(57)【要約】      （修正有）【課題】指数関数的増加によるリガンドの系統的展開（ＳＥＬＥＸ）プロセスに基づいく標的分子に対する核酸リガンドの確認方法及び製造方法の提供。【解決手段】核酸リガンドの確認は修飾核酸、ブレンド核酸を用いて、核酸の候補混合物と、標的及び非標的分子とを接触させる別々の工程によって実施する。トロンビン、血管内皮成長因子、ヒト好中球エラスターゼ、カフェイン及びテオフィリンに対する核酸リガンドの確認方法と製造方法並びにＳＥＬＥＸ方法によって確認されるトロンビンに対する核酸リガンドが含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する、精製され単離された非天然核酸リガンド。
【請求項２】
前記核酸リガンドがＶＥＧＦのその受容体への結合を阻害する、請求項１記載の核酸リガンド。
【請求項３】
前記リガンドが一本鎖である、請求項１記載の核酸リガンド。
【請求項４】
前記リガンドがＲＮＡリガンドである、請求項３記載の核酸リガンド。
【請求項５】
前記リガンドが配列番号：４８〜８２および９４〜１００からなる群より選択される、請求項４記載の核酸リガンド。
【請求項６】
前記リガンドが２’Ｆ（２’−フルオロ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項４記載の核酸リガンド。
【請求項７】
前記リガンドが２’ＮＨ２（２’−アミノ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項４記載の核酸リガンド。
【請求項８】
前記リガンドが配列番号：１０７〜１５４からなる群より選択される、請求項７記載の核酸リガンド。
【請求項９】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の、細胞の表面上のその受容体への結合を阻害するための方法であって、前記細胞に請求項２に記載の核酸リガンドを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
前記リガンドがＲＮＡリガンドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡリガンドが２’Ｆ（２’−フルオロ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡリガンドが２’ＮＨ２（２’−アミノ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む方法により同定された、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する、精製され単離された非天然核酸リガンド：
ａ）核酸の候補混合物を準備し；
ｂ）候補混合物に比べてＶＥＧＦに対して高いアフィニティーを有する核酸を残りの候補混合物から分割することができるよう、核酸の候補混合物をＶＥＧＦと接触させ；
ｃ）高いアフィニティーを有する核酸を残りの候補混合物から分割し；そして
ｄ）ＶＥＧＦの核酸リガンドを同定することができるよう、高いアフィニティーを有する核酸を増幅し、ＶＥＧＦに結合するため比較的高いアフィニティーと特異性とを有する核酸について富化された核酸の混合物を得る工程。
【請求項１４】
前記核酸の候補混合物が一本鎖核酸を含む、請求項１３記載の核酸リガンド。
【請求項１５】
前記一本鎖核酸がリボ核酸である、請求項１４記載の核酸リガンド。
【請求項１６】
前記核酸の候補混合物が２’Ｆ（２’−フルオロ）修飾リボ核酸を含む、請求項１５記載の核酸リガンド。
【請求項１７】
前記核酸の候補混合物が２’ＮＨ２（２’−アミノ）修飾リボ核酸を含む、請求項１４記載の核酸リガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒト好中球エラスターゼ、テオフィリン、カフェイン及びトロンビンに対する高アフィニティ核酸リガンドを開示する。このような核酸リガンドを確認するために本明細書で用いた方法はＳＥＬＥＸ〔指数関数的増加によるリガンドの系統的展開(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential enrichment）の頭字語〕と呼ばれる。さらに本明細書では、“カウンターＳＥＬＥＸ”と呼ばれる、密接に関連した分子を識別することができる高度に特異的な核酸リガンドを確認する方法と、“ブレンド（blended)ＳＥＬＥＸ”と呼ばれる、高アフィニティリガンドを形成するため核酸と他の官能単位とを結合させる方法と、高アフィニティによって標的分子を結合することができる修飾オリゴヌクレオチドの製造方法とを開示する。詳しくは、本明細書では、一本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡリガンド、テオフィリンとカフェインとを識別することができる一本鎖ＲＮＡリガンド、及び２’−ＮＨ２−修飾を含むトロンビンに対するＲＮＡリガンドを含む、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、カフェイン及びテオフィリンに対する高アフィニティ核酸リガンドを開示する。
【０００２】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基中に５−Ｘ及び／又は２’−Ｙ置換基(substitution)を含み、プリン塩基中に８−Ｘ及び／又は２’−Ｙ置換基とを含む１種以上の修飾ヌクレオチド塩基を含む。本発明は、本発明の修飾ヌクレオチドを含むヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、本明細書において述べる置換ヌクレオチド、塩基及び中間体の合成方法を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体の導入によって修飾される。本発明のオリゴヌクレオチドに組み入れたヌクレオチド誘導体は、核酸リガンドに付加的な官能基を組み入れる手段を紹介する。本発明は、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡリガンドである修飾された高アフィニティ核酸リガンドを含む。
【０００３】
ピリミジンの５−位置と２’−位置とにおいて化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドの特定の例を提供する。さらに、２’−ＮＨ２−修飾を含む、トロンビンに対する特異的ＲＮＡリガンドを開示する。
【０００４】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、特定の標的分子に対する改良核酸リガンドを製造するＳＥＬＥＸ方法に対する候補の混合物の化学的多様性を高める。多くの場合に、この修飾は、血清中のエンドヌクレアーゼに対して増強された相対的耐性を有するオリゴヌクレオチドをも形成する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは薬剤、診断剤、及び遺伝子療法による治療の一部として有用である。
【０００５】
本発明のブレンド核酸リガンドは少なくとも１つの核酸リガンド単位と、少なくとも１つの官能単位とから成る。核酸に結合することができる官能単位の例はタンパク質、ペプチド、光反応性(photoreactive）基、化学的反応性基、活性部位指向性(active site directed)基、脂質、ビオチン及び蛍光性化合物を含む。ブレンド核酸リガンド単位は全体として又は部分的に所定標的へのリガンドとして役立つ。官能単位は多様な機能で役立つように設計することができる。例えば、官能単位は独立的に又は核酸リガンドとの組合せで、標的に対する特異的アフィニティを有することができ、場合によっては、核酸リガンド以外の異なる、標的との相互作用部位に対するリガンドを有することができる。標的分子に共有的に反応し、標的分子にリガンドを結合させる官能単位を加えることができ、プロテアーゼ又はヌクレアーゼ活性の選択を補助する触媒基を加えることができ、例えば、ビオチン−又は蛍光−タグ付きオリゴヌクレオチドのようなレポーター分子を、診断試薬としての使用のために加えることができる。
【背景技術】
【０００６】
ＳＥＬＥＸ方法（以下では、ＳＥＬＥＸと呼ぶ）は「指数関数的増加によるリガンドの系統的展開」なる名称の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９０年６月１１日出願、現在放棄）に初めて開示された。両方とも「核酸リガンド」なる名称の、米国特許出願第０７／７１４，１３１号（１９９１年６月１０日出願）及び米国特許出願第０７／９３１，４７３号（１９９２年８月１７日出願、現在米国特許第５，２７０，１６３号）は、さらに基本的ＳＥＬＥＸ方法を開示する。これらの出願の各々を引用により特に本明細書中に取込むものとする。ＳＥＬＥＸ方法は核酸リガンドと呼ばれる生成物の種類を形成し、このようなリガンドは特有の配列を有し、所望の標的化合物又は分子に特異的に結合する性質を有する。各ＳＥＬＥＸ同定(identified)核酸リガンドは所定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が多様な二次元又は三次元構造を形成する充分な容量と、ポリマーであれモノマーであれ、実際に任意の化学化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ために利用可能な、充分な化学的多用性をそれらのモノマー内に有するという特有の洞察に基づくものである。任意のサイズの分子が標的として使用可能である。
【０００７】
ＳＥＬＥＸ方法は、結合アフィニティと選択性との実際に任意の所望の基準に達するために、同じ一般的選択テーマを用いた、候補物(candidate）の混合物からの選択と、結合、分割及び増幅(amplification）の段階的反復とを含む。好ましくはランダム化配列のセグメントを含む核酸混合物から出発して、この方法は結合のために有利な条件下で混合物を標的と接触させ、標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分割し、核酸−標的対を解離させ、核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得て、次に、必要なかぎりの多くのサイクルによって、結合、分割、解離及び増幅を再び反復する工程を含む。混合物中の核酸のバルクよりも高いアフィニティを標的に対して有する、核酸プール中の要素を分割するには、多様な方法を用いることができる。
【０００８】
理論によって縛られないが、ＳＥＬＥＸは、多数の可能な配列と構造とを含む核酸混合物内に、所定の標的に対する広範囲な結合アフィニティが存在するという発明者の洞察に基づく。例えば２０ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は４２０種の候補の可能性を有することができる。標的に対して大きいアフィニティ定数(affinity constant）を有するものが標的と結合する最も大きな可能性を有する。分割、解離及び増幅後に、高い結合アフィニティの候補を多く含む、第２核酸混合物が形成される。追加の選択ラウンドが最良のリガンドの形成を促進して、ついには得られる核酸混合物が主として１種のみ又は数種の配列から構成されるまでになる。これらをクローン化し、配列決定し、純粋リガンドとして結合アフィニティに関して個々に検査することができる。
【０００９】
選択、分割及び増幅のサイクルは所望の目的に達するまで繰り返すことができる。大抵の一般的な場合には、サイクルの反復時に結合強度の有意な改良がもはや得られなくなるまで、選択／分割／増幅を続ける。この方法を用いて、約１０１８種ほど多くの核酸種のサンプルを形成することができる。試験混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、効果的な増幅のために必要な保存配列とを含む。ランダム化配列の合成と、ランダムに開裂した細胞核酸からのサイズ選択とを含む、幾つかの方法で核酸配列変異体を製造することができる。可変配列部分は完全に又は部分的にランダムな配列を含むことができ；ランダム化配列と合体した保存配列のサブポーション(subportion)も含むことができる。選択／分割／増幅の反復の前に又は中に、突然変異生成によって、試験核酸中の配列変化が導入されるか又は増大することがある。
【００１０】
ＳＥＬＥＸ特許出願の方法の１実施態様では、選択プロセスは特定標的に最も強く結合する核酸リガンドの単離において非常に効果的であるので、選択及び増幅の１サイクルのみが必要であるに過ぎない。例えば、カラムに結合した標的と核酸が会合する可能性が、カラムが最高アフィニティの核酸リガンドを充分に分離及び単離させることができるように作用するクロマトグラフィー型プロセスで、このような効果的な選択は行われることができる。
【００１１】
多くの場合に、単一種類の核酸リガンドが確認されるまで、ＳＥＬＥＸの反復工程を実施することが必ずしも好ましいとは限らない。標的−特異的な核酸リガンド溶液は、保存配列と、標的に対する核酸リガンドのアフィニティに有意な影響を与えずに置換する又は加えることができる幾つかの配列とを有する核酸構造又はモチーフのファミリーを含むことができる。ＳＥＬＥＸプロセスを完成前に停止することによって、核酸リガンド溶液系列の幾つかの要素の配列を知ることができる。
【００１２】
種々な核酸一次、二次及び三次構造が存在することが知られている。非Watson−Crick 型相互作用に最も一般的に関係することが判明している構造又はモチーフは、ヘアーピンループ、対称的及び非対称的バルジ、シュードノット(pseudoknot)及びこれらの無数の組合せで呼ばれる。このようなモチーフの殆ど全ての周知の場合は、これらが３０個以下のヌクレオチドの核酸配列中に形成されることができることを示唆する。この理由から、隣接するランダム化セグメントによるＳＥＬＥＸ操作は約２０〜５０個のヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸配列によって開始されることがしばしば好ましい。
【００１３】
基本的ＳＥＬＥＸ方法を、特定の目的を果たすように、修正することができる。例えば、「構造に基づく核酸の選択方法」なる名称の米国特許出願第０７／９６０，０９３号（１９９２年１０月１４日出願）は、例えばベント(bent)ＤＮＡのような、特有の構造特徴を有する核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動と組合せたＳＥＬＥＸの使用を述べる。「核酸リガンドの光選択」なる名称の米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９３年７月１７日出願）は、標的分子と結合する及び／又は標的分子を光架橋する及び／又は標的分子を光不活化することができる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸに基づく方法を開示する。「指数関数的増加によるリガンドの系統的展開：溶液ＳＥＬＥＸ」なる名称の米国特許出願第０８／１４３，５６４号（１９９３年１０月２５日出願）は、標的分子に対して高いアフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低いアフィニティを有するオリゴヌクレオチドとの非常に効果的な分割を達成する、ＳＥＬＥＸに基づく方法を開示する（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９２９６をも参照のこと）。
【００１４】
ＳＥＬＥＸ特許出願は、標的分子上の１個より多い部位と、標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドとに結合する核酸リガンドを得るための方法を述べる。ＳＥＬＥＸ方法は任意の考えられる標的に結合する核酸リガンドを単離し、同定する手段を提供する。しかし、好ましい実施態様では、ＳＥＬＥＸ方法は、標的が核酸結合タンパク質と、それらの生物学的機能の一部として核酸を結合しないことが知られているタンパク質との両方を含むタンパク質である事態に適用する。例えば、「塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の高アフィニティＲＮＡリガンド」なる名称の米国特許出願第０８／０６１，６９１号（１９９３年４月２２日出願）は、ｂＦＧＦのＲＮＡリガンド阻害剤を開示し、特に本明細書に援用される「トロンビンのリガンド」なる名称の米国特許出願第０７／９７３，３３３号（１９９２年１１月６日出願）は、トロンビンに対する核酸リガンドを開示する。
【００１５】
塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は間葉起源及び神経外胚葉(neuroectodermal）起源の多くの細胞に対する多機能エフェクターである（RifkinとMoscatelli（１９８９），J. Cell Biol. １０９：１；BairedとBohlen（１９９１），Peptide Growth Factors and Their Receptors（Sporn,M.B.とRoberts,A.B.編集），３６９〜４１８頁，Springer,N.Y. ; BasilicoとMoscatelli（１９９２），Adv. Cancer Res.５９：１１５）。これは、酸性ＦＧＦ（Jaye等（１９８６），Science,２３３，５４１；Abraham 等（１９８６），Science,２３３，５４５）、ｉｎｔ−２（Moor等（１９８６），ＥＭＢＯ  Ｊ．５：９１９）、ｋＦＧＦ／ｈｓｔ／ＫＳ３（Delli-Bovi等（１９８７），Cell,５０：７２９；Taira 等（１９８７），Proc. Nati. Acad. Sci.ＵＳＡ，８４：２９８０）、ＦＧＦ−５（Zhan等（１９８８），Mol. Cell. Biol.  ８：３４８７）、ＦＧＦ−６（Marics等（１９８９），Oncogene  ４：３３５）及び表皮ケラチン細胞成長因子／ＦＧＦ−７（Finch 等（１９８９），Science ２４５：７５２）をも含む関連タンパク質のファミリーの最も研究され、最も良く特徴づけられた要素の１つである。
【００１６】
インビトロでは、ｂＦＧＦはプラスミノーゲン活性化因子の細胞増殖、移動及び誘導と、コラゲナーゼ活性とを刺激する（Presta等（１９８６），Mol. Cell.Biol. ６：４０６０；Moscatelli（１９８６），Proc. Nati. Acad. Sci.ＵＳＡ，８３：２０９１；Mignatti等（１９８９），J. Cell Biol. １０８：６７１）。インビボ（in vivo)では、これは新血管新生の最も強力な誘導物質である。インビボにおけるその脈管形成活性は組織改造及び創傷治療と、例えば腫瘍増殖、腫瘍転移、糖尿病性網膜症及び慢性関節リウマチのような病的な新血管新生を特徴とする疾患状態とにおける役割を示唆する（Folkman とKlagsbrun （１９８７）等，Science ２３５：４４２；Gospodarowitz （１９９１），Cell BiologyReviews ２５：３０７）。
【００１７】
ｂＦＧＦはまた、血管損傷後の平滑筋細胞病変の発生に重要な役割を果たすことも周知である（Reidy 等，Circulation, Suppl. III ８６：III −４３）。ｂＦＧＦ（及びＦＧＦ系統の他の要素）の過度発現は多くの悪性障害と相互に関連する（Halaban 等（１９９１），Ann. N. Y. Acad. Sci. ６３８：２３２；Takahashi 等（１９９０），Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ．８７：５７１０；Fujimoto等（１９９１），Biochem. Biophys. Res. Commun.１８０：３８６）。最近、中和抗ｂＦＧＦ抗体が、腫瘍関連血管形成を抑制することによって、インビボにおいて固体腫瘍成長を抑制することが判明している（Hori等（１９９１），Cancer Res. ５１：６１８０）。これに関連して、スラミン（周知の抗原生動物(antiprotozoal）活性を有するポリスルホン化ナフタレン誘導体）の抗腫瘍剤としての最近の治療試験が注目に値する。スラミンはポリアニオン結合部位における結合と、成長因子とその受容体との相互作用の妨害とによってｂＦＧＦの活性を阻害すると考えられる（Middaugh等（１９９２），Biochemistry  ３１：９０１６；Eriksson等（１９９２），Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ．８８：３４４１）。好ましくない幾つかの副作用と実質的な毒性とを有することの他に、スラミンは、特異的な薬物−タンパク質相互作用にその有効な治療効果を関連づけることを困難にする、幾つかの他のヘパリン結合成長因子と相互作用することが知られている（La Pocca等（１９９０），Cancer Cells  ２：１０６）。ある種のヘパリン製剤の抗脈管形成特性も観察されており（Folkman 等（１９８３），Science ２２１，７１９；Crum等（１９８５），Science ２５０，１３７５）、これらの効果は少なくとも部分的にそれらがｂＦＧＦシグナル形成を妨害する可能性に基づくと考えられる。ｂＦＧＦ結合に寄与する特異的ヘパリン画分は現在部分的に解明されているが（Ishai −Michaeli等（１９９２），Biochemistry３１：２０８０；Turnbull等（１９９２），J. Biol. Chem.  ２６７：１０３３７）、典型的なヘパリン製剤はサイズ、スルホン化度及びイズロン酸含量に関して不均一である。さらに、ヘパリンはまた多くの酵素と成長因子とにも影響を与える。したがって、モノクローナル抗体を別として、ｂＦＧＦの特異的アンタゴニストは知られていない。
【００１８】
トロンビンは重要な凝血促進活性及び抗凝血活性を有する多官能性セリンプロテアーゼである。凝血促進性酵素として、トロンビンはフィブリノーゲンを開裂し、凝固Ｖ因子、VIII因子及びXIII因子を活性化し、血小板を活性化する。トロンビンによるフィブリノーゲンの特異的開裂はフィビリンモノマーの重合を開始し、これは血餅形成における主要なイベントである。血小板の血栓形成における主要なイベントは“非結合”モードから“結合”モードへの血小板の活性化であり、トロンビンは血小板凝集の最も強力な生理学的活性剤である（BerndtとPhillips（１９８１），Platelets in Biology and Pathology, J. L. Gordon編集（アムステルダム：Elsevier／North Holland Biomedical Press），４３〜７４頁；HansenとHarker（１９８８），Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ  ８５：３１８４〜３１８８；Eidt等（１９８９），J. Clin. Invest.  ８４：１８〜２７）。したがって、凝血原として、トロンビンは出血の停止（生理学的な止血）と血管閉鎖性血栓（病理学的な血栓症）に重要な役割を果たす。
【００１９】
抗凝血剤としてトロンビンはトロンボモジュリン（ＴＭ）、血管内皮細胞の表面上に発現する糖タンパク質に結合する。活性部位配座のアロステリックな変化と、トロンビン上のＴＭ結合部位とフィブリノーゲン結合部位とのオーバーラップとの組合せによって、ＴＭは基質特異性をフィブリノーゲン及び血小板からプロティンＣへ変化させる。リン脂質表面のＣａ２＋と第２ビタミン依存性タンパク質補因子（プロティンＳ）との存在下で、活性化プロティンＣは第Ｖａ因子と第VIIIa 因子とをタンパク質分解的に分解することによって凝固を抑制する。したがって、トロンビン−ＴＭ複合体の形成はトロンビンを凝血促進性酵素から抗凝血性酵素へ変え、これらの対立活性の間の正常な釣り合いは止血の調節に重要である。それ故、トロンビンの抗凝血活性を抑制することができるトロンビンの高アフィニティ核酸リガンドを製造することが重要である。
【００２０】
インテグリンｇｐＩＩｂＩＩＩａは、フィブリノーゲンとフィブリン血餅への血小板粘着を仲介する、活性化血小板上に発現するタンパク質である（Phillips等（１９８８），Blood ７１：８３１；Frojmovic 等（１９９１），Blood７８：３６９）。ｇｐＩＩｂＩＩＩａを含めた、細胞粘着受容体のインテグリンのスーパーファミリーの要素はペプチド  アルギニン−グリシン−アスパルギン酸配列（ＲＧＤ）を認識することが知られている。ｇｐＩＩｂＩＩＩａがＲＧＤ含有リガンドを結合するときに、血小板顆粒放出、形状変化、凝集及び粘着を誘導するシグナルが発せられる（Loftus等（１９９０），Science ２４９：９１５；Ware等（１９９３），N. Eng. J. Med. ３２８：６２８）。ｇｐＩＩｂＩＩＩａ仲介血小板凝塊形成の阻害剤は、血管形成術後の心臓発作の発生の減少を含めて、多様な血管疾患における治療能力を有すると考えられる。
【００２１】
現在周知のインテグリン阻害剤は特異性の欠如によって限定される。他のインテグリンタンパク質と交差反応しない高特異性インテグリン阻害剤の開発は有意な治療能力を有すると考えられる。
【００２２】
ヒト好中球エラスターゼ（以下ではエラスターゼと呼ぶ）はヒト多形核顆粒球のアズール好性顆粒(azurophilic granule）中に貯蔵される主要なタンパク質であり（Dewald等（１９７５），J. Exp. Med.  １４１：７０９）、アズール好性顆粒は炎症性刺激時に分泌される（Bonney等（１９８９），J. Cell. Biochem.３９：４７）。エラスターゼは、結合組織中に見い出される多くの高分子を消化することができる、広範囲な基質特異性を有するセリンプロテアーゼである。例えば、エラスターゼはエラスチン、III 型及びIV型コラーゲン、及びフィブロネクチンのような高分子を加水分解することができる。結合組織成分の他に、例えば免疫グロブリン、凝固因子及び補体タンパク質のような、多くの血漿タンパク質もエラスターゼによって加水分解することができる。
【００２３】
エラスターゼは２１８アミノ酸長さの一本鎖糖タンパク質である（Sinha 等（１９８７），Proc. Natl. Acad. Sci.  ＵＳＡ  ８４：２２２８）。エラスターゼはＡｓｎ−９５及びＡｓｎ−１４４の位置に２個のＮ−グリコシル化部位を有する。エラスターゼの分子量は約２９，５００ダルトンであり、その等電点（ｐＩ）は８〜９の間である。阻害剤と錯体形成したエラスターゼの結晶構造はNavia 等（１９８９），Proc. Natl. Acad. Sci.  ＵＳＡ  ８６：７によって判明している。
【００２４】
幾つかの天然プロティナーゼ阻害剤がエラスターゼ活性の調節に有効であると判明している。ヒトα−１−プロティナーゼ阻害剤（α−１−ＰＩ）は血漿中に見い出される主要なプロテアーゼ阻害剤である（Heimburger等（１９７０），Proceeding of the First International Research Conference on ProteinaseInhibitors, Walter de Gruyter,ニューヨーク，１〜２１頁）。一部の個人では、α−１−ＰＩが根元的な遺伝的欠陥のために異常に低い量で存在する；この低いレベルは家族性気腫を惹起する（Garver等（１９８６），N. Eng. J. Med. ３１４：７６２）。他の場合には、この阻害剤は煙草の煙りによる酸化破壊のために非機能性である（Janus 等（１９８５），Lancet  ｉ：１５２）。分泌白血球プロティナーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）は、あらゆる粘膜分泌物中に見い出される他の種類のエラスターゼ阻害剤であり（ThompsonとOhlsson （１９８６），Proc.Natl. Acad. Sci.  ＵＳＡ  ８３：６６９２）、肺の上気道中に存在する主要なエラスターゼ阻害剤であると考えられる。最近、他の種類の天然エラスターゼ阻害剤、エラフィンがヒト皮膚から特徴づけられている（Wiedow等（１９９０），J. Biol. Chem.２６５：１４７９１）。
【００２５】
過度のエラスターゼ活性は、肺気腫（Kalpan等（１９７３），J. Lab. Clin.Med.８２：３４９；Powers（１９８３），Am. Rev. Respir. Dis. １２７：５５４）、のう胞性線維症、慢性関節リウマチ（Barrett 等（１９７８）,Agentsand Actions ８：１）、慢性気管支炎、未熟児における気管支肺異形成、及び成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）（Weiland 等（１９８６），Am. Rev. Respir.Dis.１３３：２１８）を含めた、幾つかの疾患に関連づけられている。大抵の場合に、これらの疾患の病因は、過度の酵素活性を制御するという主要な役割を有する、エラスターゼの天然阻害剤の不活化又は不充分さと相関している。
【００２６】
エラスターゼ特異的阻害剤の開発がしばらく前から製薬業界の主要な目的である。その結果、種々なタイプの阻害剤が開発されている。これらには、例えばペプチドクロロメチルケトンのような不可逆的阻害剤（Powers等（１９７７），Biochem. Biophys. Acta  ４８４：１５６）、例えばペプチドボロン酸(peptideboronic acid) のような可逆的阻害剤（Stone 等（１９９０），Am. Rev.Respir. Dis.  １４１：４７）、セファロスポリン（Doherty 等（１９８６），Nature  ３２２：１９２）及びペプチドアルデヒド（Kennedy 等（１９８７），Eur. J. Respir. Dis.  ７１：４７２）がある。しかし、これらの阻害剤の多くは他のセリンプロテアーゼの非特異的阻害剤でもある（Hemmi 等（１９８５），Biochemistry  ２４：１８４１）。さらに、今までに開発された、エラスターゼの高特異的ペプチド系阻害剤は経口有効性の欠如という欠点を有する（Williams等（１９９１），Am rev. Respir. Dis.  １４４：８７５）。β−ラクタム阻害剤の一部は安定性問題と経口有効性欠如の両方を有する（Knight等（１９９２），Biochemistry  ３１：４９８０）。合成阻害剤の他に、例えばα−１−プロティナーゼ（Gadeck等（１９８１），J. Clin. Invest.  ６８：１１５８）、エグリンＣ（Snider等（１９８５），Am. Rev. Respir.  Dis.  １３２：１１５５）、及びＳＬＰＩ（Gauthier等（１９８２），Biochem. Biophys. Acta  ７００：１７８；Gast等（１９９０），Am. Rev. Respir. Dis. １４１：８８９）のような、生合成的に誘導される天然生成阻害剤が現在開発中である。
【００２７】
合成ＲＮＡホモポリマー（Simon 等（１９８８），Exp. Lung Res.  １４：８５）、ｔＲＮＡとｔＤＮＡ（Lestienne とBieth （１９８３），Biochemi  ６５：４９）を含めたポリヌクレオチドがある程度エラスターゼを阻害することが判明している。例えばヘパリン及びポリアニオン多糖類のような、疎水性成分を欠いた他のポリアニオンは無効な阻害剤であることが判明しているので、これらのポリアニオンが惹起する酵素阻害は単純な静電気的相互作用によって生ずるとは思われない。ある種の肺炎球菌種の細胞抽出物（肺炎球菌，Ｓ(smooth)Ｉ型、II型及びＲ(rough）II型）は、自己消化時に、エラスターゼ阻害剤として作用する高分子量ＲＮＡを生じる（Vered 等（１９８８），Exp. Lung Res.  １４：６７）。
【００２８】
