(57)【要約】【課題】新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド、及びその調製方法の提供。当該新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイドを含む一連のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド化合物を有効成分とする新規な抗マラリア組成物の提供。【解決手段】  一般式（２）：【化１】2005179304.tif 000040（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗マラリア組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（１）：
【化１】
2005179304.tif 000031
で示される新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド。
【請求項２】
Morinda morindoidesを、有機溶媒を含む溶媒で抽出処理する工程、及び得られる抽出画分を吸着処理する工程を有する、請求項１に記載するフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）の調製方法。
【請求項３】
請求項１に記載するフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
【請求項４】
一般式（２）：
【化２】
2005179304.tif 000032
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗マラリア組成物。
【請求項５】
有効成分が、下式（１）：
【化３】
2005179304.tif 000033
下式（３）：
【化４】
2005179304.tif 000034
下式（４）：
【化５】
2005179304.tif 000035
下式（５）：
【化６】
2005179304.tif 000036
及び、下式（６）：
【化７】
2005179304.tif 000037
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドの中から選択される少なくとも１つである、請求項４に記載する抗マラリア組成物。
【請求項６】
下記の工程(1)〜(4)：
(1) Morinda morindoidesの葉を低級アルコールで抽出する工程、
(2) (1)で得られる低級アルコール抽出物をｎ−ヘキサンと水の混合溶媒で抽出し、層分離する工程、
(3) (2)で得られる水層を酢酸エチルで抽出し、層分離する工程、及び
(4) (3)で得られる酢酸エチル抽出画分を吸着処理に供する工程
を有する、一般式（２）：
【化８】
2005179304.tif 000038
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドの調製方法。
【請求項７】
下記の工程：
Ａ.  (1) Morinda morindoidesの葉を低級アルコールで抽出する工程、
(2) (1)で得られる低級アルコール抽出物をｎ−ヘキサンと水の混合溶媒で抽出し、層分離する工程、
(3) (2)で得られる水層を酢酸エチルで抽出し、層分離する工程、及び
(4) (3)で得られる酢酸エチル抽出画分を吸着処理に供する工程
を有する方法により、下記一般式（２）で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドを調製し、
【化９】
2005179304.tif 000039
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
Ｂ.  次いで、当該フェニルプロパノイド縮合型イリドイドに薬学的に許容される担体または添加剤を配合する工程、
を有する請求項４または５に記載する抗マラリア組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド、その調製方法、及びそれを抗マラリアの有効成分とする医薬組成物に関する。さらに、本発明は、公知フェニルプロパノイド縮合型イリドイドについて、抗マラリア組成物（医薬組成物）の有効成分としての新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、現在、世界中で約３億人の人が感染し、年間200万人もの人が死亡する人類最大の寄生原虫感染症であり、ＷＨＯは、2010年には患者数、死亡者数とも倍増すると推計している。しかも、多剤耐性原虫が広範囲に渡って伝播していることやワクチンの開発が困難を極めていること等から、マラリアは、エイズとともに地球規模で最も脅威になっている疾病と位置づけられている。このため、現在、マラリアの新規化学療法剤の開発は人類にとって緊急を要する重要な課題であると考えられる。
【０００３】
従来よりマラリアの治療に用いられている薬物は、１)南米起源のキナ樹皮由来のキニーネをシーズ化合物として開発されたクロロキンに代表される一連のアミノキノリン系化合物、２)中国起源の漢薬 "青蒿" から開発されたアルテミニシン（artemisinin）などのパーオキサイド化合物、及び３）ジヒドロ葉酸還元酵素を標的とする葉酸代謝拮抗薬、の３種類に大別される。しかしながら、現在、これら３種の抗マラリア薬のすべてに対して耐性な原虫が患者から確認されている感染地域も出現しており、また、マラリアの感染を媒介するハマダラ蚊も多種の殺虫剤に対して耐性を獲得していることから、耐性原虫の伝播を制御する有効な手段がない現状況において、多剤耐性原虫が全感染地域に拡散するのも時間の問題であると警鐘が鳴らされている。
【０００４】
特に、上記の既存抗マラリア薬のなかで、アミノキノリン系化合物および葉酸代謝拮抗薬は、ほとんどの感染地域で耐性が確認されており、これらの薬物を用いて、マラリアを治療することは今ではほぼ困難とされている。また、アルテミシニンは、血流中のマラリア原虫が完全に消失してから数週間後に新たに血流中に原虫が出現する、「再燃」という現象が観測される。これが、アルテミシニンの最大の問題点である。このため、アルテミシニンは、現在、主として治療初期に体内のマラリア原虫濃度を低下させるために利用されるに留まり、マラリアを根治する療法として、注射薬としてのみ効果を示すキニーネの静注が実施されている。
【０００５】
このように、上記従来の抗マラリア薬とは異なる構造を有する新規な抗マラリア活性成分の発見、並びに新規抗マラリア治療剤の開発が急務とされている。
【０００６】
こうした目的から、従来より、多くの薬用植物の中から抗マラリア活性成分を探索する試みが広く行われている。例えば、特許文献１にはアノーナ・セネガレンシスから得られるタンニン及びキニンを含有する抽出物がマラリアの治療に有効であること、特許文献２には天然または合成によって得られるアクリジン誘導体が抗マラリア剤の有効成分として有効であること、特許文献３には桂皮、地黄、芍薬、川きゅう、当帰、人参、及び甘草などの混合生薬やその抽出物が抗マラリア剤として有効であること、特許文献４にはAncistrocladus属の植物から得られるコルペンサミン及びコルペンサミン誘導体が抗マラリア活性成分として有効であること、特許文献５にはペシーラ属の植物のアルカロイド成分であるボーカミンに優れた抗マラリア活性があること、非特許文献１にはケニアで抗マラリア用に使用されている薬用植物Ajuga remotaに含まれるajugarin-1及びergosterol-5,8-endoperoxideに抗マラリア活性（in vitro）があること、並びに非特許文献２には、薬用植物Cassia occidentalis、Morinda morindoides、及びPhyllanthus niruriに抗マラリア活性があることが記載されている。
【特許文献１】特開昭６０−５４３２３号公報
【特許文献２】特開平０２−１０１０１５号公報
【特許文献３】特開平０７−８２１６５号公報
【特許文献４】特表平１０−５０１５１８号公報
【特許文献５】特表２００２−５０７５７０号公報
【非特許文献１】Kimani A. M. Kuria et al., "The Antiplasmodial Activity of Isolates from Ajuga remota", Journal of Natural Products, 2002, Vol.65, No.5, pp.789-793
