(57)【要約】【課題】  本願発明は、ゴムノキの成長に左右されない組織培養法によりラテックスが生産し、天然ゴムの効率的で、安定な生産を計ることを課題としている。【解決手段】  ゴムノキを組織培養後、不定根を生成する条件を見出し、不定根を液体で大量培養することにより、ラテックスの大量培養法の基礎を確立した。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴムノキの組織培養物から誘導した不定根又は無菌根を培養することを含む、ラテックスの産生方法。
【請求項２】
ゴムノキの組織培養物から誘導した不定根がゴムノキの葯、未熟種子又は形成層から誘導したカルスからの不定根である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ゴムノキの未熟胚の組織培養物から無菌根を誘導する請求項１記載の方法。
【請求項４】
不定根又は無菌根の誘導にIBA（インドール酪酸）を用いる請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
IBA（インドール酪酸）の添加濃度が３〜１０ppmである請求項４記載の方法。
【請求項６】
不定根又は無菌根の誘導にスクロースを用いる請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
スクロースの添加濃度が、６〜７ｗｔ％である請求項６記載の方法。
【請求項８】
ゴムノキが、パラゴムノキである請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ゴムノキの組織培養物から誘導した不定根又は無菌根を培養して産生したラテックスから有用成分を採取することを含む、ラテックスに含有される有用成分の産生方法。
【請求項１０】
ゴムノキの組織培養物から誘導した不定根又は無菌根の培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明は、植物組織培養技術、特に、ゴムノキの組織培養による、物質生産技術の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、ゴムノキの分泌するラテックスという乳液から製造される。工業用ゴム原料を目的として栽培されているゴムノキとしては、トウダイグサ科のパラゴムノキHavea  brasiliensisが特に重要であるが、ラテックスを産生するゴムノキとしては、他に、セアラゴムノキ（Manihot glaziovii）、桑科植物のインドゴムノキ（Ficus elastica）等がある。
【０００３】
ラテックスは樹皮内の乳管に存在し、乳管は形成層の外側に年に数層発達する。これにナイフで溝状に傷をつけると牛乳状のラテックスが流出する。現在は、人手により、ゴムノキの樹皮に幹を斜めに１／２周するようにナイフで溝を形成し、溝の下部にラテックスの回収器を設けてラテックスを回収している。
【０００４】
また、ゴムノキの苗を植えてから、ラテックスを採取できる程度に成長するまでには、５〜７年かかり、採取期間は、およそ２０−３０年である。
【０００５】
今までに、ラテックスを細胞培養により生産しようとする試みはあったが、いずれも、工業的に用いることができるものではない（特許文献１）。
【０００６】
また、パラゴムノキの産出するラテックス中にはおよそ３５％のゴム成分のほか、タンパク質、イノシトール、ケブラキトールなどの糖類、ビタミンEの一種であり天然の老化防止剤としても効果のあるトコトリエノールなど多くの有用物質が含まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開昭６０−２７３９２号。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の天然ゴムの生産は、ゴムの木の栽培からはじめ、成長したところで、人手によりラテックスの採取を行ってきたため、（１）生産計画を立ててから、実際にラテックスが生産できるまでに期間を要しすぎる、（２）ラテックス（ゴム）の採取は、人手によらなければならいが、ゴムの主要栽培地である東南アジアでは、工業化の進展により、労働力不足が予想されるので、今後、天然ゴムの安定的で、効率的な、新たな生産方法の開発が望まれている。
【０００９】
そこで、本願発明は、特に、ゴムノキの成長に左右されない組織培養法によりラテックスが生産し、天然ゴムの効率的で、安定な生産を計ることを課題としている。
【００１０】
更にラッテクスを組織培養で製造することにより、比較的短時間にパラゴムノキの組織を大量増殖し、ラテックス中のゴム、たんぱく質、糖、トコトリエノールなどの有用物質を効率よく産生することも課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本件発明者らは、ゴムノキを組織培養後、不定根を生成する条件を見出し、不定根を液体で大量培養することにより、ラテックスの大量培養法の基礎を確立したものである。更に、本件発明者らは、試行錯誤を繰り返し、未熟胚を組織培養し、無菌根を誘導することにも成功した。
【発明の効果】
【００１２】
