(57)【要約】【課題】  検査対象に適した反応温度において簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする核酸プローブ、それを用いた標的核酸の検出方法および核酸分析用マイクロアレイ等を提供することにある。【解決手段】  標的核酸１を検出するための核酸プローブ２であって、該核酸プローブは所定の反応温度において前記標的核酸にハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位６及び／又は７と自己核酸酵素５を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を検出するための核酸プローブであって、
該核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。
【請求項２】
前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求項１に記載の核酸プローブ。
【請求項３】
前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い請求項１又は２に記載の核酸プローブ。
【請求項４】
前記標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項５】
前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求項４に記載の核酸プローブ。
【請求項６】
担体に固定化されている請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸プローブ。
【請求項７】
核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸検出方法。
【請求項８】
前記核酸プローブを、前記所定の反応温度で前記標的核酸にハイブリダイズさせるハイブリダイズ形成工程と、
ハイブリダイズさせた前記核酸プローブを同じ反応温度のまま保持して標的核酸から解離させる解離工程と、
前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする請求項７に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
前記自己核酸酵素の作用により前記核酸プローブが特異的に切断される請求項７又は８に記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い請求項７乃至９のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求項７乃至１０のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１２】
前記標識物質は、少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求項１１に記載の核酸検出方法。
【請求項１３】
前記核酸プローブが担体に固定されている請求項７乃至１２のいずれかに記載の核酸検出方法。
【請求項１４】
試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸分析用デバイス。
【請求項１５】
前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求項１４に記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１６】
前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い請求項１４又は１５に記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１７】
前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求項１４乃至１６のいずれかに記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１８】
前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求項１７に記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１９】
所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有している核酸プローブを用いた標的核酸の検出において、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節することを特徴とする反応速度の制御方法。
【請求項２０】
自己核酸酵素の形成し易さは、前記自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により制御される請求項１９に記載の反応速度の制御方法。
【請求項２１】
前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求項１９又は２０に記載の反応速度の制御方法。
【請求項２２】
前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い請求項１９乃至２１に記載の反応速度の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定配列を有する核酸を検出する核酸プローブ、それを用いた核酸検出方法および核酸分析用デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発され、特に医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により患者個人ごとに対応したテーラーメイド医療も可能となってきており、例えば製薬分野においては、遺伝子情報に基づいて抗体やホルモンなどのタンパク質を特定し、薬剤として利用している。
さらに、農業や食品関連分野などにおいても多くの遺伝子情報を利用した製品が創り出されている。
【０００３】
ところが、遺伝子情報の整備に基づく疾患関連遺伝子同定技術の進歩にもかかわらず、ゲノム創薬によって創薬された活性小分子は未だに限られている。これは、薬剤と遺伝子発現・抑制の関係を直接的に関連付ける高速スクリーニング技術の開発が不十分であり、これらの活性小分子が生きた細胞内で及ぼす影響を定量的かつ高速に検出する手法が確立されていなかったためである。
【０００４】
そのような背景から、本発明者等は細胞内で発現されるＤＮＡやＲＮＡの細胞内での検出、細胞内配列解析を可能とする新規核酸プローブの開発を目的とし、標的遺伝子の存在により蛍光等による信号を発する新規な核酸プローブ「ＱＵＡＬプローブ」を開発した。このＱＵＡＬプローブは、細胞内鋳型ＤＮＡあるいはＲＮＡ上で自己核酸連結化学反応を起こし、反応の進行に付随して信号（蛍光）を発するものである。まず、ＱＵＡＬプローブを使用して細胞外における遺伝子診断を試み、細胞から抽出されたＫ−ｒａｓがん遺伝子上の変異を瞬時に診断することに成功した。ＱＵＡＬプローブの配列選択性は非常に高く、１塩基の違いさえも精密に診断することが可能となった（非特許文献１）。
【０００５】
さらに、このプローブを用いて標的遺伝子を検出する場合、酵素や試薬等を必要としないため、“生きた細胞”への応用が可能となった。すなわち、１塩基の精度で細胞内遺伝子診断を非常な短時間（細胞への導入から検出まで３０分程度）で行うことを可能にした。
【０００６】
しかし、上記方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡ１分子から蛍光シグナルを１つしか発生させることができないという欠点があった。従って、たとえば細胞中に多数存在するｒＲＮＡ等の検出は容易であるが、極微量しか存在しないｍＲＮＡ等の測定に用いた場合、十分な蛍光が認識できず検出が非常に困難であるという問題があった。