【非特許文献２】Tona L et al., "In-vivo antimalarial activity of Cassia occidentalis, Morinda morindoides and Phyllanthus niruri" ANNALS OF TROPICAL MEDICINE AND PARASITOLOGY, 95(1), 47-57 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、第１に新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド、及びその調製方法を提供することを目的とする。また本発明は、第２に当該新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイドを含む一連のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド化合物を有効成分とする新規な抗マラリア組成物を提供することを目的とする。さらに本発明は、第３に上記当該新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイドを含む一連のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド化合物の調製方法、並びに当該化合物を有効成分とする抗マラリア組成物の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために日夜鋭意検討していたところ、フェニルプロパノイド縮合型イリドイドに属する一連の化合物群に、抗マラリア活性があることを新たに見いだし、特にその群に属する一つのフェニルプロパノイド縮合型イリドイドは文献未収載の新規化合物であることを確認した。
【０００９】
本発明は、かかる知見に基づいて、完成したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は下記に関するものである。
項１．下式：
【００１１】
【化１０】
2005179304.tif 000002
【００１２】
で示される新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド。
項２．  Morinda morindoidesを、有機溶媒を含む溶媒で抽出処理する工程、及び得られる抽出画分を吸着処理する工程を有する、項１に記載するフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）の調製方法。
項３．  項１に記載するフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。
項3-1．  項１に記載するフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）またはその薬学的に許容される塩を、抗マラリア有効量含む医薬組成物。
項3-2．  項１に記載するフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗マラリア組成物。
項４．  一般式（２）：
【００１３】
【化１１】
2005179304.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗マラリア組成物。
項５．  有効成分が、下式（１）：
【００１５】
【化１２】
2005179304.tif 000004
【００１６】
下式（３）：
【００１７】
【化１３】
2005179304.tif 000005
【００１８】
下式（４）：
【００１９】
【化１４】
2005179304.tif 000006
【００２０】
下式（５）：
【００２１】
【化１５】
2005179304.tif 000007
【００２２】
及び、下式（６）：
【００２３】
【化１６】
2005179304.tif 000008
【００２４】
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドの中から選択される少なくとも１つである、項４に記載する抗マラリア組成物。
【００２５】
項６．  下記の工程(1)〜(4)：
(1) Morinda morindoidesの葉を低級アルコールで抽出する工程、
(2) (1)で得られる低級アルコール抽出物をｎ−ヘキサンと水の混合溶媒で抽出し、層分離する工程、
(3) (2)で得られる水層を酢酸エチルで抽出し、層分離する工程、及び
(4) (3)で得られる酢酸エチル抽出画分を吸着処理に供する工程
を有する、一般式（２）：
【００２６】
【化１７】
2005179304.tif 000009
【００２７】
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドの調製方法。
項７．  下記の工程：
Ａ.  (1) Morinda morindoidesの葉を低級アルコールで抽出する工程、
(2) (1)で得られる低級アルコール抽出物をｎ−ヘキサンと水の混合溶媒で抽出し、層分離する工程、
(3) (2)で得られる水層を酢酸エチルで抽出し、層分離する工程、及び
(4) (3)で得られる酢酸エチル抽出画分を吸着処理に供する工程
を有する方法により、下記一般式（２）で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドを調製し、
【００２８】
【化１８】
2005179304.tif 000010
【００２９】
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
Ｂ.  次いで、当該フェニルプロパノイド縮合型イリドイドに薬学的に許容される担体または添加剤を配合する工程、
を有する項４または５に記載する抗マラリア組成物の調製方法。
項８．  一般式（２）：
【００３０】
【化１９】
2005179304.tif 000011
【００３１】
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、Ｒ4は水素原子、低級アルコキシ基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドを含むMorinda morindoidesの溶媒抽出物を有効成分とする抗マラリア組成物。
項９．  上記Morinda morindoidesの溶媒抽出物が、
(1) Morinda morindoidesの葉を低級アルコールで抽出する工程、
(2) (1)で得られる低級アルコール抽出物をｎ−ヘキサンと水の混合溶媒で抽出し、層分離する工程、及び
(3) (2)で得られる水層を酢酸エチルで抽出し、層分離する工程、
で得られる酢酸エチル抽出画分である、項８に記載する抗マラリア組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（１）新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド及びその製造方法
本発明は、下式（１）で示される構造を有する新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイドを提供する。
【００３３】
【化２０】
2005179304.tif 000012
【００３４】
当該新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）は、化学的に合成することもできるが、植物、具体的には中央アフリカの薬用植物であるMorinda morindoidesを原料として抽出単離することによって調製することもできる。
【００３５】
Morinda morindoidesは、古くから薬用植物として知られており、例えば葉の煎汁が熱、リウマチ及びマラリアなどの多くの疾患の改善や治療に有効であることが知られている（非特許文献２等参照）。しかしながら、Morinda morindoidesに含まれるどの成分が抗マラリア活性を有するのか、未だ知られておらず、上記フェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）の存在も知られていない。
【００３６】
Morinda morindoidesからフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）を単離調製する場合、原料として使用するMorinda morindoidesは、全草であってもまたその一部であってもよい。好ましくは葉または葉を含む部分である。
【００３７】
