(57)【要約】【目的】  脂肪蓄積抑制剤を及びこれを配合した医薬用、飲食用又は動物飼料用組成物を提供する。【構成】  Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子等の共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換体であるナタネ、イネ等の植物から得られる種子油及び／又はその処理物を有効成分として含む医薬用、飲食用又は動物飼料用組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換体植物から得られる種子油及び／又はその処理物を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子である、請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤。
（Ａ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２又は４に記載の塩基配列；
（Ｄ）配列番号２又は４に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配
列；または
（Ｅ）配列番号２又は４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする
塩基配列：
【請求項３】
Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を
合成する能力が、リノール酸からプニカ酸を合成する能力である、請求項２に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項４】
該植物が、共役トリエン型脂肪酸を生成しない植物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂肪蓄積抑制剤を配合してなる医薬用、飲食用又は動物飼料用組成物。
【請求項６】
共役トリエン型脂肪酸の含有量が、０．０１重量％以上１０重量％以下である請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換体植物から得られる種子油及び／又はその処理物を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤及びこれを配合してなる医薬用、飲食用又は動物飼料用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に共役脂肪酸類のうち、ジエン型脂肪酸類、特に共役リノール酸については種々の薬効があることが知られている（非特許文献１）。一方、トリエン型脂肪酸類については、エレオステアリン酸がガン培養組織に対する抗腫瘍作用を有すること（非特許文献２）、プニカ酸等のトリエン型脂肪酸類を含むキササゲ、ザクロ、キリ種子油が腫瘍細胞に対して致死活性を示すこと（特許文献１、非特許文献３、非特許文献４）、また、共役高度不飽和脂肪酸のトリグリセリド誘導体が実験動物で内臓脂肪低減作用（特許文献２）を有すること等が知られている。
【特許文献１】特開２０００−２８１５７２
【特許文献２】特開２００２−１０４９６５
【非特許文献１】池田郁男、日本油化学会誌、第４８巻、第１０号、２１―２８頁、１９９９年
【非特許文献２】Cancer Letter、Vol.148、No.2、p.173-179、2000
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、７４巻、７０ページ、２０００年
【非特許文献４】Lipids、Vol.36、No.5、p.477-482、2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、脂肪蓄積抑制剤、あるいは、脂肪蓄積抑制機能を有する飲食品等を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、植物に共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を導入することにより共役トリエン型脂肪酸を生成するように改変することができ、該植物から得られる種子油を動物に投与すると、各種臓器重量を低下させることなく、脂肪蓄積量を効率よく抑制できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００５】
すなわち本発明によれば、
（１）  共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換体植物から得られる種子油及び／又はその処理物を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤、
（２）  共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子であることを特徴とする（１）に記載の脂肪蓄積抑制剤、
（Ａ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２又は４に記載の塩基配列；
（Ｄ）配列番号２又は４に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｅ）配列番号２又は４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする
塩基配列：
（３）  Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂
肪酸を合成する能力が、リノール酸からプニカ酸を合成する能力である、（２）に記載の脂肪蓄積抑制剤、
（４）  該植物が、共役トリエン型脂肪酸を生成しない植物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載に記載の脂肪蓄積抑制剤、
（５）  （１）〜（４）のいずれかに記載の脂肪蓄積抑制剤を配合してなる医薬用、飲食用又は動物飼料用組成物、
（６）  共役トリエン型脂肪酸の含有量が、０．０１重量％以上１０重量％以下である（５）に記載の組成物、
が提供される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が導入された形質転換体植物から得られる種子油及び／又はその処理物を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤及びこれを配合してなる医薬用、飲食用又は動物飼料用組成物が提供される。脂肪蓄積抑制剤は、ヒト等の哺乳動物において体内に蓄積する脂肪量増加の抑制に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子
本発明の脂肪蓄積抑制剤の有効成分となる種子油は、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を導入することにより共役トリエン型脂肪酸を生成するように改変された形質転換体植物を用いて調製することができる。
【０００８】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子の例としては、エレオステアリン酸（１８：３Δ9cis,11trans,13trans、以下「１８：３（９ｃ、１１ｔ、１３ｔ）」と示す。）の合成に関与する遺伝子（国際公開ＷＯ００/１１１７６号公報）、カレンディック酸（１８：３（８ｔ、１０ｔ、１２ｃ））の合成に関与する遺伝子(J. Biol. Chem. Vol.276, No.4, pp.2637-2643, 2001；国際公開ＷＯ０１／１２８００号公報；Plant Physiology, February 2001, Vol.125, pp.847-855)、及び、プニカ酸（１８：３（９ｃ、１１ｔ、１３ｃ））の合成に関与する遺伝子（国際公開ＷＯ０３／０２７２９６号公報）等が挙げられる。
【０００９】
また、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子の具体例として、好ましくは、下記の何れかの塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
（Ａ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２又は４に記載の塩基配列；
