(57)【要約】【課題】酵素の改良研究および産業上実用的なクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を供給する生産方法を提供する。【解決手段】クロロペルオキシダ−ゼの構造遺伝子の５’末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域について置換、欠失又は挿入することにより該ＤＮＡ領域のＧＣ含量が低減した塩基配列を有し、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子を有する組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドによって宿主微生物を形質転換して形質転換微生物を得、該形質転換微生物を培養することによりクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を生産する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロペルオキシダ−ゼの構造遺伝子の５’末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域について置換、欠失又は挿入することにより該ＤＮＡ領域のＧＣ含量が低減した塩基配列を有し、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子を有する組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドによって宿主微生物を形質転換して形質転換微生物を得、該形質転換微生物を培養することによりクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を生産することを特徴とする、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
【請求項２】
置換、欠失又は挿入により構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域のＧＣ含量が６０％未満に低減していることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ＧＣ含量が６０％未満に低減している構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域が置換前のクロロペルオキシダ−ゼと同じアミノ酸配列をコードしていることを特徴とする、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
ＧＣ含量が６０％未満に低減している構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域が配列表の配列番号：１記載の１番目から１０番目のアミノ酸配列をコードしていることを特徴とするとする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
クロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列である請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
クロロペルオキシダ−ゼの遺伝子が、配列表の配列番号：２記載のＤＮＡ塩基配列である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
組換えクロロペルオキシダ−ゼが、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸までのペプチド領域に、アミノ酸変異の導入、１アミノ酸以上の任意のアミノ酸配列の付加または欠失により、構造遺伝子のＤＮＡ５‘末端領域の少なくとも３０残基についてＤＮＡ塩基配列のＧＣ含量を６０％未満にしたクロロペルオキシダ−ゼである請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
組換えクロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列である組換えクロロペルオキシダ−ゼである請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
組換えクロロペルオキシダ−ゼの遺伝子が、配列表の配列番号：３記載のＤＮＡ塩基配列である請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
宿主微生物が、グラム染色陰性細菌である請求項１から９の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
グラム染色陰性細菌が、大腸菌である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
形質転換微生物の培養が、２０℃以上３５℃以下の培養温度で実施される培養である請求項１から１１記載の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
クロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
【請求項１４】
クロロペルオキシダ−ゼの遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号：２記載のＤＮＡ塩
基配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
【請求項１５】
組換えクロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
【請求項１６】
組換えクロロペルオキシダ−ゼの遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号：３記載のＤＮＡ塩基配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
【請求項１７】
請求項１から１２の何れか一項に記載の製造方法により製造されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とすることを特徴とするアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、又はアニリン誘導体をハロゲン化反応もしくはハロヒドリン化反応させて、対応するハロゲン化物又はハロヒドリン化物を製造する方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の製造方法によりブタジエンをハロヒドリン化反応して得られることを特徴とするブタジエンブロモヒドリン。
【請求項１９】
