(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、皮膚病の治療を行うために、有用な医薬及び有用な医薬を得るためのスクリーニング方法等を提供することにある。【解決手段】  本発明者は、上記の課題を解決するために、DHCR24ノックアウトマウスを作製することにより、当該マウスの皮膚が皮膚病の症状を呈することを見出し、本発明を完成するに至った。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡがコードするタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項４】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項１から請求項３に記載の方法。
【請求項５】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項１から請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から請求項３記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬。
【請求項７】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項６に記載の治療薬。
【請求項８】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項６に記載の治療薬。
【請求項９】
請求項１から請求項３記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬を投与することを特徴とする皮膚病の予防または治療方法。
【請求項１０】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現制御領域を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を制御することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１３】
配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質の発現制御領域を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAがコードするタンパク質の発現を制御することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１４】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質の発現制御領域を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を制御することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１５】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項１２から請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項１２から請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１２から請求項１４記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬。
【請求項１８】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項１７に記載の治療薬。
【請求項１９】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項１７に記載の治療薬。
【請求項２０】
請求項１２から１４記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬を投与することを特徴とする皮膚病の予防または治療方法。
【請求項２１】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項２４】
配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項２５】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項２６】
請求項２３から請求項２５記載の抗体の何れかを有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬。
【請求項２７】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項２６に記載の治療薬。
【請求項２８】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項２６に記載の治療薬。
【請求項２９】
請求項２３から請求項２５記載の抗体の何れかを有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬を投与することを特徴とする皮膚病の予防または治療方法。
【請求項３０】
請求項２３から請求項２５記載の抗体の何れかをあるいは組み合わせることを特徴とする皮膚病の診断方法。
【請求項３１】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項２９、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項２９、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号：１で表されるDNAまたはその部分オリゴヌクレオチドの何れかあるいは組み合わせることを特徴とする皮膚病の遺伝子診断方法。
【請求項３４】
皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
