(57)【要約】【課題】使用時に大型の装置を必要とせず、使用時および廃棄時に人体や環境に及ぼす影響が小さく、かつ、装置の汚染が少ない冷却液を提供する。【解決手段】冷却液を、水と不凍タンパク質とを含み水よりも凝固点が降下しているものとする。水と不凍タンパク質を含む冷却液は、グリコール類等を含む冷却液よりも熱伝導率が高いため、エンジンの冷却液として用いる場合に用いる熱交換機は小型なもので足り、装置全体の小型化と装置に要するコストの低減が可能となる。また、水と不凍タンパク質を含む冷却液は、グリコール類等を含む冷却液よりもＣＯＤ値が小さいため廃棄時に環境に及ぼす影響が小さい。さらに、不凍タンパク質は人体に対する毒性がない。そして、塩類等ではなく不凍タンパク質によって水の凝固点を降下させるため、装置の汚染が低減される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水と不凍タンパク質とを含み水よりも凝固点が降下していることを特徴とする冷却液。
【請求項２】
前記不凍タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる請求項１に記載の冷却液。
【請求項３】
前記不凍タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる請求項１に記載の冷却液。
【請求項４】
前記不凍タンパク質は冷却液全量に対して０．０１重量％以上含まれる請求項２または請求項３に記載の冷却液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内燃機関等の種々の装置を冷却するための冷却液に関する。
【背景技術】
【０００２】
内燃機関等の種々の装置を冷却するための冷却液としては従来より種々のものが知られている。このうち、自動車のエンジンを冷却するための冷却液としては、水と凝固点降下剤（融点降下剤）としてのアルコール類やグリコール類等とを含むものが一般に用いられている。冷却液に含まれるアルコール類やグリコール類等によって冷却液の凝固点は水よりも低くなるため、冬季における冷却液の凍結が防止される（例えば、特許文献１）。
【０００３】
凝固点降下剤としてのアルコール類やグリコール類としては、エチレングリコールやプロピレングリコールを選択することが一般的であるが、エチレングリコールやプロピレングリコールは熱伝導率が水よりも低いため、エンジンを充分に冷却するためには冷却液を多量に用いる必要がある。さらに、エンジンを冷却することで一旦上昇した冷却液の温度は下がり難いため、この冷却液の温度を再度低下させるため、大型のラジエータ等の熱交換機を設ける必要がある。これらのことから、凝固点降下剤としてエチレングリコールやプロピレングリコール等を用いる場合には装置全体が大型化するとともに装置に要するコストが高くなる問題があった。
【０００４】
また、エチレングリコールやプロピレングリコールはＣＯＤ（化学的酸素要求量）が大きいため、廃棄時の環境負荷が大きい。したがって、エチレングリコールやプロピレングリコールを含む冷却液を廃棄する際には、回収して焼却処理することが一般的であり、廃棄処理に要するコストが高くなるとともに廃棄処理が煩雑である問題があった。
【０００５】
さらに、冷却や冷凍のための冷却装置用の冷却液としては、一般にブラインと呼ばれる塩化カルシウムや食塩等の塩類の水溶液が用いられるが、塩類が多量に添加されていることから質量や粘度が増加して装置にかかる負担が大きくなる問題があった。また、このような塩類の水溶液からなる冷却液を用いる場合には、塩類の析出や装置が酸化されること等で、装置が汚染される場合がある。この場合、装置の汚染が進行すると、熱交換機等に詰まりが生じるため、多量の防食添加剤を添加する必要があり、コストが高くなるとともに質量や粘度が増加して装置への負担がさらに大きくなる問題もあった。これらのことから、装置の汚染が少なく装置への負担が小さい冷却液の開発が求められている事情もあった。
【特許文献１】特開平７−７０５５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
使用時に大型の装置を必要とせず、使用時および廃棄時に人体や環境に及ぼす影響が小さく、かつ、装置の汚染や装置への負担が少ない冷却液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決する本発明の冷却液は、水と不凍タンパク質とを含み水よりも凝固点が降下していることを特徴とする。
