(57)【要約】【課題】  腫瘍特異的Ｔ細胞を製造するための新規な方法を提供すること。【解決手段】  非特異的に活性化した抗腫瘍活性をもつＴ細胞に、腫瘍特異的ＣＴＬのＴＣＲ遺伝子を導入することにより、抗腫瘍活性をもつ腫瘍特異的Ｔ細胞を製造し、少量の血液からでも腫瘍特異的な細胞免疫治療法を可能にする。この方法によりＭＨＣクラスＩ拘束性の腫瘍特異的Ｔｈ細胞が得られ、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する腫瘍細胞に反応して抗腫瘍活性およびヘルパー活性を示す細胞を製造することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞を誘導する工程と、そのＴｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程とを含むことを特徴とする、細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項２】
Ｔｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程が、癌関連抗原を認識するＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる、請求項１記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項３】
Ｔｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程が、癌関連抗原を認識するクラスＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる、請求項１記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項４】
Ｔｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程が、癌関連抗原を認識するクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる、請求項１記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項５】
癌関連抗原が、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＡ７２−４、ＳＣＣ、ＭＫ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、ＨＥＲ２、Ｇ２５０、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＭＡＲＴ、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＲＰ、ＬＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ１からなる群より選択される、請求項２−４のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項６】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞を誘導する工程が、Ｔ細胞を含む材料を、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２の存在下で培養することにより行われる、請求項１記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項７】
抗原特異性を付与されたＴｈ細胞を精製する工程をさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項８】
抗原特異性を付与されたＴｈ細胞を精製する工程が、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる、請求項７記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項９】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程と、そのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程とを含むことを特徴とする、細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１０】
Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程が、癌関連抗原を認識するＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる、請求項９記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１１】
Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程が、癌関連抗原を認識するクラスＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる、請求項９記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１２】
Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程が、癌関連抗原を認識するクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる、請求項９記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１３】
癌関連抗原が、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＡ７２−４、ＳＣＣ、ＭＫ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、ＨＥＲ２、Ｇ２５０、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＭＡＲＴ、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＲＰ、ＬＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ１からなる群より選択される、請求項９−１２のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１４】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程が、Ｔ細胞を含む材料を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下で培養することにより行われる、請求項９記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１５】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む、請求項９−１４のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１６】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる、請求項１５記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１７】
分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む、請求項１５または１６に記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的に活性化した抗腫瘍活性を有するＴｈ細胞またはＴｈ１細胞およびＴｃ１細胞に、腫瘍抗原を特異的に認識するＴ細胞レセプターの遺伝子を導入することからなる、特異的に腫瘍細胞を傷害しうる活性化Ｔ細胞医薬の製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本特許において癌とは悪性新生物をいい、また癌と腫瘍は、同義として扱うものとする。
