(57)【要約】【課題】  大きく配列の離れた変異体から構成される人工タンパク質遺伝子ライブラリーを調製するために、あらかじめ３つの翻訳読み枠のストップコドンを排除したＤＮＡに対して、ランダムな翻訳読み枠の乗換え変異を導入し変異体集団を調製することにより、タンパク質分子多様性集団の作製方法を提供すること。【解決手段】  天然の遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼで増幅することにより、ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を調製し、該遺伝子ＤＮＡ集団を常法により発現させ、タンパク質分子多様性集団を作製する。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼで増幅することにより、ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を調製し、該遺伝子ＤＮＡ集団を発現させることを特徴とするタンパク質分子多様性集団の作製方法。
【請求項２】
複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼが、複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法。
【請求項３】
複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法。
【請求項４】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法。
【請求項５】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、所定の機能を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、前記所定の機能を有するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、前記所定の機能と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法。
【請求項６】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」を付加し、ＤＮＡ配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列「ａ」及び「ｂ」を調製し、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子のリガーゼ反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法。
【請求項７】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼで増幅することを特徴とするランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法。
【請求項８】
複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼが、複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項７記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法。
【請求項９】
複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項８記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法。
【請求項１０】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法。
【請求項１１】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、所定の機能を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、前記所定の機能を有するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、前記所定の機能と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製することを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法。
【請求項１２】
遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」を付加し、ＤＮＡ配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列「ａ」及び「ｂ」を調製し、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子のリガーゼ反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フレームシャッフリングによるタンパク質分子多様性集団の作製方法、及びそれに用いられるランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試験管内進化法を用いてタンパク質の機能特化をおこなう場合、まず、タンパク質の変異体集団ライブラリーを調製し、このライブラリー中から狙った機能を持つタンパク質クローンを選択する、といった手順がとられる。変異体集団の調製法としては、error prone ＰＣＲ法（例えば、非特許文献１参照。）やＤＮＡシャッフリング法（例えば、非特許文献２参照。）が現在よく使われている。
【０００３】
error prone ＰＣＲは、親遺伝子を鋳型としてマンガンイオン存在下でＰＣＲ増幅をおこなうことにより、親遺伝子にランダムに塩基置換を導入して変異体集団ライブラリーを調製する方法である。error prone ＰＣＲで塩基置換変異導入効率を上げた場合に、アミノ酸置換のみならず、アミノ酸をコードするコドンがストップコドンに置換されてしまう確率も高くなってしまうといった問題が存在する。また、このerror prone ＰＣＲでは、変異の割合を上昇させるような条件では意図しない欠失変異が起こりやすく(例えば、非特許文献３参照。)、その結果、他の読み枠にコードされているストップコドンが出現してしまう問題点を有している。そのため、error prone ＰＣＲは、通常は低い変異導入率、すなわち、遺伝子あたり２から３塩基の置換、アミノ酸として１残基の変異率が導入されるような条件で行われる。
【０００４】
ＤＮＡシャッフリング法は、あるタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ及び配列相同性をもつ１つ又は複数の類似ＤＮＡを用いて、それらを試験管内で相同組み換えさせることにより、比較的幅広い変異をもった変異体集団ライブラリーを調製することができる。しかしながら、ＤＮＡシャッフリング法は相同組み換えを基本としているため、配列類似性の低いＤＮＡ間でシャッフリングさせることは困難である。
