(57)【要約】【課題】迅速でかつ簡易にヒスタミンを検出できるヒスタミンの検出方法を提供する。【解決手段】ヒスタミン含有可能性のある試料液と２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとを、ｐＨ８以下で反応させる反応工程と、前記反応工程により生じる呈色に基づいて前記ヒスタミンを検出する工程と、を備えるようにする。この方法によれば、可視領域において高い発色を得ることができ、ヒスタミンを簡易かつ迅速に検出できる。【選択図】  図１
2005331381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミンの検出方法であって、
ヒスタミン含有可能性のある試料液と２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとを、ｐＨ８以下で反応させる反応工程と、
前記反応工程により生じる呈色に基づいて前記ヒスタミンを検出する工程と、
を備える、方法。
【請求項２】
前記検出工程における検出波長は、６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応工程に先立ってヒスタミンを保持可能な担体に前記試料液を供給する工程を備える、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応工程は、前記担体上において前記ヒスタミンと２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとを反応させる工程である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料液は、魚肉浸出液または魚肉抽出液である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒスタミン検出キットであって、
２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有する試薬と、
ヒスタミンを保持可能な担体を備える反応場提供部材と、
を備える、キット。
【請求項７】
前記反応場提供部材は前記担体が収容されたカラムである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記反応場提供部材は前記担体を少なくともその一端側に有するとともに把持可能な形態を備える、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
前記反応場提供部材は食品の包装容器の一部であって食品とは隔離された食品からの浸出液の吸収体である、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記試薬は前記担体の少なくとも一部に予め付与されている、請求項６〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有するヒスタミン検出試薬。
【請求項１２】
食品の衛生管理方法であって、
前記食品の原料の採取から消費に至る過程のいずれかの工程において得られる原料もしくは食品の浸出液または抽出液を、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとｐＨ８以下で反応させる反応工程と、
該反応工程により生じる呈色に基づいてヒスタミンを検出する検出工程と、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスタミン検出方法およびヒスタミン検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品に起因する食中毒などの感染症の発生を予防等する観点から食品の安全性が重要視されるようになってきている。食品に起因して発生する食中毒の一種にヒスタミン中毒を挙げることができる。ヒスタミンは、ヒスチジン脱炭酸酵素を有する細菌（主としてＭｏｒｇａｎｅｌｌａ菌）の作用で遊離ヒスチジンから生成されることが知られている。特に、マグロ、サバなどの赤身魚は、ヒスタミンの前駆物質であるヒスチジン含有量が高いため、本菌などで汚染された魚肉中には多量にヒスタミンが蓄積されることがある。このような汚染魚肉を摂取することで、一過性の中毒が発生する。この食中毒をアレルギー様食中毒（またはヒスタミン中毒）と呼んでいる。本中毒の発生状況は多くはないものの、一過性ゆえ未報告事例の存在が推定され、その実体は多いと推定される。
【０００３】
また、ヒスタミンは水溶性であるとともに、熱にも比較的安定であるため、通常の調理過程では分解除去できない。このため、本中毒を予防するには、ヒスタミン含量のモニタリングが最も効果的である。さらに、ＨＡＣＣＰ衛生管理システムにおいても、ヒスタミンは規制項目に挙げられている場合がある。
【０００４】