【非特許文献１】Sando S et.al. J. Am. Chem. Soc. 2002,124,9686
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明者らは、標的核酸を検出するための新規核酸プローブを開発した。該核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダイズした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダイズの結合力が減少し、前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする。
前記核酸プローブは、自己核酸酵素の形成を含む構造変化を生じるものであることが好ましい。また、前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものであることが好ましい。
この核酸プローブは、核酸プローブのハイブリダイズと解離が一つの標的核酸に対して複数回繰り返されるので、検出シグナルが増幅される。そのため、簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする。
しかしながら、検査対象となる標的核酸に適した検査環境は、検査対象の採取源、例えば、生物の種類、組織により異なる。一つの代表的な検査環境としては温度条件がある。体温は生物間でも異なっており、鳥インフルエンザ、狂牛病、ヒト癌遺伝子などの診断、治療に用いられる標的核酸に応じて適した検査温度を設定する必要がある。従って、検査に用いる核酸プローブは、標的核酸に適した検査温度の範囲内において検出の反応性が高いものであることが望まれる。
特に、核酸プローブを“生きた細胞”へ導入する場合には、検査温度を細胞本来の活動温度の範囲内に設定する必要性が高いため、核酸プローブが検査温度の範囲内で適した検出反応性をもつように調節することが強く望まれる。
【０００８】
本発明の目的は、上記の問題点を解決し、検査対象に応じて設定された検査温度において、簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする核酸プローブ、そのための核酸プローブの反応性を調節する方法、かかる核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法および核酸分析用デバイスを提供することにある。
より具体的には、検査対象に適した反応温度で検出シグナル増幅を可能とし、かつスループットが早く、極微量あるいは短寿命の標的遺伝子の挙動も測定可能とする核酸プローブ、該核酸プローブの所定の検査温度での反応速度を適した範囲内に調節する方法、かかる核酸プローブを用いた核酸検出方法および核酸分析用デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題の解決は、下記（１）〜（２５）の本発明により達成される。
【００１０】
（１）標的核酸を検出するための核酸プローブであって、
該核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。
【００１１】
（２）前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記（１）に記載の核酸プローブ。
【００１２】
（３）前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い前記（１）又は（２）に記載の核酸プローブ。
【００１３】
（４）前記標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の核酸プローブ。
【００１４】
（５）前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記（４）に記載の核酸プローブ。
【００１５】
（６）担体に固定化されている前記（１）乃至（５）のいずれかに記載の核酸プローブ。
【００１６】
（７）核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸検出方法。
【００１７】
（８）前記核酸プローブを、前記所定の反応温度で前記標的核酸にハイブリダイズさせるハイブリダイズ形成工程と、
ハイブリダイズさせた前記核酸プローブを同じ反応温度のまま保持して標的核酸から解離させる解離工程と、
前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする前記（７）に記載の核酸検出方法。
【００１８】
（９）前記自己核酸酵素の作用により前記核酸プローブが特異的に切断される前記（７）又は（８）に記載の核酸検出方法。
【００１９】
（１０）前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い前記（７）乃至（９）のいずれかに記載の核酸検出方法。
【００２０】
（１１）前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記（７）乃至（１０）のいずれかに記載の核酸検出方法。
【００２１】
（１２）前記標識物質は、少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記（１１）に記載の核酸検出方法。
【００２２】
（１３）前記核酸プローブが担体に固定されている前記（７）乃至（１２）のいずれかに記載の核酸検出方法。
【００２３】
（１４）試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸分析用デバイス。
【００２４】
（１５）前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記（１４）に記載の核酸分析用デバイス。
【００２５】
（１６）前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い前記（１４）又は（１５）に記載の核酸分析用デバイス。
【００２６】
（１７）前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記（１４）乃至（１６）のいずれかに記載の核酸分析用デバイス。
【００２７】
（１８）前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記（１７）に記載の核酸分析用デバイス。
【００２８】
（１９）所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有している核酸プローブを用いた標的核酸の検出において、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節することを特徴とする反応速度の制御方法。
【００２９】
（２０）自己核酸酵素の形成し易さは、前記自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により制御される前記（１９）に記載の反応速度の制御方法。
（２１）前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記（１９）又は（２０）に記載の反応速度の制御方法。
【００３０】
（２２）前記所定の反応温度（Ｔｘ）は、前記ステム部のみの核酸融解温度（Ｔ１）よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）よりも低い前記（１９）乃至（２１）のいずれかに記載の反応速度の制御方法。
【００３１】
