(57)【要約】  【課題】    温和な条件でセリシンのアシル化を行うことのできる、アシル化セリシンの製法を提供する。  【解決手段】    食品用乳化剤のひとつである糖脂肪酸エステルの合成にリパーゼが応用されていることに注目し、繭由来のセリシンのアシル化に応用した。本発明は、繭から分離したセリシンを非水溶媒中でリパーゼの存在下において有機酸と反応させることから成るアシル化セリシンの製法である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繭から分離したセリシンを非水溶媒中でリパーゼの存在下において有機酸と反応させることから成るアシル化セリシンの製法。
【請求項２】
前記リパーゼがCandida antractica又はCandida cylindrea由来のリパーゼである請求項１に記載の製法。
【請求項３】
前記有機酸が脂肪酸である請求項１又は２に記載の製法。
【請求項４】
反応温度が35〜75℃である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製法により得られたアシル化セリシンを主成分とする界面活性剤、乳化剤又は調湿剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、セリシンをアシル化する方法に関し、より詳細には、繭から絹を除去した残渣であるセリシンを、リパーゼの存在下の穏やかな条件でアシル化してアシル化セリシンを製造する法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリシンはカイコのBombyx moriの絹糸腺から吐き出された繭糸を構成する水溶性の天然高分子タンパク質である。繭糸の全重量の約70%が絹糸となるフィブロインというタンパク質から構成され、残る20〜30%がセリシンで、繭糸の外側から内側に向かって水やアルカリに溶けやすい順序にほぼ4層の連続層構造によりフィブロインの周りを取り囲んでいる（非特許文献１）。この2つのタンパク質で繭糸の約97%を占め、残りの成分は、約1.2〜1.6%の炭水化物、1%の脂質、1%の色素、0.7%の無機物であり、これらの割合は繭の品種によって多少異なる。セリシンのアミノ酸組成については、セリンが約33%と非常に多く含まれており、スレオニン及びチロシンと合計すると約46%がヒドロキシアミノ酸となる。
絹製品としてその独特の光沢や風合いを出すにはニカワ質であるセリシンは不要なものであるために大部分が除去され、有効利用されずに廃棄処分されてきた。繭の生産量は世界中で約100万トンに及び、これは乾燥繭40万トンに相当する。この生糸加工の工程で約5万トンのセリシンが生成することになる（非特許文献２）。これを廃棄することはタンパク質資源のロスであるばかりでなく、廃水のBOD（生物化学的酸素要求量）を上げるので廃水処理にも少なからず経費を必要としている。したがって、未利用のタンパク質資源としてのセリシンを有効利用する技術の開発が急務である。
【０００３】
セリシンをアシル化して化粧料や薬剤に利用する方法として、繭のシルク残分を酸で加水分解し、得られたペプチド又はアミノ酸を脂肪酸等でアシル化することが知られている（特許文献１）。しかし、加水分解を行うためには、耐強酸性の設備が必要である等の問題があり、より温和な条件でセリシンをアシル化する方法が求められてきた。
一方、食品用途等において糖脂肪酸エステルの合成にリパーゼが応用されているが（特許文献２，３等）、本発明のセリシンのようなペプチドやアミノ酸のアシル化にリパーゼを応用した例は知られていなかった。
【０００４】
【非特許文献１】間和夫監修「わかりやすい絹の科学」文化出版局 (1990)
【非特許文献２】Biotecnology Advances., 20, 91-100 (2002)
【特許文献１】特開平06-256274
【特許文献２】特開昭62-289190
【特許文献３】特開平08-245680
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、繭のシルク残分であるセリシンを有効利用し、温和な条件でセリシンのアシル化を行うことのできる、アシル化セリシンの製法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、食品用乳化剤のひとつである糖脂肪酸エステルの合成にリパーゼが応用されていることに注目し（特許文献２，３等）、繭由来のセリシンのアシル化に応用することを考え、その条件を検討することにより、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、繭から分離したセリシンを非水溶媒中でリパーゼの存在下において有機酸と反応させることから成るアシル化セリシンの製法である。
更に、本発明は、この製法により得られたアシル化セリシンを主成分とする界面活性剤、乳化剤又は調湿剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明で用いるセリシンは繭から絹を除去して得られる。繭からセリシンを分離する方法に特に制限はないが、例えば以下のようにして行うことができる。
