(57)【要約】【課題】細胞懸濁液等の液状体の採取に適しており、同時に採取した液状体の分離操作も実施可能な液状体採取装置を提供する。【解決手段】液状体採取装置１内の圧力を調整可能な内圧調整部３と、前記内圧調整部３の操作によって液状体の吸引および／または排出を可能とする吸排孔５ａを有する吸排部５と、前記吸排部５と連通され吸引した液状体を貯留可能であるとともに、吸引した前記液状体中の重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部８ａを前記吸排部５との連通部位を含まない部位に有する貯留部７と、を備えるようにする。【選択図】  図１
2005333852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状体採取装置であって、
前記装置内の圧力を調整可能な内圧調整部と、
前記内圧調整部の操作によって液状体の吸引および／または排出を可能とする吸排孔を有する吸排部と、
前記吸排部と連通され吸引した液状体を貯留可能であるとともに、吸引した前記液状体中の重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部を前記吸排部との連通部位を含まない部位に有する貯留部と、
を備える、液状体採取装置。
【請求項２】
前記液状体は細胞懸濁液である、請求項１に記載の液状体採取装置。
【請求項３】
前記貯留部は吸排部の外側に突出形成されている、請求項１または２に記載の液状体採取装置。
【請求項４】
前記貯留部は前記吸排部に対して対称的に外側に突出形成されている、請求項３に記載の液状体採取装置。
【請求項５】
前記貯留部は前記吸排部に対してほぼ直交して備えられている、請求項３または４に記載の液状体採取装置。
【請求項６】
前記貯留部は前記吸排部を中心とした円周上に二以上の前記集積部を備えている、請求項５に記載の液状体採取装置。
【請求項７】
単一の前記吸排部に対して二以上の前記内圧調整部を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の液状体採取装置。
【請求項８】
前記貯留部は前記液状体採取装置における前記吸排部の反対側端部に前記集積部を有する、請求項１または２に記載の液状体採取装置。
【請求項９】
前記貯留部は、前記吸排部を含む前記液状体採取装置の一部に対して摺動可能に構成された管状の前記内圧調整部によって形成されている、請求項８に記載の液状体採取装置。
【請求項１０】
液状体採取用チップであって、
前記チップの内部の圧力を調節可能な内圧調整装置に着脱可能であり、
接続された前記内圧調整装置の操作により液状体を吸引および排出可能な吸排孔を有する吸排部と、
前記吸排部と連通され吸引した前記液状体を貯留可能であるとともに、重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部位を前記吸排部との連通部位を含まない部位に有する貯留部と、
を備える、チップ。
【請求項１１】
細胞の培養方法であって、
請求項１〜９のいずれかに記載の液状体採取装置を用いて、細胞懸濁液を吸引して採取する採取工程と、
前記液状体採取装置の前記集積部に重力および／または遠心力によって前記細胞を集積させる細胞分離工程と、
集積された前記細胞の上清を前記内圧調整部を操作して排出するとともに前記内圧調整部を操作して新たな培地を吸引採取して集積された前記細胞を分散した細胞懸濁液を調製する細胞懸濁液調製工程と、
前記液状体採取装置内に調製した細胞懸濁液を前記内圧調整部を操作して培養容器に排出して細胞を播種する播種工程と、
播種した前記細胞を培養する培養工程と、
を備える、培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液などの液状体が採取可能であって、採取した該液状体の処理操作にも適用できる液状体採取装置およびこの液状体採取装置を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養技術が発達し、近年では医療や研究などの技術分野において培養された細胞が利用されている。例えば、患者本人から採取された少量の皮膚表皮細胞（ケラチノサイト）を培養して増殖させることによって、大量の培養表皮細胞シートを得て、熱傷などの患者に対して利用されている。このように、採取された少量の細胞から多くの細胞を得るためには、継代培養という技術が必要になる。
【０００３】
