(57)【要約】【課題】    IRF-3 を直接的に活性化する物質を見出して IFN インデューサーとして提供すること及び該IFNインデューサーをコードする核酸を提供することである。【解決手段】  構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるRIG-I変異体及び構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるMDA-5変異体並びに、これらをコードする核酸を提供した。【効果】  本発明により、IRF-3 を直接的に活性化する物質を見出して IFN インデューサーとして機能するポリペプチド及びそれをコードする核酸が初めて提供された。本発明のポリペプチドを生体に投与することにより、生体内でのIFN産生が誘起されるので本発明のポリペプチドは、癌治療、ウイルス疾患治療あるいは自己免疫疾患の治療等に有用である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるRIG-I変異体。
【請求項２】
構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるMDA-5変異体。
【請求項３】
RNA ヘリケースに相同性のある領域に欠失あるいは変異を有することを特徴とする請求項１又は２記載の変異体。
【請求項４】
二重鎖 RNA との結合能が低下しているあるいは全くない請求項１ないし３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異体。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該配列を構成するアミノ酸のうち、１個ないし数個のアミノ酸が、置換し及び／若しくは欠失し、並びに／若しくは該アミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸が挿入され及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項１記載の変異体。
【請求項７】
配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項２記載の変異体。
【請求項８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該配列を構成するアミノ酸のうち、１個ないし数個のアミノ酸が、置換し及び／若しくは欠失し、並びに／若しくは該アミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸が挿入され及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項２記載の変異体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１０】
cDNA または RNA であることを特徴とする請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
（a）配列番号１に示す塩基配列若しくはその一部、（b）配列（a）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又は（c）配列（ａ）において１〜１０個の塩基が欠失、置換及び／若しくは付加された塩基配列であって、請求項１又は２に記載の変異体をコードする核酸。
【請求項１２】
配列番号１に示す塩基配列を有する請求項１１記載の核酸。
【請求項１３】
（a）配列番号３に示す塩基配列若しくはその一部、（b）配列（a）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又は（c）配列（ａ）において１〜１０個の塩基が欠失、置換及び／若しくは付加された塩基配列であって、請求項２に記載の変異体をコードする核酸。
【請求項１４】
配列番号３に示す塩基配列を有する請求項１３記載の核酸。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の発現を可能にするプロモーターと、転写終結シグナルとを含む発現カセット。
【請求項１６】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の核酸または請求項１５に記載のカセットを含むベクター。
【請求項１７】
プラスミド性ベクターであることを特徴とする請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
ウイルス性ベクターであることを特徴とする請求項１６に記載のベクター。
【請求項１９】
ウイルス性ベクターがアデノウイルス、レトロウイルス、AAV ウイルスまたはヘルペスウイルスに由来することを特徴とする請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
ゲノムが請求項９から１４のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１５に記載のカセットを含んでいる欠損組み換えレトロウイルス。
【請求項２１】
ゲノムが請求項９から１４のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１５に記載のカセットを含んでいる欠損組み換えアデノウイルス。
【請求項２２】
