(57)【要約】【課題】  パキテン期染色体クロモメアの定量的測定とその測定結果から高精度な染色体イディオグラムの作成方法を提供する。【解決手段】  動物や植物におけるパキテン期の染色体クロモメアにおいて、その形態的特徴を定量的に測定する方法であり、（１）染色画像から染色体領域をインデックス画像として抽出する工程；（２）このインデックス画像から、擬似性カラー処理を用いてクロモメアの境界線を記録する工程；（３）クロモメアの濃度値を基に境界線内のクロモメアをマーキングする工程；（４）染色体全域のマーキング完了まで、工程（３）を繰り返す工程；（５）擬似カラー処理を用いて、染色体の長軸線に沿ったラインを引く工程；（６）工程（５）によるライン上の濃度プロファイルを測定する工程；（７）測定した濃度プロファイルをクロモメア毎に平均化し、平均プロファイルを得る工程；を含むことを特徴とし、またその測定結果から染色体イディオグラムを作成する方法。【選択図】      図１
2005156267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物または植物におけるパキテン期の染色体クロモメアにおいて、その形態的特徴を定量的に測定する方法であって、以下の工程：
（１）染色体に染色処理を施して得られた、染色画像から染色体領域をインデックス画像として抽出する工程；
（２）抽出されたインデックス画像から、擬似性カラー処理を用いた視覚支援によるクロモメアの境界線を記録する工程；
（３）クロモメアの濃度値を基に前記境界線内のクロモメアをマーキングする工程；
（４）染色体全域のマーキング完了まで、工程（３）を繰り返す工程；
（５）擬似カラー処理を用いた視覚支援により、染色体の長軸線に沿ったライン（中軸線）を引く工程；
（６）工程（５）によるラインの上の濃度プロファイルを測定する工程；および
（７）測定した濃度プロファイルをクロモメア毎に平均化して、平均プロファイルを得る工程；
を含むことを特徴とするパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法。
【請求項２】
染色体が、植物由来である請求項１の定量測定方法。
【請求項３】
植物が、イネである請求項２の定量測定方法。
【請求項４】
染色処理が、蛍光染色剤によるものである請求項１から３いずれかの定量測定方法。
【請求項５】
請求項１から４いずれかの定量測定方法によって得られた平均プロファイルから、染色体のイディオグラムを作成する方法であって、以下の工程：
（１）平均プロファイルから、移動平均値を算出することによって、局所的平均値を得る工程；
（２）得られた局所的平均値を基準にして、凝縮領域および非凝縮領域を決定する工程；
（３）濃度プロファイルより、インデックスイディオグラムとコンデセーションパターンイディオグラムの２種類のイディオグラムを作成する工程；
を含むことを特徴とする染色体のイディオグラム作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、パキテン期染色体クロモメアの定量測定方法およびこれを利用した染色体のイディオグラム作成方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、クロモメアを定量的に測定することができ、また、この測定結果を利用することにより、高精度な染色体のイディオグラムを作成することのできる、新しいパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法およびこれを利用した染色体のイディオグラム作成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのゲノム解析研究において、目的とする染色体の領域の遺伝学的、物理学的地図（染色体地図）の作成および利用は、大変重要である。ヒトの染色体には記載すべき対象が多くあり、たとえば、機能既知の遺伝子、染色体脆弱部、染色体切断点、配列の多型、さらには、疾患の原因遺伝子等がある。これら記載すべき対象を染色体地図として作成し、整理することにより、効率のよい染色体の解析研究を行なうことができる。
【０００３】
この染色体の解析研究方法の一つとして、たとえば、染色体を定量的に測定する方法が挙げられる。この染色体を定量的に測定する方法については、肉眼的な観察に基づいた蛍光 in situ hybridization（FISH）法等が知られている（たとえば、非特許文献１等）。そして、このような定量測定を発展させて、さらに効率よく染色体の定量を行なう測定も提案されている（たとえば、特許文献１）。
【０００４】
また、パキテン期における染色体の画像解析法として、「Micro Measure（以下、MMと略記する）」がコロラド州立大学によって開発された（非特許文献２）。このMMは、科学的なイメージ分析アプリケーションの一種であり、適切にデジタル化されたイメージ（たとえば、電子顕微鏡写真等）から染色体およびこれに関連する構造の測定に用いられるものである。
