(57)【要約】      （修正有）【課題】    細胞内チロシンリン酸化酵素Ｈｃｋに結合する活性を有するタンパク質とその遺伝子を用いる、単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法および単純ヘルペスウィルスの増殖抑制剤の提供。【解決手段】  （Ａ）又は（Ｂ）の組換えタンパク質を細胞内に発現させる単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法および（ａ）又は（ｂ）の核酸を細胞内に導入することを特徴とする単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法並びに増殖抑制剤。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｂ）特定のアミノ酸配列の数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質。（ａ）（Ａ）タンパク質をコードする核酸。（ｂ）（Ｂ）タンパク質をコードする核酸。【選択図】  図１
2005132740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）の組換えタンパク質を細胞内に発現させることを特徴とする単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸
配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸を細胞内に導入することを特徴とする単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法。
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配
列を含むタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質をコードする核
酸。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸を発現ベクターに組み込んでなる単純ヘルペスウィルスの増殖抑制剤。
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配
列を含むタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質をコードする核
酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法および単純ヘルペスウィルスの増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウィルスには１型（ＨＳＶ−１）と２型（ＨＳＶ−２）の２つの血清型が存在する。これらのうち、ＨＳＶ−１は初感染後、歯肉口内炎、口唇へルペス、皮膚へルペス、角膜ヘルペス、ヘルペス脳炎、陰部ヘルペスなど多様な病像を示し、ＨＳＶ−２はは主として陰部ヘルペスの病像を示す。その後、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２は三叉神経節または坐骨神経節に終生続く潜伏感染を起こし、再活性化するたびに同様の病像を引き起こす。
【０００３】
これら単純ヘルペスウィルス感染症の治療薬としては、アシクロビルとその誘導体などが用いられているが、その治療効果は充分とはいえない。
【０００４】
単純ヘルペスウィルス感染は、ウィルス粒子が細胞表面のレセプターに結合することから始まる。細胞表面のレセプターに結合したウィルスは、その後、細胞膜と融合して細胞内に進入する。一方、そのレセプターを介して細胞内に種々のシグナルが伝達される。一般に細胞内のシグナル伝達はタンパク質−タンパク質相互間の結合によって伝達される。
【０００５】
このタンパク質−タンパク質相互間の結合に関わる重要なタンパク質構造として、ＳＨ（Src homology）２ドメインとＳＨ３ドメインが良く知られている。このうち、ＳＨ２ドメインはリン酸化されたチロシン残基を含む配列を認識し、特異的に結合する。また、ＳＨ３ドメインはプロリンに富んだ配列と特異的に結合する。
【０００６】
一方、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼの一つであるＨｃｋは、シグナル伝達を担う分子であり（非特許文献１参照）、胎児性幹細胞に存在するＬＩＦ（leukaemia inhibitory factor）／ＩＬ−６（インターロイキン６）レセプターのサブユニット（gp130）にＨｃｋがアソシエートしてそのシグナル伝達に関与している（非特許文献２参照）との報告や、単球性の細胞ＴＨＰ−１のＦｃγＲIIにＨｃｋがアソシエートしてそのシグナル伝達に関与している（非特許文献３参照）との報告がなされている。
【０００７】
最近、エイズウィルス（ＨＩＶ）のｎｅｆタンパク質が、ヒトＨｃｋのＳＨ３ドメインに他のＳｒｃ型チロシンキナーゼのＳＨ３ドメインに比べて１０倍程強く結合することから（非特許文献４参照）、ＨＩＶ感染におけるＨｃｋの役割が注目されている。また、好中球の分泌顆粒に存在するＨｃｋは、顆粒球が感染菌を貪食(phagocytosis)した後のシグナル伝達に関与している可能性がある（非特許文献５参照）。
【０００８】