継代培養とは、１つの培養容器で培養した細胞を一旦剥離して回収した後、複数の培養容器に再度播種して培養することであって、必要な回数だけ繰り返すことができる。この継代培養操作では、通常、最初に、培養容器底面に接着している細胞を酵素処理などによって剥離して細胞懸濁液の状態にした後、この細胞懸濁液をピペットで吸引する。次いで、ピペット中の細胞懸濁液を遠心チューブに注入し、遠心分離器によって細胞をペレット状に凝集させた後、上清のみをピペットで吸引排出する。最後に、新しい培地を遠心チューブに注入して細胞を分散させ、この細胞懸濁液をピペットで吸引し、複数の培養容器にそれぞれ再播種して培養する（非特許文献１）。このような継代培養操作は、作業者によるマニュアル作業によって行われているため、作業者の負担になっている。また、培養におけるコンタミネーション（汚染）を防止するためには、ピペット操作などの作業において熟練した技術が必要である。その一方で、継代培養操作の工程を自動化した装置が案出されている。ＣＣＤカメラによって培養容器底面から細胞増殖の状態を観察し、所定状態に至った時点で自動的に細胞剥離、細胞回収、細胞再播種の工程を行っている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００１−２７５６５９号公報
【非特許文献１】第三版  組織培養の技術［基礎編］，日本組織培養学会編，朝倉書店，p.32-46，1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、このような自動培養装置は個々の培養ロットごとに広いスペースが必要となり、多くのロットを取り扱うのには適していない。また、多種多様な細胞を培養するには適していない。一方、細胞懸濁液などの液状体を採取するピペットは、液状体の採取と排出とのみを行なう手段として提供されてきており、それ自体多用途に用いられているものの、他の液状体操作、例えば、液状体の採取後液状体の排出までの間において遠心分離などの各種の液状体の処理操作などを実現可能に形成されているものは現状においてはない。
【０００５】
本発明は、上記問題点を鑑み、細胞懸濁液等の液状体の採取に適しており、同時に採取した液状体の分離操作も実施可能な液状体採取装置および液状体採取用チップを提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、このような液状体採取装置を用いた細胞培養方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、液状体採取装置であって、前記装置内の圧力を調整可能な内圧調整部と、前記内圧調整部の操作によって液状体の吸引および／または排出を可能とする吸排孔を有する吸排部と、前記吸排部と連通され吸引した液状体を貯留可能であるとともに、吸引した前記液状体中の重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部を前記吸排部との連通部位を含まない部位に有する貯留部と、を備える、液状体採取装置が提供される。この液状体採取装置において、前記液状体は細胞懸濁液であることが好ましい態様である。また、前記貯留部は吸排部の外側に突出形成されていることが好ましく、さらに好ましくは、前記貯留部は前記吸排部に対して対称的に外側に突出形成されている。これらの前記貯留部が吸排部の外側に突出形成されている態様においては、前記貯留部は前記吸排部に対してほぼ直交して備えることが好ましい。また、前記貯留部は管状体であることが好ましい。また、これらのいずれかの液状体採取装置においては、単一の前記貯留部が二以上の前記集積部を有することが好ましい。この態様においては、前記貯留部は、前記吸排部に対してほぼ直交して備えられ前記吸排部を中心とした円周上に二以上の前記集積部を備えていることが好ましい。さらにまた、単一の前記吸排部に対して二以上の前記内圧調整部を有することが好ましい態様である。
【０００７】
また、本発明によれば、前記貯留部は前記液状体採取装置における前記吸排部の反対側端部に前記集積部を有することが好ましい態様である。この態様においては、前記貯留部は、前記吸排部を含む前記液状体採取装置の一部に対して摺動可能に構成された管状の前記内圧調整部によって形成されていることが好ましい。
【０００８】
さらに、本発明によれば、液状体採取用チップであって、前記チップの内部の圧力を調節可能な内圧調整装置に着脱可能であり、接続された前記内圧調整装置の操作により液状体を吸引および排出可能な吸排孔を有する吸排部と、前記吸排部と連通され吸引した前記液状体を貯留可能であるとともに、重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部位を前記吸排部との連通部位を含まない部位に有する貯留部と、
を備える、チップが提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、細胞の培養方法であって、上記いずれかの液状体採取装置を用いて、培養した細胞の懸濁液を吸引して採取する採取工程と、前記液状体採取装置の前記集積部に重力および／または遠心力によって前記細胞を集積させる細胞分離工程と、集積された前記細胞の上清を前記内圧調整部を操作して排出するとともに前記内圧調整部を操作して新たな培地を吸引採取して集積された前記細胞を分散した細胞懸濁液を調製する細胞懸濁液調製工程と、前記液状体採取装置内に調製した細胞懸濁液を前記内圧調整部を操作して培養容器に排出して細胞を播種する播種工程と、播種した前記細胞を培養する培養工程と、を備える、培養方法が提供される。