(57)【要約】【課題】血管新生の促進方法及び阻害方法の提供。【解決手段】  血管内皮細胞においてIdタンパク質の発現を抑制することを特徴とする血管新生の阻害方法、血管内皮細胞においてIdタンパク質の発現を誘導することを特徴とする血管新生の促進方法、発現を阻害する対象mRNAにおける５’末端近傍から“aa”又は“a”で始まる配列を標的配列として設計されたshRNA、前記shRNAを含む医薬組成物、及びIdタンパク質をコードする遺伝子を含む医薬組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞においてIdタンパク質の発現を抑制することを特徴とする血管新生の阻害方法。
【請求項２】
Idタンパク質の発現の抑制が、RNA干渉を利用するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
RNA干渉がshRNAによるものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
shRNAがID1 shRNA及び/又はID3 shRNAである請求項３記載の方法。
【請求項５】
ID1 shRNAが、配列番号１〜５に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つである請求項４記載の方法。
【請求項６】
ID3 shRNAが、配列番号６〜８に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つである請求項４記載の方法。
【請求項７】
Idタンパク質がId1タンパク質及び/又はId3タンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項８】
血管内皮細胞においてIdタンパク質の発現を誘導することを特徴とする血管新生の促進方法。
【請求項９】
Idタンパク質の発現の誘導が、血管新生促進因子を作用させるものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
血管新生促進因子が血管内皮細胞増殖因子又はトランスフォーミング増殖因子βである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Idタンパク質がId1タンパク質及び/又はId3タンパク質である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
発現を阻害する対象mRNAにおける５’末端近傍から“aa”又は“a”で始まる塩基配列を標的配列として設計されたshRNA。
【請求項１３】
72塩基以下の長さの配列からなる請求項12記載のshRNA。
【請求項１４】
shRNAがID1 shRNA又はID3 shRNAである請求項12又は13記載のshRNA。
【請求項１５】
ID1 shRNAが、配列番号１〜５に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つである請求項14記載のshRNA。
【請求項１６】
ID3 shRNAが、配列番号６〜８に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つである請求項14記載のshRNA。
【請求項１７】
請求項12〜16のいずれか１項に記載のshRNAを含む医薬組成物。
【請求項１８】
遺伝子治療剤である請求項17記載の医薬組成物。
【請求項１９】
関節リウマチの治療に用いられることを特徴とする請求項17又は18記載の医薬組成物。
【請求項２０】
Idタンパク質をコードする遺伝子を含む医薬組成物。
【請求項２１】
遺伝子治療剤である請求項20記載の医薬組成物。
【請求項２２】
循環器系疾患の治療に用いられることを特徴とする請求項20又は21記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮細胞におけるIdタンパク質の発現調節を行なうことにより血管新生を促進又は阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ (Rheumatoid arthritis: RA)は、関節の炎症と、それに続いて起こる骨や軟骨の破壊によって特徴付けられ、自己免疫の関与が想定される疾患である。RAにおいては、線維芽細胞様滑膜の異常増殖とそれに伴う炎症性細胞の関節部位への遊走(非特許文献１）及び滑膜への浸潤、炎症性サイトカインの産生(非特許文献２）、血管新生(非特許文献３）等の現象が関節破壊の場で生じることが知られている。
【０００３】
本発明者は、以前の研究において、RA及び変形性関節症（osteoarthritis: OA）の滑膜組織におけるmRNA発現プロフィールの比較によって、RA滑膜組織におけるID（inhibitor of DNA binding/differentiation）遺伝子群の発現が増強すること、並びにId1及びId3タンパク質がRA滑膜組織内の血管内皮細胞に局在することを見出した(非特許文献４）。Idタンパク質は、Id1〜Id4で構成される分子群であり、いずれもへリックスループ-へリックス（HLH）ドメインを有するが、DNAへの結合に必要な塩基性領域を欠いている(非特許文献５）。元来、Idタンパク質は、その構造上の理由からMyoDやRbなどの塩基性HLH転写因子に対するドミナントネガティブな拮抗分子として同定されており(非特許文献５、６）、分化の過程において非常に重要な働きをすると考えられている(非特許文献７、８、９、10、11）。これらの分子は胎生期の組織やいくつかの癌細胞中において強い発現が確認されているのに対し(非特許文献12）、分化段階ではその発現が抑えられていることが知られている(非特許文献13、14）。また、Idは細胞増殖や細胞周期の前進（例えばG1期からS期への移行）も司っている(非特許文献15）。
【０００４】
これまでに、Idは細胞周期の制御を行うp16遺伝子のプロモーター領域の転写を促進するEts1、Ets2又はbHLH転写因子に直接結合してその作用を阻害し、p16タンパク質(非特許文献16）の発現を抑えることによって、細胞周期の停止を阻害することが知られている。これまでの報告によれば、Ras-ERK MAPKカスケード(非特許文献17）やSmad1/5のシグナル(非特許文献18）を受けてId3の転写が誘導されるということが知られている。
【０００５】
近年の研究によって、上記以外のIdの新たな機能が明らかになっている。例えば、Id1+/-Id3-/-マウスでは移植された腫瘍組織の増殖にとって必要な血管新生が起きず(非特許文献19）、癌の進行は進まなかった。このことは、成熟した組織内での血管新生にはId1及びId3の存在が必須であるということを示している。成人の組織において、血管新生は、癌にのみ起こる現象ではなく、RAのような慢性炎症疾患についても同様に観察される現象である。
【０００６】