請求項９から１４に記載の核酸を少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１５に記載の発現カセットを少なくとも１つ含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１６から１９のいずれか１項に記載のベクターを少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１から８に記載の変異体を少なくとも１つを含む医薬組成物。
【請求項２６】
癌治療剤またはウイルス性疾患治療剤としての請求項２２から２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項９ないし１４のいずれか１項に記載の核酸又は請求項１６から１９のいずれか１項に記載のベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換した宿主細胞にインターフェロン群を生産させ、生産されたインターフェロン群を回収することを含む、インターフェロン群の生産方法。
【請求項２８】
細胞に被検物質を作用させ、該細胞中の、請求項１記載のRIG-I変異体若しくはそのmRNA又は請求項２記載のMDA-5変異体若しくはそのmRNAを定量することによるインターフェロンの治療効果を予測する方法。
【請求項２９】
請求項１記載のRIG-I変異体及び／又は請求項２記載のMDA-5変異体の活性化を指標としたインターフェロン誘導物質あるいは抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインターフェロン制御因子活性化ポリペプチド及びそれをコードする核酸並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（IFN） はサイトカインであり、１９５７年にインフルエンザウイルスの増殖を抑える生体内因子として発見された。その後の研究から様々な生理活性を有することが明らかにされてきている。発見当初、抗ウイルス効果の他、抗ガン作用を有すことが明らかになり、さらに動物実験において、その有効性が明らかになるにつれて、ウイルス性疾患やガンの治療に IFN を応用しようとする研究が盛んに行われるようになった。これにはIFN を生体外で生産して患者に投与する方法（外来方式）あるいは、患者の生体内でIFN を生産させる方法（内発方式）が考えられた。
【０００３】
内発方式については、各種IFN 誘発物質（インデューサー）の検討が行われたが、ヒトに投与できるインデューサーを見出すことが出来なかった。一方、外来方式に関しては、内発方式の検討結果の応用および、遺伝子工学の発展により、IFN を大量に安定して産生する方法を確立することができ、IFN を治療薬として利用することを可能とした。
【０００４】
現在IFNは、抗ウイルス薬、抗ガン薬あるいは免疫調節薬として用いられている。特に I 型 IFN に分類される  IFN-α および-β は抗ヒト C 型肝炎ウイルス薬あるいは、抗ガン薬として全世界で用いられている。
【０００５】
内発方式の検討の結果、細胞レベルの検討ではある程度の効率で IFNを産生出来る方法としては、ウイルスの感染、２重鎖RNA が見出された。一方、動物レベルでのインデューサーとして多くの物質の検討が行われたが、その機構については系があまりにも複雑であり、多くの間接作用が考えられ、統一的に理解することが出来ず、現在、臨床的に用いられているインデューサーはない。しかし、上記に述べた理由から、インデューサーの臨床応用は極めて有用と考えられる。
【０００６】
ウイルス感染時におけるIFN の産生機構について図１に記した。現在までの検討により、ウイルス感染によりIFN が産生される、一次的産生活性化と産生された IFN が細胞をオートクライン的に刺激して、爆発的にIFN の産生を亢進する二次的産生活性化に分けて考えることができる（非特許文献１）。しかし、IFN 単独の刺激では IFN 産生を活性することが出来ない。これは、IFN 刺激の他、ウイルスの刺激による何らかの細胞の情報伝達系の活性化が必要であることを示している。したがって、この一次的産生活性化機構を明らかにすることがインデューサーの開発を可能にすると考えられる。
【０００７】
IFN の産生機構の解析から、IFN の産生に重要な細胞情報伝達因子として、IRF-1、2、3、4、7、ICSBP (IRF-8)および、ISGF3g (IRF-9) が見出された（非特許文献１）（IRFは、インターフェロン制御因子(Interferon Regulatory Factor)。我々はこれらの因子のなかで、特に二次的産生活性化機構に最も重要な因子としてIRF-3 を同定した。しかしながら、IRF-3 を過剰発現させてもIFN の産生を亢進させることが出来なかった。すなわち、 IRF-3 の量的増加ではなく、IFN 産生亢進には IFR-3の活性化が必要であることを明らかにした（非特許文献２）。
【０００８】
したがって、IFN を効率的に産生させるインデューサーとして、IRF-3 を直接活性させる物質が考えられた。この方法は産生機構がシンプルであり、臨床応用が可能であると考えられる。
【０００９】
局所的に内在性のIRF-3を人為的に活性化することができれば、IFNの全身大量投与は幾つかの副作用を伴うことが知られていることから、投与量を減らし、持続的にIFNの産生／作用を誘導することができる。また、IRF-3はIFN遺伝子の活性化をする以外にIFNによって誘導される遺伝子群を直接、且つ強力に活性化することが知られており、この直接的な効果も期待される。
【００１０】
【非特許文献１】Takaoka, A et al, Cancer Sci., (2003) 94(5) p.405-411
