(57)【要約】【課題】  高い網羅性、再現性を有する遺伝子発現の解析手段を提供すること。【解決手段】  下記の工程を含む方法によりＤＮＡが固定化されたマイクロビーズを提供する。（１）試料由来のＤＮＡを断片化する工程、（２）断片化したＤＮＡをサイズ分画する工程、（３）サイズ分画されたＤＮＡ断片をタグベクターに連結し、タグライブラリーを作製する工程、及び（４）タグライブラリーからタグ配列が結合したＤＮＡを調製し、マイクロビーズに結合させる工程。  また、上記マイクロビーズを使用した遺伝子発現解析方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、ＤＮＡが固定化されたマイクロビーズの製造方法：
（１）試料由来のＤＮＡを断片化する工程、
（２）断片化したＤＮＡをサイズ分画する工程、
（３）サイズ分画されたＤＮＡ断片をタグベクターに連結し、タグライブラリーを作製する工程、及び
（４）タグライブラリーからタグ配列が結合したＤＮＡを調製し、マイクロビーズに結合させる工程。
【請求項２】
工程（１）において、超音波処理によりＤＮＡの断片化が実施されることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
工程（２）において、１００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片が回収されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
試料由来のＤＮＡがｍＲＮＡを鋳型として調製されたｃＤＮＡである請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
工程（３）において、ｃＤＮＡの５’側もしくは３’側断片を選択してタグベクターに連結することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか記載の方法により製造された、ＤＮＡが固定化されたマイクロビーズを使用する遺伝子発現の解析方法であって、該マイクロビーズ上のＤＮＡと、２種類以上のＲＮＡ試料から調製した、試料ごとに異なる標識を付された核酸プローブとの間でハイブリダイゼーションを実施する工程を包含することを特徴とする遺伝子発現の解析方法。
【請求項７】
蛍光物質または発光物質で標識された核酸プローブが使用される請求項６記載の遺伝子発現の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術を用いた遺伝子発現解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術の詳細について、ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）らが報告している（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。上記ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においては、標的ＤＮＡすなわちｃＤＮＡの最下流のＧＡＴＣからポリＡ配列までの部分が結合した１本鎖タグと、ビーズ上に結合したアンチタグとの間のハイブリダイゼーションによって、１個のマイクロビーズには単一の標的ＤＮＡが対応づけられる。標的ＤＮＡがハイブリダイゼーションによって結合したマイクロビーズはセルソーターを用いて選別される。次いで、種々の酵素処理と化学処理によって標的ＤＮＡはビーズ上に共有結合される。さらに、必要に応じて標的ＤＮＡのマイクロビーズから離れた末端にアダプターが付加され、１本鎖化される。
【０００３】
【特許文献１】特表平１１−５０７５２８号公報
【非特許文献１】Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｓ．、他１２名、プロシーディングズ  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９７巻、第４号、第１６６５〜１６７０頁（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記非特許文献１記載のマイクロビーズには、最も３’側のＧＡＴＣ配列（以下、単にＧＡＴＣ配列と呼ぶことがある）からポリＡ配列までのｃＤＮＡ断片が標的ＤＮＡとして固定されているが、ＧＡＴＣ配列の有無や、ポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離などにより、マイクロビーズに固定される遺伝子配列やメガソート（Ｍｅｇａｓｏｒｔ）による発現解析対象となる遺伝子の網羅性が制限されることが問題となっている。例えば、ｃＤＮＡ中に元々ＧＡＴＣ配列のない遺伝子はクローニングされない。ポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離が長い遺伝子の場合、合成したｃＤＮＡがＧＡＴＣ配列からポリＡ配列までを含んでいないことがあり、そのようなｃＤＮＡはクローニングされない。また、ポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離が短い遺伝子は、例えば、競合ハイブリダイゼーションの際の特異性が低く、メガソートの解析対象から外れる可能性がある。さらに、固定化されているｃＤＮＡは、平均２５０ｂｐと短く、かつ、非翻訳領域である場合が多いため、ビーズに固定化されたＤＮＡの塩基配列からアミノ酸配列情報を取得できないことが多い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意検討の結果、断片化後、サイズ分画したＤＮＡを標的ＤＮＡとしてマイクロビーズに固定化することにより、メガソート時の蛍光値を上昇させること、メガソート解析対象遺伝子の網羅性を上昇させること、従来のマイクロビーズに比べ、ビーズから多くの配列情報を取得することが可能であることを見出して、本発明を完成させた。
【０００６】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、ＤＮＡが固定化されたマイクロビーズの製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）試料由来のＤＮＡを断片化する工程、