（Ｄ）配列番号２又は４に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列；または
（Ｅ）配列番号２又は４に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする
塩基配列：
なお、上記配列番号１に記載のアミノ酸配列および配列番号２に記載の塩基配列は、Trichosanthes kirilowii（キカラスウリ）から単離して決定された配列であり、また配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載の塩基配列はPunica granatum（ザクロ）から単離して決定された配列である。共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子としては、配列番号２又は４に記載の塩基配列が好ましく用いられる。
【００１０】
本明細書において、「１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列のことを言う。
本明細書において「１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列のことを言う。
【００１１】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989. 以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１２】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げらる。ここで言う一定以上の相同性とは、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
【００１３】
本明細書で言う「Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結
合を持つ脂肪酸を合成する能力を有する」とは、その遺伝子を宿主において発現させることによりΔ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂
肪酸が合成されることを意味する。具体例の一つとしては、非共役ジエン型脂肪酸からプニカ酸を合成する能力が挙げられ、特に好ましい具体例としては、リノール酸からプニカ酸を合成する能力が挙げられる。
【００１４】
宿主の種類は特に限定されないが、元来Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成することができない植物が好ましい。遺伝子を宿主において発現させることによりΔ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸が合成されるとは、より具体的には、本発明の遺伝子を有さない宿主よりも当該遺伝子を有する宿主の方がtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸の生産量が増大していることを言う。
【００１５】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中に開示した配列番号１若しくは３に記載のアミノ酸配列または配列番号２若しくは４に記載の塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離することができる。
【００１６】
具体的には、例えば、配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子が単離されたTrichosanthes kirilowii(キカラスウリ)、配列番号４に記載の塩基配列を有する遺伝子が単離されたPunica granatum(ザクロ)、又は、プニカ酸が存在することが知られているCyclanthera explodens (バクダンウリ)若しくはCayaponia africana (和名不明)等のような共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が発現している適当な植物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製する。次いで、当該ライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜する。
【００１７】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができるが、好ましくは未熟種子胚である。
また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版、8.3-8.86、1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００１８】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子のスクリーニングの際に用いるプローブとしては、例えば、国際公開ＷＯ０３／０２７２９６号公報に記載の方法に従って、配列番号２又は４に記載の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡを一般的に使用できるが、すでに取得された配列番号２又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子やその断片を使用してもよい。また、配列番号２又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００１９】
また、１つのアミノ酸を複数の塩基配列がコードしていることを考慮すると、用いるプライマーはその縮重を考慮したプライマーであることが望ましい。
なお、所望の塩基配列を有するプライマーはＤＮＡ合成機を用いて容易に合成するとができる。
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個以上の連続した塩基、好ましくは２０個以上の連続した塩基、より好ましくは３０個以上の連続した塩基、もっとも好ましくは５０個以上の連続した塩基を有するものが挙げられる。あるいは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることもできる。
【００２０】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法によるＤＮＡ/ＲＮＡ増幅法を利用することもできる。すなわちＲＮＡを鋳型に逆転写酵素によ
りｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡに対して適当なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い目的の遺伝子配列の部分断片を得る（ＲＴ−ＰＣＲ法）。得られた部分断片の塩基配列情報をもとに、さらに５'ならびに３'−ＲＡＣＥ法により目的遺伝子の全塩基配列を明らかにしたのち、遺伝子の３'および５'末端の塩基配列を有するプライマーを合成し、遺伝子の全長を単離することができる。かかるＰＣＲ法に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適時設定でき、これは常法に従って合成できる。なお、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法などの常法に従って実施することができる。
【００２１】
また、上記方法で得られる本発明の遺伝子あるいは各種ＤＮＡ断片は、常法に従って、その塩基配列を決定することができる。
このようにして得られる共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子は、例えば、配列番号１又は３に示されるアミノ酸からなるタンパク質のコードを有する塩基配列を有する遺伝子を挙げることができるが、これに限定されるわけではなく、当該遺伝子の相同物も包含される。
【００２２】
ここで遺伝子の相同物とは、本発明の遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴、および上記したようなその生物学的機能の類似性により一つの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、該遺伝子の対立遺伝子も当然含まれる。
