(57)【要約】【課題】  レーザ光源を容易に交換できるレーザ光源装置とこれを用いた共焦点顕微鏡装置を提供すること。【解決手段】  レーザ光源装置１は、波長の異なるレーザ光Ｌ１０，Ｌ２０，Ｌ３０をそれぞれ発振するレーザ光源１１，２１，３１と、レーザ光Ｌ１０，Ｌ２０，Ｌ３０から所定の波長の光をそれぞれ選択し、これらの複数のレーザ光を一つのレーザ光Ｌ１に合成する合成光学系２と、レーザ光Ｌ１を導入し、外部へ伝搬する光ファイバ５と、レーザ光源１１，２１，３１および所定の波長の光を選択するダイクロイックミラー１４，２４，３４を１対毎に保持し、連結部によって相互に着脱可能なベース部材１０，２０，３０とを備えている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、
前記レーザ光源が発振するレーザ光から所定の波長の光を選択する波長選択光学素子と、
前記レーザ光源および波長選択光学素子の１対を保持するベース部材と、
前記ベース部材に設けられ、他のレーザ光源および波長選択光学素子の１対を保持するベース部材と着脱可能に連結する連結部とを備えたことを特徴とするレーザ光源ユニット。
【請求項２】
波長の異なる複数のレーザ光をそれぞれ発振する複数台のレーザ光源と、
前記複数台のレーザ光源から出射される所定の波長の光を各波長選択光学素子でそれぞれ選択し、その選択された波長をもつ複数のレーザ光を一つに合成する合成光学系と、
前記一つに合成されたレーザ光を導入し、外部へ伝搬する光ファイバと、
前記レーザ光源および前記波長選択光学素子を１対毎に保持し、連結部によって相互に着脱可能な複数のベース部材とを備えたことを特徴とするレーザ光源装置。
【請求項３】
請求項２に記載のレーザ光源装置において、
前記複数のベース部材は、前記光ファイバのレーザ光導入口を基準として、発振波長の最も短いレーザ光源を保持するベース部材が前記レーザ光導入口に最も近く配置され、発振波長の短い順に連結されることを特徴とするレーザ光源装置。
【請求項４】
請求項２または３に記載のレーザ光源装置において、
前記複数の波長選択光学素子は、それぞれ前記選択された波長をもつ複数のレーザ光を反射するとともに、前記選択された波長付近より長い波長のレーザ光を透過するダイクロイックミラーであることを特徴とするレーザ光源装置。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のレーザ光源装置と、
前記レーザ光源装置の光ファイバを介して前記一つに合成されたレーザ光を導入し、レーザ光を励起光として標本に照射する照明光学系と、
前記標本に対して多重励起蛍光観察が可能な検出光学系とを備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡装置に用いられるレーザ光源装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、光学顕微鏡の中でも、横分解能が高いだけではなく、縦分解能も高い走査型共焦点顕微鏡が注目されている。走査型共焦点顕微鏡では、レーザ光源からのレーザ光は、照明光学系に導かれ、励起光として対物レンズを介して標本上に結像する。標本上のスポット光は、２次元的に走査されることによって観察像として観察される。標本上にレーザ光が照射されると、標本の光学的な特性によって反射、吸収、蛍光、散乱などが生じる。
【０００３】
最近では、複数の蛍光試薬で染色した生物標本に、複数の波長のレーザ光を同時に照射して観察する多重励起観察が行われている。従来技術では、光源部は、波長の異なる複数のレーザ光源をベース部に載置し、ダイクロイックミラーを用いて各レーザ光の波長を選択し、光軸を一つに合わせた後に、光ファイバに入射させている。（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２２１６６３号公報（第３頁、図２）
【０００５】