エラスターゼを阻害することができる高アフィニティリガンドの開発が例えば肺気腫（Kalpan等（１９７３），J. Lab. Clin. Med.  ８２：３４９；Powers（１９８３），Am. Rev. Respir. Dis. １２７：５５４）、のう胞性線維症、慢性関節リウマチ（Barrett 等（１９７８），Agents and Actions  ８：１）、慢性気管支炎、未熟児における気管支肺異形成、及び成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）（Weiland 等（１９８６），Am. Rev. Respir. Dis. １３３：２１８）のような疾患の治療に有用であると考えられる。
【００２９】
ｂＦＧＦのような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）はインビボにおける新血管新生又は脈管形成を誘導することができるタンパク質である。新血管新生又は脈管形成は、不充分な血液供給を知らせる外部刺激に反応して、急速に発生する新血管が既存内皮から形成されるプロセスである。脈管形成は正常な生理的条件下では一般に稀であるが、例えば乾癬、慢性関節リウマチ、血管腫、固体腫瘍成長及び転移のような、ある種の病理学的状態をしばしば付随する（Folkman とKlagsbrun （１９８７），Science  ２３５：４４２〜４４７；Kim 等（１９９３），Nature  ３６２：８４１〜８４４）。現在まで、インビボで脈管形成を誘導することができる、幾つかの成長因子が塩基性及び酸性の繊維芽細胞成長因子（αＦＧＦ、βＦＧＦ）、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、アンギオゲニン、血小板誘導内皮細胞の成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含めて、確認されている。
【００３０】
ＶＥＧＦは本来は、血管透過性を高める因子として、モルモット腹水及び腫瘍細胞培養物から精製された（Senger，D. R. 等（１９８３），Sciensce２１９：９８３〜９８５）、それ故、これは血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれている。ＶＥＧＦは熱及び酸に安定なジスルフィド結合ホモダイマーである。４種類のイソフォーム(isoform）（それぞれ、１２１、１６５、１８９及び２０６アミノ酸）が開示されており、これらはｍＲＮＡの交互スプライシングの結果であると考えられる。ＶＥＧＦの全ての分子イソフォームにおける同じＮ−末端疎水性シグナル配列の存在にも拘わらず、２種類の低分子量種のみが効果的に分泌される（Ferrara ，Ｎ等（１９９１），J. Cell. Biochem. ４７：２１１〜２１８）。大抵の細胞及び組織における主要なＶＥＧＦイソフォームは１６５アミノ酸種である。ＶＥＧＦは典型的にグリコシル化されるが、グリコシル化は効果的な分泌のみに必要であり、活性のためには必要ではない（Yeo, T. K.等（１９９１），Biochem. Biophys. Res. Commun.  １７９：１５６８〜１５７５；Peretz, D.等（１９９２），Biochem. Biophys. Res. Commun.１８２：１３４０〜１３４７）。ＶＥＧＦのアミノ酸配列は種全体にわたって一定に保持され、ＰＤＧＦのＡ型及びＢ型に対する軽度ではあるが有意な相同（１８〜２０％）を示す（Jackman, L. B.等（１９９２），J. Clin. Invest.  ８９：２４４〜２５３；Ferrara 等（１９９２），Endcrine Rev. １３：１８〜３２）。
【００３１】
他の脈管形成成長因子とは異なり、ＶＥＧＦの標的細胞特異性は血管内皮細胞に限定される。ＶＥＧＦの生物学的作用は、組織及び器官の大部分において確認されている特異的細胞−会合受容体とのその相互作用によって仲介される（Jackman, L. B.等（１９９２），J. Clin. Invest.８９：２４４〜２５３）。ＶＥＧＦの３種類の高アフィニティ受容体（ｆｉｔ１、ｋｄｒ／ｆｌｋ−１及びｆｌｔ４）が現在までにクローン化されている（Vaisman, N. 等（１９９０），J. Biol. Chem.２６５：１９４６１〜１９４６６；de Vries, C.等（１９９２），Science ２５５：９８９〜９９１；Galland, F. 等（１９９３），Oncogene８：１２３３〜１２４０）。これらの受容体はトランスメンブラン  チロシンキナーゼの系統に属し、解離定数１０−１１Ｍ〜１０−１２Ｍを有するＶＥＧＦを結合する。最近の実験は、ＶＥＧＦとその受容体との結合がヘパリン又は細胞表面−会合ヘパリン様分子によって有意に強化されることを示している（Gitay −Goren, H（１９９２），J. Biol. Chem.  ２６７：６０９３〜６０９８）。
【００３２】
血管内皮細胞の成長を促進し、血管漏出を誘導することの他に、ＶＥＧＦはタンパク質分解酵素の間質型コラゲナーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）及び組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を誘導することも知られている（Unemori E.等（１９９３），J. Biol. Chem.印刷中；Pepper, M. S. 等（１９９２），Biochem. Biophys. Res. Commun.  １８１：９０２）。これらの酵素は脈管形成関連細胞外マトリックス劣化に顕著な役割を果たすことが知られている。
【００３３】
内皮細胞の分泌した、特異的マイトジェンとして、ＶＥＧＦはインビボにおける主要な脈管形成誘導物質の１つであると考えられる。最近の幾つかの観察がこの意見を支持している。例えば、ＶＥＧＦとその受容体との発現は（i）胎芽発達（Breier, G.等（１９９２），Development  １１４：５２１〜５３２）；（ii）生殖サイクルのホルモン調節；及び（iii）腫瘍成長（Dvorak, H. F. （１９９１），J. Exp. Med.  １７４：１２７５〜１２７８；Shweiki, D. 等（１９９２），Nature  ３５９：８４３〜８４５；Plate, K. H.等（１９９２），Nature  ３５９：８４５〜８４８）に関連した脈管形成を付随する。酸素と栄養素との供給が不充分である壊死領域の発生に伴って侵襲的腫瘍成長が生ずることに注目することが適切である。組織における酸素欠乏状態（低酸素症）は周知の脈管形成刺激剤である。興味深いことには、ＶＥＧＦ発現が壊死領域に面する腫瘍細胞において最高であることが判明している（Shweiki, D. 等（１９９２），Nature  ３５９：８４３〜８４５；Plate, K. H.等（１９９２），Nature  ３５９：８４５〜８４８）。それ故、ＶＥＧＦが低酸素症−誘導脈管形成に重要な役割を果たすことが示唆されている。
【００３４】
ＶＥＧＦに対する中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）による最近の実験は、この成長因子がインビボにおける重要な腫瘍脈管形成誘導物質であることを確立するために特に有意義であった（Kim, K. J.等（１９９３），Nature  ３６２：８４１〜８４４）。ヒト横紋筋肉腫、グリア芽腫又は平滑筋肉腫を注入された免疫無防備状態（ヌード）マウスは迅速に腫瘍を発現させる。ＶＥＧＦに対する特異的中和ＭＡｂはこれらの腫瘍の成長を抑制することが判明した。腫瘍血管系の密度はＭＡｂ処理マウスでは対照に比べて減少した。他方では、同じＭＡｂがインビトロにおいて腫瘍細胞の成長速度に影響を及ぼさず、このことは成長抑制が細胞レベルにおいて仲介されず、ＶＥＧＦの１６５アミノ酸イソフォームによって仲介されると思われることを示唆する。
【００３５】
テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチン）（図４７）は喘息、気管支炎、及び気腫の治療に効果的な気管支拡張剤として広く用いられている天然生成アルカロイドである（HendelesとWeinberger（１９８３），Pharmacotherapy  ３：２）。その狭い治療指数のために、血清レベルを細心に監視して、重大な中毒を避けなければならない。テオフィリンはカフェイン（１，３，７−トリメチルキサンチン）（図４７）及びテオブロミン（３，７−ジメチルキサンチン）（両方とも血清サンプル中にしばしば存在する）に構造的に密接に関係する。それ故、分光器的特徴又は免疫学的試薬を用いる分析診断方法はこれら及びその他のアルカロイドから効果的に識別されなければならない（Jolley等（１９８１），Clin. Chem. ２７：１５７５；Broussard （１９８１），Clin. Chem. ２７：１９３１；Reinecke等（１９８６），Ann. Emergency Med. １５：１４７）。
【００３６】
ネイティブのオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによる分解に敏感である。２種類のリボヌクレアーゼが周知である。エキソヌクレアーゼと呼ばれる第１ヌクレアーゼは３’−又は５’−末端からオリゴリボヌクレオチドを逐次分解する。エキソヌクレアーゼは作用剤(attacking agent）としての水による直接加水分解を触媒することによってホスホジエステル鎖を開裂する。
【００３７】
オリゴリボヌクレオチドの分解のより一般的な形式はエンドクレアーゼによる触媒作用によって進行する。エンドクレアーゼは鎖内で３’からそれらが認識する特定塩基までをＲＮＡを開裂する。開裂機構はヌクレオチド間の結合のリンに作用するための２’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）の活性化を含む（Saenger（１９８４）：Principles of Nucleic Acid Structure, Springer Verlag,ニューヨーク，１７４頁）。この初期工程は鎖開裂を生じて、５’−生成物の２’，３’−環状ホスフェートと、３’−生成物の自由５’−ＯＨ末端とを形成する。血清中のオリゴリボヌクレオチドの主要な分解はピリミジン特異的エンドヌクレアーゼによって進行する（Pieken等（１９９０），Science ２５３：３１４）。
【００３８】
膵臓リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ  Ａ）による分解に対する２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンホモポリマーの耐性が報告されている。ポリ（２’−アミノ，２’−デオキシウリジン）とポリ（２’−アミノ，２’−デオキシシチジン）の両方はＲＮＡｓｅ  Ａ分解に対して本質的に完全に安定である。予想されたように、これらのポリマーはホスホジエステルバックボーンの水−加水分解を触媒する酵素である蛇毒ホスホジエステラーゼによって容易に分解される。ウサギ血清中におけるオリゴヌクレオチド含有２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンの安定性は非修飾オリゴリボヌクレオチドに比べて１２００倍に増大すると報告される（Pieken等（１９９０），Science  ２５３：３１４）。この方法はヌクレアーゼ耐性ハンマーヘッドリボザイムの製造に適用されている（ＰＣＴ特許出願公報第ＷＯ９２／０７０６５号）。
【００３９】
ヌクレアーゼに耐性を示すように修飾されたオリゴヌクレオチドが当該技術分野に知られている。例えば、Ikehara 等（１９８４），Eur. J. Biochem.  １３９：４４７は２’−デオキシ−２’−フルオログアノシン残基又は２’−デオキシ−２’−フルオロアデニン残基を含む混合オクタマーの合成を報告した。Ikehara 等（１９７８），Nucleic Acids Res.  ５：３３１５はポリ（２’−デオキシアデニル酸）における２’−クロロ又はブロモ置換基がヌクレアーゼ耐性を与えることを示した。Eckstein等（１９７２），Biochemistry  １１：４３３６はポリ（２’−クロロ−２’−デオキシウリジル酸）とポリ（２’−クロロ−２’−デオキシシチジル酸）とが種々なヌクレアーゼに対して耐性であることを示した。Inoue 等（１９８７），Nucleic Acids Res.  １５：６１３１は、あらゆるヌクレオチド単位に２’−ＯＣＨ３を含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成を開示した。この混合２’−ＯＣＨ３置換配列は、非置換ＲＮＡにおけると同様に強度に、それらのＲＮＡにハイブリッド化した。Shibahara 等（１９８７），Nucleic Acids Res.  １７：２３９も、あらゆるヌクレオチド単位に２’−ＯＣＨ３を含む混合オリゴヌクレオチド配列の合成を開示した。
【００４０】
エンドヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの安定性は、リボース部分の２’−ＯＨ基を例えばアミノ基又はフルオロ基のような代替え置換基と置換することによって得ることができる（Pieken等（１９９０），Science  ２５３：３１４）。２’−アミノ及び２’−フルオロ  ヌクレオシド５−トリホスフェートの両方は、結合効率が若干低下するとしても、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの基質である（Aurup 等（１９９２），Biochemistry  ３１：９６３６）。例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル又は２’−デオキシヌクレオシド５−トリホスフェートのような、他の２’−置換ヌクレオチドはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの基質として認められていない。
【００４１】
２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンヌクレオシドは以前に製造されている（Verheyden 等（１９７１），J. Org. Chem. ３６：２５０；米国特許第３，７５５，２９５号，１９７３年８月２８日発行）。しかし、非常に重要な２’−アジド，２’−デオキシウリジン先駆体の報告された合成方法は面倒であり、時間がかかり、低い収率を生じるに過ぎない。
【発明の開示】
【００４２】
本発明はＳＥＬＥＸ方法を用いる核酸リガンドの確認方法と製造方法とを含む。本発明はまた、このように確認及び製造された核酸リガンドをも含む。上記ＳＥＬＥＸ方法は所定標的に対する単一核酸リガンド又は核酸リガンドファミリーの確認を可能にする。本発明の方法は、改良された核酸リガンドを確認し、製造するために、ＳＥＬＥＸによって得られた核酸リガンド又は核酸リガンドファミリーの分析を可能にする。
【００４３】
本発明の１実施態様では、標的の生物学的活性の１つ以上を阻害することができる核酸リガンドが好ましい。このような場合に、核酸リガンドが効果的に所望の生物学的活性を阻害するかどうかを知る方法が提供される。
【００４４】
本発明はさらに、化学的修飾ヌクレオチドを含む高アフィニティ核酸リガンドの製造方法を含む。１実施態様では、修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの候補混合物によってＳＥＬＥＸを実施する。他の実施態様では、修飾ヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチドの候補混合物によってＳＥＬＥＸを実施し、選択された高アフィニティリガンドを次に修飾ヌクレオチドの組込みによって修飾する。オリゴヌクレオチド中への修飾ヌクレオチドの組込みは、核酸リガンド中へ修飾ヌクレオチドによって追加の官能基を導入する手段を提供する。本発明の方法は核酸候補混合物の化学的多様性を増強し、これらの核酸候補混合物から特異的標的へのリガンドがＳＥＬＥＸ方法によって確認される。さらに、本発明の方法は非修飾リガンドに比べてインビボ安定性の上昇した核酸リガンドを提供する。
【００４５】
本発明は１個以上の修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドを包含する。本発明の修飾ピリミジン塩基は一般式：５−Ｘ及び／又は２’−Ｙの置換を有し、修飾プリン塩基は一般式：８−Ｘ及び／又は２’−Ｙの修飾を有する。基ＸはハロゲンＩ、Ｂｒ、Ｃｌ又はアジド若しくはアミノ基を含む。基Ｙは、図１に示すように、アミノ基、フルオロ又はメトキシ基を含む。同じ機能を発揮する他の官能性置換も含まれる。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドリガンドは１個以上のＸ修飾塩基、又は１個以上のＹ修飾塩基、又はＸ修飾塩基とＹ修飾塩基との組合せを有することができる。本発明は例えば５’−トリホスフェートと、５’−ジメトキシトリチル、３’−ｂ−シアノエチル、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミジットのような、これらの置換ピリミジン及びプリンの誘導体を包含し、アデノシン及びグアノシンの場合にはイソブチリル保護塩基を含み、シトシンの場合にはアシル保護塩基を含む。さらに、本発明には本明細書に開示する、任意のヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書は５−（３−アミノアリル）ウリジントリホスフェート（５−ＡＡ−ＵＴＰ）、５−（３−アミノアリル）デオキシウリジントリホスフェート（５−ＡＡ−ＤＵＴＰ）、５−フルオレセイン−１２−ウリジントリホスフェート（５−Ｆ−１２−ＵＴＰ）、５−ジゴキシゲニン−１１−ウリジントリホスフェート（５−Ｄｉｇ−１１−ＵＴＰ）、５−ブロモウリジントリホスフェート（５−Ｂｒ−ＵＴＰ）、２’−アミノ−ウリジントリホスフェート（２’−ＮＨ２−ＵＴＰ）、２’−アミノ−シチジントリホスフェート（２’−ＮＨ２−ＣＴＰ）、２’−フルオロ−シチジントリホスフェート（２’−Ｆ−ＣＴＰ）及び２’−フルオロ−ウリジントリホスフェート（２’−Ｆ−ＵＴＰ）を含む、５及び２’−位置において修飾された特異的ヌクレオチド類似体を包含する。
【００４７】
さらに、本発明には、本発明の修飾ヌクレオチドを含むヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドリガンドが含まれる。
本発明はさらに、核酸リガンドに付加的機能を与えるために加えられた官能単位を含むブレンド核酸リガンドの形成方法を包含する。好ましい実施態様では、官能単位はブレンド核酸リガンドと標的分子との間に、付加的なアフィニティ又は、例えば阻害又は誘導のような、付加的な好ましい効果を与える。分子進化に用いるために核酸に官能基を結合させるためのこの方法は、本明細書において、ブレンドＳＥＬＥＸと呼ぶ。
【００４８】
本発明の方法は、特に選択された官能性を有する核酸リガンドを形成するための新規な手段を提供する。例えば、本発明の方法によって、標的酵素の高特異的阻害剤である高アフィニティリガンドが形成される。
【００４９】
本発明は非核酸官能単位に結合した核酸リガンドを包含する。本発明の方法によって形成されるブレンド核酸リガンドの１例では、ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）を誘導体化塩基５−（３−アミノアリル）−ウリジントリホスフェート（ＲＧＤ−ＵＴＰ）に結合させることによって、ペプチド共役ヌクレオチドを製造した。次に、オリゴヌクレオチド（ＲＧＤ−ＲＮＡ）を含むＲＧＤ−ＵＴＰを本発明の方法によって製造したが、これはＲＧＤ結合タンパク質インテグリンｇｐＩＩｂＩＩＩａに結合することが判明した。ＲＧＤ−ＲＮＡがｇｐＩＩｂＩＩＩａの高特異的阻害剤であると予想される。
【００５０】
本発明の方法によって形成されるブレンド核酸リガンドの他の例では、エラスターゼ活性を特異的に阻害する能力を有する、エラスターゼに対するブレンド核酸リガンドを形成した。阻害性ペプチドをエラスターゼに対する一本鎖ＤＮＡリガンドと、エラスターゼ活性を特異的に阻害することが判明しているブレンド核酸リガンドとに結合させた。本明細書に記載する、これらの非限定的例は本発明の方法を具体的に説明し、例示する。
【００５１】
さらに、本発明には、ＳＥＬＥＸ方法によって確認される、ＶＥＧＦに対する高アフィニティＲＮＡリガンドセットの単離及び結合特性の特徴づけが含まれる。これらのリガンドは３０連続位置においてランダム化した、約１０１４ＲＮＡ分子の初期プールから選択された。進化した(evolved）ＲＮＡリガンドは低ナノモル範囲内のアフィニティによってＶＥＧＦに結合する。
【００５２】
本明細書には、ＶＥＧＦに対する修飾ＲＮＡリガンドも含まれる。このような修飾ＲＮＡリガンドは２’−ＯＨ  ＲＮＡリガンドの確認後に、又は修飾ＲＮＡの候補混合物を用いてＳＥＬＥＸを実施することによって製造することができる。例えば、ＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２ピリミジンＲＮＡリガンドを本明細書では述べる。
【００５３】
本発明は（ａ）核酸の候補混合物をＶＥＧＦと接触させる工程と；（ｂ）ＶＥＧＦに対するアフィニティに基づいて前記候補混合物の要素を分割する工程と；（ｃ）高アフィニティ核酸を増幅して、ＶＥＧＦに結合するために比較的高いアフィニティを有する核酸配列に富化した核酸混合物を得る工程とを含む、ＶＥＧＦに対する核酸リガンド及びリガンド配列を確認する方法を包含する。
【００５４】
本明細書には、ＳＥＬＥＸ方法によって確認される、ヒト好中球エラスターゼに対する核酸リガンドも含まれる。本発明はエラスターゼに対する２’−ＮＨ２ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡリガンド、特に表４に示す２’−ＮＨ２ＲＮＡ及び表９に示す一本鎖ＤＮＡリガンドを含む。表４と７に示すリガンドと実質的に相同であり、エラスターゼと結合するための実質的に同じ能力を有する、エラスターゼに対するＲＮＡリガンド及びＤＮＡリガンドも含まれる。
【００５５】
本発明はまた、エラスターゼの生物学的活性を示す核酸リガンドをも含む。
さらに、本発明には、（ａ）一本鎖核酸の候補混合物をエラスターゼと接触させる工程と；（ｂ）高アフィニティ核酸を残りの候補混合物から分割する工程と；（ｃ）高アフィニティ核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得て、それによってエラスターゼに対する核酸リガンドを確認する工程とを含む、エラスターゼに対する核酸リガンド及びリガンド配列を確認する方法が包含される。
【００５６】
本発明はさらに、テオフィリン及びカフェインの核酸リガンドを確認し、製造する方法と、このように確認され、製造された核酸リガンドとを含む。
テオフィリンのリガンドであり、ＳＥＬＥＸ方法によって確認される核酸配列が形成される。詳しくは、テオフィリンに高いアフィニティで結合することができるＲＮＡ配列が形成される。図４８に示す核酸リガンド配列（ＴＲ８とＴＣＴ８）（配列番号：３〜１０）が、本発明に包含される。図４８に示すリガンドと実質的に相同であり、テオフィリンと結合するための実質的に同じ能力を有し、ＳＥＬＥＸ方法によって確認されるテオフィリンに対するＲＮＡリガンドも含まれる。
【００５７】
カフェインのリガンドであり、ＳＥＬＥＸ方法によって確認される核酸配列が形成される。詳しくは、カフェインに高いアフィニティで結合することができるＲＮＡ配列が形成される。図５４に示す核酸リガンド配列（ＣＲ８）（配列番号：１６〜２７）が、本発明に包含される。図５４に示すリガンドと実質的に相同であり、カフェインと結合するための実質的に同じ能力を有し、ＳＥＬＥＸ方法によって確認されるカフェインに対するＲＮＡリガンドも含まれる。
【００５８】
さらに、カウンター−ＳＥＬＥＸと呼ばれる、核酸リガンドを確認するＳＥＬＥＸ方法の拡張も本発明に含まれる。カウンター−ＳＥＬＥＸは、１種以上の非標的分子に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改良する方法である。カウンター−ＳＥＬＥＸは（ａ）候補混合物に比べて標的に対して高いアフィニティを有する核酸を候補混合物の残りから分割することができるように、候補混合物を標的分子と接触させる工程と；（ｂ）高いアフィニティを有する核酸を候補混合物の残りから分割する工程と；（ｃ）高アフィニティ核酸を１種以上の非標的分子に接触させて、１種以上の非標的分子に対して特異的アフィニティを有する核酸リガンドを除去する工程と；（ｄ）標的分子に対して特異的アフィニティを有する核酸を増幅させて、標的分子に結合するために比較的高いアフィニティと特異性とを有する核酸配列に富化した核酸混合物を得る工程とから成る。
【００５９】
本発明は、図４８に示すリガンド（ＴＣＴ８）を含めて、上記カウンター−ＳＥＬＥＸ方法によって確認される、テオフィリンに対する核酸リガンドを含む。任意の一定のリガンドに実質的に相同であり、テオフィリンと結合するための実質的に同じ能力を有する、テオフィリンに対する核酸リガンドも含まれる。
【好ましい実施態様の詳細な説明】
【００６０】
この出願は、ＳＥＬＥＸ方法と呼ばれる、核酸リガンドを確認する方法の拡張及び改良である。ＳＥＬＥＸ方法（以下ではＳＥＬＥＸと呼ぶ）は「指数関数的増加によるリガンドの系統的展開」なる名称の米国特許出願第０７／５３６，４２８号（１９９１年６月１１日出願、現在放棄）と、両方とも「核酸リガンド」なる名称の、米国特許出願第０７／７１４，１３１号（１９９１年６月１０日出願）及び米国特許出願第０７／９３１，４７３号（１９９２年８月１７日出願、現在米国特許第５，２７０，１６３号）とに初めて開示された。（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０９２９６をも参照のこと）。集約的にＳＥＬＥＸ出願と呼ばれる、これらの出願の、ＳＥＬＥＸプロセスの全ての定義と説明とを非限定的に含む、完全なテキストが特に本明細書に援用される。
【００６１】
ＳＥＬＥＸプロセスは、その最も基本的な形式において、下記一連の工程：
（１）種々な配列の核酸の候補混合物を製造する。この候補混合物は一般に固定配列の領域（すなわち、候補混合物の各要素は同じ位置に同じ配列を含む）と、ランダム化配列の領域とを含む。固定配列領域は（ａ）下記増幅工程を助成するように；（ｂ）標的に結合することが分かっている配列を模倣するように；又は（ｃ）候補混合物中の核酸の一定の構造配置の可能性を高めるように選択される。ランダム化配列は全体的にランダム化することができる（すなわち、任意の位置において塩基を発見する確率は１／４である）、又は部分的にのみランダム化することができる（例えば、任意の位置において塩基を発見する確率は０〜１００％の任意のレベルで選択される可能性がある）。
（２）標的と候補混合物の要素との間の結合に有利な条件下で、候補混合物を選択した標的と接触させる。これらの状況下で、標的と、候補混合物の核酸との相互作用が標的に対して最強のアフィニティを有する、標的と核酸との間の核酸−標的対を形成すると考えることができる。
（３）標的に対して最高のアフィニティを有する核酸を標的に対してより低いアフィニティを有する核酸から分割する。最高アフィニティ核酸に相当するごく少数の配列のみ（おそらく、核酸の１分子のみ）が候補混合物中に存在するに過ぎないので、候補混合物中の核酸の有意な量（約５〜１０％）が分割中に保持されるように、分割基準を設定することが一般に望ましい。
（４）標的に対して比較的高いアフィニティを有する、分割中に選択された核酸を次に増幅して、標的に対して比較的高いアフィニティを有する核酸を多く含有する、新しい候補混合物を形成する。
（５）上述の分割及び増幅工程を繰返すことにより、新しく形成された候補混合物に含まれる非反復配列（ｕｎｉｑｕｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は次第に少なくなっていき、標的に対する核酸混合物のアフィニティの平均値は一般に上昇する。その極限において、ＳＥＬＥＸプロセスは標的分子に対して最強のアフィニティを有するオリジナルの候補混合物からの核酸を表す一つの又は少数のユニークな核酸を含む候補混合物を与えることになる。
【００６２】
分割は、標的分子に結合したリガンドを標的分子に結合していない核酸から分離することが任意のプロセスを意味する。より大ざっぱに述べれば、分割は候補混合物中の全ての核酸を、標的分子に対するそれらの相対的アフィニティに基づいて、少なくとも２つのプールに分離することを可能にする。分割は当該技術分野において周知の、種々な方法によって達成することができる。核酸−タンパク質対はニトロセルロースフィルターに結合されるが、非結合核酸はニトロセルロースフィルターに結合されない。特異的に核酸−標的錯体を保持するカラムを分割に用いることができる。例えば、カラムに結合した標的分子と会合することができるオリゴヌクレオチドは、最高アフィニティ核酸リガンドの分離と単離とのためのカラムクロマトグラフィーの使用を可能にする。液体−液体分割も濾過ゲル遅延及び密度勾配遠心分離と同様に使用可能である。
【００６３】
ＳＥＬＥＸ特許出願はこのプロセスに関して説明し、非常に詳細に述べている。このプロセスに使用可能である標的；最初の候補混合物の製造方法；候補混合物中の核酸の分割方法；及び分割された核酸を増幅して、富化候補混合物を得る方法が包含される。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質であると、核酸結合タンパク質でない場合の両方のタンパク質標的を含めて、幾つかの標的種に対して得られたリガンド溶液をも述べる。
【００６４】
ＳＥＬＥＸは標的分子の高アフィニティリガンドを形成する。このことは核酸研究の分野において先例のない、非凡な達成である。本発明はＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェインの特異的標的に対するＳＥＬＥＸ方法の適用を含む。
【００６５】
薬剤としての使用に望ましい核酸を製造するために、核酸リガンドが、（１）標的に所望の効果を及ぼすことができるやり方で、標的に結合すること；（２）所望の効果を達成するためにできるかぎり小さいこと；（３）できるかぎり安定であること；及び（４）選択された標的に対して特異的なリガンドであることが好ましい。全てではないとしても、大抵の状況下で、核酸リガンドが標的に対して最高に可能なアフィニティを有することが好ましい。
【００６６】
同時係属出願であり、共通に譲渡された米国特許出願第０７／９６４，６２４号（１９９２年１０月２１日出願）（第’６２４号）には、ＳＥＬＥＸを実施した後に、改良された核酸リガンドを得るための方法が述べられている。「核酸リガンドの製造方法」なる名称のこの出願は本明細書に特に援用される。第’６２４号出願には、標的分子に対するリガンド効果のアッセイ；リガンドのアフィニティアッセイ；情報境界の測定；二次ＳＥＬＥＸ、ヌクレオチド置換及び化学的修飾実験による、アフィニティに対する個々のヌクレオチド寄与の定量的及び定性的評価；及び構造的測定に関する方法が包含される（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９２９６も参照のこと）。
【００６７】
本発明は基本的ＳＥＬＥＸプロセスの改良に基づく改良された核酸リガンドの製造方法を含む。本出願は本発明の下記実施態様：Ｉ．修飾ヌクレオチドを含む高アフィニティ核酸リガンド；II．ブレンドヌクレオチド−ブレンドＳＥＬＥＸを含む高アフィニティ核酸リガンド；III.血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する高アフィニティオリゴヌクレオチドリガンド；IV．ヒト好中球エラスターゼの核酸リガンド阻害剤；及びＶ．テオフィリン−カウンター−ＳＥＬＥＸとカフェイン−カウンター−ＳＥＬＥＸとを識別する高アフィニティ核酸リガンドを包含する別々の区分を含む。
