(57)【要約】      （修正有）【課題】大腸菌由来の、コンドロイチン合成酵素の機能の解明のために使用できる変異体を提供する。【解決手段】下記の（ａ）及び（ｂ）、又は（ｃ）及び（ｄ）記載の性質を有することを特徴とし、１〜数個のアミノ酸の置換を有するコンドロイチン合成酵素の変異酵素。（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。（上記（ａ）〜（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはN-アセチル-D-ガラクトサミンを示す）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸番号153〜258又は435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改変酵素。
【請求項２】
下記の（ａ）及び（ｂ）記載の性質を有することを特徴とする請求項１記載の改変酵素。
（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ａ）及び（ｂ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
【請求項３】
アミノ酸番号153〜258の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１又は２記載の改変酵素。
【請求項４】
アミノ酸番号239〜241の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有することを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載の改変酵素。
【請求項５】
241番目のアミノ酸が置換されていることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項記載の改変酵素。
【請求項６】
下記の（ｃ）及び（ｄ）記載の性質を有することを特徴とする請求項１記載の改変酵素。
（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ｃ）及び（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
【請求項７】
アミノ酸番号435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１又は６記載の改変酵素。
【請求項８】
アミノ酸番号519〜521の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有することを特徴とする請求項１、６及び７いずれか一項記載の改変酵素。
【請求項９】
521番目のアミノ酸が置換されていることを特徴とする請求項１及び６〜８いずれか一項記載の改変酵素。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか一項記載の改変酵素をコードする遺伝子を発現するように構築された、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる組換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換体を生育させ、組換体の生育物に改変酵素を蓄積させることを特徴とする、改変酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼを改変した改変酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず初めに、本明細書中で使用する略号の説明を行う。
GlcUA：グルクロン酸
GalNAc：N-アセチルガラクトサミン
UDP：ウリジン二リン酸
なお、本明細書における糖の鏡像異性体は、特記しない限り全てD体を示す。また、糖鎖を表す式中、数字はグリコシド結合が存在する炭素位置を示し、α及びβは1位グリコシド結合のアノマーを示す。
【０００３】
大腸菌K4株（Escherichia coli Serotype O5:K4(L):H4, ATCC23502）由来のコンドロイチンポリメラーゼ（以下、「本基本酵素」という）は、大腸菌K4株特有の莢膜多糖体（K4抗原）を合成する酵素の１つであり、K4抗原の主鎖である二糖繰り返し構造、コンドロイチン骨格（GlcUAβ1-3GalNAcβ1-4）ｎを合成する酵素である。すなわち、UDP-GlcUAおよびUDP-GalNAcを供与体として用いて、コンドロイチン骨格を持つ糖鎖の非還元末端に各々の供与体から交互に、GlcUAをβ1-3結合でGalNAc残基に、GalNAcをβ1-4結合でGlcUA残基に転移させ、糖鎖を伸長させていく二つの糖転移酵素活性を持つポリメラーゼである（非特許文献１）。非特許文献１には、更に本基本酵素の酵素活性を有するドメインは153-258番目及び435-539番目のアミノ酸配列中の位置に存在する旨が記載されている。同様なコンドロイチン骨格の合成酵素の一種にPasteurella multocida菌株由来のコンドロイチン合成酵素がある（非特許文献２）。また、最近ヒトを始め動物由来のコンドロイチン合成関連酵素遺伝子がいくつか見つかってきている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。しかしそれらは、本基本酵素と異なり、一方の糖転移活性だけしか持たないか、両糖転移活性があってもその組換えタンパク質ではポリメラーゼ活性は示さないと言われている（非特許文献３）。
