(57)【要約】  【課題】  固相表面へのインターカレータの非特異的吸着を有効に防止できる技術を提供すること。  【解決手段】  検出用核酸Ｄと標的核酸Ｔとの間のハイブリダイゼーションを検出する固相表面ｆを、アビジンなどの陽電荷を帯びる物質で被覆したり、シランカップリング剤由来の陽電荷を帯びる官能基で修飾したりすることによって、前記固相表面ｆに対する蛍光インターカレータＩの非特異的吸着を防止する方法と該方法を用いるハイブリダイゼーション検出方法、並びにバイオアッセイ用基板１を提供する。本発明は、固相表面ｆでのハイブリダイゼーションを、蛍光インターカレータＩを用いて検出する場合に特に有用である。  【選択図】  図７
2005331334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する固相表面を、陽電荷を帯びる物質で被覆することによって、前記固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を防止する方法。
【請求項２】
前記物質はアビジンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する固相表面を、陽電荷を帯びる官能基で修飾することによって、前記固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を防止する方法。
【請求項４】
前記官能基は、メチル基又はアミノ基であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記官能基は、シランカップリング剤の官能基であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法を用いることを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項７】
検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションをインターカレータによって検出するための固相表面を備え、該固相表面が陽電荷を帯びる物質で被覆又は陽電荷を帯びる官能基で修飾されたバイオアッセイ用基板。
【請求項８】
前記陽電荷を帯びる物質は、アビジンであることを特徴とする請求項７記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項９】
前記陽電荷を帯びる官能基は、メチル基又はアミノ基であることを特徴とする請求項７記載のバイオアッセイ用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を防止する技術に関する。より詳しくは、固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を防止する方法と該方法を用いるハイブリダイゼーション検出方法、並びにバイオアッセイ用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
また、近年、分子生物学、ナノテクノロジーに代表される微細加工技術、バイオインフォマティクスなどの進展を主な背景として、種々の測定原理を活用して、微細狭小な表面上で生体物質間の相互作用を進行させ、これを検出する技術（以下、「センサ技術」と称する。）が開発され、実用化されている。
【０００３】
例えば、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が知られている。現在提案されているＤＮＡチップは、一般的に、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域を基板上に予め設定しておき、この反応領域中の所定表面部位に固定されたプローブＤＮＡと蛍光標識された標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションを進行させ、これを光ピックアップ手段（蛍光読み取り手段）により検出する。
【０００４】
ＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。このため、ＤＮＡチップは、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００５】
ここで、ＤＮＡチップ技術では、蛍光検出によってハイブリダイゼーションを検出するのが一般的であるが、蛍光色素でラベルされたＤＮＡや残留する未精製蛍光色素誘導体などが検出表面部位やその周辺部位に非特異的に吸着することにより、蛍光検出の際のバックグラウンドノイズとなるという問題を抱えている。この問題を解決するための公知の先行技術を以下に挙げる。
【０００６】
まず、特許文献１では、ＤＮＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセインなどの消光剤を用いて、前記バックグラウンドを低減する技術を提案している。この技術は、蛍光色素のクエンチング特性（蛍光分子が他の分子と衝突すると励起エネルギーが散逸して蛍光が消光するという原理を利用するものである。
【０００７】
特許文献２には、スライドガラスなどの基板の表面の特定部位のみに、ビオチンを介してアビジンを単層に固定したＤＮＡマイクロアレイ基板を用いて、このアビジン層に予めビオチンを標識したＤＮＡプローブをアビジン−ビオチン結合により固定化する技術が提案されている。この技術によると、プローブ固定部位がＤＮＡ検出スポット部のみに制限され、該スポット部位の周囲にＤＮＡが非特異的に吸着するのを防止できるため、蛍光検出時のノイズ（不要光）の減少により、Ｓ／Ｎ比を向上させることができると説明されている。