この形態においては、前記培養工程は継代培養工程であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の液状体採取装置は、前記液状体採取装置内の圧力を調整可能な内圧調整部と、前記内圧調整部の操作によって液状体の吸引および／または排出を可能とする吸排孔を有する吸排部と、前記吸排部と連通され吸引した液状体を貯留可能であるとともに、吸引した前記液状体中の重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部を前記吸排部との連通部位を含まない部位に有する貯留部と、を備えている。この液状体採取装置によれば、採取した液状体を貯留し、前記吸排部を含まない部位に重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積させることができる。このため、この液状体採取装置によれば、単一の装置によって液状体を採取するとともに遠心分離等によって液状体中の沈降分離可能な成分を分離することができる。また、前記吸排部を含まない部位に沈降成分を集積させるため、集積部に沈降成分を保持したままで上清を排出することができ、同時に、沈降成分を集積部に保持した状態で液状物を吸引することができる。したがって、この液状体採取装置によれば、同一装置によって、液状体の吸引採取、遠心分離等による成分分離（沈降成分の集積部位への集積と、上清の排出）、沈降成分への液状体の供給を実現することができる。また、このような液状体採取装置によれば、細胞懸濁液の採取、遠心分離等による細胞の分離、所望の液状体による分離した細胞の再分散、再分散液の排出を容易に行うことができ、この結果、細胞の継代培養における一連の操作を容易化することができる。
【００１１】
以下、本発明の液状体採取装置について説明するとともに液状体採取用チップについて説明し、次いで、この液状体採取装置を用いた細胞培養方法を含む細胞処理方法について説明する。
【００１２】
（液状体採取装置）
（第１の実施形態）
まず、図１〜図４に示す本発明の一例の液状体採取装置を参照しながら、本発明の液状体採取装置の基本構成を説明しつつ、第１の実施形態について説明する。図１には、本発明の第１の実施形態の液状体採取装置（以下、単に装置という。）１が示されている。装置１は、内圧調整部３と、吸排部５と、貯留部７と、を備えている。
【００１３】
（内圧調整部）
内圧調整部３は、吸排部５の吸排孔５ａから液状体を吸引および排出可能に装置１の内部、具体的には液状体を吸引保持可能なハウジング１ａ内の圧力を調整する手段である。内圧調整部３としては、吸排孔５ａから液状体を吸排可能に吸排部５内の圧力を変動させることができるものであればよく、形状一定で内部の圧力を変動させる気体吸排手段のほか、所定範囲をスライドさせることにより、装置１の吸排孔５ａにいたる範囲の容積を拡張あるいは縮小させることのできるピストンなどのスライド部材や、可撓性によってそれ自体の内部容積を拡張および収縮可能として装置１の吸排孔５ａにいたる範囲の容積を変動可能とするスポイト部材など公知の各種容積変動部材を用いることができる。
【００１４】
なお、内圧調整部３は、単一の吸排部５に対して複数個設けられていてもよい。多量の液状体を吸排するのに都合がよく、また、内圧調整部３として、スライド等によって内部容積を変動させる部材を用いる場合には、個々の摺動部材の移動量を大きくすることなく多量の液状体の吸排が可能となる。また、摺動部材等の移動量を小さくすることで、必要量を吸引保持したときの装置１の外形サイズを小さくすることができ、取り扱いや遠心分離装置への装着を容易にすることができる。
【００１５】
装置１においては、特に、内圧調整部３を、シリンダー３ａとシリンダー３ａの内部に挿入され内部をスライド移動することでシリンダー３ａ内の容積を変動可能なピストン３ｂとから構成している。シリンダー３ａは、吸排部５と貯留部７と連通しており、シリンダー３ａ内でピストン３ｂをスライド移動させると、ハウジング１ａの外部と連通する内部容積（吸排部５と貯留部７とシリンダー３ａの内部容積）が変動するため、内部圧力が変動し、吸排孔５ａ近傍の液状体を貯留部７内部に吸引したり、貯留部７内部の液状体を排出したりできる。
【００１６】
（吸排部）
吸排部５は、開口した吸排孔５ａを備えている。吸排部５は、内圧調整部３の操作により液状体を吸引および排出可能となっているとともに液状体を貯留する貯留部７と連通されている。吸排部５は、その先端側を、液状体を吸引および排出を容易に可能な管状に形成することができる。この場合には、その先端に吸排孔５ａを備えることができる。装置１は、特に、吸排部５が吸排孔５ａに向かって先細り状の管状体に形成されている。吸排部５は、その一部において、通常は、吸排孔５ａを鉛直下方に向けて配置したときその上方において貯留部７と連通している。装置１においては、吸排部５は、吸排孔５ａから貯留部７の下端に至る管状体となっている。
【００１７】
（貯留部）
