(57)【要約】【課題】  新規ＤＮＡ合成酵素阻害物質を見出し、その利用法を提供すること。【解決手段】  本発明者は、タバコ培養細胞から新たなＤＮＡ合成酵素阻害物質を単離・精製し、構造解析の結果、ホモセリンとエタノールアミンとがペプチド結合により結合した新規ジペプチドであることを明らかにした。この新規ジペプチドはＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害する阻害活性を有しており、その類縁化合物もＤＮＡ合成酵素阻害活性が認められた。したがって、この新規ジペプチド、及びその類縁化合物は、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、生化学試薬として、さらには抗癌剤などの医薬品として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）により表されるジペプチド、又はその薬理上許容される塩。
【化１】
2005002102.tif 000004
【請求項２】
請求項１記載の化合物を有効成分とするＤＮＡ合成酵素ε選択的阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載の化合物を有効成分とする抗癌剤。
【請求項４】
α- アミノ酸と低級アルコールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項５】
α- アミノ酸は、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、及び、アラニンから選ばれることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項６】
α- アミノ酸とペプチド結合する低級アルコールアミンがエタノールアミンであることを特徴とする請求項４又は５記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項７】
低級脂肪酸と低級アルコールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項８】
低級脂肪酸は、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、コハク酸、及び、グルタル酸から選ばれることを特徴とする請求項７記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項９】
低級脂肪酸とペプチド結合する低級アルコールアミンがエタノールアミンであることを特徴とする請求項７又は８記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項１０】
ＤＮＡ合成酵素εを阻害することを特徴とする請求項４〜９の何れか１項に記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
【請求項１１】
請求項４〜９の何れか１項に記載の化合物を有効成分とする抗癌剤。
【請求項１２】
請求項１、４〜９の何れか１項に記載の化合物を有効成分とする医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する新規ジペプチド及びその類縁化合物に関する。これらの化合物は、ε型あるいはα型等のＤＮＡ合成酵素阻害作用を示し、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、さらに抗癌剤、エイズ治療剤、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、又はこれらのリード化合物として利用し得るものである。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、及びμの１２種類のＤＮＡ合成酵素が知られている。これらのＤＮＡ合成酵素群は、細胞の増殖、分裂、分化などに関与しているが、α型はＤＮＡ複製、β型は修復と組換え、δ型及びε型は複製と修復の双方を担うといった具合にタイプによって異なる機能を有することが知られている。
【０００３】
このようにＤＮＡ合成酵素は細胞の増殖等に関与することから、その酵素活性を阻害するＤＮＡ合成酵素阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制作用を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用を示し、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制作用を示すことが考えられる。このため、ＤＮＡ合成酵素阻害剤を用いた癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に効果のある医薬品の開発が期待されている。
【０００４】
例えば、ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（下記特許文献１参照）。現在、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、ジデオキシＴＴＰ(ｄｄＴＴＰ)、Ｎ-メチルマレイミド、ブチルフェニル-ｄＧＴＰなどが知られている（下記非特許文献１参照）。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもＤＮＡ合成酵素阻害作用が見出されている（下記特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−１０６３９５号公報
