(57)【要約】【課題】個体発生の際のミトコンドリアの挙動や病態形成時のあらゆる組織におけるミトコンドリアの動態を観察する系の提供。【解決手段】赤色蛍光タンパク質(DsRed2)又は青色蛍光タンパク質(ECFP)遺伝子を含む発現ベクター、及びミトコンドリアにおいて特異的にDsRed2又はECFPを発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤色蛍光タンパク質(DsRed2)又は青色蛍光タンパク質(ECFP)をコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、当該DsRed2又はECFPがミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFP発現ベクター。
【請求項２】
ミトコンドリアへの移行シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記移行シグナル配列がシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列であることを特徴とする、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】
DsRed2又はECFPをコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、当該DsRed2又はECFPがマウスのミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFP発現ベクター。
【請求項５】
ミトコンドリアへの移行シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記移行シグナル配列が、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列の全部又は一部である請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記移行シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列をコードするものである請求項５記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
ミトコンドリアにおいて特異的にDsRed2又はECFPを発現することを特徴とする請求項８記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか１項に記載の発現ベクターが導入された細胞。
【請求項１１】
請求項８又は９記載のトランスジェニック非ヒト動物由来の組織又は細胞。
【請求項１２】
以下の工程：
（ａ）請求項８若しくは９記載のトランスジェニック非ヒト動物又は請求項１０若しくは１１記載の細胞に、当該トランスジェニック非ヒト動物又は細胞に発現したDsRed2又はECFPと波長特性の異なる蛍光物質により標識された物質を接触させる工程、及び
（ｂ）ミトコンドリアと他細胞小器官、生理活性物質との相互作用を確認する工程、を含むことを特徴とする、ミトコンドリア機能解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導入遺伝子がミトコンドリアで局在的に発現するミトコンドリア局在型DsRed2およびECFP発現ベクター、及び当該発現ベクターを導入し、ミトコンドリアにおいて特異的にDsRed2又はECFPを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、生物の体内で消費するほとんどのエネルギー（ATP）を生産している細胞小器官であり、核とは別に独自のゲノムであるミトコンドリアDNA（mtDNA）を保有している。全ての動物種の細胞にはミトコンドリアが存在しており、ミトコンドリアの最も重要な機能は、そのエネルギー産生系であるといわれてきた。しかし、ここ最近、ミトコンドリアがエネルギー産生系という本来の機能とは別に、極めて広汎で、かつ重要な生命現象に深く関わっているという事実が認識されてきた。例えば、ミトコンドリアを介するアポトーシス経路、ミトコンドリアの分解系、さらに、ミトコンドリアの異常を原因とする多数の疾患（ミトコンドリア病）の解明が、医学の分野では盛んに進められるようになった。
【０００３】
しかし、これらのミトコンドリアに関する研究は、生化学や分子生物学の方法や視点を主体とするものであり、ミトコンドリアの時間的・空間的挙動を介した研究、すなわち“ミトコンドリアの挙動を直接眼で見て、その機能を推定する”といった方法は、最近になってようやく一部確立され始めたのが現状である。しかも、これらの観察記録の多くは、時間軸を固定した、いわゆる静止画像によるものであった。その原因として、これまでにミトコンドリアを染色するために用いられてきた蛍光色素であるローダミン１２３（Molecular Probes, OR; cat. R-302）やMitotracker Green FM（Molecular Probes, OR; cat. M-7514）は、励起光による退色が非常に早いことが挙げられる。
【０００４】