【０００４】
コンドロイチン・コンドロイチン硫酸は、グリコサミノグリカンの一種であるが、同様にグリコサミノグリカンの一種であるヒアルロン酸を合成する酵素について、その活性部位を改変した改変酵素が知られている（非特許文献６）。
【０００５】
【非特許文献１】J. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575
【非特許文献２】J. Biol. Chem., (2000) 275, 24124-24129
【非特許文献３】J. Biol. Chem., (2001) 276, 38721-38726
【非特許文献４】J. Biol. Chem., (2002) 277, 38179-38188
【非特許文献５】J. Biol. Chem., (2002) 277, 28189-28196
【非特許文献６】Glycobiology, (2000) 10(9), 883-889
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、本基本酵素は２つの糖転移酵素活性により、コンドロイチン糖鎖骨格（GlcUAとGalNAcとがβ1,3グリコシド結合した二糖がβ1,4グリコシド結合で連なってなる糖鎖骨格）を伸長させ高分子コンドロイチン糖鎖を合成するのに適した優れた酵素であるが、その２つの糖転移酵素活性がどの様に調整されているか、最初の糖転移を受ける受容体基質は何か、動物由来のコンドロイチン合成関連酵素群との関連性など、未だ不明であるため、それを解析する材料が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者はこれら不明な点を解明し、あわせて遺伝子工学的にアミノ酸を置換することで本基本酵素の両糖転移酵素活性を分離し、各種コンドロイチン関連オリゴ糖を調製して糖鎖構造による酵素反応性を明確にし、基質特異性を解析するために検討を行った。その結果、本基本酵素の二つの領域を改変することで、その酵素活性が制御された改変酵素が生ずることを見い出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  アミノ酸番号153〜258又は435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改変酵素。
（２）  下記の（ａ）及び（ｂ）記載の性質を有することを特徴とする（１）記載の改変酵素。
（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ａ）及び（ｂ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
（３）  アミノ酸番号153〜258の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする（１）又は（２）記載の改変酵素。
（４）  アミノ酸番号239〜241の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有することを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の改変酵素。
（５）  241番目のアミノ酸が置換されていることを特徴とする（１）〜（４）いずれか記載の改変酵素。
（６）  下記の（ｃ）及び（ｄ）記載の性質を有することを特徴とする（１）記載の改変酵素。
（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを、糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ｃ）及び（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
（７）  アミノ酸番号435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする（１）又は（６）記載の改変酵素。
（８）  アミノ酸番号519〜521の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有することを特徴とする（１）、（６）及び（７）いずれか記載の改変酵素。
（９）  521番目のアミノ酸が置換されていることを特徴とする（１）及び（６）〜（８）いずれか記載の改変酵素。
（１０）  （１）〜（９）いずれか記載の改変酵素をコードする遺伝子を発現するように構築された、発現ベクター。
（１１）  （１０）記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる組換体。
