(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なフコース硫酸含有多糖分解酵素及びその遺伝子を提供する。【解決手段】  Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは該配列に１個もしくは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがされたアミノ酸配列からなり、かつ下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖を低分子化し、フコース硫酸含有オリゴ糖化合物を遊離させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離された遺伝子。（ａ）構成糖：ウロン酸を含有する。（ｂ）フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素によって分解される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号３〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは該配列に１個もしくは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがされたアミノ酸配列からなり、かつ下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖を低分子化し、下記式〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、〔ＩＩＩ〕及び〔ＩＶ〕から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離された遺伝子。
（ａ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｂ）フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素によって分解される。
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【請求項２】
ポリペプチドがフラボバクテリウム属細菌由来のものである請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列表の配列番号７〜８のいずれかで表されるＤＮＡ配列、若しくは該配列に１個もしくは複数の塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがされたＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３記載の遺伝子と厳密な条件においてハイブリダイズすることができ、かつ下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分化し、下記式〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、〔ＩＩＩ〕及び〔ＩＶ〕から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子。
（ａ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｂ）フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素によって分解される。
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【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５記載の組換えＤＮＡが挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、該培養物よりフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とするフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
配列表の配列番号３〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列、若しくは該配列に１個もしくは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがされたアミノ酸配列を含み、かつ下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化し、下記式〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、〔ＩＩＩ〕及び〔ＩＶ〕から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる活性を有するポリペプチド。
（ａ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｂ）フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素によって分解される。
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコース硫酸含有多糖の構造解析や該多糖の低分子化物の調製に有用なフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、及び該方法によって得られるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
海藻由来のフコース硫酸含有多糖は、総称的にフコイダンと呼ばれるフコースを主成分とする硫酸化多糖であり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マンノース、グルコース等をも含むものが知られている。これらの構成糖の種類や量は、由来となる海藻の種類によって異なる。例えば、市販シグマ社製のフコイダンを１３種もの分子種に分けたという報告がある。〔カーボハイドレート  リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２５５巻、第２１３〜２２４頁（１９９４）〕
【０００３】
これらを大別すれば、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ウロン酸を含み構成糖にフコースやマンノースを含むものの２種類に分けられる。
【０００４】
フコース硫酸含有多糖の生物活性についてはマクロファージ活性増強、癌転移抑制、抗凝血等様々なものが報告されていたが、フコース硫酸含有多糖には分子種があるため活性の本体がどの分子種にあるかを調べるためにはフコース硫酸含有多糖を分離精製して調べる必要があった。しかし以前の方法ではその分離が不十分なため薬品として大量調製が困難なものであった。また、フコース硫酸含有多糖は極めて分子量が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用いるには、抗原性、均一性、抗凝血活性などの問題があるので、フコース硫酸含有多糖をある程度分解することが必要とされていた。
【０００５】
フコース硫酸含有多糖を酵素的に分解して低分子化物を調製する方法は、穏和な条件で反応が行なえるとともに酵素の基質特異性から、均一な低分子化物を得られる有利な方法である。従来よりアワビ、ホタテ貝、ウニ、海生微生物などがフコース硫酸含有多糖を分解する酵素を生産していることが報告されている。しかし、これらの酵素は一般に生体内に微量に含まれているうえに複数のフコース硫酸含有多糖分解酵素を持っているために単一の酵素を得る為に様々な精製工程が必要となっていた。さらにこれらの酵素のアミノ酸配列や遺伝子構造などは全く明らかとされていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、フコース硫酸含有多糖の調製や構造解析、また低分子化フコース硫酸含有多糖の調製に有用なフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及び該遺伝子を用い遺伝子工学的に得ることのできるフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び塩基配列を明らかにするため、フコース硫酸含有多糖分解酵素を産生する微生物の遺伝子について鋭意研究を進めた結果、アルテロモナス属細菌、フラボバクテリウム属細菌由来のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が各２種存在することを明らかにすると共に、その全塩基配列を確定し、該ポリペプチドのアミノ酸配列を初めて明らかにし、更に該遺伝子を用いてフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを工業的に有利に生産する方法をも開発することに成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する単離された遺伝子に関する。
【０００９】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡに関する。
【００１０】
本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の組換えＤＮＡを挿入されてなる微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクターに関する。
【００１１】
本発明の第４の発明は、本発明の第３の発明の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。
【００１２】
本発明の第５の発明は、本発明の第４の発明の形質転換体を培養し、該培養物よりフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とするフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。
【００１３】
本発明の第６の発明は、配列表の配列番号１〜４で表されるいずれかのアミノ酸配列を有し、かつフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドに関する。
図面の簡単な説明
図１はＯＲＦ−１とＯＲＦ−２の位置を示す図である。
図２はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示す図である。
図３はｆｄｌＡの位置を示す図である。
図４はｆｄｌＢの位置を示す図である。
図５はＤＥＡＥ−セファロースＦＦを用いたクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１５】
本発明は、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に関する。該遺伝子にコードされるポリペプチドの一例としては、アルテロモナス属細菌由来の下記（１）のエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドがあげられる。
（１）下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖（以下、フコース硫酸含有多糖−Ｆと称す）に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化させる。
（ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。
（ｂ）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
【００１６】
このフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドとしては、アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９が産生するエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素があり、該酵素は参考例１−（３）記載のように調製することができる。
【００１７】
上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆは、参考例１に記載のように調製することができる。
【００１８】
またフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素は参考例５記載のように調製することができる。
【００１９】
フコース硫酸含有多糖分解活性を有する他のポリペプチドとしてはフラボバクテリウム属細菌由来の下記（２）のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドが例示される。
（２）下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖（以下、フコース硫酸含有多糖−Ｕと称す）に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化し、下記式〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、〔ＩＩＩ〕及び〔ＩＶ〕から選択される少なくとも１以上の化合物を遊離させる。
（ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。
（ｄ）フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素によって分解される。
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【００２０】
このフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドとしてはフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２が産生するフコイダン分解酵素があり、該酵素は参考例５記載のように調製することができる。
【００２１】
なおフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕの混合物は、フコース硫酸含有多糖混合物と以下記載する。
【００２２】
本発明においてフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドとは、天然型のフコース硫酸含有多糖分解酵素のみならず、フコース硫酸含有多糖分解活性を有する限り天然型のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味である。
【００２３】
また、ここで言う天然型フコース硫酸含有多糖分解酵素としては、例えばアルテロモナス属細菌、フラボバクテリウム属細菌由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、その他の細菌類はもちろん、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物等の生物体由来のものも含まれる。
【００２４】
本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。
【００２５】
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多型や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
【００２６】
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと解釈される。
【００２７】
例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）〕。
【００２８】
更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的タンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
【００２９】
また、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個もしくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子も、天然由来の単離されたものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。
【００３０】
一般に遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
【００３１】
また、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
【００３２】
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。
【００３３】
また、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子と厳密な条件においてハイブリダイズすることができ、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明に含まれる。
【００３４】
以下、アルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９及びフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２を例として本発明を具体的に説明する。
【００３５】
このアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９は、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＳＮ−１００９と表示され、平成８年２月１３日（原寄託日）より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）〕に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７として国際寄託されている。またフラボバクテリウム  ｓｐ．  ＳＡ−００８２は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＡ−００８２と表示され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２として国際寄託されている。
【００３６】
アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９又はフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２が産生するフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を取得するには、例えば、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法、あるいはこれらを組合わせた方法を利用することができる。これらの方法には該遺伝子にハイブリダイズ可能なプローブ、あるいはＰＣＲ法によって該遺伝子またはその一部を増幅可能なプライマーが必要であるが、これらの菌株の産生するフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列や遺伝子構造は全く知られていないため、プローブあるいはプライマーとして利用可能な合成オリゴヌクレオチドを作製することができない。そこでまず、上記微生物の産生するフコース硫酸含有多糖分解酵素の部分アミノ酸配列を決定し、プローブあるいはプライマーとして利用可能な合成オリゴヌクレオチドの作製を検討する。
【００３７】
まず、例えばアルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９又はフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２を培養し、次いでその培養物から、産生されたフコース硫酸含有多糖分解酵素をそれぞれ単離、精製する。
