(57)【要約】【課題】  簡易かつ確実に細胞提供者由来の細胞か否かを判定可能とする。【解決手段】  細胞提供者のＨＬＡ型を検査し（第１ステップＳ１）、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し（第２ステップＳ２）、採取した前記培養細胞のＨＬＡ型を検査し（第３ステップＳ３）、前記細胞提供者のＨＬＡ型と前記培養細胞のＨＬＡ型とを比較し（第４ステップＳ４）、一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する（第５ステップＳ５）培養細胞の取り違え防止方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞提供者のＨＬＡ型を検査し、
提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し、
採取した前記培養細胞のＨＬＡ型を検査し、
前記細胞提供者のＨＬＡ型と前記培養細胞のＨＬＡ型とを比較し、
一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する培養細胞の取り違え防止方法。
【請求項２】
細胞提供者の体液を採取し、
提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し、
採取した前記細胞提供者の体液および前記培養細胞に対し、特定のＨＬＡと反応するＨＬＡ抗体との反応性を測定し、
得られたＨＬＡ抗体との反応性を比較し、
一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する培養細胞の取り違え防止方法。
【請求項３】
細胞提供者の体液を採取し、
提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し、
採取した前記細胞提供者の体液と前記培養細胞とを混合し、
その結果得られたサイトカインの活性を測定し、
前記サイトカインの活性が所定の値より低いときに培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する培養細胞の取り違え防止方法。
【請求項４】
前記培養細胞の一部の採取が、最終の培養容器から行われる請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の取り違え防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の取り違え防止方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより、骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
このような培養骨は、一般に、患者から採取した骨髄細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させた後に、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて細胞を培養容器から剥離する。そして、これを骨補填材に付着させて骨形成培地内に留置して二次培養を行うことにより製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
このような培養骨に代表される生体組織補填体は、製造後には、当該生体組織補填体を構成する細胞の元となった骨髄細胞の提供者である患者に戻されることが必要である。
【０００６】
このため、特に複数の提供者から提供された骨髄細胞を同時に培養する場合には、生体組織補填体の製造にあたって、その工程中に細胞の取り違えが生じないようにする必要がある。
【０００７】
一般に、細胞の提供者（ドナー）から採取した細胞に基づく最終生成物が、ドナー由来のものであるか否かを確認する方法として、マイクロサテライト検査や色素による遺伝子増幅解析（例えば特許文献１参照）のような遺伝子検査を行う方法が考えられる。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【特許文献１】特開平１１−７５８９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、マイクロサテライト検査等の遺伝子検査により、培養された細胞がドナー由来の細胞であるか否かの確認を行うには比較的長時間を要するので、移植手術が差し迫っている場合には困難となる。また、培養工程全体を長期化させることにもなり、不都合である。さらに、遺伝子検査はコストが高く、実用性に欠けるという問題もある。
【０００９】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、簡易かつ確実に細胞提供者由来の細胞か否かを判定可能な細胞の取り違え防止方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
【００１１】
本発明は、細胞提供者のＨＬＡ（ヒト白血球型：Human Leukocyte Antigen）型を検査し、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し、採取した前記培養細胞のＨＬＡ型を検査し、前記細胞提供者のＨＬＡ型と前記培養細胞のＨＬＡ型とを比較し、一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する培養細胞の取り違え防止方法を提供する。
