(57)【要約】【課題】      集団飼育されたミツバチに対する感染症の予防、治療、及びダニ等侵入防止に有効な抗菌剤の提供を目的とし、特にアメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果（静菌作用及び抗菌作用）を有する抗菌剤に関する。【解決手段】  アメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果を有する生薬、ヒノキチオールまたはローヤルゼリー抽出物を有効成分とする抗菌剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果を有する生薬を有効成分とする抗菌剤。
【請求項２】
アメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果を有するヒノキチオールを有効成分とする抗菌剤。
【請求項３】
アメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果を有するローヤルゼリー抽出物を有効成分とする抗菌剤。
【請求項４】
前記生薬が、甘草または厚朴もしくはその両方であることを特徴とする請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項５】
前記甘草が、油溶性甘草エキスであることを特徴とする請求項１または４に記載の抗菌剤。
【請求項６】
前記甘草が、甘草乾燥エキスもしくは甘草エキスのいずれかであることを特徴とする請求項１または４に記載の抗菌剤。
【請求項７】
前記厚朴が、厚朴乾燥エキスであることを特徴とする請求項１または４に記載の抗菌剤。
【請求項８】
前記抗菌効果が、静菌作用及び抗菌作用であることを特徴とする請求項１乃至７に記載の抗菌剤。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかの抗菌剤をミツバチの巣箱に添加、塗布、噴霧するいずれかのもしくはそれらの組合せによって、ミツバチのアメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌による病気の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果（静菌作用及び抗菌作用）を有する生薬、ヒノキチオールまたはローヤルゼリー抽出物を有効成分とする抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
養蜂という人工的に作り出した高密度なミツバチ飼育環境において、ミツバチのコロニー（群）が病気に集団感染する可能性が高く、特に、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病、チョーク病、ノゼマ病、バロア病（ミツバチヘキイタダニ）、アカリンダニ症、麻痺病、サックブルード、アメーバ病等の病原菌にミツバチのコロニー（群）がかかると、蜂蜜の生産量や品質の低下を招くので、養蜂業を営む業者にとっては大きな損害を受ける。
【０００３】
アメリカ腐蛆病菌とは、最も被害の大きな幼虫の病気の一つで、世界中のどの大陸にでも見られるこの病気は胞子を作るバクテリアの一種Paenibacillus larvae によって起こる。
アメリカ腐蛆病菌は、活発な蜂児生産時期の間にいつでも発生する。最初は罹病群の蜂数に顕著な減少は見られなく、少数の死亡した幼虫や蛹が存在するだけである。しかしながら、次の時期には、病気によって深刻な弱群となり、蜂群は死滅することになる。
【０００４】
アメリカ腐蛆病に罹病した巣板全体的の様子は巣房に蓋がないものであったりする。被害の大きい罹病では、蓋のない巣房に幼虫や蛹の死骸が隣片状に残るようになる。一方、健康であった幼虫は真珠のおうな乳白色からクリーム状の色に変わり、それがやがて暗褐色に変わっていく。最終的に幼虫は黒褐色になり、巣房の入り口から下部の壁に張り付いている死骸は、取り除くのは困難で働き蜂は時々そのままの状態にしている。
【０００５】
罹病して死亡した幼虫からP. larvae芽胞はやがて全巣箱に行き渡り、周囲のミツバチにも感染することになる。ミツバチに群が弱まると周辺にいる強群から盗蜜の襲撃を受けるので、襲撃した別群のミツバチにも伝染し、被害が広がる恐れがある。
【０００６】
この対策法として、例えば、米国ではミツバチにテラマイシンを与えるシロップ法、粉末法、抗生物質入りバテ法などがある。
しかしながら、前記の方法では、ミツバチから採取してくる蜂蜜の品質に影響を与えてしまう恐れがあり、また、この方法で集団飼育の環境にあるミツバチ全体に対して病気の予防効果を期待することは困難である。
【０００７】