現在、食品中のヒスタミンを測定する方法としては、酵素反応を用いて行う方法がある（特許文献１、特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−１５７５９７号公報
【特許文献２】特開平２００３−６１６５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、酵素反応を用いる測定方法は、反応時の温度管理やｐＨが重要であるとともに前処理が煩雑である。また、特殊な検出装置や検出試薬を必要とする。したがってこれらの手法では、原料たる水産品の漁獲時、流通時、あるいは加工品製造工程、ひいてはレストランなどの調理工程などにおいてヒスタミン含量を測定することは操作上および時間的に困難であった。以上のことから、簡易かつ迅速にヒスタミンを測定し、ヒスタミンに関して食品の安全および品質管理をすることが求められていた。
【０００７】
そこで、本発明は、迅速でかつ簡易にヒスタミンを検出できるヒスタミンの検出方法、ヒスタミンの検出キットを提供することを一つの目的とする。また、本発明は、迅速でかつ簡易に原料あるいは加工品中のヒスタミン含量を管理しながら水産加工品等の食品を製造することができる食品の衛生管理方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ヒスタミンの検出方法について呈色反応を検討したところ、従来、ヒスタミンと反応して蛍光物質を生成する化合物を当該蛍光物質を生成しない条件下でヒスタミンと反応させると、可視領域において高い発色を呈することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００９】
本発明の一つの形態によれば、ヒスタミンの検出方法であって、ヒスタミン含有可能性のある試料液と２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとを、ｐＨ８以下で反応させる反応工程と、前記反応工程により生じる呈色に基づいて前記ヒスタミンを検出する工程と、を備える、方法が提供される。この形態においては、前記検出工程における検出波長は、６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下であることが好ましい態様である。また、前記反応工程に先立ってヒスタミンを保持可能な担体に前記試料液を供給する工程を備えることが好ましい態様である。さらにこの態様においては、前記反応工程は、前記担体上において前記ヒスタミンと２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとを反応させる工程であることが好ましい。さらに上記いずれかの方法において、前記試料液は、魚肉浸出液または魚肉抽出液であることが好ましい態様である。
【００１０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、ヒスタミン検出キットであって、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有する試薬と、ヒスタミンを保持可能な担体を備える反応場提供部材と、を備える、キットが提供される。この形態において、前記反応場提供部材は前記担体が収容されたカラムであることが好ましい態様であり、また、前記反応場提供部材は前記担体を少なくともその一端側に有するとともに把持可能な形態を備えることも好ましい態様であり、前記反応場提供部材は食品の包装容器の一部であって食品とは隔離された食品からの浸出液の吸収体であることも好ましい態様である。これらのいずれかのキットにおいて、前記試薬は前記担体の少なくとも一部に予め付与されていることが好ましい態様である。
【００１１】
さらにまた、本発明の他の一つの形態によれば、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有するヒスタミン検出試薬が提供される。
【００１２】
さらに、本発明の他の一つの形態によれば、食品の衛生管理方法であって、前記食品の原料の採取から消費に至る過程のいずれかの工程において得られる原料もしくは食品の浸出液または抽出液を、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとｐＨ８以下で反応させる反応工程と、該反応工程により生じる呈色に基づいてヒスタミンを検出する検出工程と、を備える、方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のヒスタミンの検出方法は、ヒスタミン含有可能性のある試料液と２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとを、ｐＨ８以下で反応させる反応工程と、前記反応工程により生じる呈色に基づいて前記ヒスタミンを検出する工程とを備えている。