(57)【要約】【課題】  培地の分析方法において、大規模な分析を可能とする、より迅速で自動化された方法を提供することを目的とする。【解決手段】  基板上１２に増殖培地の滴を付着させることによって、基板の表面上に複数の増殖スポット１０をプリントするステップを含む、増殖培地検査シートを製造する方法。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に増殖培地の滴を付着させることによって、基板の表面上に複数の増殖スポットをプリントするステップを含む、増殖培地検査シートを製造する方法。
【請求項２】
前記プリントするステップは、前記複数の増殖スポットのうちの少なくとも一つに栄養分を付着させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の増殖スポットは、
（ａ）一つまたは複数の増殖培地の第１の群と、
（ｂ）一つまたは複数の栄養分の第２の群と
の可能な組合せのすべてまたは一部から構成される個々のスポットを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プリントするステップは、インクジェットプリンタでプリントするステップを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって、基板上に複数の増殖スポットをプリントするステップと、
前記基板上に細胞を配置することによって、前記プリントした増殖スポットに接種を行うステップと、
前記基板上の前記細胞を培養するステップと、
細胞増殖の形跡がないか前記増殖スポットを調べるステップと
を含む、細胞培養を行う方法。
【請求項６】
基板上に増殖スポットをプリントする増殖培地プリントシステムであって、
少なくとも一つのプリントヘッドを備え、各プリントヘッドは、液体培養培地または液体栄養分を収容する槽に接続され、各プリントヘッドは、前記基板の選択された領域上に前記液体培養培地または前記液体栄養分の滴を付着させて増殖スポットを形成するように配列され、構成されている増殖培地プリントシステム。
【請求項７】
複数のプリントヘッドを備え、各プリントヘッドが接続された前記槽は、組成が異なる液体培養培地または液体栄養分を収容する、請求項６に記載の増殖培地プリントシステム。
【請求項８】
前記プリントされた増殖スポットを滅菌する滅菌装置をさらに備える、請求項６または７に記載の増殖培地プリントシステム。
【請求項９】
細胞槽に接続され、前記基板上に細胞を接種するよう配列され、構成されたプリントヘッド、または、
デコレーション試薬槽に接続され、前記基板上の増殖スポット上に試薬をプリントするよう配列され、構成されたプリントヘッド
をさらに備える、請求項６〜８のいずれか１項に記載の増殖培地プリントシステム。
【請求項１０】
自動化された細胞分析ワークステーションであって、
少なくとも一つのプリントヘッドを備えるプリンタであって、各プリントヘッドは、液体培養培地、液体栄養分、または培養可能な生物を収容する槽に接続され、各プリントヘッドは、基板の選択された領域上に前記液体培養培地、液体栄養分、または培養可能な生物の滴を付着させて増殖スポットを形成するように、配列され、構成されているプリンタと、
無菌の環境において、選択された温度を維持する手段を備える培養チャンバと、
前記培養可能な生物の培養中の増殖を検出することができる撮像装置と、
前記プリンタと前記培養チャンバとを制御するように、かつ、前記撮像装置によって得られた画像もしくは該撮像装置によって得られた画像から導き出したデータを記録するように、好適にプログラムされた、一つまたは複数のマイクロプロセッサと、
ユーザがプリントパラメータおよび培養条件を選択することができるようにし、前記画像または該画像から導き出したデータを見るかまたは保存することができるようにする、入出力システムと
を備える、自動化された細胞分析ワークステーション。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物材料を迅速に分析（assay）するための、基板上への複数のタイプの培地の調製に関する。詳細には、本発明は、インクジェットプリント機構を用いての培地の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、培地は、水およびさまざまな培養栄養分と混合した寒天ゲルを熱滅菌することによって調製されている。溶解した寒天を、ペトリ皿、試験管、または専用のビーカー等の培養容器に注ぐ。外部の源から汚染されることがないようにするために、培地は無菌または半無菌の環境において注がなければならない。溶解した寒天培地は、いったん冷却されると、分析微生物を接種され、その分析微生物が、接種された栄養培地（nutrient medium）において増殖するかどうかが判定される。