【０００５】
さらに、前中期における染色体の測定に使用される濃度プロファイルの測定には、画像解析ソフトウエア「Chromosome Image Analyzing System（CHIAS）」が本発明者によって開発され、これを利用した染色体の測定が考慮されている（たとえば、非特許文献３等）。このCHIASは、特に植物由来の体細胞分裂期染色体の測定およびイディオグラムの作成に有用であるとしている。
【特許文献１】特開平6-118079号公報
【非特許文献１】Pinkel, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2934-2938, 1986
【非特許文献２】Aeron Reeves, "MicroMeasure", [Online], 19 October 2000, Colorado State University, Website, < URL: http://www.colostate.edu/Depts/Biology/MicroMeasure/ >
【非特許文献３】Fukui, K., Bull. Natl. Inst. Agrobiol. Resour., 4: 153-176, 1988
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記非特許文献１および特許文献１記載のような染色体の定量的測定方法は、パキテン期における染色体の形態的特徴であるクロモメアを対象としたものではないため、クロモメアの定量測定をすることが困難であるという問題があった。特に、特許文献１記載の定量測定方法の場合は、細胞分裂を停止するために、特殊な薬剤（たとえば、コルヒチン等）を別途添加する必要がある。
【０００７】
また、非特許文献２記載のMMによる染色体の画像解析法の場合は、染色体の長さ情報とプローブの位置情報を解析するだけのものであって、染色体の定量測定を行なうものではない。
【０００８】
さらに、非特許文献３に例示されているCHIASを利用した染色体の測定の場合は、クロモメア単位での定量測定を行なうものではない。
【０００９】
パキテン期は、太糸期とも呼ばれ、減数第１分裂前期の接合糸期に続く時期であり、相同染色体は完全に接合した１本の染色体に見え、細胞学的なレベルではシナプトネマ構造が全長に亘って完成し、そして、核小体を明瞭に観察することができる時期である。このため、このパキテン期における染色体の形態的特徴を有する、染色体クロモメアを定量的に測定することができれば、その測定結果に基づくことによって、体細胞分裂期における染色体に比べてはるかに高精度な染色体のイディオグラム（模式図）を作成することができる。しかしながら、上記のとおり、染色体クロモメアを特にその濃い凝縮部の領域決定に関して、人間の視覚的判断を模擬し、かつ、再現性よく、定量的に測定する方法は、未だ報告も、開発もされていないのが現状である。
【００１０】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の問題点を解消し、細胞分裂を停止させる特殊な薬剤等を別途添加する必要もなく、パキテン期における染色体クロモメアを人間の視覚的判断と略同様に定量的に測定することができ、また、その測定結果を利用して高精度な染色体のイディオグラムを作成することのできる、新しいパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法およびこれを利用した染色体のイディオグラム作成方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、第１には、動物または植物におけるパキテン期の染色体クロモメアにおいて、その形態的特徴を定量的に測定する方法であって、以下の工程：
（１）染色体に染色処理を施して得られた、染色画像から染色体領域をインデックス画像として抽出する工程；
（２）抽出されたインデックス画像から、擬似性カラー処理を用いた視覚支援によるクロモメアの境界線を記録する工程；
（３）クロモメアの濃度値を基に前記境界線内のクロモメアをマーキングする工程；
（４）染色体全域のマーキング完了まで、工程（３）を繰り返す工程；
（５）擬似カラー処理を用いた視覚支援により、染色体の長軸線に沿ったライン（中軸線）を引く工程；
（６）工程（５）によるラインの上の濃度プロファイルを測定する工程；および
（７）測定した濃度プロファイルをクロモメア毎に平均化して、平均プロファイルを得る工程；
を含むことを特徴とするパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法を提供する。
【００１２】
第２には、染色体が、植物由来であるパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法を提供し、第３には、植物が、イネであるパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法を提供し、第４には、染色処理が、蛍光染色剤によるものであるパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法を提供する。
