(57)【要約】【課題】  マメ科植物においてアレルゲンタンパク質を効率良く発現させることが可能な発現ベクター、該発現ベクターが導入された形質転換体植物の生産方法、該形質転換体植物並びにその利用を提供する。【解決手段】  本発明では、マメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターをマメ科植物、例えばミヤコグサに導入することで、マメ科植物においてアレルゲンタンパク質を生産・蓄積することが可能である。該マメ科植物を経口摂取することにより、アレルギー性疾患の経口減感作治療法に利用が可能である。アレルゲンタンパク質の一例としては、コナヒョウダニ由来のＤｅｒｆＩタンパク質を挙げることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マメ科植物内でアレルゲンタンパク質が安定的に発現するプロモーターと、当該タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなることを特徴とするマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項２】
上記マメ科植物用発現ベクターに、ターミネーターが含まれていることを特徴とする請求項１に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項３】
上記プロモーターとして、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターが用いられることを特徴とする請求項１または２に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項４】
上記ターミネーターとしてＮＯＳ−ターミネーターが用いられることを特徴とする請求項２または３に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項５】
上記アレルゲンタンパク質がダニ由来であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項６】
上記ダニがコナヒョウヒダニであることを特徴とする請求項５に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項７】
上記アレルゲンタンパク質が、ダニ由来のＤｅｒｆＩタンパク質であることを特徴とする請求項５または６に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項８】
上記マメ科植物が、ミヤコグサであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターをマメ科植物に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換植物の生産方法。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターをマメ科植物に導入してなり、アレルゲンタンパク質を含んでいることを特徴とする形質転換植物。
【請求項１１】
上記マメ科植物が、ミヤコグサであることを特徴とする請求項１０に記載の形質転換植物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の形質転換植物を用いたアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１３】
上記形質転換植物の種子を用いることを特徴とする請求項１２に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【請求項１４】
上記アレルギー疾患が、ダニアレルギー疾患であることを特徴とする請求項１２または１３に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マメ科植物内でアレルゲンタンパク質が安定的に発現するマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターと、これを用いてなる形質転換植物と、その代表的な利用の一例とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
小児喘息の約７０％以上を占めるダニアレルギーや、花粉症といったアレルギー疾患は増加傾向にあり、近い将来先進国の３人に１人がこうしたアレルギー疾患で治療を受けると予想されている。これらのアレルギー疾患にはアレルギーを引き起こすアレルゲンタンパク質がそれぞれ存在し、治療法としては図１１に示すごとく、薬物療法、減感作治療法、体質改善法がある。なかでも有効とされるアレルギー疾患の治療法は、抗ヒスタミン剤や、抗アレルギー薬等の薬物療法であるが、慢性化するため好ましいものではない（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
そこで、減感作治療法が最近クローズアップされてきている。減感作治療法とは、即時型アレルギーの原因となるアレルゲンタンパク質を少量ずつアレルギー患者に投与することによって病因アレルゲンタンパク質に対する感受性を低下させることをいい、特に吸入性アレルゲンタンパク質の場合に用いられる。この減感作治療法においては、投与アレルゲンタンパク質によって、ＩｇＥ抗体とは異なる別種の抗体（阻止抗体または遮断抗体）が産出され、これが侵入するアレルゲンと結合することにより、アレルゲンとＩｇＥ抗体とが結合して反応を起こすのを阻止すると考えられている（図１２、および非特許文献２,３参照）。
【０００４】
現在の減感作治療法は、アレルゲンタンパク質を患者に経皮注射して行われているが、注射の苦痛を伴わない、経鼻あるいは経口減感作治療法も試みられている（非特許文献４参照）。そのため、アレルゲンタンパク質を容易に経口あるいは経鼻で摂取できる方法が求められている。その手段の一つとして、アレルゲンタンパク質を植物で発現させ、該植物を経口摂取する方法が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
ところでヒトは、多くの植物を食物と利用している。植物には、葉や茎や実といった食する部位がある。実を食するものの１つとして、マメ科植物が挙げられる。ダイズをはじめとするマメ科植物はタンパク質・脂質含量が高く、やせた土地でも育つため、食料、栽培作物として世界中で栽培されている重要な栽培作物の一つである。また、マメ科植物は多様性・有用性を有し、種子に多くのタンパク質を蓄積するという特徴を持っている。
【特許文献１】特表平１４−５２６１１６号公報（公開日：平成１４（２００２）年８月２０日）
【非特許文献１】永井博弌  日本薬学会編、「もうアレルギーに苦しまないぜんそく・花粉症・アトピー性皮膚炎」、丸善、平成１２年９月３０日
【非特許文献２】ROITT・BROSTOFF・MALE  著、多田富雄  監訳、「免疫学  イラストレイテッド」、南江堂、２００２年２月１０日
【非特許文献３】多田 富雄  著、「免疫の意味論」、青土社、１９９３年１月１日
【非特許文献４】羅 智靖，大田 健，河野 陽一，古江 増隆  編集、「実験医学別冊 メディカル用語ライブラリー アレルギー 分子メカニズムから病態・診断・治療まで」、羊土社、１９９６年３月１５日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した従来の技術（特許文献１）において植物におけるアレルゲンタンパク質の生産させる手段について言及されているが、タバコ植物におけるアレルゲンタンパク質の発現に成功しているが、食用の植物（農作物）、例えば、マメ科植物においては、アレルゲンタンパク質の発現には成功していない。またダイズ等のマメ科植物は、一般的に形質転換が困難であるとされており、このことが、マメ科植物内におけるアレルゲンタンパクの生産系の確立を困難なものにしていると考えられる。
【０００７】
またダイズをはじめとするマメ科植物は、前述したごとく、やせた土地においても生育が可能であり世界中で容易に栽培することが可能であるという特徴、およびタンパク質をその可食部分である種子に蓄積するという特徴を有している。よって、かかるマメ科植物内においてアレルゲンタンパク質を効率良く生産させることができれば、アレルゲンタンパク質が蓄積された種子を経口摂取することによって、各種アレルギー性疾患の減感作治療法の好適な手段が完成するものといえる。
【０００８】
よって本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、マメ科植物においてアレルゲンタンパク質を効率良く発現させることが可能な発現ベクター、該発現ベクターが導入された形質転換体植物の生産方法、該形質転換体植物並びにその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、マメ科植物のミヤコグサ（Lotus japonicus）において、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）のメジャーアレルゲンタンパク質であるＤｅｒｆＩタンパク質を、効率良く生産することが可能な発現ベクターの構築に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）マメ科植物内でアレルゲンタンパク質が安定的に発現するプロモーターと、当該タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１２】
（２）上記マメ科植物用発現ベクターに、ターミネーターが含まれている（１）に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１３】
（３）上記プロモーターとして、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターが用いられる（１）または（２）に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１４】
（４）上記ターミネーターとしてＮＯＳ−ターミネーターが用いられる（２）または（３）に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１５】
（５）上記アレルゲンタンパク質がダニ由来である（１）ないし（４）のいずれかに記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１６】
（６）上記ダニがコナヒョウヒダニである（５）に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１７】