一方、ID遺伝子ノックアウトマウスでは癌において血管新生が抑制されたことから、ID遺伝子は、血管新生を伴う増殖性疾患の治療標的の可能性を有することが記載されている（WO01/66784号：特許文献１）。また、ID遺伝子を標的としたアンチセンス化合物も開示されている（米国特許第6372433号：特許文献２）。
【０００７】
しかし、ヒトの炎症性疾患に関連するIdの重要性は知られていない。
【特許文献１】国際公開第01/66784号パンフレット
【特許文献２】米国特許第6372433号明細書
【非特許文献１】Firestein, G.S. Arthritis Rheum. 39, 1781-1790 (1996)
【非特許文献２】Feldmann, M. et al. Cell 85, 307-310 (1996)
【非特許文献３】Koch, A.E. Arthritis Rheum. 41, 951-962 (1998)
【非特許文献４】Sakurai, D. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284, 436-442 (2001)
【非特許文献５】Benezra, R. et al. Cell 61, 49-59 (1990)
【非特許文献６】Lasorella, A. et al. Nature 407, 592-598 (2000)
【非特許文献７】Wilson, R.B. et al. Mol. Cell Biol. 11, 6185-6191 (1991)
【非特許文献８】Sun, X.H. et al. Mol. Cell Biol. 11, 5603-5611 (1991)
【非特許文献９】Hara, E. et al. J. Biol. Chem. 269, 2139-2145 (1994)
【非特許文献１０】Cooper, C.L. et al. Blood 89, 3155-3165 (1997)
【非特許文献１１】Norton, J.D. et al. Trends Cell Biol. 8, 58-65 (1998)
【非特許文献１２】Lasorella, A. et al. Oncogene 20, 8326-8333 (2001)
【非特許文献１３】Rivera, R. & Murre, C. Oncogene 20, 8308-8316 (2001)
【非特許文献１４】Yokota, Y. Oncogene 20, 8290-8298 (2001)
【非特許文献１５】Zebedee, Z. & Hara, E. Oncogene 20, 8317-8325 (2001)
【非特許文献１６】Ohtani, N. et al. Nature 22, 1067-1070 (2001)
【非特許文献１７】Bain, G. et al. Nat. Immunol. 2, 165-171 (2001)
【非特許文献１８】Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002)
【非特許文献１９】Lyden, D. et al. Nature 401, 670-617 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、内皮細胞における血管新生を促進又は阻害する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、Idタンパク質の発現を促進又は阻害することにより上記課題を解決し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
(1) 血管内皮細胞（例えばヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)、以下同様）においてIdタンパク質の発現を抑制することを特徴とする血管新生の阻害方法。
【００１２】
この場合、Idタンパク質の発現抑制はRNA干渉(RNAi)を利用することができ、例えばショートヘアピンRNA(shRNA)を用いることができる。shRNAによってId1及び/又はId3タンパク質の発現が抑制される。
【００１３】
上記shRNAとしては、ID1 shRNA及び/又はID3 shRNAが挙げられる。ID1 shRNAは、配列番号１〜５に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つを例示することができ、ID3 shRNAは、配列番号６〜８に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つを例示することができる。
(2) 血管内皮細胞（例えばHUVEC）においてIdタンパク質の発現を誘導することを特徴とする血管新生の促進方法。
【００１４】
血管内皮細胞を血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）等の血管新生促進因子を作用させると、Idタンパク質の発現を誘導することができる。発現が誘導されるIdタンパク質は、例えばId1タンパク質及び/又はId3タンパク質である。
【００１５】
(3) 発現を阻害する対象mRNAにおける５’末端近傍から“aa”又は“a”で始まる配列を標的配列として設計されたshRNA。
【００１６】
上記shRNAは、72塩基以下の長さの配列からなるものが好ましい。本発明において使用されるshRNAとしては、例えばID1 shRNA又はID3 shRNAが挙げられる。ID1 shRNAは、配列番号１〜５に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つであり、ID3 shRNAは、配列番号６〜８に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つである。これらのshRNAは、RNAiにより標的mRNAの発現を阻害することが可能である。
(4) 前記(3)記載のshRNAを含む医薬組成物。
【００１７】
上記医薬組成物は、例えば遺伝子治療剤として用いることができる。治療の対象となる疾患は、例えば関節リウマチが挙げられる。
(5) Idタンパク質をコードする遺伝子を含む医薬組成物。
【００１８】
上記医薬組成物は、例えば遺伝子治療剤として用いることができる。治療の対象となる疾患は、例えば循環器系疾患である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、Idタンパク質の発現調節（促進又は阻害）方法が提供される。Idタンパク質の発現を阻害することは、血管新生の阻害又は抑制を引き起こすことができるため、例えばRAに対する新規治療法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、血管内皮細胞においてIdタンパク質（単にIdともいう）の発現を誘導することによって血管新生を促進させる方法を提供する。また、内皮細胞においてIdタンパク質の発現を抑制することで血管新生を阻害する方法も提供する。
１．概要