（２）断片化したＤＮＡをサイズ分画する工程、
（３）サイズ分画されたＤＮＡ断片をタグベクターに連結し、タグライブラリーを作製する工程、及び
（４）タグライブラリーからタグ配列が結合したＤＮＡを調製し、マイクロビーズに結合させる工程。
【０００７】
本発明の第１の発明では、工程（１）において超音波処理によりＤＮＡの断片化を行うことができる。また、工程（２）においては、好適には１００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片が回収される。
【０００８】
本発明の第１の発明の態様のひとつとして、ｍＲＮＡを鋳型として調製されたｃＤＮＡを断片化して使用する方法が例示される。この場合、ｃＤＮＡの５’側もしくは３’側断片を選択してタグベクターに連結することもできる。
【０００９】
本発明の第２の発明は、第１の発明の方法により製造されたＤＮＡが固定化されたマイクロビーズを使用する遺伝子発現の解析方法であって、該マイクロビーズ上のＤＮＡと、２種類以上のＲＮＡ試料から調製した、試料ごとに異なる標識を付された核酸プローブとの間でハイブリダイゼーションを実施する工程を包含することを特徴とする。
【００１０】
本発明の第２の発明の方法においては、蛍光物質または発光物質で標識された核酸プローブを使用することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、一定範囲の鎖長のＤＮＡが固定化されたマイクロビーズが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を具体的に説明する。
本明細書で使用する用語について以下に説明するが、特に定義するもの以外は分子生物学、分子遺伝学等の当業者の間で一般的に理解されている意味で用語を用いている。
【００１３】
「ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術」とは、前記特許文献１および非特許文献１に開示された技術、およびこれを応用して遺伝子発現や遺伝子構造を解析する技術を意味する。すなわち、タグと呼ぶオリゴヌクレオチドを結合したＤＮＡと、タグに相補的なオリゴヌクレオチドであるアンチタグを結合したマイクロビーズとを、タグとアンチタグの間のハイブリダイゼーションにより結合させる技術である。その結果、マイクロビーズ上に固定化されたＤＮＡのライブラリーを作製することができる。ここで、１個のマイクロビーズには１種類のＤＮＡが結合している。
【００１４】
「タグライブラリー」とは、ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においてマイクロビーズに結合させるＤＮＡのライブラリーを意味する。タグライブラリーの各クローンはマイクロビーズに結合させるＤＮＡとタグ配列を同一分子内に含むＤＮＡであり、これらのクローンの集合がタグライブラリーである。
【００１５】
「タグ」とは、ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においてマイクロビーズに結合させるＤＮＡと共有結合により結合しているオリゴヌクレオチドであり、各マイクロビーズに単一配列のＤＮＡを配置するために使用する。タグのレパートリーはタグライブラリーのクローン数よりも十分に大きいことが必要である。
【００１６】
「アンチタグ」とは、ＤＮＡマイクロビーズアレイ技術においてマイクロビーズと共有結合により結合したオリゴヌクレオチドであり、前記のタグと相補的な配列を持つ。１個のマイクロビーズには単一配列のアンチタグが結合することができ、アンチタグのレパートリーはタグのレパートリーと実質的に同じ大きさである。
【００１７】
「メガソート」とは、マイクロビーズ上のＤＮＡに対し、異なる色素、例えばＣｙ５とフルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）などでそれぞれラベルした２種のプローブを競合ハイブリダイズさせた後、マイクロビーズを蛍光強度、色素の結合比率に基づいてフローサイトメーターなどにより分離する技術である。
【００１８】
「標的ＤＮＡ」とは、マイクロビーズに結合させようとするＤＮＡおよびマイクロビーズに結合したＤＮＡを意味する。標的ＤＮＡに特に制限はなく、例えばあるポリペプチドをコードする遺伝子の全領域でもよいし、その一部、例えば５’側または３’側の断片のみでもかまわない。
【００１９】
「ｅ−ｖａｌｕｅ」とは、ホモロジー検索の結果互いに関係のない配列が偶然にヒットする可能性を数値で表したものである。検索結果のｅ−ｖａｌｕｅが０に近い値であるほど、その結果は偶然でない確かな一致であるとみなすことができ、統計的に有意であると言える。
【００２０】
「特異的にハイブリダイズする」とは、互いに相補的なタグとアンチタグはハイブリダイズするが、非相補的な配列を含むタグとアンチタグはハイブリダイズしないか、あるいは低頻度にしかハイブリダイズしないことを意味する。
【００２１】
本発明の遺伝子発現解析方法について、以下に詳細に説明する。
（１）試料由来のＤＮＡを断片化する工程
遺伝子の発現状態を解析しようとする試料より調製されたＤＮＡを断片化する。前記ＤＮＡとしては、特に限定はないが、ゲノムＤＮＡ、ポリＡ  ＲＮＡや全ＲＮＡから合成したｃＤＮＡが例示される。これらＤＮＡは公知の方法で調製されたものが使用できる。さらに好適な態様としては、例えば、ｃＤＮＡの場合、鋳型となったポリＡ  ＲＮＡの３’あるいは５’の末端側に相当する部分を公知の方法、例えばビオチン標識した塩基や特異的な配列のアダプターの結合を利用して、識別可能なように加工して調製し、断片化した後にそれぞれの末端側のｃＤＮＡ断片を選択する方法が挙げられる。この方法により、方向に関する情報が明らかなＤＮＡ断片を取得することができ、有利である。また、前記断片化の方法に特に限定はないが、物理的方法（超音波処理、剪断力の負荷等）、化学的方法（酸処理等）、酵素的方法（ＤＮａｓｅ  Ｉのようなエンドヌクレアーゼによる分解等）が使用できる。
【００２２】
（２）断片化したＤＮＡをサイズ分画する工程
