(57)【要約】【課題】  生菌を含有するか含有する可能性のある検体からフルオレセイン系蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供すること。【解決手段】  微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌にフルオレセイン系蛍光試薬を接触させてから、または、フルオレセイン系蛍光試薬を接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を検出した後、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の加熱による化学変化に基づく消光を誘発せしめ、加熱前の輝度に比較して輝度が低下した光点を生菌由来の光点と判断することを特徴とする。【選択図】  図１
2005065570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌にフルオレセイン系蛍光試薬を接触させてから、または、フルオレセイン系蛍光試薬を接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を検出した後、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の加熱による化学変化に基づく消光を誘発せしめ、加熱前の輝度に比較して輝度が低下した光点を生菌由来の光点と判断することを特徴とする生菌検出方法。
【請求項２】
フルオレセイン系蛍光試薬から生成した蛍光物質がカルボキシフルオレセイン系化合物であることを特徴とする請求項１記載の生菌検出方法。
【請求項３】
フルオレセイン系蛍光試薬が５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）（Ｎ−スクシニミジルオキシカルボニル）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインから選ばれることを特徴とする請求項１または２記載の生菌検出方法。
【請求項４】
フィルタを４０℃〜６０℃に加熱することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の生菌検出方法。
【請求項５】
微生物採取用フィルタの加熱手段と、微生物採取用フィルタの微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、微生物採取用フィルタの加熱前と加熱後にそれぞれ前記光源によって励起光が照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、加熱前の輝度に比較した加熱後の輝度の低下が設定した値以上のときに生菌と判断する生菌判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、生菌判断手段から生菌と判断された信号から生菌の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする生菌計数装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体からフルオレセイン系蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光性酵素基質であるフルオレセイン系蛍光試薬が生菌を検出するための試薬として有用であることは、当業者によく知られている事実である。フルオレセイン系蛍光試薬は、生菌に細胞膜を透過して取り込まれると、細胞質内のエステラーゼなどの酵素により加水分解されてフルオレセイン骨格を有する蛍光物質（５−カルボキシフルオレセインなど）に変換されて発光機能が発現する。従って、微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌にフルオレセイン系蛍光試薬を接触させてから、または、フルオレセイン系蛍光試薬を接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を生菌と判定する方法が古くから知られている。
【０００３】
しかしながら、上記の方法では生菌を正確に検出することができないという問題がある。なぜならば、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の蛍光波長と類似した蛍光波長を有する自家蛍光物質が自然界には多く存在するので、このような自家蛍光物質がフィルタ上に存在すると、励起光を照射することで生じる光点が、いずれの物質由来のものであるのか区別をつけがたい側面を有するからである。
【０００４】