【非特許文献２】Yoneyama, M et al, EMBO J., (1998) 17(4) p.1087-1095
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、IRF-3 を直接的に活性化する物質を見出して IFN インデューサーとして提供することである。活性化物質としては、本来細胞内で機能しているシグナル分子、あるいはその変異体、またはそのシグナル分子を活性化しうる天然、あるいは人工化合物である。さらに、本発明の目的は、該IFNインデューサーをコードする核酸を提供することである。さらに、本発明の目的は、それらの医薬用途、それらを用いたインターフェロンの生産方法、それらを指標とするインターフェロンの治療効果を予測する方法、及びそれらを指標としたインターフェロン誘導物質あるいは抗癌剤のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、レチノイン酸誘導遺伝子-I (Retinoic acid-inducible gene-I、RIG-I）によりコードされるポリペプチド(ポリペプチドもRIG-Iと言う）及びメラノーマ分化抗原-5(Melanoma Differentiation Antigen-5、MDA-5)のそれぞれのＣ末端側の領域が欠失した変異体が構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできる、上記IFNインデューサーとして機能することを見出し、それを実験的に確認し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)  構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるRIG-I変異体。
(2)  構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるMDA-5変異体。
(3)   RNA ヘリケースに相同性のある領域に欠失あるいは変異を有することを特徴とする(1)又は(2)の変異体。
(4)  二重鎖 RNA との結合能が低下しているあるいは全くない(1)ないし(3)のいずれかに記載の変異体。
(5)  配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する(1)記載の変異体。
(6)  配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該配列を構成するアミノ酸のうち、１個ないし数個のアミノ酸が、置換し及び／若しくは欠失し、並びに／若しくは該アミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸が挿入され及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有する(1)記載の変異体。
(7)  配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する(2)記載の変異体。
(8)  配列番号４に示されるアミノ酸配列又は該配列を構成するアミノ酸のうち、１個ないし数個のアミノ酸が、置換し及び／若しくは欠失し、並びに／若しくは該アミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸が挿入され及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を有する(2)記載の変異体。
(9)  請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
(10)  cDNA または RNA であることを特徴とする(9)に記載の核酸。
(11)（a）配列番号１に示す塩基配列若しくはその一部、（b）配列（a）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又は（c）配列（ａ）において１〜１０個の塩基が欠失、置換及び／若しくは付加された塩基配列であって、(1)に記載の変異体をコードする核酸。
(12)  配列番号１に示す塩基配列を有する(11)記載の核酸。
(13)（a）配列番号３に示す塩基配列若しくはその一部、（b）配列（a）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、又は（c）配列（ａ）において１〜１０個の塩基が欠失、置換及び／若しくは付加された塩基配列であって、(2)に記載の変異体をコードする核酸。
(14)  配列番号３に示す塩基配列を有する(13)記載の核酸。
(15)  (9)から(14)のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の発現を可能にするプロモーターと、転写終結シグナルとを含む発現カセット。
(16)  (9)から(14)のいずれかに記載の核酸または(15)に記載のカセットを含むベクター。
(17)  プラスミド性ベクターであることを特徴とする(16)に記載のベクター。
(18)  ウイルス性ベクターであることを特徴とする(16)に記載のベクター。
(19)  ウイルス性ベクターがアデノウイルス、レトロウイルス、AAV ウイルスまたはヘルペスウイルスに由来することを特徴とする(18)に記載のベクター。
(20)  ゲノムが(9)から(14)のいずれかに記載の核酸又は(15)に記載のカセットを含んでいる欠損組み換えレトロウイルス。
(21)  ゲノムが(9)から(14)のいずれかに記載の核酸又は(15)に記載のカセットを含んでいる欠損組み換えアデノウイルス。
