(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＧＦ−β産生能を有する細胞からのＴＧＦ−β産生を抑制する作用を有するペプチドを提供する。【解決手段】特定の配列を含むペプチド及び該ペプチドをＴＧＦ−β産生抑制として含有する医薬組成物、育毛剤組成物、腎炎治療剤、肝硬変治療剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−β産生能を有する細胞からのＴＧＦ−β産生を抑制することを特徴とするペプチド。
【請求項２】
ＴＧＦ−β産生能を有する細胞がヒト毛乳頭細胞であることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ＴＧＦ−βシグナル受容能を有する細胞に対して増殖促進作用を有する請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１の配列からなるアミノ酸配列を少なくとも有する請求項１から３のいずれかに記載のペプチド
【請求項５】
配列番号２の配列からなるアミノ酸配列を有する請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする育毛剤組成物。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする腎炎治療剤。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする肝硬変治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−β産生能を有する細胞からのＴＧＦ−β産生を抑制するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−β（transforming growth factor−β）は細胞増殖促進作用または阻害作用、種々の細胞機能の促進作用または阻害作用、細胞外マトリックスの産生促進作用等、多くの活性を有するサイトカインであり、血管内皮細胞、肝細胞などの上皮細胞、毛乳頭細胞等さまざまな組織、細胞で産生されることが知られている。ＴＧＦ−βは種々の細胞で細胞外マトリックス産生促進作用を示すことから、糸球体腎炎、腎硬化症、肝線維症、肝硬変、肺線維症、骨髄線維症、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症等を引き起こす主原因と考えられ、ＴＧＦ−βの産生を抑制することにより、これら疾病の治療が可能になるものと考えられる。これまでにヒト由来細胞が産生するＴＧＦ−βの産生抑制効果を示すものとしては、網膜色素上皮細胞におけるインターフェロン（特許文献１参照）、腎臓のメサンギウム細胞におけるマクロライド化合物（特許文献２参照）、肝または肺由来細胞におけるメシル酸カモスタット等の各種化合物（特許文献３、特に式（Ｉ）の化合物参照）が知られている。また、ＴＧＦ−βはケラチノサイトの増殖や機能を抑制してアポトーシスを誘導することから脱毛にも深く関わっており、ＴＧＦ−βの産生抑制による育毛効果が期待できる。
【０００３】
社会環境の変化によるストレスや食生活の変化などが一因となり、近年薄毛や抜け毛、脱毛に悩む人が増加傾向にある。また、この傾向は、中高齢層から若年齢層にひろがりつつあることから、薄毛や抜け毛、脱毛の発症原因、メカニズムについての解明が求められている。最近では、毛生えのメカニズムについて研究がなされてきており、テストステロンからデヒドロテストステロンへの変換酵素５α−レダクターゼの阻害活性を特徴とするもの（特許文献４参照）、ＴＧＦ−βの作用抑制を特徴とするもの（特許文献５参照）等が育毛活性を有する素材として開発されてきている。しかし、これまでＴＧＦ−β産生抑制により育毛効果を示す物質は知られていなかった。
【特許文献１】特開平１０−１１４６７６号公報
【特許文献２】特開２００３−１３７７９１号公報
【特許文献３】特開平８−３３３２４９号公報
【特許文献４】特開２００３−２３８４３５号公報
【特許文献５】特開２０００−３４２２９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ＴＧＦ−β産生能を有する細胞からのＴＧＦ−β産生を抑制することを特徴とするペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＴＧＦ−β産生能を有する細胞を被験物質の存在下に培養し、生産されるＴＧＦ−βの産生量を測定することによってＴＧＦ−βの生産を抑制するペプチドを見出した。更に、ＴＧＦ−β産生能を有する細胞とＴＧＦ−βシグナル受容能を有する細胞とを被験物質の存在下培養(以下共培養と称す)し、ＴＧＦ−βの生産抑制効果を評価すると共にＴＧＦ−βシグナル受容能を有する細胞の増殖促進作用を評価することにより、ＴＧＦ−β生産抑制効果を示すと同時にＴＧＦ−βシグナル受容能を有する細胞の増殖促進作用を示すペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、ＴＧＦ−β産生能を有する細胞からのＴＧＦ−β産生を抑制することを特徴とするペプチドおよび該ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物、具体的には育毛剤組成物、腎炎治療剤及び肝硬変治療剤に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＴＧＦ−β産生能を有する細胞からのＴＧＦ−β産生を抑制することが可能となり、これを含む育毛剤組成物、腎炎治療剤及び肝硬変治療剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下本発明を詳細に説明する。本発明のＴＧＦ−β産生抑制ペプチドは、固相法、液相法等通常用いられるペプチドの合成方法により製造することが出来る。得られたペプチドは逆相シリカゲルカラム等を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいは分配、吸着樹脂、シリカゲル、アルミナ、イオン交換樹脂、ゲルろ過等のカラムクロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等により精製できる。ペプチドのアミノ酸配列はプロテインシークエンサーにより解析し、この方法により最終純度９０％以上の標品が得られる。
