(57)【要約】【課題】  蛋白質可溶化剤によって可溶化させた変性蛋白質を、高収率で機能のある蛋白質立体構造へと巻き戻す。【解決手段】  蛋白質可溶化剤で変性させた変性蛋白質を、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンを含み加熱して保温したアミン系緩衝液に添加した後、常温で所定時間静置させるか又は冷却して上記変性蛋白質を巻き戻す。前記加熱して保温した温度が７０℃以上９８℃以下であることが好ましく、前記加熱して保温するときの時間が０分から１０分でも十分に効果がある。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質可溶化剤で変性させた変性蛋白質を、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンを含み加熱して保温したアミン系緩衝液に添加した後、常温で所定時間静置させるか又は冷却して上記変性蛋白質を巻き戻すことを特徴とする変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項２】
前記加熱して保温した温度が７０℃以上９８℃以下であることを特徴とする請求項１記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項３】
前記加熱して保温するときの時間が０分から１０分であることを特徴とする請求項１記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項４】
前記アミン系緩衝液は、トリス緩衝溶剤、ＭＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項５】
前記酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンの濃度が、１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする請求項１記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項６】
前記アミン系緩衝液は、さらにアミン化合物を含有することを特徴とする請求項１記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項７】
前記アミン化合物は、塩酸グアニジン、アミノ酸類、アミノ酸誘導体類、ポリアミン類、又はそれらの塩から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項６記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項８】
前記アミノ酸類は、リジン、アルギニンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項９】
前記アミノ酸誘導体類は、リジンメチルエステル、アルギニンメチルエステルから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項１０】
前記ポリアミン類は、スペルミン、スペルミジン、プトレッシンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【請求項１１】
前記アミン系緩衝液における前記アミン化合物の濃度が１０ｍＭ〜１Ｍであることを特徴とする請求項７記載の変性蛋白質の巻き戻し方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性した変性蛋白質を高い収率で活性のある蛋白質立体構造へと巻き戻す変性蛋白質の巻き戻し方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子工学の発展により、さまざまな蛋白質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されている。例えば医薬品製造の分野では、炎症反応、抗腫瘍作用等の免疫系の調製を行うサイトカインや、疾患に特異的に働く抗体医薬品としての一本鎖抗体等が組換え体として調製され用いられている。例えば食品加工の分野では、リパーゼは脂質を分解したり脱脂をして香味を付け、アミラーゼは水飴やウイスキー、製パン加工に不可欠である糖分解をし、ペプチターゼは食品を柔らかくするなどの、組換え体蛋白質の応用が進められている。臨床診断の分野では、感染症の診断のための抗体や、病原菌、ウイルス等の外来物質の検査のための蛋白質の利用が挙げられる。
【０００３】
組換え蛋白質の大量調製にはさまざまな技術が発明され産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌、酵母の菌体内で、標的とする蛋白質を大量に発現させることは少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。しかし、組換え体で発現させた蛋白質の多くは不活性な封入体と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。例えば医薬品に用いる抗体、一本鎖抗体、サイトカインは、必ず封入体を形成する。封入体は蛋白質が変性し失活した構造が凝集したものである。機能を持った蛋白質を得るためには、封入体に蛋白質溶解剤を添加して可溶化させた後、これらを取り除くことによって活性のある蛋白質へと巻き戻す必要がある。蛋白質可溶化には、ジチオトレイトールやβメルカプトエタノール等の還元試薬を添加し、さらに高濃度の塩酸グアニジンや尿素といった蛋白質変性剤か、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム）やＴｗｅｅｎ（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Tween85等）などの界面活性剤を添加する方法が用いられる。
【０００４】
蛋白質を可溶化剤によって変性させ還元させ単量体化可溶化した後、これらを取り除くことで変性蛋白質は機能を持つ立体構造へと巻き戻る。しかし蛋白質を機能のある立体構造へと巻き戻す本反応には、不活性な凝集を形成する副反応が競合する。不活性な凝集の生成を抑制することが、機能のある立体構造へと巻き戻す反応を促進させ、収率を上げる。
【非特許文献１】Umetsu M, Tsumoto K, Hara M, Ashish K, Goda S, Adschiri T, Kumagai I. How additives influence the refolding of iｍＭunoglobulin-folded proteins in a stepwise dialysis system. Spectroscopic evidence for highly efficient refolding of a single-chain Fv fragment. J Biol Chem. 2003 Mar 14;278(11):8979-8987.