【０００８】
上記不凍タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【０００９】
上記不凍タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１０】
上記不凍タンパク質は冷却液全量に対して０．０１重量％以上含まれることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
不凍タンパク質は、水の凝固点を降下させる作用を持つタンパク質であり、所謂ＡＦＰ（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）やＡＦＧＰ（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる魚や昆虫、植物、細菌等から発見されたものがよく知られている。
【００１２】
不凍タンパク質によって水の凝固点が降下する機構は未だ明らかではないが、氷結晶の表面に不凍タンパク質が接触することで氷結晶の成長が抑制されるため、水の凝固点が降下すると考えられている。
【００１３】
本発明の冷却液は、この不凍タンパク質と水とを含むものであり、不凍タンパク質によって水の凝固点が降下する。したがって、本発明の冷却液を例えば自動車のエンジンを冷却するための冷却液として用いる場合にも、冬季における冷却液の凍結が防止される。
【００１４】
また、本発明の冷却液はエチレングリコールやプロピレングリコール等を含まないことから、エチレングリコールやプロピレングリコールの熱伝導率の低さに由来する装置の大型化や装置に要するコストの増大はない。
【００１５】
そして、この不凍タンパク質は少量で水の凝固点を充分に降下させるため、ＣＯＤ値は非常に低く環境に及ぼす影響が小さいため、廃棄時に回収して焼却する必要がない。
【００１６】
さらに、本発明の冷却液によると、塩類ではなく不凍タンパク質によって水の凝固点を降下させるため、従来のブライン等のように塩類の析出や錆の発生等による装置の汚染や質量や粘度の増加による装置への負担がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係る冷却液は、水と不凍タンパク質とを含む。不凍タンパク質としては、水の凝固点を降下させるタンパク質を用いることができる。
【００１８】
不凍タンパク質はαヘリックス構造やβヘリックス構造等のヘリックス構造を持つことが知られており、不凍タンパク質はこれらヘリカル構造をもつことで、優れた凝固点降下作用が発揮されると考えられている。また、αヘリックス構造はアミノ酸３．６残基毎に１回転する螺旋構造であるが、このようなαヘリックス構造を持つ不凍タンパク質のうち、図１に示すように、１０アミノ酸毎にスレオニン１が出現して、αヘリックス構造のヘリックス軸（らせん軸）２に対して全てのスレオニン１が同一方向に配意されるものは、特に凝固点降下作用が大きいことが知られている。
【００１９】
不凍タンパク質としては、例えば、上述したＡＦＰやＡＦＧＰとして一般に知られている、魚や昆虫等から抽出あるいは精製したものを用いることもできるし、合成した不凍タンパク質を用いることもできる。また、これら不凍タンパク質をコードする遺伝子を細菌等に導入することで細菌等に生成させた不凍タンパク質を用いることもできる。さらには、これら不凍タンパク質中の活性部位を抽出したペプチドを不凍タンパク質として用いることもできるし、これら不凍タンパク質の前駆体や、これら不凍タンパク質を適宜修飾することで耐熱性や構造安定性等の種々の性質を向上させた誘導体等を用いることもできる。
【００２０】
また、その他、不凍タンパク質の立体構造を安定化させるための緩衝液や、微生物の繁殖を防止するための抗菌剤等を本発明の冷却液にさらに加えることもできる。緩衝液としては、ｐＨ４．０〜１２．０程度の一般的な緩衝液を用いることができ、例えば、Ｇｏｏｄの緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が好ましく用いられる。また、抗菌剤としてはアジ化ナトリウム等が好ましく用いられる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明の冷却液を例を挙げて説明する。
【００２２】