【００１２】
この発明によれば、細胞提供者のＨＬＡ型と培養細胞のＨＬＡ型との一致、不一致により培養細胞が細胞提供者由来の細胞であることを簡易かつ迅速に判定することができる。したがって、培養終了後、移植前に短期間で細胞提供者由来の細胞であるか否かを確認することができる。また、ＨＬＡ検査自体は、試薬等により簡易に行うことができるので、検査に要するコストを低減することができる。
【００１３】
本発明は、細胞提供者の体液を採取し、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し、採取した前記細胞提供者の体液および前記培養細胞に対し、特定のＨＬＡと反応するＨＬＡ抗体との反応性を測定し、得られたＨＬＡ抗体との反応性を比較し、一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する培養細胞の取り違え防止方法を提供する。
【００１４】
この発明によれば、細胞提供者の体液（例えば、抹消血）と特定のＨＬＡ抗体との反応性、および、同じＨＬＡ抗体と培養細胞との反応性をそれぞれ測定し、両反応性が一致する場合には、細胞提供者のＨＬＡ型と培養細胞のＬＨＡ型とが高い確立で一致することを利用して、培養細胞が細胞提供者に由来すると判断するものである。これにより、検査に時間やコストをかけることなく、簡易かつ迅速に取り違えを防止することができる。
【００１５】
本発明は、細胞提供者の体液を採取し、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取し、採取した前記細胞提供者の体液と前記培養細胞とを混合し、その結果得られたサイトカインの活性を測定し、前記サイトカインの活性が所定の値より低いときに培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する培養細胞の取り違え防止方法を提供する。
【００１６】
この発明によれば、ＨＬＡ型の異なる細胞や血球が混合されたときに、特定のサイトカイン（例えば、インターロイキン６）が過剰に産生されることを利用したものである。すなわち、細胞提供者から採取した体液（例えば、血液）を培養後の細胞と混合することにより、特定のサイトカインの活性が所定の値より上昇した場合には、培養細胞がその細胞提供者由来の細胞ではないことがわかる。サイトカインの活性は、その量を定量することにより把握できる。細胞提供者から採取した体液と培養細胞とに対して別々に検査を行う必要がないので、さらに簡易かつ迅速に培養細胞の取り違え防止を図ることができる。
【００１７】
本発明は、上記各発明において、前記培養細胞の一部の採取が、最終の培養容器から行われる取り違え防止方法を提供する。
【００１８】
上述したＨＬＡを用いた取り違え防止方法によれば、マイクロサテライト検査のようなＤＮＡ検査方法と比較して、安価かつ迅速に取り違え防止を図ることができるが、ＨＬＡ検査にも、ＤＮＡ検査より短いとは言え、ある程度の検査時間が必要である。
【００１９】
この発明によれば、最終の培養容器が決定した時点で培養細胞の一部を採取し、最終的な培養と並行してＨＬＡやサイトカインを用いた検査を行うことができるので、培養終了後即座に、あるいは培養中に、培養細胞が細胞提供者由来の細胞であるか否かの確認を行うことができる。したがって、緊急に移植が必要な場合等、培養終了後、移植までに要する時間を短縮することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、簡易かつ迅速に、しかも低コストで、細胞の由来を確認することができ、培養された細胞が、細胞提供者とは異なる患者に戻されることをより確実に防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明に係る細胞の取り違え防止方法の第１実施形態について、図１を参照して説明する。
【００２２】
本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法は、図１に示されるように、細胞提供者のＨＬＡ型を検査する第１ステップＳ１と、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取する第２ステップＳ２と、採取した培養細胞のＨＬＡ型を検査する第３ステップＳ３と、細胞提供者のＨＬＡ型と培養細胞のＨＬＡ型とを比較する第４ステップＳ４と、一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する第５ステップＳ５とを備えている。
【００２３】
第１ステップＳ１は、細胞提供者の体液、例えば、血液を採取し、リンパ球分離法、ＨＬＡタイピング法等の所定の方法により、細胞提供者のＨＬＡ型を検査する。この第１ステップは、細胞提供者からの細胞提供前に行ってもよく、また、培養中、培養終了後のいずれに行ってもよい。
【００２４】
第２ステップＳ２は、培養が所定以上進んだ状態の培養細胞の一部を採取する。
【００２５】