【非特許文献２】Tsumoto K, Shinoki K, Kondo H, Uchikawa M, Juji T, Kumagai I. Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment. J IｍＭunol Methods. 1998 Oct 1;219(1-2):119-129.
【非特許文献３】Fink AL. Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid.  Fold Des. 1998;3(1):9-23.
【非特許文献４】Rudolph R, Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins. FASEB J. 1996 Jan;10(1):49-6. .
【特許文献１】R. Rudolph, S. Fischer, and R. Mattes, U.S. Patent ,93,86 (1997)
【特許文献２】白木賢太郎、高木昌宏、柴田典緒、黒住忠夫、蛋白質の安定化方法（特願2002-26942）
【０００５】
蛋白質可溶化剤を取り除くために、透析法か希釈法が用いられる。透析法は、透析に供することで徐々に蛋白質可溶化剤を希釈して緩衝液等に置き換え、機能のある蛋白質立体構造へと巻き戻す方法である。本方法の応用例として、蛋白質可溶化剤濃度を、さらにゆっくりと減少させることで、機能のある蛋白質立体構造への巻き戻りの収率を上げる段階的希釈法が知られている（例えば、非特許文献１）。しかし、透析法は、外液に蛋白質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、また数日の時間を必要とするので、産業上実用的ではない。
【０００６】
希釈法は、透析法と比べて、短時間で終わり容積も比較的少なくて済むので広く用いられている。希釈法は、蛋白質可溶化剤を加えた変性蛋白質溶液を、緩衝液などで過剰に希釈することで、蛋白質可溶化剤による蛋白質変性状態から機能のある蛋白質立体構造へと蛋白質を巻き戻す方法である。希釈法は蛋白質を機能のある立体構造へと巻き戻す最も簡便で低コストの方法であるが、機能のある蛋白質立体構造へと巻き戻す収率が悪いのが現状である（例えば、非特許文献２）。
【０００７】
希釈法の収率の悪さは、凝集中間体の形成が同期化することに起因する（例えば、非特許文献３）。蛋白質可溶化剤によって変性させ単量体に可溶化させた蛋白質は、緩衝液などで希釈された際に、蛋白質科学的には同じ経路を通って巻き戻ることが知られている。同時期に多分子が凝集中間体を形成すると、分子間反応の確率が増して不活性で不溶性の凝集体を形成してしまうので、機能のある立体構造へと巻き戻る蛋白質分子数が減少する。そこで現在では、凝集中間体を形成させないために、低濃度の蛋白質可溶化剤を添加する方法が採用される場合もあるが、収率の大幅な増加には至っていない（例えば、非特許文献４）。
【０００８】
一方、蛋白質は一般に不安定である。そこで、蛋白質を安定化させる方法が開発されている。例えば、添加剤を加える方法として、L-アルギニンを用いるもの（特許文献１）、アミノ酸誘導体やポリアミンを用いるもの（特許文献２）が知られている。これらは凝集しやすい蛋白質という構造特性に、安定化させる役割を与える。希釈法に蛋白質安定化剤を応用すると収率が上がる可能性があるが、予備的な実験によると収率の増加は見られなかった。
【０００９】
このような事情から、現在、常温のアミン系緩衝液類（トリス緩衝溶剤、ＭＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液等）に、蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質を添加して蛋白質を巻き戻す方法が使用されることがある（以下、これを「常温巻き戻し法」と言う）。この「常温巻き戻し法」は、蛋白質の工業的な大量生産するための巻き戻し（リフォールディング）として、短時間で行えコストも高くならない簡易な方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、この「常温巻き戻し法」では、肝心な巻き戻し収率を一定以上に上げることはできなかった。すなわち、巻き戻し（リフォールディング）は、蛋白質を工業的に大量生産するための技術であり、そのため、巻き戻し（リフォールディング）に必要な時間が長くかからないこと、コストが高くならないこと、できるだけ簡易な方法であること、そして「巻き戻し収率」が高いことが理想的である。しかしながら、上記従来の常温巻き戻し法では、副反応である凝集が生じ易く、活性のある蛋白質へと巻き戻る肝心な巻き戻し収率が低かった。