(57)【要約】【課題】本発明は各種老化モデル動物の皮膚に由来する遺伝子についてＤＮＡマイクロアレイ解析を行うことで皮膚老化に関与する因子を探索し、皮膚老化の予防及び治療に有効な新規の皮膚老化抑制因子を見出すことを課題とする。【解決手段】本発明はマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として用い、皮膚老化表現形質を改善及び／又は予防する方法、並びにそのような皮膚老化抑制因子を含んで成る医薬又は皮膚外用組成物、さらにはそのような皮膚老化抑制因子のスクリーニング方法に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを１又は複数種皮膚老化抑制因子として含有する皮膚老化表現形質を改善又は予防するための医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項２】
前記皮膚老化が更年期障害又は加齢を原因とするものである、請求項１記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項３】
前記皮膚老化が更年期障害を原因とする、請求項２記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬又は皮膚外用組成物を個体に投与することにより皮膚老化表現形質を改善又は予防する方法を提供する。
【請求項５】
前記投与が皮膚に前記医薬又は皮膚外用組成物を塗布することにより行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
皮膚老化抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物をマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として選定することを特徴とする方法。
【請求項７】
更に、前記阻害能力を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを老化モデル動物に適用し、皮膚老化表現形質の改善・予防効果を有するインヒビターを選定することを含んで成る、請求項６記載の方法。
【請求項８】
皮膚老化の進行状態を検査する方法であって、皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現が正常な皮膚中の発現に比べて亢進していたら、皮膚老化が進行していると判断することを特徴とする方法。
【請求項９】
前記皮膚老化が更年期障害又は加齢を原因とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記皮膚老化が更年期障害を原因とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現の亢進が、皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の量を測定することにより決定される、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記測定がマトリックスメタロプロテアーゼ−１２に特異的な抗体を利用するＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法による、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現の亢進が、皮膚から抽出されたマトリックスメタロプロテアーゼ−１２をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定される、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍＲＮＡの測定をポリメラーゼ連鎖反応法により行う、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２を含有する、皮膚老化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として用い、皮膚老化表現形質を改善及び／又は予防する方法、並びにそのような皮膚老化抑制因子を含んで成る医薬又は皮膚外用組成物、さらにはそのような皮膚老化抑制因子のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚老化は、その要因に基づき、大まかに自然老化、光老化、更年期障害老化に分類することができる。自然老化は文字通り加齢による老化現象であり、一般に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、たるみ、皮脂減少などの表現形質を特徴とする。光老化は紫外線照射を原因する老化現象であり、一般に黄みの増加、角層水分量の減少、しわなどの表現形質を特徴とする。そして、更年期障害老化は閉経を原因とする女性ホルモンのアンバランス化からくる老化現象であり、一般に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、皮脂減少などの表現形質を特徴とする。更年期障害老化の場合、例えばエストラジオール等のホルモン療法を行うことにより皮膚老化表現形質の改善が認められる場合がある。このように、皮膚老化はその原因に応じて表現形質も微妙に変化し、それぞれ異なる複雑なメカニズムを介して進行するものと考えられる。
【０００３】
皮膚の抗老化剤に関する研究開発はかなり行われているが、老化に関するメカニズムは十分に解明されておらず、より効果的な抗老化剤の出現が待ち望まれている。皮膚老化のメカニズムの解明は主にタンパク質レベルで行われており、例えば、マトリックスの主要な成分であるコラーゲンの減少が皮膚のたるみ、はりの低下に関わり、またエラスチンの分解変性がエラスチン分解酵素であるエラスターゼの過剰発現により起こり、弾力性の低下の原因となる等といった事実まで解明されている。その結果、コラーゲンの産生を促進し、コラーゲンの減少を防いだり、エラスターゼの過剰な発現を抑え、エラスチンの破壊、変性を防止することが皮膚の老化防止に重要であることまでは判明されている（特開平１１−３３５２３５号公報）。
【０００４】
しかしながら、このようなタンパク質レベルでの皮膚老化の研究は皮膚老化の表現形質からアプローチしたものであり、これにより皮膚老化をその根本的な原因に応じて抑制、予防する抗老化剤を見つけることはできない。上述のように皮膚老化はその原因に応じて表現形質も異なるため、その種類に応じた効果的な抗老化剤を開発する必要があり、タンパク質レベルの域を越えた、例えば遺伝子レベルでのメカニズムの解明が望まれる。しかるに、皮膚ＲＮＡの採取の困難性等を理由に、遺伝子レベルでのアプローチから皮膚老化現象の解明を図る研究は十分にはされていなかった。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１１−３３５２３５号公報
【特許文献２】
特表２００２−５１５８９８号公報
【特許文献３】
特表２００２−５３４４３５号公報
【特許文献４】
特表２００２−５３４４０４号公報
【特許文献５】
特表２００１−５０１５９４号公報
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０００  Ｊｕｎ．  １１４（６）：１１１３−９
