(57)【要約】【課題】ラン科植物のエビネ属、ガンセキラン属又はその他の偽球茎を有する植物又は搾汁もしくは搾汁からの抽出物から、安全な皮膚外用剤を提供する。【解決手段】エビネを水洗、カッターで細切りした後、水又はアルコール類で抽出する。あるいは細片を圧搾して搾汁又は搾汁からの抽出液を得る。水もしくはアルコール抽出液又は搾汁もしくは搾汁からの抽出液から、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、分画溶出を繰り返し、カラントサイドＢ原液を得、この原液をβ―グルコシダーゼ酵素で分解して、２−チオール−３−ヒドロキシインドール、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール及び３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドールを得る。本発明は、これらの化合物に適宜補助的機能性栄養成分を加えて、育毛剤、抗フケ菌剤、美白剤等を得る。天然由来のため、無刺激性で反復使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−チオール−３−ヒドロキシインドール、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール及び３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドールからなる群から選ばれた少なくともひとつを含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビネ属、ガンセキラン属、その他偽球茎を有するラン科植物からの抽出液または搾汁もしくは搾汁からの抽出物含有皮膚外用剤、特にメルカプトインドール誘導体含有皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、エビネ属に属する植物またはその搾汁からの抽出物のうち、メルカプトインドール配糖体の生理活性については、たとえば下記の特許文献が知られている。特許文献１は、メルカプトインドールの新規配糖体である２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール（カラントサイドＢ）の生理活性として、皮膚血流量増進作用を示し、育毛剤への適用可能性を示唆している。また、特許文献２は、カラントサイドＢの抗フケ剤としての用途を示している。
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−２６５４９３号公報
【特許文献２】特開平１１−０２９４８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、カラントサイドＢを含めて、メルカプトインドール誘導体を鋭意研究の結果、カラントサイドＢ類似の構造を有する２−チオール−３−ヒドロキシインドール、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール及び３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドールにもカラントサイドＢ同様の活性があることを見出し、本発明にいたった。
【０００５】
本発明は、ある種のメルカプトインドール誘導体を有効成分として含む皮膚外用剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の皮膚外用剤は、２−チオール−３−ヒドロキシインドール、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール及び３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドールからなる群から選ばれた少なくともひとつを有効成分として含むことを特徴としている。
【０００７】
このうち、２−チオール−３−ヒドロキシインドールの構造式は化１に、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドールは化２に、３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシ−インドールは化３に示す。
【０００８】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【０００９】
