(57)【要約】【課題】  微生物を生きたまま分離・濃縮することのできる方法を提供すること。【解決手段】  １種又は２種以上の微生物を含む試料から特定の微生物を生菌体のままで他の微生物から分離及び／又は生菌体のままで濃縮するための方法であって、前記試料とアミノ基被覆キトサンとを、ＳＨ基含有化合物の存在下に水性媒体中で接触させる第一の接触工程を有し、前記特定の微生物の前記アミノ基被覆キトサンとの吸着率及び脱離率が、前記他の微生物とは異なることを利用した微生物の分離及び／又は濃縮方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は２種以上の微生物を含む試料から特定の微生物を生菌体のままで他の微生物から分離及び／又は生菌体のままで濃縮するための方法であって、前記試料とアミノ基被覆キトサンとを、ＳＨ基含有化合物の存在下に水性媒体中で接触させる第一の接触工程を有し、前記特定の微生物の前記アミノ基被覆キトサンとの吸着率及び脱離率が、前記他の微生物とは異なることを利用した微生物の分離及び／又は濃縮方法。
【請求項２】
前記第一の接触工程により、前記アミノ基被覆キトサンに前記特定の微生物が吸着して生成した微生物吸着キトサンと、前記微生物吸着キトサンから前記特定の微生物を前記水性媒体中に脱離し得る脱離剤とを接触させる第二の接触工程を更に有する請求項１に記載の分離及び／又は濃縮方法。
【請求項３】
前記水性媒体中に脱離した特定の微生物を分離する分離工程を更に有する請求項２に記載の分離及び／又は濃縮方法。
【請求項４】
２種以上の微生物を含む試料から特定の微生物を生菌体のままで他の微生物から分離するためのキットであって、前記キットが、容器に収容された前記特定の微生物を吸着し得るアミノ基被覆キトサンと、前記特定の微生物が吸着したアミノ基被覆キトサンから前記特定の微生物を脱離し得る脱離剤とを備えたキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の分離及び／又は濃縮方法、並びにそれらの方法に用いるための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンは、エビ、カニなどの甲殻類や昆虫類などに多く含まれているキチンを脱アセチル化することにより得られるβ−１，４−ポリ−Ｄ−グルコサミンである。キトサンには、抗菌作用の他、コレステロール吸収抑制作用や血糖上昇抑制作用など様々な生理活性があることが知られている。また、キトサンは、微生物菌体を吸着することができるため、微生物の吸着剤としても利用できることが知られている（特許文献１参照）。しかしながら、この特許文献１にも記載されるとおり（段落［００１２］）、キトサンは、微生物の発育を抑制する抗菌性を示すために、キトサンを吸着剤として使用した場合には微生物を生きたままの状態で分離取得することはできない。
【特許文献１】特開２０００−１４３８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、微生物を生きたまま分離・濃縮することのできる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、微生物を生きたままの状態で分離できる方法を見出すために鋭意研究を行っていたところ、システインのようなＳＨ基を有する化合物存在下の水性媒体中では特定の、アミノ基を被覆したキトサンに吸着されても微生物が生菌体のままの状態で維持されるという驚くべき知見を得た。さらに、システインのようなＳＨ基を有する化合物存在下の水性媒体中では、この特定のアミノ基被覆キトサンの微生物に対する吸着率が異なること、さらには、この水性媒体中に脱離剤を添加すると、この特定のアミノ基被覆キトサンからの微生物の脱離率も異なり、しかも、微生物は生菌体のままキトサンから脱離されることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）１種又は２種以上の微生物を含む試料から特定の微生物を生菌体のままで他の微生物から分離及び／又は生菌体のままで濃縮するための方法であって、前記試料とアミノ基被覆キトサンとを、ＳＨ基含有化合物の存在下に水性媒体中で接触させる第一の接触工程を有し、前記特定の微生物の前記アミノ基被覆キトサンとの吸着率及び脱離率が、前記他の微生物とは異なることを利用した微生物の分離及び／又は濃縮方法。
【０００６】
（２）前記第一の接触工程により、前記アミノ基被覆キトサンに前記特定の微生物が吸着して生成した微生物吸着キトサンと、前記微生物吸着キトサンから前記特定の微生物を前記水性媒体中に脱離し得る脱離剤とを接触させる第二の接触工程を更に有する上記（１）に記載の分離方法。
【０００７】
（３）前記脱離した特定の微生物を含有する水性媒体を分離する分離工程を更に有する上記（２）に記載の分離方法。
【０００８】
（４）２種以上の微生物を含む試料から特定の微生物を生菌体のままで他の微生物から分離するためのキットであって、前記キットが、容器に収容された前記特定の微生物を吸着し得るアミノ基被覆キトサンと、前記特定の微生物が吸着したアミノ基被覆キトサンから前記特定の微生物を脱離し得る脱離剤とを備えたキット。
【０００９】
