(57)【要約】【課題】  微生物検体中の微生物を迅速かつ簡便に検出、同定及び／又は定量する方法を提供すること。【解決手段】  微生物検体からリボゾームＲＮＡを抽出し、該リボゾームＲＮＡを、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及び、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させた後、リボゾームＲＮＡを抽出し、切断されたリボゾームＲＮＡと切断されないリボゾームＲＮＡとを分離して、切断されたリボゾームＲＮＡをもとに特定の微生物を検出、同定及び／又は定量すること特徴とする、検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物検体からリボゾームＲＮＡを抽出し、該リボゾームＲＮＡを、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及び、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させた後、リボゾームＲＮＡを抽出し、切断されたリボゾームＲＮＡと切断されないリボゾームＲＮＡとを分離して、切断されたリボゾームＲＮＡをもとに特定の微生物を検出、同定及び／又は定量すること特徴とする、検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法。
【請求項２】
オリゴＤＮＡとして、５３０プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号１記載の塩基配列参照）、５３０プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号２記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号４記載の塩基配列参照）３２７プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）、及び３２７プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号７記載の塩基配列参照）のうちの１種類又は２種類以上のオリゴＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１記載の特異的検出、同定及び／又は定量方法。
【請求項３】
オリゴＤＮＡとして、ＥＵＢ３３８（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）、ＭＸ８２５（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）ＡＲＣ９１５（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）、ＵＮＩ５３０（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）、及びＧ１２３Ｔ（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）のうちの１種類又は２種類以上のオリゴＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１又は２記載の特異的検出、同定及び／又は定量方法。
【請求項４】
オリゴＤＮＡとして、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できる２種類以上のオリゴＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法の実施に必要な試薬・器具を含んでなることを特徴とする検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法に関し、詳しくは、微生物検体中の特定微生物を迅速、かつ簡便に検出、同定及び／又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性微生物や各種産業で活用される微生物など、産業界、医学界において分離、培養した微生物の検出及び同定は極めて重要、かつ基本的な作業であり、その迅速、かつ簡便な遂行が必要とされている。純粋に培養された微生物の検出及び同定の場合は、通常、ＤＮＡを抽出、精製し、それを基にリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子などをＰＣＲ増幅後、その遺伝子の塩基配列を解読するという作業を行う。しかし、ＰＣＲ増幅やその後の解析は極めて煩雑である上、少なくとも２日程度を要する作業のため、迅速な検出及び同定にはほど遠いのが現状である。
【０００３】
また、現在様々な問題となっている環境汚染、環境破壊などにおいて重要な役割を担う微生物の迅速な追跡、微生物群集構造を基とする環境診断、糞便中の微生物相からの人その他動物の健康状態の診断、廃水処理等バイオプロセスの状況診断等の際には、試料中の複合微生物群中に存在する特定微生物の検出及び同定のほかに、定量が必要とされることがある。このような場合にも、迅速、かつ簡便な検出、同定及び定量によるプロセス診断と、それに基づくリアルタイムなプロセス制御が極めて重要となっている。
【０００４】
微生物の検出、同定及び／又は定量法としては、特定の微生物群に対する抗体を利用する方法や、特定の微生物が有する特徴的遺伝子配列を利用し、その配列をＰＣＲ法、もしくはその遺伝子を特異的に検出するオリゴＤＮＡプローブなどを利用し、そのプローブと標的遺伝子とのハイブリッドを放射性同位元素や蛍光物質などを利用して検出する方法が挙げられる。
【０００５】
具体的には例えば、非特許文献１には、いわゆるＦＩＳＨ（Fluorescence In Situ Hybridization）を用いて微生物の検出を行う方法が記載されている。非特許文献１記載の方法によれば、特定微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡに特異的な塩基配列を持ったＤＮＡ（プローブ）を蛍光でラベルしておき、試料と混合すると、この蛍光ラベルされたプローブと、試料中に存在する特定微生物のｒＲＮＡとが結合するので、蛍光顕微鏡で観察すれば、ｒＲＮＡに結合したプローブが蛍光を発色することで、その微生物の存在が明らかとなる。例えば、細菌のｒＲＮＡと結合するプローブは緑の蛍光を発色し、メタノサエタ（Methanosaeta）属古細菌ｒＲＮＡと結合するプローブは赤の蛍光を発色するようにし、両方が存在している場合は、黄色の蛍光を発色するようにすれば、試料中の細菌と、メタノサエタ属古細菌の局在性を知ることができる。
【０００６】
また、非特許文献２には、特定微生物のｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡと２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードしている遺伝子）及びその間隙の領域に特異的な配列を持つＰＣＲプライマーを何セットか作成して、これを利用してＰＣＲを行った場合のＰＣＲ増幅産物の有無及び分子量の違いにより、特定のグループの検出を行う方法が記載されている。
【０００７】
しかし、上記従来の方法は、微生物菌体からのＤＮＡの抽出、ＤＮＡの精製、ＰＣＲ反応、電気泳動による確認を順次行う必要があり、煩雑な作業が要求されると共に、全ての工程を遂行するのに少なくても１日程度の長時間を要するものであった。
【０００８】
また、特に微生物を定量する場合は、微生物菌体からのＤＮＡの抽出、精製を行った後に、定量的ＰＣＲなどを行う必要がある。
例えば、非特許文献３には、リアルタイムＰＣＲによって、微生物の検出と定量を行う方法が記載されている。ここで、リアルタイムＰＣＲとは、基本的な操作はＰＣＲと同じであるが、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることができる方法である。遺伝子増幅のされ方、即ち遺伝子産物が対数増殖的に増加するときのサイクル数は、基となる鋳型の量に依存するため、あらかじめ濃度が分かっている外部標準ＤＮＡを鋳型としたときの遺伝子増幅の状況と比較することで、試料中の標的遺伝子の存在量を算出することができる。
【０００９】
しかしながら、定量的ＰＣＲの際には、検出したい特定微生物由来のＤＮＡ、ＲＮＡなどの外部標準ＤＮＡを最低２種類以上の希釈率で準備し、対象である試料とともに、それらもＰＣＲ反応に供し、外部標準ＤＮＡと対象試料の解析結果より数値を算出する必要があった。そのため、対象である試料に対して準備しなければならない試薬、器具が増加するだけでなく、工程そのものを増加させ、多くの煩雑な作業と時間が要求される。
【００１０】
その他にも、ＰＣＲを使用して微生物の検出を行う方法はよく利用されており、特定のグループを検出するためのＰＣＲプライマーが多数報告されている（特許文献１〜３参照）。
しかしながら、これらの方法では、試料中の特定グループの検出はできるが、ＰＣＲによる増幅の効率が一様でないため、ＰＣＲ産物量の多少が元の試料中の存在量とが一致せず、定量性がない。
【００１１】
このように、検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量する方法に関して、現時点では、煩雑な作業と時間が要求される方法しかなく、迅速、かつ簡便な検出、同定及び／又は定量法は開発されていない。
【００１２】
【非特許文献１】Sekiguchi Y. et al., Appl. Envronm. Microbiol., Mar. 1999, 1280-1288
【非特許文献２】Yu-Li Song et al., FEMS Microbiol. Letters, 187, 2000, 167-173
【非特許文献３】Ying Fang et al., J. Clin. Microbiol., Jan. 2002, 287-291
【特許文献１】特開２００１−２９９３５２号公報
【特許文献２】特開２００１−３２７２９０号公報
【特許文献３】特開２００２−８５０７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、上述の問題点を解決し、微生物検体中の微生物を迅速かつ簡便に検出、同定及び／又は定量する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、特定の微生物に由来するｒＲＮＡをオリゴＤＮＡ及びリボヌクレアーゼを用いて塩基配列特異的に切断することにより、微生物検体中の微生物を迅速、かつ簡便に検出、同定及び／又は定量することができることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００１５】
