(57)【要約】【課題】            酵素阻害作用を有する新規なピロリジン化合物を高い純度で合成し、提供すること。【解決手段】        窒素上に保護基を有し、３、４位にトランスジヒドロキシ基を有し、２位にシアノ基を有するピロリジン化合物を合成中間体として、シアノ基を還元または加水分解して、立体選択的に２位にアミノメチルまたはカルバモイル基を有する3,4-ジヒドロキシピロリジン化合物を合成することができる。得られたピロリジン誘導体は高い酵素阻害活性を示す。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(I)を有するピロリジン化合物:
2005239647.tif 000015
式中、Rは-CH2NH2及び-CONH2からなる群より選択され、2位炭素の立体配置はS体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択される、ただしRが-CH2NH2である場合には、2位、3位及び4位炭素の立体配置は(2S,3R,4R)の組合せではない。
【請求項２】
一般式(I)における3位炭素及び4位炭素の立体配置が(3S,4S)である、請求項１記載のピロリジン化合物。
【請求項３】
下記一般式(II)を有する化合物:
2005239647.tif 000016
式中、Rは、-CN、-CH2NH2、及び-CONH2からなる群より選択され、
2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、
3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、
R3は水素またはアミノ保護基であり、
ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない。
【請求項４】
R1及びR2が水素である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
R3が水素である、請求項３記載の化合物。
【請求項６】
R3がtert-ブトキシカルボニル基である、請求項３または４記載の化合物。
【請求項７】
下記一般式(II-1)で表される化合物:
2005239647.tif 000017
（式中、2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、R3は水素またはアミノ保護基であり、ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない）
のヒドロキシ保護基及びアミノ保護基のいずれかまたは両方を必要により脱保護し、シアノ基を水素化処理してアミノメチル基に変換し、ヒドロキシ保護基及びアミノ保護基が残存する場合にはこれを完全に脱保護することにより、下記式(I-1)で表されるピロリジン化合物：
2005239647.tif 000018
（式中、2位、3位及び4位炭素の立体配置は、上記式(II-1)で表される化合物と同じである）
を製造する方法。
【請求項８】
下記一般式(II-1)で表される化合物:
2005239647.tif 000019
（式中、2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、R2は水素またはヒドロキシ保護基であり、R3は水素またはアミノ保護基であり、ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない）
のヒドロキシ保護基及びアミノ保護基のいずれかまたは両方を必要により脱保護し、シアノ基を加水分解してカルバモイル基に変換し、ヒドロキシ保護基及びアミノ保護基が残存する場合にはこれを完全に脱保護することにより、下記一般式(I-2)で表されるピロリジン化合物：
2005239647.tif 000020
（式中、2位、3位及び4位炭素の立体配置は、上記式(II-1)で表される化合物と同じである）
を製造する方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の化合物を含む、酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素阻害活性を有するプロリン誘導体化合物、その製造方法及び前記製造方法における合成中間体、並びに前記化合物を含む酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質をはじめとする多くの天然物中の基本骨格として含まれているヒドロキシピロリジン化合物は、各種生理活性物質や医薬の合成中間体として、また機能性材料として有用である。例えば、2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジンの８種類ある立体異性体のうち、(2S,3R,4R)体については各種の癌治療に用いられるシスプラチンの誘導体の一部であり、配位子として白金に結合したものを合成する過程で合成されている（例えば、非特許文献１参照）。また、(2R,3R,4S)体はJack bean由来のα-マンノシダーゼに対する選択的な拮抗型阻害剤の基本骨格である（例えば、非特許文献２参照）。さらに、ピロリジン化合物の糖との構造類似性に基づく酵素阻害活性については、ヒドロキシプロリンなどもその一群に含まれる。それらのほとんどは天然に微量しか存在しないので、より詳しい研究や活用のためには化学合成する必要があり、標的となる各々の化合物の立体配置を満たした糖やアミノ酸を出発原料とする種々の合成法が報告されている。（例えば非特許文献３〜９参照）。
【０００３】
しかしながら、いずれも合成ルートが個別的で煩雑であるので、異性体や類縁体を得るためにはそれぞれ異なる原料および合成法を用いる必要があった。したがって、画一的な合成手法は未だ開発途上であるといえる。また、従来の合成法によって得られる前駆体はしばしば結晶性に乏しく、高純度が要求される生物活性試験への適用が容易ではない。特に、ヒドロキシプロリンはそれ自身が異性化しやすく、その後の官能基変換反応の実施においてエピマー化を避けることが困難である。そのような理由から、高純度の2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジンの合成例は前出の文献以外に知られていない。また、カルボン酸に起因する異性化が回避されたジヒドロキシプロリン誘導体の各立体異性体についても、実際に合成報告した例は知られていない。
【０００４】
【非特許文献１】Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 643-646
【非特許文献２】Bioorg. Med. Chem. Lett., 2001, 11, 2489-2493.
