(57)【要約】【課題】  遺伝子的に修飾された細胞を移植して、中枢神経系の欠陥、疾病、または損傷を治療するための組成物およびその調製方法を提供する。【解決手段】  中枢神経系において細胞の機能を回復するかあるいは改善する効果を有する機能性分子を生産することができる修飾されたドナー細胞を、遺伝子操作によって生成する。そして生成されたドナー細胞は、中枢神経系の欠陥、疾病、または損傷を治療するために注入して移植される。移植された細胞からは、細胞を修復するのに充分量の機能性分子が発現する。【選択図】図３
2005239721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系に欠陥、疾病又は損傷のある細胞を有する哺乳動物を治療するために、コリンクロライドを経口投与することと併せて投与されるための組成物であって、
コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）ｃＤＮＡを含有するベクターを挿入することによって遺伝子的に修飾されたドナー細胞を有効成分として含んでなる組成物。
【請求項２】
中枢神経系に欠陥、疾病又は損傷のある細胞を有する哺乳動物を治療するために、コリンクロライドを経口投与することと併せて投与されるための組成物を調整する方法であって、
コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）ｃＤＮＡを含有するベクターをドナー細胞に挿入することによってドナー細胞を遺伝子的に修飾する工程を含んでなる方法。
【請求項３】
哺乳動物の中枢神経系における欠陥、疾病又は損傷のある細胞を治療するのに投与されるための組成物を調整する方法であって、
機能性分子をエンコードする治療性のトランス遺伝子とドナー細胞が静止しているときに前記トランス遺伝子の発現を高めるようなプロモーターとを有するベクターをドナー細胞に挿入することによってドナー細胞を遺伝子的に修飾する工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、検体の中枢神経系（ＣＮＳ）に移植することによって、ＣＮＳの欠陥、疾病、あるいは損傷を治療するために、ドナー細胞の遺伝子的修飾を行う組換え技術を用いることに関する。より具体的には、この発明は、ＣＮＳ中の細胞に対して改善効果を有する分子をコードしている遺伝子をドナー細胞に挿入することに関し、それには、神経細胞ををドナー細胞に挿入して、当該ドナー細胞がＣＮＳに移植された場合に、前記分子が発現して、疾病に罹りまたは損傷を受けている細胞に対してそれらの分子の効果を作用させるようにすることが含まれる。
【０００２】
この発明は、米国海軍研究局（the Office of Naval Research）から認可された第Ｎ０００１４−８６−Ｋ−０３４７号助成委託契約、並びにＮＩＨから認可された第ＨＤ−２００３４号、第ＮＩＡ−０６０８８号、第ＨＤ−００６９９号及び米国保健福祉省（the Department of Health and Human Services）から認可された第ＮＩＡ  Ｒ０１  ＡＧ０８５１４号助成委託契約の下に、米国政府の援助を受けてなされたものである。米国政府は、この発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＮＳの欠陥に起因し、または疾病もしくは傷害の結果として起きる哺乳動物の脳の修復またはＣＮＳ機能の取り替えに対する試みは、ＣＮＳにおける複雑な構造と機能の関係の不十分な理解によって妨げられている。近年になって脳における細胞機能のいくつかの基本的原理の知識は大いに前進したが、脳の異なった領域における細胞のクラスターまたはシステムと細胞回路との間の相互作用および行動と神経学的機能の外への表れのこれらとの関係に関する理解は、ずっと遅れている。これらの問題へのアプローチの困難は、一部は哺乳動物ＣＮＳにおける多数の異なった細胞タイプとその連結の数と複雑性によってひき起されている。これに加えて、血液-脳関門が、診断、処置および新規な治療の設計に対し脳へのアクセスをさらに困難にしている。
【０００４】
たいていの正常または異常な脳機能に関する病理生理学の高度の知識がないのにもかかわらず、ＣＮＳ機能障害に対する薬理学的治療へのいくつかの試みがすでに有用かつ有効となってきている。これらには、精神医学的障害、例えば精神分裂病に対する精神に作用する薬剤の使用や、ＣＮＳ障害の生化学的細胞的基礎が比較的よく理解されている例えばパーキンソン病のようなまれなケースにおける特異的取り換え治療が含まれる。たいていの治療上のアプローチの中心にあるのは、疾病または傷害の結果として失われた脳の特異的化学的機能の取り替え、または復活という目的である。
【０００５】
脳内神経の移植は、最近になってＣＮＳ治療への付加的な可能性のあるアプローチとして浮かび上がった。治療上有用な代謝物を産生し分泌することができる細胞の取り替えまたはCNSへの付加は、反復した投薬を避け、また血液-脳関門による薬剤供給合併症(drug delivery complication)を避けるという利点を提供できる(Rosenstein, Science 235:772-774 (1987))。脳内移植の概念と基礎的手法については数十年来知られているが、移植された細胞の生存を最高にするための因子の大部分は、最近になって研究され部分的に理解されるようになったばかりである(Bjorklund et al., in Neural Grafting in the Mammalian CNS, p. 709, Elsevier, Amsterdam (1985); Sladek et al., in Neural Transplants: Development and Fuction, Plenum Press, NY (1984))。信頼でき、かつ有効な移植生存に対して決定的ないくつかの因子が確認されているが、このなかには次のものが含まれる。
【０００６】
すなわち、
（１）ドナーの年齢：移植の効率はドナー細胞の年齢が増加するほど減少する。
（２）ホストの年齢：若い受容体は年とったものよりもよりたやすく移植を受け入れる。
（３）ホストおよびドナー組織における神経栄養因子の利用可能性：創傷誘発神経栄養因子は移植生存を高める。
（４）免疫学的応答：脳は全く免疫学的に特権のある部位であるということではない。
（５）標的-ドナーマッチングの重要性：ニューロンはそれらが正常に分布するような部位に移植されたときによりよく生存する。
（６）血管新生：移植は迅速に血管新生されるべきであり、または周囲から十分によく栄養を与えることが重要である。
【０００７】
これらの決定的な因子が認識され、完全になるにつれて、脳内移植は、神経生理学者に対してＣＮＳ機能の研究に、また可能性として臨床医にはＣＮＳ疾病の治療の設計に対して有効で信頼性のある道具となってきた。このアプローチは、パーキンソン病においては実験的臨床的適用の水準まで到達している。
【０００８】
パーキンソン病は、年齢関連の傷害であって、主要な標的器官としての基底神経節を有する中脳の黒質中におけるドーパミンニューロンの欠失によって特徴付けられる。症状としては、震え、硬縮および運動失調を含む。この疾病は進行性であるが、ドーパミンに対する前駆体であるＬ−ドーパの薬理学的用量の投与を介しドーパミンの取り替えによって処置することができるが(Marsden, Trends Neurosci. 9:512 (1986); Vinken et al., in Handbook of Clinical Neurologyp. 185, Elsevier, Amsterdam (1986))、薬物療法の慢性使用によって患者はしばしばＬ−ドーパの継続的効果に対して無反応になる。この無反応状態の進展に対しては多くのメカニズムが示唆されているが、最も簡単なものは患者が細胞欠失の閾値に達するということで、この場合には残った細胞は前駆体から十分なドーパミンを合成することができない。パーキンソン病は、治療的脳内移植がヒトに使用された脳の最初の疾病である。患者の脳へ副腎髄質細胞を同種移植することによって、パーキンソン患者の病んだ基底神経節細胞へ神経伝達物質ドーパミンを供給するためにいくつかの試みが行われた(Backlund et al., J. Neurosurg. 62:169-173 (1985); Madrazo et al. New Eng. J. Med. 316:831-836 (1987))。
【０００９】
他のドナー細胞、例えば黒質からの胎児脳細胞、これはドーパミン含有細胞体に富む脳の領域であり、またパーキンソン病において最も冒される脳の領域であるが、この細胞の移植によって、選択的ドーパミン神経毒によって誘発された行動的欠損を戻すのに効果的であることが示された(Bjorklund et al., Ann. N.Y.Acad. Sci. 457:53-81 (1986); Dunnett et al., Trends Neurosci. 6:266-270(1983))。これらの実験は、シナプス連接度は機能的移植に対する要件ではないこと、および欠陥細胞の近傍においてドーパミンを構成的に産生し分泌する細胞を有することで十分であることを示唆している。
【００１０】
この背景において、パーキンソン病は、遺伝子工学的に加工された細胞の移植に対して候補となる疾病である、というのは、（１）化学的欠損がよく知られている(ドーパミン)、（２）ドーパミン産生における速度制限酵素に対するヒトおよびラット遺伝子がクローニングされている(チロジン ヒドロキシラーゼ)、（３）冒されている領域の解剖学的位置が確認されている(基底神経節)、（４）完全な機能的修復に対してシナプス連接度は要求されていないように思われるからである。
【００１１】
他のＣＮＳ疾病、このなかにはハンチングトン病(Gusella et al., Nature 306:234-238 (1983))、アルツハイマー病(Delabar et al., Science, N.Y. 235, 1390-1392 (1987); Goldgaber et al., Science, N.Y. 235:877-880 (1987); St.George-Hyslop et al., Science, N.Y. 235:885-890 (1987); Tanzi et al., Science, N.Y. 235:880-884 (1987)、バイポーラ(bipolar)病(Baron et al., Nature 326:289-292 (1987))、精神分裂症(Sherrington et al., Nature 336:164-167 (1988))、およびその他多くのヒトの疾病が含まれるが、これらの疾病の急速に増しているリスト中における遺伝子成分の最近の実証によれば、遺伝子治療はこれらのＣＮＳ疾病を取り扱う有用なアプローチであることを示唆している。
【００１２】
過去数十年間の精神生物学の進歩と平行して、分子生物学の理解における進歩と、高度の分子遺伝子手法の発展は、ヒトの疾病一般への新規な洞察を提供している。結果として、医学者と遺伝学者は生化学と遺伝子レベルにおいて多くのヒトの疾病の深遠な理解を発展させた。多くのヒトの遺伝子的疾患の正常および異常な生化学的特徴が理解され、関連した遺伝子が単離され特徴付けられ、また早期のモデルシステムが機能的野生型遺伝子を突然変異細胞中へ導入して疾病表現型を修正するために開発された(Anderson, Science 226:401-409 (1984))。このアプローチの全動物への拡張、すなわち機能遺伝子の薬理学的薬剤としての使用を介してのインビボでの疾病表現型の修正は、”遺伝子療法”と呼ばれるようになった(Friedmann et al., Science 175:949-955 (1972); Friedmann, Gene Therapy Fact and Fiction, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1983))。遺伝子療法は、疾病表現型の修正は内在する突然変異遺伝子の表現型の修飾により、またはインビボの欠陥のある、もしくは傷害を受けた細胞への新規な遺伝子情報の導入によって達成できるという仮定に基づいている。
【００１３】
現在においては、遺伝子療法の理想的なバージョンに対する技術、すなわち部位特異的遺伝子配列を介してのインビボでの修正または取り替えは、ちょうど考え始められたところで、まだよく発展していない。したがって、遺伝子療法の現在のモデルの多くは、取り替えモデルよりも実際には遺伝子の増量であり、効率的な遺伝子トランスファーシステムの開発に依存して、機能的野生型遺伝子情報をインビトロおよびインビボで遺伝子的に欠陥のある細胞内に導入することである。臨床的に有用とするためには、機能的ＤＮＡ配列(トランスジーン)に対する効率的なデリバリーベクターの利用可能性は、適当な疾病関連標的細胞または器官に近づきやすいこと、およびこれらの標的細胞へ安定かつ安全にベクターを導入するための技術の開発と結合されなければならない。
【００１４】
単純な酵素欠損の遺伝子的表現型的修正に対するモデルシステムが、特異的な代謝的遺伝子的疾病と関連した適当な可能性のある受容細胞および器官の確認と同様に現在開発研究の途上にある。授精したマウスの卵子へ導入された異種遺伝子が疾病表現型を修正できるということを示す証拠が最近得られた(Constantiniet al., Science 233:1192-1394 (1986); Mason et al.,Science 234:1372-1378 (1986); and Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))。
【００１５】
最近多大の注意が、遺伝子トランスファーに対するネズミ科レトロウイルスから誘導された遺伝子デリバリーベクターの使用に注がれてきている(Anderson, Science 226:401-409 (1984); Gilboa et al., Biotechniques 4:504-512 (1986))。このようなレトロウイルスベクターを使用するインビトロのトランスファーは広範囲の受容細胞に対して極めて効率的であり、このベクターは加えられる遺伝子に対して適当に大きな容量を有し、またこれらによる感染は受容細胞に対して僅かな代謝的または遺伝子的損害を与えるにすぎない(Shimotohno et al., Cell 26:67-77 (1981); Wei et al., J. Virol. 39:934-944 (1981); Tabin et al., Molec. Cell. Biol. 2:426-436 (1982))。いくつかの有用なシステムによって、レトロウイルスベクターによって細胞内へ導入された遺伝子の発現は、単一遺伝子酵素欠乏と関連したいくつかのヒト遺伝子疾病において代謝異常をインビトロで修正できることを証明した(Willis et al., J. Biol. Chem. 259:7842-7849 (1984); Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6563-6567 (1986))。遺伝子療法へのこのアプローチに対して可能性のある標的器官として骨髄に特に興味が持たれている。これは、地中海貧血、鎌状赤血球性貧血、ゴーシェー病、慢性肉芽腫病(ＣＧＤ)、ならびにプリン経路酵素、アデノシン デアミナーゼ(ＡＤＡ)およびプリン ヌクレオシド ホスホリラーゼ(ＰＮＰ)欠乏の結果である免疫欠乏病を含む種々の主要なヒトの疾病における骨髄誘導細胞系の傷害の普及と重要性のためである(Kantoff, supra; McIvor et al., Molec. Cell. Biol.7:838-846 (1987); Soriano et al., Science 234:1409-1413 (1986); Willis et al., supra))。その他の代謝的に重要な標的器官、例えば肝臓もまた最近これらの器官からの細胞のウイルス性ベクターによる感染の証明を介して遺伝子的処置に対して理論的に受け入れられるようになった(Wolff et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84:3344-3348 (1987))。さらに、多くの細胞特異的調整シグナル、例えばシス-アクティング エンハンサー、組織特異的プロモーター、およびその他の配列の発見は、インビボでの一般的非特異的感染および遺伝子トランスファーの後でさえも、他の多くの器官において組織特異的遺伝子発現を提供できるであろう(Khoury et al., Cell 33:313-314 (1983); Serflin et al., TrendsGenet. 1:224-230 (1985))。
【００１６】
遺伝子療法の最近開発されたモデルは、患者から採った標的細胞を用い、これを培養し、インビトロで遺伝子的に修飾してから患者に再移植する(Wolff et al., Rheumatic Dis. Clin. N. Amer. 14(2) 459-477 (1988); Eglitis et al., Biotechniques 6:608-614 (1988))。標的細胞には、骨髄幹細胞(Joyner et al.,Nature 305:556-558 (1983); Miller et al., Science 225:630-632 (1984); Williams et al., Nature 310:476-480 (1984))、線維芽細胞(Selden et al., Science 236:714-718 (1982); Garver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1050-1054 (1987) and St. Louis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3150-3154 (1988))、ケラチン細胞(Morgan et al., Science 237:1476-1479 (1987))、および肝細胞(Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344-3348 (1987))が含まれる。このインビボ遺伝子トランスファーの間接アプローチは、遺伝子を細胞へインビボで効率よく直接にトランスファーできないことによって必要とされている。ニューロンを培養によって遺伝子的に修飾することに向けての最近の進歩はいくらか見られるが(Geller et al., Science 241:1667-1669 (1988))、インビボ遺伝子トランスファーのこの間接的アプローチはＣＮＳにはまだ適用されていない。
【００１７】
新しい機能をＣＮＳ中の標的細胞に表現型的に有用なやり方で導入する、すなわち、欠陥、疾病、または機能障害を処置するためにはいくつかの方法がある（図１）。最も直接的なアプローチ、これは細胞移植に対する必要を全く回避するものであるが、機能が発育的または遺伝子的欠陥の結果として異常な細胞、すなわちテー-ザックス病、またおそらくレッシュ-ニハン病、およびパーキンソン病の場合においては神経細胞内へのトランスジーンの直接的導入である（図１中の１）。あるいは、標的細胞とギャップ結合またはその他の接触を築くことができる遺伝子的に修飾されたドナー細胞を導入することによって、欠陥のある標的細胞において新しい機能が発現される（図１中の２）。このような接触のいくつかは、代謝的に重要な小さな分子の１つの細胞から他の細胞への効率的な拡散を許して、受容細胞における表現型的変化へ導くことが知られている(Lowenstein, Biochem. Biophys. Acta. 560:1-66 (1979))。このプロセスは”代謝協同”と呼ばれ、線維芽細胞と神経膠細胞の間で起こることが知られているが(Gruber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6662-6666 (1985))、結論的にニューロンにおいてはまだ証明されていない。なおその他のドナー細胞が、近傍の欠陥のある標的細胞に取り上げられ使用されるような拡散可能な遺伝子産生物を発現し分泌することができる（図１中の３）。ドナー細胞はインビトロで遺伝子的に修飾され、または直接的にインビボで感染させられる（図１中の４）。このタイプの”協同性”は、ＣＮＳ傷害に続くコリン作動性神経死のNGF-仲介保護の場合のようにＣＮＳ細胞について証明された。(Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231-9235 (1986)) 最後に、複製-欠陥ベクターばかりでなく複製-コンピテント ヘルパー ウイルスによっても感染させられた導入されたドナー細胞は、局所的に高い力価の子孫ウイルスを産生し、これが順に近傍の標的細胞に感染して、機能的な新しいトランスジーンを産生することが可能となるであろう（図１中の５）。
【００１８】
哺乳動物の脳内にはいくつかのタイプのニューロンがある。コリン作動性ニューロンは、哺乳動物の脳内に見出され、ブローカの対角帯の中間隔膜(medial septum)と垂直肢から基底前脳の海馬体に突出している。対角帯の中間隔膜および垂直肢と海馬体とを結ぶ脳の短い神経様部分は”フィンブリエの円蓋(fimbria fornix)”と呼ばれている。脳弓采は中間隔膜と対角帯に位置するニューロンの軸索を含む。インビボでのニューロン生存の一般的に認められたモデルは、脳弓采のトランセクション(transection)または病変（”アクソトミ(axotomy)”とも呼ばれる）後における隔膜のコリン作動性ニューロンの生存である。アクソトミは隔膜と対角帯中のコリン作動性ニューロンを切断し、結果としてコリン作動性ニューロンの半分までを死なせる(Gage et al., Neuroscience 19:241-256 (1986))。この退行的応答は、神経成長因子（ＮＧＦ）からの栄養的支持の欠失に帰せられるが、このＮＧＦは正常では海馬から隔膜コリン作動性細胞体へと無傷の脳に逆行的に運ばれる(Korsching et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3513(1983); Whittemore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:817 (1986); Shelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2714 (1986); Larkfors et al.,J. Neurosci. Res. 18:525 (1987); and Seilor et al., Brain Res. 300:33 (1984))。
【００１９】
研究によって、アクソトミ前のNGFの慢性的室内投与が隔膜におけるコリン作動性ニューロンの死を防止するであろうということが示された(Hefti, J. Neurosci. 8:2155-2162 (1986); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231 (1986); Kromer, Science 235:214 (1987); Gage et al., J. Comp. Neurol. 269:147 (1988))。このように、アクソトミは逆行的ニューロン死を防止するために時間の種々の点において種々の療法の能力を決定するための一つのインビボモデルを提供する。
【００２０】
成体哺乳動物ＣＮＳの特性の一つは、摂動に続いて生成される新しい軸索は脳内において比較的短い距離だけ成長できるということである(Cajal, in Degeneration and Regeneration of the Nervous System, Oxford University Press, London, England, (1928))。成体ニューロンの傷害に対応した再生がこのように不可能なことは、次のような理由によるであろう。１）星状細胞の活性化であって、これはＣＮＳ全体に見出される支持、栄養的細胞で、傷害に続いて結果として瘢痕組織を形成し、これが軸索の再生に対して物理的関門として作用し、線維は瘢痕組織を横切ることができない、かくして星状細胞による瘢痕は軸索の伸長に対して助けとなる基質を提供することができない(Cajal, supra; Brown, J. Comp. Neurol. 87:131 (1947); Clemente, in Regeneration in the Central Nervous System, ed. Windle, pp. 147-161, Thomas, Springfield, (1955); Windle, Physiol. Rev. 36:426 (1956); and Reier et al., in Spinal Cord Reconstruction, eds. Kao et al., pp. 163-195, Raven, New York, (1983))。他方において、未熟なＣＮＳ中の星状細胞は軸索伸長の先導において重要な役割を演じる(Silver et al., J. Comp. Neurol. 210:10-29 (1982))。２）脳への傷害に続いて放出されるミエリン-関連の物質が軸索の成長をインビトロで抑制することが示された(Schwab and Croni, J. Neurosci. 8:2381-2393 (1988))。３）成体ＣＮＳにおける軸索再生の欠如は一部はそれぞれニューロンの再生を誘発し、軸索の成長を促進する栄養性分子の不適当な水準によるであろう(Reier et al., in Neural Regeneration and Transplantation, pp. 183-209, Alan R. Liss, New York, (1989) and Schwartz et al., FASEB J. 3:2371-2378 (1989))。
【００２１】
成体脳中での軸索再成長を妨げる多くの因子にもかかわらず、ラットＣＮＳ中のあるニューロン、特に網膜神経節ニューロンおよび隔膜コリン作動性ニューロンは、種々のタイプの基質への新しい軸索の伸長に対して顕著な可能性を発揮する。これらはいわゆる”神経橋(neural bridge)”であって、オートローガス(autologous)末梢神経のセグメント(David and Aguayo, Science 214:931 (1981);Benfry and Aguayo, Nature 296:150 (1982); Wendt et al., Exp. Neurol. 79:452 (1983); and Hagg et al., Exp. Neurol. 109:153 (1990))、コラーゲン マトリックス中の培養シュワン細胞(Kromer and Cornbrooks, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:6330 (1985))、胚ラット海馬(Kromer et al., Brain Res. 210:153(1981))、およびヒト羊膜(Gage et al., Exp. Brain Res. 72:371 (1988))が含まれる。脳の隔膜と海馬との連結度もニューロンの末梢ホモジネートの移植組織片を用いて証明された(Wendt, Brain Res. Bull. 15:13-18 (1985))。
【非特許文献１】Rosenstein, Science 235:772-774 (1987)
【非特許文献２】Bjorklund et al., in Neural Grafting in the Mammalian CNS, p. 709, Elsevier, Amsterdam (1985)
【非特許文献３】Sladek et al., in Neural Transplants: Development and Fuction, Plenum Press, NY (1984)
【非特許文献４】Marsden, Trends Neurosci. 9:512 (1986)
【非特許文献５】Vinken et al., in Handbook of Clinical Neurologyp. 185, Elsevier, Amsterdam (1986)
【非特許文献６】Backlund et al., J. Neurosurg. 62:169-173 (1985)
【非特許文献７】Madrazo et al. New Eng. J. Med. 316:831-836 (1987)
【非特許文献８】Bjorklund et al., Ann. N.Y.Acad. Sci. 457:53-81 (1986)
【非特許文献９】Dunnett et al., Trends Neurosci. 6:266-270(1983)
【非特許文献１０】Gusella et al., Nature 306:234-238 (1983)
【非特許文献１１】Delabar et al., Science, N.Y. 235, 1390-1392 (1987)
【非特許文献１２】Goldgaber et al., Science, N.Y. 235:877-880 (1987)
【非特許文献１３】St.George-Hyslop et al., Science, N.Y. 235:885-890 (1987)
【非特許文献１４】Tanzi et al., Science, N.Y. 235:880-884 (1987)
【非特許文献１５】Baron et al., Nature 326:289-292 (1987)
【非特許文献１６】Sherrington et al., Nature 336:164-167 (1988)
【非特許文献１７】Anderson, Science 226:401-409 (1984)
【非特許文献１８】Friedmann et al., Science 175:949-955 (1972)
【非特許文献１９】Friedmann, Gene Therapy Fact and Fiction, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1983)
【非特許文献２０】Constantiniet al., Science 233:1192-1394 (1986)
【非特許文献２１】Mason et al.,Science 234:1372-1378 (1986)
【非特許文献２２】Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)
【非特許文献２３】Anderson, Science 226:401-409 (1984)
【非特許文献２４】Gilboa et al., Biotechniques 4:504-512 (1986)
【非特許文献２５】Shimotohno et al., Cell 26:67-77 (1981)
【非特許文献２６】Wei et al., J. Virol. 39:934-944 (1981)
【非特許文献２７】Tabin et al., Molec. Cell. Biol. 2:426-436 (1982)
【非特許文献２８】Willis et al., J. Biol. Chem. 259:7842-7849 (1984)
【非特許文献２９】Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6563-6567 (1986)
【非特許文献３０】McIvor et al., Molec. Cell. Biol.7:838-846 (1987)
【非特許文献３１】Soriano et al., Science 234:1409-1413 (1986)
【非特許文献３２】Wolff et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84:3344-3348 (1987)
【非特許文献３３】Khoury et al., Cell 33:313-314 (1983)
【非特許文献３４】Serflin et al., TrendsGenet. 1:224-230 (1985)
【非特許文献３５】Wolff et al., Rheumatic Dis. Clin. N. Amer. 14(2) 459-477 (1988)
【非特許文献３６】Eglitis et al., Biotechniques 6:608-614 (1988)
【非特許文献３７】Joyner et al.,Nature 305:556-558 (1983)
【非特許文献３８】Miller et al., Science 225:630-632 (1984)
【非特許文献３９】Williams et al., Nature 310:476-480 (1984)
【非特許文献４０】Selden et al., Science 236:714-718 (1982)
【非特許文献４１】Garver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1050-1054 (1987)
【非特許文献４２】St. Louis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3150-3154 (1988)
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、効率的なベクターを介して遺伝子をトランスファーし、続いて遺伝子的に修飾された細胞をインビボで脳内移植する療法を開発し、これによって神経細胞の疾病、欠陥または機能異常を改善し、もって軸索の再生を促進して、ＣＮＳの傷害、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチングトン病を治療することは有益であるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この発明は、哺乳動物の中枢神経系における欠陥、疾病、あるいは損傷を被っている細胞を治療するための方法を提供するものであり、その方法は、中枢神経系に遺伝子的に修飾されたドナー細胞を移植することによって、中枢神経系における前記欠陥、疾病、あるいは損傷をこうむっている細胞を修復するのに充分量の機能性分子を生産することができるようにするものである。この細胞は、ｐＬＮ．８ＲＮＬ及びｐＬＴｈＲＮＬを含むウイルス性あるいはレトロウイルス性のベクター、すなわち、その細胞に直接的あるいは非直接的に作用する一個あるいはそれ以上の生産物をエンコードしている挿入された治療性の一個またはそれ以上のトランス遺伝子を含んでいるベクターを用いて操作されるか、あるいは細胞に機能性ＤＮＡを導入する他の方法によって操作される。その細胞は、培養されて、中枢神経系に懸濁液として注入される。また、中枢神経系における欠陥、疾病、あるいは損傷を受けている細胞を治療するための治療薬とともに投与される。この発明の方法は、ドナー細胞の選択と調整、トランスフェクション、及び移植を行うものである。
【００２４】
この発明のドナー細胞は、異なる解剖学的構造領域から得られる細胞タイプの混合細胞であり、また、プライマリー細胞あるいは不滅化された細胞であることができる。
【００２５】
ドナー細胞の移植は、哺乳動物のＣＮＳ内における数種の異なる部位に、ドナー細胞を複合的に移植することによって行われる。複合的に移植するための細胞は、異なるタイプのドナー細胞の混合物であってもよいし、また、同一のトランス遺伝子あるいは異なるトランス遺伝子を含有する同一タイプの細胞あるいは異なるタイプの細胞であってもよい。
【００２６】
移植は、例えばコラーゲンマトリックスのような基質物質内に細胞を植え付けて移植種を生存させることによって行うことができるし、あるいはそのような材料を用いることによって損傷した神経間の連結あるいは相互関係の改善を容易にすることができる。
【００２７】
この発明に用いられるベクターは、一個のトランス遺伝子あるいはそれ以上のトランス遺伝子の発現を高めることのできる例えばコラーゲンプロモーターのようなプロモーターを運搬するベクターを含む。
【００２８】
機能性分子の分泌は、前記分子に対する前駆体を用いることによって調節される。この発明の方法では、アセチルコリンを発現するように修飾された繊維芽細胞をＣＮＳに移植する段階と、移植された繊維芽細胞からアセチルコリンの分泌を維持しかつ高めるためのコリンクロライドの経口投与段階とを含む。
【００２９】
この発明は、哺乳動物の中枢神経系に移植された休止しているドナー細胞からの治療性のトランス遺伝子生産物の発現を高めることを含む。それは遺伝子的にドナー細胞を修飾するのに用いられるベクターに、休止しているプロモーターを挿入することによって行われる。そのプロモーターは、例えばコラーゲンプロモーター等の非−ウイルス性のプロモーターであることができる。サイトカイン（Cytokines）は、トランス遺伝子の発現を高めるためのプロモーターの活性を調節するために投与することができる。
【００３０】
免疫抑制剤は、インターフェロン−γの生産を抑制して、トランス遺伝子の発現を高めるために用いられるであろう。別法として、抗−炎症性の薬物は、治療性のトランス遺伝子の発現を高めるためにサイトカインの生産を減少させる目的で用いられる。また、成長因子をＣＮＳに移植されたドナー細胞の生存を維持するために用いることができる。
【発明の効果】
【００３１】
この発明は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に遺伝子的に修飾されたドナー細胞を移植することによって、ＣＮＳに生じた疾病あるいは損傷を治療することができる方法に関する。更に特定するとこの発明は、欠陥、疾病あるいは障害部分からから得られる細胞によって被る損傷を修復するために、ＣＮＳ内にある細胞に対する直接的あるいは非直接的な効果を有する分子を生産できるように修飾されたドナー細胞に挿入されている機能的遺伝子（トランス遺伝子）を運搬するベクターを使用することに関する。好ましくは、ＣＮＳにおける細胞の欠陥、疾病あるいは損傷を治療するために、例えば繊維芽細胞等のドナー細胞が、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）をコードする遺伝子等の一種のトランス遺伝子またはそれ以上のトランス遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを導入することによって修飾される。遺伝子的に修飾された繊維芽細胞は、例えば脳等の中枢神経系に移植され、その結果、欠陥やアルツハイマー病やパーキンソン病などの疾病、あるいは身体的な障害から生じる損傷を治療することができる。この治療は、その遺伝子的に修飾されたドナー細胞から発現することのできるトランス遺伝子生産物を発現させた結果として、損傷を受けている神経内における機能の回復、改善がなされることによるものである。ドナー細胞はまた、ＣＮＳ内に一個またはそれ以上のトランス遺伝子生産物を導入するのに用いられるものであり、そのトランス遺伝子生産物はインビボで改善された効果を有するような内生の分子の生産を高めるものである。
【００３２】
ここで用いられているように、「トランス遺伝子」または「治療生のトランス遺伝子」という用語は、機能性プロテインに対応するアミノ酸配列をコードしているドナー細胞に挿入されたＤＮＡを意味する。この機能性プロテインは、ＣＮＳの細胞に対して治療上の効果を発揮することができ、かつＣＮＳの細胞における機能の発現に対して調節できる効果を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（ドナー細胞インビトロでの遺伝子導入）
ドナー細胞インビトロでの導入する遺伝子の戦略は、図２に概略されており、以下の基本的な段階を含んでいる。（１）適切なトランス遺伝子またはＣＮＳ病や機能不全に関連して発現するトランス遺伝子の選択する段階。（２）遺伝子導入のための適当、効率的なベクターの選択と発展の段階。（３）プライマリー培養または確立された細胞培養系からのドナー細胞の調整する段階。（４）新しい機能を発現する移植されたドナー細胞が生存能力があり、安定的かつ効率的にトランス遺伝子産物を生産することができることの証明する段階。（５）移植が心身に有害な影響を引き起こさないことを証明し、（６）ホスト(host)内での望ましい表現系の効果が現れること。
【００３４】
この発明中で有用なトランス遺伝子によって生産された機能的な分子は、限定されたものではなく、成長因子、酵素、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起成長促進分子、代謝拮抗物質、これらの分子のプリカーサーを含む。特に、ドナー細胞に挿入したトランス遺伝子は、限定されたものではなく、チロシン水酸化酵素、トリプトファン水酸化酵素、ＮＧＦ，ＣｈＡＴ、ＧＡＢＡ−脱炭酸酵素、ドーパ脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）、エンケファリン、毛様体神経・栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経・栄養因子、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ＮＴ−４、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。
【００３５】
（ドナー細胞の遺伝学的な修飾）