【００３８】
次に、精製された各フコース硫酸含有多糖分解酵素について、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定するには、例えばフコース硫酸含有多糖分解酵素を直接常法に従ってエドマン分解法によるアミノ酸配列分析（例えばプロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド  バイオシステムズ社製、を用いることができる）に供することにより、フコース硫酸含有多糖分解酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定する。あるいは、精製フコース硫酸含有多糖分解酵素に、特異性の高い蛋白質加水分解酵素、例えばアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相系ＨＰＬＣを用いて分離、精製した後、精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行えば、多くのアミノ酸配列情報が得られる。
【００３９】
こうして得られるフコース硫酸含有多糖分解酵素に特異的な部分アミノ酸配列に関する情報を選択し、該情報をもとに塩基配列の縮重したオリゴヌクレオチドをデザインし合成する。このとき縮重の程度が低く長いオリゴヌクレオチド、言換えれば、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に特異性の高いオリゴヌクレオチドを合成することが必要であり、オリゴヌクレオチドのデザインがフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングに重要な要因となる。
【００４０】
次にサザンハイブリダイゼーション法によって合成オリゴヌクレオチドとフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との特異的ハイブリダイゼーションの条件を検討する必要がある。
【００４１】
例えば、アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９又はフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、常法に従いナイロン膜等にブロッティングする。ハイブリダイゼーションは、まず、例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、８．７７ｇの塩化ナトリウム及び４．４１ｇのクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物）、１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５℃で数時間保温してナイロン膜をブロッキングした後、例えば３２Ｐ等でラベルした合成オリゴヌクレオチドを加えて４２℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで４２℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。このとき、用いた合成オリゴヌクレオチドの長さやフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との相補性によって、保温温度や洗浄溶液の塩濃度等を検討し最適条件を選ぶのが効果的である。
【００４２】
このようにして検出されたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得る方法としては、直接検出されたバンドの位置に相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製した後、通常用いられる宿主−ベクター系のベクターに組込んだライブラリーを作製し、サザンハイブリダイゼーション法と同様の条件でコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを行って、目的のＤＮＡ断片を含むクローンをスクリーニング、単離すればよい。あるいは直接アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９又はフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、通常用いられる宿主−ベクター系のベクターに組込んだライブラリーを作製し、同様にハイブリダイゼーション法で目的のＤＮＡ断片を含むクローンをスクリーニング、単離してもよい。
【００４３】
用いられる宿主−ベクター系としては公知のものが使用でき、例えば大腸菌を宿主としたｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのプラスミドベクター、あるいはラムダファージなどのファージベクター等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００４４】
これら宿主−ベクター系の種類や取扱い方法は一般に用いられる種類や方法を用いれば良く、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）〔Ｊ．サムブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか著、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー１９８９年発行〕に記載されている。
【００４５】
目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選別できれば、このベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えばジデオキシ法〔プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７４巻、第５４６３頁（１９７７）〕により決定することができる。決定された塩基配列をフコース硫酸含有多糖分解酵素のＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量などと比較することによって、得られたＤＮＡ断片中の遺伝子の構造及び該遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を知ることができる。
【００４６】
また、上記のフコース硫酸含有多糖分解酵素の部分アミノ酸配列をもとに得られたオリゴヌクレオチドを用いてフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得る方法として、ＰＣＲ法を用いることができる。中でもカセットＤＮＡを用いたＰＣＲ法は、短時間で少ないアミノ酸配列情報からハイブリダイゼーション法に使用可能な目的遺伝子の断片を得る方法である。
【００４７】
例えば、フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２の培養菌体から常法にしたがって抽出したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、既知の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮＡ）を連結する。この混合物を鋳型として、上記の部分アミノ酸配列の情報をもとにデザインした該遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとカセットＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（カセットプライマー）とを用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することが可能である。カセットＤＮＡあるいはカセットプライマーについては例えばタカラバイオ社製のものを利用することができる。カセットＤＮＡは、２種類のカセットプライマーに対応する配列を含んでいるものが好ましく、まず連結した制限酵素サイトから遠い方のプライマーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行い、その反応液の一部を鋳型としてさらに内側のプライマーを用いて２回目のＰＣＲ反応を行うと効果的である。さらに、該遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーについても、並んで２種類をデザイン、合成し、上流のプライマーを１回目のＰＣＲ反応に用い、２回目のＰＣＲ反応では下流のプライマーを用いると該遺伝子の特異性が高くなり、目的ＤＮＡ断片の特異的な増幅の可能性が高くなる。
【００４８】
しかしながら、目的の遺伝子の塩基配列は不明であるため、カセットＤＮＡの連結に用いた制限酵素サイトが部分アミノ酸配列をコードする領域からＰＣＲによる増幅反応に適当な位置にあるとは限らない。そのため、多くの種類の制限酵素サイトのカセットＤＮＡを用いてみる必要がある。また、ＰＣＲは、例えばＰＣＲテクノロジー〔ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ．Ａ．）編集、ストックトンプレス社、１９８９年発行〕に記載されているような、一般に用いられている条件で行うことができるが、用いた合成オリゴヌクレオチドの長さやフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子との相補性によって、アニーリング温度、サイクル数、マグネシウム濃度、耐熱性ポリメラーゼ濃度等を検討し、非特異的な増幅バンドが最も少なくなるような最適条件を選ぶ必要がある。
【００４９】
ＰＣＲ反応液は、アガロースゲルなどの電気泳動に供し、増幅したＤＮＡ断片を確認する。これら断片は、常法に従って抽出、精製し、通常に用いられるｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などのクローニングベクターに挿入後、例えばジデオキシ法により塩基配列を解析することができる。あるいは回収した増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応に用いたカセットプライマーを用いて直接塩基配列を解析してもよい。その結果、プライマーの配列以外に、先に決定したフコース硫酸含有多糖分解酵素の部分アミノ酸配列をコードしているものが得られれば、該酵素をコードする遺伝子あるいはそれにホモロジーを示す遺伝子の断片が得られたことになる。
【００５０】
このようにしてサザンハイブリダイゼーション法あるいは、ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片が目的の酵素をコードする遺伝子の一部であった場合には、該ＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションによるゲノムライブラリーのスクリーニングを行なうか、あるいは該ＤＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行なうことにより、目的の酵素をコードする遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
【００５１】
さらに上述のように得られたフコース硫酸含有多糖分解酵素遺伝子あるいは、その一部をプローブとしてアルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９又はフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション法によって解析すれば、検出されたバンドの位置から、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むアルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９又はフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡ制限酵素断片サイズの情報が得られ、また、検出されたバンドの数によって、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子およびそれに相補性を示す遺伝子の数が予想され、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片は、前述と同様の方法により単離することができる。
【００５２】
このようにして得られたＤＮＡ断片が目的の酵素をコードする遺伝子を含むかどうかは、最終的に単離された該ＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製し、該ベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いでこの形質転換体の培養を行い、発現されたポリペプチドのフコース硫酸含有多糖分解活性を測定することにより確認することができる。
【００５３】
本発明においてはアルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９より、配列表の配列番号１及び配列番号２でそれぞれ表されるアミノ酸配列を有し、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子が単離された。配列番号１及び配列番号２でそれぞれ表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列の例を、配列表の配列番号５及び配列番号６にそれぞれ示す。
【００５４】
またフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２より、配列表の配列番号３及び配列番号４でそれぞれ表されるアミノ酸配列を有し、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子が単離された。配列番号３及び配列番号４でそれぞれ表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列の例を、配列表の配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示す。
【００５５】
本発明の遺伝子の塩基配列を用いて、フコース硫酸含有多糖分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をハイブリダイゼーションにより得る方法としては、例えば以下の方法が適用できる。
【００５６】
まず目的の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素により作製したｃＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を例えば３２Ｐ等で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列、又はその一部をコードする塩基配列であればよく、例えば、配列表の配列番号５〜８のいずれかで表される塩基配列、又はその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流した後、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的のポリペプチドをコードする遺伝子が挿入されている。
【００５７】
得られた遺伝子は、例えば次のように塩基配列を決定し、得られた遺伝子が目的のフコース硫酸含有多糖分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかを確認する。
【００５８】
塩基配列の決定は、形質転換体がプラスミドで形質転換された大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファージベクターが用いられた場合も基本的に同様のステップにより塩基配列を決定することができる。これらの培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第二版〔Ｊ．サムブルークほか著、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  １９８９年発行〕等に記載されている。
【００５９】
得られた遺伝子が目的のフコース硫酸含有多糖分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列あるいはそのコードしているアミノ酸配列を本発明の配列表の配列番号５〜８のいずれかで表される塩基配列あるいは配列表の配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と比較する。
【００６０】
得られた遺伝子がフコース硫酸含有多糖分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする領域のすべてを含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の遺伝子にハイブリダイズするフコース硫酸含有多糖分解活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドの全コード領域の塩基配列を決定することができる。
【００６１】
一方、本発明の遺伝子の塩基配列からＰＣＲ反応用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって本発明の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、更にはその遺伝子全体を得ることもできる。
【００６２】
次に得られた遺伝子を発現させ、フコース硫酸含有多糖分解活性を測定し、得られた遺伝子の機能を確定する。
【００６３】
本発明のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を用いてフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを生産するには、以下の方法が便利である。
【００６４】
まず、目的のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いでこの形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを産生させることができる。このとき該ポリペプチドは封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形で産生されることもある。宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等の培養細胞を用いることができる。
【００６５】
発現の確認は、例えばフコース硫酸含有多糖分解活性を測定することにより行うのが便利である。活性測定は、例えば組換体大腸菌の細胞抽出液を酵素液として測定することができる。
【００６６】
目的のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドの発現が認められた場合は、例えば形質転換体が大腸菌であれば、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、インデューサーの使用量・使用時期、培養時間等につき、最適条件を決定することによって効率よくフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
【００６７】
形質転換体の培養物からフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを精製するには通常の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌の場合のように細胞内にフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドが蓄積するときは、培養終了後遠心分離によって形質転換体を集め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等によって、無細胞抽出液を得る。これより、塩析や、イオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法を使用して目的のポリペプチドを精製することができる。用いる宿主−ベクター系によっては発現産物が形質転換体外に分泌される場合があるが、この場合は培養上清から同様に精製を行えばよい。