なお、蛋白質は加熱すると必ず変性するため、従来はリフォールディングを行う際にも室温で行ったり、氷上で行ったりしていた。また、従来は、蛋白質を急激に希釈すると凝集が生じることから、それを防ぐために、透析を用いて時間をかけて変性剤を抜くなどしていたため、時間がかかっていた。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、蛋白質可溶化剤によって可溶化させた変性蛋白質を、高収率で機能のある蛋白質立体構造へと巻き戻すことができる簡便な方法で短時間で行える変性蛋白質の巻き戻し方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
蛋白質を扱う研究分野（あるいはその産業上の分野）では、タンパク質を加熱すると凝集するということは常識的なものと知られている。ただしそれは、構造をとった蛋白質を加熱した場合である。本発明者は、かかる既成概念を超え、蛋白質可溶化剤で予め変性させた蛋白質を、加熱して保温したアミン系緩衝液に添加してリフォールディングするという新たな着想を得て、本発明を完成させた。すなわち、本発明の変性蛋白質の巻き戻し方法は、蛋白質可溶化剤で変性させた変性蛋白質を、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンを含み加熱して保温したアミン系緩衝液に添加した後、常温で所定時間静置させるか又は冷却して上記変性蛋白質を巻き戻すことを特徴とする。
【００１３】
従来の「常温巻き戻し法」では、常温のアミン系緩衝液類に、蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質を添加して蛋白質を巻き戻す方法が用いられる。ここで、「常温」とは１５〜２５℃を指し（「衛生試験法・Ａ解」と「日本薬局方」でも同様）、特に外部から熱を加えない状態である。しかしながら、この「常温巻き戻し法」では、副反応である凝集が生じ易く、活性のある蛋白質へと巻き戻る収率が低かった。これに対して、本発明の変性蛋白質の巻き戻し方法では、アミン系緩衝液を積極的に加熱して保温し、ここに蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質を添加した後、常温で所定時間静置させるか又は冷却して上記変性蛋白質を巻き戻している。前記アミン系緩衝液の加熱して保温により、副反応である凝集が抑制され、活性のある蛋白質へと巻き戻る収率が上昇する。
【００１４】
本発明の変性蛋白質の巻き戻し方法では、前記加熱して保温する温度や時間の設定が重要であり、これらを適正に設定することで、より一層収率が増加する。これを規定したのが、本発明の請求項２、請求項３記載の発明である。すなわち、本願の請求項２記載の発明は、前記加熱して保温した温度が７０℃以上９８℃以下であることを特徴とするものであり、請求項３記載の発明は、前記加熱して保温するときの時間が０分から１０分であることを特徴とするものである。なお、本発明の変性蛋白質の巻き戻し方法は、上述した希釈法や段階的希釈法にも適用可能である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、蛋白質可溶化剤で変性させた変性蛋白質を、加熱して保温したアミン系緩衝液に滴下するだけで、従来の常温巻き戻し方法と比べて高い巻き戻し収率を獲得することが可能になる。本発明の方法は従来の常温巻き戻し方法に比べて、アミン系緩衝液を調製し、加熱して保温するだけで良く、簡便であるが高い巻き戻し収率を上げることができる方法であり、特に常温巻き戻し方法では巻き戻し収率が悪い蛋白質に対して簡単に応用試験することもでき、産業への利用と貢献も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。
【００１７】
巻き戻し（リフォールディング）とは、不活性構造をもつ（或いは特定のコンフォメーションをとらない）蛋白質を一度変性したのち再び活性型の立体構造をもった蛋白質として回収するというプロセスを言い、ほとんどの蛋白質は、強い変性剤（尿素、ＧｄｎＨＣl等）の存在下、変性状態では可溶化することが多い。この巻き戻し（リフォールディング）が実際に必要になるケースのほとんどは、大腸菌の封入体からの蛋白質巻き戻しである。産業上重要な蛋白質を大量に調製するときに必要になる。なお、封入体の形成構造と巻き戻し（リフォールディング）との関係を図１１に示す。
【００１８】