を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微生物の分離及び／又は濃縮方法（以下、「本発明の分離・濃縮方法」ともいう）によれば、微生物の菌体の活性を損なうことなく生きたまま微生物を分離及び／又は濃縮することができる。キトサンには抗菌作用があるにも拘らず、キトサンのアミノ基を被覆し、且つＳＨ基含有化合物等を媒体中に存在させることによりアミノ基被覆キトサン（以下、単に「被覆キトサン」ともいう）と吸着しても微生物が死滅せず、生きたままの状態で吸着することは全く予想外のことであった。
【００１１】
また、本発明の分離・濃縮方法では、菌体は生きたままの状態で回収できるため、ある菌に特異的な反応を起こすことが知られている成分を使用することにより、菌を簡単に同定することができる。例えば、ある菌に特異的に結合する抗体を用いたり、あるいは、ある菌に特異的に反応する色素を用いたりすることもできる。
【００１２】
また、本発明の分離・濃縮方法によれば、被覆キトサンに吸着していた生菌体の脱離は、反応媒体中に脱離剤を添加するという極めて簡単な操作によって行うことができる。脱離剤は微生物の種類に特異的であるので、適当な種類の脱離剤を選択することにより、微生物を選択的に分離することができる。しかも脱離剤の濃度は、菌体の活性を損なわないような低濃度で行うことができる。従来、一旦キトサンに吸着した菌体は、高い塩濃度にしなければ脱離せず、そのような高い塩濃度では菌体が死滅してしまっていた。これに対して、本発明の分離・濃縮方法では塩濃度を菌体が生存し得る低濃度においても菌体を被覆キトサンから脱離させることができる。このようなことも全く予測外のことであった。
【００１３】
さらに、特に本発明の濃縮方法は、ＰＣＲの前処理に使用することができる。また、特に基材に固定化した被覆キトサンを使用した場合には、微生物は生きたままで濃縮されているので、基材に固定化されたままの微生物を選択培地に添加することにより、微生物を効率よく培養するために用いることができる。また、基材に固定化されたままの微生物を凍結（必要に応じて凍結保護剤添加）あるいは乾燥させて菌体保存用担体として用いることができる。さらに特定の菌体を固定化し、酵素や抗生物質の生産を効率良く行うこともできる。
【００１４】
本発明の分離・濃縮方法で用いる被覆キトサンは、従来は廃棄されていた甲殻類等のキチンを原料として簡単に製造することができるので、本発明の分離・濃縮方法や、これに用いるための装置の製造コストを低く抑えることができる。
【００１５】
本発明の方法を実施するための装置には、アミノ基被覆キトサンを収容した容器と、脱離剤とをセットしたキットが含まれる。本発明の装置で用いる容器は、例えば、１〜２ｍＬ程度の小さなものでもよく、運搬に要する手間やコストを抑えることができる。また、このような装置は、容器に試料や脱離剤を添加するという極めて簡単な操作しか必要とせず、取扱いが容易である。
【００１６】
一方、容器として、ガラスのような板状の基材を用い、この基材に多種類のアミノ基被覆キトサンを固定化することにより、多種類の微生物を検出することのできるチップとしても使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の微生物の分離・濃縮方法において、使用することのできる被覆キトサン、水性媒体並びにこれが含有することのできるＳＨ基含有化合物、脱離剤及びその他の成分、固定化基材、本発明の方法を適用することのできる微生物等について詳細に説明する。
【００１８】
（１）被覆キトサン
本発明の方法で使用する被覆キトサンは、キトサンのアミノ基を被覆したもので、以下のような特性を有している。
【００１９】
本明細書では、微生物を吸着すべき物質は、キトサンのアミノ基を被覆したものとして説明しているが、本発明の分離・濃縮方法で用いることのできるキトサンのアミノ基を被覆することにより得られる「アミノ基被覆キトサン」は、キチンのアミノ基を被覆することにより得られるもの、すなわち「アミノ基被覆キチン」と同等のものとして扱うことができる。キトサンは、キチンを構成する繰り返し単位であるＤ−グルコースの２位の炭素のアセチル基が所定量脱アセチル化され（通常、０．５を超える脱アセチル化度）、アミノ基になったものをいうので、キトサンもキチンも同じ骨格を有するからである。なお、本明細書でアミノ基被覆キトサンにより説明した理由は、キトサンのアミノ基を被覆する反応が、キチンのアミノ基を被覆する反応と比較して容易に行うことができるからである。
【００２０】
(i)分子量：キトサンの分子量は、後述するＳＨ基含有化合物の存在下に菌体が生きたままの状態に維持できれば特に制限はない。キトサンは、キチンを濃アルカリ溶液の存在下で加熱することにより脱アセチル化して得られるところ、その加熱条件等によって分子量が異なる混合物として得られる。本発明の分離・濃縮方法では、例えば、１万〜１００万程度に亘る広範囲に亘る分子量のものを使用することができる。
【００２１】
（ii）脱アセチル化度：キトサンの脱アセチル化度（脱アセチル化後のアセチル基の数／原料キチンのアセチル基の数）は、後述するＳＨ基含有化合物の存在下に菌体が生きたままの状態に維持できれば特に制限はなく、例えば、０．９９程度の大きい値から０．１程度まで（通常、０．５以下はキチンと呼ぶ）広範囲に亘る脱アセチル化度のものを使用することができる。
