(57)【要約】【課題】  簡便に生態環境系内の微生物群集の状況を把握することができる、微生物群集の解析方法を提供することを課題とする。【解決手段】  試験対象区内に存在する微生物を採取して、当該微生物から核酸を抽出し、抽出された核酸の所定部位を増幅し、増幅した核酸を変性高速液体クロマトグラフィーで分離処理し、試験対象区についての分離結果を解析して、微生物群集の状況を把握する。増幅する核酸の所定部位としては１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域などが好ましい。より具体的な形態としては生態環境系における汚染原因菌の検出、海水中ＣＯ2濃度と微生物群集の関係評価、酸敗原因菌の検出などが行われる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験対象区内に含まれる微生物から核酸を抽出し、抽出された核酸の所定部位を増幅し、増幅した核酸を変性高速液体クロマトグラフィーで分離処理し、試験対象区についての分離結果を解析する、微生物群集の解析方法。
【請求項２】
前記所定部位が、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の少なくとも一部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の微生物群集の解析方法。
【請求項３】
複数の異なる試験対象区ごとに、分離結果を対比させて解析することを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物群集の解析方法。
【請求項４】
同一の試験対象区について、経時的に対比させて分離結果を解析することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【請求項５】
変性高速液体クロマトグラフィーにより得られるクロマトグラムの形状パターンを対比して、分離結果を解析することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【請求項６】
変性高速液体クロマトグラフィーにより分離して得られる画分中に含まれる核酸の塩基配列を解析し、当該塩基配列を他の塩基配列と比較して、試験対象区内に含まれる微生物の種類を同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【請求項７】
試験対象区についての分離結果を解析し、生態環境系の汚染原因菌を検出する、請求項１から６のいずれか一項に記載の、微生物群集の解析方法。
【請求項８】
試験対象区についての分離結果を解析し、アコヤガイの幼生原因菌を検出する、請求項１から６のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【請求項９】
試験対象区内の海水を試験サンプルとし、海水中のＣＯ2濃度と、変性高速液体クロマトグラフィーによる試験対象区についての分離結果とを求め、式（１）に従って群集多様度Ｈ’を算出し、海水のＣＯ2濃度と微生物群集との関係を評価する、請求項１から６のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【数１】
2005065605.tif 000004
【請求項１０】
試験対象区についての分離結果を解析し、活性汚泥中の酸敗原因菌を検出する、請求項１から６のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物群集の解析方法に関し、より詳しくは、さまざまな環境系における微生物群集の概況を簡便に把握することができる微生物群集の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
古来から人間は、医薬、食品等の分野に微生物を利用してきた。特に、近年のバイオテクノロジーの進歩は、社会生活を豊かで快適なものとしている。また、微生物は有機物の分解者として重要な役割を果たしており、環境の保持に寄与している。しかし、近年では生活排水、工場排水等による富栄養化のため、生態系のバランスが崩れ、微生物の酸素消費による青潮や、病原菌の増殖など微生物に起因したり，微生物が深く関与している環境問題が深刻となっている。
【０００３】
しかしながら、環境中の微生物は、培養が困難なものが多く、正確な群集構造の把握や、病原菌の検出が困難な場合が多い。
【０００４】
ところで、近年のＤＮＡの構造解析技術の急速な進展に伴い、微生物（例えば、大腸菌、枯草菌、ラン藻、超好熱菌、酵母など）、植物（例えばイネ、シロイヌナズナなど）、哺乳動物（例えばヒト、マウスなど）などの多くの生物種について、解析が進んだ。各種生物由来のゲノム塩基配列データベースは急ピッチに整備されてきており、これらの情報を利用した環境浄化への応用も期待されている。
【０００５】
生態環境系おける微生物群の変化又は差異の検出については、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を抽出してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、濃度勾配電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａdｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、以下「ＤＧＧＥ」という）によって核酸の分離を行い、塩基配列を解析して、生態環境系の変化または差異を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３２５５９９号公報
