(57)【要約】【課題】本発明は各種老化モデル動物の皮膚に由来する遺伝子についてＤＮＡマイクロアレイ解析を行うことで皮膚老化に関与する因子を探索し、皮膚老化の予防及び治療に有効な新規の皮膚老化抑制因子を見出すことを課題とする。【解決手段】本発明はオステオポンチンのそのレセプターに結合する能力を阻害することのできるアンタゴニスト、例えばインテグリンアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として用い、皮膚老化表現形質を改善及び／又は予防する方法、並びにそのような皮膚老化抑制因子を含んで成る医薬又は皮膚外用組成物、さらにはそのような皮膚老化抑制因子のスクリーニング方法に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチンレセプターアンタゴニストを１又は複数種皮膚老化抑制因子として含有する皮膚老化表現形質を改善又は予防するための医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項２】
前記オステオポンチンレセプターがαｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、α９β１インテグリン、又はＣＤ４４である、請求項１記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項３】
前記オステオポンチンレセプターがαｖβ１インテグリン又はαｖβ５インテグリンである、請求項２記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項４】
前記皮膚老化が更年期障害又は加齢を原因とするものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項５】
前記皮膚老化が更年期障害を原因とする、請求項４記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項６】
更に皮膚老化抑制因子としてマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを１又は複数種含有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬又は皮膚外用組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬又は皮膚外用組成物を個体に投与することにより皮膚老化表現形質を改善又は予防する方法を提供する。
【請求項８】
前記投与が皮膚に前記医薬又は皮膚外用組成物を塗布することにより行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
皮膚老化抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物をオステオポンチンの有する対応のレセプターに対する結合力を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するオステオポンチンレセプターアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として選定することを特徴とする方法。
【請求項１０】
更に、前記阻害能力を有するオステオポンチンレセプターアンタゴニストを老化モデル動物に適用し、皮膚老化表現形質の改善・予防効果を有するアンタゴニストを選定することを含んで成る、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記レセプターがαｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、α９β１インテグリン、又はＣＤ４４である、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記オステオポンチンレセプターがαｖβ１インテグリン又はαｖβ５インテグリンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
皮膚老化の進行状態を検査する方法であって、皮膚中のオステオポンチンの発現が正常な皮膚中の発現に比べて亢進していたら、皮膚老化が進行していると判断することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記皮膚老化が更年期障害又は加齢を原因とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記皮膚老化が更年期障害を原因とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記皮膚中のオステオポンチンの発現の亢進が、皮膚中のオステオポンチンの量を測定することにより決定される、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記測定がオステオポンチンに特異的な抗体を利用するＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法による、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記皮膚中のオステオポンチンの発現の亢進が、皮膚から抽出されたオステオポンチンをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定される、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍＲＮＡの測定をポリメラーゼ連鎖反応法により行う、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
