(57)【要約】      （修正有）【課題】食肉などの食品製品の変敗に関わる複数種の乳酸菌と特異的に反応するプライマーを得ること、及びこれを用いて複数種の変敗乳酸菌を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(ＤＧＧＥ)を用い、同時に分離・判別できる食肉製品の変敗に関係する乳酸菌の検出方法とする。【解決手段】特定の塩基配列からなるフォワードプライマーと、別の特定の塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットからなり、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をＰＣＲによって増殖可能な食品変敗性乳酸菌の検出用ＰＣＲプライマーとする。食品から採取された乳酸菌を培養してＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該Ｖ３領域配列を増殖させ、この増殖配列をＤＧＧＥにより分離してバンドを形成させ、同条件で形成したＤＮＡ既知乳酸菌のバンドと移動距離を比較することにより乳酸菌種を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットからなり、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖可能な食品変敗性乳酸菌の検出用ＰＣＲプライマー。
【請求項２】
食品から採取された乳酸菌を培養してＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して配列番号1で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、これにより１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列を増殖させ、この増殖した配列を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離してバンドを形成させ、同条件で形成したＤＮＡ既知乳酸菌のバンドと移動距離を比較することにより乳酸菌種を判定することからなる食品変敗性乳酸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、食肉製品などの変敗に関わる乳酸菌をポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって検出するために用いる食品変敗性乳酸菌の検出用ＰＣＲプライマーに関し、さらにＰＣＲにより増幅された塩基配列が乳酸菌の種毎に異なることを利用した食品変敗性乳酸菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、食肉製品中の糖を分解して乳酸を産生するという有用菌であるが、また、酸素のない状況下でも生育することが可能であり、炭酸ガスや粘性物質を生成するものも存在する。そのため、乳酸菌は食中毒を引き起こすことはないが、食肉などの食品の品質劣化をもたらす原因菌とされている。
【０００３】
このような食品変敗性乳酸菌の発生の有無を従来の生化学的性状によって判別するためには、グラム染色、カタラーゼテスト、菌の形態及び２０数種類の糖分解性状を調べることによって菌種を判別する必要がある。
【０００４】
しかし、このような方法は、非常に煩雑で膨大な時間を要する方法であり、また菌の形状及び糖の分解性状によっては判別に曖昧な点が多く、特定に熟練を要していた。
そこで、生化学的性状による判別法に代わるものとして、遺伝子レベルでの判別法が注目されている。
【０００５】
乳酸菌のうち、ロイコノストック属のものについては、遺伝子レベルで種を判定する方法に関し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)にて１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を解析することによる方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記した判定方法は、食肉製品の変敗に関する乳酸菌をロイコノストック属のものに限定して、その種を判別するものであり、一度のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって異なる属や複数種の乳酸菌を同時に判別できる方法ではなかった。
【０００８】
また、実際の食肉製品などを製造する食品工場では、製品の品質や安全性向上を計るために、予め工場内に存在する可能性のある全ての乳酸菌を判別しておき、万一発生した場合には乳酸菌種と汚染源の特定を確実かつ迅速になし得る技術が求められている。
【０００９】
そこで、本願の発明者らは、食肉製品の変敗に関係する乳酸菌を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を用いて複数の乳酸菌を同時に分離・検出できるプライマーを希求し、これを乳酸菌の遺伝子配列などの知見を基に設計し、得られたプライマーの性能について確認試験を行ってこの発明を完成したのである。
【００１０】