【００１３】
そして、この出願の発明は、第５には、上記第１から第４いずれかの定量測定方法によって得られた平均プロファイルから、染色体のイディオグラムを作成する方法であって、以下の工程：
（１）平均プロファイルから、移動平均値を算出することによって、局所的平均値を得る工程；
（２）得られた局所的平均値を基準にして、凝縮領域および非凝縮領域を決定する工程；
（３）濃度プロファイルより、インデックスイディオグラムとコンデセーションパターンイディオグラムの２種類のイディオグラムを作成する工程；
を含むことを特徴とする染色体のイディオグラム作成方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
上記第１の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法によれば、従来の染色体の測定方法では困難であった、パキテン期染色体クロモメア、特にその凝縮部分を定量的に測定することができる。
【００１５】
第２の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法によれば、上記第１の発明と同様の効果が得られ、特に植物における染色体クロモメアの濃染領域も定量的に測定することができる。
【００１６】
第３の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法によれば、上記第２の発明と同様の効果が得られ、特にイネ由来の染色体クロモメアの濃染領域も定量的に測定することができる。
【００１７】
第４の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法によれば、上記第１から第３の発明と同様の効果が得られ、より効果的な定量測定が可能となる。
【００１８】
第５の発明の染色体のイディオグラム作成方法によれば、第１から第４の発明いずれかの測定結果を利用することにより、高精度の染色体のイディオグラムを作成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００２０】
なお、この出願の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定および染色体イディオグラム作成を実施するにあたり、ソフトウエアであるObject-image（アムステルダム大学のNorbert Vischer氏により開発、http://simon.bio.uva.nl/WWW/object-image.html）およびMicrosoft EXCEL（Microsoft社製）上で動作するマクロプログラムを利用して、各種の測定を行なった。
【００２１】
また、この出願の発明における「プロファイル」とは、染色体の長軸方向の中軸線下の輝度を表したものであり、「濃度プロファイル」は、通常の染色剤による染色処理にて得られた輝度（すなわち、濃度）分布（たとえば、Fukui, K., Bull. Natl. Inst. Agrobiol. Resour., 4: 153-176, 1988）を示したものである。そのため、染色剤として蛍光色素を用いて染色処理を行なって得られた輝度を表すプロファイルは、「蛍光プロファイル（FP）」と表記することがある。「平均プロファイル」は、何本かの染色体における濃度プロファイル（もしくは、蛍光プロファイル）を集計し、その平均を算出して得られたものである。
【００２２】
図１に、この出願の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法および染色体のイディオグラム作成方法における、実施工程の概略を模式的に例示した。
【００２３】
まず、この出願の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法について説明すると、この出願の発明は、動物または植物における、減数第１分裂前期の接合糸期に続く時期である「パキテン期」の染色体の構成要素クロモメアにおいて、従来の測定方法では困難であった、その形態的特徴を定量的に測定する方法であり、以下のとおりの工程を実施することにより、このパキテン期の染色体クロモメアを定量的に測定することのできる方法である。
１．染色体に染色処理を施して得られた、染色画像（パキテン期染色体画像）から染色体領域をインデックス画像として抽出する工程：