このような退色の短所を克服するために、近年、蛍光タンパクであるEGFPを用いた実験系が開発されてきており、ミトコンドリアについてもEGFPで標識した観察が可能となった。本発明者は、当該EGFPを用いてミトコンドリアの研究を行い、実績を上げている。例えば、哺乳動物において、mtDNAは厳密な母系遺伝を示すことが知られている。本発明者等は先に、高感度のPCR法を使用して、精子のmtDNAが胚形成初期の２細胞期までに胚細胞の細胞質から排除されることを見出した（非特許文献１、２）。この現象により、mtDNAの母系遺伝を引き起こすと考えられる。さらに、設楽ら（非特許文献３）は非侵襲性化学発光リポーター分子として広く利用されているEGFPを用い、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットVIII前駆体タンパク質のＮ末端をコードするポリヌクレオチドにEGFP cDNAクローンをつなぎ（mtGFP）、マウスへmtGFP遺伝子を導入することによって、マウス個体でミトコンドリアを可視化できるトランスジェニックマウス（mtGFP-Tgマウス）の作製に成功した。作製したmtGFP-Tgマウスと野生型マウスとの交配で得られたマウスの初期胚中にて、mtGFP-Tgマウス由来の精子を経時的に観察すると、精子ミトコンドリアに局在したEGFPのシグナルが２細胞期までに消失し、PCR法の結果を形態学的に再現できたことを報告している。
【０００５】
近年、ミトコンドリア以外の細胞小器官・生理活性物質をGFPで標識した解析が盛んに行われており、このような細胞小器官または生理活性物質の中には、ミトコンドリアと機能的に深く関わっているものがあると考えられている。上記のような解析に用いられるツールとしては、例えば、細胞内バルク分解系として知られるオートファジーを可視化した発現ベクター等が開発されている（非特許文献４）。しかし、mtGFP-Tgマウスは、ミトコンドリアにGFPを局在発現させるため、上記の発現ベクターとmtGFP-Tgマウスとを用いて、GFP標識された細胞小器官・生理活性物質を蛍光顕微鏡下で区別して同時に観察することは極めて困難である。特に、環境の変化や細胞種、病態などに対応して融合・分裂・細胞内輸送等の動的な変化を示すと考えられているミトコンドリアと他の細胞小器官・生理活性物質との相互作用を、経時的に観察することはほとんど不可能であった。
【非特許文献１】Kaneda, H. et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4542-4546
【非特許文献２】Shitara, H. et al., (1998) Genetics 148, 851-857
【非特許文献３】Shitara, H. et al., (2001) FEBS lett. 500, 7-11
【非特許文献４】Mizushima, N. et al., (2003) Mol. Biol. Cell 15, 1101-1111
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ミトコンドリアとGFP標識されたミトコンドリア以外の細胞小器官・生理活性物質とを区別しつつ同時に観察を行うためには、ミトコンドリアをGFP以外の波長特性をもつ蛍光タンパク、例えばDsRed2又はECFPで標識する必要がある。
【０００７】
従って、本発明はGFP以外の波長特性をもつ蛍光タンパク、例えばDsRed2又はECFPをミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする発現ベクター及び当該ベクターを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために種々検討した結果、あらゆる組織において外来遺伝子の強い発現を可能にする発現ベクター、例えばpCAGGS発現ベクターを選択し、ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFP発現ベクターを作製すると共に、当該ベクターを導入したトランスジェニック（Tg）動物を作製することで本発明を完成した。当該ベクターを用いることで、DsRed2又はECFPによりミトコンドリアを標識できる。また、当該Tg動物は、ECFPによってミトコンドリアが可視化される。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）を提供する。
【００１０】
（１）赤色蛍光タンパク質(DsRed2)又は青色蛍光タンパク質(ECFP)をコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、当該DsRed2又はECFPがミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFP発現ベクター。
【００１１】
（２）ミトコンドリアへの移行シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを有することを特徴とする、上記（１）に記載の発現ベクター。
【００１２】
（３）前記移行シグナル配列がシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列であることを特徴とする、上記（２）に記載の発現ベクター。
【００１３】
（４）DsRed2又はECFPをコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、当該DsRed2又はECFPがマウスのミトコンドリアで局在的に発現することを特徴とする、ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFP発現ベクター。
【００１４】
（５）ミトコンドリアへの移行シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする上記（４）に記載の発現ベクター。
【００１５】
（６）前記移行シグナル配列が、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列の全部又は一部である上記（５）に記載の発現ベクター。
【００１６】
（７）前記移行シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIのシグナル配列をコードするものである上記（５）に記載の発現ベクター。
【００１７】
（８）上記（１）から（７）のいずれかに記載の発現ベクターが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