貯留部７は、吸排部５と連通されて吸引した液状体を貯留可能に形成されている。すなわち、吸排部５から吸引した液状体が導入されて貯留可能なキャビティを備えている。貯留部７は、吸排部５とともに装置１のハウジング１ａを構成しており、吸排部５と連通され、吸排部５と同様内圧調整部７によって内部圧力が調整される。貯留部７の形態は限定しない。液状体を貯留可能なキャビティを有しており、キャビティ内部が吸排部５と連通されていればよい。したがって、貯留部７は、適当なキャビティを有する容器状であってその開口部位が吸排部５と連通する形態を採ることができる。貯留部７は、好ましくは、図１に示すような一般の遠心分離用チューブなどを含む管状の容器とする。管状体であると、その底部を集積部７ａとすることで吸排部５と十分離れた集積部７ａを容易に形成することができ、集積部７ａに沈降成分を保持した状態での液状体の吸引排出を容易に行なうことができる。
【００１８】
このような貯留部７は、一旦吸排部５にて吸引した液状体を、装置１を動かすことなどによって装置１内で移動させてはじめて導入可能に形成されていてもよいが、好ましくは吸排孔５ａから吸引した液状体を、吸引に伴ってそのまま貯留部７に導入可能に形成されている。こうした形態であれば、装置１を動かすことなく液状体を貯留部７に導入できるため、装置１の取り扱いを容易にすることができる。特に、図１および図２に示すように、貯留部７は、吸排孔５ａをおおよそ鉛直下方に位置させたとき、貯留部７に貯留した液状体が同時に吸排部５を満たすように形成されていることが好ましい。この構成によれば、貯留部７と吸排部５との間で液状体を均等に存在させることができ、液状体を装置１内で遠心分離等の処理をかける時に容易に吸排部５の液状体を貯留部７へ移動させることができる。また、装置１から液状体を排出するときには、容易に排出しようとする全ての液状体を排出できる。
【００１９】
なお、貯留部７は、装置１を方向変換させることによって吸排部５から吸引した液状体を全て貯留部７に貯留させておくことができることも好ましい。こうすることで、吸排部５には液状体が及ばない状態で貯留部７において遠心分離が可能となる。例えば、図１に示すように、吸排部５に対して貯留部７を直交状に設けることにより、液状体の吸引導入も容易であるとともに、必要に応じて装置１を方向変換すれば、貯留部７にのみ液状体を貯留することができる。
【００２０】
（集積部）
貯留部７は、少なくとも一つの集積部７ａを有している。集積部７ａは、重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を沈降させて集積させる部位である。集積部７ａは、吸排部５との連通部位を含まない部位とする。好ましくは、集積部７ａは、貯留部７において吸排部５との連通部位から最も遠位にある部分とする。こうすることで、集積部７ａに確実に沈降成分を集積保持させて上清と沈降成分とを容易に分離させることができる。多くの場合、集積部７ａは、貯留部７の最奥部あるいはその近傍であって、貯留部７を独立した容器として把握した場合の底部に相当する。また、集積部７ａは、貯留部７における重力方向および／または遠心力がかかる部位であるため、装置１は、遠心時等において貯留部７の最奥部あるいは底部近傍が遠心力方向に一致するように遠心分離装置の回転軸等に装着されるように構成される。なお、集積部７ａは、通常の遠心分離用チューブと同様に、沈降成分を集積しやすい先細り状あるいは半球状であることが好ましく、より好ましくは円錐形状である。
【００２１】
以上のことから、貯留部７の吸排部５に対する配置形態の一例として、図１および図２に示すように、貯留部７は吸排部５からその外側に突出する中空の凸状部とする例を挙げることができる。この構成によれば、スイングロータやアングルロータ等においても外側に突出させた凸状部の最奥部（底部）近傍を遠心力方向となるように遠心分離装置にセットすることが可能である。また、貯留部７と吸排部５との連通形態は、上述したように、吸排部５で吸引した液状体をそのまま同時に導入可能であることが好ましい。したがって、図１および図２に示すように、吸排部５との連通部位は吸排孔５ａの近傍であることが好ましい。また、同様に図１および図２に示すように、連通部位からそのまま液状体が貯留部７内へと導入でき、また貯留部７内からの液状体がそのまま吸排部５へと移動できるためには、液状体の吸引時、すなわち、吸排孔５ａがおおよそ鉛直下方に向けた状態において、貯留部７のキャビティがほぼ水平状になるように形成されていることが好ましい。具体的には、吸排部５に対して直交するように貯留部７が備えられていることが好ましい。こうすることで、吸排部５内の容積を超えて吸引された液状体はスムーズに貯留部７に導入されることになり、同様にスムーズに吸排部５から排出できる。なお、吸排部５の容積は貯留部７の容積に比較して十分に小さく形成されることが好ましい。例えば、５分の１程度以下とすると、十分量を貯留部７に導入でき効果的な分離操作が可能となる。
【００２２】
