(57)【要約】【課題】高感度かつ、夾雑物の非特異的吸着の低減したバイオセンサー系の提供。【解決手段】バイオセンサー表面にポリエチレングリコール修飾ナノ粒子を固定化または固定化できるバイオアッセイ系。【選択図】      図１
2005180921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）  構造式Ｉ：
【化１】
2005180921.tif 000017
式中、ＰＣＬは自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子を表し、
Ｘはバイオセンサーチップ表面に結合することのできる官能基もしくは機能性部分を表し、
ＹはＣ1−Ｃ6アルキル基、Ｘの官能基もしくは機能性部分を形成するのに使用できる保護されていてもよい官能基およびＸと同一もしくは異なる機能性部分からなる群より選ばれる１種以上の基もしくは部分を表し、ＬはＰＣＬに結合する基もしくは結合部分を表し、
Ｗ1およびＷ2は、単結合または同一もしくは異なる連結基を表し、
ＰＥＧは、エチレンオキシド単位：（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である。）を表し、
ここで、（Ｘ−Ｗ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌ)x と (Ｌ−Ｗ1−ＰＥＧ−Ｗ2−Ｙ)yにおけるＷ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌは同一もしくは異なることができ、そして
ｘおよびｙは、独立して１以上の整数であり、かつ、一緒になってＰＥＧ鎖が水性媒体中でＰＣＬの表面を被覆するのに十分な整数を表す
のポリエチレングリコール修飾ナノ粒子と、（Ｂ）  （Ａ）の粒子がＸを介して結合することができ、かつガラスまたはＰＣＬの材料に担当する材料からなる表面を有するバイオセンサーチップとのセットを含んでなるバイオアッセイに用いるためのバイオセンサー系。
【請求項２】
（Ａ）の粒子と（Ｂ）のバイオセンサーチップ表面がＸを介して結合することにより、（Ａ）の粒子が（Ｂ）のバイオセンサーチップの一つの表面の一部領域もしくは全領域を実質的に被覆するように担持された請求項１記載のバイオセンサー系。
【請求項３】
（Ａ）の粒子と（Ｂ）のバイオセンサーチップ表面が、相互に結合されうるか、または水性媒体中で被検体の競合作用により被検体により置換されるように結合した状態で使用されるものである請求項１記載のバイオセンサー系。
【請求項４】
構造式Ｉにおける−Ｌ−が
【化２】
2005180921.tif 000018
（ここで、ｐは独立して２−１２のいずれかの整数を表し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1−Ｃ6アルキル基を表し、そしてｍは２−１００のいずれかの整数を表す）の基を表し、
Ｗ1およびＷ2が独立して、単結合、Ｃ1−Ｃ6アルキレン、−ＣＯＯ−（酸素原子を介してエチレンオキシド単位のメチレン基に結合する）、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｃ1−Ｃ6アルキレン)−ＣＯＯ−、−(Ｃ1−Ｃ6アルキレン)−Ｏ−および−(Ｃ1−Ｃ6アルキレン)−Ｓ−からなる群より選ばれる基を表す、請求項１記載のバイオセンサー系。
【請求項５】
（Ａ）の粒子における構造式IのＸが生物学的な特異的結合対を形成する一員の残基であり、（Ｂ）のセンサーチップが構造式IのＰＣＬを形成する材料に対応する材料製の薄膜表面を有しており、そして該表面にＸの生物学的な特異的結合対を形成する一員に対する他の一員が直接または少なくともＣ1−Ｃ6アルキレン基もしくは（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である）を介して担持されている、請求項１記載のバイオセンサー系。
【請求項６】
（Ａ）の粒子における構造式ＩのＸが
【化３】
2005180921.tif 000019
（ここで、ｐは独立して２−１２のいずれかの整数を表し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1−Ｃ6アルキルを表す）の基を表し、（Ｂ）のセンサーチップが構造式IのＰＣＬを形成する材料のいずれかから製造された薄膜表面か、またはガラス表面を有しており、そして、（Ａ）の粒子と（Ｂ）の表面がＸの官能基を介して結合しており、但し、（Ｂ）の表面がガラス製である場合にはＸがトリアルコキシシリルを有する、請求項１記載のバイオセンサー系。
【請求項７】
（Ａ）の粒子の構造式ＩにおけるＹが式
【化４】
2005180921.tif 000020
（ここで、Ｒaは独立して、水素原子またはＣ1−Ｃ6アルキルを表し、Ｒbは独立してＣ1−Ｃ6アルキルオキシまたは２つのＲbが一緒になってオキシもしくはＣ1−Ｃ6アルキルで置換されていてもよいエチレン基を形成する原子団を表す）の基である請求項５記載のバイオセンサー系。
【請求項８】
（Ａ）の粒子の構造式（Ｉ）におけるｘ＋ｙが１ｎｍ2当たり０.１−０.５に相当するいずれかの整数である請求項１記載バイオセンサー系。
【請求項９】
（Ａ）の粒子中のＰＣＬが５〜５００ｎｍの平均横断面の長さを有する請求項１記載のバイオセンサー系。
【請求項１０】
構造式Ｉ：
【化５】
2005180921.tif 000021
式中、ＰＣＬは自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子を表し、
Ｘはバイオセンサーチップ表面に結合することのできる官能基もしくは機能性部分を表し、
ＹはＣ1−Ｃ6アルキル基、Ｘの官能基もしくは機能性部分を形成するのに使用できる保護されていてもよい官能基およびＸと同一もしくは異なる機能性部分からなる群より選ばれる１種以上の基もしくは部分を表し、ＬはＰＣＬに結合する基もしくは結合部分を表し、
Ｗ1およびＷ2は、単結合または同一もしくは異なる連結基を表し、
ＰＥＧは、エチレンオキシド単位：（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である。）を表し、
ここで、(Ｘ−Ｗ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌ)x と (Ｌ−Ｗ1−ＰＥＧ−Ｗ2−Ｙ)ｙにおけるＷ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌは同一もしくは異なることができ、Ｘが生物学的な特異的結合対を形成する一員の残基であり、Ｙが生物学的な特異的結合対を形成する残基以外の基であり、
Ｌは、式
【化６】
2005180921.tif 000022
（ここで、ｐは２−１２のいずれかの整数を表し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1−Ｃ6アルキル基を表し、そしてｍは２−１００のいずれかの整数を表す）の基を表し、
そしてｘ＋ｙはＰＣＬの表面１ｎｍ2当たり０.１−０.５に相当するいずれかの数であり、（ｘ／ｘ＋ｙ）×１００が１−９９の整数であり、そしてＰＣＬの横断面の平均寸法が５−５００ｎｍであるポリエチレングリコール修飾ナノ粒子。
【請求項１１】
Ｘの生物学的な特異的結合対を形成する一員が単糖もしくはオリゴ糖、抗原もしくはハプテン、基質、ホルモンおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる物質由来の残基である請求項１０記載のポリエチレングリコール化ナノ粒子。
【請求項１２】
（ａ）  請求項１０記載のポリエチレングリコール修飾ナノ粒子を用意し、
（ｂ）  該ナノ粒子のＰＣＬの材料に対応する薄膜表面を有し、該ナノ粒子のＸの生物学的な特異的結合対の一員に対する他の一員が直接または少なくともＣ1−Ｃ6アルキレン基もしくは（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である）を介して担持され表面を有するバイオセンサーチップを用意し、
