(57)【要約】【課題】反応速度を高め、しかも共振周波数の干渉を回避して高い精度および安定した測定ができる。【解決手段】水晶振動子１１の電極１２表面に試料溶液を流し、水晶振動子の共振周波数の変化から試料の成分を検知・定量するフローセル型ＱＣＭセンサにおいて、測定器２０は水晶振動子の共振周波数を測定する。ベースライン測定器３０は測定開始直前の測定器２０の測定値ｆ1と、試料溶液が十分に反応した後の測定値ｆ2との変化量から試料成分の検知・定量測定出力を得る。  流路は、試料溶液が伝播する縦波成分に起因する共振周波数の干渉が起きる高さよりも低くして試料溶液の反応速度を高める。流路には三方バルブ１５で試料溶液に比較して密度および粘性が十分に低いガスを注入する。流路は、試料溶液に対して親水性の高いＰＤＭＳ樹脂製またはアクリル樹脂製とした。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水晶振動子上に形成した流路に試料溶液を流し、試料溶液中の成分吸着による水晶振動子の共振周波数の変化またはインピーダンスの変化から試料成分を検知・定量するフローセル型ＱＣＭセンサにおいて、
測定開始直前の水晶振動子の共振周波数またはインピーダンスのベースライン測定と、試料溶液が十分に反応した後の水晶振動子の共振周波数またはインピーダンスのベースライン測定とを行い、両ベースライン測定による水晶振動子の共振周波数変化またはインピーダンス変化から試料成分を検知・定量測定することを特徴とするフローセル型ＱＣＭセンサによる測定方法。
【請求項２】
試料溶液が伝播する縦波成分に起因する共振周波数またはインピーダンスの干渉が起きる高さよりも低くして試料溶液の反応速度を高める流路高さにして前記ベースライン測定をすることを特徴とする請求項１に記載のフローセル型ＱＣＭセンサによる測定方法。
【請求項３】
前記流路中に試料溶液に比較して密度および粘性が十分に低いガスを注入して前記ベースライン測定をすることを特徴とする請求項１または２に記載のフローセル型ＱＣＭセンサによる測定方法。
【請求項４】
水晶振動子上に形成した流路に試料溶液を流し、試料溶液中の成分吸着による水晶振動子の共振周波数の変化またはインピーダンスの変化から試料の成分を検知・定量するフローセル型ＱＣＭセンサにおいて、
前記水晶振動子の共振周波数またはインピーダンスを測定する測定器と、
測定開始直前の前記測定器の測定値と、試料溶液が十分に反応した後の前記測定器の測定値との変化量から試料成分の検知・定量測定出力を得るベースライン測定器とを備えたことを特徴とするフローセル型ＱＣＭセンサ。
【請求項５】
前記流路は、試料溶液が伝播する縦波成分に起因する共振周波数またはインピーダンスの干渉が起きる高さよりも低くして試料溶液の反応速度を高める高さをもつ構造としたことを特徴とする請求項４に記載のフローセル型ＱＣＭセンサ。
【請求項６】
前記流路中に試料溶液に比較して密度および粘性が十分に低いガスを注入するガス注入手段を備えたことを特徴とする請求項４または５に記載のフローセル型ＱＣＭセンサ。
【請求項７】
前記流路は、試料溶液に対して親水性の高いＰＤＭＳ樹脂製またはアクリル樹脂製としたことを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載のフローセル型ＱＣＭセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水晶振動子の電極表面を試料ガスや試料溶液に晒したときの水晶振動子の共振周波数の変化やインピーダンスの変化から試料の成分を検知・定量するＱＣＭ（Quarz Crystal Microbalance）センサに関し、特に成分検知・定量の応答速度を高めるフローセル型ＱＣＭセンサおよび測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学・生化学および電気化学の分野において、反応量や生成物質量を定量することは重要なことであるが、従来装置では極めて微量の反応量に対して十分な検出感度を得ることは難しかった。
【０００３】