請求項１記載の本発明は、微生物検体からリボゾームＲＮＡを抽出し、該リボゾームＲＮＡを、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及び、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させた後、リボゾームＲＮＡを抽出し、切断されたリボゾームＲＮＡと切断されないリボゾームＲＮＡとを分離して、切断されたリボゾームＲＮＡをもとに特定の微生物を検出、同定及び／又は定量すること特徴とする、検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法を提供するものである。
【００１６】
請求項２記載の本発明は、オリゴＤＮＡとして、５３０プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号１記載の塩基配列参照）、５３０プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号２記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号４記載の塩基配列参照）３２７プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）、及び３２７プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号７記載の塩基配列参照）のうちの１種類又は２種類以上のオリゴＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１記載の特異的検出、同定及び／又は定量方法を提供するものである。
【００１７】
請求項３記載の本発明は、オリゴＤＮＡとして、ＥＵＢ３３８（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）、ＭＸ８２５（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）ＡＲＣ９１５（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）、ＵＮＩ５３０（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）、及びＧ１２３Ｔ（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）のうちの１種類又は２種類以上のオリゴＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１又は２記載の特異的検出、同定及び／又は定量方法を提供するものである。
【００１８】
請求項４記載の本発明は、オリゴＤＮＡとして、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できる２種類以上のオリゴＤＮＡを用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法を提供するものである。
【００１９】
請求項５記載の本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載の方法の実施に必要な試薬・器具を含んでなることを特徴とする検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、これまでに長時間、高コストを必要としていた煩雑な微生物の同定、検出及び／又は定量を、非常に単純な処理によって正確に、迅速、かつ簡便に達成することが可能となる。
このため、病原性微生物や各種産業で活用される微生物など、産業界、医学界において分離、培養した微生物の検出が容易となり、また、現在様々な分野で問題となっている環境汚染、環境破壊などにおいて重要な役割を担う微生物の迅速な追跡、微生物群集構造を基とする環境診断、糞便中の微生物相からの人その他動物の健康状態の診断、廃水処理等バイオプロセスの状況診断等が容易に可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
請求項１に係る本発明の検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法は、微生物検体からリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を抽出し、該ｒＲＮＡを、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及び、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させた後、ｒＲＮＡを抽出し、切断されたｒＲＮＡと切断されないｒＲＮＡとを分離して、切断されたリボゾームＲＮＡを基に特定の微生物を検出、同定及び／又は定量することを特徴とする。
【００２２】
なお、本発明において、「検出」とは、微生物検体中における特定の微生物や微生物集団（グループ）の存在がある程度予測できる場合に、その存在を確認することを意味し、「同定」とは、微生物検体中における微生物の存在が明らかである場合に、当該微生物が所属するグループを決定することを意味する。さらに、「定量」とは、微生物検体中における特定の微生物や微生物集団（グループ）の存在量が明らかでない場合に、その存在量を測定、確認することを意味する。
【００２３】
請求項１に係る本発明の特異的検出、同定及び／又は定量方法は、図１に示す４つの工程、即ち、微生物検体からｒＲＮＡを抽出する工程（工程１）、該ｒＲＮＡを、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及び、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させる工程（工程２）、ｒＲＮＡを抽出する工程（工程３）、及び切断されたｒＲＮＡと切断されないｒＲＮＡとを分離して、切断されたｒＲＮＡを基に特定の微生物を検出、同定及び／又は定量する工程（工程４）からなる。そこで、以下、工程１〜４について順を追って説明する。
【００２４】
工程１においては、微生物検体からｒＲＮＡを抽出する。
ここで、微生物検体とは、請求項１に係る本発明の特異的検出、同定及び／又は定量方法の出発となる材料を意味する。１種類又は２種類以上の微生物が含まれていることが、ある程度予測されるので、その存在を確認すべく検出したいとされる検体のほか、微生物が含まれることが明らかであるときに、その微生物が所属するグループを同定したいとされる検体、又は微生物の存在量が明らかでないとき、その存在量を確認すべく定量したいとされる検体を意味する。
微生物とは、細菌（Bacteria: 大腸菌(Escherichia coli: E. coli)、チオスリックス（Thiothrix）属など）および古細菌（Archaea: メタノサエタ（Methanosaeta）属、メタノサルシナ（Methanosarcina）属など）のほかに、カビ・酵母などの真核生物も含まれる。
【００２５】
このような微生物検体の由来は特に限定されず、例えば、培養物（純粋培養、複合微生物群の培養物のいずれも含む）、糞便、廃水、土壌、環境サンプル、バイオプロセス複合微生物菌体、あるいはそれらから分離され、培養された微生物の培養液などの何れであっても良い。
【００２６】
ｒＲＮＡとは、微生物のリボゾーム中に存在するＲＮＡを意味する。尚、ｒＲＮＡのうち、後述する工程２において切断の対象となるものとしては、ＳＳＵ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）、ＬＳＵ  ｒＲＮＡ（２３Ｓ  ｒＲＮＡ）、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２８Ｓ  ｒＲＮＡ等が挙げられる。
【００２７】
本工程１において、微生物検体からｒＲＮＡを抽出する方法としては、微生物菌体中の微生物菌体内から効率よく未分解のままでｒＲＮＡを抽出できる方法であれば、公知の方法が適用可能である。例えば、基礎生化学実験法、第４巻（核酸・遺伝子実験：日本生化学会編、東京化学同人社）に記載されている方法などが挙げられる。その具体例として、ビーズビータ法（Alm et al.，J．Microbiol．Methods，2000，40，153-162）などの高効率ＲＮＡ抽出法を採用し、酸性フェノール法で高分子のＤＮＡを除去すると同時に高純度のＲＮＡを抽出、精製する方法が挙げられ、この方法によれば、次の処理において十分なｒＲＮＡを取得することが可能となる。
【００２８】
ここで、ｒＲＮＡの抽出物に、微生物検体中に含まれていたＤＮＡ断片が残存すると、後述する工程２において、残存したＤＮＡがｒＲＮＡとハイブリダイズし、リボヌクレアーゼによる非特異的なＲＮＡの切断が起きることがある。
また、ｒＲＮＡの抽出物に、微生物検体中に含まれているｒＲＮＡ以外のＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等）が残存すると、後の工程２において、断片化されたｒＲＮＡを、正確に検出、定量する際に支障をきたす。
こうしたことを回避するために、工程２の前及び／又は後に、試料（工程２の前の場合はｒＲＮＡの抽出物，工程２の後の場合は反応後のｒＲＮＡ）に含まれるｒＲＮＡ以外の核酸（ＤＮＡ、ｒＲＮＡ以外のＲＮＡ等）を除去する（精製する）ことが好ましい。
試料に含まれるｒＲＮＡ以外の核酸を除去することにより、後の工程４において、断片化されたｒＲＮＡの高感度、かつ正確な検出、同定及び／又は定量が可能である。
【００２９】
ｒＲＮＡ以外の核酸を除去する方法としては、一般的な物理的、化学的、生物学的等の手段を用いることができる。
例えば、ゲルろ過カラムを使用した物理的手段が挙げられる。この手段は、核酸の分子量の相違に起因する移動差を利用して、ｒＲＮＡとそれ以外の核酸とを分離するものである。即ち、試料をゲルろ過カラムに通すと、比較的分子量の大きいｒＲＮＡはカラムを早く通過するのに対し、分子量の小さいＤＮＡ，ＲＮＡはカラム内に長時間滞留するので、ｒＲＮＡ以外の核酸を除去することができる。
この手段を実行する場合、後述する実施例で用いたSpin column S-400（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia biotech）社、米国、Sephacryl S-400HR）等のキットを用いることが好ましい。Spin column S-400は、マイクロチューブにセット可能なカラムに、ゲルろ過樹脂が適量充填されたキットであり、試料をアプライして、遠心分離機にかけて遠心力を加えるだけでゲルろ過を行うことができる。
【００３０】
また、他の例として、ＤＮＡ分解酵素を使用してＤＮＡを小断片に分解する生物学的手段が挙げられる。この手段によれば、まず、試料にＤＮＡ分解酵素を作用させてＤＮＡを小断片に分解すると、分子量の小さくなったＤＮＡは、エタノール沈殿を行うことでｒＲＮＡと分離する（ｒＲＮＡは沈殿するが、ＤＮＡは沈殿しない）。そして、ＤＮＡの分解後に、上記の方法と同様にゲルろ過カラムを通すことにより、ｒＲＮＡのみを回収することも可能である。