【特許文献１】特開２００３−８４００２号公報（請求項１、請求項８、段落０００８などを参照）。
【特許文献２】特開２００２−１５３２７２号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
蛍光標識されたインターカレータ（二本鎖核酸等に挿入結合する物質）を用いてハイブリダイゼーションを検出する技術が知られているが、当該インターカレータはシリコン、ガラス、金属等の基板表面に物理的又は化学的に非特異的に吸着する。この吸着によって、インターカレータは蛍光を発し、これがバックグラウンドノイズとなるため、ハイブリダイゼーションに基づく正規の蛍光強度測定の障害となり、ひいては検出精度低下の原因となる。
【０００９】
このため、基板表面でのハイブリダイゼーション検出には、前記インターカレータを採用することが難しかった。しかし、インターカレータは、標的ＤＮＡに蛍光色素を標識する手間のかかるアッセイ作業が不要となるなどの利点が多い。
【００１０】
そこで、本発明は、基板表面へのインターカレータの非特異的吸着を有効に防止できる技術を提供することにより、基板表面上でのハイブリダイゼーションの検出において、インターカレータを採用できるようにすることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する固相表面を、陽電荷を帯びるアビジンなどの物質で被覆したり、陽電荷を帯びるメチル基やアミノ基などの官能基、例えば、陽電荷を帯びるシランカップリング剤の官能基で修飾したりすることによって、前記固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を防止する方法と該方法を用いるハイブリダイゼーション検出方法を提供する。
【００１２】
また、本発明では、検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションをインターカレータによって検出するための固相表面を備え、該固相表面が陽電荷を帯びるアビジンなどの物質で被覆又は陽電荷を帯びるメチル基やアミノ基などの官能基で修飾されたＤＮＡチップなどのバイオアッセイ用基板を提供する。
【００１３】
これらの方法やバイオアッセイ用基板によれば、固相表面周辺領域に存在する蛍光インターカレータが、当該固相表面に物理的又は化学的に非特異的に吸着すると蛍光を発するため、蛍光検出の際のバックグラウンドノイズとなってしまうという技術的課題を解決できる。
【００１４】
具体的には、固相表面領域で進行するハイブリダイゼーションのアッセイ条件下では、蛍光インターカレータが陽電荷を帯びる傾向があることを突き止めたことに基づき、前記固相表面を、陽電荷を帯びるように処理することによって、蛍光インターカレータが当該固相表面に物理的又は化学的に非特異的吸着してしまうのを、電気的反発によって、有効に防止できる。
【００１５】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付け等を行う。
【００１６】
「固相表面」は、基板やビーズなどの固体材料の表面であって、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域又は空間との臨界面を意味する。
【００１７】
「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブリダイゼーション、高分子−高分子、高分子−低分子、低分子−低分子の特異的な結合又は会合を広く含む。
【００１８】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００１９】
「蛍光インターカレータ」は、二本鎖核酸などに挿入結合可能である、蛍光標識された物質又は蛍光物質それ自体である。例えば、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなどを例示できる。蛍光インターカレータからの蛍光を検出することにより、二本鎖核酸の存在を確認できるので、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００２０】
「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該物質と特異的に相互作用する物質を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸（ヌクレオチド鎖）であり、反応領域中の表面に固定又は遊離して存在する。代表例は、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸である。
【００２１】
「標的核酸」とは、前記検出用核酸とハイブリダイゼーションを示す核酸（ヌクレオチド鎖）である。
【００２２】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２３】
「バイオアッセイ用基板」は、基板上の所定の反応領域において、物質間の相互作用を進行させ、該相互作用を検出するための基板を意味し、前記物質の種類に関係なく広く包含し、前記相互作用の検出原理は問わない。
【００２４】
「ＤＮＡチップ」は、前記バイオアッセイ用基板の一つであり、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸が固定化されて微細配列された状態とされたハイブリダイゼーション検出用基板を意味し、ＤＮＡマイクロアレイの概念も含む。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を有効に防止できるので、該非特異的吸着により発生する蛍光の値を確実に低減できる。その結果、蛍光検出の際のバックグラウンドノイズを低減できるので、固相表面での蛍光インターカレータを用いたハイブリダイゼーション検出を高精度、高感度に行うことができる。