関節リウマチ(RA)病変の主座である関節では滑膜組織の異常増殖が認められ、血管新生が滑膜細胞増殖の重要なステップであることが知られている。以前、本発明者はRA患者由来滑膜組織中の血管内皮細胞において、Idタンパク質をコードする遺伝子（ID遺伝子（単にIDともいう））の発現が上昇していることを報告した。そこで本発明において、血管新生におけるIdの役割を明らかにするために、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)を用いてIdの機能解析を行なうことによって、RAの病態上重要である慢性炎症及び血管新生と、Idの血管内皮細胞中での働きとの関連を検討した。
【００２２】
本発明者は、RA滑膜内の血管内皮細胞内にIdが過剰発現することは、RAの滑膜組織で典型的に見られる炎症や血管新生にIdが関与していることを意味すると考えた。そして、Idは増殖性の細胞以外での成人の各組織において、非常に弱い発現しか観察されていないという理由から、Idの制御による血管新生の抑制がRAの有効な治療ターゲットになりうると考えた。
【００２３】
そこで、本発明では、Idの強制発現が培養血管内皮細胞の活性化及び血管新生を誘導しうるのか、また反対に、Idの発現抑制がVEGFによる血管内皮細胞の活性化及び血管新生を阻害できるのかの二点につき検討した。
【００２４】
本発明において使用する内皮細胞は、血管やリンパ管の内壁を覆う一層の扁平な細胞の総称であり、その種類に限定されるものではない。例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAEC)、腫瘍内微小血管などが挙げられる。
【００２５】
本発明において、HUVECを用いてモデル実験を行なった結果によれば、以下の事項を説明することができる。
【００２６】
HUVECなどの血管内皮細胞を血管内皮細胞増殖因子(VEGF)やトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)などの血管新生促進因子で刺激すると、Id3の発現が誘導される。血管新生促進因子であるVEGFやTGF-βの刺激によってId3の発現が誘導されるということは、血管新生の機序にはIdが関与していることを示すものである。更に、Idを過剰発現させると、Id単独でHUVECの増殖、活性化及び血管新生特性を誘導することができ、その誘導はIDをトランスフェクトしていないHUVECをVEGFで刺激した時と同程度である。
【００２７】
そして、Id3の強制発現によって、HUVECの増殖の上昇に加えてICAM-1及びE-セレクチン（E-selectin）の細胞表面発現増強、さらに細胞遊走能の増加、コラーゲンを分解するマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)2及びMMP9の発現誘導や管腔形成の増加といった血管新生の表現型の亢進が導かれる。
【００２８】
これに対し、HUVECにおけるId1、Id3の発現をRNA干渉(RNA interference, RNAi)等によって抑制すると、VEGF刺激下においても、HUVECの細胞増殖の増加や血管新生表現型の誘導は抑えられる。すなわち、HUVECにおけるID1 及びID3をノックダウンさせると、VEGFによって誘導される増殖、活性化及び血管新生を殆ど完全に消失させることができる。これらの結果は、HUVECのVEGFシグナル伝達経路においてIdが重要な役割を果たすことを示すものである。そして、RAの滑膜組織の内皮細胞にはIdが発現するが変形性関節症（OA）の内皮細胞には発現しないことから(Sakurai, D. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284, 436-442 (2001))、本発明により得られた知見は、RAの滑膜における炎症及び血管新生にIdが強く関与することを示すものである。
【００２９】
以上の結果から、Idは、血管内皮細胞における、VEGF誘導性血管内皮細胞の活性化や血管新生において、必須の役割を持つと考えられ、RAの新たな治療標的となるものである。
２．Idの発現制御
ところで、Id1+/-Id3-/-マウス（ID1ノックアウトをヘテロに、ID3ノックアウトをホモに有するマウス）を用いた実験により、以下のことが示されている。すなわち、(1)腫瘍における血管新生を維持するためにはId発現が必要であること(Lyden, D. et al. Nature 401, 670-617 (1999))、及び(2) Idを発現するVEGFR1+ BM由来内皮前駆体細胞（VEGF受容体１陽性の骨髄由来内皮前駆体細胞）の補充が腫瘍増殖にとって必要であること(Lyden, D. et al. Nat. Med. 7, 1194-1201 (2001))である。しかし、リウマチなど、ヒトの炎症性疾患に関連するIdの重要性は、これまで知られていない。
【００３０】
以前の報告によれば、Idがいくつかの方法で細胞周期を制御することが示されている(Zebedee, Z. & Hara, E. Oncogene 20, 8317-8325 (2001))。例えば、Rbタンパク質に結合して、その腫瘍抑制因子機能をブロックする方法(Bain, G. et al. Nat. Immunol. 2, 165-171 (2001))、並びにp16遺伝子プロモーター領域の転写を促進するEst1及びEst2転写因子のp16プロモーターとの結合を抑制することでp16の発現を抑制し、細胞周期の停止を阻害する方法(Ohtani, N. et al. Nature 22, 1067-1070 (2001))等である。本発明においては、少なくとも後者の作用機構がHUVECにおいて機能していることを示した。
【００３１】
前述のように、Idの強制発現によって細胞表面での発現が上昇するICAM-1及びE-セレクチンは、RAの滑膜内の内皮細胞において強く発現されることが知られている(Szekanecz, Z. et al. Arthritis Rheum. 37, 221-231 (1994)、Koch, A.E. et. al. Lab Invest. 64, 313-320 (1991))。これらの分子は、滑膜組織に炎症性細胞を補充するにあたって重要な分子である(Cutolo, M. et. al. Clin. Exp. Rheumatol. 11, 331-339 (1993))。
【００３２】
したがって、滑膜の内皮細胞におけるIdの発現は、血管新生に関与しているばかりではなく、慢性炎症の開始及び/又は永続化にも関与している可能性がある。
【００３３】