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組み合わせ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従って実施することができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる。また、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子は、前記の通り、配列番号２又は４に示される塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをも包含する。このようなＤＮＡは、配列番号２又は４に示される塩基配列を有するＤＮＡと一定以上の相同性を有するＤＮＡである。
【００２３】
上記した一定以上の相同性を有するＤＮＡとは、配列番号１又は３で示されるアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号２又は４で示される塩基配列と少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは少なくとも８０％以上の同一性、より好ましくは少なくとも９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドを言う。
【００２４】
かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃のストリンジェントな条件下で配列番号２又は４に記載した塩基配列またはその相補配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することもできる。
また、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子のうち、特に（Ｂ）配列番号１又は３に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、付加または置換されているアミノ酸配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配
列；及び（Ｄ）配列番号２又は４に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、Δ１２位に二重結合をもつ脂肪酸からtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を合成する能力を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、配列番号２又は４に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異遺伝子を取得することができる。
【００２５】
変異遺伝子を得るための方法として、例えばランダム突然変異体、標的のある突然変異体、合成遺伝子を用いた方法など（新遺伝子工学ハンドブック、実験医学  別冊、羊土社、1996参照）等の公知の方法を用いることができる。
具体的には、配列番号２又は４の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２６】
（２）共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を含むベクター
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子は適当なベクター中に組み込んで組み換えベクターとして使用することができる。ベクターの種類は発現ベクターでも非発現ベクターでもよく、目的に応じて選ぶことができる。
【００２７】
クローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自律複製できるものが好ましく、フ
ァージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。また、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ZAP Express〔ストラ
タジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)〕、Lambda ZAP II(ストラタジーン社製)、λgt10、λgt11〔ＤＮＡ Cloning, A Practical Approach, 1, 49(1985)〕、λTriplEx(クロンテック社製)、λExCell(ファルマシア社製)、pT7T318U(ファルマシア社製)、pcD2〔Mo1. Cen. Bio1., 3, 280 (1983)〕、pMW218(和光純薬社製)、pUC118(宝バイオ社製)、pGEM-3Z(プロメガ社製)、pGEM-T Easy(プロメガ社製)、pCR2.1(インビトロジェン社製)、pEG400〔J.Bac., 172, 2392 (1990)〕、pQE-30 (QIAGEN社製)等を挙げることができる。
【００２８】
発現ベクターは宿主との組み合わせを考えて選択することができ、好ましくは宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕等を例示することができ、植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕等が挙げられるが、これらの詳細は本明細書中以後にも説明する。
【００２９】
（３）共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を有する形質転換体
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を有する形質転換体（即ち、形質転換宿主細胞）は、上記した組み換えベクター（好ましくは発現ベクター）を宿主に導入することにより作製することができる。
【００３０】
また、植物細胞に形質転換する場合には、その宿主としては、その形質転換体の使用目的（例えば、プニカ酸などのtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸の大量生産）
に応じて任意に選択できる。
本明細書によれば、上記遺伝子を用いて植物体を形質転換することにより、植物体内中にtrans-11-,cis-13-共役二重結合を持つ脂肪酸を蓄積させることが可能となる。
【００３１】
形質転換される植物は、共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を導入することによって共役トリエン酸を合成することができる植物であればよく、その植物の種類は特には限定されないが、元来、共役トリエン型脂肪酸を生成しない植物であることが好ましい。なぜならば、新たに導入した共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子が発現することによって、特定の共役トリエン型脂肪酸を効率的に合成することができるからである。そのような植物として例えばナタネ、ダイズ、ヒマワリ、パーム椰子などの油量作物；例えばイネ、トウモロコシ、コムギなどの禾穀類；例えばキャベツ、レタスなどの各種の野菜類；樹木類あるいは花卉などが例示される。
【００３２】
また、形質転換される植物は、導入した共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子がコードする酵素の基質となる脂肪酸を合成する能力を有する植物であることが好ましい。例えば、プニカ酸合成酵素遺伝子を導入する場合、リノール酸、オレイン酸を合成する能力を有する植物が好ましく、具体的には、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ、パーム椰子などの油量作物；例えばイネ、トウモロコシ、コムギなどの禾穀類；例えばキャベツ、レタスなどの各種の野菜類；樹木類あるいは花卉などが例示される。
【００３３】
