(57)【要約】【課題】  小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質を発現せしむるよう作製された遺伝子、並びに該遺伝子を含む組換え発現ベクター、並びに該発現ベクターによって形質転換された形質転換体、並びに該形質転換体を利用した小胞体ストレス応答を阻害または活性化する薬剤をスクリーニングする方法、並びに該遺伝子を導入されたトランスジェニック生物を提供する。【解決手段】  小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子とレポーター蛋白質の遺伝子からなる融合遺伝子をコードする塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは挿入されたものを含む、小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質を発現せしむる遺伝子、並びに該遺伝子及び発現すべき目的遺伝子を含む組換え発現ベクター、並びに該組換え発現ベクターによって形質転換された形質転換体、それらを利用した薬剤のスクリーニング、該遺伝子を導入されたトランスジェニック生物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡ：
（ａ）小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子とレポーター蛋白質の遺伝子からなる融合遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードする請求項１に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列を有するＸＢＰ−１遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードする請求項１に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列のルシフェラーゼ遺伝子部分をレポーター蛋白質（ベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はＧＦＰ）をコードする遺伝子に置き換えた融合遺伝子をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）（ａ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードする請求項１に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列のＸＢＰ−１遺伝子部分をフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子（酵母Ｈａｃ１遺伝子）に置き換えた融合遺伝子をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）（ａ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、レポーター蛋白質を発現せしめる請求項１に記載の遺伝子をコードするＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列のＸＢＰ−１遺伝子部分をフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子（酵母Ｈａｃ１遺伝子）に置き換え、かつルシフェラーゼ遺伝子部分をレポーター蛋白質（ベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はＧＦＰ）をコードする遺伝子に置き換えた融合遺伝子をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）（ａ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え体プラスミド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え体プラスミドを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体又は形質導入体を用いた、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項７に記載の形質転換体又は形質導入体を用いた、小胞体ストレス応答を阻害する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）形質転換体又は形質導入体に薬剤を接触させるステップ、
（ｉｉ）該形質転換体又は形質導入体に小胞体ストレスを与えるステップ、
（ｉｉｉ）該形質転換体又は形質導入体内に発現するレポーター蛋白質の活性を測定するステップ、
を含むことを特徴とする小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項８に記載のスクリーニング方法により選択された、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する化合物。
【請求項１２】
請求項８に記載のスクリーニング方法により選択された、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する化合物を主な成分とする小胞体ストレス応答阻害剤。
【請求項１３】
請求項６に記載の組換え体プラスミドを導入したトランスジェニック生物。
【請求項１４】
請求項１３に記載のトランスジェニック生物を用いた生体内における小胞体ストレスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フレームスイッチ型スプライシングによりスプライシングされる遺伝子とレポーター遺伝子を接続した融合遺伝子に関する。これは、小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングにより、レポーター蛋白質が誘導されることを特徴とする。また、本発明は、これら遺伝子の一連の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質は膜結合性リボソームで翻訳合成された後、細胞内小器官である小胞体において正しいコンフォメーションに折り畳まれる。従って、小胞体内には多くのシャペロン蛋白質が存在しており、効率的な蛋白質折り畳みに寄与している。しかし、この折り畳みはいつも完全に行われるわけではない。細胞内外からのストレスによって、小胞体内の折り畳み機構が妨害されたり、小胞体に送り込まれる蛋白質量が小胞体の処理能力を超えた場合などには、小胞体内に折り畳みが不完全な蛋白質が蓄積する。この現象は小胞体ストレスと呼ばれ、細胞にとって極めて強い負荷であるが、小胞体はこれに対抗する機構を複数持っており、効率的にこれらストレスに対応している。この対応法の一つとして「転写誘導応答」が挙げられる。これは小胞体内に存在する分子シャペロンやフォールディング酵素遺伝子の転写を活性化して、小胞体のフォールディング能力を高め、異常蛋白質の折り畳みを図る応答である（非特許文献１）。
【０００３】
転写誘導応答においては、小胞体膜に存在するＲＮＡ切断酵素であるＩＲＥ１が小胞体ストレス依存的に活性化し、ＸＢＰ−１ｍＲＮＡをフレームスイッチ型スプライシングという特別な様式でスプライシングする。スプライシングを受けたＸＢＰ−１ｍＲＮＡは、強力な転写因子をコードするようになり、分子シャペロンの転写を強力に活性化する。フレームスイッチ型スプライシングの特徴は、全く新しい読み枠で蛋白質が翻訳されるようになることである。ＸＢＰ−１ｍＲＮＡにおいては遺伝子の中央部に存在する２６ｂｐがスプライスアウトされ、これ以降の読み枠が完全に変わる。哺乳類細胞においては、このようなスプライシングを受ける遺伝子は現在までにＸＢＰ−１以外に知られていない（非特許文献２）。この機構は酵母においても認められており、種を越えて存在する重要なストレス耐性機構であると考えられている。酵母の場合には、同様の機構でスプライシングされる遺伝子Ｈａｃ１が報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
近年、小胞体ストレスが癌、虚血、糖尿病をはじめとする様々な疾患に関与することが分かってきた。例えば、癌細胞は、蛋白質の合成が亢進し、さらには低酸素状態にあるので、強い小胞体ストレスがかかっていることが知られている。しかし、癌細胞は死ぬことなく増殖を続け、宿主を死に至らしめる。これは癌細胞が小胞体ストレス応答機構を利用して、ストレスを回避しているためだと考えられている。従って、この小胞体ストレス応答を阻害する化合物は癌細胞特異的に細胞死を誘導する新規な制癌剤になると考えられる。また、虚血後再かん流の場合は小胞体ストレス応答機構が脳などの細胞死を防ぐと考えられており、小胞体ストレス応答機構を活性化する化合物が効果的な薬剤となる可能性がある（非特許文献４）。このような化合物をスクリーニングしたり、細胞内、生体内の小胞体ストレスを測定するためには、これらストレスを簡便に検出、定量する技術が必須であるが、現在までにそのような方法は存在していない。現在用いられている方法の例としては、小胞体ストレスに応答してその転写量が上昇することが知られているＢｉｐ遺伝子をノーザンブロッティングで検出する方法などが挙げられるが、定量性、簡便性とも十分なものではない。（非特許文献５）。
【非特許文献１】細胞工学誌  第２１巻  ３６４−３６７頁  ２００２年
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  誌  第１０７巻  ８８１−８９１頁  ２００１年
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ  誌  第８７巻  ３９１−４０４頁  １９９６年
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  第１１０巻  １３８９−１３９８頁  ２００２年
