(57)【要約】【課題】  煩雑な工程を要さず、より大量のＧ−１−Ｐを得ることができるＧ−１−Ｐの製造法を提供する。【解決手段】  ロイコノストック属細菌をシュークロース及び３００ｍＭ以上のリン酸類又はその塩を含有する培地中で培養し、培地中に生成蓄積されたグルコース−１−リン酸を採取するグルコース−１−リン酸の製造法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコノストック属細菌を、シュークロースを含有し、リン酸類又はその塩の濃度が３００ｍＭ以上である培地中で培養し、培地中に生成蓄積されたグルコース−１−リン酸を採取するグルコース−１−リン酸の製造法。
【請求項２】
ロイコノストック属細菌が、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）である請求項１記載のグルコース−１−リン酸の製造法。
【請求項３】
ロイコノストック属細菌が、ロイコノストック・メセンテロイデスＪＣＭ９６９３株である請求項２記載のグルコース−１−リン酸の製造法。
【請求項４】
リン酸類又はその塩の濃度が、３００ｍＭ〜１．５Ｍである請求項１〜３のいずれか１項記載のグルコース−１−リン酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたグルコース−１−リン酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース−１−リン酸(以下、「Ｇ−１−Ｐ」と略称する)は、医薬品及び糖合成の基質として有用である。Ｇ−１−Ｐは、主にマルトデキストリンホスホリラーゼ（ＭＤＰａｓｅ）によって、澱粉及びデキストリン類を加リン酸分解することによって得られるが、これまでに、馬鈴薯由来のＭＤＰａｓｅを利用する方法（例えば、特許文献１参照）や微生物由来のＭＤＰａｓｅを用いるいわゆる酵素法が報告されている。
【０００３】
微生物由来のＭＤＰａｓｅを用いる酵素法としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の酵素を用いる方法(例えば、非特許文献１参照)、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）由来の酵素を用いる方法（例えば、非特許文献２参照）が報告され、さらに最近では、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（例えば、特許文献２参照）やサーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）（例えば、非特許文献３参照）等の中度好熱菌や高度好熱菌の熱安定性ＭＤＰａｓｅを利用してＧ−１−Ｐを製造する方法が報告されている。
【０００４】
しかしながら、これらのような酵素自体を用いる酵素法では、植物や菌体より酵素を抽出する工程や固定化酵素の作製等の複雑な工程が必要とされるという問題があった。そこで、本発明者らは、コリネバクテリウム属細菌を糖及び高濃度のリン酸類が存在する条件下で培養した場合に、高濃度のＧ−１−Ｐが直接培地中に生産され、Ｇ−１−Ｐが簡便に製造できることを見出し特許出願したが（特許文献３参照）、更に大量のＧ−１−Ｐを製造できる方法が望まれていた。
【特許文献１】特公平６−９５４９２号公報
【特許文献２】特開平１０−１４５８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３００８９９号公報
【非特許文献１】Enzyme Microb. Technol.,17,140-146(1995)
【非特許文献２】J. Carbohydrate Chem., 14, 1017-1028(1995)
【非特許文献３】J. Industrial Microbiol., 24, 89-93(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、煩雑な工程を要さず、より大量のＧ−１−Ｐを得ることができるＧ−１−Ｐの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、培養により多量のＧ−１−Ｐを培地中に生産する菌を種々検討したところ、シュークロースホスホリラーゼ生産菌であるロイコノストック属細菌をシュークロース及び高濃度のリン酸類が存在する条件下で培養した場合に、高濃度のＧ−１−Ｐが直接培地中に生産され、Ｇ−１−Ｐの大量製造が可能であることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、ロイコノストック属細菌を、シュークロースを含有し、リン酸類又はその塩の濃度が３００ｍＭ以上である培地中で培養し、培地中に生成蓄積されたグルコース−１−リン酸を採取するグルコース−１−リン酸の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、酵素法で必要とされる植物や菌体より酵素を抽出する工程や固定化酵素の作製等の複雑な工程を行うことなく、大量のＧ−１−Ｐを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において用いられるロイコノストック属細菌は、ロイコノストック属に属し、シュークロース及び一定濃度のリン酸類又はその塩の存在下、培地中にグルコース−１−リン酸を産生するものであればよく、例えばロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ロイコノストック・ラクチス（Leuconostoc lactis）、ロイコノストック・ファラックス（Leuconostoc fallax）、ロイコノストック・シトレウム（Leuconostoc citreum）等が挙げられ、このうち、ロイコノストック・メセンテロイデスが好ましい。具体例としてはロイコノストック・メセンテロイデスＪＣＭ９６９３株が挙げられる。
【００１０】