【特許文献２】特開平２０００−１４３５１６号公報
【非特許文献１】Annual Review of Biochemistry, 1991, 60, 513-552頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＤＮＡ合成酵素を阻害することが知られている物質の多くは基質類似物質である。例えば、抗癌剤、抗腫瘍性代謝拮抗剤として市販されているシタラビン（シトシンアラビノシド：Ａｒａ−Ｃ）は、核酸類似体であり、ｄＣＴＰと競合してＤＮＡ合成酵素を阻害することにより抗腫瘍活性を現す。また抗ＨＩＶ薬として知られるＺＤＶ（ＡＺＴ）も核酸系逆転写酵素阻害剤であり、基質類似物質である。
【０００７】
このように従来のＤＮＡ合成酵素阻害剤の多くは基質ホモログであり、ジペプチドのような基質非類似の物質に酵素阻害活性があるとは予測されていなかった。
【０００８】
また上述のように真核生物には１２種類のＤＮＡ合成酵素が知られており、各々が特有の生理学的役割を有していると考えられる。例えば、ε型のＤＮＡ合成酵素はＤＮＡ複製においてラギング鎖ではなくリーディング鎖の複製に関与するといわれる。ＤＮＡ複製を担うＤＮＡ合成酵素は他にα型とδ型が知られているが、従来のＤＮＡ合成酵素ε阻害剤はε型のみならずα型、δ型の活性をも阻害してしまい、ε型やα型のＤＮＡ合成酵素を選択的に阻害するものではなかった。もし特定の種類のＤＮＡ合成酵素を高い選択性をもって阻害する阻害剤が得られれば、そのＤＮＡ合成酵素の機能解析に使用する生化学試薬として有用であるばかりでなく、前述した抗癌剤などへの医薬品応用が期待できる。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、高い選択性でε型あるいはα型等のＤＮＡ合成酵素の活性を阻害する物質を見出すと共に、それを利用した新たなＤＮＡ合成酵素阻害剤、並びに抗癌剤などの医薬用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、タバコ培養細胞から新たなＤＮＡ合成酵素阻害物質を単離・精製し、さらに、（１）この化合物は、ホモセリンとエタノールアミンとがペプチド結合により結合した新規ジペプチドであること、（２）このジペプチドは、ＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害する阻害活性を有すること、（３）このジペプチドの類縁化合物もε型あるいはα型等のＤＮＡ合成酵素阻害活性を有すること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、医学上及び産業上有用な下記Ａ）〜Ｌ）の発明を含むものである。
Ａ）  下記の式（１）により表されるジペプチド、又はその薬理上許容される塩。
【化２】
2005002102.tif 000002
Ｂ）  上記Ａ）記載の化合物を有効成分とするＤＮＡ合成酵素ε選択的阻害剤。
Ｃ）  上記Ａ）記載の化合物を有効成分とする抗癌剤。
Ｄ）  α- アミノ酸と低級アルコールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｅ）  α- アミノ酸は、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、及び、アラニンから選ばれることを特徴とする上記Ｄ）記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｆ）  α- アミノ酸とペプチド結合する低級アルコールアミンがエタノールアミンであることを特徴とする上記Ｄ）又はＥ）記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｇ）  低級脂肪酸と低級アルコールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｈ）  低級脂肪酸は、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、コハク酸、及び、グルタル酸から選ばれることを特徴とする上記Ｇ）記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｉ）  低級脂肪酸とペプチド結合する低級アルコールアミンがエタノールアミンであることを特徴とする上記Ｇ）又はＨ）記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｊ）  ＤＮＡ合成酵素εを阻害することを特徴とする上記Ｄ）〜Ｉ）の何れかに記載のＤＮＡ合成酵素阻害剤。
Ｋ）  上記Ｄ）〜Ｉ）の何れに記載の化合物を有効成分とする抗癌剤。
Ｌ）  上記Ａ）、Ｄ）〜Ｉ）の何れかに記載の化合物を有効成分とする医薬用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、ホモセリンとエタノールアミンとがペプチド結合により結合した新規ジペプチド、及びその類縁化合物に関するものであり、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、生化学試薬として、さらには抗癌剤などの医薬品として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
（１）  タバコ培養細胞から単離・精製された新規ジペプチド
