(57)【要約】      （修正有）【課題】ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体の提供。【解決手段】ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有する特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。該アミノ酸配列をコードするＤＮＡからなる遺伝子、および、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトＮビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）は、ラクトＮビオース（ガラクトピラノシルβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン）をガラクトース−１−リン酸とＮ−アセチルグルコサミンに加リン酸分解する酵素であり、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）の菌体内にその活性が報告されている（非特許文献１）。本酵素はまたその逆反応を触媒することから、本酵素を用いることにより、食品用素材，医薬品用素材などとして有用と期待される種々のラクトＮビオース誘導体を合成することが可能である。このように、ラクトＮビオースホスホリラーゼは産業上極めて重要な酵素である。
【０００３】
しかしながら、従来、ラクトＮビオースホスホリラーゼはビフィドバクテリウム・ビフィダム菌体から抽出したものが粗酵素あるいは部分精製酵素として利用されているにすぎず（非特許文献２）、該酵素を安定的に生産して工業的利用の向上を図ることは行われていなかった。
【０００４】
【非特許文献１】Ｄａｎｉｅｌｌｅ  Ｄｅｒｅｎｓｙ−Ｄｒｏｎ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃ  Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ，  Ｃｏｌｅｔｔｅ  Ｂｒａｓｓａｒｔ，  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈａｎｅ  Ｂｏｕｑｕｅｌｅｔ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２９，  ３−１０  （１９９９）
【非特許文献２】Ｅｒｚｓｅｂｅｔ  Ｆａｒａｋａｓ，  Ｊａｃｈｉｍ  Ｔｈｉｅｍ，  Ｆｅｒｅｄｅｒｉｃ  Ｋｒｅｗｉｎｓｋｉ，  Ｓｔｅｐｈａｎｅ  Ｂｏｕｑｕｅｌｅｔ，  Ｓｙｎｌｅｔｔ，  ７２８−７３０  （２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子が提供されれば、それを用いることによりラクトＮビオースホスホリラーゼの安定的で効率的な生産が可能になると期待される。
【０００６】
そこで本発明は、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００８】
（２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００９】
（３）上記（１）又は（２）に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（４）上記（３）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクターを含む形質転換体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関する。配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質はラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有する。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号２０の第２８６〜２５３８番のＤＮＡ塩基配列が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば配列番号１９の第２０〜２２７２番のＤＮＡ塩基配列が挙げられる。
【００１２】
本発明に係る遺伝子はまた、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってよい。アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、天然に生じたものであってもよく、部位特異的変異導入方法等を行った結果として生じたものであってもよい。
【００１３】
本発明に係る遺伝子はまた、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。同様に、本発明に係る遺伝子はまた、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの全部又は一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらにハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃での条件である場合も、本発明における「ストリンジェントな条件」に含めることができる。
【００１４】
ここで、「一部の配列」とは、所定の遺伝子の塩基配列の一部分を含むＤＮＡの塩基配列であって、該ＤＮＡがラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものを指す。また「一部の配列」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するもの、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも５０塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。
【００１５】
ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性は、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中３０℃において、１０ｍＭ  αガラクトース−１−リン酸及び１０ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミンから生じるリン酸の遊離量を測定することにより評価した。
【００１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、例えばビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４（理化学研究所微生物系統保存施設より入手可能）から、実施例に示す手法で得ることができる。ビフィドバクテリウム・ビフィダム由来のラクトＮビオースホスホリラーゼをクローニングするためには、ラクトＮビオースホスホリラーゼを完全精製された状態で入手することが不可欠である。しかしながら従来、部分精製の方法および部分精製酵素の利用が報告されているのみであり（非特許文献１，２）、完全精製は安定性の面から困難である旨が報告されていた（非特許文献１）。本発明者らは、疎水クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを効果的に配置することにより困難な完全精製に初めて成功した。そして、こうして得られた完全精製酵素を用いることにより本発明を完成するに至った。更にまた本遺伝子のクローニングを行うに際して、全アミノ酸配列情報を得ることが困難であり通常のＰＣＲ法では遺伝子全長を取得することが難しい。本発明者らは、鋭意研究の結果、ＤＮＡの内部配列を増幅してからその配列を元に実施例に詳述する特殊なＰＣＲ法を行うことによりタンパク質コード領域全長を取得することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、例えばビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＪＣＭ １２１７株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手可能）から、実施例に示す手法で得ることができる。本遺伝子を得るためには、まず、タンパク質コード領域の外側のＤＮＡ配列に対するプライマーを作成しＰＣＲにて増幅できる条件を検討した後に、得られた増幅断片の配列をもとにプライマーを設計し全長配列のクローニングを行うという二段階のＰＣＲを行うことを特徴とする方法を用いる必要があった。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、データベース上に開示されているビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ２７０５株由来の機能未知遺伝子ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と９７％程度の相同性を示すのであるが、本発明に係る遺伝子の入手にもまた酵素の完全精製が必須であったこと及び上記のように二段階の特殊なＰＣＲ増幅を行う必要があることに鑑みれば、機能未知遺伝子ＢＬ１６４１が開示されているという事実にかかわらず、本発明に係る遺伝子を入手することは決して容易なことではない。