HUVECをVEGF又はTGF-βで処理すると、Idの発現が誘導される。Id3の発現は、胸腺細胞においてはRas-ERK経路によって誘導され(Bain, G. et al. Nat. Immunol. 2, 165-171 (2001))、HUVECにおいてはTGF-β経路のI型受容体を介しSmad1/5シグナル伝達によって誘導される(Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002))。他方、Id1の発現は、ヒト前立腺癌細胞系においてはRaf/MEK1/2活性化に関連しており(Ling, M.T. et. al. Oncogene 21, 8498-8505 (2002))、HUVECにおいてはSmad1/5シグナル伝達に関連する(Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002))。また、VEGFシグナル伝達経路の下流にはMAPKカスケードが存在する(Takahashi, T. et. al. Oncogene 18, 2221-2230 (1999))。他方、IL-1β、IL-8又はTNF-αによる刺激はHUVECにId3を誘導しない。これは、Idが遍在的な炎症メディエーターではなく、血管新生をもたらすシグナル伝達経路により特異的に関連していることを示すものである。
３．ID遺伝子の発現抑制用RNAの設計
ID遺伝子の発現を抑制するためには、RNA干渉(RNAi)を利用することができる。RNAiとは、dsRNA(double-strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
【００３４】
IDのノックダウンに際し、本発明においてはID1及びID3のいずれか一方をノックダウンすることができるが、両者をノックダウン（ダブルノックダウン）してもよい。ID1及びID3は類似したプロモーター領域配列を有し、そして相互に共通する生化学的機能・役割を果たすことが示されているため、ダブルノックダウンが好ましい。
【００３５】
ID1及びID3の両者をダブルノックダウンすると、VEGFによってHUVEC中に誘導される全血管新生特性の殆ど全てをブロックする。このことは、Id2及びId4がVEGFによって誘導される血管新生シグナル伝達とは無関係であることを意味する。
【００３６】
ID遺伝子の発現を抑制するには、たとえばID遺伝子に対するshRNA(short hairpin RNA)、あるいはsiRNA(small interfering RNA)を設計及び合成し、これを作用させてRNAiを起こさせればよい。shRNAはヘアピン構造に折り畳まれた小さなRNA分子であり、センス鎖とアンチセンス鎖をループでつないだステムループ構造を持つ。一方、siRNAは、細胞内でDicerによってプロセッシングを受けて産生される短鎖RNAである。shRNA及びsiRNAは、いずれもRNAiのエフェクターとして用いられる。
【００３７】
shRNAの設計基準は以下の通りである。
【００３８】
(a)  RNAiに使用するID1及びID3 shRNA配列は、各遺伝子に特異的な5'末端領域から300塩基までの間で設計する (Elbashir, S.M. et. al. Genes Dev. 15, 188-200 (2001))。
【００３９】
(b) それぞれの遺伝子転写産物の5'末端に近い領域から、aa又はaから始まるmRNA配列を標的配列として選択及び設計する。標的領域の長さは特に限定されるものではなく、好ましくは30bp以下、より好ましくは18〜25bp程度である。
【００４０】
(c) 標的のセンス鎖-ループ-標的のアンチセンス鎖の二次構造予測を行い、安定なステムループ構造を形成することができるように適宜設計する。ループ配列は7〜12塩基とすることができる。
【００４１】
具体的には、以下の塩基配列を標的配列とし、この標的配列を含み、かつ、全体では72塩基以下、例えば43〜72塩基の長さ（好ましくは45〜67塩基の長さ）の配列をshRNAとして使用することができる。下記塩基配列のうち、ID1 shRNAについては(iii)、ID3 shRNAについては(i)の配列を標的とすることが、最も阻害効率が高い点で好ましい。
【００４２】
ID1 shRNA
(i) aacuguuccauuuuccguauc（配列番号1）
(ii)aaucaugaaagucgccagugg（配列番号2）
(iii)aagaaucaugaaagucgccag（配列番号3）
(iv)aaggccggcaagacagcgagc（配列番号4）
(v)aagucgccaguggcagcaccg（配列番号5）
ID3 shRNA
(i) aaccucacagcaccucacuu（配列番号6）
(ii) aaggcgcugagcccggugcgc（配列番号7）
(iii) aauggauccugcaccacggga（配列番号8）
また、siRNAの設計基準は以下の通りである。
【００４３】
(a) Idをコードする遺伝子の開始コドンの下流の領域を選択する。開始コドンより下流の配列であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。
【００４４】
(b) 選択した領域から、aaで始まる連続する15〜30塩基、好ましくは18〜25塩基の配列を選択し、その配列のGC含量が、例えば20〜80%となるものを選択する。本発明においては、上記shRNAとして挙げた配列は、全てsiRNAの標的配列とすることができる。
【００４５】
siRNA及びshRNAを血管内皮細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNA及びshRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００４６】
上記の通り、IDをダブルノックダウンしたHUVECは、血管形成を顕著に抑制する。血管形成の抑制は、マトリゲルの主成分であるラミニンをリガンドとするα2及びβ1インテグリンの発現低下によって説明できる (Dickeson, S.K. et. al. Cell Adhes. Commun. 5, 273-281 (1998)、Davis, G.E. et. al. Exp. Cell Res. 216, 113-123 (1995))。このように、Idは内皮細胞の活性化及び血管新生をもたらす複数の経路に関与していると考えられる。Id1及びId3の機能は実質的に共通するため(Yokota, Y. Oncogene 20, 8290-8298 (2001)、Norton, J.D. et. al. Trends Cell Biol. 8, 58-65 (1998))、各Idタンパク質から多数の内皮細胞活性化及び血管新生特性への経路を描くことができる。
【００４７】
Id1は、血管新生の抑制因子であるトロンボスポンジン１(TSP-1)の発現をダウンレギュレーションすることが最近報告された(Volpert, O.V. et. al. Cancer Cell 2, 473-483 (2002))。従って、Idに関連する全ての血管新生プロセスは、TSP-1のダウンレギュレーションの観点から検討することも可能である。
【００４８】