【非特許文献３】Tetrahedron Lett., 1986, 27, 3203.
【非特許文献４】Hiranuma, S.;Shimizu, T.; Nakata, T.; Kajimoto, T.; Wong, C. H. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 8247-8250.
【非特許文献５】Bernet, B.; Murty, A. R. C. B.; Vasella, A. Helv. Chim. Acta., 1990, 73, 940-958.
【非特許文献６】Lundt, I.; Madsen, R. Synthesis, 1995, 787-793.
【非特許文献７】Dureault, A.; Portal, M.; Depezay, J. C. Synlett, 1991, 225-226.
【非特許文献８】Fitremann, J.; Dureault, A.; Depezay, J. C. Synlett, 1995, 235-237.
【非特許文献９】Baxter, E. W.; Reitz, A. B. J. Org. Chem., 1994, 59, 3175-3185
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、酵素阻害作用を有する、プロリン誘導体である新規なピロリジン化合物、前記ピロリジン化合物を高純度で得るために必要な合成中間体、前記ピロリジン化合物の製造方法、及び前記ピロリジン化合物を含む阻害剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、下記一般式(I)を有するピロリジン化合物を提供する。
2005239647.tif 000002
式中、Rは、-CH2NH2、及び-CONH2からなる群より選択され、2位炭素の立体配置はS体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択される。3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)であることがより好ましい。ただしRが-CH2NH2である場合には、2位、3位及び4位炭素の立体配置は(2S,3R,4R)の組合せではない。
なお、各一般式において炭素原子の横の＊のマークは、その炭素原子が不斉炭素であることを意味する。
【０００７】
本発明はまた、下記一般式(II)を有する化合物を提供する。
2005239647.tif 000003
式中、Rは、-CN、-CH2NH2、及び-CONH2からなる群より選択され、
2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、
3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、
R3は水素またはアミノ保護基であり、
ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない。
一般式（II）で表される化合物は、一般式（I）の化合物の製造において有用な合成中間体である。
上記一般式（II）において、R1及びR2は好ましくはtert-ブチルジメチルシリル基である。また、R3はtert-ブトキシカルボニル基であることが好ましい。
【０００８】
本発明はまた、下記一般式(II-1)で表される化合物:
2005239647.tif 000004
（式中、2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、R3は水素またはアミノ保護基であり、ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない）
のヒドロキシ保護基及びアミノ保護基のいずれかまたは両方を必要により脱保護し、シアノ基を水素化処理してアミノメチル基に変換し、ヒドロキシ保護基及びアミノ保護基が残存する場合にはこれを完全に脱保護することにより、下記式（I-1)で表されるピロリジン化合物：
2005239647.tif 000005
（式中、2位、3位及び4位炭素の立体配置は、上記式（II-1)で表される化合物と同じである）
を製造する方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、下記一般式（II-1）で表される化合物:
2005239647.tif 000006
（式中、2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、R3は水素またはアミノ保護基であり、ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない）
のヒドロキシ保護基及びアミノ保護基のいずれかまたは両方を必要により脱保護し、シアノ基を加水分解してカルバモイル基に変換し、ヒドロキシ保護基及びアミノ保護基が残存する場合にはこれを完全に脱保護することにより、下記一般式（I-2)で表されるピロリジン化合物：
2005239647.tif 000007
（式中、2位、3位及び4位炭素の立体配置は、上記式（II-1)で表される化合物と同じである）
を製造する方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、上記一般式（I）で表されるピロリジン化合物を活性化合物として含む、酵素阻害剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、光学純度の高いプロリン誘導体である新規なピロリジン化合物を得ることができる。また、本発明のピロリジン化合物は高い酵素阻害作用を示す。また、ヒドロキシピロリジン誘導体のアミノ基および／または水酸基が保護された、再結晶による精製が容易な合成中間体を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の酵素阻害作用を示すピロリジン化合物について説明する。本発明の酵素阻害作用を示すピロリジン化合物は下記一般式（I）で表される。以下、特に断り無く“本発明のピロリジン化合物”という場合には、一般式（I）で表されるいずれかの立体異性体であるピロリジン化合物をいう。
