(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞接着性が極めて高い細胞接着性ポリペプチドを提供すること。【解決手段】細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチドであって、Ｙに含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつＹに含まれるグリシン及びアラニンの合計含有割合がＹの全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００％であることを特徴とする細胞接着性ポリペプチドを用いる。ＸはArg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列、ほかに特別に表される配列を、Ｙは（Gly Ala）ａ配列 、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列及び／又は（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列を含むことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチドであって、（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつ（Ｙ）に含まれるグリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の合計含有割合が（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００個数％であることを特徴とする細胞接着性ポリペプチド。
【請求項２】
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列（Ｘ）が、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg Glu配列、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、His Ala Val配列、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）及びTyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg配列（１５６）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）が、（Gly Ala）ａ配列 、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列及び（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する請求項１又は２記載の細胞接着性ポリペプチド。
なお、ａは１〜２５の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは１〜８の整数、ｆは１〜４４の整数、ｆが１の場合ｇは１〜７の整数、ｆが２の場合ｇは１〜６の整数、ｆが３又は４の場合ｇは１〜５の整数、ｆが５又は６の場合ｇは１〜４の整数、ｆが７〜１０の整数の場合ｇは１〜３、ｆが１１〜１９の整数の場合ｇは１又は２、ｆが２０〜４４の整数の場合ｇは１、ｈは１〜１０の整数である。
【請求項４】
最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）数が２〜３０である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項５】
最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）が０．６６−１．５である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項６】
（１１６）〜（１１８）、（１２０）〜（１２２）、（１２４）〜（１５３）及び（１５８）〜（１７２）からなる群より選ばれる配列番号のいずれかで表される細胞接着性ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）及び基材（Ｂ）からなる細胞接着性ポリペプチド含有基材。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着性ポリペプチドに関する。さらに詳しくは、基材等に対する細胞の接着性を向上させる細胞接着性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、天然の細胞接着性ポリペプチドとして、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン及びカドヘリン等のヒト由来の蛋白質（非特許文献１）やフィブロイン等の昆虫由来の蛋白質（非特許文献２）が知られている。また、人工の細胞接着性ポリペプチドとして、プロネクチンＦ｛Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１２）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１０万のポリペプチド、三洋化成工業（株）製｝及びプロネクチンＬ｛Ile Lys Val Ala Val配列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）9配列（１２）とを各々約１３個有し、遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約１０万のポリペプチド、三洋化成工業（株）製｝が知られている（非特許文献３）。
【０００３】
【非特許文献１】病態生理（第９巻、第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年）
【非特許文献２】バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーション（Biochemical and Biophysical Research Communications、Vol.208, No.2, 511-516頁, 1995年）
【非特許文献３】ハンドブック  オブ  バイオデグラダブル  ポリマーズ（アブラハム著，ハーウッド  アカデミック  パブリッシャーズ発行，アムステルダム１９９７（Abraham J. Dombら著, Handbook of Biodegradable Polymers, Harwood Academic Publishers発行, Amsterdam 1997年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の天然の細胞接着性ポリペプチドは、１分子中に保有する細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列の数が少ないため細胞接着性が低いという問題があり、さらにオートクレーブ等に対する熱安定性が悪いという問題点があった。
一方、従来の人工の細胞接着性ポリペプチドは、天然の細胞接着性ポリペプチドと比べて細胞接着性及び熱安定性を向上させることができるが、細胞を無血清培地等の特殊な条件下において細胞接着性が不十分であった。
すなわち、本発明の目的は、細胞接着性が極めて高い細胞接着性ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドを使用することにより上記目的を達成することを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の細胞接着性ポリペプチドの特徴は、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチドであって、補助アミノ酸配列（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数が１〜５０個であり、かつ（Ｙ）に含まれるグリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の合計含有割合が（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて４２〜１００％である点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性が極めて高いため、従来は接着が困難であった細胞（ＮＨＤＦ細胞やＶＥＲＯ細胞等）を基材上に効率良く接着させることができる。また、オートクレーブ等に対する熱安定性が極めて高いため、簡便かつ安全性の高い殺菌ができる。したがって、本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味し、「細胞接着シグナル」とは細胞接着性をもつアミノ酸配列を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。すなわち、細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列とは、細胞接着性最小アミノ酸配列と同意である。
細胞接着シグナルを現わす最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【０００８】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg Glu配列、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、His Ala Val配列、Tyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）及びTyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg配列（１５６）が好ましく、細胞接着性の観点から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）及びTyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg配列（１５６）、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