【００１８】
（９）ミトコンドリアにおいて特異的にDsRed2又はECFPを発現することを特徴とする上記（８）に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【００１９】
（１０）上記（１）から（７）のいずれかに記載の発現ベクターが導入された細胞。
【００２０】
（１１）上記（８）又は（９）記載のトランスジェニック非ヒト動物由来の組織又は細胞。
【００２１】
（１２）上記（８）若しくは（９）に記載のトランスジェニック非ヒト動物又は上記（１０）若しくは（１１）に記載の細胞に、当該トランスジェニック非ヒト動物又は細胞に発現したDsRed2又はECFPと波長特性の異なる蛍光物質により標識された物質を接触させる工程、及び、ミトコンドリアと他細胞小器官、生理活性物質との相互作用を確認する工程、を含むことを特徴とする、ミトコンドリア機能解析方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって得られるトランスジェニック動物は、蛍光によって観察できるDsRed2又はECFPがミトコンドリアにおいて特異的に発現するため、煩雑な染色工程をとることなく細胞・組織・個体におけるミトコンドリアの動向を視覚的に捉えることが可能となる。また、従来使用されていた色素と比較して退色が顕著に少ないことから、従来不可能であったミトコンドリアの経時的観察が可能となる。更に、全ての動物細胞はミトコンドリアを有しているため、本発明のトランスジェニック動物はDsRed2又はECFPを全身で発現しており、ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFPを有する種々の細胞の供給源とすることができる。
【００２３】
また、本発明によって、例えば病態モデル動物を含む各組織及び細胞におけるミトコンドリアの局在、精子由来ミトコンドリアの初期発生過程における動向等の種々の解析が可能となる。
【００２４】
さらに、本発明のトランスジェニック動物と既存のEGFPにより細胞小器官または生理活性物質を標識したトランスジェニック動物との交雑によって得られる個体や細胞により、当該細胞小器官および生理活性物質の相互作用を容易に捉えることが可能である。また同時に、当該生理活性を促進又は抑制する被験物質のスクリーニングを行うことが可能である。従って、本発明は、分子生物学及び医療分野において、極めて広い応用範囲を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．DsRed2及びECFP
（１）DsRed2又はECFPポリペプチド
本発明において使用する赤色蛍光タンパク質（DsRed2）又は青色蛍光タンパク質（ECFP）は、サンゴ(Discosoma sp.)由来又はオワンクラゲ(Aequorea victoria)由来のものを用いることができるが、特に限定されるものではない。DsRed2又はECFPは、非侵襲性であり、また励起光照射等による退色が少ないという優れた特徴を有するものであるが、DsRED2又はECFPポリペプチドは、当分野において使用されるものの何れを使用しても良く、また、蛍光強度をより強めたり、一定期間で蛍光が消失させたりするような遺伝子改変DsRed2又はECFPを用いることもできる。市販品としては、pDsRed2, ECFP、pDsRed2, ECFP-N1/2/3（CLONTECH、cat.#6077、K6001-1）等が挙げられる。DsRed2またはECFPとしては、例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用することができる。配列番号２又は４で表されるポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を配列番号１又は３に示す。
【００２６】
本発明で用いられるポリペプチドは、赤色又は青色の蛍光を発する作用を有する限り、変異体でもよく、上記のDsRed2又はECFPのアミノ酸配列とホモロジーを有するポリペプチドでもよい。上記DsRed2又はECFPポリペプチドのアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
【００２７】
さらに、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列において1個又は複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸に欠失、置換又は付加等の変異が生じたアミノ酸配列であって、赤色又は青色の蛍光を発する作用を有するポリペプチドのアミノ酸配列も本発明において使用することができる。例えば、(i)配列番号２又は４に示すアミノ酸配列のうち1若しくは複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1個〜10個、さらに好ましくは1個〜5個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) 配列番号２又は４に示すアミノ酸配列のうち1若しくは複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1個〜10個、さらに好ましくは1個〜5個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、(iii) 配列番号２又は４に示すアミノ酸配列のうち1若しくは複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1個〜10個、さらに好ましくは1個〜5個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(iv)上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列からなり、かつ上記DsRed2又はECFPと同様の赤色又は青色の蛍光を発する作用を有するDsRed2変異型のポリペプチド又はECFP変異型のポリペプチドを使用することもできる。
