(57)【要約】      （修正有）【課題】C. smithiiのＣＯＢ遺伝子グループＩイントロンにコードされているホーミングエンドヌクレアーゼの構造と機能を明らかにし、ＤＮＡ切断酵素として提供する。【解決手段】C. smithiiのＣＯＢ遺伝子グループＩイントロン中の翻訳領域によってコードされるタンパク質の一部からなるポリペプチドであって、特定のアミノ酸配列、若しくは当該アミノ酸配列のＮ末端から１〜３７個の任意のアミノ酸が欠失した短縮されたアミノ酸配列からなる単離され若しくは精製されたポリペプチド又はその塩。【選択図】            図１
2005341803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示したアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列のＮ末端から１〜３７個の任意のアミノ酸が欠失した短縮されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする単離されたポリペプチド又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１に示した塩基配列を認識して当該認識配列を含む二本鎖ＤＮＡを切断し得る酵素活性を有することを特徴とする単離されたポリペプチド又はその塩。
【請求項３】
配列番号３〜６の何れか一つに示したアミノ酸配列を有することを特徴とするＤＮＡ切断酵素I-CsmI。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
宿主細胞内に導入したときに当該宿主細胞内で請求項１又は２に記載のポリペプチドを産生し得る発現ベクターであって、当該発現ベクターは前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に連結された請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターを含んでなる形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換細胞を培養し、得られる培養物から請求項１又は２に記載のポリペプチドを回収する工程を含むことを特徴とするＤＮＡ切断酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項３に記載のＤＮＡ切断酵素I-CsmIと、基質ＤＮＡとを、中性反応条件下で接触させることを特徴とするＤＮＡの切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の非対称な塩基配列を認識して切断する酵素I-CsmI、それをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、当該ベクターを含む形質転換体、及び当該ＤＮＡ切断酵素I-CsmIの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学、特に遺伝子工学や遺伝子解析の分野における不可欠な研究材料の一つとして、制限エンドヌクレアーゼがある。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特異的な塩基配列（認識配列）を認識し、それに結合することで作用する。酵素がＤＮＡ分子に結合すると、認識配列内あるいは当該配列の近傍の何れかの位置でＤＮＡを開裂する。制限エンドヌクレアーゼの種類により親和性を示す認識配列は異なるが、多くの制限エンドヌクレアーゼは４〜６塩基の長さを持つ二回転対称な回文配列を認識する。しかしながら、いくつかの制限エンドヌクレアーゼに関しては特異性縮退又は特異性寛容が生じ、認識配列内の一つあるいは複数の箇所において複数の塩基が認識され、また、他のケースでは非対称配列も認識される。
【０００３】
真核生物由来のグループＩイントロンにはホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子が存在することが知られている。この遺伝子は種間交雑(interspecific crosses)により一方向的に子孫へと伝達され、遺伝子変換機構によるイントロンの転移に関与していると考えられる。このようなホーミングエンドヌクレアーゼとして、単細胞緑藻(Chlamydomonas eugametos)から得られるI-CeuI（例えば、特許文献１参照）や酵母(Saccharomyces cereviciae)から得られるI-SceI（例えば、特許文献２参照）等が知られているが、これらの遺伝子は何れもグループＩイントロンに、独立した翻訳領域(ORF : Open Reading Frame)として存在する。
【０００４】
一方、単細胞緑藻(Chlamydomonas smithii)のミトコンドリアに存在するアポチトクロームｂ遺伝子（以下「ＣＯＢ遺伝子」という。）中にもグループＩイントロン（「αイントロン」と称する場合がある。）が挿入されているが、このグループＩイントロン内には上流のｃｏｂエキソンとの融合タンパク質としての翻訳領域（ＯＲＦ）が存在する（例えば、非特許文献１参照）。当該翻訳領域のＤＮＡ配列から予測されたアミノ酸配列と、アミノ酸配列が公知の他のグループＩイントロン内にある翻訳領域とを比較すると、当該翻訳領域は２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有し、二本鎖ＤＮＡ切断酵素活性を有することが示唆される。更に、当該翻訳領域を含む配列と、イントロン配列を含まないエキソンのみからなるＣＯＢ遺伝子（基質ＤＮＡ）を同時に大腸菌内に導入した場合、ＣＯＢ遺伝子を含むプラスミド上のどこかで二本鎖ＤＮＡ切断が起こることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