生物標本の様々な組織を比較観察するためには、観察目的に応じて適切なレーザ光の波長を選択しなければならない。しかし、顕微鏡装置における光源部のスペースは限られている。従来は、様々な発振波長をもつ各種のレーザ光源の中から代表的なレーザ光源を例えば３種類選び、ベース部に取り付けて使用していた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、従来は、代表的な波長のレーザ光源のみを設置していた為に、最も励起効率が高い波長の光で試料を照射することができない場合があり、常に蛍光強度の大きな蛍光が得られないという問題があった。本発明は、使用する蛍光試薬に応じてレーザ光を照射できるレーザ光源装置とこれを用いた共焦点顕微鏡装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（１）請求項１のレーザ光源ユニットは、レーザ光源と、レーザ光源が発振するレーザ光から所定の波長の光を選択する波長選択光学素子と、レーザ光源および波長選択光学素子の１対を保持するベース部材と、ベース部材に設けられ、他のレーザ光源および波長選択光学素子の１対を保持するベース部材と着脱可能に連結する連結部とを備えたことを特徴とする。
【０００８】
（２）請求項２のレーザ光源装置は、波長の異なる複数のレーザ光をそれぞれ発振する複数台のレーザ光源と、複数台のレーザ光源から出射される所定の波長の光を各波長選択光学素子でそれぞれ選択し、その選択された波長をもつ複数のレーザ光を一つに合成する合成光学系と、一つに合成されたレーザ光を導入し、外部へ伝搬する光ファイバと、レーザ光源および波長選択光学素子を１対毎に保持し、連結部によって相互に着脱可能な複数のベース部材とを備えたことを特徴とする。
上記のレーザ光源装置の複数のベース部材は、光ファイバのレーザ光導入口を基準として、発振波長の最も短いレーザ光源を保持するベース部材がレーザ光導入口に最も近く配置され、発振波長の短い順に連結されることが好ましい。
また、複数の波長選択光学素子は、それぞれ選択された波長をもつ複数のレーザ光を反射するとともに、その選択された波長付近より長い波長のレーザ光を透過するダイクロイックミラーであることが好ましい。
【０００９】
（３）請求項５の共焦点顕微鏡装置は、上記のレーザ光源装置と、レーザ光源装置の光ファイバを介してレーザ光を導入する照明光学系と、標本に対して多重励起蛍光観察が可能な検出光学系とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、レーザ光源とこれに適した光学素子を一対毎にベース部材に載置するので、使用する蛍光試薬に適する発振波長をもつレーザ光源を容易に交換でき、高強度の蛍光を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明によるレーザ光源装置と共焦点顕微鏡装置について、図１〜４を参照しながら説明する。図１〜４において、同じ構成部品には同一符号を付す。
図１は、本発明の実施の形態による共焦点顕微鏡装置の全体構成を示す構成図である。本実施の形態の共焦点顕微鏡装置は、レーザ光源装置１と走査型共焦点顕微鏡１００から構成される。なお、図１は、レーザ光源装置１を拡大した状態で模式的に示すものである。
【００１２】
−レーザ光源装置−
レーザ光源装置１は、レーザ光源１１，２１，３１（発振波長が短い順）と、合成光学系２と、ベース板３と、シングルモード光ファイバ５とから構成される。３台のレーザ光源１１，２１，３１は、それぞれ３枚のベース板１０，２０，３０に載置されている。合成光学系２は、シャッタ１２，２２，３２と、ＮＤフィルタ１３，２３，３３と、ダイクロイックミラー１４，２４，３４と、ファイバカプラ４とから構成される。シャッタ１２、ＮＤフィルタ１３、ダイクロイックミラー１４は、ベース板１０に載置されている。同様に、シャッタ２２、ＮＤフィルタ２３、ダイクロイックミラー２４は、ベース板２０に載置され、シャッタ３２、ＮＤフィルタ３３、ダイクロイックミラー３４は、ベース板３０に載置されている。ファイバカプラ４は、ベース板３に載置され、シングルモード光ファイバ５と接続されている。
