(57)【要約】【課題】バチルス・チューリンジエンシスから生物学的活性を有する新規なタンパク質をおよびそれをコードする核酸を得る。【解決手段】バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来で分子量が３４ｋＤａである、細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質の前駆体タンパク質、該前駆体タンパク質から得られる分子量が２６ｋＤａで細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質、およびこれらタンパク質をコードする核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来で分子量が３４ｋＤａである、細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質の前駆体タンパク質。
【請求項２】
配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の前駆体タンパク質。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の前駆体タンパク質。
【請求項４】
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４４として寄託されている、請求項１ないし３のいずれかに記載の前駆体タンパク質。
【請求項５】
遺伝子組み換え技術により得られる、請求項１ないし４のいずれかに記載の前駆体タンパク質。
【請求項６】
配列番号２に示すアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を有する、請求項１ないし５のいずれかに記載の前駆体タンパク質。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の前駆体タンパク質から得られる、細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質。
【請求項８】
該前駆体タンパク質をアルカリで可溶化後にプロテアーゼで活性化して得られる、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
該プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
分子量が２６ｋＤａである、請求項７ないし９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
該前駆体タンパク質からＣ末端側の断片が開裂されて得られたものである、請求項７ないし１０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１２】
配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項７ないし１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１３】
１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されている、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
細胞認識および細胞障害活性が、白血病細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞および大腸癌細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞に対して特異的である、請求項７ないし１３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１ないし６のいずれかに記載の前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
配列番号１に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項７ないし１４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１８に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号３に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質をコードする、請求項１８に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来である、請求項１５ないし２０のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４４として寄託されている、請求項２１に記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項１５ないし２２のいずれかに記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項７ないし１４のいずれかに記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２６】
請求項７ないし１４のいずれかに記載のタンパク質を含む抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来の新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。詳細には、バチルス・チューリンジエンシス（Bacillus thuringiensis：以下、「ＢＴ」と略することがある）Ａ１４７０株由来である、細胞認識および細胞障害活性を有する新規な組み換えタンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・チューリンジエンシスは、１９０１年に日本人研究者の石渡繁胤氏によって蚕の病原細菌として発見された。以来、本細菌が生産する毒素タンパク質は、微生物殺虫剤として幅広く農業害虫、衛生害虫の防除に利用されてきた。
【０００３】