この方法においてヒスタミンと２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとのｐＨ８以下での呈色反応は、従来全く知られていなかった。２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドは、ｐＨ１０以上でかつシアンイオン（ＣＮ−）の存在下で第１級アミン化合物と反応して蛍光物質を生成することが知られている（Ｂ．Ｋ．Ｍａｔｕｓｚｅｗｓｋｉ、Ｒ．Ｓ．Ｇｉｖｅｎｓ，Ｋ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｃｈａｒ，Ｒ．Ｇ．Ｃａｒｌｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５９（１９８７））。しかしながら、シアンイオンの不存在下でかつｐＨが１０未満でいかなるアミン類といかなる反応が生じるかは知られておらず、しかもヒスタミンが高い選択性でこの化合物と反応して高い発色性を有する化合物を生成することは全く予想されていなかった。
【００１４】
この新たな呈色反応に基づく本検出方法によれば、従来酵素反応を主体として検出されていたヒスタミンを簡易にかつ迅速に検出することができる。また、この呈色反応は極めて速やかにかつ安定的に進行し、例えば、シリカゲルなどの担体上においても安定して進行する。このため、ヒスタミンが保持されるような担体上にて呈色反応を生じさせることで、一層簡易にヒスタミンを検出することができる。
【００１５】
また、本発明のヒスタミン検出キットは、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有する試薬と、ヒスタミンを保持可能な担体を有する反応場提供部材と、を備えている。本キットは、ヒスタミンを保持可能な担体を有するため、この担体にヒスタミンを保持した状態で上記した呈色反応を担体上で生じさせることができる。このため、簡易にヒスタミンを検出できるキットが提供される。また、このキットによれば、使用する器具や装置を少なくできるため、食品の原料採取から提供までのいずれの工程においても容易にヒスタミン検出工程を実施することができる。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、ヒスタミン検出方法について説明するとともに、ヒスタミン検出キット、および食品衛生管理方法について説明する。なお、以下、本明細書において、特に断りのない限り、「％」は重量％を示し、「部」は重量部を意味するものとする。
【００１７】
（ヒスタミン検出方法）
ヒスタミンの検出方法について、図１に例示する検出工程の一例を参照しながら説明する。
（検査対象）
本発明方法は、ヒスタミン含有可能性のある検体を検査対象とする。したがって、食品のほか、ヒトを含む動物の血清や尿などの採取物や、ヒスタミン関連医薬スクリーニングサンプルなどを対象とすることができる。本発明の好ましい検査対象の一つは、ヒスタミン含有可能性の高い食品であり、例えば、肉類およびその加工品、魚介類およびその加工品、各種発酵食品を挙げることができる。肉類およびその加工品としては、鶏肉、豚肉およびこれらの缶詰、調理品および半調理品を含み、魚介類およびその加工品としては、マグロ、サンマ、カツオ、アジ、サバ、カジキ、トビウオなどの赤身魚を含む魚類、およびこれらの缶詰、干物などの半調理品や調理品を含み、発酵食品としては、みそ、しょうゆ、ワインを含んでいる。
【００１８】
（試料液およびその調製工程）（ステップＳ１０）
検査対象を本検出方法の試料液としては、検査対象の種類に応じ、検査対象をそのまま用いることもできるし、その浸出液を用いることもできるし、適当な抽出方法を採用した上での抽出液とすることもできる。浸出液とは、例えば、食品の場合、解凍や保存に伴って肉、魚介類から浸出する浸出液の他、肉類や魚介類を、必要に応じて粉砕後、固液分離して得られる液体画分であってもよい。また、抽出液とは、検査対象、その粉砕物、その浸出液を原料として適当な溶媒で抽出した抽出液とすることができる。
【００１９】
なお、食品を検査対象とする場合、本検出方法の試料調製に用いる部分は、全体であっても一部であってもよい。例えば、生の魚類の場合には、ヒスタミンの前駆体であるヒスチジンの主たる含有部位である魚肉部分（好ましくは血合肉でなく普通肉）を対象とすることが好ましく、魚肉缶詰などの場合には、内容物全量を対象とすることが好ましい。
【００２０】
抽出液を調製する場合、溶媒はヒスタミンに対して溶解性があればよく、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトニトリル、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）あるいは水とこれらの有機溶媒の１種あるいは２種以上との混液などを用いることができる。好ましくは、メタノール、ＴＣＡ水溶液を用いることができる。なお、みそ、しょうゆ、ワインなどの着色した食品については、エタノール、イソプロパノールなどのアルコールを用いることが好ましい。アルコールを用いたこれらの食品の抽出液は、シリカ系担体などの担体を呈色反応場として用いた場合、効果的に着色成分を担体から溶出させることができる。