（７）上記アレルゲンタンパク質がダニ由来のＤｅｒｆＩタンパク質である（５）または（６）に記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１８】
（８）上記マメ科植物が、ミヤコグサである（１）ないし（７）のいずれかに記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター。
【００１９】
（９）上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターをマメ科植物に導入する工程を含む形質転換植物の生産方法。
【００２０】
（１０）上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターをマメ科植物に導入してなり、アレルゲンタンパク質を含んでいる形質転換植物。
【００２１】
（１１）上記マメ科植物がミヤコグサである（１０）に記載の形質転換植物。
【００２２】
（１２）上記（１０）または（１１）に記載の形質転換植物を用いたアレルギー性疾患治療薬。
【００２３】
（１３）上記形質転換植物の種子を用いる（１２）に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【００２４】
（１４）上記アレルギー疾患がダニアレルギー疾患である（１２）または（１３）に記載のアレルギー性疾患治療薬。
【発明の効果】
【００２５】
以上のように、本発明にかかるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターは、ミヤコグサ等のマメ科植物中で、例えば、ダニ由来のアレルゲンタンパク質を生産させることができるという効果を奏する。それゆえ、本発明にかかる形質転換植物は、例えば、ダニアレルギー疾患等の吸入性アレルゲンによるアレルギー疾患の治療等に好適に用いることができるという効果を奏する。代表的な用途としては、種子等を経口減感作治療法に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。以下の説明では、本発明にかかるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター、本発明にかかる形質転換植物およびその生産方法、並びに本発明の利用（有用性）について、それぞれ具体的に説明する。
【００２７】
（１）本発明にかかるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター
本発明にかかるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクター（以下、説明の便宜上、アレルゲン発現ベクターと略す）は、少なくとも、プロモーターの制御下でアレルゲンタンパク質をコードする遺伝子（便宜上、アレルゲン遺伝子と称する）を連結したアレルゲン発現カセットを含む構造となっていれば特に限定されるものではない。
【００２８】
＜アレルゲンタンパク質およびアレルゲン遺伝子＞
本発明におけるアレルゲンタンパク質とは、アレルギー反応を引き起こす原因物質（アレルゲン）であれば特に限定されるものではない。アレルゲンはマクロファージにより処理されて抗原認識Ｔ細胞に提示され、抗原特異的なＴ細胞や抗体（ＩｇＥ）産生を誘導する。誘導される細胞や抗体の種類、アレルギー反応の症状は、感作される生体側の条件（遺伝子要因や栄養状態）・アレルゲンの侵入経路により異なるとされている。
【００２９】
アレルゲンの侵入経路には様々なものがあるが、基本的には、空気中を漂って気道（呼吸器）粘膜を介して感作する場合と、食品のように経口摂取により消化管粘膜を介して感作するものに分けることができ、各経路に特有の免疫機構に依存するアレルゲンが存在すると考えられている。なお、説明の便宜上、前者を呼吸器系経路と称し、後者を消化器系経路と称する。本発明におけるアレルゲンタンパク質としては、どのような経路で侵入するものであってもよいが、例えば、侵入経路が呼吸器系経路のもの、すなわち吸入性アレルゲンタンパク質を挙げることができる。
【００３０】
吸入性アレルゲンとしては、花粉やダニ等が挙げられるが、本発明では、後述する実施例に示すように、アレルゲンタンパク質としてダニ由来のもの、より具体的には、コナヒョウヒダニ由来のＤｅｒｆＩタンパク質を挙げることができる。これにより、本発明にかかる形質転換植物を、後述するように呼吸器系経路のアレルギー疾患、特に、ダニアレルギーの経口減感作治療法に用いることが可能となる。
【００３１】
なお、最近の調査研究によれば、例えば、ダイズアレルゲン、ダニアレルゲン、パイナップルアレルゲン（ブロメライン）の間にはタンパク質の一次構造に共通部分が含まれており、アレルギーの発症には、生物の分類学上の類縁関係といったものを越えて、分子レベルで共通する構造や機能が関与する可能性が高いと考えられている。また、上記のように、呼吸器系経路または消化器系経路に特有の免疫機構に依存するアレルゲンが存在するように考えられてきたが、最近の研究によれば、この考えを覆す知見も得られている。
【００３２】
したがって、本発明におけるアレルゲンタンパク質は、例えば減感作治療法に用いる場合でも、呼吸器系経路や消化器系経路に特有のアレルギーに特定されるのではなく、アレルゲンタンパク質の一次構造上から見て類縁関係にあるタンパク質を用いるようにすればよい。それゆえ、本発明におけるアレルゲンタンパク質には、アレルゲンとして特定されているタンパク質のみならず、アレルゲンとしては未だ特定されていなくても、その一次構造が類似しているタンパク質も含まれるものとする。さらには、本発明におけるアレルゲンタンパク質には、高次構造が類似しているタンパク質も含まれ、アレルゲンとなりうる程度のアミノ酸配列を含む部分タンパク質や変異タンパク質も含まれるものとする。
【００３３】
＜ベースベクターの種類＞
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターは、基となるベクター（以下の説明では、便宜上、ベースベクターと称する）に、上記アレルゲン遺伝子、プロモーター、ターミネーター等を組み込んで構築すればよい。ここで、上記ベースベクターとしては、マメ科植物に形質転換することが可能なものであれば特に限定されるものではなく、公知のプラスミド、ファージ、コスミド等を好適に用いることができる。
【００３４】
上記ベースベクターとしては、具体的には、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来プラスミド、λファージ等のバクテリオファージ、各種レトロウイルス等が挙げられる。
【００３５】
上記プラスミドの具体的な種類は特に限定されるものではないが、大腸菌（E. coli）内でも増殖できるシャトルベクターが好ましく用いられ、さらには比較的サイズの小さいものがより好ましく用いられる。具体的には、例えば、後述する実施例においては、A.tumefaciensのＴｉプラスミドを用いてマメ科植物であるミヤコグサを形質転換している。Ｔｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡを含む領域は感染植物細胞の核ゲノムに安定に組み込まれるので、高等植物における形質転換用のベクターとして広く利用されている（例えば、岩淵 雅樹、志村 令郎 編；ラボマニュアル 植物遺伝子の機能解析；丸善株式会社、島本 功、岡田 清孝 監修;植物細胞工学シリーズ4  モデル植物の実験プロトコール イネ・シロイヌナズナ編；秀潤社  参照）。
【００３６】
＜プロモーターおよびターミネーター＞
上記マルチクローニングサイトの上流にあるプロモーターは、植物体内で他の遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。中でも、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）をより好ましく用いることができる。
【００３７】
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターにおいては、このＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いることにより、植物細胞に導入されたアレルゲン遺伝子を有効かつ効率的に発現させることが可能となる。また、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、植物の形質転換用プロモーターとしては信頼性の高いものでもあるため、本発明にかかるアレルゲン発現ベクターをより優れたものとすることができる。
【００３８】
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターに用いられるターミネーターは、転写集結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよいが、本発明では、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓターミネーター、Ｎｏｓ−ｔｅｒ）を好ましく用いることができる。
【００３９】
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターにおいては、このＮｏｓターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００４０】
なお、本発明にかかるアレルゲン発現ベクターは、上記アレルゲン遺伝子、プロモーター、ターミネーター以外のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではない。
【００４１】
＜アレルゲン発現ベクターの作製方法、並びに生産方法＞
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターの作製方法については、特に限定されるものではなく、上記ベースベクターに、上述した各ＤＮＡセグメント（プロモーター、ターミネーター、アレルゲン遺伝子等）を所定の順序となるように導入すればよい。
【００４２】
上記各ＤＮＡセグメントを導入する際に用いられる試薬、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。また、本発明にかかる発現ベクターを作製するためのストラテジーについても特に限定されるものではなく、上記各ＤＮＡセグメントを、所定の順序で効率的に配列させることができるようなストラテジーであればよい。
【００４３】