【００３１】
その他、Sephacryl S-300 HR（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia biotech）社、米国）、Sephacryl S-200 HR（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）社、米国）、ジーンクリーンターボキット（バイオ１０１（Bio１０１）社、米国）等の各種ＤＮＡ、ＲＮＡ精製キットを利用した化学的手段を用いることもできる。
更に、全ての生物のｒＲＮＡの共通配列を含むオリゴＤＮＡプローブを担体（マグネットビーズやカラム内壁）に付加し、ｒＲＮＡのみを選択的に回収する方法を用いることもできる。
尚、ｒＲＮＡ以外の核酸の除去は、任意であり、ｒＲＮＡ抽出物中にＤＮＡ断片が残存していないことが明らかな場合は、省略しても差し支えない。
【００３２】
工程２においては、工程１で抽出したｒＲＮＡを、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させる。
尚、図２は、工程２〜４における操作の流れの説明図である。従って、以下、必要に応じて図２を参照しながら工程２〜４を説明する。
【００３３】
ここで、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡは、特定の微生物種、株のほか、属、更に上位の分類群における細菌、古細菌等の微生物群（グループ）に特徴的なｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡのことを意味する。
このような、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できる２種類以上のオリゴＤＮＡは、ミスマッチのない、完全に相補的な塩基配列を有するＤＮＡであることが好ましい。ミスマッチを持つオリゴＤＮＡは、ｒＲＮＡに対する結合が起こりにくくなり、結果的にＳＳＵ  ｒＲＮＡの断片化の程度が低くなるおそれがある。
【００３４】
ここで、オリゴＤＮＡの塩基数については、特に限定されないが、塩基数が１６以上のものが好ましい。オリゴＤＮＡの塩基数が１５以下の場合は、安定的なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成が困難となるおそれがあり、リボヌクレアーゼによるｒＲＮＡの切断に支障をきたす可能性がある。
塩基数の上限はないが、あまり塩基数が多いと、目的とする座位以外の位置でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成され、非特異的な切断が起こりやすくなり、正確な検出、定量に支障が出る。このことを考慮すると、塩基数の上限は２５程度であることが望ましい。
【００３５】
このような、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡの作成は、微生物試料中のｒＲＮＡ分子を直接かつ網羅的に解読する手法（Sekiguchi Y. et al., Microbiology 1998， 144， 2655-2665）を使用し、その結果得られた配列を基に作成する方法（Sekiguchi Y. et al., Appl. Envronm. Microbiol., Mar. 1999, 1280-1288）を適用して行うことができる。また、公共ＤＮＡ（ゲノム）データベースから、対象微生物のｒＲＮＡにのみ特徴的な部分配列を検索し、これを基に作成することもできる。
【００３６】
尚、上述したオリゴＤＮＡは、金属イオン等を利用した物理化学的ＲＮＡ切断を触媒する部位を持つオリゴＤＮＡであっても良い。更に、それらと同等の働き（相補的なＲＮＡ配列に結合する）を行う類似体（アナログ）であっても良い。
また、リボヌクレアーゼを付加されてなるオリゴＤＮＡ若しくはそれと同等の働き（相補的なＲＮＡ配列に結合する）を行う類似体（アナログ）であっても良い。リボヌクレアーゼが付加されてなることにより、オリゴＤＮＡが標的のｒＲＮＡと結合したときは、必ずその近傍にリボヌクレアーゼが存在することになるので、切断の効率が上がるものと考えられる。
【００３７】
このようなオリゴＤＮＡの具体例としては、請求項２に記載するように、５３０プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号１記載の塩基配列参照）、５３０プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号２記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号４記載の塩基配列参照）３２７プローブ（１６ｍｅｒ）（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）、及び３２７プローブ（２０ｍｅｒ）（配列表の配列番号７記載の塩基配列参照）のうちの１種類又は２種類以上のオリゴＤＮＡが挙げられる。
【００３８】
これらのうち、５３０プローブ（１６ｍｅｒ）及び５３０プローブ（２０ｍｅｒ）は、それぞれ原核生物（細菌及び古細菌）に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位５１５−５３０、５１１−５３０に対して相補的なオリゴＤＮＡである。
また、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）及び９０７プローブ（２０ｍｅｒ）は、それぞれ、原核生物（細菌及び古細菌）に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位９０８−９２３、９０４−９２３に対して相補的なオリゴＤＮＡである。
そして、３２７プローブ（１６ｍｅｒ）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）及び３２７プローブ（２０ｍｅｒ）は、大腸菌等の細菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位３１２−３２７、３１２−３２９、３１１−３３０に対して相補的なオリゴＤＮＡである。
【００３９】
また、オリゴＤＮＡの他の具体例としては、請求項３に記載するように、ＥＵＢ３３８（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）、ＭＸ８２５（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）ＡＲＣ９１５（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）、ＵＮＩ５３０（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）、及びＧ１２３Ｔ（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）のうちの１種類又は２種類以上のオリゴＤＮＡが挙げられる。
ＥＵＢ３３８は、大腸菌等の細菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位３３８−３５５に対して相補的なオリゴＤＮＡであり、ＭＸ８２５は、メタノサエタ・コンシリイ（M．concilii）等のメタノサエタ属古細菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位８２７−８４３に対して相補的なオリゴＤＮＡであり、ＡＲＣ９１５は、古細菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位９１２−９２９に対して相補的なオリゴＤＮＡであり、ＵＮＩ５３０は、原核生物（細菌及び古細菌）に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位５１５−５３０に対して相補的なオリゴＤＮＡであり、Ｇ１２３Ｔは、チオスリックス・ディシホルミス（T．disciformis）等のチオスリックス属細菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位６９７−７１４に対して相補的なオリゴＤＮＡである。
【００４０】
オリゴＤＮＡは、１種類を単独で用いることもできるが、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。特に、請求項４に記載するように、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できる２種類以上のオリゴＤＮＡを用いると、複数の微生物グループを同時に検出、同定及び／又は定量することができる点で、好ましい。
【００４１】
特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できる２種類以上のオリゴＤＮＡの具体例としては、上記５３０プローブ（１６ｍｅｒ）及び／又は５３０プローブ（２０ｍｅｒ）と、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）及び／又は９０７プローブ（２０ｍｅｒ）との組み合わせ；５３０プローブ（１６ｍｅｒ）及び／又は５３０プローブ（２０ｍｅｒ）と、３２７プローブ（１６ｍｅｒ）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）及び／又は３２７プローブ（２０ｍｅｒ）との組み合わせ；９０７プローブ（１６ｍｅｒ）及び／又は９０７プローブ（２０ｍｅｒ）と、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）及び／又は３２７プローブ（２０ｍｅｒ）との組み合わせ；５３０プローブ（１６ｍｅｒ）及び／又は５３０プローブ（２０ｍｅｒ）と、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）及び／又は９０７プローブ（２０ｍｅｒ）と、３２７プローブ（１６ｍｅｒ）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）及び／又は３２７プローブ（２０ｍｅｒ）との組み合わせ、が挙げられる。
【００４２】
一方、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼとしては、リボヌクレアーゼＨが挙げられる。
リボヌクレアーゼＨは、図２に示すように、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（２本鎖）を形成した部位を認識し、その部位若しくはその周辺のＲＮＡのみを切断する活性を有する。このようなリボヌクレアーゼＨは、種々の動物細胞、酵母、大腸菌などに存在する細胞由来のリボヌクレアーゼＨと、ＲＮＡ型腫瘍ウイルス（ＡＭＶ、ＲＳＶ、ＭＬＶ等）に存在するウイルス由来のリボヌクレアーゼＨとに分類されるが、請求項１に係る本発明においては、これらのいずれも使用することができる。