本件発明により、組織培養により大量に、しかも短期間で、計画的に、不定根又は無菌根を調製することが可能となった。これにより、従来は、手作業で、ゴムノキから採取されていたラッテクスを、大量に培養された不定根又は無菌根から抽出することが可能となった。さらに、組織培養により産生されたラテックスから、ゴム成分を遠心分離などの手法によって分離することにより、たんぱく質、糖、トコトリエノールなどの有用物質を選択的に効率よく取得することもできるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願発明は、ゴムノキを組織培養し、不定根を生成し、不定根を大量培養することによる、ラテックスの産生方法に関するものである。更に、本願発明は、ゴムノキの未熟胚を組織培養し、無菌根を誘導し、無菌根を大量培養することにより、ラテックスの産生方法にも関するものである。
【００１４】
組織培養の対象となるゴムノキとしては、特に好適には、パラゴムノキが挙げられるが、これ以外に、セアラゴムノキ、インドゴムノキ、パナマゴムノキ、グアユールゴムノキ、ゴムタンポポ、ラゴスゴムノキ、グッタペルガノキ、パラタゴムノキ、シス・チクルが挙げられる。
【００１５】
以下、パラゴムノキを例として説明するが、それ以外のゴムノキについても同様に方法で実施できる。
【００１６】
組織培養に用いる材料としては、パラゴムノキの根、茎、葉又は花等の種々の部分を適宜の大きさに切断して用いることができるが、好適には、つぼみ、未熟果実又は茎を利用し、つぼみから取り出した葯、未熟果実から取り出した未熟種子又は茎から取り出した形成層を材料とすることができる。
【００１７】
まず、パラゴムノキの材料の表面を洗浄する。材料として植物内部を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗っても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄することもできる。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗う。
【００１８】
次に、材料を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤・滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好適である。
【００１９】
パラゴムノキから取り出した材料からカルスを誘導し、カルスから不定根を誘導する、又は、パラゴムから採取した材料から直接無菌根を誘導することもできる。
【００２０】
Ｉ．カルスを誘導し、カルスから不定根を誘導する方法
材料として、好適には、葯、未熟種子又は形成層を用いる。カルスを誘導するには、培地にサイトカイニン系植物ホルモン及び／又はオーキシン系植物ホルモンを、低濃度で加える。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地（SchenkとHildebrandtの培地）、MS培地（MurashigeとSkoogの培地）、ＬＳ培地（LinsmaierとSkoogの培地）、Gamborg、Ｂ５、ＭＢ培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えたMS改変培地が好適である。
【００２１】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、BAP（ベンジルアミノプリン）、2iP（イソペンチニルアミノプリン）、カイネチン（６−フルフリルアミノプリン）、ゼアチン、を用いることができるが、好適には、BAP(ベンジルアミノプリン)又はKIN(カイネチン)を１〜３ppmで用いることができる。
【００２２】
オーキシン系植物ホルモンとしては、pCPA（クロロフェノキシ酢酸）、2,4-D(ジクロロフェノキシ酢酸)、IAA（インドール酢酸）、IBA（インドール酪酸）、NAA（ナフタレン酢酸）、NOA（ナフトキシ酢酸）、好適には、2,4-D(ジクロロフェノキシ酢酸)を０．３〜１．０ppmで、IAA(インドール酢酸)を約１ppmで,NAA（ナフタレン酢酸）を約１ppmで用いることができる。
【００２３】
更に好適には、サイトカイニン系植物ホルモンとオーキシン系植物ホルモンとを組み合わせて用いることができ、例えば、BAP若しくはKIN、２，４−Ｄ、及びIAA若しくはNAAの３種類を組み合わせて用いることができる。
【００２４】
更に、カルス誘導を促進するために、スクロースを６〜７wt％の高濃度で添加し、ココナッツウォーターを加えても良い。好適には、PHを５．６〜５．８に調整し、培養温度は、２６〜２８℃、暗所にてカルス誘導する。カルスの支持体としてはゲルライトあるいは寒天を用いることができる。
【００２５】
誘導したカルスを、１〜２ヶ月間同じ組成の培地で暗所、培養温度は、２６〜２８℃で、培養し、カルスを増殖させる。増殖させたカルスから、不定根を誘導する。不定根誘導には、好適には、MS基本培地にIBA（インドール酪酸）を３〜１０ppm添加した培地を用いる。更に好適には、スクロースを６〜７ｗｔ％添加する。IAA,NAA等のオーキシン類は添加しても、添加しなくても良い。  
【００２６】
２．未熟胚からの無菌根の誘導