なお、貯留部７は、吸排部５の外側の一方向に突出されていてもよいし、二以上の方向で外側に突出されていてもよい。例えば、後述するように、吸排部５に対して対称的に外側に突出されていてもよく、放射状に突出されていてもよい。したがって、貯留部７は、吸排部５に対して二個以上設けることもできる。また、多くの液量を吸引および排出可能とし、あるいは大量の沈降成分を沈降集積させるためには、容積の大きい貯留部７を形成することが好ましく、この場合、吸排部５に対して、好ましくは吸排部５の外側の二方向以上に突出する単一の貯留部７を形成して、この単一の貯留部７に対して複数個の集積部７ａを形成することもできる。こういった貯留部７については、第１の実施形態の変形例としての第２の実施形態において詳細に説明する。
【００２３】
次に、本装置１を用いた細胞の培養方法について説明し、特に継代培養操作の一例を図３および図４を参照しながら説明する。
【００２４】
まず、継代培養のため、現状の培養細胞の懸濁液を調製する（図３のステップＳ１００）。たとえば、作業者は、接着依存性の細胞を培養した培養容器（図示せず）にトリプシン溶液などの細胞剥離剤を注入し、所定時間静置することによって培養面である培養容器底面から培養細胞を剥離させる。培養細胞が剥離したことを確認するか、あるいは所定時間が経過したら、酵素処理を抑制する抑制剤を投入し、酵素処理を終了させる。剥離処理によって細胞が培養面から剥離すると、細胞は溶液中に分散し、細胞懸濁液の状態になる。なお、このような細胞剥離工程に関しては、細胞培養あるいは組織培養における当業者においては周知の事項である。
【００２５】
次に、調製した細胞懸濁液を採取する（図３のステップＳ１１０）。作業者は、装置１の吸排孔５ａを細胞懸濁液に接触させ、その状態でピストン３ｂを上方に摺動させて、装置１内の容積を増大させる。これにより装置１の内部、すなわち、貯留部７や吸排部５の内部に負圧が加わり、これにより、細胞懸濁液が吸排孔５ａから吸引される（図４（ａ））。装置１においては、特に吸排部５の直上に貯留部７が位置されており、しかも貯留部７は細胞懸濁液を吸引する状態において吸排部５に対してほぼ水平状態であるため、吸排孔５ａから吸引された細胞懸濁液はそのまま貯留部７内に導入され貯留される。
【００２６】
次に、細胞懸濁液を吸引し貯留部７に貯留させた装置１を、遠心分離装置にセットし、遠心分離して細胞を分離する（図３のステップＳ１２０）。まず、装置１を、貯留部７の集積部７ａが鉛直下方を指向するように装置１の方向を変換する。こうした方向変換により、吸排部５と貯留部７の一部を満たしていた細胞懸濁液は全て貯留部７に導入され貯留されることになり、吸排部５側には及ばない状態となる（図４（ｂ））こうした姿勢における装置１の貯留部７は、通常の遠心分離用チューブと同様の形態であるといえ、装置１の貯留部７は、スイングロータあるいはアングルロータ等いずれの形態の遠心分離装置に対して適用可能である。
【００２７】
本装置１のスイング型の遠心分離装置のチューブ懸架部（ホルダー）へのセット時および遠心時の状態を図５に示す。図５に示すように、装置１の貯留部７を遠心分離装置のホルダー８ａに懸架保持させる。ホルダー８ａは、遠心時には水平状となるよう揺動軸８ｃに支持されている。なお、装置１の吸排孔５ａには、内部の液体の蒸発や飛散を防止するためのキャップ８ｂを装着することができる。こうして遠心分離装置に本装置１をセット後、遠心分離装置を駆動させると、遠心力の作用によりホルダー８ａが水平状態となり、ホルダー８ａにセットされた装置１は集積部７ａが遠心力方向を指向した状態で回転する。遠心分離装置は常法に基づいて細胞を沈降分離可能な回転数と時間で遠心する。この遠心分離操作によって、細胞は集積部７ａに集められ、集積部７ａに細胞のペレットが形成される。同時に、細胞懸濁液中の残余の部分である懸濁液ないし溶液は上清となる。なお、遠心分離装置へ本装置１のセット時には、ピストン３ｂをシリンダー３ａ内に摺動させてシリンダー３ａ内の空気を排出しておくこともできる。こうすることで、ピストン３ｂの突出長さを減少させることができるためホルダー８ａへのセットが容易になり、本装置１をセットして使用するために必要な遠心分離装置内のスペースを縮小することができる。また、安定した遠心分離が可能となる。
【００２８】
遠心分離後、集積部７ａに集積された細胞ペレットが崩れないように注意しながら、作業者は吸排孔５ａが下方に位置する状態でピストン３ｂを下方に摺動させ、剥離剤を含む上清を吸排孔５ａより排出する（図４（ｃ）参照）。
【００２９】
次に、装置１に新たな培地を吸引採取して細胞を分散させて播種のための細胞懸濁液を調製する（図３のステップＳ１３０）。図４（ｄ）に示すように、吸排孔５ａを新鮮な液体培地に接触させた状態で、すなわち、吸排孔５ａを鉛直下方に向けた状態でピストン３ｂを上方に摺動させて液体培地を吸排部５および貯溜部７内に吸引する。新鮮な液体培地を吸引した後、吸排孔５ａを適当なフィルムあるいは専用のキャップ９で密閉した後、作業者は装置１を激しく振とうすることによって、集積部７ａに集められている細胞ペレットを分散させ、細胞を液体培地中に懸濁させることができる（図４（ｅ）参照）。これによって継代培養のために播種可能な細胞懸濁液を得ることができる。
【００３０】
細胞懸濁液が得られたら、培養容器にこれらを排出して細胞を播種する（図３のステップＳ１４０および図４（ｆ））。作業者はピストン３ｂを下方に摺動させ、所定の播種量となるように複数の培養容器に順次注入して播種工程を実施する。播種工程が実施されると、次いで所定の培養条件で培養工程を開始する。
