(57)【要約】【課題】蛍光タンパクにより標識した標本を励起することができ、これにより得られる蛍光偏光により標本の多様な機能解析を可能にした共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】偏光成分を有するレーザ光を発するレーザ光源１、レーザ光を偏向走査する走査光学ユニット４、偏向走査されたレーザ光が標本１０に励起光として照射させる対物レンズ８、励起光により励起された標本１０から発せられる偏光成分を有する蛍光より必要な波長域を検出するダイクロイックミラー３、ダイクロイックミラー３により検出された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光板１１、抽出された蛍光波長を選択するバリアフィルタ１２、この選択された蛍光を検出するホトマル１５を具備している。【選択図】      図１
2005099662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
偏光成分を有する光を発する光源手段と、
前記偏光成分を有する光を偏向走査する光走査手段と、
前記光走査手段により偏向走査された前記偏光成分を有する光を標本に励起光として照射させる対物レンズと、
前記偏光成分を有する光により励起された標本から発せられる偏光成分を有する蛍光より必要な波長域を検出する波長分割手段と、
前記波長分割手段により検出された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段、該偏光特性抽出手段で抽出された蛍光の波長を選択する波長選択手段および該波長選択手段で選択された蛍光を検出する光検出器を有する光検出手段と
を具備したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記光源手段は、偏光成分を有する光の偏光方向を可変する偏光方向可変手段を有することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記偏光方向可変手段は、前記光源手段全体を該光源手段より発せられる光の光軸を中心に回転させることを特徴とする請求項２記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
さらに前記光源手段から発せられる偏光成分を有する光を伝送する光ファイバを有し、前記偏光方向可変手段は、前記光ファイバに設けられることを特徴とする請求項２記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記偏光方向可変手段は、前記光ファイバの出力端を回転可能にした回転機構を有することを特徴とする請求項４記載の共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記標本上の各部位の既知の情報により前記偏光方向可変手段の偏光方向を制御可能にした制御手段を備えたことを特徴とする請求項２乃至５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
【請求項７】
前記光検出手段は、前記標本から発せられる蛍光のｓ偏光成分とｐ偏光成分を各別に検出する２個の光検出手段からなり、さらに、これら光検出手段より検出されるｓ偏光成分とｐ偏光成分のそれぞれの蛍光強度の時間変化に基づいて回転緩和時間と蛍光寿命を演算する演算手段を有することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項８】
前記光源手段は、複数の光源を有し、それぞれの光源は、偏光成分を有する光の偏光方向を可変する偏光方向可変手段を有することを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項９】
偏光成分を有する光を発する光源手段と、
前記偏光成分を有する光を標本に集光させる対物レンズと、
複数のピンホールまたはスリットを有し、前記光源手段からの光を前記対物レンズに導くとともに、前記標本から発せられる蛍光像が前記対物レンズを介して投影される回転ディスクと、
前記回転ディスクを透過した像より必要な波長域の蛍光を検出する波長分割手段と、
前記波長分割手段により検出された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段と、
前記偏光特性抽出手段で抽出された蛍光を撮像する撮像手段と
を具備したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項１０】
前記光源手段は、半導体レーザからなることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素や蛍光タンパクで標識された試料を、励起波長を用いて励起するとともに、試料より発する蛍光を検出する共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡として、多波長蛍光検出の方式を採用した多色共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
この多色共焦点顕微鏡は、２つ以上の蛍光着色剤によって、部位毎に異なって着色されているサンプルに対して、それぞれの蛍光着色剤に対応する波長を有するレーザ光を照射し、これにより励起されて発生する蛍光波長を、これら蛍光波長に対応するダイクロイックミラーなどの波長分離手段を介して検出する。
【０００４】
蛍光色素の偏光の向きを見積もることができる共焦点顕微鏡も知られている。例えば、特許文献２に開示された共焦点顕微鏡は、レーザ光源からのレーザ光を対物レンズを介して試料に照射し、試料からの蛍光を対物レンズを通し、ダイクロイックミラーで２光路に分岐し、これら分岐された光を互いに直交する偏光板を通して蛍光色素の偏光に応じた２つの像を取得する。
