(57)【要約】【課題】  抗原抗体反応を用いた低濃度分析が可能な、簡便かつ汎用性が高く、高精度のコンパクトな分析方法および分析装置を提供することを目的とする。【解決手段】  抗原抗体反応を用いた分析方法であって、試料中の外因性内分泌攪乱物質を分析対象とし、かつ脱硫酵素を標識として検出することを特徴とする。ここで、溶液内でのｐＨあるいは特定のイオン濃度によって検出することが好適である。または、溶液内でのｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量によって検出することが好適である。【選択図】    図１
2005106587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を用いた分析方法であって、試料中の外因性内分泌攪乱物質を分析対象とし、かつ脱硫酵素を標識として検出することを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記分析方法において、溶液内での水素イオン濃度（ｐＨ）あるいは特定のイオン濃度によって検出することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記分析方法において、溶液内でのｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量によって検出することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法を用い、外因性内分泌攪乱物質と特異的に反応する抗体を固定化した部材、モノクローナル抗体を固定化した部材、および検出器からなることを特徴とする分析装置。
【請求項５】
前記試料を、イムノアフィニティカラムに導入し濃縮することを特徴とする請求項４記載の分析装置。
【請求項６】
前記検出器としていわゆるケミカルＣＣＤを用いることを特徴とする請求項４または５に記載の分析装置。
【請求項７】
前記検出器としてイオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いることを特徴とする請求項４または５に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原抗体反応を用いた分析方法および装置に関するもので、特に環境ホルモンと呼ばれる外因性内分泌撹乱物質を高感度で、かつ簡便に検出する場合に有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年、社会的な問題となっている外因性内分泌撹乱物質、いわゆる環境ホルモンは、人体のホルモン作用を撹乱することで生体に悪影響を及ぼすと考えられている。その撹乱作用は徐々に解明されつつあるが、昨今主たる物質を選定し、各物質の体内に入るルートの解明・特定が行われるようになるとともに、これらの濃度管理が重要視されつつある。具体的には、海、河川、湖沼などの水や土地の中の各物質濃度を連続的に監視することが望まれている。
【０００３】
従来の分析方法として、放射受容体検定法( ラジオレセプタ−アッセイ) 〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ、１３８（３）；８６３−８７０（１９９７）〕、免疫検定法（イムノアッセイ）〔”Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ”、ｄｅｌ  Ｍａｚｏ  ｅｄｓ．、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）〕、蛍光偏向解消法〔Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．、１０６（９）；５５１−５５７（１９９８）〕の他、組換え酵母を使用する方法や受容体との複合体と遺伝子との結合を標識として放射活性を用いて使用する方法等が知られ、さらに高感度かつ簡便な分析方法としていくつかの提案がされている。
【０００４】
例えば、固定化女性ホルモン受容体を用いた環境ホルモンの検出方法として、図８に示すように、固定化女性ホルモン受容体（固定化エストロゲン受容体等）８２を充填した検出容器（微小セル等）８１、該容器内を励起する光源８３、励起後の検出容器内の蛍光強度を検出する検出器８４からなり、ある濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合の蛍光強度Ｆ0 と、試験すべき試料を混合した上記と同濃度の蛍光標識された女性ホルモンを上記検出容器に導入した場合の蛍光強度Ｆ1 とを比較し、Ｆ1 ＜Ｆ0 であれば、上記試験すべき試料中に環境ホルモンが存在すると判断する分析方法が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００１−１１６７５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来技術で述べた分析装置では、以下のような課題が生じることがある。
【０００６】