【００６８】
形質転換体が産生するフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドは、それが菌体内に産生されるときは菌体内の諸酵素が共存するが、これらはフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドの量に比べ微量に過ぎないため、その精製は極めて容易である。さらに、宿主として用いる細胞を選べば、フコース硫酸含有多糖に作用する宿主由来の酵素は、大幅に低減される。また、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドが菌体外に分泌される場合は、培地成分等が共存するが、これらは容易にフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドと分離できる。
【００６９】
また、例えば宿主が大腸菌の場合、発現産物が不溶性の封入体として形成されることがある。この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等を行うことにより封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリホールディング操作を行うことによって活性を保持した目的のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを得ることができる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度のフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００７０】
なお、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドと機能的に同等の活性を有するポリペプチドを生産する場合も同様の生産方法、精製方法を用いればよい。
【００７１】
このように本発明により、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドの一次構造及び遺伝子構造が提供される。また、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な製造が可能となる。
【００７２】
本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安価に高純度なフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドを得ることが可能となる。
【００７３】
以上、フコース硫酸含有多糖分解酵素を産生するアルテロモナス属細菌又はフラボバクテリウム属細菌を培養してフコース硫酸含有多糖分解酵素を生産する方法は、同時にプロテアーゼや他の多糖分解酵素が生産されるため、目的のフコース硫酸含有多糖分解酵素を単離するためには、極めて厄介なこれら酵素との分離精製が必要であり、また、酵素の生産を誘導するために培養時に培地に高価なフコース硫酸含有多糖を添加しフコース硫酸含有多糖分解酵素を誘導する必要があったが、本発明により安価に、高純度なフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドの提供が可能となった。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
参考例１
（１）乾燥ガゴメ昆布２ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノール中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程を更に３回繰返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残渣に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、８０％のエタノールで繰返し洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００を懸濁し、撹拌後ろ過し、樹脂を除いた。このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムにかけ、素通り画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物８２．２ｇを得た。
【００７６】
（２）上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物７ｇを７００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじめ０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した４０００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜４Ｍの塩化ナトリウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が０．９〜１．５Ｍで溶出してくる画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を４．７ｇ得た。
【００７７】
また塩化ナトリウム濃度が０．０５〜０．８Ｍで溶出してくる画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖−Ｕの凍結乾燥標品を２．１ｇ得た。
【００７８】
（３）アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２５時間培養して種培養液とした。  ペプトン２００ｇ、酵母エキス４ｇ、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）４ｍｌを含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れて１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、別に１２０℃、１５分殺菌した２リットルの人工海水に溶解した２０ｇの参考例１−（１）の方法を用いて調製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Ｆを添加し、また上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。
【００７９】
培養上清中のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性をフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用い、参考例２記載の方法で測定したところ、１０ｍＵ／ｍｌ・培養液であった。
【００８０】
得られた培養上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去し、８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、４００ｍｌの粗酵素を得た。
【００８１】
得られた粗酵素液を、あらかじめ５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、同緩衝液中に１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、及び６００ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶液で溶出し、活性画分を集めた。
【００８２】
得られた活性画分の酵素活性を参考例２記載の方法で測定したところ、２０４００ｍＵ（２０．４Ｕ）であった。
【００８３】
得られた活性画分を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後，１０ｍＭの塩化カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．２を添加しながら限外ろ過し、完全に緩衝液を置換した。
【００８４】
得られた酵素溶液を、あらかじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの同緩衝液で更に洗浄し、その後１５０ｍＭから４００ｍＭの塩化ナトリウムを含む同緩衝液にて塩化ナトリウムのグラジエント溶出を行った。
【００８５】
得られた活性画分を集め、限外ろ過で濃縮後、セファクリルＳ―２００によるゲルろ過を行った。溶出液には、５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０分の１濃度のジャマリンＳを含む１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液ｐＨ８．０を用いた。なお該クロマトグラフィーにより分子量を求めたところ約１０万であった。
【００８６】
得られた活性画分を集め、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭの塩化カリウム、及び４．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、あらかじめ塩化ナトリウム濃度が４Ｍの同緩衝液で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂのカラムにかけ、４Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍ、０．５Ｍ、及び０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液にて溶出した。
【００８７】
得られた活性画分を集め、限外ろ過により濃縮後、１０ｍＭの塩化カルシウム、１０ｍＭの塩化カリウム、及び１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を添加しながら限外ろ過し、完全に緩衝液を置換した。この酵素液をあらかじめ、同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００にかけ、同緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから３５０ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエント溶出を行った。
【００８８】
得られた活性画分を集め、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む同緩衝液にて充分透析後、あらかじめ５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから１５０ｍＭの塩化ナトリウムによるグラジエント溶出を行った。得られた活性画分をまとめて、精製酵素を得た。
【００８９】
また、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミド電気泳動により該精製酵素の分子量を求めたところ約９万であった。
【００９０】
参考例２
参考例１−（２）の工程により得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆを用いてエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を下記のように測定した。
【００９１】
すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と９μｌの４Ｍ塩化ナトリウム溶液と、６０μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩衝液（ｐＨ７．５）と２１μｌの水と、１２μｌの分解活性測定用被検液とを混合し、３０℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の程度を測定した。
【００９２】
対照として、分解活性測定用被検液の代りに、被検液に使用している緩衝液を用いて同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００９３】
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定量は下記式により求めた。
｛（１２×２．５）／（１００×ＭＦ）｝×｛（ＭＦ／Ｍ）−１｝×｛１／（１８０×０．０１）｝×１０００＝Ｕ／ｍｌ
（１２×２．５）／１００：反応系中に添加したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ｍｇ）
ＭＦ：基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量
Ｍ：反応生成物の平均分子量
（ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆが酵素により切断された数
１８０：反応時間（分）
０．０１：酵素液量（ｍｌ）
なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６（８ｍｍ×３００ｍｍ）（昭和電工社製）
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）
検出：示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工社製）
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：２５℃
【００９４】
反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
【００９５】
参考例３
参考例１―（２）の工程で得られたフコース硫酸含有多糖―Ｕを用いてフコース硫酸含有多糖分解活性を下記のように測定した。
２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ溶液５０μｌと、１０μｌの分解活性測定用被検液と、６０μｌの６６７ｍＭ塩化ナトリウムを含む８３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液１０５μｌと水２ｍｌを混合、攪拌し、その２３０ｎｍにおける吸光度（ＡＴ）を測定する。対照として、分解活性測定用被検液の代りに、被検液に使用している緩衝液のみを用いて同様の条件により反応させたもの、およびフコース硫酸含有多糖−Ｕ溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ同様に吸光度を測定する（ＡＢ１およびＡＢ２）。
【００９６】
１単位の酵素は、上記反応系において１分間に１μｍｏｌのマンノースとウロン酸の間のグリコシド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミリモル分子吸光係数を５．５として計算し行う。なお、酵素の活性は下記式に従って算出した。
【００９７】
（ＡＴ−ＡＢ１−ＡＢ２）×（２．１０５×１２０／５．５×１０５×
０．０１×１８０）＝Ｕ／ｍｌ
式中、
２．１０５は吸光度を測定するサンプルの液量（ｍｌ）、
１２０は酵素反応液の液量（μｌ）、
５．５は不飽和ウロン酸の２３０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数（／ｍＭ）、
１０５は希釈に用いる反応液の液量（μｌ）、
０．０１は酵素液量（ｍｌ）、
１８０は反応時間（分）
である。
【００９８】
参考例４
（１）フコース硫酸含有多糖−Ｆ及びフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により求めたところ、各々約１９万を中心とした分子量分布を示した。
（２）フコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリウム濃度における、過剰量のセチルピリジニウムクロリド存在下における沈殿形成性を図２に示す。
【００９９】
図２の縦軸は沈殿形成率（％）を示し、横軸は塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。図中、実線及び白丸はフコース硫酸含有多糖−Ｕの各塩化ナトリウム濃度での沈殿形成率を示し、図中、点線及び白三角はフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリウム濃度（Ｍ）での沈殿形成率を示す。
【０１００】
沈殿形成率の測定は、溶液温度３７℃にて、以下のように行った。
フコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれ２％の濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、これらを様々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解したフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液を各１２５μｌずつ調製した。次に、セチルピリジニウムクロリドを２．５％の濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合することにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した１．２５％のセチルピリジニウムクロリド溶液を調製した。
【０１０１】
水に溶解している２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．２５％のセチルピリジニウムクロリドで完全に沈殿させるには容量で３．２倍必要であった。そこで、各濃度の塩化ナトリウムに溶解した２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの各１２５μｌに対して各々の濃度の塩化ナトリウムに溶解したセチルピリジニウムクロリド溶液を４００μｌ添加後、十分撹拌し、３０分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフェノール−硫酸法［アナリティカル  ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）］により測定し、各塩化ナトリウム濃度下での各フコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を算出した。
【０１０２】
（３）フコース硫酸含有多糖−Ｆの成分を以下に示す方法で分析した。
まず、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の記載に従いフコース量を定量した。
【０１０３】
フコース硫酸含有多糖−Ｆの乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。グライコタッグ（ＧｌｙｃｏＴＡＧＴＭ）及びグライコタッグ  リージェント  キット（ＧｌｙｃｏＴＡＧＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）（共にタカラバイオ社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。
【０１０４】
次に、アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４巻、第３３０頁（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。
また、バイオケミカル  ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫酸含量を定量した。
【０１０５】
このフコース硫酸含有多糖−Ｆの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル比は約１０：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