【０００５】
ところで、最近、例えば、生きている細胞の目的とするタンパク質を蛍光標識して分布や移動を観察する場合等において、マーカートレーサーとして、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパクを利用することが多くなっている。
【０００６】
このようなＧＦＰにより標識した標本は、非特許文献１に記載されているように偏光特性を有している。これにより、ＧＦＰなどの蛍光タンパクを用いた標本について蛍光偏光を検出することで、タンパク質の分子運動の解析や蛍光寿命などの解析が可能になる。また、光刺激、化学反応、電気刺激、ＰＨ、温度変化などによって、蛍光タンパクの分子構造が変化することにより、その偏光特性が変化する。そのため、蛍光タンパクの偏光特性を解析することで、タンパク質の機能を解析することも可能である。
【特許文献１】特許第２８２４４６２号公報
【特許文献２】特開平８−２５４６５４号公報
【非特許文献１】ＢＩＯＰＨＯＴＯＮＩＣＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｙ，２００２，Ｐ．１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、特許文献１は、一般的な多波長蛍光の検出方法が開示しているだけで、偏光成分を持った蛍光を検出することについて、何ら述べていない。また、特許文献２は、試料からの蛍光を互いに直交する偏光板を通して蛍光色素の偏光に応じた２つの像を取得することを開示しているが、光源として、蛍光を発生させる波長光を発する共焦点顕微鏡を開示しているのみである。そして、特許文献２には、蛍光標識としてＧＦＰなどの蛍光タンパクを用いた場合に、偏光成分を持った蛍光を得るための励起方法などについて、具体的なことは、何ら述べていない。
【０００８】
本発明は、蛍光タンパクにより標識した標本を励起することができ、これにより得られる蛍光により標本の多様な機能解析を可能にした共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一局面に係る発明は、偏光成分を有する光を発する光源手段と、前記偏光成分を有する光を偏向走査する光走査手段と、前記光走査手段により偏向走査された前記偏光成分を有する光を標本に励起光として照射させる対物レンズと、前記偏光成分を有する光により励起された標本から発せられる偏光成分を有する蛍光より必要な波長域を検出する波長分割手段と、前記波長分割手段により検出された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段、該偏光特性抽出手段で抽出された蛍光の波長を選択する波長選択手段および該波長選択手段で選択された蛍光を検出する光検出器を有する光検出手段と
を具備したことを特徴とする。
【００１０】
本発明の他の局面に係る発明は、偏光成分を有する光を発する光源手段と、前記偏光成分を有する光を標本に集光させる対物レンズと、複数のピンホールまたはスリットを有し、前記光源手段からの光を前記対物レンズに導くとともに、前記標本から発せられる蛍光像が前記対物レンズを介して投影される回転ディスクと、前記回転ディスクを透過した像より必要な波長域の蛍光を検出する波長分割手段と、前記波長分割手段により検出された蛍光より所定の偏光特性の蛍光を抽出する偏光特性抽出手段と、前記偏光特性抽出手段で抽出された蛍光を撮像する撮像手段とを具備したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛍光タンパクなどにより標識した標本に対して偏光成分を有するレーザ光を励起光として照射することにより、標本を確実に励起させることができる。また、標本から発生する偏光成分を有する蛍光を波長分割手段、偏光特性抽出手段、波長選択手段を介して検出することにより、このときの検出情報からタンパク質の分子運動の解析や蛍光寿命の解析などを行うことができる。さらに共焦点顕微鏡と組合せることで、細胞内の局所的な偏光蛍光特性の情報も得ることができる。
【００１２】
また、本発明によれば、偏光方向可変手段により標本の偏光方向に合わせてレーザ光の偏光の方向を変えることができるので、標本上の異なる偏光成分を有する蛍光のデータを選択的に取得することができる。
【００１３】
さらに、標本上の各部位の検出情報により偏光方向可変手段の偏光方向を制御可能にすることにより、標本上の各部位の偏光方向に応じた情報を表示させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１５】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される共焦点レーザ走査型顕微鏡の概略構成を示している。
【００１６】
図１において、レーザ光源１は、偏光成分を有するパルス状のレーザ光を発する。
【００１７】
レーザ光源１から出力されるレーザ光の光路上には、偏光板２と、波長分割手段としてのダイクロイックミラー３と、光走査手段としての走査光学ユニット４とが配置されている。
【００１８】
偏光板２は、レーザ光源１の偏光特性（消光比）を改善して最適化を図るために使用され、レーザ光源１とともに、偏光特性を有する光源手段を構成している。ダイクロイックミラー３は、必要な波長域を検出する特性を有しており、レーザ光源１から入射するレーザ光を透過し、走査光学ユニット４側より入射する蛍光を反射（検出）する。走査光学ユニット４は、走査ミラー４ａ、４ｂを有しており、走査ミラー４ａ、４ｂはレーザ光を偏向する。
【００１９】
走査光学ユニット４により偏向されたレーザ光の光路には、リレーレンズ５およびミラー６が配置されている。また、ミラー６の反射光路には、結像レンズ７および対物レンズ８が配置されている。
【００２０】