請求項１７記載の製造方法によりフェノ−ルをハロゲン化反応して得られることを特徴とする２−Ｂｒ−フェノ−ル、４−Ｂｒ−フェノ−ル、２、４、６−Ｂｒ−フェノ−ル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化反応を産業上実用的に実現するために重要なクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子および該遺伝子で形質転換された形質転換微生物を培養することによる該酵素の生産方法に関する。本発明は更に、該生産方法により生産された該酵素による化学反応がアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、アニリン誘導体からのハロゲン化もしくはハロヒドリン化合物を得るための反応に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロロペルオキシダ−ゼの起源としては、ヘム型である海洋性糸状細菌 Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ、および、非ヘム型である糸状菌 Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｃｕｒｒｏｓａ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘが報告されている。それらに由来するクロロペルオキシダ−ゼの物理化学的特性、生化学的特性、アミノ酸配列、ＤＮＡ配列などが報告されている（Ｓ．Ｌ．Ｎｅｉｄｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ,Ｂａｓｉｃ  Ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｅｌｌｉｓ
Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ．，１９８６、Ｔ．Ｅ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４２（２），３２９−３３３，１９８７、ＷＯ９７／０４１０２）。また、クロロペルオキシダ−ゼによる工業的試みに関してＣａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来クロロペルオキシダ−ゼによるプロピレンオキサイド生産に関して報告されている（米国特許第９１４３８４号公報）。
【０００３】
しかしながら、これまでに報告のあったヘム型のクロロペルオキシダ−ゼの酵素安定性はかならずしも高くない。Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来のクロロペルオキシダ−ゼも含めてヘム型の酵素は反応溶液中に活性な分子状ハロゲンを生成することにより、酵素自信が簡単に活性を失うことにより、産業上あまり有用性がないことが認められている。（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８(1)，２８２-２８９，１９８７）また、非ヘム型であるクロロペルオキシダ−ゼについても産業上応用された報告は認められない。学術的、及び特許出願としていくつかの報告がみられるのみである。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｃｕｒｒｏｓａ由来のクロロペルオキシダ−ゼが報告されているが、その報告の中のこれらのクロロペルオキシダ−ゼの発現方法は、酵母細胞、糸状菌細胞を用いた方法であり産業上の実用性において必ずしも十分なものではない。（ＷＯ９７／０４１０２、ＷＯ９５／２７０４６）ＷＯ９５／２７０４６では、発現したクロロペルオキシダ−ゼは酵母細胞内に蓄積される為、細胞から抽出しなければならない。一般に酵母細胞は細胞壁の破壊をせねばならず目的の蛋白質の抽出が困難である欠点を有する。ＷＯ９７／０４１０２では、糸状菌によるクロロペルオキシダ−ゼの発現を行っており、大腸菌などの産業的によく用いられている微生物に比較し培養期間が４日間以上と非常に長い欠点を有する。更に、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来クロロペルオキシダ−ゼにおいては、大腸菌による蛋白質発現についてふれられているが、既報の報告者らの発現系により分離されるクロロペルオキシダ−ゼは非常に少ないものであり、組換え酵素の深い解析を妨げたと記述されており、実際の研究報告には、酵母を用いた発現系を使用していた。（Ｗ.Ｈｅｍｒｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（３４），２３８２０−２３８２７，１９９９）つまり、酵素の改良研究に使用する程度の少量の大腸菌による発現系すら存在しておらず、まして、大腸菌による産業上実用的なクロロペルオキシダ−ゼを供給する生産方法などまったく報告されていなかった。これらの報告から大腸菌を含めた微生物におけるクロロペルオキシダ−ゼの高生産方法が望まれていた。
【特許文献１】ＷＯ９７／０４１０２
【特許文献２】ＵＳ９１４３８４
【特許文献３】ＷＯ９５／２７０４６
【非特許文献１】Ｓ．Ｌ．Ｎｅｉｄｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ,Ｂａｓｉｃ  Ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ．，１９８６
【非特許文献２】Ｔ．Ｅ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４２（２），３２９−３３３，１９８７
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８(1)，２８２-２８９，１９８７
【非特許文献４】Ｗ.Ｈｅｍｒｉｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（３４），２３８２０−２３８２７，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、酵素の改良研究および産業上実用的なクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を供給する生産方法を提供することにあり、本発明のその他の課題は、本生産方法により生産されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とする化学反応による化合物を提供することにある。
【０００５】
本発明の目的は、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の有効な高生産方法を提供することであり、その一つとして、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼについて活性を保持した状態の酵素蛋白質を提供する方法を提供すること、また該酵素蛋白質の遺伝子を提供すること、該酵素蛋白質の遺伝子を含有するプラスミドを提供すること、該プラスミドで形質転換された大腸菌を含む形質転換微生物、該大腸菌を含む形質転換微生物を使用したクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産方法を提供することにある。
【０００６】
本発明のその他の目的は、該生産方法により生産されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とした化学反応によりアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、アニリン誘導体からのハロゲン化もしくはハロヒドリン化化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼについて、産業上実用性が高い大腸菌による生産方法を鋭意検討した。
【０００８】