（I）染色体に染色処理を施す。染色剤としては、たとえば、propidium iodide (PI)等が使用でき、この場合、染色後、蛍光顕微鏡にて視覚化（蛍光画像）し、そして24 bitカラー画像をRGB（赤、緑、青）各色に分解し、これらそれぞれを8 bitグレースケール画像スタックとする。なお、染色剤の使用に関しては、染色体を特定することができるものであれば、染色剤の種類や複数の染色剤を組み合わせて使用することができ、特に制限されるものではない。すなわち、単独種類の染色剤で染色してもよいし（たとえば、上記のPIのみによる染色処理等）、複数の染色剤を組み合わせての染色処理（たとえば、PIと4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)とを組み合わせての染色処理（カウンターステイン）等）等を施すことができる。また、PIのよう蛍光染色剤以外の通常色素からなる染色剤も使用することができる。
【００２４】
（II）上記（I）で得られた３つのグレースケール画像スタックそれぞれを対象に背景から、染色体領域を切り抜く（以下、スライスとすることがある）。
【００２５】
（III）得られたスライスにメディアンフィルタ処理を行い、ノイズを除去する。
【００２６】
（IV）各スライスの正規化を行い、コントラストを調整する。
【００２７】
（V）クロモメアを記入するため、RGB画像スタックに染色体領域が白く塗りつぶされた輪郭画像を追加することによって、インデックス画像とする。
２．抽出されたインデックス画像から、擬似性カラー処理を用いた視覚支援によるクロモメアの境界線を記録する工程：
（I）カウンターステイン画像を擬似カラー処理によって、クロモメアの淡染部分等の不鮮明な部分を見やすくする。これにより、染色体上の濃度分布を明瞭化することができる。
【００２８】
（II）擬似カラー処理した画像を参考にして、クロモメア境界領域に境界線上の解析対象領域（regions of interest; ROI）を記入する。
【００２９】
（III）上記の工程１の(V)で作成したスライス（すなわち、インデックス画像）へ移動させ、境界線を塗りつぶす。このとき、境界線の濃度値はクロモメアの番号と同一となるように設定（１から始まり、以降、繰り返すたびに数値が加算される）し、染色体端部から開始される。
【００３０】
(IV)デジタル化された輝度階調のデータを任意の階調に補正するために使用するテーブルである「ルックアップテーブル（LUT）」を呼び出し、使用することにより、塗りつぶしに用いた色を容易に認識することができる。
【００３１】
(V)次の工程において、クロモメア領域の塗りつぶしを確実に行なわせるため、境界線の幅は2ピクセルに設定する。
３．クロモメアの濃度値を基に前記境界線内のクロモメアをマーキングする工程：
(I)インデックス画像にクロモメア境界線を記入した後、境界線と区切られた領域を同一色で塗りつぶす。
４．染色体全域のマーキング（塗りつぶし）完了まで、工程（３）を繰り返す工程：
(I)このとき、工程２の(III)と同様に境界線の濃度値はクロモメアの番号と同一となるように設定（１から始まり、繰り返すたびに数値が加算される）し、染色体端部から開始される。
５．擬似カラー処理を用いた視覚支援により、染色体の長軸線に沿ったライン（中軸線）を引く工程：
(I)カウンターステイン画像を選択して、染色体の凝縮が見やすいLUTを呼び出す。
【００３２】
(II)セグメンテッドライン状のROIを二価染色体の中軸線上に記入する。
【００３３】
(III)ラインをオブジェクトとして保存する。
【００３４】
(IV)前記の二価染色体のもう一本の中軸線上にラインを記入し、同じく保存する。
６．工程５によるラインの上の濃度プロファイルを測定する工程：
(I)上記の工程５で保存したラインを呼び出し、RGB各色およびインデックス画像の４つのスライスを毎にライン上の濃度値、すなわち濃度プロファイルを測定することによって、濃度プロファイルとする。
（７）測定した濃度プロファイルをクロモメア毎に平均化して、平均プロファイルを得る工程：
(I)インデックス画像から測定した濃度プロファイル値をクロモメア番号のラベルとして用いる。
【００３５】
(II)測定した濃度プロファイル値内のインデックス番号に対応するRGB各色由来のプロファイルデータを抽出し、複数の測定データの平均値を作成する。全てのクロモメアで平均化を行なった後、クロモメア番号の順にプロファイル値を並べ、染色体地図となる平均プロファイルを作成する。
【００３６】
上記のとおりの工程を含むことを特徴とした、この出願の発明のパキテン期における染色体クロモメアの定量測定方法は、前記のとおり、動物としては、たとえば、ヒトやマウス、ウシ等の染色体にも利用することができる。植物では、たとえば、イネの染色体（特に第9番染色体）に利用することができ、この出願の発明は、測定・解析等の対象とする染色体の由来は、特に限定されるものではない。
【００３７】