ミラー６で反射し結像レンズ７を通ったレーザ光は、ステージ９に載置された標本１０に照射する。また、標本１０の断面１０ａ上に照射される光は、走査ミラー４ａ、４ｂの動きにより断面１０ａ上の所定の範囲で走査される。
【００２１】
標本１０には、蛍光標識としてＧＦＰなどの蛍光タンパクが用いられている。標本１０は、焦点位置に集光される偏光成分を有するレーザ光により励起され、偏光方向に一致した蛍光分子の遷移モーメントにあった偏光方向で光を吸収して励起状態となる。この場合、励起状態から失活する蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。
【００２２】
これにより、標本１０から偏光成分を持った蛍光（以下、蛍光偏光）が発生する。この蛍光偏光は、対物レンズ８で光を集められ、結像レンズ７を通過して、ミラー６、リレーレンズ５、走査光学ユニット４を通ってダイクロイックミラー３に入射する。
【００２３】
ダイクロイックミラー３で９０度曲げられた反射光路には、光検出手段を構成する偏光特性抽出手段としての偏光板１１、波長選択手段としてのバリアフィルタ１２、コンフォーカルレンズ１３、共焦点ピンホール１４および光検出器としてホトマル１５が配置されている。
【００２４】
偏光板１１は、所定の偏光特性の蛍光偏光を抽出する。バリアフィルタ１２は、蛍光偏光の波長を選択する。バリアフィルタ１２より選択された蛍光偏光は、コンフォーカルレンズ１３を通って共焦点ピンホール１４面で結像される。また、共焦点ピンホール１４を通過した蛍光偏光は、ホトマル１５で検出される。
【００２５】
この場合、偏光板１１は、コンフォーカルレンズ１３と共焦点ピンホール１４の後でも同じ効果が得られる。また、偏光板１１としては、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）、１／２波長板、偏光ローテーター、液晶シャッター、ポッケルセルなどの偏光方向を検出できればよい。ここで、ＰＢＳの場合は、蛍光偏光を、Ｐ偏光とＳ偏光に分離することができる。１／２波長板の場合は、偏光方向を変えることができるため、バリアフィルタ１２として同じ機能があるＡＯ素子などを用いると、ＡＯの偏光方向に合せて光を入れ、ＡＯによる波長選択をさせることが可能となる。
【００２６】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００２７】
レーザ光源１から偏光成分を有するレーザ光が出射すると、レーザ光偏光特性は、偏光板２で最適化され、ダイクロイックミラー３を透過して走査光学ユニット４に入射する。走査光学ユニット４に入射したレーザ光は、走査ミラー４ａ、４ｂにより偏向される。
【００２８】
走査光学ユニット４で偏向されたレーザ光は、リレーレンズ５、ミラー６を通って結像レンズ７に入射する。結像レンズ７を通ったレーザ光は、ステージ９に載置された標本１０の断面１０ａ上に集光される。
【００２９】
標本１０は、焦点位置に集光される偏光したレーザ光により励起され、偏光方向に一致した蛍光分子の遷移モーメントにあった偏光方向で光を吸収して励起状態となる。この場合、励起状態から失活に伴う蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。
【００３０】
標本１０から発せられた蛍光偏光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ８、結像レンズ７、ミラー６、リレーレンズ５、走査光学ユニット４を通ってダイクロイックミラー３に入射する。
【００３１】
ダイクロイックミラー３で９０度曲げられた蛍光偏光は、偏光板１１に入射する。偏光板１１は、所定の偏光特性の蛍光を抽出してバリアフィルタ１２に導く。バリアフィルタ１２は、蛍光偏光の中の所定の波長のみを選択し、コンフォーカルレンズ１３を通って共焦点ピンホール１４面に結像させる。共焦点ピンホール１４を貫いた蛍光偏光は、ホトマル１５に入射される。ホトマル１５は、入射した蛍光偏光の輝度を検出するとともに、電気信号に変換することにより、偏光蛍光共焦点画像データとして出力する。
【００３２】
従って、このようにすれば、ＧＦＰなどの蛍光タンパクにより標識した標本１０に対して偏光成分を有するレーザ光を励起光として照射することにより、標本１０を確実に励起させることができる。
【００３３】
また、この励起により標本１０から発生する蛍光偏光を、波長分割手段としてのダイクロイックミラー３、偏光特性抽出手段としての偏光板１１、波長選択手段としてのバリアフィルタ１２を介して検出することにより、この蛍光偏光のデータからタンパク質の分子運動の解析や偏光成分に関する蛍光寿命の解析などを行うことができる。この場合、蛍光タンパクは、光刺激、化学反応、電気刺激、ＰＨ、温度変化などによって、分子構造を変化し、偏光特性を変化させることが可能であることから、蛍光タンパクの偏光特性を解析することで、タンパク質の各種の機能を解析することができる。
【００３４】
さらに、ＧＦＰなどの蛍光タンパクを解析するには、細胞内部の特定部位にラベルすることもあるが、このように偏光成分が標本の厚さ方向によって異なる場合は、一般的な顕微鏡では検出したい部位以外の偏光成分も合成されてしまい、このような部位の偏光成分を検出することが困難である。ところが、この実施の形態では、共焦点顕微鏡のセクショニング効果により、サンプルの厚さ方向の特定部位を検出するようにできるので、細胞内の厚さ方向の特定部位の情報も確実に得ることが可能である。
【００３５】
なお、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザを使用した場合、２光子吸収による偏光蛍光画像を取得することができる。この場合の２光子吸収現象は、結像位置のみで発生するので、共焦点ピンホール１４は、理論的に不要になる。また、このとき用いられるダイクロイックミラー３は、ＩＲレーザを透過し、可視蛍光偏光を反射してホトマル１５側に導く短波長反射の特性を有する。