【００４３】
尚、リボヌクレアーゼＨではなく、ＲＮＡ（１本鎖）を認識して切断するリボヌクレアーゼを利用して、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成していないＲＮＡをすべて切断することによって、標的とするｒＲＮＡだけを部分的に残す方法も考えられる。
【００４４】
本工程２において、ｒＲＮＡを、前述のオリゴＤＮＡ及びリボヌクレアーゼと反応させる際には、ｒＲＮＡ、前述のオリゴＤＮＡ及びリボヌクレアーゼを含む反応溶液を調製して行うことができる。ここで、反応溶液に核酸変性剤を添加するか、或いは反応温度を４０−６０℃に設定することにより、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度、すなわち特異性を調整できる。
核酸変性剤とは、相補的な塩基配列を持つ２本の核酸の塩基が水素結合してハイブリッドの形成を妨げた結果、リボヌクレアーゼによる切断を起こらなくするものであり、ホルムアミド等の既知の物質が利用可能である。
核酸変性剤の添加量は、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度をどの程度調整したいかを考慮し、適宜決定することができるが、例えばホルムアミドの場合、反応溶液中に４０％以下とすることが好ましい。添加量が４０％を超えると、ハイブリッドがほとんど形成されなくなり、本発明の目的を達成できない。
【００４５】
また、反応温度を高くすると、核酸変性剤を添加した場合と同様にハイブリッドの形成が妨げられるが、６０℃を超えるとｒＲＮＡの非特異的な分解が起こりやすくなるため、正確な検出、定量に支障が出るおそれがある。一方、反応温度が４０℃未満の低温では、ｒＲＮＡ自体が部分的なＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しやすくなり、工程２でのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成が妨げられてリボヌクレアーゼによるｒＲＮＡの切断に支障をきたす。また、ミスマッチを含んだＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成されやすくなり、標的に特異的な切断が困難になる。
【００４６】
反応時間は、１０分−６０分の間で設定可能だが、正確な検出と定量のためには、１５分−３０分が好適である。
反応の終了は、リボヌクレアーゼの活性を阻害する物質（たとえば、ＥＤＴＡ、フェノールなど）を反応溶液に添加するか、リボヌクレアーゼの活性を完全に失活させる条件下に反応溶液をさらすことによって行うことができる。
【００４７】
本工程２において、反応の結果、検出したい特定の微生物に由来するｒＲＮＡは、添加したオリゴＤＮＡと完全にハイブリッドを形成するので、リボヌクレアーゼにより塩基配列特異的に切断される。一方、それ以外の微生物（即ち、検出対象外の微生物）に由来するｒＲＮＡは、添加したオリゴＤＮＡ等とハイブリッドを形成しないので、切断されない（図２参照）。
その結果、特定の微生物に由来するｒＲＮＡのみを塩基配列特異的に切断することができる。
【００４８】
工程３においては、反応後のｒＲＮＡを抽出する（図２参照）。
反応後のｒＲＮＡの抽出には、一般的に使用されるＲＮＡ抽出法（例えば、フェノール抽出、エタノール沈殿、及びそれらの組み合わせ）が適用可能である。その他の方法であっても、高効率でｒＲＮＡを抽出し、溶存している反応溶液を置換できる方法であれば好適に適用可能である。
尚、工程１の説明中で既に述べたように、工程２の後、即ち、工程３の過程において、試料に含まれるｒＲＮＡ以外の核酸を除去しても良い。
なお、本工程３を経ずとも工程４において十分高解像度でｒＲＮＡの検出、同定及び／又は定量が可能であることが明らかである場合、例えば、反応液中のｒＲＮＡ量が十分に存在しているときなどは、本工程３を省略することができる。
【００４９】
工程４においては、切断されたリボゾームＲＮＡと切断されないリボゾームＲＮＡとを分離して、切断されたリボゾームＲＮＡをもとに特定の微生物を検出、同定及び／又は定量する。
切断されたｒＲＮＡと切断されないｒＲＮＡとを分離する方法としては、分子量分画、塩基配列中のＧＣ含量の違いをもとにした分画等が挙げられるが、とりわけ、分子量分画によることが好ましい。
特定の微生物に由来するｒＲＮＡは、工程２で切断され断片化されて、分子量の小さい２以上の断片となっているので、分子量分画を行うことにより、それ以外の微生物のｒＲＮＡと容易に区別することができる（図２参照）。
【００５０】
分子量分画による方法の一例を挙げると、以下の通りである。
まず、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、もしくはそれに類するポリマー、又はそれらの組み合わせを用いた電気泳動を行い、切断されたｒＲＮＡと切断されないｒＲＮＡとを分子量の相違により分離する。その後、それぞれのｒＲＮＡを標識し、標識物質に由来するシグナル（蛍光輝度（図２参照）、放射線量、発光量等）を検出すると共に、そのシグナルからのｒＲＮＡ量を推定する。
電気泳動は、公知の方法（基礎生化学実験法、第４巻、核酸・遺伝子実験）、日本生化学会編、東京化学同人社）によることができる。
【００５１】
ｒＲＮＡの標識は、一般の核酸の測定・検出に用いられる蛍光物質（蛍光色素）、色素、放射性物質、発光物質等を使用して行うことができるし、ジゴキシゲニン等のシステムを利用した蛍光等の感度増感法や、直接核酸の紫外線吸収によるｒＲＮＡの直接検出も含まれる。
【００５２】
蛍光物質（蛍光色素）としては、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（モレキュラープローブ（molecular Probes）社、米国）、ＳＹＢＲＧｏｌｄ（モレキュラープローブ（Molecular Probes）社、米国）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（モレキュラープローブ（Molecular Probes）社、米国）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（モレキュラープローブ（Molecular Probes）社、米国）、その他ＰＩ（モレキュラープローブ（Molecular Probes）社、米国）などのシアニン系核酸染色剤などを好適なものとして挙げることができる。
【００５３】
色素としては、例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社）を、放射性物質としては、Ｐ３２，Ｃ１３などの放射性同位体を、発光物質としては、例えば、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社、米国）、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社）を挙げることができる。
【００５４】
なお、工程４において、分子量分画からシグナル値の算出まで、一連の作業を一体化したシステムを利用することは、本発明の迅速化を図る上で極めて有効である。このようなシステムとして、例えば、アジレント２１００バイオアナライザ（アジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社、米国）、コスモアイＳＶ１１００（日立化成工業、日本）、コスモアイＳＶ１２１０（日立化成工業、日本）、ＭＣＥ−２０１０（島津製作所、日本）などが好適に利用可能である。
【００５５】
切断されたｒＲＮＡをもとに特定の微生物を検出する方法としては、切断されたｒＲＮＡが存在する場合は、工程２で用いられたオリゴＤＮＡに対応する微生物や微生物集団（グループ）が微生物検体中に存在することを確認し、一方、切断されたｒＲＮＡが存在しない場合は、工程２で用いられたオリゴＤＮＡに対応する微生物や微生物集団（グループ）が微生物検体中に存在しないことを確認することにより達成される。
このような、切断されたｒＲＮＡの存在の確認は、上記のような分子量分画を行う場合、標識物質に基づくシグナル値に基づいて確認することにより達成可能である。
【００５６】
また、切断されたｒＲＮＡをもとに特定の微生物を同定する方法としては、切断されたｒＲＮＡが存在する場合は、検体中の微生物が工程２で用いられたオリゴＤＮＡに対応する微生物であるか、微生物集団（グループ）に属していることを見出し、一方、切断されたｒＲＮＡが存在しない場合は、検体中の微生物が工程２で用いられたオリゴＤＮＡに対応する微生物でなく、微生物集団（グループ）に属していないことを見出すことにより達成される。
このような、切断されたｒＲＮＡの存在の確認は、上記のような分子量分画を行う場合、標識物質に基づくシグナル値に基づいて確認することにより達成可能である。
【００５７】
更に、切断されたｒＲＮＡをもとに特定の微生物を定量する方法としては、切断されたｒＲＮＡが存在する場合に、その切断されたｒＲＮＡ量の全ｒＲＮＡ中に占める割合を算出し、その割合を微生物検体中に占める特定の微生物の存在量とすることにより達成される。
このような、切断されたｒＲＮＡ量の全ｒＲＮＡ中に占める割合の算出は、上記工程４を分子量分画により行う場合、標識物質に基づくシグナル値から切断されたリボゾームＲＮＡの存在量を推定することにより達成可能である。
【００５８】
工程２において、特定の微生物に由来するリボゾームＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できる２種類以上のオリゴＤＮＡを用いる場合には、切断されてできた断片を断片長に応じて別々に検出することで、より多種の微生物種の効率的な検出、定量及び／又は同定が可能である。
【００５９】
尚、請求項１に係る本発明の検体中の微生物の特異的検出及び／又は同定方法において、全ての工程もしくは一部の工程において非特異的なＲＮＡの分解を抑制するための方法を適用することができる。
ここで、非特異的なＲＮＡの分解とは、試料中に混入しているＲＮＡ分解酵素、又は本発明の工程若しくはその前処理において混入したＲＮＡ分解酵素による、配列には依存しないＲＮＡ（又はｒＲＮＡ）の消化、分解、断片化を意味する。また、熱やｐＨの変化などによる物理化学的に影響による、配列に依存しないＲＮＡ（又はｒＲＮＡ）の分解を含む。
非特異的なＲＮＡの分解を抑制する方法としては、公知の一般的方法（基礎生化学実験法、第４巻、核酸・遺伝子実験）、日本生化学会編、東京化学同人社）等による他、ＲＮＡ分解酵素の活性を阻害する物質（リボヌクレアーゼ阻害剤）、若しくはリボヌクレアーゼＨの活性は阻害しないが、他のＲＮＡ分解酵素の活性を阻害する物質を添加する方法などが挙げられる。