これまでの研究によって、殺虫活性を持つ結晶性タンパク質は、アルカリによる可溶化後、必要に応じてプロテアーゼ処理によって活性化され、昆虫に対する毒性を発揮することが知られている。殺虫活性を持つ結晶性タンパク質は、
（１）プロテアーゼによって活性化された状態において昆虫細胞に選択的な破壊活性を示すＣｒｙタンパク質（通常、活性化形態では分子量60〜75kDa）および
（２）昆虫の細胞に対して非選択的な破壊活性を有し、かつ赤血球の溶血活性を有するＣｙｔタンパク質（通常、活性化形態では分子量22〜30kDa）
に分類されることが明らかになっている。
【０００４】
細胞認識タンパク質としてのバチルス・チューリンジエンシスの結晶性タンパク質は、Ｃｒｙタンパク質に代表される選択性の高さ、多様性の豊富さ、および原核生物由来のタンパク質であるが故の遺伝子改変のし易さという、抗体などの他の細胞認識タンパク質にない優れた特徴を持っている。しかしながら、その用途は、今のところ昆虫細胞を標的とした殺虫剤としての利用に限定されている。また、殺虫活性を有する結晶性タンパク質を発現している菌株は、ＢＴのうちわずか３０〜４０％にすぎず、ＢＴ菌株が生産する殺虫活性を有しない結晶性タンパク質の持つ性質については、これまで不明であった。
【０００５】
本発明者らは、土壌、耕地土壌、森林土壌，養蚕農家塵埃、貯穀塵埃、病死昆虫、植物、淡水等から分離された約２０００株のバチルス・チューリンジエンシス菌株（５０種のＨ血清型と未知の血清型に属している）を用いて、活性が不明であった結晶性タンパク質の中に、アルカリによる可溶化後にプロテアーゼによって活性化されると、脊椎動物細胞（癌細胞を含む）を選択的に認識および破壊する一群の新規タンパク質が存在することを世界に先駆けて明らかにした（非特許文献１および非特許文献２）。殺虫活性を持たず、分子量が20〜70kDaであり、かつ赤血球の溶血活性を有しないこのタンパク質は、特許文献１に記載されている。
【０００６】
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来の細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質については、特許文献２に記載されている。
【特許文献１】特開平１１−２２２４９８号公報
【特許文献２】特開２００３−２８４５６８号公報
【非特許文献１】ミズキ（Mizuki, E.）、オオバ（Ohba, M.）、アカオ（Akao, T.）、ヤマシタ（Yamashita, S.）、サイトウ（Saitoh, H.）およびパーク（Park, Y.S.）、“ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー（Journal of Applied Microbiology）”, 1999, 86, p.477-486
【非特許文献２】ミズキ（Mizuki, E.）、パーク（Park, Y.S.）、サイトウ（Saitoh, H.）、ヤマシタ（Yamashita, S.）、アカオ（Akao, T.）、ヒグチ（Higuchi, K.）およびオオバ（Ohba, M.）、“クリニカル・アンド・ダイグノスティック・ラボラトリー・イムノロジー（Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology）”, 2000, 7, p.625-634
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バチルス・チューリンジエンシス菌が産生する一群の毒素タンパク質については未だ解明されていないものが多数存在しており、それらのうちから医学的に有用な活性を有するものを探索し、ヒトの疾患の治療等に役立てる必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、バチルス・チューリンジエンシス菌の中でも特にバチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株に由来し、脊椎動物細胞（癌細胞を含む）に対して選択的な細胞認識および細胞障害活性を有する新規タンパク質を見出し、そのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列を決定するとともに、そのような細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質および該タンパク質の前駆体タンパク質を遺伝子組み換え技術により作製した。
【０００９】
本発明は、その第一の側面において、バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来で分子量が３４ｋＤａである、細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質の前駆体タンパク質を提供する。
【００１０】
本発明の前駆体タンパク質は、配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するのが好ましい。好ましくは、本発明の前駆体タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。さらに、本発明の前駆体タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を有していてよい。
【００１１】
本発明の前駆体タンパク質は、バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株に由来するものである。同株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４４にて平成１４年３月２０日に寄託してある。
【００１２】
本発明は、その第二の側面において、上記３４ｋＤａの前駆体タンパク質から得られる、細胞認識および細胞障害活性を有する活性化タンパク質を提供する。当該活性化タンパク質は分子量が２６ｋＤａであり、上記前駆体タンパク質をアルカリで可溶化後にプロテアーゼ（プロテイナーゼＫなど）で活性化することにより得ることができる。
【００１３】