皮膚病が拘束性皮膚病である請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患関連遺伝子の用途に関する。さらに詳しくは、皮膚病の予防または治療として有用な疾患関連遺伝子産物を用いることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は有害な物質の浸透からの保護（バリアー機能）、水分喪失の防止、活性型ビタミンＤの合成、発汗による体温調節など生体にとり重要な機能を担っている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は痒みを伴い慢性的に経過する皮膚炎（湿疹）であるが、その根本には皮膚の生理学的異常、皮膚の乾燥とバリアー機能異常があり、そこへ様々な刺激やアレルギー反応が加わって生じると考えられている。しかしながら、その原因についてはいまのところはっきりしていない。
アトピー性皮膚炎の症状には、皮膚が乾燥しているという状態から、表皮細胞の増殖による皮膚の硬化や落屑、湿疹といった症状まで様々な段階があることが知られている。
【０００４】
拘束性皮膚病(Restrictive dermopathy)は非常に稀な致死的な先天的皮膚病である。この病気は異常な硬い皮膚とバリアー機能の障害を特徴とする常染色体劣性疾患である（非特許文献１）。
【０００５】
これら皮膚病の治療のためには、モデル動物を用いて、その症状、原因、遺伝子発現等を調べることが有効な方法の一つである。
【０００６】
これらの動物モデルの中には、transforming growth factor (TGF)β1 過剰発現マウスがある（非特許文献２）。また、TGFβ1をアトピー性皮膚炎の動物モデルNC/Ngaマウスに投与することにより、アトピー性皮膚炎の湿疹症状を抑制することが報告されている（非特許文献３）。
TGFβ1の発現量が多い場合には表皮細胞の増殖を抑制し、少ない場合には促進することが非特許文献４に報告されている。この文献では非特許文献２のTGFβ1発現マウスではTGFβ1の発現量が少なかったため、増殖促進がおきたと推論している。これらのことから、transforming growth factor (TGF)β1が皮膚病に関与していることが示唆されている。
【０００７】
transforming growth factor (TGF)β1 過剰発現マウスと同じ皮膚状態を示すモデルに、fatty acid transporter protein (FATP)4ノックアウトマウスが報告されている（非特許文献５、６）。
【０００８】
しかしながら、これらのモデル動物から、皮膚病の原因や治療方法が全て明らかになったわけでなく、新たな動物モデルを用いた皮膚病の更なる研究が必要とされている。
一方、3β-hydroxysterol-Δ24 reductase (DHCR24) gene（以下DHCR24と省略する場合がある）はデスモステロールをコレステロールに変換する酵素をコードする遺伝子である。デスモステロローシスはこの遺伝子変異により生じる常染色体劣性疾患である。今日までに、頭蓋顔面の異常、脚奇形のようなひどい発育異常を伴う２例の患者が報告されている（非特許文献７）。
両方のケースにおいて、正常レベルより血漿中のデスモステロール濃度は上昇し、コレステロール濃度は減少している。しかしながら、デスモステロローシスの発病の原因はよくわかっていない。
DHCR24遺伝子が皮膚病と関連するとの報告は今までにいっさいなされていない。
【非特許文献１】Med J. 2003 Jul;26(7):510-4
【非特許文献２】Proc Natl Acad Sci USA 90, 5237-5241, 1993
【非特許文献３】Clin Exp Allergy. 2002 Feb;32(2):309-14
【非特許文献４】PNAS 96, 8483-8488, 1999
【非特許文献５】Proc Natl Acad Sci USA 100, 5274-5279, 2003
【非特許文献６】J Cell Biol 161, 1105-1115, 2003
【非特許文献７】Am J Genet 69, 685-694, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、皮膚病の治療を行うために、有用な医薬及び有用な医薬を得るためのスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、DHCR24ノックアウトマウスを作製することにより、当該マウスの皮膚が皮膚病の症状を呈することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１１】
すなわち本発明は、
（１）配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（２）配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡがコードするタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（３）配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（４）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項１から請求項３に記載の方法。
（５）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項１から請求項３に記載の方法。
（６）請求項１から請求項３記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬。
（７）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項６に記載の治療薬。
（８）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項６に記載の治療薬。
（９）請求項１から請求項３記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬を投与することを特徴とする皮膚病の予防または治療方法。
（１０）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項９に記載の方法。
（１１）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項９に記載の方法。
