(57)【要約】【課題】  抗薬物依存形成剤を提供することを課題とする。特に、免疫抑制作用を有さない抗薬物依存形成剤を提供することを課題とする。【解決手段】  (a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有する、抗薬物依存形成剤：  (a)Leu及びIleからなるペプチド；  (b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；  (c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有する、抗薬物依存形成剤：
(a)Leu及びIleからなるペプチド；
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
【請求項２】
(a1)〜(c1)のいずれかの化合物を有効成分として含有する、抗薬物依存形成剤：
(a1)Leu−Ile；
(b1)Leu−Ileの修飾体；
(c1)薬学的に許容可能な、(a1)又は(b1)の塩。
【請求項３】
メタンフェタミン、モルヒネ、コカイン、ニコチン、アルコール、フェンサイクリンジン、またはベンゾジアゼピン類による薬物依存形成の抑制用又は治療用薬剤である、請求項１又は２に記載の抗薬物依存形成剤。
【請求項４】
以下のステップを含む、薬物依存症の予防又は治療方法：
(A)請求項１〜３のいずれかに記載の抗薬物依存形成剤を生体に投与するステップ。
【請求項５】
抗薬物依存形成剤を製造するための、(a)〜(c)のいずれかの化合物の使用：
(a)Leu及びIleからなるペプチド；
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
【請求項６】
抗薬物依存形成剤を製造するための、(a1)〜(c1)のいずれかの化合物の使用：
(a1)Leu-Ile；
(b1)Leu-Ileの修飾体；
(c1)薬学的に許容可能な、(a1)又は(b1)の塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメタンフェタミンやモルヒネ等による抗薬物依存形成剤、及びその使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類の歴史が始まった当初から、ケシの実や大麻樹脂など、自然界に存在する様々な物質が中枢神経系に作用して精神運動機能に影響を及ぼすことを人類は見出し、そして精神作用物質として今日まで用いてきた。時代が進むにつれて、コカイン、覚せい剤および有機溶剤など多くの化学合成物質までもが使用されるに至った。このような背景により、元来個人的な嗜好であったこれらの物質の使用は依存・乱用にとどまらず、現在では大きな社会問題となっている。
現在、社会問題の原因となる依存性薬物には、覚せい剤であるメタンフェタミン（ヒロポン）や麻薬性鎮痛薬であるモルヒネなどがあり、その他コカイン型など7種類の型に分類される。わが国では、特に、メタンフェタミンの若年層での乱用が報道され、近年、深刻な問題になっている。メタンフェタミンは中枢神経系でドパミンの再取り込みを抑制するとともに遊離を促進し、眠気および疲労の消失や多弁躁状態を引き起こす。また、ラットなどの動物にメタンフェタミンを連続投与すると、惹起される異常行動が進行性に増大する行動感作（sensitization）が観察される。メタンフェタミンを反復投与されると、ヒトでは強い精神依存および覚せい剤精神病を生じ、断薬後もストレス、飲酒や1回の薬物摂取により覚せい剤精神病が再燃する。一方、モルヒネはオピオイド受容体を介した中枢抑制作用を持ち、痛覚の抑制から始まり、情動の安定、多幸感を引き起こす。モルヒネを反復投与すると鎮痛耐性、精神依存および身体依存を生じることが知られている。これらの作用は、いずれもドパミンの過剰遊離が関与していると考えられているが、その詳細については明らかになっていない。
これら依存性薬物の連続投与により生じる耐性獲得、精神および身体依存の形成は薬物の短期薬理作用だけでは説明できない。脳内での長期薬物存在下、遺伝子発現を介した新たなタンパク質の合成が起こり、神経機能の可塑的変化、リモデリングが起こるためと考えられている（非特許文献４）。しかしながら、現在のところ薬物依存に有効な治療法は確立されていない。
【０００３】
一方、グリア細胞株由来神経栄養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF）及び脳由来神経栄養因子(brain-derived
neurotrophic factor; BDNF)はいずれもドパミン作動性神経系に対して神経保護作用を持つ神経栄養因子である（非特許文献１、２、６）。動物を用いた研究では、これらの因子が中枢および末梢の神経障害に対して保護作用を有することが報告されている。本発明者らは、BDNFやGDNFの産生を誘導するような低分子化合物が神経変性疾患の治療薬に結びつくと考え、長年にわたって、そのような化合物の検索を行ってきた。その中で、サイクロスポリンやタクロリムス（FK506）のような、すでに臨床現場で使われている免疫抑制剤が、培養神経細胞でのBDNFやGDNFの産生を促進することを見出している。タクロリムスが神経様株化細胞である培養PC12細胞の神経突起の伸長を促進することも報告されていることから（非特許文献３）、このような免疫抑制剤が神経系での障害を抑制することが予想される。本発明者らは更に研究を進め、タクロリムスが6-ハイドロキシドパミンによるドパミン作動性神経系の障害を防ぐことや、脊髄損傷からの機能回復を促進することを、ラットを用いた実験で明らかにしている。しかし、タクロリムスは免疫抑制作用を有するため、神経変性疾患の治療薬としての臨床応用は困難であると考えられる。そこで、図１に示すように、タクロリムスとその生体内結合蛋白(FKBP)との結合部位の類似構造であるいくつかのジペプチドであるLeu-Ile、Leu-Pro、Pro-LeuのBDNFおよびGDNFの産生誘導作用を検討したところ、Leu-IleにBDNFやGDNFの産生誘導作用が観察された。さらに、Leu-Ileにもタクロリムスと同様の神経保護作用が観察されることをドパミン作動性神経障害マウスや脊髄損傷障害ラットを用いて明らかにした。これらの神経保護作用が観察されるときに、BDNFやGDNFの産生が増加することも見出している。
