(57)【要約】  【課題】  副作用の少ないペプチド性のウィルス感染・増殖抑制剤の提供。  【解決手段】  次の式（１）で示されるペプチドを有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤。  式（１）は、ウシラクトフェリン（ＬＦ）の２４〜３９残基であり、そのＬＦ（２４〜５１）、ＬＦ（１〜５１）も用いることができる。  【効果】抗ウィルス剤として、ＨＩＶ，インフルエンザウィルス等の感染の防止あるいは治療に有用である。A-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-B  式（１）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の〔化１〕で表されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤
[化１]
A-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-
Arg-B
但しＡは、アミノ末端、アセチル基、ペプチド残基のいずれかであり、Ｂはカルボキシル末端、アミド、ペプチド残基のいずれかを示す。
【請求項２】
次の〔化２〕で表されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤
[化２]
Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Ile-Ser-Gln-Pro-Asp-Ser-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-
Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu-Lys
（ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内の２個のCys が結合して−Ｓ−Ｓ−結合を形成した酸化型であってもよい)
【請求項３】
次の〔化３〕で表されるアミノ酸配列を有するペプチド及びその薬理学的に許容される塩を有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤
[化３]
Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu
（ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内の２個のCys が結合して−Ｓ−Ｓ−結合を形成した酸化型であってもよい)
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、副作用の少ないペプチド性のウィルス感染・増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス感染による疾患の克服のために、これまで多くの努力がなされてきた。しかし近年、世界的にも猛威をふるっているヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）や毎年流行するインフルエンザウィルスのようにいまだ有効な予防法や治療法の無いものもある。ウィルス感染による疾患に対する治療法として抗ウィルス剤による化学療法がある。しかし現在のところ、全身的に投与され明白な効果を示す抗ウィルス剤はほとんど無い。その理由として、ウィルスは細胞内で増殖し、増殖のための機能をほとんど細胞に依存している。つまりウィルスは感染後、その増殖を治療すべき人体の構成細胞自体の増殖機能を利用して行っている。従ってウィルスの増殖を抑える化学物質の多くは細胞にも作用して毒性を示すからである。抗ウィルス剤の問題点としては上述のように薬剤の選択毒性が低いこと以外にもウィルス感染症の特徴から由来するいくつかの問題点がある。特に急性・全身性のウィルス感染症では、症状が現れる時期がウィルスの体内増殖のピークが過ぎてしまった後なので、むしろウィルスの感染を阻止し増殖を抑制する物質が求められている。この様なウィルスの感染を防御する方法としてワクチンの予防接種による方法があるが、この方法はしばしばアレルギー反応や種々の副作用を示すことが知られており、しかもウィルスの変異に対しては対処できないのが現実である。
【０００３】
この様な状況において、本発明者らは、ラクトフェリン（以下、ＬＦと呼ぶこともある。）、トランスフェリン、オボトランスフェリンなど鉄結合能を有するタンパク質が、インフルエンザウィルスやサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の感染・増殖を抑制することを見出し特許を出願した（例えば、特許文献１参照。）。ＬＦは、乳中に分泌される鉄結合性のタンパク質で抗菌活性があることが知られている。ＬＦは、ヒトおよびウシ由来のものについて詳細な研究が行われており、ヒトＬＦ、ウシＬＦともその全アミノ酸配列がすでに決定されている（例えば、非特許文献１及び２参照。）。また、ＬＦ等の乳タンパク質を有効成分とする抗ウィルス剤が開示されており、この中にＬＦが、外被性ウィルスおよび非外被性ウィルスに対して有効であることが記載されている（例えば、特許文献２参照。）。また最近、本発明者らは、ＨＩＶに対するこれら鉄結合性タンパク質の感染・増殖抑制効果についても確認し、ＬＦを有効成分とするＨＩＶ感染・増殖抑制剤について特許出願を行った（例えば、特許文献３参照。）。