【００１８】
本発明はまた、本発明の遺伝子を含有する組換えベクターに関する。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また、該ベクター自体が単独では複製され得ないものであっても、宿主の染色体に挿入されることによって、複製可能となるものであればよい。
【００１９】
プラスミドとしては特に限定されないが、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ系プラスミド、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹｅｐ１３等のＹｅｐ系、Ｙｃｐ５０等のＹｃｐ系等）が挙げられ、ファージＤＮＡとしては、特に限定されないが、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらにはレトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることができる。
【００２０】
本発明はまた、これらの組換えベクターを含む形質転換体に関する。かかる形質転換体は、前記組換えベクターを用いて宿主を形質転換することにより得ることができる。前記形質転換は、例えばプロトプラスト法、塩化ルビジウム法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等の常法により行われる。宿主としては、ラクトＮビオースホスホリラーゼの発現に適する宿主であればよく、微生物が好ましく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのエッシェリヒア属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などの動物細胞、ＳＦ９細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
【実施例】
【００２１】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２２】
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株（理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市広沢２番１号）より入手）を減酸素条件下において栄養培地にて培養したのち、培養物から菌体を分離した。次いで該菌体（培養液４Ｌ分）を１０ｍＬの１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で定法により破砕した後、遠心分離を行い菌体破砕液を得た。該菌体破砕液に硫酸アンモニウムを３０％飽和濃度に達するまで加え、生じた沈殿を遠心分離にて除去した。該遠心上清を、３０％飽和濃度硫酸アンモニウムを含んだ１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ  （東ソー）カラムに通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中３０％飽和〜０％の硫酸アンモニウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、硫酸アンモニウムを終濃度６０％飽和になるよう加え、遠心分離により沈殿を回収した。該沈殿を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解した後、同緩衝液により平衡化されたＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ（東ソー）カラムに通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１５０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、硫酸アンモニウムを終濃度６０％飽和になるよう加え、遠心分離により沈殿を回収した。該沈殿を１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解した後、同緩衝液により平衡化されたＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に通液し吸着させた後、該カラムから、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１５０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度勾配により酵素を溶出させた。ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を示した画分を集めた後、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析することにより、精製されたラクトＮビオースホスホリラーゼを得た。得られた酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一のバンドを示し高度に精製されていた。
【００２３】
この精製ラクトＮビオースホスホリラーゼについて、プロテインシーケンサー（PerkinElmer社製）により、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。決定した配列を配列番号３に示す。さらに、このラクトＮビオースホスホリラーゼをＶ８プロテアーゼ（Merck社製）で分解してペプチドフラグメントを調製し、２種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を配列番号４及び５に示す。
【００２４】
解読されたアミノ酸配列について相同検索を行ったところ、ＢＬ１６４１としてＧＥＮＥＳ  Ｄａｔａｂａｓｅに登録されているビフィドバクテリウム・ロンガム由来の機能未知遺伝子産物と高い相同性（相同性８１％）を示した。そこでこのＢＬ１６４１のゲノム情報を基に、隣接するタンパク質コード領域及びタンパク質コード領域内部を増幅するために２つのフォーワードプライマー（配列番号６及び７）及び２つのリバースプライマー（配列番号８及び９）を作成した。
【００２５】
これらのプライマーを組み合わせて使用し、InstaGene Matrix（Bio-Rad社製）を用いて調製したビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株及びビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株（理化学研究所微生物系統保存施設より入手）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、それぞれＰＣＲ反応により増幅させた。
【００２６】
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７に記載したフォーワードプライマーと、配列番号８に記載したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７４℃３分を２７サイクル）を行ない、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１８４８ｂｐの明瞭なバンドが確認された。このバンドをクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１８で示すＤＮＡ塩基配列（１７８８ｂｐ）が含まれていることが決定された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列の一部分と相同であることが確認された（相同性９３％）。すなわち、配列番号１８で示すＤＮＡ塩基配列がタンパク質コード領域の一部分であると推定された。