【０００５】
以上のように従来の変異体集団ライブラリー調整法であるerror prone ＰＣＲ法やＤＮＡシャッフリング法では、得られる変異体集団は出発材料の遺伝子によく似た保守的な集団となり、親株から大きく配列の離れた変異体を得ようとした場合、これらの手法には限界がある。
【０００６】
他方、あらかじめ、各翻訳読み枠の停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡの調製方法として、高分子マイクロ遺伝子重合体の作製方法(例えば、特許文献１参照。)、多機能塩基配列およびそれを含む人工遺伝子の作製方法(例えば、特許文献２参照。)、マイクロ遺伝子のランダム重合体作製法（例えば、特許文献３、非特許文献４参照。）が本発明者らにより提案されている。
【特許文献１】特許第３４１５９９５号公報
【特許文献２】特開２００１−３５２９９０号公報
【特許文献３】特開平９−１５４５８５号公報
【非特許文献１】Cadwell R. C., et al. PCR Methods Appl, 2:28-33 1992
【非特許文献２】Stemmer W. P. C. Nature, 370:389-391 1994
【非特許文献３】Arnold F. H. et al., Trends Biochem. Sci., 26:100-106, 2001
【非特許文献４】Shiba K., et al., J. Biochem. 132:689-696, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、大きく配列の離れた変異体から構成される人工タンパク質遺伝子ライブラリーを調製するために、あらかじめ３つの翻訳読み枠のストップコドンを排除したＤＮＡに対して、ランダムな翻訳読み枠の乗換え変異を導入し変異体集団を調製することにより、タンパク質分子多様性集団の作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
アミノ酸をコードするコドンは３塩基単位で翻訳されるため、１つの遺伝子ＤＮＡ配列は読み枠をずらすことにより３種のタンパク質をコードすることになる。つまり、ある天然遺伝子は実際には使われていない読み枠を含めて３倍の情報を含んでいると考えることもできる。したがって、翻訳読み枠の乗り換え変異を導入することにより、他の翻訳読み枠の情報を活用でき、その結果、親株と配列の似た変異体集団しか得られないといった従来の問題を回避できることになる。これをフレームシャッフリング法と呼ぶ。
【０００９】
フレームシャッフリング法を行うためには、乗り換え変異を導入する標的ＤＮＡの全ての読み枠でストップコドンが出現しないことが望ましい。さもなければ、翻訳読み枠の乗り換え変異を導入しても、短い翻訳産物しか得られないと予想される。
【００１０】
全ての読み枠でストップコドンが出現しないＤＮＡを調製するには、１つには、あるタンパク質配列をコードする天然遺伝子から出発して、遺伝子工学的手法により、タンパク質配列をコードしている以外の読み枠のストップコドンを排除することにより可能となる。
【００１１】
もう１つのより望ましい方法としては、芝らの発明した高分子マイクロ遺伝子重合体の作製手法（特許３４１５９９５号、及び、Shiba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3805-3810, 1997）を用いることにより、全ての翻訳読み枠のストップコドンが排除された人工遺伝子を準備することができる。この方法は、あらかじめ終止コドンが排除された短いＤＮＡ配列（マイクロ遺伝子）をタンデムに重合し大きな翻訳読み枠を調製する方法である。さらに、繰り返しの単位となるマイクロ遺伝子を、芝らの発明した多機能塩基配列設計法（特開２００１−３５２９９０）を用い、複数の読み枠に複数の機能や構造に対応したペプチドをコードするようにデザインし、その重合体をフレームシャッフリング変異導入出発材料とすることから、潜在能力の高いライブラリーを調製することができる。また、複数の全ての翻訳読み枠のストップコドンが排除されたマイクロ遺伝子を、芝らの発明したマイクロ遺伝子のランダム重合体作製法（特開平９−１５４５８５号公報，及びShiba K., et al., J. Biochem. 132:689-696, 2002）を用いて重合させることにより、全ての翻訳読み枠でストップコドンが出現しない大きなＤＮＡを調製することができる。
【００１２】
以上のような方法で調製した全ての読み枠でストップコドンが出現しないＤＮＡを出発材料にして、これにランダムに翻訳読み枠の乗換え変異、すなわちフレームシフト変異を導入することにより、大きく配列の離れた変異体から構成される人工タンパク質遺伝子ライブラリーを調製することができる（図１）。
【００１３】
翻訳読み枠の乗換え変異、すなわちフレームシフト変異を導入するには、化学化合物によるＤＮＡ処理、マンガンイオン存在下でのＰＣＲ（error prone ＰＣＲ法）、人工ヌクレオチド誘導体や、誤り率を高くした変異体ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲなどが考えられる。しかしながら、これらの従来手法では、塩基置換は効率良くおこるおものの、翻訳読み枠の乗換えを誘導する、塩基の欠失や挿入といったフレームシフト変異は低頻度でしか生じない。十分なフレームシフト変異を導入するために、全体の変異導入効率をあげてしまうと、塩基置換の中から、高頻度に終止コドンの出現がおこるといった問題が生じる問題をもつ。したがって、上述の目的のように、ランダムにフレームシフト変異を効率良く導入する方法には、そのような性質をもつＤＮＡポリメラーゼを用いる必要がある。
【００１４】
Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ（Y-family DNA polymerase）は、近年注目されているＤＮＡポリメラーゼの一群であり（Ohmori H., et al., Mol. Cell 8:7-8, 2001）、損傷乗り越え複製の能力や、複製反応時の忠実度が低く一塩基の欠失(single nucleotide deletion)を起こしやすいなどの性質が知られている。特に一塩基の欠失はフレームシフト変異そのものであるため、この性質を利用してランダムにフレームシフト変異を導入することが可能となると予想された。遺伝子工学的にこれらの酵素を利用しようと考えた場合、耐熱性に優れ、ＰＣＲを行うことができることが報告されている好熱古細菌Sulforobus solfataricus P2のＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ（Boudsocq, F., et al. Nucleic Acid Res. 29, 4607, 2001）が有用である。また、この酵素は鋳型のＤＮＡに損傷塩基が含まれていた場合、その部分を欠失した複製産物が高い割合で得られることが分かっており、この性質を利用してフレームシフト変異の導入率を制御できると考えられる。また、単純に複製反応自体の回数を増やすことによってもフレームシフト変異の導入率の制御が可能である。