繭又は繭糸を電解アルカリ水（pH 11.5）に浸漬して、95℃で７時間加熱抽出し、冷却後乾燥する。加熱抽出時間は長くなると低分子化が進み、着色が起こるので７時間程度が適当である。乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥等種々の方法で行うことができるが、乾燥物が綿状又は粉末状で扱いやすいため前２者が望ましい。減圧乾燥の場合は乾燥物が膜状になる。
【０００８】
本発明で用いるリパーゼとしてCandida antractica又はCandida cylindrea由来のリパーゼが好ましい。特に、リパーゼとして、Candida
antractica由来のNovozym 435（ノボザイムズジャパン社）及びCandida cylindrea由来のlipase OF（名糖産業）又はこれらの同等品が好ましい。
また酵素を分離回収することが容易となるように、リパーゼを固定化したものを用いることが好ましい。
【０００９】
このリパーゼを用いてセリシンのセリン等の水酸基を有機酸によりアシル化する。エステル化反応は、加水分解反応を抑制するために、水の除去が必須であり、溶媒として非水溶媒を用いる。この非水とは水分5％以下、好ましくは１％以下をいい、最も好ましくはモレキュラーシーブなどの脱水剤等を用いて乾燥させたことをいう。このような溶媒としてヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、ベンゼン、石油エーテル等が挙げられる。但し、アセトンは微量のアルデヒドを含み、副反応生成物が生成し褐変するので好ましいとはいえない。
一方の基質である有機酸、特に脂肪酸を溶解する溶媒の脱水やアシル化により生成する水の除去のために、反応中でも溶媒の脱水することが望ましい。たとえば、溶媒を蒸留したり、脱水剤を添加する。
反応液中の有機酸、特に脂肪酸の量はセリシンの水酸基の１〜５倍当量程度が好ましく、リパーゼの量はセリシンの重量に対して1〜10倍量程度が好ましい。セリシンは有機溶媒に不溶であるために、例えば固定化リパーゼとセリシンが接触したときにセリシン表面の水酸基と接触したときにだけアシル化反応が進行すると考えられるので、セリシンおよび酵素量を両者の接触が常に維持できる程度の濃度で増大させることが好ましい。またそのため、反応中は反応液を攪拌しておくことが好ましい。
【００１０】
反応温度は好ましくは35〜75℃，より好ましくは50〜65℃である。
有機酸はカルボキシル基を有する有機化合物であり、その種類は特に問わないが、好ましくは脂肪酸である。脂肪酸としては、例えば、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘニン酸、カプロレイン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレン酸、オレイン酸、カドレイン酸、エルカ酸、デカジエン酸、リノール酸、ヒラゴ酸、リノレン酸、エイコサトリエン酸、ドコサトリエン酸、ヘキサデカテトラエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、サビニン酸、イプロール酸、ヤラピノール酸、リシノール酸、フェロン酸等が挙げられる。
エステル化の程度に特に制限は無い。後述の実施例では、反応生成物（粗アシル化セリシン）を塩析で精製しているが、精製しなくとも実利的には十分有効であると考える。
本発明により得られるアシル化セリシンは、後述の実施例に示すように、優れた乳化特性を有することから食品や化粧品用の乳化剤、水分蒸発抑制や羊毛への高い収着性を示すことから皮膚や毛髪の調湿剤、界面活性剤等として利用することができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１１】
（１）繭からセリシンの分離
白繭繭層（乾繭）を電解アルカリ水（pH 11.5）に浸漬し95℃で7時間加熱抽出し、エタノールを10%濃度加えて濾過してセリシン溶液（セリシンMY-30N、シンコーシルク、和歌山）を調製した。この試料溶液を蒸留水に対して透析後、0.1M水酸化ナトリウムを用いてpH
7.0に調整し、60℃の湯浴で攪拌しながら1時間インキュベートした。次に遠心分離（室温、12,000 rpm、30分間）して回収した上清をメンブランフィルター（pore
size 0.45μm）を用いて吸引ろ過し、このろ液を凍結乾燥し、セリシンを得た。
【００１２】
得られたセリシンについてSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）及びサイズ排除クロマトグラフィーを行った。セリシンは種々の分子から構成され、さらに繭糸から熱水抽出する条件により、得られるセリシンの状態は異なる。本セリシン標品も分子量は均一ではなく、多分散であり、その分子量は約10,000〜120,000Daで、主分子量は18,700Daであった。
セリシンの化学的特徴を表１にまとめる。セリシンの等電点は3.8で、脂肪酸は0.1%（w/w）の割合で存在した。本セリシン標品のアミノ酸組成は既報(Biosci.