レトロウイルスベクターを用い、ＣＮＳに融合させることでドナー細胞を修飾する以下に書かれた方法は、単に実例の目的と既に用いられてきた典型例でしかない。しかしながら、他の手順もその技術として理解され、用いられてきたものである。
【００３６】
細胞をトランスフォーメーションし、ベクターや類似の物を作ることに用いられてきた技術のほとんどは、技術として広く実行されており、多くの従業者は、特別な状態と手順を記述するような標準的な原料について熟知している。しかし、便宜上、以下に続く段落は指標として役立つであろう。
【００３７】
（ドナー細胞の選択）
移植に用いるドナー細胞の選択は、発現される遺伝子、ベクターの特色、望まれる表現系の結果の特性にかなり依存する。レトロウイルスベクターが効率的な感染、組込み、遺伝子発現に関して、細胞分裂とＤＮＡ合成を必要とするので（Weiss et al., RNA Tumor viruses, 2nd Ed., Weiss et al., eds., Cold SpringHarbor Press, New York (1985)）、もしそのようなベクターを用いるなら、ドナー細胞は、プライマリー繊維芽細胞系か確立された培養細胞系のように、嗅粘膜や発生中や再活動しているグリアのような選ばれた領域から初期の神経細胞を複製したり、成長した神経細胞を複製する、かなり活動的に成長する細胞系である。
【００３８】
プライマリー細胞、すなわち繊維芽細胞のような生体から新鮮に得られるような細胞や、トランスフォーメーションされた状態にない細胞は、現在の発明に用いるのに適している。他の適当なドナー細胞は、不死化した（細胞分裂を繰り返すトランスフォーメーションした細胞）繊維芽細胞、グリア細胞、副腎の細胞、海馬の細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、結合組織細胞、上衣の細胞、骨髄の細胞、幹細胞、白血球、クロム親和性細胞、遺伝学的手法や現在発明されている方法でつなぐことが可能な他の哺乳類細胞を含んでいる。
【００３９】
停止し、複製を行わない標的細胞の感染性を誘導する方法の応用は、他の多くの細胞型をウイルスによる形質導入に適した状態に変える。例えば、そのようなベクター感染に通常免疫性があるラットの成体肝細胞のプライマリー培養に完全なレトロウイルスベクターを感染させる方法が発達してきた。類似の方法が他の多くの細胞に役立つかも知れない（Wolff et al., Proc. Natl. Acad/ Sci. USA84:3344-3348 (1987)）。付け加えるならば、エレクトロポレーション(electroporation)（Toneguezzo et al., Molec. Cell. Biol. 6:703-706 (1986)）やリポフェクション(lipofection)、直接的に遺伝子を挿入するような、ドナー細胞にＤＮＡを導入する効率的な非ウイルス的方法と同様に、ヘルペス(herpes)、種痘疹、アデノウイルス由来の他の多くのベクターの発達が、現在のところレトロウイルス感染に感染性が無い他の多くの細胞に遺伝子を導入するために用いられるであろう。
【００４０】
移植の成功、不成功に関連するドナー細胞のもう一つの特徴は、ドナー細胞の継代数である。ここに現れた結果は、継代培養を重ねたヒトの細胞が移植に関してトランス遺伝子を伴うトランスフェクションに用いられる可能性を示している。
【００４１】
（ベクターの選択）
他のベクターが用いられるのだけれども、現在発明された方法に用いられる最適のベクターは、レトロウイルスを含むウイルスベクターである。選ばれたウイルスベクターは以下の基準に当てはまるべきである。１）ベクターはドナー細胞に感染できなくてはならない。すなわち、適切なホスト(host)を持つウイルスベクターが選ばれなければならない。２）導入される遺伝子は、細胞内での安定的な維持と発現の点で、細胞内にとどまる能力があり、細胞死が起きない限り細胞内で発現される。３）ベクターは、できることなら、標的細胞にほとんど損傷を与えないべきである。ネズミのレトロウイルスベクターは、哺乳類の細胞の効率的な外来遺伝子の導入と発現にとっては最良の手法となっている。これらのベクターは、非常に広いホストと細胞型の範囲を持ち、充分理解されたメカニズムでホストゲノムのランダムな部位に結合し、遺伝子を安定的にかつ効率的に発現させ、ほとんどの環境下でホスト細胞を殺したり、損傷を与えない。
【００４２】
（ベクター構築の一般的手法）
望ましい治療上の遺伝子コードと制御配列を含む適切なベクターの構築には、技術的には充分理解されている（Maniatis et al., in Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New york (1982) を参照）標準的な結合と再構築の技術を用いる。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、合成されたオリゴヌクレオチドは、望ましい形態に切断され、調整され、再結合される。
【００４３】
部位特異性ＤＮＡ切断は、技術的には広く理解されている条件下で適切な制限酵素、または商業的に利用できるように制限酵素の製造者によって特殊化された特別なもの（例えば、New England Biolabs Product Catalog を参照）によって執り行われる。一般に、およそ１μｇのプラスミドやＤＮＡ配列は、およそ２０μｌの緩衝液中に１ユニットの酵素によって切断される。典型的には、超過の制限酵素を用いると、ＤＮＡ基質の完全な切断を保障される。
【００４４】
変異を大目にみるならば、切断は３７℃で１〜２時間インキュベートすることでなされる。インキュベートの後、蛋白はフェノール／クロロホルム抽出液で抽出され、エーテル抽出液により再度抽出される。核酸は、エーテルにより沈澱にされ水層に保護される。もし望むのなら、標準的なテクニックだが、切断されたフラグメントの大きさによる分離をポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行う。大きさによる分離の一般的な記述は、Methods of Enzymology 65:499-560 (1980) に見られる。
【００４５】
制限酵素によるフラグメントは、４種類のデオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰｓ）存在下で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７．６） ５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、６ｍＭ ＤＴＴ，５−１０μＭ ｄＮＴＰｓ、２０℃−２５℃で１５−２０分のインキュベート時間で扱われ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の大きなフラグメントによって扱われる平滑断片であるかもしれない。Ｋｌｅｎｏｗのフラグメントは５’末端が付着末端ばかりであり、たとえ４種類のｄＮＴＰ存在下でも１本鎖が突き出ている３’末端と噛み合う。もし望むのなら、選択的な対合はｄＮＴＰｓが一つだけ、付着末端の性質に見つけられない制限内で選択されたｄＮＴＰｓを与えられることでなされる。Ｋｌｅｎｏｗ処理後、混合液はフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈澱される。Ｓ１ヌクレアーゼやＢａｌ−３１で適切な環境下で処理すると、どの１本鎖の部分も加水分解される。
【００４６】
結合は、以下に示される標準的な条件または温度で、１５−５０μｌの容積でなされる。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ ＮａＣｌの反応液の他、４０μＭ ＡＴＰ，０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニット Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを１５℃で反応させるか（付着末端を結合するとき）、１ｍＭ ＡＴＰ，０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニット Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを２５℃で反応させる（平滑末端を結合するとき）。分子間の付着末端結合は、通常全ＤＮＡ濃度が３３−１００μｇ／ｍｌ（５−１００ｎＭ全末端濃度）で行われる。分子間の平滑末端結合は、（通常リンカーの１０−３０倍）全末端濃度が１μＭでなされる。
【００４７】
ベクターフラグメントを用いるベクター構築で、ベクターフラグメントは、通常５’末端の燐酸を取り去り、ベクターの再結合を阻害するために、バクテリア由来のアルカリフォスファターゼ(alkaline phosphatase)（ＢＡＰ）かコウシの腸由来のアルカリフォスファターゼ（ＣＩＰ）で処理される。切断は、ｐＨ８、Ｎａ＋，Ｍｇ＋２の存在下で、ベクター１ｍｇ当りおよそ１ユニットのＢＡＰかＣＩＰ、３７℃、約１時間でなされる。核酸フラグメントを回収するために、フェノール／クロロホルム混合液での抽出と、エタノール沈澱によって調整される。代わりに、ベクターの再結合は、必要としないフラグメントを切断するために付加した制限酵素の切断によって阻害されうる。
【００４８】
レトロウイルスベクターの調整の方法は、既に記述されている（Yee et al., Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol. Vol. LI, pp. 1021-1026 (1986); Wolff et al., Proc. Natl. Sci. USA 84:3344-3348 (1987); Jolly et al., Meth. in Enzymol. 149:10-25 (1987); Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5:431-437 (1985); and Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986), and Eglitis et al., Biotechniques 6:608-614 (1988)）し、今や多くの研究室で広く利用されている。レトロウイルスは、バクテリアの複製のためのプラスミド配列を含むのと同様に、レトロウイルスの長い終末反復配列（ＬＴＲｓ）とパッケージング（プサイ、Ψ）配列を含んでおり、真核細胞の複製のためのＳＶ４０の早期プロモーターやエンハンサーのような他の配列も含んでいる。ベクターは、ウイルス内にＲＮＡとして収納されており、細胞系の中にＤＮＡ構成物をトランスフェクションする。これらは、げっし類の細胞に感染できるウイルスの外膜を作るプサイ（Ψ）２、広範囲の種に感染できる外膜を作るプサイＡＭとＰＡ１２を含む。
【００４９】
好まれるウイルスベクターにおいて、トランス遺伝子は、ウイルスのＬＴＲプロモーター−エンハンサーシグナルか、内部のプロモーターの制御下で扱われる。そして、レトロウイルスのＬＴＲ内で保持されたシグナルはホスト細胞のゲノムに効率よく結合される。遺伝性のウイルスを調整するために、不完全なベクターの組替えＤＮＡ分子が、ウイルスの転写産物を遺伝性のウイルス外膜に包むために必要なレトロウイルスの機能の全てを発現するが、しかしＲＮＡ転写産物を成熟したウイルス外膜で包み込むために必要な決定的なシグナルを欠いているようなプロウイルス(provirus)を含む「プロデューサー」細胞系にトランスフェクションされる。これらは、グループ特異性抗体（ＧＡＧ）と、キャップシド(capsid)蛋白と逆転写酵素（ＰＯＬ）をコードするエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子を含む。この欠如のために、ヘルパーからの転写産物は、ウイルス外膜に包まれることができず、それゆえプロデューサー細胞は空のウイルスのみを作り出す。しかし、ＧＡＧ，ＥＮＶやＰＯＬ遺伝子が完全なプサイ配列を伴うトランス遺伝子によって移動させられた方法である、カルシウム燐酸調整トランスフェクションを用いて同じ細胞内に導入された、結合された欠陥のあるレトロウイルスベクターは、それらがパッケージング配列を持つので、トランスに包まれた転写産物を生産する。その細胞は、ホスト細胞ゲノムの別の部位で結合された２つのプロウイルス配列を含む。新しく導入されたプロウイルスからのＲＮＡ転写産物がパッケージング配列を持つので、それらは、トランスで作られたウイルス機能によってウイルス外膜に効率よく包み込まれた。理想的には、その結果は、トランス遺伝子を複製拮抗形の野性株ヘルパーウイルスから自由にする感染性した細胞による生産である。たいていの場合、遺伝子治療の全てのモデルに必要と言うわけでもないが、ヘルパーウイルスの生産は、とうてい望まれたものではない。なぜならば、ホスト動物のリンパ球やほかの組織への感染や病気を広げることに通じるかもしれないからである。
【００５０】
ヘルペスウイルスは潜在的な感染と、ある神経細胞との間に明らかに発病しない関係を確立させる能力を持つことから、ヘルペス由来のベクター、すなわち、ＨＳＶ−ＨＳＶ−１が用いられる。よく似たことだが、有用な輸送、発現ベクターをかいりょうすることは、狂犬病ウイルス、麻疹、他のパラミクソウイルス、ヒトの免疫不全レトロウイルス（ＨＩＶ）のような、ＣＮＳの細胞に効率的に感染する、他の人や動物ウイルスを最終的に理解する上で利点を得ることになるだろう。ほとんどの場合、狂犬病ウイルスを例外とするが、これらのウイルスの感染は真の意味での神経・栄養性ではない。むしろ、ホスト細胞の感染性がかなり高いことによる。それらは、感染の代謝的、生理学的効果が，ＣＮＳの細胞中で表れるので、神経・栄養性のようである。それ故、これらのウイルス由来の多くのベクターが細胞領域で様々な細胞と関係を結ぶようであり、発現に対するＣＮＳ特異性は、ＪＣウイルスのオリゴデンドログリア(oligodendroglia)特異性発現、脂質蛋白複合体とグリア細胞繊維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）遺伝子のグリア細胞特異性発現、マウスの他のＣＮＳ特異的機能を制御するような、適切な細胞特異性のエンハンサー、プロモーター、他の配列を与えられなければならない。
【００５１】
ＣＮＳ疾患を修飾するために細胞に遺伝子導入するのに用いられる他のウイルスベクターは、モロニー(Moloney)マウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のようなレトロウイルス，ＪＣ、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス(polyoma)、アデノウイルスのようなパポーバウイルス(papovavirus）、エスプタイン−バールウイルス(Esptein-Barr)（ＥＢＶ）、乳頭腫ウイルス、すなわちウシのウイルスｔｙｐｅ Ｉ（ＢＰＶ）、種痘疹やポリオウイルス、他のヒトや動物ウイルスを含む。
【００５２】
欠陥のあるウイルスベクターを用いることで生まれてきた問題は、細胞内のウイルス様または他の配列の再配列によって、発病性、複製拮抗性、野性株ウイルスの最終的な出現や「救済」の可能性である。この可能性は、ベクターの感染、安定化、発現に必要でない全てのウイルス制御配列の除去により減少される。
【００５３】
ドナー細胞に機能のあるＤＮＡトランス遺伝子を導入する以上述べてきた方法に付け加えるならば、他の方法も使えるであろう。例えば、ベクターを用いない方法は、非ウイルス的に細胞にＤＮＡを物理的にトランスフェクションする方法を含んでいる。例えば、マイクロインジェクション(microinjection)（DePamphilis et al., BioTechnique 6:662-680 (1988)）、エレクトロポレーション（Toneguzzo et al., Molec. Cell. Biol. 6:703-706 (1986)、 Potter, Anal. Biochem. 174:361-373 (1988)）、カルシウム燐酸トランスフェクション法（Graham and van der EB, 同上、Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)、 Chen and Okayama, Biotechnique. 6:632-638 (1988)）、ＤＥＡＥ−デキストラン修整転移（McCutchan and Pagano, J. Natl. Cancer Inst. 41:351-357 (1968)）など、化学的に修整してトランスフェクションする方法、陽イオンでリポソーム修整することによるトランスフェクション（Felgner et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)、Felgner and Holm, Focus 11:21-25 (1989)、 および Felgner et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 32:115-121 (1989)）、他にも技術的に知られている方法がある。
【００５４】
（ドナー細胞による表現型修正のメカニズム）
（ドナー細胞の調整）
ドナー細胞は移植のために適正な処理をせねばならない。例えば、この発明による遺伝的に修飾されたドナー細胞の注入のために、皮膚サンプルより得た繊維芽細胞の様な細胞は細胞の増殖や保存のために適した培養培地、例えば接触したまま増殖できるように牛胎児血清（ＦＣＳ）、中に置く。０．０５％トリプシンを含む、リン酸で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）のような培養基培養することにより細胞を遊離させ、グルコース１ｍｇ／ｍｌ；ＭｇＣｌ０．１ｍｇ／ｍｌ；ＣａＣｌ2 ０．１ｍｇ／ｍｌとトリプシンを不活性化するための５％の血清を加えたＰＢＳのような緩衝液で保存する。細胞をＰＢＳを用いて遠心分離によって洗浄し、その後トリプシンを除いたＰＢＳだけで再懸濁して注入に適した濃度にする。ＰＢＳに加えて、宿主の持つ物質に対して生理的に不活性な浸透圧平衡溶液を、懸濁や宿主へのドナー細胞の注入に用いてもよい。
【００５５】
移植細胞の長期生存は、細胞へのウイルスの感染、培養条件によって起こる細胞の損傷、細胞の移植や適切な血管新生(vascularization)の定着の方法、外来の細胞や導入遺伝子の生成物に対する免疫応答の効果、に依存する。哺乳動物の脳は伝統的に免疫学的に特別な器官と考えられてきたが、最近の研究によりラットの脳における外来の抗原に対する免疫反応が最終的に分かってきた。拒絶反応や移植細胞による移植細胞と宿主との反応の可能性を、表現型修正に関係する以上には細胞表面の抗原を変化させないベクターの使用や、胎児期のような、宿主細胞が免疫的に耐性のある時期の細胞を導入することが可能な場合にも、自己由来の細胞の使用により最小限にすることが重要である。
【００５６】
この発明における、患者のＣＮＳ中の疾病や外傷や損傷を処理するための、変異遺伝子をもつドナー細胞の移植における最も効果的な方法と時期は、ＣＮＳ中の神経単位のような細胞に対する損傷のひどさや疾病や外傷のひどさや経過、患者の健康と処理に対する応答、そして処理をする健康の専門家による判断に依存する。
【００５７】
もちろん、他の全ての遺伝子移植システムと同様に、正確な遺伝子発現は、遺伝子発現の程度が期待された表現型の効果を達成するに充分で、細胞に毒性を示すほど高くないことが確実となることに決定される。
【００５８】
遺伝子治療のために移植されるような遺伝子的強化(engineered)細胞を用いることに関連する問題は、細胞が静止期（分裂しない）になることによって遺伝子の発現（遺伝子転移を含む）が減少することが観察されることである（「ダウンレギュレーション」）（Palmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1330-1334 (1991)）。最初に脳に移植された繊維芽細胞は、それらが形質転換を受けて腫瘍形成性になっていないまま移植された場合には、分裂を続けない。だから、それらは脳内で静止期のまま存在する。従って、変異遺伝子の維持または発現を増加させるための手段を提供することは、細胞分裂することなく、遺伝子治療のための繊維芽細胞中の治療遺伝子の長期間安定した発現を促進するために有用である。
【００５９】
遺伝子の発現は、転写、翻訳、転写後の段階で調節される。転写開始は、遺伝子発現において初期の重要な出来事である。これはプロモーターとエンハンサーの配列に依存し、これらの配列と相互作用する細胞の特別な因子に影響を受ける。多くの原核遺伝子の転写単位は、プロモーターと、ある場合にはエンハンサーやレギュレーターといった成分とからなる（Banerji et al., Cell 27:299 (1981); Corden et al., Science 209:1406(1980); and Breathnach and Chambon, Ann.Rev.Biochem.50:349(1981)）。レトロウイルスの場合は、レトロウイルスのゲノムの複製に必要な調節因子は、長い範囲の反復（ＬＴＲ）に存在する（Weiss et al., eds., In: The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1982)）。モロニー(Molony)ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）とルー(Rous)肉腫ウイルス（ＲＳＶ）は、プロモーターとエンハンサーの配列を含む（Jolly et al. Nucleic Asid Res. 11:1855 (1983); Capecchi et al., In :Enhancer and eukaryotic geneexpression, Gulzman and Shenk,eds., pp.101-102, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York)。いくつかの非ウイルス性のプロモーターのプロモーターとエンハンサー領域も記載されている（Schmidt et al., Nature 314:285(1985)、Rossi and de Crombrugghe, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5590-5594(1987)）。
【００６０】
この発明は、コラーゲン・タイプＩ（α１とα２）（Prockop and Kivirikko, N.Eng. J. Med. 311:376 (1984); Smith and Niles,Biochem. 19:1820 (1980); deWet et al.,J.Biol.Chem. 258:14385 (1983)）、ＳＶ４０およびＬＴＲプロモーターを含むプロモーターを用いて、静止期細胞中のトランス遺伝子の発現を維持し、増加させるための方法を提案した。
【００６１】
プライマリーな繊維芽細胞のようなドナー細胞中での、トランス遺伝子の発現を調節するためのウイルス及び非ウイルスプロモーター使用に加えて、エンハンサー配列トランス遺伝子発現のレベルを上げるために用いられてきた。エンハンサーは、それら本来の遺伝子だけでなく、いくつかの外来遺伝子の転写活性をも増加することができる（Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2702 (1973)）。たとえば、この発明において、コラーゲンのエンハンサー配列は、トランス遺伝子の発現を増加させるために、コラーゲンプロモーターα２（Ｉ）とともに用いられた。
【００６２】
加えて、ＳＶ４０ウイルスに見いだされるエンハンサー配列要素は、トランス遺伝子の発現を増加させるために用いられてきた。このエンハンサー配列は、Grusset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:943 (1981)、Benoist and Chambon, Nature 290:304 (1981)、そして Fromm and Berg, J. Mol. Appl/Genetics, 1:457 (1982) に記載されたように反復する７２塩基対から成り、それらのすべてはこのリファレンスに入っている。この反復配列は、いろいろなプロモーターと連続して存在する場合に、多くの異なるウイルスや細胞性の遺伝子の転写を増加することができる（Moreau et al., Nucleic Asid Res. 9:6047 (1981)）。ほとんどの場合に、ＳＶ４０エンハンサー要素は、プラスミドＤＮＡ中に、配向していてもいろいろな方向を向いていても、または、配向しているかいろいろな方向を向いているかどちらかで存在する場合に、完全に機能する（上記 Fromm and Berg）。ＳＶ４０エンハンサーが、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ）からの転写をアップレギュレーションする能力は、ニワトリ繊維芽細胞とサル腎臓ＣＶ−１細胞において確認されている（Xu et al., In Enhancer and Eukaryotic Gene Expression, Gulzman and Shenk, eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, pp. 51-54 (1983)）。これらの細胞では、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターの下流にあるＳＶ４０エンハンサー領域を含むベクターは、クロラムフェニコールのアセチル基転移酵素の活性を、レポーター遺伝子を用いて、ＣＶ−１とＣＥＦ細胞においてそれぞれ６４倍と１８倍に増加した。
【００６３】
トランス遺伝子の発現も、プロモーター活性を調節するためにサイトカインを用いた場合、移植後の長期間安定な発現が増進されるようである。数種のサイトカインが、コラーゲンα２（Ｉ）とＬＴＲプロモーターからのトランス遺伝子の発現を調節すると報告されている（Chua et al., Connective Tissue Res. 25:161-170 (1990)、Elias et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 580:233-244 (1990)、Seliger et al., J.Immunol. 141:2138-2144 (1988) および Seliger et al., J.Virology 62:619-621 (1988)）。例えば、形質転換成長因子（ＴＧＦ）β、インターロイキン（ＩＬ）−１β、インターフェロン（Ｉｎｆ）αまたはγは、ＬＴＲのようなウイルスプロモーターによって制御されるトランス遺伝子の発現をダウンレギュレートする。α２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ）により制御されるトランス遺伝子の発現を、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＧＦβ１、そしてＩＦ−１βがアップレギュレートする。ここに登場した結果は、ＴＮＦα，ＴＧＦβ、そしてＩＬ−１βのようないくつかのサイトカインが、繊維芽細胞のようなドナー細胞中のプロモーターによって制御されるトランス遺伝子の発現を調節するために用いられてきたことを示す。有用性が証明されている他のサイトカインには、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）や表皮増殖因子（ＥＧＦ）がある。
【００６４】
コラーゲンエンハンサー配列を伴ったコラーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ(Ｅ)）は、移植後に脳内に存在する、修飾されたドナー細胞においてトランス遺伝子の発現を増加するための高濃度のサイトカインを利用するために用いることができる。加えて、デクサメタゾーンのような、ステロイドを含む抗炎症剤を、繊維芽細胞の移植後すぐに、そして引き続いて、サイトカインによって炎症反応が治まるまで、移植された患者に投与してよい。ある場合には、シクロスポリンのような免疫抑制剤を、ＬＴＲプロモーターやＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーをダウンレギュレートしてトランス遺伝子の発現を抑えるインターフェロン−γの生成を減少させるために投与してもよい。
【００６５】
インビボでの使用においては、コラーゲンプロモーターによって制御されるトランス遺伝子は、細胞に導入してその後直接脳に移植し、他からの影響を受けないようにする。患者の自然な応答として移植後に放出されたサイトカインは、選択されたトランス遺伝子の転写によって制御されるコラーゲンプロモーターを刺激する。
【００６６】
成長因子ｂＦＧＦとＥＧＦを含むサイトカインもまた、ＣＮＳ中に移植されたドナー細胞の生存を高めるために、移植前、移植中又は移植後に投与してよい。
【００６７】
移植後の遺伝的に高められた遺伝子の産物の分泌を調節できることは有用である。ここで示した具体例と同様に、伝達物質アセチルコリン（Ａｃｈ）のような遺伝子産物の放出は、アルツハイマー病では非常に少ない。ＭＬＶベクターに感染した培養細胞コリンのアセチル基転移酵素ｃＤＮＡの発現は、アセチルコリンの前駆体コリンを用いて増加できた。このことは、大脳内の遺伝子療法の食事制限の方法を示唆する。
【００６８】
いくつかの、あるいは多くのＣＮＳ疾患遺伝的修正は、正しい細胞間のシナプス連結の構成または再構成を必要とするようだ。これらの可能性を研究するためのモデル系はまだ開発されていない。複製して(replicating)形質転換されていない細胞培養系が少なく、複製しない神経細胞でもレトロウイルスの感染に対して応答がないためである。しかし、最近の研究によれば、胚の海馬神経細胞の永続性を必要とするものを含むが、複製する神経細胞培養系は、インビボでの遺伝子転移やさらにインビボでの移植のためにすぐに利用できるようになるようである（Caettano and MacKay, Nature 347:762-765 (1990)）。
【００６９】
そのようなニューロンは、レトロウイルスや他のウイルスからのベクターによる有効な導入を可能にし、またもしそれらが神経細胞としての特徴を保持できるなら、それらは脳内に移植された後他の細胞とシナプス接合を形成できるであろう。代わりになるものとして、ＣＮＳ中に存在する細胞で、海馬の歯状回腹葉のように発達の遅いものや 、嗅覚粘膜や歯状回のように生体においても分裂を続けるものがある。
【００７０】
移植に非神経細胞を用いることは、宿主内部の標的細胞との特異的な神経接合の発達を妨げる。だから、繊維芽細胞や他の非神経性のドナー細胞や、インビボの標的細胞の表現型に及ぼす効果は、必要とされる遺伝子産物や代謝産物の拡散か、、ギャップ結合（「代謝的共同作用」）か、ドナー細胞から分泌された遺伝産物や代謝産物の標的細胞による取り込みか、による。ドナー細胞はまた、新しい遺伝子産物や代謝産物が発現することによって、毒物の「シンク」となって神経毒を除去する。
【００７１】
代わりとして、神経ブリッジは、損傷を受けたＣＮＳ組織中のニューロン間の再結合を促進する。上部に記したように、コラーゲンマトリクスのような培養基物質に懸濁して移植されたドナー細胞は神経ブリッジとして軸索の再生や損傷したニューロンの再接合を促進し、合成または生体内物質、例えば神経細胞や胎盤の破砕懸濁液あるいは神経突起を伸長させる細胞外マトリクス、から形成される神経ブリッジとの連絡に用いられるようだ。
【００７２】
（移植）
この発明の方法は、欠陥、疾病及び外傷を受けたＣＮＳの領域に挿入するトランス遺伝子を含有するドナー細胞の脳内移植を企図するものである。
【００７３】
神経トランス植え付け、または「移植」は、中枢神経系内への細胞植え付け、または脳室腔内への細胞植え付けや宿主脳の表面の硬膜下への細胞植え付けを含むものである。好結果を得る植え付けに対する条件は（１）移植の生存率（２）植え付け部位における移植片の保持力（３）植え付け部位における病理学的な反応の最小量、である。
【００７４】
例えば、胎児の脳組織のような多種の神経組織を宿主脳へ植え付ける方法は、Neural Grafting in the Mammalian CNS の中に記述されてきた。Bjorklund and Stenevi,eds.,(1985) Das,Ch.3 pp.23-30;Freed ,Ch.4,pp.31-40;Stenevi et al.,Ch.5,pp.41-50;Brundin et al.,Ch.6,pp.51-60;David et al.,Ch.7 ,pp.61-70;Seiger,Ch.8,pp.71-77(1985)これらはここで参照文献として編入されている。これらの手順は内実質(intraparenchymal)の植え付けを含んでいる。つまり、植え付けの時に脳実質へ置くために、宿主脳内へ注入したり置換したりすることによって達せられる宿主脳内のことである（これは、脳外または外実質(extraparenchymal)植え付けと比較される）（Das,同上文献参照）。
【００７５】
内実質植え付けの主要な２つの手順は、（１）宿主脳実質内へドナー細胞を注入すること、（２）宿主脳実質を露出するために外科的手段で腔を準備し、腔内へ移植片を置換することである（Das,同上文献参照）。両方法によって、移植の時に移植片と宿主脳組織間の実質並置がなされ、また、両方法は移植片と宿主脳組織間の解剖的統合を容易にする。移植片が宿主脳の統合的部分になることが必要なときや、宿主の生命を生きのばすためには、これが重要である。
【００７６】
代わりに、移植片は脳室内に設置されるであろう。例えば、大脳脳室や硬膜へ設けられたり、軟膜及び蜘蛛膜と軟膜とを組み込ませることによって宿主脳から離されたところの宿主脳の表面へ設けられる。脳室への移植は、ドナー細胞の注入によって達せられたり、また、固形組織の栓を形成するために３％コラーゲンのような培養基で細胞を成長させることによって達成させられる。この、固形組織栓は移植片の転移を防ぐために脳室内に移植される。軟膜下の移植に対しては、細胞は、硬膜内にスリットを作成後に脳表面の周囲に注入される。宿主脳の選択された領域への注入は、挿入されるマイクロシリンジの針を許容するために穴を開け、硬膜に突き通すことによってなされる。このマイクロシリンジは好適に定位の枠にのせられており、３次元的な定位(stereotaxic)座標は、脳の望ましい位置及び脊髄の中に針を設置するように選ばれている。
【００７７】
ドナー細胞は、また、脊髄だけでなく脳の核、核質、海馬皮質、線条体、及び尾形領域内に供給される。
【００７８】
継代接種されたドナー細胞に対しては、好適に、細胞は約２から約２０の継代接種によって受け継がれる。
【００７９】
移植に対して、細胞懸濁液は、シリンジ内に引き上げられ、麻酔をかけられた移植受容者に投与される。多数の注入はこの手順を使ってなされる。ドナー組織の世代、すなわち発展段階は移植後の細胞生存のよい結果に影響する。
【００８０】
このように細胞の懸濁手順は、相対的に傷のない脳内及び脊髄内の所定の部位へ遺伝子的に修飾されたドナー細胞の移植を許容し、また、数種の異なった部位や、同じ細胞懸濁液を使う同種の部位に於ける同時複合移植も可能にし、また、異なった解剖学的領域からの細胞の混合物をも可能にする。複合移植は細胞型の混合物から成り、または、細胞内へ挿入されるトランス遺伝子の混合物から成る。好適には、約１０4 から約１０8 個の細胞が単位移植に対して供給される。脊髄移植に都合のよい腔への植え付けに対して、組織は植え付け腔を形成するためにＣＮＳの外表面に近い領域から取り除かれる。これは、例えば、同上文献のSteneviらによって記されているように、脳上にある骨を取り除き、泡状のゲルの様なもので出血をとめることによってなされる。吸い込みは腔をつくるために使用される。一つ以上の移植は、細胞や固形組織移植の注入を用いて同じ腔においてなされる。
【００８１】
外傷を受けた脳内へのドナー細胞の移植は異なる手順を必要とする。例えば、移植を試行する前に、損傷部位を清潔にし、出血は止めなければならない。加えて、ドナー細胞は、外傷を受けた脳の病理学的な環境において移植の転位を防ぐために、宿主脳の損傷及び腔を満たすような十分な生長可能力を持っていなければならない。
【００８２】
よって、この発明は、ＣＮＳの、欠陥を受けた、疾病を持つ、または損傷した細胞を取り扱うために、移植脊髄への遺伝子的に修飾されたドナー細胞に対する方法を提供するものである。
【００８３】
この発明の方法は、また、ＣＮＳ内の疾病や外傷を取り扱うために、他の治療学的手順と結び付けて、トランス遺伝子ドナーの移植の使用をも意図している。こうして、この発明の遺伝子的に修飾されたドナー細胞は、他の細胞と共に共同移植され、有益に働いている遺伝子的に修飾された細胞と遺伝子的に修飾されていない細胞の両方は、副腎からのクロム親和性細胞や胎児の脳細胞、及び胎盤細胞のようなＣＮＳ内の細胞に影響を及ぼす。この遺伝子的に修飾されたドナー細胞は、共同移植された遺伝子的に修飾されていない細胞の生存率や機能を支えるために提供される。例えば、下記の実施例に記述されたようなインビボでの神経生長因子（ＮＧＦ）を供給するために修飾された繊維芽細胞がある。
【００８４】
さらに、この発明の遺伝子的に修飾されたドナー細胞は、ＣＮＳの欠陥や損傷及び疾病の取扱において治療学的薬物とともに有効に共同投与される。このＣＮＳは生長因子のようなもので、つまり、神経生長因子；ガングリオシド；抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒物、代謝拮抗物質、軸索プロモーティング分子(neurite promoting molecules)、及びドーパミンの前駆体のＬ−ドーパのようなこれらの薬物の前駆体である。
【００８５】
この発明の方法は好ましい実施例によって例証される。そこでは、治療学的トランス遺伝子を運ぶベクターを含むドナー細胞は検体内の皮質内に移植される。最初の好ましい実施例では、確定したＨＰＲＴ欠損ラット繊維芽細胞ライン２０８Ｆ、プライマリーラット繊維芽細胞及び出生後１日が経過したプライマリーラットの星状細胞が、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子的に修飾された培養細胞が哺乳類の脳内の移植の際に生き残るをいうことと、トランス遺伝子生成物を発現し続けることを示すために使用されてきた。
【００８６】
２つめの好ましい実施例では、繊維芽細胞はレトロウイルスベクターとの感染によってＮＧＦを分泌するために遺伝子的に修飾され、また、修飾された繊維芽細胞はフィンブリエ円蓋領域の外科的な損傷をもつラットの脳内へ移植される。移植された細胞は生き残り、処理無しでは死んでしまうコリン作動性ニューロンの変質を防ぐために十分なＮＧＦを供給した。加えて、保護されたコリン作動性細胞は軸索を発芽する。これは、ＮＧＦの産生細胞の方向に突き出た。
【００８７】
３つめの好ましい実施例では、繊維芽細胞はレトロウイルスベクターとの感染によってＬ−ドーパを発現したり分泌するために遺伝子的に修飾された。また、修飾された繊維芽細胞は、片側のドーパミン涸渇の結果としてのパーキンソン病をモデルするラットの尾形内に移植された。細胞は生き残ってドーパミンの涸渇によって引き起こされた循環運動を減少させるほど十分なＬ−ドーパを供給する。
【００８８】
４つめの好ましい実施例では、皮膚生検から分離され培養地で維持された皮膚のプライマリー繊維芽細胞は、成体ラット線条体内への皮質内移植に対して自己細胞として用いられた。繊維芽細胞は一度コンフルエントすると増殖を終え、インビトロで抑制された接触をもつ。繊維芽細胞は以下の皮質内移植で少なくとも８週間生存し、インビボでコラーゲンやフィボロネクチンを合成し続ける。移植はまた、３週間から８週間同じ体積を維持する。このことは、皮膚プライマリー繊維芽細胞が腫れあがったり死んでいないことを示している。食細胞移動や星状細胞肥大や移植への湿潤を含む動的な宿主−移植相互作用は、成体ラットＣＮＳにおいて皮膚プライマリー繊維芽細胞の移植の構造的統合を示していることが観察された。
【００８９】
５つめの好ましい実施例では、ラットの同系交配の系統からの皮膚生検から得られた皮膚プライマリー繊維芽細胞は遺伝的な修飾や移植に対してドナー細胞として使用された。ドナーラットとして同遺伝的系統のラットの脳内に移植したところ、チロシンハイドロキナーゼ（ＴＨ）またはβ−ガラクトシダーゼのどちらかに対するトランス遺伝子を含む繊維芽細胞は１０週間生き残り、トランス遺伝子を発現し続けた。移植された繊維芽細胞によって合成されたＴＨは、インビトロで観察されるようにチロシンをＬ−ドーパに変換し、行動的測定を通して評定されるような宿主脳に影響を及ぼすように見えた。線条体へ局所的にＬ−ドーパを供給することは線条体のドーパミン作用性の入力の損失に対して部分的に補うのに十分であることが示された。
【００９０】
６つめの好ましい実施例では、ヒトＮＧＦに対してドナー細胞として供給される老人繊維芽細胞の能力が示された。
【００９１】