【０００４】
【非特許文献１】Hoffer BJ,Hoffman A, Bowenkamp K, Huettl P, Hudson J, Martin D, Lin LF, Gerhardt GA.: Glialcell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbraindopaminergic neurons in vivo. Neurosci Lett 182: 107-11 (1995)
【非特許文献２】Levivier M, Przedborski S,Bencsics C, Kang UJ: Intrastriatal implantation of fibroblasts geneticallyengineered to produce brain-derived neurotrophic factor prevents degenerationof dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci 15: 7810-20(1995)
【非特許文献３】Lyons WE, George EB, Dawson TM,Steiner JP, Snyder SH: Immunosuppressant FK506 promotes neurite outgrowth incultures of PC12 cells and sensory ganglia. Proc Natl Acad Sci U S A 12: 3191-5(1994)
【非特許文献４】Nestler EJ: Molecular basis oflong-term plasticity underlying addiction. Nat Rev Neurosci 2: 119-28 (2001)
【非特許文献５】Noda Y, Miyamoto Y, Mamiya T,Kamei H, Furukawa H, Nabeshima T: Involvement of dopaminergic system inphencyclidine-induced place preference in mice pretreated with phencyclidinerepeatedly. J Pharmacol Exp Ther 286: 44-51 (1998)
【非特許文献６】Tomac A, Lindqvist E, Lin LF,Ogren SO, Young D, Hoffer BJ, Olson L: Protection and repair of thenigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo. Nature 373: 335-9(1995)
【非特許文献７】中島晶, 山田清文, Tran Manh Hung, 瀬戸愛花, 斎藤邦明, 清島満, 鍋島俊隆:Methamphetamineにより誘発される神経毒性におけるTNF-alphaの神経保護効果. 第75回日本薬理学会年会
【非特許文献８】山田裕一郎, 新田淳美, 中島晶, 斎藤邦明, 清島満, 山田清文, 鍋島俊隆: 薬物依存形成における腫瘍壊死因子（tumornecrosis factor-α; TNF-α）の役割. 第12回神経行動薬理若手研究者の集い
【非特許文献９】MesserCJ, Eisch AJ, Carlezon WA Jr, Whisler K, Shen L, Wolf DH, Westphal H, CollinsF, Russell DS, Nestler EJ.Related Articles, Links Role for GDNF in biochemicaland behavioral adaptations to drugs of abuse. Neuron. 2000, 26, 247-57.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は以上の背景の下なされたものであって、抗薬物依存形成剤を提供することを目的とする。特に、免疫抑制作用を有さない抗薬物依存形成剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑み、本発明者らは以下の検討を行なった。即ち、BDNFやGDNFがドパミン作動性神経系の機能調節に働いていることや、これら神経栄養因子が薬物依存に対して抑制作用を持つことが報告されていること(非特許文献９)に注目し、GDNF産生誘導作用をもつLeu-Ile（ジペプチド）の、薬物依存形成抑制薬としての可能性について検討した。その結果、メタンフェタミン又はモルヒネによって誘発される場所嗜好性に対してLeu-Ileが抑制効果を有することを見出した。また、メタンフェタミン又はモルヒネの連続投与によって引き起こされる行動感作がLeu-Ileの投与によって有意に抑制されることが判明した。また、メタンフェタミンまたはモルヒネによって場所嗜好性や行動感作が成立したマウスにLeu-Ileを投与したところ、嗜好性や行動感作の程度が減少した。更に検討を進めたところ、Leu-Ileを連続投与したマウスの脳（側坐核、海馬及び線条体）ではTNF-α発現量の増加が観察された。TNF-αが、メタンフェタミンやモルヒネの薬物依存形成を阻害することが報告されており（非特許文献７、８）、このことを考え合わせれば、Leu-IleはTNF-αの発現を促し、その結果として薬物依存形成を抑制したものと予想される。