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターの生産方法、すなわち、上記作製方法で作製されたアレルゲン発現ベクターを増殖させる方法についても特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には、ベースベクターとして大腸菌でも増殖できるシャトルベクターを用いた場合には、大腸菌をホストとして当該大腸菌細胞内で増殖させればよい。このときベースベクターや作製されたアレルゲン発現ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。また、大腸菌細胞から増殖したアレルゲン発現ベクターを回収する方法も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。
【００４４】
本発明で用いられるアレルゲン発現ベクターの代表的な例としては、後述する実施例に示すように、ＤｅｒｆＩ遺伝子断片と、ｐＢＩ１２１またはｐＩＧ１２１Ｈｍのカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター下流に存在するＧＵＳ遺伝子とを置換することにより構築された、ｐＢＩ１２１−ＤｅｒｆＩまたはｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩを挙げることができる。
【００４５】
（２）本発明にかかる形質転換植物およびその生産方法
本発明にかかる形質転換植物は、上記アレルゲン発現ベクターを導入してなるマメ科植物であり、アレルゲンタンパク質を含んでいる植物である。なお、本発明において「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、本発明における「形質転換植物」とは、植物個体のみならず、培養細胞等の細胞、組織、並びに器官も含む意味である。
【００４６】
＜マメ科植物＞
本発明で用いられるマメ科植物としては、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ダイズ、アズキ、ソラマメ、トラマメ、エンドウ、インゲン、緑豆、シナガワハギ、アルファルファ、クローバー、レンゲソウ、オヤマノエンドウ、エビスグサ、ミヤコグサ、タルウマゴヤシ等を挙げることができる。これらの中でも、後述する実施例に示すように、ミヤコグサを好ましく用いることができる。
【００４７】
ミヤコグサは、マメ科植物の中でもモデル植物として有用であり、様々な分子遺伝学的解析がなされている。すなわちミヤコグサは実験用の植物として高い信頼性があるとともに、マメ科でもあるため、ミヤコグサを用いることで、本発明にかかる形質転換植物を容易に生産することができるとともに、他のマメ科植物への応用も可能となる。
【００４８】
＜アレルゲンタンパク質の発現部位＞
本発明にかかる形質転換植物は、アレルゲン遺伝子の発現によりアレルゲンタンパク質を含むものであるが、このアレルゲンタンパク質の存在部位としては特に限定されるものではない。
【００４９】
具体的には、上記アレルゲンタンパク質は、マクロ的に見て植物個体全体に含まれていればよいが、ミクロ的に見れば、植物個体を構成する全ての細胞においてアレルゲン遺伝子が発現する必要はなく、何れかの組織や器官に特異的に発現していてもよい。換言すれば、アレルゲン発現ベクターの発現を制御することによって、特定の組織や器官に優先的にアレルゲン遺伝子を発現させることも可能となる。
【００５０】
例えば、マメ科植物を食用とする場合には、その食用部位の種子であるため、種子にアレルゲン遺伝子を発現させることにより、アレルゲンタンパク質を含む種子を得ることができる。このようにアレルゲンタンパク質を含む種子は、後述するように、経口摂取による各種アレルギー性疾患の減感作治療法に用いることが可能となる。
【００５１】
＜形質転換植物の生産方法＞
本発明にかかる形質転換植物の生産方法は、少なくとも上記アレルゲン発現ベクターをマメ科植物に導入する工程（便宜上、形質転換工程と称する）を含んでいれば良いが、宿主となるマメ科植物へアレルゲン発現ベクターを導入する具体的な手法は特に限定されるものではなく、宿主となる植物体の種類に応じた適切な形質転換方法を用いればよい。植物体への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができ、後述する実施例に示すように、本発明でもアグロバクテリウム法を好適に用いることができる。またその他パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００５２】
上記アレルゲン発現ベクターが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、ゲノミックＰＣＲ法、ゲノミックサザンブロット解析を用いることができる。
【００５３】
なお、本発明にかかる形質転換植物の生産方法では、上記形質転換工程以外の工程が含まれていてもよいことはいうまでもない。また、本発明で得られる形質転換植物の成育方法は特に限定されるものではなく、宿主植物の種類や形質転換植物の用途に応じて公知の方法を用いることができる。
【００５４】
（３）本発明の利用（有用性）
本発明にかかるアレルゲン発現ベクターは、マメ科植物の形質転換に好適に用いることができるものである。また、本発明にかかる形質転換植物は、アレルゲンタンパク質を含むものである。マメ科植物には、食用となる植物（農作物）が多く含まれることから、本発明の代表的な利用分野としては、アレルギー性疾患治療薬を挙げることができる。
【００５５】
具体的には、前述したように、本発明にかかる形質転換植物を減感作治療法に用いることができる。減感作治療法では、アレルゲンタンパク質を少量ずつアレルギー患者に投与することによって病因アレルゲンタンパク質に対する感受性を低下させる療法である。食用となるマメ科植物の多くは種子を食するので、形質転換植物の種子をアレルギー性疾患の減感作治療薬として摂取することで、アレルギー疾患の治療を図ることが可能となる。
【００５６】
また、本発明にかかる形質転換植物は、アレルゲンタンパク質としてダニ由来のものを用いている。上記減感作療法は、前述したように、特に吸入性アレルゲンタンパク質の場合に用いられるので、本発明にかかる形質転換植物は、アレルギー性疾患の中でも、ダニアレルギー疾患に好適に用いることができる。
【００５７】
例えば、図１に示す模式図を用いてさらに具体的に説明すると、以下のとおりである。まず、ダニアレルギー疾患の原因のひとつで、コナヒョウヒダニ由来の主要抗原であるＤｅｒｆＩをコードする遺伝子をクローニングし、発現ベクターを構築する。その発現ベクターを用いて植物体（特に可食植物）を形質転換する。かかる形質転換体植物では、ＤｅｒｆＩタンパク質が生産され蓄積されている。そのＤｅｒｆＩタンパク質が、蓄積した形質転換体植物の可食部分を、ダニアレルギー患者が食すことによって、アレルゲンを注射等によって投与する方法と同様の減感作治療の効果がある。また注射等による減感作治療法では、苦痛を伴うが、本方法によれば、苦痛は皆無である。
【００５８】
本発明では、上記植物体として、マメ科植物を用いている。上述したように、マメ科植物はタンパク質・脂質含量が高く、やせた土地でも育つため、食料、栽培作物として世界中で栽培されている重要な栽培作物の一つであり、種子に多くのタンパク質を蓄積することができるため、減感作療法に好適に用いることが可能である。
【００５９】
本発明にかかるアレルギー性疾患治療薬剤は、上記形質転換植物を用いたものであるが、その治療対象は必ずしもヒトに限定されるものではない。例えば、最近では、イヌやネコ等のペット用家畜、あるいは野生動物でもニホンザル等では、アレルギー疾患が報告されている。それゆえ、本発明にかかるアレルギー性疾患治療薬は、これらヒト以外の動物に対しても有効に用いることができる。
【００６０】
本発明にかかるアレルギー性治療薬剤の具体的な使用方法は特に限定されるものではなく、例えば種子等の可食部位をそのまままたは調理して摂取してもよいが、可食部位を原料とした加工食品としてもよい。加工食品とすることで、アレルギー疾患治療薬剤をより摂取しやすくすることができる。なお、加工食品の具体的な種類は特に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００６１】
また、本発明にかかる形質転換植物の利用は、上記アレルギー性疾患治療薬剤に限定されるものではない。例えば、本発明にかかるアレルゲン発現ベクターを過剰発現ベクターとすることによって、形質転換植物中で大量にアレルゲンタンパク質を生産させる用途を挙げることができる。これによって、大量のアレルゲンタンパク質を容易に得ることができる。
【００６２】
以下にいくつかの実施例、並びに図面を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００６３】
以下本発明を実施例および図２〜１０に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６４】
以下の実施例において使用した材料について説明する。
【００６５】
〔使用菌株、植物種及びプラスミド〕
〈菌株〉
遺伝子導入に用いたアグロバクテリウムは、（１）Agrobacterium tumefaciens LBA4404 （以下A.tumefaciens LBA4404と略す。以下同様に略す。）（土壌細菌、RifR）（Handberg K, Stougaard J. (1992) Lotus japonicus, diploid legume species for classical and molecular genetics. Plant J. 487-496.参照）、（２）A.tumefaciens  PC（土壌細菌、RifR）、（３）およびA.tumefaciens  C58C1（土壌細菌、RifR）（Shozo Ohta,Satoru Mita,Tsukaho Hattori and Kenzo Nakamura（1990）Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase（GUS）Reporter Gene Containing an Intron Within the Codig Sequence. Plant Cell Physiol.31(6),805-813 参照）を使用した。
【００６６】
形質転換用宿主大腸菌は、Escherichia coli DH5α（以下E.coli DH5αと略す）（supE44，ΔlacU169〈φ80lacZΔM15〉， hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1）を使用した。
【００６７】
〈植物〉
形質転換用植物としては、ミヤコグサ  Lotus japonicus acc B-129 ‘Gifu'、および  Lotus japonicus acc MG-20 ‘Miyakojima’を用いた。