【０００９】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも２個有すればよいが、細胞接着性の観点から、１分子中に２〜３０個有するものが好ましく、さらに好ましくは３〜２０個、特に好ましくは４〜１０個有するものである。また、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００１０】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）と最小アミノ酸配列（Ｘ）との間に存在するアミノ酸配列であり、補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列であれば制限なく使用できるが、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の結晶性（結晶性が高い方が好ましい）及び細胞接着性等の観点から、（Gly Ala）ａ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列、（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列、（Gly）ｉ、（Ala）ｊ、及び／又は（Gly Gly Ala）ｋ配列を有することが好ましく、さらに好ましくは（Gly Ala）ａ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列、及び／又は（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列及び／又は（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列を有するものである。
なお、ａは１〜２５の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは１〜８の整数、ｆは１〜４４の整数、ｆが１の場合ｇは１〜７の整数、ｆが２の場合ｇは１〜６の整数、ｆが３又は４の場合ｇは１〜５の整数、ｆが５又は６の場合ｇは１〜４の整数、ｆが７〜１０の整数の場合ｇは１〜３、ｆが１１〜１９の整数の場合ｇは１又は２、ｆが２０〜４４の整数の場合ｇは１、ｈは１〜１０の整数、ｉ及びｊは１〜５０の整数、ｋは１〜１６の整数である。
【００１１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、以上の配列の他に、他のアミノ酸（セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等）を含んでいてもよい。
【００１２】
補助アミノ酸配列（Ｙ）に含まれるグリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の合計含有割合（個数％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、４２〜１００が好ましく、さらに好ましくは５０〜９５、特に好ましくは５５〜９０、より特に好ましくは６０〜８５、最も好ましくは６１〜８０である。すなわち、（Gly）及び（Ala）の合計含有割合（個数％）の下限は、（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、４２が好ましく、さらに好ましくは５０、特に好ましくは５５、より特に好ましくは６０、最も好ましくは６１であり、また同様に上限は、１００が好ましく、さらに好ましくは９５、特に好ましくは９０、より特に好ましくは８５、最も好ましくは８０である。この範囲であると、細胞接着性がさらに良好となる。
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Gly／Ala）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜４である。すなわち、この場合、グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の含有個数割合（Gly／Ala）の下限は、０．０３が好ましく、さらに好ましくは０．０８、特に好ましくは０．２であり、また同様に上限は、４０が好ましく、さらに好ましくは１３、特に好ましくは４である。
【００１３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）に含まれる全アミノ酸個数（個）は、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは５〜４７、特に好ましくは１０〜４３、最も好ましくは１５〜４０である。この範囲であると、細胞接着性がさらに良好となる。
なお、補助アミノ酸配列（Ｙ）に含まれる全アミノ酸数がこの範囲を越えるか、Gly及びAlaの合計含有割合がこの範囲未満であると、細胞接着性が悪化する傾向がある。
【００１４】
（Gly Ala）ａ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１３）〜（２３）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２４）〜（２８）、（１１５）及び（１５７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２９）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３９）〜（４３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４４）〜（７４）及び（１２３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（７５）〜（８１）及び（１１９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）ｉ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（８２）〜（９４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）ｊ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（９５）〜（１０７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）ｋ配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１０８）〜（１１４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
これらの配列番号のうち、（１６）〜（２８）、（３０）〜（３３）、（３５）〜（３８）、（４０）〜（４３）、（４７）〜（６５）、（７０）〜（７１）、（７５）〜（７８）、（９３）〜（９４）、（１０６）〜（１０７）、（１１１）〜（１１５）、（１１９）、（１２３）及び（１５７）が好ましく、さらに好ましくは（２４）〜（２８）、（４７）〜（６５）、（７０）〜（７１）、（７５）〜（７８）、（１１５）、（１１９）、（１２３）及び（１５７）、特に好ましくは（２４）〜（２８）、（１１５）、（１１９）、（１２３）及び（１５７）である。
【００１５】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造を有すれば、一部に分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよいが、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００１６】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であれば、（Ｘ）と（Ｙ）とが直接化学結合していてもよく、他のアミノ酸を介して化学結合していてもよい。また、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有量は、細胞接着性ポリペプチド１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。
【００１７】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）数（個）は、２〜３０が好ましく、さらに好ましくは３〜２０、特に好ましくは４〜１０である。また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ない｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．６６−１．５が好ましく、さらに好ましくは０．９−１．４、特に好ましくは１．０−１．３である。
【００１８】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、３００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜３００，０００、特に好ましくは３，０００〜１００，０００である。すなわち、（Ｐ）の（Ｍｎ）の上限は、１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは３００，０００、特に好ましくは１００，０００であり、また同様に下限は３００が好ましく、さらに好ましくは１，０００、特に好ましくは３，０００である。なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛細胞接着性ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる（以下、同じ）。