つまり、自然水や地中などの環境中の環境ホルモンの存在量は、非常に低濃度レベルであり、高い精度の分析値を得ることができる検出感度の確保は非常に困難であり、また精度を上げるためには分析時間を大幅に増加させる必要がある。また、高い選択性を得ることが困難であることから、環境中の環境ホルモンを抽出し濃縮してから分析するという非常に煩雑な作業を必要とする。従って、各所の試料を分析する必要性が増えるにつれ、迅速かつ簡易で精度の高い分析装置の要請が非常に高まっている。
【０００７】
また、上述のような分析方法では、バッチ的に所定量の試料中の環境ホルモンの濃度を分析することはできても、複数の物質を同時に分析することはできず、分析成分ごとに試料を準備する必要があり、時間的に作業も煩雑化するという課題があった。
さらに、吸光光度法を用いて検出する場合には、一般に発色剤等を添加する必要から試薬などの調整管理が煩雑となり、別途流路を有する分光光学系を必要とすることから装置の複雑化を招くという課題があった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、上記のような問題点を解決し、抗原抗体反応を用いた低濃度分析が可能な、簡便かつ汎用性が高く、高精度のコンパクトな分析方法および分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す分析装置により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
本発明は、抗原抗体反応を用いた分析方法であって、試料中の外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）を分析対象とし、かつ脱硫酵素を標識として検出することを特徴とする。固定化された抗体に結合した脱硫酵素によって硫酸や亜硫酸などの含硫黄イオンが発生すること、およびそれに伴う溶液の性状が大きく変化することを利用し、脱硫酵素を標識として、脱硫酵素と環境ホルモンとの競合反応及び酵素と基質の反応により生じる変化を測定することにより、環境ホルモンの濃度を高感度に分析することができる。従って、環境ホルモンの低濃度分析が可能な、高精度に分析する方法を提供することができる。
【００１１】
また、本発明は、前記分析方法において、溶液内での水素イオン濃度（ｐＨ）あるいは特定のイオン濃度によって検出することを特徴とする。固定化された抗体に結合した脱硫酵素によって溶液のｐＨあるいは特定のイオン濃度が大きく変化することを利用し、脱硫酵素を基に作製された標識物と環境ホルモンとの競合反応及び酵素と基質の反応により生じるｐＨあるいは特定のイオン濃度を検出することで、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。従って、環境ホルモンの低濃度分析が可能な、簡便かつ汎用性が高く、高精度に分析する方法を提供することができる。
【００１２】
あるいは、前記分析方法において、脱硫酵素を標識として、溶液内でのｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量によって検出することが、好適である。前記含硫黄イオンの発生に伴って大きく変化するｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量を検出することで、試料原水のｐＨあるいは特定のイオン濃度に関係なく、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【００１３】
また、本発明は、上記のような分析方法を用いた分析装置であって、外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）と特異的に反応する抗体を固定化した部材、モノクローナル抗体を固定化した部材、および検出器からなることを特徴とする。こうした分析装置は、微量の環境ホルモンを特異的かつ効果的に濃縮し、低濃度の環境ホルモンを簡便に分析することができるとともに、汎用性が高くかつ高精度のコンパクトな分析を可能とする。
【００１４】
ここで、前記試料を、イムノアフィニティカラムに導入し濃縮することが好適である。環境ホルモンと特異的に反応する抗体を固定化したイムノアフィニティカラムに試料を流通させることで、試料中の環境ホルモンを高効率に濃縮し、低濃度の環境ホルモンを簡便かつ汎用性が高く、高精度のコンパクトに分析することが可能な装置を提供することができる。
【００１５】
また、前記検出器としていわゆるケミカルＣＣＤを用いることが好適である。ケミカルＣＣＤのｐＨに対する高い感応性を活かしながら、上記加水分解によって生じるｐＨ変化の２次元情報を得ることができることから、複数の成分分析など本発明の広い展開が可能となる。
【００１６】
さらに、前記検出器としてイオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いることが好適である。ＩＳＦＥＴの各種イオン濃度に対する高い感応性および特定イオンに対する高い選択性を活かしながら、上記加水分解によって生じる溶液中のイオン濃度の変化を検出することで、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【発明の効果】