本工程では、上記（１）で得られたＤＮＡ断片をサイズ分画操作に供し、適切な範囲の鎖長のＤＮＡ断片が選択される。サイズ分画の方法に特に限定はなく、公知の手法がいずれも適用できる。例えば、ゲル電気泳動の後ゲルからＤＮＡを回収する方法、ゲルろ過法、限外ろ過法等が使用できる。この工程においては、１００〜１０００ｂｐ、望ましくは４００〜６００ｂｐの鎖長のＤＮＡ断片が回収されるよう分画操作が実施される。
【００２３】
（３）サイズ分画されたＤＮＡ断片をタグベクターに連結し、タグライブラリーを作製する工程
上記工程（２）で得られた、断片化されたＤＮＡをタグベクターに連結する。
タグベクターに含まれるタグ配列としては、前記特許文献１に開示されたものが使用でき、その中でも、前記非特許文献１に述べられたものが特に好適に使用できる。また、タグベクターは薬剤耐性等の選択マーカーを含んでいることが望ましい。大腸菌を宿主として使用する場合、マーカーとしてはアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性等の薬剤耐性遺伝子が使用できる。
上記工程（２）で得られたＤＮＡ断片の末端は、タグベクターに連結する前に平滑化してもよい。平滑化処理には、例えばＢＡＬ３１エキソヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素またはこれらの酵素の組み合わせによる処理を利用できる。このようにして調製したＤＮＡ断片は、平滑末端を有する、直鎖状化したタグベクターと効率よく連結できる。物理的または化学的処理によって断片化したＤＮＡ断片の末端形状は不揃いで、５’−ＯＨ、５’−リン酸、３’−ＯＨ、３’−リン酸のものが混在している。このうちＴ４  ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡ連結酵素の基質になるのは５’−リン酸基と３’−ＯＨ基を持つＤＮＡだけなので、アルカリホスファターゼ等の酵素により末端のリン酸基を除去したのちにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素により５’末端を選択的にリン酸化すれば、効率よくベクターに連結可能なＤＮＡ断片となる。断片化ＤＮＡの平滑化した末端を、リンカーやアダプターを連結することによって突出末端に変換することもできる。リンカーやアダプターを連結されたＤＮＡ断片は、そのままタグベクターに連結してもよいし、例えば、ＰＣＲ等によって増幅後、適当な制限酵素で消化してから連結してもよい。このＤＮＡ断片は、生成した突出末端に相補的な末端を有する直鎖状のタグベクターとさらに効率よく連結することができる。このとき、上記工程（１）で用いたＤＮＡがそれぞれの末端を識別可能なように加工したものである場合は、所望の末端側のＤＮＡ断片について、例えばストレプトアビジンとの親和性を利用して選択した後にリンカーやアダプターを結合させることや、特異的配列のプライマーを用いたＰＣＲで増幅することが可能である。こうして取得されたＤＮＡ断片は、タグ配列に対して本来のＤＮＡの向きを反映した一定方向にそろうよう、タグベクターに挿入することができる。
【００２４】
断片化ＤＮＡが連結されたタグベクターを適当な宿主、好ましくは大腸菌に導入する。ＤＮＡの宿主への導入は公知の方法によって行うことができ、特に限定はないが、大腸菌を宿主として形質転換を行う場合にはエレクトロポレーション法やコンピテントセルを用いた方法が使用できる。タグベクターのマーカー遺伝子に対応する選択圧のもと、形質転換体を培養し、その細胞から断片化ＤＮＡとタグベクターが連結されたＤＮＡの混合物であるタグライブラリーを調製する。タグライブラリー調製においては、公知の方法でＤＮＡの調製を実施すればよく、タグベクターがプラスミドベクターである場合には、例えばアルカリ−ＳＤＳ法が使用できる。
この際、形質転換を行った宿主細胞の一部を固形選択培地に接種し、出現するコロニー数を計数することにより、タグライブラリーに含まれる独立したクローン数を測定することが望ましい。
【００２５】
以下の工程に使用する独立したクローン数は目的により適宜設定すればよいが、メガソートの網羅性を考慮すれば１０４以上、好ましくは１０５以上、さらに好ましくは１０６以上に設定される。タグライブラリーを複数個のプールとして作製しておき、使用するプールの個数を選択することにより目的のクローン数を得る方法が有効である。この場合、プール１個あたりのクローン数を１万〜数十万、作製するプール数を２個から１００個とすることにより目的のクローン数を有するタグライブラリーを簡便に調製できる。
【００２６】
前記非特許文献１のタグベクターは、タグ部分の配列が異なる約１７００万種類のプラスミドの混合物である。メガソートを行うためには１個のマイクロビーズには１種類の配列のＤＮＡを結合させる必要があり、そのためには１種類のタグ配列には１種類の標的ＤＮＡ配列を対応させることが必要である。タグライブラリーの各プールに含まれるクローン数を１７万〜１００万に設定し、標的ＤＮＡのマイクロビーズへの結合をプールごとに行うことにより、２種類以上の標的ＤＮＡが結合したタグの割合を０．５〜数％という低い値に抑えることができる。
【００２７】
本発明の方法にてタグライブラリーを作製すると、例えば、ヒトのｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３７  ｍＲＮＡのように、ＧＡＴＣ配列を持たないために前記非特許文献１の方法ではクローニングできなかった遺伝子をクローニングできるようになり、制限酵素の認識配列に依存せずに均一鎖長のｃＤＮＡ断片を取得することができる。また、本発明の方法によれば、例えば、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３１  ｍＲＮＡは４２８ｂｐのｃＤＮＡ断片として得られ、ホモロジー検索、例えばＢＬＡＳＴにより検索した場合、ｅ−ｖａｌｕｅは０であるが、前記非特許文献１の方法では、該遺伝子は２３ｂｐの短いｃＤＮＡ断片としてしか得られないため、ｅ−ｖａｌｕｅが２ｅ−８となり、ホモロジー検索の信頼性が低い。
【００２８】
（４）タグライブラリーからタグ配列が結合したＤＮＡを調製し、マイクロビーズに結合させる工程