【実施例】
【００２６】
固相表面を、陽電荷を帯びる物質で被覆することによって、前記固相表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を防止する方法の有効性を検証するべく、以下の試験Ｉ、ＩＩを行なった。
【００２７】
試験Ｉ
アビジンで処理されていない固相基板（シリコン基板）への蛍光インターカレータの非特異的吸着の状態を確認する試験（試験Ｉ−１）、アビジンで処理された固相基板への蛍光インターカレータの非特異的吸着の状態を確認する試験（試験Ｉ−２）。
【００２８】
（試験Ｉ−１）
まず、公知のプラズマ・アッシング技術によって表面を洗浄したシリコン基板を用意した。このシリコン基板を、蛍光インターカレータであるＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩ（Molecular Probes社製）の原液をＴｒｉｓ-ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファー(pH7.8)で１万倍に希釈し、該希釈溶液中に前記シリコン基板を３０分間浸漬することによって染色した。蛍光強度の測定は、顕微分光装置を用いて５３５ｎｍの蛍光強度の値を測定した。
【００２９】
この結果を、図１に示す。図１中、縦軸は顕微分光装置（大塚電子製）で測定した５３５ｎｍの蛍光強度値である。この蛍光値は、図１に示すように、０．０２８であった。ＤＮＡチップでのＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを用いたハイブリダイゼーション検出を想定した場合、当該蛍光インターカレータの固相基板への非特異的吸着によって発生する蛍光値が０．０２８以上を示すと、バックグラウンドノイズになってしまう。従って、本試験により、蛍光インターカレータの固相基板への非特異的吸着を防止する必要があることが明らかになった。
【００３０】
(試験Ｉ−２）
次に、アビジン処理された固相基板に対する蛍光インターカレータの固相基板への非特異的吸着の状態を確認する試験。
【００３１】
本試験は、金で被覆したシリコン基板へアビジン（詳細）を固定し、当該アビジンへの蛍光インターカレータの吸着量を測定（重量変化の定量）することにより行った。
【００３２】
具体的には、Quartz Crystal Microbalance（略称「ＱＣＭ」）法を用いて、アビジン固定した表面への蛍光インターカレータの吸着を測定した。なお、「ＱＣＭ法」は、発振している水晶振動子の電極表面での重量変化を水晶振動子の周波数変化で求める手法である。本試験では、ＱＣＭ装置として、イニシアム社製・AFFINIX Qを用いた。なお、本試験における蛍光インターカレータは、上記試験Ｉ−１と同様に、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを用いた。
【００３３】
上記ＱＣＭ装置の水晶振動子の電極である金の表面に、次の方法で、アビジンを固定した。まず、プローブ・ユニットにあらかじめ搭載されている水晶振動子の金電極表面をピランハ溶液で洗浄した後、１ｍＭジチオジプロピオン酸水溶液を滴下し，室温で９０分間反応させた。
【００３４】
次に，1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（ＥＤＣ）の存在下で、Ｎ-Hydroxysucciniimide(ＮＨＳ）と反応させた。ＴＥバッファー２００ｍＭ 塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で洗浄後に、金電極を持つ水晶振動子のプローブ・ユニットをＱＣＭ装置の回路に接続し、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に浸漬した。緩衝液中での発振周波数の安定を確認した後、終濃度が１．２５μｇ／ｍｌとなるようにアビジン溶液を滴下し、周波数変化を測定した。
【００３５】
この測定結果を図２に示す。この図２に示すように、８０分後のアビジン吸着量を測定したところ，５６０ｎｇ／ｃｍ2となった。これにより、前記電極表面に対するアビジンの被覆が、ほぼ１００％であることをまず確認した。
【００３６】
続いて、上記方法によって得られた、アビジンを固定した電極を持つ水晶振動子のプローブ・ユニットを用いて、蛍光インターカレータの吸着量を測定した。この時のアビジン固定時間は８０分間とした。なお、残基として残るカルボキシル基は、１Ｍエタノールアミン水溶液で不活性とした。
【００３７】
アビジンを固定した電極を持つ水晶振動子のプローブ・ユニットを、ＱＣＭ装置の回路に接続して、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）バッファー液に浸漬した。発振周波数の安定を待ち、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを終濃度が原液の１万倍希釈になるように、ＰＢＳバッファー液中に滴下した。この時の発振周波数を計２回測定した。その結果を図３に示す。図３中において、横軸は時間、縦軸は変化量（ｎｇ／ｃｍ2）を示している。
【００３８】
