(57)【要約】【課題】  鱗し目害虫、特に、ハスモンヨトウに対して、優れた殺虫活性を有する組換え微生物を提供する。【解決手段】  鱗し目害虫、特に、ハスモンヨトウに対して殺虫活性を有する殺虫タンパク質の少なくとも結晶化領域にアミノ酸残基の置換による改変を生じさせて、殺虫活性を向上させる。【選択図】  図１
2005052032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも結晶化領域に改変を有する改変殺虫タンパク質をコードする遺伝子であって、
前記改変が、前記結晶化領域のＮ末端領域中の１〜数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得られることを特徴とする改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項２】
前記アミノ酸残基の置換が、殺虫活性を向上させるものである請求項１に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項３】
前記殺虫タンパク質が天然殺虫タンパク質である請求項１または２に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項４】
前記殺虫タンパク質がCry1Caである請求項１に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項５】
前記改変を有する結晶化領域のN末端領域が、Cry1Caの第６２７番目のアミノ酸残基から第６８０番目のアミノ酸残基までの領域である請求項４に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項６】
前記Ｎ末端領域内の少なくとも第６２７番目、第６３０番目および第６４５番目のアミノ酸残基のそれぞれが、他のアミノ酸残基と置換されている請求項５に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項７】
前記Ｎ末端領域内の第６７２番目、第６７３番目、第６７８番目及び第６８０番目から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が更に他のアミノ酸残基と置換されている請求項６に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項８】
活性領域にアミノ酸残基の置換による改変を更に有する請求項１〜７のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項９】
前記活性領域における改変が、第１４８番目及び第４３７番目の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換である請求項８に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項１０】
置換により導入されるアミノ酸残基が、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸またはグルタミンである請求項１〜９のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
【請求項１１】
前記改変殺虫タンパク質がCry1Caに対して以下の改変のいずれか１つを行って得られたものである請求項１に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
（１）改変タンパク質４３７−２
第１４８番目のアミノ酸残基をアラニンに、第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（２）改変タンパク質９２５−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（３）改変タンパク質３０００−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（４）改変タンパク質３００２−２
第１４８番目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（５）改変タンパク質５００４−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸をグリシンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をグリシンに置換。
（６）改変タンパク質５００５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（７）改変タンパク質５００８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（８）改変タンパク質５０１５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に及び第６７３番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換。
（９）改変タンパク質５０１８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をプロリンに置換。
（１０）改変タンパク質５０１９−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに及び第６７３番目のアミノ酸をプロリンに置換。
（１１）改変タンパク質８００１−１
第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
【請求項１２】
請求項１から請求項１１のいずれに記載される改変殺虫タンパク質遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクターＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターＤＮＡにより形質転換された殺虫活性を有することを特徴とする組換え微生物。
【請求項１４】
請求項１３の微生物を含む鱗し目害虫用の防除剤。
【請求項１５】
鱗し目害虫がハスモンヨトウである請求項１４に記載の防除剤。
【請求項１６】
請求項１３の微生物を防除剤の活性成分として用いることを特徴とする鱗し目害虫の防除方法。
【請求項１７】
鱗し目害虫がハスモンヨトウである請求項１４に記載の防除方法。
【請求項１８】
少なくとも結晶化領域に改変を有する改変殺虫タンパク質であって、
前記改変が、前記結晶化領域のＮ末端領域中の１〜数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得られることを特徴とする改変殺虫タンパク質。
【請求項１９】
前記アミノ酸残基の置換が、殺虫活性を向上させるものである請求項１８に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２０】
前記殺虫タンパク質が天然殺虫タンパク質である請求項１８または１９に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２１】
前記殺虫タンパク質がCry1Caである請求項２０に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２２】
前記改変を有する結晶化領域のN末端領域が、Cry1Caの第６２７番目のアミノ酸残基から第６８０番目のアミノ酸残基までの領域である請求項２１に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２３】
前記Ｎ末端領域内の少なくとも第６２７番目、第６３０番目および第６４５番目のアミノ酸残基のそれぞれが、他のアミノ酸残基と置換されている請求項２２に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２４】
前記Ｎ末端領域内の第６７２番目、第６７３番目、第６７８番目及び第６８０番目から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が更に他のアミノ酸残基と置換されている請求項２３に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２５】
活性領域にアミノ酸残基の置換による改変を更に有する請求項１８〜２４のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２６】
前記活性領域における改変が、第１４８番目及び第４３７番目の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換である請求項２５に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２７】
置換により導入されるアミノ酸残基が、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸またはグルタミンである請求項１８〜２６のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項２８】
前記改変殺虫タンパク質がCry1Caに対して以下の改変のいずれか１つを行って得られたものである請求項１８に記載の改変殺虫タンパク質。
（１）改変タンパク質４３７−２
第１４８番目のアミノ酸残基をアラニンに、第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（２）改変タンパク質９２５−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（３）改変タンパク質３０００−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（４）改変タンパク質３００２−２
第１４８番目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（５）改変タンパク質５００４−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸をグリシンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をグリシンに置換。
（６）改変タンパク質５００５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（７）改変タンパク質５００８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（８）改変タンパク質５０１５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に及び第６７３番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換。
（９）改変タンパク質５０１８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をプロリンに置換。
（１０）改変タンパク質５０１９−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに及び第６７３番目のアミノ酸をプロリンに置換。
（１１）改変タンパク質８００１−１
第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
【請求項２９】
請求項１８〜２７のいずれかに記載の殺虫タンパク質を含む鱗し目害虫用の防除剤。
【請求項３０】
鱗し目害虫がハスモンヨトウである請求項２９に記載の防除剤。
【請求項３１】
請求項１８〜２７のいずれかに記載の殺虫タンパク質を防除剤の活性成分として用いることを特徴とする鱗し目害虫の防除方法。
【請求項３２】
鱗し目害虫がハスモンヨトウである請求項３１に記載の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鱗し目害虫、特にハスモンヨトウに対して強い殺虫活性を示す改変殺虫タンパク質遺伝子に関する。該改変遺伝子を含み、これを枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）等の微生物菌体内に発現させる発現ベクターDNA、および該発現ベクターDNAを保持し、殺虫活性を有する組換え微生物に関する。同時に、該組換え微生物を用いた鱗し目害虫、特にハスモンヨトウに対する防除剤及び防除法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・チューリンゲンシス（以下、BT菌）は、グラム陽性の殺虫性芽胞形成かん菌で、芽胞形成時にタンパク性の結晶体（以下、殺虫タンパク質）を形成する。BT菌は、鱗し目昆虫に対する効果や人畜への安全性、かつ天敵に対する悪影響が少ないことなどから、総合害虫管理（IPM）に適した薬剤として広く利用され、BT剤は現在までに国内で約２０剤が登録されている。商品化されたBT剤の多くは主にコナガ、アオムシ等への防除に用いられ、ハスモンヨトウに登録のある薬剤は少ない（丸山  威ら  関東東山病害虫研究会報  第47巻  P.121-124  （2000年）：非特許文献１）。
【０００３】
菌の殺虫活性は、主にBT菌によって産生される分子量約６５ｋＤａから１３０ｋＤａの殺虫タンパク質による。この殺虫タンパク質は、２つの機能部分からなる。殺虫活性を示す前半部分（Ｎ−末端側）の活性領域と、殺虫タンパク質の結晶形成に関与すると考えられている後半部分（Ｃ−末端側）の結晶化領域である。殺虫タンパク質は、昆虫に食べられた後、昆虫の消化液のアルカリ性条件下で可溶化後、消化酵素による分解を受けて、結晶化領域が除去されて、活性本体となって初めて殺虫活性を示すようになる（杜ら  蛋白質  核酸  酵素：第46巻  P.363-372  (2001年) ：非特許文献２）。
【０００４】
これまでに、約２００種の殺虫タンパク質遺伝子がクローニングされ、それらのタンパク質の１次構造が推定されている。これらの殺虫タンパク質は平均距離法を用いて分子系統樹が作成され、２８クラスからなるCry1からCry28までのCryタンパク質と、２クラスからなるCytタンパク質の、計30クラスに分類されている（Crickmoreら  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.  Vol.62  PP.807-813  (1998) ：非特許文献３）。各クラスは配列類似性の程度によりさらにサブクラスに分類され、例えば、Cry1クラスはCry1Ab、Cry1Ca等に分類される。Cry1クラスのタンパク質は該して鱗し目昆虫に殺虫活性を有するが、殺虫スペクトラムやLC50値は個々の殺虫タンパク質毎に異なっている。
【０００５】
