(57)【要約】【課題】  従来の無細胞タンパク質合成系では困難であった翻訳後修飾等を可能とする細胞内膜成分を含んだ無細胞タンパク質合成液、およびその製造方法、並びにその利用法を提供する。【解決手段】  植物の培養細胞由来プロトプラストから液胞が除去され、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜成分を含む脱液胞化プロトプラストを密度勾配遠心法により回収する。当該脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞タンパク質合成液を用いてタンパク質合成することにより、翻訳後修飾や分泌シグナルのプロセッシング等を試験管内で再現可能とした。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞のプロトプラストを用いて、脱液胞化プロトプラストを調製する脱液胞化プロトプラスト調製工程と、
当該脱液胞化プロトプラストを用いて、無細胞タンパク質合成液を調製する無細胞タンパク質合成液調製工程と、
を含むことを特徴とする、無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項２】
上記脱液胞化プロトプラスト調製工程には、脱液胞化プロトプラストを取得するために密度勾配遠心法を用いる密度勾配遠心工程が含まれることを特徴とする、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項３】
上記密度勾配遠心工程に用いる密度勾配液として、２種類以上の密度の異なる密度勾配液を重層して用いることを特徴とする、請求項２に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項４】
上記密度勾配遠心工程に用いる密度勾配液には、連続密度勾配液が含まれることを特徴とする、請求項２または３のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項５】
上記密度勾配遠心工程において、脱液胞化プロトプラストが、密度の異なる密度勾配液の液−液界面に濃縮して遠心分画されるように重層した密度勾配液を用いることを特徴とする、請求項３または４のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項６】
上記連続密度勾配液は、上記脱液胞化プロトプラストが濃縮される密度勾配液の液−液界面より上層に重層されることを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項７】
上記密度勾配液として、コロイド状シリカ製密度勾配液を用いることを特徴とする、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項８】
上記コロイド状シリカ製密度勾配液はパーコール（商品名）であることを特徴とする、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項９】
４５〜７５％（ｖ/ｖ）の範囲内から選択される濃度のパーコールを最下層とすることを特徴とする、請求項８に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１０】
下層から順に４５〜７５％（ｖ/ｖ）、３５〜５０％（ｖ/ｖ）および１０〜３５％（ｖ/ｖ）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように用いることを特徴とする、請求項８に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１１】
下層から順に７０％（ｖ/ｖ）、４０％（ｖ/ｖ）および３０％（ｖ/ｖ）の濃度のパーコールを重層して用いることを特徴とする、請求項８に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１２】
下層から順に４５〜７５％（ｖ/ｖ）、３５〜５０％（ｖ/ｖ）、（１０〜２０％（ｖ/ｖ））ないし（２５〜３５％（ｖ/ｖ））の連続密度勾配、および５〜１５％（ｖ/ｖ）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように濃度順に用いることを特徴とする、請求項８に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１３】
下層から順に７０％（ｖ/ｖ）、４０％（ｖ/ｖ）、２０ないし３０％（ｖ/ｖ）の連続密度勾配、および１５％（ｖ/ｖ）の濃度のパーコールを重層して用いることを特徴とする、請求項８に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１４】
上記脱液胞化プロトプラスト調製工程の前段に、植物細胞からプロトプラストを調製する、プロトプラスト調製工程を含むことを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１５】
上記植物細胞のプロトプラストは、植物の培養細胞から調製されるものであることを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１６】
上記植物がタバコ（Nicotiana tabacum）またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成液の製造方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法によって得られることを特徴とする、無細胞タンパク質合成液。
【請求項１８】
請求項１７に記載の無細胞タンパク質合成液を含む無細胞タンパク質合成反応液であって、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、スペルミン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼおよびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含むものであることを特徴とする、無細胞タンパク質合成反応液。
【請求項１９】
上記無細胞タンパク質合成合成反応液において、スペルミンの濃度が８０μＭ未満、かつクレアチンキナーゼの濃度が１００μｇ／ｍＬ超であることを特徴とする、請求項１８に記載の無細胞タンパク質合成液。
【請求項２０】
請求項１７に記載の無細胞タンパク質合成液を製造するための、無細胞タンパク質合成液製造キット。
【請求項２１】
植物細胞のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製するために用いられる脱液胞化試薬と、
脱液胞化プロトプラストから無細胞タンパク質合成液を調製するために用いられる合成液調製試薬と、
を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成液製造キット。
【請求項２２】
上記脱液胞化試薬には、密度勾配液が含まれることを特徴とする、請求項２１に記載の無細胞タンパク質合成液製造キット。
【請求項２３】
さらに、植物細胞のプロトプラストを調製するために用いられるプロトプラスト調製試薬を含むことを特徴とする、請求項２１または２２に記載の無細胞タンパク質合成液製造キット。
【請求項２４】
上記プロトプラスト調製試薬には、植物細胞の細胞壁を消化する酵素類が含まれることを特徴とする、請求項２３に記載の無細胞タンパク質合成液製造キット。
【請求項２５】
請求項１７に記載の無細胞タンパク質合成液と、
上記無細胞タンパク質合成液に添加して、無細胞タンパク質合成反応液を調製するための反応液調製試薬と、
を含むことを特徴とする、無細胞タンパク質合成キット。
【請求項２６】
さらに、取得目的のタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター、ＲＮＡ合成酵素および基質を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項２７】
さらに、コントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡ、またはコントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクターを含むことを特徴とする、請求項２５または２６に記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項２８】
さらに、無細胞タンパク質合成反応用プレートを含むことを特徴とする、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項２９】
合成されたタンパク質を検出するための、電気泳動用ゲル、緩衝液、試薬等を含むことを特徴とする、請求項２５ないし２８のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項３０】
請求項１７、１８、１９、２５ないし２９に記載の無細胞タンパク質合成液、無細胞タンパク質合成反応液および無細胞タンパク質合成キットのいずれかを用いてタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成液およびその製造方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法である。生細胞を用いる遺伝子工学的タンパク質生産系と比較し、操作が簡便で、タンパク質合成に要する時間も比較的短時間で済み、細胞毒性を持つタンパク質の合成も可能になる等多くの利点を有する。このような無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。
【０００３】
従来、一般的に用いられている無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、および大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系がある。これらの系の選択は、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して行う必要がある。一般的に真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択される。
