(57)【要約】【解決手段】  本発明は、腫瘍組織などの標的細胞を死滅させる標的細胞の死滅方法と、標的細胞を死滅させるための薬剤、及び標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置に関する。本発明においては、マクロファージ細胞１に５−アミノレブリン酸を投与し、次にこのマクロファージ細胞に、例えば４８０〜６４０ｎｍの範囲にピーク波長を持つ光を第１光照射手段としてのグリーンランプ３によって照射するとともに、さらに６４０〜７００ｎｍの範囲にピーク波長を持つ第２光照射手段としてのＹＡＧレーザ装置４からのレーザ光を照射して、薬剤を製造する。そしてこの薬剤を腫瘍などの標的細胞に適用することによって、標的細胞を効果的に死滅させることができる。【効果】  ５−ＡＬＡを投与して光を照射したマクロファージ細胞を腫瘍などの標的細胞に適用しているので、従来に比較して優れた治療効果が得られる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ細胞に５−アミノレブリン酸を投与する工程と、５−アミノレブリン酸が投与されたマクロファージ細胞に光を照射する工程と、光を照射したマクロファージ細胞を腫瘍などの標的細胞に適用する工程とを有することを特徴とする標的細胞の死滅方法。
【請求項２】
マクロファージ細胞に光を照射する工程が、４８０〜６４０ｎｍの範囲にピーク波長を持つ第１光照射手段による照射工程と、６４０〜７００ｎｍの範囲にピーク波長を持つ第２光照射手段による照射工程とからなることを特徴とする請求項１に記載の標的細胞の死滅方法。
【請求項３】
マクロファージ細胞に５−アミノレブリン酸を投与し、マクロファージ細胞内で５−アミノレブリン酸が代謝経路に入りプロトポルフィリンＩＸを生合成させた後、所定の波長を有する光を照射したことを特徴とする標的細胞を死滅させるための薬剤。
【請求項４】
マクロファージ細胞に蓄積した光感受性物質に対し第１の波長を持つ光を照射する第１光照射手段と、上記光感受性物質に対して第１の波長よりも長い波長を持つ光を照射する第２光照射手段とを備え、上記光感受性物質に第１光照射手段からの光を照射してから、第２光照射手段からの光を照射することを特徴とする標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置。
【請求項５】
上記第１光照射手段から照射される光の波長が４８０〜６４０ｎｍの範囲にピーク波長を持つ光であり、第２光照射手段から照射される光の波長が６４０〜７００ｎｍの範囲にピーク波長を持つ光であることを特徴とする請求項４に記載の標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置。
【請求項６】
上記第２照射手段は、フロントミラーとリアミラーとの間でレーザ光を発振するＹＡＧレーザ装置からなり、フロントミラーとリアミラーには少なくとも１３１８ｎｍから１３３９ｎｍを含む広域の反射膜コーティングを施したことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織などの標的細胞を死滅させる標的細胞の死滅方法と、標的細胞を死滅させるための薬剤、及び標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍特に悪性腫瘍の治療には早期発見早期治療が最も重要な要因であり、近年種々の方法により早期発見早期治療を行なうことができるようになってきている。
その一つに光感受性物質を使用した光力学的治療（いわゆるＰＤＴ：ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）が知られている。
この光力学的治療は、光感受性物質が腫瘍に特異的に集積することを利用し、腫瘍の部位を特定することにより早期発見することができるとともに、これらの物質に光を照射することにより光感受性物質が活性化され、例えば活性酸素や酸素ラジカルを発生させて腫瘍細胞を直接的に死滅、破壊、又は増殖能力を減少させることができる。
【０００３】
光感受性物質としては、ソラレン類、ポルフィリン類、クロリン類など種々のものが知られているが、５−アミノレブリン酸（５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ：５−ＡＬＡ）を用いたプロトポルフィリンＩＸ（Ｐｐ−ＩＸ）が安全性、有効性の観点から注目を集めている。この５−ＡＬＡは元来体内でヘム合成代謝経路の一環として存在する物質であり無害に等しく、５−ＡＬＡから体内代謝により生合成されたＰｐ−ＩＸは腫瘍親和性にも優れているので、近年急速に臨床応用されるようになってきている。