【非特許文献１】Profiling of Complex Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rRNA, Applied and Environmental Microbiology, March 1993, p695-700
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような状況の下、本発明は、簡便に生態環境系内の微生物群集の状況を把握することができる、微生物群集の解析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目課題を解決すべく、鋭意研究を進めたところ、所定の試験対象区から微生物を採取して核酸を抽出・増幅し、これを変性高速液体クロマトグラフィー（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下「ＤＨＰＬＣ」という）により分離させて得られる結果により、微生物群集の概況を把握できることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。
【０００９】
〔１〕  試験対象区内に含まれる微生物から核酸を抽出し、抽出された核酸の所定部位を増幅し、増幅した核酸を変性高速液体クロマトグラフィーで分離処理し、試験対象区についての分離結果を解析する、微生物群集の解析方法。
〔２〕  前記所定部位が、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の少なくとも一部を含むことを特徴とする、上記〔１〕に記載の微生物群集の解析方法。
〔３〕  複数の異なる試験対象区ごとに、分離結果を対比させて解析することを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の微生物群集の解析方法。
〔４〕  同一の試験対象区について、経時的に対比させて分離結果を解析することを特徴とする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔５〕  変性高速液体クロマトグラフィーにより得られるクロマトグラムの形状パターンを対比して、分離結果を解析することを特徴とする、上記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔６〕  変性高速液体クロマトグラフィーにより分離して得られる画分中に含まれる核酸の塩基配列を解析し、当該塩基配列を他の塩基配列と比較して、試験対象区内に含まれる微生物の種類を同定する、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔７〕  試験対象区についての分離結果を解析し、生態環境系の汚染原因菌を検出する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の、微生物群集の解析方法。
〔８〕  試験対象区についての分離結果を解析し、アコヤガイの幼生原因菌を検出する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔９〕  試験対象区内の海水を試験サンプルとし、海水中のＣＯ2濃度と、変性高速液体クロマトグラフィーによる試験対象区についての分離結果とを求め、式（１）に従って群集多様度Ｈ’を算出し、海水のＣＯ2濃度と微生物群集との関係を評価する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【００１０】
【数１】
2005065605.tif 000002
【００１１】
〔１０〕  試験対象区についての分離結果を解析し、活性汚泥中の酸敗原因菌を検出する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、微生物群集の概況を簡便に解析することができる。本発明は、微生物に関連する様々な生態環境解析に極めて好適である。より具体的には、本発明は、農林業関連、漁業関連、環境汚染調査、環境モニタリングなどにおける微生物の解析に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の微生物群集の解析方法は、試験対象区内に含まれる微生物から核酸を抽出し、抽出された核酸の所定部位を増幅し、増幅した核酸を変性高速液体クロマトグラフィーで分離処理し、試験対象区についての分離結果を解析する。試験対象区とは、試験の対象とする区域・領域であり、空間的なものも平面的なものも含まれる。試験対象区は、解析を行う者（以下「試験者」という）の任意であり、例えば、海、河川、湖沼、土壌、森林などの屋外環境的な領域を試験対象区としてもよいし、また工場、研究所、家屋などの室内を試験対象区としてもよい。試験対象区内に含まれる微生物を得る方法は特に限定されない。例えば、試験対象区内に含まれる微生物を得るために、試験対象区から微生物が存在する試験サンプルを採取する。具体的には、上記のような試験対象区から採取される、水、土、空気などを試験サンプルとすることができる。
【００１４】
試験サンプルから、そこに含まれている微生物の核酸を抽出する。核酸は、二本鎖ポリヌクレオチドとして回収することが好ましい。核酸の抽出方法は、定法によればよく、例えば、濾過、培養、遠心、溶解等を行い、回収できる。なお、本明細書において核酸とは、ポリヌクレオチドのことであり、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。また、ポリヌクレオチドとは、少なくとも２以上のヌクレオチドが結合した高分子をいう。