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は各種老化モデル動物の皮膚に由来する遺伝子についてＤＮＡマイクロアレイ解析を行うことで皮膚老化に関与する因子を探索し、皮膚老化の予防及び治療に有効な新規の皮膚老化抑制因子を見出すことを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は老化モデル動物の皮膚に由来する遺伝子についてＤＮＡマイクロアレイ解析に成功し、皮膚老化に関与する因子を見出すことができた。
【０００８】
本発明者はＤＮＡマイクロアレイ解析の結果、卵巣摘出により更年期障害を人為的に誘導して皮膚老化させたモデルラット（以下「更年期障害モデル」と称する場合がある）及び自然皮膚老化したモデルマウスの皮膚由来の遺伝子群の双方において、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２（以下、「ＭＭＰ−１２」と称する場合がある）及びオステオポンチン遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出した。従って、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２の活性を阻害できれば、皮膚の老化を治療及び／又は予防できるものと推認される。
【０００９】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２はマクロファージエラスターゼ（ＨＭＥ）とも称され、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーの一メンバーであり、エラスチンを分解する。また、エラスチンの他に、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどのマトリックス、ノンマトリックス成分を分解する。マトリックスメタロプロテアーゼファミリーによる結合組織の非制御分解は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、敗血性関節炎；角膜、皮膚、又は胃潰瘍；腫瘍転移、浸潤、又は血管形成；歯周病；タンパク尿；アルツハイマー病；冠状血栓症、及び骨疾患等の多くの病理状態の特徴である。マトリクスメタロプロテアーゼファミリーはまた、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生合成及びＴＮＦの生産又は作用の阻害にも関わっている。しかしながら、皮膚老化に注目すると、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーのうちＭＭＰ−１、２、９が皮膚老化に関与し、その活性を阻害することで皮膚老化を抑制できるとの具体的な報告はあるが（例えば特表２００２−５１５８９８号公報参照）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２に限っては、それと皮膚老化との関係を示唆する論文や研究発表はない。マトリックスメタロプロテアーゼ−１２に関しては皮膚癌、光線性ダメージなどにより発現が亢進するとの報告があるにすぎない。例えば、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０００  Ｊｕｎ．  １１４（６）：１１１３−９（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  （ＭＭＰ−１２）  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．）、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９９９  Ｏｃｔ．  １１３（４）：６６４−７２  （Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ  （ＭＭＰ−７）  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｅｔａｌｌｏｅｌａｓｔａｓｅ  （ＭＭＰ−１２）  ｉｎ  ａｃｔｉｎｉｃ  ｄａｍａｇｅ．）、  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９９９  Ａｐｒ．  １１２（４）：４９９−５０５  （Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  （ＭＭＰ−１２）  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．）を参照されたい。従って、皮膚老化によりマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現が亢進されることは極めて驚くべき事実である。
【００１０】
第一の観点において、本発明はマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを１又は複数種皮膚老化抑制因子として含有する皮膚老化表現形質を改善又は予防するための医薬又は皮膚外用組成物を提供する。好ましくは、この皮膚老化は更年期障害及び／又は加齢を原因とするものである。
【００１１】
第二の観点において、本発明は上記医薬又は皮膚外用組成物を個体、例えばヒトに投与することにより皮膚老化表現形質を改善又は予防する方法を提供する。好適な態様において、この投与は皮膚に当該医薬又は皮膚外用組成物を塗布することにより実施する。
【００１２】
第三の観点において、本発明は皮膚老化抑制因子をスクリーニングする方法で提供する。このスクリーニング方法は、候補化合物をマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として選定することを特徴。好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを老化モデル動物に適用し、皮膚老化表現形質の改善・予防効果を有するインヒビターを選定することを含んで成る。
【００１３】
第四の観点において、本発明は、皮膚老化の進行状態を検査する方法を提供する。この方法は、皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現が正常な皮膚中の発現に比べて亢進していたら、皮膚老化が進行していると判断することを特徴とする。
好適な態様において、上記皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現の亢進は、皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はマトリックスメタロプロテアーゼ−１２に特異的な抗体を利用するＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法により行われる。
別の好適な態様において、上記皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現の亢進は、皮膚から抽出されたのマトリックスメタロプロテアーゼ−１２をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はポリメラーゼ連鎖反応法により行われる。
【００１４】
第五の観点において、本発明はマトリックスメタロプロテアーゼ−１２を含有する皮膚老化促進剤を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