【０００４】
この様に、ＬＦなどの鉄結合性タンパク質はウィルスの感染・増殖抑制効果を持つことが次第に明らかとなり、抗ウィルス剤として、その実用化が期待されてきた。これらタンパク質が実際に感染・増殖抑制剤として用いられるためには、(i)体内に投与した場合、抗原性の点で問題が無いこと、(ii)大量に供給できること、が必要である。これらの鉄結合性タンパク質のうち、ウシＬＦやウシトランスフェリン、又は鶏卵から得られるオボトランスフェリンは大量に供給できるが、人体内に投与した場合抗原性を示すという問題がある。一方、ヒトＬＦは抗原性に関しては問題無いが、大量に供給することは困難である。
この様な問題を解決するために、本発明者らはＬＦ由来のペプチドフラグメントのうち、次に示す〔化４〕および〔化５〕が抗ウィルス活性を持つことを見出し特許出願を行った（例えば、特許文献４参照。）。
【０００５】
[化４]
Cys-Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Pro-Pro-Val-Ser-Cys
（ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内の２個のCysが−Ｓ−Ｓ−結合して酸化型となってもよい。)
【０００６】
[化５]
Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys
（ただし、式中Cys は還元型でもよく、またペプチド内の２個のCysが−Ｓ−Ｓ−結合して酸化型となってもよい。)
【０００７】
これらのペプチドはそれぞれヒトＬＦの２０〜３７残基およびウシＬＦの１９〜３６残基に相当するもので、分子内のＳ−Ｓ結合は抗ウィルス活性に必須ではなかった。これらのペプチドは天然のＬＦに比べて極めて鎖長が短いため、化学合成や遺伝子操作による合成により容易に供給することができる。またマウスを用いた感染防御試験においては、ＣＭＶの感染を完全に抑制するのに必要な〔化４〕および〔化５〕のペプチド量は0.1g/体重kgであった。
【０００８】
ＬＦフラグメントに関するこれまでの知見としては、ヒトＬＦの１〜５０残基部分がＬＦ分子の受容体結合領域であるとする報告（例えば、非特許文献３参照。）、ヒトＬＦの４〜５２に相当するペプチドがＬＦとリンパ球の結合を阻害したという報告（例えば、非特許文献４参照。）、ヒトＬＦの１〜４７残基に相当するペプチドおよびウシＬＦの１７〜４１残基に相当するペプチドが抗菌活性をもつという報告（例えば、非特許文献５参照。）などがあるが、抗ウィルス活性についての記載は無い。またこの抗菌活性に関して、ヒトＬＦの１９〜２９残基あるいはウシＬＦ１８〜２８残基部分を含むペプチド（例えば、特許文献５参照。）、また、ヒトＬＦの２１〜２６残基あるいはウシＬＦ２０〜２４残基部分を含むペプチド（例えば、特許文献６参照。）、ウシＬＦの２１〜２５残基あるいはウシＬＦ２５〜２９残基部分を含むペプチド（例えば、特許文献７参照。）、ウシＬＦの２０〜２４残基部分を含むペプチド（例えば、特許文献８参照。）についてそれぞれ記載されているが、いずれも本発明の抗ウィルス効果に必須な部位とは異なっている。
【特許文献１】特開平２−２３３６１９号公報
【特許文献２】特開平１−２３３２２６号公報
【特許文献３】特願平４−２２０６３５号
【特許文献４】特願平５−０６９２１０号
【特許文献５】特開平５−０７８３９２号公報
【特許文献６】特開平５−１４８２９５号公報
【特許文献７】特開平５−１４８２９６号公報
【特許文献８】特開平５−１４８２９７号公報
【非特許文献１】M.W. Rey et al., NeucleicAcid Res., Vol.18, 5288,1990
【非特許文献２】P.E. Mead et al., Neucleic Acid Res.,Vol.18,7167,1990
【非特許文献３】B.F. Anderson et al.,J.Mol.Biol.,209,711,1989
【非特許文献４】D.Legrand et al., Biochemistry,31,9243,1992
【非特許文献５】W.Bellamy et al., Biochem.Biophys.Acta,1121, 130,1992
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、体内に投与した場合に、抗原性の点で問題が無く、大量に供給できるＬＦフラグメントよりなる、強力な抗ウィルス活性を有するウィルス感染・増殖抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来のＬＦフラグメントよりもさらに強力な抗ウイルス活性を有するＬＦフラグメントを得る目的で、いくつかのＬＦフラグメントを化学的に合成し、その抗ウィルス活性を検討することで、ウシＬＦの抗ウィルス活性に関する必須部分を検索した。その結果、ウシＬＦでは次の〔化６〕で示される２４〜３９残基部分が抗ウィルス活性に必須であることを見出した。なお以後のＬＦペプチドの残基の番号は天然のウシラクトフェリンのアミノ酸配列に付与された番号を用いる。
【００１１】
[化６]
Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg
【００１２】