この図３から、蛍光インターカレータであるＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩの添加を開始してから時間が経過しても、周波数変化はかなり小さいことがわかる。従って、アビジン上へのＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩの非特異的吸着がほぼないことを確認することができた。また、対照区として、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを含まないＰＢＳバッファー液を滴下して発振周波数を測定したところ、その周波数変化は、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを含む場合と同様に、周波数変化は見られなかった。なお、これらの結果を受けて、図３では、対照区の結果とアビジン存在下での計二回の試験結果がほぼ重なってグラフ化されている。
【００３９】
次に、アビジン処理された基板へのインターカレータ色素の吸着の測定（蛍光値の測定）を行なった。上記と同様の方法で金基板上にアビジンを固定し、同様に蛍光値の測定を行った。その結果を図４に示す。なお、図４中、縦軸は顕微分光で測定した５３５ｎｍの蛍光強度値である。
【００４０】
図４に示すように、測定された蛍光値は、０．００８４であった。これは、図１の結果と比較すればわかるように、シリコン基板上へのインターカレータの吸着、発光の値の３０％（0.0084／0.028）程度である。
【００４１】
従って、ＤＮＡチップなどの固相基板をアビジンで処理すると、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを用いてハイブリダイゼーションを検出する際の検出精度の向上につながる。
【００４２】
試験ＩＩ
シランカップリング剤で処理された基板へのインターカレータ色素の吸着の測定（蛍光値の測定）に関する試験。
【００４３】
シランカップリング剤によってシラン処理したシリコン基板への蛍光インターカレータの吸着の測定試験を行った。なお、この試験ＩＩ−１において、シリコン基板のシラン処理に用いたシランカップリング剤は、日本ユニカ社製・メルカプトプロピルトリエトキシシラン（mercaptopropyltriethoxysilane：HS(CH2）Si(OC2H5)3)と信越化学工業株式会社製・アミノプロピルトリエトキシシラン（3-aminopropyltriethoxysilane：H2N(CH2)3Si(OC2H5)3）、信越化学工業株式会社製・メチルシラン（Methylsilane: CH3SiH3）であり、蛍光インターカレータは、上記試験Ｉと同様に、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩ（Molecular Probes社製）を用いた。
【００４４】
前記各シランカップリング剤でシラン処理したシリコン基板を、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩの原液をＴＥバッファー液(ｐＨ７．８)で１万倍希釈した希釈液に３０分間浸漬することによって染色した後、顕微分光装置を用いて５３５ｎｍの蛍光強度値を測定した。この測定結果を図５に示す。図５中、縦軸は顕微分光で測定した５３５ｎｍの蛍光強度値を示している。
【００４５】
それぞれの蛍光値は、メルカプトプロピルトリエトキシシランの場合が０．０３８、アミノプロピルトリエトキシシランの場合が０．００８５であった。
また、メチルシランの場合では、０．０１６であった（図５参照）。
【００４６】
この結果から、シラン化処理されていないシリコン基板の蛍光値０．０２８（図１参照）と比べて、表面残基が負のチャージになるメルカプトシラン処理の場合には、蛍光値が０．０３８であったことから、蛍光インターカレータの吸着、発光量は大きくなることがわかった。
【００４７】
これに対して、アミノシラン処理により表面が正のチャージを持つアミノ基で覆われた場合には、蛍光値が０．００８５であったことから蛍光インターカレータの吸着、発光量は、シラン化処理されていないシリコン基板と比較して、３０％（0.0085/0.028）となった。従って、アミノ基による蛍光インターカレータの非特異的吸着防止を達成できる。
【００４８】
また、メチルシランにより表面が正のチャージを持つメチル基で覆われた場合では、蛍光値は０．０１６であり、メチルシラン化処理されていないシリコン基板と比較して、５７％（0.016/0.028）の吸着、発光量であることが明らかとなった。従って、メチル基による蛍光インターカレータの非特異的吸着防止を達成できる。
【００４９】
このように、ＤＮＡチップ等の固相基板表面において、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを用いてハイブリダイゼーションを検出する場合には、基板表面の官能基をメチル基やアミノ基にすることにより、基板表面へのインターカレータの非特異的吸着を防止してバックグラウンドノイズを低く抑えることができるため、ハイブリダイゼーション検出精度を向上させることができる。
【００５０】
試験ＩＩＩ
アビジンを固定した金基板を用いて、ハイブリダイゼーションを行ったときのバックグラウンドノイズの程度を検証する試験。
【００５１】
アビジンを固定した金基板に、１００ｎＭの５’末端ビオチン化オリゴ（30mer、エスペックオリゴサービス製）を加えて、３０分間反応させ、プローブＤＮＡ（検出用核酸）固定化反応とした。その後、１００ｎＭの標的核酸を加えて５５℃で４時間ハイブリダイゼーション反応を行った。ここで形成された基板上の２本鎖ＤＮＡにＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ溶液を添加し、３０分以上反応させた後、顕微分光により５３５ｎｍの蛍光強度値を測定した。
【００５２】
その結果、ハイブリダイゼーション反応後のＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩの吸着、発光量は０．０４２であった。これをバックグラウンド値（アビジンを固定した時のみの発光量＝０．００８４、試験Ｉ−２の結果を参照）と比較すると、該バックグラウンド値は、２０％（0.0084/0.042）まで抑えられていた。
