(57)【要約】【課題】自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴ及びその製造方法を提供することにある。【解決手段】自己集合物質とＣＮＴとの混合物を提供する工程；及び前記混合物を前記自己集合物質がＣＮＴの上で自己集合される条件で処理して自己集合物質でＣＮＴをラッピングする工程を含む自己集合物質でラッピングされた水溶性ＣＮＴの製造方法を提供する。本発明はまた、上記方法によって製造され、自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴを提供する。【選択図】図３
2005156534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己集合物質とＣＮＴとの混合物を提供する工程；及び該混合物を該自己集合物質がＣＮＴ上に自己集合される条件で処理して自己集合物質でＣＮＴをラッピングする工程を含む、自己集合物質でラッピングされた水溶性ＣＮＴの製造方法。
【請求項２】
前記自己集合物質はＳＬＰまたはＳＬＰサブユニットであることを特徴とする、請求項
１に記載の水溶性ＣＮＴの製造方法。
【請求項３】
前記ＳＬＰは  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ，  Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ，Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ，Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ，Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍで構成された群から選択されるバクテリア由来であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＬＰはＡｃｉｄｉａｎｕｓ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ，Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ，Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ，Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｌｏｂｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｏｂｉｕｍ（ｓａｌｉｎａｒｕｍ），Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｏｌｃａｎｉｉ，Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｏｔｙｌｉｃｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｕｍ，Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ及びＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘで構成された群から選択されるアルケ由来であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＬＰはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
請求項１または請求項２の方法により製造され、自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴ。
【請求項７】
請求項６に記載の自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴに標的バイオ物質或いは有機化合物と反応するか結合するレセプターを取り付けることを特徴とするバイオセンサーの製造方法。
【請求項８】
前記レセプターは酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、コファクタ−または炭水化物であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により製作され、自己集合物質でラッピングされているＣＮＴに標的バイオ物質或いは有機化合物と反応するか結合するレセプターが取り付けられていることを特徴とするバイオセンサー。
【請求項１０】
前記レセプターは酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、コファクタ−または炭水化物であることを特徴とする、請求項９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
請求項９に記載のバイオセンサーを利用することを特徴とする、レセプターに結合するか反応する標的バイオ物質或いは有機化合物を検出する方法。
【請求項１２】
標的バイオ物質或いは有機化合物はタンパク質、核酸、酵素、抗体、炭水化物または脂質であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己集合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）物質でラッピング（ｗｒａｐｐｉｎｇ）された水溶性カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅ：ＣＮＴ）、その製造方法及び該自己集合物質でラッピングされたＣＮＴに標的バイオ物質と結合するか反応するリセプターが選択的に取り付けられているバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＮＴとは、地球上に多量に存在する炭素からなる炭素同素体であり、一つの炭素が他の炭素原子と六角形の蜂の巣柄に結合されてチューブ形状になっている物質であって、チューブの直径がナノメートル（ｎｍ＝１０億分の１メートル）水準の極めて小さな領域の物質である。ＣＮＴは、優秀な機械的特性、電気的選択性、優れた電界放出特性、高效率の水素貯蔵媒体特性などを有しながら、現存する物質の中で欠陷がほとんどない完璧な新素材として知られている。