【非特許文献５】Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  誌  第１６巻  ４５２−４６６頁  ２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、小胞体ストレスにさらされることによりフレームスイッチ型スプライシングされる遺伝子と、レポーター遺伝子を接続した人工遺伝子を用いて小胞体ストレスを簡便に検出する方法を提供すること、さらにこれら遺伝子を用いた新規薬剤探索方法を提供すること、さらにこれら遺伝子を用いて生体内の小胞体ストレス応答を検出する方法を提供すること、などである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質が発現するような人工遺伝子を作製すべく鋭意研究した。ＸＢＰ−１遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を特定の様式で接続し、この融合遺伝子が小胞体ストレス依存的にルシフェラーゼ蛋白質を発現することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、配列表の配列番号：２に示すＸＢＰ−１遺伝子（非スプライシング型）の第１１５４番目の塩基の直後に配列表の配列番号：３に示すホタルルシフェラーゼ遺伝子を接続し、配列表の配列番号：１に示すＸＢＰ−１とルシフェラーゼの融合遺伝子を作成した。この遺伝子を導入したプラスミドを構築し、これをヒト細胞株に導入した形質転換体を作製した。更に、この形質転換体に小胞体ストレスを与えた際、ルシフェラーゼが発現し、機能することを見出した。また、この細胞株を用いて、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する化合物のスクリーニングが可能であることを見出した。
【０００８】
従って、本発明は、以下の（１）〜（１１）に関するものである。
（１）以下の（ａ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡ：
（ａ）小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子とレポーター蛋白質の遺伝子からなる融合遺伝子であることを特徴とするＤＮＡ、
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードする（１）に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列を有するＸＢＰ−１遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、
【０００９】
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードする（１）に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列のルシフェラーゼ遺伝子部分をレポーター蛋白質（ベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はＧＦＰ）をコードする遺伝子に置き換えた融合遺伝子をコードするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードする（１）に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列のＸＢＰ−１遺伝子部分をフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子（酵母Ｈａｃ１遺伝子）に置き換えた融合遺伝子をコードするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）に示す小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受けることにより、レポーター蛋白質を発現せしめる（１）に記載の遺伝子をコードするＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号：１に示す塩基配列のＸＢＰ−１遺伝子部分をフレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子（酵母Ｈａｃ１遺伝子）に置き換え、かつルシフェラーゼ遺伝子部分をレポーター蛋白質（ベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、又はＧＦＰ）をコードする遺伝子に置き換えた融合遺伝子をコードするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、
【００１０】
（６）（１）〜（５）のいずれか一項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え体プラスミド、
（７）（６）に記載の組換え体プラスミドを含む形質転換体又は形質導入体、
（８）（７）に記載の形質転換体又は形質導入体を用いた、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニング方法、
（９）（７）に記載の形質転換体又は形質導入体を用いた、小胞体ストレス応答を阻害する薬剤のスクリーニング方法、
（１０）（８）に記載の小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ｉ）形質転換体又は形質導入体に薬剤を接触させるステップ、
（ｉｉ）該形質転換体又は形質導入体に小胞体ストレスを与えるステップ、
（ｉｉｉ）該形質転換体又は形質導入体内に発現するレポーター蛋白質の活性を測定するステップ、
を含むことを特徴とする小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニング方法、
【００１１】
（１１）（８）に記載のスクリーニング方法により選択された、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する化合物、
（１２）（８）に記載のスクリーニング方法により選択された、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する化合物を主な成分とする小胞体ストレス応答阻害剤、
（１３）（６）に記載の組換え体プラスミドを導入したトランスジェニック生物、
（１４）（１３）に記載のトランスジェニック生物を用いた生体内における小胞体ストレスの検出方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質の発現をもたらす遺伝子が提供される。これらは、小胞体ストレス、あるいは小胞体ストレス耐性が原因で起こる癌、虚血、糖尿病などの疾患に対する薬剤のスクリーニングに有用である。また、これらを導入したトランスジェニック生物は、薬剤の標的臓器探索、副作用予測などにも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下本発明をより具体的に説明する。
（１） 本発明の小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質を発現させる遺伝子
（１−１）本発明の小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子を作製するためには、フレームスイッチ型スプライシングを受ける遺伝子（例えばＸＢＰ−１）の下流に、フレームスイッチ型スプライシングを受けた時に読み枠が合うように、３の倍数であって、その中にストップコドンを含まない塩基配列をはさんで、レポーター遺伝子（例えばホタルルシフェラーゼ）を接続すればよい。
【００１４】
本発明の小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子の塩基配列は、例えば配列表の配列番号：１に示した通りである。
【００１５】
次に、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子の機能を確認する目的で、以後の実施例に示すように、配列表の配列番号：１に示される塩基配列を有する遺伝子を組み込んだプラスミドを構築し、ヒト培養細胞株中で発現させた形質転換体を作製した。この形質転換体に小胞体ストレスとして知られるタプシガルギン（和光純薬社製）、Ａ２３１８７（ＳＩＧＭＡ社）や２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社）を処理すると、ルシフェラーゼの活性が認められた。また、フレームスイッチ型スプライシングに必要なわずか１塩基を置換した突然変異体では、小胞体ストレスによるルシフェラーゼの活性が認められないこと、フレームスイッチ型スプライシングに関わるＲＮＡ切断酵素ＩＲＥ１のドミナントネガティブ体により、小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼの活性が阻害されることを確認した。これらの結果より、配列表の配列番号１に示した塩基配列を有する遺伝子が、小胞体ストレスに応答して活性化されるＩＲＥ１によってフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果ルシフェラーゼを発現せしむる遺伝子であることを明らかにした。
【００１６】
（１−２）
配列表の配列番号：１に示す塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつ小胞体ストレス依存的にルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子も本発明の範囲内のものである。塩基の欠失、置換もしくは付加は、実質的にその融合遺伝子全体の構造および機能に影響を与えない程度のものである。これらの塩基の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとの塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のものが許容し得る。
