(57)【要約】【課題】  酵素法によるエタノールアミンリン脂質分析試薬を提供すること【解決手段】  少なくともホスフォリパーゼ、エタノールアミンに作用する酵素を含有してなる試薬を用いてエタノールアミンリン脂質濃度を分析する。【効果】  煩雑な操作が不要で、正確、簡便、安価にエタノールアミンリン脂質を定量する事が可能になる。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともホスフォリパーゼとチラミンオキシダーゼを用いることを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
【請求項２】
少なくともチラミンオキシダーゼを含有する第１試薬（R1）にエタノールアミン含有リン脂質を含有する被験液を加えて反応を行った後、少なくともエタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素を含有する第二試薬（R2）を添加して反応を行なうことを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
【請求項３】
エタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼDである請求項１記載のエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
【請求項４】
少なくともホスフォリパーゼとチラミンオキシダーゼを含有することを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
【請求項５】
少なくともチラミンオキシダーゼを含有する第１試薬（R1）と少なくともエタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素を含有する第二試薬（R2）から構成することを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
【請求項６】
エタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼDである請求項４記載のエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素法によるエタノールアミン含有リン脂質の分析方法および分析用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質の１種であるエタノールアミン含有リン脂質は、食品素材や血液等の生体中に幅広く存在している。このリン脂質含量や濃度を分析する方法は古くからシリカゲルやアルミナ等を支持体とする薄層クロマトグラフィー操作でリン脂質を予め分離した後、リン脂質を発色させその程度により濃度を測定する方法、HPLC法による方法や酵素を用いた測定法が知られている（非特許文献１）が、酵素による発色反応時間が１５分と長くその短時間化が望まれていた。
【非特許文献１】医学のあゆみ、第１２７巻、第２号、昭和５８年、１１４−１２０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、被験液中のエタノールアミン含有リン脂質を短時間で簡便に精度良く分析する酵素的分析方法、ならびに該方法に使用するエタノールアミン含有リン脂質分析用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者は多方面から鋭意検討した結果、被験液をリン脂質加水分解酵素であるホスフォリパーゼとエタノールアミンに作用する酵素を用いることにより簡便で精度よく糖化リン脂質を分析できる方法を考案し本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は、
1) 少なくともホスフォリパーゼとチラミンオキシダーゼを用いることを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
２）少なくともチラミンオキシダーゼを含有する第１試薬（R1）にエタノールアミン含有リン脂質を含有する被験液を加えて反応を行った後、少なくともエタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素を含有する第二試薬（R2）を添加して反応を行なうことを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
３）エタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼDである請求項１記載のエタノールアミン含有リン脂質の分析方法
４）少なくともホスフォリパーゼとチラミンオキシダーゼを含有することを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
５）少なくともチラミンオキシダーゼを含有する第１試薬（R1）と少なくともエタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素を含有する第二試薬（R2）から構成することを特徴とするエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物
６）エタノールアミン含有リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼDである請求項４記載のエタノールアミン含有リン脂質の分析用組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に用いるホスフォリパーゼはエタノールアミン含有リン脂質を加水分解できる酵素であればよい。リン脂質を加水分解する酵素としてホスフォリパーゼA、B、C、Dが知られておりこれらの酵素は動植物、微生物等自然界に幅広く存在している。エタノールアミン含有リン脂質を測定するためにこれらのいずれの酵素を使用できるが試薬原料としてはホスフォリパーゼCあるいはホスフォリパーゼDが好ましく特にホスフォリパーゼDが好ましい。本酵素はキャベツ、ピーナッツ、人参等の植物組織や放線菌等の微生物に存在していることが知られ、そのいずれの酵素を使用することができるが、酵素自身の安定性、酵素の安定供給の面から微生物由来の酵素が好ましい。中でも放線菌の１種であるストレプトマイセス・クロモフスクス由来のホスフォリパーゼDが反応性、安定性に優れており特に好ましい。本ホスフォリパーゼDはエタノールアミン含有リン脂質以外のホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、ホスファチジルセリン等のリン脂質に幅広く作用する性質を有するがエタノールアミン含有リン脂質を分析する上では全く問題は生じない。この酵素の試薬中での濃度は０．０５から１００単位/ml、好ましくは０．５から５０単位/ｍｌである。なお酵素の活性は基質ホスファチジルコリンを３７℃１分間に１マイクロモル分解する活性を１単位とした。
