(57)【要約】【課題】本発明は、新規胚性幹細胞分化誘導物質の提供を目的とする。【解決手段】カロテノイド類が例えば、マウス胚由来腫瘍Ｐ１９細胞を神経様細胞に分化誘導することを見い出したことにより、本発明に至った。  カロテノイド類としては、ルテイン、β−カロテン等が挙げられる。  また、ステノトロフォモナス属又はフラボバクテリウム属の培養微生物をエタノール等で抽出した抽出物中にカロテノイド類が含まれていて、これらのカロテノイド類も幹細胞を神経様細胞に分化誘導することが明らかになった。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド類からなる、幹細胞の分化誘導物質。
【請求項２】
幹細胞が胚性幹細胞であることを特徴とする請求項１記載の分化誘導物質。
【請求項３】
カロテノイド類が、ルテイン又はβ−カロテンであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の分化誘導物質。
【請求項４】
カロテノイド類が、培養微生物からの抽出物であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の分化誘導物質。
【請求項５】
培養微生物がステノトロフォモナス属又はフラボバクテリウム属であることを特徴とする請求項４記載の分化誘導物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、マウス胚由来腫瘍細胞Ｐ１９細胞を神経様細胞に分化させうるような、新規胚性幹細胞分化誘導物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ１９細胞はマウス胚由来の腫瘍細胞系であり、外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の様々な細胞に分化できる。レチノイン酸によってこの細胞は神経、星状細胞、繊維芽細胞様細胞に分化することが報告されている（MacPherson and McBurney,1995）。
この培養細胞から分化した神経は不可逆的に分裂終了しており、典型的な神経細胞の形態で、多くの中枢神経系細胞マーカー、即ち神経特異性エノラーゼ、神経フィラメントタンパク、神経特異性細胞核抗体（NeuN）によって中枢神経細胞の特長を持つことが確認された。
マウスＰ１９細胞のin vitroでの分化に関する研究のほとんどはレチノイン酸を用いて行われてきた（MacPhersonら1997，Parnas and Linial 1995，Dedharら1991）。
【０００３】
分化を誘導する新規化学物質の探索が細胞の分化の機序を調べるために世界中で多くの研究者により熱心に行われてきているが、レチノイン酸がＰ１９細胞を完全に発達した神経細胞へと分化させる確かなメカニズムはまだ明らかになっていない。
胚性幹細胞はヒト初期発生学のモデルや新規の成長因子や医薬品の開発ツールとして利用され、また、移植医療の供給細胞としての可能性も秘めている。
そこで、各種細胞への分化を誘導する新規化学物質に対する要望と高い期待がある。
【０００４】
【非特許文献１】MacPherson P.A and McBurney M.W.(1995)P19 embryonal carcinoma cells: A source of cultured neurons amenable to genetic manipulation. Methods, A Companion to Methods in Enzymology 7:238-252.
【非特許文献２】MacPherson P.A.，Jones, S., Pawson P.A., Marshall K.C. and McBurney M.W.(1997). P19 cells differentiate in to glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience, 80:487-499.
【非特許文献３】Parnas, D. and Linial M.(1995) Cholinergic properties of neurons differentiated from an embryonal carcinoma cell-line (P19). International Journal of Developmental Neuroscience, 13:767-781.
