(57)【要約】【課題】  本発明は、ＳＩＫ２に作用する化合物をスクリーニングし、新規な糖尿病治療薬となるリード化合物をスクリーニングする系を確立すること。【解決手段】  本発明のスクリーニング方法は、ＤＮＡ結合因子と、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターと、ＳＩＫ２とを含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定する工程を含む、ＳＩＫ２に作用する物質のスクリーニング方法であって、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼと、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジン類とを上記系内に共存させることを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合因子と、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターと、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを含む系に、
被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定する工程を含む、上記配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに作用する物質のスクリーニング方法であって、
ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼと、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジン類とを上記系内に共存させることを特徴とする、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
上記ＤＮＡ結合因子が、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体のリガンド結合領域と他の転写因子のＤＮＡ結合領域との融合タンパク質、ｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質、又はｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質と他の転写因子のＤＮＡ結合領域との融合タンパク質である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記ＤＮＡ結合因子が、該ＤＮＡ結合因子をコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系で発現させたものである、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
上記配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系で発現させたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
スクリーニングが細胞内で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＤＮＡ結合因子をコードする遺伝子を含むベクター、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター、及びｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを保持する細胞を、被検物質と接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定する工程を含む、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
上記ＤＮＡ結合因子が、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体のリガンド結合領域と他の転写因子のＤＮＡ結合領域との融合タンパク質、ｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質、又はｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質のリガンド結合領域と他の転写因子のＤＮＡ結合領域との融合タンパク質である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
上記細胞が哺乳動物細胞である、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩誘導性キナーゼ２に作用する化合物をスクリーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法は、新規な糖尿病治療薬をスクリーニングすることができる。
【背景技術】
【０００２】
各種のホルモンや神経伝達物質が細胞内のｃＡＭＰ濃度を増加させることが知られている。細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇すると、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）を活性化させる。ＰＫＡの触媒ドメインが、ＰＫＡ活性を負に調節する調節ドメインから解離されることによってＰＫＡが活性化されることが報告されている（Mayr et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 2, 599-609(2001)）。活性化されたＰＫＡはｃＡＭＰ応答配列（以下、本明細書において「ＣＲＥ」ともいう）に結合する転写因子であるｃＡＭＰresponsive element binding protein（以下、本明細書において「ＣＲＥＢ」という」）をリン酸化し、リン酸化されたＣＲＥＢがＣＲＥに結合し、遺伝子の転写活性を制御することが知られている。
【０００３】