(22)  (9)から(14)に記載の核酸を少なくとも１つを含む医薬組成物。
(23)  (15)に記載の発現カセットを少なくとも１つ含む医薬組成物。
(24)  (16)から(19)のいずれか１項に記載のベクターを少なくとも１つを含む医薬組成物。
(25)  (1)から(8)に記載の変異体を少なくとも１つを含む医薬組成物。
(26)  癌治療剤またはウイルス性疾患治療剤としての(22)から(25)のいずれかに記載の医薬組成物。
(27)  (9)ないし(14)のいずれか１項に記載の核酸又は(16)から(19)のいずれかに記載のベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換した宿主細胞にインターフェロン群を生産させ、生産されたインターフェロン群を回収することを含む、インターフェロン群の生産方法。
(28)  細胞に被検物質を作用させ、該細胞中の、(1)記載のRIG-I変異体若しくはそのmRNA又は(2)記載のMDA-5変異体若しくはそのmRNAを定量することによるインターフェロンの治療効果を予測する方法。
(29)  (1)記載のRIG-I変異体及び／又は請求項２記載のMDA-5変異体の活性化を指標としたインターフェロン誘導物質あるいは抗癌剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、IRF-3 を直接的に活性化する物質を見出して IFN インデューサーとして機能するポリペプチド及びそれをコードする核酸が初めて提供された。本発明のポリペプチドを生体に投与することにより、生体内でのIFN産生が誘起されるので本発明のポリペプチドは、癌治療、ウイルス疾患治療あるいは自己免疫疾患の治療等に有用である。また、本発明の核酸を含むベクターを生体に投与することにより、本発明のポリペプチドを生体内で内発的に生産させることができ、やはり癌治療、ウイルス疾患治療あるいは自己免疫疾患の治療等に有用である。また、本発明のポリペプチドをin vitroでIFN生産細胞に投与し、または、本発明の核酸を含むベクターで該細胞を形質転換することにより、該細胞によるIFN生産を高めることができる。さらに、本発明のポリペプチド又はそれをコードするmRNAの量を指標として、インターフェロンの治療効果を予測したりインターフェロン誘導物質あるいは抗癌剤のスクリーニングが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．  本発明に関わるRIG-I 及びMDA5 変異体
Retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I)はレチノイン酸によって誘導されるタンパク質として、Melanoma Differentiation Antigen-5 (MDA-5)はメラノーマの分化時に発現する遺伝子として同定された。共にタンパク質のN-末端側にcaspase recruitment domain (CARD) 及び、その後ろに helicase domain を持つ特徴的なタンパク質である。これらのタンパク質のうち、helicase domain を欠失させることにより、構成的に IFN の産生を亢進させることが可能であることを本発明で明らかにした。このことから、Helicase domain を変異あるいは欠失させることによりhelicase 機能を欠失あるいは低下させたRIG-I 及びMDA-5 変異体が、構成的に IFN の産生を亢進させる機能を有することが考えられる。従ってhelicase 機能を欠失あるいは低下させたRIG-I 及びMDA-5 変異体及びそれらの変異体をコードする核酸が本発明に含まれる。
【００１６】
RIG-I変異体ポリペプチドの好ましい例として、配列番号２に示す２２９アミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。このペプチドは、天然のRIG-IのＮ末端から１〜２２９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、一般に、生理活性を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち、少数のものが置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸が挿入された変異体（以下、上記天然の変異体を構成するアミノ酸が置換し及び／若しくは欠失し、並びに／又は少数のアミノ酸が挿入されたものを「修飾体」という）であっても、その生理活性を維持する場合があることは広く知られている。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するRIG-I変異体の修飾体であって、構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるものは本発明の範囲に含まれる。このような修飾体は、配列番号２で示すアミノ酸配列と、８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものが好ましく、特に、置換、欠失及び／又は挿入されるアミノ酸の数が１個ないし数個のものが好ましい。また、アミノ酸配列の同一性は、この分野で汎用されているソフトウェアであるBLASTを用いて容易に行うことができる。BLASTは、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のホームページで誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に同一性を調べることができる。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けできる。少数のアミノ酸が置換された修飾体を得る場合、これらの各グループ内での置換であれば、ポリペプチドの生理活性が変化しないことが多い。また、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドや該ポリペプチドの上記修飾体を含む融合タンパク質は、通常、これらのポリペプチドの生理活性を維持しているので、このような融合タンパク質を用いることもできる。