【００２８】
このような配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００２９】
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００３０】
さらに、DsRed2又はECFPポリペプチドには他のペプチド配列により付加された融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素(HA)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、多重ヒスチジンタグ(6×His、10×His等)等のタンパク質の識別を容易にする配列、組換え技術によりタンパク質を発現させる際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
（２）DsRed2又はECFP遺伝子
本発明において、DsRed2又はECFP遺伝子は、配列番号１又は３で表される塩基配列のほか、前記本発明のDsRed2又はECFPポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されない。例えば、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、赤色又は青色の蛍光を発する作用を有する作用が維持されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
【００３１】
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸 (DNA) またはリボ核酸 (RNA)等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成DNA及びRNAを含むが、DNAであることが好ましい。また、天然以外の人工塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
【００３２】
本発明のDsRed2又はECFP遺伝子は、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１又は３で表される塩基配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号１又は３で表される塩基配列とは異なる塩基配列を含むものである。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリペプチドを発現させるのに用いる場合、使用する細胞のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる(Grantham et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 43-74)。
【００３３】
さらに、本発明のDsRed2又はECFP遺伝子は、配列番号１又は３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド、または該塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、赤色又は青色の蛍光を発する作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなDsRed2又はECFP遺伝子は、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００３４】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、25℃」、「1×SSC、0.1％SDS、25℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、42℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「0.1×SSC、0.1％SDS、68℃」等の条件を挙げることができる。当業者は、このようなバッファーの塩濃度、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のDsRED2又はECFP遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58)等を参照することができる。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド配列に相補的な配列が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、前記の部位特異的変異誘発法等の公知方法に従って調製することができる。また、変異の誘発は、前記の市販のキットを用いることもできる。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の配列決定法により確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463) 等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサー（例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社)）を利用して配列を解析することも可能である。
２．発現ベクター