（２３）前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記（１９）乃至（２２）のいずれかに記載の反応速度の制御方法。
【００３２】
（２４）前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記（２３）に記載の反応速度の制御方法。
【００３３】
（２５）前記核酸プローブが担体に固定されている前記（１９）乃至（２４）のいずれかに記載の反応速度の制御方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズした時に、構造変化を起こして分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、この自己核酸酵素の作用により、標的核酸１分子上で、核酸プローブの結合・解離からなる反応サイクルを容易に形成することができ、標的核酸の検出感度が向上する。
また、自己核酸酵素によれば、核酸プローブ分子内で例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性を得ることができ、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することができる。
さらに、本発明の核酸プローブは、検査対象に応じて設定された検査温度において良好な反応性が得られるように核酸プローブの反応速度が制御されているので、高い検査感度が得られ又は効率よく検査を終了することができる。
さらに、例えば生きた細胞内での検出を行う場合のように、検査温度が特に厳しく制約される場合でも、本発明の核酸プローブを用いることによって、簡便に高感度の検査を行うことが可能である。
従って、本発明によれば、複雑かつ大掛かりな装置を必要とすることなく、短時間で高感度かつ簡便に標的核酸を「認識」、「シグナル増幅」、「検出」することができる。さらに、制限酵素や他の化学物質等を必要としないため、生きた細胞内に導入しても遺伝子等の標的核酸を「認識」、「シグナル増幅」、「診断」できる。したがって、細胞内のｍＲＮＡなどの極微量の遺伝子をモニターすることもできるので、ポストゲノム薬剤の遺伝子発現誘導・抑制の高速スクリーニングを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、標的核酸を検出するための核酸プローブであって、その構造が、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離するように設計されており、且つ、前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、前記分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする。
このような構成とすることにより、標的核酸を検出、測定する環境に応じて設定された所定の反応温度における標的核酸の存在を示すシグナルの増幅、検出感度の向上を適切に図ることができる。
【００３６】
また、本発明の核酸プローブは標識物質を有するものであることが好ましい。これによって、標的核酸の存在をより容易に確認することができる。さらに、かかる標識物質は、前記核酸プローブが前記標的核酸から解離する前後で異なるシグナルを発するものであることがより好ましい。
【００３７】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。図１は本発明の核酸検出方法における反応サイクルの一例を示す概念図、図２は本発明の核酸プローブの一例（核酸プローブ２）を示す模式図、図３は、同じ核酸プローブ２が標的核酸にハイブリダイズした状態を示す模式図、図４は、本発明の一実施例による標的核酸の検出反応の結果を示すグラフである。なお、図において用いた符号としては、核酸プローブがハイブリダイズする前、ハイブリダイズした状態および解離した後を通して、核酸プローブの共通する部位に対して同じ符号を用いた。
【００３８】
本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を検出する場合には、図１に示すように、標的核酸１の分子上で、核酸プローブの結合・解離を含む反応サイクルが形成される。図１において、核酸プローブ２と標的核酸１とが接触すると、相互にハイブリダイズし複合体を形成する（Ａ）。ハイブリダイズした核酸プローブ２は自己核酸酵素５を形成し、この酵素５は特定配列を有する切断部位９で切断する（Ｂ）。切断された核酸プローブは、標的核酸との結合状態を維持できず自発的に解離する（Ｃ）。このとき蛍光物質Ｆは、消光物質Ｑとの相互作用を喪失し蛍光を発する。フリーになった標的核酸１には、再び新たな核酸プローブ２がハイブリダイズし、プロセス（Ａ）〜（Ｃ）を繰返すことにより蛍光シグナルが増幅される。このように、１分子の標的核酸上で、検出シグナルの増幅が行われるため、標的核酸が、極微量あるいは短寿命の場合であっても高感度で検出することができる。
【００３９】
また、この反応サイクルにおいて、制限酵素や化学物質等を使用しないため、本発明の核酸プローブを直接生きた細胞に導入し、プロセス（Ａ）〜（Ｃ）を進行させることも可能である。したがって、本発明によれば、細胞内で遺伝子等の標的核酸の「認識」、「シグナル増幅」、「診断」ができ、例えば投与された薬剤とそれによる遺伝子の発現・抑制との関係を直接的に観察するスクリーニングが可能となる。
さらに、ＰＣＲ等による遺伝子増幅や反応温度の制御等の必要がないため、実験室や分析機器等の特殊な機器や設備が不要となり、家庭内や学校、職場等、医療・研究施設外においても遺伝子診断を行なうことができる。
【００４０】
ここで、本発明でいう「標的核酸」とは、定量的、定性的検出、または単なる検出を目的とする核酸または遺伝子を意味し、精製、未精製のいずれの状態のものをも含む。また標的核酸は、その種類はいかなるものでもよく、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡおよび人工的に修飾された核酸等を挙げることができる。標的核酸の塩基配列は、例えば、マキサム・ギルバート法、ジデオキシ法等により決定することができる。
【００４１】
本発明の核酸プローブの一例（核酸プローブ２）を図２及び図３に示す。この核酸プローブ２はオリゴヌクレオチドで構成され、通常、一般的なオリゴヌクレオチド製造方法で製造することができる。例えば、化学合成法、プラスミドベクターやファジーベクター等を使用する微生物法、あるいは核酸合成機を使用する方法等が挙げられるが、核酸合成機を使用することが好ましい。
核酸プローブ２の塩基数は、５〜１００塩基が好ましく、１０〜７０塩基がより好ましい。塩基数が大きすぎる場合、非特異的ハイブリダイズが起こって検出精度が低下するおそれがある。また、細胞内遺伝子診断を行なう場合、細胞膜に対する透過性が低下し、効率良く細胞内核酸検出が行ない得ない場合がある。一方、塩基数が小さすぎる場合、ハイブリダイズ力が十分でなく検出感度が低下するおそれがある。
【００４２】
本発明の核酸プローブは、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位を有する。これにより、核酸プローブはサンプル中の検出すべき標的核酸を捕捉することができる。
また、本発明の核酸プローブは、前記相補部位を介して標的核酸にハイブリダイズした時に、分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素として作用する部位を含むステム部を形成可能なステム部形成領域を有する。
図２に示した核酸プローブ２は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位３ａ、３ｂと共に、分子内ハイブリダイズ部位６、７及び自己核酸酵素５を含むステム部を形成可能なステム部形成領域４とを備える。
【００４３】