オステオポンチンを含有する、皮膚老化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はオステオポンチンのそのレセプターに結合する能力を阻害することのできるアンタゴニスト（以下、「オステオポンチンレセプターアンタゴニスト」と称する場合がある）、例えばインテグリンアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として用い、皮膚老化表現形質を改善及び／又は予防する方法、並びにそのような皮膚老化抑制因子を含んで成る医薬又は皮膚外用組成物、さらにはそのような皮膚老化抑制因子のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚老化は、その要因に基づき、大まかに自然老化、光老化、更年期障害老化に分類することができる。自然老化は文字通り加齢による老化現象であり、一般に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、たるみ、皮脂減少などの表現形質を特徴とする。光老化は紫外線照射を原因する老化現象であり、一般に黄みの増加、角層水分量の減少、しわなどの表現形質を特徴とする。そして、更年期障害老化は閉経を原因とする女性ホルモンのアンバランス化からくる老化現象であり、一般に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、皮脂減少などの表現形質を特徴とする。更年期障害老化の場合、例えばエストラジオール等のホルモン療法を行うことにより皮膚老化表現形質の改善が認められる場合がある。このように、皮膚老化はその原因に応じて表現形質も微妙に変化し、それぞれ異なる複雑なメカニズムを介して進行するものと考えられる。
【０００３】
皮膚の抗老化剤に関する研究開発はかなり行われているが、老化に関するメカニズムは十分に解明されておらず、より効果的な抗老化剤の出現が待ち望まれている。皮膚老化のメカニズムの解明は主にタンパク質レベルで行われており、例えば、マトリックスの主要な成分であるコラーゲンの減少が皮膚のたるみ、はりの低下に関わり、またエラスチンの分解変性がエラスチン分解酵素であるエラスターゼの過剰発現により起こり、弾力性の低下の原因となる等といった事実まで解明されている。その結果、コラーゲンの産生を促進し、コラーゲンの減少を防いだり、エラスターゼの過剰な発現を抑え、エラスチンの破壊、変性を防止することが皮膚の老化防止に重要であることまでは判明されている（特開平１１−３３５２３５号公報）。
【０００４】
しかしながら、このようなタンパク質レベルでの皮膚老化の研究は皮膚老化の表現形質からアプローチしたものであり、これにより皮膚老化をその根本的な原因に応じて抑制、予防する抗老化剤を見つけることはできない。上述のように皮膚老化はその原因に応じて表現形質も異なるため、その種類に応じた効果的な抗老化剤を開発する必要があり、タンパク質レベルの域を越えた、例えば遺伝子レベルでのメカニズムの解明が望まれる。しかるに、皮膚ＲＮＡの採取の困難性等を理由に、遺伝子レベルでのアプローチから皮膚老化現象の解明を図る研究は十分にはされていなかった。
【特許文献１】
特開平１１−３３５２３５号公報
【特許文献２】
特表２００２−５３３４０７号公報
【特許文献３】
特開平６−３２９６９８号公報
【特許文献４】
特開平９−１３２５９３号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は各種老化モデル動物の皮膚に由来する遺伝子についてＤＮＡマイクロアレイ解析を行うことで皮膚老化に関与する因子を探索し、皮膚老化の予防及び治療に有効な新規の皮膚老化抑制因子を見出すことを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は老化モデル動物の皮膚に由来する遺伝子についてＤＮＡマイクロアレイ解析に成功し、皮膚老化に関与する因子を見出すことができた。
【０００７】
本発明者はＤＮＡマイクロアレイ解析の結果、卵巣摘出により更年期障害を人為的に誘導して皮膚老化させたモデルラット（以下「更年期障害モデル」と称する場合がある）及び自然皮膚老化したモデルマウスの皮膚由来の遺伝子群の双方において、オステオポンチン遺伝子及びマトリックスメタロプロテアーゼ−１２（以下、「ＭＭＰ−１２」と称する場合がある）の発現が特異的に亢進されていることを見出した。従って、オステオポンチンのその特異的なレセプター、例えばインテグリンやＣＤ４４への結合を抑えれば、皮膚の老化を治療及び／又は予防できるものと推認される。
【０００８】
オステオポンチンは分子の中央部にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ配列（ＲＧＤ部）をもつ６９ｋＤのリン酸化糖タンパク質であり、そのＲＧＤ部が種々のインテグリンやＣＤ４４といった受容体のリガンドになり、これら受容体を介して種々の細胞の接着に関与することで知られる。また、Ｃａ２＋結合活性やサイトカイン様活性も示し、健常な骨格の維持や感染抵抗性などの生理機能の保持のほか、癌、代謝病、免疫病を含む様々な病態との関連について多くの関心が寄せられている。しかしながら、オステオポンチンと皮膚老化との関係について示唆する論文や研究発表は過去になされていないことから、皮膚老化によりオステオポンチンの発現が亢進されることは極めて驚くべき事実である。
【０００９】
従って、第一の観点において、本発明はオステオポンチンのそのレセプターに結合する能力を阻害することのできるアンタゴニストを１又は複数種皮膚老化抑制因子として含有する皮膚老化表現形質を改善又は予防するための医薬又は皮膚外用組成物を提供する。好ましくは、この皮膚老化は更年期障害及び／又は加齢を原因とするものである。上記組成物は更に皮膚老化抑制因子としてマトリックスメタロプロテアーゼ−１２インヒビターを１又は複数種含有してよい。
【００１０】
第二の観点において、本発明は上記医薬又は皮膚外用組成物を個体、例えばヒトに投与することにより皮膚老化表現形質を改善又は予防する方法を提供する。好適な態様において、この投与は皮膚に当該医薬又は皮膚外用組成物を塗布することにより実施する。
【００１１】
第三の観点において、本発明は、本発明の組成物及び方法に使用するための皮膚老化抑制因子を同定するためのスクリーニング方法も提供する。このスクリーニング方法は、候補化合物をオステオポンチンの有する対応のレセプターに対する結合力を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するオステオポンチンレセプターアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として選定することを特徴とする。好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有るオステオポンチンレセプターアンタゴニストを老化モデル動物に適用し、皮膚老化表現形質の改善・予防効果を有するアンタゴニストを選定することを含んで成る。