（１２）  （１１）記載の組換体を生育させ、組換体の生育物に改変酵素を蓄積させることを特徴とする、改変酵素の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、GlcUA又はGalNAcを糖鎖に転移する新たな改変酵素が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（Ａ）本発明改変酵素
本発明改変酵素は、アミノ酸番号153〜258又は435〜539の範囲内に１〜数個のアミノ酸の置換を有する配列番号２記載のアミノ酸配列からなる改変酵素である。
【００１１】
本発明改変酵素における「配列番号２記載のアミノ酸配列」は、本基本酵素のアミノ酸配列であり、かかる酵素のタンパク質は前述のように２つの糖転移酵素活性を持つ、アミノ酸686個からなるポリペプチドである。この中で糖供与体である糖ヌクレオチド結合モチーフ（DXD）が２ヶ所、239〜241と519〜521がありこの近傍が糖転移活性部位であると推定される。
【００１２】
本発明改変酵素は、上記糖ヌクレオチド結合モチーフ近傍にアミノ酸の置換を有していることが好ましい。すなわち配列番号２中、アミノ酸番号153〜258の範囲又はアミノ酸番号435〜539の範囲に１又は数個のアミノ酸の置換を有することが好ましい。ここで「1〜数個」とは、1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個を示し、最も好ましくは1個が挙げられるが、本発明の所期の目的を果たしうる限りにおいてこれに限定はされない。
【００１３】
以下、便宜上、アミノ酸番号153〜258にアミノ酸の置換を有する本発明改変酵素を本発明改変酵素１と、アミノ酸番号435〜539にアミノ酸の置換を有する本発明改変酵素を本発明改変酵素２として説明する。
【００１４】
（１）本発明改変酵素１
本発明改変酵素１は、本発明改変酵素のうち、下記の（ａ）及び（ｂ）記載の性質を有することを特徴とする改変酵素である。
（ａ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｂ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ａ）及び（ｂ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
【００１５】
本発明改変酵素１は、本基本酵素の改変酵素である。本基本酵素のアミノ酸配列（配列番号２記載のアミノ酸配列）中、アミノ酸番号239〜241の範囲内にアミノ酸の置換を有していることが好ましい。本基本酵素においては、上記アミノ酸番号239〜241はアスパラギン酸−システイン−アスパラギン酸という配列からなるが、本発明改変酵素１においては、これらが本基本酵素とは異なるアミノ酸に置換している。本発明改変酵素１においては、これらの３残基のアミノ酸のうち、特に何れかのアスパラギン酸に置換が起こっていることがより好ましい。例えばアスパラギン酸が置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、アスパラギン酸以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。同様にシステインが置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、システイン以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、セリン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。例えば241番目のアスパラギン酸をリジンに置換する場合には、アスパラギン酸のトリプレット（gat）をリジンのトリプレット（例えば「aaa」）に置換することで、アミノ酸の置換を行うことができる。
【００１６】
本発明改変酵素１の最も好ましい態様である、配列番号２中のアミノ酸番号241のアスパラギン酸がリジンに置換したものをコードする塩基配列とコードされるアミノ酸配列とを配列番号７に、アミノ酸配列のみを配列番号８に示す。
【００１７】
本発明改変酵素１は、上記（ａ）及び（ｂ）の性質を有している。かかる性質のうち、（ａ）の性質は、本基本酵素が有する活性と同様の活性である。
GlcUA供与体としては、グルクロン酸ヌクレオチドが好ましい。グルクロン酸ヌクレオチドとしては、例えばUDP-GlcUA、アデノシン二リン酸(ADP)-GlcUA、シチジン二リン酸(CMP)-GalUA、及びグアノシン二リン酸(GDP)-GlcUAが挙げられ、その中でも特にUDP-GlcUAが好ましくは例示される。
【００１８】