本発明者らは、この活性部分を含み、さらに高活性な抗ウィルスペプチドを開発する目的で、〔化６〕に示したペプチドを中心にＮ端側およびＣ端側にペプチド鎖を延長したところ、ウシＬＦでは１〜５１残基〔化７〕に相当する部分および２４〜５１残基〔化８〕に相当する部分がこれまで知られていたＬＦ由来ペプチドに比べて顕著に高活性であることを見出した。
【００１３】
[化７]
Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr-Ile-Ser-Gln-Pro-Asp-Ser-Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu-Lys
【００１４】
[化８]
Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe-Ala-Leu-Glu-Cys-Ile-Arg-Ala-Ile-Ala-Glu
【００１５】
また、これらのペプチドフラグメントのうち〔化７〕は、分子内に２つのＳ−Ｓ結合をもつことができるが、このＳ−Ｓ結合はウイルス活性の発現には必須ではなく、Ｓ−Ｓ結合は存在していても、存在していなくとも良い。
従って、〔化７〕のCys は還元型であってもあるいは相互にＳ−Ｓ結合して酸化型になってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の実施により、ウィルス感染・増殖抑制剤が提供される。
本発明によるウィルス感染・増殖阻止作用のある組成物の作用効果を要約すると次のとおりである。
（１）ウィルスの感染を防ぐことができ、また、既感染者に対しては、体内でさらにウィルスが増殖して感染細胞が増加することを防ぐことができる。
（２）通常食品として摂取している成分を有効成分とする組成であるため、投与することによる副作用の心配が少ない。
（３）低分子であるため、ＬＦなどの結合性タンパク質に比べ化学合成法などで比較的容易にしかも大量に調製できる。ゆえに特定の患者の治療に使用が限定されることがなく、広くウィルスの感染・増殖を予防することもできる。
本発明のウィルス感染・増殖抑制剤は、インフルエンザあるいはエイズの予防または治療や臓器移植の際のサイトメガロウィルス感染防御に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、次の〔化９〕で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とするウィルス感染・増殖抑制剤に関する。
また、このペプチドは薬理的に許容される塩の形態であってもよい。
【００１８】
[化９]
A-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-B
但し式中Aは、アミノ末端、アセチル基、ペプチド残基のいずれかであり、Bはカルボキシル末端、アミド、ペプチド残基のいずれかを示す。
【００１９】
また〔化９〕に示す配列を基にＮ末端側およびＣ末端側にペプチド鎖を延長したペプチドを有効成分とすることができる。このようなペプチドとしては、例えば、前記した、〔化７〕、〔化８〕に示すペプチドが例示される。さらにこれらの薬理的に許容される塩、例えば塩酸塩、酢酸塩なども用いることができる。〔化９〕に示すペプチドは、ウシＬＦの２４〜３９残基に相当する配列であり、前述のように本発明における抗ウィルス活性に必須な領域である。以下本発明のウィルス感染・増殖抑制剤中の有効成分のＬＦ由来のアミノ酸配列を含むペプチドは、ウシＬＦ（２４−５１）のようにＬＦ中のアミノ酸配列の番号で記載する。
本発明のペプチドを得るためには、通常の化学合成による方法、ＬＦのプロテアーゼ分解物から単離する方法、遺伝子組み換えによる方法などいずれによっても良い。さらに、市販のペプチドシンセサイザー等の合成装置を用いて直鎖ペプチドを得た後、通常の方法でＳ−Ｓ結合を形成させることもできるし、Ｓ−Ｓ結合を形成させなくても良い。
【００２０】
これらのペプチドまたはペプチド誘導体は単独もしくは賦型剤、安定剤を添加して製剤化することができる。本発明のウィルス感染・増殖抑制剤は、経口、注射、座薬として投与することができる。通常は、成人１日あたり０．１〜１．０ｇを投与することにより効果を示す。またこれらのペプチドは、従来から食品素材として用いられているタンパク質の一部なので安全性の面でも問題無い。特にウシ由来のペプチドフラグメントは、その抗原性が低いため実用上好ましい。
【００２１】
以下に本発明によるウィルス感染・増殖抑制剤について実施例により詳細に説明する。なお、合成は、泉谷ら著「ペプチド合成の基礎と実験」（1985年丸善刊）p194-233に記載の方法に従い固相合成法にて行った。
【実施例１】
【００２２】
ウシＬＦ（２４−３９）の合成
ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基としてＣ末端側から遂次ペプチド鎖を延長することにより０．２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド１３４０ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド５４３ｍｇは、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（２１．５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶出：０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出〕により精製し直鎖精製ペプチド３６７ｍｇを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果９０％であった。