本明細書において、形質転換の対象となる植物体としては、種子、芽生え、苗、カルス、培養細胞、植物成体などが挙げられ、例えば、ナタネの場合には芽生えまたはプロトプラスト；ダイズの場合には芽生え、カルスまたは培養細胞；ヒマワリの場合には芽生え；パーム椰子の場合にはカルスまたは培養細胞；イネの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；トウモロコシには、芽生え、苗、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；コムギの場合には、芽生え、カルスまたは培養細胞；キャベツの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト；レタスの場合には、芽生え、カルス、培養細胞またはプロトプラスト等と言ったように、当業者が通常行うように、対象植物によって適宜好ましい部位を選択して行えばよい。
【００３４】
植物への形質転換法は常法に従って行うことができ、例えば、アグロバクテリウムによる方法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法などを用いた細胞へのＤＮＡ直接導入法を挙げることができる。組み込む発現カセットは公知のプラスミドを用い、常法により作製することができる。
【００３５】
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を植物体に形質転換するためのベクターは、脂質を合成している組織で発現可能なプロモーターを含むことが好ましく、具体的には、例えば種子特異的に発現するプロモーター、または葉で発現するプロモーターなどがより好ましい。種子特異的発現には、ナピン、クルシフェリン、グルテリン、プロラミン、グリシンなど種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、あるいは、脂質合成に関与する酵素を含めたタンパク質や脂質を蓄積するオイルボディーを構成するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、例えばアセチルCoA結合タンパク質やオ
レオシンをコードする遺伝子のプロモーターを用いることができる。葉での発現には、例えばカリフラワーモザイクウィルスの35Sタンパク質をコードする遺伝子やRubisco small
subunitをコードする遺伝子のプロモーターなどを用いることができる。
【００３６】
さらに、ターミネーターを含むものが好ましく、ターミネーターとしては、例えば、ノパリンシンセターゼのターミネーターなどが挙げられる。
また、これらのベクターは、上記遺伝子を植物に導入する方法によって２種類のものが考えられる。例えば、アグロバクテリウムを介して遺伝子導入する場合には、形質転換された植物を選抜するための選抜マーカー、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子やハイグロマイシン抵抗性遺伝子などと、25bpのボーダー配列を含むバイナリーベクターを、一方物理的に遺伝子導入する場合には、上記の抵抗性遺伝子を含む大腸菌由来のプラスミド、例えばpUCなどのベクターを用いる。
【００３７】
（４）共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を有する形質転換体植物の培養方法、植物体の調製方法及び植物体からの種子の取得方法
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を有する植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換宿主細胞を培養する培地としては、ＭＳ培地、Ｒ２Ｐ培地等、その植物種に応じて通常用いられる培地が用いられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、１５〜３５℃等の条件下で行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
形質転換細胞から植物体への調整は通常不定芽形成、不定根形成あるいは不定胚形成過程を経て植物体を再生させることができるが、その方法はその植物種に応じて用いられる方法が異なる。例えばナタネの場合にはゼアチン、ベンジルアミノプリンなどの植物ホルモンを培地加えて形質転換細胞を培養することにより不定芽が形成され、得られた再生芽をベンジルアミノプリンなどの植物ホルモンを任意に含んだ発芽培地、引き続いてナフタレン酢酸、ベンジルアミノプリンなどの植物ホルモンを任意に含んだ発根培地で培養することで再生個体を得ることができる。また、イネの場合にはナフタレン酢酸、ベンジルアミノプリンなどの植物ホルモンを任意に含んだ培地で形質転換細胞を培養することにより不定芽が形成され、引き続いて植物ホルモンを含まない発根培地で培養することによって再生個体を得ることができる。
【００３９】
このように再生個体を得るには当業者が通常行うように、対象植物によって適宜好ましい培地を選択して用いればよい。再生させた幼植物は通常馴化過程を経て鉢に移し、通常の非形質転換体と同様に育てることができる。また、自殖あるいは他殖によって非形質転換体と同様に種子を得ることができる。
【００４０】
（５）形質転換体植物種子から種子油の製造方法
共役トリエン型脂肪酸の合成に関与する酵素遺伝子を導入することにより共役トリエン型脂肪酸を生成するように改変された形質転換体植物種子から種子油を回収する方法は特に限定されず、このような種子油を媒体から回収するための通常の方法を使用することができる。
【００４１】
例えば、形質転換体植物の場合、本発明の形質転換体の種子をすりつぶしたり、それらを圧搾することにより脂肪酸を含む油溶性成分を抽出することができる。
種子からの脂肪酸を含む油溶性成分の抽出にあたっては、種子全体から抽出してもよいが、例えばイネ等の場合、種子を胚成分、胚乳成分、胡粉層（糠層）を含む部分等に分け抽出することも可能である。特に、胡粉層（糠層）を含む部分は、油溶性成分が多量に存在し、少量からでも効率よく脂肪酸を含む油溶性成分を抽出することができる。
【００４２】
これらは、含油量が多い場合はフィルタープレスや遠心分離により油分を回収してそのまま植物油成分として、化粧品等に添加して用いてもよいし、含油量が少ない場合や食品などに使用する場合にはヘキサン等の有機溶媒を用いて抽出した後、脱ガム、脱酸、脱色、脱臭等の精製を施すことができる。
また、必要に応じて、脂肪酸を含む油溶性成分をカラムクロマトグラフィー等を用いて分離精製し、目的とするトリエン型脂肪酸成分のみを単離し、医薬品等として用いてもよい。
【００４３】
種子中の脂肪酸含量は常法により測定することができる。たとえば、葉や種子を材料としてBrowseらの方法（Anal. Biochem., vol.152, p.141-145, 1985）に従って脂肪酸のメチルエステルを調製し、ヘキサンで抽出した後、ガスクロマトグラフィーで分析できる(Plant Physiol. Biochem., vol.30, p.425-434, 1992)。
【００４４】
（６）形質転換体植物から得られる種子油を有効成分としてなる脂肪蓄積抑制剤およびこれを配合した組成物の調製
形質転換体植物から得られる種子油は、動物において優れた脂肪蓄積抑制作用を有しているので、該種子油を脂肪蓄積抑制剤として用いることができる。また該脂肪蓄積抑制剤を適宜配合した医薬用組成物、飲食用組成物又は動物飼料用組成物とすることができる。
【００４５】
本発明では、前記種子または種子油を、そのまま利用することもできるが、脂肪酸（共役トリエン型脂肪酸及び非共役トリエン型脂肪酸を含む）又はその誘導体の形に加工して用いてもよい。脂肪酸への加工方法は、上記種子油を必要に応じて前処理した後、加水分解して脂肪酸を得、それを精製するといった方法が好ましい。種子油の前処理方法としては、融点以上の温度で放置して比重の大きなものを沈降除去したり、比重の軽いものを遠心分離除去するといった物理的な方法、又は原料油脂に硫酸又はリン酸を加えて加熱攪拌し、タンパク質、有機色素類を分解し、中和、洗浄により除去したり、活性白土を加えて加熱処理し、分解物、着色物質、樹脂状物質等を吸着除去するといった化学的な方法が挙げられる。また、加水分解の具体例としては、油脂を水酸化カリウム等のアルカリでケン化する方法、酸化亜鉛、酸化カルシウム、又は酸化マグネシウムを触媒として用いて中圧条件下で分解する中圧触媒分解法、又は高圧下連続的に分解する連続高圧分解法等の化学的な方法、リパーゼや微生物を用いる生物学的な加水分解法等が挙げられる。脂肪酸の分離精製法としては、バッチ式、半連続式、連続式蒸留装置、又は精密蒸留装置を用いて目的とする脂肪酸を蒸留精製する方法、過飽和状態の溶液又は溶融体を目的とする脂肪酸に応じて適切な温度に冷却し、結晶を生成させ、生成した結晶を、圧搾法、Ｓｏｌｅｘｏｌ法（米国特許第2293674号、1942）、Ｅｍｅｒｓｏｌ法（米国特許第2421157号、1974）、Ｈｅｎｋｅｌ法（Ｗ．Ｓｔｅｉｎら、J. Am. Oil Chem. Soc.、vol.45、471、1968）等の方法で分取する方法が挙げられる。