そこで、下記の特許文献１において、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点の蛍光画像を記録した後、染色された媒体に光照射して光退色を誘発せしめてから再び蛍光画像を記録し、光照射前後の蛍光画像の差画像として現れた光点を生菌と判断する方法が提案されている。この方法は、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質に強力な励起エネルギーを有する励起光を照射することによる蛍光の減弱、即ち、光退色という現象を利用し、フィルタ上の自家蛍光物質の存在による生菌の検出精度への影響を排除しようとするものである。
【特許文献１】特開平１０−２１５８９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記の特許文献１において提案されている方法によっても、必ずしも満足できる成果を得ることができるわけではない。なぜならば、特許文献１の段落番号００１８にも記載の通り、光退色は生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質のみに起こる現象ではなく、岩石等も光退色するので、岩石等が夾雑物としてフィルタ上に存在すると、生菌の検出精度に影響を及ぼすことになるからである。本発明者は、検体に含まれる自家蛍光する夾雑物の多くが光退色することを確認している。岩石等のような質量があるとか、蛍光性が強い夾雑物の光退色は軽微であるが、食品等の検体に含まれる自家蛍光する夾雑物には、微弱な蛍光性を持つものが多く含まれており、これらは生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の光退色具合と極めて近似した程度の光退色を起こす。これは、光退色は、蛍光エネルギー源である蛍光物質に強力な励起エネルギーを有する励起光を照射することで当該物質が有する蛍光エネルギーを短時間で消費せしめることによる現象であるが、光退色の程度は、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質が保有する蛍光エネルギーと自家蛍光する夾雑物が保有する蛍光エネルギーの消費競争に基づくことによる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体からフルオレセイン系蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することを目的とする。
【０００７】
上記の点に鑑みてなされた本発明の生菌検出方法は、請求項１記載の通り、微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌にフルオレセイン系蛍光試薬を接触させてから、または、フルオレセイン系蛍光試薬を接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉してから、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を検出した後、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の加熱による化学変化に基づく消光を誘発せしめ、加熱前の輝度に比較して輝度が低下した光点を生菌由来の光点と判断することを特徴とする。
また、請求項２記載の生菌検出方法は、請求項１記載の生菌検出方法において、フルオレセイン系蛍光試薬から生成した蛍光物質がカルボキシフルオレセイン系化合物であることを特徴とする。
また、請求項３記載の生菌検出方法は、請求項１または２記載の生菌検出方法において、フルオレセイン系蛍光試薬が５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）（Ｎ−スクシニミジルオキシカルボニル）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインから選ばれることを特徴とする。
また、請求項４記載の生菌検出方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の生菌検出方法において、フィルタを４０℃〜６０℃に加熱することを特徴とする。
また、本発明の生菌計数装置は、請求項５記載の通り、微生物採取用フィルタの加熱手段と、微生物採取用フィルタの微小な一定面積に予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって発光する予め定められた波長域の光を受光する受光手段と、微生物採取用フィルタの加熱前と加熱後にそれぞれ前記光源によって励起光が照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し、加熱前の輝度に比較した加熱後の輝度の低下が設定した値以上のときに生菌と判断する生菌判断手段と、前記微小な一定面積を連続または断続的に移動させる移動手段と、生菌判断手段から生菌と判断された信号から生菌の数量を積算する積算手段を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の生菌検出方法は、上記の特許文献１において提案されている方法とは異なり、生菌に取り込まれたフルオレセイン系蛍光試薬から生成したフルオレセイン骨格を有する蛍光物質に対し、光退色を誘発せしめるのではなく、消光を誘発せしめる、つまり、当該物質が保有する蛍光エネルギーを消費せしめるのではなく、化学変化により光ることをできなくすることを特徴とする。