７つめの好ましい実施例では、ラット繊維芽細胞は遺伝子的に修飾されて、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ｄＣｈＡＴ）を発現し、分泌する。ＡＣｈの皮質内及び皮質外レベルが外因のコリンクロライドを付加することによって増加することが示された。加えて、血清欠乏や誘導されて休止するコンフルエントによって再結合ＣｈＡＴ活性は８０％減少した。（活性な生長細胞と比較して）ＡＣｈ遊離はまた、休止繊維芽細胞培養地において抑えられた。外因コリンはＡＣｈ分泌における減少を和らげる。これらの結果は、繊維芽細胞がＡＣｈを供給するように遺伝子的に修飾でき、また、ＡＣｈ遊離が規制できること、例えば、培養培地内へコリンを供給することによって増加することを示している。
【００９２】
９つめの好ましい実施例では、サイトカイン、抗炎症性薬物及びデクサメタゾーンは、ＬＴＲプロモーター活性へのそれらの効力に対して評価され皮膚プライマリー繊維芽細胞内でのＣＡＴ及びｄＣｈＡＴ遺伝子の発現を高める。加えて、コラーゲンエンハンサー（Ｃｏｌｌ（Ｅ））をもつコラーゲンプロモーターα２（Ｉ）は、休止繊維芽細胞でのＣＡＴの発現におけるサイトカインの効力の評価に用いられた。
【００９３】
１０番目の好ましい実施例では、皮膚プライマリー繊維芽細胞はＮＧＦを発現し分泌するために修飾され、また、成体の雌ラットの線条体へ移植された。１週間から３週間で、下記の線条体植え込み、及びＮＧＦレセプター−免疫反応性軸索はＮＧＦ−供給繊維芽細胞の移植片を取り囲んだ。３週間から８週間では、ＮＧＦレセプター−ポジティブプロフィール(NGF receptor-positive profiles)が移植片内部に見つかった。正常なプライマリー繊維芽細胞の移植制御は免疫反応性軸索を欠乏させる。超微細構造的試験によって、移植片の細胞外マトリックス内部の髄鞘のない軸索は活性星状細胞の進行過程で取り囲まれ、また、異なった基底層は軸索グリアルバンドル(bundles)を取り囲んだことが示された。活性星状細胞の進行過程は遺伝子的に修飾されたプライマリー繊維芽細胞を含む制御と移植の両方で明白であった。この実施例によってインビボでのモデルが説明され、これは、移植片からのＮＧＦの遊離がＮＧＦレセプター−ポジティブ軸索の成長方向性を誘発し、成熟活性星状細胞が軸索が移動する上での許容される基質を供給することを示している。この実施例において、遺伝子的に修飾された繊維芽細胞はまた、コラーゲンマトリックス移植片に置かれ、成体ラットの培地隔膜の再生殖性容量を評定した。移植片はＮＧＦを供給し、また、隔膜軸索の再生殖を促進した；移植片は繊維芽細胞移植を制御するために比較される髄鞘のない軸索の多数を所有した。再生殖される隔膜軸索は求心路遮断された海馬に神経分配をした；海馬歯状回内の隔膜入力の地形学的及びシナプス組織化は、隔膜核から引き起こされる正常なコリン作動性神経分布のものと同様であった。
【００９４】
ここに説明されているこの発明をよりよく理解する目的で、以下の実験例が記載されている。これらの実験例は例示の目的で単に示されているものであって、その実験例によってこの発明の範囲が限定されるものではないことを理解すべきである。
【００９５】
［実験例Ｉ］
「ＨＰＲＴトランス遺伝子を発現するように遺伝子修飾を施した細胞の脳への脳内移植」
（細胞への感染）
ドナー ヒポキサンチン グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に欠陥をもつ２０８Ｆラットの繊維芽細胞（Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80:477-481 (1983)）に、ＨＰＲＴ ｃＤＮＡを発現するプロトタイプＨＰＲＴベクター ｐＬＳ Ｐ ＬＭ（Miller et al., Science 225:630-632 (1984); Yee et al., Gene 53:97-104 (1987)）またはＴｎ５トランスポゾン ネオマイシン−耐性遺伝子（ｎｅｏR、）及びホタルのルチフェラーゼｃＤＮＡ（de Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7:725-737 (1987)）の双方を発現するｎｅｏR−ルチフェラーゼベクター ｐＬＮＨＬ２（Eglitis et al., Sience 230:1395-1398 (1985); Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)）を感染させた（図４）。ｐＬＳＰ ＬＭベクターはベクター ｐＬＰＬ２（Miller et al., Molec, Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986)）に由来し、翻訳終止コドンのイン−ビトロ突然変異誘発により付加された新たなＣ末端ヘキサペプチドを持つプロテインをコードしているヒトＨＰＲＴ ｃＤＮＡを含んでいる。ベクター ｐＬｐＬＭ（Yee et al., Gene 53:97-104 (1987)）はＸｈｏｌ及びＢａｍＨｌにより１．３Ｋｂの長さの断片に切断し、すでにＸｈｏｌ及びＢａｍＨｌで切断されたプラスミド ｐＬｐＬ２（Miller,同上文献参照）の中へ組み入れた。得られたベクターは、ｐＬＳ Ｐ ＬＭである。
【００９６】
ベクター ｐＬＮＨＬ２は、ホタルのルチフェラーゼ（ＬＵＸ）をコードしているｃＤＮＡと、Ｔｎ５ネオマイシン−耐性遺伝子（ｎｅｏR）及びヒトサイトメガロウイルス即時初期遺伝子（ＨＣＭＶ）のプロモーターとエンハンサーとを保持している。５’及び３’ＬＴＲｓは、Ｍａｓｏｎらにより述べられた（Science 234:1372-1378 (1986)）複製ハツカネズミ白血病遺伝子（ＭＬＶ）から得られた。ベクター ｐＬＮＨＬ２は以下のように調製した：プラスミド ｐＬＮＨＰＬ２（YeeらによりＰＮＨＰ−１としても知られている、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5197-5209 (1987)）をＢａｍＨＩで切断しＨＰＲＴ ＤＮＡ配列を取り除く。末端はＫｌｅｎｏｗ ポリメラーゼにより修復した。プラスミド ｐＬＶ２Ａ（deWet et al., Molec. Cell. Biol.,上述）（Ｄｒ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉから提供された，University of California, San Diego, CA）はＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｓｐｌにより切断され、ルチフェラーゼ断片を単離した。末端は前述の手順により修復した。ＢａｍＨｌで切断されたｐＬＮＨＬ２とＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｓｐｌで切断されたｐＳＶ２Ａを結合してベクター ｐＬＮＨＬ２を合成した（図５）。
【００９７】
確実に感染細胞のみを用いるために、細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含んだＨＰＲＴを発現する細胞のための選択培地と、ネオマイシン類似体Ｇ４１８を含んだｎｅｏRを発現する細胞のための選択培地との双方でインキュベートした。
【００９８】
プライマリーの繊維芽細胞と星状細胞にはｎｅｏR−ルチフェラーゼベクターのみを感染させた。続いてＨＡＴ耐性及びＧ４１８耐性細胞は、無血清培地か、またはラットの脳内に於ける免疫応答を抑制するためにラットの血清を含む培地で一晩インキュベートした。
【００９９】
（移植）
細胞は平衡にあるグルコース−食塩水溶液中で再攪拌し、滅菌シリンジを用いてラットの脳の数カ所の領域中へ定位に注入した。１μｌ当り１０，０００から１００，０００個の細胞を含む液を１μｌ／ｍｉｎの速度で総量３−５μｌ注入した。１週間ないし３カ月後に動物は死に、移植細胞を含む領域を特定して切り取ったあと、組織学的および生化学的に調査した。
【０１００】
（組織学的分析）
移植細胞を組織学的に評価するために、一般形態学的特徴を記述するためＮｉｓｓｌ着色剤及びクレジルバイオレットで、また特定細胞の抗原マーカー（繊維芽細胞に対してフィブロネクチン、膠細胞に対して膠繊維酸性蛋白（ＧＦＡＰ））の存在を確立するために免疫化学的方法を用いてラットの体内に各試薬を潅流させることにより脳を着色し区分した。要約して述べると、切断片を０．２５％トリトン−Ｘを含んだトリス−バッファー食塩水（ｐＨ７．４）中ですすいだ。切断片はフィブロネクチンに対するうさぎのポリクローナル抗体（１：２０００に希釈；baralle, University of Oxford, England）及びＧＦＡＰ（Gage et al., Exp. Neurol. 102:2-13 (1989); Dakopatt, Glostryp, Denmarkから入手可能）の０．２５％トリトン−Ｘ及び３％ヤギ血清を含んだＴＢＳによる１：１０００希釈溶液、またはラット マクロファージの膜ポリペプチド、顆粒性白血球および樹状細胞（MRC OX-42, Serotec）に対するモノクローナル抗体であるマウスＩｇＧ２ａの０．２５％トリトン−Ｘ及び１％ウシ血清を含んだ０．１Ｍ ＴＢＳによる１：１００希釈溶液中で４℃で２４時間インキュベートした。完全にすすいだ後、切断片はビオチン化されたヤギの抗−ウサギＩｇＧ（Vectastain）の０．２５％トリトン−Ｘ及び１５％ウマ血清を含んだ０．１Ｍ ＴＢＳによる１：２００希釈溶液中でインキュベートし、続いて０．２５％トリトン−Ｘと１％ヤギ血清または１％ウマ血清を含んだＴＢＳ中ですすいだ。この切断片はアビジンとビオチン化したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Vectastain, ABCkit, Vector Labs, Burlingame, CA）とのコンプレックスの０．２５％トリトン−Ｘ及び１％ヤギ血清または１％ウマ血清を含んだ０．１Ｍ ＴＢＳによる１：１００希釈溶液中で室温で１時間インキュベートし、続いて完全にすすいだ。ペルオキシダーゼは０．０５％３，３−ジアミノベンジジン テトラヒドロクロリド（ＤＢＡ）（SigmaChemical Co., St. Louis, MO）、０．０５％ＮｉＣｌ2及び０．０１％Ｈ2Ｏ2のＴＢＳ溶液中で室温で１５分間反応させて明視化した。
【０１０１】
７週間前にラットのネオ線条体(neostriatum)に移植したプライマリーのラット繊維芽細胞を図６に示す。一続きの４０μｍの厚さの切断片はアンチフィブロネクチン（図６（ａ），図６（ｄ））、クレジールバイオレット(cresyl violet)（Disbrey et al., Historogical Laboratory Methods, E. & S. Livingstone, Edinburgh and London (1970)）（図６（ｂ），図６（ｅ））及び抗−ＧＦＡＰ（図６（ｃ），図６（ｆ））により着色した。生き残っている細胞は無傷で、注入領域の周辺に凝集または集合しているように見えた。カニューレ管においてのみ見られるものと同様に、細胞は移植片の中心部ではフィブロネクチンによる強い着色を示し、移植片の周辺部では反応性神経膠質腫症のためにはっきりとしたＧＦＡＰ−着色剤による着色を示した。しかし移植片自身においてもわずかなＧＦＡＰ着色が観察された。クレジルバイオレットによって濃く着色された小さな丸い細胞が移植片の領域中において観察されたが、これは傷ついたことにより浸透した小膠細胞またはリンパ球であろう。マクロファージは多くの移植片においても観察された。繊維芽細胞の多くにおいて、クレジルバイオレットの着色により見られる細長い形や、細胞を囲んでいるコラーゲン物質のシートにより編まれた桃色によって同定することができた。２０８Ｆ繊維芽細胞の外観はプライマリー繊維芽細胞と同様である（提示せず）。星状細胞移植片もまた同じ外観を示すが、フィブロネクチン陽性ではなく、移植片の中心を通じてＧＦＡＰにより染色された。これら三つの細胞型について、レトロウイルス感染細胞とコントロール細胞で違いは認められなかった。これらの細胞懸濁移植片の重要な性質としては、大抵の細胞が注入部位の周辺に集まって残留し、このような環境においては注入部位から宿主の脳のなかの遠方まで移動するといった様子はなかった。この明らかな移動性の欠如は他のドナー細胞型や移植部位とはかなり異なっており、それゆえ細胞が移植される脳内の領域、ドナー細胞の性質、トランス遺伝子に対する標的細胞の表現型などがドナー細胞を選択する際の重要な要因であろう。
【０１０２】
（移植細胞の特徴付け）
移植細胞を解剖して再培養の準備をし、またトリプシンにより細胞を融解して生化学的、分子的特徴付けを行うための準備を整えた。ヒトＨＰＲＴ活性の検出のために、以前に示した手順により細胞抽出液は各試料の大部分から用意し、ポリアクリルアミドゲルの等電点に焦点を合わせたＨＰＲＴ分析（Jolly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:477-481 (1983); Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 80:4709-4713 (1983); Willis et al., J. Biol. Chem. 259:7842-7849 (1984); Miller et al., Sience 255:630-632 (1984); Gruber et al., Science 230:1057-1061 (1985), and Yee et al., Gene 53:97-104 (1987)）。 各試料の残渣は培地上に載せた。ＨＰＲＴベクターに感染後のラット２０８Ｆ細胞ＨＡＴ耐性のＨＰＲＴゲル分析の結果は、ラットの脳幹神経節の一方に移植した。移植後３及び７週間後の様子と分析前の様子は図７に示した。
【０１０３】
ヒトＨＰＲＴ酵素活性の存在は、脳に移植された、感染して遺伝的に変更を受けたラット２０８Ｆ細胞は生き残り、少なくても７週間に渡って容易に検出できるレベルのＨＰＲＴトランス遺伝子を発現し続けることを示している。さらに移植細胞は首尾よく再培養され、初めの培養組織と形態学的に同一の細胞を産生した。これらの細胞へヘルパーウイルスを感染させた結果ＨＰＲＴウイルスが産生されたが、これは細胞の同一性を確立し、プロウイルスが無傷であることを示している。ｎｅｏR−ルチフェラーゼベクターを用いた研究は、ルチフェラーゼ感染細胞の生存と発現とを確立する。
【０１０４】
［実験例ＩＩ］
「損傷を受けた脳へのＮＧＦを発現するよう遺伝学的に修飾された細胞の移植」
上記の実験例は、レトロウィルスベクターを使って遺伝学的に修飾した培養細胞が哺乳動物の脳に移植したとき生き続けること及びトランス遺伝子産物が発現することを実証した。この実験例は、遺伝学的に修飾された細胞によってインビボで欠損し、または以前に損傷を受けた脳の機能を補いあるいは修復しうるかどうかを決定するために行われた。
【０１０５】
（ＮＧＦベクターｐＬＮ．８ＲＮＬの構築）
すでに報告されている方法（Wolfら、Mol. Biol. Med. 5:43ー59 (1988)）によってレトロウィルスはモロニー(Moloney)ネズミ白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）（Varmusら、RNA Tumor Viruses; Weissら、Cold Spring Harbor, NY, p. 233 (1982)）からつくられた。pLN.8RNLベクターは、マウスＮＧＦ ｃＤＮＡ（Scott et al., Nature 302:538 (1983); Ullrich et al., Nature 303:821 (1983)）の７７７塩基対Ｈｇａｌ−Ｐｓｔｌフラグメントをウィルスの５’末端ＬＴＲの制限下に含む。この挿入は、交換神経抑制を受けたマウス組織に多いより短いＮＧＦトランスクリプト（Edwards et al., Nature 319:784 (1986)）に対応し、構成的に分泌されるNGF前駆体をコードすると信じられる。ベクターは、また、内部ラウス サルコマ ウィルスプロモターの制限下、トランスポゾンＴｎ５のネオマイシン抵抗性機能（Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:327 (1982)）をコードする支配的な選択的マーカーを含んでいた。
【０１０６】
プラスミドｐＳＰＮ１５’（Wolf et al., Mol. Biol. Med. 5:43-59 (1988)、Harvard Medical School Boston, MA ブレイクフィールド博士より供与）は、公知の方法（Maniatis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NewYork, (1982)）により制限酵素ＰｓｔｌとＨｇａｌを使って消化され、ＮＧＦシーケンスを含む７７７塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメントは、標準的な精製方法（Maniatis, et al., 上記文献）によって単離された。そして７７７ｂｐは、Ｙｅｅらによってpro. Natl. Aca. Sci. (USA)84: 5197-5201 (1987)に記載された方法によってプラスミドｐＬＭＴＰＬに平滑末端でつながれた。プラスミドｐＬＭＴＰＬは、メタロチオネイン プロモターを除くためＨｉｎｄＩＩＩを使って消化され、ほとんどのＨＰＲＴｃＤＮＡ及びオーバーハンギング５’末端はＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを使ってマニアテス（Maniatis）ら（上記文献）の方法で修復された。上記のようにして単離された７７７ｂｐフラグメントのオーバーハンギング末端は同様に修復された。７７７ｂｐフラグメントはそれから消化されたプラスミドｐＬＭＴＰＬに平滑末端でつながれた。その結果生成するプラスミドはＰＬＮ．８Ｌと呼ばれ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１株にトランスフェクトされ、培養され、塩化セシウム遠心法を含むプラスミド精製のための確立された方法(Maniatisら、上記文献）によって精製された。精製されたプラスミドｐＬＮ．８Ｌは制限酵素ＢａｍＨＩとＣｌａｌを使って消化され、生成する６．１キロ塩基フラグメントはプラスミドｐＬＬＲＮＬより単離された２．１ｋ塩基ＢａｍＨｌ−Ｃｌａｌにつながれた。プラスミドｐＬＬＲＮＬは以下のようにde Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725-737 (1987)に記載されたプラスミドＪＤ２０４から由来する：プラスミドＪＤ２０４に由来するホタルルシフェラーゼ遺伝子からの１７１７ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｓｐ１フラグメントとSouthernとBergによりMol.Appl. Genet. 1:327-341 (1982)に記載されたプラスミドｐＳＶ２ＮｅｏＲ の１３２１ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａｌフラグメントはプラスミドｐＵＣＲＨからの３００ｂｐＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント中の変異ＲＳＶプロモターを含むフラグメントとつながれた。プラスミドｐＬＬＲＮＬは図８に描かれている。
【０１０７】
プラスミドｐＵＣＲＨ以下のようにして生成された。プラスミドｐＲＳＶｎｅｏＲはＨｉｎｄＩＩＩを使って制限され、直線化されたプラスミドはＨＰＲＴシーケンスを除くためにＨｉｎｄＩＩＩを使って制限することによって得られたプラスミドｐＰＲ１（図９）（Universityof Carifornia, San Diego, CA Dr. Friedmannから供与）からの残りのフラグメントとつながれた。プラスミドｐＰＲ１はＰｓｔとＲｓａを使ってｐ４ａＡ８（Jolly et al., Pro. Natl. Acad. Sci. 80:477-481 (1983)）から得られた。生成したプラスミドはｐＲＨＮと呼ばれ、ＰｖｕＩＩによって制限され、再結合されてプラスミドＰＮ（＋）とＰＡＣ（−）を形成する。ＰＮ（＋）はＢａｍＨｌを使って制限される。生成した直線化されたプラスミドはＢａｍＨＩを使って制限されたｐＳＶｏｒｉプラスミドから得られたフラグメントとつながれた。プラスミドｐＳＶｏｒｉはプラスミドｐ４ａＡ８をＳａｌｌとＰｓｔｌを使って制限し、生成するフラグメントをＳａｌｌとＰｓｔｌで制限されたプラスミドｐＵＣｌ８（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD）サブクローニングすることによって得られた。生成するプラスミドはｐＳＶｏｒｉと呼ばれる。
【０１０８】
ＢａｍＨＬ制限プラスミドＰＮ（＋）とＢａｍＨｌ制限プラスミドｐＳＶｏｒｉをつなぐことによって得られるプラスミドｐＲＨ＋Ｓ＋はＭｓｔＩＩによって制限され、オーバーハンギング５’末端はＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを使って上記のようにして修復された。このフラグメントはＳｍａｌによって直線化されたＭ１３ｍｐ１８（Bethesda Research Laboratories）につながれ、仔牛小腸のアルカリホスファターゼ（Boeringer Mannheim, Mannheim, W. Germany）によってリン酸加水分解された。生成するプラスミドはｐｍｐＲＨと呼ばれ、ＲＳＶプロモーターから発現したＨＰＲＴｃＤＮＡを含んでいた。
【０１０９】
プラスミドｐｍｐＲＨはポリアデニレーションシグナルをＡＡＴＡＡＡからＡＧＣＡＡＡに変えるためKunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)によって位置指向的ミュータジェネシスに付された。ミュータジェネシスの後、生成するプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩによって制限され、生じるフラグメントはプラスミドｐＵＣ１９（Bethesda Research Laboratories）を制限して得られるＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにつながれてプラスミドｐＵＣＲＳＶを生じた。プラスミドＣＲＳＶはＢａｍＨｌとＰｓｔｌを使って制限されＲＳＶプロモーターを含むフラグメントを生じた。このフラグメントは上記実験例Ｉに記載されたような方法でプラスミドｐＬＳ Ｐ ＬＭの制限によって得られたプラスミドＨＰＲＴをコードする遺伝子を含むＰｓｔｌ−Ｓｓｔｌフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１９から得られたＢａｍＨ１−ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントにつながれてプラスミドｐＵＣＲＣを生じた。ｐＵＣＲＨからのＢａｍＨｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントと、ｐＪＤ２０４からの１７１７ｂｐ Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｓｓｐｌフラグメントと、ｐＳＶ２ＮｅｏＲからの１３２１ｂｐ Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｓｍａｌｌフラグメントの間の結合生成物はトランスフェクトされ、既に記載した確立された方法で精製され、プラスミドｐＬＬＲＮＬと呼ばれた（図８）。
【０１１０】
トランスフェクトし、精製した後、プラスミドｐＬＮ．８Ｌからの６．１ ＢａｍＨｌ−Ｃｌａｌキロ塩基フラグメントとプラスミドｐＬＬＲＮＬからの２．１キロ塩基ＢａｍＨｌ−Ｃｌａｌフラグメントの結合から生じるプラスミドはｐＬＮ．８ＲＮＬと呼ばれる。
【０１１１】
（伝染性レトロウィルスの調整）
伝染性レトロウィルスはｐＬＮ．８ＲＮＬをＰＡ３１７アンフォトロフィック生産細胞（Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895 (1986)、Dr.Miller, Fred Hutchinson Cancer Research Centerより供与）に、カルシウムホスフェート共沈澱法（Graham et al., Virology 52:456 (1973)）により、これらの細胞の培地を使って、Ψ−２エコトロピック産生細胞（Mann et al., Cell 33:153 (1983)）に、４μg/mlのpolybrane（Sigma Chemical, St. Louis, Mo）存在下に感染させることによって作られた。最高力価４ｘ１０5コロニー形成単位／ｍｌを示すΨ−２クローンからのウィルスが、確立されたラット フィブロブラストセルライン ２０８Ｆ（Quade, Virology 98:461 (1979)）に、ミヤノハラ(Miyanohara)らによってProc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)に報告された方法で、感染させるために使われた。
【０１１２】
（ＮＧＦ産生と分泌のアッセイ）
ネオマイシン類縁体G418を含む培地から選ばれた個々のネオマイシン抵抗性２０８Ｆコロニーは増殖され、２部位（ＥＬＩＳＡ）エンザイム イムノアッセイ（Korsching et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:3513-3516 (1983)）によって、市販の試薬を製造業者（Boehringer Mannheim）のプロトコールに従って使用し、ＮＧＦ産生と分泌がテストされた。最高レベルのＮＧＦを産生するクローンは１ｍｇの総細胞タンパク当り１．７ｎｇのＮＧＦを含んでおり、５０ｐｇ／ｈｒ１０5細胞の速度で培地中にＮＧＦを分泌した。このクローンによって分泌されるＮＧＦは、ｐｃ１２ラット好クローム性細胞腫（Greene, et al, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 73:2424 (1976)）からの軸索派生を誘導する活性によって決定されるように、生物学的に活性である。感染していない２０８Ｆ細胞は、対照的に、いずれのアッセイにおいても検出可能なレベルのＮＧＦを産生しなかった。
【０１１３】
（卵管のフィンブリエの円蓋の切断）
卵管フィンブリエの円蓋の切断(axotomy)はGage et al., Brain Res. 268:27-37 (1983)及びNeuroscience 19(1) 241-255 (1986)に記載の方法で行われた。簡潔に記述すれば、実験開始時において体重２００ｇ−２２５ｇの雌の成人したSprague-Dawleyラット（Bantin and Kingman, San Francisco, CA）が使用された。動物はケタミン-キシラジン混合物（１０μｇ／ｋｇ Ketalar, Parke-Davis AnnArbor, MIと５μｇ／ｋｇ Rompun, Hoechst, Frnnkfurt, W. Germany）を腹腔内に注射することによって麻酔された。偏側吸収病巣はGage et al, Brain Res. 268:27-37 (1983)に記載されているような方法で、帯状皮質を通した吸引と、卵管のフィンブリエ円蓋を片側だけ完全に切断し、そして、海馬及びその上に横たわる帯状皮質の背側の尖端を除去することによって作られ、海馬ターゲット上の部分的神経支配除去が行われた。個々の実験グループ中の全ての動物が同じ片側だけの吸引病巣を受けた。卵管フィンブリエ円蓋病巣は上記のようにして１６匹のラットに作られた；８匹のラットは感染細胞の移植を受け、残る８匹のラットは感染していないコントロールのラットである。
【０１１４】
フィブロネクチンで染まる部分はフィブロブラスト特異的マーカーであるが、両グループにおいて同程度の移植生存性を示すことが分かった（図１３（ａ）、図１３（ｂ））。コリン作動性細胞体の生存率を評価するためのコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）に染まる部分は、感染細胞を移植された動物の内側隔壁の病巣部位にはコントロールの移植を受けた動物におけるよりも多くのニューロンが残っていることが分かった（図１３（ｃ）、図１３（ｆ））。
【０１１５】
レトロウィルスに感染した細胞（ＮＧＦ分泌）とコントロールの２０８Ｆ細胞は０．０５％トリプシンと１ｍＭＥＤＴＡを含むダルベッコ（Dulbecco）のホスフェートバッファーセーライン（ＰＢＳ）を使ってコンフルエントプレートから除去され、１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌとＣａＣｌ2（complete ＰＢＳ）及び５％ラットセーラムを使って抽出され、トリプシンは不活性化された。細胞は４℃で４分間１０００×ｇで遠心分離によってペレット化され、完全ＰＢＳによって２回洗浄され、完全ＰＢＳに１０5ｃｅｌｌｓ／μｌで再懸濁された。４μｌの懸濁細胞はフリーハンドでハミルトンシリンジを使って動物の体腔と体腔と同側の側方脳室に注射された。１個のゲラチン泡は体腔の表面にそっと置かれ、動物は縫合された。
（免疫組織化学）外科的手術から２週間目にラットは潅流され、脳が取り出され、１夜間固定され、ホスフェートバッファーを含む３０％スクロース中に２４時間４℃で置かれた。４０μｍ厚の部分は凍結スライドミクロトーム上で切断され、クリオプロテクタント（ホスフェートバッファーグリセロールとエチレングリコール）中ー２０℃で保存された。すべての５番目の部分はフィブロブラスト生存率を評価するためにフィブロネクチンに対してポリクローナル抗体を使って標準的方法によって免疫組織化学的にラベルされた。コリンアセチルトランスフェラーゼに対するポリクローナル抗体（抗−ＣｈＡＴ 抗血清(antiserum)）が作られ、コリン作動性細胞体の生存率がGage et al., J. of Comparative Neurol. 269:147-155に記載されたようにして評価された。組織部分はHsu et al., 29:1349-1353 (1981)とそこに引用された文献のアビジン−ビオチン(avidin-biotin)ラベル化法の変法に従って免疫組織学的にプロセスされた。この方法は以下のステップからなる：１）ＣｈＡＴの抗体またはコントロール抗体（即ち前免疫シーラムまたは吸収アンチシーラム）との１夜間インキュベーション。ＣｈＡＴ抗体は１％山羊シーラムと０．２５％トリトンＸー１００を含む０．１Ｍトリスセーラインを使って１：１５００に希釈された；２）１％山羊セーラムを含むトリスーセーラインで１：２００に希釈されたビオチン化された山羊抗うさぎ抗体ＩｇＧ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）との1時間インキュベーション；３）１％山羊セーラムを含むトリスーセーラムで１：１００に希釈されたＡＢＣコンプレックス(Vector Laboratories)との1時間インキュベーション；４）０．０５％３、３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と０．０１％過酸化水素と０．１Ｍトリスバッファー中の０．０４％塩化ニッケルで１５分間処理。免疫学的にラベルされた組織部分はガラススライドに乗せられ、風乾され、パーマウントとガラスカバースリップで覆われた。セプタムで２００μｍ隔てられたＣｈＡＴに染まる二つの部分はコリン作動性細胞生存率の程度を評価するために使われた。同側および反対側隔壁の全てのＣｈＡＴ陽性細胞はオリンパスＱｕｅ−２イメージ分析システムを使って平面の面積に従って分類され、それぞれ数えられた。また組織はHerdreen et al., J. Histochem. 33:134-140 (1985)とそこに引用された文献の方法に従ってアセチルコリンエステラーゼに染色され、卵管フィンブリエ円蓋の切断が完全に行われたかどうかを評価された。
【０１１６】
ニューロンの生存率は定量され（図１４）、何もしていない反対側のセプタムに比べて病巣のある側のセプタムにおける残っているコリン作動性細胞のパーセンテージとして表現される場合には、ＮＧＦ分泌細胞を移植された動物の場合には９２％であったが、コントロールの細胞を移植された動物の場合には４９％しかなかった。コントロールグループの結果は、移植は受けなかったが病巣を持つ動物における以前の観察に相当するものであった（Gage et al., Neurosci. 8:2155 (1986); Williams et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 83:9231 (1986); Kromer, Science 235:214 (1987); Gage et al., J. Comp. Neurol. 369:147 (1988)）。
【０１１７】
ＮＧＦグループにおけるＣｈＡＴ陽性細胞のパーセンテージの著しい増加に加えて、ＡＣｈＥ陽性ファイバーと細胞の染色も増加していることが示された（図１５）。最も際だった発見はセプタムの背側に偏った四分の一円における強力で急激な生長反応であり、移植細胞を含む腔と隣接する部分が最も強く染まることである（図１５）。
【０１１８】
上記の結果はＣＮＳに移植された細胞によるトランス遺伝子発現の容易さをものがたるものであり、また遺伝学的に修飾された細胞の移植によってもたらされた動物全体における表現型の矯正をはじめて示したものである。
【０１１９】
［実験例ＩＩＩ］
「パーキンソン病に感染したラットのＣＮＳにＬ−ドーパを発現するように遺伝的に修飾した繊維芽細胞の移植」
この実験例は、ドナー細胞を遺伝的に修飾し、細胞をＣＮＳに移植する現在の発明された方法が、パーキンソン病のラットのモデルのように、動物のモデルでの病気の症状を意味ありげに改善することが実証され、受け入れられてきた。
【０１２０】
この実験例で用いられた繊維芽細胞にＬ−ドーパを生産する能力を与える方法は、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）に、カテコールアミン合成の反応速度を限定する段階である、チロシンがＬ−ドーパに転化する作用を触媒する能力があることに基づいている。ＴＨの補因子であるテトラヒドロビオプテリン(tetrahydrobiopterine)（Ｈ4−Ｂ）は、ＴＨ酵素活性を必要とする。脳はビオプテリンを高いレベルで保持しており、また繊維芽細胞はビオプテリンをＨ2−ビオプテリンに減少させるので、ＴＨは脳内に位置する繊維芽細胞に対し働きかけているようだ。
【０１２１】
（レトロウイルスベクターｐＬＴｈＲＮＬの構築）
ベクターｐＬＴｈＲＮＬは、モロニー白血病ウイルス由来レトロウイルスベクターだが、５’ＬＴＲ配列由来のチロシン水酸化酵素（ＴＨ）のラットｃＤＮＡを発現するように構築され、細胞内のＲＳＶプロモーターの位置から転写されるネオマイオシン−耐性遺伝子を含んでいた。これら３種類のプラスミドからのフラグメント，ｐＬＲｂＬ，ｐＴＨ５４，ｐＬＨＲＮＬは、ｐＬＭＴＰＬから一緒に結合された。プラスミドｐＬＲｂＬは、（実験例IIに既に記述されたのと同様に）プラスミドｐＬＭＴＰＬを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＨｐａｌで切断し、ＨＰＲＴ遺伝子を含むフラグメントを取り去ることによって得られた。残ったプラスミドＤＮＡは，プラスミドｐＧＥＭ１−４．５ｋｂ（ｐＧＥＭ１−４は、網膜芽腫遺伝子（Ｒｂ）をコードするＤＮＡを、ウィスコンシン州マジソンのプロメガから入手したプラスミドｐＧＥＭ１に挿入することで構築され、カリフォルニア州サンジエゴにあるカリフォルニア大学のリー博士から提供を受けた。）をＨｉｎｄ IIIとＳｃａ２の制限酵素で切断した後得られた３．５ｋｂのフラグメントと結合された。結果的に得られたプラスミドはｐＬＲｂＬと名付けられた。
【０１２２】
ラットのＴＨ ｃＤＮＡを含む１６８８個のｂｐフラグメントは、プラスミドｐＴＨ５４を制限酵素ＢａｍＩＩＩとＳｐｈ１で切断することで得られた（O'Malley, J. Neurosci. Res. 60:3-10 (1986), suppied by Dr. O'Malley, WashingtonUniversity, St. Louis, Mo）。
【０１２３】
プラスミドｐＴＨ５４とプラスミドｐＬＲｂＬ由来のフラグメントを、プラスミドｐＬ２ＲＮＬ（実験例Ｉに書かれている）から得られたＣｌａ１とＳｍａ１のフラグメントと結合させて、チロシン水酸化酵素をコードする遺伝子を運ぶウイルスを作るプロデューサー細胞にトランスフェクションするためにレトロウイルスのプロウイルスを含むベクターｐＬＴｈＲＮＬが得られた。ｐＬＴｈＲＮＬの由来と円形制限酵素マップは、図１７に示してある。
【０１２４】
実験例ＩＩに示されているようにヘルパー−フリーのレトロウイルスが作られ、レトロウイルスの感染がなされた。上のＬＴｈＲＮＬプロウイルスを含むプラスミドＤＮＡは、ここではリファランスで紹介するが、Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)によって書かれているように、ワシントン州シアトルにあるフレッド ハッチントン癌研究センターのミラーによって供給されるアンフォトロピックなＰＡ３１７ヘルパー細胞株にＣａＰＯ4トランスフェクションされた。トランスフェクションして２日後、これらの細胞の培地は濾過され、エコトロピックΨ２ヘルパー細胞株（Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986), supplied by Dr. Miller）に感染させるのに用いられた。最も高いレベルでＴＨ活性を含み、最も多くのウイルス量（５×１０5／ｍｌ）を産生したＧ４１８−耐性Ψ２クローン（Ψ２／ＴＨ）を選んだ。不死化したラットの繊維芽細胞（２０８Ｆ）（Quade, Virology 98:461-465 (1979)）が、Ψ２／ＴＨプロデューサー細胞によって作られたＬＴｈＲＮＬウイルスの１０-4以下の感染多重度（ＭＯＩ）で感染した．Ｇ４１８耐性クローンはさらなる研究で確立された。全てのレトロウイルス感染は、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）存在下でなされた。細胞は、ネオマイシン−耐性遺伝子の発現ためにＧ−４１８が４００μｇ／ｍｌに増えることによって選び出した。
【０１２５】
（チロシン水酸化酵素活性定量分析）
１０ｃｍのプレートにコンフルエントになった細胞を２回カルシウム・マグネシウムフリーのダルベルコの燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗い、その後、プレートから剥す。細胞を、氷冷し、酢酸でｐＨ８．４に調整した０．１５ｍｌの５０ｍＭトリス／５０ｍＭ ピロ燐酸ナトリウム／０．２％ トリトン Ｘ−１００でホモジェネートした。その後、２−４℃で１５分関３２０００ｇで遠心分離した。その上澄みをＴＨと蛋白測定の両方に用いた。ＴＨ活性は、以前に記述された（Iuvone et al., J. Neurochem, 43:1359-1368 (1986)）ように、14Ｃでラベルした２０μＭチロシン、１ｍＭ ６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリン（６ＭＰＨ4）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，カリフォルニア州のラ・ジョラ）マグンシウム燐酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて、脱炭酸酵素共役反応で測定した。蛋白は、標準的な方法だがウシ血清アルブミンを用いてロウリー(Lowry)（J. Biol. Chem. 193:265 (1951)）の方法で決定した。
【０１２６】
（カテコールアミンとその代謝産物の定量分析）
培養細胞は、（最終濃度が５０ｎＭになるように）アスコルビン酸を凍らせる前の細胞ペレットに添加することを除けば、チロシン水酸化酵素活性の定量分析のようにプレートから剥した。細胞はＤＭＥに１０％のウシ胎児血清を加えた培地で培養した。培養にはプレートから剥す１６時間前から０．１ｍＭ ６ＭＰＨ4を付加した。細胞は、２５０μｌの５ｎｇ／ｍｌの３，４−ジヒドロオキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）を含む０．１Ｎ ＨＣｌ／０．１％ メタ重亜硫酸ナトリウム／０．２％ Ｎａ2 ＥＤＴＡ中でホモジェネートした。ドーパミン、ドーパ，３，４−ヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、ＤＨＢＡ，３−メトキシ−４−ヒソロキシフェニルグリコール（ＭＨＰＧ）は、アルミナ吸収の上澄みから抽出され（Anton et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 138:360-375 (1962)）、１５０μｌの０．１Ｎ Ｈ3ＰＯ4で溶出した。それらは、Iovone et al., Brain Res. 418:314-324 (1987)に示されてるように、高濃度の硫酸オクチルナトリウム（０．４５ｍＭ）と低いｐＨ（２．８）を含むように調整した移動相を使う、電気化学的検出法であるＨＰＬＣによって解析した。ホモバニリック酸（ＨＶＡ）はＨＰＬＣによって解析された。培地中のカテコールアミンと代謝産物の濃度もまた、別な方法であるＨＰＬＣ−ＥＣによって決定された。上述のアルミナ抽出液の手順は省略します。培地は、０．１過塩素酸／０．０１Ｍ ＥＤＴＡに調整され、沈澱する物質を除去し、ＨＰＬＣ−ＥＣに直接用いることができるように１００００ｇで１０分間遠心分離された。この系において、２つの相は、０．１３７％ ＳＤＳを含むｐＨ３．２の０．１Ｍ燐酸緩衝液（緩衝液Ａ）と４０％エタノールを含むｐＨ３．３５の燐酸緩衝液（緩衝液Ｂ）から成り立っている。サンプルの複合体は、１２分間緩衝液Ａ１００％の状態で溶出した後、緩衝液Ｂをリニアーな勾配で徐々に混合して、３０分かけて緩衝液Ｂが１００％の状態になるように溶出した。そのとき溶出液は、６０ｍＶの電圧をかけた１６対の電量分析の電極の間を通過した。