【０００３】
ＣＮＴは、各種装置の電子放出源（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｅｍｉｔｔｅｒ），ＶＦＤ（ｖａｃｕｕｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｓｐｌａｙ），白色光源、ＦＥＤ（ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｉｓｐｌａｙ），リチウムイオン２次電池電極，水素貯蔵燃料電池，ナノワイヤ、ナノカプセル、ナノピンセットＡＦＭ／ＳＴＭチップ（ｔｉｐ）、単電子素子、ガスセンサー、医・工学用微細部品，高機能複合体等で無限な応用可能性を示している。
【０００４】
ＣＮＴは、このように力学的強固性と化学的安全性が優れ、半導体及び導体の性質を持ち合わせており、直径が短く、長さが相対的に非常に長い特性を持ち、平板表示素子、トランジスター、エネルギー貯蔵体などの素材として優れた性質を示し、ナノサイズの各種センサーへの応用性が非常に高い（非特許文献１参照）。
【０００５】
一方、ＣＮＴを生命工学分野で応用する事例が最近多く登場している。グルコースセンサー、蛋白質の検出、特定ＤＮＡ配列の検出（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）などのバイオスセンサーに対するＣＮＴの応用可能性が提示されている。ＣＮＴを基盤とした多層（ｍｕｌｔｉｌｙｅｒ）からの生物分子検索は、表面積が広くて電気伝導度にも優れていて、ＤＮＡのような生物分子が固定される量が増え、生物分子に対する検出敏感度が増大できる。
【０００６】
しかし、現在まで知られているＣＮＴ物質は全ての有機溶媒に対して不溶性を持っていて応用において多くの制限を有し（非特許文献５参照）、また分子レベルでＣＮＴの化学性質を理解することが難しかった（非特許文献６参照）。
【０００７】
最近、高分子、天然高分子、炭水化物及びペプチドを用いた共有結合、非共有結合及びミセルー技法を通じてＣＮＴの溶解性を高めるための研究が進行して来た（非特許文献７、  非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４参照）。
【０００８】
また、物理的な吸着を利用して炭水化物をＣＮＴに結合またはラッピングしてバイオセンサーとしての応用可能性を提示した（非特許文献１１、非特許文献１５参照）。しかし、このような方法はＣＮＴの表面に炭水化物が単に物理的な吸着またはファンデルワールス力（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）によって結合されていて結合力が弱いだけではなく、結合した炭水化物の配向を正確に調節し難いという大きい短所がある（非特許文献１６参照）。
【０００９】
最近、ナノバイオテクノロジー分野で優秀な自己集合性質を有するＳＬＰ（細胞表面タンパク質）に高い関心を持つようになった。ＳＬＰの最も大きい特徴はその結晶配列（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ａｒｒａｙ）構造にある。多くの他の種類のグラム陰性及びグラム陽性バクテリアまたはアルケ（Ａｒｃｈａｅ）などでもＳＬＰが発現されている（非特許文献１７参照）。ＳＬＰは１，２，４，６個のサブユニットで構成され、傾き形、四角形、六角形の対称格子構造を持っていて、各格子の距離が２．５〜３５ｎｍで一定になっている。各々のサブユニットは非共有タンパク質−タンパク質結合によって多くの多様な条件の溶液で自己集合する性質を有すると知られている（非特許文献１８、非特許文献１９参照）。しかし、一般的な条件では前記のような結晶配列構造を持つことが非常に難しくその構造も非共有タンパク質−タンパク質結合として弱いと知られている。このような配向性を持って自己集合することにおいて一部のバクテリアから由来されたＳＬＰの場合シリコン、金属、高分子などの基質の表面で自己集合する結果が報告された（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２参照）。
【００１０】
最近、本発明の発明者らは酵素反応を用いて炭水化物をＣＮＴにラッピングして、前記炭水化物でラッピングされた水溶性ＣＮＴにバイオレセプターを結合させてバイオセンサーを製作したことがある（特許文献１参照）。ＣＮＴ表面に結合される炭水化物の結合力が補強されて、炭水化物の配向などが正確に調節できる長所があるが、炭水化物のラッピング効率が少し落ちる短所がある。
【００１１】
それで、本発明者らはラッピングの効率が高い水溶性ＣＮＴを開発しようと鋭意努力した結果、精製されたＳＬＰが高い配向性を持って安定にＣＮＴの周りに自己集合を通じて高効率でラッピングされることを確認して、本発明を完成することに至った。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＫＲ０３／０２１６４
【非特許文献１】Ｄａｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＣ．Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，３５：１０３５，２００２
【非特許文献２】Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３７５：１０３−５，  ２００３