【００１２】
第四の観点において、本発明は、皮膚老化の進行状態を検査する方法を提供する。この方法は、皮膚中のオステオポンチンの発現が正常な皮膚中の発現量に比べて亢進していたら、皮膚老化が進行していると判断することを特徴とする。
好適な態様において、上記皮膚中のオステオポンチンの発現の亢進は、皮膚中のオステオポンチンの量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はオステオポンチンに特異的な抗体を利用するＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法により行われる。
別の好適な態様において、上記皮膚中のオステオポンチンの発現の亢進は、皮膚から抽出されたのオステオポンチンをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はポリメラーゼ連鎖反応法により行われる。
【００１３】
第五の観点において、本発明はオステオポンチンを含有する皮膚老化促進剤を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
上述の通り、オステオポンチンは分子の中央部にＲＧＤ部をもつ、種に応じて２６４〜３０１個のアミノ酸から成る６９ｋＤのリン酸化糖タンパク質である。オステオポンチンは炎症性サイトカイン、炎症性マトリックスとも称され、様々な病態の悪性因子として働くものと考えられている。そのレセプターとしては骨細胞に往々にして存在するαｖβ３インテグリン、角化細胞に存在するαｖβ１インテグリン及びαｖβ５インテグリン、他にα４β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、α９β１インテグリン、さらにはヒアルロン酸受容体でもあるＣＤ４４が挙げられる。本発明者は、更年期障害モデルマウス及び加齢マウスの皮膚由来の遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ解析により、更年期障害や加齢によって皮膚細胞内のオステオポンチン遺伝子の発現が亢進することを驚くべきことに見出した。従って、オステオポンチンがそのレセプターに結合することを抑えることで更年期障害や加齢による皮膚老化の進行を抑え、皮膚老化表現形質を改善及び／又は予防できることが推認される。
【００１５】
本発明は上記オステオポンチンレセプターアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として含んで成る医薬又は皮膚外用組成物を提供する。本発明に係る組成物は皮膚老化表現形質、例えば弾性力低下、皮膚（真皮及び表皮）厚の減少、角層水分量減少（乾燥肌）、皮膚色変化（黄み増加、赤み減少）、くすみ、皮膚の炎症、新陳代謝活性低下等を改善・予防することができる。
【００１６】
上記オステオポンチンレセプターアンタゴニストには当業界において様々なものが知られ、例えば限定することなく、特表２００２−５３３４０７号公報記載の以下の化合物が挙げられる。
（３Ｒ）−Ｎ−［［５−（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］−３−ピリジニル］カルボニル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［［１，６−ジヒドロ−６−オキソ−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］−３−ピリジニル］カルボニル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［３−アミノ−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
３Ｒ）−Ｎ−［３−［（ヒドロキシアミノ）カルボニル］−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ）−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［３−［（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
【００１７】
（３Ｒ）−Ｎ−［３−［（アミノイミノメチル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［３−ヒドロキシ−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［３−ヒドロキシ−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［３−ヒドロキシ−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（５−ブロモ−３−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
（３Ｒ）−Ｎ−［３−ヒドロキシ−５−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−５−ヒドロキシ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］グリシル−３−（３−ブロモ−５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−ｂ−アラニン；
ｂ−［３−［［［３−［［４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）アミノ］フェニル］スルフォニル］アミノ］フェニル］−３，５−ジフルオロベンゼンプロパン酸；
３，５−ジフルオロ−ｂ−［３−［［［３−［（１，４，５，６−テトラヒドロ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］アミノ］メチル］フェニル］ベンゼンプロパン酸；
【００１８】
（２Ｅ）−３−［３−エチル−４−［［３−［（１、４、５、６−テトラヒドロ−２−ピリミジニル）アミノ］ベンゾイル］アミノ］フェニル］−２−プロペン酸；