結論として、本発明者は、VEGFによって誘導されるHUVECの活性化及び血管新生にIdが不可欠な役割を果たすことを示した。(a)内皮細胞活性化及び血管新生がRNAiにより抑制されること、(b)健常な成体組織では、その殆どにおいてIdの発現が低いこと、及び(c)関節内注射によってIdを疾患組織に投与することが可能であることから、Idは、RA等の細胞増殖性疾患に対する新規治療法を開発するための標的であると考えられる。
４．医薬組成物
本発明において作製されたshRNA、siRNA等の核酸は、免疫系疾患、細胞増殖性疾患、あるいは糖尿病性網膜症や黄斑変性症などの血管新生疾患を治療するための医薬組成物として使用することができる。
【００４９】
本発明の核酸を細胞増殖性疾患の遺伝子治療剤として使用する場合は、例えば、以下の組織に生じる疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。
【００５０】
消化器系：口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、すい臓など
呼吸器系：気管、気管支、肺など
泌尿器系：腎臓、膀胱など
心臓血管系：心臓、動脈、静脈
リンパ系：リンパ管、リンパ節、脾臓、胸腺
感覚器系：視覚器、聴覚器
中枢神経系：脳（大脳、間脳、中脳、小脳）、延髄、脊髄
骨格系：頭蓋骨、脊柱、肋骨、胸骨、上肢骨、上腕骨、下肢骨、大腿骨、関節等
筋：骨格筋、平滑筋等
その他：皮膚、歯、歯肉
これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明の医薬組成物の使用対象とすることができる。本発明においては、例えば関節リウマチの予防又は治療目的とすることが好ましい。
【００５１】
また、本発明においては、Idタンパク質をコードする遺伝子を、循環器系疾患を治療するための医薬組成物（例えば遺伝子治療剤）として使用することができる。
【００５２】
循環器系疾患としては、例えば冠動脈狭窄症、四肢虚血性疾患、閉塞性動脈硬化症、虚血性潰瘍・壊死、バージャー病などが挙げられる。
【００５３】
Idタンパク質をコードする遺伝子（ID遺伝子）は、以下の通り公知であり、NCBI（National Center for Biotechnology Information：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) に開示されている情報をもとにして、通常のクローニング手法により（J. Sambrook, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001)、当業者が容易に取得することができる。
【００５４】
ID1 遺伝子：NCBIアクセッション番号ＮＭ_181353
Homo sapiens inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein (ID1), transcript variant 2, mRNA
ID3 遺伝子： NCBIアクセッション番号ＮＭ_002167
Homo sapiens inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein, mRNA
上記ID1遺伝子の塩基配列を配列番号23に、Id1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。また、上記ID3遺伝子の塩基配列を配列番号25に、Id3タンパク質のアミノ酸配列を配列番号26に示す。
【００５５】
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。リポソームは、生体適合性材料（脂質膜）を含む小胞であるため、リポソームと本発明の医薬組成物とを混合することにより、リポソーム内部又は脂質二分子層に核酸を保持させることができる。次に、核酸を保持したリポソームを細胞とともに培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下の投与方法で投与すればよい。
【００５６】
本発明の医薬組成物の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、患部、筋肉、皮下、皮内等に局所投与することができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することも可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり1010から1011PFU程度であり、1週〜4週間隔で投与される。
【００５７】
なお、ID遺伝子の発現においては、腫瘍化との関連が示唆されている（Norton JD. Journal of Cell Science 113, 3897-3905, 2000)。従って、ID遺伝子を発現させる場合（循環器系疾患の治療目的として使用する場合）は、腫瘍化に留意しつつ、投与量を調節し、あるいはリポソーム等を用いたドラッグデリバリーシステム(DDS)を適用することによって、安全性に関する最適条件を決定し得ることが期待される。
【００５８】
ID遺伝子を、プラスミドDNAを用いた遺伝子治療剤として使用する場合は、プラスミドDNAの直接注射法を採用することができる。プラスミドDNAは短時間で大量に調製することが可能であり、取り扱いが容易であること、注入時の濃度は特に限定がないこと、さらに、プラスミドDNAは安定性が高い分子であるため目的の組織に到達した後でも安定に発現することができることなどの種々の利点を有する。
【００５９】
DNAの注射方法は、精製したプラスミドDNAを生理食塩水などに溶解し、直接筋肉内に注射するというものである。プラスミドDNAを筋肉内注射するときの用量は、0.1μg〜1mg、好ましくは5μg〜100μgである。その結果、注射部位周辺にプラスミドDNAが取り込まれて、注射後にIdタンパク質遺伝子の発現産物が作られる。これにより、虚血性疾患の治療又は改善効果を得ることができる。
【００６０】
ID遺伝子又はshRNAを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばGenomONE: 石原産業）を用いることもできる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
１．方法
(1) トランスフェクション
初代培養のHUVECを常法のごとく単離し、10%FCS、ヘパリン500μl/ml、ｂFGF 2ng/mlを添加したMCDB151培養液を用いて、0.1％のゼラチンで前処理をしたプレート上で培養を行なった。トランスフェクションはEffectene transfection reagent (QIAGEN)を用いて行なった。IDの強制発現はpBLASTベクター(InvivoGen)を用いて行なった。陰性対照としてpBLAST49-mcsを用いた。ID1とID3の発現をノックダウンするためにshRNAの配列をデザインした。配列は以下の通りである。それぞれの配列の3'末端はRNA発現ベクター（ID1用は psiRNA-hH1neo(InvivoGen)、ID3用はpSilencer 2.0-U6(Ambion))に組み込むための突出配列である。下線部は、標的RNA領域及びその相補領域である。