上記工程（３）で調製したタグライブラリーより、タグ配列が付加されたＤＮＡの断片を調製する。この方法に特に限定はないが、例えば前記のライブラリーを１種類または複数種類の適当な制限酵素で消化した後、消化物をゲル電気泳動やゲルろ過等による分子量分画に供してベクター部分が除去されたＤＮＡを調製する方法、およびＰＣＲによる方法等が例示される。特に、ＰＣＲによる方法は、標的ＤＮＡとタグを含むＤＮＡを大量に調製する場合に簡便であること、目的の部分だけを増幅できるのでベクターを除去する必要がないこと等の利点がある。この場合、標的ＤＮＡ側のプライマーを蛍光基、タグ側のプライマーをビオチン等の特異的選別が可能な基で標識しておくことにより以後の操作を効率的かつ簡便に行うことができる。
【００２９】
このＤＮＡのタグ部分を例えば次の方法により１本鎖化する。前記非特許文献１のタグはＡ、Ｔ、Ｇ塩基からなり、タグの相補鎖はＴ、Ａ、Ｃからなる。前記ＤＮＡについて、必要に応じてタグとタグ側の末端の間を切断する制限酵素で消化、末端断片を除去したのち、ｄＧＴＰ存在下Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを作用させることによりタグ部分だけを１本鎖化できる。
【００３０】
こうして得られた１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片を、アンチタグが結合したマイクロビーズ（以下、マイクロビーズと略す）に結合させる。マイクロビーズは、例えば前記特許文献１および非特許文献１に記載された方法で調製することができる。１本鎖タグつき標的ＤＮＡとマイクロビーズを混合してインキュベーションし、ハイブリダイゼーションを実施する。インキュベーション液の組成、温度等の条件は、マイクロビーズ上のアンチタグと断片化標的ＤＮＡに結合した１本鎖タグが特異的にハイブリダイズする条件であれば特に限定はない。特異的にハイブリダイズする条件の一例として、本発明を特に限定するものではないが、非特許文献１に記載のインキュベーション液、すなわち５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸Ｎａ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、３％デキストラン硫酸を含有する溶液は本発明に好適である。インキュベーションの時間、温度にも特に限定はないが、非特許文献１に記載の７２℃、３日間ハイブリダイズさせる条件が好適に使用できる。
【００３１】
インキュベーションの終了後にマイクロビーズを洗浄し、次いで１本鎖タグつき標的ＤＮＡがハイブリダイゼーションにより結合したマイクロビーズを選別する。標的ＤＮＡ側のＰＣＲプライマーを蛍光標識しておけば、当該標識を指標にセルソーターを用いてマイクロビーズを選別できるので、操作の容易性、得られるマイクロビーズの純度等の点で有利である。
【００３２】
次いで、ＤＮＡリガーゼによってマイクロビーズに結合した標的ＤＮＡ断片とアンチタグとの間に共有結合を形成させる。使用するＤＮＡリガーゼに特に限定はないが、例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼが好適に使用できる。ＤＮＡリガーゼによる反応に先立って、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼでマイクロビーズを処理するとＤＮＡリガーゼ反応の効率が向上する場合があるので、必要に応じてこの反応を行えばよい。使用するＤＮＡポリメラーゼに特に限定はないが、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。
【００３３】
上記の方法により作製された、ＤＮＡの固定化されたマイクロビーズは、遺伝子中に存在する制限酵素サイトの位置とは無関係に設定された、特定の範囲の鎖長を有するＤＮＡが固定されている。非翻訳領域がのみがマイクロビーズに固定化されている可能性は非常に低い。したがって、こうして得られたマイクロビーズは網羅的な遺伝子発現の解析において非常に有用である。
【００３４】
以下に、このマイクロビーズを使用した遺伝子発現解析方法について説明する。
本発明の遺伝子発現の解析方法は、上記の方法により作製されたマイクロビーズ（標的ＤＮＡ結合マイクロビーズ）上のＤＮＡと、２種類以上のＲＮＡ試料から調製した、試料ごとに異なる蛍光または発光物質により標識された核酸プローブとをハイブリダイズさせ、個々のビーズが有する蛍光または発光を読み取る工程を包含する。
【００３５】
まず、マイクロビーズ上に存在する標的ＤＮＡの末端の、蛍光基を含むＤＮＡ断片を制限酵素消化によって除去する。必要に応じ、後の工程で選択されたビーズからそこに固定化されたＤＮＡを回収するためにアダプターを付加してもよい。
次いで、アルカリ処理を行い、アンチタグが連結されていない側のＤＮＡ鎖を除去することで、ビーズ上の標的ＤＮＡに対してプローブがハイブリダイズすることが可能になる。
【００３６】
標的ＤＮＡ部分が一本鎖になったマイクロビーズは何個使用してもよいが、解析対象の網羅性を考慮すると、望ましくは４０万個以上のマイクロビーズに対して、蛍光色素で標識したプローブＤＮＡをハイブリダイズさせる。プローブは何種類でもよいが、１種類のサンプルから蛍光または発光標識したプローブを調製し、ビーズにハイブリダイズさせてもよいし、２種類以上のサンプルを別々の蛍光または発光色素で標識して、競合ハイブリダイズさせることもできる。プローブの材料は遺伝子発現量を反映する核酸であれば、特に限定はなく、例えばｃＤＮＡ、全ＲＮＡ、ポリＡ  ＲＮＡ、ｃＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により調製したＲＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー由来のＰＣＲ産物などを使用すればよい。蛍光色素には特に限定はないが、例えばＣｙ５、Ｃｙ３、フルオレセインなどが使用できる。或いは、例えばビオチン標識など一次標識したＤＮＡをプローブとして用い、ハイブリダイゼーションの後、例えばフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）標識ストレプトアビジンなどにより、２段階で蛍光色素を結合させることもできる。プローブの標識方法には特に限定はなく、例えばＰＣＲ逆転写反応、ｃＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ合成・増幅時に蛍光基質を取り込ませる酵素的方法でもよいし、例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡなどの特定の塩基を蛍光標識する化学的方法でもよい。