近年、ＡＴカット水晶振動子を用いてマイクロバランス原理を応用したケミカル及びバイオセンサーが注目を集めている。ＡＴカット水晶振動子は、その主共振周波数が振動子の板厚と反比例する現象を呈し、その電極面に試料成分が成膜したり、あるいは物質の吸着が起きると表面に存在する物質の単位平面積当たりの重量に対応した周波数のシフトが起きる。
【０００４】
ＱＣＭセンサは、上記の周波数シフト現象を応用したもので、ＡＴカット水晶振動子は広い温度範囲において周波数が安定しているため、安定した検出感度が期待でき、条件が揃えば１〜１０ｎｇの吸着物質の検出がリアルタイムで可能である。（１）式に吸着物質量と周波数のシフト量の関係を示す。
【０００５】
【数１】
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【０００６】
ここで、ΔＦ：共振周波数変化量、Ｆ：共振周波数、Δｔ：水晶板の厚み変化量、ｔ：水晶板の厚み、Δｍ：吸着物質量、ρq：水晶の密度、μ：水晶の弾性率、Ａ：電極面積である。
【０００７】
上記（１）式から分かるとおり、水晶振動子上に吸着した物質のうち、検知・定量できるのは水晶振動子の電極上のみであるため、検知・定量しようとする成分に応じたレセプタは電極表面に形成させることとなる。
【０００８】
実際の測定では、検知・定量したい試料が溶液中に分散されている場合、上記のレセプタ装着水晶振動子を図５または図６に示すセル構成で設置することとなる。しかし、これらのセル構成では以下の問題がある。
【０００９】
１）図５に示す静置溶液型セルでは、レセプタと検知・定量したい試料との結合は、溶液中の試料の拡散率に律速されるため、反応速度が遅い。
【００１０】
２）図６に示す試料溶液強制撹絆型セルでは、撹拌により試料溶液の拡散律速を抑制する効果はあるが、溶液中の試料成分が必ずしもレセプタである水晶振動子電極上に到達するとは限らない。特に、溶液中の試料成分が希薄になるに従い撹拌効果は減少するものと考えられる。
【００１１】
上記の反応速度を高める方式として、フローセル型に構成したものが提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。これら特許文献によるフローセル型の測定装置は、水晶振動子上に溶液を流入および水晶振動子上を経た溶液を流出させる流路を形成するフローセルを設けた構造とする。また、特許文献１では、水晶振動子上での溶液の流れが乱れるのを防止するため、流路の幅、深さ、長さを規定したフローセル構造が提案されている。
【特許文献１】特許第２９０５０６４号
【特許文献２】特開平１１−１８３４７９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前記のフローセル構造をＱＣＭセンサに適用した場合、従来の溶液強制撹絆型セルなどに比べて、反応速度を高めることができる。
【００１３】
図７にフローセル型ＱＣＭセンサの構成例を示し、このＱＣＭセンサによる抗原抗体の反応速度の測定例を図８に示す。これに対比させるものとして図９に溶液強制撹絆型セルによる測定例を示す。
【００１４】
この測定には検出物質としてＣＲＰ（Ｃ−反応性蛋白）を用い、強制撹枠型は回転数９００ｒｐｍとし、溶液量９ｍＬのバッファ溶液中に図中で示された各濃度のものを添加することで最小試料濃度を判定した。フローセル型は、幅４.４ｍｍ、高さ１.５ｍｍの流路に予め１.１８５ｎｇ／ｍＬ濃度に調整した試料溶液を流速４００μＬ／ｍｉｎの条件で反応させた。
【００１５】
これら測定例から明らかなように、フローセル構造を用いることで反応時間の短縮および低濃度試料の検出が可能である。
【００１６】
しかし、ＱＣＭセンサをフローセル構造へ展開する場合、Zuxuan Lin（Anal.Chem.1995,67,685-693）らにより報告されているとおり、水晶振動子の振動成分である縦波成分が溶液中を伝播し流路壁から反射することに起因した共振周波数の干渉の問題がある。
【００１７】
共振周波数の干渉は、使用する溶液の伝播速度と流路高さに起因する。この検証として、図６の静置溶液型ＱＣＭセンサを用いてその液面の変化から反射波の影響を確認した。図１０は１００％エタノールの蒸発による共振周波数の測定結果を、図１１は図１０の測定結果を液面高さに対する共振周波数の変化量をプロットしたものを示す。