【００２１】
（呈色反応に対する前処理工程）（ステップＳ２０）
こうした抽出溶媒による抽出液や浸出液などの試料液は、呈色反応に適した液性を有し呈色反応の障害になるような夾雑物を含まない場合には、そのまま呈色反応に用いることができるが、そうでない場合には、前処理によって呈色反応に適した液性とされるのが好ましい。本方法における呈色反応は、水性媒体であってｐＨが１０未満（好ましくは３以上８以下）で行われることが好ましい。このため、呈色反応に先立って、試料液自体がこのような液性を有するように調製されていることが好ましい。こうすることで、試薬と接触させることのみで呈色反応を速やかに行うことができる。なお、試料液のｐＨは、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液を用いるほか、塩酸などの無機酸や有機酸、水酸化ナトリウムなどのアルカリなどを用いて行うことができる。
【００２２】
浸出液や抽出液中のヒスタミンを水性媒体へ抽出するには、例えば、適当な担体を充てんしたカラムや担体を装着したフィルターを用いて行うことができる他、各種溶媒を用いた溶解性の相違に基づく抽出操作を用いることによって行うことができる。例えば、浸出液あるいは抽出液を、適当な担体に供給してこれらの液中のヒスタミンを担体に吸着あるいは保持させた上、適当な洗浄溶媒で担体を洗浄して、その後、担体にヒスタミンを溶出させる溶出溶媒を供給してヒスタミンを溶出させ、該溶出液を試料液とすることができる。抽出液を担体に供給するにあたっては、担体の種類にもよるが、酸性担体を用いる場合には、抽出液を中性〜アルカリに調整しておくことが好ましい。
【００２３】
かかる担体としては、特に限定しないで、セルロース、レーヨン、ビニロン、ポリエステル、ナイロン、アクリルなど各種の有機高分子のほか、シリカなどの無機高分子を用いることができる。ヒスタミンがアミノ基を有していることから、カルボン酸基やスルホン酸基などを有する陽イオン交換樹脂のほかシリカなどの酸性担体を用いるとヒスタミンを容易に保持可能であるため好ましい。また、担体の形態は特に問わないで、繊維状、粒状、シート状等各種の形態のものを使用することができる。担体に対して抽出液を供給しやすいような形態の支持体に保持されていることが好ましい。粒状、繊維状、シート状等のいずれの形態の担体にも適用できる支持体はカラムである。なお、担体を充てんするカラムは、好ましくは外部から内部が視認可能な透過性を有している。また、シート状の形態の担体は、そのまま帯状等の各種の形態の試験紙として用いることもできるし、周縁の少なくとも一部を支持するフレームを有する支持体等に保持させることもできる。
【００２４】
夾雑物を除去するには、抽出液等が供給された後の担体を水やリン酸緩衝液（０．２Ｍ程度、ｐＨ６〜ｐＨ７程度）などで洗浄することができる。また、担体からヒスタミンの溶出させる際の溶出液としては、塩酸水溶液などを用いることができる。この方法によれば、呈色反応に先立って夾雑物を除去するとともにヒスタミンを濃縮（精製）しておくこともできる。なお、こうしてヒスタミンを保持させた担体からヒスタミンを溶出させることなく、そのまま反応場として用いることでもきる。この場合、反応工程の一部としてこれらの操作工程を実施することができる。これについては後段で詳述する。
【００２５】
（呈色反応工程）（ステップＳ３０）
（検出試薬）
本方法において用いる検出試薬は、呈色反応物質として２，３−ナフタレンジアルデヒドを含有している。なお、２，３−ナフタレンジアルデヒドの誘導体あるいは類縁物質であって、ヒスタミンと反応して２，３−ナフタレンジアルデヒドと同等以上の発色を呈するものも使用することができる。呈色試薬は、２，３−ナフタレンジアルデヒドと、これを溶解するアセトニトリル、メタノール等の溶媒とを含有している。また、２，３−ナフタレンジアルデヒドの濃度は特に限定しないが、１ｍＭ程度であれば、０．０１ｍＭ以上のヒスタミン濃度に対応して良好な発色を呈する。なお、本検出試薬は、適宜、防腐剤、安定剤等他の添加剤を含んでいてもよい。
【００２６】
（反応条件）
本方法は、試料液中のヒスタミンと２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとをｐＨ１０未満で接触させることにより生じる呈色反応を利用する。好ましくは、ｐＨ３以上８以下の範囲で接触させる。ｐＨ３以上８以下であると、良好な発色性を得ることができる。より好ましくは、ｐＨ４以上７以下である。ｐＨ４未満であってもｐＨ７を越えても発色が弱くなり特に目視による検出が困難になるからである。さらに好ましくは、ｐＨ５以上７以下である。ｐＨ５以上７以下であると、呈色反応が速やかに進行するため、迅速な検出が可能となる。最も好ましくはｐＨ５以上６以下である。ｐＨ５以上６以下であると、発色が速やかに安定するからであり、迅速かつ精度の高い検出が可能となる。このようなｐＨ条件は、リン酸緩衝液などの緩衝液にて容易に形成することができる。