また、この出願の発明は、上記の染色体クロモメアの定量測定方法によって得られた、測定結果（平均プロファイル）を利用して、高精度な染色体イディオグラムを作成することができる。すなわち、以下の工程を実施することにより、人間の視覚的判断と略同様に染色体上の濃淡の分布を判断することができ、そして染色体イディオグラムを作成することができる。特に工程（１）および（２）については、人間の視覚的判断は、染色体等における定量的な分析・解析における研究結果をより精度のよい研究結果へと改善することのできるアプローチの一つであることから、本発明者は、既に報告されている染色体の濃淡部の分析を画像解析法を活用しながら、人間の視覚的判断を反映することができる研究結果（Fukui, K., and Kamisugi, Y., Chromosome Res., 3: 79-86, 1995）に基づき、さらなる鋭意研究の結果、さらに発展させてこの出願の発明としたものである。
１．平均プロファイルから、移動平均値を算出することによって、局所的平均値を得る工程：
(I)平均化したプロファイルより染色体内の各クロモメアの平均長を算出する。
【００３８】
(II)クロモメアの平均長をカーネルとして、平均プロファイルの移動平均の値を測定、作成する。
２．得られた局所的平均値を基準にして、凝縮領域および非凝縮領域を決定する工程：
(I)平均プロファイルの値から移動平均の値を減算する。
【００３９】
(II)平均プロファイル内の算出結果が、正の値の場合は「凝縮領域」、負の値の場合は「非凝縮領域」と決定する。
３．濃度プロファイルより、インデックスイディオグラムとコンデセーションパターンイディオグラムの２種類のイディオグラムを作成する工程：
(I)濃度プロファイルの値を基に染色体の平均幅のグレイグラム（模式図）を描画する。
(II)インデックス画像の濃度プロファイルの値を基に染色体の平均幅のグレイグラムを描画する。
(III)上記の工程３の(II)におけるグレイグラムに対して、軸と垂直方向にスムージング処理を行なう。このスムージング処理により、濃染部は濃く、淡染部は薄いイメージが作成される。
(IV)スレッシュホールドを行い、輪郭を抽出する。
(V)上記の工程２(II)によって得られた算出結果と、上記の工程３(III)によって得られた輪郭とを組み合わせることによって、バンド状のイディオグラムである「コンデセーションパターンインディオグラム」を得ることができる。
(ＶI)そして、工程３(II)のインデックス画像のグレイグラムと、工程３(III)および(IV)を組み合わせることによって、クロモメア情報と凝縮の程度を二次元的に表現することのできる「インデックスインディオグラム」を得ることができる。
【００４０】
この出願の発明は、上記のとおりパキテン期における染色体クロモメアを定量的に測定することにより、その測定結果に基づいて、コンピュータやソフトウエア等を活用することにより、従来の体細胞染色体のイディオグラムよりもはるかに高精度な、しかも人間の視覚的判断と略同様な染色体のイディオグラムを作成することができる。
【００４１】
すなわち、この出願の発明は、遺伝子地図の作成の際に大変有効なものとなる。具体的には、前中期染色体よりもパキテン期染色体（1 pixel=67nm）を基に解析することにより、より詳細なアドレスを決めることができることから、パキテン期染色体地図は、遺伝子情報の配置をより詳細に解析するのに適している。また、体細胞染色体と比較して、パキテン期染色体をFISH法による遺伝子マッピングにおいても高精度な遺伝子地図を作成することが期待できる。
【００４２】
次に、この出願の発明は、クロモメアを地図に記載することを容易とするため、ヘテロクロマチンおよびユークロマチンのような構造的にユニークな特徴を正確に位置決めするための目印とする効果を有している。形態学的な特徴はパキテン期の染色体において、効果的に観察および確認できる。たとえば、13番および14番のクロモメアにて確認することができる収縮は、パキテン期の染色体においてのみ確認することができる。
【００４３】
以下に、パキテン期のイネ第9番染色体に適用したこの出願の発明の実施例を示し、さらに詳しく、この出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。
【００４４】
なお、以下の実施例においては、イネの第9番染色体のNOR部分がPIおよびDAPIによって、異なる色調で染色されるため、染色剤として蛍光色素の一種であるPIおよびDAPIの2種類の蛍光染色剤を使用している。
【実施例】
【００４５】
実施例１  パキテン期染色体クロモメアの定量測定
(I) 植物体
本実施例において使用した植物体は、イネである日本晴(Oryza sativa L.)を用いた。長さ約0.72-0.75mmの葯を若い円錐花から採取し、固定剤によって固定した。固定剤は、エタノール：酢酸＝3：1の割合で調整されたものを用いた。なお、サンプルを保存する際には、上記固定剤中に入れて、-20℃にて保存する。長期保存の場合は、70%のエタノールに入れて、-70℃にて保存する。
(II) 染色体の調整
