(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞をシート状に培養して細胞へのダメージを抑制して剥離を容易に行える。【解決手段】間葉系幹細胞培養液に濃度２０〜４００μｇ/ｍｌのビタミンＣを添加して培養ディッシュ上で培養する。ビタミンＣを添加して培養することで、コラーゲンの合成が促進されて細胞間の結びつきが強まり、間葉系幹細胞１をシート状に形成する。培養された間葉系幹細胞１をトリプシン等を使用せずにピンセット等で剥離する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞培養液から間葉系幹細胞を培養するようにした間葉系幹細胞の製造方法であって、前記間葉系幹細胞培養液にビタミンＣを２０μｇ/ｍｌ以上の濃度で添加して培養するようにしたことを特徴とする間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記ビタミンＣは４００μｇ/ｍｌ以下の濃度で添加するようにしたことを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項３】
培養された間葉系幹細胞は略シート状に形成されることを特徴とする請求項１または２に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項４】
培養された間葉系幹細胞を物理的手段によって剥離するようにしたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養ディッシュ等で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養するようにした間葉系幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等の様々な細胞に分化する能力をもっている。従来、間葉系幹細胞を培養して再生医療に利用する場合、培養ディッシュで間葉系幹細胞培養液を培養すると、培養ディッシュの任意の複数箇所に分離した状態で間葉系幹細胞が形成される。この細胞を剥離させるに際してピンセット等で剥がそうとすると、ちぎれたり分離したりしてしまうために連続するシート状のものとして取り出すことができない。そのため、一括して取り出すために、培養ディッシュ上に形成された間葉系幹細胞にトリプシンを添加して、剥離させている。
そして培養ディッシュから取り出して集めた間葉系幹細胞を支持体に播種して分化をかけるか、またはこの間葉系幹細胞を他の細胞に分化誘導してからトリプシンで剥がして支持体に播種するようにしている。
また、間葉系幹細胞の製造方法として下記特許文献１に記載の方法が提案されている。この方法では、細胞培養培地としてグルコース、ミネラル、ビタミン、成長因子及びＬ−グルタミンを含み、しかもＬ−グルタミンが３００ｍｇ/Ｌ以上の濃度で存在するものを用い、この培地内でヒト細胞を培養することで細胞の増殖及び/または分化の速度を増加させることができるとしている。
【０００３】
しかしながら、特許文献１は培地にグルコース、ミネラル、ビタミン、成長因子及びＬ−グルタミンを含むことで細胞の増殖や分化の速度を増加させるという発明であり、培養した間葉系幹細胞をシート状に形成したり、剥離性を向上させるというものではなかった。
他方、先行文献である特願２００２−８４２５２出願では、間葉系幹細胞を温度応答性培養皿で培養して培養細胞シートとして剥離させ、この間葉系幹細胞の培養細胞シートをフィブリン糊等の接着剤を介して生分解性シートに接着してシート状に形成している。そして、この生分解性シートに接合した培養細胞シートを生体に接触させて目的の細胞に分化させるようにしている。
【特許文献１】特表２００３−５１８３７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、トリプシンを用いた間葉系幹細胞の剥離方法は、トリプシンを添加して無理矢理剥がすことになるために、細胞へのダメージが大きいという欠点があった。また、特許文献１は、培養した間葉系幹細胞をシート状に形成したり剥離性を向上させるという技術については全く記載されていない。更に上述の先行文献では、間葉系幹細胞をシート状に剥離するために培養ディッシュとして温度応答性培養皿を使用しなければならず、しかもシートとして生体に使用するためにはコラーゲン等からなる生分解性シートに接着して一体化するという煩雑な作業を必要としていた。
本発明は、このような実情に鑑みて、細胞へのダメージを抑制して培養後の剥離を容易に行えるようにした間葉系幹細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明による間葉系幹細胞の製造方法は、間葉系幹細胞培養液から間葉系幹細胞を培養するようにした間葉系幹細胞の製造方法であって、間葉系幹細胞培養液にビタミンＣを２０μｇ/ｍｌ以上の濃度で添加して培養するようにしたことを特徴とする。
本発明によれば、間葉系幹細胞培養液に濃度２０μｇ/ｍｌ以上のビタミンＣを添加して培養することで、コラーゲンの合成が促進されて細胞間の結びつきが強められて蓄積されるために細胞が三次元方向に成長してシート状に形成される。そのため、培養された間葉系幹細胞をトリプシン等を使用せずにシート状に結合された状態で培養ディッシュ等から剥離させて回収することができる。しかも、培養された間葉系幹細胞は剥離の際にトリプシン等を使用しないために細胞へのダメージを抑制でき、細胞間の結びつきが強いために生分解性シートを接着したり支持体に播種しなくても生体に適用できる。
【０００６】
ビタミンＣは４００μｇ/ｍｌ以下の濃度で添加するのが好ましい。
ビタミンＣを４００μｇ/ｍｌ以下の濃度で添加することで、細胞に毒性が生じる等を防止してシート状の間葉系幹細胞を確実に生成でき、濃度が４００μｇ/ｍｌを越えると細胞に毒性が生じ、細胞の機能を破壊するおそれがある等の不具合が起こる。
また、培養された間葉系幹細胞は略シート状に形成される。
コラーゲンの合成が促進されて細胞間の結びつきが強いために細胞がシート状に形成され、一体に剥がし易い。しかも、そのまま生体に移植することもでき、従来のように支持体に播種して分化をかけたりする必要がないために移植の安全性が向上する。