【００１５】
各翻訳読み枠のストップコドンが排除されている人工遺伝子ｐＹＴ３２０をマイクロ遺伝子重合法で調製し、これを鋳型としてＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応を行い、フレームシフト変異体集団の作成を試みた。その結果、ｐＹＴ３２０に対する変異の導入効率は、塩基置換率１．８６％、フレームシフト変異率０．５５％であり、クローンあたり平均１回以上のフレームシフト変異の導入を行うことができた。
【００１６】
同じくｐＹＴ３２０を鋳型として従来のerror prone ＰＣＲ法で変異導入をおこなってみると、３３サイクルの変異導入ではフレームシフト変異率０．０９％にすぎなかった。Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼで得られたフレームシフト変異率０．５５％に近い効率（０．４４％）を得るためには９９サイクルのerror prone ＰＣＲが必要であったが、この条件では塩基置換変異率が７．３１％と跳ね上がってしまい、終止コドンが頻発するためにライブラリーの多くのクローンは短いタンパク質しかコードしないといった重大な問題がおこってしまう。
【００１７】
以上のように、Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼを利用することにより、塩基置換変異を抑えながら、フレームシフト変異を導入することが可能となった。
【００１８】
フレームシャッフリング法で得られた変異体遺伝子から大腸菌内でのタンパク質の発現を試みたところ、フレームシフトが導入された変異体遺伝子１２種のうち、５種の発現を確認した。
【００１９】
次いで、得られた変異体タンパク質を精製し、その物理化学的な性質を解析した。変異体タンパク質のストークス半径は、変異導入により１３．５Åから５３．８Åまで変化することが確認され、これら変異体タンパク質の動的光散乱測定では変異導入により単分散から多分散へと変化することが確認された。沈降平衡法による超遠心分析で、変異導入によるタンパク質の平均分子量の変化、すなわちサブユニットの会合状態の変化が確認された。変異体タンパク質の二次構造含量を円偏光二色性スペクトルにより確認したところ、そのαヘリックスの量は０％から５５．８％と変異体タンパク質により大きく異なっていた。また、いくつかの変異体タンパク質の二次構造の熱及び変性剤濃度に対する安定性は、それぞれ異なっていた。
【００２０】
このように、ランダムにフレームシフト変異を遺伝子に導入することにより、その翻訳産物である変異タンパク質の諸性質が大きく変化することが示された。すなわち、従来のerror prone ＰＣＲなどによる変異体集団の作成法では得られなかった、多様な物理化学的性質を持つ変異体集団が得られることが明らかとなった。本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００２１】
すなわち本発明は、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼで増幅することにより、ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を調製し、該遺伝子ＤＮＡ集団を発現させることを特徴とするタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項１）や、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼが、複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項２）や、複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項３）や、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項４）や、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、所定の機能を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、前記所定の機能を有するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、前記所定の機能と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項５）や、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」を付加し、ＤＮＡ配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列「ａ」及び「ｂ」を調製し、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子のリガーゼ反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項６）に関する。
【００２２】
また本発明は、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼで増幅することを特徴とするランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法（請求項７）や、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼが、複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項７記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法（請求項８）や、複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項８記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法（請求項９）や、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法（請求項１０）や、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、所定の機能を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、前記所定の機能を有するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、前記所定の機能と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製することを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法（請求項１１）や、遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を、マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