本発明者は、タバコ培養細胞から新たなＤＮＡ合成酵素阻害物質を単離・精製し、その構造を1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル法、13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル法、及び高速電子衝撃質量分析法により決定したところ、その化学構造は前記の式（１）に示されるように、Ｌ−ホモセリンとエタノールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド（L-homoseryl-ethanolamine）であることが分かった。なお、このジペプチドの単離・精製法およびその構造決定法の詳細は、後述の実施例において説明する。
【００１４】
データベース検索の結果、上記ジペプチドは新規物質であることが判明した。そこで、後述の方法によりこの新規ジペプチドを化学合成し、そのＤＮＡ合成酵素阻害活性を調べたところ、天然物と同様に合成ジペプチドもＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害する阻害活性が認められた。即ち、このジペプチドは、複製型ＤＮＡ合成酵素α、δ、εのうちＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害し、その５０％阻害濃度（IC50）は42.0μg/mlであった（図４）。また、種々のＤＮＡ合成酵素およびＤＮＡ代謝系酵素に対する上記ジペプチドの阻害活性を調べたところ、100μg/mlにおいて、ヒト由来のＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害した（図５）。なお、各実験方法の詳細は後述する。
【００１５】
図６のグラフＡ・Ｂは、上記ジペプチドのＤＮＡ合成酵素ε阻害様式を検討し、その結果を両逆数プロット（Lineweaver-Burk plots）にして示したものである。ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡの伸長反応には、鋳型ＤＮＡとヌクレオチドの２つの基質が必要であるため、それぞれの基質に対する阻害様式を検討した。グラフＡは、鋳型ＤＮＡ（poly(dA)/oligo(dT)）についての結果、グラフＢは、ヌクレオチド（dTTP）についての結果であり、いずれの基質に対しても上記ジペプチドは非拮抗阻害を示した。したがって、上記ジペプチドは、ＤＮＡ合成酵素εの基質結合部位とは異なる部位に結合し、これにより酵素の形が変形し阻害活性を示すものと考えられる。
【００１６】
このように本発明のジペプチドは、哺乳動物のＤＮＡ合成酵素εを特異的に阻害したので、ＤＮＡ合成酵素ε選択的阻害剤として、さらにこのような特異的阻害能をもつ生化学試薬として有用である。また、本発明のジペプチド、及びその薬理上許容される塩は、後述のように医薬品のリード化合物等として用いることにより、抗癌剤をはじめとする医薬品への応用が可能である。
【００１７】
なお、本発明における「ジペプチド」は、単に２つのアミノ酸同士がペプチド結合したものだけを意味するのではなく、カルボン酸とアミンとがペプチド結合により結合したものを広く包含する意味である。前記の式（１）に示されるジペプチドは、ホモセリンとエタノールアミンとがペプチド結合したものであるが、ホモセリンはＬ型に限らず、Ｄ型であってもよい。
【００１８】
「その薬理上許容される塩」の塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、スルホン酸塩、有機酸塩、及び、アミノ酸塩が挙げられ、好適には塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。
【００１９】
本発明のジペプチド、及びその薬理上許容される塩は、培養細胞などから単離・精製した天然物であってもよいし、合成したものであってもよい。製造方法についても、後述の単離・精製法や合成法に限定されるものではなく、これらの方法に適宜改変・改良を加えた方法やさらに別工程を付加した方法によっても製造可能である。
【００２０】
（２）  類縁化合物とそのＤＮＡ合成酵素阻害活性
本発明者は、さらに上記ジペプチドと共に、その類縁化合物を６種類化学合成し、各化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性を調査した。その結果が図９に示される。図中、化合物１は上記ジペプチド、即ち、前記の式（１）に示されるジペプチドであり、化合物２〜７はその類縁化合物である。図８には、合成化合物１〜７の各構造式が示される。化合物１は、α―アミノ酸であるＬ−ホモセリンとＬ−エタノールアミンとがペプチド結合したものであったが、化合物２〜７は、図８に示すように、化合物１のＬ−ホモセリンを他のα―アミノ酸（即ち、それぞれＬ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン）に変えたものである。
【００２１】
図９に示すように、類縁化合物２〜７はいずれもＤＮＡ合成酵素阻害活性を有していた。化合物２はＤＮＡ合成酵素εを、化合物６はＤＮＡ合成酵素αを最も強く阻害した。化合物５もＤＮＡ合成酵素αを強く阻害した。化合物１は他の実験結果と同様にＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害した。
【００２２】
このように合成化合物の種類によりＤＮＡ合成酵素阻害活性の選択性が変動するものの、いずれの類縁化合物もε型あるいはα型等のＤＮＡ合成酵素阻害活性を有することが示された。また化合物２などは化合物１と比べてＤＮＡ合成酵素εをより強く阻害した。したがって、このような類縁化合物もＤＮＡ合成酵素阻害剤として有用であり、さらに抗癌剤などの医薬品への応用も可能である。