【００１５】
なお、本発明における遺伝子工学的な処理、例えば、核酸、タンパク質、プラスミド、種々の酵素、形質転換体などの調製、形質転換体の選抜、ＰＣＲ法などの諸操作については、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, J. Sambrookら編、1989、COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、それらを参照して行えばよい。
【００１６】
抽出された核酸の所定部位を増幅する。核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法により、容易に行うことができる。また、核酸をＧＣクランプを用いてさらに増幅してもよい。
【００１７】
増幅する部位は、解析の目的などに応じて適宜調整可能であるが、一つの基準としては、微生物群に共通して存在している領域であり、かつ、種または属などの違いを反映しているなどの条件を満たすことが好ましい。微生物群に共通している領域を用いることにより、試験対象区内に存在することが予測される微生物の種類ごとに増幅部位を調整する手間を減らし、微生物の種類にかかわらず、１サンプルにつき特定のプライマーを用いて増幅することができる。また、種や属などの違いにより異なる配列を有する領域であれば、微生物群の選別を明確にできる。増幅する所定部位として、例えば、好ましくは１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ  Ｂなどが挙げられる。１６Ｓ  ｒＲＮＡは、原核生物などに代表される微生物のほとんどが有しており、また種または属ごとの保存安定性が良いため、多数の微生物種が混在するサンプルについて、微生物群集の状況に関する定性的、定量的な解析を行うのに適している。なお、上記のような目的を達するために、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域すべてを増幅してもよいし、または、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の一部を増幅してもよい。
【００１８】
次に、増幅した核酸をＤＨＰＬＣによって分離する。ＤＨＰＬＣによる分析条件等は、適宜調整してよい。分析条件の設定、操作は、ＤＨＰＣＬの通常の手法により適宜定められる。例えば、解析温度や濃度勾配などの条件により調整し、溶出時間の差を調整することができる。ＤＨＰＬＣによる核酸の分離は、二本鎖核酸配列の違いによる分離性能が高く、また再現性もよいため、微生物群の解析を的確に行うことができる。また、ＤＨＰＬＣに関しては、文献：Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review, Wenzhog Xiao et al, HUMAN MUTATION 17:439-474(2001)などを参照してよい。
【００１９】
ＤＨＰＬＣの結果を基に試験対象区についての分離結果を解析する。ＤＨＰＬＣの結果は、例えばクロマトグラムとして表され、クロマトグラムの形状パターンを、分離結果を解析することにより、微生物群の解析を行うことができる。クロマトグラムの形状パターンは、そのピーク位置、高さ、数などとして構成され、特定の点に着目して解析してもよいし、また、クロマトグラム全体像として解析することもできる。また、予め微生物種などに特異的なクロマトグラムの形状パターンを調査しておき、これと対比して、試験対象区内に存在する微生物種の概要を把握することも可能である。また、クロマトグラムの形状パターンと、特定の環境現象との関係を予め調査しておき、これに基づいて、環境状況の把握、環境変化の予測を行うこともできる。
【００２０】
ＤＨＰＬＣによる分離結果に基づいて微生物群の解析を行う限り、分離結果に基づく微生物群の解析の手法は特に限定されるものはないが、好ましい形態としては例えば、以下のような解析方法が挙げられる。例えば、複数の異なる試験対象区ごとに、分析結果を対比させて解析する形態が挙げられる。このようにすることにより、各試験対象区の違いを解析することができる。また、少なくとも１つ正常区の分析結果を得ておくことにより、他の試験対象区が正常であるか、何らかの異常を生じているかなどを判断あるいは予測することができる。
【００２１】
また、他の解析形態としては、同一の試験対象区について、経時的に対比させて分離結果を解析する形態が例示される。このように解析することにより、経時的な微生物群の変動を把握することができ、環境モニタリングなどとして好適である。
【００２２】
また、本発明の解析方法の他の実施形態として、ＤＨＰＬＣにより分離して得られる画分中に含まれる核酸の塩基配列を解析し、当該塩基配列を他の塩基配列と比較して、試験対象区内に含まれる微生物種を同定する形態が挙げられる。塩基配列の解析は、サンガー法、マクサム・ギルバート法、またはこれらの改変法などの定法によって行うことができる。得られた塩基配列のデータは、既知の各種データベースを利用して、既知の配列との相同性（ホモロジー）などのパラメータに基づき、微生物の種類を特定する。核酸またはアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratry, EMBL nucleic acid sequence data library）、ＧｅｎＢａｎｋ（Genetic sequence data bank）などのデータベースを利用する。
