(57)【要約】【課題】ＬｏｌＡとＬｏｌＢの結晶構造を解明する。【解決手段】細菌リポタンパク質局在化因子であるＬｏｌＡおよびＬｏｌＢからなる群から選ばれるいずれかの結晶。【選択図】図１
2005008520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌リポタンパク質局在化因子であるＬｏｌＡおよびＬｏｌＢからなる群から選ばれるいずれかの結晶。
【請求項２】
前記結晶がＬｏｌＡの結晶であって、下記のいずれかの性質を有する請求項１に記載の結晶：
（１）空間群Ｉ２２２に属し、ａ＝５５．８Å，  ｂ＝７５．４Å  および  ｃ＝９９．５Åの単位格子定数を有する斜方晶系結晶；
（２）空間群Ｐ３１２１  （またはＰ３２２１）に属し、ａ＝ｂ＝６０．６Å  および  ｃ＝７９．０Åの単位格子定数を有する三方晶系結晶。
【請求項３】
前記結晶がＬｏｌＢの結晶であって、下記のいずれかの性質を有する請求項１に記載の結晶：
（１）  空間群Ｐ２１に属し、ａ＝３７．２Å，  ｂ＝１１２．４Å，  ｃ＝４７．８Åおよびβ＝１１１．４゜の単位格子定数を有する単斜晶系結晶；
（２）  空間群Ｐ６３２２に属し、ａ＝ｂ＝７１．４Å  および  ｃ＝１３３．９Åの単位格子定数を有する六方晶系結晶。
【請求項４】
請求項２または３に記載の少なくとも２種の細菌リポタンパク質局在化因子の３次元構造を比較することにより、細菌リポタンパク質の脂質結合に必要なアミノ酸および／または立体構造を決定する方法。
【請求項５】
図１に示される細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＡの立体構造であって、αヘリックス（α１，α２，α３）およびループ３−４が高い柔軟性を有するＬｏｌＡの立体構造。
【請求項６】
図２に示される細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＢの立体構造であって、残基Ａｌａ１−Ｐｒｏ９は無秩序であり、疎水性キャビティが溶媒に対して開かれているＬｏｌＢの立体構造（但し、ＬｏｌＢのアミノ酸配列の１位のアミノ酸はシステインまたはアラニンである）。
【請求項７】
以下の特徴の少なくとも１種を利用することを特徴とする細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＡおよび／またはＬｏｌＢの作用を調節する薬物の分子設計方法：
（１）ＬｏｌＡの閉じられた疎水性キャビティ構造
（２）ＬｏｌＢの開かれた疎水性キャビティ構造
（３）ＬｏｌＢのＬｅｕ６８残基のリポタンパク質の外膜への輸送機能
（４）相同性が８％のＬｏｌＡとＬｏｌＢの間の高い構造類似性
【請求項８】
ＬｏｌＡの閉じられた疎水性キャビティ構造の構成残基がＬ６  （Ａ１），  Ｌ１０  （Ａ１），  Ｆ１６  （Ｂ１），  Ａ１８  （Ｂ１），  Ｆ２０  （Ｂ１），  Ｌ３９  （Ｂ２），  Ｖ４１  （Ｂ２），  Ｒ４３  （Ｂ２），  Ｆ４７  （Ｂ３），  Ｗ４９  （Ｂ３），  Ｆ９０  （Ａ２），  Ｉ９３  （Ａ２），  Ａ９４  （Ａ２），  Ｗ１０１  （Ａ３），  Ｆ１１３  （Ｂ８），  Ｆ１２７  （Ｂ９），  Ｉ１２９  （Ｂ９），  Ｖ１３１  （Ｂ９），  Ｉ１３７  （Ｂ１０），  Ｆ１４０  （Ｂ１０）であり、
ＬｏｌＢの開かれた疎水性キャビティ構造の構成残基がＦ３７  （Ｂ１），  Ｖ４６  （Ｂ２），  Ｆ５０  （Ｂ２），  Ｗ５２  （Ｂ２），  Ｌ６２  （Ｂ３），  Ｌ６４  （Ｂ３），  Ｌ７３  （Ｂ４），  Ｉ１０１  （Ａ２），  Ｔ１０５  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｍ１０７  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｉ１０９  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｌ１１１  （Ａ３），  Ｌ１１４  （Ａ３），  Ｉ１１８  （Ａ３），  Ｌ１７８  （Ｂ１１）
（ここで、括弧内は該残基の属する二次構造である。）
である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
薬物が抗菌剤である請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＬｏｌＡの閉じられた疎水性キャビティ構造からＬｏｌＢの開かれた疎水性キャビティ構造へのリポタンパク質又は脂質の輸送を調節する請求項７の薬物の分子設計方法。
【請求項１１】
リポタンパク質に対する親和性の低いＬｏｌＡから親和性の高いＬｏｌＢへのリポタンパク質の輸送を調節する請求項７に記載の薬物の分子設計方法。
【請求項１２】
ＬｏｌＡのＬ６−Ｇ１６０からなる単離精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
ＬｏｌＢのＮ２９−Ｋ１８６からなる単離精製されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの結晶構造、細菌リポタンパク質局在化因子の立体構造の決定方法、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの立体構造、ＬｏｌＡおよび／またはＬｏｌＢの作用を調節する薬物の分子設計方法、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢのアシル基結合に必須のポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術およびその課題】
親水性環境を通る脂質修飾タンパク質の膜間輸送は、タンパク質因子を必要とする。例えば真核細胞において、小胞輸送系に関与するＲａｂ  タンパク質は、Ｒａｂ−ＧＤＰ解離阻害剤との複合体形成後に膜間輸送される（Ｚｅｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，  １９９５；  Ｎｏｖｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｅｒｉａｌ，  １９９７）。Ｎ末端で脂質修飾システインを有する細菌リポタンパク質は、細胞エンベロープの重要な構成要素であり様々な細胞活性を担う（Ｈａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９０）。ライム病のスピロヘータであるＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉは、１００以上のリポタンパク質を有し、その幾つかは今なお未知のメカニズムにより細胞表面に局在し、宿主細胞の免疫応答を誘発する（Ｂｒｉｇｈｔｂｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。大腸菌もまたＮ末端システイン  （Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）の隣に局在する選別シグナルに依存して外膜または内膜のペリプラズム表面に少なくとも９０のリポタンパク質を有する（Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。この位置でのアスパラギン酸は内膜−特異的シグナルとして機能し、一方他の残基はリポタンパク質を外膜に向かわせる  （Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【０００３】
リポタンパク質は、シグナルペプチドとともに前駆体として合成され、内膜を透過する（Ｐｕｇｓｌｅｙ，  １９９３；  Ｄｒｉｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。その後の成熟リポタンパク質へのプロセッシング、すなわち成熟領域のＮ末端に局在するシステイン残基のチオエーテル結合によるジグリセリドの結合、リポタンパク質特異的シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチドの切断、システインのアミノ基へのアシル鎖の結合が内膜のペリプラズム表面で連続的に生じる（Ｓａｎｋａｒａｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９４）。このようにして形成された成熟リポタンパク質は次いで選別され、Ｌｏｌシステムにより対応する膜に局在化される。内膜のＬｏｌＣＤＥ複合体はＡＢＣ  （ＡＴＰ−結合カセット）  トランスポーター・スーパーファミリーに属し、ＡＴＰ依存的に外膜特異的リポタンパク質を放出し（Ｙａｋｕｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、ペリプラズム分子シャペロン、ＬｏｌＡを有する水溶性複合体の形成をもたらす（Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体はペリプラズムを通ってリポタンパク質受容体ＬｏｌＢが存在する外膜へ移動する（Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体がＬｏｌＢと相互作用すると、リポタンパク質はＬｏｌＡからＬｏｌＢに輸送され、最終的に外膜に局在化する。いかなるＬｏｌタンパク質の欠乏も大腸菌にとって致死的である（Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｎａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）．
ＬｏｌＡ  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）とＬｏｌＢ  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）はともに単量体形態で機能する。ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体はＬｏｌＢ  機能の非存在下においてのみｉｎ  ｖｉｖｏ  （Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  １９９７）の両方で安定である。ＬｏｌＢ−リポタンパク質複合体はまた外膜の非存在下で安定である  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。これらの観察を合わせると、リポタンパク質結合だけでなく結合リポタンパク質の迅速な輸送がＬｏｌＡとＬｏｌＢの共通の機能であることを示している。非機能性ＬｏｌＡ変異体が単離されたが（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ２００２）、リポタンパク質転送メカニズムの構造的基礎についてはほとんど知られていない。ＬｏｌＡとＬｏｌＢの分子的メカニズムを明確にするために２つのタンパク質の結晶構造を明らかにすることが重要である。
