(57)【要約】【課題】アンザンジュをはじめとするアブラナ科植物に含有される成分の詳細について解明することを目的とする。【解決手段】アブラナ科植物から低級脂肪族アルコール又はその含水物による抽出によって得られる抽出液又は抽出エキスを有効成分として含有することを特徴とするＮＯ産生抑制用組成物、さらには、アブラナ科植物から得られた新規化合物が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科植物から低級脂肪族アルコール又はその含水物による抽出によって得られる抽出液又は抽出エキスを有効成分として含有することを特徴とするＮＯ産生抑制用組成物。
【請求項２】
前記抽出液又は抽出エキスが、ヒエロチンＢ、２，３−ジヒドロ−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−ヒドロキシメチル−５−（２−ホルミルビニル）−７−ヒドロキシベンゾフラン、（＋）−デヒドロジコニフェリルアルコール、（＋）−バラノフォニン、３−ヒドロキシ−１−［４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−ヒドロキシメチルエトキシ］−３−メトキシフェニル］−プロパン−１−オン及び（＋）−ピノレシノールからなる群から選択される１以上の化合物を含有する請求項１に記載のＮＯ産生抑制用組成物。
【請求項３】
アブラナ科植物がアナスタチカ属のアンザンジュである請求項１又は２に記載のＮＯ産生抑制用組成物。
【請求項４】
式１又は式２
【化１】
2005002052.tif 000007
で表される化合物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の組成物を含有する健康食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アブラナ科植物の抽出物とその用途に関し、より詳細には、アブラナ科植物からの抽出液又は抽出エキスを有効成分とするＮＯ産生抑制用組成物及び該抽出液に含まれる新規化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アブラナ科  （Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）  植物のアナスタチカ属アンザンジュ（Ａｎａｓｔａｔｉｃａ  ｈｉｅｒｏｃｈｕｎｔｉｃａ）は、一年生植物で、中央アジアからアフリカ北部の砂漠地帯に分布する。Ｍａｒｉａｎ  Ｈａｎｄ  （聖母マリアの手）と通称され、最もよく知られているエジプト民間薬であり、エジプトの各都市のハーブ店などで広く市販されている。その全草は難産、子宮出血などの婦人病の治療に有効であると言われている。
アンザンジュのエキスには、抗炎症作用や抗菌作用があることが報告されており、その主成分としては、パラフィン（Ｃ２５Ｈ５２，  Ｃ２９Ｈ６０，  Ｃ３１Ｈ６４）、ステロール類（主にβ−シトステロール）及びフラボノイドが含有されると報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。
しかし、アンザンジュをはじめとするアブラナ科植物に含有される他の成分の詳細については未だ完全に解明されていない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ａｂｏｕ−Ｍａｎｄｏｕｒ  Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，  １４，  ６５７−６６１（１９９５）
【非特許文献２】
Ｒｉｚｋ  Ａ．  Ｍ．ら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｇ．，  ３１，３２７−３２９（１９９３）
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、エジプト生薬の機能性成分の探索研究の一環として、アブラナ科植物に含まれる機能性成分について鋭意研究を行った結果、今までに報告されたことがない新規化合物を見出し、その化学構造を決定するとともに、アブラナ科植物の幾つかの抽出物に、無機の遊離ラジカルである一酸化窒素（ＮＯ）の産生抑制活性が認められることを新たに見出し、本発明の完成に至った。
【０００５】
したがって、本発明によれば、アブラナ科植物から低級脂肪族アルコール又はその含水物による抽出によって得られる抽出液又は抽出エキスを有効成分として含有することを特徴とするＮＯ産生抑制用組成物が提供される。
また、本発明によれば、式１又は式２
【化２】
2005002052.tif 000002
で表される新規化合物が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のＮＯ産生抑制用組成物は、アブラナ科植物（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）から低級脂肪族アルコール又はその含水物を用いて抽出した抽出液又は抽出エキスを有効成分として含有する。アブラナ科植物としては、アナスタチカ属（Ａｎａｓｔａｔｉｃａ）に属するものが挙げられ、さらに具体的には、アンザンジュ（ｈｉｅｒｏｃｈｕｎｔｉｃａ）及びその同属植物が挙げられる。
アブラナ科植物は、一年生植物で、その産地は特に限定されるものではないが、一般に、中央アジアからアフリカ北部の砂漠地帯に分布する。特に、エジプト産のものが好ましい。これらの植物は、通常、全草が用いられるが、その一部を用いてもよい。また、全草又はその一部は乾燥したものであってもよいし、そのままの形態であってもよい。