本発明は以上の知見に基づいてなされたものであって、以下の構成を提供する。
[１]  (a)〜(c)のいずれかの化合物を有効成分として含有する、抗薬物依存形成剤：
(a)Leu及びIleからなるペプチド；
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
[２]  (a1)〜(c1)のいずれかの化合物を有効成分として含有する、抗薬物依存形成剤：
(a1)Leu−Ile；
(b1)Leu−Ileの修飾体；
(c1)薬学的に許容可能な、(a1)又は(b1)の塩。
[３]  メタンフェタミン、モルヒネ、コカイン、ニコチン、アルコール、フェンサイクリンジン、またはベンゾジアゼピン類による薬物依存形成の抑制用又は治療用薬剤である、[１]又は[２]に記載の抗薬物依存形成剤。
[４]  以下のステップを含む、薬物依存症の予防又は治療方法：
(A)[１]〜[３]のいずれかに記載の抗薬物依存形成剤を生体に投与するステップ。
[５]  抗薬物依存形成剤を製造するための、(a)〜(c)のいずれかの化合物の使用：
(a)Leu及びIleからなるペプチド；
(b)Leu及びIleからなるペプチドの修飾体；
(c)薬学的に許容可能な、(a)又は(b)の塩。
[６]  抗薬物依存形成剤を製造するための、(a1)〜(c1)のいずれかの化合物の使用：
(a1)Leu-Ile；
(b1)Leu-Ileの修飾体；
(c1)薬学的に許容可能な、(a1)又は(b1)の塩。
【０００７】
本明細書では慣例の標記法に従い左端がアミノ末端、右端がカルボキシ末端となるようにペプチドを表記する。また、アミノ酸残基がL形の場合には、L形である旨の表示を省略することがある。また、特に記載のない限り本明細書では、ジペプチドをはじめ様々な長さのペプチドを含む用語として「ペプチド」を使用する。
【０００８】
「抗薬物依存形成剤」とは、薬物依存形成を抑制するために使用される薬剤、又は形成された薬物依存の症状を改善（部分的又は完全な治癒を含む）するために使用される薬剤のことをいう。したがって本発明の抗薬物依存形成剤には、薬物依存症の予防的処置に使用可能な薬剤、及び薬物依存症の治療に使用可能な薬剤が含まれる。原因となる薬物によっても異なるが、薬物依存症は薬物の精神的な作用（効果）に依存する精神依存、退薬に伴う生体反応を避けるための身体依存、又は耐性の獲得（或いはこれらの組み合わせ）を特徴とする。薬物依存症の原因となる薬物としては、メタンフェタミン、モルヒネ、コカイン、ニコチン、アルコール、フェンザイクリジン、ベンゾジアゼピン類等(各種の塩を含む)を例示できるが、本発明が対象とする薬物依存症はこれらの薬物に関連するものに限られない。
【発明の効果】
【０００９】
本発明を構成するペプチド又はペプチド修飾体は、免疫抑制作用を伴うことなく薬物依存形成を抑制する。したがってこれらのペプチド等を有効成分として含有する本発明の薬剤は、薬物依存症の予防用又は治療用として好適である。また、本発明を構成するペプチド等は基本構造がジペプチドという非常に単純なものであるため、その調製が容易であるという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の薬剤はその一態様において、Leu及びIleからなるペプチド（ジペプチド）を有効成分として含む。Leu（ロイシン）は別名２−アミノイソカプロン酸と呼ばれ、そのL形は以下の化学式で表される。
【化１】
2005041834.tif 000002
一方、Ile（イソロイシン）は別名２−アミノ−３−メチル−ｎ−吉草酸と呼ばれ、そのL形は以下の化学式で表される。
【化２】
2005041834.tif 000003
本発明のペプチドでは好ましくはこれら二つのアミノ酸残基がN末端側からC末端側に向かってロイシン、イソロイシンの順に連結されている。
本発明において各アミノ酸残基はいずれもL形であることが好ましいが、アミノ酸残基の一部又は全部がD形であってもよい。
【００１１】
本発明の薬剤は他の態様において、上記ペプチドの修飾体（以下、「ペプチド修飾体」という）を有効成分とする。本発明における「ペプチド修飾体」とは、LeuとIleからなる基本構造（ジペプチド）に対して、その一部（複数箇所であってもよい）を他の原子団等で置換すること、或いは他の分子を付加すること等の修飾を施すことによって、少なくとも一部において前記基本構造と相違する構造の化合物をいう。