【００１３】
図１に示されるベース板１０，２０の構造を図２を参照して説明する。
図２は、図１に示す個々のレーザ光源を載置するベース部の構造を示す模式図である。図２（ａ）は、ベース板１０および２０の上面図、図２（ｂ）は、その側面図である。ベース板１０には、側面に２つのピン１０ａが植設され、対向する側面に２つの穴部１０ｂが形成されており、ベース板２０にも、側面に２つのピン２０ａが植設され、対向する側面に２つの穴部２０ｂが形成されている。２つのピン１０ａの間隔と２つの穴部１０ｂの間隔は同一である。また、ベース板１０，２０には貫通穴（不図示）が形成されている。
【００１４】
保持部１６は、図２（ｂ）で紙面の垂直方向に延在する２本のレール１６ａと、２本のレール１６ａを平行に支持する支持部材１６ｂと、２本のレール１６ａの下面に設けられた弾性部材１６ｃとから成る。ボルト１５は、各ベース板をレール１６ａに固定するために用いられる。
【００１５】
ベース板１０と２０を連結するときは、ベース板１０と２０をレール１６ａ上に載置し、ベース板２０のピン２０ａをベース板１０の穴部１０ｂに嵌合させ、ボルト１５を貫通穴に通してベース板１０と２０をレール１６ａに固定する。反対に、ベース板１０と２０を分離するときは、ボルト１５を外し、ピン２０ａを穴部１０ｂから引き抜く。このように連結作業、分離作業が容易である。
【００１６】
各ベース板は、総て２つのピンの間隔と２つの穴部の間隔とが同一であるから、総てのベース板は相互に連結することができる。また、ピンと穴部との連結は、位置決めも兼ねているので、連結作業後の光学調整は不要となる。なお、図示は省略したが、ファイバカプラ４が載置されるベース板３にも、２つの穴部が同一間隔で形成されており、レーザ光源が載置される各々のベース板の２つのピンと嵌合させることができるようになっている。
【００１７】
再び図１を参照すると、レーザ光源１１から放射したレーザ光Ｌ１０は、光路を開いたシャッタ１２、光量を調整するＮＤフィルタ１３を経てダイクロイックミラー１４に入射する。ダイクロイックミラー１４は、レーザ光Ｌ１０の発振波長中で、通常、発振強度の高い中心波長付近の光を選択して図面上で右方へ反射させ、ファイバカプラ４へ導く。このとき、ダイクロイックミラー１４は、中心波長付近の光よりも長波長側の光を図面上で上方へ透過させる。
【００１８】
同様に、レーザ光源２１から放射したレーザ光Ｌ２０は、シャッタ２２、ＮＤフィルタ２３を経てダイクロイックミラー２４に入射する。レーザ光Ｌ２０の選択された波長付近の光は、ダイクロイックミラー２４により右方へ反射し、ダイクロイックミラー１４を透過してファイバカプラ４へ入射し、レーザ光Ｌ２０の選択波長付近よりも長波長側の光は、上方へ透過する。
【００１９】
レーザ光源３１から放射したレーザ光Ｌ３０は、シャッタ３２、ＮＤフィルタ３３を経てダイクロイックミラー３４に入射する。レーザ光Ｌ３０の選択された波長付近の光は、ダイクロイックミラー３４により右方へ反射し、ダイクロイックミラー２４、１４を順次透過してファイバカプラ４へ入射する。レーザ光Ｌ３０の選択波長付近よりも長波長側の光は、上方へ透過する。但し、ダイクロイックミラー３４は、最も長波長側（図中、左端）に位置しており、光透過性は必須ではないので、全反射ミラーに置き換えてもよい。
【００２０】
このようにして波長選択されたレーザ光Ｌ１０，Ｌ２０，Ｌ３０は、１本のビームとなり、レーザ光Ｌ１としてファイバカプラ４へ入射し、集光レンズ４ａで集光された後に、シングルモード光ファイバ５に入射する。波長選択されたレーザ光Ｌ１０，Ｌ２０，Ｌ３０は、それぞれダイクロイックミラー１４，２４，３４の位置と角度を変えることにより、同一軸上になるように調整することができる。
【００２１】