【０００７】
アブラナ科植物から抽出液を得るために、例えば、全草をそのまま、又は乾燥し、あるいは粉砕して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１〜３０倍程度の低級脂肪族アルコール又はその含水物を用いて抽出することが適当である。低級脂肪族アルコールとしては、炭素数１〜４の脂肪族アルコールが挙げられ、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール等が挙げられる。また、１〜３０重量％程度の水を含有する低級脂肪族アルコール含水物であってもよい。
抽出は、温浸又は熱浸等で行うことができる。例えば、５０〜８５℃程度の温度で、振盪下又は非振盪下に、上記の全草を上記の溶媒に浸漬することによって行うことが適当である。振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うことが適当であり、非振盪下に浸漬する場合は、１時間〜２０日間程度行うことが適当である。なお、上記の温度より低い温度で浸漬することも可能であるが、その場合には、上記時間よりも長時間浸漬することが適当である。抽出処理は、同一原料について１回のみ行ってもよいが、複数回、例えば、２〜５回程度行うことが好ましい。
【０００８】
得られた抽出液は、濃縮して抽出エキスとしてもよい。濃縮は、低温低圧下で行うことが好ましい。この濃縮は乾固するまで行ってもよい。なお、濃縮する前にろ過し、ろ液を濃縮してもよい。また、抽出エキスは、濃縮したままの状態であってもよいし、粉末状又は凍結乾燥品等としてもよい。濃縮する方法、粉末状又は凍結乾燥品とする方法は、当該分野で公知の方法を用いることができる。
得られた抽出液は、濃縮する前後に、精製処理に付してもよい。精製処理は、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独又は組み合わせて採用することができる。例えば、クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等のいずれか又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。
【０００９】
なかでも、抽出液を濃縮して抽出エキスとしたものを、酢酸エチルと水を用いて分配し、得られた水相をさらにブタノールを用いて分配抽出することが好ましい。分配抽出は、室温下、振盪下又は非振盪下など、当該分野で通常行われる方法にしたがって行うことができ、さらに、得られた各可溶画分を上記の精製処理に付してもよい。
【００１０】
本発明の抽出液又は抽出エキスは、通常、下記に示す化合物をいずれか１つ含有することが好ましく、式１〜３、５〜８及び１１のいずれか１つを含有することがより好ましく、さらには式１、５〜８及び１１のいずれか１つを含有することが好ましい。
【化３】
2005002052.tif 000003
これらの化合物のうち、式１〜４、６及び９は、上記ブタノールで分配抽出して得られるブタノール可溶画分中に、その他の化合物は、酢酸エチルで分配抽出して得られる酢酸エチル可溶画分中に得ることができる。
【００１１】
ここで、式３以降の化合物は既知化合物であるが、式１  （３−［２−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−ヒドロキシメチル−７−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル］−プロペノール）又は式２  （７−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシメチル−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−カルバルデヒド）で表される化合物（２，３−ジヒドロベンゾフラン骨格の２位と３位は、それぞれ異なって、あるいはともにＲ又はＳの立体配置を有していてもよい）は新規化合物として見出され、それぞれヒエロチン（ｈｉｅｒｏｃｈｉｎ）  Ｂ及びＣと命名された。
また、式１の化合物と式５〜８及び１１で示される化合物は、単独でＮＯ産生抑制作用を有し、特に式５、７及び８の化合物は、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）の誘導に顕著な阻害作用を有することが初めて見出された。
【００１２】
菌体膜成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）やＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカイン刺激を受けたマクロファージなどが産生するｉＮＯＳによって生成されるＮＯは、生体防御機構を担っている反面、敗血症におけるショック症状（エンドトキシンショック）や各種臓器障害、炎症性疾患の原因物質の一種であることが知られている。したがって、これらの化合物は、これらの症状の治療又は予防を目的としたＮＯ産生抑制用組成物として用いることができる。
上記のような抽出液又は抽出エキス及び化合物は、それぞれそのままの状態又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野において公知の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の医薬品の形態で使用することができる。