このようなＨｃｋの関与するシグナル伝達の研究や、ＨＩＶのｎｅｆタンパク質の挙動の解明研究等のために、ヒト細胞内チロシンリン酸化酵素Ｈｃｋに結合する活性を有するタンパク質並びにそのタンパク質とそれをもたらす遺伝子は有用であると考えられ、本発明者らは、ヒト胎盤などの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから、いわゆる酵母２−ハイブリッドシステム（Yeast two-hybrid system）を用いたスクリーニングによって、細胞内チロシンリン酸化酵素ＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合する活性を有する新規ヒトタンパク質（ＨＳＢ−１）とその遺伝子（ＳＨ３ＫＢＰ１）を見出し、これらが腫瘍致死因子刺激によって誘導されるアポトーシスを促進することを見出した（特許文献１）。
【０００９】
後記配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、ＰＲＲと略する）は、ＨＳＢ−１に含まれるプロリンに富んだ領域であり、この領域を介してＳＨ３ドメインと結合する。
【００１０】
【特許文献１】再公表特許 ＷＯ０１／０３２８６９
【非特許文献１】ZIEGLER, S.F.,ら、Molecular and Cellular Biology,7, 2276-228          5(1987)
【非特許文献２】Emist M.,raら、The EMBO Journal, 13,1574-1584(1994)
【非特許文献３】Ghazizadeh, S.,ら、Journal of Biological Chemistry,269, 8878          -8884(1994)
【非特許文献４】Lee C-Hら、EMBO Journal 14, 5006-5015 (1995)
【非特許文献５】Welch, H., and Maridonneau-Parini, I., Journal of Biological          Chemistry,272, 102-109 (1997)
【非特許文献６】Take,H., ら、Biochemical and  Biophysical Research                    Communications,268, 321-328 (2000)
【非特許文献７】Gout, I., ら、EMBO Journal,19, 4015-4025 (2000)
【非特許文献８】Borinstein, S.C., ら、Cell Signaling,12, 769-779 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、単純ヘルペスウイルスの増殖抑制を有効に行うことのできる方法、特に、細胞内チロシンリン酸化酵素Ｈｃｋに結合する活性を有するタンパク質とその遺伝子に着目し、これを用いる、単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法および単純ヘルペスウィルスの増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、細胞内チロシンリン酸化酵素Ｈｃｋに結合する活性を有するタンパク質もしくはその部分を含むタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ）を細胞内に導入し、このタンパク質もしくはその部分を含むタンパク質を細胞内に発現させることによって、単純ヘルペスウィルスの増殖を抑制することに成功し、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は以下の（Ａ）又は（Ｂ）の組換えタンパク質を細胞内に発現させることを特徴とする単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法を提供するものである。
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸
配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質。
【００１４】
また、本発明は  以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸を細胞内に導入することを特徴とする単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法を提供するものである。
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配
列を含むタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質をコードする核
酸。
【００１５】
更に本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸を発現ベクターに組み込んでなる単純ヘルペスウィルスの増殖抑制剤を提供するものである。
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配
列を含むタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質をコードする核
酸。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の（Ａ）又は（Ｂ）の組換えタンパク質は単純ヘルペスウィルスの増殖を抑制する機能を有するため、単純ヘルペスウィルス感染の機構解明に有効である。また、単純ヘルペスウィルス感染症の治療薬の開発に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法は、次の（Ａ）または（Ｂ）