核酸プローブは、図２に示すようにステム部形成領域４の両側に少なくとも各々１箇所以上、合計で２箇所以上の相補部位３ａ、３ｂを有することが好ましい。これにより、複数の部位で標的核酸を見分けることができ、検出感度の向上を図ることができる。
また、ステム部形成領域４の両側に少なくとも各々１箇所以上、合計で２箇所以上の相補部位３ａ、３ｂを有する場合には、核酸プローブと標的核酸との結合力を容易に制御することが可能となる。例えば、標的核酸に対する結合力は相補配列の数に概ね比例し、図１中（Ａ）において、核酸プローブ２の標的核酸１に対する結合力は、相補部位３ａと相補部位３ｂとの結合力の和であると解される。これに対し、核酸プローブに切断等が生じた場合（Ｂ）、各断片の結合力は標的核酸に相補結合している部分（相補部位３ａ、相補部位３ｂ）単独の結合力しかないことになる。すなわち、切断によって標的核酸への結合力は減少することになる。この結合力の減少を利用することにより、標的核酸へのハイブリダイズと解離のプロセスを含む反応サイクルを確立させることができる。
【００４４】
さらに、核酸プローブ２を２箇所以上の相補部位（３ａ、３ｂ）を介してステム部の両側の位置で標的核酸１にハイブリダイズさせることにより、形成される自己核酸酵素５をより安定化させ、切断効率の向上を図ることができる。
核酸プローブが少なくとも２箇所以上の相補部位を有する場合、各相補部位の塩基数は、１〜１３塩基とすることが好ましく、２〜１０塩基程度がより好ましい。各相補部位の長さを１〜１０塩基とすることによって、生物体内温度付近（３７℃付近）において、各相補部位単独では標的核酸とのハイブリダイズを維持できないものとし、より容易に自発的に解離させることができる。したがって、このような設計にすれば、直接生体内や細胞内に導入して核酸プローブと標的核酸との反応サイクルを成立させることが容易となる。なお、各相補部位の塩基数は同数であっても相異なる数としてもよい。
【００４５】
ステム部形成領域４は、核酸プローブ２が標的核酸１にハイブリダイズした時に自己核酸酵素の形成等の構造変化が起こる領域であり、その後、自己核酸酵素の作用による構造変化に起因して核酸プローブから解離することができる。
ここで「ステム部」とは、図３に示すように、核酸プローブが前記相補部位により標的核酸にハイブリダイズした時に生じる、いわゆる３方向連結（three-way junction）の交差部分から突出した核酸プローブのヘアピン構造を形成する部分である。
【００４６】
ステム部形成領域４は、例えば相補部位が２箇所以上ある場合には、一の相補部位３ａと他の相補部位３ｂとの間の領域にあることが好ましい。このような構成にすることにより、核酸プローブが標的核酸に確実に固定され、ステム部内の自己核酸酵素５はより安定化する。
そして、自己核酸酵素の作用の結果、ヌクレオチドの切断等、構造変化が進行したとき、核酸プローブと標的核酸との結合力を減少させるよう設計することがより容易になる。
【００４７】
自己核酸酵素形成部位５は、核酸プローブが標的核酸に結合したとき、酵素活性を発現するための金属イオンを捕捉する空洞を形成するようコンホメーション変化し得る領域を含む。
ここで「自己核酸酵素」とは、核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズし自己核酸酵素を含むステム部を形成した時に、ハイブリダイズした核酸プローブ自体にアロステリックに作用して、該核酸プローブを標的核酸との結合を維持できない構造に変化させて、標的核酸からの解離を誘発する酵素を意味する。
【００４８】
本発明では、自己核酸酵素形成部位から形成される自己核酸酵素は、切断活性、結合活性、その他いずれの活性を有するものであってもよいが、例示した核酸プローブ２のような切断活性を有するものが好ましい。例えば、図２および図３に示すように、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした後、自己核酸酵素の作用により２つの相補部位３ａと３ｂの間の切断部位９で特異的に切断された場合、各相補部位の結合力の総和力でもって標的核酸と結合状態を維持していたものが、切断後、短くなった各断片は標的核酸とのハイブリダイズを維持できず標的核酸から解離する。フリーとなった標的核酸は新たな核酸プローブと結合し、自己核酸酵素の形成、切断、解離、新たなハイブリダイズ形成を順次繰り返す反応サイクルを繰り返すことができる。したがって、遊離した切断片がシグナルを発するように設計された核酸プローブを使用した場合、１分子の標的核酸上でシグナルが増幅されるため、検出感度の向上を図ることができる。
【００４９】
自己核酸酵素形成部位から形成される自己核酸酵素５としては、ＤＮＡ酵素、ＲＮＡ酵素等が挙げられるがそのいずれであってもよく、これらの核酸酵素は、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、ＨＤＶ型およびその他のいずれのタイプを含むものでもよい。
【００５０】
この自己核酸酵素の作用により、標的核酸１分子上で、核酸プローブの結合・解離からなるサイクルを容易に形成することができ、標的核酸の検出感度が向上する。
また、自己核酸酵素によれば、核酸プローブ分子内で例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性を得ることができ、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することができる。
【００５１】
また、通常、特異的切断をさせたい場合、切断しようとする特定配列部位を認識する酵素を選択して使用しなければならないが、任意の配列で核酸を切断しようとすると、あらゆる場合において特定配列部位を認識し切断する制限酵素が存在するとは限らない。しかし、本発明の核酸プローブは、同一分子内に自己核酸酵素形成部位とともに自己核酸酵素により認識・切断等される特定配列を有するため、酵素活性の発現について所望の特性を備えるよう設計が自由であり、制限酵素を用いる場合のごとき上記制限がない。
なお、切断部位９は、核酸プローブがハイブリダイズした後自己核酸酵素５が形成されたとき、切断活性が最も効率よく発揮される位置に配置されることが好ましい。
【００５２】
従って、本発明の核酸プローブは、標的核酸をアロステリックエフェクターとする、例えば自己切断型遺伝子診断プローブとして機能することができる。自己切断したヌクレオチドの各断片は、等温下ではそれぞれ標的核酸との相補的結合（ハイブリダイズ）を維持することができず自発的に解離する。その後、新たな核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズし、自己核酸酵素を形成した後解離する。こうして図１に示すような核酸プローブの結合・解離からなる触媒サイクルが順次繰り返されることにより、蛍光シグナル等に代表される検出シグナルが増幅されるため、ＰＣＲ等の核酸増幅等を行うことなく、従来の核酸測定法では非常に困難であった微量の核酸や遺伝子等も容易に検出可能となった。
また、本発明の核酸プローブは自己核酸酵素を形成するため特別の酵素や試薬の添加を必要とせず、生きた細胞への導入を可能にするものである。従って、本発明の核酸プローブを用いれば、細胞内における１分子レベルの核酸や遺伝子の挙動をも観察することができる。
【００５３】
また、本発明の核酸プローブは、該核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズする時に分子内ハイブリダイズ部位となる配列（分子内ハイブリダイズ形成領域）をステム部形成領域内に有する。このように設計することによって、自己核酸酵素による切断効率が向上する。すなわち、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした後、形成された自己核酸酵素がより安定化され、特異的切断等の酵素活性の発現がより確実となる。