【０１０６】
フコース硫酸含有多糖−Ｕの成分を上記方法に準じ測定した。その結果、フコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトース、グルコース、ラムノース、キシロース、ウロン酸であった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基はモル比で約１０：７：４：５：２０であった。
【０１０７】
（４）このフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−１３５度であった。
またフコース硫酸含有多糖−Ｕの比旋光度は−５３．６度であった。
【０１０８】
（５）１％のフコース硫酸含有多糖−Ｆ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの下記参考例５に記載のエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応による分解物の生成は認められなかった。
【０１０９】
上記条件でフコース硫酸含有多糖−Ｕと参考例５に記載のフコイダン分解酵素を２５℃で４８時間反応させた。反応の進行と共に２３０ｎｍの吸光度が増加することを確認し、本酵素によりフコース硫酸含有多糖−Ｕが分解されていることが判明した。
【０１１０】
参考例５
参考例４記載のフコイダン分解酵素は以下の方法により調製される。該フコイダン分解酵素の生産に用いる菌株としては、該酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体例としては例えば、フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）が挙げられる。
【０１１１】
本菌株は青森県の海水中より新たに検索して得た菌株で、この菌株はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＡ−００８２と表示され、平成７年３月２９日（原寄託日）より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２の受託番号で国際寄託されている。
【０１１２】
本菌株の培地に加える栄養源は使用する菌株が利用し、フコイダン分解酵素を生産するものであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
【０１１３】
本フコイダン分解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、一般に培養温度は１５℃〜３０℃、培地のｐＨは５〜９がよく、５〜７２時間の通気撹拌培養で本フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本フコイダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するのは当然のことである。
【０１１４】
本フコイダン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
【０１１５】
上記のフラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
【０１１６】
次いで、この抽出液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製を行い、純化された本フコイダン分解酵素を得ることができる。
【０１１７】
また、上記の培養液から菌体を除去した培養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することができる。
【０１１８】
フコイダン分解酵素の精製例を示す。
フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）をグルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２４時間培養して種培養液とした。グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％、及び消泡剤（信越化学工業製、ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
【０１１９】
この菌体を、２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中のフコイダン分解酵素の活性を参考例３記載の方法で測定したところ、培地１ｍｌ中に５ｍＵの活性が検出された。なお、活性測定については後に記載する。
【０１２０】
本抽出液に、終濃度が９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、撹拌溶解後、遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭの塩化ナトリウムの直線濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。次に、この活性画分に終濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、４Ｍから１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。次に、この活性画分を限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル  Ｓ−３００（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分子量をセファクリル  Ｓ−３００の保持時間から求めたところ約４６万であった。次にこの活性画分に２５ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透析した。この酵素液を、あらかじめ２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ）  Ｑ  ＨＲ５／５（ファルマシア社製）のカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、２５０ｍＭから４５０ｍＭの塩化ナトリウムの直線濃度勾配により溶出させ、活性画分を集め、精製酵素を得た。以上の精製工程を表１に示す。なお、タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行う。その際１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算する。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
また、下記の方法によってもフコイダン分解酵素を精製することができる。
フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を、グルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２０時間培養して種培養液とした。ガゴメ昆布由来のフコイダン０．３％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養液上清を得た。本培養で得られた菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体抽出液中のフコイダン分解酵素の活性を測定したところ、培地１ｍｌ中に２０ｍＵの活性が検出された。
【０１２３】
一方、この培養液上清を限外ろ過（ろ過膜の排除分子量１万）（アミコン社製）により濃縮し、フコイダン分解酵素を測定したところ培養液１ｍｌ当り６ｍＵの活性が検出された。
【０１２４】
上記の培養液上清の濃縮液に、終濃度が９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、撹拌溶解後遠心分離し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で十分透析した。透析により生じた沈殿を遠心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液にて十分洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が４Ｍとなるように食塩を加え、あらかじめ４Ｍの食塩を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロース  ＣＬ−４Ｂのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で十分洗浄後、４Ｍから１Ｍの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を限外ろ過器（アミコン社製）で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル  Ｓ−２００でゲルろ過を行い活性画分を集めた。次にこの活性画分に終濃度が３．５Ｍとなるように食塩を加え、あらかじめ３．５Ｍの食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロース  ＨＰのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝液で洗浄後、３．５Ｍから１．５Ｍの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集めて精製酵素を得た。この酵素の分子量をセファクリル  Ｓ−２００の保持時間から求めたところ約７万であった。
【０１２５】
実施例１
（１）エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の生産菌株であるアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地５００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２３時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、その半量の菌体を１０ｍｌの抽出緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）〕中に懸濁後、１ｍｌの抽出緩衝液に溶解した２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を添加し、氷浴上で３０分間保冷した。次いで、１０ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液〔１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ〕を添加した後、５０℃で２時間保温した。この後室温に戻し、等容のＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕飽和フェノールを加えて１時間穏やかに撹拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した（以降この操作をフェノール抽出と略す）。
【０１２６】
この上層に、等容のＴＥ緩衝液飽和フェノール／クロロホルム１：１を加えて穏やかに撹拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した（以降この操作をフェノール／クロロホルム抽出と略す）。再度フェノール／クロロホルム抽出を行った後、水層に０．１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加え更に２倍量のエタノールを加えてＤＮＡを析出させガラス棒で巻取った後、８０％エタノールでリンスして軽く風乾した。このゲノムＤＮＡを２０ｍｌの２０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡが溶解したＴＥ緩衝液中に溶解させ、３７℃で５時間保温してＲＮＡを分解した。フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出の後、先と同様にしてエタノール添加後ＤＮＡ回収し、５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ約２０ｍｇを得た。
【０１２７】
（２）実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ１００μｇを１０ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと３７℃で１分４０秒間消化し部分分解後、フェノール／クロロホルム抽出し上層を回収した。上層に１／１０倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）及び２．５倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収した後、８０％エタノールでリンスして風乾した（以降この操作をエタノール沈殿と略す）。得られた部分分解物を、１．２５−５Ｍ塩化ナトリウム密度勾配超遠心法によりサイズ分画を行い、１０〜２０ｋｂｐのサイズを含む画分からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたゲノムＤＮＡ部分分解物０．１８μｇとノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）社製ラムダブルースターＢａｍＨＩアーム（λ  Ｂｌｕｅ  ＳＴＡＲ  ＢａｍＨＩ  ａｒｍ）０．６μｇと混ぜ、タカラバイオ社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた後、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製ギガパックＩＩゴールドキット（ＧｉｇａＰａｃｋ  ＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｋｉｔ）を用いてラムダファージにパッケージングを行い、アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１２８】
（３）参考例１−（３）で得たアルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９の精製エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素タンパク質２００ｐｍｏｌを、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化した脱塩用のカラム（ファーストデソルティングカラムＰＣ３．２／１０、ファルマシア社製）にアプライ後、同緩衝液で溶出し、緩衝液を置換した。溶出液をガラスバイアルに集め濃縮乾固後、ピリジン１０μｌ、４−ビニルピリジン２μｌ、トリ−Ｎ−ブチルフォスフィン２μｌ、水１０μｌの入った一回り大きなガラス試験管の中にガラスバイアルごと試料を入れ、ガラス試験管を封管した後、９５℃で１０分間反応させてピリジルエチル化した。反応終了後ガラスバイアルを取出し、数回水と共沸させて揮発性成分を除いた。
【０１２９】
得られたピリジルエチル化されたフコース含有多糖分解酵素タンパク質に、４０μｌの８Ｍ尿素を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、９０μｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）及び０．５ｐｍｏｌのアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ（タカラバイオ社製）を加え、３０℃で一晩消化し、得られた消化物からペプチド断片をＨＰＬＣシステム（スマートシステム、ファルマシア社製）にて精製した。カラムは、μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０（ファルマシア社製）を用い、１００μｌ／ｍｉｎの流速で行った。溶出は、溶出液として０．１２％トリフルオロ酢酸水溶液（溶出液Ａ）及び０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（溶出液Ｂ）を用い、溶出液Ｂの割合を０％でサンプルをアプライし、９０分間で溶出液Ｂの割合を５５％にまであげる直線濃度勾配法にて溶出し、分離精製した。各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い、部分アミノ酸配列Ｆ２７（配列番号９）、Ｆ３４（配列番号１０）、Ｆ４７（配列番号１１）、Ｆ５２（配列番号１２）を決定した。
【０１３０】
（４）実施例１−（１）で調製したゲノムＤＮＡ２０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、及びＸｂａＩ各１００ユニットで各々３７℃で４時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出した。消化物をエタノール沈殿により回収し、各１０μｇを更に同じ制限酵素５０ユニットで各々３７℃で１６時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により消化物を回収した。この消化物各５μｇを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、サザンブロット法（文献：遺伝子研究法ＩＩ、第２１８〜２２１頁、東京化学同人）により、アマシャム社製ナイロン膜〔商品名  ハイボンドＮ＋（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）〕にＤＮＡを転写した。
【０１３１】
ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列Ｆ２７（配列番号９）から混合オリゴヌクレオチドｐＦＤＡ２７（配列番号１３）を合成し用いた。合成オリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌをメガラベルキット（ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ  ＫＩＴ、タカラバイオ社製）を用いて３２Ｐで標識した。
【０１３２】
上記調製したフィルターを６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃で３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを０．５ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるように加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、まず６×ＳＳＣ中室温で１０分間、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温で１０分間、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、４２℃で３０分間洗浄し、余分な水分を除いた後、富士フィルム社製イメージングプレートに３０分間露光した後、富士フィルム社製ＢＡＳ２０００イメージングアナライザーにて検出した。
【０１３３】
その結果、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化物で２３ｋｂｐ以上の位置、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物で約４．８、１．４、及び０．３ｋｂｐの位置、ＰｓｔＩ消化物で２３ｋｂｐ以上及び３．６ｋｂｐの位置、ＳａｃＩ消化物で２３ｋｂｐ以上及び９．８ｋｂｐの位置、ＳｐｈＩ消化物で２３ｋｂｐ以上、４．９ｋｂｐ、及び３．０ｋｂｐの位置、ＸｂａＩ消化物で約１２、５．２、及び３．５ｋｂｐの位置に、それぞれプローブとハイブリダイズするバンドを認めた。
【０１３４】