【０００４】
本発明は、ＬｏｌＡとＬｏｌＢの結晶構造を解明することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢについて複数の結晶構造を特定することに成功した。この結晶構造の特定により、グラム陰性菌の疎水性タンパク質の輸送メカニズムが解明され、抗菌剤の分子設計が可能になる等の様々な応用が期待できる。
【０００６】
本発明は、以下のＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの結晶構造、細菌リポタンパク質局在化因子の立体構造の決定方法、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの立体構造、ＬｏｌＡおよび／またはＬｏｌＢの作用を調節する薬物の分子設計方法、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢのアシル基結合に必須のポリペプチドに関する。
項１．  細菌リポタンパク質局在化因子であるＬｏｌＡおよびＬｏｌＢからなる群から選ばれるいずれかの結晶。
項２．  前記結晶がＬｏｌＡの結晶であって、下記のいずれかの性質を有する項１に記載の結晶：
（１）空間群Ｉ２２２に属し、ａ＝５５．８Å，  ｂ＝７５．４Å  および  ｃ＝９９．５Åの単位格子定数を有する斜方晶系結晶；
（２）空間群Ｐ３１２１  （またはＰ３２２１）に属し、ａ＝ｂ＝  ６０．６Å  および  ｃ＝  ７９．０Åの単位格子定数を有する三方晶系結晶。
項３．  前記結晶がＬｏｌＢの結晶であって、下記のいずれかの性質を有する項１に記載の結晶：
（１）  空間群Ｐ２１に属し、ａ＝３７．２Å，  ｂ＝１１２．４Å，  ｃ＝４７．８Åおよびβ＝１１１．４゜の単位格子定数を有する単斜晶系結晶；
（２）  空間群Ｐ６３２２に属し、ａ＝ｂ＝７１．４Å  および  ｃ＝１３３．９Åの単位格子定数を有する六方晶系結晶。
項４．  項２または３に記載の少なくとも２種の細菌リポタンパク質局在化因子の３次元構造を比較することにより、細菌リポタンパク質の脂質結合に必要なアミノ酸および／または立体構造を決定する方法。
項５．  図１に示される細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＡの立体構造であって、αヘリックス（α１，α２，α３）およびループ３−４が高い柔軟性を有するＬｏｌＡの立体構造。
項６．  図２に示される細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＢの立体構造であって、残基Ａｌａ１−Ｐｒｏ９は無秩序であり、疎水性キャビティが溶媒に対して開かれているＬｏｌＢの立体構造（但し、ＬｏｌＢのアミノ酸配列の１位のアミノ酸はシステインまたはアラニンである）。
項７．  以下の特徴の少なくとも１種を利用することを特徴とする細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＡおよび／またはＬｏｌＢの作用を調節する薬物の分子設計方法：
（１）ＬｏｌＡの閉じられた疎水性キャビティ構造
（２）ＬｏｌＢの開かれた疎水性キャビティ構造
（３）ＬｏｌＢのＬｅｕ６８残基のリポタンパク質の外膜への輸送機能
（４）相同性が８％のＬｏｌＡとＬｏｌＢの間の高い構造類似性
項８．  ＬｏｌＡの閉じられた疎水性キャビティ構造の構成残基がＬ６  （Ａ１），  Ｌ１０  （Ａ１），  Ｆ１６  （Ｂ１），  Ａ１８  （Ｂ１），  Ｆ２０  （Ｂ１），  Ｌ３９  （Ｂ２），  Ｖ４１  （Ｂ２），  Ｒ４３  （Ｂ２），  Ｆ４７  （Ｂ３），  Ｗ４９  （Ｂ３），  Ｆ９０  （Ａ２），  Ｉ９３  （Ａ２），  Ａ９４  （Ａ２），  Ｗ１０１  （Ａ３），  Ｆ１１３  （Ｂ８），  Ｆ１２７  （Ｂ９），  Ｉ１２９  （Ｂ９），  Ｖ１３１  （Ｂ９），  Ｉ１３７  （Ｂ１０），  Ｆ１４０  （Ｂ１０）であり、
ＬｏｌＢの開かれた疎水性キャビティ構造の構成残基がＦ３７  （Ｂ１），  Ｖ４６  （Ｂ２），  Ｆ５０  （Ｂ２），  Ｗ５２  （Ｂ２），  Ｌ６２  （Ｂ３），  Ｌ６４  （Ｂ３），  Ｌ７３  （Ｂ４），  Ｉ１０１  （Ａ２），  Ｔ１０５  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｍ１０７  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｉ１０９  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｌ１１１  （Ａ３），  Ｌ１１４  （Ａ３），  Ｉ１１８  （Ａ３），  Ｌ１７８  （Ｂ１１）
（ここで、括弧内は該残基の属する二次構造である。）
である項７に記載の方法。
項９．  薬物が抗菌剤である項７または８に記載の方法。
項１０．  ＬｏｌＡの閉じられた疎水性キャビティ構造からＬｏｌＢの開かれた疎水性キャビティ構造へのリポタンパク質又は脂質の輸送を調節する請求項７の薬物の分子設計方法。
項１１．  リポタンパク質に対する親和性の低いＬｏｌＡから親和性の高いＬｏｌＢへのリポタンパク質の輸送を調節する項７に記載の薬物の分子設計方法。
項１２．  ＬｏｌＡのＬ６−Ｇ１６０からなる単離精製されたポリペプチド。
項１３．  ＬｏｌＢのＮ２９−Ｋ１８６からなる単離精製されたポリペプチド。
【０００７】
【発明の実施の形態】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの結晶の全体構造に関するものである。
【０００８】
ＬｏｌＡの全体構造
本発明者らは、２つの結晶型（すなわち、斜方晶系および三方晶系型）（Ｔａｋｅｄａら、提唱）を有するペリプラズムシャペロンＬｏｌＡの結晶構造を決定した。斜方晶系型の構造は、白金誘導体を用いたＭＡＤ法によって解かれ、１．６５Å分解能にて精密化された（ｒｅｆｉｎｅｄ）。三方晶系型の構造は、分子置換法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）によって解かれ、１．９Å分解能にて精密化された。この２つの結晶型についての結晶学的データおよび精密化の統計値を表１に要約する。ＬｏｌＡの構造は、３つのα−ヘリックス（α１−α３）によって塞がれる（ｐｌｕｇｇｅｄ）逆平行β−シート（β１−β１１）を含む閉じていないβ−バレルとして特徴付けられた（図１ＡおよびＢ）。β１１およびβ１２を接続する長いループは、β−シートの外側に位置する。β１２鎖は、β６と平行β−シートを形成する。ストランドの順番は、７８９［１０］［１１］１２３４５６［１２］である。β−シートおよび３つのα−ヘリックスの内部表面は、高度に疎水性である（図４を参照のこと）。
ＬｏｌＢの全体構造
外膜レセプターＬｏｌＢは不溶性リポタンパク質であるので、１位においてシステインの代わりにアラニンを有する可溶性ＬｏｌＢ変異体（ｍＬｏｌＢ）が、結晶化のために使用された（Ｍａｔｓｕｙａｍａら、１９９７）。２つの結晶型（すなわち、単斜晶系および六方晶系型）（Ｔａｋｅｄａら、提出済）が、Ｎ−末端アシル鎖を欠くｍＬｏｌＢについて得られた。単斜晶系型の構造は、セレノメチオニン化されたｍＬｏｌＢを用いたＭＡＤ法によって解かれ、そして１．９Å分解能にて精密化された。六方晶系型の構造は、分子置換法によって解かれ、２．２Å分解能にて精密化された。この２つの結晶型についての結晶学的データおよび精密化統計値を、表１に列挙する。図２ＡおよびＢは、ＬｏｌＢのリボンモデルを示す。ＬｏｌＢの分子構造は、ＬｏｌＡの分子構造に非常に類似しているが、これら２つのタンパク質の間では８％の低い配列同一性しか示さない。ＬｏｌＢの構造もまた、３つのαヘリックス（α１−α３）によって覆われる逆平行β−シート（β１−β１１）を含む。ストランドの順番は、７８９［１０］［１１］１２３４５６である。β−シートおよび３つのα−ヘリックスの内部表面もまた、高度に疎水性である（図６を参照のこと）。ＬｏｌＡにおいて見いだされるＣ−末端の長いループおよびβ１２は、ＬｏｌＢ中に存在しない。２つのＬｏｌタンパク質の詳細な構造比較の結果は、後に議論される。
ＬｏｌＡの２つの結晶型の間の構造の相違
タンパク質は、溶液中で最小のエネルギーを示すよう種々のコンフォメーションをとることができ、またこれらのコンフォメーションは機能に密接に関係している。しかしながら、ある特定のコンフォメーションが、結晶のパッキングの制限によって安定化される。それゆえ、２つ以上の結晶型について決定される結晶構造は、タンパク質の動的性質に関して有用な情報を提供する。２つの結晶型について決定されたＬｏｌＡの構造が比較された。全体構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ）は本質的に同一であるが、２つの構造間にいくつかの有意な相違が見いだされた。これらの相違は、ＬｏｌＡの機能の分子メカニズムを明らかにするために重要である。この２つの分子構造は重ね合わせられ（ｓｕｐｅｒｐｏｓｅｄ）（これは、ＣＣＰ４ソフトウェアスーツ（ソフトウェアの集合）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，  １９９４）のＬＳＱＫＡＢプログラム（Ｋａｂｓｃｈ，  １９７６）を用いて行われた）、全てのＣα原子の根平均二乗偏差が１．６７Åであることが示された。３つのヘリックスおよび柔軟なループ領域において、大きな相違が観測された（図３Ａ）。例えば、α２−ヘリックスの平均偏差は約１．８５Åである（図３ＡおよびＢ）。これとは対照的に、β−シートは、小さい偏差を伴ってよく重ね合わせられる（β３およびβ４−ストランド（ループ３−４）を接続するループの顕著な柔軟性ゆえに、β３−鎖のＣ−末端部およびβ４−鎖のＮ−末端部が２つの構造間において有意な相違を示すことを除く）。完全に保存される残基であるＧｌｙ３７は、この残基がβ２の中央に位置するにも関わらず、２．３Åの大きな偏差を示す（図３Ａ）。この残基は、α２−ヘリックスの変動に重要であると考えられ、またこのα２−ヘリックスのＰｈｅ９０およびβ３−鎖のＴｒｐ４９（これら両方ともが、Ｇｌｙ３７の近くに位置する）のコンフォメーション変化を可能にする。この２つの結晶中において、３つのα−ヘリックスの温度因子は小さい。それにも関わらず、この２つの結晶型はこれらの構造の相違を示し、ＬｏｌＡのα−ヘリックスが溶液中で本質的に可動性であることが示唆される。