化１、化２、化３に示すメルカプトインドール誘導体（以下「ＭＩＤ」という）は、例えばエビネ属植物、その抽出液、搾汁または搾汁からの抽出液から単離したカラントサイドＢをβ―グルコシダーゼ酵素により分解して得ることができる。またカラントサイドＢを単離することなく、エビネ属植物、その抽出液、搾汁または搾汁からの抽出液に直接β−グルコシダーゼ酵素を作用させて得ることもできる。
【００１０】
本発明の皮膚外用剤には、通常用いられる補助的機能栄養成分として、ビタミン類、アミノ酸類、動植物油、塩化ナトリウム等を適宜選択して用いることができる。例えば、ビタミン類には、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＤ類、ビタミンＥ（トコフェロール）、パントテン酸ナトリウム、パントテン酸カリウム、ビタミンＨ（ビオチン）の誘導体等がある。アミノ酸には、ドーパ（β−３−４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、動植物油として、馬油、卵油、オリーブ油、ツバキ油、菜種油、ゴマ油、胚油等を用いることができる。また、保湿剤としては、水飴、マルトース、３−メチル−１，３−ブタンジオール、ソルビトール、乳酸、ｔ−ブタノール、１，３−ブタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、メチルプロパンジオール、メトキシイソプロパノール、メトキシジグリコール、その他のグリコール類を使用することもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の皮膚外用剤は、メルカプトインドール誘導体特有の血流促進作用、抗フケ菌作用を有する。また抗チロシナーゼ活性に優れ、美白作用、保湿作用も期待できる。特に、その作用がマイルドで毒性がないことから、長期の反復使用に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の皮膚外用薬の有効成分であるＭＩＤは、例えば下記の方法により作ることができる。
【００１３】
エビネ属、ガンセキラン属、その他偽球茎するラン科植物からの抽出液または搾汁もしくは搾汁からの抽出物からカラントサイドＢを単離する。カラントサイドＢをβ―グルコシダーゼ酵素で分解して、ＭＩＤを得る。β―グルコシダーゼ酵素による分解は、カラントサイドＢの単離工程を経ずに、エビネ属植物の抽出液またはその搾汁もしくは搾汁からの抽出液に直接酵素を作用させて行うこともできる。
【００１４】
本発明において用いるエビネ属（Ｃａｌａｎｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｌｏｒ  Ｌｉｎｄｌ．）に属する植物としては、次のものを例示できる。
（０１）ジエビネ型：ジエビネ（Ｃ．ｄｉｓｃｏｌｏｒ）、キエビネ（Ｃ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ）、キリシマエビネ（Ｃ．ａｒｉｓｔｕｌｉｆｅｒａ）、アマミエビネ（Ｃ．ａｍａｍｉａｎａ）、ニオイエビネ（Ｃ．ｉｚｕ−ｉｎｓｕｌａｒｉｓ）、サルメンエビネ（Ｃ．ｔｒｉｃａｒｉｎａｔａ）、トクノシマエビネ（Ｃ．ｔｏｋｕｎｏｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ）、アリサンエビネ（Ｃ．ａｒｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、ホソバナエビネ（Ｃ．ｇｒａｃｉｌｉｆｌｏｒａ）、ヒマラヤニオイエビネ（Ｃ．ｐｌａｎｔａｇｉｎｅａ）、クロロレウカ（Ｃ．ｃｈｌｏｒｏｌｅｕｃａ）、トガリバエビネ（Ｃ．ｃａｕｄａｔｉｌａｂｅｌｌａ）。
（０２）スズフリエビネ型：スズフリエビネ（Ｃ．ｌｉｕｋｉｕｅｎｓｉｓ）、タマザキエビネ（Ｃ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）、プルクラ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｒａ）。
（０３）タガネラン型：タガネラン（Ｃ．ｂｕｎｇｏａｎａ）、ホワイテアナ（Ｃ．ｗｈｉｔｅａｎａ）。
（０４）サクラジマエビネ型：サクラジマエビネ（Ｃ．ｏｂｌａｎｃｅｏｌａｔａ）、マンニイ（Ｃ．ｍａｎｎｉ）。