実施例１−（２）で調製したアルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９のゲノムＤＮＡライブラリーからフコース硫酸含有多糖分解酵素遺伝子を含むクローンを、ノバジェン社のラムダブルースター取扱説明書に従って、プラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。まず、ファージライブラリーを大腸菌ＥＲ１６４７に感染させ、直径８．５ｃｍのＬ培地プレート４枚に、１枚当り約５００個のプラークを形成させた。このプレートにアマシャム社製ナイロン膜〔商品名  ハイボンドＮ＋〕を１枚目は約３０秒間、２枚目は約２分間接触させ、各プレート２枚ずつファージを写し取った。このナイロン膜を０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムの溶液に浸したろ紙上で５分間変性処理し、次いで、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ塩化ナトリウムの溶液に浸したろ紙上で５分間中和処理した後、２×ＳＳＣでリンスした。このナイロン膜と合成オリゴヌクレオチドｐＦＤＡ２７（配列番号１３）を、前述のサザンハイブリダイゼーションと同じ条件でハイブリダイゼーション、洗浄、検出したところ、１８個のポジティブシグナルが得られた。元のプレートよりポジティブシグナル付近のプラークをかきとり、ＳＭ緩衝液に懸濁し、再度、新しいプレートにプラークを形成させ、同様の操作を繰返すことにより１４個のポジティブシグナルを与えるファージを単離した。
【０１３５】
ノバジェン社のラムダブルースター取扱説明書に従って、得られた各ファージを大腸菌ＢＭ２５．８に感染させたのちアンピシリン耐性のコロニーを選択し、ファージをプラスミドの形に変換した。得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法により再度プラスミドＤＮＡを調製した。得られた各クローンのプラスミドをそれぞれｐＳＦＤＡ１、２、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１６、及びｐＳＦＤＡ１７と命名した。
【０１３６】
各プラスミドをそれぞれ、ラムダブルースターベクターのクローニングサイトの両端にある制限酵素ＮｏｔＩで消化し、０．３％アガロースゲル電気泳動により解析したところ、８．４〜１７．４ｋｂｐの断片が挿入されていることが明らかとなった。また、各プラスミドをそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前述したようにサザンブロッティングの後、合成オリゴヌクレオチドｐＦＤＡ２７（配列番号１３）によりハイブリダイゼーションを行って解析を行ったところ、約４．８ｋｂｐのバンドを与えるもの（ｐＳＦＤＡ１、及びｐＳＦＤＡ１７）、約４．８及び０．３ｋｂｐのバンドを与えるもの（ｐＳＦＤＡ５、６、７、１１、及びｐＳＦＤＡ１３）、約１．４ｋｂｐのバンドを与えるもの（ｐＳＦＤＡ１０）、約０．３ｋｂｐのバンドとそれ以外のサイズのバンドを与えるもの（ｐＳＦＤＡ２、及びｐＳＦＤＡ１４）、約４．８ｋｂｐのバンドとそれ以外のサイズのバンドを与えるもの（ｐＳＦＤＡ１６）、５．０ｋｂｐ以上のサイズのバンドを与えるもの（ｐＳＦＤＡ４、８、及びｐＳＦＤＡ１２）の６つのグループに分けられた。しかし、約１．４ｋｂｐのバンドを与えるｐＳＦＤＡ１０以外は、アガロースゲル電気泳動のエチジウムブロマイド染色でそれぞれ良く似たサイズのバンドが複数検出されることから、各プラスミドにはほぼ同じ位置のゲノムＤＮＡで、約４．８及び０．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片あるいはどちらか一方、又はその一部が挿入されていると推定された。また、このｐＦＤＡ２７とハイブリダイズする約４．８及び０．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ゲノム上の非常に近接した部分にあると推測された。したがって、得られた１４個のプラスミドは、約１．４ｋｂｐのバンドを与えるｐＳＦＤＡ１０  とそれ以外のプラスミドに大きくグループ分けされ、ゲノムＤＮＡＨｉｎｄＩＩＩ消化物のサザンハイブリダイゼーションで検出された約４．８、１．４、及び０．３ｋｂｐのいずれか、あるいは約４．８及び０．３ｋｂｐの両方を持つことが推測された。得られたプラスミドの中から、約１０．２ｋｂｐの挿入断片を持ち、約４．８及び０．３ｋｂｐの両方のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むｐＳＦＤＡ７、及び約８．４ｋｂｐの挿入断片を持ち、約１．４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むｐＳＦＤＡ１０について、数種類の制限酵素で消化後アガロースゲル電気泳動で分析して制限酵素地図を作製すると共に、合成オリゴヌクレオチドｐＦＤＡ２７とハイブリダイズした領域をプラスミドｐＵＣ１１９などにサブクローニング後、ジデオキシ法によって塩基配列を解析した。ｐＳＦＤＡ１０の約１．４ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片中からは、ｐＦＤＡ２７の１７塩基中１４塩基が一致する配列が見出されたが、Ｆ２７のアミノ酸配列をコードする配列とは一致しないことから、この断片はｐＦＤＡ２７とハイブリダイズするものの、エンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素遺伝子とは無関係な断片であると考えられた。一方、ｐＳＦＤＡ７の約４．８及び０．３ｋｂｐの両方のＨｉｎｄＩＩＩ断片中から、ｐＦＤＡ２７の一つの配列と全く一致し、周りの配列も含めて実施例１−（３）で決定した部分アミノ酸配列Ｆ２７（配列番号９）に一致するアミノ酸をコードする配列が���出された。
【０１３７】
また、この約４．８ｋｂｐと０．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片は、制限酵素地図上で約３ｋｂｐ以上離れており、参考例１−（３）記載のアルテロモナス  ｓｐ．ＳＮ−１００９から精製されたエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素のゲルろ過法にて測定される分子量約１０万から予想される該酵素遺伝子のサイズより大きいことから、少なくとも２種類の類似した遺伝子があることが予想された。
【０１３８】
ｐＳＦＤＡ７を導入した大腸菌ＪＭ１０９株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＳＦＤＡ７と表示する。また、ｐＳＦＤＡ７を導入した大腸菌ＪＭ１０９株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＳＦＤＡ７と表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年８月１日よりＦＥＲＭ  Ｐ−１６３６２として寄託され、前記工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−６３４０（国際寄託への移管請求日：平成１０年５月６日）として国際寄託されている。
【０１３９】
ｐＳＦＤＡ７について、更にプライマー伸長法を用いたジデオキシ法によって詳しく塩基配列を解析し、ｐＳＦＤＡ７の１０．２ｋｂｐの挿入断片の中、８．３ｋｂｐの塩基配列を決定したところ、２６４６塩基（終止コドンを含む）の読取り枠１（以降、ＯＲＦ−１と略す）と２４４５塩基（終止コドンを含む）の読取り枠２（以降、ＯＲＦ−２と略す）の二つの読取り枠が見出された。ゲノムＤＮＡＨｉｎｄＩＩＩ消化物のサザンハイブリダイゼーションで検出された約０．３及び４．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片は、正確にはそれぞれ１４０及び４５４９塩基対の長さで、それぞれＯＲＦ−１及びＯＲＦ−２の一部あるいは全長を含んでいた。ＯＲＦ−２がコードするアミノ酸配列中に、実施例１−（３）で決定したエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素部分アミノ酸配列Ｆ２７（配列番号９）と一致する配列以外に、部分アミノ酸配列Ｆ３４（配列番号１０）、Ｆ４７（配列番号１１）、及びＦ５２（配列番号１２）と非常に相同性の高い配列が見出された。したがって、ＯＲＦ−２は、アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を実質的にコードしていると考えられる。一方、ＯＲＦ−１がコードするアミノ酸配列中にも、実施例１−（３）で決定したエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素部分アミノ酸配列Ｆ２７（配列番号９）と一致する配列以外に、部分アミノ酸配列Ｆ３４（配列番号１０）、及びＦ５２（配列番号１２）と相同性の高い配列が見出されたが、部分アミノ酸配列Ｆ４７（配列番号１１）に高い相同性を示す配列は見出されなかった。ＯＲＦ−１とＯＲＦ−２のコードするアミノ酸配列を比較すると、ＯＲＦ−１のＮ末端付近にＯＲＦ−２には無い６７アミノ酸残基の挿入配列があり、挿入配列以降のアミノ酸配列は７０％以上と非常に高い相同性を示すことからＯＲＦ−１もフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードしていると考えられた。以上のようにして、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ＯＲＦ−２）及びその遺伝子に非常に高い相同性を示す、フコース硫酸含有多糖分解活性を有すると考えられる新規ポリペプチドをコードする遺伝子（ＯＲＦ−１）の全塩基配列が決定された。
【０１４０】
その結果を図１に示す。すなわち図１は、ＯＲＦ−１とＯＲＦ−２の位置を示した図である。図中黒い矢印はＯＲＦ−１のコード領域及び向きを、図中斜線の矢印はＯＲＦ−２のコード領域及び向きをそれぞれ示す。また、ＯＲＦ−１の塩基配列を配列表の配列番号６に、ＯＲＦ−１がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。更にＯＲＦ−２の塩基配列を配列表の配列番号５に、ＯＲＦ−２がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【０１４１】
以上、本発明により実質的にエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ＯＲＦ−２）及びその遺伝子に相同性を示し、フコース硫酸含有多糖分解活性を有すると考えられる新規ポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ＯＲＦ−１）が単離、精製された。
【０１４２】
実施例２
実施例１で得られた、実質的にエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ＯＲＦ−２）の直接発現ベクターを構築するために、ＯＲＦ−２の開始コドンを発現ベクター上の至適化された開始コドンと一致させ、ＯＲＦ−２の５’領域の一部を挿入したプラスミドｐＥＦＤＡ−Ｎを構築した。
【０１４３】
まず、合成ＤＮＡ、ＦＤＡ−Ｎ１（配列番号１４）及びＦＤＡ−Ｎ２（配列番号１５）を合成した。ＦＤＡ−Ｎ１は配列表の配列番号５の塩基配列番号１−１３の配列を含む１５ｍｅｒの合成ＤＮＡであり、ＦＤＡ−Ｎ２は配列表の配列番号５の塩基配列番号４−１３の配列に相補的な配列を含む１５ｍｅｒの合成ＤＮＡである。
【０１４４】
これら合成ＤＮＡを０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液中で、７０℃で１０分間保温後、室温まで徐冷し二本鎖を形成させ、合成ＤＮＡリンカーＦＤＡ−Ｎを調製した。得られたＦＤＡ−Ｎは、配列表の配列番号５の塩基配列番号８−１３にあるＳｎａＢＩサイトを含み、開始コドンのところでＮｃｏＩサイトと、ＳｎａＢＩサイトのすぐ下流でＢａｍＨＩサイトと連結可能な合成ＤＮＡリンカーである。
【０１４５】
一方、Ｔ７プロモーターを使った発現ベクターであるｐＥＴ２１ｄ〔ノバジェン社製〕を、Ｔ７プロモーター下流にある発現のために至適化された開始コドンを含むＮｃｏＩサイトと、マルチクローニングサイト内にあるＢａｍＨＩサイトで切断した。この消化物と、先に調製した合成ＤＮＡリンカーＦＤＡ−ＮをＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地プレート上で生育するコロニーを選択した。各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡをＳｎａＢＩ消化後１％アガロースゲル電気泳動を行い、ＳｎａＢＩで切断可能なプラスミドを選択し、更にジデオキシ法による挿入断片の塩基配列の確認を行い、ｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩサイト間にＯＲＦ−２の開始コドンからＳｎａＢＩサイトまでの領域が挿入されたプラスミドｐＥＦＤＡ−Ｎを得た。
【０１４６】
次に、実施例１で得られたプラスミドｐＳＦＤＡ７約５μｇを３０ユニットのＳｎａＢＩで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＯＲＦ−２のほぼ全長の領域を含む約２．５ｋｂｐのＳｎａＢＩ  断片を切出して抽出精製した。このＳｎａＢＩ  断片を先に構築したプラスミドｐＥＦＤＡ−ＮのＳｎａＢＩ消化物と混ぜ、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地プレート上で生育するコロニーを選択した。先と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、ＳｎａＢＩ消化後１％アガロースゲル電気泳動を行い、２．５ｋｂｐのＳｎａＢＩ断片が遊離するプラスミドを選択した。更にジデオキシ法による挿入断片の向きの確認を行い、ＯＲＦ−２がＴ７プロモーターと同じ向きに挿入されているプラスミドを選択した。こうして得られた、ｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩサイトにある開始コドンからＯＲＦ−２の全長が挿入されている発現プラスミドをｐＥＦＤＡＩＩ１０３と命名した。
【０１４７】
こうして得られたｐＥＦＤＡＩＩ１０３を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩＩ１０３を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む５ｍｌのＬ培地に接種して３７℃で振とう培養し、濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．８の段階で、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、培養温度を１５℃として更に一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、細胞破砕用緩衝液〔２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化カリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム〕１ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液とした。
【０１４８】
対照として、ｐＥＴ２１ｄで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄについて同時に同じ条件で培養を行い、大腸菌抽出液を調製し、以下の分析に用いた。
まず、大腸菌抽出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩＩ１０３の抽出液中に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの抽出液では見られない分子量約９万のバンドが観察された。この分子量は、配列表の配列番号１に示したＯＲＦ−２がコードし得るアミノ酸配列から計算されるポリペプチドの分子量８８２１０とよく一致すると共に、アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９より精製されたエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した分子量約９万と一致する。以上のように、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩＩ１０３がＯＲＦ−２がコードするポリペプチドを発現していることが確認できた。
【０１４９】
次に、大腸菌抽出液のエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を参考例２記載の方法で測定した。
【０１５０】
その結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩＩ１０３の抽出液中から、５２０ｍＵ／ｍｌのエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性が検出された。すなわち、ＯＲＦ−２がコードするポリペプチドは、フコース硫酸含有多糖分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩＩ１０３の培養液１ｍｌ中に約１０４ｍＵのフコース硫酸含有多糖分解活性を有するＯＲＦ−２がコードするポリペプチドが生産されていたことが分かる。
【０１５１】
一方、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの抽出液からは、エンド型フコース硫酸含有多糖分解活性は全く検出されなかった。
【０１５２】
実施例３
ＯＲＦ−１及びＯＲＦ−２の開始コドンから１５塩基までの配列は全く一致し、その領域内に制限酵素ＳｎａＢＩサイトがある。すなわち、実施例２で構築したプラスミドｐＥＦＤＡ−Ｎ中の挿入配列はＯＲＦ−１とＯＲＦ−２で全く同じであるため、このｐＥＦＤＡ−ＮをＯＲＦ−１の発現ベクターの構築に用いることができる。
【０１５３】
まず、実施例１で得られたプラスミドｐＳＦＤＡ７約５μｇを３０ユニットのＳｎａＢＩで３７℃、２時間消化後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ＯＲＦ−１のほぼ全長の領域を含む約３．２ｋｂｐのＳｎａＢＩ断片を切出して抽出精製した。このＳｎａＢＩ断片をプラスミドｐＥＦＤＡ−ＮのＳｎａＢＩ消化物と混ぜ、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地プレート上で生育するコロニーを選択した。
【０１５４】
実施例２と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し、ＳｎａＢＩ消化後１％アガロースゲル電気泳動を行い、３．２ｋｂｐのＳｎａＢＩ断片が遊離するプラスミドを選択した。更にジデオキシ法による挿入断片の向きの確認を行い、ＯＲＦ−１がＴ７プロモーターと同じ向きに挿入されているプラスミドを選択した。こうして得られた、ｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩサイトにある開始コドンからＯＲＦ−１の全長が挿入されている発現プラスミドをｐＥＦＤＡＩ１０３と命名した。
【０１５５】
こうして得られたｐＥＦＤＡＩ１０３を用いて実施例２と同様の方法でＯＲＦ−１がコードするポリペプチドの発現とフコース硫酸含有多糖分解活性の確認を行った。
【０１５６】
すなわち、まず大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＥＦＤＡＩ１０３を用いて形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩ１０３を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む５ｍｌのＬ培地に接種して３７℃で振とう培養し、濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．８の段階で、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、培養温度を１５℃として更に一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、細胞破砕用緩衝液１ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液とした。