上述の通り、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２はエラスチンをはじめ、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどのタンパク質を基質として分解するメタロプロテアーゼである。本発明者は、更年期障害モデルマウス及び加齢マウスの皮膚由来の遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ解析により、更年期障害や加齢によって皮膚細胞内のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２遺伝子の発現が亢進することを驚くべきことに見出した。従って、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２の活性を抑えることで更年期障害や加齢による皮膚老化の進行を抑え、皮膚老化表現形質を改善及び／又は予防できることが推認される。
【００１６】
本発明は上記マトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として含んで成る医薬又は皮膚外用組成物を提供する。本発明に係る組成物は皮膚老化表現形質、例えば弾性力低下、皮膚（真皮及び表皮）厚の減少、角層水分量減少（乾燥肌）、皮膚色変化（黄み増加、赤み減少）、くすみ、皮膚の炎症、新陳代謝活性低下等を改善・予防することができる。
【００１７】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２の上記活性を阻害するインヒビターは当業界において様々なものが知られ、例えば限定することなく、特表２００２−５３４４３５号公報に記載のメルカプトアセチルアミドジペプチドカルボン酸類、特表２００２−５３４４０４号公報に記載の４−ビアリール酪酸および５−ビアリールペンタン酸誘導体、特表２００１−５０１５９４号公報に記載のペプチド  Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｊ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（式中、Ｊはハイドロプロリン）及びその類似体Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｊ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｂｚ）などが挙げられる。
【００１８】
本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、例えば水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形剤等の形態で適用される。従来から公知の方法でこれらの形態に調製したうえで、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤、水−油２層系、水−油−粉末３層系、注射剤、内服剤（錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等）、坐剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入することができる。当該組成物は上記マトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として、特に限定することなく、組成物全量に基づき例えば０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度含有するであろう。
【００１９】
これらの剤型の中でも、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等の皮膚外用剤が、本発明の目的に適する剤型である。なお、ここで記す皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品（軟膏剤等）、化粧料［洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧品；ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧品；口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品等］が含まれる。特に本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、抗老化用の化粧料としての適用が好適である。
【００２０】
本発明の医薬又は皮膚外用組成物においては、所望する剤型に応じて従来公知の賦形剤や香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料等の粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等が適宜配合される。さらにこの他の薬効成分を本発明の本発明の医薬又は皮膚外用組成物に配合することは、その配合により所期の効果を損なわない範囲内で可能である。
【００２１】
皮膚老化抑制因子をスクリーニングする方法
本発明は、本発明の組成物及び方法に使用するための皮膚老化抑制因子を同定するためのスクリーニング方法も提供する。このスクリーニング方法は、候補化合物をマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを皮膚老化抑制因子として選定することを特徴。好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを老化モデル動物に適用し、皮膚老化表現形質の改善・予防効果を有するインヒビターを選定することを含んで成る。
【００２２】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２の活性を阻害する候補化合物の能力について評価する工程は当業界の技術常識の範囲内で実施され、如何なる方法に限定されるものでもない。例えば、基質としてマトリックスメタロプロテアーゼ−１２により分解されるタンパク質、例えばエラスチンを用い、候補化合物の存在下でマトリックスメタロプロテアーゼ−１２と酵素反応させる。そして、このような候補化合物の存在下で測定されたマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の基質分解活性が、候補化合物の不在下でのマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の基質分解活性と比較して低下したならば、かかる候補化合物は真のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターであると判定できる。その評価基準としては、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の分解活性を５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上低下させる場合に真のインヒビターであると判定することができる。基質としては、エラスチンの他に、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどが利用できる。
