(57)【要約】【課題】  カプセル化細胞を宿主に移植する方法を提供すること。【解決手段】  本発明の方法は、細胞を制限条件に十分な期間曝して、制限条件に応答する所望の細胞特性を確立する工程、およびカプセル化細胞を宿主に移植する工程を包含し、細胞特性は移植後、実質的に維持される。カプセル化細胞は、生物学的に活性な分子を産生する。これらの分子は、疾患または障害を予防または処置するに有用であるか、または宿主の代謝機能を提供、修復、または増強するに有用であり得る。本発明により生産される細胞はまた、インビトロでの適用、診断目的または他の目的に有用であり得る。制限条件に曝すことによって産生される細胞もまた、提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼に生物学的に活性な分子を送達するための方法であって、該方法は、該眼にカプセルを移植する工程を包含し、該カプセルは、生物学的に活性な分子の細胞供給源を含むコア、および周囲生体適合性被覆物を含有し、該被覆物は、該眼に、該生物学的に活性な分子を拡散させる、方法。
【請求項２】
前記被覆物は、透過選択性かつ免疫隔離性の膜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カプセルは、前記眼の房水または硝子体液中に移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カプセルは、中空ファイバーとして構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的に活性な分子は、神経伝達物質、鎮痛剤、および成長因子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被覆物は、半透膜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
眼に生物学的に活性な分子を送達するためのカプセル化細胞システムであって、該システムは、少なくとも１つのカプセルを含み、カプセルの各々は、生物学的に活性な分子の細胞供給源を含むコア、および周囲生体適合性被覆物を含有し、該被覆物は、該眼に生物学的に活性な分子を拡散させる、カプセル化細胞システム。
【請求項８】
前記被覆物は、透過選択性かつ免疫隔離性の膜を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記被覆物は、半透膜を含む、請求項７記載のシステム。
【請求項１０】
前記カプセルは、前記眼の硝子体液または房水中に移植される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
前記カプセルは、中空ファイバーとして構成される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１２】
前記生物学的に活性な分子は、神経伝達物質、鎮痛剤、および成長因子からなる群より選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項１３】
前記カプセルは、前記眼の構造に前記カプセルを固定するために適合されたつなぎをさらに含有する、請求項７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主への移植のためのカプセル化細胞の調製に関する。細胞は、インビボまたはインビトロのいずれかで１つ以上の制限条件に曝されることによって調製され、この制限条件は、制限条件に応答する所望の細胞特性を確立するのに十分な期間、所望の移植部位における条件に、さらに厳密に適合する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的に活性な分子を産生するカプセル化細胞は、宿主に移植された場合、多くの疾患または障害を予防または処置するか、または宿主における１つ以上の代謝機能を提供、修復、または増強するために使用され得る。
【０００３】
細胞をカプセル化する１つのアプローチは、「マイクロカプセル化」と呼ばれ、ここでは小球は細胞含有溶液の微小滴をカプセル化する（Ｓｅｆｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２９、１１３５−１１４３頁（１９８７）；Ｓｕｇａｍｏｒｉら、Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  ３５、７９１−７９９頁（１９８９））。
【０００４】
細胞をカプセル化するための別のアプローチは、「マクロカプセル化」であり、熱可塑性のカプセル内に複数の細胞をカプセル化する工程を包含する。代表的に、これは、細胞を中空ファイバー内に導入し、次いで末端をシールすることによって達成される。種々のタイプのマクロカプセルが当該分野において公知である。特に、Ｄｉｏｎｎｅら（ＷＯ９２／１９１９５）は、マトリックス内に分散された細胞および半透過性の表面被覆物を有するマクロカプセルについて述べており、そしてこれは本明細書中において参考として援用する。Ａｅｂｉｓｃｈｅｒの米国特許第５，１５８，８８１号、同第５，２８３，１８７号および同第５，２８４，７６１号もまた参照のこと。これらは、ポリマー溶液と細胞懸濁液とを同時成形することによって形成される細胞カプセルについて述べている。
【０００５】
代表的に、カプセル化および移植に用いられる細胞を、組織（主に細胞）から直接単離する場合、それらを分散させ、洗浄し、次いでカプセル化する。例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ，３２、１３４−７頁（１９８６）；Ａｌｔｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３５、６２５−３３頁（１９８６）；Ｃｈａｎｇら、米国特許第５，０８４，３５０号；ＤａｒｑｕａｙおよびＲｅａｃｈ、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２８、７７６−８０頁（１９８５）；ＳｕｇａｍｏｒｉおよびＳｅｆｔｏｎ；Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ，３５、７９１−９頁（１９８９）を参照のこと。
【０００６】
不死化された細胞または細胞株をカプセル化し、そして移植しようとする場合、それらは、代表的に栄養富化培地から単離される。例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１２、５０−５５頁（１９８１）；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１１１、２６９−７５頁（１９８１）（ドーパミン分泌ＰＣ１２細胞）、およびＷａｒｄら、ＷＯ９３／２２４２７（ＩｇＧ分泌ＭＯＰＣ−３１Ｃ細胞）を参照のこと。
【０００７】
カプセル化細胞は、通常インビトロでインキュベートされ、そして移植前に機能的に特徴付けされる。カプセル化細胞は、この前移植段階の間、定められた培地中でしばしば培養される。多くの場合、培地は、栄養添加物を含まない平衡化塩溶液である（例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ、上記；Ａｌｔｍａｎ、上記；Ｃｈａｎｇら、上記）。あるいは、カプセル化細胞は、種々のアミノ酸、ビタミン、無機塩、およびグルコース（２ｇ／Ｌ；１１．１１  ｍＭ）を含み（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、ＰｏｌｌａｒｄおよびＷａｌｋｅｒ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、６９６−７００頁（１９９０））、そして代表的に５％〜１５％の仔ウシ血清またはウマ血清を補充したＰＲＭＩ  １６４０のような栄養培地中でインキュベートされる。
【０００８】
カプセル化され、そして宿主に移植される細胞は、インビトロの条件に比べて、少なくとも２回の重要な栄養条件の変化を受けなければならない。第１の変化は、カプセル化の際に生じる。
【０００９】
インビトロの条件に比べて、カプセル化環境内の細胞は、栄養が涸渇される。この涸渇は２つの様式で出現する。外部環境とカプセル内部との間には栄養勾配があり、これは膜を界にして自然に形成される。この勾配はさらに増大される。なぜなら、分子は、宿主組織の外側とカプセル内部の各位置での細胞との間を自由に拡散しないからである。カプセル表面により近い細胞は、カプセル被覆物を横切って拡散する栄養素に優先的に接近する。さらに、カプセル表面に近い細胞の老廃物ほど、より迅速に排出される。
【００１０】
栄養素（例えば、酸素およびグルコース）濃度の第２の重要な変化は、宿主への移植の際に生じる。これは、インビトロの酸素レベルおよび少なくともいくつかの他の栄養素レベルが、一般にインビボで生じるよりもかなり高いからである。従って、これらの分子のカプセル内への拡散に対する駆動力は、インビボで減少される。
【００１１】
これらの栄養環境の変化は、１つ以上の細胞特性の変化を生じ得る。例えば、細胞死または細胞の生存期間の減少が生じ得る。さらに、移植の際の環境条件の変化もまた、残りのカプセル化生存細胞の他の特性（例えば、細胞増殖速度、または生物学的活性分子を産生する細胞の能力）に影響し得る。細胞の別個のサブ集団の増殖速度の変化は、より早く増殖するサブ集団の細胞によるカプセルの奪取を生じ得、カプセル産出の特徴の見かけ上のシフトまたは他の潜在的に所望しない影響を潜在的に引き起こす。
【００１２】
インビボ移植条件とインビトロ条件との間の１つの重要な差異は、培養細胞に適応されるグルコース濃度である。組織培養の条件と移植部位での条件との間の別の差異は、細胞に利用可能な酸素の量である。他の栄養素は、培養培地の有意に異なる濃度で、そして所定の移植部位で存在し得る。
【００１３】
代謝が高度に活性な細胞または組織は、栄養素および酸素の欠乏（低酸素症）の影響を特に受けやすい。同様に、密集した毛細管床によって通常支持され、それ故、インビボで高酸素レベルおよび高栄養素レベルで増殖するように馴化される多くの内分泌組織は、このような挙動を示す；膵臓のランゲルハンス島および副腎のクロム親和性細胞は、特に低酸素症ショックに感受性である。
【００１４】
酸素圧および栄養素ストレスの変化が、多様な細胞機能に影響する極めて多くの遺伝子の発現を変えることが知られている。このような変化は、一定のｍＲＮＡの安定性および機能に影響し得る。例えば、チロシンヒドロキシラーゼのｍＲＮＡは、ドーパミン産生の工程を制限する速度を触媒する酵素をコードするが、これは栄養素のストレスの影響を受け得る。
【００１５】
さらに、種々の熱ショック遺伝子、および中間代謝物に関与する酵素（例えば、解糖経路および糖新生経路）と同様の代謝酵素の発現は、低グルコースレベルまたは低アミノ酸レベルの影響を受け得る。
【００１６】
重要なことに、酸素が奪われている高度に分化した細胞タイプは、細胞が低酸素症ショックから回復するまで、その組織特異的機能を消失し得る［例えば、ＷｏｌｆｆｅおよびＴａｔａ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７６，８−１５頁（１９８４）を参照のこと］。消失または減少した機能は、タンパク質の合成および改変を包含する。これは、極めて治療的な因子の産生および分泌に影響し得、細胞はこれらの因子を周囲の宿主組織に供給するように意図される。さらに、低酸素症の症状は、場合によって、悪性の形質転換を引き起こし得る（例えば、Ｈ．Ｇｏｌｄｂｌａｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７、２４１−５２頁（１９７３）を参照のこと）。
【特許文献１】ＷＯ９２／１９１９５
【特許文献２】米国特許第５，１５８，８８１号
【特許文献３】米国特許第５，２８３，１８７号
【特許文献４】米国特許第５，２８４，７６１号
【特許文献５】米国特許第５，０８４，３５０号
【特許文献６】ＷＯ９３／２２４２７
【非特許文献１】Ｓｅｆｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２９、１１３５−１１４３頁（１９８７）
【非特許文献２】Ｓｕｇａｍｏｒｉら、Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  ３５、７９１−７９９頁（１９８９）
【非特許文献３】Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ，３２、１３４−７頁（１９８６）
【非特許文献４】Ａｌｔｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３５、６２５−３３頁（１９８６）
【非特許文献５】ＤａｒｑｕａｙおよびＲｅａｃｈ、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２８、７７６−８０頁（１９８５）
【非特許文献６】ＳｕｇａｍｏｒｉおよびＳｅｆｔｏｎ；Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．  Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ，３５、７９１−９頁（１９８９）
【非特許文献７】Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１２、５０−５５頁（１９８１）
【非特許文献８】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１１１、２６９−７５頁（１９８１）
【非特許文献９】Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、ＰｏｌｌａｒｄおよびＷａｌｋｅｒ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、６９６−７００頁（１９９０）
【非特許文献１０】ＷｏｌｆｆｅおよびＴａｔａ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７６，  ８−１５頁（１９８４）
【非特許文献１１】Ｈ．Ｇｏｌｄｂｌａｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７、２４１−５２頁（１９７３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
以下の工程を包含する移植の方法の開発が所望される：移植前に、細胞を１つ以上の制限条件に曝すかまたは馴化させ、移植の際の環境条件の変化の影響から生じる細胞特性の変化を減少し、それ故、宿主に対する任意の有害な結果を減少する工程。そのように調製される細胞の細胞株の開発もまた所望される。インビボ環境の変化を受けている細胞のエクソビボ研究のための手段を提供することもまた所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、カプセル化細胞を宿主に移植する方法に関し、以下の工程を包含する：細胞を、インビトロまたはインビボのいずれかで、１つ以上の制限条件に十分な期間曝し、宿主の移植部位での移植の前に、制限条件に応答した所望の細胞特性を確立する工程。好ましくは、移植後、本発明の方法によって確立された細胞特性は実質的に維持される。カプセル化細胞は、生物学的に活性な分子を産生する。これらの分子は、疾患または障害を予防または処置するに有用であるか、または宿主の代謝機能を提供、修復、または増強するに有用であり得る。本発明により生産される細胞はまた、インビトロでの適用、診断目的または他の目的に有用であり得る。