当該フェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）の調製は、制限はされないが、例えば、(1) Morinda morindoidesの全草またはその一部（好ましくは葉または葉を含む部分）を、有機溶媒を含む溶媒で抽出処理する工程、及び(2)当該工程で得られる抽出画分を吸着処理する工程を経て行うことができる。
【００３８】
Morinda morindoidesの抽出処理は、抽出溶媒中に、生または乾燥処理したMorinda morindoidesの全草またはその一部（好ましくは、葉）の粗末又は細切物を、低温、加温または煮沸条件下で浸漬する方法；低温、加温または煮沸条件下で攪拌しながら抽出を行う方法；またはパーコレーション法等によって行うことができる。かかる抽出に用いられる抽出溶媒としては、特に制限されないが、水、低級アルコール、またはこれらの混合物を挙げることができる。好ましくは低級アルコールである。ここで低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、及びブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコールを例示することができる。
【００３９】
なお、抽出処理は、上記方法によって得られた抽出物について、さらに同一または異なる抽出溶媒を用いて、１回若しくは複数回繰り返し行うこともできる。例えば、上記の抽出処理で得られた抽出画分を、さらに水と非極性有機溶媒との混合液を抽出溶媒として用いて、抽出処理する方法を挙げることができる。ここで非極性有機溶媒としては、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、ジクロロメタン等を挙げることができる。
【００４０】
より具体的な抽出方法としては、実施例で示すように、(a) Morinda morindoidesの全草またはその一部（好ましくは、葉）を、低級アルコールで抽出し、(b) 得られたアルコール抽出物を水とｎ−ヘキサンの混合溶媒で抽出した後、層分離し、さらに(c) 得られた水層画分を水と酢酸エチルの混合溶媒で抽出し、次いで層分離し、酢酸エチル抽出画分を分取する方法を挙げることができる。
【００４１】
得られた抽出画分は、必要に応じて濾過、共沈または遠心分離によって固形物を除去した後、そのまま若しくは濃縮して、次の処理工程に供することができる。
【００４２】
吸着処理は、当業界における常法に従って行うことができる。例えば活性炭、シリカゲルまたは多孔質セラミックなどによる吸着処理；スチレン系のデュオライトS-861（商標「Duolite」, U.S.A.ダイヤモンド・シャムロック社製、以下同じ）、デュオライトS-862、デュオライトS-863又はデュオライトS-866；芳香族系のセパビーズSP70（商標「セパビーズ」、三菱化学（株）製、以下同じ）、セパビーズSP700、セパビーズSP825；ダイアイオンHP10（商標「ダイアイオン」、三菱化学（株）製、以下同じ）、ダイアイオンHP20、ダイアイオンHP21、ダイアイオンHP40、及びダイアイオンHP50；あるいはアンバーライトXAD-4（商標「アンバーライト」、オルガノ製、以下同じ）、アンバーライトXAD-7、アンバーライトXAD-2000などの合成吸着樹脂を用いた吸着樹脂処理を挙げることができる。
【００４３】
かかる吸着処理において、Morinda morindoidesの抽出物またはその処理物を樹脂担体に供して、夾雑物を樹脂に吸着させて、フェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）を含む画分を溶出取得するか、またはフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）を樹脂に吸着させた後に、樹脂を洗浄して夾雑物を除去し、次いで適当な溶出液でフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）を樹脂から脱離溶出させる方法を採用することができる。また、ＨＰＬＣ等を用いてフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）のピーク画分を取得する方法も採用できる。さらに、必要に応じてイオン交換処理や晶析処理などを行うこともできる。なお、フェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）の調製方法の詳細は、後述する実施例の記載が参照できる。
【００４４】
斯くして得られる、フェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）は、後述する実施例で示すように、抗マラリア活性を有し、また細胞毒性が低いため、抗マラリア医薬組成物の有効成分として有効に利用することができる。なお、本発明のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（１）には、上記構造式で包括的に示される構造異性体のいずれもが包含される。
【００４５】
（２）抗マラリア組成物
本発明は、また下記の一般式（２）：
【００４６】
【化２１】
2005179304.tif 000013
【００４７】
（式中、Ｒ1は水酸基、低級アルキルアミノ基または低級アルコキシ基を示し、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、同一または異なって、水素原子、低級アルキル基、アシル基、低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基を示し、またＲ4は水素原子、低級アルキル基、−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7[以上、Ｒ7は低級アルキル基である]を示す。また、Ａはシングルボンドまたはダブルボンドであって、Ａがシングルボンドである場合は、Ｒ6は水酸基または低級アルコキシ基であり、ダブルボンドである場合は、Ｒ6は酸素原子を示す。）
で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗マラリア組成物に関する。
【００４８】
ここで、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5で示される低級アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖状または分枝状のアルキル基を意味する。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、第三級ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、及びｎ−ヘキシル基を挙げることができる。好ましくは、メチル基、及びエチル基である。
【００４９】
Ｒ1で示される低級アルキルアミノ基；Ｒ1及びＲ4で示される低級アルコキシ基；Ｒ2、Ｒ3またはＲ5で示される低級アルキルカルバモイル基または低級アルコキシカルボニル基において用いられる低級アルキル基としても上記のものを挙げることができる。
【００５０】
ここで低級アルキルアミノ基として、具体的にはメチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、sec−ブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、及びｎ−ヘキシルアミノ基を挙げることができる。好ましくはメチルアミノ基、及びエチルアミノ基である。
【００５１】
低級アルコキシ基として、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、sec−ブトキシ基、ｎ−ペントキシ基、イソペントキシ基、及びｎ−ヘキソシキ基を挙げることができる。好ましくはメトキシ基、及びエトキシ基である。
【００５２】
低級アルキルカルバモイル基として、具体的にはメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ｎ−プロピルカルバモイル基、イソプロピルカルバモイル基、ｎ−ブチルカルバモイル基、イソブチルカルバモイル基、sec−ブチルカルバモイル基、ｎ−ペンチルカルバモイル基、イソペンチルカルバモイル基、及びｎ−ヘキシルカルバモイル基を挙げることができる。好ましくはメチルカルバモイル基、及びエチルカルバモイル基である。
【００５３】
低級アルキルカルボニル基として、具体的にはメチルカルボニル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、イソプロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、イソブチルカルボニル基、sec−ブチルカルボニル基、ｎ−ペンチルカルボニル基、イソペンチルカルボニル基、及びｎ−ヘキシルカルボニル基を挙げることができる。好ましくはメチルカルボニル基、及びエチルカルボニル基である。