しかしながら、上記C. smithiiイントロン由来のホーミングエンドヌクレアーゼは、インビボでのＤＮＡ切断活性は認められているものの、未だタンパク質として単離、精製されておらず、その認識配列の同定、ＤＮＡ切断点の形状、及び酵素反応条件等の詳細については明らかではない。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５４２００３２号明細書
【特許文献２】米国特許第６６１０５４５号明細書
【非特許文献１】Colleaux L. 外３名、モレキュラー・ジェネラル・ジェネティクス(Mol Gen Genet)、１９９０年、第２２３巻、ｐ．２８８−２９６
【非特許文献２】Ma, Din-Pow外３名、プラント・モレキュラー・バイオロジー(Plant Molecular Biology)、１９９２年、第１８巻、ｐ．１００１−１００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、C. smithiiのＣＯＢ遺伝子グループＩイントロンにコードされているホーミングエンドヌクレアーゼの構造と機能を明らかにし、ＤＮＡ切断酵素として提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
C. smithiiのＣＯＢ遺伝子グループＩイントロン中の翻訳領域は、上流のＣＯＢエキソンとの融合タンパク質として翻訳される３７４残基のアミノ酸配列から構成される。この融合タンパク質全体を大腸菌で発現させてもほとんど目的タンパク質が得られないことから、本発明者らは当該融合タンパク質のＮ末端領域を短縮した種々のポリペプチドを発現するベクターを構築し、大腸菌で発現させることによってＤＮＡ切断酵素活性を有する領域を決定した。その結果、上記融合タンパク質から、ＣＯＢエキソンを完全に含むＮ末端領域を大きく欠失した特定のポリペプチド（おそらく活性ドメインを形成すると考えられる）が顕著なＤＮＡ切断酵素活性を示し、かつ大腸菌内で大量に発現することを見出して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、C. smithiiのＣＯＢ遺伝子グループＩイントロン中の翻訳領域によってコードされるタンパク質の一部からなるポリペプチドであって、配列番号３に示したアミノ酸配列、若しくは当該アミノ酸配列のＮ末端から１〜３７個の任意のアミノ酸が欠失した短縮されたアミノ酸配列からなることを特徴とする単離され若しくは精製されたポリペプチド又はその塩を提供する。本発明のポリペプチドは、配列番号１に示した塩基配列を認識して当該塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを切断し得るＤＮＡ切断酵素活性を有する。本発明の好ましい実施形態において、配列番号３〜６の何れか一つに示したアミノ酸配列を有するＤＮＡ切断酵素が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のポリペプチドは大腸菌細胞内において極めて効率よく発現させることができ、それらを用いてインビトロの実験系でＤＮＡ切断酵素活性の詳細な解析を行うことができる。このようにして明らかとなったＤＮＡ切断酵素I-CsmIは、特徴的な１６塩基対の非対称性の認識配列を有することが分かった。従って、本発明のＤＮＡ切断酵素は、ゲノムＤＮＡを非常に大きな断片に切断して重複のないＤＮＡバンクの作製に用いたり、ゲノムＤＮＡのマッピング（位置情報の取得）等に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（本発明のポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、特定の塩基配列を認識して前記塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを切断し得るＤＮＡ切断酵素活性を有するポリペプチドである。より具体的には、配列番号３に示したアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは前記ポリペプチドのＮ末端から１〜３７個の任意のアミノ酸残基が欠失したポリペプチドに関する。また、本発明は、上記各ポリペプチドにおいて、１若しくは数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、特定の塩基配列、例えば、配列番号１に示した塩基配列を認識して該塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを切断し得るエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドに関する。本明細書においては、上記各ポリペプチドを総称して「本発明のポリペプチド」と称する。
【００１２】
従って、本発明のポリペプチドは、実質的に、配列番号３に示したアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列のＮ末端から１〜３７個の任意のアミノ酸、好ましくは２０個又は３７個のアミノ酸が欠失した短縮されたアミノ酸配列からなることを特徴とする。このように、本発明のポリペプチドは、C. smithiiのＣＯＢ遺伝子グループＩイントロン中の翻訳領域にコードされるアミノ酸配列に由来する所定のアミノ酸配列から構成されるが、ＤＮＡ切断酵素活性を損なわない限り、例えば、Ｎ末端に翻訳開始コドンのメチオニンやアフィニティー精製のために用いるタグ配列を有していてもよい。
【００１３】
本発明のポリペプチドが有するＤＮＡ切断酵素活性は、以下の塩基配列を認識し、かつ矢印にて特定される部位において開裂を行う。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴ↓ＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１）
３’−ＣＣＣＣＧＧ↑ＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡ−５’
【００１４】