【００１７】
（１−３）
配列表の配列番号：１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼを発現せしめるＤＮＡも本発明の範囲内のものである。このようなハイブリダイズするＤＮＡ変異体としては、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結などにより部分ＤＮＡ配列が変化したものが挙げられる。これらのＤＮＡ変異体が配列番号１に示すＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０ｍＭ  トリスー塩酸（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％デキストラン硫酸、０．２ｍｇ／ｍＬ酵母ＲＮＡ、０．２ｍｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ）中で、遺伝子を結合したメンブランを６５℃にて、４時間保温し、プレハイブリダイゼーションとし、次に放射性標識した遺伝子断片を放射性同位体量にして１００万ｄｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６５℃にて、１６時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行い、続いて、このメンブランを、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２×ＳＳＣ溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸三ナトリウム）中で、６５℃にて、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーで解析した際に、Ｘ線フイルム上でハイブリダイズが確認されるものである。
【００１８】
（１−４）
配列表の配列番号：１に示す塩基配列のルシフェラーゼ遺伝子部分を任意のレポーター遺伝子（例えばベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＧＦＰ等の生物発光触媒酵素）に置き換えた遺伝子で、小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。ベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＧＦＰ遺伝子としては例えば、ベータガラクトシダーゼ：ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  誌  １５７巻  ２３８−２４４頁  １９８８年、ウミシイタケルシフェラーゼ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  誌  ８８巻  ４４３８−４４４２頁  １９９１年、ＧＦＰ：Ｇｅｎｅ  誌  １１１巻  ２２９−２３３頁  １９９２年などの文献記載のものを適宜合成して得ることができる。
【００１９】
（１−５）
（１−４）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有し、かつ小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。塩基の欠失、置換もしくは付加は、実質的にその融合遺伝子全体の構造および機能に影響を与えない程度のものである。これらの塩基の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとの塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のものが許容し得る。
【００２０】
（１−６）
（１−４）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ小胞体ストレス刺激依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。このようなハイブリダイズするＤＮＡ変異体としては、上記（１―３）において例示したのと同様のものが挙げられる。これらのＤＮＡ変異体が（１−４）に示されるＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、上記（１−３）で記載したのと同様のストリンジェントな条件で同様にハイブリダイズが確認されるものである。
【００２１】
（１−７）
配列表の配列番号：１に示す塩基配列のＸＢＰ−１遺伝子部分をフレームスイッチ型スプライシングを受ける任意の遺伝子（例えば酵母Ｈａｃ１遺伝子）に置き換えた遺伝子で、小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。酵母Ｈａｃ１遺伝子については例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  誌  ２２巻  ５２７９−５２８８頁  １９９４年の文献記載のものを適宜合成して得ることができる。
【００２２】
（１−８）
（１−７）に示されるＤＮＡにおいて、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有し、かつ小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。塩基の欠失、置換もしくは付加は、実質的にその融合遺伝子全体の構造および機能に影響を与えない程度のものである。これらの塩基の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとの塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のものが許容し得る。
【００２３】
（１−９）
（１−７）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ小胞体ストレス刺激依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果ルシフェラーゼを発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。このようなハイブリダイズするＤＮＡ変異体としては、上記（１―３）において例示したのと同様のものが挙げられる。これらのＤＮＡ変異体が（１−７）に示されるＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、上記（１−３）で記載したのと同様のストリンジェントな条件で同様にハイブリダイズが確認されるものである。
【００２４】
（１−１０）
配列表の配列番号：１に示す塩基配列のＸＢＰ−１遺伝子部分をフレームスイッチ型スプライシングを受ける任意の遺伝子（例えば酵母Ｈａｃ１遺伝子）に置き換え、かつルシフェラーゼ遺伝子部分を任意のレポーター遺伝子（例えばベータガラクトシダーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＧＦＰ）に置き換えた遺伝子で、小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。
【００２５】
（１−１１）
（１−１０）に示されるＤＮＡにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列を有し、かつ小胞体ストレス依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。塩基の欠失、置換もしくは付加は、実質的にその融合遺伝子全体の構造および機能に影響を与えない程度のものである。これらの塩基の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとの塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９９％以上のものが許容し得る。
【００２６】
（１−１２）
（１−１０）に示されるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ小胞体ストレス刺激依存的にフレームスイッチ型スプライシングを受け、その結果レポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子をコードするＤＮＡも本発明の範囲内のものである。このようなハイブリダイズするＤＮＡ変異体としては、上記（１―３）において例示したのと同様のものが挙げられる。これらのＤＮＡ変異体が（１−１０）に示されるＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、上記（１−３）で記載したのと同様のストリンジェントな条件で同様にハイブリダイズが確認されるものである。
【００２７】
（２）本発明の小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質の発現を示す遺伝子を含む組換え体プラスミド
本発明の小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質を発現せしめる遺伝子を含む組換え体プラスミドを構築することで、該遺伝子を大腸菌などに安定に保持させることが可能であり、この際ベクターとしては、一般に使われるものはすべて使用可能であるが、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）等がある。以後に述べる実施例では、小胞体ストレス依存的にルシフェラーゼ蛋白質の活性化を示す遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）に組み込んだｐＢＳ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅが例示されている。これらプラスミドを必要に応じて適当な制限酵素などで切断した後、適当なベクターに接続し、大腸菌用、昆虫細胞用、動物細胞用、トランスジェニック動物作成用のベクターとすることが出来る。動物細胞発現用プラスミドとしては、ｐＤＥＳＴ２６等のプラスミドをベクターとして使用すればよい。