【０００４】
真核生物由来遺伝子産物や、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多い。例えば、糖鎖付加等の翻訳後修飾、分泌シグナルのプロセッシング、細胞内膜上に存在する各種タンパク質との相互作用等である。しかしながら、従来の無細胞タンパク質合成系では、抽出液の調製時に主要な細胞内膜成分が除かれてしまうため、前述の各種生化学反応を試験管内で再現することは困難である。唯一、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系では、反応系にイヌ膵臓ミクロソーム膜を添加することにより、翻訳後修飾や、分泌シグナルのプロセッシングが可能である（非特許文献１）。また、コムギ胚芽抽出液を用いる系にイヌ膵臓ミクロソーム膜を添加した場合、ミクロソーム膜の添加量に応じて翻訳活性が低下する現象が報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
一方、脱液胞化プロトプラストについては、ＢＹ−２タバコ培養細胞由来のプロトプラストをパーコール（商品名、ポリビニルピロリドン被膜を持つコロイド状シリカ製品）溶液中で遠心することにより、液胞とそれ以外の細胞成分（脱液胞化プロトプラスト）に分離可能であることが報告されている（非特許文献３）。
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 5598―5602 (1981)
【非特許文献２】J.Biol.Chem.、253, 3753―3756 (1978)
【非特許文献３】Protoplasma、155, 239-242 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、従来の無細胞タンパク質合成系においては、無細胞タンパク質合成液中に主要な細胞内膜成分が含まれていないため、翻訳後修飾や分泌シグナルのプロセッシングは不可能である。唯一、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系では、反応系にイヌ膵臓ミクロソーム膜を添加することにより、翻訳後修飾や、分泌シグナルのプロセッシングが可能であるが、ミクロソーム膜を別に用意する必要があり、操作も煩雑となる。したがって、活性発現に細胞内膜成分の関与が必要な遺伝子産物を、活性型として安定に合成することが可能な無細胞タンパク質合成系、すなわち細胞内膜成分を含んだ無細胞タンパク質合成液の開発が強く望まれている。
【０００７】
また、従来の無細胞タンパク質合成系においては、高分子量タンパク質の合成効率が悪いという問題があった。したがって、高分子量タンパク質を効率よく合成できる無細胞タンパク質合成液の開発が望まれている。
【０００８】
一方、非特許文献３に記載されている脱液胞化プロトプラストの分離方法では、遠心管の底に脱液胞化プロトプラストが堆積するため、同じく底に堆積する糖質等の固形成分の影響により脱液胞化プロトプラストが破砕されてしまうという問題があった。したがって、無傷の脱液胞化プロトプラストを効率よく回収できる工夫が必要である。
【０００９】
本発明は、上記従来の問題に鑑みなされたものであり、その目的は、翻訳後修飾等を可能とする細胞内膜成分を含んだ無細胞タンパク質合成液、およびその製造方法、並びにその利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用できることを見出した。また、濃度の異なる密度勾配液を重層して遠心分画することにより、植物のプロトプラストから無傷の脱液胞化プロトプラストを効率よく回収できることを見出した。さらに、重層する密度勾配液の一層を連続密度勾配液にすることにより、脱液胞化プロトプラストの回収効率が大幅に向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成液の製造方法は、上記の課題を解決するために、植物のプロトプラストを用いて、脱液胞化プロトプラストを調製する脱液胞化プロトプラスト調製工程と、当該脱液胞化プロトプラストを用いて、無細胞タンパク質合成液を調製する無細胞タンパク質合成液調製工程とを含むことを特徴とする。本製造方法により得られる無細胞タンパク質合成液を用いた無細胞タンパク質合成系においては、翻訳後修飾が可能となり、高分子タンパク質を効率よく合成することが可能となる。
【００１２】
上記脱液胞化プロトプラスト調製工程には、密度勾配遠心法を用いてプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを取得する密度勾配遠心工程を含むことができる。密度勾配遠心法に用いる密度勾配液としては、２種類以上の密度の異なる密度勾配液を重層して用いることが好ましい。また、連続密度勾配液を用いてもよい。２種類以上の濃度の異なる密度勾配液を用いる場合には、脱液胞化プロトプラストが、密度の異なる密度勾配液の液−液界面に濃縮して遠心分画されるよう濃度を選択して重層することが好ましい。脱液胞化プロトプラストが液−液界面に濃縮して遠心分画されることにより、脱液胞化プロトプラストを損傷させることなく回収することができる。また、上記連続密度勾配液は、上記脱液胞化プロトプラストが濃縮される密度勾配液の液−液界面より上層に重層されることが好ましい。
【００１３】
密度勾配液としては、コロイド状シリカ製密度勾配液を用いることが好ましく、パーコール（商品名）を用いることがさらに好ましい。密度勾配液としてパーコール（商品名）を用いる場合には、４５〜７５％（v/v）の範囲内から選択される濃度のパーコールを最下層とすることが好ましい。パーコールを３層に重層して用いる場合には、下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）および１０〜３５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）および３０％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。
【００１４】
連続密度勾配のパーコールを用いる場合には、下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）、（１０〜２０％（v/v））ないし（２５〜３５％（v/v））の連続密度勾配、および５〜１５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように濃度順に用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）、２０ないし３０％（v/v）の連続密度勾配、および１５％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。連続密度勾配液を用いることにより、脱液胞化プロトプラストの回収効率を向上させることが可能となる。
【００１５】
本発明に係る製造方法においては、脱液胞化プロトプラスト調製工程の前段に、植物細胞からプロトプラストを調製するプロトプラスト調製工程が含まれていてもよい。
【００１６】
本発明に係る製造方法において、プロトプラストの調製に供される植物細胞は、特に限定されるものではないが、植物の培養細胞であることが好ましい。植物の種類としては、タバコ（Nicotiana tabacum）またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を好適に使用することができる。
【００１７】
本発明に係る無細胞タンパク質合成合成液は、本発明に係る製造方法により得られる無細胞タンパク質合成液である。本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いた無細胞タンパク質合成系においては、翻訳後修飾が可能となり、高分子量タンパク質を効率よく合成することが可能となる。
【００１８】
本発明に係る無細胞タンパク質合成反応液は、上記無細胞タンパク質合成液を含み、それ以外に酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、スペルミン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼおよびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含むものであることを特徴とする。さらに、スペルミンの濃度が８０μＭ未満、かつクレアチンキナーゼの濃度が１００μｇ／ｍＬ超であることが好ましい。これにより、翻訳活性を向上させることが可能となる。
【００１９】
本発明に係る無細胞タンパク質合成液製造キットは、本発明に係る製造方法により無細胞タンパク質合成液を得るために使用するキットである。本キットには、プロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製するため用いられる脱液胞化試薬および脱液胞化プロトプラストから無細胞タンパク質合成液を調製するために用いられる合成液調製試薬が含まれており、さらに、植物のプロトプラストを調製するために用いられるプロトプラスト調製試薬が含まれていることが好ましい。上記脱液胞化試薬には、密度勾配液が含まれていることが好ましく、上記プロトプラスト調製試薬には、植物細胞の細胞壁を消化する酵素類が含まれていることが好ましい。本キットを用いることにより、簡便に脱液胞化プロトプラスト由来の無細胞タンパク質合成液を製造することが可能となる。
【００２０】
本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、本発明に係る製造方法により得られる無細胞タンパク質合成液と、無細胞タンパク質合成液に添加して、無細胞タンパク質合成反応液を調製するための反応液調製試薬とを含むものである。さらに、以下のものが含まれていることが好ましい。
（１）取得目的のタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター、ＲＮＡ合成酵素および基質。