【特許文献１】特開平２００２−１９３７１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、集団飼育されたミツバチに対する感染症の予防、治療、及びダニ等侵入防止に有効な抗菌剤の提供を目的とし、特にアメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果（静菌作用及び抗菌作用）を有する抗菌剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に対する抗菌効果（静菌作用及び抗菌作用）を有する生薬、ヒノキチオールまたはローヤルゼリー抽出物を有効成分とする抗菌剤を提供する。
【００１０】
本発明の抗菌剤は、ミツバチ群に感染する、アメリカ腐蛆病、ヨーロッパ腐蛆病、チョーク病、ノゼマ病、バロア病（ミツバチヘキイタダニ）、アカリンダニ症、麻痺病、サックブルード、アメーバ病等に有効であり、特にアメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に有効な抗菌剤である。
【００１１】
本発明の抗菌剤に用いる有効成分の生薬には、甘草または厚朴もしくはその両方を用いることができる。一般に市販されている甘草もしくは厚朴であれば本発明において用いることができる。
また、本発明において特に好ましいのは、油溶性甘草エキス、甘草エキス、甘草乾燥エキスのいずれかである甘草、もしくは厚朴乾燥エキスである。
【００１２】
本発明において特に好ましい油溶性甘草エキスは黄褐色の粉状で、水に不溶、エタノール可溶性分９５％以上の物質であり、甘草エキスは褐色のペースト状で、水に可溶で、グリチルリチン酸４．５％以上の物質であり、また、甘草乾燥エキスは灰褐色の粉状で、水に可溶で、水製エキス８０％以上の物質であり、そして、厚朴乾燥エキスは灰褐色の粉状で、水に可溶で、希エタノールエキス７５％以上、水製エキス８０％以上の物質である。
【００１３】
本発明の抗菌剤に用いる有効成分に、ヒノキチオールまたは、ローヤルゼリーの抽出物を用いることができる。ヒノキチオールには、抗菌効能をもち従来の巣箱にヒノキチオールを添加し噴霧することによって感染病菌特にアメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌に有効である。一方、ヒノキチオールを用いることによって巣箱全体をヒノキでつくるより、同様に抗菌効果を得るのに遥か経済的である。
【００１４】
本発明で用いるヒノキチオールは白色の粉状で、水に不溶、アルコールに可溶性物質であり、また、ローヤルゼリーの抽出物は白色の固形で、水に不溶、アルコールに可溶性物質であり、特に２日齢の幼虫から得たローヤルゼリーであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明で用いる抗菌剤は、多くに養殖生産品の抗生物質の代わりとして使用することができる。
【００１６】
本発明の抗菌剤による抗菌効果とは、静菌作用及び抗菌作用である。本発明において静菌作用とは、微生物の増殖を阻害あるいは阻止することであり、抗菌作用とは、微生物の一部あるいは全部を死滅・除去することである。
【００１７】
本発明の抗菌剤によるミツバチのアメリカ腐蛆病菌及びその類縁菌である枯草菌による病気の抑制方法としては、本発明の抗菌剤をミツバチまたはミツバチの巣箱に添加、塗布、噴霧するいずれかもしくはそれらの組あわせた方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗菌剤は、集団で飼育されているミツバチに対するアメリカ腐蛆病菌（Paenibacillus larvae）及びその類縁菌である枯草菌(Bacillus subtilis)の感染への抗菌効果(静菌作用及び抗菌効果)を有する。
【実施例】
【００１９】
以下に、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明が当該実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。
本発明の抗菌剤の有効成分である生薬(甘草及び厚朴)、ヒノキチオール及びローヤルゼリー抽出物のアメリカ腐蛆病菌（Paenibacillus larvae）及びその類縁菌である枯草菌(Bacillus subtilis)に対する、抗菌効果(静菌作用及び抗菌効果)について調査した。
【００２０】
下記被験物質１−７を用意し、被験物質６（ヒノキチオール）を除く6薬剤は、100%製剤、被験物質６は1%製剤であった。
【００２１】
被験物質１：
名称：油溶性甘草エキス。
性状等：黄褐色の粉状で、水に不溶、アルコールに可溶性物質。
保管条件：冷暗所。
【００２２】
被験物質２：
名称：新疆産甘草。