上記の殺虫タンパク質の中では、ハスモンヨトウに対し比較的高活性を有する殺虫タンパク質としては，Cry1Caが知られている。Cry1Caのハスモンヨトウに対するLC50値は、155.0μg/cm2である。ハスモンヨトウと同じヤガ科に属するシロイチモンジヨトウに対するLC50値は、68.9μg/cm2である。コナガに高活性を有する殺虫タンパク質（Cry1Ba）のLC50値は1.2μg/cm2である（LAMBERTら  Appl.  Environ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  62  80-86(1996) ：非特許文献４）。このように、ハスモンヨトウに対し比較的強い殺虫活性を有するＣｒｙ１Ｃａといえども、それらの殺虫活性は、BT殺虫タンパク質に高い感受性を示すといわれているコナガやシロイチモンジヨトウのLC50値に比べると弱い。従って、ハスモンヨトウに対する殺虫活性を改良する必要があり、ハスモンヨトウに対し高活性な殺虫タンパク質の創製を目指して、数多くの改変が試みられてきた。
【０００６】
コナガやシロイチモンジヨトウと比較して、ハスモンヨトウがBT剤に対して感受性が低い原因として、ハスモンヨトウの中腸消化液中に含まれるプロテアーゼ活性が強力で、活性本体自体が低分子化されるためと信じられている（堀ら、植物防疫  第45巻(第12号)、P.493(1991)：非特許文献５）。
【０００７】
そこで、活性本体となる活性化領域に着目し、当該アミノ酸配列を改変する試み（特開平2-2359号公報：特許文献１、特表2001-506490公報：特許文献２）や異なる殺虫タンパク質間でのキメラ構築による相加効果や相乗効果を期待した改変の試み（WO-200215701公報：特許文献３、特表平9-502343号公報：特許文献４、特表平10-500844号公報：特許文献５、特表平11-514236号公報：特許文献６）が報告されている。しかし、直接殺虫活性と関係ないと考えられている結晶化領域に着目し、アミノ酸あるいは該領域をコードする遺伝子の改変の試みは報告されていない。
【０００８】
なお、Cry1Caとして分類されるCry1Ca1〜Cry1Ca3の遺伝子の全長または部分塩基配列は、Honeeら  NAR  16  6240  （1988）（非特許文献６）、Sanchisら  Molecular  Microbiology 3  229  （1989）（非特許文献７）及び特開平3-224487号公報（特許文献７）にそれぞれ開示されている。
【非特許文献１】丸山  威ら  関東東山病害虫研究会報  第47巻  P.121-124  （2000年）
【非特許文献２】杜ら  蛋白質  核酸  酵素：第46巻  P.363-372  (2001年)
【非特許文献３】Crickmoreら  Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.  Vol.62  PP.807-813  (1998)
【非特許文献４】LAMBERTら  Appl.  Environ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  62  80-86(1996)
【非特許文献５】堀ら、植物防疫  第45巻(第12号)、P.493(1991)
【非特許文献６】Honeeら  NAR  16  6240  （1988）
【非特許文献７】Sanchisら  Molecular  Microbiology 3  229  （1989）
【特許文献１】特開平2-2359号公報
【特許文献２】特表2001-506490公報
【特許文献３】国際公開第2002／15701号パンフレット
【特許文献４】特表平9-502343号公報
【特許文献５】特表平10-500844号公報
【特許文献６】特表平11-514236号公報
【特許文献７】特開平3-224487号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ハスモンヨトウによる深刻な被害が、近年各種作物で目立っており、有効な防除薬剤が求められている。BT菌は、現在のところ、主に、アブラナ科作物のコナガおよびモンシロチョウの防除に用いられ、ハスモンヨトウに登録のある薬剤でも効果が不十分で、ハスモンヨトウに対し効果の高い薬剤が求められている。
【００１０】
本発明者らは、これらの課題を解決すべく、ハスモンヨトウに対する殺虫活性を向上さることを鋭意検討した結果、殺虫タンパク質の特定部位のアミノ酸を置換することにより改変殺虫タンパク質を得、該タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミで微生物を形質転換することにより、鱗し目害虫、特にハスモンヨトウに対して、優れた殺虫活性を有する組換え微生物を創出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一般に、ハスモンヨトウがBT剤に対して感受性が低い原因として、ハスモンヨトウの中腸消化液中に含まれるプロテアーゼ活性が強力で、活性本体自体が低分子化されるためと信じられている（堀ら、植物防疫  ４５（１２）  ４９３（１９９１）：先に挙げた非特許文献５）。
【００１２】
このような状況の中、本発明者らは、Ｃｒｙ１Ｃａ遺伝子の殺虫活性をさらに高めるべく、鋭意検討した。その過程において、本発明者らは、従来の発想とは異なり、直接的に殺虫活性と関係のないと考えられている結晶化構造に着目し、その結晶化領域のN末端領域のアミノ酸残基の置換の殺虫活性との関係について検討した結果、驚くべきことに、結晶化領域のN末端領域のアミノ酸配列を改変することによって殺虫活性を改善した改変殺虫タンパク質遺伝子を創製できることを見出した。
【００１３】
特に、殺虫タンパク質の結晶化領域のN末端領域として、Ｃｒｙ１Ｃａの第６２７番目のアミノ残基から第６８０番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、アミノ酸残基を置換することによって、殺虫活性を改善した改変殺虫タンパク質を創製できることを見出した。
【００１４】
好ましくは、Cry1Caの結晶化領域のN末端領域における上記のアミノ酸配列について以下のアミノ酸残基の置換を行うことで、殺虫活性を有する改変殺虫タンパク質遺伝子を創製することができた。
（１）第６２７番目のアミノ酸残基、第６３０番目のアミノ酸残基、第６４５番目のアミノ酸残基、第６７２番目のアミノ酸残基、および第６７３番目のアミノ酸残基を本来存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基に置換。
（２）第６２７番目のアミノ酸残基、第６３０番目のアミノ酸残基、第６４５番目のアミノ酸残基、第６７２番目のアミノ酸残基、第６７３番目のアミノ酸残基、第６７８番目のアミノ酸残基および第６８０番目のアミノ酸残基を本来存在するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基に置換。
【００１５】
さらに、驚くべきことに、本発明の結晶化領域を改変した殺虫タンパク質では、活性化領域における本来存在するアミノ酸残基の置換を、結晶化領域のＮ末端領域の改変に更に付加することによっても、殺虫活性をさらに向上させることが可能であることを見出した。このような殺虫タンパク質としては、Cry1Caの活性化領域の第１４８番目及び第４３７番目のアミノ酸残基の少なくとも一方を他のアミノ酸残基に置換させたものが好ましい。更に、活性化領域と結晶化領域の両方に置換による改変を生じさせた場合における好ましい例としては、Cry1Caに対して以下の改変を行ったものを挙げることができる。
１）第１４８番目、第４３７番目、第６２７番目、第６３０番目、および第６４５番目のアミノ酸残基を置換。
２）第１４８番目、第６２７番目、第６３０番目、第６４５番目、第６７２番目、第６７３番目、第６７８番目、および第６８０番目のアミノ酸残基を置換。
３）第４３７番目、第６２７番目、第６３０番目、第６４５番目、第６７２番目および第６７３番目のアミノ酸残基を置換。
【００１６】
また、置換により所定位置に導入されるアミノ酸残基としては、殺虫タンパク質の置換対象部位に本来存在するアミノ酸残基以外の全てのアミノ酸を上げることができるが、好ましい例としては、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン及びグルタミン酸をあげることができる。
【００１７】
すなわち、本発明の改変殺虫タンパク質の遺伝子は、上述したアミノ酸配列における改変を有することにより、ハスモンヨトウに対して、優れた殺虫活性を有する殺虫タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１８】
更に、本発明者らは、本発明の改変殺虫タンパク質遺伝子を発現ベクターに結合した状態で宿主微生物に導入して得られる組換え微生物を用いて、ハスモンヨトウを含む鱗し目害虫を防除できることを見出し、本発明を完成した。
【００１９】
好ましい改変殺虫タンパク質の例として４３７−２、９２５−２、３０００−１、３００２−２、５００４−１、５００５−１、５００８−１、５０１５−１、５０１８−１、５０１９−２、８００１−１を、これらの改変殺虫タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドとしてｐ４３７−２、ｐ９２５−２、ｐ３０００−１、ｐ５００４−１、ｐ５００５−１、ｐ５００８−１、ｐ５０１５−１、ｐ５０１８−１、ｐ５０１９−２を、それらのプラスミドによって大腸菌（DH５α）（東洋紡）を形質転換して得た組換え微生物としての例としては、ｐ４３７−２ＴＦ、ｐ９２５−２TF、ｐ３０００−１TF、ｐ５００４−１TF、ｐ５００５−１TF、ｐ５００８−１TF、ｐ５０１５−１TF、ｐ５０１８−１TF、ｐ５０１９−２TFがあげられる（表１、表２）。
【００２０】
これらの組換え微生物は、天然型殺虫タンパク質（Cry1Ca）をコードする遺伝子を含むプラスミド（ｐＡ１３（図１））によって大腸菌を形質転換して得られた組換え微生物ｐＡ１３ＴＦに比べ、高い殺虫活性を有することを見出した（図２）。
【００２１】
すなわち、本発明には以下の各態様が含まれる。
［１］  少なくとも結晶化領域に改変を有する改変殺虫タンパク質をコードする遺伝子であって、
前記改変が、前記結晶化領域のＮ末端領域中の１〜数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得られることを特徴とする改変殺虫タンパク質遺伝子。
［２］  前記アミノ酸残基の置換が、殺虫活性を向上させるものである［１］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［３］  前記殺虫タンパク質が天然殺虫タンパク質である［１］または［２］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［４］  前記殺虫タンパク質がCry1Caである［１］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［５］  前記改変を有する結晶化領域のN末端領域が、Cry1Caの第６２７番目のアミノ酸残基から第６８０番目のアミノ酸残基までの領域である［４］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［６］  前記Ｎ末端領域内の少なくとも第６２７番目、第６３０番目および第６４５番目のアミノ酸残基のそれぞれが、他のアミノ酸残基と置換されている［５］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［７］  前記Ｎ末端領域内の第６７２番目、第６７３番目、第６７８番目及び第６８０番目から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が更に他のアミノ酸残基と置換されている［６］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［８］  活性領域にアミノ酸残基の置換による改変を更に有する［１］〜［７］のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［９］  前記活性領域における改変が、第１４８番目及び第４３７番目の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換である［８］に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［１０］  置換により導入されるアミノ酸残基が、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸またはグルタミンである［１］〜［９］のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
［１１］  前記改変殺虫タンパク質がCry1Caに対して以下の改変のいずれか１つを行って得られたものである請求項１に記載の改変殺虫タンパク質遺伝子。
（１）改変タンパク質４３７−２
第１４８番目のアミノ酸残基をアラニンに、第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（２）改変タンパク質９２５−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（３）改変タンパク質３０００−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（４）改変タンパク質３００２−２
第１４８番目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（５）改変タンパク質５００４−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸をグリシンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をグリシンに置換。
（６）改変タンパク質５００５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（７）改変タンパク質５００８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（８）改変タンパク質５０１５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に及び第６７３番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換。
（９）改変タンパク質５０１８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をプロリンに置換。
（１０）改変タンパク質５０１９−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに及び第６７３番目のアミノ酸をプロリンに置換。
