宿主が培養されることを可能にする発現ベクターを保有し、その結果ヘテロダイマータンパク質が細胞非含有培地から直接精製され得る。細胞内に産生されるヘテロダイマーは、細胞溶解物から単離され得る。公知の手順に従う有用な精製方法、例えば、分子サイズ排除、イオン交換クロマトグラフィー、HPLCなどは、当該分野の技術の範囲内にある。
【００９２】
本発明のこの記載および開示は、本発明の精神および範囲内にある全ての実施態様を含むことが意図されることが理解される。例えば、分子の活性に実質的に影響することなく、オープンリーディングフレームのアミノ酸配列内のアミノ酸を挿入、欠失、または置換することは当該分野の知識の範囲内にあり、そしてこのような欠失、付加、または置換を有するヘテロダイマーのサブユニットは、本発明に含まれる。
【００９３】
以下の実施例は、例示のために提供されるが、いかなる方法においても本発明を制限することは意図されない。これらの実施例において、全ての培地を高圧滅菌した。培地を冷却した後、熱不安定性補充物および抗生物質を添加した。N培地の成分は、DavisおよびDeSerres, Methods Enzymol. (1970) 27A:29-143による総説中に見い出され得る。アンピシリンが培地に添加される場合、約50〜100μg/mlの最終濃度が用いられる。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
（pXpressへの異種DNAの挿入）
Ａ．ヒトLH遺伝子のαサブユニットを含有する挿入物を、ベクター中に挿入するためにゲル精製する。このサブユニットについての完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、Boothby,M.ら、J Biol Chem (1981) 256:5121-5127およびFiddes, J.C.ら、J MolAppl Genet (1981) １：3-18により報告されている。
【００９５】
ヘテロダイマーのサブユニットの発現のための宿主ベクター「pXpress」を、本明細書中に参考として援用する、1993年12月23日に公開されたPCT出願WO93/25663号、および1993年８月12日に出願された米国特許出願番号第08/105,448号に記載されるように調製した。このベクターは、このベクターについてホモカリオンである形質転換体のために、pfpaを含有する培地上で選択マーカーを提供し、そしてまたAmpr遺伝子も含有する。
【００９６】
簡単に述べれば、例示のベクターpXpressは、Stuart, W.D.ら、Genome(1988) 30:198-203に記載されるベクターpBN3から構築される。pBN3は、図１に示されるmtr遺伝子を含有する2783bpのN.crassaゲノムDNAを含有し、それは、遺伝子中のBglII部位およびベクター中に含有されるBamHI部位に挟まれる。pBN3をBamHIおよびBglIIで消化し、そしてmtr遺伝子を含有するセグメントを、Pharmaciaから得られた、市販されているベクターpTZ18RのBamHI部位に挿入した。これは、クローンpN807およびpN816を生じ、ここでpTZ18Rベクターのポリリンカー中に含まれるEcoRI部位はORFの上流にある；反対向きのクローンをpN846およびpN839と命名した。pXpressは、pTZ18Rの5'ポリリンカーが欠失されたpN846の変種である。pXpressベクターは、mtrプロモーターのすぐ下流の上流領域に所望のDNAの挿入のための有用なクローニング部位（SalI/AccI/HincII）(図１における307位）を、およびORFの後の方の３分の１にも所望のDNAの挿入のための有用なクローニング部位（1406位のHincIIおよび1920位のAccI）を有する。
【００９７】
５μgのpN846 DNAを、標準的な方法（KooおよびStuart Genome(1991) 34:644-651）によりE.coli NM522から単離した。このDNAをXbaIおよびHindIIIで二重消化し、KlenowおよびNTPsで処理し、Geneclean（Bio101）で浄化し、そして室温で１晩、400ユニットのDNA T4ポリメラーゼを用いて連結した。連結混合物を用いて、E.coli NM522宿主細胞を形質転換し、そしてAmprについて選択した。形質転換されたコロニーを釣り上げ、そして一晩チューブ内の1.5mlの液体培養中で生育させた。プラスミドDNAを単離し、そしてHindIII、XbaI、およびPstI制限酵素部位の存在について試験した。次いで３つの部位を欠失した単離物を、pN846に存在すると予測される残りの部位について試験した。予測される部位を失い、そして予測された部位を保持する１つのプラスミドを、プラスミドpXpressと命名した。
【００９８】
pXressを、SalIおよび、次いでHincIIで消化し、mtrプロモーターの後のbp307における5'末端で突き出たSalI粘着末端、およびmtr遺伝子ORF内のbp1406におけるHincII平滑末端部位が取り除かれたmtr遺伝子配列の一部を有するベクターを生成する。
【００９９】
適切な制限酵素部位を備えたαLHサブユニットORFの0.5μgのサンプルを、40ユニットのT4リガーゼを用い、そして16℃で一晩インキュベートすることにより、0.5μgのpXpressに連結する。フラグメントは、SalIをXhoIに、そして平滑末端HindIIIを平滑末端HincIIに（従って４つの制限酵素部位全ては失われる）に結合する。
【０１００】
連結されたフラグメントを、コンピテントなE.coli細胞DH-5αに形質転換し、そして形質転換体を、アンピシリン耐性について選択する。耐性コロニーを、液体培養で生育させ、そして標準的な手順を実施してプラスミドDNAを単離する。プラスミドを制限酵素EcoRVで消化し、プラスミドのサイズを試験する（すなわち、挿入物の存在を確認する）。次いで陽性と検定されたプラスミドをBamHIで消化し、プラスミド中への挿入物の向きを試験する。陽性のプラスミドを、所望のサブユニットについてpLHαと改名する。
