(57)【要約】    【課題】    等電点電気泳動を行なうにあたり、電極液の拡散が生じないチップを提供する。    【解決手段】    ガラス基板１１には試料を流す流路１６が形成され、基板１０にはｐＨ勾配を生じさせるための電極液を注入するリザーバ１４，１５と試料を導入又は排出するための穴１２，１３がリザーバとは別の位置に形成されている。リザーバ１４，１５の底には高分子半透膜などのイオン透過性半透膜１８が接着剤で固着され、電極液が流路に進入しないようになっている。リザーバ１４，１５に電極を挿入して電圧を印加し、ＵＶ光などの光源を流路に照射して、光源の反対側に配置されたフォトダイオードアレイなどの１次元検出器で検出することによって、測定対象タンパク質が収束したことを検出することができる。    【選択図】  図１
2005331411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
板状部材の内部に流路を有し、その流路の両端に液出入口をもつ等電点電気泳動チップにおいて、
前記流路に沿った２つの位置に前記液出入口とは別のｐＨ勾配を形成するための電極液導入穴が形成され、
前記穴と流路はイオンが透過する素材を介して接続されている等電点電気泳動チップ。
【請求項２】
前記素材は半透膜である請求項１に記載の等電点電気泳動チップ。
【請求項３】
前記半透膜は、再生セルロース、セルロースアセテート、ポリアクリルニトリル共重合体、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、芳香族ポリスルホン、芳香族ポリアミド及びカーボネート・エチレンオキシド共重合体からなる群から選ばれた高分子化合物である請求項２に記載の等電点電気泳動チップ。
【請求項４】
前記素材は板状部材に接着剤により固着されている請求項１から３のいずれかに記載の等電点電気泳動チップ。
【請求項５】
請求項１から４に記載の等電点電気泳動チップと、前記電極液導入穴間の流路に電圧を印加する電源装置と、前記流路に光を照射する光源と、前記光源からの光による前記流路からの光を検出する検出器とを備えた等電点電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、タンパク質等の両性電解質をその等電点（isoelectric point: PI）で分離し分析する等電点電気泳動装置と、特にマイクロチップを用いたプロテオーム解析に適した等電点電気泳動チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の研究には、分子の大きさと電荷の違いによる分離方法としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）等が用いられ、等電点を利用した分離方法として等電点電気泳動が用いられている。
【０００３】
近年、分析化学の分野ではμＴＡＳ（Micro Total Analysis Systems）の研究が盛んになりつつあり、マイクロチップを用いて分析の高速・省サンプル・省溶媒化を図ることが期待されている。
特に、プロテオーム解析では高価で貴重なサンプルを用いることから、ハイスループットであることが要求されており、マイクロチップを用いた等電点電気泳動によるタンパク質の分析は特に有用である。
【０００４】
タンパク質の分析方法の一つである等電点電気泳動は、ｐＨ勾配が形成される両性電解物質溶液を用いて電圧を印加することで、タンパク質の等電点においてタンパク質を収束させ、同定・定量を行なう技術である（非特許文献１参照。）。
【０００５】
従来用いられている等電点電気泳動では、水素イオンと水酸化物イオンを通すための電極液を両性電解物質溶液が満たされた流路の両端に加える必要があるが、流路中の試料との間の拡散や電極液注入時における水頭差により、電極液が流路に進入してくることが問題であったため、電極液に高い粘性を示す試薬を添加することによって電極液が流路に侵入することを防止していた。
【非特許文献１】電気学会研究会資料ＣＨＳ−０３−５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
等電点電気泳動を行なうとき、試料のｐＨが極端に高い場合や低い場合は電極液が加水分解により分解され、又、電極液の粘性が高いために電気泳動装置を洗浄するなどの操作が難しいという欠点があった。
本発明は操作性のすぐれた等電点電気泳動装置と、マイクロチップを用いた電気泳動チップを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、板状部材の内部に流路を有し、その流路の両端に液出入口をもつ等電点電気泳動チップにおいて、前記流路に沿った２つの位置に前記液出入口とは別のｐＨ勾配を形成するための電極液導入穴が形成され、前記穴と流路はイオンが透過する素材を介して接続されている。
ここで「チップ」とは必ずしも小さいことを意味するものではなく、板状部材の内部に流路が形成されたものを意味している。
【０００８】
前記素材の好ましいものは半透膜である。半透膜としては、例えば、再生セルロース、セルロースアセテート、ポリアクリルニトリル共重合体、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、芳香族ポリスルホン、芳香族ポリアミド及びカーボネート・エチレンオキシド共重合体からなる群から選ばれた高分子化合物を用いることができる。
前記素材は接着剤により板状部材に固着することができる。
【０００９】
本発明の等電点電気泳動装置は、本発明の等電点電気泳動チップと、その等電点電気泳動チップの電極液導入穴間の流路に電圧を印加する電源装置と、前記流路に光を照射する光源と、前記光源の光による前記流路からの光を検出する検出器とを備えている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の等電点電気泳動チップでは、電極液の拡散や電極液注入時における水頭差を防ぐために、ｐＨ勾配を形成するための電極液と電気泳動を行なわせる試料を別々に配置し、電極液の導入口と板状部材内部の流路が接する界面にイオン透過性の膜を配置したことによって、電極液の拡散や流路への侵入がなくなるので、分析操作を簡便に行なうことができる。