【０１２７】
（パーキンソン病のラットモデル）
雌のスプラーグ−ドーレイ(Sprague-Dawley)ラットの前脳束中央（座標で言うところのＡＰ＝−４．４，ＭＬ＝１．１，ＤＶ＝７．５の位置）に生理食塩水１２μｌに対し２μｇのアスコルビック酸 ６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を片側注射した。作られた障害の完成は、１０〜２０日後転回行動を引き起こすアポモルフィン(apomorphine)の注射（０．１ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）またはアンフェタミン(amphetamine)の注射（５ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）で評価した（Ungerstedt and Arbuthnott, Brain Res. 24:485-493 (1970)）。移植の前に、どの動物も少なくとも１日２回はアポモルフィンかアンフェタミンの判断基準である転回行動が確立していることを試験された。１分間に７回以上転回するようになった動物は（Schmidt et al., J. Neurochem. 38:737-748 (1982)）、研究に用いられた（アポモルフィンを投与した後逆側に１分間当り少なくとも７回転回するものと、アンフェタミンを投与した後障害とは同じ側に１分間当り少なくとも７回転回するもの。アポモルフィンは１９回、アンフェタミンは１４回試験した。）。基準から後移植に平均転回数の変化は、４種類の動物グループで比較された。
【０１２８】
（繊維芽細胞の移植）
１０ｃｍのプレートにコンフルエントになったＴＨ感染した繊維芽細胞と感染していないものを０．０５％ トリプシンを含むＰＢＳでトリプシン処理した後、トリプシンの活性を抑えたまま１ｍｇ／ｍｌ グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ2，０．１ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ2、そして５％ ラット血清を含むＰＢＳでピペッティングした。細胞を２回ＰＢＳ中で１０００ｇで遠心分離することで洗い、１μｌ中に８００００個の密度になるようにＰＢＳ中に懸濁した。移植位置は転回非対称から回復する決定的だと思われるところだから（Herrera etal., Brain Res. 297:53-61 (1984); Dunnett et al., Scand. Suppl. 522:29-37 (1983)）、懸濁した細胞を神経をまひさせた脳内の最前部のくちばし状部位（座標で言うところのＡＰ＝１．４、ＭＬ＝２．０、ＤＶ＝３．５−５．５からＡＰ＝２．５、ＭＬ＝１．５，ＤＶ＝３．５／４．５の位置）と後部に尾状部位（ＡＰ＝０．４、ＭＬ＝１．５、ＤＶ＝３．５／４．５）の２、３箇所各々離れた位置に定位に注射した。どの位置にも１〜２ｍｍの範囲に２回に分けて、トータルで４μｌ注射した。コントロールにあたる障害を受けた動物には感染していない繊維芽細胞を注射した。
【０１２９】
（移植後の行動テスト）
移植したラットは移植後１〜２週間後転回非対称性を試験した。
【０１３０】
（組織学的手法）
最終的な行動試験の後、ラットは麻酔をし、１０％ホルマリンを噴霧した。脳は一夜かけて固定し、４８時間３０％サッカロース中に置き、フリージングミクロトームで切片（４０μｍ）にした。それぞれの切片は、クレゾールバイオレット(cresyl violet)、フィブロネクチン(fibronectin)（ＦＢ）、ＴＨをポリクローナルアンチチロシン水酸化酵素抗体（Eugenetech、ＮＪ）で染色した。手短に解説すると、切片は０．２５％ トリトン−Ｘを含むトリス緩衝液（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）でリンスした。切片は２４時間４℃で０．２５％ トリトン−Ｘと３％ヤギ血清を含むＴＢＳに６００分の一に希釈したウサギのチロシン水酸化酵素のポリクローナル抗体か、同じくＴＢＳに２０００分の一に希釈したポリクローナルアンチフィブロネクチンとインキュベートした。リンス後、切片は、１時間、０．２５％トリトン−Ｘと１％ヤギ血清を含む０．１Ｍ ＴＢＳに２００倍に希釈したビオチニレートされたヤギのアンチウサギＩｇＧ（ベクタスタイン(Vectastain)とインキュベートした。その後、０．２５％トリトン−Ｘと１％ヤギ血清を含む０．１Ｍ ＴＢＳで何回かリンスした。切片は、それから、０．２５％トリトン−Ｘと１％ヤギ血清を含む０．１Ｍ ＴＢＳで１００倍に希釈されたアビジン(avidin)とビオチレートされたセイヨウワサビペルオキシダーゼ(peroxidase)（カリフォルニア州バーリンガムにあるベクター研究所のＡＢＣキットのベクタスタイン）の複合体と１時間室温でインキュベートし、その後リンスした。ペルオキシダーゼは、０．０５％ ３，３−ジアミノベンジンテトラヒドロキシクロライド（ＤＡＢ）（ミズーリ州セントルイスにあるＳｉｇｍａ化学より入手）、０．０５％ ＮｉＣｌ2、０．０１％ Ｈ2Ｏ2を含むＴＢＳ中で室温で１５分反応させることによって目に見えるようになる。据え付けられた切片は、繊維芽細胞の積極的な移植の大きさと位置を評価された。
【０１３１】
（高レベルにＴＨを発現する繊維芽細胞クローンの確立）
不滅化したラットの繊維芽細胞（２０８Ｆ）は、Ψ２／ＴＨプロデューサー細胞によって作られたＬＴｈＲＮＬウイルスによって感染を受け、１２個のＧ４１８耐性クローンが確立した。［表１］は、これら１２個のＧ４１８耐性クローンのうちで最も高い活性を持つ３種類のＴＨ活性と、Ψ２プロデューサー細胞株のＴＨ活性を示している。
【０１３２】
【表１】
2005239721.tif 000003
【０１３３】
最も高い活性を持つクローン（クローン ２０８Ｆ／ＴＨ−８と２０８Ｆ／ＴＨ−１１）のＴＨ活性は、ラットの線条体のＴＨ活性のおよそ４分の１である。最も高い活性を有するクローン ２０８Ｆ／ＴＨ−８は、今後の研究に用いるために選択された。
【０１３４】
（ＴＨを発現する繊維芽細胞はＬ−ドーパを生産し、分泌する。）
ＴＨを発現する繊維芽細胞２０８Ｆ／ＴＨ−８とコントロールの２０８Ｆの細胞抽出液は、Ｌ−ドーパの定量に用いられた［表２］。６ＭＰＨ4を添加した培地中で培養した２０８Ｆ／ＴＨ−８細胞のみがＬ−ドーパを生産した。コントロールの細胞はＬ−ドーパを検出できるほど生産しなかった。ドーパミンとその代謝産物であるＤＯＰＡＣとＨＶＡは、２０８Ｆ／ＴＨ−８細胞と２０８Ｆコントロール細胞のどちらでも検出できなかった。
【０１３５】
【表２】
2005239721.tif 000004
【０１３６】
［表２］で示されるように、Ｌ−ドーパは、２０８Ｆ／ＴＨ−８細胞の培地中でも、コントロール２０８Ｆ培地中で６３ｎｇ／ｈ／１０6ｃｅｌｌｓ、ＴＨ感染した培地中で２３９ｎｇ／ｈ／１０6ｃｅｌｌｓ検出された。２０８Ｆ／ＴＨ−８またはコントロールの繊維芽細胞に含まれるか放出されたＬ−ドーパ代謝産物は検出できないレベルではなかった。
【０１３７】
（移植の組織学的試験）
移植した繊維芽細胞は、神経まひした尾状内の多くの位置の実質組織中で生き延びた。フィブロネクチンの積極的な移植で生き残るために、おおむね位置にかかわらず移植片が適当な大きさであることが必要らしい（図１８（ａ）と（ｂ））。シリンジ管でのフィブロネクチン染色という限定された条件に基づいても、生き延びることができなかったのは、３１の移植例のうちわずか４例だけだった（図１８（ｃ）と（ｄ））。移植片が生き延びることができなかったラットの行動のデータは、統計処理から除外された。繊維芽細胞のＴＨ免疫活性は、インビトロでもインビボでも観察されなかった。
【０１３８】
（転回非対称性に対する移植効果）
薬物誘導による個々の動物の転回数を、移植前と移植後２週間の時点で比較した。アポモルフィンで試験したラットとアンフェタミンで試験したラットの間に相違はみられないので、それぞれの転回数を同じように扱うことにした。
【０１３９】
転回非対称性の改善は、移植位置に依存していた。尾状器官の尾状部位に繊維芽細胞移植片を持つラット（図１９最上部）（ＡＰ＝０〜０．４）には、転回行動にあまり変化が無かった。くちばし状部位の実質組織にＴＨ感染し、生き延びている繊維芽細胞を持つラット（ＡＰ＝１．４〜２．２）は、移植後２週間で平均３３％薬物誘導による転回が減少した（図１９最下部）。
【０１４０】
これらの結果から、ＴＨ遺伝子をコードするラットｃＤＮＡは、繊維芽細胞に安定的に形質転換されるとき、機能のあるＴＨ酵素活性を示したことがわかる。ＴＨ遺伝子を発現する繊維芽細胞は、インビトロでＬ−ドーパを生産し、分泌することができる。これらのドーパ生産性繊維芽細胞がくちばし状部位に移植されたとき、パーキンソン病のラットモデルの転回非対称性をかなり減少させた。コントロールの繊維芽細胞はインビトロでＬ−ドーパを余り生産せず、これらのラットの転回非対称性を減少させないことから、これらのドーパ生産性細胞がラットの転回非対称性を減少させる能力は、単に細胞内のＴＨ遺伝子の存在に依存しなければならない。これらのデータは、少なくとも２週間の転回行動の効果を示している。
【０１４１】
ドーパ生産性繊維芽細胞の転回行動に対する効果は、くちばし状部位の位置に依存している。胎児の神経をラットに移植する以前の研究データは、移植がくちばし状部位に行われたとき、転回非対称性が最も効率的に減少することを示している（Dunnett, 同上）。実験に用いられた繊維芽細胞は軸索を伸ばすことができないので、移植の位置は適切な移植位置決定にかなり依存する。
【０１４２】
ドーパ生産性繊維芽細胞が転回非対称性を減少させる正確なメカニズムは、決定されている。たぶん、ひとたびドーパが分泌されると、全身神経麻酔した動物体内でさえ、尾状部位のドーパ脱炭酸酵素活性が充分なまま残される（Lloyd etal., Science 170: 1212-1213 (1970); Hornykiewicz, British Med. J. 29:172-178 (1973)）。その結果、Ｌ−ドーパが薬物誘導された転回行動を修整するドーパミンに変換される。これらのドーパ生産性細胞の活動に対するこの仮定のメカニズムは、パーキンソン病に対するＬ−ドーパの治療系の非常に確定した効果に一致するだろう（Calne, N. Eng. J. Med. 310:523-524 (1984)）。これらのドーパ生産性繊維芽細胞は実質的にはＬ−ドーパの局所的に小さなポンプの役割を担う。
【０１４３】
この実験例で示されているように、細胞をＬ−ドーパを生産するように修飾する能力は、パーキンソン病の移植治療にとって理想的な細胞を探す研究に発展している。ＴＨ遺伝子を発現するように修飾され、腫瘍に変化したり、他の疾病を引き起こすことなしに脳内に長く生き残ることができる細胞ならどんな細胞でも、用いられる可能性がある。これらの特殊に不死化したラットの繊維芽細胞は３カ月経っても腫瘍に変化することはなく、プライマリー繊維芽細胞やプライマリーグリア細胞のようなプライマリー細胞は、腫瘍化の傾向が理論的にも低く、ある実例では移植に好ましいとされている。付け加えると、自家組織移植のために患者自身のプライマリー細胞を利用して、移植による拒絶反応を減少させることができるだろう。しかし、この実験例で用いられた２０８Ｆ細胞のような不死化した細胞の利用は、たやすく利用されている、よく特性を知られている細胞をたくさん用意することが有利であることを示している。
【０１４４】
これらの結果は、繊維芽細胞が通常神経によって与えられるような機能を与えることができるように遺伝学的に修飾されうること、それ故神経移植のために胎児の組織を利用する必要が無いことを示している。移植という物理的な治療法と遺伝子導入を組み合わせることが、ＣＮＳ機能不全の処置に力強い方法となる。現在発明された方法は動物やヒトの脳内疾患の他のモデルの処置にも用いられるかも知れない。
【０１４５】
［実験例ＩＶ］
「培養した自己のプライマリーの皮膚繊維芽細胞の移植」
前述のとおり、大脳内への移植の際の拒絶を最小限にし、プライマリーの繊維芽細胞などの自己の細胞を用いて腫瘍の形成を防ぐことは、確実な環境においては望ましいことである。この実験例において、プライマリーの繊維芽細胞は、細胞のインビトロおよびインビボにおける成長の評価、および移植細胞のドナー線条体への定着の評価によって、大脳内移植に対するこの細胞集団の評価をおこなった。
【０１４６】
これらの実験において、培地内でのプライマリーの皮膚繊維芽細胞の成長速度が測定された。成長と培地内での細胞の特徴が、それらについての以下の移植を予言できるかどうかを決めるために，この成長型は、インビトロにおいて固定したラット−１繊維芽細胞のものと比較した。移植前に培地で細胞が受け得る継代接種の数や移植細胞の密度を含む、プライマリーの繊維芽細胞の生存に影響すると思われる変数もまた試験された。培養細胞への新たな遺伝物質の導入には、変更を受けた個体群の選択と拡張に対するいくつかの経路が要求されるため、前者の評価が重要となる。移植細胞の密度は、最適な移植サイズの決定に際し変更された。移植片の形態学的および神経化学的特徴付けもまた行われ、自己繊維芽細胞移植片とホスト線条体間の細胞相互作用が示された。
【０１４７】
皮膚バイオプシー(biopsies)は、２３匹のメスのスプレージ−ドウレイ(Sprague-Dawley)ラット（２００−２５０ｇ）の腹部の壁(ventral abdominal wall)から採取した。各バイオプシーからの純粋な繊維芽細胞は通常の条件下で維持し、１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭを週に３度与えた。集合体に成長した繊維芽細胞を１：２に分割した。プライマリーの皮膚繊維芽細胞の成長速度はコールターカウンター(Coulter Counter)（Coulter Electronics Inc）を用いて決定した。これらの細胞の３部分からなる試料を毎日測定し、同条件下で成長させ採取した固定したラット−１繊維芽細胞のものと比較した。
【０１４８】
大脳内移植にとって、各動物からのプライマリーの皮膚繊維芽細胞は１回あるいは４回の継代接種を行った（継代接種１代から４代の間におよそ５回の細胞分裂が起こった）。これらの細胞は集合体に成長し休止状態において採取された。培養した繊維芽細胞は１ｍｇ／ｋｇのＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2と０．１％のグルコースを加えた移植用リン酸緩衝食塩水に懸濁した。懸濁液の密度は、１０4から１０5個の細胞／μｌの範囲であった。その動物にケタミン−キシラジン(ketamine-xylazine)（１０ｍｇ／ｋｇのケタラール、パルケ−デイビス、アンアーバー、ＭＩ(Ketarar, Parke-Davis, Ann Arbor, MI)；５ｍｇ／ｋｇのランパン、ヘキスト、フランクフルト、ジャーマニー(Rumpun, Hoechst, Frankfurt, Germany)；及び６ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンマレート、テクアメリカ(acepromazine maleate, TechAmerica)）を血管内注入して麻酔がかけられ、フレームの定位置に置かれた。それぞれの動物には、それ自身の皮膚のバイオプシー(biopsies)から得られた培養された皮膚の繊維芽細胞の移植片が移植された。４個の細胞懸濁液（３μｌ／部位）の全てが、ハミルトンシリンジ(Hamilton syringe)に入っていて、２個の吻側と２個の尾側で線条体の定位に注入された。移植の後、３週間から８週間、その動物は生存した。
【０１４９】
大脳内のプライマリー皮膚の生きている繊維芽細胞移植片を感染するパラメーターを評価するために、２種の実験が細胞の継代接種（ｎ＝１２）及び細胞の密度（ｎ＝９）の結果を示すことができるように計画された。第１番目の実験では、３匹のラットのグループに、１代から４代の継代接種が行われた自己のプライマリー皮膚の繊維芽細胞（１０5個の細胞／μｌ）が注入された。これらの動物は手術を施された後、３週間から８週間で殺されて潅流された。第２番目の実験では３匹の動物のグループに、１０4、２．５×１０4、５．０×１０4、あるいは１０5個の細胞／μｌの懸濁液が注入された。；継代接種（４代）の回数及び生存期間（８週間）は一定であった。
【０１５０】
（組織の準備と組織学）
光学顕微鏡を用いるために、動物に対し４％パラホルムアルデヒドを含んだリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を心臓を通して潅流させた。脳を取り出し、一晩固定し、３０％スクロースの中に３日放置した。線条体の通った頭頂部分は凍らせたミクロトームの上で４０μｍの厚さに切り出し凍結防止剤の中へ集めた。一続きの切断片はクレジルバイオレットにより着色した。残りの切断片はフィブロネクチン、膠繊維酸性蛋白（ＧＦＡＰ）、および小膠細胞および／またはマクロファージの免疫組織化学的検出のため３つの組に分けられた。この切断片は内生ペルオキシダーゼ活性を食い止めるため、初めに０．６％過酸化水素を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で３０分間処理した。切断片は緩衝液で洗浄し、ウサギの抗−ヒト繊維芽細胞免疫グロブリン（ＩｇＧ）（１：２０００に希釈）またはウサギの抗−ヒトＧＦＡＰＩｇＧ（１：１０００に希釈）中で、３％標準ヤギ血清および０．２５％トリトン−Ｘとともにトリス緩衝液中において室温で一晩培養した。つぎにこれらを緩衝液ですすぎ、ビオチン化されたヤギの抗−ウサギＩｇＧ（１：２５０に希釈）中で１時間培養した。さらに洗浄後、それらをアビジン−ビオチン複合体（Vector Laboratories）中で１時間培養し、洗浄した。これらを０．０２５％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）テトラヒドロクロリド、０．５％ニッケルクロリドおよび０．０３％過酸化水素とともにトリス緩衝液中で５分間処理した。
【０１５１】
反応性小膠細胞および／またはマクロファージの免疫組織化学的局在化はマウス モノクローナル抗体 ＭＲＣ ＯＸ−４２（Serotec）を用いて行われた。切断片は緩衝液で洗浄しＭＲＣ ＯＸ−４２（１０μｌ／ｍｌの濃度で）、３％標準ウマ血清および０．２５％トリトン−Ｘとともにトリス緩衝液中で室温で一晩培養した。これらを洗浄してビオチン化したウマ抗−マウスＩｇＧ（１：１６０に希釈）中で１時間培養した。切断片を洗浄しアビジン−ビオチン複合体中で培養し、再び洗浄しＤＡＢ溶液中で反応させた（前述のように）。免疫ペルオキシダーゼ反応の後すべての切断片をトリス緩衝液で、続いてリン酸緩衝液で洗浄した。これらはクロームアルム−ゼラチン(chrome alum-gelatin)を塗ったスライドに載せ、エタノールで脱水した後カバーグラスを装着した。
【０１５２】
電子顕微鏡を用いるために、動物（ｎ＝２、細胞密度研究から得られた）に対し、４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドを含んだトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を心臓を通して潅流させた。脳を取り出して３時間固定した後、線条体の通った頭頂部分をオックスフォードビブラトーメ(Oxford vibratome)上で５０μｍの厚さに切り出しトリス緩衝液中に集めた。切断片はフィブロネクチン(fibronectin)により免疫組織化学的に着色かまたは緩衝剤で処理した１％オスミウムテトラオキシド中で１時間固定した。後者の切断片をすすぎメタノールにより脱水し、プロピレンオキシド中で明確化し、ポリ／ベッド(Poly/Bed)およびアラルダイト(Araldite)の混合液中に固定した。移植片を評価するために、やや薄い切断片（１−２μｍ）を集めて１％トルイジンブルーで着色した。ごく薄い切断片はＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｏｍ Ｕ３超ミクロトーム上で切断し、銅のグリッド上に集めて酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で着色した。切断片はＪＥＯＬ １００ ＣＸＩＩ透過型電子顕微鏡で観察した。
【０１５３】
（移植片の分析）
フィブロネクチンは、通常ラットの脳においては検出されないため、繊維芽細胞移植片はフィブロネクチンで免疫組織化学的に着色された領域によって規定される。免疫反応性を示す切断片は、Ｃｕｅ−２画像分析システム（Olympus Corp）を用いて解析した。免疫着色はマニュアルに沿って追跡し（倍率(mag.)＝４×）、移植片の領域は与えられた系列の中で各切断片について計算された。移植片の体積（ｍｍ3）はウィリンジ(Uylings)らによってこの系列から計算され（J. Neurosci. Meth. 18:18-37 (1986)）この参考文献中に記述されている。尚この文献は参照としてここに組み入れられる。切断片は、電子顕微鏡で観察した試料と同様にクレジルバイオレット，ＧＦＡＰおよびＭＲＣ ＯＸ−４２で着色し、定量的に評価された。
【０１５４】
（ラット−１繊維芽細胞およびプライマリーの繊維芽細胞に対する成長曲線）
接触阻害を受けたと推定される固定された繊維芽細胞であるラット−１細胞の成長速度は、同様の条件下で培養されたプライマリーの繊維芽細胞のものと比較した。初めの１週間はいずれの細胞型の成長曲線も同様であったが、１０日後には劇的に異なる成長様式が観察された（図２０）。ラット−１細胞は一旦コンフルエントに到達した後も成長し続けたため、接触阻害されていないように思われた。一方、プライマリーの皮膚繊維芽細胞の成長は、細胞が一旦コンフルエントに到達した後は安定した。これらの成長の持続（ラット−１繊維芽細胞）対静止（プライマリーの皮膚繊維芽細胞）という様式は３週間継続した。
【０１５５】
（細胞の継代接種）
線条体におけるプライマリーの繊維芽細胞の大きさに影響を与えると思われるパラメーターは、移植に先立って行われたインビトロでの継代接種の数である。この研究では、移植片の細胞の密度は一定で１μｌあたり１０5個である。繊維芽細胞の懸濁液を注入された６匹の動物は、培地において１度の継代接種そ受け、繊維芽細胞の注入を受けた他の６匹の動物は４度の継代接種そ受けた。各グループからの３匹の動物は殺され、移植を受けた後３ないし８週間潅流した。２−ファクターＡＮＯＶＡは継代接種１回および４回の移植片の体積の違いを評価するために移植後３ないし８週間に渡って使用した（図２１）。フィブロネクチン免疫着色により決定した移植片の体積は、移植に先立って行われた培地上での継代接種の回数の関数として異ならなかった（１対４）。脳へ移植した培養自己繊維芽細胞は、腫瘍を形成したり衰退および死滅することはないことも明かであった。実際、移植片の大きさはインビボで３週間および８週間生存したものでは明らかに違いは見られなかった。
【０１５６】
（細胞の密度）
測定された、移植片の大きさのもう一つのパラメーターは、線条体に移植した細胞の密度である。４つの密度（１μｌあたり１０4、２．５×１０4、５．０×１０4または１０5個）が評価され、移植片の体積はフィブロネクチンを用いて免疫組織化学的に決定された。大脳内への移植のための繊維芽細胞は培地での４回の継代接種の後に採取され、動物は移植から８週間後に殺した．２−ファクターＡＮＯＶＡを用いて、４つのグループの間で移植片の体積の明かな違いが観察された；高い細胞密度の懸濁移植片のほうが低い細胞密度のものより大きい移植片を産生した（図２２）。これより、移植片の体積と移植細胞の密度との関係は明らかである。
【０１５７】
（組織学）
構造的に関連した糖蛋白の仲間であるフィブロネクチンによる免疫着色は、大脳内移植の大きさと範囲を示した。３週間目に線条体の神経網(neuropil)への幾分わずかの拡張をしめし、他方８週間後では移植片はより縮小し突起が少なくなった様子であった（図２３）。しかしながらフィブロネクチンによる免疫着色は、移植片の内部や近くの個々の繊維芽細胞や他の細胞成分を分離することができなかった。クレジルバイオレットによる着色では、繊維芽細胞に特徴的な長い核が移植片において観察された（図２４（ａ）、（ｂ））。移植片を通っている血管も見られ、残骸が含まれている(debris-filled)細胞が中心部に優先的に存在していた。ＧＦＡＰにより免疫組織化学的に着色された星状細胞は、３週間目では移植片を囲むホスト線条体中で顕著であったが、移植片内の免疫着色は希薄であった。ＧＦＡＰ−免疫反応作用は、８週間目の移植片の内部および周囲の両方で観察された（図２４（ｃ）、（ｄ））。ＭＲＣ ＯＸ−４２免疫反応性によって視覚化した反応性の小膠細胞および／またはマクロファージは、３週目では移植片を取り囲んでいたが、８週目では勢力が衰え、より変異していた（図２４（ｅ）、（ｆ））。
【０１５８】
（原形質超微細構造）
移植後８週目におけるプライマリーの繊維芽細胞自己移植片の構造組織化は電子顕微鏡レベルで調査された。移植片の最も顕著な特徴は、多量の繊維芽細胞およびコラーゲンの存在である。繊維芽細胞はしばしば凝集している楕円の核をもっていた；核小体はめったに観測されなかった（図２５（ａ）、（ｂ））。これらの細胞の細胞質は内部原形質の粗い網状組織、長く延びたミトコンドリア、および分泌性小胞をふくんでいた。少量のゴルジ体は明らかであった。移植片の至るところで見られた細長い繊維芽細胞の突起は、内部原形質の粗い網状組織と分泌性小胞をもまた含んでいた（図２５（ｃ））。繊維芽細胞体とその突起をコラーゲンがびっしりと取り囲んでいた。繊維芽細胞とコラーゲンのいずれもが、線条体神経網においては観察されなかった。移植片の細胞外基質中において、コラーゲンの束の間を通って、肥大した星状細胞が拡張するのが観察された；星状細胞の細胞体は繊維芽細胞移植組織の中には見られなかった（図２６（ａ））。移植片の食細胞の形態学は変わりやすい；サイトプラズマはわずかな細胞小器官をもち、大抵は電子の詰まった小片で満たされている（図２６（ｂ））。これらの細胞の核は不規則で、染色質はしばしば核の包膜に凝集している。移植して８週間後、移植片の周辺および内部にわずかのリンパ球もまた観測された。
【０１５９】
プライマリーの繊維芽細胞の他の著しい特徴は、連続型毛細管の存在であった；管くうの内皮の内面は連続しており、穿孔(fenestrations)は明確ではなかった（図２７（ａ））。これらの管を囲んでいる基底層が存在していた。管腔を取り囲んでいる内皮細胞は、核膜内で凝縮した染色質をもつ核をもっていた。内皮細胞の管状および非管状双方の原形質膜における多くの小嚢の陥入は明らかで、細胞質中の小嚢もどうように明確だった（図２７（ｂ））。細胞間接合は内皮細胞間の極近接した部位で観察された（図２７（ｃ））。コラーゲンおよび／または反応性星状細胞は、移植片の毛細管と近く結合していた。毛細管に近接したこれらの反応生星状細胞の性質は、単繊維で満たされ正常な大脳の管を包むこれらの無髄神経の末端球(endfeet)の星状細胞とは似ていなかった（図２７（ｄ））。ある毛細管はまた、管を完全に囲むいくつかの反応性の星状細胞の突起をもっていた；内皮と星状細胞の間の空間には通常コラーゲンが存在し、その大きさは変化した。
【０１６０】
プライマリーの繊維芽細胞は、一度それら同士が接触してコンフルエントに達すると増殖を停止した。このことはインビトロでの接触阻害を示している。ここに示したように線条体への移植後、プライマリーの皮膚繊維芽細胞の移植片の体積は３ないし８週間のあいだ一定であった；これより腫瘍形成や死滅といった傾向はインビボでのプライマリーの皮膚繊維芽細胞では特徴的ではなかった。たとえば接触阻害といった培地におけるプライマリーの繊維芽細胞の特徴は、ＣＮＳへ移植後の移植片の成長および生存に反映されているであろう。この研究論文からのデータはまた、細胞懸濁液の密度がプライマリーの皮膚繊維芽細胞の移植片の大きさを決定するもう一つの因子であることを示している：高密度の細胞懸濁液は低密度のものより大きな移植片を産生する。移植に先立って行われた培地での細胞継代接種の数と移植後の期間は移植片の大きさに影響する因子とは思われない。
【０１６１】
プライマリーの皮膚繊維芽細胞を移植に用いるもう一つの利点は、自己細胞の免疫拒絶反応の可能性を低減できることである。同種移植片に対する免疫学的応答は、特に２０８Ｆ繊維芽細胞において、移植後の細胞を死滅させる一つの要因であろう。この実験例では、皮膚バイオプシーからの繊維芽細胞は培養条件下で育てられドナーの線条体へ移植された。この実験例では皮膚バイオプシーからの繊維芽細胞は培養条件下で育てられドナー線条体に移植された。繊維芽細胞を線条体に定位に設置した後、血液−脳関門が破壊されリンパ球を含んだいくつかの細胞個体群が傷ついた部位から侵入する。移植片の近くにリンパ球が存在するにもかかわらずこれらの自己細胞に対する免疫反応は最小限であるように見えた。それゆえ、プライマリーの繊維芽細胞の組織適合性はまたインビボでの移植片の生存を促進するであろう。
【０１６２】
この実験例は成長したラットＣＮＳプライマリーの皮膚繊維芽細胞の生存の維持の直接の証拠を提供する。原形質超微細構造の分析はこれらの移植片が他の細胞個体群（たとえば食細胞やリンパ球など）に加えて、はじめは繊維芽細胞とコラーゲンから構成されていることを示している。線条細胞に移植して８週間後の繊維芽細胞の形態学的特徴は、皮膚において通常見られるものと同じであり、凝集した染色質をもつ楕円の核、延びたミトコンドリアおよび２、３のゴルジ体をもつ。サイトプラズマと繊維芽細胞の突起との内部における、内部原形質の網状組織や分泌性小嚢の存在は、活発なプロテインの産生を強く示唆している。さらに、おびただしいフィブロネクチンによる免疫着色とコラーゲンの存在は、移植片において繊維芽細胞が２つの異なる細胞産生物を合成していることの証拠を提供している。コラーゲンが産生されているにもかかわらず、移植後３ないし８週間にわたりほぼ同じ大きさを保ち続ける。この観察結果に対する１つのもっともらしい説明は、培養繊維芽細胞はコラーゲン分解酵素（コラーゲナーゼ）を産生することが知られており（Millis et al., Exp. Geront. 24:559-575 (1989)）それゆえ移植片中において繊維芽細胞がコラーゲンの産生および抑制のレベルを調節しているかも知れない。光学および電子顕微鏡の観察結果からラットの線条体へ移植したプライマリーの繊維芽細胞はその形態学的特徴を維持し、コラーゲンとフィブロネクチンとを産生、分泌し、８週間まで生き延びることが結論された。生存細胞の総数あるいは生き残った細胞の比率は決定されなかったが、移植後８週間では移植片において高い比率で細胞が生存している見込みは少ない。繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などの栄養物質はラットＣＮＳ中へ移植したプライマリーの皮膚繊維芽細胞の生存率を増加させるであろう。
【０１６３】
（ホスト−移植片相互作用）
培養した自己の繊維芽細胞の移植の重要な問題は、これらの移植片がホストの神経系に結合するかどうかである。ラットの線条体に培養したプライマリーの皮膚繊維芽細胞を移植した後、ホストと移植片との動的相互作用による３つの顕著な細胞の事象が観察された。これらは一時的な出来事で、以下のように起こった；１）活性化、および移植片への小膠細胞および／あるいはマクロファージの移動；２）新血管新生；３）星状細胞突起の肥大および移植片への侵入。血液−脳関門の傷への浸み込みにおけるＣＮＳへの初期応答の以前の調査のデータに基づいて、ここに記述したモデル系はここに組み入れられる。単核食細胞はＣＮＳの中で傷に対して最初に応答した細胞であることが示されている（Imamoto and Leblond,J.Comp.Neurol.174:225-280(1977)）。マクロファージ、小膠細胞および顆粒性白血球は、ヒトおよびマウスの補体型３（Robinson et al., Immunol. 57:239-247 (1986)）のラット相同物を認識するＭＲＣ ＯＸ−４２を用いて免疫組織化学的に示されるであろう。ここに示した結果は、ここに示した結果は、ＯＸ−４２免疫応答性を保持した細胞は、３ないし８週間後に移植片の周辺に存在していることを示している。８週間目の組織の電子顕微鏡による調査は、移植片と無傷の神経網との間の境界領域での食細胞の存在を確実にし、またこれらの細胞はＯＸ−４２により免疫組織化学的に着色されているだろう。食細胞はまた、移植細胞中至るところに存在するが、移植片自身の内部ではＯＸ−４２免疫反応性は明らかではなかった。それゆえ非免疫反応性食細胞は他の細胞個体群あるいはマクロファージ、小膠細胞および補体の欠如した顆粒性白血球を構成する。細胞は傷ついた部位に移動し、移植片に侵入する。
【０１６４】
移植後の繊維芽細胞の運命を決定する重要なホスト−移植片細胞相互作用は、移植片の中への脈管系の構築である。移植片の中への脈管系の構築歯、ある部分、繊維芽細胞成長因子のような血管生成物質に依存している。移植された皮膚繊維芽細胞による繊維芽細胞成長因子の産生および放出は血管生成を促進する。移植片における新血管新生は、インターロイキン−１を産生および放出する反応性の小膠細胞およびマクロファージによっても促進される。
【０１６５】
ＣＮＳへの管組織の移植は、新たな毛細管の生成について周囲のホスト組織に完全に依存する。皮膚繊維芽細胞移植片の内部の毛細管は、一続きの管くうを形成しまた細胞が並列に位置した部位の細胞間接合（必ずしも強い接合でない）を保持した窓のない内皮細胞からなりたっている；これらの管は結合および神経組織の双方で見つかる管を暗示している；しかしいくつかの特徴により移植片の毛細管は近接した線条体のそれと区別される。第一に、移植片内の内皮細胞は多くの細胞内小嚢と原形質膜への小嚢の陥入があり、他方神経毛細管では管くうおよび反管くう側でわずかの小嚢の陥入が認められた。第二に、移植片の管と会合した反応性星状細胞は、神経毛細管を取り囲んでいる無髄神経の末端球の星状細胞とは似ておらず、ここで前者の様子は線条で覆われ肥大していつも移植片の毛細管を包んでいるわけではない。第三に、内皮と、移植片の毛細管の反応性星状細胞の側面との間の管の近くの空間は変わりやすく、しばしば介在要素（コラーゲンを含む）が存在している。神経管は基底層を含むせまい管に近接した空間をもつ。
【０１６６】
線条神経網とプライマリーの繊維芽細胞の間で観察された３つ目の相互作用は自家移植片への星状細胞の応答性であった。大脳内移植はふつう、反応性星状細胞の突起の移動および／あるいは膠の境界膜(limitans)の生成を含む膠反応を引き起こす。これらの研究は、ＧＦＡＰ−免疫反応性星状細胞ペルカルヤ(perkaraya)は、３および８週間の移植片の周囲に多く存在し、免疫反応性突起は８週間目の移植片の内部で見つかった。原形質超微細構造のデータは後者の観察を確証し、反応性星状細胞の突起は移植片の至るところに存在するが細胞本体は移植片自身の外部に残ったままであることを示している。本研究および他の研究で観察された星状細胞の応答は、ある部分傷ついた部位の近くに存在する反応性小膠細胞およびマクロファージ（これらの細胞はインビトロでインターロイキン−１を産生し放出することがしられている）の存在のためであろう。
【０１６７】
これらの結果は、成長したラットのＣＮＳへ移植した培養した繊維芽細胞の生存の直接の証拠を提示している。これらの移植片は線条体中に腫瘍を形成せず、起こり得る免疫学的応答はこれらの細胞の自己組織の特性のため細最小限のようにみえた。さらに、繊維芽細胞移植片は構造的にも機能的にもホスト脳に結合した。繊維芽細胞の成長したラットＣＮＳ細胞への構造的および機能的結合を示すホスト線条体と繊維芽細胞との間の動的相互作用は、移植片中の管系の構築、食細胞の移動、そして反応性星状細胞突起の移植片への浸入および肥大を含む。まとめとして、これらの特色は、プライマリーの繊維芽細胞は大脳への移植に対するふさわしいドナー細胞の候補者であり、それゆえ病気や損傷を受けたＣＮＳの遺伝子治療のために遺伝子に変更を施した細胞として用いられるだろうことを示している。
【０１６８】
［実験例Ｖ］
「Ｌ−ドーパ産生プライマリー繊維芽細胞の移植」
この実験例は遺伝学的に修飾されたプライマリー繊維芽細胞が脳に移植された後長期間生き残ることを確かめるものである。上記の実験を発展させ、ラットＴＨ遺伝子がフィッシャーラットの皮膚バイオプシーによって得られたプライマリー繊維芽細胞に挿入された。ＴＨ−含有プライマリー繊維芽細胞の生存率はフィッシャーラットの脳への移植後、黒質線条体経路の前６−ＯＨＤＡ病巣を使って二ヶ月間にわたって調べられた。さらに、移植された繊維芽細胞内ＴＨ−トランス遺伝子及びトランス遺伝子産物の存在が調べられた。最後に、遺伝学的に修飾された繊維芽細胞のインビボにおける延長された機能は、移植を受けたラットの転回行動を移植後八週間にわたって二週間ごとに評価することによって研究された。
【０１６９】
（レトロウィルスベクターの調製）
この実験で使われるベクターｐＬＴｈＲＮＬの調製は上記実験例IIIのようにして行われた（図１６及び図１７参照）。
【０１７０】
（繊維芽細胞の調製）
プライマリー繊維芽細胞はスライ(Sly)とグラブ(Grubb)（Methods in Enzymology, Vol. LVIII, Colowick and Kaplan, Eds., Academic Press, New York, pp. 444-450 (1979)）の方法で同系交配フィッシャー３４４ラットの腹皮膚生検からえられた。簡単にはラットはケタミン(Ketamine)、アセプトマジン(Aceptomazine)、ロンパン(Rompun)の混合物で麻酔された。腹部は毛をそられ、アルコールで現れた。約１ー２平方センチの皮膚が取られ、簡単にアルコールですすがれ、すぐに滅菌したＤＭＥＭ／Ｓを入れたバイアル瓶の中に置かれた。生検は通常採取後二次間以内にカバーガラスに移され、２１日間ＤＭＥＭ／Ｓ中で培養された。細胞はポリブレン（４μｇ／ｍｌ）存在下感染の多重度１０でエコトロピックＬＴｈＲＮＬまたはＢＡＧウィルス（Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:156-160 (1987)）に感染させられた。Ｇ−４１８抵抗性細胞はコンフルエントになるまで増殖させられ、ＴＨ活性の発現をデカルボキシラーゼ結合アッセイ法（Iuvone, J. Neurochem. 43:1359-1368 (1984)）によって試験された。ＴＨ−活性とＴＨ−免疫反応性をインビトロで示すサブクローン（ＦＦ２／ＴＨ）が移植のために選ばれた。ＢＡＧウィルスに感染し、βガラクトシダーゼ活性（β−Ｇａｌ）をインビトロで発現している繊維芽細胞コントロール細胞（ＦＦ２／βＧａｌ）として使われた。
【０１７１】
（インビトロ生化学分析）
Ｌ−ドーパ及びその代謝物の産生と感染細胞からの分泌は２４時間１００μｍのテテトラヒドロビオプテリン、ＴＨの活性コファクターを補われたＤＭＥＭ／Ｓ中で細胞を増殖させてから調べられた。条件を設定された培地と細胞は集められ、０．１Ｍ 過塩素酸（ＰＣＡ）と０．０５ ＭのＥＤＴＡに対して調整され、４℃１５分１００００×ｇで遠心分離され、沈澱物を除かれた。サンプルはカテコールアミン及びカテコールアミン代謝物の存在を上記実験例ＩＩのようにしてＰＣＡ抽出物を１６個の電気化学センサー（Matson et al., Clin. Chem. 30:1477-1488 (1984); Langlais et al., Monitoring Neurotransmitter Release During Behavior, Fillenz, et al., eds., Horwood, Chichester, U. K., pp. 224-232 (1986); Matson et al., Life Sci. 41:905-908 (1987)）を備えたクーロメトリックエレクトロードアレイ、グラヂエント液体クロマトグラフィー（CEAS model 55-0650, ESA, Bedfore, MA）に注入することによって分析された。
【０１７２】
（レジョン(Lesions)）