（０５）キソエビネ型：キソエビネ（Ｃ．ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒｉ）、アルピナ（Ｃ．ａｌｐｉｎａ）。
（０６）キンセイラン型：キンセイラン（Ｃ．ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）。
（０７）ヒロハノカラン型：ヒロハノカラン（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ）。
（０８）アサヒエビネ型：アサヒエビネ（Ｃ．ｈａｔｔｏｒｉｉ）。
（０９）ナツエビネ型：ナツエビネ（Ｃ．ｒｅｆｌｅｘａ）。
（１０）ツルラン型：ツルラン（Ｃ．ｆｕｒｃａｔａ）、オナガエビネ（Ｃ．ｌｏｎｇｉｃａｌｃａｒａｔａ）、オキナワエビネ（Ｃ．ｏｋｉｎａｗａｅｎｓｉｓ）、マスカ（Ｃ．ｍａｓｕｃａ）、マダガスカリエンシス（Ｃ．ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ナタレンシス（Ｃ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）。
（１１）トクサラン型：トクサラン（Ｃ．ｖｅｎｕｓｔａ）、シロトクサラン（Ｃ．ｌｏｎｇｉｐｅｓ）、ビロバ（Ｃ．ｂｉｌｏｂａ）。
（１２）ペステイタ型：ベステイタ（Ｃ．ｖｅｓｔｉｔａ）、ロゼア（Ｃ．ｒｏｓｅａ）、エルメリ（Ｃ．ｅｌｍｅｒｉ）、ルベンス（Ｃ．ｒｕｂｅｎｓ）、カージオグロッサ（Ｃ．ｃａｒｄｉｏｇｌｏｓｓａ）。
【００１５】
ガンセキラン属（Ｐｈａｉｕｓｆｌａｖｕｓ（Ｂｌｕｍｅ）  Ｌｉｎｄｌ．）、その他の偽球茎を有するラン科植物としては、ホテイラン属（Ｃａｌｙｐｓｏ  Ｓａｌｉｓｂ．）、ヒトツボクロ属（Ｔｉｐｕｌａｒｉａ  Ｎｕｔｔ．）、ナリヤラン属（Ａｒｕｎｄｉｖａ  Ｂｌｕｍｅ）、シラン属（Ｂｌｅｔｉｌｌａ  Ｒｅｉｃｈｂ．  Ｆｉｌ．）、クモキリソウ属（Ｌｉｐａｒｉｓ  Ｌ．Ｃ．  Ｒｉｃｈａｒｄ）、サワラン属（Ｅｌｅｏｒｃｈｉｓ  Ｆ．  Ｍｅａｋ．）、ヤチラン属（Ｍａｌａｘｉｓ  Ｓｏｌａｎｄ．）、コウトウシラン属（Ｓｐａｔｈｇｌｏｔｔｉｓ  Ｂｌｕｍｅ）、エンレイショウキラン属（Ａｃａｔｈｏｐｈｉｐｐｉｕｍ  Ｂｌｕｍｅ）、ヒメトケンラン属（Ｔａｉｎｉａ  Ｂｌｕｍｅ）、ヒメクリソラン属（Ｈａｎｃｏｃｋｉａ  Ｒｏｌｆｅ）、メオトラン属（Ｇｅｏｄｏｒｕｍ  Ｊａｃｋｓｏｎ）、イモネヤガラ属（Ｅｕｌｏｐｈｉａ  Ｒ．Ｂｒ．）、サイハイラン属（Ｃｒｅｍａｓｔｒａ  Ｌｉｎｄｌ．）、コハクラン属（Ｋｉｔｉｇｏｒｃｈｉｓ  Ｆ．Ｍｅａｋ）、コケイラン属（Ｏｒｅｏｒｃｈｉｓ  Ｌｉｎｄｌ．）、シュンラン属（Ｃｉｍｂｉｄｉｕｍ  Ｓｗ．）、オサラン属（Ｅｒｉａ  Ｌｉｎｄｌ．）、マツジタラン属（Ｂｕｌｂｏｐｈｌｌｕｍ  Ｔｈｏｕ．）を挙げることができる。
【００１６】
抽出溶媒としては、水、低級アルキルアルコール、多価アルコールの単独または混合物を使用する。低級アルキルアルコールには、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等、望ましくはエタノールを用いる。多価アルコールとしては、例えばエチレングリコール、メトキシジグリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、メチルプロパンジオール、１，３−ブチレングリコール、２，３−ブタンジオール、３−メチル−１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、グリセリン、ジグリセリン、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンメチルグルコシドなどを好適に用いることができる。
【００１７】
エビネ属植物からの抽出液または搾汁は、エビネ属に属する植物の少なくとも１種の花、根、茎、葉など全草を水洗、粗切りして、溶媒に浸漬抽出するか、プレス圧搾により得られる。溶媒抽出では、エビネ約１０ｋｇに対して、例えば２０〜９０％エチルアルコール約２０リットルを混合し、７〜１０日間冷暗所において密閉保存した後、固液分離して濾過する。望ましくは、圧搾して得られた搾汁に対して、２０〜９０％の含水エチルアルコールを約１：１（容量）の割合で混合抽出する。得られた抽出液は、約１〜２週間、冷暗所において密封熟成すると、さらに効果的である。搾汁製造の際の圧縮圧は、５００〜５，０００ｋｇ／ｃｍ２程度に設定すればよい。搾汁はそのまままたは精製もしくは希釈して使用することもできる。