（１１）改変タンパク質８００１−１
第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
［１２］  ［１］から［１１］のいずれに記載される改変殺虫タンパク質遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクターＤＮＡ。
［１３］  ［１２］に記載の組換えベクターＤＮＡにより形質転換された殺虫活性を有することを特徴とする組換え微生物。
［１４］  ［１３］の微生物を含む鱗し目害虫用の防除剤。
［１５］  鱗し目害虫がハスモンヨトウである［１４］に記載の防除剤。
［１６］  ［１３］の微生物を防除剤の活性成分として用いることを特徴とする鱗し目害虫の防除方法。
［１７］  鱗し目害虫がハスモンヨトウである［１４］に記載の防除方法。
［１８］  少なくとも結晶化領域に改変を有する改変殺虫タンパク質であって、
前記改変が、前記結晶化領域のＮ末端領域中の１〜数個のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得られることを特徴とする改変殺虫タンパク質。
［１９］
前記アミノ酸残基の置換が、殺虫活性を向上させるものである請求項１８に記載の改変殺虫タンパク質。
［２０］  前記殺虫タンパク質が天然殺虫タンパク質である［１８］または［１９］に記載の改変殺虫タンパク質。
［２１］  前記殺虫タンパク質がCry1Caである［２０］に記載の改変殺虫タンパク質。
［２２］  前記改変を有する結晶化領域のN末端領域が、Cry1Caの第６２７番目のアミノ酸残基から第６８０番目のアミノ酸残基までの領域である［２１］に記載の改変殺虫タンパク質。
［２３］  前記Ｎ末端領域内の少なくとも第６２７番目、第６３０番目および第６４５番目のアミノ酸残基のそれぞれが、他のアミノ酸残基と置換されている［２２］に記載の改変殺虫タンパク質。
［２４］  前記Ｎ末端領域内の第６７２番目、第６７３番目、第６７８番目及び第６８０番目から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が更に他のアミノ酸残基と置換されている［２３］に記載の改変殺虫タンパク質。
［２５］  活性領域にアミノ酸残基の置換による改変を更に有する［１８］〜［２４］のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質。
［２６］  前記活性領域における改変が、第１４８番目及び第４３７番目の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換である［２５］に記載の改変殺虫タンパク質。
［２７］  置換により導入されるアミノ酸残基が、アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸またはグルタミンである［１８］〜［２６］のいずれかに記載の改変殺虫タンパク質。
［２８］  前記改変殺虫タンパク質がCry1Caに対して以下の改変のいずれか１つを行って得られたものである［１８］に記載の改変殺虫タンパク質。
（１）改変タンパク質４３７−２
第１４８番目のアミノ酸残基をアラニンに、第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（２）改変タンパク質９２５−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（３）改変タンパク質３０００−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（４）改変タンパク質３００２−２
第１４８番目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに置換。
（５）改変タンパク質５００４−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸をグリシンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をグリシンに置換。
（６）改変タンパク質５００５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（７）改変タンパク質５００８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
（８）改変タンパク質５０１５−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に及び第６７３番目のアミノ酸をグルタミン酸に置換。
（９）改変タンパク質５０１８−１
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をプロリンに置換。
（１０）改変タンパク質５０１９−２
第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに及び第６７３番目のアミノ酸をプロリンに置換。
（１１）改変タンパク質８００１−１
第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換。
［２９］  ［１８］〜［２７］のいずれかに記載の殺虫タンパク質を含む鱗し目害虫用の防除剤。
［３０］  鱗し目害虫がハスモンヨトウである［２９］に記載の防除剤。
［３１］  ［１８］〜［２７］のいずれかに記載の殺虫タンパク質を防除剤の活性成分として用いることを特徴とする鱗し目害虫の防除方法。
［３２］  鱗し目害虫がハスモンヨトウである［３１］に記載の防除方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の改変殺虫タンパク質遺伝子を用いることにより、鱗し目害虫、特に、ハスモンヨトウに対し高い殺虫活性を有する組換え微生物を創製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明にかかる改変の一例を詳細に説明する。
【００２４】
対象となる殺虫タンパク質遺伝子は、殺虫タンパク質をコードする遺伝子であれば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ由来等のいずれでもよい。この遺伝子にコードされる殺虫タンパク質としては、少なくともハスモンヨトウに対する殺虫効果が、本発明にかかる結晶化領域のＮ末端領域のアミノ酸配列の改変により殺虫効果が向上するものであればよく、例えばCryタンパク質の中でもハスモンヨトウに高活性なCry1Caを好ましい殺虫タンパク質として挙げることができる。このCry1Caをコードする遺伝子（Cry1Ca遺伝子）は、Cry1Ca1、Cry1Ca2、Cry1Ca3等に細分類化され、それらの全長または部分塩基配列は以下の各文献に記載されている。
イ）B.thurigiensis etomocidus 60.5から単離されたCry1Ca1遺伝子の配列は、Honeeらによって記載された（Honeeら  NAR  16  6240  （1988）：非特許文献６）。
ロ）B.thurigiensis aizawai 7.29から単離されたCry1Ca2遺伝子の配列の上流領域は、Sanchisらによって記載された（Sanchisら  Molecular  Microbiology 3  229  （1989）：非特許文献７）。
ハ）B.thurigiensis aizawai PS81Iから単離されたCry1Ca3遺伝子の配列は、Payneらによって記載された（ペインら  特開平3-224487号公報：特許文献７）。
【００２５】
これらの遺伝子の相同性はアミノ酸レベルで９５％以上であり、それぞれの殺虫タンパク質の殺虫活性には大きな差があるという報告はなく、従って、Cry1Ca1、Cry1Ca2、Cry1Ca3は少なくとも殺虫活性に関しては実質的に同等であると考えられている。すなわち、Cryタンパク質は、アラビア数字と大文字および小文字のアルファベットの３段階で表記され、Cryに続く数字は４５％以上の相同性（アミノ酸レベル）を１つの目安にしてグループ化したものに付けたもので、１〜３２に分類されている。各グループ中で７８％〜９５％の相同性を目安にグループ化され、大文字のＡから順に割り当てられ、更にそのグループ中の９５％以上の相同性をもつものがグループ化され、小文字アルファベットでａから順に割り当てられて分類されている。従って、CryCa１〜３はCryCaに含まれるものである。
【００２６】
なお、Cry1Caの結晶化領域のN末端領域（第６２７番目のアミノ酸残基から第６８０番目のアミノ酸残基までの領域）に相当するCryCa以外の殺虫タンパク質の結晶化領域のN末端領域についても本発明にかかる改変を行うことができる。
【００２７】
Cry1Ca1遺伝子の好ましい具体例としては配列番号（SEQ ID NO）：２のアミノ酸配列をコードする配列番号：３の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。なお、この配列において活性領域は１アミノ酸残基目から〜６２７アミノ酸残基目の領域であり、結晶化領域は６２８アミノ酸残基目以降の領域である。
【００２８】
更に、改変殺虫タンパク質の好ましい例としては、４３７−２、９２５−２、３０００−１、５００４−１、５００５−１、５００８−１、５０１５−１、５０１８−１、５０１９−２があげられる（表１）。
【００２９】
４３７−２は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第１４８番目のアミノ酸残基をアラニンに、第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコードする塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３０】
９２５−２は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコードする塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３１】
３０００−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコードする塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３２】
３００２−２は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第１４８番目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８番目のアミノ酸残基をアラニンに、および第６８０番目のアミノ酸残基をアラニンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコードする塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３３】
５００４−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸をグリシンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をグリシンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコードする塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３４】
５００５−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコードする塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３５】
５００８−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコート゛する塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３６】
５０１５−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコート゛する塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３７】
５０１８−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、および第６７３番目のアミノ酸残基をプロリンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコート゛する塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３８】
５０１９−２は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、及び第６７３番目のアミノ酸残基をプロリンに改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコート゛する塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００３９】
８００１−１は、Ｃｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）の第４３７番目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、および第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した殺虫タンパク質（表１）で、その遺伝子がコート゛する塩基配列でＣｒｙ１Ｃａの塩基配列（配列番号：３）との相違部分は表２に示した。
【００４０】
【表１】
2005052032.tif 000003
表１中、Ａｒｇはアルギニンを示し、Ｌｙｓはリジンを示し、Ａｌａはアラニンを示し、Ｇｌｕはグルタミン酸を示し、Ｇｌｙはグリシンを示し、Ｐｒｏはプロリンを示し、Ｇｌｎはグルタミンを示す。
【００４１】
【表２】
2005052032.tif 000004
改変殺虫タンパク質遺伝子は、変異体作成キット、例えば、QuickChangeRSite-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて得ることができる。すなわち、目的の箇所に変異を導入するように設計したプライマーＤＮＡを化学合成し、これと鋳型とするＤＮＡとを混合後し、ＰＣＲ反応を行うことにより得ることができる。
【００４２】
殺虫タンパク質遺伝子は定法に従い、ベクターDNAに組み込み、大腸菌等の宿主を用いて組換えベクターDNAを構築することができる。
【００４３】