（ｃ）  （ａ）の粒子および（ｂ）のバイオセンサーチップを該生物学的な特異的結合を形成しうる構成員のいずれかの一員を被検体として含むことが疑われる生物学的流体と接触させ、
（ｄ）  被検体の競合作用による（ａ）の粒子と（ｂ）のバイオセンサーチップ表面との結合の程度の変化を決定し、
（ｅ）  該変化を生物学的流体中の被検体濃度の指標とする、
ことを含んでなる生物学的流体中の被検体の検出方法。
【請求項１３】
段階（ｄ）の（ａ）の粒子と（ｂ）のバイオセンサーチップとの結合の程度の変化が、表面プラズモン共鳴スペクトルの変化により検出される請求項１２記載の検出方法。
【請求項１４】
生物学的な特異的結合対を形成しうる構成員が糖とそれに対するレクチン、抗原もしくはハプテンとそれに対する抗体、基質とそれに対する酵素、ホルモンとそれに対する受容体タンパク質、オリゴヌクレオチドとそれの相補鎖配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドからなる群より選ばれる請求項１２記載の検出方法。
【請求項１５】
（ａ）の粒子と（ｂ）のバイオセンサーチップ表面とが生物学的な特異的結合対を形成して予め結合されている請求項１２記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオアッセイの技術分野に関し、より具体的には、生物学的流体等に含まれる被検体以外の夾雑物による非特異吸着もしくは結合を低減もしくは防止するか、被検体の検出感度を高めることのできるバイオセンサー系、ならびに該バイオセンサー系を使用するアッセイ方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物学的試料中に存在する被検体を検出する方法として、多種多様な検出様式をもつバイオセンサーが提案されている。そのようなバイオセンサーの中で、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲともいう）を利用するセンサーは、金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率変化に対して敏感である（例えば、非特許文献１参照）。ＳＰＲは、表面と複雑な生物学的溶液との間で生じる過程のインサイチュ（in situ）での観察が可能であり、そして例えば標識を使用することなくリアルタイムに被検体からのデータが入手できるので、動力学的および熱力学的なパラメーターを取得するのに適していることから注目を集めているセンサーの一つである。
【０００３】
このような表面をもつバイオセンサーチップの典型的なものとしては、アマシャム  ファルマシア  バイオテク（株）から入手できるＢＩＡＣＯＲＥ（商標）がある。このＢＩＡＣＯＲＥは、末端がカルボキシル化されたデキストランのマトリックスが半透明の状態で金の薄膜上に固定されている。より具体的には、式ＨＳ−Ｒ−Ｙ（Ｒは１０原子を越える鎖の長さを有し、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭化水素鎖であり、Ｙはリガンド又は生適合性多孔質マトリックスを共有結合させるための活性基である）で表される有機分子を用いて、そのチオール（またはメルカプト）基を介して金、銀などの自由電子金属の薄膜表面へ結合させて密に詰め込まれた単層で該表面を被覆し、次いで、生適合性多孔質マトリックスとして、リガンドを結合させるための官能基を有していてもよいアガロース、デキストラン、ポリエチレングリコール等からなるヒドロゲルを共有結合した表面を有するバイオセンサーチップが提供されている（例えば、特許文献１参照。）。このようなバイオセンサーチップ上での生物学的物質、例えば、タンパク質の検出に際しては、ＳＰＲシグナルの一定の増幅および非特異吸着の防止が達成される。
【０００４】
また、主として、目的とする被検体タンパク質等の測定に際して、生物学的流体中等に存在する夾雑物のセンサーチップ表面への非特異吸着を防止するものとして、支持体上へ硫黄原子（メルカプト基の）を介して結合したスペーサー分子（炭素原子数１〜３０のアルキレン鎖）に親水性リンカー部（鎖長４から１５原子の直鎖分子）と固相反応物質（ビオチン誘導体残基）が順に共有結合した表面を有するセンサーチップも提供されている（例えば、特許文献２参照。）。また、ＨＳ−スペーサー分子（炭素原子数１１のアルキレン鎖）−親水性リンカー（エチレンオキシド単位３個または６個からなる鎖）−をベースとする化合物を用い、メルカプト基を介して金表面に自己集成した単層を有するセンサーチップも提供されている（例えば、非特許文献２参照。）。さらに、エチレンオキシド単位が５−１０,０００の範囲にあるヘテロテレケリックポリマーを担持する表面をもつセンサーチップを提案されている（特許文献３参照。）。
【０００５】
上述のとおり、このような表面を有するセンサーチップはＳＰＲシグナルの一定の増幅も達成される。しかしながら、さらなる検出感度を高め得るバイオセンサー系として、コロイド金（Ａｕ）を金薄膜表面（これらの表面には、上記の各文献に記載されているような、デキストラン層、ポリエチレングリコール層を担持しない。）を有するセンサーチップと組み合わせて使用するものも多数提供されている。一般に、かような系では、コロイド金を使用しない系に比べて、プラズモン角の大きなシフト、広幅なプラズモン共鳴および最低反射率の著しい増大がもたらされること等が、利点として挙げられている（例えば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、特許文献４、特許文献５参照。）。これらの金コロイドまたは金ナノ粒子をＳＰＲの増幅もしくは増強に用いる系のセンサーチップ表面は、共通して、金薄膜上をアルカンチオール（例えば、３−メルカプトプロピオン酸もしくは３−メルカプトエチルアミン）等で修飾し、次いでビオチンまたはアビジンもしくはストレプトアビジン、抗体、等を共有結合させている。金コロイドまたは金ナノ粒子は、上記のようなアルカンチオール類を用いるか、または用いることなく、タンパク質を結合（化学的吸着を含む。）して、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体のごとき、生物学的な特異的結合対を形成することにより、上記のセンサーチップ表面に結合させている。また、上記の非特許文献５では、金または銀の支持体（センサーチップ）上に２−アミノエタンチオール（ＡＥＴ）または１,６−ヘキサンジチオール（ＨＤＴ）を用いて、直接、金ナノ粒子を固定すると、Ａｕ／ＡＥＴ／Ａｕ系は増強されたＳＰＲ感度を示すが、Ａｕ／ＨＤＴ／Ａｕ系は、金ナノ粒子の増幅効果が相当低くなることが示唆されている（その第１１１５９頁、序の項参照。）。またさらに、上記のような金ナノ粒子を用いてガラス製センサーチップ上に自己集成単層を形成すると、可視−ＵＶスペクトロフォトメーターで、チップ表面上で生物分子間の相互作用がリアルタイムに追跡できることも知られている（例えば、非特許文献６参照。）。
【０００６】
なお、上記のようなバイオセンサー系を構成するものでないが、バイオアッセイにおける標識として用いる金属粒子の表面をポリエチレングリコール（またはポリエチレンオキシドともいう）のような水溶性で、かつ、水性媒体中でモビリティの高いポリマー鎖で修飾し、該粒子の分散安定性を改善する方法（非特許文献７参照。）や、金属粒子表面に結合したポリエチレングリコールの該結合部位の他の末端に機能性化合物の残基を有するポリエチレングリコール化［以下、ＰＥＧ修飾（PEG modified）ともいう。］金属粒子、半導体粒子または磁性粒子も水性媒体中で分散安定性を示すものとして知られている（非特許文献８、特許文献６、特許文献７参照。）。また、半導体ナノ粒子をポリマー（例えば、ジアセチレン、スチレン等で取り囲むようにした粒子を生物学的な物質を検出するためのプローブとして用いることも提案されている（例えば、特許文献８参照。）。
【０００７】
上述の金ナノ粒子をＳＰＲの感度の向上に用いる系では、金ナノ粒子とバイオセンサーチップの金薄膜表面との間の距離または粒子と表面との結合様式によって増感効果が異なることが示唆されている（例えば、上記の非特許文献６参照。）。したがって、上述のような金ナノ粒子とバイオセンサーチップを用いる系を特許文献１に記載されるような表面に適用しても、感度が低下するか、または夾雑物の非特異吸着の防止ができない、可能性がある。
