(57)【要約】【課題】（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤の溶出試験法の提供。【解決手段】  （１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤の溶出試験法であって、理論段数２５００以上、分離度２．０以上の条件で、陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムを用い、電気伝導度の変化を感知して、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとリン酸及びクエン酸を分離して、分析する（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤の溶出試験法であって、理論段数２５００以上、分離度２．０以上の条件で、陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムを用い、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとリン酸及びクエン酸を分離することを特徴とする（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項２】
分析時間が１５分以内である請求項１記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項３】
陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムの温度が２５〜５０℃である請求項１または２記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項４】
陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムの温度が２５〜４０℃である請求項１または２記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項５】
陰イオン交換樹脂が親水性である請求項１〜４のいずれかに記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項６】
陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムがイオンパック（登録商標）５Ｓである請求項１記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項７】
溶離液として水酸化ナトリウム水溶液を用い、水酸化ナトリウム水溶液の濃度勾配を２０〜４４ｍｍｏｌ／Ｌから６０ｍｍｏｌ／Ｌに４．５〜７分間で変化させ、６０ｍＭで１．５〜３分間保ち溶出する請求項１記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項８】
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤の溶出試験法であって：
（１）陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムを用い、
（２）溶離液として水酸化ナトリウム水溶液を用い、
（３）流速を０．８〜１．２ｍＬ／分とし、
（４）水酸化ナトリウム水溶液の濃度勾配を２０〜４４ｍｍｏｌ／Ｌから６０ｍｍｏｌ／Ｌに４．５〜７分間で変化させ、６０ｍＭで１．５〜３分間保ち溶出し、
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとリン酸及びクエン酸を分離することを特徴とする（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項９】
陰イオン交換樹脂が、無孔性樹脂からなるコアの表面がスルホン化され、該コアの表面に４級アルカノールアミンで修飾されたマイクロビーズ（登録商標）が付着したものである請求項８記載の分析方法。
【請求項１０】
陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムがイオンパック（登録商標）５Ｓである請求項８記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【請求項１１】
カラム温度が２５〜５０℃の範囲である請求項８記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩の新規な分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩は、二つのＣ−Ｐ結合を有することを特徴とする化合物である。（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート・２ナトリウム塩は強力に骨吸収を抑制する化合物群として知られている。（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩は、in vitroにおいて、細胞培養や器官培養において、さまざまな手段によって引き起こされた骨吸収を抑制する。前者においては破骨細胞による石灰化組織上での小窩（pit）の形成を抑制する。また器官培養においては、胎仔長管骨や、新生仔頭蓋冠における骨吸収を減少させることが知られている。副甲状腺ホルモン、カルシトリオール、プロスタグランジン、腫瘍細胞などの骨吸収刺激物質の作用が（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩によって抑制されることが知られている。