（１２）配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現制御領域を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を制御することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１３）配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質の発現制御領域を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAがコードするタンパク質の発現を制御することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１４）配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質の発現制御領域を用いることを特徴とする、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を制御することにより皮膚病の予防又は／及び治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
（１５）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項１２から請求項１４に記載の方法。
（１６）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項１２から請求項１４に記載の方法。
（１７）請求項１２から請求項１４記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬。
（１８）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項１７に記載の治療薬。
（１９）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項１７に記載の治療薬。
（２０）請求項１２から１４記載のスクリーニング方法の何れかを用いて得られる化合物、その光学異性体、その薬学的に許容される塩、それらの水和物またはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬を投与することを特徴とする皮膚病の予防または治療方法。
（２１）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項２０に記載の方法。
（２２）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項２０に記載の方法。
（２３）配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
（２４）配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
（２５）配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
（２６）請求項２３から請求項２５記載の抗体の何れかを有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬。
（２７）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項２６に記載の治療薬。
（２８）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項２６に記載の治療薬。
（２９）請求項２３から請求項２５記載の抗体の何れかを有効成分として含有する皮膚病の予防及び／又は治療薬を投与することを特徴とする皮膚病の予防または治療方法。
（３０）請求項２３から請求項２５記載の抗体の何れかをあるいは組み合わせることを特徴とする皮膚病の診断方法。
（３１）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項２９、請求項３０に記載の方法。
（３２）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項２９、請求項３０に記載の方法。
（３３）配列番号：１で表されるDNAまたはその部分オリゴヌクレオチドの何れかあるいは組み合わせることを特徴とする皮膚病の遺伝子診断方法。
（３４）皮膚病がアトピー性皮膚炎である請求項３３に記載の方法。
（３５）皮膚病が拘束性皮膚病である請求項３３に記載の方法。
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
【００１３】
本発明の遺伝子及びタンパク質はいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物由来のものがある。これらのうち、ヒトの治療薬の研究開発に用いるのであればヒト由来のものであることが好ましい。本発明で用いられる配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称する場合もある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウスなど）の細胞（例えば、神経細胞、グリア細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１４】
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００１５】
配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表されるDNAと約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９から４０ｍＭ、好ましくは約１９から２０ｍＭで、温度が約５０から７０℃、好ましくは約６０から６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
また、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列を挿入、欠失もしくは置換したアミノ酸配列を有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から３０個程度、好ましくは１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から３０個程度、好ましくは１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から３０個程度、好ましくは１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から３０個程度、好ましくは１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