【００１３】
2005239647.tif 000008
式中、Rは、-CH2NH2、及び-CONH2からなる群より選択され、2位炭素の立体配置はS体またはR体であり、3位炭素及び4位炭素の立体配置は、(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択される。ただしRが-CH2NH2である場合には、2位、3位及び4位炭素の立体配置は(2S,3R,4R)の組合せではない。
酵素阻害作用の観点から、一般式（I）において、Rは-CH2NH2、及び-CONH2からなる群より選択されることが好ましく、-CH2NH2であることがより好ましい。また、3位炭素及び4位炭素の立体配置は、(3S,4S)であることが好ましい。
【００１４】
本発明のピロリジン化合物を合成する際に有用な合成中間体として下記一般式(II)を有する化合物が挙げられる。
2005239647.tif 000009
式中、Rは、-CN、-CH2NH2、及び-CONH2からなる群より選択され、
2位炭素の立体配置は、S体またはR体であり、
3位炭素及び4位炭素の立体配置は(3S,4S)及び（3R,4R）の組合せから選択され、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリルからなる群より選択され、
R3は水素またはアミノ保護基であり、
ただしR1とR2は同じであっても異なっていてもよく、及びR1、R2及びR3は同時に水素を表さない。
【００１５】
上記式（II）のR1及びR2は、合成方法によっては、上記シリル系保護基以外のヒドロキシ保護基を経由する場合もあり得る。この場合にはヒドロキシ保護基とは、通常水酸基を保護するために用いられる、エーテル型保護基、エステル型保護基、カーボネート型保護基等、例えば“Protective Groups in Organic Synthesis” T. W. Greene, John Wiley & Sons、に記載されるヒドロキシ基の保護基を適宜使用することができる。また、R2はR1と同じ保護基であってもよい。
R3に関して、アミノ保護基は、２級アミノ基を保護するために通常用いられるいずれの保護基であってもよい。具体的には、t-ブチルオキシカルボニル基（Boc基）や、ベンジルオキシカルボニル基（Cbz基）、若しくは“Protective Groups in Organic Synthesis” T. W. Greene, John Wiley & Sons、に記載されるカーバメート型アミノ保護基等を適宜使用することができる。好ましくは、t-ブチルオキシカルボニル基（Boc基）及びベンジルオキシカルボニル基（Cbz基）が挙げられ、より好ましくはBoc基である。
式（II-1）及び（II-2）における“アミノ保護基”という用語は、上述した式（II）におけるものと同じ意味を有する。
【００１６】
本発明のピロリジン化合物を製造する方法について以下に説明する。
本発明の酵素阻害剤である3,4-ジヒドロキシプロリンアミドおよび2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジンは、合成中間体であるN-保護-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（参考文献：特開2002-088059号公報）（例えば、1-tert-ブトキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン）のシアノ基を選択的に変換して合成することができる。各工程においては公知の手法を適用できる。その際、生成物の立体配置は用いるシアノ誘導体のそれと同じである。また、各化合物の鏡像異性体においても同様に反応を行うことができる。
【００１７】
スキーム１は、本発明のピロリジン化合物を製造する方法の一実施態様について、概略を示したものである。２位にシアノ基を有し、３、４位が任意のヒドロキシ保護基で保護されたピロリジン化合物（cis-(1),trans-(1)）のピロリジン環上の窒素原子を、任意のアミノ保護基で保護し、３、４位のヒドロキシ保護基を脱保護した後、シアノ基をアミノメチル基またはカルバモイル基に変換し、アミノ保護基を脱保護して、本発明のピロリジン化合物（cis-(5),cis-(7),trans-(5),trans-(7)）を製造することができる。
３、４位のヒドロキシ保護基はシアノ基をアミノメチル基またはカルバモイル基に変換した後、脱保護することもできる。
【００１８】
2005239647.tif 000010
【００１９】
より具体的に特定の保護基を用いて本発明のピロリジン化合物を製造する方法について、スキーム２に従い説明する。スキーム２には、２位と３位がシスの関係にある２−アミノメチルピロリジン化合物及び２−カルバモイルピロリジン化合物の合成スキームが示されている。
【００２０】
2005239647.tif 000011
【００２１】
まず、ピロリジン環上の窒素原子にtert-ブトキシカルボニル基を導入する。tert-ブトキシカルボニル基の導入においては、市販の試薬あるいは調製した保護基導入試薬、例えばBoc2O等、を用いることができ、任意に塩基共存下で、適当な反応溶媒中で、上記試薬と原料のピロリジン化合物を反応させることにより、tert-ブトキシカルボニル基を導入することができる。Boc2Oは過剰に使用することができるが、単離・精製の簡単のため、使用量としては原料の2-シアノピロリジン化合物(cis-(1))１当量に対して１〜１０当量が好ましく、さらに好ましくは１.５〜３当量である。また、共存させる塩基としては、トリエチルアミンに代表される３級アミンやピリジンなどの有機塩基および炭酸カリウムに代表される無機塩基が使用できる。反応溶媒としては、通常メタノール、エタノールをはじめとするアルコール類、水、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,2-ジメトキシエタン、1,4-ジオキサンおよびこれらの混合溶媒などが使用できる。反応温度は、通常−２０〜５０℃程度が好ましく、特に０〜２０℃が好ましい。反応時間は、通常５分間〜２日間程度が好ましい。