本発明の組換えベクターDNAとは、本発明の改変殺虫タンパク質遺伝子とベクターＤＮＡとを結合させたあらゆる組換え体ＤＮＡを意味する。宿主内で保持されるプラスミド、ファージ、コスミドなどの核外遺伝子をベクターとして、宿主内に導入して保持させるもののみならず、本発明にかかる改変殺虫タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ等を宿主菌の染色体ＤＮＡ等に組換え導入するために利用されるベクターも含まれる。本発明のベクターＤＮＡとしては、通常遺伝子組換え実験に用いられるいかなるベクターＤＮＡの使用も可能であるが、例えば、宿主菌として、バチルス・ズブチリスやバチルス・チュリンゲニシス（Bacillus thuringiensis）を用いる場合、プラスミドとしてｐＵＢ１１０やｐＣ１９４などが、ファージとしてρ１１やφ１０５などが、また宿主菌として大腸菌を用いる場合には、プラスミドにはｐＢＲ３２２やｐＵＣ１９などが、ファージとしてλファージなどが適している。
【００４４】
本発明の改変殺虫タンパク質を有する発現ベクターDNAはベクターＤＮＡを適当に選ぶことにより大腸菌のみならず、バチルス属細菌などのあらゆる細菌類、酵母、放線菌、かび等に導入可能である。本発明の組換え微生物にはこれらの各種宿主の形質転換体が含まれる。
【００４５】
大腸菌を宿主として用いる場合は、Competent  high  DH５α株（東洋紡製：省略する場合はDH５αと記載）を好ましい大腸菌株として挙げることができる。
【００４６】
本発明の組換え体ＤＮＡを大腸菌等の宿主微生物に導入することにより、菌体で改変殺虫タンパク質を生産する組換え微生物を得ることができる。バチルス属細菌を形質転換する方法としては、コンピテント細胞を用いる方法やプロトプラスト法やエレクトロポレーション法がある。
【００４７】
このようにして構築した組換え微生物を適当な培地、条件で培養することにより、組換え微生物をそのまま、あるいは、あるいは適当な製剤化処理した後に、鱗し目害虫に摂食させることによって、鱗し目害虫、特に、ハスモンヨトウの防除に用いることができる。
【００４８】
なお、本発明にかかる改変された殺虫タンパク質及びそれを生産する組み換え微生物は、製剤化することで、鱗し目害虫、特に、ハスモンヨトウの防除に用いる防除剤とすることができる。例えば、組み換え微生物の場合、それを含む防除剤（BT剤）としては、生菌剤や死菌剤が挙げられ、その際の剤形としては、水和剤、顆粒水和剤、フロアブル剤、ドライフロアブル剤などを挙げることができ、定法に従って調製することができる。有効成分の含有量としては、生菌剤の場合は１０％程度、死菌剤の場合は７％程度とすることができる。これらの中では、適用範囲や条件を緩和できるという点からは死菌剤が好ましい。
【００４９】
以下、具体例によって、改変殺虫タンパク質をコードする遺伝子の構築法、該遺伝子を得て微生物を形質転換する方法、および該微生物を用いた防除方法について説明するが、本発明はこの実施例に何ら制限されるものでない。
【実施例】
【００５０】
実施例１
（天然型殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ｃａ遺伝子発現プラスミド（ｐＡ１３）の構築法）
天然型殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ｃａ遺伝子発現プラスミド（ｐＡ１３）は図１に示したストラテジーに従って構築した。なお、図中、Ｃｒｙ１Ｃａは天然型殺虫タンパク質を示し、ｃｒｙ１ＣａはＣｒｙ１Ｃａをコードする塩基配列を表し、Ｐｍはバチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ#遺伝子のプロモーターを表し、ＳＤはバチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ#遺伝子のリボゾーム結合部位を表す。
【００５１】
まず、ＢＴ菌＃１０７４株を２×SG培地20ｍｌを用いて、３０℃で１５時間培養した集菌後、プラスミドを定法に従って調製した。この＃１０７４株は、公的に入手可能である（Bacillus  Genetic  Stock  Center  Catalog  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ、Seventh  Edition（The  Bacillus  Ｓtock  Center、  The  Ohio  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  1999)参照）。
【００５２】
次に、このプラスミドＤＮＡを鋳型として、合成プライマー（1CA-N：5'CATGCCATGGAGGAAAATAAT3'（配列番号：４）、1CA―R：5'GTGGCATGCTATTCCTCCATAAGGAG3' （配列番号：５））を用い、PCR酵素としてKOD-Plus-（TOYOBO社製）を用いて、Ｃｒｙ１Ｃa遺伝子を増幅した。なお、基本反応条件、サイクリング条件は使用説明書に従った。増幅後のDNA断片は、制限酵素NcoＩ（東洋紡製）、制限酵素SphＩ（東洋紡製）で処理した後、Cry1Ca構造遺伝子を含む約３５００ｂｐのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、QIAｑｕｉｃｋR  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。
【００５３】
次に、ｐＵＣ１９（東洋紡製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位と制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位の間にバチスル・アミロリキファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域、ＳＤ領域を組込んだ発現用ベクターpUC-NPを制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡製）と制限酵素ＳｐｈＩ（東洋紡製）で切断後生じる２つのＤＮＡ断片のうち、ラージＤＮＡフラグメントを回収した。
【００５４】
なお、ｐUC-NPは、pUC19（東洋紡社製）のEcoRIサイトとBamHIサイトの間に挿入した、バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域・SD領域を有するもので、このプロモーター領域・SD領域は、文献（J. Biotechnology, 2, 75-85 (1985)）に記載の配列情報を元に、通常の方法で得たものである。
【００５５】
次に、合成DNA−A（5'GATCCTCCATGGAATTCCTGCAGGCATG3’ （配列番号：６））と、合成DNA−B（5’CCTGCACGGAATTCCATGGAG3’ （配列番号：７））とをアニーリング後、先に得たラージＤＮＡフラグメントとをDNA  Ligation  Ｋｉｔ  Ver.2（タカラ社製）を用いて結合させ、pUC-NPの制限酵素BamHI切断部位と制限酵素ＳｐｈI切断部位の間に、制限酵素ＮｏｃI切断部位、制限酵素ＥｃｏＲI切断部位、制限酵素ＰｓｔI切断部位を有する発現ベクターｐ＃７を構築した。この発現ベクターの全塩基配列は、配列表に配列番号：１として示した。次に、このｐ＃７を制限酵素ＮｃｏI（東洋紡製）と制限酵素ＳｐｈI（東洋紡製）で切断後、生じる２つのＤＮＡ断片の内、大きなＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片と先に調製したＣｒｙ１Ｃａ遺伝子を含む約３５００ｂｐのＤＮＡ断片を結合させて、天然型殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ｃa遺伝子発現プラスミドｐＡ１３を構築した（図１）。
【００５６】
実施例２
（改変殺虫タンパク質（９２５−２）発現プラスミドｐ９２５−２の構築法）
実施例１で構築したプラスミドpA13で大腸菌株（DH５α）を形質転換し、得られた組換え微生物ｐＡ１３ＴＦをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いてプラスミドｐＡ１３を調製した。
【００５７】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。
【００５８】
まず、鋳型DNAは天然型Cry1Ca遺伝子発現プラスミドpA13を用いた。合成プライマーとして下記の合成プライマーＡと合成プライマーＢを用いて、天然型Cry１Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質９２５−０をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ９２５−０を構築した。該プラスミドによる大腸菌DH５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ９２５−０ＴＦとした。
合成プライマーA（配列番号：８）：
５’GAATCTGATTTAGAAGCAGCACAAGCGGCGGTGAATGCC3’
合成プライマーＢ（配列番号：９）：
5’GGCATTCACCGCCGCTTGTGCTGCTTCTAAATCAGATTC３’
次に、鋳型DNAとして、プラスミドｐ９２５−０DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、下記の合成プライマーＣと合成プライマーＤを用いて、天然型Cry１Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質(９２５−２)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ９２５−２を構築した。該プラスミドによる大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ９２５−２ＴＦとした。
合成プライマーC（配列番号：１０）：
5'CTTCTTCCAATCAAATCGGGTTAGCAACCGATGTGACGGATTATC3'
合成プライマーＤ（配列番号：１１）：
5'GATAATCCGTCACATCGGTTGCTAACCCGATTTGATTGGAAGAAG3'。
【００５９】
実施例３
（改変殺虫タンパク質（５００８−１）発現プラスミドｐ５００８−１の構築法）
実施例２で構築した形質転換株ｐ９２５−０TFをＬＢ培地で３０℃１８時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ９２５−０を調製した。
【００６０】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-DirectedMutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとしては、ｐ９２５−０ＤＮＡを用いた。更に、合成プライマーとして下記の合成プライマーＥと合成プライマーＦを用いて、天然型Cry１Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した改変殺虫タンパク質（５００８−０）をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５００８−０を構築した。該プラスミドによる大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５００８−０ＴＦとした。
合成プライマーE（配列番号：１２）：
5'CTTCTTCCAATCAAATCGGGTTAGAAACCGATGTGACGGATTATC3'
合成プライマーＦ（配列番号：１３）：
5'GATAATCCGTCACATCGGTTTCTAACCCGATTTGATTGGAAGAAG3'
次に、ｐ５００８−０ＴＦをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ５００８−０を調製した。
【００６１】
ｐ５００８−０ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いた。更に、合成プライマーとして下記の合成プライマーＧと合成プライマーＨを用いて、天然型Cry１Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７３残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した改変殺虫タンパク質(５００８−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５００８−１を構築した。
該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５００８−１ＴＦとした。
合成プライマーG（配列番号：１４）：
5’CAGATGAATTTTGTCTGGATGAAGAGGAAGAATTGTCCGAGAAAGTC3’
合成プライマーＨ（配列番号：１５）：
5’GACTTTCTCGGACAATTCTTCCTCTTCATCCAGACAAAATTCATCTG3’。
【００６２】
実施例４
（改変殺虫タンパク質（５００５−１）発現プラスミドｐ５００５−１の構築法）
実施例３で得たｐ５００８−１TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いてプラスミドｐ５００８−１を調製した。
【００６３】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、ｐ５００８−１DNAを用いた。更に、合成プライマーとして下記の合成プライマーIと合成プライマーＪを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７３残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した改変殺虫タンパク質(５００５−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５００５−１を構築した。
【００６４】
該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５００５−１ＴＦとした。
合成プライマーＩ（配列番号：１６）：
5'GAATCTGATTTAGAAGAAGCACAAGAGGCGGTGAATGCC3'
合成プライマーJ（配列番号：１７）：
5'GGCATTCACCGCCTCTTGTGCTTCTTCTAAATCAGATTC3’。
【００６５】
実施例５
（改変殺虫タンパク質（５００４−１）発現プラスミドｐ５００４−１の構築法）
実施例４で構築したｐ５００５−１TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR
Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ５００５−１を調製した。
【００６６】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、ｐ５００５−１DNAを用いた。更に、合成プライマーとして下記の合成プライマーＫと合成プライマーＬを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６３０番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６４５番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグリシンに、第６７３残基目のアミノ酸残基をグリシンに改変した改変殺虫タンパク質(５００４−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５００４−１を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５００４−１ＴＦとした。
合成プライマーK（配列番号：１８）：
5'CAGATGAATTTTGTCTGGATGAAGGGGGAGAATTGTCCGAGAAAGTC3'
合成プライマーL（配列番号：１９）：
5'GACTTTCTCGGACAATTCTCCCCCTTCATCCAGACAAAATTCATCTG3’。
【００６７】
実施例６
（改変殺虫タンパク質（５０１８−１）発現プラスミドｐ５０１８−１の構築法）
実施例２で構築したｐ９２５−２TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ９２５−２を調製した。
【００６８】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、ｐ９２５−２DNAを用いた。更に、合成プライマーとして下記の合成プライマーＭと合成プライマーＮを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７３残基目のアミノ酸残基をプロリンに改変した改変殺虫タンパク質(５０１８−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５０１８−１構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５０１８−１ＴＦとした。
合成プライマーM（配列番号：２０）：
5'CAGATGAATTTTGTCTGGATGAACCGCCAGAATTGTCCGAGAAAGTC3’
合成プライマーN（配列番号：２１）：
5'GACTTTCTCGGACAATTCTGGCGGTTCATCCAGACAAAATTCATCTG3’。
【００６９】
実施例７（改変殺虫タンパク質（５０１９−２）発現プラスミドｐ５０１９−２の構築法）
実施例６で構築した形質転換株５０１８−１TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ５０１８−１TF  を調製した。
【００７０】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、ｐ５０１８−１DNAを用いた。更に、このＤＮＡプライマーとして、下記の合成プライマーＯと合成プライマーＰとを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２番目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７３残基目のアミノ酸残基をプロリンに改変した改変殺虫タンパク質５０１９−２をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５０１９−２を構築した。
該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５０１９−２ＴＦとした。
合成プライマーＯ（配列番号：２２）：
5'CTTCTTCCAATCAAATCGGGTTACCAACCGATGTGACGGATTATC3'
合成プライマーＰ（配列番号：２３）：
5'GATAATCCGTCACATCGGTTGGTAACCCGATTTGATTGGAAGAAG3'。
【００７１】
実施例８
（改変殺虫タンパク質（５０１５−１）発現プラスミドｐ５０１５−１の構築法）
実施例６で構築した形質転換株５０１９−２TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ５０１９−２TF  を調製した。
【００７２】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、プラスミドｐ５０１９−２DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、下記の合成プライマーＧと合成プライマーＨを用いて、天然型Cry1Ca(配列番号：２)の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をプロリンに、第６７２6番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７３残基目のアミノ酸残基をグルタミン酸に改変した改変殺虫タンパク質(５０１５−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５０１５−１を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ５０１５−１ＴＦとした。
合成プライマーG（配列番号：１４）：
5'CAGATGAATTTTGTCTGＧATGAAGAGGAAGAATTGTCCGAGAAAGTC3‘
合成プライマーH（配列番号：１５）：
5'GACTTTCTCGGACAATTCTTCCTCTTCATCCAGACAAAATTCATCTG3’。
【００７３】
実施例９
（改変殺虫タンパク質（３０００−１）発現プラスミドｐ３０００−１の構築法）
実施例２で構築した形質転換株９２５−２TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ９２５−２TF  を調製した。
【００７４】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、プラスミドｐ９２５−２DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、以下の合成プライマーＱと合成プライマーＲを用いて、天然型Cry1Ca(配列番号：２)の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３残基目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質(３０００−０)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ３０００−０を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ３０００−０ＴＦとした。
合成プライマーＱ（配列番号：２４）：
5'CAGATGAATTTTGTCTGGATGAAGCGGCAGAATTGTCCGAGAAAGTC3'
合成プライマーＲ（配列番号：２５）：
5'GACTTTCTCGGACAATTCTGCCGCTTCATCCAGACAAAATTCATCTG3’
次に、鋳型DNAとして、プラスミドｐ３０００−０DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、下記の合成プライマーＳと合成プライマーＴを用いて、天然型Cry1Ca(配列番号：２)の第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６８０残基目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質(３０００−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ３０００−１を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ３０００−１ＴＦとした。
合成プライマーS（配列番号：２６）：
５'GCGGCAGAATTGTCCGAGGCAGTCGCACATGCGAAGCGACTC３’
合成プライマーT（配列番号：２７）：
５'GAGTCGCTTCGCATGTGCGACTGCCTCGGACAATTCTGCCGC３’。
【００７５】
実施例１０
（改変殺虫タンパク質（４３７−２）発現プラスミドｐ４３７−２の構築法）
実施例２で構築した形質転換株９２５−２TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ９２５−２TF  を調製した。
【００７６】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、プラスミドｐ９２５−２DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、合成プライマーＵと合成プライマーＸを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第１４８残基目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質(４３７−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ４３７−１を構築した。
合成プライマーU（配列番号：２８）：
5’GAAAGGGACATTCCTTCGTTTGCAATTTCTGGATTTGAAG3’
合成プライマーX（配列番号：２９）：
5’CTTCAAATCCAGAAATTGCAAACGAAGGAATGTCCCTTTC5’
次に、鋳型DNAとしてｐ４３７−１DNAを鋳型として用いた。更に、合成プライマーとして、下記の合成プライマーＹと合成プライマーＺを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第１４８残基目のアミノ酸をアラニンに、第４３７残基目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質(４３７−２)をコードする遺伝子を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ４３７−２ＴＦとした。
合成プライマーY（配列番号：３０）：
5’CGTTTATGTCATGCAACTTTTGTTCAACAATCTGGAACACCTTTTTTAAC3’
合成プライマーＺ（配列番号：３１）：
5’GTTAAAAAAGGTGTTCCAGATTGTTGAACAAAAGTTGCATGACATAAACG3’。
【００７７】
実施例１１
（改変殺虫タンパク質（３００２−２）発現プラスミドｐ３００２−２の構築法）
実施例９で構築した形質転換株３０００−１TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ３０００−１  を調製した。
【００７８】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、プラスミドｐ３０００−１DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、合成プライマーＵと合成プライマーＸを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第１４８残基目のアミノ酸をアラニンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７２番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７３残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６７８残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６８０残基目のアミノ酸残基をアラニンに改変した改変殺虫タンパク質(３００２−２)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ３００２−２を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ３００２−２ＴＦとした。
合成プライマーＵ（配列番号：２８）：
5’GAAAGGGACATTCCTTCGTTTGCAATTTCTGGATTTGAAG3’
合成プライマーＸ（配列番号：３０）：
5’CTTCAAATCCAGAAATTGCAAACGAAGGAATGTCCCTTTC5’。
【００７９】
実施例１２
（改変殺虫タンパク質（８００１−１）発現プラスミドｐ８００１−１の構築法）
実施例３で構築した形質転換株５００８−１TFをLB培地で30℃18時間培養後、（ＱＩＡ  prepR  Spin  Miniｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製））を用いて、プラスミドｐ５００８−１TF  を調製した。
【００８０】
殺虫タンパク質遺伝子の改変は、QuickChangeR Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、次のような鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡとを用いて実施した。なお、反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、鋳型DNAとして、プラスミドｐ５００８−１DNAを用いた。更に、合成プライマーとして、下記の合成プライマーＹと合成プライマーＺを用いて、天然型Cry1Ca（配列番号：２）の第４３７残基目のアミノ酸残基をグルタミンに、第６２７残基目のアミノ酸残基をアラニンに、第６３０番目のアミノ酸残基をアラニンに、第６４５番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７２番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に、第６７３番目のアミノ酸残基をグルタミンに改変した改変殺虫タンパク質(８００１−１)をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ８００１−１を構築した。該プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換して得られた組換え微生物をｐ８００１−１ＴＦとした。