【００１７】
以上のように、抗原抗体反応を用いた本発明における分析方法であっては、脱硫酵素を標識として、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。従って、環境ホルモンの低濃度分析が可能な、簡便かつ汎用性が高く、高精度に分析する方法を提供することができる。
【００１８】
また、固定化された抗体と結合した脱硫酵素の分解によって生じる溶液中のｐＨあるいは特定のイオン濃度を検出することで、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【００１９】
さらに、脱硫酵素を標識とし溶液中のｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量を検出することで、試料原水のｐＨあるいは特定のイオン濃度に関係なく、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【００２０】
また、上記のような分析方法を用い、環境ホルモン）と特異的に反応する抗体を固定化した部材、モノクローナル抗体を固定化した部材、および検出器からなる分析装置にあっては、低濃度の環境ホルモンを簡便に分析することができるとともに汎用性が高く、かつ高精度のコンパクトな分析を可能とする。
【００２１】
ここで、環境ホルモンと特異的に反応する抗体を固定化したイムノアフィニティカラムに試料を流通させることで、試料中の環境ホルモンを濃縮し、低濃度の環境ホルモンを簡便かつ汎用性が高く、高精度のコンパクトに分析することができる装置を提供することができる。
【００２２】
また、前記検出器としていわゆるケミカルＣＣＤを用いた場合には、ケミカルＣＣＤのｐＨに対する高い感応性を活かしながら、上記加水分解によって生じるｐＨ変化の２次元情報を得ることができることから、複数の成分分析など本発明の広い展開が可能となる。
【００２３】
さらに、前記検出器としてＩＳＦＥＴを用いた場合には、ＩＳＦＥＴの各種イオン濃度に対する高い感応性および特定イオンに対する高い選択性を活かしながら、上記加水分解によって生じる溶液中のイオン濃度の変化を検出することで、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２５】
本発明は、抗原抗体反応を用いた分析方法であって、試料中の外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）を分析対象とし、かつ脱硫酵素を標識として検出することを特徴とする。本発明者は、特定の環境ホルモンと脱硫酵素との競合反応を利用し、かつ脱硫酵素による硫酸や亜硫酸などの含硫黄イオンの発生に伴う溶液の性状が大きく変化することを利用することにより環境ホルモンの濃度を分析することができることを見出したもので、脱硫酵素を標識として、低濃度の環境ホルモンを簡易かつ高感度に分析することができる。つまり、固定化された抗体に結合した脱硫酵素と環境ホルモンとの競合反応及び酵素と基質の反応により生じる微小変化を高感度に検出可能な分析方法を適用することによって、低濃度の環境ホルモンに対する選択性の高い分析が可能となる。
【００２６】
ここで、環境ホルモンとは、ビスフェノールＡ（図３（Ａ）参照）、ダイオキシン類、ポリ塩化ビフェニール類（ＰＣＢ）、ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）、シマジン、ｐ，ｐ’−ジクロルジフェニルトリクロルエタン（ＤＤＴ）など、環境省が挙げる内分泌攪乱作用を有すると疑われる化学物質６５物質を含む物質をいう。
【００２７】
脱硫酵素とは、デスルフィナーゼ活性を有する酵素をいい、本発明においては、広く脱硫酵素に基に作製された標識物を含めた概念をいう。例えば、図３（Ｂ）に示すような反応を行うＤｓｚＢあるいはベンゼンスルフィン酸デスルフィナーゼなどが挙げられる。また、脱硫酵素は、その分子量が小さいことおよび酸性域での反応性が非常に高いことおよびモノマーであることから標識物として優れている。一方、環境ホルモンの分析においては、環境ホルモン自体が小さなものであることから、同様の形態を有する標識物が好ましい。従って、本発明においては、こうした特性を環境ホルモンの分析の標識として有効に利用することで、応答性の速い分析が可能となり、塩類の発生の少ない分析が可能となるという非常に優位な分析方法を提供することができる。
【００２８】
基質とは、酵素の作用を受けて変化する物質をいい、一定の化学構造をもつ物質との間で特異的に作用する。本発明においては、脱硫酵素と特異的に反応し、硫酸イオンや亜硫酸イオンなどの含硫黄イオンの発生を促すことで、脱硫酵素の標識機能を増長する働きを示し、例えば、スルチンやベンゼンスルフォン酸などが使用可能である。
【００２９】