」を付加し、ＤＮＡ配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列「ａ」及び「ｂ」を調製し、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子のリガーゼ反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法（請求項１２）に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のタンパク質分子多様性集団の作製方法によると、異なる翻訳読み枠に途中からアミノ酸配列が入れ代わるため、既知の方法と比べ多くの連続したアミノ酸置換変異を導入することが可能となり、また、あらかじめ各翻訳読み枠で停止コドンを排除してあるため、フレームシフト変異により途中で翻訳が止まってしまう可能性も低く、さらに、Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼによる複製反応を複数回繰り返すことにより、より多くのフレームシフトを導入することが可能となる。したがって、本発明によると、大きく配列の離れた変異体から構成される人工タンパク質遺伝子ライブラリーを調製するために、あらかじめ３つの翻訳読み枠のストップコドンを排除したＤＮＡに対して、ランダムな翻訳読み枠の乗換え変異を導入し変異体集団を調製することにより、タンパク質分子多様性集団を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のタンパク質分子多様性集団の作製方法としては、天然の遺伝子等の遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼで増幅することにより、ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を調製し、該遺伝子ＤＮＡ集団を発現させる方法であれば特に制限されるものではなく、また、かかるタンパク質分子多様性集団の作製に用いられる本発明のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団の調製方法としては、天然の遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼで増幅する方法であれば特に制限されるものではない。
【００２５】
上記複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼとしては、複製時に高頻度に塩基の欠失、置換、付加等の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼであれば特に制限されないが、中でもＤＮＡポリメラーゼ複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼを好適に例示することができる。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼ複製時に高頻度に塩基の欠失を起こすＤＮＡポリメラーゼとして、Sulforobus solfataricus P1のＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ(polY1)、Sulforobus solfataricus P2のＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ(polY1又はDpo4)、大腸菌のＵｍｕＣ、大腸菌のＤｉｎＢ、ＤＮＡポリメラーゼη、ＤＮＡポリメラーゼι、ＤＮＡポリメラーゼκ、Ｒｅｖ３０等を、その他の塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼとして、Mutazyme DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社、La Jolla）、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＡ）変異体(Camps, M., et al., PNAS 100:9727-9732, 2003)等を例示することができる。
【００２６】
また、上記の天然の遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列の調製方法は特に制限されないが、例えば、少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチドＡ及びオリゴヌクレオチドＢに、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製する、前記特許文献１に詳述されている方法や、所定の機能を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、前記所定の機能を有するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、前記所定の機能と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択する、前記特許文献２に詳述されている方法や、マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」を付加し、ＤＮＡ配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列「ａ」及び「ｂ」を調製し、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子のリガーゼ反応を行う、前記特許文献３に詳述されている方法などを有利に挙げることができる。
【００２７】
また、上記のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を発現させる方法としては、遺伝子ＤＮＡを発現させる公知の方法であればどのような方法でもよい。例えば、発現系としては、遺伝子ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２８】
上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動物細胞や植物細胞などを挙げることができ、また、遺伝子ＤＮＡが組み込まれた発現系の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２９】
本発明のタンパク質分子多様性集団は、マーカータンパク質やペプチドタグと結合させておくこともできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができる。
【００３０】
かかるタンパク質分子多様性集団を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、上記タンパク質分子多様性集団に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記タンパク質分子多様性集団にＨｉｓタグ等のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のあるＮｉ−ＮＴＡ等の物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質分子多様性集団を得ることができる。