【００１９】
好ましい細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がArg Gly Asp配列（ｘ１）の場合
（ｘ１）の５個とSer Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser Thr Gly配列（１１５）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１）（１１６）、（ｘ１）の１０個と（ｙ１）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２）（１１７）、（ｘ１）の１５個と（ｙ１）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３）（１１８）、（ｘ１）の４個とSer Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser Thr Gly 配列（１１９）（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４）（１２０）、（ｘ１）の８個と（ｙ２）の７個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ５）（１２１）、（ｘ１）の１２個と（ｙ２）の１１個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ６）（１２２）、（ｘ１）の５個とSer Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser Thr Gly 配列（１２３）（ｙ３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ７）（１２４）、（ｘ１）の１０個と（ｙ３）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ８）（１２５）、（ｘ１）の１５個と（ｙ３）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ９）（１２６）、（ｘ１）の５個と(Gly Ala)13配列（ｙ４）（２１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１０）（１２７）、（ｘ１）の１０個と（ｙ４）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１１）（１２８）、及び（ｘ１）の１５個と（ｙ４）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１２）（１２９）等。
【００２０】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）（ｘ２）の場合
（ｘ２）の５個とSer Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser Thr Gly配列（１１５）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１３）（１３０）、（ｘ２）の１０個と（ｙ１）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１４）（１３１）、（ｘ２）の１５個と（ｙ１）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１５）（１３２）、（ｘ２）の４個とSer Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser Thr Gly 配列（１１９）（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１６）（１３３）、（ｘ２）の８個と（ｙ２）の７個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１７）（１３４）、（ｘ２）の１２個と（ｙ２）の１１個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１８）（１３５）、（ｘ２）の５個とSer Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser Thr Gly 配列（１２３）（ｙ３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ１９）（１３６）、（ｘ２）の１０個と（ｙ３）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２０）（１３７）、（ｘ２）の１５個と（ｙ３）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２１）（１３８）、（ｘ２）の５個と（Gly Ala）13配列（ｙ４）（２１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２２）（１３９）、（ｘ２）の１０個と（ｙ４）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２３）（１４０）、及び（ｘ２）の１５個と（ｙ４）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２４）（１４１）等。
【００２１】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ３）の場合
（ｘ３）の５個とSer Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser Thr Gly配列（１１５）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２５）（１４２）、（ｘ３）の１０個と（ｙ１）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２６）（１４３）、（ｘ３）の１５個と（ｙ１）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２７）（１４４）、（ｘ３）の４個とSer Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser Thr Gly 配列（１１９）（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２８）（１４５）、（ｘ３）の８個と（ｙ２）の７個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ２９）（１４６）、（ｘ３）の１２個と（ｙ２）の１１個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３０）（１４７）、（ｘ３）の５個とSer Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser Thr Gly 配列（１２３）（ｙ３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３１）（１４８）、（ｘ３）の１０個と（ｙ３）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３２）（１４９）、（ｘ３）の１５個と（ｙ３）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３３）（１５０）、（ｘ３）の５個と(Gly Ala)13配列（ｙ４）（２１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３４）（１５１）、（ｘ３）の１０個と（ｙ４）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３５）（１５２）、及び（ｘ３）の１５個と（ｙ４）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３６）（１５３）等。
【００２２】
（４）最小アミノ酸配列（Ｘ）がTyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg配列（１５６）（ｘ４）の場合