【０１５７】
大腸菌抽出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩ１０３の抽出液中に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの抽出液では見られない分子量約１０万のバンドが観察された。この分子量は、配列表の配列番号２に示したＯＲＦ−１がコードし得るアミノ酸配列から計算されるポリペプチドの分子量９４９１０とよく一致し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩ１０３がＯＲＦ−１がコードするポリペプチドを発現していることが確認できた。
【０１５８】
次に、大腸菌抽出液のエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性を参考例２記載の方法で測定した。
【０１５９】
その結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩ１０３の抽出液から３５．８ｍＵ／ｍｌのエンド型フコース硫酸含有多糖分解活性が検出された。すなわち、ＯＲＦ−１がコードするポリペプチドはフコース硫酸含有多糖分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＤＡＩ１０３の培養液１ｍｌ中に、約７．２ｍＵのフコース硫酸含有多糖分解活性を有するＯＲＦ−１をコードするポリペプチドが生産されていたことが分かる。
【０１６０】
一方、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの抽出液からは、エンド型フコース硫酸含有多糖分解活性は全く検出されなかった。
【０１６１】
実施例４
（１）  フコイダン分解酵素の生産菌株であるフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０２）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地５００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２３時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、その半量の菌体を１０ｍｌの抽出緩衝液〔５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）〕中に懸濁後、１ｍｌの抽出緩衝液に溶解した２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を添加し、氷浴上で３０分間保冷した。次いで、１０ｍｌのプロテイナーゼＫ溶液〔１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ〕を添加した後、５０℃で２時間保温した。この後室温に戻し、等容のＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕飽和フェノールを加えて１時間穏やかに攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した。この上層に、等容のＴＥ緩衝液飽和フェノール／クロロホルム１：１を加えて穏やかに攪拌し、１００００ｒｐｍで２０分間遠心した後上層を回収した。再度フェノール／クロロホルム抽出をおこなった後、水層に０．１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えさらに２倍量のエタノールを加えてＤＮＡを析出させガラス棒で巻き取った後、８０％エタノールでリンスして軽く風乾した。このゲノムＤＮＡを２０ｍｌの２０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡが溶解したＴＥ緩衝液中に溶解させ、３７℃で５時間保温してＲＮＡを分解した。フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出の後、先と同様にしてエタノール添加後ＤＮＡ回収し、５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ約２０ｍｇを得た。
【０１６２】
（２）  実施例４−（１）で調製したゲノムＤＮＡ１００μｇを１０ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと３７℃で１分４０秒間消化し部分分解させ、フェノール／クロロホルム抽出し上層を回収した。上層に１／１０倍容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）および２．５倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、遠心分離により沈殿を回収した後、８０％エタノールでリンスして風乾した。得られた部分分解物を、１．２５−５Ｍ塩化ナトリウム密度勾配超遠心法によりサイズ分画をおこない、１０−２０ｋｂｐのサイズを含む画分からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。得られたゲノムＤＮＡ部分分解物０．２μｇとノバジェン社製ラムダブルースターＢａｍＨＩアーム０．６μｇと混ぜ、タカラバイオ社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた後、ストラタジーン社製ギガパックＩＩゴールドキットを用いてラムダファージにパッケージングを行い、フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１６３】
（３）  参考例５のようにして得られたフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２の精製フコイダン分解酵素タンパク質２００ｐｍｏｌを、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化した脱塩用のカラム（ファーストデソルティングカラムＰＣ３．２／１０、ファルマシア社製）にアプライ後、同緩衝液で溶出し、緩衝液を置換した。溶出液をガラスバイアルに集め濃縮乾固後、ピリジン１０μｌ、４−ビニルピリジン２μｌ、トリ−Ｎ−ブチルフォスフィン２μｌ、水１０μｌの入った一回り大きなガラス試験管の中にガラスバイアルごと試料を入れ、ガラス試験管を封管した後、９５℃で１０分間反応させてピリジルエチル化した。反応終了後ガラスバイアルを取り出し、数回水と共沸させて揮発性成分を除いた。
【０１６４】
得られたピリジルエチル化されたフコイダン分解酵素タンパク質を、４０μｌの８Ｍ尿素を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、９０μｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）及び０．５ｐｍｏｌのアクロモバクター  プロテアーゼＩ（タカラバイオ社製）を加え、３０℃で一晩消化し、得られた消化物からペプチド断片をＨＰＬＣシステム（スマートシステム、ファルマシア社製）にて精製した。カラムは、μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０（ファルマシア社製）を用い、１００μｌ／ｍｉｎの流速で行った。溶出は、溶出液として０．１２％トリフルオロ酢酸水溶液（溶出液Ａ）および０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（溶出液Ｂ）を用い、溶出液Ｂの割合を０％でサンプルをアプライし、８０分間で溶出液Ｂの割合を５５％にまであげる直線濃度勾配法にて溶出し、溶出液Ｂの割合が２７％以上で溶出されるピークとして溶出画分Ｌ２７、Ｌ３１、およびＬ３６等を得た。さらに、分離のよくなかった溶出液Ｂの割合が１７〜２７％の画分を集めて、濃縮し、同じＨＰＬＣシステムに添加後、溶出パターンを８７分間で溶出液Ｂの割合を１５％から４０％にまであげる直線濃度勾配にて溶出し、溶出画分ＬＲ８、ＬＲ９、ＬＲ１４、およびＬＲ１６等を得た。得られた各ペプチド画分についてアミノ酸配列分析を行い、部分アミノ酸配列Ｌ２７（配列番号１６）、Ｌ３６（配列番号１７）、ＬＲ９（配列番号１８）、ＬＲ１４（配列番号１９）、およびＬＲ１６（配列番号２０）を決定した。
【０１６５】
（４）  実施例４−（１）で調製したゲノムＤＮＡ２．４μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｕｎＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、およびＳａｕ３ＡＩ各３０ユニットで各々３７℃で３時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出した。消化物をエタノール沈殿により回収した。この各消化物約０．５μｇを、ＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩ消化物にはＥｃｏＲＩカセット、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物にはＨｉｎｄＩＩＩカセット、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ消化物にはＸｂａＩカセット、およびＳａｕ３ＡＩ消化物にはＳａｕ３ＡＩカセット（各カセットＤＮＡはいずれもタカラバイオ社製）各２０ｎｇ（Ｓａｕ３ＡＩカセットは２００ｎｇ）と混合後、タカラバイオ社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結させた。反応物をエタノール沈殿により回収して１０μｌの水に溶解し、カセットＤＮＡを用いたＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。
【０１６６】
一方、実施例４−（３）で決定した部分アミノ酸配列ＬＲ１４（配列番号１９）の１〜６のアミノ酸配列からｐＬ１４Ｆ１７（配列番号２１）、３〜１１のアミノ酸配列からｐＬ１４Ｆ２６（配列番号２２）の混合オリゴヌクレオチドをそれぞれアミノ酸配列と同じ向きに合成した。
【０１６７】
先に調製した鋳型ＤＮＡ各１μｌ、カセットプライマーＣ１（タカラバイオ社製）２０ｐｍｏｌ、混合オリゴヌクレオチドｐＬ１４Ｆ１７（配列番号２１）１００ｐｍｏｌ、および滅菌水を加えて２２μｌとし、９４℃で１０分間加熱後急冷した。ここに１０μｌの１０倍濃度Ｅｘタック増幅用緩衝液（タカラバイオ社製）、１６μｌの１．２５ｍＭｄＮＴＰ  混合液、２．５ユニットのタカラＥｘタック（Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、タカラバイオ社製）、および滅菌水を加えて１００μｌとし、さらにミネラルオイルを重層した。この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０、タカラバイオ社製）による増幅反応に供した。ＰＣＲ反応は、９４℃で０．５分間の変性、４５℃で２分間のアニーリング、７２℃で３分間の合成反応のサイクルを２５サイクル行い、最後７２℃で７分間保温して合成を完結させた。
【０１６８】
次に、滅菌水で１０倍希釈した１回目のＰＣＲ反応液を９４℃で１０分間加熱後急冷したものを鋳型ＤＮＡとして２回目のＰＣＲ反応を行った。すなわち、１０μｌの熱処理した１回目のＰＣＲ反応液、カセットプライマーＣ２（タカラバイオ社製）２０ｐｍｏｌ、混合オリゴヌクレオチドｐＬ１４Ｆ２６（配列番号２２）１００ｐｍｏｌ、１０μｌの１０倍濃度Ｅｘ  タック増幅用緩衝液、１６μｌの１．２５ｍＭｄＮＴＰ  混合液、２．５ユニットのタカラＥｘタック、および滅菌水を加えて１００μｌとし、さらにミネラルオイルを重層した。この混合液を９４℃で０．５分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング、７２℃で３分間の合成反応のサイクルを２５サイクル行い、最後７２℃で７分間保温して合成を完結させた。また同時に、それぞれの反応液に対してカセットプライマーＣ２のみあるいは混合オリゴヌクレオチドｐＬ１４Ｆ２６のみの反応液についてもＰＣＲ反応を行い、各プライマーの非特異的増幅産物のコントロールとした。
【０１６９】
アガロースゲル電気泳動で反応液を分析し、非特異的増幅産物のコントロールと比較したところ、多くの反応液で複数本の増幅バンドが検出された。これらの中から比較的バックグランドが低く、１本のバンドが強く増幅されていたＭｕｎＩ消化物−ＥｃｏＲＩカセットの２回目ＰＣＲ反応液から約０．７ｋｂｐのバンドを抽出精製した。このＤＮＡ断片とｐＴ７ブルー  Ｔ−ベクター（ｐＴ７ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ノバジェン社製）を混合し、ＤＮＡライゲーションキットを用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．００４％のＸ−Ｇａｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬ培地プレート上で生育する白色コロニーを選択した。各形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、約０．７ｋｂｐのバンドが挿入されたプラスミドを選択しｐＴ７−Ｍｕｎと命名した。このｐＴ７−Ｍｕｎの挿入配列をジデオキシ法により塩基配列分析を行ったところ、２回目のＰＣＲ反応に用いたｐＬ１４Ｆ２６の配列に続いて部分アミノ酸配列ＬＲ１４（配列番号１９）の１２番目以降のアミノ酸配列をコードする領域が見出された。さらに下流には部分アミノ酸配列Ｌ２７（配列番号１６）と非常に高い相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域が見出された。これらのことからこの約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片は、フコイダン分解酵素遺伝子の一部であることが明らかとなった。この約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片のプライマーｐＬ１４Ｆ２６からＥｃｏＲＩカセットとの連結点までの配列を配列番号２３に示した。
【０１７０】
（５）  実施例４−（１）で調製したゲノムＤＮＡ２０μｇずつを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、およびＸｂａＩ各１００ユニットで各々３７℃で４時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出した。消化物をエタノール沈殿により回収し、各１０μｇをさらに同じ制限酵素５０ユニットで各々３７℃で１６時間消化後、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により消化物を回収した。この消化物各５μｇを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、サザンブロット法により、アマシャム社製ナイロン膜ハイボンドＮ＋にＤＮＡを転写した。
【０１７１】
一方、実施例４−（４）で得られたｐＴ７−Ｍｕｎ約４μｇをベクター由来のＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで消化し、遊離する約０．７ｋｂｐのフコイダン分解酵素遺伝子の一部を含む断片を抽出精製した。このＤＮＡ断片をブカベストラベリングキット（ＢｃａＢＥＳＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を用いて３２Ｐで標識し、ハイブリダイゼーションのプローブＤＮＡを調製した。
【０１７２】
上記調製したフィルターを６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを約１００万ｃｐｍ／ｍｌの濃度になるように加え、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、まず６×ＳＳＣ中室温で１０分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温で５分間、さらに０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中４５℃で３０分間洗浄し、余分な水分を除いた後、富士フィルム社製イメージングプレートに３０分間露光した後、富士フィルム社製ＢＡＳ２０００イメージングアナライザーにて検出した。
【０１７３】
その結果、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩ、ＳａｌＩ消化物で２３ｋｂｐ以上の位置に１本、ＥｃｏＲＩ消化物で約８および３ｋｂｐの位置に２本、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物で約１１および４ｋｂｐの位置に２本、ＰｓｔＩ消化物で約１２および２．５ｋｂｐの位置に２本、ＳａｃＩ消化物で約１０および９．５ｋｂｐの位置に２本、ＸｂａＩ消化物で約６ｋｂｐの位置に１本のそれぞれプローブと強くハイブリダイズするバンドを認めた。このことから、フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡ上にフコイダン分解酵素遺伝子が２種類あることが強く示唆された。
【０１７４】
（６）  実施例４−（２）で調製したフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡライブラリーからフコイダン分解酵素遺伝子を含むクローンを、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）社のラムダブルースター取扱説明書に従って、プラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。
【０１７５】
まず、ファージライブラリーを大腸菌ＥＲ１６４７に感染させ、直径８．５ｃｍのＬ培地プレート５枚に、１枚当たり約３００個のプラークを形成させた。プレートにアマシャム社製ナイロン膜ハイボンドＮ＋を約３０秒間接触させファージを写し取った。このナイロン膜を０．５Ｍ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムの溶液中で５分間変性、次いで、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ塩化ナトリウムの溶液中で５分間中和処理し、２×ＳＳＣでリンスした後風乾した。このナイロン膜を紫外線照射処理してＤＮＡを固定化後、実施例４−（５）のサザンハイブリダイゼーションと同じ条件でハイブリダイゼーション、洗浄、検出を行った結果、３６個のポジティブシグナルが得られた。元のプレートよりポジティブシグナル付近のプラークをかきとり、ＳＭ緩衝液に懸濁しファージを回収した。得られたファージ液のいくつかについて、再度新しいプレートにプラークを形成させ、同様の操作を繰り返すことにより９個のポジティブシグナルを与えるファージを単離した。
【０１７６】
ノバジェン社のラムダブルースター取扱説明書に従って、得られた各ファージを大腸菌ＢＭ２５．８に感染させたのち１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地プレートに広げ、アンピシリン耐性のコロニーを選択することによりファージをプラスミドの形に変換した。得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた各クローンのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地に接種し、３７℃で終夜培養した培養液からアルカリ溶菌法により再度プラスミドＤＮＡを調製した。得られた各クローンのプラスミドをそれぞれｐＳＦＬＡ１、５、１０、１１、１２、１３、１５、１７、およびｐＳＦＬＡ１８と命名した。