【００３７】
標識プローブと標的ＤＮＡ結合マイクロビーズとを混合してインキュベーションし、ハイブリダイゼーションを実施する。インキュベーション液の組成、温度等の条件は、プローブがマイクロビーズ上の一本鎖標的ＤＮＡに、特異的にハイブリダイズする条件であれば特に限定はないが、例えば非特許文献１に記載の条件、すなわち４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、６５℃、一晩ハイブリダイズさせる条件が好適に使用できる。
【００３８】
インキュベーション終了後のマイクロビーズを洗浄後、セルソーターにより興味のある領域をゲートとして設定し、そこに含まれるマイクロビーズをソートする。ソートされた領域のビーズから標的ＤＮＡをクローニング・シークエンス解析し、クラスタリング、ホモロジーサーチなどを行うと、各ゲートに何の遺伝子が何個含まれるかという情報が取得できる。ソートされたマイクロビーズ上の標的ＤＮＡを同定する方法に特に限定はないが、ビーズに固定されたＤＮＡをＰＣＲ等により増幅したあとプラスミドベクターにクローニングして塩基配列を決定する方法が好適に使用できる。マイクロビーズ上の標的ＤＮＡを増幅する方法に特に限定はなく、例えば複数のビーズを鋳型としたＰＣＲを行うこともできるし、一個一個のビーズを分離してからＰＣＲを行ってもよい。また、マイクロビーズ上のＤＮＡとハイブリダイズしたプローブＤＮＡやＲＮＡ適切な方法、例えばＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲにより増幅してもよい。
【００３９】
ＰＣＲ産物のベクターへのクローニングには、そのままＴＡベクターなどに連結する方法、末端を平滑化した後に平滑末端を有する直鎖化したベクターに連結する方法、適当な制限酵素部位を付加したプライマーを使用して得たＰＣＲ産物を該制限酵素で消化し、相補的末端を有するベクターに挿入する方法等が使用できる。
【００４０】
本発明の遺伝子発現解析方法によれば、プローブとマイクロビーズ上のＤＮＡとが安定してハイブリダイズすることができるため、より網羅性を向上させ、かつ再現性の高い解析を行うことができる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素消化などの基本的な操作にてついてはサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年に記載の方法によった。さらに、以下に示す大腸菌を用いたプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌ＴＯＰ１０を宿主として使用した。また、形質転換された大腸菌は３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）、あるいは上記培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢ−クロラムフェニコールプレートを用いて３７℃で好気的に培養した。
【００４２】
実施例１
１．試料の調製
ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１．３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で７日間培養し、好中球様細胞に分化させた。さらに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加し５％ＣＯ２存在下で３７℃、６時間培養した後、終濃度  １００ｎｇ／ｍｌのホルボール  １２−ミリステート  １３−アセテート（ＴＰＡ）溶液を添加し、５％ＣＯ２存在下で３７℃、４時間培養した。この細胞を以下、ＴＰＡ処理細胞とよぶ。なお、コントロールとして、ＴＰＡ刺激を与えるかわりに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を添加して、同様に培養したものを調製した。以下、コントロール細胞とよぶ。ＴＰＡ処理細胞とコントロール細胞をそれぞれ回収してトリゾル試薬（ギブコ社製）により全ＲＮＡを抽出し、さらにオリゴテックスｓｕｐｅｒ（タカラバイオ社製）によりポリＡ  ＲＮＡを精製した。
【００４３】
２．タグライブラリー作製
ＨＬ−６０  コントロール細胞由来２．５μｇのポリＡ  ＲＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１で示される塩基配列からなり、５’末端がビオチン化されたプライマーを用いた逆転写反応により合成した二本鎖ｃＤＮＡを、フェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿により精製し、４００μｌのＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。このｃＤＮＡについてＵＲ−２０Ｐ（トミー精工社製）により１５秒間の超音波処理を４回行った後、ＣＩＡＰ（仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ、タカラバイオ社製）により脱リン酸処理を行った。このＤＮＡをフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿によって精製し、タカラＢｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｎａｔｉｏｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎキット（タカラバイオ社製）を用いて末端の平滑化とリン酸化を行った。アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分離し、４００〜６００ｂｐの鎖長に相当するゲルブロックを切り出し、ここからＱＩＡＧＥＮ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）によりＤＮＡを抽出した。