脂肪細胞の分化および機能も、やはり細胞内ｃＡＭＰによって調節されており（Reuschet al., Mol. Cell. Biol. 20, 1008-1020(2000)）、ＣＲＥＢの活性化は脂肪細胞の分化誘導に必要不可欠であり、主にＣＲＥＢが脂肪細胞分化を調節していることが報告されている。また、プレニレーションの阻害によりインスリン誘導性の脂肪細胞の分化機構が阻害された場合、ＣＲＥＢの活性化により脂肪細胞の分化が補完されることも報告されている。一方、ＣＲＥＢは血糖ホメオスタシスの機構を制御している。すなわち、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ−ＣＲＥＢ−ＣＲＥシグナルは脂肪細胞の分化や機能、血糖の調節において非常に重要な役割を果たしており、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ−ＣＲＥＢ−ＣＲＥシグナルをコントロールすることで肥満や糖尿病等を予防、改善できると考えられる。
【０００４】
一方、ペルオキシソームは、動植物の細胞中に存在する小器官であり、コレステロール等の脂質代謝や吸収に関する酵素群を含んでいる。ペルオキシソームは、食餌や生理的要因によって誘導されて増加するが、抗脂血薬（フィブレート類）、殺虫剤及びフタル酸類の可塑剤等を含む構造的に多様な化合物を投与することによって肝臓や腎臓のペルオキシソームの大きさ及び数を増加させることが知られており、また、それと共にβ−酸化サイクルに必要とされる酵素の発現増加を介してペルオキシソームの脂肪酸代謝能を高めることが知られており、ペルオキシソームプロリフェレータ（peroxisome proliferator）と呼ばれている。ペルオキシソームプロリフェレータの研究の中から、これら化合物群によって活性化される核内受容体が同定されペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（peroxisomeproliferator activated receptor:ＰＰＡＲ）と命名された。
【０００５】
ＰＰＡＲは、その構造から核内受容体スーパーファミリーの一員であると考えられている。ＰＰＡＲはリガンドとの結合により活性化され、標的遺伝子上流域に存在する応答配列（ＰＰＲＥ：peroxisome proliferator response element）に結合して標的遺伝子の転写を活性化する機能を有する。
【０００６】
これまでに、ＰＰＡＲには、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγと呼ばれている３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定されており、それぞれの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている（Lemberger et al, Annu.Rev.Cell.Dev.Biol., vol.12, p335-363, 1996）。
【０００７】
上記３種のＰＰＡＲのうち、ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く関与する因子であるとされている（Tontonoz et al, Genes and Development, vol.8, p1224-1234, 1994;Tontonoz et al, Cell, vol.79, p1147-1156, 1994）。
また、ＰＰＡＲγは脂肪細胞に特異的に発現し、脂肪細胞の分化誘導に重要な役割を担う転写因子／核内レセプターである。抗糖尿作用を有するＴＺＤがＰＰＡＲγのリガンドとなることから、ＴＺＤの抗糖尿病作用はＰＰＡＲγの転写活性化により発揮されるのであろうと予想されている。
【０００８】
一方、種々のチアゾリジンジオン誘導体がインスリン非依存性糖尿病において血糖降下作用を示すことから、新しい糖尿病薬として用いることが期待されている。チアゾリジンジオン誘導体のＰＰＡＲγ活性化能と遺伝性肥満マウスにおける血糖降下作用には強い相関が見られることから、ＰＰＡＲγがチアゾリジンジオン誘導体の薬理作用の標的分子であると考えられている。従って、ＰＰＡＲγのアゴニストとして特異的に作用する化合物は糖尿病治療薬として非常に有効であると考えられている。しかしながら、チアゾリジンジオン誘導体は副作用として肝障害を起こすことがあり、臨床上問題となっている。
【０００９】
塩誘導性キナーゼ２（以下、本明細書において「ＳＩＫ２」ともいう）は、主に脂肪組織に発現しており、脂肪の分化成熟を制御していることが明らかになった。ＳＩＫ２、特にＳＩＫ２のドメイン３はＣＲＥＢやＰＰＡＲγ等の転写活性因子の活性を制御する機能を有することが明らかになってきた。
【００１０】
【非特許文献１】Mayr et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 2,599-609, 2001
【非特許文献２】Reuschet al., Mol. Cell. Biol. 20, 1008-1020,2000
【非特許文献３】Lemberger etal, Annu.Rev.Cell.Dev.Biol., vol.12, p335-363, 1996
【非特許文献４】Tontonoz et al,Genes and Development, vol.8, p1224-1234, 1994
【非特許文献５】Tontonoz et al,Cell, vol.79, p1147-1156, 1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明は、塩誘導性キナーゼ２に作用する化合物をスクリーニングし、チアゾリジンジオン誘導体との併用薬又はチアゾリジンジオン誘導体の代替薬として有用な、新規糖尿病治療薬のリード化合物をスクリーニングする系を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、ＤＮＡ結合因子と、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列が連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、及びＳＩＫ２を含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として上記被検物質の作用を測定する工程を含むスクリーニング方法において、特定の物質を系内に共存させることにより、上記目的を達成し得るという知見を得、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、ＤＮＡ結合因子と、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターと、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定する工程を含む、上記配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに作用する物質のスクリーニング方法であって、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼと、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジン類とを上記系内に共存させることを特徴とする、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１４】