【００５４】
Ｒ4で示される−ＯＣＯＲ7、−ＯＣＯＮＨＲ7、またはＯＣＯＯＲ7において用いられる低級アルキル基（Ｒ7）としても上記のものを挙げることができる。好ましくは、メチル基及びエチル基である。
【００５５】
また、Ｒ2で示されるアシル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、及びヘキサノイル基を挙げることができる。好ましくは、アセチル基及びプロピオニル基を挙げることができる。
【００５６】
Ｒ1は、好ましくは水酸基または低級アルコキシ基であり、より好ましくは低級アルコキシ基；Ｒ2は好ましくは水素原子及びアシル基；Ｒ3は好ましくは水素原子及びアシル基、より好ましくは水素原子；Ｒ4は好ましくは水素原子及びアルコキシ基；Ｒ5は好ましくは水素原子及びアシル基、より好ましくは水素原子である。Ｒ6は、好ましくはＡがシングルボンドの場合は水酸基であり、Ａがダブルボンドの場合は酸素原子である。
【００５７】
なお、本発明の抗マラリア組成物の有効成分として用いられるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドには、上記一般式（２）に包括的に含まれる構造異性体も含まれる。
【００５８】
上記一般式（２）で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドに含まれる具体的な化合物としては、下式（１）、（３）、（４）、（５）、及び（６）で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイドを挙げることができる。
【００５９】
【化２２】
2005179304.tif 000014
【００６０】
【化２３】
2005179304.tif 000015
【００６１】
【化２４】
2005179304.tif 000016
【００６２】
【化２５】
2005179304.tif 000017
【００６３】
【化２６】
2005179304.tif 000018
【００６４】
式（１）で示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（ＭＭ−２）の調製方法は、前述の通りである。式（３）〜（６）でそれぞれ示されるフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（ＭＭ−１、ＭＭ−３、ＭＭ−４、及びＭＭ−５）も同様にして、Morinda morindoidesの全草またはその一部（好ましくは葉または葉を含む部分）から調製することができる。これらの調製方法は、後述する実施例に詳細に記載されており、これを参考にすることができる。
【００６５】
なお、式（１）及び式（３）〜（６）で示されるＭＭ−１、ＭＭ−２、ＭＭ−３、ＭＭ−４、及びＭＭ−５以外の本発明のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド（２）は、ＭＭ−１、ＭＭ−２、ＭＭ−３、ＭＭ−４またはＭＭ−５を出発原料として、当業界の技術常識に従って調製することができる。
【００６６】
一例として、ＭＭ−４を出発原料として、Ｒ1，Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7として各種の官能基を含む一般式（２）のフェニルプロパノイド縮合型イリドイドを合成する方法を、下記反応式Ｉ、II、III、及び反応式IVに例示する。なお、一般式（２）に含まれるその他のフェニルプロパノイド縮合型イリドイドも、ＭＭ−１、ＭＭ−２、ＭＭ−３、またはＭＭ−５を出発原料として、これに準じて同様に合成することができる。
【００６７】
【化２７】
2005179304.tif 000019
【００６８】
ここで、ＭＭ−４を出発原料として、下記の反応(1)並びに(2)を行うことにより、それぞれＭＭ−４のカルボン酸(a)、並びにＭＭ−４のエステル体(b)、及びアミド体(c)を合成することができる。
【００６９】
(1) ＭＭ−４を１０％ ＫＯＨのメタノール溶液に溶解し、室温で３０分攪拌する。反応液の液性をｐＨ３にして、抽出操作を行い、カルボン酸(a)を得る。
【００７０】
(2) (1)で生成したカルボン酸(a)と低級アルコール(Ｒ8ＯＨ、Ｒ8は低級アルキル基[定義は前述の通り、以下同じ])、あるいは低級アルキルアミン(Ｒ8ＮＨ2、Ｒ8は低級アルキル基)をジクロロメタンに溶解し、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）及びＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）を加えて、室温で３時間攪拌する。次いで、抽出操作によりＭＭ−４のエステル体(b)、またはアミド体(c)を得る。
【００７１】
【化２８】
2005179304.tif 000020
【００７２】
ここで、ＭＭ−４を出発原料として、下記の反応(3)並びに(4)を行うことにより、それぞれＭＭ−４の13位カルボニル体(d)、並びにＭＭ−４の13位アルコキシ(e)を合成することができる。
【００７３】
(3) ＭＭ−４を1,4-ジオキサンに溶解し、ＤＤＱ（2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン）を加えて室温で２時間攪拌し、次いで抽出操作をすることにより、ＭＭ−４の13位カルボニル体(d)を得る。
【００７４】
(4) ＭＭ−４をジクロロメタンに溶解し、Ｅｔ3Ｎを加えて室温で30分間攪拌した後、Ｒ8-Ｂｒ (Ｒ8は低級アルキル基)を加えて、さらに１時間攪拌した。反応液から抽出操作によって、ＭＭ−４の13位アルコキシ(e)を得る。
【００７５】
【化２９】
2005179304.tif 000021
【００７６】
ここで、ＭＭ−４を出発原料として、下記の反応(5)〜(7)を行うことにより、それぞれＭＭ−４の6''-アシル体(f)、ＭＭ−４のアルキリデン体(g)、ＭＭ−４の6''-カーボネート体(h)及び6''-カーバメート体(i)を合成することができる。
(5)  ＭＭ−４をピリジンに溶解し、酸無水物〔(Ｒ8ＣＯ)2Ｏ、Ｒ8は低級アルキル基〕を加えて０℃で、３０分間攪拌する。次いで抽出操作によりＭＭ−４の6''-アシル体(f)を得る。
(6)  ＭＭ−４をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解し、これにアルデヒド(Ｒ8ＣＨＯ、Ｒ8は低級アルキル基)と触媒量のＴｓＯＨ（パラトルエンスルホン酸）を加えて室温で１時間攪拌する。次いで、抽出操作によりＭＭ−４のアルキリデン体(g)を得る。
(7)  ＭＭ−４をピリジンに溶解し、Ｒ8ＣＯＣｌ (Ｒ8は低級アルキル基) あるいはイソシアネート(Ｒ8-Ｎ=Ｃ=Ｏ、Ｒ8は低級アルキル基)を加えて室温で３０分間攪拌する。次いで、抽出操作によりＭＭ−４の6''-カーボネート体(h)または3',4'-カーバメート体（i）を得る。
【００７７】
【化３０】
2005179304.tif 000022
【００７８】
ここで、ＭＭ−４を出発原料として、下記の反応(8)〜(11)を行うことにより、それぞれＭＭ−４のカテコール体(j)、3',4'-ジアシル体(k)、3',4'-カーボネート体(l)、3',4'-カーバメート体(m)、及び3',4'-アルコキシ体(n)を合成することができる。
(8)  ＭＭ−４をジクロロメタンに溶解し−７８℃でＢＢｒ3を加え、０℃で１時間攪拌する。次いで抽出操作によりＭＭ−４のカテコール体(j)を得る。
(9)  (8)で生成したカテコール体(j)をピリジンに溶解し、酸無水物〔(Ｒ8ＣＯ)2Ｏ、Ｒ8は低級アルキル基〕を加えて、０℃で３０分間攪拌する。次いで抽出操作により、ＭＭ−４の3',4'-ジアシル体(k)を得る。
(10) (8)で生成したカテコール体(j)をピリジンに溶解し、Ｒ8ＣＯＣｌ (Ｒ8は低級アルキル基) あるいはイソシアネート(Ｒ8-Ｎ=Ｃ=Ｏ、Ｒ8は低級アルキル基)を加えて室温で３０分間攪拌する。次いで抽出操作によりＭＭ−４の3',4'-カーボネート体(l)または3',4'-カーバメート体(m)を得る。
(11) (8)で生成したカテコール体をジクロロメタンに溶解し、ＮａＨを加え、０℃で３０分間攪拌した後、Ｒ8-Ｂｒ (Ｒ8は低級アルキル基)を加えて室温で１時間攪拌する。次いで、反応液から抽出操作によってＭＭ−４の3',4'-アルコキシ体(n)を得る。
