(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内でのＪＣウイルスの粒子形成を阻害して、その増殖を抑制し、ひいてはヒト進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の治療法開発に貢献すると予想されるペプチド様化合物やそれをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】ＪＣウイルスの主要な外殻蛋白質であるＶＰ１と相互作用し、ＪＣウイルスのAgnoproteinに由来するペプチド配列中にウイルス粒子の形成を阻害する配列が２ケ所あることを明らかにした。これら生理活性的に効果のある領域のペプチドや、これらペプチドをコードするＤＮＡを、ＪＣウイルスの粒子形成阻害剤やＰＭＬの予防・治療剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチド。
【請求項３】
以下の(ａ)又は(ｂ)のペプチドをコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチド
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチド。
【請求項８】
以下の(ａ)又は(ｂ)のペプチドをコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチド
【請求項９】
配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチド。
【請求項１２】
請求項３〜５及び８〜１０のいずれか記載のＤＮＡを発現することができる組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを有効成分とすることを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成阻害剤。
【請求項１４】
請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを生体内への投与することを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成の阻害方法。
【請求項１５】
請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを有効成分とすることを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療剤。
【請求項１６】
請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを生体内への投与することを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療方法。
【請求項１７】
請求項１２記載の組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成阻害剤。
【請求項１８】
請求項１２記載の組換えベクターを生体内への投与することを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成の阻害方法。
【請求項１９】
請求項１２記載の組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療剤。
【請求項２０】
請求項１２記載の組換えベクターを生体内への投与することを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＪＣウイルス アグノ蛋白（Agnoprotein）由来のペプチドやそれをコードするＤＮＡを有効成分とするＪＣウイルスの粒子形成阻害剤やヒト進行性多巣性白質脳症（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy；ＰＭＬ）の予防・治療剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）はＪＣウイルス（ＪＣＶ）の感染によって惹起される脱髄性疾患である。ＪＣＶはポリオーマウイルス属に属する２本鎖環状ＤＮＡウイルスであり、通常は７０％以上の健常人の尿路系に不顕性感染しているが、宿主が免疫不全状態に陥ると脳に移行し、オリゴデンドログリアに感染して増殖することで致死的な脱髄を起こす。
【０００３】
従来ＰＭＬは比較的稀な疾患であったが、ＡＩＤＳ患者の増加や骨髄・臓器移植治療の導入に伴って近年増加傾向にある。特に移植治療においては、患者が極度の免疫抑制状態に曝されることは不可避であり、ＰＭＬのコントロールが移植治療の成否に大きく影響すると考えられる。このような現状にも関わらず、これまでＰＭＬの治療に用いられてきたＤＮＡ合成阻害剤であるcytosine arabinoside (Ara-C)やインターフェロンβはいずれもその効果が明らかでなく、現在の段階では未だ有効な治療法が確立されていなかった。
【０００４】
本発明者らは、先に、ＪＣウイルスのグリア細胞特異的感染機構の解明とウイルス脳症の治療法の確立を目指して研究した結果、ＪＣウイルスがコードする機能未知の蛋白質Agnoproteinの解析を通じて、AgnoproteinがJCVのウイルス粒子形成を促進することや、agno遺伝子に変異を有しAgnoproteinを発現できないＪＣウイルスはその増殖が著しく遅延することを既に明らかにし、アンチセンスオリゴやＲＮＡｉ等の遺伝子工学的手法を用いてagno遺伝子の発現を人為的に制御する、あるいは抗Agnoprotein抗体を用いてAgnoproteinの機能を阻害することはＪＣウイルスの増殖を抑制し、ひいてはＰＭＬの治療法開発に貢献しうることを報告した（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００３−１６０５１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、生体内でのＪＣＶのの粒子形成を阻害して、その増殖を抑制し、ひいてはＰＭＬの治療法開発に貢献すると予想されるペプチド様化合物やそれをコードするＤＮＡを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
AgnoproteinはＪＣＶの後期蛋白転写領域の最上流にコードされ、７１個のアミノ酸から成る蛋白（８ｋＤａ）が転写翻訳されるが、その機能は未知であったが、本発明者らは、Agnoproteinのアミノ酸配列中にＪＣＶの主要な外殻蛋白質であるＶＰ１に結合する配列が存在することを見い出し、このAgnoproteinとＪＣＶ外殻蛋白であるＶＰ１の結合領域を決定した。また、Agnoproteinに由来するペプチド配列中に粒子の形成を促進する配列が１ケ所（４１から７１番目）、阻害する配列が２ケ所（１１から３０番目、および４８から７１番目）あることを明らかにした。１１から３０番目と４１から７１番目の配列を持つペプチドは、ＶＰ１のＣ端のＧＳＴ融合蛋白質と結合することから、ＶＰ１単量体、もしくはＶＰ１５量体のＣ端部分でAgnoproteinが相互作用することによってウイルス粒子の形成を補助しているものと推察される。さらに、Agnoproteinの一部のアミノ酸配列を有するペプチド断片がウイルス粒子の形成を阻害することを見い出した。即ち、この配列（ウイルス粒子形成阻害配列）を有するペプチド様化合物を用いることによって、ＪＣＶ粒子の新たな生成を防ぐことができることを見い出した。１１から３０番目の配列を持つペプチドをＶＰ１と共存させることによって、この補助的役割を阻害し粒子形成能を低下させたものと推察される。