【００６８】
〈プラスミド〉
アレルゲンタンパク質発現用ベクターの構築に用いるベクターとしては、（１）ｐＢＩ１２１（binary vector，KmR）（Yukoh Hiei,Shozo Ohta,Toshihiko Komari and Takashi Kumashiro（1994）Efficient transformation of rice（Oryza sativa L.）mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal,6(2),271-282）、およびWhite FF,Nester EW（1980）J.Bacteriol.144:710-720参照）、（２）およびｐＩＧ１２１Ｈｍ（binary vector，KmR，HmR）（Stiller J, Martirani L, Tuppale S, Chian RJ, Chiurazzi M, Gresshof, PM. (1997)High frequency transformation and regeneration of transgenic plants in model legume Lotus japonicus. J. Exp. Bot. 48, 1357-65.、およびHoekema,A.,Hirsch,P.R.,Hooykaas,P.J.J.and Schilperoort,R.A.（1983）A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature,303,179-180参照）を使用した。
【００６９】
〈アレルゲンタンパク質および該遺伝子〉
発現させるアレルゲンタンパク質には、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の主要アレルゲンの一つであるＤｅｒｆＩを用いることとした。なお、該タンパク質をコードする遺伝子ＤｅｒｆＩ遺伝子は、発明者の小埜和久がクローニングしたものを用いた。
【００７０】
該遺伝子産物は、分子量約２５ｋＤａのタンパク質である。また分子内に一つのアスパラギン型糖鎖添加シグナルを持ち、システインプロテアーゼ活性を持つことが知られている（Richard A.Jefferson.Tony A.Kavanagh and Michael W.Bevan（1987）GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.The EMBO Journal. 6 (3) 3901-3907、およびRichard A.Jefferson.（1987）Asseying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene Fusion System.PLANT MOLECULAR BIOLOGY REPORTER. 5(4) 387-405参照）。
【００７１】
〈大腸菌用培地〉
ＳＯＢ培地の組成は、Trypton  2.0%(w/v)、Yeast Extract  0.5%(w/v)、NaCl  0.05%(w/v)、KCl  2.5mM、MgCl2  0.01M、MgSO4  0.01Mである。
【００７２】
ＬＢ培地の組成は、Trypton  1.0％(w/v)、Yeast Extract  0.5％(w/v)、NaCl  1.0％(w/v)、Agar  1.5％(w/v)である。
【００７３】
〈アグロバクテリウム用培地〉
ＹＥＰ寒天培地の組成は、Yeast Extract  1.0%、Peptone  1.0%、NaCl  0.5%、Ager  1.5%、Kanamycin  50 mg/ml、Rifampicin  100 mg/ml、0.3M K2HPO4/KH2PO4(pH6.8)、K2HPO4  2.59g、KH2PO4  2.05gである。
【００７４】
ＹＭＢ液体培地の組成は、マンニトール  0.2%(w/v)、Yeast Extract  0.04%(w/v)、MgSO4.7H2O  0.02%(w/v)、NaCl  0.01%(w/v)である。使用時に0.3Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）を1.0％となるように添加する。
【００７５】
〈植物用培地〉
Vitamin stock（1000×）は、GAMBORG'S VITAMIN POWDER（SIGMA）  11.2g、Thiamine hydrochloride  1.0g、Nicotinic acid  100mg、Pyridoxine hydrochloride  100mg、myo-inositol  10gを脱イオン水で100mlにメスアップ後、0.2mmのフィルターで除菌して調製した。
【００７６】
MES（1M、pH5.2）は、MES 21.3gを滅菌水に溶かし、1M NaOHでpH 5.2とした後に、100mlとした。0.2mmのフィルターで滅菌し、分注して-20℃で保存する。
【００７７】
BAP（1mg/ml）は、6-Benzyl Amino Purine (Sigma: #B-3408) 50mgを1mlの1M NaOHに溶かし、滅菌水で50mlとした。0.2mmのフィルターで除菌し、分注して-20℃で保存する。
【００７８】
NAA（1mg/ml）は、α-Naphthalene Acetic Acid (Sigma; #N-1145) 50mgを24mlの95% エタノールに溶かし、滅菌水で50mlとした。0.2mmのフィルターで除菌し、分注して-20℃で保存する。
【００７９】
G418（50mg/ml）は、GENETICIN Disulfate Salt (Sigma)50mgを1mlの滅菌水に溶解後、0.2mmのフィルターで除菌し、分注して-20℃で保存した。
【００８０】
Gamborg'S B5 basal saltsは、Gamborg's B5 Medium salt Mixture (Wako: #399-00621)  3.3g、KNO3  2500mg、MgSO4・7H2O  250mg、NaH2PO4・H2O  150mg、CaCl2・2H2O  150mg、(NH4)2SO4  134mg、Na2-EDTA  37.3mg、FeSO4・7H2O  27.8mg、MnSO4・H2O  10mg、H3BO3  3mg、ZnSO4・7H2O  2mg、KI  0.75mg、Na2MoO4・2H2O  0.25mg、CuSO4・5H2O  0.025mg、CoCl2・6H2O  0.025mgを1000mlの蒸留水に溶かし、オートクレーブして保存した。
【００８１】
Co-cultivation培地の組成は、Gamborg's B5 basal salts  0.1×、Vitamin  0.1×、NAA  0.05mg/ml、BAP  0.5mg/ml、MES (pH5.2)  5mM、Acetosyringone  20mg/mlである。
【００８２】
Callus培地は、Gamborg's B5 basal salts  1×、sucrose  2.0%(w/v)、を蒸留水に溶かし、1N NaOHでpH5.5に調整し、phytagelを0.3%(w/v)加えて、オートクレーブし、熱いうちに(NH4)2SO4  10mM NH4+を加え、70℃以下に冷やしてから、Vitamin  1×、NAA  0.05mg/ml、BAP  0.2mg/ml（Miyakojimaの場合）または0.5mg/ml（Gifuの場合）、Claforan  300mg/ml、G418（Geneticin）  25mg/ml
を添加して調製した。
【００８３】
Shoot Induction培地は、Gamborg's B5 basal salts  1×、sucrose  2.0%(w/v)を蒸留水に溶かし、1N NaOHでpH5.5に調整後、phytagelを0.3%(w/v)加えて、オートクレーブし、熱いうちに(NH4)2SO4  10mM NH4+を加え、70℃以下に冷やしてから、Vitamin  1×、NAA  0.05mg/ml、BAP  0.2mg/ml（Miyakojimaの場合）または0.5mg/ml（Gifuの場合）を添加して調製した。
【００８４】
Shoot Elongation培地は、Gamborg's B5 basal salts  1×、sucrose  2.0%(w/v)を蒸留水に溶かし、1N NaOHでpH5.5に調整後、phytagelを0.3%(w/v)加えて、オートクレーブし、70℃以下に冷やしてからVitamin  1×、BAP  0.2mg/mlを添加して調製した。
【００８５】
Root induction培地は、Gamborg's B5 basal salts  1×、sucrose  1.0%(w/v)を蒸留水に溶かし、1N NaOHでpH5.5に調整後、phytagelを0.4%(w/v)加えて、オートクレーブし、70℃以下に冷やしてからVitamin  0.5×、NAA  0.5mg/mlを添加して調製した。
【００８６】
Root Elongation培地は、Gamborg's B5 basal salts  0.5×、sucrose  1.0%(w/v)を蒸留水に溶かし、1N NaOHでpH5.5に調整後、phytagelを0.4%(w/v)加えて、オートクレーブし、70℃以下に冷やしてからVitamin  0.5×を添加して調製した。
【００８７】
＜使用試薬＞
RNaseA溶液の組成は、Tris-HCl (pH 7.5)  10mM、NaCl  15mM、RnaseA  10mg/mlである。
【００８８】
固定液の組成は、メタノール  50%(v/v)、酢酸  10%(v/v)である。
【００８９】
Transfer Bufferの組成は、Tris  25mM、Glycine  192mM、メタノール  20%(v/v)である。
【００９０】
Ponceau溶液の組成は、Ponceau S  0.01%(w/v)、酢酸  0.1%(v/v)である。
【００９１】
TTBS Bufferの組成は、Tris-HCl (pH 7.4)  20mM、NaCl  150mM、Tween-20  0.2%(v/v)である。
【００９２】
Extraction Bufferの組成は、Tris-HCl (pH 7.5)  200mM、NaCl  250mM、EDTA  25mM、SDS  0.5%(w/v)である。
【００９３】
2％CTAB solutionの組成は、Tris-HCl (pH 8.0)  100mM、EDTA (pH 8.0)  20mM、NaCl  1.4M、CTAB  2.0%(w/v)である。
【００９４】
1％CTAB  solutionの組成は、Tris-HCl (pH 8.0)  50mM、EDTA (pH 8.0)  10mM、CTAB  1.0%(w/v)である。