（１．不凍タンパク質のアミノ酸配列の選択）
昆虫であるチャイロコメノゴミムシダマシ（ｙｅｌｌｏｗ  ｍｅａｌｗｏｒｍ）の幼虫由来のＡＦＰのうち、配列番号３〜１２で表されるアミノ酸配列が、水の凝固点を降下させる活性部位であると考えられている（Ｌｉｏｕ  ＹＣ，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３５）：１１４１５−２４．Ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｅｅｔｌｅ  Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ．）。配列番号３〜１２に示される各アミノ酸配列の共通する部分を抽出し、抽出されたアミノ酸配列部分をアミノ酸配列の順序に従って並べることで、配列番号１で表されるアミノ酸配列を得た。詳しくは、配列番号３のおよび４のアミノ酸配列では２８番目〜３１番目と４９番目〜７４番目の部分を、配列番号５〜８および１０〜１１のアミノ酸配列では２８番目〜６２番目の部分を、配列番号９のアミノ酸配列では２８番目〜４６番目と７１番目〜８６番目の部分を、配列番号１２のアミノ酸配列では２１番目〜５５番目の部分を比較し、出現頻度の高いアミノ酸を選択して配列番号１のアミノ酸配列を得た。また、Ｎ末端がアミドされたタンパク質がαヘリックス構造をとることが知られていることから、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端にはアスパラギン酸を導入した。
【００２３】
以下、この配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる不凍タンパク質を、第１の不凍タンパク質と呼ぶ。
【００２４】
また、魚であるカレイ（ｗｉｎｔｅｒ  ｆｌｏｕｄｅｒ）由来のＡＦＰのうち、配列番号２で表されるアミノ酸配列が、水の凝固点を降下させる活性部位であると考えられている（Ｚａｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３４８０６−３４８１２）。以下、この配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる不凍タンパク質を、第２の不凍タンパク質と呼ぶ。
【００２５】
（２．不凍タンパク質の合成）
ペプチド合成装置を用い、以下に説明するＦｍｏｃ法による固相合成法に従って、第１の不凍タンパク質および第２の不凍タンパク質の合成をおこなった。なお、ペプチド合成機としてはＡｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰｅｐｔｒｏｎＩＩＩ−Ｒ２４，Ｐｅｐｔｒｏｎ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いた。また、合成反応開始時に用いるアミノ酸としては、カルボキシル基を介して樹脂に結合されているとともに、アミノ基がＦｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｂｏｎｙｌ）保護基で保護されているもの（Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）を用いた。なお、以下特に説明がない場合にはアミノ酸のアミノ基とカルボキシル基以外の官能基もまた保護基で保護されているものとする。
【００２６】
（１）カルボキシル基を介して樹脂に結合されているとともにアミノ基がＦｍｏｃ保護基で保護されているアミノ酸のＦｍｏｃ保護基を取り除き、アミノ基を遊離させた。
【００２７】
（２）遊離したアミノ基に、Ｆｍｏｃ保護基でアミノ基を保護したアミノ酸のカルボキシル基を脱水縮合させることにより、アミノ酸同士をペプチド結合させた。
【００２８】
（２）生成したペプチドからＦｍｏｃ保護基を除去した。
【００２９】
（３）遊離したアミノ基にＦｍｏｃ保護基でアミノ基を保護した別のアミノ酸のカルボキシル基を脱水縮合させた。
【００３０】
（４）（２）〜（３）を繰り返してカルボキシル末端（Ｃ末端）側からアミノ末端（Ｎ末端）側にアミノ酸を１つずつ結合させてペプチド鎖を伸長させた。
【００３１】
（５）伸長したペプチド鎖から全ての保護基を除去した。この（１）〜（５）の操作で、目的ペプチドおよび不純物を含むペプチド混合物を得た。
【００３２】
