(57)【要約】【課題】本発明の目的は、シイタケに含まれる有効成分を含む分画物を提供することである。また、酸化物質関連疾患に対する有効な予防手段または治療手段を提供し、また当該治療手段となりうる医薬組成物、食品および飲料を提供することである。【解決手段】本願発明は、１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；を含む方法により調製される、シイタケ菌糸体抽出物の分画物を提供する。また、本発明により、当該分画物を含む医薬組成物、食品、飲料などが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノール類を含有するシイタケ菌糸体抽出物の分画物であって、
１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および
２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；
を含む方法により調製することができる前記分画物。
【請求項２】
請求項１に記載の分画物を含む抗酸化剤。
【請求項３】
請求項２に記載の抗酸化剤を含む、肝障害の治療または予防のための医薬組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の抗酸化剤を含む経口摂取用組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の抗酸化剤を含む食品。
【請求項６】
請求項２に記載の抗酸化剤を含む飲料。
【請求項７】
請求項１に記載の分画物を含む生体膜保護剤。
【請求項８】
請求項７に記載の生体膜保護剤を含む、生体膜保護のための医薬組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の生体膜保護剤を含む経口摂取用組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の生体膜保護剤を含む食品。
【請求項１１】
請求項７に記載の生体膜保護剤を含む飲料。
【請求項１２】
請求項１に記載の分画物を含む肝臓保護剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の肝臓保護剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の肝臓保護剤を含む経口摂取用組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の肝臓保護剤を含む食品。
【請求項１６】
請求項１２に記載の肝臓保護剤を含む飲料。
【請求項１７】
ポリフェノール類を含有するシイタケ菌糸体抽出物の分画物の調製方法であって、
１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および
２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、薬理効果を有するシイタケ菌糸体由来の分画物、および当該分画物の製造方法に関する。さらに本発明は、当該分画物を含む経口摂取組成物、医薬組成物、抗酸化剤、生体膜保護剤および肝臓保護剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の各種難治疾患、成人病、癌や悪性腫瘍の発生の増加に対する、食物繊維や食用キノコの有用性が注目されており、この分野での様々な研究が報告されている。なかでもシイタケ（椎茸）は日本、中国の代表的な食用キノコで、日本では３００年前から人工栽培が行われている。
【０００３】
シイタケに含まれる薬理作用を有する具体的な成分としては、食用とされる子実体から分離されたエリタデニンのコレステロール低下作用（非特許文献１を参照）、レンチナンの抗癌作用（非特許文献２および３を参照）がよく知られている。１９８５年には製剤化されたレンチナンが胃がんの注射薬として販売が開始されている。
【０００４】
シイタケの菌糸体は、食用にされる子実体の前段階で、菌糸の状態のものであるが、消化吸収がよく栄養価が高いということで注目され、その薬理作用について多くの報告がされている。なかでも、ラットおよびマウスでの発癌実験において、実験動物の大腸、肝臓などの腫瘍形成および移植腫瘍細胞の増殖を抑制し、生存率を上昇させる作用（非特許文献４および５を参照）、抗体産生を増強し抗体を介するＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）による免疫学的肝細胞障害に抑制的効果を示す作用（非特許文献６を参照）、免疫調節作用（非特許文献７を参照）などについて、注目すべき報告がされている。また植物に対する作用では、発根促進、農作物の成長促進などの植物ホルモン様作用（非特許文献８を参照）や抗植物ウイルス作用（非特許文献９および１０を参照）のあることも報告されている。しかし、シイタケの菌糸体に関しては、その薬理作用のメカニズムや具体的な有効成分についての報告はほとんどされていない。実際、シイタケ菌糸体抽出物（ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ  ｍｙｃｅｌｉａ）には、レンチナンの主鎖である１，３−β−Ｄ−グルカンは約０．００１８％とごく微量しか含まれておらず、エリタデニンはほとんど含有されていないことから、シイタケの菌糸体の薬理作用は、これらの成分以外のものが関与して発現している可能性が高い。
【０００５】
さらにシイタケ菌糸体抽出物が有する生体膜保護作用および抗酸化作用に関していくつかの報告がされている（非特許文献１１を参照）。特に抗酸化活性に関しては、生体内における活性酸素（例えば、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素）などの酸化物質は、多くの疾患と関連することが知られており、そのような疾患には、癌、炎症、アレルギー性疾患、動脈硬化や虚血性心疾患などの循環器系疾患、肺気腫や喘息などの呼吸器系疾患、胃潰瘍や十二指腸潰瘍などの消化器系疾患などが含まれる。またシイタケ菌糸体は、比較的安価で経済性に優れ、かつ永年にわたって食品として摂取され続けてきたものである。従って、有用な薬理作用を有するシイタケ菌糸体由来の成分は、ヒトに投与した場合の安全性に優れており、特に長期間経口的に投与した場合の安全性に優れていると考えられる。