【００１９】
従って、１つの局面において、本発明は、宿主に細胞を移植する方法であって：
（ａ）該細胞を生体適合性カプセルにカプセル化する工程、
（ｂ）該細胞を１つ以上の制限条件に十分な期間曝して、制限条件（１つまたは複数）に応答する所望の細胞特性を確立する工程、および
（ｃ）該カプセル化細胞を宿主の移植部位で移植する工程であって、該細胞が移植後実質的に維持される、工程、
を包含する、方法、を提供する。
【００２０】
１つの実施形態において、前記カプセル化細胞は、インビトロで制限条件（１つまたは複数）に曝される。
【００２１】
別の実施形態において、前記カプセル化細胞は、レピシエントの移植部位で移植することによって、インビボで制限条件（１つまたは複数）に曝される。
【００２２】
別の実施形態において、前記細胞は、前記宿主に対して異種であり、そして前記カプセルは、免疫隔離性である。
【００２３】
別の実施形態において、少なくとも１つの制限条件は、約４０ｍｇ／デシリットルから約７０ｍｇ／デシリットルまでの範囲のグルコース濃度である。
【００２４】
別の実施形態において、少なくとも１つの制限条件は、約４０ｍｍＨｇから約６５ｍｍＨｇまでの範囲の酸素濃度である。
【００２５】
別の実施形態において、少なくとも１つの制限条件は、脳脊髄液または脳実質内の生理ドーパンミン濃度未満のドーパミン濃度である。
【００２６】
好ましい実施形態において、前記細胞は、副腎のクロム親和性細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびＰＣ１２細胞からなる群より選択される。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、前記細胞は、ＰＣ１２細胞であって、そして６ヶ月間以上レピシエントに移植される。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、前記細胞は、副腎のクロム親和性細胞であって、そして４ヶ月間以上レピシエントに移植される。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、前記細胞は、ＰＣ１２細胞であって、そして３週間以上レピシエントに移植される。
【００３０】
別の実施形態において、前記細胞は、神経伝達物質、鎮痛剤、および成長因子からなる群より選択される生物学的に活性な分子を産生する。
【００３１】
好ましい実施形態において、前記生物学的に活性な分子は、少なくとも１種のカテコールアミンである。
【００３２】
別の実施形態において、前記カプセルは、脳脊髄液および脳実質からなる群より選択される移植部位で、宿主に移植される。
【００３３】
別の実施形態において、前記宿主は、ヒトである。
【００３４】
別の局面において、本発明は、制限条件に応答する所望の細胞特性を示す細胞であって、
（ａ）細胞を生体適合性カプセルにカプセル化する工程、および
（ｂ）該カプセル化細胞を霊長類レピシエントの移植部位で少なくとも６ヶ月間移植して、移植部位で起こる制限条件に応答する所望の細胞特性を確立する工程であって、該細胞がレピシエントに対して異種である、工程、
によって生産される、細胞、を提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、前記細胞は、非霊長類の副腎クロム親和性細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびＰＣ１２細胞からなる群より選択される。
【００３６】
好ましい実施形態において、前記細胞は、非霊長類の副腎クロム親和性細胞である。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、前記細胞は、ＰＣ１２細胞である。
【００３８】
さらに好ましい実施形態において、前記所望の細胞特性は、前記細胞のカテコールアミン産出量の変化である。
【００３９】
さらに好ましい実施形態において、前記所望の細胞特性は、前記細胞のカテコールアミン産出量の増加である。
【００４０】
別の実施形態において、前記カプセルは、脳脊髄液および脳実質からなる群より選択される移植部位で移植される。
【００４１】
別の実施形態において、前記宿主は、ヒトである。
【００４２】
別の局面において、本発明は、異種宿主に細胞を移植する方法であって：
（ａ）２つ以上の制限条件下で該細胞を培養する工程、
（ｂ）該細胞を生体適合性カプセルにカプセル化し、さらに該カプセル化細胞を１つ以上の制限条件に十分な期間曝して、制限条件に応答する所望の細胞特性を確立する工程、および
（ｃ）宿主の移植部位で該カプセル化細胞を移植する工程であって、該細胞特性が移植後実質的に維持される、工程、
を包含する、方法、を提供する。
【００４３】
本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明に記載されている。
【発明の効果】
【００４４】
種々の疾患または障害を予防または処置するに有用であるか、または宿主の代謝機能を提供、修復、または増強するに有用カプセル化細胞を宿主に移植する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
（発明の詳細な説明）
「細胞特性」は、測定され得る任意の表現型特性を包含し、細胞生存率、増殖速度、および生物学的に活性な分子の細胞生産を含む。所望の細胞特性は、制限条件に対する応答における１つ以上の生物学的に活性な分子の産生レベルの変化、または２つの生物学的に活性な分子の産出比の変化を言及し得る。さらに、所望の細胞特性は、制限条件に対する応答における生物学的に活性な分子の産生の安定性にまで言及し得る。
【００４６】
用語「制限条件」は、細胞が通常または必要に応じてインビトロで培養される１つ以上の条件が改変され、所望の宿主移植部位にて実際のまたは予想されるインビボでの条件により厳密に適合することを意味する。
【００４７】
「生物学的に活性な分子」は、（ａ）この分子が生成される細胞内で機能し得るか（例えば、アポトーシスを防ぐためのｂｃｌ−２）、（ｂ）細胞表面上で発現されて、他の細胞または生物学的に活性な分子（例えば、神経伝達物質のレセプターまたは細胞接着分子）との細胞相互作用に影響し得るか、あるいは（ｃ）この分子が生成される細胞から放出または分泌されて、遠隔の標的細胞に対してその効果を発揮し得る（例えば、神経伝達物質、ホルモン、成長因子、サイトカイン、または細胞内もしくは細胞間シグナル伝達の他のトランスデューサー）。生物学的に活性な分子は、宿主における疾患または障害の処置または予防に有用であり得るか、あるいは宿主における１つ以上の代謝機能を提供、修復、または増強し得る。
【００４８】
用語「宿主」または「レシピエント」は、適切な動物被験体をいい、哺乳動物、特にヒト被験体を包含する。用語「レシピエント」は、細胞が所望の細胞特性を示すように、細胞が１つ以上の制限条件に曝される動物をいう。用語「宿主」は、カプセル化細胞が所望の細胞特性を示す動物が移植されることをいう。
【００４９】
用語「細胞」は、任意の形態の細胞をいい、組織内に保持される細胞、細胞クラスター、および個別に単離された細胞を包含するがこれらに限定されない。本発明における細胞は、生物学的に活性な分子を産生する。細胞は、初代細胞または分裂細胞であり得、生物学的に活性な分子を自然に産生するか、またはそのように遺伝子操作されている。
【００５０】
「生体適合性カプセル」は、宿主哺乳動物への移植の際に、カプセルが、カプセルの機能に有害に影響するかまたはカプセルの機能を作動不能にするに十分な宿主の応答を引き出さないことを意味する。このような作動不能性は、例えば、カプセルの回りの線維（ｆｉｂｒｏｓｔｉｃ）構造の形成によって起こり、線維構造内の細胞への栄養素の拡散を制限する生じ得る。有害な影響はまた、カプセルの拒絶、またはカプセルからの毒性化合物もしくは発熱性化合物（例えば、合成ポリマー副生物）の周辺宿主組織への放出を包含し得る。
【００５１】
「免疫隔離性（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｏｒｙ）カプセル」は、カプセルが長期間インビボで機能するように、哺乳動物宿主への移植の際にカプセルが、カプセルコア内の細胞に対する宿主免疫系の有害な影響を最小にすることを意味する。
【００５２】
用語「ヒドロゲル」は、三次元網目構造の架橋親水性ポリマーを意味する。網目構造は、実質的に水から構成されるゲル（好ましくは９０％より多くが水であるゲルであるがこれに限定されない）の形態にある。架橋ヒドロゲルはまた、固体も考えられ得る。なぜなら、ヒドロゲルは、かなりの剪断ストレスが適用されない限り、流動も変形もしないからである。
【００５３】
１つの実施態様において、細胞は生体適合性カプセル内にカプセル化され、そして宿主における移植部位での移植前にインビトロで１つ以上の制限条件に曝される。細胞は、制限条件（１つまたは複数）に十分な期間曝され、制限条件に応答する所望の細胞特性を確立する。好ましくは、宿主における移植部位でのカプセル化細胞の移植後も、細胞特性は実質的に維持される。
【００５４】
意図される制限条件は、以下の１つ以上の改変を包含する：
温度、ｐＨ、または気圧、あるいは有効濃度の１つ以上の代謝物またはコファクター（糖、アルコール、カルボン酸、アミノ酸、脂肪酸、核酸、ガス、金属イオン、または細胞の増殖、機能もしくは生存率に起因する他の生物学的因子を含むが、これらに限定されない）の改変を包含し、その結果この改変は、所望の移植部位でインビボ条件にさらに厳密に適合する。さらに、制限条件はまた、１つ以上の生物学的に活性な分子の有効濃度を改変し得る。これらの分子は、ホルモン、成長因子、神経伝達物質、サイトカイン、または細胞内または細胞間シグナル伝達に関係する他の生物学的に活性な因子を包含するがこれらに限定されない。
【００５５】
いくつかの栄養素および生物学的に活性な因子は、通常インビトロで起こるよりも低いインビボ濃度で存在し得る。あるいは、いくつかの栄養素および生物学的に活性な因子は、通常インビトロで起こるよりも高いインビボ濃度で存在し得る。
【００５６】
さらに、本発明によって意図される制限条件は、インビボまたはインビトロのいずれかでカプセル化細胞を、選択された移植部位由来の標的細胞に曝して、カプセル化細胞内に所望の細胞特性を生成することを包含する。例えば、ＷａｉｎｅｒおよびＨｅｌｌｅｒ、「神経ハイブリッド細胞株：作製、特徴付けおよび有用性」、Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ，Ｊ．Ｗｏｏｄ［編］、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．、２０頁（１９９２）を参照のこと。
【００５７】
任意の適切な培養培地が、本発明の方法とともに使用され得る。当業者の１人は、所定の最小組織培養培地を改変して、所望の濃度の栄養素または重要ガス、あるいは所望の移植部位を特徴付ける他の制限条件を達成し得る。
【００５８】
細胞がインビトロで制限条件に曝される場合、培養条件は徐々に、そして継続的に改変され得るか、または１つ以上の工程の変化により改変されて、所望の制限条件が達成され得る。
【００５９】
好ましい実施態様において、選択された移植部位でレシピエントに細胞を移植することによって、細胞はインビボで１つ以上の制限条件に曝される。選択された移植部位近傍の分子環境は、その部位で移植されそして馴化された細胞の特性に影響し得る。例えば、１つ以上の生物学的に活性な因子（例えば、ホルモン、成長因子、神経伝達物質またはサイトカイン）の濃度は、移植された細胞がその部位での生存のための遺伝子発現プロフィールを適応することによって増殖し、馴化するか、または所望の治療因子を産生する能力に影響し得る。一旦、細胞がインビボで制限条件に十分な時間曝されて所望の細胞特性を示すと、細胞は回収され、そして宿主に移植され得る。
【００６０】
本発明者らは、インビボでの制限条件への曝露を所望する。なぜなら、細胞により示される所望の標的細胞特性は、すべての細胞表現型特性を同時に制限条件に調整することによって確立される。対照的に、インビトロでの制限条件への馴化または曝露により、いくつかの所望の細胞特性の確立を生じ得る。しかし、これらの細胞を宿主に移植する場合、他の細胞特性も変更され得、そして確立された所望の標的細胞特性（１つまたは複数）に影響し得る。
【００６１】
好ましくは、レシピエントおよび宿主は両方とも霊長類であり、最も好ましくは、宿主はヒトである。好ましくは、宿主の移植部位はレシピエントの部位と同一である。
【００６２】
本実施態様に従ってインビボで調製される細胞はまた、１つ以上の制限条件下で維持され得、そして診断または他の目的でインビトロで使用され得る。
【００６３】
別の実施態様において、カプセル化前に、細胞はインビトロで複数の制限条件に曝される。好ましくは、次いで細胞はカプセル化され、そして宿主への移植前にさらなる制限条件に曝される。カプセル化前に１つ以上の制限条件に曝すと、初代集団から生存細胞を選択し得、そしてそれらの細胞のみをカプセル化し得る。使用される細胞が有糸分裂後の細胞、またはそうでなければ非分裂細胞である場合、細胞は、それらの見かけの健康状態および表現型に基づき、好ましくは所望の生物学的に活性な分子の産生によって測定されるように、初代集団から選択され得る。使用される細胞が活発に分裂している細胞である場合、生存細胞は代表的に初代集団よりさらに増殖する。
【００６４】
制限条件に応答する所望の細胞特性を確立するのに十分な時間は、使用される細胞ならびに制限条件に従って変化する。代表的に、細胞は初めて制限条件（１つまたは複数）に曝されるトランジションの期間を受け、その間細胞特性が制限条件に応答して確立するまで細胞の表現型は継続して変化する。トランジションに要する時間は、日常の実験によって決定され得る。
【００６５】
好ましい実施態様において、神経成長因子（ＮＧＦ）を分泌するように遺伝子操作されたベビーハムスターの腎細胞（ＢＨＫ細胞）は、コラーゲン／Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）マトリックス内に懸濁され、そして末端をシールされた中空の半透過性ファイバー内にカプセル化される。このようなＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞の調製については、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９に記載されており、本明細書中に参考として援用されている。カプセルはインビトロで低酸素および低グルコース条件に馴化され、そしてカプセルから放出されるＮＧＦの量が、インビトロ馴化時間の関数としてアッセイされる。カプセル当たりのＮＧＦ産生速度は、インビトロの馴化時間とともに増加する（図１）。
【００６６】
別の好ましい実施態様において、カプセル化ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞は宿主の側脳室に移植され、そしてインビボで馴化される。カプセルを外植し、馴化細胞を取り出し、そして継代を繰り返すことによって増殖させ、次いでインビボ馴化細胞をレピシエントへの移植するために再カプセル化する。非馴化細胞またはインビボ馴化細胞を有するカプセルを、再移植前およびレピシエントへの再移植後の種々の時間で、ＮＧＦ放出についてアッセイする（図１１）。