【００１３】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。そのような媒体としては、医薬的に受容な賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）；充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）；錠剤用滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）；崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は受容な湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
錠剤は、通常の方法でコーティングしてもよい。液体製剤は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよく、使用前に水又は他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。
【００１４】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂）；乳化剤（例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート又はアラビアゴム）；（食用脂を含んでいてもよい）非水性賦形剤（例えばアーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールのような油性エステル）；保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル、又はソルビン酸）及び所望により着色剤等を含んでいてもよい。
また、上記抽出液又は抽出エキス及びそれらに含まれる個々の化合物は、健康食品に利用することができる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味し、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。
【００１５】
これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、上記抽出液等を混合又は塗布、噴霧などして添加して、健康食品とすることができる。
上記抽出液又は抽出エキス及び化合物の使用量は、濃縮、精製の程度、疾患の重篤度、服用者の体重、年齢等によって適宜調整することができ、例えば、成人１回につき抽出液又は抽出エキスでは精製度や水分含量等に応じて、１〜２００００ｍｇ程度が挙げられ、化合物の状態では１〜１，０００ｍｇ程度が挙げられ、食前３０分位に１日３回服用するのが望ましい。
また、健康食品としての使用時には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対し、上記抽出液又は抽出エキス、あるいは化合物を、１０〜１００，０００ｍｇ程度の範囲で用いることが適当である。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明の抽出物、新規化合物及びそれらの作用についての実施例を具体的に説明する。
アンザンジュ全草のメタノール抽出 
アンザンジュ全草３．５  ｋｇ（エジプト産）を粉砕し、メタノール［ナカライテスク社製、特級］（１０  Ｌ）を加え、加熱還流下３時間抽出した。抽出後、ひだ折りろ紙（アドバンテック社製、Ｎｏ．  ２ろ紙）にてろ過し、抽出残査にさらにメタノール（１０  Ｌ）を加え、３時間加熱還流し、同様にろ過作業を行った。合計３回の抽出を行い、その抽出液をあわせ、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下、溶媒留去し、アンザンジュのメタノール抽出エキス１８３．５  ｇ（生薬からの収率５．２４％）を得た。
【００１７】
アンザンジュメタノール抽出エキスの溶媒分画 
アンザンジュのメタノール抽出エキス（１５１．１  ｇ）を酢酸エチル−水（１：１、ｖ／ｖ）混液に分配抽出した。
水層に、さらにブタノールを加えて溶媒抽出し、酢酸エチル移行部、ブタノール移行部及び水移行部から真空下、溶媒留去して、各移行部について６９．８ｇ（２．４２％）、１８．２ｇ（０．６３％）及び６３．１ｇ（２．１９％）のエキスを得た。
ブタノール移行部エキスの分離・精製 
ブタノール移行部エキスを順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［富士シリシア社製、ＢＷ−２００、１５０〜３５０メッシュ、５４０ｇ、移動相：ｎ−ヘキサン（ナカライテスク社製、特級）：酢酸エチル（２：１−１：１）−クロロホルム（ナカライテスク社製、特級）：メタノール：水（１０：３：１、下層）−（７：３：１、下層）−（６：４：１）−メタノール］にて順次溶出した。
【００１８】
さらに、得られたフラクションを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｒｅｘ  ＯＤＳ  ＤＭ１０２０Ｔ、１００〜２００メッシュ、１００  ｇ、移動相：メタノール：水（２０：８０−４０：６０−６０：４０）−メタノール］及び高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）［検出器：島津示差屈折型検出器ＲＩＤ−６Ａ、ポンプ：島津ＬＣ−１０Ａ、ＨＰＬＣカラム：ＹＭＣ社製ＹＭＣ  Ｐａｃｋ−ＯＤＳ−Ａ、２０  ｍｍ  ｉ．ｄ．  ×  ２５０ｍｍ、移動相：メタノール：水（４５：５５）］に付した。