大腸菌による生産方法の有効性を確認するには、検討した大腸菌の発現するクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を確認することが必要である。その方法は、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子を含むプラスミドを構築し、該プラスミドで形質転換された大腸菌を分離し、さらに得られた形質転換微生物を培養して、クロロペルオキシダ−ゼの総活性を測定するという一連の行程よりなる。
【０００９】
本発明者らは、大腸菌でクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産のため、糸状菌由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子をＤＮＡ塩基配列を変化させずに大腸菌発現ベクタ−に導入し発現を試みた。しかし、この方法では、Ｗ.Ｈｅｍｒｉｋａ  ｅｔ  
ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（３４），２３８２０−２３８２７，１９９９の報告と同様に検出感度の鋭敏なフェノ−ルレッド検定法によっても微量な発色しか認められなかった。
【００１０】
Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子は、全体としてＧＣ含量が高い、構造遺伝子のＮ末端開始１０アミノ部分においてはＧＣ含量が６０％であり、単独のＧ，Ｃ塩基の他、ＧＧＧＧ塩基配列を有する箇所が１箇所、ＣＣＣ塩基配列を有する場所が２箇所、ＣＣＣＣ塩基配列を有する箇所が１箇所存在している。これらの配列によるＮ末端開始部位の２次構造の形成しやすさが、目的遺伝子の転写、翻訳に影響を及ぼして発現を抑制することが大きな要因ではないかと考えた。生来のアミノ酸配列の蛋白質を生産することを目的として、アミノ酸配列を変えることなしに構造遺伝子の２次構造を形成しにくくする為にＧＣ塩基配列の含量を低減させるアミノ酸コドンへの改良がよいという仮設を立て、これを検証した。その結果、Ｎ末端の２、６、７、１０番目のアミノ酸についてＧＣ含量を低減させたアミノ酸コドンへ改良したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系において、改良を加えていない生来のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系に比べて高い生産性が達成された。上記の高い生産性の達成から、生来のアミノ酸配列とは異なる蛋白質として生産する場合においても、組換えクロロペルオキシダ−ゼＮ末端開始部位に２次構造を形成させず、且つクロロペルオキシダ−ゼ酵素活性に影響を及ぼさない、アミノ酸配列へのＮ末端領域の変異、付加、欠失ができるのではないかと仮設を立て、これを検証した。その結果、β―ガラクトシダ−ゼ開始部位由来の９アミノ酸配列をＮ末端に付加して改良したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来の組換えクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系において、改良を加えていない生来のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ構造遺伝子を用いた発現系に比べて高い生産性が達成された。
【００１１】
さらに、本発明者らは、培養温度を検討し大腸菌によって発現されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の活性の向上を試みた。蛋白質翻訳が行われるようになったクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を大腸菌から抽出すると不溶性画分に存在しており活性は殆ど認められなかった。そこで、培養温度を３７℃、３０℃、２５℃と低下させることによりクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が可溶性画分に移行することが判った。それとともに活性の増大することも明らかになった。これにより、これまでの報告では、活性確認が殆どできなかった大腸菌によるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の発現を大幅に向上し、産業上実用的な活性型のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産発現を可能にすることに成功した。
【００１２】
本発明のその他の課題を解決するために該クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子を有するプラスミド（組換えプラスミド）で宿主微生物を形質転換した形質転換微生物により生産したクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を用い、ブタジエンからブタジエンハロヒドリンやフェノ−ルからブロモフェノ−ルなどのハロゲン化化合物を生成することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。
（１）  クロロペルオキシダ−ゼの構造遺伝子の５’末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域について置換、欠失又は挿入することにより該ＤＮＡ領域のＧＣ含量が低減した塩基配列を有し、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子を有する組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドによって宿主微生物を形質転換して形質転換微生物を得、該形質転換微生物を培養することによりクロロペルオキシダ−ゼ活性を有す
る蛋白質を生産することを特徴とする、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の製造方法。
（２）  置換、欠失又は挿入により構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域のＧＣ含量が６０％未満に低減していることを特徴とする、（１）記載の製造方法。
（３）  ＧＣ含量が６０％未満に低減している構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域が置換前のクロロペルオキシダ−ゼと同じアミノ酸配列をコードしていることを特徴とする、（２）記載の製造方法。
（４）  ＧＣ含量が６０％未満に低減している構造遺伝子の５‘末端から少なくとも３０塩基までのＤＮＡ領域が配列表の配列番号：１記載の１番目から１０番目のアミノ酸配列をコードしていることを特徴とするとする（３）記載の製造方法。
（５）  クロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列である（４）記載の製造方法。
（６）  クロロペルオキシダ−ゼの遺伝子が、配列表の配列番号：２記載のＤＮＡ塩基配列である（５）記載の製造方法。
（７）  組換えクロロペルオキシダ−ゼが、N末端から１０番目のアミノ酸までのペプチド領域に、アミノ酸変異の導入、１アミノ酸以上の任意のアミノ酸配列の付加または欠失により、構造遺伝子のＤＮＡ５‘末端領域の少なくとも３０残基についてＤＮＡ塩基配列のＧＣ含量を６０％未満にしたクロロペルオキシダ−ゼである（１）記載の製造方法。