【００９５】
〔実施例１：マメ科植物用発現ベクターｐＢＩ１２１−ＤｅｒｆＩの構築〕
ｐＢＩ１２１（図２（ａ）参照）をＸｂａＩ／ＳａｃＩで処理し、ＧＵＳ遺伝子領域を切り出した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに組み込まれたＤｅｒｆＩ遺伝子を、ＸｂａＩ／ＳａｃＩで制限酵素処理し切り出した（図２(ｂ)参照）。ｐＢＩ１２１とＤｅｒｆＩ遺伝子のフラグメントはゲル抽出を行い、これらのフラグメントをライゲーションし、大腸菌を形質転換した。
【００９６】
得られた形質転換体から抽出したプラスミドをＸｂａＩ／ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、およびＸｂａＩ／ＮｏｔＩで制限酵素処理し、ＤｅｒｆＩ遺伝子の挿入を確認した。さらにＰＣＲ増幅およびシークエンスによりＤｅｒｆＩ遺伝子の挿入を確認した。その結果ＤｅｒｆＩ遺伝子の挿入が確認されたプラスミドを、目的のｐＢＩ１２１−ＤｅｒｆＩとした(図２(ｃ)参照)。
【００９７】
〔実施例２：マメ科植物用発現ベクターｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩの構築〕
ｐＩＧ１２１Ｈｍ（図３（ａ）参照）をＸｂａＩ／ＳａｃＩで処理し、イントロンＧＵＳ遺伝子領域を切り出した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに組み込まれたＤｅｒｆＩ遺伝子を、ＸｂａＩ／ＳａｃＩで制限酵素処理し切り出した（図３(ｂ)参照）。
【００９８】
ｐＩＧ１２１Ｈｍは、ＣＩＡＰ処理を行った。ＣＩＡＰ処理は、以下のようにして行った。プラスミドを制限酵素処理し、０．１倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．２倍量の９９％エタノールを入れ、２０分間室温におき、１２,０００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離を行った。得られたペレットを、７０％エタノールでリンスをし、遠心分離後乾燥させた。これを、１０μlのMilliQ Waterに溶かし、ＣＩＡＰ buffer（宝酒造社製）１μl，ＣＩＡＰ（宝酒造社製）０．５μlを加え、３７℃で３０分間反応させた。さらに、０．５ＭのＥＤＴＡ  ０.５μl加え、６５℃，３０分間の条件でＣＩＡＰを失活させた。等量のフェノール／クロロホルム／イソプロパノール（ｐ／Ｃ／Ｉ）を加え、１２，０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した。上清をとり、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．２倍量の９９％エタノールを入れ、−８０℃に３０分間おき、１２,０００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離した。得られたペレットを７０％エタノールでリンスをし、遠心分離後乾燥させた。これを、１０μlのMilliQ Waterに溶解した。
【００９９】
ＤｅｒｆＩ遺伝子のフラグメントはゲル抽出により取得した。これらのフラグメントをライゲーションし、大腸菌を形質転換した。
【０１００】
得られた形質転換体から抽出したプラスミドをＸｂａＩ／ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、およびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ＤｅｒｆＩ遺伝子の挿入を確認した。さらにＰＣＲ増幅およびシークエンスによりＤｅｒｆＩ遺伝子の挿入を確認した。その結果ＤｅｒｆＩ遺伝子の挿入が確認されたプラスミドを、目的のｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩとした(図３(ｃ)参照)。
【０１０１】
〔実施例３：マメ科植物用発現ベクターｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩを用いたミヤコグサ（L.japonicus）の形質転換〕
＜エレクトロポレーション＞
宿主株として用いるA.tumefaciensをＬＢ培地（Rif,Kmそれぞれ５０μg／ｍｌ添加）３ｍｌに植菌し、２８℃で２晩振とう培養し、この前培養液を３００ｍｌのＬＢ培地に１％植菌した。この本培養液のＯＤ660が０．５付近になるまで培養をし、その後氷中(以後すべて氷中で作業する)に１０分間静置して増殖を停止させた。６，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃下で遠心分離(TOMY)を行って集菌した。
【０１０２】
３００ｍｌ、１００ｍｌ、６ｍｌそれぞれの１０％グリセロール(２７２ｍＭ シュークロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む)で３回洗浄し、最後に３ｍｌの上記と同様の１０％グリセロールに懸濁した。これを２００μlずつ１．５ｍｌ遠心チューブに分注し、液体窒素で急凍し、使用するまで−８０℃にて保存した。
【０１０３】
菌体を手中で急解凍しプラスミドＤＮＡ約１μｇを加えて、０．２ｃｍのキュベットに全量移し、氷中に２０分間静置後、２.５ｋＶ、１２９Ω、約５.０ｍｓｅｃの条件下で、BTX ELECTRO CELL MANIPULATOR（登録商標）600を用いてエレクトロポレーションを行った。直ちにキュベット中の菌体を、９００μｌのＬＢ培地に移し、２８℃で１時間振とう培養した。該培養液を７，００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離後、上清３００μｌを捨て懸濁した。この懸濁液を、ＬＢ寒天培地（Km,Rifそれぞれ５０μｇ／ｍｌ添加）上にそれぞれ２０μｌ、２００μｌを塗布した。
【０１０４】
上記方法により、ｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩをA.tumefaciens  PC，A.tumefaciens  LBA4404，A.tumefaciens  C58に導入した。得られた各形質転換体  A.tumefaciensからのプラスミドＤＮＡを調製し、ＸｂａＩ／ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＳａｌＩ／ＳｐｈＩによりｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩの挿入を確認した。さらに、シークエンスを行ってｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩ挿入を確認した。その結果ｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩを保持するA.tumefaciensを取得することができた。
【０１０５】
＜アグロバクテリウム法による形質転換＞
感染の２日前からA.tumefaciensをＹＥＰ寒天培地に植菌し、２８℃で培養した。培養した菌を掻き取り、４ｍｌのＹＭＢ液体培地に懸濁した。９０×２０ｍｍペトリ皿に滅菌濾紙のを５ｍｍほど（５〜１０枚）パイルし、１０〜２０ｍｌのCo-cultivation培地を加えた。A.tumefaciens懸濁液を９０ｍｍペトリ皿中においた２枚の滅菌濾紙（６×６ｃｍ）に加えた。
【０１０６】
幼植物の胚軸(長さ１〜２ｃｍ)を子葉の直下と根との境目で切り、A.tumefaciens懸濁液で湿らせた濾紙の上に並べた（６０〜７０本）。１０本程度を束ねて、ピンセットで押さえ、メスで３ｍｍ程度に細切した。すべて切り終わるまでA.tumefaciens懸濁液に載せておいた。
【０１０７】
切断した胚軸切片を、Co-cultivation培地を含む濾紙の上に並べた。パラフィルムでシールし、アルミホイルで遮光した。明／暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータに入れ、アルミホイルで遮光し、６日間共存培養した。
【０１０８】
次にカルス誘導を行った。具体的には、共存培地から胚軸切片を載せたまま、一番上の濾紙だけをピンセットで取り上げ、Co-cultivation培地の持込みをできるだけ少なくするように、濾紙をゆっくり持ち上げ傾けて、よく水気を切り、９０×２０ｍｍペトリ皿中のカルス培地の上にろ紙と培地の隙間に空気が入らないように置いた。明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータ内で１週間培養した。
【０１０９】
切片を１つずつ、新しいカルス培地に植え継ぎ、サージカルテープでシールして、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータで培養した。切片は７日ごとに植え継ぎ、２〜５週間選別培養を続けた。緑色のカルスが１ｍｍ以上の大きさになったら、褐変化した組織と切り離し培養を続けた。
【０１１０】
次にシュート誘導を行った。具体的には、カルス誘導培地で２〜５週間培養したカルスを再分化培地（Shoot Induction培地）に植え継いだ。形質転換体であることが確認できた緑色カルス、あるいはカルス培地で５週間以上selectionされたカルスは、再分化培地から抗生物質を除いた。その他のカルスは、再分化培地でさらに２週間selectionを続けた。
【０１１１】
培地における抗生物質の存在は、再分化を阻害し、また過度の選択圧は再分化個体のsomaclonalな異常の頻度を高め、再生個体の不稔率を高めためできるだけ早く除いた。
【０１１２】
カルスは、７日ごとに植え継ぎ、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータで３〜７週間培養を続けた。
【０１１３】
カルスの一部または全体が濃緑色になり、シュートが分化し始め再分化が始まったら、続いてシュート伸長に移行した。再生したシュートの生長は、ＮＨ4+によって阻害されるので、シュートの再生を見たら直ちにShoot elongation培地に移した。
【０１１４】
シュート原基が形成されたカルスを、Shoot elongation培地に植え継いだ。カルスは７日ごとに植え継ぎ、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータで３〜６週間培養を続けた。シュートが１ｃｍ程度に成長したら、Root induction培地に移す、または、挿し木法によりシュートから再生を行った。
【０１１５】