【００６７】
別の好ましい実施態様において、シングルスキン半透過性膜にカプセル化されたＰＣ１２細胞を、霊長類の脳内でインビボ制限条件に６ヶ月間曝す。６ヶ月の移植期間後、細胞は制限条件に応答する所望の細胞特性を示す（すなわち、細胞は、Ｌ−ドーパのドーパミンに対する基礎放出比によって測定されるように、神経伝達物質産生の変化、ならびに移植前のレベルと比較した他のカテコールアミンの相対的産出量の変化を示す）（図７）。
【００６８】
別の好ましい実施態様において、ＰＣ１２細胞はカプセル化され、そして正常なドーパミンレベルを有するか、または予め６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の投与により誘導され、単系的に減少されるドーパミンレベルを有するかのいずれかである黒質脳領域中、インビボで馴化される。２８日間または６０日間インビボで馴化されたＰＣ１２細胞は、より短期間馴化された細胞よりも高いレベルのＬ−ドーパを産生する。正常ドーパミンレベルの存在下、インビボで馴化された細胞は、レピシエントに再移植される場合、ドーパミンレベルの減少を伴う６−ＯＨＤＡ損傷黒質において馴化された細胞が再移植される場合よりも、ドーパミンに対してより高い割合のＬ−ドーパを産生する（図９）。
【００６９】
別の実施態様において、ダブルスキン半透過性膜にカプセル化された副腎のクロム親和性細胞を、ヒトにおいてクモ膜下腔内でインビボ制限条件に５５日間および８４日間曝す。移植期間後、細胞は神経伝達物質の産生の変化を示した。
【００７０】
多くの異なる移植部位が意図される。これらの移植部位は、中枢神経系を含み、これは、脳ならびに眼の房水および硝子体液を含む。脳内の好ましい部位は、線条、大脳皮質、視床下核、およびマイネルトの基底神経節（ｎｕｃｌｅｕｓ  Ｂａｓａｌｉｓ  Ｍｅｙｎｅｒｔ）を含む。他の好ましい部位は、脳脊髄液であり、最も好ましくはクモ膜下腔および側脳室である。本発明はまた、腎被膜下部位、および腹腔内部位および皮下部位、または他の任意の治療上有益な部位への移植を意図する。
【００７１】
いくつかの場合において、至適環境を作製するためにインビボ馴化の前または同時に移植部位を改変することは、有益であり得る。例えば、パーキンソン病の公知のモデルは、脳黒質内の６−ヒドロキシドーパミンの投与を包含する。この毒物は、ドーパミン作用性ニューロンに対して選択的である。細胞は、この損傷領域に移植され得、そして馴化され得る。ＰＣ１２細胞（このような損傷脳への移植の場合カテコールアミンを分泌する）は、インビボで約１ヶ月後にカテコールアミン産出量の全体的な増加を示す。さらにインビボで約１４日後、カテコールアミン種の割合は、ドーパミンに対する基礎Ｌ−ドーパの割合の減少を伴って変化する。
【００７２】
局部環境は、移植部位間で、および異なる種間で変化する。所定の移植部位の局部環境は、同一種の個体間で変化する。一般に、所定の移植部位に存在する代謝物およびガス濃度は、公表されている情報から概算され得るか、または不適切な実験でなければ、当業者によって決定され得る。
【００７３】
例えば、ヒトにおいて、体内の代表的な酸素分圧は、動脈血中の約９０ｍｍＨｇから運動時の筋肉組織中の１ｍｍＨｇ未満までの範囲にあることが知られている。他の代表的な酸素分圧は：静脈血（４０ｍｍＨｇ）、腹膜腔（４７ｍｍＨｇ）、および脳脊髄液（５９ｍｍＨｇ）である。
【００７４】
同様に、代表的なグルコース値は、血液が供給される組織において８０〜１２０ｍｇ／デシリットル（４．４〜６．７ｍＭ）、および脳脊髄液（ＣＳＦ）において４０〜７０ｍｇ／デシリットル（２．２〜３．９ｍＭ）の範囲にある［Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ、第Ｉ巻、測定の単位、体液、身体の組成、栄養素、第８版、Ｃ．Ｌｅｎｔｎｅｒ編、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ、１９８４を参照のこと］。これらの例および他のこのような例は、Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓにおいて見出され得、本明細書中に参考として援用される。表Ｉは、血清およびＣＳＦ中に存在する多くの化合物の濃度の比較である。
【００７５】
【表１】
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グルコース、アミノ酸、乳酸、およびリボ核酸を包含する分子は、血液−脳関門を通過してＣＳＦに輸送され、脳室、クモ膜下腔、および脊柱管のようなＣＳＦに浸された領域に供給される。ガラクトース濃度は、ＣＦＳ中では典型的に血清中より１０倍高く、そしてピルビン酸および乳酸は、ＣＳＦ中では血清中より濃度が高い。対照的に、ほとんどのアミノ酸は、血液中ではＣＳＦ中よりも５〜３０倍濃度が高い（Ｇｅｉｇｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ、第Ｉ巻、上記、１６９頁）。
【００７６】
他の「微量栄養素」物質（例えば、ビタミンＣ、葉酸塩類（ビタミンＢ複合体の要素）、デオキシリボヌクレオチド、およびピリドキシン（ビタミンＢ６））は、血液−脳関門を通過してＣＳＦに能動的に輸送される。さらに、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびクロリドのようなイオンの濃度は、ＣＳＦにおいて厳密に調節される（ＳｐｅｃｔｏｒおよびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，６８−７４頁（１９８９年１１月））。
【００７７】
培養培地に存在する代謝物は、代表的に、組織培養中の細胞の増殖および生存率を最適化するために選択される。これらの化合物の濃度は、所定の移植部位に存在する濃度とは異なる。細胞は、しばしば、所望の移植部位で見出される濃度よりも高い塩およびグルコースの濃度で増殖させられる。例えば、ＲＰＭＩ  １６４０培地は１１．１  ｍＭのグルコースを含有するのに対して、グルコースレベルは血清では約４．５  ｍＭであり、そしてＣＳＦでは２．２〜３．９  ｍＭに過ぎない。
【００７８】
同様に、ＲＰＭＩ  １６４０中のカルシウムレベルは０．４２  ｍＭであるのに対して、ＣＳＦ中のカルシウムレベルは１．２  ｍＭであり、そして血清中のカルシウムレベルは２．４４  ｍＭである（表１）。また、亜鉛イオンは、ＣＳＦには０．５μＭ、血清には１６．７μＭで存在し、そしてＲＰＭＩ  １６４０培地には存在しない。
【００７９】
さらに、ほとんどの細胞は、インビトロで室内酸素レベル（１４２  ｍｍＨｇ）で、または室内の加湿された空気および５％〜７％のＣＯ２を有するインキュベーターで培養される（例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｂｉｏ−ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  上記；Ｗａｒｄら、上記）。これは、宿主の選択された移植部位にインビボで存在する酸素濃度よりも有意に高いことがあり得る。
【００８０】
さらに、全ての組織培養培地は、インビボで存在する寿命の短い分子を欠いている。これらの寿命の短い分子は、迅速に分解し、そしてインビボで絶えず合成されるかまたは補充される。いくつかの培養培地が、熱で不活性化したウシ胎児血清または馬血清を補充し、いくつかの物質を置換するが、寿命の短い分子もまた、一般に血清には少ないかまたは存在しない。血清を補充する場合、代表的には、全培地の２０％未満は血清であり、それにより、これらの分子は、血清に見出される濃度のよくても僅か１／５の濃度で存在する。さらに、血清を補充した培養培地は、不調和性宿主（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｈｏｓｔ）には生じない分子を含有し、そしてカプセル化細胞に好ましくない効果を有し得る分子を含有し得る。最後に、ほとんどの成分の血清濃度がそれらの間質液中の濃度を反映するが、特定の物質の濃度は、血清と間質液との間で有意に異なり得る。
【００８１】
本発明で使用される細胞は、宿主と同種異系（すなわち、宿主と同一の種に由来する）または宿主とは異種（すなわち、異なる種に由来する）であり得る。本発明者らは、異種宿主に細胞を移植することを好む。異種宿主で移植用の細胞を調製することは、同種宿主に比べて異なる制限条件を包含し得ること、および異なる細胞特性を有する表現型の異なる細胞集団を産生し得ることが理解される。
【００８２】
細胞は、ドナー（すなわち、初代細胞または組織（成人、新生児および胎児の細胞または組織を含む）、またはインビトロで複製する細胞（例えば、遺伝的に改変された細胞を含む、不死化細胞または細胞株）のいずれかにより調製され得る。
【００８３】
初代細胞は、非分裂（有糸分裂後）の正常組織から、自然分裂（有糸分裂）細胞（例えば、肝臓中の細胞）から、または脾臓および骨髄細胞のような多分化能幹細胞から由来し得る。インビボで得られた有糸分裂活性な細胞は、ガン細胞（腫瘍細胞）からも由来し得る。
【００８４】
本発明に従って使用される初代細胞は、哺乳類のＣＮＳ由来の増殖因子応答性の神経始原幹細胞［ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，１７０７−１０頁（１９９２）；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，８５９１−９５頁，（１９９２）；Ｒａｙら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，３６０２−０６頁，（１９９３）］、初代線維芽細胞、シュワン細胞、神経膠星状細胞、β−ＴＣ細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞、ＡＴＴ２０細胞、寡突起膠細胞およびそれらの前駆体、筋芽細胞、筋管、副腎髄質の副腎クロム親和性細胞または組織を含む。本発明者らは、神経幹細胞および副腎クロム親和性細胞を好む。
【００８５】
シュワン細胞もまた好適であり、これは、Ｂｕｎｇｅの方法に従って調製され得る（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０３５３６号）。カプセル化シュワン細胞は脳の適切な領域に移植されて、パーキンソン病に関連する黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンの変性を防ぎ得る。一般には、好ましい移植部位がこの線条内またはその付近にある。細胞をカプセル化することにより、栄養性因子の分泌を促進し得る。なぜなら、細胞は、ニューロンと近接せず、そしてミエリン形成は生じないからである。神経膠星状細胞および寡突起膠細胞を含む他のグリア細胞タイプは、この目的ためにカプセル化および移植され得る。
【００８６】
選択された生成物を産生する細胞または組織を単離する技術は公知であるか、または公知の手順から適応され得る。例えば、ランゲルハンス島は、Ｓｃｈａｒｐらの米国特許第４，８６８．１２１号に記載のように、機械的拡張およびコラゲナーゼ消化の組み合せを用いて大型動物（例えば、ヒトまたはブタ）の膵臓から単離され得る。島は、Ｓｃｈａｒｐら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２９，増刊１，１９−３０頁（１９８０）の方法により、ラットのような小型動物から単離され得る。
【００８７】
同様に、肝細胞は、Ｓｕｎら、Ｂｉｏｍａｔ．Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ．，１５，４８３−４９６頁（１９８７）に記載のように、組織分画後のコラゲナーゼ消化を用いて肝組織から単離され得る。副腎クロム親和性細胞は、公知の方法により単離され得る［Ｌｉｂｅｔｔ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６４，１１０３−６１頁（１９８４）；Ｓａｇｅｎら、米国特許第４，７５３，６３５号］。
【００８８】
不死化された細胞は、初代供給源から得られるか、またはウイルス、ウイルス遺伝子産物、ガン遺伝子、あるいは他の不死化遺伝子または他の遺伝子産物で形質転換された細胞から選択され得る。公共機関から入手できる、本発明の実施に適切な細胞株の例は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞（Ｌ−Ｍ）、ＮＩＨスイスマウス胚（ＮＩＨ−３Ｔ３）、アフリカミドリザル細胞株（ＣＯＳ−ａ、ＣＯＳ−７、ＢＳＣ−１、ＢＳＣ−４０、ＢＭＴ−１０およびＶｅｒｏを含む）、ラット副腎クロム親和性細胞腫（ＰＣ１２）、ＰＣ１２Ａ、ラットグリア腫瘍（Ｃ６）細胞、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ腫）細胞、ＭＯＰＣ−３１Ｃマウス形質細胞腫細胞、ＭＮ９Ｄ細胞、ＭＮ９Ｈ細胞およびｒｉｐＴＡｇトランスジェニックマウス由来の細胞を含む。本発明者らは、ＢＨＫ細胞およびＰＣ１２  細胞を好む。
【００８９】
細胞不死化の技術は、Ｌａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０４、５９６−６０２頁（１９８３）およびＣｅｐｋｏ、Ｎｅｕｒｏｎ１、３４５−３５３頁（１９８８）に記載されている。候補細胞株は、遺伝子操作された、インスリンを分泌するβ細胞株、例えば、ＮＩＴ細胞（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０、８４２頁（１９９１））およびＲＩＮ細胞（Ｃｈｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、６２８−６３２頁（１９７７））、ＡＴＴ細胞（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、６８８−６９２頁（１９９２））、ＣＨＯ細胞（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、９１３３−３７頁、（１９９０））、およびβ−ＴＣ−３細胞（Ｔａｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １２、４２２−３２頁、（１９９２））を含む。
【００９０】
本発明の細胞は、自然に、生物学的に活性な分子を産生するか、またはそのように遺伝子操作され得る。例えば、線維芽細胞が、選択された生成物（例えば、神経増殖因子、エリトロポイエチン、インスリン、ＣＮＦＴまたは第ＶＩＩＩ因子）のための発現ベクターでトランスフェクトされ得る。
【００９１】
疾患または障害を処置するために使用され得る生物学的に活性な分子の例は、糖尿病を処置するために使用され得るインスリン、上皮小体機能不全症を処置するために使用され得る上皮小体ホルモン、貧血を処置するために使用され得るエリトロポイエチン、およびてんかんを処置するために使用され得るγ−アミノ酪酸を含む。
【００９２】
同様に、生物学的に活性な分子（例えば、栄養性因子および成長因子）は、ハンチントン舞踏病およびアルツハイマー病のような神経変性病態、ＡＩＤＳに関連する痴呆症、ならびにパーキンソン病を処置および予防するために使用され得る。リンホカインまたはサイトカインのような生物学的応答因子は、患者の免疫系を増強し得るかまたは抗炎症剤として作用し得、そして特定の慢性感染症またはガンを処置するのに有用であり得る。さらに、カテコールアミン、エンドルフィン、エンケファリン、および他のオピオイドペプチドもまた、カプセル化細胞により供給されて、疼痛を治療し得る。