（ｘ４）の５個とSer Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser Thr Gly配列（１１５）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４０）（１５９）、（ｘ４）の１０個と（ｙ１）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４１）（１６０）、（ｘ４）の１５個と（ｙ１）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４２）（１６１）、（ｘ４）の４個とSer Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser Thr Gly 配列（１１９）（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４３）（１６２）、（ｘ４）の８個と（ｙ２）の７個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４４）（１６３）、（ｘ４）の１２個と（ｙ２）の１１個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４５）（１６４）、（ｘ４）の５個とSer Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser Thr Gly 配列（１２３）（ｙ３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４６）（１６５）、（ｘ４）の１０個と（ｙ３）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４７）（１６６）、（ｘ４）の１５個と（ｙ３）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４８）（１６７）、（ｘ４）の５個と(Gly Ala)13配列（ｙ４）（２１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ４９）（１６８）、（ｘ４）の１０個と（ｙ４）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ５０）（１６９）、（ｘ４）の１５個と（ｙ４）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ５１）（１７０）、（ｘ４）の５個とAla Ser（Ala Gly Ser Gly Ala Gly）3 Ala Ser配列（１５７）（ｙ５）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ５２）（１７１）、（ｘ４）の１０個と（ｙ５）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ３９）（１５８）、及び（ｘ４）の１５個と（ｙ５）の１４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するポリペプチド（Ｐ５３）（１７２）等。
【００２３】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）は、通常人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が適用できる。なお、遺伝子組み換え法による場合、組み換え微生物由来の不純物を含むことがあるため、抗ポリペプチド抗体等を用いたアフィニティ精製等によって精製し、ポリペプチドの純度を６０重量％以上にすることが好ましく、さらに好ましくは７０重量％以上、特に好ましくは８０重量％以上にすることである。これらの製造法のうち、細胞接着性ポリペプチドのアミノ酸配列を容易に設計・製造できるという観点から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００２４】
有機合成法による細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）としては、ポリペプチド（Ｐ１０）〜（Ｐ１２）、ポリペプチド（Ｐ２２）〜（Ｐ２４）、ポリペプチド（Ｐ３４）〜（Ｐ３６）、及び（Ｐ４９）〜（Ｐ５１）等が挙げられる。
遺伝子組み換え法による細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）としては、ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ５３）等が挙げられる。
【００２５】
本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）は、基材（Ｂ）とともに細胞接着性ポリペプチド含有基材とすることができる。
基材（Ｂ）の材質としては、細胞や生体に悪影響を及ぼさないものであれば制限無く使用でき、例えば、細胞培養での使用時や細胞の生体への適用時に、培養液や体液に分散、溶解又は吸収され易い材料｛以下、易生分解性材料（Ｎ１）｝、及び細胞培養での使用時や生体への適用時に、培養液や体液に分散、溶解又は吸収され難い材料｛以下、難生分解性材料（Ｎ２）｝が使用できる。また易生分解性材料（Ｎ１）及び難生分解性材料（Ｎ２）を組み合わせて使用することもできる。
【００２６】
易生分解性材料（Ｎ１）としては、天然高分子（Ｎ１Ａ）、合成高分子（Ｎ１Ｂ）及び無機物（Ｎ１Ｃ）等が使用できる。
天然高分子（Ｎ１Ａ）としては、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、エラスチン、キチン、キトサン、フィブリン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、アルブミン、ポリヒドロキシ酪酸、ペクチン、ペクチン酸、ガラクタン、プルラン、アガロース、セルロース、グルテン及びフィブロイン等が挙げられる。
合成高分子（Ｎ１Ｂ）としては、乳酸、ロイシン、グリコール酸、ε−カプロラクトン、ジオキサノン、リンゴ酸、ラクチド及びグリコリドからなる群より選ばれた単量体を必須単量体としてなる（共）重合体（ポリグリコール酸）並びに本発明の細胞接着性ポリペプチドを含まない合成ポリペプチド等が挙げられる。
無機物（Ｎ１Ｃ）としては、炭酸カルシウム及びリン酸カルシウム等が用いられる。
炭酸カルシウムとしては、軽質炭酸カルシウム及び重質炭酸カルシウム等が挙げられる。  リン酸カルシウムとしては、ヒドロキシアパタイト、トリカルシウムフォスフェート及びこれらと他のリン酸カルシウム（モノカルシウムハイドロジェンフォスフェート等）との混合物等が挙げられる。
これらのうち、天然高分子（Ｎ１Ａ）及び合成高分子（Ｎ１Ｂ）が好ましく、さらに好ましくは天然高分子（Ｎ１Ａ）、特に好ましくはコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、フィブリン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、アガロース、セルロース及びフィブロインである。
【００２７】
難生分解性材料（Ｎ２）としては、天然高分子（Ｎ２Ａ）、合成高分子（Ｎ２Ｂ）及び無機物（Ｎ２Ｃ）等が使用できる。
天然高分子（Ｎ２Ａ）としては、天然繊維（綿、毛、麻及び絹等）等が挙げられる。
合成高分子（Ｎ２Ｂ）としては、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン及びこれらの変性物等）、オレフィン共重合体｛エチレン−ビニルアセテート共重合体、エチレン−エチル（メタ）アクリレート共重合体、エチレン−メチル（メタ）アクリレート共重合体及びエチレン−（メタ）アクリル酸共重合体等｝、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、フッ素樹脂、シリコーン樹脂、セルロース、ビスコースレイヨン、キュプラレーヨン、ポリノジック、アセテート、トリアセテート、ポリアクリロニトリル、ビニロン及びビニリデン等が用いられる。
無機物（Ｎ２Ｃ）としては、金属（金、銀、プラチナ、チタン及びニッケル等）及びセラミックス（アルミナ、ジルコニア及び窒化アルミニウム等）等が用いられる。
これらのうち、合成高分子（Ｎ２Ｂ）と無機物（Ｎ２Ｃ）が好ましく、さらに好ましくは合成高分子（Ｎ２Ｂ）、特に好ましくは、ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリスチレン及びシリコーン樹脂である。
【００２８】
基材（Ｂ）の形状としては、細胞が接着可能な形状であれば特に制限がなく、一般に用いられるものが使用でき、プレート、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアビーズ及びホローファイバー、シート（フィルム、フォーム（スポンジ）及び布等）及びゲル等のいずれでもよい。
【００２９】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）と基材（Ｂ）は、化学結合（イオン結合、水素結合及び／又は共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって複合化される。細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）と基材（Ｂ）が強固に結合される点で、化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００３０】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）と基材（Ｂ）とを共有結合させる方法としては、＜１＞（Ｐ）のうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる方法；＜２＞（Ｐ）のうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ｂ）のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる方法；＜３＞（Ｐ）のうちヒドロキシル基を有するものと（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる方法；＜４＞（Ｐ）のうちハロゲンを有するものと（Ｂ）のうちヒドロキシル基又はメルカプト基を有するものとを反応させる方法；及び＜５＞（Ｐ）のうちビニル基を有するものと（Ｂ）のうちアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有するものとを反応させる方法等が挙げられる。
【００３１】
これらの反応は公知の方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法等）で行うことができる。具体的には、以下の＜１＞〜＜５＞の通りである。
＜１＞（Ｐ）のうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、（Ｂ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ'−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ'（−ＯＣＯＲが（Ｂ）に由来する部分）｝とした後、これと（Ｐ）のうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとを接触させることによって、（Ｂ）と（Ｐ）とを、アミド結合により化学結合させることができる。