ドーパミン作動性黒質線条質経路はニューロトキシン６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）によって片側に偏って傷つけられた。６−ＯＨＤＡは６μｇ／μｌの濃度でセーラインに溶解され、０．１％アスコルビンサンを加えられ、酸化を遅らされた。雌のフィッシャー３４４ラット（１３０−１６０ｇ）は上記のようにして麻酔され、接触走性フレームに入れられた。２μｌの６−ＯＨＤＡが前脳束左中央（ＡＰ＝−４．４ｍｍ， ＭＬ＝１．１ｍｍ， ＤＶ＝７．５ｍｍ）へ毎分１μｌでパキノス(Paxinos)とワトソン(Watson)のThe Rat BraininStereotaxic Coordinates, San Diego, Academic Press,(1986)に従って注入された。注射後２ｍｍ持ち上げられ、２分間ニューロトキシンを拡散させるために休んだ。１０ー１４日間のリカバリー期間の後、障害を受けたラットはアポモルフィンを使って障害の程度を計られた。
【０１７３】
非特異的な線条体の損傷が転回行動の変化に与える寄与を計るため、線条体の片側だけカイニン酸（ＫＡ）障害を受けた６−ＯＨＤＡ障害ラットを用いて上記実験例ＩＩＩの方法が行われた。この実験のために雌のスプレイジ−ドーレイ(Sprague-Dawley)ラットが麻酔され、上記のようにして６−ＯＨＤＡを使って障害を与えられた。アポモルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）に対して１分間に７回以上の転回行動を示したラットはＫＡ障害のために選ばれた。カイニン酸は５μｇ／μｌの濃度でセーラインに溶解され、麻酔されたラットの線条体（ＡＰ＝０．３ｍｍ， ＭＬ＝２ｍｍ， ＤＶ＝４ｍｍ）にいろいろなドースで注射された。３匹のラットは１．０μｇ、別の３匹は２．０μｇ、３匹は４．０μｇ、２匹は５．０μｇ注射された。ＫＡは０．１μｌ／ｍｉｎで加えられ、それからシリンジはゆっくり２ｍｍ持ち上げられ、２分間ニューロトキシンを拡散させるため、そのままおかれた。注射後すぐにジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ）が与えられ、ＫＡを与えたことで起こる恐れのある発作が抑えられた。
【０１７４】
（挙動試験）
神経を切断され麻酔された線条体の中の後神経ドーパミン受容体の感受性はアポモルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）投与による６−ＯＨＤＡ障害の７−１０日後実験例ＩＩＩのようにして評価された。ラットは自動ロートメターボールの中に入れられ、総転回数が１０分ごとに６０分間計測された。２回のアポモルフィン試験の後に、毎分最低７回転以上したラットがつぎのテストのために選ばれた。ラットは最低３回アポモルフィンを使って試験されるか、または前回の測定から転回数の変化がみられなくなるまで試験された（Bevan, Neurosci. Letter 35:185-189 (1983); Castro et al., Psychopharm. 85:333-339 (1985)）。各アポモルフィン試験の後１０日が経過した。移植後８週間の間、２週間毎にアポモルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を使って試験された。ＫＡ障害を持つラットは障害を与えられてから２、４、６週目にアポモルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を使って評価された。統計的な比較のために、６０分間における正味の毎分の回転数が移植後決定され、最小二乗法を使って移植前の値と比べられた。
【０１７５】
（移植）
繊維芽細胞は上記実験例IIのようにして移植のために調製された。簡単には細胞はＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ中の０．０５％トリプシンと１ｍｇＥＤＴＡによって組織培養プレートから取り出され、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、０．１％ グルコース（完全ＰＢＳ）及び５％ラットセーラムを加えたＰＢＳ中に懸濁された。細胞は遠心法によって集められ、完全ＰＢＳで２回洗浄され、完全ＰＢＳ中に１０００００細胞／μｌの濃度で再懸濁された。
【０１７６】
計１０μｌのＦＦ２／ＴＨ （Ｎ＝１０）またはＦＦ２／βＧａｌ（Ｎ＝５）を投与された１５匹の麻酔されたラットは繊維芽細胞を線条体内（ＡＰ＝０．３ｍｍｍ， ＭＬ＝２．０ｍｍ， ＤＶ＝４．５ｍｍ， ＡＰ＝１．５ｍｍ，ＭＬ＝２．０， ＤＶ＝４．５ｍｍ）の２箇所に注射された。それぞれの箇所では２．５μｌの細胞が分配され、シリンジは１ｍｍ持ち上げられ、さらに２．５μｌの細胞がカニューラ管から押し出された。細胞は毎分１μｌの速度で加えられた。最も背側に注射した後シリンジはそのままの位置に２分間おかれ、細胞が拡散するようにした。移植を受けていないほかの５匹のラットはコントロールとして使った。
【０１７７】
（解剖の方法）
インビトロにおける免疫組織化学的分析のためには感染した繊維芽細胞が４％パラホルムアルデヒドでスライド上に固定され、０．２％トリトンＸ−１００を使って浸透化され、TH(Boehringer Mannheim Biochemicals)に対するモノクローナル抗体と１夜間インキュベートされた。染色はアビジンービオチン法（Vector Laboratories, Elite Kit）によりニッケル強化３、３’−ジエチルアミノベンジジン（ＤＡＢ）をクロマゲンとして行われた。
【０１７８】
インビボ分析のためには移植された繊維芽細胞が移植後１０週後ＴＨ−及びフィブロネクチン免疫反応性に対して調べられた。ラットは深く麻酔され、簡単にセーラインですすいだ後、４％パラホルムアルデヒドで潅流された。脳は取り出され、同じ固定液の中に１夜間置かれ、３０％スクロース中に移されて平衡に達せられた。凍結部分はスライドミクロソーム（４０μｍ）上で切断され、クリオプロテクタント中に集められプロセッシングのために保存された。自由浮動部位は１夜間フィブロブラストマーカー（Organon Technica）に対する抗体かまたはＴＨに対するモノクローナル抗体とともにインキュベートされた。フィブロネクチン染色はアビジン−ビオチンとそれに続くニッケル強化ＤＡＢを使って行われた。ＴＨでラベルされた部分はマウス抗原に対する蛍光マイクロスコピー（Jackson ImmunoResearch Labs., Inc., Bar Harbor, Main）のためにローダミンと結合した二次抗体とインキュベートされた。いくつかの部分はミクログリアまたは単球／マクロファージを同定するためにＯＸ−４２（Serotec）抗体またはＥＤ−１（Chemicon）抗体を使ってプロセスされた。部分はＯＸ−４２抗体と４８時間またはＥＤ−１抗体と２４時間４℃でインキュベートされた。後日ＯＸ−４２はアビジンービオチン及びニッケル強化ＤＡＢを使って発展させられ、ＥＤ−１ラベルされた部分はローダミンでラベルされた二次抗体と上記のようにしてインキュベートされた。
【０１７９】
（インシトゥでのハイブリダイゼーション）
ＴＨ ｍＲＮＡに対するインシトゥでのハイブリダイゼーションは、［35Ｓ］でラベルされたプローブを用いて行われた。その方法については、Higgins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:1297-1301 (1988)に記載されており、その文献の記載は参照としてここに組み入れられる。ＴＨプローブの６３個の塩基対からなる鋳型は、ラットのＴＨ ｍＲＮＡ（Dr. Dona Chikaraishi, Tufts Medical School, Boston, MA から提供を受けた。）に相補的な３１１個のヌクレオチドからなるｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＳＰ６５を、ＡｖａＩＩを用いて切断することによって生成され、ＳＰ６ポリメラーゼによって転写された。スライドにマウントされた部分は、４％のパラホルムアルデヒドを用いて１分間で固定化され、プロテイナーゼＫを用いて５分間、切断された後、トリエタノールアミン（０．１Ｍの０．９％ＮａＣｌ及び０．１％のアセチックアンハイドライド）中で室温にて１０分間インキュベートされた。その部分は、つづいてアルコールで脱水されてから室温にて５分間クロロホルムによる処理が行われ、１００％のエタノールに２分間戻されてから、あと２分間９５％のエタノールでの処理が行われ、空気乾燥がなされた。脱水された部分は、５０％ホルムアミド、０．７５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのパイプス(Pipes)（ｐＨ６．８）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＤＴＴ、５Ｘのデンハルト溶液（０．０２％のＢＳＡ、０．０２％のフィコール(Ficoll)、０．０２％のポリビニルピロリドン）、０．２％のＳＤＳ、１０％のデキストランサルフェート、及び５００μｇ／ｍｌの変性されたイーストのｔＲＮＡを含有する緩衝液中で、１−３時間プレハイブリダイゼーションされた。そのプレハイブリダイゼーションの後で、過剰の緩衝液が除去され、その部分は５５℃で１８時間、全容量が７５μｌであるハイブリダイゼーション緩衝液中に含まれている１０−１５ｎｇのラベルされたプローブを用いてハイブリダイゼーションされた。そのスライドは、リンスされた後で、ＲＮａｓｅがある状態あるいはない状態で、０．６ＭのＮａＣｌ、０．０６Ｍのクエン酸Ｎａを含有する溶液中でハイブリダイゼーションが行われた。後で行ったハイブリダイゼーションのリンスを行った後、その部分は空気乾燥され、２４時間Ｘ−線フィルム（Kodak XAR）が照射された。つづいてその部分はコダックのＮＴＢ−２エマルジョンに浸漬され、４日間、４℃で放置され、増殖させた。
【０１８０】
大量のＴＨ−発現型繊維芽細胞がＴＨ−免疫反応性に対して染色された場合、ＴＨ−ラベルの強度の違いが観察された。高レベルのＴＨを安定に発現するクローンを単離しようとして、ＴＨ−発現型細胞がサブクローン化された。選択されたクローンであるＦＦ／ＴＨは、比較的均一なＴＨ−免疫活性（図２８参照）を示した。このクローンは、明白な形態学上の形態が、感染されていない繊維芽細胞あるいはβｇａｌを運搬するベクターで感染された繊維芽細胞に似ている。細胞は、通常、本体（soma）から広がる多角的な過程で延長された。βＧａｌを発現する細胞は、インビトロではＴＨ−免疫活性が現れなかった。
【０１８１】
（インビトロでの分析）
ＴＨあるいはβＧａｌ（ＦＦ２／βＧａｌ）に対する遺伝子を運搬するベクターを注入したプライマリー繊維芽細胞は、デカルボキシラーゼ−結合型の分析を用いてＴＨ活性について試験がおこなわれた。ＴＨ活性はＦＦ２／ＴＨ細胞においてのみ見いだされ、そのレベルは１．１±０．４ピコモル（pmole）のＬ−ドーパ／分／ｍｇタンパク質であった。ＦＦ２／ＴＨのプライマリー繊維芽細胞内におけるこのＴＨのレベルは、同じＬＴｈＲＮＬベクター（上記実験例ＩＩＩ参照）で感染された免疫済みの２０８Ｆ繊維芽細胞に対して前に観察されたレベルと比較された。
【０１８２】
感染された繊維芽細胞は、１００μＭのＢＨ4、すなわちＴＨに対する天然の共同因子に接触させて２４時間たった時点において、Ｌ−ドーパ及び他のカテコールアミンの産生及び放出に対して分析が行われた。ＴＨ遺伝子を含有する細胞から集められた培地には、１０6個の細胞あたり１７．２μｇのＬ−ドーパが含まれることがわかった。ＦＦ２／ＴＨ細胞ペレットの分析を通して評価されたように、Ｌ−ドーパの細胞内での定量は、１０6個の細胞あたり０．２μｇのＬ−ドーパであった。コントロールのＦＦ２／βＧａｌ細胞では、Ｌ−ドーパが含まれないかあるいはＬ−ドーパは放出されなかった。検出可能なＬ−ドーパの代謝産物、たとえばドーパミン、３，４−ジハイドロキシフェニルアセティックアシッド、あるいはホモバニリックアシッド等の代謝産物も、ＦＦ２／ＴＨやＦＦ２／βＧａｌ細胞のいずれかの細胞の培地、あるいはいずれかの細胞のペレットから集められたサンプル中にはなかった。
【０１８３】
（繊維芽細胞を移植されたラットの行動分析）
ＦＦ２／ＴＨ細胞あるいはＦＦ２／βＧａｌ細胞が移植された全ての６−ＯＨＤＡレジョン化されたラットは、移植手術を行った２４時間以内に普通に食べたり飲んだりしており、移植後、２カ月のテスト期間の間、体重は変わらないかあるいはわずかに増加することが分かった。移植されたラットの自発的な行動には明かな変化が見られず、身の回りや運動能力の行動は、移植されなかったレジョン化されたコントロールラットで現れるそれらの行動と比較された。
【０１８４】
インビボで移植された細胞からのＬ−ドーパの生産及び放出を評価するために、行動テストが行われた。ラットはアポモルフィンが投与された。アポモルフィンは、ドーパミン−涸渇の状態にある線条体の受容体の活性化を引き起こす薬物である。このこの薬物で誘導される興奮は、定量可能な巡回あるいは転回パターンで歩行する行動にラットを導く（Ungerstedt and Arbuthnott, Brain Res. 24:485-493 (1970)）。移植後、アポモルフィンを投与した後６０分間での１分間あたりの転回回数の平均が、移植されたラット及びコントロールである移植されていないラットについて測定され、統計学上の分析が行われている移植前の転回回数と比較された。コントロールの動物では、移植後の転回回数にわずかなレベルの増加が見られた（図２９のコントロール参照）が、それは、移植する以前に観察された転回回数レベル（ｐ＞０．０５）と比べて統計学的な差異はなかった。βＧａｌを含有する細胞を移植されたラットが起こすアポモルフィンで誘導される転回回数もまた、移植後２カ月の期間を通じて移植前の転回回数（ｐ＞０．０５；図２９、ＦＦ２／βＧａｌ）との間に違いは見られなかった。対照的に、ＦＦ２／ＴＨラットでは、移植後２週間の転回運動に意味あるほどの減少が現れ、その減少は移植後８週間を通して認められた（図２９、ＦＦ２／ＴＨ参照）。ＦＦ２／ＴＨラットの転回において、最初の６５％の減少、即ち１１．７±３．０から４．１±２．９（平均値±標準誤差の平均）の減少がおこり、移植後６及び８週間では、移植前のレベルよりもほぼ３０％以下のプラトーに縮小された。
【０１８５】
（解剖学上の分析）
繊維芽細胞の移植片は、移植後１０週間めの全てのラットの脳内に存在していた。しかしながら、２匹の動物からは移植片がその期間の間に消失していた。一般的には、ＦＦ２／ＴＨ細胞及びＦＦ２／βＧａｌ細胞の移植片の配置は、比較的吻側−尾側に沿って広がっている部位及び中央側の部位の両方の部位と同等に見いだされた。しかしながら典型的には、ＦＦ２／ＴＨの移植片は、ＦＦ２／βＧａｌの移植片よりも大きかった。ＦＦ２／ＴＨのグループのうちには、移植片の大きさと、転回行動の減少との間に相関関係はなかった。
【０１８６】
全ての移植片は、大量のコラーゲン繊維の中に散在して、延長している繊維芽細胞様の細胞を含んでいた。典型的な繊維芽細胞に加えて、大きくて黄色の細胞が明らかにヘマシデリン(hemasiderin)で満たされた状態でその移植片のコア内に見いだされた。これらの細胞にはしばしば残骸が含まれているので、小神経膠細胞及びモノサイト／マクロファージに対して特異的に染色されるマーカーであるＯＸ−４２及びＥＤ−１を用いてその移植片を通過する領域が染色される。しかしながら、免疫反応性のマクロファージはその移植片の周辺で見いだされるが、大量の残骸で満たされている細胞のコア部分はＯＸ−４２あるいはＥＤ−１でラベルされなかった。
【０１８７】
トランス遺伝子が移植された繊維芽細胞中で発現し続けるかどうかを評価するために、その移植片を通過する領域は、ＴＨ ｍＲＮＡにインシトゥでハイブリダイゼーションするために処理された。ＴＨ ｍＲＮＡに対する積極的なハイブリダイゼーションは、ＦＦ２／ＴＨ繊維芽細胞を含有する移植片中の細胞に存在していることが分かったのみであった（図３０（ａ）参照）。ＦＦ２／ＴＨ細胞及びＦＦ２／βＧａｌ細胞の移植片（図３０（ｂ）、コントロール参照）においては、コラーゲン繊維であらかじめ占拠されて構成されている移植片領域では、周辺の背景よりも有意にグレインの密度が小さいことが判明した。グレイン密度の増加を示している形態学上の細胞はさまざまであり、それらの細胞は伸長した繊維芽細胞の形態特徴を数多く示していた（図３１（ｃ））。しかしながら、積極的なＴＨのハイブリダイゼーションを伴ういくつかの細胞は、大きくて丸いものとして観察され、時としてヘマシデリンや顆粒状の微粒子で満たされていた。ＴＨ ｍＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションが行われたβＧａｌ移植片内には、細胞の存在は認められなかった（図３１（ｄ）参照）。
【０１８８】
トランス遺伝子の生産物が繊維芽細胞内で合成され、その細胞内に存在しているかどうかを調べるために、移植片に対して、ＴＨ−免疫反応性及びβＧａｌ組織化学について実験が行われた。ＦＦ２／ＴＨの移植片内には、伸長された形状の繊維芽細胞でＴＨ−ラベルされた細胞が、コラーゲン繊維の中に散在していることが観察された（図３２（ａ）参照）。自己蛍光物質はその移植片中に存在していたが、物質の形及び５２８ｎｍを通るブロードな蛍光（図３２（ａ）及び（ｂ）、星印）により、ローダミン−特異性ラベリング（５８２ｎｍで発光）から容易に識別可能な形であった。インビトロで観察されたように、ＴＨラベリングの強度には不均一性があった。自己蛍光細胞はＦＦ２／βＧａｌ移植片内に存在したが、識別可能なＴＨ−免疫反応性繊維芽細胞はなかった。βＧａｌ組織化学について染色された部分は、ＦＦ２／βＧａｌ移植片内の細胞の拡散した細胞質ラベリングを明らかにした。ＦＦ２／βＧａｌ染色が移植片のコア内の大円形細胞内及び繊維芽細胞に典型的な延びた形の細胞内に認められた（図３１（ｂ））。ＦＦ２／ＴＨ移植片内のβＧａｌ反応性は、先に内因性のマクロファージについて述べた青い粒状の染色を有する小数の円形細胞に限られた（Shimohara et al., Mol. Brain Res. 5:271-278 (1989)）。
【０１８９】
これらの結果は、皮膚生検から得られたプライマリー繊維芽細胞はトランス遺伝子を発現するためにカルチャー内で増殖することができ遺伝子的に操作できることを確認している。挿入されたＴＨ遺伝子産生がインビトロで合成され生物学的に活性化されているという証拠は、組織学的及び生化学的計測により提供された。ＴＨ遺伝子を含む細胞は、インビトロでＴＨに対する正の免疫反応性を示した。そして、ＴＨに対するプテリンコファクターの存在のもとで、細胞培養基中におけるチロシンの存在は、ＴＨ酵素活性を通じてＬ−ドーパに転換された。
【０１９０】
遺伝子操作についてのプライマリー繊維芽細胞の本質的な利点は、これらの変性された細胞を自己移植のためのドナー物質として使用し、従って宿主からの免疫学的応答の問題を最小にすることについての可能性である。この研究で使用されたプライマリー繊維芽細胞は、同一のドナー動物には移植されず、むしろ遺伝学的に同系交配のフィッシャー３４４ラット(Fischer 344 rat)が、神経芽細胞のドナーと変性された細胞の両方として使用された。この同種移植的アプローチは、インビトロでの細胞の維持を簡単にする一方、自己移植のそれらを近づけた条件を与えるので選択された。ラットの脳への６−ＯＨＤＡレジョンの移植に続いて、βＧａｌまたはＴＨについての遺伝子を含むプライマリー繊維芽細胞は少なくとも１０週間生存することが発見された。更に、移植された繊維芽細胞はβＧａｌ及びＴＨトランス遺伝子を、毎２カ月の移植後の生存期間中、発現し続けた。ＴＨを含む細胞がインビボでＬ−ドーパを産生し分泌し続ける証拠は、行動に関する観察測定、即ちＴＨを含む繊維芽細胞の移植片を有するラットについてのみ転回の非対称性における少なからぬ減少が観察されたことから提供された。
【０１９１】
（脳内における繊維芽細胞の生存）
２カ月間での実験期間の後、ＦＦ２／ＴＨ移植片はＦＦ２／βＧａｌ移植片よりも大きいことが観察された。この違いが生じる理由はわかっていない。脳内にプライマリーの繊維芽細胞が生存し続けるためのファクターはたくさんあるが、それには植え付けの前の細胞の状態、及び細胞が移植の前に培地に維持されている時間が含まれる。現在の研究で用いられているＦＦ２／ＴＨは、ＴＨ−発現性の繊維芽細胞のサブクローンであり、一方ＦＦ２／βＧａｌ細胞はβＧａｌ−発現性の繊維芽細胞の大量集団であった。大量のＦＦ２／βＧａｌ細胞よりも更に二量化を経てＦＦ２／ＴＨ細胞を合成するサブクローニング法は、インビボで生存している繊維芽細胞の能力に影響を与える可能性がある。早期の継代接種では、繊維芽細胞の移植片の大きさと実験例ＩＶにおいて示されているような移植の前の培養物における細胞の分割回数との間に相関関係は認められなかった。培養物中でより長期間維持された繊維芽細胞は、例えば今日の研究で用いられているのはＦＦ２細胞であり、このような繊維芽細胞は、４−６週間後の移植片の大きさあるいは構成に本質的な変化はみられず、６カ月間もの間脳内にうまく生存していた。
【０１９２】
脳内に生存している繊維芽細胞に影響を与える他のファクターとしては、適切な栄養素を供給するために移植された細胞を利用できることを含む。血管の生成は、ＦＦ２／ＴＨ移植片内では明白であるが、小さい方のＦＦ２／βＧａｌ移植片内ではあまり明白ではなかった。移植片に血管供給を確立するための時間経過も、繊維芽細胞の長期間の生存に影響を与える。他の細胞タイプ、例えば胎児の神経細胞などの細胞タイプを含有する移植片は、移植後の生存のためには迅速な血管の新生にかかっていることが判明している（Stenevi et al., Brain Res. 114:1-20 (1976)参照）。移植片内の血管が、典型的な脳の血管のように巨大分子に対する障壁を確立しているか、あるいは典型的な移植片周辺のもとの組織に見られるような漏出が残っている（Rosenstein and Brightman, J. Comp. Neurol 250:339-351 (1986)参照）かどうかも、移植された繊維芽細胞の生存に影響を与える。移植後に脳内血管を切開することは、脳内の細胞に対して典型的には役に立たないファクターに対し、脳に「窓(window)」を開けることを示唆している（Rosenstein and Bridhtman, 同上文献；Sandberg et al., Exp. Neurol. 102:149-152 (1988)参照）。このようなファクターは、血清が強化された培養培地（Gibbs et al., Brain Res. 382:409-415 (1986); Ezerman, Brain Res. 469:253-261 (1988)参照）に維持されている細胞にとって好適であるであろう。逆に血管の入口は、傷つき易い位置に移植された細胞が配されることによって、循環しているマクロファージから攻撃される。
【０１９３】
（移植片の構築）
移植された細胞は、２カ月間生存することがわかっているが、全ての移植片は大きい、ヘマシデリン(hemasiderin)及び残骸が含まれている細胞のコア部分に特徴を有しており、それは最初にマクロファージの攻撃を受けたことが示唆されている。しかしながら、ＥＤ−１−ポジティブなマクロファージの数には限りがあるので、いくつかの移植片の周辺では散在していることが観察されたが、移植片のコア部分内の細胞は、ＥＤ−１あるいはＯＸ−４２のいずれか、即ち小膠細胞及び単核細胞／マクロファージに対して特異的なマーカーであるＥＤ−１あるいはＯＸ−４２のいずれかとも免疫反応が起きなかった。更に、移植片がβＧａｌで染色された場合には、あらかじめ持っていた酵素が外来のマクロファージ内にはっきりとした顆粒の出現を示すことがわかり（Shimohara et al., 同上文献, 1989）、ＦＦ２／ＴＨあるいはＦＦ２／βＧａｌ移植片のいずれかの中ではその大きなコア細胞がどれも顆粒の染色を示さなかった。しかしながら、ＦＦ２／βＧａｌ移植片内のいくつかのコア細胞はそれぞれ拡散と細胞質のβＧａｌを明白に示しており、あらかじめラベルすることによって、βＧａｌトランス遺伝子を含有する免疫化された繊維芽細胞の特徴であることが示されている（Shimohara et al., 同上文献, 1989）。最後に、ＦＦ２／ＴＨ移植片内の大きなコア細胞は、ＴＨ ｍＲＮＡに対してポジティブにハイブリダイゼーションすることを示していた。これらの観察から、繊維芽細胞の移植片のコア部分内にある食細胞が、もとのドナー細胞の懸濁液からもたらされることが強く示唆された。
【０１９４】
（移植片の機能のメカニズム）
繊維芽細胞の植え付けが、ポストシナプスドーパミンレセプター関連した欠乏及び、線条体の組織の損失による行動における人工産物的「回復」を生産する可能性は考えられてきた。しかしながら、これが見込みがないことを示唆する２つの証拠がある。第一には、ＦＦ２／ＴＨラットと同じ容量及び同じ細胞数で移植されたＦＦ２／βＧａｌラットは、移植の後の転回行動が有意に変化をすることを示していなかった。第２には、カイニン酸で内在性の神経とレセプターの破壊することは損傷後の転回行動を引き起こし、その転回行動はＦＦ２／ＴＨラットで観察された転回行動とは明らかに異なっていた。最小のＫＡレジョンを持つラット、あるいは移植によって包囲される領域よりもずっと小さい領域に影響を与えるレジョンを持つラットは、損傷後２週間の時点の１９％から、損傷後６週間の時点の５０％以上にまでの転回に確実な減少を示しており、それはＫＡ投与の後に線条体内に起こることが知られている変性的な変化と一致している（Coyleand Schwarcz, Nature 263:244-246 (1976)参照）。対照的に、ＦＦ２／ＴＨに対して観察された転回行動における明白な減少は、移植後２週間で起こり（６５％）、続いて徐々に増加して安定になるが、６−８週間の間ではより高くて転回の数は徐々に増加する（ベースライン以下の３０％）。２週間から８週間の間の移植の効力の明かな減少は、数種の異なるメカニズムから生じるであろう。第１番目としては、いくつかの移植された細胞が、移植後最初の１週間内でなくなるであろう。他の研究では繊維芽細胞移植片は、植え付け後３週間を経ると脳内での大きさの萎縮が見られた。この時よりも後では、安定な移植片の大きさが、少なくとも６カ月間は持続された。移植後の期間が長い場合には、移植の効果を減少させる第２番目の理由としては、繊維芽細胞の代謝における性質の変化が関連している。構築された繊維芽細胞は、代謝活性が低下している静止期の細胞の性質を有しているであろう（Dean et al., J. Biol. Chem. 261:9161-9166 (1986); Rao and Church Exp. Cell Res. 178:449-456 (1988)参照）。また、その繊維芽細胞は、Ｌ−ドーパの生産を減少させる性質も有しているであろう。最後に、移植片の効果は、繊維芽細胞に挿入されたＴＨ ｃＤＮＡの欠失あるいは再配列等の遺伝子的な事象によって、あるいはＴＨ ｃＤＮＡの転写を進行させるＬＴＲプロモーターからの転写の後成の停止によって譲歩的に解釈される。このような事実は、他のレトロウイルスベクターについても記録されている（Xu et al.,同上文献, 1989）。
【０１９５】
ＦＦ２／ＴＨ−移植ラットのアポモルフィン転回の減少を説明する最後の可能性は、移植片が皮質組織への非特異的な損傷を通して皮質−線条体相互作用を中断するであろう、ということである。このような損傷は、６−ＯＨＤＡ−レジョン化(lesioned)ラットの転回行動を減少させるということが報告されている（Freed and Canon-Spoor, Behav. Brain Res. 32:279-288 (1989)参照）。しかしながら、脳内での非制御的な生長を示す不滅化されたラットの繊維芽細胞を用いる我々の以前の研究では、皮質組織に制限された大規模な損傷はアポモルフィン誘導された転回行動でのドロップ(drop)とは関連していなかった。現在の研究で試験された移植片は、ラット−１の移植片で見られるものより皮質組織への移植拡張がかなり制限されていることを示しているので、ＦＦ２／ＴＨラットの減少した転回行動が、皮質−線条体経路への非特異的損傷を反映して起こっているとは思われない。
【０１９６】
現在では、Ｌ−ドーパがパーキンソン病（ＰＤ）の症状の最も効果的な治療薬である。しかしながらＬ−ドーパの長期の計画的投与は、望ましくない副作用を引き起こす。その副作用とは、随意運動障害や「オン−オフ」現象である（Marsden amd Parks, Lancet 7:292-296 (1976)参照）。これらの問題のいくつかは、Ｌ−ドーパの経口投与の後の細胞質内のＬ−ドーパのレベルの変動から生じることが示唆されており、それはＬ−ドーパの連続的な注入によって軽減されうる（Nutt et al., New Eng. J. Med. 310:483-488 (1984)参照）。Ｌ−ドーパあるいはドーパミンを生産するように遺伝子的に修飾された細胞を脳内に移植することは、ＰＤの症状をコントロールするための別法を提供するものであり、そしてそれは、脳内の適当な標的領域に直接ドーパミンを連続的、局所的注入をすることによって、Ｌ−ドーパの広範囲の投与による副作用を小さくするするための別法を提供するものでもある。
【０１９７】
これらの結果は、トランス遺伝子を発現するように遺伝子的に修飾されたプライマリー繊維芽細胞が、脳内移植のための生育能力があるドナー細胞を提供し、かつＰＤなどのヒトの神経学的な疾病を治療するための有効な攻略法を提供できることを示している。
【０１９８】
［実験例ＶＩ］
「ドナー細胞として供給される老化繊維芽細胞の能力」
この実験例では、老人繊維芽細胞が皮質内移植に対してドナー細胞として有効であるかを実証する。
【０１９９】
（ヒト神経生長因子（ＮＧＦ）に対するレトロウイルス構築）
ヒトＮＧＦｃＤＮＡ（Syntex Research,Palo Alto,CAから入手した）を含むモロニーネズミ白血病ウイルス、ｐＬｈＮＲＮＬが用いられた。このベクターはｄＣｈＡＴ遺伝子の場所でのプラスミドｐＬＣｈＲＮＬ内にＮＧＦｃＤＮＡを挿入することによって準備された（実験例ＶＩＩ、図３４参照）。５’長末端反復配列（ＬＴＲ）はヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）ｃＤＮＡの発現を進行させた。内部のロウスサルコーマウイルスＬＴＲプロモーター(Internal Rous sarcoma virus LTR promoter)は選択できるバクテリアルネオマイシン耐性遺伝子(selectable bacterial neomycin resistant gene)（ｎｅｏR ）の発現を進行させた。
【０２００】
（ウイルスストックの生産）
感染ウイルスストックの生産は、カルシウムフォスフェイト共沈によってプラスミドＤＮＡをもつアンフォトロピック細胞ラインＰＡ３１７を最初のトランスフェトすることによって達成され、これは、Miller and Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986)に記されている（Miller, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WAから供給された）。これらの細胞からの条件づけられた培地は、集められ、濾過され、エコトロッピックヘルパー細胞ラインプサイ（Ψ）２を感染するために用いられた。これは、MannらによってCell 33:153-159(1983)に記されている。これらの細胞からの条件づけられた培地はそのときアンフォトロピックヘルパー細胞ＰＡ３１７を感染するために用いられた。このラインからの生産細胞(producer cells)は、ネオマイシンアナログＧ４１８（Gibco/BRL, Gaithersburg, MD）の４００μｇ／ｍｌを含む培地内の細胞を生長させることによってｎｅｏR 遺伝子のそれらの発現のために選択された。最高力価（約４×１０4 c.f.u.／ｍｌ）を生産するＰＡ３１７クローンからのウイルスは以下に記されるように多種の細胞ラインを感染するために用いられた。
【０２０１】
（細胞の感染）
皮膚生検から得られた、及び細胞ラインとして確定したプライマリー繊維芽細胞はアンフォトロピックレトロウイルスに感染された。若いラット（約３カ月）のプライマリー繊維芽細胞はマウスＮＧＦを発現するエコトロピックウイルスまたは、ヒトＮＧＦを発現するアンフォトロピックウイルスに感染された。老人の（アルツハイマー病の６６歳の男性及びアルツハイマー病でない６９歳の男性）からの皮膚プライマリー繊維芽細胞はDr. R. Katzman, University of California, San Diego, CAによって皮膚生検より得られた。若い（新生児の）ヒト皮膚繊維芽細胞は、University of Cakifornia, San Diego, CAのCore Tissue Culture Facilityより得られた。アカゲザルの皮膚繊維芽細胞（１０歳の雄及び１１歳の雌）は、University of California, Davis, CAのPrimate Centerから生検により得られた。
【０２０２】
７０％から８０％までコンフルエントになるまで生長した繊維芽細胞は、レトロウイルス及びポリブレン４μｇ／ｍｌを含む培地の１０ｍｌとともに夜通し培養された。この感染は連続して３日間で達成された。結果的に、培地は吸引され、Ｇ４１８の４００μｇ／ｍｌを含む新鮮な培地に置換された。感染後に、細胞は培地を補ったＧ４１８で断続的に維持された。
【０２０３】
（ＮＧＦ活性の検定）
感染された繊維芽細胞によるＮＧＦ生産及び分泌は、抗−βＮＧＦ抗体（Boehringer-Mannheim, Germany）を用いた２部位ＥＬＩＳＡ分析によって検定された。これは、上述の実験例ＩＩに記述してある。ＮＧＦ活性は図３３に示されているその日に培地内で測定された。図３３は、ＮＧＦ量がヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）またはマウスＮＧＦ（ラット繊維芽細胞）のどちらかを発現する異なる起源の繊維芽細胞から、異なるコンフルエントで分泌したことを示している。すべての場合に、ＮＧＦの生産は、コンフルエント間で増加するか、少なくとも定常を維持する（モンキー細胞に対して）。対数期またはコンフルエント期間においては、ヒト繊維芽細胞の若さ、老化によってＮＧＦの生産での違いはほとんどなかった。
【０２０４】
これらの結果は、ヒトの疾病のヒトでない霊長類（例えば、モンキー）が遺伝子的に修飾されたトランス遺伝子の移植の効力をテストするために利用できることを示している。加えて、これらの結果によって、老人繊維芽細胞がトランス遺伝子を運ぶベクターに好結果的に感染されることが示され、また、老人繊維芽細胞がドナー細胞として用いることができることを提案している。
【０２０５】
［実験例ＶＩＩ］
「ドナー細胞から生じるトランス遺伝子生産物の遊離の調節」
この実験例は、トランス遺伝子生産物であるアセチルコリン（ＡＣｈ）の分泌の調節について示している。なお、アセチルコリンは、コリンを用いてトランスフェクトされた細胞から得られる。
【０２０６】
（細胞の培養）
ラット−１の繊維芽細胞を、０．１％のグルタミンと１０％のＦＢＳで懸濁させたＤＭＥＭ中で生育させた。培養物を、１０％のＣＯ2 、３７℃の条件下でインキュベートさせた。
【０２０７】
（レトロウイルスの構築）
ドロソフィラ(Drosophila)ＣｈＡＴ（ｄＣｈＡＴ） ｃＤＮＡを有するモロニーネズミの白血病ウイルスベクター(a Moloney murine leukemia viral vector)（ＭｏＭＬＶ）（Dr. P. Salvaterra, Duarte, CAから入手）、ｐＬＣｈＲＮＬは、図３４にに示されているように構築された。プラスミドｐＣｈａ−２（Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4081-4085 (1986)）から得られるｄＣｈＡＴ ｃＤＮＡを含む２５１９個の塩基対(base pair)（ｂｐ）からなるＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、ｐＢＲ３２２から得られる３７７個のｂｐからなるＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント、及びレトロウイルス構築体であるｐＬＬＲＮＬ（Xu et al., Virology 171:331-341 (1989)）である６５００個のｂｐからなるフラグメントが、公知の方法（Sambrook et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ed. C. Nolan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)参照）によって組み入れられた。ｐＬＬＲＮＬ内の５’ＬＴＲは、ｄＣｈＡＴ遺伝子の発現を進行させる。同様に、内部のＲＳＶプロモーターは、特異性のあるバクテリアのネオマイシン抵抗性の遺伝子（ｎｅｏR ）の発現を進行させる。
【０２０８】
（感染(infection)）
感染することのできるベクター株の生産は、アンホトロピック(amphotropic)なヘルパー細胞ライン ＰＡ３１７（Miller and Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986)）をプラスミドＤＮＡを用いて、まず、トランスフェクトすることによって行われた。これらの細胞によって条件付けられている培地が集められて、フィルーターがかけられてからエコトロピック(ecotropic)なヘルパー細胞ラインΨ−２（Mann et al., Cell 33:153-159 (1983)）を感染するために用いられた。このラインを形成する生産細胞は、４００μｇ／ｍｌのネオマイシンアナログ Ｇ４１８（Gibco）を含有する培養培地中で細胞を生育させることによって、ｎｅｏR の発現がなされるように選択された。全部で１６個のコロニーから選択される２個のＧ４１８−抵抗性のコロニーであって、最高レベルのＣｈＡＴ活性とウイルスに対する最も高いタイター（力価）（ほぼ１０4 ｃ．ｆ．ｕ．／ｍｌ）を発現しているコロニーが、ラット−１細胞を感染するために用いられた。
【０２０９】
１０ｃｍの組織培養プレート上でコンフルエントするように生育させたラット−１の繊維芽細胞を、１：５に分割し、１日間成長させた後、数種のレトロウイルスと４μｇ／ｍｌのポリブレン(polybrene)を含有する５ｍｌの培地でインキュベートした。細胞はこの培地中で一晩インキュベートさせた。次に、培地をアスピレートして４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する新鮮な培地への植え変えを行った。感染させた後、その細胞をＧ４１８の補充を行った培養培地中で引続き維持した。
【０２１０】
（ＣｈＡＴ活性の検定）
ＣｈＡＴ活性の検定を行うために用いられる方法は、Fonnumによる次の文献J. Neurochem. 24:407-409 (1975)中に記載された方法の変形法である。なお、この文献は、参考文献としてここに組み入れられる。繊維芽細胞は、３５ｍｍの組織培養皿に植え付けられて、７０−８０％のコンフルエントになるまで培養された。続いてその細胞は、ＰＢＳで洗浄され、ホモジェネートした緩衝液（０．１％のトリトン Ｘ−１００を含有する０．８７ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）中にその細胞をスクラップすることによって集められた。その再懸濁液を１．５ｍｌのエッペンドルフ(Eppendorf)管に移し、超音波処理（３Ｘ、１０分間）を行った。超音波処理を行ったホモジェネートのうち、１０マイクロリッターを別のエッペンドルフ管に移した。１０マイクロリッターの放射線活性のある溶液（０．２ｍＭの14Ｃ−アセチルコエンザイムＡ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．２ｍＭのエゼリンサリチレート、４ｍＭのコリンクロライド、１８ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4）が添加された。この混合物は、３７℃で５分間インキュベートされた。その反応は、１００μｌの氷冷された蒸留水を添加することによって止められた。サンプルは１．０ｍｌの抽出緩衝液（８５０ｍｌのトルエン及び１５０ｍｌのアセトニトリル中に、１５ｇのソジウムテトラフェニルボロンを混合した溶液）で抽出が行われ、エッペンドルフ マイクロ遠心分離管内で２分間遠心分離が行なわれた。その後、０．６５ｍｌの有機層が集められ、５．０ｍｌのシンチレーションカクテル(scintillation cocktail)（National Diagnostics, Manville, NJ）に加えられた。サンプルは、１０分間、シンチレーションカウンターで計数された。培養物に対するプロテインの量は、クマージー(Coomassie)のプロテイン分析（Pierce Rockville, IL）によって測定された。
【０２１１】
（ノーザンブロット分析）