また、GlcUA受容体としては、非還元末端にGalNAc残基が存在するコンドロイチン糖鎖骨格が好ましく、特にかかるGalNAcは硫酸化などの修飾がされていない残基であることが好ましい。かかるGlcUA受容体としてのコンドロイチン糖鎖骨格の長さは特に限定はされないが、少なくとも4糖残基以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明改変酵素１は、GalNAc供与体からGalNAcをコンドロイチン糖鎖骨格に転移する働きを実質的に有しないが、ここでGalNAc供与体とは、例えばGalNAcヌクレオチド（ADP-GalNAc、GDP-GalNAc、UDP-GalNAc、CDP-GalNAcなど）が挙げられる。さらにGalNAc受容体とは、GalNAcが上記GalNAc供与体から転移されうる物質を指し、好ましくはGalNAcヌクレオチドから、本基本酵素の作用によりGalNAcが転移されうる糖鎖を指す。かかる糖鎖の例としては、非還元末端にGlcUA残基を有する４糖以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格が挙げられる。
【００２０】
上記（ａ）及び（ｂ）の性質は、後述の実施例２及び実施例３記載の手法を用いることで容易に同定することが可能である。なお、ここで「実質的に有しない」とは、陽性対象である本基本酵素が有する活性と比して活性が5%以下であることを指して使用する。
【００２１】
（２）本発明改変酵素２
本発明改変酵素２は、本発明酵素のうち、下記の（ｃ）及び（ｄ）記載の性質を有することを特徴とする改変酵素である。
（ｃ）GalNAc供与体からGalNAcを糖鎖の非還元末端に転移する。
（ｄ）GlcUA供与体からGlcUAを糖鎖の非還元末端に転移する働きを実質的に有しない。
（上記（ｃ）及び（ｄ）において、GlcUAはD-グルクロン酸を、GalNAcはＮ−アセチル-D-ガラクトサミンを示す）
【００２２】
本発明改変酵素２は、本基本酵素の改変酵素である。本基本酵素のアミノ酸配列（配列番号２記載のアミノ酸配列）中、アミノ酸番号519〜521の範囲内にアミノ酸の置換を有していることが好ましい。本基本酵素においては、上記アミノ酸番号519〜521はアスパラギン酸−セリン−アスパラギン酸という配列からなるが、本発明改変酵素２においては、これらが本基本酵素とは異なるアミノ酸に置換している。本発明改変酵素２においては、これらの３残基のアミノ酸のうち、特に何れかのアスパラギン酸に置換が起こっていることがより好ましい。例えばアスパラギン酸が置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、アスパラギン酸以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。同様にセリンが置換した後のアミノ酸は、生体内のタンパク質を構成するアミノ酸のうち、セリン以外のアミノ酸が挙げられ、その中でも特にアラニン、リジン、スレオニンへの置換が好ましく、特にリジンへの置換が好ましい。
【００２３】
本発明改変酵素２の最も好ましい態様である、配列番号２中のアミノ酸番号521のアスパラギン酸がリジンに置換したものをコードする塩基配列とコードされるアミノ酸配列とを配列番号１１に、アミノ酸配列のみを配列番号１２に示す。
【００２４】
本発明改変酵素２は、上記（ｃ）及び（ｄ）の性質を有している。かかる性質のうち、（ｃ）の性質は、本基本酵素が有する活性と同様の活性である。
【００２５】
GalNAc供与体とは、GalNAcヌクレオチドが好ましい。GlcUAヌクレオチドとしては、例えばUDP-GalNAc、ADP-GalNAc、CMP-GalNAc、及びGDP-GalNAcが挙げられ、その中でも特にUDP-GalNAcが好ましくは例示される。
【００２６】
また、GalNAc受容体としては、非還元末端にGlcUAが存在するコンドロイチン糖鎖骨格が好ましい。かかるGlcNAc受容体としてのコンドロイチン糖鎖骨格の長さは特に限定はされないが、少なくとも4糖残基以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明改変酵素２は、GlcUA供与体からGlcUAをコンドロイチン糖鎖骨格に転移する働きを実質的に有しないが、ここでGlcUA供与体とは、例えばGlcUAヌクレオチド（ADP-GlcUA、GDP-GlcUA、UDP-GlcUA、CDP-GlcUAなど）が挙げられる。さらにGlcUA受容体とは、GlcUAが上記GlcUA供与体から転移されうる物質を指し、好ましくはGlcUAヌクレオチドから、本基本酵素の作用によりGlcUAが転移されうる糖鎖を指す。かかる糖鎖の例としては、非還元末端にGalNAc残基を有する４糖以上からなるコンドロイチン糖鎖骨格が挙げられる。
【００２８】
上記（ｃ）及び（ｄ）の性質は、後述の実施例２及び実施例３記載の手法を用いることで容易に同定することが可能である。なお、ここで「実質的に有しない」とは、陽性対象である本基本酵素が有する活性と比して活性が5%以下であることを指して使用する。
【００２９】
（Ｂ）本発明改変酵素の製造方法
本発明改変酵素は下記の方法により製造することができる。