すなわち、この発明の課題は、上記した問題点を解決して、食肉などの食品製品の変敗に関わる複数種の乳酸菌と特異的に反応するプライマーを得ること、及びこれを用いて複数種の変敗乳酸菌を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)を用い、同時に分離・判別できる食肉製品の変敗に関係する乳酸菌の検出方法とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記した課題を解決するために、本願の食品変敗性乳酸菌の検出用ＰＣＲプライマーに係る発明は、配列番号1で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットからなり、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖可能な食品変敗性乳酸菌の検出用ＰＣＲプライマーとしたのである。
【００１２】
または、同上の課題を解決するために、本願の食品変敗性乳酸菌の検出方法に係る発明では、食品から採取された乳酸菌を培養してＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して配列番号1で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、これにより１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列を増殖させ、この増殖配列を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離してバンドを形成させ、同条件で形成したＤＮＡ既知乳酸菌のバンドと移動距離を比較することにより乳酸菌種を判定することからなる食品変敗性乳酸菌の検出方法としたのである。
【００１３】
上記したように構成されるＰＣＲプライマーは、配列番号１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットであることにより、これを用いて１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖させた場合に、食品変敗性乳酸菌の属および種に特有の塩基配列の荷電的な特徴を顕在化させることができ、そのことによって電気泳動移動度により種を判別可能な状態にできるものである。
【００１４】
同様に、前記した食品変敗性乳酸菌の検出方法では、配列番号１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で示される塩基配列からなるリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットを用いて１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖させることで、食品変敗性乳酸菌の属および種に特有の塩基配列の荷電的な特徴を顕在化させることができる。
【００１５】
そして、増殖した所定の塩基配列を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）によって分離してバンドを形成させると、このバンドの位置は、前記ＤＧＧＥを一定の条件で行なうことで、所定の乳酸菌種が特定の位置に定まるため、予め種毎に調べておいたＤＧＧＥのバンド移動距離（移動距離）と、種々の食品変敗性乳酸菌を含むサンプルから得られたＤＧＧＥ分画位置を対比することにより、複数種からなる乳酸菌群を種別に判定することができる食品変敗性乳酸菌の検出方法になる。
【発明の効果】
【００１６】
本願のＰＣＲプライマーに係る発明は、以上説明したように、所定の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットとして、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖可能なものとしたので、食肉などの食品製品の変敗に関わる複数種の乳酸菌と特異的に反応する食品変敗性乳酸菌の検出用ＰＣＲプライマーになるという利点がある。
【００１７】
また、本願の食品変敗性乳酸菌の検出方法に係る発明は、以上説明したように、所定の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーとを組み合わせたプライマーセットとして、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子に由来するＶ３領域配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖させ、増殖配列を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）によりバンドを形成させ、このバンドの移動距離の比較から乳酸菌種を判定するので、複数種の変敗乳酸菌をＤＧＧＥで同時に分離・判別できる食肉製品の変敗に関係する乳酸菌の検出方法となる利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［乳酸菌検出用ＰＣＲプライマーの設計］