繊維芽細胞は、１０ｃｍの組織培養プレートに植え付けられ、７０−８０％のコンフルエントに達するまで培養された。ＰＢＳで洗浄された後、それぞれの培養物から全ＲＮＡが、０．５ｍｌのグアニニジン イソチオシアネート溶液中で細胞を抽出することによって単離された。（Chomczynski and Sachhi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)の記載参照。なお、この文献は参照文献としてここに組み入れられる。）ＲＮＡの量は、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量された。全ＲＮＡのうち１０μｇ〜１５μｇが、１，２％のホルムアルデヒド−アガロース ゲルに載せられた。分離されたＲＮＡが、サンブロックらの文献（Sambrook et al., in 「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」, (Ed. Nolan), Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)： 尚この文献は、参照文献としてここに組み入れられる。）に記載されているような、ナイロン膜（ＭＳＩ）の上にブロットされた。ブロットは、１〜４時間、４２℃でプレハイブリダイゼーション（５０％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性されたヘリング精子(denatured herring sperm)のＤＮＡ）が行われた。プローブは、ｐＬＣｈＲＮＬから得られるほぼ２．５ＫｂのＥｃｏＲ１フラグメント、あるいはｐＧＣｃから得られる９５３ｂｐのＢａｍＨＩフラグメント（H.Jinnah, University of California, San Diego, CAから入手できる。）を活性化することによって準備され、それぞれｄＣｈＡＴあるいはシクロフィリンのｍＲＮＡを検出するために用いられる。そのフラグメントは、１．０％の低融解のアガロースゲル上で単離され、ジーンクリーン(Gene Clean)（Bio 101, San Diego, CA）を用いて精製された後、32Ｐ−ｄＣＴＰを用いてランダムプリミング(random priming)（Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN）によってラベルされた。ブロットあたり、約１×１０6 ｃｐｍ／１０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液が用いられた。放射活性ラベルされたプローブは、プレハイブリダイゼーション溶液に直接的に提供された。ハイブリダイゼーションは、４２℃で１２−２０時間行われた。その後、ブロットは６Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い、室温の状態で二度洗浄され、次に１Ｘ ＳＣＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて４２℃で二度洗浄され、最後に０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて６５℃で一度洗浄された。すべては１０分間で洗浄が行われた。その洗浄済みのブロットは、プラスチックフィルムでラップされ、オートラジオグラフィー（ＸＡＲフィルム、Kodak, Rochester, NY）が行われた。そのプローブは、５０％のホルムアミド、１０Ｘ ＳＳＰＥ中、６５℃以上で１時間、そのブロットをインキュベートすることによって続いて起こるハイブリダイゼーションのために除去された。そのブロットは、次のプレハイブリダイゼーション前にｓＸ ＳＳＰＥ中ですすがれた。オートラジオグラフの密度走査は、ＬＫＢの高速走査 ＸＬレーザー濃度計上で管理された。
【０２１２】
（免疫組織化学）
繊維芽細胞は、２個のウェルの組織培養スライド（Tissue Tek）に、１×１０4 個の細胞密度で植え付けられ、２日から３日間育成させて４％のＰＢＳ−緩衝液のパラホルムアルデヒドを用いて固定化された。培養物は、０．２５％のトリトン−ＰＲＳで１５分間、透過され、ＰＢＳで二度洗浄され、そして室温で一晩、プライマリー抗体とともにインキュベートされた。用いられたプライマリー抗体は、ウサギ−抗−ｄＣｈＡＴ（１：１００、Dr. P. Salvaterra, Duarte, CAから入手）、マウス−抗−ビメンチン(mouse-anti-vimentin)（１：２５０、Vector Laboratoriesから入手）、またはウサギ−抗−ラットＣｈＡＴ（１：７５００、Boehringer Mannheimから入手）であった。ほとんどの場合において培養は、ビメンチン、及び一種のあるいは他のＣｈＡＴ抗体に対する抗体を用いて同時にインキュベートされた。初めのインキュベートが行われた後、培養物は、再びＰＢＳで二度洗浄され、更に３７℃で１時間、蛍光色素でラベルされたヤギ−抗−ウサギ（１：１００、Vector Laboratoriesから入手）、及びヤギ−抗−マウス（１：１００、Chemicon, Temecular, CAから入手）、すなわち第２番目の抗体、とともにインキュベートされた。スライドは、ハイドロマウント(Hydromount)（National Diagnostics）でマウントされ、オリンパスの蛍光顕微鏡で観察された。
【０２１３】
（血清の欠乏及びコンフルエント状態で生じる静止期）
ラット−１細胞は、６０ｍｍのプレートあたり２．５×１０5 個の細胞密度でプレートにおかれた。血清を欠乏させた実験では、細胞を７０ー８０％のコンフルエントに到達させた後、培養培地を吸引させて新鮮なＤＭＥＭのみで置換した。コントロールの細胞は、通常の血清を追加した培地に植え付けられた。インキュベートは２０時間行われた。
【０２１４】
コンフルエント状態で生じる静止期では、細胞は上記に記載したように植え付けられている。それから培養物はそれらがコンフルエントに到達した後、３、７、及び１４日間維持された。これらの培養物を植え付けるために、等量の培養培地が吸引されて、等量の新鮮な培地で置き換えられた。最後の植え付けを行って３日たった時点で、その細胞の分析が行われた。ノーザンブロット分析では、細胞は１０ｃｍのプレートに植え付けられて、上記に記載したのと同様の処理が行われた。
【０２１５】
（［メチル］−3Ｈ−チミジンの導入）
チミジンの導入は、対数期あるいは静止期の成長段階における繊維芽細胞の増殖速度をモニターするのに用いられた。細胞は１０ｃｍの培養皿に植え付けられ、3Ｈ−チミジン（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；０．５μＣｉ／ｍｌ；ベーヒンガーマンハイム(Boehinger Mannheim)）とともに５時間インキュベートされた。続いて培養物は、トリプシン化され、ヘマサイトメーター（血球計算器）を用いて計数され、ペレット化されてから、続いて１ｍｌの０．３ＭのＮａＯＨ中に懸濁された。ＮａＯＨ溶液中で３０分間、インキュベートされた。その後全溶解物は、１０ｍｌのシンチレーション溶液を含有するシンチレーションバイアルにピペットで滴下され、マークＩＩＩの液相シンチレーションシステムの６８８１型（Tracor Analytic, Austin, TX）にて計数された。
【０２１６】
（ＨＰＬＣによるＡＣｈの測定）
ＡＣｈは、電気化学的検定法を用いたＨＰＬＣによって測定された。ＡＣｈは、弱いカチオンが帯電しているカラム上にてコリンから分離された。このカラムは、ラウリルサルフェート(laurylsulphate)を用いる逆相クロムファーカートリッジＣ１８カラム(Chrompher Cartridge C18 column)（１００ｍｍ×３ｍｍ、Chompack）にかけることによって準備された。免疫化されたアセチルコリンエステラーゼ（タイプＶＩ−Ｓ）及びコリンオキシダーゼ（Sigma, St. Louis, MO）を含有する酵素的な次のカラムのリアクター（１０×２．１ｍｍ、Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN）を用いることによって、ＡＣｈはハイドロジェンパーオキサイド(hydrogen peroxide)に変換された。続いてハイドロジェンパーオキサイドは、電気化学的な検出器（生物分析システム）で、Ａｇ／ＡｇＣｌからなる参照電極に対して＋０．５Ｖの電位に保たれている白金電極を用いて測定された。０．１Ｍの燐酸カルシウムと０．１ｍＭのテトラメチルアンモニウム ヒドロキサイドを含み、ｐＨ８．１に調整された移動相が、アイソクラティックポンプ(isocratic pump)（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いて０．８ｍｌ／分の流速が供給された。
【０２１７】
繊維芽細胞によって条件づけられた培地は、０．２２μｍのミリポアフィルター(Millipore filter)を通して濾過され、更にサンプルの調整を行うことなくその分析用のカラムに直接注入された。細胞内部のＡＣｈのレベルは、ペレットを再懸濁し、その懸濁液を超音波処理して、次に遠心分離によって細胞の残渣を除去し、つづいて０．２２μｍのミリポアフィルターで濾過することによって測定された。そして、残った濾過物は、分析カラムに注入された。
【０２１８】
（ＡＣｈの生産におけるコリンクロライドとアセチル−ｄｌ−カルニチンの影響）
繊維芽細胞を、３５ｍｍのプレートあたり１×１０5 個の細胞数で植え付け、７０−８０％のコンフルエントになるまで生育させた。続いて培地を吸引した後、適当量のコリンクロライド（Sigma）あるいはアセチル−ｄｌ−カルニチン（Sigma）を含有する新鮮な培地で置き換えた。細胞はこの培地中にて２０時間インキュベートされた。繊維芽細胞は採取されて、ＣｈＡＴ分析あるいはＨＰＬＣによるＡＣｈの測定のためのいずれかに用いるべく調製された。ＨＰＬＣによって分析するための培養株は、培地中に含まれている０．１ｍＭのエゼリンを有していた。
【０２１９】
（統計学上の分析）
学生らのｔ−テスト及びＡＮＯＶＡ統計学上の分析法（STATView, Palo Alto, CA）が実験間の差異を検出するために用いられた。ホック後のダンネットｔテスト(post-hoc Dunnet t test）は、グループ間の個々の違いを調べるのに用いられた。
【０２２０】
（ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞によってｄＣｈＡＴ発現の確認）
ラット−１の繊維芽細胞は、レトロウイルス（図３４）で感染されて、Ｇ４１８−含有の培地で選択された。感染された細胞におけるｄＣｈＡＴの存在は、免疫細胞化学によってまずは確認された。感染されていないラット−１（コントロール）及びラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞は、ビメンチン(vimentin)及びｄＣｈＡＴあるいはビメンチン及びラット−ＣｈＡＴに対する抗体を用いて同時に染色された（図３５（ａ）−（ｆ）参照）。ビメンチンの免疫活性は繊維芽細胞の形態を効果的に現す（図３５（ａ）−（ｃ）参照）。ほとんどのラット−ｄＣｈＡＴ細胞は、形態学的にコントロールとは区別がつかず、平で上皮のような表現型を示していた。ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞は、形態学上はコントロールと区別して観察されず、伸長された形態を現していた。
【０２２１】
期待どおり抗−ｄＣｈＡＴ抗体は、ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞だけでラベルされた（図３５（ａ）と図３５（ｅ）の比較参照）。ｄＣｈＡＴの染色は、細胞質を通って平均的に分配された。しかしながら核の周りに隣接して、より大きな強度の免疫活性をもつ領域が存在していた。かく自体は染色されなかった。再結合しているｄＣｈＡＴの存在に対して染色されることに加えて、ラット−１細胞及びラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞はまた、ラット−ＣｈＡＴの存在に対して染色された。コントロールの細胞あるいはラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞のいずれにおいてもラット−ＣｈＡＴの免疫染色がなされたことの兆候はなかった（図３５（ｆ）参照）。ラット−ＣｈＡＴの免疫活性の欠乏は、ラット−１細胞における内性の(endogenous)ＣｈＡＴ活性が、あったとしても非常に少ないことを示している。更に、これらの観察は、ｄＣｈＡＴ分子がラット−ＣｈＡＴと免疫学上、区別されることを示している。従来の生化学的及び分子的な研究では、ｄＣｈＡＴと他の哺乳動物のクローン化されたＣｈＡＴとの間の配列が異なっていることが報告されている（Berrard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9280-9284 (1987); Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4081-4085 (1987)参照）。これらのデータは、ｄＣｈＡＴがＡＣｈの形成を触媒することに加えて、ラットのＣＮＳに移植されたｄＣｈＡＴ−発現繊維芽細胞の特異的なマーカーとして用いることができることを示している。
【０２２２】
ラット−１の繊維芽細胞とラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞から得られる全ＲＮＡもまた、ノーザンブロット分析によって比較され、トランス遺伝子の発現の特異性を調べることができる。この研究から得られる結果は明らかに、ｄＣｈＡＴをコードするｍＲＮＡがラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞においてのみ存在していることを示している（図３６（ａ））。ラット−１／ｄＣｈＡＴから単離されたｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡの大きさは、約６ｋｂであった。ｍＲＮＡの大きさは、ｄＣｈＡＴシストロンとＲＳＶプロモーターとの間に位置しているプリアデニル化配列の欠如に起因している。このことは、５’ＬＴＲから３’ＬＴＲへの転写が妨害を受けることなく進行できるようにしている。
【０２２３】
最後に、コントロールとラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞について、ＣｈＡＴ活性が分析された。ラット−１細胞で検出されたＣｈＡＴのレベルは、広くさまざまであり、活性をもたないものから、約６．４ｎｍｏｌＡＣｈ／時間／プロテインｍｇのレベルのものまであった。コントロール細胞によって示された平均的な活性は、約１．９±１．１ｎｍｏｌＡＣｈ／時間／プロテインｍｇであった（図３６（ｂ）参照）。ラット−１細胞で検出されたＣｈＡＴが低レベルであるのに対して、ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞のＣｈＡＴ活性は、１２００倍以上の高さであった。ラット−１／ｄＣｈＡＴ培養株の平均的な活性は、２３９７±１４９ｎｍｏｌＡＣｈ／時間／プロテインｍｇであった（図３６（ｂ））。更に、形質変換された繊維芽細胞によってｄＣｈＡＴを発現させると、安定であった。感染の後１年間、続けて継代接種を行った繊維芽細胞におけるＣｈＡＴの活性は、感染の後、１週間で分析された繊維芽細胞におけるＣｈＡＴの活性と同じであった。
【０２２４】
（ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞のＡＣｈの生産及び分泌）
形質転換されたラット−１細胞がインビトロでの分析でコリンをアセチル化する能力を持つ活性な再結合酵素を発現することを証明する実験では、細胞がその細胞質からＡＣｈを製造し、放出する能力を持つことについては証明されない。したがって、培養培地内及び細胞内で見いだされたＡＣｈのレベルは、電気化学的な検出を伴うＨＰＬＣによって分析された。細胞内、あるいは感染されていないラット−１細胞の栄養培地内のいずれにおいてもＡＣｈは見いだされなかった（図３６（ｃ）参照）。この結果は、ラット−１細胞において検出されたｃＤＮＡ活性が、コリンをアセチル化する能力がある酵素で汚染されていることに起因していることを示唆している。カルニチンアセチルトランスフェラーゼはほとんどの細胞内で見いだされる酵素であり、この酵素は、アセチル−ＣｏＡからコリンへ、アセチル基を移すことができる（White and Wu, Biochemistry 12:841-846 (1973)）。コントロールの培養物においてＡＣｈのない場合とは対照的に、意味を持つほどのレベルのＡＣｈが、細胞内及び細胞外のいずれにおいてもラット−１／ｃＤＮＡ培養物中では測定された（図３６（ｃ）参照）。ＡＣｈの平均的な細胞内容量は、０．７８±０．２３ｎｍｏｌであった。これに匹敵して培養培地においては、約１．７±０．１０ｎｍｏｌのＡＣｈが見いだされた。
【０２２５】
これらの結果は、ＡＣｈがラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞によって製造される活性を有すること、また、ＡＣｈが細胞から周囲の培養培地内に放出されることを示している。
【０２２６】
（ＣｈＡＴ及びＡＣｈ発現におけるコリンクロライド及びアセチル−ｄｌ−カルニチンの効果）
コリンクロライド及びアセチルカルニチンは、種々のモデルシステムの神経あるいはシナプトソーム(synaptosomes)からのＡＣｈの分泌を高めることが報告されている（Gibson and Shimada, Biochem. Pharmacol. 29:167-174 (1980); Imperato, neurosci. Lett. 107:251-255 (1989); Jenden et al., Science 19:635-637 (1976); Tucek, J. Neurochem. 44:1-24 (1985)参照）。これらの薬物は、ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞におけるＡＣｈの分泌及びＣｈＡＴの活性を調節する能力についてテストされた。コリンクロライドは、０．２５−５００μＭの範囲の濃度で用いられた（図３７（ａ）参照）。これらの濃度は培地内（約２８μＭ）及び血清内（２μ以下）に通常含まれている濃度に添加して調整された。外因性のコリン濃度は０．２５−５．０μＭであり、ＡＣｈレベルに影響を与えなかった。１０μＭでは、細胞内のＡＣｈ濃度及び分泌されたＡＣｈ濃度のどちらも増加した（図３７（ａ））。コリンの細胞内レベルがほぼ２倍に増加した場合、培養培地内に見いだされたＡＣｈの濃度は約１．８倍増加した。コリンの濃度が増加し続けるに従って、細胞内のＡＣｈレベルは増加し続ける。５００μＭ以上の濃度にまでコリンを添加しても、ＡＣｈ含有量が更に増加することはなかった。
【０２２７】
細胞内のＡＣｈが確実に増加することとは対照的に、分泌されたＡＣｈは、１０μＭのコリンで８０％増加した後、５０μＭ及び１００μＭのコリンで基底レベルに戻って減少した（図３７（ａ）参照）。２００μＭのコリンでは、放出されたＡＣｈのレベルは、ほぼ２．０倍に増加した。ＡＣｈは、５００μＭのコリンまで増加し続け、その場合、コントロール（コリンが加えられていないもの）の培養物で観察されたレベルの２．６倍に到達した。５００μＭ以上のコリンの濃度になると、ＡＣｈの放出が更に増加することはなかった。感染されていないラット−１細胞の培地にコリン（１０ｍＭに達するまで）を添加しても、ＨＰＬＣによって測定されたようにＡＣｈの検出が結果として得られなかった。
【０２２８】
ＣｈＡＴ活性におけるコリンの効果も、測定された（図３７（ｂ）参照）。１０，２００，及び５００μＭのコリンの濃度がテストされた。培養培地へのコリンの添加は、ラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞のＣｈＡＴ活性に、重大な影響を与えなかった。
【０２２９】
ＡＣｈにおけるアセチル−ｄｌ−カルニチンの影響についてもテストされた。アセチル−ｄｌ−カルニチンは、ラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞から生産されかつ放出されるＡＣｈの量に対して影響を与えず、またＣｈＡＴ活性に対しても影響を与えなかった。
【０２３０】
（ｄＣｈＡＴの発現における血清の欠乏及びコンフルエントの効果）
ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞の特徴のほとんどは、増殖している繊維芽細胞の培養物に導かれている。しかしながら、最終目的は移植のために繊維芽細胞を用いることである。脳に移植された繊維芽細胞は、ほとんど活動的に増殖することはない。したがって、インビトロで静止期にある繊維芽細胞の活性は、インビボで見い出されている条件をより正確に反映でき、そのことは評価すべきである。この評価は、脳に植え付けられた非−分割の繊維芽細胞の活性について、予言的な情報を提供するものである。繊維芽細胞の培養において静止期に導くために、ラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞は血清−フリーの培地あるいは高密度のいずれかの条件で数日間、維持される。しかしながら両者の方法では、チミジンの導入は有意に減少し、それはコンフルエント段階に達した後、チミジンの導入が結果的にずっと低下することになるまでの延長された期間中、繊維芽細胞が維持されたままであった（表３参照）。
【０２３１】
【表３】
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【０２３２】
図３８（ａ）には、ＣｈＡＴ活性における血清欠乏の効果が示されている。この処置によって、繊維芽細胞の形態（morphology）あるいは生育状態（health）に顕著に影響を与えることはなかった。これに対して、血清が不足している培地においてラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞を維持した場合、トランス遺伝子の発現に対して顕著な減少が引き起こされた。血清の欠乏は、ＣｈＡＴ活性においてほぼ８０％の減少を生じさせた。
【０２３３】
ノーザンブロット分析は、ｄＣｈＡＴのｍＲＮＡの定常状態のレベルが血清の欠乏状態とともに減少するかどうかを調べるために行われた。血清が培養物から除かれた場合、ｄＣｈＡＴのｍＲＮＡのレベルは、有意に減少（約４６％）した（図３８（ｂ）参照）。同様のブロットはまた、内部のコントロールとして用いられたシクロフィリンに対するｃＤＮＡプローブを用いても調べられた（McKinnon et al., Mol. Cell. Biol. 7:2148-2154 (1987)参照）。期待に反して、シクロスフィリンのｍＲＮＡの定常状態レベルもまた、血清が欠乏した繊維芽細胞では減少（約４３％）していた。ｄＣｈＡＴのシクロフィリンに対する吸光度を、光濃度計で測定することによって、ｄＣｈＡＴとシクロフィリンのｍＲＮＡの定常状態のレベルで見られた減少が、比例条件にあることが確信できた。実際に、ｄＣｈＡＴのシクロフィリンに対する相対的な吸光度の比率は、コントロールと血清を欠乏した培養物との比率と同様であった（図３８（ｃ）参照）。アクチン(actin)とＨＰＲＴのｍＲＮＡもまた、血清を欠乏した繊維芽細胞において減少していた。
【０２３４】
血清の欠乏状態が、繊維芽細胞の一般的な代謝産物に影響を与えることが明かであるため、他の代わりの方法が用いられた。その方法では、繊維芽細胞がコンフルエントに到達（コンフルエント後の日数を、ＤＰＣとする）した後、３，７，及び１４日間その繊維芽細胞を維持しつづけることによって、静止期が誘導された。３ＤＰＣでは、コントロールである成長中の培養物で観察された活性の８０％にまでＣｈＡＴのレベルが減少した（図３９（ａ）参照）。ＤＰＣを増加させるにつれて、ＣｈＡＴの活性は低下し続け、７ＤＰＣ及び１４ＤＰＣではそれぞれ、コントロールのレベルの５０％から２０％に減少した（図３９（ａ）参照）。１４ＤＰＣを越えて細胞を維持を行っても、ＣｈＡＴ活性が更に低下することは結果として起こらなかった。
【０２３５】
コンフルエントなラット−１／ｄＣｈＡＴにおけるｄＣｈＡＴのｍＲＮＡの量は、ノーザンブロット分析によって測定された（図３９（ｂ）参照）。成長期の培養物（コントロール）あるいはコンフルエントなラット−１の培養物から単離されたｄＣｈＡＴのｍＲＮＡのレベルは、明かな減少は見られなかったが、光濃度計での分析によれば、ｄＣｈＡＴのｍＲＮＡの定常状態のレベルが、３ＤＰＣ及び１４ＤＰＣでそれぞれ約２９％及び約３５％が減少することが明らかにされた。興味深いことに、相対的にｄＣｈＡＴのｍＲＮＡのレベルが減少するにつれて、シクロフィリンのｍＲＮＡのレベルは増加した。コントロールに比較して、３ＤＰＣ及び１４ＤＰＣ培養物から単離されたシクロフィリンのｍＲＮＡの相対的な量は、ほぼ８４％増加していた。シクロフィリンの比率に対するｄＣｈＡＴの測定は、６０．５％の減少が３ＤＰＣで起こり、また６４％の減少が１４ＤＰＣで起こることを示していた（図３９（ｃ）参照）。全ての数は、成長期の細胞に対して決定されたｄＣｈＡＴ／シクロフィリンの比率との間に相対関係を有している。
【０２３６】
（コンフルエントな繊維芽細胞からＡＣｈが遊離する場合のコリンの効果）
コンフルエントな繊維芽細胞からのＡＣｈの遊離をコリンが高めることができるかどうかについて評価する目的で、ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞が、７ＤＰＣ（コンフルエント後の日数）の期間中コンフルエントの培地、あるいはコリンを追加（５００μＭ）した培地のうちのいずれかの培地で維持された。図４０には、コンフルエント段階において、ＡＣｈの生産及び放出に関してラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞を維持した場合の効果について示されている。７ＤＰＣのラット−１／ｄＣｈＡＴ培養物におけるＡＣｈ（細胞内及び細胞外のもの）の全体の内容量は、有糸核分裂をしている細胞を含有する培養物において測定された内容物の１８．９％であった。全ＡＣｈの減少は、分子内におけるＡＣｈの減少及び放出がそれぞれ５０．１％及び８２．１％であることが明白であった。正常な培地で維持されているコンフルエントな培養物と対照すると、コリンが追加された培地に維持されている静止期のラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞は、増殖中のラット−１／ｄＣｈＡＴ培養物において測定されたＡＣｈのレベルに匹敵するほどのＡＣｈのレベルを示していた（図４０参照）。細胞内のＡＣｈレベルは、外部のコリンが栄養培地に加えられた場合、１３８％になるまで増加し、それは正常の培地に維持されているコンフルエントな繊維芽細胞に匹敵するほどであった。同様に、細胞内部のＡＣｈの量は、４７３％まで増加した。
【０２３７】
この実験例で述べた上記の結果は、ラット−１の繊維芽細胞を、ｄＣｈＡＴをコードしているｃＤＮＡを含有するレトロウイルスベクターを用いてうまく感染することができることを示している。更に、これらの細胞は工業生産することができ、更に重要なことは、ＣｈＡＴ触媒、ＡＣｈの生産を自由に行うことができる。増殖している繊維芽細胞からのＡＣｈの生産及び分泌は、追加のコリンクロライドがその培養培地に加えられているかどうかで調節することができる。これらのデータはまた、トランス遺伝子の発現が静止期の繊維芽細胞においては減少することを示しているが、コリンはこれらの細胞からのＡＣｈの放出を高めることができる。
【０２３８】
ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞は、ＡＣｈ生産に影響を与える可能性のあるいくつかの因子がインビトロで研究されることができたため、開発されてきた。ラット−１の繊維芽細胞は、それらの遺伝子型あるいは表現型においてかりに変化するとしてもほとんど変化することなく培養株を維持し続けることができるという理由から選択された。これらの細胞におけるトランス遺伝子の発現における安定性は、ＣｈＡＴの活性がレトロウイルス感染の後、１週間あるいは１年後に分析された細胞においても同じであるという観察結果から反映される。ＡＣｈ−分泌性の繊維芽細胞を開発するにあたっての短期的な見方における目的は、これらの細胞のフラクションを分析して、ＣＮＳに移植することである。しかしながら、ラットのＣＮＳに移植されたラット−１及び他の繊維芽細胞の細胞ラインは、時として腫瘍を形成する（Horellou et al., Neuron 5:393-402 (1990); Wolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)参照）。対照的に比較すると、プライマリーの皮膚の繊維芽細胞は、腫瘍の形成を誘導することなく脳に延長された期間（６ｍｏｓ．）生存することができる（Fisher et al., Neuron 6:371-380 (1991); Kajiwa et al., J. Comp. Neurol. 308:2-13 (1991)参照）。このように、かりにＡＣｈ−分泌性の繊維芽細胞が脳の典型の移植に用いられるならば、プライマリー細胞が用いられるべきである。プライマリーの皮膚の繊維芽細胞は、コリンや静止期にかかわらず、ラット−１／ｄＣｈＡＴ細胞と同様の方法で反応するように見える（即ち、それぞれＡＣｈの分泌は増加し、ＣｈＡＴの活性は低下する。）。したがって、この実験例で用いられているラット−１の繊維芽細胞は、同様の培養条件下で生育させたプライマリーの繊維芽細胞の反応に対しての厳密なインビトロでの形式で用いられる。
【０２３９】
ＣＮＳ内の体液性の環境を操作することによって、目的とする分子の分泌を調節することができるならば、機能的な効果を生じるようにＣＮＳに移植された細胞の能力を高めることができる点で有効である。ここに記載されているインビトロでの実験では、コリンがラット−１／ｄＣｈＡＴの繊維芽細胞によるＡＣｈの生産及び分泌を増加させる。重要なことは、コリンはまた、静止期（コンフルエント）の繊維芽細胞からのＡＣｈの生産及び遊離の増加を誘導する。この後者の観察結果によると、ＣＮＳに移植されたＣｈＡＴ生産性細胞からのＡＣｈの生産を調節することのできる手段を提供することが可能となる。現時点では、外来性のコリンによって引き起こされる細胞内、及び細胞外のＡＣｈの増加を裏付けるメカニズムについては知られていない。しかしながら、ＣｈＡＴ活性を測定することによって評価されたのと同様に、酵素の量はコリンの細胞外濃度を増加させたことによって影響されない。これらの結果は、反応速度、即ちＡＣｈの形成方向の反応であって酵素が関与していない反応速度は、コリンが追加された繊維芽細胞培養で観察されたＡＣｈのレベルの増加が原因となっている。
【０２４０】
これらの結果は、例えば食餌の追加としてコリンを投与することによって、脳に移植されたｄＣｈＡＴ−発現性の繊維芽細胞におけるＡＣｈの遊離が増加する可能性があることを示唆している。コリンは、血液−脳関門をとおることが報告されている（Cohen and Wurtman, Life Sci. 16:1095-1102 (1975); Cohen and Wurtman, Science 191:561-562 (1976); Wecker and Schmidt, Brain Res. 184:234-238 (1980)参照）。
【０２４１】
トランス遺伝子生産物の分泌の実行可能な調節に加え、遺伝子的に修飾された細胞のもう一つの望ましい性質としては、その修飾された細胞が移植された後安定であって、再結合遺伝子が長期間発現することである。脳に移植された繊維芽細胞は、コピーできる量のコラーゲンでそれらのまわりを取り巻いており、明らかに増殖を終える（Kawajaら、同上文献参照1991）。現在の研究は、ＭｏＭＬＶＬＴＲからのトランス遺伝子の発現が血清欠乏及び接触阻害された静止期繊維芽細胞において劇的に減少することを強く示唆している。血清欠乏及びコンフルエント状態に誘導された静止期の背後の動力学のメカニズムは明かでないが、それらは、明らかに異なっている。これは、ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ及びＣｈＡＴ活性が接触阻害された細胞を含む倍地内より血清欠乏繊維芽細胞内のほうでより速く減少するという観測によって証明されている。
【０２４２】
現在のデータは、いったんプライマリー繊維芽細胞が脳内に移植されると、これらの細胞内でプロウイルス性トランス遺伝子からの発現が減少することを示唆している。この仮説は以前の研究から支持される。この研究は、ＴＨ発現性の２０８Ｆ繊維芽細胞が、インビトロではＴＨに対して免疫ラベルされうるが、いったん脳に移植されると効果的には染色されないということを示したものである（Wolffら同上文献参照１９８９）。ＧＡＤに対する遺伝子を発現するプライマリー繊維芽細胞は、また、それらが脳内へ植え付けられる際に、ＧＡＤ活性での際だった減少を示す（Chenら、J.Cell.Biochem.,45-252-257(1991)）。ＴＨ ｍＲＮＡ及びプロテインの残渣量が後のプライマリー繊維芽細胞の植え付け後（１０週間）に見られることが、更に最近のインシトゥでのハイブリダイゼーション及び免疫細胞化学的研究によって示されてきている（Fisherら、同上文献参照１９９１）。この実験例で表されている成果を結び付ける結果から、再結合生成物量が静止期繊維芽細胞で減少するが、細胞内にはまだ、残渣量が存在するということが示される。結果によって、ｄＣｈＡＴ活性の基準線レベル（増殖している細胞内で見つかるものの約２０％）が静止期ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞に存在する、ということが示される。この活性量は、１４ＤＰＣより長い周期のコンフルエント状態において、繊維芽細胞を維持することによっては減少しない。このように、もし、トランス遺伝子の活性が十分に高められていても（インビトロでのコンフルエント細胞で測定されたような）、いったん細胞が植え付けられて残った活性量は機能的な効力を引き出すには十分であろう。この仮説は、基質（コリン）の量が静止期ラット−１／ｄＣｈＡＴ繊維芽細胞からＡＣｈを遊離するのを高める、という観測から支持される。それ故、あるトランス遺伝子の発現でのその少量は、定義された後成的な要因によって補われるであろう。
【０２４３】
結論として、これらの結果によって、繊維芽細胞はＡＣｈを生産し、分泌するように遺伝子学的に変えられる、ということが示される。ＡＣｈ遊離は細胞外コリン濃度を操作することによって増加させることができ、また、可能なら、食餌コリンを投与することによって増加させることができる。これらのデータはまた、トランス遺伝子発現がインビトロでの増殖停止とともに著しく減少することを示している。
【０２４４】
［実験例ＶＩＩＩ］
「静止状態にある繊維芽細胞のプロモーターの利用」
この実験例では、成長期（ログ）とコンフルエント（静止期）の繊維芽細胞のプロモーターの比較した。この研究で用いられたレポータートランス遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyltransferase)（ＣＡＴ）である。
【０２４５】
（ベクターの発現）
増殖中または静止中のプライマリー繊維芽細胞内でのトランス遺伝子の発現を決定する様々なプロモーターの制御条件下で、ＣＡＴ遺伝子を含むベクターの発現は得られている。ＣＡＴ遺伝子がＳＶ４０エンハンサー配列とＳＶ４０プロモーターの制御のもとで発現されるプラスミドｐＳＶ２ＣＡＴ（Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051 (1982); Subramani and Southern, Anal. Biochem. 135:1 (1983); ATCC No. 37155）と、プラスミドｐＳＶ２３２ＡＣＡＴ（図４１、カリフォルニア州サンジエゴにあるカリフォルニア大学のＤ、ジョリー博士とセオドア、フリードマン博士から提供を受け、フロムとベルグのJ. Mol. Appl. Genet. 2:127-135 (1983)に記載の方法によって構築した）を用いた。プラスミドｐＲＳＶＣＡＴ（Rous sarcoma virus long terminal repeat promoter and enhancer, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781 (1982); ATCC No. 37152）、ｐＭＬＶＣＡＴ（図４２、ｐＳＶ２３２ＡＣＡＴとｐＧＥＭ−３（ウィスコンシン州マジソンのプロメガ社から購入した）とｐＮ２（Eglitis et al., Science 230:1345-1398 (1985)に記載され、カリフォルニア州サンジエゴにあるカリフォルニア大学のローゼンベルグ博士から提供を受けた）マウスのモローニー白血病ウイルスの長い終末反復プロモーターとエンハンサー）とｐＣＭＶＣＡＴ（図４３、ｐＳＶ２３２ＡＣＡＴとｐＯＮ２４９（カリフォルニア州パロアルトにあるスタンフォード大学医学部のＥ．Ｓ．モカルスキーから提供を受けた）からローゼンベルグ博士が構築した、ヒトのサイトメガロウイルスの初期プロモーターとエンハンサー）は、（カリフォルニア州サンジエゴにあるカリフォルニア大学の）フリードマン博士から提供された。コラーゲンプロモーターは、テキサス州ヒューストンのＭ．Ｄ．アンダーソン癌センターのド・クロムブルッグ博士より与えられた。プラスミドｐＧ１００とｐＡＺ１００３（de Crombrugghe and Schmidt, Methods in Enzymology 266:61-76 (1987)）はテキサス州ヒューストンのド・クロムブルッグ博士より与えられ、マウスのα１（Ｉ）とα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（de Crombrugghe, 同上文献、α２（Ｉ）；Thompson et al., Annals New York Acad. Sci. 580:454-458 (1990)、α１（Ｉ））の制御下でＣＡＴ遺伝子を含む。
【０２４６】
ＣＡＴは、哺乳類に類似のものが無いバクテリアの遺伝子なので、トランスフェクションした細胞で見つけられたＣＡＴ活性は、トランスフェクションしたプラスミドの存在に依存する。トランスフェクションした細胞のＣＡＴ酵素のレベルは、プロモーターの強度と釣合がとれている（Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6772 (1982)）。
【０２４７】
（繊維芽細胞培養系の確立）
ラットの皮膚のプライマリー繊維芽細胞をとるために、（２００〜２５０ｇの）２０匹の若い麻酔したフィッシャー３４４ラットの腹部を７０％エタノールで洗い、どのラットからも２５×２５ｍｍの生体材料を取り、即座に７０％アルコールに浸す。その組織からアルコールを除去するために燐酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に移す。その後、生体材料は、１０ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ(collagenase)を含むＰＢＳに移され、１５分間３７℃でインキュベートされた。皮膚層は、良質の毛抜と３０分間酵素により切断することにより表皮層から剥された。細胞は、ペレットにされ、３５ｍｍ2の培養皿に移され、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ（ニューヨーク州グランドアイランドのギブコから購入した）の最小培地（ＤＭＥＭ）で維持した。全ての培養は、３７℃で１０％ ＣＯ2下で維持され、分裂細胞の比が全体の３分の１、またコンフルエントな状態に８０〜９０％になるように培養した。トランスフェクションした繊維芽細胞はコンフルエントな状態に７０〜８０％に成長したログフェイズの段階でＣＡＴ活性を測定した。コンフルエントな状態でＣＡＴ活性を定量する場合は、１００％コンフルエントに成長した細胞を定量まで７日間そのままにしておいた。
【０２４８】
（繊維芽細胞のトランスフェクション）
繊維芽細胞は，リポフェクチン試薬（BRL, Inc., Gaithersburg, MD）を用いて、Fergner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987)及びFelgner andHolm, Focus 11:21-25 (1988)に記された方法で、プラスミドＤＮＡ対ｐＲＳＶｎｅｏR プラスミドが１０：１の比率で選択されたプラスミドでトランスフェクションされた。そのどちらもリファレンスに組み込まれている。それぞれの６０mm培養皿（５×１０5細胞／培養皿）に、異なる量のＤＮＡと３０μｇリポフェクチン試薬を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＢＲＬ，Ｉｎｃ．）３ｍｌを用いた。
【０２４９】
適切に形質転換したものを選択するために、ＲＳＶ／ＬＴＲのコントロール下におけるｎｅｏR 遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡは、レポーター遺伝子（ＣＡＴ）を含むベクターＤＮＡと、いろいろな種類のプロモーターの制御下で、１：１０の比率で混合された。一旦Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄した後、繊維芽細胞はＤＮＡ／リポフェクチン混合液の存在下で５時間３７℃で培養した。その後、培地を１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに替え、選択前に２４−３６時間インキュベートした。
