(57)【要約】【課題】含有ＤＮＡ量が極微量である試料や、ＤＮＡの断片化が起っている試料など、従来の個人識別法において判定が困難であった試料からも、容易に個人識別ができる方法を提供する。【解決手段】識別すべき個人のＤＮＡを含む試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を利用して個人を識別する、個人識別法。複数個人のＤＮＡの情報が、前記複数個人の名前又は前記複数個人を特定することができる記号と共に収納されたデータベースを用意し、識別すべき特定個人のＤＮＡを含有する試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を得て、前記データベースに収納された前記複数個人のＤＮＡの情報と、前記特定個人のＤＮＡの情報とを照合し、前記特定個人を識別する、個人識別法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別すべき個人のＤＮＡを含む試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を利用して個人を識別する、個人識別法。
【請求項２】
前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型を利用する、請求項１に記載の個人識別法。
【請求項３】
前記ＤＮＡの情報としてＳＴＲ多型を利用する、請求項１又は２に記載の個人識別法。
【請求項４】
前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型とＳＴＲ多型とを組み合わせて利用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の個人識別法。
【請求項５】
複数個人のＤＮＡの情報が、前記複数個人の名前又は前記複数個人を特定することができる記号と共に収納されたデータベースを用意し、
識別すべき特定個人のＤＮＡを含有する試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を得て、
前記データベースに収納された前記複数個人のＤＮＡの情報と、前記特定個人のＤＮＡの情報とを照合し、前記特定個人を識別する、個人識別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子検査及びＤＮＡ鑑定に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪試料を利用した個人識別は、ＳＴＲ多型などのＤＮＡ型を判定する方法を用いて、従来から行われている。特に毛髪試料に毛根鞘が付着している場合は、ＭＣＴ１１８検査法やＨＬＡＤＱα検査法などによって、比較的容易にＤＮＡ型判定を行うことが可能である。（例えば、科学警察研究所報告法科学編、第５０巻、第１号、１９９７年２月参照。）しかしながら、毛髪試料が自然脱毛や毛幹部のみである場合は、試料中に含有されるＤＮＡが微量であり、かつ断片化が起こっているため、ゲノムを用いたＤＮＡ判定を行うことが難しい。一方、ミトコンドリアＤＮＡはその回収が容易であるためにＤＮＡ判定によく用いられるが、現状では５０〜１００人に１人の割合で同じ結果が出ると言われており、検出感度の低さが問題となる。
【０００３】
【非特許文献１】科学警察研究所報告法科学編、第５０巻、第１号、１９９７年２月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明の目的は、含有ＤＮＡ量が極微量である試料や、ＤＮＡの断片化が起っている試料など、従来の個人識別法において判定が困難であった試料からも、容易に個人識別ができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）識別すべき個人のＤＮＡを含む試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を利用して個人を識別する、個人識別法。
（２）前記試料が毛髪、爪、皮膚、口腔粘膜及び血液から選ばれる、前記（１）に記載の個人識別法。
（３）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型を利用する、前記（１）又は（２）に記載の個人識別法。
（４）前記ＤＮＡの情報としてＳＴＲ多型を利用する、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の個人識別法。
（５）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型とＳＴＲ多型とを組み合わせて利用する、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の個人識別法。
（６）複数個人のＤＮＡの情報が、前記複数個人の名前又は前記複数個人を特定することができる記号と共に収納されたデータベースを用意し、