【００２２】
このようにして得られたN-Boc-2-シアノ誘導体(cis-(2))の３、４位水酸基の保護基であるTBDMS基（tert-ブチルジメチルシリル基）は、フッ化物イオンの作用による除去が可能である。この反応は、市販のTBAF（テトラヒドロフラン溶液）を利用する方法が適用できる。TBAF（テトラヒドロフラン溶液）の使用量は、N-Boc-2-シアノ誘導体(cis-(2))１当量に対して１〜１０当量、好ましくは１.５〜３当量である。反応溶媒としては、通常テトラヒドロフランなどが使用できる。反応温度は、通常−１０〜５０℃程度が好ましく、特に０〜２０℃が好ましい。反応時間は、通常５分間〜２日間程度が好ましい。
【００２３】
この反応において生成する1-tert-ブトキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(3)）のジアステレオマー過剰率は、出発物質(cis-(1))のそれに準じたものであるが、この化合物は再結晶による精製が可能である。再結晶溶媒としては、メタノール、エタノールをはじめとするアルコール類、アセトン、酢酸エチルなどが使用できる。
【００２４】
1-tert-ブトキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン(cis-(3))のシアノ基は、パラジウム-活性炭を代表とする不均一系触媒の存在下で水素の付加を受け、相当するアミノメチル基へと変換される。パラジウム-活性炭は過剰に使用することができるが、生成物の物理的吸着による損失を回避するために使用量を制限することが望ましい。使用量としては原料１当量に対して０．０１〜２当量が好ましく、さらに好ましくは０．１〜０．５当量である。本反応で用いる還元剤は水素または水素を含むガスが好ましく、その供給方法は公知の方法を適用できる。例えば、反応溶液中に水素を含むガスを通気しても良いし、水素ガス雰囲気下において反応液を撹拌、あるいは反応系内においてシクロヘキサジエンなどから水素移動させても良い。反応溶媒としては、通常メタノール、エタノールをはじめとするアルコール類、水、酢酸エチル、酢酸、ギ酸、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,2-ジメトキシエタン、1,4-ジオキサンおよびこれらの混合溶媒などが使用できる。反応温度は、通常−２０〜５０℃程度が好ましく、特に０〜２０℃が好ましい。反応時間は、通常５分間〜２日間程度が好ましい。
【００２５】
このようにして得られたN-Bocアミノメチル誘導体（cis-(4)）のBoc基は、トリフルオロ酢酸 (TFA)の作用による除去が可能である。この反応は、TFAを溶媒として用いることができる。TFAの使用量は、N-Bocアミノメチル誘導体（cis-(4)）１ mmolに対して０.１〜１０ ml、好ましくは１〜３ mlである。反応温度は、通常−１０〜５０℃程度が好ましく、特に０〜２０℃が好ましい。反応時間は、通常５分間〜２日間程度が好ましい。
【００２６】
この反応において生成する2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(５)）のジアステレオマー過剰率は、出発物質である（cis-(1)）に準じたものであるが、この原料は再結晶による精製が可能である。したがって、高純度の1-tert-ブトキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(1)）からは純粋な2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(5)）が得られる。
【００２７】
2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(5)）は、ゲルろ過カラムおよびイオン交換樹脂を用いた精製が可能である。ゲルろ過カラムとしては、Sephadex（登録商標） G-15（ファルマシア製）をはじめとする一般的なものが使用できる。また、樹脂としてはDOWEX（登録商標） 50WX-8（ダウケミカル社製）をはじめとする酸性樹脂が使用できる。
【００２８】
次に、2-カルバモイルピロリジン化合物の合成について説明する。スキーム２において、合成中間体1-tert-ブトキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(3)）のシアノ基は、炭酸カリウムに代表される無機塩基の存在下で過酸化水素水による酸化を受け、相当するアミド（cis-(6)）へと変換される。過酸化水素水は過剰に使用することができるが、使用量としては原料１当量に対して１〜３００当量が好ましく、さらに好ましくは１００〜２００当量である。また、共存させる塩基の使用量は、原料１当量に対して１〜１０当量が好ましく、さらに好ましくは３〜５当量である。反応溶媒としては、通常メタノール、エタノールをはじめとするアルコール類、水、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、1,2-ジメトキシエタン、1,4-ジオキサン及びこれらの混合溶媒が使用できる。
【００２９】
このようにして得られたN-Boc-カルバモイル誘導体（cis-(6)）のBoc基は、トリフルオロ酢酸(TFA)の作用による除去が可能である。この反応は、TFAを溶媒として用いることができる。TFAの使用量は、N-Bocアミノメチル誘導体（cis-(6)）１ mmolに対して０.１〜１０ ml、好ましくは１〜３ mlである。反応温度は、通常−１０〜５０℃程度が好ましく、特に０〜２０℃が好ましい。反応時間は、通常５分間〜２日間程度が好ましい。