図１に本発明者らが行った常温巻き戻し方法と本発明の高温巻き戻し方法の順序を記す。図１（Ａ）に示す常温巻き戻し方法では、常温のトリス緩衝液等のアミン系緩衝液類に、蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質を添加して蛋白質を巻き戻す方法が用いられる。しかし、副反応である凝集が生じやすく、活性のある蛋白質へと巻き戻る収率が低いことが多かった。そこで、本発明では、図１（Ｂ）に示すように、蛋白質可溶化剤で変性させた変性蛋白質を、加熱して保温したアミン系緩衝液に添加し、その後、常温で所定時間静置させるか又は冷却して上記変性蛋白質を巻き戻すようにしている。
【００１９】
ここで、本発明において対象になる蛋白質は、例えばリゾチーム、エステラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、グリコシターゼ、ガラクターゼ、ペプチターゼ、リパーゼ等の酵素、例えば血液凝固因子、抗体、一本鎖抗体、アルブミン、ヘモグロビンなどの非酵素性蛋白質、例えばこれらを生体から調製したものや組換え体等の遺伝子工学的に作製したもの、例えば粗精製蛋白質や精製蛋白質等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
蛋白質の巻き戻り易さは、蛋白質濃度と希釈率に関係があり、蛋白質濃度が薄い方が巻き戻り易く（例えば０．０２ｍｇ／ｍｌ）急激に希釈するのは巻き戻り難い。したがって、巻き戻しに際しては、これらを考慮して蛋白質濃度及び希釈率を設定することが好ましい。例えば、蛋白質濃度を１．０ｍｇ／ｍｌとし、希釈率を１００倍程度とする。前記希釈率は巻き戻しには厳しい条件であり、１０倍〜２０倍程度の希釈率としてもよい。
【００２０】
本発明において使用される蛋白質可溶化剤とは、通常広く用いられる塩酸グアニジン、尿素等の変性剤の他に、例えばＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate：ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ（Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Tween85等）、ＣＨＡＰＳ（3-[（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸）等の界面活性剤、及び／又は、例えばジチオスレイトール、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、βメルカプトエタノール等の酸化還元試薬を含んだ溶液で、蛋白質を可溶化させる溶媒であれば特に限定されるものではない。この溶媒に例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の塩類、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、グッド緩衝液等のｐＨ緩衝液、例えば水酸化ナトリウムや塩酸等のｐＨ調製剤を含んだ溶媒によって適宜調製されたものも含まれる。
【００２１】
本発明において、Ｓ−Ｓ結合を含む蛋白質のリフォールディングに際して酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンを添加することは従来の常温巻き戻し法と同様である。しかし、本発明では、更にアミン系緩衝液を加えることを特徴とする。すなわち、高温下で巻き戻すためには、従来の常温巻き戻しとは異なり、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンに加えて更にアミン系緩衝液が必須である。
【００２２】
ここで、アミン系緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液等を挙げることができる。前記アミン系緩衝液は、ｐＨ２〜１２の溶液であることが好ましく、特に、ｐＨ５〜９の範囲に緩衝作用を有することが好ましい。また、前記酸化型グルタチオンや還元型グルタチオンは、前述の通り、巻き戻しの対象となる蛋白質にＳ−Ｓ結合が含まれる場合には、その添加が必須であり、通常は、これら両者を併用する。また、前記酸化型グルタチオンや還元型グルタチオンの濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ（Ｍはｍｏｌ／ｌ）とすることが好ましい。
【００２３】
さらに、実験の結果、酸化型グルタチオン及び／又は還元型グルタチオンを含むアミン系緩衝液（アミン化合物を含むアミン系緩衝液）に、アルギニンや塩酸グアニジンなどアミン化合物を添加すると、更に巻き戻し収率が上がることがわかった。したがって、上記アミン系緩衝液には、さらにアミン化合物を添加することが好ましい。
【００２４】