【００３１】
このように、本発明の液状体採取装置によれば、剥離した細胞などを液状体に懸濁させて得られる細胞懸濁液の採取、細胞分離（細胞の集積と上清の排出）、新たな培地による細胞懸濁液の調製、１あるいは２以上の培養容器への分注を含む播種工程などの継代操作に必要な作業を１つの装置内で全て行えるため、作業者の負担を軽減することができる。また、工程毎におけるピペットと容器間での液状体の移し替えなどの操作が省略でき細胞が外部に曝される機会を減少させることができて、コンタミネーションの可能性を低減することができる。以上のことから、本装置は、細胞懸濁液の処理、特に、継代培養に伴う細胞の処理に適している。この他、本装置は、重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を含む液状体の採取、分離、洗浄等の操作にも適している。例えば、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を含む液状体の採取、分離、洗浄等の操作にも適している。
【００３２】
（第２の実施形態）
次に、第１の実施形態の変形例である第２の実施形態の装置１１について図６を参照しながら説明する。第１の実施形態では、貯留部７は、吸排部５の外周方向の一方側のみに形成した略Ｌ字形態を有するものであったが、例えば、図６に示すように、貯留部１７を吸排部１５の両外側に突出するように設けることができる。また、図６の装置１１においては、貯留部１７は、一つのキャビティを有し、両側の端部が閉じられた管状体であって、その長尺方向の中央部分において吸排部１５と連通されている。この貯留部１７の両端は、重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分が集積可能な集積部１７ａとなっており、円錐状の端部形態を有している。したがって、貯留部１７は、吸排部１５を中心とする円周上に二つの集積部１７ａを有していることになる。また、貯留部１７は、吸排部１５と直交状に位置されており、吸排孔１５ａが鉛直下方を指向するときには、水平状となるように形成されている。
【００３３】
図７に本装置１１を用いた細胞培養方法について、細胞懸濁液を採取し遠心分離後に新たな細胞懸濁液を調製する一連の操作例を示しながら説明する。図７（ａ）および図７（ｂ）に示すように、装置１と同様にシリンダー１３ａ外へピストン１３ｂをスライド移動させるよう操作して吸排部１５および貯留部１７に細胞懸濁液を吸引する。その後、回転軸２０への適当な支持部材１６を用いて吸排部１５が回転中心となるように遠心分離装置に装着する。図７（ｂ）においては、吸排孔１５ａに密着して密封するキャップ１８を施した上で、給排部１５と貯留部１７とを支持部材１６によって回転軸２０に固定している。装置１１は、吸排部１５を中心として左右対称であるため、吸排部１５を回転中心となるように遠心分離装置に装着することにより、予め貯留部１７を水平状（回転軸２０に対して直角）に保持させることができる。
【００３４】
図７（ｃ）に示すように、遠心分離操作により貯留部１７内の細胞懸濁液の細胞は、両端の集積部１７ａに集積される。すなわち、装置１１においては、吸排部１５に対して単一の貯留部１７を有しながら、二つの集積部１７ａを有しているため、多量の細胞懸濁液の処理が可能となっている。また、吸排部１５を中心とする外縁側に集積部１７ａを有する構成となっているため、吸排部１５を回転中心とした遠心によりこれらの集積部１７ａに一挙に細胞を集積させることができる。次いで、図７（ｄ）に示すように、遠心分離後、貯留部１７内の上清をピストン１３ｂを操作して貯留部１７および吸排部１５から排出する。以下、図４に示すのと同様にして新たな培地を貯留部１７に供給し、装置１１を振とうなどすることにより集積部１７ａの細胞を再懸濁させることができる。
【００３５】
こうした装置１１によれば、貯留部１７の容積の拡大が容易であり、また、多数の集積部１７ａを円周上に備えているため、多量の細胞培養液などの液状体の取り扱いに好適である。さらに、貯留部１７は、吸排部１５に対して直交状に備えられているため、スイング式ロータを用いなくても吸排部１５を回転中心とすれば容易に回転軸２０に対して直角の状態で遠心分離できる。
【００３６】
なお、この形態では、貯溜部１７に対して１つの内圧調整部１３を設けたもので説明したが、１つの貯溜部１７に対して複数の内圧調整部１３を設けてもよい（図８参照）。こうすれば、ピストンなどスライド部材のストローク量が少なくても、容積の変動量を大きくすることができて多くの空気を吸排できるので装置をコンパクトにすることができるとともに作業者は操作し易くなる。なお、図８に示すように、ピストン１３ｂの操作を容易にするために、ピストン１３ｂの操作部位（把持部位）を一体の操作部１３ｃにすることができる。
【００３７】