なお、上記認識配列の特異性は特定の塩基について縮退しており、上記配列の１又は複数の塩基が他の塩基に置換されていても本発明のＤＮＡ切断酵素によって同様に開裂されるような塩基配列として規定される。具体的には、上記ＤＮＡ切断酵素活性を有する酵素は、以下の配列群から選択される何れか１つの塩基配列を認識して当該塩基配列を含む二本鎖ＤＮＡを切断することができる。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１）
５’−ＧＧＧＡＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号７）
５’−ＧＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号８）
５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号９）
５’−ＧＧＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１０）
５’−ＧＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＧＧＧＧＣＴＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＧＧＧＧＣＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１３）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１６）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１７）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１８）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＡＴ−３’（配列番号１９）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴ−３’（配列番号２０）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２１）
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧ−３’（配列番号２２）
及び
５’−ＧＧＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２３）
なお、上記配列中、認識配列の縮退は置換された塩基に下線を付して表した。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、配列番号３〜６の何れか一つに示したアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるＤＮＡ切断酵素I-CsmI（本発明のI-CsmI）が提供される。特に、配列番号６に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドは、αイントロンにコードされる２００個のアミノ酸残基からなる比較的小さな分子であるにもかかわらず、高いＤＮＡ切断酵素活性を示す。なお、配列番号４〜６に示したアミノ酸配列は、I-CsmIの翻訳領域においてコードされる、それぞれ２３７、２１７、及び２００個のアミノ酸配列のＮ末端にヒスチジンタグ配列が付加されたものであるが、これらのタグ配列はI-CsmIの酵素活性に直接影響するものではない。
【００１６】
異なる実施形態において、本発明のI-CsmIは、ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡのような大きなＤＮＡを切断するために用いることができる。本発明のI-CsmIを用いてＤＮＡを切断するための好ましい方法としては、配列番号３〜６の何れか一つに示したアミノ酸配列を有するＤＮＡ切断酵素I-CsmIと、基質ＤＮＡとを、中性反応条件下で接触させることを特徴とする。従来報告されているＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するホーミングエンドヌクレアーゼは、何れもｐＨ９付近のアルカリ反応条件下で高い酵素活性を有するが、本発明のＤＮＡ切断酵素I-CsmIは、ｐＨ７付近の中性反応条件下で高い酵素活性を示す。その他の至適反応条件は、以下の実施例において詳細に説明される。
【００１７】
（本発明のポリヌクレオチド）
また、本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドの両方をいい、それらは修飾されていてもよい。例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ及びそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定されない。「本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」とは、本発明のポリペプチドをコードし得る限り、遺伝暗号の縮退に基づく任意の塩基配列を選択することができ、このようなポリヌクレオチドとしては、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも含まれる。一旦ポリヌクレオチドの塩基配列が確定すると、その後は化学合成によってこのポリヌクレオチドを得ることができる。これらのポリヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。または当該ポリヌクレオチドが由来する遺伝子の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとして、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの全部又は一部を鋳型としたＰＣＲによって特定の遺伝子に由来するポリヌクレオチドを得ることができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、配列番号２に示した塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその５’末端から所定の長さの塩基を欠失し、かつ本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１９】