【００５４】
例えば図２に示した核酸プローブ２の場合には、そのステム部形成領域４内に、標的核酸とハイブリダイズした時にステム部内の塩基同士での自己ハイブリダイズ可能な分子内ハイブリダイズ形成領域６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂが存在している。この核酸プローブ２が標的核酸にハイブリダイズしたときに、図３に示すように、自己核酸酵素５の両側に、領域６ａと領域６ｂによる分子内ハイブリダイズ部位６と、領域７ａと領域７ｂによる分子内ハイブリダイズ部位７が形成され、ステム部のヘアピン部分にループ部８が形成される。
自己核酸酵素を安定化させる観点から、分子内ハイブリダイズ部位６及び部位７のうち少なくとも一方が形成可能であることが好ましく、両方が形成可能であることがさらに好ましい。
なお「ループ部」とは、ステム部のヘアピン部位に存在する環状部分であり、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした時に形成される。
【００５５】
核酸プローブを様々な検査対象に有効利用するためには、核酸プローブが検査対象の検査温度において適正な反応性を有することが望ましい。かかる観点から本発明においては、標的核酸の検出における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ形成領域（６，７）に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節する。
【００５６】
分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数は、ステム部内に分子内ハイブリダイズが１箇所しか形成されない場合には、その部位に存在する自己ハイブリダイズした相補的塩基対の数を意味し、ステム部内に分子内ハイブリダイズが２箇所以上に形成される場合には、全ての分子内ハイブリダイズ部位に存在する自己ハイブリダイズした相補的塩基対の数の合計を意味する。
例えば、図３に例示する核酸プローブ２の場合には、分子内ハイブリダイズ部位６に存在する相補的結合した塩基対の数Ｙと、分子内ハイブリダイズ部位７に存在する相補的結合した塩基対の数Ｚの選択により、反応性を制御することができる。
なお、分子内ハイブリダイズ形成領域にステム部内で相補的結合しない塩基（ミスマッチ部位）が含まれていても差し支えないが、その部位の塩基は、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数には算入しない。
【００５７】
本発明の核酸プローブを標的核酸と反応させる温度を一定とした場合、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が多いほど核酸プローブは安定化する傾向がある。
しかしながら、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が多すぎる場合には、標的核酸が存在していない場合においても核酸プローブが自己核酸酵素を形成したり、核酸プローブ同士のクロスハイブリダイゼーションを生じて擬陽性シグナルを発する等、検出精度・感度の低下を招くおそれがある。
一方、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が少ないほど核酸プローブの反応速度は減少し、Ｓ／Ｎ比（検査上のノイズ）は改善される傾向にある。
しかしながら、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が少なすぎる場合には、ステム部の構造が不安定になり、自己核酸酵素による自己切断速度が減少し、検査の感度が悪くなるおそれがある。
【００５８】
従って、本発明においては、検査対象の検査温度として設定された一定の反応温度における標的核酸存在下での自己核酸酵素の形成のし易さ、核酸プローブの切断等の構造変化の反応速度並びにこれに起因する解離のし易さを、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした時にステム部内において自己ハイブリダイズする相補的塩基対の数を変えることにより調節することができ、それによって検査温度に応じて核酸プローブに適正な反応性を付与することができる。
すなわち、所定の反応温度における自己核酸酵素の活性が低く、核酸プローブの反応速度が遅い場合には、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数を多くすることにより反応速度を加速し、一方、所定の反応温度における自己核酸酵素の活性が過剰で、標的核酸が存在しないのに擬陽性反応を呈する場合には、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数を少なくすることにより反応速度を抑制し、それによって検査温度に応じて核酸プローブに適正な反応性を付与することができる。
【００５９】
一例として、図３に例示する核酸プローブ２を用い、反応温度を３７℃に設定する場合には、自己核酸酵素５を挟んで分子内ハイブリダイズ部位６に存在する相補的結合した塩基対の数Ｙと、分子内ハイブリダイズ部位７に存在する相補的結合した塩基対の数Ｚの合計Ｙ＋Ｚは２〜１２塩基程度とすることが好ましい。
【００６０】
分子内ハイブリダイズ形成領域内に存在する自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数は、前記ステム部４のみの核酸融解温度（Ｔ１）が所定の反応温度（Ｔｘ）よりも低く、且つ、核酸プローブ２が標的核酸１とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）が反応温度（Ｔｘ）よりも高くなるように設定されることが好ましい。すなわち、式で表すと次の通りである。
Ｔ１＜Ｔｘ＜Ｔ２
ここで、「ステム部４のみの核酸融解温度（Ｔ１）」とは、標的核酸非存在時のステム部の塩基配列のみからなるポリ又はオリゴヌクレオチドの核酸融解温度を意味し、ＵＶ吸光度の温度変化で測定できる。
また、「核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度（Ｔ２）」とは、核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした後、自己核酸酵素の作用により構造変化した後の核酸融解温度を意味し、ＵＶ吸光度の温度変化で測定できる。
【００６１】
ステム部４のみの核酸融解温度（Ｔ１）が所定の反応温度（Ｔｘ）よりも高い場合には、反応温度Ｔｘにおいてステム部が非常に安定で自己核酸酵素を容易に形成し、核酸プローブ２は標的核酸が存在するか否かに係わらず、自己切断等の自発的な構造変化又は解離が促進される。
一方、核酸プローブ２と標的核酸１のハイブリダイズ後の核酸融解温度（Ｔ２）が所定の反応温度（Ｔｘ）よりも低い場合には、反応温度Ｔｘにおいて標的核酸とのハイブリダイズの安定性が低すぎるために、自己核酸酵素が形成されず、反応が起こりにくい。
【００６２】
本発明の核酸プローブは、標的核酸の存在を認識容易にする手段を備える標識物質１０を有することが好ましい。標識物質を有することにより、より確実に標的核酸の存在を確認することができる。
標識物質１０としては、例えば蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質やこれらの誘導体物質およびラジオアイソトープ等を挙げることができるが、なかでも蛍光物質（蛍光物質の誘導体物質を含む）を使用することが好ましい。蛍光物質を使用すれば、標的核酸の存在をシグナルとして視認容易にし、標的核酸の検出がより簡便・かつ確実になる。さらに、細胞内に導入しても生体安全性を損なわないものを選択可能で、細胞内での標的核酸の挙動を追跡する動的パラメータとしても使用することができる。