【００３０】
この反応において生成する3,4-ジヒドロキシプロリンアミド（cis-(7)）のジアステレオマー過剰率は、出発物質の（cis-(1)）それに準じたものであるが、この原料は再結晶による精製が可能である。したがって、高純度の1-tert-ブトキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(1)）からは純粋な3,4-ジヒドロキシプロリンアミド（cis-(7)）が得られる。
【００３１】
3,4-ジヒドロキシプロリンアミド（cis-(7)）は、ゲルろ過カラムおよびイオン交換樹脂を用いた精製が可能である。ゲルろ過カラムとしては、Sephadex（登録商標） G-15（ファルマシア製）をはじめとする一般的なものが使用できる。また、樹脂としてはDOWEX（登録商標） 50WX-8（ダウケミカル社製）をはじめとする酸性樹脂が使用できる。
【００３２】
上述したスキーム２は2,3-cis体の製造を示しているが、2,3-trans体（スキーム３）及び2,3-cis体と2,3-trans体それぞれの鏡像異性体についても、スキーム２と同様の工程を経て合成されるものである。各工程の反応条件については本発明物質の異性体のうち代表1種のものを、得られる化合物の物性値については個別に記載した。その際、簡単のために化合物番号にcisまたはtransを付与することで立体異性体を区別し、D-酒石酸から導いた化合物にent-を付与することで鏡像異性体を区別している。
2005239647.tif 000012
【００３３】
本発明のピロリジン化合物は、酵素阻害作用を示す。酵素阻害剤とは、酵素の触媒作用によっておこなわれる反応に対して酵素−基質複合体の形成を阻害し、反応を抑制する物質群の総称であり、酵素阻害作用とは、可逆的あるいは不可逆的に酵素と結合して酵素−基質複合体の生成を妨げるものに大別される。
糖転移酵素や糖加水分解酵素（グリコシダーゼ）は糖鎖を合成・分解する重要な酵素であり、それらの阻害剤は、ウイルスなどに見られる糖タンパク質糖鎖の生合成阻害に利用できることが知られている。本発明のピロリジン化合物は特に、グリコシダーゼ阻害作用が顕著である。
本発明のピロリジン化合物を含む組成物は酵素阻害剤として使用することができ、上記酵素にに関連した疾患に対する治療剤、医学的実験ツール等として様々な利用法がある。
【実施例】
【００３４】
実施例１
(2R,3S,4S)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン (cis-(3)) ＜L-酒石酸から導かれる2,3-シス型Boc体＞  の合成
L-酒石酸から公知の方法によって得られる(2R,3S,4S)-3,4-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ-2-シアノピロリジン cis-(1)(2.39 g, 6.70 mmol)のメタノール(120 ml)溶液に、Boc2O(2.19 g, 10.1 mmol)とトリエチルアミン(2.18 ml, 20.1 mmol) を加え、室温にて１２時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を濃縮して残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン : 酢酸エチル ＝ 19 : 1)で精製し、(2R,3S,4S)-3,4-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノピロリジン cis-(2)(2.8 g, 92％)を得た。なお、cis-(2)は２位エピマーとの混合物(de = 76〜88％)であり、原料である(1)の純度と同等である。また、２位エピマーそれぞれのシリカゲルカラムによる分離は困難である。この(2R,3S,4S)-3,4-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)オキシ-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノピロリジン（cis-(2)）(2.41 g, 5.27 mmol)のTHF(48 ml)溶液に、テトラn-ブチルアンモニウムフルオライド(1M in THF, 13.2 ml, 13.2 mmol)を加え、室温にて１２時間撹拌した。反応溶液を濃縮して大部分のTHFを留去後、酢酸エチルにて希釈、飽和食塩水で洗浄、乾燥、濃縮することで生成物cis-(3)を粗結晶として定量的に得た。２位エピマーを含む粗結晶(de = 76〜88％)は酢酸エチルから再結晶することにより精製され、純粋な(2R,3S,4S)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジンcis-(3)は、５０〜７０％の収率で単離される。
分子式：C10H16N2O4
分子量：228.25
比旋光度：[a]D -94.0° (c 1.0, MeOH)
融点：124.5〜125.5℃
Rf値： 0.46(EtOAc)
1H NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 4.58 (d, 1H, H-2, J = 5.1 Hz), 4.11 (dd, 1H, H-3, J = 5.1, 4.0 Hz), 3.99 (ddd, 1H, H-4, J = 4.0, 5.1, 3.3 Hz), 3.45 (dd, 1H, H-5a, J = 5.1, 11.4 Hz), 3.22 (dd, 1H, H-5b, J = 3.3, 11.4 Hz), 1.38 (s, 9H, t-Bu).
13C NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 154.67, 117.43, 82.06, 75.56 (C-3), 73.60 (C-4), 53.07 (C-2), 51.84 (C-5), 28.62.
