(57)【要約】【課題】腎臓の再生などによる腎臓疾患に対する新たな治療法の確立を可能にするために、腎臓の発生に必須である新規因子の同定及びその機能解析を目的とする。【解決手段】  腎臓の形態形成に必須である新規タンパク質GZF1（GDNF-inducible zinc finger gene 1）、該タンパク質をコードするGZF1遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びGZF1タンパク質の製造方法。また、新規タンパク質GZF1又は該タンパク質をコードする遺伝子を含む医薬組成物。また、新規タンパク質GZF1に対する抗体、該タンパク質をコードするGZF1遺伝子に対するアンチセンス核酸、及び該抗体又は該アンチセンスを含有する医薬組成物。【選択図】なし    【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）又は（b）のポリペプチドを含むポリペプチド又はその塩。
（a）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号１で示される配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項２】
腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド又はその塩。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項４】
以下の（a）、（b）又は（c）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（a）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（b）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（c）（a）又は（b）のポリヌクレオチドの相補鎖
【請求項５】
腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とするポリペプチドをコードする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（a）又は（b）のポリペプチドを含むポリペプチド又はその塩。
（a）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号３で示される配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項７】
腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド又はその塩。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項９】
以下の（a）、（b）又は（c）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（a）配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（b）配列番号４で示される延期配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（c）（a）又は（b）のポリヌクレオチドの相補鎖
【請求項１０】
腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とするポリペプチドをコードする請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項３ないし５、又は８ないし１０に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から請求項１又２に記載のポリペプチド又はその塩を取得することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド又はその塩の製造方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から請求項６又７に記載のポリペプチド又はその塩を取得することを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド又はその塩の製造方法。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の方法によって製造される組換えポリペプチド又はその塩。
【請求項１６】
腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とする請求項１５に記載の組換えポリペプチド又はその塩。
【請求項１７】
請求項１、２、６、７、１５又は１６に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１８】
請求項１、２、６、７、１５又は１６に記載のポリペプチドに対するアンチセンス。
【請求項１９】
請求項１、２、６、７、１５又は１６に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１１に記載の組換えベクターを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓の形態形成に必須である新規タンパク質GZF1（GDNF-inducible zinc finger gene 1）、該タンパク質をコードするGZF1遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びGZF1タンパク質の製造方法に関する。
また、本発明は、新規タンパク質GZF1に対する抗体、該タンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスにも関する。
さらに、本発明は、新規タンパク質GZF1、該タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター、該タンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスを含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、生体内における代謝活動により生じる有害物質などの老廃物を血中から濾過することで除去し、身体の健康維持を図るべく機能する重要な臓器の一つである。従って、腎臓の一部又は全ての機能が喪失されると、水分及び有害物質が体内に蓄積され、高カリウム血症などの致死的な疾患を誘発する場合がある。
腎不全などの腎臓疾患を治療する代表的な方法として、人工透析を挙げることができるが、これらの治療に要する医療費は国費によって賄われる部分が多く、社会全体に対する負担が大きくなっている。
このような従来の治療法に代わる新たな方法又は治療薬の開発がここ数年切望されており、特に、ある種の細胞源から最終的に腎臓を再生することが少なからず現実的な課題として取り上げられている。そのためには、まず腎臓の発生のメカニズムを探ることが重要であり、かかるメカニズムを解明することは、腎臓疾患の治療分野において大いなる進展をもたらすものと考えられる。
【０００３】
哺乳類の腎臓は前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成される。そのうち、後腎は、中間中胚葉の後方領域に生じる後腎管組織から発生する（中腎の後方の造腎細胞策より発生する）（Saxen, 1987）。腎臓の発生が、尿管芽上皮組織と後腎管組織との間の相互のシグナル伝達により誘導されることはよく知られているが、近年、上皮尿管芽の分岐において、協同的に機能する多くの重要な分子が、インビトロ及びインビボの研究によって同定されている。これらの分子には、発生過程の腎臓の特定部位において連続的に発現される転写因子、分泌ペプチド、細胞表面レセプター及び細胞外マトリクスが含まれる（Dressler,2002；Piscione及びRosenblum, 2002；Vainio及びLin, 2002）。それら分子の中で、GDNF（グリア由来神経栄養因子）及びRETレセプターチロシンキナーゼは、尿管芽分岐の重要な制御因子であると考えられている。
GDNFは、グリコシルホスファチジルイノシトール結合細胞表面タンパク質であるGFRα1（GDNFファミリーレセプターα1）との結合を介してRETキナーゼを活性化する（Manie等, 2001；Takahashi, 2001；Airaksinen及びSaarma, 2002）。GDNFが後腎管組織から分泌され、RET及びGFRα1が分岐中の尿管芽上皮組織の細胞表面上に発現されることが報告されている（Pachnis等, 1993；Tsuzuki等, 1995；Moore等, 1996；Sainio等, 1997）。これらのことから、腎臓の正常な発生には、GDNF/RETシグナル伝達系の活性化をもたらす尿管芽上皮組織と後腎管組織との相互作用が必須であると考えられる。
【０００４】
Pax2, Pax8, Eya-1及びEmx-2は、腎臓管及び後腎管組織において一過的に発現され、発生中の腎臓におけるGDNF及び／又はRETの発現を制御することが知られている（Brophy等, 2001；Bouchard等, 2002；Miyamoto等, 1997；Xu等, 1999）。さらに、レチノイン酸レセプター、Rarα及びRarβ2を活性化する３番目の腎臓細胞タイプである間質性間充織由来のビタミンAのシグナルは、尿管芽でのRET発現に必要であり（Batourina等, 2001）、GDNF/RETシグナル伝達系の活性化における腎臓特異的な制御機構であることが示されている。さらに、forkhead/wingedへリックス転写因子であるFoxd1（Hatini等, 1996）、及び塩基性へリックス−ループ−へリックス転写因子であるPod1（Quaggin等, 1999）は、腎臓の発生過程において、部位特異的なRETの発現をコントロールしている可能性がある。しかしながら、GDNF-RETシグナル伝達によって制御される遺伝子の中で、どの遺伝子の発現が、正常な尿管芽分岐に必要であるかは、これまでのところ明らかにされていない。
また、腎臓発生に必要とされる因子としてマウスからSall1遺伝子が単離されている（非特許文献１）。Sall1のノックアウトマウスは生直後に死亡し、左右の腎臓が完全に欠損することが報告されている。該Sall1遺伝子と本発明のGZF1遺伝子との間に相同性は見出せないことから両遺伝子は全く異なるものである。