【００１６】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から２０個程度、より好ましくは１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１から２０個程度、より好ましくは１から１０個程度、さらに好ましくは１から５個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１から１０個程度、より好ましくは１から５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１７】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。      
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表されるDNAがコードするアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、配列番号：１で表されるDNAの相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を有するＤＮＡなどがあげられる。ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は、それぞれ前記と同様な方法および条件が用いられる。
【００１８】
本発明のタンパク質が皮膚病の改善に有用であることを証明するためには、当該タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトしたマウスの皮膚が皮膚病の症状を呈することを示せばよい。当該タンパク質をコードする遺伝子のノックアウトマウスにおいて、このタンパク質の発現だけがなくなる。従って、このノックアウトマウスが呈する症状は当該タンパク質の欠失が原因である。このノックアウトマウスが皮膚病の症状を呈する場合は、当該タンパク質が皮膚病の原因であり、皮膚病を治療するためには、当該タンパク質の発現量を増加するか、発現しているタンパク質の活性を高めれば良いことになる。
ノックアウトマウスの作製は常法に従って作製することができる。
【００１９】
ノックアウトマウスの皮膚が皮膚病の症状を呈しているかは実施例に記載の方法により確認できるが、この方法に限定されるわけではない。
例えば、正常の皮膚には発現していないが、皮膚病の皮膚には発現しているタンパク質を検出することにより確認できる。このタンパク質としてはケラチン６、ケラチン１４があるが、これらに限定されるわけではない。
また、既に皮膚病モデルとして確立している、transforming growth factor (TGF)β1 過剰発現マウスやfatty acid transporter protein (FATP)4ノックアウトマウス等と皮膚の表現形を比較することによっても証明できるが、これらに限定されるわけではない。
これらのモデルマウスは皮膚に光沢があり、皺がなく、皮膚が硬くなるのが特徴である。
また、アトピー性皮膚炎においては、その原因の一つとして皮膚のバリアー機能異常が考えられることから、皮膚の透過性を調べることによっても確認できる。すなわち、正常皮膚と比較し、ルシファーイェローなどが角皮層を越えて透過する場合はバリアー機能に障害があり、皮膚病の症状を呈していることが確認できる。
以下に、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトしたマウスが皮膚病の症状を呈する場合は、当該タンパク質が皮膚病の原因であり、皮膚病を治療するためには、当該タンパク質の発現量を増加するか、発現しているタンパク質の活性を高めれば良いことになる。よって本発明のタンパク質の活性を促進若しくは発現量を増大する化合物、又はその塩は、皮膚病の医薬として使用できる。したがって、本発明のタンパク質及び当該タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のタンパク質の活性を促進若しくは発現量を増大する化合物、又はその塩のスクリーニングを行うために有用である。
すなわち、本発明は本発明のタンパク質及び当該タンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を促進若しくは発現量を増大する化合物、又はその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００２０】
具体的には、例えば本発明のタンパク質と被検化合物の結合を基準としてスクリーニングを行うことができる。
本発明のタンパク質と被験化合物の結合は、いずれか一方を固相に固定し、他方を標識しておくことによって容易に検出することができる。したがって、たとえば支持体上に合成されたコンビナトリアルライブラリーは、本発明のスクリーニングに好適な被験化合物である。この場合は、蛍光標識した本発明のタンパク質を反応させることにより、両者の結合を容易に検出することができる。
本発明によって決定された遺伝子の情報を利用して、プロモーターやエンハンサーを単離することができる。例えば、ゲノムライブラリーを、遺伝子の塩基配列に基づくプローブでスクリーニングすることによって、本発明のタンパク質のゲノムDNAを単離することができる。単離されたゲノムDNAをもとに、プロモーターやエンハンサー等の発現制御領域を取得することができる。こうして取得された発現制御領域は、当該遺伝子の発現の制御を目的とする医薬品の開発に利用することができる。
【００２１】
具体的には、プロモーター等の下流にレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子を結合したベクターを構築し、適当な宿主細胞、例えば哺乳類動物細胞を該ベクターで形質転換することにより、スクリーニング用細胞を作製する。被験化合物を該細胞の培地中に添加し適当な時間の後、レポーター遺伝子が発現するか否かを測定することにより、本発明の遺伝子の発現を制御する医薬品を取得することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるプロモーターもしくはエンハンサー等の発現制御領域、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞、または本発明で用いられるプロモーターもしくはエンハンサー等の発現制御領域を有するベクターで形質転換された細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物又は本発明のタンパク質の発現を制御する化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明で用いられるタンパク質の塩と同様のものが用いられる。