【００１８】
本発明におけるカラントサイドＢの単離工程は、次ぎのように行う。エビネランからのメタノール熱時抽出液を酢酸エチルと水（１：１）で分配抽出する。次いで水移行部を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、水、メタノールで順次溶出し、メタノール溶出部を得る。メタノール溶出部を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、さらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離することにより、化４のカラントサイドＢが単離される。
【００１９】
【化４】
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【００２０】
次に、化４のカラントサイドＢ含有溶液にβ−グルコシダーゼ酵素を添加すると、化５、化６、化７式に示すように分解して、本発明の２−チオール−３−ヒドロキシインドール（化１）、２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール（化２）及び３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール（化３）のメルカプトインドール誘導体（ＭＩＤ）が得られる。
【００２１】
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【００２２】
本発明のＭＩＤは、前記カラントサイドＢの単離工程を経ずに、エビネ植物の搾汁を長時間放置しても、搾汁中に含まれるβ―グルコシダーゼ酵素によりある程度生成するが、望ましくは、種々の植物種子、例えば桃仁、杏仁などに存在する酵素エムルシン（β―グルコシダーゼ）を添加すると、短時間で多量に得られる。
【００２３】
本発明のＭＩＤ含有溶液は、後述するようにカラントサイドＢ同様の血行促進作用、育毛作用、抗フケ菌作用に加えて、抗チロシナーゼ作用に基づく美白作用、保湿作用も認められる。
【００２４】
ＭＩＤ含有溶液には、必要に応じて通常の皮膚外用剤に使用する添加剤を用いることができる。例えば、ビタミン類としては、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＤ類、ビタミンＥ（トコフェロール）、パントテン酸ナトリウム、パントテン酸カリウム、ビタミンＨ（ビオチン）等及びこれらの誘導体がある。アミノ酸には、ドーパ（β−３−４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、動植物油として、馬油、卵油、オリーブ油、ツバキ油、菜種油、ゴマ油、胚芽油等を用いることができる。また、保湿剤として、水飴、マルトース、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、３−メチル−１，３−ブタンジオール、ソルビトール、乳酸、ｔ−ブタノール、２，３−ブタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、メチルプロパンジオール、メトキシイソプロパノール、メトキシジグリコール、メトキシメチルブタノール、その他のグリコール類を使用することもできる。
【００２５】
添加剤の種類及び添加量は、使用目的によって異なるので特定できないが、一般的な皮膚外用剤にあっては、重量％で、エタノール１０〜５０％、ＭＩＤが約０．０１〜１０％、酢酸トコフェロールが約０．０１〜１．０％、馬油が約０．０１〜５％、パントテン酸ナトリウムが約０．０１〜４％、ニコチン酸アミドが約０．０１〜５％、アスコルビン酸が約０．０１〜１０％、グリコール酸が約０．０１〜１０％、ビオチンが約０．００１〜１％、ビタミンＢ６が約０．０１〜２％、塩化ナトリウムが約０．１〜５％である。精製水は適量用いる。
【００２６】
また化粧用組成液にあっては、重量％で、エタノール１０〜５０％、ＭＩＤが約０．０１〜１％、酢酸トコフェロールが約０．０１〜０．５％、馬油が約０．０１〜１％、パントテン酸ナトリウムが約０．０１〜１％、ニコチン酸アミドが約０．０１〜１％、アスコルビン酸が約０．０１〜２％、グリコール酸が約０．０１〜５％、ビオチンが約０．００１〜０．１％、ビタミンＢ６が約０．０１〜１％、塩化ナトリウムが約０．１〜５％である。
【００２７】