【００２３】
また上記以外の類縁化合物も同様にＤＮＡ合成酵素阻害活性を有するものと考えられる。具体的には、図１０の化合物８〜１５が例示される。図中、化合物１〜７は、それぞれ上述の化合物１〜７であり、エタノールアミンとペプチド結合するα―アミノ酸がそれぞれＬ−ホモセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギンの物質である。これに対して化合物８〜１５は、エタノールアミンとペプチド結合するα―アミノ酸または低級脂肪酸がそれぞれＬ―グリシン、Ｌ−アラニン、プロピオン酸、酪酸（ブタン酸）、イソ酪酸、Ｎ- アセチルＬ- セリン、コハク酸、グルタル酸の物質である。なお、化合物１３のＮ- アセチルＬ- セリンはＬ−セリンのアミノ基（ＮＨ2）の水素がアセチル基によって置換された誘導体であるが、このような誘導体とエタノールアミンとのジペプチドであってもよい。
【００２４】
また類縁化合物は、エタノールアミン以外の低級アルコールアミンとα―アミノ酸または低級脂肪酸とがペプチド結合したジペプチドであってもよい。したがって、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤としては、(i) α- アミノ酸と低級アルコールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド、又はその薬理上許容される塩と、(ii) 低級脂肪酸と低級アルコールアミンとがペプチド結合により結合したジペプチド、又はその薬理上許容される塩とが挙げられる。
【００２５】
ここで「α- アミノ酸」には、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のほか、ホモセリン、オルニチン、シトルリンなどのα- アミノ酸、さらにこれらアミノ酸のアミノ基（ＮＨ2）の水素が炭素数１〜６のアルキル基またはアシル基（例えばホルミル基、アセチル基、マロニル基、ベンゾイル基など）によって置換された誘導体も含まれる。また、Ｌ型に限らず、Ｄ型であってもよいし、構造異性体であってもよい。具体的には、中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、セリン、ホモセリン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リシン、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸などが例示され、これらの中でも鎖長が比較的短いセリン、ホモセリン、トレオニン、硫黄を含むシステイン、メチオニン、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、及びその誘導体であるアスパラギンが好ましい。誘導体の例としては、Ｌ型セリンのアミノ基の水素原子がアセチル基によって置換された前記Ｎ- アセチルＬ- セリンなどが例示される。
【００２６】
「低級アルコールアミン」とは、炭素数１〜６のアルコール、すなわちメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、及びこれらの異性体のアミンをいい、これらの中でもエタノールアミンが好ましい。
【００２７】
「低級脂肪酸」には、炭素数１〜６の脂肪酸、すなわちギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸（ブタン酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸のほか、ジカルボン酸であるシュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、炭素数１〜６の不飽和脂肪酸（例えば、アクリル酸、マレイン酸、フマル酸など）、さらにこれらの異性体が含まれる。
【００２８】
「その薬理上許容される塩」の塩としては、前述と同様に、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、スルホン酸塩、有機酸塩、及び、アミノ酸塩が挙げられ、好適には塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。
【００２９】
さらに本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、これら化合物中の１〜３の水素原子がフッ素、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲン原子で置換されたものであってもよい。
【００３０】
換言すれば、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤となる類縁化合物は、下記の式（２）により表される構造を有する化合物であって、下記（イ）〜（ニ）の化合物として特定することができる。
【化３】
2005002102.tif 000003
【００３１】
（イ）  式（２）中、R2 = -NH2、R3 = -CH2CH2OHを固定し、R1を置換した化合物：このタイプの化合物は入手可能なα-アミノ酸とエタノールアミンとの組み合わせになる。Ｌ-アミノ酸のほかＤ-アミノ酸も導入可能である。
【００３２】
（ロ）  上記（イ）で得られる化合物のR2の-NH2基を修飾した化合物：このタイプの化合物はR2の-NH2基の水素原子が様々な鎖長を持ったアルキル基またはアシル基に置換された誘導体である。
【００３３】