本発明におけるペプチド修飾体の代表例としては、各アミノ酸残基において側鎖の一部（原子又は原子団）が他の原子又は原子団で置換されたペプチド誘導体を挙げることができる。このようなペプチド誘導体は、最終生成物として当該ペプチド誘導体が得られるように設計された任意の製造工程によって調製することができる。したがって、目的のペプチド誘導体が、あるペプチドにおいて一部（例えば側鎖の一部である原子団）が特定の原子団によって見かけ上置換されたものである場合には、当該目的のペプチド誘導体はこの見かけ上基本となるペプチドを出発材料として当該特定の原子団を用いた置換反応によって製造されたものであっても、或いは例えば他の構造のペプチドを出発材料として適当な置換反応等（場合によって複数工程であってもよい）によって製造されたものであってもよい。したがって例えばLeu-Ileからなるジペプチドの誘導体の場合、Leu-Ileからなるジペプチドが出発材料として用いられていなくともよい。
ここでの他の原子又は原子団としては、ヒドロキシル基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）、アルキル基（メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等）、ヒドロキシアルキル基（ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等）、アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基等）、アシル基（ホルミル基、アセチル基、マロニル基、ベンゾイル基等）等を例示することができる。
【００１２】
尚、本発明のペプチド修飾体には、構成アミノ酸残基内の官能基が適当な保護基によって保護されているものも含まれる。このような目的に使用される保護基としては、アシル基、アルキル基、単糖、オリゴ糖、多糖等を用いることができる。このような保護基は、保護基を結合させるペプチド部位や使用する保護基の種類などに応じて、アミド結合、エステル結合、ウレタン結合、尿素結合等によって連結される。
【００１３】
アミノ酸を付加（連結）することによって本発明のペプチド修飾体を形成することも可能である。但し、溶解性や生体内利用率の面からアミノ酸の付加数はあまり多くないことが好ましいと考えられる。具体的には付加するアミノ酸の数としては例えば１〜９個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個又は２個である。尚、基本となるペプチド（又はペプチド修飾体）の両側においてアミノ酸の付加が行なわれていてもよい。
【００１４】
本発明のペプチド修飾体の更なる例としては、糖鎖の付加による修飾が施されているものを挙げることができる。また、Ｎ末端又はＣ末端が他の原子等で置換されることによってアルキルアミン、アルキルアミド、スルフィニル、スルフォニルアミド、ハライド、アミド、アミノアルコール、エステル、アミノアルデヒド等に分類される各種ペプチド誘導体も本発明のペプチド修飾体に含まれる。
【００１５】
尚、以上で説明した各種の修飾方法を組み合わせることによって構成されるペプチド誘導体を本発明のペプチド修飾体としてもよい。
【００１６】
本発明の薬剤は更に他の態様において、上記ペプチド又は上記ペプチド修飾体の塩を有効成分とする。本発明の塩は薬学的に許容可能な限りその種類は特に限定されず、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等との塩（無機酸塩）や、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等との塩（有機酸塩）をその例として挙げることができる。これらの塩の調製は慣用手段によって行なうことができる。
【００１７】
本発明の薬剤に含有されるペプチド、ペプチド修飾体、或いはこれらいずれかの塩（以下、これらをまとめて「ペプチド等」という）は典型的には直鎖状であるが、環状構造を有する化合物の使用を排除するものではない。即ち、アミノ酸残基の側鎖同士の連結などによって部分的又は全体的に環状構造を形成するペプチド等を、本発明の薬剤の有効成分として使用することもできる。
【００１８】
本発明におけるペプチド等は、公知のペプチド合成法（例えば固相合成法、液相合成法）によって製造することができる。但し、本発明のペプチド等が天然に存在する場合には、抽出、精製などの操作によってそれを調製することもできる。本発明のペプチド等の取得源としては例えば、動物細胞（ヒトを含む）、植物細胞、体液（血液、尿等）等が考えられる。
遺伝子工学的手法を用いて本発明のペプチド等を調製してもよい。即ち、本発明のペプチド等をコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたペプチド等を回収することにより本発明のペプチド等を調製することもできる。回収されたペプチド等は必要に応じて精製される。回収されたペプチド等を適当な置換反応に供し、所望のペプチド修飾体に変換することもできる。
本発明におけるペプチド等の中で例えばLeu-Ile等は市販されており、国産化学株式会社（KOKUSAN CHEMICAL Co.,Ltd. 東京、日本）より入手することができる。
【００１９】
以上のペプチド等の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００２０】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして調製できる。
このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって患者に適用され得る。
本発明の薬剤中における有効成分（ペプチド等）の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量％〜約90重量％とする。
【００２１】