【０２５０】
安定した形質転換細胞は、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択された。トランスフェクションされた細胞は培養皿が少なくとも５０％コンフルエントになったときに継代接種された。トランスフェクションされた繊維芽細胞は８０％よりコンフルエントになったとき、１：２の比率で分割した。
【０２５１】
ＣＡＴを発現したトランスフェクションされた細胞は、対数増殖期及びコンフルエントになった後の両方において、下に示すように分析された。結果は、安定して生存したＣＡＴトランス遺伝子の発現が、細胞がコンフルエントになった後で減少するのか増加するのかを決定するために比較された。
【０２５２】
（ＣＡＴ活性の分析）
ＣＡＴ活性はスレイらの方法（Sleigh, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)）の変形法を用いて分析が行われた。なお、この文献の記載はここに組み入れられる。トランスフェクトが行われた繊維芽細胞を含む皿は、ＰＢＳを用いて洗浄され、その細胞はスクラップすることによって集められた。細胞は、０．２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８の緩衝液（１００μｌ／プレート）中で再懸濁され、超音波をあてて溶解させた後、細胞の残骸を取り除くために遠心分離がかけられた。溶解性のフラクションから得られるプロテインの濃縮物は、クマージーのプロテイン試薬（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を用いて検出された。分析するために、それぞれのトランスフェクションから得られた等量のプロテインを用いた。細胞の抽出液に加えた場合、１００μｌの反応混合液には、２０μｌの８ｍＭクロラムフェニコールと５μｌの０．５ｍＭの冷たくて［14Ｃ］アセチル−ＣｏＡを含んでいた。３７℃で１時間、インキュベートを行った後、クロラムフェニコールとそのアセチル化体は、０．１２ｍｌのエチルアセテートで抽出が行われた。約８０μｌの有機層が、室温で遠心分離（１０，０００×ｇ）した後で集められた。続いて、反応混合物はエチルアセテートを用いて再抽出された。約１００μｌの有機層が集められ、前に集められた８０μｌの有機層と混合された。１ｍｌのパッカード インスタジェル(Packard Instagel)（Packaard, Downers Grove, IL）を有機層に添加した後、得られたサンプルは、シンチレーションカウンターで計数された。
【０２５３】
（ノーザン ブロット分析）
繊維芽細胞の成長の対数期あるいはコンフルエント期の間、トランス遺伝子のさまざまな発現が転写レベルで起きているかどうかを調べるためにノーザンブロット分析が行われ、以下に説明したとおり、合成されたＲＮＡの量が定量された。１０ｃｍのプレートで生育させた細胞は、７０−８０％のコンフルエント状態あるいは７日間コンフルエント状態を維持した後のいずれかの段階で、ノーザンブロット分析を行うことによって、全ＲＮＡの単離のための工程が行われた。それぞれの培養物から得られた全ＲＮＡは、０．５ｍｌのグアニジジンイソチオシアネート溶液中でその細胞を抽出することによって単離された。これは、コムチンスキーらの方法（Chomczynski and Sacchi, in the Anal. Biochem, 162:156-159 (1987)）に従っておこなわれ、この文献の記載はここに組み入れられる。プロテインとＤＮＡは、フェノール−クロロホルムを用いて抽出することによってＤＮＡから分離された。全ＲＮＡの量は２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量された。続いて全ＲＮＡのうちの１０から１５μｇが、１．２％のホルムアルデヒド−アガロースゲルにかけられた。分離されたＲＮＡは、ナイロン膜（Hybridization Transfer Membrane, MSI, Inc.）上に、１０Ｘ ＳＳＣを用いてキャピラリーで散布することによってブロットされた。このブロットのプレハイブリダイゼーション（５０％ホルムアミド、５Ｘのデンハルト溶液(Denhardt's solution)、５ＸのＳＳＰＥ、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性させたヘリング精子のＤＮＡ）は、４２℃で１−２時間行われた。
【０２５４】
プローブを得るために、ｄＣｈＡＴ ｃＤＮＡは、ｐＬＣｈＲＮＬから得られるｐｓｔＩ酵素を用いてｐｃＭＶＣＡＴから活性化され、そしてマニアチスらの下記に記載した方法によって低融解のアガロースゲル上で精製された。（Maniatis et al., in Molecular Cloning-A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1982)、なお、この文献の記載は参照としてここに組み入れられる。） 32Ｐを用いてランダムプリミング(random priming)（MAniatis et al., 同上文献）によってラベルされた。変性された放射活性ラベルされたプローブ（２分間沸騰した後で氷冷を行ったもの）が、そのプレハイブリダイゼーション溶液に直接的に添加された。ハイブリダイゼーションは、４２℃で１２−２０時間行われた。その後、ブロットは６Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用い、室温の状態で二度洗浄され、次に１Ｘ ＳＣＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４２℃で二度洗浄され、最後に０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて６５℃で一度洗浄された。すべては１０分間で洗浄が行われた。その洗浄済みのゲルは、プラスチック性のＸＡＲフィルムでラップされ、オートラジオグラフィー（ＸＡＲフィルム、Kodak, Rochester, NY）が行われた。それぞれのＲＮＡバンドの強度は、ＬＫＢの高速走査 ＸＬレーザー濃度計上（LKB Sweden）で走査することによって測定された。ブロットは、洗浄されることによって全ての数が除去され、内部標準として用いることができるようにシクロフィリンを用いて再プローブされた。プローブは、続くハイブリダイゼーションを行うために、５０％のホルムアミド、６Ｘ ＳＳＰＥ中、６５℃以上で３０分間洗浄することによって除去された。ブロットは、プレハイブリダイゼーションがうまく行くように、２Ｘ ＳＳＰＥ中にてリンスされた。
【０２５５】
この実験例では、ＳＶ４０とＬＴＲプロモーター、及びα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター、すなわちコラーゲンエンハンサーを有するプロモーターと有しないプロモーターの両方が、対数期の繊維芽細胞と静止期の繊維芽細胞についてテストされた。その結果は図４４に示されている。
【０２５６】
ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０）を含有する繊維芽細胞におけるＣＡＴ活性のレベルは、成長細胞及び静止細胞に対して、それぞれ約３２４７及び約２７１２ ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であった。このことは、約１７％の減衰である。同様に、ＬＴＲを含有する繊維芽細胞におけるＣＡＴ活性は、約２４％のコンフルエント（対数期の細胞については３２９１ ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であり、静止期の細胞については２４９４ ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であった。）にすることによって減少した。対照的に、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターを含有する繊維芽細胞で測定されたＣＡＴのレベルは、静止期で増加したが、これらの細胞からの全体を通しての発現量は低下した。エンハンサーを持たないα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ）を含有する繊維芽細胞のＣＡＴ活性は、対数期の細胞及び静止期の細胞に対してそれぞれ約１３ＤＰＭ／μｇのプロテイン量及び約７５ ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であった。このことは約５７６％の増加であることを示している。コラーゲンエンハンサーを有するα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（Ｃｏｌｌ（Ｅ）： Rossi and de Crombrugghe,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 5590-5594 (1981)）を含有する繊維芽細胞では、ＣＡＴのレベルが、対数期の繊維芽細胞では４０５ＤＰＭ／μｇのプロテイン量、静止期の繊維芽細胞では６０６ＤＰＭ／μｇのプロテイン量であることを示していた。このことは、約１４９％増加したということができる。
【０２５７】
これらの結果から、ウイルス性のプロモーターから得られるトランス遺伝子の発現は、静止期の繊維芽細胞においては減衰することが判明している。これに対して、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターからのトランス遺伝子の発現は、静止期の細胞で増加する。脳に移植された繊維芽細胞が分裂することがないため、安定なトランス遺伝子の発現を最大にする一つの方法として、静止期の繊維芽細胞において通常の活性を有するプロモーターを用いることによる方法があげられる。α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターは、そのようなプロモーターである。更に、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーターのエンハンサーは、好適な条件下でトランス遺伝子の発現を行わせることにおいて、α２（Ｉ）プロモーターと同様の効果を有している。
【０２５８】
これらの結果は、分割が終了している細胞が体内に移植された場合に、その細胞から生じるトランス遺伝子の発現を増加することによって、治療性のトランス遺伝子の長期間にわたっての安定な発現を促進することのできるような方法を示している。
【０２５９】
［実験例ＩＸ］
「サイトカイン及び抗−炎症性薬物によるプロモーターの調整」
たくさんの単核の食細胞及びリンパ球は、血液−脳関門を通過した後、ＣＮＳを侵害する。これは、例えば脳に細胞の移植を行った後などに起こる。これらの細胞は、細胞外部の周りの領域にサイトカインを分泌することが知られている。移植された材質周辺へのこれらの細胞の侵入及び蓄積は、移植後１週間以内に観察された。繊維芽細胞は種々のサイトカインに反応することがわかっているため、プライマリーラットの繊維芽細胞において、ＬＴＲ−作動性のトランス遺伝子の発現を調節するサイトカインの役割を評価するためにこの実験例は行われた。
【０２６０】
この実験例は、次の２つの利用について説明されている。１）ＬＴＲ−作動性のプロウイルスｍＲＮＡの定常状態レベルにおいてサイトカインの効果を除去するための抗−炎症薬物であるデキサメタゾン（dexamethasone）を利用すること；及び、２）移植後の脳内に存在する高レベルのサイトカインの利点を活用するために、コラーゲンエンハンサー（Ｃｏｌｌ（Ｅ））を伴うα２（Ｉ）コラーゲン（Ｃｏｌｌ）プロモーターを利用すること、の２種である。この実験例において、利用されるトランス遺伝子は、ドロソフィラ（Drosophila）コリントランスフェラーゼ（ｄＣｈＡＴ）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であった。
【０２６１】
（方法）
この実験例で用いられる方法は、上記の実験例ＶＩＩＩで記載されているとおりであるが、以下の例外が含まれている。
【０２６２】
（リポフェクション(lipofection)）
リポフェクションの方法は、前記の実験例ＶＩＩＩに記載されたとおりであった。この実験例で繊維が細胞をトランスフェクトするのに用いられるプラスミドは、ｐＭＬＶＣＡＴ（ＬＴＲプロモーターは、カリフォルニア州、サンジエゴ、ユニバーシティ オブ カリフォルニアのフリーマン博士から提供を受けた。）、及びｐＲ４０（Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター及びエンハンサー（Rossi and de Chombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5590-5594 (1987),及びテキサス州、ハウストン、ＭＤアンダーソン癌センターのデ クロモバルジ（Dr. de Crombrugghe）博士から提供を受けた。）であった。ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞は、前記実験例ＶＩＩにおいて上記に記載されたようなレトロウイルスで感染することによって形質導入された。
【０２６３】
（繊維芽細胞の培養物）
プライマリー皮膚の繊維芽細胞の培養物は、以下の点で異なっているが、上記の実験例VIIIに記載されたように構築された。ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞は、１０％のＦＢＳ及び２００μｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されたＤＭＥＭを用いた３５ｍｍの組織培養皿中でコンフルエントになるまで生育させた。コンフルエントに到達した時点で、２％の血清を含有する培地に移して、更に７日間維持させた。ｐＭＬＶＣＡＴあるいはｐＲ４０プラスミドでリポフェクトされた繊維芽細胞は、ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞について記載されているように、コンフルエントになるまで増殖した。しかしながら、コンフルエントに到達した後は、これらの細胞は１０％の血清を含有する培地で４日間維持させた。それらの細胞は続いて、最後の３日間は２％の血清を含有する培地に移された（コンフルエントに達した後、全体では７日間であった。）。
【０２６４】
（サイトカインあるいは抗−炎症性薬物を用いるトランスフェトされた繊維芽細胞の処理）
サイトカインは、コンフルエントに達した後、７日目に加えられた。ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（３０μ／ｍｌ）、及びＴＨＦα（１５０ｎｇ／ｍｌ）が、２４時間培養物とともにインキュベートされた。更に、抗−炎症性薬物であるデキサメタゾン（２５μＭ）が繊維芽細胞にのみに、及びＴＧＦβ１及びＩＬ−１β１の存在下で加えられた。その細胞はその後、ノーザンブロット分析（ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞について）が行われ、また、ＣＡＴ分析（ＬＴＲあるいはＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーターを含有する細胞について）が行われた。Ｉｎｆγは、他のサイトカインに対して上記に記載されたようにインキュベートされた。しかしながらいくつかの実験においては、Ｉｎｆγを含有する培地が吸引され、新鮮な２％の血清を含有する培地を用いて置き換えられた。細胞はこのように、更に４８時間維持され、その後ノーザンブロット分析あるいはＣＡＴ分析が行われた。この手法は、Ｉｎｆγが機能を発揮するこれだけの時間を必要とすることを測定するために用いられた。
【０２６５】
コンフルエントな状態にあるｄＣｈＡＴ発現性の繊維芽細胞は、上記に記載されたＴＧＦβ１、ＴＮＦα、ＩＬ−１βあるいはＩｎｆγとともにインキュベートされた。これらの培養物から得られる全ｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析によってプロウイルス性のｍＲＮＡを選択的に認識するｃＤＮＡフラグメントを用いて単離され、プローブ操作された。図４５（ａ）は、ＴＧＦβ１（レーン２）及びＩＬ−１β（レーン３）の両者が、プロウイルス性のｍＲＮＡの定常状態レベルを有意に減少させることを示している。一方、ＴＮＦα（レーン４）は、プロウイルス性のｍＲＮＡのレベルに対して有意の影響を生じさせなかった。図４５（ｂ）は、ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡの容量に対するＩｎｆγの影響について示している。２４時間たった後、プロウイルス性のｍＲＮＡの定常状態においては変化が見られなかったが、ｍＲＮＡのレベルはＩｎｆγが除去されて新鮮培地で置き換えられた後４８時間後には顕著に減少していた。
【０２６６】
これらの結果は、サイトカインがインビトロでのＬＴＲ作動性遺伝子ｄＣｈＡＴの発現に対して影響を与えることを示している。
【０２６７】
図４６はノーザンブロット分析の結果であり、そのブロット分析では、ＬＴＲ−作動性のｄＣｈＡＴ−生産性繊維芽細胞をコンフルエント状態に導くＴＧＦβ１及びＩＬ−１βの複合投与を行うことによってその繊維芽細胞中に含まれるプロウイルス性のｍＲＮＡの量を少なからず減少させることが示されている。これとは対照的にデキサメタゾンは、ノーザンブロット分析によって検出されるｄＣｈＡＴのｍＲＮＡ量を増加させた。ｄＣｈＡＴ−繊維芽細胞をかりに、デキサメタゾン、ＴＧＦβ１、及びＩＬ−１βと同時に２４時間接触させた場合、プロウイルスのｍＲＮＡのレベルはコントロール培養物において検出されたレベルと同じであった。これらの結果は、抗−炎症性薬物、即ちデキサメタゾンなどのステロイドを含む抗−炎症性薬物が、インビトロでのプロウイルスのｍＲＮＡの定常状態レベルにおいてＴＧＦβ１及びＩＬ−１βの否定的な影響が加わるのを妨げることができることを示唆している。
【０２６８】
上記に記載されているように、数種のサイトカインは、ＬＴＲからのトランス遺伝子の発現を低めるように調節を行う。繊維芽細胞を脳に移植した後でのこれらのサイトカインの効果を軽減するための一法としては、例えばデキサメタゾンなどの抗−炎症性薬物を用いて炎症性反応を抑えることが挙げられる。抗−炎症性薬物の投与を必要としない別の方法としては、サイトカインの存在によって影響されないか、あるいはできるだけ高められるような一種あるいはそれ以上のプロモーターを使用することである。このようなプロモーターの一つには、α２（Ｉ）コラーゲンプロモーターがある。これらの実験例では、ＣＡＴ遺伝子がレセプターとして用いられた。
【０２６９】
図４７には、静止期の繊維芽細胞の培養物において、ＣＡＴの発現に対してのＴＧＦβ１、ＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩｎｆγの効果が示されている。尚そこではＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーがトランス遺伝子の発現（Ｃｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞）を進行させるために使用された。これらの実験例においてその培養物は、コンフルエントな培養状態に達した後の７日間のうち最後の３日間は、２％の血清を含有する培地で維持された。驚くべきことに、２％の血清を含む培地で維持されていたＣｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞の培養物のＣＡＴ活性は、１０％の血清を含む培地で維持されていた比較対照の培養物のＣＡＴ活性よりも４４０％も大きかった（図４７（ａ））。この活性は、ＬＴＲに対して測定された活性にまで達していた（図４４（実験例ＶＩＩＩ）及び図４７（ａ）と比較される。）。
【０２７０】
サイトカインのテストを行った場合では、ＴＧＦβ及びＩＬ−１βはＣＡＴ活性に有意の影響を与えなかった（図４７（ｂ）参照）。一方、ＴＮＦαに接触させた場合では、ＣＡＴ活性が約３２％増加するという結果を示した。対照的に、ＩＮＦγとともにインキュベートしたＣｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞では、ＣＡＴ活性はほぼ５３％の減少を示していた。この測定は、Ｉｎｆγが除かれて、２％の血清を含む新鮮な培地で置き換えられた後の４８時間たった時点で行われた。
【０２７１】
（Ｃｏｌｌ（Ｅ）を用いるインビボでの発現）
ＬＴＲ−ＣＡＴ細胞（繊維芽細胞であって、ここではＣＡＴ遺伝子がＬＴＲによって作動される。）及びＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ細胞（繊維芽細胞であって、ここではＣＡＴ遺伝子がα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター−コラーゲンエンハンサーによって作動される。）は、上記実験例ＶＩＩＩに記載されたような３４４匹の成体のフィッシャーラットの線条体に移植された。３回の（３）μｌのＬＴＲ−ＣＡＴあるいはＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ細胞（２００，０００個の細胞／μｌ：全体では６００，０００個の細胞）が注入された。ＬＴＲ−ＣＡＴ繊維芽細胞が右側に注入され、Ｃｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ細胞が左側に注入された。移植から１週間から４週間の時点で、その動物を潅流し、脳が切断されて免疫組織化学的に調べるように加工された。抗体である抗−クロラムフェニコールが１：２０００の希釈度で用いられ、５プライム−３−プライム、ボルダー社（Boulder, Co.）から購入された。
【０２７２】
図４８において示されているように、強く染色された多くのＣＡＴ−ポジティブな繊維芽細胞が、ＬＴＲ−繊維芽細胞あるいはＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ繊維芽細胞のいずれかを含有する移植後１週間の移植片において観察された（図４８（ａ）、図４８（ｂ）の白い矢印参照）。染色の強度が、２種の移植タイプ間で比較された。４週間の時点でのＣＡＴの染色は（図４８（ｃ）及び４８（ｄ）における白い矢印参照）、Ｃｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ繊維芽細胞の移植片ではより強く現れた。この時点では、全ての移植片に関連して更に多くの食細胞が認められた（矢じりは、移植宿主の脳の界面(interface)を示している。）これらの結果は、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーが、脳へのドナー細胞の移植の後でのトランス遺伝子の発現を、より安定でかつより強くすることができることを示唆している。４週間目の移植片の中心に食細胞が存在することは、サイトカインが高レベルでまだなお存在しているのであろうということを示している。このように、ＬＴＲに比較してＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーからの方がより強く発現することの理由の一つとしては、サイトカインが発現を増加するように働くことが考えられる。
【０２７３】
この実験例で得られたデータは、１）あるサイトカイン（例えばＴＧＦβ１、ＩＬ−１β、及びＩｎｆγ）は、プロウイルス性のｍＲＮＡのレベルに対して否定的な影響を及ぼすこと、２）デキサメタゾンは、プロウイルス性のｍＲＮＡの定常状態レベルに対するＴＧＦβ及びＩＬ−１βの否定的な影響を打ち消すことができること、３）Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーは、移植後の脳に見いだされるサイトカインのレベルを高めるように利用することができること、を示している。
【０２７４】
サイトカインがＬＴＲからの発現を抑制的に調節できるという観察結果は、脳に植え付けられた繊維芽細胞がサイトカインによって影響される可能性があることを示唆している。このサイトカインは、移植後に脳に浸透して来る血液由来の単核細胞である食細胞及びリンパ球によって生産される。小膠細胞(microglial cell)および内皮細胞(endothelial cell)は、脳内におけるサイトカインのもう一つの源であり、このシナリオに寄与できる。このように、移植された繊維芽細胞におけるＬＴＲ−作動性のトランス遺伝子の発現は、結果的に移植後の経過時間で起こるであろう。ＬＴＲにおけるサイトカインの望ましくない抑制的な働きを打ち消すための一つの方法として、サイトカインの生産を減少させる抗−炎症性の薬物等の分子を用いる方法が挙げられる。この手法は、移植された繊維芽細胞でのトランス遺伝子の発現の安定性を増加させるだけでなく、免疫応答を減少させることによって細胞の生き残りに対して貢献することもできる。
【０２７５】
これに代わるアプローチとして、サイトカインによって効果を高めるように調節される機能を有するか、あるいはサイトカインによって少なくとも影響されないプロモーターを用いることによって、サイトカインの効果を利用する方法が挙げられる。この実験例は、ＴＧＦβ１及びＴＮＦαがＣｏｌｌ（Ｅ）−繊維芽細胞におけるトランス遺伝子の発現に対して否定的な影響を与えないこと（ＣＡＴの活性によって評価されたような）を示している。対照的に、ＴＮＦαは発現を増加させる。Ｉｎｆγは、ＬＴＲに対する影響（即ちトランス遺伝子の発現を減少させること。）と同様に、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーに対しても影響を及ぼす。従って、シクロスポリン等の免疫抑制剤を用いて、Ｔ−リンパ球から得られるＩｎｆγなどのサイトカインの遊離を調節することが更に必要とされる。
【０２７６】
このデータはまた、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーからの発現が、１０％の血清を含有する培地に比較して、２％の血清を含有する培地に維持されている細胞においての方が好くなからず増加することを示している。発現レベルは、ＬＴＲを含む繊維芽細胞で観察された観察レベルと比較される。体内に移植された繊維芽細胞は、培養時よりも少ない血清要素にさらされるであろう。従って、ある条件下では、Ｃｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーからの発現を、トランス遺伝子の発現を進行させるのに現在用いられている最強のウイルス性プロモーターと同等にすることができるであろう。
【０２７７】
［実験例Ｘ］
「成体の軸索切断された神経の再生」
この実験例においては、成体のラットのＣＮＳにおける栄養ファクターに応答する異常の軸索の成長を維持する基質を評価する新しいインビボ モデルが提供される。これに加えて、軸索切断後のラットの中隔の神経の再生能力に関するNGFの重要性が評価される。
【０２７８】
この実験例は、成体の星状細胞が、遺伝学的に修飾されたプライマリーの繊維芽細胞の線状体内の移植片からＮＧＦにより供給される場合には、軸索成長のために許容すべき基質として供することができることを指摘する。これに加えて、軸索切断後のラットの中隔の神経の再生能力に関するＮＧＦを分泌する修飾されたプライマリーの繊維芽細胞の移植片の効果が評価される。
【０２７９】
上記した実験例ＩＩで詳述したごとき調製されたＮＧＦを発現させかつ分泌する遺伝学的に修飾されたプライマリーの皮膚繊維芽細胞からなる移植片は、成体ラツトの線条体に移植された。プライマリーの繊維芽細胞はフィメールフィシャー３４４ラツトの皮膚生検から得られた。細胞は標準的な培養条件の下で養われ、胎生小牛漿液を３％含むＤＭＥＭを週３回供給された。プライマリーの細胞は上記実験例ＩＩで詳述したごとく、マウスβ−ＮＧＦ、ｐＬＮ．８ＲＬＮに起因するｃＤＮＡを含むミューラン レトロウィルス ベクターで感染された。感染された細胞は、ネオマイオシン アナログ Ｇ４１８で選択された。移植するための細胞を分離する以前に、培養媒体のサンプルはコントロールおよび感染された細胞から除かれた。感応的な２部位イムノアッセイ（ボーエルヒンガ−マンハイム）を採用して、感染された細胞が１５４−１７３ｐｇ ＮＧＦ／ｈｒ／１０５細胞を生成しかつ分泌したことを測定された。ＮＧＦのレベルは コントロール媒体では検出され得なかった。フィメール フィッシャー ラット（重量約１７５〜２００ｇ）は、ケタミン−キシラミンの混合物（ケタミン２５ｍｇ／ｍｌ；ロンパン１．３ｍｇ／ｍｌ；アセプロマジン０．２５ｍｇ／ｍｌ）で麻酔された。頭部は剃られ、定位のフレームに配置された。手術が開始される以前に、頭部に殺菌剤が付与された。各動物はグラフティング液（ＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2の１μｇ／ｍｌと０．１％のグルコースを追加されたホスフェード バッファーサリン）の３μｍ中の３×１０5細胞を線条体内に受けた。：右側にはＮＧＦ−生産細胞、左側には非感染細胞。１，３および８週間の生存期間の後、動物は麻酔をかけられ、０．１Ｍホスフェート バッフアーの４％パラフォルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドを噴門を通して潅流された。移植片を通した水平状または矢状縫合セクションは、フリージングミクロトームで切断されてＮＧＦ受容体の免疫反応のために処理されるか、またはビブラトームで切断されて電子顕微鏡実験のために処理された。
【０２８０】
遺伝学的に修飾された細胞は右線条体に注入され、また非感染のコントロール細胞は左線条体に注入された。移植後１週間、ＮＧＦ受容体−免疫反応軸索の集網はＮＧＦ生産繊維芽細胞を構成する線条体の移植片の尾側極で明確であり、それ故僅かな数の大きくなりかつ膨れた免疫反応軸索のプロフィルが非感染コントロール細胞の移植片の近くで観察された（図４９（ａ）および図４９（ｂ））。３週間でＮＧＦ生産移植片を取り巻く免疫反応軸索の密度は劇的に増大した。わずかなＮＧＦ受容体−免疫反応プロフィルはＮＧＦ生産細胞を構成する移植片を完全に満たし、また移植片を取り巻く軸索プロフィルの集網はもはや存在しなかった（図４９（ｄ））。これらの免疫反応プロフィルは単一軸索より大きくて明瞭であり、通常縦形で広がった。非感染のプライマリの繊維芽細胞の移植片は移植後３〜８週間で免疫染色された軸索プロフィルのそのようなパターンを欠くけれども、ＮＧＦ受容体免疫反応はわずかな血管に制限された（図４９（ｃ））。
【０２８１】
超微細構造の実験は、全ての線条体内の移植片が広範囲のラフな内質細網をともなうプライマリの繊維芽細胞およびコラーゲンで満たされた細胞外マトリックスで構成されていることを示した（図５０）。毛細血管は、これらの移植片内に広範囲な血管集網を与えた非穿孔の内皮細胞を構成した（図５０）。移植後３および８週間で、反応性星状細胞は移植片を完全に包み込んだ。これらの星状細胞のプロフィルは、移植片の周囲に並列するこれらの表面に明瞭な基底ラミナをもった。ＣＮＳ神経網と非ＣＮＳの移植片間のこの関門は、神経網の貫通している傷に続いて通常発見される「グリアル スカア(gleal scar)」の特性を示した。反応性の星状細胞の突起もまた移植片の物質内に広がり、しばしば毛細血管に強く結合された。ＮＧＦ生産移植片の細胞外のマトリックス内のみにおいて、無髄軸索の管束が移植片のいたるところに散在された。明確で球形の小水庖がしばしばよく観察された。フィラメントを沢山もつ反応性星状細胞の突起は、これらの軸索のプロフィルを回旋型に包み込むことを発見された（図５１（ａ）、図５１（ｂ））。基底ラミナは全体の軸索−神経膠の複合体を取り巻き、軸索と星状細胞間の対向する形質膜では明確でなかった。これらの軸索−神経膠配列の発生は、移植後３週間より８週間において大きかった。軸索のプロフィルは非感染のコントロール細胞の移植片内では発見されなかった。
【０２８２】
これらのデータは、ＮＧＦ受容体−陽性軸索がＮＧＦ生産のプライマリの皮膚繊維芽細胞の移植片に対して成長することを示す。他方、非感染細胞の移植片は、同様の神経の応答を顕在化させない。しかしながら、細胞の両タイプの移植組織は３週以前に反応性星状細胞を、移植片を取り巻きかつカプセルに包み込むように誘発する。この神経膠の関門の存在にもかかわらず、反応性星状細胞の突起の精巧な配列に沿って広がる無髄軸索は、ＮＧＦ生産移植片内でのみ発見された。これらの軸索はもっぱら、明瞭な基底ラミナを欠く星状細胞の表面に閉じ込められた。プライマリの繊維芽細胞の移植組織の細胞外マトリックスは軸索の成長のための他の伝導基質、例えばコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチン等からなるけれども、移植片内で成長する軸索はこれらの成分とは結合しなかった。これらの全ては、インビトロでの軸索の成長のための伝導基質として予め指摘された。従って、遺伝学的に修飾されたプライマリの皮膚繊維芽細胞の移植片を浸透するＮＧＦ感受性の軸索にとっては、反応性星状細胞は軸索の伸長のために好ましい基質である。
【０２８３】
これらの結果は、成体ＣＮＳにおける成熟した反応性星状細胞が、軸索の成長を阻止するよりむしろ促進する基質として作用することができることを示す。ＮＧＦを生産する遺伝学的に修飾された細胞の内線条体の移植片を採用するためには、好結果の軸索の伸長は必要な屈性および栄養維持を要求することをこれらのデータは示している。従って、成長促進ファクターの有効性は、成長のための基質ではなく、再配列に対して大きく影響することが明かである。
【０２８４】
軸索の再配列での移植片の効果を試験するために、インビボでNGFを発現させるべき遺伝学的に修飾されたプライマリの細胞が確立され、また軸索切断されたコリン作用性の中隔の神経の栄養維持を提供するために示された。インビボでNGFの細胞源を提供するために、実験例ＩＩで詳述されたごとく調製されたＮＧＦを発現させるべく遺伝学的に修飾されたプライマリの皮膚繊維芽細胞はコラーゲンのマトリックスに懸濁され、吻側の海馬状隆起に突出する中隔の軸索のための主要なルートである、フィンブリエ円蓋（ＦＦ）通路の片方だけの切除により形成された空洞に配置された。
【０２８５】
麻酔の下で、プライマリの皮膚繊維芽細胞はフィメル フィシャー３４４ラツトの腹部の腹壁の生検から得られ、これらの細胞は標準の培養条件の下で維持された。マウスβ−ＮＧＦ、ｐＬＮ．８ＲＮＬに起因するｃＤＮＡを含むレトロウィルス ベクターを使用して、プライマリの細胞が培養中に感染され、これらの細胞によるＮＧＦ生産物はその後２部位イムノアッセイ（実験例ＩＩで詳述）を使用して評価された。細胞をコラーゲンのマトリックス中に懸濁するために、ＮＧＦ生産のプライマリの細胞およびコントロールの非感染のプライマリ細胞の培養物がホスフェート−バッファド サリンで濯がれ、トリプシン化され、そしてＤＭＥＭ中に懸濁された。細胞はその後計数されて、総量１０6の細胞が媒体中で等分化された。ラットテール（シグマ）からのタイプＩコラーゲンはその最終濃度が３％となるように０．１％酢酸で溶解された。よりアルカリ性の媒体を調製するために水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）が細胞の懸濁液に添加され、その後コラーゲンが添加され（最終濃度１％）、混合され、そして遠心分離器のチューブに等分化された。コラーゲン／繊維芽細胞のマトリックスはその後３７℃で４８時間インキュベートされた。４０個のフィメル フィシャー３４４ラット（重量約１７５ｇ）が手術のために、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）、ロンパス（４．０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（５．６ｍｇ／ｋｇ）の混合物を使用して麻酔をかけられた。これらの頭部が剃られ、動物はコッフ定位フレームに配置された。手術は実験例ＩＩで詳述しているように２つのステップの手順であった。第１に、帯状皮質を通じる片方だけの吸引の損傷およびＦＦ経路が立体鏡視界の下で形成された。その後、コラーゲン／繊維芽細胞のマトリックスは小片に切断され（約２〜３ｍｍ3）、傷つけた空洞に配置された。他の動物はFFの損傷のみを受けた。動物は手術から回復し、３，４または８週間生存した。これらの生存期間の後、動物は上記したごとく深く麻酔をかけられ、ホスフェートバッファー（超微細構造の場合のために０．１％のグルタルアルデヒドが添加された）の４％パラホルムアルデヒドを噴門を通して潅流された。脳が除去され、ポストフィックス(post fixed)され、 フリージングミクロトームまたはビブラトームのいずれかで切断され、そして各片（厚み４０〜５０μｍ）はアセチルクロリンエステラーゼ組織化学、免疫組織化学および超ミクロトーミイのために処理された。
【０２８６】
完全な片方だけのＦＦの損傷を受けかつ空洞内に移植片を有する動物のみが、以下の評価を受けた。
【０２８７】
１）軸索切断に続く中隔の神経の救済、２）移植片および海馬状隆起のアセチルクロリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）組織化学的およびＮＧＦ受容体の免疫化学的染色、３）移植片のニツスル染色、およびチロシン ハイドロキシラーゼ（ＴＨ）、神経膠繊維のアシデック プロテイン（ＧＦＡＰ）およびラミナの免疫化学的染色、４）損傷の同側の海馬状隆起およびＮＧＦ生産またはコントロール非感染の繊維芽細胞のいずれかの移植片からの蛍光マーカーの逆行性輸送、５）移植片の超微細構造の組織、６）ＮＧＦ生産移植片の移植片と同側の輸入路遮断された歯状脳回におけるＡＣｈＥ染色の超微細構造の分配。
【０２８８】
組織化学的および免疫化学的検出は次のごとくなされる。コラーゲン／繊維芽細胞の移植片に起因する切片は０．５％チオニン水溶液を使用してニッスル物質にて染色され、ヘドリーン等の修飾方法（J.Histochem. Cytochem. 33:134-140 (1985)）を使用してＡＣｈＥにて組織化学的に染色され、およびラミニン、神経膠繊維アシデックプロテイン（ＧＦＡＰ）およびチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）にて免疫組織化学的に染色された。中隔に起因する切片はＮＧＦ受容体にて免疫組織化学的に染色され、海馬状隆起に起因する切断片はＡＣｈＥにて組織化学的に、ＮＧＦ受容体およびＴＨにて免疫組織化学的に染色された。
【０２８９】
ＮＧＦ受容体、ＴＨおよびＧＦＡＰの免組織化学的検出は同じプロトコルを使用した。切断片は初めに０．６％ハイドロジェン パーオキサイドの水溶液で３０分間処理され、ＴＢＳで簡単に濯ぐがれ、そしてＴＢＳ、３％の規定のウマ血清および０．２５％トリトン−Ｘを含む溶液中で１時間インキュベートされた（この溶液は全ての抗体を希釈するために使用された）。その後、切片は以下の抗体の１つを含む溶液中、４℃で４８時間インキュベートされた。ＮＧＦに対するモノクロナール １９２ ＩｇＧ（Chandler et al., J. Biol. Chem. 259:6882-6889 (1984), 1:100 dilution）、ＴＨに対するモノクロナール ＩｇＧ（Boehringer-Mannheim; 1:250）、およびＧＦＡＰに対するモノクロナール ＩｇＧ（Amersham,1:100）。コントロール切片はプライマリの抗血清を欠いている溶液中でインキュベートされる。全ての切片はその後バッファーで濯すがれ、ビオチン化されたウマ抗−マウスＩｇＧ（1:167）中、室温で１時間インキュベートされた。その他の濯すぎの後、切片はアビディン−ビオチン コンプレックス（ABC;VectorLaboratories）中で１時間インキュベートされた。これらはその後再度濯がれ、ＴＢＳ中に０．０２５％のジアミノベンジジン テトラハイドロクロライド、０．５％のニツケルクロライド、０．１８％のハイドロジェン パーオキサイドを含む溶液中で５分間反応された。切片をバッファー中で濯ぐことによって、その反応は停止された。
【０２９０】
移植片に起因する切片はまた、ラミニンにて免疫組織化学的に染色された。再び、切片は初めに０．６％のハイドロジェン パーオキサイド水溶液で処理され、濯がれ、そして３％の規定のヤギ血清および０．２５％のトリトン−Ｘを含むＴＢＳの溶液中でインキュベートされた。切片はその後ウサギ抗−ヒト リミニンＩｇＧ（１：８００希釈）の添加された上記と同様の溶液中、４℃で４８時間インキュベートされた。コントロール切片はプライマリの抗血清を欠いている溶液中でインキュベートされた。それらはその後濯がれ、ビオチン化されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ（１：２２０）中、室温で１時間インキュベートされた。その他の濯ぎの後、切片はＡＢＣ中でインキュベートされ、上記と同様に反応された。
【０２９１】
