(57)【要約】【課題】  試料溶液に含まれるダイオキシン様化合物の生体に対する毒性を正確に評価しうる、安価で簡便かつ迅速であるとともに高感度かつ高精度なダイオキシン様化合物の測定することを可能とする。【解決手段】  ダイオキシン様化合物によって活性化される生体内の一連の反応、つまりダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって誘発される、タンパク質やDNAの結合や解離などの相互作用を再現し、更にその相互作用を、非常に高感度で安定した物質間相互作用の検出方法として汎用されているＳＰＲ法を用いて検出する測定方法および測定キット。【選択図】  図１
2005106622.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）アリルハイドロカーボンレセプター（以下、AHRと記す）タンパク質と、ダイオキシン様化合物とAHRタンパク質の複合体に特異的に結合するアリルハイドロカーボンレセプター核移行因子（以下、ARNTと記す）タンパク質のどちらか一方を固相上に固定化し、（２）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合に起因する、AHRタンパク質とARNTタンパク質の複合体形成による質量増加に伴う溶液の屈折率変化を、表面プラズモン共鳴（以下、SPRと記す）現象を利用して検出することにより、（３）AHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を定量化することを特徴とするダイオキシン様化合物の測定方法  
【請求項２】
（１）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によってAHRタンパク質から解離するHSP90タンパク質とAHRタンパク質との複合体を固相上に固定化し、（２）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合に起因する、該複合体の解離による質量減少に伴う溶液の屈折率変化を、SPR現象を利用して検出することにより、（３）AHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を定量化することを特徴とするダイオキシン様化合物の測定方法  
【請求項３】
（１）AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に特異的に結合するDNAを固相上に固定化し、（２）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって形成された該複合体の、該DNAへの結合による質量増加に伴う溶液の屈折率変化を、SPR現象を利用して検出することにより、（３）AHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を定量化することを特徴とするダイオキシン様化合物の測定方法
【請求項４】
ARNTタンパク質を含む試薬と、固相上にAHRタンパク質を固定化したSPR測定用チップからなることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法を利用した測定キット
【請求項５】
AHRタンパク質を含む試薬と、固相上にARNTタンパク質を固定化したSPR測定用チップからなることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法を利用した測定キット
【請求項６】
AHRタンパク質とHSP９０タンパク質が複合体を形成しており、かつ、その複合体中のAHRタンパク質を固相上に固定化したSPR測定用チップと、試料希釈のための試薬からなることを特徴とする、請求項２に記載の測定方法を利用した測定キット
【請求項７】
AHRタンパク質とHSP９０タンパク質が複合体を形成しており、かつ、その複合体中のHSP90タンパク質を固相上に固定化したSPR測定用チップと、試料希釈のための試薬からなることを特徴とする、請求項２に記載の測定方法を利用した測定キット
【請求項８】
AHRタンパク質とARNTタンパク質を含む試薬と、固相上にAHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に特異的に結合するDNAを固定化したSPR測定用チップからなることを特徴とする、請求項３に記載の測定方法を利用した測定キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料、海水、河川水、地下水などの水系試料中のダイオキシン様化合物を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、体内に取り込まれることによってホルモン様の働きをしたり、ホルモンの働きを阻害したりする内分泌攪乱物質が注目を集めている。これらの多くは生体内のホルモン受容体と結合することにより、様々な毒性を引き起こすことが知られている。内分泌攪乱物質の中でもダイオキシン様化合物は、微量でも非常に強い毒性を持ち、催奇性、生殖異常、体重減少、免疫抑制、発癌、上皮細胞異形成などを惹起する。このため生体におけるダイオキシン様化合物の蓄積や環境および食品などの安全性評価として、それらを検出や測定する試みがなされている。
【０００３】
現在、一般的なダイオキシン様化合物の測定法としては、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグフィー高分解能マススペクトロメトリー、高速液体クロマトグラフィー高分解能マススペクトロメトリーなどが利用される。しかし、これらの方法では微量成分の検出に十分な感度が得られない場合があり、更に大型で高価な装置や排気設備を有した特定施設を必要とする。しかも、操作が非常に煩雑であり、測定に長時間を要する場合が多い。また、これらの方法では、まず試料中に含まれる毒性物質の化学量を求め、その毒性を基準となる毒性物質の毒性に換算した上でその総和（TEQ、毒性等価量）を求め、試料の毒性として評価する必要がある。よって、試料に含まれる毒性物質すべてを同定し、更に正確に定量し、試料の組成を完全に明らかにしなければ、正確に毒性を評価することは出来ない。