根誘導は以下のとおりに行った。１ｃｍ程度に成長したシュートをメスまたはハサミを用いて切り取り、Root induction培地に移した。１つのカルスから１０〜１５本のシュートが出るので、同一のカルス由来の個体はまとめて、他のものと識別できるようにしておいた。
【０１１６】
Root induction培地にシュートの葉が触れないように浅く突き刺し、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータで７〜１０日間培養した。このとき、Root induction培地にシュートの葉が触れると白化した。培養後、切り口がカルス化するが、この段階で発根はしなかった。
【０１１７】
次に根伸長を行った。具体的には、Root elongation培地を入れた角型ポットに、根誘導を行った植物を浅く突き刺し、サージカルテープでシールし、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータで３〜４週間培養した。この間、培地交換は行わなかった。伸長した根が２〜３ｃｍになったらポットへ移植した。
【０１１８】
移植は、以下のとおり鉢上げ法により行った。具体的には、伸長した根が２〜３ｃｍ程度になったら、根が切れないようにRoot elongation培地から取り出し、培地をよく除いた後、バーミキュライトを詰めたビニールポット（１個体／ポット）に移植しラップをして、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータ内で１週間かけ徐々に馴化した。必要に応じて根粒菌を接種、または、HYPONex  N-P-K＝5-10-5（商品名、HYPONeX JAPAN CORP.LTD ，1000倍希釈）を与え、生育の様子を見ながら、インキュベータ内で育成した。
【０１１９】
馴化法は以下のとおり行った。具体的には、伸長した根が２〜３ｃｍ程度になったら、根が切れないようにRoot elongation培地から取り出し、穴を開けたチューブにバーミキュライトを詰め移植した。このチューブを容器に入れ、Ｂ＆Ｄ培地をチューブの底がつかる程度加えラップをして、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータ内で１週間かけ徐々に馴化した。必要に応じて根粒菌を接種または、HYPONex  N-P-K＝5-10-5（商品名、HYPONeX JAPAN CORP.LTD ，1000倍希釈）を与え、生育の様子を見ながら、インキュベータ内でさらに１〜２週間育成し、植物が十分な大きさ（shootの長さ３〜４ｃｍ）になったら、バーミキュライトを詰めたビニールポットに移植した。
【０１２０】
挿し木法は以下のとおりに行った。得られたシュートを切り取り、バーミキュライトをつめたポットに挿し木した。ラップで覆い、明/暗−１６時間／８時間−２３℃／２０℃に設定したインキュベータ内で１週間かけて徐々に馴化した。１〜２週間で２〜３ｃｍの根が形成された。必要に応じて根粒菌を接種または、HYPONex  N-P-K＝5-10-5（商品名、HYPONeX JAPAN CORP.LTD ，1000倍希釈）を与え、生育の様子を見ながら、インキュベータ内で育成した。
【０１２１】
その結果、カルス形成率は６０％であり、シュート形成率は４０％であり、個体への再生率は４０％であった。
【０１２２】
〔実施例４：Ｔ0植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認〕
＜ＰＣＲ法によるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認＞
再分化された形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子の存在を確認するために、植物細胞組織を用いてＰＣＲ増幅を行った。具体的な方法は以下に示すとおりである。
【０１２３】
植物から葉を１〜２枚切り取り１.５ｍｌ１．５ｍｌ遠心チューブチューブに入れた。この組織にExtraction Bufferを５０μl加え、ミキサーで組織を破砕した。これに１００％エタノールを１００μl加え、混合後、室温で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿にMilliQ Waterを５０μl加え、ピペッティングやタッピングによってよく混合した。この溶液を５μl用いていかに示す方法にてＰＣＲ増幅を行った。
【０１２４】
ミニ１．５ｍｌ遠心チューブドルフチューブに、上述の調製法を用いて精製したゲノムＤＮＡ溶液５μl、２.５ｍＭｄＮＴＰ ４.０μl、Ex Taq polymerase（宝酒造社製）０．２μl（２．５Ｕ）、１０×Taq polymerase buffer ５．０μl，プライマーは、それぞれ最終濃度が０.５μＭになるように２．５μl入れ、滅菌水で５０μlにメスアップし、ＰＣＲ反応を行った。
【０１２５】
ＤｅｒｆＩの存在を確認する場合は、プライマーとして、ＤｅｒｆＩの開始コドン部分、ＤｅｒｆＩ−Ｓ：５‘−ＴＧＡＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴ−３’（配列番号１参照）、リバースプライマーとしてＤｅｒｆＩの終止コドン部分、ＤｅｒｆＩ−ＡＳ：５‘−ＧＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＡ−３’（配列番号２参照）を選択した。これらを、ＰＣＲ反応器に入れ、反応させた。反応プログラムは、(1)９４℃で５分間、(2)９４℃で１分間、５５℃１分間、７２℃で１分間（(2)は３０サイクル）、(3)４℃一定で行った。
【０１２６】
図４に上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片について、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示した。その結果、再生された個体のほぼ全てにおいて、ＤｅｒｆＩ遺伝子と同じ長さ（約１ｋｂ）のＰＣＲ増幅断片が確認された。一方、野生型では断片が確認されなかった（図４参照）。このことより、再分化した形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子が存在することが確認された。
【０１２７】
＜サザンブロット法によるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認＞
上記ＰＣＲ法による確認は、サンプル量が少なく迅速で容易に確認ができるという利点がある。しかし、調製したサンプル中に含まれる夾雑物によりＰＣＲ反応が阻害される場合があること、確認されたＤｅｒｆＩ遺伝子がトランジェントのものであるのかゲノム中に組み込まれたものであるのかの区別がつかないこと、およびＤｅｒｆＩ遺伝子のコピー数まで知ることができない等の欠点があるため、次にサザンブロット法を用いて、再分化された形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子の存在を確認することとした。
【０１２８】
植物組織からのゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法により行った。具体的には、以下のとおりである。使用する乳鉢、乳棒、ビーカー、薬サジを乾熱滅菌し、乳鉢、乳棒を−８０℃に冷却した。乳鉢に０．１ｇ〜０．５ｇの植物組織を入れ、液体窒素を加え完全に破砕した。約３００μlの２％CTAB solutionを添加し、よく混合した。これを１．５ｍｌ遠心チューブに移し、６５℃のブロックヒーターで３０分間加温した。等量のクロロホルム／イソプロパノール（Ｃ／Ｉ）を加え、穏やかに５分間撹拌し、１２，０００ｒｐｍ、室温で１５分間遠心分離し、上層を移してもう一度Ｃ／Ｉ処理を行った。新しい１．５ｍｌ遠心チューブチューブに上清を移して、１〜１．５倍量の１％CTAB solutionを加え、転倒混和し、1時間室温で静置後、８，０００ｒｐｍ,室温で１分間遠心分離を行った。
【０１２９】
上清を捨て、４００μlの１Ｍ ＣｓＣｌを加え、沈殿を完全に溶かし、８００μlの１００％エタノールを加え、転倒混和し、−８０℃で２０分以上静置し、１５，０００ｒｐｍ,4℃で１０分間遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿に４００μlの７０％エタノールを加えリンスをし、１５，０００ｒｐｍ,室温で１０分間遠心分離を行い、乾燥した。ドライアップしたＤＮＡを１００μlのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶かした。
【０１３０】
この溶液に、ＲＮａｓｅＡ溶液を２μl加え、３７℃で１〜２時間反応させた。これに等量のＣ／Ｉを加え、穏やかに攪拌し、１０，０００ｒｐｍ，室温で１０分間遠心分離を行い、上層を新しい１．５ｍｌ遠心チューブチューブに移した。
【０１３１】
１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと０．５５倍量のイソプロパノールを加え、転倒混和し、１０〜１５分間室温で静置した。１２，０００ｒｐｍ，室温で１０分間遠心分離を行った後、上清を捨て、ペレットを５００μｌの７０％エタノールでリンスし、１２，０００ｒｐｍ，室温で１０分間遠心分離を行った後、上清を捨てゲノムＤＮＡを集め、乾燥し、３０μlのMilliQ Waterに溶かした。
【０１３２】
得られたゲノムＤＮＡ溶液を１００倍希釈し、吸光光度計Ｕ−３０００（日立製）を用いて２６０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定した。濃度は１Ａｂｓ260＝５０ｎｇ／μｌとして計算した。
【０１３３】
ＤｅｒｆＩプローブの調製は以下のようにして行った。アガロースゲルから抽出したＤｅｒｆＩ  ＤＮＡ断片を、１０ｎｇ／μlになるように希釈し、この溶液を１０μl遠心チューブに移し、９５℃で５分間熱変性させた。これを氷中で急冷しスピンダウンして遠心チューブの底にサンプルを集め、Reaction buffer(AlkPhos DirectTM Labelling and Detection System，Amersham Pharmacia Biotech)を１０μl加え完全に混和した。次に、Labelling reagent（AlkPhos DirectTM Labelling and Detection System，Amersham Pharmacia Biotech）を２μl加え混和、さらに１／５に希釈したCross-linker solution(AlkPhos DirectTM Labelling and Detection System，Amersham Pharmacia Biotech)を１０μl加え完全に混和し、スピンダウンし３７℃で３０分間インキュベートした。