【０００５】
【非特許文献１】Nishinakamura等, Development 128:3105-3115, 2001.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、後腎の尿管芽中で高発現し、BTB/POZドメイン及びジンクフィンガーモチーフを有する新規GDNF誘導タンパク質GZF1（GDNF-inducible zinc finger gene 1）、該タンパク質をコードするヒト又はマウスGZF1遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びヒト又はマウスGZF1タンパク質の製造方法等を提供することを目的とする。
また、本発明は、新規タンパク質GZF1に対する抗体及び該タンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、新規タンパク質GZF1、該タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター、該タンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ディファレンシャルディスプレイ法を用いて、GDNFによって誘導される新規遺伝子ヒトGZF1を取得し、さらに該遺伝子の配列情報に基づいて該遺伝子のマウスオルソログ遺伝子（マウスGZF1遺伝子）を取得し、GDNF/RETシグナルシステムを介した該遺伝子の発現が腎臓の形態形成に必要であることを示し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２０）である。
【０００８】
（１）    以下の（a）又は（b）のポリペプチドを含むポリペプチド又はその塩。
（a）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号１で示される配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）    腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とする上記（１）に記載のポリペプチド又はその塩。
（３）    請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
（４）    以下の（a）、（b）又は（c）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（a）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（b）配列番号２で示される延期配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（c）（a）又は（b）のポリヌクレオチドの相補鎖
（５）    腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とするポリペプチドをコードする上記（４）に記載のポリヌクレオチド。
（６）    以下の（a）又は（b）のポリペプチドを含むポリペプチド又はその塩。
（a）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号３で示される配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（７）    腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とする（６）に記載のポリペプチド又はその塩。
（８）    上記（６）又は（７）に記載のポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドの相補鎖。
（９）    以下の（a）、（b）又は（c）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（a）配列番号４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（b）配列番号４で示される延期配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（c）（a）又は（b）のポリヌクレオチドの相補鎖
（１０）  腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とするポリペプチドをコードする上記（９）に記載のポリヌクレオチド。
【０００９】
（１１）  上記（３）ないし（５）、又は（８）ないし（１０）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（１２）  上記（１１）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１３）  上記（１２）に記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から上記（１）又（２）に記載のポリペプチド又はその塩を取得することを特徴とする上記（１）に記載のポリペプチド又はその塩の製造方法。
（１４）  上記（１２）に記載の形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から上記（６）又（７）に記載のポリペプチド又はその塩を取得することを特徴とする上記（６）に記載のポリペプチド又はその塩の製造方法。
（１５）  上記（１３）又は（１４）に記載の方法によって製造される組換えポリペプチド又はその塩。
（１６）  腎臓の形態形成に必須であって、１０のジンクフィンガーモチーフ及びBTB/POZドメインを有することを特徴とする上記（１５）に記載の組換えポリペプチド又はその塩
（１７）  上記（１）、（２）、（６）、（７）、（１５）又は（１６）に記載のポリペプチドに対する抗体。
（１８）  上記（１）、（２）、（６）、（７）、（１５）又は（１６）に記載のポリペプチドに対するアンチセンス。
（１９）  上記（１）、（２）、（６）、（７）、（１５）又は（１６）に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
（２０）  上記（１１）に記載の組換えベクターを含む医薬組成物。
【００１０】
本明細書中で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」なる用語は、特に言及しない限り、同じ意味で使用されるものとする。
本明細書中で開示される「ポリペプチド」及び「タンパク質」には、異種性のアミノ酸配列と融合されたものを含み、また、グリコシル化されたもの及びグリコシル化されていないものの両方を含む。ここで、「異種性のアミノ酸配列と融合されたもの」には、例えば、分泌シグナル配列融合ポリペプチド、エピトープタグ化ポリペプチドなどが含まれる。
「エピトープタグ化ポリペプチド」とは、タグポリペプチドと融合したキメラポリペプチドを意味する。このようなタグは、タグに対して抗体が作成され又利用可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないエピトープタグを提供する。内在性エピトープと抗タグ抗体の反応性を減少させるために、タグポリペプチドは好ましくはユニークである。一般に、好適なタグポリペプチドは少なくとも６アミノ酸残基を有し、一般に、約８から５０アミノ酸残基の間であり、好ましくは８から２０アミノ酸残基の間である。エピトープタグ配列の例には、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）、インフルエンザAウィルス由来のHA及びFLAGなどが含まれる。
本明細書中に記載の「ジンクフィンガーモチーフ」とは、特定の間隔でシステインを2個とヒスチジンを2個含み、これらシステイン及びヒスチジンが亜鉛イオンに結合することにより「指」のような構造を形成しうるアミノ酸配列のことである。「ジンクフィンガーモチーフ」に相当する「指」のような構造部分が、DNAの2重らせんの溝に入り込むことで、特定のDNA配列を認識・結合する機能を有する。
「BTB/POZ」は、タンパク質相互作用モチーフのことである。
本明細書中で用いられる「腎臓の発生に必須」又は「腎臓の形態形成に必須」であるとは、目的の因子（例えば、核酸、タンパク質など）が存在しない若しくは本来の活性を有さない場合に、腎臓の発生が阻害されるか、又はある程度発生したとしても正常な成体の腎臓にまで発生し得ない状態をさす。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新規タンパク質GZF1（GDNF-inducible zinc finger gene 1）、該タンパク質をコードするヒト又はマウスGZF1遺伝子が提供される。
また、本発明により、ヒト又はマウスGZF1遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びヒト又はマウスGZF1タンパク質の製造方法が提供される。
また、さらに、本発明により、新規タンパク質GZF1に対する抗体が提供される。
さらに、本発明によりGZF1遺伝子に対するアンチセンスが提供される
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のポリペプチド（GZF1ポリペプチド又はGZF1タンパク質とも称する）とは配列番号１（ヒト）又は配列番号３（マウス）で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのことである。
ここで、当該ポリペプチドの取得方法、該ポリペプチドの組換体の調製方法、該ポリペプチドを特異的に認識する抗体の作成方法、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスの調製方法、及び該ポリペプチド等を含んでなる医薬組成物の調製方法等について順を追って説明していく。
【００１３】
１．本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニング
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列（DNA又はRNA）を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードするDNA、RNAは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNAとRNAとのハイブリッドでもよい。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、サブトラクション法と総称される遺伝子の選択的な単離方法及び従来の分子生物学的技術に基づいて取得することができる。サブトラクション法は、例えば、ディファレンシャルスクリーニング法、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法、又はディファレンシャルディスプレイ法などが知られているが、本発明の実施においては、ディファレンシャルディスプレイ法（Liang等, 1992）が最も望ましい。
【００１４】
ディファレンシャルディスプレイ法は、異なる条件下（本発明においては、GDNFによる誘導の有無による相違）の細胞で発現しているmRNAの発現量の差を検出する方法で、mRNAのpolyAと結合するアンカープライマー（通常、dTのオリゴマー）と任意の配列を有するオリゴプライマーを用いたRT-PCRを応用した方法である。例えば、アンカープライマーを数種類〜数十種類、任意のオリゴマープライマーを数十種類用意し、全ての組み合わせにおいてRT-PCRを行う。RT-PCRに必要な試薬及び条件等は当業者であれば容易に選択し、また決定することができる。あるいは、商業的に販売されているキット（例えば、TaKaRa社など）を利用し、該キットに添付の実験説明書の方法に従って実施することもできる。
RT-PCR産物は、適切な濃度（例えば、4%〜6%）の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い分離する。目的の条件下（本発明においてはGDNF誘導下）においてのみ、発現されているmRNAに対応するバンドをゲルから切り出し、定法により、サブクローニング、配列決定を行うことで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得することができる。サブクローニング、配列決定の方法は、例えば、Sambrook, J. Molecular cloning 2nd eds: a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. 1989.などを参照のこと。
【００１５】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの取得に使用可能な細胞は、該ポリペプチドのmRNAが発現しているか又はGDNFによってその発現が誘導される細胞であれば如何なる細胞も使用可能であるが、例えば、脳、心臓、骨格筋、腎臓、肝臓、精巣、などの組織に由来する細胞、又は株化細胞（例えば、ヒトTGW細胞、ヒトNB39細胞又はマウスNeuro2a細胞など）を用いることが好ましい。また、前記細胞が由来する動物は、如何なる動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）であってもよい。
ここで開示された新規GZF1遺伝子のDNA配列が確定されると、当該分野における技術常識に基づいて、当該新規GZF1遺伝子又は該遺伝子のオルソログは、例えば、使用可能な動物組織、限定はしないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなどの組織から調製されたcDNAライブラリーより、例えば、PCR法、ハイブリダイゼーション法などを用いることで、容易に取得することができる（例えば、Sambrook, J. 1989. Molecular cloning 2nd eds: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.を参照のこと）。あるいは、ここで開示されたDNA配列情報に基づいて、新規GZF1ポリペプチドの全長又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列を化学的に合成してもよい。
【００１６】
２．本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明のポリペプチドをコードするDNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、cDNAライブラリーから調製したもの、あるいは合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。具体的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２又は４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のポリペプチドと実質的に同質の性質（例えば、腎臓の発生に必須である）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであればいずれのものであってもよい。
【００１７】
配列番号２又は４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、配列番号２で表わされる塩基配列と好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％， 88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，最も好ましくは約99％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有するDNA等が挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の技術常識により決定され（例えば、Sambrook等, 1989などを参照のこと）、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な条件である。例えば、ナトリウム濃度が約20〜40mM、好ましくは約20〜25mM、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件などである。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上述の本発明の部分ペプチドをコードする核酸配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、cDNAより、当該技術分野において公知の方法により単離されたもの、合成DNAのいずれであってもよい。
【００１８】
３．本発明のポリペプチド及びその部分ペプチド
本発明のポリペプチド（以下、GZF1ポリペプチド又はGZF1タンパク質と称する場合もある）は、配列番号１又は３で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号１又は３で表わされるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％， 88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，最も好ましくは約99％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、腎臓の発生に必須なポリペプチドである。
あるいは、本発明のポリペプチドには、配列番号１又は３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列中の1又は2個以上（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号１又は３で表わされるアミノ酸配列に1又は2個以上（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、並びに配列番号１又は３で表わされるアミノ酸配列中の1又は2個以上（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含む、突然変異ポリペプチドが含まれる。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、新規GZF1ポリペプチドをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって、改変することによって行うことができる。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、MutanTM−G（TAKARA社）、MutanTM−K（TAKARA社））等を使用し、Guppedduplex法やKunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法によって、塩基の置換行なうことによって達成することができる。
【００１９】
また、本発明のポリペプチドのC末端は、通常カルボキシル基（−COOH）又はカルボキシレート（-COO-）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−CONH2）やエステル（−COOR）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のRとしては、C1-6アルキル基（例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル）、C3-8シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、C1-6アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル-C1-2アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−C1-2アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のポリペプチドがC末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも、本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明のポリペプチドのN末端は、通常アミノ基（−NH2）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のC1-6アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、N端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のポリペプチドに含まれる。