【００２８】
（３）形質転換体又は形質導入体
上記の組換え体プラスミドを、適当な宿主に導入して、形質転換体または形質導入体を構築することが出来る。大腸菌、酵母、昆虫、哺乳類細胞が使用可能である。小胞体ストレス測定用プラスミドを保持する形質転換体は、上記のように発現ベクターに組み込んだ組換え体プラスミドを適当な宿主に形質転換することにより得られる。例えば、図１に示すような組換え体プラスミドを哺乳類培養細胞に導入して、形質転換体が得られる。形質転換体又は形質導入体は適当な栄養培地で培養し、その細胞中に発現したレポーター遺伝子の活性を定量することによって、小胞体ストレス応答活性を測定することが出来る。
【００２９】
（４）薬剤のスクリーニング
本発明では、本発明の形質転換体又は形質導入体を用いた新規薬剤のスクリーニング方法が提供される。例えば、本発明の組換え体プラスミドを導入した培養細胞を用い、小胞体ストレス依存的なレポーター蛋白質の発現を調節するような薬剤をスクリーニングすることによって、小胞体ストレス応答を調節する物質を発見することが出来る。組換え体プラスミドを導入する培養細胞としては、実施例中で用いたヒト胚腎臓線維芽細胞である２９３細胞株を始め、継代培養可能ないかなる培養細胞株も使用可能である。組換えプラスミドとしては、実施例中で用いたｐＤＥＳＴ２６を始め、あらゆるベクターが使用可能である。スクリーニング系の構築にあたっては、培養細胞株を選択し、スクリーニング用ベクターをリポフェクション法などを用いて導入する。この形質転換細胞を選択薬剤とともに培養することによって、スクリーニング用ベクターを含む細胞のみを成育させることが出来る。これらの細胞はこのままスクリーニングに用いても良いし、クローニングすることによって、単一の細胞株として調製した後、スクリーニングに用いても良い。これらの細胞に、サンプルを添加し、そのレポーター蛋白質の活性を測定することによって、小胞体ストレス応答を調節する物質を探索することが出来る。なお、小胞体ストレスを与える場合はサンプルの添加の前後・同時を問わず与えることができる。サンプルとしては、例えば微生物二次代謝産物を用いても良いし、合成した化合物を用いても良い。本発明の形質転換体又は形質導入体を用いた新規薬剤のスクリーニング方法により選択された薬剤のうち、小胞体ストレス応答を阻害する物質は、例えば、癌に特異的な細胞死を誘導し、新規制癌剤となると期待される。また、小胞体ストレス応答を活性化する物質は、例えば、虚血によって起こる細胞死を防ぐ有効な治療薬となると期待される。
【００３０】
（５）トランスジェニック生物
本発明の組換え体プラスミドを適当な制限酵素で切断、精製し、これをマウス受精卵前核にマイクロインジェクションした後、偽妊娠状態にした雌マウスの卵管に移植することにより、トランスジェニックマウスを得ることができる。この際遺伝子を導入する生物としては、一般に使われるものはすべて使用可能であるが、例えば、マウス、ラット、線虫等がある。これらのトランスジェニック生物は小胞体ストレス依存的にレポーター蛋白質が発現するので、活性を測定することで各臓器にかかる小胞体ストレスをモニターすることが可能となる。これを利用すれば、例えばある化合物が生体のどの臓器にストレスを与えるかを明らかにできると考えられ、薬剤標的臓器の同定や、副作用の予測などが可能となると期待される。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
（１）ＸＢＰ−１遺伝子とホタルルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子の調製
（１−１）ＸＢＰ−１遺伝子の増幅
ＸＢＰ−１（非スプライシング型）発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ）（Ｃｅｌｌ  誌  １０７巻  ８８１−８９１頁  ２００１年）１ｎｇを鋳型として、配列表の配列番号４、５に示されるプライマーセットを用い、ＸＢＰ−１遺伝子（非スプライシング型）の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法を実施するにあたり、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ  ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲの条件は、９８℃（１０秒）、６５℃（２秒）、７４℃（３０秒）を１サイクルとし、３０サイクルにわたって増幅せしめた。ＰＣＲ増幅産物は、フェノール処理、クロロホルム処理による除蛋白質後、エタノール沈殿せしめた。次にこのＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、１５μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。このＤＮＡ溶液を、０．８％アガロース電気泳動により分画し、抽出、精製した。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰ（宝酒造社製）を用い、１５μＬのＴＥ溶液で溶出した。この精製ＤＮＡ２μＬと、２ｎｇの大腸菌用ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社製）で切断後、その切断末端にチミンを一つ付加したＤＮＡ（以下ｐＢＳ／ＥｃｏＲＶ  ＴＡと表記する）とをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて接続した。以下、このプラスミドをｐＢＳ／ＸＢＰ−１（１−１１５４）と表記する。
【００３３】
（１−２）ルシフェラーゼ遺伝子の増幅
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＧＬ３ｐｒｏｍｏｔｅｒ（プロメガ社製）３．６ｎｇを鋳型として、配列表の配列番号６、７に示されるプライマーセットを用い、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法を実施するにあたり、ＤＮＡポリメラーゼはＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造社製）を用い、ＰＣＲ条件は、９５℃（１分）、５５℃（１分）、７２℃（２分）を１サイクルとし、３０サイクル増幅した。ＰＣＲ増幅産物は、フェノール処理、クロロホルム処理による除蛋白質後、エタノール沈殿した。次にこのＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、２０μＬのＴＥ溶液に溶解した。次に、このＤＮＡ１６μＬを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ（東洋紡社製）で切断後、０．８％アガロース電気泳動により分画し、抽出、精製した。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用い、１５μＬのＴＥ溶液で溶出した。この精製ＤＮＡ２μＬと、１０ｎｇの大腸菌用ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで切断後、アルカリホスファターゼ処理したものとをＤＮＡライゲーションキットを用いて接続した。以下、このプラスミドをｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと表記する。
【００３４】
（１−３）融合遺伝子の作製
２００ｎｇのｐＢＳ／ＸＢＰ−１（１−１１５４）ならびにｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した（以下、ｐＢＳ／ＸＢＰ−１（１−１１５４）／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ、ｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩと表記する）。ｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩに、１μＬのエビアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を加え、３７℃、３０分間保温することにより末端を脱リン酸化した後、６５℃、１５分間保温することにより、酵素を失活させた。両ＤＮＡに、２０μｇのグリコーゲンを加え、エタノール沈殿することにより、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、１５μＬのＴＥ溶液に溶解した。次に、このＤＮＡ溶液を、０．８％アガロース電気泳動により分画した。ｐＢＳ／ＸＢＰ−１（１−１１５４）／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩは、ＸＢＰ−１遺伝子を含む１．１キロベースの断片を抽出し、精製した（以下ＸＢＰ−１（１−１１５４）／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ  １．１ｋｂと表記する）。ｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む４．６キロベースの断片を抽出し、精製した（以下ｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ  ４．６ｋｂと表記する）。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用い、１５μＬのＴＥ溶液で溶出した。続いて、１μＬのＸＢＰ−１（１−１１５４）／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ  １．１ｋｂと、１μＬのｐＢＳ／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ  ４．６ｋｂとをＤＮＡライゲーションキットを用いて接続した。以下、このプラスミドをｐＢＳ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと表記する。このプラスミドの塩基配列を配列表の配列番号８に示す。