【００４４】
このＤＮＡを１ｍｇのダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）に、２５℃で３０分間結合させ、ＭＰＣ（ダイナル社製）に３０秒間静置した後、上清を除去した。１×ＢＷ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ）によりビーズの洗浄を行った後、ＢａｍＨＩサイトを持つアダプターＤＮＡを添加し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により、１６℃、一晩、ライゲーション反応を行った。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなり、５’末端がビオチン化されたオリゴヌクレオチドと、配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたものである。１×ＢＷによるビーズ洗浄の後、ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ社製）にてビーズから切り出し、得られたＤＮＡ溶液をフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿によって精製した。このＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号４で示されるビオチン化オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号５で示されたオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物をキアクイックＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（キアゲン社製）にて精製後、ＢａｍＨＩで消化し、ダイナビーズに結合させ、回収した上清ＤＮＡを、フェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿によってＤＮＡを精製した。
【００４５】
一方、上記の方法とは独立して、ＴＰＡ処理細胞、コントロール細胞のそれぞれから非特許文献１の方法に従って最下流のＧＡＴＣ配列からポリＡ配列までのｃＤＮＡ断片を取得した。
前記非特許文献１記載のタグベクターｐＮＣＶ２をＢａｍＨＩおよびＢｂｓＩ（いずれもＮＥＢ社製）により消化したあと、ＣＩＡＰ（タカラバイオ社製）により脱リン酸処理を行った。
超音波処理を使用する本発明の方法で得られたｃＤＮＡ断片、および前記非特許文献１の方法で得られたｃＤＮＡ断片のそれぞれと、前述の直鎖化したｐＮＣＶ２とを、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）により連結し、得られた組換えプラスミドを用いたエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体の一部をＬＢ−クロラムフェニコールプレートに接種し、生じたコロニー数から独立したクローン数を算出するとともに、残りの形質転換体をＬＢ−クロラムフェニコール含有ＬＢ培地に接種し、クローン数１６万相当の培養物からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、６個のプールからなるタグライブラリーを得た。タグライブラリー中の９６クローンのｃＤＮＡについて塩基配列を決定したところ、挿入ＤＮＡの鎖長は４００〜６００ｂｐの範囲に分布していた。
【００４６】
３．マイクロビーズの調製
上記２．で調製したプラスミドプールを鋳型にして前記非特許文献１の方法でＰＣＲ、制限酵素ＰａｃＩ（ＮＥＢ社製）による消化及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）によるタグ部分の１本鎖化を行った。
１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片５０μｇと、アンチタグが結合したマイクロビーズ１．６７×１０７個を混合し、１００μｌの５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、３％デキストラン硫酸中で７２℃、３日間ハイブリダイズさせた。マイクロビーズを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２に続いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄したのち、ＭｏＦｌｏサイトメーター（ダコ  サイトメーション社製）を用いてＦＡＭによる蛍光強度が上位１％であるマイクロビーズをソーティングした（第１回目ソーティング）。
【００４７】
ソーティングしたマイクロビーズにＴ４  ＤＮＡリガーゼを作用させることによって標的ＤＮＡ断片とアンチタグの間に共有結合を形成させ、次いでＢａｍＨＩで消化した。さらにｄＧＴＰ存在下、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼをマイクロビーズに作用させた後、アダプターＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号７で示される塩基配列からなり、５’末端がリン酸化され、３’末端がＦＡＭ標識されたオリゴヌクレオチドとをアニールさせたものである。最後に、アルカリ処理による一本鎖化を行い，ＭｏＦｌｏサイトメーターを用いてＦＡＭの蛍光を持たないマイクロビーズをソーティングした（２回目ソーティング）。
【００４８】
４．Ｍｅｇａｓｏｒｔ（競合ハイブリダイゼージョン）
コントロール細胞、およびＴＰＡ処理細胞由来のポリＡ  ＲＮＡ各０．５μｇを鋳型とし、配列表の配列番号８で示されるＴ７プロモーター配列付きのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（タカラバイオ社製）によりｃＤＮＡ合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型として、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）によりＲＮＡを合成した。なお、コントロール細胞由来のｃＤＮＡにはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＵＴＰを、ＴＰＡ刺激細胞由来のｃＤＮＡにはＣｙ５−ｄＵＴＰを取り込ませ、ＲＮＡプローブを調製した。