（ハ）  式（２）中、R2 = -H、R3 = -CH2CH2OHを固定し、R1を置換した化合物：このタイプの化合物は入手可能な脂肪酸とエタノールアミンとの組み合わせになる。
【００３４】
（ニ）  上記（イ）、（ロ）、（ハ）で得られる化合物のエタノールアミンを入手可能なアルコールアミンに置換した誘導体。
【００３５】
これらの化合物は、通常の液相法および固相法を包含する一般的なペプチド化学合成法に従い反応させることにより製造することができる。該合成法において採用される縮合反応も公知の各種縮合反応に従うことができる。該合成法に採用される縮合反応としては、例えば、酸無水物法、混合酸無水物法、酸塩化物法、活性エステル法、アジド法、ＤＣＣ法、酸化還元法、ジフェニルホスホリルアジド法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェイト法、ウッドワード法などを例示できる。これら各方法に使用される溶媒も、この種のペプチド縮合反応に慣用される各種溶媒から適宜選択することができる。その例として、テトラヒドロフラン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、Ｎ−メチルピロリドンなど、およびこれらの混合溶媒などが例示できる。
【００３６】
上記縮合反応において、反応に関与しない官能基は常法に従い、通常の保護基により保護でき、また固相担体と結合させることによっても保護することもでき、これらは反応終了後に脱離できる。例えば、アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル、第三級ブトキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルなどを例示できる。さらに、２−塩化−トリチル樹脂などの固相担体と結合させ保護することも例示できる。これら保護基および樹脂の脱離反応もまた慣用される方法、例えば、接触還元法や、ピペリジン、フッ化水素、臭化水素、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などを用いる方法およびこれらを組み合わせる方法に従い実施できる。
【００３７】
かくして得られる本発明のジペプチド類は、常法に従い、高速液体クロマトグラフィーなどの各種精製手段により適宜その精製を行うことができる。
【００３８】
（３）  本発明のジペプチド、及びその類縁化合物の有用性
本発明者がタバコ培養細胞から単離・精製した新規ジペプチド（即ち、前記化合物１）は、前述のように、ＤＮＡ合成酵素ε選択的阻害剤として、生化学試薬として、さらには抗癌剤などの医薬品として利用可能である。
【００３９】
特にＤＮＡ合成酵素εは複製型および修復型のＤＮＡ合成酵素であるため、癌細胞のような細胞分裂がさかんな細胞や組織において本酵素活性が高い。したがって、化合物１は抗癌剤としての作用を有すると考えられる。ＤＮＡ合成酵素には、このε型の他に１０種類以上のＤＮＡ合成酵素が知られているが、これらのＤＮＡ合成酵素のうち、α型およびδ型は、ε型のものと同じ生化学的類型にあると考えられている。ここで、生化学的類型とは、次の(i)〜(iii)に掲げる酵素機能について共通性を有することを指す。即ち、(i) 特定の化合物に対する感受性の有無：例えばこれら３種のＤＮＡ合成酵素は共に、Ｎ-メチルマレイミドおよびブチルフェニル-ｄＧＴＰに対する感受性を持つが、ジデオキシＴＴＰ (ｄｄＴＴＰ)に対する感受性を持たない。(ii) 忠実度(fidelity)：鋳型ＤＮＡに対するＤＮＡ合成の高い正確さを持つ。(iii) 反応の場：これら３種のＤＮＡ合成酵素は共に細胞分裂と連動するＤＮＡ複製に直接的に関与している。ＤＮＡ合成酵素α型（δ型およびε型も生化学的類型として含む）は、一般に細胞周期に応じてＤＮＡ合成を司ると考えられている。したがって、ＤＮＡ合成酵素εに対する特異的な阻害活性を有する化合物１は、連続的かつ急激に細胞増殖を生じている癌細胞に対する増殖抑制能を有し得るものと考えることができる。
【００４０】
また化合物１の類縁化合物についても、前述のように、ＤＮＡ合成酵素阻害活性が認められたため、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、生化学試薬として、さらには抗癌剤などの医薬品として利用可能である。
【００４１】
医薬品としての利用には、本発明の化合物を医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することも含まれる。本発明の化合物の基本構造はジペプチドであるため、その毒性は低く、細胞膜に対しても透過性を有すると考えられる。なお、本発明の化合物を体内投与する際は経口投与よりも非経口投与が好ましく、またリポソームなどの運搬体に封入して投与することが好ましい。このとき癌細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位（病変部位）に本発明の化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００４２】
また本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、抗癌剤以外の医薬品への利用、さらには健康食品としての利用も可能であり、癌やエイズの発症、進行を予防する作用あるいは治療効果、また臓器移植時の免疫抑制作用をねらいとして利用することができ、とりわけ抗癌剤、抗ウイルス剤および免疫抑制剤として有効である。また、これらの疾患の予防措置の手段としても使用することが可能である。さらに、本発明の前記化合物と構造が類似しているキョートルフィンは、チロシンとアルギニンとからなるジペプチドであり、鎮痛作用を持っているため、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は鎮痛効果をもつ医薬品又は食品として利用できる可能性がある。