【００７９】
本発明の抗マラリア組成物は、上記一般式（２）で示される一連のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド、特に式（１）及び式（３）〜（６）で示されるＭＭ−１、ＭＭ−２、ＭＭ−３、ＭＭ−４、及びＭＭ−５の他、これらの薬学的に許容される塩を有効成分とすることもできる。ここで薬学的に許容される塩としては、特に制限されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、またはリン酸などの無機酸との付加塩；酢酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との付加塩が挙げられる。
【００８０】
なお、本発明の抗マラリア組成物は、本発明の効果を損なわない限り、配合する有効成分の精製度を特に問うものではない。従って、上記一般式（２）で示される一連のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド、特に式（１）及び式（３）〜（６）で示されるＭＭ−１、ＭＭ−２、ＭＭ−３、ＭＭ−４、及びＭＭ−５、またはこれらの薬学的に許容される塩を粗精製物として含むものであってもよい。かかる粗精製物としては、前述するMorinda morindoidesの全草またはその一部（好ましくは葉または葉を含む部分）から調製される、これらのフェニルプロパノイド縮合型イリドイドを含む抽出画分を挙げることができる。
【００８１】
また、本発明の抗マラリア組成物には、本発明の効果を損なわない限り、他の公知または将来開発される抗マラリア薬を組み合わせて配合することも特に制限されない。
【００８２】
本発明の抗マラリア組成物は、上記有効成分に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤が配合されていてもよく、上記有効成分をそのまま又は上記担体若しくは添加剤とともに、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、エマルジョンまたはシロップ剤等の経口剤の形態；注射剤、点滴剤、坐剤などの非経口剤の形態に調製することができる。かかる経口剤は、通常、有効成分に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を適宜組み合わせて配合した後、常法に従って、上記各種形態に調製することができる。
【００８３】
また、注射剤や点滴剤などを調製する場合は、有効成分に必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加して、必要ならば凍結乾燥を行って、常法により皮下、筋肉、静脈内・腹腔内用注射剤、点滴剤として調製することができる。
【００８４】
さらに、これらの製剤には、上記成分の他に香料、界面活性剤、無痛化剤、安定剤などの成分を配合することもできる。
【００８５】
本発明の抗マラリア組成物の投与量は、症状の程度や患者の体重や年齢などによっても異なるが、例えば経口用製剤として人に投与する場合、フェニルプロパノイド縮合型イリドイドの量として１０〜２０mg／kgを１日１回〜数回にわけて投与することができる。
【実施例】
【００８６】
以下に、本発明の構成ならびに効果をより明確にするために、製造例、実施例、比較例及び実験例を記載する。但し、本発明は、これらの実施例等に何ら影響されるものではない。
【００８７】
実施例１
Ａ．検体の調製
（１）メタノール抽出
乾燥したMorinda morindoidesの葉部の粉砕物600ｇにメタノール４Ｌを加えて、室温で３時間抽出した。その後、これを濾過して濾液を回収した。一方、得られた残査にメタノール４Ｌを加え加熱還流下で２時間抽出し、その後濾過して濾液を採取した。この加熱還流抽出を、ここで得られた残渣に再度行い、回収した全ての濾液を集めて濃縮し、15ｇの固体（以下「メタノール抽出物」と呼ぶ）を得た。
【００８８】
（２）ｎ-ヘキサン／Ｈ2Ｏ処理
（１）で得られたメタノール抽出物のうち8.12 gを、n-ヘキサン／Ｈ2Ｏの700 mL／700 mL混合液（1000mL）に加え、良く攪拌し、両層に分配溶解させた。次いで層分離により、水層とn-ヘキサン層とに分別回収した。回収したn-ヘキサン層を完全乾固して1.69 gの固体（以下「n-ヘキサン抽出物」と呼ぶ）を得た。
【００８９】
（３）酢酸エチルによる抽出
一方、（２）の層分離によって回収した水層側に、酢酸エチル500mLを加え、良く攪拌し、両層に分配溶解させた。層分離により、水層と酢酸エチル層とに分別回収した。回収した水層側に、更に酢酸エチル500mLを加え、再び良く攪拌し、両層に分配溶解し、層分離を行い、得られた水層と酢酸エチル層を、先に回収しておいた水層と酢酸エチル層の画分にそれぞれ合わせた。一緒にした酢酸エチル層を絶乾して1.27 gの固体（以下「酢酸エチル抽出物」と呼ぶ）を得た。
【００９０】
（４）n-ブタノールによる抽出
上記（３）の層分離で回収取得した水層に、n-ブタノール350 mLを加えよく振盪した後、層分離を行い、水層とn-ブタノール層とに分別回収した。回収した水層側に、更にn-ブタノール350 mLを加えよく振盪した後、層分離を行った。得られたn-ブタノール層を回収し、先に回収しておいたn-ブタノール層と一緒にして、絶乾し、1.66 gの固体（以下「n-ブタノール抽出物」と呼ぶ）を得た。また、水層も同様に、先に回収しておいた水層と一緒にして絶乾して、5.5 gの固体（以下「水抽出物」と呼ぶ）を得た。
【００９１】
Ｂ．各検体の抗マラリア活性の測定
（１）〜（４）で調製した各抽出物（検体）の抗マラリア活性を評価するために、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）Honduras-1株〔米国ダートマス医科大学(Department of Microbiology Dartmouth Medical School Lebanon, NH03756, USA)、クロロキン感受性〕を用いて、マラリア原虫の生育阻害率を測定した。
【００９２】
培地は、RPMI1640（GIBCOBRL）粉末10.4ｇを蒸留水1Lに溶解し、炭酸水素ナトリウム2ｇを加え、２〜３時間攪拌後、ｐＨを7.4に調整し、吸引濾過後、HEPES緩衝液25mL及び10mg/ml濃度のゲンタマイシン溶液1mLを加え、更に無菌ヒトＡ型血清100mLを加えて作成した。液体窒素より取り出したマラリア原虫はDiggsら（Diggs，C.L. et al., Am. J. Trop.Med. Hyg., 24, 760-766 (1975)）の方法に従って回収し、10％ヒトＡ型血清添加RPMI1640 5mLでヘマトクリット3％となるように、新鮮赤血球添加後、シャーレ（5mL）中で培養した。培養条件は、酸素5％、二酸化炭素5％、及び窒素90％の雰囲気下、37℃のインキュベーター内で培養した。
【００９３】
マラリア原虫の生育阻害率を測定する前に、マラリア原虫をring期に同調させるために、LambrosとVandenbergらの方法（Lambros,C., Vandenberg,J.P., J. Parasitol., 65, 418-420 (1979)）に従って、上記マラリア原虫を細胞ペレット容積の5倍容積の5％ソルビトールに10分間暴露した。その後、RPMI1640で洗浄し、上記培地を用いて再培養した。このマラリア原虫の培養液を50 μL 96穴のプレートに注入した。この培養液のヘマトクリット値は2％であり、感染率は0.5％である。
【００９４】
マラリア原虫の生育阻害率の測定は、具体的には下記のようにして行った。
各検体（上記抽出物）をDMSOに溶解し、上記培地を用いて適切な濃度に希釈して被験試料とした（DMSO最終濃度1％）。この被験試料50 μLを、先にマラリア原虫の培養液（50 μL）を添加しておいた96穴プレートに添加した（合計100 μL）。混合液中のDMSOの終濃度は1％である。これを37℃で、72時間培養した。その後、スライドグラス上でスメアフィルムを作成し、これをGiemsa染色液で染色して、顕微鏡下で10000個の赤血球のうち感染した赤血球数を求めた。上記被験試料に代えてDMSOと培地で調整した溶液（50 μL、DMSO最終濃度1％）を添加して同様に試験した場合のマラリア原虫の感染率（対照感染率）と、検体存在下でのマラリア原虫の感染率（検体存在下での感染率）から、下式に従ってマラリア原虫の生育阻害率を算出した。なお、陽性対照薬としてはキニーネを使用した。なお、被験試料は最終濃度として1μg/mL、5μg/mLとなるように希釈して使用した。
【００９５】