【００９３】
カプセル化細胞は、酵素欠損を矯正するのに有用な生物学的に活性な分子を供給するために使用され得る。このような欠損の１例は、激症肝不全であり、ここで、肝組織はもはや毒素を除去し得ないか、または代謝廃物を排出し得ない。別の例は、フェニルケトン尿症であり、ここで、アミノ酸であるフェニルアラニンが罹患幼児の血流において危険なレベルに上昇する。
【００９４】
あるいは、カプセル化細胞は、宿主から有害物質または所望でない生成物を除去する生物学的に活性な分子を産生し得る。例えば、カプセル化細胞は、宿主からコレステロールを「排出する」生物学的に活性な分子を産生し得る。
【００９５】
本発明の生物学的に活性な分子として、ホルモン、サイトカイン、成長因子、栄養因子、脈管形成因子、抗体、血液凝固因子、リンフォカイン、酵素、および他の治療因子、またはそれらのアゴニスト、前駆体、活性アナログ、または活性フラグメントが挙げられる。これらは、カテコールアミン、エンドルフィン、エンケファリンおよび他のオピオイドペプチド、ジノルフィン、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、エリトロポイエチン、サブスタンスＰ、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養−３（ＮＴ−３）、神経栄養−４／５（ＮＴ−４／５）、一連の線維芽細胞増殖因子、毛様体状神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＣＮＴＦ関連分子およびインスリン様成長因子Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを含む。
【００９６】
ある実施態様において、生物学的に活性な分子は、神経伝達物質である。このような神経伝達物質として、ドーパミン、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、セロトニン、アセチルコリン、ノレピネフリン、エピネフリン、グルタミン酸、および他のペプチド性神経伝達物質が挙げられ、好ましくはドーパミン、ノレピネフリン、またはエピネフリンである。さらに、生物学的に活性な分子は、例えば、ドーパミンの前駆体であるＬ−ドーパを含む神経伝達物質のアゴニスト、アナログ、またはフラグメントであり得る。
【００９７】
別の実施態様において、馴化細胞は、カテコールアミン、エンケファリン、オピオイドペプチド、またはそれらの使用し得るアゴニスト、またはアナログ、あるいはそれらの混合物を包含する抗侵害受容因子を分泌する。好ましくは、カテコールアミンまたはエンケファリンが分泌され、最も好ましくは、カテコールアミンとエンケファリンとの混合物が分泌される。
【００９８】
本発明において、有用なカプセルは、代表的には、少なくとも一つの半透過性外表面膜または細胞含有コアを取り巻く被覆物を有する。被覆物により栄養素、生物学的に活性な分子および他の選択された産物のカプセルを介した拡散が可能になる。カプセルは生体適合性であり、好ましくは免疫隔離性である。コアは、液体培地に懸濁されるかあるいはヒドロゲルマトリックス内に固定されるかのいずれかの単離された細胞を含む。
【００９９】
カプセルを構築するために使用される物質の選択は多くの要因により決定され、そしてＤｉｏｎｎｅ  ＷＯ  ９２／１９１９５に詳細に記載されている。簡単に述べると、種々のポリマーおよびポリマーブレンドがカプセル被覆物を製造するために使用され得る。カプセルを形成するポリマー性膜は、ポリアクリレート（アクリル性コポリマーを含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニルコポリマー、ポリウレタン、ポリエスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリスルフォン、ポリホスファゼン、ポリアクリリニトリル、ＰＡＮ／ＰＶＣ、ならびにそれらの誘導体、コポリマー、および混合物を含有し得る。
【０１００】
カプセルは、当該分野で公知の任意の適切な方法により形成され得る。一つのこのような方法は、生物学的組織フラグメント、細胞小器官、または細胞の懸濁液および／または他の治療因子を含有し得るポリマー注型溶液および凝集剤の同時押し出し成形を包含する。被覆物はシングルスキン（タイプ１、２）またはダブルスキン（タイプ４）を有し得る。シングルスキン中空ファイバーはポリマー溶液の表面の一面のみの同時押し出し成形時にクエンチすることにより生成され得る。ダブルスキン中空ファイバーは、ポリマー溶液の両表面を同時押し出し成形時にクエンチすることにより生成され得る。代表的には、タイプ４中空ファイバーと比較して、より大きな百分率のタイプ１中空ファイバーの表面がマクロカプセルによって占められている。タイプ２中空ファイバーは中間程度である。例えば、Ｄｉｏｎｎｅ、ＷＯ  ９２／１９１９５および米国特許第５，１５８，８８１号、および同５，２８３，１８７号および同５，２８４，７６１号を参照のこと（これらは本明細書中において参考として援用する）。
【０１０１】
円筒状、デスク形状または球形のような多くのカプセル形態が可能である。
【０１０２】
ビヒクルの被覆物は、透過選択性膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を決定するポアサイズを有する。ＭＷＣＯより大きな分子は、膜を通過することを物理的に妨げられる。膜のポアサイズは、細胞により産生される特定の因子がビヒクルの外へ拡散することを可能にするが、しかしビヒクルへの宿主の免疫応答因子の進入を排除するよう選択される。代表的には、ＭＷＣＯは５０ｋＤ〜２００ｋＤの範囲であり、好ましくは５０ｋＤ〜１００ｋＤの範囲である。最も適切な膜組成物はまた、選択された移植部位に存在することが知られている免疫エフェクター分子とビヒクルの外膜成分との間の反応性を最小限にする。
【０１０３】
免疫隔離ビヒクルのコアは、その中に単離された特定の細胞のための適切な局部環境を提供するように構築される。コアは細胞増殖を維持するのに十分な液体培地を含み得る。液体コアは、ＰＣ１２細胞のような形質転換細胞株を維持するのに特に適切である。あるいは、コアはゲルマトリックスを含み得る。ゲルマトリックスはヒドロゲル（アルギネート、「Ｖｉｔｒｏｇｅｎ」など）または細胞外マトリックス成分から構成され得る。例えばＤｉｏｎｎｅ  ＷＯ  ９２／１９１９５を参照されたい。
【０１０４】
ヒドロゲルを形成する組成物は概ね３つのクラスに分類される。第１のクラスは負の実効電荷を有する（例えばアルギネート）。第２のクラスは正の実効電荷を有する（例えば、コラーゲンおよびラミニン）。市販の細胞外マトリックス成分の例として、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭおよびＶｉｔｒｏｇｅｎＴＭが挙げられる。第３のクラスは電荷において正味中性である（例えば、高度に架橋されたポリエチレンオキシド、またはポリビニルアルコール）。
【０１０５】
ヒドロゲルマトリックスからなるコアは、ランゲルハンス島細胞または副腎クロム親和性細胞のような集塊物または凝集体を形成する傾向を有する細胞または組織を維持するのに特に適している。
【０１０６】
カプセルのコア内に充填しようとする細胞の数または組織の量に影響する要因は、（１）カプセルのサイズおよび外形；（２）カプセル内の細胞の有糸分裂活性、および（３）コアの調製および／または充填のための粘度要求物を包含する。これらの因子はＤｉｏｎｎｅ  ＷＯ  ９２／１９１９５に詳細に記載される。
【０１０７】
移植されたマクロカプセルは、カプセル上に作製されたつなぎを用いて容易に回収され得る。ミクロカプセルは吸引または任意の他の適切な方法を用いて回収され得る。特に、ミクロカプセルの回収は、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７０７６に記載されるようなポーチデバイスの使用により容易にされる。
【０１０８】
カプセルをシールする任意の適切な方法が用いられ得、これらは、ポリマー性接着剤および／または切り離し（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）シール、結び（ｋｎｏｔｔｉｎｇ）シール、および加熱シールの使用を包含する。さらに、任意の適切な「乾燥」シール法もまた、使用され得る。このような方法において、細胞含有溶液が導入される非多孔性取り付け具（ｆｉｔｔｉｎｇ）が提供される。充填後、カプセルはシールされる。このような方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７０１５に記載される（これは本明細書中で参考に援用される）。
【０１０９】
好ましくは、インビボの移植の前に、カプセルの機能性を確立するための１つ以上のインビトロアッセイが用いられる。これらの目的のために、当該分野で周知のアッセイまたは診断テストが使用され得る。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｂｅｌｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３を参照のこと。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、クロマトグラフィーアッセイまたは酵素アッセイ、あるいは分泌される産物に特異的なバイオアッセイが用いられ得る。所望される場合、移植物の分泌機能は、レピシエントから適切なサンプル（例えば、血清）を採取してそれをアッセイすることにより期間中モニターされ得る。宿主が霊長類である場合、微小透析（ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）が用いられ得る。
【０１１０】
さらに、細胞の代謝活性が、酸素の取り込み、グルコース利用のような機能、またはミトコンドリア機能をモニターすることによって、追跡され得る。酸素の取り込み速度は、当該分野で公知の方法を用いて測定され得る（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（＃１２７１）およびポリエチレン膜を有するＣｌａｒｋ型電極（＃７３１）を用いる）。
【０１１１】
異種遺伝子産物を発現するように操作された細胞の遺伝安定性は、当該分野で公知の技術を用いて、遺伝子挿入物のコピー数を測定することによりアッセイされ得る。例えば、プラスミドコピー数は、ゲノムＤＮＡの酵素消化、ブロッティング、プロービング、およびＰｈｏｓｈｏｒＩｍａｇｅ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、公知の標準とシグナルを比較することにより測定され得る。
【０１１２】
カプセルの数およびサイズは、特定の用途のために必要な生物学的活性量により決定される移植時の治療効果を生み出すのに十分であるべきである。分泌細胞が治療物質を放出する場合、当該分野に公知の標準容量の考慮および基準が、必要な分泌物質の量を決定するために用いられる。考慮すべき要因は、Ｄｉｏｎｎｅ  ＷＯ  ９２／１９１９５に記載される。
【０１１３】
カプセル化細胞の移植は、減菌条件下で行われる。一般的に、分泌物質または宿主への機能および移植された細胞または組織への栄養素の適切な送達を可能にし、そして回収および／または再配置のためのカプセルへのアクセスを可能にする宿主中の部位に移植される。
【０１１４】
次に、本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらはいかなる方法によっても制限するようには意図されるべきではない。
【実施例】
【０１１５】
（実施例１：低酸素および低グルコース環境に曝されたカプセル化ＢＨＫ細胞によるＮＧＦ分泌）
（ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞株産生）
ＮＧＦを分泌するＢＨＫ細胞株を産生し、そして低酸素および低グルコース環境に曝した。
【０１１６】
ヒト遺伝子の、第１イントロンの３’末端の約３７ｂｐ、ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＮＧＦのタンパク質翻訳開始であると考えられる２つのＡＴＧ配列および全コード配列および３’非翻訳領域全体を含む２．５１ｋｂのフラグメント（Ｈｏｙｌｅら、Ｎｅｕｒｏｎ，  １０，  １０１９−３４頁、１９９３）を、ＤＨＦＲベースのｐＮＵＴ発現ベクター中のマウスメタロチオネイン−１プロモーター（−６５０〜＋７）およびラットインシュリンＩＩ遺伝子の第１イントロン（Ｂａｅｔｇｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８３，  ５４５４−５８頁  （１９８６））のすぐ下流にサブクローン化した。
【０１１７】
ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、リン酸カルシウム法を用いてｐＮＵＴ−βＮＧＦ構築物でトランスフェクトした。ＢＨＫ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ａｍｐｈ  Ｂ（０．８ｇ／ｌ）、およびＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ中で５％  ＣＯ２にて３７℃で増殖させた。トランスフェクトされたＢＨＫ細胞を、２００μＭのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で３〜４週間選択し、そして２００μＭのメトトレキセートを用いてあるいは用いずに、耐性細胞をポリクローナル集団として維持した。
【０１１８】
（ＰＡＮ／ＰＶＣファイバーの調製）
選択透過性中空ファイバーを、乾燥ジェット−湿潤スピン技術［Ｃａｂａｓｓｏ，  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  第１２巻、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第３版、４９２−５１７頁、１９８０；Ｄｉｏｎｎｅ，  ＷＯ  ９２／１９１９５］により調製した。非対称中空ファイバーを、ジメチルスルホキシド中１０％（ｗ／ｗ）のポリアクリロニトリル−ポリビニルクロリド（ＰＡＮ／ＰＶＣ）コポリマー溶液から注型（ｃａｓｔ）し、そして直接凝固浴槽中にクエンチした。得られたダブルスキン（Ｔｙｐｅ４）ファイバーを非溶媒水浴槽中に回収し、グリセリン化し、そして乾燥させた。
【０１１９】
（マトリックスの調製）
８ｍｌのラット尾のコラーゲン（ＩＶ型、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ、ｌｏｔ  ９１−１０８３）を、１ｍｌのフェノールレッド／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、そしてこの溶液をｐＨ７．０に調整した。８ｍｌのＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）（Ｃｅｌｔｒｉｘ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｌｏｔ  ９２Ｈ１７６）を、２ｍｌのフェノールレッド／ＰＢＳに加えた。等容量のコラーゲン溶液とＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）溶液とを一緒に混合してマトリックス溶液を形成した。