培地に添加されるリン酸類又はその塩としては、例えばリン酸、メタリン酸、トリポリリン酸、ポリリン酸、二リン酸、ポリメタリン酸及びこれらの塩類が挙げられ、塩としてはナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。特に好ましいリン酸類の塩としては、例えばリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等が挙げられる。本発明においては、リン酸類とその塩又は数種のリン酸類の塩を混合して用いることが好ましい。培地中のリン酸類又はその塩の濃度は、効果の点から３００ｍＭ以上であることが必要であるが、好ましくは３００ｍＭ〜１．５Ｍの範囲、更に好ましくは６００ｍＭ〜１．２Ｍ、特に８００ｍＭ〜１Ｍが望ましい。
【００１１】
本発明において用いられる培地は、ロイコノストック属細菌が生育できるものであればよく、上記の糖及びリン酸類又はその塩の他に、炭素源、窒素源、金属ミネラル類、ビタミン類等を含有する液体培地等が使用できる。
【００１２】
ここで、糖質以外の炭素源としては、例えば酢酸塩等の有機酸塩が挙げられ、窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機及び有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物等の窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸、アラニン、メチオニン等のアミノ酸等が挙げられ、金属ミネラル類としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が挙げられ、これらを単独で又は必要に応じ混合して用いればよい。
【００１３】
培養は、微生物が十分に生育できる条件となるようｐＨ及び温度を適宜調整して行われるが、通常ｐＨ６〜ｐＨ８、温度２５℃〜３５℃で２４時間〜１２０時間で行われることが好ましい。また培養方法は、静置培養、振とう培養、醗酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００１４】
培地中に生成蓄積したグルコース−１−リン酸を採取する方法は、公知の方法に従って行えばよく、例えば、菌体を分離除去し、遠心分離、限外ろ過、イオン交換、逆浸透膜、電気透析、塩析、晶析等を組み合わせることにより行われる。
【００１５】
かくして、本発明の方法によれば、高濃度のＧ−１−Ｐを直接培地中に生産させることが可能であり、酵素を用いる酵素法と比較して煩雑な工程を行うことなく、大量のＧ−１−Ｐを製造することができる。
【実施例】
【００１６】
＜Ｇ−１−Ｐの定量＞
培地中のＧ−１−Ｐの定量は、Weinhausle（前記非特許文献１）の方法を一部改変し、行った。すなわち、９６穴マイクロプレート上で適宜希釈したサンプル１００μLに酵素反応液（100mM Tris−酢酸緩衝液（pH６．８）、２mM EDTA、10mM 硫酸マグネシウム、２mM NAD、１０μMグルコース−１，６−二リン酸、１．２unit/mLホスホグルコムターゼ（ウサギ筋肉由来、ロシュダイアグノスティック社製）、１．２unit/mL グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素（Leuconostoc mesenteroides由来、ロシュダイイアグノスティック社製））を１００μL加え、３７℃で３０分間保温した後、３４０nmの吸光度を測定した。
【００１７】
実施例１  Ｇ−１−Ｐの生産法
ロイコノストック属細菌として、ロイコノストック・メセンテロイデスＪＣＭ９６９３株を使用した。
種培養は、リトマスミルク培地（１０％リトマスミルク(Difco社)、０．１％酵母エキス(Difco社)）１０ｍＬを試験管に分注したものに同培地で生育後低温保存してある培養液から０．１ｍＬ接種し、３０℃、２日間静置培養を行った。
主培養は、５％ポリペプトン、５％酵母エキス(Difco社)、０．２％硫酸マグネシウム、０．１％塩化マンガン（II）四水和物、０．００１％硫酸鉄（III）水和物、シュークロース１５％、にリン酸緩衝液（ｐＨ７）を１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、６００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭ、１２００ｍＭとなるように添加した培地（５ｍＬ）を試験管に分注したものを用い、前述の種培養液を０．０５ｍＬ接種し３０℃で静置培養した。培養液を遠心分離して得られた上清のＧ−１−Ｐ濃度を測定した。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
2005052080.tif 000002
【００１９】
実施例２  Ｇ−１−Ｐの生産法
ロイコノストック属細菌として、ロイコノストック・メセンテロイデスＪＣＭ９６９３株を使用した。
種培養は、リトマスミルク培地（１０％リトマスミルク(Difco社)、０．１％酵母エキス(Difco社)）１０ｍＬを試験管に分注したものに同培地で生育後低温保存してある培養液から０．１ｍＬ接種し、３０℃、２日間静置培養を行った。
主培養は、５％ポリペプトン、５％酵母エキス(Difco社)、０．２％硫酸マグネシウム、０．１％塩化マンガン（II）四水和物、０．００１％硫酸鉄（III）水和物、シュークロース３％、にリン酸緩衝液（ｐＨ７）を８００ｍＭとなるように添加した培地（５ｍＬ）を試験管に分注したものを用い、前述の種培養液を０．０５ｍＬ接種し３０℃で２日間静置培養した後、５０％シュークロースを含む８００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を５ｍＬ添加しさらに培養を続けた。培養液を遠心分離して得られた上清のＧ−１−Ｐ濃度を測定した。結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
2005052080.tif 000003
【００２１】
以上の結果、３００ｍＭ以上のリン酸類を含有する培地でＧ−１−Ｐを効率良く生産させることができた。