【０００８】
［特許文献１］
特開平４−５０１６０５公報
［特許文献２］
米国特許第３０７１８２３号明細書
［特許文献３］
国際公開第０１／８６３０１号パンフレット
［特許文献４］
特開２００２−２６７６６９公報
［特許文献５］
特開２０００−５５９２０号公報
［特許文献６］
特開２００１−２０００５０号公報
［特許文献７］
特開２００２−８０９０３号公報
［特許文献８］
米国特許第６２０７３９２号明細書
［非特許文献１］
A．Szabo et al.，Curr．Opin．Strnct．Biol．５（１９９５）６９９−７０５
［非特許文献２］
Roberts et al.，J．Am．Chem．Soc．１９９８，１２０，６５４８−６５５５
［非特許文献３］
L．A．Lyon et al.，Anal．Chem．１９９８，７０，５１７７−５１８３、特に、５１７７頁の序の項
［非特許文献４］
L．He et al.，J．Am．Chem．Soc．２０００，１２２，９０７１−９０７７
［非特許文献５］
E．Hutter et al.，J．Phys．Chem．B ２００１，１０５，１１１５９−１１１６８
［非特許文献６］
N．Nath et al.，Anal．Chem．２００２，７４，５０４−５０９
［非特許文献７］
W. Pwuelfine et al., J. Am. Chem. Soc．１２０（４８），１２６９６−１２６９７（１９９８）
［非特許文献８］
Otsuka et al.，J．Am．Chem．Soc．２００１，１２３，８２２６−８２３０
なお、以上の文献は引用することにより、それらの内容はそっくり本明細書の内容となる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、以上に述べたＳＰＲ等を利用するセンサーの感度をさらに高め、しかも、夾雑タンパク質等による非特異的吸着を抑制したセンサーチップ表面およびアッセイ系の提供にある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＢＩＡＣＯＲＥ(R)のセンサーチップや、ポリエチレングリコール修飾表面をもつセンサーチップと、主として水性媒体中での分散安定性を改善するものとして提供されているポリエチレングリコール修飾金属粒子もしくは半導体粒子を組み合わせて用いると、対応するセンサーチップによるバイオアッセイの感度を高め得るとともに、夾雑物による非特異吸着を防止または抑制できることを見出した。本発明は、かような知見に基づき、完成されたものである。
【００１１】
本発明によれば、（Ａ）  構造式Ｉ：
【００１２】
【化７】
2005180921.tif 000003
【００１３】
式中、ＰＣＬは自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子を表し、
Ｘはバイオセンサーチップ表面に結合することのできる官能基もしくは機能性部分を表し、
ＹはＣ1−Ｃ6アルキル基、Ｘの官能基もしくは機能性部分を形成するのに使用できる保護されていてもよい官能基およびＸと同一もしくは異なる機能性部分からなる群より選ばれる１種以上の基もしくは部分を表し、ＬはＰＣＬに結合する基もしくは結合部分を表し、
Ｗ1およびＷ2は、単結合または同一もしくは異なる連結基を表し、
ＰＥＧは、エチレンオキシド単位：（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である。）を表し、
ここで、（Ｘ−Ｗ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌ)x と (Ｌ−Ｗ1−ＰＥＧ−Ｗ2−Ｙ)yにおけるＷ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌは同一もしくは異なることができ、そして
ｘおよびｙは、独立して１以上の整数であり、かつ、一緒になってＰＥＧ鎖が水性媒体中でＰＣＬの表面を被覆するのに十分な整数を表す
のポリエチレングリコール修飾ナノ粒子と、（Ｂ）  （Ａ）の粒子がＸを介して結合することができ、かつガラスなどの誘電体またはＰＣＬの材料に担当する材料からなる表面を有するバイオセンサーチップとのセットを含んでなるバイオアッセイに用いるためのバイオセンサー系が提供される。
【００１４】
別の態様の本発明として、前記の構造式IにおけるＸが生物学的な特異的結合対を形成する一員の残基であり、Ｙが生物学的な特異的結合対を形成する残基以外の基であり、
Ｌは、式
【００１５】
【化８】
2005180921.tif 000004
【００１６】
（ここで、ｐは２−１２のいずれかの整数を表し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1−Ｃ6アルキル基を表し、そしてｍは２〜１００のいずれかの整数を表す）の基を表し、そしてｘ＋ｙはＰＣＬの表面１ｎｍ2当たり０.１−０.５、好ましくは０.２５−０.４０に相当するいずれかの数であり、（ｘ／ｘ＋ｙ）×１００が１−９９、好ましくは２０−６５の整数であり、そしてＰＣＬの横断面の平均寸法が１−５００ｎｍ、好ましくは５−５００ｎｍであるポリエチレングリコール修飾ナノ粒子も提供される。
【００１７】
さらに別の態様の発明として、（ａ）  前記ポリエチレングリコール修飾ナノ粒子を用意し、
（ｂ）  該ナノ粒子のＰＣＬの材料に対応する薄膜表面を有し、該ナノ粒子のＸの生物学的な特異的結合対の一員に対する他の一員が直接または少なくともＣ1−Ｃ6アルキレン基もしくは(−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である）を介して担持された表面を有するバイオセンサーチップを用意し、
（ｃ）  （ａ）の粒子および（ｂ）のバイオセンサーチップを該生物学的な特異的結合を形成しうる構成員のいずれかの一員を被検体として含むことが疑われる生物学的流体と接触させ、
（ｄ）  被検体の競合作用による（ａ）の粒子と（ｂ）のバイオセンサーチップ表面との結合の程度の変化を決定し、
（ｅ）  該変化を生物学的流体中の被検体濃度の指標とする、
ことを含んでなる生物学的流体中の被検体の検出方法も、提供される。
【００１８】
本発明に従う、（Ａ）の粒子と（Ｂ）のバイオセンサーチップとのセットは、それらが結合（共有結合または非共有結合（例えば、生物学的な特異的結合にみられる疎水結合、イオン結合、化学吸着、等））を形成すると、例えば共鳴ラマン散乱を表面増感効果により増大させる。
【００１９】
特に、自由電子金属微粒子にあっては表面プラズモン共鳴シグナルの著しい変化（プラズモン角の大きなシフト、広幅なプラズモン共鳴および最低反射率の増大）がもたらされる。驚くべきことに、このような変化は、バイオセンサーチップ上にかなりの厚さをもつデキストラン層を担持するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサーチップと該（Ａ）の粒子が結合した場合にも認められる。
【００２０】
さらに、本発明に従う、（Ａ）の粒子で被覆された（Ｂ）のバイオセンサーチップ表面は、仮に該チップ表面が上記のようなデキストラン層やポリエチレングリコール修飾されていなくても、例えば、生物学的流体中に存在するタンパク質等の非特異的吸着を有意に抑制できる。
【００２１】
以下、本発明をさらに具体的に述べる。
【００２２】
