(57)【要約】  【課題】サリチル酸ナトリウムを安定剤として含む、長期に亘り高い安定性を保持する安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物及びこれを含むグルコース測定用試薬組成物並びにＰＱＱ−ＧＤＨの長期に亘る安定化方法を提供することを課題とする。  【解決手段】サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を含む安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。ＰＱＱ−ＧＤＨに、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を添加するＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法。上記の安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物と電子受容体と、を含むグルコース測定用試薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を含む安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項２】
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を添加するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法。
【請求項３】
請求項１に記載の安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物と電子受容体と、を含むグルコース測定用試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子受容体の存在下でグルコースの定量を行うのに好適なＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱ−ＧＤＨということがある）の安定な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱ−ＧＤＨは、ＰＱＱと共役してグルコースを酸化し、グルコノラクトンを生成する反応を触媒する。この性質を利用してＰＱＱ−ＧＤＨは、臨床検査や食品分析、培養プロセスのモニタリング等におけるグルコースの定量に利用されている。最近、特に血中グルコース測定を目的としたバイオセンサーへの用途が注目されている。バイオセンサーには、グルコースオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼも利用されているが、これらと比較してＰＱＱ−ＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない事や、補酵素の添加を必要としない事よりバイオセンサーに極めて好適である。しかし、ＰＱＱ−ＧＤＨは、グルコースオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼと比較すると安定性に欠けるという問題のある事が知られている。この問題を解決するため、従来、アスパラギン酸、グルタミン酸、α‐ケトグルタル酸、リンゴ酸、α‐サイクロデキストリンのうち1種又は2種以上及びアルブミンを含有するＰＱＱ−ＧＤＨ（特許文献１参照）、（１）カルシウムイオンまたはカルシウム塩および（２）グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有するＰＱＱ−ＧＤＨ（特許文献２参照）等が報告されている。
【特許文献１】特開2001-224368号公報
【特許文献２】特開平9-140378号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の安定化されたＰＱＱ−ＧＤＨは、グルコースオキシダーゼやＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ並の安定性は得られていないので、臨床検査、食品分析等においてのグルコース分析で測定値への影響が生ずるおそれがある。また、従来のＰＱＱ−ＧＤＨは、数日間の保存後の安定性は明らかになっているが、数ヶ月の保存後の安定性については明らかでない。さらに、ＰＱＱ−ＧＤＨの安定化剤として、サリチル酸ナトリウムが有効であることについての報告はない。
【０００４】
本発明は、上記の事情に基づきなされたもので、サリチル酸ナトリウムを安定剤として含む、長期に亘り高い安定性を保持する安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物及びこれを含むグルコース測定用試薬組成物を提供することを課題とする。また、ＰＱＱ−ＧＤＨの長期に亘る安定化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決するため検討を重ね、サリチル酸ナトリウムがＰＱＱ−ＧＤＨの安定化効果に優れることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、請求項１に記載の発明は、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を含む安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物を要旨とする。
【０００６】
また、請求項２に記載の発明は、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を添加するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化方法を要旨とする。
【０００７】