【０００４】
上記５−ＡＬＡから生合成されたＰｐ−ＩＸに照射される光は、３５０〜７００ｎｍの範囲の波長を含む光を用いることが有効とされている。（特許文献１、特許文献２）
すなわちＰｐ−ＩＸは通常４８０〜５５０ｎｍおよび６３０ｎｍ程度に吸収帯があるが、この波長の光を照射するとＰｐ−ＩＸが光プロトポルフィリンを始めとする種々の光生成物に分解され、新たに６７０ｎｍ程度付近に強い吸収帯が発生するからである。
このため、従来は両方の吸収帯を含む波長の光を照射するようにしていた。
【特許文献１】特表平１１−５０１９１４号公報
【特許文献２】特表２００４−５０５１０５号公報
【０００５】
一方、マクロファージ細胞は、体の中に入ってきた細菌や癌細胞(異物)を見つけるとすぐに反応し、貧食作用により自分の体の細胞内へ細菌や癌細胞(異物)を取り込み、強い消化酵素により細菌や異物を殺菌、消化すると共に抗原の情報をヘルパーＴ細胞へ伝えるという作用を行なうことが知られている。しかしながら、癌細胞などの強い細胞はマクロファージだけでは対応できず、他の免疫細胞の助けを借りて癌細胞を攻撃するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した光力学的治療による従来の方法によっても腫瘍細胞の死滅効果（破壊、又は増殖能力を減少させることを含む）を得ることができるが、より優れた効果が望まれていた。
このような問題に鑑み、本発明は従来に比較して優れた効果が得られる、腫瘍組織などの標的細胞を死滅させる標的細胞の死滅方法と、標的細胞を死滅させるための薬剤、及び標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち請求項１の発明は、マクロファージ細胞に５−ＡＬＡを投与する工程と、５−ＡＬＡが投与されたマクロファージ細胞に光を照射する工程と、光を照射したマクロファージ細胞を腫瘍などの標的細胞に適用する工程とを有することを特徴とする標的細胞の死滅方法を提供するものである。
【０００８】
また請求項３の発明は、マクロファージ細胞に５−ＡＬＡを投与し、かつ所定の波長を有する光を照射したことを特徴とする標的細胞を死滅させるための薬剤を提供するものである。
【０００９】
また請求項４の発明は、マクロファージ細胞に蓄積した光感受性物質に対し第１の波長を持つ光を照射する第１光照射手段と、上記光感受性物質に対して第１の波長よりも長い波長を持つ光を照射する第２光照射手段とを備え、上記光感受性物質に第１光照射手段からの光を照射してから、第２光照射手段からの光を照射することを特徴とする標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
請求項１の死滅方法によれば、５−ＡＬＡを投与して光を照射したマクロファージ細胞を腫瘍などの標的細胞に適用しているので、後述するように従来に比較して優れた標的細胞の死滅効果が、すなわち治療効果が得られるようになる。
また請求項３の標的細胞を死滅させるための薬剤は、５−ＡＬＡを投与して所定の波長を有する光を照射したマクロファージ細胞であるので、これによって従来に比較して優れた治療効果を得ることができる。
さらに請求項４の製造装置によれば、第１光照射手段によって光感受性物質を蓄積させたマクロファージ細胞に第１の波長を持つ光を照射することができ、また第１光照射手段から光を照射した上記光感受性物質に、第２光照射手段によって第２の波長を持つ光を照射することができるので、波長の長い光により細胞への浸透性が高くなり従来に比較して優れた治療効果を有する標的細胞を死滅させるための薬剤を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下図示実施例について本発明を説明すると、図１において、標的細胞を死滅させるための薬剤の製造装置は、マクロファージ培養細胞１を収容する容器２と、第１光照射手段としてのグリーンランプ３と、第２光照射手段としてのＹＡＧレーザ装置４とを備えている。第１光照射手段および第２光照射手段としてはグリーンランプ３やＹＡＧレーザ装置４に限定されるものではなく、必要な波長を有する光を照射することができるものであれば如何なるものであってもよい。