（２）コントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡ、またはコントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター。
（３）無細胞タンパク質合成反応用プレート
（４）合成されたタンパク質を検出するための、電気泳動用ゲル、緩衝液、試薬等
本キットを用いることにより、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いた系でのタンパク質合成を、簡便に行うことが可能となる。
【００２１】
また、上記の無細胞タンパク質合成液、無細胞タンパク質合成反応液および無細胞タンパク質合成キットのいずれかを用いてタンパク質を生産するタンパク質生産方法も本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、植物のプロトプラストから液胞が除去され、かつ液胞以外の細胞内膜成分（細胞内膜系とも呼ぶ）を含む、脱液胞化プロトプラスト抽出液を含む無細胞タンパク質合成液およびその製造方法、無細胞タンパク質合成液製造キット、および無細胞タンパク質合成キットである。
【００２３】
本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いた無細胞タンパク質合成系においては、ミクロソーム膜を別途添加しなくても翻訳後修飾が可能となり、また、従来困難であった高分子量タンパク質を効率よく合成できるという効果を奏する。また、無細胞タンパク質合成反応液の組成を工夫することにより、翻訳活性が向上するという効果を奏する。
【００２４】
また、本発明に係る製造方法を用いると、脱液胞化プロトプラストを無傷で効率よく回収することができ、さらに連続密度勾配液を用いることにより、脱液胞化プロトプラストの回収率が向上するという効果を奏する。
【００２５】
さらに、本発明に係る製造キットを用いることにより、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を簡便に製造でき、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットを用いることにより、簡便に無細胞タンパク質合成を実施することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２７】
（１）本発明に係る無細胞タンパク質合成液
本発明に係る無細胞タンパク質合成液は、本発明に係る無細胞タンパク質合成液の製造方法（以下適宜「製造方法」と略す）により得られるものであればよく、具体的には、植物細胞より調製されたプロトプラストから液胞が除去され、かつ液胞以外の細胞内膜成分（細胞内膜系とも呼ぶ）を含む脱液胞化プロトプラスト抽出液を含むものであればよい。また、脱液胞化プロトプラスト抽出液以外に含まれる成分は、特に限定されるものではない。通常、脱液胞化プロトプラストを回収後、脱液胞化プロトプラストを懸濁する緩衝液の成分等が含まれる。なお、当該緩衝液の組成、ｐH、温度などの諸条件は使用する植物細胞に応じて適宜設定可能であることはいうまでもない。
【００２８】
「プロトプラスト」とは、細菌、菌類、植物等の細胞壁を持つ細胞から細胞壁を取り除き、原形質膜で囲まれた状態にした細胞をいう。「液胞」とは、高等植物等にみられる細胞内小器官であり、周囲の原形質から脂質膜により明確に区画され、水溶液を満たした細胞内小器官をいう。この水溶液中には、無機イオン、有機酸、炭水化物等と共に、タンパク質成分としてプロテアーゼやＲＮａｓｅを含むことが知られている。そのため、これらの成分が無細胞タンパク質合成系に存在する事はタンパク質合成の効率を低下させるため好ましくないと考えられる。「細胞内膜成分」とは、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官をいい、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞等の細胞内顆粒全般を指す。特に小胞体、ゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質や分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００２９】
本発明に係る無細胞タンパク質合成液には、液胞以外の細胞内膜成分が保持されているため、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いた無細胞タンパク質合成系により、翻訳後修飾や膜結合型活性の解析を行うことが可能である。
【００３０】
（２）本発明に係る無細胞タンパク質合成液の製造方法
本発明に係る無細胞タンパク質合成液の製造方法（以下、適宜「製造方法」と略記する）は、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する、脱液胞化プロトプラスト調製工程と、当該脱液胞化プロトプラストから無細胞タンパク質合成液を調製する、無細胞タンパク質合成液調製工程とを含むものである。さらに、脱液胞化プロトプラスト調製工程の前段に、植物細胞からプロトプラストを調製するプロトプラスト調製工程を含んでいてもよい。もちろん、これら以外の工程を含んでいてもよい。例えば、脱液胞化プロトプラスト調製工程と無細胞タンパク質合成液調製工程との間に脱液胞化プロトプラストがどの程度調製されているかを確認する工程などを含んでいてもよいことはいうまでもない。
【００３１】
〔使用植物〕
本製造方法に使用できる植物細胞としては、脱液胞化プロトプラストを得ることができる植物細胞であれば、特に限定されるものではない。したがって、植物細胞に遺伝子組換え等の遺伝子操作を加えた、人工の植物細胞を使用することも可能である。例えば、形質転換植物由来の細胞、特定の因子を欠損させた細胞、特定の因子を過剰発現させた細胞等を用いることができる。特定の翻訳関連因子を欠損させた無細胞タンパク質合成液を製造すれば、翻訳機構の分子メカニズムを解析する研究等に非常に有用である。
【００３２】
本製造方法においては、株化された培養細胞を使用することが好ましい。株化された培養細胞は、均一な細胞集団を大量に得ることができるという利点がある。中でも、タバコ（Nicotiana tabacum）培養細胞またはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）培養細胞が好適である。これら培養細胞は、タバコ植物組織、あるいはシロイヌナズナ植物組織から、通常の植物組織培養方法（参考文献：植物バイオテクノロジー、S.H.Mantell, J.A.Matthews, R.A.McKee著、オーム社（1987））によって作製することができる。
【００３３】
〔脱液胞化プロトプラスト調製工程〕
脱液胞化プロトプラスト調製工程は、本製造方法において、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する工程である。本工程において用いる方法としては、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストが得られる方法であれば特に限定されるものではないが、密度勾配遠心法を用いることが好ましい。すなわち、脱液胞化プロトプラスト調製工程は、密度勾配遠心工程を含むことが好ましい。ここで、「密度勾配遠心法」とは、遠心管内に溶質で濃度勾配、すなわち密度勾配をつけた溶液（密度勾配液）を作製し、試料を加えて遠心し、巨大分子や細胞内粒子などの成分を同じ密度の位置まで沈降あるいは浮遊させ、密度の異なる成分を分離、分画する方法である。使用する密度勾配液としては、特に限定されるものではなく、例えば、ショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配液（シリカゾル）等が挙げられる。中でも、生体膜の保全性と遠心時間の短さの点でコロイド状シリカ製密度勾配液の使用が好ましい。ここで、「コロイド状シリカ製密度勾配液」とは、表面処理されたコロイド状シリカを分散させて調製した密度勾配液をいう。コロイド状シリカ製密度勾配液として、具体的には、例えば、パーコール（商品名、アマシャムバイオサイエンス株式会社製）を挙げることができる。パーコールはポリビニルピロリドンの被膜を持つコロイド状シリカ製品で、密度1.13g/mLの溶液として販売されており、密度勾配遠心用媒体として、広く使用されている。パーコールは、植物のプロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製する場合の密度勾配液として、最も適しているものの１つである。ただし、コロイド状シリカ製密度勾配液はパーコールに限定されるものではなく、同等の性質を有するものであれば、好適に用いることができる。
【００３４】
密度勾配遠心法においては、密度の異なる密度勾配液を重層して用いることが好ましい。本製造方法において、密度の異なるパーコールの重層による密度勾配遠心法を適用する場合には、下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）および１０〜３５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）および３０％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。この場合、タバコ培養細胞由来の脱液胞化プロトプラストは、７０％（v/v）パーコールと４０％（v/v）パーコールの境界面に濃縮して分画され、シロイヌナズナ由来の脱液胞化プロトプラストは４０％（v/v）パーコールと３０％（v/v）パーコールの境界面に濃縮して分画される。
【００３５】
また、密度勾配液に連続密度勾配液を用いることができる。「連続密度勾配液」とは、ある濃度から別の濃度まで連続した密度勾配を形成している状態にある密度勾配液を意味する。例えば、遠心管に３０％（v/v）パーコール溶液入れ、その上に等量の２０％（v/v）パーコール溶液を重層して、グラジエントメーカーを用いて回転させると、最上部の２０％（v/v）から最下部の３０％（v/v）まで滑らかに連続する密度勾配を形成した連続密度勾配液を作製することができる。連続密度勾配液を用いると、プロトプラストの最初の集束位置が分散するため、多量のプロトプラストを処理しても脱液胞化プロトプラストの収量が低下することがないという利点がある。