固定化した葯を20分間、蒸留水で洗浄した。この葯から花粉母細胞を除去して後、潰してスライドグラスに載置した。このスライドをドライアイスにて凍結させ、カバーグラスを外し、サンプルを風乾させた（Ohmido, N., et al., Plant Mol. Biol., 47, 413-421, 2001）。染色体サンプルは、酵素浸潤風乾方法（EMA法、Fukui, K. and Iijima, K., Theor. Appl. Genet., 81, 589-596, 1991等）に従って、根から採取した。
【００４６】
すなわち、染色前の処理として、RNase A (100μg/ml、60分間)処理を行なった。その5分後、2×SSC溶液で洗浄し、前記のスライドを70%エタノール、95%エタノール、99.5%エタノールの順で処理をすることによって、脱水処理を行なった。風乾させた後、サンプルを1μg/mlのpropidium iodide (PI)および1μg/mlの4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)とを含有する染色溶液により、染色を行った。パキテン期および体細胞前中期の染色体におけるイメージ像は蛍光顕微鏡（BY60、Olympus社製）により視覚化され、このイメージ像をCCDカメラ（PXL1400、Princeton Instrument社製、米国）によってデジタル的に捕捉した。このデジタル画像は、12 bitのグレースケールのイメージ像として保存した。
(III) 蛍光in situ ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization、 FISH）法
本実施例における蛍光in situ ハイブリダイゼーション法（以下、FISH法とする）は、公知のFISH法（Ohmido, N. and Fukui, K., Plant Mol. Biol., 35, 963-968, 1997およびOhmido, N., et al., Plant Mol. Biol., 38, 1043-1052, 1998）に従って行なった。
【００４７】
このFISH法に用いたDNAプローブは、3.8kbのインサートとして17S-5.8S-25S rDNA（45 rDNA）（Sano, Y., and Sano, R., Genome 33, 209-218, 1990）が含まれており、ニックトランスレーションによってビオチン標識されている。そして、ハイブリダイズしたDNAは、アビジン-FITC（Vector Laboratories社製、米国）により検出た。検出には、ビオチン化抗アビジンD（Vector Laboratories社製、米国）およびアビジン-FITC（2次シグナル増幅）を用いた。
実施例２  染色体のイディオグラム作成
(I) ソフトウエアの使用による解析
染色体のデジタル画像の解析は、特殊なソフトウエア（IP Lab Spectrum ver. 3.1.1、Scanalytics Inc., 米国）およびPhotoshop（ver. 3、Adobe Systems Inc., 米国）を用いて行なった。12 bitのグレースケールイメージ像を8 bitのイメージ像に変換した後、CHIAS 3（Kato, S., and Fukui, K., Chromosome Res. 6, 473-479, 1998）を利用して、染色体のイメージ像の解析を行なった。染色体の長さと濃度プロファイルを測定するため、改良型CHIAS 3のステップ1マクロプログラム（Kato, S., et al., Res. Report Hokuriku Natl. Agr. Exp. Stn. 36, 1-62, 1998）と「Object-Image (ver. 2.06) 」とを組み合わせて測定に用いた。Object-Imageは、Mac OS版における「NIH-Image」の新バージョンである。なお、本実施例では、PI等の蛍光色素による染色処理を行ない蛍光色の輝度分布を対象としているため、濃度ファイルを「蛍光プロファイル（Fluorescence Profile、FP）」と記載することがある。
【００４８】
なお、Windows（登録商標）版のObject-Imageは、インターネットサイトである「ARDI (http://www.bio.ardi.com)」において、入手することができる。このObject-Imageは、アムステルダム大学の分子細胞生物研究所のアムステルダムバイオセンターによって開発され、インターネットサイトである、「http://simon.bio.uva.nl/object-image.html」にて公表されている。
【００４９】
また、ソフトウエアであるCHIAS 3についてもインターネットサイトである「http://www.bio.eng.osaka-u.ac.jp/cl/biocladm/chias」、もしくは、同じくインターネットサイトの「http://www2.kobe-u.ac.jp/~ohmido/cl/chiasIII」にて無料で入手することができる。クロモメアの長さおよびFPは、ステップ2のマクロプログラム（EXCEL ver. 8, Microsoft社製、米国）を用いて平均化した。