ＬｏｌＡの疎水性キャビティーは閉じている
Ｘ−Ｐｒｏ間のｃｉｓペプチド結合の出現率は約５％であることが報告されてきている（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９０；  Ｊａｂｓら、１９９９）。これとは対照的に、７つのＸ−ｐｒｏ結合のうち２つ（Ａｒｇ４３−Ｐｒｏ４４およびＧｌｎ５３−Ｐｒｏ５４）が、ＬｏｌＡにおいてｃｉｓコンフォメーションをとることが見いだされた。Ｇｌｎ５３以外のこれらの残基は、ＬｏｌＡホモログ間で高度に保存される（図１Ｃ）。Ａｒｇ４３の側鎖は、このｃｉｓペプチド結合に起因して（図３Ｃ）、分子の内部へ指向する（図１ＡおよびＢ）。Ａｒｇ４３のコンフォメーションおよびその水素結合パターンは、斜方晶系と三方晶系結晶との間で異なるが、Ａｒｇ４３の側鎖Ｎ原子は、両結晶において、α１−およびα２−ヘリックス中の残基の主鎖カルボニルへ水素結合され、これによりβ２−鎖へのこのヘリックスの強い固定化が引き起こされる（図３Ｄ）。ＬｏｌＡにおける他の残基は、このような役割を果たさない。
【０００９】
β−シートおよび３つのα−ヘリックスの内側表面は、疎水性残基から成り、また中空のキャビティーを形成し、バルクの溶媒（ｂｕｌｋ  ｓｏｌｖｅｎｔ）から切り離されている。ＬｏｌＡの疎水性キャビティーはおそらく、リポタンパク質のアシル鎖の結合部位である。このキャビティーは、図４Ａに示されるように、芳香族残基の側鎖によって囲まれている。これらの芳香族残基は、ＬｏｌＡホモログ間で高度に保存されている（図１Ｃ、緑色三角形）。α２−ヘリックス中に位置するＰｈｅ９０は、斜方晶系型において、Ｔｒｐ４９およびＬｅｕ５９との疎水性相互作用を受けるのに対し、三方晶系型におけるものは、Ｐｈｅ４７およびＴｒｐ４９と相互作用する。その結果、キャビティーを塞ぐ残基は、斜方晶系（図４ＢおよびＣ）と三方晶系（図４ＤおよびＥ）型との間で異なる。これらの相違にも関わらず、疎水性キャビティーの形状は、２つの結晶間において有意には異ならない。さらに、両結晶における疎水性キャビティーは、β２へ固定化される３つのα−ヘリックス（α１−α３）によって、バルクの溶媒から切り離されたままである。この「フタ（ｌｉｄ）」は、リポタンパク質の収容（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ）および放出（ｒｅｌｅａｓｅ）の際に、それぞれ開け閉めされると予想される。ＬｏｌＡの閉じた型は、Ａｒｇ４３とα１−およびα２−へリックにおける残基との間の水素結合によって安定化される。ＬｏｌＡが会合リポタンパク質をＬｏｌＢへ容易に輸送し、次いで遊離型へ戻ることが示されている（Ｍａｔｓｕｙａｍａら、１９９７）。これらの観測は、ＬｏｌＡの閉ざされた型がリポタンパク質−結合型よりも安定であることを示唆する。水素結合の切断が、フタを開けるために必要であり、それはＬｏｌＣＤＥ複合体によって触媒されるＡＴＰエネルギーの消費を伴う（図７）。
【００１０】
結合部位を開けるためのα−ヘリックスの運動を伴う同様のメカニズムが、種々の親油性薬物を結合するＢｍｒＲ（多剤輸送因子の転写活性化因子）について報告されてきている（Ｚｈｅｌｅｚｎｏｖａら、１９９９）。ＬｏｌＡはまた、種々の長さおよび飽和度のアシル鎖を有するリポタンパク質を結合する（Ｆｕｋｕｄａら、２００２）。このようなフタ／ロック（ｌｏｃｋ）結合メカニズムの存在は、欠失ＬｏｌＡ変異体（図１Ｃ中の赤い三角形によって示される変異位置）の分析の結果によって支持されてきた。これらの残基は、β−ストランドとα−ヘリックスのフタの境界面で見いだされる（図１ＡおよびＢ）。４７位でフェニルアラニンの代わりにグルタミン酸を有するＬｏｌＡの変異体（Ｆ４７Ｅ）は、リポタンパク質を結合することができない（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、２００２）。Ｆ４７Ｅ変異体におけるβ−シートとフタヘリックスとの間にさらなる水素結合が形成され、フタが開くことをより困難にしていると思われる。ＬｏｌＡ（Ｒ４３Ｌ）および（Ｅ１４４Ｗ）変異体はリポタンパク質を結合するが、会合リポタンパク質をＬｏｌＢへ輸送することができない（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、２００１、未公開の実験結果）。β−シートとフタヘリックスとの間の水素結合は、Ｒ４３Ｌにおいて形成されず、またＥ１４４Ｗにおける大きな疎水性残基の導入によって弱められ得る。これらの変異は、結合型のものと比べて、遊離型の安定性を低下させ、それゆえペリプラズムにおけるこの複合体の蓄積がもたらされる（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、２００１，  ２００２）。
ＬｏｌＢの疎水性キャビティーは開いている
本発明者らは、２つの結晶型を有するＬｏｌＢについての３つの構造を得た；非対称単位中に２つの分子を含む単斜晶系型および六方晶系型。六方晶系結晶と単斜晶系結晶における２つの分子（ＡおよびＢ）との間のＣα原子の根平均二乗偏差が、それぞれ１．１４Åおよび１．３０Åであるのに対し、この偏差値は、単斜晶系結晶における２つの分子の間で０．８０Åである。β鎖間のループ領域において、最も大きな相違が観察された（図５Ａ）。ヘリックスの偏差は、ＬｏｌＡにおいてよりもＬｏｌＢにおいて低いが、β−シートの偏差は、ＬｏｌＡにおいてよりもＬｏｌＢにおいて高い。ＬｏｌＢ  β−シートの大きな偏差は、結晶化の過程において使用されるポリエチレングリコール２０００モノメチルエーテル（ＰＥＧＭＭＥ２０００）によって引き起こされた。ＰＥＧＭＭＥ２０００は、六方晶系型の疎水性キャビティーにのみに存在し（図５ＣおよびＤを比較のこと）、β−シートの拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を引き起こす（図５Ｂ）。キャビティーの大きさは、膜中に豊富に存在するＣ１８鎖のサイズにほぼ対応しているけれども、観測された電子密度からＰＥＧＭＭＥ２０００の１２個の原子をモデリングすることができた。この疎水性キャビティーはおそらく、アシル鎖結合部位であり、ＬｏｌＢがＰＥＧＭＭＥ２０００のようなリポタンパク質のアシル鎖を収容する（図６Ａ）。キャビティーを形成する残基は、高度に保存され（図２Ｃ、青色三角形）、主にロイシンおよびイソロイシン（これらは、芳香族残基よりもよりフレキシブルな疎水性側鎖を有する）である。対照的に、ＬｏｌＡの疎水性キャビティーは、芳香族残基から形成される（図４Ａ）。キャビティー形成残基におけるこのような相違は、ＬｏｌＡとＬｏｌＢとの間のリポタンパク質についての親和性における相違の一因となると予期される。キャビティーの大きさから判断して、単一のアシル鎖のみがこのキャビティー内に収容される。
【００１１】
この疎水性キャビティーのバルクの溶媒への接続性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）は、ＬｏｌＢ単斜晶系結晶の２つの構造間で有意に異なる。分子Ａのキャビティーが３つの残基（Ｌｅｕ６４，Ｌｅｕ７３およびＭｅｔ１０７）の側鎖によってふさがれるのに対し（図６ＢおよびＣ）、分子Ｂのキャビティーは溶媒領域につながっている（図６ＤおよびＥ）。この相違は、Ｌｅｕ６４の側鎖のコンフォメーション変化によって引き起こされる。この残基のχ１値は、分子ＡおよびＢに対してそれぞれ７５．３および−７５．６度である。疎水性キャビティーの入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）近くの他の特徴は、本質的に同じである。それゆえ、キャビティーは溶媒領域へ自発的に拡がる（ｅｘｐａｎｄ）と考えられる。六方晶系型の疎水性キャビティーは、ＰＥＧＭＭＥ２０００の存在ゆえに、バルクの溶媒に対して完全に開いている（図６ＦおよびＧ）。要するに、これらの結果は、ＬｏｌＢが、溶液中に存在するＰＥＧＭＭＥ２０００のような疎水性化合物を自発的に結合し、そしてそのβ−ストランドを拡張することを示唆する。
ＬｏｌＢの疎水的なループおよびＮ−末端領域
ＬｏｌＢは、外膜の内側の層へ会合リポタンパク質を輸送する。現在のところ、どのようにしてＬｏｌＢがこれを運び出すかについては知られていない。しかしながら、ＬｏｌＢの構造は、外膜へのリポタンパク質輸送のために必要不可欠であり得るいくつかの特徴を明らかにする。疎水性ロイシン残基（Ｌｅｕ６８）がβ３とβ４との間のループの先端に位置し、一方このループは、溶媒領域中へ突き出ている（図２Ｂ）。このロイシン（またはイソロイシン）は、ＬｏｌＢホモログの間で保存される（図２Ｃ、黄色三角形）。隣接する残基（Ｐｒｏ６７）もまた疎水性である。これらの２つの疎水性残基を含むループは、ＬｏｌＢがリポタンパク質を外膜へ輸送する際に、外膜へのアンカーとして機能することができる。他方、ＬｏｌＡは、このような突き出したループを有さず、そのため不都合な逆方向のリポタンパク質の内膜への輸送が起こりそうにない。
【００１２】
ＬｏｌＢの残基Ａｌａ１−Ｐｒｏ９は、構造の無秩序さ（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）ゆえに、２つの結晶型の電子密度マップに表れない。ＬｏｌＢホモログのＮ−末端領域は、グリシンおよびプロリン残基に富んでおり（図２Ｃ、黄色文字）、２次構造の形成が好ましくないことが示唆される。ＬｏｌＢのＮ−末端ループの柔軟性は、リポタンパク質がＬｏｌＢから外膜へ輸送される際に、重要であるとおもわれる。
ＬｏｌＡとＬｏｌＢとの間の構造比較