【００３６】
なお、上記連続密度勾配液は、上記脱液胞化プロトプラストが濃縮される密度勾配液の液−液界面より上層に重層されることが好ましい。このように連続密度勾配液を重層して密度勾配遠心法を実施する場合、脱液胞化プロトプラストは、連続密度勾配液中を通過して、所定の密度勾配液の液−液界面まで沈降することになる。この場合、プロトプラストの最初の集束位置が分散するため、段階的な密度勾配のみを形成して脱液胞化プロトプラストを取得する場合に比べて、脱液胞化プロトプラストをより高収率で取得することができる。
【００３７】
本製造方法において、連続密度勾配のパーコールを用いる場合には下層から順に４５〜７５％（v/v）、３５〜５０％（v/v）、（１０〜２０％（v/v））ないし（２５〜３５％（v/v））の連続密度勾配、および５〜１５％（v/v）の範囲から選択される濃度のパーコールを、最下層が最高濃度、最上層が最低濃度となるように濃度順に用いることが好ましく、下層から順に７０％（v/v）、４０％（v/v）、２０ないし３０％（v/v）の連続密度勾配、および１５％（v/v）の濃度のパーコールを重層して用いることが最も好ましい。連続密度勾配の密度勾配液を用いることにより、脱液胞化プロトプラストの回収効率を向上させることが可能となる。
【００３８】
脱液胞化プロトプラストが遠心管の底に沈殿すると、同じく底に沈殿する糖質等の固形成分により脱液胞化プロトプラストが破砕されてしまうため、密度の異なる密度勾配液の液−液界面に濃縮して遠心分画されるように密度勾配液の密度を設定することが重要である。液−液界面に分画されることにより、無傷の脱液胞化プロトプラストを回収することが可能となる。密度勾配液としてパーコールを用いる場合、脱液胞化プロトプラストを遠心管の底に沈殿させないために、４５〜７５％（v/v）の範囲内で選択される濃度のパーコール溶液を最下層とすることが好ましい。
【００３９】
〔無細胞タンパク質合成液調製工程〕
無細胞タンパク質合成液調製工程は、本製造方法において、脱液胞化プロトプラストから無細胞タンパク質合成液を調製する工程である。本工程において用いる方法としては、脱液胞化プロトプラスト抽出液が得られる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。通常、脱液胞化プロトプラスト懸濁液を調製し、ホモジナイザーを用いて脱液胞化プロトプラストを破砕した後に遠心分離し、上清を回収する方法が一般的である。ただし、この方法に限定されるものではない。
【００４０】
本工程において、脱液胞化プロトプラストを懸濁する緩衝液の組成は特に限定されるものではないが、細胞質と同様の性質を有するものが好ましい。すなわち、ミリモル（mM）オーダーのマグネシウムイオンと100mM程度のカリウムイオンを含み、中性に近いpHを有する緩衝液が好適である。また、還元剤、プロテアーゼ阻害剤等を含んでいてもよい。また、還元剤、プロテアーゼ阻害剤等は抽出液を調製した後に添加してもよい。
【００４１】
〔プロトプラスト調製工程〕
プロトプラスト調製工程は、本製造方法において、植物細胞からプロトプラストを調製する工程である。本工程において用いる方法としては、植物細胞からプロトプラストが得られる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。通常、酵素処理により植物細胞の細胞壁を消化する方法が一般的である。ただし、この方法に限定されるものではない。
【００４２】
細胞壁を消化する酵素としては、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、ドリセラーゼを挙げることができるが、これに限定されるものではない。使用する酵素の種類、濃度等も、特に限定されるものではなく、用いる植物細胞の種類の応じて適宜選択すればよい。例えば、タバコ培養細胞を、１％セルラーゼ、０．１％ペクトリアーゼ、１％ドリセラーゼ存在下で処理することにより、タバコ培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。また、シロイヌナズナ培養細胞を、１％セルラーゼ、０．２％ペクトリアーゼ存在下で処理することにより、シロイヌナズナ培養細胞由来のプロトプラストを調製することができる。
【００４３】
（３）本発明に係る無細胞タンパク質合成液の利用
〔本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いたタンパク質合成〕
本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成は、従来の無細胞タンパク質合成系（コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系など）と同様の方法で行うことができる。すなわち、公知のバッチ法であってもよいし、連続式無細胞タンパク質合成系（Science, 242, 1162-1164 (1988)）であってもよい。バッチ法は、予め翻訳反応に必要な要素をすべて加え、反応液を均一混合して合成反応を行う方法である。連続式無細胞タンパク質合成系は、透析膜により反応液と反応基質溶液とを仕切ること（透析法）、あるいは密度の異なる反応基質溶液の上層あるいは下層に反応液を重層すること（重層法）により、基質分解産物の蓄積を防止しつつ基質の供給を連続して行い、合成反応を長時間持続させる方法である。タンパク質合成に利用するエネルギー源としては、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
【００４４】
すなわち、本発明には、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を用いてタンパク質を生産するタンパク質生産方法が含まれる。なお、当該タンパク質生産方法には、後述する無細胞タンパク質合成反応液、または無細胞タンパク質合成キットを使用する場合も含まれる。このタンパク質生産方法によれば、従来の無細胞タンパク質合成系では、生産できなかった有用なタンパク質（活性発現に細胞内膜成分が必要なタンパク質、高分子タンパク質など）を効率よく生産することができる。
【００４５】
また、本発明には、上記無細胞タンパク質合成液、無細胞タンパク質合成反応液および無細胞タンパク質合成キットのいずれかを用いて生産されたタンパク質も含まれる。なお、上記タンパク質生産方法によって生産されるタンパク質の種類、性質、由来などは、特に限定されるものではなく、原核生物、真核生物、植物、動物、ウイルスなど種々の生物種由来のタンパク質を生産することができる。なかでも、従来の無細胞タンパク質合成系では生産が困難であった、糖鎖付加等の翻訳後修飾、分泌シグナルのプロセッシング、細胞内膜上に存在する各種タンパク質との相互作用等が活性発現に必要なタンパク質や、高分子タンパク質などを本発明に係るタンパク質生産方法により生産することが好ましい。
【００４６】
〔無細胞タンパク質合成反応液〕
本発明に係る無細胞タンパク質合成反応液は、本発明に係る製造方法により得られる無細胞タンパク質合成液を含み、それ以外に酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、スペルミン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、アミノ酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼおよびＲＮＡ分解酵素阻害剤を含む無細胞タンパク質合成反応液である。これら以外の成分を含んでいてもよいことはいうまでもない。また、上記成分の濃度は、適宜適切な濃度を選択して使用すればよく、特に限定されるものではない。
【００４７】
上記組成の中で、スペルミン濃度を８０μＭ未満とし、クレアチンキナーゼ濃度を１００μｇ／ｍＬ超とすることにより翻訳活性を向上させることが可能となる。後述する〔実施例９〕で説明するが、無細胞タンパク質合成反応液の組成について検討した結果、従来の反応条件と新規反応条件で、同時にRenilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡを鋳型として合成反応を行ったところ、約１．７倍の翻訳活性の向上が認められた。従来の組成から濃度を変更した成分は、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、スペルミンおよびクレアチンキナーゼである（実施例９の表４参照）。上記成分の濃度変更が翻訳活性の向上に効果を示したことは明らかであるが、最も効果が大きかったのはスペルミンである。スペルミンの濃度を減少することにより、理由は不明であるが翻訳活性を向上させることができる。また、クレアチンキナーゼの濃度を増加することにより、反応持続時間を長くする効果を得ることができる。酢酸カリウムおよび酢酸マグネシウムの濃度変更は翻訳活性を向上させる効果としては僅かであるが、この変更により最適化されている。さらに、従来脱液胞化プロトプラストを破砕した後に加えていたベントナイトについては、効果が認められないことが判明したため添加しなくてもよい。
【００４８】
上記のように、従来の組成から濃度を変更した組成を有する無細胞タンパク質合成反応液を用いることにより、翻訳活性を向上させることが可能となる。
【００４９】
（４）本発明に係る無細胞タンパク質合成液製造キット
本発明に係る無細胞タンパク質合成液製造キットは、本発明に係る無細胞タンパク質合成液の製造方法により無細胞タンパク質合成液を製造するためのキットである。したがって、本キットは、上述した無細胞タンパク質合成液の製造方法を実施するためのキットであれば、特に限定されるものではない。本キットを使用することにより、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を簡便に製造することが可能となる。本キットの具体的な構成としては、例えば、プロトプラストから脱液胞化プロトプラストを調製するために用いられる試薬（脱液胞化試薬）、脱液胞化プロトプラストから無細胞タンパク質合成液を調製するために用いられる試薬（合成液調製試薬）、植物のプロトプラストを調製するために用いられる試薬（プロトプラスト調製試薬）を挙げることができる。ここで「試薬」には、酵素や塩類等の一般的な試薬の他に、一連の操作に使用される器具等を含んでもよいものとする。