また（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩は成長期の動物において、一次骨梁と二次骨梁の吸収を抑制し、骨幹端のモデリングとリモデリングを停止させることが知られており、骨吸収が亢進したパジェット病、腫瘍随伴性骨疾患、骨粗鬆症の患者に応用されている。
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩は、通常のＵＶ検知法で使用される波長に範囲には、ほとんど吸光度が無いため測定が困難であった。そこで、特許文献１には、ニッケル等の金属とキレートを形成させ測定する方法が提案されている。しかし、非特許文献１の「後発医薬品の生物学的同等性試験ガイドライン」に記載されている試験液である「薄めたMcIlvaineの緩衝液」で溶出試験を実施するとき、試験液中のクエン酸と銅がキレートを形成するため、特許文献１の方法は適用できなかった。
また、非特許文献２には、同じビスフォスフォネート化合物である、（ジクロロメチレン）ビス−フォスフォネートをイオンクロマトグラフを用いて分析する方法が提案されている。しかしこの方法では、分析時間が長いため、多数のサンプルを分析する溶出試験の試験法として適していなかった。
【特許文献１】特開２００２−５８９３
【非特許文献１】「後発医薬品の生物学的同等性試験ガイドライン」平成13年5月31日 医薬審発第786号
【非特許文献２】Determination of impurities in clodronic acid by anion-exchange chromatograpy. G.E.Taylor Journal of Chromatography A, 770(1997)261-271
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、緩衝液の成分に関わらず、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を簡便・迅速に分析する方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の溶離液とその濃度勾配法で、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとMcIlvaineの緩衝液中のリン酸及びクエン酸を分離できることを見いだし、更に検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は：
１．  （１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤の溶出試験法であって、理論段数２５００以上、分離度２．０以上の条件で、陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムを用い、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとリン酸及びクエン酸を分離することを特徴とする（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
２．  分析時間が１５分以内である１．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
３．  陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムの温度が２５〜５０℃である１．または２．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
４．  陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムの温度が２５〜４０℃である１．または２．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
５．  陰イオン交換樹脂が親水性である１．〜４．のいずれかに記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
６．  陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムがイオンパック（登録商標）５Ｓである１．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
７．  溶離液として水酸化ナトリウム水溶液を用い、水酸化ナトリウム水溶液の濃度勾配を２０〜４４ｍｍｏｌ／Ｌから６０ｍｍｏｌ／Ｌに４．５〜７分間で変化させ、６０ｍＭで１．５〜３分間保ち溶出する請求項１記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
８．  （１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤の溶出試験法であって：
（１）陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムを用い、
（２）溶離液として水酸化ナトリウム水溶液を用い、
（３）流速を０．８〜１．２ｍＬ／分とし、
（４）水酸化ナトリウム水溶液の濃度勾配を２０〜４４ｍｍｏｌ／Ｌから６０ｍｍｏｌ／Ｌに４．５〜７分間で変化させ、６０ｍＭで１．５〜３分間保ち溶出し、
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとリン酸及びクエン酸を分離することを特徴とする（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