上記ＤＮＡ結合因子としては、例えば、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（以下、本明細書において「ＰＰＡＲ」ともいう）、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体のリガンド結合領域と他の転写因子のＤＮＡ結合領域との融合タンパク質、ｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質（以下、本明細書において「ＣＲＥＢ」ともいう）、又はｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質のリガンド結合領域と他の転写因子のＤＮＡ結合領域との融合タンパク質が用いられる。
【００１５】
上記ＤＮＡ結合因子は、該ＤＮＡ結合因子をコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系で発現させたものであることが好ましい。
上記配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系で発現させたものであることが好ましい。
上記スクリーニングは細胞内で行われることが好ましく、細胞は哺乳動物細胞であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、ＤＮＡ結合因子をコードする遺伝子を含むベクター、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター、及びｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを保持する細胞を、被検物質と接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定する工程を含む、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のスクリーニング方法によれば、糖尿病治療薬として有用な化合物を精度良く、効率的にスクリーニングすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法は、ＤＮＡ結合因子と、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターと、ＳＩＫ２とを含む系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定する工程を含む、ＳＩＫ２に作用する物質のスクリーニング方法であって、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼと、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジン類とを上記系内に共存させることを特徴とする。ここで、ＳＩＫ２は、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法において用いられるＤＮＡ結合因子としては、例えばＰＰＡＲ及びＣＲＥＢが挙げられる。以下、先ずＰＰＡＲを用いる場合について説明する。
ＰＰＡＲとしては、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγ等のサブタイプが知られており、本発明においてはこれらのサブタイプのいずれをも用いることができる。これらのうち、ＰＰＡＲγは、抗糖尿病作用を有するチアゾリジンジオン誘導体の標的分子であり、これに対する特異的作用薬を同定及びスクリーニングする方法は糖尿病治療薬として有用である。
【００２０】
ＰＰＡＲは、いずれの種由来のものであってもよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物由来のものの他、アフリカツメガエル由来のもの等が用いられる。これらのうち、ヒトの治療薬を研究開発するという目的からは、ヒト由来のものを用いることが好ましい。
【００２１】
ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）及びＰＰＡＲγの遺伝子配列及びアミノ酸配列は既に報告されている。また、ＰＰＡＲγには、ＰＰＡＲγ１及びＰＰＡＲγ２の２種のアイソフォームが存在しており、ＰＰＡＲγ１はＰＰＡＲγ２と比較するとＮ末端側の３０アミノ酸残基が欠失しているが、その他のアミノ酸配列は全く同一である。
【００２２】
本発明において、ＤＮＡ結合因子としてＰＰＡＲを用いる場合、少なくともＰＰＡＲのリガンド結合領域を含むタンパク質を用いればよい。
ＰＰＡＲのリガンド結合領域は、ＰＰＡＲαの場合、Ｎ末端側から約１６７番目から４６８番目までのアミノ酸残基を含む領域に、ＰＰＡＲδ（又はＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）の場合、Ｎ末端側から約１３８番目から４４０番目までのアミノ酸残基を含む領域に、ＰＰＡＲγの場合、Ｎ末端側から約１７４番目から４７５番目までのアミノ酸残基を含む領域に相当するものとされている。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法においては、ＰＰＡＲのリガンド結合領域と他の転写因子との融合タンパク質を用いることもできる。転写因子は、ＤＮＡ結合領域のみでよい。本発明において、ＰＰＡＲという場合には、この融合タンパク質も含むものとする。用いられる転写因子としては、例えば酵母由来のＧＡＬ４タンパク質、ＧＣＮ４タンパク質、ＡＤＲ１タンパク質等が挙げられる。