好ましくは、外果皮が硬化する前の段階の未熟な緑色の果実を利用する。未熟果実の表面を、周知の滅菌剤、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム好適には、エタノールで滅菌する。滅菌した後、果実の内部の種子をとりだす。未熟種子の胚に成長する部分を摘出する。
【００２７】
摘出した未熟胚は、培地で成長させる。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地、MS培地、ＬＳ培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えたMS改変培地が好適である。
【００２８】
比較的成長した未熟胚から、ＭS基本培地をベースにスクロースを添加すれば、ホルモン種にあまり影響されることなしに根を誘導することができる。
【００２９】
３．根の大量増殖
上記１．又は２．で誘導された不定根又は無菌根を、適宜の大きさ、好適には、２〜３cm角の小片に切り分ける。適宜の培地、例えば、Whiteの培地、Hellerの培地、ＳＨ培地、MS培地、ＬＳ培地、又はMＢ培地を用いることができ、好適には、MS培地を用い、培地中にIBA３〜１０ppmを加えて、２６〜２８度で培養することにより、根の増殖を行うことができる。培地は固体でも液体でも良いが、好適には、液体培地を用いて、振トウ培養を行う。液体培養は、ジャーファーメンターを用いることもできる。液体培養することで、いっそう効率のよい増殖が可能で、移植操作も容易となる。
【００３０】
４．根からラテックスの確認および抽出
増殖がすすんだ根培養物は、切断すると、ラテックスが析出し、目視して確認することができる。
【００３１】
さらに、微量のラテックスを熱分解GC/MSやFT-IRなどの手法で分析することにより、ゴム成分を確認した。
【００３２】
また、大量に増殖した根より、ラテックスを抽出し、さらにゴム成分を遠心分離などの手法によって分離することにより、たんぱく質、糖（スクロース、保湿剤として用いることができるケブラキトール、myo−イノシトール等）、トコトリエノール、アミノ酸などの有用物質を選択的に効率よく取得できる。
【実施例】
【００３３】
組織培養によるラテックスの産生方法
（１）＜葯・未熟種子・形成層からカルスを経由して不定根を得る方法＞
外植体として用いる雄花の葯は蕾の状態のものをパラゴムノキから採取し、希釈した次亜塩素酸ソーダ溶液で消毒後、蕾を開いて取り出した。未熟種子は外皮が緑色の軟らかい果実から採取した。形成層は若い枝を採取し、表面をエタノールで洗浄後、サンプリングした。
【００３４】
カルス誘導にはMS基本培地に、1〜3ppmのBAP若しくはKINと、0.3〜1ppmの2,4-D、さらに1ppmのNAA若しくはIAAを添加、さらに6〜7％のスクロースおよび5％程度のココナッツウォータを加えた培地を調整した。pHは5.6〜5.8に調製し、支持体としては、ゲルライトあるいは寒天粉末を使用した。
【００３５】
27〜28℃の暗所で1〜2ヶ月培養することにより、カルスの増殖が確認された。
増殖されたカルスはホルモン組成のみ3〜10ppmに変えた、カルス誘導と同一組成の培地に移植した。IAA、NAAなどのオーキシンは加えても加えなくてもよい。IBAを加え、16時間光照射した27〜28℃の環境で1〜数ヶ月培養することにより不定根を誘導することができた。形成した発根を図１に示す。
【００３６】
（２）＜未熟胚から無菌根を誘導する方法＞
比較的成長した未熟胚を種子からサンプリングし、MS基本培地に6〜7％のスクロースを加えた培地で培養することにより、ホルモン種にはあまり影響されることなしに、無菌根を誘導することができた。
【００３７】
（３）＜根の大量増殖＞
上記(1),(2)の培養で得た根を2〜3cm以上の小片に切り分け、IBA3〜10ppmを加えた培地で根を増殖させた。培地は個体でも液体でも良い結果を得た。(図２参照。)
【００３８】
（４）＜培養根中のラテックスの確認＞
増殖が進んだ根の培養物においては、移植操作時の切断により、ラテックスの浸出が目視で確認できた。さらにその組成を分析するために、培養根を有機溶媒(クロロホルムなど)でソクスレー抽出を行い、抽出部分を熱分解GC/MS,FT-IR,NMRなどの手法で分析した。
【００３９】
例えば、NMRでＣＤＣ１３を溶媒として測定したところ、１３５．２４ppm、１２５．０８ppm、３２．２５ppm、２６．４４ppm、及び２３．４４ppmの位置に高いピークが見られ、これ以外に、１２８．０ppm、１２０．４ppm、２９．７ppm、２２．７ppm及び14.1ppmの位置に低いピークが見られた。
【００４０】
その結果、天然ゴムの主成分である、シスポリイソプレンが多量に存在することが確認されたほか、糖類、アミノ酸、タンパク質、高級脂肪酸などの有用成分が同定された。(図３  NMRスペクトル  参照)
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】IBA含有培地でカルスの発根
【図２】伸長した培養根
【図３】培養根からクロロホルムで抽出した抽出物の13C-NMRスペクトル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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