また、培養された間葉系幹細胞を物理的手段によって剥離するようにしてもよい。
培養された間葉系幹細胞は細胞間の結びつきの強いシート状に形成されるために、トリプシン等を使用しなくてもピンセット等の物理的手段で剥がすことができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明による間葉系幹細胞は、培養して形成された間葉系幹細胞の細胞間の結びつきが強く、トリプシン酵素を用いずにピンセット等の物理的手段で剥離することができると共に、支持体等を使って培養することなくそのまま生体に移植できる。加えて、ビタミンＣによる抗酸化作用によって細胞の保存安定性が増大する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態による間葉系幹細胞の製造方法を図１及び図２により説明する。
図１は本実施の形態による間葉系幹細胞１を示すもので、培養されてシート状に形成された培養細胞シート１ａを構成している。この培養細胞シート１ａは例えば単層のものでって、厚み約５〜５０μｍ程度とされている。培養細胞シート１ａの表面には細胞外マトリックス２が接着状態で配置されている。細胞外マトリックス２は、例えば培養の間に合成されたものであって、細胞膜表面に発現した受容体を介して細胞に接着状態に配設されている。
【０００９】
次に、このような間葉系幹細胞１の培養細胞シート１ａの製造方法を図２に基づいて説明する。この製造方法は、間葉系幹細胞培養液にビタミンＣを添加する添加工程と、間葉系幹細胞培養液を所定の培養温度で例えば培養ディッシュ３上でシート状に培養する培養工程と、シート状に形成された間葉系幹細胞１をピンセットを使用して剥離する剥離工程とを備えている。
先ず添加工程において、間葉系幹細胞培養液にビタミンＣを添加する。添加するビタミンＣの濃度は２０〜４００μｇ/ｍｌの範囲とする。この範囲内であれば、間葉系幹細胞培養液を培養ディッシュの上に沈着させてコラーゲンの合成を促進してシート状の細胞を形成することができる。しかも剥離に際して、培養した間葉系幹細胞１細胞間の結びつきが強いためにトリプシンを使用することなく、ピンセット等の物理的手段で容易に剥離することができる。
一方、添加するビタミンＣが濃度２０μｇ/ｍｌ未満であると、間葉系幹細胞の沈着はできるもののコラーゲンの合成が十分できないためにシート状に形成されにくい。また濃度４００μｇ/ｍｌを越えると、間葉系幹細胞をシート状には形成できるものの、細胞にわずかな毒性が生じ、細胞を破壊するおそれがある等のために好ましくない。ビタミンＣの添加量は、好ましくは５０〜１００μｇ/ｍｌとする。
また、間葉系幹細胞１の成長因子として、例えば塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を間葉系幹細胞培養液に１〜１００ｎｇ/ｍｌ添加する。これによって細胞の成長が早くなる。
【００１０】
そして、培養工程において、培養ディッシュ３の上に、上述したビタミンＣや塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を所要量だけ添加した間葉系幹細胞培養液を載せて、例えば人間の体温に近い３７℃程度の培養温度に維持し、２週間以上培養する。これによって、間葉系幹細胞１を培養ディッシュ３の表面に沈着させる。しかも、間葉系幹細胞培養液にビタミンＣを添加して培養することで、コラーゲンの合成が促進されて細胞の活性が強まり細胞間の結びつきが強められる。そして間葉系幹細胞１が培養ディッシュ３に蓄積されるために細胞が三次元方向に形成される。２週間以上に亘って長期に培養することでシート状に形成される。
このとき、間葉系幹細胞１は、培養の間に細胞外マトリックス２を合成・分泌・沈着して、細胞外マトリックス３は培養ディッシュ３表面と間葉系幹細胞１の層との間に配置される。このようにして、間葉系幹細胞１は、図２（ａ）に示すように、シート状に連続して形成されて培養細胞シート１ａを形成する。
そしてシート状の間葉系幹細胞１の回収に際し、図２（ｂ）に示すように、シート状の間葉系幹細胞１をピンセットで把持して引き剥がすと細胞はコラーゲンの合成促進によって細胞間の結びつきが強いために、培養ディッシュ３から細胞外マトリックス２が剥がれてシート状として剥離できる。
【００１１】
このようにして得られた間葉系幹細胞１の培養細胞シート１ａに分化誘導をかけると、そのまま例えば、培養骨シート、培養脂肪シート、培養軟骨シート、培養血管シート、真皮などになる。そのため、従来のように培養された間葉系幹細胞１を支持体に播種して培養するのと違って、支持体に播種することなくそのまま生体の疾患部位等に移植することができる。そして、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の自身のシグナルで目的の細胞に分化できる。しかもこの間葉系幹細胞１はビタミンＣを含むためにその抗酸化作用により細胞の保存安定性が増す。
また、間葉系幹細胞１を顆粒担体と一緒に使用する場合、間葉系幹細胞１の培養細胞シート１ａで顆粒担体を包むことによりそのまま生体に移植する等の適用を行え、煩雑な播種作業を省略できる。
【００１２】
上述のように本実施の形態によれば、間葉系幹細胞１を細胞間の結びつきが強いシート状に形成することで、トリプシンや温度感応性培養皿等を用いることなく、細胞を傷めずにピンセット等の物理的手段によって培養ディッシュ３から剥離することができる。しかも、支持体に播種したり生分解性シート等に接着することもなく、そのまま生体に移植できると共にビタミンＣの抗酸化作用により細胞の保存安定性が増大する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施の形態による間葉系幹細胞の製造方法で得られたシート状の間葉系幹細胞の縦断面図である。
【図２】（ａ）、（ｂ）は図１に示すシート状の間葉系幹細胞を培養ディッシュから剥離する工程を示す断面図である。
【符号の説明】
【００１４】
１  間葉系幹細胞
１ａ  細胞培養シート
【図１】
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【図２】
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