【００５０】
〔脱液胞化試薬〕
脱液胞化試薬としては、上記脱液胞化プロトプラスト調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、密度勾配液、密度勾配液を希釈するための希釈液やプロトプラストを懸濁するための緩衝液、遠心管等を挙げることができる。
【００５１】
すなわち、脱液胞化試薬には、少なくとも密度勾配液が含まれていることが好ましい。密度勾配液としては、具体的には、上述のショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配液（シリカゾル）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。キットに含まれる密度勾配液は、密度勾配液の原液として一定密度の１種類の密度勾配液であってもよく、異なる密度に調製した複数の密度勾配液であってもよい。前者の場合は、キットの使用者が自由に使用密度を選択できるという利点があり、後者の場合は、そのまま密度勾配液を重層するだけで密度勾配遠心分離を実施でき、使用密度を選択して調製するという手間を省けるという利点がある。
【００５２】
〔合成液調製試薬〕
合成液調製試薬としては、上記無細胞タンパク質合成液調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。例えば、無細胞タンパク質合成液の調製を、脱液胞化プロトプラストをホモジナイズしてその遠心上清を得るという方法により行う場合には、回収した脱液胞化プロトプラストを洗浄するための緩衝液、脱液胞化プロトプラストを懸濁してホモジナイズするための緩衝液、ホモジナイザー管、遠心管等を挙げることができる。
【００５３】
〔プロトプラスト調製試薬〕
プロトプラスト調製試薬としては、上記プロトプラスト調製工程において使用する試薬であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、植物細胞の細胞壁を消化する酵素を含む酵素処理液、酵素処理後にプロトプラストを洗浄するための緩衝液、遠心管等を挙げることができる。
【００５４】
すなわち、プロトプラスト調製試薬には、少なくとも植物細胞の細胞壁を消化する酵素類が含まれていることが好ましい。当該酵素類としては、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、ドリセラーゼ等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
（５）本発明に係る無細胞タンパク質合成キット
本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を含む無細胞タンパク質合成系により目的の遺伝子がコードするタンパク質を合成するためのキットである。したがって、本キットは、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を含む無細胞タンパク質合成系により目的の遺伝子がコードするタンパク質を合成できるものであれば、特に限定されるものではない。本キットを使用することにより、本発明に係る無細胞タンパク質合成液を含む無細胞タンパク質合成系において、目的の遺伝子がコードするタンパク質の合成を簡便に行うことが可能となる。本キットの具体的な構成の一例について、以下に説明する。
【００５６】
〔本発明に係る無細胞タンパク質合成液および反応液調製試薬〕
本キットには、本発明に係る無細胞タンパク質合成液が含まれることはいうまでもないが、さらに、これに添加して無細胞タンパク質合成反応液を調製するための反応液調製試薬が含まれることが好ましい。反応液調製試薬に含まれる成分として、具体的には、例えば、タンパク質合成に利用するエネルギー源としての、ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸等や、タンパク質合成に利用するアミノ酸（２０種類のＬ型アミノ酸）等が挙げられる。
【００５７】
〔目的のタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター、ＲＮＡ合成酵素および基質〕
無細胞タンパク質合成系においては、翻訳の鋳型としてのＲＮＡが必要である。この翻訳の鋳型となるＲＮＡは、通常、ＲＮＡ転写用プロモーターを有するベクターにｃＤＮＡを挿入し、ＲＮＡ合成酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）を作用させることにより得られる。したがって、本キットには、目的のタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター、ＲＮＡ合成酵素、基質、緩衝液が含まれることが好ましい。
【００５８】
上記「目的のタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター」とは、従来公知のＲＮＡ転写用プロモーターを有するベクターであって、当該プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を挿入する部位（マルチクローニングサイト等）を有するものをいう。また、「ＲＮＡ合成酵素」とは、上記ベクターに挿入された目的タンパク質の遺伝子から、目的のタンパク質をコードする遺伝子に対応するｍＲＮＡを作製する、いわゆるＲＮＡポリメラーゼをいう。また、「基質」とは、上記ＲＮＡ合成酵素がｍＲＮＡを生成する際に使用する物質（ヌクレオチド三リン酸など）をいう。「緩衝液」は使用状況に応じて適宜設定可能である。
【００５９】
なお、無細胞タンパク質合成系には、上記転写されたＲＮＡを精製した後に無細胞タンパク質合成反応液に添加する系と、ｃＤＮＡを挿入した上記ベクターを無細胞タンパク質合成反応液に添加して、転写および翻訳を同一反応液中で行う系とがあるが、いずれの系においても上記目的のタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター、ＲＮＡ合成酵素、基質、緩衝液が含まれることが好ましい。
【００６０】
〔コントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡ、またはコントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクター〕
本キットを用いる無細胞タンパク質合成反応において、タンパク質合成能を確認する目的に、反応ごとにコントロール群を設けることは重要である。したがって、本キットには、コントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡ、またはコントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクターが含まれることが好ましい。コントロールタンパク質は、本無細胞タンパク質合成系において確実に翻訳されることが明らかなタンパク質であればよく、特に限定されるものではない。上記、ＲＮＡを無細胞タンパク質合成反応液に添加する系においては、コントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡをキットの構成とすることができる。ただしコントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクターをキットの構成とすることも可能である。一方、転写および翻訳を同一反応液中で行う系では、コントロールタンパク質をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを作製するためのベクターをキットの構成とすることが必要である。
【００６１】
〔その他〕
その他に、本キットの構成として、無細胞タンパク質合成反応用プレートが含まれていることが好ましい。さらに、合成されたタンパク質を検出するための、電気泳動用ゲル、緩衝液、試薬等が含まれていることが好ましい。これらが本キットに含まれていることにより、使用者はさらに簡便に本キットを用いて無細胞タンパク質合成反応を行うことが可能となる。
【００６２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６３】
〔実施例１：タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液の調製〕
（１）タバコ培養細胞の作製
Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度２％）で滅菌後、滅菌水を含んだ脱脂綿に播種し、暗黒下、２５℃で培養した。２週間後、展開した下胚軸を切取り、更に0.2mg/Lの2,4-Dおよび30g/Lのsucroseを含むムラシゲ・スクーグ培地に置床し、２５℃、暗黒下でカルス誘導を行った。得られたカルスを１週間毎に継代培養し、増殖旺盛なタバコ培養細胞株を確立した。
【００６４】
（２）プロトプラストの調製
上記タバコ培養細胞を、0.2mg/Lの2,4-Dおよび30g/Lのsucroseを含むムラシゲ・スクーグ培地に継代し、２６〜２７℃、１３０ｒｐｍ、暗黒下で、7日間、フラスコを用いて培養した。これにより、定常状態にある細胞を取得した。この細胞を更に新鮮な培地に継代し、同一条件で３日間培養した。遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去し、細胞を集めた。得られた細胞に０．４Ｍマンニトール（３０℃）を加えて、１０分間、室温に静置した。これを再び遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去した後、プロトプラスト調製液（１％セルラーゼ“ONOZUKA”RS（ヤクルト社製）、０．１％ペクトリアーゼＹ２３（キッコーマン社製）、１％ドリセラーゼ（協和発酵社製）、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５．５）を添加し、３０℃、２時間反応させ、プロトプラストを調製した。
【００６５】
（３）脱液胞化プロトプラストの調製