【非特許文献４】Dedhar S., Robertson, K and Gray V.(1991) Induction of expression of the αｖβ1 and  αｖβ3  Integrin heterodimers during retinoic acid-induced neuronal differentiation of Murine embryonal carcinoma cells. Journal of Biological Chemistry, 266:21846-21852
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、胚性幹細胞を分化させうる新規胚性幹細胞分化誘導物質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、精意研究の結果、カロテノイド類が、例えば、マウス胚由来腫瘍Ｐ１９細胞を神経様細胞に分化誘導することを見い出したことにより、なされたものである。
カロテノイド類としては、ルテイン、β−カロテン等が挙げられる。
また、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）又はフラボバクテリウム属（Flavobacterium）の培養微生物をエタノール等で抽出した抽出物中に様々なカロテノイド類が含まれていて、これらのカロテノイド類も幹細胞を神経様細胞に分化誘導することが明らかになった。
【０００７】
これらのカロテノイド類を１μＭ培養液に添加して所定期間培養すると、両端から長い軸索突起が生じた神経様細胞が観察された。
カロテノイドにより誘導された神経様細胞の核の形、サイズ、神経フィラメントの長さ及び枝分かれのパターンなどの形態観察の結果はレチノイン酸（分化誘導物質として一般的に知られている物質）によって分化誘導された神経細胞の形態と一致した。
更に抗マウス神経細胞核モノクローナル抗体（NeuN）、抗マウス神経フィラメント１６０クローンＮＮ１８マーカー抗体とフルオレセインを結合した二次抗体を用いて染色し、カロテノイド類により誘導された神経様細胞の特性を確認した。
本研究で示されたこれらの結果はカロテノイド類がＰ１９細胞を神経様細胞に分化させる新規化学物質の候補であることを示唆している。
更に、本研究の結果はＰ１９細胞が今回検討されたカロテノイド類を認識する受容体を保有していることを示しており、今後、胚由来幹細胞の神経やその他の細胞への分化を促進する新しいファクター解明の手がかりとなることが期待される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明において、カロテノイド類が胚由来幹細胞を分化させる新規誘導物質である可能性が示唆され、分化した細胞の免疫細胞化学的検討によりそれを確認出来た。
【実施例】
【０００９】
（Ｐ１９細胞の培養）
定法に従ってマウス胚由来腫瘍細胞P19細胞を培養した。すなわち  未分化のＰ１９細胞はα-ミネラルエッセンシャルメディウム（α-ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）に１０％牛胎児血清、０．３６％（ｗ／ｖ）炭酸水素ナトリウム、１％抗生剤混合物を添加した培地で３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。なお、培養は１０ｍｌあたり５×１０７個の単層で指数関数的に増殖するように維持した。
（幹細胞の分化誘導）
トリプシン処理で採取した上記細胞は１×１０６個を3-5ｍｌの培養液（α-ＭＥＭに2-8％の牛胎児血清を添加したもの）中に懸濁し、培養皿に接着しないように牛血清アルブミンであらかじめコートした微生物用培養皿(径35 mm)に播いた。
ここに陽性対照（レチノイン酸）、標準カロテノイド（ルテイン、β−カロテン）、微生物由来のカロテノイド抽出物をそれぞれ最終濃度が0.1 - 10μＭになるように各培養皿に添加し、培養した。培養１日でいずれの場合も細胞の集合体が形成される（図 1）。
４日間の培養の後、トリプシン処理で細胞を採取し、ポリＬ-リジンなどの接着物質をコートしたカバーグラス上で再培養すると約２日で細胞体の両端から軸索突起の生えた神経様細胞が得られた。
【００１０】
（カロテノイド抽出物の分離精製法）
カロテノイド類抽出物はステノトロフォモナス属のＤ１（受託番号FERM P-18481）及びフラボバクテリウム属のＰ１０４（受託番号FERM BP-5006）の培養菌体からアセトンとヘキサンの混合溶媒により抽出後、減圧蒸留により溶媒留去濃縮し、１００％エタノールで溶解して調整した。