ID1：TCCCAAAGAA TCATGAAAGT CGCCAGTTCA AGAGACTGGC GACTTTCATG ATTCTTTT（配列番号９）
及び
ID3：TCGGATCCAA CCTCACAGCA CCTCACTTCT TCAAGAGAGA AGTGAGGTGC TGTGAGGTTT TTTTTGGAAA AGCTTGG（配列番号10）
(2) RT-PCR
Total RNAはRNeasy miniキット(QIAGEN)を用いて抽出し、DNase処理をした。RNAからの初めのcDNA合成はImProm-II逆転写酵素システム(Promega)を用いた。定量的RT-PCRはLightCycler (登録商標）DNA master SYBR Green Iとそれぞれの特異的プライマーとを用いてリアルタイムRT-PCRマシーンで行なった。データ解析はLightCycler analysis software (Roche Diagnostics)を用いて、フィットポイント法(fit-points method)で行なった。それぞれのcDNAサンプルは、βアクチン又はGAPDHを用いてtotal RNAレベルで標準化した。HUVECでのVEGFとTGFβによるId3の発現誘導の解析は、通常のRT-PCRで行なった。RT-PCRに用いたプライマー対は以下の通りである。
Id3:
フォワード：5'-CTCCACGCTCTGAAAAGACC-3' （配列番号11）
リバース：5'-ACTCAGATTAAGCCAGGTGGA-3' （配列番号12）
p16:
フォワード：5'-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3' （配列番号13）
リバース：5'-GCAGTTAAGGGGGCACGAGTG-3' （配列番号14）
ICAM-1: 
フォワード：5'-ACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGT-3' （配列番号15）
リバース：5'-GTACACGGTGAGGAAGGTTTTAGCTGTTG-3' （配列番号16）
E-セレクチン: 
フォワード：5'-AAAACTTCCATGAGGCCAAA-3' （配列番号17）
リバース：5'-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3' （配列番号18）
MMP2: 
フォワード：5'-ATGACAGCTGCACCACTGAG-3' （配列番号19）
リバース：5'-TGATGTCATCCTGGGACAGA-3' （配列番号20）
MMP9:
フォワード：5'-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3' （配列番号21）
リバース：5'-CCCTCAGTGAAGCGGTACAT-3' （配列番号22）
PCRは、LightCycler (登録商標）DNA master SYBR Green Iを用いて、はじめに95°C 10分反応させ、その後 95°C 5 秒、58°C 10 秒72°C 秒のサイクルを45サイクル行なった。
【００６２】
PCR産物を電気泳動にかけ、SYBR Goldによって染色後、mRNA発現量の相対値をバンドの濃さを図り、計算することによって、Id3及びβアクチンの発現量を測定した。
(3) 細胞増殖アッセイ
HUVECの増殖をWST-1細胞増殖アッセイ（タカラバイオ）によって計測した。細胞をゼラチンでコートした96穴のプレートにまいた。10μlのWST-1溶液を各ウェルに混ぜ、4時間37℃で静置した。溶液を96穴プレートに移し変えて480nmの吸光を測定した。
(4) フローサイトメトリー
プレート上で培養しているHUVECをトリプシン-EDTAと0.02% EDTA-PBSを用いて回収し、0.1% BSA 、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSに再溶解させ、50ng/mlのヒトガンマグロブリンで30分室温で処理した。直接免疫蛍光を用いる場合は細胞を蛍光標識されたモノクローナル抗体とアイソタイプコントロール抗体で30分処理した。間接免疫蛍光を用いる場合は非標識のモノクローナル抗体とアイソタイプコントロール抗体で30分氷上で処理後、洗浄し、PE標識のヤギ抗マウスIgGで処理を行なった。蛍光はEPICS XL(Beckman Coulter)を用いて解析した。使用したモノクローナル抗体は、FITC標識化抗ヒトαvインテグリン、PE標識化抗ヒトICAM-1、PE標識化抗ヒトβ1インテグリン、Cy-クロム標識化抗ヒトE-セレクチン、及び未標識の抗ヒトα2インテグリンであった。アイソタイプ対照として、マウスIgG1-RD1/マウスIgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-Cy-クロム及び非標識IgG1を用いた。
(5) 遊走アッセイ
遊走アッセイは8μ孔のトランスウェルチャンバー(Corning)を用いて行なった。細胞を回収後血清の入っていない培養液に再浮遊させ、各ウェル1×104個になるようにゼラチンで処理した上のチャンバーに播いた。下のチャンバーには10% FCSとそれぞれサイトカインが入っている培養液で満たした。上下のチャンバーをあわせ、37℃で8時間静置した後、トリプシン-EDTAを用いて下層にある細胞を回収し、EPICSを用いて細胞数を計測した。
(6) ザイモグラフィー
HUVECを100mmのプレート上にまき、DMEMとF-12 HAM培養液が1:1の比率で混合した培養液中で37℃、8時間静置した。上清を回収しCentricon YM-10で濃縮した。MMPを0.1%のゼラチンを含むSDSポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、ゲルを5mM CaCl2 と1μM ZnCl2を含む緩衝液に浸すことによって酵素活性を展開させた。ゲルをクマシーブルーで染色し、メタノールと酢酸で脱色した。ゼラチン分解部位は染色されていないバンドとして検出される。
(7) In vitro管腔形成
In vitro管腔形成はマトリゲルを用いて行なった。マトリゲルを氷上で6ウェルプレートにまき、37℃で30分静置することによって固まらせた。ここに各ウェル5×104になるようにマトリゲル上に細胞をまき、VEGF存在、非存在それぞれの条件下で37℃で24時間静置した。顕微鏡下でゲル上での管腔形成を観察した。
２．結果
(1) VEGF、TGFβによるHUVECのIdの発現誘導