また、この形態では、貯留部１７は、左右対称に吸排部１５から突出する管状体として構成したが、これに限定するものではなく、吸排部１５に対してほぼ直交して備えられて外側に突出されていればよい。吸排部１５から突出される貯留部１７としては、さらに吸排部１５に対して追加の管状体を備えることもできるし、吸排部１５の全周を囲む一つのキャビティを有しその外周縁に一つ（連続状の場合も含む）あるいは複数の集積部１７ａを備えるようなリング状あるいはスター状等の貯留部１７を形成することもできる。
【００３８】
なお、装置１１の貯留部１７内に区画を設けて装置１のような吸排部１５に対して一方向のみに突出した貯留部を内部に形成することもできる。
【００３９】
（第３の実施形態）
次に、本発明の液状体採取装置の第３の実施形態について図９を参照しながら説明する。この装置２１は、第１の実施形態と同様、内圧調整部２３、吸排部２５と、貯留部２７と、を備えている。以下、第１の実施形態と異なる点を主として説明する。
【００４０】
（内圧調整部）
装置２１における内圧調整部２３も、装置２１内の内部容積を変動させることにより内部圧力を調整するものであって、吸排部２５の管状体２５ｂを保持する柱状の軸体２１ａに対して摺動するスライド部材２３ａを備えている。スライド部材２３ａは、底部（図９左図においては天井部）を有し他端において開口するチューブ状であって、その内部に軸体２１ａを収容して、この軸体２１ａに対して摺動可能に構成されている。スライド部材２３ａの底部の内部形状は円錐形状となっており、吸排部２５からの管状体２５ｂが開口する端面とスライド部材２３ａとに液状体を貯留するキャビティを構成している。スライド部材２３ａの下方の端部形状は、山状部と谷状部とを有する凹凸状に形成されている。
【００４１】
（吸排部）
吸排部２５は、吸排孔２５ａを先端に有する細い管状体２５ｂを有し、軸体２１ａに接続されている。管状体２５ｂは、軸体２１ａ内を通過して軸体２１ａのスライド部材２３ａ内に露出された端面にまで到達されており、管状体２５ｂ内部とスライド部材２３ａ内部とは連通されている。この結果、スライド部材２３ａの摺動によって吸排孔２５ａから液状体を吸排可能となっている。
【００４２】
（貯留部）
装置２１における貯留部２７は、上記スライド部材２３ａ内部を、液状体を貯留するキャビティとするものである。すなわち、貯留部２７は内圧調整部２３のスライド部材２３ａに一致している。貯留部２７は、吸排部２５の管状体２５ｂと連通するとともに、その内部圧力がそれ自身でもあるスライド部材２３の軸体２１ａに対するスライド移動によって調整可能に形成されている。貯留部２７（スライド部材２３ａ）の円錐状の底部（天井部）は、重力および／または遠心力によって沈降分離可能な成分を集積可能な集積部２７ａとなっている。
【００４３】
（ロック機構）
本装置２１においては、スライド部材２３ａを軸体２１ａに対して固定可能なロック機構を有している。軸体２１ａは、吸排部２５の管状体２５ｂ側の外周にスリーブ２１ｂを有し、スリーブ２１ｂは、スライド部材２３ａをスリーブ２１ｂに対して固定可能な係合部２１ｃを有している。係合部２１ｃは、スライド部材２３ａを吸排孔２５ａから離れるようにスライド移動させた状態で軸体２１ａに対して固定可能とする。このため、係合部２１ｃは、そのような固定状態を容易に形成可能にスリーブ２１ｂのスライド部材２３ａ側に形成されている。図９においては、スリーブ２１ｂがスライド部材２３ａの山状部と谷状部にそれぞれ対応する谷状部と山状部とを有しており、係合部２１ｃは、この山状部の先端に切欠き状の係合凹部として形成されている。
【００４４】
一方、スライド部材２３ａは、係合部２１ｃに係合可能な係合部２３ｂを有している。図９においては、スライド部材２３ａの山状部の先端部が係合部２１ｃに係合する係合部２３ｂとして形成されている。このロック機構においては、スライド部材２３ａが軸体２１ａの軸方向に沿ってスライド移動可能であるとともに軸体２１ａ周りを回転可能であるので、容易にスライド部材２３ａの係合部２３ｂをスリーブ２１ｂの係合部２１ｃに係合させることができるようになっている。また、軸体２１ａの周囲に形成したスリーブ２１ｂと軸体２１ａの周囲をスライド移動および回転移動可能なスライド部材２３ａの対向する端部において係合するように形成しているため、外側に突起物を形成することなく装置２１の取り扱いを妨げないロック機構となっている。なお、ロック機構の係合形態は特に限定されないで各種の係合形態を採ることができる。
【００４５】
次に、図９を参照しながら装置２１を用いた細胞培養方法について、装置２１の継代培養操作における使用例を挙げて説明する。図９（ａ）に示すように、装置２１の吸排孔２５ａを鉛直下方を指向させるようにして細胞懸濁液に接触させた状態でスライド部材２３ａを上方に操作することで、スライド部材２３ａ内のキャビティ、すなわち貯留部２７の内部容積が増大されることにより、吸排孔２５ａから細胞懸濁液が吸引される。細胞懸濁液は管状体２５ｂを上方に移動してスライド部材２３ａ内、すなわち、貯留部２７内に導入される。
【００４６】
