(57)【要約】【課題】アブラナ科植物病害である根こぶ病に対して防除効果が高く、環境汚染のないアブラナ科病害の防除剤および防除方法を提供する。【解決手段】アブラナ科植物根こぶ病に対して拮抗能を有するシュードモナス属ベトナミエンシスを有効成分として含む防除剤を用いる。ＣＧＦ４１５３菌株、ＣＧＦ４１６４菌株、ＣＧＦ５１００菌株によりなる防除剤が特に好ましい。これらの防除剤は、▲１▼播種時の土壌に混和する方法、▲２▼播種後に菌液をかん注する方法、▲３▼発芽後に菌液をかん注する方法、▲４▼育苗中に菌液をかん注する方法、▲５▼植付け時に苗を菌液に浸漬する方法の何れかの方法で用いるのが好ましく、何れか２つの方法を併用すると、特に高い効果が得られる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科植物の難防除土壌病害である根こぶ病に対して拮抗能を有するシュードモナス属ベトナミエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）を有効成分として含む防除剤を用いることからなるアブラナ科植物の根こぶ病の防除方法。
【請求項２】
シュードモナス属ベトナミエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）がＣＧＦ４１５３、ＣＧＦ４１６４またはＣＧＦ５１００であることを特徴とする、請求項１に記載のアブラナ科植物の根こぶ病の防除方法。
【請求項３】
シュードモナス属ベトナミエンシスを、▲１▼播種時の土壌に混和する方法、▲２▼播種後に菌液をかん注する方法、▲３▼発芽後に菌液をかん注する方法、▲４▼育苗中に菌液をかん注する方法、▲５▼植付け時に苗を菌液に浸漬する方法、のうち何れかの方法により作用させることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のアブラナ科植物の根こぶ病の防除方法。
【請求項４】
請求項３において、▲１▼乃至▲５▼の方法のうち、何れか２つ以上の方法を組み合わせることを特徴とする、請求項３に記載のアブラナ科植物の根こぶ病の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、学名シュードモナス属ベトナミエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）に属する細菌を用いたアブラナ科植物病害の防除方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アブラナ科植物病害の主要な土壌病害であるである根こぶ病は、ハクサイ、キャベツ、カリフラワーなどアブラナ科植物３００種以上の植物に発生する、土壌糸状菌病害である。根こぶ病は、これらアブラナ科作物の安定した生産に支障をきたしている。病徴としては、植付け後２０日位から根にこぶが生成し、初期から感染した場合にはハクサイやキャベツでは結球せず、後半以降に感染した場合でも収穫物が大きくならず、全く収穫が得られないこともある。
【０００３】
現在これらの病害の防除には、土壌消毒剤としていくつかの化学薬剤が使用されている。しかし、これらの化学薬剤には、環境上の問題や使用者及び近隣住民への安全性の問題、さらに近年の消費者の減農薬・無農薬指向に合致しないという問題がある。更には、病原菌の菌密度が高い場合には、効果が劣ることも稀ではない。
【０００４】
そこで、この病害の防除には、防除効果が高く、水質汚染などの環境汚染及び安全性を満足する防除剤の開発が望まれている。
【０００５】
これまでにアブラナ科植物根こぶ病に対しての生物防除法としては、糸状菌を用いた防除例（非特許文献１）や、バチルス属細菌による防除例（特許文献１）はあるものの、シュードモナス属ベトナミエンシス細菌による報告例はない。
【０００６】
また、これまでにシュードモナス属ベトナミエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）を用いた生物防除は、豆科植物のピシュームによる立枯病の防除の報告（非特許文献２）があるが、アブラナ科植物病害への適用例は知られていない。
【０００７】
なお、ここで示すシュードモナス属ベトナミエンシスについては、イネ種子病害に対して防除効果を持つことが示され、本出願人によって既に特許出願されている（特許文献２）。
【０００８】
【非特許文献１】
日植病報、（日本）、１９９６年、第６２巻、第３号、ｐ．２８１
【非特許文献２】
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、（アメリカ合衆国）、１９９８年、  第８８巻、第９号、Ｓｕｐｐｌ．，Ｓ４６−Ｓ４７
【特許文献１】
特開平１１−３３５２１７号公報
【特許文献２】