【０００６】
したがって、例えば抗酸化活性または生体膜保護活性などの有用な薬理作用についての有効成分を効率よく摂取するために、有効成分を高濃度で含むシイタケの菌糸体成分の分画物は、種々の疾患の治療および／または予防のための有効な手段となりうるものであり、当該分画物を効率よく調製するための方法が求められている。
【特許文献１】特開平１１−２２８４４０号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、第９巻、第１４９−１５６頁、２００２年
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、第１０巻、第８５５−８６１頁、１９８８年
【非特許文献３】Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、第４０９−４３５頁、１９８４年
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１７巻、第１０９−１１４頁、１９８２年
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２７巻、１−６頁、１９８５年
【非特許文献６】肝胆膵、第１５巻、第１２７−１３５頁、１９８７年
【非特許文献７】和漢医薬学会誌、第８巻、第１６２−１６６頁、１９９１年
【非特許文献８】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第２６巻、第２２１−２２８頁、１９８５年
【非特許文献９】Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１７７巻、第２３５−２４４頁、１９８８年
【非特許文献１０】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第５４巻、第１３３７−１３３９頁、１９９０年
【非特許文献１１】和漢医薬学雑誌、第１９巻（増刊号）、第１６１頁、２００２年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、特異的に生理活性を有するシイタケ菌糸体の分画物の調製方法を見出し、さらに当該分画物が抗酸化作用および生体膜保護作用、ならびに肝保護作用を有することを発見して本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の目的は、抗酸化作用および／または生体膜保護作用、ならびに肝障害の治療作用および／または予防作用を有するシイタケ菌糸体由来の分画物、および当該分画物を含む抗酸化剤、生体膜保護剤、肝臓保護剤および経口摂取用組成物、ならびに当該抗酸化剤、生体膜保護剤または肝臓保護剤を含む医薬組成物、経口摂取用組成物、食品および飲料を提供することである。
【０００９】
すなわち本願発明の一つの側面によれば、ポリフェノール類を含有するシイタケ菌糸体抽出物の分画物であって、１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；を含む方法により調製される前記分画物が提供される。
【００１０】
本発明の他の側面によれば、前記沈殿画分を含む抗酸化剤が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、前記抗酸化剤を含む医薬組成物が提供される。該医薬組成物は特に限定はされないが、例えば肝障害の治療および／または予防のために用いることができる。さらに、本発明の他の側面によれば、前記抗酸化剤を含む経口摂取用組成物、食品および飲料が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、前記沈殿画分を含む生体膜保護剤が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、前記生体膜保護剤を含む医薬組成物が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、前記生体膜保護剤を含む経口摂取用組成物、食品および飲料が提供される。
【００１２】
本発明の別の側面によれば、前記沈殿画分を含む肝臓保護剤が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、前記肝臓保護剤を含む医薬組成物が提供される。さらに、本発明の他の側面によれば、前記肝臓保護剤を含む経口摂取用組成物、食品および飲料が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、ポリフェノール類を含有するシイタケ菌糸体抽出物の分画物の調製方法であって、
１）シイタケ菌糸体抽出物に、エタノールを含有する溶液を加え、当該溶液に対する可溶性画分を得る工程；および
２）当該可溶性画分をゲルろ過クロマトグラフィーに供し、蒸留水で溶出をおこなった後、メタノールを含有する溶液で溶出を行い、当該溶液による溶出画分を得る工程；
を含む前記方法が提供される。
【００１４】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明におけるシイタケ菌糸体は、培養により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよく、例えばシイタケ菌を固体培地で培養して得られる菌糸体を用いることができる。本発明において用いられるシイタケ菌糸体抽出物は、当該技術分野において公知の方法により調製することができるが、例えば、菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下に粉砕、分解して得られる抽出物を用いることができる。当該シイタケ菌糸体抽出物は、限定はされないが、例えば以下の方法により得られたものを使用することができる。