【００２３】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターの皮膚老化現象の改善・予防効果についての確認する工程はこのインヒビターを老化モデル動物、例えば卵巣摘出により更年期障害を人為的に誘導して皮膚老化させたモデル動物や自然皮膚老化したモデル動物を利用して実施することができる。動物としては例えばマウス、ラット、ウサギなど様々な動物が利用できる。好適な態様においては、このアンタゴニストの溶液、例えば水溶液を調製してから老化モデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、老化現象の表現形質を評価することで、改善・予防効果の有無を判定することができる。老化現象の表現形質としては、例えば弾性力低下、皮膚（真皮及び表皮）厚の減少、角層水分量減少（乾燥肌）、皮膚色変化（黄み増加、赤み減少）、くすみ、皮膚の炎症、新陳代謝活性低下等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２４】
皮膚老化の進行状態を検査する方法
本発明はまた、皮膚老化の進行状態を検査する方法を提供する。この方法は、皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現が正常な皮膚中の発現に比べ亢進していたら、皮膚老化が進行していると判断することを特徴とする。ここで正常な皮膚とは、好適には上述の皮膚老化表現形質を有さない皮膚をいう。
皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の発現の亢進は、例えば皮膚中のマトリックスメタロプロテアーゼ−１２の量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はマトリックスメタロプロテアーゼ−１２に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等、様々な方法により実施できる。また、皮膚からＲＮＡを抽出し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により行われる。
【００２５】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１２を含有する皮膚老化促進剤
上述の通り、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２は更年期障害老化や加齢による皮膚老化の原因因子である可能性が示唆されていることから、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２を皮膚に適用すれば更年期障害や加齢が関与する皮膚老化を人為的に惹起できるものと考えられる。従って、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２を含有する皮膚老化促進剤を利用することにより、皮膚老化モデルを構築することが可能となる。このような皮膚老化促進剤は更年期障害老化や加齢による皮膚老化の抗老化剤の研究、開発に極めて有用である。
【００２６】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２７】
【実施例】
方法
更年期障害モデル動物（ＯＶＸ）の作製
５週齢のラット（ＨＷＹ−１、♀）、およびマウス（ＨＲ−１、♀）に定法に従い卵巣摘出手術を施した。コントロール群（Ｓｈａｍ）は実際の卵巣摘出以外、同様の手術を施した。さらに、卵巣摘出手術を施したラットおよびマウスにエストラジオールを２週間連続投与し、エストラジオールによるホルモン置換治療による効果も調べた（ＯＶＸ＋Ｅ２）。卵巣摘出手術４週間後（９週齢）、子宮重量の顕著な減少により卵巣摘出手術の是非を確認した。
【００２８】
自然老化モデル動物の作製
８７週齢マウス（ＨＲ−１）を自然老化マウスとして用いた。若年コントロールとして９週齢マウス（ＨＲ−１）を用いた。また、自然老化経時マウスとして２０，４０，６０週齢マウス（ＨＲ−１）を合わせて用いた。皮膚からのＲＮＡ採取は上期卵巣摘出ラットと同様の方法を用いた。
【００２９】
老化モデル動物の皮膚老化について、皮膚の色み、具体的には赤み、黄みの増減、角層水分量、並びにたるみ、しわ、皮脂量について調べた。その結果、更年期障害モデル動物では赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、皮脂の減少といった更年期障害固有の皮膚老化が認められた。自然老化モデル動物でも更年期障害モデル動物と同様に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、皮脂の減少が認められ、さらにはたるみも認められた。尚、更年期障害モデルの場合、エストラジオールによるホルモン置換治療により角層水分量の回復が認められた。以上の結果により、更年期障害モデル動物及び自然老化モデル動物は共に皮膚老化の表現形質を示す良好なモデルであることがわかり、よってそのような表現形質を示す皮膚からＲＮＡを採取して、皮膚老化原因遺伝子を探索した。
【００３０】
皮膚からのトータルＲＮＡ採取
ラットまたはマウス背部の皮膚全層を採取、脂肪層を取り除き、１センチ角に切断して液体窒素で凍結した。凍結した皮膚片を破砕後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社、メーカー推奨プロトコル）によりトータルＲＮＡを抽出、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）により、精製した。
【００３１】
マイクロアレイ用サンプルの反応
マイクロアレイ解析はアフィメトリックス社ジーンチップ及びアジレント社マイクロアレイを用いた。
（１）アフィメトリックス社用サンプル調製
アフィメトリックス社推奨プロトコルに準じて反応を行った。トータルＲＮＡ  １０μｇをＴ７−（ｄＴ）２４  プライマー、１００ｐｍｏｌ（Ｓｉｇｍａ社）と共に７０℃で１０分間反応させた。その後、５ｘ第一鎖反応バッファー４μｌ，  ０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  １μｌ，  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ２μｌ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて、４２℃で１時間反応させた。この反応物に、Ｒｎａｓｅ非含有水９１μｌ，  ５ｘ第二鎖反応バッファー３０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ミックス３μｌ，１０Ｕ／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  リガーゼ１μｌ，１０Ｕ／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ４μｌ，  ２Ｕ／μｌ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ  １μｌ  （すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、１６℃で２時間反応させた。