【００３１】
本発明の遺伝子ＤＮＡ配列を調製タンパク質分子多様性集団は、例えば、以下のようにして作製することができる。まず、天然の遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した直鎖状の鋳型ＤＮＡを調製する。この直鎖状の鋳型ＤＮＡを、Sulfolobus solfataricus P2のＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼであるＤｐｏ４遺伝子等の複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼを、プロモーターを含む発現用プラスミドに組み込み、これを大腸菌等の宿主で発現させた後に精製した、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅し、ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団をクローニングする。次に、クローニングしたランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を常法により大腸菌等の宿主で発現させ、精製することにより得ることができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
（Ｄｐｏ４遺伝子の発現）
Sulfolobus solfataricus P2のＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼであるＤｐｏ４遺伝子がＴ７プロモーターを含む発現用プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）(ノバジェン, Madison)に組み込まれているプラスミドｐ１９１４(Boudsocq, F., et al. Nucleic Acid Res. 29, 4607, 2001)を含む大腸菌Rosetta(DE3)pLysS (ノバジェン)を５０μｇ／ｍｌカルベニシリン(シグマ社, St. Louis)と２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（シグマ）を含むＬＢ培地（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）５ｍｌで３７℃、１６時間以上培養した。その後、培養液を５０ｍＬポリプロピレン製遠心管（旭テクノグラス,千葉）に移し、低速遠心機Ｈ−３Ｒ（コクサン,東京）で３０００ｒｐｍで１５分遠心して菌体を沈殿させた後に上清を除き、同量の同じ抗生物質を含む培地に再び懸濁した。この大腸菌懸濁液を３００ｍｌ枝付きフラスコ中の同じ抗生物質を含む１００ｍＬの培地に１ｍｌ接種して３７℃で約４時間培養し、大腸菌の増殖の度合いを比色計（タイテック社,東京）で６６０ｎｍの吸光度の経時変化により確認し、ＯＤ660＝０．４に達してから、イソプロピル−β−Ｄ−チオーガラクトピラノシド（以下ＩＰＴＧ、タカラバイオ、滋賀）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに３時間培養した。その後、培養液を低速遠心機と５０ｍｌポリプロピレン製遠心管で３０００ｒｐｍ，１５分で回収し、−８０℃で保存した。
【実施例２】
【００３４】
（Ｄｐｏ４の精製）
保存した組換えタンパク質の発現を誘導した大腸菌を、氷上で解凍し、カラムバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（シグマ）ｐＨ７．０，７５ｍＭ 塩化ナトリウム（和光純約工業、東京），０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡ、和光純約工業），１ｍＭ ジチオトレイトール（シグマ），１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（以下ＰＭＳＦ、シグマ），）２ｍＬに懸濁した後に、超音波装置用スピッツチューブ（ＡＳ−１０００、東湘電気）に入れ、超音波細胞粉砕装置（Biorupter、コスモバイオ、東京）を用いて、出力２００Ｗで５０秒間隔をおいて１０秒照射し、これを５回繰り返して菌体を破砕した。破砕した菌体を１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、微量高速遠心機（MRX-150およびTMA IIローター、トミー社、東京）で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心して不溶性画分を除き、上清を得た。この上清を再び別のエッペンドルフ管に移し、ヒートブロック  ＡＬＢ−１２０（旭テクノグラス）で５５℃に１０分間加熱し、夾雑タンパク質を凝集させ、再び微量遠心機で１５０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより、組換えタンパク質を含む粗分画液を得た。得られた粗分画液をＨｉ−Ｌｏａｄ−Ｓ １６／１０ カラム（ファルマシアバイオテック社, Uppsala）及びＦＰＬＣシステム（ファルマシアバイオテック）により精製した。流速２．５ｍｌ／分で粗抽出液約２ｍｌをカラムに通じた後に、同じ流速で１００ｍＬの５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含むカラムバッファーでカラムを洗浄し、その後流速５ｍｌ／分で塩化ナトリウム濃度を１０００ｍＭまで線形に変化させて、組換えタンパク質を溶出した。溶出液を８ｍｌずつ分取し、その各分画の一部をマルチゲル１５／２５（第一化学  東京）と電気泳動槽「第一」（第一科学）、及び電気泳動用電源装置ＡＥ−８４５０（アトー,東京）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ゲルをＣＢＢ染色(Phast gel blue-R, ファルマシアバイオテック)することにより溶出されたタンパク質を検出し、組換えタンパク質Ｄｐｏ４が含まれている分画を集め、CENTRIPREP10（アミコン, Beverly)で３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで濃縮し、−２０℃で保存した。
【実施例３】
【００３５】
（鋳型の調製）