その結果、新規化合物であるヒエロチンＢ（１、０．０００３％）及びヒエロチンＣ（２、０．０００７％）が、ヒエロチンＡ（３、０．０００５％）、４  （０．００１０％）、９  （０．０００６％）、（＋）−ラリシレシノール（ｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）（０．００２４％）、（＋）−ピノレシノール（６、０．００５％）、ケンフェロール（０．０００６％）、ルテオリン（０．０００８％）、ルチン（０．０００７％）及びβ−シトステロール３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（０．００２５％）とともに得られた。
【００１９】
酢酸エチル移行部エキスの分離・精製
酢酸エチル移行部エキスを、ブタノール移行部エキスと同様に処理したところ、２，３−ジヒドロ−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−ヒドロキシメチル−５−（２−ホルミルビニル）−７−ヒドロキシベンゾフラン  （５、０．００６１％）、（＋）−デヒドロジコニフェリルアルコール（７、０．００１１％）、（＋）−バラノフォニン（８、０．０００５％）、１０  （０．００２％）、３−ヒドロキシ−１−［４−［２−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−ヒドロキシメチルエトキシ］−３−メトキシフェニル］−プロパン−１−オン（１１、０．０００２％）、１２  （０．０００６％）、１３  （０．００２９％）、１４  （０．００１１％）及びエボフォリンＢ  （１５、０．０００９％）が得られた。
ブタノール移行部エキス及び酢酸エチル移行部エキスから得られた化合物の構造を以下に示す（化合物名とともに、又は化合物名に代えて記載する番号は、以下の化学構造式の番号を示す）。
【００２０】
【化４】
2005002052.tif 000004
【００２１】
新規化合物の物性
・ヒエロチンＢ：
無色油状物；
［α］Ｄ２４  ＋２９．７°  （ｃ  ０．４０，  ＭｅＯＨ），  ［α］Ｄ２６  ＋４０．９°  （ｃ  ０．３０，  ＣＨＣｌ３）；
ＣＤ  （ＭｅＯＨ）  λｍａｘ  （Δε）  ２３３  （−４．９４），  ２６９  （＋３．８９），  ２８６  （＋４．１６）；
ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λｍａｘ  （ｌｏｇ  ε）  ２７９  （４．２０）；
ＩＲ  （フィルム）  νｍａｘ  ３５６７，  ３４２０，  １６５３，  １６３６，  １５０７，  １２６４，  １０２６  ｃｍ−１；
１Ｈ  ＮＭＲ  （アセトン−ｄ６，  ５００  ＭＨｚ）  δ３．５３  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−８），  ３．７９，  ３．８０，  ３．８７  （それぞれ３Ｈ，  全てｓ，  ＯＣＨ３−３，  ４，  及び  ３’），  ３．８３  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ２−９），  ４．１８  （２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝１．２，  ５．８  Ｈｚ，  Ｈ２−９’），  ５．６０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．４  Ｈｚ，  Ｈ−７），  ６．２４  （１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ＝１５．９，  ５．８  Ｈｚ，  Ｈ−８’），  ６．５３  （１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ＝１５．９，  １．２  Ｈｚ，  Ｈ−７’），  ６．９２  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝８．３  Ｈｚ，  Ｈ−５），  ６．９５，  ６．９８  （それぞれ１Ｈ，  いずれもｄ，  Ｊ＝１．８  Ｈｚ，  Ｈ−２’  及び６’），  ６．９６  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝１．９，  ８．３  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ７．０４  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝１．９  Ｈｚ，  Ｈ−２）；