識別すべき特定個人のＤＮＡを含有する試料から抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を行い、その後、前記ＤＮＡの情報を得て、
前記データベースに収納された前記複数個人のＤＮＡの情報と、前記特定個人のＤＮＡの情報とを照合し、前記特定個人を識別する、個人識別法。
（７）前記試料が毛髪、爪、皮膚、口腔粘膜及び血液から選ばれる、前記（６）に記載の個人識別法。
（８）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型を利用する、前記（６）又は（７）に記載の個人識別法。
（９）前記ＤＮＡの情報としてＳＴＲ多型を利用する、前記（６）〜（８）のいずれかに記載の個人識別法。
（１０）前記ＤＮＡの情報としてミトコンドリアＤＮＡ多型とＳＴＲ多型とを組み合わせて利用する、前記（６）〜（９）のいずれかに記載の個人識別法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、含有ＤＮＡ量が極微量である試料や、ＤＮＡの断片化が起っている試料など、従来の個人識別法において判定が困難であった試料からも、容易に個人識別ができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において個人識別のために用いられる試料には、人体由来試料や人体由来試料を含む物体などが挙げられる。人体由来試料としては、体液、組織、及びそれらに由来する細胞などが挙げられる。体液としては、血液、唾液、精液などが挙げられる。組織としては、毛髪、骨、歯牙、爪、皮膚、口腔粘膜などが挙げられる。また、人体由来試料を含む物体としては、例えば血痕の付着した着衣、唾液が付着した切手などが挙げられ、また、血液を採取したろ紙や包埋試料切片などの組織標本なども挙げられる。本発明は特に、毛髪、爪、皮膚、口腔粘膜、血液（血痕）等を試料として用いる個人識別において好ましく用いられる。また本発明は、含まれるＤＮＡ量が極微量であったり、断片化していたりする試料から個人識別を行う場合に特に有効である。このような試料としては、例えば、毛根鞘がない毛幹部のみの毛髪試料などが挙げられる。
【０００８】
本発明においては、上記試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いる。抽出方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。
【０００９】
抽出されたゲノムＤＮＡに対しては、ゲノムＤＮＡ全体を増幅する処理を行う。このことによりゲノムＤＮＡ全体を数百万倍程度まで増幅することができる。ゲノムＤＮＡ全体の増幅法としては、GenomiPhi DNA Amplification kit（アマシャムファルマシア社製）による増幅法、ＤＯＰ(degenerate oligonucleotide primed)−ＰＣＲ法、ＰＥＰ(primer extension preamplification)−ＰＣＲ法などを用いることができる。試料のゲノムＤＮＡ全体を増幅する処理を行うことにより、試料から抽出することができるＤＮＡ量が極微量であったり、ＤＮＡの断片化が起ったりしていても、目的領域のＤＮＡ増幅が可能となる。毛髪を試料に用いた場合を例に挙げて説明すると、従来法では、試料の毛髪の洗浄・ＤＮＡの抽出を行った後にＰＣＲ処理を行っても、解析が不能となる場合がある。一方、本発明では、試料の毛髪の洗浄・ＤＮＡの抽出を行った後、ゲノムＤＮＡの増幅処理を行うため、その後のＰＣＲ反応、及びシーケンスやＳＴＲ解析などを行うことが可能になる。従って、個人識別の判定が可能となる。
【００１０】
次に、増幅されたゲノムＤＮＡから目的の領域、すなわち、個人識別に利用するＤＮＡの情報が存在する部位を含む領域を増幅する。このような部位としては、ＤＮＡの情報を利用する通常の個人識別の場合と同様に、個人間で多型性を示すことが知られている部位を選択することができる。このような部位は、ミトコンドリアＤＮＡや核ＤＮＡなどに存在する。
【００１１】
ミトコンドリアＤＮＡは個人間の多型性が高いことで知られている。従って本発明においては、ミトコンドリアＤＮＡ多型の情報を利用することが好ましい。特にミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域には多くの多型が蓄積されているため、Ｄループ領域の多型情報を利用することはより好ましい。
【００１２】
核ＤＮＡにおいては、ミニサテライト・マイクロサテライトの反復数が個人間で異なることが知られている。従って、ミニサテライト・マイクロサテライト多型情報から個人を識別することができる。本発明においては、マイクロサテライト多型としてＳＴＲ多型の情報を利用することが好ましい。ＳＴＲ型としては、ＴＨ０１型などが挙げられる。また、一塩基多型を必要数解析することによって個人を識別することも可能である。
【００１３】