本発明の他の局面では以上の薬剤を使用した薬物依存症の予防方法又は治療方法（以下、これら二つの方法をまとめて「治療方法等」という）が提供される。本発明の治療方法等は、上記のペプチド、ペプチド修飾体、又はこれらいずれかの塩を有効成分として含む薬剤を生体に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。薬剤の投与量は症状、患者の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、Leu-Ileを有効成分として含む薬剤を使用する場合には、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約0.1〜約1000mg、好ましくは約1mg〜約100mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、患者の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
【実施例１】
【００２２】
1.マウスにおけるメタンフェタミン又はモルヒネによる場所嗜好性に対するLeu-Ileの作用
1-2.実験材料及び方法
1-2-1.動物
実験には、開始時8週齢のICR雄性マウス（日本SLC、浜松）を使用した。マウスを、明暗サイクルが 12時間（点灯A.M8:00）、室温23±１℃、湿度50±5 %の条件下で飼育し、餌（CE2: 日本クレア、東京）及び水は共に自由に与えた。尚、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認されており、名古屋大学医学部動物実験指針及びPrinciples of Laboratory Animal Care （National
Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に準じた。
【００２３】
1-2-2.薬物
実験には塩酸メタンフェタミン（ヒロポン、大日本製薬、大阪）、塩酸モルヒネ（塩野義製薬、大阪）及びLeu-Ile（国産化学、東京）を使用した。いずれの薬物も生理食塩水（saline）に溶解して使用した。
【００２４】
1-2-3.実験装置
実験には、明暗の二つのチャンバーを備えるとともに、マウスがこれらのチャンバー間を行き来できないようにする仕切りを有する装置(それぞれ縦15 cm, 横15 cm, 高さ15cm)を使用した。各チャンバーでの滞在時間は、SCANET（ニューロサイエンス、東京）を用いて測定した。
【００２５】
1-2-4.条件付け場所嗜好性試験（conditioned place preference test）
条件付け場所嗜好性試験は、Nodaら(1998)の方法（非特許文献５）に準じて行った。2日間のPre-conditioning testでは1日15分として3日間マウスに両チャンバー間を自由に行き来させることで装置に馴れさせた後、3日目に各チャンバーでの滞在時間(pre-value)を計測した。Pre-conditioning
testにひき続き、6日間のConditioning testを行った。Conditioning testでは、各チャンバー間に仕切りを入れ、いずれか一方のチャンバーのみにマウスが滞在するようにした。4、6、8日目はメタンフェタミンもしくはモルヒネを皮下投与直後後、嗜好性の低かった（Pre-conditioning testにおいて滞在時間の短かった）チャンバーに、そして5、7、9日目は、生理食塩水を皮下投与した直後に逆のチャンバーに入れた。Post conditioning testでは再びマウスに両チャンバー間を自由に行き来させ、各チャンバーでの滞在時間、即ちpost-valueを計測した。場所嗜好性は（post-value）-（pre-value）で求めた。尚、テスト期間の全日において、チャンバーに入れる1時間前のマウスに対して腹腔内投与することによってLeu-Ileの投与を行なった。また、Leu-Ileの投与を伴わずにメタンフェタミンまたはモルヒネによる条件付け嗜好性試験を行った後、Leu-Ileを５日間投与し、場所嗜好性成立後の作用についても検討した。
【００２６】
1-2-5.統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析として一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合には更にBonferroniの多重比較検定を行った。尚、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
【００２７】
1-3.結果
1-3-1.メタンフェタミンによって誘発される場所嗜好性に対するLeu-Ileの作用
メタンフェタミンにより誘発される場所嗜好性に対するLeu-Ileの抑制効果を、マウスを用いて検討した。Post conditioning testにおいて、メタンフェタミンによって条件づけされた方のチャンバーにマウスが滞在する時間が有意に延長したが、Leu-Ile 1.5 μmole/kgを併用するとメタンフェタミンにより誘発される場所嗜好性は有意に抑制された（47±13%）。一方、Leu-Ileを7.5μmole/kg又は15 μmole/kg投与した群では、メタンフェタミンによる場所嗜好性に対する有意な抑制作用は観察されなかった(図２)。また、Leu-Ileと生理食塩水の併用は場所嗜好性に影響を与えず（グラフの左欄）、このことを考慮すればメタンフェタミンによって誘導された場所嗜好性に対するLeu-Ileの抑制作用は嫌悪効果によるものではないと考えられる。一方、場所嗜好性が成立したマウスにLeu-Ileを５日間投与すると、場所嗜好性が抑制された（図３）。