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ，Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１００：４９８４−９，  ２００３
【非特許文献４】Ｃａｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５：２８７−９３、  ２００３
【非特許文献５】Ｂｏｃｈｒａｔｈ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１９９２，１９９７
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８２：９５，１９９８
【非特許文献７】Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙ．Ｌｅｔｔ．，３４２：２６５，２００１
【非特許文献８】Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ，１２４：９０３４，２００２
【非特許文献９】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３５：８８２５，２００２
【非特許文献１０】Ｋａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ，１２５，５６５０，  ２００３
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｔ．，１２７：１３５３，２００２
【非特許文献１２】Ｓｔａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３５：７５１６，２００２
【非特許文献１３】Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２：２５，２００２
【非特許文献１４】Ｐａｎｔａｒｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：９６１，２００３
【非特許文献１５】Ｓｔａｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４１：２５０８，２００２
【非特許文献１６】Ｃｈａｍｂｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，３：８４３，２００３
【非特許文献１７】Ｐｕｍ  ａｎｄ  Ｓｌｅｙｔｅｒ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：８，１９９９
【非特許文献１８】Ｓｌｅｙｔｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２５３，  １９９９
【非特許文献１９】Ｇｙｏｒｖａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，３：３１５，２００３
【非特許文献２０】Ｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ９９：１４６４６，２００２
【非特許文献２１】Ｓｈｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８９：５８５，１９９７
【非特許文献２２】Ｋｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：１６６４，１９９７
【非特許文献２３】Ｂｒｅｉｔｗｉｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１：９１８，１９９６
【非特許文献２４】Ｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１７：８５９，２００２
【非特許文献２５】Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７５：１８７，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴ及びその製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴに多様な種類のバイオレセプターを取り付けたバイオセンサー及びその製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、前記バイオセンサーを用いて多様な種類のレセプターに結合するか、反応する多様な標的バイオ物質を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は自己集合物質とＣＮＴの混合物を提供する工程；及び前記混合物を前記自己集合物質がＣＮＴの上で自己集合される条件で処理して自己集合物質でＣＮＴをラッピングする工程を含む自己集合物質でラッピングされた水溶性ＣＮＴの製造方法を提供する。
【００１６】
本発明において、自己集合性質を有する自己集合物質はＳＬＰまたはＳＬＰサブユニットであることを特徴とすることができ、前記ＳＬＰはＡｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ，Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ，Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ，Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍで構成された群から選択されるバクテリア由来または  