【００３５】
（１−４）融合遺伝子発現ベクターの作製
１μｇのｐＢＳ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ及びＰｖｕＩ（東洋紡社製）で切断した後、０．８％アガロース電気泳動により分画した。ＸＢＰ−１遺伝子とホタルルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子を含む２．８キロベースの断片を抽出し、精製した（以下ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＰｖｕＩ  ２．８ｋｂと表記する）。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用い、１３μＬのＴＥ溶液で溶出した。また、導入するベクターとしてｐＥＮＴＲ３Ｃ（インビトロジェン社製）を用いた。７５０ｎｇのｐＥＮＴＲ３Ｃを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断した後、１μＬのエビアルカリホスファターゼを加え、３７℃、３０分間保温することにより末端を脱リン酸化した。続いて、６５℃、１５分間保温し、酵素を失活させた後、２０μｇのグリコーゲンを加え、エタノール沈殿することにより、ＤＮＡを回収した。次にこのＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、１５μＬのＴＥ溶液に溶解した。このＤＮＡ溶液を、０．８％アガロース電気泳動により分画し、抽出、精製した（以下ｐＥＮＴＲ３Ｃ／ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ（ＳＡＰ）と表記する）。精製には、ＥＡＳＹＴＲＡＰを用い、１３μＬのＴＥ溶液で溶出した。続いて、１．５μＬのＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ／ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＰｖｕＩ  ２．８ｋｂと、１μＬのｐＥＮＴＲ３Ｃ／ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ（ＳＡＰ）をＤＮＡライゲーションキットを用いて接続した。以下、このプラスミドをｐＥＮＴＲ３Ｃ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと表記する。引き続いてＬＲ反応を行って、哺乳類細胞の発現ベクターであるｐＤＥＳＴ２６上にＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を組み込んだ。すなわち、２００ｎｇのｐＥＮＴＲ３Ｃ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと、１５０ｎｇのｐＤＥＳＴ２６（インビトロジェン社製）を混合し、ここに組換え用酵素であるＣｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン社製）を加えることによって、遺伝子の組換えを行った。作製された発現ベクターを以下ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子と表記する。
【００３６】
（２）融合遺伝子発現ベクターを用いた小胞体ストレス測定
次に、このベクターを細胞に導入した際、小胞体ストレス依存的にルシフェラーゼが発現するかどうか検討した。
【００３７】
（２−１）発現ベクターの一過性導入による小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼの発現
１ウェルあたり３０００個の２９３細胞を９６ウェルプレートに散布した。メディウムはＥ−ＭＥＭ（旭テクノグラス社製）に最終濃度が１０％となるようにＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を添加したもの（以下Ｅ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳと表記する）を用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて７２時間培養した後、メディウムをＦＢＳを含まないＥ−ＭＥＭに置換した。続いて、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター０．１μｇを導入した。プラスミドの導入はリポフェクトアミンプラス試薬（インビトロジェン社製）を用いて行った。すなわち、プラスミド溶液に１０μＬのＤ−ＭＥＭ（旭テクノグラス社製）と１μＬのプラス試薬を加え、良く攪拌した後、室温にて１５分間保温した。続いて、０．５μＬのリポフェクトアミン試薬を加え、良く攪拌した後、室温にてさらに１５分間保温した。これに５０μＬのＤ−ＭＥＭを加え、攪拌した後、上記の手順で培養した２９３細胞に投与し、穏やかに混和後、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、３時間培養し、プラスミドを取り込ませた。続いてメディウムをＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳに置換し、５％二酸化炭素の存在下、培養を続けた。メディウム交換して１６、２０時間後に最終濃度が１、３μＭとなるように小胞体ストレス誘導剤として知られるＡ２３１８７（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、それぞれさらに８時間、４時間培養した。コントロールとしては、Ａ２３１８７を加えず、２４時間培養したものを用いた。次に以下の方法でルシフェラーゼ活性の測定を行った。細胞培養ディッシュ中のメディウムを除去し、５０μＬの細胞溶解試薬（２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭ  ジチオトレイトール、２ｍＭ  ＣＤＴＡ、０．２％トライトンＸ−１００、１０％グリセロール）を添加した後、室温にて１５分間保温した。この細胞溶解液を２０μＬ分取し、基質液（２０ｍＭ  トリシンー水酸化ナトリウム（ｐＨ７．８）、１．０７ｍＭ  塩基性炭酸マグネシウム、２．６７ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、３３．３ｍＭ  ジチオトレイトール、２７０μＭ  コエンザイムＡ、４７０μＭルシフェリン、５３０μＭ  アデノシン三リン酸）５０μＬを添加した後、ルミノメーター（パーキンエルマー社製）にてその化学発光強度を測定した。
【００３８】
これらの結果を図１に示す。この結果、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ導入細胞において、小胞体ストレスに応答したルシフェラーゼの活性が認められた。これは小胞体ストレスにより活性化されたＩＲＥ１により融合遺伝子がフレームスイッチ型スプライシングを受けた結果、ルシフェラーゼ蛋白質が翻訳されたものと考えることが出来る。このルシフェラーゼ蛋白質の発現機構を図２に示す。
【００３９】
（２−２）ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ融合遺伝子の点突然変異体を用いた解析
上記の小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼの発現が、確かにストレス依存的に活性化されるＩＲＥ１によるフレームスイッチ型スプライシングによるものであることを証明する必要がある。現在までにＸＢＰ−１遺伝子において、ＩＲＥ１によるフレームスイッチ型スプライシングに必要な塩基は３つ同定されている（Ｃｅｌｌ  誌  第１０７巻  ８８１−８９１頁  ２００１年）。従って、そのうちのわずか１塩基を変換したＸＢＰ−１の点突然変異体とホタルルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子を作製し、この遺伝子の発現においては、小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼの活性は認められないことを示せば、上記で見られたルシフェラーゼの活性が、小胞体ストレスによって誘導されるＩＲＥ１の機能によることが示されるはずである。
【００４０】
（２−２−１）点突然変異体の作製
点突然変異体の作製は以下の方法で行った。即ち、２μｇのｐＢＳ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを０．２Ｍ  水酸化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で室温にて５分間保温し、ＤＮＡの変性を行った。次に、このＤＮＡをエタノール沈殿することにより、ＤＮＡを回収した。続いてこのＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、１００μＬのＴＥ溶液に溶解した。０．２μｇの上記変性ＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号９に示す突然変異体作製用オリゴヌクレオチドを用いて、Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（プロメガ社製）により、突然変異体の作製を行った。突然変異体は配列表の配列番号１に示される融合遺伝子の４９６番目のグアニンがシトシンに変換されたものである。得られた変異遺伝子は塩基配列を決定し、確かに目的の点突然変異が起こっていることを確認した。得られた変異遺伝子を含むベクターをｐＢＳ／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）と表記する。このベクターを元に（１−４）と同様の方法で、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）遺伝子を哺乳類発現ベクターであるｐＤＥＳＴ２６に導入した。このベクターをｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）と表記する。