すなわち、バガス（サトウキビのしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう解束し、この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５５℃の温度に保ちながら添加するとともに、前記固体培地を前記酵素の存在下に粉砕、すりつぶしてバガス繊維の少なくとも７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし、次いで９０℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させるとともに滅菌し、得られた懸濁状液をろ過することによってシイタケ菌糸体抽出液を得る。当該抽出液をシイタケ菌糸体抽出物として用いてもよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存し、使用時に種々の形態で使用するのが便宜的である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末で、吸湿性があり、特異な味と臭いをもつ。このようにして得られるシイタケ菌糸体抽出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を１５〜５０％、好ましくは２０〜４０％（ｗ／ｗ）、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質分析によりタンパク質を１０〜４０％、好ましくは１３〜３０％（ｗ／ｗ）、没食子酸を標準とするＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法によりポリフェノール類を１〜５％、好ましくは２．５〜３．５％（ｗ／ｗ）含む。シイタケ菌糸体抽出物にはそのほかに脂質約０．１％、繊維約０．４％、灰分約２０％を含むが、これに限定されない。
【００１５】
また、シイタケ菌糸体抽出物の構成糖組成（％）の一例は以下の通りであったが、この組成は培養条件などによって変動しうる：キシロース：１５．２；アラビノース：８．２；マンノース：８．４；グルコース：３９．４；ガラクトース：５．４；アミノ糖：１２．０；ウロン酸：１１．３。
【００１６】
本発明における「エタノールを含有する溶液」とは、溶媒中にエタノールを容積比で２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％、最も好ましくは４５〜５５％含む溶液を意味する。当該溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができ、好ましくは水を用いることができる。当該溶液とシイタケ菌糸体抽出物との混合物は、例えば一定時間静置することにより、当該溶液に対する可溶性成分を含む画分を得ることができる。ここで静置する時間は、限定はされないが例えば６時間〜１００時間、好ましくは２４時間〜８４時間、より好ましくは６０時間〜８４時間とすることができる。また、調製に要する時間を短縮するために、必要に応じて当該混合物を加熱および／または攪拌してもよい。当該混合物における不溶物をろ過やデカンテーションなどの方法により取り除くことにより得られる可溶性画分は、そのまま溶液として使用することもできるが、必要に応じて濃縮および／または凍結乾燥などを行うことにより得られる濃縮液、粘稠物質または固体を可溶性画分として、次の工程において使用することができる。
【００１７】
本発明におけるゲルろ過カラムクロマトグラフィーは、本発明の技術分野において知られている通常の方法により行うことができる。本発明におけるゲルろ過カラムクロマトグラフィーには、当該技術分野において通常使用される担体を用いて行うことができる。担体の具体例には、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲなどが含まれる。ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの溶出液として使用される水は、蒸留水、純水、超純水などであり、好ましくは蒸留水が使用される。本発明における「メタノールを含有する溶液」とは、溶媒中にメタノールを容積比で５０〜１００％、好ましくは７０〜１００％、さらに好ましくは９０〜１００％含む溶液を意味し、好ましくは市販の９９．８％メタノール溶液を用いることができる。当該溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができ、好ましくは水を用いることができる。本発明の分画物は前記メタノールを含有する溶液の溶出画分として得られる。当該溶出画分を、例えば減圧濃縮、凍結乾燥、および透析などのさらなる精製などの処理を施して得られる濃縮液、粘稠物質および固体も本発明に含まれる。
【００１８】
本発明におけるゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製により、一般的には比較的低分子量の極性物質を含む分画物を得ることができるが、本発明はそのような分画物に限定されない。本発明の分画物は、例えばポリフェノール類（フェノール類、フェノールを含む）、タンパク質、糖類を含みうる。本明細書で用いられる用語「ポリフェノール類」とは、既知のフェノール類検出方法であるＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により定量される全フェノール成分を意味し、フェノールを含む。また用語「フェノール」とは、芳香族炭化水素核の水素原子をヒドロキシル基で置換した化合物の総称を意味する。
【００１９】
本発明の分画物は、例えばカテキンを標準物質とするＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により定量されるポリフェノール類を１１〜３５％、好ましくは１２〜３０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは１３〜２０％（ｗ／ｗ）、例えば１２％以上含みうる。特に限定はされないが、例えばポリフェノール類には、５−ヒドロキシメチルフルフラール、プロトカテキュ酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）およびガリック酸メチルなどのフェノール類（ポリフェノールまたは多価フェノール）、ならびにシリンガ酸およびバニリン酸などのフェノールが含まれる。