本発明においてDsRed2又はECFPを発現させるのに使用可能な発現ベクターは、当分野において使用されるものを適宜使用することができ、例えば、上記DsRed2又はECFP遺伝子を導入する細胞または動物の種類等に応じて選択すれば良い。特に限定されるものではないが、本発明で用いられる発現ベクターとしては、組織特異性を有さず、強い発現が期待できるpCAGGS発現ベクター（Niwa, B.ら, (1991) Gene 108, 193-200）が好適に使用できる。なお、細胞または動物への遺伝子の導入の際には、発現ベクターをそのまま導入しても良いが、目的の遺伝子を含む発現カセットを調製して導入しても良く、導入する細胞または動物に応じて導入部分を適宜選択することができる。従って、本明細書において、「発現ベクター」には、上記発現カセットも含まれる。当該発現カセットとしては、例えば、ミトコンドリア移行シグナル、プロモーター、エンハンサー、ターミネータ、コザック配列、ポリアデニル化シグナル等が挙げられる。
【００３８】
導入されたDsRed2又はECFPがミトコンドリアで局在的かつ特異的に発現するためには、例えば発現ベクターがDsRed2又はECFP遺伝子の上流側にミトコンドリアへの移行シグナル配列を有することが好ましい。このようなミトコンドリア移行シグナル配列としては、例えばシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIIIの移行シグナル配列、シトクロムCのcDNA等が挙げられる。ベクター配列上、上記移行シグナル配列とDsRed2又はECFP遺伝子とは隣接していても、あるいは数十塩基離れていても良いが、両者の読み枠が一致することが必要である。また、目的遺伝子を導入する細胞又は動物の種に応じて上記移行シグナル配列の種を適宜選択することができる。
【００３９】
本発明において、ミトコンドリアで局在的かつ特異的に目的遺伝子を発現させるために用いられるシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIII移行シグナル（以下、「本発明の移行シグナル」ともいう）には、例えばマウス由来の配列を用いることができる。当該配列のマウスアミノ酸配列は配列番号６に、配列番号６をコードする核酸配列は配列番号５（配列番号５の内、CDSは第55〜267番塩基）で示す。本発明の移行シグナルは、ミトコンドリア移行シグナルとして機能する限り、配列番号６の全長又は部分でもよい。ここで、「ミトコンドリア移行シグナルとして機能する」とは、細胞質で合成された前駆体タンパク質をミトコンドリアへ輸送し局在させることをいい、このような移行シグナルの多くは、成熟タンパク質のN末端に存在する。例えば，当該部分としては配列番号６で示されるアミノ酸配列の第１〜２４番残基の部分であってもよい。また、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全長又は部分に対する、上記１．で記載したような相同性を有するポリペプチド、欠失、置換、付加等の変異体、他のペプチド配列を融合した融合タンパク質等であってもよい。
【００４０】
本発明で用いられるのシトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIII移行シグナルをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の移行シグナル遺伝子」ともいう）は、配列番号５で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの全長又は部分である。当該部分の選択は、当該部分に続くDsRed2やECFP等の目的遺伝子の読み枠に従うことが好ましい。本発明の移行シグナル遺伝子は、配列番号５の第55〜267番塩基で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの全長又は部分ほか、配列番号６で表されるアミノ酸配列において欠失、挿入、置換、付加等の変異ポリペプチドの全長又は部分であって、ミトコンドリア移行シグナルとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。前記のとおり、本発明の移行シグナル遺伝子は、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号５（配列番号５の内、CDSは第55〜267番塩基）で表される塩基配列に加えて、前記縮重により配列番号５で表される塩基配列とは異なる塩基配列を含むものである。また例えば、配列番号５のうち、配列番号６で示されるアミノ酸配列の第１〜２４番残基の部分をコードする塩基配列、つまり配列番号５で示される塩基配列の第５５〜１２６番塩基、またはこれらの上記変異体も本発明の移行シグナル遺伝子に含まれる。さらに、本発明の移行シグナル遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドの全長（第55〜267番塩基）若しくは部分、又は当該塩基配列に相補的な配列に対して前記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ミトコンドリア移行シグナルとして機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全長又は部分を含む。このようなポリヌクレオチドは、上記１．に示す方法により得ることができる。また、本発明の移行シグナル遺伝子は、配列番号６で表されるアミノ酸配列の全長又は部分において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド配列に相補的な配列が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、前記の部位特異的変異誘発法等の公知方法に従って調製することができる。また、変異の誘発は、前記の市販のキットを用いることもできる。
【００４１】