それらの高い構造類似性ゆえに、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢは同じ構造ファミリーに属し、同じ原型タンパク質を有するようである。ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢ構造は、ＤＡＬＩサーバー（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ，  １９９５）を使用して１３４個のＣα原子について３．２Åの根平均二乗偏差および１０．６のＺ−スコアで、良く重ね合わせられた。この重ね合わせられた構造はまた、それらの間のいくつかの顕著な相違を明らかにした。Ｎ−末端の近くのα１ヘリックスは、ＬｏｌＡにおいてよりもＬｏｌＢにおいてさらに、β−シートの外へ突き出している。ＬｏｌＢのα２ヘリックスが分子の表面上に位置し、溶媒領域へ露出されるのに対し、ＬｏｌＡのα２ヘリックスは分子の中央に位置する。ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢのα３ヘリックスは、中心のβ−バレルを重ね合わせた場合、各々についてほとんど垂直に配向する。ＬｏｌＡのＡｒｇ４３が、その疎水性キャビティーを溶媒領域から切り離すロックとして機能するのに対し、ＬｏｌＢにおいてこのような役割を果たす残基は存在しない。
【００１３】
本発明者等は、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの立体構造を解明することにより、ＬｏｌＢが、ＬｏｌＡよりもリポタンパク質に対してより高い親和性を有することを確認した。
【００１４】
本発明で明らかにされたＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの構造は、強く固定化されるフタおよび芳香族残基によって形成される疎水性キャビティーの両方がＬｏｌＡの低い親和性の原因になることを示唆する。また、ＬｏｌＡの遊離型がリポタンパク質結合型よりも安定であり、おそらく結合リポタンパク質の放出（ｅｊｅｃｔｉｏｎ）を引き起こすことも予期される。他方、遊離型ＬｏｌＢだけでなく、ＰＥＧＭＭＥ２０００結合型ＬｏｌＢもまた結晶化され得る。ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの性質におけるこれらの相違は、リポタンパク質のベクトル的輸送（ｖｅｃｔｏｒｉａｌ  輸送）に必要不可欠である。等電点電気泳動で決定されるＬｏｌＡ  （ｐＩ＝〜６）およびＬｏｌＢ  （ｐＩ＝〜９）の静電的な性質における相違もまた、この２つのタンパク質の一時的な結合のために重要であり得る。
【００１５】
ＬｏｌＡ  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）とＬｏｌＢ  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）はともに単量体形態で機能する。ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体はＬｏｌＢ  機能の非存在下においてのみｉｎ  ｖｉｖｏ  （Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  １９９７）の両方で安定であり、リポタンパク質に対する親和性はＬｏｌＢよりもＬｏｌＡに対してより低いことが示唆される。ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体からＬｏｌＢ  へのリポタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ輸送（Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）はまた、リポタンパク質輸送がこれら２つのタンパク質間の親和性の差異に起因して起こることが示唆される。ＬｏｌＢ−リポタンパク質複合体はまた外膜の非存在下で安定である  （Ｍａｔｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【００１６】
他のタンパク質との構造比較
ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢ構造は、ＤＡＬＩサーバーを用いて他のタンパク質構造と比較された（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ，１９９５）。β−バレル構造を有するタンパク質（リポカリンファミリータンパク質（Ｂａｎａｓｚａｋら、１９９４）のような）は種々の疎水性分子を結合するけれども、完全に閉じたβ−バレル構造を有する。β−ストランドを有する他の脂質−結合タンパク質（ＰｈｏＧＤＰ−解離インヒビター（Ｇｏｓｓｅｒら、１９９７）およびホスファチジルエタノールアミン−結合タンパク質（Ｓｅｒｒｅら、１９９８）のような）は、ＬｏｌＡまたはＬｏｌＢと完全に異なる結合様式を示した。ＭＬＮ６４−ＳＴＡＲＴドメインタンパク質の構造は、おそらく最も類似している（このタンパク質では、閉じていないβ−バレル構造およびヘリックスは、コレステロールを結合する疎水性トンネルを形成する（ＴｓｕｊｉｓｈｉｔａおよびＨｕｒｌｅｙ，  ２０００））。ＬｏｌＢにおいて見いだされる疎水性ループはまた、このＭＬＮ６４−ＳＴＡＲＴドメインタンパク質中に存在する（ここで、このループは、脂質の結合（ｌｏａｄｉｎｇ）および解離（ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）に関与すると考えられる）。しかしながら、ヘリックスの配置およびβ−ストランドの数の両方が、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢにおけるものと実質的に異なる。さらに、２つのＬｏｌタンパク質とＳＴＡＲＴドメインタンパク質との間の有意な配列類似性は存在しない。グラム陰性菌のペリプラズム空間において、基質結合タンパク質は、高い親和性を有する特定の基質を集め、それらをＡＢＣトランスポーターへ輸送する。これらのタンパク質は一般的に、２つのドメインを有する（ＢｏｏｓおよびＥｐｐｌｅｒ，  ２００１）。ＬｏｌＡはペリプラズムのタンパク質であるけれども、ペリプラズム結合タンパク質の構造は、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの構造と有意に異なる。
リポタンパク質の移動メカニズム
発明者らの以前の観測と共にここに示されるＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの構造は、Ｌｏｌシステム依存的リポタンパク質輸送（以下および図７に要約される）の基礎を成すメカニズムについての私達の理解をさらに広げる。
１．ＬｏｌＣＤＥ複合体が外膜−特異的リポタンパク質と相互作用するとき、ＬｏｌＤは、ＡＴＰエネルギーを膜の細胞質側で放出する（Ｍａｓｕｄａら、２００２）。このエネルギーは、ＬｏｌＤからＬｏｌＣ／ＬｏｌＥへ伝達され、そして膜の外側の層（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）からリポタンパク質を放出するために利用され、ペリプラズムにおいて水溶性ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体の形成へ導く。これには、ＬｏｌＡのＡｒｇ４３とフタを形成するヘリックスとの間の水素結合の切断によって、ＬｏｌＡのフタを開けることを必要とする。膜の細胞質側で放出されたＡＴＰエネルギーは、このように膜のペリプラズム側で利用され、不安定なＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体を形成する。内膜特異的リポタンパク質は、ＬｏｌＣＤＥによって認識されず、それゆえ内膜中に残る（Ｍａｓｕｄａら、２００２）。
２．ＬｏｌＡ−リポタンパク質複合体がＬｏｌＢと相互作用する場合、それらのリポタンパク質に対する疎水性キャビティー間の親和性の相違に従って、リポタンパク質がＬｏｌＡからＬｏｌＢへ輸送される。リポタンパク質の放出時に、ＬｏｌＡはより安定な遊離型へ変化し、次いで次のリポタンパク質放出反応サイクルを触媒する。
３．外膜へ固定化されている（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＬｏｌＢは、フレキシブルなＮ−末端領域を介して外膜方向へ揺れ動き、次いで会合リポタンパク質を外膜の内側の層へ輸送する。リポタンパク質は、３つのアシル鎖を介して外膜へ安定に固定化される。突き出しているループの先端に位置するＬｅｕ６８は、ＬｏｌＢと外膜との間の接触を促進すると思われる。
【００１７】
全てのＬｏｌタンパク質の配列は、グラム陰性菌の間で高度に保存され、またほとんどの細菌はそれらのエンベロープ中にリポタンパク質を有する。ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢのもつ非常に類似な疎水性キャビティーが関連するリポタンパク質輸送メカニズムはまたグラム陰性菌の間で保存されているので疎水性タンパク質または脂質についての他の輸送システムへの見識を提供するであろう。
【００１８】
Ｌｏｌシステムによるバクテリアの内膜から外膜へのリポ蛋白質の輸送について
リポ蛋白質は疎水的なアシル鎖を持つため不溶性で、生体膜に組み込まれて存在している。外膜に運ばれるべきリポ蛋白質も、内膜にとどまるリポ蛋白質も、内膜のペリプラズム側に組み込まれた状態でシグナル配列の切断やアシル鎖の修飾を受け成熟する。リポ蛋白質の局在は＋２位のアミノ酸の種類によって決定されていて、内膜にとどまるリポ蛋白質は＋２位にアスパラギン酸を持つが、外膜に輸送されるべきリポ蛋白質はそれ以外のアミノ酸を持つ。外膜リポ蛋白質はＬｏｌＣＤＥ複合体に選択的に認識され、ＡＴＰ加水分解エネルギーを使用してそのリポ蛋白質が内膜から遊離される。ＬｏｌＡのＡｒｇ４３とαへリックスの間の水素結合が切れ、αへリックスのふたが開き、その結果露出する内部の疎水的な分子表面にリポ蛋白質のアシル鎖の部分を結合する。このＬｏｌＡ−リポ蛋白質複合体では、疎水的なアシル基の部分がＬｏｌＡで覆われているためペリプラズム空間の溶液に溶けることが出来るようになる。リポ蛋白質は生体膜に組み込まれている状態が自由エネルギー的に安定であり、このような蛋白質との複合体はそれに比べると不安定である。このＬｏｌＡ−リポ蛋白質複合体はＡＴＰのエネルギーを複合体の形に変換したものだと言える。ＬｏｌＡ−リポ蛋白質複合体はペリプラズム空間を拡散し、外膜に到達する。ＬｏｌＡ（ｐＩ〜６）は外膜のペリプラズム側に結合しているＬｏｌＢ（ｐＩ〜９）とは電荷の違いによって静電的相互作用をしやすいと考えられる。ＬｏｌＢとＬｏｌＡ−リポ蛋白質が相互作用するとアシル鎖がＬｏｌＡからＬｏｌＢに移りＬｏｌＢ−リポ蛋白質複合体が形成される。ＬｏｌＡからＬｏｌＢにリポ蛋白質が移動するのは、ＬｏｌＡとＬｏｌＢとのアシル鎖に対する結合能の違いを利用している。