（８）  組換えクロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列である組換えクロロペルオキシダ−ゼである（７）記載の製造方法。
（９）  組換えクロロペルオキシダ−ゼの遺伝子が、配列表の配列番号：３記載のＤＮＡ塩基配列である（８）記載の製造方法。
（１０）  宿主微生物が、グラム染色陰性細菌である（１）から（９）の何れか一項に記載の製造方法。
（１１）  グラム染色陰性細菌が、大腸菌である（１０）に記載の製造方法。
（１２）  形質転換微生物の培養が、２０℃以上３５℃以下の培養温度で実施される培養である（１）から（１１）の何れか一項に記載の製造方法。
（１３）  クロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１４）  クロロペルオキシダ−ゼの遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号：２記載のＤＮＡ塩基配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１５）  組換えクロロペルオキシダ−ゼが、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１６）  組換えクロロペルオキシダ−ゼの遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号：
３記載のＤＮＡ塩基配列であるクロロペルオキシダ−ゼ。
（１７）  （１）から（１２）の何れか一項に記載の製造方法により製造されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒とすることを特徴とするアルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、又はアニリン誘導体をハロゲン化反応もしくはハロヒドリン化反応させて、対応するハロゲン化物又はハロヒドリン化物を製造する方法。
（１８）  （１７）記載の製造方法によりブタジエンをハロヒドリン化反応して得られることを特徴とするブタジエンブロモヒドリン。
（１９）  （１７）記載の製造方法によりフェノ−ルをハロゲン化反応して得られることを特徴とする２−Ｂｒ−フェノ−ル、４−Ｂｒ−フェノ−ル、２、４、６−Ｂｒ−フェノ−ル。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、酵素の改良研究および産業上実用的な量のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を供給する生産方法を提供することができる。本生産方法により生産されたクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を触媒として使用することによる化学反応による化合物を提供することができる。
【００１５】
本発明にかかるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を用いることによる酸化反応を産業上実用的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明にかかるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産方法は、配列表の配列番号：１記載のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼに対応するアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも１０番目までのアミノ酸配列に対応するコドンのＧＣ含量を低減した配列表の配列番号：２記載のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子及びまたは、請求項１記載のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が配列表の配列番号：１記載のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に対応する配列番号：１記載のアミノ酸配列を基準としたＮ末端領域へのアミノ酸変異の導入、任意のアミノ酸配列の付加または開始アミノ酸領域の欠失を有し、且つ本来のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を失わせないようにした塩基配列を有する組換えクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子、を含むプラスミドによって形質転換された形質転換微生物を培養する生産方法により規定することができる。
【００１７】
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明にかかるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の生産方法は上記の特性を有するものであり、Ｎ末端から少なくとも１０番目までのアミノ酸配列が上記の特性を有するクロロペルオキシダ−ゼであるか、もしくは、対象となる天然のクロロペルオキシダ−ゼ活性が失われない程度に、Ｎ末端領域への変異の導入、任意のアミノ酸配列の付加または開始アミノ酸領域の欠失を施した組換えクロロペルオキシダ−ゼであれば、いかなる生物由来のクロロペルオキシダ−ゼであっても本発明に包含されるものとする。
【００１８】
（１）  クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質
本発明において、クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質とは、天然のアミノ酸配列を有する酵素（クロロペルオキシダーゼ）及び組換え酵素（組換えクロロペルオキシダーゼ）の両方を合わせた酵素を指す。ここにおいて、クロロペルオキシダーゼとは、天然物及び天然の酵素と同じアミノ酸配列を有する酵素を指す。さらに、組換えクロロペルオキシダーゼとは、天然とはアミノ酸配列が異なるがクロロペルオキシダーゼの活性を有する酵素を指す。
【００１９】
（２）  クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子
本発明において、クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子とは、クロロペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコ−ドする遺伝子（クロロペルオキシダーゼ遺伝子及び組換えクロロペルオキシダーゼ遺伝子）を指す。ここにおいて、クロロペルオキシダーゼ遺伝子とは、クロロペルオキシダーゼをコードし天然の遺伝子と同じ塩基配列を有する遺伝子（クロロペルオキダーゼ天然型遺伝子）及びクロロペルオキシダーゼをコードし天然と異なる塩基配列を有する遺伝子（クロロペルオキシダーゼ改変型遺伝子）を合わせた遺伝子を指す。さらに、組換えクロロペルオキシダーゼ遺伝子とは、組換えクロロペルオキシダーゼをコードする遺伝子を指す。さらに、本発明におけるクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の遺伝子をコードするポリヌクレオチドには配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を含む。配列番号：２に示す塩基配列は、同配列番号：２に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、同配列番号：２に示す塩基配列のみならず、そのアミノ酸配列の１１番目以降に異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログも本発明の範疇に含まれる。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号：１に示すＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼ遺伝子ＤＮＡ塩基配列によりコードされるＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ（ＩＦＯ８８８５）由来のクロロペルオキシダ−ゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。