また、請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物と電子受容体と、を含むグルコース測定用試薬組成物を要旨とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物によれば、保存後、長期間に亘り安定して酵素活性を維持できる。また、本発明のサリチル酸ナトリウムと共にアルブミン及び／又はゼラチンが添加された安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物によれば、サリチル酸ナトリウムに起因する酵素水溶液の懸濁が生じないので、酵素水溶液のろ過操作を回避できる。本発明のＰＱＱ−ＧＤＨの安定化方法によれば、ＰＱＱ−ＧＤＨの酵素活性を長期に亘り安定して保持できる。また、本発明のグルコース測定用試薬組成物によれば、ＰＱＱ−ＧＤＨの酵素活性を長期に亘り安定して保持できるので、臨床検査や食品分析等において測定誤差を抑えて精度の高いグルコースの測定を長期に亘り行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の安定化ＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼ組成物は、ＰＱＱ−ＧＤＨに、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を含むものである。本発明の安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物は、これらの安定化剤を含有するものであれば水性組成物、凍結乾燥物を問わない。しかし、ＰＱＱ−ＧＤＨにサリチル酸ナトリウムのみを添加すると、該凍結乾燥物を水に溶解する際に混濁を生じ、このままでは測定誤差を招くことがある。そのため、ろ過という煩雑で余分な操作が必要となる。ところが、サリチル酸ナトリウムと共にアルブミン及び／又はゼラチンを加えると混濁が生じず、作用機序は明らかでないがアルブミン及び／又はゼラチンには、サリチル酸ナトリウムに起因する混濁を防止する効果が認められる。
【００１０】
使用できるアルブミンは、牛血清アルブミン、卵白アルブミンなどを例示できる。また、ゼラチンは、フィッシュゼラチン（ノーランド社製）、ポリペプタイド（（株）ニッピ社製）等を例示できるが、特に限定はない。
【００１１】
サリチル酸ナトリウムの添加量としては、対蛋白量あたり1重量%〜70重量%、好ましくは5重量〜50重量%、アルブミンの添加量としては50重量%〜700重量%、好ましくは100重量〜500重量%、ゼラチンの添加量としては50重量%〜700重量%、好ましくは100重量%〜500重量%である。
【００１２】
本発明に用いるＰＱＱ−ＧＤＨは、補酵素としてＰＱＱを必要とする公知のものを限定なく用いることができる。例えば、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobactor calcoaceticus）IFO12552、IFO13006、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobactor calcoaceticus）NCIB11517等が生産するＰＱＱ−ＧＤＨを用いることができる。また、これら遺伝子を大腸菌等に導入し構築した組換え菌が生産するＰＱＱ−ＧＤＨを用いることができる。
【００１３】
ＰＱＱ−ＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として下記のようにグルコースを酸化してσ-グルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。
グルコース＋電子受容体→σ-グルコノラクトン＋還元型電子受容体
この酵素活性は、ＰＱＱ−ＧＤＨによるグルコースの酸化に伴って還元されるＰＱＱの量を酸化還元試薬の呈色反応により定量することができる。呈色試薬として例えば、PMS-DCIP、1-methoxy-PMS-XTT、フェリシアン化カリウムなどを用いることができる。
本発明においてＰＱＱ−ＧＤＨ活性の測定を原則として以下の試薬を用い以下の条件で行なうことができる。
〈試薬〉
10mmol/L MOPS（pH7.0）、1mmol/L 1-methoxy PMS（フェナジンメトサルフェート）、0.25mmol/L XTT、5mmol/L グルコース
〈測定条件〉
上記試薬混液140μLを25℃で約5分予備加温した後に0.1mLの酵素溶液を加え、緩やかに混和する。その後、水を対照とし25℃に制御された分光光度計で15分間記録し、その直線部分から1分間あたりの410nmの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、同様に吸光度変化を測定する。上記条件で1分間に生成するホルマザン1/2μmol/Lの酵素量を1単位（U）とする。
【００１４】
本発明のグルコース測定用試薬組成物は、ＰＱＱ−ＧＤＨに、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムとアルブミン、サリチル酸ナトリウムとゼラチン、サリチル酸ナトリウムとアルブミンとゼラチン、からなる群より選ばれた１種の安定化剤を含む安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物と電子受容体とを含むものである。電子受容体として、フェリシアニド、電子キャリアと2,6-ジクロロフェノールインドフェノールの組み合わせ、電子キャリアとテトラゾリウム塩の組み合わせ等が挙げられる。これらグルコース測定用試薬組成物で検体中のグルコースを測定する場合、生成した還元型電子受容体を比色定量する方法、電気化学的に定量する方法などがある。また、グルコース測定用試薬組成物は、緩衝液を含み、ホウ酸、トリス塩酸、グッド緩衝液などを例示できる。
【００１５】
グルコース測定用試薬組成物における電子受容体の割合は、安定化ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに対して10重量%〜60重量%、好ましくは20重量%〜40重量%である。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