ｐＹＴ３２０（配列番号１）及びｐＹＴ２８８（配列番号２）を鋳型としたＰＣＲにより直鎖状の鋳型ＤＮＡを調製した。ｐＹＴ３２０及びｐＹＴ２８８は、あらかじめ各翻訳読み枠の停止コドンを排除したマイクロ遺伝子をもとに、マイクロ遺伝子重合法（特許３４１５９９５号公報参照）により人工的に作製した遺伝子配列を含むプラスミドである(Shiba K., et al. J. Mol. Biol. 320:833, 2002)。ｐＹＴ３２０又はｐＹＴ２８８のプラスミドＤＮＡ２ｎｇを含む、ＰＣＲ反応液を調製した。この反応液には、１０ｍＭ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸塩（以下トリス塩酸）ｐＨ８．３，５０ｍＭ塩化カリウム，１．５ｍＭ塩化マグネシウム，５０ｎＭｄＮＴＰｓ，３．5units High Fiderity Taq DNA polymerase(ロシュ  ダイアグノスティックス社, Basel)及びプライマーＫＹ１０８７(配列番号３：5'-GGA TAA CAA TTC CCC TCT AGA AAT-3')，ＫＹ１０８６(配列番号４：5'-TTG CTC AGC GGT GGC AGC AGC CAA-3')が各々３００ｐｍｏｌ含まれる。この反応液を２００μＬ thin wall PCRチューブ（東洋紡績,大阪）に入れ、サーマルサイクラーPCR-2400（パーキンエルマー, Norwalk）による温度サイクル（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０回）により反応を行った。増幅したＤＮＡを１．０％ＴＡＥアガロースゲル（アガロースＭＥ  岩井化学  東京）、及びMupid II 電機泳動装置（コスモ・バイオ  東京）を用いて１００Ｖ，３０分の電気泳動で分離し、目的の大きさのバンドをゲルより切り出した後に、GeneClean II kit（キューバイオジーン, Carlsbad）により精製した。得られたＤＮＡを再びＴＡＥアガロースで電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド（シグマ）で染色し、その蛍光強度を濃度既知のＤＮＡと比較することにより、その濃度を決定した。
【実施例４】
【００３６】
（Y-polymeraseによるＰＣＲ）
４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０），５ｍＭ塩化マグネシウム，１０ｍＭジチオトレイトール，６０ｍＭ塩化カリウム，１Ｍベタイン（シグマ），４８０ｎＭ ｄＮＴＰｓ，４８０ｎｍｏｌのプライマーＫＹ１０８７及びＫＹ１０８６、並びに実施例３で調製した鋳型ｐＹＴ３２０及びｐＹＴ２８８のＤＮＡ各１０ｎｇを含む反応溶液をそれぞれ調製した。サーマルサイクラーで９９．９℃で５分加熱し、その後９０℃に温度を下げ、実施例２で調製した精製済みのＤｐｏ４を１．５μｇ添加した。その後、温度サイクル９０℃で３０秒，５５℃で２０秒，６５℃で３分を３０回繰り返した後に４℃に温度を下げ、反応を終了した。反応産物の１０μＬをＴＡＥ−アガロースゲルに泳動し、増幅の確認をした（図２）。
【実施例５】
【００３７】
（クローニング）
上記の各ＰＣＲ反応産物４０μＬを１．０％ＴＡＥアガロースゲルで分離し、特異的に増幅したバンドをゲルから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎII  ｋｉｔにより精製した。精製ＤＮＡを鋳型として、内側のプライマーＫＹ８３７（配列番号５：5'-AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GA-3'），ＫＹ８３６（配列番号６：5'-TCA GCT TCC TTT CGG GCT TTG TTA-3'）を用いてＰＣＲ反応を行った。その他の反応条件等は上記実施例３と同様に行った。各反応産物を同様にアガロースゲル電気泳動とＤＮＡ精製キットにより精製し、その後、制限酵素Sal I及びSpe I（ニューイングランドバイオラブス, Beverly）で切断し、同酵素で切断済みのベクターｐＫＳ６００（配列番号７）へとライゲーションした。ｐＫＳ６００は市販の大腸菌発現用のプラスミドｐＱＥ９（キアゲン, Hilden）のマルチプルクローニングサイトを改変したものであり、前述の制限酵素サイトを含んでいる。そのライゲーション反応液を大腸菌XL1-blue（ストラタジーン, La Jolla）に形質転換し、インサートを含む２０クローンを選択し、そのプラスミドをQIAGEN mini kit（キアゲン）により精製し、DTCS cycle sequence reaction kit（ベックマン）を用いたダイターミネイト法によりキャピラリーシーケンサーCEQ2000XL DNA analyzer（ベックマン）で配列を決定した。
【実施例６】
【００３８】
（変異導入の解析）
Y-family DNA polymeraseによりｐＹＴ３２０の遺伝子をコードする領域を増幅し、それを元にしたライブラリーからランダムにピックアップした２０クローンのSal IサイトからSpe IサイトまでのＤＮＡ配列を決定した結果、２つのクローン（ｐＫＫ１０６−１２とｐＫＫ１０６−１９）を除く全てのクローンに変異が導入されていることを確認した（配列番号８〜２７；ｐＫＫ１０６−１〜ｐＫＫ１０６−２０）。これら２０クローンの塩基置換率は１．８６％、フレームシフト変異率は０．５５％であった。
【００３９】
従来用いられているミュータジェネシスＰＣＲ（Bartel D. P., et al. Science 261:1411-8, 1993）によるｐＹＴ３２０の同じ領域に対して変異導入の割合を確認したところ、３３サイクルの反応では塩基置換率は２．１４％、フレームシフト変異率は０．０９％であり、９９サイクルの反応では塩基置換率は７．３１％、フレームシフト変異率は０．４４％であった（表１）。これらと比較して、Y-family DNA polymeraseを用いたＰＣＲは従来のミュータジェネシスＰＣＲよりもストップコドンの出現を引き起こす塩基置換変異の割合が低く、フレームシフト変異の導入効率が高いことが明らかとなった。
【００４０】
【表１】
2005065575.tif 000003
【００４１】
そして、Y-family DNA polymeraseにより得られた変異体２０クローン中１２クローンにフレームシフト変異が導入されていた。それらの内、遺伝子の途中で停止コドンが生じたクローンは６クローンで、１４クローンは全長が翻訳されるようになっていた（図３）。
【００４２】
また、Y-family DNA polymeraseによりｐＹＴ２８８の遺伝子をコードする領域を増幅し、それを元にしたライブラリーからランダムにピックアップした２０クローンのSal IサイトからSpe IサイトまでのＤＮＡ配列を決定した結果、１つのクローン（ｐＫＫ１０５−３）を除く全てのクローンに変異が導入されていることを確認した（配列番号２８〜４７；ｐＫＫ１０５−１，ｐＫＫ１０５−３〜ｐＫＫ１０５−１０，ｐＫＫ１０５−１２〜ｐＫＫ１０５−２２）。解析した２０クローン中の４クローンは約３０〜４０アミノ酸残基分の欠失を含んでいた。これら４クローンを除く１６クローンの塩基置換率は１．６０％、フレームシフト変異率は０．４７％であった。２０クローン中１７クローンにフレームシフト変異が導入されていた。それら１７クローンの内、遺伝子の途中で停止コドンが生じたクローンは５クローンで、欠失を含まない残りの１２クローンは全長が翻訳されるようになっていた（図４）。これらの配列を翻訳することにより得られると予想されるアミノ酸配列は、鋳型としたクローンと異なる翻訳読み枠が出現している（図３及び図４）（配列番号４８〜６７；１０６−１〜１０６−２０、及び６８〜８７；１０５−１，１０５−３〜１０５−１０，１０５−１２〜１０５−２２）。