【００５０】
平均プロファイルを用いて前記のPIおよびDAPI染色したイメージ像における9番染色体の中軸にラインを引いて、ピクセル毎のグレーバリューを算出することによって、測定曲線を作成した。PIおよびDAPIの蛍光パターンと異なる領域は、上記の算出により除外した。DAPI染色のグレーバリューは、得られた第2次回帰方程式に基づいて、PIの値に調整した。そして、定量的なパキテン期染色体地図、あるいは、パキテン期のイディオグラムは、Object-ImageおよびPhotoshopを用いて作成した。
(II) 解析結果
(a) イネのパキテン期9番染色体の確認：
図２から図９に示したように、パキテン期染色体におけるクロモメアは、PIおよびDAPI染色それぞれに観察することができた。PIおよびDAPI染色は、クロモメアに沿って特徴的なパターンを示すことが確認された。なお、図２から図９に共通して、図中のスケールバーは、5μmを示している。
【００５１】
図２は、パキテン期染色体のカウンター染色の結果を示した図であり、矢印は、DAPIの弱い染色度合いおよびPIの強い染色度合いにおけるNucleolar Organizing Region（NOR）を示している。また、「Cen」は、Centromereを示している。
【００５２】
図３は、イネのパキテン期における9番染色体をPI染色による染色結果を示した図である。また、図４は、DAPI染色によるイネのパキテン期における9番染色体を示した図である。
【００５３】
図２および図５のとおり、染色体領域には、しばしば核小体と結合することが観察された。この核小体は、図６または図７に示したような、1つの球状、または、2つの球状を呈しており、ほとんどの核にて観察することができた。したがって、この染色体領域は、9番染色体のNORであると考慮することができ、さらに、図７の矢印に示したとおり、パキテン期における9番の相同染色体もしばしば確認することができた。
【００５４】
図８は、パキテン期染色体のFISH法の観察結果を示した図である。この図８に示したとおり、FITC標識済み45s rDNAをFISH法のプローブとして使用し、染色体とハイブリダイゼーションさせた後、このプローブから発する蛍光シグナルを検出した。そして、この蛍光シグナルを検出された領域は、NORであることも確認することができた。
伸長された状態の2つの染色体において、PI染色により強く染色され
図９では、体細胞前中期染色体におけるPIとDAPIによるダブル染色は、伸長された状態の2つの染色体において、PIによる強い染色度合いを示している染色領域を備えていることを明らかにしたことを示した。体細胞分裂における分裂凝縮パターンからこの2つの染色体は、9番染色体であることは既に知られており（たとえば、Fukui, K., and Iijima, K., Theor. Appl. Genet., 81, p589-596, 1991等）、その短腕部の末端にNORがあることを確認することができた。
【００５５】
図１０は、PIおよびDAPI染色処理後のパキテン期における9番染色体の中軸線に沿って作成された平均化濃度プロファイル（FP）をグラフで示した図である。矢印は、第１および第２の収縮をそれぞれ示している。また、PIのFPを「FPPI」、DAPIのFPを「FPDAPI」とした。
FPPIおよびFPDAPIは、NORを除いた染色体全体を染色し、FPPIでは、NORで最も高い値を示した。しかしながら、FPDAPIでは、NOR においてFPPIと同程度の蛍光強度を示す結果は見られなかった。
【００５６】
(b) 第9番染色体の特徴：
NORにおけるFPPIおよびFPDAPIの蛍光強度の差異比率は、5.75であり、他の染色体領域（およそ0.80-1.28）よりも顕著に高い蛍光強度を検出することができた。DAPIの蛍光強度は、個々の染色体に毎にPIの強度に合わせ調整した。イメージ像解析によって、長さ（26.27μm-30.13μm、99%のコンフィデェントインターバル）に基づいて、統計学的に算出した細胞周期における同時期にて、5つの染色体から取得した10個のFPPIを利用した。この5つの染色体の平均の長さは、27.87μm（418 pixels）であった。9番染色体では、22個のクロモメアを視覚化することができた。そして、FPPIおよびFPDAPIは、相互に類似しており、またPI染色は、DNAのGC含有率に関わらず染色されることから、FPPIを用いて、パキテン期染色体地図として、作成することができる。
【００５７】
また、表１に例示したように、それぞれのクロモメアの平均の長さは、1.27μm（19.02 pixels）であった。染色強度および長さにおける差異をこれらクロモメア間で観察することができた。たとえば、クロモメア（14番）は、その長さは短く（15.1μm）、凝縮の度合いも弱かった。その一方で、別のクロモメア（16番）では、その長さは長く（26.0μm）、大きなヘテロクロマチン領域であることが確認された。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