【０００３】
最も一般的な培地の分析方法において、分析にはペトリ皿を用いる。通常の、さまざまな炭水化物源上の酵母菌の分析において、例えば、ペトリ皿上に、異なる炭水化物源でできた３つのスポットを配置する。この３つの炭水化物源のそれぞれの近くに酵母菌の細胞を接種し、皿の培養環境を保つ。色の濃くなった増殖培地（growth medium）を通しての、濁度計または目視検査によって、酵母菌の増殖を判定する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述の分析法等の従来の分析における問題点の一つは、非常に時間がかかるということである。典型的なペトリ皿では、一般的に用いることができるスポットは３つしかないので、４６種類の炭水化物源を検査するただ一つの酵母菌の滴定（titer）の場合であっても、１６枚のペトリ皿が必要であり、典型的には、熟練した研究員であっても少なくとも半日はかかってしまう。大規模な分析を行う、より迅速で自動化された方法が、依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、基板の表面上に複数の増殖スポット（growth spots）をプリントすることによって増殖培地検査シート（growth medium test sheet）を製造する方法を含む。スポットは、基板上に増殖培地の滴を付着させる（depositing）ことによってプリントされる。
【０００６】
他の態様において、本発明は、基板上に増殖スポットをプリントする増殖培地プリントシステムを備える。システムは、少なくとも一つのプリントヘッドを含む。各プリントヘッドは、液体培養培地または液体栄養分（liquid nutrient）を収容する槽（reservoir）に接続され、基板の選択した領域上に液体培養培地または液体栄養分の滴を付着させて増殖スポットを形成するよう、配列され、構成されている。さらに他の態様において、本発明は、細胞培養を行う方法を含む。この方法は、基板上に増殖培地の滴を付着させる（例えば、インクジェットプリンタによって）ことによって、その基板上に複数の増殖スポットをプリントする工程と、基板上に細胞を配置することによって、プリントした増殖スポットに接種を行う工程と、細胞を培養する工程と、および細胞増殖の形跡（evidence）がないか増殖スポットを調べる工程とを含む。さらに他の態様において、本発明は、増殖培地検査シートを備える。増殖培地検査シートは、それぞれが培地を備える複数の増殖スポットをその上にプリントした基板を備える。増殖スポットは、サイズおよび形状が一様であってもよく、組成（compositions）が異なっても、実質的に同一であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明を、図面を参照して説明する。
【０００８】
本明細書において用いる「培養可能な細胞」という用語は、酵母菌、カビおよびその他の菌類、バクテリア、藻類およびその他の植物細胞、ならびにヒトおよびその他の動物細胞を含むがこれに限定するものではない、培養で（in culture）増殖することができるすべての細胞を含む。
【０００９】
本明細書において用いる「増殖培地（growth medium）」という用語は、寒天ゲル、ゼラチン、ポリマー、および細胞培養に用いることができるその他の不活性な培地すべてを含む。
【００１０】
本明細書において用いる「栄養分（nutrients）」という用語は、炭水化物およびその他の炭素源、ミネラルおよびミネラル塩、タンパク質およびアミノ酸、脂質および脂肪酸、ならびにビタミンを含むがこれに限定するものではない、摂取し、代謝作用によって化学的に変質するかまたは細胞に取り入れることができるいかなる化合物（compound）も含む。
【００１１】
本明細書において用いる「接種」という用語は、増殖培地上に調整した量の培養可能な細胞を配置するプロセス（process）を表す。