また上記物質以外であっても、通常皮膚外用剤や化粧料に添加される補助的添加剤は適宜使用することができる。またローション、乳液、クリーム、パック、軟膏、化粧水、浴用剤など、使用目的あるいは剤形に応じて、一般的に使われている材料は任意に用いてもよい。
【００２８】
添加剤の作用は、必ずしも明確ではないが、ビタミン類は粘膜、神経の保健に役立ち、皮膚の角質化の防止機能がある。ビタミンＢ１、ビタミンＢ２は、皮膚、粘膜の神経を安定化させるとともに活性化し、細胞呼吸を助ける。ビタミンＣは皮膚の新陳代謝を促し、ビタミンＥは血行促進、細胞活性化作用がある。ビタミンＨ、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸とその塩類は、いずれも代謝機能を改善し、ビオチンは皮膚疾患の予防作用がある。動植物油は皮膚をやわらかくし、特に馬油と胚芽油は効果的である。グリコール酸はｐＨ調整のために使用し、塩化ナトリウムはその浸透圧的な作用により、有効成分が皮膚の深部まで浸透しやすくする。
【００２９】
本発明のＭＩＤ含有溶液の育毛、抗フケ菌、美白、保湿作用の機序は、必ずしも明確ではないが、後述のように育毛、抗フケ菌作用は、カラントサイドＢ類似の皮膚血流量増進作用、抗フケ菌作用に基づくものと推定され、美白作用は抗チロシナーゼ活性に基づくものと推定できる。
【実施例１】
【００３０】
エビネ新鮮根茎１０ｋｇを細切りした後、エタノール１８リットルで熱時抽出を計３回おこなった。エタノール抽出液３回分をあわせて減圧下溶媒留去し、エタノール抽出エキス３６０ｇ（３．６％）を得た。エビネエタノール抽出エキス３６０ｇを酢酸エチルエーテル：水（１：１）で分配し、酢酸エチルエーテル移行部１１０ｇ（１．１％）、水移行部２５０ｇ（２．５％）を得た。得られた水移行部エキスを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１．０ｋｇ，（水→メタノール）］で糖除去し、メタノール流出部エキス１５ｇ（０．１５％）を得た。メタノール流出部エキス１５ｇを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ，メタノール：水（５０：５０→８０：２０，ｖ／ｖ）］で分画し、フラクションＦｒ．１（１．５ｇ，０．０１５％）、Ｆｒ．２（３．０ｇ，０．０３０％）、Ｆｒ．３（３．４ｇ，０．０３４％）、Ｆｒ．４（０．５ｇ，０．００５％）、Ｆｒ．５（０．７ｇ，０．００７％）、Ｆｒ．６（３．１ｇ，０．０３１％）、Ｆｒ．７（３．４ｇ，０．０３４％）を得た。Ｆｒ．１（１．５ｇ）をさらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１５ｇ，クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（下層）→６５：３５：１０（下層）→６：４：１］で分画し、Ｆｒ．１−１〜Ｆｒ１−８を得た。Ｆｒ．１−５（２１０ｍｇ，０．００２２％）を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ，メタノール：水（４０：６０，ｖ／ｖ）］、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［カラム；ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ−５（２５０×２０ｍｍ  ｉ．ｄ．），溶媒；アセトニトリル：水（２５：７５，ｖ／ｖ），流速；９．０ｍｌ／分］で分離精製し、カラントサイドＢ（化１，１５ｍｇ，０．０００１５％）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎ）（８．８ｍｇ，０．００００９％）を得た。この操作を複数回繰り返し、カラントサイドＢ液の必要量を確保した。
【００３１】
カラントサイドＢの溶剤を留去、精製した後、カラントサイドＢ含有水溶液に対して、β−グルコシダーゼ酵素を添加混合し、常温、常圧で２４時間放置した。放置後分析した結果、カラントサイドＢの一部がβ−グルコシダーゼ酵素により分解されて、化１の２−チオール−３−ヒドロキシインドール、化２の２−Ｓ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドール及び化３の３−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２−チオール−３−ヒドロキシインドールが検出された。検出には、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた。
