(57)【要約】      （修正有）【課題】レジオネラタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及びレジオネラ病に対する感染防御活性を有する薬剤を提供する。【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列を有するレジオネラタンパク質LaiA、該タンパク質をコードする配列番号２の塩基配列を有する遺伝子、及び前記タンパク質を有効成分として含有する、レジオネラ感染の防御活性を有するワクチンである薬剤。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）若しくは（b）のタンパク質、または下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するその断片。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するレジオネラタンパク質LaiA
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するタンパク質
【請求項２】
下記（a）若しくは（b）のタンパク質、または下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片をコードするポリヌクレオチド。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するレジオネラタンパク質LaiA
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するタンパク質
【請求項３】
レジオネラタンパク質LaiAをコードする配列番号２の塩基配列を有する遺伝子。
【請求項４】
請求項１記載の（a）若しくは（b）のタンパク質、又は断片を有効成分とすることを特徴とするレジオネラ症に対する感染防御活性を有する薬剤。
【請求項５】
レジオネラ感染を防ぐためのワクチンであることを特徴とする請求項４記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及びレジオネラ症に対する感染防御活性を有する薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌は自然界では湿った土壌や河川などの真水、空調冷却塔水、給水給湯設備、循環濾過式浴槽などの人工的な水利用設備に生息し、ヒトへの感染源となる。本属菌はエアロゾルに含まれて散布され、経気道感染により肺炎やポンティアック熱を引き起こす。レジオネラ属菌は細胞内寄生細菌で、レジオネラ肺炎の起炎菌の８割以上はレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella  pneumophila、以下L. pneumophilaとも言うことがある）によるものである。高齢者などを主とする易感染宿主は罹患率が高く、院内感染もしばしば起こす。抗生物質による適切な治療をしないと致命率は高くなる。
【０００３】
そこで、特表平１４−５２３０３０号公報（特許文献１）に記載されるように、レジオネラ属の細菌から特定の精製手段によってタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原を得る方法、及び該抗原を用いたレジオネラ菌の検出方法が開発されるなど、種々のレジオネラの検出方法が開発されている。
【０００４】
一方で、リスクファクターの高いひとへのワクチン接種は予防法の一つとして有用であると考えられる。しかしながら、レジオネラ症の予防のために接種するワクチン、あるいはレジオネラ症に感染した際に致命率を低下させる性質を有する薬剤、すなわち、感染防御活性を有する薬剤に関する研究はいままでにほとんど行われていない。
【特許文献１】特表平１４−５２３０３０号公報（請求項１および２０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、レジオネラタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、及びレジオネラ症に対する感染防御活性を有する薬剤を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる実情において、本発明者は鋭意検討を行なった結果、新規レジオネラタンパク質LaiAが、レジオネラの肺胞上皮細胞への接着、侵入及び病原性発現に関係し、マウスの感染成立に重要な役割を果たしているとともにレジオネラ感染後患者回復期血清に特異的に反応するため、該レジオネラタンパク質LaiAを有効成分とする薬剤が、レジオネラに対する感染防御活性を有する可能性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明（１）は、下記（a）若しくは（b）のタンパク質、または下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片を提供するものである。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するレジオネラタンパク質LaiA
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するタンパク質
また、本発明（２）は、下記（a）若しくは（b）のタンパク質、または下記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であって、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片をコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
（a）配列番号１のアミノ酸配列を有するレジオネラタンパク質LaiA
（b）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するタンパク質
また、本発明（３）は、レジオネラタンパク質LaiAをコードする配列番号２の塩基配列を有する遺伝子を提供するものである。
【０００８】
また、本発明（４）は、請求項１記載の（a）若しくは（b）のタンパク質、又は断片を有効成分とするレジオネラ症に対する感染防御活性を有する薬剤を提供するものである。