【００２４】
転写因子のＤＮＡ結合領域は、応答配列に相当するＤＮＡの結合能を有しているが、単独では転写活性化能を有しないものが好ましい。また、転写因子の転写活性化領域は、転写活性化能を有しているが、単独で応答配列に対するＤＮＡ結合能を有しないものが好ましい。
【００２５】
転写因子のＤＮＡ結合領域は、例えばＧＡＬ４の場合、Ｎ末端側（およそ第１番目から１４７番目までのアミノ酸を含む領域）に存在することが知られている。また、ＧＣＮ４の場合、Ｃ末端側（およそ第２２８番目から２６５番目までのアミノ酸を含む領域）に存在することが知られている。また、ＡＤＲ１の場合、Ｎ末端側（およそ第７６番目から１７２番目までのアミノ酸を含む領域）に存在することが知られている。
【００２６】
ＰＰＡＲ又はＰＰＡＲと他の転写因子との融合タンパク質は、直接タンパク質としてスクリーニング系に添加することもできるし、又はＰＰＡＲをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系中でＰＰＡＲが発現されるように系を構築することも可能である。ＰＰＡＲをコードする遺伝子は、通常の遺伝子組み換え技術によって構築することができる。上述したように、ＰＰＡＲの遺伝子配列は公知であり、この遺伝子配列情報をもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ法やハイブリダイズ法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができる。これらを適当なベクターのプロモーターの下流に連結してＰＰＡＲを発現するベクターを作成することにより、適当な宿主中でＰＰＡＲを発現させることができる。
【００２７】
用いられるベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５またはｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例えばｐＳＨ１９またはｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等のウイルス等の動物ウイルスの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、araBADプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、penPプロモーター、XYLプロモーター、HWPプロモーター、CWPプロモーター等が好ましく、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましく、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター等が好ましく用いられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、OplE2プロモーター等が用いられる。
【００２８】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒgdｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたタンパク質を他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれのタンパク質に分離することができる。
【００２９】
ＰＰＡＲを発現して、本発明のスクリーニング方法において使用する場合に、発現させるための宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６０巻，１６０(１９６８)），ＪＭ１０３（NucleicAcids Research，９巻，３０９(１９８１)），ＪＡ２２１（Journal of Molecular Biology，１２０巻，５１７(１９７８)），ＨＢ１０１（Journalof Molecular Biology，４１巻，４５９(１９６９)）、Ｃ６００（Genetics, 39巻，４４０（１９５４）、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４（Gene，２４巻，２５５(１９８３)），２０７−２１〔Journal ofBiochemistry，９５巻，８７(１９８４)〕およびバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccaromycescerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccaromycespombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）Ｍ７１およびハンセヌラ・ポリモーファ(Hansenula polymorpha)等が用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusianiの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyxmori N 細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn,J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。哺乳動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
【００３０】
上述した細胞で発現したＰＰＡＲは、上述した細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせことによる公知のタンパク質の精製方法によって精製することができる。
【００３１】
ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列としては、ＰＰＲＥ又は転写因子のＤＮＡ結合領域が結合し得るＤＮＡ配列が用いられる。
【００３２】
ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列は、例えば転写因子としてＧＡＬ４を用いる場合、応答配列としては、ＧＡＬ（ガラクトース遺伝子）と称されるＧＡＬ４特異的なＤＮＡ配列を用いることができる。
【００３３】