添加するアミン化合物としては、例えばグアニジウムや尿素等のカオトロピックイオン類、例えばリジンやアルギニン等のアミノ酸類、例えばリジンメチルエステル、アルギニンメチルエステル等のアミノ酸誘導体類、例えばスペルミンやスペルミジンやプトレッシン等のポリアミン類、から選ばれる少なくとも１種類のアミン類、又はそれらの塩単独もしくはその組み合わせ等を挙げることができる。
【００２５】
本発明において使用されるアミン系緩衝液は、蛋白質の機能を失わせるような濃度及び組成でなければ特に限定されない。したがって、前記アミン化合物や酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン等に加えて種々の添加物を添加することも可能である。添加物としては、具体的には、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の塩類、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、グッド緩衝液等のｐＨ緩衝液、例えば水酸化ナトリウム、トリフルオロ酢酸、塩酸、酢酸、硝酸等の酸塩基類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール等の有機溶媒類、例えば塩酸グアニジン、尿素、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ、ＣＨＡＰＳ等の蛋白質可溶化剤等を挙げることができ、これらの中から目的とする測定物質あるいは測定法に応じて適宜選択して添加調製された溶液を用いることができる。
【００２６】
本発明の変性蛋白質の巻き戻し方法においては、前記加熱して保温する際の温度も重要であり、例えば、温度を７０℃以上９８℃以下とすることが好ましい。これは、実験により約５℃から６５℃では５％以下の巻き戻り収率であったが、７０℃から９８℃では１０％以上の巻き戻し収率を示したことによる。なお、９８℃より高くすると沸騰するため９８℃以下にする必要がある。ここで、蛋白質変性温度以上に加熱して保温しても良い。蛋白質変性温度は蛋白質によって異なるが、例えばリゾチームの場合は８０℃である。
【００２７】
また、前記加熱して保温するときの時間は、０分から１０分とすることが好ましい。高温での保温が０分から１０分の間で実験したところ、この間でほぼ同じ収率を上げることができた。具体的には、巻き戻し収率（Renaturation yield）を１０％向上させることができた。ここで、「０分」とは、加熱して保温したアミン系緩衝液中に蛋白質を添加して、直ぐに常温で所定時間静置させるか又は冷却する場合を言う。１０分以内に終了したいときには、常温で所定時間静置させる場合よりも上記冷却する方が早く終了することができる。このようにして所要時間が１０分以内に終了することもできる。また、冷却する方法であるが、上記加熱して保温した後に氷上に置くことを言う。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実施例について、実験結果を基に説明する。
実験１
（常温で巻き戻した場合）
蛋白質は、リゾチーム（ニワトリリゾチーム）を用いた。変性には、６．０Ｍの塩酸グアニジン、３０ｍＭＤＴＴを用いて、１００ｍｇ／ｍｌのリゾチームを還元変性させた。また、１９８μＬのアミン化合物を含有するアミン系緩衝液を次の組成で調製した。すなわち、アミン系緩衝液が１００ｍＭのアルギニンを含有するとき（比較例１−２）又は塩酸グアニジンを含有するとき（比較例１−３）と、５００ｍＭのアルギニンを含有するとき（比較例１−４）又は塩酸グアニジンを含有するとき（比較例１−５）と、これらアルギニン又は塩酸グアニジンの含有量が０ｍＭのとき（Control：比較例１−１）における温度と巻き戻し収率との関係を測定した。いずれの場合も、アミン緩衝液として終濃度が１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）を使用した。また、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を３ｍＭに固定して、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を０〜１０ｍＭまでの範囲で調製したものを使用した。すなわち、３ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）のみである場合と、これに還元型グルタチオン（ＧＳＨ）２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、あるいは１０ｍＭを加えたものを上記トリス緩衝液に添加した。