【００２７】
反応温度は特に限定しないが、４℃以上４０℃以下で行うことが好ましい。本方法における呈色反応は、この温度範囲内において呈色強度が温度に依存しないことが確認されている。したがって、本方法は、常温範囲で温度制御の不要な検出方法となっている。反応時間も特に限定しないが、この呈色反応は、非常に速やかに生じ、ｐＨにもよるが、１分程度で目視で判定可能な程度に呈色し、５分〜３０分程度で安定した発色を呈する。したがって、好ましくは１分以上の範囲で反応時間を任意に設定することができる。
【００２８】
（担体の利用）
液性の調整あるいは呈色反応を妨害する可能性のある夾雑物質を除去しヒスタミンを濃縮するのに用いた担体を、そのまま試薬との呈色反応の場として用いることができる。すなわち、担体にヒスタミンを保持させた状態で担体に試薬を供給することで担体上でヒスタミンと２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドとの呈色反応を生じさせることができる。例えば、上記の方法で調製した抽出液を、ヒスタミンを保持可能な陽イオン交換樹脂やシリカ系担体に供給し適当な洗浄液で夾雑物質を洗浄した後、ヒスタミンを担体から溶出させることなくヒスタミンを担体に保持させた状態で、ここに試薬を供給して反応させることができる。また、上記の方法で予め夾雑物などを除去した試料液を上記担体に供給する場合には、特に洗浄等をしなくても、必要に応じてｐＨを調整した後、試薬を担体に供給すれば担体上で反応させることができる。こうすることで、いずれの場合も担体にヒスタミンを濃縮したうえで反応させることができるため、担体を視認可能な状態な場合には、そのまま目視による検出に適した呈色形態（発色強度等）を容易に得ることができる。例えば、０．０５ｍＭ程度のヒスタミンについて目視による検出が可能であることを確認している。さらに、この形態では速やかに発色する点においても簡易あるいは迅速な検出に適している。さらに、抽出液を担体に供給する場合には、液性の調整等の前処理と反応とを一挙に行うことができる。したがって、この方法は、特に、夾雑物質等の影響が大きい可能性のある食品を検査対象とする場合に有用である。なお、発色の視認性を向上させるには、無色から白色の担体を用いることが好ましい。
【００２９】
担体を呈色反応の場として用いる一例を挙げる。マグロなどの新鮮魚肉（刺身）の適量をホモジナイズし、５％程度のＴＣＡ水溶液適量を加えてさらにホモジナイズし、その後、遠心分離等により固液分離して液体画分（遠心分離の場合には上清）を採取する。水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いてｐＨを約５〜７に調整し、これを試料液（ただし夾雑物等は除去されていない状態である。）とする。この試料液をシリカゲルが充てんされた外部から内部を視認できるミニカラムに供給し、水および／またはｐＨ５．０〜７．０程度のリン酸緩衝液で洗浄し、洗浄後の担体に試薬を供給する。ヒスタミンは担体に保持されているために、担体上で直ちに試薬と接触して呈色反応が生じ担体において発色する。こうした方法によれば、ヒスタミンは担体に濃縮されて保持されるため、容易にかつ高感度に発色を視認できる。また、ヒスタミンの精製と反応とを同一の場所でかつ極めて迅速に行うことができるため、簡易にヒスタミンを検出することができる。
【００３０】
なお、みそ、しょうゆ、ワインなどの着色した食品のアルコール抽出液のヒスタミン検出において担体を用いる場合、洗浄液として、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アミルアルコールなどの炭素数２〜５のアルコール用いることで、これらの食品のヒスタミン抽出液の着色成分を選択的に担体から除去することができ、担体においてヒスタミンに基づく呈色反応を容易に視認できるようになる。
【００３１】
（検出工程）（ステップＳ４０）
本方法における呈色反応による発色は可視光領域、特に、５００ｎｍ以上７５０ｎｍの範囲において容易に観察することができる。したがって、目視によってもその濃淡を確認することが容易であるため、目視によって定性分析のみならずある程度の定量分析も可能である。吸収波長を選択して装置的に吸光度を検出して測定する場合、好ましくは、６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲で検出波長を選択して測定する。６００ｎｍ以上７００ｎｍ以下であると、他の腐敗アミンであるプトレシン、カタベリン、スペルミジンなどのポリアミンに対して高い選択性で発色するからである。
【００３２】
（定性および定量）