【実施例２】
【００２３】
ウシＬＦ（２４−５１）の合成
実施例１と同様の方法で合成し、純度９３％のウシＬＦ（２４−５１）の鎖状ペプチド４３２ｍｇを得た。
【実施例３】
【００２４】
Ｎ−アセチル−ウシＬＦ（２４−３９）−アミド（Ａｃ−ウシＬＦ（２４−３９）−ＮＨ2）の合成
ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）によりベンズヒドリルアミン樹脂を用い第３ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基をアミノ末端の保護基としてＣ末端側から遂次ペプチド鎖を延長することにより０．２５ｍｍｏｌスケールで合成を行った。縮合反応をすべて終えた後、アミノ末端のｔ−Ｂｏｃ基を除去し、無水酢酸でこれをアセチル化した。ＨＦ処理によりペプチドの樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＨＦを除去し目的の粗Ａｃ−ウシＬＦ（２４−３９）−ＮＨ2を得た。この粗ペプチドを実施例１と同様にしてＨＰＬＣで精製し、純度９１％の精製ペプチド４２ｍｇを得た。
【実施例４】
【００２５】
ウシＬＦ（１−５１）、〔19Cys(Acm),36Cys(Acm) 〕ウシＬＦ（１−５１）および〔9CysSH,19Cys(Acm),36Cys(Acm),45CysSH〕ウシＬＦ（１−５１）の合成
ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基とし、19Cysおよび36Cys のＳＨ基をアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護してＣ末端側から遂次ペプチド鎖を延長することにより０．２５ｍｍｏｌスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド２７６７ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペプチド８６５ｍｇは、ＨＰＬＣ〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（２１．５×１５０ｍｍ，東ソー社），溶出：０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出〕により精製し、直鎖精製ペプチド〔9CysSH,19Cys(Acm),36Cys(Acm),45CysSH〕ウシＬＦ（１−５１）５８９ｍｇを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果９５％であった。
このペプチドをフェリシアン化カリウム存在下空気酸化により9Cys,45CysにＳ−Ｓ結合を形成させ、さらにＨＰＬＣにて精製することで、純度８８％の〔19Cys(Acm),36Cys(Acm) 〕ウシＬＦ（１−５１）４６７ｍｇを得た。
さらにこのペプチドをヨウ素処理しＡｃｍ基の除去とＳ−Ｓ結合の形成を同時に行い、ＨＰＬＣで精製することでウシＬＦ（１−５１）１０１ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分析の結果、このペプチドの純度は８７％であった。
【実施例５】
【００２６】
ウィルス感染・増殖抑制剤の製造
上記実施例１〜４の方法により得たペプチドの注射製剤の生産例を示す。
（1）ウシＬＦ（２４−３９） 4ｇ
ツイーン80             2mg
グリシン 2ｇ
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
（2）ウシＬＦ（２４−５１）  4g
ツイーン80              1mg
ソルビトール            2g
グリシン                1g
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００２７】
（3）ウシＬＦ（１−５１）   4g
ツイーン80             1mg
ソルビトール           2g
グリシン 1g
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
（4）Ａｃ−ウシＬＦ（２４−３９）−ＮＨ2   4g
ソルビトール                          4g
ヒト血清アルブミン                   50mg
上記組成をpH7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００２８】
以下に実験例を示し、本発明の効果をさらに詳細に説明する。
【実験例１】
【００２９】
ＬＦ由来ペプチドのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対する感染・増殖抑制効果
方法：ＬＦ由来ペプチドを２％血清添加ＭＥＭ培地に溶解し、濾過滅菌しストック溶液とした。このストック溶液を必要に応じて２％血清添加ＭＥＭ培地により希釈して用いた。ヒト胎児繊維芽細胞（ＨＥＬ細胞）を試料を含む２％血清添加ＭＥＭ培地に懸濁させ１０分間インキュベートした。遠心分離により細胞を取り出し、さらに２％血清添加ＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄した後、細胞を２％血清添加ＭＥＭ培地に懸濁させた。これにヒトＣＭＶ（ＴＡＮＡＫＡ株）を添加し、２４時間培養後、ヒトＣＭＶ陽性血清で蛍光染色し、細胞へのヒトＣＭＶの吸着能力を測定した。