特開２００２−１７３４３号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アブラナ科植物病害であるハクサイ根こぶ病、キャベツ根こぶ病等のアブラナ科植物根こぶ病に対して防除効果が高く、環境汚染のないアブラナ科植物病害の防除方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ハクサイなどアブラナ科根こぶ病に対して、シュードモナス属ベトナミエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）に属する微生物が高い防除効果を有することを見いだし、これらの中でＣＧＦ４１５３、ＣＧＦ４１６４またはＣＧＦ５１００の菌株が特に高い防除能を有することを見出し、発明を完成させた。
【００１１】
なお、関連する技術として、本出願人は、シュードモナス属ベトナミエンシスに属するＣＧＦ４１５３、ＣＧＦ４１６４、ＣＧＦ５１００菌株が、アブラナ科植物のバーティシリウム病害に対して、高度な防除能を有することを見出し、既に出願している（特願２００２−２６２４３号）。
【００１２】
これまでにアブラナ科植物根こぶ病に対して用いられた実績のある糸状菌やバチルス属細菌に比べると、シュードモナス属ベトナミエンシスはその培養と製剤化が特に容易であるという利点があり、工業的な量産を行う上で有利である。
【００１３】
すなわち本発明は、シュードモナス属ベトナミエンシス菌株並びにその生菌を有効成分として含有することを特徴とするアブラナ科植物根こぶ病害の防除剤並びにそれを用いたアブラナ科植物根こぶ病害の防除方法である。
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明の微生物は、アブラナ科植物根こぶ病害に対して高い防除効果を有するシュードモナス属ベトナミエンシス（特にこの種に属するＣＧＦ４１５３菌株、ＣＧＦ４１６４菌株またはＣＧＦ５１００菌株）である。
【００１５】
シュードモナス属ベトナミエンシスにＣＧＦ４１５３、ＣＧＦ４１６４、ＣＧＦ５１００菌株は、イネや野菜から分離・収集した約７０００菌株の細菌から、イネばか苗病菌、イネ苗いもち病菌に対する抗菌活性、さらに育苗試験による選抜の結果得られた菌株である。
【００１６】
シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３，ＣＧＦ４１６４，ＣＧＦ５１００は、光学顕微鏡および電子顕微鏡での形態観察の結果、細胞の大きさは、１〜３μｍの桿菌であり、細胞の多形性はなく、いずれも運動性を有していた。グラム反応は、陰性で、内胞子は形成しなかった。
【００１７】
その他の細菌学的性質について、以下に示す。
１．培養的性質
ＣＧＦ４１５３，ＣＧＦ４１６４，ＣＧＦ５１００のブイヨン寒天培地における生育状態を以下に示す。観察は、３０℃、３日間培養後に行った。
【００１８】
ＣＧＦ４１５３，ＣＧＦ４１６４のコロニー形態は、クリーム色、円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、ＣＧＦ５１００のコロニー形態は、クリーム色、円形、全縁やや波状、目玉焼き状、光沢ありである。水溶性の色素は産生しない。
２．一般的性質
【００１９】
【表１】
2005008528.tif 000002
【００２０】
以上の細菌学的性質により、ＣＧＦ４１５３，ＣＧＦ４１６４及びＣＧＦ５１００は、いずれも運動性を有するグラム陰性の桿菌で、カタラーゼ活性陽性、オキシダーゼ活性陽性、内胞子を形成せず、さらにニトロゲナーゼ活性を有することにより、シュードモナス属ベトナミエンシスに属する細菌に分類された。
【００２１】
本発明の該当菌株は、工業技術院生命工学工業研究所に寄託され、以下の寄託番号を得ている。
【００２２】
2005008528.tif 000003
上記のイネばか苗病を有効に防除するシュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３，ＣＧＦ４１６４及びＣＧＦ５１００の３菌株について、ハクサイ根こぶ病に対して防除試験を行った。方法は、供試菌株の１０８ｃｆｕ／ｍｌ希釈液にハクサイ苗の根を植付け時に２４時間浸漬処理を行い、汚染土壌に植え付けた後、４〜５週間目に発病調査を行った。その結果、ハクサイ根こぶ病を抑制することがわかった。また、播種時の土壌に菌を混和し、さらに定植時に浸漬処理を行うと防除効果が高くなる事がわかった。
【００２３】
次に、これらの菌の培養および防除剤としての製剤化について述べる。これらの菌の培養は、慣用の手法で行うことができるが、以下に例をもって説明する。ここで使用する培地は菌が増殖するものであれば特に限定するものではない。生育に可能な炭素源、窒素源、無機物を適当に含有している培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。培地としては８０２培地、ブイヨン培地、キングＢ培地、ＰＳ培地、ＰＤＢ培地などが例示できる。以上のような培地で１５〜４２℃好ましくは２８℃〜３５℃で１０〜３５時間培養し増殖させたのちに遠心分離機もしくは膜濃縮機により濃縮して集菌を行い、培地成分を取り除く。この操作により、菌体の濃度は通常１×１０１０〜５０×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ程度に濃縮される。