【０００７】
本発明に使用しうるエタノールアミンに作用する酵素としては、エタノールアミンに作用する酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、例えばオキシダーゼ、キナーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。中でもオキシダーゼは良く知られており、産業用に製造されていることから安価に入手することが可能であり好ましい。エタノールアミンに作用するオキシダーゼとしてはエタノールアミンに良好に作用し、過酸化水素を生成する酵素であればいかなる酵素を用いても良い。エタノールアミンを酸化する酵素の例としては、バチルス属由来酵素があげられるが、本酵素を使用した場合には少なくとも１５分の反応時間が必要である（医学のあゆみ、第１２７巻、第２号、昭和５８年、１１４−１２０頁）。
【０００８】
これに比較してアースロバクター属由来のチラミンオキシダーゼは５分間で発色反応を効率良く行なうことができる。更に酵素の安定性、酵素の安定供給の面からアースロバクター属由来のチラミンオキシダーゼが特に好ましい。その試薬中での濃度は０．１から５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１から２０単位／ｍｌである。チラミンに作用する酵素の活性はチラミンを基質にして３７℃１分間に１マイクロモルを酸化する活性を１単位とした。また、被検液中に含有するモノアミン、ジアミンを消去する目的でチラミンオキシダーゼとモノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼとを併用することもできる。モノアミン、ジアミンを酸化する酵素としてブタ腎、ブタ血漿、ウシ血漿、マメ科幼植物、アスペルギルス・ニガー由来の酵素が知られているが、上記の消去の目的には基質特異性が広い性質をもつアスペルギルス・ニガー由来酵素が好ましい。
【０００９】
次にエタノールアミン含有リン脂質の分析試薬について述べる。分析用試薬の保存安定性を保つために分析試薬は２種類の試薬に分割され使用される。また血清等の生体成分中には遊離のアミンが存在することがあるため正誤差を生じる危険性が考えられる。エタノールアミンオキシダーゼ（チラミンオキシダーゼ）、カタラーゼあるいはパーオキシダーゼとフェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等のトリンダー試薬の色原体とを含有する試薬１（R1）に被験液を添加し予め加温することでこの成分を消去することができる。試薬２（R2）はホスフォリパーゼD、４アミノアンチピリン若しくは3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーからなる成分で構成される。R1とR2が混合されると同時にエタノールアミンオキシダーゼ反応で生成される過酸化水素はトリンダー試薬の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成する。この色素の吸光度を分光学的に測定することができる。
【００１０】
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例としてN,Nジメチルアニリン、N,Nジエチルアニリン、2,4ジクロロフェノール、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5ジメチルアニリン(MAPS)、N-エチル-N- （2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-3,5- ジメチルアニリン（MAOS）、N-エチル-N- （2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-m- トルイジン（TOOS）、N-エチル-N- スルホプロピル-m- アニシジン（ADPS）、N-エチル-N- スルホプロピルアニリン（ALPS）、N-エチル-N- スルホプロピル-3,5- ジメトキシアニリン（DAPS）、N-スルホプロピル-3,5- ジメトキシアニリン（HDAPS ）、N-エチル-N- スルホプロピル-m- トルイジン（TOPS）、N-エチル-N- （2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-m- アニシジン（ADOS）、N-エチル-N- （2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）アニリン（ALOS）、N-（2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-3,5- ジメトキシアニリン（HDAOS ）、N-スルホプロピル−アニリン（HALPS ）（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。また過酸化水素はパーオキシダーゼ存在下ロイコ型試薬を用いて発色することができる。この試薬の具体例としては、o-ジアニシジン、o-トリジン、3,3 ジアミノベンジジン、3,3,5,5-テトラメチルベンジジン；以上同人化学研究所社製、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4- ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（DA64）、10- （カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7- ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（DA67）；以上和光純薬社製等が挙げられる。
【００１１】