カルボジイミド化合物としては例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００３２】
＜２＞（Ｐ）のうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ｂ）のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、（Ｂ）のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ、Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒが（Ｂ）に由来｝とした後、これと（Ｐ）のうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものとを接触させることによって、（Ｂ）と（Ｐ）とを、Ｎ−Ｃ結合により化学結合させることができる。
カルボニルジイミダゾール化合物としては例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
【００３３】
＜３＞（Ｐ）のうちヒドロキシル基を有するものと（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、（Ｂ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素とした後、これと（Ｐ）のうちヒドロキシル基を有するものとを接触させることによって、（Ｂ）と（Ｐ）とを、エステル結合により化学結合させることができる。
【００３４】
＜４＞（Ｐ）のうちハロゲンを有するものと（Ｂ）のうちヒドロキシル基又はメルカプト基を有するものとを反応させる場合、両者をアルカリ化合物の存在下又は非存在下に混合することによって、（Ｂ）と（Ｐ）とを、エーテル結合又はチオエーテル結合により化学結合させることができる。
アルカリ化合物としては例えば、無機アルカリ化合物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウム等）及び有機アルカリ化合物（ジメチルアミノピリジン、アンモニア、トリエチルアミン、ナトリウムメトキシド及びＤＢＵ（サンアプロ社登録商標）等）等が挙げられる。
【００３５】
＜５＞（Ｐ）のうちビニル基を有するものと（Ｂ）のうちアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、両者をアルカリ化合物の存在下あるいは非存在下に混合しマイケル付加させることによって、（Ｂ）と（Ｐ）とを、Ｃ−Ｎ又はＣ−Ｏ結合により化学結合させることができる。
【００３６】
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）を基材（Ｂ）に、物理吸着、イオン結合及び／又は水素結合させる方法としては、例えば、溶媒等に（Ｐ）と（Ｂ）とを投入し混合して作製する方法等が挙げられる。
溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・糖、酸及び／又は塩基を０．００１〜５０重量％（好ましくは０．０１〜１０重量％）含有する水溶液、水、有機酸及び体液等が使用できる。
【００３７】
無機塩としては、ハロゲン化アルカリ金属塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム及び臭化リチウム等）、ハロゲン化アルカリ土類金属塩（塩化カルシウム及び臭化マグネシウム）、硫酸アルカリ金属塩（硫酸ナトリウム及び硫酸水素カリウム等）、硫酸アルカリ土類金属塩（硫酸マグネシウム及び硫酸カルシウム等）、硫酸重金属塩（硫酸銅及び硫酸鉄等）、リン酸アルカリ金属塩（リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸水素カリウム等）、硝酸アルカリ金属塩（硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム等）、硝酸重金属塩（硝酸鉄及び硝酸銅等）、炭酸アルカリ金属塩（炭酸ナトリウム及び炭酸水素カリウム等）及び過ハロゲン酸アルカリ金属（過塩素酸ナトリウム及び過塩素酸リチウム等）等が使用できる。
有機酸塩としては、炭素数１〜６の有機酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又は重金属塩等が使用でき、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、酢酸カルシウム及び酢酸銅等が挙げられる。
【００３８】
アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等が挙げられる。
ビタミンとしては、コリン、イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ12及びビタミンＣ等が挙げられる。
アルコールとしては、炭素数１〜４のアルコール等が使用でき、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール及びブタノール等が挙げられる。
脂質・糖としては、脂質、単糖、２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。
【００３９】
酸としては、無機酸（鉱酸）及び炭素数１〜６の有機酸等が使用でき、塩酸、燐酸、硫酸、過塩素酸、酢酸、蟻酸、リンゴ酸、フェノール及びカテコール等が挙げられる。
塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜６の有機塩基等が使用でき、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、ジメチルアミノピリジン、ナトリウムメトキシド及びＤＢＵ（サンアプロ社登録商標）、アンモニア、トリエタノールアミン及びトリエチルアミン等が挙げられる。
水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。
有機酸としては、炭素数１〜６のカルボン酸等が使用でき、蟻酸、酢酸、プロピオン酸及びヘキサン酸等が挙げられる。
体液としては、血液、血漿、血清及び尿等が挙げられる。
これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液である。
【００４０】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材中の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の含有量は、基材（Ｂ）の単位面積あたり、０．１ｎｇ／ｃｍ2〜１００ｍｇ／ｃｍ2が好ましく、さらに好ましくは１ｎｇ／ｃｍ2〜１０ｍｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ2〜１ｍｇ／ｃｍ2、最も好ましくは１００ｎｇ／ｃｍ2〜１００μｇ／ｃｍ2である。すなわち、（Ｐ）の含有量の下限は、（Ｂ）の単位面積あたり、０．１ｎｇ／ｃｍ2が好ましく、さらに好ましくは１ｎｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ2、最も好ましくは１００ｎｇ／ｃｍ2であり、また同様に上限は、１００ｍｇ／ｃｍ2が好ましく、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１ｍｇ／ｃｍ2、最も好ましくは１００μｇ／ｃｍ2である。なお、単位面積は、基材（Ｂ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味する。ここで、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の含有量の測定方法は特に限定されないが、免疫学的測定法等が利用でき、例えば、細胞接着性ポリペプチド含有基材の表面の一部（例えば、１ｃｍ×１ｃｍの正方形状）を切り取り、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）と結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体）を反応させ、この反応した酵素標識抗体の酵素量を測定することにより、単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の含有量を測定することができる。また、酵素の代わりにアイソトープ、色素、蛍光物質又は発光物質等を用いて抗体に標識し、酵素量の代わりに放射線量、色素量、蛍光強度又は発光強度等を測定することにより、単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の含有量を測定することもできる。
【００４１】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。これらのうち、滅菌操作が簡便な点で、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌が好ましい。
オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌する場合の加熱温度（℃）としては、４０〜１８０が好ましく、さらに好ましくは６０〜１６０、特に好ましくは８０〜１４０である。すなわち、この場合の加熱温度（℃）の下限は、４０が好ましく、さらに好ましくは６０、特に好ましくは８０であり、また同様に上限は、１８０が好ましく、さらに好ましくは１６０、特に好ましくは１４０である。
オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌する場合の加熱時間としては、１秒〜５０００分が好ましく、さらに好ましくは１０秒〜５００分、特に好ましくは１〜１００分である。すなわち、この場合の加熱時間の下限は、１秒が好ましく、さらに好ましくは１０秒、特に好ましくは１分であり、また同様に上限は、５０００分が好ましく、さらに好ましくは５００分、特に好ましくは１００分である。
オートクレーブ滅菌する場合の槽内圧力（ＭＰａ）としては、０．００２〜５が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１、特に好ましくは０．０５〜０．２である。すなわち、この場合の槽内圧力（ＭＰａ）の下限は、０．００２が好ましく、さらに好ましくは０．０１、特に好ましくは０．０５であり、また同様に上限は、５が好ましく、さらに好ましくは１、特に好ましくは０．２である。
【００４２】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法としては、公知の培養基材の代わりに本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を使用する以外、公知の方法が適用できる。
細胞培養工程としては、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材又は、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材が入った適当な容器（シャーレ、プレート、フラスコ、ビーカー及びファーメンター等）に、細胞（ＣＥ）を縣濁させた培地（ＭＥ）を加えて適当な条件で培養する方法等が挙げられる。
【００４３】
本発明の細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）としては細胞であれば制限がないが、哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞、及び昆虫細胞が適している。
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝実質細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（oval cell、small hepatocyte等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。
【００４４】
哺乳動物由来の株化細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＡＨ１３０細胞、Ｂ９５−８細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＢＳ−Ｃ−１細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｃ−６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｆ９細胞、ＦＬ細胞、ＦＬ５−１細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｇ−３６１細胞、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞、Ｈ４−II−Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ−２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＴＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢ細胞、Ｌ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞、Ｎ１８細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮＧ１０８−１５細胞、ＮＲＫ細胞、ＯＣ１０細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、Ｐ３８８細胞、ＰＡ１２細胞、ＰＡ３１７細胞、ＰＣ−１２細胞、ＰＧ１３細胞、ＱＧＨ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＰＭＩ−１７８８細胞、ＳＧＥ１細胞、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞、ＳＴ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｖ７９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ−３８細胞、ψ２細胞、及びψＣＲＥ細胞等が挙げられる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
【００４５】
昆虫細胞としては、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる｛昆虫バイオ工場（木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、２０００年）。
【００４６】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養方法に用いる培地（ＭＥ）は、特に制限無く一般の細胞培養に用いられるものが利用でき、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＯPTIＰＲＯTMＳＦＭ培地、２９３ＳＦＭII培地、ＣＤ２９３培地、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。
また、これらの培地に血清等を添加したものも利用できる。しかし、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、血清を使用しなくても細胞接着活性が高いため、ウイルス感染など血清由来のバイオハザードが心配される場合は血清を使用しないことが好ましい。
血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれ、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられ、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。
血清を使用する場合、血清の使用量（重量％）は、培地の重量に基づいて、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．３〜３０、特に好ましくは１〜２０である。すなわち、血清の使用量（重量％）の下限は、培地の重量に基づいて、０．１が好ましく、さらに好ましくは０．３、特に好ましくは１であり、また同様に上限は５０が好ましく、さらに好ましくは３０、特に好ましくは２０である。
【００４７】
培地中には、添加剤として必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。
細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０-16〜１０-3が好ましく、さらに好ましくは１０-14〜１０-5、特に好ましくは１０-12〜１０-7である。すなわち、この場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）の下限は、培地の重量に基づいて、１０-16が好ましく、さらに好ましくは１０-14、特に好ましくは１０-12であり、また同様に上限は１０-3が好ましく、さらに好ましくは１０-5、特に好ましくは１０-7である。
【００４８】
これらの培地には、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量（重量％）は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０-6〜１０が好ましく、さらに好ましくは１０-5〜１、特に好ましくは１０-4〜０．１である。すなわち、この場合、抗菌剤の含有量（重量％）の下限は、培地の重量に基づいて、１０-6が好ましく、さらに好ましくは１０-5、特に好ましくは１０-4であり、また同様に上限は１０が好ましく、さらに好ましくは１、特に好ましくは０．１である。
【００４９】
細胞の播取量は、使用する細胞や細胞接着性ポリペプチド含有基材（Ｂ）の種類等によって異なるが、（Ｂ）の表面積１ｃｍ2当り、１０〜１０００万個が好ましく、さらに好ましくは１００〜１００万個、特に好ましくは１０００〜１０万個である。
また、培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては特に制限はないが、培地１ｍＬ当たり、１００〜１億個が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１千万個、特に好ましくは１万〜１００万個である。
【００５０】
培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、２〜３日毎に培地交換しなら培養する条件である。
【００５１】
培養後に細胞を細胞接着性ポリペプチド含有基材から剥離して回収する場合は、＜１＞ＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は、トリプシンやコラゲナーゼ等の蛋白質分解酵素で処理して回収する方法、＜２＞スクレーパー等で掻きとることによって回収する方法、＜３＞細胞接着性ポリペプチド含有基材（Ｂ）及び／又は培地の温度を培養条件の温度より下げることによって回収する方法等が挙げられる。