【００２０】
また当該分画物は、例えばＬｏｗｒｙ法によるタンパク質分析により定量されるタンパク質を６０〜８０％、好ましくは６５〜８５％（ｗ／ｗ）、例えばフェノール−硫酸法による糖質分析により定量される糖質を０〜２０％、好ましくは５〜１５％（ｗ／ｗ）含みうる。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「抗酸化剤」とは、一般的には、生体内における活性酸素（例えば、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素）などの酸化物質の作用を消去または減弱させる薬剤を意味する。活性酸素による組織障害に起因する疾患としては、限定はされないが、癌、炎症、アレルギー性疾患、動脈硬化や虚血性心疾患などの循環器系疾患、肺気腫や喘息などの呼吸器系疾患、胃潰瘍や十二指腸潰瘍などの消化器系疾患、糖尿病の合併症および皮膚疾患などを挙げることができる。例えば、本発明の抗酸化剤は、肝障害、皮膚疾患および老化の予防および／または治療における効果が期待できる。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「生体膜」とは、各種細胞や細胞小器官を囲む膜を意味する。細胞には各種臓器、器官、組織の細胞、血液細胞、生殖細胞などを含む。細胞小器官は、一定の機能を有する細胞質の有形成分であり、ゴルジ体、ミトコンドリア、中心小体、リボソーム、小胞体、リソソーム、核膜などを含む。
【００２３】
本明細書で用いられる「生体膜保護」とは、生体膜を安定化させること、生体膜を各種原因に由来する傷害、破損などから保護すること、生体膜の傷害、破損などを予防および治療することを含む。生体膜の傷害、破損に起因すると考えられている疾患には、限定はされないが、例えば、高コレステロール血症、冠動脈疾患などが含まれる。例えば、肝傷害時の指標となる血清ＡＳＴやＡＬＴの上昇は肝細胞膜傷害により細胞内ＡＳＴ、ＡＬＴが細胞外に流出した結果であると考えられており、本発明の生体膜保護剤によって肝障害の改善が期待できる。
【００２４】
本明細書で用いられる「肝臓保護剤」とは、一般的には、薬物や有害物質による肝障害、免疫学的肝障害、ウィルス性肝障害、脂肪肝、肝癌、アルコール性肝障害、肝硬変などによる肝臓機能の低下を抑制するもの、肝臓を保護するもの全般を意味する。
【００２５】
本発明の抗酸化剤、生体膜保護剤および肝臓保護剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができるが、これらには限定されない。当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
【００２６】
本発明の抗酸化剤、生体膜保護剤および肝臓保護剤の投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、治療有効量および／または予防有効量の抗酸化剤、生体膜保護剤および／または肝臓保護剤を含むことができる。例えば本発明のシイタケ菌糸体抽出物の分画物として、一般に１０〜５００００ｍｇ／日／成人、好ましくは１００〜５０００ｍｇ／日／成人の用量で使用される。当該医薬組成物の投与は、単回投与または複数回投与であってもよく、たとえば他の抗酸化剤、生体膜保護剤、肝臓保護剤などの他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【００２７】
また、本発明の経口摂取用組成物は、そのまま機能性食品として使用できるほか、医薬品、医薬部外品、飲食物等の成分、食品添加物などとして使用することができる。当該使用により、本発明の抗酸化効果、生体膜保護効果および肝臓保護効果を有する当該経口摂取用組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な抗酸化作用、生体膜保護作用および肝臓保護作用による体質改善、酸化物質に起因する疾患の治療および発症の予防が可能となる。本発明の抗酸化剤、生体膜保護剤または肝臓保護剤を含む食品または飲料の例としては、抗酸化効果、生体膜保護効果もしくは肝臓保護効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが含まれる。本発明の食品または飲料は、限定はされないが、シイタケ菌糸体抽出物の分画物の他に、鉄およびカルシウムなどの無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖およびキトサンなどの食物繊維、大豆抽出物などのタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖および乳糖などの糖類を含むことができる。
【発明の効果】
【００２８】
以下の実施例で示すように、本発明の分画物は抗酸化作用、生体膜保護作用、および肝臓保護作用を有することが明らかとなった。特に本発明は、種々の肝毒素（ネクローシス誘導性肝毒素、アポトーシス誘導性肝毒素など）に対しての肝細胞保護効果、および当該効果に起因する肝臓保護効果も有する。したがって本発明により、酸化物質関連疾患、生体膜破損に起因する疾患、および肝臓疾患に対する治療および／または予防のための有効な手段を提供する。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  シイタケ菌糸体抽出物の調製方法