上記プロトプラスト調製液中のプロトプラストを、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除くことにより回収した。これに０．４Ｍマンニトールを加えて洗浄し、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除いた。この洗浄操作を４回繰り返した後、３０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、30%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）にプロトプラストを懸濁した。この細胞懸濁液を遠心チューブに移し、その下層に４０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、40%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）、さらにその下層に７０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、70%パーコール（v/v）、0.7Mマンニトール）を、注射器を用いて注入した。これを遠心分離（ベックマン社製ＪＳ２４．１５、10,000×ｇ、６０分間、２５℃）し、４０％パーコール溶液の層と７０％パーコール溶液の層との界面に位置している細胞を回収した。この細胞を顕微鏡観察したところ、液胞がなく、細胞小器官が保持された目的の脱液胞化プロトプラストが大多数を占めていた。
【００６６】
（４）脱液胞化プロトプラスト抽出液の調製
〔脱液胞化プロトプラスト抽出液調製法１〕
上記、回収した脱液胞化プロトプラストを氷冷した０．４Ｍマンニトールで３回洗浄した。洗浄後の脱液胞化プロトプラストに、細胞量の４倍容の氷冷ＴＲバッファー（30mM HEPES-KOH（pH7.4）、100mM KOAc、2mM Mg(OAc)2、2mM DTT、Protease inhibitor cocktail（Roche社製、Complete Mini EDTA-free（商品名）、１粒/10mL））を添加し、氷冷したダウンス型ホモジナイザー（tight）で５０回ストロークして、脱液胞化プロトプラストを破砕した。細胞量の1/20倍容の40mg/mLベントナイト溶液を添加し、遠心分離（トミー精工製ＴＭＳ−２１、８００×ｇ、１０分間、４℃）した。この上清を回収し、−８０℃で凍結保存した。本調製法により調製した脱液胞化プロトプラスト抽出液（無細胞タンパク質合成液）は、以下に記載する実施例３〜７で使用した。
【００６７】
〔脱液胞化プロトプラスト抽出液調製法２〕
上記脱液胞化プロトプラスト抽出液調製法１において、ＴＲバッファーの組成を変更した（30mM HEPES-KOH（pH7.4）、80mM KOAc、1.8mM Mg(OAc)2、2mM DTT、Protease inhibitor cocktail（Roche社製、Complete Mini EDTA-free（商品名）、１粒/10mL））。すなわち、酢酸カリウム（KOAc）の濃度を100mMから80mMに、酢酸マグネシウムの濃度を2mMから1.8mMに変更した。また、破砕後にベントナイト溶液を添加せず、直ちに遠心分離し、上清を回収した。他の条件については、脱液胞化プロトプラスト抽出液調製法１と同様である。本調製法により調製した脱液胞化プロトプラスト抽出液（無細胞タンパク質合成液）は、以下に記載する実施例９で使用した。
【００６８】
〔実施例２：シロイヌナズナ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液の調製〕
（１）シロイヌナズナ培養細胞の作製
Arabidopsis thaliana種子を７０％エタノールで滅菌後、ハイポネックス（登録商標、株式会社ハイポネックスジャパン製）1/1000希釈液を含んだ脱脂綿に播種し、照明下（照度：３０００ルクス）、２３℃で培養した。２週間後、幼苗を切取り、更にＪＰＬ培地（30mL/L JPL A’（65.5g/L KNO3、4.4ｇ/L CaCl2・2H2O、3.7g/L MgSO4・7H2O、1.7g/L KH2PO4）、0.3mL/L JPL B（6.2g/L H3BO3、22.3g/L MnSO4・4H2O、10.6g/L ZnSO4・7H2O、0.83g/L KI、0.25g/L Na2MoO4・2H2O、0.025g/L CoCl2・6H2O、0.025g/L CuSO4・5H2O）、1mL/L JPL C（2780mg/L FeSO4・7H2O、3720mg/L Na2-EDTA・2H2O）、 10mL/L JPL D（10g/L myo-Inositol、0.2g/L glycine）、1mL/L JPL VT（500mg/L nicotinic acid、500mg/L pyridoxine・HCl、400mg/L thiamine・HCl）、1mL/L JPL P（5,300mg/L KH2PO4、21,850mg/L Na2HPO4・12H2O）、1μM NAA、15g/L sucrose、pH5.7）に置床し、２５℃、照明下（３０００ルクス）でカルス誘導を行った。得られたカルスを２週間毎に継代培養し、増殖旺盛なシロイヌナズナ培養細胞株を確立した。
【００６９】
（２）プロトプラストの調製
上記シロイヌナズナ培養細胞を、ＪＰＬ培地に継代し、２３℃、１２０ｒｐｍ、連続白色光下で、１４日間、フラスコを用いて培養した。これにより、定常状態にある細胞を取得した。この細胞を更に新鮮な培地に継代し、同一条件で３日間培養した。遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去し、細胞を集めた。得られた細胞に０．６Ｍマンニトール（２５℃）を加えて、１０分間、室温に静置した。これを再び遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、１分間）して上清を除去した後、プロトプラスト調製液（１％セルラーゼ“ONOZUKA”RS（ヤクルト社製）、０．２％ペクトリアーゼＹ２３（キッコーマン社製）、０．６Ｍマンニトール、ｐＨ５．８）を添加し、２５℃、３時間反応させ、プロトプラストを調製した。
【００７０】
（３）脱液胞化プロトプラストの調製
上記プロトプラスト調製液中のプロトプラストを、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除くことにより回収した。これに０．６Ｍマンニトール（２５℃）を加えて洗浄し、遠心分離（トミー精工製ＬＣ−１２１、；８００ｒｐｍ、５分間）して上清を除いた。この洗浄操作を４回繰り返した後、３０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、30%パーコール（v/v））にプロトプラストを懸濁した。この細胞懸濁液を遠心チューブに移し、その下層に４０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、40%パーコール（v/v））、さらにその下層に７０％パーコール溶液（5mM PIPES-KOH（pH7.4）、20mM MgCl2、70%パーコール（v/v））を、注射器を用いて注入した。これを遠心分離（ベックマン社製ＪＳ２４．１５、10,000×ｇ、６０分間、２５℃）し、３０％パーコール溶液の層と４０％パーコール溶液の層との界面に位置している細胞を回収した。この細胞を顕微鏡観察したところ、液胞がなく、細胞小器官が保持された目的の脱液胞化プロトプラストが大多数を占めていた。
【００７１】
（４）脱液胞化プロトプラスト抽出液の調製
上記、回収した脱液胞化プロトプラストを氷冷した０．４Ｍマンニトールで３回洗浄した。洗浄後の脱液胞化プロトプラストに、細胞量の４倍容の氷冷ＴＲバッファー（30mM HEPES-KOH（pH7.4）、100mM KOAc、2mM Mg(OAc)2、2mM DTT、Protease inhibitor cocktail（Roche社製、Complete Mini EDTA-free（商品名）、１粒/10mL））を添加し、氷冷したダウンス型ホモジナイザー（tight）で５０回ストロークして、脱液胞化プロトプラストを破砕した。細胞量の1/20倍容の40mg/mLベントナイト溶液を添加し、遠心分離（トミー精工社製ＴＭＳ−２１、；３、０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。この上清を回収し、−８０℃で凍結保存した。
【００７２】
〔実施例３：脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いたRenilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳〕
上記タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液およびシロイヌナズナ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行った。反応液（総量５２．５μＬ）の組成を表１に示した。なお、Renilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡの量は、42.2ngとした。
【００７３】
【表１】
2005065651.tif 000002
比較のため実施した、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成反応の反応液（総量５０μＬ）の組成を表２に示した。Renilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡの量は、同様に42.2ngとした。なお、表１ではメチオニンを除く１９種類のアミノ酸混合液を使用し、表２ではシステインを除く１９種類のアミノ酸混合液を使用しているが、いずれを用いても差がないことを確認している。
【００７４】
【表２】
2005065651.tif 000003
各反応液のタンパク質含量は、タバコ培養細胞由来の脱液胞化プロトプラスト抽出液では２.６７ｍｇ／ｍＬ、シロイヌナズナ培養細胞由来の脱液胞化プロトプラスト抽出液では４.１４ｍｇ／ｍＬ、コムギ胚芽抽出液では５.８２ｍｇ／ｍＬであった。
【００７５】
２５℃、９０分間インキュベートしてタンパク質合成反応を行った。反応開始３０分、６０分および９０分後にサンプルのルシフェラーゼ活性をRenilla Luciferase Assay System（Promega社製）を用いて測定した。