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこのアミノ酸
配列を含むタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質。
の組換えタンパク質（以下、「本発明組換え蛋白」という）で、ヒトチロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合する活性を有するタンパク質分子を細胞内に発現させるものである。
【００１８】
本発明組換えタンパクのうち、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質の例としては、ＨＳＢ−１（再公表特許  ＷＯ０１／０３２８６９；特許文献１）やヒトタンパク質ＣＩＮ８５（非特許文献６）があげられる。また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質の例としては、ラットタンパク質Ｒｕｋ（非特許文献７）やＳＥＴＡ (非特許文献８)があげられる。
【００１９】
本発明による単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法では、本発明組換えタンパク質を細胞内に発現させることが必要であるが、その方法の一例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配
列を含むタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリー
チロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質をコードする核
酸。
を細胞内に導入する方法が挙げられる。
【００２０】
この方法を実施するためには、本発明組換えタンパクをコードする核酸を適当なベクターに組み込み、これを細胞に導入する方法が挙げられる。また、本発明の組換えタンパクを多量に得るには、上記の本発明組換えタンパクをコードする核酸を組み込んだベクターで適当な宿主細胞を形質転換し、これを培養する方法が挙げられる。上記核酸の例としては、配列番号２で表される核酸およびこれを含む核酸並びにこれらの縮重した核酸が挙げられる。
【００２１】
本発明方法において使用する組換えベクター及び形質転換体の作製は、例えば、次の方法により行うことができる。
【００２２】
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターにＰＲＲやそれを含むタンパク質などの本発明組換えタンパクをコードするＤＮＡ（すなわち、（ａ）や（ｂ）で表される塩基）を連結、挿入することにより得ることができる。ＰＲＲなどの本発明組換えタンパクをコードするＤＮＡを連結、挿入するためのベクターは、このＤＮＡが宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が利用できる。
【００２３】
ベクターのうちプラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばクローンテク社、タカラバイオ社、アムシャムバイオサイエンス社等から提供されるものを用いてもよい。また、ファージＤＮＡとしては、例えばＭ１３ｍｐ１８、λｇｔ１１等が挙げられる。
【００２４】
ベクターに本発明組換えタンパクをコードするＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２５】
本発明のＰＲＲなどの本発明組換えタンパクをコードするＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで本発明のベクターには、プロモーター並びに本発明のＤＮＡの他、ターミネーター、リボソーム結合配列等を組み込んでもよい。なお、これらを具備した発現ベクターが多数市販されているので、これらの発現ベクターのマルチクローニングサイトに本発明のＤＮＡ断片を挿入することにより、本発明組換えタンパクを発現する組換えベクターを容易に作製することができる。
【００２６】
（２）形質転換細胞の作製
本発明の形質転換体は、上記した組換えベクターを、目的遺伝子（すなわち、組換えタンパクをコードするＤＮＡ）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで宿主としては本発明のＤＮＡを発現でき、単純ヘルペスウィルスが感染できるのであれば特に限定されるものではない。例えば、ＨｅＬａ細胞等の動物細胞等が挙げられる。細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００２７】
本発明による単純ヘルペスウィルスの増殖抑制活性は、例えば、次の方法で調べることができる。すなわち、下記実施例に具体的に記載するように、ＰＲＲなどの本発明組換えタンパクを発現する組換えベクターによって形質転換されたＨｅＬａ細胞は、ＰＲＲなどの本発明組換えタンパクを恒常的に過剰生産する。一方、単純ヘルペスウィルスは細胞に感染すると、感染細胞を変性させ、最終的に溶解させることが知られている。
【００２８】