【００４３】
次に、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤を配合してなる医薬用組成物および食用組成物について説明する。本発明の化合物を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
【００４４】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中のジペプチドの配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の阻害剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００４５】
ここに、結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例として挙げることができる。界面活性剤の例としてラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。滑沢剤では、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等を例示できる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例として挙げることができる。また、ジペプチドは懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００４６】
非経口剤として本発明の所望の効果を発現せしめるには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人でジペプチドの重量として１日あたり１〜６０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中のジペプチドの配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００４７】
本発明の他の組成物の好適な態様は食用組成物である。即ち、前述の本発明の化合物を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００４８】
また、ヒトと他の哺乳動物のＤＮＡ合成酵素の構造は殆ど同じであるため、本発明のＤＮＡ合成酵素阻害剤は、ヒト以外の哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素阻害剤としても利用可能である。
【実施例】
【００４９】
以下図面を参照して、本発明の実施例について説明する。
【００５０】
〔実施例１：タバコ培養細胞からのＤＮＡ合成酵素阻害物質の単離・精製〕
図１に示す方法で、タバコ培養細胞からＤＮＡ合成酵素阻害物質を単離・精製した。即ち、まずタバコ培養細胞（BY-2株(Nicotina tabacum L. cv. Bright Yellow 2)）を５０%メタノールで抽出し、この抽出液をIR-120B、Dowex 1x2、Amberlite CG-50、Dowex 1x2のイオン交換カラムクロマトグラフィー４本に順次かけて、完全精製した。精製した物質を化合物１とした。
【００５１】
〔実施例２：化合物１の構造決定〕
実施例１で得られたＤＮＡ合成酵素阻害物質（化合物１）の構造を1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル法、13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル法、及び高速電子衝撃質量分析法により決定した。図２には化合物１の500 MHz 1H NMRスペクトルチャートを、図３には125 MHz 13C NMRスペクトルチャートをそれぞれ示す。
【００５２】
化合物１はアメ状の化合物で、比旋光度は+21.8°（c = 0.32，H2O）を示した。高分解能FAB-MS データから化合物１の分子式をC6H14N2O3と決定した。各種一次元および二次元NMRスペクトルデータから化合物１の相対構造を、ホモセリンのカルボキシル基とエタノールアミンのアミノ基とがペプチド結合したジペプチド（homoseryl-ethanolamine）と決定した。データベース検索の結果、このジペプチドは新規物質であった。そこで、この化合物１を下記の方法で化学合成した。
【００５３】
〔実施例３：化合物１の化学合成〕
化合物１の構造を確認するとともにその絶対構造を決定するために、以下に説明する方法でL-homoseryl-ethanolamine (H-Hse-Gly-ol)の化学合成を行った。なお、説明中の略語は下記の意味である。
DMF: N,N-dimethylformamide;
Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl;
HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate;
Trt: trityl;
DIEA: N,N’-diisopropylethylamine;
TFA: trifluoroacetic acid.
【００５４】