本発明の２６ｋＤａの活性なタンパク質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。この配列番号４に示すアミノ酸配列は、本発明の前駆体タンパク質の有するアミノ酸配列である配列番号２のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２４６に対応するものである。本発明の２６ｋＤａの活性なタンパク質は、当該アミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を有していてよい。
【００１４】
本発明の活性化タンパク質は、特定の脊椎動物細胞（癌細胞を含む）に対して選択的な細胞認識および細胞障害活性を有し、とりわけ白血病細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞および大腸癌細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞に対して特異的に細胞認識および細胞障害活性を示す。
【００１５】
本発明は、その第三の側面において、本発明の３４ｋＤａの前駆体タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明の３４ｋＤａの前駆体タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する。本発明の該ＤＮＡは、配列番号１に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをも包含する。
【００１６】
本発明は、その第四の側面において、本発明の２６ｋＤａの活性化タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明の２６ｋＤａの活性化タンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する。この配列番号３に示すヌクレオチド配列は、本発明の前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列である配列番号１のヌクレオチド残基４〜ヌクレオチド残基７３８に対応するものである。本発明の該ＤＮＡは、配列番号３に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００１７】
本発明の３４ｋＤａの前駆体タンパク質をコードするＤＮＡおよび２６ｋＤａの活性化タンパク質をコードするＤＮＡは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来であるのが好ましい。
【００１８】
本発明は、その第五の側面において、本発明の３４ｋＤａの前駆体タンパク質をコードするＤＮＡまたは２６ｋＤａの活性化タンパク質をコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを提供する。
【００１９】
本発明は、その第六の側面において、本発明の組み換えベクターにより形質転換した宿主細胞を提供する。
【００２０】
本発明は、その第七の側面において、本発明の２６ｋＤａの活性化タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、その第八の側面において、本発明の２６ｋＤａの活性化タンパク質を含む抗癌剤を提供する。
【００２２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明者らは、バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株から本発明の３４ｋＤａ前駆体タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、当該３４ｋＤａ前駆体タンパク質の遺伝子を大腸菌に組み込んで組換え３４ｋＤａタンパク質を調製した。
また、天然のバチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株から本発明の２６ｋＤａ活性化タンパク質を単離精製することにも成功した。
【００２３】
本発明の３４ｋＤａ前駆体タンパク質をアルカリで可溶化後にプロテアーゼ処理すると２６ｋＤａの活性なタンパク質が得られる。すなわち、２６ｋＤａのタンパク質は、３４ｋＤａの前駆体タンパク質を加水分解したときに得られる大きな断片である。詳細には、３４ｋＤａ前駆体タンパク質のＣ末端側断片が開裂されたときの大きな断片が２６ｋＤａタンパク質である。本発明の３４ｋＤａ前駆体タンパク質は配列番号２に示すアミノ酸配列を有するが、この前駆体タンパク質から得られる２６ｋＤａの活性タンパク質は配列番号４に示すアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基２〜アミノ酸残基２４６に対応するアミノ酸配列）を有する。
【００２４】
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株からの本発明の３４ｋＤａ前駆体タンパク質をコードする遺伝子のクローニングは、以下のようにして行った。
特開２００３−２８４５６８号公報に記載の３２ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする際に、当該３２ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子とともに本発明の３４ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる。すなわち、実施例に記載するように、３２ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする際に得られるpSHAN32.1プラスミド中に６.６ｋｂのＤＮＡフラグメントが含まれ、このＤＮＡフラグメント中に本発明の３４ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子が含まれることが見出された。
【００２５】