本発明に従うバイオセンサー系の特に注視している使用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したバイオアッセイ（生物分子のアッセイ）に向けられているが、本発明にいうアッセイはＳＰＲ以外のトレースできるシグナル、放射能、各種電磁波の接触角、沈降、紫外分光、ラマン散乱、等の変化を利用するものも包含する。本発明にいうバイオアッセイが検出対象とする生物分子は、所謂、生物学的な特異的結合対（例えば、生物分子どうしが疎水結合、イオン結合、等によって形成する。）、より具体的には非共有結合対を形成する構成員、リガントとレセプター、例えば、抗原もしくはハプテンと抗体、糖とレクチン、基質と酵素、ホルモンとその受容体、オリゴヌクレオチドとそれの相補鎖、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン類のごとき結合対を形成するいずれかの構成員であることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明にいう「バイオセンサー系」とは、上記のごときアッセイを行うのに用いることのできる各要素またはそれらの集成体もしくは組み合わせ物を意味する。さらに、本明細書では、「微粒子」および「ナノ粒子」は、互換可能に使用されており、特記されない限り、ナノオーダーのものに限定されることなく、サブナノまたは数マイクロメーターのものまで包含するものとして用いられている。
【００２４】
以下、本発明の構成について詳述する。
（Ａ）  構造式Ｉで表されるＰＥＧ修飾ナノ粒子に関して
ＰＣＬは、自由電子金属（例えば、金、銀、白金、アルミニウム、銅、等）、半導体（例えば、ＣｄＳ、ＺｎＳ、ＣｄＳｅ、ＩｎＡｓ等）および金属酸化物（例えば、ＴｉＯ4、Ｃｒ2Ｏ3等）からなる群より選ばれる材料製の微粒子であることができる。限定されるものでないが、１〜５００ｎｍの平均横断面の寸法を有するものが都合よく利用できる。
【００２５】
Ｌは、上記粒子表面に結合（化学結合もしくは化学吸着、金属酸化物にあっては、水酸化により生じる表面−ＯＨ基を介する共有結合等）しうる基もしくは部分を介する結合であり、本発明の目的に沿うものであれば、いかなるものであってもよい。しかし、好ましくは、次式（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）
【００２６】
【化９】
2005180921.tif 000005
【００２７】
からなる群より選ばれる基を介する結合を表す（ここで、ｐは２〜１２のいずれかの整数を表し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立してＣ1−Ｃ6アルキル基を表し、そしてｍは２−５００、好ましくは５〜１００のいずれかの整数を表す。）。かような結合は、例えば（ｉ）および（ｉｉｉ）の基または部分（もしくはセグメント）であるときは、上記の粒子表面との間で形成されるものであることができ、また、（ｉｉ）の基または部分であるときは、水酸化された金属酸化物表面の−ＯＨとシラノール基との間の脱アルコール反応を伴って形成される結合であることもできる。
【００２８】
ＰＥＧは、エチレンオキシド単位：(−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)n（ここで、ｎは５−１０,０００、好ましくは１０〜１０,０００、より好ましくは２０〜２５００のいずれかの整数である。）である。
【００２９】
Ｘはバイオセンサーチップ表面に結合することのできる官能基もしくは機能性部分を表す。官能基もしくは機能性部分は、上記のＬを形成しうるものとして例示した式（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）で示される基もしくは部分であることもでき、さらに、上記の生物学的な特異的結合対を形成しうる一構成員の残基、ならびにバイオアッセイに影響を及ぼさないタンパク質の残基であることもできる。
【００３０】
該特異的結合対の構成員のうち、一般に分子量の小さいもの、例えば、ハプテン、糖、基質、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ビオチン由来の残基が好ましい。
【００３１】
ＹはＣ1−Ｃ6アルキル基、Ｘについて定義した基もしくは機能性部分またはその保護された形態にある部分またはＸとは別の基もしくは機能性部分またはその保護された形態にある基もしくは部分であることができる。Ｘとは別の基もしくは部分の代表的なものとしては、次式（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）
【００３２】
【化１０】
2005180921.tif 000006
【００３３】
（ここで、Ｒaは独立して、水素原子またはＣ1−Ｃ6アルキルを表し、Ｒbは独立してＣ1−Ｃ6アルキルオキシまたは２つのＲbが一緒になってオキシもしくはＣ1−Ｃ6アルキルで置換されていてもよいエチレン基を形成する原子団を表す。）で表される基から選ばれるものが挙げられる。Ｙの好ましいものとしては、上記式（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）、並びにＸについて定義した、式（ｉ）およびＣ1−Ｃ6アルキル基からなる群より選ばれる基もしくは部分を挙げることができる。
【００３４】
Ｗ1およびＷ2は独立して、連結基、例えば単結合、Ｃ1−Ｃ6アルキレン、−ＣＯＯ−（酸素原子を介してエチレンオキシド単位のメチレン基に結合する）、−Ｏ−、−Ｓ−、−(Ｃ1−Ｃ6アルキレン)−ＣＯＯ−、−(Ｃ1−Ｃ6アルキレン)−Ｏ−および−(Ｃ1−Ｃ6アルキレン)−Ｓ−からなる群より選ばれる基であることができる。
【００３５】
以上の各基、部分および／またはセグメントから構成される式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
(ＩＩ)    Ｘ−Ｗ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌ  および
(ＩＩＩ)  Ｌ−Ｗ1−ＰＥＧ−Ｗ2−Ｙ
で表されるポリマーは、上記ＸおよびＹの定義から理解できるように同一であることができるが、異なっていることが好ましい。また、これらの式中のＷ2−ＰＥＧ−Ｗ1−Ｌは同一もしくは異なることができる。式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表されるポリマーは、それぞれ独立して１以上の整数個（それぞれ、ｘおよびｙの整数に対応する。）が単一ＰＣＬ表面上に結合する。これらのｘ＋ｙは、ＰＣＬ表面をＰＥＧ鎖が被覆するのに十分な整数で存在する。この数は、本発明に従う、ポリエチレングリコール化粒子表面（かような粒子でセンサーチップ表面が被覆された場合にはその被覆表面）に水性媒体中で非特異的なタンパク質等の吸着が抑制できる数であろう。抑制の程度については、後述する実施例を参考にできる。なお、非特異的なタンパク質等の吸着とは、例えば、Ｘが生物学的な特異的結合対を形成しうる一員、例えば、抗原である場合に、それに対する抗体が結合するような特異的結合を介するもの以外の吸着を意味する。限定されるものでないが、ｘ＋ｙの具体的な数は、ＰＣＬ表面１ｎｍ2当たり０.１−０.５、好ましくは０.２５−０.４０となる数に相当するいずれかの数である。ｘとｙの割合は、上述のとおり、式（ＩＩ）と式（ＩＩＩ）で表されるポリマーが同一であることができるように、任意であることができる。しかし、後述するような、バイオセンサー表面と該ＰＥＧ修飾粒子との生物学的な特異的結合に対する被検体の競合作用を利用するようなアッセイにおいては、ｘとｙの総数当たりのｘの割合は、１−９９、好ましくは２０−６５であることができる。このような割合で式（ＩＩ）（Ｘが生物学的な特異的結合対を形成する一員である。）のポリマーと式（ＩＩＩ）（ＹがＸと異なり、Ｘと結合しない基もしくは部分である。）のポリマーをＰＣＬ上に配置できる。このような態様の粒子は、迅速かつ、高感度のアッセイを行うことに役立つ。
【００３６】
以上のポリエチレングリコール化粒子の典型的なものは、上述の Otsuka et al.，J．Am．Chem．Soc．２００１，１２３，８２２６−８２３０、特開２００１−２０００５０号公報、特開２００２−８０９０３号公報に記載されており、また、これらの記載に準じて製造できる。また、該粒子を形成するために利用できる。特に、ヘテロテレケリックポリマーは、本発明の一部が提案した、ＷＯ  ９６／３２４３４、ＷＯ  ９６／３３２３３、ＷＯ  ９７／０６２０２に記載するブロックコポリマーのα，ω−末端の機能化を参考すれば、当業者にとって容易に製造できるであろう。