【０１０１】
Ｂ．この実施例の段落Ａの方法に正確に類似する方法で、LHβサブユニットをコードする遺伝子をpXpressに挿入し、pLHβを得る。このサブユニットの完全配列は、Boorstein,W.R.ら、Nature (1982) 300:419-422に記載されている。
【０１０２】
（実施例２）
（Neurosporaスフェロプラストの形質転換およびLHサブユニットの発現）
Ａ．Y152m14株（ヒスチジン要求性）のNeurosporaスフェロプラストを標準的な方法によりpLHαで形質転換する（KooおよびStuart1991、前出）。このプラスミドをSacIで切断することにより線状にする。線状化プラスミドの５μgのサンプルを用いて、1×108のスフェロプラストを形質転換する。混合物を、ヒスチジンを補充した15mlの最少上層寒天中に入れ、そして0.05mg/mlのp-フルオロフェニルアラニン（「pfpa」）を含有する下層寒天上に拡げる。プレートを３日後にスクリーニングする。コロニーを釣り上げ、そしてチューブスラント中に0.05mg/mlのpfpaおよびヒスチジン補充物を含有する固体Vogelの1×培地上で生育させる。
【０１０３】
コロニーを、２回の蒸留水で２％のスクロースおよびヒスチジンを含む1×Vogelの培地の液体培養に移す。この培養物を回収し、そしてLHαサブユニットの存在についてアッセイする。
【０１０４】
Ｂ．N. crassa M246-89601-2A株は、生合成および異化デヒドロキナーゼ活性の両方を欠く二重変異体（qa-2、arom-9）である。この株は、少なくとも１つの芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の補充無しには最小培地上で生育し得ない。培地にヒスチジンではなくフェニルアラニンが補充される以外は、この実施例の段落Ａの手順を用いて、この株をpLHβで形質転換する。段落Ａのように、液体培養に移した後、培養物を、LHβサブユニットについてアッセイする。
（実施例３）
（ヘテロカリオン形成）
実施例２の第１および第２の形質転換された菌類株の両方を、ヒスチジンおよびフェニルアラニンを欠いた最小培地上で培養する。この培地は、２つの株に、単一の隔膜壁の内側に両方の型の核を有するヘテロカリオン細胞を形成することを「強いる」。
【０１０５】
融合した、ヘテロカリオンの宿主を、αおよびβサブユニットの発現に好適な条件下で最小培地上で維持する。正しくアセンブルされたヘテロダイマーのLHが産生され、培養物から回収し、そして所望であれば、従来技術により精製する。
【０１０６】
本発明の所定の実施態様が、例示の目的で本明細書中に記載されていることが認識される、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが前述から理解される。従って、本発明は、添付された請求項による以外は、限定されるべきではない。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、一般に、糸状菌類における異種遺伝子の発現の発現に関し、より詳細には、本発明は、少なくとも２つのサブユニットを含有する異種ヘテロダイマーを産生し得るヘテロカリオンの糸状菌類宿主に関する。ヘテロカリオンは、第１および第２の核を含有し；それぞれの核は、ヘテロダイマーの１つのサブユニットのための発現系を含有する。ヘテロカリオンは、第１の菌類宿主株、およびヘテロカリオン適合性対立遺伝子に関して第１の菌類宿主株と同型接合である第２の菌類宿主株を一緒に培養することにより調製される。ここで、第１および第２の菌類宿主株は、ヘテロカリオン宿主が形成されなければ、第１および第２の菌類株のどちらも生存し得ない条件下で一緒に培養される。本発明によって、原核生物または真核生物の酵素、血液タンパク質、ホルモン、成長因子、ワクチンのための病原体由来の毒素および他のタンパク質、構造タンパク質、リンホカイン、膜表面タンパク質、免疫グロブリン、酵素調節因子、転写調節因子などの有用なヘテロダイマーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】図１Ａは、完全なオープンリーディングフレームおよびプロモーターおよび転写終結シグナルを含有するN. crassaのmtr遺伝子の約2.9kbフラグメントのヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、完全なオープンリーディングフレームおよびプロモーターおよび転写終結シグナルを含有するN. crassaのmtr遺伝子の約2.9kbフラグメントのヌクレオチド配列を示す図であって、図１Ａの続きの図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、完全なオープンリーディングフレームおよびプロモーターおよび転写終結シグナルを含有するN. crassaのmtr遺伝子の約2.9kbフラグメントのヌクレオチド配列を示す図であって、図１Ｂの続きの図である。
【図２Ａ】図２Ａは、mtr遺伝子座のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、mtr遺伝子座のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図であって、図２Ａの続きの図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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