【０００９】
また、本発明（５）は、レジオネラ感染を防ぐためのワクチンである前記発明（４）記載の薬剤を提供するものである。本発明（５）は、前記発明（４）が奏する効果に加えて、レジオネラ感染を予防する薬剤を提供することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、新規なレジオネラタンパク質又はその断片及びそれをコードする新規なポリヌクレオチドを提供することができる。また、本発明は、レジオネラ症に対する感染防御活性を有する新規な薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係る配列番号１のアミノ酸配列を有するレジオネラタンパク質LaiA（前記（a）のタンパク質）及び該タンパク質をコードする配列番号２の塩基配列を有する遺伝子は、以下の手順で得ることができる。
【００１２】
L. pneumophila８０−０４５株を培養し、染色体DNAを抽出し、全ゲノム発現ライブラリーを作製する。レジオネラ症患者の回復期血清および正常成人血清を用いて、抗体スクリーニングを行い、ヒト患者の回復期血清によってのみ認識される陽性クローンを選択する。陽性クローンに含まれるすべてのORF(open reading frame)をサブクローニングし、抗体スクリーニングを繰り返し行い、回復期血清により認識されるタンパク質が発現されるORFのみを同定する。該ORFが、相同性データベース検索により、サッカロマイセス・セレビサエ（Saccharomyces cerevisiae、以下サッカロマイセス・セレビサエと言う）のインテグリン類似遺伝子（integrin analogue gene、以下インテグリン類似遺伝子と言う）と相同性（ホモロジー）を有するORFとして特定される配列番号２の塩基配列を有する新規遺伝子であり、該ORFを発現して得られるタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質である。該レジオネラタンパク質は、後述するようにL. pneumophilaの肺胞上皮細胞への付着に関与していることから、L. pneumophila adhesion molecule homologous to integrin analogue of Saccharomyces cerevisiae (LaiA) 、レジオネラタンパク質LaiAと名付けた。
【００１３】
配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有するタンパク質（前記（b）のタンパク質）、及び前記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であり、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片は、通常の組換えタンパク質製造法により、例えば、対応する塩基配列を有するポリヌクレオチドを合成して発現することにより得ることができる。また、（a）のタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性とは、下記する実施例で測定されるレジオネラの上皮細胞への付着性、侵入性、マウスへの病原性発現の内いずれか一つを示す。
【００１４】
本発明に係る前記（a）若しくは（b）のタンパク質、前記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であり、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片は、大腸菌発現系を用いて発現することができ、例えば、Sambrook and Russell らの方法（Molecular Cloning, 3rd ed, 2001）により行うことができる。前記タンパク質を発現させる際の大腸菌発現ベクターの発現要素は、プロモーターとして、lacプロモーター、tacプロモーター等を用いることができ、前記断片を発現させる際の発現要素は、プロモーターとして、lacプロモーター、tacプロモーター等を用いることができる。また、前記タンパク質を発現させる際のベクターとしては、pUC系ベクター、pGEXベクター等を用いることができ、前記断片を発現させる際のベクターとしては、pUC系ベクター、pGEXベクター等を用いることができる。
【００１５】
また、生成したタンパク質の精製法としては、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法等の公知の方法を用いることができる。
【００１６】
本発明の薬剤は、前記（a）若しくは（b）のタンパク質、または前記（a）若しくは（b）のタンパク質の断片であり、（a）のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを有する断片を有効成分として含有するものである。
【００１７】
本発明の薬剤は、レジオネラ症に対する免疫応答を誘導するための薬剤組成物に有用である。該薬剤組成物は、本発明の薬剤を免疫原的有効量含有するものである。ここで免疫原的有効量とは、レジオネラ症に対する感染防御活性を動物又はヒトにおいて誘導するのに必要な本発明の薬剤の量を示すことを意味する。
【００１８】
本発明の薬剤は、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により非経口的に、あるいは経口的に投与し得る。非経口投与のための製薬上許容可能な担体調製物としては、滅菌あるいは水性または非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、注射可能有機エステル、例えばエチルオレエートである。閉塞用包帯用の担体は、皮膚透過性を増大し、抗原吸収を増強するために用い得る。経口投与のための液体投薬形態は一般に、液体投薬形態を包含するリポソーム溶液を包含し得る。リポソームを懸濁するための適切な形態としては、当業界で一般に用いられている不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳濁液、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。不活性希釈剤の他に、このような組成物は、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、ならびに甘味剤、風味剤および香料も含有し得る。