【試験例１】
【００３２】
（ラット皮膚血流量増進作用）
実験動物として、ＳＬｃ：ウィスター系雄性ラット（体重１８０〜２００ｇ）を用いた。皮膚血流量は、レーザードップラー血流計（Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ  ＰＦ２Ｂ，Ｐｅｒｉｍｅｄ）を用いて測定した。ラットの背部を剪毛し、翌日にウレタン（１ｇ／ｋｇ）麻酔下でラットの皮膚血流量を測定し、前値とした。前値測定直後に被験液２５μｌ（５０％エタノール溶液）を前値測定部位に塗布し、その２０分後に塗布部位の皮膚血流量を再度測定し、前値に対する増加率を算出した。被検群には実施例１で得られたＭＩＤ含有液（０．２％）とカラントサイドＢ液（０．２％）を用い、対照群には５０％エタノール溶液を塗布した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005179218.tif 000009
【試験例２】
【００３４】
（抗フケ菌作用）
被検群として、実施例1のＭＩＤ、カラントサイドＢを用い、対照例としてテトラサイクリン・ＨＣｌを用いて、次の方法により試験した。ＭＩＤ含有液とカラントサイドＢ液から４５℃減圧下で溶媒を完全に留去して、各乾燥物を得た。次いで、各乾燥物を精製水に溶かして試料液を調製、滅菌済みのメンブレンフィルターを用いて濾過除菌した。滅菌精製水を用いて、濾過した試料液を希釈した。１ｍｌの液体培地に試料７．５μｌを加えて被検培地とした。このとき試料の希釈濃度は、公比２倍で段階希釈した。用いた培地は、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ブドウ糖１０％、オリーブ油１．０％、ｐＨ６．０であった。菌の接種及び培養は、凍結保存菌を解凍して、その１０μｌを液体培地１０ｍｌに接種、２５℃で一晩振盪培養した。接種菌液は、あらかじめ測定した１晩振盪培養後の菌数により、約菌数１０６個／ｍｌとした。被検培地への接種菌液（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）１０μｌ、最終菌液量は約１０４個／ｍｌとした。判定は、以下の基準に従い最小阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。結果を表２に示す。
【００３５】
（１） 発育陽性（＋）の判定基準：肉眼的に混濁または沈殿が認められた場合。
（２） 発育阻止（−）の判定基準：肉眼的に混濁または沈殿が認められない場合。
【００３６】
【表２】
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【試験例３】
【００３７】
（抗チロシナーゼ活性）
ＭａｓｏｎとＰｅｔｅｒｓｏｎの方法に準じて、美白効果につき次の試験をした。被検液として、実施例１のＭＩＤとカラントサイドＢを用い、対照例として陽性対照薬コウジ酸を用いた。被検液０．５ｍｌにＬ−ドーパ溶液（ｐＨ６．８、ＰＢＳ中０．０３％）０．５ｍｌを加えて、２５℃、１０分間インキュベートした。次いで、マッシュルーム由来のチロシナーゼ溶液（ｐＨ６．８、ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを添加し、２５℃、５分間インキュベートした。反応後、４７５ｎｍ吸光度（Ｄ１）を測定した。別にドーパ溶液を添加せずに、同様な操作で吸光度（Ｄ２）を測定するとともに、さらに被検液無添加におけるドーパクロム生成量としての吸光度（Ｄ３）を測定した。前記Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３を用い、下式によりドーパクロム生成阻害率（阻害率％）を求め、チロシナーゼ阻害活性とした。結果を表３に示す。表３において、ＯＤは光学的濃度、ＳＤはその標準偏差である。
阻害率（％）＝｛［Ｄ３−（Ｄ１−Ｄ２）］／Ｄ３｝×１００
【００３８】
【表３】
2005179218.tif 000011
【試験例４】
【００３９】
（皮膚刺激性試験）