【００４１】
（２−２−２）小胞体ストレス非感受性点突然変異体の一過性導入におけるルシフェラーゼの発現の阻害
次に、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）遺伝子による小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼ活性化を以下の方法により検討した。１ウェルあたり２万個の２９３細胞を９６ウェルプレートに散布した。メディウムはＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて２４時間培養した。続いて、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター又はｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）各０．２μｇを導入した。プラスミドの導入はリポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン社製）を用いて行った。すなわち、プラスミド溶液に２５μＬのＥ−ＭＥＭを加えた後、０．５μＬのリポフェクタミン２０００試薬と２５μＬのＥ−ＭＥＭを混合したものを加え、良く攪拌した後、室温にて２０分間保温した。これを上記の手順で培養した２９３細胞に投与し、穏やかに混和後、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、２４時間培養し、プラスミドを取り込ませた。この後、最終濃度が３μＭとなるようにＡ２３１８７を加え、１、２、４時間培養した。Ａ２３１８７を加えないものを準備し、コントロールとした。またルシフェラーゼ活性の測定は上記（２−１）に示されたものと同様の方法で行った。
【００４２】
これらの結果を図３に示す。結果、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）遺伝子を導入した群においては、小胞体ストレスによるルシフェラーゼの活性がほとんど認められなかった（図中ではＸＢＰ−１  ｍｔ−ｌｕｃと表示されている）。一方、コントロールとして用いたＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を導入した群においては、小胞体ストレスによるルシフェラーゼの強い活性が認められた（図中ではＸＢＰ−１  ｗｔ−ｌｕｃと表示されている）。従って、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子導入によって起こる小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼ活性は、ＸＢＰ−１遺伝子部分がフレームスイッチ型スプライシングを受けた結果起こっているということが証明された。
【００４３】
（２−３）ＩＲＥ１ドミナントネガティブ体発現ベクターの一過性導入による小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼ発現の阻害
次に、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子導入による小胞体依存的なルシフェラーゼの発現が、ＩＲＥ１によるフレームスイッチ型スプライシングによるものであることを証明するために、ＩＲＥ１のドミナントネガティブ体の発現ベクターを導入した時に、上記の小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼの発現が阻害されるかどうか検討した。実験は以下の方法で行った。１ウェルあたり２万個の２９３細胞を９６ウェルプレートに散布した。メディウムはＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて２４時間培養した。続いて、プラスミドの導入を行った。一群はｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター０．０２μｇならびにｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＩＲＥ１  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ０．２μｇ、もう一群はｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター０．０２μｇならびにｐｃＤＮＡ３０．２μｇを導入した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＩＲＥ１  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅは、ＩＲＥ１のドミナントネガティブ体の発現ベクターであり、（Ｃｅｌｌ  誌  １０７巻  ８８１−８９１頁  ２００１年）に記載されているものを用いた。プラスミドの導入はリポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン社製）を用いて行った。すなわち、プラスミド溶液に２５μＬのＥ−ＭＥＭを加えた後、０．５μＬのリポフェクタミン２０００試薬と２５μＬのＥ−ＭＥＭを混合したものを加え、良く攪拌した後、室温にて２０分間保温した。これを上記の手順で培養した２９３細胞に投与し、穏やかに混和後、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、２４時間培養し、プラスミドを取り込ませた。この後、最終濃度が３μＭとなるようにＡ２３１８７を加え、１、２、４時間培養した。Ａ２３１８７を加えないものを準備し、コントロールとした。またルシフェラーゼ活性の測定は上記（２−１）に示されたものと同様の方法で行った。
【００４４】
これらの結果を図４に示す。この結果、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＩＲＥ１  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅを導入した群においては、小胞体ストレス依存的なルシフェラーゼの活性が強く阻害されることが分かった。この結果、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子は小胞体ストレスに応答して活性化されるＩＲＥ１によってスプライシングされ、ルシフェラーゼの発現が起こることが証明された。配列表の配列番号１で示される融合遺伝子が、フレームスイッチ型スプライシングを受けた時に生じる遺伝子配列を配列表の配列番号１０に示す。また、配列表の配列番号１で示される融合遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１１に、配列表の配列番号１０で示される遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１２に示す。配列表の配列番号１で示される融合遺伝子の第４９４番目から第５１９番目までの塩基が切り取られることで、当初２６１アミノ酸であった蛋白質がルシフェラーゼ蛋白質を含んだ９２８アミノ酸の蛋白質となる。
【００４５】
（３）融合遺伝子発現ベクターを保持する細胞の取得
次に、上記融合遺伝子を恒常的に発現する細胞の取得ならびに機能評価を以下の方法に従って行った。
【００４６】
（３−１）発現ベクターの導入
１００万個の２９３細胞を直径６０ｍｍの培養ディッシュに散布した。メディウムはＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて２４時間培養した後、メディウムをＦＢＳを含まないＥ−ＭＥＭに置換した。続いて、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクター２μｇを導入した。プラスミドの導入はリポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社製）を用いて行った。すなわち、プラスミド溶液に１２５μＬのＤ−ＭＥＭ（旭テクノグラス社製）と１２μＬのリポフェクタミン試薬を加え、良く攪拌した後室温にて１５分間保温した。これを上記の手順で培養した２９３細胞に投与し、穏やかに混和後、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、３時間培養し、プラスミドを取り込ませた。続いてメディウムをＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳに置換し、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、２１時間培養した。引き続いて、この細胞をトリプシン処理によりディッシュからはがし、直径１００ｍｍの培養ディッシュに全細胞量の０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％をそれぞれ散布した。３７℃にて、２日間培養した後、選択用薬剤として、０．８ｍｇ／ｍＬのジェネティシン（ナカライテスク社製）を添加した。培地を３日おきに交換しつつ、上記条件にてさらに２週間培養することによって、プラスミド中の遺伝子が細胞内遺伝子中に導入され、ジェネティシン耐性となった細胞を選択した。この細胞株中にはｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅが導入されていると考えられる。次に、この細胞群において小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングによりＸＢＰ−１とルシフェラーゼの融合蛋白質が生じることをウエスタンブロッティングの手法を用いて確認した。