先ず、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法に使用する乳酸菌検出用プライマーを１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域にて作成する。
【００１９】
標的遺伝子領域の１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域は、Ｅ．ｃｏｌｉの１６ＳｒＤＮＡの約３３０塩基目から５３０塩基目の約２００塩基からなる領域である。この発明ではＴｍ値やプライマーダイマーの可能性を再検討し、Lane et al.(1991)の338fプライマー、Muyzer et al.(1993)の２プライマーをそれぞれ改変し、ＧＣ４０−３３９Ｆ（配列番号１）、Ｖ３−５３Ｒプライマー（配列番号２）を新規に創作して用いる。
【００２０】
フォワードプライマーに付加したＧＣ−ｃｌｕｍｐの配列には、Sheffield et al. (1989)の配列を用いる。すなわち、フォワード方向のプライマーＧＣ４０−３３９Ｆは、Ampe et al. (AEM, 65, 5464-5473,1999)のプライマー位置から1塩基下流方向に伸ばし、GCクランプの配列をSheffield et al.(Proc.Natl. Acid. Sci. USA, 86, 232-236, 1989)によるものと置き換える。
また、リバースプライマーＶ３−５３Ｒプライマーは、Lane, D. J.: 16S/23S rRNA sequencing: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Stackebrandt, E. and Goodfellow, M.(eds.), p. 115-136 (1991)の530Rプライマーの３’側を一塩基欠損したものである。
このプライマーペアを用いてＰＣＲ条件を設定し、食肉製品から分離された乳酸菌を用いてＤＧＧＥ条件を決定する。
【００２１】
［乳酸菌の培養とＤＮＡの分離］
まず、食肉などを原料とする種々の食品から採取した乳酸菌を培養してＤＮＡを分離する。
この発明でいう食品変敗性乳酸菌の検出対象の食品とは、乳酸菌の検出の有無によって食品の変敗を判別しようとする検査対象物であり、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ロイコノストック属などの乳酸菌が増殖する可能性のある食品である他に、特に条件を限定するものではない。例えば、食肉、食肉加工品、乳製品などが代表例として挙げられる。
【００２２】
このような食品から採取して乳酸菌を培養するには、食品から採取した微生物サンプルを乳酸菌培養について適当な培地に植菌し、３０℃程度の恒温条件で培養する。例えば、ＧＡＭブイヨン（日本水産社製）にグルコースを２％配合した培地などが適当なものである。
【００２３】
培養した乳酸菌は、例えば１２０００rpmの速度で２分間程度の遠心分離などで集菌し、さらにＤＮＡを分離する。ＤＮＡを分離するには、市販のキレート剤を添加して９５℃で５分間加熱する熱処理を行ない、これを例えば１４０００rpmの速度で５分間程度の遠心分離をして、その上澄みを採取すればよい。このように分取されたＤＮＡには、蛋白質その他の共雑物が多く混ざっているので、できるだけ精製して用いることが好ましい。
【００２４】
次に、ＤＮＡに対して前記した配列番号１、２の所定プライマーセットを用い、常法に従ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なって乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に由来する特定遺伝子領域を増幅させる。
【００２５】
ＰＣＲは、ＤＮＡに所定プライマーセットをアニーリングさせた状態で市販のＤＮＡポリメラーゼを作用させて２本鎖とし、その後の熱変性により１本鎖にするという操作を、例えば３０回繰り返すことにより、乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させ、いわゆる連鎖反応させることができる。
【００２６】
増幅したＤＮＡ断片の有無、すなわち種々の乳酸菌の検出は、ゲルの写真をコンピュータに入力し、濃淡を解析することにより確認することができ、その他に電気泳動法で所定の荷電性のある分画の有無を調べることで行なえる。電気泳動は、サイズ排除クロマトグラフィーの充填剤として周知のアガロースゲルを用いたゲルクロマトグラフィーを採用することができる。
【００２７】
電気泳動法で得られた分画を分取してＤＮＡを染色し、その紫外線透過量を測定して種々の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の有無を確認することができる。
【実施例】
【００２８】
［使用菌株、培地及び培養法］
菌株は、過去に食肉製品から検出された表１に示す保存菌株を用い、乳酸菌の培地は２％Ｄ−グルコースを添加したＧＡＭ  broth(日水)にて３０℃で培養した。
なお、表１および図１中に示したサンプル番号またはレーン番号に対応する菌種（学名の日本語表記）は以下の通りである。
（1）ロイコノストック・カルノーサム
（2）エンテロコッカス・フェカリス
（3）ラクトバチルス・サケ