【００２８】
1-3-2.モルヒネによって誘発される場所嗜好性に対するLeu-Ileの作用
モルヒネにより誘発される場所嗜好性に対するLeu-Ileの抑制効果を、マウスを用いて検討した。Post conditioning testにおいて、モルヒネによって条件づけされた方のチャンバーにマウスが滞在する時間が有意に延長したが、Leu-Ile 1.5 μmole/kgを併用するとモルヒネにより誘発される場所嗜好性は有意に抑制され、滞在時間が短縮された（51±6%）。一方、Leu-Ileを7.5μmole/kg又は15 μmole/kg投与した群では場所嗜好性の抑制作用は観察されなかった(図４)。また、メタンフェタミンにおける実験の結果と同様にLeu-Ileと生理食塩水の併用は場所嗜好性に影響は与えず（グラフの左欄）、このことを考慮すればモルヒネによって誘導された場所嗜好性に対するLeu-Ileの抑制作用は嫌悪効果によるものではないと考えられる。一方、場所嗜好性が成立したマウスにLeu-Ileを５日間投与すると、場所嗜好性は抑制された（図５）。
【実施例２】
【００２９】
2.マウスにおけるメタンフェタミン又はモルヒネ連続投与による行動感作に対するLeu-Ileの作用
2-2-1.動物
実験には、開始時8週齢のICR雄性マウス（日本SLC、浜松）を使用した。マウスを、明暗サイクルが12時間（点灯A.M8:00）、室温23±１℃、湿度50±5%の条件下で飼育し、餌（CE2: 日本クレア、東京）及び水は共に自由に与えた。尚、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認されており、名古屋大学医学部動物実験指針およびPrinciples of Laboratory Animal Care （National
Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に準じた。
【００３０】
2-2-2.薬物
実験には、塩酸メタンフェタミン（ヒロポン、大日本製薬、大阪）、塩酸モルヒネ（塩野義製薬、大阪）及びLeu-Ile（国産化学、東京）を使用した。いずれの薬物も生理食塩水（saline）に溶解して使用した。
【００３１】
2-2-3.実験装置
実験には、ホームケージと同一種類のアクリルケージ(縦28cm、横17cm、高さ13cm)を用い、床に少量の飼育用チップを置いた。実験開始日から終了日まで、測定時のケージ及び飼育用チップを各マウス同一とした。行動量の測定にはinfrared detector（ニューロサイエンス、東京）を用い、測定結果をAB305 Measure及びABTEXT（ニューロサイエンス、東京）で解析した。
【００３２】
2-2-4.運動量測定試験
第1〜3日目はマウスを測定用のケージに2時間入れ、測定環境に馴れさせた。4日目以降は1日1回メタンフェタミン又はモルヒネの皮下投与を行い、投与直後から2時間の総運動量を測定した。Leu-Ileはいずれの試験日も、測定ケージに入れる1時間前に腹腔内投与を行った。
【００３３】
2-2-5.統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析として二元配置反復測定分散分析を行い、有意差が認められた場合には更にBonferroniの多重比較検定を行った。尚、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
【００３４】
2-3.結果
2-3-1.マウスにおけるメタンフェタミン連続投与による行動感作に対するLeu-Ileの作用
メタンフェタミンを連続投与することによる行動感作に対するLeu-Ileの抑制効果を検討した。投与開始日においては、メタンフェタミン（MAP）(1mg/kg, s.c.)を投与することにより、投与直後から2時間後までの行動量が約3倍に増加した。毎日連続してメタンフェタミンを投与すると、10日目にはメタンフェタミンを投与することによって投与後2時間の行動量は約6倍以上に増加し、行動感作が観察された。このような現象を逆耐性現象(sensitization)という。メタンフェタミンによるこのような行動感作がLeu-Ile（1.5 μmole/kg、7.5 μmole/kg及び15 μmole/kg）を併用投与することで有意に抑制された（それぞれ58%±4、64%±3及び48%±4）（図６ａ）。尚、図６ｂ〜ｄにはメタンフェタミン投与開始から1、5、11日目、各日の運動量を示した。Leu-Ileと生理食塩水の併用は自発運動に影響を与えず、このことからメタンフェタミンによる自発運動亢進に対するLeu-Ileの抑制効果はLeu-Ile自身の運動抑制によるものではないと考えられる。
【００３５】
2-3-2マウスにおけるモルヒネ連続投与による行動感作に対するLeu-Ileの作用
モルヒネ連続投与による行動感作に対するLeu-Ileの抑制効果を検討した。投与開始日においては、モルヒネ（MOR）(10 mg/kg, s.c.)を投与することにより、投与直後から2時間後までの行動量が約1.5倍に増加した。毎日連続してモルヒネを投与すると、10日目にはモルヒネを投与することによって投与後2時間の行動量は約3倍以上に増加し、行動感作が観察された。モルヒネの連続投与による自発運動亢進は、Leu-Ile（1.5μmole/kg、7.5μmole/kg及び15 μmole/kgを併用することで有意に抑制された（それぞれ72%±2、51%±7、47%±1）（図７ａ）。尚、図７ｂ〜ｄには、モルヒネ投与から1、5、11日目、各日の運動量を示した。Leu-Ileと生理食塩水の併用は自発運動に影響を与えず、このことからモルヒネによる行動感作に対するLeu-Ileの抑制効果は運動抑制によるものではないと考えられる。