【０１２０】
（充填手順および密封手順）
９０％のコンフルエンシーまで増殖したＮＧＦ産生ＢＨＫ細胞の単一細胞懸濁液を、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）でリンスし、約１分間トリプシン処理し、そして１０００ｒｐｍでの３分間の遠心分離によりペレット化した。この細胞を培地中に再懸濁し、２×１０７細胞／ｍｌの最終細胞濃度にした。次いで、この細胞懸濁液をコラーゲン／Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）マトリックス溶液と１：１で混合し、最終細胞濃度を１×１０７細胞／ｍｌにした。
【０１２１】
カプセル化に先立ち、マトリックス中で細胞を穏やかに混合し、確実にスラリー分布を均一にした。斜めに切った２４ゲージのカテーテル先端部およびＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、２．５マイクロリッター（μｌ）の細胞／マトリックススラリー（１０，０００細胞／μｌ）をファイバー中に充填した。
【０１２２】
近位端に隔壁固定具を備えるハブ上に１〜１．１ｃｍ長の乾燥中空ファイバーを取り付けることによりカプセルを密封した。ハブは、このデバイスの管腔内に注入される細胞の充填アクセスを有する。２．５μｌの細胞懸濁液を注入した後、隔壁を切り離し、そして光硬化アクリレート（ＬｕｘｔｒａｋＴＭ  ＬＣＭ  ２４，ＩＣＩ  Ｒｅｓｉｎｓ  ＵＳ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、アクセスポートを密封した（「ハブ」密封）。続いて、１．５ｃｍ、内径０．０２０インチのシラスティックチューブをアクリル性ハブを覆って配置することにより、カプセルを「つないだ（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）」。
【０１２３】
カプセルを３日間周囲の酸素レベルに馴化させ、そしてベースラインのＮＧＦ分泌について試験した。３日目の培地を１ミリリットル（ｍｌ）の新鮮な培地と交換した。
【０１２４】
次いで、低グルコース（０．８ｍｇ／ｌ）かつ低酸素（５０ｍｍＨｇ）または高グルコース（５．５ｍｇ／ｌ）かつ周囲の酸素レベル（１４２ｍｍＨｇ）を含む２４ウェルプレートにカプセルを入れた。培地を交換し、そして７日ごとにＮＧＦアッセイを行った。交換の１日前に、新鮮な培地を、各馴化条件についての適切な酸素濃度にした。カプセル化細胞をこのように４週間培養した。
【０１２５】
０、３、７、１４、２１、および２８日目にＮＧＦレベルをＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により測定した。細胞生存能プロファイルの形態学的測定のために、代表的なカプセルを４％のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。
【０１２６】
４％のパラホルムアルデヒド中での固定の後、回収したカプセルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、９５％までの漸変アルコール中で脱水し、そしてグリコールメタクリレート浸潤溶液（Ｈｉｓｔｏｒｅｓｉｎｅ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ）中に包埋した。３ミクロン厚の切片をミクロトーム（Ｓｕｐｅｒｃｕｔ  ２０６５，Ｌｅｉｃａ）で切り出し、ガラススライド上に載せてクレシルバイオレットで染色した。
【０１２７】
（ＮＧＦ  ＥＬＩＳＡ）
カプセル化ＢＨＫ／ＮＧＦ細胞から放出されるｈＮＧＦの定量は以下のように行った。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり１５０μｌの、コーティング緩衝液（１×ＰＢＳ（ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含有しない）／０．１％のアジ化ナトリウム；ｐＨ９．６）中１ｎｇ／ｍｌの抗マウス−β（２．５Ｓ）ＮＧＦでコートし、そして３７℃で少なくとも２時間あるいは４℃で一晩インキュベートした。
【０１２８】
コーティング溶液を捨て、ウェルを３００μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２００ｍＭ  ＮａＣｌ／１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／０．１％のアジ化ナトリウム；ｐＨ７．０）で３回洗浄し、そして１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する３００μｌのコーティング溶液を用いて室温で３０分間ブロックした。次いで、ウェルを３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。馴化培地サンプルを２×サンプル緩衝液（サンプル緩衝液は洗浄緩衝液と同一である、ただし２％のＢＳＡを含有する）中に１：１で希釈し、調製したサンプルの１０μｌをウェルに充填した。このプレートを３７℃で少なくとも２時間または４℃で一晩インキュベートした。
【０１２９】
各ウェルを空にし、３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして１００μｌの４Ｕ／ｍｌの抗マウス−β（２．５Ｓ）ＮＧＦ−β−ｇａｌ結合体を加えた。プレートを３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。各ウェルを空にし、３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして２００μｌのクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド基質溶液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％のアジ化ナトリウム／１％  ＢＳＡ；ｐＨ７．０中の４０ｍｇ  ＣＰＲＧ）を加えた。プレートを３７℃で３０分間〜１時間、または発色が５７０ｎｍでの光度計測に充分になるまでインキュベートした。
【０１３０】
（結果）
２つの環境条件下での時間の関数としての１カプセル当たりのＮＧＦ放出を、ハブ密封を用いる１０％Ｔｙｐｅ４ファイバーについて、図１および図２に示した。データを、２４時間当たりに１カプセル当たり放出されるＮＧＦ（ｎｇ）として表す。１カプセル当たりのＮＧＦの産生は評価期間にわたって増加した。
【０１３１】
（実施例２：種々の水力学的透過率を有するカプセル中の、カプセル化後に馴化したＢＨＫ細胞によるＮＧＦ分泌）
実施例１に記載のＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞を本実施例に使用した。注型溶液中に１２．５％および１５％のＰＡＮ／ＰＶＣ、ならびに１０％のＰＡＮ／ＰＶＣを用いてマクロカプセルを調製する以外は、中空ファイバーを実施例１に記載のように調製した。ＰＡＮ／ＰＶＣダブルスキンファイバー（Ｔ４）は１ｃｍの長さであり、そして以下の特徴を有した：
％固形分                内径（μｍ）            水力学的透過率
１０                      ７２１                      ６０
１２．５                  ７３３                      ２０
１５                      ７４６                      １３
（水力学的透過率はｍｌ／分／ｍ２／ｍｍＨｇで表す）
ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞を３つのタイプのマクロカプセル中に充填し、そして実施例１に記載のように密封した。カプセルを４週間低グルコースかつ低酸素条件に曝し、そして実施例１に記載のようにＮＧＦ放出について試験した。
【０１３２】
時間の関数としての３つの異なるカプセルタイプからのＮＧＦの産出量を図３に示す。１０％  ＰＡＮ／ＰＶＣカプセルからの平均ＮＧＦ放出は、４週間後に約５０ｎｇ／カプセル／２４時間であり、これに対し１２．５％  ＰＡＮ／ＰＶＣカプセルについては約３０ｎｇ／カプセル／２４時間であった。１５％  ＰＡＮ／ＰＶＣカプセルは、１、２、３または４週間後、検出可能なレベルのＮＧＦを産生しなかった。カプセルの形態学的検査により、１０％および１２．５％  ＰＡＮ／ＰＶＣカプセル中に健常な細胞クラスターが存在することを確認した。４週間後の１５％  ＰＡＮ／ＰＶＣカプセル中には死細胞のみが存在した。
【０１３３】
（実施例３：カプセル化ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞を宿主に移植する）
実施例１のカプセル化細胞を、ＢＨＫ細胞からのＮＧＦ分泌レベルがこれらの制限条件下で安定するまで、実施例１の低酸素かつ低グルコース濃度に曝す。カプセル化細胞をヒト宿主に移植する。移植部位は、側脳室および線条体を包含する。脳へのカプセルの移植についての手順は、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、ＷＯ  ９３／００１２７（本明細書中に参考として援用する）に公開されている。
【０１３４】
（実施例４：インビトロ制限条件に曝されたカプセル化副腎クロム親和性細胞）
Ｌｉｖｅｔｔ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６４，  １１０３−６２頁（１９８４）に記載のように、コラゲナーゼ切断によりウシ副腎クロム親和性細胞を副腎から採取した。実質的にＷＯ９２／１９１９５に記載されるように、副腎細胞凝集物を、ＣａＣｌ２で架橋した１．５％アルギネートマトリックス中に固定し、そしてダブルスキンＴｙｐｅ４免疫隔離性ＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー膜（内径７５０μｍ、壁厚８５μｍ、ＭＷＣＯ  ６０ｋＤ）中にカプセル化した。
【０１３５】
カプセル化細胞を、２０、４０、６０、８０、およひ１４２ｍｍＨｇのｐＯ２で２週間培養した。２日目および１４日目に、この細胞を、基礎およびＫ＋誘発カテコールアミン放出について試験した。１４日後、カプセルを４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、そして形態学的検査のために処理し、切片化し、そして形態学的に評価した。
【０１３６】
電気化学的検出を用いるＨＰＬＣによりカテコールアミンを分析した。クロマトグラフィーのシステムには、電量多電極検出器（モデル５１００Ａ，ＥＳＡ，Ｉｎｃ．）、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ６２００ポンプ（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｉｎｃ．）、およびＭＰＬＣ  ＮｅｗＧｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）に取り付けたＨｙｐｅｒｓｉｌ  １５０ｍｍ×４．６ｍｍ、３ミクロンＯＤＳカラム（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いた。２６℃で実施した。
【０１３７】
移動相は、７５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．４ｍＭのオクタンスルホン酸、０．２７４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍＬ／Ｌ  ＣＨ３ＣＮからなった。濃リン酸を用いてｐＨを３．０に調整した。流速を１．０ｍＬ／分に維持した。
【０１３８】
検出器を、＋４５０ｍＶで動作するプレインジェクターガードセル（モデル５０２０）、および電極１および２についてそれぞれ−４０ｍＶおよび＋４００ｍＶで酸化スクリーンモードで動作する高解像度２重分析セル（モデル５０１１）に取り付けた。分析物を検出器２で測定した。
【０１３９】
３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のスタンダードを用いて、Ｌ−ドーパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、Ｄｏｐａｃ（３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）、ノルエピネフリン（ＮＥ）およびドーパミン（ＤＡ）については５２ｆｍｏｌの検出閾値およびＨＶＡ（ホモバニリン酸）についてはカラム上の１０４ｆｍｏｌの検出閾値を、それぞれ２〜５％、９〜１２％、１５〜２４％および６〜１７％の閾値のパーセント標準偏差の範囲で確認した。１連７点の標準曲線は、カラム上の分析物が、Ｌ−ドーパ、Ｄｏｐａｃ、ＮＥおよびＤＡについては５２ｆｍｏｌ〜３３００ｆｍｏｌの範囲、ＨＶＡについては１０４〜６６００ｆｍｏｌの範囲で直線であった（それぞれ、ｒ２値は０．９９９、０．９９８、０．９９９、および０．９９９であった）。
【０１４０】
データを獲得し、そしてＷａｔｅｒｓ  ８４５  ＶＡＸ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いてピーク領域を積分した。
【０１４１】
結果を図４に示す。データを、ピコモル／３０分（基礎産出量）あるいはピコモル／１５分（Ｋ＋誘発産出量）として表す。より高いＯ２濃度では、ノルエピネフリン（ＮＥ）およびエピネフリン（ＥＰＩ）の基礎放出および特にＫ＋誘発放出はいずれも２日目より１４日目が高かった。従って、制限条件へのカプセル化細胞の曝露により１以上の細胞特性の変化が生じた。
【０１４２】
（実施例５：インビボ制限条件に曝されたカプセル化副腎クロム親和性細胞）
ウシ副腎クロム親和性細胞を実施例４に記載のように調製した。実質的に、ＷＯ９２／１９１９５に記載されるように、副腎細胞凝集物を、ＣａＣｌ２で架橋した１．５％のアルギネートマトリックス中に固定し、そしてシングルスキンＴｙｐｅ２免疫隔離性ＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー膜（内径５００μｍ、壁厚７０〜９０μｍ、ＭＷＣＯ  ６０ｋＤ）またはダブルスキンＴｙｐｅ４免疫隔離性ＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー膜（内径５００μｍ、壁厚７０〜９０μｍ、ＭＷＣＯ  ６０ｋＤ）のいずれかにカプセル化した。
【０１４３】
カプセル化した細胞を、ラットレシピエントの線条体への移植によりインビボ制限条件に曝した。一匹のラット当たり２カプセルを両側に移植した。正中切開に続いて、切歯バーを耳内線（ｉｎｔｒａ−ａｕｒａｌ  ｌｉｎｅ）の０．３ｍｍ下にセットし、ブレグマから＋０．５ｍｍ、側方に３．０ｍｍの座標で頭蓋にドリルで穴を開けた。カプセルを硬膜から７ｍｍの深さに設置した。
【０１４４】
移植の前およびインビボでの６週間後のカテコールアミン産生についてカプセルをアッセイした。カテコールを実施例４に記載されるようにアッセイした。