【００７６】
結果を図１に示した。図中の、ＮＴはタバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を、ＡＴはシロイヌナズナ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を、ＷＧＥは市販のコムギ胚芽抽出液（Promega社製）をそれぞれ用いたことを示している。
【００７７】
図１から明らかなように、タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を無細胞タンパク質合成液として用い、Renilla由来ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを鋳型としてバッチ式無細胞タンパク質合成を試みた場合、従来のコムギ胚芽抽出液を用いた系と比較して、反応液中のタンパク質含量が低いにもかかわらず、４〜５倍程度高い翻訳活性を有することが示された。同様に、シロイヌナズナ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を無細胞タンパク質合成液として用いた場合においても、コムギ胚芽抽出液を用いた系の３〜４倍高い翻訳活性を有することが示された。
【００７８】
〔実施例４：脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いたウイルスＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成反応〕
従来の無細胞タンパク質合成系では発現が困難であった、タバコモザイクウイルス（以下適宜「ＴＭＶ」と略記する）由来遺伝子産物１８０Ｋタンパク質、および１３０Ｋタンパク質の合成を試みた。すなわち、タバコ培養細胞およびシロイヌナズナ培養細胞より調製した脱液胞化プロトプラスト抽出液をそれぞれ用いて、ＴＭＶ-Ｌ（タバコモザイクウイルストマト系統）またはＴＭＶ-Ｃｇ（タバコモザイクウイルスアブラナ系統）のＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成反応を行った。脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた無細胞タンパク質合成反応液（総量５２．５μＬ）の組成は表１と同じである。ウイルスＲＮＡの量は、ＴＭＶ-ＬおよびＴＭＶ-Ｃｇとも1.0μgとした。
【００７９】
対照として、市販のコムギ胚芽抽出液（Promega社製）を用いて上記ＴＭＶ-ＬおよびＴＭＶ-ＣｇのＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成を行った。コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成反応液（総量５０μＬ）の組成は、表２と同じである。ウイルスＲＮＡの量は、ＴＭＶ-ＬおよびＴＭＶ-Ｃｇとも1.0μgとした。
【００８０】
２５℃、９０分間インキュベートしてタンパク質合成反応を行った。反応後、反応液３μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後ウェスタン解析した（ゲル：６％ポリアクリルアミドゲル（自製）、一次抗体：抗ＴＭＶ-Ｌヘリカーゼドメイン抗体、または抗ＴＭＶ-Ｃｇヘリカーゼドメイン抗体（自製）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Pharmacia Biotech社製、Anti-rabbit IgG HRP-Linked whole Ab、コード：NA934）、分子量マーカー：Prestained Protein Marker, Broad Range（ＮＥＢ社製））。
【００８１】
結果を図２ＡおよびＢに示した。図２ＡはＴＭＶ-ＬのＲＮＡを鋳型とした場合の結果を示し、図２ＢはＴＭＶ-ＣｇのＲＮＡを鋳型とした場合の結果を示す。図中のＷＧＥはコムギ胚芽抽出液、ＮＴはタバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液、ＡＴはシロイヌナズナ由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を表す。＋は合成反応液にウイルスＲＮＡを加えたことを表し、−は合成反応液にウイルスＲＮＡを加えていないことを表す。
【００８２】
図２ＡおよびＢから明らかなように、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成反系では１８０Ｋタンパク質は検出不能であり、１３０Ｋタンパク質はかろうじてスメアーなバンドとして検出される程度であった。一方、タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液およびシロイヌナズナ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系においては、いずれも多量の１３０Ｋおよび１８０Ｋタンパク質が検出された。
【００８３】
この結果より、ＴＭＶの１３０Ｋおよび１８０Ｋタンパク質のような高分子量タンパク質については、従来のコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系では合成困難であるが、タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系、およびシロイヌナズナ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系においては、合成可能であることが示された。
【００８４】
〔実施例５：タバコ培養細胞由来プロトプラスト抽出液、液胞抽出液および脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いたウイルスＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成反応〕
タバコ培養細胞より調製したプロトプラスト抽出液、液胞抽出液、および脱液胞化プロトプラスト抽出液をそれぞれ用いて、ＴＭＶ-Ｌ（タバコモザイクウイルストマト系統）のＲＮＡを鋳型としてタンパク質合成反応を行った。なお、液胞は脱液胞化プロトプラストを調製する密度勾配遠心において、最上部、液面の少し下に分画される。無細胞タンパク質合成反応液（総量５２．５μＬ）の組成は表１と同じである。ＴＭＶ-ＬのＲＮＡ量は1.0μg、Renilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡの量は、42.2ngとした。
【００８５】
２５℃、９０分間インキュベートしてタンパク質合成反応を行った。反応後、膜画分と細胞質画分を分離する目的で、各サンプルを超遠心分離（30,000×ｇ、３０分間、４℃）し、沈殿（膜画分）と上清（細胞質画分）に分画した。反応液３μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その後ウェスタン解析した（ゲル：NnPAGE？4-12%Bis-Tris Gel（Invitrogen社製）、一次抗体：抗ＴＭＶ-Ｌヘリカーゼドメイン抗体（自製）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Amersham Pharmacia Biotech社製、Anti-rabbit IgG HRP-Linked whole Ab、コード：NA934）、分子量マーカー：Prestained Protein Marker, Broad Range（ＮＥＢ社製））。
【００８６】
結果を図３に示した。図中のprotoplastはプロトプラストを、vacuoleは液胞を、mini-protoplastは脱液胞化プロトプラストを示し、ＬはＴＭＶ-ＬのＲＮＡ、ＲはRenilla由来ルシフェラーゼのｍＲＮＡをそれぞれ鋳型としたことを示し、Ｔは超遠心分離していない合成後の反応液、Ｓは遠心後の上清、Ｐは遠心後の沈殿を示す。
【００８７】
図３から明らかなように、脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた場合にのみ、ＴＭＶ-Ｌ  ＲＮＡ由来の翻訳産物（１３０Ｋおよび１８０Ｋタンパク質）のバンドが明瞭に検出された。一方、プロトプラスト抽出液および液胞抽出液を用いた場合にはＴＭＶ-ＬＲＮＡ由来の翻訳産物は検出されなかった。
【００８８】
〔実施例６：ウイルスＲＮＡのin vitro複製〕
ＴＭＶでは１８０Ｋタンパク質と１３０Ｋタンパク質が、感染細胞由来の膜タンパク質であるＴＯＭ１タンパク質等と複製複合体を形成し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）として働くことが報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 10107-10112 (2000)）。したがって、細胞内膜成分を含む脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた無細胞タンパク質合成を実施した場合、in vivoと同様のＲＮＡ合成能力を持ったＲｄＲｐがin vitroで形成されていることが期待された。そこで、ウイルスＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成を行った後、ＲｄＲｐ活性を測定した。
【００８９】
タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系において、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ-Ｌ）、カブクリンクルウイルス（ＴＣＶ）およびブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）のＲＮＡを鋳型としてタンパク合成を行った。無細胞タンパク質合成反応液（総量５２．５μＬ）の組成は表１と同じである。ウイルスＲＮＡの量は、ＴＭＶ-Ｌは1.0μg、ＴＣＶは0.8μg、ＢＭＶは0.98μgとした。
【００９０】