性状等：黄褐色の粉状で、水に可溶性物質。
保管条件：冷暗所
【００２３】
被験物質３：
名称：甘草乾燥エキス。
性状等：灰褐色の粉状で、水に可溶性物質。
保管条件：冷暗所
【００２４】
被験物質４：
名称：甘草エキス。
性状等：褐色のペースト状で、水に可溶性物質である。
保管条件：冷暗所
【００２５】
被験物質５：
名称：厚朴乾燥エキス。
性状等：灰褐色の粉状で、水に可溶性物質。
保管条件：冷暗所
【００２６】
被験物質６：
名称：ヒノキチオール。
性状等：白色の粉状で、水に不溶、アルコールに可溶性物質。
保管条件：冷暗所。
【００２７】
被験物質７：
名称：ローヤルゼリー抽出物。
性状等：白色の固形で、水に不溶、アルコールに可溶性物質。
【００２８】
供試菌としては、アメリカ腐蛆病菌（Paenibacillus larvae）野外分離株10株（1993年以降に日本国内で発生の認められたアメリカ腐蛆病罹患蜂群より、当研究所で分離・保管された株）、及び、枯草菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）である。
【００２９】
実施例１
被験物質１−７のPaenibacillus larvaeに対する抗菌効果及び対照株のBacillus subtilisに対する抗菌効果を調査した。
【００３０】
被験物質の調製：
可溶性溶媒を用いて、濃厚な溶液(以下「原液」という。)を調製した。なお、原液においては、以下の事項について予め調査を行い、抗菌効果を評価する際の参考資料とした。
(1)-１  原液中の細菌及び真菌の有無について、
(1)-２  それぞれの被験物質を使用して培地を調製した際の pHを測定した。
【００３１】
(2)   日本化学療法学会標準法の寒天平板希釈法に準じた方法で、植物型菌体に対する静菌作用の調査（以下「薬剤感受性試験」という。）を実施した。
(3)  それぞれの菌株で以下に示す培地を使用して測定用培地を用意した。
(3)-１  Paenibacillus larvae 
J培地    酵母エキス            10g
トリプトン            5g
リン酸水素二カリウム  3g
寒天末                15g
精製水            1000mL
(3)-２  Bacillus subtilis
ミュラーヒントン寒天培地（BBL社製）
【００３２】
(4)  被験物質の試験濃度を以下のように調整した。
被験物質１〜５の培地中最終濃度は、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12及び10.24％の11段階とした。
被験物質６の培地中最終濃度は、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512及び1024ppmの11段階とした。
被験物質７の培地中最終濃度は、1、2.5、5、10、15及び20％の6段階とした。
【００３３】
(5)  接種用菌液の調製
増殖用培地として上記(3)に示すぞれぞれの培地の寒天末を含まない培地を用いた。Paenibacillus larvaeは、微好気環境（37℃、5%CO2）下で48時間培養して、107CFU/mLになるように調製した。Bacillus subtilisは、37℃、好気環境下で培養して、106CFU/mLになるように調製した。
【００３４】
(6)  ミクロプランター(佐久間製作所)を用いて菌の接種を行った。
(7)  以下のように判定した。
各被験物質を含有する培地に供試菌を接種し、Paenibacillus larvaeについては2日培養、Bacillus subtilisについては1日培養後に発育の有無を観察し、発育を抑制した最小濃度（Minimum Inhibitory Concentration、以下「MIC」という。）を判定した。
【００３５】
(8)  植物型菌体に対する抗菌作用の調査：
薬剤感受性試験において、菌の発育が抑制された培地上における接種部位周辺の寒天を採取し、被験物質を含有しない培地に移植して培養し、培養開始から7日間、菌の発育の有無を観察した。最終日に発育が認められなかった被験物質の最小濃度（Minimum Bactericidal Concentration、以下「MBC」という。）を判定した。
【００３６】
試験結果：
(1)  原液中の細菌及び真菌の有無についての調査結果の詳細を表１に示す。
【表１】
2005132804.tif 000002
【００３７】
生薬には、その製法により付着菌が存在する場合があることが確認されていることから、被験物質中の細菌及び真菌混在の有無を予備的に調査した。
調査方法は、被験物質原液を培地に塗布して本試験の供試菌の発育条件で培養した時、発育する細菌及び真菌が存在するか否かを調査した。