図１１は、9番染色体のクロモメアより、凝縮領域を抽出してグラフで示した図であり、このグラフとともに平均化FP、移動平均値および平均化FP-移動平均値、それぞれに対応するイメージマップを示した図である。
【００６０】
すなわち、クロモメアにおける凝縮領域および非凝縮領域を測定、解析することによって、作成したものである。これら領域は、染色処理を行なった染色体において明領域もしくは暗領域として観察された。図１１中の黒色太線は、FPPIを示し、薄色太線は、移動平均値を基に算出したローカル平均化値を示している。さらに、原FPPI値からこの平均化値引いた値は、図１１に示したとおり、X軸上を上下に推移している。そして、このことから標準化されたデータを取得することができ、これによって、クロモメアの位置および凝縮パターンの情報に基づいて、高精度なイディオグラムを作成することができる。
【００６１】
(c) 第9番染色体におけるパキテン期染色体、体細胞前中期染色体およびリンケージマップにおける比較検討：
図１２に例示したとおり、9番染色体におけるパキテン期染色体（凝縮パターンイディオグラムおよびインデックスイディオグラム）のマップ、体細胞前中期染色体のマップ（たとえば、Fukui, K., and Iijima, K., Theor. Appl. Genet., 81, p589-596, 1991参照）およびリンケージマップ（たとえば、RGP Public Data、「http://web.staff.or.jp/」参照）それぞれにおける比較検討を行なった。また、前記の表１には、パキテン期9番染色体におけるユニットの長さに対しての組換え頻度（cM/μm）を、長腕部（5.18）および短腕部（0.21）それぞれについても示している。
【００６２】
結果は、前中期およびパキテン期染色体におけるセントロメアの位置は、ほぼ近似している結果を得た。しかしながら、リンケージマップにおけるセントロメアの位置は、前中期およびパキテン期染色体と大きく異なっている。また、NORの位置についても異なっており、さらに、前中期およびパキテン期染色体との間でも異なっていることが確認された。特にリンケージマップにおける、この大きな差異は、染色体組換えが不十分、もしくは、検出精度が不十分であることが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、細胞分裂を停止させる特殊な薬剤等を別途添加する必要もなく、パキテン期における染色体クロモメアの濃凝縮部を人間の視覚的判断と略同様に、かつ、定量的に測定することができ、また、その測定結果を利用して高精度な染色体のイディオグラムを作成することのできる、新しいパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法およびこれを利用した染色体のイディオグラム作成方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】この出願の発明のパキテン期染色体クロモメアの定量測定方法および染色体のイディオグラム作成方法における、実施工程を模式的に例示した概略図である。
【図２】パキテン期染色体のカウンター染色の結果を示した図であり、矢印は、DAPIの弱い染色度合いおよびPIの強い染色度合いにおけるNORを示し、また、「Cen」は、Centromeric Regionを示している。
【図３】イネのパキテン期における9番染色体をPI染色による染色結果を示した図である。
【図４】DAPI染色によるイネのパキテン期における9番染色体を示した図である。
【図５】9番染色体のパキテン中期において、染色体領域に核小体が結合する様子を例示した図である。
【図６】核小体が、1つの球状を呈している様子を例示した図である。
【図７】核小体が、2つの球状を呈している様子を例示した図である。
【図８】パキテン期染色体において、FISH法による観察結果を例示した図である。
【図９】体細胞前中期染色体におけるPIとDAPIによるダブル染色の結果を観察した図である。矢印は、サテライト領域を示し、「Cen」は、Centromereを示している。
【図１０】PIおよびDAPI染色処理後のパキテン期における9番染色体の中軸線に沿って作成された平均化濃度プロファイル（FP）をグラフで示した図である。
【図１１】9番染色体のクロモメアより、凝縮領域を抽出してグラフで示した図であり、このグラフとともに平均化FP、移動平均値および平均化FP-移動平均値、それぞれに対応するイメージマップを併せて示した図である。
【図１２】9番染色体におけるパキテン期染色体のマップ、体細胞前中期染色体のマップおよびリンケージマップそれぞれを比較検討するため例示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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