マラリア原虫の生育阻害率（％）
＝（対照感染率 − 検体存在下での感染率）／対照感染率 × 100。
【００９６】
Ｃ．各検体（各抽出物）の毒性評価
上記（１）〜（４）で調製した各検体（各抽出物）について、細胞毒性を評価するために、MTT法（M.C.Alley,et al.,"Feasibility of Drug Screening with Panels of Human Tumor Cell Lines Using a Microculture Tetrazolium Assay", Cancer Res., 48, 589 (1988))に従って、ヒトのガン細胞KB3-1の生育阻害率％を測定した。
【００９７】
まず、上記検体（上記抽出物、乾固物）をDMSOに溶解し、培地（10% fetal bovine serum含有RPMI1640培地）を用いて適切な濃度（5μg/mL、50μg/mL）に希釈して被験試料とした（DMSO最終濃度1％）。この被験試料100 μLを、KB3-1細胞の浮遊液100 μL (2 x 104個/mL)に添加して、5％CO2下、37℃の条件下で培養した。
【００９８】
培養72時間後、MTT試薬（3-(4,5)-dimethylthiazo-2,5-dimethyltetrazolium bromide）25 μLを添加し、さらに3時間培養した。次いで、培地のみを吸引除去し、DMSO 200μLを加えて、生成したMTT folmazanを抽出し、その色素量を比色定量法(540 nm)によって定量した。生成した色素量から生存細胞数を算出した。被験試料（100 μL）に代えてDMSOと培地から調製した溶液（100 μL、DMSO最終濃度1％）を添加して試験した場合の生成色素量（対照色素生成量）と、検体存在下での生成色素量（検体存在下色素量）から、下式に従って被験試料存在下での生育阻害率％を求めて、各検体（抽出物）の細胞毒性を評価した。なお、陽性対照としてコルヒチンを用いた。
【００９９】
生育阻害率（％）＝（対照色素量−検体存在下色素量）／対照色素量 x 100。
【０１００】
結果を表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2005179304.tif 000023
【０１０２】
この結果、特に１μg/mL濃度の各抽出物のマラリア原虫の生育阻害率 (%)の結果から、酢酸エチル抽出物（1μg/mL）に比較的高い抗マラリア活性があることがわかった。
【０１０３】
なお、陽性対照試験として行ったキニーネのマラリア原虫に対する生育阻害率 (%)は、0.1μg/mLで83.1％、0.033μg/mLで35.0％であった。陽性対照試験として行ったコルヒチンのKB3-1細胞に対する生育阻害率 (%)は、5 ng/mLで42.2％であった。
【０１０４】
実施例２
（１）精製画分の取得
実施例１で得られたMorinda morindoides（葉部）の酢酸エチル抽出物1.26 gをシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別精製した。具体的には、酢酸エチル抽出物1.26 gをCHCl3:MeOH=96 : 4に溶解し、これをSiO2 (30g)を充填し、予め溶媒（CHCl3:MeOH=96 : 4）で平衡化しておいたガラスカラム（内径30mm、長さ10cm）に吸着させ、溶出溶媒としてクロロホルムとメタノールの混合液（CHCl3:MeOH=96:4）を100ｍL通導して、画分Ａ (62.4 mg[乾固物重量、以下同じ]、収率4.95％)を得た。さらに、クロロホルムとメタノールとの混合比を変えた溶出溶媒をカラムに通導して、画分Ｂ (溶出溶媒[CHCl3:MeOH=10:1]、77.6 mg、収率6.16％)、画分Ｃ (溶出溶媒[CHCl3:MeOH=10:1]、213.7 mg、収率17.0％）、画分Ｄ (溶出溶媒[CHCl3:MeOH=7:1]、182.4 mg、収率14.5％)、画分Ｅ (溶出溶媒[CHCl3:MeOH=7:3]、242.2 mg、収率19.2％)、及び画分Ｆ (溶出溶媒[MeOH]、134.1 mg、収率10.6%)をそれぞれ得た。
【０１０５】
（２）画分Ａ〜Ｆの抗マラリア活性と毒性
画分Ａ〜Ｆの抗マラリア活性と毒性を、実施例１と同様の方法に従ってマラリア原虫の生育阻害率(％)及びKB3-1細胞の生育阻害率(％)に基づいて評価した。結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
2005179304.tif 000024
【０１０７】
この結果、特に１μg/mL濃度の各抽出物のマラリア原虫の生育阻害率 (%)の結果から、画分Ｃ、Ｄ及びＥに、比較的高い抗マラリア活性があることがわかった。
【０１０８】
なお、陽性対照試験として行ったキニーネのマラリア原虫に対する生育阻害率 (%)は、0.1μg/mLで91.8％、0.033μg/mLで52.4％であった。陽性対照試験として行ったコルヒチンのKB3-1細胞に対する生育阻害率 (%)は、5 ng/mLで49.7％であった。
【０１０９】
実施例３    画分Ｃ
（１）画分Ｃの精製
実施例２で得られた画分Ｃ (40.1 mg) を、シリカゲルＨＰＬＣを用いてさらに精製を行った。具体的には、画分Ｃ（40.1 mg）をEtOAc:EtOH=15:1に溶解した後、下記の条件のＨＰＬＣに供した。
【０１１０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：cosmosil 5SL-II 10 mm i.d. x 250 mm（ナカライテスク社製）
移動相：EtOAc:EtOH=15:1
流速：3.0 mL/min
検出器：UV 250 nm。
【０１１１】
その結果、２つのピーク（Rt .9.0 minとRt. 10.0 min）が検出された。各ピーク画分を分取して、最初のピーク画分を画分MM-1 (12.5 mg、収率31.2％)として、また２番目のピーク画分を画分MM-2 (10.1 mg、収率25.2％)として取得した。
【０１１２】
（２）画分MM-1、及びMM-2の同定
上記で得られた画分MM-1及び画分MM-2について、1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSの測定を行い、化合物を同定した。
【０１１３】
（2-1）画分MM-1
画分MM-1について得られた1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSのデータ結果を下記に示す。
・1H NMR (500 MHz, CD3OD) d: 7.51 (1H, brs, 3), 7.35 (1H, brs, 10), 7.27 (2H, d, J = ca. 7.9 Hz, 3', 5'), 6.78 (2H, d, J = 7.9 Hz, 2', 6'), 6.47 (1H, dd, J = 5.5, 2.4 Hz, 6) 5.59 (1H, dd, J = 5.5, 1.8 Hz, 7), 5.35 (1H, brs 13), 4.99 (1H, d, J = 4.9 Hz, 1), 4.62 (1H, dd, J = 7.9, 1.8 Hz, 1''), 4.24 (1H, brd, J = 12.2, 6"a), 4.21 (1H, dd, J = 12.2, 6.1, 6"b), 3.88 (1H, dd like, J = 7.9, 1.2 Hz, 5), 3.74 (3H, s, COOMe), 3.44-3.47 (1H, m, 5"), 3.38(1H, dd, J = 9.2, 8.5, 3"), 3.35 (1H, m, 4"), 3.18 (1H, dd, J = 9.2, 7.9, 2"), 2.93 (1H, dd, J = 7.9, 4.9 Hz, 9), 1.86 (3H s, 6"-CH3CO).
・13C NMR (125 MHz, CD3OD) dc:172.6 (6"-COCH3), 172.1 (12), 168.1 (14), 158.4 (4'), 152.2 (3), 149.8 (10), 141.2 (6), 138.1 (11), 133.2 (1'), 129.9 (7), 129.4 (3', 5'), 116.2 (2', 6'), 111.0 (4), 100.5 (1"), 97.8 (8), 94.3 (1), 77.6(3"), 75.6 (5"), 74.2 (2"), 71.4 (4"), 69.7 (13), 64.6 (6"), 52.0 (COOMe), 51.0 (9), 39.9 (5), 20.7 (6"-CH3COO). 