本発明は、前記分析方法において、溶液内で水素イオン濃度（ｐＨ）あるいは特定のイオン濃度によって検出することを特徴とする。上記のような反応によって生じる微小変化を、特にｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化として検出することによって、低濃度の環境ホルモンに対する選択性の高い分析が可能となる。つまり、固定化された抗体に結合した脱硫酵素の基質による分解反応を利用し、分解によって生じる硫酸や亜硫酸などの含硫黄イオンの発生に伴う溶液のｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化を検出することで、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【００３０】
脱硫酵素が有する環境ホルモンの分析における優れた標識性を活かしつつ、ｐＨあるいは特定のイオン濃度の測定手段との組合せによって、優れた環境ホルモンの分析方法を提供することができる。特に、ｐＨあるいは特定のイオン濃度の測定に際しては、試料（被検水）中の不純物や塵埃等の影響を受けずに分析することが可能であり、こうした点においても、本発明は優れた分析方法である。
【００３１】
また、ｐＨあるいは特定のイオン濃度の測定手段は特に制限されるものではなく、ガラス電極式やＩＳＦＥＴあるいはケミカルＣＣＤなどの使用が可能であり、簡易な方法での高感度分析が可能である。特にＩＳＦＥＴについては、後述するように各種イオン濃度に対する高い感応性および特定イオンに対する高い選択性から非常に有用である。
【００３２】
以下、図１にその基本的な実施の態様を例示する。
（１）河川水１を採取する。ここで、２は環境ホルモンを示す。  
（２）河川水１を、特定の抗体３が固定化されたカラム４に導入する。このとき、試料中の環境ホルモン２は、抗体３と特異的に反応し、結合体５を形成し、濃縮する。抗体３およびカラム４の具体例については後述する。  
（３）抗体３と結合した環境ホルモン２を酸等で外し、濃縮液１ａを作成する。  
（４）濃縮液１ａに、脱硫酵素との結合体である抗原６を混合し、モノクローナル抗体７が胆持された部材８（例えばプレートなど）に導入する。このとき、環境ホルモン２と抗原６とが競合しモノクローナル抗体７へ結合する。  
（５）胆持部材８を洗浄し、残留する試料を除去する。  
（６）次に、胆持部材８に基質９を導入する。そのときモノクローナル抗体７近傍の溶液のｐＨが変化する。  
（７）ここで、部材８に設置されたｐＨ検出器１０によって、その一定時間後のｐＨを検出する。  
（８）次に、予め上記河川水１の代わりに既知の特定環境ホルモン濃度の標準試料を（１）〜（６）のステップに適用して求めた、特定環境ホルモン濃度とｐＨとの関係から、環境ホルモンの濃度を算出する。
以上の分析方法によって、試料中の環境ホルモンの濃度を検出することができる。
【００３３】
本発明の別の実施の態様を、図２に例示する。  
（１）濃縮液１ａの作成までは上記と同様である。  
（２）脱硫酵素（標識物）とモノクローナル抗体との結合体７ａおよび濃縮液１ａを、抗原６ａが胆持された部材８（例えばプレートなど）に導入する。このとき、環境ホルモン２と抗原６ａとが競合し、結合体７ａへ結合する。  
（３）胆持部材８を洗浄し、残留する試料を除去する。  
（４）次に、胆持部材８に基質９を導入する。そのとき抗原６ａ近傍の溶液のｐＨが変化する。  
（５）ここで、部材８に設置されたｐＨ検出器１０によって、その一定時間後のｐＨを検出する。  
（６）次に、予め上記河川水１の代わりに既知の特定環境ホルモン濃度の標準試料を（１）〜（５）のステップに適用して求めた、特定環境ホルモン濃度とｐＨとの関係から、環境ホルモンの濃度を算出する。
以上の分析方法によって、試料中の環境ホルモンの濃度を検出することができる。
【００３４】
また、前記分析方法において、脱硫酵素を用いた抗原抗体反応を、溶液内でのｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量によって検出することが、好適である。本発明における抗原抗体反応において、反応時間および変化量は、脱硫酵素やモノクローナル抗体の量あるいは試料の量などによって異なるが、同一条件では、所定時間内（実施例に例示する図５では１〜２時間）におけるｐＨあるいは特定のイオン濃度は直線的に変化し、その変化量は環境ホルモンの濃度と相関関係にあることを見出したもので、前記基質の分解によって大きく変化するｐＨあるいは例えば硫酸イオン濃度の変化量を検出することで、試料原水のｐＨあるいは特定のイオン濃度に影響を受けることなく、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【００３５】
このとき、測定条件が決まれば、環境ホルモン濃度とｐＨあるいは特定のイオン濃度の変化量との関係は理論的に算出することができることから、数秒〜数分といった短時間での分析が容易になる。従って、上記と同様の分析方法を用い、ｐＨあるいは特定のイオン濃度の検出値の微分を求めることで、河川水中のビスフェノールＡ等の環境ホルモンの濃度を分析することができる。
【００３６】