【００２２】
（iii）：被覆キトサンのアミノ基の被覆率もまた、後述するＳＨ基含有化合物の存在下に菌体が生きたままの状態に維持できれば特に制限はなく、例えば、４０〜１００％程度まで広範囲に亘る被覆率のものを使用することができる。
【００２３】
アミノ基の被覆は、第一級アミンの少なくとも１つの水素原子を他の基で被覆されればよい。
【００２４】
キトサンのアミノ基の被覆方法には、アルデヒド類によるシッフ塩基化（ホルムアルデヒド、アクロレイン等を使用）やアルキル化（アルキルアルデヒド等を使用）が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、カルボン酸無水物を用いるアシル化や、グリオキシル酸を用いるカルボキシルメチル化もアミノ基の被覆方法として利用することができる。これらのアミノ基の被覆反応自体は、当業者に既知の反応である。
【００２５】
本発明者らは、上述した被覆キトサンの特性のうち、少なくとも１つを変更することにより、ある微生物の被覆キトサンとの吸着率と被覆キトサンからの脱離率が変わること、さらには微生物の種類に応じても被覆キトサンとの吸着率と被覆キトサンからの脱離率は異なるという知見を得た。本発明の分離・濃縮方法では、この知見を利用して、微生物の分離を特異的に行うことができる。
【００２６】
（２）水性媒体
本発明の分離・濃縮方法は、水性媒体中で行うことができる。水性媒体は、典型的には水溶液である。
【００２７】
水性媒体は、少なくとも、菌体と被覆キトサンとが吸着している間には以下に説明するＳＨ基含有化合物のような吸着助剤を必須の成分とする。一方、菌体を被覆キトサンから脱離する時には、後述する脱離剤を必須の成分とし、これに追加して界面活性剤も併用することができる。また、水性媒体は、菌体の吸着時及び脱離時の両方を通じて、必要に応じて後述の任意の成分を含有することができる。
【００２８】
（２−１）ＳＨ基含有化合物等（少なくとも吸着時に必須の成分）
ＳＨ基含有化合物としては、システイン、グルタチオンのようなアミノ基とカルボキシル基も併せ持つ水溶性有機化合物等を挙げることができる。
【００２９】
なお、ＳＨ基を含有していなくても、硫黄原子を含有する化合物その他の化合物によっても菌体を生きたままの状態に維持できるものであれば、そのような化合物も本発明の分離・濃縮方法においてＳＨ基含有化合物と同等に吸着助剤として使用することができる。
【００３０】
ＳＨ基含有化合物の水性媒体中の濃度は、水性媒体中で被覆キトサンに吸着しても菌体が生きたままの状態に維持できれば特に制限はなく、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭ程度までの広範囲に亘る濃度にすることができる。
【００３１】
本発明者らは、上述したＳＨ基化合物が存在することにより微生物が生きたままの状態で被覆キトサンに効率よく吸着できるとの知見を得た。
【００３２】
（２−２）脱離剤（脱離時に必須の成分）
脱離剤は、被覆キトサンに吸着した菌体を生きたままの状態で脱離することができるものであれば、分離・濃縮すべき微生物の種類等に応じて様々なものを使用することができる。なお、脱離剤は、被覆キトサンに菌体を吸着させるときには存在しないほうが、被覆キトサンと菌体との吸着率を上げる観点から好ましい。
【００３３】
以下に、脱離剤の例を列記する。これらの脱離剤の濃度は、種類に応じて各菌体が死滅してしまう濃度未満で使用する。また、脱離剤は、１種のみを用いても、複数種類を併用することも可能である。
【００３４】
・ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＳＰ（ポリリン酸ナトリウム））
・アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム）
・アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）
・緩衝剤（例えば、トリス）
・ヘテロ環化合物（例えば、イミダゾール）
・有機酸（例えば、クエン酸、リンゴ酸）
本発明者らは、上記脱離剤が、その種類や濃度に依存して、微生物の種類に対して何らかの特異性を有しているという知見を得た。本発明の分離・濃縮方法では、このような知見を利用して分離・濃縮を特異的に行うことができる。
【００３５】
また、上記脱離剤と併用して、界面活性剤を用いることにより、脱離剤の脱離作用を高めることができる。
【００３６】
使用する界面活性剤は、微生物の生きたままの状態に維持されるもので、被覆キトサンからの微生物の脱離状況等に応じて、非イオン性（例えば、Tween 20、Tween 80（いずれも商品名））、中性界面活性剤（例えば、CHAPS（3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]propanesulfonic acid）を使用することができる。
【００３７】
（２−３）任意成分（吸着時及び脱離時に共通）
水性媒体は、菌体を生きたままの状態に維持する等のために以下の任意成分を含有することができる。各任意成分の濃度は、当業者であればその目的等に応じて適宜設定することができる。