【００２０】
本発明に係る上記いずれかのポリペプチド中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の部分ペプチドは、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を含むものである限り、如何なるものであってもよい。本発明の部分ペプチドの中でも、１０のジンクフィンガーモチーフ領域、BTB/POZドメインは、特に、有用である。
本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも10個以上、好ましくは30個以上、より好ましくは80個以上である。通常、本発明の部分ペプチドのC末端はカルボキシル基（−COOH）、N末端はアミノ基（−NH2）であるが、化学修飾されていてもよい。
本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、無機酸、限定はしないが、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの塩、有機酸、限定はしないが、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの塩等が挙げられる。また、無機塩基、限定はしないが、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属などとの塩、有機塩基、限定はしないが、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどとの塩が挙げられる。
【００２１】
本発明のポリペプチド又はその塩は、本発明のポリペプチドを発現しているヒトや動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の培養細胞又は組織から、当該分野における通常の技術により抽出・分離することができ、あるいは後述のように本発明のポリペプチドをコードするDNAを含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても調製することができる。ヒトや動物の組織又は細胞から調製する場合、ヒトや動物の組織または細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
【００２２】
また、本発明の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチド合成法又は本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる（例えば、Bondanszky等, 1996；Schroeder等, 1965を参照のこと）。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
上記の方法で得られる本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができる、塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２３】
４．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリペプチド（本発明のポリペプチドと実質的に同一なポリペプチド及びそれらの部分ペプチドも含む、以下同様）をコードするDNAを連結することにより得ることができる。本発明のポリペプチドをコードするDNA配列を挿入するためのベクターは、クローニング用に供される場合には、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、本発明のポリペプチドを発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該ポリペプチドをコードするDNA断片を発現させることができるプロモーターを有するものが使用可能である。
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pCBD-C等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5、pC194等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YEp24、YCp50、YIp30等）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２４】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、HSV-TKプロモーター、EF-1αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、tacプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λＰLプロモーター、lppプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
【００２５】
本発明の組換えベクターには本発明のポリペプチドコード化配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、SV40複製起点（SV40ori）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Hygr）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）、アンピシリン耐性遺伝子（Ampr）、カナマイシン耐性遺伝子（Kanr）、ネオマイシン耐性遺伝子（Neor, G418）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、本発明のポリペプチドのN末端側に適当なシグナル配列を付加してもよい。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、OmpAシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα-アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α-インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが利用可能である。
【００２６】
上述のベクターに対して本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入するには、上記１においてクローニングされた本発明のポリペプチドをコードするDNAをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するDNAはその5'末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGA又はTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。連結するDNAは、当該DNA中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
以上の方法により、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列を含むベクターを構築することができる。
【００２７】
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換え発現ベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２８】
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法（Cohen等, 1972）、エレクトロポレーション法（Shigekawa及びDower, 1988）等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法（Becker等, 1990）、スフェロプラスト法（Hinnen等, 1978）、酢酸リチウム法（Itoh等, 1983）等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、DEAEデキストラン法（Lopata等, 1984）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama, 1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が挙げられる。
以上のようにして、本発明のポリペプチドをコードするDNAが挿入された発現ベクターを含む形質転換体を得ることができる。
【００２９】
５．本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、上記４において得られる形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３０】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、LB培地、M9培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約15〜37℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
酵母を培養するための培地としては、SD培地、YPD培地があげられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。  