そしてこの作用を用いて単純ヘルペスウィルスの増殖を測定する方法として、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ50）法とプラーク法が知られている。例えば、ＰＲＲを恒常的に過剰生産するＨｅＬａ細胞（以下、ＨｅＬａ／ＦＬＡＧ-ＰＲＲ細胞と略する）に単純ヘルペス１型ウィルスを感染させた場合、単純ヘルペス１型ウィルスの増殖は対照のＨｅＬａ細胞に感染させた場合の約３０分の１に抑制される。すなわち、ＰＲＲは単純ヘルペス１型ウィルスの増殖を抑制する。一方、ＰＲＲを含むタンパク質ＨＳＢ−１を過剰生産するＨｅＬａ細胞（以下、ＨｅＬａ／Ｖ５−ＨＳＢ−１細胞と略する）に単純ヘルペス１型または単純ヘルペス２型ウィルスを感染させ、形成されるプラークの数を測定すると、対照のＨｅＬａ細胞に感染させた場合の約５分の１から４分の１に減少する。すなわち、ＰＲＲを含むタンパク質も単純ヘルペスウィルスの増殖を抑制する。従って、これらの方法で、本発明組換えタンパクによる単純ヘルペスウィルスの増殖抑制が示される。
【００２９】
本発明の単純ヘルペスウィルスの増殖抑制方法の利用の一例としては、本発明組換えタンパクをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターの治療剤としての利用が挙げられる。この場合は、以下の（ａ）又は（ｂ）
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質または当該アミノ酸配
列を含むタンパク質をコードする核酸。
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるか、これを含み、Ｓｒｃファミリ
ーチロシンキナーゼＨｃｋのＳＨ３ドメインに結合するタンパク質をコードする
核酸。
を発現ベクターに組み込み、これを単純ヘルペスウィルスの増殖抑制剤として使用すればよく、非経口ないし経口で患部に投与すればよい。
【００３０】
発現ベクターを非経口で投与する方法の例としては、当該ベクターを含む液剤を、筋肉内注射する方法、皮下注射する方法や、遺伝子銃を使用する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実 施 例 １
発現ベクターの構築：
ＰＲＲを発現する組換えベクター（以下、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４−ＰＲＲと称する）を作製するため、ＰＲＲをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法により合成した。プライマーは下記のものをセンスプライマー、アンチセンスプライマーとして用い、ＰＣＲ反応はタカラバイオ社のＰＣＲキット（Pyrobest DNA Polymerase）キットを使用した。また、テンプレートＤＮＡには、ＨＳＢ−１をコードするｃＤＮＡを用いた（再公表特許 ＷＯ０１／０３２８６９）。
【００３３】
センスプライマー：  AAGAATTCCGAAAAGGAAGGGAATAGACCCAAGAAGCCA（配列番号３）
アンチセンスプライマー：  AAGGATCCTCAGTCCAGGATGCCAGATAGCGAACTGCCGGC（配列番                              号４）
【００３４】
ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の反応を１サイクルとし、このサイクルを３０回繰り返し反応した。次に得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｍａＩで切断したプラスミドｐＮＥＢ１９３にクローニングした。これをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、ＰＲＲｃＤＮＡフラグメントを得、発現ベクターｐＦＬＡＧ-ＣＭＶ４（シグマ社製）へ挿入してｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４−ＰＲＲを取得した。
【００３５】
一方、ＨＳＢ−１を発現する組換えベクター（以下、ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−ＨＳＢ−１と称する）は、ＨＳＢ−１をコードするｃＤＮＡ（再公表特許  ＷＯ０１／０３２８６９）を、発現ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２のマルチクローニングサイトを一部改変したベクター（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ４と称する）に挿入して取得した。
【００３６】
実 施 例  ２
ＨｅＬａ細胞のＰＲＲを発現する恒常的形質転換体の作製：
ＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ  ２２９）は、３７℃、５％炭酸ガス存在下に、１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）添加、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ培地と略す）で培養した。次いで、実施例１で作製したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４−ＰＲＲをエレクトロポレーション法でＨｅＬａ細胞に導入した。
【００３７】