〔実施例１〕
以下に示す方法でＰＱＱ−ＧＤＨ生産菌を作成した。
アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobactor calcoaceticus)IFO12552株の染色体DNAを次の方法で分離した。同菌株を10mLのLB培地で30℃、一晩振とう培養した後、遠心処理（15000rpm、10分間）により集菌した。得られた菌体からDneasy tissue kit（キアゲン社）を用いて染色体DNAを抽出、精製し、TEバッファーに溶解した。その後、次のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、目的とするPQQ−GDH遺伝子を含むDNA領域を増幅させた。尚、ここで使用されるプライマーは、アシネトバクター・スピーシーズ  L.M.D 79.41株由来の可溶性PQQ−GDHの塩基配列（A-M  Cleton-JansenらMol. Gen. Genet., 217, 430（1989））を基に設計した。
フォワードプライマー：5’-ACAAATCATATAGAGAACTCG-3’(配列番号1)
リバースプライマー：5’-TTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAGAGATCCTGGG-3’(配列番号2）
PCRは、以下に示す組成の溶液中で行ない、94℃2分間の反応、次に94℃30秒間、48℃30秒間、及び72℃2分間の反応を30サイクル、最後に72℃10分間の反応を行なう条件とした。
TAKARA  LA-taq：0.5μL、10-fold buffer：5μL、25mM MgCl2：5μL、  dNTP  mix（2.5mM）：8μL、フォワードプライマー（10pmol/μL）：1μL、リバースプライマー（10pmol/μL）：1μL、テンプレート：H2Oで50μLに調整
【００１８】
上記で得られた増幅遺伝子断片をpGEM-T Easy vector（キアゲン社）に連結し、このプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換した。得られたプラスミドをpTGEM-GHDBとした。このプラスミドpTGEM-GHDBを鋳型とし、次のプライマーを用いたPCRを行なった。
フォワードプライマー：5’-GCGGCCGCGAATTCATGAATAAACATTTATTGGCTAAAATTACTTTAT-3’
（配列番号３）
フォワードプライマー：5’-GCGGCCGCCTGCAGCTATTACTTAGCCTTATAGGTGAACTTAATGAGAGATCCTGGG-3’（配列番号４）
PCRは以下に示す組成の溶液中で行ない、94℃2分間の反応、次に94℃30秒間、55℃30秒間、および72℃2分間の反応を30サイクル、最後に72℃10分間の反応を行なう条件とした。
Sigma KlenTaq：0.5μL、10-fold buffer：5μL、dNTP mix（10mM）：2.5μL、フォワードプライマー（10pmol/μL）：2μL、リバースプライマー（10pmol/μL）：2μL、テンプレート：H2Oで50μLに調整
【００１９】
得られた増幅遺伝子を制限酵素EcoRIとPstIにて切断した。切断した遺伝子断片を発現ベクターに連結し、このプラスミドで大腸菌JM109株を形質転換した。
【００２０】
〔実施例２〕
実施例１で作成したＰＱＱ−ＧＤＨ生産菌を以下に示すように培養後精製を行ないＰＱＱ−ＧＤＨを得た。
前培養培地組成は、酵母エキス 0.5%、ペプトン 1.0%、NaCl 1.0%、アンピシリンナトリウム 0.01%（pH7.0）とした。その後、121℃20分間滅菌後、生産菌を接種し37℃、7時間培養した。前培養液を本培地に接種後、33℃、48時間ジャーファーメンターで通気撹拌培養を行なった。本培地は、酵母エキス 0.5%、ペプトン 1.0%、NaCl 1.0%(pH6.5)とした。滅菌は121℃、20分間行なった。遠心分離で得られた菌体をマルチビーズショッカーにより破砕した。その後、凝集処理、ろ過、UF、DEAE-セファロースカラムクロマト、CM-セファロースカラムクロマト、UFを行なった後以下に示す様にＰＱＱ−ＧＤＨに安定化剤を添加後、凍結乾燥を行ない、各種サンプルを作成した。尚、安定化剤の添加割合は凍結乾燥前の溶液の蛋白量を基準に添加した。
サンプル（１）：無添加
サンプル（２）：サリチル酸ナトリウム20重量%添加
サンプル（３）：サリチル酸ナトリウム30重量%添加
サンプル（４）：サリチル酸ナトリウム重量20%、アルブミン200重量%添加
サンプル（５）：サリチル酸ナトリウム30重量%、アルブミン200重量%添加
サンプル（６）：サリチル酸ナトリウム20重量%、ゼラチン200重量%添加
サンプル（７）：サリチル酸ナトリウム30重量%、ゼラチン200重量%添加
サンプル（８）：サリチル酸ナトリウム20重量%、アルブミン200重量%、フェリシアン化カリウム30重量%添加
サンプル（９）：サリチル酸ナトリウム20重量%、フェリシアン化カリウム30重量%添加
【００２１】
〔実施例３〕
実施例２で得た各サンプルを37℃で4ヶ月放置しＰＱＱ−ＧＤＨ活性を測定した。凍結乾燥直後のサンプル残存活性を100%として各サンプルの1ヶ月毎の残存活性を相対値で測定した。また、４ヶ月処理後のサンプルについて、水溶解時の混濁生成の有無を調べた
（混濁生成する場合：＋、混濁生成しない場合：−）。結果は、図１に示した。
【００２２】
【表１】
2005333872.tif 000002
【００２３】
サリチル酸ナトリウムの存在下、サリチル酸ナトリウムとアルブミンの存在下あるいはサリチル酸ナトリウムとゼラチン存在下では安定性が著しく向上した。また、アルブミンもゼラチンも含まないサンプル（２）、サンプル（３）及びサンプル（９）は混濁していたが、サンプル（４）〜（８）はいずれも清澄であった。
【配列表】
2005333872000001.app