【００１２】
本明細書において用いる「培養（culturing）」という用語は、接種した増殖培地を、細胞が増殖できる状態に保つプロセスを表す。培養には、熱および／または水分を加えることが含まれてもよく、典型的には、培養を行う培地をいかなる異種細胞（foreign cells）からも隔離することが含まれる。
【００１３】
本明細書において用いる「デコレーション（Decoration）」という用語は、細胞に接触している試薬の、検出可能な変化によって、その細胞の存在または量を割り出すプロセスのことを言う（例えば、試薬は、色の変化によって培養物のｐＨを示すｐＨ指示薬であってもよく、または特定の種類（class）の細胞に優先的に結合する着色物（colored stain）であってもよい）。
【００１４】
本明細書において用いる「エリシター」という用語は、培養物の増殖を刺激または抑制することができる、任意の生化学物質のことを言う。後述する本発明の方法に従って、培養物の増殖にさまざまなエリシターが及ぼす影響を調べることができる。
【００１５】
本発明によれば、ベース基板（base substrate）のシート（例えば、透明フィルム、ガラス、またはその他の、好ましくは透明であるが必ずしも透明とは限らない好適な培養材料）に、互いに同じまたは異なる増殖培地および／または栄養分のスポットのアレイを塗布する。例えば、図１に示すように、透明シート１２上に、さまざまな組合せの増殖培地および栄養分を含む円１０のアレイを付着させてもよい。
【００１６】
図示の実施形態において、培地の増殖スポット１０はそれぞれ、隣のスポットと組成が異なる（しかし、例えば測定を重複させたり、またはさまざまな個々の細胞培養の初期条件を同一にしたりするために、いくつかの増殖スポット１０が同じ培養組成を含むことは、本発明の範囲内である。）。付着させた増殖スポット１０はそれぞれが、一つまたは複数の寒天等の増殖培地成分および／または炭水化物等の栄養分でできた、薄い層からなる。好ましくは、各増殖スポット１０の厚さは略同じである。さらに、増殖スポット１０は好ましくは、後述するように、培養物を光学的に検出しやすくするために、十分薄くて少なくとも部分的に透明である。実施形態によっては、増殖スポット１０は、それぞれのスポットの内容を識別するラベル１４を有する。
【００１７】
増殖スポット１０は、インクジェットプリンタ等のプリント機構によって、基板１２上に付着される。本発明による増殖スポットをプリントする例示的なプリンタを、図２に概略的に示す。プリンタ２０は、複数の供給ヘッド（delivery head）２２を備える。供給ヘッド２２はそれぞれ、異なる増殖培地または栄養分を収容する槽２４に接続されている（あるタイプの分析については、槽２４はまた、エリシター等、さらなる化学物質および／または生体分子を含んでもよい。例えば、培養中にビタミン等の生体分子が栄養分取込みに及ぼす影響を調べることが望ましいかもしれない）。オプションの、さらなるプリントヘッド２６を、従来のプリントインクを含む槽２８に接続してもよい。プリンタはさらに、紙、透明シート、ガラス、またはその他のプリント媒体上にプリントするための、当該技術分野において従来既知のもの等の基板処理手段３０を備える。ヒータ３２またはその他の滅菌手段もまた任意選択的に含んで、基板１２および増殖培地スポット１０が無菌状態であることを保証してもよい。
【００１８】
使用において、図２のプリンタ２０は、例えば従来のドロップオンデマンドのインクジェットプリント技法を用いて、槽２４から増殖培地および栄養分の小滴を付着させることによって、図１に示すもの等の基板１２上に増殖スポット１０のアレイをプリントする。当該技術分野において既知であるその他のプリント技法もまた、本発明の範囲内に含まれる。増殖スポット１０は、単一の増殖培地もしくは栄養分を含んでもよく、重ねてプリントすることまたは同時に付着させることによって製造した、培地および／または栄養分の混合物を含んでもよい。
【００１９】
好ましい実施形態において、プリンタ２０はまた、スポットの内容を識別する、それぞれの増殖スポット１０用のラベル１４もプリントする。ラベルは、テキスト、バーコード、またはその他の識別表示を含んでもよく、ブラック、カラー、またはマルチカラーでプリントしてもよい。
【００２０】