【０１３４】
ゲノミックサザンブロット解析は、AlkPhos DirectTM Labelling and Detection System with CDP-Star（Amersham Pharmacia Biotech製）を用いて行った。具体的には、以下のとおりにした。
【０１３５】
得られたゲノムＤＮＡの制限酵素処理（ＢａｍＨＩ）を行った。制限酵素反応には、Universal Buffer Set（宝バイオ株式会社製）の中から使用する制限酵素に適した緩衝液（１０×Ｌ、１０×Ｍ、１０×Ｈ、１０×Ｋ、１０×Ｔ）を選んで使用した。ゲノムＤＮＡを約７μｇ含む溶液に、適切な量の制限酵素と緩衝液を加え、滅菌水で全量を４０μlとした。３７℃で１０〜１５時間反応させた。
【０１３６】
続いて、この反応溶液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動用緩衝液にＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒを使用し、泳動用ゲルはアガロース（宝酒造）を０．８％（ｗ／ｖ）になるように１×ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒで調製し、水平型のゲルを作製した。ＤＮＡ溶液４０μlに対して４μlの10×Gel-loading Buffer（宝バイオ株式会社製）を加えてゲルに充填後、５０Ｖで５〜６時間電気泳動を行った。サイズマーカーとして、λＤＮＡのＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩ断片を用いた。電気泳動後、アガロ−スゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで３０分間染色し、ＵＶトランスイルミネーター（ＴＤＭ−２０、ＵＶＰ）でＤＮＡバンドを観察した。
【０１３７】
次に、このゲルからＤＮＡ断片をメンブレン(Hybond-N，Amersham Pharmacia Biotech)へとトランスファーした。染色したゲルを、蒸留水を用いて室温で５分間振とうし、次いで、変性溶液に浸し室温で３０分間ゆるやかに振とうした。さらに、蒸留水を用いて室温で５分間振とうし、中和溶液に浸し室温で３０分間ゆるやかに振とうした。そして、２０×ＳＳＣを用いた毛細管作用でメンブレンに一晩でトランスファーした。
【０１３８】
メンブレンをラップで包み、ＤＮＡ面が下になるようにしてＵＶランプを５分間照射しＤＮＡをメンブレンに固定後、２×ＳＳＣに浸し室温で５分間穏やかに振とうした後、メンブレンをハイブリバッグ(コスモ・バイオ株式会社製)に入れた。５５℃に温めたハイブリダイゼーションバッファーを加え、５５℃で１５分間以上プレハイブリダイゼーションを行った。これに調製したプローブを加え、５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【０１３９】
５５℃に加温した１次洗浄バッファーにブロットを浸し、５５℃で１０分間穏やかに振とうした。これを繰り返し、次に新しい容器にブロットを移し、２次洗浄バッファーで５分間穏やかに振とうした。これを繰り返し、ブロットから２次洗浄バッファーを除き、ラップの上に置いた。ブロットにDetection reagent(CDP-StarTM，Amersham Pharmacia Biotech)を添加し２〜５分間静置し、ブロットから余分なバッファーを除いた後、ハイブリバッグに入れた。
【０１４０】
このブロットとＸ線フィルム(Kodak，Medical X-ray Film)をフィルムカセットにセットし、２時間〜一晩露光して現像を行った。
【０１４１】
サザンブロット解析の結果を図５に示した。形質転換体植物の各レーンで１本から数本のバンドが見られ、野生型のレーンではバンドの存在が確認されなかった。よって、ＤｅｒｆＩ遺伝子は、形質転換体植物のゲノム中に１から数コピーで存在することが確認できた。
【０１４２】
〔実施例５：Ｔ1植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認〕
＜ＰＣＲ法によるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認＞
Ｔ1形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子の存在を確認するために、Ｔ0形質転換体植物と同様にして、植物組織を用いてＰＣＲ増幅を行った。具体的な方法は、実施例４と同様である。
【０１４３】
Ｔ1形質転換体植物についてのＰＣＲ増幅の結果を図６に示した。Ｔ1形質転換体植物においてもＴ0形質転換体植物と同様に、ＤｅｒｆＩ遺伝子と同じ長さ（約１ｋｂ）のＰＣＲ増幅断片が確認された。一方、野生型では断片が確認されなかった（図６参照）。
【０１４４】
よって、Ｔ1形質転換体植物においても、Ｔ0形質転換体植物と同様にＤｅｒｆＩ遺伝子が存在し、Ｔ0植物から遺伝子が後代に受け継がれていることがわかった。また、Ｔ0同じ形質転換体植物由来のＴ1形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子を持つものと持たないものが存在したが、これはＴ0形質転換体植物において組み込まれたＤｅｒｆＩ遺伝子がヘテロであるために、子であるＴ1形質転換体植物において分離が生じたと考えられる。
【０１４５】
＜サザンブロット法によるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認＞
続いて実施例４の時と同様の理由から、Ｔ1形質転換体植物においても、サザンブロット解析を行った。方法については実施例４と同様にして行った。
【０１４６】
Ｔ1形質転換体植物についてのサザンブロット解析の結果を図７に示した。Ｔ1形質転換体植物の各レーンで１〜２本のバンドが見られ、野生型のレーンではバンドの存在が確認されなかった。よって、ＤｅｒｆＩ遺伝子は、Ｔ1形質転換体植物のゲノム中に１〜２コピーで存在することが確認できた。このことから、Ｔ1形質転換体植物においても、Ｔ0形質転換体植物と同じコピー数でアレルゲン遺伝子が遺伝していることがわかった。
【０１４７】
〔実施例６：Ｔ1形質転換体植物におけるＲＴ−ＰＣＲ〕
得られたＴ1形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子の転写を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１４８】
植物組織からの全ＲＮＡの抽出には、RNeasy Mini Kit（商品名、キアゲン社製）を用いて行った。具体的には、以下のとおりである。
【０１４９】
使用する乳鉢、乳棒、ビーカー、薬サジを乾熱滅菌し、乳鉢、乳棒を−８０℃に冷やした。乳鉢に０．０８〜０．１ｇの植物組織を入れ、液体窒素を加え完全に破砕した。これを０．０１倍量のβ−メルカプトエタノールを加えたＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴの入ったビーカーに移し、ピペッティングにより溶液を攪拌し、QIA shredder columnに移し、１５，０００ｒｐｍ、室温で２分間遠心分離を行った。
【０１５０】
次にdebrisをとらないように、collection tubeにたまった上清を新しいこれを１．５ｍｌ遠心チューブに移した。０．５倍量の１００％エタノールを加え、ピペッティングにより攪拌し、RNeasy Mini Spin columnに移し、１０，０００ｒｐｍ、室温で１５秒間遠心分離を行った。
【０１５１】
Collection tubeにたまったflow-throughを除き、７００μｌ Buffer RW1をRNeasy Mini Spin columnに加え、１０，０００ｒｐｍ、室温で１５秒間遠心分離を行った。
【０１５２】
RNeasy Mini Spin columnを新しいcollection tubeに移し、５００μlのBuffer RPEを加え、１０，０００ｒｐｍ、室温で１５秒間遠心分離を行った。
【０１５３】
Collection tubeにたまったflow-throughを除き、再び５００μｌのBuffer RPEを加え、１５，０００ｒｐｍ、室温で２分間遠心分離を行った。
【０１５４】
RNeasy Mini Spin columnを新しい１．５ｍｌ遠心チューブの上に乗せ、３０〜５０μlのRNase-free terを加え、１０，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離を行い、ＲＮＡを溶出させた。最後にこの溶出液を新しい１．５ｍｌ遠心チューブに移した。
【０１５５】
ここで得られたＲＮＡ溶液を１００倍希釈し、吸光光度計Ｕ−３０００（日立製）を用いて得られたゲノムＤＮＡ溶液を１００倍希釈し、吸光光度計Ｕ−３０００（日立製）を用いて２６０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定した。濃度は１Ａｂｓ260＝４０ｎｇ／μｌとして計算した。
【０１５６】
逆転写反応は、以下に示すとおりに行った。ＤｅｒｆＩ−ＡＳ：５‘−ＧＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＡ−３’（配列番号２参照）（５０ｐｍｏｌ）と、得られたＲＮＡ（０．２５μｇ），ＤＥＰＣ処理をしたＨ2Ｏ（up to ２０μl）の反応液を調製し、６５℃で１０分間反応させＲＮＡを変性させた。これを、氷上で急冷させ、そのまま１分間以上おいた。
【０１５７】
この反応液に５× first strand buffer  ４μl、１００ｍＭ ＤＴＴ  2μl、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ  ２μl、RNase inhibitor（promega社製）  ０．２μl、Super ScriptTMII(invitrogen社)  ０．２μlを加え、５０℃で３０分間以上反応させ逆転写反応を行った。その後７５℃で１５分間置き、反応を停止させた。
【０１５８】
次に逆転写産物を用いてＰＣＲを行った。具体的には以下のとおりにして行った。
【０１５９】
１．５ｍｌ遠心チューブに、得られた逆転写産物４μl、２．５ｍＭｄＮＴＰ ０．８μｌ、Ex Taq polymerase（タカラバイオ社製）０．１μl（１．２５Ｕ）、１０×ExTaq polymerase buffer ２．０μｌ、プライマーは、それぞれ最終濃度が１μＭになるように入れ、プライマーとして、ＤｅｒｆＩの開始コドン部分、ＤｅｒｆＩ−Ｓ：５‘−ＴＧＡＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴ−３’（配列番号１参照）、リバースプライマーとしてＤｅｒｆＩの終止コドン部分、ＤｅｒｆＩ−ＡＳ：５‘−ＧＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＡ−３’（配列番号２参照）を選択した。これらを、ＰＣＲ反応器に入れ、２０μｌスケールにて反応させた。