【００１７】
MDA-5変異体ポリペプチドの好ましい例として、配列番号４に示す２９４アミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。このペプチドは、天然のMDA-5のＮ末端から１〜２９４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、一般に、生理活性を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち、少数のものが置換し若しくは欠失し、又は少数のアミノ酸が挿入された修飾体であっても、その生理活性を維持する場合があることは広く知られている。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するMDA-5変異体の修飾体であって、構成的にIRF 群を活性化することにより、インターフェロンの産生を亢進させることのできるものは本発明の範囲に含まれる。このような修飾体は、配列番号４で示すアミノ酸配列と、８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものが好ましく、特に、置換、欠失及び／又は挿入されるアミノ酸の数が１個ないし数個のものが好ましい。また、アミノ酸配列の同一性は、この分野で汎用されているソフトウェアであるBLASTを用いて容易に行うことができる。BLASTは、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のホームページで誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に同一性を調べることができる。なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けできる。少数のアミノ酸が置換された修飾体を得る場合、これらの各グループ内での置換であれば、ポリペプチドの生理活性が変化しないことが多い。また、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドや該ポリペプチドの上記変異体や修飾体を含む融合タンパク質は、通常、これらのポリペプチドの生理活性を維持しているので、このような融合タンパク質を用いることもできる。
【００１８】
また、上記したRIG-1変異体又はMDA-5変異体や、上記したそれらのさらなる修飾体をコードする核酸も本発明の範囲に含まれる。配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するRIG-1変異体をコードする核酸の塩基配列の１例が配列番号１に示されている。配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するMDA-5変異体をコードする核酸の塩基配列の１例が配列番号１に示されている。これらの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、上記変異体又は修飾体をコードするものも本発明の核酸に含まれる。個々で、ストリンジェント条件は、5 x Denhardt's reagent, 6 x SSC,0.5% SDS又は0.1% SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう条件である。また、配列番号１又は３の塩基配列中、１〜１０個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列であって、上記変異体又は修飾体をコードする核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
２．本発明に関わるRIG-I 及びMDA-5 変異体核酸の発現法
１．記載の核酸はIFN のインデューサーとして使用し得る。ウイルス感染症治療、癌治療薬あるいは、自己免疫疾患治療薬と使用し得る。そのために本発明は、１．記載の核酸と、その発現を可能にするプロモーターと転写終結シグナルとを含む任意の発現カセットにも関する。前記プロモーターは哺乳動物、好ましくはヒトの細胞内で機能するプロモーターの中から選択する。従って、プロモーターは、遺伝子の転写を特異的又は非特異的に、誘導的又は非誘導的に、強く又は弱く刺激又は抑制する任意のプロモーター又は誘導配列であり得る。具体例としては特に、真核生物由来又はウイルスのプロモーター配列が挙げられる。これは例えば、標的細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であっても良い。