【００３８】
・緩衝剤（緩衝能を有するｐＨの範囲４．０〜８．０であり、微生物を生きたままの状態に維持できるという条件を満足するもの、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
・防腐剤（例えば、ナトリウムアジド）
（２−４）ｐＨ
水性媒体のｐＨは、微生物の至適ｐＨなどにより異なるが、通常、４．０〜８．０の範囲にすることができる。
【００３９】
（３）基材
被覆キトサンは、水性媒体中で遊離の状態として存在することもできる。
【００４０】
また、被覆キトサンは、必要に応じて架橋剤を介して、適切な固定化基材に結合させることもできる。
【００４１】
固定化基材は、シリカゲルのように流動できる基材であっても、ガラス管のようにそうでないもののいずれでもよい。また、固定化基材の材料も、シリカゲル（例えば、カラム用シリカ）、ガラスチューブ、ポリスチレン等、被覆キトサンを固定化できるものであれば特に制限はない。
【００４２】
被覆キトサンを基材に固定化する方法は、被覆キトサンの微生物への吸着作用等に悪影響を及ぼさなければどのようなものでもよい。例えば、被覆キトサンのアミノ基を直接に基材に固定化してもよいし、適当な架橋剤を介して基材に固定化してもよい。架橋剤としては、ポリカルボン酸、ヘキサメチレンジイソシアネート等を用いることができる。また、基材は、アミノ基、ビニル基、エポキシ基等の官能基を有するものを用いることができる。これらの官能基を有する基材は、市販品又は市販品から既知の方法で作成することができる。また、被覆キトサンを基材に固定化するための反応条件は、当業者であれば既知の反応に基づいて適宜設定することができる。
【００４３】
特に、固定化基材としてカラム用シリカを用いる場合には、アミノ基を官能基として有するシリカを固定化基材として、グルタルアルデヒドを架橋剤として用いることにより、キトサンのアミノ基を被覆すると共に、固定化基材に被覆キトサンを固定化することができるので便利である。また、この場合は、シリカに固定化した被覆キトサンは、分散媒中で懸濁状態で使用することもできるし、カラム等に充填して使用することもできる。
【００４４】
なお、所定の脱アセチル化度を有する被覆キトサンを基材に固定化すると、その脱アセチル化度は固定化に寄与した分だけ小さくなる。一方、所定のアミノ被覆率を有する被覆キトサンを基材に固定化すると、そのアミノ被覆率は、固定化に寄与した分だけ大きくなる。したがって、被覆キトサンを基材に固定化する際には、この脱アセチル化度の減少及びアミノ被覆率の上昇を考慮して、固定化前の被覆キトサンの脱アセチル化度及びアミノ被覆率を決定すべきことに留意する。
【００４５】
（４）微生物
本発明の分離・濃縮方法で使用することのできる微生物としては、真菌類（酵母菌）、細菌類（グラム陽性及び陰性のいずれでもよい）、例えば、Escherichia、Bacillus、Micrococcus、Staphylococcus、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Staphylococcus、Vibrio、Aeromonas）などが含まれる。しかしながら、本発明の分離・濃縮方法を適用することのできる微生物は、これらに限定されるものではない。
【００４６】
次に、本発明の分離・濃縮方法を説明する。
【００４７】
本発明の分離・濃縮方法では、水性媒体中でＳＨ基含有化合物の存在下に被覆キトサンと微生物とを接触させる。本発明の分離・濃縮方法は、接触させる微生物の被覆キトサンとの吸着率が、微生物の種類に依存して異なることを利用して、微生物を生菌体のままで分離・濃縮することができるものである。したがって、本発明の分離・濃縮方法では、その効果が奏されるならば、その接触前及び／又は後に他の工程を施すことができる。
【００４８】
本発明の分離・濃縮方法では、被覆キトサンと微生物との接触条件｛例えば、接触時間、周囲の環境（雰囲気、温度、湿度、ｐＨ等）｝は、当業者であれば適宜選択することが可能である。通常、５〜６０分の接触時間、常温、常圧、対象となる微生物の生存可能なｐＨ、浸透圧で行うことができる。
【００４９】
本発明の分離・濃縮方法では、微生物に依存して被覆キトサンとの吸着率が異なるので、微生物が吸着した被覆キトサンと、被覆キトサンに吸着することなく水性媒体中に残存する微生物とを分離することにより、これら複数の微生物を互いに分離することができる。
【００５０】
以下に、水性媒体中でＳＨ基含有化合物の存在下に被覆キトサンと２種類以上の種類の微生物とを接触させた後に実施することのできる分離及び／又は回収手順（以下、「分離・回収手順」ともいう）の様々な態様を列記するが、本発明の分離・濃縮方法はこれらの態様に限定されるものではない。また、以下の分離・回収手順は、単独で行うことも、２種類以上の分離・回収手順を併用することもできる。さらに、１種類の分離・回収手順は、２回以上に分けて行うこともできる。このとき、各分離・回収手順は連続して行ってもよいし、あるいは他の工程が介在していてもよい。
【００５１】