元素分析：計算値 C; 52.62, H; 7.07, N; 12.27. 実測値 C; 52.77, H; 6.80, N; 12.05.
以下の化合物についても、上記と同様の操作により相当する原料から得ることが可能である。
【００３５】
実施例２
(2S,3S,4S)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（trans-(3)）  ＜L-酒石酸から導かれる2,3-トランス型Boc体＞  
分子式：C10H16N2O4
分子量：228.25
比旋光度：[a]D +59.3° (c 1.0, MeOH)
融点：152〜154.5℃
Rf 値： 0.45 (EtOAc)
1H NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 4.25 (br s, 1H, H-2), 4.18 (br s, 1H, H-3), 4.02 (br d, 1H, H-4, J = 1.8 Hz), 3.46 (dd, 1H, H-5a, J = 4.0, 11.4 Hz), 3.25 (d, 1H, H-5b, J = 11.4 Hz), 1.38 (s, 9H, t-Bu).
13C NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 154.97, 118.20, 82.02, 79.12 (C-3), 74.30 (C-4), 53.82 (C-2), 52.76 (C-5), 28.64.
元素分析：計算値 C; 52.62, H; 7.07, N; 12.27. 実測値 C; 52.63, H; 6.88, N; 12.01.
【００３６】
実施例３
(2S,3R,4R)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン(ent-cis-3)
分子式：C10H16N2O4
分子量：228.25
比旋光度：[a]D +94.0° (c 1.0, MeOH)
融点：124.5〜125.5℃ 
Rf 値： 0.46 (EtOAc)
1H NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 4.58 (d, 1H, H-2, J = 5.1 Hz), 4.11 (dd, 1H, H-3, J = 5.1, 4.0 Hz), 3.99 (ddd, 1H, H-4, J = 4.0, 5.1, 3.3 Hz), 3.45 (dd, 1H, H-5a, J = 5.1, 11.4 Hz), 3.22 (dd, 1H, H-5b, J = 3.3, 11.4 Hz), 1.38 (s, 9H, t-Bu).
13C NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 154.67, 117.43, 82.06, 75.56 (C-3), 73.60 (C-4), 53.07 (C-2), 51.84 (C-5), 28.62.  （cis-(3)と一致）
元素分析：計算値 C; 52.62, H; 7.07, N; 12.27. 実測値 C; 52.91, H; 6.62, N; 12.59.
【００３７】
実施例４
(2R,3R,4R)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン(ent-trans-(3))
分子式：C10H16N2O4
分子量：228.25
比旋光度：[a]D -59.3° (c 1.0, MeOH)
融点：152〜154.5℃
Rf 値： 0.45 (EtOAc)
1H NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 4.25 (br s, 1H, H-2), 4.18 (br s, 1H, H-3), 4.02 (br d, 1H, H-4, J = 1.8 Hz), 3.46 (dd, 1H, H-5a, J = 4.0, 11.4 Hz), 3.25 (d, 1H, H-5b, J = 11.4 Hz), 1.38 (s, 9H, t-Bu).
13C NMR (DMSO-d6 at 100℃) d 154.97, 118.20, 82.02, 79.12 (C-3), 74.30 (C-4), 53.82 (C-2), 52.76 (C-5), 28.64.   （trans-(3)と一致）
元素分析：計算値 C; 52.62, H; 7.07, N; 12.27. 実測値 C; 52.63, H; 6.88, N; 12.01.
【００３８】
実施例５
(2R,3S,4S)-2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン二塩酸塩(cis-(5))の合成
再結晶により精製された純粋な(2R,3S,4S)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(3)）(13.5 mg, 0.191 mmol)をエタノール(6 ml)に溶かし、20％水酸化パラジウム-活性炭(6.8 mg)と酢酸(0.75 ml)を加え、水素ガス雰囲気下室温にて30分間撹拌した。反応終了後、溶液をセライトろ過し、濃縮すると相当するN-Bocアミノメチル誘導体cis-(4)が高収率で得られた。このN-Bocアミノメチル誘導体をTFA(ca. 1 ml)に溶かし、室温にて10分間撹拌した。濃縮すると(2R,3S,4S)-2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(5)）はトリフルオロ酢酸塩として得られる。これは、Sephadex（登録商標） G-15（ファルマシア製）にてゲルろ過(水で溶出)して、さらにDOWEX（登録商標） 50WX-8（ダウケミカル社製）にてイオン交換カラム(1.3N アンモニア水で溶出)することで塩フリーとして単離される。さらに濃縮乾固したのちに1M塩酸を加えて濃縮すると塩酸塩として単離される。（収率：約95％, de = 100％）
分子式：C5H14Cl2N2O2
分子量：205.08376
比旋光度：[a]D -4.0° (c 0.64, H2O)
Rf 値： 0.4 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.30 (d, 1H, H-4, J = 4.0 Hz), 4.25 (d, 1H, H-3, J = 3.3 Hz), 3.97 (ddd, 1H, H-2, J = 3.3, 6.6, 6.6 Hz), 3.61 (dd, 1H, H-5a, J = 4.0, 13.1 Hz), 3.47 (dd, 1H, H-2'a, J = 6.6, 13.8 Hz), 3.37 (dd, 1H, H-2'b, J = 6.6, 13.8 Hz), 3.23 (d, 1H, H-5b, J = 13.1 Hz).