【００３６】
3.マウス脳内におけるLeu-Ile連続投与後の腫瘍壊死因子-α(tumor necrosis factor
alpha ;TNF-α)発現変化に対する作用
3-2-1.動物
実験には、開始時8週齢のICR雄性マウス（日本SLC、浜松）を使用した。マウスを、明暗サイクルが12時間（点灯A.M8:00）、室温23±１℃、湿度50±5%の条件下で飼育し、餌（CE2: 日本クレア、東京）及び水は共に自由に与えた。尚、本研究計画は名古屋大学医学部動物実験委員会により承認されており、名古屋大学医学部動物実験指針及びPrinciples of Laboratory Animal Care （National
Institutes of Health Publication 85-23, 1985）に準じた。
【００３７】
3-2-2.薬物
実験にはLeu-Ile（国産化学、東京）を生理食塩水(saline)に溶解して使用した。
【００３８】
3-2-3.real-time RT-PCR(reverse transcriptase polimerase
chain reaction)による解析
マウスにLeu-Ileを14日間、腹腔内投与し、最終投与の2時間後にマウスを屠殺して脳を摘出した。摘出した脳から氷冷下で皮質、側坐核、線条体、及び海馬を分画しそれぞれを−80℃で冷凍保存した。脳組織からのmRNA抽出にはTRIZOL(Invitrogen、CA、USA)を用いた。抽出したmRNAを鋳型としSuperScriptTM
First-Standard Synthesis for RT-PCR(Invitrogen、CA、USA)を用いてcDNA合成を行い、PCRのサンプルにした。
【００３９】
3-2-3.実験装置
real-time RT-PCRによる遺伝子発現量の測定にはiCycler iQ Detection System(BIO-RAD、CA、USA)を用いた。PCRの条件、用いたプライマー、プローブ及び内在性のコントロールの塩基配列を以下に示す。
条件：変性（denature）を95℃で15 sec、アニーリング（annealing）及び伸長（elongation）を60℃で1 min
TNF-α:順方向プライマー（forward primer）  5’-CCCTTGCCCAGCCAGAA-3’（配列番号１）
逆方向プライマー（reverse primer）  5’-CCCCCTAAAAGACACGAAGATG-3’（配列番号２）
プローブ  5’-AGCTTGATGTCATCTCTTCGTGGGCT-3’（配列番号３）、TaqManTM、蛍光プローブ（Applied
Biosystems、CA、USA)
コントロール:TaqMan Ribosomal RNA Control Regents(VICTM
Probe)(Applied Biosystems、CA、USA)
【００４０】
3-2-4.統計解析
結果は全て平均値と標準誤差によって示した。統計解析として一元配置分散分析を行い、有意差が認められた場合には更にBonferroniの多重比較検定を行った。尚、危険率5%以下で差がある場合を有意な差があるとした。
【００４１】
3-3.結果
3-3-1.マウス脳内におけるLeu-Ile連続投与後のTNF-α発現変化に対する作用
Leu-Ileを5日間連続投与した後のマウス脳でのTNF-α発現変化を検討した。結果を図８に示す。今回、実験を行ったいずれの脳部位においてもTNF-αmRNAの検出は可能であった。側坐核（NAc）および海馬（Hip）においてはLeu-Ile 7.5 μmole/kg又は15 μmole/kg、線条体（Str）においてはLeu-Ile
1.5 μmole/kg又は15 μmole/kgを連続投与することでTNF−αのmRNAの発現が有意に増加した。一方、今回の実験結果においては、皮質（FC）では変化は観察されなかった。
【００４２】
以上のように、Leu-Ileは末梢投与された時にマウスの脳内TNF-αの発現を増加させていた。TNF-αの発現が促進された結果として、メタンフェタミンやモルヒネによる場所嗜好性や行動感作が抑制された可能性が考えられる。
薬物依存の抑制または治療に有効な薬剤はこれまでに知られていない。以上の実施例で示されるようにLeu-Ileは薬物依存形成の抑制に高い効果を有することから、それ自体は勿論のこと、薬学的見地から改良を施して得られる化合物は、薬物依存形成の抑制用又は治療用薬剤として有効なものとなる。
【００４３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の薬物依存形成抑制剤は、メタンフェタミン、モルヒネ等の薬物の連続投与によって引き起こされる、精神依存、身体依存、及び／又は耐性獲得の予防又は治療に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、タクロリムス（FK506）の構造及びその生体内結合蛋白(FKBP)結合部位の類似構造であるジペプチド（Leu-Ile）の構造を模式的に示す図である。生体内結合蛋白(FKBP)との結合に重要と思われる部位を円で囲った。
