(57)【要約】【課題】  従来のＨＣＶ抗体測定法は、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体をも検出するため、供血者検体検査において、二次感染のおそれのないＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者の血液も廃棄されることとなり、供血の有効利用の観点からより効率的なＨＣＶ抗体測定法が求められている。【解決手段】  ＨＣＶコア抗原ポリペプチドを用いるＨＣＶ抗体測定法において、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドまたはその部分断片を反応液に並存させることにより、ＨＣＶコア抗原ポリペプチドに対するＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体の結合を阻害する一方で、ＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者のＨＣＶ抗体の結合を維持し得る。本発明は、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者由来のサンプルを効率的に排除し得る上記ポリペプチドおよび該ペプチドを用いた特異性の改良されたＨＣＶ抗体測定法を提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列またはその部分配列から成るペプチド。
【請求項２】
６個以上のアミノ酸から成る請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
８個以上のアミノ酸から成る請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号３、４、６、１６から１９および２５から３０のいずれかのアミノ酸配列から成る請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列から成る核酸。
【請求項６】
サンプルをＨＣＶコア抗原ポリペプチドと接触させるＨＣＶ抗体を免疫学的に検出する方法であって、ＨＣＶコア抗原ポリペプチドとサンプルとの反応液が請求項１から４のいずれかに記載のペプチドを含むことを特徴とするＨＣＶ抗体の検出方法。
【請求項７】
前記ＨＣＶコア抗原ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から成り抗ＨＣＶコア抗原ポリペプチド抗体と結合し得るポリペプチドまたはこれらポリペプチドを含む融合タンパク質である請求項６に記載のＨＣＶ抗体の検出方法。
【請求項８】
ＨＣＶコア抗原ポリペプチドがリコンビナント抗原である、請求項６に記載のＨＣＶ抗体の測定方法。
【請求項９】
ＨＣＶコア抗原ポリペプチドが大腸菌により発現させたＨＣ−３４リコンビナント抗原である、請求項８に記載のＨＣＶ抗体の測定方法。
【請求項１０】
凝集法の原理により免疫学的にＨＣＶ抗体を検出する、請求項５から９のいずれかに記載のＨＣＶ抗体の測定方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のペプチドおよびＨＣＶコア抗原ポリペプチドを含む、ＨＣＶ抗体の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的にＨＣＶ抗体を検出する測定方法において、反応液に添加することによりＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体に対する検出能のみを低減し、ＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者のＨＣＶ抗体に対する検出能を維持することができるポリペプチドを提供するものである。また、本発明は該ポリペプチドを用いたＨＣＶ抗体の測定方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、血液等の体液を介してヒトに感染し、肝炎を発症する。本邦におけるＨＣＶ感染者数は推定２００万人とも言われ、ＨＣＶ感染症は国民病として認知され、その克服が国家的重要課題の一つとなっている。既にＨＣＶ感染症の診断のために、血液等の試料中のＨＣＶ抗体、ＨＣＶ抗原又はＨＣＶ  ＲＮＡ等の検査法が開発されたが、より正確で効率的な診断のため、測定法（測定試薬）の改良は今なお重要な課題である。