【００１８】
図１０の測定結果は、溶液高さの変化に対する干渉周波数の依存性が現れており、また、溶液高さ（イコール流路高さ）が一定であっても水晶振動子の共振周波数が変化すれば干渉状態が変化することを示唆している。
【００１９】
図１１では、溶液を伝播する反射波の影響を受けないためには、ＱＣＭ表面とフローセル壁をある高さ以上にする必要があることを示唆している。図１１の場合は、溶液を伝播する反射波の影響を受けない液面高さは０.９ｍｍ以上となる。しかし、溶液流路を高くすることは、流路体積を大きくすることになり、反応速度が遅くなるという新たな問題が生じる。
【００２０】
なお、液面高さについて、図１０および図１１では１００％エタノールを測定溶液とする場合であり、溶液の違いによって、反射波の影響を無視できる液面高さは異なってくる。
【００２１】
以上のことから、フローセル構造を採用したＱＣＭセンサでは、試料溶液ごとに反射波の影響が無視できる位置まで流路を高くしなければならないが、流路が高くなると試料溶液の流路体積が大きくなり、反応速度が低下する問題がある。
【００２２】
本発明の目的は、反応速度を高め、しかも共振周波数の干渉を回避して高い精度および安定した測定ができるフローセル型ＱＣＭセンサおよびこのＱＣＭセンサによる測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、前記の課題を解決するため、試料溶液の流路高さを低くして反応速度を高め、これに伴いＱＣＭセンサの共振周波数やインピーダンスに干渉現象が起きて測定精度が低下または不安定になるのを回避するために、測定開始直前のベースライン測定と試料溶液が十分に反応した後のベースライン測定によって試料溶液の検知・定量測定をするようにしたもので、以下の方法および装置を特徴とする。
【００２４】
（方法の発明）
（１）水晶振動子上に形成した流路に試料溶液を流し、試料溶液中の成分吸着による水晶振動子の共振周波数の変化またはインピーダンスの変化から試料成分を検知・定量するフローセル型ＱＣＭセンサにおいて、
測定開始直前の水晶振動子の共振周波数またはインピーダンスのベースライン測定と、試料溶液が十分に反応した後の水晶振動子の共振周波数またはインピーダンスのベースライン測定とを行い、両ベースライン測定による水晶振動子の共振周波数変化またはインピーダンス変化から試料成分を検知・定量測定することを特徴とする。
【００２５】
（２）試料溶液が伝播する縦波成分に起因する共振周波数またはインピーダンスの干渉が起きる高さよりも低くして試料溶液の反応速度を高める流路高さにして前記ベースライン測定をすることを特徴とする。
【００２６】
（３）前記流路中に試料溶液に比較して密度および粘性が十分に低いガスを注入して前記ベースライン測定をすることを特徴とする。
【００２７】
（装置の発明）
（４）水晶振動子上に形成した流路に試料溶液を流し、試料溶液中の成分吸着による水晶振動子の共振周波数の変化またはインピーダンスの変化から試料の成分を検知・定量するフローセル型ＱＣＭセンサにおいて、
前記水晶振動子の共振周波数またはインピーダンスを測定する測定器と、
測定開始直前の前記測定器の測定値と、試料溶液が十分に反応した後の前記測定器の測定値との変化量から試料成分の検知・定量測定出力を得るベースライン測定器とを備えたことを特徴とする。
【００２８】
（５）前記流路は、試料溶液が伝播する縦波成分に起因する共振周波数またはインピーダンスの干渉が起きる高さよりも低くして試料溶液の反応速度を高める高さをもつ構造としたことを特徴とする。
【００２９】
（６）前記流路中に試料溶液に比較して密度および粘性が十分に低いガスを注入するガス注入手段を備えたことを特徴とする。
【００３０】
（７）前記流路は、試料溶液に対して親水性の高いＰＤＭＳ樹脂製またはアクリル樹脂製としたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
以上のとおり、本発明によれば、測定開始直前のベースライン測定と試料溶液が十分に反応した後のベースライン測定によって試料溶液の検知・定量測定をするため、ＱＣＭセンサの共振周波数やインピーダンスに干渉現象が起きて測定精度が低下または不安定になるのを回避することができる。
