(57)【要約】【課題】  抗体を簡便に効率よく細胞内に導入する方法を提供する。【解決手段】  抗体結合タンパク質の全部又は一部と、細胞膜透過性ペプチドとを含む融合タンパク質、及びこの融合タンパク質を利用して、細胞内へタンパク質を導入する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体結合タンパク質の全部又は一部と、細胞膜透過性ペプチドとを含む融合タンパク質。
【請求項２】
抗体結合タンパク質が、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、又はプロテインLである請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
細胞膜透過性ペプチドが、配列番号１乃至３３のいずれか一つの配列番号記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするDNA。
【請求項５】
請求項４記載のDNAを含むベクター。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか一項記載の融合タンパク質を有効成分として含有するタンパク質の細胞内導入試薬。
【請求項７】
タンパク質が、抗体である請求項６記載のタンパク質の細胞内導入試薬。
【請求項８】
（１）請求項１乃至３のいずれか一項記載の融合タンパク質、（２）導入しようとする抗体、及び（３）抗体の導入対象とする細胞の三者を共存させることを特徴とする抗体の細胞内導入方法。
【請求項９】
導入しようとするタンパク質と、このタンパク質と結合可能な抗体を共存させ、抗体とタンパク質の結合体を作製し、その後、（１）請求項１乃至３のいずれか一項記載の融合タンパク質、（２）前記抗体とタンパク質の結合体、及び（３）タンパク質の導入対象とする細胞の三者を共存させることを特徴とするタンパク質の細胞内導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体などを細胞内へ導入する方法、及びにそれに用いる試薬などに関する。この方法は、細胞を傷つけることなく、簡易な手法で細胞内へ抗体などを導入することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞内への抗体の導入法は、これまでマイクロインジェクションやエレクトロポレーションといった物理的に細胞に穴を開ける方法と細胞膜透過性ペプチドを利用した方法が報告されている。しかし物理的に細胞に穴を開ける方法は特殊な装置を必要とし、細胞へのダメージが大きいうえに、導入効率の低さが問題となっている。一方ペプチドを利用した方法では、抗体に膜透過性ペプチドを非特異的に吸着させる、あるいは化学的にペプチドを抗体に結合させる方法が報告されている。特に前者は既に、Activemotif社のChariotとして商品化されている。しかしこの方法では、抗体とペプチドを非特異的に結合させるため、他のタンパク質の存在下では目的物以外のタンパク質が導入される可能性がある。また、抗体への化学結合法は種々の抗体毎に結合反応・精製を行う必要がある。
【０００３】
【非特許文献１】NatureBiotechnology, 19, 1173-1176, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗体の細胞内への導入は、抗体の標的となるタンパク質の生細胞内での動態解析を行う上で有効な技術であり、生命科学分野の研究における強力なツールとなる。また、細胞内に導入された抗体と標的タンパク質の結合により、標的タンパク質の機能が阻害されることから、抗体医薬として医療分野での利用も期待出来る。細胞内への抗体導入において、特異性や導入効率が問題となる。
【０００５】
本発明は、抗体を簡便に効率よく細胞内に導入する方法の開発を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、抗体結合タンパク質と細胞膜透過性ペプチドからなる融合タンパク質を利用することにより、抗体を簡便かつ効率的に細胞内に導入できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕抗体結合タンパク質の全部又は一部と、細胞膜透過性ペプチドとを含む融合タンパク質。
〔２〕抗体結合タンパク質が、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、又はプロテインLである〔１〕記載の融合タンパク質。
〔３〕細胞膜透過性ペプチドが、配列番号１乃至３３のいずれか一つの配列番号記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである〔１〕記載の融合タンパク質。
〔４〕〔１〕乃至〔３〕のいずれか記載の融合タンパク質をコードするDNA。
〔５〕〔４〕記載のDNAを含むベクター。
〔６〕〔１〕乃至〔３〕のいずれか記載の融合タンパク質を有効成分として含有するタンパク質の細胞内導入試薬。
〔７〕タンパク質が、抗体である〔６〕記載のタンパク質の細胞内導入試薬。
〔８〕（１）〔１〕乃至〔３〕のいずれか記載の融合タンパク質、（２）導入しようとする抗体、及び（３）抗体の導入対象とする細胞の三者を共存させることを特徴とする抗体の細胞内導入方法。