バガス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、シイタケ菌糸を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇに、純水３．５Ｌを加え、４０℃に保ちながら精製セルラーゼ２．０ｇを加え培地含有混合物とした。次いで培地含有混合物を変速付ギヤーポンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分における粉砕およびすりつぶし作用を２００分間程度加え、バガス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕およびすりつぶしは、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。その後、培地含有混合物をさらに加熱して９０℃として３０分間放置し、酵素を失活せしめ、かつ殺菌を施した。得られた培地含有混合物を６０メッシュろ布を用いてろ過して、濃縮した後、凍結乾燥粉末をシイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）として得た。
【００３０】
［実施例２］  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の調製および成分の同定
２−１  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の調製
シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）を５０％エタノール水溶液に加え３日間静置し、抽出を行った。不溶画分を濾別し、可溶画分である抽出液を減圧ろ過した後の凍結乾燥により、シイタケ菌糸体抽出物に対して約９０重量％収率で茶褐色の５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）を得た。不溶画分は適量の蒸留水に分散させた後、凍結乾燥により褐色の５０％エタノール水溶液不溶画分（ＥＩ）を得た。得られたＥＳ画分を少量のエタノールで溶解し、ゲルろ過クロマトグラフィーに供した。担体にはＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用い、移動相としてまず蒸留水を用い、その後メタノールを用いて溶出を行った。メタノールで溶出した画分を減圧濃縮、凍結乾燥し、シイタケ菌糸体抽出物に対して約１０重量％の収率でメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）を得た。
２−２  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の成分構成比の測定
得られた各画分の成分構成比を以下の定量分析法により算出した。即ち、糖はフェノール硫酸法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒ．Ｌ．ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＭ．Ｌ．Ｗｏｌｆｒｏｍ編、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第１巻、第３８８頁、１９６２年を参照。）、タンパク質はＬｏｗｒｙ法の改良法であるＢＣＡ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１５０巻、第７６頁、１９８５年を参照。）、ポリフェノール類はＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法（Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｔａｎｎｉｎｓ：  Ｃｏｎｓｅｑｕｗｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｍｅｄｉｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  第１３巻、１９８９年を参照。）により定量した。Ｆｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法の測定条件は以下の通りである。
【００３１】
標準物質：カテキン
検量線の作成：任意の濃度のカテキンの１点と原点とにより作成
測定波長：７６０μｍ
検液濃度：０．２％（Ｗ／Ｗ）
シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）、５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）についての成分測定結果の一例を表１に示す。表１に示される測定結果より、シイタケ菌糸体抽出物と５０％エタノール水溶液抽出画分はほぼ同一の成分構成比を有するが、メタノール溶出画分においてはタンパク質とポリフェノール類の構成比が著しく高いことが明らかとなった。ただし、この組成はシイタケ菌糸体培養条件などによって変動しうるものである。
【００３２】
表１．シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）、５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）およびメタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）についての成分比（重量％）
【００３３】
【表１】
2005132812.tif 000002
【００３４】
２−３  シイタケ菌糸体抽出物の分画物の成分の同定
得られたＥＳ−Ｍｅ画分をエタノール：メタノール＝１：１の溶液に溶解させ試料とし、オープンカラムクロマトグラフィー（ＬＨ−２０ｇｅｌ、流速：１．５ｍｌ／分）を用いて１２２本の試験管に分取した。これらの試験管について、波長２８０ｎｍにおける吸光度およびＤＰＰＨラジカル消去活性を測定し、その結果に基づき４つのフラクションに分けた。フラクションについて以下の条件でＨＰＬＣ分析を行い、リテンションタイムより各フェノールを同定した。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＨＧ−５（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ）
流速：１０ｍｌ／分
温度：３５℃
溶離液：メタノール／０．０１％ＴＦＡ＝５／９５〜９０／１０（４５分）