【００２０】
（３）  組換えプラスミド
このクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質をコ−ドする組換えプラスミドを、その宿主中での発現を可能とするプロモ−タ−と組み合わせて、宿主中での複製が可能な複製オリジンを有する、例えば、大腸菌用であるｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８等のプラスミドに組み込むことで、本発明のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質をコ−ドする組換えプラスミドを得ることができる。プロモ−タ−としては、組換えＤＮＡの宿主大腸菌中での発現を可能とするものであればよい。組換えプラスミドの一例としては、プロモ−タ−、リボゾ−ム結合部位、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡが５‘から３’方向にこの順番に結合された部分を有するものを挙げることができる。
【００２１】
（４）  宿主微生物
本発明に使用される宿主微生物は、本発明の形質転換微生物を与え得る限り特にその種類を限定される細菌、カビ、酵母を例示できるが、使用経験豊富で安全性が高い大腸菌が好ましく、そのようなものとして、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株、Ｂ株、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）等が挙げられる。ＡＴＣＣは、アメリカン・タイプカルチャ−・コレクションの番号である。
【００２２】
（５）  形質転換微生物
本発明の形質転換微生物は、本発明に係る組換えプラスミドを有する限り特に限定はないが、宿主微生物が大腸菌である場合には上記の組換えプラスミドを大腸菌宿主にそれ自体公知の方法で形質転換により導入すればよい。組換えプラスミドによる宿主の形質転換は、例えば塩化ルビジウム法によりコンピテントセルを調製し、プラスミドを加えて、４２℃、３０秒間のヒ−トショック、および氷冷、２分間のコ−ルドショックを与えることによりプラスミドを宿主菌体内に形質導入する方法など、常法により容易に実施可能である。得られた大腸菌形質転換体においては、細胞質内にＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が蓄積される。
【００２３】
（６）    形質転換微生物の培養
該プラスミドで形質転換して得られた形質転換微生物の培養は、公知の培養方法に準じて行うことができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質を産生できる条件であれば特に制限はない。さらに詳しく述べると使用する培地は、一般微生物の栄養源として公知のものが使用でき、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。培地のｐＨは、６〜９の範囲で選べばよく、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２４〜３７℃で好気的に培養を行う。培養期間は１〜７日間の範囲で目的のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来のクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の含量が最大になるまで培養すればよい。
【００２４】
（７）  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  ＩＦＯ８８８５の培養
Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  ＩＦＯ８８８５を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育し得るものであるならば何でも使用できる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース、シュクロース、マルトース等の糖類、窒素源としてペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。またこの他に、必要に応じて、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が適宜使用される。上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ５〜９、１９〜３４℃、好ましくはｐＨ７．２、２４℃にて好気的に１日〜１４日間培養する。
【００２５】
（８）  クロロペルオキシダ−ゼ酵素の活性測定方法
酵素活性は、モノクロロジメドンからモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求める。５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、６０μＭ  モノクロロジメドン、５ｍＭ  過酸化水素から成る反応組成液に調製したクロロペルオキシダ−ゼ溶液を適当量加えて、３０℃で反応させる。１分間の２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定し、１ユニットを、３０℃、１分間、１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量と定義する。
【００２６】
（９）  クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質による化学反応
クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質による化学反応は、一般に以下のような条件で行う。ｐＨに関しては、、通常ｐＨ５−８の緩衝液中で行う。使用する緩衝液は、反応を行わせるｐＨで緩衝能を有するものであればいずれのものでも使用可能であるが、通常クエン酸塩を含む緩衝液が好適である。反応温度は、使用するクロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質が活性を有する範囲であればいずれでもよいが、好ましくは２０℃から７０℃付近である。本発明で使用される基質は、本酵素反応によりハロヒドリン化反応または、ハロゲン化反応を受けるものではあればいずれの化合物でも使用され得るが、一般的には、アルケン、アルキン、シクロプロパン、β-ジケトン、フェノ−ル誘導体、アニリン誘導体である。以上の基質を使用する場合は、反応溶液中に溶解した状態であることが望ましいが、水に難溶性の基質であっても少量のメタノ−ル、エタノ−ル、ジメチル
スルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの極性溶媒に溶解後、これを反応溶液中に入れ、十分に分散させた状態で使用してもかまわない。また、超音波破砕処理等によって分散してもかまわない。使用するハライドイオンの量は、添加した基質（モル量）に対して幾分過剰のモル量存在すればよい。また、添加する過酸化物、あるいは過酸化水素は、反応が十分に進行する量であれば任意の量添加できるが、一般的には存在する基質量に対してモル比で０．１から１０の割合で添加することが好ましい。尚、過酸化水素を添加する場合は、その添加方法として、反応液中にハライドイオン化合物、基質、酵素を添加した後に、徐々に加えて行くことが好ましい。反応時間、添加する酵素量は基質が変換される条件であれば任意の時間、任意の酵素量が選択できる。以上のようにして反応した結果、生成する生成物の確認は、薄層クロマトグラフィ−、高速液体クロマトグラフィ−、ガスクロマトグラフィ−等の常法を使用することが出来る。又、反応生成物は、反応終了後、溶媒で抽出、イオン交換樹脂等やシリカゲルなどを用いるクロマトグラフィ−により分離できる。この他にも本発明により得られた生成物の分離精製には、他の一般的な精製法を組み合わせることも可能である。また、得られた反応生成物の同定は、標準化合物が入手できる場合は、薄層クロマトグラフィ−、高速液体クロマトグラフィ−、ガスクロマトグラフィ−により同定できる。また、更に必要な場合は、質量スペクトル、ＮＭＲスペクトルなどの常法を用いることも可能である。
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。特に明記しない限り、以下の実施例において組換え微生物の作成については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ.、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年発行に記載の方法に従った。
【実施例１】
【００２８】
［１］Ｎ末端アミノ酸領域ＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量低減操作の有用性検討
・  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドの作製
３％  グルコース、０．８％  酵母エキス、０．２％  リン酸水素ニカリウム、０．１％  硫酸マグネシウム、０．０００１％  オルソバナジン酸ナトリウムからなる培地を調製して、１２０℃、２０分間殺菌後、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ ＩＦＯ８８８５株を接種し、２４℃、１００ｒｐｍで１日間培養した。培養液からろ過により菌体を回収後、クライオプレス（マイクロテック・ニチオン）を用いて菌体を破砕した。破砕した菌体１０ｍｇよりＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄ−７０００Ａ（Ｇｅｎｔｒａ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、４．９μｇの染色体ＤＮＡを得た。
【００２９】
配列表の配列番号：４及び配列番号：５に記載のオリゴヌクレオチドプライマ−とＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  ＩＦＯ８８８５菌体から抽出した染色体ＤＮＡを用い、以下、１０ｍＭ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡから成る溶液を作成し、９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、６８℃で１．５分のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で５分保持するの反応条件であるＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）により増幅２本鎖化した。増幅した２本鎖を、制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄIIIで切断して大腸菌由来プリンヌクレオシドフォスフォリラ−ゼ由来ＳＤ配列及びＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  ＩＦＯ８８８５由来クロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡフラグメント（１）を得た。また、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、ベクタ−側フラグメント（２）を得た。これらのフラグメント（１）及び（２）をライゲ−ションすることにより、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  ＩＦＯ８８８５由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドｐＵＦＣ３−７を構築した。
【００３０】
［２］Ｎ末端アミノ酸領域ＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量を低減したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドの作製
［１］で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−７を鋳型として、配列番号：６に示すオリゴヌクレオチドと配列番号：４及び７から１０に示した種々のオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用したＰＣＲ、及び、配列番号：１０及び配列番号：５に示したオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲを行い、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼのＮ末端アミノ酸領域２、６、７、１０位までのアミノ酸配列のＧＣ含有量を低減したクロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡフラグメントを増幅した。ＰＣＲは、以下に示す、１０ｍＭ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、１ｎｇ／μＬ  鋳型ｐＵＦＣ３−７プラスミドから成る溶液を作成し、９４℃で２分保持した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で１．５分のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で５分保持するの反応条件で行った。その後、それぞれのフラグメントを、タカラ社製ＢＫＬキットにより平滑末端化、及びリン酸化処理を行い、フラグメント（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）を得た。