【００６８】
本明細書では、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェインに対する修飾核酸リガンドと非修飾核酸リガンドとを開示し、特許請求する。本発明によって包含されるリガンドの範囲は、本明細書において確認される、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェインのあらゆるリガンドに及ぶ。本発明はまた、本明細書に開示される特異的核酸リガンドに実質的に相同であり、これらの特異的核酸リガンドと実質的に同じトロンビン結合能力を有する修飾核酸配列及び非修飾核酸配列をも含む。実質的に相同とは、７０％を越える、最も好ましくは８０％を越える一次配列相同度を意味する。実質的に同じ、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェイン結合能力とは、アフィニティが本明細書に述べる実質的相同配列のアフィニティの２桁の範囲内であることを意味する。所定の配列（特に本明細書に述べた配列と実質的に相同である）が実質的に同じ、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェイン結合能力を有するかどうかを判定することは、充分に当業者の熟練の範囲内である。
【００６９】
既に判明しているように、一次配列相同性を殆ど又は全く有さない配列がまだ、実質的に同じの標的分子結合能力を有することもある。結合が核酸リガンドの二次又は三次構造によって制御されることは明らかである。これらの理由から、本発明は本明細書に開示するリガンドと実質的に同じ構造形を有し、本明細書に開示する修飾核酸リガンド及び非修飾核酸リガンドと実質的に同じ、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェイン結合能力とを有する核酸リガンドを含む。この場合に、実質的に同じ構造は、ＶＥＧＦ、エラスターゼ、トロンビン、テオフィリン及びカフェインに対するアフィニティを生ずる、本明細書に開示するリガンドと共通の構造要素を有する全ての核酸リガンドを含む。本発明はさらに、例えば２’−フルオロ修飾のような、多様な修飾ヌクレオチドを含むリガンドを包含する。
【００７０】
［Ｉ．修飾ヌクレオチドを含む高アフィニティ核酸リガンド］
本発明は改良核酸リガンドの製造方法に関する。本発明の方法の１実施態様では、１個以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの候補混合物によってＳＥＬＥＸを実施する。修飾ヌクレオチドの存在は候補混合物の化学的多様性を高めて、特定標的分子に対する改良リガンドの確認を可能にする。本発明の方法の他の実施態様では、ＳＥＬＥＸプロセスによって選択した核酸リガンドを修飾ヌクレオチドの組込みによって修飾する。
【００７１】
本発明の方法が適用される、リガンドの重要な修飾及び誘導体化は、インビボでの治療中に劣化とクリアランスとに対する耐性を与えるものである。本発明の方法によって与えられる他の改良は、種々な組織又は細胞膜バリヤーを横切る能力の強化、又は標的分子に対するアフィニティを有意に妨害しない、他の任意の補助的性質を含むことができる。
【００７２】
ヌクレオチド類似体によるＳＥＬＥＸ実施によって得られる化学的多様性上昇は、例えば、ヌクレアーゼに対する安定性増強、レポーター基の組込み、標的に対して共役架橋することができる部分の導入、又は安定な配座異性体及び新規なオリゴヌクレオチド形の形成のためのリガンド内架橋の導入のような、リガンド特性を導入することができる。
【００７３】
ＳＥＬＥＸ候補混合物ライブラリー中への２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンの導入はそれらの５’−トリホスフェート誘導体の製造を必要とする。これはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質として認識される形である。さらに、自動化化学合成によって最終のオリゴヌクレオチドリガンド中に導入するために、類似体をホスホラミジットとしても製造しなければならない。これらの誘導体はそれらの製造方法と共に述べられている（Aurup 等（１９９２），Biochemistry３１：９６３６）。ＤＮＡ鋳型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写による２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン含有オリゴヌクレオチドの合成も、既に報告されている（同上；Pieken等（１９９０），Science ２５３：３１４）。２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンヌクレオチドは、それらの５’−ジホスフェート誘導体の重合によっても製造されている（Hobbs 等（１９７３），Biochem.  １２：５１３８）。２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン含有オリゴヌクレオチドは自動化化学合成によっても製造されている。ホスホラミジットモノマーの製造において２’−アミノ基を保護するためにトリフルオロアセチル基が用いられている（Pieken等（１９９０），上記文献）。
【００７４】
上記及びＳＥＬＥＸ特許出願に述べられるように、ＳＥＬＥＸテクノロジーは大きい化学種プールからの反復濃縮によって所定分子標的に対する特異的高アフィニティオリゴヌクレオチドリガンドを確認する。本発明の１実施態様では、増幅されたオリゴデオキシリボヌクレオチド相同体にＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写する。したがって、濃縮プロセスの各工程中に、ライブラリーがそのヌクレオシドトリホスフェート構成ブロックから再構成される。この特徴は化学的に修飾されたヌクレオシドトリホスフェートの導入を可能にし、したがって、ネイティブＲＮＡに見られない化学官能基を有するリガンドの富化を可能にする。このような修飾の例は所定ＲＮＡ配列のリボース位置及び／又はホスフェート位置における化学的置換を含む。例えば、Cook等，ＰＣＴ出願第ＷＯ９２０３５６８号；Schinazi等の米国特許第５，１１８，６７２号；Hobbs 等（１９７３），Biochem.  １２：５１３８；Guschlbauer 等（１９７７），Nucleic Acids Res.４：１９３３；Shibaharu 等（１９８７），Nucleic Acids Res.  １５：４４０３；Pieken等（１９９０），上記文献を参照のこと、これらの各参考文献は本明細書に援用される。
【００７５】
本発明によって達成される化学的多様性増強は幾つかの化合物の化学的合成を必要とする。共通の中間体から種々な所望ヌクレオチド類似体の製造を可能にする高度に拡張性の合成方法が利用可能であることが望ましい。これらの類似体は、あらゆる場合に、オリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ耐性を意味することが必要である。
【００７６】
ピリミジンの５−位置に多様な修飾基を導入することができる。このような方法は「Method for Palladium  Catalized Carbon-Carbon Coupling andProducts」なる名称の米国特許出願第０８／０７６，７３５号（ＵＳＳＮ  ０８／０７６，７３５）（１９９３年６月１４日出願）に述べられており、この出願は特に本明細書に援用される。ＵＳＳＮ  ０８／０７６，７３５に記載される方法は５−ヨード又は５−ブロモピリミジン先駆体を必要とする。ヌクレアーゼ耐性でもある塩基修飾ピリミジンを形成するために、カップリング技法に関して、２’−修飾先駆体から出発することが好ましい（ＵＳＳＮ  ０８／０７６，７３５）。
【００７７】
５−ヨード−２’−アミノ，２’−デオキシウリジンは今までに製造されている（Verheyden 等（１９７１），J. Org. Chem. ３６：２５０）。しかし、これは本明細書に開示する用途に適用されていない。５−ヨード，２’−デオキシウリジンは候補オリゴヌクレオチドのＳＥＬＥＸライブラリー中に５’−トリホスフェート誘導体として導入される。５−ヨード置換基は５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンの標準ホスホリル化に用いられる反応条件に適合しない。その代わりに、今までに開示されていない５’−トリホスフェート誘導体を２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン  ５’−トリホスフェートから５−位置の水銀化（Dale等（１９７５），Biochemistry  １４：２４４７）とその後のヨード化（Dale等（１９７５），Nucleic Acids Res.  ２：９１５）によって製造する。これらの修飾塩基は、塩基修飾ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドリガンドの製造における主要な中間体である。
【００７８】
本発明の修飾核酸リガンドは１個以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。本発明の核酸リガンドに含まれる修飾ヌクレオチド対非修飾ヌクレオチドの割合は１〜１００％の範囲であることができる。
【００７９】
修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリー候補混合物によってＳＥＬＥＸを実施する、本発明の方法の１実施態様では、オリゴヌクレオチド合成混合物に１個以上の修飾ヌクレオチドを含めることによって、オリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオチドの所望の組込み度が達成される。
【００８０】
ＳＥＬＥＸによって確認される非修飾ヌクレオチド含有核酸リガンド中に１個以上の修飾ヌクレオチドを組み込む、本発明の方法の第２実施態様では、標的分子に対する高アフィニティ核酸リガンド又はリガンドのファミリーが確認されるように、２’−ＯＨオリゴヌクレオチドの初期候補混合物によってＳＥＬＥＸを完成まで実施する。次に、修飾ヌクレオチドを含む、標的分子に対する高アフィニティリガンドが製造されるように、修飾ヌクレオチドの存在下でこれらのリガンドを転写する。本発明は特定の位置において修飾されたオリゴヌクレオチドリガンドを含む。特定の位置に修飾ヌクレオチドを含む核酸リガンドを合成によって製造することができる。
【００８１】
本発明の方法の他の実施態様では、標的分子に対する一部強化されたアフィニティに関して２’−ＯＨオリゴヌクレオチドの候補混合物が選択されるように、ＳＥＬＥＸを完成まででなく、数回の選択ラウンドで実施する。次に、修飾ヌクレオチドの存在下で転写を実施することによって、部分的に選択されたオリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドを組み込む。
【００８２】
実施例１はＳＥＬＥＸを実施するための一般的実験方法を説明する。既存のＳＥＬＥＸプロトコールに有用であるために、修飾ヌクレオチドはそれらのトリホスフェート形において１種以上のポリメラーゼの基質でなければならず、得られる修飾オリゴヌクレオチドは増幅のための鋳型でなければならない。図２に示す４種類の基本型の５修飾ウリジン：５−ＡＡ−ＵＴＰ、５−Ｆ−１２−ＵＴＰ、５−Ｄｉｇ−１１−ＵＴＰ及び５−Ｂｒ−ＵＴＰが上記必要条件を満たし、ＳＥＬＥＸに使用可能であることを、実施例２は実証する。これらの修飾ヌクレオチドを、標準転写条件下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡ中に組み込む。修飾転写体をＡＭＶ逆転写酵素によってｃＤＮＡ中に逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。
【００８３】
上述したように、２’−アミノ修飾されたピリミジンとプリンとはエンドヌクレアーゼ活性に対して強化された耐性を示す。実施例３はヒトトロンビンに対する２’−ＮＨ２リガンドのＳＥＬＥＸ選択を説明する。トロンビンに対する選択された２’−ＯＨ及び２’−ＮＨ２リガンドのアフィニティを比較する。実施例３はＲＮＡリガンドのＳＥＬＥＸ確認を説明するが、特異的標的分子に対するＤＮＡリガンドのＳＥＬＥＸ確認のために同じ操作を実施することができる。ＤＮＡ  ＳＥＬＥＸのための唯一の酵素必要条件は、修飾デオキシヌクレオシドトリホスフェートがＴａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ又は他の適当なポリメラーゼの基質として役立つことである。ジゴキシゲニン−１１−デオキシウリジントリホスフェートがＰＣＲにおけるＴＰＰの代替え基質として使用可能であることが知られている（Lanzillo（１９９０），Biotechniques ８：６２１）。
【００８４】
本発明は図６に示すトロンビンの特異的な２’−ＯＨ及び２’−ＮＨ２核酸リガンドを含む。本発明はまた、図６に示す特異的核酸リガンドに実質的に相同であり、この特異的核酸リガンドと実質的に同じトロンビン結合能力を有する、修飾及び非修飾核酸リガンドを含む。
【００８５】
既に示したように、一次配列相同性を殆ど又は全く有さない配列は、実質的に同じ標的分子結合能力をまだ有する可能性がある。核酸リガンドの二次又は三次構造によって結合が制御されることは明らかである。これらの理由から、本発明は本明細書に記載するリガンドと実質的に同じ構造形を有し、図６に示す修飾及び非修飾核酸リガンドと実質的に同じトロンビン結合能力を有する核酸リガンドを含む。この場合に、実質的に同じ構造とは、トロンビンに対するアフィニティを生じる、図７に示す共通構造要素を有する全ての核酸リガンドを含む。本発明はさらに、例えば２’−フルオロ修飾のような、多様な修飾ヌクレオチドを含むリガンドを包含する。
【００８６】
実施例４は５−ヨード，２’−アミノデオキシウリジンの新規な合成方法を説明する。図９に示す中間体５−ヨード，２’−アミノデオキシウリジンの合成は、より少ない合成工程によって先行技術方法を凌駕する大きな収量の化合物を生じる。
【００８７】
実施例５は５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン  ５’−トリホスフェートの合成を説明する。５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン  ５’−トリホスフェートはそれらの５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシピリミジンヌクレオシド先駆体から製造することができない、この理由はホスホリル化反応に用いる条件が５−ヨード基と適合しないからである。しかし、これらは２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン  ５’−トリホスフェートからＣ−５位置の水銀化と、その後のヨード化とによって製造することができる。
【００８８】
実施例６はトロンビンの２’−ＮＨ２修飾リガンドのインビボ安定性を説明する。
本発明の方法はさらに、修飾ヌクレオチドによるオリゴヌクレオチド中への官能基の組込みを含む。ＳＥＬＥＸ方法の生成物の１つは一次構造と二次構造との共通部分であり、これはこの共通部分に基づいた設計を有するオリゴヌクレオチドリガンドの化学的又は酵素的合成を可能にする。ＳＥＬＥＸの複製装置はサブユニットレベル（例えば、リボヌクレオチド）におけるむしろ限定された変化を必要とするので、このようなリガンドは標的分子の結合表面の有効原子空間を不完全に満たす。しかし、これらのリガンドは標的分子と付加的な接点を形成するように誘導体化されることができる高アフィニティ骨組みと見なされることができる。さらに、共通部分は、結合に適切である原子群デスクリプターと、適切な原子群相互作用に一致する原子群デスクリプターとを含む。本発明はさらに、修飾ヌクレオチドを介して導入される付加的官能基を含む核酸リガンドを包含する。官能基を導入する手法は実施例７で説明する。
【００８９】
［II．ブレンドヌクレオチド−ブレンドＳＥＬＥＸを含む高アフィニティ核酸リガンド］
本発明はさらに、特異的標的分子に対する高アフィニティブレンド核酸リガンドの形成方法を含む。この方法は少なくとも１個の官能基を含むブレンド核酸分子を形成する。
【００９０】
ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに結合することができる官能単位には、標的分子によって認識可能な、ペプチド、アミノ酸、脂肪族基及び脂質鎖、又は例えばペプチドモチーフのような、より大きな化合物がある。オリゴヌクレオチドのこれらの非核酸成分は特異的結合ポケットに嵌合して、適当な水素結合、塩架橋又はファン  デル  ワールス相互作用によって堅い結合を形成する。
【００９１】
本発明のある一定の実施態様では、得られるブレンド核酸リガンドがＳＥＬＥＸ形成リガンドを標的分子の特異的部位に案内することができる。ＳＥＬＥＸ後改良によって、例えば、ＲＮＡ疎水性を高め、結合、膜分割及び／又は透過性を強化する、又は診断手段としての使用に関してビオチン−若しくは蛍光タグ付きレポーターオリゴヌクレオチドのような、レポーター分子を加えるためのように、リガンドに機能性を加えるために、ＳＥＬＥＸ後に、他のブレンド核酸リガンドを製造することができる。ＳＥＬＥＸリガンドを標的分子に共有結合的に反応させ、結合させる化学基の添加によって、ブレンド核酸リガンドを形成することができる。さらに、核酸に触媒基を加えて、プロテアーゼ又はヌクレアーゼ活性によるＳＥＬＥＸリガンドの選択を助成することができる。官能単位は、ＳＥＬＥＸ形成核酸リガンドの特異性によって決定される身体の特異的位置に交付される毒素又は放射性化学物質としても役立つ。
【００９２】
ブレンド核酸リガンドは、本明細書では、少なくとも１個の核酸単位と少なくとも１個の官能単位とを含むものとして定義される。核酸リガンドはＳＥＬＥＸ特許出願に開示されるように、ＳＥＬＥＸ方法によって一般的に確認される、任意の核酸として定義される。官能単位は核酸と自然には会合しない、任意の化学種であり、本明細書に列挙するように、任意の数の官能基を有することができる。
【００９３】
本発明の好ましい１実施態様では、候補混合物の各核酸配列が少なくとも１個の官能単位を含む初期候補混合物、又は“ブレンド候補混合物”を用いて、ＳＥＬＥＸ方法を実施することによって、ブレンド核酸リガンドを製造する。これは、候補混合物の各核酸配列が（１）核酸配列の５’末端又は３’末端に結合した単一官能単位；（２）核酸配列の５’末端と３’末端の両方における官能単位；（３）個々の核酸残基に加えた官能単位；（４）全てのピリミジン若しくはプリン残基の全体若しくは一部に結合した官能単位；又は（５）所定タイプの全てのヌクレオチドの全体若しくは一部に結合した官能単位を有する候補混合物を用いて、達成することができる。官能単位は、候補混合物の各核酸配列の固定領域又はランダム化領域にのみ結合することもできる。
【００９４】
本発明の好ましい代替え実施態様では、ブレンド候補混合物を用いないＳＥＬＥＸ方法によって確認される核酸リガンドに１個以上の官能単位を結合させることができる。核酸リガンドへの１個以上の官能単位の結合点も、ブレンド核酸リガンドの究極の必要条件に依存して変化することができる。
【００９５】
下記実施例８〜１１は本発明のブレンド核酸リガンドの形成方法を説明する。これらの実施例が達成するように、新しい官能単位を含む、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは標的分子の特異的部位に対するブレンド核酸リガンドの形成に有用である。
【００９６】
特異的ペプチド結合ポケットを標的とするためのＳＥＬＥＸ核酸リガンドへのペプチド分子の結合に関して、２実施例を述べる。最初の実施例では、配列  アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）をヌクレオチドに結合させて、非選択ポリリボヌクレオチド中に酵素的に組入れる。ＲＧＤ含有ペプチドはｇｐＩＩｂＩＩＩａインテグリンタンパク質によって認識され、結合されて、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ仲介血小板凝集を生じる。例えば、フィブロネクチン、ヴェトロネクチン、コラーゲン又はラミニンの受容体のような、他のインテグリンと交差反応しないｇｐＩＩｂＩＩＩａに対して高いアフィニティを有するＳＥＬＥＸ  ＲＧＤ−核酸リガンドを形成することができる。ＲＧＤペプチドを含むＳＥＬＥＸブレンド核酸リガンドはｇｐＩＩｂＩＩＩａリガンド部位に又はその近くに結合して、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ活性を特異的に阻害することができる。第２実施例では、エラスターゼに対するＳＥＬＥＸ確認一本鎖ＤＮＡリガンドを製造して、阻害性基質のペプチドクロロメチルケトンに結合させた。得られたブレンド核酸リガンドはエラスターゼを特異的に阻害することが判明した。
【００９７】
実施例８はペプチド共役ＲＮＡの形成を説明する。ペプチド  Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）を誘導体化塩基，５−（３−アミノアリル）−ウリジントリホスフェートに結合させて、図１２に示すような、ペプチド共役ＵＴＰ（ＲＧＤ−ＵＴＰ）を製造した。ＲＧＤ−ＵＴＰをＳＥＬＥＸ  Ｔ７−触媒鋳型−依存性転写に用いて、全てのウリジン位置にＲＧＤペプチドを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを製造することができる。Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）ペプチドを選択した、この理由はマトリックスタンパク質中のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフが細胞付着受容体のインテグリンスーパーファミリーのタンパク質によって特異的に認識され、結合されるからである。インテグリンは例えばフィブロネクチン、ラミニン及びヴィトロネクチンのようなタンパク質にＲＧＤ配列含有部位において結合する。この結合は、約１０−５ＭのKdを有するインテグリンタンパク質を結合する、短いＲＧＤ含有ペプチドによって阻害される。
【００９８】
インテグリンに対するＲＧＤ含有ペプチドの特異性のために、本出願の発明者は、オリゴヌクレオチドに共役したＲＧＤ含有ペプチドがＲＧＤ結合標的分子に対する高アフィニティリガンドの選択を促進すると結論した。しかし、ブレンド候補混合物を用いる、本発明のこの実施態様によると、ペプチド共役オリゴヌクレオチドはＳＥＬＥＸ方法とも適合しなければならない、すなわち、ペプチド共役ヌクレオチドは妥当な効率で転写ＲＮＡ中に組み込まれなければならず、分割したＲＮＡは増幅と追加のＳＥＬＥＸラウンドとのために相補的ＤＮＡ中に妥当な効率で転写されなければならない。下記実施例８と９は、新たな官能基を含む核酸リガンドの上首尾なＳＥＬＥＸ確認のために必要な条件の全てが本発明の方法によって満たされることを実証する。ネイティブ又は非修飾オリゴヌクレオチドと比較して大きいサイズと変化したチャージによって及び３１０nmにおけるＵＶショルダーによって実証されるように、ペプチド−ＵＴＰ誘導体をブレンドＲＮＡオリゴヌクレオチド中に酵素的に組み入れた。
【００９９】
実施例９はＲＧＤ結合インテグリンｇｐＩＩｂＩＩＩａへのＲＧＤ−ＲＮＡの結合を説明する。分離後に、結合ＲＧＤ−ＲＮＡを通常のＳＥＬＥＸプロトコールを用いてＤＮＡ中に逆転写した。効果的な転写、分割及び逆転写は、本発明の部位指向性ブレンド核酸リガンドが基本的ＳＥＬＥＸ方法に適合することを示す。
【０１００】
本明細書に開示する方法は、例えばペプチドのような非核酸官能単位をオリゴヌクレオチド中に導入するスキームの全てを含むわけではない。しかし、このような方法は充分に、当業者の熟練の範囲内であると考えられる。実施例８において実施するように、全てのウリジンにペプチドを配置することは、ＳＥＬＥＸ方法に用いるための他の標識方法に比べて、幾つかの利点を有する。第一に、展開ＲＮＡリガンドがペプチド結合部位に密接して結合することができるように、ペプチドがランダム領域と固定領域との両方を通して導入される。第二に、多重部位へのペプチドの分配はＲＮＡのジオメトリーを限定せず、最適ペプチド位置のＳＥＬＥＸ確認を妨害しない。第三に、予備誘導体化ヌクレオチドをＳＥＬＥＸによって用いることができる。転写後の修飾は付加的な時間と専門的知識を必要とし、結合効率の付加的な変数を導入することになる。
【０１０１】
非核酸官能単位を核酸に結合させるための他の方法を用いて、結合部位の非オーバーラップスペクトルを有する展開リガンドを得ることができる。例えば、ＳＥＬＥＸ確認ＲＮＡリガンドの５’末端又は３’末端にペプチドを配置することができる。非核酸官能単位をランダムな位置及び量で導入するための本発明の他の実施態様は、非伝統的な塩基対による鋳型指向性反応の使用による。この方法はＳＥＬＥＸ確認リガンド上の非核酸基の最良の配置を選択するために分子進化を用いる。例えば、Ｘ−ｄｙ塩基対を用いることができる、この場合にＸは誘導体化可能なリボヌクレオチドであり、デオキシヌクレオチドｄｙはＸとのみ対になると考えられる。Ｘ−ＲＮＡはｄｙ−ＤＮＡ鋳型におけるｄｙの反対側の位置においてのみ非核酸官能単位を含むと考えられ；誘導体化Ｘ塩基は固定若しくはランダム領域に、又は両方の領域に配置されることができ；各位置におけるＸの量は０〜１００％の範囲で変化することができる。非展開ＳＥＬＥＸリガンドの配列スペースは、ＳＥＬＥＸプロトコールの変化を必要とせずに、この第１５塩基の置換によってＮ４からＮ５まで拡大することができる。
【０１０２】
この実施態様を光−ＳＥＬＥＸ（米国特許出願第０８／１２３，９３５号，１９９３年９月１７日出願、本明細書に特に援用される）によって用いて、光活性塩基をランダム部位に配置し、これらのブレンドリガンドを光分解後に分割し、次に、標的との架橋のために必要な、最小数の置換塩基によって高アフィニティリガンドを選択する。同じやり方で、例えばクロロメチルケトンのような、酵素活性部位において共有結合的に反応する官能単位を組み入れて、不可逆的な酵素阻害剤を製造することができる。蛍光タグ、ビオチン、放射能標識、脂質基のＳＥＬＥＸ後の組込みのために、又はヌクレアーゼ消化からの保護のための固有修飾塩基によるオリゴヌクレオチドのキャッピングにも、指向性組込みを利用することができる。非核酸官能単位を組み入れて、ブレンドＳＥＬＥＸリガンドを製造することは、高アフィニティ結合リガンドを製造するために有効な、構造と相互作用とのレパートリーを増加させる。種々なタイプの官能単位を組み入れて、あるスペクトルの分子構造を製造することができる。この構造スペクトルの一端には、通常のポリ核酸が存在し、この場合にはリガンド相互作用は核酸官能単位のみに関係する。核酸トポロジーは配列によって決定され、配列分割と増幅とは基本的ＳＥＬＥＸ工程であるので、最良のリガンドトポロジーは核酸展開によって選択される。
【０１０３】
以下の実施例１０はエラスターゼ阻害剤として作用する、エラスターゼに対するブレンド核酸リガンドの製造を説明する。Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトンはエラスターゼの効果的な不可逆的阻害剤である。しかし、クロロメチルケトン官能基の非特異的高反応性は、テトラペプチドのmM範囲のKdと共に、阻害剤分子を治療剤として不適切にする。エラスターゼに対する核酸リガンドの酵素阻害は、ブレンド核酸が基質結合ポケットを占めることによって酵素を阻害するように、このようなリガンドを基質テトラペプチドに加水分解不能なやり方で結合させることによって、改良することができる。このようなブレンド核酸では、アフィニティと特異性はＳＥＬＥＸ誘導核酸リガンドによって与えられるが、阻害はペプチドによって与えられる。
【０１０４】
スプライントブレンドＳＥＬＥＸと呼ばれる、本発明の１実施態様では、ブレンド核酸リガンドの官能単位をＳＥＬＥＸ誘導核酸リガンドに、リガンドの核酸配列領域にハイブリッド化する核酸への官能単位の結合によって核酸リガンドに結合させる。好ましい実施態様では、官能単位オリゴヌクレオチドはＤＮＡであり、核酸リガンドの固定領域、又は少なくとも、標的の結合反応に関与しない核酸リガンド領域にハイブリッド化する。
【０１０５】
この実施態様の１変形では、固定領域とランダム化領域とから成る核酸配列の候補混合物の製造によって、ＳＥＬＥＸプロセスを実施する。候補混合物は選択された官能基に結合したオリゴヌクレオチドをも含む。オリゴヌクレオチドは核酸候補混合物の固定領域に相補的であり、候補混合物のバルク(bulk)からの高アフィニティリガンドの分割のためにＳＥＬＥＸに用いられる条件下で、ハイブリッド化することができる。分割後に、オリゴー官能単位が核酸配列から解離するように条件を調節することができる。
【０１０６】
この実施態様に対する利益には、（１）候補混合物の核酸配列のランダム領域との相互作用のために利用可能である部位に、例えばペプチド類似体のような、単一官能単位を配置する；（２）官能単位が別の分子に結合するので、結合反応を１回のみ実施すればよいが、官能単位を直接核酸リガンドに結合する場合には、ＳＥＬＥＸサイクル毎に結合反応を実施しなければならない（この反応からのアリコートをＳＥＬＥＸの各サイクルに用いるために取り出すことができる）；（３）官能単位とオリゴヌクレオチドとの間の結合化学はＲＮＡ統合性又は溶解性に適合する必要がない・・・したがって、結合の作業を簡単化する；（４）官能単位が標的と共有結合錯体を形成する場合には、候補混合物の特定(selected)要素のＳＥＬＥＸ誘導核酸リガンド部分を増幅又は確認のために標的から放出することができる；及び（５）ブレンド核酸リガンドの上首尾な確認後に、核酸のテザード(tethered)部分をヘアーピンループに形成して、ブレンド核酸リガンドの２部分を共有結合させることができる。ヒト好中球エラスターゼに対するスプライントブレンド核酸リガンドの例を実施例１１に示す。
【０１０７】
［III.  血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対する高アフィニティオリゴヌクレオチドリガンド］
本発明はＳＥＬＥＸ方法と改良ＳＥＬＥＸ方法とを血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の特異的標的に適用する。下記実施例１２〜１５では、ＶＥＧＦに対する核酸リガンド溶液を単離し、確認するために用いる実験パラメータを記載する。
【０１０８】
本発明は、図２７に示す、ＶＥＧＦに対する特異的ＲＮＡリガンド（配列番号：４８〜８２）を含む。本発明によって包含されるリガンドの範囲はＳＥＬＥＸ方法によって確認されるＶＥＧＦの全てのＲＮＡリガンドに及ぶ。さらに詳しくは、本発明は図２７に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であり、実質的に同じＶＥＧＦ結合能力を有する核酸配列を有する。
【０１０９】
本発明はまた、図３４に示す、ＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡリガンドを含む。それ故、本発明の範囲はＳＥＬＥＸ方法によって確認される全ての修飾核酸リガンドと、図３４に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であり、実質的に同じＶＥＧＦ結合能力を有する全ての配列とに及ぶ。