分離・回収手順の第一の態様は、被覆キトサンに吸着した微生物と水性媒体に残存した微生物とを分離・回収するものであり、例えば、重力を用いたり（静置、遠心分離等）、クロマトグラフィーを用いて（カラムクロマトグラフィー等）行うことができる。これらの手順の選択は、被覆キトサンが担体に固定化されているか否か、回収に費やす時間、分離する微生物の種類数等に応じて適宜行うことができる。
【００５２】
この方法により微生物を分離する際には、微生物ごとの吸着率の差が大きいほうが高い精度で分離することが可能である。一般的には、少なくとも２０％程度の吸着率の差があれば分離が可能である。
【００５３】
ここで、吸着率（％）は、以下の式により求めた６００ｎｍにおける光学濃度で表される：
｛（被覆キトサンとの接触後の水性媒体の光学濃度）／
（被覆キトサンとの接触前の水性媒体の光学濃度）｝×１００
なお、光学濃度の測定波長を６００ｎｍとしたのは、通常菌体懸濁液の吸収波長が６００ｎｍであるからであるが、６６０ｎｍや７５０ｎｍでも得られる結果は同じである。
【００５４】
別の態様は、被覆キトサンに吸着した複数の微生物を分離するものである。このとき、適切な脱離剤を選択し、被覆キトサンから微生物を脱離させた後に、脱離した微生物を分離・回収する。その際の分離・回収手順は、上述したものを利用することができる。
【００５５】
脱離剤の使用条件（使用する脱離剤の種類、濃度、脱離剤添加後脱離が完了するまでの時間、脱離剤の添加方法等）は、被覆キトサンと微生物との吸着率｛具体的には、選択した脱離剤、使用する被覆キトサン、分離されるべき微生物の種類、所望する分離の精度、分離・回収手順等｝に応じて、適宜選択することができる。一般的には、脱離剤の濃度は、１〜５００mM程度、脱離剤添加後直ちに脱離が開始し、１〜２０分程度で脱離させることができる。また、脱離剤は、直接水性媒体に添加することもできるし、水溶液等として水性媒体に添加したり、クロマトグラフィーを用いる場合には、溶出液として添加することができる。
【００５６】
この態様により微生物を分離・回収する際には、微生物ごとの率の差が大きければ高い精度で分離することができる。一般的には、少なくとも２０％程度の脱離率の差があれば分離が可能である。
【００５７】
ここで、脱離率（％）は、以下の式により求めた６００ｎｍにおける光学濃度で表される：
［（脱離剤使用後の水性媒体の光学濃度）／
｛（被覆キトサンとの接触前の水性媒体の光学濃度）−（脱離剤使用前の水性媒体の光学濃度）｝]×１００
この態様での典型的な分離・回収手順は、吸着した複数種類の微生物それぞれに対して特異的な脱離剤を順次使用する手順である。具体的には、被覆キトサンに第一の微生物と第二の微生物が吸着している場合に、第一の脱離剤（これは、第一の微生物を脱離させることはできるが第二の微生物を脱離させることはできない）を使用して、第一の微生物を水性媒体中に放出させる。この水性媒体を除去した後に、第二の脱離剤（これは、第二の微生物を脱離させることができる）を使用して、第二の微生物を水性媒体中に放出させる。
【００５８】
さらに、別の態様として、微生物と被覆キトサンとを接触させた後に、脱離剤を使用することなく、被覆キトサンに吸着した微生物を分取することも可能である。この態様では、使用する被覆キトサンは、分子量、脱アセチル化度、アミノ基の被覆率、被覆キトサンを基材に固定化するか否か、使用する基材の種類等の性質のうち、少なくとも１つが異なれば、微生物との吸着率が異なるものを混合物として使用する。
【００５９】
以上本発明の分離・回収方法を２種類以上の微生物を対象としてこれらの少なくとも１種を他の微生物から分離することを前提として説明したが、本発明の分離・回収方法の原理の一つ、すなわち、微生物の被覆キトサンとの吸着率及び脱離率が微生物の種類に依存して異なることを利用すれば、以下のような変形方法としても利用することができる。本発明には、このような変形方法も含まれる。
【００６０】
その変形例には、試料中に特定の微生物が存在するか否かの検出方法が含まれる。具体的には、この検出方法は、試料中に特定の微生物が存在している場合には、その特定の微生物と吸着し得るアミノ基被覆キトサンと試料とを、ＳＨ基含有化合物の存在下に水性媒体中で接触させる第一の接触工程と；その特定の微生物が吸着した被覆キトサンと、その特定の微生物をアミノ基被覆キトサンから水性媒体中に脱離させ得る脱離剤とを接触させる第二の接触工程とを有し、水性媒体中に微生物が存在すれば、その特定の微生物が試料中に存在していることを検出できるものである。一方、試料中に特定の微生物が存在していない場合には、その特定の微生物と吸着し得るアミノ基被覆キトサンと試料とを、ＳＨ基含有化合物の存在下に水性媒体中で接触させる第一の接触工程と；その特定の微生物が吸着していない被覆キトサンと、その特定の微生物をアミノ基被覆キトサンから水性媒体中に脱離させ得る脱離剤とを接触させる第二の接触工程とを有し、水性媒体中に微生物が存在しなければ、その特定の微生物が試料中に存在していないことを検出できるものである。
【００６１】
この方法によれば、特定の微生物を同定する試薬等を使用することなく、試料中にその特定の微生物が存在するか否かを判断することができる。
【００６２】