13C NMR (D2O) d 74.25 (C-3), 73.86 (C-4), 58.56 (C-2), 51.52 (C-5), 35.65 (C-2').
以下の化合物についても、上記と同様の操作により相当する原料から得ることが可能である。
【００３９】
実施例６
(2S,3S,4S)-2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン二塩酸塩(trans-(5))
分子式：C5H14Cl2N2O2
分子量：205.08376
比旋光度：[a]D -9.8° (c 0.95, H2O)
Rf 値： 0.4 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.31 (br s, 1H, H-4), 4.20 (br s, 1H, H-3), 3.77 (ddd, 1H, H-2, J = 2.9, 6.9, 6.9 Hz), 3.57 (dd, 1H, H-5a, J = 4.2, 12.5 Hz), 3.47 (d, 2H, H-2'a and 2'b, J = 6.9 Hz), 3.39 (d, 1H, H-5b, J = 12.5 Hz).
13C NMR (D2O) d 76.65 (C-3), 73.36 (C-4), 62.22 (C-2), 50.61 (C-5), 38.57 (C-2').
【００４０】
実施例７
(2S,3R,4R)-2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン二塩酸塩(ent-cis-(5))
分子式：C5H14Cl2N2O2
分子量：205.08376
比旋光度：[a]D +4.0° (c 0.64, H2O)
Rf 値： 0.4 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.30 (d, 1H, H-4, J = 4.0 Hz), 4.25 (d, 1H, H-3, J = 3.3 Hz), 3.97 (ddd, 1H, H-2, J = 3.3, 6.6, 6.6 Hz), 3.61 (dd, 1H, H-5a, J = 4.0, 13.1 Hz), 3.47 (dd, 1H, H-2'a, J = 6.6, 13.8 Hz), 3.37 (dd, 1H, H-2'b, J = 6.6, 13.8 Hz), 3.23 (d, 1H, H-5b, J = 13.1 Hz).
13C NMR (D2O) d 74.25 (C-3), 73.86 (C-4), 58.56 (C-2), 51.52 (C-5), 35.65 (C-2').  （cis-(5)と一致）
【００４１】
実施例８
(2R,3R,4R)-2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン二塩酸塩(ent-trans-(5))
分子式：C5H14Cl2N2O2
分子量：205.08376
比旋光度：[a]D +9.8° (c 0.95, H2O)
Rf 値： 0.4 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.31 (br s, 1H, H-4), 4.20 (br s, 1H, H-3), 3.77 (ddd, 1H, H-2, J = 2.9, 6.9, 6.9 Hz), 3.57 (dd, 1H, H-5a, J = 4.2, 12.5 Hz), 3.47 (d, 2H, H-2'a and 2'b, J = 6.9 Hz), 3.39 (d, 1H, H-5b, J = 12.5 Hz).
13C NMR (D2O) d 76.65 (C-3), 73.36 (C-4), 62.22 (C-2), 50.61 (C-5), 38.57 (C-2').  （trans-(5)と一致）
【００４２】
実施例９
(2R,3S,4S)-3,4-ジヒドロキシプロリンアミド塩酸塩(cis-(7))の合成
再結晶により精製された純粋な(2R,3S,4S)-1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジン（cis-(3)）(43.5 mg, 0.191 mmol)をメタノール(0.4 ml)に溶かし、炭酸ナトリウム(40.6 mg, 0.831 mmol)と31％過酸化水素水(0.84 ml, 24.6 mmol)を加え、室温にて１時間撹拌した。反応終了後、溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液(ca. 30 ml)にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を乾燥、濃縮すると相当するN-Bocアミド誘導体cis-(6)が高収率で得られた。このN-Bocアミド誘導体をTFA(ca. 0.4 ml)に溶かし、室温にて３時間撹拌した。濃縮すると(2R,3S,4S)-3,4-ジヒドロキシプロリンアミド（cis-(7)）はトリフルオロ酢酸塩が得られる。これは、Sephadex（登録商標） G-15（ファルマシア製）にてゲルろ過(水で溶出)して、さらにDOWEX（登録商標） 50WX-8（ダウケミカル社製）にてイオン交換カラム(1.3N アンモニア水で溶出)することで塩フリーとして単離される。さらに濃縮乾固したのちに1M塩酸を加えて濃縮すると塩酸塩として単離される。（収率：約５８％, de = 100％）
分子式：C5H11ClN2O3
分子量：182.6066
比旋光度：[a]D -4.2° (c 0.54, H2O)
Rf 値： 0.42 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.46 (d, 1H, H-2, J = 4.4 Hz), 4.36 (br d, 1H, H-3, J = 4.0 Hz), 4.25 (dd, 1H, H-4, J = 1.1, 3.5 Hz), 3.48 (dd, 1H, H-5a, J = 3.5, 12.8 Hz), 3.19 (d, 1H, H-5b, J = 12.8 Hz).