（２Ｅ）−３−［３−［２−［３−［（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）アミノ］フェニル］−２−オキソエトキシ］フェニル］−２−プロペン酸；
（１０Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［３−（２−ピリジニルアミノ）プロポキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸；
（２Ｓ）−７−［［（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イルメチル）メチルアミノ］カルボニル］−２，３，４，５−テトラヒドロ−４−メチル−３−オキソ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸；
（２Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−４−メチル−７−［［［（５−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−イル］メチル］アミノ］カルボニル］−３−オキソ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸；
（ｂＲ）−ｂ−［［［（３Ｒ）−２−オキソ−３−［２−（１，５，６，７−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）エチル］−１−ピロリジニル］アセチル］アミノ］−１Ｈ−インドール−３−ペンタン酸；
（１０Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［３−（２−ピリジニルアミノ）プロポキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸；
（２Ｓ）−７−［［（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イルメチル）メチルアミノ］カルボニル］−２，３，４，５−テトラヒドロ−４−メチル−３−オキソ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸；
（２Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロ−４−メチル−７−［［［（５−メチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−イル］メチル］アミノ］カルボニル］−３−オキソ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−酢酸；
（ｂＲ）−ｂ−［［［（３Ｒ）−２−オキソ−３−［２−（１，５，６，７−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）エチル］−１−ピロリジニル］アセチル］アミノ］−１Ｈ−インドール−３−ペンタン酸。
【００１９】
別の好適な態様において、当該アンタゴニストはペプチド、例えば線状ペプチドまたは環状ペプチドであってもよい。線状ペプチドとしては、例えば特開平６−３２１９８８号公報に記載のペプチド、例えば  Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−ＯＨ、が挙げられ、環状ペプチドとしては、例えば特開平６−３２９６９８号公報又は特開平９−１３２５９３号公報に記載のペプチド、例えばシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）（式中、Ｄは任意の天然及び非天然アミノ酸である）が挙げられる。
【００２０】
さらには、当該アンタゴニストは抗インテグリン抗体、好ましくはαｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、α９β１インテグリンに特異的な抗体、又は抗Ｄ４４抗体であってよい。かかる抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の作成方法は当業者に周知であり、例えばＬｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ｅｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８６，  ２６１：  ９０４２−９０４８；  Ｈｕｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，  １０７：  ２６２３−２６３４に記載されている。
【００２１】
好適な態様において、本発明の医薬又は皮膚外用組成物は上記オステオポンチンレセプターアンタゴニストに加え、１又は複数種のＭＭＰ−１２インヒビターを含有してよい。上述の通り本発明者はＤＮＡマイクロアレイ解析の結果、更年期モデル及び自然皮膚老化したモデルマウスの皮膚由来の遺伝子群の双方において、オステオポンチン遺伝子及びＭＭＰ−１２遺伝子の発現が特異的に亢進されていることを見出した。従って、ＭＭＰ−１２の活性を阻害すれば、皮膚の老化を治療及び／又は予防できるものと推認される。ＭＭＰ−１２はマクロファージエラスターゼとも称され、エラスチン、ＩＶ型コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどのマトリックス、ノンマトリックス成分を分解する酵素である。
【００２２】
ＭＭＰ−１２の活性を阻害するインヒビターは当業界において様々なものが知られ、例えば限定することなく、特表２００２−５３４４３５号公報に記載のメルカプトアセチルアミドジペプチドカルボン酸類、特表２００２−５３４４０４号公報に記載の４−ビアリール酪酸および５−ビアリールペンタン酸誘導体、特表２００１−５０１５９４号公報に記載のペプチド  Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｊ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（式中、Ｊはハイドロプロリン）及びその類似体Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｊ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ａｂｚ）などが挙げられる。
