(57)【要約】【課題】  複数の酵素反応を連続して行うことにより、生体内における物質生成過程と同様にして、所望の物質を効率よく製造しうる方法及びそれを実施するのに好適な反応装置を提供する。【解決手段】  それぞれ異なった酵素を固定化した複数のマイクロチャネルを直列に連結し、それに原料を含む液体媒体を連続的に供給し、複数段階の酵素反応を行わせる多段階酵素反応方法、及びそれぞれマイクロチャネル内を表面修飾して異なった酵素を固定化した複数のユニットを直列に連結して構成された多段階酵素反応用マイクロリアクターである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ異なった酵素を固定化した複数のマイクロチャネルを直列に連結し、それに原料を含む液体媒体を連続的に供給し、複数段階の酵素反応を行わせることを特徴とする多段階酵素反応方法。
【請求項２】
液体媒体が水溶液、有機溶液又は超臨界流体である請求項１記載の多段階酵素反応方法。
【請求項３】
それぞれマイクロチャネル内を表面修飾して異なった酵素を固定化した複数のユニットを直列に連結して構成されたことを特徴とする多段階酵素反応用マイクロリアクター。
【請求項４】
マイクロチャネルの幅が５０〜２０００μｍの範囲にある請求項３記載の多段階酵素反応用マイクロリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャネルを利用して、多段階の酵素反応を行う方法及びその反応を行うのに好適な多段階酵素反応用マイクロリアクターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、化学分野、電気機械的分野において、径１０〜１００μｍのキャピラリーやマイクロチャネルを利用して、微量分析、微量合成、微量微生物培養、微量電気泳動、微量電気浸透などの化学的・電気的又は機械的操作を行うことが試みられている（非特許文献１）。これらは、少量の試料を用いて、迅速にそれぞれの方法の結果を確認しうるという利点があるため、各方面への応用がはかられている。
【０００３】
そして、これらの中で化学反応を効率的に行うための装置、いわゆるマイクロリアクターについては、流体化学反応の制御性が向上し、反応生成物の収率、純度の改善が予想される上に、リアクターの幅を狭くすることができ、普通サイズのリアクターに比べ、体積当りの表面積の比率を大きくしうるので、化学反応の効率化の手段として注目されている。
【０００４】
ところで、化学、生化学の分野においては、反応効率を向上させるために触媒を使用する場合が多く、この際触媒効率を向上させることが課題となっている。例えば光学活性化合物の不斉合成に際し、酵素や有機金属錯体などの有機分子を用いる場合、これらは無機触媒に比べコスト高になるのを免れないので、触媒効率を改善し、使用量の減少や再利用をはかることが実用化の上で必要になってくる。
【０００５】
特に、生体内においては複数の酵素反応が組み合わされ、効率的な物質合成が行われているので、これと同様にして多段階の酵素合成による物質生産を行うことができれば、種々多様の物質を簡単に合成しうる画期的なプロセスを実現できるばかりでなく、化学プロセスの低環境負荷化に大きく寄与できる筈である。
【０００６】
しかしながら、これまで行われてきたバルク系での酵素反応は、平衡反応であるため、中間生成物が夾雑し、目的物を効率よく得ることが困難であった。したがって、バルクの反応においては、単一の酵素を用いた一段階反応のみが行われていた。
【０００７】
【非特許文献１】「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，第２８５巻，ｐ８３−８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような事情のもとで、複数の酵素反応を連続して行うことにより、生体内における物質生成過程と同様にして、所望の物質を効率よく製造しうる方法及びそれを実施するのに好適な反応装置を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、先に不活性材料からなる固体表面に、マイクロチャネルを刻設し、そのマイクロチャネルの壁面に触媒能を有する有機分子、例えば酵素分子を固定させたマイクロリアクターを開発したが（特願２００２−６７０２３号）、さらに研究を重ねた結果、このマイクロリアクターに異なった酵素分子を固定化し、これを複数組み合わせれば、多段階の酵素反応を行わせることができることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、それぞれ異なった酵素を固定化した複数のマイクロチャネルを直列に連結し、それに原料を含む液体媒体を連続的に供給し、複数段階の酵素反応を行わせることを特徴とする多段階酵素反応方法、及びそれぞれマイクロチャネル内を表面修飾して異なった酵素を固定化した複数のユニットを直列に連結して構成されたことを特徴とする多段階酵素反応用マイクロリアクターを提供するものである。
【００１１】
次に本発明を添付図面に従って説明する。図１は、本発明方法を実施するのに好適なマイクロリアクターの構造の１例を示す平面図であり、このマイクロリアクターは不活性材料からなる基板１，１´にマイクロチャネル２，２´が蛇行して刻設され、このマイクロチャネル２の壁面に酵素分子が固定された２個のユニット（Ｉ、ＩＩ）が直列に連結されることによって構成されている。
【００１２】
そして、ユニットＩ及びＩＩのマイクロチャネルの壁面にはそれぞれ異なった酵素分子が固定され、ポンプ３から供給される原料化合物Ａは先ずユニットＩにおける酵素の作用を受けて中間生成物Ｂとなり、次いでこれがユニットＩＩに送られ、ここでさらに酵素の作用を受けて目的生成物Ｃとなる。
【００１３】