蛍光物質としては特に限定されず、任意のものを使用することができるが、例えば、アントラセン、フルオロセイン、テトラメチルローダミン、スルホローダミン等のローダミン類、ダンシルクロライド、テキサスレッド等を挙げることができるが、検出目的等に応じてその他のいかなる蛍光物質も使用することができる。
【００６３】
さらに標識物質１０としては、少なくとも１つの蛍光物質から構成されるものでもよく、相互に蛍光共鳴エネルギー輸送が可能な蛍光物質の組合せからなるもの、および１対の蛍光物質と消光物質かなる組合せからなるもの等が挙げられるが、一対の蛍光物質と消光物質とを有することが好ましい。蛍光物質と消光物質との相互作用を利用することにより、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイズ・解離の現象が異なるシグナル、すなわち蛍光特性の変化として視覚化され、標的核酸の存在が蛍光強度の増加として観察可能となる。
【００６４】
図３において本発明の核酸プローブの一例を示すように、蛍光物質Ｆと消光物質Ｑとは、自己核酸酵素による切断部位９を介した位置にそれぞれ設けられていることが好ましい。その原理は蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resource energy transfer：ＦＲＥＴ）に基づく。ＦＲＥＴが成立するためには、特に蛍光物質（Ｆ）と消光物質（Ｑ）との物質間の距離が重要となるが、本発明の核酸プローブ２が標的核酸１にハイブリダイズしている状態では、ＦとＱとの物質間距離はＦＲＥＴが成立していて消光するような距離に設計されている。その後、自己核酸酵素が作用し、オリゴヌクレオチドが所定の切断部位で切断されると、各切断片は標的核酸との結合を維持できず解離する。その結果、ＦＲＥＴから解放された蛍光物質は蛍光発光する。このように蛍光強度の増加から標的核酸を検出・定量することができる。
また、このようなＦＲＥＴ法によれば、ハイブリダイズした核酸プローブと、ハイブリダイズしない核酸プローブとを分離することなく目的の標的核酸の検出が可能となり、手順が簡略化され好ましい。
蛍光物質と消光物質とは、標的核酸にハイブリダイズした状態で切断部位を挟んで、約５〜３０塩基配列の距離で隔てられていることが好ましいが、必ずしもこの場合に限られるものではない。
なお、核酸プローブに導入する標識物質としては、エネルギー供与物質とエネルギー受容物質（ＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ）からなる組合わせを採用することもできる。
【００６５】
本発明の核酸プローブは、ガラス製基板等の担体表面に固定された形態、いわゆる「ＤＮＡチップ」として使用することが可能であり、Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐとして使用することもできる。
また、核酸プローブを担体表面にアレイ状に配列させたＤＮＡマイクロアレイ、流動的なビーズに固定されたＤＮＡマイクロビーズアレイとすることも可能である。ＤＮＡマイクロアレイとする場合、塩基配列の異なる核酸プローブを同一固体上に固定させておくことにより、同時に多種・多量の遺伝子の検出・定量も可能となる。さらに、標的核酸によって異なる色を発するマルチカラープローブとしての適用も可能である。
【００６６】
ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイ等に代表される核酸分析用デバイスの担体の材質としては、例えばプラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミックおよびこれらを含む複合材料等が挙げられる。プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。
また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及びアパタイト等が挙げられる。
天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及びそれら誘導体が挙げられる。また、セラミックとして具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。
【００６７】
上記担体の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、各種成形品（ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、中空糸、スライド及び細胞培養容器等）およびラテックス等を挙げることができ、それらの大きさについては特に制限はない。
【００６８】
本発明の核酸の検出方法は、上記本発明の核酸プローブを使用するものであって、この核酸プローブは標的核酸にハイブリダイズした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブは前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする。
このような本発明の方法によれば、核酸プローブ自身が標的核酸の認識、シグナルの増幅の両者を行うため、ＰＣＲ等によってサンプルＤＮＡ（ＲＮＡ）を増幅する必要がない。したがって、従来法のように制限酵素等を必要としないので、核酸プローブ内に制限酵素部位を設ける必要もない。さらに化学物質等の添加を必要とせず、一定温度下で反応が進行するため、細胞内における標的核酸の検出方法としても使用することができる。
換言すれば、基本的には核酸プローブを試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズさせる操作のみであり、この後、自発的に核酸プローブの構造変化、ハイブリダイズ結合力の減少、核酸プローブの解離、シグナルの蓄積、が起こって標的核酸の測定が可能となる。このように操作が非常に簡単なため、複雑・特殊な装置や特別の試薬等が不要であり、必要時に必要なところ、例えば診療所、家庭、学校、職場等において速かに遺伝子診断を行なうことができる。
【００６９】
本発明の核酸検出方法は、核酸プローブが前記標的核酸から解離する前後において、異なるシグナルを発する標識物質を有する核酸プローブを用いることが好ましい。
このように構成することにより、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイズ・解離などの現象が、シグナルの変化として視認容易となり、標的核酸の検出がより容易になる。
また、本発明の核酸検出方法は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダイズ形成工程と、ハイブリダイズ形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダイズの結合力が減少して該核酸プローブが前記標的核酸から解離する解離工程と、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。
このような方法によれば、標的核酸と一度ハイブリダイズした核酸プローブ上にある標識物質をポジティブに検出できるため、操作性に優れ、容易かつ高精度で標的核酸の検出を行うことができる。
さらに、核酸プローブの相補部位でのみ標的核酸とハイブリダイズさせるため、ハイブリダイゼーションを完了するのに要する時間を短縮することができ、検査の迅速化を図ることができる。
【００７０】
本発明の核酸検出方法の具体例を図面に基づいて説明する。
まず、標的核酸１と本発明の核酸プローブ２とをハイブリダイズさせる（図１（Ａ））。ハイブリダイズ形成工程において、反応条件は適宜設定可能であり、公知の方法によって行うことができ、いわゆる「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件下で行われる。例えば、ｐＨ７．０〜８．５、温度３０〜６０℃の約０．０１〜０．１Ｍ未満のナトリウムイオン塩濃度の溶液を用いて行われる。