すなわち、本基本酵素の遺伝子を含む発現ベクター（例えばJ. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575に記載された発現ベクター「pTrcHisC-K4CP」など）を鋳型として、ポリメラーゼチェインリアクション（PCR）法により、本基本酵素の遺伝子に点変異を有する塩基配列を有するベクターを増幅することにより、本発明改変酵素をコードする遺伝子を得ることができる。特にベクターとして環状DNA構造を有する発現ベクターを用いた場合には、変異を挿入したい領域に、予め変異を挿入したプライマーを使用する。かかる方法を用いると、環状DNAそのものが増幅されて、発現ベクターに変異が挿入された状態で複製が行われ、変異を有する発現ベクターのコピーが生ずるため好ましい。前記ベクターに予め薬剤（ネオマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子を組み込んでおくことで、後述の組換体の選択を容易とすることも可能であり、また、PCR法の鋳型として使用する発現ベクターを、本基本酵素とタグ（Hisタグ、プロテインA、FLAG等の公知のタグ配列）とを連続して（複合タンパク質として）発現するように構築しておくことで、後述の組換体を生育させた生育物からの本発明改変酵素の精製、単離を容易とすることも可能である。
【００３０】
PCR法の増幅産物である「点変異を有する本基本酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター」を、発現ベクターが所望の発現を行うことができる宿主細胞に形質転換又は形質導入させて、組換体を調製する。例えば上記で例示したpTrcHisC-K4CPを使用して本発明改変酵素をコードするDNAを調製した場合には、宿主細胞としては大腸菌（E. coli）などが例示される。かかる発現ベクターと宿主との組み合わせは、当業者であれば適宜容易に選択しうる。
【００３１】
組換体を適切な条件下で生育させることで、本発明改変酵素を生育物（培養上清、組換体内等）に蓄積させることが可能である。また、適当なタグとの融合タンパク質として本発明改変酵素を発現させた場合には、かかるタグに対する抗体等特異的に結合しうる物質を用いて、容易に本発明改変酵素を精製、単離することが可能である。
【実施例１】
【００３２】
点改変酵素の取得
J. Biol. Chem., (2002) 277, 21567-21575に記載された、大腸菌K4株由来のコンドロイチン合成酵素タンパク質発現ベクター（pTrcHisC-K4CP）0.05μgを鋳型として、プライマー１（配列番号３）12pmolとプライマー２（配列番号４）12pmolを用い、pfu-turbo DNA ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）2.5単位を加えてポリメラーゼチェインリアクション（PCR）反応を行った。反応条件は、反応液50μlを、95℃で30秒前処理後、95℃で30秒；55℃で1分；68℃で12分のサイクルを16回繰り返し、最後に68℃で10分間反応して終了させた。反応液に制限酵素Dpn1（NEB社製）を10単位添加して37℃で1時間処理し、その処理液1μlを50μlの大腸菌 XL1-Blue supercompetent cells （ストラタジーン社製）に添加してトランスフォーメーションを行った。アンピシリン（100μｇ/ml）含有LBプレート培地上で37℃で一晩培養して、育成してきたクローンのうち6個を選択して、各クローン中のプラスミドのDNA配列を確認して、求める変異が起こっているプラスミドが入ったクローンを選んだ。この物は配列番号６のアミノ酸配列からなるペプチド（Hisタグ）に配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド（241番目のアスパラギン酸をリジンに改変した本発明改変酵素１）が結合したタンパク質（以下「D241K」とも記載する）を発現する。
【００３３】
上記と同様にしてプライマー３（配列番号９）およびプライマー４（配列番号１０）を用いてPCRを行い、Dpn1処理後、トランスフォーメーションして、求める変異が起こっているプラスミドが入ったクローンを選んだ。この物は配列番号６のアミノ酸配列からなるペプチド（Hisタグ）に配列番号１２のアミノ酸配列からなるペプチド（521番目のアスパラギン酸をリジンに改変した本発明改変酵素２）が結合したタンパク質（以下「D521K」とも記載する）を発現する。
【００３４】
これらのクローンを常法により培養し、イソプロピル-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）で誘導して組換えタンパク質を発現させ、ソニケータで菌体破砕後、その上清より Ni-NTAアガロース（キアゲン社製）カラムを用いて精製して、それぞれのタンパク質（D241K、D521K）を得た。また、野生型構造のプラスミド（pTrcHisC-K4CP）を持つクローンからも同様にして野生型の組換え酵素タンパク質（本基本酵素）がHisタグと結合してなるタンパク質（以下「K4CP」と記載する）を得た。
【実施例２】
【００３５】
酵素活性測定