【００２７】
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株由来遺伝子の完全長のタンパク質コード領域を取得するために、解析されたＤＮＡ塩基配列（配列番号１８）の情報をもとにＰＣＲ増幅を更に行った。
【００２８】
完全長のタンパク質コード領域を含むＤＮＡの５’末端側上流を増幅することを目的として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６に示すフォーワードプライマーと配列番号１０に示すリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７４℃３分を２７サイクル）を行ない、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１９４９ｂｐの明瞭なバンドが確認された。更にまた、完全長のタンパク質コード領域を含むＤＮＡの３’末端側下流を増幅することを目的として、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、解析されたＤＮＡ塩基配列（配列番号１８）をもとに作製したプライマー（配列番号１１〜１３）を用いてサーマルアシンメトリックインターレイストＰＣＲ法（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社、１９９７年、８３頁）を行った（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡）  ＰＣＲ１回目  ９４℃１分、６５℃１分、６８℃３分を５サイクル、９４℃１分、２５℃３分、６８℃３分を１サイクル、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒４９℃１分、６８℃３分を１５サイクル：  ＰＣＲ２回目  ９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒、６３℃１分、６８℃３分、９４℃３０秒４９℃１分、６８℃３分を１５サイクル）。反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約１０００ｂｐの明瞭なバンドが確認された。
【００２９】
こうして得られた２つのバンドをそれぞれクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析してＤＮＡ塩基配列をそれぞれ解読した。解読結果から、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株ゲノムＤＮＡ中には、配列番号２０で示すＤＮＡ塩基配列が存在することが確認された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、配列番号２０の第２８６番〜第２５３８番がコードするアミノ酸配列が、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と相同であることが確認された（相同性９０％）。すなわち、配列番号２０の第２８６番〜第２５３８番がタンパク質コード領域であると推定された。
【００３０】
また、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６に記載したフォーワードプライマーと、配列番号９に記載したリバースプライマーとを用いてＰＣＲ増幅を行ない（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９８℃１０秒、６０℃１０秒、７４℃２分を２７サイクル）、反応産物をアガロースゲル電気泳動に供したところ、２６００ｂｐの明瞭なバンドが確認された。このバンドをＤＮＡシークエンサーで分析したところ、配列番号１９で示すＤＮＡ塩基配列（２３３５ｂｐ）が含まれていることが決定された。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、配列番号１９の第２０番〜第２２７２番（２２５３ｂｐ）がコードするアミノ酸配列が、ＢＬ１６４１がコードするアミノ酸配列と相同であることが確認された（相同性９７％）。すなわち、配列番号１９の第２０番〜第２２７２番がタンパク質コード領域であると推定された。
【００３１】
次に、これらのタンパク質コード領域がラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子であることを確認するために、大腸菌による遺伝子の発現系を構築した。
【００３２】
タンパク質コード領域の５’末端配列及び３’末端配列をもとにプライマー（配列番号１４〜１７）を作成した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株については配列番号１４のフォーワードプライマー及び配列番号１５のリバースプライマーを用い、また、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株については配列番号１６のフォーワードプライマー及び配列番号１７のリバースプライマーを用い、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてタンパク質コード領域の全長をＰＣＲにより増幅した（ＰＣＲ条件：ポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡）を用い、９６℃１５秒、６０℃１５秒、７４℃２分を２７サイクル）。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ２８ａ（Novagen社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。さらに、これらのプラスミドを用いてSambrook，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌ＢＬ２１株（Novagen社製）を形質転換した。形質転換はジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いる電気穿孔法により行った。
【００３３】
以上のようにして得た形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子を発現させ、組換えタンパク質の生産を行った。これらの組換えタンパク質がラクトＮビオースホスホリラーゼ活性を有していたことからクローニングされた遺伝子がいずれもラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが確認された。なお、ラクトＮビオースホスホリラーゼ活性はαガラクトース１リン酸とＮアセチルグルコサミンからのリン酸遊離、及びラクトＮビオースの加リン酸分解によるガラクトース１リン酸とＮアセチルグルコサミンの生成により確認した。
【００３４】
また、活性型ラクトＮビオースホスホリラーゼの分子量を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて評価したところ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株由来ラクトＮビオースホスホリラーゼ及びビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株由来ラクトＮビオースホスホリラーゼのいずれについても約８５,０００ダルトンであり、遺伝子でコードされるタンパク質の分子量８４,２５０及び８４,３２７とそれぞれ良く一致していた。
【００３５】
以上の通り、ラクトＮビオースホスホリラーゼ遺伝子が見出された。すなわち、ラクトＮビオースホスホリラーゼの構造遺伝子は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＪＣＭ １２５４株では配列番号２０の塩基配列中の２８６番目以降２５３８番目までの間に、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＪＣＭ １２１７株では配列番号１９の塩基配列中の２０番目以降２２７２番目までの間にそれぞれ存在することが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
【配列表】
2005341883000001.app