この３４ｋＤａタンパク質遺伝子の５’および３’末端ヌクレオチド配列をもとにプライマーを作製してＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物を所定の制限酵素で処理後に発現ベクターに導入し、ついで適当な宿主細胞、たとえば大腸菌ＢＬ２１細胞を形質転換することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質を遺伝子組み換え技術により製造するための組換えベクターおよび発現ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。このようなベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、たとえばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、たとえばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、たとえばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。バチルス・チューリンジエンシス由来プラスミドとして、ｐＨＴ３１０１、ｐＨＴ３１５などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００２７】
特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが配置された発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（たとえば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが使用される。
【００２８】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびShine-Dalgarno（ＳＤ）配列を包含する。
【００２９】
形質転換体の培地中に本発明のタンパク質を分泌させる場合において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡがシグナルペプチドのコード配列を含まない場合は、ベクターとして、開始コドンに続いて適当なシグナルコドンをさらに含む分泌発現用ベクターを用いるのが好ましい。
【００３０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡがゲノムＤＮＡから単離され、本来のプロモーターおよびターミネーター領域を含む形態で得られる場合には、本発明の発現ベクターは、目的の宿主細胞内で複製保持または自律増殖できる公知のクローニングベクターの適当な部位に該ＤＮＡを挿入することにより調製することができる。
【００３１】
本発明はまた、上記の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を提供する。本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、当該技術分野において通常使用される天然の細胞あるいは人工的に樹立された変異細胞または組換え細胞など種々の細胞（たとえば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌、バチルス・チューリンジエンシスまたはその変異株等（好ましくは、毒素タンパク質を生産しないバチルス・チューリンジエンシス株）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属、クリベロマイセス属等）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示されるが、原核生物細胞がより好ましい。また、本発明のタンパク質を発現するのに適したバチルス・チューリンジエンシス変異株を、当業者は自ら作製することができる。たとえば、毒素タンパク質を生産するバチルス・チューリンジエンシス株からキュアリングを行い、プラスミドＤＮＡを除くことによって、毒素タンパク質を生産しないバチルス・チューリンジエンシス株が得られる。当業者は、上記手法を用いて、毒素タンパク質を生産せずに本発明のタンパク質を生産する任意のバチルス・チューリンジエンシス株を取得することができる（詳細については、Gonzalez, J. M. et al. PLASMID 5, 351-365(1981)を参照のこと）。
【００３２】
発現ベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。たとえば、細菌の場合は、Cohenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69,2110 (1972)）、プロトプラスト法、コンピテント法等によって、酵母の場合は、Hinnenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927 (1978)）、リチウム法等によって、動物細胞の場合は、Grahamの方法（Virology, 52, 456 (1973)）等によって、また昆虫細胞の場合は、Summersらの方法（Mol. Cell. Biol.3,2156-2165 (1983) ）等によって、それぞれ形質転換することができる。
【００３３】
本発明は、本発明の３４ｋＤａ前駆体タンパク質または２６ｋＤａタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、配列番号２に示すアミノ酸配列（本発明の前駆体タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を有するもの、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するもの、配列番号１に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするもの、配列番号４に示すアミノ酸配列（本発明の活性化タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を有するもの、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有するもの、および配列番号３に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞認識および細胞障害活性を有するタンパク質をコードするものを包含する。本発明の２６ｋＤａタンパク質をコードするＤＮＡは配列番号３に示すヌクレオチド配列を有し、このヌクレオチド配列は配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド残基４〜ヌクレオチド残基７３８に対応するものである。