温度制御を正確にしたデータを得るために本実験ではＰＣＲ装置を使用し、マイクロチューブ１は、Takara社製Micro PCR Tube (0.2 ml with cap) を用い、２μＬの蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質溶液を添加し、２４時間放置後、遠心上清を活性測定してプロットした。その結果を図１０（常温で巻き戻した場合）に示す。「巻き戻る収率」は、巻き戻り率やリフォールド効率、Renaturation yieldとも呼ばれ、実験を通してリフォールディングしたサンプルの活性／天然型の活性×１００で計算した値である。
【００２９】
図１０に示すように、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を３ｍＭに固定して、この一定の酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）に還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を０〜１０ｍＭまでの範囲で調製しても、いずれの比較例でも、室温では、巻き戻し収率を上げることはできなかった。
【００３０】
これに対して、本発明の高温巻き戻し方法を図１（Ｂ）に示す。この方法では、加熱して保温したアミン化合物を含有するアミン系緩衝液に、蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質を添加した後、低温に戻すことによって蛋白質を巻き戻す。加熱して保温したアミン化合物を反応させることで副反応を抑制することができ、活性のある蛋白質へと巻き戻る収率を改善することができた。
【００３１】
実験２
（加熱して保温する温度と巻き戻し収率との関係）
蛋白質は、リゾチーム（ニワトリリゾチーム）を用いた。変性には、６．０Ｍの塩酸グアニジン、３０ｍＭＤＴＴを用いて、１００ｍｇ／ｍｌのリゾチームを還元変性させた。また、アミン化合物を含有するアミン系緩衝液を次の組成で調製した。すなわち、１００ｍＭのアルギニンを含有するときを実施例２−１とし、１００ｍＭの塩酸グアニジンを含有するときを実施例２−２とし、５００ｍＭのアルギニンを含有するときを実施例２−３とし、５００ｍＭの塩酸グアニジンを含有するときを実施例２−４し、これらアルギニン又は塩酸グアニジンが０ｍＭのときにおける温度と巻き戻し収率との関係を測定した。いずれの場合もアミン系緩衝液として終濃度が１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）を使用した。また、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を３ｍＭに固定して、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を０〜１０ｍＭまでの範囲で調製したものを使用した。すなわち、３ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）のみである場合と、これに２ｍＭと３ｍＭと４ｍＭと６ｍＭと８ｍＭと１０ｍＭを加えたものを上記トリス緩衝液に添加した。マイクロチューブはTakara社製Micro PCR Tube (0.2 ml with cap) を用い、１９８μＬの上記アミン化合物を含有するアミン系緩衝液を５分間、５〜９８℃で保温した後、２μＬの蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質溶液を添加し、５分間それぞれの温度で保温した。５分間の保温の後、氷上で１分間冷却（急冷）し、室温で２４時間放置後、遠心上清を活性測定してプロットした。その結果を図２（温度と巻き戻し収率の関係）に示す。なお、アルギニン又は塩酸グアニジンが０ｍＭのときにおいても、上記１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）は使用されている。これが図２におけるControl（比較例２）である。
【００３２】
図２に示すように、上記比較例２も実施例２−１から実施例２−４も高温になるほど巻き戻し収率が高くなることがわかる。２０℃付近から巻き戻し収率が５％を超え、その効果が表れる。また、７０℃から９８℃とき、実施例２−１と実施例２−２では約１０％から１５％以上の巻き戻し収率を示し、実施例２−３では約１５％から１７％の巻き戻し収率を示し、実施例２−４では約２０％から２７％の巻き戻し収率を示した。また、トリス緩衝液のみの比較例２と、実施例２−１、２−２との比較からアミン化合物を含有するアミン系緩衝液として、塩酸グアニジンやアルギニンを添加した場合には収率が増加することが分かる。また、実施例２−１と実施例２−３との比較、実施例２−２と実施例２−４との比較からアミン化合物を含有するアミン系緩衝液として、塩酸グアニジンやアルギニンを添加した量が多いほど巻き戻し収率が増加することが分かる。