【００３６】
（変形例１）
第１の実施の形態では、標本１０の蛍光偏光を検出する例を述べたが、図２に示す構成により、さらに蛍光寿命の測定を行うことも可能である。図２において、図１と同一部分には同符号を付している。
【００３７】
この場合、ダイクロイックミラー３の反射光路に、光分割手段としてハーフミラー２０が挿入されている。そして、ハーフミラー２０の透過光路に、上述した偏光板１１、バリアフィルタ１２、コンフォーカルレンズ１３、共焦点ピンホール１４およびホトマル１５が配置され、また、反射光路に偏光板２１、バリアフィルタ２２、コンフォーカルレンズ２３、共焦点ピンホール２４およびホトマル２５が配置されている。
【００３８】
ここで、偏光板１１は、蛍光偏光のｓ偏光成分を抽出し、偏光板２１は、ｐ偏光成分を抽出するものとすると、これら偏光板１１、２１で抽出されるｓ偏光成分およびｐ偏光成分のそれぞれの蛍光強度がホトマル１５、２５で検出される。
【００３９】
また、ホトマル１５、２５には、演算手段としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）２６が接続されている。ＰＣ２６は、ホトマル１５、２５で検出されるｓ偏光成分およびｐ偏光成分のそれぞれの蛍光強度に基づいて下式により異方性比ｒ（ｔ）を計算する。
【００４０】
ｒ（ｔ）＝［Ｉｓ（ｔ）−Ｉｐ（ｔ）］／［Ｉｓ（ｔ）＋２・Ｉｐ（ｔ）］  …（１）
ここで、Ｉｓ（ｔ）はｓ偏光成分の蛍光強度、Ｉｐ（ｔ）はｐ偏光成分の蛍光強度である。
【００４１】
異方性比ｒ（ｔ）は、回転緩和時間、揺動拡散速度などと一定の関係があり、異方性比ｒ（ｔ）により分子の様々な動的特性を知ることができる。また、同時に、Ｉｓ（ｔ）＋Ｉｐ（ｔ）を求めれば、その減衰曲線から回転運動とは無関係に蛍光タンパクなどの蛍光寿命も求めることができる。分子、蛍光タンパクの動的特性も蛍光寿命も周囲の様々な条件によって変化するので、これらの情報を同時に測定できれば、生命科学上の重要な解析ツールとなり得る。
【００４２】
（変形例２）
第１の実施の形態では、１個のレーザ光源と１個の光検出部を設けた例を述べたが、図３に示すように、２個のレーザ光源と２個の光検出部を設けるようにもできる。図３において、図１と同一部分には同符号を付している。
【００４３】
変形例２では、レーザ光源１とともに、レーザ光源３１が設けられている。レーザ光源３１は、レーザ光源１と波長の異なる偏光成分を有するレーザ光を発する。
【００４４】
レーザ光源１から出力されるレーザ光の光路上には、偏光板２を介して合成ミラー３２が配置されている。また、レーザ光源３１から出力されるレーザ光の光路上には、偏光板３３を介してミラー３４が配置されている。ミラー３４で反射したレーザ光は、合成ミラー３２に入射する。
【００４５】
合成ミラー３２は、波長特性をもったダイクロイックミラーや偏光特性をもった偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）に置き換えることが可能である。また、ＡＯＴＦなどの音響光学素子などを用いて合成することも可能である。
【００４６】
合成ミラー３２で合成されたレーザ光の光路上には、偏光板３５を介してダイクロイックミラー３および走査光学ユニット４が配置されている。
【００４７】
一方、ダイクロイックミラー３の反射光路には、偏光板３６を介して光分割手段としてハーフミラー３７が挿入されている。そして、ハーフミラー３７の透過光路には、第１の光検出手段４３として、偏光板１１、バリアフィルタ１２、コンフォーカルレンズ１３、共焦点ピンホール１４およびホトマル１５が配置され、また、反射光路には、第２の光検出手段４４として偏光板３８、バリアフィルタ３９、コンフォーカルレンズ４０、共焦点ピンホール４１およびホトマル４２が配置されている。
【００４８】
このようにして、複数のレーザ光源１、３１と光検出手段４３、４４を用意することで、多波長蛍光の標本や、部分的に偏光方向が異なる標本に対応させることが可能になる。
【００４９】
ここで、多波長蛍光の標本の場合は、各蛍光波長に対応させて、レーザ光源１、３１の波長を設定すると共に、光検出手段４３、４４ごとに波長選択手段のバリアフィルタ１２、３９による選択波長を設定することにより対処可能である。また、部分的に偏光方向が異なる標本の場合は、偏光特性の異なるレーザ光源１、３１を用意しておき、標本上の偏光方向が異なる部位毎にレーザ光源１、３１の偏光方向を選択することにより対処可能である。
【００５０】
なお、本変形例では、２個のレーザ光源と２個の光検出手段を設ける例を述べたが、これらレーザ光源および光検出手段は、２個以上の場合であってもよい。
【００５１】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００５２】
図４は、第２の実施の形態の概略構成を示す図であり、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５３】
第２の実施の形態において、レーザ光源１から出力されるレーザ光の光路上には、光ファイバ５１の入力端５１１が配置されている。光ファイバ５１は、レーザ光源１からの偏光成分を有するレーザ光を伝送する。光ファイバ５１として、例えば、偏波面保存ファイバを用いるのが望ましい。
【００５４】
光ファイバ５１の出力端５１２には、偏光方向可変手段として回転機構５２が設けられている。回転機構５２は、光ファイバ５１の出力端５１２を回転可能とする構成になっていて、出力端５１２の回転角度によって、レーザ光の偏向方向を自由に変えられる。つまり、回転機構５２は、標本１０の偏光方向に合わせてレーザ光の偏向方向を変えられる。これにより、回転機構５２を９０度回転させることで、ｓ偏光成分の励起とｐ偏光成分の励起による蛍光偏光のデータを選択的に取得できる。
【００５５】
