(57)【要約】【課題】  サルモネラ属微生物の発現を特異的に抑制する機構を見出した上で、抗生物質を用いずに、サルモネラ属微生物による感染症を予防できるサルモネラ属細菌感染症予防剤、洗浄剤、飲食品添加物を得る。【解決手段】  １，２−プロパンジオールを有効成分とするものであり、この１，２−プロパンジオールは、サルモネラ属微生物の細胞侵入に関与するＳＰＩ−１遺伝子群の統括的アクチベータであるｈｉｌＡ遺伝子の発現を抑制する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−プロパンジオールを有効成分とするサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤。
【請求項２】
サルモネラ病原遺伝子が、サルモネラ属微生物の細胞侵入に関与するＳＰＩ−１遺伝子群の統括的アクチベータであるｈｉｌＡ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤。
【請求項３】
前記請求項１又は２に記載のサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤を有効成分とすることを特徴とするサルモネラ属細菌感染症予防剤。
【請求項４】
前記請求項１又は２に記載の抑制剤が洗浄剤成分と共に添加されていることを特徴とする洗浄剤。
【請求項５】
前記請求項１又は２に記載の抑制剤が飲食品中に添加されていることを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルモネラ病原遺伝子発現の抑制に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラは、大腸菌や赤痢菌と同じ仲間に属し、ウシ、ブタ、鶏などの家畜やペット動物の腸管内容物や糞便中からしばしば分離される病原細菌であり、古くから食中毒の原因菌の一つとして知られており、この菌によって汚染された食品が原因で、集団食中毒や家庭内食中毒がしばしば発生していた。
【０００３】
一方、二成分制御系遺伝子ｃｐｘＲ−ｃｐｘＡは赤痢菌において、病原遺伝子の発現を活性化するｖｉｒＦ遺伝子の発現をｐＨ依存的に制御し、ｐＨ６．０ではｖｉｒＦの発現は１／１０に抑制される（非特許文献１及び非特許文献２参照）。また、サルモネラの細胞侵入に関与するＳＰＩ−１遺伝子群の統括的アクチベータ(activator) であるｈｉｌＡ遺伝子の発現解析の結果、２成分制御系のセンサー、ｃｐｘＡが低ｐＨ条件において、ｈｉｌＡ遺伝子の活性化に必要であることも報告済みである。具体的には、サルモネラ属微生物ｃｐｘＡ欠損株において、ｖｉｒＦ遺伝子と似た働きをするｈｉｌＡ遺伝子の発現はｐＨ依存的に制御される事も見出している（非特許文献３参照）。
【０００４】
サルモネラ属細菌による感染症としては、サルモネラ属細菌が細胞内に侵入することでマクロファージの集積やサイトカインの産生が生じることで引き起こされる炎症反応や細胞内で増殖して血流・リンパ液を経て各臓器に転位することで引き起こされる多臓器不全や敗血症が挙げられる。また、マクロファージ内でも増殖できることから、マクロファージによる生体防御機能が働かず、細胞侵入後の排除は困難と考えられている。
【０００５】
一方、ｈｉｌＡ遺伝子は、このサルモネラの細胞内への侵入に関与する遺伝子であると考えられており、ｈｉｌＡ遺伝子の発現を抑制することで、サルモネラの細胞内への侵入を防ぎ、結果として感染症を予防できることが考えられている。
【０００６】
【非特許文献１】Nakayama. et al. (1995)  Invrolvernent of cpxA, a sensor of a two-component regulatory system, in the pH-dependent regulation of expression of Shigella sonnei virF gene. J. Bacteriol. 177, 5062-5069.
【非特許文献２】Nakayama et al. (1998) Identification of cpxR as a positive regulator essential for esseritial expression of the Shigella sonnei virF gene. J. Bacteriol. 180, 3522-3528.