【０００４】
また簡便法として、抗ダイオキシン様化合物抗体を用いた水晶振動子測定装置や酵素免疫測定（ELISA）法による測定キットが開発、市販されている。しかしながらこの方法では、添加、洗浄を数段階繰り返さなければならず操作が煩雑であり、測定に数時間を要するとともに、感度や定量性が不十分である。更に、汎用されている抗ダイオキシン様化合物抗体は人体への毒性と全く無関係の選択結合性を示すものが多く、化学物質の毒性の程度と抗体への結合量との相関が得られておらず、正確な毒性評価を行うことが出来ない。
【０００５】
そこで、これらの問題を解決すべく、ダイオキシン様化合物によって活性化される生体内の一連の反応を再現することで、より正確に毒性を評価できる、ダイオキシン様物質の検出や測定を行う方法が開発されている。すなわち、本来、ダイオキシン様化合物は体内に取り込まれた後、AHRタンパク質と結合してからDNAと作用し毒性を発揮することから、AHRタンパク質に対するダイオキシン様化合物の結合量を知ることによって、その毒性を極めてよく反映した検出や測定を行うものである。
【０００６】
その一例としてダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって誘発される、AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に特異的に結合するDNA断片（DREエレメントを含むDNA断片）をプレート上に固定化し、該複合体の一部であるARNTタンパク質に結合しうる抗ARNT抗体を用いたELISA法によりダイオキシン様化合物を検出する方法がある（特許文献１参照）。しかしながらこの方法では前述の抗ダイオキシン様化合物抗体を用いたELISA法と同様に操作が煩雑であり、感度や定量性が不十分である。
【０００７】
また、DREエレメントを含むDNA断片を固定化した圧電振動子において、ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって形成された、AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体が該DNA断片へ結合することによる質量増加を、圧電振動子から発生する起電周波数の変化として検出する方法もある（特許文献２参照）。しかしながら圧電振動子による検出は、外来要因に影響を受けやすいためノイズが大きく、また安定したシグナル（周波数変化度）を得ることが非常に難しいことから、そのデータの精度や再現性に問題があると指摘されている。
【特許文献１】特表２００１−５０３１３０
【特許文献２】特開２００１−８３１５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
解決しようとする問題は、試料溶液に含まれるダイオキシン様化合物の、生体に対する毒性を正確に評価しうる、安価で簡便かつ迅速であるとともに高感度かつ高精度なダイオキシン様化合物の測定方法、およびそのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の特徴は、ダイオキシン様化合物によって活性化される生体内の一連の反応、つまりダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって誘発される、タンパク質やDNAの結合や解離などの相互作用を再現し、更にその相互作用を、非常に高感度で安定した物質間相互作用の検出方法として汎用されているＳＰＲ法を用いて検出することにある。
【００１０】
すなわち、請求項１記載の測定方法は、（１）アリルハイドロカーボンレセプター（AHR）タンパク質と、ダイオキシン様化合物とAHRタンパク質の複合体に特異的に結合するアリルハイドロカーボンレセプター核移行因子（ARNT）タンパク質のどちらか一方を固相上に固定化し、（２）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合に起因する、AHRタンパク質とARNTタンパク質の複合体形成による質量増加に伴う溶液の屈折率変化を、表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用して検出することにより、（３）AHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を定量化することを特徴とする。まず、SPRによる検出は非常に高感度で高精度であり、測定系も非常に簡便なものが確立されていることから、従来の測定方法と比較して簡便さ、迅速さにおいても大変有効である。更に、ダイオキシン様化合物により誘引されるAHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体形成に伴う質量変化は、ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合による質量変化よりも変化量が大きいため、結果としてAHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を直接検出するよりも高感度な測定を行うことが可能とした。また、一連の反応は可逆反応であり、相互作用するタンパク質の一方を固相上に固定化しているため、洗浄操作を行うことによりセンサを繰り返し使用することができ、低コスト化を可能とした。
【００１１】