なお、標的核酸は、通常、高温処理等によって予め一本鎖に変性されていることが好ましい。
【００７１】
次に、ハイブリダイズした核酸プローブは一定条件の下、分子内バイブリダイズ部位６，７と自己核酸酵素５を形成する（図１（Ａ））。この自己核酸酵素５によって特定配列の認識と酵素活性の発現が核酸プローブ２内で起こる。自己核酸酵素５が切断活性を有する場合、特定配列を有する切断部位９でヌクレオチドが切断される（図１（Ｂ））。このように切断された核酸プローブ２は、標的核酸１との結合状態を維持することができず解離する（図１（Ｃ））。これにより、核酸プローブ断片上の蛍光物質Ｆは消光物質Ｑの影響を受けることがなくなって蛍光シグナルを発する。このシグナルを次の検出工程において検出・解析する。
【００７２】
検出工程は、核酸プローブの性状や標識物質に応じ、適宜検出手段を選択することにより行なうことができる。例えば、核酸プローブが蛍光物質で標識されている場合は、蛍光顕微鏡等で検出することができ、放射性同位元素で標識されている場合はオートラジオグラフィー、化学発光物質で標識されている場合には、感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析を実施し標的核酸の定性、定量分析が可能である。
なお、標識物質を有しない核酸プローブを用いた場合には、例えば切断された核酸プローブ断片をゲル電気泳動などで確認することにより標的核酸の検出を行なうことができる。
【００７３】
本発明の核酸検出方法において、核酸酵素反応工程では前記核酸プローブが切断されることが好ましい。
上述のとおり、自己核酸酵素の活性は特に限定されないが、切断活性の発現により核酸プローブが切断されることが好ましい。核酸プローブが切断されることによりできた各断片は、標的核酸とのハイブリダイズを維持できず標的核酸から解離し、その後、新たな核酸プローブが標的核酸に結合する。その結果、このようなシグナルの増幅を可能にする反応サイクルを容易に形成することができる。
また、本発明においては、検査対象に応じて設定された検査温度において良好な反応性が得られるように核酸プローブの反応速度が制御されているので、高い検査感度が得られ又は効率よく検査を終了することができる。
さらに、例えば生きた細胞内での検出を行う場合のように、検査温度が特に厳しく制約される場合でも、本発明の核酸プローブを用いることによって、簡便に高感度の検査を行うことが可能である。
【００７４】
また、本発明の核酸検出方法において、核酸プローブは担体に固定されていることが好ましい。このようにすることによって、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ等の核酸分析用デバイスを構成することができ、高感度で多量の遺伝子データを得ることが可能となる。
さらに、本発明の核酸プローブを使用した核酸分析用デバイスによれば、例えば、薬剤投与後の経過時間ごとに細胞あるいは臓器からｍＲＮＡを取り出し、本発明の核酸プローブを固定化したＤＮＡチップ等で測定することで、遺伝子ごとのｍＲＮＡ量の経時変化を見ることができる。ｍＲＮＡ量が増加することは、ＤＮＡ分子からの遺伝情報が活発に転写されることを意味し、遺伝子の働きが増加することに対応する。この遺伝子の働きの時間変化をコンピュータ解析することで、遺伝子パスウェイの情報等が得られる。
また、塩基配列の異なる２以上の本発明の核酸プローブを同一担体に固定させた核酸検出用デバイスを構成することにより、一度に多種類の標的核酸を検出・測定することができる。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
上記本発明の核酸プローブの製造例を具体的に説明する。
（１）核酸プローブの設計
下記式（Ｉ）（配列番号１）で表される３種類の核酸プローブ（ＴＡＳＣ１、ＴＡＳＣ２、ＴＡＳＣ３）を設計した。
【００７６】
【化１】
2005341865.tif 000003
【００７７】
【表１】
2005341865.tif 000004
【００７８】
式（Ｉ）に含まれる各機能的部位及び標的核酸にハイブリダイズした状態を以下に図示する。
【００７９】
【化２】
2005341865.tif 000005
【００８０】
【化３】
2005341865.tif 000006
【００８１】
核酸プローブＴＡＳＣ１、２及び３の構造は式（Ｉ）で表される。核酸プローブＴＡＳＣ１（塩基数５９：配列番号２）、ＴＡＳＣ２（塩基数５７：配列番号３）及びＴＡＳＣ３（塩基数５５：配列番号４）は、１本鎖ヌクレオチドの両端に、検出目的となる標的核酸とハイブリダイズする塩基配列を有する２つの相補部位３ａ（配列の長さ１０塩基）、３ｂ（配列の長さ１０塩基）を設けた。そして、その中間領域にステム部形成領域４を設けた。
自己核酸酵素形成部位と各相補部位３ａ、３ｂとの間の領域には、分子内ハイブリダイズを可能とする領域を設けた。各プローブは、領域６ａと６ｂから形成される分子内ハイブリダイズ部位６及び領域７ａと７ｂから形成される分子内ハイブリダイズ部位７の２箇所で相補的結合可能な塩基対の種類又は存在の有無が、表１の如く相違する。また、分子内ハイブリダイズ部位７は、相補的塩基対と共にＧ−Ｔミスマッチを１つ含んでいる。
図３中、分子内ハイブリダイズ部位６に含まれる相補的塩基対の数をＹ、及び、分子内ハイブリダイズ部位７に含まれる相補的塩基対の数（Ｇ−Ｔミスマッチを除いた数）をＺとすると、ＴＡＳＣ１の場合には、Ｙ＋Ｚ＝７（Ｙ＝４、Ｚ＝３）、ＴＡＳＣ２の場合には、Ｙ＋Ｚ＝６（Ｙ＝３、Ｚ＝３）、ＴＡＳＣ３の場合には、Ｙ＋Ｚ＝５（Ｙ＝３、Ｚ＝２）である。
【００８２】
さらに、５'末端から１８番目のチミンの塩基環の５位に消光物質Ｑとして「Ｄａｂｃｙｌ−ｄＴ」（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（株）社製、米国）を、また５'末端から１４番目のチミンの塩基環の５位に蛍光物質Ｆとして「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ」（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（株）社製、米国）を導入した。
【００８３】
（２）核酸プローブの合成
上記のように設計された各核酸プローブ（ＴＡＳＣ１、２及び３）は、ＤＮＡ合成機を使用した固相法により固相合成し、脱保護を行った後、ゲル電気泳動法により目的鎖長のヌクレチド鎖のみを分離精製した。
詳しくは、まずＡ−ＴＯＭ−ＣＥ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（株）社製、米国）を保護基として用いて標識物質（蛍光物質Ｆおよび消光物質Ｑ）を保護し、ＤＮＡ合成機（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（株）社製、米国）を用いた固相法により、１μｍｏｌスケールで、標識物質を導入した上記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
合成後、生成物をチューブに移し、ここにメチルアミン(40％ aqueous methylamineと33％ ethanolic methylamineとの等量混合溶液)を１．５ｍＬ加え、３５℃で６時間インキュベートすることにより、核酸プローブを樹脂固相から切り出すと同時に、塩基部位、リン酸基、および蛍光物質部位の保護基を除去した。
【００８４】
次に、このチューブを氷上で冷やした後、チューブを注意深く開け、滅菌状態下で上澄み液を回収し、これを完全に乾燥するまで凍結乾燥した。