（発現ベクター）
本発明の発現ベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチドを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
【００２０】
プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２１】
ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明のポリヌクレオチドは、その遺伝子としての機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のポリヌクレオチドのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２２】
（形質転換細胞）
本発明の形質転換細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。簡便で効率が良いことから多くの場合、ベクターを用いて形質転換が行われる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００２３】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のポリヌクレオチドを導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２４】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２５】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153,163-168)等が挙げられる。
【００２６】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２７】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００２８】
（本発明のＤＮＡ切断酵素I-CsmIの製造方法）
本発明のＤＮＡ切断酵素I-CsmIは、前記形質転換細胞を培養し、その培養物から本発明のＤＮＡ切断酵素I-CsmIを回収することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、又は培養細胞若しくは培養細胞の破砕物の何れをも意味する。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体の培養は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地を用いて行う。これらの培地には、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００２９】
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００３１】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３２】
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。
【００３３】
（ＤＮＡ切断酵素I-CsmIの利用方法）
生物から有用な遺伝子をクローン化したり、遺伝子多型や塩基配列を決定するために、遺伝子工学や医療の分野においてＤＮＡバンクの作製が要求されている。従来、ゲノムＤＮＡ等を１００ｋｂを越える大きさに切断するには、超音波破砕等の物理的な方法か、細菌由来のII型の制限酵素をごく短時間作用させるなどの手法が採られてきた。このような実験条件の浮動に左右される処理過程を含む方法では、処理ごとに得られたＤＮＡ断片の集団は同じではない。また、このような手法を用いて作られたＤＮＡ断片の集団は、相互に不確定な重なり合う領域を持つ。そのため、ゲノム全体を網羅するような、クローン化されたＤＮＡ断片セット（ＤＮＡバンク）を用意するには、非常に多くのクローンを用意する必要があった。これに対し、I-CsmIを用いれば、長いＤＮＡ断片集団を簡単に作ることができる。しかもその断片は相互に重なり合いを持たないので、ＤＮＡバンクを作製するために必要なクローンの数を大幅に減らすことができる。また、酵素処理によって得られるＤＮＡ集団は常に一定しているため産業上も極めて有用である。
【００３４】
また、本発明に係るＤＮＡ切断酵素I-CsmIは、ゲノムに導入した標識配列の断片を切断するために用いることができる。あらかじめ、I-CsmIが切断できる配列をトランスポゾンや遺伝子破壊のためのＤＮＡ断片（タグ）に埋め込んでおき、トランスポゾンの活性化処理後、又はタグの挿入操作後にI-CsmIを作用させれば、転移したトランスポゾン部や新たにタグが導入された部分、即ちそれまでゲノムに無かった新たな箇所において切断が生じる。これにより、転移したトランスポゾンや導入タグに関するゲノム内の位置情報を得ることができる。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
［実施例１］ＤＮＡ切断酵素活性を持つ領域の同定とI-CsmIポリペプチドの発現
本実施例で用いたChlamydomonas smithii CC-1373及びC. reinhardtii CC-124は、Chlamydomonas genetic center（米国、デューク大学）から入手した。これらの単細胞緑藻はＴＡＰ培地中、２５００ルクス(lux)の一定強度の光線下、激しく振とうしながら２５℃で培養した。