【０００３】
ＨＣＶ抗体測定法としては、１９８８年に第１世代ＨＣＶ抗体測定法（ＮＳ４領域のＣ１００−３抗原を使用）が報告され（特許文献１および２参照）、続いて感度・特異性の改良された第２世代ＨＣＶ抗体測定法（コア領域の抗原、ＮＳ３領域の抗原、及びＮＳ４領域の抗原を使用）が開発され（特許文献３および４参照）、ＨＣＶ感染症の診断に大いに貢献した。その後、ＮＳ５領域の抗原を使用する第３世代ＨＣＶ抗体測定法も開発されたが性能は第２世代測定法と同等であり、現在では第２世代、及び第３世代の両検査試薬が広く使用されている。本邦でのＨＣＶ抗体検査試薬の販売数は年間約３，０００万テストと言われ、感染症検査分野において一大市場を成している。
【０００４】
現在、ＨＣＶ感染が疑われる患者の初期診断、またはＨＣＶ感染に関する集団健康診断や供血者検体検査における初期検査法としては、一般的に定性的なＨＣＶ抗体検査が行われている。しかしながら、従来のＨＣＶ抗体測定法においては、抗体陽性と判定されながらもＨＣＶ  ＲＮＡが検出されない場合があり（非特許文献１および２参照）、これらは測定系の非特異的な反応又は交差反応による偽陽性の可能性もあるが、ほとんどの場合はＨＣＶ感染状態より治癒した後もＨＣＶ抗体が血中に存続する既往感染を示していると考えられている。ＨＣＶ既往感染者と持続感染者（キャリア）の判別のために、定性的なＨＣＶ抗体検査に追加して、定量的なＨＣＶ抗体検査、ＨＣＶ抗原検査、又はＨＣＶ  ＲＮＡ検査等が行われている（非特許文献２および３参照）。
【特許文献１】欧州特許出願公開第３１８２１６号公報
【特許文献２】欧州特許出願公開第３８８２３２号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第４５０９３１号公報
【特許文献４】欧州特許出願公報第４７２２０７号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ．ａｌ；“Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ”１９９３、６５、ｐ．１９９−２０３
【非特許文献２】吉澤浩司：「臨床医」２００２年、２８巻、第１号、ｐ．７−１１
【非特許文献３】吉澤浩司、飯野四郎：「ウイルス肝炎  診断・予防・治療の手引き」１９９８年  文光堂
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のＨＣＶ抗体測定法がＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体をも検出することは、特に供血者検体検査の分野において深刻な問題となっている。即ち、ＨＣＶ抗体陽性と判定される被検者におけるＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者の割合は、集団健康診断においては２０〜３０％程度であるが（非特許文献３参照）、供血者検査では現在では５％未満とそのほとんどがＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者で占められている。ＨＣＶ抗体陽性と判定された血液はＨＣＶ  ＲＮＡの有無に関わらず廃棄されるため、供血の有効利用の観点から、より効率的なＨＣＶ抗体測定法、即ちより選択的にＨＣＶキャリアを検出するＨＣＶ抗体測定法が熱望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本願発明者は、従来のＨＣＶ抗体測定法と比較して、より選択的にＨＣＶキャリアのＨＣＶ抗体を検出するＨＣＶ抗体測定法を開発するため鋭意研究した。即ち、ＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者の検体中のＨＣＶ抗体に対する検出能を維持しつつ、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者の検体中のＨＣＶ抗体に対する検出能を低減させることにより、従来法と比較してＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者のＨＣＶ抗体をより選択的に検出する測定法を鋭意研究した。その結果、ＨＣＶコア抗原ポリペプチドを用いるＨＣＶ抗体測定法において、当該ポリペプチドのアミノ酸配列中の特定領域に由来するペプチドを反応液に添加することにより、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体に対する検出能のみが低減され、ＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者のＨＣＶ抗体に対する検出能は維持されることを見出した。本知見に基づき、新規なＨＣＶ抗体測定法、即ちＨＣＶ  ＲＮＡの有無に対する特異性の改良されたＨＣＶ抗体測定法を発明した。