本発明の発現ベクターには、この他に導入される遺伝子の発現を適切に制御するためのプロモーター、ターミネーター等の調節配列、HA1等のタグが含まれていても良い。
３．トランスジェニック非ヒト動物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ミトコンドリアにおいて特異的にDsRed2又はECFPを発現することを特徴とし、特に上記発現ベクターが導入されていることを特徴とするものである。
【００４２】
動物の種類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ミニブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、魚類、ショウジョウバエ等の昆虫類、線虫等を挙げることができるが、ヒト以外であればいずれでも良く、特に限定されるものではない。本発明においてトランスジェニック非ヒト動物は、飼育及び操作上の簡便性の点から、哺乳類が好ましく、げっ歯類がより好ましく、マウスが特に好ましい。
【００４３】
本発明のトランスジェニック動物は、例えば以下のようにして作製することができる。まず、上記２．のようにしてDsRed2又はECFP発現ベクターを作製し、次いで制限酵素切断等により、該発現ベクターから発現カセットを切り出し、全能性細胞に導入する。全能性細胞としては、受精卵、初期胚、胚性幹細胞（ES細胞）等を用いることができる。全能性細胞への導入は、静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法等の当分野において通常用いられる手法により行うことができる。
【００４４】
上記処理を行った全能性細胞を仮親の卵管に移植し、産仔を出生させ、その産仔の中からDsRed2又はECFP遺伝子を有する個体を選択する。ここで、DsRed2又はECFP遺伝子を有する個体であるか否かは、DsRed2又はECFP遺伝子に特異的なプローブやプライマーを用いたサザンブロッティングやPCRによる従来法によっても確認できるが、本発明の場合には、発現したDsRed2又はECFPは、それぞれ赤色又は青色の蛍光を発するために、視覚的に観察して判断することもできる。
４．DsRed2又はECFP発現細胞
また、本発明により、上記ミトコンドリア局在型DsRed2又はECFP発現ベクターが導入された細胞も提供される。
【００４５】
本発明の組織又は細胞は、上記トランスジェニック動物由来の組織又は細胞であってもよい。トランスジェニック動物からの組織又は細胞は、解剖学的手法やこれに引き続くトリプシン分散法、すりつぶし法、explant法等によって得ることができる。
【００４６】
上記のように、本発明の組織または細胞は、上記トランスジェニック動物由来の組織または細胞であってもよいが、これに限定されるものではなく、ミトコンドリアを有する真核生物の細胞であればいずれでも良い。例えばミトコンドリアを有する真核生物の細胞として、植物細胞、酵母、ショウジョウバエ等が挙げられる。これら細胞への本発明の発現ベクターの導入は、当分野で通常使用される前記の手法により行うことができる。
５．ミトコンドリア機能の解析方法
本発明のトランスジェニック動物、組織及び細胞において、DsRed2又はECFPに由来する蛍光はミトコンドリアに局在し、特異的に発現する。従って、本発明のトランスジェニック動物により、例えば胚形成初期における精子のミトコンドリアの状況を非侵襲的に観察することが可能となる。本発明のトランスジェニック動物の蛍光は、強くかつ安定しており、共焦点レーザー走査型顕微鏡下における反復的観察を実施できるものである。
【００４７】
さらに、近年多く開発されてきたミトコンドリア以外の細胞小器官や生理活性物質をEGFPにより標識したトランスジェニックマウスと本発明のトランスジェニックマウスを交雑するだけで、波長特性の異なる蛍光物質を同時に観察することが可能となる。すなわち、ミトコンドリアと他細胞小器官や生理活性物質との相互作用を視覚的に解析することが、様々に分化した組織・細胞において可能となる。このことは環境の変化、細胞種、病態に対応して融合・分裂・細胞内輸送等の動的な変化を示すと考えられているミトコンドリアと他の細胞小器官・生理活性物質との相互作用を、経時的に観察することが可能となることをも意味する。本発明で用いられるDsRed2の励起波長は、425〜575 nm、好ましくは540〜565 nm、より好ましくは558 nmであり、放射波長は、550〜675 nm、好ましくは568〜642 nm、より好ましくは583 nmであり、例えば、励起／放射波長が558／583 (nm)の組み合わせを選択できる。また、本発明で用いられるECFPの励起波長は、375〜500 nm、好ましくは426〜446 nm、より好ましくは433 nmであり、放射波長は、450〜625 nm、好ましくは460〜500 nm、より好ましくは475 nmであり、例えば、励起／放射波長が433／475 (nm)の組み合わせを選択できる。上記の波長特性と異なる蛍光タンパク質としてはDsRed2又はECFPの波長特性を考慮して選択することができ、例えばEGFP、励起／放射波長は488／507 (nm)を用いることができる。
【００４８】
また、種々の疾患の病態形成・進展にミトコンドリアの障害の関与が想定されているものは数多く知られている。従って、本発明において得られたトランスジェニック動物を用いて、種々の病態モデル（脳虚血モデル、心筋虚血モデル等）を作製することにより、各種病態におけるミトコンドリア障害の部位や程度を知ることができ、これらの病態の解明やモデルの特徴付けが可能となる。
【００４９】
さらにまた、本発明に係るトランスジェニック動物、または該トランスジェニック動物由来の細胞を使用することにより、ミトコンドリア障害抑制剤あるいは誘発剤等のスクリーニングを行うことが可能となる。
【００５０】
以下、実施例により本発明を詳しく述べるが、本発明は実施例により限定されない。