【００１９】
本発明の薬剤を含有する抗原製剤がアジュバントを含有することも可能である。アジュバントおよび抗原は、免疫系への提示の前に混合されるか、あるいは別々に、免疫感作される動物（ヒトを含む）の同一部位に提示される。アジュバントは、それらの組成に基づいて、大まかにいくつかの群に分けられる。
【００２０】
これらの群としては、油アジュバント（例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント）、無機塩（例えば、AlK(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、ミョウバン、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、カオリンおよび炭素）、ポリヌクレオチド（例えばポリICおよびポリAU酸）、ならびにある種の天然物質（例えば、結核菌Mycobacterium tuberculosisからのロウD、ならびにCorynebacterium parvum、百日咳菌Bordetella pertussisおよびブルセラ族の成員に見出される物質）が挙げられる。
【００２１】
また、本発明の薬剤は、レジオネラ症を予防するためのワクチンに用いることができる。本発明の薬剤は、ヒトの他、家畜やペットなどの動物にも用いることができる。
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００２３】
＜L. pneumophila８０−０４５株を用いた全ゲノムライブラリーの作成＞
レジオネラ症感染患者から採取し、Feeley らの方法（Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology, 1979, 10:437-441.）により培養したL. pneumophila８０−０４５株から、Sambrook and Russellらの方法（Molecular Cloning, 3rd ed, 2001）により抽出した染色体DNAを用いて、ZAP express undigested vector キット (Stratagene社製) により全ゲノムライブラリーを作成した。全ゲノムライブラリー作成に際して、大腸菌発現系に用いる大腸菌株としては、XL1-Blue MRF’ 株を用い、大腸菌発現ベクターの発現要素としては、lacプロモーターを用い、発現ベクターとしては l ZAP expression ベクターを用いた。
＜IVIAT(in vivo induced antigen technology)による抗原タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング＞
本実験では約１００、０００個のクローンを抗体スクリーニングした。抗体スクリーニングは、レジオネラ症感染患者の回復期血清及び正常成人血清を用いて、Stratagene’s picoBlueTMimmunoscreening キット (Stratagene社製) により行い、正常成人血清とは反応せずに回復期血清と特異的に反応するレジオネラタンパク質を発現した陽性クローンを３つ選択した。３つの陽性クローンの全塩基配列を Dye Terminator 法により決定し、次いで３つの陽性クローンが含んでいるすべてのORFを、lacプロモーター及び pUC19 ベクターを用いてサブクローニングした。さらに、３つの陽性クローンから作成したサブクローンについて、上記した抗体スクリーニングを行って、正常成人血清とは反応せずに回復期血清と特異的に反応するレジオネラタンパク質を発現したサブクローンを同定した。このサブクローンに含まれるORFについて、さらに抗体スクリーニングを行い、正常成人血清とは反応せずに回復期血清と特異的に反応する分子量約170kDaのレジオネラタンパク質を産生しているORF１つを同定した。該分子量約170kDaのレジオネラタンパク質を同定した抗体スクリーニングの結果を図１に示す。図１中、左から第１段が大腸菌DH10B株を用いた結果であり、左から第２段が該分子量約170kDaのレジオネラタンパク質に対応するORFを含むpMMB207acベクターを導入して発現させた大腸菌DH10B株を用いた結果であり、左から第３段がpMMB207acベクターのみを導入し、前記ORFを含まない大腸菌DH10B株を用いた結果であり、左から第４段がレジオネラタンパク質に対応するORFの第 1 〜第２６７塩基対及び第２６７１〜第 ４５４２ 塩基対を含むpMMB207acベクターを導入して発現させた大腸菌DH10B株を用いた結果である。
＜相同性検索データベースによる検索＞
相同性検索データベースとしては、GenomeNet データベースを用い、相同性検索プログラムとしては BLASTP を用いて検索を行った。上記レジオネラタンパク質LaiAのアミノ酸配列、または部分配列と相同性を持つアミノ酸配列の検索を行った。
＜変異株の作製＞
レジオネラのレジオネラタンパク質LaiAのORFに薬剤耐性カセットをコードする遺伝子断片を挿入し、レジオネラタンパク質LaiAをコードする遺伝子に変異を生じた変異株LAM0101を作製した。さらに、変異株LAM0101に対して、レジオネラタンパク質LaiAに対応するORFを含むpMMB207acベクター、及びpMMB207acベクターのみを導入し、変異株LAM0102及び変異株LAM0103を作製した。
＜細胞への付着性、侵入性、増殖性の測定実験＞