ＬｏｌＡの疎水キャビティーは多くの芳香属性アミノ酸で構成されるが、ＬｏｌＢの疎水キャビティーは主にロイシンやイソロイシンなどの柔軟な（いろいろなコンフォメーションを持つことの出来る）側鎖を持ったアミノ酸で構成されている。こうしたキャビティーを構成するアミノ酸側鎖の柔軟性の違いは、主に疎水相互作用の主因であるエントロピーの寄与によりアシル鎖との親和性に対して大きな影響を与える。ＬｏｌＢのほうがＬｏｌＡよりもアシル鎖に対して大きな親和性を持っていてＬｏｌＡからＬｏｌＢへのリポ蛋白質の移動はエネルギーの必要なしに進行できる。リポ蛋白質を遊離したＬｏｌＡでは、再びαへリックスのふたが閉じて、ふたとＡｒｇ４３の間に水素結合が形成された安定な閉構造に戻り、次の輸送サイクルで使用される。ＬｏｌＡからリポ蛋白質を受け取るためにはＬｏｌＢのキャビティーはペリプラズム側を向いていないといけないが、リポ蛋白質を外膜に組み込むためにはリポ蛋白質を結合しているキャビティーを外膜側に向けなければならない。ＬｏｌＢを外膜に繋ぎ止めているＮ端にはグリシンやプロリンが多く存在していて二次構造を形成せず柔軟性に富むので、このような動きが可能である。また、アシル鎖を外膜に組み込むためには外膜を構成する脂質の頭部が互いに形成する水素結合を切断しなければならない。この役割をＰｒｏ６７とＬｅｕ６８が存在するループが担っていると考えられる。このループは疎水的な性質を持つ残基を持ちながら、溶媒中に飛び出しているという特徴を持っている。このような疎水的なループは他の脂質輸送蛋白質でもみられ、それらのたんぱく質では脂質の脂質膜からの取り込みや脂質膜への組み込みに関与している。また、ＬｏｌＡがこのような疎水的なループを持たずにＬｏｌＢのみに存在することによってＬｏｌＡから内膜へのリポ蛋白質の逆戻りの移動が防止でき、ＡＴＰエネルギーの有効利用に一役買っている。そうやってリポ蛋白質は最終的には最も安定にアシル鎖を繋ぎ止めることのできる外膜に組み込まれる。
ＬｏｌＡのアシル基結合に必要な部分
必要最小限の部分は、α１を除くＬ６−Ｇ１６０  （Ｌ６は結合部位を構成）であり、α１を含める場合にはＤ１−Ｇ１６０となる。
【００１９】
なお、Ａ１６１以降は外側のループでアシル鎖の結合には関与しない。
【００２０】
さらに、ＬｏｌＡのアシル基結合部位の構成残基を以下および図８に示す。なお、括弧内は該残基の属する二次構造である。
Ｌ６  （Ａ１），  Ｌ１０  （Ａ１），  Ｆ１６  （Ｂ１），  Ａ１８  （Ｂ１），  Ｆ２０  （Ｂ１），  Ｌ３９  （Ｂ２），  Ｖ４１  （Ｂ２），  Ｒ４３  （Ｂ２），  Ｆ４７  （Ｂ３），  Ｗ４９  （Ｂ３），  Ｆ９０  （Ａ２），  Ｉ９３  （Ａ２），  Ａ９４  （Ａ２），  Ｗ１０１  （Ａ３），  Ｆ１１３  （Ｂ８），  Ｆ１２７  （Ｂ９），  Ｉ１２９  （Ｂ９），  Ｖ１３１  （Ｂ９），  Ｉ１３７  （Ｂ１０），  Ｆ１４０  （Ｂ１０），
ＬｏｌＢのアシル基結合に必要な部分
必要最小限の部分は、α１を除くＮ２９−Ｋ１８６であり、α１を含める場合にはＧ１０−Ｋ１８６となる。
【００２１】
Ｐ９以前は電子密度を元にモデルを構築できない。
【００２２】
さらに、ＬｏｌＢのアシル基結合部位の構成残基を以下および図８に示す。なお、括弧内は該残基の属する二次構造である。
Ｆ３７  （Ｂ１），  Ｖ４６  （Ｂ２），  Ｆ５０  （Ｂ２），  Ｗ５２  （Ｂ２），  Ｌ６２  （Ｂ３），  Ｌ６４  （Ｂ３），  Ｌ７３  （Ｂ４），  Ｉ１０１  （Ａ２），  Ｔ１０５  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｍ１０７  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｉ１０９  （ｌｏｏｐ  Ａ２−Ａ３），  Ｌ１１１  （Ａ３），  Ｌ１１４  （Ａ３），  Ｉ１１８  （Ａ３），  Ｌ１７８  （Ｂ１１）
本発明により、ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢについて複数の結晶を得、それらの結晶構造を比較することにより、リポタンパク質と結合する疎水性キャビティ、リポタンパク質の結合および放出に関する様々な情報が得られた。
【００２３】
この情報を利用することにより、当業者であればＬｏｌＡおよびＬｏｌＢのリポタンパク質結合作用に影響を及ぼす薬物の分子設計を容易に行うことができる
例えばＬｏｌＡ、ＬｏｌＢの結晶構造解析で得た原子座標データを利用し、常法に従いタンパク質モデルを作成し、候補化合物とのマッチングを行うことができる。
【００２４】
ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢは細菌間において高度に保存されかつ細菌の生存に必須の蛋白であるので、例えばその阻害剤は、広い抗菌スペクトルを有する強力な抗菌剤になると期待される。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、細菌リポタンパク質局在化因子ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの結晶構造が初めて明らかにされた。
【００２６】
ＬｏｌＡとＬｏｌＢは、アミノ酸配列の相同性が低いにもかかわらずその立体構造は非常に類似しており、細菌におけるリポタンパク質局在化因子の共通構造が明らかにされた。
【００２７】
ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢなどの細菌リポタンパク質局在化因子は細菌の生存に必須のタンパク質であるので、この立体構造情報に基づき、ＬｏｌＡ、ＬｏｌＢなどのリポタンパク質局在化因子をターゲットにした抗菌剤の開発が可能になる。
【００２８】
また、ＬｏｌＡとＬｏｌＢのリポタンパク質の輸送形態、リポタンパク質の結合部位の詳細な構造が明らかにされたことで、リポタンパク質の輸送の調節に関与する様々な薬物の分子設計が可能になる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
（１）物質および方法
ＬｏｌＡおよびＬｏｌＢの発現および精製
野生型ＬｏｌＡを過剰発現させ、さらに（Ｍａｔｓｕｙａｍａら、１９９５）に記載されるように精製した。水溶性ＬｏｌＢ変異体（ｍＬｏｌＢ）を過剰発現させ、さらに（Ｍａｔｓｕｙａｍａら、  １９９７）に記載されるように精製した。セレノメチオニルｍＬｏｌＢを、セレノメチオニンを含む最小培地中において３７℃にて増殖させたＥ．ｃｏｌｉ  Ｐ４Ｘ８（Ｈｆｒ  Ｐ４Ｘ  λ−ｍｅｔＢ１）中において過剰発現させ、さらにｍＬｏｌＢについて記載されるように精製した。
（２）ＬｏｌＡの結晶学的研究
ＬｏｌＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）中において〜２０  ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。ＬｏｌＡの２つの結晶型を、ハンギングドロップ蒸気拡散法（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ｖａｐｏｒ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって得た。斜方晶系結晶を、１５％  ＰＥＧ８０００、８０  ｍＭ  カコジル酸ナトリウム（ｐＨ  ６．５）、０．１５  Ｍ  酢酸亜鉛および２０％  グリセロール中において４℃にて成長させた。三方晶系結晶を、１５％  ＰＥＧ１５００、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、および２０％  グリセロールを含む溶液中において２０℃にて得た。斜方晶系結晶の白金誘導体は、結晶を２ｍＭ  Ｋ２ＰｔＢｒ４含有保存液中で５日間ソーキングすることによって調製された。低温での回折データ収集のために、全ての斜方晶系結晶をナイロンループ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で拾い上げ、そして液体エタンを用いて急速に冷却した。この斜方晶系結晶は、空間群Ｉ２２２に属し、そして単位格子定数（ｕｎｉｔ−ｃｅｌｌ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）は、ａ＝５５．８Å，  ｂ＝７５．４Å  および  ｃ＝９９．５Åである。三方晶系結晶は、空間群Ｐ３１２１  （ｏｒ  Ｐ３２２１）に属し、ａ＝ｂ＝６０．６Å  および  ｃ＝７９．０Åの単位格子定数を有する。斜方晶系結晶の白金誘導体についての多波長異常回折データ（Ｍｕｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ）を、１つの結晶から収集した。ＳＯＬＶＥプログラム（ＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒおよびＢｅｒｅｎｄｚｅｎ，１９９９）を用いて２．５Å分解能までの初期位相を計算し、０．５２のｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔを得た。ＲＥＳＯＬＶＥプログラム（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，  ２０００）を用いて電子密度修正（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）後、ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔが０．５７に改善した。この結晶化、データ収集および位相測定の詳細は、他のところで報告される  （Ｔａｋｅｄａら、提出済み）。ＸｔａｌＶｉｅｗプログラム（ＭｃＲｅｅ，  １９９９）を用いて、構造モデルを電子密度マップに当てはめた。ネイティブなデータに対してＣＮＳプログラム（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）を用いるシミレーテッドアニーリング法によって、この構造を精密化した。観測された反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ）の５％を精密化から省略し、Ｒｆｒｅｅ因子を計算するために使用した。最終的な構造モデルは、０．２４９および０．２２２のＲｆｒｅｅおよびＲｗｏｒｋ値を示した。この最終的な構造は、フレキシブルなループ領域に相当するアミノ酸残基２７−３１を含まない。三方晶系型の構造は、ＬｏｌＡの斜方晶系結晶型の分子構造を検索モデルとして用いて、ＣＮＳプログラムを使用する分子置換法によって解かれた。正確な空間群はＰ３２２１であると決定された。１．９Å分解能でのモデルについての最終的なＲｆｒｅｅおよびＲｗｏｒｋ値は、それぞれ０．２５９および０．２２６である。