【００３０】
結果：表１にヒトＬＦ由来ペプチドのＣＭＶに対する感染・増殖阻害効果を示す。表１に示すペプチドのうち抗ウィルス活性をもつペプチドに共通する配列から、２５〜４０残基部分が活性に必須な構造を含むものと推察された。これは、ウシＬＦの場合２４〜３９残基部分に相当する。また表２では、ウシＬＦ由来ペプチドがＣＭＶの感染・増殖を、コントロールと比較して９０％阻害するのに必要な最少濃度を示している。この結果より、本発明によるペプチドは、天然のＬＦやこれまで知られていたＬＦ由来のペプチドより低濃度で抗ウィルス効果を示すことが明らかとなった。なおここで使用したペプチドのうち本発明を構成するペプチド以外のものについても、実施例１に示した方法と同様にして化学的に合成したものであり、その純度はＨＰＬＣによる分析の結果いずれも８５％以上であることを確認している。
【００３１】
[表１]
ヒトＬＦ由来ペプチドのＣＭＶに対する感染増殖阻害効果
__________________________________________________________
ペプチド*1       Ｓ−Ｓ結合         感染阻害率(％)
__________________________________________________________
LF(1-52）   10Cys-46Cys,20Cys-37Cys          95
LF(1-52)    10Cys-46Cys,                     95
LF(1-52)                                     97
LF(18-52)                                    24
LF(25-52)                                    91
LF(1-40)                                     97
LF(28-40)                                     0
LF(19-31)                                     2
LF(2-19)                                     14
LF(4-29)                                      0
LF(18-42) 97
__________________________________________________________
*1 ペプチド濃度は、0.5mg/ml
【００３２】
[表２]
ＬＦ由来ペプチドの抗ＣＭＶ効果における最少活性発現濃度
__________________________________________________________
サンプル                 最少活性発現濃度*1(mg/ml)
__________________________________________________________
ウシＬＦ                              1.0
ウシＬＦ(24-39)                       1.0
ウシＬＦ(24-51)                       0.5
ウシＬＦ(1-51)                        0.05
ウシＬＦ(17-41)                       2.0
_________________________________________________________
*1 ９０％の感染阻止率を示す濃度
【実験例２】
【００３３】
ＬＦ由来ペプチドのＨＩＶに対する感染・増殖抑制効果
方法：ＨＩＶの一株であるＨＴＬＶ−IIIB持続感染株であるＭＯＬＴ−４／ＨＴＬＶ−IIIB（以下ＭＴ−４と略記する）細胞の培養上清をウィルス液として用いた。上清は−８０℃に保存した。検定に用いる細胞はヒトＴ細胞系のＭＴ−４を用いた。ＭＴ−４は１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて継代した。試料（ＬＦ由来ペプチド）は、培地（ＲＰＭＩ１６４０）に溶解し目的の濃度として細胞に１ｍｌ添加した。６０分間インキュベートした後、ＨＩＶをｍｏｉ（細胞／感染ウィルス比）＝０．０１となるようにＭＴ−４細胞に感染させ、３×１０5／ｍｌに調製した細胞液を１ｍｌ加えた。細胞を３日間培養後、ＨＩＶ感染細胞を間接蛍光抗体法を用いて測定した。
ＨＩＶ感染細胞は、ＨＩＶ感染患者血清を一次抗体とした間接蛍光抗体法で測定した。蛍光顕微鏡下で細胞５００個以上を観察し、蛍光染色された細胞の割合を算出した。なお、陽性コントロールとして試料を加えずに培養したＨＩＶ感染ＭＴ−４細胞、陰性コントロールとしてウィルス液を添加しない細胞培養を同時に行った。
【００３４】
結果：実験結果を表３に示す。結果はＨＩＶの感染を９０％阻止するのに必要な濃度を示している。この結果より、本発明によるペプチドは、天然のＬＦやこれまで知られていたＬＦ由来のペプチドより低濃度で抗ウィルス効果を示すことが明らかとなった。
【００３５】
[表３]