上記容器２内に収容されたマクロファージ培養細胞１としては、ＲＡＷ２６４．７を使用した。
また上記第１光照射手段としてのグリーンランプ３は、第１の波長として５０７〜６００ｎｍの範囲の波長を発することができるグリーンランプ（東芝製）を使用した。
さらに第２光照射手段としてのＹＡＧレーザ装置４は、第２の波長として６５９ｎｍ、６６４ｎｍおよび６６９ｎｍの３種の波長を出力することができるＹＡＧレーザ装置を使用した。
【００１２】
図２は上記ＹＡＧレーザ装置４の概略構成図で、図示実施例ではＹＡＧレーザ装置４は、同一構成の５台のＹＡＧレーザモジュール５と、所定位置に配置されて共振器を構成する一対のフロントミラー６およびリヤミラー７とを備えている。
５台のレーザモジュール５は予め定めた位置に配置してあり、それによって各レーザモジュール５によって発振されるレーザ光Ｌは、各レーザモジュール５によってそれぞれ所要の方向に反射されるとともにそれぞれ増幅されながらフロントミラー６とリヤミラー７との間で共振されるようになっている。そして所定出力以上に増幅されたレーザ光Ｌは、上記フロントミラー６を透過しファイバー８を介して上記マクロファージ培養細胞１に照射されるようになっている（図１参照）。
それぞれのレーザモジュール５は、図示しないがレーザ媒質として薄板状としたＹＡＧ結晶と半導体レーザとを備えている。上記レーザ媒質としてのＹＡＧ結晶の表面と背面は平行となるようにしてあり、かつ、背面はレーザ媒質の内部で発生したレーザ光Ｌを反射させる反射面としてある。そして半導体レーザからのレーザ光によりレーザ媒質が励起されてレーザ光Ｌが発振されるようになっている。このようなレーザモジュールは既に公知であるので、詳細な説明は省略する。
【００１３】
上記フロントミラー６とリアミラー７はいずれも凹面鏡から構成してあり、フロントミラー６の近傍に非線形光学結晶（ＬＢＯ）９を配置するとともにシャッター１０を配置し、またリアミラー７の近傍にＱスイッチ１１を配置してある。
上記非線形光学結晶９のレーザ光Ｌの通過する部分には、波長が１３００ｎｍ〜１３４０ｎｍおよび、６５０ｎｍ〜６７０ｎｍの光が通過するようにコーティング１２が施してある。また、フロントミラー６とリアミラー７の反射面には、１３００ｎｍから１３４０ｎｍの光を９９．５％以上反射するようにコーティング１３が施してある。
これにより、レーザモジュール５から発振された波長のうち１３１９ｎｍおよび１３３９ｎｍの波長を選択的に発振器内で増幅できるようにしている。さらに、上記フロントミラー６とリアミラー７に施されたコーティング１３により２つの異なる波長を増幅できるようにしているため、その和周波である６６４ｎｍのレーザ光を発振することができるようにしている。
すなわち、本発明によれば、ＹＡＧレーザの発振波長である１３１９ｎｍおよび１３３９ｎｍの光が上記非線形光学結晶９を通過することにより得られる各波長の１／２である６５９ｎｍおよび６６９ｎｍの波長のレーザ光に加え、１３１９ｎｍおよび１３３９ｎｍの光の和周波である６６４ｎｍのレーザ光との３波長のレーザ光を得ることができる。
従って、従来ＹＡＧレーザでは１つの波長のレーザ光しか使用していなかったが、この３波長のレーザ光は、６７０ｎｍをピークとして６６０ｎｍから６８０ｎｍに吸収帯を持つＰｐ−ＩＸの光生成物に対して、非常に有用である。
また上記シャッター１０はレーザ光Ｌの光路を開閉するもので、シャッター１０が閉じられている間はレーザ光がＹＡＧレーザ装置４から外部に放射されることがないようにしてある。
さらに上記Ｑスイッチ１１は、レーザ光Ｌのパルス発振をより瞬間的なものにすることによってピーク出力を高めると同時に、生体へのダメージを低減するために設けたものである。
【００１４】
次に、上記製造装置を用いて、標的細胞を死滅させるための薬剤を製造した。
すなわち、先ず、上述したようにマクロファージ培養細胞１としてＲＡＷ２６４．７を用い、これに最終濃度１００μｍｏｌの５−ＡＬＡを１２時間投与し、それによってマクロファージ培養細胞１にＰｐ−ＩＸを誘導させてこれを蓄積させた。
次に、上記Ｐｐ−ＩＸを蓄積したマクロファージ培養細胞１に、第１光照射手段としてのグリーンランプ３からの光を２Ｊ／ｃｍ２照射した。この光は、上述したように５０７〜６００ｎｍの範囲の波長を有している。
このとき、図３で示すように、Ｐｐ−ＩＸの最も効率がよい吸収波長は４８０〜５５０ｎｍおよび６３０ｎｍであるが、上記グリーンランプ３の照射によってＰｐ−ＩＸが光プロトポルフィリンを始めとする種々の光生成物に分解されると、最も効率がよい吸収波長は６７０ｎｍ付近に偏移することになる。