【非特許文献３】Nakayama et al. (2003) Activation of hilA expression at low pH requires thesignal ,sensor CpxA, but not the cognate response regulator CpxR, in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Microbiology 149, 2809-2817.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、ペニシリンの発明以来、種々の抗生物質が世に出ている。その一方で、安易な抗生物質の使用によって多剤耐性菌の問題がある。食中毒菌の１つであるサルモネラ属微生物についても、多剤耐性を有するものが現れ始めている。
【０００８】
そこで、抗生物質を用いない感染症の予防・治療効果についても検討が行われ、既に有機酸の一種であるプロピオン酸に、ｈｉｌＡ遺伝子の発現抑制効果があることが知られ、細胞内への侵入を抑制できるであろうことが示唆されていた。
【０００９】
しかしながら、プロピオン酸は強い酸であるため、例えばサルモネラ属細菌の感染症の予防を目的として飲食品に添加したとしても、飲食品本来の呈味を損なってしまうといった問題があった。また、ｈｉｌＡ遺伝子の発現がどのような機構により抑制されているかについては、十分に解明されておらず、プロピオン酸以外、どのような物質にｈｉｌＡ遺伝子の発現を抑制する効果があるかは不明であった。
【００１０】
本発明者等は、ｈｉｌＡ遺伝子の発現の機構について鋭意検討した結果、種々のＮＡＤ依存型グリセロール脱水素酵素がｈｉｌＡ遺伝子の発現に関与することを新たに見出した。
【００１１】
即ち、本発明は、サルモネラ属微生物の発現を特異的に抑制する機構を見出した上で、抗生物質を用いずに、サルモネラ属微生物による感染症を予防できるサルモネラ属細菌感染症予防剤、洗浄剤、飲食品添加物を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１に記載された発明に係るサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤は、１，２−プロパンジオールを有効成分とするものである。
【００１３】
請求項２に記載された発明に係るサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤は、請求項１に記載のサルモネラ病原遺伝子が、サルモネラ属微生物の細胞侵入に関与するＳＰＩ−１遺伝子群の統括的アクチベータであるｈｉｌＡ遺伝子であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項３に記載された発明に係るサルモネラ属細菌感染症予防剤は、請求項１又は２に記載のサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤を有効成分とすることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項４に記載された発明に係る洗浄剤は、請求項１又は２に記載の抑制剤が洗浄剤成分と共に添加されていることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項５に記載された発明に係る飲食品は、請求項１又は２に記載の抑制剤が飲食品中に添加されていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は以上説明した通り、サルモネラ属微生物の病原遺伝子の発現を特異的に抑制するサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤、サルモネラ属微生物による感染症を予防できるサルモネラ属細菌感染症予防剤、洗浄剤、及び飲食品を得ることができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１，２−プロパンジオール（１，２−Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）は、「プロピレングリコール」とも呼ばれる２価のアルコールであり、毒性がなく、無味無臭である。
【００１９】
本発明においては、１，２−プロパンジオールがサルモネラ属微生物の病原遺伝子発現を抑制することを初めて見出した。より具体的には、１，２−プロパンジオールがサルモネラ属微生物の細胞侵入に関与するＳＰＩ−１遺伝子群の統括的アクチベータであるｈｉｌＡ遺伝子の発現を抑制することを初めて見出したものである。
【００２０】
従って、本発明の１，２−プロパンジオールによるサルモネラ病原遺伝子発現の抑制剤は、１，２−プロパンジオールをサルモネラ属微生物のｈｉｌＡ抑制成分とするものである。
【００２１】