【００３４】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいう。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション反応や洗浄の際の塩濃度および温度等を適宜変化させることにより調節することができる。相同性の程度は、たとえば、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ検索をデフォルトで使用することによって算定される。
【００３５】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を天然に産生する細胞、すなわちバチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株、および本発明のタンパク質を発現するＤＮＡをコードする発現ベクターを含有する形質転換体から得ることができる。本発明のタンパク質は、上記のようにして調製される発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を回収することによって製造することができる。また、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を天然に産生する細胞であるバチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株を培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を回収することによって得られる。かくして回収したタンパク質は、アルカリ緩衝液での可溶化後にプロテアーゼによって処理することにより活性化することができる。
【００３６】
形質転換体の培養に使用する培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素［たとえば、無機塩（たとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（たとえばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など］を含んでいてもよい。
【００３７】
培養は当該技術分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
宿主細胞が細菌、放線菌、酵母、糸状菌等である場合には、たとえば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８の培地である。宿主細胞が大腸菌の場合には、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)）等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜２４時間行うことができる。宿主細胞が枯草菌の場合には、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主細胞がバチルス・チューリンジエンシスまたはその変異株（好ましくはバチルス・チューリンジエンシスＢＦＲ１）の場合には、好ましい培地としてはＣＹＳ培地（Yamamoto, T., ACS Symp. Ser. 432, 46-60 (1990)）が挙げられる（この場合、培養は、たとえば、寒天平板上で２０℃で９６時間行う）。宿主細胞が酵母の場合には、培地として、たとえばBurkholder最少培地（Bostian. K.L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００３９】
宿主細胞が動物細胞の場合には、培地として、たとえば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）（Science, 122, 501 (1952)）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）（Virology, 8, 396 (1959)）、ＲＰＭＩ１６４０培地（J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)）、１９９培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００４０】
本発明のタンパク質の精製は、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。たとえば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。
【００４１】
本発明に従って得られた３４ｋＤａの組換えタンパク質は、アルカリで可溶化後にプロテアーゼ（プロテイナーゼＫなど）で３７℃にて１〜２時間インキュベートすることにより活性化されて２６ｋＤａの活性化タンパク質を生成する。
【００４２】
本明細書において「細胞障害活性」とは、特定の細胞を特異的に破壊する能力をいう。たとえば、実施例に記載されるＭＴＴアッセイにより測定した場合に、特定の細胞に対してたとえば、約２μｇ/ｍｌ以下、好ましくは約１μｇ/ｍｌ以下、より好ましくは約０.５μｇ/ｍｌ以下、さらにより好ましくは約０.２５μｇ/ｍｌ以下のＥＣ50（μｇ精製タンパク質／ｍｌ）を示す場合に、「細胞障害活性」を有するものとみなされる。また、ＭＴＴアッセイ以外の方法によって測定する場合には、特定の細胞に対する細胞障害活性が、ネガティブコントロールに対する細胞障害活性よりも有意に高い場合に、その細胞に対して細胞障害活性を有するものとみなされる。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞障害活性を示さない任意の細胞が挙げられるが、たとえば、Jurkat細胞、Ｋ５６２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＵｔＳＭＣ細胞、ＨＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞から任意に選択される細胞をネガティブコントロールとして用いることができる。