本発明の分離・濃縮方法において、微生物を濃縮することができる場合には、次のような場合が含まれる。ある液体試料に微生物が存在する場合であって、被覆キトサンが基材に固定化されその固定化された被覆キトサンに微生物が吸着された場合には、基材に固定化された微生物の濃度は、元々の試料における微生物濃度よりも高くすることができる。また、別の液体試料微生物を被覆キトサンと吸着させた後、上清を除去し、次いで添加する脱離剤を少量の水溶液の状態で添加することにより、微生物が上清に脱離する。この場合、上清中の微生物濃度は、元々の試料における微生物濃度よりも高くすることができる。
【００６３】
以上説明した本発明の方法（上記変形例を含む）に用いることのできる装置（以下、「本発明の装置」ともいう）について説明する。
【００６４】
本発明の装置は、少なくとも、水性媒体中でＳＨ基含有化合物の存在下に被覆キトサンと微生物とを接触させることのできる場所が提供できるものであれば、どのようなものでもよい。微生物を回収し及び／又は濃縮すること等を考慮すると、特に次のようなものが好適である。
【００６５】
・被覆キトサンを収容する試験管、カラム、有穴プレート
これらの装置において、被覆キトサンは基材に固定化したものでも、固定化していないものでもよい。
【００６６】
・被覆キトサンを固定化したチップ
チップとして使用する場合には、被覆キトサンは、ガラス板等の基材に固定化したものとする。
【００６７】
上記装置には、必要に応じて、脱離剤も具備するキットの形にすることができる。このキットには、分離した微生物を培養するための培地、分離した微生物を同定するための試薬等もさらに具備することができる。これら脱離剤等追加に具備する具体的な物の種類や量等は、対象となる微生物等に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００６８】
本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６９】
特に、本発明の分離・濃縮方法を適用することのできる微生物は以下の実施例で使用したものに限定されない。本発明の分離・濃縮方法は、以下の実施例で使用する微生物以外のものであっても、その微生物が、ＳＨ基含有化合物の存在下に水性媒体中で被覆キトサンとどの程度の吸着率で結合するか／あるいは結合しないか、さらにはどのような脱離剤を使用すれば脱離できるか等について予備試験を行えば、いずれもの微生物にも適用することができる。
【００７０】
（実施例１）
１．供試菌株として、Escherichia coli XL1-blue、Bacillus subtilis IAM12118、Micrococcus Luteus IAM1056、Staphylococcus aureus IAM12544、Saccharomyces ludwigii IAM12243、Saccharomyces cerevisiae IAM4512、Schizosaccharomyces pombe IAM4863、Lactobacillus casei NRIC1046、Staphylococcus epiderimidis JCM2411、Vibrio parahaemolyticus IFO12711、Aeromonas hydrophyla IFO12978、Streptococcus mutans GS5、Streptococcus sobrinus 6715、Streptococcus salivarius ATCC9222を使用した。これらの菌株は、いずれも商業的、その他の手順により入手可能なものである。なお、S. mutans、S.sobrinus及びS.salivariusは、日本大学松戸歯学部細菌学教室の保存菌株である。
【００７１】
２．菌液の調製
上記菌株をそれぞれ培養し集菌後10mM MOPS（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)溶液（pH7.0）で３回洗浄した。それぞれの菌株を10mM MOPSに懸濁し、これにL-システイン溶液（10mM MOPSにシステインを溶解させた）を加え、最終的にL-システインの濃度が50mMになるように調整した。それぞれの菌株の懸濁液の光学濃度（O.D.)600nmにおける吸光値が0.7になるように50mM L-システイン＋10mM MOPS溶液で調整した。
【００７２】
３．キトサンの固定化
マイクロチューブ（2mL容量）にシリカNH-DM1020（富士シリシア製）50mgに0.1M酢酸溶液（pH5.0、0.25mMナトリウムアザイド添加）190μlを加えて10分間脱気、その後キトサン溶液を1.5mL加えた。25%グルタルアルデヒドを0.3mL加えて室温下ですばやく攪拌した（３時間）。その後10mM MOPSにて５回洗浄した。
【００７３】
尚、キトサン溶液は、0.1M酢酸溶液（pH5.0、0.25mMナトリウムアザイド添加）にキトサンの濃度が0.05%になるように溶解した。また、ここで使用したキトサンの分子量は、重量平均分子量１５万、脱アセチル化度は０．９９であった。
【００７４】
４．菌体のキトサンへの吸着