【００４６】
本発明の脂肪蓄積抑制剤に有効成分として含まれる種子油及びその処理物は、生理学的に許容されるそれらの塩、水和物並びに溶媒和物等であってもよい。該種子油を加水分解処理により生成する脂肪酸の塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩などの薬学的に許容し得る塩などがあげられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩があげられる。
【００４７】
上記種子油及び／又はその処理物を有効成分として含む脂肪蓄積抑制剤は、必要に応じて適当な添加剤を配合するなどして、それ自体公知の通常用いられる方法により調製することができる。
本発明の脂肪高蓄積抑制剤は、単独または他の物質を適宜配合することにより医薬用組成物とすることができる。
【００４８】
上記した本発明の脂肪酸蓄積抑制剤の有効成分として用いられる種子油及びその処理物は、それ自体単独で脂肪蓄積抑制剤として患者に投与することもできるが、薬理学的に許容される製剤用添加物等を用いて医薬品組成物として調製し、これを投与するのが好ましい。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、マイクロカプセル剤、リポソーム製剤、トローチ、舌下剤、液剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁剤等として経口的に、あるいは無菌の水性液もしくは油性液として製造した注射剤や、座剤、軟膏、貼付剤等として非経口的にも使用できるが、経口的な使用が好ましい。
【００４９】
これらは例えば、該化合物を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和し、充填又は打錠等の当業界で周知の方法を用いて製造することができる。これらの医薬品組成物における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００５０】
例えば、錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、セルロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラート等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、ショ糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリー等の香味剤等が用いられる。また、錠剤は必要に応じて腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングを施すこともできる。カプセルについては、前記の添加剤にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
【００５１】
かくして得られる医薬品組成物は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや、ヒト以外の哺乳動物に対して脂肪蓄積の抑制剤として投与することができる。該組成物に含まれる前記化合物の投与量は、対象疾患、症状、対象臓器、投与対象、投与方法等により差異はあるが、例えば、脂肪蓄積抑制の目的で該化合物を経口投与する場合は、一般的に成人（体重60kgとして）においては、一日につき約5 mg〜10 g、好ましくは約30 mg〜3 g、より好ましくは約300 mg〜3 gである。
【００５２】
また、一日の投与量を一〜数回に分けて投与するのが望ましい。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を同様に投与することができる。
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、単独または他の物質を適宜配合することにより飲食用組成物とすることができる。飲食用組成物における本発明の共役トリエン型脂肪酸を含む種子油及び／又はその処理物の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜１０重量％、好ましくは０．０５〜２重量％、更に好ましくは０．０８〜０．８重量％の範囲である。また、飲食用組成物中の脂肪に対する共役トリエン型脂肪酸を含む種子油及び／又はその処理物の割合としては特に制限されないが、固形分換算で例えば、０．１重量％以上、好ましくは０．５状量％以上、さらに好ましくは１．２重量％以上である。また、所望に応じて、飲食用組成物として許容される各種の担体及び／又は添加剤を添加配合してもよい。
【００５３】
担体の具体例としては、キャリアー担体、エクステンダー剤、希釈剤、増量剤、分散剤、ブドウ糖、乳糖等の賦形剤、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の結合剤、水、エタノール、植物油等の溶媒、溶解補助剤、重曹等の緩衝剤、溶解促進剤、ナトリウムＣＭＣ、ＨＰＭＣ、カンテン、ゼラチン等のゲル化剤、ナトリウムＣＭＣ、ナトリウムアルギネート等の懸濁化剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
添加剤の具体例としては、グルタミン酸、イノシン酸等の可食性、嗜好性を向上させるための調味料、バニラ、ミント、ローズマリー、リナロール、天然香料等の香料、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＥ、パントテン酸、ニコチン酸等のビタミン類、ステビア等の甘味料、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、マロン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸等の有機酸、着色料、湿気防止剤、ファイバー、電解質、ミネラル、栄養素、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、湿潤剤、茶抽出物、コーヒー抽出物、ココア抽出物、オレンジ、グレープ、アップル、モモ、パイナップル、ナシ、プラム、サクランボ、パパイア、トマト、メロン、イチゴ、ラズベリー等のフルーツ抽出物等の天然植物抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の飲食用組成物の種類は特に限定されないが、具体例としては、コーヒー、紅茶、緑茶、ウーロン茶等の茶飲料類、豆乳、青汁、果物ジュース、野菜ジュース等の果実野菜飲料類、ヨーグルト等の乳酸菌飲料類、牛乳等の乳飲料類、コーラ等の炭酸飲料類、及び各種のスポーツドリンク類等の他、パン類のベーカリー製品、米飯、麺類、豆腐等の大豆加工食品、ソーセージやハム等の魚畜肉加工食品、ケーキ、クッキー、饅頭、煎餅、アイスクリーム、プデイング、羊羹、キャンディー、チョコレート等の菓子類、バター、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、マーガリン、ショートニング等の加工油脂食品、マヨネーズ、ドレッシング、醤油、味噌、ソース等の調味料、コンニャク、漬け物類等が挙げられる。
【００５６】
さらに、本発明の脂肪蓄積抑制剤は、そのまま単独で、又は可食性や嗜好性を向上するための調味料、香料等を適宜配合することにより動物飼料用組成物とすることもできる。このとき、一定の物性を保つため、乳化剤、安定剤を配合することもできる。また、これらは、工業的に生産される種々の加工飼料、ペットフードの原料素材として用いることもできる。また、本発明の脂肪蓄積抑制剤あるいはその処理物を動物飼料用組成物に直接振りかけて用いてもよい。動物飼料用組成物における共役トリエン型脂肪酸を含む共役トリエン酸系油脂及び／又はその処理物の含有量は特に制限されないが、動物飼料に対して固形分換算で例えば０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．０５重量％〜２重量％、さらに好ましくは０．０８重量％〜０．８重量％の範囲である。また、食餌中の脂肪に対する共役トリエン型脂肪酸を含む種子油及び／又はその処理物の割合としては特に制限されないが、固形分換算で例えば、０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、さらに好ましくは１．２重量％以上である。