さらに本発明においては、上記多型情報を２種類以上組み合わせて利用することにより個人識別の判定の確度を高めることが好ましい。例えば、いくつかのＳＴＲ多型の情報を組み合わせて判定しても良いし、ＳＴＲ多型とミトコンドリア多型との情報を組み合わせて判定しても良い。この中でも、本発明においては、ＳＴＲ多型とミトコンドリア多型との情報を組み合わせて個人識別の判定を行うことが好ましい。
【００１４】
上述の多型部位を含む領域を増幅する方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。例えば、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの方法を用いることができる。
増幅された領域のＤＮＡに対しては、公知の方法によって解析を行うことにより配列の解読やタイプの分類を行い、ＤＮＡ多型情報を得る。
【００１５】
個人識別の判定は、例えば、以下のようにして行うことができる。由来元となる特定個人を識別すべき未知試料から、上述のようにゲノムＤＮＡの増幅を行うことによってＤＮＡの情報を得る。別途、前記未知試料の由来元となる特定個人である可能性がある個人から、ＤＮＡを含む試料を採取し、同様の操作を行い、ＤＮＡの情報を得る。両方のＤＮＡの情報を照合する。照合の結果、双方が一致する場合、前記個人は前記未知試料の由来元となる特定個人であると高い確率で判定することができる。反対に一致しない場合、前記個人は前記特定個人でないと高い確率で判定することができる。なお、上述の例においては、未知試料、及び、特定個人である可能性がある個人から採取したＤＮＡを含む試料の両方に対して、ゲノムＤＮＡの増幅処理を行っているが、どちらか一方のみ、例えば回収することができるＤＮＡ量が極少ない試料に対してのみ、前記処理を行っても構わない。
【００１６】
また本発明においては、特定個人である可能性がある個人を複数選択してもよい。この場合は、複数個人から採取した試料と前記未知試料とのＤＮＡの情報をそれぞれ照合する。照合の結果、前記未知試料とＤＮＡの情報が一致する試料がある場合、一致した試料の採取元が前記特定個人であると高い確率で判定することができる。反対にＤＮＡの情報が一致する試料がない場合、前記複数個人の中に前記特定個人はいないと高い確率で判定することができる。
【００１７】
さらに、複数個人のそれぞれのＤＮＡの情報が、それぞれの個人名又は個人を特定することができる記号とともに収納されたデータベースを用いることによって個人識別することもできる。すなわち、未知試料から上述のようにゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を経ることによって得られたＤＮＡの情報と、前記データベースに収納されたＤＮＡの情報とを照合して個人を識別することができる。ここで前記記号としては、アルファベットや数字などから構成される番号や、バーコードなども含まれる。記号を用いたデータベースを用いるときは、通常、データベースとは別に、記号と個人名とを対応させたリストも共に用いる。このリストによって、記号から個人を特定することができる。
【００１８】
データベースの対象となる複数個人としては、未知試料の由来元となる特定個人である可能性がある者が挙げられる。例えば、未知試料が製品又は製品の製造にかかわる設備中に混入した毛髪などの異物である場合、データベースの対象となる複数個人は、製品又は製品の製造に関わる設備中にその異物を混入させる機会のある従業員などである。
【００１９】
このようなデータベースは、例えば、以下のように作成することができる。
まず、未知試料の由来元となる特定個人である可能性がある複数個人から構成される母集団を選択する。選択された母集団の各個人について、ＤＮＡの情報を得て、記録する。
【００２０】
例えば、ミトコンドリアＤＮＡの多型情報について記録する場合は、以下のように記録することができる。まず、前記複数個人から採取された試料のＤＮＡ配列をそれぞれ解読する。別途、前記複数個人の以外の個人をモデル試料提供者として選択し、選択された個人から採取されたモデル試料のＤＮＡ塩基配列を解読する。モデル試料についてはそのＤＮＡ塩基配列を記録し、複数個人から採取された試料については、モデル試料のＤＮＡ塩基配列と異なる塩基を有する部位の塩基のみを記録することができる。このとき、前記母集団の各個人の名前又は各個人を特定することができる記号とともにそれぞれの多型情報を記録する。
【００２１】
また例えば、ＳＴＲ多型情報について記録する場合は、以下のように記録することができる。すなわち、前記母集団の各個人から採取された試料について多型のタイプを特定し、各個人の名前または各個人を特定することができる記号とともに、特定されたそれぞれの多型のタイプを記録することができる。
【００２２】
上記のように記録されたものを、データベースとして利用することができる。前記未知試料のＤＮＡの情報とデータベース中のＤＮＡの情報とを照合した結果、前記未知試料とＤＮＡの情報が一致する試料がある場合、一致した試料の採取元が前記特定個人であると高い確率で判定することができる。反対にＤＮＡの情報が一致する試料がデータベース中にない場合、前記母集団の中に前記特定個人はいないと高い確率で判定することができる。