【０００７】
また、４８から７１番目の配列を持つペプチドは、ＶＰ１のＮ端半分、もしくはＣ端半分の領域とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合蛋白質を結合反応させたＧＳＴ融合蛋白質（それぞれＧＳＴ−ＶＰ１（Ｎ）、ＧＳＴ−ＶＰ１（Ｃ）とする）のいずれにも結合しなかったにもかかわらず、粒子形成能を阻害した。このことは、このペプチドがＶＰ１全長から成る立体構造を認識して結合し粒子の形成を阻害する、という機構が推察される。宿主細胞内でのウイルス粒子の成熟は、ウイルスの増殖と宿主細胞の破壊とともに、他細胞への新たな感染において重要な過程である。本発明により、Agnoprotein由来のペプチドを用いることによって、ＪＣＶ粒子の形成を阻害し、その結果ウイルスの増殖を有意に抑制できる可能性が示唆された。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドや、（３）以下の(ａ)又は(ｂ)のペプチドをコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドや、（４）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（５）請求項４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【０００９】
また本発明は、（６）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、（７）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドや、（８）以下の(ａ)又は(ｂ)のペプチドをコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドや、（９）配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（１０）請求項９記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【００１０】
さらに本発明は、（１１）請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチドや、（１２）請求項３〜５及び８〜１０のいずれか記載のＤＮＡを発現することができる組換えベクターや、（１３）請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを有効成分とすることを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成阻害剤や、（１４）請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを生体内への投与することを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成の阻害方法や、（１５）請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを有効成分とすることを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療剤や、（１６）請求項１若しくは２又は６若しくは７記載のペプチドを生体内への投与することを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療方法や、（１７）請求項１２記載の組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成阻害剤や、（１８）請求項１２記載の組換えベクターを生体内への投与することを特徴とするＪＣウイルスの粒子形成の阻害方法や、（１９）請求項１２記載の組換えベクターを有効成分とすることを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療剤や、（２０）請求項１２記載の組換えベクターを生体内への投与することを特徴とするヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ＪＣＶ粒子の形成を阻害し、その結果ウイルスの増殖を有意に抑制することができ、ヒト進行性多巣性白質脳症の予防・治療剤が可能となる。すなわち、ＪＣＶのAgnoproteinの部分配列（ウイルス粒子形成阻害配列）を有するペプチド様化合物を抗ウイルス剤として用いて、粒子形成を阻害することによってウイルスの増殖を抑える治療法を、従来の治療法に替わるＰＭＬの有効な治療法として提供することができる。ＪＣＶのウイルス粒子形成阻害配列が本発明により明らかになったことから、その配列からウイルス粒子形成に最も重要な部分構造を決定することができる。他方、ＪＣＶ遺伝子の転写、翻訳に関与する機構を阻止する治療法では、ＪＣＶ遺伝子の増幅には宿主由来の多くの酵素群が関与していることから宿主への副作用が懸念される。しかし、本発明による治療法では、ウイルス粒子形成というウイルス自身が持つ機構をウイルス由来の化合物で阻止する、また、ヒトの７０％以上がＪＣＶに不顕性に感染している（すなわち、ウイルス粒子形成阻害配列に対する免疫応答が少ないと考えられる）、という観点から見ると、宿主細胞への副作用が少ないことが利点として挙げられる。また、ＨＩＶなどのＲＮＡウイルスと比較してＤＮＡウイルスは変異の頻度が低いことから、ウイルス遺伝子の変異による影響が少ないと考えられる。とくに、ＪＣＶ構成蛋白質をコードしている領域では遺伝子変異の度合いが極めて低いため、耐性ウイルスが出現する可能性は極めて低いものと思われる。ウイルス粒子形成阻害配列を持つ化合物を疾患部位に効率よく導入する必要があるが、ペプチド様化合物の多くは水溶性であり、生体への投与は容易である。また、ペプチド化合物はその合成法が既に確立されているため、短時間に安価で大量の合成が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のペプチドとしては、（Ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドであれば特に制限されず、また、本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡ；（Ｃ）配列番号１又は３に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１又は３に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されず、ここで「ＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチド」とは、後述する実施例におけるＶＰ１由来ウイルス様粒子形成能の評価において、当該ペプチド非存在下における場合と比べて、粒子形成量の減少がＰ＜０．０５で統計学的に有意であるペプチドをいう。