Ａｃｉｄｉａｎｕｓ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ，Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ，Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ，Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｌｏｂｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｏｂｉｕｍ（ｓａｌｉｎａｒｕｍ），Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｏｌｃａｎｉｉ，Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｏｔｙｌｉｃｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｕｍ，Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ及びＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘで構成された群から選択されるアルケ由来であることを特徴とすることができる。より好ましくは、前記ＳＬＰはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であることを特徴とすることができる。
【００１７】
本発明はまた、前記方法によって製造され、自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴを提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴに標的バイオ物質或いは有機化合物と反応するか結合するレセプターを取り付けることを特徴とするバイオセンサーの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記方法により製作され、自己集合物質でラッピングされているＣＮＴに標的バイオ物質或いは有機化合物と反応するか結合するレセプターが取り付けられていることを特徴とするバイオセンサー及び前記バイオセンサーを利用することを特徴とする前記レセプターに結合するか前記レセプターと反応するか結合する標的バイオ物質の検出方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、前記方法により製作され、ＳＬＰまたはＳＬＰサブユニットでラッピングされている水溶性ＣＮＴを提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記ＳＬＰまたはＳＬＰサブユニットでラッピングされている水溶性ＣＮＴに標的バイオ物質または有機化合物と反応するか、結合するレセプターを取り付けることを特徴とするバイオセンサーの製造方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記方法により製作され、ＳＬＰまたはＳＬＰサブユニットでラッピングされているＣＮＴに標的バイオ物質または有機化合物と反応するか、結合するレセプタ−が取り付けられていることを特徴とする前記バイオセンサー及び前記バイオセンサーを利用することを特徴とする前記レセプターに結合するか、前記レセプターと反応する標的バイオ物質の検出方法を提供する。
【００２３】
本発明において、標的バイオ物質または有機化合物は前記レセプターに結合するか、前記レセプターと反応して標的の役割ができる物質で、好ましくはタンパク質、核酸、抗体、酵素、炭水化物、脂質または他のバイオ分子であって、より好ましくは質病に関するタンパク質である。
【００２４】
本発明において、レセプターは酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、コファクタ−または炭水化物であることを特徴とすることができる。
【００２５】
本発明で使用される“自己集合物質”という用語は非共有結合（水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）、疎水性結合、静電気的結合等）により誘導され支持体に集合される物を包括する概念で、脂質、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他の有機物質を含む。自己集合を通じて形成された物質は一定な配向と構造を有し、また機能性を維持することを特徴とする。広く知られている自己集合としては脂質二重膜（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、ウイルス表面タンパク質（ｖｉｒｕｓ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＬＰ、ＤＮＡ、ＲＮＡ等があって、ＣＮＴ上で自己集合されて水溶性を示す有機超分子も本発明の自己集合物質として用いられる。
【００２６】
自己集合する有機超分子としては、図１で示すように、円板型又はディスク型デンドリマー１、扇形の（ｆａｎ−ｓｈａｐｅｄ）有機超分子２、棒状鎖型又は円錐型の分子５などがある。扇形の有機超分子の一例としては下記の化学式１の化合物を、円板型有機超分子の一例としては、下記の化学式２の化合物を、また円錐型有機超分子の一例としては下記の化学式３の化合物がそれぞれ挙げられる。
【００２７】
【化１】
2005156534.tif 000003
【００２８】
【化２】
2005156534.tif 000004
【００２９】
【化３】
2005156534.tif 000005
【化４】
2005156534.tif 000006
【００３０】
このような有機超分子は単量体が共有結合で連結された高分子とは異なり、ファンデルワールス力のような物理的な２次結合によって一定の構造を形成する。かかる有機超分子は適正な温度や濃度、外部磁場、電場などによって自己集合を行って特定の微細構造を形成する。扇形の分子が自己集合によって板状構造１を形成し、この板状構造が集まって円柱形態３を作り、更に円柱が六角形に配列された３次元構造４を形成する（図１ａ）。そのほかに円錐型の有機超分子５の場合は、円錐型が自己集合して球型６になし、球が集まって３次元の空間上に一定の構造７で配列される（図１ｂ）。