【００３７】
なお、上記の定義中で用いた、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルキルオキシ、Ｃ1−Ｃ6アルキレンが、異なる基または部分について用いられている場合であっても、それらは共通の意味を有する。例えば、Ｃ1−Ｃ6アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ.−ブチル、ｎ−ヘキシル等を表し、Ｃ1−Ｃ6アルキルオキシとしては、上記Ｃ1−Ｃ6アルキルのそれぞれの対応するアルキルオキシが例示される。また、Ｃ1−Ｃ6−アルキレンは、メチレン、エチレン、プロピレン、１,３−トリメチレン、１,６−ヘキサメチレン等である。
（Ｂ）  バイオセンサーチップに関して
バイオセンサーチップは、その表面が上記（Ａ）で詳述したＰＥＧ修飾ナノ粒子のＸ基もしくは部分と結合でき、バイオアッセイに利用できるものであれば、その形状、寸法に制限はない。しかし、好ましくは、その表面はセットで用いられるＰＣＬを形成する材料と同一もしくは同一のクラス（例えば、自由電子金属の場合、金と金、金と銀；半導体の場合、ＣｄＳとＣｄＳ、ＣｄＳとＩｎＡｓ）となるように選ぶのが、（Ａ）の粒子と該センサーチップから得られる上述のごときシグナルを増強するのに好ましい。しかし、可視−ＵＶスペクトロメーターを用いてシグナルを検出する場合には、これらの光を透過するクリスタルまたはガラスであることもできる。該表面は、通常、対応する材料を蒸着させた薄膜であることができる。
【００３８】
このような表面は、上記（Ａ）の粒子におけるＸの基もしくは部分との結合形成が促進できるように修飾されているか、また、Ｘがタンパク質である場合には、材料それら自体であることができる。かような修飾は、式（Ｉ）におけるＬについて記載したような、ＰＣＬとの結合性を示す基もしくは部分を少なくとも一片末端にもつ有機化合物で行うことができる。例えば、金、銀、半導体から形成された表面をもつチップでは、アルカンチオール（例えば、３−メルカプトプロピオン酸もしくは２−メルカプトアミン）を用いて表面を修飾した後、遊離のカルボキシル基もしくはアミノ基を利用して、生物学的な特異的結合対を形成しうる一員（Ｘの一員に対するもの）を共有結合して好ましい表面を完成することができる。このような表面をもつバイオセンサーチップとしては、上述の非特許文献３、非特許文献５、特許文献４、特許文献５に記載されたものが例示できる。
【００３９】
また、表面にデキストラン層を担持したＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサーチップ、ポリ（オキシエチレン）鎖を中間に有するヘテロテレケリックポリマーで被覆された表面をもつセンサーチップ（例えば、特許文献３参照）をもつものも、本発明で使用できる。
【００４０】
その他のセンサーチップも、当業者であれば、以上の従来技術を参照することにより作製できるであろう。
【００４１】
以上のＰＣＬ表面およびセンサーチップ表面を修飾するのに用いることのできる典型的なヘテロテレケリップポリマーは、下記の反応スキームに従って製造できる。
反応スキームＩ：
【００４２】
【化１１】
2005180921.tif 000007
【００４３】
反応スキームＩＩ−ａ：
【００４４】
【化１２】
2005180921.tif 000008
【００４５】
反応スキームＩＩ−ｂ：
【００４６】
【化１３】
2005180921.tif 000009
【００４７】
（以上の各式中の略号は、Ｍはカリウム、ナトリウム、リチウムを表す。)
以上のリビング重合工程は、それ自体公知の反応条件の下で実施できる（例えば、上記のＷＯ ９６／３２４３４、ＷＯ ９７／０６２０２、等を参照されたい。引用することにより、これらの文献の内容は本明細書の内容となる。）。その他は、後述する実施例に従い、または記載されている条件を改変して実施できる。
【００４８】
また、式
【００４９】
【化１４】
2005180921.tif 000010
【００５０】
は、本発明者らの一部による Kataoka et al., Macromolecules、１９９９、３２、６８９２−６８９４（この文献の内容は、引用することにより本明細書の内容となる）に記載の方法に従って得ることができる。ＰＥＧ  Ｍｗ＝５０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＡＭＡ（ポリ［（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］）の重合度ｍ＝６８）を後述するＰＥＧ修飾微粒子の作成に用いる。
【００５１】
これらのポリマーを用いるＰＣＬのＰＥＧ修飾について、簡単に述べると、構造式ＩにおけるＰＣＬを構成する自由電子金属微粒子、金属酸化物微粒子または半導体微粒子は、それぞれ、市販品を利用するか、それぞれ相当するコロイドを形成することにより得た微粒子を利用することができる。また、本発明に従うＰＥＧ修飾ナノ粒子は、例えば、それぞれ相当する微粒子（例えば、０.５ｎｍ〜１μｍ、好ましくは１ｎｍ〜２００ｎｍの平均粒径）を形成する工程中に上述の前駆体ポリマーを共存させて形成することにより、前駆体ポリマーが微粒子表面に結合した、構造式Ｉの表面またはその前駆表面を作成することもできる。（Ａ）の粒子と（Ｂ）のセンサーチップのセットに関して
（Ｂ）のセンサーチップ表面がＢＩＡＣＯＲＥ（商標）のようなデキストラン層をもつものまたはＷＯ  ０１／８６３０１  Ａ１に記載されているようにポリ（エチレンオキシド）鎖を中間に有するポリマーで修飾されたもの以外は、被検体を含むことが疑われる試料液と接触する表面が（Ａ）の粒子で実質的に被覆されるように、（Ａ）の粒子と（Ｂ）のセンサーチップは使用され、特に、これらは結合した状態で使用される。こうして、（Ａ）の粒子が（Ｂ）のセンサーチップ表面を被覆した形態にある表面は、（Ａ）の粒子表面上の式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表されるポリマーの作用により、表面へのタンパク質等の非特異的吸着を有意に抑制できる。勿論のこと、粒子による各種シグナルの増幅効果も得られる。
【００５２】
また、（Ａ）の粒子におけるＸが生物学的な特異的結合対を形成する一員であり、（Ｂ）のセンサーチップ表面上に、該一員に対する他の一員が存在する場合には、アッセイの概念について略図的に示す図１に示すような態様で、（Ａ）の粒子と（Ｂ）のセンサーチップとのセットを使用できる。図中の三角印は、例えば、糖、ビオチン、抗原もしくはハプテン、ホルモン、オリゴヌクレオチド等を表し、該三角が嵌合する印は、それぞれ、レクチン、アビジンもしくはストレプトアビジン、抗体、受容体タンパク質、相補性オリゴヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド、等を表す。また、これらの印に結合する波線はポリ（エチレンオキシド）セグメントであることができる。
【００５３】
このような概念図で表されるバイオアッセイ方法も本発明の一態様である。
【００５４】
一般的には、（ａ）  上記に従って製造されうる（Ａ）の粒子を用意し、
（ｂ）  該ナノ粒子のＰＣＬの材料に対応する薄膜表面を有し、該ナノ粒子のＸの生物学的な特異的結合対の一員に対する他の一員が直接または少なくともＣ1−Ｃ6アルキレン基もしくは（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−)ｎ（ここで、ｎは５−１０,０００のいずれかの整数である）を介して担持され表面を有するバイオセンサーチップを用意し、
（ｃ）  （ａ）の粒子および（ｂ）のバイオセンサーチップを該生物学的な特異的結合を形成しうる構成員のいずれかの一員を被検体として含むことが疑われる生物学的流体と接触させ、
（ｄ）  被検体の競合作用による（ａ）の粒子と（ｂ）のバイオセンサーチップ表面との結合の程度の変化を決定し、
（ｅ）  該変化を生物学的流体中の被検体濃度の指標とする、