【０００９】
ＴＧＦ−β産生抑制効果を示すペプチド化合物としては、１７アミノ酸からなり、配列番号１記載の共通配列を有するペプチドであればよく、具体的には配列番号２〜７記載のペプチドを例示することができる。特に配列番号２又は３記載のペプチド化合物が好ましい。
Cys-Asn-Xaa-Gly-Xaa-Ser-Xaa-Asn-Ser-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Ser-Arg
（配列番号１：共通配列；Xaaは任意のアミノ酸を表す。）
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Asn-Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg（配列番号２：native17aa）
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Leu-Ser-Tyr-Asn-Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg（配列番号３：T6L）
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Thr-Ser-Phe-Asn-Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg（配列番号４：Y8F）
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Leu-Ser-Phe-Asn-Ser-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg（配列番号５：6mut）
Ala-Cys-Asn-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Asn-Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg（配列番号６：S1A）
Ser-Cys-Asn-Ala-Gly-Thr-Ser-Tyr-Asn-Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg（配列番号７：S4A）
これら配列番号２〜７記載のペプチドは、ＴＧＦ−β産生抑制効果を示すと共に共培養下で細胞増殖促進効果をも併せ持つ。
【００１０】
また一方で、配列番号２記載のペプチドのＮ末端から１０番目のSerをAlaに置き換えたペプチド（配列番号８）又は１３番目のSerをAlaに置き換えたペプチド（配列番号９）はＴＧＦ−β産生抑制効果が認められなくなることから、これらＮ末端から１０番目、１３番目のSer残基がＴＧＦ−β産生抑制効果に重要であることが判る。これら配列番号８および９のペプチドにはＴＧＦ−β産生抑制効果が認められないのみならず、共培養下で細胞増殖促進効果も認められない。
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Asn-Ala-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg（配列番号８：S10A）
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Asn-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Val-Ser-Arg（配列番号９：S13A）
更に、配列番号２記載のペプチドのＮ末端から６アミノ酸を削ったペプチド（配列番号１０）、配列番号２記載のペプチドのＮ末端から９アミノ酸を削ったペプチド（配列番号１１）、配列番号２記載のペプチドのＣ末端から７アミノ酸を削ったペプチド（配列番号１２）ではＴＧＦ−β産生抑制効果が認められなくなることから、配列番号２記載のペプチドのＮ末端から１０番目、１３番目のSer残基以外にもＮ末端側のアミノ酸配列が重要であることが明らかである。これら配列番号１０〜１２のペプチドにはＴＧＦ−β産生抑制効果が認められないのみならず、共培養下で細胞増殖促進効果も認められない。
Ser-Tyr-Asn-Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg
（配列番号１０：dN6）
Ser-Ile-Ser-Ser-Val-Val-Ser-Arg
（配列番号１１：dN9）
Ser-Cys-Asn-Ser-Gly-Thr-Ser-Tyr-Asn-Ser
（配列番号１２：dC7）
本発明にかかるＴＧＦ−β生産細胞に対するＴＧＦ−β産生の抑制作用を有するペプチドは、必要に応じて薬学的に許容される担体、希釈剤、製剤化のための賦型剤及び補助剤などとともに医薬組成物として提供できる。剤型としては、粒剤、粉剤などの固体状の医薬組成物、乳剤、注射剤、液注剤などの液状の医薬組成物、貼薬などの半固形剤など、所望に応じた剤型とすることができる。また、本発明にかかる医薬組成物の有効成分としてのペプチドは、ＴＧＦ−β生産細胞におけるＴＧＦ−β産生を制御する作用を有し、ＴＧＦ−β産生の抑制機能を有する化合物が、育毛剤、腎炎治療剤及び肝硬変治療剤として有用であることが知られていることから、これらの医薬の有効成分として利用できる。
【実施例】
【００１１】
以下に、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１２】
実施例１（ＴＧＦ−β高産生不死化ヒト由来毛乳頭細胞株の確立）