図３は、ベース板に載置された各種のレーザ光源を例示する模式図である。図示のように、各レーザ光源、各ダイクロイックミラー等は、各ベース板に載置されており、各レーザ光源は、発振波長によって寸法や形状が様々である。各ダイクロイックミラーも、それぞれ固有の分光特性を有している。
【００２２】
レーザ光源５１は、中心波長が４０５ｎｍのレーザ光Ｌ５０を出力するＶｉｏｌｅｔ−ＬＤである。同様に、レーザ光源６１はＤＰＳＳレーザ（Ｌ６０：４３０ｎｍ）、レーザ光源１１は空冷Ａｒレーザレーザ（Ｌ１０：４８８ｎｍと５１４ｎｍ）、レーザ光源２１はＧ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（Ｌ２０：５４３ｎｍ）、レーザ光源３１はＹ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（Ｌ３０：５９４ｎｍ）、レーザ光源４１はＲ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ（Ｌ４０：６３３ｎｍ）である。
【００２３】
−走査型共焦点顕微鏡−
図１に示されるように、走査型共焦点顕微鏡１００は、落射型蛍光顕微鏡の構成であり、照明光学系１１０と検出光学系１２０を備えている。照明光学系１１０は、シングルモード光ファイバ５によりレーザ光源装置１と接続されている。照明光学系１１０は、レーザ光Ｌ１の光路に沿って、ビームエキスパンダ１１１、ビームスプリッタ１１２、光走査部１１３、走査レンズ１１４、リレーレンズ１１６、対物レンズ１１８の順に配設されている。光走査部１１３には、後に図４で説明する一対の可動式全反射ミラー１１３ａ，１１３ｂが設けられている。
【００２４】
検出光学系１２０は、生物標本Ｓからの光に沿って、対物レンズ１１８、リレーレンズ１１６、走査レンズ１１４、光走査部１１３、ビームスプリッタ１１２、光検出レンズ１１９、ピンホール付き遮光板１２１、マルチモード光ファイバ１２２、光検出器１３０の順に配設されている。光検出器１３０は、コリメータレンズ１３１、ダイクロイックミラー１３２、バリアフィルタ１３３，１３４、光検出素子１３５，１３６を備えている。また、光検出器１３０は、画像処理部１４０に電気的に接続されている。
【００２５】
以下、図４を参照しながら照明光学系１１０と検出光学系１２０を詳細に説明する。
図４は、本発明の実施の形態による走査型共焦点顕微鏡の光学系を説明するための図である。レーザ光源装置１からのレーザ光Ｌ１は、シングルモード光ファイバ５によりビームエキスパンダ１１１に入射する。レーザ光Ｌ１は、前述したように複数の波長の光を含む１本のビームである。レーザ光Ｌ１は、ビームエキスパンダ１１１により所望のビーム径に拡大され、光走査部１１３に入る。レーザ光Ｌ１は、全反射ミラー１１３ａ，１１３ｂを連動して傾き角度を変えることにより、光軸と直交する２方向に２次元的に走査され、走査レンズ１１４によって一次像面１１５に結像した後に、リレーレンズ１１６、ミラー１１７、対物レンズ１１８を経て、生物標本Ｓ上で点像として結像する。この点像は、対物レンズ１１８のＮＡで決まる大きさに集光されているので、この点における生物標本Ｓの光学的な特性により、反射、吸収、蛍光発生、散乱などの現象が照射領域で生ずる。なお、ミラー１１７は、単にレーザ光Ｌ１の方向を変えるだけなので必須のものではない。
【００２６】
生物標本Ｓからの蛍光や反射光は、対物レンズ１１８、ミラー１１７を経て、リレーレンズ１１６によって一次像面１１５に結像した後に、走査レンズ１１４によって平行光とされて光走査部１１３に入る。生物標本Ｓからの蛍光は、光走査部１１３によって走査されることにより、すなわちデスキャンされることにより、照明光として入射したレーザ光Ｌ１と同一の光路に常に戻されることになる。
【００２７】