また、大腸菌プラスミドｐＵＣ１１８を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、その後、脱リン酸化しベクタ−側フラグメント（９）を得た。その後、フラグメント（３）とフラグメント（９）をライゲ−ション後、大腸菌に形質転換することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ０を得た。同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（４）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ２を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（５）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ６を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（６）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ７を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（７）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ１０を、同様にフラグメント（３）に代えてフラグメント（８）を使用することにより発現プラスミドｐＵ１１ＦＣＮ１０ΔＣをそれぞれ得た。
【００３１】
［３］Ｎ末端アミノ酸領域ＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量を低減したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ
ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評価
［１］及び［２］で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−７、ｐＵ１１ＦＣＮ０、ｐＵ１１ＦＣＮ２、ｐＵ１１ＦＣＮ６、ｐＵ１１ＦＣＮ７、ｐＵ１１ＦＣＮ１０、ｐＵ１１ＦＣＮ１０ΔＣにより形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を形質転換し、大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＵＦＣ３−７、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ０、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ２、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ６、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ７、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０、Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０ΔＣをそれぞれ得た。
【００３２】
この形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で、２５℃、２４時間培養した。培養後の菌体を回収し１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）による細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液は、バイオラッド社製プロテインアッセイキットにより蛋白質濃度を測定し、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）を含有する１００ｍＭクエンサン緩衝液（ｐＨ６）中で等蛋白質量になるように調製した。その後、酵素活性を測定した。結果を、表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005117911.tif 000002
【００３４】
表１の結果より、Ｎ末端アミノ酸領域中少なくとも１０アミノ酸位までＤＮＡ塩基配列のＧＣ含有量を低減したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体はモノクロロジメドンを基質とした活性評価において、生来のＤＮＡ塩基配列を有した大腸菌形質転換体およびその他の形質転換体が酵素活性の検出が出来なかったのに対し、著しく向上していることが判明した。また、アミノ酸配列のＣ末端に付加したヒスチジンタグ配列の付加、付加しないことについては、クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の発現に関して大きな差異をもたらさないことが明らかになった。
【実施例２】
【００３５】
培養温度のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼ活性発現への有効性検討
実施例１で構築した大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で、２５℃、３０℃、３７℃で２４時間培養した。培養後の菌体を回収し１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）による細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液は、バイオラッド社製プロテインアッセイキットにより蛋白質濃度を測定し、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）を含有する１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で等蛋白質量になるように調製した。その後、酵素活性を測定した。結果を、表２に示す。
【００３６】
【表２】
2005117911.tif 000003
【００３７】
表２の結果より、２５℃、３０℃で培養した大腸菌形質転換体ではモノクロロジメドンを基質とした活性評価において向上していることが判明した。
【実施例３】
【００３８】
Ｎ末端アミノ酸領域へのアミノ酸配列付加の有用性検討
［１］Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドの作製２
配列表の配列番号：１１及び配列番号：１２に記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）により増幅２本鎖化した。ＰＣＲは、以下に示す、１０ｍＭ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、１ｎｇ／μＬ  鋳型ｐＵＦＣ３−７プラスミドから成る溶液を作成し、９４℃で２分保持した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、６８℃で１．５分のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で５分保持するの反応条件で行った。その後、増幅２本鎖化断片を、制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断してＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼをコ−ドするＤＮＡフラグメント（１０）を得た。また、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIで切断し、ベクタ−側フラグメント（１１）を得た。これらのフラグメント（１０）及び（１１）をライゲ−ションすることにより、β-ガラクトシダ−ゼ由来の９アミノ酸配列を付加されたＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドｐＵＦＣ３−１を構築した。