（６）（５）で得られたペプチド混合物を逆相クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８ＲＰカラム）にかけトリフルオロ酢酸を含む溶媒で溶出して精製し、不純物を取り除いた。そののちに、凍結乾燥（または減圧乾燥）により乾燥し結晶化した。
【００３３】
（１）〜（６）の操作により、目的とするペプチドが得られ、第１の不凍タンパク質および第２の不凍タンパク質が合成された。なお、（１）〜（４）の操作に順次結合させたアミノ酸の種類は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列にしたがったものである。
【００３４】
（３．凝固点測定試験）
上述した（２．不凍タンパク質の合成）で合成された第１の不凍タンパク質を水に溶解させて、第１の不凍タンパク質を０．０１重量％含む実施例１の冷却液、第１の不凍タンパク質を０．０５重量％含む実施例２の冷却液、および、第１の不凍タンパク質を０．１重量％で含む実施例３の冷却液を調製した。
【００３５】
また、同様に第２の不凍タンパク質を０．０１重量％含む実施例４の冷却液と、第２の不凍タンパク質を０．０５重量％含む実施例５の冷却液とを調製した。得られた各実施例の冷却液のうち各々２０ｍｇずつをとり、ＤＳＣ３１００Ｓ（Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ社製）を用いた示差走査熱量測定法によって凝固点を測定した。
【００３６】
本凝固点測定試験で測定された実施例１〜５の冷却液の凝固点を表すグラフを図２に示す。図２中横軸は各冷却液中に含まれる不凍タンパク質濃度（重量％）を示し、縦軸は水の凝固点から各冷却液の凝固点を引いた値（凝固点降下度）を示す。
【００３７】
図２に示されるように、不凍タンパク質水溶液である本発明の冷却液は、凝固点降下度が正の値となり、水よりも凝固点が降下している。このため、本発明の冷却液は自動車のエンジン用の冷却液等に好ましく用いられることがわかる。
【００３８】
また、参考までに、チャイロコメノゴミムシダマシの幼虫由来のＡＦＰ水溶液の凝固点を表すグラフを図３に示す。このグラフは、Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ｓ．Ｂ．らの論文（Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ｓ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，６８９０−６８９７）によるものである。
【００３９】
図３に示されるグラフによると、０．０１重量％のＡＦＰ水溶液の凝固点降下度は１．２℃である。これに対して、図２に示されるグラフによると、０．０１重量％の第１の不凍タンパク質を含む実施例１の不凍液の凝固点降下度は４．５℃であり、図３に示されるＡＦＰ水溶液よりも凝固点が大きく降下していることが判る。このことは、第１の不凍タンパク質がＡＦＰから活性部位のみを抽出したものであることに起因している。すなわち、同重量である場合には、活性部位のみからなる第１の不凍タンパク質は、活性部位以外の部分を含むＡＦＰに比べてより多くの活性部位を持つ。このため、第１の不凍タンパク質水溶液は通常のＡＦＰ水溶液よりも凝固点降下度が大きくなると考えられる。
【００４０】
なお、本発明の冷却液には、例えば配列番号１や配列番号２のアミノ酸配列のみからなる不凍タンパク質だけでなく、配列番号１や配列番号２のアミノ酸配列に、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるものを用いることもできる。この場合にも、活性部位、すなわち配列番号１や配列番号２のアミノ酸配列の部分が、その他の部分に対して多く含まれる程、凝固点降下度が大きくなる。
【００４１】
（４．熱伝導率測定試験）
エチレングリコールを５０重量％含む比較例１の冷却液を調製した。この比較例１の冷却液および水の冷却液の熱伝導率を非定常熱線法により測定した。
【００４２】
本熱伝導率測定試験で測定された水および比較例１の冷却液の２０℃〜８０℃における熱伝導率を表すグラフを図４に示す。図４中横軸は温度を示し、縦軸は熱伝導率を示す。
【００４３】
図４に示されるように、従来の冷却液である比較例１の冷却液に比べて水は大きな熱伝導率を示した。なお、本発明の冷却液である各実施例の冷却液は、水に微量のタンパク質を溶解あるいは分散させたものであるため、熱伝導率は水とほぼ同じである。