本検出方法によれば、定性分析および定量分析が可能である。定性分析においては目視による確認が可能である。定量分析にあたっては、予め用意した１あるいは２以上の標準溶液を用いて所定波長の吸光度に基づいて標準曲線を作成するなどするか、あるいは予め一定濃度のヒスタミンに対して与えられた所定の吸光度あるいは吸光度係数に基づいて試料液の濃度を求めることができる。また、予め１あるいは２以上の濃度のヒスタミン標準溶液に対して本方法によって得られる標準色の溶液（標準溶液）あるいは標準品（例えば、担体が着色された状態のもの）を作製しておくことで、これらの標準溶液を参照すれば、目視によって簡易で迅速な定量分析が可能となる。
【００３３】
ヒスタミン標準溶液を利用して確認できる本方法におけるヒスタミンの検出限界は、おおよそ０．０１ｍＭである。試料に対する検出限界は、試料採取量等を適宜調整することによって調整することができるが、例えば、マグロ魚肉を用いた場合には、少なくとも２５ｐｐｍの検出限界を確保できることを確認している。
【００３４】
（検出キット）
こうした本発明のヒスタミンの検出方法を行うのに好ましいキットは、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有する試薬と、ヒスタミンを保持可能な担体を備える反応場提供部材と、を備えることができる。このキットは、ヒスタミンの前処理とヒスタミンの呈色反応との場として担体を有しているため、ヒスタミンの検出を簡易にかつ迅速に行うことができる。この検出キットにおいて、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドを含有する試薬は既に述べたとおりの構成とすることができる。また、反応場提供部材の反応場を構成する担体は、既に記載したとおりの構成のものを用いることができる。反応場提供部材は、ヒスタミンを保持可能な担体のみからなる構成とすることもできるし、当該担体を適当な保持部材によって保持する構成とすることができる。例えば、担体を少なくともその一端側に有するとともに把持可能な形態を備えることもできる。
【００３５】
反応場提供部材を担体のみから構成する場合とは、例えば、担体を帯状等各種形態の試験紙のようにする場合を挙げることができる。試験紙形態とする場合、手指やピンセット等にて把持しやすいような把持部を有するか長尺体であることが好ましい。カラム形態の反応場提供部材の例を図２に示す。この反応場提供部材２は、透明な材料で形成された筒状のカラム４に粒状の担体６が充てんされて形成されている。カラム４内の担体６の上下にはそれぞれセルロース等の繊維状体のフィルター８を備えることもできる。このような反応場提供部材２を用いて、前処理と呈色反応を担体にて行う例を図３に示す。この例では、カラム形態の反応場提供部材２の担体６に、試料液を供給し、次いで、適当な洗浄液で担体６を洗浄した後、担体６に試薬を供給している。この結果、担体が発色したかの状態でヒスタミンを検出できる。
【００３６】
また、把持部１８を有する反応場提供部材１２の例を図４に示す。この反応場提供部材１２は、全体として棒状体であって、その一端側に担体１６を露出して有するとともに他端側を把持部１８として有している。棒状体はプラスチック製でありその担体支持部位は、シート状担体を露出して支持できるようなフレーム１４を有している。このフレーム１４内において担体１６は露出されており、当該露出部位に試料液を供給し浸透させることで担体１６にヒスタミンを保持させることが可能となっている。この形態において、シート状担体１６は供給された試料液が担体を通過して供給側と反対側へのみ流出可能なフィルター状にフレーム１４に対して保持されていてもよいし、試料液の供給側の反対側がフレーム１４の一部によって遮断されていてもよいし、さらに試料液の供給側の反対側に試料液の少なくとも一部を貯留可能に形成されていてもよい。
【００３７】
また、反応場提供部材は、食品の包装容器の一部に備えることもできる。すなわち、担体を食品とは隔離された食品からの浸出液の吸収体として用い、担体を包装容器における食品からの浸出液が浸透可能な部位に備えることもできる。なお、担体は、直接食品と接触しないように備えられる。また、担体は、担体側に一旦浸透した浸出液が食品収容側へ逆流しないような半透性部材を介して備えられていることが好ましい。また、この担体は、包装容器の外部から視認できるあるいは包装容器から取り外し可能に備えられていることが好ましい。食品の包装容器の一部にこうした反応場提供部材を備えることで、食品の保存、流通、販売工程において容易にヒスタミンを検出することができる。
【００３８】
これら各種の反応場提供部材において、呈色反応に先立って除去することが好ましい夾雑物を含有する試料液に対してはカラム形態の反応場提供部材を用いるのが好ましい。また、予め夾雑物が除去されている場合あるいはそのような夾雑物の存在可能性が低い試料液に対しては、試験紙形態あるいはフレーム部を有する形態の反応場提供部材を用いるのが好ましい。