また、従来、電極液が流路に侵入することを防止するために用いていた粘性の高い電極液を用いる必要がないので、電気泳動装置や試料の洗浄等などでも分析の高速化が可能となる。
【００１１】
このように本発明を用いると、等電点電気泳動分析を簡便で、高速に、かつ高精度に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１に本発明の等電点電気泳動チップの一実施例を説明する。（Ａ）は平面図、（Ｂ）はそのＸ―Ｘ線位置での断面図である。基板１０，１１はガラス基板であり、例えば石英ガラス基板である。両ガラス基板１０，１１はフッ酸などによって接合され、チップが形成されている。ガラス基板１１の接合面側の表面には、数百μｍ以下の幅、深さを持つ液体試料分析用流路として用いる微小な流路１６が形成されている。
ガラス基板１０には、流路１６の両端に対応する位置に液体試料の導入又は排出用の貫通穴１２，１３が形成されている。
【００１３】
ガラス基板１０にはさらに穴１２，１３間で流路１６に沿った２つの位置に電極液導入穴となるリザーバ１４，１５が形成され、リザーバ１４，１５の底には、例えばセルロースアセテートなどのイオン透過性高分子半透膜１８が接着剤で固着され、その膜を通して流路１６と接続されている。リザーバ１４，１５にはｐＨ勾配を生じさせる電極液が溜められている。
【００１４】
本発明の等電点電気泳動チップは、図１の構造に限定されず、流路１６と穴１２，１３及びリザーバ１４，１５が同じ基板に形成されている構造や、３枚の基板を接合したもの、１枚のガラス基板の内部に流路が形成されている構造など、試料導入口とリザーバが別々に配置されているものであればよい。また、流路の形状も実施例のものに限定されない。
【００１５】
イオン透過性膜としては、再生セルロース、セルロースアセテート、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、芳香族ポリスルホン、芳香族ポリアミド、カーボネート・エチレンオキシド共重合体などの高分子化合物を用いることができ、膜厚の減少と透析液側の塩膜抵抗の減少によって透析効率を向上させることができる。
【００１６】
イオン透過性膜の製造方法には、ポリマーを溶媒で溶解した紡糸液を、環状中空紡口から直接又は空中走行を経由して凝固浴に導きゲル化させ、ポリマーと溶媒を相分離させて中空糸とする湿式紡糸法、空中走行時に冷却ゲル化させ、次いで凝固浴にて脱溶媒相分離させる乾湿式分離法、及び、ポリマーに可塑剤等を加え熱溶融した紡糸液を環状中空紡糸口から空気中に押し出し、冷却相分離させた後水溶液中で可塑剤を除去する溶融紡糸法の３種類がある。また、この時使用される中空糸形成剤には、不活性ガスや凝固性または非凝固性の液体が用いられる。このようにして得られた中空糸の膜構造は、主に成膜時のポリマーと溶媒の相分離過程で形成されるポリマー粒子の大きさと凝集で決まるが、これらはポリマーや溶媒の種類、成膜時の方法と条件によって決定される。
【００１７】
一実施例のチップの製造方法を説明する。（Ａ）まず、ガラス基板１１を洗浄した後、ＳｉやＣｒ等を成膜し、フォトレジストをコーティングする。（Ｂ）次に、フォトマスクを用いてＵＶ（紫外）光をフォトレジストに露光する。（Ｃ）その後、フォトレジストを現像してパターニングする。（Ｄ）パターニングされたフォトレジストをマスクとして、ＳｉやＣｒ等をエッチングしてパターニングし、ＳｉやＣｒ等のパターンをマスクとしてガラス基板を例えば４６％フッ酸水溶液にてエッチングして、流路溝を形成する。（Ｅ）フォトレジストを除去し、ＳｉやＣｒ等を除去する。（Ｆ）ガラス基板１０に試料導入用の穴１２及び排出用の穴１３、並びにリザーバ用の穴１４，１５をサンドブラスト法などにより形成する。（Ｇ）両ガラス基板１０，１１を流路溝が内部になるように合わせて、フッ酸などによって接合する。
製造方法は前記エッチング法に限られず、機械的加工、レーザー加工、成型などによっても行なうことができる。
【００１８】
図２に、一実施例のチップを用いた等電点電気泳動装置の一実施例を説明する。等電点電気泳動チップ中の流路１６に、両性電解質溶液と測定対象タンパク質を混合したものを試料導入口１２から充填する。リザーバ１４に酸性溶液を満たし、リザーバ１５にアルカリ性溶液を満たす。リザーバ１４，１５に電極を挿入して、電源２４によりリザーバ１４，１５間の流路１６に電圧を印加する。２０は流路に印加される電圧を測定する電圧計、２２は流路を流れる電流を測定する電流計である。
【００１９】
光源２６を用いて、例えばＵＶ光３０を等電点電気泳動チップ１の流路１６に沿って照射し、光源２６の反対側に流路１６に沿って配置されたフォトダイオードアレイなどの一次元検出器３２を用いて流路１６を透過したＵＶ光３０を検出する。光３０はＵＶ光に限定されず、可視光線などでもよい。電圧印加後、測定対象タンパク質が収束したことを検出器３２により検出する。
【００２０】
等電点電気泳動装置としては、流路１６中の試料タンパク質中から発生する蛍光を検出するようにしてもよい。また、複数又は連続波長を含む光源を用い、検出器３２を２次元検出器とするとともに、分光器を配置することにより、試料タンパク質による吸収スペクトル又は蛍光スペクトルを検出するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、ペプチド、タンパク質等の両性電解質をその等電点で分離し分析する等電点電気泳動分析に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】等電点電気泳動チップの一実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はそのＸ−Ｘ線位置での断面図である。
【図２】等電点電気泳動装置の一実施例を示す概略斜視図である。
【符号の説明】
【００２３】
１０，１１      ガラス基板
１２            試料導入口
１３            試料排出口
１４，１５      電極液用リザーバ
１６            流路
１８            半透膜
２４            電源
２６            光源
３０            ＵＶ光
３２            検出器
【図１】
2005331411.tif 000003
【図２】
2005331411.tif 000004