真核生物プロモーターとしては、特に、構成的遺伝子を発現させるプロモーター（HPRT、PGK、アクチン、チューブリン遺伝子、EF-1遺伝子等のプロモーター）、中間フィラメントのプロモーター(GFAP、デスミン、ビメンチン、ニューロフィラメント、ケラチン遺伝子等のプロモーター)、治療遺伝子プロモーター（例えば、MDR、CFTR、第VIII 因子、アポAI遺伝子等のプロモーター）、組織特異的（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪酸結合腸タンパク質、平滑筋α―アクチン遺伝子等のプロモーター）、又は刺激に応答するプロモーター（ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体遺伝子等のプロモーター）を使用しうる。プロモーターはまた、ウイルスゲノムに由来するプロモーター配列、例えば、アデノウイルスの EIA 及びMLP遺伝子のプロモーター、CMV の初期プロモーター又は、RSV、LTR等のプロモーターであっても良い。さらに、これらのプロモーター部分は、活性化配列、調節配列、又は組織特異的発現もしくは組織優性発現を可能にする配列の付加により改変しうる。
【００２０】
なお、哺乳動物や哺乳動物細胞に外来遺伝子を導入するためのベクターはこの分野において周知であり、また種々のものが市販されている。本発明においては、これらの市販のベクターのクローニングサイトに本発明の核酸を挿入して本発明のベクターを得ることができる。
【００２１】
３．本発明に関わるRIG-I 及びMDA-5 変異体核酸の治療薬としての利用方法
IFN の治療効果のある疾患に対しての治療薬として利用することができる。例えば、ウイルス感染症治療、癌治療薬あるいは、自己免疫疾患治療薬と使用し得る。本発明の特に好ましい実施形態では、核酸又はカセットをベクター内に導入する。使用するベクターは、化学的なもの（リポソーム、ナノパーティクル、ペプチド複合体、脂質又はカチオンポリマー等）、ウイルス由来のもの（レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、AAV等）、又はプラスミド由来のものであり得る。ウイルス性ベクターの使用は、ウイルスの天然のトランスフェクション特性を基本とする。従って、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスおよび、アデノ随伴ウイルスを要することが可能である。本発明のベクターは、真核細胞内への核酸導入及びその内部での発現を促進することのできる非ウイルス性物質であっても良い。化学的又は生化学的な合成又は天然ベクターは、特に利便性、安全性の理由で、またトランスフェクションすべき DNA の大きさに関する理論的な制限がないという理由で、有用な天然ウイルス代替物である。
【００２２】
本発明で使用する核酸またはベクターは、局所投与、非経口投与、鼻内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、経皮投与等に適用するように処方しうる。核酸はまたはベクターは注射可能形態で使用する。従って、特に治療すべき部位に直接注射する場合には、注射液を形成するために医薬的に許容しうる任意のビヒクルと混合しうる。これは特に、無菌溶液、等張溶液、または場合に応じて無菌水もしくは生理学的食塩水の添加により注射可能溶液の形成が可能な乾燥組成物であり得る。本発明は少なくとも前述核酸あるいはベクターを一つ含む総ての医薬品に関するものである。
【００２３】
投与量は、投与の目的、症状等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、ポリペプチドを投与する場合、通常、成人１日当たり、有効成分の量として、経口投与の場合には0.1μｇ〜１００mg程度、非経口投与の場合には0.01μｇ〜１０mg程度である。また、固形癌組織等に注入する場合には、通常、組織100 g当たり0.1 ｍｇ〜１０ｍｇ程度である。また、本発明のベクターを投与して内発的にIFNの生産を誘導させる場合の投与量は、通常、筋肉内、腹腔内、静脈内投与等では動物の体重１ｋｇ当たり通常、0.1mgから10mg程度であり、遺伝子銃を用いた皮内投与では、動物の体重１ｋｇ当たり通常、0.01mg〜1mg程度である。
【００２４】
４．本発明に関わるRIG-I 及びMDA-5 変異体核酸によるIFN 産生の工業的利用方法
本発明はIFN の産生を誘導する方法であり、細胞に本発明で使用する核酸またはベクターを前述した方法を用いて導入することにより、大量に IFN を産生する細胞株を樹立することが可能である。細胞は株化した細胞であれば、種類を問わない。例えば、タンパク質性医薬品を生産するのに用いられている、 COS細胞、CHO細胞、線維芽細胞などが挙げられるがこれらの細胞に限定するものではない。
【００２５】
５．本発明に関わる  RIG-I 及びMDA-5変異体の定量によるIFN 治療効果の予測
本発明中、IFN-β の細胞感受性とRIG-I変異体 及びMDA-5変異体の発現量に相関関係が有ることを見出した。すなわち、IFN-βの作用が現れやすい細胞ほどRIG-I 及びMDA-5変異体の発現量が高いということである。このことは、IFN 治療効果と毒性の予測をするに重要な知見である。つまり、病巣部位でのRIG-I 及びMDA-5変異体の発現量と非病巣部位でのRIG-I 及びMDA-5変異体の発現量を検出することにより、治療効果と毒性のモニタリングをすることにより、不必要な毒性の発現を防止することが可能である。発現量の測定は、各変異体のmRNA量を測定する方法や、各変異体に特異的な抗体を用いた免疫測定等の常法により行うことができる。なお、Ｃ末端側が欠失していないRIG-IやMDA-5は、IRFの活性化作用を有していないので、mRNA量を指標にする場合には、完全なRIG-IやMDA-5をコードするmRNAの量を差し引くこと等により、RIG-I変異体やMDA-5変異体のmRNAのみを定量する。同様に、RIG-I変異体やMDA-5変異体と反応する抗体を用いる場合には、これらの変異体のＣ末端領域をエピトープとするモノクローナル抗体を用いることにより、完全なRIG-IやMDA-5と区別してRIG-I変異体やMDA-5変異体を測定することができる。