【００２４】
本発明のシュードモナス・ベトナミエンシスは、このようにして培養された生菌のままでも高い防除効果を有するが、製剤化（粉剤もしくは粒剤に加工することをいう）により、これらの菌を商品として長期保存できるようになる。この製剤化は、培養した菌を、しかるべき担体と混合することにより行うことができる。この場合の担体には、タルク、クレー、炭酸カルシウム、ケイソウ土等の鉱物性粉末や、ピートモス、さらには、ポリビニルアルコールなどの高分子化合物、ザンサンゴムやアルギン酸などの天然高分子化合物などがある。菌体の濃度は、液剤の場合は、１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上とするのが好ましい。固体（水和剤、粉剤）の場合は、１０５ｃｆｕ／ｇ以上、好ましくは１０７ｃｆｕ／ｇ以上とする。
【００２５】
また、湿菌体に糖類とグルタミン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液からなる保護剤を加え、真空乾燥することもできる。糖類としてサッカロース、フルクトース、グルコースおよびソルビトールの一種または二種以上からなる糖類を用いる。真空乾燥する前に保護剤と混合した菌体を予備凍結し、凍結したまま真空乾燥することが菌の生存率を維持するためには好ましい。
【００２６】
さらに、製剤の担体としては、タルク、カオリン、ケイソウ土、炭酸カルシウムなどが糖類と共にまたは単独で使用できる。
【００２７】
次に、本発明の菌の、アブラナ科植物への使用法について、ハクサイを例として述べる。一般にハクサイの生産は育苗トレイに播種し、３〜５週間育苗した後に、畑に定植することにより行う。本発明の防除剤は、上記培養した生菌もしくは製剤を、播種時の育苗培土に混合したり、定植前の苗をその希釈液（生菌もしくは製剤化した菌を水で希釈したものをいう）に浸漬したり、もしくは、その両方の処理を組み合わせたりして使用することができる。
【００２８】
シュードモナス属ベトナミエンシスは、▲１▼播種時の土壌に混和する方法、▲２▼播種後に菌液をかん注する方法、▲３▼発芽後に菌液をかん注する方法、▲４▼育苗中に菌液をかん注する方法、▲５▼植付け時に苗を菌液に浸漬する方法、のうち何れかの方法により作用させることが好ましい。
【００２９】
これら▲１▼〜▲５▼の方法はいずれも効果があるが、本発明者らは、上記▲１▼〜▲５▼の方法のうち、少なくとも２つの方法（例えば▲１▼と▲５▼）を組み合わせて行うことにより、防除効果が安定し、特に好ましいことを見出した。
【００３０】
本発明の防除剤を上記方法で使用する場合、育苗培土への混合処理の場合は、土壌１Ｌ当りに１ｇ以上混合し、均一になるように撹拌する。培土中の菌濃度は１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上になるように調整する。また、育苗された苗を定植前に本防除剤希釈液に浸漬処理する場合の希釈液の菌濃度は１０６ｃｆｕ／ｍｌ以上、好ましくは１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上になるように調整する。
【００３１】
【実施例】
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。なお、実施例に用いた培地の組成を次に示す。
ブイヨン培地：肉エキス  ３ｇ、ペプトン  １０ｇ、ＮａＣｌ  １５ｇ、水１Ｌ、ｐＨ７．０
ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース培地）：ポテト滲出液２００ｇ、ブドウ糖２０ｇ、水１Ｌ、ｐＨ５．６）。
【００３２】
〔実施例１〕  ハクサイ根こぶ病に対する防除試験
シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、供試菌の懸濁液を調整した。この懸濁液に、ハクサイ苗（品種：としこし）を浸漬し、懸濁液に浸漬したまま２４時間置いた。その後、汚染土壌に植え付けた。汚染土壌は、ハクサイ根こぶ菌に罹病したハクサイ根（根こぶ付き）をホモジナイズし混和した畑土壌を使用した。３２日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表３に示す。
【００３３】
シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株の懸濁液の菌濃度は、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌで行った。その結果、シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株に高い防除効果が認められた。ハクサイ根こぶ病の検定は根部の根こぶの生成程度から発病度を算出し、評価した。
根部発病指数０；健全、１；根の１０％以下に寝こぶの付着を認める、２；根の１０％から５０％に根こぶの付着を認める、３；根の５０％以上に寝こぶの付着を認める。