さらに、２μｌ（１０Ｕ／μｌ）のＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、１６℃で５分間反応後、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて反応を止めた。Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓ  （Ｑｉａｇｅｎ社）を用いクリーンアップを行い、Ｒｎａｓｅ  非含有水１２μｌに溶出した。得られたｃＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写反応によりビオチン付加ｃＲＮＡを作製し（Ｅｎｚｏ，  Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。ｃＲＮＡをフラグメンテーションバッファー中で９４℃にて３５分間分断した後、ジーンチップハイブリダイゼーションに用いた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００を用い、洗浄、染色後、アフィメトリックス社スキャナーによりデータ読み取りを行った。
【００３２】
（２）アジレントｃＤＮＡマイクロアレイ用サンプル
サンプルの調製及びハイブリダイゼーションはアジレント社推奨プロトコルに準じた。トータルＲＮＡ１０μｇを、ｃＤＮＡラベル化キット（アジレント社）を用いてラベル化ｃＤＮＡを合成した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ社，メーカー推奨プロトコル）にて精製後、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにより溶媒を乾燥した。次に、マウスｃＤＮＡマイクロアレイキット（アジレント社、Ｇ４１０Ａ）を用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。アジレント社スキャナーによりデータ読み取りを行った。
【００３３】
ＲＴ−ＰＣＲ
皮膚から採取したトータルＲＮＡ各（Ｓｈａｍ，  ＯＶＸ，  ＯＶＸ＋Ｅ２または９週齢及び８７週齢）１μｇをオリゴ−ｄＴプライマー（２４ｍｅｒ）  １００ｐｍｏｌ（Ｓｉｇｍａ）と共に７０℃で１０  分（総容量２０μｌ）反応させた。その後、５ｘ第一鎖反応バッファー  ４μｌ，  ０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ，  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ミックス４μｌ，  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  １μｌ（すべてｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、４２℃で１時間反応させた。最後に７０℃で１０分反応させて伸長させ、ｃＤＮＡテンプレートを調製した。ｒＴａｑ用１０×バッファー  ５μｌ，  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ，  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ミックス５μｌ，  ｒＴａｑ  ０．５μｌ（すべてＴＯＹＯＢＯ社），  ｄｄＨ２Ｏ  ３３．５μｌ，  ｃＤＮＡテンプレート各１μｌ  （Ｓｈａｍ，  ＯＶＸ，  ＯＶＸ＋Ｅ２または９週齢及び８７週齢）プライマー（下記配列参照）、センス及びアンチセンス各２０ｍＭ  １μｌ（総容量５０μｌ）をすべて加え、ＰＣＲ反応〔９４℃  ２分、（９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分）を３０サイクル、７２℃  １０分〕を行った。
【００３４】
プライマー配列（ラット、マウス共通配列）
ＭＭＰ−１２−センス          ＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧ
ＭＭＰ−１２−アンチセンス    ＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡ
【００３５】
最後に１．５％エチジウムブロマイド含有アガロースゲルにて電気泳動して約３００ｂｐのバンドを得た。尚、参考データーのため、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子をＰＣＲ増幅させた。
【００３６】
解析結果１
約９，０００種の遺伝子の発現を網羅的に解析した結果、更年期障害モデル動物（ラット）の皮膚では、３１種の遺伝子について２分の１以下に至る発現率の減少が認められ、６種の遺伝子について１．５倍以上の発現率の亢進が認められた。そのうち、驚くべきことに、従来において皮膚老化との関与が全く示唆されていないＭＭＰ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現が、図１及び下記の表に示すとおりコントロール動物と比べ顕著に亢進することが認められた。
【００３７】
【表１】
2005053789.tif 000002
【００３８】
この結果は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２が皮膚更年期障害の原因遺伝子である可能性が高いことを示唆する。
【００３９】
解析結果２
約１２，０００種の遺伝子の発現をアジレント社マウスｃＤＮＡアレイを用い網羅的に解析した結果、自然老化モデル動物（マウス）の皮膚において、従来技術では皮膚自然老化との関与が全く示唆されていないマトリックスメタロプロテアーゼ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現が、図２及び下記の表に示すとおりコントロールと比べて顕著に亢進することが認められた。経時での検討においても、図３に示すとおり、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現は４０週齢以降亢進し、８７週齢では更に亢進することが認められた。
【００４０】
【表２】
2005053789.tif 000003
【００４１】
この結果は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２が皮膚自然老化現象の原因遺伝子である可能性が高いことを示唆する。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、従来技術には存在しない全く新規な抗老化剤の提供が可能となる。
【配列表】
2005053789.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲによる、マウス更年期モデルにおけるＭＭＰ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現を示す。
【図２】ＰＣＲによる、マウス自然老化モデルにおけるＭＭＰ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現を示す。
【図３】マイクロアレイによる、マウス老齢モデル経時におけるＭＭＰ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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