【００３２】
また、試料溶液の流路高さを低くして反応速度を高めることができる。
【００３３】
さらに、反応前後のベースライン測定を気相中で行うことにより、溶液中を伝播する縦波成分に起因する周波数干渉が無視できるため、フローセルの流路高さを一層低くすることができ、反応速度を一層向上させ、測定時間も短縮することができる。また、気相中で反応量を測定するため、水晶振動子のＱ値を高く取ることができ、高感度な測定が可能となる。
【００３４】
また、流路を親水性材料で構成するため、試料溶液の滑らかな流れを得、干渉を一層減らすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
図１は、本発明の実施形態を示すＱＣＭセンサの装置構成図である。ＱＣＭセンサ本体１０は、図７と同様に、フローセル型の構造とする。このフローセル型構造では、水晶基板１１の一方の面に電極１２とそのリード線１３が形成され、他方の面に電極１２’とそのリード線１３’が形成され、電極１２側はフローセル容器１４内に露出される。フローセル容器１４には三方バルブ１５から注入管１６を通して注入された試料溶液が電極１２面を流れ、排出管１７から排出される。三方バルブ１５は、試料溶液と窒素ガス（Ｎ2）を切り替えてフローセル容器１４内に注入可能にする。
【００３６】
ここで、試料溶液の流路高さ（フローセル容器１４の内壁高さ）は、電極１２での試料溶液とレセプタとの反応速度を高めるために十分に低くしておく。この場合、前記のように水晶振動子の振動成分である縦波成分が溶液中を伝播し流路壁から反射することに起因した共振周波数の干渉の問題が残るが、この干渉による測定精度低下および不安定の問題は以下の測定法およびＱＣＭセンサ構成によって解消する。
【００３７】
（１）ベースライン測定
共振周波数測定器２０は、ＱＣＭセンサ本体１０の水晶振動子（電極１２、１２’と水晶基板１１）の共振周波数を測定する。この測定器２０の構成および測定方法は従来のものと同様のものであり、その詳細説明は省略する。
【００３８】
ベースライン測定器３０は、共振周波数測定器２０で測定した共振周波数信号を入力とする。ベースライン測定器３０は、図２に測定フローを示すように、ＱＣＭセンサ本体１０内に試料溶液を注入する直前（電極１２上のレセプタと試料溶液の反応前）、すなわちフローセル容器１４内に窒素ガス（Ｎ2）注入した雰囲気中での共振周波数信号を得てその値ｆ1を記憶しておき、その後にフローセル容器１４内に試料溶液が注入され、レセプタと試料溶液が十分に反応するに要する一定時間後に溶液注入を停止させて窒素ガス（Ｎ2）を再注入し、フローセル容器１４内を窒素ガスで置換した雰囲気中での共振周波数信号を得てその値ｆ2を記憶し、これら共振周波数ｆ1、ｆ2の差Δｆを基に前記の（１）式から吸着物質量Δｍの測定出力を得る。
【００３９】
タイマ４０は、レセプタと試料溶液が十分に反応するに要する一定時間（図２における時間Ｔ）を計時し、共振周波数測定器２０に対する周波数測定開始指令と、三方バルブ１５への溶液注入と窒素ガス注入の切り替え指令と、ベースライン測定器３０に対する周波数ｆ1およびｆ2の取得タイミングを発生する。
【００４０】
したがって、ＱＣＭセンサ本体１０における共振周波数測定は、レセプタと試料溶液との反応が始まる直前のベースライン測定と、レセプタと試料溶液との反応が十分に安定した直後に行うベースライン測定となり、これらベースライン測定では前記の縦波成分が溶液中を伝播し流路壁から反射する現象はほぼ治まっており、この反射に起因した共振周波数の干渉は起きず、安定した共振周波数測定と吸着物質量測定出力を得ることができる。
【００４１】
なお、共振周波数測定器２０による周波数測定に代えて、水晶振動子のインピーダンス変化から吸着物質量を測定するＱＣＭセンサの場合、ベースライン測定器３０は測定開始直前と一定時間後のインピーダンス変化から吸着物質量の測定出力を得ることができる。
【００４２】
（２）ガス注入によるベースライン測定
上記構成のＱＣＭセンサにおいて、流路の周辺には試料溶液に比較して密度及び粘性が十分に低いガス（湿度が管理された大気、乾燥空気や窒素雰囲気）を注入した状態で共振周波数測定およびベースライン測定を行う。図１の場合は、フローセル容器１４を気密構造とし、三方バルブ１５によってフローセル容器１４内に窒素ガス（Ｎ2）を注入する場合を示す。