【００４７】
以下に実験方法を示す。１００万個の２９３細胞を直径６０ｍｍの培養ディッシュに散布した。メディウムはＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いた。これらを、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて２４時間培養した後、３μＭのＡ２３１８７を処理し、さらに０、４、８時間培養した。これら細胞をそれぞれ５ｍＬのＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で一度洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳを加え、スクレイパーを用いて細胞を回収した。遠心でＰＢＳを除いた後、１００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  トリスー塩酸（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を加え、良くピペッティングした後、氷中で２０分間保温した。これを１５０００回転、４℃にて３０分間遠心し、上清をライセートとして回収した。コントロールとしては、２９３細胞にｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ）又はｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｓｐｌｉｃｅｄ）を一過性に発現させ、同様な手法で調製したライセートを用いることとした。各ライセート３０μｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画し、これをミニトランスブロットブロッティング装置（バイオラッド社製）を用いて、ニトロセルロース膜（ザルトリウス社製）に転写した。次に、このメンブレンを５％のスキムミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ）（以下ＴＢＳ−ＴＭと表記する）中で室温にて３０分間振とうしブロッキングした。続いて、このメンブレンを抗ＸＢＰ−１抗体（サンタクルズ社製：ｓｃ−７１６０）を加えたＴＢＳ−ＴＭ中で、室温にて２時間穏やかに振とうした。抗体は全体量の０．０５％となるように加えた。続いて、ＴＢＳ−ＴＭ中で３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を加えたＴＢＳ−ＴＭ中で室温にて１時間穏やかに振とうした。抗体は全体量の０．０１％となるように加えた。ＴＢＳ中で３回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、抗ＸＢＰ−１抗体と反応する蛋白質を検出した。
【００４８】
この結果を図５に示す。図に示されるように、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ導入細胞群においては、Ａ２３１８７依存的にＸＢＰ−１とルシフェラーゼの融合蛋白質のサイズである１１０ＫＤａの位置に強いバンドが認められるようになった（レーン３から５）。これは、ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ融合遺伝子が細胞内で予想通りにフレームスイッチ型スプライシングを受け、ＸＢＰ−１蛋白質部分とルシフェラーゼ蛋白質部分を含んだ新たな融合蛋白質が生成していることを示している。
【００４９】
（３−２）単離クローンにおける小胞体依存的ルシフェラーゼ活性化
ディッシュ上でコロニーを形成した細胞群を２０クローン単離し、２４穴の培養ディッシュに散布し、培養を継続した。これらクローンは、小胞体ストレス刺激に対して、ルシフェラーゼ活性の増大を示すことが期待できる。そこで、次にこれらクローンのＡ２３１８７に対する反応性を以下の手順により検討した。１ウェルあたり各クローン化細胞１０万個を２４ウェルプレートに散布した。メディウムはＥ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳを用いた。これらを５％の二酸化炭素存在下、３７℃にて２４時間培養した後、３μＭのＡ２３１８７を処理して、５％二酸化炭素の存在下、３７℃にて、それぞれ０、０．５、１、２、４、６時間培養した。これらの細胞について、そのルシフェラーゼ活性を測定することによって、小胞体ストレスによるルシフェラーゼの活性化が認められるかどうか検討した。その結果、Ａ２３１８７処理により有意にルシフェラーゼ活性の上昇を示すクローンが複数個得られた。
【００５０】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図６に示す。図中の値は、Ａ２３１８７未処理群のルシフェラーゼ活性を１００とした場合の処理群の相対的な活性を示している。Ａ２３１８７に応答して、ルシフェラーゼの活性が認められるクローンが５つ得られた。これらの細胞株は、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニングに有用である。
【００５１】
実施例２
融合遺伝子を利用した小胞体ストレス応答阻害剤のスクリーニング
ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを導入した細胞株のうち、図６に示されたクローンのうち、クローン２を選択し（以下２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞と記載する。２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞は小胞体ストレスにさらされることにより発光する。）、これを利用した小胞体ストレス応答阻害剤のスクリーニング系を構築した。
【００５２】
すなわち、５０００個の２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞を、３８４穴プレート（ヌンク社製）に散布し、続いて最終濃度が２μｇ／ｍＬになるようにサンプル化合物を処理した。ここにさらに最終濃度３００ｎＭとなるように小胞体ストレスを引き起こすタプシガルギン（和光純薬社製）を処理し、室温で１時間保温した後、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間保温した。この細胞に、発光基質であるＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）を２０μＬ加え、室温で１０分間保温した後、その発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー社製）を利用して測定し、小胞体ストレス依存的な発光を阻害する化合物を探索した。
【００５３】
次に上記において得られた、小胞体ストレス依存的な発光を阻害するサンプル化合物の阻害作用の特異性を証明するためにＸＢＰ−１と融合していないルシフェラーゼ遺伝子のみを発現する２９３細胞（以下２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞と記載する。２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞は小胞体ストレスの有無に関わらず、発光する。）を対照とし、サンプル化合物の濃度の他は同様の反応条件で２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞と２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞にそれぞれサンプル化合物（最終濃度：０、０．２、０．６、２、６μｇ／ｍｌ）およびタプシガルギンを処理し、各細胞における発光を測定し、２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞の小胞体ストレス依存的な発光は阻害するが、２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞の発光は阻害しない化合物を小胞体ストレス応答を阻害する化合物として選択した。例えば、下記式（１）で表される化合物Ａは０．６μｇ／ｍＬの濃度で２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの小胞体ストレス依存的な発光を７３％阻害するが、２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの阻害は認めない（図７）ことから、小胞体ストレス応答を阻害する化合物であると考えられる。
【００５４】
【化１】
2005065692.tif 000002
【００５５】
上記式（１）で表される化合物ＡはＳｅｒｉｙａ  Ｋｈｉｍｉｃｈｅｓｋａｙａ（１９５８），ｐ．５９０−５９９に記載の方法により３，４−ｂｉｓ（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−２，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅとｉｓｏ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを原料として以下のスキームに従って容易に合成できる。
【００５６】
【化２】
2005065692.tif 000003
【００５７】