【００６０】
ＲＮＡ分解酵素の活性を阻害する物質（リボヌクレアーゼ阻害剤）、若しくはリボヌクレアーゼＨの活性は阻害しないが他のＲＮＡ分解酵素の活性を阻害する物質としては、例えば、ＲＮａｓｉｎ（プロメガ（Promega）社、米国）、Ａｎｔｉ−ＲＮａｓｅ（アンビオン（Ambion）社、米国）、ＲＮａｓｅインヒビター（アンビオン（Ambion）社、米国）、ＲＮａｓｅブロックＩ（ストラタジーン（STRATAGENE clong systems）社、米国）、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（アンビオン（Ambion）社、米国）などが挙げられる。
【００６１】
以上説明したように、請求項１に係る本発明の検体中の微生物の特異的検出及び／又は同定方法によれば、短時間の反応（すなわち、一回のｒＲＮＡ切断反応と一回の分離操作のみで）により、外部標準等を必要とせず、極めて迅速かつ簡便に対象微生物の検出、定量及び／又は同定を達成できる。
このような請求項１に係る本発明の検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法を実施するために好適なキットを提供するのが、請求項５記載の本発明である。
【００６２】
即ち、請求項５記載の本発明のキットは、請求項１〜４に記載の方法の実施に必要な試薬・器具を含んでなることを特徴とする検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量キットである。
請求項５記載の本発明のキットは、請求項１〜４に記載の方法の実施に必要な試薬・器具、例えば、ＲＮＡを抽出・精製するための試薬・器具、ｒＲＮＡの特異的な切断を行うための試薬・器具、切断されたｒＲＮＡを回収するための試薬・器具のことを指し、具体的には、ＲＮＡを抽出・精製する目的で用いられる分離器具又は試薬、ｒＲＮＡを切断する目的で用いられる緩衝液又は金属塩を含む溶液、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼ、特異的なグループのｒＲＮＡに相補的な塩基配列を持つオリゴＤＮＡのうちいずれかを含むものである。
請求項５に係る本発明のキットによれば、請求項１に係る本発明の検体中の微生物の特異的検出、同定及び／又は定量方法をより簡便に実施することが可能である。
【００６３】
次に本発明の実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
オリゴＤＮＡとして５３０プローブ（１６ｍｅｒ）を用いて以下の工程１〜４を行い、微生物検体中の大腸菌を検出した。
【００６５】
（工程１）
微生物検体としての大腸菌の培養液から、酸性フェノール法でｒＲＮＡを抽出し、それをＳｐｉｎｃｏｌｕｍｎ  Ｓ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲ）で精製した。精製ＲＮＡ試料は、紫外線吸光度によりその濃度を算出し、抽出したＲＮＡを約１００ｎｇ／μＬになるよう希釈・調製した。
【００６６】
（工程２）
更に、以下の反応溶液を作成、使用した。
【００６７】
（１）１０×ハイブリダイゼーション溶液
２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
２５０ｍＭ  塩化ナトリウム
【００６８】
（２）４×酵素溶液
８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
４０ｍＭ  塩化マグネシウム
５０ｍＭ  塩化ナトリウム
４ｍＭ  ＤＴＴ
１２０μｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン
【００６９】
（３）３×反応停止液
３０ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．９Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
【００７０】
（４）リボヌクレアーゼＨ溶液（リボヌクレアーゼＨ）
５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼＨ
４０ｍＭ  ＴｒｉｓーＨＣｌ（ｐＨ７．５）
３０ｍＭ  塩化ナトリウム
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール
５０％  グリセロール
【００７１】
ｒＲＮＡの塩基配列特異的切断操作手順について以下に詳細に説明する。
あらかじめ、１２．５μＬの酵素溶液（４×酵素溶液９９．８％、リボヌクレアーゼＨ溶液０．２％の割合で混合）を作成し、５０℃で保温した。次に、反応溶液としてｒＲＮＡ溶液（工程１で調製したもの）５μＬ、１０×ハイブリダイゼーション溶液２．５μＬ、オリゴＤＮＡとしての５３０プローブ（１６ｍｅｒ）５μＬ、純水２５μＬを反応チューブ内で混合後、９５℃１分間加熱し、すみやかに５０℃まで冷却した。５０℃に到達してから１分後に、あらかじめ調製した酵素溶液を全量反応溶液に添加し、１５分間反応させた。その後、３×反応停止液を２５μＬ添加して反応を終了させると共に、反応溶液を冷却した（塩基特異的切断サンプル）。
尚、比較のため、酵素溶液を添加しなかった他は同様にして反応を行った（酵素溶液無添加サンプル）。また、オリゴＤＮＡを添加しなかった他は同様にして反応を行った（オリゴＤＮＡ無添加サンプル）。
【００７２】
（工程３）
得られた各サンプルについて、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、反応後のｒＲＮＡを抽出した。
【００７３】
（工程４）
工程３において抽出されたｒＲＮＡについて、１．２％アガロースゲルで電気泳動を行った。その後、泳動ゲルをＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社、米国）で染色した。
菌体からのｒＲＮＡの抽出からここまでの全工程は、２−３時間程度であり極めて迅速かつ簡便であった。
【００７４】
一方、工程３において抽出されたｒＲＮＡについて、アジレント２１００バイオアナライザ（アジレントテクノロジー（Agilent Technologies）社、米国）を使用してｒＲＮＡの電気泳動を行った。また、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡについても、同様に電気泳動を行った。尚、アジレント２１００バイオアナライザを用いた場合、菌体からのｒＲＮＡの抽出からここまでの全工程は、２時間以内で終了し、更により迅速な測定が可能であった。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果を、図３に示す。尚、図３のレーン１、２、３、４は、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果、塩基配列特異的切断サンプルの結果、酵素溶液無添加比較サンプルの結果、及びオリゴＤＮＡ無添加比較サンプルの結果を示す。
【００７５】
その結果、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡは、図３のレーン１に示すように、ＬＳＵ  ｒＲＮＡとＳＳＵ  ｒＲＮＡによってほぼ構成されている。一方、オリゴＤＮＡ（５３０プローブ（１６ｍｅｒ））とリボヌクレアーゼＨによって切断されたサンプルのｒＲＮＡは、図３のレーン２のように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断されている。切断箇所は５３０プローブが標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約５００付近であり、分断化された２種類の分子は、それぞれ約５００塩基長、及び１０００塩基長であった。このことは、オリゴＤＮＡが原核動物である大腸菌のｒＲＮＡの塩基配列を認識し、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成した結果、リボヌクレアーゼＨによる塩基配列特異的な切断が行われたことを示している。
なお、酵素溶液無添加比較サンプルや、オリゴＤＮＡ無添加比較サンプルでは、ｒＲＮＡの塩基配列特異的切断は全く起こらないことが判明した（図３のレーン３及び４参照）。
このように、微生物検体中に存在する大腸菌に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合するオリゴＤＮＡ（５３０プローブ（１６ｍｅｒ））を用いることにより、微生物検体中の大腸菌を検出することができた。
【実施例２】
【００７６】
実施例１において、オリゴＤＮＡとして、５３０プローブ（１６ｍｅｒ）に加えて、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）を同時に用いた他は、実施例１と同様に行い、微生物検体中の大腸菌を検出した。
【００７７】
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果を、図４に示す。尚、図４のレーン１〜７は、それぞれ、ＲＮＡサイズマーカー、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果、塩基配列特異的切断サンプル（上記（１）５３０プローブを添加した場合）の結果、塩基配列特異的切断サンプル（上記（２）９０７プローブを添加した場合）の結果、塩基配列特異的切断サンプル（上記（３）５３０プローブ及び９０７プローブを添加した場合）の結果、酵素溶液無添加比較サンプルの結果、及びオリゴＤＮＡ無添加比較サンプルの結果を示す。
【００７８】
その結果、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡは、図４のレーン２に示すように、ＬＳＵ  ｒＲＮＡとＳＳＵ  ｒＲＮＡによってほぼ構成されている。
一方、オリゴＤＮＡ（５３０プローブ（１６ｍｅｒ））とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡは、図４のレーン３の矢印で示されたバンドから明らかなように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断されている。切断箇所は５３０プローブが標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約５００付近であることに対応し、分断化された２種類の分子は、それぞれ約５００塩基長、及び１０００塩基長であった。
【００７９】