【０１１０】
本発明は第２リガンドを確認するための開示リガンドの使用を包含する。１実施態様では、標的分子の特異的部位に結合する第１ＳＥＬＥＸ確認リガンドを用いて、同じ部位に結合する第２リガンドを溶離する。他の実施態様では、標的分子の特異的部位に結合する第１ＳＥＬＥＸ確認リガンドを用いて、同じ部位に結合しない第２リガンドを選択する。この場合に、結合部位が第１リガンドで飽和され、標的分子上の異なる箇所に結合するリガンドに関して選択が生ずるように、ＳＥＬＥＸが第１リガンドの存在下で実施される。抗イディオタイプ抗体の形成に類似する、他の実施態様では、ＶＥＧＦに対するＳＥＬＥＸ確認リガンド自体を標的分子として用いて、ＶＥＧＦ結合部位に似ている第２リガンドを確認することができる。このような第２リガンドはＶＥＧＦ−基質結合と競合して、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する。
【０１１１】
図２７と３４に示すＶＥＧＦのＲＮＡリガンドの配列相同の考察は、一次相同を殆ど又は全く有さない配列が実質的に同じＶＥＧＦ結合能力を有する可能性があることを実証する。これらの理由から、本発明は本明細書に開示するリガンドと実質的に同じ構造を有し、図２７と３４に示す核酸リガンドと実質的に同じＶＥＧＦ結合能力を有する核酸リガンドをも含む。
【０１１２】
実施例１２は、ＶＥＧＦに対する高アフィニティ核酸リガンドの形成に用いられる実験方法を説明する。実施例１３は、図２７に示す、ＶＥＧＦに対する高アフィニティＲＮＡリガンドを説明する。実施例１４は、ＶＥＧＦに対する切頭(truncated）ＲＮＡリガンドを説明する。実施例１５は、ＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２ピリミジン修飾ＲＮＡリガンドの形成に用いられる実験方法を説明する。
【０１１３】
［IV. ヒト好中球エラスターゼの核酸リガンド阻害剤］
本発明はまた、ＳＥＬＥＸ方法と改良ＳＥＬＥＸ方法とをヒト好中球エラスターゼ（エラスターゼ）の特異的標的に適用する。下記実施例１６〜２２では、エラスターゼに対する核酸リガンドの単離と確認とに用いる実験パラメータを説明する。
【０１１４】
特に、本発明は、表４に示す、エラスターゼの２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドを含む。包含されるリガンドの範囲は、ＳＥＬＥＸ方法によって確認される、修飾された及び修飾されない、エラスターゼの全てのＲＮＡリガンドと、さらに、本発明のリガンドの使用によって得られるリガンドとに及ぶ。より詳しくは、本発明は表４に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であり、実質的に同じエラスターゼ結合能力を有する核酸配列を含む。
【０１１５】
本発明はまた、実施例１６に説明する方法によって確認される、表９に示すエラスターゼの特異的ＤＮＡリガンドをも含む。包含されるリガンドの範囲は、ＳＥＬＥＸ方法によって確認される、修飾された及び修飾されない、エラスターゼの全てのＤＮＡリガンドと、さらに、本発明のリガンドの使用によって得られるリガンドとに及ぶ。より詳しくは、本発明は表９に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であり、実質的に同じエラスターゼ結合能力を有する核酸配列を含む。
【０１１６】
本発明は、第２リガンドを確認するための開示リガンドの使用をも包含する。１実施態様では、標的分子の特異的部位に結合する第１ＳＥＬＥＸ確認リガンドを用いて、同じ部位に結合する第２リガンドを溶離する。他の実施態様では、標的分子の特異的部位に結合する第１ＳＥＬＥＸ確認リガンドを用いて、同じ部位に結合しない第２リガンドを選択する。この場合に、結合部位が第１リガンドによって飽和され、標的分子上の異なる箇所に結合するリガンドに関して選択が生ずるように、ＳＥＬＥＸが第１リガンドの存在下で実施される。抗イディオタイプ抗体の形成に類似する、他の実施態様では、エラスターゼに対するＳＥＬＥＸ確認リガンド自体を標的分子として用いて、エラスターゼ結合部位に似ている第２リガンドを確認することができる。このような第２リガンドはエラスターゼ−基質結合と競合して、エラスターゼの生物学的活性を阻害する。
【０１１７】
表４に示すエラスターゼのＲＮＡリガンドと表９に示すＤＮＡリガンドとの配列相同の考察は、一次相同を殆ど又は全く有さない配列が実質的に同じエラスターゼ結合能力を有する可能性があることを実証する。これらの理由から、本発明は本明細書に開示するリガンドと実質的に同じ三次元構造を有し、表４と９に示す核酸リガンドと実質的に同じエラスターゼ結合能力を有する核酸リガンドをも含む。
【０１１８】
本発明はエラスターゼ活性を阻害する２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡリガンドを確認し、説明する（実施例１８）。これらの阻害性リガンドの幾つかを３’−固定配列の除去によって切頭し、この切頭リガンドのエラスターゼ阻害能力を試験した（実施例１９）。一次配列相同に基づいて、エラスターゼのリガンドを幾つかのクラスにグループ分けした。この結果は、クラスＩとIIリガンドに関しては、３’−切頭リガンドは全長リガンドと同じエラスターゼ阻害能力を有することを実証する。しかし、クラスIII とIVリガンドに関しては、３’−固定配列切頭リガンドはそれらのエラスターゼ阻害能力を失った。
【０１１９】
エラスターゼへのリガンドのアフィニティに対する小さい一価カチオン（例えばＫ＋及びＬｉ＋）の存在を試験した（実施例２０）。この結果は、Ｋ＋がＬｉ＋よりも高いアフィニティの二次構造の形成に有利であることを示唆する。
【０１２０】
結合に対するpHの影響．  リガンド結合に対するpHの総合影響は、タンパク質とリガンドとの両方によって寄与される要素の相互作用に関係する。エラスターゼによって寄与される要素を単離するために、エラスターゼに対する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガンドの結合を試験した、この場合に結合に対するpHの影響は主としてエラスターゼに対するpHの影響に由来すると考えられた（実施例２１）。ｓｓＤＮＡリガンドは低いpHにおいてより良好に結合し、結合のKdは２pH単位にわたって約２倍に上昇した。これに反して、エラスターゼに対する２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドの結合はpHによって深く影響された。この結合のKdはpHが６．５から６．２５までに低下したときに１０倍より大きく上昇した。エラスターゼに対する２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡリガンドの最適結合は、pH７．０においてＳＥＬＥＸを実施する場合である。
【０１２１】
２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡリガンドの結合がpH依存性であるという観察は、如何にしたらリガンドを最も良く利用することができるかをもたらす。例えば、異なるpHを有する２種類のバッファーを用いることによって、それぞれが異なるpHにおいて結合する、所定標的に対する２種類のリガンドを開発することが可能である。同様に、特定pHを有する１細胞区画における所定標的分子に対しては高アフィニティ結合し、異なるpHを有する他の細胞区画における同じタンパク質には結合しないように、リガンドを調整することができる。同様に、ある一定の細胞種類中では、例えば正常細胞よりも低い内部pHを有することが分かっている腫瘍細胞中では、特異的に活性であるリガンドを２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡによって発見することができる。
【０１２２】
核酸模倣物．  本明細書で確認される数種類のエラスターゼリガンドは“Ｇ−クァルテット”型構造を有するように思われる。隣接グアニンの反復ランを多く含有する配列は構造転位を受けて、４グアニン残基のフーグスティーン型（Hoogstein)水素結合によって結合した平面的クァルテットを形成する。Ｘ線繊維回析データに基づいて、Ｇ−クァルテットがポリｒＧに関して説明されている（Zimmerman 等（１９７５），J. Mol. Biol. ９２：１８１〜１９２）。１９８０年代後半に、この構造は幾つかの塩基によって中断されたグアニンの短いランを含むＤＮＡ配列において確認されており、このようなＤＮＡ配列は免疫グロブリンスイッチ領域において（Sen, D. とGilbert, W. （１９８８），Nature  ３３４：３６４〜３６６）及びテロマーにおいて（Williamson等（１９８９），Cell  ５９：８７１〜８８０）発見されている。Ｇ−クァルテット構造は一本ＤＮＡ鎖内で（分子内Ｇ−クァルテット）、又は二本鎖間で（Sundquist 等（１９８９），Nature  ３４２：８２５〜８２９；Kang等（１９９２），Nature  ３５６：１２６〜１３１）又は四本鎖間で（分子間Ｇ−クァルテット）（Sen （１９８８），上記文献）生ずる可能性がある。ホモポリマー、ポリｒＧ上でのＧ−クァルテット構造についての最初の報告後に、この構造への大きな注目がＤＮＡに集中してきた。しかし、最近の報告（Sundquist 等（１９９３），Proc. Natl.Acad. Sci.  ＵＳＡ  ９０：３３９３〜３３９７；Awang （１９９３），Biochem.  ３２：１１４５３〜１１４５７）では、例えばＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡのようなヘテロＲＮＡ分子においてＧ−クァルテット構造が確認されている。Ｇ−クァルテット構造を有する核酸リガンドは、核酸模倣分子を開発するための魅力的な候補である。分子内テトラプレックスにおける可能な基本的改良としての、合成リンカーによる結合ループヌクレオチドの置換を実施例２２において試験した。このような分子では、図４４に示すように、合成テザーが、Ｇ−クァルテットの形状をとるための折り畳み（folding)を可能にする。
【０１２３】
［Ｖ．テオフィリンとカフェインとを識別する高アフィニティ核酸リガンド−カウンター−ＳＥＬＥＸ］
本発明はＳＥＬＥＸ方法とカウンター−ＳＥＬＥＸ方法とをカフェイン及びテオフィリンの特異的標的に適用する。実施例２３〜２９は、テオフィリン及びカフェインに対する核酸リガンドの単離と確認とに用いる実験パラメータを説明する。
【０１２４】
特に、本発明は、図４８Ａと４８Ｂに示す、テオフィリンの核酸リガンドと、図５４に示すカフェインの特異的核酸リガンドとを含む。包含されるリガンドの範囲は、ＳＥＬＥＸ方法及びカウンター−ＳＥＬＥＸ方法によって確認される、修飾された及び修飾されない、テオフィリン及びカフェインの全てのリガンドとに及ぶ。より詳しくは、本発明は図４８と５４に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であり、実質的に同じテオフィリン及びカフェイン結合能力を有する核酸配列を含む。
【０１２５】
図４８と５４に示すテオフィリン及びカフェインのリガンドの配列相同についての考察は、一次相同性を殆ど又は全く有さない配列が実質的に同じテオフィリン及びカフェイン結合能力を有する可能性があることを実証する。これらの理由から、本発明は本明細書に開示するリガンドと実質的に同じ三次元構造を有し、図４８と５４に示す核酸リガンドと実質的に同じテオフィリン及びカフェイン結合能力を有する核酸配列を含む。
【０１２６】
特に、本発明の範囲には、ＲＮＡリガンドのリボースの２’−ＮＨ２及び／又は２’−Ｆ修飾を含むテオフィリン及びカフェインのＲＮＡリガンドが含まれる。
本明細書に開示する、テオフィリン及びカフェインに対する核酸リガンド及び核酸リガンド溶液は診断用試薬として有用である。さらに、本明細書に開示する、テオフィリン及びカフェインに対する核酸リガンドは治療目的のために有利に使用可能である。
【０１２７】
本発明は、ある点では、モノクローナル抗体よりも優れた、テオフィリン及びカフェインに対する結合及び識別特性を有するオリゴヌクレオチドを形成するためにＳＥＬＥＸを如何に適用できるかを示す。以下に示すように、テオフィリンに対するＳＥＬＥＸ選択核酸リガンドはモノクローナル抗体に匹敵する、テオフィリンに対するアフィニティを優れた選択性で有する。
【０１２８】
本発明は、本明細書において“カウンター−ＳＥＬＥＸ”と呼ぶ、ＳＥＬＥＸ方法の新規な改良方法を含む。カウンター−ＳＥＬＥＸ方法はＳＥＬＥＸ実験から好ましくない配列を除去する有力な手段である。この方法の重要性は、この方法がＳＥＬＥＸプールの特異性を高める手段を提供することである。また、この方法は高アフィニティ及び高選択性の核酸リガンドを確認するために必要なＳＥＬＥＸ選択ラウンドの回数を減ずる方法を提供する。さらに、この方法は、密接に関連した分子を含めた、他の分子と交差反応しない、標的分子の核酸リガンドを確認する方法を提供する。
【０１２９】
一般に、カウンター−ＳＥＬＥＸ方法は（ａ）核酸の候補混合物を製造する工程（候補混合物は１種類以上の修飾ヌクレオチドと共に核酸を含むことができる）と；（ｂ）候補混合物に比べて、標的に対して大きいアフィニティを有する核酸リガンドが標的分子に結合して、候補混合物の残部から分割されるように、候補混合物を標的分子と接触させる工程（標的分子はカラムに結合することができるが、必ずしも結合する必要はない）と；（ｃ）大きいアフィニティの核酸を候補混合物の残部から分割する工程と；（ｄ）非標的分子に対してアフィニティを有する標的分子結合核酸が除去されるように、大きいアフィニティの核酸を１種以上の非標的分子と接触させる工程と；（ｅ）標的分子に対して特異的アフィニティを有する核酸を増幅して、標的分子に対して比較的高いアフィニティと特異性とを有する配列を多く含有する核酸混合物を得る工程とから成る。
【０１３０】
カウンター−ＳＥＬＥＸ方法の１実施態様では、カラムに結合したオリゴヌクレオチドによってカウンター−ＳＥＬＥＸを実施する。この実施態様を用いて、標的分子に結合する、好ましくない交差反応性を有するオリゴヌクレオチドを除去する。簡単に述べると、標的分子をカラムに結合させ、標的分子に結合したオリゴヌクレオチドがカラム中に保持されるように、オリゴヌクレオチドの候補混合物をカラムに供給した。次に、カラムを結合バッファーによって洗浄して、非結合オリゴヌクレオチドを除去する。次に、交差反応性が好ましくない、１種以上の非標的分子又はカウンターリガンドを溶液として大きなモル過剰でカラムに供給する。モル過剰はカラムに結合した量の１０３〜１０４倍と定義される。これは、カウンターリガンドをも結合するカラムからの結合オリゴヌクレオチドの除去を生じる。次に、標的分子を溶液として大きなモル過剰でカラムに供給して、好ましいリガンド結合特異性を有するオリゴヌクレオチドを除去する。カウンター−ＳＥＬＥＸを単一種類のカウンター−リガンド分子によって実施して、その後に２種類以上のカウンター−リガンド分子に暴露させる又は数種類の関連カウンター−リガンドのカクテルによって、数種類の化合物に交差反応性を有するオリゴヌクレオチドを除去する。さらに、１回以上のＳＥＬＥＸ選択ラウンドによって標的分子に対するアフィニティに関してオリゴヌクレオチドを予備選択した後に、カウンター−ＳＥＬＥＸを実施することができる。
【０１３１】
カウンター−ＳＥＬＥＸ方法の第２実施態様では、カウンター−ＳＥＬＥＸを溶液中で実施する。このアプローチを溶液中の好ましくない交差反応性を有するオリゴヌクレオチドを除去するように設計される。カウンター−ＳＥＬＥＸのこの実施態様では、カラム上の標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が、結合バッファー中に存在するカウンター−リガンドによって実施される。オリゴヌクレオチドがカラムにひと度結合したならば、カラムを激しく洗浄する。この方法はカウンター−リガンドに対して交差反応性を有するオリゴヌクレオチドがカラムに結合することを防止する。カウンター−ＳＥＬＥＸ方法のこの実施態様は、他のペプチドに関連した配列を有するペプチドへの結合のためにＳＥＬＥＸ実験に用いることができる。この実施態様は、ＳＥＬＥＸ選択オリゴヌクレオチドのインビボにおける他の標的分子との交差反応性によって起こりうる副作用を回避するように意図される。例えば、腸血管(vasointestinal)ペプチド（ＶＩＰ）のようなペプチドホルモンに対する核酸リガンドを確認するために、ＳＥＬＥＸを実施することができる。ＶＩＰのアミノ酸配列は、インビボにおいて幾つかの重要な役割を果たすペプチドホルモングルカゴンの配列に類似する。カウンター−ＳＥＬＥＸの第２実施態様によると、溶液中でグルカゴンと交差反応せず、それ故、インビボにおいてもグルカゴンと交差反応しない、ＶＩＰに対する核酸リガンドが確認される。カウンター−ＳＥＬＥＸのこの実施態様を溶液中の１種以上のカウンター−リガンド分子によって実施して、インビボにおける２種以上の標的分子に交差反応性を有する核酸リガンドを除去することができる。さらに、１回以上のＳＥＬＥＸ選択ラウンド後に、カウンター−ＳＥＬＥＸを実施することができる。
【０１３２】
標的分子結合核酸種の富化を促進するためのカウンター−ＳＥＬＥＸ方法の利用は、ＳＥＬＥＸとカウンター−ＳＥＬＥＸとの同じ回数の選択ラウンド後にプールされたＲＮＡの結合特性を比較することによって、説明される。３回のＳＥＬＥＸ選択ラウンド後に、固定化テオフィリンに最初に結合したＲＮＡの１２％がその後のカフェインによる溶離に耐性であった（ＴＲ８）。カフェインによる３回のカウンター−ＳＥＬＥＸ選択ラウンド後に、最初に結合したＲＮＡの４５％がカフェイン溶離に耐性であった（ＴＣＴ８）。
【０１３３】
第８回選択ラウンドのＳＥＬＥＸ  ＲＮＡ（ＴＲ８）（実施例２３）とカウンター−ＳＥＬＥＸ（ＴＣＴ８）（実施例２４）とのプールに由来する二本鎖ｃＤＮＡ群(population)に対してＤＮＡ配列分析を実施した。この分析は、両方のプールが配列において決定的に非ランダムである（データ示さず）。ｃＤＮＡをプラスミド中に挿入し、細菌クローンを形成した。細菌クローンから単離したプラスミドＤＮＡから、ＲＮＡリガンドをコードする適切な領域をＰＣＲによって増幅して、それらの配列を決定した。１１個のＴＣＴ８クローンと８個のＴＲ８クローンとの配列を図４８ＡとＢに示す（配列番号：２４６〜２５８）。テオフィリンに結合するように選択されたリガンドは、１４位置において完全に保存され、それぞれＴＣＴ８及びＴＲ８クローンとして存在する、注目すべき１５塩基配列を示す。この配列は別々の２モチーフから成る：モチーフ１は５’−ＡＵＡＣＣＡ−３’（配列番号：２４４）であり、モチーフ２は５’−ＣＣＵＵＧＧ（Ｃ／Ａ）ＡＧ−３’（配列番号：２４５）である。配列と、モチーフ１と２の間の間隔はリガンド間で可変であり、８〜２０残基の範囲である。
【０１３４】
異なるリガンドにおけるモチーフ間に配置されたコンフォーメーションの検査は、これらのＲＮＡの可能な二次構造についての重要な情報を与える。ＴＣＴ８リガンド及びＴＲ８リガンドの全てを図５０に示す、同様な一般的な二次構造コンフォーメーションに折り込む(fold)ことが可能である。これらのコンフォーメーションは可変領域と、二次構造に関係すると仮定される、フランキング(flanking)固定領域の限定領域とを示す。これらのコンフォーメーションの幾つかの特徴が注目に価する。詳しくは、各リガンドは“ｖｓｔｅｍ１”及び“ｖｓｔｅｍ２”と呼ばれる、可変な長さと配列ループの２個のステムと、“ｖｌｏｏｐ”と呼ばれる、可変な長さと配列のループとを含む。これらの構造特徴はモデル内で保存モチーフにフランクする。モチーフ１と２は、モチーフ２のＣＣＡトリプレットとモチーフ１のＵＧＧトリプレットとの相互作用を通して塩基対合される。全ての場合に、モチーフ１のＣＣＵトリプレットは非対称バルジとして描写される。このモデルは、モチーフ１の（Ｃ／Ａ）ＡＧに対立するモチーフ２のＡＵＡから成る非対称バルジとして、保存領域の残りの６ヌクレオチドを含む。このバルジは可変な長さと配列のステムによって閉ざされる。ＣＣＵ成分と（Ｃ／Ａ）ＡＧ成分との相対的空間配向は、ＣＣＵ成分が３’配置（例えば、ＴＣＴ８−５、ＴＣＴ８−７、ＴＣＴ８−８、ＴＣＴ８−１、ＴＣＴ８−６（配列番号：２４７、２５０、２５２、２４８））、又は５’配置（例えば、ＴＣＴ８−１１、ＴＣＴ８−３（配列番号：２５４〜２５５））のいずれであるとしても、保護されるので、これらの配向はこのリガンドファミリーにおいて明確に特異的である。この非対称バルジのクロージャー(closure）がしばしば、５’領域（例えば、ＴＣＴ８−５（配列番号：２４７））又は３’領域（例えば、ＴＣＴ８−７（配列番号：２５０））のいずれかからの固定配列の関与を含むことは注目に価する。各クローンにおける１５ヌクレオチドの保存は、例えばｖｌｏｏｐ及びｖｓｔｅｍ１と２のような可変配列の残りの構造成分はテオフィリンの結合に直接関係しないことを示唆する。ｖｌｏｏｐとｖｓｔｅｍとは、保存塩基から成る結合面又はポケットの配置に構造的役割を果たすと考えられる。図５０にコンセンサス二次モデルを示す。
【０１３５】
本発明は、核酸が治療的に重要な小型分子と特異的に相互作用することができることを示し、さらに診断用試薬としてのこれらのオリゴヌクレオチドの可能な使用を実証する。現在、血清テオフィリンレベルを測定するために、モノクローナル抗体が一般に用いられている（Poncelet等（１９９０），J. Immunoassay１１：７７）。テオフィリンに対するＲＮＡリガンドのアフィニティは臨床アッセイに用いられる抗体の同アフィニティに匹敵する（Poncelet等（１９９０），上記文献）。これらの抗体は関連化合物を識別するそれらの能力において異なるが、これらの抗体は典型的に例えばカフェイン及びテオブロミンのような化合物との０．１〜１％交差反応性を示す。本明細書に述べるＲＮＡリガンドの識別力はこのような抗体よりも少なくとも１桁大きい。これらの結果は、オリゴヌクレオチドが予想外の認識性と特異性とを示すことができるという事実の確認を容易にする。
【０１３６】
本明細書に述べる研究の他に、ＲＮＡの構造的多用性(structuralversatility)はＲＮＡが他の小型分子と相互作用するその能力によって実証される。これらには、Ｉ型イントロンとグアノシンとの相互作用（BaseとCech（１９８４），Nature  ３０８：８２０）及びＩ型イントロンとアルギニンとの相互作用（Yarus （１９８８），Science  ２４０：１７５１）、ＨＩＶ  ＴＡＲ  ＲＮＡによるアルギニンの結合（Tao とFrankel （１９９２），Proc. Natl. Acad. Sci.  ＵＳＡ  ８９：２７２３）、及び一組の非特性化ＲＮＡとアミノ結合トリプトファンアガロースとの結合（Famulok とSzostak （１９９２），J. Amer.Chem. Soc.  １１４：３９９０）が含まれる。本明細書に述べる研究に特に関係するのは、アルギニン（Yarus （１９８８），上記文献）及びトリプトファン（Famulok とSzostak （１９９２），上記文献）のＲＮＡによる立体選択的認識の観察である。これらのリガンドの結合ポケットの詳細な構造は、熱心な研究の対象であった。ＳＥＬＥＸ方法の重要な特徴は、それらの類似性が重要な高次構造クルーを表す配列ファミリーがこの方法によって得られることである。これらのクルーはモデル化と、化学的及び物理的方法による構造分析とのための出発点を与える。さらに、本明細書に述べるカウンター−ＳＥＬＥＸ方法を用いて、特異的リガンドが得られる速度を促進し、さらに重要なことには、オリゴヌクレオチド群から、問題の標的に構造的に密接に関連した標的に対してアフィニティを有する種を選択的に除去することができる。ＳＥＬＥＸの可能な適用が、サイズ及び化学的クラスに関係なく、バイオメディカル的に重要な実際に如何なる分子をも含むことを実証する。
【０１３７】
実施例２３は、平衡濾過分析と、ＳＥＬＥＸの８選択ラウンド後のテオフィリンリガンドファミリーの選択とを含めた、本発明に用いられる一般的実験手順を説明する。実施例２４は、ＳＥＬＥＸの５選択ラウンド及びカフェインによるカウンター−ＳＥＬＥＸの３選択ラウンド後に選択された、テオフィリンリガンドファミリーＴＣＴ８の選択を説明する。実施例２５はＳＥＬＥＸの８選択ラウンド後のカフェインリガンドファミリーＣＲ８の確認を説明する。実施例２６は典型的なテオフィリンＲＮＡリガンド（ＴＣＴ８−４（配列番号：２４９））の結合特性を説明する。これらの結果は、幾つかのモノクローナル抗体に関して観察された結果と同様に、ＴＣＴ８−４が０．５８μＭのKdによってテオフィリンによって結合することを示す。ＴＣＴ８−４の保存モチーフ（ｍＴＣＴ８−４）を含む切頭リガンドを構成した、これは全長リガンドよりも約５．８倍大きい、０．１１μＭのKdによってテオフィリンを結合することが判明した。実施例２７はテオフィリンに対するＲＮＡリガンドに関して、キサンチン誘導体によって実施した競合結合研究を説明する。これらの研究は総合的結合に対する種々な成分の相対的寄与を調べることを可能にする。実施例２８はテオフィリンに対する高アフィニティリガンドの分子モデル化の態様を説明する。
【０１３８】
下記実施例によって、本発明を説明し、例示する。
【実施例１】
【０１３９】
［実験手順］ 
ＳＥＬＥＸ．  これらの研究所からの前記報告書〔例えば、Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：５０５；Tuerk 等（１９９２ａ），Proc. Natl. Acad. Sci.  ＵＡＳ  ８９：６９８８；Tuerk 等（１９９２ｂ），PolymeraseChain Reaction（Ferre, F., Mullis, K., Gibbs, R.  及びRoss, A.  編集）Birkhauser, ニューヨーク）参照〕中の記載と同様に、ＳＥＬＥＸプロトコールの本質的な特徴は米国特許第５，２７０，１６３号公報中に詳細な記載がある。簡単に言えば、インビトロにおける転写用ＤＮＡ鋳型（定常配列領域によってフランクされた３０のランダム領域を含む）及び対応ＰＣＲプライマーを化学的に合成した（Ｏｐｅｒｏｎ）。このランダム領域はオリゴヌクレオチド合成中にその４個のヌクレオチドの等モル混合物を利用することにより生じさせた。この二つの定常領域はＰＣＲプライマーアニーリング部位、ｃＤＮＡ合成用プライマーアニーリング部位、Ｔ7 ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域、及びベクター中へのクローニングを可能とする制限酵素部位を含むように設計された。
【０１４０】
ニトロセルロースフイルター結合検定
タンパクに結合したオリゴヌクレオチドは、ニトロセルロース膜フィルター〔Yarus とBerg（１９７０），Anal. Biochem.  ３５：４５０；LowaryとUhlenbeck （１９８７），Nucleic Acids Res.  １５：１０４８５；Tuerk とGold（１９９０），上記文献〕を通じての濾過により未結合の種から効率的に分離することができる。複数のニトロセルロースフイルター（Milipore, 孔度０．４５μｍ、タイプＨＡ）をフイルターマニホールド上に固定し、バッファー４〜１０mlで洗浄した。０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むバッファー（ＰＢＳ）中での３７℃におけるタンパク質の連続希釈液と共にの、３２Ｐ標識ＲＮＡのインキュベーション（５〜１０分間）後に、この溶液類を緩和減圧下、４５μｌアリコート量で上記フイルターに供給し、さらにＰＢＳ  ５mlで洗浄した。次いで、これらのフイルターを赤外ランプで乾燥させ、シンチレーション計数管でカウントした。
【０１４１】
クローニング及び配列決定．  富化プールの個々のメンバーをｐＵＣ１８ベクター中にクローニングし、文献〔Schneider 等（１９９２），J. Mol. Biol.（印刷中）；Tuerk とGold（１９９０），上記文献〕に記載のように配列決定した。
【実施例２】
【０１４２】
［修飾ＲＮＡ］
ＲＮＡ中への５−修飾ウリジンの組込み．  ４種の原型５−修飾ウリジン類、５−ＡＡ−ＵＴＰ、５−Ｆ−１２−ＵＴＰ、５−Ｄｉｇ−１１−ＵＴＰ、及び５−Ｂｒ−ＵＴＰ（図２中に示す）を標準転写条件下で上記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ中に組み入れた（４０mM  Tris−Ｃｌ、pH８．０、１２mMＭｇＣｌ２、５mM  ＤＴＴ、１mM  スペルミジン、０．００２％  Triton  Ｘ−１００、４％  ＰＥＧ、３７℃）。ＵＴＰ、５−ＡＡ−ＵＴＰ、及び５−Ｂｒ−ＵＴＰによって実施した転写生成物を示している、１５％変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを図３に示す。この転写効率は、２mMリボヌクレオチドトリホスフェート、１００nM  二本鎖ＤＮＡ鋳型、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）５単位／μｌを用いた３時間のインキュベーション後に得られた３２Ｐ−放射能標識転写物の全量から概算した。５−ＡＡ−ＵＴＰ、５−Ｆ−１２−ＵＴＰ、５−Ｄｉｇ−１１−ＵＴＰ、及び５−Ｂｒ−ＵＴＰは、ＵＴＰとの比較で、それぞれ２８％、５１％、２３％及び５０％の効率で組み込まれた。ＵＴＰを転写混合物から除外した場合には、転写が検出されなかった。
【０１４３】
５−ＡＡ−ＵＴＰ、５−Ｆ−１２−ＵＴＰ、５−Ｄｉｇ−１１−ＵＴＰ、又は５−Ｂｒ−ＵＴＰを含む修飾転写物は、ＡＭＶ逆転写酵素により、未修飾ＲＮＡの場合に匹敵する効率で、ｃＤＮＡ中に逆転写された（５０mM  Tris、pH  ８．３、６０mM  ＮａＣｌ、６mM  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１０mM  ＤＴＴ、３７℃）（データは示さず）。次いで、これらのｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＵＴＰ、５−ＡＡ−ＵＴＰ、及び５−Ｂｒ−ＵＴＰ転写から誘導されたＰＣＲ生成物の配列決定によると、三つの全ての場合（図４）で同じ生成物が得られた。これらの結果は、修飾ヌクレオチドがＲＮＡ  ＳＥＬＥＸ手順中に直接組み込まれるうることを示している。
【実施例３】
【０１４４】
［トロンビンに対する２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンド］
２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡ．  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＡＴＰ、ＧＴＰ、２’−ＮＨ２−ＵＴＰ、及び２’−ＮＨ２−ＣＴＰを含む反応において、ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡから転写した。
【０１４５】
トロンビンに関する２’−ＯＨ及び２’−ＮＨ２ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸ．トロンビンを用いたＳＥＬＥＸ実験を、殆ど同一条件下で、２’−ＯＨ  ＲＮＡ及び２’−ＮＨ２ＲＮＡによって実施した。両方の実験では、３０Ｎ３鋳型／プライマーセットを使用した。２’−ＯＨ  ＲＮＡを用いたＳＥＬＥＸは１Ｘ結合バッファー（５０mM  Tris−Ｃｌ、pH７．７、１００mM  ＮａＣｌ、１mMＭｇＣｌ２、及び１mM  ＤＴＴ）中で実施した。２’−ＮＨ２ＲＮＡを用いたＳＥＬＥＸは、ＤＴＴなしの１Ｘ結合バッファー中で実施した。上記２’−ＯＨＲＮＡ実験には、ＲＮＡとタンパク質のほぼ等モル濃度を用いた。２’−ＮＨ２バルクＲＮＡはトロンビンに対して一層高い初期アフィニティーを有しているので（ｋＤ２’−ＯＨ  ≧１．０×１０−６；ｋＤ２’−ＮＨ２’≦１．０×１０−６）、この場合のＳＥＬＥＸ実験に用いたタンパク質濃度は上記より高かった。両実験共に、ＲＮＡの同濃度（２．５×１０−７）で開始し、ＲＮＡとタンパク質の等モル又はタンパク過剰で行った。