【００５３】
上記試験結果に基づいて、図７に示されたような形態構成のバイオアッセイ用基板１を提供できる。該基板１は、基材層１１と、該基材層１１に積層された中間層１２と、該中間層１２に積層された表層１３と、を備える。
【００５４】
基材層１１は、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。例えば、基材層１１を、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって所望の形態に成形する。基板１を安価な合成樹脂を用いて基板を成形することができる。従来使用されていたガラスチップに比して、低ランニングコストを実現できる。
【００５５】
中間層１２は、必要に応じて設けられる層であり、場合によっては、電極として利用できる導体層１２１、さらにはこの導体層１２１を被覆する絶縁層１２２を設けることができる。
【００５６】
導体層１２１は、基材層１１の裏面側からの光ピックアップが可能となる点から、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）などの光透過性の導電材料で形成するのが望ましい。この導体層は、反応領域２内に貯留又は保持される媒質に対して電界を形成する場合の電極として利用することができる。
【００５７】
絶縁層１２２は、例えば、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などの絶縁性の無機材料で形成する。反応領域２中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止することができるからである。
【００５８】
樹脂表層１３は、一例を挙げると、感光性のポリイミド樹脂によって形成できる。このポリイミドにフォトレジストによる表面処理加工を施して、符号２に示すような微細なウエル形状の反応領域を形成し、該反応領域王領域２内でハイブリダイゼーションを進行させるようにしてもよい。なお、反応領域２の形成方法は、特に限定されない。
【００５９】
該反応領域２の形状やサイズは特に限定されないが、その長さ、幅、深さは、それぞれ数μｍから数百μｍであって、このサイズ値は、励起光のスポット径やサンプル溶液（検出用核酸含有溶液、標的核酸含有溶液）の最小滴下可能量に基づいて決定することができる。
【００６０】
反応領域２の固相表面ｆには、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）やアミノシランやメチルシランなどのシランカップリング剤などによって表面処理を施し、該固相表面Ｆが陽電荷を帯びるように形成する。なお、図１において符号３は、陽電荷層を示している。
【００６１】
この陽電荷層３を備える固相表面ｆに対して、アビジン−ビオチン結合やジスルフィド結合などを介して、検出用核酸Ｄの末端を固定し、その後、標的核酸Ｔと蛍光インターカレータＩを別々に又は同時に添加して、該インターカレータＩの蛍光を光ピックアップ手段によって検出する（図６中に付記したＸ部の円囲い拡大図を参照）。これにより、検出用核酸Ｄと標的核酸Ｔとの間のハイブリダイゼーションを検出する。
【００６２】
この基板１では、蛍光インターカレータＩが固相表面ｆに対して、非特異的に吸着して蛍光を発することを防止できるので、ハイブリダイゼーション検出の際の蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減できる。この結果、ハイブリダイゼーション検出を高精度に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出技術やＤＮＡチップ技術として有用である。特に、蛍光インターカレータなどの蛍光強度の測定に基づいて、ハイブリダイゼーションを基板表面で検出する技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】試験Ｉ−１の結果を示す図（蛍光インターカレータ（SYBERGreenＩ)で染色したシリコン基板（アビジン処理なし）からの蛍光値を示す図面代用グラフ）。
【図２】試験Ｉ−２の結果を示す図（ＱＣＭ装置の金電極へのアビジンの固定量を示す図面代用グラフ）。
【図３】試験Ｉ−２の結果を示す図（アビジンへの蛍光インターカレータの吸着量を示す図面代用グラフ）。
【図４】試験Ｉ−２の結果を示す図（蛍光インターカレータを滴下した、アビジン固定化金基板からの蛍光値を示す図面代用グラフ）。
【図５】試験ＩＩの結果を示す図（シランカップリング剤によってシラン処理したシリコン基板への蛍光インターカレータの吸着の測定試験の結果を示す図面代用グラフ）。
【図６】試験ＩＩＩの結果を示す図（アビジンを固定した金基板を用いて、ハイブリダイゼーションを行ったときのバックグラウンドノイズの程度を検証する試験の結果を示す図面代用グラフ）。
【図７】本発明に係るバイオアッセイ用基板の要部構成を簡略に示す図である。
【符号の説明】
【００６５】
１  バイオアッセイ用基板
２  反応領域
３  陽電荷層
Ｄ  検出用核酸
ｆ  固相表面
Ｉ  蛍光インターカレータ
Ｔ  標的核酸
【図１】
2005331334.tif 000003
【図２】
2005331334.tif 000004
【図３】
2005331334.tif 000005
【図４】
2005331334.tif 000006
【図５】
2005331334.tif 000007
【図６】
2005331334.tif 000008
【図７】
2005331334.tif 000009