９．  陰イオン交換樹脂が、無孔性樹脂からなるコアの表面がスルホン化され、該コアの表面に４級アルカノールアミンで修飾されたマイクロビーズ（登録商標）が付着したものである８．記載の分析方法；
１０．  陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムがイオンパック（登録商標）５Ｓである７．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法。
１１．  カラム温度が２５〜５０℃の範囲である８．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
１２．  溶出液が薄めたMcIlvaineの緩衝液である１．〜１１．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；
１３．  薄めたMcIlvaineの緩衝液のｐＨが３．０〜７．５の範囲である１２．記載の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析方法；等
に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとMcIlvaineの緩衝液中のリン酸及びクエン酸を分離でき、「後発医薬品の生物学的同等性試験ガイドライン」に記載されている試験液である「薄めたMcIlvaineの緩衝液」を用いた溶出試験での定量分析が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
理論段数と分離度の定義については、第十四改正日本薬局方に記載されている。
理論段数とは、カラム中における物質のバンドの広がりの度合いを示す値である。具体的には、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの理論段数を指す。更に具体的には、下記の式で定義される。
【０００７】
【数１】
2005180938.tif 000002
【０００８】
分離度とは、クロマトグラム上のピーク相互の保持時間とそれぞれのピーク幅との関係を示すものである。具体的には、クエン酸と（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分離度を指す。更に具体的には、下記式で定義される。
【０００９】
【数２】
2005180938.tif 000003
本発明の（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの分析法においては、理論段数２５００以上、分離度２．０以上の条件から選択される。更に、好ましくは理論段数３０００以上、分離度２．２以上の条件が選択される。
【００１０】
本発明に使用できる薄めたMcIlvaineの緩衝液とは、リン酸１水素二ナトリウム水溶液とクエン酸水溶液を用いてｐＨを調整したものである。
薄めたMcIlvaineの緩衝液のｐＨは、３．０〜７．５、好ましくは５．５〜７．５の範囲のものが挙げられる。
薄めたMcIlvaineの緩衝液の調製に用いるリン酸１水素二ナトリウム水溶液の濃度は、０．０１〜０．０５mol/L、クエン酸水溶液の濃度は、０．００５〜０．０２５mol/Lの範囲のものが挙げられる。
更に具体的には、リン酸１水素二ナトリウム水溶液の濃度は、０．０５mol/L、クエン酸水溶液の濃度は、０．０２５mol/Lを用いてｐＨを調整したものが挙げられる。
【００１１】
本発明に用いられるイオンクロマトグラフ法の陰イオン交換樹脂を充填剤とするカラムとしては、陰イオン交換樹脂が、無孔性樹脂からなるコアの表面がスルホン化され、該コアの表面に４級アルカノールアミンで修飾されたマイクロビーズ（登録商標）が付着したもの等が挙げられる。陰イオン交換樹脂は親水性のものが好ましい。具体的には、例えば、ダイオネクス社からIonpac（登録商標） AS5が市販されているものが挙げられる。カラムの形状は、内径４．０ mm、長さ２５０ mm、陰イオン交換樹脂の粒径が１５mmであることが望ましい。
本発明に用いられるイオンクロマトグラフ法のカラム温度は２５〜５０ ℃の範囲から選択される。好ましくは２５〜４０℃の範囲から選択される。
【００１２】
溶離液としては、水酸化ナトリウム水溶液が用いられる。
本発明に用いられるイオンクロマトグラフ法の水酸化ナトリウム水溶液の濃度勾配は、２０〜４４mmol/Lを４．５から７分間で６０mMまで変化させ、６０mMで１．５から４分間保つ条件、好ましくは、２８mmol/Lを５分間で６０mMまで変化させ、６０mMで２分間保つ条件が挙げられる。
流量としては、０．８〜１．２ｍＬ／分の範囲から選択される。具体的には１ｍＬが挙げられる。
【００１３】
検出器としては、（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートにはほとんどＵＶ吸収が無いことから、電気伝導度検出器を用いることが好ましい。具体的には、例えば、ダイオネクス社製電気化学検出器ED-40型等が挙げられる。
また、分離カラムの後、サプレッサーを通し、溶離液中のナトリウムイオンを水素イオンに交換し、バックグランドを下げて、Ｓ／Ｎ比を上げて検出器に送ることが好ましい。具体的には、例えば、ダイオネクス社製オートサプレッサーASRS-ULTRA,4mm等が挙げられる。
【００１４】
イオンクロマトグラフに使用される具体的な装置としては、例えば、ダイオネクス社製  DX-500型（ポンプ： グラジェントポンプGP-50型、オートサンプラー：オートサンプラー AS-3500型、カラムオーブン：クロマトグラフィーオーブンLC-30型、検出器：電気化学検出器ED-40型、オートサプレッサー： ASRS-ULTRA, 4 mm）が挙げられる。
【００１５】