キトサン固定化シリカに上記調整菌液1.8mLを添加し室温下で一時間攪拌した。その後、静置しキトサン固定化シリカを沈殿させ、上清を除去した。この上清のO.D.600nmにおける吸光値を測定した。上清を除いた沈殿に様々に調整した溶出液1.8mLを加え室温下で15分間攪拌した。その後、静置しキトサン固定化シリカを沈殿させ、溶出液のO.D.600nmにおける吸光値を測定した。各種溶出液の添加によって分離してくる菌の割合は以下の計算式にて算出した。
【００７５】
脱離率（％）＝溶出液添加後の上清のO.D.600nmの吸光値÷(0.7（最初の菌液のO.D.600）−吸着後の上清）×100
上記14種類の菌株をキトサン固定化シリカと混合し、これにいろいろな溶出液で溶出させた際の菌の脱離率を表１と表２にまとめた。
【表１】
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【００７６】
【表２】
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【００７７】
表１及び表２に示す結果から菌種によって脱離できる溶出液の種類が異なることが判明した。
【００７８】
表１の結果から、以下のことも判明した。Sacch. cerevisiae、Sacch. ludwigi及びSchizo. pombeは、いずれも酵母菌に属するものであるが、例えば、脱離剤として1M 塩化ナトリウムを使用するとS. cerevisiaeは75%以上が脱離するのに対して、S. ludwigi及びS. pombeは25%以下しか脱離しない。この結果から、少なくとも実施例１の条件下では、酵母菌は、種によって、脱離のし易さが大きく異なっている。このことから、酵母菌については、種のレベルでの分離が可能なようである。同様の現象は、口腔細菌においても認められた（表２のS. mutans、S. sobrinus及びS. salivariusの結果を参照されたい。）。
【００７９】
表１に示す菌株のうち、E. coliはグラム陰性菌であり、それ以外の菌株は、グラム陽性菌である。実施例１の条件下では、脱離剤として0.1Mクエン酸と1%CHAPSとの混合液を使用すると、グラム陰性菌をより選択的に分離することができるようである。また、0.1Mアルギニン（Arg）と1%CHAPSとの混合液やTris緩衝液と1%CHAPSとの混合液を使用すると、グラム陽性菌をより選択的に分離することができるようである。
【００８０】
また、実施例１の条件下では、脱離液中に界面活性剤を含有すると、含有しない場合と比較して回収率が上がった。
【００８１】
（実施例２）
種類の違う菌体混合液からの分離
E. coli XL1-blueとB. subtilis IAM12118の菌体混合液を実施例１と同様に調整した。この混合液1.8mLをキトサン固定化シリカに添加し室温下で1時間攪拌した。その後、静置しキトサン固定化シリカを沈殿させ、上清を除去した。この上清の0.D.600nmにおける吸光値を測定した。
【００８２】
残渣（沈殿）にL-システインとMOPSがそれぞれ50mM及び10mMになるように調整した混合水溶液（以下、「50mM L-システイン＋10mM MOPS溶液」というように記載する）1.8mLを添加し、菌を洗浄した後に、上清を除去し、この上清の吸光値(O.D.600nm）を測定することを１サイクルとして、このサイクルを３回繰り返し、それぞれの上清の吸光値(O.D.600nm）を記録した（図１−１のフラクションNo.２〜４に対応）。その後0.1Mクエン酸＋１％ Tween 20（商品名）溶液1.8mLを添加し、菌を脱離させた後に上清を除去し、この上清の吸光値(O.D.600nm）を測定することを１サイクルとして、これを３回繰り返しそれぞれの上清の吸光値(O.D.600nm)を記録した（図１−１のフラクションNo.５〜７に対応）。その後50nM L-システイン＋10mM MOPS溶液1.8mLを添加し、菌を洗浄した後に上清を除去し、この上清の吸光値(O.D.600nm)を測定した（図１−１のフラクションNo.８〜９に対応）。その後0.1M Arg＋１％ Tween溶液1.8mLを添加し菌を脱離させた後に、上清を除去し、この上清の吸光値(O.D.600nm）を測定することを１サイクルとして、このサイクルを３回繰り返し、それぞれの上清の吸光値(O.D.600nm)を記録した（図１−１のフラクションNo.１０〜１２に対応）。
【００８３】
E. coli XL1-blueとB. subtilis IAM12118の菌体混合液の代わりに、E. coli XL1-blue単独液と、B. subtilis IAM12118単独液を用いて、上記と同じ操作を行った。
【００８４】
結果を図１−１及び図１−２に示した。図１−１は、各フラクション（横軸）の吸光値（縦軸）を示している。黒四角は、E. coli XL1-blueとB. subtilis IAM12118の菌体混合液（Mix)を、黒丸は、E. coli XL1-blue単独液（E. coli）を、黒三角は、B. subtilis IAM12118単独液（B. subtilis)での結果を示している。図１−２は、E. coli、B. subtilis及びMixで得られた各フラクションNo.５（Solution A)とフラクションNo.１０(Solution B)の顕微鏡写真（倍率１，０００）である。
【００８５】