この例においては、ユニットＩ及びＩＩにおいて２段階の酵素反応が行われているが、所望ならばさらにユニットの数を増やし、３段階、４段階…の酵素反応を連続して行わせることもできる。
【００１４】
この各ユニットで基板１として用いる不活性材料は、酵素反応の反応体や溶媒、及びその生成物に対し反応性を示さない材料のことである。このようなものの例としては、従来のマイクロリアクターのベースとして用いられていた材料、例えばガラス、石英、又はシリカ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、マグネシア、ジルコニア、アルミナ、アパタイト、窒化ケイ素、及びチタン、アルミニウム、イットリウム、タングステンのような金属の酸化物、炭化物、窒化物、ホウ化物、ケイ化物などのセラミックスを挙げることができる。
【００１５】
このほか上記の要件を満たすものである限り、金属、プラスチックなども用いることができる。このベースの形状としては、板状体が普遍であるが、所望ならば弧状体、球体、粒体などのものを用いることができる。
【００１６】
次に、この基板１の上に設けるマイクロチャネル２はマイクロドリルやレーザを用いる加工やエッチング処理により簡単に刻設することができる。このマイクロチャネルは幅５０〜２０００μｍ、好ましくは１００〜４００μｍ、深さ５０〜２０００μｍ、好ましくは１００〜４００μｍのサイズで刻設される。このマイクロチャネルの長さには特に制限はなく、使用される基板のサイズに依存するが、通常１００〜３００ｍｍの範囲で選ばれる。
【００１７】
このように刻設されたマイクロチャネル壁面に酵素分子を固定化するには、例えば先ず不活性材料にそれと親和性を有するアミノ基含有化合物をマイクロチャネルの壁面と接触させて壁面にアミノ基含有化合物残基を導入したのち、これに酵素分子を反応させ、固定することによって行うことができる。
【００１８】
すなわち、ガラスや石英や、シリカ、Ｓｉ／ＳｉＯ2のようなシリカ系セラミックスをベースとして用いた場合には、アミノプロピルシランのようなアミノ基含有ケイ素化合物を反応させ、マイクロチャネル壁面のシラノール基にこの化合物の残基を導入し、この残基中のアミノ基に酵素分子を結合させて固定することができる。
【００１９】
このアミノ基に酵素分子を結合させるには、例えばコハク酸のようなジカルボン酸を介して直接結合させるか、あるいはグルタルアルデヒドのようなアミノ基反応性架橋剤を結合させたのち、これに酵素分子のアミノ基を結合させる。
【００２０】
また、水酸基含有アルキルシラン誘導体を反応させ、これに酵素分子を脱水縮合させてエステル結合を形成させて結合させることもできるし、ハロゲン化アルキルシラン誘導体を反応させたのち、イミン形成によりチオール含有アミンを導入することもできる。
【００２１】
このようにして、マイクロチャネルの壁面にアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼなどの酵素分子を固定化することができる。
【００２２】
そのほか、アミノ末端又はカルボキシル末端に連続したヒスチジン残基をもつ酵素分子、例えばカゼインキナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素などの酵素分子は、以下のようにニッケル錯体を介して固定化することができる。
【００２３】
すなわち、前記のようにアミノ基含有ケイ素化合物で化学修飾したのち、ジカルボン酸無水物、例えば無水コハク酸で処理し、次いで１‐エチル‐３‐アミノプロピルカルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとの混合物を反応させることにより、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させる。
【００２４】
次いで、この活性エステルに、錯化合物形成剤、例えばＮ‐（５‐アミノ‐１‐カルボキシペンチル）イミノジ酢酸を反応させたのち、可溶性ニッケル塩、例えば硫酸ニッケルの溶液を反応させて、ニッケル錯体を形成させることにより、チャネル表面にニッケル錯体を固定化する。
【００２５】
このようにして得られるニッケル錯体を表面に結合したマイクロチャネルに、アミノ末端又はカルボキシル末端に連続したヒスチジン残基をもつ酵素分子を接触させると、この酵素分子は、ニッケル錯体を介して簡単にマイクロチャネル表面に固定化される。
【００２６】
このようにしてニッケル錯体を介して固定された酵素分子は、還元処理するか、あるいはイミダゾールやＥＤＴＡのようなキレート剤で処理することにより、容易に脱離させることができ、固定化及び脱離反応は可逆的であるので、触媒能が低下した場合などには簡単に新らしい酵素分子と交換することができるので有利である。
【００２７】
本発明においては、このようにしてマイクロチャネルの壁面に酵素分子を固定化したユニットの２個又はそれ以上を前のユニットのマイクロチャネルの排出口と後のユニットのマイクロチャネルの導出口とを連結して構成されたマイクロリアクターを用いて連続的な酵素反応を行う。
【００２８】
そして、このように酵素を固定したマイクロチャネルをもつ複数のユニットからなるマイクロリアクターを用いて酵素反応を行うと、マイクロチャネルのもつ体積に対する表面積の比率が大きくなるため、従来の方法に比べ、反応効率を著しく向上させることができる。
【００２９】
また、マイクロチャネル表面に酵素分子を可逆的に固定化しているため、反応終了後、反応液から酵素分子を分離、回収することなく、マイクロチャネルに基質となる原料を継続的に供給することにより、多段階の酵素反応を連続的に行うことができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によると、生体内で通常行われている多段階の酵素反応を行うことができるので、高効率で各種有機化合物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