更に本発明の抑制剤は、より具体的には、この抑制剤を洗浄剤成分と共に添加することにより洗浄剤として使用すること、更に、抑制剤を飲食品中に添加することにより飲食品添加剤として使用することを得るものである。即ち、１，２−プロパンジオールを例えば生卵の洗浄剤として使用して、サルモネラ属微生物による感染を特異的に抑制する効果を奏したり、従来の１，２−プロパンジオールは品質保持剤として特定の食品に添加しているところ、食中毒の発生しやすい飲食品に添加することにより、サルモネラ属微生物による感染を特異的に抑制する効果を奏する。
【００２２】
本発明の抑制剤の有効成分としての１，２−プロパンジオールの含有濃度は、サルモネラ属微生物による感染症を予防できる濃度であって人体等に影響のない量を上限として含まれていればよい。例えば、サルモネラ属細菌感染症予防剤としては、薬剤の全量に対して０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜５重量％、特に１〜２重量％添加することが好ましい。また、洗浄剤としては、全量に対して、０．１〜２０重量％、好ましくは０．１〜５重量％、特に１〜２重量％添加することが好ましい。更に、飲食品としては、全量に対して、０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜１重量％、特に０．４〜１重量％添加することが好ましい。
【００２３】
本発明では、ｈｉｌＡ遺伝子活性化の具体的メカニズムを解明するために、ｃｐｘＡ変異株の、低ｐＨ条件でのｈｉｌＡ遺伝子発現を回復させるマルチコピーサプレッサーを検索し、新規なＮＡＤ依存型グリセロ−ル脱水素酵素遺伝子（ｇｄｈ）を同定した。サルモネラのゲノム情報によると、ＮＡＤ依存型グリセロール脱水素酵素は２種類存在し、もう一つの遺伝子はｇｌｄＡと呼ばれている。
【００２４】
そこで、種々のＮＡＤ依存型グリセロール脱水素酵素の欠損株を作製し、ｈｉｌＡ遺伝子の発現量をモニターしたところ、ｇｄｈ−ｇｌｄＡ二重欠損株でのみ、ｈｉｌＡ発現が野生株のほぼ５０％まで低下し、各単独の欠損株ではこのような低下は観察されなかった。このことから、ｈｉｌＡ遺伝子の充分な発現には、総体的なグリセロール脱水素酵素活性が必要であると思われる。
【００２５】
代謝酵素による遺伝子発現制御は、直接にはその酵素の基質／産物が関与すると考えられる。一方、従来から知られていたプロピオン酸はグリセロール脱水素酵素の基質／産物ではないことから、プロピオン酸以外の化合物がｈｉｌＡ発現を抑制することが期待されていた。この観点からいくつかのグリセロール脱水素酵素の基質となり得る化合物を検索したところ、ｌ，２−プロパンジオールの培地への添加によって、野生株でのｈｉｌＡ発現が約半分に抑制されることを見出した。
【００２６】
本発明の抑制剤の有効成分としての１，２−プロパンジオールは、サルモネラ属微生物の病原性遺伝子の発現を特異的に抑制するため、薬剤や飲食品として経口接種しても、宿主内に存在している他の腸内細菌等に対しては、何ら悪影響を及ぼすものではない。
【実施例】
【００２７】
Ａ．材料と方法
1. 菌株
本実施例で用いた菌株は次の６株である。
・Salmonlla eneria serovar Typhimurium ＳＬ１３４４
・S. enterica ＳＮ１４５９（ｃｐｘＡ欠損株）
・S. enterica ＳＮ１４６０（ｇｄｈ欠損株）
・S. enterica ＳＮ１４６１（ｇｌｄＡ欠損株）
・S. enterica ＳＮ１４６２（ｇｄｈ-ｇｌｄＡ二重欠損株）
【００２８】
2. 培地
ＬＢ培地（１% Bacto-tryptone／0.5% Bacto-yeast extract/0.5% NaCl, ｐＨ７．０) に０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を加えて、ｐＨを７．０に調整した。抗生物質は必要に応じて次の濃度で添加した。
・アンピシリン（Ａｐ）        １００μｇ／ｍｌ、
・クロラムフェニコール（Ｃｍ）  ２０μｇ／ｍｌ
【００２９】
3. プラスミド
本実施例で用いたプラスミドは次の２種類である。
・ｐＨＳＧ５９５：pSC101 replicon cloning vector,Cmｒ
・ｐＳＮ８４９  ：hilA-lacZ fusion gene cloned into pHSG595,Cmｒ
【００３０】
4. β−ガラクトシダーゼ活性の測定方法
β−ガラクトシダーゼ活性の測定方法はMillerの方法に準じた。試験菌株をＬＢ培地で静置の状態で前培養し、１／３００量をＬＢ−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に接種後、１６時間静置培養した。培養後、菌体を１ｍｌのＺ液（６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ，４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５０ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０）で懸濁した。この菌液０．１ｍｌにＺ液を０．９ｍｌ加え、最終容量を１ｍｌにした。