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20％のウシ胎児血清を含むMEM培地、DMEM培地、RPMI 1640培地等が用いられる。pHは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体に本発明のポリペプチドを生成させることができる。上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
【００３１】
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により本発明のポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンX-100などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びSDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電化の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３２】
６．本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のアンチセンス
アンチセンスは、RNA又はDNAであってよく、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現に関する有効な阻害因子として作用する。アンチセンスRNAは、例えば、インビボにおいてmRNAとハイブリダイズし、mRNAからGZF1タンパク質への翻訳を阻害するようにデザインされる（Okano等, 1991）。また、DNAオリゴヌクレオチドは、例えば、GZF1遺伝子の転写開始領域に対して相補的となるようにデザインされ、その結果GZF1ポリヌクレオチドの発現を阻害する（Cohen, 1989）。
これらのアンチセンスRNA又はDNAがGZF1遺伝子又はGZF1タンパク質の発現を阻害するようにインビボにおいて機能し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスDNAが用いられる場合には、例えば、標的遺伝子配列の約-10と+10の間の位置に結合するオリゴヌクレオチドであることが望ましい。
【００３３】
７．本発明のポリペプチドに対する抗体
本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体（以下、抗GZF1ポリペプチド抗体と称する）、及びそのFab又はF(ab’)2などの抗体断片を含む。
ここでの「抗体」（GZF1タンパク質の活性を促進する抗体、GZF1タンパク質の活性を阻害する抗体の両方を含む）には、GZF1ポリペプチドに対するモノエピトープ特異抗GZF1ポリペプチド抗体、ポリエピトープ特異抗GZF1ポリペプチド抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原にはGZF1ポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質A合成−トレハロースジコリノミコレート（MPL-TDM）が含まれる。特に、本発明のポリペプチドの部分ペプチドを免疫原とする場合は、免疫応答を増強するために、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターなどの免疫原性を有するタンパク質と該免疫原とを結合させたのち、インジェクトしてもよい。
あるいは、IgY分子を産生するニワトリを用いて調製してもよい（Schade等, 1996）。
抗体産生方法の詳細は、例えば、Ausubel等, 1987又はHarlow及びLane, 1988を参照のこと。
【００３４】
（２）モノクローナル抗体
抗GZF1ポリペプチドモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Milstein及びCuello, 1983）。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（i）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ii）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（iii）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（iv）所望のモノクローナル抗体（抗GZF1ポリペプチドモノクローナル抗体）を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（PBLs）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。免疫原には、本発明のポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片も含まれる。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合される（Goding, 1996）。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT又はHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。
【００３５】
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株による、ヒトモノクローナル抗体産生に関しては、Kozbor等, 1984；Schook, 1987を参照のこと。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、GZF1ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生の有無を培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（RIA）又は酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）などの免疫沈降又はインビトロでの結合アッセイにより評価することができる（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）。
抗GZF1ポリペプチドモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ細胞は、限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離することができる（Goding, 1996）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、RPMI-1640、場合によっては、タンパク質を含まない培地若しくは無血清培地などが含まれる（例えば、Ultra DOMA PF又はHL-1；Biowhittaker；Walkersville, MD）。また、ハイブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。
【００３６】
モノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインAセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）などの当業者にとって周知の方法によって単離、精製される。
また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製することができる（米国特許第4166452号, 1979）。抗GZF1ポリペプチド抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から目的のモノクローナル抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するのに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。その結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。単離されたDNA断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターに抗体遺伝子を導入し、該ベクターを他の免疫グロブリンタンパク質を生産しないsimian COS-7細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトする。単離されたDNA断片は、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列と置換することにより（米国特許第4816567号, 1989；Morrison等, 1987）、又は非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全て又は一部と免疫グロブリンコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、キメラ二価抗体を調製するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。
【００３７】
（３）ヒト化及びヒト抗体
抗GZF1ポリペプチド抗体には、ヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Fv, Fab, Fab', F(ab')2又は他の抗体の抗原結合領域など）である。
一般に、ヒト化抗体は非ヒト由来の免疫グロブリンから導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、可変ドメインから選ばれる。ヒト化抗体は、例えばマウスのCDRs又はCDR（相補性決定領域）配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより作製することができる（Jones等, 1986；Riechmann等, 1988；Verhoeyen等, 1988）。つまり、ヒト化抗体とは、ヒト由来の特定のCDR中のある残基と、該残基に相当するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のCDR中の残基と置換されているヒト抗体のことである。また、非ヒト由来の残基によって、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が置換される場合もある（Jones等, 1986；Presta, 1992；Riechmann等, 1988）。