この結果から、E. coli XL1-blueとB. subtilis IAM12118の混合液から脱離液を変えることによって生きた状態で分離できたことが判る。
【００８６】
（比較例１）
L-システインを含有しないこと以外は実施例２と同じ実験を行ったが、この実施例で使用した脱離剤の濃度では菌は脱離しないことを確認した。さらに、脱離剤の濃度を上げてみたところ（NaClで２４％）、菌は脱離しなかった。
【００８７】
（実施例３）
E. coli XL1-blueとB. subtilis IAM12118の混合液の代わりに、B. subtilis IAM12118とS. cerevisiae IAM4512の混合液を用い、また脱離液として１M NaClと0.1Arg＋1%Tween 20とを用いたこと以外は実施例２と同じ実験を行った。その結果、これらの菌を生きた状態で分離できた（図２−１及び図２−２参照）。
【００８８】
（実施例４）
E. coli XL1-blueとB. subtilis IAM12118の混合液の代わりに、E.coli XL1-blueとS. cerevisiae IAM4512の混合液を用い、脱離剤として0.01M NaClと0.1Mクエン酸＋1% Tween 20とを用いたこと以外は実施例２と同じ実験を行った。その結果、これらの菌を生きた状態で分離できた（図３−１及び図３−３参照）。
【００８９】
（実施例５）
ＳＨ基含有化合物としてL-システインの代わりにメチオニン及びグルタチオンを用い、菌体は、S. mutans GS5を用いて、実施例１と同様の実験を行った。なお、ＳＨ基含有化合物を含有しないコントロールとして、10mM MOPSのみを用いたので、離脱液は、50mM メチオニン＋10mM MOPS及び50mM グルタチオン＋10mM MOPSとした。
【００９０】
結果を表３に示す。
【表３】
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【００９１】
表３に示す結果から、固定化した被覆キトサンに各種溶液（ＳＨ基を含まない）を用いた場合でも菌体は吸着することがわかる。しかし、ＳＨ基含有のグルタチオンを用いた方が、吸着率が高く、分離・濃縮には、より適していることがわかった。
【００９２】
（測定例１）
実施例１と同じ方法でシリカNH-DM1020固定化キトサンに菌体（E. coli XL1-blue、B. subtilis IAM12118、M. Luteus IAM1056、S. aureus IAM12544、S. cerevisiae IAM4512、S. ludwigii IAM12243及びS. pombe IMA4863）を吸着させ、それらの吸着率を測定した。水性媒体として、50mMシステイン＋10mM MOPSを用いた。
【００９３】
図４に得られた結果を示す。
【００９４】
図４に示す結果から、各菌体は高い吸着率を示したので、幅広い菌種に使用できることがわかった。
【００９５】
（測定例２）
シリカNH-DM1020、シリカNH-DM1020にグルタルアルデヒドを結合させたもの、さらにシリカNH-DM1020にグルタルアルデヒドを架橋剤として用いキトサンを結合させたもの、以上３種のIRスペクトルを測定した。
【００９６】
IRスペクトルを図５に示す。
【００９７】
この結果から結合したキトサンの脱アセチル化度は低くなっていることがわかる。
【００９８】
（測定例３）
実施例１で調製したシリカに固定化したキトサンを含有する水懸濁液中の塩（NaCl)濃度の違いより微生物（E. coli及びB. subtilis)が受ける影響を調べた。
【００９９】
試料Ａ：水懸濁液中の塩濃度0M
試料Ｂ：水懸濁液中の塩濃度0.5M
試料Ｃ：水懸濁液中の塩濃度1M
試料Ａでは、いずれの微生物も生きた状態にあったが、試料Ｂでは、E. coliは生きた状態であったが、B. subtilisは死滅した状態であり、試料Ｃでは、E. coli、B. subtilis両菌株共死滅した状態であった。
【０１００】
これらのことから、各試料におけるキトサンは、図６示す模式図のような状態と分子構造でシリカに固定化されていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１−１】図１−１は実施例２で得られた各フラクションの吸光値を示すグラフである。
【図１−２】図１−２は、図１−１のピークを示す２つのフラクションの顕微鏡写真である。
【図２−１】図２−１は実施例３で得られた各フラクションの吸光値を示すグラフである。
【図２−２】図２−２は、図２−１のピークを示す２つのフラクションの顕微鏡写真である。
【図３−１】図３−１は実施例４で得られた各フラクションの吸光値を示すグラフである。
【図３−２】図３−２は、図３−１のピークを示す２つのフラクションの顕微鏡写真である。
【図４】図４は、各菌体の吸着率を示すグラフである。
【図５】図５は、IRスペクトルである。
【図６】図６は、シリカに固定化された被覆キトサンの模式図
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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