ヒト肺胞上皮II型細胞A549とヒト由来マクロファージ系細胞U937を用いて、レジオネラの野生株及び前記変異株LAM0101、LAM0102、及びLAM0103をそれぞれ感染させる実験を以下のように行った。A549細胞とU937細胞とをRPMI1640培地（Invitrogen社製）を含んだ２４wellsプレートにそれぞれ１８時間と４８時間培養した。A549細胞にはレジオネラL. pneumophila８０−０４５株の野生株及び前記変異株LAM0101、LAM0102、及びLAM0103にそれぞれ１．５時間感染させ、PBSで２回以上の洗浄を行い、次いで細胞を培地から剥がし、レジオネラ用BCYE培地にまいて、Marata ら（Entry and intracellular growth of Legionella pneumophila in alveolar epithelial cells. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 1998, 157:1967-1974.）の方法に従って、A549細胞に付着した菌数を調べ、付着性を測定した。付着した菌数の相対値を図２（Ａ）に示す。さらに、A549細胞にレジオネラL. pneumophila８０−０４５株の野生株及び前記変異株LAM0101、LAM0102、及びLAM0103にそれぞれ１．５時間感染させ、抗菌薬ゲンタマイシンに２時間作用させて細胞表面に付着したレジオネラ菌を殺し、Marata ら（Entry and intracellular growth of Legionella pneumophila in alveolar epithelial cells. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 1998, 157:1967-1974.）の方法に従って、A549細胞内に侵入した菌数を調べた。侵入した菌数の相対値を図２（Ｂ）に示す。U937細胞には、レジオネラL. pneumophila８０−０４５株の野生株及び前記変異株LAM0101にそれぞれ１時間感染させ、PBSで２回以上の洗浄を行い、次いで感染後０時間、２４時間、４８時間後のU937細胞内での前記野生株及び前記変異株LAM0101の菌数の経時変化をMarata ら（Entry and intracellular growth of Legionella pneumophila in alveolar epithelial cells. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 1998, 157:1967-1974.）の方法に従って、求めることにより増殖性を求めた。測定結果を図３に示す。
＜マウスを用いた病原性の測定実験＞
６週齢のＡ／Ｊマウスを用いて、レジオネラL. pneumophila８０−０４５株の野生株及び前記変異株LAM0101を、３．７×１０８個、１×１０８個、３．７×１０７個、１×１０７個、３．７×１０６個、１×１０６個、及び３．７×１０５個ずつ鼻腔内感染させ、１ヶ月後の生存率を測定し、５０％致死量（LD50）を求めた。その結果を表１に示す。また、前記野生株及び前記変異株LAM0101を１×１０７個ずつ感染させた際のＡ／Ｊマウスの生存率の１２日後までの経時変化を図４に示す。
【００２４】
【表１】
2005065612.tif 000002
図１に示すように、３次スクリーニングまで行うことにより、レジオネラ症患者回復期血清と特異的に反応する分子量約170kDaのレジオネラタンパク質LaiAを産生しているクローンを選択できた。このタンパク質をコードする遺伝子の全長をクローニングし、塩基配列を決定した。また、該分子量約170kDaのレジオネラタンパク質LaiAのアミノ酸配列（１５１３アミノ酸残基）を配列番号１に示し、該レジオネラタンパク質LaiAに対応するORFの全塩基配列（４５４２ｂｐ）を配列番号２に示す。また、相同性検索データベースによる検索を行った結果、レジオネラタンパク質LaiAは、その配列番号１のアミノ酸配列の第１１０５〜１５１０残基が、サッカロマイセス・セレビサエのインテグリン類似体と約４１％の相同性（ホモロジー）を有することがわかった。サッカロマイセス・セレビサエのインテグリン類似遺伝子が細胞の接着に関わる遺伝子であることから、レジオネラタンパク質LaiAをコードする遺伝子は、細胞への接着に関わることが推測された。
【００２５】
図２（Ａ）及び（Ｂ）の結果から、A549細胞に前記野生株及び前記変異株を感染させる実験を行った結果、レジオネラタンパク質LaiAをコードする遺伝子を変異させた変異株LAM0101及び変異株LAM0103では、付着した菌数及び侵入した菌数が野生株に対して約３０％にまで低下したことがわかった。
【００２６】
図３の結果から、前記野生株及び変異株LAM0101は、U937細胞内の増殖性において違いが見られなかった。
【００２７】
表１の結果から、Ａ／Ｊマウスへの鼻腔内感染実験において、変異株LAM0101の５０％致死量（LD50）は、前記野生株に比べて、約１０倍高いことが明らかになった。
【００２８】
以上の結果から、レジオネラタンパク質LaiAをコードする遺伝子は、L. pneumophilaの肺胞上皮細胞への付着、侵入及びマウスへの病原性発現に関与していることが明らかとなった。また、レジオネラタンパク質LaiAが、レジオネラ感染後の患者回復期血清に特異的に反応することから、このタンパク質分子をワクチンとして使うことにより、レジオネラ感染を防御できる抗体を誘導できる可能性があることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】分子量約170kDaのレジオネラタンパク質を同定した抗体スクリーニングの結果を示す図である。
【図２】（Ａ）及び（Ｂ）は、野生株及び変異株をA549細胞に感染させ、A549細胞に付着した菌数の相対値の結果、並びに野生株及び変異株をA549細胞に感染させ、A549細胞内に侵入した菌数の相対値の結果をそれぞれ示す図である。
【図３】野生株及び変異株LAM0101をU937細胞に感染させた際の、感染後０時間、２４時間、４８時間後のU937細胞内での前記野生株及び変異株LAM0101の菌数の経時変化を示す図である。
【図４】野生株及び変異株LAM0101を１×１０７個ずつ感染させた際のＡ／Ｊマウスの生存率の１２日後までの経時変化を示す図である。                             <A HREF=’’配列表ファイル2. txt’’>配列表ファイル2.txt</A>
【配列表フリーテキスト】
【００３０】
配列番号１は、レジオネラタンパク質LaiAのアミノ酸配列を示し、配列番号２は、レジオネラタンパク質LaiAのコードする遺伝子の塩基配列を示すものである。
【図１】
2005065612.tif 000003
【図２】
2005065612.tif 000004
【図３】
2005065612.tif 000005
【図４】
2005065612.tif 000006
【配列表】
2005065612000001.app