【００２３】
本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、例えば水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形剤等の形態で適用される。従来から公知の方法でこれらの形態に調製したうえで、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤、水−油２層系、水−油−粉末３層系、注射剤、内服剤（錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等）、坐剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入することができる。当該組成物は上記オステオポンチンレセプターアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として、特に限定することなく、組成物全量に基づき例えば０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度含有するであろう。
【００２４】
これらの剤型の中でも、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等の皮膚外用剤が、本発明の目的に適する剤型である。なお、ここで記す皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品（軟膏剤等）、化粧料［洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧品；ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧品；口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品等］が含まれる。特に本発明の医薬又は皮膚外用組成物は、抗老化用の化粧料としての適用が好適である。
【００２５】
本発明の医薬又は皮膚外用組成物においては、所望する剤型に応じて従来公知の賦形剤や香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料等の粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等が適宜配合される。さらにこの他の薬効成分を本発明の本発明の医薬又は皮膚外用組成物に配合することは、その配合により所期の効果を損なわない範囲内で可能である。
【００２６】
皮膚老化抑制因子をスクリーニングする方法
本発明は、本発明の組成物及び方法に使用するための皮膚老化抑制因子を同定するためのスクリーニング方法も提供する。このスクリーニング方法は、候補化合物をオステオポンチンの有する対応のレセプターに対する結合力を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するオステオポンチンレセプターアンタゴニストを皮膚老化抑制因子として選定することを特徴とする。
好適な態様において、上記スクリーニング方法は更に、上記阻害能力を有するオステオポンチンレセプターアンタゴニストを老化モデル動物に適用し、皮膚老化表現形質の改善・予防効果を有するアンタゴニストを選定することを含んで成る。
【００２７】
オステオポンチンレセプターに対するオステオポンチンの結合性を候補化合物が阻害する能力について評価する工程は当業界の技術常識の範囲内で実施され、如何なる方法に限定されるものでもない。例えば、適当な標識手段で標識したオステオポンチンを候補化合物と競合させた状態でレセプターに作用させ、候補化合物と競合した状況下での標識オステオポンチンの結合力が候補化合物不在下での結合力と比較して低下すれば、当該候補化合物がオステオポンチンの結合性を阻害する真のオステオポンチンレセプターアンタゴニストであると判定できる。その評価基準としては、例えば標識オステオポンチンの結合力を５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上低下させる場合に真のオステオポンチンレセプターアンタゴニストであると判定することができる。標識手段としては酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素、又はこれらいずれかの標識手段で標識した抗−オステオポンチン抗体などを使用してよく、その測定方法も使用する標識に応じて選定される。また、レセプターは適当な固体、例えばマイクロタイタープレート、ビーズ等に固相しておくことが好ましい。レセプターとしてはαｖβ３インテグリン、αｖβ１インテグリン、αｖβ５インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、α９β１インテグリン、ＣＤ４４等が挙げられる。特に限定するわけではないが、角化細胞に存在するαｖβ１インテグリン及びαｖβ５インテグリンが好ましい。
【００２８】
オステオポンチンレセプターアンタゴニストの皮膚老化現象の改善・予防効果を確認する工程はこのアンタゴニストを老化モデル動物、例えば卵巣摘出により更年期障害を人為的に誘導して皮膚老化させたモデル動物や自然皮膚老化したモデル動物を利用して実施することができる。動物としては例えばマウス、ラット、ウサギなど様々な動物が利用できる。好適な態様においては、このアンタゴニストの溶液、例えば水溶液を調製してから老化モデル動物の皮膚に繰り返し塗布し、老化現象の表現形質を評価することで、改善・予防効果の有無を判定することができる。老化現象の表現形質としては、例えば弾性力低下、皮膚（真皮及び表皮）厚の減少、角層水分量減少（乾燥肌）、皮膚色変化（黄み増加、赤み減少）、くすみ、皮膚の炎症、新陳代謝活性低下等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００２９】
皮膚老化の進行状態を検査する方法