【００３３】
実験３
（アミン化合物の組成の比較）
実験１と同様の蛋白質可溶化剤と還元剤で還元変性させた蛋白質（リゾチーム）を用意した。終濃度が次の組成になるアミン化合物を含有するアミン系緩衝液を調製した。５０ｍＭと１００ｍＭと２００ｍＭと３００ｍＭのアルギニン（Arg）と、５０ｍＭと１００ｍＭと２００ｍＭと３００ｍＭのアルギニンエチルエステル（ArgEE）と、５０ｍＭと１００ｍＭと２００ｍＭと３００ｍＭのアルギニン（Arg）と、５０ｍＭと１００ｍＭと２００ｍＭと３００ｍＭのアルギニンエチルエステル（ArgEE）と、５０ｍＭと１００ｍＭと２００ｍＭと３００ｍＭのグリシンエチルエステル（GlyEE）を用意した。
【００３４】
予め１９８μＬの上記アミン化合物を含有するアミン系緩衝液を５分間、５〜９８℃で保温した後、２μＬの還元変性させた蛋白質に溶液を添加し、それぞれの温度で５分間保温した。その後、氷上で１分間冷却し、２４時間後の残存活性を測定した。いずれの場合もアミン系緩衝液として終濃度が１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）を使用した。また、６ｍＭの酸化型グルタチオン(GSSG)と３ｍＭの還元型グルタチオン(GSH)を使用する点は実験２と同様である。その結果を図３（アミン化合物の比較）に示す。なお、１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）のみが含まれる場合で常温巻き戻しが図３におけるControl（比較例３）であり、９８℃に加熱して保温した場合がControl（実施例３）である。
【００３５】
図３に示すように、Control（比較例３）である従来の常温巻き戻し法での収率が５％であったのに対して、アミン化合物を含有するアミン系緩衝液としてトリス緩衝液を用い加熱して保温して巻き戻した実施例３では１１％の収率を示した。すなわち、トリス緩衝液のみを用い高温で巻き戻した場合でも従来の常温巻き戻し法よりも巻き戻し収率が高くなることが分かる。さらにアミン化合物類であるArg及びArgEE、GlyEE、塩酸グアニジンを添加して９８℃に加熱して保温すると、巻き戻し収率がより高くなることがわかる。
【００３６】
実験４
（アミン化合物を含有するアミン系緩衝液の濃度依存性）
アミン化合物の代表としてアルギニンと塩酸グアニジンを取り上げ、アミン化合物を含有するアミン系緩衝液の濃度依存性を調べた。実験１と同様の蛋白質可溶化剤と還元剤で還元変性させた蛋白質（リゾチーム）を用意した。アミン化合物を含有するアミン系緩衝液を次の組成で調製した。いずれの場合もアミン系緩衝液として終濃度が１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）を使用した。また、終濃度が６ｍＭの還元型グルタチオン及び３ｍＭの酸化型グルタチオンを添加した。常温巻き戻し法の比較例３は、１９８μＬのアミン化合物を含有するアミン系緩衝液を５分間、２０℃で保温した後、２μＬの蛋白質可溶化剤と還元剤で還元変性させた蛋白質溶液を添加し、５分間保温した。２４時間後の残存活性を測定した。その結果を図４（アミン化合物の濃度依存性）に示す。常温でのアルギニン（Arg）を比較例４−１とし、常温での塩酸グアニジン（GdnHCl）を比較例４−２とした。
【００３７】
一方、本発明に係る実施例の方は、０〜１０００ｍＭのアルギニン（Arg）又は塩酸グアニジン（GdnHCl）をアミン化合物として用い、１９８μＬのアミン化合物を含有するアミン系緩衝液を５分間、９８℃で保温した後、２μＬの蛋白質可溶化剤で変性させた蛋白質溶液を添加し、５分間、９８℃で保温した。５分間の保温の後、氷上で１分間冷却し、２４時間後の残存活性を測定した。その結果を図４（アミン化合物の比較）に示す。９８℃でのアルギニン（Arg）を実施例４−１とし、９８℃でのグアニジン（Gdn）を実施例４−２とした。
【００３８】
図４に示すように、同一の組成であっても、アミン化合物を含有するアミン系緩衝液を高温（９８℃）で加熱する実施例４―１と実施例４−２の方が、０〜１０００ｍＭのいかなる範囲のアミン化合物濃度（アルギニン又は塩酸グアニジンの濃度）であっても、常温巻き戻し法と比べて（比較例４−１と４−２）、本発明の方が巻き戻し収率が増加することが分かった。
【００３９】
実験５
（アミン化合物を含有するアミン系緩衝液に含まれるグルタチオン濃度の検討）