フルオレセイン骨格を有する蛍光物質は、他の蛍光物質よりも加熱によって容易に化学変化するので、５０℃程度の低温でも分解して消光を起こす。本発明者の知見によれば、フルオレセイン骨格を有する蛍光物質由来の光点の消光減衰特性は、自家蛍光物質由来の光点の消光減衰特性と減衰速度の点で大きな違いがあることから、この消光減衰特性の違いを利用することで、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において用いることができるフルオレセイン系蛍光試薬としては、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（６−）カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル、５−（６−）スルホフルオレセインジアセテート、フルオレセインジアセテート、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート、５−（６−）（Ｎ−スクシニミジルオキシカルボニル）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインなどの公知の試薬が挙げられる。これらの試薬は、生菌に細胞膜を透過して取り込まれると、細胞質内のエステラーゼなどの酵素により加水分解されてフルオレセイン骨格を有する蛍光物質であるカルボキシフルオレセイン系化合物に変換されて発光機能が発現する。
【００１０】
以下、本発明の生菌検出方法を順を追って説明する。
【００１１】
まず、微生物採取用フィルタ上に捕捉した生菌にフルオレセイン系蛍光試薬を接触させるか、または、フルオレセイン系蛍光試薬を接触させた生菌を微生物採取用フィルタ上に捕捉する。この操作は自体公知の方法に準じて行えばよい。本発明において生菌を含有するか含有する可能性のある検体は液状検体であるが、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合は、それ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合は、それをホモジナイズして液状検体としたり、その表面から綿棒などを用いて生菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体としたりする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて生菌を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。こうした液状検体を微生物採取用フィルタで吸引濾過することでフィルタ上に生菌を捕捉してから試薬をフィルタの上方から滴下するか、または、液状検体に試薬を混合した後、液状検体を微生物採取用フィルタで吸引濾過することで、フィルタ上に染色された生菌を捕捉する。
【００１２】
なお、微生物採取用フィルタとしては、例えば、孔径が０．１μｍ〜１μｍの公知のものを用いることができる。
【００１３】
次に、フィルタ上に励起光を照射することで生じる光点を検出する。この操作は、例えば、カルボキシフルオレセイン系化合物は、波長が４９５ｎｍ付近の励起光を照射した場合、波長が５２４ｎｍ付近の蛍光を発するので、当該蛍光をＣＣＤカメラを用いて画像撮影することにより行えばよい。
【００１４】
次に、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の加熱による化学変化に基づく消光を誘発せしめる。この操作は、例えば、フィルタを４０℃〜６０℃に加熱することで行うことが望ましい。加熱温度が４０℃を下回ると、蛍光物質の化学変化を十分に引き起こすことができない恐れがある一方、加熱温度が６０℃を上回ると、微生物採取用フィルタの構成素材（高分子樹脂など）の熱変形などを引き起こすことで、加熱前後での光点の定点比較ができなくなる恐れがあることに留意する必要がある。
【００１５】
その後、フィルタ上に励起光を再び照射してから画像撮影し、加熱前後での光点の定点比較をすることで、光点の消光減衰特性を調べる。その結果、加熱前の輝度に比較して輝度が速やかに低下した光点は、その消光が生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の加熱による化学変化に基づくものであるとし、蛍光物質由来の光点と判断する。一方、加熱前の輝度に比較して輝度が低下しない光点や、低下してもその低下率がごく僅かであったり低下に時間を要したりする光点は、自家蛍光物質由来の光点と判断する。
【００１６】
なお、必要であれば、蛍光物質の加熱による消光誘発操作と加熱前後での光点の定点比較を更に繰り返して行ってもよい。
【００１７】