貯留部２７に細胞懸濁液を保持したら、スライド部材２３ａを軸体２１ａ周りに回転させて、係合部２３ｂをスリーブ２１ｂの係合部２１ｃの位置に合わせるとともにスライド部材２３ａを少し下方に押し下げて係合部２１ｃに係合させる。その後、装置２１の上下を反転させて、使用する遠心分離装置の形態に応じた形態でセットする。本装置２１は、全体として柱状であるため、遠心分離装置がスイング型であってもアングル型であっても容易にセットして遠心分離することができる。
【００４７】
図９（ｂ）に示すスイング型の遠心分離装置への使用例では、細胞懸濁液の吸引時とは上下を反転させた装置２１を図示しないロータに対して揺動軸２８ｃを介して固定されるホルダー２８ｂにセットすることができる。吸排孔２５ａは適宜キャップ２８ｂをしておくこともできる。こうした状態で遠心分離装置を駆動させると、遠心時においては揺動軸２８ｃを介してホルダー２８ａが水平状となり、装置２１の集積部２７ａが遠心方向に一致された状態となる。遠心分離後は、第１の実施形態と同様に操作することで、継代培養操作を終了できる。
【００４８】
本装置２１によれば、貯留部２７が装置２１において吸排部２５と反対側に位置されているため、全体として直線状の柱状形態を採ることができ、コンパクト化されている。また、内圧調整部２３のスライド部材２３ａを、集積部に適した内部形状の底部を有するチューブ状とすることで、チューブ内を貯留部２７として兼用することができる点においても、コンパクト化されている。このようなコンパクト化によって、細胞懸濁液などの液状体の採取、分離、混合・懸濁、排出などの操作を容易に行なうことができる。特に、全体として一つのシリンジ形態を有しているため、通常の遠心分離装置にも容易にセットすることができる。さらに、装置２１は、吸排部２５が細長い管状体２５ｂからなるため、管状体２５ｂに吸引した液状体を容易に貯留部２７へ導入することができる。
【００４９】
なお、図１０に示すように、貯留部２７内の液状体を効率よく排出するために、吸排部２５と貯留部２７との連通部位（軸体２１ａの貯留部２７に露出される端面）はすり鉢状に形成することが好ましい。
【００５０】
なお、上記した実施形態において、液状体として細胞懸濁液を採取する場合について説明したが、本装置で採取するのは細胞懸濁液以外にも固形成分を含む懸濁液、２相以上の液相を有する混合液、エマルジョン、スラリーなど各種の液状体を採取するとともに分離することができる。
【００５１】
上記した実施形態において、液状体中の沈降分離可能な成分の集積部への集積には遠心力を用いる場合について説明したが、例えば、液状体採取装置の集積部を鉛直下方に位置するようにして静置して重力によって前記成分を沈降させることもできる。
【００５２】
各種の液状体採取装置および該液状体採取装置を用いた細胞培養方法を例示したが、本発明の液状体採取用チップは、上記した第１の実施形態および第２の実施形態における本発明の液状体採取装置において内圧調整部を備えず、別に準備された内圧調整装置に着脱可能したものである。したがってこれらの各種形態の吸排部および貯留部の形態をそのまま本発明の液状体採取用チップに適用することができる。このようなチップによれば、遠心分離操作時には、内圧調整装置から取り外して操作することができるとともに、液状体の吸排時には、内圧調整装置を装着することができる。遠心分離時には内圧調整装置を取り外すことにより、遠心分離に際しての取り扱いや遠心時の安定性に優れる装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の液状体採取装置の一例を示す図。
【図２】図１の液状体採取装置の断面を示す図。
【図３】継代培養操作の一例を示す工程図。
【図４】継代培養操作に伴う液状体採取装置の使用例を示す図。
【図５】液状体採取装置の遠心分離装置へのセット時の状態と遠心時の状態とを示す図（ａ）および（ｂ）。
【図６】本発明の液状体採取装置の他の一例を示す図。
【図７】図６の液状体採取装置の継代培養操作に伴う使用例を示す図。
【図８】図６に示す液状体採取装置の変形例を示す図。
【図９】本発明の液状体採取装置の他の一例を示す図（ａ）および（ｂ）。
【図１０】図９に示す液状体採取装置の変形例を示す図。
【符号の説明】
【００５４】
１、１１、２１  液状体採取装置、１ａ  ハウジング、３、１３、２３  内圧調整部、３ａ，１３ａ  シリンダー、３ｂ、１３ｂ  ピストン、５、１５、２５  吸排部、５ａ、１５ａ、２５ａ  吸排孔、７、１７、２７  貯留部、７ａ、１７ａ、２７ａ  集積部、８ａ，２８ａ  ホルダー、８ｂ、２８ｂ  キャップ、８ｃ、２８ｃ  揺動軸、１８  キャップ、２０  回転軸、２１ａ  軸体、２１ｂ  スリーブ、係合部２１ｃ、２３ａ  スライド部材、２３ｂ  係合部、２５ｂ  管状体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005333852.tif 000009
【図８】
2005333852.tif 000010
【図９】
2005333852.tif 000011
【図１０】
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