【００２６】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するものであり、発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２７】
IRF-3 の活性化因子の同定 
ヒト癌細胞株K562細胞は内在性のαおよびβ型などのＩ型IFN遺伝子を欠失していることが知られている。我々は、この細胞がニューカッスル病ウイルス（NDV）に感染しても、I型IFNの発現誘導に必須な転写因子であるIRF-3の活性化が見られないことを見出した。ところが、この細胞をIFNで前処理の後、NDV感染を行うとIRF-3の活性化が観察された。従ってIFN処理によって新たに誘導される遺伝子によってコードされるタンパク質がウイルスによるIRF-3の活性化に必須であると考えられた。この未知の遺伝子の探索を目的として発現クローニングを行った。
【００２８】
１．RIG-I 変異体の同定
1000単位／mlのIFN-β（東レ株式会社）でK562細胞を10時間処理し、ISOGEN （ニッポンジーン）を用いて total RNA を抽出後、Oligotex-dT30 mRNA Purification kit (TAKARA)を用いてmRNAを調製した。得られた mRMA をSMART cDNA Library Construction kit (クローンテック) 用いてcDNAを合成し、哺乳類動物細胞発現ベクターpEFBOSDoriに挿入して発現cDNAライブラリーを作成した。ライブラリーは大腸菌宿主にトランスフォームし、クローンを得た。20クローンをひとまとめとして培養後、プラスミドDNAを抽出した。このようなプールを4992培養した（理論的な全クローン数：4992 x 20 = 99,840）。IRF-3の活性化因子の同定はマウスL929細胞に各々のプールからのDNAと２種類のレポーター遺伝子を同時にリポフェクトアミン（インビトロジェン）を用いてトランスフェクトして行った。レポーターは、プロモーター配列の上流にIRFの結合配列の８回繰り返しを有するホタルルシフェラーゼ遺伝子（p-55C1BLuc）、およびヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターを有するウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ptkRL）である。前者はIRF-3を含むIRFファミリーによる遺伝子活性化の評価、後者はDNAトランスフェクションの効率の補正を目的としている。トランスフェクション後、24時間で細胞にpolyI:CをDEAE dextran法及び50マイクロM Tiloroneによって刺激後、６時間で各々のルシフェラーゼ活性を Dual-Luciferase Assay System（プロメガ）を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正後、活性の高かったプールについて複数回アッセイを繰り返し、再現性のあるプールについて、DNAから遡って各クローンを得、そのDNAを調整し、一次スクリーニングと同様にアッセイを繰り返した。再び活性の高かったクローンの再現性を確認した後、cDNAインサートの塩基配列を決定した。複数の得られたクローンのうち一つ、B-H12はルシフェラーゼ活性が最も高く、塩基配列決定の結果、Retinoic Acid Inducible Gene-I (RIG-I)のN末端側の部分をコードしていることが判明した。このクローンでは翻訳開始のATGから284番目のアミノ酸までがコードされており、その後にベクター由来の22アミノ酸が付加されていた。詳しい解析の結果、ベクター由来のアミノ酸配列は活性に無関係であり、少なくとも開始コドンから229番目までの部分（RIG-I 1-229）があれば上記の活性化が起こることが判明した。次いで全長のRIG-IにRIG-I 1-229と同様の 活性があるかどうかを確認するため、ヒト293細胞にRIG-I 1-229および全長のRIG-I （RIG-I FL）を一過的に発現させた。RIG-I の全長は PCR 法を用いてクローニングした。上記で使用した cDNA を鋳型として配列番号５  （5'-aat tca tgt cca cct tag taa at-3'）、配列番号６  （5'-ctc att ccc tgt agc tga ag-3'）及び、配列番号７  （5'-cga ttt act aag gtg gac atg-3'）をプライマーとして、全長RIG-Iは配列番号５及び６の組合せで、RIG-I1-229は配列番号５及び７の組合せでEx-Taq （TAKAR）を用いてPCR を行い、RIG-I 全長及びRIG-I1-229をコードする cDNA を得た。この cDNA をpEFBOSDoriに挿入し、発現ベクターpEFBOS-RIG-I 及びpEFBOS-RIG-I1-229を構築した。ヒト293細胞にpEFBOS-RIG-I 及びpEFBOS-RIG-I1-229 を導入して、RIG-I及び、RIG-I 1-229を発現させた培養液上清中のIFN-βの濃度を ELISA 法（東レ株式会社）で測定した。その結果、RIG-I1-229を発現させた培養上清中でのみでIFN-βの産生亢進が確認された（図２）。��って、RIG-I 1-229は構成的に IRF-3 を活性化させて、 IFN の産生を亢進させることのできるインデューサーであることが示された。