【０００３】
末梢血より分離した単核球をインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下で培養することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抵抗性の腫瘍に対して幅広く抗腫瘍活性をもつリンフォカイン活性化キラ−（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ、ＬＡＫ）細胞を誘導することができる（例えば、非特許文献１参照）。その後、遺伝子組み換え技術により大量のＩＬ−２が入手可能となり（例えば、非特許文献２参照）、腫瘍に対するＬＡＫ細胞を用いた養子免疫療法の臨床応用がなされ、その有用性が示された（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
さらにＩＬ−２に抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を加えて培養することにより、少量の末梢血から得られた単核球よりＬＡＫ活性をもつ細胞を大量に培養することが可能となった（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
末梢のＴリンパ球は細胞表面にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と共にＣＤ３分子を発現しており、ＣＤ４またはＣＤ８分子の発現の違いにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分類される。
【０００６】
細胞表面に発現した分子（たとえばＣＤ４分子、ＣＤ８分子）に対するＭｏＡｂと磁気ビーズを用いることにより、目的の細胞表面抗原を有する細胞を濃縮または除去することができる（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
Ｔｈ細胞はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２などのサイトカインを産生するＴｈ１細胞と、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などのサイトカインを産生するＴｈ２細胞に分けられ（例えば、非特許文献５参照）、Ｔｈ１細胞は細胞性免疫のエフェクターとして働き、Ｔｈ２細胞は体液性免疫の調節を担っている。またＴｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４はＴｈ１細胞を抑制する（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
初期のＴｈ細胞活性化の際にＩＬ−１２の存在によりＴｈ１細胞の分化が起こり（例えば、非特許文献７参照）、ＩＬ−４の存在によりＴｈ２細胞の分化が起こる（例えば、非特許文献８参照）。
【０００９】
一方、ＣＴＬは、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞と同様のサイトカイン産生パターンにより、Ｔｃ１細胞とＴｃ２細胞とに分類される。Ｔｃ１細胞は強力な細胞傷害性を示し、Ｔｃ２細胞は免疫抑制的作用を担っており、ＩＬ−１２またはＩＬ−４の存在によりＴｃ１細胞またはＴｃ２細胞へ分化する（例えば、非特許文献９参照）。
【００１０】
Ｔ細胞はＴＣＲによりＭＨＣ分子／抗原ペプチド複合体を認識して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの標的細胞に結合するが、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し（ＭＨＣクラスＩ拘束性）、Ｔｈ細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみしか結合できない（ＭＨＣクラスＩＩ拘束性）とされている。
【００１１】
また、ＭＨＣクラスＩ分子はほとんどの有核細胞に発現しているが、ＭＨＣクラスＩＩ分子は限られた一部の細胞しか発現していない。このためＴｈ細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現した樹状細胞やＢ細胞、活性化Ｔ細胞などとは結合できるが、これら以外の腫瘍細胞や感染細胞などには直接結合することができない。
【００１２】
しかし遺伝子操作によってＭＨＣクラスＩ拘束性とされるＣＴＬ由来のＴＣＲ遺伝子を導入したＭＨＣクラスＩＩ拘束性とされるＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞が、対応抗原をパルスしたＡＰＣとＣＤ８非依存的に反応して活性化されることができ、対応抗原に結合できるＴＣＲを発現していることが示された。また、非特異的な抗腫瘍活性をもつ末梢血リンパ球に腫瘍抗原特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲ遺伝子を導入することにより、特異的に腫瘍を傷害することができる（例えば、非特許文献１０参照）。
【特許文献１】特許番号  第２５３０９６６号
【非特許文献１】Ｇｒｉｍｍら，１９８２．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５５：１８２３−１８４１
【非特許文献２】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，１９８３．Ｎａｔｕｒｅ，３０２：３０５−３１０
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８５．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１３：１４８５−１４９２
【非特許文献４】Ｏｃｈｏａら，１９８７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：２７２８−２７３３
【非特許文献５】Ｍｏｓｍｓｎｎら，１９８６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：２３４８−２３５７
【非特許文献６】Ｍａｇｇｉら，１９９２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２１４２−２１４７
【非特許文献７】Ｓｅｄｅｒら，１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０１８８−１０１９２
【非特許文献８】Ｈｓｉｅｈら，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０６５−６０６９
【非特許文献９】Ｍｏｓｍａｎｎら，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１７：１３８−１４６
【非特許文献１０】Ｍｏｒｇａｎら，２００３．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：３２８７−３２９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
生体外で腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、手術によって患者本人の腫瘍組織を得る必要がある。また最近では腫瘍抗原ペプチドを用いた腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導が可能となっているが、限られたタイプのＭＨＣを有する患者しか適応できない。
【００１４】
さらに腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、多くの手間と時間さらには誘導に使用するＡＰＣを得るために大量の血液を必要とし、細胞治療に必要な量の腫瘍特異的Ｔ細胞を得るのは困難である。
【００１５】