【００３７】
Chlamydomonas smithii (CC-1373)から抽出した全ＤＮＡを鋳型として用い、ＰＣＲ法によりαイントロンを含むＣＯＢ遺伝子全体を増幅した。続いて、Ｎ末端が短縮された３種類の翻訳領域（それぞれ２３７、２１７及び２００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする。）を作製した。これら３種類の翻訳領域（以下、ORF(237)、ORF(217)、及びORF(200)と称する。）は、Ｎ末端アミノ酸をコードする領域が異なるが、αイントロン中に存在する１つの終止コドン（TAA)を共有する（図１参照）。ORF(237)を増幅するためのプライマー対の両末端にはXhoI切断部位を導入した。ORF(200)及びORF(217)を増幅するための正方向プライマーの末端にはNdeI切断部位を導入し、逆方向プライマーの末端にはFbaI切断部位を導入した。上記３種類の翻訳領域を増幅した後、それぞれに適した制限酵素で切断し、ORF(237)についてはpET19ｂベクター（Novagen社製）のXhoI部位に１０個のヒスチジンタグと共にインフレームでクローン化した。一方、他の２種類の翻訳領域はpET15ｂベクター（Novagen社製）のNdeI/BamHI部位に６個のヒスチジンタグと共にインフレームでクローン化した。このようにして作製した構築物を大腸菌DH5/αに導入してプラスミドＤＮＡを増幅した後、大腸菌BL21-CodonPlusTM(DE3)-RIL（Stratagene社製）に導入して短縮されたI-CsmIポリペプチドを大量発現した。
【００３８】
上記の方法により作製した３種類の短縮された翻訳領域を有する大腸菌クローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２０００ｍｌ中、３７℃で培養した。培養液の濁度(OD600nm)が０．６に達したときに終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加することによって遺伝子発現を誘導した。更に、３０℃で４時間培養後、細胞を遠心分離により回収した。回収した大腸菌細胞を、超音波処理用緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、４００ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのβ-メルカプトエタノール及び２０μｇ／ｍｌのリゾチーム）４０ｍｌに懸濁し、氷冷下にて超音波破砕し、続いて１０００００ｘｇ、１時間遠心分離した。上清をあらかじめ洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、４００ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのβ-メルカプトエタノール及び１０ｍＭイミダゾール）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ（キアゲン社製）カラム（総容積５ｍｌ）に負荷した。カラムを５０ｍｌの同緩衝液で洗浄し、１００ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、４００ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのβ-メルカプトエタノール及び２００ｍＭイミダゾール）にてタンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質画分を回収し、保存緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０容量％のグリセリン、及び６ｍＭのβ-メルカプトエタノール）に対して透析して過剰のイミダゾールを除去した。１ｇの湿菌体から６ｍｇのタンパク質が回収された。ORF(237)、ORF(217)、及びORF(200)から合成された産物をそれぞれI-CsmI(237)、I-CsmI(217)、及びI-CsmI(200)と称する。
【００３９】
基質として、イントロンを持たないChlamydomonas reinhardtiiのＣＯＢ遺伝子全域（約４．９ｋｂ）を用いて、ｐＨ７、２５℃、２５ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２の条件下において切断実験を行った。その結果、翻訳領域のＮ末端部分を大きく欠損させた３種類のI-CsmIポリペプチドは、いずれも二本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列を認識して、１．２ｋｂ及び３．７ｋｂの２つのＤＮＡ断片に切断する活性のあることが分かった。
【００４０】
［実施例２］ＤＮＡ切断酵素I-CsmIが認識するＤＮＡ配列長の決定
C. reinhardtiiにおいてαイントロンが挿入されている点を中心にして、５’上流及び３’下流に１２塩基ずつ（合計２４塩基）、１０塩基ずつ（合計２０塩基）、９塩基ずつ（合計１８塩基）からなる化学合成ＤＮＡをpCITE-4a+ベクター（Novagen社製）のEcoRV部位にクローン化した。これらのプラスミドをpC24-nt、pC20-nt、又はpC18-ntと称する。これらのプラスミドを、まずScaIで切断して線状化した後、認識配列を決定するための基質として用いた。すなわち、上記線状化した基質１．５μｇを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．０１％ＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇ、１μｇのI-CsmI(200)を含む反応溶液５０μｌ中、２５℃で２４時間反応し、その反応溶液１０μｌを０．８％アガロースゲル電気泳動で解析した。
【００４１】