合成プライマーY（配列番号：３０）：
５’CGTTTATGTCATGCAACTTTTGTTCAACAATCTGGAACACCTTTTTTAAC３’
合成プライマーＺ（配列番号：３１）：
５'GTTAAAAAAGGTGTTCCAGATTGTTGAACAAAAGTTGCATGACATAAACG３’。
【００８１】
実施例１３
（組換え微生物における改変殺虫タンパク質の発現の確認）
実施例１〜１２で構築したｐＡ１３TF、ｐ９２５−２TF、ｐ５００４−１TF、ｐ５００５−１TF、ｐ５００８−１TF、ｐ５０１５−１TF、ｐ５０１８−１TF、ｐ５０１９−２TF、ｐ３０００−１TF、ｐ３００２−２TF、ｐ４３７−２TF及びｐ８００１−１TFのそれぞれをＬＢ培地（２ｍｌ）で３０℃１５時間培養した。内、各培養液について、１ｍｌを遠心後（７０００ｒｐｍ、５分間）し菌体を回収した。回収した菌体は、１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチウム（生化学工業製）を含む溶菌溶液（２５ｍM  Tris-HCl（ｐH8.0）、２ｍM  EDTA、５０ｍM  Glucose）に懸濁後、３７℃で１時間反応させ、溶菌させた。この溶菌液２０μＬに、４×ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（組成）、５０ｍＭ炭酸緩衝液（Na2CO3  ｐＨ９．６）を加え、１００℃で５分処置後、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（インビトロジェン社製）で解析した。殺虫タンパク質、改変殺虫タンパク質の130kDaバンドの濃さはデンシトメーターを用いて解析した。その結果、それぞれの組換え微生物における改変殺虫タンパク質の発現の程度は、全可溶性蛋白質の約１０％で、形質転換体間で大きな差は認められなかった。なお、コントロールとして図１に示した構成のプラスミドｐＵＣ−ＮＰを有するＤＨ５αを用いて上記と同様にして溶菌溶液を調製し、約130kDaに相当する位置でのタンパク質の検出があるかどうか確認したところ、約130ｋDaでのバンドは認められなかった。
【００８２】
実施例１４
（該改変殺虫タンパク質をコードする含むプラスミドによる組換え微生物を用いた防除方法）
組換え微生物ｐＡ１３TF、ｐ９２５−２TF、ｐ５００４−１TF、ｐ５００５−１TF、ｐ５００８−１TF、ｐ５０１５−１TF、ｐ５０１８−１TF、ｐ５０１９−２TF、ｐ３０００−１TF、ｐ３００２−２TF、ｐ４３７−２TF及びｐ８００１−１TFのそれぞれをLB液体培地（Difco）２０ｍｌで３０℃１６時間培養した。各培養液２０ｍｌの内の１０ｍｌを７０００ｒｐｍ、５分間遠心して、集菌した後、得られた菌体を１ｍｌの水に再懸濁した。これらの懸濁液を用いて、ハスモンヨトウに対する殺虫活性を検討した。
【００８３】
方法は、食餌混入法を用いた。すなわち、１ｇの鱗し目幼虫用人工飼料（インセクタLF  （日本農産工業製））に、上記懸濁液（２５０μＬ）を加え、よく混合した後、ハスモンヨトウの２令幼虫を５頭、放飼した。２５℃に放置後、３日後と６日後の死虫数を測定した。１群５匹で、２連で行った。処理３日後と、処理６日後に死虫率（％）を求めた。得られた結果は図２に示されている。図中のＡは天然型殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ｃａを発現プラスミドｐA１３で形質転換された組換え微生物（ｐＡ１３ＴＦ）から、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、K、Lはそれぞれ改変殺虫タンパク質発現プラスミドで形質転換された組換え微生物（ｐ４３７−２ＴＦ、ｐ９２５−２ＴＦ、ｐ３０００−１ＴＦ、ｐ５００４−１ＴＦ、ｐ５００５−１ＴＦ、ｐ５００８−１ＴＦ、ｐ５０１５−１ＴＦ、ｐ５０１８−１ＴＦ、ｐ５０１９−２ＴＦ、ｐ３００２−２TF、ｐ８００１−１TF）から調製したサンプルを示す。
【００８４】
すなわち、組換え微生物、ｐ４３７−２ＴＦ、ｐ９２５−２ＴＦ、ｐ３０００−１ＴＦ、ｐ５００４−１ＴＦ、ｐ５００５−１ＴＦ、ｐ５００８−１ＴＦ、ｐ５０１５−１ＴＦ、ｐ５０１８−１ＴＦ、ｐ５０１９−２ＴＦ、ｐ３００２−２TF、ｐ８００１−１TFの処理３日後（処理６日後）の死虫率は、それぞれ１０(２０)％、２０(５０)％、５０（９０）％、３０（７０）％、３０（７０）％、４０（８０）％、４０（８０）％、２０（７０）％、７０（９０）％、４０（８０）％、９０（１００）％、４０（９０）％であった（図２）。
【００８５】
改変殺虫タンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換された組換え微生物は、いずれも天然型殺虫タンパク質Cry1Ca遺伝子を含むプラスミドで形質転換された組換え微生物に比して数倍高い死虫率であることを示した。また、結晶化領域のＮ末端領域にのみアミノ酸残基が置換された改変殺虫タンパク質は、９２５−２、５００４−１、５００５−１、５００８−１、５０１５−１、５０１８−１、５０１９−２、３０００−１である。結晶化領域と活性化領域の両方のアミノ酸が置換されたものは、３００２−２、４３７−２、８００１−１である。すなわち、３００２−２は、３０００−１にＣｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）における第１４８番目のアミノ酸残基の置換が付加されたものであり、８０００−１は、５００８−１にＣｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）における第４３７番目のアミノ酸の置換が付加されたものであり、４３７−２はＣｒｙ１Ｃａ（配列番号：２）における第１４８番目と第４３７番目のアミノ酸残基の置換が付加されたものである。ｐ３００２−２ＴＦ、ｐ４３７−２ＴＦ、ｐ８００１−１ＴＦの殺虫活性は、付加される前のｐ３０００−１ＴＦ、ｐ９２５−２ＴＦ、ｐ５００８−１ＴＦの処理３後（処理６日後）の死虫率に比較して、それぞれ  ７０（９０）％から９０（１００）％に、２０（５０）％から４０（８０）％に、３０（７０）％から４０（９０）％に死虫率が高まった（図２）。
【００８６】
なお、実施例１３で示したように、これらの形質転換株間での殺虫タンパク質、あるいは改変殺虫タンパク質の発現の程度はほぼ同じであったことから、各組換え微生物間の死虫率の差は、殺虫タンパク質の機能の差によると考えられる。
【００８７】
このことより、本発明の組換え微生物から、改変殺虫タンパク質を製造し、その改変殺  虫タンパク質そのものを用いた害虫の防除も可能である。
【００８８】
配列のリスト
配列番号１〜３の配列は以下のとおりである。
配列番号：１
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca   60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg  120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc  180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc  240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat  300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt  360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgatcttaac atttttcccc  420
tatcattttt cccgtcttca tttgtcattt tttccagaaa aaatcgcgtc attcgactca  480
tgtctaatcc aacacgtgtc tctcggctta tcccctgaca ccgcccgccg acagcccgca  540
tgggacgatt ctatcaattc agccgcggag tctagtttta tattgcagaa tgcgagattg  600
ctggtttatt ataacaatat aagttttcat tattttcaaa aagggggatc ctccatggaa  660
ttcctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg  720
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg  780
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc  840
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt  900
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct  960
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 1020
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 1080
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 1140
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 1200
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 1260
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 1320
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 1380
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 1440
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 1500
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 1560
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 1620
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 1680
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 1740
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 1800
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 1860
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 1920
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 1980
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 2040
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 2100
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 2160
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 2220
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 2280
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 2340
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 2400
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 2460
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 2520
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 2580
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 2640
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 2700
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 2760
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 2820
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 2880
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3015
（配列番号２）
Met Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 
1               5                   10                  15
Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr 
20                  25                  30
Gly Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu 
35                  40                  45
Val Ser Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile 
50                  55                  60
Asp Phe Val Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe 
65                  70                  75
Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe 
80                  85                  90
Ala Arg Asn Ala Ala Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn 