まずH-Gly-ol-Trt(2-Cl)-樹脂（渡辺化学）（588 mg, 0.2 mmol）をDMF (10 ml)に懸濁し、室温で５時間放置した。この懸濁液にFmoc-Hse(Trt)-OH (233.5 mg, 0.4 mmol)およびHATU (152.1 mg, 0.4 mmol)を加えて溶解し、DIEA (104.5 μl, 0.6 mmol) を加え室温で２時間撹拌した後、ろ過し、DMFで５回洗浄した。ここで得た保護ペプチドアルコール樹脂を室温で20%ピペリジンのDMF溶液（10 ml）で10分間処理し、脱Fmoc化後、乾燥し、H-Hse(Trt)-Gly-ol-Trt(2-Cl)-樹脂700 mgを得た。この部分保護ペプチドアルコール樹脂を室温で蒸留水（0.25 ml）存在下TFA (9.5 ml)で120分間処理し、保護基を除去するとともにペプチドアルコールを樹脂から脱離した。樹脂をろ過により除去し、ろ液を留去後、乾燥し62.1 mgの粗ペプチドアルコールを得た。ここに得られた粗生成物 (62.1 mg)を1N HCl (2 ml)に溶解後、不溶物をろ去し、0.005N HClを溶出液として用い、Develosil RPAQUEOUS-AR-5 (20 ×250 mm)による分取用逆相HPLCで精製し、精製H-Hse-Gly-ol 19.2 mgを得た。合成品の500 MHz 1H NMRスペクトルは天然物の化合物１のものと完全に一致し、その比旋光度も+18.3°（c = 0.32，H2O）であったことから、天然物の化合物１の絶対構造をL-homoseryl-ethanolamineと決定した。
【００５５】
〔実施例４：化合物１のＤＮＡ合成酵素阻害活性〕
上記実施例３で得た化合物１のＤＮＡ合成酵素群に対する活性を以下の方法で測定した。
ＤＮＡ合成酵素として哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素α、δおよびεについて試験を行った。ＤＮＡ合成酵素αは、牛胸腺から常法により抽出精製した標品を、ＤＮＡ合成酵素δおよびεはヒト子宮癌（HeLa）細胞の抽出液からサブユニットカラムクロマトグラフィー、抗体カラムクロマトグラフィーで精製した標品を用いた。
【００５６】
これらのＤＮＡ合成酵素に対する化合物１の阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２，核酸IV、東京化学同人、第63頁〜66頁）を用いた。すなわち、放射性同位元素で標識した[3Ｈ]-ＴＴＰを含む系においてＤＮＡ合成反応を行い、放射比活性を生成物（合成ＤＮＡ鎖）量の指標とするものである。阻害率は、(a)コントロールでの合成ＤＮＡ量、(b) 化合物１存在下での合成ＤＮＡ量について、
(a - b) / a X 100 = 阻害率（％）
として評価した。得られた結果を図４に示す。同図に示すように、化合物１は複製型ＤＮＡ合成酵素α、δ、εのうち、ＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害した。なお、化合物１の５０％阻害濃度（IC50）は42.0μg/mlであった。
【００５７】
また同様の方法で、各種ＤＮＡ合成酵素およびＤＮＡ代謝系酵素に対する化合物１の阻害活性を調べた。その結果を図５に示す。同図に示すように、化合物１は、１００μg/mlにおいて、ヒト由来のＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害した。
【００５８】
次に、化合物１のＤＮＡ合成酵素ε阻害様式について検討した。その結果を図６に示す。図中、グラフＡ・Ｂは両逆数プロット（Lineweaver-Burk plots）を示すものであり、グラフＡは、基質が鋳型ＤＮＡ（poly(dA)/oligo(dT)）の場合の結果、グラフＢは、基質がヌクレオチド（dTTP）の場合の結果である。化合物１はいずれの基質に対しても非拮抗阻害を示した。この結果から、化合物１は、ＤＮＡ合成酵素εの基質結合部位とは異なる部位に結合し、これにより酵素の形が変形し阻害活性を示すものと考えられる。
【００５９】
グラフＣ・ＤはDixon plotsを示すものであり、グラフＣは、鋳型ＤＮＡに対する結果、グラフＤは、ヌクレオチドに対する結果である。化合物１は、鋳型ＤＮＡに対して阻害定数（Ｋｉ）15.2μg/ml、ヌクレオチドに対して阻害定数（Ｋｉ）26.0μg/mlを示した。
【００６０】
さらに、ＤＮＡ合成酵素ε反応条件を変化させたときの化合物１による酵素阻害活性の影響について検討した。その結果を図７に示す。
【００６１】
実験では、100μg/mlの核酸poly (rC)、100μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)、または0.05%および0.1%の界面活性剤(Nonidet P-40 (NP-40) )をＤＮＡ合成酵素ε反応液に添加した。また化合物１が非存在下のＤＮＡ合成酵素ε活性を100%とした。
【００６２】
図７に示すように、過剰の核酸（100μg/mlのpoly(rC)）や蛋白質（100μg/mlのBSA）を添加しても阻害に変化はなかった。この結果から、化合物１はＤＮＡ合成酵素εへ選択的に結合することにより阻害するものと考えられる。また中性界面活性剤（Nonidet P-40）の添加による阻害の解消は見られなかった。この結果から、化合物１とＤＮＡ合成酵素εとの結合は親水的相互作用であると考えられる。
【００６３】
〔実施例５：化合物１の類縁化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性（１）〕