【００１３】
上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとしては、配列番号５に示されるAgnoproteinをコードするＤＮＡ配列のうち３１番目から９０番目の塩基配列を、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとしては、配列番号５に示されるAgnoproteinをコードするＤＮＡ配列のうち１４２番目から２１３番目の塩基配列を、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとしては配列番号６に示されるAgnoproteinのアミノ酸配列のうち１１番目から３０番目のアミノ酸配列を、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとしては配列番号６に示されるAgnoproteinのアミノ酸配列のうち４８番目から７１番目のアミノ酸配列を、それぞれ挙げることができる。
【００１４】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。そして、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＪＣウイルスの粒子形成能阻害活性を有するペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡとしては、配列番号１又は３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを好適に例示することができ、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
【００１５】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、ＤＮＡ工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、ＤＮＡ工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。ＤＮＡ工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
【００１６】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１７】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００１８】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１若しくは３に示される塩基配列情報又は配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、あるいは、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００１９】
具体的には、Agnoproteinが由来するＪＣＶより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明のＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明のＤＮＡを取得することができ、本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２０】
本発明のペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、化学合成したペプチドでも、ＤＮＡ組換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。化学合成によりペプチドを調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のペプチドを合成することもできる。ＤＮＡ組換え技術によりペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のペプチドを調製することができる。
【００２１】
例えば、ＤＮＡ組換え技術によって、本発明のペプチドを調製する場合、かかるペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのペプチドの精製物を得ることができる。
【００２２】
さらに、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてＪＣＶ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、常法により配列番号１又は３に示されるＤＮＡを取得し、これを発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるペプチドを製造することができる。
【００２３】
上記本発明のペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している本発明の融合ペプチドとしては特に制限されず、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合ペプチド、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２４】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを動物細胞用の発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより、本発明のペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、上記本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２５】
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Clontech社製）、ｐＧＢＴ−９(Clontech社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
本発明のＪＣウイルスの粒子形成阻害剤としては、本発明のペプチドや本発明の組換えベクターを有効成分とする組成物であれば特に制限されず、また、本発明のヒト進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の予防・治療剤としては、本発明のペプチドや本発明の組換えベクターを有効成分とする組成物であれば特に制限されるものではなく、ＰＭＬの予防・治療剤には、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これらＰＭＬの予防・治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、本発明のＰＭＬの予防・治療剤の投与量は、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができる。