また、オリゴＤＮＡ（９０７プローブ（１６ｍｅｒ））とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡは、図４のレーン４の矢印で示されたバンドから明らかなように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断されている。切断箇所は９０７プローブが標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約９００付近であることに対応し、分断化された２種類の分子は、それぞれ約６００塩基長、及び９００塩基長であった。
更に、オリゴＤＮＡ（５３０プローブ及び９０７プローブ）とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡは、図４のレーン５の矢印で示されたバンドから明らかなように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが３本に分断されている。切断箇所は５３０プローブが標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約５００付近と、９０７プローブが標的とする座位約９００付近の２箇所であるから、分断化された３種類の分子の分子量は、短いものから約４００、５００、６００と予想される。電気泳動で検出された３本の分子の分子量は、約４００、５００、６００であり、予想された結果と一致していた。
これらのことは、異なる座位に結合する複数のオリゴＤＮＡを用いた場合も、それぞれのオリゴＤＮＡが対応する座位でＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより、微生物に由来するｒＲＮＡが塩基配列特異的に切断されていることを示している。
なお、酵素溶液無添加比較サンプルや、オリゴＤＮＡ無添加比較サンプルでは、ｒＲＮＡの塩基配列特異的切断は全く起こらないことが判明した（図４のレーン６及び７参照）。
【００８０】
このように、大腸菌に由来するｒＲＮＡの異なる座位に対して相補的に結合する２種類以上のオリゴＤＮＡを同時に用いても、それぞれのオリゴＤＮＡが標的とする座位でｒＲＮＡと結合し、ｒＲＮＡを切断でき、大腸菌を検出できることが明らかとなった。
【実施例３】
【００８１】
実施例１において、工程２における反応温度を４１℃，４５℃，４８℃，５１℃，５３℃，５６℃，６０℃，６５℃及び７０℃としてそれぞれ反応を行った他は、同様の操作を行って微生物検体中の大腸菌を検出した。
アガロースゲルを用いた電気泳動の結果を、図５に示す。尚、図５のレーン１〜１２は、それぞれ、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果、反応温度４１℃の結果，反応温度４５℃の結果，反応温度４８℃の結果，反応温度５１℃の結果，反応温度５３℃の結果，反応温度５６℃の結果，反応温度６０℃の結果，反応温度６５℃の結果、反応温度７０℃の結果、酵素溶液無添加比較サンプル（反応温度７０℃）の結果、及びオリゴＤＮＡ無添加比較サンプル（反応温度７０℃）の結果を示す。
【００８２】
その結果、図５のレーン２−８の結果から明らかなとおり、反応温度が４１℃，４５℃，４８℃，５１℃，５３℃，５６℃，６０℃の場合は、いずれも、ＳＳＵ  ｒＲＮＡが２本に切断されているのが明らかである。一方、図５のレーン９及び１０の結果から明らかなとおり、反応温度が６５℃及び７０℃の場合は、ＬＳＵ  ｒＲＮＡが薄くなっている上に、レーン全体が白くぼやけていた。これらは、ｒＲＮＡの非特異的な分解があったことを示しており、６０℃よりも高い温度で反応させることが不適当であることを示唆している。
このことから、工程２における反応温度を４０−６０℃の間で変化させることにより、使用するオリゴＤＮＡと完全に相補的なｒＲＮＡのみを選択的に分断化することができ、微生物検体中の大腸菌を検出できることが明らかとなった。
【実施例４】
【００８３】
実施例１において、オリゴＤＮＡとして３２７プローブ（１２ｍｅｒ）（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）、３２７プローブ（１４ｍｅｒ）（配列表の配列番号１４記載の塩基配列参照）、３２７プローブ（１６ｍｅｒ）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）及び３２７プローブ（２０ｍｅｒ）をそれぞれ用いて、反応温度を４０−６０℃の間で変化させた他は、実施例１と同様に行って微生物検体中の大腸菌を検出した。
尚、３２７プローブ（１２ｍｅｒ）及び３２７プローブ（１４ｍｅｒ）は、大腸菌等の細菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位３１４−３２５、３１３−３２６に対して相補的なオリゴＤＮＡである。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合の反応温度の推移による影響を、図６に示す。
【００８４】
その結果、図６から明らかなとおり、３２７プローブ（１６ｍｅｒ）、３２７プローブ（１８ｍｅｒ）及び３２７プローブ（２０ｍｅｒ）を用いた場合、ＳＳＵ  ｒＲＮＡを１００％切断することができる反応温度が存在したが、３２７プローブ（１２ｍｅｒ）及び３２７プローブ（１４ｍｅｒ）を用いた場合、いずれの反応温度においても、ＳＳＵ  ｒＲＮＡを１００％切断することはできなかった。
【００８５】
尚、オリゴＤＮＡとして、５３０プローブ（１２ｍｅｒ）（配列表の配列番号１５記載の塩基配列参照）、５３０プローブ（１６ｍｅｒ）、５３０プローブ（２０ｍｅｒ）、９０７プローブ（１２ｍｅｒ）（配列表の配列番号１６記載の塩基配列参照）、９０７プローブ（１６ｍｅｒ）及び９０７プローブ（２０ｍｅｒ）を使用して同様に微生物の検出を行った。５３０プローブ（１２ｍｅｒ）及び９０７プローブ（１２ｍｅｒ）は、それぞれ原核生物（細菌及び古細菌）に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位５１９−５３０、９１２−９２３に対して相補的なオリゴＤＮＡである。
この場合も、塩基数が１６ｍｅｒ、２０ｍｅｒのオリゴＤＮＡではＳＳＵ  ｒＲＮＡを１００％切断できる反応温度が存在していたが、１２ｍｅｒのオリゴＤＮＡではＳＳＵ  ｒＲＮＡを１００％切断することはできなかった。
【００８６】
塩基数が１２ｍｅｒ、１４ｍｅｒのオリゴＤＮＡを用いた場合、標的であるｒＲＮＡに完全に相補的な配列を持つにもかかわらず、１００％切断することができなかったのは、これらのオリゴＤＮＡが短すぎてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成が不安定となり、リボヌクレアーゼＨによる切断を十分に受けることができなかったからと推測される。
このことから、十分な塩基数、具体的には塩基数１６以上のオリゴＤＮＡを用いることにより、オリゴＤＮＡと完全に相補的なｒＲＮＡを完全に分断化することができ、微生物検体中の大腸菌を検出できることが明らかとなった。
【実施例５】
【００８７】
実施例１において、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを０−５０％添加し、オリゴＤＮＡとして３２７プローブ（１８ｍｅｒ）を使用した他は、実施例１と同様に行って微生物検体中の大腸菌を検出した。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を、図７に示す。
【００８８】
その結果、図７から明らかなとおり、ホルムアミド濃度が高くなるにつれて、ＳＳＵ  ｒＲＮＡの断片化の程度が低下した。これは、ホルムアミドの添加により、ＳＳＵ  ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡとのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが妨げられた結果、リボヌクレアーゼＨによる切断が起こらなくなったことを示唆している。
このことから、工程２において、反応溶液にホルムアミドを添加することにより、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度、すなわち特異性を調整でき、微生物検体中の大腸菌を検出できることが明らかとなった。
【００８９】
〔比較例１〕
実施例１において、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを０−５０％添加し、オリゴＤＮＡとして３２７（Ｍ９ａ）プローブ（配列表の配列番号１７記載の塩基配列参照）、３２７（Ｍ９ｃ）プローブ（配列表の配列番号１８記載の塩基配列参照）、３２７（Ｍ１３）プローブ（配列表の配列番号１９記載の塩基配列参照）、３２７（Ｍ１４）プローブ（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）、３２７（Ｍ６）プローブ（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）、３２７（Ｍ１）プローブ（配列表の配列番号２２記載の塩基配列参照）及び３２７（Ｍ１８）プローブ（配列表の配列番号２３記載の塩基配列参照）をそれぞれ使用した他は、実施例１と同様に行って微生物検体中の大腸菌を検出した。
尚、各オリゴＤＮＡは、大腸菌に由来するＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位３１２−３２９に対して相補的なオリゴＤＮＡについて、１箇所ずつミスマッチを持たせたものである。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、各オリゴＤＮＡを用いた場合の、断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を、図８に示す。
【００９０】
その結果、図８から明らかなとおり、オリゴＤＮＡの持つミスマッチの位置により、ＳＳＵ  ｒＲＮＡの断片化の程度が相違していた。これは、ミスマッチの位置により、ＳＳＵ  ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡとのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの程度が相違する結果、リボヌクレアーゼＨによる切断が起こらなくなったことを示唆している。また、ミスマッチを持っているどのオリゴＤＮＡであっても、完全一致であるオリゴＤＮＡと比較して、ＳＳＵ  ｒＲＮＡの断片化の程度は低くなった。
このように、ｒＲＮＡの１塩基の違いで断片化の程度が異なってくることから、本発明の方法において、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡを用いることにより、完全一致する標的の配列のみを認識し、切断できることが明らかとなった。
【実施例６】
【００９１】
微生物検体として大腸菌の培養液、及びメタノサエタ・コンシリイの培養液を使用し、それぞれから抽出したｒＲＮＡについて、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを０−５０％添加し、オリゴＤＮＡとしてＥＵＢ３３８を使用したほかは、実施例１と同様に行って、微生物検体中の細菌の検出を行った。