その結果、最もＤＰＰＨラジカル消去活性が強いフラクション中に、シリンガ酸（ＲＴ：２０．７分）、バニリン酸（ＲＴ：１９．８分）およびプロトカテキュ酸（３，４−ジヒドロキシ安息香酸）、ガリック酸メチルが含まれることを確認した。また、２番目に活性が強いフラクション中に、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＲＴ：１０．９分）が含まれることを確認した。
【００３５】
［実施例３］  肝ミクロソームの脂質過酸化反応に及ぼすシイタケ菌糸体抽出物分画の作用
３−１  肝ミクロソームの分離・調製
２４時間絶食したＷｉｓｔａｒ系雄性ラット１０週齢を軽エーテル麻酔下で脱血屠殺し、冷却生理食塩水で肝臓を還流した後、生理食塩水で肝ホモジネート液を作製した。この肝ホモジネートを、１０，０００×ｇで１０分間遠心した後、その上清を１００，０００×ｇ  で６０分間遠心し、沈殿を脱イオン蒸留水で洗浄した後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）に懸濁後、ホモジナイザーで再び均一に分散させ、ミクロソーム分画懸濁液とした。ＢＣＡ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１５０巻、第７６頁、１９８５年を参照。）により蛋白濃度を測定し、５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ懸濁液に調製した。
３−２  肝ミクロソームによる脂質過酸化反応
具体的な実験操作は福沢らの方法を参考に行った（ビタミン、第６３巻、第２１５頁、１９８９年を参照。）。０．１ｍｌの被検物質溶液、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を０．６ｍｌ、３−１で調製したミクロソーム溶液（５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ）を０．１ｍｌ（終濃度０．５ｍｇ）、１．７ｍＭのＡＤＰ・Ｎａと０．１ｍＭのＦｅＣｌ3の混合溶液からなるＡＤＰ・Ｆｅ3+溶液を０．１ｍｌ（終濃度ＡＤＰ  ０．１７ｍＭ  ＦｅＣｌ3  ０．０１ｍＭ）、および１ｍＭのＮＡＤＰＨを０．１ｍｌ（終濃度０．１ｍＭ）を混合し、３７℃でインキュベートし、インキュベート開始時（０分）ならびに開始後５分、１５分および３０分後に過酸化脂質の値を測定した。
３−３  過酸化脂質量の測定
ＴＢＡ法に改良を加えたＢｕｅｇｅおよびＡｕｓｔの方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第５２巻、第３０２−３１０頁、１９７８年を参照。）で５３５ｎｍの吸光度を指標として過酸化脂質の生成量を測定した。すなわち、反応溶液全量１ｍｌと、ＴＢＡ試薬２ｍｌ、５０ｍＭのＢＨＴエタノール溶液３０μｌを遠沈管に加え、１００℃１５分インキュベートした。インキュベート後速やかに冷却し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清に生成するマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を分光光度計（Ｏ．Ｄ．５３５ｎｍ）を用いて測定した。その測定結果を図１に示す。対照のＭＤＡの値は反応開始５分後に約３ｎｍｏｌ／ｍｌと著しく上昇し、３０分後の反応終了時までほぼ同様の値を示した。Ｌ．Ｅ．Ｍ．およびＥＳ−Ｍｅはこのミクロソームの脂質過酸化反応を抑制し、特にＥＳ−Ｍｅによる抑制は顕著であった。即ち、Ｌ．Ｅ．Ｍ．においては、終濃度１ｍｇ／ｍｌでほぼ１００％の抑制率を示したものの、０．５ｍｇ／ｍｌで８５％、０．２５ｍｇ／ｍｌで６０％、０．１２５ｍｇ／ｍｌで４５％と減少した。それに対し、ＥＳ−Ｍｅでは、最も低濃度である、終濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌの溶液中でもほぼ１００％の抑制を示した。
［実施例４］  ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性の測定
Ｍ．Ｓ．Ｂｌｏｉｓらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第１８１巻、第１１９９−１２００頁、１９５８年）の変法により測定した。５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、エタノール、０．５ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）をそれぞれ２：２：１の割合で混和した反応液を２５℃にてインキュベートし、最終濃度がそれぞれ０．０５、０．１、０．２および０．４ｍｇ／ｍｌとなるように試料を混和し、５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。反応溶液にサンプルを加えたときの吸光度をＡｂｓ（サンプル）、サンプル液の代わりに水を加えたときの吸光度をＡｂｓ（対照）として、以下の式によりＤＰＰＨラジカルの消去活性を求めた。
【００３６】
【化１】
2005132812.tif 000003
【００３７】
その測定結果を図２に示す。Ｌ．Ｅ．Ｍ．の終濃度０．１ｍｇ／ｍｌより低濃度ではＤＰＰＨラジカル消去活性は１０％未満であるが、ＥＳ−Ｍｅでは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度まで約８０％のラジカルの消去活性を示し、０．０５ｍｇ／ｍｌ溶液中でも約４０％の活性が認められた。
［実施例５］  Ｏ2ラジカル（Ｏ2・-）消去活性の測定
具体的な実験操作はＧ．Ｒ．Ｂｕｅｔｔｎｅｒの方法を参考に行った（Ｆｒｅｅ．Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．第３巻、第２５９−３０３頁、１９８７年を参照。）。ＥＳＲ装置（ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ  ＥＳＲ  ｓｐｅｃｔｒｏ  ｍｅｔｅｒ：日本電子社製）を用いて、  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒポキサンチンとキサンチンオキシダーゼで発生するＯ2ラジカル（Ｏ2・-）消去活性を、Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳおよびＥＳ−Ｍｅについて測定した。