光走査部１１３からビームスプリッタ１１２に入射した蛍光は、ビームスプリッタ１１２で反射され、光検出レンズ１１９によって遮光板１２１上に集光される。遮光板１２１には、ピンホール１２１ａが形成されており、遮光板１２１と生物標本Ｓとは共役な位置関係にあるので、生物標本Ｓ上の蛍光出射点の像がピンホール１２１ａの位置に形成され、ピンホール１２１ａを通過した光のみがマルチモード光ファイバ１２２を介して光検出器１３０に到達する。生物標本Ｓ上の他の点から発生した光があったとしても、遮光板１２１で遮られて光検出器１３０には到達しない。その結果、走査型共焦点顕微鏡においては、横分解能が高いだけではなく、縦分解能も高い標本観察が可能となる。
【００２８】
光検出器１３０に到達した蛍光は、コリメータレンズ１３１を介してダイクロイックミラー１３２に入射し、２種類の波長の蛍光に分離され、それぞれバリアフィルタ１３３，１３４に入射し、光検出素子１３５，１３６によって検出される。図４では、２組のバリアフィルタと光検出素子が示されているが、検出したい波長の種類に応じて３組以上備えることができる。
【００２９】
以下、図５〜７を参照しながら、本実施の形態の共焦点顕微鏡装置の使用方法、特にレーザ光源の交換作業について説明する。図５,６においては、図１,３と同じ構成部品には同一符号を付し、説明を省略する。
【００３０】
図５は、図３に示した６種類のレーザ光源をそれぞれ載置するベース板を右から左へレーザ光源の発振波長が短い順に並べて構成されたレーザ光源装置の構成図である。この場合、多種類のレーザ光源を装備しているので、生物標本Ｓを染色する蛍光試薬の種類が多くともそれに応じた多重励起観察が可能である。反面、選択された蛍光試薬の励起に関与しないレーザ光源も装備されたままなので、レーザ光源装置は大型となってしまう。従って、蛍光発生に必要なレーザ光源だけを装備するようにすれば、レーザ光源装置のコンパクト化が実現できる。
【００３１】
図６は、３種類のレーザ光源をそれぞれ載置するベース板を右から左へレーザ光源の発振波長が短い順に並べて構成されたレーザ光源装置の構成図である。
図６（ａ）に示されるように、レーザ光源装置１には、空冷Ａｒレーザ１１（４８８ｎｍと５１４ｎｍ）とＧ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ２１（５４３ｎｍ）とＹ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ３１（５９４ｎｍ）が既に取り付けられている。レーザ光源ユニットの取り付け手順としては、ピンと穴部の嵌合により、ベース板３にベース板１０を、ベース板１０にベース板２０を、ベース板２０にベース板３０を順次装着すればよい。
【００３２】
今、生物標本Ｓを染色する蛍光試薬としてAcridine Orangeが選択された場合、図７に示されるような励起・蛍光スペクトル図となる。励起スペクトル曲線については、左縦軸の吸収が用いられ、蛍光スペクトル曲線については、右縦軸の蛍光強度が用いられる。励起スペクトル曲線の吸収量が大きい程、励起効率が高いことを表している。
【００３３】
Acridine Orangeを蛍光試薬として用いると、励起効率は、波長４３０ｎｍ近傍で最大となる。しかし、空冷Ａｒレーザ１１、Ｇ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ２１、Ｙ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ３１の組み合わせ（図６（ａ））では、この中で最も短波長である空冷Ａｒレーザ１１の発振波長４８８ｎｍによる励起となり、励起効率は非常に低い。励起効率が低い場合は、より明るい蛍光を発生させるために、レーザ光の出力を上げなければならないが、高強度のレーザ光を生物標本Ｓに照射することは、生物標本Ｓにダメージ（退色）を与えることになり、正確な観察の妨げとなる。
【００３４】
従って、励起効率の観点から、ＤＰＳＳレーザ６１（４３０ｎｍ）を使用するのが望ましい。例えば、図６（ｂ）に示されるように、ＤＰＳＳレーザ６１、空冷Ａｒレーザ１１、Ｇ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ２１の組み合わせを選択した場合、レーザ光源の交換が必要になる。交換後の配置は、ファイバカプラ４から近い順にＤＰＳＳレーザ６１、空冷Ａｒレーザ１１、Ｇ／Ｈｅ−Ｎｅレーザ２１となる。