セラミックス基板上に、マイクロドリルを用いた機械加工法により、幅２００μｍ、深さ２００μｍ、長さ４０ｃｍのチャネルを作製し、ガラス板と接着することにより、マイクロチャネル構造を有するユニットを作製した。
【００３３】
このようにして得たユニットのチャネル内を先ず濃硫酸と３０％過酸化水素水を体積比７：３の割合で混合した液体で約１２時間洗い、表面に付着した有機物などの夾雑物を分解、洗浄した。次に超純水で洗浄した後、３‐アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランを質量比２：８の割合で混合したものを９５％エチルアルコールに溶解し、体積比で３％とした溶液で処理した。１時間後エチルアルコールで洗浄し、窒素ガスを通したのち、１１５℃に保った乾燥器内で１時間乾燥することにより、表面修飾を行った。
【００３４】
次いで、このチャネル内に無水コハク酸をＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドに１ミリモル／リットルの濃度で溶かした溶液を注入し、３０分反応させたのち、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドで洗浄したのち、さらに１‐エチル‐３（３‐アミノプロピル）カルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドを各々１ミリモル／リットルになるよう混合した溶液をチャネル内に流してＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを調製した。
【００３５】
このようにして、ユニット２個を調製し、それぞれに５ｍｇ／リットルの濃度でリン酸緩衝液に溶解したクエン酸リアーゼとオキサロ酢酸脱炭酸酵素の溶液を流通し、それぞれクエン酸リアーゼとオキサロ酢酸脱炭酸酵素を固定化したユニット２個を作製した。そして、このクエン酸リアーゼを固定化したユニットのマイクロチャネルの排出口とオキサロ酢酸脱炭酸酵素を固定化したユニットのマイクロチャネルの導入孔をシリコンチューブで連結し、これをプランジャーポンプに接続して図１に示す構造のマイクロリアクターを作製した。
【００３６】
次に、このマイクロチャネルに、１００ミリモル／リットルに調整したクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に１ミリモル／リットルの塩化マグネシウムを溶解させたものを通し、２段階の酵素反応を行った。シリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させた結果、毎分１０ｍｌの流量において１００％の収率でピルビン酸を得た。
【実施例２】
【００３７】
実施例１と同様の方法で、市販のフューズドシリカマイクロキャピラリー（内径３２０μｍ、長さ４０ｃｍ）のチャネル表面を化学修飾したものを３本作製した。それぞれのキャピラリーに５ｍｇ／リットルの濃度でリン酸緩衝液に溶解したクエン酸リアーゼとオキサロ酢酸脱炭酸酵素とＬ−乳酸脱水素酵素の溶液を通し、クエン酸リアーゼ２、オキサロ酢酸脱炭酸酵素２´、Ｌ−乳酸脱水素酵素２”を固定化したマイクロリアクターを作製し、これを連結してポンプ３に接続して図２に示すマイクロリアクターを作製した。
【００３８】
上記マイクロチャネルに、１００ミリモル／リットルに調整したクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化マグネシウム（１ミリモル／リットル）とＮＡＤＨ（１１０ミリモル／リットル）を溶解させたものを流通させ、３段階の酵素反応を行った。シリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させて、滞留時間を変化させていったところ、毎分１０ｍｌの流量において１００％の収率でＬ−乳酸を得た。
【実施例３】
【００３９】
実施例２と同様、市販のフューズドシリカマイクロキャピラリー（内径３２０μｍ、長さ４０ｃｍ）のチャネル表面を化学修飾したものを３本作製した。それぞれのキャピラリーに５ｍｇ／リットルの濃度でリン酸緩衝液に溶解させたクエン酸リアーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸酵素とチロシンフェノールリアーゼの溶液を通し、クエン酸リアーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸酵素、チロシンフェノールリアーゼを固定化したマイクロリアクターを作製した。
【００４０】
上記マイクロチャネルに、１００ミリモル／リットルに調整したクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化マグネシウム（１ミリモル／リットル）、塩化アンモニウム（１１０ミリモル／リットル）、フェノール（１１０ミリモル／リットル）を溶解させたものを流通させ、３段階の酵素反応を行った。シリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させ、滞留時間を変化させた結果、毎分１０ｍｌの流量において９８％以上の収率でＬ−チロシンを得た。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明のマイクロリアクターの１例を示す平面図。
【図２】実施例２で用いたマイクロリアクターの構造を示す平面図。
【符号の説明】
【００４２】
１，１´  基板
２，２´  マイクロチャネル
３  供給ポンプ
【図１】
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【図２】
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