凍結乾燥した後、テトラブチルアンモニウムフルオライド（1Ｍ in ＴＨＦ）１ｍＬをチューブに加え、５０℃で１０分間振盪することにより保護基のついた核酸プローブを溶解して保護基をはずし、ついで３５℃に冷却した後、再び６時間振盪した。
次に１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）１ｍＬをチューブに加え、よく振盪した。これを遠心濃縮法によってＴＨＦを除去した。さらに、１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）１ｍＬを先ほどのチューブに加え、全量を約２ｍＬとした。
【００８５】
（３）核酸プローブの精製
ＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）を水１５ｍＬで平衡化した後、先ほどの核酸プローブ溶液２ｍＬをカラムに加えた。溶液を完全にゲルに浸透させた後、水０．５ｍＬを加えゲル濾過を行い、未反応物を除去した。この後、水３ｍＬを用いて脱塩した核酸プローブを溶出した。
得られた核酸プローブを凍結乾燥した後、７Ｍ尿素含有２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。電気泳動後、ＵＶ照射することにより核酸プローブのバンド（分画）を確認し、この分画を切り出した。これを遠心管でガラス棒を用いてゲルを粉砕し、緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム−０．１％ＳＤＳ１ｍＬのＥＤＴＡ溶液 、ｐＨ＝７．８）を１０ｍＬ加え、３７℃で６時間振盪し、遠心後に上清よりエタノール沈殿して沈殿物を回収した。この沈殿物を水０．４ｍＬに溶解した後、−２０℃で保存した。
【００８６】
（実施例２）
上記実施例１で製造した核酸プローブＴＡＳＣ１を用いた標的核酸の検出法を具体的に説明する。
（１）ハイブリダイゼーションおよび自己核酸酵素反応
標的核酸として２０merのオリゴＤＮＡを使用した。この標的核酸１００ｐｍｏｌと核酸プローブ（ＴＡＳＣ１）１μｍｏｌとを、５０ｍＭ トリス−２５ｍＭ 塩化マグネシウム水溶液（ｐＨ＝８．０）１００μＬ中で、３７℃、０〜２時間インキュベートした。
そこへ、エタノール８００μＬを加え、温度４℃、１２，０００×ｇで遠心することによりエタノール沈殿を行った。上清を除き、さらに残存しているエタノールを真空乾燥によって完全に除去した。
【００８７】
（２）標的核酸の検出
Ａ  電気泳動法による検出
真空乾燥によりエタノールが完全に除去された沈殿物をホルムアミド５μＬに溶解し、７Ｍ尿素含有２０％ ポリアクリルアミドゲルによるゲル電気泳動を行った。ＵＶランプを照射し、バンドの存在を確認したところ、核酸プローブよりも長さが短い核酸プローブ断片の存在が認められた。この結果、核酸プローブは標的核酸とハイブリダイゼーションし、自己切断酵素反応を起こしたことが確認され、標的核酸の存在が確認された。
Ｂ  蛍光シグナルによる検出
上記（４）と同様に標的核酸として２０merのオリゴＤＮＡを選択し、標的核酸１００ｐｍｏｌと、核酸プローブ１μｍｏｌとを５０ｍＭ トリス−２５ｍＭ 塩化マグネシウム水溶液（ｐＨ＝８．０）３５０ｍＬ中で、３７℃、６時間インキュベートした。
この反応溶液に波長４９５ｎｍの励起光を照射し、測定蛍光波長５２０ｎｍの蛍光スペクトルの経時変化を測定した。蛍光波長５２０ｎｍにおける蛍光強度の増加により、標的核酸の存在を確認することができた。
【００８８】
上記実施例の結果を図４に示す。図中、実線は本実施例において標的核酸の検出を行った場合の核酸プローブ切断量を示し、点線は触媒サイクルを確立しない従来の核酸プローブを用いた場合の核酸プローブ切断量の理論値を示す。
この結果から明らかなように、従来の核酸プローブでは、１等量の標的核酸に対して理論上、最大１等量のプローブしか反応しないところ、本発明の核酸プローブでは、時間とともに切断量が増加している。このことから１等量の標的核酸に対し、１等量以上の核酸プローブが結合し、自己切断した後解離していくことがわかった。
以上のように、本発明によれば、標的核酸が微量にしか存在しないものであっても検出シグナル等を増幅でき、感度よく測定可能であることがわかる。
【００８９】
（実施例３）
上記実施例１で製造した核酸プローブＴＡＳＣ１、２及び３の各々について、標的オリゴヌクレオチドの存在下（５倍モル過剰）及び非存在下における核酸プローブの自己開裂速度定数を測定した。
その手順としては、最終濃度１μＭとなるように核酸プローブを５０ｍＭ トリス−２５ｍＭ 塩化マグネシウム水溶液（ｐＨ＝８．０）１００μＬ中に溶解させ、５μＭの標的核酸を加えたのち、３７℃でインキュベートした。核酸プローブはエタノール沈殿により回収し、全量をローディングバッファーに溶解させ、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ATTOデンシトグラフによってそれぞれのバンド強度を定量し、標的オリゴヌクレオチド存在下での速度定数（ｋｏｂｓ＋）、標的オリゴヌクレオチド非存在下での速度定数（ｋｏｂｓ−）、及び、アロステリック活性係数（ｋｏｂｓ＋／ｋｏｂｓ−）を算出した。
その結果は、表２に示した通りである。
【００９０】
【表２】
2005341865.tif 000007
【００９１】
標的オリゴヌクレオチド存在下でのＴＡＳＣ１の自己開裂速度定数（ｋｏｂｓ＋）は、１４×１０−３ｍｉｎ−１であり、標的オリゴヌクレオチド非存在下でのＴＡＳＣ１の自己開裂速度定数（ｋｏｂｓ−）は、０．９×１０−３ｍｉｎ−１であった。ｋｏｂｓ＋／ｋｏｂｓ−で表されるアロステリック活性係数の値が大きいほどアロステリック活性が高いことを表すが、ＴＡＳＣ１は、この係数（ｋｏｂｓ＋／ｋｏｂｓ−）の値がほぼ１６であった。
速度定数ｋｏｂｓ＋及びｋｏｂｓ−の両方ともステム部から相補的塩基対（Ｎ１とＮ４の対及びＮ２とＮ３の対）が段階的に除去されるとき（すなわちプローブ１からプローブ２を経てプローブ３となるとき）に減少した。そして、この場合に、速度定数ｋｏｂｓ−のほうがより高い感度で減少した。この結果、プローブ３のアロステリック活性係数（ｋｏｂｓ＋／ｋｏｂｓ−）が最も向上したが、検知速度（ｋｏｂｓ＋）はプローブ１が最も大きかった。
表２に示した結果は、ＴＡＳＣ１、２及び３を反応温度３７℃で用いた場合の結果である。この結果より、ステム部の安定性と自己切断反応の速度は比例関係にあることが分かる。しかし、ステム部が最も安定なＴＡＳＣ１においても、３７℃において標的核酸依存的な自己切断を起こすことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の核酸検出方法における反応サイクルの一例を示す概念図である。
【図２】本発明の核酸プローブの一例を示す模式図である。
【図３】本発明の核酸プローブが標的核酸に結合した状態を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施例による標的核酸の検出反応の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９３】
１      標的核酸
２      核酸プローブ
３ａ    相補部位
３ｂ    相補部位
４      ステム部形成領域又はステム部
５      自己核酸酵素形成部位又は自己核酸酵素
６      分子内ハイブリダイズ形成領域又は分子内ハイブリダイズ部位
７      分子内ハイブリダイズ形成領域又は分子内ハイブリダイズ部位
８      ループ部
９      切断部位
１０    標識物質
Ｆ      蛍光物質
Ｑ      消光物質
【図１】
2005341865.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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