（３）ＬｏｌＢの結晶学的研究
ＬｏｌＢを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）中において〜２０  ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。２つの異なる結晶型を、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって得た。単斜晶系結晶を、３０％  ＰＥＧＭＭＥ２０００、０．１  ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．６）、および０．２  Ｍ  硫酸アンモニウム中において２０℃にて成長させた。セレノメチオニル化タンパク質の単斜晶系結晶を、３０％  ＰＥＧＭＭＥ２０００、０．１ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．６）、および０．２Ｍ  硫酸セシウム中において２０℃にて得た。低温での回折実験のために、全ての結晶をナイロンループ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で拾い上げ、そしていかなる抗凍結剤（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）をも用いずに液体エタンを用いて急速に冷却した。この結晶は空間群Ｐ２１に属し、格子定数はａ＝３７．２Å，  ｂ＝１１２．４Å，  ｃ＝４７．８Åおよびβ＝１１１．４゜で、非対称単位における２つの分子を含む。初期位相を、４波長データセットを使用してセレノメチオニル化誘導体を用いたＭＡＤ法によって計算した。１０個のセレン原子の全ての部位を、ＳＯＬＶＥプログラムによって決定した。２．５Å分解能でのｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔは、０．５０であった。ＲＥＳＯＬＶＥプログラムを用いて、溶媒平坦化（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）を行い、ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔが０．５５となった。結晶化、データ収集および位相測定の詳細は、他のところで報告される  （Ｔａｋｅｄａら、提出済）。１．９Å分解能での最終的なモデル構造は、０．２４９および０．２１５のＲｆｒｅｅおよびＲｗｏｒｋ値を示した。また非対称単位における２つの分子の最小二乗重ね合わせは、０．８０Åの根平均二乗偏差を与えた。ＬｏｌＢの六方晶系結晶はまた、３０％  ＰＥＧＭＭＥ２０００、０．１  ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．６）、０．２Ｍ  硫酸アンモニウムおよび０．１５Ｍ  ヨウ化ナトリウム中において２０℃にて成長させた。この結晶は、ａ＝ｂ＝７１．４  Åおよび  ｃ＝１３３．９Åの格子定数を持ち、空間群Ｐ６３２２に属する。この構造は、ＬｏｌＢの単斜晶系型の分子構造を検索モデルとして用いて、ＣＮＳプログラムを使用した分子置換法によって解かれた。２．２Å分解能でのモデルについての最終的なＲｆｒｅｅおよびＲｗｏｒｋ値は、それぞれ０．２４７および０．２１７である。全ての回折データを、ＳＰｒｉｎｇ−８（Ｈａｒｉｍａ，Ｊａｐａｎ）のＢＬ３８Ｂ１およびＢＬ４４Ｂ２ビームラインにて収集し、そしてＨＫＬ２０００パッケージを用いて処理した（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ，  １９９７）。ＰＲＯＣＨＥＣＫプログラム（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９９３）を用いて全ての構造モデルについて得られるラマテャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｐｌｏｔｓ）は、全ての残基が最も好ましいか次いで許容される領域中に存在する（すなわち、十分に許容されうるまたは許容されない領域中には全く存在しない）ことを示した。図は、ＭｏｌＳｃｒｉｐｔ （Ｋｒａｕｌｉｓ，  １９９１）、ＸｔａｌＶｉｅｗ  （ＭｃＲｅｅ，  １９９９）、およびＷｅｂＬａｂＶｉｅｗｅｒＰｒｏ  （Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎ���．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）プログラムを用いて作成された。
【００３０】
【表１】
2005008520.tif 000003
【００３１】
括弧の中の値は、最も高い分解能シェルのものを示す
【数１】
2005008520.tif 000004
Ｒｆｒｅｅは、テストセットとして精密度に含まれない５％の反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）から計算された。
Ｒ．ｍ．ｓ．、根平均二乗
座標誤差は、テストセットの反射を用いてＬｕｚｚａｔｉプロットから計算された。
参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
Ｂａｎａｓｚａｋ，Ｌ．，  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎ．，  Ｘｕ，Ｚ．，  Ｂｅｒｎｌｏｈｒ，Ｄ．Ａ．，  Ｃｏｗａｎ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．  （１９９４）  Ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａｄｖａｎ．  Ｐｒｏｔ．  Ｃｈｅｍ．，  ４５，  ８９−１５１．
Ｂｏｏｓ，Ｗ．  ａｎｄ  Ｅｐｐｌｅｒ，Ｔ．  （２００１）  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．  Ｉｎ  Ｇ．．Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ，  （ｅｄ．），  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  ，Ｗｉｅｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ｐｐ．  ７７−１１４．
Ｂｒｉｇｈｔｂｉｌｌ，Ｈ．Ｄ，  Ｌｉｂｒａｔｙ，Ｄ．Ｈ，  Ｋｒｕｔｚｉｋ，Ｓ．Ｒ，  Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｂ，  Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ｊ．Ｔ，  Ｂｌｅｈａｒｓｋｉ，Ｊ．Ｒ，  Ｍａｉｔｌａｎｄ，Ｍ．，  Ｎｏｒｇａｒｄ，Ｍ．Ｖ．，  Ｐｌｅｖｙ，Ｓ．  Ｅ．，  Ｓｍａｌｅ，Ｓ．Ｔ．，  Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｐ．Ｊ．，  Ｂｌｏｏｍ，Ｂ．Ｒ．，  Ｇｏｄｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｄｌｉｎ，Ｒ．Ｌ．  （１９９９）  Ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  ７３２−７３９．
Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．，  Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，  Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．，  ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．Ｌ．，  Ｇｒｏｓ，Ｐ．，  Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，  Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，  Ｋｕｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．，  Ｎｉｌｇｅｓ，Ｍ．，  Ｐａｎｎｕ，Ｎ．Ｓ．，  Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，  Ｒｉｃｅ，Ｌ．Ｍ．，  Ｓｉｍｏｎｓｏｎ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｌ．  （１９９８）  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ＆  ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ａ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ，  ５４，  ９０５−９２１．
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  （１９９４）  Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  ｓｕｉｔｅ：  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．  Ｄ，  ５０，  ７６０−７６３．
Ｄｒｉｅｓｓｅｎ，Ａ．Ｊ．Ｍ．，  Ｍａｎｔｉｎｇ，Ｅ．Ｈ．  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｏｅｓ，Ｃ．  （２００１）  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ８，  ４９２−４９８．