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）  δ３．８６，  ３．８７，  ３．９１  （それぞれ３Ｈ，  全てｓ，  ＯＣＨ３−３，  ４，  及び３’），  ３．６４  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−８），  ［３．９３  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ４．９，  １１．０  Ｈｚ），  ３．９９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．１，  １１．０  Ｈｚ），  Ｈ２−９］，  ４．３１  （２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．５，  ５．８  Ｈｚ，  Ｈ２−９’），  ５．６０  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．４  Ｈｚ，  Ｈ−７），  ６．２５  （１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ  ＝  １５．９，  ５．８  Ｈｚ，  Ｈ−８’），  ６．５６  （１Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ  ＝  １５．９，  １．５  Ｈｚ，  Ｈ−７’），  ６．８３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  Ｈ−５），  ６．８９，  ６．９０  （それぞれ１Ｈ，  いずれもｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  Ｈ−２’  及び６’），  ６．９３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  Ｈ−２），  ６．９５  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ２．２，  ８．５  Ｈｚ，  Ｈ−６）；
１３Ｃ  ＮＭＲ  データ、表１参照；
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３７２  ［Ｍ＋，  ４７］，  ３５４  ［Ｍ＋−Ｈ２Ｏ，  １００］；  ＨＲＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３７２．１６０６  （Ｃ２１Ｈ２４Ｏ６  ［Ｍ＋］について算出，  ３７２．１５７３）。
【００２２】
・ヒエロチンＣ：
淡黄色油状物；
［α］Ｄ２７  −６０．１°  （ｃ  １．００，  ＭｅＯＨ）；
ＣＤ  （ＭｅＯＨ）  λｍａｘ  （Δε）  ２３３  （＋５．１７），  ２４６  （−４．６３），  ２９５  （−４．０２）；
ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λｍａｘ  （ｌｏｇ  ε）  ２３５  （４．２８），  ２８９  （４．１０）；
ＩＲ  （フィルム）  νｍａｘ  ３６５２，  ３５６９，  １６８４，  １６７０，  １６５５，  １５０９，  １２７７，  １０３２  ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤｌ３ＯＤ，  ５００  ＭＨｚ）  δ３．５８  （１Ｈ，  ｍ，  Ｈ−８），  ３．８２  （３Ｈ，  ｓ，  ＯＣＨ３−３），  ３．８５  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ２−９），  ５．６５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝６．４  Ｈｚ，  Ｈ−７），  ６．７８  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝８．３  Ｈｚ，  Ｈ−５），  ６．８５  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝２．１，  ８．３  Ｈｚ，  Ｈ−６），  ６．９７  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ，  Ｈ−２），  ７．２８，  ７．３９  （それぞれ１Ｈ，  いずれもｄ，  Ｊ＝１．６  Ｈｚ，  Ｈ−２’  及び６’），  ９．７２  （１Ｈ，  ｓ，  Ｈ−７’）；１３Ｃ  ＮＭＲ  データ、表１参照；
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３１６  ［Ｍ＋，  ４１］，  ２８６  ［１００］；  ＨＲＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３１６．０９４５  （Ｃ１７Ｈ１６Ｏ６  ［Ｍ＋］について算出，  ３１６．０９４７）。
【００２３】
【表１】
2005002052.tif 000005
【００２４】
リポ多糖活性化マクロファージにおけるＮＯ産生に対する作用 
Ｔａｏらの方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，  ５１（６），  ６５４−６６２  （２００３）参照）に準じ、マウスのリポ多糖（ＬＰＳ）−活性化マクロファージにおけるＮＯ産生に対する各化合物の作用を検討した。
あらかじめ４日前に４％チオグリコレート（ＴＧＣ）培地を腹腔内注射したｄｄＹ系雄性マウスの腹腔から腹腔滲出細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで洗浄して、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地に細胞を懸濁し、９６−ウェルのマイクロプレートに１ウェル当り５×１０５細胞／２００μｌずつ播種した。