美容整形外科手術の副産物として得られた男性型脱毛の頭皮より毛乳頭細胞を単離し、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；日水製薬）に牛胎児血清（jrh Biociences）を終濃度１０％になるように添加し、さらに終濃度５０Ｕ／ｍＬのペニシリンＧと５０μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを加えた培地（以下増殖用培地と称す）を用いて３７℃にて５％ＣＯ2存在下で培養した（J. Investig. Dermatol. Symp. Proc.,Vo.8, 69-71, (2003)）。毛乳頭細胞を６ well plate（Costar）に５×１０5 cells/wellで播種し、ＳＶ４０のｏｒｉを欠失したプラスミドSV-ori-8-16（JCRB）を毛乳頭細胞に導入した。細胞導入の条件は、FuGene6（Roche）を用いて添付されたマニュアルに従って、１ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地に交換後、１μｇ／wellのSV-ori-8-16と３μＬ/wellのFuGene6を添加し、５時間処理した後、増殖用培地に戻した。導入して約２０日後にＳＶ４０のプラスミドを導入した細胞からやや小さめの増殖の早い細胞からなる増殖型コロニーが９個出現し、グラスリングを用いてクローニングを行った。最終的に、DP2-SV40-No.1、DP2-SV40-No.2、 DP2-SV40-No.5、 DP2-SV40-No.6、 DP2-SV40-No.7、 DP2-SV40-No.8、DP2-SV40-No.9の７個の不死化細胞を確立した。SV-ori-8-16を導入していない毛乳頭細胞は、継代１０代程度で増殖が止まったが、不死化毛乳頭細胞は１０代以降も増殖を続けた。不死化前の毛乳頭細胞の倍化時間は２週間程度であったが、不死化毛乳頭細胞の倍化時間は１．５日から３日と増殖速度が速くなっていた。
【００１３】
不死化毛乳頭細胞を単独培養した場合の、培養上清中のＴＧＦ−β1濃度を調べるため、不死化毛乳頭細胞を６wellプレートに５×１０5cells/wellで播種し３．５ｍＬ増殖培地で４日培養後、３．５ｍＬ無血清-ＤＭＥＭ培地交換し、２日後に培養上清を回収した。培養上清のＴＧＦ−β1濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D  Systems）を用いて添付のマニュアルの方法に従って測定した結果、DP2-SV40-No.1、DP2-SV40-No.2、 DP2-SV40-No.5、 DP2-SV40-No.6、 DP2-SV40-No.7、 DP2-SV40-No.8の細胞培養上清は不死化前の毛乳頭細胞に比べて７００ｐｇ／ｍＬ−１１００ｐｇ／ｍＬと高いＴＧＦ−β１産生が認められた。
【００１４】
実施例２（不死化毛乳頭細胞株における配列番号２記載ペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果）
取得した不死化毛乳頭細胞株（DP2-SV40-No.8）を６wellプレートに５×１０5cells/wellで播種し、３．５ｍＬ増殖培地で１日培養後、終濃度３０μＭの配列番号２記載のペプチドを含む３．５ｍＬ無血清-ＤＭＥＭ培地に交換し、更に５日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清のＴＧＦ−β1濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D  Systems）を用いて添付のマニュアルの方法に従って測定した。結果を図１に示す。配列番号２記載のペプチドは顕著なＴＧＦ−β１産生阻害効果を示した。
【００１５】
比較例１
終濃度３０μＭの配列番号２記載のペプチドを含まないこと以外は実施例２記載の方法と同様に実施した。結果を図１に示す。
【００１６】
実施例３
取得した不死化毛乳頭細胞株（DP2-SV40-No.8）を６wellプレートに５×１０5cells/wellで播種し、３．５ｍＬ増殖培地で１日培養した。また、ケラチノサイト細胞を６wellプレートに５×１０4cells/wellで播種し、３．５ｍＬ増殖培地で１日培養した。培養後、終濃度３０μＭの配列番号２〜７記載のペプチドから選ばれる１種を含む３．５ｍＬ無血清−ＤＭＥＭ培地で両細胞を更に５日間共培養した後に培養上清を回収した。培養上清のＴＧＦ−β1濃度は、ＥＬＩＳＡキット（R&D  Systems）を用いて添付のマニュアルの方法に従って測定した。配列番号２〜７記載の各ペプチドのＴＧＦ−β産生抑制効果を図２に示す。また、共培養後のケラチノサイト細胞の増殖を細胞数をカウントすることにより算出した。結果を図３に示す。
【００１７】
比較例２
終濃度３０μＭの配列番号２〜７記載のペプチドを含まないこと以外は実施例３記載の方法と同様に実施した。結果を図２、図３、図４および図５に示す。
【００１８】
実施例４
配列番号２〜７記載のペプチドの代わりに配列番号８〜１２記載のペプチドから選ばれる１種を含む無血清−ＤＭＥＭ培地で共培養した以外は実施例３記載の方法と同様に実施した。結果を図４および図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】不死化毛乳頭細胞における配列番号２記載のアミノ酸配列を有するペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果を示す図である。
【図２】不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号２〜７記載のアミノ酸配列を有するペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果を示す図である。
【図３】不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号２〜７記載のアミノ酸配列を有するペプチドのケラチノサイト細胞増殖促進効果を示す図である。
【図４】不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号２、８〜１２記載のアミノ酸配列を有するペプチドのＴＧＦ−β１産生抑制効果を示す図である。
【図５】不死化毛乳頭細胞とケラチノサイト細胞との共培養下における配列番号２、８〜１２記載のアミノ酸配列を有するペプチドのケラチノサイト細胞増殖促進効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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