(57)【要約】  【課題】  神経突起伸展作用を有する低分子化合物を提供することを目的とする。  【解決手段】  本発明は、成長ホルモン遊離促進物質を有効成分として含有する神経突起伸展剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン遊離促進物質を有効成分とする神経突起伸展剤。
【請求項２】
成長ホルモン遊離促進物質が成長ホルモン遊離ペプチドである請求項１に記載の神経突起伸展剤。
【請求項３】
成長ホルモン遊離ペプチドがプラルモレリン、グレリン、グレリン類似体又はこれらの製薬的に受容される塩である請求項２記載の神経突起伸展剤。
【請求項４】
成長ホルモン遊離ペプチドがプラルモレリン又はその製薬的に受容される塩である請求項２記載の神経突起伸展剤。
【請求項５】
神経麻痺の改善剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経突起伸展剤。
【請求項６】
痴呆改善剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経突起伸展剤。
【請求項７】
記憶改善剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経突起伸展剤。
【請求項８】
脳機能賦活剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の神経突起伸展剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン遊離促進物質を有効成分として含有する神経突起伸展剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、発生過程において外部環境の影響を受けて神経突起をのばし、神経回路を形成する。神経終末と他のニューロンの神経細胞の樹状突起との間にシナプスが形成され、これにより信号伝達がおこなわれている。記憶障害又は痴呆などの患者において神経突起の消失が見られることからこの神経突起の伸長に伴うシナプス形成は記憶と密接な関係があると考えられている。したがって、神経回路網が破綻している神経細胞の神経突起を伸長させることにより、神経細胞同士のシナプス応答を再編、増強させることができ、ダメージを受ける前の機能の回復、例えば、記憶の改善ないし痴呆の治療を行うことが期待できる。
【０００３】
神経成長因子（ＮＧＦ）に代表される神経栄養因子は、神経細胞の発生を促し、その生存を維持し、脳の損傷時には修復するなどの作用があることが推測されている。しかし、ＮＧＦはアミノ酸１１８個で分子量が大きく（分子量１３，２５９）、血液脳関門を通過できず、脳への移行が困難であるので、医薬として問題がある。したがって、低分子で上記活性を有する化合物が求められている。
【０００４】
一方、成長ホルモン遊離ペプチド（以下ＧＨＲＰと略す）及び成長ホルモン分泌促進物質（以下GH secretagogue、GHSと略す）という成長ホルモン遊離促進物質は、様々な生理活性作用を有することが知られており、神経細胞のアポトーシス及びネクローシスを防止する効果も有することが報告されている（特許文献１）。しかし、この報告では、神経細胞の変性又は死により失われた機能の修復、脳高次機能の再構築は極めて難しいという認識の下、神経細胞の変性又は死を防ぐことを目的としたものであった。
【０００５】
【特許文献１】国際特許公開WO01/47558号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、神経突起伸展作用を有する低分子化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、神経回路網の破綻を機能的に修復する低分子化合物を鋭意研究したところ、意外にも成長ホルモン遊離促進物質が神経突起伸展作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、成長ホルモン分泌促進物質を有効成分として含有する神経突起伸展剤（以下、「本発明の製剤」という）を提供する。
本発明の他の態様によると、成長ホルモン遊離促進物質が成長ホルモン遊離ペプチドである上記神経突起伸展剤を提供する。
【０００９】
本発明の他の態様によると、成長ホルモン遊離ペプチドがプラルモレリン、グレリン、グレリン類似体又はこれらの製薬的に受容される塩である上記神経突起伸展剤を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様によると、成長ホルモン遊離ペプチドがプラルモレリン又はその製薬的に受容される塩である上記神経突起伸展剤を提供する。
本発明の他の態様によると、神経麻痺の改善剤である上記神経突起伸展剤を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様によると、痴呆改善剤である上記神経突起伸展剤を提供する。
本発明の他の態様によると、記憶改善剤である上記神経突起伸展剤を提供する。
本発明の他の態様によると、脳機能賦活剤である上記神経突起伸展剤を提供する。
【００１２】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明の製剤は、神経突起伸展作用により神経細胞同士のシナプス応答を再編、増強させることができ、神経疾患で低下した機能を回復することができる。
具体的には、以下の疾患の治癒又は症状の改善があげられる：
筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、ニューロパシー、外傷性の神経損傷や神経欠損に起因する神経障害、毒性神経障害、多発性硬化症等の末梢神経の疾患に付随する神経麻痺（運動障害及び知覚障害を含む）の改善、並びにアルツハイマー病、血管性痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄損傷等の中枢神経の障害及び疾患における記憶障害の改善、痴呆の治療、脳機能賦活作用。