応答配列の下流に連結されるレポーター遺伝子は、特に限定されないが、安定でかつ活性の定量が容易なものが好ましい。このようなレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ等をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子は、遺伝子本来のプロモータを有するものであってもよいし、プロモータ部分が他の遺伝子由来のものと置換されたものを用いてもよい。。レポータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結されていればよい。
【００３４】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト由来の塩誘導性キナーゼ２（以下、本明細書において「ＳＩＫ２」ともいう）のＮ末端のメチオニンからＣ末端のアスパラギンまでの９２７個のアミノ酸からなるペプチド配列である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナルで誘導され、ＰＫＡによりリン酸化されて活性化され、ｃＡＭＰ responsive element binding protein（以下、本明細書において「ＣＲＥＢ」という」）の遺伝子発現活性を制御しているタンパク質である。
【００３５】
なお、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ヒトまたは他の温血動物由来のＳＩＫ２遺伝子の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅することによって得られる。本発明者らは、すでにＳＩＫ２が３つのドメイン部分を有していることを見出しており、それらは、キナーゼ活性を有するキナーゼドメイン（ドメイン１）、タンパクの安定化の役割を果たしている安定化ドメイン（ドメイン２）およびキナーゼ活性を制御している制御ドメイン（ドメイン３）であり、ドメイン２がリン酸化制御を受け、リン酸化により転写抑制活性を失うことを明らかにしている。
【００３６】
ドメイン３は転写抑制に特に重要な役割を有しいることを見出している。本発明においては、ＳＩＫ２の制御ドメイン部分を用いることが重要であり、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＳＩＫ２のドメイン３部分である。
【００３７】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：１で表わされるポリペプチドである、ヒト由来のＳＩＫ２の５７７番目のプロリンから６２３番目のグルタミンまでの４７アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン３部分）である、ペプチド配列である。また、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとは、配列番号：１で表わされるポリペプチドである、ヒト由来のＳＩＫ２の５７７番目のプロリンから５９４番目のグリシンまでの１８アミノ酸からなる制御ドメイン部分（ドメイン３部分）である、ペプチド配列である。
【００３８】
配列番号：２又は配列番号：３で表わされるポリペプチドは、従来より公知のペプチドの合成法に従って製造してもよく、また、配列番号：１で表わされるポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を制御しているとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによってｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写調節活性を有する。すなわち、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＳＩＫ２のタンパク質リン酸化活性を制御するとともに、脂肪細胞を含む一般的な培養細胞内で発現させた場合にはリン酸化を受けることによってｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）制御下にある遺伝子の転写活性のモジュレータとしての機能を有する。
【００３９】
本明細書において、「実質的に同一」とは、ポリペプチドの活性が同一であること、すなわち、遺伝子転写活性の制御機能を有することを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換または付加された場合、その欠失、置換または付加がなされたポリペプチドは、欠失、置換または付加がなされていないものと活性が同一であれば、実質的に同一である。一般的に、相同性の程度が、全体の９０％、好ましくは９５％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、実質的に同一であると解釈される。一般には、アミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるポリペプチドは実質的に同一である。
【００４０】
配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、直接ポリペプチドとしてスクリーニング系に添加することもできるし、又は配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系中で該タンパク質が発現されるように系を構築することも可能である。該タンパク質をコードする遺伝子は、通常の遺伝子組み換え技術によって構築することができる。遺伝子配列情報をもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ法やハイブリダイズ法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができる。これらを適当なベクターのプロモーターの下流に連結して該タンパク質を発現するベクターを作成することにより、適当な宿主中で該タンパク質を発現させることができる。用いられるベクターや宿主については、上述したＰＰＡＲと同様である。
【００４１】
ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（以下、本明細書において「ＰＫＡ」ともいう）は、直接タンパク質としてスクリーニング系に添加することもできるし、又はＰＫＡをコードする遺伝子を含むベクターを用いて、スクリーニング系中でＰＫＡが発現されるように系を構築することも可能である。該ＰＫＡをコードする遺伝子は、通常の遺伝子組み換え技術によって構築することができる。遺伝子配列情報をもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、ＰＣＲ法やハイブリダイズ法によりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができる。これらを適当なベクターのプロモーターの下流に連結して該タンパク質を発現するベクターを作成することにより、適当な宿主中でＰＫＡを発現させることができる。
【００４２】
チアゾリジンジオン誘導体としては、例えばトログリタゾン、ピオグリタゾン、ロジグリタゾン、５−〔４−（２−メチル−６−ニトロ−４−オキソクロマン−２−イルメトキシ）ベンジル〕チアゾリン−２，４−ジオン、５−〔４−（６−アミノ−２，５，７，８−テトラメチル−４−ヒドロキシクロマン−２−イルメトキシ）ベンジル〕チアゾリジン−２，４−ジオン、５−〔４−（６−アミノ−２，５，７，８−テトラメチル−４−オキソクロマン−２−イルメトキシ）ベンジル〕チアゾリジン−２，４−ジオン等が挙げられる。
【００４３】
プロスタグランジン類としては、例えば、プロスタグランジン Ｅ2、プロスタグランジン Ｆ2α、プロスタグランジン Ｇ2、プロスタグランジン Ｈ2、プロスタグランジン Ｉ2、プロスタグランジン Ｊ2、プロスタグランジンＤ2、トロンボキサンＡ2等が挙げられる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法は、スクリーニング系に上記成分を加え、レポーター遺伝子の発現を指標として、被検物質の作用を測定する。該スクリーニング方法は、in vivo及びin vitroで行いうる。これに限定するわけではないが、本発明のスクリーニング方法は、ＤＮＡ結合因子をコードする遺伝子を含むベクター、該ＤＮＡ結合因子に対応する応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むベクター、配列番号：１、配列番号：２又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター、及びｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを保持する細胞を、被検物質と接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、上記被検物質の作用を測定することによって行なうことが好ましい。用いられる細胞としては哺乳動物細胞が好ましく、哺乳動物細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＶ１、ＨｅＬａ、３Ｔ３−Ｌ１、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７等が挙げられる。
なお、遺伝子の導入は、慣用のリポソーム法やエレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００４５】
遺伝子導入された哺乳動物細胞は、例えば、約５〜２０％の仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地に、ＰＫＡ、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジン類を加えて培養することができる。培地のｐＨは６〜８程度であることが好ましく、培養は、通常約３０〜４０℃の温度で約３〜７２時間行なう。
培養終了後、細胞を回収して適当な溶解バッファー中で破砕し、遠心によって上清を得て細胞抽出液とし、これを用いてレポーター遺伝子の発現をアッセイする。
【００４６】
本発明者らは、上述したＳＩＫ２の５８７番目のセリンをアラニンに置換すると、ＰＫＡによるリン酸化が起こらなくなることを見出し、このＰＫＡによるリン酸化能を失ったポリペプチドがＰＫＡと、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジンの存在下でＰＰＡＲの活性を促進することを見出した。
従って、ＳＩＫ２（５８７Ａ）の作用と同等の作用を示す化合物はチアゾリジンジオン誘導体の使用量を減らすことができると考えられる。従って、ＰＰＡＲの活性を促進することのできる化合物は、糖・脂質の代謝異常に関与する疾患の治療薬として利用できる可能性がある。従って、本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされる化合物は、肥満・糖尿病の治療薬の開発に有用である。
【００４７】
上述した説明においては、ＤＮＡ結合因子としてＰＰＡＲ又はＰＰＡＲと他の転写因子との融合タンパク質を用いたが、本発明においては、ＤＮＡ結合因子としてｃＡＭＰレスポンスエレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）又はＣＲＥＢと他の転写因子との融合タンパク質を用いることもできる。
ＣＲＥＢは、活性化されたＰＫＡによってリン酸化され、リン酸化後にｃＡＭＰ応答配列（以下、本明細書において「ＣＲＥ」ともいう）に結合し、遺伝子の転写活性を制御する機能を有している。
【００４８】
本発明者らは、ＳＩＫ２（５８７Ａ）が、ＰＫＡと、チアゾリジンジオン誘導体又はプロスタグランジンの存在下でＣＲＥＢの活性を抑制することを見出した。
従って、ＳＩＫ２（５８７Ａ）の作用と同等の作用を示す化合物はチアゾリジンジオン誘導体の使用量を減らすことができると考えられる。従って、ＣＲＥＢの活性を抑制することのできる化合物は、糖・脂質の代謝異常に関与する疾患の治療薬として利用できる可能性がある。従って、本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされる化合物は、肥満・糖尿病の治療薬の開発に有用である。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法において、ＤＮＡ結合因子としてＣＲＥＢを用いる場合も、ＰＰＡＲを用いる場合と同様に、他の転写因子との融合タンパク質を用いることもできる。本発明において、用いられる転写因子としては、例えば酵母由来のＧＡＬ４タンパク質、ＧＣＮ４タンパク質、ＡＤＲ１タンパク質等が挙げられる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法において、ＤＮＡ結合因子としてＣＲＥＢを用いる場合、他の成分等については上述した方法と同様である。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