【０１７７】
各プラスミドをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、およびＸｂａＩを適当に組み合わせて消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、前述したようにサザンハイブリダイゼーションを行い、各挿入断片の制限酵素地図を作成して解析した。その結果、アガロースゲル電気泳動のエチジウムブロマイド染色でそれぞれ良く似たサイズのバンドが複数検出されるとともに、ＳａｃＩ消化によりｐＴ７−Ｍｕｎの約０．７ｋｂｐ挿入断片とハイブリダイズするバンドが２本となるｐＳＦＬＡ１、１０、１２、１５、およびｐＳＦＬＡ１８の組と、同様にＫｐｎＩ消化によりｐＴ７−Ｍｕｎの約０．７ｋｂｐ挿入断片とハイブリダイズするバンドが２本となるｐＳＦＬＡ５、１１、１３、およびｐＳＦＬＡ１７の組の２つにグループ分けされることが明らかとなった。さらに、ｐＳＦＬＡ５、ｐＳＦＬＡ１０、およびｐＳＦＬＡ１７の３つのプラスミドはＸｂａＩ消化により約６ｋｂｐの断片を遊離することが明らかとなり、実施例４−（５）のサザンハイブリダイゼーションで検出された約６ｋｂｐのＸｂａＩ消化物のバンドは２本のバンドが重なり合っていることが示唆され、フラボバクテリウム  ｓｐ．ＳＡ−００８２のゲノムＤＮＡ上にフコイダン分解酵素遺伝子が少なくとも２種類あることが明らかとなった。
【０１７８】
そこで各グループのプラスミドからｐＳＦＬＡ１０およびｐＳＦＬＡ１７を選びさらに挿入断片の解析を行った。すなわち、これらプラスミド約３μｇをＸｂａＩ消化し、遊離する約６ｋｂｐの断片を抽出精製した。これらＸｂａＩ断片をそれぞれクロラムフェニコール耐性ベクターであるｐＨＳＧ３９９（タカラバイオ社製）のＸｂａＩ消化物と混ぜ、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０．００４％のＸ−Ｇａｌ、および１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬ培地プレート上で生育する白色コロニーを選択した。各形質転換体を３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ培地に接種し、３７℃終夜培養後、培養菌体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素消化後アガロースゲル電気泳動を行って解析した。その結果、ｐＳＦＬＡ１０由来の約６ｋｂｐＤＮＡがベクターＤＮＡに対してそれぞれ逆向きに挿入されたｐＨ１０Ｘ６−１およびｐＨ１０Ｘ６−２を得た。また同様にｐＳＦＬＡ１７由来の約６ｋｂｐＤＮＡが挿入されたｐＨ１７Ｘ６−７およびｐＨ１７Ｘ６−１１を得た。ｐＨ１０Ｘ６−１が導入された大腸菌ＪＭ１０９株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨ１０Ｘ６−１と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６６５９として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−６３４１（国際寄託の移管請求日：平成１０年５月６日）として国際寄託されている。ｐＨ１７Ｘ６−７が導入された大腸菌ＪＭ１０９株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨ１７Ｘ６−７と表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６６６０として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−６３４２（国際寄託の移管請求日：平成１０年５月６日）として国際寄託されている。これらプラスミドについて直接プライマー伸長法によって、あるいは制限酵素消化後サブクローニング等を行ってジデオキシ法によって詳しく塩基配列を解析したところ、ｐＳＦＬＡ１０由来の約６ｋｂｐのＤＮＡ断片から２０９４塩基（終止コドンを含む）の読み取り枠が、ｐＳＦＬＡ１７由来の約６ｋｂｐのＤＮＡ断片から２１１５塩基（終止コドンを含む）の読み取り枠がそれぞれ見いだされ、これら読み取り枠がコードするアミノ酸配列中に実施例４−（３）で決定した部分アミノ酸配列と非常に高い相同性を示す領域が見出された。
【０１７９】
ｐＳＦＬＡ１０由来の読み取り枠をｆｄｌＡ、ｐＳＦＬＡ１７由来の読み取り枠をｆｄｌＢとそれぞれ命名した。
【０１８０】
その結果を図３及び図４に示す。すなわち図３はｐＳＦＬＡ１０内のｆｄｌＡの位置を示す図であり、図４はｐＳＦＬＡ１０内のｆｄｌＢの位置を示す図である。図３中の黒い矢印はｆｄｌＡのコード領域及び向きをそれぞれ示し、図４中の黒い矢印はｆｄｌＢのコード領域及び向きをそれぞれ示す。
【０１８１】
ｆｄｌＡがコードするアミノ酸配列中には、実施例４−（３）で決定したフコイダン分解酵素部分アミノ酸配列Ｌ３６（配列番号１７）およびＬＲ１４（配列番号１９）と一致する配列が、また、部分アミノ酸配列Ｌ２７（配列番号１６）、ＬＲ９（配列番号１８）およびＬＲ１６（配列番号２０）と非常に相同性の高い配列が見いだされた。さらに、実施例４−（３）でＬＲ８と命名されたペプチド画分は、各サイクル２つのアミノ酸誘導体がアミノ酸配列分析で検出され、一義的にアミノ酸配列が決定されていなかったが、ｆｄｌＡがコードするアミノ酸配列中の２カ所の配列を当てはめることにより各サイクルで検出されたアミノ酸誘導体が説明できることから、この画分にはこの２カ所の配列を含むペプチドが入っていたことが明らかとなった。それぞれの配列をＬＲ８−１（配列番号２４）およびＬＲ８−２（配列番号２５）と命名した。このようにｆｄｌＡがコードするアミノ酸配列は、実施例４−（３）のフコイダン分解酵素部分アミノ酸配列分析により明らかとなった全てのアミノ酸配列と一致あるいは高い相同性を示すことから、フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のフコイダン分解酵素を実質的にコードしていると考えられる。
【０１８２】
一方、ｆｄｌＢがコードするアミノ酸配列中にも、フコイダン分解酵素部分アミノ酸配列ＬＲ１４（配列番号１９）およびＬＲ８−１（配列番号２４）と一致する配列が、また、部分アミノ酸配列Ｌ２７（配列番号１６）、ＬＲ１６（配列番号２０）、およびＬＲ８−２（配列番号２５）と相同性の高い配列が見いだされたが、部分アミノ酸配列Ｌ３６（配列番号１７）およびＬＲ９（配列番号１８）に高い相同性を示す配列は見いだされなかった。しかし、ｆｄｌＡとｆｄｌＢを比較すると塩基配列およびアミノ酸配列の相同性は各々約６７％および約５６％と高いことからｆｄｌＢもフコイダン分解活性を有するポリペプチドをコードしていると考えられた。以上のようにして、フコイダン分解活性を有するポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ｆｄｌＡ）およびその遺伝子に非常に高い相同性を示す遺伝子（ｆｄｌＢ）の全塩基配列が決定された。ｆｄｌＡの塩基配列を配列表の配列番号７に、ｆｄｌＡがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。更にｆｄｌＢの塩基配列を配列表の配列番号８に、ｆｄｌＢがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示す。
【０１８３】
以上、本発明により実質的にフコイダン分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ｆｄｌＡ）およびその遺伝子に相同性を示し、フコース硫酸含有多糖分解活性を有すると考えられる新規ポリペプチドをコードすると考えられる遺伝子（ｆｄｌＢ）が単離、精製された。
【０１８４】
実施例５
まず、実施例４で得られた、実質的にフコイダン分解酵素をコードすると考えられる遺伝子（ｆｄｌＡ）の直接発現ベクターを構築した。
【０１８５】
実施例４で得られたプラスミドｐＨ１０Ｘ６−１は、ｐＳＦＬＡ１０由来の約６ｋｂｐのＸｂａＩ断片がｆｄｌＡ遺伝子及びベクター上のｌａｃプロモーターと向かい合う向きに挿入されていた。このｐＨ１０Ｘ６−１をｆｄｌＡ遺伝子内部のＳａｃＩで消化し、さらにｆｄｌＡ遺伝子の開始コドンの位置にあるＢｓｐＨＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、ｆｄｌＡのＮ末端領域をコードする約４００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出して抽出精製した。
【０１８６】
一方、Ｔ７プロモーターを使った発現ベクターであるｐＥＴ２１ｄ（ノバジェン社製）を、Ｔ７プロモーター下流にある発現のために至適化された開始コドンを含むＮｃｏＩサイトと、マルチクローニングサイト内にあるＳａｃＩサイトで切断後、先に調製したｆｄｌＡのＮ末端領域をコードする約４００ｂｐのＢｓｐＨＩ−ＳａｃＩ  断片を挿入し、プラスミドｐＥＦＬＡ１０−Ｎを構築した。
【０１８７】
次に、プラスミドｐＨ１０Ｘ６−１をＨｉｎｄＩＩＩ消化することによりｆｄｌＡ遺伝子内部およびベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩサイトで切断し、ｆｄｌＡ遺伝子の終止コドンを含むＣ末端領域をコードする約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出して抽出精製した。この断片を先に構築したプラスミドｐＥＦＬＡ１０−ＮのＨｉｎｄＩＩＩ消化物と連結し、ｆｄｌＡ遺伝子全長が再生する方向に該２ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片が挿入されたプラスミドを選択した。こうして得られた、ｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩサイトにある開始コドンからｆｄｌＡの全長が挿入されている発現プラスミドをｐＥＦＬＡ１０と命名した。
【０１８８】
こうして得られたｐＥＦＬＡ１０を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１０を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬ培地に接種して３７℃で振とう培養し、濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．８の段階で、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、培養温度を１５℃としてさらに一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、細胞破砕用緩衝液〔２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ塩化ナトリウム〕０．５ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この懸濁液の一部をとり大腸菌破砕液とした。さらにこれを遠心分離して不溶物を除き大腸菌抽出液とした。
【０１８９】
対照として、ｐＥＴ２１ｄで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄについて同時に同じ条件で培養を行い、大腸菌破砕液および抽出液を調製し、以下の分析に用いた。
【０１９０】
まず、大腸菌破砕液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１０の破砕液中に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの破砕液中には見られない分子量約７．６万のバンドが観察された。この分子量は、配列表の配列番号３に示したｆｄｌＡがコードし得るアミノ酸配列から計算されるポリペプチドの分子量７５，７４０とよく一致するとともに、参考例５記載のフラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のより精製されたフコイダン分解酵素のゲル濾過法で分析した分子量約７万とよく一致する。以上のように、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１０がｆｄｌＡがコードするポリペプチドを発現していることが確認できた。
【０１９１】
次に、大腸菌抽出液のフコース硫酸含有多糖分解活性を参考例３に記載の方法で測定した。
【０１９２】
その結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１０の抽出液中のフコイダン分解活性は２，３００ｍＵ／ｍｌであることが分かった。すなわち、ｆｄｌＡがコードするポリペプチドはフコイダン分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１０の培養液１ｍｌ中に約２３０ｍＵのフコース硫酸含有多糖分解活性を有するｆｄｌＡがコードするポリペプチドが生産されていたことが分かる。
【０１９３】
一方、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの抽出液からは、フコイダン分解活性は全く検出されなかった。
【０１９４】
実施例６
実施例４で得られた、フコース硫酸含有多糖分解活性を有すると考えられる新規ポリペプチドをコードする遺伝子、ｆｄｌＢの直接発現ベクターを構築した。このｆｄｌＢ遺伝子の開始コドンの位置にはＢｓｐＨＩの認識配列が存在するが、その上流の配列の影響でメチル化を受けるため、宿主として用いた大腸菌ＪＭ１０９から回収したプラスミドは直接ＢｓｐＨＩで消化出来なかった。そこで、ＰＣＲ法を用いて増幅したＤＮＡ断片を用いて構築を行った。
【０１９５】
実施例４で得られたプラスミドｐＨ１７Ｘ６−７は、ｐＳＦＬＡ１７由来の約６ｋｂｐのＸｂａＩ断片がｆｄｌＢ遺伝子とベクター上のｌａｃプロモーターが同じ向きに挿入されていた。まず、ｐＨ１７Ｘ６−７をｆｄｌＢ遺伝子内部およびベクター由来のＫｐｎＩサイトで切断後、セルフライゲーションさせプラスミドｐＨ１７Ｘ６−７Ｋを構築した。このｐＨ１７Ｘ６−７Ｋを鋳型として、ｆｄｌＢのコード領域よりも上流の位置で、ｆｄｌＢと同じ向きの合成ＤＮＡプライマー１７Ｘ６Ｆ４（配列番号２６）およびベクターにアニーリング可能なＭ１３プライマーＭ４（タカラバイオ社製）の組でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、実施例４−（４）と同様の反応液組成中、９４℃で０．５分間の変性、５５℃で０．５分間のプライマーアニーリング、７２℃で１分間の合成反応のサイクルを２５サイクル行い、最後７２℃で７分間保温して合成を完結させた。反応液をフェノール／クロロホルム抽出後、増幅した約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。この断片をｆｄｌＢ遺伝子の開始コドンの位置にあるＢｓｐＨＩおよびコード領域内にあるＭｆｌＩサイトで切断した後、３％アガロースゲル電気泳動により分離し、ｆｄｌＢのＮ末端領域をコードする約４５０ｂｐのＢｓｐＨＩ−ＭｆｌＩ  断片を切り出して抽出精製した。
【０１９６】
一方、実施例５と同様にＴ７プロモーターを使った発現ベクターであるｐＥＴ２１ｄを、ＮｃｏＩサイトとマルチクローニングサイト内にあるＢａｍＨＩサイトで切断後、先に調製したｆｄｌＢのＮ末端領域をコードする約４５０ｂｐのＢｓｐＨＩ−ＭｆｌＩ  断片を挿入し、プラスミドｐＥＦＬＡ１７−Ｎを構築した。
【０１９７】
次に、プラスミドｐＨ１７Ｘ６−７をｆｄｌＢ遺伝子内部にあるＮｓｐＶサイトおよびｆｄｌＢ遺伝子下流にあるＥｃｏＲＩサイトで切断し、ｆｄｌＢ遺伝子の終止コドンを含むＣ末端領域をコードする約２ｋｂｐのＮｓｐＶ−ＥｃｏＲＩ断片を切り出して抽出精製した。この断片を先に構築したプラスミドｐＥＦＬＡ１７−ＮのＮｓｐＶ−ＥｃｏＲＩ間に挿入した。こうして得られた、ｐＥＴ２１ｄのＮｃｏＩサイトにある開始コドンからｆｄｌＢの全長が挿入されている発現プラスミドをｐＥＦＬＡ１７と命名した。
【０１９８】
こうして得られたｐＥＦＬＡ１７を用いて実施例３と同様の方法でｆｄｌＢがコードするポリペプチドの発現とフコイダン分解活性の確認を行った。
【０１９９】
すなわち、まず大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＥＦＬＡ１７を用いて形質転換した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１７を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬ培地に接種して３７℃で振とう培養し、濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．８の段階で、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、培養温度を１５℃としてさらに一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、細胞破砕用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この懸濁液の一部をとり大腸菌破砕液とした。さらにこれを遠心分離して不溶物を除き大腸菌抽出液とした。
【０２００】
大腸菌破砕液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１７の破砕液中に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの破砕液中には見られない分子量約７．７万のバンドが観察された。この分子量は、配列表の配列番号４に示したｆｄｌＢがコードし得るアミノ酸配列から計算されるポリペプチドの分子量７６，９２９とよく一致し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１７がｆｄｌＢをコードするポリペプチドを発現していることが確認できた。
【０２０１】
次に、大腸菌抽出液のフコイダン分解活性を実施例３に記載の方法で測定した。
【０２０２】
その結果、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１７の抽出液から４８０ｍＵ／ｍｌのフコイダン分解活性が検出された。すなわち、ｆｄｌＢがコードするポリペプチドはフコース硫酸含有多糖分解活性を有し、本発明の遺伝子を持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＦＬＡ１７の培養液１ｍｌ中に約４８ｍＵのフコース硫酸含有多糖分解活性を有するｆｄｌＢがコードするポリペプチドが生産されていたことが分かる。
【０２０３】
一方、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｄの抽出液からは、フコイダン分解活性は全く検出されなかった。
【０２０４】
実施例７
実施例５および実施例６で得られた、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドのフコース硫酸含有多糖−Ｕへの作用を調べた。
【０２０５】
すなわち、５０μｌの１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５０μｌの２．５％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、および１０μｌの４Ｍの塩化ナトリウムの混合液に、１０μｌの実施例５あるいは実施例６で得られたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド溶液を添加し、２５℃で保持した。反応開始より１６、４０、および６５時間の時点で反応液を分取しＨＰＬＣにより反応生成物を分析した。ＨＰＬＣの条件は下記に依った。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０２．５（昭和電工社製）
カラム温度：２５℃
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液
流速：１ｍｌ／分