【００１３】
本発明の「成長ホルモン遊離促進物質」としては、成長ホルモン遊離ペプチド（ＧＨＲＰ）並びに成長ホルモン分泌促進物質（ＧＨ secretagogue、ＧＨＳ）が含まれる。
「成長ホルモン遊離ペプチド（ＧＨＲＰ）」とは、成長ホルモン遊離を促進させる薬理活性を有するペプチドをいい、このような同等の機能を有する限り、各種誘導体（例えば、ペプチド構成アミノ酸が置換された誘導体、エステル誘導体）も包含される。ペプチド中のアミノ酸残基やアミノ酸誘導体残基の数および由来（例えば、ヒトの細胞より分離、精製したもの、合成品、半合成品、遺伝子工学により得られたものなど）などについては、特に制限がない。
【００１４】
ここで、「アミノ酸誘導体」とは、アルキル置換トリプトファン、β−ナフチルアラニン、α−ナフチルアラニン、３，４−ジヒドロフェニルアラニン、メチルバリンなどが挙げられる。また、アミノ酸およびアミノ酸誘導体はＬ体、Ｄ体のいずれも含む。
【００１５】
「成長ホルモン分泌促進物質」とは、成長ホルモン分泌を促進させる薬理活性を有する非ペプチド性物質をいい、このような同等の機能を有する限り、各種誘導体（例えば、エステル誘導体）も包含される。
【００１６】
成長ホルモン遊離ペプチド（ＧＨＲＰ）の具体的化合物としては、これらに限定されるものではないが、プラルモレリン、ヘキサレリン、GHRP-１、GHRP-6（SK＆F−110679）、グレリン及びグレリン類似体、またはそれらの塩、エステルなどが挙げられる。好ましい例としては、プラルモレリン、グレリン及びグレリン類似体、またはそれらの塩があげられ、より好ましい例は、グレリン及びグレリン類似体、またはそれらの塩である。
【００１７】
これらの塩の例は、下記に記載されるが、好ましい例としては、塩酸塩があげられる（例えば、プラルモレリンニ塩酸塩、ヘキサレリン塩酸塩）。
グレリンは、下記表に記載された化学構造で示される、２８個のアミノ酸を有するペプチドである。グレリン類似体には、成長ホルモン遊離促進作用を有する限り、２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているものも包含され、さらに、これらの各種誘導体〔例えば、ペプチド構成アミノ酸が置換された誘導体（アミノ酸間に基、例えば、アルキレンが挿入されたものも包含する）及びエステル誘導体〕も包含される。
【００１８】
ペプチド中のアミノ酸残基やアミノ酸誘導体残基の由来（例えば、ヒト、ラットの細胞より分離、精製したもの、合成品、半合成品、遺伝子工学により得られたものなど）などについては、特に制限がない。
【００１９】
２８個のアミノ酸の１個以上のアミノ酸が欠損、置換または付加されているもの例としては、下記のものがあげられる。
グレリンのアミノ酸が１個欠損した例としては、１４番目のＧｌｎ残基が欠除した、des-Gln14-グレリンなどが代表的である。
【００２０】
さらに、本発明のグレリン類似体には、J.Med.Chem.2000, 43, 4370-4376に記載された下記のようなものも包含される。
例えば、グレリン２８個のアミノ酸のうち、Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸（好ましくは、Ｎ末端４個のアミノ酸）を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているペプチド及びその誘導体であって、成長ホルモン遊離促進作用を有するものがあげられる。
【００２１】
Ｎ末端から３番目のアミノ酸の側鎖の例としてはグレリンの側鎖であるオクタノイル以外のアシル基及びアルキル基（これらの炭素数は６〜１８が好ましい）があげられる。
具体的には、下記のものがあげられる：
−ＣＨ２（ＣＨ２）９ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）６ＣＨ３、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＯ−（ＣＨ２）９ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）１４ＣＨ３、−ＣＯ−（ＣＨ２）６ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−ＣＯＰｈ、
下記式：
【００２２】
【化１】
2005239712.tif 000002
【００２３】
Ｎ末端から３及び４番目のアミノ酸を有し、かつＮ末端から３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）の側鎖が置換されているグレリン類似体の具体的な例としては、第３７回ペプチド討論会（２０００年１０月１８日〜２０日）で報告された化合物：
ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯ−Ｓｅｒ（オクチル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２があげられる
【００２４】
【化２】
2005239712.tif 000003
【００２５】
成長ホルモン分泌促進物質（ＧＨ secretagogue、ＧＨＳ）の具体的化合物としては、これらに限定されるものではないが、イブタモレリン[例えば、イブタモレリンメシレート（MK-0677）]、カプロモレリン（CP-424391）、タビモレリン（NN−703）及びNNC-260722、またはそれらの塩、エステルなどが挙げられる。これらの塩の例は、下記に記載されるが、好ましい例としては、塩酸塩があげられる。
【００２６】
上記化合物の代表的なものは、以下の表に詳細を記載する。
【００２７】
【表１】
2005239712.tif 000004