この合成反応液40μLに、10μLの５×RdRpアッセイバッファー（5mM ATP、5mM GTP、0.125mM CTP、5mM UTP、50mM dithiothreitol、10mM Mg(CH3COO)2、0.5μg/μL actinomycin D、20μCi [α-32P]CTP）を加え、２８℃、６０分間インキュベートした。反応終了後、フェノール抽出、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、エタノール沈殿処理を行った後、滅菌水３０μＬに溶解した。
【００９１】
Ｓ１ヌクレアーゼ処理を加える場合は、上記溶液の一部を取り、1/10倍容の3M NaOAc（pH5.5）を加え、７５℃で５分間、続いて室温で１０分間インキュベートした後、遠心分離し、２．５倍容のエタノールを加え、−８０℃で２０分間静置した。サンプルを室温に戻して、再度遠心分離し、上清を取り除いた後、風乾した。この沈殿をＳ１ヌクレアーゼ（TaKaRa社製）希釈液に溶解し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理を加えた。処理後、フェノール抽出、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出、エタノール沈殿処理を行った後、滅菌水に溶解した。これらの溶液を８Ｍ尿素−２．４％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウイルスＲＮＡの複製を解析した。
【００９２】
結果を図４に示した。図中のＴＭＶ-ＬはタバコモザイクウイルスのＲＮＡ、ＴＣＶはカブクリンクルウイルスのＲＮＡ、ＢＭＶはブロムモザイクウイルスのＲＮＡをそれぞれ翻訳したことを示し、ｎｏＲＮＡは無細胞タンパク質合成液にＲＮＡを加えていないことを示す。Ｓ１の＋−はＳ１ヌクレアーゼ処理の有無を示す。
【００９３】
図４から明らかなように、３種類すべてのウイルスとも、一本鎖のウイルスＲＮＡが非常に効率よく複製されていた。この結果から、脱液胞化プロトプラスト抽出液にはウイルスの複製に必須の因子が十分量含まれていることが示された。また、翻訳産物のＲＮＡ合成活性を安定して検出できたことから、脱液胞化プロトプラスト抽出液には内在性のＲＮａｓｅがほとんど含まれていないことが示された。ウイルスのin vitroタンパク質合成／ウイルスＲＮＡ複製は、唯一動物ウイルスのポリオウイルスにおいて報告されているが（Science, 254, 1647-1651(1991)）、植物ウイルスでは例がない。したがって、本発明に係る無細胞タンパク質合成系により、初めてin vivo翻訳／複製系のin vitroにおける忠実な再現が可能となった。
【００９４】
〔実施例７：ウイルスＲＮＡのin vitro複製における翻訳阻害剤の影響〕
上記実施例６で示した、ウイルスＲＮＡのin vitro複製がタバコ培養細胞由来の無細胞タンパク質合成液に内在するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるものではないことを証明するために、翻訳阻害剤である200μMピューロマイシン、710μMシクロヘキシミドをタンパク質合成の前と後にそれぞれ添加した。
【００９５】
その結果、合成反応前に添加した場合には、ＴＭＶの複製酵素である１３０Ｋタンパク質および１８０Ｋタンパク質が検出されず、ＲＮＡも複製されなかった。一方、タンパク質合成反応後に添加した場合には、ＲＮＡ複製における阻害効果は認められなかった。この結果から、ウイルスＲＮＡのin vitro複製がタバコ培養細胞由来の無細胞タンパク質合成液に内在するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるものではないことが明らかとなった。
【００９６】
〔実施例８：連続密度勾配液を用いた脱液胞化プロトプラストの回収〕
脱液胞化プロトプラストの回収率を向上させるため、パーコール溶液の組成変更を検討した。その結果、密度勾配液の一層に連続密度勾配液を用いることで脱液胞化プロトプラストの回収率が向上することを見出した。すなわち、パーコール溶液を下層から順に７０％、４０％、２０ないし３０％の連続密度勾配、および１５％として、脱液胞化プロトプラストの回収を行った。以下にこの組成のパーコール溶液を用いて脱液胞化プロトプラストを遠心分画する手順について記載する。なお、本実施例に使用したＢＹ−２細胞（タバコ培養細胞株）は、北海道大学大学院地球環境科学研究科・山崎健一助教授から入手した。
【００９７】
［1］JS24.14用遠心チューブ（Beckman社製、No.361707）に、３０％パーコール溶液４ｍＬを入れ、その上に２０％パーコール溶液４ｍＬを重層する。
【００９８】
［2］グラジエントメーカーを用いて３分間回転させる。これにより、２０〜３０％パーコール溶液の連続密度勾配液ができる。
【００９９】
［3］その下層に４０％パーコール溶液を２ｍＬ、さらにその下層に７０％パーコール溶液２ｍＬを注入する。
【０１００】
［4］ＢＹ−２プロトプラスト１ｍＬを、１５％パーコール溶液２ｍＬに懸濁し、グラジエントパーコール溶液の上に重層する。
【０１０１】
［5］遠心分離（12,000×ｇ、６５分、２５℃）する。
【０１０２】
［6］４０％パーコール溶液の層と７０％パーコール溶液の層との界面に位置している細胞を回収する。
【０１０３】
上記［1］〜［6］の手順により、100mLのＢＹ−２サスペンジョンカルチャー（これは20〜30mL（Packed cell volume：PCV）のＢＹ−２細胞、4〜5mL（PCV）のプロトプラストに相当する）から、500〜700μLの脱液胞化プロトプラストが得られた。ちなみに、不連続密度勾配（ステップワイズ密度勾配）を用いた従来法（パーコール溶液を下層から順に７０％、４０％および３０％とした方法、実施例１および２参照）では、同量のＢＹ−２細胞から100〜200μLの脱液胞化プロトプラストが得られる。
【０１０４】
連続密度勾配液を用いることにより脱液胞化プロトプラストの回収率が向上した理由としては、プロトプラストの最初の集束位置が分散するためであると考えられる。すなわち、不連続（ステップワイズ）密度勾配に多量のプロトプラストをかけると、脱液胞化プロトプラストの回収率が極端に悪くなるが、これは、多くのプロトプラストが一旦同一界面に集中するため、下にあるプロトプラストが上にあるプロトプラストを押し上げ、また逆に上にあるプロトプラストが下にあるプロトプラストを押さえつける結果、プロトプラストの「引きちぎり」がうまくゆかないことが原因であると考えられる。連続密度勾配にしてプロトプラストの最初の集束位置を分散させればいわゆる「引きちぎり」がうまくいくため、多量のプロトプラストを処理しても脱液胞化プロトプラストの収量が低下することなく、回収率が向上したものと考えられる。
【０１０５】
〔実施例９：無細胞タンパク質合成液の組成の検討〕
翻訳活性を向上させることを目的に、無細胞タンパク質合成液の組成の変更を検討した。多数の試行を行った結果、従来の組成より翻訳活性が大幅に向上する無細胞タンパク質合成液の組成を見出した。
【０１０６】
従来の組成は表１に示した組成と同じである。変更後の組成を表３に示した。また、従来の組成と変更後の組成の比較を表４に示した。
【０１０７】
【表３】
2005065651.tif 000004
【０１０８】
【表４】
2005065651.tif 000005
従来の組成（表１）および変更後の組成（表３）のそれぞれに、Renilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡを42.2ng加えて２５℃で１２０分間反応を行った。反応開始３０分、６０分、９０分および１２０分後にサンプルのルシフェラーゼ活性をRenilla Luciferase Assay System（Promega社製）を用いて測定した。
【０１０９】
結果を図５に示した。図５から明らかなように、変更後の組成の翻訳活性は従来の組成の翻訳活性と比較して、反応開始１２０分後において約１．７倍に向上しており、反応開始直後から翻訳活性の差は維持されていた。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明は、翻訳後修飾等、タンパク質翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を試験管内で再現することが可能な無細胞タンパク質合成系を提供できる画期的な発明である。したがって、タンパク質の機能解析や構造解析を通じて、動物および植物の疾病の予防、治療の研究に多大な貢献ができ、医薬品産業、農薬産業、試薬産業、医療機器産業等のみならず、広く医療や農業の発展に寄与するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】各種in vitro翻訳用抽出液を用いたRenilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳産物量を比較したグラフである。
【図２】各種抽出液を用いたタバコモザイクウイルスＲＮＡのin vitro翻訳産物をウェスタン解析した図である。図２ＡはＴＭＶ-ＬのＲＮＡを鋳型とした場合の結果を示した図であり、図２ＢはＴＭＶ-ＣｇのＲＮＡを鋳型とした場合の結果を示した図である。
【図３】タバコ培養細胞由来のプロトプラスト抽出液、液胞抽出液、脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いてＴＭＶ-ＬのＲＮＡを鋳型としたin vitro翻訳を行い、得られたサンプルをウェスタン解析した図である。
【図４】タバコ培養細胞由来脱液胞化プロトプラスト抽出液を用いて様々な植物ウイルスのin vitro翻訳を行った後in vitro複製を行い、得られたウイルスＲＮＡを解析した電気泳動図である。
【図５】脱液胞化BY-2プロトプラスト抽出液を用いて従来の条件と新規条件でRenilla由来ルシフェラーゼｍＲＮＡを翻訳した際の翻訳産物量を比較したグラフである。
【図１】
2005065651.tif 000006
【図２】
2005065651.tif 000007
【図３】
2005065651.tif 000008
【図４】
2005065651.tif 000009
【図５】
2005065651.tif 000010