また、請求項２記載の測定方法は（１）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって、AHRタンパク質から解離するHSP90タンパク質と、AHRタンパク質との複合体を固相上に固定化し、（２）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合に起因する、該複合体の解離による質量減少に伴う溶液の屈折率変化を、SPR現象を利用して検出することにより、（３）AHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を定量化することを特徴とする。まず、SPRによる検出は非常に高感度で高精度であり、測定系も非常に簡便なものが確立されていることから、従来の測定方法と比較して簡便さ、迅速さにおいても大変有効である。更に、ダイオキシン様化合物により誘引されるAHRタンパク質とHsp90タンパク質との複合体の解離に伴う質量変化は、ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合による質量変化よりも変化量が大きいため、結果としてAHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を直接検出するよりも高感度な測定を行うことを可能とした。
【００１２】
また、請求項３記載の測定方法は（１）AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に特異的に結合するDNAを固相上に固定化し、（２）ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合によって形成された該複合体の、該DNAへの結合による質量増加に伴う溶液の屈折率変化を、SPR現象を利用して検出することにより、（３）AHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を定量化することを特徴とする。まず、SPRによる検出は非常に高感度で高精度であり、測定系も非常に簡便なものが確立されていることから、従来の測定方法と比較して簡便さ、迅速さにおいても大変有効である。更にダイオキシン様化合物により形成されるAHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体と、DNAとの結合に伴う質量変化は、ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合による質量変化よりも変化量が大きいため、結果としてAHRタンパク質に結合したダイオキシン様化合物を直接検出するよりも高感度な測定を行うことを可能とした。また、一連の反応は可逆反応であり、非常に安定な物質であるDNAを固相上に固定化していることから、洗浄操作によりセンサを繰り返し使用することができ、低コスト化に加えて、高耐久性化を可能とした。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、試料溶液に含まれるダイオキシン様化合物の、生体に対する毒性を正確に評価しうる、安価で簡便かつ迅速であるとともに高感度かつ高精度なダイオキシン様化合物の測定が可能になるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
請求項１に記載の測定方法におけるAHRタンパク質については、ダイオキシン様化合物との結合活性ならびに、ダイオキシン様化合物との結合に誘引されるARNTタンパク質との結合活性を有してさえいれば、その由来や構造は特に限定されるものではない。例えばアミノ酸配列の改変や修飾などにより、ダイオキシン様化合物やARNTタンパク質に対する親和性を高めたり、質量を増したりして、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。本発明で用いられるARNTタンパク質については、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質との結合活性を有してさえいればその由来や構造は特に限定されるものではない。例えばアミノ酸配列の改変や修飾などにより、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質に対する親和性を高めたり、質量を増したりして、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。また本発明の検出方法は、SPR法を利用することを特徴とする。SPRは、プリズム表面の金属薄膜上の質量変化に伴う屈折率変化を検出する方法であり、物質の相互作用を標識なしで検出することが可能であり、非常に高精度で高感度な検出方法である。具体的には、相互作用する物質の一方を金属薄膜表面に固定化し、これに作用するもう一方の物質を含む試料を展開することにより両物質の結合に伴う金属薄膜表面での微量な質量変化による屈折率変化を検出する。本発明においては、AHRタンパク質、ARNTタンパク質のいずれを金属薄膜表面に固定化してもよい。タンパク質を固相表面に固定する方法は公知の方法から好適なものを選択すればよく、AHRタンパク質とダイオキシン様化合物、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質とARNTタンパク質の結合を妨げるものでなければ特に限定されない。具体的には、あらかじめ金属表面に結合可能な官能基を有する物質を導入してタンパク質が有する反応基と化学的に結合させるか、金属表面とタンパク質を、それぞれ化学的に結合または吸着可能な物質で修飾した後、反応させることにより固定することができる。
【００１５】
請求項２に記載の測定方法におけるAHRタンパク質については、ダイオキシン様化合物ならびに、HSP９０タンパク質との結合活性を有し、更にダイオキシン様化合物との結合によりHSPタンパク質と解離しさえすればその由来や構造は特に限定されるものではない。例えばアミノ酸配列の改変や修飾などにより、ダイオキシン様化合物に対する親和性を高めたり、質量を増したりして、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。本発明で用いられるHSP９０タンパク質については、AHRタンパク質との結合活性を有し、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質と解離しさえすればその由来や構造は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列の改変や修飾などにより、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質に対する親和性を低めたり、質量を増したりして、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。