【００２３】
以下、さらに具体的な例を挙げて本発明を説明する。
［毛幹部からのゲノムＤＮＡの抽出］
成人５名にＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧのそれぞれの検体記号を付し、検査試料として頭毛の毛幹部６cmをそれぞれ採取した。それぞれの検査試料をエタノールで洗浄、乾燥した後、０．５〜１cmに細切した。市販の抽出キット「ＩＳＯＨＡＩＲ」（日本ジーン製）を使用し、キットに添付された説明書のプロトコルに従ってそれぞれの試料からＤＮＡの抽出を行った。
【００２４】
［ゲノムＤＮＡの増幅］
抽出したＤＮＡから１μlを用いて、ゲノムＤＮＡの増幅を行った。このとき、市販の抽出キット「GenomiPhi DNA Amplification kit」（アマシャムファルマシア社製）を使用し、キットに添付された説明書のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡの増幅を行った。３０℃での増幅反応は、１６時間行った。ここで、ゲノムＤＮＡ増幅を行う前のゲノムＤＮＡと、ゲノム増幅を行った後のゲノムＤＮＡとについて、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図１に示す。ここで、＋は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行った試料を表し、−は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行う前の試料を表す。図１が示すように、明らかな増幅が観察された。
【００２５】
［目的領域の核酸増幅］
目的とする増幅領域を、ＳＴＲ領域及びミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域とした。
ＳＴＲ解析用の蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーを用意した。これは、ＳＴＲ領域としてＴＨ０１領域の１５４〜１７８ｂｐを増幅するものを選択し、プライマーセットの配列をＤＮＡ多型Vol6 264-267より入手した。フォワードプライマーについては、ＴＡＭＲＡ蛍光標識を行った。以下に、用いたプライマーの配列を示す。
フォワードプライマー  GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT  （配列番号１）
リバースプライマー    GTGATTCCCATTGGCCTGTTCCTC  （配列番号２）
【００２６】
ミトコンドリアＤＮＡのＤループ解析用のオリゴヌクレオチドプライマーを用意した。これは、Ｄループ領域の中でも多型の多い１５９７８〜３８ｂｐの６２９ｂｐを増幅するものを選択した。以下に、用いたプライマーの配列を示す。
フォワードプライマー  ACCATTAGCACCCAAAGCTA      （配列番号３）
リバースプライマー    GAGGGCACTCACCAATTATCC     （配列番号４）
【００２７】
上記プライマーを用いて、各領域のＰＣＲ増幅を下記の方法で行った。増幅したＤＮＡを１〜１０6倍まで１０倍ずつ段階希釈を行ったものを１μlずつ反応に用いた。上記各プライマーを３pmolずつ、各ヌクレオチド３リン酸（dNTP）を１０nmolずつ、１０× Ex Taq bufferを１μl、ET Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を０．３unit加え、全液量を１０μlとしてＰＣＲ反応を行った。
【００２８】
ＰＣＲ反応の条件は、最初の変性条件のみ９５℃で２分間、その後は、それぞれ次の条件下で増幅反応を行った。変性条件が９５℃で３０秒間、アニーリングは５８℃で３０秒間、伸長反応は７２℃で４５秒間のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で８分間の伸長反応を行い、目的のＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応の確認は、２〜５μlのＰＣＲ産物を２％アガロースで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、増幅産物のバンドを確認した。この結果、Ｄループ領域のＰＣＲ増幅産物で１０5倍、ＴＨ０１領域のＰＣＲ増幅産物で１０3倍希釈した試料においてＰＣＲ産物のバンドが確認できた。
【００２９】
［ゲノムＤＮＡ増幅の効果の検証］