【実施例１】
【００５１】
発現ベクターの構築
シトクロムｃオキシダーゼサブユニットVIII（COX8、GeneBank U15541）のシグナル配列を、
5'-GCA GAA TTC GCC ACC ATG CCA AGG CTC CCC CC-3'（配列番号７）
及び
5'-GGC GGA TCC TAA GCT TGC ATA ATC AGG AAC ATC ATA ATG GGC TTT GGG AAC C-3'（配列番号８）
をプライマーとして使用し、C57BL/6J(B6)由来のゲノムDNAを鋳型としてPCR反応によって増幅した。
【００５２】
PCRの反応液組成は、Ex Taq （TaKaRa）およびその添付説明書に準じて調整（プライマーの最終濃度は1μM）したものであり、PCR反応は、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のセットを25サイクル行った。
【００５３】
この場合、配列番号８のプライマーにはHA1の塩基配列（TAA GCT TGC ATA ATC AGG AAC ATC ATA：配列番号８の10〜36番の塩基）が含まれる。従ってPCR反応によって得られた増幅産物には、HA1の塩基配列が組み込まれている。
【００５４】
DsRed2（配列番号１）のコード領域は、
5'-CAT GGA TCC ATG GCC TCC TCC GAG AAC G-3'（配列番号９）
及び
5'-TAC GAA TTC CTA CAG GAA CAG GTG GTG GCG-3'（配列番号１０）
をプライマーとし、組み換えプラスミドpDsRed2-Mito（Clontech、CA）を鋳型としてPCR反応によって増幅した。
【００５５】
PCRの反応液組成は、Ex Taq （TaKaRa）およびその添付説明書に準じて調整（プライマーの最終濃度は1μM）したものであり、PCR反応は、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のセットを25サイクル行った。
【００５６】
また、ECFP（配列番号３）のコード領域は、
5'-CAT GGA TCC ATG GTG AGC AAG GGC GAG-3'（配列番号１１）
及び
5'-TAA GAA TTC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC-3'（配列番号１２）
をプライマーとし、組み換えプラスミドpECFP-Mito（Clontech、CA）を鋳型としてPCR反応によって増幅した。
【００５７】
PCRの反応液組成は、Ex Taq （TaKaRa）およびその添付説明書に準じて調整（プライマーの最終濃度は1μM）したものであり、PCR反応は、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のセットを25サイクル行った。
【００５８】
上記のように増幅したCOX8とDsRed2又はECFPのコード領域のPCR産物をEcoRI及びBamHIによって切断し、EcoRIで切断したpCAGGS発現ベクター（Niwa, B.ら, (1991) Gene 108, 193-200）中にライゲートした。
【００５９】
上記の手順によって構築した発現ベクターpCAGGS-COX8-DsRed2 (図１中(A) 、5573 bp)及びpCAGGS-COX8-ECFP (図１中(B)、5615 bp)の主要部の構成を図１に、全配列を配列番号１３及び１４に示す。
【実施例２】
【００６０】
トランスジェニックマウスの作製
トランスジェニック動物作製のために用いるDNA断片を、BlnI及びSalIによる二重切断によって取得し（図１）、クローニングベクターからアガロースゲル電気泳動によって分離し、次いでこれをQIAEX II（QIAGEN、CA）によって精製した。精製したDNA断片を受精したマウス（B6）卵細胞の前核中に標準的手法（Hogan, B.ら, (1994) Manipulating the Mouse Embryo 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に従って注入した。トランスジェニックマウスの同定のために、耳穿孔片（ear-punched pieces）からゲノムDNAを調製した。すなわち、穿孔片をPCR緩衝液／非イオン性界面活性剤及びプロテイナーゼＫ（50 mM KCl、10 mM Tris-HCl、(pH8)、1.5 mM MgCl2、0.1％ ゼラチン、0.45％ NP-40、0.45％ Tween-20、及び100μg/ml プロテイナーゼＫ）中に入れ、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、プロテインキナーゼＫを失活させるために、９５℃で１５分間インキュベートし、得られた溶液をDNA試料とした。導入遺伝子の確認のためには
5'-TCC TAC AGC TCC TGG GCA ACG T-3'（配列番号１５）
及び
5'-TGG TAT TTG TGA GCC AGG GCA TT-3'（配列番号１６）
をプライマーとして使用し、pCAGGSの領域を鋳型としてPCR反応によって増幅した。
【００６１】
PCRの反応液組成は、AmpliTaq Gold （ABI社）およびその添付説明書に準じて調整（プライマーの最終濃度は1μM）したものであり、PCR反応は、95℃で10分の後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のセットを35サイクル行った。
【００６２】
結果を図２に示す。図２の(A)は、mtDsRed2-Tgにおける導入遺伝子の検出を示し、レーン１；導入遺伝子（5 ng）とC57BL/6Jの総DNA（1μg）、２；Ｂ６由来総DNA（1μg）、３〜６；サンプルDNA、７；マーカー（500 bpラダー）である。図２の(B)は、mtECFP-Tgにおける導入遺伝子の検出を示し、レーン１〜３；サンプルDNA、４；マーカー（100 bpラダー）である。