また本発明の検出方法は、SPR法を利用することを特徴としており、AHRタンパク質とHSP90タンパク質との複合体において、そのいずれか一方のタンパク質を固相上に固定化することにより、ダイオキシン様化合物のAHRタンパク質への結合に誘引される複合体の解離に伴う固相上の質量減少を検出することが可能になる。AHRタンパク質とHSP９０タンパク質との複合体を固相表面に固定する方法は公知の方法から好適なものを選択すればよく、AHRタンパク質とHSP90タンパク質の結合、AHRタンパク質とダイオキシン様化合物の結合、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質とHSP90タンパク質の解離を妨げるものでなければ特に限定されない。具体的には、あらかじめ金属表面に結合可能な官能基を有する物質を導入してタンパク質が有する反応基と化学的に結合させるか、金属表面とタンパク質を、それぞれ化学的に結合または吸着可能な物質で修飾した後、反応させることにより固定することができる。
【００１６】
請求項３に記載の測定方法におけるAHRタンパク質については、ダイオキシン様化合物との結合活性ならびに、ダイオキシン様化合物との結合に誘引されるARNTタンパク質との結合活性、およびARNTタンパク質との複合体を形成した際に特定の配列を有するDNAとの結合活性を有してさえいればその由来や構造は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列の改変や修飾などにより、ダイオキシン様化合物やARNTタンパク質、DNAに対する親和性を高めたり、質量を増したりして、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。また、ARNTタンパク質については、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質との結合活性、およびAHRタンパク質との複合体を形成した際に、特定の配列を有するDNAとの結合活性を有してさえいればその由来や構造は特に限定されるものではない。例えば、アミノ酸配列の改変や修飾などにより、ダイオキシン様化合物と結合したAHRタンパク質や、DNAに対する親和性を高めたり、質量を増したりして、検出に好適なタンパク質を作製し利用することができる。また、DNAの由来や構造は、AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に結合することができるのであれば特に限定されない。具体的には、AHRタンパク質の働きにより発現が誘導される遺伝子の上流に位置し、AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体が特異的に結合することが確認され、DRE配列と呼ばれる５’−ＴＮＧＣＧＴＧ−３’で表される配列を含むＤＮＡ断片が好適である（ここで、「Ｎ」は「ＡまたはＣまたはＧまたはＴ」を示す）。また、本発明の検出方法は、SPR法を利用することを特徴とする。ここではAHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体と特異的に結合するDNAを固相上に固定化する。DNAを固相表面に固定する方法は公知の方法から好適なものを選択すればよく、AHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体の結合を妨げるものでなければ特に限定されない。あらかじめ金属表面にある物質を導入し、更にＤＮＡ断片にはその物質と化学的に結合もしくは吸着可能な物質を導入しておき、両者を反応させることにより固定することができる。具体的には、たとえば固相上のアビジンとビオチン修飾したDNAの結合により固定する方法などが挙げられる。
【００１７】
請求項４に記載の測定キットは、ARNTタンパク質を含む試薬と、固相上にAHRタンパク質を固定化したSPR測定用チップからなることを特徴とする。本発明において、ＡＲＮＴタンパク質を含む試薬は、ＡＲＮＴタンパク質が（１）一定の濃度で含まれる溶液、あるいは（２）乾燥状態の固体とそれを溶解可能な溶媒の組み合わせ、のいずれかの形態で供給される。溶媒となる溶液としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【００１８】
請求項５に記載の測定キットは、AHRタンパク質を含む試薬と、固相上にARNTタンパク質を固定化したSPR測定用チップからなることを特徴とする。本発明において、ＡＨＲタンパク質を含む試薬は、ＡＨＲタンパク質が（１）一定の濃度で含まれる溶液、あるいは（２）乾燥状態の固体とそれを溶解可能な溶媒の組み合わせ、のいずれかの形態で供給される。溶媒となる溶液としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【００１９】
請求項６に記載の測定キットは、AHRタンパク質とHSP９０タンパク質が複合体を形成しており、かつ、その複合体中のAHRタンパク質を固相上に固定化したSPR測定用チップと、試料希釈のための試薬からなることを特徴とする。
試料希釈のための試薬としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【００２０】
請求項７に記載の測定キットは、AHRタンパク質とHSP９０タンパク質が複合体を形成しており、かつ、その複合体中のHSP90タンパク質を固相上に固定化したSPR測定用チップと、試料希釈のための試薬からなることを特徴とする。
試料希釈のための試薬としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【００２１】