【０１４５】
図５は、Ｔｙｐｅ２膜を使用して得た結果を示す。データを、ピコモル／カプセル／１５分で表す。基礎（パネルＡ）およびＫ＋誘発（パネルＣ）のＮＥおよびＥＰＩ放出のレベルは、移植の前と６週間の移植期間後で同様であった。しかし、インビボでの６週間の曝露期間後のニコチン誘発（パネルＢ）ＮＥおよびＥＰＩ放出レベルは、移植前のレベルより高かった。
【０１４６】
図６は、Ｔｙｐｅ４膜を用いて得た結果を示す。Ｋ＋誘発（パネルＣ）ＮＥおよびＥＰＩ放出レベルは、移植前と６週間の移植期間後で同様であった。しかし、６週間のインビボでの曝露期間後のニコチン誘発（パネルＢ）ＮＥおよびＥＰＩ放出レベルは、移植前のレベルより高かった。さらに、移植前と６週間移植期間後とのカテコールアミン放出の基礎レベルの間に差異が存在した（パネルＡ）。
【０１４７】
（実施例６：インビボ制限条件に曝されたカプセル化副腎クロム親和性細胞）
ウシ副腎クロム親和性細胞を実施例４に記載のように調製した。実質的に、ＷＯ９２／１９１９５に記載されるように、副腎細胞凝集物を、ＣａＣｌ２で架橋した１．５％のアルギネートマトリックス中に固定し、そしてダブルスキンＴｙｐｅ４免疫隔離性ＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー膜（内径５００μｍ、壁厚７０〜９０μｍ、ＭＷＣＯ  ６０ｋＤ）にカプセル化した。
【０１４８】
ラットレシピエントの脊髄のくも膜下腔への移植により、カプセル化細胞をインビボ制限条件に曝した。手術の手順は、実質的にＡｅｂｉｓｃｈｅｒら、ＷＯ  ９３／００１２７に記載されるように実施した。
【０１４９】
移植前およびインビボでの６週間後のカテコールアミン産生についてカプセルをアッセイした。カテコールアミンを実施例４に記載されるようにアッセイした。データを、ピコモル／カプセル／３０分で表す。
【０１５０】
図７は、移植前後におけるＮＥおよびＥＰＩ産生レベルの差異を示す。カプセル化細胞を６ヶ月間移植した。インビボでの６ヶ月後、基礎およびニコチン刺激のＥＰＩ産生は顕著に減少し、一方ＮＥ産生は顕著に増加した。
【０１５１】
（実施例７：霊長類の脳におけるインビボ制限条件に曝したカプセル化ＰＣ１２細胞）
ＰＣ１２細胞を、１０％の加熱失活したウマ血清、５％ウシ胎児血清および１００単位のペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ中の懸濁培養で増殖させ、回収し、遠心分離にかけ、そして上清を捨てた。
【０１５２】
激しい撹拌を用いて、Ｆｌｕｋａ  Ｈｉｇｈ  ＭＷキトサン（４．４ｇ）を、７０℃で１５０ｍｌの滅菌０．８５％生理食塩水中に溶解した。４５ｍｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ｐＨ  ８．０）を用いて、溶液のｐＨを６．２に調整した。０．２２μｍのミリポアフィルターを通して溶液を滅菌濾過した。
【０１５３】
キトサン溶液を等容量のＲＰＭＩと混合し、そして細胞ペレットを再懸濁して５×１０６細胞／ｍｌの濃度にするために用いた。細胞／キトサン溶液（約１，０００μｌ）をＰＡＮ／ＰＶＣと同時に押し出して、シングルスキンＸＰ１１免疫隔離性ＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー膜（内径４５０〜５００μｍ、壁厚５０〜６５μｍ、ＭＷＣＯ  ６５〜１００ｋＤ、水力学的透過率５３ｍｌ／分／ｍ２／ｍｍＨｇ、グルコース質量移動係数８×１０−４ｃｍ／ｓ、ポアサイズ透過率８８％ＢＳＡ拒絶係数）を形成した。米国特許第５，１５８，８８１号、同第５，２８３，１８７号、および同第５，２８４，７６１号に記載の一般的な手順を用いて、これらのファイバーを形成した。ファイバーを切り取って適切な寸法（約１ｃｍ）にし、そして端部を加熱クリンピングすることにより密封した。
【０１５４】
カプセル化細胞を３匹のアカゲザルに移植した。手術の手順は、実質的にＡｅｂｉｓｃｈｅｒら、ＷＯ  ９３／００１２７に記載されるように行った。２つのカプセルを尾状核（ｃａｕｄａｔｅ）中の異なる位置に移植し、そして３つのカプセルを被殻中の異なる位置に移植した。被殻および尾状核への移植のための見かけの定位座標を以下のように得た：被殻部位１＝耳内０（ｉｎｔｒａ−ａｕｒａｌ  ｚｅｒｏ）から前方２３．０ｍｍ、矢状縫合から側方９．０ｍｍそして脳表面から腹側１６．５ｍｍ；被殻部位２＝耳内０から前方１９．０ｍｍ、矢状縫合から側方１０．０ｍｍそして脳表面から腹側１９．５ｍｍ；被殻部位３＝耳内０から前方１５．５ｍｍ、矢状縫合から側方１１．５ｍｍそして脳表面から腹側２１．０ｍｍ；尾状核部位１＝耳内０から前方１８．０ｍｍ、矢状縫合から側方４．０ｍｍそして脳表面から腹側１５．０ｍｍ；尾状核部位２＝内耳０から前方２２．０ｍｍ、矢状縫合から側方４．５ｍｍそして脳表面から腹側１８．０ｍｍ。
【０１５５】
カプセル化細胞を約６ヶ月移植し、次いで回収した。移植前および移植後のＬ−ドーパ（Ｌ−ｄ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（ＥＰＩ）、Ｄｏｐａｃ（ｄｐｃ）、ドーパミン（ＤＡ）、およびホモバニリン酸（ＨＶＡ）の基礎レベルおよびＫ＋誘発レベルについて、実施例４に記載のようにカプセルをアッセイした。表２に示すデータは、ピコモル／カプセル／３０分（基礎）あるいはピコモル／カプセル／１５分（Ｋ＋誘発）として表す。表２の結果は、カプセル化した細胞の特性が、制限条件への６ヶ月間の曝露後、顕著に異なることを示す。
【０１５６】
【表２Ａ】
2005239726.tif 000003
【０１５７】
【表２Ｂ】
2005239726.tif 000004
【０１５８】
【表２Ｃ】
2005239726.tif 000005
（実施例８：カプセル化ＰＣ１２細胞をヒトに移植する）
ＰＣ１２細胞をカプセル化し、そして実施例７に記載のようにレシピエントに移植する。６ケ月後、このカプセルを外植しそしてＬ−ドーパ／ドーパミン比をアッセイする。細胞をマルチウェルデッシュにプレートし、そしてインビトロで所定範囲のＯ２条件下で培養する。細胞を定期的にＬ−ドーパおよびドーパミン産出量についてアッセイする。目的のＬ−ドーパ／ドーパミン比で放出する細胞を選択し、そして実質的にＷＯ  ９２／００１２７に記載されたような外科的手順を用いてヒト脳に移植する。
【０１５９】
（実施例９：ラット線条体中のインビボ制限条件に曝されたカプセル化ＰＣ１２細胞）
（カプセル）
カプセルを、実質的に実施例７に記載されたようなＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー（ＩＤ  ４５０〜５００μｍ、壁５０〜６５μｍ、ＭＷＣＯ  １００  ｋＤ、水力学的透過率５３ｍｌ／分／ｍ２／ｍｍＨｇ）を用いる転相技法を用いて、中空ファイバーから調製した。
【０１６０】
（細胞培養およびカプセル化）
ＰＣ１２およびＰＣ１２Ａ細胞を、水飽和、７％ＣＯ２周囲大気雰囲気中３７℃で、無血清の規定培地ＨＬ−１（Ｖｅｎｔｒｅｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｏｒｔｌａｎｄ，  Ｍａｉｎｅ）中、８０  ＲＰＭで５００ｍｌのスピナー培養で培養した。細胞を、スピナー培養上清を収集しそして８００ｇで遠心分離することにより回収した。生存能をトリパンブルーの排除により評価し、そしてこれはカプセル化に先立って９０±５％であることが示された。
【０１６１】
細胞を、ＨＬ−１（ｐＨ７．３）中に、４×１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ｐＨ６．７の２％（Ｗ／Ｖ）低粘度キトサン（ＰＲＯＴＯＳＡＮ（登録商標）、キトサンクロリド、Ｐｒｏｔａｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ，  Ｄｒａｍｍｅｎ，  Ｎｏｒｗａｙ）を含む等容量の溶液を、ＰＣ１２およびＰＣ１２Ａ細胞に、最終細胞濃度が２．０×１０７細胞／ｍｌとなるように添加した。
【０１６２】
個々のカプセルは、長さ７±０．５ｍｍであった。ＰＣ１２およびＰＣ１２Ａ細胞を充填したカプセルを２つの別のバッチで製造し、そして１ｍｌのＨＬ−１培地を含む２４マルチウェル組織培養プレート中に配置した。
【０１６３】
カプセル化の５〜７日後、自由に浮遊するカプセルを、（１０μＭアスコルビン酸を含む）１ｍＬのＨＢＳＳ  ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、残存培養培地を除去した。サンプリングは、２５０μＬ  ＨＢＳＳ中、３０分間のインキュベーションで行った（基礎放出）。すべてのサンプルは、クエン酸還元性酸性化緩衝液（ＣＲＡＢ）を迅速に添加することにより酸化から保護し、そして１０ｍＭクエン酸、２０μＭメタ重亜硫酸ナトリウム、および０．１Ｎ  過塩素酸中で安定なサンプル調製物を生成した。長期間保存は−８０℃で行った。標準品は、ストック溶液をＨＢＳＳ中に希釈し、そしてそれらをＣＲＡＢおよび０．１Ｎ  過塩素酸で安定化することにより調製した。
【０１６４】
（線条体のドーパミン枯渇）
ラットを、ケタミン（３３ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（１．７ｍｇ／ｍｌ）、およびアセプロマジン（１０ｍｇ／ｍｌ）の混合物の１．０ｍｌ／ｋｇ筋肉内注射で麻酔し、そしてＫｏｐｆ定位装置に置いた。総計１２μｇの６−ＯＨＤＡ（０．２μｇ／μｌのアスコルビン酸を含む０．９％の生理食塩水中に溶解した２μｇ／μｌの濃度で６μｌ容量）を、１．０μｌ／分の速度で注入し、そして注入カニューレをゆっくりと引き抜く前に５分間拡散させた。注入座標は、ブレグマの４．２ｍｍ後方、正中線から１．０ｍｍ外側面、そして硬膜の７．４ｍｍ腹側であった。
【０１６５】
（カプセル移植）
損傷の４ケ月後（最後のアポモルフィン注入の２．７５ケ月後）、カプセルを移植した。ラットを先のように麻酔し、そして矢状切開を頭皮に作成し、そしてポリマーカプセルを配置するための孔をドリルで開けた。ラットに、定位フレームに取り付けた１８ゲージのＴｅｆｌｏｎカテーテル内にカプセルを配置することにより移植した。ステンレス鋼栓子をカニューレ内に配置し、デバイスを脳内に下げ、そして栓子をその場に保持する一方、外部カニューレは持ち上げられて宿主線条体内にカプセルを受動的に配置した。移植のための定位座標は：プレグマの０．５ｍｍ前方、矢状縫合の３．８ｍｍ外側、および皮質表面の７．５ｍｍ下であった。移植物を受けなかったラットは、偽手術を受けた（麻酔され、頭皮を切り開き、頭蓋にドリルで孔を開け、そして硬膜を穿孔した）。
【０１６６】
（生化学的分析）
挙動テストの終了後、カプセル（ＰＣ１２、ＰＣ１２Ａ）を持たないラット、および空のカプセルを持つラットの半数を、ＣＯ２チャンバー中で麻酔し、そしてすばやく断頭した。これらの脳を、頭蓋から取り出し、カプセルを取り出し、両方の線条体を切り出し、エッペンドルフチューブ内に置き、そして液体窒素中で急速凍結した。宿主線条体からカプセルを回収した後、カプセルを１ｍｌのリン酸ＨＢＳＳ中に約３０分間置いた。リン酸ＨＢＳＳを取り除き、そして１ｍｌのＨＥＰＥＳ  ＨＢＳＳを添加した。カテコールアミン分析を、実施例４に記載のように行った。カテコールアミンアッセイが終了した後、デバイスを４％パラホルムアルデヒド中に配置し、そして形態学的分析を行った。
【０１６７】
図８は、各々同定番号を割り当てた個々のカプセルに対してプロットされた、３０分間にわたり測定したドーパミンおよびＬ−ドーパの放出を示す。図８に示されるように、移植９０日後のＬ−ドーパおよびドーパミンの産生レベルは、移植前レベルとは有意に異なっていた。
【０１６８】
（実施例１０：ヒトのクモ膜下腔でインビボ制限条件に曝されたカプセル化副腎クロム親和性細胞）
ウシ副腎クロム親和性細胞を実施例４に記載のように調製した。副腎細胞凝集体を、ＣａＣｌ２で架橋した１．５％アルギネートマトリックス中に固定化し、そしてダブルスキンのＴｙｐｅ  ４、免疫隔離性ＰＡＮ／ＰＶＣ中空ファイバー膜（ＩＤ  ７７０μｍ、壁７０μｍ、ＭＷＣＯ  ６０〜１００  ｋＤ）中に、実質的にＷＯ  ９２／１９１９５に記載されるようにカプセル化した。
【０１６９】
カプセル化した細胞を、末期癌を有し、麻薬治療で痛みが完全には軽減されず、そして髄膜腔に活性な感染または腫瘍の証拠がない、二人のヒト患者のクモ膜下腔に移植した。インフォームドコンセントを患者から得、そしてＬａｕｓａｎｎｅ大学医学部倫理委員会（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から承認を受けた。
【０１７０】
１．０％のリドカインを用いた局所浸潤を用いて、皮膚ならびに骨膜、および黄色靭帯までも含む他の深部結合組織構造に麻酔を確立した。３〜５ｃｍの皮膚切開を、正中線の右または左１〜２ｃｍの側矢状平面に作成し、そして胸腰筋膜まで続けた。腸骨稜および腰椎棘突起を含む伝統的な骨の標認点（ｌａｎｄｍａｒｋ）ならびにＸ線透視法の指標を用いて、１８ゲージのＴｏｕｈｙ注射針を、Ｌ−３とＬ−４との間のクモ膜下腔に、斜位側正中アプローチを経て導入した。注射針は、クモ膜下腔に浅く入るような向き、好ましくは矢状面または横断面のいずれかで脊髄に関して３０〜３５゜を超えない角度にした。
【０１７１】
ガイドワイヤを、それがクモ膜下腔中に４〜５ｃｍ伸びるまで、Ｔｏｕｈｙ注射針ハブの管腔を下に向かって通過させた（予備測定することにより決定した）。Ｔｏｕｈｙ注射針をワイヤから取り出した。
【０１７２】
次いで、７Ｆｒｅｎｃｈの拡張器をガイドワイヤ上に配置し、そしてワイヤを用いて、拡張器を、それが筋膜、側脊髄（ｐａｒａｓｐｉｎｏｕｓ）筋、および黄色靭帯を通じてクモ膜下空間に向かってワイヤの軌跡（ｔｒａｃｋ）を追従して穏やかではあるが確実に押されるように仕向けた。
【０１７３】
ワイヤの軌跡が７Ｆｒｅｎｃｈ拡張器により「過剰拡張」された後、６Ｆｒｅｎｃｈの拡張器およびカニューレシースを組立てそしてガイドワイヤ上に置いた。この６Ｆｒｅｎｃｈの拡張器およびカニューレを、クモ膜下腔中へ、カニューレの開口部先端がクモ膜下腔内に７ｃｍ位置するまで注意深く進めた。
【０１７４】
カニューレの適切な位置が確かめられたとき、ガイドワイヤと６Ｆｒｅｎｃｈ拡張器を順番にゆっくりとカニューレの管腔から取り出した。
【０１７５】
カプセル化副腎クロム親和性細胞を、殺菌した二重包装容器中に提供し、輸送媒体中に浴しそして管状シリコーンつなぎ（ｔｅｔｈｅｒ）を備えて完全に組み立てた。デバイスの膜部分を注意深くカニューレ中に導入した。カプセルを、膜の先端部がクモ膜下腔中のカニューレの頭側の先端部内２〜１０ｍｍの点に到達するまで進めた。カプセルを押し出し具を用いて配置した後、カニューレと押し出し具を完全に抜き取った。カプセルを、デバイスの５ｃｍ長膜部分が、馬尾の腹側にあるクモ膜下腔を含むＣＳＦ内に完全に横たわるように最終的に配置した。
【０１７６】
カプセルを、患者１では８４日後、そして患者２では５５日後に外植した。インビボ制限条件に曝した後のカテコールアミン産生量−−ノルエピネフリン（「ＮＥ」）およびエピネフリン（「ＥＰＩ」）−−を移植前レベルと比較した（表３）。カテコールアミンは実施例４に記載したように測定した。表３のデータは、ピコモル／カプセル／３０分（基礎）、またはピコモル／カプセル／１５分（ニコチン刺激：Ｎ−Ｓ）として示されている。カテコールアミン産生量は、移植前と制限条件に曝した後では有意に異なった。