本発明で用いられるタンパク質の活性を促進する化合物又は本発明のタンパク質の発現を制御する化合物は、皮膚病に対する予防・治療剤などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化し、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラットなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、例えば経口投与する場合、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、例えばサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。また、本発明の抗体は本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時における各分画中の本発明タンパク質の検出、被検細胞内における本発明タンパク質の挙動の分析などに使用することもできる。
本発明の抗体を含有する医薬品は本発明のタンパク質の活性を促進する作用を有する場合は、本発明の抗体は低毒性であり、皮膚病に対する予防・治療剤として使用することができる。本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、など）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人に使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１から２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１から１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１から５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１から５回程度、好ましくは１日１から３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５から５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５から１００ｍｇ、その他の剤形では１０から２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
遺伝子診断剤本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたは該ｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは該ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
以下に本発明を実施例で具体的に説明するが、これはその代表例を示すものであって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
DHCR24ノックアウトマウスにおいて、皮膚に異常が生じているかを調べることを目的として以下の実験を行った。
【実施例１】
【００２３】
（DHCR24ノックアウトマウス）
DHCR24ヘテロ接合(+/-)C57BL/6Jと129/b(F0世代)の掛け合わせマウスはQuark Biotech Inc.より得た(Science 302, 2087, 2003)。これらのマウスはC57BL/6JあるいはICRマウスと掛け合わせた。表１に示すごとくメンデルの法則に従い常染色体性劣性遺伝を示した。ほとんどのホモ接合(+/+)マウスは生後3日以内に死亡した。このため、全てのマウスの写真及び組織は生後1日のマウスから得た。
【００２４】
図１はワイルドタイプマウスとDHCR24(-/-)ノックアウトマウスを示す。ワイルドタイプマウスと比較し、皮膚に光沢があり、皺がない(wrikle less)のが特徴である。
【実施例２】
【００２５】
（組織学的検査）
ヘマトキシリン/エオシン染色のために、新生マウスはエーテルで麻酔をかけ、ブワン溶液で固定した。その後heart levelで背中の皮膚をパラフィン包埋した。切片は8μmの厚さで切り、ヘマトキシリン/エオシンで染色し、光学顕微鏡で観察し、写真撮影した。
切片は8μmの厚さで切り、ヘマトキシリン/エオシンで染色し、光学顕微鏡で観察し、写真撮影した。
【００２６】
図２に正常な表皮を示す。表皮は５つの層（角質層、淡明層、顆粒層、有棘細胞層、基底細胞層）に分かれている。
【００２７】
ヘマトキシリン/エオシン染色はDHCR24(-/-)ノックアウトマウスの表皮が表皮細胞の著しい増加と共にに平らで厚くなっていることを示した（図３）。ケラトヒアリンを有する顆粒層がワイルドタイプマウスにおいては観察されるが、DHCR24(-/-)ノックアウトマウスにおいては殆ど観察されなかった。DHCR24(-/-)ノックアウトマウスにおける表皮細胞の増加は有棘細胞層、基底細胞層に認められた。
図４に示されるように、DHCR24(-/-)ノックアウトマウスの皮膚における毛脂の構成単位がワイルドタイプより少なくなっていた。
【００２８】
これらの結果はDHCR24の遺伝子の欠失が表皮の異常増殖と分化障害を引き起こしたことを示す。
【実施例３】
【００２９】
（免疫組織染色）
免疫組織化学のために、麻酔後新生マウスを4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1M phosphate buffer (PB, pH 7.4)で心臓を通して還流固定した。その後heart levelで背中の皮膚を同じ固定溶液で一昼夜固定した。組織は30%蔗糖中に3日間4℃で保存した。その後、組織をO.C.T.中で液体窒素により凍結し、-80℃で保存した。切片は16μmの厚さで切り、-80℃で保存した。続いて、切片をPBS(phosphate buffered saline)でリンスし、30分間0.1% Triton X-100/PBS (phosphate buffered saline)で浸透させ、PBSで洗い、5%通常牛血清(BSA)と3%通常やぎ血清でブロッキングした。ケラチン１４、ケラチン６に対する一次抗体（Covance Inc. (Princeton, NJ, USA)）、β-galactosidase (Promega Co. (Tokyo, Japan))は0.1%PBS及び0.02%NaN3を含むPBSでそれぞれ1:1000、1:500、7(μg/ml)になるように希釈し、ブロッキング後の切片を4℃オーバーナイトでインキュベーションした。PBSで洗った後、切片は二次抗体、ビオチン化した抗マウスIgG（1:250）と室温で50分間インキュベーションした。その後、PBSで洗い、切片を遮光下で50分間FITC/ストレプトアビジンコンプレックス（1:100）とインキュベーションした。その後切片をPBSで洗い、ミリポア水でリンスし、Victor’s Hard set mounting溶媒でマウントし、共焦点顕微鏡(LSM510, Carl Zeiss, Tokyo, Japan)で観察し、写真撮影した。