【００２９】
2．MDA-5 変異体の同定
ヒトゲノムデータベースを検索したところ、RIG-I 遺伝子との相同性の比較的高い遺伝子としてMDA-5を見出した。MDA-5はRIG-1 同様ヘリカーゼモチーフのN末端側にRIG-I に相同性のある約200アミノ酸からなる部分を有していることが明らかとなった。そこで、実際にMDA-5及び、MDA-5のN末端側(MDA-5-294)を発現させて確認した。MDA-5及び、MDA-5 -294はRT- PCR 法を用いてクローニングした。上記で使用した cDNA を鋳型として配列番号８  （5'-cct cta gaa gaa aga tgt cga atg ggt-3'）、配列番号９  （5'-tct tca atc aag tgc taa tc-3'）及び、配列番号１０  （5'-cca tcg att cac tct tca tct gaa tca ctt c-3'）をプライマーとして全長 MDA-5 は配列番号８及び９の組み合わせで、MDA-5 -294は配列番号８及び１０の組み合わせで）Ex-Taq （TAKARA）を用いてPCR を行い、MDA-5及び、MDA-5 -294  cDNA を得た。この cDNA をpEFBOSDoriに挿入して発現ベクターpEFBOS- MDA-5及びpEFBOS- MDA-5 -294を構築した。ヒト293細胞にpEFBOS- MDA-5及びpEFBOS- MDA-5 -294 を導入して、MDA-5及び、MDA-5 -294を発現させた培養液上清中のIFN-βの濃度を ELISA 法（東レ株式会社）で測定した。その結果、MDA-5-294を発現させた培養上清中でのみでIFN-βの産生亢進が確認された（図３）。
【００３０】
従って、MDA-5 -294はRIG-I 1-229と同様に構成的に IRF-3 を活性化させて、IFN の産生を亢進させることのできるインデューサーであることが示された。
【実施例２】
【００３１】
RIG-I 及びMDA5 変異体 による抗ウイルス作用
HeLa細胞に、pEFBOS-RIG-I1-229あるいはpEFBOS- MDA-5 -294を導入し、RIG-I1-229あるいはMDA-5 -294を細胞内に発現させた。これにNDVを感染させ、細胞のウイルス感染による細胞障害の影響について評価した。その結果、RIG-I1-229あるいはMDA-5 -294を細胞内に発現させた細胞では、細胞障害が認められず、NDVに対しウイルス抵抗性を示した。即ち、RIG-I1-229あるいはMDA-5 -294は抗ウイルス作用を示すことが示された。
【実施例３】
【００３２】
RIG-I 及びMDA5 変異体 による細胞増殖抑制作用
293細胞にpEFBOS、pEFBOS-RIG-I、 pEFBOS-RIG-I1-229 、pEFBOS- MDA-5あるいはpEFBOS- MDA-5 -294を導入しRIG-I 、RIG-I1-229、MDA-5あるいはMDA-5 -294を細胞内に発現させた。遺伝子導入３日後の細胞の増殖をMTS（プロメガ）を用いて評価したところ、RIG-I1-229あるいはMDA-5 -294を細胞内に発現した細胞の増殖は、対照群（pEFBOS導入）に比較し、有意に抑制されていた。一方、RIG-Iあるいは、MDA-5を導入しても、細胞増殖は抑制されなかった。この結果から、RIG-I1-229及びMDA-5 -294はには、細胞増殖抑制作用があることが明らかになった。
【実施例４】
【００３３】
RIG-I 及びMDA5 変異体の重合化による IFN-β の産生亢進
HeLa細胞にFKBP（FK結合蛋白質）を３回繰返したコンストラクトあるいはそれにRIG-I1-229を融合させたコンストラクトをトランスフェクトして、安定に発現するクローンを得た。その細胞にFKBPを２量体化する薬剤AP20187を10 nM, 17hr処理してIRF-3の活性化をNative PAGE/Western blottingで検討した。その結果、FKBPとRIG-I1-229の融合体を多量体化した時に強いIRF-3の活性化が起きることが判明した。この時には細胞上清中にIFN-β活性が確認された（図４）。加えて、この細胞を２日間さらに培養すると、IRF-3の活性化が見られた細胞のみ、細胞増殖が阻害さた。従ってRIG-I変異体を人為的に活性化することにより細胞増殖抑制が誘導されることが判明した。以上の結果、ウイルスや二重鎖RNAを全く必要とせずにRIG-I 及びMDA5 変異体の重合化させることによりIRF-3が活性化されIFN-βが誘導されることが示された。また、RIG-Iを活性化する薬剤をスクリーニングする事により、新たなIFNインディユーサー、抗癌剤のスクリーニングを行うことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ウイルス感染時のIFN産生機構を説明する図である。
【図２】RIG-I及び本発明のRIG-I変異体によるIFN-βの生産量を比較して示す図である。
【図３】MDA-5及び本発明のMDA-5変異体によるIFN-βの生産量を比較して示す図である。
【図４】RIG-I変異体の重合化によるIRF-3の活性化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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