したがって、本発明は、腫瘍特異的Ｔ細胞、特にＴｈ細胞あるいはＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を製造するための新規な方法を提供することを目的とする。
【００１６】
さらに、ＭＨＣクラスＩ分子はほとんどの有核細胞に発現するが、ＭＨＣクラスＩＩ分子は活性化した細胞を含む一部の細胞にしか発現していないため、ヘルパーＴ細胞は全ての細胞に直接結合できるわけではない。
【００１７】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合しうる腫瘍特異的ヘルパーＴ細胞、特にＴｈ１細胞を製造するための新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｃ１細胞に腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を特異的に傷害しうる細胞に加工できることを見い出した。さらに非特異的に活性化したＭＨＣクラスＩＩ拘束性のＴｈ１細胞に、ＭＨＣクラスＩ拘束性の抗原特異的ＣＴＬより得られたＴＣＲ遺伝子を導入することにより、ＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチド複合体と反応できるヘルパー活性さらには抗腫瘍活性を有する細胞に加工できることを見い出した。
【００１９】
本発明は、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞を誘導する工程と、そのＴｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程とを含むことを特徴とする、細胞治療用の細胞の製造方法を提供する。好ましくは、Ｔ細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる。また好ましくは、Ｔｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するクラスＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる。また好ましくは、Ｔｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程と、そのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程とを含むことを特徴とする、細胞治療用の細胞の製造方法を提供する。好ましくは、Ｔ細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる。また好ましくは、Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するクラスＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる。また好ましくは、Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するクラスＩＩ拘束性ＴＣＲの遺伝子を導入することにより行われる。
【００２１】
本発明の方法において、好ましくは、癌関連抗原は、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＡ７２−４、ＳＣＣ、ＭＫ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、ＨＥＲ２、Ｇ２５０、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＭＡＲＴ、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＲＰ、ＬＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ１からなる群より選択される。
【００２２】
別の態様においては、本発明の方法において、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞を誘導する工程は、患者の末梢血などから採取したＴ細胞を含む材料を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２の存在下で培養することにより行われる。
【００２３】
別の態様においては、本発明の方法において、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程は、患者の末梢血などから採取したＴ細胞を含む材料を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下、好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体の存在下、さらに好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体およびＩＦＮ−γの存在下で培養することにより行われる。
【００２４】
別の態様においては、本発明の方法は、抗原特異性を付与されたＴｈ細胞を精製する工程をさらに含む。好ましくは、抗原特異性を付与されたＴｈ細胞を精製する工程は、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる。
【００２５】
別の態様においては、本発明の方法は、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む。好ましくは、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程は、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる。
【００２６】
別の態様においては、本発明の方法は、分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の細胞治療用の細胞の製造方法は、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞を誘導する工程と、そのＴｈ細胞に抗原特異性を付与するための工程とを含む。
【００２８】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞は、以下のようにして誘導することができる。ヒトの末梢血から比重遠心法等の方法により回収した単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２の存在下に、培地（ＡＩＭ−Ｖ：インビトロジェン社、ヒトＡＢ型血清、培養細胞と同一血液型、好ましくは自己血清を０．１〜３０％、好ましくは５〜１０％）で培養する。ＩＬ−２の終濃度は１０〜２０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ＩＵ／ｍｌである。このようにして、抗原非特異的に活性化したＴｈ細胞を誘導することができる。
【００２９】
別の態様においては、本発明の細胞治療用の細胞の製造方法は、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程と、そのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程とを含む。
【００３０】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞は、以下のようにして誘導することができる。ヒトの末梢血から比重遠心法等の方法により回収した単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下、好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体の存在下、さらに好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体およびＩＦＮ−γの存在下で培養するの存在下に、培地（ＡＩＭ−Ｖ：インビトロジェン社、ヒト血清添加：ＡＢ型血清、培養細胞と同一血液型、好ましくは自己血清を０．１〜３０％、好ましくは５〜１０％）で培養する。各サイトカインの好ましい濃度は、終濃度で、ＩＬ−２については、１０〜２０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ＩＵ／ｍｌであり、ＩＬ−１２については、１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ＩＵ／ｍｌであり、ＩＦＮ−γについては、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、抗ＩＬ−４抗体については、０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１０μｇ／ｍｌである。このようにして、抗原非特異的に活性化したＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導することができる。