【０００７】
（発明の構成）
本発明は、以下に示すアミノ酸配列１（ａａ１〜ａａ１２０）を有する、ＨＣＶ感染症の診断に有用なＨＣＶコア抗原ポリペプチドを用いてＨＣＶ抗体を検出する測定法において、配列１の部分配列（ａａ１〜ａａ６２；アミノ酸配列２）に由来するアミノ酸配列を有するペプチドを反応液に含有するＨＣＶ抗体測定法に関する。
【０００８】
【化１】
2005312358.tif 000002
【０００９】
アミノ酸配列１は、１９８７年Ｃｈｉｒｏｎ社により開示されたＨＣＶポリペプチドの部分配列（ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ；ａａ１〜ａａ１２０）であり、ＨＣＶ粒子のコア抗原ポリペプチドの免疫学的に重要なエピトープを形成すると考えられ、現在市販されている多くのＨＣＶ抗体測定試薬において配列１、または配列１に相同的なアミノ酸配列を有するＨＣＶ抗原ポリペプチドが使用されている。
【００１０】
本発明において反応液に含有せしめるペプチドは、ＨＣＶコア抗原ペプチドとＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体との結合をほぼ完全に拮抗阻害する一方で、ＨＣＶコア抗原ペプチドとＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者のＨＣＶ抗体との結合を少なくとも一部拮抗阻害し得ない性質を有することが望まれる。このような性質を有するペプチドを検索するために、配列１に由来する配列を有する数多くのペプチドを配列１の全領域を網羅するように化学合成により調製した。そしてこれらのペプチドを単独で、またはいくつかのペプチドを組み合せて同時に、従来のＨＣＶ抗体測定法の反応液に添加して、反応性を鋭意検討した。その結果驚くべきことに、配列１の部分配列ａａ１〜ａａ６２に由来するアミノ酸配列が上記所望の性質を有するのに対し、配列１の部分配列ａａ６３〜ａａ１２０に由来するアミノ酸配列はＨＣＶ抗原ペプチドとＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者のＨＣＶ抗体との結合を阻害し得ないことを見出した。その結果、本発明の目的のために有用なペプチドは、配列２（配列１のａａ１〜ａａ６２）に由来するアミノ酸配列を有すると結論付けられた。
【００１１】
このようにして得られたペプチドは、ＨＣＶコア抗原ポリペプチドを用いて免疫学的にＨＣＶ抗体を検出する測定法の反応液に添加した場合、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性者由来検体の反応を阻害する一方、ＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者由来検体の反応は阻害しない、またはほとんど阻害しない。これにより、従来法と比較してＨＣＶ  ＲＮＡ陰性群におけるＨＣＶ抗体陽性数を低減し、ＨＣＶ抗体陽性検体中のＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者（キャリア）の割合を相対的に増すこと、即ちＨＣＶ  ＲＮＡ陽性者のＨＣＶ抗体をより選択的に検出することが可能となった。
【００１２】
本発明において、ペプチドは最終的にＨＣＶコア抗原ポリペプチド試薬と試料検体との反応液に含有せしめれば良く、その添加方法はいろいろな方法を取り得る。望ましくは、ペプチドを測定過程の初期に直接検体に、または検体希釈液に添加して検体中のＨＣＶ抗体と反応させた後、ＨＣＶコア抗原ポリペプチド試薬と検体とを反応させる方法がより効果的であるが、この方法に限定されるものではない。例えば、ペプチドをＨＣＶコア抗原ポリペプチド試薬に添加しておき、次に検体と反応させる方法も取り得る。また、最終的に反応液に含有せしめるペプチドの免疫学的な活性が十分高ければ、検体とＨＣＶコア抗原ポリペプチド試薬とを混合した後に、ペプチドを反応液に添加する方法も取り得る。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による特異性の改良されたＨＣＶ抗体測定法により陽性と判定された被検者は、従来のＨＣＶ抗体測定法で陽性と判定された被検者と比較してＨＣＶ  ＲＮＡ陽性である確率が高く、初期診断である定性的なＨＣＶ抗体検査の段階で、ＨＣＶ既往感染者とＨＣＶキャリアとのより正確な判別が可能となる。