【０１４６】
配列決定．  各実験〔図６（配列番号：１−３９）〕において、配列の二つの支配的クラス（２’−ＯＨ）又はグループ（２’−ＮＨ２）が得られた。この２’−ＯＨ  ＲＮＡの場合は、Ｉ型は２２／２６クローンを含み、II型は６／２８クローンを含んでいた。２’−ＮＨ２ＲＮＡの場合は、Ｉグループは１５／４７クローンを、IIグループは３０／４５クローンを、III グループは２／４７クローンを含んでいた。各クラス共に３０Ｎ領域以内では著しい相同を示した。
【０１４７】
二次構造分析．  図７に見られるトロンビンに対する高アフィニティ２’−ＯＨ及び２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドの二次構造を予見した。クローン１７（配列番号：３６）は上記IIグループの２’−ＮＨ２リガンドのＡサブグループの代表である。クローン１６（配列番号：７）は上記２’−ＯＨリガンドのＩクラスリガンドの代表であり、クローン２７（配列番号：１８）は上記２’−ＯＨリガンドのIIクラスリガンドの代表である。
【０１４８】
結合性分析．  全ての結合性分析はニトロセルロースフイルター結合により行った。タンパク質濃度より低い固定ＲＮＡ濃度の存在下、タンパク質濃度を増加させることにより測定される結合曲線を上記２’−ＯＨリガンドの場合は図８Ａに示し、上記バルク２’−ＮＨ２リガンドの場合を図８Ｂに示した。これらの条件下、上記ＲＮＡ１６及び２７の場合のkDは、それぞれ３０nM及び６０nMを示す。配列決定された上記バルク２’−ＮＨ２ラウンド１５リガンドの場合のkDは約２００nMである。
【実施例４】
【０１４９】
［５−ヨード，２’−アミノデオキシウリジンの合成］
報告された５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジン〔Verheyden等（１９７１），J. Org. Chem. ３６：２５０〕の合成例には５段階が包含され、所望化合物の総収率は３％であった。本明細書に記載する方法は５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジンをウリジンからの４段階で総収率４６％で調製する方法である。５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジンの合成を図９に示す。以下に示す方法では、ウリジンを標準法により最初に脱水して、２，２’−アンヒドロウリジン（収率９２％）にする。Ｉｄ．次いでこの中間体を下記実施例７〔２’−アジド−２’デオキシウリジン（ＡＤＵ）の合成〕に準拠して、２’−アジド，２’−デオキシウリジンに転化（収率８４％）する。Robins等（１９８２），Can. J. Chem. ６０：５５４の方法を適用して、ＡＤＵを５’−及び３’−ＯＨ基の保護なしにＣ−５位置でヨウ素化（収率７６％）する。この５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジンをトリフェニルホスフィンで還元すると、所望化合物が７８％の収率で得られた。
【０１５０】
２，２’−無水ウリジンの合成  ヘキサメチレンホスホルアミド（ＨＭＰＡ）（４００ml）中のウリジン（２００ｇ、８１９mmol）の懸濁液に、炭酸水素ナトリウム（５．３ｇ、６３．１mmol、０．０７７当量（ｅｑ．））及びジフェニルカーボネート（２２８．１ｇ、１０６４．７mmol、１．３ｅｑ．）を添加した。この混合物を１１時間、１３５℃に加熱した。室温に冷却後、ジエチルエーテル（２リットル）を加え、沈殿を濾過した。固形物をエーテル（３×１リットル）で３回洗浄した。濾液中に水（１リットル）を加え、水性層を分離し、メチレンクロリド（３×１リットル）で３回抽出した。この水性相を蒸発乾固させた。併合固形物を熱メタノールから再結晶したところ、２，２’−無水ウリジン１７０ｇ（収率９２％）が得られた。この生成物のスペクトル特性は文献値〔HamptonとNichol（１９６６），Biochemistry  ５：２０７６］と一致した。
【０１５１】
２’−アジド，２’−デオキシウリジンの合成  この２’−アジド、２’−デオキシウリジン（ＡＤＵ）の合成法はMoffat等（１９７１），J. Org. Chem.３６：２５０に記載されている。この手順によれば、無水ウリジンをリチウムアジド（７．１ｅｑ．）と共にＨＭＰＡ中、１５０℃で処理する。幾つかの副生成物を分離した後、所望生成物が収率僅か５０％で得られる。クロマトグラフィープロセスによりさらに精製することなく、使用できるＡＤＵの高収率の合成法の出現が望まれる。発癌性が知られているＨＭＰＡを使用しない方法であることも望まれる。
【０１５２】
１００−１１０℃におけるＤＭＦ中のＮ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）の存在下で、リチウムアジドを現場で発生させる方法が開発された。無水ウリジンを１０５−１１０℃においてＤＭＦ中で、このリチウムアジド：ＴＭＥＤＡ複合体（１．５ｅｑ．）と２４〜４８時間反応させると、単独生成物としてのＡＤＵが高収率で形成される。上記方法は既知方法を凌駕する実質的な改良を示す。
【０１５３】
フッ化リチウム（０．９３ｇ、３６mmol）を１０５℃に加熱したＤＭＦ（２０ml）中に懸濁した。この撹拌懸濁液中にＴＭＥＤＡ（２０ml）を、次いでアジドトリメチルシラン（４．１５ｇ、３６mmol）を添加した。３０分間撹拌した後に、無水ウリジン（４．５２ｇ、２０mol)を加え、４８時間反応を進行させた。溶媒を減圧下で除去し、次いで残渣をメタノールから３回、同時蒸発させた。この残渣をメタノール（１０ml）中に溶解し、次いで酢酸エチル（４０ml）を加え、この塩及び残留出発物質の殆どを沈殿させた。濾過した溶液をフラッシュシリカゲル（１７０ｇ）上に供給し、２０％メタノール／酢酸エチルで溶離した。生成物が乳白色固体（３．３８ｇ、６３％）として得られた。
【０１５４】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ）ｄ３．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９，１２．２Ｈｚ，Ｈ５Ａ’），３．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，１．２．Ｈｚ，Ｈ５Ｂ’），３．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９，４．４Ｈｚ，Ｈ４’），４．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４，Ｈ２’），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，５．４Ｈｚ，Ｈ３’），５．１８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，−ＯＨ），５．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｈ１’），５．９６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，−ＯＨ），７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），１１．４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＮＨ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ）ｄ６０．２０，６４．５７，７０．４２，８５．２１，８５．５５，１０２．０３，１３９．９８，１５０．４０，１６２．９６．
【０１５５】
５−ヨード，２’−アジド，２’−デオキシウリジンの合成．  メタノール（２０ml）中の２’−アジド，２’−デオキシウリジン（２．５ｇ、９．３mmol）の溶液に、ＩＣｌ（３．３ｇ、２０．５mmol、２．２ｅｑ．）を添加する。この混合物を３０分間、５０℃に加熱する。室温に冷却後、等量のエーテルを加え、白色沈殿を濾過する。この沈殿をメタノール性アンモニウム（２０ml）中で室温において１５分間撹拌し、次いで蒸発乾固させ、５−ヨード，２’−アジド，２’−デオキシウリジン（２．８１ｇ、収率７６％）を得る。
【０１５６】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ８．５８（ｓ，１Ｈ，Ｈ６），５．８８（ｄ，１Ｈ，Ｈ１’，ＪＨ１’，Ｈ２’＝３．５Ｈｚ），４．４６（ｔ，１Ｈ，Ｈ３’，Ｊ＝５．８Ｈｚ），４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２’，ＪＨ１’，Ｈ２’＝３．９Ｈｚ，ＪＨ２’，Ｈ３’＝５．３Ｈｚ），４．０１（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ５’ＡＪｇｅｍ＝１２．３Ｈｚ，ＪＨ５’，Ｈ４’＝２．４Ｈｚ），３．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ５’Ｂ，Ｊｇｅｍ＝１２．３Ｈｚ，ＪＨ５’，Ｈ４’＝２．４Ｈｚ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ１６３．０３，１５２．１７，１４６．５０，８８．８８，８６．１８，７１．２１，６７／６７，６１．００，４８．１５．ＦＡＢ  質量スペクトル，（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ３９６．
【０１５７】
５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジンの合成．  ジオキサン（３３ml）中の５−ヨード，２’−アジド，２’−デオキシウリジン（２．４８ｇ、６．３mmol）の溶液に、トリフェニルホスフィン（５．８ｇ、２２mmol、３．５ｅｑ．）を添加し、この混合物を室温において１時間、撹拌すると、この間に白色沈殿が形成する。この沈殿を回収し、ジエチルエーテル（３×５０ml）で３回洗浄する。濾液を蒸発乾固させて、最少量のジオキサン中に溶解し、−２０℃において４８時間貯蔵する。この沈殿を回収し、ジエチルエーテルで洗浄する。一緒にした沈殿は５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  １．８１ｇ（収率７８％）を生じた。このスペクトル特性は文献値（Verheyden 等（１９７１），上記文献）と一致した。
【実施例５】
【０１５８】
［５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシピリミジン  ５’−トリホスフェートの合成］
２’−アミノ−，２’−デオキシピリミジン  ５’−トリホスフェートの合成は今までに詳細には報告されていない。この２’−アミノ，２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェートは２’−アジド，２’−デオキシウリジンの５’−ホスホリル化とその後の還元反応（Aurup 等（１９９２），Biochemistry３１：９６３６）を経て調製した。この経路では３’−ＯＨ基の保護が必要であり、これは５’−ＯＨ基の断続的(intermittent)保護によってのみ選択的に達成することができる。本明細書に述べる調製法は、２’−アミノ，２’−デオキシウリジンから僅か２段階で上記化合物が得られる方法である。この手法はホスホリル化反応中に上記３’−ＯＨ基をブロックする保護基を上記２’−ＯＨ基が保有する限りは３’−ＯＨ基の保護は必要ではないという前提に基づいている。本明細書に述べる２’−アミノ，２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェートの合成を図１０に示す。
【０１５９】
２’−アミノ，２’−デオキシウリジンの２’−アミノ基をトリフルオロアセチル化する（Imazawa 等（１９７９），J. Org. Chem. ４４：２０３９）（収率８２％）。この中間体を５’−位置でホスホリル化する（LudwigとEckstein（１９８９），J. Org. Chem. ５４：６３１）（収率６１％）。２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’−トリホスフェートの５−ヨード誘導体は水銀化反応（Dale等（１９７５），Biochemistry  １４：２４４７）により一段階で調製した。２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’−トリホスフェート及び５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’−トリホスフェートの両方はＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対する基質であることが判明した。後者化合物に関しては、このことは今までに全く開示されていない。
【０１６０】
２’−トリフルオロアセチルアミノ，２’−デオキシウリジン．  メタノール（１５０ml）中の２’−アミノ，２’−デオキシウリジン（２．０ｇ、８．２２mmol）の懸濁液に、Ｓ−エチルトリフルオロチオアセテート（１．６ml、１２．４８mmol、１．５ｅｑ．）を添加した。この混合物を室温において一昼夜撹拌した。反応混合物を通じて２時間、窒素をバブルさせて揮発性チオ副生成物を除去した。この混合物を蒸発乾固させ、固体をメタノール／クロロホルムから再結晶させて、２’−トリフルオロアセチルアミノ，２’−デオキシウリジン  ２．３ｇ（８２％）を得た。この分析データは文献値（Imazawa （１９７９），上記文献）と一致した。
【０１６１】
２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’−トリホスフェート．  ２’−（Ｎ−トリフルオロアセチル）アミノ，２’−デオキシウリジン（２３０mg、０．６８mmol）を減圧下で３時間、乾燥させ、無水ジオキサン（２ml）及び無水ピリジン（０．６８ml）中に溶解した。この溶液に、無水ジオキサン中の２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ジオキサホスホリノン（１５２mg、１Ｍになるように溶解）の新たに調製した溶液を添加した。この反応を室温において１０分間撹拌した後、無水ＤＭＦ中のビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートの溶液（２．０４ml、１．０２mmol、１．５ｅｑ．）及びトリブチルアミン（１６２μｌ、０．６８mmol）を添加した。室温における１５分間後に、ヨウ素溶液（２７９mg、１％溶液、ピリジン／水９８：２ｖ／ｖ）を添加した。この混合物を室温においてさらに１５分間撹拌し、過剰のヨウ素をＮａＨＳＯ４水溶液（５％溶液）によって消滅させた。この混合物を蒸発乾固させ、残渣を水（１０ml）中に溶解した。濃アンモニア（１０ml）を添加した後、この混合物を室温において１時間放置した。生成物をＤＥＡＥ  Sephadex  Ａ２５（Phamacia）クロマトグラフィー（０〜１Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネートバッファー）により精製した。過剰のバッファー塩を除去するために、この生成物をメタノールから繰り返して濃縮して、テトラキス（トリエチルアンモニウム）−２’−アミノ，２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート  ３６４mg（６２％）を得た。
【０１６２】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）δ７．２１（ｄ，１Ｈ，Ｈ６，ＪＨ６，Ｈ５＝８．１Ｈｚ），５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｈ１’，ＪＨ１’，Ｈ２’＝７．９Ｈｚ），５．０５（ｄ，１Ｈ，Ｈ５，ＪＨ６，Ｈ５＝８．１Ｈｚ），３．８２（ｄｄ，Ｈ３’，ＪＨ３’，Ｈ２’＝５．３Ｈｚ，ＪＨ３’，Ｈ４’＝１．６Ｈｚ，３．４９（ｍ，１Ｈ，ＨＡ），３．４２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．３８（ｍ，１Ｈ，Ｈ５’Ｂ），３．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ２’，ＪＨ１’，Ｈ２’＝７．９Ｈｚ，ＪＨ２’，Ｈ３’＝５．３Ｈｚ），２．５２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ），２．３８（ｑ，２４Ｈ，−ＣＨ２），０．５２（ｔ，３６Ｈ，−ＣＨ３）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１．５ＭＨｚ，メタノール−ｄ４，Ｈ３ＰＯ４外部標準として）δ−８．２４（ｄ，Ｐα，Ｊpγpβ＝２１Ｈｚ），−１１．２７（ｄ，Ｐα，Ｊpα，pβ＝２１Ｈｚ），−２２．４３（ｔ，Ｐβ，Ｊ＝２１Ｈｚ）．
【０１６３】
５’−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’トリホスフェート．  酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、２ml、pH６．０）中のテトラキス（トリエチルアンモニウム）−２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’−トリホスフェート（３５．２mg、０．０２mmol、０．０２Ｍ）の溶液に、酢酸第二水銀の溶液（６３．７４mg、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム中、０．０１Ｍ）を添加した。この混合物を５０℃において３時間加熱した。この混合物を室温に冷却した後に、エタノール中のヨウ素溶液（エタノール  ８０μｌ中、Ｉ２２５．３８mg）を添加した。この混合物を暗所、室温において１時間撹拌した。生成物をＤＥＡＥSephadex−Ａ２５（Pharmacia)クロマトグラフィー（０〜１Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネートバッファー）で精製した。過剰のバッファー塩を除去するために、この生成物をメタノールから繰り返し濃縮して、テトラキス（トリエチルアンモニウム）−５−ヨード，２’−アミノ，２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート  ６mg（３０％）を得た。ＵＶ：λmax ２７３nm。
【実施例６】
【０１６４】
［２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡ（トロンビンのリガンド）のインビボ安定性］
ピリミジン上の２’−ＮＨ２基で修飾したトロンビンリガンド（３８−mer ）（ＰＫ−５）の血漿動力学を評価するために研究を行った。
【０１６５】
血漿動力学曲線はラット（５匹）を用いて得た。５匹の雄Sprague −Dawleyラットの各々に１μＣi の３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドを静脈注射した。１５及び３０分後に並びに１、２、４、７及び２４時間後に血液サンプルをＥＤＴＡ含有チユーブ中に採取した。血漿を細胞から分離し、フェノール沈殿させた。この血漿サンプル１０μＬの放射能をセンチレーション計数管により定量した。各実験動物の場合に得られた血漿動力学曲線を図１１に示す。
【０１６６】
この血漿動力学曲線の形状は、身体水全般に急速に分配されて、少なくとも６時間はインビボで安定に留まる、類似長さの２’−ＯＣＨ３安定化オリゴヌクレオチドによって観察されるものと類似していた。ウサギに静脈投与された非安定化ホスホジエステル２０−mer オリゴデオキシヌクレオチドに関しては、４分間の分配相半減期が報告された(Goodchild等（１９９１），Antisense Res. andDev.１：１５３）。オリゴリボヌクレオチドの血漿半減期についてのインビボのデータは開示されていない。しかし、これらが血清ヌクレアーゼの存在下ではオリゴデオキシヌクレオチドの場合よりも不安定であることをインビトロのデータが示している(Crooke （１９９２），Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.３２：３２９）。
【実施例７】
【０１６７】
［官能基の導入］
５−ＡＡ−ＵＴＰ及び５−ＡＡ−ｄＵＴＰは第１級アミン官能価を含み、これは、Muhlegger 等（１９８９），Nucleosides ＆ necleotides  ８：１１６１が示すように、カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド結合により各種の他の官能基が容易に導入できるので有用である（図５）。疎水性又は総電荷のような、修飾オリゴヌクレオチドの包括的な物理化学的特性は適当な”側鎖”の導入により調節することができる。その上、所定の標的分子上の充分に定義された部位に結合することが知られている分子をこれに関連して用いて、この標的分子上の特異的領域への核酸リガンドの結合を固定することができる。このオリゴヌクレオチドのフレームワークが追加の結合エネルギーを提供するように発展するので、このような部分自体はこれら標的分子に対して適度なアフィニティを必要とするにすぎない。この手法の一例を図５に示す。
【実施例８】
【０１６８】
［ペプチド共役ＵＴＰの合成］
試薬．  ５−（３−アミノアリル）−ウリジン５’−トリホスフェートのナトリウム塩はSigma Chem. Co. （ミズリー州，セントルイス）から入手した。Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）はＧＩＢＣＯＬ−ＢＲＬ（メリーランド州，ガイサースブルグ）から入手した。１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）はPierceChemical Co.（イリノイ州，ロックホード）から入手した。他の化学薬品はAldrich Chemical Company（ウィスコンシン州，ミルウォーキー）から入手可能な、高品質のもであった。
【０１６９】
ＡＡ−ＵＴＰのスクシニル化．  ペプチドＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）を、このペプチドのＮ−末端α−アミノ基から２段階反応を経てＵＴＰに結合させた。このα−アミノ基はこのペプチド中で唯一の反応性アミンであり、インテグリン結合のためには必要とされない。ペプチドカルボニル基との縮合はアスパラギン酸残基をブロックするように機能しうるので、インテグリン結合を妨げる。
【０１７０】
５−（３−アミノアリル）ＵＴＰ（５mg）を０．２Ｍホウ酸ナトリウム（pH８．５）２５０μｌ中に溶解した。この溶液を無水コハク酸（９７mg／１．１４mlＤＭＦ）７５０μｌと混合し、４℃において２時間反応させた。０．１Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネート（pH７．６）の等容量を添加し、濾過し、さらにＭｏｎｏ  Ｑ  ５×５  アニオン交換ＦＰＬＣ(Pharmacia) 上で精製した。このサンプルを０．１Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネート中で供給し、１．０Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネートまでの直線勾配で溶離した。このカラムを２０分間にわたって１．０ml／分で溶離した。主要ピークをプールし、冷凍し、乾燥ＤＭＦ中に溶解して、次の反応に備えた。このサンプルをＰＥＩ−Ｆクロマトグラフィープレート（J. T. Baker)上にスポットして、ＴＬＣにより分析し、０．２Ｍリン酸ナトリウム（pH３．５）を用いて展開した。
【０１７１】
スクシニル−ＵＴＰのクロマトグラフィー単離．  上記スクシニル化反応混合物を０．１Ｍトリエチルアンモニウム−バイカーボネート（pH７．６）（バッファーＡ）で１：１に希釈し、濾過し、同一バッファーで平衡させた０．５cm×５cm  Ｍｏｎｏ  Ｑ  アニオン交換カラムに供給した。このカラムを１．０Ｍトリエチルアンモニウム−バイカーボネート（バッファーＢ）までの勾配を用いて流速０．５ml／ml（１分／フラクション）（図１３）で溶離した。スクシニル−ＵＴＰはイオン交換により容易に出発物質から分離した。スクシニル−ＵＴＰは、ＵＴＰと同様に、Ｍｏｎｏ  Ｑから溶離するが、一方ＡＡ−ＵＰＴはこの５’−トリホスフェートを部分的に中和し、この塩勾配において早期に溶離するので、この分離が達成できる。この勾配において上記Ｍｏｎｏ  Ｑカラムから遅れて（バッファーＢ  ９２％）溶離するスクシニル−ＵＴＰは、反応物及び上記ＡＡ−ＵＴＰ（バッファーＢ  約６８％で溶離する）から良好に分離した。他の幾つかのピークも存在したが、ＵＶ吸収性物質の大部分がこの主要ピーク中に溶離した。次の工程への準備として揮発性バッファーを除去するために、フラクション４３−４９からプールしたスクシニル−ＵＴＰを凍結乾燥した。この段階の収率は８０〜９５％であった。この乾燥サンプルを乾燥ＤＭＦ中に溶解し、そのＵＶスペクトルを測定した。このピークは２９０nmにおいて予想最大値を示した。
【０１７２】
５’−（３−スクシニル−アミノアリル）ウリジン  ５’−トリホスフェートへのＧＲＧＤＴＰペプチドの結合．  水溶性カルボジイミドを用いて上記ＲＧＤペプチドをスクシニル−ＵＴＰと縮合させた。ＤＭＦ（５８μｌ）中のスクシニル−ＵＴＰを４℃に冷却した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１１７μｌ（２４mg／１．４ml  ＤＭＦ）を加え、この混合物を４℃で３０分間反応させた。ＥＤＣ  １７５μｌ（０．１Ｍ、pH４．８）を添加し、この混合物を４℃において２時間反応させた。活性化ヌクレオチドを凍結乾燥ＧＲＧＤＴＰ  １４mg中に添加し、この混合物を４℃において２時間反応させた。この反応混合物を０．１Ｍトリエチルアンモニウムバイカーボネートで１：１に希釈し、Ｍｏｎｏ  Ｑカラム上で上記のように精製し、ＴＬＣ及びＦＡＢ(Fast Atom Bomberdment）質量スペクトロメトリー(University of Colorado Structural Division)により分析した。
【０１７３】
ＲＧＤ−ＵＴＰのクロマトグラフィー単離  ＲＧＤ−ＵＴＰをイオン交換クロマトグラフイーにより精製した。このペプチド結合反応混合物をバッファーＡで希釈し、濾過し、上記Ｍｏｎｏ  Ｑカラム上で精製した。ＲＧＤ−ＵＴＰは、ＡＡ−ＵＴＰと同様に、但しスクシニル−ＵＴＰに先立って、このＭｏｎｏ  Ｑカラムから溶離し、このことはアルギニン側鎖もホスフェート電荷と相互反応することを示唆した。主要ピークは、残留スクシニル−ＵＴＰ（バッファーＢ  約９０％において溶離した）のピークに先立って、バッファーＢ  約７０％において溶離した（図１４）。早期に溶離したＥＤＣ以外には、痕跡量の他のピークが検出されただけであった。フラクション３５−３８をプールし、凍結乾燥した。このサンプルを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及びＦＡＢ質量スペクトロスコピーのために、乾燥ＤＭＦ中に溶解した。このサンプルは２９０nmにおいて最大吸着を示した。
【０１７４】
ＡＡ−ＵＴＰ、スクシニル−ＵＴＰ及びＲＧＤ−ＵＴＰの薄層クロマトグラフィー．  図１５に示すように、ＲＧＤ−ＵＴＰはＡＡ−ＵＴＰ及びスクシニル−ＵＴＰの両方から明瞭に分離される。ＡＡ−ＵＴＰ、スクシニル−ＵＴＰ、及びＲＧＤ−ＵＴＰをセルロースＰＥＩ−Ｆ  ＴＬＣプレート（J. T. Baker, Inc.)上にスポットし、次いで０．７５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，pH３．５で展開した。ＡＡ−ＵＴＰは溶剤フロント近くに移動し、スクシニル−ＵＴＰはＲｆ０．４２で移動し、ＲＧＤ−ＵＴＰは原点(origin)に留まった。このＴＬＣ系は生成物形成を監視するために理想的な方法である。
【０１７５】
質量スペクトロメトリー分析．  ＦＡＢ質量スペクトロスコピーで分析したＲＧＤ−ＵＴＰは、計算式重量（ＦＷ）１２２２に極めて近接した質量１２２３を生じた。この質量スペクトロスコピー結果の精度は、ＲＧＤが予期したように結合し、別個の又は追加の誘導体の導入を引き起こす副反応が起こらなかったことを示している。なお、トリホスフェートの分解又は脱ホスホリル化を示す小ピークは存在しなかった。
【実施例９】
【０１７６】
［ｇｐIIｂIII ａへのＲＧＤ−ＲＮＡの結合］
分子生物学的方法．  アガロース電気泳動、Ｔ７ＲＮＡ転写、及びＡＭＶ逆転写を、一般的にはＳＥＬＥＸ特許出願に記載のように行った。ＲＮＡオリゴヌクレオチドのＦＰＬＣ精製は５×５  Ｍｏｎｏ  Ｑアニオン交換カラムを用いて実施した。このＲＮＡ転写反応混合物をフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、洗浄し、かつ５０mMリン酸ナトリウム、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、６Ｍ  尿素、５０％ホルムアミド(Fisher 、Ultrapore 、ＵＶ低吸光度）（pH６．０）中に溶解した。サンプル供給後に、このカラムを１Ｍ  ＮａＣｌまでの直線勾配を用いて展開した。このＲＮＡピークを２：１ｖ／ｖエタノールの添加により沈殿させ、このペレットを８０％エタノールで洗浄し、speed −vac 中で乾燥し、次いでＳＥＬＥＸ結合バッファー（１５０mM  ＮａＣｌ、１０nM  ＨＥＰＥＳ、２mM  ＣａＣｌ２、１mM  ＭｇＣｌ２、０．１％Tween 、pH７．４）中に溶解した。ＲＮＡ及びＲＮＡ−ｇｐIIｂIII ａ(Enzyme Research）複合体を３７℃における１０分間のインキュベーションによって調製して、予め平衡させ、上記結合バッファー中でランする１６×１００ Superdex ２００カラム(Pharmacia)上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。上記Superdexカラムから回収したサンプルからの濃縮とデタージエント除去とは、Resource  Ｑカラム(Pharmacia) 上への吸着及び１Ｍ  ＮａＣｌによる溶離によって実施した。
【０１７７】
ＲＧＤ−ＵＴＰ転写及び精製．  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ反応にＲＧＤ−ＵＴＰを通常のＵＴＰの代わりに使用して、ＵＴＰを使用した場合に得られる収率の少なくとも５０％の収率を得た。ＲＧＤ−ＵＴＰ及び他のＮＴＰの濃度は１mMであった；このＤＮＡ鋳型は３０塩基対ランダム配列の側面に位置する５’及び３’固定領域を含むものであった。このＲＮＡ転写物を６Ｍ尿素及び５０％ホルムアミドを含むホスフェートバッファー中でアニオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）上に吸着させて精製し、１Ｍ  ＮａＣｌ（図１６）までの勾配を用いて溶離した。ＲＧＤ−ＲＮＡは、誘導体化ＲＮＡのチャージの変更及び恐らくはコンホメーションの変更と一致して、通常のＵＴＰを用いて形成した同等ＲＮＡ転写物の溶離位置に僅かに先立つた勾配位置において、１つの主要ピークとしてカラムから溶離した。切頭ＲＮＡ物質の量は通常のＲＮＡ転写に較べて、ごく僅かに増加した。