ラットＳＩＫ１と５’端が相同であるＥＳＴクローン（ＩＤ：2842716、GenBank acc:AV146436）、および３’端が相同であるＥＳＴクローン（ＩＤ：IMAGE1230878、GenBank acc：AA880086）のｃＤＮＡ配列を参考に、配列番号：５で表わされるヒトＳＩＫ２の５’端プライマー、および配列番号：６で表わされるヒトＳＩＫ２の３’端プライマーを作製した。なお、配列番号：５の５’端から８番目の塩基まではＢａｍＨＩリンカーである。また、配列番号：６の４６番目のＧは元々はＴであるためＢａｍＨＩで切断されるが、以下のクローニング作業によりＢａｍＨＩ切断部位はｃＤＮＡの５’に存在することが好ましいため、この位置のＴをＧに置換している。次いで、マウス白色脂肪細胞（Ｓｌｃ：ｄｄｙ（日本エスエルシー））由来ＲＮＡからＳＩＫ２の蛋白翻訳領域全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。得られたｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４に示す。
増幅したｃＤＮＡをｐＴａｒｇｅｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ付属の酵素を使用して導入し、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２を得た。
【００５２】
タンパク質リン酸化活性を欠損させたｈＳＩＫ２（Ｋ４９Ｍ）を、配列番号：７で表わされるオリゴＤＮＡ、およびｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２を鋳型とし、ＧｅｎＥｄｉｔｏｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を利用して部位特異的変異法により作製した。作製した変異ＳＩＫ２  ｃＤＮＡは全長ＳＩＫ２の49番目のリジンがメチオニンに置換された変異ＳＩＫ２をコードしている。得られたｃＤＮＡをｐＴａｒｇｅｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ付属の酵素を使用して導入し、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（４９Ｍ）を得た。
【００５３】
ＰＫＡリン酸化部位を破壊したＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）を、配列番号：８で表わされるオリゴＤＮＡ、およびｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２を鋳型とし、ＧｅｎＥｄｉｔｏｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を利用して部位特異的変異法により作製した。作製した変異ＳＩＫ２  ｃＤＮＡは全長ＳＩＫ２の５８７番目のセリンがアラニンに置換された変異ＳＩＫ２をコードしている。得られたｃＤＮＡをｐＴａｒｇｅｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へ付属の酵素を使用して導入し、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（Ｓ５８７Ａ）を得た。
【００５４】
ＰＭ−ＰＰＡＲγは、ＰＭベクター（Invitrogen Corp）にＰＰＡＲγ遺伝子を導入したものである。
ｐＩＲＥＳ−ＰＫＡは、ｐＩＲＥＳベクター（Clonetec Corp）にＰＫＡ遺伝子を導入したものである。
【００５５】
Opti-MEM(Invitrogen Corp)250μlを入れた試験管に、pRL-SV40ベクター（プロメガ株式会社）30ng、pTAL-GAL(pTAL-LucにGAL遺伝子を導入したもの；ClonetecCorp)200ng、pM-PPARγ 200ng及びpTargetベクター (プロメガ株式会社)200ngを加えた。この試験管に、さらにpIRESベクター（ClonetecCorp）又はpIRES-PKA 100ngを加え、リポフェクタミン2000（InvitrogenCorp）3μlを用いて、HEK293細胞をトランスフェクションした。４．５時間インキュベーションした後、10％仔ウシ血清を含むDMEM培地2ｍlへ培地交換を行ない、３７℃で24時間培養した。培養後、デュアルルシフェラーゼ定量試薬（プロメガ株式会社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、PKAの非存在下および存在下におけるPPARγの転写活性を調べた。
【００５６】
また、上記pTargetベクターに代えて、pTarget-SIK2、pTarget-SIK2(587A)、またはpTarget-SIK2(49M)を用いて同様にトランスフェクションし、SIK2及び変異型SIK2のPPARγの転写活性への影響を調べた。
更に、上述と同様に遺伝子導入した８種類のHEK293細胞の培地中にトログリタゾンを10-6モル濃度になるように加え、上述と同様に培養、ルシフェラーゼ活性を測定し、トログリタゾンの存在下におけるPPARγの転写活性を測定した。
上記実験は、pM-PPARγに代えてpMベクター（Invitrogen Corp）を用いた実験をコントロールとした。
【００５７】
結果を図１に示す。図１は、ＰＰＡＲγ転写活性に対する影響を調べた結果を示す図である。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性を示す（図１におけるルシフェラーゼ活性の単位は、ｐＭベクターを用いたコントロールにおけるルシフェラーゼ活性を１とした場合の比で表した。）。グラフにおいては、左側から、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（５８７Ａ）、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（４９Ｍ）を用いた場合の結果である。グラフのそれぞれにおいて、左側から、ＰＫＡ及びトログリタゾン非存在下における結果、ＰＫＡ存在下でトログリタゾン非存在下における結果、ＰＫＡ非存在下でトログリタゾン存在下における結果、ＰＫＡ及びトログリタゾン存在下における結果を示す。