【０１６０】
反応プログラムは、(1)９４℃で５分間、(2)９４℃で１分間、５５℃１分間、７２℃で１分間（(2)は３０サイクル）、(3)４℃一定で行った。
【０１６１】
図８にＲＴ−ＰＣＲの結果を示した。Ｔ1形質転換体植物のうち逆転写を行ったもののみでバンドが得られ、逆転写なしのＴ1形質転換体植物および野生型ではバンドが得られなかったことから、ＤｅｒｆＩ遺伝子を持つ形質転換体植物で、該遺伝子の転写が起こっていると考えられる。
【０１６２】
また、ＤｅｒｆＩ遺伝子の転写が見られないＴ1形質転換体植物も存在することから、ＤｅｒｆＩ遺伝子のゲノム中の導入部位によって転写に違いがあるといえる。
【０１６３】
〔実施例７：Ｔ1形質転換体植物におけるウエスタンブロット解析〕
ＲＴ−ＰＣＲによるＤｅｒｆＩ遺伝子の転写の確認ができた形質転換植物において、ＤｅｒｆＩタンパク質の発現を確認するために、ウエスタンブロット解析を行った。
【０１６４】
Ｔ1形質転換体植物からのタンパク質の調製は、以下のとおりにして行った。使用する乳鉢、乳棒、ビーカー、薬サジを乾熱滅菌し、乳鉢、乳棒を−８０℃に冷やした。乳鉢に０．１ｇ〜０．３ｇの植物組織を入れ、液体窒素を加え完全に破砕した。３倍量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.７）を加え、そこに破砕組織を加えよく混合した。これを１．５ｍｌ遠心チューブに移し、５〜１０分間氷上に放置し、１０，０００ｒｐｍ,４℃で１５分間遠心分離を行った。上層を新しいエッペンチューブに移し、これを可溶性タンパク質溶液とした。
【０１６５】
このタンパク質溶液の濃度を、Bradford試薬(Bradford Reagent，SIGMA #B-6916)を用いて測定した。得られたタンパク質溶液を１００倍希釈し１００μl遠心チューブに取り、これにBradford試薬を９００μl加え、２分間以上静置した後、吸光光度計Ｕ−３０００（日立製）を用いて５９５ｎｍの吸光度を測定した。濃度はＢＳＡを用いた検定曲線から求めた。
【０１６６】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと称す）は、以下のようにして行った。１２％アクリルアミドゲルを泳動用ゲルに、縦型電気泳動槽(BIO-RAD社製)を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動ｂｕｆｆｅｒ内でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。１０〜３０μｇのタンパク質が含まれるタンパク質溶液に対して、Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを混合し、９５℃で５分間処理した。各ウェルに１０μｇのタンパク質が入るようにアプライし、２０ｍＡで２時間電気泳動を行った。
【０１６７】
泳動後のバンドの確認には、ＣＢＢ(WAKO Quick-CBB)を用いた。電気泳動を行ったアクリルアミドゲルを固定液に浸し、１０分間振とうした。これを２回繰り返し、固定液を除きＣＢＢ染色液に浸し、３０分間振とうした。ＣＢＢ染色液を除き、蒸留水に浸し１０〜１５分間振とうし、余分な染色液を除いた。
【０１６８】
ウエスタンブロットは、以下のとおりにして行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルからウェット式のブロッティング装置を用いて１２０ｍＡで一晩、タンパク質をニトロセルロースメンブレン(ADVANTEC，Membrane Filters Cellulose Nitrate 0.45μm)にトランスファーした。
【０１６９】
このメンブレンをPonceau溶液に１分間浸した後、蒸留水で充分にすすぎ、トランスファーしたタンパク質を確認した。続いて、Ponceauを除くためにメンブレンをＴＴＢＳに浸し、１５分間〜１時間振とうした。乳鉢で破砕した０．１〜０．３ｇの植物組織を加えたＴＴＢＳにメンブレンを浸し、２時間穏やかに振とうすることにより、Blockingを行った。ＴＴＢＳで１００倍に希釈した１次抗体（ＤｅｒｆＩモノクローナル抗体）にメンブレンを浸し、２時間穏やかに浸透した。次に、メンブレンをＴＴＢＳに浸し穏やかに１０分間振とうしてメンブレンを洗浄した。線状操作を３回繰り返した。
【０１７０】
ＴＴＢＳで２５００倍に希釈した２次抗体にメンブレンを浸し、２時間穏やかに浸透した。このメンブレンをＴＴＢＳに浸し、穏やかに５分間振とうすることによって洗浄した。この操作を３回繰り返した。
【０１７１】
シグナルの検出は、ＢＣＩＰ（Promega社製）、ＮＢＴ（Promega社製）により行った。
【０１７２】
ウエスタンブロット解析を行った結果を、図９に示した。Ｔ0形質転換体植物において、標品であるＤｅｒｆＩタンパク質と同じサイズに強いシグナルが得られたことから、各Ｔ0形質転換植物でＤｅｒｆＩタンパク質が発現していると考えられた。
【０１７３】
よって、本発明にかかるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターを用いて、ＤｅｒｆＩ遺伝子を導入したミヤコグサにおいて、確かなＤｅｒｆＩタンパク質の発現を確認することができた。
【０１７４】
〔実施例８：Ｔ2形質転換体植物におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認（ＰＣＲ法）〕
ＤｅｒｆＩ遺伝子の後代への遺伝を確認するために、Ｔ2形質転換体植物の芽生えを用いてＰＣＲを行った。試験方法については、前述の実施例４および５に準じて行った。
【０１７５】
Ｔ2形質転換体植物におけるＰＣＲの結果を図１０に示した。この結果において、Ｔ2形質転換体植物においても、約１ｋｂの長さのＤｅｒｆＩ遺伝子と同じ長さの増幅断片の存在が確認された。ＤｅｒｆＩ遺伝子は、後代へ遺伝されていることが確認された。
【０１７６】
またそれぞれのラインにおいて、分離のパターンが得られた。この中でも、同一ラインのほぼ全ての個体でＤｅｒｆＩ遺伝子の存在が確認されたものや、一部でしか確認できないものもあった。前者のパターンを示した親個体であるＴ1形質転換体植物は、ホモ個体であり、後者のヘテロ型の分離を示したものは親個体をヘテロ個体であるということがわかった。
【０１７７】
以上説示したごとく、本発明にかかるマメ科植物用アレルゲンタンパク質発現ベクターを用いることによって、アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子（ＤｅｒｆＩ遺伝子）をマメ科植物のミヤコグサに導入することが可能であった。また該遺伝子は、後代においても遺伝されるということがわかった。さらに該遺伝子が導入された形質転換体植物において、確かなアレルゲンタンパク質の発現を確認することができた。よって、本発明は、アレルゲンタンパク質を植物、特にマメ科植物において発現させるための有効な手段であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
以上のように、本発明では、マメ科植物にアレルゲンタンパク質を生産させることができるので、アグリビジネス等の農学的な産業だけでなく、アレルギー性疾患治療薬剤のように医薬・医療産業にも好適に応用することができる。さらには、本発明にかかるアレルゲン発現ベクターを市販のベクターとして用いたり、形質転換植物中で生産させたアレルゲンタンパク質を精製して市販したりすることができるので、実験・研究用の試薬産業等にも応用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】本発明にかかる形質転換体植物による経口減感作治療法の一例を示す模式図である。
【図２】本発明にかかる発現ベクターｐＢＩ１２１−ＤｅｒｆＩの構築方法を示す工程図である。
【図３】本発明にかかる発現ベクターｐＩＧ１２１Ｈｍ−ＤｅｒｆＩの構築方法を示す工程図である。
【図４】実施例４において、Ｔ0植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認をＰＣＲ法により行った結果を示す電気泳動図である。
【図５】実施例４において、Ｔ0植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認をサザンブロット法により行った結果を示す図である。
【図６】実施例５において、Ｔ1植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認をＰＣＲ法により行った結果を示す電気泳動図である。
【図７】実施例５において、Ｔ1植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認をサザンブロット法により行った結果を示す図である。
【図８】実施例６において、Ｔ1形質転換体植物においてＤｅｒｆＩ遺伝子の転写を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図９】実施例７において、ＲＴ−ＰＣＲによるＤｅｒｆＩ遺伝子の転写の確認ができた形質転換植物において、ＤｅｒｆＩタンパク質の発現を確認するために、ウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図１０】実施例８において、Ｔ2植物体におけるＤｅｒｆＩ遺伝子の確認をＰＣＲ法により行った結果を示す電気泳動図である。
【図１１】アレルギー性疾患の治療方法の特徴、長所・短所を説明する図である。
【図１２】減感作治療法の作用機序について説明する図である。
【図１】
2005065577.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005065577.tif 000009
【図８】
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【図９】
2005065577.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2005065577.tif 000013
【図１２】
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【配列表】
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