回転機構５２の前面には、偏光板２が設けられている。この偏光板２は、回転機構５２の回転にあわせて回転可能になっていて、回転機構５２より出射される光の偏光方向と同じ偏光方向になる。
【００５６】
回転機構５２には、制御手段としてコントローラ５３が接続されている。コントローラ５３には、走査光学ユニット４とホトマル１５が接続され、さらに、操作部５４とモニタ５５が接続されている。
【００５７】
コントローラ５３は、操作部５４の操作により回転機構５２を回転制御し、レーザ光の偏向方向を任意に設定できる。また、コントローラ５３は、走査光学ユニット４の走査ミラー４ａ、４ｂの動きに応じた標本１０上の走査情報に基づいて標本１０上の各部位を検出する手段（図示せず）を有していて、ここでの検出情報により回転機構５２を回転制御するとともに、これにより取得されるホトマル１５のデータによって、モニタ５５上に標本１０上の各部位の画像情報を表示させる。
【００５８】
このようにすれば、コントローラ５３により、標本１０の偏光方向に合わせて回転機構５２を回転させ、レーザ光の偏光方向を変えることにより、標本１０上のｓ偏光成分とｐ偏光成分の励起による偏光方向に応じた情報を選択的に取得することができる。
【００５９】
また、標本１０上での偏向方向等の特性が、例えば、図５中のＡ（ｓ偏光）、Ｂ（ｐ偏光）、Ｃ（無偏光）に示すように、各部位で異なることが既知である場合は、走査光学ユニット４の走査ミラー４ａ、４ｂの動きに応じた標本１０上での走査情報に基づいて、つまり標本１０上のＡ、Ｂ、Ｃの各部位に合わせて回転機構５２を回転させて、レーザ光の偏向方向を変えることにより、モニタ５５上に標本１０上の各部位の画像情報を表示させることができる（図５）。
【００６０】
さらに、ここでは、レーザ光源１から出力されるレーザ光を光ファイバ５１を用いて回転機構５２に導入することで、回転機構５２の回転する部分をコンパクトにできる。この場合、光ファイバ５１の入力端５１１側で、波長の異なる光や偏光方向の異なるレーザ光を合成して導入すれば、多数のレーザ光を一つの回転機構５２で偏光方向を変えることができる。
【００６１】
なお、第２の実施の形態では、レーザ光の偏向方向を変える方法として、回転機構５２というメカ的な構成を採用したが、偏光方向を変えることができれば、これ以外の方法でもよく、例えば、光学式の偏光ローテータを使用する方法や、光源にランダム偏光のレーザを使用して、このランダムな光から１／４波長板と偏光板を組み合わせて任意の偏光成分を抜き出して使用することも可能である。この場合は、１／２波長板などを組み合わせることでｐ偏光とｓ偏光に変えることも可能である。さらには、レーザ光源１全体を光軸を中心に回転させるようにしても、レーザ光の偏向方向を変えることができる。
【００６２】
（変形例）
第２の実施の形態では、１個のレーザ光源と１個の光検出手段を設けた例を述べたが、図４と同一部分には同符号を付した図６に示すように、２個のレーザ光源と２個の光検出手段を設けるようにもできる。
【００６３】
この場合、レーザ光源１とともに、レーザ光源６０が設けられている。レーザ光源６０は、レーザ光源１と同様に、偏光成分を有するレーザ光を発するものが用いられる。
【００６４】
レーザ光源１から出力されるレーザ光の光路上には、光学式の偏光ローテータ６１を介して合成ミラー６２が配置されている。また、レーザ光源６０から出力されるレーザ光の光路上には、光学式の偏光ローテータ６３を介してミラー６４が配置されている。ここで、偏光ローテータ６１、６３は、レーザ光源１、６０のレーザ光の偏向方向を任意に設定できる。
【００６５】
ミラー６４で反射したレーザ光は、合成ミラー６２に入射する。合成ミラー６２は、波長特性をもったダイクロイックミラーや偏光特性をもった偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）に置き換えることが可能である。また、ＡＯＴＦなどの音響光学素子などを用いて合成することも可能である。
【００６６】
合成ミラー６２で合成されたレーザ光の光路上には、光ファイバ５１の入力端５１１が配置されている。また、光ファイバ５１の出力端５１２側には、偏光板６５を介してダイクロイックミラー３および走査光学ユニット４が配置されている。
【００６７】
一方、ダイクロイックミラー３の反射光路には、偏光板６６を介して光分割手段としてハーフミラー６７が挿入されている。そして、ハーフミラー６７の透過光路には、第１の光検出手段７３として、偏光板１１、バリアフィルタ１２、コンフォーカルレンズ１３、共焦点ピンホール１４およびホトマル１５が配置され、また、反射光路には、第２の光検出手段７４として偏光板６８、バリアフィルタ６９、コンフォーカルレンズ７０、共焦点ピンホール７１およびホトマル７２が配置されている。
【００６８】
このように、レーザ光源１、６０について、それぞれの偏光ローテータ６１、６３を操作することにより、レーザ光の偏向方向を各別に設定することができる。つまり、偏光ローテータ６１を操作してレーザ光源１のレーザ光をｓ偏光に、偏光ローテータ６３を操作してレーザ光源６０のレーザ光をｐ偏光に設定することが可能となり、これらｓ偏光とｐ偏光のレーザ光を合成したものを励起光として標本１０に与えることができる。勿論、偏光ローテータ６１を操作してレーザ光源１のレーザ光をｐ偏光に、偏光ローテータ６３を操作してレーザ光源６０のレーザ光をｓ偏光に設定することも可能である。
【００６９】
これにより、標本１０の各部位で偏向方向が異なる場合も、これら偏光方向の違いに合わせて、レーザ光源１、６０のレーザ光の偏光方向を最適な状態に設定することができる。この場合、偏光板６５は、光路から退避させるか同期して回転させる。
【００７０】