本発明はまた、皮膚老化の進行状態を検査する方法を提供する。この方法は、皮膚中のオステオポンチンの発現が正常な皮膚中の発現に比べ亢進していたら、皮膚老化が進行していると判断することを特徴とする。ここで正常な皮膚とは、好適には上述の皮膚老化表現形質を有さない皮膚をいう。
皮膚中のオステオポンチンの発現の亢進は、例えば皮膚中のオステオポンチンの量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はオステオポンチンに特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等、様々な方法により実施できる。また、皮膚中のオステオポンチンの発現の亢進は、皮膚からＲＮＡを抽出し、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により行われる。
【００３０】
オステオポンチンを含有する皮膚老化促進剤
上述の通り、オステオポンチンは更年期障害老化や加齢による皮膚老化の原因因子である可能性が示唆されていることから、オステオポンチンを皮膚に適用すれば更年期障害や加齢が関与する皮膚老化を人為的に惹起できるものと考えられる。従って、オステオポンチンを含有する皮膚老化促進剤を利用することにより、皮膚老化モデルを構築することが可能となる。このような皮膚老化促進剤は更年期障害老化や加齢による皮膚老化の抗老化剤の研究、開発に極めて有用である。
【００３１】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
方法
更年期障害モデル動物（ＯＶＸ）の作製
５週齢のラット（ＨＷＹ−１、♀）、およびマウス（ＨＲ−１、♀）に定法に従い卵巣摘出手術を施した。コントロール群（Ｓｈａｍ）は実際の卵巣摘出以外、同様の手術を施した。さらに、卵巣摘出手術を施したラットおよびマウスにエストラジオールを２週間連続投与し、エストラジオールによるホルモン置換治療による効果も調べた（ＯＶＸ＋Ｅ２）。卵巣摘出手術４週間後（９週齢）、子宮重量の顕著な減少により卵巣摘出手術の是非を確認した。
【００３３】
自然老化モデル動物の作製
８７週齢マウス（ＨＲ−１）を自然老化マウスとして用いた。若年コントロールとして９週齢マウス（ＨＲ−１）を用いた。また、自然老化経時マウスとして２０，４０，６０週齢マウス（ＨＲ−１）を合わせて用いた。皮膚からのＲＮＡ採取は上期卵巣摘出ラットと同様の方法を用いた。
【００３４】
老化モデル動物の皮膚老化について、皮膚の色み、具体的には赤み、黄みの増減、角層水分量、並びにたるみ、しわ、皮脂量について調べた。その結果、更年期障害モデル動物では赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、皮脂の減少といった更年期障害固有の皮膚老化が認められた。自然老化モデル動物でも更年期障害モデル動物と同様に赤みの減少、黄みの増加、角層水分量の減少、皮脂の減少が認められ、さらにはたるみも認められた。尚、更年期障害モデルの場合、エストラジオールによるホルモン置換治療により角層水分量の回復が認められた。以上の結果により、更年期障害モデル動物及び自然老化モデル動物は共に皮膚老化の表現形質を示す良好なモデルであることがわかり、よってそのような表現形質を示す皮膚からＲＮＡを採取して、皮膚老化原因遺伝子を探索した。
【００３５】
皮膚からのトータルＲＮＡ採取
ラットまたはマウス背部の皮膚全層を採取、脂肪層を取り除き、１センチ角に切断して液体窒素で凍結した。凍結した皮膚片を破砕後、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社、メーカー推奨プロトコル）によりトータルＲＮＡを抽出、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）により、精製した。
【００３６】
マイクロアレイ用サンプルの反応
マイクロアレイ解析はアフィメトリックス社ジーンチップ及びアジレント社マイクロアレイを用いた。
（１）アフィメトリックス社用サンプル調製
アフィメトリックス社推奨プロトコルに準じて反応を行った。トータルＲＮＡ  １０μｇをＴ７−（ｄＴ）２４  プライマー、１００ｐｍｏｌ（Ｓｉｇｍａ社）と共に７０℃で１０分間反応させた。その後、５ｘ第一鎖反応バッファー４μｌ，  ０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ，  １０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス  １μｌ，  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ２μｌ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えて、４２℃で１時間反応させた。この反応物に、Ｒｎａｓｅ非含有水９１μｌ，  ５ｘ第二鎖反応バッファー３０μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ミックス３μｌ，１０Ｕ／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  リガーゼ１μｌ，１０Ｕ／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ４μｌ，  ２Ｕ／μｌ  Ｒｎａｓｅ  Ｈ  １μｌ  （すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、１６℃で２時間反応させた。さらに、２μｌ（１０Ｕ／μｌ）のＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、１６℃で５分間反応後、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて反応を止めた。Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓ  （Ｑｉａｇｅｎ社）を用いクリーンアップを行い、Ｒｎａｓｅ  非含有水１２μｌに溶出した。得られたｃＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写反応によりビオチン付加ｃＲＮＡを作製し（Ｅｎｚｏ，  Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。ｃＲＮＡをフラグメンテーションバッファー中で９４℃にて３５分間分断した後、ジーンチップハイブリダイゼーションに用いた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００を用い、洗浄、染色後、アフィメトリックス社スキャナーによりデータ読み取りを行った。