【００４３】
また、本発明のタンパク質は、特定の細胞を特異的に認識し、かつ破壊することによって、特定の細胞に対して特異的な細胞障害活性を示す。従って、本発明のタンパク質は、特異的な「細胞認識活性」を有する。たとえば、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた相互作用解析により測定した場合に、特定の細胞に対する細胞認識活性が、ネガティブコントロールに対する細胞認識活性よりも有意に高い場合に、その細胞に対して細胞認識活性を有するものとみなされる。ネガティブコントロールとしては、本発明のタンパク質が細胞認識活性を示さない任意の細胞が挙げられる。当業者は、ネガティブコントロールとして使用し得る細胞を適宜選択することができる。
【００４４】
本発明の２６ｋＤａタンパク質は、とりわけ、ヒト由来の白血病Ｔ細胞（好ましくはＭＯＬＴ−４細胞）、前骨髄性白血病細胞（好ましくはＨＬ６０細胞）、リンパ腫細胞（好ましくはＵ−９３７ＤＥ−４細胞）、子宮癌細胞（好ましくはＳａｗａｎｏ細胞およびＴＣＳ細胞）、肝癌細胞（好ましくはＨｅｐＧ２細胞）および大腸癌細胞（好ましくは結腸癌細胞、より好ましくはＣＡＣＯ−２細胞）、並びにラット由来の癌細胞（好ましくはＰＣ１２細胞）を特異的に認識し、これら細胞に対して細胞障害活性を示す。
【００４５】
上記のように、本発明の２６ｋＤａタンパク質は、とりわけ特定のヒト由来癌細胞を特異的に認識し、これら癌細胞に対して選択的に細胞障害活性を示すことから、抗癌剤として用いることができる。従って、本発明は、本発明の２６ｋＤａタンパク質を有効成分として含む医薬組成物、とりわけ抗癌剤を包含する。本発明の抗癌剤の適用症としては、白血病、好ましくは異常なＴ細胞に起因する白血病、前骨髄性白血病、リンパ腫、子宮頸癌、子宮癌、肝臓癌、結腸癌等が挙げられる。
【００４６】
本発明の医薬組成物または抗癌剤は、有効成分としての本発明の２６ｋＤａタンパク質を通常の薬理学的に許容しうる賦形剤または担体と混合することにより調製することができる。本発明の医薬組成物または抗癌剤は、適宜、散剤、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、坐剤、液剤、乳濁液、懸濁液、エアロゾル剤、スプレー剤、その他の使用に適した剤形であってよい。有効成分である本発明の２６ｋＤａタンパク質の治療上有効な用量は、その精製度、活性および投与法、並びに処置すべき個々の患者の年齢、健康状態、体重、性別および疾患の種類によっても相違するが、当業者は、それらの因子を考慮して、用量を適宜決定することができる。
【００４７】
本発明の２６ｋＤａ活性化タンパク質を抗癌剤として使用する場合、本発明のタンパク質単独でも有効であるが、効果を増強するために他の抗癌剤との複合体（共有結合性でも非共有結合性でもよい）や併用剤としても使用することができる。たとえば、免疫グロブリンと抗癌剤との複合体が報告されているが、本発明のタンパク質も同様に、他の抗癌剤との複合体として使用することができる。また、本発明のタンパク質は、放射性同位体（たとえば、131Ｉ）で標識することができる。たとえば、131Ｉで標識した抗ＣＤ２０モノクローナル抗体での治療によって、Ｂ細胞リンパ腫患者において非常に良好な結果が得られたことが報告されているが、本発明のタンパク質も同様に131Ｉで標識すると癌細胞に対する破壊効果が増強される。また、本発明のタンパク質は、毒素（たとえば、リシン）との複合体として使用することもできる。たとえば、抗ＣＤ５抗体とリシンＡ鎖との複合体によってＴ細胞リンパ腫の患者において顕著な効果が確認されたとの報告があるが、本発明のタンパク質も同様にリシンＡ鎖との複合体として使用することができる。
【００４８】
上記特徴に加え、本発明のタンパク質は、非常に選択性が高いため薬物送達システムにも利用することができる。たとえば、本発明のタンパク質は、他の物質との融合によって、特異的な指向性をその物質に付与することができる。本発明のタンパク質は優れた選択性を有することから、免疫グロブリン（抗体）と同様にターゲッティング療法に使用できることが理解されるであろう。
【００４９】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
なお、以下の実施例において、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部癌細胞）、Sawano細胞（ヒト子宮内膜腺癌細胞）、ＴＣＳ細胞（ヒト角化型扁平上皮癌細胞）、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌細胞）、ＭＯＬＴ−４細胞（ヒト白血病Ｔ細胞）、Jurkat細胞（ヒト白血病Ｔ細胞）、ＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）、ＣＡＣＯ−２細胞（ヒト結腸癌細胞）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）、Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病細胞）、ＣＨＯ細胞（ハムスター卵巣由来細胞）、ＰＣ１２細胞（ラット褐色腫由来細胞）、Ｕ９３７ＤＥ−４細胞（ヒトリンパ腫由来細胞）Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児由来繊維芽細胞）は理化学研究所から、ＵｔＳＭＣ細胞（ヒト正常子宮平滑筋細胞）は宝酒造株式会社から、ＨＣ細胞（ヒト正常肝細胞）はセルシステムズ社からそれぞれ購入した。
【００５０】
実施例１［バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株からの２６ｋＤａタンパク質の調製］
バチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４４）（以下、「BT A1470株」と略す）が胞子形成時に作る封入体を収集し、これに可溶化緩衝液（50mM炭酸ナトリウム（pH10.5）、10mM DTT、1mM EDTA）を加えて37℃で1時間インキュベートした。これを7,000×gにて20分遠心し、上清を得た。こうして得た上清を0.45μmのフィルターに通して不溶物を濾過後、1N塩酸でpH9.2に調製し、1mg/mlのプロテイナーゼＫ（和光純薬製；ロットナンバーPAQ7953）を終濃度で50μg/mlになるように加えて37℃で1.5時間インキュベートした。100mM PMSFを終濃度で1mMになるように添加してプロテイナーゼＫによるプロセッシングを停止させ、同時に氷冷し、もう一度0.45μmのフィルターにかけた。このサンプルをResource Qカラム（アマシャムバイオサイエンス社の陰イオン交換クロマトグラフィーカラム）に通して（running bufferは50mM Glycine NaOH、pH10.8を使用）、素通りする画分を収集した。この画分を10mM Hepes、10mM DTT（pH7.8）で透析し、Resource Sカラム（アマシャムバイオサイエンス社の陽イオン交換クロマトグラフィカラム）に通して（running bufferは10mM Hepes、10mM DTT、pH7.8を使用）、素通りする画分を収集した。この画分が精製された26kDaタンパク質である。こうして得た26kDaタンパク質をPVDF膜に転写し、オートマチックアミノ酸シークエンサーModel 473A（アプライドバイオシステム社）を用いてN末側のアミノ酸配列を決定した。
【００５１】
実施例２［３４ｋＤａタンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体の調製］
BT A1470株由来の32kDaタンパク質をPVDF膜（Bio-Rad，Hercules, Ca, U.S.A.）に転写し、プロテインシーケンサーModel 473A（Applied Biosystems, Foster, CA, U.S.A.）を用いてＮ末端配列を決定した。このＮ末端の10個のアミノ酸配列（AlaIleIleAsnLeuAlaAsnGluLeuAla：配列番号５）を、20-mer縮重オリゴヌクレオチドプローブ（GAAATT(A)TATGGT(A)ATGCAATA：配列番号６）（32kDa F2オリゴヌクレオチド）の設計に使用した。このオリゴヌクレオチド配列は、32kDaタンパク質Ｎ末端配列のＥ（10番目）からＹ（16番目）に対応している。
【００５２】
さらに、このタンパク質のＮ末端以外のアミノ酸配列をClevelandら（Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MWおよびLaemmli UK (1977) Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis, J. Biol. Chem., 252(3), 1102-1106）の方法によって決定した。このタンパク質を、Staphylococcus aureus V8 protease（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）で処理し、得られた内部ペプチドを15% SDS-PAGEで分離した。分離した内部ペプチドのうち1つのＮ末端配列を上記の方法で決定した。始めの19個のアミノ酸配列（GlyAlaValThrAsnGluAsnLysTyrThrLeuAspAlaThrGlnAspPheArgAsp：配列番号７）を、20-mer縮重オリゴヌクレオチドプローブ（GTATATTTATTTTCATTT(A)GT：配列番号８）（32kDa R2オリゴヌクレオチド）の設計に使用した。このオリゴヌクレオチド配列は、上記19個のアミノ酸配列のＴ（10番目）からＴ（4番目）に対応している。
【００５３】
次に、32kDa F2オリゴヌクレオチドおよび32kDa R2オリゴヌクレオチドを用いて、BT A1470株の全プラスミドについてＰＣＲを行なった。その結果、400bpのＰＣＲ産物が得られ、これを精製した。次いで、精製400bp ＰＣＲ産物をECL nucleic acid labeling system (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)によってペルオキシダーゼで標識し、プローブを作製した。次いで、BT A1470株に含まれる全てのプラスミドＤＮＡを抽出し、このプラスミドＤＮＡを制限酵素（ClaI）処理によってフラグメントに切断した。ペルオキシダーゼで標識したプローブは、上記フラグメントのうち約6.6kbのClaIフラグメントに特異的にハイブリダイズした。
【００５４】
BT A1470株プラスミドのフラグメント(5〜7kb)をpBluescript SK(+)のClaI部位に挿入した。標識プローブを用いて、このプラスミドで形質転換した大腸菌（Escherichia coli）DH5αに対するハイブリダイゼーションを確認した。この大腸菌DH5αは、pSHAN32.1プラスミドを含んでいた。このプラスミドは6.6kb ＤＮＡフラグメントを有し、その中に32kDaタンパク質の他、ORF1および本発明の34kDaタンパク質の遺伝子が含まれていた。
【００５５】
この34kDaタンパク質遺伝子の5’および3’末端ヌクレオチド配列をもとに34kDa F1オリゴヌクレオチド（GGTGGATCATATGGCGATTAT：配列番号９）および34kDa R1オリゴヌクレオチド（CTAGCTCGAGCTGAAGAGATACCACAGGGTCAA：配列番号１０）を設計した。その２種オリゴヌクレオチドを用いて、pSHAN32.1を鋳型としてPCRを行った。その結果、5’末端には制限酵素NdeI、3’末端には制限酵素XhoIの認識配列を付加した34kDaタンパク質のヌクレオチド配列がPCR産物として得られた。次いで、このPCR産物を制限酵素NdeIおよびXhoIで処理し、同じ制限酵素で処理された発現ベクターpET30a(＋)（Stratagene、La Jolla, CA）に挿入した結果、プラスミドpSHAN34.2を得た。次いで、このプラスミドpSHAN34.2を大腸菌 BL21(Stratagene、La Jolla, CA)に形質転換して、大腸菌BL21(pSHAN34.2)株を得た。
【００５６】
実施例３［形質転換体からの３４ｋＤａタンパク質の調製］