また、２個のレーザ光源１、６０を用いる場合、異なった蛍光波長を励起するためレーザ光の波長が異なっている場合と、レーザ光の波長が同じで偏光方向が異なる場合に適用できる。このうちレーザ光の波長が異なっている場合は、標本１０の蛍光波長に対するレーザ光を選択して用いれば、多波長の蛍光標本に対応させることが可能である。また、レーザ光の波長が同じで偏光方向が異なる場合は、偏光ローテータ６１、６３により偏光方向を変えることで、蛍光波長ごとに偏光特性が異なる標本１０に対応させることができる。
【００７１】
なお、上述では、２個のレーザ光源と２個の光検出手段を設ける例を述べたが、これらレーザ光源および光検出手段は、２個以上の場合であってもよい。
【００７２】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００７３】
上述した第１および第２の実施の形態では、レーザ光をスポットで集光して、走査する共焦点レーザ走査型顕微鏡についで述べたが、共焦点顕微鏡には、その他にも方式があり、同様な効果を得ることが可能である。
【００７４】
図７は、第３の実施の形態の概略構成を示す。
【００７５】
図７において、光源８１から出射される光は、コリメータレンズ８２で平行光となって偏光板８３に入射する。偏光板８３は、光源８１の光を偏光特性を有する光に変換する。偏光板８３は、光源８１とともに、偏光特性を有する光源手段を構成している。
【００７６】
偏光板８３に入射した光は、偏光特性を持った光に変換され、波長分割素子８４で、励起波長幅のものが選択される。ここで、波長分割素子８４には、ダイクロイックミラーやＡＯＭなどが用いられる。
【００７７】
波長分割素子８４で、選択された光は、回転ディスク８５を通り、結像レンズ８６、対物レンズ８７を介して標本８８面の焦点位置に励起光として入射する。
【００７８】
回転ディスク８５は、対物レンズ８７のエアリー径もしくはエアリー径×０．５程度の大きさのピンホールやスリットなどの光を規制する機能を有する。回転ディスク８５は、対物レンズ８７と光学的に共役な位置である焦点面に配置されるとともに、回転軸８５１を介して図示しないモータの軸に連結され、一定の回転速度で回転する。
【００７９】
標本８８は、励起光により偏光成分を持った蛍光を発生し、対物レンズ８７を介し、結像レンズ８６により回転ディスク８５上に蛍光像を投影する。投影された像のうち焦点の合っている部分は、ピンホールやスリットを通過して共焦点効果を得て、さらに波長分割素子８４を透過し、偏光板８９で偏光成分が選択されたのち、結像レンズ９０を介して撮像手段としてのＣＣＤカメラ９１で撮像される。
【００８０】
このように構成した共焦点顕微鏡によっても、上述した共焦点レーザ走査型顕微鏡と同じ効果を得ることが可能である。また、このような共焦点顕微鏡では、光源８１に、白色光源やＬＥＤあるいはレーザ光源などを使用することが可能であり、レーザ光源を使用した場合は、偏光成分をもったレーザ光源を使用することで、偏光板８３を省略することが可能である。
【００８１】
（第４の実施の形態）
次に、本発明の第４の実施の形態を説明する。
【００８２】
第４の実施の形態は、本発明をさらに具体的に説明するための図で、図８は、第４の実施の形態が適用される共焦点レーザ走査型顕微鏡の概略構成を示している。
【００８３】
図８において、レーザ光源１０１は、偏光成分を有するパルス状のレーザ光を励起光として発生する。この場合、レーザ光源１０１には、小型で、しかもレーザ光のオンオフが容易な半導体レーザが用いられている。
【００８４】
レーザ光源１０１からのレーザ光の光路上には、コンデンサレンズ１０２、偏光板としてのポラライザ１０３およびダイクロイックミラー１０４が配置されている。
【００８５】
コンデンサレンズ１０２は、レーザ光源１０１からの励起光を最適な直径にコリメートする。ポラライザ１０３は、レーザ光源１の偏光特性（消光比）を改善して最適化を図るための。ダイクロイックミラー１０４は、必要な波長域を検出する特性を有する。ダイクロイックミラー１０４は、レーザ光源１０１から入射するレーザ光を反射し、後述する走査光学ユニット１０５側より入射する蛍光を透過（検出）する。なお、ダイクロイックミラー１０４は、励起光の波長や後述する標本１１０が発する蛍光の波長が必要に応じて変えられると、対応する特性のものに変更できるように着脱可能になっている。
【００８６】
ダイクロイックミラー１０４の反射光路には、走査光学ユニット１０５が配置されている。走査光学ユニット１０５は、走査ミラー１０５ａ、１０５ｂを有し、これら走査ミラー１０５ａ、１０５ｂによりレーザ光を偏向する。
【００８７】
走査光学ユニット１０５により偏向されたレーザ光の光路には、瞳投影レンズ１０６およびミラー１０７が配置されている。また、ミラー１０７の反射光路には、結像レンズ１０８および対物レンズ１０９が配置されている。
【００８８】
ミラー１０７で反射し結像レンズ１０８を通ったレーザ光は、走査ミラー１０５ａ、１０５ｂの動きにより対物レンズ１０９の視野全面にわたって走査される。
【００８９】
この場合も標本１１０には、蛍光標識としてＧＦＰなどの蛍光タンパクが用いられている。標本１１０は、焦点位置に集光される偏光成分を有するレーザ光により励起され、偏光方向に一致した蛍光分子の遷移モーメントにあった偏光方向で光を吸収して励起状態となる。この場合、励起状態から失活する蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。
【００９０】
これにより、標本１１０から偏光成分を持った蛍光（以下、「蛍光偏光」と称する）が発生し、この蛍光偏光は、対物レンズ１０９で光を集められ、結像レンズ１０８を通過して、ミラー１０７、瞳投影レンズ１０６、走査光学ユニット１０５を通ってダイクロイックミラー１０４に入射する。ダイクロイックミラー１０４は、蛍光偏光と励起光が混在した戻り光を分離し、蛍光偏光を透過する。
【００９１】