【００２３】
本発明の方法は、生態環境系の汚染原因菌の検出に特に有効である。すなわち、その生態環境系に微生物に起因する汚染が生じた場合、そのような汚染が生じていない生態環境系と対比することにより、汚染原因菌を検出することができる。例えば、養殖中のアコヤガイの幼生が大量に斃死したとき、その原因が特定微生物の増殖によるものである場合には、該特定微生物を検出することができる。また、本発明の方法は、ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響の評価手法などの環境評価法としても適用することができる。本発明の解析方法にそってＤＨＰＬＣを用いて分析し、ＤＨＰＬＣのピーク数、ピーク強度から群集多様度を求めることにより、ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響を評価することができる。また、活性汚泥を利用したメタン発酵においては、酸敗がメタン発酵装置の安定運転を妨げる原因となっている。ここで、正常状態における塩基配列のデータベースを蓄積しておき、酸敗が発生したときの塩基配列のデータと対比することにより、酸敗関連微生物を検出することができる。メタン発酵装置運転中は、酸敗関連微生物の動向をＰＣＲ等でモニタリングし、検出された場合には発酵の負荷を減少させることで酸敗を防止し、安定運転を行うことが可能となる。
【００２４】
次に、本発明の微生物群の解析方法を適用した実施形態についてより具体的に例示する。
（アコヤガイの幼生大量斃死原因菌の推定）
アコヤガイ幼生大量弊死海水と正常海水とを試験サンプルとして採取し、これらの試験サンプルそれぞれについて核酸を抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡに含まれる１６ＳＶ３領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。増幅したＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣに供して、それぞれの試験サンプルについてピークパターンを得る。
【００２５】
アコヤガイ幼生大量弊死海水と正常海水中のバクテリア群集構造をピークパターンにより比較し、アコヤガイ幼生大量弊死海水中に特徴的なピークが検出された画分を回収する。回収した画分に含まれるＤＮＡ断片をシークエンスし、塩基配列をデータベースを利用して解析することにより、例えばVibrio pectenicidaなどのバクテリアがアコヤガイ幼生大量弊死海水の試験サンプル中に含まれているなどのように、アコヤガイ幼生大量弊死海水の原因と関連すると推定されるバクテリアを特定できる。
【００２６】
このように原因と推定されるバクテリアが特定されることにより、そのバクテリアに特有のＤＮＡ領域とハイブリダイズするポリヌクレオチド断片を調製し、他の海水試験サンプルについて蛍光イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization）を行うことにより、前もってアコヤガイ幼生大量弊死を予測することが出来るため、アコヤガイ幼生を正常な海水に移動させれば大量弊死を防ぐことが出来る。例えば、Vibrio pectenicidaを検出するための塩基配列としては、：5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3'（配列番号１）を用いることができ、このＤＮＡ断片を用いて蛍光イン・サイチュー・ハイブリダイゼーションを行う。また、Vibrio pectenicidaの検出には、5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3'（配列番号２）を固定したＤＮＡマイクロアレイもしくはフォワードプライマー（forward primer） 5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3'（配列番号３）、リバースプライマー（riverse primer） 5'-ATCACCGGCAGTCTCCCTGG-3'（配列番号４）を用いてＰＣＲを行うことでも可能である。
【００２７】
（ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響の評価）
近年、大気中のＣＯ2濃度上昇に伴う地球温暖化の問題がクローズアップされているところ、その解決手段の１つとして、ＣＯ2海洋隔離（Ｏｃｅａｎ  Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯ2）技術の研究開発が進められている。ＣＯ2海洋隔離技術は大気中のＣＯ2を海水中に投入することにより大気中のＣＯ2濃度の上昇を抑制しようとする技術である（第１５回海洋工学シンポジウム（日本造船学会）講演集、「海洋生態系に対するＣＯ2影響調査のためのメソコスム実験」、平成１２年１月２０、２１日など参照）。
【００２８】
本発明の微生物群集の解析方法は、海水中のＣＯ2濃度差による微生物群集への影響を評価する方法に適用することができ、より具体的な適用例として、ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響評価に用いることができる。
【００２９】