細胞は、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞であり、その培養は、培養容器内に貯留した所定の培養液内において、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％を維持して行われる。使用する培養液は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
【００２６】
この場合、細胞の成長状態に応じて、複数回にわたり培養容器がより大きいものへと切り替えられる。したがって、第２ステップＳ２は、細胞が最終の培養容器へ移し替えられた後に行われることが好ましい。これにより、最終的に細胞提供者へ戻される細胞に対してＨＬＡ検査を行うことが可能となる。
【００２７】
特に、最終の培養容器へ移し替えられた細胞の採取は、できるだけ早期に行うことが好ましい。細胞の培養終了までにはある程度の期間を要するので、その期間を利用してＨＬＡ検査を行うことができるからである。
【００２８】
第３ステップＳ３は、第２ステップＳ２において採取した細胞についてＨＬＡ型を検査する。検査法は、第１ステップＳ１と同様の方法でよい。
【００２９】
第４ステップＳ４は、第１ステップＳ１で得られた細胞提供者のＨＬＡ型と第３ステップＳ３で得られた培養細胞のＨＬＡ型とを比較する。そして、比較の結果、ＨＬＡ型が一致する場合にのみ、第５ステップＳ５において、培養細胞が細胞提供者由来の細胞であると判定され、一致しない場合には、細胞提供者への移植が禁止される。複数の細胞提供者から提供された複数種の細胞を同時に培養している場合には、他の細胞提供者のＨＬＡ型との比較を行い、一致した場合には当該培養細胞が当該他の細胞提供者由来の細胞であると判断することにしてもよい。
【００３０】
このように、本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法によれば、検査に時間がかかり、かつコスト高であったＤＮＡ検査と比較して、簡易かつ低コストのＨＬＡ検査により、細胞提供者と培養細胞との同一性を確認することができる。この方法によれば、細胞提供者と培養細胞との同一性がない場合には、数百〜数万分の１の確率でしかＨＬＡ型が一致しないので、高い精度で細胞提供者と培養細胞との同一性を確認することができる。また、この方法によれば、数時間から１日程度で測定、確認が可能であり、確認に要する時間を短縮することができる。
【００３１】
また、最終の培養容器に移し替えられた時点で採取した培養細胞の一部を用いてＨＬＡ型を検査することにより、最終的な培養終了時には、細胞提供者と培養細胞との同一性を確認しておくことができるので、培養終了後即座に細胞提供者に対する移植手術を行うことが可能となる。その結果、緊急を要する移植手術においても、同一性確認作業を待つことなく、迅速に対応することができるという効果を奏する。
【００３２】
なお、ＨＬＡ型の確認に要する時間が予め確定できる場合には、培養終了時点からその時間分遡った時点でＨＬＡ型の検査が開始できるようにスケジューリングすれば、培養終了時に同一性確認作業を終了しておくことができるので無駄がない。
【００３３】
次に、本発明の第２実施形態に係る細胞の取り違え防止方法について、図２を参照して以下に説明する。
【００３４】
本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法は、細胞提供者の体液を採取する第１ステップＳ１１と、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取する第２ステップＳ１２と、採取した細胞提供者の体液および培養細胞に対し、特定のＨＬＡと反応するＨＬＡ抗体との反応性を測定する第３ステップＳ１３と、得られたＨＬＡ抗体との反応性を比較する第４ステップＳ１４と、一致する場合に、培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する第５ステップＳ１５とを備えている。
【００３５】
前記第１ステップＳ１１は、細胞提供者の体液、例えば、血液を採取する。この第１ステップＳ１１および採取した血液に対しての後述する第３ステップＳ１３は、細胞提供者からの細胞提供前に行ってもよく、また、培養中、培養終了後のいずれに行ってもよい。
【００３６】
第２ステップＳ１２は、第１実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００３７】
第３ステップＳ１３は、特定のＨＬＡと反応するＨＬＡ抗体（例えば、抗ＨＬＡクラスＩ）との反応性を、第１ステップＳ１１において採取した細胞提供者の体液および第２ステップＳ１２において採取した培養細胞に対してそれぞれ測定する。
【００３８】
具体的には、ＨＬＡタイピングプレート（ビオテスト社、リンフォタイプＨＬＡプレート）によりＨＬＡ抗血清に対する反応性を測定する。もしくは、リンパ球障害試験法（ＮＩＨ標準法に準じるマイクロビーズ法）による反応性の測定を外部検査機関に委託してもよい。
【００３９】
第４ステップＳ１４は、第３ステップＳ１３において得られた反応性を比較する。そして、比較の結果、反応性する場合にのみ、第５ステップＳ１５において、培養細胞が細胞提供者由来の細胞であると判定され、一致しない場合には、細胞提供者への移植が禁止される。複数の細胞提供者から提供された複数種の細胞を同時に培養している場合には、他の細胞提供者の体液に対するＨＬＡ抗体との反応性の結果との照合を行い、一致した場合には当該培養細胞が当該他の細胞提供者由来の細胞であると判断することにしてもよい。