尚、古細菌であるメタノサエタ・コンシリイのｒＲＮＡは、細菌である大腸菌のｒＲＮＡと比較して、ＥＵＢ３３８に相補的な部分で５塩基の置換が存在する。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、各微生物検体における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を、図９に示す。
【００９２】
その結果、図９から明らかなとおり、ホルムアミド濃度０−１５％において、大腸菌由来のＳＳＵ  ｒＲＮＡはほぼ１００％が２本に断片化されていたが、大腸菌とは全く配列の異なるｒＲＮＡを有するメタノサエタ・コンシリイでは、ほとんど断片化されていない。
これらのことは、ＥＵＢ３３８が細菌である大腸菌のｒＲＮＡとＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより、大腸菌に由来するｒＲＮＡが塩基配列特異的に切断されていることを示している。
このように、ＥＵＢ３３８を用いることにより、微生物検体中の細菌（大腸菌）を特異的に検出することができた。
また、大腸菌のｒＲＮＡにおいて、１５％を超えるホルムアミド濃度で反応を行った場合、断片化率が徐々に減少し、３０％を超えると急激に減少し、４５％ホルムアミド存在下では１６Ｓ  ｒＲＮＡは全く切断されなかった。
実施例５の結果とあわせて考えると、工程２において、反応溶液にホルムアミドを添加することにより、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度、すなわち特異性を調整できることが明らかとなった。
【実施例７】
【００９３】
微生物検体として大腸菌の培養液及びメタノサエタ・コンシリイの培養液を用い、それぞれから抽出したｒＲＮＡについて、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを０−５０％添加し、オリゴＤＮＡとして、ＡＲＣ９１５を使用したほかは、実施例１と同様に行って、古細菌の検出を行った。
尚、細菌である大腸菌のｒＲＮＡは、古細菌であるメタノサエタ・コンシリイのｒＲＮＡと比較して、ＡＲＣ９１５に相補的な部分で３塩基の置換が存在する。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、各微生物検体における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を、図１０に示す。
【００９４】
その結果、図１０から明らかなとおり、ホルムアミド濃度２０−３５％において、メタノサエタ・コンシリイ由来のＳＳＵ  ｒＲＮＡは高い断片化率で２本に断片化されていたが、メタノサエタ・コンシリイとは全く配列の異なるｒＲＮＡを有する大腸菌では、ほとんど断片化されていない。
これらのことは、ＡＲＣ９１５が古細菌であるメタノサエタ・コンシリイのｒＲＮＡとＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより、メタノサエタ・コンシリイに由来するｒＲＮＡが塩基配列特異的に切断されていることを示している。
このように、ＡＲＣ９１５を用いることにより、微生物検体中の古細菌（メタノサエタ・コンシリイ）を特異的に検出することができた。
【００９５】
また、メタノサエタ・コンシリイにおいて、２５％を超えるホルムアミド濃度で反応を行った場合、断片化率が徐々に減少し、３０％を超えると急激に減少し、５０％のホルムアミド存在下では１６Ｓ  ｒＲＮＡは全く切断されなかった。
実施例５の結果とあわせて考えると、工程２において、反応溶液にホルムアミドを添加することにより、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度、すなわち特異性を調整できることが明らかとなった。
【実施例８】
【００９６】
微生物検体としてメタノサエタ・コンシリイの培養液、及びメタノサルシナ・バーケリ（M．barkeri、古細菌の一種）の培養液を使用し、それぞれから抽出したｒＲＮＡについて、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを０−５０％添加し、オリゴＤＮＡとして、ＭＸ８２５を使用したほかは、実施例１と同様に行って、微生物検体中のメタノサエタ属古細菌の検出を行った。
尚、メタノサルシナ・バーケリのｒＲＮＡは、メタノサエタ属古細菌であるメタノサエタ・コンシリイのｒＲＮＡと比較して、ＭＸ８２５に相補的な部分で２塩基の置換が存在する。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、各微生物検体における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を、図１１に示す。
【００９７】
その結果、図１１から明らかなとおり、ホルムアミド濃度０−２０％において、メタノサエタ・コンシリイ由来のＳＳＵ  ｒＲＮＡは高い断片化率で２本に断片化されていたが、メタノサエタ・コンシリイとは全く配列の異なるｒＲＮＡを有するメタノサルシナ・バーケリでは、ほとんど断片化されていない。
これらのことは、ＭＸ８２５がメタノサエタ属古細菌であるメタノサエタ・コンシリイに由来するｒＲＮＡとＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより、メタノサエタ・コンシリイに由来するｒＲＮＡが塩基配列特異的に切断されていることを示している。
このように、ＭＸ８２５を用いることにより、微生物検体中の比較的近縁な古細菌の中から、メタノサエタ属古細菌（メタノサエタ・コンシリイ）を特異的に検出することができた。
【００９８】
また、メタノサエタ・コンシリイにおいて、２０％を超えるホルムアミド濃度で反応を行った場合、断片化率が徐々に減少し、２５％を超えると急激に減少し、３５％以上のホルムアミド存在下では１６Ｓ  ｒＲＮＡは全く切断されなかった。
実施例５の結果とあわせて考えると、工程２において、反応溶液にホルムアミドを添加することにより、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度、すなわち特異性を調整できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００９９】
微生物検体としてチオスリックス・ディシホルミスの培養液、及びレジオネラ・ニューモフィラ（L．pneumophila）の培養液を用い、それぞれから抽出したｒＲＮＡについて、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを０−５０％添加し、オリゴＤＮＡとして、Ｇ１２３Ｔを使用したほかは、実施例１と同様に行って、チオスリックス属細菌であるチオスリックス・ディシホルミスの検出を行った。
尚、レジオネラ・ニューモフィラのｒＲＮＡは、チオスリックス属細菌であるチオスリックス・ディシホルミスのｒＲＮＡと比較して、Ｇ１２３Ｔに相補的な部分で１塩基の置換が存在する。
アジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果、各微生物検体における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を、図１２に示す。
【０１００】
その結果、図１２から明らかなとおり、ホルムアミド濃度２５−３０％において、チオスリックス・ディシホルミス由来のＳＳＵ  ｒＲＮＡは高い断片化率で２本に断片化されていたが、チオスリックス・ディシホルミスとは全く配列の異なるｒＲＮＡを有するレジオネラ・ニューモフィラでは、ほとんど断片化されていない。
これらのことは、Ｇ１２３Ｔがチオスリックス属細菌であるチオスリックス・ディシホルミスのｒＲＮＡとＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより、チオスリックス・ディシホルミスに由来するｒＲＮＡが塩基配列特異的に切断されていることを示している。
このように、Ｇ１２３Ｔを用いることにより、微生物検体中のチオスリックス属細菌（チオスリックス・ディシホルミス）を特異的に検出することができた。
【０１０１】
また、チオスリックス・ディシホルミスにおいて、２０％を超えるホルムアミド濃度で反応を行った場合、断片化率が徐々に減少し、２５％を超えると急激に減少し、４５％以上のホルムアミド存在下ではＳＳＵ  ｒＲＮＡは全く切断されなかった。
実施例５の結果とあわせて考えると、工程２において、反応溶液にホルムアミドを添加することにより、ｒＲＮＡとオリゴＤＮＡの結合度、すなわち特異性を調整できることが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１０２】
本手法により微生物検体中の微生物量が正確に定量可能か否かを確認した。
ＥＵＢ３３８は、実施例６において、ホルムアミド濃度２５％で８５％の細菌ｒＲＮＡが分断されるが、古細菌（メタノサエタ・コンシリイ）の１６Ｓ  ｒＲＮＡは全く分断化されないことが判明している。そこで、本実施例では、微生物検体として、メタノサエタ・コンシリイと細菌である大腸菌のＲＮＡを任意の割合で混合した試料を用い、工程２の反応溶液中に核酸変性剤としてのホルムアミドを２５％添加した他は実施例６と同様にＥＵＢ３３８Ｉによる断片化作業を行い、本手法が正しく複合ＲＮＡ中の特定ＲＮＡ量を推定できるかどうかを確認した。
その結果、得られた断片化ｒＲＮＡ量（実測値）は、上記の通り細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在量の８５％を意味しているため、これを利用して、微生物検体中にもともと存在する細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在量を算出（補正計算後の値）した。得られる細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在量（補正計算後の値）と、微生物検体中の実際の細菌の含有量との関係を示したグラフを図１３に示す。
【０１０３】
図１３から、細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在量は、微生物検体中の細菌の混合割合が１００％から非常に低い％（０．５％未満：図１３中の右下のグラフ参照）まで良く符合していることがわかる。
このことから、本発明により、極めて正確に、かつ外部標準を必要とすることなく一回の反応、及び一回の電気泳動で、微生物検体中の大腸菌を迅速に定量可能であることが判明した。
【実施例１１】
【０１０４】
微生物検体として、表１に示す実際の環境サンプルを用い、オリゴＤＮＡとして、表１に示す５種類のオリゴＤＮＡを同時に使用したほかは、実施例１と同様に行って、各微生物検体中の微生物の検出と定量を行った。