【００３９】
これらの反応場提供部材に備えられる担体の少なくとも一部には、予め試薬を保持させておくことができる。こうすることで、担体に試料液を供給するのみで速やかに担体上で呈色反応を生じさせることができる。担体に対する試薬の保持形態は特に限定しない。担体の一部に例えば「×」などのマークを形成可能に保持させることもできる。また、バーコードリーダーで読み取り可能なマーク（バーコード）を形成可能に保持させることもできる。こうしたマークを形成することで、ヒスタミン検出時には、これらのマークが担体において現出されるため、その後の判定を容易に行うことができる。特に、機械的読み取りによって行うことで衛生管理を容易に行うことができるようになる。
【００４０】
なお、担体に保持させる２，３−ナフタレンカルボキシアルデヒドの量は必要とされる検出限界等によって適宜設定することができる。
【００４１】
（食品の衛生管理方法）
こうした本発明のヒスタミン検出方法及び検出キットを、食品の製造工程に含まれるいずれかの工程において用いてヒスタミンを検出することによって、食品の原料採取工程から提供工程までのヒスタミンに関する衛生管理を行うことができる。食品の製造工程としては、この他、原料の保存、流通、一次加工、二次加工、最終加工等の各種工程を含めることができる。かかる衛生管理方法においては、ヒスタミン含量濃度あるいは各工程において定められた基準以下であるか否かをヒスタミン検出履歴として記録して管理することができる。
【００４２】
なお、ヒスタミンは腐敗の指標でもあるため、本発明方法及びキットは、食品、特に魚肉類及びその加工品の衛生管理のみならず鮮度管理にも用いることができる。また、本発明方法及びキットは、ヒトの尿や血清を対象としたアレルギー検出にも用いることができる。さらに、ヒスタミン濃度を指標とする医薬スクリーニングにも用いることができる。
【実施例１】
【００４３】
以下、本発明を具体例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（１）ヒスタミンの発色とｐＨ
０．１ｍＭのヒスタミン水溶液を調製し、該水溶液０．５ｍｌと、０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ２，４，５，６，７，８，９）２．５ｍｌと、１ｍＭの２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドのアセトニトリル溶液０．５ｍｌとを混合し、３０分後に発色を確認した。各発色液を目視で観察したところ、ｐＨ２とｐＨ９ではほとんど着色されず、ｐＨ８で薄く色着き、ｐＨ４以上７以下の範囲で目視によって緑色〜青緑色〜オレンジ色の発色を明確に確認できた。
【００４５】
また、０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ４，５，６，７，８，９．５）を調製し、上記と同様に操作して混合液を調製し、３０分経過後に可視領域の吸収スペクトルを測定した。結果を図５に示す。また、０．１Ｍ緩衝液（ｐＨ２．５，４，５，６，７，８，９．５）を調製し、上記と同様に操作して混合液を調製し、６１０ｎｍで時間を追って吸光度を測定した。結果を図６に示す。
【００４６】
図５に示すように、ｐＨ６以下において５００ｎｍから８００ｎｍにおいて吸収極大を有するスペクトルを有しているとともに大きな吸光度を示した。特に、６００ｎｍから７００ｎｍにおいて高い吸光度を示した。特にｐＨ５と６において高い吸光度を示した。一方、ｐＨ７以上では、同様の波長域に吸収極大を認めず、また、吸光度も低かった。これらの結果は、目視観察の結果と一致していた。
【００４７】
また、図６に示すように、いずれのｐＨにおいても１０分から３０分の間で吸光度が安定していた。ｐＨ５および６では高い吸光度を示すとともにｐＨ５，６，７では１０分以内に急激に吸光度が上昇した。以上のことから、反応ｐＨは、２以上９以下であることが好ましく、より好ましくは、ｐＨ５以上７以下であることがわかった。また、ｐＨ５および６が迅速かつ高感度なヒスタミン検出に有効であることがわかった。
【００４８】
なお、０．０５ｍＭから１．０ｍＭのヒスタミン標準溶液にて波長６１０ｎｍにおける吸光度を用いて標準曲線を作製したところ、相関係数ｒは、０．９９７であり、十分な定量性があることを確認した。
【００４９】
（２）アミノ酸及び他のアミン類の発色
アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、セロトニン、カタベリン、スペルミジン、プトレスシンおよびヒスタミンについて０．１ｍＭ水溶液（プトレスシンのみ１ｍＭ）を調製し、これらの各水溶液０．５ｍｌと、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２．５ｍｌと、１ｍＭ２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒドのアセトニトリル溶液０．５ｍｌとを混合し、３０分後に発色を確認した。各発色液を目視で観察したところ、アルギニン、アスパラギン及びカタベリンについてはほとんど発色せず、ヒスチジン、セロトニン及びスペルミジンについてやや発色し、プトレスシン（ただし１ｍＭ）及びヒスタミンについてはよく発色していた。