外用で用いられている実施例１のＭＩＤ含有液について、モルモットを用いた皮膚刺激性の試験を行った。ハートレー系モルモットは雌性３００ｇ前後を６匹一群として用いた。試験前にエーテルで麻酔し、背部を広く電気バリカンで剃毛し、さらにシェーバーで剃毛する。除毛部を消毒用アルコールでよく拭き、試料の塗布部位の一方を注射針で格子状の傷を入れた。検体の抽出０．５ｍｌを２．５×２．５ｃｍの濾紙上に吸着させ、しっかりと防水フィルム（森下仁丹社製）で固定し、その上を伸縮粘着包帯で固定した。貼布後２４時間目にパッチをはがし、紅斑や浮腫の程度をブランクとしてエタノールを用い比較した。その結果、ＭＩＤ含有液に、特に皮膚を刺激する反応は認められず、ブランクの場合と同様であった。
【００４０】
試験例１，２，３の結果、実施例１のＭＩＤおよびその含有液は、ラット皮膚血流促進作用、抗フケ菌作用、抗チロシナーゼ活性において、カラントサイドＢ同様の効果があることが判明した。また試験例４の結果から、ＭＩＤ含有液には皮膚刺激性も認められない。
【配合例１】
【００４１】
（頭皮外用剤）
各成分を下記の割合で配合し、頭皮外用剤を調製した。単位は（ｇ）である。
エタノール                        ２００．００
ＭＩＤ                                １．００
酢酸トコフェロール                    ０．２０
馬油                                  ２．００
パントテン酸ナトリウム                １．００
ニコチン酸アミド                      １．５０
アスコルビン酸                        ３．００
グリコール酸                        １０．００
ビオチン                              ０．６０
ビタミンＢ６                          ０．７５
塩化ナトリウム                        ９．００
精製水                          （全体が１リットルになるように適量補充。）
【試験例５】
【００４２】
フケ、抜け毛の激しい男性５人と女性５人に、配合例１で得た頭皮外用液を２回／日６ヶ月間試用してもらった。フケ及び抜け毛の発生は、全員１週間後には顕著に改善された。６ヵ月後には、全員頭髪が増えて起立してきた。特に女性の抜け毛の改善が顕著であった。
【配合例２】
【００４３】
（化粧水）
各成分を下記の割合で配合し、化粧水を調製した。単位は（ｇ）である。
エタノール                        ２００．００
ＭＩＤ                                ０．５０
酢酸トコフェロール                    ０．２０
馬油                                  ２．００
パントテン酸ナトリウム                １．００
ニコチン酸アミド                      １．５０
アスコルビン酸                        ３．００
グリコール酸                        １０．００
ビオチン                              ０．６０
ビタミンＢ６                          ０．７５
塩化ナトリウム                        ９．００
精製水                          （全体が１リットルになるように適量補充。）
【試験例６】
【００４４】
年齢４０〜５０歳の女性３人と男性２人に、配合例１の化粧水を２回／日、２０日間試用してもらい、美白効果と保湿効果を中心に聴取した。その結果、全員３日目頃から肌がしっとりしてきた。しみはほとんど消失し、くすみのあった女性２人のうち１人は消失、１人は薄くなった。
【００４５】
以上の実施例、配合例、試験例からも明らかなように、本発明のＭＩＤおよびその含有液は、血行促進作用、育毛、抗フケ菌作用においては、カラントサイドＢおよびその含有液より若干優れている。また、チロシナーゼ阻害活性作用に基づく美白作用においても優れている。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の皮膚外用剤は、含有するＭＩＤの作用から、育毛、養毛剤、抗フケ菌剤等の頭皮外用剤、また皮膚ケア剤として、一般の化粧料等にも広く適用できる。剤形も、用途に応じて、ローション、乳液、クリーム、パック、軟膏、化粧水、浴用剤なども可能と考えられる。