請求項８に記載の測定キットは、AHRタンパク質とARNTタンパク質を含む試薬と、固相上にAHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に特異的に結合するDNAを固定化したSPR測定用チップからなることを特徴とする。本測定キットにおいて、ＡＨＲタンパク質とＡＲＮＴタンパク質を含む試薬は、ＡＨＲタンパク質、およびＡＲＮＴタンパク質が（１）一定の濃度で含まれる溶液、あるいは（２）乾燥状態の固体とそれを溶解可能な溶媒の組み合わせ、のいずれかの形態で供給される。溶媒となる溶液としては測定に好適な溶液、例えば緩衝液が好適に利用される。
【実施例１】
【００２２】
（測定試薬の調整）
バキュロウィルスを宿主とした系を用いて発現したヒト由来ＡＨＲタンパク質とＡＲＮＴタンパク質を精製した。精製したＡＨＲタンパク質をビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、PBS緩衝液に溶解させ500μg/mlのビオチン化ＡＨＲタンパク質溶液を調製し、あらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップSA（ビアコア社製）に流速15μl/minで10分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してＡＨＲタンパク質をチップ上に固定した。ＡＲＮＴタンパク質はＰＢＳ緩衝液に溶解させ、200μg/mlのARNT溶液を調整した。これを測定キット（１）とした。
【００２３】
（２，３，７，８−TCDDの測定）
１pg~１０００ng/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDを含有する標準溶液を作成した。２００μg/mlのARNT溶液１９０μlと標準溶液を１０μｌずつ混合後、SPR（Biacore 1000、ビアコア社製）に供した。すなわち、AHRタンパク質を固定化した測定用チップにこの混合溶液を流速20μl/minで８分間展開した後、PBS緩衝液で１分間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを0とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図１に示した。測定キット（１）では、0.２〜１００ｐg/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDの測定が測定可能であった。
【実施例２】
【００２４】
（測定試薬の調整）
バキュロウィルスを宿主とした系を用いて発現したヒト由来ＡＨＲタンパク質とＡＲＮＴタンパク質を精製した。精製したARNTタンパク質をビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、PBS緩衝液に溶解させ500μg/mlのビオチン化ARNTタンパク質溶液を調製し、あらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップSA（ビアコア社製）に流速15μl/minで10分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してARNTタンパク質をチップ上に固定した。AHRタンパク質はＰＢＳ緩衝液に溶解させ、200μg/mlのARNT溶液を調整した。これを測定キット（２）とした。
【００２５】
（２，３，７，８−TCDDの測定）
1pg/ml~１０００ng/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDを含有する標準溶液を作成した。２００μg/mlのAHR溶液１９０μlと標準溶液を１０μｌずつ混合後、SPR（Biacore 1000、ビアコア社製）に供した。すなわち、ARNTタンパク質を固定化した測定用チップにこの混合溶液を流速20μl/minで８分間展開した後、PBS緩衝液で１分間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを0とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図２に示した。測定キット（２）では、0.２〜１００ｐg/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDの測定が測定可能であった。
【実施例３】
【００２６】
（測定試薬の調整）
バキュロウィルスを宿主とした系を用いて発現したヒト由来ＡＨＲタンパク質とＨＳＰ９０タンパク質を精製した。精製したＡＨＲタンパク質をビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、PBS緩衝液に溶解させ500μg/mlのビオチン化ＡＨＲタンパク質溶液を調製し、あらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップSA（ビアコア社製）に流速15μl/minで10分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してＡＨＲタンパク質をチップ上に固定した。ＨＳＰ９０タンパク質はＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μg/mlのＨＳＰ９０溶液を調整し、ＡＨＲタンパク質を固定化したチップに流速１５μl/minで１０分間展開し、チップ上にAHRタンパク質とHSP９０タンパク質との複合体を形成させた。これを測定キット（３）とした。
【００２７】
（２，３，７，８−TCDDの測定）
1pg/ml~１０００ng/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDを含有する標準溶液を作成した。２００μg/mlのPBS溶液１９０μlと標準溶液を１０μｌずつ混合後、SPR（Biacore 1000、ビアコア社製）に供した。すなわち、すなわち、AHRタンパク質とHSP90タンパク質との複合体を固定化した測定用チップにこの混合溶液を流速20μl/minで８分間展開した後、PBS緩衝液で１分間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを0とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図３に示した。測定キット（３）では、１〜１００ｐg/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDの測定が測定可能であった。
