(57)【要約】【課題】光学純度の高い光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルを効率よく製造する方法を提供する。【解決手段】特定のα−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルのラセミ体に、エステル結合を不斉加水分解する能力を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を作用させて（Ｒ）体α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及び（Ｓ）体α−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル結合をR体選択的不斉加水分解する能力を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を、下記一般式（１）で表されるα-メチルアルカンジカルボン酸ジエステルに作用させて、下記一般式（２）で表される（R）体α-メチルアルカンジカルボン酸-ω-モノエステル及び下記一般式（３）で表される（S）体α-メチルアルカンジカルボン酸ジエステルを製造する方法。
【化１】
2005341972.tif 000006
【化２】
2005341972.tif 000007
【化３】
2005341972.tif 000008
【請求項２】
エステル結合をR体選択的不斉加水分解するリパーゼ、プロテアーゼ又はエステラーゼをコードする遺伝子により形質転換された遺伝子操作微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を、下記一般式（１）で表されるα-メチルアルカンジカルボン酸ジエステルのラセミ体に作用させて、下記一般式（２）で表される（R）体α-メチルアルカンジカルボン酸-ω-モノエステル及び下記一般式（３）で表される（S）体α-メチルアルカンジカルボン酸ジエステルを製造する方法。
【化４】
2005341972.tif 000009
【化５】
2005341972.tif 000010
【化６】
2005341972.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の医薬、農薬等の合成中間体となる有用な特定の光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬、農薬等の生理活性物質の合成中間体としての光学活性体の需要が急速に高まっており、様々な手法を用いた光学活性体の合成研究が盛んに行われている。
【０００３】
一般式（２）で表されるα−メチルアルカンジカルボン酸誘導体の中で例えばα−メチルコハク酸モノエステルは、メチルコハク酸ジエステルをアルカリ触媒等により部分加水分解することにより得ることができる。しかしながら、この場合、反応生成物はα−メチルコハク酸、α−メチルコハク酸−１−モノエステル、α−メチルコハク酸−４−モノエステル及びα−メチルコハク酸ジエステルの混合物となるので、目的の生成物を選択的かつ高純度で得ることが困難である。さらに、ラセミ混合物を基質とした場合、このような反応様式では光学分割能は期待できない。
【０００４】
一方、Barnett, Morris, Biochem.J. 40, 451(1946) にはα−メチルコハク酸モノエステルを選択的に合成する方法として一般的に下記反応式（４）に示されるような無水イタコン酸を原料とする方法が開示されている。
【０００５】
【化７】
2005341972.tif 000002
【０００６】
しかし、かかる方法で得られるα−メチルコハク酸モノエステルはラセミ体であり、このような反応様式では光学活性体は得られないという問題がある。
【０００７】
T.Morimoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41(6), 1149 (1993)にはイタコン酸又はイタコン酸ジメチルを不斉還元し、光学活性α−メチルコハク酸又は光学活性α−メチルコハク酸ジメチルを得る方法も報告されているが、高価な不斉触媒を使用しなければならないため、工業的に有利な方法とは言い難い。
【０００８】
一方、Eryka Guibe-Jampel et al., J. Chem. Soc., Chem.Commun.,1080,1987にはα−メチルコハク酸ジエステルを豚膵臓リパーゼで加水分解し、α−メチルコハク酸−１−モノエステルを得る方法が報告されている。しかしながら、この方法で得られるモノエステルの光学純度、位置選択性は高いものの、高価な動物由来の酵素を使用するため、工業的に有利な方法とは言い難い。
【０００９】
又、特開平２−１９５８９０号公報には微生物由来の酵素を用いてα−メチルコハク酸ジエステルを加水分解し、α−メチルコハク酸−４−モノエステルを得る方法が記載されている。この方法では４−モノエステルが９５〜９８％と位置選択性は高いものの、立体選択的な加水分解は殆ど達成されておらず、ラセミ体ジエステルを原料とした場合、生成物の光学純度は１６％ｅ．ｅ．程度にすぎないという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述した如き問題点を有さずに、光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルを高い光学純度で位置選択的に効率よく製造する方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
即ち、本発明は、下記一般式（１）で表されるα−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルのラセミ体に、エステル結合を不斉加水分解する能力を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を作用させて下記一般式（２）で表される（Ｒ）体α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及び下記一般式（３）で表される（Ｓ）体α−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルを製造する方法にある。
【化８】
2005341972.tif 000003
【化９】
2005341972.tif 000004
【化１０】
2005341972.tif 000005
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、光学純度の高い光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルを効率よく製造することが可能である。生成したカルボン酸ジエステルとカルボン酸モノエステルの分離、精製も容易であり、工業的に有利な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、基質として使用可能な上記一般式（１）で表されるα−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルのラセミ体としては、Ｒがメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基又はヘキシル基であり、ｎが１又は２のものが挙げられる。
【００１４】