【００４９】
これらのプローブを、コントロール細胞およびＴＰＡ処理細胞由来のポリＡ  ＲＮＡから前記非特許文献１の方法で作製したマイクロビーズ（以下、従来法マイクロビーズと呼ぶ）４０万個の混合し、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ロシュダイアグノスティックス社製）中、５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。一方、上記実施例１−３．で作製したマイクロビーズ（以下、本発明のマイクロビーズと呼ぶ）４０万個についても同様のハイブリダイゼーションを行った。１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、次いで、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる洗浄を行った後、ＭｏＦｌｏサイトメーターを用いて解析を行った。その結果、本発明のマイクロビーズの蛍光値は、従来法マイクロビーズを使用した場合に比べて高く、ハイブリダイズしなかったマイクロビーズとの区別が容易であった。
ＭｏＦｌｏサイトメーターを用いて、ＴＰＡ刺激によって発現量が上昇した遺伝子が結合したマイクロビーズを含む領域（以下、Ｕｐゲートとする）と、発現量が減少した遺伝子が結合したマイクロビーズを含む領域（以下、Ｄｏｗｎゲートとする）より、全マイクロビーズ数の１％相当ずつをソートした。
【００５０】
５．Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ
ソートされたビーズの一部、約２００個相当を鋳型とし、配列表の配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲにより、マイクロビーズ上のＤＮＡを増幅した。Ｔａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて３’側にＴが一塩基突出した直鎖化ｐＴ７Ｂｌｕｅ２（ノバジェン社製）に連結した。なお、従来法マイクロビーズについては、同様に増幅したＰＣＲ産物をＳａｕ３ＡＩとＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ社製）にて消化した後、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ社製）で直鎖化したｐＴ７Ｂｌｕｅ２ベクターに、Ｔａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２を用いて連結した。従来法マイクロビーズおよび本発明のマイクロビーズ由来のクローンを、ＵｐゲートおよびＤｏｗｎゲートから各１９２個ずつシークエンス解析した。
【００５１】
パラセルクラスタリングパッケージ（パラセル社製）によるクラスタリング解析後、ｎｔＤＢに対してＢＬＡＳＴ検索を行った結果、ヒットした遺伝子は１０２種類であった。このうち６種類は、ＧＡＴＣ配列を持たない遺伝子、例えばｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３７  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００９７）であり、これらは、すなわち、前記非特許文献１の方法では、取得不可能な遺伝子である。また、ＧＡＴＣ配列までの距離が９０ｂｐ以下である遺伝子について、６個取得できた。その一例として、ＧＡＴＣ配列からポリＡ配列までの距離が２３ｂｐである、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３１  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ００９９３２）が挙げられる。仮に、従来法マイクロビーズから当該遺伝子が取得されたとしても、ＢＬＡＳＴ検索時のｅ−ｖａｌｕｅは２ｅ−８であり信頼性が低かったであろう。しかし、本発明の方法ならば、当該遺伝子の３’末端領域４２８ｂｐがマイクロビーズに固定されたため、得られた配列情報が多い上に、ｅ−ｖａｌｕｅが０であり、非常に高い信頼性で、遺伝子を同定することができた。
【００５２】
従来法マイクロビーズを使用してメガソートを行った場合は、ＧＡＴＣ配列を持たない遺伝子を取得することができなかった。また、ポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離が８０ｂｐ以下の遺伝子については、３種類取得できたが、いずれも短い配列であるため、ＢＬＡＳＴ検索におけるｅ−ｖａｌｕｅによる信頼性が低かった。
よって、制限酵素部位によらず、ある程度の長さを持つ断片をビーズに固定化することは、メガソートにおけるハイブリダイゼーションの特異性が上昇すること、さらには、より長い配列情報を取得すること、非常に高い信頼性で遺伝子を同定できること等の点で、有利である。
一方、Ｍｅｇａｓｏｒｔで取得した遺伝子のうち、ポリＡからＧＡＴＣまでの距離が長い、例えば、５００ｂｐ以上である遺伝子は、従来法ビーズを使用した場合は、全体の１０％であるのに対し、本発明の方法によると、全体の２２％となり、ポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離が長い遺伝子をより多く取得することができた。
【００５３】
実施例２
１．試料の調製
マウスＣＬ５７ＢＬの雄雌各５匹の心臓または骨格筋よりトリゾル試薬（ギブコ社製）にて全ＲＮＡを抽出した。
【００５４】
２．タグライブラリー作製