【００５８】
図１に示すように、ＰＰＡＲγの転写活性は、ＰＫＡ、又はトログリタゾンの存在下では、ＳＩＫ２、ＳＩＫ２（５８７Ａ）及びＳＩＫ２（４９Ｍ）のいずれが存在してもほとんど同じであった。これに対し、ＰＫＡ及びトログリタゾンの存在下においては、ＳＩＫ２（５８７Ａ）の存在下では、ＳＩＫ２、ＳＩＫ（４９Ｍ）の存在下よりも活性が向上していた。
【００５９】
実施例２
トログリタゾンに代え、プロスタグランジンＪ２（濃度：３．０μＭ）を用いて、実施例１と同様に操作を行い、ＰＰＡＲγの転写活性を測定した。結果は示さないが、プロスタグランジンＪ２及びＰＫＡが存在する場合には、ＳＩＫ２（５８７Ａ）の存在下では、ＳＩＫ２、ＳＩＫ（４９Ｍ）の存在下よりも活性が向上していた。
【００６０】
実施例３
ＰＭ−ＣＲＥＢは、ＰＭベクター（Invitrogen Corp）にＣＲＥＢ遺伝子を導入したものである。
【００６１】
Opti-MEM(Invitrogen Corp)250μlを入れた試験管に、pRL-SV40ベクター（プロメガ株式会社）30ng、pTAL-GAL(pTAL-LucにGAL遺伝子を導入したもの；ClonetecCorp)200ng、pM-ＣＲＥＢ 200ng及びpTargetベクター (プロメガ株式会社)200ngを加えた。この試験管に、さらにpIRESベクター（Clonetec Corp）又はpIRES-PKA100ngを加え、リポフェクタミン2000（InvitrogenCorp）3μlを用いて、HEK293細胞をトランスフェクションした。４．５時間インキュベーションした後、10％仔ウシ血清を含むDMEM培地2ｍlへ培地交換を行ない、３７℃で24時間培養した。培養後、デュアルルシフェラーゼ定量試薬（プロメガ株式会社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、PKAの非存在下および存在下におけるＣＲＥＢの転写活性を調べた。
【００６２】
また、上記pTargetベクターに代えて、pTarget-SIK2、pTarget-SIK2(587A)、またはpTarget-SIK2(49M)を用いて同様にトランスフェクションし、SIK2及び変異型SIK2のＣＲＥＢの転写活性への影響を調べた。
更に、上述と同様に遺伝子導入した８種類のHEK293細胞の培地中にトログリタゾンを10-6モル濃度になるように加え、上述と同様に培養、ルシフェラーゼ活性を測定し、トログリタゾンの存在下におけるＣＲＥＢの転写活性を測定した。
上記実験は、pM-ＣＲＥＢに代えてpMベクター（Invitrogen Corp）を用いた実験をコントロールとした。
【００６３】
結果を図２に示す。図２は、ＣＲＥＢ転写活性に対する影響を調べた結果を示す図である。グラフの縦軸はルシフェラーゼ活性を示す（図２におけるルシフェラーゼ活性の単位は、ｐＭベクターを用いたコントロールにおけるルシフェラーゼ活性を１とした場合の比で表した。）。グラフにおいては、左側から、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（５８７Ａ）、ｐＴａｒｇｅｔ−ＳＩＫ２（４９Ｍ）を用いた場合の結果である。グラフのそれぞれにおいて、左側から、ＰＫＡ及びトログリタゾン非存在下における結果、ＰＫＡ存在下でトログリタゾン非存在下における結果、ＰＫＡ非存在下でトログリタゾン存在下における結果、ＰＫＡ及びトログリタゾン存在下における結果を示す。
【００６４】
図２に示すように、ＣＲＥＢの転写活性は、ＰＫＡ、又はトログリタゾンの存在下では、ＳＩＫ２、ＳＩＫ２（５８７Ａ）及びＳＩＫ２（４９Ｍ）のいずれが存在してもほとんど同じであった。これに対し、ＰＫＡ及びトログリタゾンの存在下においては、ＳＩＫ２（５８７Ａ）の存在下では、ＳＩＫ２、ＳＩＫ（４９Ｍ）の存在下よりも活性が抑制されていた。
【００６５】
実施例４
トログリタゾンに代え、プロスタグランジンＪ２（濃度：３．０μＭ）を用いて、実施例３と同様に操作を行い、ＣＲＥＢの転写活性を測定した。結果は示さないが、プロスタグランジンＪ２及びＰＫＡが存在する場合には、ＳＩＫ２（５８７Ａ）の存在下では、ＳＩＫ２、ＳＩＫ（４９Ｍ）の存在下よりも活性が抑制されていた。
【００６６】
実施例５
Opti-MEM(InvitrogenCorp)250μlを入れた試験管に、pRL-SV40ベクター（プロメガ株式会社）30ng、pTAL-GAL(Clonetec Corp)200ng、pM-PPARγ 200ng及びpTarget-SIK2ベクター 200ngを加えた。この試験管に、更にpIRES-PKA100ngを加え、リポフェクタミン2000（InvitrogenCorp）3μlを使用してHEK293細胞をトランスフェクションした。３７℃で4.5時間培養した後、10％仔ウシ血清を含むDMEM培地2ｍlへ培地交換を行ない、培地中に10-6モルのトログリタゾン及び試験化合物を加え、３７℃で24時間培養した。培養後、デュアルルシフェラーゼ定量試薬（プロメガ株式会社）を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、試験化合物存在下におけるPPARγの転写活性を調べた。試験化合物存在下におけるPPARγの活性が、ＳＩＫ２（５８７Ａ）存在下におけるＰＰＡＲγの活性と同程度である場合、その試験化合物はＳＩＫ２の活性を制御するものであり、その試験化合物は糖尿病治療薬として用いることのできるものである可能性が高い。
【００６７】
実施例６
pM-PPARγに代え、pM-CREBを用いた以外は実施例５と同様に操作を行い、ルシフェラーゼ活性を測定し、CREBの転写活性を調べた。試験化合物存在下におけるCREBの活性がＳＩＫ２（５８７Ａ）存在下におけるＣＲＥＢの活性と同程度である場合、その試験化合物はＳＩＫ２の活性を制御するものであり、その試験化合物は糖尿病治療薬として用いることのできるものである可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＰＰＡＲγ転写活性に対する影響を調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、ＣＲＥＢ転写活性に対する影響を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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