【００１４】
ＨＣＶ抗体陽性と判定された場合、ＨＣＶキャリアかどうかを確認するため、引き続きＨＣＶ抗体定量法、ＨＣＶ抗原検査、ＨＣＶ  ＲＮＡ検査等の確認検査が行われるが、本発明による特異性の改良されたＨＣＶ測定法を使用するとＨＣＶ抗体陽性者数が低減し、確認検査に回る被検者数を低減することが可能であり、検査の効率化や医療費の低減に貢献出来る。
【００１５】
また、供血者検体のＨＣＶ抗体検査において、本発明による特異性の改良されたＨＣＶ抗体測定法を使用すると、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性血においてＨＣＶ抗体陽性と判定され、廃棄処分される血液の割合が低減し、輸血用及び血液製剤の原料として利用出来る血液数が増加し、血液の有効利用に貢献出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下の実施例により、本発明の有効性及び利点を詳細に説明するが、本発明の範囲及び本質を限定するものではない。
【００１７】
この実施例は、凝集法の原理でＨＣＶ抗体を測定する方法に関するが、他の方法例えば放射標識免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素標識免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光標識免疫測定法（ＣＬＩＡ）、イムノクロマトグラフィー、パーティクルカウント法など、凝集法とは測定原理の異なる免疫学的なＨＣＶ抗体測定法にも応用可能である。
【００１８】
この実施例は、担体である赤血球にＨＣＶコア抗原ポリペプチドを固定し、ＨＣＶ抗体を捕捉し検出する測定法であるが、担体としては赤血球以外にもゼラチン粒子、ラテックス粒子などの人工担体などを使用することが出来る。更には、ＨＣＶコア抗原ポリペプチドを担体に固定せず、標識体として用いてＨＣＶ抗体を測定する方法にも応用可能である。
【００１９】
この実施例で使用したＨＣＶコア抗原ポリペプチドは、アミノ酸配列１を有し、大腸菌によりＣＫＳとの融合蛋白質として発現させたリコンビナントＨＣ−３４抗原（ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ；ａａ１〜ａａ１５０）であるが、他にも酵母によりＳＯＤとの融合蛋白質として発現させたＣ２２−３抗原（ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ；ａａ１〜ａａ１２０）、ＨＣＶ  ＮＳ３領域の抗原ポリペプチド（３３Ｃ抗原）との融合蛋白質として発現させたＨＣ−４３抗原（ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ；ａａ１〜ａａ１５０＋ａａ１１９２〜ａａ１４５７）などが使用可能である。また必ずしもアミノ酸配列１に１００％一致する配列を有する抗原ポリペプチドである必要はなく、または必ずしもアミノ酸配列１の全アミノ酸を有する抗原ポリペプチドである必要はなく、アミノ酸配列１に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは約９０％以上の相同的なアミノ酸配列を有するＨＣＶコア抗原ポリペプチドであれば使用可能である。このようなＨＣＶコア抗原ポリペプチドとしては、他にＪＣＣ−２抗原（ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ；ａａ１〜ａａ１２０）、Ｊ７  Ｃｏｒｅ抗原（ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ；ａａ１〜ａａ１１５）などが挙げられる。
【００２０】