５％ＣＯ２の空気存在下で３７℃で１時間培養後、ＰＢＳで洗浄して非付着細胞を除き、付着細胞（ギムザ染色によれば９５％以上がマクロファージ）を、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳと試験化合物（１〜１００μＭ）を含む新鮮な培地（２００μｌ／ウェル）で２０時間培養した。
【００２５】
各ウェルにおけるＮＯ産生量は、培養液中に蓄積した亜硝酸塩の濃度をグリース試薬を用いて測定することにより評価した。細胞毒性は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）比色アッセイ法によって測定した。すなわち、試験化合物と２０時間インキュベーションした後、ＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）溶液を各ウェルに１０μｌずつ加え、４時間培養後、培地を除き、０．０４Ｍ  ＨＣｌを含むイソプロパノールを加えて細胞中に生じたホルマザンを溶解した。
ホルマザン溶液の５７０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）を比較対照薬として用いた。
各被験物質はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、溶液を培地に加えた（最終ＤＭＳＯ濃度０．５％）。阻害（％）は、以下の式より算出し、濃度−阻害曲線からＩＣ５０を求めた：
阻害（％）＝（（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ））×１００
［Ａ：ＬＰＳ（＋）、化合物（−）のＮＯ２−濃度（μＭ）；Ｂ：ＬＰＳ（＋）、化合物（−）のＮＯ２−濃度（μＭ）；Ｃ：ＬＰＳ（−）、化合物（−）  のＮＯ２−濃度（μＭ）］
【００２６】
【表２】
2005002052.tif 000006
【００２７】
この結果、本発明により得られた植物の抽出化合物の幾つかは、細胞毒性を示さない濃度でＬＰＳ−活性化マクロファージからのＮＯ産生阻害活性を有することが示された。５、７及び８の化合物の阻害活性は、非選択的ＮＯＳ阻害剤であるＬ−ＮＭＭＡよりも強かった。
【００２８】
ＮＯＳ誘導に対する化合物の作用
マクロファージにおけるｉＮＯＳ誘導の試験化合物の作用を、Ｔａｏらの方法を一部改変して評価した。
雄性ｄｄＹマウス由来のＴＧＣ誘導性腹腔滲出細胞（７．５×１０６細胞／３ｍＬ／ウェル）を１時間６−ウェルのプレートで培養し、付着細胞を得た。洗浄後、培養培地を５％ＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳと試験化合物を含む新鮮な培地に交換し、２０時間培養した。溶解緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、プロテアーゼインヒビターカクテル（１ｔａｂ／５０ｍＬ）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ｐＨ７．４）を用いて細胞を回収し、超音波処理した。
【００２９】
ＢＣＡ（登録商標）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いるＢＣＡ法により各懸濁液のタンパク質濃度を測定後、懸濁液にラエミリ緩衝液を加えて沸騰水浴中で５分間加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に、各試料からタンパク質４０μｇ相当を７．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動に付した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に電気的に転写した。５％脱脂粉乳を含むＴｒｉｓ−緩衝液（Ｔ−ＴＢＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．４）中で膜をインキュベートした後、Ｔ−ＴＢＳで洗浄し、ｉＮＯＳに対するマウス由来モノクローナルＩｇＧ抗体（１０００倍希釈）で処理した。
次いで、膜をＴ−ＴＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗マウスＩｇＧ抗体である二次抗体（５０００倍希釈）で処理した。Ｔ−ＴＢＳで洗浄した後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）とＸ−線フィルムを用いて検出し、図１に示す結果を得た。
【００３０】
ＬＰＳとの２０時間のインキュベート後、ｉＮＯＳが１３０ｋＤａで検出され、５、７及び８の化合物が、ＮＯ産生とｉＮＯＳの誘導に阻害作用を示すことが認められた。
これらの結果から、ＬＰＳ−活性化マクロファージのｉＮＯＳ誘導は、ＮＯの産生阻害にも関わる化合物によって抑制されることが示され、化合物が、ＬＰＳ−活性化マクロファージにおけるｉＮＯＳ誘導に対する阻害活性に起因して、ＮＯ産生を阻害することが示唆された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、植物由来の天然抽出物を、従来品と同等又はそれより高い
ＮＯ産生阻害活性を有するＮＯ産生抑制組成物として使用することができる。ま
た、新規な化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＰＳ−活性化マウスマクロファージにおけるｉＮＯＳ誘導に対する抽出化合物の作用の結果を示す。
【図１】
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