これを抗生物質Ｇ４１８硫酸塩（シグマ社）（０.８ｍｇ／ｍｌ）を添加した培地で培養し、発育してきた耐性クローンからＰＲＲ（ＦＬＡＧで標識されている）を発現しているクローンを選抜した（ＨｅＬａ／ＦＬＡＧ−ＰＲＲ）。対照のＨｅＬａ細胞は、上記と同様な方法でベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４をＨｅＬａ細胞に導入して作製した（ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ−１と称する）。
【００３８】
実 施 例  ３
ＨｅＬａ細胞のＰＲＲを発現する恒常的形質転換体の作製：
実施例１で作製したｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−ＨＳＢ−１をエレクトロポレーション法でＨｅＬａ細胞に導入した。これを抗生物質ピューロマイシン（シグマ社）（０.３μｇ／ｍｌ）を添加した培地で培養し、発育してきた耐性クローンからＨＳＢ−１（Ｖ５で標識されている）を発現しているクローンを選抜した（ＨｅＬａ／Ｖ５−ＨＳＢ−１）。対照のＨｅＬａ細胞は、上記と同様な方法でベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ４をＨｅＬａ細胞に導入して作製した（ＨｅＬａ／ｃｏｎｔｒｏｌ−２と称する）。
【００３９】
実 施 例  ４
単純ヘルペスウィルス増殖の測定：
実施例２で作製したそれぞれの細胞を、２４穴マイクロプレートにまき、一晩培養してコンフルエントな単層培養細胞を調製した。培養液を取り除き、イーグルＭＥＭ培地で１回洗浄した後、単純ヘルペス１型ウィルスを接種した（２５ＴＣＩＤ50／０.１ｍｌ／ｗｅｌｌ）。
【００４０】
３７℃で１時間保温した後、ウィルス液を取り除き、２％のＦＢＳを添加したイーグルＭＥＭ培地を１ｍｌ／ｗｅｌｌ加えて３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。１日、２日、３日及び５日間培養後、各ＨｅＬａ細胞を３回凍結融解を繰り返し、ウィルス液を回収した。回収されたウィルス液中の単純ヘルペス１型ウィルスの量をＴＣＩＤ50法で測定した。図１に示したように、ＨｅＬａ／ＦＬＡＧ−ＰＲＲは単純ヘルペス１型ウィルスの増殖抑制効果を示した。
【００４１】
実 施 例  ５
ＴＣＩＤ50法による単純ヘルペス１型ウィルスの量の測定：
Ｖｅｒｏ細胞を９６穴マイクロプレートにまき、一晩培養してコンフルエントな単層培養細胞を調製した（５％のＦＢＳを添加したイーグルＭＥＭ培地を使用した）。一方、実施例４で回収した各ウィルス液の１０倍希釈系列を２％のＦＢＳを添加したイーグルＭＥＭ培地で調製した。９６穴マイクロプレートのＶｅｒｏ細胞培養液を取り除き、これに各ウィルス液の希釈液を０.１ｍｌずつ各ウェルに加えた。但し、１つの希釈液につき、５ウェルに加えた。
【００４２】
これらを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４日間培養した。その後、２％のホルマリンを含有する０.０２％クリスタルバイオレットの染色液で細胞を染色して、ウィルスによる細胞変性効果が見られるウェルを陽性、細胞変性効果が見られないウェルを陰性とし、５０％のウェルに細胞変性効果が認められる希釈率をReed-Muench法（Reed, J.L., ら、The American Journal of Hygiene, 27, 493-497 (1938)）によって求め、ＴＣＩＤ50を算出した。
【００４３】
実 施 例  ６
プラーク法による単純ヘルペスウィルス増殖抑制効果の測定：
実施例３で作製したそれぞれの細胞を、１２穴マイクロプレートにまき、一晩培養してコンフルエントな単層培養細胞を調製した。培養液を取り除き、イーグルＭＥＭ培地で１回洗浄した後、単純ヘルペス１型または２型ウィルスを接種した（４００ＴＣＩＤ50／０.２ｍｌ／ｗｅｌｌ）。
【００４４】
１時間、３７℃で保温した後、ウィルス液を取り除き、２％のＦＢＳ及び０.６％メチルセルロースを添加したイーグルＭＥＭ培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ加えて３７℃、５％炭酸ガス存在下で２日間（単純ヘルペス２型ウィルス感染の場合）または３日間（単純ヘルペス１型ウィルス感染の場合）培養した。
【００４５】
その後、培養液を取り除き、２％のホルマリンを含有する０.０２％クリスタルバイオレットの染色液で細胞を染色してプラーク数を計測した。結果を表１に示した。ＨｅＬａ／Ｖ５−ＨＳＢ−１細胞は明らかなプラーク数減少効果を示し、単純ヘルペスウィルス増殖抑制効果を示した。
【００４６】
【表１】
2005132740.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の（Ａ）又は（Ｂ）の組換えタンパク質は単純ヘルペスウィルスの増殖を抑制する機能を有するものである。
【００４８】
従って、これらの組換えタンパクを発現する、前記（ａ）および（ｂ）の塩基は、単純ヘルペスウィルス感染症の治療薬の開発に有効なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＰＲＲを発現させたＨｅＬａ細胞での単純ヘルペス１型ウィルスの増殖抑制結果を示すグラフである。図中、縦軸は２４穴マイクロプレート中の単純ヘルペス１型ウィルスの量（ＴＣＩＤ50／ｍｌ）、横軸は培養日数である。なお、ＰＲＲを発現させたＨｅＬａ細胞としては２つのクローン（ｃｌ1及びｃｌ２）の結果を示した。
【図１】
2005132740.tif 000004
【配列表】
2005132740000001.app