〔９〕導入しようとするタンパク質と、このタンパク質と結合可能な抗体を共存させ、抗体とタンパク質の結合体を作製し、その後、（１）〔１〕乃至〔３〕のいずれか記載の融合タンパク質、（２）前記抗体とタンパク質の結合体、及び（３）タンパク質の導入対象とする細胞の三者を共存させることを特徴とするタンパク質の細胞内導入方法。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明の融合タンパク質は、抗体結合タンパク質の全部又は一部と、細胞膜透過性ペプチドとを含むものである。
【００１０】
抗体結合タンパク質は、抗体と結合することができるものであれば特に限定されず、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質であるプロテインA、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の微生物群由来のタンパク質であるプロテインG、プロテインAとプロテインGを遺伝子工学的に融合させたプロテインA/G、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus magnus）由来のタンパク質であるプロテインLなどを使用することができる。
【００１１】
抗体結合タンパク質は、タンパク質全体を使用してもよいが、抗体結合能を持つドメイン（例えば、プロテインAのBドメイン）のみを使用してもよい。
【００１２】
細胞膜透過性ペプチドも特に限定されず、一般的に知られている細胞膜透過性ペプチド、例えば、Journal of BiologicalChemistry, 277(4), 2437-2443, 2002、Current Opinion in Molecular Therapeutics, 2(2),162-167, 2000、TRENDS in Biotechnology, 19(1), 21-28, 2001などに記載されているペプチドを使用することができる。具体的には、以下のペプチドを使用することができる。
HIVTAT(YGRKKRRQRRR)〔配列番号１〕
KaposiFGF (AAVALLPAVLLALLAP)〔配列番号２〕
Grb2(AAVLLPVLLAAP)〔配列番号３〕
Integrinβ3 (VTVLALAGVGVG)〔配列番号４〕
HIV-1gp41 (GALFLGFLGAAGSTMGA)〔配列番号５〕
InfluenzaHA-2 (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)〔配列番号６〕
Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK)〔配列番号７〕
HerpesSimplex Virus VP22 (DAATATRGRSAASPRTERPRAPARSASRPRRPVE)〔配列番号８〕
W/R(RRWRRWWRRWWRRWRR)〔配列番号９〕
NLS(KKKRKV)〔配列番号１０〕
AlkCWK(CWKKKKKKKKKKKKKKKKKK)〔配列番号１１〕
DiCWK18(K18WCCWK18)〔配列番号１２〕
Transportan (GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL)〔配列番号１３〕
DipaLytic(GLFEALEELWEAK)〔配列番号１４〕
HIV-1 Rev(TRQARRNRRRRWRERQR)〔配列番号１５〕
R9-TAT(GRRRRRRRRRPPQ)〔配列番号１６〕
R8(RRRRRRRR)〔配列番号１７〕
FHV coat(RRRRNRTRRNRRRVR)〔配列番号１８〕
BMV-gag(KMTRAQRRAAARRNRWTAR)〔配列番号１９〕
HTLV-IIRex (TRRQRTRRARRNR)〔配列番号２０〕
huamn cFOS (KRRIRRERNKMAAAKSRNRRRELTDT)〔配列番号２１〕
human cJUN (RIKAERKRMRNRIAASKSRKRKLERIAR)〔配列番号２２〕
YeastGCN-4 (KRARNTEAARRSRARKLQRMKQ)〔配列番号２３〕
P1(K16GGCMFGCGG)〔配列番号２４〕
P3a (VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA)〔配列番号２５〕
P9.3 (IGRIDPANGKTKYAPKFQDKATRSNYYGNSPS)〔配列番号２６〕
Plae(PLAEIDGIELTY)〔配列番号２７〕
Kplae(K16GGPLAEDGIELGA)〔配列番号２８〕
cKplae(K16GGPLAEDGIELCA)〔配列番号２９〕
Hel-11-7 (KLLKLLLKLWLKLLKLLL)〔配列番号３０〕
KK(KKKKKKKKGGC)〔配列番号３１〕
KWK(KWKKKWKKGCC)〔配列番号３２〕
RWR (RWRRRWRRGGC)〔配列番号３３〕
なお、上記のアミノ酸配列には、L体のアミノ酸だけでなく、D体のアミノ酸も含まれる。
【００１３】