基板１２上に増殖スポットをプリントする前または後に、プリンタは任意選択的に、ヒータ３２、紫外線ランプ（図示せず）、またはその他の接種前に培地を滅菌する既知の機構等の、滅菌手段を含んでもよい。
【００２１】
滅菌後（滅菌を行う場合には）、酵母菌、カビ、バクテリア、またはその他の細胞等の検査する生物体が、基板１２上に接種される。接種は、増殖スポット１０のプリントと同じ方法で生物溶液をプリントすることによって行ってもよく、あらかじめプリントされたシート１２に対して手作業で行ってもよい。生物のプリントが、増殖スポットと同じ装置において行われる場合には、それぞれの増殖スポット１０における生物の量および配置を精密に制御することができる。しかしこの場合、該当する増殖培地および栄養分の槽２４をすべて、実験が行われる場所に有して、プリントが同時に行えるようにすることが必要である。または、さまざまな培地スポットをあらかじめプリントしたシートを、調製して使用するまで無菌状態で保管してもよい。このようなシートは、生物の検査を行わなければならないときにはいつでも、手作業で接種することも、プリンタを用いて接種することもできる。図３は、接種後の図１の検査シートを示す。接種スポット１６は、それぞれの増殖スポット１０の中心にプリントされている。
【００２２】
接種後、従来の技法を用いて基板１２を培養し、検査生物が増殖できるようにする（例えば、有意な細胞分裂が生じるのに十分な時間の間、基板を適切な温度および湿度状態に保つことによって）。次に基板１２を調べて、どの増殖培地が検査生物の増殖を促進するかを判定する。実施形態によっては、シートをスキャナまたはその他の分析装置内に配置して、透過光または反射光のどちらかによって濁度を測定することによって、正の（positive）増殖を判定してもよい。さらに、特に透明な基板については、増殖を肉眼で見ることができる。
【００２３】
培養中の増殖の検出を向上させるために、増殖スポットをデコレーションすることもまた、本発明の範囲内である。検査生物の増殖に悪影響を及ぼさないデコレーション試薬は、増殖が起こる前に塗布してもよいが、望ましくない有毒作用を有する試薬は、培養後に塗布するべきである。どちらの場合にも、デコレーション試薬は、増殖培地および栄養分と同じ方法でプリントによって塗布してもよく、手作業で塗布してもよい。無毒の試薬は、増殖スポット１０と同時にプリントしてもよい。培養後に試薬を塗布する場合には、基板１２をもう一度プリンタを通して供給し、試薬を配置してもよい。デコレーション後、上述のようにスキャナまたはその他の分析装置を用いて増殖を観察する。図４は、培養およびデコレーション後の図３の検査シートを示す。異なる増殖スポット１０は、細胞培養物の増殖の度合いに対応する、異なる濃さを有する。（その他のデコレーション試薬を用いて、増殖スポットの色合い（hue）もまた、細胞増殖の度合いを反映するようにしてもよい。）
【００２４】
本発明に従って増殖スポット１０がプリントされるときには、従来の手作業で増殖培地を付着させる方法と比較して、プリントが一貫している（consistency）ので、増殖スポット１０の電子計測技術（electronic metrology）が向上する。さらに、増殖スポットと同時に検査シート上にラベルをプリントすることができるので、分析結果の解釈において混同を防止するのに役立つ。
【００２５】
本発明の方法はまた、従来の増殖の静的分析に加えて、より動的な情報を得るのに用いてもよい。細胞増殖の動的情報を得るために、リアルタイムでまたはコマ撮りで細胞増殖の自動分析を行ってもよい。例えば、一定の間隔（リアルタイムの情報を効果的に提供するのに十分短くてもよい）をあけてシートをスキャンすることによって、細胞増殖の進行の「ムービー（movies）」を得てもよい。または、異なる増殖スポットを特徴づける非画像データ（例えば、濁度、サイズ、および／またはカラー）を、間隔を置いて記録してもよい。このようなデータを比較して、例えば、さまざまな培地および栄養分が細胞増殖の速度に及ぼす影響、または、さまざまな生物の相対的増殖特性に及ぼす影響を判定してもよい。
【００２６】