【００５０】
これらの発色液について可視光領域の吸収スペクトルを測定した結果を図７に示す。ヒスタミンの吸光度が大きくなる６００ｎｍから７００ｎｍにおいては、セロトニンが比較的吸光度を示すに過ぎず、他の妨害可能性のあるポリアミン類（スペルミジン及びプトレスシン）については低い吸光度を示していた。なお、セロトニンはヒト由来であって食品において通常検出されないタンパク質である。以上のことから、本呈色反応は、アミノ基を有する各種化合物においても、選択的に高い発色を呈することがわかった。したがって、ヒスタミンの精製レベルが高い場合には、精度の高い測定が可能であり、ヒスタミンの精製レベルが高くなくても一定以上の精度でヒスタミンを測定できることがわかった。
【実施例２】
【００５１】
（回収実験）
次に、新鮮魚肉（市販のマグロ刺身）に対してヒスタミン標準品を添加して回収実験を行った。なお、ヒスタミン標準品は、二塩酸ヒスタミン（試薬特級、和光純薬工業株式会社製）を用い、試薬には、２，３−ナフタレンジカルボキシアルデヒド（アルドリッチ製）の１ｍＭアセトニトリル溶液用いた。
【００５２】
市販の新鮮なマグロ刺身５ｇをホモジナイザー（ＮＩＨＯＮＳＥＩＫＩ ＫＡＩＳＨＡ，ＬＴＤ．）に量り採り、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍ相当の標準ヒスタミン水溶液を添加し、次に、５％ＴＣＡ水溶液３０ｍｌを加えて１分間ホモジナイズした。この液を４℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し（ｈｉｍａｃ ＣＲ−２０、日立工機株式会社製）、上清１０００μＬに１Ｍ水酸化ナトリウムすなわち、溶液２５０μＬを加えてよく攪拌して、試料液とした。このＴＣＡ抽出試料液のｐＨは８であった。なお、ＴＣＡ水溶液をメタノールに変える点及び１Ｍ水酸化ナトリウムの添加量を２０μＬとする以外は同様に操作してメタノール抽出の試料液も調製した。このメタノール抽出試料液のｐＨは７であった。
【００５３】
市販の１ｍｌ注射筒（１ｍｌツベルクリン用、テルモ株式会社製）に担体としてシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０、メルク製、１．０７７３４．１０００）約５０ｍｇを筒内の底部に上下のシールに少量の脱脂綿を用いて充てんし、ヒスタミン検出用カラムを調製し、これをヒスタミン検出用カートリッジとした。
【００５４】
作製したカートリッジに上記試料液５００μＬを導入後速やかに予め備えられていたピストンを用いて担体を加圧して試料液に担体を通過させた。さらに試料液５００μＬを同様にしてカートリッジに導入して担体を通過させた後、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬを１回導入し通過させ、さらに、水２００μＬを４回導入し通過させて担体を洗浄した。次いで、試薬２００μＬを導入し同様にして通過させた。
【００５５】
試薬２００μＬを通過させてから１分経過後に担体の色を観察したところ、２５ｐｐｍ添加試料液について明確に呈色を目視にて確認できた。なお、６時間経過後においてもほとんど退色は認められなかった。なお、抽出溶媒の種類によらないで同様の結果を得ることができた。以上のことから、本カートリッジにおけるヒスタミンの検出限界は２５ｐｐｍであること及び１分の反応時間があれば目視によって２５ｐｐｍレベルでヒスタミンを検出できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ヒスタミンの検出方法の一例を示す工程図。
【図２】ヒスタミン検出キットにおける反応場提供部材の一例を示す図。
【図３】図２の反応場提供部材を用いたヒスタミン検出の一例を示す図。
【図４】ヒスタミン検出キットにおける反応場提供部材の他の一例を示す図。
【図５】発色液の可視領域の吸収スペクトルを示す図。
【図６】発色液の吸光度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図７】各種アミンの発色液の可視光領域の吸収スペクトルを示す図。
【符号の説明】
【００５７】
２、１２  反応場提供部材、４  カラム、６、１６  担体、８  フィルター、１４  フレーム、１８  把持部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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