【００４４】
したがって、発明の冷却液を自動車のエンジン用冷却液として用いる場合には、小さな流量で充分にエンジンを冷却することができるため、冷却液を循環させるポンプに加わる負荷が低減される。また、本発明の冷却液は熱伝導率が大きいことから、エンジンを冷却することで一旦上昇した冷却液の温度は容易に低下する。このため、冷却液を冷却する熱交換機は小型なもので足り、装置全体の小型化と装置に要するコストの低減が可能となる。
【００４５】
（５．ＣＯＤ試験）
エチレングリコールを１０重量％含む比較例２の冷却液、エチレングリコールを１２重量％含む比較例３の冷却液、エチレングリコールを１６重量％含む比較例４の冷却液、エチレングリコールを２０重量％含む比較例５の冷却液、エチレングリコールを２２重量％含む比較例６の冷却液、および実施例１〜５の冷却液の理論ＣＯＤを算出した。
【００４６】
算出方法は、新訂明解環境分析技術手法（日本環境測定分析協会編、しらかば出版）に記載の方法に準じた。第１のタンパク質は化１式に示す反応にしたがって酸化され、第２のタンパク質は化２式に示す反応にしたがって酸化される。このため、１０7ｐｐｍの第１タンパク質（分子量３０２４）を完全に酸化するには１９．７×１０5ｐｐｍの酸素が、１０7ｐｐｍの第２のタンパク質（分子量３８１３）を完全に酸化するには１７×１０5ｐｐｍの酸素が必要になると考えられる。なお、１０7ｐｐｍの比較例２の冷却液を完全に酸化させるには１２．５×１０4ｐｐｍの酸素が、１０7ｐｐｍの比較例３の冷却液を完全に酸化させるには１５．０×１０4ｐｐｍの酸素が、１０7ｐｐｍの比較例４の冷却液を完全に酸化させるには２０．０×１０4ｐｐｍの酸素が、１０7ｐｐｍの比較例５の冷却液を完全に酸化させるには２５．６×１０4ｐｐｍの酸素が、１０7ｐｐｍの比較例６の冷却液を完全に酸化させるには２８．１６×１０4ｐｐｍの酸素が必要になると考えられる。
【００４７】
【化１】
2005239885.tif 000002
【００４８】
【化２】
2005239885.tif 000003
【００４９】
算出された各実施例および比較例の冷却液の理論ＣＯＤ値を表すグラフを図５に示す。図５中縦軸は各冷却液の理論ＣＯＤ値を示し、横軸は各実施例および比較例の冷却液の凝固点降下度を示す。
【００５０】
図５に示されるように、実施例の冷却液は、同じ凝固点降下度となる比較例の冷却液よりも理論ＣＯＤ値が著しく小さくなっている。これは、不凍タンパク質は少量でも優れた凝固点降下作用を発揮することから、冷却液中に添加する不凍タンパク質の量は少なくて済むためと考えられる。
【００５１】
実施例３、実施例５、および比較例２〜６の冷却液の凝固点降下度、理論ＣＯＤ値および熱伝導率を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2005239885.tif 000004
【００５３】
表１に示すように、実施例３および実施例５の冷却液は比較例５および比較例６の冷却液と同程度の凝固点降下度を示すものであるが、比較例５および比較例６の冷却液よりも高い熱伝導率と、比較例５および比較例６の冷却液よりも著しく小さいＣＯＤとを示す。この結果からも、本発明の冷却液がグリコール類等が配合されている従来の冷却液よりも優れた冷却液であることが判る。
【００５４】
（６．熱安定性試験）
（２．不凍タンパク質の合成）で合成された第２の不凍タンパク質を水に溶解させて、第２の不凍タンパク質を０．３５重量％を含む実施例６の冷却液を調製した。この実施例６の冷却液を恒温槽に入れ、９０℃で１時間、３時間、６時間熱処理した。
【００５５】
各時間熱処理した実施例６の冷却液の凝固点を、（３．凝固点測定試験）と同じ方法で測定した。また、熱処理していない実施例６の冷却液の凝固点を同様に測定した。各時間熱処理した冷却液の凝固点と、熱処理していない冷却液の凝固点とから、熱処理後の冷却液の残存活性を算出した。残存活性は以下の式で算出した。
【００５６】
残存活性（％）＝熱処理した冷却液の凝固点／熱処理していない冷却液の凝固点×100
本凝固点測定試験で測定された実施例６の冷却液の残存活性を表すグラフを図６に示す。図６中横軸は各冷却液に熱処理を施した時間を示し、縦軸は冷却液の残存活性（％）を示す。
【００５７】