【００３８】
８．本発明のポリペプチド、抗GZF1ポリペプチド抗体を含む医薬的組成物
本発明のポリペプチド、又は抗GZF1ポリペプチド抗体は、腎臓の発生又は再生に効果を発揮し、又は異常な腎臓発生又は再生を抑制する効果を発揮することが期待できる。
本発明のポリペプチド又は抗GZF1ポリペプチド抗体は、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で治療剤として使用され得る。通常、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質又は抗体及び薬剤的に受容可能な坦体が含まれる。
「薬剤的に受容可能な坦体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである（Gennaro, 2000）。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及びヒト血清アルブミンなどが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明のポリペプチド又は抗GZF1ポリペプチド抗体の活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。
【００３９】
（１）医薬組成物の調製
本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
pHは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【００４０】
（２）注射可能な製剤
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒を、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、CREMOPHOR ELTM(BASF, Parsippany, N.J.)、又はリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、GZF1ポリペプチド、抗GZF1ポリペプチド抗体など）を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【００４１】
（３）経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、PRIMOGEL、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はSTRROTESなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
【００４２】
（４）担体
本発明のポリペプチド及び抗GZF1ポリペプチド抗体は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの制御放出製剤として、体内から即時に除去されことを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ALZA Corporation(Mountain View, CA)及びNOVA  Pharmaceuticals, Inc.(Lake Elsinore, CA)から入手することが可能で、また、当業者によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のFab'断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい（Martin及びPapahadjopoulos, 1982）。詳細な調製方法は、例えば、Eppstein等, 1985；Hwang等, 1980中の記載を参照のこと。
【００４３】
（５）投与量
本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする遺伝子等による特定の疾患の治療又は予防において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約0.1μg/kgから約500mg/kgを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約0.1μg/kgから約250mg/kgであり、より好ましくは一日に約0.5〜約100mg/kgである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは1.0から1000mgの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0,
250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0及び1000.0mgである。化合物は一日に1〜4回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。
【００４４】
（６）単位投与量
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物（例えば、GZF1ポリペプチドなど）の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。
【００４５】
（７）遺伝子治療組成物
本発明において開示される核酸分子（例えば、GZF1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが挿入されたベクター、GZF1遺伝子に対するアンチセンス核酸も含む）を患者の細胞に導入する方法には、主としてインビボ又はエキソビボの２つの方法がある。インビボ送達においては、治療が必要とされる患者の部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の治療が意図される部位の細胞を単離し、単離された細胞に製剤化した核酸分子を導入し、導入された細胞を患者に直接又は、例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与することができる（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸分子を生細胞に導入するために利用可能な技術は、培養細胞等にインビトロで導入されるか、又は患者にインビボで導入するかに依存して選択される。哺乳動物細胞にインビトロで核酸分子を導入するのに適した技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン法、リン酸カルシウム沈降法などが挙げられる。トランスフェクションには、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸分子の細胞への導入が含まれる。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【００４６】
現在、インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（AAV））、及びカチオン性脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPE、及びDC-Cho1である；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1):54-65 (1996) 参照）を利用した系が含まれる。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルスでありその中でも、最も好ましくはアデノウイルス、AAV、レンチウイルス又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子などが含まれる。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、例えば、GZF1ポリペプチドをコードする遺伝子を含んだ状態で転写される場合、該コード化遺伝子の翻訳を可能とするシスエレメント、即ち翻訳開始配列として機能する核酸配列を含む。このようなベクター構築物は、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（LTR）又はその一部を含む。さらに、これらのベクターには、通常、該ベクターを含む宿主細胞からGZF1ポリペプチドを分泌させるシグナル配列が含まれる。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列である。場合によっては、ベクター構築物は、ポリアデニル化並びに翻訳終結配列も含む。例えば、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、DNA合成の開始点、及び3’LTR又はその一部を含む。非ウイルス性の他のベクターは、例えばカチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを用いることもできる。
場合によっては、治療に用いる核酸を目的の細胞にターゲティングする試薬、例えば、細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、又は標的細胞上のレセプターのリガンドなどと共に提供するのが望ましい。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第5,681,746号を参照のこと。
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：ディファレンシャルディスプレイ解析によるGZF1遺伝子の同定及び発現パターンの解析。
方法：
GDNF誘導遺伝子を同定するために、RET及びGFRα1遺伝子を発現しているTGWヒト神経芽細胞腫細胞株から定法に従ってmRNAを調製し（例えば、Sambrook, J. Molecular
cloning 2nd eds: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor. 1989.などを参照のこと）、ディファレンシャルディスプレイ解析を行った。