【００３１】
次に、このようにして得られた非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ細胞あるいはＴｈ１細胞およびＴｃ１細胞に、腫瘍細胞に対する抗原特異性を付与する。Ｔｈ細胞あるいはＴｈ１細胞およびＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識するＴＣＲの遺伝子を導入して、ＴＣＲをそのＴｈ細胞あるいはＴｈ１細胞およびＴｃ１細胞表面上で発現させることにより行う。ＴＣＲは、クラスＩ拘束性ＴＣＲであっても、クラスＩＩ拘束性ＴＣＲであってもよい。
【００３２】
ＴＣＲ遺伝子は、腫瘍特異的なヒトＣＴＬクローンから単離することができる。腫瘍特異的なＣＴＬクローンは、ヒトから単離したＴ細胞を限界希釈することによりクローニングしてもよく、あるいはヒトから単離したＣＴＬをインビトロで抗原の存在下で培養することにより誘導してもよい。ＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子に特異的な配列に対応するプライマーを用いて、５’ＲＡＣＥ法によりそれぞれ容易にクローニングすることができる。
【００３３】
ＴＣＲ遺伝子は、種々のウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入することができる。このようなベクターとしては、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、リポソーム等が挙げられる。ベクターは、Ｔ細胞中でＴＣＲ遺伝子が発現されるような様式で配列された、プロモーター領域、開始コドン、終止コドンおよびターミネーター領域等を含む。ＴＣＲ遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、適宜パーケージングプラスミド、ヘルパープラスミド等を利用して、上述の抗原非特異的に活性化したＴ細胞に導入することができる。このようにして、腫瘍細胞に対する特異性を付与されたＴｈ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｃ１細胞を得ることができる。
【００３４】
本発明の好ましい態様においては、抗原非特異的に活性化したＴ細胞として、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性であるＴｈ細胞を用い、これに腫瘍特異的ＣＴＬのＴＣＲ遺伝子を導入することにより、クラスＩ拘束性のＴＣＲを発現して直接腫瘍細胞に結合しうるＴｈ細胞を製造することができる。このようなＴｈ細胞は、抗腫瘍活性とヘルパー活性との両方を有するため、癌の治療において用いるのに非常に有用である。特に好ましくはＴｈ細胞はＴｈ１細胞である。
【００３５】
さらに、上述のようにして得られた活性化Ｔ細胞の集団において、抗原特異性を付与されたＴｈ細胞を精製してもよい。この工程は、ＣＤ４抗体を結合した磁気ビーズを使用して抗原特異性を有するＣＤ４陽性細胞を単離することにより行うことができる。
【００３６】
また、上述のようにして得られた活性化Ｔ細胞の集団において、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離してもよい。この工程は、ＣＤ４またはＣＤ８抗体を結合した磁気ビーズを使用して、抗原特異性を有するＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞を単離することにより行うことができる。このようにして分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とは、癌の治療において、最適な効果が得られるように任意の割合で混合することができる。
【００３７】
本発明の方法により得られた抗原特異性を付与されたＴｈ細胞、Ｔｈ１細胞およびＴｃ１細胞の抗原特異性は、以下のようにして評価することができる。ＨＬＡがわかっているヒト末梢血単核球をＥＢウイルスによりトランスフォームしてリンフォブラスト細胞株（ＬＣＬ）を得る。この培養液に、目的とする抗原の当該ＨＬＡ拘束性ペプチドを添加することにより、ペプチドパルスを行う。この操作により細胞表面に当該ＨＬＡ／抗原ペプチド複合体が発現したＬＣＬ細胞が得られる。次に、マイトマイシンＣ処理して不活性化したペプチドパルスＬＣＬ細胞、または対照としてペプチドパルスしていないＬＣＬ細胞と、本発明の方法により得られた抗原特異性を付与されたＴｈ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｃ１細胞とを共培養する。培養上清中のＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量を測定して比較することにより、抗原特異性を測定することができる。
【００３８】
また、本発明の方法により得られた抗原特異性を付与されたＴｈ細胞、Ｔｈ１細胞またはＴｃ１細胞の抗腫瘍活性は、Ｔ細胞を51Ｃｒ標識したペプチドパルスＬＣＬ細胞と一定時間接触させ、放出される51Ｃｒの量を測定することにより評価することができる。
【００３９】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４０】
ＴＣＲ遺伝子を含有するウイルスベクターの作製
ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人由来の腫瘍抗原ＷＴ１を有する腫瘍に特異的なＣＴＬクローンＴＡＫ−１から、５’ＲＡＣＥ法によりＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子を単離し、配列を同定した。
【００４１】
ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＣＴＬ由来のＷＴ１特異的なＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子をレンチウイルスベクターＣＳＩＩに組み込み大腸菌株ＤＨ１０Ｂに導入後、増殖させたベクターをＣａＣｌ2遠心法により精製した。
【００４２】
培養中の２９３T細胞にＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＣＴＬ由来のＷＴ１特異的なＴＣＲα鎖遺伝子、ＴＣＲβ鎖遺伝子を組み込んだレンチウイルスベクターＣＳＩＩをパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、Ｒｅｖ発現プラスミドｐＲＶＳ−Ｒｅｖ、ＶＳＶ−ＧプラスミドｐＭＤ．Ｇと共に加えてさらに培養し、フォルスコリン処理後に該ＴＣＲα鎖遺伝子、ＴＣＲβ鎖遺伝子を組み込んだレンチウイルスベクターを多量に含む培養上清を回収した。
【実施例２】
【００４３】
Ｔ細胞の非特異的活性化
あらかじめ、抗ＣＤ３抗体を培養プレートに固相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレートを準備しておき、末梢血から比重遠心法により回収した単核球を、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、２μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４抗体（タイプ１サイトカイン）を加えたタイプ１培養条件で培養した。
【実施例３】