次に、化合物１を基にして、その類縁化合物（化合物２〜７）を６種類化学合成し、各化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性を調査した。図８には、化合物１〜７の各構造式が示される。同図に示すように、化合物２〜７は、化合物１のＬ−ホモセリンを他のα―アミノ酸（即ち、それぞれＬ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン）に変えたものである。
【００６４】
上記化合物１〜７のＤＮＡ合成酵素阻害活性を調べた結果を図９に示す。実験では、哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素α（複製型）、β（修復型）、δ（複製・修復型）およびε（複製・修復型）に対する阻害を調査した。同図に示すように、類縁化合物２〜７はいずれもＤＮＡ合成酵素阻害活性を有していた。化合物２はＤＮＡ合成酵素εを、化合物６はＤＮＡ合成酵素αを最も強く阻害した。化合物５もＤＮＡ合成酵素αを強く阻害した。化合物１は前述の実験結果と同様にＤＮＡ合成酵素εを選択的に阻害した。
【００６５】
このように合成化合物の種類によりＤＮＡ合成酵素阻害活性の選択性が変動するものの、いずれの類縁化合物もε型あるいはα型等のＤＮＡ合成酵素阻害活性を有することが示された。また化合物２などは化合物１と比べてＤＮＡ合成酵素εをより強く阻害した。したがって、このような類縁化合物もＤＮＡ合成酵素阻害剤として有用である。
【００６６】
〔実施例６：化合物１の類縁化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性（２）〕
上記実施例５において調査した化合物１〜７のほかに、さらに類縁化合物（化合物８〜３６）を化学合成し、計３６種類の各化合物についてＤＮＡ合成酵素阻害活性を調査した。図１１および図１２には、化合物１〜３６の各構造式が示される。図中、化合物２３の「Imidazole」はイミダゾール環を、化合物２２・２５の「Ph」はフェノール核をそれぞれ示す。また、化合物１６〜１９の略記号欄における記号「Ｄ」はα―アミノ酸がＤ型であることを示す。合成した化合物１〜３６のうち、化合物１、１３、１５、１６、２１、２４、２６、２８および３２の計９つの化合物は新規物質である。
【００６７】
上記合成化合物１〜３６のＤＮＡ合成酵素阻害活性を調べた結果を図１３に示す。実験では、各合成化合物20μg/mlにおけるＤＮＡ合成酵素（α、β、δおよびε）阻害活性を調査した。図中、黒色のバーはＤＮＡ合成酵素αの結果、縦縞、点模様、斜め縞のバーはそれぞれ、ＤＮＡ合成酵素β、δ、εの結果を示す。同図に示すように、これら化合物の多くはＤＮＡ合成酵素α（及び／又はε）を選択的に阻害した。
【００６８】
図１４は、各合成化合物20μg/mlおよび200μg/mlにおけるＤＮＡ合成酵素α阻害活性の調査結果をまとめたグラフである。図中、点模様のバーは各化合物20μg/mlにおける結果、黒色のバーは各化合物200μg/mlにおける結果を示す。同図に示すように、化合物５、６、７、９、１８、１９および２６の計７つの化合物は、特にＤＮＡ合成酵素αを有意に阻害するものであった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
以上のように、本発明は、ホモセリンとエタノールアミンとがペプチド結合により結合した新規ジペプチド、及びその類縁化合物に関するものであり、前述したとおり、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、生化学試薬として、さらには抗癌剤などの医薬品として利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明の新規ジペプチドのタバコ培養細胞からの単離・精製方法を説明する図である。
【図２】本発明の新規ジペプチドの構造解析に用いた500 MHz 1H NMRスペクトルチャートである。
【図３】本発明の新規ジペプチドの構造解析に用いた125 MHz 13C NMRスペクトルチャートである。
【図４】ＤＮＡ合成酵素α、δ、εに対する本発明の新規ジペプチドの阻害活性を調べた結果を示すグラフである。
【図５】各種ＤＮＡ合成酵素およびＤＮＡ代謝系酵素に対する本発明の新規ジペプチドの阻害活性を調べた結果を示すグラフである。
【図６】グラフＡ〜Ｄは、本発明の新規ジペプチドのＤＮＡ合成酵素ε阻害様式について調べた結果を示すグラフである。
【図７】ＤＮＡ合成酵素ε反応条件を変化させたときの本発明の新規ジペプチドによる酵素阻害活性の影響について調べた結果を示す図である。
【図８】本発明の新規ジペプチド、及びその類縁化合物の各構造式を示す図である。
【図９】本発明の新規ジペプチド、及びその類縁化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性について調べた結果を示す図である。
【図１０】本発明の新規ジペプチドの類縁化合物を例示する図である。
【図１１】本発明の新規ジペプチド、及びその類縁化合物の各構造式を示す図である。
【図１２】図１１に続き、本発明の類縁化合物の各構造式を示す図である。
【図１３】本発明の新規ジペプチド、及びその類縁化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性について調べた結果を示す図である。
【図１４】本発明の新規ジペプチド、及びその類縁化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性について調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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