Biotecnol. Biochem., 62 (1), 145-147 (1998))のアミノ酸組成の特徴と一致していた。セリンは34.3%で、セリンも含めたハイドロキシアミノ酸の総量は45.9%であった。極性の中性、酸性、塩基性のアミノ酸の総量は43.8%であり、非極性のアミノ酸の総量は11.2%であった。塩基性アミノ酸残基よりも酸性残基が多いので等電点が酸性を示すと考えられる。
【表１】
2005052066.tif 000002
【００１３】
（２）リパーゼを用いたセリシンのアシル化
ネジ口三角フラスコにセリシンを1g秤りとり、110℃で1時間加熱乾燥した。その後、予めモレキュラーシーブで脱水処理（10mg/ml）したヘキサン50mlを加え、ポリトロンPCU-2（KINEMATICA社製）でセリシンを微粉状（24,000rpm、約1分間）にしてからモレキュラーシーブを約2g加えて脱気した。ここにオレイン酸
3.5mlを加え、最後にNovozym 435（ノボザイムズジャパン社）を10 g加えて窒素置換して密栓した。この三角フラスコを60回/分で振とうしながら60℃、96時間インキュベートした。インキュベート終了後の反応混合物をヘキサン中でステンレスメッシュに通してモレキュラーシーブを除去した後、メンブランフィルター（pore
size 0.45μm）で吸引ろ過して残渣を回収した。これを直ちにビーカーに移し、クロロホルム/ヘキサン（5:1 (v/v)）混合液を加えて室温で1時間静置した後、液面に浮いた大部分の酵素を上清とともに除去した。さらにガラス製の遠心管（i.d.
24×100mm）に移し、同混合液を加えて遠心分離（室温、3,000 rpm、5分間）して酵素を上清とともに除去した。酵素粒子を完全に除去するまでこの操作を繰り返した後、ヘキサンで沈殿を3回洗浄してから減圧乾固した。これを蒸留水に溶解し、蒸留水に対して透析後、0.1M水酸化ナトリウムでpH
7.0に調整してからメンブランフィルター（pore size 0.45μm）で吸引ろ過した。このろ液を凍結乾燥した粗アシル化セリシン標品の収率は84%（844mg）であった。
この粗アシル化セリシンを直ちに酸素吸収剤（A-2500HS、I.S.O. Inc.）とともに真空デシケーターに入れて脱気した後、塩析するまで低温室で保存した。
なお、Novozym 435を加えないで同様にインキュベートし、同様の方法で調製したセリシンをコントロールセリシンとした。
【００１４】
（３）粗アシル化セリシンの精製
得られた粗アシル化セリシン標品中には未反応のセリシンが多く存在すると推測されるため塩析により精製した。
粗アシル化セリシンを1%濃度になるように0.2M酢酸緩衝液（pH 4.5）に溶解し、硫酸アンモニウムを終濃度35%飽和になるように攪拌しながら徐々に加えて1時間攪拌後、一晩低温室で静置した。これを遠心分離（12,000
rpm、30min、4℃）し、上清はそのまま、沈殿は蒸留水に再懸濁してから透析した後、0.1M水酸化ナトリウムでpH 7.0に調整し、上清画分はそのままメンブランフィルター（0.45μm）でろ過、沈殿画分は60℃に加熱溶解してから同様にろ過してそれぞれ凍結乾燥した。塩析沈殿画分の凍結乾燥標品をアシル化セリシンとし、使用するまで酸素吸収剤とともに真空デシケーターに入れて低温室で保存した。凍結乾燥して得られた精製アシル化セリシンの収率は8.4%（84mg）であった。
【００１５】
得られたアシル化セリシンの分子量を決定するためサイズ排除クロマトグラフィーを行った。各試料とも3連で測定し、平均値をもって主分子量とした結果、表２に示すようにアシル化セリシンの主分子量は22,000Daであった。
【表２】
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なお表中、Sericin-OAは、オレイン酸によりアシル化されたセリシンをいう。
【００１６】
アシル化セリシンの化学分析結果を表３及び表４に示す。
【表３】
2005052066.tif 000004
【００１７】
【表４】
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表３の脂肪酸含量を見ると、アシル化セリシンはコントロールセリシン及びセリシンよりも脂肪酸含量が約10倍に増加している。また表４に示すように、アシル化セリシンのオレイン酸含量はコントロールセリシン及びセリシンより約19倍高かった。
これらの結果は、Novozym 435によるヘキサン中の固相エステル合成反応によりセリシンがアシル化されたことを示している。
【００１８】
以下、実施例１で得たアシル化セリシンの界面活性特性を調べた。