海水中のＣＯ2濃度差による微生物群集への影響の評価は、例えば、次のように行うことができる。まず、試験サンプルとなる海水を用意する。試験サンプルは海から採取したそのものについてＣＯ2を測定しておいてもよいし、また、予めＣＯ2を所定の濃度に調整して複数のＣＯ2濃度の試験サンプルを調製し、シミュレーションするように設定してもよい。他方、所定のＣＯ2濃度の海水の微生物群集の状態を解析するために、試験サンプル（海水）から核酸を抽出し、１６ＳＶ３領域をＰＣＲ法で増幅し、増幅したＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣで分離して、その結果を解析する。
【００３０】
解析手法の具体例としては、ＤＨＰＬＣのピーク数、ピーク強度から群集多様度（例えば、Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｅａｖｅｒ  ｉｎｄｅｘ  Ｈ’）を求め、影響の程度を推定する方法などが例示される。群集多様度：Ｈ’は、ピーク数：Ｄ、Ｄ個のピークの高さの合計に占めるｉ番目のピーク高さの割合をａiとして、下記式１に基づいて計算する。Ｈ’の数値が高いほど微生物群集の多様性が高いことを示し、Ｈ’の数値が低いほど微生物群集の多様性が低いことが推定される。Ｈ’の数値とＣＯ2濃度とを照らし合わせることにより、海水中のＣＯ2濃度の微生物群集に対する影響を評価することができる。
【００３１】
【数２】
2005065605.tif 000003
【００３２】
（メタン発酵装置における酸敗関連微生物の解析）
活性汚泥を利用したメタン発酵装置において、活性汚泥を試験サンプルとして採取し、試験サンプルから核酸を抽出し、１６ＳＶ３領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。増幅したＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣに供して、ピークパターンを得て、活性汚泥中の微生物群集を解析する。
【００３３】
メタン発酵では酸敗が安定運転を妨げる原因となっているため，正常状態と酸敗した状態との微生物群集を比較し，酸敗関連微生物を推定する。メタン発酵装置運転中は，酸敗関連微生物の動向をＰＣＲ等でモニタリングし，検出された場合には負荷を減少させることで酸敗を防ぎ，安定運転が可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
（１）ＤＮＡの抽出
ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いて行った。試薬、Ｂｕｆｆｅｒ等は、特に記載がないものについてはキット添付のものを用いた。
【００３６】
（１−ａ）試薬の調製
（試薬１）；１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１２．１１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。ＨＣｌでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
（試薬２）；０．５ ＥＤＴＡＥＤＴＡＮａ2・２Ｈ2Ｏ １８．６１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
（試薬３）；ＴＥ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ０．５ ＥＤＴＡ ２００μＬ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。
混合後オートクレーブ処理。
【００３７】
（１−ｂ）操作
使用した上記培養株は詳細は次の通りである。なお、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００３８】
Edwardsiella tarda；長崎大学金井助教授より分譲を受けた(番号：NUF805)。
Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132
Vibrio harveyi ATCC 14126
Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046
【００３９】
上記の菌株をそれぞれ培養した培養液１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、遠心により菌を回収した。次いでフィルターを５０ｍＬ遠心管（Ｎａｌｇｅ Ｃｏ．，ＮＹ，ＵＳＡ）に入れ、菌を回収した１．５ｍＬマイクロチューブにＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製  ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を３００μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした。その後５０℃で３０分間インキュベートした。これに、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製  ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を１５０μＬ加えて５〜６秒ボルテックスした後、５０℃で１５分間インキュベートした。これにＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製  ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を１５０μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした後、氷上に１５分間静置した。これを１２０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心し、水相を１．５ｍＬマイクロチューブに分取した。これに２〜２．５倍量のエタノールを加え、よく混合し、１２０００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心した。これの上清を捨て、沈殿を７５％エタノールでリンス後、試薬３ ５０μＬに溶解させた。