【００３８】
２．０ｍＭのヒポキサンチン（リン酸バッファー溶液、ｐＨ７．４）５０μｌ、および５．５ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＥＴＡＰＡＣ）（リン酸バッファー溶液、ｐＨ７．４）３５μｌを試験管にとり、これに種々の濃度のＬ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ、ＥＳ−Ｍｅの水懸濁液５０μｌを加え、さらに４．０ＭのＤＭＰＯ２０μｌ、および０．４ｕｎｉｔ／ｍｌのキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）５０μｌを添加し、攪拌後に生成するＯ2ラジカルの値をＥＳＲを用いて測定した。測定条件は磁場３３５．１±５ｍＴ、Ｍｎ：５６６、ｆｉｅｌｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ：０．７９×０．１、時定数：０．０３秒、掃引時間：１分、Ｐｏｗｅｒ：８、Ｇａｉｎ：×５００で室温測定した。Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳおよびＥＳ−Ｍｅは終濃度がそれぞれ０．４、０．２、０．１および０．０５ｍｇ／ｍｌになるよう添加した。Ｏ2ラジカル消去活性の値はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ．ＵＳＡ）の活性値に換算した。測定結果を図３に示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒポキサンチンとキサンチンオキシダーゼより生成するＯ2ラジカルは、Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ、ＥＳ−Ｍｅの添加で消去され、特にＥＳ−Ｍｅが著しい活性を示すことが明らかとなった。その力価をＳＯＤの値に換算して、Ｌ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳ、ＥＳ−Ｍｅを各々０．０５ｍｇ／ｍｌ（終濃度）添加した時１．７０、１．５９、８．００ｕｎｉｔ／ｍｌであった。その後試料の添加濃度を上げると、濃度依存的にＯ2ラジカル消去活性は増加し、ＥＳ−Ｍｅ０．４ｍｇ／ｍｌ溶液中の活性は４２．１０ｕｎｉｔ／ｍｌであった。
［実施例６］  赤血球溶血保護作用の測定
６−１  赤血球浮遊液の調製
１０週齢Ｗｉｓｔａｒ系の雄ラットから採血し（抗凝固剤としてヘパリン添加）、生理食塩水で２回洗浄し、等張緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ：０．２６ｇ、ＮａＨＰＯ4：１．１５ｇ、ＮａＣｌ：８．００ｇのＨ2Ｏ：１０００ｍｌの溶液、ｐＨ７．４）で希釈し、４０％（Ｖ／Ｖ）の赤血球浮遊液を作製した。
６−２  低張溶血保護作用
阿部らの方法（Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第３１６巻、２６２−２６５頁、１９８１年を参照。）に従い各種濃度のＬ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳおよびＥＳ−Ｍｅを含んだ低張緩衝液（５６ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸ナトリウム（１０ｍＭ）バッファー、ｐＨ７．４）と、同じ濃度のＬ．Ｅ．Ｍ．、ＥＳおよびＥＳ−Ｍｅを含んだ等張緩衝液を各々３．０ｍｌ、この対照として被検薬を含まない低張緩衝液、被検薬を含まない等張緩衝液を各々３．０ｍｌの合計４本を１セットとして同時に２０μｌの赤血球浮遊液を加え、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後直ちに、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清の吸光度（５４０ｎｍ）を測定した。サンプルを加えた低張緩衝液の吸光度をＡｂｓ（サンプル低張緩衝液）、サンプルを加えた等張緩衝液の吸光度をＡｂｓ（サンプル等張緩衝液）、低張緩衝液にサンプル液の代わりに水を加えたときの吸光度をＡｂｓ（対照低張緩衝液）、および等張緩衝液にサンプル液の代わりに水を加えたときの吸光度をＡｂｓ（対照等張緩衝液）として、被検薬物を含まない低張緩衝液中での溶血率を１００とした時の各々の溶液中での溶血率を次式より算出した。
【００３９】
【化２】
2005132812.tif 000004
【００４０】
測定結果を図４に示す。図４の各グラフにおいて、溶血率が１００以下の値は溶血保護作用を、１００以上の値は溶血促進作用を示す。Ｌ．Ｅ．Ｍ．およびＥＳ画分の終濃度０．４から０．０１３ｍｇ／ｍｌまで６段階のいずれの濃度においても、低張溶血に対する作用は認められなかった。一方ＥＳ−Ｍｅでは、０．０２５ｍｇ／ｍｌ溶液中で約６％、０．０５ｍｇ／ｍｌ溶液中で約１１％、０．１０ｍｇ／ｍｌ溶液中で約１２％、０．２０ｍｇ／ｍｌ溶液中で約４３％の溶血保護作用が認められた。この時の低張溶液の浸透圧を測定すると、対照は１４３ｍＯｓＭ、ＥＳ−Ｍｅ０．４ｍｇ／ｍｌ添加低張溶液は１４３ｍＯｓＭとであり、ＥＳ−Ｍｅを添加することにより浸透圧には影響を及ぼさないことがわかった。以上の結果より、ＥＳ−Ｍｅは、Ｌ．Ｅ．Ｍ．やＥＳにはない低張溶液中における生体膜保護効果を有することが確認された。
６−３  熱溶血保護作用