図３は、本発明の生菌検出方法を好適に実施するための生菌計数装置の一態様を示す概念図である。この生菌計数装置１は、光源１０４、光源集光手段としてのレンズ１１０、受光部１１１を含む。光源１０４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ１１２で分光する。分光された励起光はダイクロイックミラー１１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１１０を経て検査台１１６にセットされた微生物採取用フィルタ２（別途の操作によりフィルタ上に染色された生菌を捕捉してあるもの）上に集光される。光源１０４から発せられた励起光は、レンズ１１０によって集光されるが、その際、レンズ１１０によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。ここで、微小な一定面積とは、直径１ｍｍ程度の範囲を指し示す。励起光を照射する範囲（微小な一定面積）は、フィルタ上の全域にわたって図略の移動手段により連続的にまたは断続的に移動させられる。励起光により励起された生菌が発する蛍光は、再びダイクロイックミラー１１３を透過する。その際、蛍光はダイクロイックミラー１１３をそのまま透過し、受光部１１１に到達する。一定の時間内に受光部１１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ１１４を経て、受光部１１１に内蔵された光電変換素子１１５に到達し、信号化され、認識されて画像にされる。
【００１８】
この生菌計数装置１は、検査台１１６にセットされた微生物採取用フィルタ２の加熱手段１１７を有する。この加熱手段１１７は、例えば、近赤外線を主としてフィルタ上に照射することができるロングパスフィルタを付けたハロゲンランプである。蛍光の画像撮影が行われた後、微生物採取用フィルタ２をセットした検査台１１６は、加熱手段１１７の下方に移動させられ、微生物採取用フィルタ２が加熱されることで、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質の加熱による化学変化に基づく消光が誘発される。
【００１９】
その後、微生物採取用フィルタ２をセットした検査台１１６は、再びレンズ１１０の下方に移動させられ、フィルタ上に励起光が照射されてから画像撮影される。
【００２０】
最後に、生菌判断手段１０５によって、加熱前後の画像比較による光点の定点比較がなされ、加熱前の輝度に比較した加熱後の輝度の低下が設定した値以上の光点は生菌由来の光点と判断され、生菌と判断された光点は図略の積算手段により積算されて計数される。
【００２１】
なお、微生物採取フィルタの加熱手段は、フィルタをその下面から直接加熱することができる検査台１１６に埋設されたヒータなどであってもよい。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例と比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００２３】
実施例１：本発明の熱分解消光法の効果について
２つの液状検体を用意した。１つは前培養した大腸菌懸濁水で、１つは４０％（ｗ／ｖ）含水エタノールに混合し４８時間滅菌した工場用水である。
２つの液状検体を各々孔径が０．４μｍの微生物採取用フィルタ（メンブレンフィルタ）で吸引濾過し、一方のフィルタ上に大腸菌を、他方のフィルタ上に工業用水中夾雑物を捕捉した。
フィルタの上方から濃度５０μＭの５−（６−）カルボシキフルオレセインジアセテートの水溶液を滴下し、３０分間染色を行った後、再び吸引濾過してフィルタ上の液状成分を除去した。
こうして調製されたフィルタを、図３の構成を有する生菌計数装置の検査台にセットし、フィルタ上に波長が４９５ｎｍの励起光を照射して波長が５２４ｎｍの蛍光を発する光点の初期画像撮影を行った。
初期画像撮影を行った後、加熱手段として波長が６２０ｎｍのロングパスフィルタを付けた２０Ｗのハロゲンランプを用い、この光源から近赤外線を主としてフィルタ上に３０秒間照射して加熱による消光誘発操作を行った。非接触式赤外線温度計にて照射後のフィルタ表面の温度を測定すると約５０℃であった（加熱程度は照射時間で制御）。
フィルタ表面の温度が室温程度になるまで冷却した後、再びフィルタ上に波長が４９５ｎｍの励起光を照射して波長が５２４ｎｍの蛍光を発する光点の後期画像撮影を行った。
引き続いて後期画像撮影を行ったフィルタ上に、加熱手段として波長が６２０ｎｍのロングパスフィルタを付けた２０Ｗのハロゲンランプを用い、この光源から近赤外線を主として３０秒間照射して２回目の加熱による消光誘発操作を行った。そしてフィルタ表面の温度が室温程度になるまで冷却した後、フィルタ上に波長が４９５ｎｍの励起光を照射して波長が５２４ｎｍの蛍光を発する光点の２回目の後期画像撮影を行った。さらに以上の操作を繰り返し、３回目、４回目の加熱による消光誘発操作と後期画像撮影を行った。