【００３１】
本発明で使用されている“ラッピング”という用語は前記自己集合物質がＣＮＴ上に自己集合され、非共有結合によってＣＮＴの表面を囲むことを総称することと定義される。
【００３２】
本発明で使用される“バイオセンサー”という用語はバイオ物質と反応するか結合するレセプターが自己集合物質でラッピングされているＣＮＴに結合されていることを包括する概念で前記自己集合物質でラッピングされているＣＮＴに結合されているバイオチップを含むものと定義される。
【００３３】
また、本発明で使用される“バイオ物質”という用語は核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸，酵素基質、リガンド、コファクター、炭水化物、脂質、オリゴヌクレオチド、  ＲＮＡなどの生体から有来の物質を総称するものと定義される。
上記課題を解決するために、本発明は以下を提供する。
（項目１）自己集合物質とＣＮＴとの混合物を提供する工程；及び該混合物を該自己集合物質がＣＮＴ上に自己集合される条件で処理して自己集合物質でＣＮＴをラッピングする工程を含む、自己集合物質でラッピングされた水溶性ＣＮＴの製造方法。
（項目２）上記自己集合物質はＳＬＰまたはＳＬＰサブユニットであることを特徴とする、項目１に記載の水溶性ＣＮＴの製造方法。
（項目３）上記ＳＬＰは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ，  Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ，Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ，Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｕｎｃｉｎａｔｕｍ，Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｖｕｉ，Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍで構成された群から選択されるバクテリア由来であることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（項目４）上記ＳＬＰはＡｃｉｄｉａｎｕｓ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ，Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ，Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ，Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｌｏｂｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｏｂｉｕｍ（ｓａｌｉｎａｒｕｍ），Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｏｌｃａｎｉｉ，Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｏｔｙｌｉｃｕｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎｕｓ  ｌｉｍｉｃｏｌａ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｕｍ，Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ及びＴｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘで構成された群から選択されるアルケ由来であることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（項目５）上記ＳＬＰはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（項目６）項目１または項目２の方法により製造され、自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴ。
（項目７）項目６に記載の自己集合物質でラッピングされている水溶性ＣＮＴに標的バイオ物質或いは有機化合物と反応するか結合するレセプターを取り付けることを特徴とするバイオセンサーの製造方法。
（項目８）上記レセプターは酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、コファクタ−または炭水化物であることを特徴とする、項目７に記載の方法。
（項目９）項目７に記載の方法により製作され、自己集合物質でラッピングされているＣＮＴに標的バイオ物質或いは有機化合物と反応するか結合するレセプターが取り付けられていることを特徴とするバイオセンサー。
（項目１０）上記レセプターは酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、コファクタ−または炭水化物であることを特徴とする、項目９に記載のバイオセンサー。
（項目１１）項目９に記載のバイオセンサーを利用することを特徴とする、レセプターに結合するか反応する標的バイオ物質或いは有機化合物を検出する方法。
（項目１２）標的バイオ物質或いは有機化合物はタンパク質、核酸、酵素、抗体、炭水化物または脂質であることを特徴とする、項目１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は自己集合物質でラッピングされた水溶性ＣＮＴ及びその製造方法を提供する効果がある。本発明による、自己集合物質でラッピングされたＣＮＴは水溶性を示し、一般のＣＮＴと比較して非常に優れた応用性を有する。