本発明の融合タンパク質は、抗体結合タンパク質、細胞膜透過性ペプチドのほかにも他のタンパク質やペプチドを含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の融合タンパク質は、抗体と特異的に結合し、それを細胞内に導入することができるので、抗体の細胞内導入方法に利用することができる。具体的には、（１）本発明の融合タンパク質、（２）導入しようとする抗体、及び（３）抗体の導入対象とする細胞の三者を共存させることにより、抗体を細胞内に導入することができる。
【００１５】
導入しようとする抗体は、融合タンパク質に含まれる抗体結合タンパク質と結合可能なものを用いる。例えば、抗体結合タンパク質がプロテインAであれば、ウサギIgG、ヒトIgG、ブタIgGなどを使用し、プロテインGであれば、マウスIgG、ヤギIgG、ヒツジIgGなどを使用し、プロテインLであれば、マウスIgG、ラットIgGなどを使用する。
【００１６】
抗体の導入対象とする細胞は主として動物細胞であるが、他の細胞を対象としてもよい。
【００１７】
抗体の導入時における融合タンパク質の濃度は特に限定されないが、0.5〜2 μg/ml程度とするのが好適である。また、抗体の濃度も特に限定されないが、0.5〜10μg/ml程度とするのが好適である。更に、細胞の濃度も限定されないが、1x104〜1x105 cells/cm2程度とするのが好適である。
【００１８】
融合タンパク質、抗体、細胞の三者を共存させる時間は特に限定されないが、4〜18時間程度とするのが好適である。
【００１９】
この抗体の導入方法では、融合タンパク質を抗体と共存させるだけで、融合タンパク質は抗体と結合し、これを細胞内へ導入するので、簡便に抗体の導入を行うことができる。また、融合タンパク質は、抗体と特異的に結合するので、培地中に他のタンパク質（例えば、血清中に含まれるタンパク質など）が存在していても、他のタンパク質を導入することなく、抗体のみを細胞内に導入することができる。
【００２０】
上記の抗体の導入方法を利用し、抗体以外のタンパク質の導入を行うことも可能である。具体的には、導入しようとするタンパク質と、このタンパク質と結合可能な抗体を共存させ、抗体とタンパク質の結合体を作製し、その後、（１）本発明の融合タンパク質、（２）前記抗体とタンパク質の結合体、及び（３）タンパク質の導入対象とする細胞の三者を共存させることにより、タンパク質を導入することが可能である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、細胞を傷つけることなく、簡便に抗体などのタンパク質を細胞内に導入できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
細胞膜透過性ペプチドとして、HIV由来のTATタンパク質中に存在するYGRKKRRQRRRの細胞膜透過ドメイン配列を利用した。このペプチド配列に対応するDNAを合成し、発現プラスミドpET-32cに挿入した。TATをコードする遺伝子の下流に、抗体結合能を有するタンパク質であるプロテインAのBドメインをコードする遺伝子を挿入し、TAT-Bドメイン発現ベクターpET-TAT-Bを構築した。このプラスミドにより大腸菌BL21(DE3)株を形質転換して、IPTGによりTAT-Bドメイン融合タンパク質の発現を誘導した。発現した組換えタンパク質は、ヒスチジンタグを利用してニッケルカラムにより精製した。また同時にコントロールとしてTAT配列を欠損させたBドメインタンパク質のプラスミドも作製し、発現させた。このTAT-Bドメイン、B-ドメインタンパク質が抗体結合能を有することは、ウエスタンブロッティングにより確認した(図１)。
【００２４】
抗体の細胞導入は、次の様に行った。精製した各タンパク質(0.25-1μg)と蛍光標識されたウサギIgG(10μg)とを30μlのリン酸緩衝液中で混合し10分間室温でインキュベーションした。その後、2mlの血清入り培地の入った6穴プレート内で培養したマウス繊維芽細胞3T3L1に混合液を添加した。添加12時間後の細胞をレーザー共焦点顕微鏡で観察した(図２)。その結果、Bドメインタンパク質では蛍光は観察されなかったが、TAT-Bドメインタンパク質では細胞内に蛍光が観察され、TAT-Bドメインにより抗体が細胞内に導入されていることが確認された。また、タンパク質濃度を変化させ細胞に加え、12時間後に細胞をトリプシン処理しフローサイトメターにより蛍光強度を測定した。その結果Bドメインタンパク質を添加した細胞では蛍光強度の変化は見られなかったが、TAT-B3ドメインタンパク質ではタンパク濃度に依存した蛍光強度の増加が確認できた(図３)。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】融合タンパク質の抗体結合能を確認するためのウエスタンブロッティングの結果を示す図。
【図２】抗体を導入した細胞のレーザー共焦点顕微鏡画像。
【図３】抗体導入量の測定結果を示す図。
【図３】
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【図１】
2005052083.tif 000003
【図２】
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【配列表】
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