【００２８】
【表２】
2005239712.tif 000005
【００２９】
【表３】
2005239712.tif 000006
【００３０】
上記化合物の製薬的に受容される塩としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸等の鉱酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸との塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩等が挙げられる。
【００３１】
本発明の製剤において、成長ホルモン遊離促進物質及びその製薬的に受容される塩を２種以上組み合わせて用いてもよい。
本発明に用いられる成長ホルモン遊離促進物質は、公知の製剤技術により、単独でまたは薬理学的に許容しうる担体、添加剤等とともに、通常の経口型製剤及び非経口型製剤、例えば、液剤（注射剤、点鼻剤、シロップ剤、ドライシロップ剤など）、錠剤、トローチ剤、カプセル剤（硬、軟、マイクロカプセル等）、散剤、細粒剤、顆粒剤、軟膏剤、坐剤等などに製剤可能であり、また、ドラッグデリバリーシステム（例えば、徐放剤等）などの剤型にも製剤可能である。
【００３２】
本発明の製剤に用いることができる担体、添加剤等としては以下のような通常医薬品の調剤に使用されるものがあげられる：例えば生理食塩液、水（常水、蒸留水、精製水、注射用水など）、リンゲル液等の水性溶剤、例えば、油性溶剤（植物油など）、水溶性溶剤（プロピレングリコール、マクロゴール、エタノ−ル、グリセリンなど）等の非水性溶剤、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、マイクロクリスタリンワックス、サラシミツロウ、流動パラフィン、白色ワセリン等の基剤、例えば蔗糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、ぶどう糖、セルロース、タルク、燐酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビヤゴム、ポリエチレングリコール、蔗糖、デンプン等の結合剤、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、炭酸水素ナトリウム、燐酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、例えばクエン酸、メントール、グリシン、ソルビトール、オレンジ末等の矯味剤、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、クロロブタノール、四級アンモニウム塩（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）等の保存剤及び防腐剤、例えばアルブミン、ゼラチン、ソルビトール、マンニトール等の安定剤、例えばメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁化剤、例えばグリセリン、ソルビトール等の可塑剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース等の分散剤、例えば塩酸、シクロデキストリン等の溶解補助剤、例えばモノステアリン酸ナトリウム等の乳化剤、例えば塩化ナトリウム等の電解質並びに例えば糖アルコール類、糖類及びアルコール類等の非電解質の浸透圧調整剤、着香剤等。
【００３３】
また、経口製剤の場合、吸収性促進のために、特開平１０−456194公報記載のような結晶セルロース（「アビセル」[商品名、旭化成工業（株）製]等、水膨潤性セルロース（カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等）を含むことができる。
【００３４】
通常、経口、皮下、点鼻、動脈注（点滴を含む）、静脈注、脊髄腔注または脳局所投与等の手段によりヒトを含む哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）に投与される。
【００３５】
本願製剤の投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与ルート等により差異はあるが、例えば成人（体重５０ないし７０ｋｇ）の治療のために使用するに際し、成長ホルモン遊離促進物質として、経口投与のためには、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜１００ｍｇ、静脈内投与のためには、体重１ｋｇ当たり約０．１〜１０００μｇを１日に１ないし４回に分けて投与されることができる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの記載によって限定的に解釈されるものではない。
【００３７】
実施例１（神経突起伸展作用試験）
ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞を、１０％牛胎児血清及び５％ウマ血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、２５ｃｍ２プレートに対し２ｘ１０５細胞／ウエルとなるように蒔き、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。
【００３８】
各薬物、ラットグレリン（ペプチド研究所）及びプラルモレリンニ塩酸塩（ＫＰ−１０２）（科研製薬（株））の１０−４Ｍのストック溶液を用いて所定の濃度になるように上記培地へ直接添加した。
【００３９】
薬物処置一週間後に、総細胞数及び細胞体直径の1.5倍以上の神経突起(樹状突起と軸索)を持つ細胞の数を各々カウントし、該神経突起を持つ細胞数の総細胞数に対する割合を算出した。次に、該神経突起を持つ細胞数の総細胞数に対する割合の対照群における割合に対する比を求め、これを神経突起伸展として図１に示す。