Idが生理的な血管新生に関与するか否かを検討するために、HUVECのVEGF、TGF(刺激によるId3の発現誘導を検討した。VEGF又はTGF(で刺激した、又は刺激していないHUVEC中におけるID3 mRNAレベルをRT-PCRによって測定した。陽性対照として、ID3 でトランスフェクトしたHUVEC (Id3-t)を用いた。
【００６３】
VEGF (20ng/ml)（図１a、b）、及びTGFβ(0.5ng/ml)（図１c、d）で血管内皮細胞を刺激したときにId1、Id3の有意な発現増強が認められた（図１b、d、P<0.05）。図１b及び図１dは、それぞれ図１a及び図１cに示されたバンドの相対強度を示す。この結果から、上記の因子による血管新生誘導シグナル系路にIdが位置することが示された。一方IL-1、IL-8、TNFα等の血管新生促進因子ではIdの発現は誘導できなかった。
(2) Id3強制発現によるHUVEC増殖の誘導
次に、Idのみの刺激でHUVECの活性化及び血管新生を誘導しうるか否かを検討するために、遺伝子導入により、HUVECにId3を過剰発現させた。pBLAST49-hId3(c) (Id3-t)又はpBLAST49-mcs (Mock-t)ベクターをHUVEC中に導入した。各導入細胞から全RNAを単離し、リアルタイムRT-PCRによってID3 mRNAレベルを連続的に定量した。また、細胞増殖は、MTTアッセイによって測定した。
【００６４】
遺伝子導入24時間後、陰性対照との比較では、遺伝子導入細胞においてmRNAレベルで4.1倍のId3の発現増強が観察された（図２a）。ID3導入細胞では24時間で陰性対照に比べて1.9倍の増殖能の上昇が見られ、VEGF刺激後の遺伝子非導入細胞とほぼ同等の増殖を示した（図２b）。図２ｂにおいて、ID3導入細胞（黒塗りの棒）はベクターのみ導入した細胞(白抜きの棒)と比較して有意に高い増殖を示した。ID3導入細胞の増殖は、導入していないHUVEC（陰影を付けた棒）の増殖（10 ng/mlのVEGFで刺激）に匹敵した。従って、ID3過剰発現はHUVECの増殖を誘導することが示された。
【００６５】
Idはp16の発現調節を行なうことによって細胞周期を調節していることがすでに知られているが、本実験では、図２cに示すようにp16とId3のmRNAレベルでの発現が逆相関の関係にあり、この機序がHUVECにおいても機能していることが示された。
(3) Id3強制発現によるHUVEC活性化の誘導
Id3の強制発現がHUVECの活性化を誘導できるか否かを調べるために、血管内皮細胞の活性化マーカーとしてICAM-1とE-selectinの発現を測定した。トランスフェクションの24時間後にフローサイトメトリーを実施した。
【００６６】
Id3強制発現により、mRNAレベルでICAM-1、E-selectin共にそれぞれ4.8倍（図３a）及び4.2倍（図３b）の発現の上昇が見られ、細胞表面の発現も増加した（図３a、b）。ID3トランスフェクタントにおいては、両方の活性化マーカーが有意にアップレギュレーションされていた。以上の結果からId3の強制発現のみでHUVECの活性化を誘導しうることが示された。
(4) Id3強制発現による血管新生の誘導
次にId3の強制発現によってHUVECで血管新生が誘導できるか否かを検討した。Id3強制発現血管内皮細胞では遊走能が亢進しており、ID3導入細胞は、特にIL-1β (0.5 ng/ml)又はVEGF (20 ng/ml)で刺激したときに、顕著な遊走活性の増大を示した（図４a）。Id3強制発現により、非刺激下において、MMP2とMMP9の発現量は、mRNAレベルで3.2倍、3.7倍とそれぞれ上昇しており、VEGF刺激による遺伝子非導入細胞のMMPs産生能上昇と同等であった（図４b）。MMP2とMMP9の酵素活性レベルでの上昇も、ザイモグラフィーにより確認された。両分子ともに活性化MMP2、MMP9量が増加しており、MMP2及びMMP9活性のアップレギュレーションが確認された。（図４c）。さらにマトリゲルを用いて管腔形成を検討したところ、ID3導入細胞ではVEGF刺激無しでも充分な管腔形成が誘導された（図４d）。この血管形成の程度は、VEGF (10 ng/ml)の存在下で培養した、Mock導入細胞の血管形成に匹敵した。これらの結果を合わせて考えると、HUVECでのId3の強制発現によって血管新生が誘導されることが明らかになった。
(5) HUVECのVEGF誘導性の増殖、活性化はID1 とID3 shRNAによって阻害される
次に、Id3はVEGF刺激によって誘導されるHUVECの細胞増殖、活性化、血管新生にとって必須であるか否かを検証した。Id1とId3の発現を阻害するためにRNAiを用いた。HUVECにID1とID3のsmall hairpin RNA (shRNA)を発現するベクターを1.25、5、10ng/mlの濃度で導入した。VEGF (20 ng/ml)の存在下又は非存在下でHUVECを24時間培養した後、ID3及びGAPDHのmRNAを定量した。
【００６７】
図５aに示すように、VEGFで誘導されるID3の発現が、ベクターの用量依存的に阻害された。なお、ID1誘導もID3と同様に抑制された。この結果から、以降の実験ではID1、ID3shRNAベクターとも10ng/mlを使用濃度とした。
【００６８】
また、shRNAの強制発現を行なってから24時間後に、WST-1を用いてHUVECの増殖を分析した。Id1/Id3ノックダウン細胞は、VEGFで刺激しても、対照と比べると細胞増殖が有意に阻害された（図５b、P<0.05）。
【００６９】
また、VEGF (20 ng/ml)で刺激した、又は刺激していないモックトランスフェクタント、及びVEGFで刺激したID1/ID3 shRNAダブルノックアウト細胞におけるICAM-1、E-セレクチン及びαvインテグリンの表面発現を測定した。
【００７０】
ID1/ID3ダブルノックダウンにより、VEGFによって誘導されるICAM-1及びE-セレクチンの発現を殆ど完全に抑制し、またαvインテグリンの基底発現レベルを低下させた。ICAM-1（図５c）やE-selectin（図５d）のVEGFによる発現上昇も抑制された。さらに他の活性化マーカーであるαvインテグリンの発現も、shRNA非導入細胞と比較して低下していた（図５e）。ID1又はID3 shRNA単独の発現を阻害した場合は、ICAM-1の発現は抑制されたが、他の活性化マーカーであるE-selectinやαvインテグリンの発現を阻害することはできなかった。
(6) VEGF誘導性血管新生はID1 とID3 shRNAによって阻害される
本発明者は、ID1/ID3 ダブルノックダウンHUVECにおいて、VEGF誘導性血管新生が阻害されるか否かを検討した。
【００７１】
VEGF (20 ng/ml)で8時間刺激した後のID1/ID3 shRNA導入細胞では、VEGF誘導性の遊走能の活性化が抑制された（図６a）。また、ID1/ID3ノックダウン細胞では、VEGF刺激下において、MMP9の産生は下がらなかったのに対し、MMP2の発現は有意に抑制された（図６b）。
【００７２】