・FAB-MS: 589 (M-H)- 。
【０１１４】
この結果と文献報告値（J. Nat. Prod. 2003, 66, 97-102）とを比較して、画分ＭＭ−１は次の構造を有する化合物であると判定した。
【０１１５】
【化３１】
2005179304.tif 000025
【０１１６】
（式中、Ａｃはアセチル基（−COCH3）を、Ｍｅはメチル基（−CH3）を意味する。）
（2-2）画分MM-2
画分MM-2について得られた1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSのデータ結果は下記の通りである。
・1H NMR (500 MHz, CD3OD) d: 7.51 (1H, brs, 3), 7.28 (1H, brs, 10), 7.01 (1H, brs, 2'), 6.89 (1H, d, J = 8.6 Hz, 6'), 6.79 (1H, d, J = 7.9 Hz, 5'), 6.48 (1H, dd, J = 5.5, 2.4 Hz, 6), 5.59 (1H, dd, J = 5.5, 1.8 Hz, 7), 5.35 (1H, brs, 13), 4.97 (1H, d, J = 3.1 Hz, 1), 4.54 (1H, d, J = 7.9 Hz, 1''), 4.20 (1H, dd, J = 12.2, 6.1 Hz, 6''a), 4.15 (1H, brd, J = 12.2 Hz, 6''b), 3.89(3H, s, 3'-OMe), 3.86 (1H, brd, J = 7.9 Hz, 5), 3.74 (3H, s, COOMe), 3.12-3.43 (4H, m, 2'', 3'', 4'', 5''), 2.98 (1H, dd, J = 7.9, 3.6 Hz, 9)。
・13C NMR (125 MHz, CD3OD) dc: 172.3 (12), 152.1 (3), 149.8 (10), 149.1 (3'), 147.7 (4'), 140.7 (6), 138.3 (11), 134.0 (1'), 130.3 (7), 121.3 (6'), 116.2 (5'), 111.5 (4), 111.6 (2'), 100.4 (1''), 97.8 (8), 94.0 (1), 77.7 (3''), 75.6 (5''), 74.2 (2''), 71.4 (4''), 70.0 (13), 64.6 (6''), 56.7 (3''-OMe), 52.0 (COOMe), 51.0 (9), 39.4 (5). 
・FAB-MS: 619 (M-H)- 。
【０１１７】
以上のデータより、ＭＭ−２は次の構造を有する新規化合物と判定した。
【０１１８】
【化３２】
2005179304.tif 000026
【０１１９】
（式中、Ａｃはアセチル基（−COCH3）を、Ｍｅはメチル基（−CH3）を意味する。）
実施例４    画分Ｄ
（１）画分Ｄの精製
実施例２で得られた画分Ｄ (25.2mg) を、シリカゲルＨＰＬＣを用いてさらに精製を行った。具体的には、画分Ｄ（25.2 mg）をEtOAc:EtOH=10:1に溶解した後、下記の条件のＨＰＬＣに供した。
【０１２０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：cosmosil 5SL-II 10 mm i.d. x 250 mm（ナカライテスク社製）
移動相：EtOAc:EtOH=10:1
流速：3.0 mL/min
検出器：UV 250 nm。
【０１２１】
その結果、２つのピーク（Rt. 8.9 minとRt. 9.9 min）が検出された。各ピーク画分を分取して、最初のピーク画分を画分MM-3 (4.5mg、収率17.9％)として、また２番目のピーク画分を画分MM-4 (12.4 mg、収率49.2％)として取得した。
【０１２２】
（２）画分MM-3、及びMM-4の同定
上記で得られた画分MM-3及び画分MM-4について、1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSの測定を行い、化合物を同定した。
（2-1）画分MM-3
画分MM-3について得られた1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSのデータ結果を下記に示す。
・1H NMR (500 MHz, CD3OD) d : 7.51 (1H, d, J = 1.4 Hz, 3), 7.44 (1H, d, J = 1.2 Hz, 10), 7.27 (2H,  d, J = 8.5 Hz, 3', 5'), 6.77 (2H, d, J = 8.5 Hz, 2', 6'), 6.46 (1H, dd, J = 5.7, 2.4 Hz, 6), 5.56 (1H, dd, J = 5.7, 2.2 Hz, 7), 5.35 (1H, brs 13), 5.14 (1H, d, J = 4.9 Hz, 1), 4.66 (1H, d, J = 7.9 Hz, 1"), 3.90 (1H,  brdd, J = 7.7, 1.8 Hz, 5), 3.78 (1H, dd, J = 12.2, 2.0 Hz, 6"a), 3.74 (3H, s, COOMe), 3.68 (1H, dd, J = 12.2, 2.0 Hz, 6"b), 3.36-3.38 (2H, m, 3", 4"), 3.27 (1H, m, 5"), 3.20 (1H, t-like, J = 7.9 Hz, 2"), 2.90 (1H, dd, J = 7.7, 4.9 Hz, 9).
・13C NMR (125 MHz, CD3OD) dc:172.2 (12), 168.3 (14), 158.4 (4'), 152.5 (3), 150.0 (10), 141.6 (6), 137.8 (11), 133.3 (1'), 129.9 (7), 129.7 (3', 5'), 116.2 (2', 6'), 110.7 (4), 100.5 (1"), 97.9 (8), 94.4 (1), 78.3 (5"), 77.8(3"), 74.4 (2"), 70.8 (4"), 69.8 (13), 62.1 (6"), 52.0 (COOMe), 50.7 (9), 40.3 (5). 
・FAB-MS: 547 (M-H)- 。
【０１２３】
以上のデータと文献報告値とを比較して、画分ＭＭ−３は次の構造を有する化合物であると判定した。
【０１２４】
【化３３】
2005179304.tif 000027
【０１２５】
（式中、Ｍｅはメチル基（−CH3）を意味する。）
（2-2）画分MM-4
画分MM-4について得られた1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSのデータ結果を以下に示す。
・1H NMR (500 MHz, CD3OD) d: 7.50 (1H, d, J = 1.4 Hz, 3), 7.32 (1H, brs, 10), 7.00 (1H, d, J = 1.4 Hz, 2'), 6.90 (1H, dd, J = 8.1, 1.6 Hz, 6'), 6.78 (1H, d, J = 8.1 Hz, 5'), 6.47 (1H, dd, J = 5.5, 2.6 Hz, 6), 5.56 (1H, dd, J = 5.5, 1.6 Hz, 7), 5.36 (1H, brs 13), 5.12 (1H, d, J = 3.7 Hz, 1), 4.57 (1H, d, J = 7.9 Hz, 1"), 3.90 (1H, m, 5), 3.88 (3H, s, 3'-OMe), 3.74 (3H, s, COOMe), 3.71 (1H, dd, J = 12.2, 2.2 Hz, 6"a), 3.66 (1H, dd, J = 12.2, 4.5 Hz, 6"b), 3.33-3.35 (2H, m, 3", 4"), 3.21 (1H, m, 5"), 3.14 (1H, dd, J = 7.9, 9.2 Hz, 2"), 2.97 (1H, dd, J = 7.9, 3.7 Hz, 9).
・13C NMR (125 MHz, CD3OD) dc:172.2 (12), 168.3 (14), 151.9 (3), 149.6(10), 148.9 (3'), 147.5 (4'), 140.7 (6), 138.1 (11), 133.8 (1'), 130.1 (7), 121.1(6'), 115.9 (5'), 111.4 (2'), 111.3 (4), 99.9 (1"), 97.8 (8), 93.6 (1), 78.1 (5"), 77.7(3"), 74.3 (2"), 70.6 (4"), 69.9 (13), 61.9 (6"), 56.4 (3'-OMe), 51.8 (COOMe), 50.7 (9), 40.0 (5). 