【実施例７】
【００４３】
（変異体タンパク質の発現）
各変異体タンパク質をコードするプラスミドを含む大腸菌XL1-Blueを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１％のグルコースを含むＬＢ培地１ｍＬに接種し、３７℃で１６時間培養した。得られた一晩培養液６０μＬを１．５ｍＬエッペンドルフ管に移し、微量高速遠心機で１００００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除き、菌体を同濃度のカルベニシリンとグルコースを含むＬＢ培地６ｍＬに懸濁し、あらかじめ滅菌しておいた直径１８ｍｍのパイレックスガラス製試験管（旭テクノグラス）に入れ、３７℃にて１５０ｒｐｍで振盪培養した。比色計でＯＤ660の吸光度の経時変化を測定し、約３時間後にＯＤ660が０．３に達したのを確認してから、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２時間培養した。その後、変異体タンパク質を発現した大腸菌を含む培養液１００μＬを１．５ｍＬエッペンドルフ管に移し、微量高速遠心機で１００００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除き、１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１２５ｍＭ トリス塩酸ｐＨ６．８，５％ β−メルカプトエタノール，２％ラウリル硫酸ナトリウム，５％スクロース，０．０１％ ブロモフェノールブルー）に菌体を溶解し、ヒートブロックで９５℃に５分間加熱した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ＣＢＢ染色によりタンパク質を検出した。得られた泳動像（図５）により、フレームシフト変異体（１０６−３，１０６−８，１０６−１０，１０６−１１，１０６−１３及び１０５−４，１０５−７，１０５−８，１０５−９，１０５−１０，１０５−１２，１０５−１３，１０５−１７，１０５−１９，１０５−２２）の発現を確認した。
【実施例８】
【００４４】
（変異体タンパク質の精製）
ｐＹＴ３２０由来の変異体タンパク質である１０６−３，１０６−８，１０６−１０，１０６−１１，１０６−１３、及び変異を含まない１０６−１２をコードするプラスミドを含む大腸菌XL1-Blueを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１％のグルコースを含むＬＢ培地２５ｍＬに接種し、３７℃で１６時間振盪培養した。得られた一晩培養液を５０ｍＬ遠心管に移し、低速遠心機で３０００ｒｐｍで１５分間遠心して上清を除き、菌体を同濃度のカルベニシリンとグルコースを含むＬＢ培５００ｍＬに懸濁し、あらかじめ滅菌しておいた羽根つき３Ｌフラスコに入れ、３７℃にて１００ｒｐｍで振盪培養した。比色計でＯＤ660の吸光度の経時変化を測定し、約３時間後にＯＤ660が０．３に達したのを確認してから、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３〜４時間培養した。その後、変異体タンパク質を発現した大腸菌を含む培養液を２５０ｍＬ遠心管（ベックマン）に移し、ベックマン遠心機（HP301, JA-14 rotor, ベックマン）で３０００ｇで１５分間遠心して上清を除き、菌体を５０ｍＬ遠心管に移して−８０℃で保存した。
【００４５】
組換えタンパク質は、ヒスチジンタグを利用して、変性条件下で精製を行った。まず、保存した大腸菌を溶解バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム，１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０，６Ｍ塩酸グアニジン（ナカライテスク），１００ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ ＰＭＳＦ）４０ｍＬに懸濁し、３７℃で１時間穏やかに振盪することにより菌体を溶解した。その後、ベックマン遠心機（ＪＡ−１２ローター）で７０００ｇ，３０分遠心分離し、上清を別のチューブに移した。これに、あらかじめ溶解バッファーへと置換したＴＡＬＯＮ  レジン（クロンテック）の５０％懸濁液４ｍＬを加え、マイルドミキサー（ＰＲ１２，タイテック）を用いて一時間室温で穏やかに撹拌し、その後、低速遠心機にて７００ｇで５分間遠心してから、上清を除きレジンを回収した。続いて、２０ｍＬの溶解バッファーに再度レジンを懸濁し、同様に撹拌と遠心分離によりレジンを回収し、２ｍＬの溶解バッファーにレジンを懸濁して、ムロマックカラム（Ｍサイズ、室町化学工業、東京）にレジンを移し、溶解バッファーを下から滴下して除いた。次いで、６ｍＬの洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０，８Ｍ尿素（ナカライテスク），１００ｍＭ塩化ナトリウム，１５ｍＭイミダゾール（和光純薬工業））によりレジンを洗浄し、８ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．０，２０ｍＭ ＭＥＳ（和光純薬工業），８Ｍ尿素，１００ｍＭ塩化ナトリウム，２５０ｍＭイミダゾール）によりタンパク質をレジンから解離させ、溶出した。溶出液を１ｍＬずつ分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を多く含む分画を確認し、その３ｍＬをSlide-A-Lyzer透析カセット（分画分子量10,000,PEBIO,Rockford）を用いて、５０ｍＭトリス酢酸ｐＨ４．０，１００ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡを含むバッファー５００ｍＬに対して透析して尿素を除き、CENTRIPREP10（アミコン）により濃縮して、−２０℃で保存した。
【実施例９】
【００４６】
（ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量の測定）
得られた変異体タンパク質のストークス半径をゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。まず、各タンパク質サンプルを２００μｇ／ｍＬに希釈し、そのサンプルを微量透析装置（Bio-Tech, 第一化学）及びサンプルカップ（分画分子量8000, 第一化学）を用いて５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4 ｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，６Ｍ 塩酸グアニジンを含むバッファーに対して透析することにより完全に変性させた。次に、その一部を１Ｍグアニジンを含む同バッファーに対して透析を行った。ゲルろ過クロマトグラフィーはSuperose 12カラム（ファルマシア）及びＦＰＬＣシステムと亜鉛ランプを用いて行った。分子量スタンダードとして、アルブミン、オブアルブミン、キモトリプシノーゲン及びリボヌクレアーゼＡ（いずれもファルマシア）を用いて、６Ｍグアニジン及び１Ｍグアニジン存在下での変異体タンパク質のストークス半径を求めた（表２）。１Ｍグアニジンで二本のピークが溶出されたものは、各々に対応するストークス半径の値を示している。これらの結果より、フレームシフト変異の導入により、変異体タンパク質のストークス半径が多様に変化することが示された。