【００１５】
そこで次に、上記グリーンランプ３を照射したマクロファージ培養細胞１に、第１の波長よりも長い波長を持つ第２光照射手段としてのＹＡＧレーザ装置４から、第２の波長として６５９ｎｍ、６６４ｎｍ、６６９ｎｍの３種の波長を有するレーザ光Ｌを１３．５Ｊ／ｃｍ２照射して、標的細胞を死滅させるための薬剤を製造した。
このとき、各波長毎のエネルギー密度は、６５９ｎｍが７．４Ｊ／ｃｍ２、６６４ｎｍが３．８Ｊ／ｃｍ２、６６９ｎｍが２．３Ｊ／ｃｍ２であり、レーザ光Ｌのトータルエネルギー密度は１３．５Ｊ／ｃｍ２であった。
【００１６】
上記薬剤の効果を測定した試験結果は次の通りであった。
本発明１  生き残りの細胞の割合＝１７．１００
死んだ細胞の割合＝６５．５００
両者の割合の比＝３８３．０４０
本発明２  生き残りの細胞の割合＝２２．１００
死んだ細胞の割合＝６０．６００
両者の割合の比＝２７４．２１０
比較例１  生き残りの細胞の割合＝７３．９００
死んだ細胞の割合＝１６．０００
両者の割合の比＝２１．６５０
比較例２  生き残りの細胞の割合＝７９．４００
死んだ細胞の割合＝１０．４００
両者の割合の比＝１３．１００
上記生き残りの細胞の割合とは、試験後におけるＨＬ−６０の全細胞数に対して生存している細胞数の割合を示したものであり、死んだ細胞の割合とは全細胞数に対してネクロシスとアポトーシスとなった細胞数の割合を示したものである。また両者の割合の比とは、死んだ細胞の割合を生き残りの細胞の割合で割った割合を示したものである。
また図４は、上記生き残りの細胞の割合（Ｖｉａｂｌｅ）、死んだ細胞の割合（Ｄａｍａｇｅｄ）および両者の割合の比（Ｒａｔｉｏ）を棒グラフとして示したものである。
【００１７】
上記本発明１の薬剤は、マクロファージ培養細胞１に、１００μｍｏｌの５−ＡＬＡを投与するとともに、上述したようにグリーンランプ３からの光を２Ｊ／ｃｍ２照射し、さらにＹＡＧレーザ装置４からレーザ光Ｌを照射したものである。他方、本発明２の薬剤はグリーンランプ３からの光を照射しただけで、ＹＡＧレーザ装置４からのレーザ光Ｌは照射していないものである。
上記比較例１と比較例２の薬剤は、マクロファージ培養細胞１に、５−ＡＬＡを投与せずに、グリーンランプ３からの光を２Ｊ／ｃｍ２照射し、比較例１は、さらにＹＡＧレーザ装置４からレーザ光Ｌを照射したものである。
また本試験では、標的細胞としてヒト白血病由来培養細胞（ＨＬ−６０）を使用した。すなわち、このＨＬ−６０に上述の製造方法で製造した薬剤を添加して、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で炭酸ガス培養器によって１２時間培養した後、ＭＥＢＣＹＴＯアポトーシスキット（ＭＢＬ社製）によって細胞を染色し、その後フローサイトメータ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）にて両者の割合の比を計測した。
【００１８】
本発明１と比較例１との比較から明らかなように、比較例１における両者の割合の比が２１．６５０であるのに対し、本発明１における両者の割合の比は３８３．０４０となっており、約１７．７倍の治療効果が得られる。
本発明２と比較例２との比較では、比較例２における両者の割合の比が１３．１００であるのに対し、本発明２における両者の割合の比は２７４．２１０となっており、約２１倍の治療効果が得られる。
このように、本発明によれば、マクロファージ細胞の貧食作用及び強い消化力と、Ｐｐ−ＩＸに光を照射することにより得られる活性酸素や酸素ラジカルにより腫瘍などの標的細胞を効率的にかつ直接的に死滅、破壊、又は増殖能力を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例を示す正面図。
【図２】第２光照射手段としてのＹＡＧレーザ装置４の概略構成図。
【図３】Ｐｐ−ＩＸの吸収波長と光生成物の吸収波長とを示す図。
【図４】試験結果を示す図
【符号の説明】
【００２０】
１  マクロファージ
３  グリーンランプ（第１光照射手段）
４  ＹＡＧレーザ装置（第２光照射手段）
６  フロントミラー
７  リアミラー
９  非線形光学結晶
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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