【００５２】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養で得られる細胞（ＣＥ２）としては、細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）と同じものが挙げられる。なお、細胞（ＣＥ）が分化して、元の細胞（ＣＥ）とは異なる細胞（ＣＥ２）が得られる場合がある。例えば、元の細胞（ＣＥ）が骨髄未分化間葉系幹細胞であって、細胞（ＣＥ２）が骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞等の場合である（ティッシュ・エンジニアリング、上田実 編、財団法人名古屋大学出版会、１９９９年１０月１０日）。
【００５３】
本発明の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に好適である。
研究開発用としては、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替、遺伝子導入、目的物質（細胞、生理活性物質、遺伝子、有害化学物質及び薬効成分等）のスクリーニング及び細胞の精製や機能解析等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産に利用できる。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の治療に利用できる。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）細胞接着性ポリペプチド［Ｐ１］の調製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の５個とSer Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser Thr Gly配列（１１５）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量約２万のThr Ser Thr Gly [Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser Thr Gly]4 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Ala Gly Ala Gly Ser Gly)3 Ala Ser 配列（１１６）のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造した。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（１１６）［Ｐ１］を得た。
【００５５】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］の調製
細胞接着ポリペプチド（Ｐ１）１ｍｇを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１ｍＬに溶解し、さらに、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で２０倍希釈して、Ｐ１溶液Ａ（Ｐ１の濃度：５０μｇ／ｍＬ）を作製した。このＰ１溶液Ａを９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］を作製した（Ｐ１付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００５６】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ｂ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）１ｍｇを蟻酸１ｍＬに溶解し、さらに蟻酸で１０倍希釈して、Ｐ１溶液Ｂ（Ｐ１の濃度：１００μｇ／ｍＬ）を作製した。このＰ１溶液Ｂを９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１６μＬ／穴で投入し、２７±３℃で１２時間放置し、蟻酸が完全に乾いた後、２時間の減圧（１０ｍｍＨｇ）乾燥を行った。乾燥後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ｂ］を作製した（Ｐ１付着量：約５μｇ／ｃｍ2）。
【００５７】
＜実施例２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド［Ｐ５］の調製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の８個とSer Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser Thr Gly 配列（１１９）（ｙ２）の７個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量約３万のThr Ser Thr Gly [Arg Gly Asp Ser Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser Thr Gly ]7 Arg Gly Asp Ser Pro Ala (Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser配列（１２1）のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造した。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（１２１）［Ｐ５］を得た。
【００５８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２Ａ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ５を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２Ａ］を作製した（Ｐ５付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００５９】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２Ｂ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ５を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ｂ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ２Ｂ］を作製した（Ｐ５付着量：約５μｇ／ｃｍ2）。
【００６０】
＜実施例３＞
（１）細胞接着性ポリペプチド［Ｐ７］の調製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の５個とSer Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser Thr Gly 配列（１２３）（ｙ３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量約２万のThr Ser Thr Gly [Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser Thr Gly]4 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ala Ser Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala Ala Ser配列（１２４）のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造した。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（１２４）［Ｐ７］を得た。
【００６１】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３Ａ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ７を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３Ａ］を作製した（Ｐ７付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００６２】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３Ｂ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ７を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ｂ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ３Ｂ］を作製した（Ｐ７付着量：約５μｇ／ｃｍ2）。
【００６３】
＜実施例４＞
（１）細胞接着性ポリペプチド［Ｐ３９］の調製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg配列（１５６）（ｘ４）の１０個とAla Ser（Ala Gly Ser Gly Ala Gly）3 Ala Ser配列（１５７）（ｙ５）の９個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量約５万のMet His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met  Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile Gly Ser Ser Arg Met Thr Ser Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Ser (Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg（Ala Ser (Ala Gly Ser Gly Ala Gly）3 Ala Ser））9 Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Ala Ser Met Ser Arg Val Asp Leu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 配列（１５８）のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造した。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（１５８）［Ｐ３９］を得た。