この実施例では、アミノ酸配列２から得られ、連続する８個から２０個のアミノ酸からなるペプチドを使用したが、使用するペプチドのアミノ酸数はこれらに限定されるものではない。一般にペプチドのエピトープ（免疫学的な反応性部位、即ち抗体が特異的に結合する部位）は、特有の少なくとも５個のアミノ酸により構成され、より一般的には特有の少なくとも８から１０個のアミノ酸により構成されることが知られている。例えば、連続する６個のアミノ酸で構成されるペプチドが特異的に抗体と結合することが知られている（特公平６−３４４５）。従って本発明においても、連続する少なくとも６個、好ましくは連続する少なくとも８個のアミノ酸で構成されるペプチドが使用可能と考えるべきである。
【００２１】
この実施例で使用したペプチドは、アミノ酸配列２から得られ、化学的合成により調製した連続した２０個以下のアミノ酸からなるペプチドであったが、調製の効率化や反応性、安定性の向上等のために、これらよりもアミノ酸数の多いペプチドを化学合成し、または遺伝子工学的な方法などにより異種のペプチドやポリペプチドとの融合ポリペプチドとして調製し、使用することも可能である。また、このように調製したペプチドやポリペプチドは、単独で使用するのみならず、同様な効果を有する異種ペプチドと混合したり、ペプチド同士を連結したり、異種タンパク質等のキャリアに結合させたものも使用することができる。
【実施例１】
【００２２】
方法：この実施例においては、第２世代ＨＣＶ抗体測定試薬ＨＣＶ  ＰＨＡ「アボット」（アボットジャパン社製）の測定系において、反応液にペプチドを添加した。ＨＣＶ  ＰＨＡ「アボット」においては、ＨＣＶコア抗原ポリペプチド（リコンビナントＨＣ−３４抗原）が固相（抗原感作用血球）に固定化されている。ＨＣ−３４抗原は、ＨＣＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ；ａａ１〜ａａ１５０のアミノ酸配列を有するアミノ酸数３９６、分子量約４４ｋＤａのリコンビナント抗原である。
【００２３】
表１に示すように、アミノ酸配列１に由来する２８個のペプチドを化学合成した。
【００２４】
【表１】
2005312358.tif 000003
【００２５】
これらのペプチドを表２に示す３９通りの組合せにより、ＨＣＶ  ＰＨＡ「アボット」の検体希釈液に添加した。
【００２６】
【表２】
2005312358.tif 000004
【００２７】
各ペプチドの添加濃度は１０ｕｇ／ｍＬとした。これらのペプチド添加検体希釈液、及び比較対照としてペプチドを添加しない検体希釈液と、ＨＣＶ  ＰＨＡ「アボット」添付の抗原感作血球試薬を用いて、供血者血漿検体５０例のＨＣＶ抗体を測定した。
【００２８】
測定方法は、基本的にＨＣＶ  ＰＨＡ「アボット」の添付文書記載の方法に従ったが、添加ペプチドと検体中のＨＣＶ抗体とを十分に反応させるため、検体希釈液により検体を希釈して１時間以上静置した後、抗原感作血球液と反応させた。使用した５０例の検体は、予めＰＣＲ法によるＨＣＶ  ＲＮＡ検査を行った結果、４７例がＲＮＡ陰性、３例がＲＮＡ陽性であった。
【００２９】
結果：表２にペプチド添加及び非添加の検体希釈液を用いた測定結果を示した。ペプチド非添加の検体希釈液を用いた場合、５０例全例がＨＣＶ抗体陽性と判定された。３９通りのペプチド添加のうち３５通りにおいて、ＲＮＡ陰性検体群のＨＣＶ抗体陽性数が低減したが、これらのペプチドは全てアミノ酸配列２（アミノ酸配列１；ａａ１〜ａａ６２）に由来する配列を有していた。一方、アミノ酸配列２以外の領域（アミノ酸配列１；ａａ６３〜ａａ１２０）に由来するペプチド、即ち表１に示したペプチド５、ペプチド６、ペプチド７、ペプチド８の添加においては、ＲＮＡ陰性検体群のＨＣＶ抗体陽性数を低減する効果は全く認められなかった。
【００３０】
ＲＮＡ陽性群のＨＣＶ抗体陽性数を変化させず、ＲＮＡ陰性検体群のＨＣＶ抗体陽性数を最も多く低減した添加ペプチドの組合せにおいては、ＲＮＡ陰性検体４７例におけるＨＣＶ抗体陽性数が２２例（４７％）減少して２５例となった。即ち、総ＨＣＶ抗体陽性数はＲＮＡ陽性群の３例とＲＮＡ陰性群の２５例との合計２８例にまで減じ、結果的にＨＣＶ抗体陽性群におけるＲＮＡ陽性検体の割合が６．０％（＝３／５０）から１０．７％（＝３／２８）に増加した。
【００３１】
ＲＮＡ陽性群のＨＣＶ抗体陽性数を変化させず、ＲＮＡ陰性検体群のＨＣＶ抗体陽性数のみを低減した添加ペプチドの組合せにおいては、表３に示したアミノ酸配列２由来の１３個のペプチドのうち何れかを含んでおり、これらのペプチドが本発明にとって特に有用であると考えられた。
【００３２】
【表３】
2005312358.tif 000005
【配列表】
2005312358000001.app