また別途、ゲノムＤＮＡ増幅を行う前の抽出ＤＮＡ１μlについても上記プライマーを用いて各領域のＰＣＲ増幅処理を行った。ゲノムＤＮＡ増幅を行った後にＰＣＲ増幅した試料と、ゲノム増幅を行わずにＰＣＲ増幅した試料とのアガロースゲル電気泳動の結果を図２の（ａ）及び（ｂ）に示す。図２の（ａ）は、ミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域のＰＣＲ増幅結果である。図２の（ｂ）は、ＴＨ０１領域のＰＣＲ増幅結果である。両方の図において、＋は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行った試料を表し、−は、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行わなかった試料を表す。両方の図が示すように、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行なわかった試料はＰＣＲ増幅が認められないが、ゲノムＤＮＡ増幅処理を行った試料はＰＣＲ増幅が認められた。
【００３０】
［解析結果］
ＴＨ０１領域のＰＣＲ産物については、さらに１０倍に希釈した後、RISA 384 sequencer（島津製作所製）を用いて電気泳動し、蛍光を検出することで多型のバンドを確認し、ＴＨ０１型を判定した。この結果を図３に示す。図３が示すように、全ての検体において明瞭なバンドの分離が認められた。これらの泳動パターンから、５検体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧは、ＡＡ、ＢＤ及びＡＤの３種類のタイプに分類することができた。
【００３１】
ミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域のＰＣＲ産物については、オートシークエンサーを用いたダイレクトシーケンス法により塩基配列を解析した。すなわちＰＣＲ産物からプライマー除去キット（EXO-SAP、アマシャムファルマシア社製）を用いてプライマーを除き、Thermo Sequenase cycle sequencing kit（アマシャムファルマシア社製）によってサイクルシーケンシング反応を行い、RISA 384 sequencer（島津製作所製）で電気泳動して塩基配列を決定した。また、別途、５検体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧ以外の個人からモデル試料として頭毛の毛幹部を採取し、５検体から採取した試料に対して行った処理と同様の処理を行うことによって、ミトコンドリアＤＮＡのＤループ領域のＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
【００３２】
表１に、モデル試料（sample）の塩基配列及び５検体Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧから採取した試料の１５９７８〜３８ｂｐの塩基配列中、多型が認められた１５の部位（１６１２９、１６１３７、１６１４７、１６１４９、１６１５９、１６１８４、１６１９４、１６２４５、１６２７５、１６２８２、１６２９５、１６２９６、１６２９８、１６３３３、及び１６４９０番目のポジション）を表した。モデル試料については、１５の部位全てを具体的にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣで表した。５検体から採取した試料については、便宜的に、モデル試料の多型部位の塩基と異なる塩基のみを具体的にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣで表し、モデル試料の多型部位の塩基と同じ塩基は＊で表している。さらに表１には、前述のようにして得られた５検体のＴＨ０１型（TH01 type）も記載した。表１が示すように、５検体の全てにおいて異なるハプロタイプが判定した。
【００３３】
【表１】
2005065617.tif 000003
【００３４】
従って、表１は、個人識別のためのデータベースとして利用することができる。すなわち、未知試料から、上述のようにゲノムＤＮＡ全体の増幅処理を経て得られたＤＮＡの情報と、表１のデータベースとを照合し、ＤＮＡの情報が一致するかどうかを調べる。例えば、未知試料について個人ＡとＤＮＡの情報が一致した場合、未知試料の由来元は個人Ａであると高い確率で判定することができる。反対に、未知試料について表１中にＤＮＡの情報が一致するものがない場合、未知試料の由来元は個人Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＧのいずれでもないと高い確率で判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ゲノムＤＮＡ増幅処理の効果を表す電気泳動の結果である。
【図２】ゲノムＤＮＡ増幅処理の効果を表す電気泳動の結果である。
【図３】ＴＨ０１型の判定結果である。
【図１】
2005065617.tif 000004
【図２】
2005065617.tif 000005
【図３】
2005065617.tif 000006
【配列表】
2005065617000001.app