また、遺伝子非導入HUVEC、Mock導入HUVEC、並びにID1及びID3 shRNAのダブル導入HUVEC細胞をVEGF (20 ng/ml)の存在下で24時間培養した。
【００７３】
ID1/ID3ダブルノックダウンによって、管腔形成の顕著な抑制が観察された。VEGF存在下における管腔形成も、ID1及びID3 shRNA導入細胞では減少した（図６c）。これらの血管新生の阻害の理由の一つとして、図６d、eに示すようにID1、ID3 shRNA導入細胞におけるα2及びβ1インテグリンの発現抑制（両インテグリンともダウンレギュレーションされた）が考えられる。
【００７４】
以上の結果から、VEGFによって誘導されるHUVECの血管新生において、Idは必須の役割を果たしていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
IdがVEGFで活性化される血管内皮細胞の活性化、血管新生の誘導に重要なこと、成人の組織ではIdの強い発現があまり見られないことなどから、IdのRNAiを用いた抑制法がRAの治療の新たなターゲットとなりうる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１ａ】VEGF (20 ng/ml)によってHUVEC中にID3 mRNAの発現を誘導した結果を示す電気泳動写真である。
【図１ｂ】VEGF (20 ng/ml)によってHUVEC中にID3 mRNAの発現を誘導した結果を示す図である。
【図１ｃ】TGF-β(0.5 ng/ml) によってHUVEC中にID3 mRNAの発現を誘導した結果を示す電気泳動写真である。
【図１ｄ】TGF-β(0.5 ng/ml) によってHUVEC中にID3 mRNAの発現を誘導した結果を示す図である。
【図２ａ】リアルタイムRT-PCRによってID3 mRNAレベルを継時的に定量した結果を示す図である。
【図２ｂ】トランスフェクション24時間後のHUVECの増殖を示す図である。
【図２ｃ】ID3導入細胞及び非導入細胞のP16 mRNAレベルをリアルタイムRT-PCRによって測定した結果を示す図である。P16 発現はID3発現と逆相関していた。
【図３ａ】ID3導入細胞及び非導入細胞におけるICAM-1のmRNAレベルを示す図である。
【図３ｂ】ID3導入細胞及び非導入細胞におけるE-セレクチンのmRNAレベルを示す図である。
【図３ｃ】ID3導入細胞及び非導入細胞におけるICAM-1の表面発現を示す図である。MFI：平均蛍光強度。
【図３ｄ】ID3導入細胞及び非導入細胞におけるE-セレクチンの表面発現を示す図である。MFI：平均蛍光強度。
【図４ａ】遊走アッセイの結果を示す図である。
【図４ｂ】MMP2及びMMP9のmRNAレベルを示す図である。ID3導入細胞において、MMP2及びMMP9の発現は有意に増大した。
【図４ｃ】ザイモグラフィーを示す写真である。
【図４ｄ】ID3導入細胞による管腔形成を示す写真である。
【図５ａ】ID1及びID3 shRNA発現ベクターを種々の濃度で用いて、又はpSilencerを単独で用いて（Mock）、HUVECをトランスフェクトしたときのmRNAを定量した結果を示す図である。
【図５ｂ】ダブルノックダウン細胞における細胞増殖の測定結果を示す図である。ID1/ID3ダブルノックダウン細胞においては、VEGFによって誘導される増殖は有意に抑制された。
【図５ｃ】VEGFによって誘導されるICAM-1活性化をID1/ID3ダブルノックダウンにより抑制したときのICAM-1の表面発現を示す図である。MFI：平均蛍光強度。
【図５ｄ】VEGFによって誘導されるE-selectin活性化をID1/ID3ダブルノックダウンにより抑制したときのE-selectinの表面発現を示す図である。MFI：平均蛍光強度。
【図５ｅ】VEGFによって誘導されるαvインテグリン活性化をID1/ID3ダブルノックダウンにより抑制したときのαvインテグリンの表面発現を示す図である。MFI：平均蛍光強度。
【図６ａ】遊走アッセイの結果を示す図である。
【図６ｂ】VEGF (20 ng/ml)の存在下で8時間培養したID1/ID3 shRNA導入細胞又は非導入細胞におけるMMP mRNAの発現を示す図である。
【図６ｃ】管腔形成アッセイの結果を示す写真である。
【図６ｄ】VEGF (20 ng/ml)で刺激したID1/ID3 shRNA導入細胞におけるα2インテグリンの表面発現を示す図である。MFI:平均蛍光強度。
【図６ｅ】VEGF (20 ng/ml)で刺激したID1/ID3 shRNA導入細胞におけるβ1インテグリンの表面発現を示す図である。MFI:平均蛍光強度。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１：合成RNA
配列番号２：合成RNA
配列番号３：合成RNA
配列番号４：合成RNA
配列番号５：合成RNA
配列番号６：合成RNA
配列番号７：合成RNA
配列番号８：合成RNA
配列番号９：合成RNA
配列番号10：合成RNA
配列番号11：合成DNA
配列番号12：合成DNA
配列番号13：合成DNA
配列番号14：合成DNA
配列番号15：合成DNA
配列番号16：合成DNA
配列番号17：合成DNA
配列番号18：合成DNA
配列番号19：合成DNA
配列番号20：合成DNA
配列番号21：合成DNA
配列番号22：合成DNA
【図１ａ】
2005065661.tif 000002
【図１ｂ】
2005065661.tif 000003
【図１ｃ】
2005065661.tif 000004
【図１ｄ】
2005065661.tif 000005
【図２ａ】
2005065661.tif 000006
【図２ｂ】
2005065661.tif 000007
【図２ｃ】
2005065661.tif 000008
【図３ａ】
2005065661.tif 000009
【図３ｂ】
2005065661.tif 000010
【図３ｃ】
2005065661.tif 000011
【図３ｄ】
2005065661.tif 000012
【図４ａ】
2005065661.tif 000013
【図４ｂ】
2005065661.tif 000014
【図４ｃ】
2005065661.tif 000015
【図４ｄ】
2005065661.tif 000016
【図５ａ】
2005065661.tif 000017
【図５ｂ】
2005065661.tif 000018
【図５ｃ】
2005065661.tif 000019
【図５ｄ】
2005065661.tif 000020
【図５ｅ】
2005065661.tif 000021
【図６ａ】
2005065661.tif 000022
【図６ｂ】
2005065661.tif 000023
【図６ｃ】
2005065661.tif 000024
【図６ｄ】
2005065661.tif 000025
【図６ｅ】
2005065661.tif 000026
【配列表】
2005065661000001.app