ことを含んでなる生物学的流体中の被検体の検出方法、が提供される。上記の段階（ｄ）における、（ａ）の粒子と（ｂ）のセンサーチップとの結合の程度の変化は表面プラズモン共鳴スペクトルの変化、例えばプラズモン角のシフト、最低反射率の増大、であることが好ましい。
【００５５】
このようなアッセイ方法は、生物学的な特異的結合対を形成する一員（被検体）を含むことが疑われる水性液体試料のいかなるものにも、理論上、適用できるが、特に、生物学的流体、例えば、血清、血漿、尿、唾液、等、またはこれらの濃縮もしくは希釈液に適用することを意図している。
【００５６】
かような方法によれば、迅速かつ高感度のアッセイができる。
【００５７】
【実施例】
以下、具体例を挙げてさらに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
製造例１：ＰＥＧ修飾金微粒子の製造法（その１）：
使用ポリマー：Acetal−ＰＥＧ−ＳＨ（Ｍｎ＝５０００）
【００５８】
【化１５】
2005180921.tif 000011
【００５９】
Acetal−ＰＥＧ−ＳＨ：ＨＡｕＣｌ4＝１／６：１（モル比）の比で混合した水溶液にＨＡｕＣｌ4に対して１０倍モル量のＮａＢＨ4を添加し、還元法により金コロイドを調整した。末端アセタール基をｐＨ２塩酸で処理しアルデヒド基に返還後、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドと反応し、ラクトース−ＰＥＧ−ＳＨで修飾した金コロイド水溶液（平均粒径：８.７ｎｍ）を得た。
【００６０】
なお、アセタール−ＰＥＧ−ＳＨは、下記のとおりに製造した。
【００６１】
アルゴン置換した受器中に蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２０ｍｌと開始剤３,３−ジエトキシ−１−プロパノール０.２ｍｍｏｌ（０.０３２ｍｌ）を加え、さらに当量のカリウムナフタレンを加えて１５分撹拌することでメタル化を行った。その後、エチレンオキシド２２.７ｍｍｏｌ（１,１３５ｍｌ）を加え、室温で２日間撹拌し重合させた。停止剤としてＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）０.４ｍｍｏｌ（０.１２５ｇ）を少量の蒸留ＴＨＦに溶解させ、この溶液に対し前記の重合反応溶液を等圧滴下漏斗にて氷冷下で滴下した。一晩撹拌して停止反応を行った後に、飽和食塩水洗浄・クロロホルム抽出、エーテル再沈、ベンゼン凍結乾燥を経て、ポリマーを回収した。回収したポリマーは1Ｈ−ＮＭＲにて構造を確認し、末端に導入されたＳＰＤＰ残基の量は、２−メルカプトエタノールと反応させることによって遊離した２−チオピリドンのＵＶ吸収によっても確認した。
【００６２】
ＰＥＧ−ＳＳ−Ｐｙ ２.０×１０-2ｍｍｏｌ（１００ｍｇ）を蒸留水４ｍｌに溶解させ、さらに５倍ｍｏｌ量のジチオトレイトール０.１ｍｍｏｌ（１５.４２ｍｇ）を加え、室温で３０分撹拌した。反応後、飽和食塩水洗浄・クロロホルム抽出・エーテル再沈を経てポリマー（以下、ＰＥＧ５０００と略記する）を回収した。回収したポリマーは1Ｈ−ＮＭＲによって構造を確認し、さらに２−ピリジルジスルフィド（２−ＰＤＳ）との反応により、末端ＳＨ基の定量を行った。製造例２：ＰＥＧ修飾金微粒子の製造法（その２）：
使用ポリマー：Acetal−ＰＥＧ−ＳＨ（Ｍｎ＝３２００）
【００６３】
【化１６】
2005180921.tif 000012
【００６４】
（１）  使用ポリマーの製造
反応スキームＩに従い、開始剤に３,３−ジエトキシ−１−プロパノール、停止剤にメチルスルフォニルクロライドを用いてアセタール基とメチルスルホニル基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧをアニオン重合により合成した。さらに、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でカリウムオルトエチルジチオカルボネートと室温で３時間反応させることによって、メチルスルホニル基をエチルジチオカルボネート基に転化したポリマーを得た。
【００６５】
その後、同じくＴＨＦ中でプロピルアミンとの反応によって上式で示されるα−末端にメルカプト基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ（Acetal−ＰＥＧ−ＳＨ）を得た。
（２）  金粒子のＰＥＧ修飾
Acetal−ＰＥＯ−ＳＨ（Ｍｎ＝３２００）とアセタール−ＰＥＯ−ＯＨ（比較例）（Ｍｎ＝３０００）を、それぞれポリマーと金粒子とのモル比が５.０×１０6：１になるように測りとり純水２.０ｍＬに溶解させた。そして、ＮａＯＨ溶液にてｐＨ６.５に調製し、金コロイド１.０ｍＬ（２.５８×１０-13ｍｏｌ、ｐＨ６.５）を加え室温で３時間激しく撹拌させた。次いで、遠心分離［４２,０００ｇ（ｇは重力加速度）、３０分］後、溶液を取り除き、残渣にＴＨＦ３ｍＬを加えて超音波をかけて再分散させた。これらのサンプルについてＵＶを用いて特性解析を行った。
【００６６】
このポリマーを用いた金粒子の調製においては、遠心分離後、ＴＨＦ溶液に再分散させたときのＵＶ−ｖｉｓスペクトルから、未修飾の金粒子のＵＶスペクトルは、粒子の凝集に基づく６００ｎｍ以上に大きな吸収ピークを示していることが確認できた。Acetal−ＰＥＯ−ＯＨ（比較例）で処理した金粒子は、未修飾の金粒子のＵＶスペクトルのように６００ｎｍ以上に大きなピークを持たなかったものの、全体的にピークが高波長側へシフトし多少微粒子分散が不安定化していることが確認された。他方、遠心操作後、ｐＨ３の水溶液中に再分散させた時もAcetal−ＰＥＧ−ＳＨのみが非常に安定であり、ベンゼンを用いた凍結乾燥後の再分散性もよいことが確認できた。
（３）  ＰＥＧ修飾金微粒子の特性（ゼータ電位）
通常の金微粒子の水溶液分散系では粒子表面を負に荷電させることによりそのチャージ反発により分散安定化させているのに対し、ＰＥＧ化金微粒子ではその表面に全くチャージがないことがゼータ電位測定（大塚電子：ＥＬＳ８０００）により確認された。すなわち、市販の金微粒子は−３４.５ｍＶであるのに対し、今回作成した金微粒子−ヘテロＰＥＧ複合体（Acetal−ＰＥＧ−ＳＨ／Ａｕ）では−０.８６ｍＶとなっており、殆ど誤差の範囲で粒子表面にチャージがないといえ、表面がＰＥＧ鎖で覆われているものと推測される。
【００６７】
測定データを表１に示す。
【００６８】
【表１】
2005180921.tif 000013
【００６９】
測定溶液：
緩衝剤ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2ＯとＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを１０ｍＭ（モル濃度）加え、そのイオン強度を０.０１５、ｐＨを７.５に調整したリン酸緩衝溶液。
【００７０】
測定機器：ＥＬＳ−８０００（大塚電子）
製造例３：ＰＥＧ修飾金微粒子の製造法（その３）：
この例では、使用ポリマー（Acetal−ＰＥＧ−ＰＡＭＡ）：
【００７１】
【化１７】
2005180921.tif 000014
【００７２】
（上述の Kataoka et al.，Macromolecules、１９９９、３２、６８９２−６８９４に記載の方法に従って得られた。ＰＥＧ  Ｍｗ＝５０００ｇ／ｍｏｌ、ＰＡＭＡブロック共重合体水溶液５ｍＬ（ＮＨ：Ａｕ＝８：１）を混ぜ室温で２４時間撹拌した。所定時間ごとにＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定したところ、金微粒子に由来する５４０ｎｍのピークが次第に上昇し、還元剤を加えない状態で金コロイド粒子（微粒子）分散体が生成していることが確認された。この溶液を光散乱により測定（ＤＬＳ：動的光散乱）したところ、平均粒径１２ｎｍの単分散コロイド粒子が生成していることが確認された。
【００７３】
さらに、透過型電子顕微鏡によって、完全に均一な粒子が生成していることが確認された。この溶液をｐＨ＝２〜１０の範囲で変化させ、１日放置しても全くスペクトルに変化は見られず、この系で極めて安定な金コロイド粒子（微粒子）が得られたことが確認された。
【００７４】