実施例２で得た大腸菌株をLB培地に植えて、37℃で振とうしながら1晩培養した。これを8,000×g、15分の遠心分離で集菌し、-20℃で凍結した。集菌し凍結した大腸菌を溶解液（50mM Tris-HCl(pH8)、25%Sucrose、1mM EDTA）10mLに分散し、10mg/mLリゾチームを0.5mL入れて、室温で30分放置し、その後超音波破砕機で3分間処理し、10mL界面活性剤液（0.2M NaCl、1%デオキシコール酸ナトリウム、1%Nonidet P-40）を入れて室温で30分間放置した。これを8,000×gで30分遠心分離すると目的のタンパク質を含む封入体を回収できた。1％TritonX-100、1mM EDTA液20mLで洗浄し、8,000×gで15分遠心分離する操作を2回繰り返し、蒸留水で３回洗浄した。こうして得た目的のタンパク質を含む封入体を50mM Na2CO3（pH10.8）、10mM DTTおよび1mM EDTAからなるアルカリ緩衝液240μlを加えて37℃で１時間可溶化した。次に遠心分離により目的タンパク質を含む上清を回収した。
【００５７】
実施例４［３４ｋＤａタンパク質からの活性化タンパク質の調製］
実施例３で得た上清を0.45μmのフィルターに通して不溶物を濾過後、1N塩酸でpH9.2に調製し、これに最終濃度が30μg/mlとなるように1mg/mlのプロテイナーゼＫ（和光純薬製；ロットナンバーPAQ7953）を加え、37℃で1.5時間インキュベートした。その後、100mMのPMSFを最終濃度で1mMになるように加えてプロテイナーゼＫによるプロセシングを停止させた。1N HClによって溶液のpHを中性付近に戻し、フィルターでの濾過によって除菌して、活性化タンパク質溶液を得た。
【００５８】
実施例５［SDS-PAGE電気泳動およびウエスタンブロッティング］
実施例２で得た大腸菌BL21(pSHAN34.2)株が発現するタンパク質について調べるため、同大腸菌株が生産するタンパク質のプロフィールをプロテイナーゼＫ処理前および処理後で比較した。
（１）SDS-PAGE電気泳動
15%泳動ゲルおよび4%濃縮ゲルを用いてSDS-PAGE電気泳動を行った。分子量マーカーは、Bio-Rad社製（250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15および10kDa）を用い、実施例３で得たタンパク質溶液および実施例４で得た活性化タンパク質溶液を泳動した。結果を図１に示す（Std：分子量マーカー；レーン1：プロテイナーゼＫ処理前；レーン2：プロテイナーゼＫ処理後）。
【００５９】
（２）ウエスタンブロッティング
さらに、プロテイナーゼＫ処理後のタンパク質についてウエスタンブロッティングを行なった。電気泳動したタンパク質をPVDF膜（Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.）に転写し、一次抗体（実施例１で得た活性型精製タンパク質を用いて調製）および二次抗体（アルカリフォスフォターゼ標識抗ウサギIgG）を用いて活性タンパク質を検出した。
【００６０】
以上の結果から、大腸菌BL21(pSHAN34.2)株がBT A1470株と同じ分子量（34kDa）のタンパク質を生産すること、さらに、この得られた34kDaタンパク質が、アルカリ緩衝液で可溶化され、次いでプロテイナーゼＫ処理後にBT A1470株と同様に活性型の26kDaタンパク質を生成することが明らかになった。
【００６１】
実施例６［培養細胞の調製］
種々の細胞株を表１に示される条件で培養し、それら培養された各細胞について、2.2×105細胞/mlの濃度で96ウェルマルチウェルプレートに90μlずつ分注した。この96ウェルマルチウェルプレート中で細胞をさらに24時間培養し、次いで試験に用いた。
【００６２】
【表１】
2005333865.tif 000002
【００６３】
実施例７［種々の癌細胞に対する細胞障害効果の測定］
大腸菌組換え株由来の26kDaタンパク質の細胞障害活性を、ＭＴＴ法による細胞生存率で測定し、EC50を計算した。まず、実施例４に記載の方法によって調製した活性型の26kDaタンパク質を得た。次に96ウェルマルチタイタープレートの各ウェル中の培養細胞に、26kDaタンパク質を終濃度で2μg/mlから1/2の段階希釈になるように添加した。細胞生存率の測定をタンパク質添加の20時間後に行なった。細胞生存率については、市販のCellTiter96TM試薬（プロメガ株式会社製）を用いてＭＴＴ法により測定した。EC50の計算結果を表２に示す。また、このうち本タンパク質が特に高い細胞傷害活性を示したCACO-2細胞とSawano細胞のＭＴＴ法による細胞生存曲線をそれぞれ図２と図３に示す。さらに本タンパク質がほとんど細胞傷害活性を示さなかったHC細胞に対する細胞生存曲線を図４に示す。
【００６４】
【表２】
2005333865.tif 000003
【００６５】
表２に示される結果から、本発明の26kDaタンパク質は、特定の細胞、とりわけ特定のヒト癌細胞を特異的に認識し、選択的な細胞障害性を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、特定の細胞に対して選択的な細胞認識および細胞障害活性を有する新規なタンパク質およびその前駆体タンパク質を提供する。本発明の活性タンパク質は、特定の細胞、とりわけ特定のヒト癌細胞に対して選択的に細胞障害活性を示すことから、特定の癌を攻撃する抗癌剤として特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のバチルス・チューリンジエンシスＡ１４７０株由来タンパク質のプロテイナーゼＫ処理前および処理後におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。
【００６８】
【図２】本発明の活性タンパク質で処理後のＣＡＣＯ−２細胞のＭＴＴ法による細胞生存曲線を示す。
【００６９】
【図３】本発明の活性タンパク質で処理後のSawano細胞のＭＴＴ法による細胞生存曲線を示す。
【００７０】
【図４】本発明の活性タンパク質で処理後のＨＣ細胞のＭＴＴ法による細胞生存曲線を示す。
【図１】
2005333865.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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