本発明で用いる微生物は、α−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルのエステル結合を不斉加水分解し、光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルを生産する能力を有するものであれば特に制限はない。代表的なものとしては、シュードモナス(Pseudomonas)属、エセリキア(Escherichia)属に属する微生物が挙げられる。具体的にはシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)MR-2068(FERM BP-3846)、エセリキア・コリ(Escheri-chia coli)MR-2103(FERM BP-3835)が挙げられる。エセリキア・コリ(Escherich-ia coli)MR-2103(FERM BP-3835)は、シュードモナス・プチダ(Pseudomonasput-ida)MR-2068(FERM BP-3846)由来のエステラーゼ遺伝子で形質転換された株である。
【００１５】
本発明で用いる微生物の培養は、液体培地でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル等の成分を適宜配合したものが用いられる。微生物の加水分解能を向上させるため、培地にエステルを少量添加することも可能である。培養は微生物が生育可能である温度、ｐＨで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行うことが好ましい。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行ってもよい。
【００１６】
加水分解反応を行うに際しては、培養の開始時又は途中で培地にエステルを添加してもよく、予め微生物を培養した後、培養液にエステルを添加してもよい。また増殖した微生物の菌体を遠心分離等により採取し、これをエステルを含む反応媒体に加えても良い。菌体は、アセトン、トルエン等で処理した菌体を用いてもよい。
【００１７】
又、菌体の代わりに培養液等の培養物、菌体破砕物、菌体抽出物、粗酵素、精製酵素等の菌体処理物を用いてもよく、更に、酵素又は微生物を適当な担体に固定化し、反応を行った後に回収再利用することも可能である。
【００１８】
ここで、酵素としては微生物由来の各種リパーゼ、プロテアーゼ及びエステラーゼ等が使用可能である。
【００１９】
なお、反応媒体としては例えばイオン交換水、緩衝液が用いられる。反応媒体又は培養液中のエステル濃度としては、０．１〜７０重量％が好ましく、更に好ましくは５〜４０重量％である。メタノール、アセトン、界面活性剤等を反応系に添加することも可能である。反応液のｐＨは、２〜１１、好ましくは５〜８の範囲である。反応が進行するに従い生成したカルボン酸により反応液のｐＨが低下してくるが、この場合は適当な中和剤で最適ｐＨに維持することが望ましい。反応温度は５〜７０℃が好ましく、２０〜６０℃が更に好ましい。
【００２０】
反応終了液より生成物の分離精製は、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル等の有機溶媒による抽出を行い、蒸留あるいはカラムクロマトグラフィーなどの常法を適用することにより、光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸ジエステルを精製、取得することができる。抽出後の水層のｐＨを２以下に下げることにより、その対掌体である光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステルを遊離酸とした後、有機溶媒、例えば酢酸エチルで抽出すれば光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステルを回収することができる。
【００２１】
このようにして得られた光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルは、公知の方法でジエステルまたはジカルボン酸に誘導可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１ 光学活性α−メチルコハク酸モノエステル及びその対掌体ジエステルの製造。
エセリキア・コリ(Escherichia coli)MR-2103(FERM BP-3835)を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）５００ｍｌに植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水で洗浄した後、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液に、ラセミ体−α−メチルコハク酸ジメチル５０ｇを加え、３０℃で２０時間反応させた。この間、反応液のｐＨは、１０％ＮａＯＨ水溶液を用いて７．０に調整した。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、未反応のα−メチルコハク酸ジメチルを酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発除去し、更に蒸留精製し、１９．８ｇの光学活性α−メチルコハク酸ジメチルを得た。この光学活性α−メチルコハク酸ジメチルは、光学分割カラム（キラルセルＯＤ、ダイセル化学工業（株）社製）を用いて光学純度を測定したところ、（Ｓ）体で９９％ｅ．ｅ．であった。次いで水相のｐＨを希硫酸で２．０に下げた後、水相中の酸分を酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発除去し、更に蒸留精製し、１７．２ｇの光学活性α−メチルコハク酸−４−モノエステルを得た。これは、光学分割カラム（キラルセルＯＤ、ダイセル化学工業（株）社製）を用いて光学純度を測定したところ、（Ｒ）体で９６％ｅ．ｅ．であった。また、1Ｈ−ＮＭＲより、得られたモノエステルは４−エステルのみで、１−エステルの混在は認められなかった。
【００２４】
実施例２ 光学活性α−メチルグルタル酸モノエステル及びその対掌体ジエステルの製造。
実施例１で得た菌体懸濁液に、ラセミ体−α−メチルグルタル酸ジメチル５０ｇを加え、３０℃で２０時間反応させた。この間、反応液のｐＨは、１０％ＮａＯＨ水溶液を用いて７．０に調整した。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、未反応のα−メチルグルタル酸ジメチルを酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発除去し、更に蒸留精製し、１８．２ｇの光学活性α−メチルグルタル酸ジメチルを得た。この光学活性α−メチルグルタル酸ジメチルは、tris[3-(heptafluoropropylhydroxymethylene)-(+)-camphorato]-europium(III)を用いて1Ｈ−ＮＭＲスペクトルより光学純度を測定したところ、（Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であった。次いで水相のｐＨを希硫酸で２．０に下げた後、水相中の酸分を酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発除去し、更に蒸留精製し、１８．０ｇの光学活性α−メチルグルタル酸−４−モノエステルを得た。1Ｈ−ＮＭＲより、得られたモノエステルは４−エステルのみで、１−エステルの混在は認められなかった。この光学活性α−メチルグルタル酸−４−モノエステルを常法によりジエステルに導いた後、前記と同様の方法で光学純度をもとめたところ、（Ｒ）体で９６％ｅ．ｅ．であった。