阿部らの方法（Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第３１６巻、第２６２−２６５頁、１９８１年を参照。）に従い、試験管に各種濃度のＬＥＭ、ＥＳおよびＥＳ−Ｍｅを含んだ等張緩衝液（１５４ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７．４）３．０ｍｌを入れた試験管を２本（ａ）と、この対照として被検薬を含まない等張緩衝液３．０ｍｌを入れた試験管を２本（ｂ）の合計４本を準備し、同時に２０μｌの赤血球浮遊液を添加し、（ａ）および（ｂ）の内の１本ずつは５４．５℃の水浴中で２０分間インキュベートし、残りの１本ずつは室温でインキュベートした。インキュベート後直ちに氷冷し、３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清の吸光度（５４０ｎｍ）を測定した。サンプル溶液に熱を加えたときの吸光度をＡｂｓ（サンプル加熱）、室温で処理したサンプル溶液の吸光度をＡｂｓ（サンプル非加熱）、サンプル液の代わりに水を加え加熱した溶液の吸光度をＡｂｓ（対照加熱）、およびサンプル液の代わりに水を加え室温で処理した溶液の吸光度をＡｂｓ（対照非加熱）として、被検薬物を含まない等張緩衝液中での溶血率を１００とした時の各々の溶液中での溶血率を次式より算出した。
【００４１】
【化３】
2005132812.tif 000005
【００４２】
Ｌ．Ｅ．Ｍ．およびＥＳにおいては０．０５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で熱溶血保護作用が認められたのに対し、ＥＳ−Ｍｅでは０．０１３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で溶血保護活性が認められ、０．０２５ｍｇ／ｍｌで最も強く、約３９％の溶血保護作用が認められた。また図５の結果から、ＥＳ−Ｍｅの溶血保護作用には至適濃度が存在することが示唆される。
［実施例７］  ブロモベンゼンの毒性に対する肝細胞保護効果の測定
ラットより単離した肝細胞を１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度でポリスチレン培養プレートに播種し、１０％血清入りＷＥ培地で２４時間初代培養した。播種後２４時間の培地交換の際に、ネクローシス誘導性の肝毒素であるブロモベンゼン（ＢＢ）１ｍＭ及び肝保護物質としてシイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）（０．２、０．１および０．０５ｍｇ／ｍｌ）、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）（０．１、０．０５および０．０１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。添加溶媒を加えてから２４時間後にトリパンブルーを用いた細胞数計測法を用いて、生細胞数を計測した。
【００４３】
測定結果を図６に示す。Ｌ．Ｅ．Ｍ．については０．０５ｍｇ／ｍｌでは肝細胞保護効果が確認されなかったのに対し、ＥＳ−Ｍｅについては最低濃度の０．０１ｍｇ／ｍｌまで保護効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】肝ミクロソームの脂質過酸化反応による過酸化脂質の発生量の測定値を示すグラフであり、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）と比して、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）がより顕著に脂質過酸化反応を抑制することを示すものである。
【図２】ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性の測定結果を示すグラフであり、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）と比して、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）がより高いラジカル消去活性を有することを示すものである。
【図３】Ｏ2ラジカル（Ｏ2・-）消去活性の測定値をスーパーオキシドジスムターゼ消去活性の活性値に換算した値を示すグラフであり、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）および５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）と比して、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）がより高いＯ2ラジカル消去活性を有することを示すものである。
【図４】図４は、低張溶液中における赤血球溶血率を測定した結果を示すグラフであり、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）が、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）や５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）にはない低張溶液中における生体膜保護効果を有することを示すものである。
【図５】加熱条件下における赤血球溶血率を測定した結果を示すグラフであり、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）が、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）や５０％エタノール水溶液抽出画分（ＥＳ）と比してより低濃度で加熱条件下における生体膜保護効果を発揮することを示すものである。
【図６】図６は、ブロモベンゼンの毒性に対する肝細胞保護効果を測定した結果を示すグラフであり、メタノール溶出画分（ＥＳ−Ｍｅ）が、シイタケ菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）と比してより低濃度で効果を発現することを示すものである。
【図１】
2005132812.tif 000006
【図２】
2005132812.tif 000007
【図３】
2005132812.tif 000008
【図４】
2005132812.tif 000009
【図５】
2005132812.tif 000010
【図６】
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