13C NMR (D2O) d 167.77, 75.41 (C-3), 74.79 (C-4), 63.35 (C-2), 51.12 (C-5).
以下の化合物についても、上記と同様の操作により相当する原料から得ることが可能である。
【００４３】
実施例１０
(2S,3S,4S)-3,4-ジヒドロキシプロリンアミド塩酸塩（trans-(7)）  ＜L-酒石酸から導かれる2,3-トランス型アミド体＞  
分子式：C5H11ClN2O3
分子量：182.6066
比旋光度：[a]D +0.64° (c 1.0, H2O)
Rf 値： 0.35 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.32 (br s, 1H, H-2), 4.18-4.14 (m, 2H, H-3 and 4), 3.46 (dd, 1H, H-5a, J = 4.0, 12.5 Hz), 3.29 (dd, 1H, H-5b, J = 0.7, 12.5 Hz).
13C NMR (D2O) d 168.56, 78.54 (C-2), 73.95 (C-4), 65.59 (C-3), 50.85 (C-5).
【００４４】
実施例１１
(2S,3R,4R)-3,4-ジヒドロキシプロリンアミド塩酸塩 (ent-cis-(7))   
分子式：C5H11ClN2O3
分子量：182.6066
比旋光度：[a]D +4.2° (c 0.54, H2O)
Rf 値： 0.42 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.46 (d, 1H, H-2, J = 4.4 Hz), 4.36 (br d, 1H, H-3, J = 4.0 Hz), 4.25 (dd, 1H, H-4, J = 1.1, 3.5 Hz), 3.48 (dd, 1H, H-5a, J = 3.5, 12.8 Hz), 3.19 (d, 1H, H-5b, J = 12.8 Hz).
13C NMR (D2O) d 167.77, 75.41 (C-3), 74.79 (C-4), 63.35 (C-2), 51.12 (C-5).  （cis-(7)と一致）
【００４５】
実施例１２
(2R,3R,4R)-3,4-ジヒドロキシプロリンアミド塩酸塩(ent-trans-(7))
分子式：C5H11ClN2O3
分子量：182.6066
比旋光度：[a]D -0.64° (c 1.0, H2O)
Rf 値： 0.35 (n-BuOH : AcOH : H2O = 1 : 1 : 1)
1H NMR (D2O) d 4.32 (br s, 1H, H-2), 4.18-4.14 (m, 2H, H-3 and 4), 3.46 (dd, 1H, H-5a, J = 4.0, 12.5 Hz), 3.29 (dd, 1H, H-5b, J = 0.7, 12.5 Hz).
13C NMR (D2O) d 168.56, 78.54 (C-2), 73.95 (C-4), 65.59 (C-3), 50.85 (C-5).  （trans-(7)と一致）
【００４６】
実施例１３
４種のアミノメチル体と４種のカルバモイル体のグリコシダーゼ阻害活性
市販されている一般的なグリコシダーゼに対する阻害実験を以下のように行なった。合成した各種ピロリジン化合物１４mMを含む基質溶液に、各酵素を添加して、生成するp-ニトロフェノールを４００ｎｍで吸光度測定して定量することにより、基質分解率を求め、各化合物の酵素反応阻害率を決定した。結果を表１および表２に示す。
【００４７】
表１  2-アミノメチル体の各種グリコシダーゼに対する阻害活性
2005239647.tif 000013
NI=活性無し
【００４８】
表２  2-カルバモイル体の各種グリコシダーゼに対する阻害活性
2005239647.tif 000014
NI=活性無し
【００４９】
以上の工程を経て得られた1-tert-ブチルオキシカルボニル-2-シアノ-3,4-ジヒドロキシピロリジンおよび2-置換-3,4-ジヒドロキシピロリジンは、生物活性試験において要求される純度を満足するものであった。また、2-アミノメチル-3,4-ジヒドロキシピロリジン及び2-カルバモイル-3,4-ジヒドロキシピロリジンの各光学異性体は、様々なグリコシダーゼに対し阻害活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の一連の化合物は、種々のグリコシダーゼ阻害剤をはじめとする各種生理活性物質若しくは医薬品として、また官能基変換により様々な生理活性物質類縁体を合成する際の合成中間体として有用である。また、関連する生物学的事象の研究ツールあるいは機能性材料の前駆体としても非常に有用である。