【００３０】
抗PCNA (proliferative cell nuclear antigen)抗体での免疫組織化学のための組織固定はHEと同じにした。切片はその抗体（1:200で希釈）(Dako Cytomation, Kyoto, Japan)で4℃オーバーナイトでインキュベーションした。後の操作は上記と同じに行ったが、２次抗体でインキュベーションした後、切片は50分間ストレプトアビジン/パーオキシダーゼでインキュベーションした。洗滌後、室温で0.02% (W/V) 3,3’-diaminobenzidine (Sigma St. Louis MO,USA) を含むTris-HCl buffer (pH 7.6) and 0.006% H2O2で可視化した。ミリポア水で洗滌後、切片は脱水し、mount-quick (Daido Sangyo Co, Ltd. Tokyo, Japan)でマウントした。
ケラチン６は増殖している表皮細胞に発現し、通常の表皮細胞では発現していない。図５に示されるように、ケラチン６はワイルドタイプの皮膚においては殆ど観察されない、一方DHCR24(-/-)ノックアウトマウスの表皮には発現が著しい。
【００３１】
ケラチン１４は図６に示されるように、ワイルドタイプの表皮の基底細胞層及び毛包の外根鞘ににのみ発現している。しかしながら、DHCR24(-/-)ノックアウトマウスにおいて毛包には発現していないが、増殖し厚くなった表皮細胞に発現している。このため、DHCR24の欠乏は表皮細胞の異常な増殖と分化障害を引き起こすことが示された。
【００３２】
どの細胞が異常増殖を起こしているのか調べるために、細胞増殖マーカーであるPCNAを用いた免疫組織染色を行った（図７）。ワイルドタイプマウスにおいては、基底細胞層だけが染色された、一方DHCR24(-/-)ノックアウトマウスにおいては基底細胞層の上の表皮細胞において染色され、有棘細胞、基底細胞の異常増殖が示された。真皮における細胞の増殖はヘテロ接合ノックアウトマウスにおいおいても観察された。
【実施例４】
【００３３】
（オイル-レッド-O染色）
組織は面積組織化学に記載された方法により固定した。16μmの厚さの凍結切片は60%イソプロピルアルコール中に素早く浸した。オイルレッドO（Merck, Merck KGaA. Darmstadt, Germany）は0.5%イソプロピルアルコールで用時調製し、0.66容量のミリポア水で希釈し、濾紙(Number 2, Advantec Toyo Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)で濾過した。組織切片は室温で20分間ワーキング溶液で染色し、その後60%イソプロピルアルコール中に素早く浸し、メチルグリーンで対照染色した。その後、抗フェーディング試薬を含むマウンティング溶媒でマウントした。
表皮細胞の分化異常で何が生じるのか調べるために、オイル-レッド-O染色を行った。図８に示されるように、ワイルドタイプマウスでは染色は観察されなかった。対照的に、DHCR24(-/-)ノックアウトマウスの表皮の低squamous層において、脂質小滴が観察された。中性脂質とコレステロールエステルがオイル-レッド-Oにより染色されるので、DHCR24の欠失は表皮細胞における脂質の恒常性が障害されていることが示唆された。
【実施例５】
【００３４】
（皮膚透過性アッセイ）
皮膚は有害物質の透過を阻害し、生体を保護している。この皮膚のバリアー機能を検討するため、ルシフェールイエローの皮膚透過性を新生仔DHCR24 (-/-)及びコントロールマウスにおいて分析した。新生仔マウスの背中がリンゲル溶液(pH 7.4)中の1mMルシフェールイエロージカリウム塩(Aldrich Chemical Co., Inc. Milwaukee, WI, U.S.A.)に接触するようペトリ皿で固定した。1時間のインキュベーションの後、マウスを液体窒素で凍結し、5μmの厚さで背腹方向に切片化した。PBSでリンスした後、切片は室温で30分間15%ホルマリン(Wako Pure Chemical Ind. Osaka, Japan)で固定化した。その後PBSでリンスし、ハードセットマウンティング溶媒medium (Victor Laboratories, Inc. Burlingam, CA, U.S.A.)でマウントした。切片は蛍光イソチオシアネイト用フィルターを用いて共焦点顕微鏡下で観察した。
図９に示すようにルシフェールイエローはワイルドタイプマウスでは角質層においてのみ観察され、バリアーが完全に機能していることが示された。一方、DHCR24(-/-)ノックアウトマウスにおいては染色液が表皮中に浸透し、バリアー機能が障害されていることが確認された。
以上より、DHCR24(-/-)ノックアウトマウスにおいて、皮膚異常が生じることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ワイルドタイプマウスとDHCR24(-/-)ノックアウトマウスを示す図である。
【図２】正常な表皮を示す図である。
【図３】ヘマトキシリン/エオシン染色された皮膚を示す図である。
【図４】皮膚における毛脂の構成単位を示す図である。
【図５】ケラチン６に対する抗体で免疫組織染色された皮膚を示す図である。
【図６】ケラチン１４に対する抗体で免疫組織染色された皮膚を示す図である。
【図７】PCNAに対する抗体で免疫組織染色された皮膚を示す図である。
【図８】オイル-レッド-O染色された皮膚を示す図である。
【図９】DHCR24ノックアウトマウスにおけるルシフェールイエローの皮膚透過性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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