【００４０】
実験結果
対照群の細胞では、７日間の培養により、僅かに神経突起伸展が認められた。
ＰＣ１２細胞は、ＮＧＦによる神経突起伸展作用が弱いのに対し、グレリン及びＫＰ−１０２によって、神経突起伸展作用が認められた。
【００４１】
グレリン（１０−９−１０−７Ｍ）を７日間添加した群においていずれの濃度においても対照群と比較して、１．５−１．９倍の顕著な神経突起伸展作用が認められた。
ＫＰ−１０２（１０−１０−１０−９Ｍ）を７日間添加した群において対照群と比較して、有意な神経突起伸展作用が認められた。
【００４２】
実施例２
実施例１における成長ホルモン遊離促進物質による神経突起伸展作用が、成長ホルモン遊離促進物質受容体を介する作用であることを以下で確認した。
【００４３】
成長ホルモン遊離促進物質として、ラットグレリン（ペプチド研究所）及びプラルモレリンニ塩酸塩（ＫＰ−１０２）（科研製薬（株））を用いた。成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬として、グレリン抗体であるウサギ抗ラットGHS-R抗体（Alpha Diagnostic international Inc.、Cat#: GHSR11-S, Antiserum）（１０００倍希釈）（以下、「グレリン抗体」という）、(D-Lys3)-GHRP-6（Bachem）（以下、「D-Lys」という）および(D-Arg1,D-Phe5,D-Try7,9,Leu11)-サブスタンスP（Bachem）（以下、「SubP」という）を用いた。
【００４４】
ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞を、１０％牛胎児血清及び５％ウマ血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、２５ｃｍ２プレートに対し２ｘ１０５細胞／ウエルとなるように蒔き、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。
【００４５】
成長ホルモン遊離促進物質及び成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬は、所定の濃度になるように上記培地へ直接添加した。グレリンは１０−８Ｍ、ＫＰ−１０２は１０−９Ｍ、D-Lysは１０−４Ｍ、SubPは１０−６Ｍの最終濃度になるようにした。成長ホルモン遊離促進物質の神経突起伸展促進作用に対する成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬の影響をみる場合には、成長ホルモン遊離促進物質及び成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬を同時に培地へ添加した。
【００４６】
薬物添加後一週間培養時に、総細胞数及び細胞体直径の1.5倍以上の神経突起(樹状突起と軸索)を持つ細胞の数を各々カウントし、該神経突起を持つ細胞数の総細胞数に対する割合を算出した。次に、該神経突起を持つ細胞数の総細胞数に対する割合の対照群における割合に対する比を求め、これを神経突起伸展として図２〜４に示す。
【００４７】
実験結果
成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬単独を添加した群（ｎ＝３）ではPC12細胞に対する神経突起伸展作用は認められなかった（図２参照）。
【００４８】
グレリン及び成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬を添加した群（ｎ＝３）では、グレリン単独を添加した群（ｎ＝３）の神経突起伸展促進作用の抑制作用が認められた（図３参照）。
【００４９】
ＫＰ−１０２及び成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬を添加した群（ｎ＝３）では、ＫＰ−１０２単独を添加した群（ｎ＝３）の神経突起伸展促進作用の抑制作用が認められた（図４参照）。
【００５０】
以上の結果より、成長ホルモン遊離促進物質による神経突起伸展作用は、成長ホルモン遊離促進物質受容体を介して発現していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
成長ホルモン遊離促進物質が神経細胞突起伸展剤として有効であることが本発明によってはじめて明らかとなった。本発明の製剤は、神経細胞突起伸展作用により、末梢神経の疾患に付随する神経麻痺（運動障害及び知覚障害を含む）の改善剤、並びに中枢神経の障害及び疾患における記憶障害の改善剤、痴呆の治療剤、脳機能賦活剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ＰＣ細胞における神経突起伸展に対するグレリン及びＫＰ−１０２（プラルモレリンニ塩酸塩）の影響を示す。値は平均±Ｓ．Ｅ．で示す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１ｖｓ．対照
【図２】図２は、成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬の神経突起伸展作用を示す。
【図３】図３は、グレリンの神経突起伸展作用に対する成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬の影響を示す。
【図４】図４は、ＫＰ−１０２（プラルモレリンニ塩酸塩）の神経突起伸展作用に対する成長ホルモン遊離促進物質受容体の拮抗薬の影響を示す。
【図１】
2005239712.tif 000007
【図２】
2005239712.tif 000008
【図３】
2005239712.tif 000009
【図４】
2005239712.tif 000010