本発明の分析法に使用される溶出試験装置は、日本薬局法に定められる溶出試験装置を用いることが望ましいが、米国薬局方による装置でも、実験用ビーカーを応用した装置でも差し支えない。日本薬局方に準拠した装置としては、例えば富山産業株式会社製NTR-VS6P, NTR-6000を使用できる。放出液の量は、薬物の性質に応じて適宜選択されるが、通常は５００〜９００ｍLである。また、溶出試験に使用する溶媒は、ｐＨの調整したMcIlvaine緩衝液等を用いることができる。
試験温度は剤の性質に応じて適宜選択されるが、通常２５〜３８℃の範囲から選択される。
【００１６】
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートまたはその塩を有効成分とする経口剤としては、例えば、ダイドロネル（登録商標）が挙げられる。
【００１７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネート標準品を２１０℃で２時間乾燥し、その約２２ｍｇを精密に量り、ｐＨ５．５の薄めたMcIlvaine緩衝液（０．０５mol/Lリン酸１水素二ナトリウムと０．０２５mol/Lクエン酸を用いてｐＨ５．５に調整する）に溶かし、正確に１００ｍＬとし、標準溶液とした。標準溶液につき、溶離液、流量及びカラム温度の条件を表1のとおりに変更し、検出器、オートサプレッサー、分析カラム、ガードカラム、アニオントラップカラム、注入量については表２に示す条件でイオンクロマトグラフ法により試験を行った。クエン酸及び（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートの保持時間、ピーク面積、ピーク高さの中点におけるピーク幅を測定し、理論段数及び分離度を次式により求めた。イオンクロマトグラフは、ダイオネクス社製  DX-500型（ポンプ： グラジェントポンプGP-50型、オートサンプラー：オートサンプラー AS-3500型、カラムオーブン：クロマトグラフィーオーブンLC-30型、検出器：電気化学検出器ED-40型、オートサプレッサー： ASRS-ULTRA, 4 mm）を用いた。
【００１９】
【表１】
2005180938.tif 000004
【００２０】
【表２】
2005180938.tif 000005
【００２１】
【数３】
2005180938.tif 000006
【００２２】
【数４】
2005180938.tif 000007
【００２３】
実施例１の結果を表３及び図１〜８に示す。いずれにおいても、理論段数及び分離度は良好であり、分析時間１２分の迅速な測定が可能であった。
【００２４】
【表３】
2005180938.tif 000008
【実施例２】
【００２５】
比較例１
溶離液、流量及びカラム温度の条件については、表４のとおりに条件を変更し、検出器、オートサプレッサー、分析カラム、ガードカラム、アニオントラップカラム、注入量は表２のとおりに、その他は実施例1と同様の方法で試験を行った。
【００２６】
【表４】
2005180938.tif 000009
【００２７】
比較例１の結果を表５及び図９〜１１に示す。条件９は非特許文献２の試験条件であり、分析時間が35分であった。条件１０では（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとクエン酸が分離しなかった。条件１１では、じゅうぶんな理論段数及び分離度が得られなかった。
【００２８】
【表５】
2005180938.tif 000010
【実施例３】
【００２９】
比較例２
溶離液、流量及びカラム温度の条件については、表６のとおりに条件を変更し、検出器、オートサプレッサー、分析カラム、ガードカラム、アニオントラップカラム、注入量は表７のとおりに、その他は実施例１と同様の方法で試験を行った。
【００３０】
【表６】
2005180938.tif 000011
【００３１】
【表７】
2005180938.tif 000012
【００３２】
比較例２の結果を表８及び図１２〜１６に示す。条件１０では（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートとクエン酸が分離しなかった。その他の条件では充分な分離度及び理論段数が得られなかった。
【００３３】
【表８】
2005180938.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】条件1のイオンクロマトグラムクロマトグラム中、Ａはリン酸、Ｂはクエン酸、Ｃは（１−ヒドロキシエチリデン）ビス−フォスフォネートを指す。以下も同様。
【図２】条件2のイオンクロマトグラム
【図３】条件3のイオンクロマトグラム
【図４】条件4のイオンクロマトグラム
【図５】条件5のイオンクロマトグラム
【図６】条件6のイオンクロマトグラム
【図７】条件7のイオンクロマトグラム
【図８】条件8のイオンクロマトグラム
【図９】条件9のイオンクロマトグラム
【図１０】条件10のイオンクロマトグラム
【図１１】条件11のイオンクロマトグラム
【図１２】条件12のイオンクロマトグラム
【図１３】条件13のイオンクロマトグラム
【図１４】条件14のイオンクロマトグラム
【図１５】条件15のイオンクロマトグラム
【図１６】条件16のイオンクロマトグラム
【図１】
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【図２】
2005180938.tif 000015
【図３】
2005180938.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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