また、本発明は、上記のような分析方法を用いた分析装置であって、外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）と特異的に反応する抗体を固定化した部材、モノクローナル抗体を固定化した部材、および検出器からなることを特徴とする。このような構成要素を有する分析装置にあっては、環境ホルモンと特異的に反応する抗体をカラム部分に導入することにより高効率に測定対象物質を濃縮することが可能であり、モノクローナル抗体を胆持する部材に濃縮後の試料を導入し、そのｐＨまたは特定のイオン濃度の変化を検出することで簡易かつ高感度の分析が可能となる。また、各々がコンパクトな構成要素からなるものであり、分析装置全体としても非常にコンパクトな装置とすることができる。
【００３７】
ここで、モノクローナル抗体は、特定成分との抗原抗体反応を形成するという特性を有することから、本発明のように選択性の高い分析方法には最適であり、具体的には、ビスフェノールＡやシメトリンなどの抗体が使用可能である。
【００３８】
環境ホルモンと特異的に反応する抗体を固定する部材あるいはモノクローナル抗体を固定化する部材としては、カラムやプレートなどの構造をとることが多いが、これに限定するものではない（以下「カラム等」という。）。通常、抗体との結合性の良い素材として、例えば、後述のニトロセルロースやガラスビーズが挙げられる。
【００３９】
カラム等の固定化部材の使用態様としては、流通型と循環型の２つが挙げられる。一般には流通型が多く使用されるが、所定流量で順次試料を導入する方法や導入・停止を一定時間間隔で繰り返す方法がある。また、試料中の環境ホルモン濃度が低い場合には循環型を使用して、試料を何度もカラム等に導入することで、より濃縮率を高めることができる。
【００４０】
また、各々異なった抗体を胆持した複数のカラム等を並べて、複数の環境ホルモンを同時に測定することが可能であり、あるいは、同一抗体を胆持した複数のカラム等を並べて、試料を順次これらのカラム等に導入することで、連続に近い測定を行うことが可能となる。
【００４１】
さらに、抗原抗体反応においては、１つのカラム等に複数の異なった種類の抗体を共存して設けることが可能である。カラム上の抗体の分布に対応したカラム等のｐＨの分布を測定できれば、試料中に含まれる複数の環境ホルモンを同時に測定することができる。このように本発明においては、抗原抗体反応の特殊性を活かした各種のカラム等を使用態様が可能であり、汎用性の高い分析方法として利用することができる。
【００４２】
本発明において、試料を、イムノアフィニティカラムに導入し濃縮することが好適である。つまり、イムノアフィニティカラムは環境ホルモンと特異的に反応する抗体の固定化に最適であり、本発明に適用することで環境ホルモンを効率よく保持し濃縮することができる。従って、イムノアフィニティカラムに試料を流通させることで、試料中の環境ホルモンを効率よく濃縮し、低濃度の環境ホルモンを簡便かつ汎用性が高く、高精度のコンパクトに分析することができる装置を提供することができる。
【００４３】
また、このようなイムノアフィニティカラムを用いることで、非常に高感度かつ選択性・迅速性の高い分析装置を提供することができるとともに、各種測定方法に適用可能な単体のカラムとしても有用である。
【００４４】
具体的には、精製したｓｃＦｖ抗体溶液（図３（Ｃ）参照）をカップリングバッファーに置換し、セファロース樹脂に加えて撹拌しカップリング反応を行った後、バッファー液を加えて洗浄およびブロッキングを行った後、チメロサールを含むＰＢＳに置換し、ガラスカラムに分注して作製する方法が例として挙げられる。
【００４５】
また、前記検出器としていわゆるケミカルＣＣＤを用いることが好適である。ケミカルＣＣＤは、図４に示したセンシング部１１に測定対象の化学物質が存在する場合、その物質濃度に応じ、電気的なエネルギーレベルを表す電位が発生し、その電位に応じた電荷を蓄積することができる。そこで、この電荷量を測定することにより化学物質の濃度を求めることができる。この測定法による大きな特長としては、電荷注入〜電荷転送を繰り返すことにより、電荷を累積し、信号を任意の大きさ（Ｎ倍）に増幅することが可能で、非常に高感度化を目指すことができる。また、この測定法によるとランダムに生じるノイズ成分はお互いにキャンセルされるため、ノイズが増幅されることがなく、信号成分だけを増幅することができる。例えば、１回の測定時の信号出力がＳとすると、５回蓄積測定を行なった場合の信号出力は５倍の５Ｓとなるが、ノイズ成分はランダムな信号なので増幅されない。このような原理で、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＣＤデバイスでは高精度測定が可能となる。と同時にセンシング部１１を複数の部位に分割し、各部位の電荷量を測定することで、２次元情報を得ることができるという優れた特性がある。
【００４６】
こうしたｐＨに対する高い感応性を活かしながら、上記加水分解によって生じるｐＨ変化の２次元情報を得ることができることから、上記のようにカラムの一部の領域に特定の抗体を担持し他の領域に他種の抗体を担持することで複数の成分分析を行うなど本発明の広い展開が可能となる。
【００４７】