試験例１ 乳化性試験
アシル化セリシンを0.1%濃度となるように、0.1Mリン酸-0.05Mクエン酸緩衝液（McIlvaine緩衝液、pH 7.0）に溶解した。この溶液2mlを水相、コーン油0.5mlを油相としてそれぞれ試験管内にとり、径7mmのジェネレーターシャフト（PTA
7）を取り付けたポリトロンPCU-2（KINEMATICA社製）を用いて25℃で24,000 rpm、1分間ホモジナイズして水中油滴型（o/w）エマルションを調製した。
o/w型エマルション調製後、恒温層を用いて30℃に保持しながら水相底部から0、10、30、60及び120分後に50μl分取し、0.1% SDS溶液で50倍に希釈して攪拌後、500
nmの吸光度を3連で測定して濁度とした。
比較のため、セリシン（上記アシル化前のセリシン）、上記コントロールセリシン及び牛血清アルブミン（BSA）（和光純薬）を用いた。
乳化活性EAI（emulsifing activity index）は、Pearce and Kinsellaの方法(J. Agric. Food
Chem., 26, 716-723 (1978))にしたがって下式に従って算出した。
EAI＝2 T /φC
T＝2.3A/l（A＝A500、l＝10−2ｍ（光路長））
T：濁度、 A：希釈倍率を考慮に入れた500 nmにおける吸光度（A500×50）
φ＝油相の割合（＝0.2）、C＝標品濃度（0.1%＝103 g/m3）
試験の結果を図１に示す。アシル化によりEAI値は有意に増加しており、得られたアシル化セリシンが優れた乳化能を有していることを示している。
【００１９】
試験例２ 油滴界面への吸着性試験
試験例１と同様にエマルションを調製し、乳化直後及び乳化60分後に試験管底部からエマルションを1.5ml分取して1,000 rpm、25℃で5分間遠心分離を行い、油相と水相に分離した。この水相の1mlを分取して再度20,000
rpm、25℃で30分間遠心分離し、この水相からさらに0.7ml分取して同緩衝液で2倍希釈した後、同様に遠心分離した。この操作を2回繰り返し、得られた水相のタンパク質含量をミクロビュレット法(J.
Am. Oil Chem. Soc., 76, 1291-1295 (1999))で測定し、水相におけるタンパク質吸着率を算出した。
結果を図２に示す。乳化直後(0min)では添加したアシル化セリシンが約30%と最も高い吸着率を示し、次いでBSA（約12%）、コントロールセリシン（約9%）の順であった。この結果は、アシル化セリシンの油滴界面への良好な吸着を示している。
この結果から、アシル化セリシンは油滴界面により多くの分子が吸着、配向することで優れた乳化活性及び乳化安定性を示すものと考えられる。
【００２０】
試験例３  保湿性試験
アシル化セリシン及びコントロールセリシンをそれぞれ蒸留水に溶解し、0.1M NaOHを用いてpH 7.0に調整して60℃で10分間攪拌した後、18,000
rpmで10分間遠心分離した。この上清をメンブレンフィルター（pore size 0.45μm）でろ過後、ミクロビュレット法に供して濃度を測定して2.0%（w/v）に調整した。この試料溶液を白金製オープン型容器に約30mg採取後、直ちに示差熱熱重量同時測定装置（TG/DTA
6200、セイコーインスツルメンツ、千葉）にセットし、水分量の重量変化及びリファレンスとの温度差を測定した。測定条件は30℃から180℃まで、昇温速度5℃/minで、リファレンスにサファイアプレート（Al2O3）30mgを用いてガスフローをせずに行い、各3連で測定した。
揮発性収着物質の脱離反応などの解析に有用なTG曲線の時間微分曲線である微分熱重量曲線（DTG曲線）のピークトップの温度における蒸発速度を最大蒸発速度（Vmax）とした。試料の親水性及び保湿性が高ければ、水分の蒸発を抑制するためTVmaxは高温側にシフトし、単位時間あたりの蒸発量も抑制されるためVmaxは低下すると考えられる。
結果を図３に示す。アシル化セリシンが水分の蒸発を効果的に抑制していることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１で得られたアシル化セリシンの乳化性試験の結果を示す図である。
【図２】実施例１で得られたアシル化セリシンの油滴界面への吸着性試験の結果を示す図である。
【図３】実施例１で得られたアシル化セリシンの保湿性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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