上記の全ＲＮＡ  ２０μｇを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、上記実施例１と同様の方法で超音波処理、脱リン酸化、平滑化およびリン酸化、アガロースゲル電気泳動による鎖長４００〜６００ｂｐに相当するＤＮＡ断片の回収・精製、アビジンビーズへの結合を行った。次いで、内部にＳｆａ  ＮＩ部位を持つアダプターＤＮＡを連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号１２で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたものである。アダプターが連結されたＤＮＡを含むアビジンビーズ懸濁液、または、ＢｓｍＢＩ（ＮＥＢ社製）にてビーズから切り出したＤＮＡ溶液を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ｃＤＮＡのポリＡ側のプライマーには、５’側にＳｆａ  ＮＩ認識配列を挿入しておいた。
【００５５】
ＰＣＲ産物の一部をタイプＩＩｓ制限酵素であるＳｆａ  ＮＩで消化した後、ダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（ダイナル社製）に結合させ、回収した上清ＤＮＡを、フェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿により精製した。
この断片化ＤＮＡと非特許文献１の方法にて直鎖化したｐＮＣＶ２をＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）により連結し、得られた組換えプラスミドを用いたエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。クローン数１６万相当の培養物からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、８個のプールからなるタグライブラリーを得た。コロニーＰＣＲを行ったところ、タグライブラリー中のｃＤＮＡの分子量は、４００〜６００ｂｐの範囲に分布していた。
【００５６】
マウス心臓より作製したライブラリーから任意の９６クローンについてシークエンス解析、クラスタリングを行った結果、５９個の遺伝子を同定することができた。このうち２個は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ，  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＶＩｃ（Ｃｏｘ６ｃ）ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０５３０７１）のように、ＧＡＴＣ配列を持たない遺伝子、すなわち前記非特許文献１の方法では取得できない遺伝子であった。また、３個は、ポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離が９０ｂｐ以下の遺伝子であり、その一例として、５８ｂｐである、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＩＩ（Ｃｏｘ２）ｍＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ；  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ（ｇｂ｜ＡＦ３７８８３０．１｜ＡＦ３７８８３０）が挙げられる。当該遺伝子が、仮に、前記非特許文献１の方法によってクローニングされたとしても、ＢＬＡＳＴ検索結果のｅ−ｖａｌｕｅは４ｅ−７であったであろう。しかし、本発明の方法ならば、当該遺伝子は、４６７ｂｐの断片長となるため、ｅ−ｖａｌｕｅが０となり、高い信頼性で遺伝子同定を行うことが可能であった。
【００５７】
また、ポリＡからＧＡＴＣまでの距離が５００ｂｐ以上の遺伝子は、逆転写の際、ＧＡＴＣまで到達しない可能性も考えられるが、例えばＧＡＴＣまでの距離が９８８ｂｐであるＭｏｕｓｅ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｍＲＮＡ，  ３’  ｆｌａｎｋ．（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｍ７４７５１）のようにポリＡ配列からＧＡＴＣ配列までの距離が５００ｂｐを超える遺伝子が４種類含まれていた。
以上のことから、従来のマイクロビーズアレイ技術とは異なり、ＧＡＴＣ配列の有無や、ｃＤＮＡ中のＧＡＴＣ配列の位置に影響されずに、タグライブラリーを作製することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、一定範囲の鎖長のＤＮＡが固定化されたマイクロビーズが提供される。前記マイクロビーズは遺伝子の網羅性、プローブとのハイブリダイゼーションの安定性に優れており、生物における遺伝子発現の解析において有用である。特に、本発明のマイクロビーズをメガソート法に使用した場合にはメガソート時の蛍光値の上昇、メガソート解析対象遺伝子の網羅性の増加、従来法より多くの配列情報の取得が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID:1; Primer to synthesizing cDNA from mRNA
SEQ ID:2; Oligonucleotide constituting adapter comprising BamHI site.
SEQ ID:3; Oligonucleotide constituting adapter comprising BamHI site.
SEQ ID:4; PCR primer.
SEQ ID:5; PCR primer.
SEQ ID:6; PCR primer.
SEQ ID:7; Oligonucleotide constituting adapter.
SEQ ID:8; Primer to synthesizing cDNA from mRNA
SEQ ID:9; PCR primer.
SEQ ID:10; PCR primer.
SEQ ID:11; Oligonucleotide constituting adapter comprising SfaNI site.
SEQ ID:12; Oligonucleotide constituting adapter comprising SfaNI site.
【配列表】
2005117943000001.app