ＨＰＬＣによる分析でステノトロフォモナス属のＤ１からはルテイン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、β−カロテンが主要なカロテノイドとして検出された。
フラボバクテリウム属のＰ１０４からはゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、β−カロテンが主要なカロテノイドとして検出された。
【００１１】
（Ｐ１９細胞由来神経様細胞の免疫細胞化学実験）
カロテノイド類やレチノイン酸で処理して得られたＰ１９細胞由来神経様細胞の免疫細胞化学実験では、核を染色するために一次抗体としてマウス抗神経細胞核モノクローナル抗体（NeuN、ケミコン社、ＵＳＡ ） を、神経フィラメントの染色のための一次抗体としてマウス抗神経フィラメント１６０クローンＮＮ１８マーカー抗体（シグマ社、ＵＳＡ）を、二次抗体としてフルオレセイン結合二次抗体（ケミコン社、ＵＳＡ）を用いた。
分化した細胞を定法に従いパラホルムアルデヒドを含むリン酸バッファ中、室温で１０分間インキュベートして固定した。
細胞をリン酸バッファで洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含むリン酸バッファ中、３７℃で３０分間インキュベートしてブロッキングした（抗体の非特異的な結合を防ぐ操作）。
１００倍希釈したNeuN抗体または抗神経フィラメント１６０クローンＮＮ１８マーカー抗体を添加し、４℃で一晩インキュベートした。
リン酸バッファで洗浄後、フルオレセイン結合二次抗体に３７℃で４時間インキュベートし、免疫化学的に染色した。    
【００１２】
（結果）
マウス胚由来腫瘍１９細胞は培養を続けることで自然に分化することはないがルテイン、β−カロテン、カロテノイド抽出物の適用によって神経様細胞に分化した。
細胞集合体の形成から始まる分化プロセスは、レチノイン酸により引き起こされる分化のプロセスとほぼ同じであった（図１）。
また、ポリＬ-リジンでコートしたカバーグラスに播いた細胞を無血清培地中で培養すると、２４時間後に細胞体の両端から伸びる構造が現れたのが観察された。
細胞体と神経フィラメントの大きさと形は次の日、更に長く伸びたことが確認された。カロテノイド類処置により分化した神経様細胞の核の形状と神経フィラメントの長さは陽性対照であるレチノイン酸により分化した神経細胞と同様であった（図２）。
培養微生物からのカロテノイド抽出物を適用した培養細胞は同濃度の標準カロテノイドであるルテインやβ−カロテンを適用した場合よりも数多く神経様細胞に分化し、疑似神経ネットワークを形成していた。
また、神経様細胞の神経フィラメントはレチノイン酸やカロテノイド抽出物を適用した場合より、ルテインやβ−カロテンを適用した場合の方がより太かった。
【００１３】
形態的に神経様細胞であると考えられる細胞が神経細胞の特長を持っていることを神経細胞核特異的なマーカーであるNeuNと抗神経フィラメント１６０クローンＮＮ１８マーカー抗体を用いた免疫細胞化学的検討により確認した（図３）。
NeuNは明らかに細胞核特異的に、ＮＮ１８マーカー抗体は明らかに神経フィラメント特異的に染色していた。
ＮＮ１８マーカー抗体による染色で複数のタイプの神経様細胞が存在する可能性が認められた。
本研究の結果から、カロテノイド類が明らかにこれまでに知られていなかった新規の分化誘導物質（Ｐ１９細胞を分化させうる物質）であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｐ１９細胞集合体の例を示す。  Ａは無添加、Ｂはステノトロフォモナス属由来のカロテノイド抽出物添加。  レチノイン酸、カロテノイド類のいずれの添加によってもＢと同様の集合体が観察された。
【図２】Ｐ１９細胞の神経様細胞分化を示す。  Ａは分化誘導剤を添加しないで培養したＰ１９細胞、Ｂはレチノイン酸添加、Ｃはルテイン添加、Ｄはβ-カロテン添加。  カロテノイド抽出物を添加してもB-Cとほぼ同様の細胞分化が観察された。
【図３】免疫化学的染色結果の例を示す。  Ａはルテインにより分化した細胞を抗神経細胞核抗体（NeuN）で染めたもので、細胞核が特的に染色されている。  Ｂはステノトロフォモナス属由来のカロテノイド抽出物により分化した細胞を抗神経フィラメント１６０クローンNN18マーカーで染めたもので、フィラメントが特異的に染色されている。  本発明で用いたいずれの分化誘導物質を用いてもこれらの特異的抗体により同様の染色結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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