実施例２より、ＸＢＰ−１遺伝子とレポーター遺伝子の融合遺伝子を用いたスクリーニング方法は、小胞体ストレス応答を調節する化合物のスクリーニング方法として有用であることが示された。このスクリーニング方法で選択された化合物は小胞体ストレス応答が関与する、癌、虚血、糖尿病などの病態の有用な治療薬になることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ヒト胚腎臓線維芽細胞株である２９３細胞株に、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを導入した２４時間後、最終濃度０、１、３μＭのＡ２３１８７を添加し、さらにそれぞれを０、４、８時間培養した。これらの細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することによって、小胞体ストレス依存的なレポーター蛋白質の発現が認められるかどうか検討した。結果は、Ａ２３１８７非処理群の値を１００として表示した。結果、Ａ２３１８７処理群では、非処理群に比べて有意に高いルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。このことは、小胞体ストレスによって融合遺伝子がスプライシングされ、その結果ルシフェラーゼ蛋白質が翻訳されるようになったためと考えられる。
【図２】ＸＢＰ−１遺伝子とホタルルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子が小胞体ストレスに応答してルシフェラーゼの活性を生じる機構を図示したものである。
【図３】ヒト胚腎臓線維芽細胞株である２９３細胞株に、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ又はｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｍｔ）を導入した２４時間後、最終濃度３μＭのＡ２３１８７を添加し、さらに０、１、２、４時間培養した。これらの細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することによって、点突然変異体において小胞体ストレス依存的なレポーター蛋白質の発現が抑制されるどうか検討した。結果、点突然変異体導入群（ＸＢＰ−１  ｍｔ−ｌｕｃ）では、非変異体導入群（ＸＢＰ−１  ｗｔ−ｌｕｃ）に比べて有意にルシフェラーゼの活性が抑制されていることが分かった。この結果は、小胞体ストレスによって誘導されるルシフェラーゼの発現が、ＸＢＰ−１遺伝子部分にフレームスイッチ型スプライシングを受けた結果であることを示している。
【図４】ヒト胚腎臓線維芽細胞株である２９３細胞株に、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ０．０２μｇとｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＩＲＥ１  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ０．２μｇ、又はｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ０．０２μｇとｐｃＤＮＡ３０．２μｇを導入した２４時間後、それぞれの群に最終濃度３μＭのＡ２３１８７を添加し、さらに０、１、２、４時間培養した。これらの細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することによって、ＩＲＥ１  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ体によって小胞体ストレス依存的なレポーター蛋白質の発現が抑制されるどうか検討した。結果、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＩＲＥ１  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ導入群では、ｐｃＤＮＡ３導入群に比べて有意にルシフェラーゼの活性が抑制されていることが分かった。この結果は、小胞体ストレスによって誘導されるルシフェラーゼの発現が、ＩＲＥ１による特異的なスプライシングによるものであることを示している。
【図５】ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを恒常的に発現するヒト胚腎臓線維芽細胞株２９３細胞株（２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと表記する）に３μＭのＡ２３１８７を処理して、０、４、８時間培養した。これらから蛋白質を調製し、抗ＸＢＰ−１抗体でウエスタンブロッティングを行った。コントロールとして、２９３細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ）又は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｓｐｌｉｃｅｄ）を導入したものを用いた。レーン１は２９３細胞にｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｓｐｌｉｃｅｄ）を導入したライセート、レーン２は２９３細胞にｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＸＢＰ−１（ｕｎｓｐｌｉｃｅｄ）を導入したライセート、レーン３は２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのライセート、レーン４は２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに３μＭ  Ａ２３１８７を処理して４時間培養したライセート、レーン５は２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに３μＭ  Ａ２３１８７を処理して８時間培養したライセートである。分画は１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで行い、各レーンには３０μｇずつの蛋白質が泳動されている。Ａ２３１８７を４、８時間処理した群では、ＸＢＰ−１とホタルルシフェラーゼの融合蛋白質のサイズにあたる約１１０ＫＤａの位置に、ＸＢＰ−１抗体と反応するバンドが認められる。
【図６】ヒト胚腎臓線維芽細胞株である２９３細胞株に、ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを導入した後、ジェネティシンで選択を行い、ベクターが導入された細胞をクローン化した。それらに、３μＭのＡ２３１８７を処理し、さらに０、３０分、１、２、４、６時間培養した。これらの細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することによって、クローンの中で小胞体ストレスに応答してルシフェラーゼの活性化を起こすものがあるかどうか検討した。値はＡ２３１８７未処理群を１００とした時のルシフェラーゼ活性の値で示してある。結果、２０クローン中５クローンにおいて、小胞体ストレスに応答したルシフェラーゼの活性化が認められた。これらの細胞株は、小胞体ストレス応答を阻害あるいは活性化する薬剤のスクリーニングに有用である。
【図７】ｐＤＥＳＴ２６／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを恒常的に発現するヒト胚腎臓線維芽細胞株２９３細胞株（２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞）に、０、０．２、０．６、２、６μｇ／ｍｌの化合物Ａならびに３００ｎＭのタプシガルギンを処理して、４時間培養した。コントロールとして、ｐＤＥＳＴ２６／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを恒常的に発現する２９３細胞株（２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に同様の処理をしたものを準備した。これらの細胞に、発光基質であるＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏを２０μｌ加え、室温で１０分間保温後、その発光を測定した結果を示す。０．６μｇ／ｍｌ以上の濃度の化合物Ａは、２９３／ＸＢＰ−１−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞の発光を強く抑制したが、２９３／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞の発光は抑制しなかった。このことから、化合物Ａは、ＸＢＰ−１遺伝子がフレームスイッチ型スプライシングを受ける経路を阻害しているものと考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列表の配列番号：１の塩基配列はＸＢＰ−１とホタルルシフェラーゼの融合遺伝子を示す。
配列表の配列番号：２の塩基配列はＸＢＰ−１遺伝子を示す。
配列表の配列番号：３の塩基配列はホタルルシフェラーゼ遺伝子を示す。
配列表の配列番号：４から７の塩基配列は、ＰＣＲプライマーを示す。
配列表の配列番号：８の塩基配列は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）に導入されたＸＢＰ−１とホタルルシフェラーゼの融合遺伝子を示す。
配列表の配列番号：９の塩基配列は、点突然変異導入に用いるプライマーを示す。
配列表の配列番号：１０の塩基配列はフレームスイッチ型スプライシングを受けた後のＸＢＰ−１とホタルルシフェラーゼの融合遺伝子を示す。
配列表の配列番号：１１のアミノ酸配列は、ＸＢＰ−１とルシフェラーゼの融合遺伝子がフレームスイッチ型スプライシングを受けていない時に翻訳される蛋白質を示す。
配列表の配列番号：１２のアミノ酸配列は、ＸＢＰ−１とホタルルシフェラーゼの融合遺伝子がフレームスイッチ型スプライシングを受けた時に翻訳される蛋白質を示す。
【図１】
2005065692.tif 000004
【図２】
2005065692.tif 000005
【図３】
2005065692.tif 000006
【図４】
2005065692.tif 000007
【図５】
2005065692.tif 000008
【図６】
2005065692.tif 000009
【図７】
2005065692.tif 000010
【配列表】
2005065692000001.app