ダイクロイックミラー１０４の透過光路には、集光レンズ１１１、共焦点ピンホール１１２が配置されている。集光レンズ１１１は、標本１１０の一点から発せられた蛍光偏光を共焦点ピンホール１１２上に結像する。共焦点ピンホール１１２は、対物レンズ１０９の焦点と光学的に共役な位置に配置され、標本１１０からの蛍光偏光のうち合焦の成分を通過させるが、非合焦の成分を透過できない。この場合、共焦点ピンホール１１２の大きさは、共焦点効果が十分に実現されるために、集光レンズ１１１によって形成されるエアリディスクよりも小さいことが必要である。従って、対物レンズ１０９が交換されると、これに応じて異なった大きさのピンホールに変更される機構を持つことが望ましい。具体的には、例えば、異なる大きさのピンホールを有する円板状のターレットを、対物レンズ１０９の切換に用いられるレボルバ（不図示）と同期して回転させるようにすればよい。
【００９２】
共焦点ピンホール１１２を抜けた光の光路上には、偏光ビームスプリッタ１１３が配置されている。偏光ビームスプリッタ１１３は、共焦点ピンホール１１２を抜けた光を直交する２偏光成分、つまりｐ偏光成分とｓ偏光成分に分離する。この場合、偏光ビームスプリッタ１１３は、蛍光波長の種類が非常に多様であるため、できる限り広帯域であることが望ましい。できれば、ダイクロイックミラー１０４と同様に、蛍光の波長が変えられた場合、対応する特性のものに変更できるように着脱可能とするのが望ましい。
【００９３】
偏光ビームスプリッタ１１３より分離された一方の光路には、第１の検出系として、バリアフィルタ１１４ａ、アナライザ１１５ａ、光検出器１１６ａが配置され、また、他方の光路には、第２の検出径として、バリアフィルタ１１４ｂ、アナライザ１１５ｂ、光検出器１１６ｂが配置されている。これら２つの検出系は、ほぼ同等な特性を有している。
【００９４】
ここで、バリアフィルタ１１４ａ、１１４ｂは、ダイクロイックミラー１０４で遮断しきれなかった励起光を完全にカットする。つまり、一般に蛍光の発光効率はそれほど高くなく、特に、パルス光励起によるホトンカウンティングの場合は、蛍光に含まれるレーザ光の漏れの蛍光測定の及ぼす影響が、他の顕微鏡観察と比べて大きいために用いられている。アナライザ１１５ａ、１１５ｂは、偏光ビームスプリッタ１１３を広帯域にしようとすると、透過光、反射光ともに反対方向の不要な偏光成分が混在する割合が大きくなる（１〜５％）ので、正確な測定を実現するために用いられている。光検出器１１６ａ、１１６ｂとして、ホトマルチューブ、アバランシェダイオードなどの高感度で低雑音の検出器が使用されている。
【００９５】
なお、図８では、共焦点ピンホール１１２を抜けた光が大きく広がるように書かれているが、集光レンズ１１１と瞳投影レンズ１０６の焦点距離の比を大きくして、共焦点ピンホール１１２上への結像倍率を上げれば、光検出器１１６ａ、１１６ｂの受光面に対して光の広がりを十分に小さく抑えることができる。勿論、空間的余裕があれば、共焦点ピンホール１１２の像を光検出器１１６ａ、１１６ｂ上に投影する光学系を構成してもよい。
【００９６】
一方、結像レンズ１０８と対物レンズ１０９との間には、ハーフミラー１１６が配置され、反射ミラー１０７と結像レンズ１０８との間には、観察鏡筒１１７が配置されている。
【００９７】
ハーフミラー１１６には、観察照明ユニット１１８からの照明光が入射される。この照明光は、ハーフミラー１１６で反射し、対物レンズ１０９を介して標本１１０に照射され、また、標本１１０からの反射光は、ハーフミラー１１６を透過し、結像レンズ１０８を介して観察鏡筒１１７に入射し、一般の光学顕微鏡として標本像を目視またはＴＶ観察できる。
【００９８】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００９９】
レーザ光源１０１からパルス状のレーザ光が発せられると、レーザ光は、コリメータレンズ１０２でコリメートされ、ポラライザ１０３で偏光特性を最適化された後、ダイクロイックミラー１０４で反射して走査光学ユニット１０５に入射する。
【０１００】
走査光学ユニット１０５に入射したレーザ光は、走査ミラー１０５ａ、１０５ｂにより偏向され、瞳投影レンズ１０６、ミラー１０７を介して結像レンズ１０８に入射する。結像レンズ１０８を透過したレーザ光は、標本１１０に集光する。
【０１０１】
標本１１０は、焦点位置に集光される偏光したレーザ光により励起された状態となる。この場合、励起状態から失活に伴う蛍光も遷移モーメントと一致した偏光となる。
【０１０２】
標本１１０から発せられた蛍光偏光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ１０９、結像レンズ１０８、ミラー１０７、瞳投影レンズ１０６、走査光学ユニット１０５を通ってダイクロイックミラー１０４に入射する。
【０１０３】
ダイクロイックミラー１０４を透過した蛍光偏光は、集光レンズ１１１を通って共焦点ピンホール１１２上に結像される。共焦点ピンホール１１２を貫いた蛍光偏光は、偏光ビームスプリッタ１１３により直交する２偏光成分、つまりｐ偏光成分とｓ偏光成分に分離される。
【０１０４】
偏光ビームスプリッタ１１３で分離された一方の偏光成分の蛍光は、バリアフィルタ１１４ａ、アナライザ１１５ａを介して光検出器１１６ａに入射され、また、他方の偏光成分の蛍光は、バリアフィルタ１１４ｂ、アナライザ１１５ｂを介して光検出器１１６ｂに入射される。光検出器１１６ａ、１１６ｂは、入射した蛍光の輝度を検出するとともに、電気信号に変換し、共焦点画像データとして出力する。
【０１０５】
そして、このようにして取得される標本１１０の各走査点に対応する光検出器１１６ａ、１１６ｂからの出力信号それぞれの偏光成分に対する比または差を考慮すれば、蛍光分子の回転緩和時間の画像を得ることができる。また、これらの和を計算すれば、分子回転の有無に関わらない蛍光寿命画像を得ることができる。さらに、光検出器１１６ａ、１１６ｂで光子数をカウントし、これら光子数の合計を画素ごとに係数すれば、蛍光強度画像を得ることができる。この場合、各画素ごとに照射する励起パルスの数は同一でなければならない。