【００４３】
この測定方式によれば、密度及び粘性の低い気相中で、試料溶液が電極１２表面を流れるときに、反射波の発生およびその干渉を小さくして一層安定した測定ができる。また、乾燥した気相に電極１２を晒すことで、試料溶液の反応後のフローセル容器１４内を乾燥させ、また大気に含まれる水分が電極表面に吸着しないようにする。また、水晶振動子のＱ値（共振の鋭さを示し、共振回路のＳ／Ｎ比に反映される）を高く取ることができ、高感度測定が可能となる。
【００４４】
このＮ2ガスを注入したＱＣＭセンサにおける実験として、窒素雰囲気（１ａｔｍ，２５℃）中でベースライン測定した場合、流路高さは約３０μｍ程度まで低くして、良好な反応速度で安定した測定および高い感度を得ることができた。
【００４５】
（３）ＱＣＭセンサ本体の構成
フローセル型ＱＣＭセンサは、微小な流路に試料溶液を流すため、試料溶液に対して親水性の高い流路構成とすることで試料溶液の滑らかな流れを得ることが重要となる。また、安価なことも重要な要素であることから、以下に示す２種類のＱＣＭセンサ構成および作製方法を提案する。
【００４６】
（実施例１）ＰＤＭＳ樹脂製流路を用いたフローセル型ＱＣＭセンサの構成および作製方法。
【００４７】
図３にＱＣＭセンサの作製手順を示す。水晶振動子作製は、水晶振動子面に電極１２とリード線１３を形成し（Ｓ１）、電極１２の形状と厚み調整により主共振周波数を調整する（Ｓ２）。
【００４８】
流路作製は、ウレタン母型にＰＤＭＳ樹脂を射出成型して流路成型体を得（Ｓ３）、酸素プラズマ処理によりＰＤＭＳ樹脂表面（流路部）を親水化処理をする（Ｓ４）。
【００４９】
最後に、ＰＤＭＳ樹脂の自己接着性を利用して、水晶振動子にＰＤＭＳ樹脂流路を貼り合わせる（Ｓ５）。
【００５０】
本実施例による方法は、ＱＣＭセンサ本体をその親水性を高めながら非常に簡便な作製方法が特徴となる。
【００５１】
（実施例２）アクリル樹脂製流路を用いたフローセル型ＱＣＭセンサの構成および作製方法。
【００５２】
図４にＱＣＭセンサの作製手順を示す。同図が図３と異なる手順のみを説明する。流路作製は、鋳型にアクリル樹脂を射出成型して流路成型体を得（Ｓ６）、アクリル樹脂製の流路成型体のうち、水晶振動子を貼り付ける面に接着剤をコーティングする（Ｓ７）。ここでは、ＰＭＭＡ製フォトレジスト（ＯＤＵＲシリーズ、東京応化製）を用い、スピンコートする。
【００５３】
この後、接着剤を塗布したアクリル製流路と水晶振動子を貼り合わせ（Ｓ５）、強制循環型乾燥器中で接着剤を乾燥させる（Ｓ８）。
【００５４】
本実施例による方法は、実施例１と同様に、ＱＣＭセンサ本体をその親水性を高めながら非常に簡便な作製方法が特徴となる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の実施形態を示すフローセル型ＱＣＭセンサの装置構成図。
【図２】実施形態における測定フロー。
【図３】実施形態におけるＰＤＭＳ樹脂製流路を用いたフローセル型ＱＣＭセンサ本体の作製手順。
【図４】実施形態におけるアクリル樹脂製流路を用いたフローセル型ＱＣＭセンサ本体の作製手順。
【図５】従来の静置溶液型セル構造。
【図６】従来の強制撹拌溶液型セル構造。
【図７】従来のフローセル型ＱＣＭセンサ本体構造。
【図８】フローセル型ＱＣＭセンサを用いた抗原抗体反応の測定例。
【図９】溶液強制撹拌型セルを用いた抗原抗体反応の測定例。
【図１０】１００％エタノールの蒸発による水晶振動子の共振周波数変化の例。
【図１１】１００％エタノールの液面高さ（溶液量）に対する共振周波数の反射液依存性の例。
【符号の説明】
【００５６】
１０  ＱＣＭセンサ本体
２０  共振周波数測定器
３０  ベースライン測定器
４０  タイマ
１１  水晶振動子
１２，１２’  電極
１４  フローセル容器
１５  三方バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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