【０１７７】
【表３】
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（実施例１１：インビボ制限条件に曝された馴化および再カプセル化ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞）
カプセル化ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞を実施例１に従って調製し、ラット脳の側脳室中に移植し、そして１４ケ月間インビボ制限条件に曝すことにより馴化した。１４ケ月後、カプセルを外植し、２つのカプセルから馴化細胞をプールし、そして１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地中で継代することにより増殖させた。ＢＨＫ−ｈＮＧＦクローン２３と称されるクローン株を本実験に用いた。これらの細胞を等分し、そして各部分を液体窒素中で凍結した。インビボで馴化されていないコントロールＢＨＫ−ｈＮＧＦクローン２３細胞を、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中インビトロで増殖させた（ＢＨＫ−ｈＮＧＦクローン２３細胞バンク）。
【０１７８】
以下の６つのグループの細胞およびカプセルを試験した：
グループ１：ＢＨＫ−ｈＮＧＦ２３細胞（インビボ外植カプセル由来の馴化細胞）；Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）マトリッスク中に再カプセル化；ラット脳の側脳室中に移植されたカプセル；
グループ２：ＢＨＫ−ｈＮＧＦ２３細胞（馴化細胞）；カプセル化用の１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ（マトリックスなし）中に再懸濁；ラット脳の側脳室中に移植されたカプセル；
グループ３：ＢＨＫ−ｈＮＧＦ２３コントロール細胞（細胞バンク由来；以前には移植されていない）；Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）マトリッスク中に再カプセル化；ラット脳の側脳室中に移植されたカプセル；
グループ４：ＢＨＫ−ｈＮＧＦ２３コントロール細胞（細胞バンク由来；以前には移植されていない）；カプセル化用の１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ（マトリックスなし）中に再懸濁；ラット脳の側脳室中に移植されたカプセル；
グループ５：ＢＨＫ−コントロール細胞（バンク由来；以前には移植されていない）；Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）マトリッスク中に再カプセル化；ラット脳の側脳室中に移植されたカプセル；および
グループ６：ＢＨＫ−コントロール細胞（バンク由来；以前には移植されていない）；カプセル化用の１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ（マトリックスなし）中に再懸濁；ラット脳の側脳室中に移植されたカプセル。
【０１７９】
（カプセル）
馴化ＢＨＫ−ｈＮＧＦクローン２３細胞を、本質的に実施例１に記載のようにカプセル化した。大部分のカプセルはＨＦ１２０７９４−６ファイバーから作成され、そして７ｍｍの最終長さを有していた。いくつかのコントロールカプセルを、実施例７〜９で用いたＸＰ１１ファイバーに匹敵する１０１−９７−９ファイバーから作成した。
【０１８０】
ＨＦ１２０７９４−６シングルスキンファイバーは、平均して、８６．４μの壁厚；４５３．２μの内径（Ｉ．Ｄ．）；６２５．１μの外径（Ｏ．Ｄ．）；４３．０  ｍｍ／分／ｍ２／ｍｍＨｇの水力学的透過率（ＨＰ）；および１８７ｋＤのデキストラン拡散試験に基づく分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。
【０１８１】
１０１−９７−９シングルスキンファイバーは、平均して、５９μの壁厚；５４１μのＩ．Ｄ．；３１ｇの引張り強度；６２  ｍｍ／分／ｍ２／ｍｍＨｇのＨＰ；および８８ｋＤのデキストラン拡散試験に基づくＭＷＣＯを有する。
【０１８２】
（カプセル化）
マトリックス中にカプセル化された細胞（グループ１、３および５）を、ＰＣ−１培地で１：１に希釈したＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）中に、充填密度１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。カプセルを、移植前５〜７日間の期間、ＰＣ−１培地に保持した。マトリックスなしでカブセル化された、グループ２、４および６の細胞を１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中に再懸濁し、そして移植前保持期間の間ローラードラム上のチューブ中に置いた。
【０１８３】
（カプセル移植）
予めインビボで馴化したＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞を含むカブセルおよびコントロールカプセルを、ランダムに選択し、そしてラットの両側の側脳室中に移植した。非馴化ＢＨＫ−ｈＮＧＦ細胞の平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）試料をコントロールとして供した。
【０１８４】
（生化学的分析）
グループ１〜６からのカプセルを、実施例１に記載のように、ＮＧＦ放出についてアッセイした。馴化または非馴化細胞を含むカプセルからのＮＧＦ放出を、移植前および移植後１ケ月間測定した。グループ１〜４のカプセルからのＮＧＦ産出量を図１１に示す。ＮＧＦ非産生コントロール細胞のデータは示されていない。ＮＧＦ産出値アッセイの後、カプセルを４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして組織学、切片化および形態学的分析のために加工した。
【０１８５】
（実施例１２：黒質中に片側性損傷を有するラットでインビボ条件に曝したカプセル化ＰＣ１２細胞）
（細胞培養およびカプセル化）
ＰＣ１２細胞を、実質的に実施例９に記載されたように培養し、そしてカプセル化した。
【０１８６】
（黒質ドーパミン枯渇）
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）は、黒質中のドーパミン作動性ニューロンに対して選択的に毒性である。黒質中に６−ＯＨＤＡによる障害を持つラットは、低ドーパミンレベルと関連するパーキンソン病様特性を発現する。ラットを実施例９に記載のように麻酔し、そしてＫｏｐｆ定位装置に置いた。合計１０μｇの６−ＯＨＤＡ（０．２μｇ／μｌのアスコルビン酸を含む０．９％の生理食塩水中に溶解した２．５μｇ／μｌの４μｌ容量）を片側に注入し、そして注入カニューレをゆっくりと引き抜く前に、５分間拡散させた。注入座標は、切歯バーを＋５．０ｍｍにセットし、プレグマの３．２ｍｍ後方、正中線の２．７ｍｍ外側、および硬膜の８．０ｍｍ腹側であった。
【０１８７】
（カプセル移植）
ラットが片側性に障害を受けた後３〜４週間に、カプセルを両側性に移植した。ラットを麻酔し、そして実施例９に記載の手順および定位座標を用いてカプセルを移植した。
【０１８８】
（生化学的分析）
デバイスを移植後３、１０、２８、および６０日に取り出した。ラットをＣＯ２チャンバー内で麻酔し、そしてすばやく断頭した。脳を頭蓋骨から取り出し、そしてカプセルを脳の障害を有する側および有さない側（コントロール）から取り出した。線条体および側坐核（ｎｕｃｌｅｉ  ａｃｃｕｍｂｅｎ）の両方をカテコールアミン分析のために切り出し、それらをエッペンドルフチューブ中に置き、そして液体窒素中でチューブを急速凍結した。カプセルを１ｍｌのリン酸ＨＢＳＳ中に約３０分間置いた。リン酸ＨＢＳＳを除去し、そして１ｍｌ  ＨＥＰＥＳ  ＨＢＳＳを添加した。カテコールアミン分析を実施例４に記載のように実施した。カテコールアミンアッセイが終了した後、カプセルを形態学的分析のために４％パラホルムアルデヒド中に置いた。
【０１８９】
図９（パネルＡ）は、８つの移植前カプセル（「移植前」）、および障害を有する（低ドーパミン）または非障害の（コントロール）線条体いずれかから、移植後、５、１４、２８または６０日に外植したカプセルからの、３０分間にわたるＬ−ドーパの平均放出を示す。パネルＡは、カプセル化ＰＣ１２細胞により産生されるカテコールアミンの相対量が時間により変化することを示す。障害側およびコントロール側から外植されたカプセルは両方とも、２〜３週間の間のインビボ馴化後、より高いＬ−ドーパ産出速度を示した。
【０１９０】
図９（パネルＢ）は、上記パネルＡのカプセルから放出されるＬ−ドーパ／ドーパミン比を示す。パネルＢは、低ドーパミン環境でインビボ馴化後、カプセル化細胞がコントロール環境で馴化した細胞より低いＬ−ドーパ／ドーパミン比を生じたことを示す。このＬ−ドーパ／ドーパミン比は、インビボで約１４日後比較的安定になった。損傷およびコントロール側から外植されたカプセルは両方とも、移植前産出レベルに比べてインビボ馴化された後には、より高い産出Ｌ−ドーパ／ドーパミン比を示した。
【０１９１】
（実施例１３：霊長類脳で馴化されたカプセル化されたＰＣ１２細胞からの移植前および移植後カテコールアミン産出値の比較）
ＰＣ１２細胞が「ＸＰ１１−相当」ファイバー中にカプセル化されそして実施例７に記載のように霊長類脳で馴化された多くの実験からのカテコールアミン産出値が、それらが移植される前の同じカプセルからのカテコールアミン産出値に対して比較される。カプセル化ＰＣ１２細胞を、移植前のＬ−ドーパおよびドーパミン基礎産出速度についてアッセイした。表４に報告されたデータは、移植前カテコールアミン産出を表す。次いで、カプセルをインビボ馴化のために霊長類脳中に移植し、移植後１、２．５、３、４、５および６ケ月に外植し、そしてＬ−ドーパおよびドーパミン基礎産出速度をアッセイした（図１０）。
【０１９２】
図１０および表４の要約データの比較は、移植前産出および外植産出が顕著に異なることを示す。表４の列１の移植前データは、図１０における１ケ月間隔の外植データ点に対応する。同様に、表４の他の列のデータは、図１０でプロットされた他の毎月のデータ点に対応する。
【０１９３】
【表４】
2005239726.tif 000007
（実施例１４：ｈＣＮＴＦを分泌するＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ−ＣＮＴＦ）の産生）
ヒトＣＮＴＦ（ｈＣＮＴＦ）遺伝子を、ポリリンカーを含む完全ｐＵＣ１８配列を含む、ｐＮＵＴと称される、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を基礎にした発現ベクター中に挿入した。ＤＨＦＲの変異体形態をコードするｃＤＮＡの転写はＳＶ４０プロモーターにより駆動される。３’末端は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の３’末端（ＨＢＶ３’）と融合し、効率的なポリアデニル化および成熟シグナルを確実にする。
【０１９４】
ｈＣＮＴＦ遺伝子は、ヒトＤＮＡのＰＣＲ増幅により得た。用いたプライマーは、天然ｈＣＮＴＦ開始コドンの位置にＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。ｈＣＮＴＦ遺伝子をその５’最末端で、マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子由来の１５０ｂｐ配列に融合させた。ＥｃｏＲＩ部位は、ｈＣＮＴＦタンパク質のアミノ末端部分が、Ｉｇ遺伝子の最初の１８アミノ酸に対応するように用いた。ポリアデニル化配列およびｍＲＮＡ３’末端成熟に重要な他の配列を含むヒト成長ホルモン遺伝子（ｈＧＨ）由来の３２５ｂｐ  ＡｖａＩフラグメントをｈＣＮＴＦ遺伝子の３’最末端にクローニングした。簡単に述べれば、このフラグメントを、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカーのＳｐｅＩ部位に導入し、５’および３’末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位を作成した。ＢａｍＨＩ部位をｈＣＮＴＦの３’末端で操作されたＢｇｌＩＩ部位に連結した。
【０１９５】
この構築物を、マウスＭＴ−Ｉプロモーターの＋６位に挿入し、そして完全３０５０ｂｐ  ＭＴ／Ｉｇ／ｈＣＮＴＦ／ｈＧＨ  ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＮＵＴベクターのＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ部位中に挿入した。最後に、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を、ベクターのＮｏｔＩ部位中にクローン化し、それ故、それをＤＨＦＲ遺伝子から完全ｐＵＣ−１８プラスミドにより分離する。この最終構築物をＲＰ３２２４Ｅ２と命名する。
【０１９６】
ＲＰ３２２４Ｅ２ベクターＤＮＡを、標準のＥ．ｃｏｌｉ株（ＨＢ１０１）中で増幅し、そしてＱｉａｇｅｎ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（Ｋｏｎｔｒｏｎ）を用いて精製した。ＤＮＡを、標準のカルシウム／リン酸トランスフェクション手順を用いてトランスフェクトし、そして増加する濃度のメトトレキセートを用いて選択した。細胞を、ＰＣ−１組織培養培地中に維持しながら、メトトレキセート中で連続的に選択する。ＰＣ−１培地は、ヒト組換え供給源からのタンパク質を含む規定培地である。
【０１９７】
薬剤選択（２５〜２００μＭメトトレキセート）の後、ＢＨＫ（ＢＨＫ−ＣＮＴＦ）細胞を、数カ月の間薬剤選択なしにインビトロで維持し、そしてノーザンブロット分析、バイオアッセイまたはＥＬＩＳＡにより評価したときＣＮＴＦ発現の損失のないことを示した。ＣＮＴＦ産生のレベルは、バイオアッセイによりおよびＥＬＩＳＡにより測定したとき約１．０ｎｇ／１０３細胞／時であった。
【０１９８】
（実施例１５：ヒト腰椎クモ膜下腔中で馴化されそして筋萎縮性側索硬化症の処置のためにヒトに再移植されたＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞）
（細胞カプセル化）
実施例１４のＣＮＴＦ分泌ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ−ＣＮＴＦ）を、適切な長さのより長いつなぎ（ｔｅｔｈｅｒ）をヒト腰椎クモ膜下腔中への移植に用いた点を除いて、本質的に実施例１に記載のようにカプセル化した。デバイスは、２×１０５トランスフェクト細胞／μｌコラーゲン溶液（Ｚｙｄｅｒｍ）の密度で充填した。各カプセルからのＣＮＴＦ放出を、カプセルを２ｍｌの新鮮ＰＣ１培地に３０分間浸漬することにより測定した。次いで、ＣＮＴＦ測定を、Ｒ＆Ｄ  Ｅｌｉｓａ  ｓｙｔｅｍを用いて、回収した培地で実施した。カプセルを、１μ／日のＣＮＴＦの用量でクモ膜下腔内に送達するために選択した。ヒト患者の各々が１つのデバイスを投与された。
【０１９９】
（腰椎クモ膜下腔中のカプセル化ＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞のインビボ馴化）
カプセル化ＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞を、ヒト被験体の腰椎クモ膜下腔中に１ケ月間移植した。更なるカプセルを６ケ月までの間インビボで馴化する。１ケ月目の外植に際し、カプセルあたりのＣＮＴＦ放出の速度を、実施例１２に記載のようにアッセイした。ＣＮＴＦアッセイを実施した後、カプセルを、形態学的分析のために４％パラホルムアルデヒド中で固定した。
【０２００】
インビボで馴化されたＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞を、カプセルから取り出し、プールし、そしてすぐに、被験体のクモ膜下腔の環境に最も緊密に適合するように選択された低酸素およびグルコース制限条件下、ＰＣ１培地中で増殖することにより培養した。ＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞を、パラレルコントロールとして周囲の条件下で培養した。馴化細胞が特徴付けられ、そして他の制限条件にさらに馴化され得る。
【０２０１】
１つのセットの実験では、周囲の条件または制限条件下でインビトロ培養された、インビボ馴化ＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞を、（最初のカプセル化に用いたのと本質的に同じ手順に従って）再カプセル化し、そして宿主被験体に移植する。
【０２０２】
別のセットの実験では、ヒト宿主中に移植される馴化細胞は、まず、非ヒト霊長類レシピエント中のインビトロ制限条件に馴化される。
【０２０３】
被験体は、複数レベルの上位運動神経および下位運動神経欠陥；３本の肢または２本の肢および延髄筋系において活性でかつ慢性の脱神経を示す確証電気生理学的研究；自発的運動系の外側に神経学的関連がない；神経学的欠陥、特に形質細胞疾患の頚部脊椎症を引き起こし得る主要な疾患の証拠がない、の組み合わせの症状発現によりＡＬＳと診断された患者である。患者は比較的壮健、即ち、補助なしで歩行し得、そして疾患進行の初期である。患者には、開始時に、正常の７５％以上の努力肺活量を有する。
【０２０４】
患者は、最初の週の間は毎日、第２週から第４週は週に１度、その後は月に１度、なかんずく、発熱、口内炎、咳およびヘルペスに対する再活性化のような副作用について監視される。以下の試験を効力評価のために月に１度実施する：Ｔｕｆｔｓ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘａｍ  （ＴＱＮＥ）；延髄協調；呼吸機能−−努力肺活量、吸気量。血液を、最初の４週の間は週に１度、その後は月に１度、血漿ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦに対する潜在的抗体、Ｃ−反応性タンパク質、フィブリノーゲンの検出のために引き抜く。
手術手順
カプセル化ＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞の移植のための手術手順は以下の通りである。ＩＶアクセスを確立しそして予防的に抗生物質（セファゾリンナトリウム、１グラム  ＩＶ）を投与した後、患者を、腰椎を前方に曲げてほぼ側臥位または膝−胸位のいずれかで手術台の上に載せる。手術領域は、無菌的に調製して覆い、正中線の背側腰部領域をＳ−１レベルからＬ−１まで露出し、そしてＣ−アームＸ線透視法を用いて腰椎の手術時造影を行う。１．０％リドカインを用いた局所浸潤を用いて皮膚、ならびに骨膜および、黄色靭帯までを含む他の深部結合性組織構造に麻酔を確立する。
【０２０５】
３〜５ｃｍの皮膚切開を、止血のために電気メスを用いて正中線の右または左１〜２ｃｍの側矢状平面に作成し、そして胸腰筋膜まで続けた。腸骨稜および腰椎棘突起を含む伝統的な骨の標認点ならびにＸ線透視法の指標を用いて、１８ゲージのＴｏｕｈｙ注射針を、Ｌ−３とＬ−４との間のクモ膜下腔に、斜位側正中アプローチを経て導入する。注射針は、クモ膜下腔に浅く入るような向き、好ましくは矢状面または横断面のいずれかで脊髄に関して３０〜３５゜を超えない角度にする。注射針先端の適切な位置を、移植前カテコールアミン、エンケファリン、グルコース、ヒトＣＮＴＦ、およびタンパク質レベルおよび細胞数のための数ｍｌの脳脊髄液（ＣＳＦ）の引き抜きにより確認する。
【０２０６】
Ｔｏｕｈｙ注射針ハブを再検査し、先端部で開口部が好ましい方向に向いていることを確認し（開口部の向きは、注射針ハブ上の栓子用の指示ノッチにより示される）、そしてガイドワイヤがクモ膜下腔中に４〜５ｃｍに伸びるまで（予め測定することにより決定）注射針の管腔に沿って通過させる。ワイヤの通過の間に、注射針からワイヤの進行に抵抗がなく、そして患者が顕著な神経学的症状を訴えないことに注意すること。これら観察のいずれもが、ガイドワイヤの誤操作を示し得、そして神経根または脊髄損傷の切迫した可能性を示し得る。
【０２０７】
ガイドワイヤがクモ膜下腔で適切に配置されたように見えた後、Ｔｏｕｈｙ注射針を別に引き抜きそしてワイヤから取り出す。次いで、脊柱管の正中線中のワイヤの位置（馬尾の予想される位置の前方）およびねじれまたは説明不能な屈曲がないことをＸ線透視法で確認する。Ｔｏｕｈｙ注射針を除去した後、ガイドワイヤは、粗いワイヤ表面が密で繊維状の黄色靭帯を通って進行するのでほんのごくわずかの抵抗でクモ膜下腔中におよびクモ膜下腔から出て自由に動き得るべきである。
【０２０８】
７Ｆｒｅｎｃｈ拡張器を、次いで、ガイドワイヤ上に置き、ワイヤを用いて拡張器がワイヤの軌跡に追従して、クモ膜下腔に向かって、筋膜、傍脊髄筋、および黄色靭帯を通って、穏やかにしかし確実に押されるように仕向ける。７Ｆｒｅｎｃｈ拡張器の進行を停止し、そして黄色靭帯を通過した後に抵抗がなくなるのを検出するとすぐにワイヤから拡張器を取り除く。これは、クモ膜下腔内で比較的剛直なこの拡張器を任意の有意な程度まで、進行させそして操作することをさけるために行われる。
【０２０９】
ワイヤの軌跡が７Ｆｒｅｎｃｈ拡張器により「過剰拡張された」後、６Ｆｒｅｎｃｈ拡張器およびカニューレシースを組立て、そしてガイドワイヤ上に置いた。６Ｆｒｅｎｃｈ拡張器およびカニューレを、カニューレの開口先端部がクモ膜下腔内の７ｃｍの位置に配置されるまで注意深く進行させる。７Ｆｒｅｎｃｈ拡張器の場合と同様に、組み立てた６Ｆｒｅｎｃｈ拡張器およびカニューレを、拡張器の管腔内でワイヤにより仕向ける。クモ膜下腔内の位置を、デバイスを予備測定することにより測定し、そして総体的にはＸ線透視法により確認する。クモ膜下腔内の拡張器およびカニューレの操作にはかなり注意し、誤方向および可能な神経学的損傷を避けるべきである。
【０２１０】
カニューレが適切に配置されたことが確認されたとき、ガイドワイヤおよび６Ｆｒｅｎｃｈ拡張器を順番にカニューレの管腔からゆっくりと取り出す。手術台上での患者の位置に依存して、この点でのカニューレを通るＣＳＦ流れが認知されるべきであり、非常に活発であり得、過剰のＣＳＦ損失を避けるために、カニューレにふたをしまたはカプセル移植片の非常に迅速な配置が必要である。
【０２１１】
カプセル化馴化ＢＨＫ−ＣＮＴＦ細胞は、輸送媒体中に浴され、そして管状のシリコーンのつなぎを備えて完全に組立てられた、殺菌、二重外被コンテナ中で提供され得る。カニューレを通じてそしてクモ膜下腔中への移植の前に、カプセルを挿入キットトレイに移し得、そこではカプセルは、それが損傷または主要な欠陥について総体的に検査される間輸送媒体中に維持される位置に配置される。
【０２１２】
カプセルのつなぎ部分は、デバイスの膜部分に押し出し具の小直径ワイヤ部分を挿入することによりステンレス鋼押し出し具上に取り付けられ、そして注意深くカニューレ中に導入される。カプセルを、膜の先端部分が、クモ膜下腔中のカニューレの頭側の先端部内２〜１０ｍｍである点に達するまで進める。この配置は、カニューレおよびカプセル−つなぎ−押し出し具アセンブリを予め測定することにより達成され、そしてそれはカプセルの膜部分が位置に進められる全時間の間カニューレにより保護されることを確実にする。
【０２１３】
カプセルがカニューレ内に配置された後、カニューレがカプセルおよび押し出し具上から完全に引き抜かれる間、カプセルがクモ膜下腔中の位置に（進むこともなくまたは引き抜かれることもなく）押し出し具を用いて保持される。次いで、押し出し具を、シリコーンのつなぎから押し出し具のワイヤ部分をスライドさせることによりカプセルから取り外す。この方法を用いて、カプセルを、デバイスの膜部分が、ＣＳＦを含むクモ膜下腔内で馬尾腹側に完全に横たわるように最終配置する。それは、硬膜および黄色靭帯からシリコーンのつなぎが出る前に、このつなぎがクモ膜下腔内を通る、ほぼ１〜２ｃｍの長さのこのつなぎにより、その尾側の末端で係留される。このつなぎは、このレベルから、傍脊髄筋を通って外に続き、そして胸腰筋膜から出て、デバイスを取り付けるために利用可能なほぼ１０〜１２ｃｍのフリーのつなぎ材料を残す。
【０２１４】
ＣＳＦの漏れは、フィブリン接着剤（Ｔｉｓｓｅｌ（登録商標））を傍脊髄筋中のつなぎで占められる走路中に注入し、そして巾着縫合を用いて走路の浅在筋膜開口部を硬く閉じることことにより最小にする。次いで、つなぎの自由末端を非吸収縫合糸を用いて係留し、そして皮膚および皮下組織の２層閉鎖で完全に覆った。
【０２１５】
次いで、患者を神経手術回復エリアに移し、そして手術後２４時間の間、ベッド上に横たわって、厳格に安静に維持する。抗生物質による予防もまた、移植手順後２４時間継続する。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、０．８ｇ／ｌグルコース（低Ｏ２／ｇｌ）を含む培地中、５０ｍｍＨｇ、インビトロでインキュベートしたカプセル化ＢＨＫ細胞からのＮＧＦ分泌を示す。ＢＨＫ細胞をハブ−シールドタイプ４ダブルスキンカプセル中にカプセル化した。ＮＧＦ分泌／カプセル／２４時間（バーの高さで示した）を３、７、１４、２１、および２８日にアッセイした。
【図２】図２は、５．５ｇ／ｌグルコース（高Ｏ２／ｇｌ）を含む培地中、１４２ｍｍＨｇ、インビトロでインキュベートしたカプセル化ＢＨＫ細胞を示す。ＢＨＫ細胞をハブ−シールドタイプ４（Ｔ４）カプセル中にカプセル化し、そしてＮＧＦ分泌／カプセル／２４時間（バーの高さで示した）を３、７、１４、２１、および２８日にアッセイした。
【図３】図３は、期間中（ａ）１０％  ＰＡＮ／ＰＶＣ、（ｂ）１２．５％  ＰＡＮ／ＰＶＣ、または（Ｃ）１５％  ＰＡＮ／ＰＶＣのいずれかから作成されたハブ−シールド、タイプ４（Ｔ４）カプセル中で、図１のように低Ｏ２／ｇｌ培地中、インビトロでインキュベートしたカプセル化ＢＨＫ細胞からのＮＧＦ分泌を示す。ＮＧＦ分泌／カプセル／２４時間（バーの高さで示した）を３、７、１４、２１、および２８日に測定した。
【図４Ａ】図４Ａは、２０、４０、６０、８０、または１４０ｍｍＨｇ  Ｏ２で１４日間インビトロで培養したカプセル化副腎のクロム親和性細胞による酸素圧の関数としてのノルエピネフリン（ＮＥ）およびエピネフリン（ＥＰＩ）の放出を示す。放出は２日目および１４日目に測定した。パネルＡは、基礎ＮＥ放出を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、２０、４０、６０、８０、または１４０ｍｍＨｇ  Ｏ２で１４日間インビトロで培養したカプセル化副腎のクロム親和性細胞による酸素圧の関数としてのノルエピネフリン（ＮＥ）およびエピネフリン（ＥＰＩ）の放出を示す。放出は２日目および１４日目に測定した。パネルＢは、Ｋ＋誘発性ＮＥの放出を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、２０、４０、６０、８０、または１４０ｍｍＨｇ  Ｏ２で１４日間インビトロで培養したカプセル化副腎のクロム親和性細胞による酸素圧の関数としてのノルエピネフリン（ＮＥ）およびエピネフリン（ＥＰＩ）の放出を示す。放出は２日目および１４日目に測定した。パネルＣは、基礎ＥＰＩ放出を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、２０、４０、６０、８０、または１４０ｍｍＨｇ  Ｏ２で１４日間インビトロで培養したカプセル化副腎のクロム親和性細胞による酸素圧の関数としてのノルエピネフリン（ＮＥ）およびエピネフリン（ＥＰＩ）の放出を示す。放出は２日目および１４日目に測定した。パネルＤは、Ｋ＋誘発性ＥＰＩの放出を示す。
【図５】図５は、タイプ２カプセル中にカプセル化された仔ウシ副腎のクロム親和性細胞によるカテコールアミンの放出（移植前、および６週間移植期間後の回収後）を示す。パネルＡは、移植期間前および後のＮＥおよびＥＰＩの基礎放出を示す。パネルＢは、移植期間前および後のＮＥおよびＥＰＩのニコチン刺激性放出を示す。パネルＣは、移植期間前および後のＮＥおよびＥＰＩのＫ＋誘発性放出を示す。
【図６】図６は、タイプ４カプセル中にカプセル化された仔ウシの副腎のクロム親和性細胞によるカテコールアミンの放出（移植前、および６週間移植期間後の回収後）を示す。パネルＡは、移植期間前および後のＮＥおよびＥＰＩの基礎放出を示す。パネルＢは、移植期間前および後のＮＥおよびＥＰＩのニコチン刺激性放出を示す。パネルＣは、移植期間前および後のＮＥおよびＥＰＩのＫ＋誘発性放出を示す。
【図７】図７は、カプセル化された仔ウシ副腎のクロム親和性細胞による基礎（Ａ）およびニコチン刺激性（Ｂ）カテコールアミン産出（移植前、およびラットのクモ膜下腔における６ヶ月移植期間後の回収後）を示す。
【図８】図８は、カプセル化されたＰＣ１２およびＰＣ１２Ａ細胞によるドーパミンおよびＬ−ドーパの放出（移植前、およびラット線条における３ヶ月移植期間後の回収後）を示す。パネルＡおよびＢは、ＰＣ１２およびＰＣ１２Ａ細胞それぞれに対する移植前の基礎産出を示す。パネルＣおよびＤは、  ＰＣ１２およびＰＣ１２Ａ細胞それぞれに対する外植後の基礎産出を示す。
【図９】図９は、正常ドーパミンレベルまたはラット黒質の６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）損傷によって引き起こされる低ドーパミンレベルにインビボで馴化する細胞のカテコールアミン産出を比較している。パネルＡは、黒質の損傷領域（斜線棒）または非損傷領域（白棒）のいずれかにおけるインビボでの馴化時間の関数として、ＰＣ１２細胞からのＬ−ドーパ産出の基礎速度を示す。パネルＢは、黒質の損傷領域（斜線棒）または非損傷領域（白棒）のいずれかにおけるインビボでの馴化時間の関数として、ドーパミン産出速度に対するＬ−ドーパ産出速度比を示す。
【図１０】図１０は、霊長類脳におけるインビボでの馴化時間（月単位）の関数として、カプセル化ＰＣ１２細胞からのカテコールアミン産出を示す。白四角は基礎Ｌ−ドーパを表し、そして白丸は基礎ドーパミンレベルを表す。
【図１１】図１１は、Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）マトリックス中またはマトリックスなしのＨＦ  １２０７９４−６シングルスキンファイバーにカプセル化した、移植前、および１４ヶ月移植後のＢＨＫ−ｈＮＧＦクローン２３細胞からのＮＧＦ産出速度を示す。Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ  （ＣＢ）細胞は、非馴化ＢＨＫ−ｈＮＧＦクローン２３細胞である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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