この溶液にブロック共重合体の１０倍当量の１,２−ジアミノ−４,５−ジメトキシ２塩酸塩（ＤＤＢ）を添加し、ＮａＣｌによってｐＨを２.４５に調整した。溶液を分画分子量５００の透析膜にて透析し、励起波長２６９ｎｍで蛍光測定した結果、４１０ｎｍに強い蛍光を示した。この結果より、調整された金粒子表面に Acetal−ＰＥＧ／ＰＡＭＡブロック共重合体の末端アセタール基がアルデヒド基に変換され、ＤＤＢと効率的に反応していることが確認された。こうして形成したアルデヒド基を介して各種の機能性部分をもたらすことができる。
製造例４：ＰＥＧ修飾半導体微粒子の製造：
蒸留水８０ｍＬ中に上述の Acetal−ＰＥＧ／ＰＡＭＡブロック（４.１９×１０-7ｍｏｌ）、ＣｄＣｌ2（６×１０-6ｍｏｌ）及びＮａ2Ｓ・９Ｈ2Ｏ（６×１０-6ｍｏｌ）を加え、撹拌機（７５０ｒｐｍ）で２０分間撹拌した。得られたＰＥＧ修飾半導体（ＣｄＳ）微粒子（粒径４ｎｍ）を励起波長３００ｎｍにて蛍光を測定したところＣｄＳ微粒子特有の強い蛍光が現れた。
実施例１：ＰＥＧ修飾微粒子のセンサーチップ表面への固定化：
（１）  センサ−チップ表面の調製
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とＳＰＤＰのジスルフィド結合還元剤であるジチオスレイトール（ＤＴＴ）をそれぞれ１ｍＭ、２ｍＭとなるように混合したエタノール溶液をセンサーチップの金表面に２時間反応させた。その後、洗浄した金表面をこの溶液に３０分浸漬させ、さらに、０.１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンＰＢＳ溶液（ｐＨ６.４）を２０分間流すことで、金表面のストレプトアビジン化を行った。
（２）  製造例２に従って得られたＰＥＧ（Acetal−ＰＥＧ−ＳＨ）修飾金微粒子を調製後、ｐＨ２に金微粒子溶液を調整し、２時間アセタール基の脱保護を行い、アルデヒド基に変換した。溶液をｐＨ６に調整し、ＰＥＧに対して４倍量のビオシチンヒドラジドを添加し、６時間攪拌しながら反応させた（ここで、ＰＥＧに対して４倍量とは、金微粒子の表面積を粒径から算出し、ＰＥＧの表面密度を０.２５〜０.４０本／ｎｍ2と仮定した。この値は微粒子の個数からＰＥＧの本数を算出した値である。通例表面密度は０.２５を使っている。０.２５の値はＰＥＧ化金微粒子のＴｇから算出したものである）。その後、ＮａＢＨ4を加え３日間攪拌した。遠心精製後、１０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ６.４）を溶媒置換溶液を調製した。こうして得られたビオチニル化されたＰＥＧ修飾金微粒子溶液に（１）で調製した金表面を有するチップを浸漬することにより、該表面にＰＥＧ修飾金微粒子が固定された。
（３）  表面の特性
（２）で調製されたＰＥＧ修飾金微粒子固定化表面を０.１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＰＢＳ溶液（ｐＨ６.４）に１時間浸漬させ、表面への吸着量をＳＰＲにより測定した。その結果、未処理の金表面に対するＢＳＡ吸着はＳＰＲ角度変化より△θ＝０.２１°であったが、ＰＥＧ修飾金微粒子固定化表面においては、△θ＝０.０２°であった。これらのデータは、ＰＥＧ修飾金微粒子固定化表面は血液中のタンパク質ＢＳＡの、非特異的吸着を抑制することを示す。
実施例２：ＰＥＧ修飾金ナノ粒子を利用したＳＰＲによるアッセイ
以下常にＳＰＲの流速は常に１０μＬ／ｍｉｎであり、設定温度は２５℃である。またバッファーはすべて０.２２μｍフィルターを通した後、脱気したものを用いた。また、別の流路はレクチンを固定化していないコントロールの流路とした。また、センサーチップ表面のレクチンに結合した金ナノ粒子をすべて解離させる再生溶液には、１００ｍｇ／ｍＬのガラクトースを含むバッファーを用いた。
Ａ）  センサーチップへのレクチンの固定化
実験方法と結果
ＳＰＲセンサーチップ（ＣＭ５：ＢＩＡＣＯＲＥより入手。）を挿入して、りん酸緩衝溶液（ｐＨ７.４，１０．１５）をＳＰＲの流路に安定するまで流した。次にＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の１：１混合溶液を１００μＬインジェクトし、チップ上のカルボキシル基を活性化させた。続けてＲＣＡ120（５０μｇ／ｍＬ、溶媒はｐＨ５.０の酢酸緩衝溶液）をインジェクトして固定化させ、最後に１Ｍエタノールアミド塩酸塩）を７０μＬインジェクトして、残った活性化ＮＨＳ基をブロッキングした。この時のＲＵと最初のＲＵの差により、レクチン固定量は５６００ＲＵ（〜５.６ｎｇ／ｍｍ2＝２.８×１０-2レクチンｎｍ2）となった。
Ｂ）  ｌａｃ６５とレクチンの特異的結合の確認（ｌａｃ６５とは金ナノ粒子（ＰＥＧ５２０本）上のＰＥＧの末端の６５％にラクトースを有するサンプル）
実験方法
４０μｇ／ｍＬのｌａｃ６５を１８００秒間（３００μＬ）インジェクトすることで、センサーチップ表面のレクチンと金ナノ粒子の結合を測定した。その後バッファーを３０００秒間流すことにより、金ナノ粒子の解離を測定し、最後に１００ｍｇ／ｍＬのガラクトースをインジェクトすることでセンサーチップを再生した。
結果と考察
図２にｌａｃ６５のセンサーグラムを示す。同じ濃度のフリーのラクトース−ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ−ラクトースはほとんどＲＵの増加がなかったのに対して、ｌａｃ６５は５２００ＲＵの増加が得られた。また、ラクトースを表面に有するミセルの系と比較すると、７０００ＲＵのレクチンが結合しているセンサーチップ上に５００μｇ／ｍＬのミセルをインジェクトすると〜１４００ＲＵのレスポンスが得られているが、本実験で用いた金ナノ粒子の粒径はこのミセルと同じくらいであるが、１０分の１濃度で４倍のレスポンスが得られたことから、金ナノ粒子によりレスポンスが大きく上昇したと言える。このように大きなレスポンスが得られた理由としては、一つは金ナノ粒子の比重が非常に大きいため、チップ表面の誘電率が大きく上昇したことと、チップの金基板と金ナノ粒子との表面プラズモンどうしの相互作用とが挙げられる。
【００７５】
次にバッファーを流したときの解離についてであるが、バッファーを流してもほとんど解離しなかった。そのため、金ナノ粒子とレクチン結合は非常に強いものだと考えられる。
【００７６】
また、ｌａｃ０は結合が確認されなかったのに対して、ｌａｃ６５は結合が確認されたことと、ガラクトースを添加することにより、大きくレスポンスの減少、つまり金ナノ粒子の解離が確認されたことから、金ナノ粒子表層のラクトースとＲＣＡ１２０レクチンとの特異的結合が示唆された。
Ｃ）  結合におけるリガンド密度の効果
実験方法
ラクトース密度０〜６５％の金ナノ粒子（ｌａｃ０、ｌａｃ１０、ｌａｃ２０、ｌａｃ３０、ｌａｃ４０、ｌａｃ５０、ｌａｃ６５）をそれぞれ４０、１０、１、０.１μｇ／ｍＬの濃度で３００μＬインジェクトし、その結合量を測定した。
結果と考察
まず、ｌａｃ０−ｌａｃ６５における濃度とレスポンスの関係を図３（ａ）に示す。ここから、ラクトース密度が大きいほど、また濃度が大きいほどＲＵは増加するという結果が得られた。また、１０μｇ／ｍＬの濃度でインジェクトしたときのｌａｃ０−ｌａｃ６５までのセンサーグラムを図３（ｂ）に、リガンド密度と結合量（ＲＵ）との関係を図３（ｃ）に示す。これらの結果から、ｌａｃ１０はほとんどレクチンとラクトースは結合せず、ｌａｃ２０は少し結合が確認され、さらにそれ以上ではリガンド密度の増加に伴い、結合が促進するということになり、これはＵＶの結果とほぼ一致する。ＵＶの実験の考察では、臨界値が２０％の理由として、１）レクチンが過剰に溶液中に存在するために粒子がレクチンによりキャッピングされる、２）スペクトルの変化として表面プラズモンを検出するにはある程度以上の金ナノ粒子の凝集が必要である、３）多価結合の三つの理由を考えていたが、ＳＰＲではキャッピングは起こらないし、ＵＶの時のように表面プラズモンのスペクトル変化を見ているわけでもないので臨界値の理由は多価結合が考えられる。具体的には、リガンド密度が大きいと多数のリガンドとレクチンが結合して、強固な結合を生じるが、小さいリガンド密度では、１対１のリガンドとレクチンの結合のように少数のリガンドしか結合に関与できないと考えられる。