【００３１】
これに０．１％ ＳＤＳ及びクロロホルムをそれぞれ２０μｌ ずつ加えて撹拌し、細胞破砕を行った。２８℃で５分間予備加温し、４ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）溶液を０．２ｍｌ加え、２８℃で１０分間反応を行った。１ＭＮａ２ＣＯ３を０．５ｍｌ添加して反応を停止後、４２０ｎｍ，５５０ｎｍ，６００ｎｍの吸光度を測定し、ミラー単位を算出した。
【００３２】
5. 欠損株の取得方法
欠損させたい目的の遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置換したベクターを作製し、相同組換え（doub1e-crossover）を起こした株を選別した。目的とおりに置換されているかはＰＣＲ解析により行った。
【００３３】
Ｂ．マルチコピーサプレッサーの取得
ＳＬ１３４４株の遺伝子ライブラリ−をｃｐｘＡ欠損株／ｐＳＮ８４９に形質転換し、β−ガラクトシダーゼ活性の回復を指標として、マルチコピーサプレッサーを選択した。十数個のコロニーをピックアップし、プラスミドに挿入されている断片を解析した所、３種類の遺伝子に大別された。１つは既知の転写因子ｈｉｌＣであり、もう１つは転写因子と相同性の高い未知の遺伝子で、ｈｉｌＦと名付けた。３つめは、意外な事に、グリセロール脱水素酵素と相同性の高い未知の遺伝子で、ｇｄｈ遺伝子と名付けた。今回は、ｇｄｈ遺伝子に着目して欠損株を取得し、以下の解析を行った。
【００３４】
Ｃ．各欠損株のｈｉｌＡ発現量の解析
各遺伝子の欠損株（ｇｄｈ欠損株、ｇｌｄＡ欠損株）及びｇｄｈ−ｇｌｄＡ二重欠損株と親株（ＷＴ）のｈｉｌＡ遺伝子発現量を測定した。次の表１には実測値及び親株を１００とした場合の発現比率を％表示で示した。
【００３５】
表１に示す通り、各遺伝子単独の欠損株では、野生株と比較してｈｉｌＡ発現に大きな差は見られなかったが、二重欠損株では６割程度にｈｉｌＡ発現が抑制されていた。このことから、ｈｉｌＡ遺伝子の充分な発現には、総体的なグリセロール脱水素酵素活性が必要であると思われた。
【００３６】
【表１】
2005239576.tif 000002
【００３７】
Ｄ．ｌ，２−プロパンジオール添加によるｈｉｌＡ発現の抑制
代謝酵素による遺伝子発現制御は、直接にはその酵素の基質／産物が関与すると考えられる。この観点から、いくつかのグリセロール脱水素酵素の基質となり得る化合物を検索した。その中で、ｌ，２−プロパンジオール（ＰＤＬ）の抑制活性が一番強いことが判明したので、ｌ，２−プロパンジオールを終濃度１５０ｍＭとなるように培地に添加し、野生株のｈｉｌＡ発現をどの程度抑制するかを測定した。表２には実測値及びｌ，２−プロパンジオール未添加の親株を１００とした場合の発現比率を％表示で示した。
【００３８】
【表２】
2005239576.tif 000003
【００３９】
表２に示す通り、ｌ，２−プロパンジオールの添加により、野生株のｈｉｌＡ発現が約半分に抑制されることを見出した。プロピオン酸にｈｉｌＡ遺伝子の発現抑制効果がある事が知られているが、有機酸以外の物質が病原遺伝子発現と密接に関わっていることは極めて興味深く、グリセロール脱水素酵素の基質や産物が病原遺伝子の発現を抑制する可能性が示唆された。
【００４０】
Ｅ．考察
有機酸による殺菌作用及び病原遺伝子発現抑制効果は広く知られているが、具体的なメカニズムは不明なままである。今回、新たに１，２−プロパンジオールがｈｉｌＡの発現を抑制することが明らかになった。１，２−プロパンジオ−ルは腸管常在菌叢により、食物や宿主細胞膜内の脂質から代謝産物として産生されることが知られている。１，２−プロパンジオールはサルモネラ属微生物の増殖を阻害せず、ｈｉｌＡ遺伝子の発現を抑制することから、この物質を応用した予防・治療が、耐性菌の出現が問題となる抗生物質に頼る治療の代替療法になるものと期待される。
【００４１】
Ｆ．製剤例
1. サルモネラ属細菌感染症予防剤の製剤
１，２−プロパンジオ−ル５０ｍｇに乳酸９３０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム１０ｍｇ、タルク１０ｍｇを加え、充分混合し、密閉して２４時間放置後、打錠した。得られた薬剤は、安定なものであり、服用しやすいものであった。
【００４２】
2. 洗浄剤の製剤
次の表３に示した組成による洗浄剤を作製した。なお、得られた洗浄剤は、使用感にも優れた極めて有用なものであった。
【００４３】
【表３】
2005239576.tif 000004
【００４４】
3. 飲食品添加物としての使用
次の表４に示した組成による飲食品添加物を作製した。得られたパンは、食感も良く、味も良好であり、通常のパンに比べて遜色のないものであった。
【００４５】
【表４】
2005239576.tif 000005