発病度＝１００×｛Σ（指数の値）×（各指数に該当する固体数）｝÷｛３×（供試株数）｝。
【００３４】
【表２】
2005008528.tif 000004
【００３５】
〔実施例２〕  キャベツ根こぶ病に対する防除試験
シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、供試菌の懸濁液を調整した。この懸濁液に、キャベツ苗（品種：湖水）を浸漬し、懸濁液に浸漬したまま２４時間置いた。その後、ハクサイ根こぶ病の罹病根の破砕液を混和した汚染土壌を詰めた１０．５ｃｍのポリポットに移植した。約４６日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表３に示す。シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株の懸濁液の菌濃度は、１０８ｃｆｕ／ｍｌで行った。その結果、シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株に高い防除効果が認められた。
【００３６】
【表３】
2005008528.tif 000005
【００３７】
〔実施例３〕  ハクサイ根こぶ病に対する防除試験
シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１６４及び５１００株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、供試菌の懸濁液を調整した。
【００３８】
この懸濁液を育苗培土（クレハ園芸培土）に混和し、ハクサイ種（品種：無双）を播種した。その後、４〜５葉まで生育した苗をＣＧＦ４１５３の菌液に浸漬し、懸濁液に浸漬したまま２４時間置いた。その後、汚染土壌に植え付けた。汚染土壌は、ハクサイ根こぶ菌に罹病したハクサイ根（根こぶ付き）をホモジナイズし混和した畑土壌を使用した。３２日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表４に示す。シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１６４及び５１００株の懸濁液の菌濃度は、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌで行った。その結果、シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１６４及び５１００株に高い防除効果が認められた。ハクサイ根こぶ病の検定は根部の根こぶの生成程度から発病度を算出し、評価した。
根部発病指数０；健全、１；根の１０％以下に寝こぶの付着を認める、２；根の１０％から５０％に根こぶの付着を認める、３；根の５０％以上に寝こぶの付着を認める。
発病度＝１００×｛Σ（指数の値）×（各指数に該当する固体数）｝÷｛３×（供試株数）｝。
【００３９】
【表４】
2005008528.tif 000006
【００４０】
〔実施例４〕ハクサイ根こぶ病に対する防除試験（処理方法の組み合わせ）
シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、供試菌の懸濁液を調整した。この懸濁液を菌濃度を１×１×１０８ｃｆｕ／ｇに調整し播種土壌（クレハ園芸培土）に混合し、ハクサイ種子（品種：無双）を播種した。さらに生育したハクサイ苗の根をＣＧＦ４１５３菌液（１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）に浸漬し、２４時間置いた。その後、汚染土壌に植え付けた。汚染土壌は、ハクサイ根こぶ菌に罹病したハクサイ根（根こぶ付き）をホモジナイズし混和した畑土壌を使用した。３２日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表５に示す。
【００４１】
その結果、シュードモナス属ベトナミエンシスＣＧＦ４１５３株に高い防除効果が認められた。特に、播種時土壌混和処理と植付け時の浸漬処理を両方行った場合は、浸漬処理の単独よりも効果が高かった。ハクサイ根こぶ病の検定は根部の根こぶの生成程度から発病度を算出し、評価した。
根部発病指数０；健全、１；根の１０％以下に寝こぶの付着を認める、２；根の１０％から５０％に根こぶの付着を認める、３；根の５０％以上に寝こぶの付着を認める。
発病度＝１００×｛Σ（指数の値）×（各指数に該当する固体数）｝÷｛３×（供試株数）｝。
【００４２】
【表５】
2005008528.tif 000007
【００４３】
【発明の効果】
本発明におけるアブラナ科植物根こぶ病の防除剤または防除方法を用いれば、アブラナ科植物根こぶ病の病害に対して発病を強く抑制することができ、現在使用されている化学薬剤と同等以上の効果を奏する。
【００４４】
また、本発明の防除剤の使用は既存の化学薬剤のように農薬による環境汚染を引き起こすことはない。さらに、本発明の防除剤は市場において安定な状態で流通させることができる。