【００３９】
［２］Ｎ末端アミノ酸領域にβ-ガラクトシダ−ゼ由来の９アミノ酸配列を付加したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来組換えクロロペルオキシダ−ゼ発現プラスミドで形質転換した大腸菌形質転換体の評価
［１］で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−１、実施例１で構築した発現プラスミドｐＵＦＣ３−７およびｐＵＣ１８により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌形質転換株ＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−１、ＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−７、およびＪＭ１０９／ｐＵＣ１８をそれぞれ得た。
【００４０】
この形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地中で、２５℃、２４時間培養した。培養後の菌体を回収し１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）による細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液は、バイオラッド社製プロテインアッセイキットにより蛋白質濃度を測定し、１ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）を含有する１００ｍＭクエンサン緩衝液（ｐＨ６）中で等蛋白質量になるように調製した。その後、酵素活性を測定した結果、培養液量当りＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−１では０．０２６Ｕ／ｍｌ、ＪＭ１０９／ｐＵＦＣ３−７では活性確認できず、およびＪＭ１０９／ｐＵＣ１８では、活性確認できずとなった。本検討結果より、Ｎ末端アミノ酸領域にβ-ガラクトシダ−ゼ由来の９アミノ酸配列を付加することにより、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来組換えクロロペルオキシダ−ゼの活性型発現が向上することがわかった。
【実施例４】
【００４１】
大腸菌形質転換細胞により発現したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ  由来クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質の種々化学反応に対する有用性検討
・  クロロペルオキシダ−ゼサンプルの調製
実施例１で構築した大腸菌形質転換株Ｗ３１１０／ｐＵ１１ＦＣＮ１０をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で３７℃で１６時間培養した。この培養菌体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌＬＢ液体培地中で、２５℃で２４時間培養した。培養後の菌体を回収しＱＩＡＧＥＮ社製Ｈｉｓ-ｔａｇカラムキットを使用し同キットリシス緩衝液により懸濁後、細胞破砕液を調製した。調製した細胞破砕液をニッケルキレ−トカラムにより精製した。精製画分をスピンカラムを用いて脱塩処理し１．３Ｕの酵素調製液を得た。
【００４２】
［２］クロロペルオキシダ−ゼによるブタジエンブロモヒドリンの生成
ガラスバイアルに１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍｌ中で最終濃度が１００ｍＭ  ＫＢｒ、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）、［１］の方法により調製した１．２Ｕクロロペルオキシダ−ゼになるようにした。反応バイアル中から気相部分を１０ｍｌシリンジで抜き取り、４４６μモル等量の１，３−ブタジエンガス１０ｍｌを加えた。１０分間の保温後、１００ｍＭ過酸化水素を１ｍｌ添加し攪拌しながら反応を開始した。過酸化水素は２時間ごとに１００μモル相当を添加し反応を継続した。反応４時間後、反応液を抜き取り、等量の酢酸エチルで抽出をした。その抽出液を用いてドデカンを内部標準としてガスクロマトグラフィ−分析をした。ガスクロマトグラフィ−は、島津製作所製ＧＣ−９Ａ、分析カラムはＪ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＢ−１７０１を用い３００℃でインジェクション後、４０℃で９分間保持後、毎分１０℃づつ昇温させ２５０℃までの傾斜上昇をするように設定して行った。その結果、標準化合物と同等の保持時間を示した。４時間でのブタジエンブロモヒドリンの生成量は、１０８μモルだった。更に、本ブタジエンブロモヒドリンは、抽出まえの反応液に１０％の水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１０以上にすることによりブタジエンモノエポキシドに変換された。ブタジエンモノエポキシドと同等であることは標準試料とのガスクロマトグラフィ−の比較分析により確かめた。塩基処理後の反応生成物及び標準試料の保持時間は７．７分であり同一であった。
【００４３】
［３］クロロペルオキシダ−ゼ活性を有する蛋白質による臭化フェノ−ルの生成
ガラスバイアルに１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍｌ中で最終濃度が１００ｍＭ  ＫＢｒ、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム（Ｎａ3ＶＯ4）、［１］の方法により調製した１．２Ｕクロロペルオキシダ−ゼ，５ｍＭフェノ−ルになるように反応液を調製した。１Ｍ過酸化水素を１０μｌ添加し攪拌しながら反応を開始した。過酸化水素は３０分ごとに添加し反応を継続した。反応３時間後、反応液を抜き取り、等量の酢酸エチルで抽出をした。その抽出液を用いてドデカンを内部標準としてガスクロマトグラフィ−分析をした。ガスクロマトグラフィ−は、島津製作所製ＧＣ−１７００、分析カラムはＪ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＢ１７０１を用い３００℃でインジェクション後、１５０℃で１分間保持後、毎分４℃づつ昇温させ２５０℃までの傾斜上昇をするように設定して行った。その結果、２−Ｂｒ−フェノ−ル、４−Ｂｒ−フェノ−ル、２，４，６−Ｂｒ−フェノ−ルの標準化合物と同等の保持時間１１．４分、１８．４分、２５．６分を示し、同化合物が合成されていることが確認された。
【配列表】
2005117911000001.app