その結果、イントロンの挿入点を中心にした２４塩基長の配列を有するプラスミドpC24-ntでは完全に二本鎖ＤＮＡの切断が起こったが、２０塩基長及び１８塩基長の配列を有するpC20-nt及びpC18-ntでは全く切断は認められなかった。これらの結果より、I-CsmI(200)が認識するＤＮＡ配列は、イントロンの挿入点を中心とした２０塩基長を越えて存在し、２４塩基長以内に収まっていることが明らかになった。このように、非常に長い領域に渡ってＤＮＡの塩基配列を認識して切断する酵素はグループＩイントロンの翻訳領域にコードされているホーミングエンドヌクレアーゼを除いて知られていない。現在、遺伝子工学の分野で使われている細菌由来のII型の制限酵素が４塩基又は６塩基の連続したＤＮＡ配列を認識するのに比べて際立った特徴である。
【００４２】
［実施例３］切断部位及び切断末端の形状
実施例２で作成したプラスミドpC24-ntをScaI及びI-CsmI(237)で二重消化して得られた２つのＤＮＡ断片（１．７ｋｂ及び２．０ｋｂ断片）を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、電気溶出法により回収した。それぞれの断片をＴＥ緩衝液中、９５℃で５分間処理し急冷することによって一本鎖ＤＮＡに変換した。この一本鎖ＤＮＡの混合物（コード鎖及び非コード鎖、全量１μｇ）にＴ４ＲＮＡリガーゼ（タカラバイオ株式会社製）４０ユニットを添加して５０μｌの反応溶液（０．００６％ＢＳＡ、２５容量％ポリエチレングリコール６０００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＤＴＴ、及び１ｍＭのＡＴＰ）中、５℃にて１８時間自己連結反応を行った。この自己連結した一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により連結部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅された断片の塩基配列を決定して切断部位の塩基配列を明らかにした。また、切断末端の形状（即ち、平滑末端、或いは３’又は５’突出末端の何れか）を調べるために切断されたＤＮＡ断片を０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＴ４ＤＮＡリガーゼにより処理した。末端を平滑処理した後、１．７ｋｂ及び２．０ｋｂ断片を自己連結させ、連結部位周辺の塩基配列を決定した。
【００４３】
その結果、図２に示したように、コード鎖ではαイントロン挿入部位から５塩基下流で、また、非コード鎖ではαイントロン挿入部位から１塩基下流で切断されていることが分かった。Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる切断断片の処理の結果、末端の４塩基が欠失することが分かり、切断点が３’突出型であることが確認された。
【００４４】
［実施例４］至適反応条件及び動力学的パラメーターの決定
C. reinhardtii (CC-124)のＣＯＢ遺伝子全体とその境界領域を含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片をpT7-Blue2ベクター（Novagen社製）にクローン化したプラスミドをpCOB1.8と称する。このプラスミドを、まずNotIにて切断して線状化し以下の実験の基質として用いた。
【００４５】
上記の線状化した基質ＤＮＡ１．０μｇ（I-CsmI(217)）、又は１．５μｇ（I-CsmI(237)及びI-CsmI(200)）を含む５０μｌの反応溶液（２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ＢＳＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０））を標準として用いた。上記反応条件における１つのパラメーター、即ち、ｐＨ、ＮａＣｌ濃度、Ｍｇ２＋濃度、および反応温度の何れかを変えて、各因子の至適条件を調べた。緩衝液を所定のｐＨに合わせるために用いた試薬は、ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０及び９．０）並びにＴＡＰＳ（ｐＨ１０．０）である。I-CsmI(237)及びI-CsmI(200)による反応は２４時間インキュベートを行ったが、I-CsmI(217)による反応は凝集を防止するために６時間のインキュベーションに短縮した。反応産物は、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドにより染色した。消化された断片の相対量をＮＩＨイメージプログラム（バージョン１．６１）を用いて計算した。
【００４６】
その結果を図３（Ａ）〜（Ｄ）に示した。図中、各グラフには３種類の酵素について横軸に示した条件下における酵素活性をプロットした。各グラフの下に示した電気泳動の写真はI-CsmI(200)によって切断された基質ＤＮＡのパターンを示す。アガロースゲルの各レーンは、上のグラフの横軸に示したそれぞれの条件に対応する。矢じりは加えた基質ＤＮＡの位置を示し、一方、矢印は切断されたＤＮＡの位置を示す。図３（Ａ）に示したように、３種類の酵素の至適ｐＨは、何れも共通してｐＨ７であった。Ｎａ＋及びＭｇ２＋の至適濃度は、I-CsmI(237)及びI-CsmI(200)についてはそれぞれ２５ｍＭ及び５ｍＭであったが、I-CsmI(217)については７５ｍＭと１０ｍＭであった（図３（Ｂ）及び（Ｃ）参照）。至適反応温度は、I-CsmI(237)及びI-CsmI(200)の両方共に３５℃であったが、I-CsmI(217)については３０℃であった（図３（Ｄ）参照）。従って、これら３種類の組換えI-CsmI酵素の至適反応条件は通常の細胞質の生理的条件と一致することが分かった。
【００４７】