検出器：示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１  昭和電工社製）
【０２０６】
なお、反応生成物としては現在までに下記の構造のものが知られているので、下記の物質を標準物質として使用した。なお、下記の式〔Ｉ〕〜〔ＩＶ〕の物質は、以下の方法で製造したものを用いた。
【０２０７】
乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械製作所製）により粉砕し、１０倍量の８５％メタノール中で７０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に２０倍量の水を加え、１００℃、３時間処理し、ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、遠心分離した。その沈殿を、エタノールで十分洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に除去した後、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）（アミコン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して精製ガゴメ昆布フコイダンを得た。収率は、乾燥ガゴメ昆布粉末重量に対して約４％であった。
【０２０８】
次に５％の該精製ガゴメ昆布フコイダン溶液６００ｍｌと、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）７５０ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム１５０ｍｌと１７５０ｍＵ／ｍｌの参考例５記載のフコイダン分解酵素溶液３．４３ｍｌを混合し、２５℃で１４４時間反応させた。反応液をポアサイズ３５００の透析膜を用いて透析し、分子量３５００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアシライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩後、１０ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（４ｃｍ×２５ｃｍ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーに供した。溶出は、酢酸アンモニウムによる濃度勾配により実施し、溶出液は、５０ｍｌずつ分取した。図５に該クロマトグラフィーの溶出を示す。該クロマトグラフィーにより９つの画分（ａ）〜（ｉ）を取得し、その中の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）画分を構造解析に使用した。
【０２０９】
次に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｆ）画分について常法に従って構造解析を行い、（ａ）画分が下記式〔Ｉ〕、（ｂ）画分が下記式〔ＩＩＩ〕、（ｃ）画分が下記式〔ＩＶ〕、（ｆ）画分が下記式〔ＩＩ〕の化合物である事を確認のうえ、各画分を上記の反応生成物の分析の標準品として使用した。
なお上記のＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにおける各画分のフラクションナンバーは、（ａ）：４２―４３（ｂ）：８４―９１（ｃ）：５１―５２（ｆ）：６２―６３であった。
2005312459.tif 000008
2005312459.tif 000009
2005312459.tif 000010
2005312459.tif 000011
【０２１０】
上記の反応生成物の分析の結果、実施例５で得られたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを用いた場合反応生成物は上記〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、および〔ＩＩＩ〕のみであったが、実施例６で得られたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを用いた場合の反応生成物は上記〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、および〔ＩＩＩ〕に加えて、〔ＩＶ〕が大量に含まれており、その後反応を続けても、〔ＩＶ〕は〔Ｉ〕に分解されなかった。
【０２１１】
すなわち、実施例５のようにして得られたｆｄｌＡがコードするポリペプチドは、フコース硫酸含有多糖−Ｕに作用して、上記〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、および〔ＩＩＩ〕のような３糖を最終切断単位として遊離させるが、実施例６のようにして得られたｆｄｌＢがコードするポリペプチドは、フコース硫酸含有多糖−Ｕに作用して、上記〔ＩＶ〕のような６糖も最終切断単位として遊離させるものであることが判明した。
【０２１２】
実施例８
実施例５および実施例６において、ｆｄｌＡおよびｆｄｌＢ遺伝子を含むそれぞれの組換え体大腸菌により各遺伝子がコードするポリペプチドが生産され、それら大腸菌抽出液中からフコース硫酸含有多糖分解活性が検出され、ｆｄｌＡおよびｆｄｌＢがコードするポリペプチドはフコース硫酸含有多糖分解活性を有することが確認された。しかしながら、大腸菌抽出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、大腸菌破砕液と比較してわずかな量の組換え体ポリペプチドしか検出されず、生産されたポリペプチドの一部のみが活性型の可溶性ポリペプチドとして発現されることが示唆された。
【０２１３】
フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２のフコイダン分解酵素は菌体外分泌酵素であり、膜透過のための分泌シグナルがＮ末端に付加した前駆体の形で発現されることが予想される。そこで、ｆｄｌＡおよびｆｄｌＢのコードするＮ末端アミノ酸配列を調べたところ、開始メチオニンからそれぞれ２５番目、２４番目のアラニン残基までの領域が分泌シグナルと予想された。この疎水的な分泌シグナルの存在が、実施例５および実施例６におけるそれぞれの組換え体ポリペプチドの可溶性と関係があると考えられたので、ｆｄｌＡおよびｆｄｌＢそれぞれの分泌シグナルを除いた発現プラスミドを構築した。
【０２１４】
（１）まず、ｆｄｌＡの開始メチオニンから２６番目グルタミン残基の直上流に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを導入するためにプライマーＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍ（配列番号２７）およびプライマー１０Ｘ６Ｒ４（配列番号２８）をデザインし、合成した。ＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍは配列表の配列番号７の塩基配列番号７６−９５の配列の上流にＢａｍＨＩサイトを配した２８ｍｅｒの合成ＤＮＡである。また、１０Ｘ６Ｒ４は配列表の配列番号７の塩基配列番号１４７１−１４９１の配列に相補的な２１ｍｅｒの合成ＤＮＡである。
【０２１５】
実施例５で構築したｐＥＦＬＡ１０を鋳型として、プライマーＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍと１０Ｘ６Ｒ４の組でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、実施例４−（４）と同様の反応液組成中、９４℃で０．５分間の変性、５０℃で１分間のプライマーアニーリング、７２℃で２分間の合成反応のサイクルを２５サイクル行い、最後７２℃で７分間保温して合成を完結させた。反応液をアガロースゲル電気泳動により分離後、増幅した約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。この断片を実施例４−（４）と同様の方法で、ｐＴ７ブルーＴ−ベクター（ノバジェン社製）に挿入したプラスミドＤＮＡを調製し塩基配列を確認した。得られたプラスミドをプライマーＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍに配したＢａｍＨＩサイトおよびｆｄｌＡコード領域内にあるＳｎａＢＩサイトで切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ｆｄｌＡの開始メチオニンから２６番目グルタミン残基以降のＮ末端領域をコードする約４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｎａＢＩ断片を切り出して抽出精製した。
【０２１６】
一方、実施例５と同様なＴ７プロモーターを使った発現ベクターであるｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）をマルチクローニングサイト内のＨｉｎｄＩＩＩサイトで切断し、実施例５で調製したｆｄｌＡ遺伝子の終止コドンを含むＣ末端領域をコードする約２ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片をＴ７プロモーターとｆｄｌＡ遺伝子が同じ向きとなるように挿入し、プラスミドｐＥＦＤＬＡ−Ｃを構築した。このｐＥＦＤＬＡ−Ｃをマルチクローニングサイト由来のＢａｍＨＩサイトおよびｆｄｌＡコード領域内にあるＳｎａＢＩサイトで切断し、先に調製したｆｄｌＡの開始メチオニンから２６番目グルタミン残基以降のＮ末端領域をコードする約４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳｎａＢＩ断片を挿入し、プラスミド  ｐＥＦＤＬＡ１０１を得た。
【０２１７】
この  プラスミド  ｐＥＦＤＬＡ１０１は、Ｔ７プロモーターの下流にｐＥＴ２１ａ由来の１４残基のＮ末端リーダー配列（配列番号２９）に続いて配列表の配列番号３の２６番目以降の配列がつながったポリペプチドをコードしている。
【０２１８】
（２）プライマーＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍのデザインに用いたｆｄｌＡの２６番目のグルタミン残基以降の２０塩基の配列は、同様にｆｄｌＢの２５番目のグルタミン残基以降の配列（配列表の配列番号８の塩基配列番号７３−９２）と一致する。従って、実施例８−（１）で用いたプライマーＦＤＬ−Ｑ−ＢａｍはそのままｆｄｌＢ発現ベクターの構築に用いることができ、基本的に実施例８−（１）と同様の方法を用いてｆｄｌＢ発現ベクターｐＥＦＤＬＢ１０１を構築した。
【０２１９】
まず、ＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍを用いてＰＣＲ反応を行うために、配列表の配列番号８の塩基配列番号１４８９−１５０８の配列に相補的な２０ｍｅｒの合成ＤＮＡ、１７Ｘ６Ｒ１（配列番号３０）を作製した。実施例６で構築したｐＥＦＬＢ１７を鋳型として、プライマーＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍと１７Ｘ６Ｒ１の組でＰＣＲ反応を行い、増幅した約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。この断片をｐＴ７ブルー  Ｔ−ベクターに挿入し、プラスミドＤＮＡを調製し塩基配列を確認した。
【０２２０】
次に、得られたプラスミドをプライマーＦＤＬ−Ｑ−Ｂａｍに配したＢａｍＨＩサイトおよびｆｄｌＢコード領域内にあるＮｓｐＶサイトで切断した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ｆｄｌＢの開始メチオニンから２５番目のグルタミン残基以降のＮ末端領域をコードする約２１０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮｓｐＶ断片を切り出して抽出精製した。
【０２２１】
一方、実施例４で得られたプラスミドｐＨ１７Ｘ６−７をＥｃｏＲＩサイトで切断し、ｆｄｌＢ遺伝子全長を含む約２．６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を切り出して抽出精製した。この断片をｐＥＴ２１ａのマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩサイトに、Ｔ７プロモーターとｆｄｌＢ遺伝子が同じ向きとなるように挿入し、プラスミドｐＥＦＤＬＢ−Ｗを構築した。このｐＥＦＤＬＢ−Ｗをマルチクローニングサイト由来のＢａｍＨＩサイトおよびｆｄｌＢコード領域内にあるＮｓｐＶサイトで切断し、先に調製したｆｄｌＢの開始メチオニンから２５番目のグルタミン残基以降のＮ末端領域をコードする約２１０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮｓｐＶ断片を挿入し、プラスミドｐＥＦＤＬＢ１０１を得た。
【０２２２】
このプラスミド  ｐＥＦＤＬＢ１０１は、Ｔ７プロモーターの下流に実施例８−（１）で得たプラスミド  ｐＥＦＤＬＡ１０１と全く同じ１４残基のＮ末端リーダー配列（配列番号２９）に続いて配列表の配列番号４の２５番目以降の配列がつながったポリペプチドをコードしている。
【０２２３】
（３）実施例８−（１）、（２）で得られたｐＥＦＤＬＡ１０１およびｐＥＦＤＬＢ１０１を用いて、実施例５と同様の方法で組換え体の培養、菌体抽出液の調製を行い、実施例５および実施例６で構築したｐＥＦＬＡ１０およびｐＥＦＬＡ１７による各組換え体ポリペプチドの発現量とフコイダン分解活性の比較を行った。
【０２２４】
すなわち、ｐＥＦＬＡ１０、ｐＥＦＬＡ１７、ｐＥＦＤＬＡ１０１、あるいは  ｐＥＦＤＬＢ１０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬ培地に接種して３７℃で振とう培養した。培養液の濁度がＯ．Ｄ．６００＝０．８の段階で、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた後、培養温度を１５℃としてさらに一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、細胞破砕用緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この懸濁液の一部をとり大腸菌破砕液とした。さらにこれを遠心分離して不溶物を除き大腸菌抽出液とした。
【０２２５】
各大腸菌破砕液および抽出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、常法に従ってクマシーブリリアントブルー染色を行い解析したところ、いずれの大腸菌破砕液にも予想される分子量のポリペプチドの大量発現が観察された。同時に泳動したウシ血清アルブミン量との比較によりその発現量を見積もるとともに、各抽出液中のフコイダン分解活性を参考例３に記載の方法で測定した。これらの結果を表２にまとめて記載した。
【０２２６】
【表２】
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【０２２７】
表２に示されるように、破砕液中に含まれる目的ポリペプチドの発現量は、分泌シグナルと予想される配列の代わりにＮ末端リーダー配列が付加するように構築されたｐＥＦＤＬＡ１０１（ｆｄｌＡ）、ｐＥＦＤＬＢ１０１（ｆｄｌＢ）の方が、予想分泌シグナルを持つ直接発現プラスミドｐＥＦＬＡ１０（ｆｄｌＡ）、ｐＥＦＬＡ１７（ｆｄｌＢ）と比べていずれの遺伝子の場合も２倍程度の高い生産量を示した。
【０２２８】
また、分泌シグナルを持つ場合は抽出液中に存在する目的ポリペプチド量が破砕液と比較して極端に少なくなり、発現されたポリペプチドの多くが不溶性として存在しているのに対し、分泌シグナルを除いた場合は破砕液とほぼ等量の目的ポリペプチドが抽出液中に検出され、発現されたポリペプチドがほとんど可溶性として存在していることが明らかとなった。さらに、抽出液中の活性量も目的ポリペプチドの存在量に対応して大きく上昇した。
【０２２９】
実施例９
実施例２および実施例３で得られた、フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドのフコース硫酸含有多糖−Ｆへの作用を調べた。
【０２３０】
すなわち、５００μｌの５０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、５０μｌの参考例１―（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ  ２．５％溶液、５０μｌの１Ｍ塩化カルシウム及び７５μｌの４Ｍ塩化ナトリウムの混合液に、１００μｌの実施例２あるいは実施例３で得られた９．７ｍＵ／ｍｌのフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド溶液を添加しさらに蒸留水を加えて全量を１ｍｌにした。２５℃で１８時間反応した後、反応生成物をＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣの条件は下記に依った。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０４（昭和電工社製）
カラム温度：２５℃
溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液
流速：１ｍｌ／分
検出器：示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１  昭和電工社製）
【０２３１】
上記の本発明の遺伝子がコードされるポリペプチドの作用により生成する反応生成物の分析の結果、実施例２及び実施例３で得られたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを用いた場合の反応生成物中にはいずれもＨＰＬＣのリテンションタイムで８．６２分及び９．３０分の２つのピークが検出された。
【０２３２】
なお実施例２で得られたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを用いた場合と実施例３で得られたフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを用いた場合を比較すると実施例２の方が、９．３０分の物質を多く生成していた。
【０２３３】
発明の効果
本発明によりフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、これによりフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドを提供することが可能になると共に、フコース硫酸含有多糖分解活性を持つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。
【０２３４】
本発明によれば、フコース硫酸含有多糖分解酵素の誘導生産のために培地にフコース硫酸含有多糖を加える必要が無く、生産性は高い。また、プロテアーゼや他の多糖分解酵素などの酵素が同時に生産されることもなく、精製も容易である。フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及び塩基配列が提供されたことにより、アミノ酸配列を基に抗フコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチド抗体を作製することや、塩基配列を基にフコース硫酸含有多糖分解活性を有するポリペプチドの塩基配列に特異的なプローブやプライマーを作製することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】ＯＲＦ−１とＯＲＦ−２の位置を示す図である。
【図２】フコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示す図である。
【図３】ｆｄｌＡの位置を示す図である。
【図４】ｆｄｌＢの位置を示す図である。
【図５】ＤＥＡＥ−セファロースＦＦを用いたクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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