【実施例４】
【００２８】
（測定試薬の調整）
バキュロウィルスを宿主とした系を用いて発現したヒト由来ＡＨＲタンパク質とＨＳＰ９０タンパク質を精製した。精製したHSP90タンパク質をビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、PBS緩衝液に溶解させ500μg/mlのビオチン化HSP90タンパク質溶液を調製し、あらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップSA（ビアコア社製）に流速15μl/minで10分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してHSP90タンパク質をチップ上に固定した。AHRタンパク質はＰＢＳ緩衝液に溶解させ、５００μg/mlのＨＳＰ９０溶液を調整し、HSP90タンパク質を固定化したチップに流速１５μl/minで１０分間展開し、チップ上にAHRタンパク質とHSP９０タンパク質との複合体を形成させた。これを測定キット（４）とした。
【００２９】
（２，３，７，８−TCDDの測定）
1pg/ml~１０００ng/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDを含有する標準溶液を作成した。２００μg/mlのPBS溶液１９０μlと標準溶液を１０μｌずつ混合後、SPR（Biacore 1000、ビアコア社製）に供した。すなわち、AHRタンパク質とHSP90タンパク質との複合体を固定化した測定用チップにこの混合溶液を流速20μl/minで８分間展開した後、PBS緩衝液で１分間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを0とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図４に示した。測定キット（４）では、１〜２００ｐg/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDの測定が測定可能であった。
【実施例５】
【００３０】
（測定試薬の調整）
バキュロウィルスを宿主とした系を用いて発現したヒト由来ＡＨＲタンパク質とＡＲＮＴタンパク質を精製し、それぞれＰＢＳ緩衝液に溶解させ、２00μg/mlのAHRタンパク質と２00μg/mlのARNTタンパク質溶液を調整した。また、DRE配列（５’−ＴＮＧＣＧＴＧ−３’）を含む一本鎖DNA（５’−ＧＡＧＴＴＧＣＧＴＧＴＡＧＣＧＴＧＣＣＡ−３’）とそれに相補的な配列を有する一本鎖DNA（５’−ＴＧＧＣＡＣＧＣＴＡＣＡＣＧＣＡＡＣＴＣ−３’）を合成し、アニーリングにより２本鎖ＤＮＡを形成し、５’末端に、ビオチン化試薬（同仁化学研究所製）を用いてビオチン標識し、PBS緩衝液に溶解させ500μg/mlのビオチン化ＤＮＡ溶液を調製した。このＤＮＡ溶液をあらかじめストレプトアビジンが固定されているセンサーチップSA（ビアコア社製）に流速15μl/minで10分間展開し、ストレプトアビジンとビオチンの結合を介してARNTタンパク質をチップ上に固定した。これを測定キット（５）とした。
【００３１】
（２，３，７，８−TCDDの測定）
1pg/ml~1000ng/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDを含有する標準溶液を作成した。２００μg/mlのAHRタンパク質と２００μg/mlのARNTタンパク質を含む溶液１９０μlと標準溶液を１０μｌずつ混合後、SPR（Biacore 1000、ビアコア社製）に供した。すなわち、ARNTタンパク質を固定化した測定用チップにこの混合溶液を流速20μl/minで８分間展開した後、PBS緩衝液で１分間洗浄した。混合溶液展開開始点における共振シグナルを0とした時の、洗浄後の共振シグナルをレスポンスとした。測定結果を図５に示した。測定キット（５）では、0.１〜５００ｐg/mlの濃度の２，３，７，８−TCDDの測定が測定可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ARNTタンパク質を含む試薬と、固相上にAHRタンパク質を固定化したSPR測定用チップを用いたSPRによる検出を利用した２，３，７，８−TCDDの測定結果を示す図である。実施例１の測定結果を示している。
【図２】AHRタンパク質を含む試薬と、固相上にARNTタンパク質を固定化したSPR測定用チップを用いたSPRによる検出を利用した２，３，７，８−TCDDの測定結果を示す図である。実施例２の測定結果を示している。
【図３】AHRタンパク質とHSP９０タンパク質が複合体を形成しており、かつ、その複合体中のAHRタンパク質を固相上に固定化したSPR測定用チップと、試料希釈のための試薬を用いたSPRによる検出を利用した２，３，７，８−TCDDの測定結果を示す図である。実施例３の測定結果を示している。
【図４】AHRタンパク質とHSP９０タンパク質が複合体を形成しており、かつ、その複合体中のHSP90タンパク質を固相上に固定化したSPR測定用チップと、試料希釈のための試薬を用いたSPRによる検出を利用した２，３，７，８−TCDDの測定結果を示す図である。実施例４の測定結果を示している。
【図５】AHRタンパク質とARNTタンパク質を含む試薬と、固相上にAHRタンパク質とARNTタンパク質との複合体に特異的に結合するDNAを固定化したSPR測定用チップを用いたSPRによる検出を利用した２，３，７，８−TCDDの測定結果を示す図である。実施例５の測定結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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