95                  100                 105
Phe Asn Ile Tyr Val Glu Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro 
110                 115                 120
Asn Asn Pro Ala Thr Arg Thr Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile 
125                 130                 135
Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser 
140                 145                 150
Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn 
155                 160                 165
Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile Phe Gly Glu Arg 
170                 175                 180
Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn Tyr Asn Arg Leu 
185                 190                 195
Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala Asn Thr Tyr 
200                 205                 210
Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln Asp Trp 
215                 220                 225
Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu 
230                 235                 240
Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro 
245                 250                 255
Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro 
260                 265                 270
Leu Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro 
275                 280                 285
Thr Phe Asn Val Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu 
290                 295                 300
Phe Asp Ile Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser 
305                 310                 315
Val Gly Arg Asn Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser 
320                 325                 330
Leu Ile Gly Gly Gly Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu 
335                 340                 345
Ala Asn Gln Glu Pro Pro Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val 
350                 355                 360
Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro 
365                 370                 375
Trp Pro Ala Pro Pro Phe Asn Leu Arg Gly Val Glu Gly Val Glu 
280                 385                 390
Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr Tyr Arg Gly Arg Gly Thr 
395                 400                 405
Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu Asp Asn Ser Val Pro 
410                 415                 420
Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Val 
425                 430                 435
Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr Gly Val Val Phe Ser 
440                 445                 450
Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu 
455                 460                 465
Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp Gly 
470                 475                 480
Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile 
485                 490                 495
Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn 
500                 505                 510
Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr 
515                 520                 525
Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala 
530                 535                 540
Ser Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln 
545                 550                 555
Lys Thr Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg 
560                 565                 570
Tyr Thr Asp Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp 
575                 580                 585
Ile Ile Gly Ile Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile 
590                 595                 600
Ser Ser Gly Glu Leu Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala 
605                 610                 615
Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys 
620                 625                 630
Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys 
635                 640                 645
Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val 
650                 655                 660
Asp Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu 
665                 670                 675
Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn 
680                 685                 690
Leu Leu Gln Asp Pro Asn Phe Arg Gly Ile Asn Arg Gln Pro Asp 
695                 700                 705
Arg Gly Trp Arg Gly Ser Thr Asp Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp 
710                 715                 720
Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val Thr Leu Pro Gly Thr Val Asp 
725                 730                 735
Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys 
740                 745                 750
Leu Lys Ala Tyr Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp 
755                 760                 765
Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His 
770                 775                 780
Glu Ile Val Asn Val Pro Gly Thr Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser 
785                 790                 795
Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala 
800                 805                 810
Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp 
815                 820                 825
Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser His His Phe Thr Leu Asp Ile 
830                 835                 840
Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn Glu Asp Leu Gly Val Trp Val 
845                 850                 855
Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp Gly His Ala Arg Leu Gly Asn 
860                 865                 870
Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro Leu Leu Gly Glu Ala Leu Ala 
875                 880                 885
Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys 
890                 895                 900
Leu Gln Leu Glu Thr Asn Ile Val Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser 
905                 910                 915
Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser Gln Tyr Asp Arg Leu Gln Val 
920                 925                 930
Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His Ala Ala Asp Lys Arg Val His 
935                 940                 945
Arg Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly 
950                 955                 960
Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu Leu Glu Glu Arg Ile Phe Thr 
965                 970                 975
Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp 