20mmol/l MnCl2, 0.1mol/l (NH4)2SO4, 1mol/l エチレングリコールを含む 50 mmol/l Tris-HCl緩衝液（pH7.2）に、受容体基質として100pmolのCSC-6（サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸C（生化学工業株式会社製）を睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で分解して精製することで得られるコンドロイチン硫酸C六糖）あるいはCSC-7(6+1)（CSC-6に本基本酵素を作用させその非還元末端にUDP-GalNAcを導入して得られる七糖）を用い、供与体基質としてそれぞれ 3nmolのUDP-GalNAc とUDP-GlcUAを用いた。必要に応じて供与体基質は放射活性体 UDP-[3H]GalNAcあるいはUDP-[14C]GlcUAを用いた。酵素タンパク質としては上記K4CP、D241K及びD521Kを、それぞれ一種類ずつ、タンパク質量として0.15μg添加した。全量を50μlに調製し、30℃で30分間酵素反応させた後、加熱して酵素を失活させた（沸騰水中1分間）。その反応液を氷冷し、1.3%(v/v)酢酸カリウムを含む95%(v/v)エタノールを150μl添加し、析出した沈殿を10,000×gで20分間遠心分離することで採取した。沈殿を50μlの蒸留水に溶解し、Superdex Peptide HR10/30 カラム（アマシャム  バイオサイエンス株式会社製）にアプライし、0.2mol/l 食塩水を0.5 ml／分の流速で流し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。溶出液を0.5ml毎に分画し、画分中の放射能をシンチレーションカウンターで計測した。酵素反応で得られた生成物の分子量は放射活性の溶出位置から求め、糖転移酵素活性は放射活性の量より計算した。
【００３６】
その結果、K4CPは受容体基質（CSC-6, CSC7(6+1)）に関わらず良く反応し、分子量2,500から20,000の高分子コンドロイチン糖鎖を合成した。ところが、D241KはCSC-6を基質として用いると糖転移反応は起こらず、CSC-7(6+1) を基質に用いると、UDP-GlcUAからGlcUAを１糖のみ転移させて８糖のみを合成した。また、D521KはCSC-7(6+1) では酵素反応が起こらず、CSC-6を基質とすると、UDP-GalNAcからGalNAcを１糖のみ転移させて７糖のみを合成した。
【００３７】
したがって、D241KはK4CPのうちGlcUA転移酵素活性のみを保持し、D521KはGalNAc転移酵素活性だけを持つ酵素になったことが明らかである。
さらに、D241K及びD521Kを同時に反応系に加え同様に酵素反応を行うと、お互いに補完し合い、K4CPと同様な高分子コンドロイチン糖鎖を合成することが分かった。
【実施例３】
【００３８】
基質特異性
実施例２記載のオリゴ糖CSC-6及びCSC-7(6+1)に加え、クジラ軟骨由来コンドロイチン硫酸A（生化学工業株式会社製）から同様の手法で得た６糖（CSA-6）、コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したコンドロイチン（生化学工業株式会社製）から同様の手法で得た６糖（CH-6）、さらにサメ軟骨由来コンドロイチン硫酸Cをヒアルロニダーゼで分解して得た８糖をβ-グルクロニダーゼ（シグマ社製）を用いて非還元末端のGlcUA残基を除いた７糖（CSC-7(8-1)）、クジラ由来コンドロイチン硫酸Aから得た８糖からCSC-7(8-1)と同様にして得た７糖（CSA-7(8-1)）、およびコンドロイチン由来の８糖から同様にして得た７糖（CH-7(8-1)）を酵素反応の受容体基質として用いた。
【００３９】
CSC-6, CSA-6, CH-6 を用いて酵素反応を行うと、K4CPはすべて高分子コンドロイチン糖鎖を合成し、D521KはGalNAc１糖を転移して７糖を合成した。D241Kは反応しなかった。
CSC-7(6+1)及びCH-7(8-1)を用いると、K4CPは高分子コンドロイチン糖鎖を合成し、D241KはGlaUA１糖を転移して８糖を合成し、D521Kは反応しなかった。ところが、CSC-7(8-1)およびCSA-7(8-1)を用いると、どの酵素も糖転移が起こらなかった。
【００４０】
CSC-7(6+1)及びCH-7(8-1)と、CSC-7(8-1)及びCSA-7(8-1)との構造上の相違点は非還元末端にある。すなわち、CSC-7(6+1)及びCH-7(8-1)の非還元末端は修飾（硫酸化）を受けていないGalNAc残基であり、CSC-7(8-1)及びCSA-7(8-1) の非還元末端は硫酸基の修飾を受けているGalNAc(6S)あるいはGlaNAc(4S)残基である。
【００４１】
したがって、K4CP及びD241Kの酵素活性発現には、受容体基質の非還元末端構造が硫酸基などの修飾を受けていないことが条件であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明により、酵素の機能の解明が可能となるとともに、改変酵素を医薬、試薬などに利用することができる。
【配列表】
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