Ｄ）  解離におけるリガンド密度の効果
実験方法
ラクトース密度３０−６５％の金ナノ粒子（ｌａｃ３０、ｌａｃ４０、ｌａｃ５０、ｌａｃ６５）４０μｇ／ｍＬをそれぞれ数１０μＬインジェクトし、約４００ＲＵ金ナノ粒子を結合させた。その後、ガラクトース０.１、１μｇ／ｍＬを含むバッファーをインジェクトし、各ガラクトース濃度での解離量を測定した。
結果と考察
図４（ａ）にガラクトース０.１μｇ／ｍＬをインジェクトしたときのセンサーグラムを示す。ここではｌａｃ３０、ｌａｃ４０は時間がたつにつれて徐々に解離していくのが確認されたが、ｌａｃ６５、ｌａｃ５０はほとんど解離が確認されなかったので、リガンド密度と解離量との関係を図４（ｂ）に示した。ここから４０％と５０％の間に顕著な差が見られた。すなわち、ｌａｃ３０、ｌａｃ４０の解離量に比べて、ｌａｃ５０、ｌａｃ６５の解離量はかなり少なかった。これはＵＶの実験にいてもＮＩＡの増加に４０％と５０％の間で大きな差があったことと関連があると考えられる。恐らく、このリガンド密度で多価結合の価数に変化があったのではないかと推測される。
【００７７】
また、解離によって高感度に検出することを考えると、リガンド密度が３０％以下ならば、０.１μｇ／ｍＬ以下まで検出できるということも示された。これに対して５０％以上ならば、検出限界はそれ以上の濃度となり、解離においてはリガンド密度がある程度低い方がより高感度に検出できることになり、リガンド密度の効果を詳細に調べることによって、このような応用も考えることができる。
製造例５：非結合末端アミノ化粒子の製造
市販の金微粒子溶液（５ｎｍ）に対して５×１０4倍量の acetal−ＰＥＧ−ＳＨに還元剤としてＮａＢＨ4を加え、１時間反応させた後、金微粒子溶液と同じｐＨ＝６.５に調整したものを金微粒子溶液と混合し、１時間撹拌反応させた。ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨを１ｍｇ／ｍｌ加え、ウォーターバス７５℃に保ち２時間反応させた。この安定化金コロイド溶液（金微粒子粒径：５ｎｍ、ＰＥＧ４５００）を遠心分離（４℃、３５００００×ｇ、４０分）することで余剰ポリマーを除去した後、ＨＣｌを用いてｐＨ２に調整し、アセタール基の脱保護を行った（２時間）。脱保護後、ＮａＯＨを用いてｐＨ６に調整し、下記の表２に示すような条件で酢酸アンモニウムを加え３時間反応させた。３時間後ＰＥＧに対してそれぞれ還元剤を加え撹拌した。２４時間後、遠心精製（４℃、３５００００×ｇ、３０分）を行い、超純水に再分散させた。末端アミノ化の確認としてζ電位の測定を行った。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
測定結果を図５に示す。図から、低ｐＨでのゼータ電位がプラスになり、アミノ化が確認された。
実施例３：金ナノ粒子をＳＰＲチップ表面に直接固定化し、ＰＥＧ末端をビオチン化する方法
オゾン洗浄した金チップ（オゾン洗浄機で１５分）を用意した。これを、別に、用意したアミノ基を有するＰＥＧ化金ナノ粒子（ＰＥＧ４５００粒径５ｎｍ、０.７６×１０-10ｍｏｌ／ｍＬ）を含むＰＥＧ−ＯＨ（２０００）１ｍｇ／ｍｌに浸漬（一晩）した（サンプル１）。
【００８０】
ＢｉａＣｏｒｅ３０００に装着し、スルホスクシンイミジルＤ−ビオチン（０.１ｍｇ／ｍｌ流速２０μｌ／分）を１０分間流しＰＥＧ末端アミノ基のビオチン化を行った（サンプル２）。次いで、無水酢酸１０％水溶液（流速１０μｌ／分）を２０分流し、未反応アミノ基のアセチル化を行った（サンプル３）。このようにして調製したＳＰＲセンサーチップ表面に対してタンパク吸着試験を行った。
実施例４：ＳＰＲセンサーチップ表面にＳＰＤＰにて活性エステルを導入し、アミノ基を有するＰＥＧ化金ナノ粒子を固定化する方法
オゾン洗浄した金チップ（オゾン洗浄機で１５分）を用意した。これを１ｍＭＳＰＤＰおよび２ｍＭ ＤＴＴ含有エタノール溶液に３０分間浸漬した。
【００８１】
さらに別に、用意したアミノ化金ナノ粒子（ＰＥＧ４５００粒径５ｎｍ、０.７６×１０-10ｍｏｌ／ｍＬ）を含むＰＥＧ−ＯＨ（２０００）１ｍｇ／ｍｌに浸漬（一晩）した（サンプル４）。
【００８２】
ＢｉａＣｏｒｅ３０００に装着し、スルホスクシンイミジルＤ−ビオチン（０.１ｍｇ／ｍｌ流速２０ｍｌ／分）を１０分間流しＰＥＧ末端アミノ基のビオチン化を行った（サンプル５）。次いで、無水酢酸１０％水溶液（流速１０μｌ／分）を２０分流し、未反応アミノ基のアセチル化を行った（サンプル６）。このようにして調製したＳＰＲセンサーチップ表面に対してタンパク吸着試験を行った。
【００８３】
結果を図６に示す。図６中のＲｕｎ１はサンプル１を用いた結果、Ｒｕｎ２はサンプル１の代わりに acetal−ＰＥＧ金ナノ粒子を用いた結果、Ｒｕｎ３はサンプル４を用いた結果、Ｒｕｎ４はサンプル４の代わりに acetal−ＰＥＧ金ナノ粒子を用いた結果を示す。図６より、アミノ基を有するＰＥＧ化金ナノ粒子のＳＰＲセンサーチップ表面への担持量が大きいことがわかる。
【００８４】
また、各表面調製における各段階でのレスポンス変化の様子を下記の表３に示す。
【００８５】
【表３】
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【００８６】
金チップ表面に直接アミノ化金微粒子を浸漬させ調製した直接吸着による表面（１）において特異・非特異吸着を観察した結果を図７に示す。図７中、一番上の線はストレプトアビジン、中間の線はＢＳＡ（アミノ基残余状態）、一番下の線はＢＳＡの吸着を、棒グラフは左から順にサンプル１にストレプトアビジンを、サンプル２にＢＳＡを、そしてサンプル３にＢＳＡを吸着させる試験の結果である。
【００８７】
他方、金チップ表面にＳＰＤＰを利用してアミノ化金微粒子を固定化した表面（２）において特異・非特異吸着を観察した結果を図８に示す。
【００８８】
図７および図８から、図８のＳＰＤＰで固定化した表面（２）においてストレプトアビジンとの特異的吸着がより多く観察されていることがわかる。これまで調製してきたビオチン化金微粒子を用いた表面ではストレプトアビジンとＢＳＡの吸着を観察しても特異・非特異と言えるような大きな差異が観察されなかったのに対し、図８では２５００（×１０-40）と９（×１０-40）という大きな差異を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に従うＰＥＧ修飾金ナノ粒子とセンサーチップ表面との関係を示す概念図である。ａ）は金属面上にＰＥＧ修飾金ナノ粒子が固定された高感度システムの略図であり、（ｉ）は非特異的吸着を抑制するＰＥＧ鎖を表し、（ｉｉ）リガンド分子を表し、そして（ｉｉｉ）はＳＰＲ応答を強化する金粒子を表す。ｂ）は、競合アッセイ系を構成する略図である。
【図２】ｌａｃ６５とレクチンの特異的結合を確認するために行った実験結果のセンサーグラムである。
【図３】ＰＥＧ修飾金ナノ粒子表面上のラクトース密度とレクチン固定化表面とのレスポンスの関係を示すグラフである。
【図４】ラクトース−レクチンを介して結合したＰＥＧ修飾金ナノ粒子とセンサーチップとのガラクトースの競合による解離状態を示すセンサーグラムである。
【図５】非結合末端にアミノ基を有するＰＥＧ修飾金ナノ粒子のゼータ電位の測定結果を示すグラフ（●印の曲線）と非結合末端アセタール化ホルミル基を有する金ナノ粒子の同様な測定結果を示すグラフ（■印の曲線）である。
【図６】非結合末端にビオチン残基を有するＰＥＧ修飾金ナノ粒子へのタンパク質の担持量を測定した結果を示すグラフである。
【図７】金チップ表面に非結合末端にアミノ基を有するＰＥＧ修飾金ナノ粒子を直接吸着させた表面における各種タンパク質の吸着性を示すグラフである。
【図８】図７で用いた金ナノ粒子をＳＰＤＰを利用して金チップ表面に結合させた表面のタンパク質の吸着性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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