（4）ロイコノストック・アルゼンチナム
（5）エンテロコッカス・マロドレイタス
（6）ロイコノストック・メセンテロイデス
（7）ラクトバチルス・フェルメンタム
（8）ロイコノストック・サイトリウム
【００２９】
【表１】
2005117980.tif 000002
【００３０】
［ＰＣＲによるＤＮＡ増幅］
試料の調製；増菌液を１．５mlエッペンドルフチューブに取り、冷却遠心分離(15000×g, 5min)によって集菌し、菌体のペレットにLysozyme-TE buffer(５mg/ml)５６７μlを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応後、１０％ＳＤＳsolution３０μlと２０mg/mlのプロテイナーゼK３μlを加え、さらに３７℃で６０分間反応させた。
【００３１】
次に、５Ｍ NaCl溶液１００μlを加えてよく混合した後、クロロホルム：イソアミルアルコール(２４：１)溶液７００μlと緩やかにかつ充分に撹拌した後、冷却遠心分離（１５０００×g,１０分）処理をした。そして、上層を別のチューブに取り、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(２５：２４：１)溶液を加えて同様に撹拌した後、冷却遠心分離（１５０００×g,１０分）した。上層をさらに別のチューブに取り、０．６容のイソプロパノールを加えてＤＮＡを析出させた。
【００３２】
析出したＤＮＡは７０%エタノール１mlを入れたチューブに移し取り、冷却遠心分離（１５０００×g、５分）によって沈殿させた後、脱気乾燥し、ＴＥバッファによって再溶解して試料とした。
【００３３】
ＰＣＲ増幅領域は、１６ＳｒＤＮＡの多型領域Ｖ３[E.coliにおける(Brosis et al. 1978)３３９−５３０塩基に相当する領域]を用いた。
【００３４】
ＰＣＲ反応液組成とＰＣＲ作業工程は、以下の通りである。
［ＰＣＲ反応液組成］  １０×ＰＣＲバッファ(１．５mM MgCl2 ) (Takara)５μl、dNTP mixture (Takara)4μl、２０pmol/μｌＧＣ４０−３３９fプライマー１．２５μl、２０pmol/μｌＶ３−５３Ｒプライマー１．２５μl、TaqＤＮＡポリメラーゼ(Takara)０．２５μl、templateＤＮＡ(５ng/μl)５μl、Ｄ．Ｗ.３３．２５μl。
【００３５】
［ＰＣＲ作業工程（プログラム）］  ９５℃５分、(９５℃３０秒−７０℃*１３０秒−７２℃*２１０秒)×２０サイクル、(９４℃３０秒−６２℃３０秒−７２℃３０秒)×５サイクル。＊1は２サイクル毎に０．８℃ずつ減少であり、＊２は２サイクル毎に２秒ずつ増加である。
【００３６】
［ＤＧＧＥ解析］
ＤＧＧＥ解析は、Bio-Rad D-code Systemを用いて行った。泳動には変性剤濃度(100%変性剤濃度を７Ｍ尿素,４０%ホルムアミドとした。)３０%から６０％のグラジェントをつけた８％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動条件は、２００Ｖ,３時間、６０℃で行った。泳動終了後ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、バンドパターンの解析を行った。
【００３７】
［ＤＧＧＥ解析のプライマー設計及び最適反応条件設定］
まずＰＣＲ−ＤＧＧＥ法に使用するための配列番号１および２に示す乳酸菌検出用プライマーを、１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域にて作成した。
【００３８】
次に、変敗食肉製品から分離された乳酸菌を用いて、これらを最も良く分離できるＤＧＧＥ解析条件を検討した。図１に示した８種の変敗原因乳酸菌を各種条件で変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）により分離してバンドを形成させたところ、８％アクリルアミドゲル、変性剤濃度３０−６０％、泳動時間３時間で泳動した時に、最も良く分離できることが明らかとなった。
【００３９】
変敗原因乳酸菌をＤＧＧＥ解析に供すると、図１に示すように、菌種別に異なる位置にバンドが確認された。また、バンドの検出位置は、互いの１６ＳｒＤＮＡの配列相同性には関係なく、属の異なる２種、ロイコノストック・サイトリウム（Leu.citreum）とラクトバチルス・フェルメンタム（Lb. fermentum）のように極めて近い位置にバンドが出るものもあった。これはＤＧＧＥの泳動が、ＰＣＲ増幅産物の変性に伴う立体構造の違いをポリアクリルアミドゲルによって分離しているためと考えられるが、増幅産物の全体的なＧＣ含量には影響を受けているようであり、腸内細菌群、クロストリディウム（Clostridium）、乳酸菌群のような大きなグループでのバンド位置は、ほぼ一定であった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】８種の変敗乳酸菌の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法による分離パターンを示す写真
【図１】
2005117980.tif 000003
【配列表】
2005117980000001.app