【００４７】
【表２】
2005065575.tif 000004
【実施例１０】
【００４８】
（ＣＤスペクトルの測定）
変異体タンパク質の２次構造の含量をＣＤスペクトルにより求めた。まず、各変異体タンパク質を終濃度が５μＭになるように、ｐＨ８．０，６．０，４．０，２．０の１０ｍＭ リン酸に対して透析し、その後１．５ｍｌのエッペンドルフ管に移し高速微量遠心機で１５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、凝集したタンパク質を除いた。続いて、調製したタンパク質溶液５００μＬをセル長２ｍｍの石英セルに入れ、円偏光二色性スペクトル測定器（Ｊ−８２０，日本分光，東京）、及びペルチェ式ミクロセル装置（ＰＭＨ−４２８Ｌ，日本分光）により、５℃でのＣＤスペクトルを測定した（図６）。変異体タンパク質１０６−１１はｐＨ８のとき、リン酸バッファー中で強く凝集したため、そのpHでは測定不能であった。得られたスペクトルを２次構造解析プログラム（日本分光）により解析した結果、（表３）に示す割合で２次構造を含んでいることが示された。この結果より、フレームシフト変異の導入により、二次構造含量が変化することが判明した。
【００４９】
【表３】
2005065575.tif 000005
次いで、１０６−１２，１０６−８，１０６−１０について、温度に対する２次構造の安定性を調べるため、温度を５℃から９５℃まで毎分１℃の速度で変化させて、２２２ｎｍのＣＤ値の変化を測定した（図７）。その結果、各タンパク質の温度に対するＣＤスペクトル変化から、折り畳み中間体が存在せず、折り畳み状態及び変性状態の二状態のみの変化を仮定した場合のＴｍは８３．１０℃、６５．４６℃、３４．１３℃であった。このようにフレームシフト変異により大きく熱安定性が変化することが示された。
【００５０】
また、１０６−１２，１０６−８，１０６−１０について、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で変性剤である塩酸グアニジン濃度を０Ｍから６Ｍまで変化させた時の２２２ｎｍにおけるＣＤ値の変化を観察した（図８）。温度変化の場合と同様に、折り畳み中間体が存在せず、折り畳み状態及び変性状態の二状態のみの変化を仮定した場合の状態変化の中間点の塩酸グアニジン濃度（Ｃｍ）はそれぞれ２．５Ｍ，１．１Ｍ，２．０Ｍであったが、変性に伴う自由エネルギー変化（ΔＧＨ2Ｏ）を計算したところ、２．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。このように、塩酸グアニジンに対する安定性や変性に伴う自由エネルギー変化はフレームシフト変異の導入により、多様に変化することが判明した。
【実施例１１】
【００５１】
（動的光散乱測定）
各タンパク質の流体半径を動的光散乱により測定した。まず、各タンパク質の終濃度が２ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、５０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むバッファーに対して透析した。その結果、１０６−１２，１０６−８以外のタンパク質は沈殿したため、５０ｍＭトリス酢酸，１００ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡのバッファー中で測定を行った。動的光散乱測定装置Dynapro-MS800（プロテインソリューションズ社、Charlottesville）により流体半径を測定した（表４）。その結果、変異導入前の１０６−１２及び１０６−８は単分散を示したが、その他の変異体タンパク質は多分散を示し、様々な会合状態をとっていることが示された。
【００５２】
【表４】
2005065575.tif 000006
【実施例１２】
【００５３】
（超遠心分析）
沈降平衡法による超遠心分析により１０６−１２，１０６−８の平均分子量を測定した。まず、各タンパク質を２０ｍＭリン酸、２００ｍＭ塩化ナトリウムに対して透析し、１０６−１２は０．２５，０．５，１ｍｇ／ｍＬ，１０６−８は０．０２５，０．０５，０．１ｍｇ／ｍＬの溶液各々１２０μＬを調製し、６穴チャコール充填エポキシ樹脂製センターピース（ベックマン）と、バックグラウンド補正用のタンパク質を含まないバッファーを各ウェルに入れ、石英ガラス製のウィンドウを用いてセルを組み立てた。セルをAn-Ti60ローター（ベックマン）へと組み込み、超遠心分析器ＸＬ−１（ベックマン）により２８０ｎｍの吸光度を半径方向に対して走査し、２０℃、２５０００ｒｐｍで約２０時間遠心することにより平衡に達した際の半径方向に対する吸光度を記録し、装置付属の計算機により単量体とした時の分子量を求めた。その結果、１０６−１２では５８２３２、１０６−８では６４３４３の値が得られた。従って、動的光散乱測定において、単分散を示した変異体タンパク質でも、フレームシフト変異の導入によりタンパク質の会合状態が変化することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の概略を示す図である。
【図２】Y-family DNA polymeraseによるＰＣＲの結果を、１％アガロースゲルで泳動後の写真として示す図である。上端に用いた鋳型の種類を示す。
【図３】本発明の各変異体クローンの予想される翻訳産物の配列を示す図である。
【図４】本発明の各変異体クローンの予想される翻訳産物の配列を示す図である。
【図５】本発明の各変異体クローンの大腸菌での発現を示す図である。発現誘導後の大腸菌培養液に含まれる総タンパク質をＰＡＧゲル１５／２５（第一化学薬品）で分離。マーカーはタンパク質マーカー「第一」３（第一化学薬品）で、上からそれぞれ９９、６６、４２、３０、２０、１４ｋＤａ。各変異体の番号はゲルの上端に示した。
【図６】本発明の各変異体タンパク質のＣＤスペクトルを示す図である。得られた円二色性値は残基平均モル楕円率としてグラフに表した。
【図７】本発明の５℃から９５℃の温度に対する各タンパク質の２２２ｎｍのＣＤ値の変化を示す図である。各タンパク質で異なるＣＤ値を示すため、５℃のときを０、９５℃のときを１として規格化して表示した。
【図８】本発明の塩酸グアニジン濃度を０Ｍから６Ｍまで変化させたときの、各タンパク質の２２２ｎｍのＣＤ値の変化を示す図である。各タンパク質で異なるＣＤ値を示すため、０Ｍのときを０、６Ｍのときを１として規格化して表示した。
【図１】
2005065575.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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