【０１７８】
ＲＧＤ−３０ｎ７  ＲＮＡのｇｐIIｂIII ａへの結合．  未結合ＲＧＤ−ＲＮＡからｇｐIIｂIII ａインテグリンに結合したＲＧＤ−ＲＮＡを分離するのに用いたサイズに基づく分割法は、ｇｐIIｂIII ａ（Kd＜１０−８）に対する高アフィニティーＲＮＡリガンドを確認するためのひとつの方法である。ＲＧＤ−ＲＮＡを０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２mM  ＣａＣｌ２、１mM  ＭｇＣｌ２、２０mM  ＨＥＰＥＳ、０．１％  Tween ２０、pH７．４中で、ｇｐIIｂIII ａ（２mg／ml）と共にインキュベートした。この結果は、ｇｐIIｂIII ａと共にインキュベートしたＲＧＤ−ＲＮＡが、ｇｐIIｂIII ａと共にインキュベートしなかったサンプルで得られる場合よりも、高分子量のＲＮＡピークを生じることを示した。ＵＴＰによって製造し、同様に分割した通常のＲＮＡは高分子量ピークを示さなかった、このことはＲＧＤペプチドに結合していないＲＮＡのｇｐIIｂIII ａへの結合が、ブレンド分子の結合よりも弱かったことを実証する。この推定分子質量は各ウリジン位置（図１７）におけるＲＧＤペプチドの付加とは矛盾しない。より結論的に述べると、クロマトグラフィー精製したＲＧＤ−ＲＮＡは、通常のＲＮＡに比べて、ＡＡ−ＵＴＰの組込みの結果として３１０nmにおける吸光度シヨルダーを示した。早期溶離物質の小ピークがカラム空隙(void volume) 中に検出されたが、このものはタンパク質なしにクロマトグラフィー処理したＲＧＤ−ＲＮＡサンプル中には存在しなかった。吸着及びアニオン交換カラムからの溶離によって、この高分子量ＲＧＤ−ＲＮＡ−ｇｐIIｂIII ａピークを濃縮し、デタージエント除去した。このＲＮＡを逆転写して、ＰＣＲ増幅した。得られたＤＮＡはアガロース電気泳動に際して期待サイズの単一バンドを生成し、例えＳＥＬＥＸ分割中に抽出されるＲＮＡの量が少なくても、許容しうる効率でＲＮＡが逆転写されたことを示している。
【実施例１０】
【０１７９】
［エラスターゼ阻害剤としての基質結合ＳＥＬＥＸ由来のブレンドリガンド］
阻害剤ペプチドに結合した高アフィニティ、高特異性核酸リガンドがエラスターゼに対する高アフィニティ阻害剤を生成するためのひとつの実用的方法であることを実証するために、エラスターゼに対するｓｓＤＮＡを阻害性基質ペプチドクロロメチルケトンに結合させて、非加水分解性連鎖を形成させることによりクロロメチル官能価を不活性化させた。ＴＡＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＧＴＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡ（配列番号：４２）配列を有するｓｓＤＮＡリガンド１７（ＤＮＡ１７）は、エラスターゼに対するKd  １５nMを有する。ＤＮＡ−１７の何れの末端がエラスターゼの活性部位に極めて接近しているのかは不明であったので、上記基質ペプチドがこのＤＮＡの３’及び５’の両端に付着するようにブレンド核酸分子を調製した。
【０１８０】
ペプチド共役．  付着の化学を図１８に示す。４個の１８−原子エチレングリコール部分（スペーサーのホスホルアミダイト(Clonetech) を用いて合成）と、３’末端のチオール基とを有するオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成法により合成し、標準法により脱保護し、次いでゲル精製した。この３’−ＳＨ基を脱保護した直後に、このオリゴヌクレオチドをSephdex −Ｇ５０スピンカラム（事前に０．５Ｍトリエチルアンモニウムアセテートバッファー（pH７．５）中で平衡させた）に通過させて過剰のＤＴＴを除き、次いでＮ−メトキシスクシニルＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトン（２５mg／２００μｌ  ＤＭＦ）と混合した。この混合物を３７℃において一晩インキュベートした。１Ｍ  ＤＴＴ２０μｌを添加して、未反応クロロメチルケトン阻害剤を不活性化した。最後に、ペプチド共役ＤＮＡを３回連続のSephadex−Ｇ５０スピンカラムによるか、又は逆相ＨＰＬＣのいずれかにより未結合ペプチドから最終的に精製した。
【０１８１】
エラスターゼ阻害検定．  このエラスターゼ阻害検定は色原体テトラペプチド基質の使用に基づいている。この検定は１０nM  エラスターゼ、０．５mM  Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリド（配列番号：４３）、１５０mM  ＮａＣｌ、２６mM  ＫＣｌ、２mM  ＭｇＣｌ２、０．０２％ＨＳＡ、０．０５％ＤＭＳＯ、０．０１％Triton  Ｘ−１００、及び１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含むバッファー中で、２５℃において実施した。この検定は、エラスターゼ誘導ｐ−ニトロアニリド放出の発生を時間の関数としてスペクトロスコピー（ＯＤ  ４０５nm）によって測定した。阻害剤が存在しない場合のｐ−ニトロアニリド発生の速度を対照として用いた。不可逆的阻害剤Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトンの存在下で陽性対照を確立した。
【０１８２】
最終ブレンド核酸リガンド調製において痕跡量の未反応Ｎ−メトキシスクシニルＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトンが存在すると、酵素は阻害されることになる。しかし、この可能性は、この阻害剤がＤＴＴにより不活化されることにより排除される。Ｎ−メトキシスクシニルＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトンのＤＴＴによる不活化を図１９に示す。１．９５Ｍ  Ｎ−メトキシスクシニルＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトンを５０mM  ＤＴＴと共にインキュベーションすると、この阻害が消滅した。不活化阻害剤によって見られる部分的阻害は高ペプチド濃度に基づく競合阻害による可能性がある。
【０１８３】
２０mM  ＤＴＴの存在下でのブレンド核酸リガンドの阻害を図２０に示す。エラスターゼの５’末端ブレンド核酸リガンド及び３’末端ブレンド核酸リガンドによる上記阻害を図２１に示す。Ｎ−メトキシスクシニルＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：４４）又はブレンド核酸リガンドによるエラスターゼ阻害のLineweaver−Burkのプロットを図２２に示す。この基質に関して得られるＫｍ  ０．１６mMという結果は文献値と一致する。上記ブレンド核酸リガンドのＫｉは、上記阻害剤ペプチド単独の９２０μＭに対して３０μＭであり、すなわち３０，０００倍の改善に相当する。
【０１８４】
ウロキナーゼ及びトロンビンから成る２種の他のヒトのセリンプロテアーゼの３’−末端ブレンド核酸ＤＮＡ−１７による阻害も試験し、その結果を図２３に示す。濃度７０nmではこの３’末端ブレンド核酸は５０％より大きいエラスターゼ阻害率を有するが、６５０nmの濃度においてさえも、ウロキナーゼもトロンビンも検知できる程度には阻害されなかった。これらの結果は、エラスターゼに対する上記ブレンド核酸リガンドの特異性を実証する。
【実施例１１】
【０１８５】
［スプリントブレンドＳＥＬＥＸ］
標準ＳＥＬＥＸ候補混合物、及び図２４に示すような核酸配列の候補混合物の固定領域の一部にハイブリッド形成する核酸配列に付着したバリルホスホネートを含有する単一化合物を調製することによって、スプリントブレンドＳＥＬＥＸプロセスを実施した。図２４は上記バリルホスホネートとヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）との間に起こる化学反応をも示す。
【０１８６】
このバリルホスホネートはＮＨＳエステルを経由して活性化した。この化合物を、４０Ｎ７．１の５’−固定領域に相補的な１９−mer ＤＮＡオリゴの５’ヘキシルアミンリンカーに結合させた。ピリミジン２’ＮＨ２−置換ＲＮＡから成る候補混合物をこのスプリントにハイブリッド形成させ、次いで飽和未満の(subsaturating) タンパク質濃度でＨＮＥと反応させた。反応を１００倍に希釈して、 次いでニトロセルロースに通して濾過することによって、共有結合複合体を富化した。
【０１８７】
上記ＨＮＥと反応した種の選択を５ラウンド行った後に、このプールの反応性をゲル電気泳動（５％ポリアクリルアミド／ＴＢＥ  pH８又はＭＡＥ  pH６／０．２５％ＳＤＳ）により評価した。結果を図２５に示す。反応速度の分析はＫ１ｏｂｓ≒０．１分−１、及びＫ２ｏｂｓ≒０．０１分−１の二相動力学(biphasic kinetics) を示す。この反応は、恐らく上記バリルホスホネートがラセミ混合物であるために、３０％でプラトーを形成し、理論的限界は５０％である。タンパク質濃度５０nMにおけるＫ１ｏｂｓ０．１分−１という値は、二次速度定数≧２×１０６Ｍ−１分−１を示す。バリルホスホネート単独の場合の速度定数の文献値は１０３〜１０４Ｍ−１分−１である（Oleksyszyn等（１９８９），Biophys.Biochem. Res. Comm. １６１：１４３〜１４９）。このように、上記スプリントブレンド核酸混合物は上記種の反応速度を少なくとも１０３倍上昇させる。上記選択プールの反応も高度に特異性である。このプールとトロンビン、他のセリンプロテアーゼ、との反応は検出されない。このトロンビン反応の二次反応速度定数は＜２００Ｍ−１分−１であり、エラスターゼの場合の反応速度よりも１０４倍低い。
【実施例１２】
【０１８８】
［材料及び方法−ＶＥＧＦに対する核酸リガンド］
材料．  組み換えヒトＤＮＡ（１６５アミノ酸形；ＭＷ４６，０００）はDr. Napoleone Ferrara (Genentech) からの寄贈品であった。他の全ての試薬及び化学薬品は入手可能な最高純度のものであり、商業的供給源から購入した。
【０１８９】
ＳＥＬＥＸ．  このＳＥＬＥＸプロトコールの本質的な特徴は実施例１に記載する。ＶＥＧＦに対するアフィニティーを有するＲＮＡリガンドをスクリーニングするために、ランダムＲＮＡの初期プール（それぞれ、転写及びＰＣＲ増幅のための固定配列によりフランクされた(flanked) ３０ヌクレオチドランダム領域を含む）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡ鋳型の約２００ピコモル（１０１４分子）の転写によってインビトロで形成した。このＤＮＡ鋳型及び対応ＰＣＲプライマーは、確立された固相オリゴヌクレオチド合成プロトコールを用いて化学的に調製した。上記ランダム領域はオリゴヌクレオチド合成中に４種の未修飾ヌクレオチドの等モル混合物を用いることによって生じさせた。２定常領域はＰＣＲプライマーアニーリング部位、ＤＮＡ合成用プライマーアニーリング部位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び、ベクター（図２６）（配列番号：４５〜４７）中へのクローニングを可能にする制限酵素部位を含むように設計された。１００〜３００nM鋳型、Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼ５単位／μｌ、及び４０mM  Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（pH８．０）（１２mMＭｇＣｌ２、５mM  ＤＴＴ、１mM  スペルミジン、０．００２％Triton  Ｘ−１００、４％ＰＥＧを含む）から成る転写混合物を３７℃において２〜３時間インキュベートした。通常、これらの条件下では１０〜１００倍の転写増幅が生じた。高アフィニティＲＮＡリガンドの選択は、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ＝１０．１mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８mM  ＫＨ２ＰＯ４.、１３７mM  ＮａＣｌ、２．７mM  ＫＣｌ、pH７．４）５０ml中でＶＥＧＦをＲＮＡと共に３７℃において１０〜２０分間インキュベートし、次いでこのタンパク質−ＲＮＡ複合体をニトロセルロースフイルター分割（Tuerk Ｃ及びGold  Ｌ（１９９０），Science ２４９，５０５〜５１０）により未結合種から分離することによって実施した。次いで選択したＲＮＡ（通常は全投入ＲＮＡ量の５〜１０％に達する）をフイルターから抽出し、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴ）によりｃＤＮＡ中に逆転写させた。逆転写は５０mM  Ｔｒｉｓバッファー（pH８．３）［６０mM  ＮａＣｌ、６mM  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１０mM  ＤＴＴ及び１単位／μｌ  ＡＭＶ  ＲＴ］中で、４８℃（６０分）において実施した。標準条件下でのＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅は、インビトロ転写の次のラウンドのために充分な量の二本鎖ＤＮＡを生成した。
【０１９０】
ニトロセルロースフイルター結合検定．
ニトロセルロースフイルター（孔度０．２μｍ、Schhleicher and Schuell 、ニューハンプシャー州，キーン）をフイルターマニホールド上に固定し、バッファー４〜１０mlで洗浄した。０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有バッファー（ＰＢＳ）中で上記タンパク質の連続希釈液と共に３２Ｐ標識ＲＮＡを３７℃において１０分間インキュベートした後に、この溶液を緩和な減圧下で、４５mlアリコートとしてフイルター上に供給し、ＰＢＳ５mlで洗浄した。次いでこれらのフイルターを赤外ランプ下で乾燥させ、シンチレーション計数管でカウントした。
【０１９１】
平衡解離定数．  最も単純な場合に、ＶＥＧＦ（Ｐ）へのＲＮＡ（Ｒ）の平衡結合は式１で示すことができる：
【式１】
【０１９２】
2005065701.tif 000002
【０１９３】
［式中、Kd＝（［Ｒ］［Ｐ］／［Ｒ．Ｐ］）は平衡解離定数である］
物質−収支(mass-balance)式を用いて、平衡（ｑ）時の結合ＲＮＡの分率を測定可能量（式２）として表示することができる：
【式２】
【０１９４】
2005065701.tif 000003
【０１９５】
［式中、ＰｔとＲｔとは全タンパク質濃度と全ＲＮＡ濃度であり、ｆはニトロセルロースフィルター上のタンパク質−ＲＮＡ複合体の保持効率を表す］。我々の検定におけるＶＥＧＦに関するｆの平均値は０．７であった。
【０１９６】
殆どのＲＮＡリガンドはＶＥＧＦに対する二相結合を示した。これらのリガンドに関して、異なるアフィニティーでＶＥＧＦに結合する（式３と４）相互交換不能な２成分（Ｒ１とＲ2 ）に、全ＲＮＡが分割されると仮定するモデルによって、ＶＥＧＦへのＲＮＡの結合を説明する。
【式３】
【０１９７】
2005065701.tif 000004
【式４】
【０１９８】
2005065701.tif 000005
【０１９９】
この場合に、全結合ＲＮＡ（ｑ）の分率は式５により与えられる：
【式５】
【０２００】
2005065701.tif 000006
【０２０１】
［式中、χ1 及びχ2 （＝１−ｃｌ）はＲ1 及びＲ2 のモル分率であり、Kd１及びKd２は対応解離定数である］
結合試験に用いた内部標識ＲＮＡリガンドはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写によりインビトロで調製し(Millingan等（１９８７），Nucl. Acids Res.１５：８７８３）、サイズの均一性を確保するために変性ポリアクリルアミドゲル上で精製した。全てのＲＮＡリガンドはＰＢＳ中で約１nMの濃度に希釈し、９０℃で２分間変性させ、次いで氷上で冷却してから、タンパク質と共にインキュベートした。高希釈率で行なう上記変性／再生サイクルは、ＲＮＡがダイマ−及び他の高次凝集体を本質的に含まないことを保証するために必要である。他の希釈物を作るためのＶＥＧＦストック溶液の濃度は、ＶＥＧＦダイマーに関するε２８０での計算値  ４６，０００Ｍ−１cm−１を用いて２８０nmにおける吸光度読取り値から算出した(Gill 等（１９８９），Anal. Biochem.  １８２：３１９）。結合曲線を決めるデータセットはソフトウエア  パケージ  Kaleidagraph(Synergy Software 、ペンシルバニア州，リーディング）を用いる非リニア最少二乗法により、式２又は５のいずれかに当てはめた。
【０２０２】
情報境界決定．  ３’境界決定のためには、高アフィニティＶＥＧＦリガンドを５’−末端においてγ−３２Ｐ−ＡＴＰ(New England Biolabs、マサチューセッツ州，バーバリー）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州，バーバリー）で放射能標識するか、又は５’境界決定のためには、３’末端においてα−３２ＰＣp 及びＴ４ＲＮＡリガーゼ(New EnglandBiolabs)によって放射能標識した。放射能標識したリガンドを部分アルカリ加水分解し、次いで、５、０．５、又は０．１２５nMにおいて溶液中でＶＥＧＦに選択的に結合させてから、ニトロセルロースフイルターに通過させた。保持されたオリゴヌクレオチドを８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分解した。各実験において、最少タンパク質濃度においてＶＥＧＦによって結合した最少放射能標識オリゴヌクレオチドが情報境界を画定する。ＲＮＡｓｅＴ１(BoehringerMannheim Biochemicals 、インジアナ州，インディアナポリス）による５’−又は３’−標識ＲＮＡリガンドの部分的消化物を用いて、グアノシンによる標識オリゴヌクレオチド末端の位置をマークした。
【０２０３】
クローン化及び配列決定．  上記富化プールの個々の要素をｐＵＣ１８ベクターにクローン化し、文献(Schneider、Ｄ．等（１９９２），J. Mol. Bio ．２２８：８６２−８６９）に記載のように配列決定した。
【０２０４】
受容体結合性．  ＶＥＧＦをIodesen 法a(Jakeman 等（１９９２），J. Clin.Invest. ８９：２４４）により２．４×１０４cpm ／ngの比活性まで放射能標識した。ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を密度１〜２×１０５細胞／孔で２４孔プレート中で平板培養し、ＥＧＭ培地(Clonetics、カリホルニア州，サンジエゴ）中で密集(confluence)まで増殖させた（２４〜４８時間）。密集時に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１２５Ｉ−標識ＶＥＧＦ含有α−ＭＥＭ無血清倍地中で、非標識競合物（ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、又はＲＮＡ）の存在又は不存在下、４℃において２時間インキュベートした。ＲＮＡによって実施した実験では、胎盤性ＲＮase 阻害剤(Promega、ウィスコンシン州，マディソン）０．２単位を上記倍地中に加えた。これらのＲＮＡリガンドが実験の過程中に分解しないことが判明した。２時間のインキュベーション期間の終了時に、上澄み液を取り出し、孔をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ＨＵＶＥＣを１％Triton  Ｘ−１００／１ＭＮａＯＨで溶解し、細胞関連１２５Ｉ−ＶＥＧＦの量をγ−カウンティングにより測定した。
【実施例１３】
【０２０５】
［ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド］
３０連続位置においてランダム化した約１０１４ＲＮＡ分子をＶＥＧＦ標的初期選択に用いた。ランダムＲＮＡは約０．２μＭのアフィニティでＶＥＧＦに結合した。ＳＥＬＥＸの１３ラウンド後に、進化したＲＮＡプールのアフィニティーの観察された改良は、約２桁であった（データは示さず）。６４個の単離物をクローン化し、次いでこの発展プールから配列決定し、３７個の非反復配列が見いだされた（１又は２位置のみで異なる配列は非反復とは見なさなかった）。上記３７個の非反復配列中で３４配列は発展領域における配列類似性に基づいて６ファミリーに分類できた。３種のユニーククローン、４（ＧＧＧＡＵＧＵＵＵＧＧＣＵＡＵＣＵＣＧＧＡＵＡＧＵＧＣＣＣＣ）（配列番号：８３）、１６（ＧＣＵＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＮＵＡＧＧＧＡＧＣＵＡＧ）（配列番号：８４）及び１８（ＵＵＧＡＧＵＧＡＵＧＵＧＣＵＵＧＡＣＧＵＡＵＣＧＣＵＧＣＡＣ）（配列番号：８５）では、上記６ファミリーの要素との配列類似性が限定された。
【０２０６】
共通構造．  明確に画定された機能性を共有する要素から成る類似配列のグループは、 共通一次構造の決定を可能にするのに加えて、しばしば二次構造予見のための有力な鍵を含む(James（１９８８），Meth. Enzymol.  １８０：２２７）基礎となる仮定は、類似一次構造を有するリガンドが、保存残基がユニークな、充分に定義されたモチーフに組織化されている、類似の二次構造をとりうるということである。これに関して、強く、明瞭な二次構造を有するリガンドは、共通折畳み(consensus folding) がそれ程明瞭ではない類似セット内の他の配列に対して、優れた構造的見本を提供することができる。また、例えば塩基対合のような、二次構造の保存要素も整列した配列セットの共変異分析によって検出することができる(James等（１９８８），上記文献：Gutell等（１９９２），Nucl. Acids Res.２０：５７８５）。上記６配列ファミリーに関する予測共通二次構造を図２８（配列番号：８６〜９１）に示す。
【０２０７】
上記ファミリー１の配列セット（Ａ１７、Ｇ１９及び２３〜２２６位置におけるＣＡＵＣ配列）中に最も高度に保存された残基は９〜１０ヌクレオチドループ
（配列番号：８６）中に収容されることができる。位置１６〜位置２７間（Ｇ−Ｃは１１回中８回の頻度で起こり（８／１１）、Ｃ−Ｇは３／１１の頻度で起こる) 、位置１５〜２８間（Ｕ−Ｇ、７／１１；Ｇ−Ｃ、３／１１；Ｕ−Ａ、１／１１）及び位置１４〜２９間（Ｇ−Ｃ、５／１１；Ｕ−Ａ、２／１１、及びＣ−Ｇ、１／１１）の塩基対合共変異は予測二次構造を支持する。このファミリー中の多くのリガンドが１５塩基対までを含む安定な伸長ステムを有していることは注目に値する。
【０２０８】
上記ファミリー２の配列セットでは、強く保存されたＵＧＣＣＧ及びＵＵＧＡＵＧ（Ｇ／Ｕ）Ｇ配列（位置８−１２及び２６−３３）が環状に並べ換えられる。この共通二次構造では、これらのヌクレオチドは非対称内部ループ（図２８）（配列番号：８７）内で又はこれに隣接して同じ配置で見いだされる。この結果は、図２８に示された上記共通モチーフ外部のヌクレオチドが結合には重要でないことを示唆する。塩基対合共変異は位置５〜３６間（Ｃ−Ｇ、２／７；Ｇ−Ｃ、２／７；Ｕ−Ａ、１／７；Ｇ−Ｕ、１／７）、位置６〜３５間（Ａ−Ｕ、４／７；Ｃ−Ｇ、１／７；Ｃ−Ｇ、１／７；Ｇ−Ｃ、１／７）、位置７〜３４間（Ａ−Ｕ、４／７；Ｇ−Ｃ、１／７）、位置１１〜２８間（Ｃ−Ｇ、６／７：Ｇ−Ｃ、１／７）、位置１２〜２７間（Ｇ−Ｕ、６／７；Ｃ−Ｇ、１／７）、位置１３〜２６間（Ａ−Ｕ、５／７；Ｇ−Ｃ、１／７；Ｇ−Ｉ、１／７）、位置１４〜２５間（Ｇ−Ｃ、４／７；−Ｇ、２／７）及び位置１５〜２４間（Ｃ−Ｇ、４／７；Ｇ−Ｃ、２／７）に認められる。
【０２０９】
ファミリー３とファミリー４の配列セットは、バルジ化ヘアピンモチーフ中に配置された、２１（ＧＧＧＡＡＣＣＵＧＣＧＵ（Ｃ／Ｕ）ＵＣＧＧＣＡＣＣ（配列番号：９２）、位置１１〜３１）と１５（ＧＧＵＵＧＡＧＵＣＵＧＵＣＣＣ（配列番号：９３）、位置１５〜２９）との高度に保存された連続ストレッチ(contiguous stretch)を特徴とする（図２８）（配置番号：８８〜８９）。塩基対合共変異はファミリー３の位置８〜３３間（Ａ−Ｕ、２／４；Ｇ−Ｃ、２／４）、位置９〜３２間（Ａ−Ｕ、２／４；Ｕ−Ａ、１／４；Ｇ−Ｃ、１／４）及び位置１０〜３１間（Ａ−Ｕ、１／４；Ｇ−Ｃ、３／４）並びにファミリー４の位置１３〜３１間（Ａ−Ｕ、４／７；Ｇ−Ｃ、２／７；Ｕ−Ａ、１／７）及び位置１４〜３０間（Ｃ−Ｇ、３／７；Ｕ−Ａ、３／７；Ａ−Ｕ、１／７）に検出される。
【０２１０】
ファミリー５の共通二次構造は、保存ＵＡＧＵＵＧＧ（位置９〜１５）及びＣＣＧ（位置２９〜３１）配列が低保存配列によってインターラプトされている、非対称内部ループである（図２８）（配列番号：９０）。軽度の塩基−対合共変異は位置８〜３２間（Ａ−Ｕ、２／４；Ｕ−Ｇ、１／４）、位置１６〜２６間（Ｇ−Ｃ、２／４；Ａ−Ｕ、１／４）、位置１７〜２５間（Ａ−Ｕ、２／４；Ｇ−Ｃ、１／４）及び位置１８〜２４間（Ｃ−Ｇ、２／４；Ｇ−Ｃ、１／４）に見られる。
【０２１１】
ファミリー６は２配列のみを有するので、共通配列又は共通構造なる概念はあまり意味がない。それにも拘わらず、これらの２配列は極めて類似しており（９０％同一性）、共通のモチーフ中に折り畳まれることができる（図２８）（配列番号：９１）。塩基対合共変異は位置１〜３２間（Ａ−Ｕ、１／２；Ｇ−Ｕ、１／２）、位置２〜３１間（Ｃ−Ｇ、１／２；Ｇ−Ｃ、１／２）、位置１４〜２０間（Ｕ−Ａ、１／２；Ｇ−Ｃ、１／２）及び位置１５〜１９間（Ａ−Ｕ、１／２；Ｇ−Ｕ、１／２）に見い出される。
【０２１２】
アフィニティ．  ２つのタンパク質濃度（１nM及び１０nM）においてＶＥＧＦに結合したＲＮＡの量を測定することによって、ＶＥＧＦに対する全ての非反復配列クローンのアフィニティをスクリーニングした。次いで、６配列ファミリーの各々からの最良リガンドの結合性を一連のタンパク質濃度にわたって分析した（図２９）。これらのデータ点を式２（一相結合）又は式５（二相結合）のいずれかに当てはめて解離定数を計算した。これらの値を表１に示す。
【０２１３】
情報境界．  ＶＥＧＦに対する高アフィニティ結合に必要な最小限の配列情報を決定する目的で、欠失変異分析を上記６ファミリーの各々からの代表要素について実施した。これらの実験は、３’末端又は５’末端（それぞれ、３'又は５'境界決定のため）のいずれかにおいてＲＮＡリガンドを放射能標識し、次いで限定アルカリ加水分解し、遊離ＲＮＡとニトロセルロースフイルター結合ＲＮＡとを分割し、変性ポリアクリルアミドゲル上でＶＥＧＦに対して高アフィニティーを保持した加水分解フラグメントを分解することにより行った(Tuerk等（１９９０），J. Mol. Bio.  ２１３：７４９）。３’及び５’境界実験からの一緒にした情報は、上記タンパク質に対する高アフィニティを有する最短配列セグメントの概要を述べるものである（図３０）（配列番号：９４）。全長標識した末端に関連して、リガンドの非標識末端における境界をこれらの実験が連続的に決めることを理解することは重要である。この全長末端は上記タンパク質との付加的接点を提供するか、又は競合二次構造に関与することができるので、両末端で切頭されたリガンドは対応全長母体よりも低い又は高い、タンパク質に対するアフィニティを有することができる。次の切頭リガンドは合成ＤＮＡ鋳型からインビトロでの転写により調製した：１００ｔ（ファミリー１）ＧＧＣＣＧＧＵＡＧ−ＵＣＧＣＡＵＧＧＣＣＣＡＵＣＧＣＧＣＣＣＧＧ（配列番号：９５）、４４ｔ（ファミリー２）（ＧＧａａＧＣＵＵＧＡＵＧＧＧＵＧＡＣＡＣＡＣＧＵＣＡＵＧＣＣＧＡＧＣｕ（配列番号：９６）、１２ｔ（ファミリー３）（ＧＧＡＡＧＧＧＡＡＣＣＵＧＣＧＵＣＵＣＧＧＣＡＣＣｕｕｃｇ（配列番号：９７）、４０ｔ（ファミリー４）ＧＧＵＣＡＡＣＧＧＵＵＧＡＧＵＣＵＧＵＣＣＣＧｕｕｃｇａｃ（配列番号：９８）、８４ｔ（ファミリー５）ＧｇｃｕｃａａＡＧＵＵＧＧＡＧＧＣＣＵＧＵＣＣＵＣＧＣＣＧＵＡＧＡＧＣ（配列番号：９９）及び１２６ｔ（ファミリー６）ＧＧａＡＣＧＧＵＵＣＵＧＵＧＵＧＵＧＧＡＣＵＡＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧｕｕ（配列番号：１００）（文字ｔは切頭配列を意味し；下線グアニンは初期配列には存在せず、転写効率向上のために添加したもの［Milligan等（１９９０），上記文献］；小文字は定常配列領域からのヌクレオチドを示す）。これら切頭リガンドに関する結合曲線及び解離定数を、母体リガンドと共に図２９及び表１に示す。リガンド４０ｔ（配列番号：９８）及び１２６ｔ（配列番号：１００）は、対応全長リガンドに較べれば有意に充分低い程度でＶＥＧＦと結合しているという明瞭な事実はあるが、上記切頭リガンド対全長リガンドの解離定数は一般的には類似している。
【０２１４】
競合実験は、上記ファミリーのそれぞれを代表する切頭リガンドのあらゆる可能な対合組み合わせの結合が相互に排他的であることを示した［１００ｔ（配列番号：９５）、４４ｔ（配列番号：９６）、１２ｔ（配列番号：９７）、４０ｔ（配列番号：９８）、８４ｔ（配列番号：９９）、及び１２６ｔ（配列番号：１００）］。さらに、これらリガンドの全ては低分子量（≒５，１００  Da）ヘパリンにより置換される（データは示さず）。切頭リガンド及び低分子量ヘパリンは非競合リガンド対を観察できる確率を最大にする目的でこれらの実験に使用した。したがって、ＶＥＧＦに対する高アフィニティ結合のために多重の非同形溶液(multiple non-isomorphic solutions) が存在するにも拘わらず、試験した全てのリガンドは上記タンパク質の同一領域に結合することができるように思われる。タンパク質は、一般に、核酸リガンドに対して”免疫優先(immunodominant ) ”ドメインを有しうる。
【実施例１４】
【０２１５】
［ＶＥＧＦに対する切頭ＲＮＡリガンドの特異性］
特異性の問題を解明するために、４種類の他のヘパリン結合タンパク質（ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、抗トロンビンIII 及びトロンビン）に対する２種類の切頭高アフィニティリガンド、１００ｔ（配列番号：９５）及び４４ｔ（配列番号：９６）の結合を試験した。解離定数はニトロセルロースフイルター分割方法を用いて決定した。結果を表２に示す。１０mMジチオトレイトール含有バッファー中でのこれらリガンドのＶＥＧＦに対する結合は少なくとも１０００倍弱い。
【０２１６】
受容体結合．  ＥＧＦではない非標識ＶＥＧＦは濃度依存的にＨＵＶＥＣに対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦ結合を阻害することが判明した（データは示さず）、このことは１２５Ｉ−ＶＥＧＦがＨＵＶＥＣ上の特異的部位に結合することを立証した。以前の研究（Myoken等（１９９１），Proc. Natl. Acad. Sci. USA  ８８：５８１９）で報告されているように、ＨＵＶＥＣ上の受容体の２クラスは、解離定数≒５×１０−１１Ｍ（７，０００受容体／細胞）及び≒５×１０−１０Ｍ（２０，０００受容体／細胞）でＶＥＧＦに結合することが観察された（図３１）。
【０２１７】