【図２】図２は、メタンフェタミン（MAP）による条件付け場所嗜好性試験におけるLeu-Ileの効果を示すグラフである。メタンフェタミン（皮下投与  １ｍｇ/kg)投与１時間前にLeu-Ileを投与した(個体数=8〜10)。♯p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。*p<0.05、対  生理食塩水/メタンフェタミン-投与群。
【図３】図３は、メタンフェタミンにより場所嗜好性が成立したマウスに対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。Leu-Ileの投与によって場所嗜好性が抑制されたことがわかる。♯p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。*p<0.05、対  生理食塩水/メタンフェタミン-投与群。
【図４】図４は、モルヒネ（MOR）による条件付け場所嗜好性試験におけるLeu-Ileの効果を示すグラフである。モルヒネ（皮下投与  １０ｍｇ/kg)投与１時間前にLeu-Ileを投与した(個体数=8〜10)。♯p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。*p<0.05、対  生理食塩水/モルヒネ-投与群。
【図５】図５は、モルヒネ（MOR）により場所嗜好性が成立したマウスに対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。Leu-Ileの投与によって場所嗜好性が抑制されたことがわかる。*p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。
【図６ａ】図６ａは、メタンフェタミン（MAP）によって誘発される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。行動量はメタンフェタミン投与後２時間測定した。*p<0.05、対  生理食塩水/メタンフェタミン投与群。
【図６ｂ】図６ｂは、メタンフェタミン（MAP）単回投与によって誘導される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。メタンフェタミン投与後２時間の行動量を測定した。＃p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群
【図６ｃ】図６ｃは、メタンフェタミン（MAP）の連続５日間投与によって誘導される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。メタンフェタミン投与後２時間の行動量を測定した。*p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。
【図６ｄ】図６ｄは、メタンフェタミン（MAP）の連続１１日間投与によって誘導される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。メタンフェタミン投与後２時間の行動量を測定した。*p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。♯p<0.05、対  生理食塩水/メタンフェタミン投与群。
【図７ａ】図７ａは、モルヒネ（MOR）によって誘発される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。行動量はモルヒネ投与後２時間測定した。*p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。
【図７ｂ】図７ｂは、モルヒネ（MOR）単回投与によって誘発される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。行動量はモルヒネ投与後２時間測定した。
【図７ｃ】図７ｃは、モルヒネ（MOR）の５日間投与によって誘発される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。行動量はモルヒネ投与後２時間測定した。*p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。♯p<0.05、対  生理食塩水/モルヒネ投与群。
【図７ｄ】図７ｄは、モルヒネ（MOR）の連続１１日間投与によって誘導される自発運動量亢進に対するLeu-Ileの効果を示すグラフである。モルヒネ投与後２時間の行動量を測定した。*p<0.05、対  生理食塩水/生理食塩水-投与群。♯p<0.05、対  生理食塩水/モルヒネ投与群。
【図８】図８は、Leu-Ileを１４日間投与した後のTNF-α mRNAの発現量を示すグラフである。*p<0.05、対  生理食塩投与群。Fc:前頭葉皮質、NAc:側坐核、Str:線条体、Hip:海馬。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
2005041834.tif 000010
【図６ｃ】
2005041834.tif 000011
【図６ｄ】
2005041834.tif 000012
【図７ａ】
2005041834.tif 000013
【図７ｂ】
2005041834.tif 000014
【図７ｃ】
2005041834.tif 000015
【図７ｄ】
2005041834.tif 000016
【図８】
2005041834.tif 000017
【配列表】
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