ＦＦの片方だけの切除、およびコラーゲンとプライマリの繊維芽細胞を構成する移植片の配置の後３週間および８週間、ＮＧＦ受容体−免疫反応性神経の個体群において注目された減少が、同じ側の内側の中隔において明かであった（図５２ａおよび５２ｂ）。内側中隔（ＭＳ）および移植片（Ｇ）および海馬状隆起の歯状脳回（ＤＧ）を通して引かれたラインは、この図における顕微鏡写真の冠状セクションのレベルを表す。海馬状隆起内での蛍光性のミクロスフェアのための注入位置もまた示されている。同じ側（右）の中隔におけるＮＧＦ受容体−陽性神経の適度の救済はＮＧＦ生産移植片で明白である（矢じりは中隔の中央ラインを示す）。
【０２９２】
ＮＧＦ生産繊維芽細胞の移植片で救済されるＮＧＦ受容体−免疫反応の中隔の神経の決定のためには、ＮＧＦ受容体にて免疫組織化学的に染色された中隔の領域による１２０μｍの５個の切片が神経を計数するために選択された。計数格子（０．５×０．５ｍｍ）が同じ側および反対側の内側の中隔における全ての免疫反応の神経を計数するために使用された。各動物群のための動物当りのNGF受容体−陽性生存細胞のパーセンテージの間の相違がワン−ウェイアノバ(one-way ANOVA)により評価された。片方だけのFF切除後３または４週間、および８週間の、損傷空洞におけるＮＧＦ−生成繊維芽細胞またはコントロール非感染の繊維芽細胞の移植片で、または移植片の無い場合に救済された中隔の神経のパーセンテージ（反対側対同じ側）を示す結果が、表４に表示されている。中隔による冠状セクションは、中隔の神経の生存の数値を求めるためにＮＧＦにて免疫組織化学的に染色された。繊維芽細胞の移植片に起因する切片は、交換神経系軸索の内方への伸びを評価するためにＴＨにて、移植片に対する星状細胞の応答性を評価するためにＧＦＡＰにて、また新血管発性を示すためにラミニンにて免疫組織化学的に染色された。移植片および同じ側の海馬状隆起に起因する切片は、中隔の軸索の再生を検査するためにＡＣｈＥおよびＮＧＦ受容体にて組織化学的に染色された。
【０２９３】
【表４】
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【０２９４】
［表４］は、ＮＧＦ−生産プライマリ繊維芽細胞の移植片が３（または４）週間および８週間において、同期間におけるコントロール非感染プライマリ繊維芽細胞をもつコラーゲンの移植片よりも、ＮＧＦ受容体−陽性の中隔の神経のより高いパーセンテージを有意的に維持したことを示している。ＮＧＦ受容体−免疫反応神経のパーセンテージは、コントロール非感染移植片と移植片無しとを比較される。従って、ＮＧＦ−生産細胞での救済の程度は適度である一方、これらの結果は、遺伝学的に修飾されたプライマリの繊維芽細胞によりＮＧＦのためのトランス遺伝子のインビボでの発現のための間接的な証明を提供する。この発現は細胞を、軸索切断されたコリン作用性の中隔の神経に対する栄養維持を提供することを可能とする。
【０２９５】
移植片および輸入路遮断された海馬状隆起の歯状脳回内での中隔の軸索の再配列は、ＡＣｈＥおよびＮＧＦ受容体染色の検出により評価された。ＮＧＦ−生産繊維芽細胞移植片はＡＣｈＥにて激しく適度に染色した（図５２（ｃ））。他方、コントロール非感染のプライマリ繊維芽細胞の移植片は、しばしばＡＣｈＥ反応性を欠いた（図５２（ｄ））。ＮＧＦ−生産移植片は濃厚に染色された周囲を有するために、コントロール移植片はＡＣｈＥ反応性を欠くということに注目せよ（点線は移植片の隣接した境界線を示す）。
【０２９６】
片側に偏したＦＦの横切断および空洞内のコントロール非−感染繊維芽細胞／コラーゲンの移植片の配置の後３週間、輸入路遮断された歯状脳回はＡＣｈＥおよびＮＧＦ受容体にて染色された軸索が全く無かった。これは、正常な歯状脳回においてみられたＡＣｈＥ（図５２（ｅ））およびＮＧＦ受容体による顕著な染色とは全くの対照であった。ＡＣｈＥ染色の正常なパターンは、歯状脳回の全ての層に対して強いインプットを示す。損傷／移植後８週間の間、輸入路遮断された歯状脳回はなおＡＣｈＥ−陽性の軸索を欠くが（図５２（ｇ））、いまやＮＧＦ受容体にて免疫組織化学的に染色された大きな径の軸索を、特に歯状脳回の多形の層中に備えた。これらの軸索は、ＦＦの損傷後の海馬状隆起内で発生する交感神経系軸索を暗示している（Batcheler et al.,J.Comp.Neurol.284:187 (1989)を参照）。２つのケースでは、ＡＣｈＥ−陽性の軸索は、反対側から輸入路遮断された海馬状隆起までコントロール移植片の下を横切って観察された。ＦＦの片側に偏した横切断およびＮＧＦ−生成繊維芽細胞のコラーゲン内への配置後３週間、ＡＣｈＥ−陽性の軸索の適度の集網が輸入路遮断された歯状脳回の内側および上側の形状に明白であった。８週間の間、ＡＣｈＥ−陽性繊維は飛躍的に増大したが、なお多くの軸索は上内側の歯状脳回に制限された。しかしながら、あるケースの場合には、歯状脳回およびＣＡ２−３範囲で地形的に組織化されたＡＣｈＥ−陽性の軸索が観察された（図５２（ｆ））。再神経支配のパターンが正常な損傷の無い海馬状隆起（図５２（ｅ））のＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索と比較されたけれども、軸索の密度は通常少なかった。ＮＧＦ−生成移植片の場合には、ＮＧＦ受容体にて染色された大径の軸索もまた、輸入路遮断された歯状脳回の多形の層で、通常海馬状隆起の尾側の位置で観察された。
【０２９７】
ＮＧＦ−生産移植片とコントロール移植片でのＡＣｈＥ染色のパターンは著しく相違したけれども、両型の移植片は類似する細胞個体群とＴＨ、ＧＦＡＰおよびラミニンによる免疫染色を備えていた。ニッスル染色は、全ての移植片が繊維芽細胞、リンパ球、肥満細胞、形質細胞、毛細血管の星状および内皮細胞を含む移植片内またはその周囲に種々の異なる細胞型をもつコラーゲンの濃密な管束で構成されていることを示した。また、両型の移植片はわずかな数のＴＨ−免疫反応の軸索を、特に濃密なコラーゲン管束の内に備えていた。ＧＦＡＰによる免疫組織化学的に染色された星状細胞の突起は、損傷空洞の周囲の損傷された神経組織からの広がり、および移植片の外側面内への浸透を認められた。ときには、ＧＦＡＰ−陽性の細胞が移植片内で認められた。ＮＧＦ−生産および非感染のプライマリ繊維芽細胞の移植片のラミニン免疫染色は、広範囲の宿主−誘導された血管の網状組織を示した。また、伸長されたラミニン−免疫反応細胞体、多分シュワン細胞が、移植片の両型の濃密なコラーゲン管束の内部および周囲で発見された。
【０２９８】
ＦＦの切除後新しい軸索を再生し、また輸入路遮断された海馬状隆起を神経支配を再支配するこれらの中隔の神経の起源を決定するため、蛍光ミクロスウェアの定位配置が同じ側の歯状脳回およびＣＡ２−３領域に行われた。ＮＧＦ−生産（ｎ＝５）またはコントロール非感染（ｎ＝４）繊維芽細胞の移植片をもつ９個の深く麻酔をかけられた動物は、損傷と同じ側の海馬状隆起の歯状脳回およびＣＡ２−３領域内にローダミン−蛍光ミクロスウェア（２００ｎｌ／領域）の２つの定位の配置を受けた。４８時間の回復に続いて、動物は再度麻酔をかけられ、４％のパラホルムアルデヒドで噴門を通して潅流された。脳はフリージング ミクロトームで冠状に切断され、中隔領域内で逆行的に標的された神経は蛍光顕微鏡で認められた。図５２（ｈ）における概略図は注入位置を示す。
【０２９９】
最も多くの逆行的に蛍光標識された伸長した神経は、同じ側の内側の中隔および斜めの帯領域で発見された。一方、わずかなものが中隔の中線および反対側の中隔の核で観察された（図５３）。コントロール非感染繊維芽細胞をもつ場合は、中隔の領域には逆行的に標識された神経を有していなかった。
【０３００】
超微細構造のレベルでは、移植片は移植後８週間で遊離した外側の細網配列をもつ濃密なコラーゲンの管束からなっていた。繊維芽細胞は密集したコラーゲンと細網状コラーゲンの構成内で観察され、そしてこれらの細胞の弱められた突起は両領域のコラーゲンの密集した集積を包んだ。基底ラミナにより取り巻かれた非穿孔の内皮細胞を構成した毛細血管は、移植片のいたるところで発見された。リンパ球、形質細胞、肥満細胞、および食細胞を含む幾多の型の細胞もまた、移植片内で観察された。星状細胞およびそれらの突起は密集したコラーゲンの中央部の周囲の遊離した細網内で広く発見された。ＮＧＦ−生成および非感染繊維芽細胞の移植片の間での最も顕著な相違は、無髄軸索の数であった。すなわち、９６０μｍ2の領域では１６２５の軸索がＮＧＦ−生産移植片で発見され、これに対してコントロール移植片では３２９の軸索であった。ＮＧＦ−生産（ｎ＝３異なるケース）またはコントロール非感染（ｎ＝３ 異なるケース）繊維芽細胞／コラーゲンの移植片の極薄の切片が試験され、軸索の総数が１０格子ます目内で計数された（５格子ます目の２並列カラム、総面積９６０μｍ2、密集および遊離したコラーゲン領域の移植片組織で）。ＮＧＦ−生産移植片の３つの場合では、コントロー非感染移植片の３つの場合での３２９個に比較して、１６２５個の軸索が発見された。
【０３０１】
図５４（ａ）−図５４（ｃ）に示されたように、多数の軸索は中間フィラメントを含む星状細胞（＊）の狭い突起を取り巻き、または同突起に入っていた。これらの星状細胞のプロフィルは、移植細胞外のマトリックスに面するこれらの細胞表面で基底ラミナ（矢じり）を備えている。軸索は通常、基底ラミナを欠いているこれらの星状細胞の表面に並んで発見される。このような軸索はまた、繊維芽細胞（Ｆ）（図５４（ｄ））、他の星状細胞に類似する細胞、およびそれらの突起を含んでいる、星状細胞またはその他の細胞の細胞体の近くで発見される。なお、無髄軸索は毛細血管の内皮細胞の基底ラミナに強く結合し（Ｃ）、またはＮＧＦ−生産移植片の細胞外のマトリックス内で発見された。コラーゲン原繊維は軸索の間に分配している（図５４（ｅ））。ＮＧＦ−生産またはコントロール繊維芽細胞の移植片の内には、スワン細胞（Ｓ）およびそれらの突起により包まれたわずかな数の無髄軸索が細網領域で観察された。（毛細血管のルーメン＝Ｌ）（図５４（ｆ））。移植片の両型の密集したコラーゲンの領域内で観察された軸索は、通常低減された神経膠内に覆われている。ときには、コントロール移植片もまた、細胞外のマトリックス内に軸索の非常に小さな個体群を備えていた。
【０３０２】
ＮＧＦ−生産移植片の配置後の輸入路遮断された海馬状隆起の超構造的な実験は、歯状神経膠内でＡＣｈＥ反応のまばらな分配を示す。電子密度反応(electron-dense reaction)は、小径の形質膜、無髄軸索、および明確な球状小胞を含んでいる末端に集中された。これらの染色された軸索のプロフィルは、歯状脳回の分子層で広く発見された（図５５）。歯状神経網は、ＡＣｈＥ−陽性の無髄軸索の集団をいたるところで分配され、またこれらの軸索の集合体は通常星状細胞近くで発見された。ときには、ＡＣｈＥのために反応性を有している軸索の末端は樹状突起のシャフトおよびスパインに接するシナプスを形成した。しかしながら、ＡＣｈＥ−陽性の末端と顆粒状の神経の樹状突起のプロフィルの間の接触の対称は、近接の位置で反応生成物の局在性により通常不明瞭であった。コントロール非感染細胞をもつこれらの動物の輸入路遮断された歯状脳回の切片はＡＣｈＥ反応性を欠くために、その後の分析は超微細構造のレベルでは導けなかった。
【０３０３】
特に、図５５は、超微細構造のレベルで実験したその組織の近くでただちに得られた、ＡＣｈＥにより染色された歯状脳回のコントロール切片（４０μｍ）を示す。ＡＣｈＥ−陽性の繊維は、内部（ＩＭ）および外部（ＯＭ）の分子層、および顆粒状層（Ｇ）で明確である。ＡＣｈＥ−陽性の全組織および繊維もまた、多形の層（Ｐ）で発見される。図５５（ｂ）および５５（ｃ）は、ＡＣｈＥ−陽性の無髄軸索の集団が顆粒状（Ｂ）および分子（Ｃ）層のいたるところで発見される。図５５（ｄ）、５５（ｅ）および５５（ｆ）は、ＡＣｈＥ−陽性の末端形成のスナプスが分子層における樹状突起のシャフト（Ｓｈ）およびスパイン（Ｓｐ）に接触（矢じり）することを示している。星状細胞の突起（Ａｓ）は通常、歯状脳回におけるＡＣｈＥ−陽性の軸索および末端の集団の近くで観察される。
【０３０４】
これらの結果は、中隔のコリン作用性の神経の再生能力におけるＮＧＦのごとき栄養／屈性の物質の重要性を指摘する。これは、内側の中隔で救済されたＮＧＦ受容体−陽性の神経のパーセンテージ、および片側に偏したＦＦ損傷およびＮＧＦ−生産のプライマリの繊維芽細胞をもつコラーゲンのマトリックスを構成する移植片の配置後の海馬状隆起の歯状脳回の再神経支配により評価される。従って、ＮＧＦ−生産のプライマリ繊維芽細胞の大脳内の移植片は、実験例ＩＩに示すようにＮＧＦ−生産の不滅化された繊維芽細胞のような軸索切断後、および側生の脳室内の外因性ＮＧＦの注入（Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986); Kromer, Science 235:214 (1987); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231 (1986)）後の、コリン作用性の中隔の神経の逆行する変性を阻止することができる。コラーゲン マトリックスにおけるNGF−生産のプライマリの繊維芽細胞で救済された細胞のパーセンテージは、しかしながら、ＮＧＦまたはＮＧＦ−生産不滅化繊維芽細胞の移植組織の脳室内への注入で達成されるそれよりも低い。これは、１）ＮＧＦ生産物の低いレベルに起因するコラーゲン マトリックス内に実際に移植された細胞の僅かな数；２）移植後のトランス遺伝子の可能な抑制方向の調節(down-regulation)による。
【０３０５】
これらの結果は、中隔の神経から新しい軸索の成長を維持する組織の他の異なるタイプのごとく、コラーゲン マトリックス内でのＮＧＦ−生産繊維芽細胞の移植片もまた、中隔の繊維の成長を維持し、その結果海馬状隆起のまばらな再神経支配が３週間で明かである、ということを示している。しかしながら、８週間までは、海馬状隆起内での軸索の密度は３週間で見られるよりも明らかに増大している。海馬状隆起に対する中隔のＡＣｈＥ−陽性の繊維の内への伸びは極わずかで、標識細胞は逆行性トレーサの配置の後で歯状脳回と同じ側の中隔の領域では発見されないので、コラーゲン内のコントロール細胞の移植は維持をほとんどまたは全く現さない。同様に、細胞をもたない抹消神経（すなわち、シュワン細胞を欠くもの）の移植片は、中隔の軸索の成長を維持できない（Hagg et al., Exp. Neurol. 112:79 (1991)）。同時に、これらのデータは、中隔の軸索が成長のための細胞および細胞外の基質からなる多くの異なる移植環境を使用することができることを示している。
【０３０６】
これらのデータはまた、プライマリの皮膚繊維芽細胞を含んでいるコラーゲン移植片は、プライマリの細胞がＮＧＦを生成するために遺伝学的に修飾されているか否かにかかわらず、基底ラミナ、星状細胞およびシュワン細胞をもつ毛細血管の同様の内への伸びを促すことを示している。その上、移植片の両タイプの細胞外のマトリックスは類似するので、ラミニンの免疫染色のパターンおよびコラーゲンの分配が比較される。ＮＧＦ−生産移植片とコントロール移植片との間の実際の相違は、ＡＣｈＥのための強い染色とＮＧＦ−生産移植片内の無髄軸索の発生量にある。先づ第１に、著しいＡＣｈＥ反応性がＮＧＦ−生産移植片で明かである。コントロール移植片は通常ＡＣｈＥ染色を欠いている。しかしながら、移植片の両タイプは、シュワン細胞およびそれらの突起内に伸長する軸索と同様に、ＴＨ−免疫反応繊維のまばらな個体群を備えている。これらの神経膠のエレメントで結合された最多数の軸索は、ＴＨ−陽性の交感神経の内への伸びを示す。第２に、ＮＧＦ−生産移植片は、星状細胞の突起で覆われ、毛細血管を通過し、またはコラーゲンのルーズな配列内に広がる多数の軸索を有する。これに対して、コントロール移植片は、細胞外の環境において軸索の非常の小さな個体群を有するのみである。これらの収集データから、不安定にされた中隔の神経から発生するＮＧＦ−感応の軸索は、ＮＧＦの効用と、新しい成長のための許容すべき移植環境を必要とする。インビボでＮＧＦを生産する遺伝学的に修飾された細胞の移植片を使用することにより、再配列している中隔の軸索がここで種々の異なる基質上に、その存在においてのみ成長することを示した。ＮＧＦのレベルを高めることなしに、軸索は、たとえ同じ細胞および細胞外基質が役立つとしても、コラーゲンおよびコントロール非感染繊維芽細胞からなる移植片に応答して再生しない。
【０３０７】
軸索切断および移植にともなうラットにおける中隔のコリン作用性の神経の再配列の能力を実験する以前の研究は、ある橋絡する環境をもつ輸入路遮断された海馬状隆起の「再神経支配」に関したものであった（Hagg et al., Exp. Neurol. 112:79 (1991)）。しかしながら、今までの研究は、海馬状隆起内のＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索がシナプス後部の標的を実際に神経支配する直接の形態学的証拠を提供しなかった。本実験例で提供された超微細構造のデータは、ＡＣｈＥの活性のために染色された軸索が、ＦＦ損傷およびＮＧＦ−生産繊維芽細胞の移植後８週間、輸入路遮断された脳回内に著しく分配されることを示している。これらの軸索はたびたび２またはそれ以上の集団において認められる。ＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索の超微細構造の組織は、ＮＧＦ受容体により免疫組織化学的に染色された中隔の軸索もまた正常なラットの歯状脳回内で小さな集合体を形成するという最近の観察に類似する（Kawaja and Gage, J. Comp. Neurol. 307:517 (1991)）。これに加えて、これらの新しく形成されたＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索は、輸入路遮断された歯状脳回において樹状突起のシャフトおよびスパインと接触するシナプスを形成する末端を生じさせる。中隔のコリン作用性の軸索と顆粒の樹状突起のプロフィルの間のシナプス接触物のパターンは、ラットの歯状脳回で正常に発見されるものと比較される。コリン作用性の軸索と顆粒の神経との間の軸索切断の接触物はまれである（Shute and Lewis, Zellforsch. Mikrosk. 69:334 (1966); and Clarke, Brain Res. 360:349 (1985)）。胎生の中隔の移植片がFF切除後成体ラットの歯状脳回内に移植される場合には、移植片からのコリン作用性の軸索は顆粒の神経の全組織を正常よりより高い頻度で刺激することは、価値のある言及である（Clarke et al., Brain Res. 369:151 (1986)）。さらに、樹状突起のプロフィルと接触している移植−誘導のコリン作用性の軸索の数は劇的に低減する（Ｉｄ）。これらのデータから、輸入路遮断された歯状脳回内の胎生中隔の移植片からのコリン作用性の軸索は顆粒の神経をもつユニークなシナプスの配列を形成する一方、コラーゲンおよび繊維芽細胞のＮＧＦ−高移植片(NGF−rich grafts)を横切って再生する軸索は、歯状脳回内で正常なシナプスの組織化を繰り返す（すなわち、ＡＣｈＥ−陽性の中隔の軸索は樹状突起のシャフトおよびスパイン上で優先的に終結する）。
【０３０８】
この実験例に提示された結果は、コラーゲンのマトリツクスにおけるＮＧＦ−生産コリン作用性の神経がラットの内側の中隔の損傷されたコリン作用性の神経を維持し、これらの神経から発生するＮＧＦ−感応性の軸索を再成することのために誘導された環境を提供し、そして中隔の軸索による歯状脳回の輸入路遮断された顆粒の神経の再神経支配に影響を及ぼす、ことを指摘する。特に、これらの移植片は軸索の伸長およびシナプスの接触性を促す。ＮＧＦ−感応性の軸索を再成するためには、ＮＧＦ−生産プライマリ繊維芽細胞およびコラーゲンからなる移植片内での成長のために、細胞およびマトリックスの両基質が使用される。ＮＧＦのレベルを高めることなしには（すなわち、コントロール繊維芽細胞／コラーゲンの移植片を使用すること）、伝導基質の存在にもかかわらず、中隔の神経のより高い割合が変性を被り、そして軸索は成長するのに失敗する。
【０３０９】
ＮＧＦに加えて、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、ＮＴ−４、および繊毛状の栄養ファクター（ＣＮＴＦ）のごとき他の神経栄養のファクターが、軸索切断された神経を維持するために、またＣＮＳにおける他の神経の個体群の軸索の再成長を増進するために使用される。
【０３１０】
上記したようなこの発明の改良および変形は、この発明の精神およびその範囲を逸脱することなくなされることは明かである。詳述された特定の具体例は、実施例として与えられたものにすぎず、この発明は、特許請求の範囲の文言にのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】標的細胞においての新しい機能の作用を概説しかつ分析するための様式を模式的に示した図である。
【図２】遺伝子操作されたドナー細胞を用いてＣＮＳ内の標的細胞に新しい機能を導入するための手法を示した概略図である。
【図３】トランス遺伝子を含む遺伝性のレトロウイルスベクターの合成を説明するための概略図である。（ＧＡＧ＝特異的抗原基；ＥＮＶ＝エンベロープ；ＰＯＬ＝逆転写酵素（reverse transcriptase））
【図４】実験例Ｉに記載されているような完全なベクターＬＳΔＰΔＬＭ及びｐＬＮＨＩ2 の線形の制限酵素マップを示した概略図である。（矢印は、プロモーターの位置と、転写の方向を示している。ＬＳΔＰΔＬＭの斜線を施したボックスは、インビトロで突然変異を起こすことによって組み入れられた新規な末端ヘキサペプチドを有するプロテインをコードしているヒトのＨＰＲＴ ｃＤＮＡを現している。ＬＴＲ＝長末端反復配列）
【図５】実験例Ｉに記載されているようなベクターｐＬＮＨＬ2 の環状の制限酵素マップを示す図である。
【図６】（ａ）〜（ｆ）は実験例Ｉに説明されているように、ラットの基底ガングリア（rat basal ganglia）内に移植されたホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いて前もって感染させたプライマリーラットの繊維芽細胞の顕微鏡写真である。（図６（ａ），（ｄ）＝抗−フィブロネクチン（anti-fibronectin）；図６（ｂ），（ｅ）＝クレシールバイオレット（cresyl violet）；図６（ｃ），（ｆ）＝ＧＦＡＰ； 倍率：図６（ａ）〜（ｃ）＝８８Ｘ；（ｄ）〜（ｆ）＝４４０Ｘ）
【図７】実験例Ｉに説明されているように、基底ガングリアからの脳抽出物のＨＰＲＴ酵素活性に対して行われた等電点に焦点を合わせた時のゲルの写真である。
【図８】実験例ＩＩにおいて説明されているようなベクターｐＬＬＲＮＬの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図９】実験例ＩＩにおいて説明されているようなベクターｐＰＲｌの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図１０】実験例ＩＩにおいて説明されているようなベクターｐＵＣＲＨの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図１１】実験例ＩＩにおいて示されているように、ウイルス性の５’長末端反復配列（ＬＴＲ）のコントロールのもとにおかれている、マウスの神経成長因子（ＮＧＦ）ｃＤＮＡの７７７塩基対Ｈｇａｌ−Ｐｓｔｌフラグメントを含有する完全なＮＧＦレトロウイルスベクターＰＬＮ．８ＲＮＬの直線状の制限酵素マップを示す図である。（矢印は、転写の開始部位を示している。；ｐｓｉ（Ψ）＝レトロウイルス性のパッケージされているシグナル；ＲＳＶ＝ルース サルコーマウイルスのプロモーター(Rous sarcoma virus promoter)；ｎｅｏR ＝ネオマイシン−耐性遺伝子のマーカー）
【図１２】図１１及び実験例ＩＩに示したようなベクターｐＬＮ．８ＲＮＬの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図１３】実験例ＩＩにおいて説明されているようなフィブロネクチン及びＣｈＡＴに対して、免疫組織化学的な染色を行った場合の顕微鏡写真である。（図１３（ａ），（ｂ）＝卵管のフィンブリエの円蓋腔（the fimbria fornix cavity）； 図１３（ｃ）〜（ｆ）＝ＣｈＡＴに対して染色が行われている組織の内側の隔膜（medial septum）を通して採取した頭頂部分(coronal section)； 図１３図１３（ａ），（ｃ），（ｅ）＝レトロウイルス−感染した細胞を移植された動物； 図１３（ｂ），（ｄ），（ｆ）＝コントロールの細胞を移植された動物； 倍率（Ｍａｇ．）：図１３（ａ）及び（ｂ）＝２０Ｘ； 図１３（ｃ）及び（ｄ）＝７０Ｘ； 図１３（ｅ）及び（ｆ）＝２２０Ｘ）
【図１４】実験例ＩＩにおいて説明したように、ラットの隔膜内にあるＣｈＡＴ−免疫反応性の細胞の生存を、ＮＧＦの存在する場合及び存在しない場合について調べた場合の結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例ＩＩにおいて説明したアセチルコリンエステラーゼの組織化学を示す顕微鏡写真である。（図１５（ａ）＝ＮＧＦ−感染されたドナー細胞を移植された動物の低倍率のもの； 図１５（ｃ）＝内側の隔膜を通した場合の（ａ）の高倍率のもの； 図１５（ｅ）＝背側で側方の象限を通して（ａ）を高倍率にしたもの； 図１５（ｂ），（ｄ），（ｆ）＝コントロールの細胞を移植された動物で、図１５（ａ），（ｃ），（ｅ）に対して記載したのと同じ条件で行われたもの； 倍率（Ｍａｇ．）：図１５（ａ），（ｂ）＝２０Ｘ； 図１５（ｃ）〜（ｆ）＝２２０Ｘ）
【図１６】実験例ＩＩＩに記載されているように、ｐＬＴｈＲＮＬレトロウイルス性の完全なベクターの線形状の制限酵素マップを示す概略図である。（矢印は、プロモーターの位置と転写の方向を示している。； ＬＴＲ＝長末端反復配列； ＲＳＶ＝修飾されたＲＳＶプロモーター； ｎｅｏR ＝ネオマイシン−抵抗性の遺伝子）
【図１７】図１６に示され、かつ実験例ＩＩにおいて説明されているように、ベクターｐＬＴｈＲＮＬの誘導を説明するための図である。
【図１８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＩＩにおいて説明されているとおり、フィブロネクチン免疫活性を示す尾形への繊維芽細胞移植を示す顕微鏡写真である。（倍率：図１８（ａ），（ｃ）＝１０Ｘ； 図１８（ｂ），（ｄ）＝２０Ｘ）
【図１９】実験例ＩＩＩ に説明されているとおり、４群の実験動物のグループについて、基準点から次の移植までのローテーションの回数を調べた場合の平均的な変化の割合を示すグラフである。（図面の上部：尾の線条体においてコントロールによる移植及びＴＨ−感染物についての移植による置き換え；下部：吻側の線条体においてコントロールによる移植及びＴＨ−感染物についての移植による置き換え；横軸は標準偏差）
【図２０】実験例ＩＶにおける記載に従って、プライマリースキン（primaryskin）の繊維芽細胞及びラット−１の繊維芽細胞の成長曲線を示したグラフである。
【図２１】実験例ＩＶにおいて記載されているように、移植するに先立ち培地において一回あるいは４回の継代接種を行った後、経過を観察しつつ３週間から８週間生存させた後の自己の繊維芽細胞の容量（ｍｍ3）を示すヒストグラムである。
【図２２】実験例ＩＶに記載されているように、１μｌあたり１０4個、２．５×１０4個、及び１０5個の細胞を移植して得られた自己の繊維芽細胞移植片の容量（ｍｍ3）を示すヒストグラムである。
【図２３】（ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＶで説明したとおり、移植後、３週間（図２３（ａ），（ｃ））及び８週間（図２３（ｂ），（ｄ））たった時点で繊維芽細胞を免疫組織化学的に染色し、得られた線条体プライマリー繊維芽細胞の移植片（Ｇ）を示す写真である。（倍率：図２３（ａ），（ｂ）＝１２Ｘ； 図２３（ｃ），（ｄ）＝１２０Ｘ）
【図２４】（ａ）〜（ｆ）は、実験例ＩＶにおいて説明されているように、移植後、３週間（図２４（ａ），（ｃ），（ｅ））及び８週間（図２４（ｂ），（ｄ），（ｆ））たった時点で、クレシルバイオレット（図２４（ａ），（ｂ））で染色した線条体内のプライマリー繊維芽細胞の写真、及び同時点で、ＧＦＡＰについて（図２４（ｃ），（ｄ））、及びＯＸ−４２（図２４（ｅ），（ｆ））について免疫学的に染色した線条体内のプライマリー繊維芽細胞の写真、繊維芽細胞を免疫組織化学的に染色し、得られた線条体プライマリー繊維芽細胞の移植片（Ｇ）を示す写真である。（倍率＝１２０Ｘ）
【図２５】（ａ）〜（ｃ）は、実験例ＩＶにおいて説明したように、移植（Ｆ＝繊維芽細胞自体； 固形点＝繊維芽細胞の存在部分である。）した後８週間で自己移植の超構造（ultrastructure）を示す写真である。（倍率：図２５（ａ）＝６，６００Ｘ； 図２５（ｂ）＝９，１００Ｘ； 図２５（ｃ）＝１６，６００Ｘ）
【図２６】（ａ），（ｂ）は、実験例ＩＶに記載されているように、移植片に存在する星状細胞の存在部分及び食細胞を示す写真である。（倍率：図２６（ａ）＝１６，６００Ｘ； 図２６（ｂ）＝１５，０００Ｘ）
【図２７】（ａ），（ｄ）は、実験例ＩＶにおいて記載したように、移植血管を示す写真である。（図２７（ａ）、Ｅ＝窓のない内皮細胞（fenestrated endothelial cells））； 図２７（ｂ）、矢じり部＝嵌入部分； 図２７（ｃ）、矢印＝細胞内部への注入； 図２７（ｄ）、Ａｓ＝星状細胞の存在部分； 倍率：図２７（ａ）＝１３，２００Ｘ； 図２７（ｂ）＝２５，４００Ｘ； 図２７（ｃ）＝２５，０００Ｘ； 図２７（ｄ）＝１６，６００Ｘ）
【図２８】実験例Ｖにおいて説明したように、ＴＨトランス遺伝子を含有するプライマリー繊維芽細胞のチロシンヒドロキシラーゼに対して、インビトロでラベリングした結果を示す写真である。（倍率＝２５Ｘ）
【図２９】実験例Ｖにおいて説明されているように、アポモルフィンが導入された６−ＯＨＤＡ−障害を与えられたラット（6-OHDA-lesioned rats）での転回行動に対しての移植の結果を示すグラフである。
【図３０】（ａ）〜（ｂ）は、実験例Ｖにおいて説明したように、ラットの線条体に移植されたＴＨプライマリー繊維芽細胞に、インシトゥでハイブリダイゼーションした結果を示す顕微鏡写真である。（図３０（ａ）は、ＦＦ２／ＴＨ細胞の移植片； 図３０（ｂ）は、ＦＦ２／βＧａｌ細胞（コントロール）の移植片； Ｇ＝移植片； Ｖ＝脳室）
【図３１】（ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｖに記載されたとおり、βＧａｌ組織化学的にあるいはＴＨｍＲＮＡにインシトゥでハイブリダイゼーションのいずれかに対して、移植された細胞をインビボでラベリングした結果を示す写真である。（図３１（ａ）は、βＧａｌを組織化学的に染色したＦＦ２／βＧａｌの移植片； 図３１（ｂ）は、ＦＦ２／Ｇａｌ移植片の高倍率としたもの； 図３１（ｃ）は、ＦＦ２／ＴＨ移植でのＴＨ ｍＲＮＡに対するインシトゥでのハイブリダイゼーション、矢印＝繊維芽細胞； 図３１（ｄ）は、ＦＦ２／βＧａｌ移植でのＴＨ ｍＲＮＡに対するインシトゥでのハイブリダイゼーション； 倍率：（ａ）＝１０Ｘ、（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）＝４０Ｘ）
【図３２】（ａ），（ｂ）は、実験例Ｖにおいて示されているように、インビボにおけるＦＦ２／ＴＨ繊維芽細胞のＴＨ−免疫活性を示す写真である。（アストリスク＝ロダミン蛍光色素； 倍率＝２０Ｘ）
【図３３】実験例ＶＩに示され、かつ説明されているように、遺伝子及び細胞タイプから得られるヒトのＮＧＦの分泌を図示したグラフである。
【図３４】実験例ＶＩＩに示されているように、ｐＬＣｈＲＮＬベクターの模式図である。
【図３５】実験例ＶＩＩにおいて記載されているように、免疫染色された繊維芽細胞の写真である。
【図３６】（ａ），（ｃ）は、実験例ＶＩＩにおける記載に従うもので、次の結果を示している。：図３６（ａ）は、繊維芽細胞から得られた全ＲＮＡのノーザンブロット分析； 図３６（ｂ）は、繊維芽細胞におけるＣｈＡＴ活性の分析であり、図３６（ｃ）は繊維芽細胞によって培地に分泌されたＡＣｈの分析である。
【図３７】（ａ）〜（ｂ）は、ＨＰＬＣによって測定されているように、また、実験例ＶＩＩに記載されているように、ラット−１／ｄＣｈＡＴの培養物にコリンクロライドを添加した結果を図示したグラフである。（図３７（ａ）＝細胞内のＡＣｈ及び細胞外のＡＣｈにおける効果； 図３７（ｂ）＝ＣｈＡＴ活性についての効果）
【図３８】（ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにて説明したように、ＣｈＡＴ活性（図３８（ａ））； 定常レベルのｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ（図３８（ｂ））；及びｄＣｈＡＴ／シクロフィリン（ｃｙｃ．） ｍＲＮＡの比（図３８（ｃ））についての効果によって解るように、ｄＣｈＡＴの発現において血清を除去することによって導かれる静止期の状態を結果的に示している。
【図３９】（ａ）〜（ｃ）は、実験例ＶＩＩにて説明したように、ＣｈＡＴ活性（図３９（ａ））； ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡのレベル（図３９（ｂ））； 及びｄＣｈＡＴ／シクロフィリン（ｃｙｃ．）の比（図３９（ｃ））についての効果によって解るように、ｄＣｈＡＴの発現において阻害剤を接触されることによって導かれる静止期の状態を結果的に示している。
【図４０】実験例ＶＩＩにおいて記載されているように、融合性の繊維芽細胞から得られるＡＣｈの遊離におけるコリンの効果を示す棒グラフである。
【図４１】実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているように、ベクターｐＳＶＳ３２ＡＣＡＴの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図４２】実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているように、ベクターｐＭＬＶＣＡＴの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図４３】実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているように、ベクターｐＣＭＶＣＡＴの環状の制限酵素マップを示す図である。
【図４４】実験例ＶＩＩＩにおいて説明されているように、ＳＶ ４０、ＬＴＲ及びコラーゲンプロモーター（Ｃｏｌ１及びＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサー）の相対的なＣＡＴ発現を示す棒状グラフである。
【図４５】（ａ）〜（ｂ）は、実験例ＩＸにおいて説明されているように、ｄＣｈＡＴ−発現性の繊維芽細胞におけるＴＧＦβ、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの効果を示すノーザンブロットの写真である。（図４５（ａ）は、ＴＧＦ−β（レーン２）及びＩＬ−１β（レーン３）の効果を示す。図４５（ｂ）は、Ｉｎｆγの効果を示している。レーン１＝コントロール； シクロフィリン（Ｃｙｃ）＝実質的なコントロール； レーン２＝２４時間後の効果； レーン３＝４８時間後の効果； ｄＣｈＡＴ＝ｄＣｈＡＴプロウイルス性（proviral）のｍＲＮＡを示している。）
【図４６】実験例ＩＸにおいて説明されているように、融合性のｄＣｈＡＴ−生産性の繊維芽細胞におけるＴＧＦγ及びＩＬ−１βの複合投与、更にデキサメタゾンを加えた複合投与の効果を示すノーザンブロットの写真である。（レーン１＝コントロール； レーン２＝ＴＧＦ−β／ＩＬ−１β； レーン３＝デキサメタゾンのみの投与； レーン４＝ＴＧＦβ／ＩＬ−１β及びデキサメタゾン；強いシグナル＝ｄＣｈＡＴ ｍＲＮＡ； 弱いシグナル＝シクロフィリン ｍＲＮＡ）
【図４７】（ａ）〜（ｂ）は、実験例ＩＸに記載されているように、２％の血清に対して１０％含まれているコラーゲンプロモーターについての活性と、コラーゲンプロモーター上の種々のサイトカインの効果について示している棒状グラフである。
【図４８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例ＩＸにおいて記載されているように、成体のフィッシャーラット（Fischer rats）の線条体に移植されたＬＴＲ−ＣＡＴ（図４８（ａ），図４８（ｂ））細胞、あるいはＣｏｌｌ（Ｅ）−ＣＡＴ（図４８（ｃ），図４８（ｄ））細胞の移植片を示す顕微鏡写真である。（白い矢印＝繊維芽細胞）
【図４９】（ａ）〜（ｄ）は、実験例Ｘにおいて記載されているように、移植（右の線条体に注入されて遺伝子的に修飾された細胞、及び左の線条体に注入された感染されていないコントロール）した後、１週間（図４９（ａ），図４９（ｂ））及び８週間（図４９（ｃ），図４９（ｄ））たった時点で、左と右の線条体を通過して水平に断面した状態を示す顕微鏡写真である。（Ｇ＝移植片； ＮＧ＝メイネルト（Meynert）の核の基底（nucleus basalis）； ＲＴ＝細網の視床核（reticular thalamic nucleus）； スケールバー：図４９（ａ），（ｂ）は０．４５ｍｍ； 図４９（ｃ），（ｄ）は、０．２２ｍｍ）
【図５０】実験例Ｘに記載されているように、移植後、８週間のＮＧＦ−生産細胞が結合された移植片の電子顕微鏡写真である。（Ｆ＝繊維芽細胞； Ｅ＝内皮細胞； 矢印＝星状細胞の存在部分； スケールバー＝１．０μｍ）
【図５１】実験例Ｘにおいて記載されているように、８週間たった時点でのＮＧＦ−生産細胞の移植片内での軸索−膠の配列（axo-glial arrangement）を顕微鏡で見た写真及びその模式図である。（Ａｘ＝髄鞘のない軸索； Ａｓ＝反応性の星状細胞の存在部分； 矢じり＝基底層（basal lamina）； スケールバー＝１．０μｍ）
【図５２】（ｈ）は、実験例Ｘにおいて記載されているように、片側のフィンブリエ−円蓋（ＦＦ）を剥離し、ＮＧＦ−生産性あるいはコントロールである非−感染のプライマリー繊維芽細胞のいずれかを用いてコラーゲンを構成する移植片の置き換えを行った後の成体ラットの前頭の矢状縫合部を概略的に示した図であり、（ａ）〜（ｇ）は、その該当部分の写真である。（ＭＳ＝培地の隔膜、Ｇ＝移植片、及びＤＧ＝海馬の有歯の脳回、図５２（ａ），（ｂ）＝片側のＦＦの吸引障害（unilateral FF aspirative lesion））と、ＮＧＦ−生産（図５２（ａ））あるいはコントロール（図５２（ｂ））の移植片（矢じりは、中隔の中心線）のいずれかの置き換えを行った後に、ＮＧＦレセプターに対して免疫組織化学的に染色された中隔を通して比較することのできるレベルで見た頭頂部分、；図５２（ｃ），（ｄ）＝ＡＣｈＥで染色されたＮＧＦ−生産性あるいはコントロールである非感染（図５２（ｄ））の繊維芽細胞のいずれかの移植片を通して見た頭頂部分（点線は、移植のほぼ境界線を示しており、スケールバーは、図５２（ｂ），（ｃ）では１００μｍ； 図５２（ｄ）のスケールバーは２００μｍ）； 図５２（ｅ），（ｆ），（ｇ））＝ＡＣｈＥで染色された海馬の有歯の脳回を通して見た場合の頭頂部分（Ｇ＝顆粒層；， ＩＭ＝内側の分子層； ＯＭ＝外側の分子層、及びＰ＝ポリモルフォリン層）
【図５３】（ａ）〜（ｄ）は実験例Ｘに記載されているように、衰退してゆく蛍光で中隔神経がラベルされ、続いてＮＧＦ−生産性の移植片を受け入れた動物に手術を行った後の有歯の脳回内の蛍光ミクロスフェア（fluorescent microspheres）の定位置に配されることを示す顕微鏡写真である。（図５３（ａ）＝同じ側の中心部分の隔膜； 図５３（ｂ）＝反対側の斜めのバンド； 図５３（ｃ）＝中隔の中心線； 及び図５３（ｄ）＝同じ側の斜めのバンド； スケールバー＝５０μｍ）
【図５４】（ａ）〜（ｆ）は、実験例Ｘに説明されているとおり、手術を行った後のコラーゲン及びＮＧＦ−生産性繊維芽細胞の移植片内にある髄鞘を有していない軸索の超構造的分散配置を示す電子顕微鏡写真である。（＊＝星状細胞の存在部分； Ｓ＝スワン細胞（Schwann cells）； Ｌ＝キャピラリーの管腔（ルーメン））
【図５５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例Ｘに説明されているように、ＦＦを剥離してコラーゲンマトリックス中にＮＧＦ−生産性の繊維芽細胞を移植した後においての有歯の脳回中におけるＡＣｈＥ活性を、局所的な分配配置として示した図（図５５（ａ））であり、またシナプスでの分配配置として示した図（図５５（ｂ）〜（ｆ））である。（図５５（ａ）＝超構造的なレベルで検出を行う組織にすぐに隣接している部分を採取し、ＡＣｈＥで染色された有歯の脳回の頭頂部分（４０μｍ）、ＩＭ＝内側の分子層、ＯＭ＝外側の分子層； Ｇ＝顆粒層； Ｐ＝ポリモルフォリン層； 図５５（ｂ）＝顆粒層； 図５５（ｃ）＝分子層；図５５（ｄ）、（ｅ），（ｆ）の矢じり＝シナプスの接触部、Ｓｈ＝樹状突起の形状； Ｓｐ＝脊髄、Ａｓ＝星状細胞の存在部分、スケールバー：図５５（ａ）＝２５μｍ； 図５５（ｂ）＝０．５μｍ、図５５（ｃ）及びそれぞれ図５５（ｄ）〜（ｆ）＝０．２５μｍ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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