初期画像中において、一定以上の輝度（ＣＣＤ階調レベル０〜２５５）と大きさ（ＣＣＤ画素数）を持つオブジェクトを所定数抽出し、このオブジェクトが各消光誘発回数の後期画像中においてどのように変化したかを、初期画像中より抽出した各オブジェクトの輝度値に対するこのオブジェクトの各消光誘発回数の後期画像中における輝度値の減衰率を算出し、そして輝度値の減衰率が５０％以内のオブジェクトを計数し、総オブジェクト数に対する存在比率を算出することで調べた。
２つの液状検体について、初期画像中における輝度値に対する消光誘発回数毎に撮影した後期画像中における輝度値の減衰率が５０％以内のオブジェクトの存在比率の推移を調べた結果を図１に示す。図１において、縦軸は輝度値の減衰率が５０％以内のオブジェクトの存在比率を示し、横軸は消光誘発のための近赤外線を主とした累積照射時間を示す。図中における実線は液状検体が大腸菌懸濁水の場合の推移である。破線は液状検体が工場用水の場合の推移である。
図１から明らかなように、大腸菌に取り込まれたフルオレセイン系蛍光試薬から生成したフルオレセイン骨格を有する蛍光物質由来のオブジェクトの消光減衰特性は、工業用水中の蛍光性を有する夾雑物由来のオブジェクトの消光減衰特性と大きく異なり、短時間の加熱によって速やかに消光した。
従って、以上の実験結果から、近赤外線を主とした累積照射時間が３０秒〜６０秒の範囲で、後期画像中において、初期画像中における輝度よりも輝度が大きく低下したオブジェクト（例えば輝度値の減衰率が５０％以上のもの）は、生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質由来のものであり、生菌を極めて高い確率で検出できることがわかった。
なお、以上の実験結果の再現性は、大腸菌懸濁水と工場用水以外の液状検体を用いた同様の実験によって確認済みである。
【００２４】
比較例１：従来法である光退色法の効果について
実施例１と同様にして２つの液状検体を用意し、染色された大腸菌を捕捉したフィルタと、染色された工業用水中夾雑物を捕捉したフィルタを調製した。実施例１における加熱手段のかわりに、蛍光顕微鏡の光源である１００Ｗのハロゲンランプを用い、この光源から発せられる励起光を励起バンドパスフィルタ（波長４７０ｎｍ〜４９０ｎｍ）とダイクロイックミラー（波長５０５ｎｍ）を経てフィルタ上に照射し（光照射量は照射時間で制御）、染色された大腸菌と染色された工業用水中夾雑物の光退色を誘発せしめること以外は実施例１と同様にして、２つの液状検体について、初期画像中における輝度値に対する光退色誘発回数毎に撮影した後期画像中における輝度値の減衰率が５０％以内のオブジェクトの存在比率の推移を調べた。結果を図２に示す。図２において、縦軸は輝度値の減衰率が５０％以内のオブジェクトの存在比率を示し、横軸は光退色誘発のための励起光の累積照射時間を示す。図中における実線は液状検体が大腸菌懸濁水の場合の推移である。破線は液状検体が工場用水の場合の推移である。
図２から明らかなように、光退色法による２つの液状検体における輝度値の減衰率が５０％以内のオブジェクトの存在比率の推移は、実施例１の熱分解消光法によるそれと大きく異なり、大腸菌に取り込まれたフルオレセイン系蛍光試薬から生成したフルオレセイン骨格を有する蛍光物質が光退色していく具合と、工業用水中の蛍光性を有する夾雑物が光退色していく具合とに、大きな差異が見られなかった。これは、大腸菌内の蛍光物質の量と工業用水中の蛍光性を有する夾雑物の量の差異が直接的に輝度の低下として表れるためであり、微生物の大きさである１μｍ程度の自然界に存在する蛍光性を有する物体は、光退色法によって極めて容易に光退色し、輝度の低下を起こすことが判明した。
従って、以上の実験結果から、短時間のうちに速やかに光退色する物体であっても、その特性を生菌に取り込まれた試薬から生成した蛍光物質に基づくものであると判断することはできないことがわかった。
なお、以上の実験結果の再現性は、大腸菌懸濁水と工場用水以外の液状検体を用いた同様の実験によって確認済みである。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、生菌を含有するか含有する可能性のある検体からフルオレセイン系蛍光試薬を用いて生菌を検出する方法であって、従来から知られている方法と比較してより正確に生菌の検出を行うことができる方法および生菌計数装置を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例における本発明の熱分解消光法の効果を示すグラフ。
【図２】同、従来法である光退色法の効果を示すグラフ。
【図３】本発明の生菌検出方法を好適に実施するための生菌計数装置の一態様を示す概念図。
【符号の説明】
【００２７】
１  生菌計数装置
２  微生物採取フィルタ
１０４  光源
１０５  生菌判断手段
１１０  レンズ
１１１  受光部
１１２  励起光分光フィルタ
１１３  ダイクロイックミラー
１１４  蛍光分光フィルタ
１１５  光電変換素子
１１６  検査台
１１７  加熱手段
【図１】
2005065570.tif 000003
【図２】
2005065570.tif 000004
【図３】
2005065570.tif 000005