【０１０６】
なお、このような第４の実施の形態の直交する偏光成分に対する検出信号強度（光子数）は、偏光ビームスプリッタ１１３の透過率、反射率の違い、バリアフィルタ１１４ａ、１１４ｂの透過率の違い、アナライザ１１５ａ、１１５ｂの透過率の違い、光検出器１１６ａ、１１６ｂの感度の違いなどによって微妙に異なることがある。そこで、上述した計算を行う場合は、これらを補正係数として組み込んだ計算を行う必要がある。また、ダイクロイックミラー１０４を適当な波長特性のものに交換し、偏光ビームスプリッタ１１３をハーフミラーに交換し、アナライザ１１５ａ、１１５ｂに代えて異なった波長域のバンドパスフィルタ用いれば、異なる２波長の蛍光強度画像と蛍光寿命画像を同時に得ることができる。
【０１０７】
従って、このようにすれば、標本１１０に対する１回の励起光走査により、共焦点効果による蛍光強度分布の断層像が取得できるとともに、ラベリングされた分子の回転緩和時間像と蛍光寿命像を取得することができる。また、僅かな光学部品を交換するのみで、様々な蛍光波長を発する蛍光による標本上の性質の違いなども観測することができる。
【０１０８】
本発明の実施の形態によれば、蛍光タンパクなどにより標識した標本に対して偏光成分を有するレーザ光を励起光として照射することにより、標本を確実に励起させることができる。また、標本から発生する偏光成分を有する蛍光を波長分割手段、偏光特性抽出手段、波長選択手段を介して検出することにより、このときの検出情報からタンパク質の分子運動の解析や蛍光寿命の解析などを行うことができる。さらに共焦点顕微鏡と組合せることで、細胞内の局所的な偏光蛍光特性の情報も得ることができる。
【０１０９】
また、本発明の実施の形態によれば、偏光方向可変手段により標本の偏光方向に合わせてレーザ光の偏光の方向を変えることができるので、標本上の異なる偏光成分を有する蛍光のデータを選択的に取得することができる。
【０１１０】
さらに、標本上の各部位の検出情報により偏光方向可変手段の偏光方向を制御可能にすることにより、標本上の各部位の偏光方向に応じた情報を表示させることができる。
【０１１１】
本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。
【０１１２】
本発明の実施の形態によれば、蛍光タンパクにより標識した標本を励起することができ、これにより得られる蛍光偏光により標本の多様な機能解析を可能にした共焦点顕微鏡を提供できる。
【０１１３】
また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の変形例１の概略構成を示す図。
【図３】第１の実施の形態の変形例２の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図５】第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図６】第２の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。
【図７】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図８】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
【０１１５】
１．３１、６０…レーザ光源、２…偏光板、３…ダイクロイックミラー、４…走査光学ユニット、４ａ．４ｂ…走査ミラー、５…リレーレンズ、６…ミラー、７…結像レンズ、８…対物レンズ、９…ステージ、１０…標本、１０ａ…断面、１２…バリアフィルタ、１３…コンフォーカルレンズ、１４…共焦点ピンホール、１５…ホトマル、２０…ハーフミラー、２１…偏光板、２２…バリアフィルタ、２３…コンフォーカルレンズ、２４…共焦点ピンホール、２５…ホトマル、２６…ＰＣ、３１…レーザ光源、３２…合成ミラー、３３、３５、３６、３８…偏光板、３４…ミラー、３７…ハーフミラー、３９…バリアフィルタ、４０…コンフォーカルレンズ、４１…共焦点ピンホール、４２…ホトマル、４３…第１の光検出手段、４４…第２の光検出手段部、５１…光ファイバ、５１１…入力端、５１２…出力端、５２…回転機構、５３…コントローラ、５４…操作部、５５…モニタ、６０…レーザ光源、６１．６３…偏光ローテータ、６２…合成ミラー、６４…ミラー、６５、６６…偏光板、６７…ハーフミラー、６８…偏光板、６９…バリアフィルタ、７０…コンフォーカルレンズ、７１…共焦点ピンホール、７２…ホトマル、７３…第１の光検出手段、７４…第２の光検出手段、８１…光源、８２…コリメータレンズ、８３…偏光板、８４…波長分割素子、８５…回転ディスク、８５１…回転軸、８６…結像レンズ、８７…対物レンズ、８８…標本、８９…偏光板、９０…結像レンズ、９１…ＣＣＤカメラ、１０１…レーザ光源、１０２…コリメータレンズ、１０３…ポラライザ、１０４…ダイクロイックミラー、１０５…走査光学ユニット、１０５ａ．１０５ｂ…走査ミラー、１０６…瞳投影レンズ、１０７…反射ミラー、１０８…結像レンズ、１０９…対物レンズ、１１０…標本、１１１…集光レンズ、１１２…共焦点ピンホール、１１３…偏光ビームスプリッタ、１１４ａ．１１４ｂ…バリアフィルタ、１１５ａ．１１５ｂ…アナライザ、１１６ａ．１１６ｂ…光検出器、１１６…ハーフミラー、１１７…観察鏡筒、１１８…観察照明ユニット。
【図１】
2005099662.tif 000003
【図２】
2005099662.tif 000004
【図３】
2005099662.tif 000005
【図４】
2005099662.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
2005099662.tif 000009
【図８】
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