Ａ下水処理場嫌気消化汚泥におけるアジレント２１００バイオアナライザを用いた電気泳動の結果を、図１４に示す。尚、図１４のレーン１〜６は、それぞれ、ＲＮＡサイズマーカー、ＵＮＩ５３０の結果、ＥＵＢ３３８の結果、ＡＲＣ９１５の結果、ＭＸ８２５の結果及び工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果を示す。
また、各微生物検体において、各オリゴＤＮＡにより断片化された大腸菌由来ＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合を、表１に示す。
【０１０５】
【表１】
2005065535.tif 000003
【０１０６】
図１４に示すように、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡは、図１４のレーン６に示すように、ＬＳＵ  ｒＲＮＡとＳＳＵ  ｒＲＮＡによってほぼ構成されている。
一方、ＵＮＩ５３０とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡは、図１４のレーン２のように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断され、レーン４及び５に比べ明確なバンドが検出されている。切断箇所はＵＮＩ５３０が標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約５００付近であるのに対応し、分断化された２種類の分子は、それぞれ約５００塩基長、及び１０００塩基長であった。このことから、Ａ下水処理場嫌気消化汚泥中には、原核生物が比較的多数含まれていることが分かった（表１の「Ａ下水処理場嫌気消化汚泥」の項参照）。
【０１０７】
また、ＥＵＢ３３８とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡも、図１４のレーン３のように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断され、レーン４及び５に比べ明確なバンドが検出されている。切断箇所はＥＵＢ３３８が標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約３５０付近であるのに対応し、分断化された２種類の分子は、それぞれ約３５０塩基長、及び１１５０塩基長であった。このことから、Ａ下水処理場嫌気消化汚泥中には、細菌が比較的多数含まれていることが分かった（表１の「Ａ下水処理場嫌気消化汚泥」の項参照）。
【０１０８】
更に、ＡＲＣ９１５とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡも、図１４のレーン４のように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断され、レーン２及び３に比べ比較的薄いバンドが検出されている。切断箇所はＡＲＣ９１５が標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約９００付近であるのに対応し、分断化された２種類の分子は、それぞれ約６００塩基長、及び９００塩基長であった。このことから、Ａ下水処理場嫌気消化汚泥中には、古細菌が少数含まれていることが分かった（表１の「Ａ下水処理場嫌気消化汚泥」の項参照）。
【０１０９】
更にまた、ＭＸ８２５とリボヌクレアーゼＨによって切断されたｒＲＮＡも、図１４のレーン５のように、ＳＳＵ  ｒＲＮＡのみが２本に分断され、レーン２及び３に比べ比較的薄いバンドが検出されている。切断箇所はＭＸ８２５が標的とするＳＳＵ  ｒＲＮＡの座位約８００付近であり、分断化された２種類の分子は、それぞれ約７００塩基長、８００塩基長であった。このことから、Ａ下水処理場嫌気消化汚泥中には、メタノサエタ属古細菌が少数含まれていることが分かった（表１の「Ａ下水処理場嫌気消化汚泥」の項参照）。
【０１１０】
尚、図１４には示さないが、Ｇ１２３ＴとリボヌクレアーゼＨによっては、ｒＲＮＡは切断されなかった（表１参照）。
Ａ下水処理場嫌気消化汚泥以外の微生物検体についても、上記したのと同様の方法により、微生物の同定及び定量を同時に行うことができた。
【０１１１】
これらの結果から明らかなように、実際の環境サンプルを対象とした場合においても、検体中の原核生物、細菌、古細菌、メタノサエタ属古細菌、チオスリックス属細菌といったような、特定のグループに属する微生物を正確に検出し、定量することができた。
【０１１２】
以上述べたように、請求項１に係る本発明の検体中の微生物の特異的検出及び／又は同定方法によれば、微生物検体からリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を抽出し、該ｒＲＮＡを、特定の微生物に由来するｒＲＮＡに対して相補的に結合してＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成できるオリゴＤＮＡ、及び、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを特異的に切断するリボヌクレアーゼと反応させた後、ｒＲＮＡを抽出し、切断されたｒＲＮＡと切断されないｒＲＮＡとを分離して、切断されたリボゾームＲＮＡをもとに特定の微生物を検出、同定及び／又は定量することにより、非常に単純な処理によって迅速かつ簡便に達成することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明によれば、これまでに長時間、高コストを必要としていた煩雑な微生物の同定、検出及び／又は定量を、非常に単純な処理によって正確に、迅速、かつ簡便に達成することが可能となる。
このため、病原性微生物や各種産業で活用される微生物など、産業界、医学界において分離、培養した微生物の検出が容易となり、また、現在様々な分野で問題となっている環境汚染、環境破壊などにおいて重要な役割を担う微生物の迅速な追跡、微生物群集構造を基とする環境診断、糞便中の微生物相からの人その他動物の健康状態の診断、廃水処理等バイオプロセスの状況診断等が容易に可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明の特異的検出、同定及び／又は定量方法の４つの工程の流れを示す説明図である。
【図２】本発明の特異的検出、同定及び／又は定量方法の工程２〜４における操作の流れの説明図である。
【図３】実施例1の電気泳動の結果を示す図である。
【図４】実施例２の電気泳動の結果を示す図である。
【図５】実施例３の電気泳動の結果を示す図である。
【図６】実施例４における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合の反応温度の推移による影響を示すグラフである。
【図７】実施例５における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を示すグラフである。
【図８】比較例１における、各オリゴＤＮＡを用いた場合の断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を示すグラフである。
【図９】実施例６における、各微生物における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を示すグラフである。
【図１０】実施例７における、各微生物における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を示すグラフである。
【図１１】実施例８における、各微生物における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を示すグラフである。
【図１２】実施例９における、各微生物における断片化されたＳＳＵ  ｒＲＮＡの全ｒＲＮＡ中に占める割合のホルムアミド濃度の推移による影響を示すグラフである。
【図１３】実施例１０における、細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡの存在量（補正計算後の値）と、微生物検体中の実際の細菌の含有量との関係を示したグラフである。
【図１４】実施例１１における電気泳動の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１１５】
図３のレーン１、２、３、４は、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果、塩基配列特異的切断サンプルの結果、酵素溶液無添加比較サンプルの結果、及びオリゴＤＮＡ無添加比較サンプルの結果を示す。
図４のレーン１〜６は、それぞれ、ＲＮＡサイズマーカー、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果、塩基配列特異的切断サンプル（上記（１）５３０プローブを添加した場合）の結果、塩基配列特異的切断サンプル（上記（２）９０７プローブを添加した場合）の結果、塩基配列特異的切断サンプル（上記（３）５３０プローブ及び９０７プローブを添加した場合）の結果、酵素溶液無添加比較サンプルの結果、及びオリゴＤＮＡ無添加比較サンプルの結果を示す。
図５のレーン１〜１２は、それぞれ、工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果、反応温度４１℃の結果，反応温度４５℃の結果，反応温度４８℃の結果，反応温度５１℃の結果，反応温度５３℃の結果，反応温度５６℃の結果，反応温度６０℃の結果，反応温度６５℃の結果、反応温度７０℃の結果、酵素溶液無添加比較サンプル（反応温度７０℃）の結果、及びオリゴＤＮＡ無添加比較サンプル（反応温度７０℃）の結果を示す。
図１４のレーン１〜６は、それぞれ、ＲＮＡサイズマーカー、ＵＮＩ５３０の結果、ＥＵＢ３３８の結果、ＡＲＣ９１５の結果、ＭＸ８２５の結果及び工程１終了時（切断前）のｒＲＮＡ抽出物の結果を示す。
【図１】
2005065535.tif 000004
【図２】
2005065535.tif 000005
【図３】
2005065535.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005065535.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2005065535.tif 000013
【図１１】
2005065535.tif 000014
【図１２】
2005065535.tif 000015
【図１３】
2005065535.tif 000016
【図１４】
2005065535.tif 000017
【配列表】
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