【００６４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４Ａ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ３９を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４Ａ］を作製した（Ｐ３９付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００６５】
＜比較例１＞
（１）細胞接着性ポリペプチド［Ｐ4］の調製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の１４個とSer Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9 Gly Ala Ala Val Thr Gly 配列（１５４）（ｙ５）の１３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量約１０万のMet Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Asp Pro Met Gly Ala Gly Ser (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)6 Gly Ala Ala Val Thr Gly [Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9 Gly Ala Ala Val Thr Gly ]13 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)2 Gly Ala Gly Ala Met Asp Pro Gly Arg Tyr Gln Leu Ser Ala Gly Arg Tyr His Tyr Gln Leu Val Trp Cys Gln Lys配列（１５５）のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造した。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（１５５）［Ｐ３７］を得た。
【００６６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５Ａ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ３７を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５］を作製した（Ｐ３７付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００６７】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４Ｂ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりにＰ３７を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ｂ］の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ４Ｂ］を作製した（Ｐ３７付着量：約５μｇ／ｃｍ2）。
【００６８】
＜比較例２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド［Ｐ５］の調製
ウシ由来コラーゲンタイプＩ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）をオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド［Ｐ３８］を得た。
【００６９】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６Ａ］の調製
３．１５ｍｇ／ｍＬの細胞接着ポリペプチド（Ｐ３８）を０．０１２Ｎの塩酸水溶液で６３倍希釈して、Ｐ３８溶液Ａ（Ｐ３８の濃度：５０μｇ／ｍＬ）を作製した。このＰ３８溶液Ａを９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ６Ａ］を作製した（Ｐ３８付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００７０】
（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５Ｂ］の調製
３．１５ｍｇ／ｍＬの細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３８）を蟻酸で３１．５倍希釈して、Ｐ３８溶液Ｂ（Ｐ３８の濃度：１００μｇ／ｍＬ）を作製した。このＰ３８溶液Ｂを９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１６μＬ／穴で投入し、２７±３℃で１２時間放置し、蟻酸が完全に乾いた後、２時間の減圧（１０ｍｍＨｇ）乾燥を行った。乾燥後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ５Ｂ］を作製した（Ｐ３８付着量：約５μｇ／ｃｍ2）。
【００７１】
＜比較例３＞
（１）基材［Ｈ７Ａ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）を使用しない以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ａ］と同様にして、基材［Ｈ７Ａ］を作製した。
（２）基材［Ｈ６Ｂ］の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）を使用しない以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材［ＰＢ１Ｂ］と同様にして、基材［Ｈ６Ｂ］を作製した。
【００７２】
＜評価１：ＮＨＤＦ細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞）の細胞接着活性＞
（１）ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を評価基材（ＰＢ１Ａ〜ＰＢ６Ａ及びＨ７Ａ）に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、ＤＭＥＭ（ICN Biomedicals社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＮＨＤＦ細胞を１万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中にて１時間放置して培養した。
【００７３】
（２）培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、塩化ナトリウムを０．８５重量％含有するイオン交換水（以下、生理食塩水）を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【００７４】
（３）４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。なお、テトラカラーワンのテトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより還元されて、ホルマザンを生成することにより発色する。
【００７５】
【表１】
2005002106.tif 000002
【００７６】
＜評価２：ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）の細胞接着活性＞
（１）ＰＢＳに牛血清アルブミンを０．２重量％含有する水溶液を評価基材（ＰＢ１Ｂ〜ＰＢ５Ｂ及びＨ６Ｂ）に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、ＤＭＥＭ（ICN Biomedicals社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＶＥＲＯ細胞を１万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中にて１時間放置して培養した。
【００７７】
（２）培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
【００７８】
（３）４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着活性とした。細胞接着活性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【００７９】
【表２】
2005002106.tif 000003
【００８０】
表１及び表２の結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、比較例の細胞接着性ポリペプチドや細胞接着性ポリペプチドを使用しない場合に比べて、細胞接着性が極めて高いことが判る。
【配列表】
2005002106000001.app