細菌混在の確認には、トリプチケースソイ寒天培地(37℃、好気培養)及びハートインフュージョン寒天培地（37℃、微好気培養）、真菌混在の確認には、クロラムフェニコール添加サブロー寒天培地（37℃、好気培養）を使用した。なお、真菌の培養温度条件は通常25℃であるが、本試験では供試菌の培養が37℃であるため真菌混在の確認も37℃で行った。
【００３８】
調査は培養後1日〜7日まで行い、それぞれの培養条件で菌の発育の有無を観察した。
その結果、各培養条件で、培養後7日までに菌の発育が認められなかったことから、今回供試した被験物質には試験に影響を及ぼす細菌及び真菌の混在はないことが確認された。
【００３９】
(2)  被験物質添加培地のpHについての測定結果の詳細を表２に示す。
【表２】
2005132804.tif 000003
【００４０】
今回の試験では、使用する培地中の被験物質濃度が高濃度であるために培地のpHが変動することが考えられた。そのためMIC用培地調製時に培地のpHを測定し、被験物質の抗菌効果を評価する際の参考とした。
使用した培地は、J培地で被験物質無添加ではpH 7.1であった。被験物質1及び６は、最高濃度添加培地のpHが6.8であり、ほとんど変化は認められなかった。被験物質2〜5では、最高濃度添加培地のpHが5.3〜5.9で、多少酸性に傾いていたが、2.56% 添加培地ではpH6.5〜6.8の中性であった。
【００４１】
被験物質７では、20%(最高濃度)添加培地のpHが3.5、10%添加培地のpHが4.1、最低濃度添加培地(1%)のpHが5.9で、被験物質添加培地全般が、酸性に傾いていた。
【００４２】
(3)  薬剤感受性試験（MIC）の薬剤感受性試験成績の詳細を表3に示す。
【表３】
2005132804.tif 000004
2005132804.tif 000005
【００４３】
P. larvaでは、ほとんどの被験物質でのMIC値が1濃度に集中したが、被験物質２及び６では <0.01〜0.64%(被験物質2) 及び <1〜8ppm(被験物質6)とMIC値に幅が認められた。
P. larvaeと対照株のB. subtilisのMIC値は被検物質1、3、4、5及び７では極めて近似した値を示した。
なお、薬剤感受性試験の接種菌液中濃度は、P. larvaeで1.8〜4.4×107  CFU/mL、B. subtilisで2.2×106CFU/mLであった。
【００４４】
(4)  植物型菌体に対する抗菌作用（MBC）の植物型菌体に対する抗菌作用の成績の詳細を表４に示す。
【表４】
2005132804.tif 000006
2005132804.tif 000007
【００４５】
P. larvaeのMBC値は、被験物質1で10.24 〜>10.24%、被験物質２で0.64 〜>10.24%、被験物質３で0.16 〜>10.24%、被験物質４で5.12 〜>10.24%、被験物質５で0.32 〜 1.28%、被験物質６で16〜>1024ppm、被験物質７で<1〜10%であった。被験物質5及び7を除くほとんどの被験物質で、MBC値が高濃度であった。
【００４６】
結論
Paenibacillus larvaeの薬剤感受性試験では、全被験物質で今回設定した濃度範囲内の低濃度でMIC値を示した。また、対照菌のBacillus subtilisでも同様の傾向が確認された。MIC試験で陰性を示した株を再度培養・観察した結果は、Paenibacillus larvaeではほとんどの株で増殖が確認され、被験物質1〜4及び6ではMBC値が最高濃度添加量以上となった。被験物質5のMBC値は、設定濃度範囲の中間である0.64%添加濃度であった。
このことから、今回の被験物質はPaenibacillus larvaeに対する静菌効果は期待できるが、被験物質５以外の被験物質の抗菌効果はあまり期待できないと推測された。
【００４７】
被験物質7は、MIC値 <1%、MBC値5%と低濃度の値であったが、これは、被験物質添加培地のpHによる影響が考えられる。被験物質7以外の添加培地では、最高濃度添加培地(被験物質1-5:10.24%、被験物質6:1024ppm)で、pHが若干酸性になる傾向が見られたが、それ以下の濃度ではほとんど中性に戻り、薬剤感受性試験に影響を及ぼすものではないと判断された。被験物質7では、最低濃度添加(1%)で pH5.9、最高濃度添加(20%)でpH 3.5と強い酸性を示していたため、MIC及びMBCに影響があったと考えられる。
【００４８】
生薬には付着菌が存在する場合が多くみられることから、被験物質中の付着菌の有無を観察したが、観察期間中、細菌及び真菌の発育は認められず、被験物質中に試験結果に影響を及ぼすような細菌及び真菌の混入はないことが確認された。