配列ファミリー［１００ｔ（配列番号：９５）、ファミリー１；４４ｔ（配列番号：９６）、ファミリー２；１２ｔ（配列番号：９７）、ファミリー３；４０ｔ（配列番号：９８）、ファミリー４；８４ｔ（配列番号：９９）、ファミリー５；及び１２６ｔ（配列番号：１００）、ファミリー６］の各々を代表する切頭リガンドの１グループ並びにランダムＲＮＡについて、その細胞−表面受容体へのＶＥＧＦの結合阻害能力を試験した。ランダムＲＮＡ以外の全ての高アフィニティーリガンドは濃度依存的にＶＥＧＦ−ＶＥＧＦ受容体の相互反応を阻害し、２０〜４０nM範囲内では半阻害が生起した（図３２）。
【実施例１５】
【０２１８】
［ＶＥＧＦに対する修飾２’−ＮＨ２ピリミジンＲＮＡリガンド］
改良された安定性を有するリガンドをインビトロで形成するために、ＶＥＧＦを標的とする２種のＳＥＬＥＸ実験（Ａ及びＢ）を各ピリミジンの２’位置にＮＨ２官能基を含むランダム化ＲＮＡの別々のプールを用いて開始した。上記２種の実験に対する出発リガンドプールは、３０（ＳＥＬＥＸ実験Ａ）および５０（ＳＥＬＥＸ実験Ｂ）連続位置でランダム化した修飾ＲＮＡの約１０１４分子（５００pmol）を含有していた。この出発ＲＮＡ及び対応ＰＣＲプライマーは図３３（配列番号：１０１〜１０６）中で定義する。修飾ＲＮＡの発展領域に対応する配列を図３４に示す。
【０２１９】
類似一次構造を有するリガンドを５ファミリーにグループ化し、これらの共通配列を各ファミリーセットの下方に示す（図３４）（配列番号：１０７〜１９０）。類似一次構造を有する配列グループ（ファミリー）を図３４に整列させ、これらの共通配列を各セットの下方に示す。類似／関連配列の組合せ、ファミリーのいずれにも含まれない配列（“その他の配列”）、及び高アフィニティーでニトロセルロースフイルターに付加的に結合するリガンドに対応する配列は別々のグループとして示してある。配列中の文字Ｎは配列決定用ゲル上の不明瞭位置を示す。共通配列中のイタリック文字Ｎは保存されない位置（すなわち、いずれのヌクレオチドもこの位置に見い出されうる）を示す。ランダムＲＮＡ  Ａ（３０Ｎ８）、ランダムＲＮＡＢ（５０Ｎ７）及びＶＥＧＦに対する修飾２’−アミノピリミジン高アフィニティＲＮＡリガンドセットに関する解離定数を表３に示す。
【実施例１６】
【０２２０】
［材料及び方法−エラスターゼに対する核酸リガンド］
材料．  ヒト好中球エラスターゼはAthens Research and Technoligy（ジョージア州，アテンス）から購入した。全てのオリゴデオキシヌクレオチドはシアノエチルホスホラミジットを用いる標準化学手法によりOperon Technologies において合成した。
【０２２１】
２’−ＮＨ２ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸ．このＳＥＬＥＸプロトコールの本質的特徴は実施例１に記載する。初期候補混合物のランダムヌクレオチドは２’−ＮＨ２ピリミジン及び２’−ＯＨプリン塩基から構成された。インビトロでの転写による全てのＲＮＡ合成段階は２’−ＮＨ２ピリミジン塩基を用いて行った。
【０２２２】
簡単に述べれば、ＲＮＡの第１ラウンドランダムプールは画定された領域によりフランクされた４０−ヌクレオチドランダム領域を含むＤＮＡ鋳型の転写から誘導され；このプールのコンプレキシテイ) は１０１４分子のオーダであった。このＤＮＡ鋳型及び対応ＰＣＲプライマーはシアノエチルホスホラミジット（Operon）を用いた標準手法により化学的に合成した。このランダム領域はオリゴヌクレオチド合成中に等モル結合を得るためにそれぞれの最適濃度における４ホスホラミジットの全てと反応させることにより生じさせた。上記鋳型のフランキング領域中に画定されたヌクレオチド配列は、ＰＣＲのため、逆転写酵素のためのプライマーアニーリング部位として、及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして、並びにベクター中へのクローニングを可能にする制限酵素部位として役立った。
【０２２３】
ＳＥＬＥＸを図４６に示すプライマー−鋳型混合物Ｉによって実施した。２’−ＮＨ２ＲＮＡ転写は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、２’−ＮＨ２ＣＴＰ及び２’−ＮＨ２ＵＴＰの各２mM、４０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、１２mM  ＭｇＣｌ２、１mM  Spermidine、５mM  ＤＴＴ、０．００２％  Triton  Ｘ−１００及び４％ポリエチレングリコール（ｗ／ｖ）を含む１００μｌ転写反応中で、室温において２時間行った。全長転写物をゲル精製し、結合バッファー［１５０mMＮａＣｌ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．０）、２mM  ＭｇＣｌ２及び６mM  ＫＣｌ］中に再懸濁させ、７０℃において３分間加熱し、氷上で冷却し、さらに３７℃において１０分間ＮＨＥと共にインキュベートした。
【０２２４】
このＲＮＡプールを１５０mM  ＮａＣｌ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．０）、２mM  ＭｇＣｌ２、及び６mM  ＫＣｌを含む結合バッファー中で、エラスターゼ（１．７〜０．００３μＭ）と共に３７℃において１０分間インキュベートした。このＲＮＡ−タンパク質混合物をニトロセルロースフイルター（０．４５μ、Millipore)に通過させ、さらにフイルター上に保持されたＲＮＡ−タンパク質複合体からＲＮＡを溶離させ（Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：５０５）させ、回収した。回収ＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素を用いて４８℃においてｃＤＮＡに逆転写した。生成ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、増幅ＤＮＡをＴ７ＲＮＡポメラーゼの鋳型として用いて、次のＳＥＬＥＸラウンドのためのＲＮＡプールを得た。好ましくないニトロセルロース結合ＲＮＡ分子の選択及び増幅を避けるために、次回のＨＮＥ選択ラウンドに先立って、新たに転写したＲＮＡプールを数層のニトロセルロースフイルターに通過させた（負の選択）。ＲＮＡの富化プールのエラスターゼアフィニティが初期ランダムプールよりも著しく改良されるまで、この手順を繰り返した。
【０２２５】
２’−ＮＨ２ＲＮＡプールの有意な結合がひと度達成されたならば、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡをHindIII 及びBamHＩで消化し、標準手法によって同じ酵素で予め消化したｐＵＣ１８中にクローン化した（Tuerk とGold（１９９０），Science ２４９：５０５）。組み換えプラスミドを単離し、配列決定した。
【０２２６】
一本鎖ＤＮＡ  ＳＥＬＥＸ．  一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の候補ライブラリーを用いてＳＥＬＥＸを行った。このＳＥＬＥＸ実験は図４６に示すプライマー−鋳型混合物IIを使用して行った。簡単に述べれば、ニトロセルロースフイルター分割後に、フィルターを中和フェノールと７Ｍ尿素との混合物中で３７℃においてインキュベートし、その後に水性相を抽出することによって、フイルター結合ｓｓＤＮＡを回収した。回収ｓｓＤＮＡをエタノール沈殿させ、アリコートをＰＣＲ反応において鋳型として用いて、高分子量ＤＮＡの形成なしに、正確なサイズの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成するために必要な最適サイクル数を確認した。鋳型としての上記残留回収ｓｓＤＮＡ及びビオチニル化プライマー（ＢＩＯ−３Ｇ2 ）及び非ビオチニル化プライマー（５Ｇ２）を用いて行ったバルクＰＣＲ反応（８００μｌ）のために、この最適サイクル数を採用した。このＰＣＲ生成物をゲル精製し、未組込みビオチニル化プライマーを除去した。この二本鎖ＤＮＡの非ビオチニル化鎖を、ストレプタビジンビーズ(Pierce)２００μｌを用いて上記ＰＣＲ生成物のインキュベーションと、その後のアルカリ変性（０．１５Ｎ  ＮａＯＨ、室温３０分）とによって、相補的鎖から分離した。回収一本鎖ＤＮＡを中和し、エタノール沈殿させ、ＳＥＬＥＸの次回ラウンドに用いた。ストレプタビジン捕捉によるｓｓＤＮＡの回収率は約３０〜４０％であった。
【０２２７】
ビオチニル化プライマー３Ｇ２及び非ビオチニル化プライマー５Ｇ２のＰＣＲにおける使用は、ストレプタビジン捕捉後にボトムＤＮＡ鎖を生ずる。したがって、ＳＥＬＥＸの第１ラウンド用のかなり大きな配列空間を得るために、１０nmのＨＰＬＣ−精製合成ボトム鎖を使用した。各ＳＥＬＥＸラウンドに関して、ｓｓＤＮＡの小フラクションを末端標識し、ゲル精製し、３種の異なったエラスターゼ濃度によるミニ結合曲線用に使用した。次いでこれらの結果を用いて、ＤＮＡの５〜１０％が次回ラウンドに用いるバックグラウンドレベルを越えてフイルター上に留まるタンパク濃度を得た。
【０２２８】
第１ラウンド以外は、各ＳＥＬＥＸラウンド後に、フイルターに結合したＤＮＡ分子［エラスターゼ（フイルターバインダー）ではなく］を除去するために、選択したｓｓＤＮＡを４〜５ニトロセルロースフイルターの層に通過させた。しかし、この予備濾過処理後にも、フイルターバインダーの割合は０．２％から１２〜１５％ほどまで増加した。高バックグラウンド問題を回避するために、タンパク質−ＤＮＡ混合物を濾過した後直ちに０．５Ｍ尿素溶液でこれらのフイルターを洗浄した。この尿素処理によりバックグラウンド結合レベルは０．１〜０．２％になった。したがって、各ＳＥＬＥＸラウンド中並びに結合曲線決定中に、０．５Ｍ尿素１０ml及び結合バッファー１０mlを用いて上記フイルターを洗浄した。
【０２２９】
ｔＲＮＡを含めた数種のポリアニオンは、エラスターゼに結合して、エラスターゼを阻害することが判明している(LestienneとBieth （１９８３），Biochem６５：４９−５２）。選択の厳重さを向上させるために，ｓｓＤＮＡの濃度よりも８〜１０倍高い濃度でｔＲＮＡを競合物として９回目ＳＥＬＥＸラウンド後に上記結合反応系中に包含させた。ランダムｓｓＤＮＡの見掛けKdは約０．２５μＭであると測定され、一方１４回ＳＥＬＥＸラウンド後のｓｓＤＮＡのKdは２２nMであった。
【０２３０】
エラスターゼ阻害検定．  このエラスターゼ阻害検定は色原体テトラペプチド基質の使用に基づく。この検定は１０nMエラスターゼ、０．５mM  Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリド、１５０mMＮａＣｌ、２６mM  ＫＣｌ、２mM  ＭｇＣｌ２、０．０２％ＨＳＡ、０．０５％ＤＭＳＯ，０．０１％  Triton  Ｘ−１００、及び１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む溶液中で、２５℃において実施した。この検定はスペクトロスコピー（ＯＤ  ４０５nm）によってエラスターゼ誘導ｐ−ニトロアニリドの生成を時間の関数として測定した。阻害剤が存在しない場合のｐ−ニトロアニリドの生成速度を負の対照として用いた；正の対照は不可逆的阻害剤  Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンを含有した。ＯＤ値を時間に対してプロットし、この勾配を用いて、酵素活性の速度を算出した。
【０２３１】
細胞脱離検定．  エラスターゼ誘導内皮細胞脱離を培養内皮細胞中で測定する検定法を開発した。内皮細胞は標準培養条件下で、２４孔プレート中で増殖させて密集単分子層を得た。試験リガンドの存在又は不存在下でのエラスターゼの添加に先立って、この細胞を溶液Ａ（ＰＢＳ、２０mM  ＨＥＰＥＳ、１０mMグルコース）で洗浄した。３７℃において４５分間のインキュベーション後に、上澄み液を取り出し、脱離細胞をカウントした。
【実施例１７】
【０２３２】
［２’−ＮＨ２ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸ］
１７回ラウンドに関して上述したようにＳＥＬＥＸを行った。結果として生じた、エラスターゼに対する富化プールのアフィニティーは著しく改良された（Kd０．８μＭを有する非選択ランダムプールに較べて、解離定数（Kd）約７０nM）。この時点で、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡをクローン化し、個々の６０クローンの配列決定を行った（表４、配列番号：１９１〜２１５）。リガンドを一次配列相同に基づいて数クラスにグループ分けした。異なるクラスに属する代表的リガンドのKdを表５に示す。
【０２３３】
リガンドの特異性．  表６に示すように、エラスターゼに対する２’−ＮＨ２リガンドは、トロンビン及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等の他のタンパクに対して高アフィニティ結合を示さなかった。ヒトエラスターゼに対するこのリガンドの特異性を、ヒト及びブタのエラスターゼに結合する典型的なリガンド１４（配列番号：２００）と比較することにより試験した。これらのタンパク質間の相同は全体で約４０％であるが、この配列は触媒領域では実質的に同一である。図３５に示すように、リガンド１４（配列番号：２００）は、いかなる濃度においても検出可能なレベルではブタのエラスターゼとは結合しなかった。
【実施例１８】
【０２３４】
［エラスターゼに対する阻害リガンドの確認］
実施例１６に記載のエラスターゼ阻害検定を用いて、エラスターゼに対する阻害活性を有する数種のリガンドを確認した。クラスＩ及びクラスIIに属する分子はエラスターゼを阻害することが判明した。クラスIII のクローン９（配列番号：２０２）及びクラスIVのクローン１９（配列番号：２０５）も阻害活性を示した。図３６に代表的リガンド３４（配列番号：１９７）のエラスターゼ阻害活性を示す。試験した全てのＲＮＡリガンドのエラスターゼ阻害活性はＲＮＡ濃度に依存し、最高エラスターゼ阻害率は約３０％であった。
【０２３５】
異なるクラスからのリガンドが類似のエラスターゼ阻害性を示すので、リガンド２４及び３０（配列番号：１９８と１９１）（クラスＩ及びII）並びにリガンド５６及び１９（配列番号：１９５と２０５）（クラスII及びIV）を用いて、これらのリガンドが相互に競合するか否かを決定するための競合実験を行った。この結果（図３７Ａ及び図３７Ｂ）は、これらのリガンドは上記エラスターゼタンパク質の同じ結合部位に対して又は空間的に近接した結合部位に対して相互に競合するらしいことを示している。
【０２３６】
リガンドがエラスターゼの活性部位又は基質結合部位のいずれに結合するかを知るために実験を行った。Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンと不可逆的に複合体を形成したエラスターゼに対するリガンド３４（配列番号：１９７）の結合性を試験した。この阻害剤のクロロメチルケトン部位はエラスターゼの活性部位と不可逆的に結合し、そのテトラペプチド部分は基質結合ポケットを占拠する(Navia等（１９８９），Proc. Natl.Acad. Sci. USA  ８６：７）。図３８に見られるように、この結果は、リガンド３４（配列番号：１９７）がネイチブ酵素に対すると同じ程度に複合体化エラスターゼに結合したことを示している。これらの結果は、リガンドがエラスターゼの活性部位にも基質結合ポケットにも結合しないという結論を支持する。リガンド仲介エラスターゼ阻害は、酵素表面の活性部位近くに結合するリガンド又は離れた部位に結合して、ある程度触媒活性を劣化させる酵素のアロステリック変化を誘導するリガンドに由来すると考えられる。
【０２３７】
エラスターゼに対する天然阻害剤であるα−１−抗トリプシン（α−１ＰＩ）はエラスターゼと堅い、不可逆的な酵素−阻害剤複合体を形成する。α−１ＰＩ−複合エラスターゼに対するリガンド３４（配列番号：１９７）の結合を検討した。この結果（図３９）は、リガンド３４が複合体化酵素を結合しないことを示している。この結合性の欠如に対する１つの可能な説明は、リガンドがα−１ＰＩと相互反応する、エラスターゼの表面上の部位に結合するということである。或いは、α−１ＰＩ結合が、リガンド結合を完全に破壊するような、エラスターゼのコンホメーション変化を誘導すると考えられる。
【０２３８】
α−１ＰＩ−誘導阻害に及ぼすリガンド結合の影響を検討した。代表的リガンド１９（配列番号：２０５）はα−１ＰＩ阻害に対して追加的に作用し、天然阻害剤の阻害活性を向上させることが判明した（図４０）。
【０２３９】
細胞脱離検定を、阻害性リガンド２４、３０及び１９（配列番号：１９８、１９１及び２０５）を用いて行った。図４１に見られるように、上記リガンドの全てが実質的にエラスターゼ活性を阻害した。
【実施例１９】
【０２４０】
［切頭エラスターゼリガンド］
２’−ＮＨ２修飾ＲＮＡリガンドの３’配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いて、４種の異なるリガンド［クラスＩリガンド１２（配列番号：１９１）、クラスIIリガンド１４（配列番号：２００）、クラスIII リガンド９（配列番号：２０２）及びクラスIVリガンド１９（配列番号：２０５）の３’−固定領域を除去した。この結果（図７）は、３’−固定領域がリガンド１２（クラスＩ）及び１４（クラスII）の高アフィニティー結合のために不要であることを示している。両方の３’−切頭リガンド（６４ヌクレオチド）のKdは、全長リガンド（８７ヌクレオチド）に類似したKdを有した。しかし、この３’固定領域の除去はリガンド１９及び９にとっては有害であった。それ故、この３’−固定末端はこれらリガンドによる酵素阻害にとっては重要であるように見える。
【実施例２０】
【０２４１】
［二次構造形成に及ぼす１価カチオンの影響］
結合バッファー中の本発明の２’−ＮＨ２修飾エラスターゼリガンドにより想定された三次元分子構造は、確実には、知られていない。しかし、次の証拠は、これらのリガンドがＧ−クァルテット構造（図４２）を形成することを暗示する。２’−ＮＨ２−置換ＲＮＡが、２’−ＯＨ  ＲＮＡ類似体に較べて、ヘリックスコイル転移において異常に低い溶融温度を有することが提案されてきた。若しそうであるならば、このことはクラスＩ及びIIリガンドにおけるステム・ループ構造の形成とは矛盾するはずである。２’−ＮＨ２リガンドによるＳＥＬＥＸが、ヘリックス構造を有するＲＮＡリガンドの生成を本質的に妨害することが可能である。この予見は今後、試験されるべきである。
【０２４２】
２’−ＮＨ２ＳＥＬＥＸで用いた結合バッファーは６mM  ＫＣｌ、Ｇ−クァルテット構造を安定化することが知られている１価イオンを含有した。この結合バッファー中にＫＣｌが存在しない場合は、３クローン（２１、２４及び３４）（配列番号：１９５、１９８  及び１９７）の結合アフィニティーに影響が及ぼされる。図４３に見られるように、ＫＣｌの存在下と不存在下とではKd値に著しい変化がある。例えば、クローン２１（配列番号：１９５）はＫＣｌの存在下で、エラスターゼに対して３９nMのKdを有するが、ＫＣｌの不存在下ではこのKdが１９２nMに低下する。このことは、ＫＣｌがリガンド結合において重要な役割を演じ、恐らくエラスターゼに対する高い結合アフィニティを有する二次構造の形成を容易にすることを暗示する。
【０２４３】
次いで、エラスターゼに対するリガンド結合をリガンド３０（配列番号：１９１）（クラスＩ）、３４（配列番号：１９７）（クラスII）、及び９（配列番号：２０２）（クラス111）を用いて結合バッファー［１５０mM  ＸＣｌ、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．０）、２mM  ＭｇＣｌ２、この場合ＸはＬｉ、Ｋ又はＴｒｉｓである］中で研究した。（表８）この実験の目的は、Ｋ（これはＧ−クァルテット構造の形成を容易にする）、Ｌｉ（これはＧ−クァルテット構造の形成を助成しない）、又はＴｒｉｓ（これはＧ−クァルテット構造の形成には影響しない）の存在下でのアフィニティを比較することにあった。クラスＩ及びIIに属するリガンドのアフィニティは６mM  ＫＣｌバッファー中におけるよりも１５０mMにおいて一層高かった。このことは高アフィニティ二次構造の分率がＫＣｌ濃度を高めることによって増加することを暗示する。しかし、リガンド９（配列番号：２０２）（クラスIII ）は高ＫＣｌの存在下で一層低いエラスターゼアフィニティを示すので、リガンド９の二次構造はクラスＩ及びIIリガンドにより想定される二次構造とは異なる可能性がある。エラスターゼに対するクラスＩ及びIIリガンドの最低アフィニティはＬｉの存在下で観察され、ＬｉはＧ−クァルテット構造の形成を助成しない１価カチオンである。
【０２４４】
Ｔｒｉｓバッファーの存在下では、３種のリガンドは全てエラスターゼに対して適度に高いアフィニティを示した（しかし、ＫＣｌバッファー中でのクラスＩ及びIIリガンドの場合よりも低い）。恐らくＫ+ によりＴｒｉｓが汚染されることが原因であるか、或いは、高濃度の１価イオンの不存在下で、Ｍｇ＋＋イオンが二次構造の確立に関与すると考えられる。Ｍｇ＋＋によりＲＮＡ  Ｇ−クァルテット構造が安定化されることの幾つかの証拠(SundquistとHeapy （１９９３），Pro. Natl. Acad. Sci. USA  ９０：３３９３）が報告されている。
【実施例２１】
【０２４５】
［エラスターゼに結合する２’−ＮＨ２ＲＮＡ及び非修飾一本鎖ＤＮＡリガンドに及ぼすpHの影響］
２’−ＮＨ２−ＮＴＰ（ヌクレオチドトリホスフェート）のpKa は約６．５であり、生理的pH範囲７．３５〜７．４５から離れていない。したがって、一定の生理的pHでは、２’−ＮＨ２−修飾ＮＴＰを含む所定ＲＮＡ分子はプロトン化及び非プロトン化２’−ＮＨ２基の分布を有するはずである。その結果、pHの僅かな変化がリガンドのプロトン化度に影響を与え、これが標的分子への結合に影響を与える可能性があると考えられる。
【０２４６】
代表的２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンド１４及び非修飾一本鎖ＤＮＡリガンド１７のエラスターゼへの結合をpH範囲５．０〜８．０にわたって試験した。結果を図４４に示す。２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドの結合はpHにより深く影響される。例えば、そのKdはpH６．５からpH６．２５までに１０倍を越えて増加する。２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドに対する最適結合はpH７．０において観察され、このpHにおいてＳＥＬＥＸを実施した。ｓｓＤＮＡリガンドはpH５において一層良好に結合し、そのKdは２pH単位にわたって約３倍増加した。
【実施例２２】
【０２４７】
［核酸模倣物］
Ｇ−クァルテット構造の連結ループヌクレオチドを合成リンカーのテザー（tether）グループ（図４５）で置き換えた。模倣配列、１７−ＬＱＴ（ＴＡＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＧＧＬＧＧＧＬＧＧＧＬＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡ）（配列番号：５３）を得るために、ＤＮＡ−１７（ＴＡＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＧＴＡＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＧＧＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡ）（配列番号：５２）を１８−炭素エチレングリコールリンカー(Spacer ホスホラミジット；Clonetech)で置き換えた２つのループヌクレオチドを用いて合成した。Ｌはエチレングリコールリンカーを表わす。インターヌクレオチドホスフェートの長さは約３−炭素距離である。このように、この１８−炭素リンカーはＧ−クァルテット構造にループバックするのに充分な可変性を有することが期待された。しかし、１７−ＬＱＴは充分なアフィニティでエラスターゼに結合しないことが判った。
【０２４８】
高アフィニティ結合が存在しないことは、タンパク質認識に必要なループヌクレオチドの欠如によるか、またはテトラプレックス中に折り畳まれるオリゴヌクレオチドを制約している合成テザーに原因がある可能性がある。
【実施例２３】
【０２４９】
［方法及び材料−テオフイリン及びカフェインに対する核酸リガンド］
材料．  １−カルボキシプロピルテオフィリンはAbbott Laboratories （イリノイ州，アボットパーク）から提供を受けた。
【０２５０】
ＳＥＬＥＸ．  このＳＥＬＥＸプロトコールの基本的特徴は実施例１に記載がある。簡単に言えば、インビトロにおける転写（定常配列領域によりフランクされた４０ランダム位置を含む）用のＤＮＡ鋳型及び対応ＰＣＲプライマーを化学的に合成した(Operon)。このランダム領域はオリゴヌクレオチド合成中に４ヌクレオチドの等モル混合物を利用して合成した。この２つの定常領域はＰＣＲプライマーアニーリング部位、ｃＤＮＡ合成用プライマーアニーリング部位、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び、ベクターへのクローン化を可能にする制限酵素部位を含むように設計した。テオフイリンＳＥＬＥＸ実験は１００mMＨＥＰＥＳバッファー（１００mM  ＨＥＰＥＳ、pH７．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび５mM  ＭｇＣｌ２）を用いた。
【０２５１】
クローン化及び配列決定．  富化プールの個々の要素をｐＵＣ18ベクター中にクローン化し、文献(Scheider 等（１９９２），J. Mol. Bio. Proc. Natl.Acad. Sci. USA  ＵＳＡ  ８９：６９９２；Tuerk とGold（１９９０），上記文献）記載のように配列決定した。
【０２５２】
平衡濾過分析．  ”平衡濾過”と呼称される、オリゴヌクレオチドによるテオフィリン結合を検定するための迅速手法を開発した。これらの検定法は［１４Ｃ］- テオフィリンと、所定濃度（図５１を参照）のＲＮＡとを、１００mM  ＨＥＰＥＳ（pH７．３）、５mM  ＭｇＣ  2 、及び５０mM  ＮａＣｌを含む反応混合物（１５０μｌ）中に添加することにより実施した。各結合混合物を２５℃において５分間インキュベートした。次いで、この混合物をMicrocon１０(Amicon)濾過装置上に置き、１４，０００×ｇで４分間遠心分離した。これらの条件下、このＲＮＡはフイルターにより保持され、一方テオフィリンは自由にフイルターを通過した。サンプル２５μｌをフイルターの各サイドから取り出し、シンチレーション計数管で放射能を測定した。各反応は３回繰り返した。他の実験により、この手法が平衡透析によって得られる結果に類似した結果をもたらすことが確認された。結合に対する平衡透析分析は上記と同じ反応条件下で行った。各結合混合物をSpectra 透析器(Spectrum)中に２５℃において２時間放置した。チヤンバー内に保持された放射能を測定した。データは１：１化学量論(Gill 等（１９９１），J. Mol. Biol.  ２２０：３０７）を前提にした二次結合方程式に最少二乗法によって適合した（図５１）。
【０２５３】
テオフィリンに対するＲＮＡリガンドの選択．
テオフィリンに対してアフィニティを有するＲＮＡ分子をスクリーニングするために、各々が転写とＰＣＲ増幅のための固定配列によってフランクされた４０ヌクレオチドランダム領域を含む、１０１４ランダムＲＮＡのプールを形成した。これらのＲＮＡは、上記のように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより二本鎖ＤＮＡの転写により形成し、次いで［α］３２Ｐ−ＡＴＰで放射能標識した。標識ＲＮＡのプールをＥＡＨ  Sepharose カラムに添加し、このカラムに対して結合試薬１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）（ＥＤＣ）及び６０Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてアミド結合を経由して１−カルボキシプロピルテオフィリン（１−cp  テオフィリン）を共有結合させた。それぞれのＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、約０．５nmolのＲＮＡを約５０nmolテオフィリン含有カラム中に添加した。０．５Ｍ  ＮａＣｌの添加は、このカラムに結合している非特異的ＲＮＡを低減させるために必要であることが判明した。１０分間相互作用させた後に、カラムを負荷バッファーによって洗浄して、非特異的結合ＲＮＡを除去した。結合ＲＮＡを０．１Ｍテオフィリンによって溶離して分割した。この溶離ＲＮＡを沈殿させ、ＡＭＶ逆転写酵素によって逆転写し、次いで得られるＤＮＡを上記のようにＰＣＲによって増幅した。この手法セットがＳＥＬＥＸの１ラウンドを構成した。
【０２５４】
テオフィリンＳＥＬＥＸ  ＴＲ８．  ８回選択ラウンドにわたる実験の一般的推移を、テオフィリンカラムから明確に溶離した各選択ラウンドに対して投入された標識ＲＮＡの割合を測定することによって監視した。第１選択ラウンドでは約０．０５％ランダムＲＮＡがカラムから溶離した。８ラウンドの選択後に、この投入ＲＮＡの約６２％がテオフィリンにより溶離され、このことは出発群に較べて、約１２００倍のアフィニティ富化を示した。このＳＥＬＥＸ実験をＴＲ８と呼称した。
【実施例２４】
【０２５５】
［テオフィリンリガンドに対するカウンター−ＳＥＬＥＸ選択］
ＴＣＴ８：
第１ＳＥＬＥＸ分割プロトコールの変形を第５回ＳＥＬＥＸ選択ラウンド後に実施した。ＳＥＬＥＸプロセスの厳密さを向上させるために、異なる溶離プロトコールを採用した。洗浄直後にテオフィリンで溶離するよりも寧ろ、第５回ＳＥＬＥＸラウンド後に結合ＲＮＡを先ず０．１Ｍカフェインによってチャレンジ(challenge) 処理した。残留ＲＮＡを０．１Ｍテオフィリンで溶離した。
【０２５６】
第１カウンター−ＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、テオフィリン−結合ＲＮＡの９９．７％がカフェインによって溶離した。残りの０．３％をテオフィリンによって溶離し、増幅した。第２カウンター−ＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、結合ＲＮＡの７０％がテオフィリンによって溶離し、結合ＲＮＡの残り３０％をテオフィリンによって溶離し、増幅した。第３及び最終カウンター−ＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは“ＴＣＴ８”と命名されたＲＮＡプールが生じた。このＴＣＴ８の約８０％はテオフィリンカラムに直接結合し、出発群に較べて約４０００倍のアフィニティ富化を示した。結合ＲＮＡの中で、５４％はカフェイン作用に耐性であり、その後にテオフィリンによって溶離した。
【実施例２５】
【０２５７】
［カフェインに対するＲＮＡリガンドのＳＥＬＥＸ選択］
実施例２３に記載した実験と同様なやり方で、カフェインに対する高アフィニティＲＮＡリガンドを確認した。ＳＥＬＥＸの８回選択ラウンドをSepharose 結合カフェインを分子標的として実施した。結合ＲＮＡを過剰の遊離カフェインで溶離した。カフェインに対してアフィニティを有するＲＮＡに関するＲＮＡ群の富化は、上記テオフィリンＳＥＬＥＸ実験同様に進めた。第１選択ラウンドでは、ランダムＲＮＡの約０．０１％がカフェインによって溶離した。８回選択ラウンド後に、投入ＲＮＡの５２．５％がカフェインによって溶離した。２１種の細菌クローンがこの群から生成し、ＣＲ８と命名され、実施例２３に記載のように配列決定された。ＣＲ８配列を図５４に示す。
【０２５８】