上記アミン系緩衝液を使用するとともに、酸化型グルタチオンを３ｍＭに固定し、還元型グルタチオン濃度を０ｍＭ〜１０ｍＭに変化させたこと以外は、実験４と同じ実験を行った。その結果を図５（グルタチオンの濃度変化）に示す。ここで、１００ｍＭのアルギニン（Arg）で９８℃の場合を実施例５−１とし、５００ｍＭのアルギニン（Arg）の場合を実施例５−２とした。また、１００ｍＭの塩酸グアニジン（GdnHCl）で９８℃の場合を実施例５−３とし、５００ｍＭの塩酸グアニジン（GdnHCl）の場合を実施例５−４とした。また、１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）のみが含まれる場合がControl（比較例５）である。
【００４０】
図５に示すように、酸化型グルタチオンを３ｍＭに固定し、還元型グルタチオン濃度を３ｍＭとしたときが最も巻き戻し収率が最も高く、さらに還元型グルタチオン濃度を高くすると、いずれの実施例も比較例も巻き戻し収率がやや下がる傾向を示した。したがって、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの割合は、１：１が最適ということが分かる。ただし、いずれの実施例も常温巻き戻し法と比べて巻き戻し収率が改善されていることが分かる。
【００４１】
実験６
（加熱して保温する時間の検討）
実験２では９８℃での保温時間を５分に設定したが、冷却による保温時間を変化させて巻き戻し収率を比べた。図６（加熱して保温する時間変化）に保温時間と巻き戻し収率の関係を示す。１分〜１０分の範囲では保温時間によらず、アミン化合物を含有するアミン系緩衝液が高温であれば高い巻き戻し収率が得られることが分かった。
【００４２】
実験７
（高温で保温する時間の検討）
本実験７は、上記冷却の替わりに、常温で所定時間静置させる以外は同様の実験を行った。ここでの「常温で所定時間静置」した時間は、加熱して保温した後で１分経過後と２４時間経過後である。具体的には、過熱による９８℃で５分間保温の後、氷冷なし（そのまま室温にした場合（図７）と、９８?で５分保温した後、氷冷を1分行した場合と、９８?で５分保温した後、氷冷を２４時間行った場合（図９）と比較した。添加剤としては、図７から図９に示すアルギニン（Arg）や塩酸グアニジン（GdnHCl）等で、濃度は全て１００ｍＭである。なお、１００ｍＭのトリス緩衝液（pH7.4）のみが含まれる場合がControlである。しかし、常温で所定時間静置させることで上記冷却の場合よりも時間はかかったが、加熱して保温した時間によらず、アミン化合物を含有するアミン系緩衝液に還元変性蛋白質を添加すると高い巻き戻し収率が得られることが分かった。したがって、加熱して保温したアミン化合物を含有するアミン系緩衝液に添加した後は、上記のように冷却しても、又、常温で所定時間静置させても良いことが分かる。また、氷上において１分冷却した場合も氷上において２４時間経過した後でもほぼ同じ結果であった。したがって、本発明によれば、氷上におく時間は５分前後で、本発明の全工程でも１０分程度と非常に短い時間で行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の変性蛋白質の巻き戻し方法（高温巻き戻し方法）と常温巻き戻し方法とを比較して示す図である。
【図２】本発明の巻き戻す時に希釈するアミン化合物を含有するアミン系緩衝液の温度に対する巻き戻し収率を示したグラフである。
【図３】本発明のアミン化合物を含有するアミン系緩衝液の組成と濃度を変えた時の巻き戻し収率を示したグラフ化した図である。
【図４】本発明のアミン化合物を含有するアミン系緩衝液の添加アミンの濃度依存性を比較したグラフ化した図である。
【図５】本発明のアミン化合物を含有するアミン系緩衝液のグルタチオンの濃度を比較した図である。
【図６】本発明の加熱時間変化を比較したグラフ化した図である。
【図７】本発明の氷による冷却によらずに室温にした場合をグラフ化した図である。
【図８】本発明の氷による冷却を１分間行った場合をグラフ化した図である。
【図９】本発明の氷による冷却を２４時間行った場合をグラフ化した図である。
【図１０】従来の常温巻き戻し法によってグルタチオンの濃度を調製したグラフ化した図である。
【図１１】封入体から活性のある目的タンパク質を得るまでの一般的な流れを示す図である。
【符号の説明】
【００４４】
１      マイクロチューブ、
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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