GDNF（100ng/ml）（Pepro Tech社，London）で、２時間処理したTGW細胞から、RNA精製キット（Qiagen社）を用いて全RNAを単離した。混入している染色体DNAを除去するために、RNaseフリーのDNase Iで処理した後、TaKaRaローダミン蛍光ディファレンシャルディスプレイシステムを用い（TaKaRa社、#6626）、キットに添付の説明書に従って、ディファレンシャルディスプレイPCRを行った（Watanabe等, 2002）。例えば、RT-PCR反応は、キットに添付の説明書に従い反応混合液を調製し、55℃30分、95℃5分、5℃5分間の反応で逆転写反応を行わせた後、得られた反応産物（1st DNA）を用いて、94℃2分、38℃5分、72℃5分間の反応を行わせ、さらに、94℃30秒、38℃2分、72℃1分間の反応を34サイクル行った。蛍光産物は、変性尿素−４％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分離した。差示的に発現されたバンドを切り出し、定法に従って配列決定を行い、得られた配列情報を公的なデータベースと比較した。
TGWヒト神経芽細胞腫細胞株及びマウス精巣由来のcDNAライブラリーは、GIBCO BRL社、Super Script ChoiceSystem for cDNA Synthesisを用いて調製した。また、GZF1遺伝子の発現を確認するためのノザンブロッティングには、得られた全長cDNAを用いた。
発現確認を行ったヒトの組織、ヒト胎児組織、マウス胎児組織のノザンブロット用の転写メンブレンは、クロンテック社から購入した。
【００４８】
結果：
GDNFによる刺激の後、強度が増大した124のcDNAに対応するバンドを検出した。これらのcDNAのバンドを単離し配列決定した後、73の独立のcDNAクローンを同定し、GDNF刺激後の発現の増大を確かめるためのノザンブロッティングを行った。その結果、GDNFによって14の遺伝子の発現が誘導されることが明らかとなった。これら14遺伝子には、c-FOS、CREM及びcdc様キナーゼ遺伝子など10の既知遺伝子と、4の配列未知の遺伝子が含まれていた。かかる配列未知の遺伝子の中から、GZF1（GDNF-inducible zinc finger gene 1）と命名したBTB/POZドメインとC2H2タイプのジンクフィンガーモチーフを持つ新規遺伝子について解析を進めた。
GDNF処理したTGWヒト神経芽細胞腫細胞株のRNAから構築したcDNAライブラリー由来の全長cDNAを単離し、その全長をpGEX-5X-2（Amersham Pharmacia社）のSmaI-NotIサイトに挿入した。そのcDNA配列から、この遺伝子はアミノ末端領域にBTB/POZドメインを有し、10のC2H2タイプのジンクフィンガーを含む711アミノ酸からなるタンパク質をコードすることが明らかになった（図１）。さらに、GZF1には、BTB/POZドメインとジンクフィンガーモチーフとの間に核局在化シグナルが含まれていた。また、ヒトGZF1配列と84%の同一性を示すマウスオルソログcDNAもマウス精巣cDNAライブラリーから単離した（図１）。ヒト及びマウスGZF1 cDNA及びタンパク質の配列は、各々、登録番号AB100265及びAB100266でGenBank/EMBL/DDBJに登録した。
GZF1遺伝子発現について種々のヒト組織について検討した結果、単一の4.8kb mRNAが脳、心臓、骨格筋、腎臓及び肝臓中で検出された（図２）。さらに検討したヒト胎児組織の中では、脳及び腎臓において相対的に最も高いレベルで発現が確認された（図２）。また、マウスGZF1遺伝子の発現は、腎臓を含む幾つかの組織及び異なるステージのマウス胎児（7日から17日目胎児）においても検出された（図３）。
【００４９】
実施例２：GDNFによるGZF1発現の誘導及びその細胞内局在。
方法：
ウサギ抗GZF1ポリクローナル抗体は、ヒトGZF1のカルボキシ末端19アミノ酸（LTPQTDSMPTQLHSLSNME（配列番号５））にウシサイログロブリンを結合させたものを抗原としてウサギに２週おきに８回免疫したのち、抗血清を調製し、得られた抗血清から抗原ペプチドを用いて、定法に従ってアフィニティー精製を行った。調製された抗GZF1ポリクローナル抗体は、マウスGZF1ポリペプチドも認識するものであった。抗GFPポリクローナル抗体及び抗αチューブリンモノクローナル抗体及び抗サイトケラチンモノクローナル抗体は、Clontech社、Sigma社から購入した。また、ウサギ抗RETポリクローナル抗体は既に報告したもの（Tsuzukiら, 1995）を用いた。
【００５０】
結果：
TGW細胞の培地中に100ng/mlになるようにGDNFを添加して細胞を刺激し、刺激後0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48時間後に細胞からmRNAを調製してノザンブロッティング解析を行った（図４）。その結果、TGW細胞中のGZF1遺伝子誘導は、GDNF刺激後1時間及び24-48時間の２つのピークを示した（図４）。GDNFによるGZF1遺伝子誘導のパターンは、RT-PCR分析によっても確認されている。
次に、作製した抗GZF1抗体を用いて、TGW細胞及びNeuro2a細胞中に存在するGZF1タンパク質を確認した。GDNF（100 ng/ml）で48時間処理したTGW細胞及びNeuro2aマウス神経芽細胞腫細胞株由来の全細胞抽出物（タンパク質20μg）をプレイミュンウサギIgG（レーン１）又は抗GZF1抗体（レーン２）を用いてウェスタンブロッティングを行った。その結果、95kDaと115kDaタンパク質及び115kDaタンパク質が、TGW及びNeuro2a細胞由来の抽出物中に各々検出された（図５）。見かけの分子量が異なるバンド（95kDaと115kDa）が検出されたことから、これらのタンパク質についてN-又はO-結合グリコシル化の有無について見当したが、糖鎖の存在を確認することはできなかった。従って、GZF1の予想される分子量と見かけの分子量（80kDaと95及び115kDa）との間の差異は、特有なタンパク質構造又はその他の修飾によって引き起こされている可能性が示唆される。
また、TGW細胞及びNB39ヒト神経芽細胞腫細胞株において、GZF1の発現を調べると、GDNF（100 ng/ml）による刺激後24-27時間後にこれらのタンパク質の発現が顕著に上昇した（図６）。GZF1タンパク質の誘導は、GDNF刺激後の早い段階では観察されなかったが、おそらく、刺激後初期の段階でのGZF1mRNAの発現上昇は短期間の一過的上昇（およそ、GDNF刺激後1-2時間）であることから、タンパク質の発現上昇までは確認されなかったものと考えられる
【００５１】
本発明により開示された抗体を用いて、培養細胞中でのGZF1タンパク質の細胞内局在について検討を行った。GDNF（100ng/ml）で48時間処理したTGW細胞を抗GZF1抗体で染色した後、FITC結合抗ウサギIgG抗体でインキュベートした結果、GZF1タンパク質はGDNFで処理されたTGW細胞の核に主として検出された（図７、TGW）。ネガティブコントロールとしてプロテインAで精製した正常ウサギIgGで染色した場合、TGW細胞においてポジティブな染色は観察されなかった。
本発明により開示された抗体によって検出されたバンドがGZF1タンパク質であることを確認するために、EGFP-GZF1融合遺伝子を発現ベクター（Clontech社）に構築し、HEK293T細胞へトランスフェクトした。図７、HEK293Tに示されるように、EGFP-GZF1融合タンパク質の発現はトランスフェクトされた細胞の核中で観察された。さらに、EGFP-GZF1融合タンパク質について、抗GZF1及び抗GFP抗体によるウェスタンブロッティングにより解析を行った。EGFG-GZF1融合遺伝子でトランスフェクトしない（-）又はした（+）TWG細胞又はHEK293T細胞の抽出物を抗GZF1又は抗GFP抗体で解析した（図８）。その結果、予想される分子量107kDaとの差異（33kDa）は、内在性GZF1タンパク質の予想される分子量と見かけの分子量（80kDaと115kDa）との間の差異とほぼ同じであったことから、抗GZF1抗体によって認識されるバンドがGZF1タンパク質であることが確認された。
【００５２】
実施例３：マウス胎児及びマウス新生児腎臓中でのGZF1発現の免疫組織学的解析。
腎臓発生におけるGZF1の重要性を明らかにするために、我々は抗GZF1抗体でマウス胎児腎臓を染色した。
方法：
ICRマウスの胎児（交配13.5-14.5日）及び新生児の腎臓を本研究に用いた。胎児又は新生児の異なる発生段階の腎臓を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。4μm切片をキシレンで脱パラフィン化し、エチルアルコールにより再水和させた。RETの染色の場合は、10 mMクエン酸緩衝液（pH6.0）中で12分間、マイクロウェーブで前処理し、室温で冷やした。一次抗体の非特異的な結合は10%ヤギ血清で30分間室温でブロッキングを行った。切片は一次抗体で一晩4℃でインキュベートし、内在性のペルオキシダーゼを0.3%の過酸化水素で15分間ブロックした。スライドはペルオキシダーゼで標識ポリマー（EnVision+, Dako）を結合した二次抗体でインキュベートし、反応産物は、ジアミノベンチジン及び過酸化水素で視覚化した。カウンター染色は、ヘマトキシリンで行った。
【００５３】
結果：
連続切片により、13.5-14.5日目、胎児の同一の後腎尿管芽におけるGZF1とRETの発現を検出した（図９(A)-(D)）。GZF1抗体により、13.5-14.5日目の胎児後腎の尿管芽が強く染色された（図９(B)及び(D)）。また、RETの場合と同様に、GZF1発現は、生後の腎臓において著しく減少した。ネガティブコントロールとして、抗GZF1抗体の代わりに、プロテインＡで精製したウサギIgGにより染色を行ったが、ポジティブな染色像は観察されなかった。
【００５４】
実施例４：マウスGZF1ポリヌクレオチドに対するアンチセンスによる尿管芽分岐の阻害実験。
方法：
（１）アンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