【００４０】
（２）ＤＮＡの精製
抽出したＤＮＡは、ＤＮＡ精製用カラムＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。試薬の調製、精製方法は、マニュアルに従った。
【００４１】
（３）ＰＣＲ反応
精製されたＤＮＡをＧＣクランプつきバクテリア特異的プライマー（フォワードプライマー  5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'（配列番号５、図１、５’側から４０ｂｐがＧＣクランプに相当）、リバースプライマー  5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'（配列番号６））を用いてＰＣＲにより１６Ｓ  Ｖ３領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた（図２）。
【００４２】
ＰＣＲ反応に用いたdNTP MIX、Ｂｕｆｆｅｒは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付のものを用いた。
【００４３】
また、ＰＣＲ反応においてチューブには以下の溶液を入れて混合した。
10×PCR Buffer 10μL
dNTP MIX 10μL
primer forward 1μL
primer reverse 1μL
template DNA 10ng
AmpliTaq Gold 0.5μL
滅菌水
総容量 100μL
【００４４】
（４）ＤＨＰＬＣ
得られたＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣにより分析した。分析は、トランスゲノミック社（ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ，  ＩＮＣ）のウェ−ブシステム（ＷＡＶＥ（登録商標）ＳＹＳＴＥＭ）核酸フラグメント解析装置を用いた。装置の操作は添付のマニュアルに従った。また、ＤＨＰＬＣの分析条件は次の通りとした。
DHPLC分析条件
Buffer A: 100 mM triethylammonium acetate (TEAA), pH 7.0
Buffer B: 100 mM TEAA, pH 7.0, 25% acetonitrile
Gradient: 48% - 57% Buffer B
Flow rate: 0.4 ml/min
Column temperature: 50℃、64.5℃、70℃
【００４５】
その結果、６４．５℃の条件においてそれぞれのバクテリア由来のピークとしてＤＮＡ断片を分離することができた（図３）。
【００４６】
（実施例２）
本発明の解析方法を環境サンプルに適用した。海水１リットルを０．２μｍヌクレポアフィルターで濾過し、次いでフィルターを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、上記実施例１と同様にして上記実施例１と同様にしてフィルター上バクテリアよりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを実施例１と同様にＰＣＲを行い，実施例１と同じ条件でＤＨＰＬＣにより分析を行った。その結果、図４のような結果が得られた。ピークパターンを見ることにより，時間の経過によってバクテリア群集構造が変化していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＧＣクランプつきバクテリア特異的プライマー（フォワードプライマー）を示す図である。
【図２】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法で増幅する様子を模式的に示した図である。
【図３】培養菌株４種を用いたＤＨＰＬＣによるＤＮＡ断片分離により得られたクロマトグラムを示す図である。
【図４】環境サンプル（海水）について経時的に分析した結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１；In situ ハイブリダイゼーション用フラグメント
配列番号２；ＤＮＡアレイ用フラグメント
配列番号３；フォワードプライマー
配列番号４；リバースプライマー
配列番号５；ＧＣクランプを備えたＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号６；ＰＣＲ用リバースプライマー
【図１】
2005065605.tif 000005
【図２】
2005065605.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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