また過酸化水素の定量方法としては蛍光法や電極法でも分析することができる。蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、4-ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフルオレスシン誘導体等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロール等を用いることが出来る。カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドを定量する方法としては、ハンチ反応を用いる方法や、MBTHとの縮合反応により発色させる方法、若しくはアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いる方法等が挙げられる。
【００１２】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知、の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。本発明の分析用試薬には必要に応じて緩衝液、酵素の安定化剤、防腐剤等を適宜使用する。
【００１３】
適宜な添加物において、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレンひまし油、ポリオキシエチレンステロール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンラノリン類、ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸・リン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、Ｎアシルアミノ酸塩類、アルキルエーテルカルボン酸塩類、アルキルリン酸塩、Ｎアシルタウリン酸塩、スルホン酸塩、アルキル硫酸、酢酸ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤、レシチン誘導体、ポリエチレングリコール類、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ポリエチレングリコールイソオクチルフェニルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、等の0.01〜10%、好適には0.05〜5%、各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の1mM〜5M、好適には10mM〜1M、各種緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等の10mM〜2M、好適には20mM〜1M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの0.01〜10%、好適には0.05〜1%を適宜添加すれば良い。
エタノールアミンオキシダーゼの安定化剤としてはソルビトールに代表される各種糖類を適宜使用する。これらは0.1〜10%、好適には0.5〜５%の範囲で添加すればいい。
【００１４】
本発明に使用しうるエタノールアミン含有リン脂質の定量方法としては、前記本発明のエタノールアミン含有リン脂質分析用組成物１ｍｌに被験液0.01〜0.05mlを加え、37℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後一定時間後の2点間の数分ないし数十分間、例えば3分後と4分後の1分間、または3分後と8分後の5分間における変化した、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度のエタノールアミンリン脂質を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化蛋白質の量を求めることができる。
【実施例】
【００１５】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１６】
〔実施例１〕    
試薬１（R1）は下記最終濃度になるように各成分を混合して調製した。
50ｍM  トリスー塩酸緩衝液（ｐH８．０）
６U/ml  チラミンオキシダーゼ（旭化成社製）
10U/ml  パーオキシダーゼ（シグマ社製）
０．１％  トリトンX100              
０．１％  TOOS
【００１７】
〔実施例２〕  
試薬２（R2）は下記最終濃度になるように各成分を混合して調整した。
50ｍM  トリスー塩酸緩衝液（ｐH８．０）
ホスフォリパーゼD        （旭化成社製；７U/ml）
２ｍM  塩化カルシウム
０．１％  ４アミノアンチピリン
０．１％  トリトンX100
【００１８】
〔実施例３〕    
実施例１および２記載の反応液各５００マイクロリットルを混合し、０．１から１ｍMのホスファチジルエタノールアミン溶液２０マイクロリットルを添加し、３７℃で５分間反応後、５５０nmの吸光度を測定した。そのときの結果を図１に示した。
図１から分かるようにホスフォリパーゼ及びエタノールアミンに作用する酵素を用いてホスファチジルエタノールアミンを測定することが可能であった。またホスファチジルエタノールアミンの替わりにリゾホスファチジルエタノールアミンを用いても同様の結果が得られた。
【００１９】
〔実施例４〕    
実施例１記載の反応液５００μｌに、０〜１００μＭのフェニルエチルアミンを含む０．５ｍＭホスファチジルエタノールアミン溶液２０マイクロリットルを添加し、３７℃で５分間アミンの消去反応を行い、続いて実施例２記載の反応液５００μｌを添加し３７℃で５分間反応後、５５０nmの吸光度を測定した。そのときの結果を図２に示した。
図２から分かるようにフェニルエチルアミンの濃度によらず、一定の糖化ホスファチジルエタノールアミンの測定値が得られることから、遊離のアミンを消去して、正確にホスファチジルエタノールアミンのみを測定することが可能であった。またホスファチジルエタノールアミンの替わりにリゾホスファチジルエタノールアミンを用いても同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明の分析方法及び分析用組成物は、食品中のリン脂質分析や臨床診断に好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施例３に基づくエタノールアミンリン脂質測定の検量線である。
【図２】本発明の実施例４に基づく遊離のアミンのエタノールアミンリン脂質測定における影響試験結果である。
【図１】
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【図２】
2005052034.tif 000003