・FAB-MS: 577 (M-H)- 。
【０１２６】
上記のデータ結果と文献報告値（J. Nat. Prod. 2003, 66, 97-102.）とを比較して、画分MM-4は次の構造を有する化合物である判定した。
【０１２７】
【化３４】
2005179304.tif 000028
【０１２８】
（式中、Ｍｅはメチル基（−CH3）を意味する。）
実施例５    画分Ｅ
（１）画分Ｅの精製
実施例２で得られた画分Ｅ (240mg、乾固物重量) を、ＯＤＳカラム及びシリカゲルＨＰＬＣを用いてさらに精製を行った。具体的には、画分Ｅ（240mg）を水に溶解した後、予め水で平衡化させておいた、ＯＤＳ（8ｇ）充填ガラスカラム（内径20mm、長さ5cm）に通液して吸着させ、次いで、溶出溶媒として水を通導して画分Ｅ１（32.6mg[乾固物重量]、収率13.6％）を取得した。さらに溶出溶媒として含水メタノール溶液（MeOH:H2O=20:80）を通導して画分Ｅ２ (103.9mg[乾固物重量]、収率43.3％)を、次いでメタノールを通導して画分Ｅ３ (67.5mg[乾固物重量]、収率28.1％)をそれぞれ得た。
【０１２９】
さらに上記で得られた画分Ｅ２の濃縮乾固物（103.9 mg）のうち18.6 mgを、CH2Cl2:MeOH=9:1に溶解した後、下記の条件のシリカゲルＨＰＬＣに供した。
【０１３０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：  cosmosil 5SL-II（10 mm i.d. x 250 mm)、
移動相：  CH2Cl2:MeOH=9:1
流速  ：  3.0 mL/min
検出器：  UV 250 nm。
【０１３１】
その結果、１つのピーク（Rt 18.2 min）が検出された。このピーク画分を分離精製し、画分MM-5 (2.9 mg、収率15.6％)を得た。
【０１３２】
（２）画分MM-5の同定
上記で得られた画分MM-5について、1H-NMR、13C-NMRおよびFAB-MSの測定を行った。結果を下記に示す。
・1H NMR (500 MHz, CD3OD) d: 7.86 (1H, brs, 10), 7.51 (1H, d, J = 1.8 Hz, 3), 7.50 (1H, d, J = 1.8 Hz, 2'), 7.49 (1H, dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 6'), 6.90 (1H, d, J = ca. 8.5 Hz, 5'), 6.54 (1H, dd, J = 5.5, 2.4 Hz, 6), 5.67 (1H, dd, J = 5.5, 2.4 Hz, 7), 5.49 (1H, d, J = 4.9 Hz, 1), 4.65 (1H, d, J = 7.9 Hz, 1"), 3.99 (1H, dd, J = 7.9, 2.4 Hz, 5), 3.93 (3H, s, 3'-OMe), 3.80 (1H, dd, J = 12.2, 2.4 Hz, 6"a), 3.74 (3H, s, COOMe), 3.65-3.71 (1H, m, 6"b), 3.23-3.33 (3H, m, 3", 4", 5"), 3.15 (1H, dd, J = 9.2, 7.9, Hz, 2"), 3.09 (1H, dd, J = 7.9, 4.9Hz, 9).
・13C NMR (125 MHz, CD3OD) dc:188.5 (13), 169.9 (12), 168.3 (14), 159.1 (10), 155.5 (4'), 152.5 (3), 149.6 (3'), 142.4 (6), 131.6 (11), 129.1 (7), 129.1 (1'), 127.1(6'), 116.2 (5'), 112.7 (2'), 111.2 (4), 100.0 (1"), 97.8 (8), 94.0 (1), 78.7 (5"), 77.7(3"), 74.6 (2"), 71.7 (4"), 62.9 (6"), 56.5 (3'-OMe), 52.0 (COOMe), 51.4 (9), 40.6 (5).
・FAB-MS: 575 (M-H)-.
上記データ結果と文献報告値（J. Nat. Prod. 2003, 66, 97-102）とを比較して、画分MM-5は次の構造を有する化合物である判定した。
【０１３３】
【化３５】
2005179304.tif 000029
【０１３４】
（式中、Ｍｅはメチル基（−CH3）を意味する。）
実施例６    各化合物の抗マラリア活性
実施例３〜５で取得した各化合物について抗マラリア活性及び毒性を、実施例１に記載する方法に準じて評価した。具体的には、抗マラリア活性は、実施例３〜５で取得した各化合物について各種濃度の試料を作成し、実施例１に記載する方法に従って熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）Honduras-1株の生育阻害率を測定し、マラリア原虫の50％が致死する試料濃度をIC50として求めた。毒性は、実施例３〜５で取得した各化合物をそれぞれ150μMとなるように調整し、実施例１に記載する方法（MTT法）に従って、当該試料のヒトガン細胞KB3-1の生育阻害率％を求めた。結果を表３に示す。
【０１３５】
【表３】
2005179304.tif 000030
【０１３６】
なお、上記試験において、陽性対照試験として行ったキニーネのマラリア原虫に対する生育阻害率 (%)は、0.1μg/mLで90.1％、0.033μg/mLで49.1％であった。陽性対照試験として行ったコルヒチンのKB3-1細胞に対する生育阻害率 (%)は、5 ng/mLで49.0％であった。
【０１３７】
この結果から、いずれの化合物にも抗マラリア活性が認められ、特にMM-5及びMM-2はより高い抗マラリア活性を備えていた。さらに、細胞毒性の結果から、これらの化合物はいずれも毒性が低く比較的安全な化合物であることがわかる。すなわち、これらの化合物は、毒性の低い比較的安全な抗マラリア剤の有効成分となりえることがわかる。
【０１３８】
製剤例１
化合物ＭＭ−１ 200mg、乳糖3g、とうもろこし澱粉1.28g、ヒドロキシプロピルセルロース200mg、ステアリン酸マグネシウム20mgを、よく混合して造粒した後、打錠して、１錠あたり100mgの錠剤形態の、抗マラリア組成物とする。
【０１３９】
製剤例２〜５
製造例１の化合物ＭＭ−１ 200 mgに代えて、化合物ＭＭ−２ 20mg（製造例２）、化合物ＭＭ−３ 500 mg（製造例３）、化合物ＭＭ−４ 50mg（製造例４）または化合物ＭＭ−５ 10mg（製造例５）を用いて、製造例１と同様に、各成分をよく混合して造粒した後、打錠して、１錠あたり100mgの錠剤形態の、抗マラリア組成物とする。
【０１４０】
製剤例６
メタノール抽出物の画分1000 mg、乳糖2.5g、馬鈴薯澱粉1.75g、結晶セルロース240mg、及びステアリン酸マグネシウム10mgをよく混合し、この混合物をカプセルに充填し、１カプセル中メタノール抽出物を1000 mgの割合で含む錠剤形態の、抗マラリア組成物とする。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、文献未掲載の新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイド、及びその調製方法を提供する。当該新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイドは、抗マラリア活性を有しており、抗マラリア組成物の有効成分として有用である。また本発明によれは、当該新規フェニルプロパノイド縮合型イリドイドを含む一連のフェニルプロパノイド縮合型イリドイド化合物を有効成分とする新規な抗マラリア組成物を提供することができる。