ＬＦ由来ペプチドの抗ＨＩＶ効果における最少活性発現濃度
_________________________________________________________
サンプル                    最少活性発現濃度*1(mg／ml)
_________________________________________________________
ウシＬＦ                                  0.1
ウシＬＦ(24−39)                          0.05
ウシＬＦ(24−51)                          0.05
ウシＬＦ(1−51)                           0.05
ウシＬＦ(17−41)                          0.1
_________________________________________________________
*1 ９０％の感染阻止率を示す濃度
【実験例３】
【００３６】
ＬＦ由来ペプチドのインフルエンザウィルスに対する感染・増殖抑制効果
方法：インフルエンザウィルスに対するＬＦ由来ペプチドの感染・増殖抑制効果は、ウィルス実験学総論、国立予防衛生研究所学友会編、ｐ．１１３−１２９  丸善（１９７３）に従い、ふ化鶏卵内培養法によって行った。ヒトＬＦ、ウシＬＦおよび実施例１−３で調製したペプチドを生理食塩水に溶解し、濾過滅菌した。卵令１０日のふ化鶏卵２５個を５個ずつ５群にわけ、コントロール群には生理食塩水のみを、他の群には試料溶液１００μｌを尿液腔内に接種した。３時間後、各ふ化鶏卵にインフルエンザウィルスＡ／ＰＲ／８／３４のウィルス液１００μｌを尿液腔内に接種した。なおここで用いたウィルス量は、尿液腔内に接種した後採取した尿液を６４倍希釈した溶液で赤血球凝集（ＨＡ）反応を示すことのできるウィルス量である。２日後それぞれの卵を氷室中で一夜静置しその後尿液を採取した。得られた尿液を生理食塩水で段階的に希釈しこれにヒヨコ安定化赤血球（武田薬品）を加え、ＨＡ反応を行うことでウィルスを定量した。
【００３７】
結果：実験結果を表４に示す。結果はインフルエンザウィルスの感染を９０％阻止するのに必要な濃度を示している。この結果より、本発明によるペプチドは、天然のＬＦやこれまで知られていたＬＦ由来のペプチドより低濃度で抗ウィルス効果を示すことが明らかとなった。
【００３８】
[表４]
ＬＦ由来ペプチドの抗インフルエンザウィルス効果における最少活性発現濃度
________________________________________________________________________
サンプル                最少活性発現濃度*1(mg／ml)
________________________________________________________________________
ウシＬＦ                           2.0
ウシＬＦ(24-39)                    0.5
ウシＬＦ(24−51)                   0.2
ウシＬＦ(1−51)                    0.2
ウシＬＦ(17−41)                   1.0
________________________________________________________________________
*1 ９０％の感染阻止率を示す濃度
【実験例４】
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＭＶ感染防御試験
方法：４週令雄のＢａｌｂｃ／ＡＪｃｌマウス（１群１０匹）を用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に試料を溶かし、マウス腹腔内に投与した。６時間後、１×１０6ＰＦＵのマウスＣＭＶを腹腔内に投与し、１０日後のマウスの生存率で感染防御率を評価した。
【００４０】
結果：実験結果を表５に示す。本発明によるペプチドは０．０１ｇ／体重ｋｇ以上の投与でマウスＣＭＶに対して感染防御効果をもつことが明らかとなった。
【００４１】
[表５]
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスＣＭＶ感染防御試験
______________________________________________________
試料                投与量（g／体重kg）  生存率（％）
_______________________________________________________
―                          ―                100
ＣＭＶ                                            0
ＣＭＶ＋ウシＬＦ（1−51）    0.002               20
0.005               40
0.01               100
0.02               100
0.05               100
______________________________________________________
【配列表】
2005008645000001.app