980                 985                 990
Phe Asn Asn Gly Leu Leu Cys Trp Asn Val Lys Gly His Val Glu 
995                1000                1005
Val Glu Glu Gln Asn Asn His Arg Ser Val Leu Val Ile Pro Glu 
1010                1015                1020
Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Arg Val Cys Pro Gly Arg 
1025                1030                1035
Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu 
1040                1045                1050
Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu 
1055                1060                1065
Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu Glu Val Tyr Pro Asn Asn Thr 
1070                1075                1080
Val Thr Cys Ile Asn Tyr Thr Gly Thr Gln Glu Glu Tyr Glu Gly 
1085                1090                1095
Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Gln Gly Tyr Asp Glu Ala Tyr Gly Asn 
1100                1105                1110
Asn Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr Glu Glu Lys 
1115                1120                1125
Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu Ser Asn Arg 
1130                1135                1140
Gly Tyr Gly Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Ala Gly Tyr Val Thr Lys 
1145                1150                1155
Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp Ile Glu Ile 
1160                1165                1170
Gly Glu Thr Gly Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val Glu Leu Leu 
1175                1180                1185
Leu Met Glu Glu 
配列番号：３
ATG GAG GAA AAT AAT CAA AAT CAA TGC ATA CCT TAC AAT TGT TTA 
AGT AAT CCT GAA GAA GTA CTT TTG GAT GGA GAA CGG ATA TCA ACT 
GGT AAT TCA TCA ATT GAT ATT TCT CTG TCA CTT GTT CAG TTT CTG 
GTA TCT AAC TTT GTA CCA GGG GGA GGA TTT TTA GTT GGA TTA ATA 
GAT TTT GTA TGG GGA ATA GTT GGC CCT TCT CAA TGG GAT GCA TTT 
CTA GTA CAA ATT GAA CAA TTA ATT AAT GAA AGA ATA GCT GAA TTT 
GCT AGG AAT GCT GCT ATT GCT AAT TTA GAA GGA TTA GGA AAC AAT 
TTC AAT ATA TAT GTG GAA GCA TTT AAA GAA TGG GAA GAA GAT CCT 
AAT AAT CCA GCA ACC AGG ACC AGA GTA ATT GAT CGC TTT CGT ATA 
CTT GAT GGG CTA CTT GAA AGG GAC ATT CCT TCG TTT CGA ATT TCT 
GGA TTT GAA GTA CCC CTT TTA TCC GTT TAT GCT CAA GCG GCC AAT 
CTG CAT CTA GCT ATA TTA AGA GAT TCT GTA ATT TTT GGA GAA AGA 
TGG GGA TTG ACA ACG ATA AAT GTC AAT GAA AAC TAT AAT AGA CTA 
ATT AGG CAT ATT GAT GAA TAT GCT GAT CAC TGT GCA AAT ACG TAT 
AAT CGG GGA TTA AAT AAT TTA CCG AAA TCT ACG TAT CAA GAT TGG 
ATA ACA TAT AAT CGA TTA CGG AGA GAC TTA ACA TTG ACT GTA TTA 
GAT ATC GCC GCT TTC TTT CCA AAC TAT GAC AAT AGG AGA TAT CCA 
ATT CAG CCA GTT GGT CAA CTA ACA AGG GAA GTT TAT ACG GAC CCA 
TTA ATT AAT TTT AAT CCA CAG TTA CGA TCT GTA GCT CAA TTA CCT 
ACT TTT AAC GTT ATG GAG AGC AGC GCA ATT AGA AAT CCT CAT TTA 
TTT GAT ATA TTG AAT AAT CTT ACA ATC TTT ACG GAT TGG TTT AGT 
GTT GGA CGC AAT TTT TAT TGG GGA GGA CAT CGA GTA ATA TCT AGC 
CTT ATA GGA GGT GGT AAC ATA ACA TCT CCT ATA TAT GGA AGA GAG 
GCG AAC CAG GAG CCT CCA AGA TCC TTT ACT TTT AAT GGA CCG GTA 
TTT AGG ACT TTA TCA AAT CCT ACT TTA CGA TTA TTA CAG CAA CCT 
TGG CCA GCG CCA CCA TTT AAT TTA CGT GGT GTT GAA GGA GTA GAA 
TTT TCT ACA CCT ACA AAT AGC TTT ACG TAT CGA GGA AGA GGT ACG 
GTT GAT TCT TTA ACT GAA TTA CCG CCT GAG GAT AAT AGT GTG CCA 
CCT CGC GAA GGA TAT AGT CAT CGT TTA TGT CAT GCA ACT TTT GTT 
CAA AGA TCT GGA ACA CCT TTT TTA ACA ACT GGT GTA GTA TTT TCT 
TGG ACG CAT CGT AGT GCA ACT CTT ACA AAT ACA ATT GAT CCA GAG 
AGA ATT AAT CAA ATA CCT TTA GTG AAA GGA TTT AGA GTT TGG GGG 
GGC ACC TCT GTC ATT ACA GGA CCA GGA TTT ACA GGA GGG GAT ATC 
CTT CGA AGA AAT ACC TTT GGT GAT TTT GTA TCT CTA CAA GTC AAT 
ATT AAT TCA CCA ATT ACC CAA AGA TAC CGT TTA AGA TTT CGT TAC 
GCT TCC AGT AGG GAT GCA CGA GTT ATA GTA TTA ACA GGA GCG GCA 
TCC ACA GGA GTG GGA GGC CAA GTT AGT GTA AAT ATG CCT CTT CAG 
AAA ACT ATG GAA ATA GGG GAG AAC TTA ACA TCT AGA ACA TTT AGA 
TAT ACC GAT TTT AGT AAT CCT TTT TCA TTT AGA GCT AAT CCA GAT 
ATA ATT GGG ATA AGT GAA CAA CCT CTA TTT GGT GCA GGT TCT ATT 
AGT AGC GGT GAA CTT TAT ATA GAT AAA ATT GAA ATT ATT CTA GCA 
GAT AGA ACA TTT AAG GCA GAA TCT GAT TTA GAA GCA GCA CAA GCG 
GCG GTG AAT GCC CTG TTT ACT TCT TCC AAT CAA ATC GGG TTA AAA 
ACC GAT GTG ACG GAT TAT CAT ATT GAT CAA GTA TCC AAT TTA GTG 
GAT TGT TTA TCA GAT GAA TTT TGT CTG GAT GAA AAG CGA GAA TTG 
TCC GAG AAA GTC AAA CAT GCG AAG CGA CTC AGT GAT GAG CGG AAT 
TTA CTT CAA GAT CCA AAC TTC AGA GGG ATC AAT AGA CAA CCA GAC 
CGT GGC TGG AGA GGA AGT ACA GAT ATT ACC ATC CAA GGA GGA GAT 
GAC GTA TTC AAA GAG AAT TAC GTC ACA CTA CCG GGT ACC GTT GAT 
GAG TGC TAT CCA ACG TAT TTA TAT CAG AAA ATA GAT GAG TCG AAA 
TTA AAA GCT TAT ACC CGT TAT GAA TTA AGA GGG TAT ATC GAA GAT 
AGT CAA GAC TTA GAA ATC TAT TTG ATC CGT TAC AAT GCA AAA CAC 
GAA ATA GTA AAT GTG CCA GGC ACG GGT TCC TTA TGG CCG CTT TCA 
GCC CAA AGT CCA ATC GGA AAG TGT GGA GAA CCG AAT CGA TGC GCG 
CCA CAC CTT GAA TGG AAT CCT GAT CTA GAT TGT TCC TGC AGA GAC 
GGG GAA AAA TGT GCA CAT CAT TCC ACC TTG GAT ATT GAT GTT GGA 
TGT ACA GAC TTA AAT GAG GAC TTA GGT GTA TGG GTG ATA TTC AAG 
ATT AAG ACG CAA GAT GGC CAT GCA AGA CTA GGG AAT CTA GAG TTT 
CTC GAA GAG AAA CCA TTA TTA GGG GAA GCA CTA GCT CGT GTG AAA 
AGA GCG GAG AAG AAG TGG AGA GAC AAA CGA GAG AAA CTG CAG TTG 
GAA ACA AAT ATT GTT TAT AAA GAG GCA AAA GAA TCT GTA GAT GCT 
TTA TTT GTA AAC TCT CAA TAT GAT AGA TTA CAA GTG GAT ACG AAC 
ATC GCG ATG ATT CAT GCG GCA GAT AAA CGC GTT CAT AGA ATC CGG 
GAA GCG TAT CTG CCG GAG CTG TCT GTG ATT CCA GGT GTC AAT GCG 
GCC ATT TTT GCA GAA TTA GAA GAG CGT ATT TTC ACA GCG TTT TCC 
TTA TAT GAT GCG AGA AAT GTC ATT AAA AAT GGC GAT TTC AAT AAT 
GGC TTA TTA TGC TGG AAC GTG AAA GGG CAT GTA GAG GTA GAA GAG 
CAA AAC AAC CAC CGT TCG GTC CTT GTT ATC CCA GAA TGG GAG GCA 
GAA GTG TCG CAA GAG GTT CGT GTC TGT CCA GGT CGT GGC TAT ATC 
CTT CGT GTC ACA GCG TAC AAA GAG GGA TAT GGA GAA GGC TGC GTA 
ACG ATC CAT GAG ATC GAG AAC AAT ACA GAC GAA CTG AAA TTC AGC 
AAC TGT GTA GAA GAG GAA GTA TAT CCA AAC AAC ACG GTA ACG TGT 
ATT AAT TAT ACT GGG ACT CAA GAA GAA TAT GAG GGT ACG TAC ACT 
TCT CGT AAT CAA GGA TAT GAC GAA GCC TAT GGT AAT AAC CCT TCC 
GTA CCA GCT GAT TAT GCG TCA GTC TAT GAA GAA AAA TCG TAT ACA 
GAT GGA CGA AGA GAG AAT CCT TGT GAA TCT AAC AGA GGA TAT GGG 
GAT TAC ACA CCA CTA CCG GCT GGT TAT GTA ACA AAG GAA TTA GAG 
TAC TTC CCA GAG ACC GAT AAG GTA TGG ATT GAG ATT GGA GAA ACA 
GAA GGA ACA TTC ATC GTG GAC AGC GTG GAA TTA CTC CTT ATG GAG 
GAA TAG 
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】天然型殺虫タンパク質Cry1Ca発現プラスミド(ｐA13)の構築法を示す模式図である。
【図２】各種形質転換株殺虫活性比較を示す図である。
【図１】
2005052032.tif 000005
【図２】
2005052032.tif 000006
【配列表】
2005052032000001.app