【００３７】
（２）アジレントｃＤＮＡマイクロアレイ用サンプル
サンプルの調製及びハイブリダイゼーションはアジレント社推奨プロトコルに準じた。トータルＲＮＡ１０μｇを、ｃＤＮＡラベル化キット（アジレント社）を用いてラベル化ｃＤＮＡを合成した。Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ社，メーカー推奨プロトコル）にて精製後、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにより溶媒を乾燥した。次に、マウスｃＤＮＡマイクロアレイキット（アジレント社、Ｇ４１０Ａ）を用いてハイブリダイゼーション後、スライドガラスを洗浄した。アジレント社スキャナーによりデータ読み取りを行った。
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲ
皮膚から採取したトータルＲＮＡ各（Ｓｈａｍ，  ＯＶＸ，  ＯＶＸ＋Ｅ２または９週齢及び８７週齢）１μｇをオリゴ−ｄＴプライマー（２４ｍｅｒ）  １００ｐｍｏｌ（Ｓｉｇｍａ）と共に７０℃で１０  分（総容量２０μｌ）反応させた。その後、５ｘ第一鎖反応バッファー  ４μｌ，  ０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ，  ２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ミックス４μｌ，  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  １μｌ（すべてｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、４２℃で１時間反応させた。最後に７０℃で１０分反応させて伸長させ、ｃＤＮＡテンプレートを調製した。ｒＴａｑ用１０×バッファー  ５μｌ，  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ，  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ミックス５μｌ，  ｒＴａｑ  ０．５μｌ（すべてＴＯＹＯＢＯ社），  ｄｄＨ２Ｏ  ３３．５μｌ，  ｃＤＮＡテンプレート各１μｌ  （Ｓｈａｍ，  ＯＶＸ，  ＯＶＸ＋Ｅ２または９週齢及び８７週齢）プライマー（下記配列参照）、センス及びアンチセンス各２０ｍＭ  １μｌ（総容量５０μｌ）をすべて加え、ＰＣＲ反応〔９４℃  ２分、（９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分）を３０サイクル、７２℃  １０分〕を行った。
【００３９】
プライマー配列（ラット、マウス共通配列）
オステオポンチン−センス              ＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＧＧＴ
オステオポンチン−アンチセンス        ＡＡＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＣ
【００４０】
最後に１．５％エチジウムブロマイド含有アガロースゲルにて電気泳動して約３００ｂｐのバンドを得た。尚、参考データーのため、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子をＰＣＲ増幅させた。
【００４１】
解析結果１
約９，０００種の遺伝子の発現を網羅的に解析した結果、更年期障害モデル動物（ラット）の皮膚では、３１種の遺伝子について２分の１以下に至る発現率の減少が認められ、６種の遺伝子について１．５倍以上の発現率の亢進が認められた。そのうち、驚くべきことに、従来において皮膚老化との関与が全く示唆されていないオステオポンチン及びＭＭＰ−１２遺伝子の発現が、図１及び下記の表に示すとおりコントロール動物と比べ顕著に亢進することが認められた。
【００４２】
【表１】
2005053790.tif 000002
【００４３】
この結果は、オステオポンチンが皮膚更年期障害の原因遺伝子である可能性が高いことを示唆する。
【００４４】
解析結果２
約１２，０００種の遺伝子の発現をアジレント社マウスｃＤＮＡアレイを用い網羅的に解析した結果、自然老化モデル動物の皮膚（マウス）において、従来技術では皮膚自然老化との関与が全く示唆されていないオステオポンチン及びＭＭＰ−１２遺伝子の発現が、図２及び下記の表に示すとおりコントロールと比べて顕著に亢進することが認められた。経時での検討においても、図４に示す通り、オステオポンチン及びＭＭＰ−１２遺伝子の発現が４０週齢以降亢進し、８７週齢では更に亢進することが認められた。
【００４５】
【表２】
2005053790.tif 000003
【００４６】
この結果は、オステオポンチンが皮膚自然老化現象の原因遺伝子である可能性が高いことを示唆する。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、従来技術には存在しない全く新規な抗老化剤の提供が可能となる。
【００４８】
【配列表】
2005053790.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲによる、ラット更年期モデルにおけるオステオポンチン遺伝子の発現を示す。
【図２】ＰＣＲによる、マウス更年期モデルにおけるオステオポンチン及びＭＭＰ−１２遺伝子の発現を示す。
【図３】ＰＣＲによる、マウス自然老化モデルにおけるオステオポンチン及びＭＭＰ−１２遺伝子の発現を示す。
【図４】マイクロアレイによる、マウス老齢モデル経時におけるＭＭＰ−１２及びオステオポンチン遺伝子の発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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