【００４４】
ＴＣＲ遺伝子を導入したＴ細胞の調製
タイプ１培養条件で２日間培養した単核球に、実施例１で得られたレンチウイルスベクターを含む培養上清とタイプ１サイトカインとを加えて培養し、さらにこの２４時間後にもレンチウイルスベクターを含む培養上清とタイプ１サイトカインを加えて培養することにより、非特異的に活性化したＴ細胞にＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＣＴＬ由来のＷＴ１特異的なＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子を導入した。
【００４５】
さらに１０日間培養して、ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＣＴＬ由来のＷＴ１特異的なＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子を導入した活性化Ｔ細胞を増殖させた。
【００４６】
ＨＬＡ−Ａ２４陽性健常人ＣＴＬ由来のＷＴ１特異的なＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子を導入し、タイプ１培養条件で非特異的に活性化したＴ細胞を市販のＭＡＣＳマイクロビーズＣＤ４またはＭＡＣＳマイクロビーズＣＤ８（ミルテニー・バイオテック社）を用いてＣＤ４陽性T細胞（Ｔｈ１細胞）またはＣＤ８陽性T細胞（Ｔｃ１細胞）をそれぞれ単離した。
【実施例４】
【００４７】
ＴＣＲ遺伝子を導入したＴ細胞の抗腫瘍活性の評価
ヒトのＭＨＣクラスＩ抗原の中で日本人に最も高い頻度で存在するＨＬＡ−Ａ２４陽性の健常人の末梢血単核球をＥＢウイルスによりトランスフォームして得られたＨＬＡ−Ａ２４陽性リンフォブラスト細胞株（ＬＣＬ）を仮想腫瘍細胞とし、ＷＴ１タンパク質のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し１６時間反応（ペプチドをパルス）させた後、未反応のペプチドを洗浄した。この操作により細胞表面にＨＬＡ−Ａ２４／ＷＴ１ペプチド複合体が発現したＬＣＬ細胞が得られる。
【００４８】
実施例３で精製したＴｈ１細胞（ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞）またはＴｃ１細胞（ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞）を、ＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞またはパルスしないＬＣＬ細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化したいずれかと２４時間の共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γとＩＬ−２の量を測定した。
【００４９】
その結果、ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞とＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞のいずれにおいても、ＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞との共培養によりＩＦＮ−γの産生が見られたが、ペプチドをパルスしないＬＣＬ細胞との共培養によってはＩＦＮ−γの産生は見られなかった（図１）。
【００５０】
また、ＩＬ−２の産生はＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞と共培養した場合はＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞では見られたものの、ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞ではＴｈ１細胞と比べ低かった。ペプチドをパルスしないＬＣＬ細胞との共培養によってはＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞、ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞いずれにおいてもＩＬ−２の産生は見られなかった（図２）。
【００５１】
なお、比較対照のＷＴ１特異的ＴＣＲ遺伝子を導入していないコントロールＴｈ１細胞とコントロールＴｃ１細胞では、ＷＴ１ペプチドをパルスＬＣＬ細胞との共培養によってＩＦＮ−γ、ＩＬ−２ともに産生は見られなかった（図１、２）。
【００５２】
51Ｃｒ標識したＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞を標的細胞として、精製したＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞またはＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞の細胞傷害活性を４時間の51Ｃｒリリースアッセイにて測定した。また比較対照としてのＷＴ１特異的ＴＣＲ遺伝子を導入していないコントロールＴｈ１細胞とコントロールＴｃ１細胞の細胞傷害活性の測定も行った。
【００５３】
その結果、ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞では細胞傷害活性を示したが、コントロールＴｈ１細胞では細胞傷害活性を示さなかった。また、ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞ではＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞と比べて非常に強い細胞傷害活性を示したが、コントロールＴｃ１細胞では細胞傷害活性を示さなかった。（図３）
【００５４】
以上の結果より、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｃ１細胞に腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を導入することにより、腫瘍細胞を特異的に傷害しうる細胞に加工できることが示された。また、非特異的に活性化したＭＨＣクラスＩＩ拘束性のＴｈ１細胞に、ＭＨＣクラスＩ拘束性の抗原特異的ＣＴＬより得られたＴＣＲ遺伝子を導入することにより、ＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチド複合体と反応できるヘルパー活性さらには抗腫瘍活性を有する細胞に加工できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞またはペプチドをパルスしないＬＣＬ細胞との共培養によるＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞とＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞のＩＦＮ−γ産生能の比較
【図２】ＷＴ１ペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞またはペプチドをパルスしないＬＣＬ細胞との共培養によるＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞とＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞のＩＬ−２産生能の比較
【図３】ＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｈ１細胞とＷＴ１−Ａ２４ＴＣＲ＋Ｔｃ１細胞のペプチドをパルスしたＬＣＬ細胞に対する細胞傷害活性
【図１】
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【図２】
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【図３】
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