動的方法はまた、一つまたは複数のエリシターが生物（複数可）に及ぼす影響を捕らえるのに用いてもよい。例えば、異なるエリシターを異なる増殖スポットに加えて、それらが増殖速度に及ぼす影響を判定してもよい。細胞とエリシターとの相互作用を特徴づけるために、増殖速度と培養形態学（growth morphology）とは両方とも、時間の関数として測定してもよい。細胞形態学を特徴づけるときには、個々の細胞の特性が観察できるように好ましくは高倍率が用いられる。エリシターの添加後直ちに高速画像取込みを用いることによって、細胞の過渡的な挙動もまた調べることができる。
【００２７】
本発明の一実施形態は、完全に自動化された細胞分析ワークステーションである。ワークステーションは、上述のように増殖培地、細胞、ならびに任意選択的に、栄養分、エリシター、デコレーション試薬、および／またはその他の生体分子を付着させるのに用いるプリンタと、増殖細胞のシートを適切な培養状態に保持する好適な培養領域とを備える。ワークステーションはさらに、培養物の増殖を一度だけまたは動的に測定する、スキャナ、カメラ、またはその他の撮像システムを備える。ワークステーションは、好ましくはまた、測定した培養物に対して、画像分析、パターン認識、過渡分析、組合せ統計（combinatorial statistics）、またはその他の計算動作を行うよう好適にプログラムされた、マイクロプロセッサも備える。ユーザは単に、所望の実験に合わせてワークステーションをプログラムして適切な細胞および試薬を供給すればよく、そうすると自動化されたシステムが実験を行い、培養物の画像の提供および培養物の増殖パターンの分析を含む、所望のフォーマットで結果を提供する。
【実施例】
【００２８】
具体的な実施例において、本発明を、β−ガラクトシダーゼを製造しないゲノムを有するプラスミド形質転換大腸菌株におけるβ−ガラクトシダーゼの活性の存在の分析に用いる。ゲノムのプラスミド形質転換後、個々のバクテリアのうちのいくつかは、β−ガラクトシダーゼを生成する能力を持つ。β−ガラクトシダーゼの存在下で青になる寒天とＸ−ｇａｌとの混合物を用いて、本発明に従って増殖培地をプリントする。次に、形質転換したバクテリアを少量、増殖培地スポットに重ねてプリントし、シートを培養して増殖が可能になるようにする。青になる増殖スポットは、β−ガラクトシダーゼを製造するゲノムを含むプラスミド形質転換大腸菌のコロニーを含んでいる。従来のスキャン技術を用いて、このようなスポットを自動的に検出することができる。
【００２９】
他の実施例において、同じシート上にさまざまな組の増殖培地をプリントすることができる。それぞれのプリントした領域は、単一の増殖培地から成っており、それぞれの増殖培地は、炭水化物の組成が異なることによって互いに異なっている。次に、このようなスポットに酵母菌またはバクテリアの細胞をプリントすることができる。プリントした領域での増殖は、炭水化物の正の代謝を示す。炭水化物のこのタイプの検査は、酵母菌の種類を区別するのに非常に有用である。
【００３０】
プリントしたアレイから増殖したコロニーに、エリシターを添加してもよい。アレイは、毒素にさらすと色が変化する細胞等であれば、細胞の働きを変化させる生化学毒素（biochemical toxins）にさらしてもよい。
【００３１】
本明細書を検討し本明細書において開示する本発明を実施すれば、その他の実施形態は、当業者には明白となろう。本明細書および実施例は、単に例示的であるとみなされることが意図され、本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって示される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の実施形態による、増殖培地スポットのアレイをプリントした透明シートである。
【図２】本発明の実施形態による、基板上に増殖スポットをプリントするプリント機構である。
【図３】本発明の実施形態による、接種後の図１の透明シートを示す。
【図４】本発明の実施形態による、培養およびデコレーション後の図３の検査シートを示す。
【符号の説明】
【００３３】
１０  増殖スポット
１２  基板
１４  ラベル
１６  接種スポット
２０  プリンタ
２２  供給ヘッド
２４  槽
２６  プリントヘッド
２８  従来のプリントインクを含む槽
３０  基板処理手段
３２  ヒータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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