【００４０】
このように、本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法によれば、第１実施形態に係る細胞の取り違え防止方法と同様に、簡易かつ低コストの反応性検査により、細胞提供者と培養細胞との同一性を確認することができる。
【００４１】
また、最終の培養容器への移し替え後に培養細胞を採取することとすれば、第１実施形態と同様に、反応性検査に要する時間を節約して、培養終了後即座に細胞提供者への移植手術を行うことが可能となる。
【００４２】
次に、本発明の第３実施形態に係る細胞の取り違え防止方法について、図３を参照して以下に説明する。
【００４３】
本実施形態に係る取り違え防止方法は、図３に示されるように、細胞提供者の体液を採取する第１ステップＳ２１と、提供された細胞を培養した後に、当該培養細胞の一部を採取する第２ステップＳ２２と、採取した細胞提供者の体液と培養細胞とを混合する第３ステップＳ２３と、その結果得られたサイトカインの活性を測定する第４ステップＳ２４と、サイトカインの活性が所定の値より低いときに培養細胞が細胞提供者に由来すると判定する第５ステップＳ２５とを備えている。
【００４４】
第１ステップＳ２１および第２ステップＳ２２は、上記第１実施形態および第２実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００４５】
第３ステップＳ２３は、採取した細胞提供者の体液と培養細胞とを混合することにより発生する反応を利用する。具体的には、体液と培養細胞とを混合し、所定時間にわたって培養する。ＨＬＡ型の異なる体液と細胞とが混合されたときには、細胞からサイトカイン（例えばインターロイキン６）が過剰に産生される。したがって、所定時間経過後に産生されているサイトカインの量を測定することにより、サイトカインの活性がわかる。
【００４６】
第４ステップＳ２４は、細胞提供者の体液と培養細胞とを混合することにより産生されたサイトカイン量を測定する。
【００４７】
具体的には、化学発光免疫測定法による測定試薬キット（富士レビオ社）により、インターロイキン６の値を定量する。
【００４８】
第５ステップＳ２５は、ＨＬＡ型が一致しないと判断しうるサイトカイン量をしきい値として予め設定しておき、実際に産生されたサイトカイン量がしきい値を超えたか否かを判断する。これにより、当該しきい値を超える量のサイトカインが産生されているときには、細胞提供者と培養細胞との同一性が得られないと判断することができ、サイトカインの量がしきい値を下回っているときには、細胞提供者と培養細胞との同一性が得られたと判断することができる。
【００４９】
このように、本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法によれば、第１、第２実施形態に係る細胞の取り違え防止方法と同様に、簡易かつ低コストのサイトカイン量の測定により、細胞提供者と培養細胞との同一性を確認することができる。また、最終の培養容器への移し替え後に培養細胞を採取することとすれば、第１、第２実施形態と同様に、反応性検査に要する時間を節約して、培養終了後即座に細胞提供者への移植手術を行うことが可能となる。
【００５０】
さらに、本実施形態に係る細胞の取り違え防止方法によれば、細胞提供者から採取した体液と培養細胞とを混合したものに対してサイトカイン量を測定するので、体液と培養細胞とにそれぞれ検査を行う必要がなく、より簡易に同一性を確認することができる。
【００５１】
なお、上記実施形態においては、培養する細胞としては、骨髄由来の間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を培養することにしてもよい。また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。
【００５２】
また、ＤＮＡ検査が十分に短時間に行うことができる場合には、最終の培養容器に移し替えられた後に採取された培養細胞に対してＤＮＡ検査を行うことにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の第１実施形態に係る細胞の取り違え防止方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の第２実施形態に係る細胞の取り違え防止方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の第３実施形態に係る細胞の取り違え防止方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００５４】
Ｓ１，Ｓ１１，Ｓ２１  第１ステップ
Ｓ２，Ｓ１２，Ｓ２２  第２ステップ
Ｓ３  Ｓ１３，Ｓ２３  第３ステップ
Ｓ４，Ｓ１４，Ｓ２４  第４ステップ
Ｓ５，Ｓ１５，Ｓ２５  第５ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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