さらに、前記検出器としてイオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いることが好適である。ＩＳＦＥＴは、特殊な薄膜が、インピーダンス変換機能を果たす電界効果トランジスタに一体化された構造の半導体センサであり、化学修飾により様々なイオン検出が可能であるという優れた特性を有している。また、従来のガラス電極の課題とされた「破損しやすい」「洗浄しにくい」「内部液の補充等のメンテナンスが必要」といったことがなく、かつ小型化が可能であることから、本発明の分析装置には非常に適している。従って、ＩＳＦＥＴの各種イオン濃度に対する高い感応性および特定イオンに対する高い選択性を活かしながら、上記加水分解によって生じる溶液中のイオン濃度の変化を検出することで、環境ホルモンの濃度を簡易かつ高感度に分析することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。なお、本発明がかかる実施例等に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００４９】
＜結合体溶液の調製＞
（１）測定装置及び材料
脱硫酵素は、１００ユニットのものを使用した。スルチンは、２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。抗ビスフェノールＡモノクローナル抗体は、神戸大学で作製されたＢＢＡ２１８７を使用した。ビスフェノールＡ（ナカライテスク社製）は、メタノールに溶解して使用した。その他の試薬については生化学グレードのものを使用した。
【００５０】
＜参照例１＞
（１）直接競合ＥＬＩＳＡ
ビスフェノールＡモノクローナル抗体の固相されたマイクロプレートにビスフェノールＡ及び脱硫酵素（ＤｓｚＢ）を入れ、一定時間競合反応させた後に洗浄を行い、基質であるスルチンと反応させ、反応中に変化するｐＨを測定した。測定は、マイクロピペットで反応液を攪拌後直ちに行なった。測定には開発したプローブ型Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣＣＤデバイス及びガラスｐＨ電極（ＭＰ６０６９：堀場製作所製) を用いた。  
（２）結果
測定結果を図５に示す。ガラス電極の測定感度は、ＩＣ５０値で２．４ｎｇ／ｍＬだった。また、１．０ｎｇ／ｍＬのビスフェノールＡも再現性良く測定できた。一方、ケミカルＣＣＤセンサにおいてもＩＣ５０値で２．９ｎｇ／ｍＬとガラス電極とほぼ同程度の感度を示し、ビスフェノールＡを測定できた。また、１．０ｎｇ／ｍＬのビスフェノールＡも再現性良く測定できた。
【００５１】
＜参照例２＞
（１）選択性試験
また、本分析方法の選択性を確認するために、ビスフェノールＡの代わりに構造の異なるトリアジン系除草剤シメトリンの反応性を調べた。
（２）結果
図６から明らかなとおり、本分析方法においては、シメトリンとは全く反応せず、ビスフェノールＡを特異的に測定できることが確認できた。
【００５２】
＜実施例＞
（１）環境サンプル中のビスフェノールＡの測定
環境サンプルは、桂川（京都市）の表層水を採取した。採取後、２号濾紙で濾過し、適当な濃度のビスフェノールＡを添加し、直接競合ＥＬＩＳＡによる測定に供した。
（２）結果
図７に示した通り、環境水を用いた場合でもビスフェノールＡを測定できた。このことから、脱硫酵素を用いたＥＬＩＳＡは、前処理が簡便なため高い実用性を持つと考えられ、環境サンプルへ適用するために好適な測定系であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明に係る分析方法の基本構成を例示する説明図である。
【図２】本発明に係る分析方法の他の構成を例示する説明図である。
【図３】ビスフェノールＡ、脱硫酵素およびｓｃＦｖ抗体を例示する説明図である。
【図４】本発明の実施例における測定手段であるケミカルＣＣＤの一例を示す説明図である。
【図５】本発明の実施例におけるビスフェノールＡの濃度とｐＨとの関係を例示する説明図である。
【図６】本発明の実施例におけるビスフェノールＡに対する特異性を例示する説明図である。
【図７】本発明の環境サンプルに対する実施可能性を例示する説明図である。
【図８】従来技術に係る分析装置の構成を例示する説明図である。
【符号の説明】
【００５４】
１    試料（河川水）
１ａ  濃縮液
２    環境ホルモン
３    抗体
４    胆持部材（カラム）
５、７ａ  結合体
６、６ａ  抗原
７    モノクローナル抗体
８    胆持部材（プレート）
９    基質（スルチン）
１０  ｐＨ検出器
１１  ケミカルＣＣＤのセンシング部
【図１】
2005106587.tif 000003
【図２】
2005106587.tif 000004
【図３】
2005106587.tif 000005
【図４】
2005106587.tif 000006
【図５】
2005106587.tif 000007
【図６】
2005106587.tif 000008
【図７】
2005106587.tif 000009
【図８】
2005106587.tif 000010