このように、使用する蛍光試薬の励起波長に合わせて必要な波長のレーザ光源のみを観察時に設置できるので、レーザ光源装置の占めるスペースを小さくすることができる。
【００３５】
図６（ａ）から図６（ｂ）のようにレーザ光源ユニットを交換する手順としては、（１）ベース板３０を取り外し、（２）ベース板１０と２０を左側にずらし、（３）ベース板１０と３とのスペースにベース板６０を装着する。このように、レーザ光源の交換作業は容易である。
ベース板同士の連結は、前述したピンと穴部との嵌合によって行われるので、３本のレーザ光Ｌ６０，Ｌ１０，Ｌ２０は光軸が合った１本のレーザ光Ｌ１となり、ファイバカプラ４を経てシングルモード光ファイバ５へ入射する。従って、位置決め、光軸調整は不要となる。もちろん、ベース板同士の連結にピンと穴部との嵌合を用いなくとも、光軸がずれない連結方法であれば別の方法でもよい。例えば、各ベース板の位置決めをするための位置決め部材をレールに設け、各ベース板同士の位置関係を決定するように構成してもよい。
【００３６】
本実施の形態では、ファイバカプラ４の近くに発振波長が短いレーザ光源を配置し、発振波長が短い順に配列したレーザ光源装置について説明したが、必ずしも発振波長が短い順に配置しなくともよい。例えば、選択される波長λ１、λ２、λ３（但し、λ１＜λ２＜λ３）の３つのレーザ光源ユニットがあり、ファイバカプラ４の近くからλ２、λ１、λ３の順に配置された場合、ダイクロイックミラーの分光特性を次のように設定すればよい。すなわち、選択波長λ２のレーザ光源ユニットのダイクロイックミラーは、選択波長λ２付近の光を反射し、選択波長λ２付近より長い波長の光と短い波長の光の両者を透過するように設定される。
【００３７】
また、本実施の形態では、走査型共焦点顕微鏡１００を落射型顕微鏡の構成とし、蛍光観察について説明したが、本実施の形態は、反射像の観察や散乱光の検出にも適用できる。さらに、落射型顕微鏡の構成の代わりに透過型顕微鏡の構成とすれば、蛍光観察や散乱光の検出に加えて透過光量の吸収を加味した透過像観察にも適用できる。生物標本による反射、透過、吸収、蛍光、散乱などは、照射光の波長に依存する性質をもっている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の実施の形態に係る共焦点顕微鏡の全体構成を示す構成図である。
【図２】図１に示す個々のレーザ光源を載置するベース板の構造を示す図である。
【図３】ベース板に載置された各種のレーザ光源を例示する模式図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る走査型共焦点顕微鏡の光学系を説明する図である。
【図５】６種類のレーザ光源を配置した場合のレーザ光源装置の構成図である。
【図６】３種類のレーザ光源を配置した場合のレーザ光源装置の構成図である。
【図７】蛍光試薬Acridine Orangeに対する励起・蛍光スペクトル図である。
【符号の説明】
【００３９】
１：レーザ光源装置
２：合成光学系
３，１０，２０，３０，４０，５０，６０：ベース板
４：ファイバカプラ
５：シングルモードファイバ
１０，２０，３０，４０，５０，６０：レーザ光源
１４，２４，３４，４４，５４，６４：ダイクロイックミラー
１００：走査型共焦点顕微鏡
１１０：照明光学系
１２０：検出光学系
Ｓ：生物標本
Ｌ１，Ｌ１０，Ｌ２０，Ｌ３０，Ｌ４０，Ｌ５０，Ｌ６０：レーザ光
【図１】
2005085885.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2005085885.tif 000006
【図５】
2005085885.tif 000007
【図６】
2005085885.tif 000008
【図７】
2005085885.tif 000009