このＣＲ８配列ファミリーの重要な特徴は、これがテオフィリンＲＮＡ結合ファミリーの１５ヌクレオチド保存モチーフに対する見かけの類似性を有さないことである（データは示さず）。このように、カフェインに対する高アフィニティに関して選択されたＲＮＡが、テオフィリンに結合するように選択されたＲＮＡから明瞭に区別されることは意外である。ＣＲ８ＲＮＡプールの１４Ｃ−カフェインとの結合特性を平衡透析により研究した。このＣＲ８ＲＮＡプールは１５μＭのKdによって、８回選択ラウンド後のテオフィリンに対するテオフィリン結合ＲＮＡ群のアフィニティとは異ならないアフィニティによってカフェインと結合した。
【実施例２６】
【０２５９】
［テオフィリンに対するＲＮＡリガンドの結合特性］
テオフィリンＳＥＬＥＸ実験に由来する特異的ＲＮＡ種の結合特性を、１４Ｃ−テオフィリン及び種々な濃度の代表的ＳＥＬＥＸリガンドＴＣＴ８−４（配列番号：２４９）を用いて平衡濾過分析により調査した。これらの実験結果は、このＴＣＴ８−４  ＲＮＡ−テオフィリン相互作用のKdが０．５８μＭであることを実証した（図５１）。このアフィニティは、テオフィリンに対して生じたモノクロナール抗体に関して観察されるアフィニティに類似する(Poncelet 等（１９９０），J. Immunoassay  １１：７７）。
【０２６０】
切頭ＲＮＡリガンドによるテオフィリンへの結合（ｍＴＣＴ８−４（配列番号：２８６））．  テオフィリンに対する高アフィニティ結合をもたらすＴＣＴ８−４リガンド中の決定因子が１５ヌクレオチド保存ドメイン中に存在するという仮説を、これらのドメインと限定フランキング残基とを含む切頭ＲＮＡの結合特性を測定することによって試験した。このミニＴＣＴ８−４ＲＮＡ構成体［ｍＴＣＴ８−４（配列番号：２８６）］（図５２）は、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡの配列から設計されたＤＮＡ鋳型から得られる３９ヌクレオチドＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写物である。ｍＴＣＴ８−４中に存在するＴＣＴ８−４配列を図４９に示す。本質的に、ｍＴＣＴ８−４はモチーフ１と２、及びＴＣＴ８−４の６bp vstem１領域と４bp vstem２領域を含む。これは、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡの２４ヌクレオチド３’固定領域を欠いている。ｍＴＣＴ８−４ＲＮＡを、インビトロにおいて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって形成し、ゲル精製し、平衡濾過分析を用いて１４Ｃ−テオフィリン結合能力に関して試験した。テオフィリンに結合しているｍＴＣＴ８−４に関してKdは０．１１μＭと測定された（図５１）。このアフィニティはＴＣＴ８−４のアフィニティよりも約７倍大きく、このことはＴＣＴ８−４中のフランキング固定配列領域の存在が、恐らくテオフィリン結合部位を含む保存配列要素のコンホメーションへのその影響のために、オリゴヌクレオチドのアフィニティを減少させることを示唆する。テオフィリン結合に必要な構造決定因子がオリゴヌクレオチドの保存領域に殆ど限定され、このオリゴヌクレオチドの特異的三次元配向は非保存フランキングステムとステム−ループドメインとによって指定される(dictated)と思われるという結論になる。
【実施例２７】
【０２６１】
［キサンチン誘導体による競合結合研究］
小分子−ＲＮＡ相互作用の魅力的な特徴は、小分子の多様な構成体の全般的結合に対する相対的寄与を、容易に定量的に調査できる機会にある。競合結合実験を種々なキサンチン誘導体及び関連化合物を用いて実施した。これらの実験では、種々な濃度で添加した競合物が１４Ｃ−テオフィリン−ＴＣＴ８−４  ＲＮＡ相互作用に及ぼす影響を測定した。殊に興味があるのは、１、３及び７位置のＣＨ３残基の役割であり；これらは個々におよび組合わせた場合の両方で評価した。さらに、テオフィリンに較べてケト型酸素を含む１，３−ジメチル尿酸によって、８位置を調べ、またキサンチンの２−位置ケト酸素を欠くハイポキサンチンがこの構成成分の評価を可能にする。
【０２６２】
１００mM  ＨＥＰＥＳバッファー含有反応混合物１５０μｌ中の１μＭ［１４Ｃ］−テオフィリンと３．３μＭ  ＴＣＴ８−４ＲＮＡ（配列番号：２４９）とに対して、種々な濃度の可能な競合物を添加して、平衡濾過検定を行った。各反応は実施例２３に記載のように行った。競合データは標準競合式及び適合手法(Gill 等（１９９１），J. Mol. Biol. ２２０：３０７）を用いて、競合物対ＲＮＡの化学量論１：１を前提にして、当てはめた。ＲＮＡに対するテオフィリンのKd＝０．４５μＭを用いた。このようなデータから、競合物解離定数（Kc）が得られた。テオフィリン及び特異的競合物が同じ部位に結合する条件下では、Kc＝Kdである。これらのデータを表１０に要約する。競合結合データを図５３に示す。
【０２６３】
ＲＮＡ結合表面の種々の特徴がこれらの研究から明らかになる。第一に、これらの結果はＳＥＬＥＸ  ＲＮＡによる認識においてキサンチン誘導体の７位置が果たす主要な役割を強調する。７−メチルキサンチンはキサンチンの少なくとも１５００倍効果が小さく、キサンチン自体はテオフィリンの約２３倍効果が小さい。キサンチンによる比較的良好な競合は、アンアドーンド(unadorned) 平面環状系がＲＮＡ結合表面によって緊密に収容されることを実証する。７−メチルキサンチンの挙動から予期されるように、テオブロミン（３，７−ジメチルキサンチン）もまたＴＣＴ８−４  ＲＮＡにより充分に認識されない。キサンチンに較べて３−メチルキサンチンの競合が約５倍良好なことから判るように、この３−位置は有効な結合エネルギーを提供する。これに反して、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡは、キサンチンに較べて、１−位置メチルに比較的認識しない。ハイポキサンチンのＲＮＡによる結合は、キサンチンに較べて、約５倍弱く、この２−位置ケト型酸素もまたこの認識に重要であることを示している。最後に、１，３−ジメチル尿酸はテオフィリンに較べると極めて認識され難く、このことは結合部位が８−位置に対して高度に敏感であることを示唆する。
【０２６４】
カフェインによる競合結合研究．
カフェインがＲＮＡ結合に関してテオフィリンの極度に弱い競合物であることを、競合結合研究は実証した。この競合データは約６．５mMのカフェインに対するKdと一致する。このように、ＴＣＴ８−４（配列番号：２４９）は、約５．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧに対応して、テオフィリンとカフェインとを少なくとも９０００倍で識別することできる。ＴＣＴ８−４切頭バージョン、ｍＴＣＴ８−４（配列番号：２８６）に較べて、この識別力は６０，０００倍である。これらの実験から、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡがこれらキサンチン誘導体の７−及び８−位置を厳密に検査する結合表面又はポケットを含み、主として、カフェインの７−位置メチル基に適応できないことに基づいて、テオフィリンとカフェインとを識別することが判る。
【実施例２８】
【０２６５】
［テオフィリンに対する高アフィニティリガンドの分子モデル製作］
クラスＩ分子とクラスII分子のそれぞれ中に存在する保存配列は、テオフィリン認識において、これらの高い識別力を究極的に合理的に説明するやり方で、空間的に配置させることができる。最初の段階として、分子モデル製作、エネルギー最少化及び保存領域とフランキング配列との分子動力学を用いて、保存配列と限定フランキング領域とから成る小オリゴヌクレオチドをモデル化する。このモデルには、ヘリカルであると予見される部分をモデル化するために、ｔＲＮＡ結晶データに由来するＡ−形ヘリカルパラメーターを組み込む。バルジ化ヌクレオチドは、このヘリカル軸中に局部的なよじれを導入すると考えられる(Riordan等（１９９２），J. Mol. Biol. ２２６：３０５）。この三塩基ピリミジンバルジを、ＮＭＲ分析によってＨＩＶ  ＴＡＲ  ＲＮＡにおいて既に分析された、同様なトラクトに基づいて、フランキングヘリカル領域内にスタックされるようにモデル化した(Puglisi等（１９９２），Science ２５７：７６）。さらに、予備的なヌクレアーゼマッピング実験は、このバルジ中の２つのＣ残基がヌクレアーゼＣＬ3 に接近不能であることを実証する（データは示さず）。この三塩基対称バルジを、２個の非Watson−Crick ＣＡ塩基対ＡＣとＡＧによってフランクされる、中央ＵＡ  Watson−Crick 塩基対を用いてモデル化した。この保存配列において可変な単一位置がＣＡまたはＡＡ対を可能にすることは注目に価する、これらの対は、Ｒｅｖタンパク質によるＨＩＶＲｅｖ  Response ElementのＲＮＡ認識を利用した人為的系統発生実験からイソステリックであると考えられる(Bartel 等（１９９１），Cell  ６７：５２９；Ellington （１９９３），Curent Biol.３：３７５）。注目すべきことには、このモデルでは、オリゴヌクエオチドの大半を含むＡ−形ヘリックスの主要溝形成に、全ての保存配列が一貫した構造的役割を演ずる。非対称ＣＣＵバルジと、非Watson−Crick 塩基対とは完全な二本鎖ＲＮＡにおける主要溝に比較して、主要溝を僅かに開く効果を有する。非WatsonCrick 塩基対によって与えられるヘリカル動揺による主要溝のこのような変形は、タンパク質−ＲＮＡ相互作用の共通テーマである(Bartel （１９９１），上記文献；Ellington （１９９３），上記文献）。テオフィリンがこの主要溝中に物理的に収容されうることは明瞭であるが、このモデルはカフェイン結合からの識別を合理的に説明するための充分な詳細に欠けている（図５３）。
【０２６６】
【表１】
2005065701.tif 000007
【０２６７】
【表２】
2005065701.tif 000008
【０２６８】
【表３】
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【０２６９】
【表４】
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【０２７０】
【表５】
2005065701.tif 000011
【０２７１】
【表６】
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【０２７２】
【表７】
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【０２７３】
【表８】
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【０２７４】
【表９】
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【０２７５】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】図１は、本発明の方法によって使用することができる、幾つかの２’−及び５’−置換ヌクレオシドを説明する。
【図２】図２は、５−アリルアミノ−ＵＴＰ（５−ＡＡ−ＵＴＰ）と、５−ブロモ−ＵＴＰ（５−Ｂｒ−ＵＴＰ）と、５−フルオレッセイン−１２−ＵＴＰ（５−Ｆ−１２−ＵＴＰ）と、５−ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ（５−Ｄｉｇ−１１−ＵＴＰ）との構造を示す。
【図３】図３は、定義された配列の８７−ｍｅｒの転写のための１５％変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。４時点は０．５、１．０、２．０及び３．０時間である。
【図４】図４は、標的の特定部位に対するオリゴヌクレオチドの結合を指示する５−ＡＡ−ＵＴＰ（ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸに関して）上の又は５−ＡＡ−ｄＵＴＰ（ＤＮＡ  ＳＥＬＥＸに関して）上の側鎖の例を示す。
【図５】図５は、５−ＡＡ−ＵＴＰ及び５−ＡＡ−ｄＵＴＰの第１級アミン基中に、カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド結合によって多様な官能基をどのように導入することができるかを示す。
【図６】図６は、ヒトトロンビンに対する、ＳＥＬＥＸによって単離したＲＮＡリガンドのヌクレオチド配列を示す。各配列は左から右へ３ブロック：（１）５’固定領域、（２）３０塩基対（３０Ｎ）可変領域、及び（３）３’固定領域に分けられる。図６ＡはクラスＩとＩＩとに分離した２’−ＯＨ  ＲＮＡリガンドを示す。図６ＢはグループＩ、II及びIII に分離した２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドを示す。
【図７】図７は、ＲＮＡリガンドの提案された二次構造を示す。図７ＡはクラスＩの２’−ＯＨ  ＲＮＡクローン１６の配列と、クラスＩＩの２’−ＯＨ  ＲＮＡクローン２７の配列とを示す。図７ＢはグループＩの２’−ＮＨ２ＲＮＡクローン３２の配列と、グループＩＩのサブＡ  ２’−ＯＨ  ＲＮＡクローン３７及びサブＢのクローン１７の配列と、グループＩＩＩの２’−ＮＨ２ＲＮＡクローン２９の配列を示す。
【図８】図８は、トロンビンリガンドの結合曲線を示す。図８Ａは非選択３０Ｎ３  ＲＮＡに対するトロンビン結合曲線（●）と、２’−ＯＨ  ＲＮＡリガンド  クラスＩクローン１６（◇）及びクラスＩＩクローン２７（Ｘ）のトロンビン結合曲線とを示す。図８Ｂは２’−ＮＨ２−３０Ｎ３（非選択）に対するトロンビン結合曲線（●）と、２’−ＯＨ  ＲＮＡリガンドクローン３２、３７及び１７に対するトロンビン結合曲線（◇）とを示す。
【図９】図９は、５−ヨード−２’−アミノ，２’−デオキシウリジンの４工程合成を説明する。
【図１０】図１０は、２’−アミノ，２’−デオキシウリジン  ５’−トリホスフェートの合成を説明する。
【図１１】図１１は、トロンビンに対する３２Ｐ標識ＲＮＡリガンドを注入した実験ラット５匹の各々に関して得られた血漿動力学曲線を示す。血液サンプルは１、２、４、７及び２４時間目に採取した。
【図１２】図１２は、５−（３−アミノアリル）−ウリジントリホスフェート（ＡＡ−ＵＴＰ）の構造と、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＵＴＰ（ＲＧＤ−ＵＴＰ）を製造するための合成スキームとを説明する。反応条件の詳細は実施例８に記載する通りである。
【図１３】図１３Ａは、Ｍｏｎｏ  Ｑアニオン交換カラムクロマトグラフィーによるスクシニル−ＵＴＰの単離を示す。図１３Ｂはフラクション対２９０nmにおける光学濃度を示す。実施例８に記載するように、スクシニル−ＵＴＰはフラクション４３〜４９として溶出した。
【図１４】図１４Ａは、Ｍｏｎｏ  Ｑアニオン交換カラムクロマトグラフィーによるＲＧＤ−ＵＴＰの単離を示す。図１４Ｂはフラクション対２９０nmにおける光学濃度を示す。実施例８に記載するように、ＲＧＤ−ＵＴＰはフラクション３５〜３８として溶出した。
【図１５】図１５は、アミノアリル−ＵＴＰ、スクシニル−ＵＴＰ及びＲＧＤ−ＵＴＰの薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１６】図１６は、アニオン交換クロマトグラフィーによるＲＧＤ−ＵＴＰ  ＲＮＡ転写体の結果を示す。Ｍｏｎｏ  Ｑアニオン交換カラムからのＰＧＤ−ＵＴＰ  ＲＮＡ（□）とＲＮＡ（◆）との溶離を示す。
【図１７】図１７は、Superdex  ２００（Pharmacia)上でのサイズ排除クロマトグラフィーによるＲＧＤ−３０ｎ７とｇｐＩＩｂＩＩＩａの分離を示す。ｇｐＩＩｂＩＩＩａに結合したＲＧＤ−３０ｎ７の溶離プロフィル（□）とＲＧＤ−３０ｎ７の溶離プロフィル（◆）とを示す。
【図１８】図１８は、高アフィニティ一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ−１７）に対する阻害性基質ペプチドＮ−メトキシスクシニル  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）ケトンの結合の化学を示す。
【図１９】図１９は、５０mM  ＤＴＴによる１．９５mM  Ｎ−メトキシスクシニルＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチル（配列番号：４１）の不活化を示す。
【図２０】図２０は、２０mM  ＤＴＴの存在下でのブレンド核酸リガンドの阻害を示す。
【図２１】図２１は、クロロメチルケトンによって５’末端に共役したＤＮＡ−１７によるエラスターゼ阻害（○）と、クロロメチルケトンによって３’末端に共役したＤＮＡ−１７によるエラスターゼ阻害（●）とを示す。
【図２２】図２２は、Ｎ−メトキシスクシニル  Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：４４）（●）と、ペプチド共役オリゴヌクレオチド（□）と、基質単独（○）とによるエラスターゼ阻害のLineweaver−Burkプロットである。
【図２３】図２３は、３’末端に共役した阻害剤を含むＤＮＡと、含まないＤＮＡとによるエラスターゼ阻害を、ウロキナーゼ及びトロンビンに対する共役リガンドと非共役リガンドの効果に比較して示す。
【図２４】図２４は、以下の実施例１１で用いるような、核酸セグメントに結合したバリルホスホネート部分と、この種とヒト好中球エラスターゼとの反応とを示す。
【図２５】図２５は、ゲル電気泳動によって測定した、５ラウンドのＳＥＬＥＸ後のスプリント  ブレンドＳＥＬＥＸ核酸リガンドのプールの一次速度定数を示す；ＴＢＥ  pH８（■）及びＭＡＥ  pH６（●）。
【図２６】図２６は、実施例１２と１３に記載するＶＥＧＦ  ＳＥＬＥＸ実験に用いる出発ＲＮＡ及びＰＣＲプライマーを示す。
【図２７−１】図２７は、ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンドの６ファミリー（一次配列相同によってグループ分け）に関するアラインド(aligned）配列と予測二次構造とを示す。矢印は二本鎖（ステム）領域の逆方向反復に下線を施す。定常配列領域と進化配列領域とにおけるヌクレオチドを区別するために、それぞれ、小文字と大文字とを用いる。位置は、示したウィンドウの５’末端に最も近い進化ヌクレオチドから（任意に）出発して、連続的に番号を付ける。
【図２７−２】図２７は、ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンドの６ファミリー（一次配列相同によってグループ分け）に関するアラインド(aligned）配列と予測二次構造とを示す。矢印は二本鎖（ステム）領域の逆方向反復に下線を施す。定常配列領域と進化配列領域とにおけるヌクレオチドを区別するために、それぞれ、小文字と大文字とを用いる。位置は、示したウィンドウの５’末端に最も近い進化ヌクレオチドから（任意に）出発して、連続的に番号を付ける。
【図２８】図２８は、ある種のＶＥＧＦリガンドファミリーに関する共通配列と予測二次構造とを示す。＞６０％但し＜８０％の頻度で生ずる位置を明示するために、簡単なテキスト(plain text)を用いる。個々のヌクレオチドが強度に維持される位置（頻度＞８０％）を略述する。括弧内の残基はその位置において空隙に等しい頻度で生ずる。図２７の説明に記載した番号付け系を用いる。Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｙ＝Ｃ又はＵ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｄ＝Ａ、Ｇ又はＵ；Ｖ＝Ｇ、Ａ又はＣ；Ｓ＝Ｇ又はＣ；Ｋ＝Ｇ又はＵ；Ｎ＝任意の塩基及びプライム（’）は相補的塩基を指示する。
【図２９】図２９は、ＶＥＧＦに対する典型的な高アフィニティリガンドセットの結合曲線を示す。試験した全長リガンド（○）と切形リガンド（△）とは１００（配列番号：５５）と１００ｔ（配列番号：９５）（ファミリー１，図２９Ａ）；４４（配列番号：６４）と４４ｔ（配列番号：９６）（ファミリー２，図２９Ｂ）；１２（配列番号：６６）（配列番号：）と１２ｔ（配列番号：９７）（ファミリー３，図２９）；４０（配列番号：２８）と４０ｔ（配列番号：９８）（ファミリー４，図２９Ｄ）；８４（配列番号：８０）と８４ｔ（配列番号：９９）（ファミリー５，図２９Ｅ）；及び１２６（配列番号：８２）と１２６ｔ（配列番号：１００）（ファミリー６，図２９Ｆ）であった。ニトロセルロースフィルターに結合した３２Ｐ−標識ＲＮＡのフラクションを全タンパク質濃度の関数としてプロットし、ラインはｅｑ．２（４０ｔ、８４及び８４ｔ）又はｅｑ．５（他の全てのリガンド）へのデータ点の適合を示す。ＲＮＡ濃度は２６０nmにおける吸光度読み取りから測定した（そして、典型的に＜５０pMであった）。結合反応は０．０１％ヒト血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化生理食塩水中で３７℃において実施された。
【図３０】図３０は、代表的な高アフィニティＶＥＧＦリガンド（リガンド１２（配列番号：６６））に関する３’−及び５’−境界の測定結果を示す。３’−境界測定（図３０Ａ）は、８％変性ポリアクリルアミドゲル上で分解された、部分的加水分解された５’−末端標識ＲＮＡ（レーン４）、５nM（レーン１）、０．５nM（レーン２）又は０．１２５nM（レーン３）における部分的加水分解されたＲＮＡのＶＥＧＦ添加インキュベーション後にニトロセルロースフィルター上に保留された加水分解フラグメント、及び５’−末端標識ＲＮＡのＲＮアーゼＴ１による部分的ダイジェストを示す。５’−境界（図３０Ｂ）は、３’−末端において放射能標識したＲＮＡを用いた以外は、同じやり方で測定した。ＲＮアーゼＴ１ダイジェスト（レーン１）、部分的アルカリ加水分解（レーン２）、及び５nM（レーン３）、０．５nM（レーン４）又は０．１２５nM（レーン５）におけるＶＥＧＦ添加インキュベーション後のニトロセルロースフィルター上に保留された加水分解フラグメントが示される。矢印は最小リガンド１２（イタライズド(italized)）の３’−境界及び５’−境界を指示する。
【図３１】図３１はＨＵＶＥＣＳに対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦ結合のScotchard 分析を示す。データ点は２回測定の平均値である。増加する濃度の１２５Ｉ−ＶＥＧＦを５０倍過剰の非標識ＶＥＧＦの存在下又は不存在下で２Ｘ１０５細胞と共にインキュベートして、遊離１２５Ｉ−ＶＥＧＦ濃度（インサート）の関数として１２５Ｉ−ＶＥＧＦの総量（○）、特異的結合（□）及び非特異的結合（△）を測定した。
【図３２】図３２は、ＲＮＡ濃度の関数として、細胞表面受容体に関する１２５Ｉ−ＶＥＧＦの結合に対するランダムＲＮＡ（○）と、代表的な高アフィニティＲＮＡリガンド１００ｔ（配列番号：９５）（ファミリー１）（△）と、４４ｔ（配列番号：９６）（ファミリー２）（□）との影響を示す。他の配列ファミリーを表す高アフィニティリガンドの阻害影響は、リガンド１００ｔ及び４４ｔの阻害影響と実質的に同じである。
【図３３】図３３は、実験ＡとＢの出発ランダムＲＮＡと、ＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２−ＲＮＡリガンドの確認（実施例１５）に用いたＰＣＲプライマーとを示す。
【図３４−１】図３４は、実施例１５に記載するＳＥＬＥＸ方法によって確認されるＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２−ＲＮＡリガンドを示す。
【図３４−２】図３４は、実施例１５に記載するＳＥＬＥＸ方法によって確認されるＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２−ＲＮＡリガンドを示す。
【図３４−３】図３４は、実施例１５に記載するＳＥＬＥＸ方法によって確認されるＶＥＧＦに対する２’−ＮＨ２−ＲＮＡリガンドを示す。
【図３５】図３５は、ヒト（●）エラスターゼ（Ｋｄ＝１４．５nM）とブタ（○）エラスターゼ（Kd＝１．３μＭ）とに対する典型的なリガンド１４（配列番号：２００）の結合を示す、この場合にエラスターゼ濃度は１０−１０Ｍから１０−６Ｍまで変化した。
【図３６】図３６は、典型的なリガンド３４（配列番号：１９７）のエラスターゼ阻害活性を示す。ｐ−ニトロアニリドの形成をエラスターゼの不存在下（○）、不可逆的阻害剤Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンの存在下（●）、任意の阻害剤の不存在下（□）、及び１８０nMリガンド３４の存在下（◇）で測定した。
【図３７】図３７Ａは、リガンド２４（配列番号：１９８）と３０（配列番号：１９１）（クラスＩとII）との間で実施した競合実験の結果を示す。図３７Ｂは、リガンド５６（配列番号：１９５）と１９（配列番号：２０５）（クラスIIとIV）との間で実施した競合実験の結果を示す。
【図３８】図３８は、Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトンに不可逆的に結合したエラスターゼ（○）（Ｋｄ＝２６nM）に、又はネイティブエラスターゼ（●）（Ｋｄ＝２５nM）に対する典型的なリガンド３４（配列番号：１９７）の結合を示す。
【図３９】図３９は、α−１−プロティナーゼ阻害剤（α−１ＰＩ）と複合体化したエラスターゼ（○）又はネイティブエラスターゼ（●）に対する典型的なリガンド３４（配列番号：１９７）の結合を示す。
【図４０】図４０は、エラスターゼのα−１ＰＩ誘導阻害に対する典型的リガンド１９（配列番号：２０５）の付加的効果を示す。ｐ−ニトロアニリドの形成をエラスターゼ単独の存在下（◆）、５nM  α−１ＰＩの存在下（○と●）、５nM  α−１ＰＩ及び３２５nMリガンド１９の存在下（□と△）で測定した。
【図４１】図４１は、エラスターゼ単独によって、又は阻害性リガンド２４（配列番号：１９８）、３０（配列番号：１９１）若しくは１９（配列番号：２０５）の存在下のエラスターゼによって実施した細胞脱離アッセイの結果を示す。
【図４２】図４２は、Ｇ−クァルテット配列（配列番号：１９７）の予測二次構造を示す。
【図４３】図４３は、６mM  ＫＣｌの存在下及び不存在下におけるエラスターゼに対するリガンド２１（配列番号：１９５）と、リガンド２４（配列番号：１９８）と、リガンド３４（配列番号：１９７）とのエラスターゼに対する結合アフィニティを示す。
【図４４】図４４は、エラスターゼに対する２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンド１４（配列番号：２００）（３’−固定配列トランケート）と非修飾一本鎖ＤＮＡリガンド１７（配列番号：１９１）との結合へのpHの影響を示す。
【図４５】図４５は、予測Ｇ−クァルテット構造と、結合ループヌクレオチドを合成エチレングリコールのリンカーテザー(linker tether）によって置換した模倣分子とを示す。
【図４６】図４６は、２’−ＮＨ２−ＲＮＡ  ＳＥＬＥＸプライマー−鋳型構造（プライマー−鋳型−混合物Ｉ）と、ｓｓＤＮＡ  ＳＥＬＥＸプライマー−鋳型構造（プライマー−鋳型−混合物II）とを示す。
【図４７】図４７は、テオフィリン及びカフェインの構造を示す。
【図４８Ａ】図４８は、ＳＥＬＥＸ方法によって（名称  ＴＲ８（配列番号：２５１〜２５３、２５６〜２５８））、及びカウンター−ＳＥＬＥＸ方法によって（名称  ＴＣＴ８（配列番号：２４７〜２５０、２５４〜２５５））選択された、テオフィリンに対してアフィニティを有する２クラスのＲＮＡ分子のアラインド配列を示す。図２ＡはクラスＩ配列を示す。図２ＢはクラスII配列を示す。配列を誘導したクローン番号は配列の左側に示す。場合によっては、多重単離物が得られた。図示した配列はＳＥＬＥＸプロセスの開始時に最初はランダムであった４０ヌクレオチド配列を含有した。太い大文字の配列は維持される配列であり、アラインメントの基礎を与える。矢印は可能な分子内相補的塩基の領域に上線を施す。星印は、可変性を示すモチーフ１における単一位置を標識する。点線はヌクレオチドの不存在を表す。クラスＩとIIはサーキュラーパーミュテーションによって関連づけられる。
【図４８Ｂ】図４８は、ＳＥＬＥＸ方法によって（名称  ＴＲ８（配列番号：２５１〜２５３、２５６〜２５８））、及びカウンター−ＳＥＬＥＸ方法によって（名称  ＴＣＴ８（配列番号：２４７〜２５０、２５４〜２５５））選択された、テオフィリンに対してアフィニティを有する２クラスのＲＮＡ分子のアラインド配列を示す。図２ＡはクラスＩ配列を示す。図２ＢはクラスII配列を示す。配列を誘導したクローン番号は配列の左側に示す。場合によっては、多重単離物が得られた。図示した配列はＳＥＬＥＸプロセスの開始時に最初はランダムであった４０ヌクレオチド配列を含有した。太い大文字の配列は維持される配列であり、アラインメントの基礎を与える。矢印は可能な分子内相補的塩基の領域に上線を施す。星印は、可変性を示すモチーフ１における単一位置を標識する。点線はヌクレオチドの不存在を表す。クラスＩとIIはサーキュラーパーミュテーションによって関連づけられる。
【図４９−１】図４９は、ＴＲ８  ＳＥＬＥＸ実験とＴＣＴ８  ＳＥＬＥＸ実験とによって得られるテオフィリン結合ＲＮＡ種の予測二次構造を示す。シャドーテキスト中の塩基は、ランダム領域にフランクした固定５’又は３’領域のいずれかに最初存在した。いずれの固定領域も提案された構造に寄与することができることに注目のこと。ＴＣＴ８−４リガンド（配列番号：２４９）中の矢印は、位置１−３８ＡＵ対がｍＴＣＴ８−４におけるＧＣ対に変化したことを除いて、微小誘導体ｍＴＣＴ８−４の末端を表す。
【図４９−２】図４９は、ＴＲ８  ＳＥＬＥＸ実験とＴＣＴ８  ＳＥＬＥＸ実験とによって得られるテオフィリン結合ＲＮＡ種の予測二次構造を示す。シャドーテキスト中の塩基は、ランダム領域にフランクした固定５’又は３’領域のいずれかに最初存在した。いずれの固定領域も提案された構造に寄与することができることに注目のこと。ＴＣＴ８−４リガンド（配列番号：２４９）中の矢印は、位置１−３８ＡＵ対がｍＴＣＴ８−４におけるＧＣ対に変化したことを除いて、微小誘導体ｍＴＣＴ８−４の末端を表す。
【図５０】図５０は、テオフィリン結合ＲＮＡ種の予測二次構造を説明する。ＮとＮ’とは任意の相補的塩基対である。数字は得られたリガンド中に観察される種々なドメインのサイズ範囲を表す。
【図５１】図５１は、ＴＣＴ８−４（配列番号：２４９）とｍＴＣＴ８−４  ＲＮＡとの結合特性を示す。
【図５２】図５２は、ｍＴＣＴ８−４の予測二次構造を示す。
【図５３】図５３は、キサンチン誘導体の、ＴＣＴ８−４  ＲＮＡ（配列番号：２４９）との競合結合分析を示す。
【図５４】図５４は、カフェインに対するＲＮＡリガンドの配列（ＣＲ８（配列番号：２５９〜２７０））を示す。これらのリガンドは８ＳＥＬＥＸラウンド後に確認された。
【図５５】図５５は、実施例２７に記載する、ＴＣＴ８−４ＲＮＡによる競合結合実験に用いた一連の誘導体と共にテオフィリンの化学構造を示す。括弧内の数字はテオフィリンに対する競合体の効率、Ｋｃ（ｃ）／Ｋｃ（ｔ）を表す。Ｋｃ（ｃ）は個々の競合体の解離定数であり、Ｋｃ（ｔ）はテオフィリンの競合解離定数である。１−ｃｐテオフィリンは１−カルボキシプロピルテオフィリンである。“＞”によって表示される、ある一定のデータは競合体の溶解性によって限定される最小値である。各実験は２通りに実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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