【００５７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１：  キカラスウリ由来プニカ酸合成関連遺伝子の単離と発現
（１）キカラスウリ由来プニカ酸合成酵素遺伝子の単離
WO03/027296号公報の実施例１に記載の方法に従って、キカラスウリ由来プニカ酸合成酵
素（コンジュゲース）をコードする遺伝子（以下、「TkFac」と称することがある）を単
離した。単離されたプニカ酸合成酵素遺伝子の塩基配列を配列番号２に記載し、遺伝子にコードされる酵素のアミノ酸配列を配列番号１に記載する。
【００５９】
（２）キカラスウリ由来プニカ酸合成酵素遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
WO03/027296号公報の実施例１に記載の方法に従って、（１）で得られたキカラスウリ
由来プニカ酸合成酵素遺伝子ｃＤＮＡ「TkFac」を、バイナリーベクターpLAN421[Plant Cell Reports, 10, 286-290 (1991)]に挿入することにより、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター配列とアグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター配列の間に該ｃＤＮＡが挿入したバイナリーベクターpKS-TkFacを作製した。
【００６０】
また、Napin遺伝子プロモーター配列[The Journal of Biological Chemistry, 262, 12196-12201 (1987)]をpLAN421のカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター配列と入れ替えたバイナリーベクター[Plant Molecular Biology, 26, 1115-1124 (1994)]に、上述の該ｃＤＮＡ断片を挿入することにより、Napinプロモーター配列とアグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター配列の間に該ｃＤＮＡが挿入されたバイナリーベクターpKN-TkFacを作製した。
【００６１】
これらプラスミドを用いてDH5αの形質転換を行い、スペクチノマイシン（50μg/ml）
とテトラサイクリン（12.5μg/ml）を含むLB培地上に形成されたコロニーを得た。コロニーよりpKN-TkFacおよびpKS-TkFacプラスミドＤＮＡを精製し、これらを用いてエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウムEHA101株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（50μg/ml）、テトラサイクリン（2.5μg/ml）、クロラムフェニコール(25μg/ml)およびカナマイシン（50μg/ml）を含むYEB寒天培地(0.5% Peptone, 0.5% Beef extract, 0.1% Yeast extract, 0.5% sucrose, 1.5% agarose)上に形成されたコロニーを得た。コロニーの一部をとり、PCRを行い反応産物の検出を行ったところ、期待されるサイズのＤＮＡ断片の生成が見られた。これらのことから、得られたコロニーはそれぞれpKN-TkFacまたはpKS-TkFacを含むアグロバクテリウム形質転換体であることを確認した。
【００６２】
（３）ナタネ形質転換体の作製
WO03/027296号公報の実施例１に記載の方法に従って、ナタネ形質転換体を作製した。
ナタネ（Brassica napus cv. Westar）はPlant Mol.Biol.26,1115-1124,1996に報告されている方法に従って形質転換を行った。即ち、3% sucroseを含んだMS培地で無菌発芽させたナタネ下胚軸を、2〜5 mmに切断し前培養培地 (0.2 μg/ml;2,4-D, 3% sucroseを含
むB5培地 ) 上で一晩前培養した。（２）で作製したpKN-TkFac又はpKS-TkFacを含むアグ
ロバクテリウム形質転換体をYEB培地で増殖させた後、4000 gで10分間遠心により集菌し
て、3% sucroseを含んだMS培地に再懸濁を行った。この懸濁液に、先のナタネ下胚軸を加えて20分間振とうさせた。取り出した下胚軸を滅菌濾紙上で風乾した後、元の前培養培地に戻して3日間アグロバクテリウムと共存培養した。カナマイシン（30μg/ml）を含む選
択培地 (2μg/ml Zeatin, 3μg/ml BAP, 1〜2% sucrose, 500μg/ml カルベニシリンを含んだB5培地) に移して選抜を行った。これにより得られた緑色の再生芽を、伸長培地 (0.5μg/ml BAP、3% sucrose、500μg/ml カルベニシリン、30 μg/ml  カナマイシンを含むB5培地)及び発根培地 (0.01μg/ml NAA, 0.4μg /ml BAP, 1% sucrose, 250 μg/ml カルベニシリンを含むMS培地) で培養して再生個体を得た。これら再生個体の葉からDneasy  Plant Mini（Qiagen社製）を用いてDNAを抽出し、PCRを行い反応産物の検出を行ったところ、期待されるサイズのＤＮＡ断片の生成が見られ、形質転換体であることが確認された。これら形質転換体は鉢上げして自家受粉種子（T1種子）を採取した。
【００６３】
（４）ナタネ形質転換体の脂肪酸分析
得られたT1種子5粒を乳鉢及び乳棒ですりつぶした後、1mlの0.5Mナトリウムメトキシド／メタノールを加えて懸濁した後、懸濁液をガラス管に移して５０℃で１時間メチル化処理した。以後、WO03/027296号公報に記載の方法に従って、ナタネ形質転換体の脂質分析
を行った。 ＧＣ分析により非形質転換体種子と形質転換体T1種子の脂肪酸組成を比較し
たところ、形質転換体T1種子（図１Ｂ）では非形質転換体の種子（図１Ａ）にはみられない新たなピークが検出された。このピーク（図１Ｂ、矢印）はキカラスウリ種子由来脂肪酸ＧＣサンプルに含まれるプニカ酸メチルエステルのピークと同じ時間に検出されたことから、キカラスウリ由来コンジュゲースがナタネ種子中でプニカ酸を生成したことを明らかにした。なお、図１中の数字で表したピークは各脂肪酸のメチルエステルであり、それぞれ、１６：０（パルミチン酸（palmitic acid））、１８：１（９ｃ）（オレイン酸（oleic acid））、１８：２（９ｃ，１２ｃ）（リノール酸（linoleic acid））、１８：３（９ｃ, １２ｃ, １５ｃ）（α−リノレン酸（α−linolenic acid））、２０：１（１１ｃ）（ゴンドイン酸（gondoic acid））、２２：０（ベヘン酸（behenic acid））、および１８：３（９ｃ，１１ｔ，１３ｃ）（プニカ酸（punicic acid ））である。最初の数値は炭素数を示し、その次の数値は不飽和結合の数を示し、不飽和結合の数の直後の括弧内の数値は該不飽和結合の位置を示し、ｃ及びｔはそれぞれシス及びトランスを示す。
【００６４】
実施例２：  ザクロ由来プニカ酸合成関連遺伝子の単離と発現
（１）ザクロ由来プニカ酸合成酵素遺伝子の単離
WO03/027296号公報の実施例２に記載の方法に従って、ザクロ由来プニカ酸合成酵素（コ
ンジュゲース）をコードする遺伝子（以下、「PgFac」と称することがある）を単離した
。単離されたプニカ酸合成酵素遺伝子の塩基配列を配列番号４に記載し、遺伝子にコードされる酵素のアミノ酸配列を配列番号３に記載する。
【００６５】
（２）ザクロ由来プニカ酸合成酵素遺伝子を含むイネ形質転換ベクターの構築
WO03/027296号公報の実施例２に記載の方法に従って、（１）で得られたザクロ由来プ
ニカ酸合成酵素遺伝子ｃＤＮＡ「PgFac」を、イネ胚グロブリン遺伝子Reg2（Plant Cell Physiology, vol. 37, 612-620）の翻訳開始コドンより上流1252bpを含むプロモーター領域（rEGlb p）、GUS遺伝子ならびにノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター配列（Nos t）を連結したプラスミドpUC19に、GUS遺伝子と入れ替えにPgFacを含むＤＮＡ断片を挿入した後、大腸菌DH5αの形質転換を行いコロニーを得た。これよりプラスミドＤＮＡを精