【００３５】
特に、前記自己集合物質でラッピングされた水溶性ＣＮＴに多様なレセプターを取り付けたバイオセンサーの製作が可能であり、これを利用して前記レセプターに結合するか、反応する標的バイオ物質或いは有機化合物を簡単に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００３７】
本発明の好ましい例により、精製されたＳＬＰを使用してクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中に懸濁されたＣＮＴに添加して自己集合反応を行ってＳＬＰでラッピングされたＣＮＴを製造した（図３）。この反応産物をＡＦＭイメージを通じて確認した（図４、図５）。
【００３８】
微生物から精製されたＳＬＰは疎水性を有している多様な基質上に自己集合しやすい性質を有している。このような性質を用いてＳＬＰでラッピングされている水溶性ＣＮＴが製造できる。
【００３９】
前記製造されたＳＬＰでラッピングされたＣＮＴに標的バイオ物質と反応するか結合するレセプターを取り付ける方法は従来の方法が利用できる。例えば、基質表面に自己集合されたＳＬＰをグルタルアルデヒドを利用して架橋させる方法（非特許文献２３、  非特許文献１９参照）、またはＳＬＰのＮ末端にストレプトアビジンを融合させて発現した後、自己集合反応を誘導してバイオチンーアビジン結合を検査する方法（非特許文献２０参照）などが利用できる。
【００４０】
本発明のバイオセンサーを用いてレセプターに結合するか、又は反応する標的バイオ物質を検出する方法は従来知られている様々な方法が使用できる。バイオセンサーの電気的特性を測定するプローブステーション及び、バイオセンサーから発生される蛍光物質を検出する蛍光顕微鏡を用いて、反応結果を測定することができる。また、反応物に放射線同位元素を取り付けて反応させた後、一定の面で計測器を用いて放射線を測定する既存の方法を利用することもできる（非特許文献２４参照）。
【００４１】
電気的性質を用いて液相中で測定できる方法として酸化還元反応と電荷の蓄積量を用いる方法が利用できる。酸化還元反応は現在普遍化された電気化学的検出法であって、サイクリックボタメトリー（ｃｙｃｌｉｃ  ｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）、ポテンショメトリー（ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｙ）、及びアンペロメトリー（ａｍｐｅｒｍｅｔｒｙ）などの利用して水素または電子の変化が測定できる。
【００４２】
また、液相中で底の基板に荷電されたイオンの電荷量を測定する方法としてはチップを形成する上層基版に電極を形成し、上層基版の電極が帯電される程度を測定してＣＮＴに形成されたイオンの濃度を測定することができる。ここで、電解質と電流の関係は、“電解質水溶液の濃度∝電流の強さ”である。即ち、ＣＮＴ表面に生じた反応物のイオン濃度による電解質の濃度分布が電流の強さに比例するので、底の基板で形成されたイオンの濃度を測定することができる。
【００４３】
以下、本発明をより具体的に説明するために、実施例を用いて説明する。しかし、本発明による実施例はいろんな他の形態で変形でき、本発明の範囲は下記のような実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は当業者に本発明をより安全に説明するために供されるものである。
【００４４】
特に、下記実施例では自己集合物質としてＳＬＰだけを例示したが、ＣＮＴ上で自己集合されて水溶性を示すものなら、制限なく使用することができる。また、このような自己集合物質を混合して使用することも可能し、これら全てが本発明の範囲に属する。
【００４５】
また、下記実施例ではＳＬＰでラッピングされた水溶性ＣＮＴだけを例示したが、前記ＳＬＰでラッピングされた水溶性ＣＮＴ上のＳＬＰに酵素基質、リガンド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＰＮＡ，脂質、コファクタ−、炭水化物などのレセプターを固定してバイオセンサーを製作し、これを利用して前記レセプターに結合するか、反応する標的バイオ物質または有機化合物を容易に検出することは当業者に自明なことである。
【００４６】
実施例１：ＳＬＰの製造
【００４７】
まず、ナノ自己集合できるＳＬＰを効率的に生産することができる新しい菌株を探すために、多様な菌株（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ，Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓなど）からＳＬＰの生産可否を確認した。様々な菌株を選択して培養した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、ＳＬＰの生産効率が一番いい菌株は高温で培養可能なＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓであった。
【００４８】
ＳＬＰの大量生産のためＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＫＴＣＴ２１０７）を高濃度で培養した。前記菌株は超高熱性グラム陽性バクテリアで、適当な培養温度が非常に高く、このような超高熱性の菌株を高濃度で培養した例はない。高濃度培養はＲ／２倍地を利用して５５℃で行った。５００ｇ／Ｌのグルコース、５０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの組成を持った培地溶液をＤＯ−ｓｔａｔ方式で供給するが、グルコースによるカタボリック阻害と細胞分解を防ぐため、供給時のグルコース濃度が１ｇ／Ｌを超えないように調節した。６５時間培養後、細胞濃度は１０ｇ／Ｌであった。このような結果は今まで培養した中で最も高い濃度の高熱性細菌である。この時、ＳＬＰの生産程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析して、全体タンパク質の３０％以上の効率で生産されたことを確認した。