【００６３】
その結果、DsRed2の遺伝子は３〜６番のマウスのゲノムに、ECFPの遺伝子は１番のマウスのゲノムに存在することが確認された（図２）。
【実施例３】
【００６４】
トランスジェニックマウス個体におけるDsRed2とECFPの発現の確認
実施例２によって得られたトランスジェニックマウスにおけるDsRed2発現を確認するために、出生直後のマウス個体の前肢を蛍光顕微鏡で観察した。
【００６５】
DsRed2の蛍光は、Carl Zeissレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSM510）で可視化した。DsRed2蛍光は543 nmのHeNeレーザーで励起し、560 nmロングパス放出フィルターを通して画像化した。
【００６６】
図３Aに示すように、本発明のmtDsRed2-Tg（TG）においては前肢全体においてDsRed2の発現による蛍光が観察された。これに対して野生型（WT）では蛍光は観察されなかった。また、図３Bに示すように、作製されたmtECFP-Tg（TG）においてはECFPの発現による蛍光が観察され、野生型（WT）では蛍光が観察されなかった。
【実施例４】
【００６７】
トランスジェニックマウスの繊維芽細胞におけるDsRed2発現の確認
繊維芽細胞の初代培養は外植片培養法（Fischer SMら, Methods in Cell Biology (Harris, C.C.ら編) (1980) 21:207-227, Academic Press, London）に従って行った。培養した繊維芽細胞を、1μg/ml ローダミン１２３を含有するDMEM中、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、染色された繊維芽細胞をDMEMで２回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡を使用して観察した。
【００６８】
DsRed2またはローダミン１２３の蛍光は、Carl Zeissレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSM510）で可視化した。DsRed2蛍光は543 nmのHeNeレーザーで励起し、560 nmロングパス放出フィルターを通して画像化した。ローダミン１２３の蛍光は、488 nmのアルゴンイオンレーザー線で励起し、505-530 nmバンドパス放出フィルターを通して画像化した。
【００６９】
結果を図４に示す。図４のAは明視野、BはDsRed2像、Cはローダミン123像、およびDはA〜Cの重ね合わせ像を示す。スケールバーは10μmである。
【００７０】
図４に示すように、DsRed2による蛍光及びローダミン１２３による蛍光はほとんど一致していた。
【実施例５】
【００７１】
トランスジェニックマウスの繊維芽細胞におけるミトコンドリア（DsRed2）とオートファジー（EGFP）の観察
繊維芽細胞は実施例４に従って調製した。図５は、細胞内のバルク分解系であるオートファジーの過程でオートファゴソームを可視化したマウスであるGFP-LC3＃53（Mizushima, N.ら、(2003) Mol. Biol. Cell 15, 1101-1111）と本発明のトランスジェニックマウスであるmtDsRed2-Tgとの交配により得られた雑種第一世代の個体由来繊維芽細胞像である。EGFPおよびDsRed2の蛍光の検出には、ライカ倒立蛍光顕微鏡（DMIRE2）を使用した。光源としてはキセノンランプを使用し、EGFPの蛍光は励起436±10 nm／吸収480±20 nm、DsRed2の蛍光は励起546±6 nm／吸収605±37.5 nmのフィルターブロックを使用した。
【００７２】
図５Aは雑種第一世代の個体由来繊維芽細胞中のEGFP (オートファゴソーム)像、Bは当該細胞中のDsRed2 (ミトコンドリア)像、CはAとBの重ね合わせ像、DはCの左四角部分の拡大像、及びEはCの右四角部分の拡大像を示す。スケールバーは、C；10μm、DとE；1μmである。図５に示すようにオートファゴソーム（EGFP）とミトコンドリア（DsRed2）を同時に観察することが可能であり、特に図５D,Eではミトコンドリアとオートファゴソームの局在がほぼ一致し、ミトコンドリアがオートファジーによって分解されている可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明のミトコンドリア局在型DsRed2（A）, ECFP（B）発現ベクターの主要部の構成を示す図である。
【図２】PCR法による導入遺伝子の検出を示す図である。
【図３】トランスジェニックマウス個体におけるDsRed2（A）、ECFP（B）発現を示す図である。
【図４】トランスジェニックマウスの細胞におけるDsRed2発現を示す図である。
【図５】本発明のトランスジェニックマウスとオートファゴソームをEGFPにより標識したトランスジェニックマウスとの交雑により得られた個体由来の細胞におけるDsRed2とEGFP発現を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：ベクター
配列番号１４：ベクター
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
【図１】
2005333845.tif 000002
【図２】
2005333845.tif 000003
【図３】
2005333845.tif 000004
【図４】
2005333845.tif 000005
【図５】
2005333845.tif 000006
【配列表】
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