【００２７】
経口的に投与する製剤の場合、薬理学的に許容される担体としては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、デンプン等の賦形剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、懸濁液製剤には生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。
【００２８】
本発明のＪＣウイルスの粒子形成阻害方法としては、本発明のペプチドや本発明の組換えベクターを生体内への投与する方法であれば特に制限されず、また、本発明のヒト進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）の予防・治療方法としては、本発明のペプチドや本発明の組換えベクターを生体内への投与する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明のペプチドや本発明の組換えベクターを生体内へ投与して、細胞内へデリバリーする方法としては、上記本発明の組換えベクターを細胞内に導入する方法や、前記本発明のペプチドを細胞内に導入する方法であれば特に制限されず、組み換えベクターの細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、感染等により行うことができ、また、本発明のペプチドの細胞内への導入には、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）や、ペプチドと非共有結合で複合体を作り細胞内に取り込まれるリポソーム様形態のカチオン性脂質等の細胞毒性のない試薬を用いることができる。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［Overlay法による外殻蛋白質VP1とAgnoprotein由来のペプチドの結合の確認］
ＪＣＶは５，１３０ｂｐの２本鎖環状ＤＮＡウイルスで、外殻蛋白質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３にウイルスのゲノムＤＮＡが含まれて（パッケージングされて）いる。一方、Agnoproteinは７１個のアミノ酸から成り、発明者らによってＶＰ１と結合することが示されていたが、７１個のアミノ酸のうちのどの領域が結合に必要なのか明らかにはされていなかった。そこで、発明者らはAgnoproteinに由来する約２０から３０残基から成る８種類のペプチド断片を合成し、これとＶＰ１が結合するか否かをOverlay法を用いて解析した。具体的には１０μｇのペプチドをニトロセルロース膜にスポットし、風乾した後、膜上のペプチドと、ＶＰ１のＮ端半分、もしくはＣ端半分の領域とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合蛋白質を反応させた。結合したＧＳＴ融合蛋白質（それぞれＧＳＴ−ＶＰ１（Ｎ）、ＧＳＴ−ＶＰ１（Ｃ）とする）を抗ＶＰ１抗体で検出することによりＶＰ１結合領域を決定した。
［ＶＰ１とAgnoproteinの結合領域の決定］
実験に用いた８種類の合成ペプチド断片を図１に示した。これらのペプチド断片のうち、Agnoproteinの１１から３８番目の領域のペプチドはＶＰ１のＮ、Ｃ端領域のどちらにも結合することが示された（図２）。また、２１から３８番目のペプチドはＶＰ１のＮ端領域に、１１から３０番目、４１から７１番目の２種類のペプチドはＶＰ１のＣ端領域に結合することが示された（図２）。いずれのペプチドもＧＳＴ単体には結合しなかった。
【実施例２】
【００３１】
［Agnoprotein由来ペプチドの存在下でのＶＰ１由来ウイルス様粒子形成能の評価］
ＶＰ１由来ウイルス様粒子形成能の評価には（１）ゲルろ過法、（２）５％から３５％のショ糖密度勾配遠心法を用いた。各２μＭのＶＰ１とAgnoprotein由来合成ペプチドを混和し、氷上で１時間粒子形成反応を行った後、粒子形成量をゲルろ過法、ショ糖密度勾配遠心法を用いて評価した。ゲルろ過法は、ＶＰ１由来ウイルス様粒子とＶＰ１の単量体、その中間体であるＶＰ１の５量体を分離できる。このことを利用してＶＰ１由来ウイルス様粒子に由来するピーク強度を測定し、各ペプチド存在下でのウイルス様粒子形成量を測定した。また、ショ糖密度勾配遠心法では、ウイルス様粒子とＶＰ１単量体を比重の違いによって分離でき、ウイルス様粒子は最も比重の高い画分に沈澱する。遠心後の溶液を１ｍｌずつ分画し、画分中のＶＰ１を抗ＶＰ１抗体で検出し、ウイルス様粒子形成能における各ペプチドの影響を評価した。
［Agnoprotein由来ペプチドのウイルス様粒子形成への影響］
図３に、ＶＰ１を大腸菌を用いて合成し、ウイルスと同様の形態、同様の細胞侵入能を有するウイルス様粒子形成量をゲルろ過法で調べた結果を示した。ペプチド非存在下での粒子形成量を１とすると、１１番目から３０番目のペプチドの存在下では粒子形成量は約半分に減少した。一方、４１番目から７１番目のペプチドの存在下では約２倍に増加した。これらの減少、増加はＰ＜０．０５で統計学的に有意であった（＊印）。また、１１から３８、２１から３８、４８から７１番目のペプチドの存在下では、粒子のピークのみならず、ＶＰ１の５量体、また単量体のいずれのピークも観測されなかったため、ゲルろ過法でウイルス様粒子形成量を測定することはできなかった（図中Ｎ／Ａ）。そこで、各ペプチドが粒子形成量に与える影響をショ糖密度勾配遠心法で評価した結果を図４に示した。ペプチド非存在下（図中Control）では、比重の軽い画分（図中Top）から重い画分（図中Bottom）にかけて広くＶＰ１が検出された。特に、最も重い画分に検出されたＶＰ１は粒子であるものと考えられた。この画分には、１から２０、１１から３８、２１から３８、３１から６０、４１から７１、４１から６０番目の６種のペプチドの存在下でもＶＰ１のシグナルが検出された。しかし、２１から３８、４８から７１番目のペプチドの存在下では粒子形成を示すシグナルは検出されなかった。このことから、２１から３８、４８から７１番目のペプチドは粒子形成阻害配列であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例に用いたAgnoprotein由来の８種類の合成ペプチド断片を示す図である。
【図２】図１に示されるAgnoproteinの１１から３８番目の領域のペプチドがＶＰ１のＮ、Ｃ端領域のどちらにも結合することを、２１から３８番目のペプチドはＶＰ１のＮ端領域に結合することを、１１から３０番目、４１から７１番目の２種類のペプチドはＶＰ１のＣ端領域に結合することを示す図である。
【図３】大腸菌を用いて合成したＶＰ１のウイルス様粒子形成量をゲルろ過法で調べた結果を示す図である。
【図４】本発明のペプチドが粒子形成量に与える影響をショ糖密度勾配遠心法で評価した結果示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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