【００４９】
ＳＬＰを分離するため、まずフレンチプレス（ＡＰＶシステム、イギリス）を用いて細胞を完全に破砕した後、０．５％トリトンＸ−１００で１時間前処理した。前処理された物を５ＭのＧｕＨＣｌで溶かし、４℃で２時間ＳＬＰを抽出した後、遠心分離（４０，０００ｇ）で細胞外膜を取り除いた。最後に上澄液を透析して純粋なＳＬＰを効率的に分離した。
【００５０】
分離されたＳＬＰ含有溶液を６４μＬずつ取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル溶液（２５％グリセロール、２％ＳＤＳ，１４．４ｍＭ２−メルカプトエタンオール及び０．１％ブロモフェノールブルーを含む６０ｍＭトリス−ＨＣＬ）１６μＬと混合して１０分間沸かした後、１２％分離用ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルは染色溶液（メタノール４０％、酢酸１０％及びｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅＲ  ０．２５ｇ／Ｌ）で２時間以上浸漬して染色し、また脱色溶液（メタノール４０％及び酢酸７％）に２時間以上ずつ２回浸漬して脱色した。
【００５１】
図２で、レーンＭは標準タンパク質分子量を表し、レーン１とレーン２は前記過程を通じて精製されたＳＬＰを現す。図２で示すように、ＳＬＰは非常に効率的に分離・精製された。
【００５２】
実施例２：ＳＬＰでラッピングされたＣＮＴの製造
【００５３】
本発明で使用されたＣＮＴはＣａｒｂｏＬｅｘ  Ｉｎｃ．からＣＮＴを入手して分離・精製してから使用した（非特許文献２５参照）。実施例１で精製されたＳＬＰを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に先に懸濁させたＣＮＴ（１００μｇ）と混合し、ＳＬＰの最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように混合した後、常温で１０時間放置して自己集合反応を誘導した（図３）。ＳＬＰは疎水性を有するＣＮＴ上に自己集合する性質を持っていて、特別な条件を加えなくてもＳＬＰでラッピングされている水溶性ＣＮＴをよく製造することができる。
【００５４】
反応が終わった後ＳＬＰ−ＣＮＴ反応産物を６，０００ｒｐｍで５分間蒸留水で３回洗浄して、２０μＬのＳＬＰ−ＣＮＴ反応産物をシリコンウェハーの滴下した後、このウェハーを真空がかかっている３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。
【００５５】
実施例３：ＳＬＰでラッピングされたＣＮＴの確認
【００５６】
実施例２で生物学的な自己集合反応を通じて製造されたＳＬＰ−ＣＮＴ反応産物は下記のような方法でＡＦＭ（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージを確認した。
【００５７】
原子間力顕微鏡（ＮａｎｏＳｃｏｐｅ  ＩＩＩ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をタッピングモード（ｔａｐｐｉｎｇ  ｍｏｄｅ）で運転して空気中で分析し、チップはナノプローブＴＥＳＰを使用した。典型的に柔らかい試料分析で接触モード（ｃｏｎｔａｃｔ  ｍｏｄｅ）の適用が難しいから、これを克服するためタッピングモードと命名された技法が用いられるし、試料と探針の間の引力も考慮してイメージを得る非接触モードの技法が利用することもある。時によってタッピングモードをダイナミックモードとも命名して、  非接触モードとダイナミックモードを全部含めて非接触モードとも言える。周波数は２４０−２８０ｋＨｚ、スキャン速度は１．９７Ｈｚで分析した。
【００５８】
図４と図５はＡＦＭ分析を通じてＳＬＰがラッピングされたＣＮＴの結果を示すイメージである。スキャンサイズは０．８μｍであって、スキャン速度は０．７８２５Ｈｚであった。約６５０ｎｍ長さを持つＣＮＴをラッピングしているＳＬＰがＣＮＴを被覆している形状でイメージ化されていることを示している。
【００５９】
以上、本発明の内容の特定な部分を詳しく記述したが、当業者において、前記の具体的な技術はひたすら望ましい実施の様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白なことである。故に本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれの等価物によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】自己集合する有機超分子の模型を示す図であり、図１ａは円板型又はディスク型デンドリマー１及び扇形の有機超分子２が自己集合によって円柱形態３を作り、これらの円柱が六角形に配列された３次元構造４を形成することを示し、図１ｂは棒−鎖型又は円錐型の分子５が自己集合によって球型６を作り、これらの球が集まって３次元の空間上に一定の構造７で配列されることを示している。
【図２】精製されたＳＬＰに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図３】ＳＬＰを利用してＣＮＴをラッピングする方法を示す概略図である。
【図４】ＡＦＭ分析を通じてＳＬＰでラッピングされたＣＮＴの結果を示すイメージである。
【符号の説明】
【００６１】
１  円板型又はディスク型デンドリマー
２  扇形の有機超分子
３  円柱形態
４  ３次元構造
５  円錐型の分子
６  球型
７  一定の構造
【図１】
2005156534.tif 000007
【図２】
2005156534.tif 000008
【図３】
2005156534.tif 000009
【図４】
2005156534.tif 000010