上記３種類の酵素の中で、最もＮ末端領域の短縮されたI-CsmI(200)について、線状化したプラスミドpCOB1.8を基質として動力学的パラメーターを決定した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．０１％ＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇ、１μｇの精製されたI-CsmI(200)を含む反応溶液２５０μｌを用いて３０℃で反応を行った。基質濃度を０．５〜１０ｎｇ／μｌの間で種々に変化させて反応を行い、反応混合液から異なった時間で２０μｌの一定量を採取し、これに１μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ及び１．２５μｌの１０％ＳＤＳを添加して反応を停止した。続いて、反応停止混合液を５０℃にて５分間処理して酵素を完全に変性させた。これらの試料を０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ１万倍に希釈したＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Molecular probes社製）で染色して可視化した。消化された断片の相対的強度をイメージアナライザーＬａｓ１０００（富士写真株式会社製）及びＮＩＨ  Ｉｍａｇｅで定量化した。
【００４８】
その結果を図５に示した。図５（Ａ）は、０．５、１、２、５、及び１０ｎｇ／μｌの各濃度の基質ＤＮＡを用いたときの切断反応速度を表したものである。図５（Ｂ）は、Ｋｍ値、Ｖｍａｘ値、及びｋｃａｔ値を求めるために、得られた反応速度に基づいてHanes-Wolf'sプロットを行った結果を示す。その結果、ＤＮＡ切断酵素I-CsmI(200)は、Ｋｍ＝２．５ｘ１０−９（Ｍ）、Ｖｍａｘ＝１．８ｘ１０−１２（Ｍ／ｓ）、及びｋｃａｔ＝４．７ｘ１０−４（／ｓ）を有することが分かった。
【００４９】
［実施例５］切断可能なＤＮＡ配列の決定
ＤＮＡ切断酵素I-CsmIの認識配列を含み、１０４塩基長からなるC. reinhardtiiＣＯＢ遺伝子の特定部分を化学合成し、ＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡに転換した。この二本鎖ＤＮＡを標準とし、一塩基ずつ変異を加えた基質の切断されやすさを比較した。特定の変異を有するＰＣＲプライマーを用いて、実施例２で予想された２４塩基長の認識配列の何れか１塩基を他の３つの塩基に変換した７２種類の基質ＤＮＡを調製した。それぞれ５０ｎｇの基質ＤＮＡを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．０１％ＢＳＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇ、１μｇのI-CsmI(200)を含む反応溶液中、３０℃、８時間処理した。反応液を３％アガロースゲル電気泳動した後、ゲルをＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色し、切断された結果生じたＤＮＡ断片量を、その蛍光強度を測定することにより見積もった。その結果を図４に示した。
【００５０】
図４（Ａ）は種々の一塩基置換を有する基質ＤＮＡのI-CsmI(200)による切断パターンを示す。図中Ｍ．Ｗ．は分子量マーカーを、Ｗは野生型の配列を表す。矢じりは加えた基質ＤＮＡ（１０４塩基長）の位置を示し、一方、矢印は切断されたＤＮＡ（６０及び４４塩基長）の位置を示す。各レーン上部の数字はαイントロン挿入部位との関連を示し、＋は上流側、−は下流側を示す。Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴは塩基置換後の各位置に存在する塩基を示す。図４（Ｂ）は、I-CsmI(200)及びI-CsmI(217)による認識配列の変異導入実験の結果をまとめたものであって、上部にC. reinhardtiiＣＯＢ遺伝子のコード鎖を示す。各位置における３種類の置換可能な塩基を左端のカラムに示した。塩基配列上部の数字はイントロン挿入部位との関連を示す。図中、＋＋＋は野生型よりも切断されやすい塩基変異を、＋＋は野生型と同等に切断される塩基変異を、＋は野生型よりも切断されにくい塩基変異を、−はほとんど切断されない塩基変異をそして黒丸は野生型の塩基を示す。
【００５１】
これらの結果より、切断を阻害する塩基変異は、イントロン挿入部位の−５位から＋１１位に位置した。すなわち、配列番号１に示した１６塩基対の非対称の塩基配列は、I-CsmIが基質を認識するために必要である。一方、この認識配列の中の特定の塩基については他の塩基に置換されていてもI-CsmIにより切断可能であり、いわゆる特異性縮退又は特異性寛容が生じている。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】Chlamydomonas smithiiのＣＯＢ遺伝子領域における、Ｎ末端の短縮したＤＮＡ切断酵素I-CsmIをコードする翻訳領域を表わした模式図である。図中、＊はＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの位置を、a.a.はアミノ酸残基を示す。
【図２】ＤＮＡ切断酵素I-CsmIの切断部位及び切断末端の形状を表わす。
【図３】I-CsmIによる基質ＤＮＡの切断反応におけるｐＨ，Ｍｇ２＋、Ｎａ＋及び反応温度の影響を表わしたグラフ及び電気泳動パターンである。◆：I-CsmI(237)、▲：I-CsmI(217)、■：I-CsmI(200)
【図４】I-CsmIの認識配列に種々の一塩基置換変異を導入したときの切断パターン（Ａ）及びその解析結果（Ｂ）である。
【図５】種々の濃度の線状化した基質ＤＮＡを用いてI-CsmI(200)によるＤＮＡ切断反応速度を解析した結果を示す。◆：０．５ｎｇ／μｌ、■：１ｎｇ／μｌ、▲：２ｎｇ／μｌ、×：５ｎｇ／μｌ、＊：１０ｎｇ／μｌ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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