製し、rEGlb p、PgFacおよびNos tを含むプラスミドを得た。次にこれを制限酵素EcoRIとPstIで切断し、rEGlb p、PgFacおよびNos tを含むＤＮＡ断片を精製した後、pBSII sk+の対応する制限酵素部位にライゲーションし、大腸菌DH5αの形質転換を行いコロニーを得
た。これよりプラスミドＤＮＡを精製し、rEGlb p、PgFacおよびNos tを含むプラスミド
を得た。
【００６６】
次にこのプラスミドを、制限酵素SmaI、KpnIおよびXmnIで切断し、rEGlb p、PgFacおよびNos tを含むSmaI-KpnI断片を精製した。一方、バイナリーベクターpMM473.1[平成９年
度産業技術開発事業新エネルギー・産業技術総合開発委託複合生物系等生物資源利用技術開発 (生物利用石油代替燃料製造技術の開発) 成果報告書、第３章石油代替有用資源生産技術、（１）熱帯油糧作物の高度利用技術、p.87-141、財団法人バイオインダストリー協会、1998]を制限酵素HpaIとKpnIで切断し、これと上述の該ｃＤＮＡ断片をライゲーショ
ンすることにより、バイナリーベクターpME-PgFacを作製した。これを用いてエレクトロ
ポーレーション法によりアグロバクテリウムEHA101株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（50μg/ml）、テトラサイクリン（2.5μg/ml）、クロラムフェニコール(25μg/ml)
およびカナマイシン（50μg/ml）を含むYEB寒天培地(0.5％ Peptone, 0.5％ Beef extract, 0.1％ Yeast extract, 0.5％ sucrose, 1.5％ agarose)上に形成されたコロニーを得た。コロニーの一部をとり、PCRを行い反応産物の検出を行ったところ、期待されるサイズのＤＮＡ断片の生成が見られた。これらのことから、得られたコロニーはpME-PgFacを含むアグロバクテリウム形質転換体であることを確認した。
【００６７】
（３）イネ形質転換体の作製
WO03/027296号公報の実施例２に記載の方法に従って、イネ形質転換体の作成をした。
イネ（Oryza sativa L.）はSpringer Lbs Manual 分子遺伝学・分子生物学的実験法 モデル植物ラボマニュアルpp108-138（岩淵雅樹、岡田清孝、島本功=編  シュプリンガー・フェアラーク東京社）に報告されている方法に従って形質転換を行った。即ち、籾を取り除いたイネ種子３０粒を１／２希釈アンチホルミン溶液（50(v/v)%次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素5%、和光純薬）、Tween20 数滴）中で２０分間振とう滅菌し、滅菌水で３回洗浄した。これらの滅菌種子をカルス誘導培地(2N6培地＝30mg/mlシュークロース、1mg/lカザミノ酸、2μg/ml 2,4-D、8mg/ml アガロース入りN6培地)上に播種して、28℃暗所で３
週間培養し、更に、新しいカルス誘導培地に移植して28℃暗所で４日間培養することによりイネカルスを誘導した。（２）記載のpME-PgFacを有したアグロバクテリウムをYEB培地で増殖させた後、4000gで10分間遠心により集菌して、40μg/mlのアセトシリンゴン、50 μg/ml スペクチノマイシン、50μg/ml カナマイシンを含有したAAI培地にOD600＝0.18〜0.20になるように再懸濁を行った。この懸濁液に、先のイネカルスを加えて15分間室温で振とうさせた。取り出したカルスを滅菌濾紙上で風乾した後、共存培養培地（N6CO培地＝30mg/ml シュークロース、10mg/ml グルコース、2μg/ml 2,4-D、40μg/mlアセトシリン
ゴン、6mg/mlアガロース入りN6培地）に移して25℃暗所で３日間アグロバクテリウムと共存培養した。15mg/ml ハイグロマイシン、250mg/ml カルベニシリンを含む滅菌水に共存
培養後のカルスを移して振とう、上清を廃棄する洗浄操作を10回繰り返して、アグロバクテリウムの除菌を行った後、滅菌濾紙上で余分な水分を除いてから選抜培地（N6SE培地＝1mg/ml カザミノ酸、30mg/ml シュークロース、2μg/ml 2,4-D、6mg/ml アガロース、30mg/ml ハイグロマイシン、500μg/mlカルベニシリンを含むN6培地）に移して28℃暗所で３週間選抜を行った。これにより増殖したカルスを50mg/ml ハイグロマイシン、500μg/ml カルベニシリン含有の新しいN6SE培地に移植して更に28℃暗所で３週間選抜を行った。次に、得られたハイグロマイシン耐性カルスを再生培地（MSRE培地＝30mg/ml シュークロース、30mg/ml ソルビトール、1μg/ml 1-ナフタレン酢酸、2μg/ml 6-ベンジルアミノプリン、8mg/ml アガロース、30μg/ml ハイグロマイシン、500μg/ml カルベニシリンを含むMS培地）で培養して再生個体を得た。これら再生個体の葉からDneasy Plant Mini (Qiagen社製)を用いてDNAを抽出し、PCRを行い反応産物の検出を行ったところ、期待されるサイズのＤＮＡ断片の生成が見られ、形質転換体であることが確認された。これら形質転換体はワグネルポットに移植して自家受粉種子（T1種子）を採種した。
【００６８】
（４）イネ形質転換体の脂肪酸分析
WO03/027296号公報の実施例２に記載の方法に従って、得られたT1種子の全種子中に含
まれる脂肪酸を分析した。即ち、種子１粒を乳鉢および乳棒ですりつぶした後、1.5mlの0.5Mナトリウムメトキシド／メタノールを加えて懸濁し、懸濁液をガラス管に移して50℃
で１時間メチル化処理し、イネ転換体の脂質分析を行った。ＧＣ分析により非形質転換体種子と形質転換体T1種子の脂肪酸組成を比較したところ、形質転換体T1種子（図２Ｂ）非形質転換体の種子（図２Ａ）には見られない新たなピークが検出された。このピーク（図２Ｂ、矢印）はザクロ由来脂肪酸GCサンプルに含まれるプニカ酸メチルエステルのピークと同じ時間に検出されたことから、ザクロ由来コンジュゲースによりイネ種子中でプニカ酸が生成していることが明らかになった。
【００６９】
非形質転換体、pME-PgFac形質転換体、それぞれ３個体について種子の脂肪酸組成を比
較した（表１）。pME-PgFacでは平均3%のプニカ酸の蓄積が見られた。そのうち最大のも
のは4.2%だった。
【００７０】
【表１】
2005239704.tif 000002
【００７１】
また、T1種子の組織別脂肪酸組成の分析には、種子を実体顕微鏡下でメスを用いて胚および胡粉層（糠層）を含む部分と胚乳部分に分け、胚乳部分は乳鉢・乳棒ですりつぶした後、1.5mlの0.5Mナトリウムメトキシド／メタノールを加えて懸濁、ガラス管に移した。
胚を含む糠層はそのままガラス管に移して、1.5mlの0.5Mナトリウムメトキシド／メタノ
ールを加え、それ以後は全種子の場合と同様に処理して分析を行った。
【００７２】
非形質転換種子およびpME-PgFac形質転換種子、それぞれ４粒について胚および糠層と
胚乳部分の脂肪酸組成測定し比較した（表２）。形質転換種子では脂質を蓄積している胚および糠層では平均5.1%のプニカ酸の蓄積が見られた。一方、胚乳部分では平均3％の蓄
積量だった。また、形質転換体種子ではプニカ酸の蓄積に伴い、非形質転換体種子と比較してオレイン酸含量の増加とリノール酸含量の減少が認められた。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
なお、図２中の数字で表したピークは各脂肪酸のメチルエステルであり、それぞれ、１６：０（パルミチン酸(palmitic acid)）、１８：０（ステアリン酸（stearic acid））、１８：１（９ｃ）（オレイン酸(oleic acid)）、１８：２（９ｃ、１２ｃ）（リノール酸(linoleic acid)）、１８：３（９ｃ、１２ｃ、１５ｃ）（リノレン酸(α-linolenic acid)）、２２：０（ベヘン酸）、および１８：３（９ｃ、１１ｔ、１３ｃ）（プニカ酸(punicic acid)）である。最初の数値は炭素数を示し、その次の数値は不飽和結合の数を示し、不飽和結合の数の直後の括弧内の数値は該不飽和結合の位置を示し、ｃおよびｔはそれぞれシスおよびトランスを示す。
【００７５】