図６に示されるように、第２の不凍タンパク質を含む実施例６の冷却液は、９０℃で６時間熱処理したにも関わらず熱処理前の８０％の凝固点降下活性を維持した。通常、タンパク質は６０℃程度で立体構造が変化するため高温に曝されると機能を発揮しないが、本発明の不凍タンパク質は熱安定性に優れ、自動車のエンジン用冷却液等の恒温に曝される冷却液として好ましく用いられることがわかる。
【００５８】
（７．シュミレーションによるｐＨ安定性試験）
上述したように、不凍タンパク質のうちヘリカル構造が凝固点降下作用を発揮する部分だと考えられているため、ヘリカル構造を多く持つ不凍タンパク質は、より優れた凝固点降下作用を発揮すると考えられる。
【００５９】
一方、タンパク質に含まれるヘリカル構造の量はｐＨによって左右される。すなわち、タンパク質が曝されるｐＨによってタンパク質の３次構造は変化するため、タンパク質に含まれるヘリカル構造の量はｐＨによって変化する。そこで、配列番号１の不凍タンパク質および配列番号２の不凍タンパク質について、種々のｐＨに曝した場合のαヘリックスの量をシュミレーションした。シュミレーションは、ペプチドのαヘリックス構造予測ソフトであるＡｇａｄｉｒ（Http://www．embl-heidelberg．de/cgi/agadir-wrapper.pl）を用いておこなった。このソフトを用い、配列番号１および配列番号２の不凍タンパク質のアミノ酸配列を入力して、２７８Ｋ（４．８５℃）、イオン強度０の条件でｐＨ１〜１４の場合におけるαヘリックス含有率（％）を求めた。なお、αヘリックス含有率はペプチド中の全アミノ酸のうちヘリックス構造をとるアミノ酸の割合とした。
【００６０】
シュミレーションにより得られたｐＨとαヘリックス含有率との関係を図７に示す。なお、図７中縦軸はαヘリックス含有率（％）を示し、横軸はｐＨを示す。
【００６１】
図７に示すように、配列番号１の不凍タンパク質はｐＨ８〜１１の範囲でαヘリックス含有率が高くなり、ｐＨ９．８付近でαヘリックス含有率が最も高くなると推定される。また、配列番号２の不凍タンパク質は、ｐＨ７〜１４の範囲でαヘリックス含有率が高くなり、ｐＨ８．２付近でαヘリックス含有率が最も高くなると推定される。したがって、配列番号１の不凍タンパク質はｐＨ８〜１１付近でより優れた凝固点降下作用を示し、配列番号２の不凍タンパク質はｐＨ７〜１４付近でより優れた凝固点降下作用を示すと考えられる。
【００６２】
ここで、上述した（３．凝固点測定試験）で凝固点を測定した各実施例の不凍液は、ｐＨ３．１〜３．２程度と酸性であった。これは、不凍タンパク質の合成後に逆相クロマトグラフィーにより不凍タンパク質を精製する際に、溶媒としてトリフルオロ酢酸を用いたためと考えられる。このトリフルオロ酢酸は、精製後に不凍タンパク質を凍結乾燥あるいは減圧乾燥する際に大部分が揮発するが、一部は残存するために、不凍液のｐＨが低くなっていると考えられる。したがって、各実施例の不凍液のｐＨを配列番号１の不凍タンパク質については８〜１１程度に、配列番号２の不凍タンパク質については７〜１４程度に調整すれば、（３．凝固点測定試験）で得られた結果よりも、より凝固点が降下するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】一般的な不凍タンパク質のαヘリックス構造を模式的に表す図である。
【図２】凝固点測定試験で測定された実施例１〜５の冷却液の凝固点を表すグラフである。
【図３】チャイロコメノゴミムシダマシの幼虫由来のＡＦＰ水溶液の凝固点を表すグラフである。
【図４】熱伝導率測定試験で測定された水および比較例１の冷却液の２０℃〜８０℃における熱伝導率を表すグラフである。
【図５】ＣＯＤ試験で算出された各実施例および比較例の冷却液の理論ＣＯＤ値を表すグラフである。
【図６】凝固点測定試験で測定された実施例６の冷却液の残存活性を表すグラフである。
【図７】シュミレーションにより得られたｐＨとαヘリックス含有率との関係を表すグラフである。
【図１】
2005239885.tif 000005
【図２】
2005239885.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005239885.tif 000010
【図７】
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【配列表】
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