マウスGZF1 mRNAの二次構造予測に基づいて６つのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ODNs）（配列番号６；CACTTTCCATCTTCCTTCT（AS-1）、配列番号７；TCTGCCACTTTCCAT（AS-2）、配列番号８；GATTTGGATTCCAGCAAAA（AS-3）、配列番号９；AGTGGTGAAGATTTGGATTC（AS-4）、配列番号１０；TCTCATGCAGAAGGTTG（AS-5）、配列番号１１；AGCTCATGCATCTCAT（AS-6））をデザインした（例えば、RNA二次構造予測ソフトRNA Structure 3.6を用いた）（図１０(A)）。その結果、開始コドンの近傍領域又はループを形成する領域を標的とすることにした。ホスホロチオネート化された６つのアンチセンス（ODNs）を合成し、HPLCで精製した。トランスフェクションの一日前、Neuro2a細胞を1.5 x 105細胞／ウェルの密度で24ウェルプレートにプレーティングし、各アンチセンスODNを最終濃度200 nMで用いてトランスフェクトさせた。トランスフェクションは、オリゴフェクタミン試薬（Invitrogen社）を用いて行った。細胞は、トランスフェクション後48時間で回収し、抗GZF1抗体を用いたウェスタンブロッティングによりGZF1タンパク質の発現の有無について解析を行った。
【００５５】
（２）後腎器官培養
後腎器官培養は、Kanwar等（2002）により記載されている方法に従って行った。後腎は、11.5日目ICRマウス胎児から単離し、Transwell-Clear（Costar社）中、5% CO2、37℃の条件下、保湿されたインキュベーター内で4日間培養した。培地は、DMEM及びHam’s栄養素混合F-12（Sigma社）の等量で構成され、トランスフェリン（50μg/ml）、ペニシリン（100μg/ml）及びストレプトマイシン（100μg/ml）が添加された。培地には、血清又は他のいずれの成長因子も添加しなかった。マウスGZF1のセンス、アンチセンスまたはスクランブル（アンチセンスの配列をランダムに組替えたもの）ODNは、培地に対し、0.5-2.0μM／日の濃度で添加した。
後腎の移植片は、実体顕微鏡で直接撮影した後、抗サイトケラチン抗体を用いて尿管芽の染色を行った。後腎器官培養の初期状態を100%メタノールで固定し、PBSで3回洗浄し、0.2%Triton
x-100を含んだPBSで15分間処理し、膜の透過性を上昇させた。最初の状態を3%ウシ血清アルブミンを含むPBS中でブロッキングを行った。その後、50倍希釈した抗サイトケラチン抗体と4℃で、一晩インキュベートし、未反応の抗体をPBSで洗浄した後、さらに、100倍に希釈したCy3結合ロバ抗マウスIgGと4℃で、一晩インキュベートした。未反応の抗体をPBSで洗浄し、スライドをPermaFluor（Shandon社）でマウントし、CCDカメラを備えた蛍光顕微鏡（BX50、DP70、OLYMPUS）で観察を行った。
【００５６】
結果：
マウス神経芽細胞腫（Neuro2a細胞）を各アンチセンスODNの存在下で2日間培養した場合、２つのアンチセンスODNs（AS-4及びAS-5と呼ぶ）が、Neuro2A細胞中でマウスGZF1タンパク質の発現を顕著に減少させた（図１０(B)）。さらに、AS-4配列に対応するセンスODNs（SS-4）及びスクランブルODNs（SC-4；AS-4の配列をランダムに組替えたもの）は、GZF1の発現には影響を及ぼさなかった（図１０(B)、SS-4及びSC-4）。従って、11.5日目ICRマウス胎児から単離した後腎をAS-4又はAS-5の存在下で4日間インキュベートし、尿管芽の分岐を抗サイトケラチン抗体で染色して観察した。AS-4（図１０(C)）及びAS-5は、顕著に分岐を阻害したが、SS-4又はSC-4の存在下では正常に分岐が起こった（図１０(C)、SS-4及びSC-4）。他方、Neuro2A細胞中でGZF1タンパク質の発現に影響を及ぼさなかった他のアンチセンスODNs（AS-1, 2, 3, 6）は、尿管芽分岐にも影響を与えなかった。
以上の結果から、GZF1遺伝子が、腎臓分岐の形態形成に必要な新規GDNF誘導遺伝子であることが明らかとなった。
【００５７】
プラスミド名            受託番号                    寄託日
ｐＧＳＴ−ＧＺＦ１      ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４６４    ２００３年８月４日
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、GDNF誘導遺伝子GZF1が初めて同定され、GZF1がGDNF/RETシグナル伝達の下流で機能する重要な尿管芽分岐因子であり、腎臓の形態形成に必須の因子であることが明らかにされた。また、GZF1遺伝子を手がかりにして、腎臓発生に重要な役割を果たしている未知なる因子をさらに同定することが可能となる。従って、GZF1遺伝子及び該遺伝子と密接に関連して機能する因子を同定し、それを利用することで、修復能力を喪失している生体の腎臓の再生を可能ならしめることが期待できる。
【００５９】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ヒト及びマウスGZF1タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。BTB/POZドメイン（BTB/POZ domain）、核局在化シグナル（bipartite NLS）及び10のC2H2型ジンクフィンガーモチーフ（zinc finger1〜10）の各位置が配列上部に示されている。ヒトとマウスの間で同一のアミノ酸は、影付きで示す。
【図２】ヒトのGZF1の発現をノザンブロットで解析を行った結果を示す。単一の4.8kb転写産物が幾つかのヒト及びマウスの組織中で検出された（上のパネル）。同じメンブレンをコントロールとしてβ-アクチン（β-actin）cDNAでプローブ化した（下のパネル）。ここで、brain, heart, sk. muscle, colon(no mucosa), thymus, spleen, kidney,liver, small intestine, placenta,及びlungは、各々、脳、心臓、骨格筋、結腸（非粘膜）、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤及び肺を意味する。
【図３】マウスのGZF1の発現をノザンブロットで解析を行った結果を示す。単一の4.8kb転写産物が幾つかのヒト及びマウスの組織中で検出された（上のパネル）。同じメンブレンをコントロールとしてβ-アクチン（β-actin）cDNAでプローブ化した（下のパネル）。ここで、heart, brain, spleen, lung, liver, sk. muscle, kidney及びtestisは、各々、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣を意味する。
【図４】TGW神経芽細胞腫細胞株中でGDNFに刺激されたGZF1 mRNA発現量の経時変化を示す。TGW細胞を、刺激後表示された時間にGDNF（100ng/ml）で刺激し、全RNAに対しヒトGZF1 cDNAを用いてノザンブロッティングを行った結果を示す（上のパネル）。コントロールとして28SリボソームRNAの量を示す（下のパネル）。
【図５】GDNF（100 ng/ml）で48時間処理したTGW細胞及びNeuro2aマウス神経芽細胞腫細胞株由来の全細胞抽出物中のGZF1タンパク質の発現量を示す。
【図６】GDNFで処理したヒト神経芽細胞腫細胞株中でのGZF1タンパク質発現の経時変化の結果を示す。表示された時間、GDNF（100ng/ml）で処理したTGW及びNB39ヒト神経芽細胞腫細胞株の抽出物（20μgタンパク質）に対して、抗GZF1（anti-GZF1）抗体又は抗αチューブリン抗体（anti-αtubulin）を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【図７】GZF1タンパク質の核局在の様子を示す。TGWは、TGW細胞を抗GZF1抗体で染色した結果を示し、HEK293Tは、EGFP-GZF1融合遺伝子をHEK293T細胞中へトランスフェクトしたのち共焦点レーザー顕微鏡により解析を行った結果を示す。
【図８】EGFP-GZF1融合タンパク質のウェスタンブロットによる解析結果を示す。（-）又は（+）は、TWG細胞又はHEK293T細胞へのEGFP-GZF1融合遺伝子でトランスフェクションの有無を示す。
【図９】マウス胎児及び新生児腎臓におけるGZF1発現に関する免疫組織学的解析の結果を示す。（A及びC）13.5-14.5日の胎児後腎の尿管芽におけるRETの分布を示す。（C及びD）13.5-14.5日の胎児後腎の尿管芽におけるGZF1の分布を示す。C及びDの矢頭は、尿管芽を示す。バーは100μmを示す。
【図１０】マウスGZF1のホスホロチオエイト化アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、尿管芽分岐の阻害実験の結果を示す。（A）マウスGZF1ヌクレオチド配列に対する６つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ODNs）（18-20mer）配列を示す。（B）Neuro2aマウス神経芽細胞腫細胞株中でのGZF1発現の阻害実験の結果を示す。Neuro2a細胞に６のアンチセンスODNs（200 nM）の各々を用いてトランスフェクトした。同様にAS-4に対応するセンス（SS-4）及びスクランブル（SC-4）ODNsが合成され、Neuro2a中へ導入された。115kDaのGZF1及びコントロールとして55kDaαチューブリンのタンパク質発現の様子が示される。（C）後腎器官培養中での尿管芽分岐の阻害実験の結果を示す。ICRマウス由来の全E11.5マウス腎臓移植片は、1.5μM SS-4, AS-4又はSC-4の存在下で4日間インキュベートした。（上のパネル）実体顕微鏡観察により、SS-4又はSC-4で処理した後腎中では、正常な腎臓の器官形成（尿管芽分岐及び間葉凝縮）が行われたが、AS-4で処理した後腎においては、著しく異常な形態形成が観察された。（下のパネル）尿管芽を、マウス抗サイトケラチン抗体で染色し、Cy3結合ロバ抗マウスIgGでインキュベートして、視覚化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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