実施例３：  ナタネ形質転換体種子油の脂肪蓄積抑制効果
前記実施例１の（３）において作製した形質転換体ナタネ種子約950g、非形質転換体のナタネ種子約900gおよびザクロ種子約760gを用いてそれぞれの種子油を抽出した。抽出方法を以下に示す。
【００７６】
まず種子を小型粉砕機で粉砕し、等量のヘキサンを加えて懸濁した後、一晩静置して油を抽出した。懸濁液をフィルターで漉して回収した後、残渣について更に同様の操作を２度行った。回収したヘキサン層はあわせてエバポレーターにてヘキサンを飛ばし、それぞれプニカ酸含有形質転換体ナタネ油約240g、非形質転換体ナタネ油約260gおよびザクロ油約80gを得た。
【００７７】
得られた油の脂肪酸組成を分析するため、各抽出油一滴をガラス管に垂らし、それに1 mlの0.5 Mナトリウムメトキシド／メタノールを加えた後、５０℃で1時間メチル化反応した。それに1.5mlの0.9MNaClと1mlのヘキサンを加えて攪拌抽出し、2000×g、5分間遠心して上清を真空乾燥させた。これにより抽出されたそれぞれの脂肪酸メチルエステルに20μlのヘキサンを加えて溶解させ、内1μlをGC18A(Shimadzu社)でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を行った。この場合、分析には、TC-70、60m×0.25mm、ID 0.25μmのキャピラリーカラム(GL Science社)を用い、150℃から240℃に3℃/分で昇温後、240℃で6分間恒温分析を行った。その結果、プニカ酸含有形質転換体ナタネ油は2.4%の、ザクロ油は83%のプニカ酸をそれぞれ含有していた(表３参照)。これらの油を以下の動物実験に供した。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
6週齢のICR系CD-1雄マウスを1群6匹として非形質転換体ナタネ油群、形質転換体ナタネ油群、ザクロ油１群、ザクロ油２群の4群に分け、4週間自由摂食させた。
食餌は表４に示すような米国国立栄養研究所（The American Institute of Nutrition:AIN）が推奨するAIN-93G組成に基づき純化食を調製した。食餌の調製に用いた乳製カゼイン、Ｌ−レシチン、酒石酸コリン及び、ｔ−ブチルヒドロキノンは和光純薬社製、大豆油は日清オイリオ社製、α化コーンスターチ、コーンスターチ、及びセルロースはオリエンタル酵母社製、スクロースは大日本明治製糖社製、ミネラル混合およびビタミン混合は日本農産工業社製である。
【００８０】
試験油として上記で搾油したプニカ酸含有（形質転換体）ナタネ油および非形質転換体ナタネ油（ブランク）を飼料の10%添加した。また対照ザクロ油群として形質転換体ナタ
ネ油と同じプニカ酸含量になるように非形質転換体ナタネ油33.6に対してザクロ油を１の割合で、飼料の10%になるように加えたザクロ油１群と、形質転換体ナタネ油のプニカ酸
含量の２倍になるように非形質転換体ナタネ油15.5に対してザクロ油１の割合で飼料の10%になるように添加したザクロ油２群の二つの群を用いた。それぞれの食餌脂肪の脂肪酸組成は表５のとおりである。このような組成の食餌を６週齢のICR系CD-1雄マウス（一群６匹）に４週間自由摂食させた。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
食餌及び水は２日毎に換え、摂食量と体重を測定した。マウスは屠殺前日に絶食させた後、エーテル麻酔後大動脈採血により屠殺した。内臓組織（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）及び内臓脂肪組織（腎周辺と副睾丸周辺の白色脂肪組織）は実験終了時に重量を測定した。その結果を表６及び７に示す。結果は、Student's T testにより有意差検定（Ｐ<0.05）を行い、非形質転換体ナタネ油群（ブランク）と比較した各群の効果を比較した。腎臓周辺脂肪組織重量は非形質転換体ナタネ油群（ブランク）に比べ形質転換体ナタネ油群で有意な低値を示した。このような傾向は、ザクロ油1群では認められず、ザクロ油2群で認められた。睾丸周辺脂肪組織重量も、非形質転換体ナタネ油群（ブランク）に比べ形質転換体ナタネ油群で有意な低値を示したが、ザクロ油対照群（対照）では違いはなかった。また、各内臓組織の重量にはいずれも対照群との差は認められなかった。
【００８４】
【表６】
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【００８５】
【表７】
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【００８６】
実施例４：イネ形質転換体種子油の脂肪蓄積抑制効果
前記実施例２の（３）で作製した形質転換体イネ種子約780gを用いて種子油（コメ油）を抽出した。抽出方法は実施例３に記載した方法に従った。その結果17.5gのコメ油を得
た。
実施例３に記載した方法に従って得られた油の脂肪酸組成の分析を行ったところ、表８に示すとおり、プニカ酸含有形質転換体コメ油のプニカ酸含有率は５％だった。この油を以下の動物実験に供した。
【００８７】
【表８】
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【００８８】
6週齢のCRj:CD-1(ICR)雄マウスを一群6匹として非形質転換体コメ油群、形質転換体コメ油群、ザクロ油入り非形質転換体コメ油群の3群に分け、4週間自由摂食させた。その際、非形質転換体コメ油には市販のホーソー油脂化学社製スーパーサラダ油コシヒカリを用いた。
食餌は表9に示すようなAIN-93G組成に基づき馴化食を調整した。食餌のうち試験油以外はオリエンタル酵母(株)社製の精製飼料(マウス・ラット用標準配合AIN-93G)を用いた。
【００８９】
【表９】
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【００９０】
試験油として上記で搾油したプニカ酸含有（形質転換体）コメ油および市販の非形質転換体コメ油を飼料の10%になるように添加した。また対照ザクロ油群として形質転換体コメ油と同じプニカ酸含量になるように、非形質転換体コメ油15.5に対して実施例3で搾油したザクロ油1の割合で、飼料の10%になるように加えたものを用いた。それぞれの食餌脂肪の脂肪酸組成は表１０のとおりである。このような組成の食餌を6週齢のCRj:CD-1(ICR)雄マウス(一群6匹)に4週間自由摂食させた。
【００９１】
【表１０】
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【００９２】
食餌および水は一週間に一回の頻度で交換し、2日から3日毎に摂食量と体重を測定した。マウスはジエチルエーテルの吸入麻酔下で後大静脈より採血して屠殺した。ただし、絶食は行わなかった。内臓組織(肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺)および内臓脂肪組織(腎周辺と副睾丸周辺の白色脂肪組織)は実験終了時に重量を測定した。その結果を表１１および表１２に示す。腎臓周辺脂肪組織重量、副睾丸周辺脂肪組織重量ともに非形質転換コメ油群(ブランク)に比べ形質転換体コメ油群では低値を示し、特に腎臓周辺脂肪組織重量ではStudent's T testによる有意差検定（P<0.05）で有意差が認められた。このような傾向はザクロ油群でも認められたものの有意差はなかった。また、各内臓組織の重量にはいずれも対照群との差は認められなかった。
【００９３】
【表１１】
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【００９４】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、非形質転換体ナタネの種子（Ａ）およびpKN-TkFac形質転換体ナタネの種子（Ｂ）より調製した脂肪酸メチルエステルをＧＣにより分析した結果である。図中の*印は試料に加えたペンタデカン酸メチルエステルに対応するピーク。
【図２】図２は、非形質転換体イネの種子（Ａ）、pME-PgFac形質転換体イネ種子（Ｂ）より調製した脂肪酸メチルエステルをＧＣにより分析した結果である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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