Ｆｒａｓｅｒ，Ｃ．Ｍ．，  Ｃａｓｊｅｎｓ，Ｓ．，  Ｈｕａｎｇ，Ｗ．Ｍ．，  Ｓｕｔｔｏｎ，Ｇ．Ｇ．，  Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｒ．，  Ｌａｔｈｉｇｒａ，Ｒ．，  Ｗｈｉｔｅ，Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅ，  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９０，  ５８０−５８６．
Ｆｕｋｕｄａ，Ａ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．，  Ｈａｒａ，Ｔ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，Ｊ．，  Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００２）  Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｌｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｄｅｐｅｎｄ  ｏｎ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ４３５１２−４３５１８．
Ｇｏｓｓｅｒ，Ｙ．Ｑ．，  Ｎｏｍａｎｂｈｏｙ，Ｔ．Ｋ．，  Ａｇｈａｚａｄｅｈ，Ｂ．，  Ｍａｎｏｒ，Ｄ．，  Ｃｏｍｂｓ，Ｃ．，  Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，Ｍ．Ｋ．  （１９９７）  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｒｈｏ  ＧＤＰ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｓ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ＧＴＰａｓｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８７，  ８１４−８１９．
Ｈａｙａｓｈｉ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．  （１９９０）  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｊ．  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．  Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．，  ２２，  ４５１−４７１．
Ｈｏｌｍ，Ｌ．  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．  （１９９５）  ＤＡＬＩ：  ａ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０，  ４７８−４８０．
Ｊａｂｓ，Ａ．，  Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．  （１９９９）  Ｎｏｎ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ｃｉｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２８６，  ２９１−３０４．
Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．  （１９７６）  Ａ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｅｓｔ  ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｒｅｌａｔｅ  ｔｗｏ  ｓｅｔｓ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ａ，  ３２，  ９２２−９２３．
Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｐ．Ｊ．  （１９９１）  ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ：  ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｂｏｔｈ  ｄｅｔａｉｌ  ａｎｄ  ｓｃｈｅｍａｔｉｃ  ｐｌｏｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  ２４，  ９４６−９５０．
Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，  ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．  （１９９３）  ＰＲＯＣＨＥＣＫ：  ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｃｈｅｃｋ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，  ２６，  ２８３−２９１．
Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００２）  Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９，  ７３９０−７３９５．
Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．，  Ｔａｊｉｍａ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （１９９５）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｓｔｉｎｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４，  ３３６５−３３７２．
Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．，  Ｙｏｋｏｔａ，Ｎ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （１９９７）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，  ＬｏｌＢ  （ＨｅｍＭ），  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＬｏｌＡ  （ｐ２０）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １６，  ６９４７−６９５５．
ＭｃＲｅｅ，Ｄ．Ｅ．  （１９９９）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＵＳＡ．
Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ａ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００１）  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ＬｏｌＡ，  ａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ＬｏｌＢ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２８７，  １１２５−１１２８．
Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ａ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００２）  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ，  ＬｏｌＡ，  ｔｉｇｈｔｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＬｏｌＣＤＥ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ５２８，  １９３−１９６．
Ｎａｒｉｔａ，Ｓ．，  Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００２）  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｌＣＤＥ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｉｓ  ｌｅｔｈａｌ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８４，  １４１７−１４２２．
Ｎｏｖｉｃｋ，Ｐ．  ａｎｄ  Ｚｅｒｉａｌ，Ｍ．  （１９９７）  Ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒａｂ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ９，  ４９６−５０４．
Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．  ａｎｄ  Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２７６，  ３０７−３２６．
Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ａ．Ｐ．  （１９９３）  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ５７，  ５０−１０８．
Ｓａｎｋａｒａｎ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．Ｃ．  （１９９４）  Ｌｉｐｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  １９７０１−１９７０６．
Ｓｅｒｒｅ，Ｌ．，  Ｖａｌｌｅｅ，Ｂ．，  Ｂｕｒｅａｕｄ，Ｎ．，  Ｓｃｈｏｅｎｔｇｅｎ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｚｅｌｗｅｒ，Ｃ．  （１９９８）  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｂｒａｉｎ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １５，  １２５５−１２６５．
Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｄ．Ｅ．，  Ｓａｒｋａｒ，Ａ．  ａｎｄ  Ｗａｍｐｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．  （１９９０）  Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｉｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１４，  ２５３−２６０．
Ｔａｊｉｍａ，Ｔ．，  Ｙｏｋｏｔａ，Ｎ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬｏｌＡ，  ａ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４３９，  ５１−５４．
Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００１）  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｌＢ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｌｅｔｈａｌ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｌａｓｍ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８３，  ６５３８−６５４２．
Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．，  Ｋｕｒｏｄａ，Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２００１）  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ａｓ  ｔｈｅ  ＬｏｌＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ４７６９０−４７６９４．
Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．  （２０００）  Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ，  ５６，  ９６５−９７２．
Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，Ｊ．  （１９９９）  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＭＡＤ  ａｎｄ  ＭＩＲ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ，  ５５，  ８４９−８６１．
Ｔｓｕｊｉｓｈｉｔａ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ，Ｊ．Ｈ．  （２０００）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａ  ＳｔＡＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７，  ４０８−４１４．
Ｙａｋｕｓｈｉ，Ｔ．，  Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．，  Ｎａｒｉｔａ，Ｓ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｔｏｋｕｄａ，Ｈ．  （２０００）  Ａ  ｎｅｗ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２，  ２１２−２１８．
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．，  Ｙｕ，Ｆ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．  （１９８８）  Ａ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ．  Ｃｅｌｌ，  ５３，  ４２３−４３２．
Ｚｅｒｉａｌ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ａ．  （１９９５）  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＵＫ．
Ｚｈｅｌｅｚｎｏｖａ，Ｅ．Ｅ．，  Ｍａｒｋｈａｍ，Ｐ．Ｎ．，  Ｎｅｙｆａｋｈ，Ａ．Ａ．  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｒ．Ｇ．  （１９９９）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＢｍｒＲ，  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．  Ｃｅｌｌ，  ９６，  ３５３−３６２．
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬｏｌＡの結晶構造
（Ａ）ＬｏｌＡ分子をリボンモデルとして表す（ここで、α−ヘリックス（α１―α３）およびβ−鎖（β１−β１１）を、それぞれ赤色および緑色で示す）。ループおよび短い３１０ヘリックスを黄色で、また長いループおよびβ１２は灰色で表す。変異誘発させた残基（Ｍｉｙａｍｏｔｏら、２００１，  ２００２）を、球棒モデル（ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）として表す。
（Ｂ）Ａにおいて示されるＬｏｌＡを水平軸のまわりに９０度回転させた。
（Ｃ）ＬｏｌＡホモログの配列アラインメント。α−および３１０−ヘリックスは円筒をよって、またβ鎖を矢印によって示す。配色は、ＡおよびＢにおけるものと同じである。変異誘発させた残基を赤色三角形（丸囲み）によって示す。疎水性キャビティーを囲む芳香族残基（本文を参照のこと）を緑色三角形によって示す。Ｅｃｏ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；  Ｓｔｙ，  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；  Ｙｐｅ，  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ；  Ｈｉｎ，  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；  Ａａｃ，  Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ；  Ｐｍｕ，  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ．
【図２】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬｏｌＢの結晶構造
（Ａ）ＬｏｌＢ分子をリボンモデルとして表す（ここで、α−ヘリックス（α１―α３）およびβ−鎖（β１−β１１）を、それぞれ桃色および青色で示す）。ループおよび短い３１０−ヘリックスを黄色で表す。（疎水性アンカーと思われる）Ｌｅｕ６８を、球棒モデルとして表す。
（Ｂ）Ａにおいて示されるＬｏｌＢを水平軸のまわりに９０度回転させた。
（Ｃ）ＬｏｌＢホモログの配列アラインメント。α−および３１０−ヘリックスを円筒によって、またβ鎖を矢印によって示す。配色は、ＡおよびＢにおけるものと同じである。疎水性キャビティーを形成する残基（本文を参照のこと）を、青色三角形によって示した。疎水性アンカーを、黄色三角形（丸囲み）によって示す。
【図３】ＬｏｌＡの２つの結晶型間の構造の相違
（Ａ）ＬｏｌＡの斜方晶系および三方晶系結晶の間のＣα原子の位置のずれ（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を、残基数に対して示す。配色は、図１Ａ中のものに対応する。大きなずれを示す領域は示される。
（Ｂ）ＬｏｌＡの重ね合わせられた斜方晶系（灰色）および三方晶系（緑色）結晶型のステレオ図。
（Ｃ）ＬｏｌＡの斜方晶系型におけるＡｒｇ４３とＰｒｏ４４との間のｃｉｓペプチド結合。これらの２つの残基の（シグマＡで重みをつけた）Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌｃオミットマップ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌｃ  ｏｍｉｔ  ｍａｐ）を、３．５σレベルで、緑色メッシュとして示す（ここで、これらの残基をマップの計算から排除した）。
（Ｄ）ＬｏｌＡの三方晶系型におけるＡｒｇ４３と閉塞ヘリックス（α１−α２）との間の水素結合。斜方晶系型（灰色）の構造を比較のために重ね合わせる。断続線は、Ａｒｇ４３とα−ヘリックスとの間の３．３Å以内の水素結合を示す。
【図４】ＬｏｌＡの疎水性キャビティー
（Ａ）ＬｏｌＡの分子表面を示す。芳香族残基（Ｐｈｅ，  ＴｒｐおよびＴｙｒ）を緑色で、また他の疎水性残基（Ａｌａ，  Ｉｌｅ，  Ｌｅｕ，  Ｍｅｔ，  ＰｒｏおよびＶａｌ）を明緑色で示される。閉塞α−ヘリックスをチューブとして表した。この図は、図１Ａ中のものと同じである。
（ＢおよびＣ）ＬｏｌＡの斜方晶系型における内部疎水性キャビティーの側面および上面図を示す。探査（ｐｒｏｂｅ）半径は１．４Åである。キャビティーを塞ぐことに関与する残基（Ｐｈｅ４７，  Ｔｒｐ４９，  Ｌｅｕ５９，  Ｐｈｅ９０およびＭｅｔ９１）の側鎖を赤色で示した。
（ＤおよびＥ）ＬｏｌＡの三方晶系型における内部疎水性キャビティーの側面および上面図を示す。キャビティーを塞ぐことに関与する残基（Ｐｈｅ４７，  Ｔｒｐ４９，  Ｐｈｅ９０およびＴｙｒ１５２）の側鎖を赤色で示した。
【図５】ＬｏｌＢの構造のずれ
（Ａ）ＬｏｌＢの単斜晶系（分子Ａ）と六方晶系結晶との間のＣα原子の位置的なずれを、残基数に対して示した。配色は図２Ａにおけるものと同じである。さらに、単斜晶系型における分子ＡとＢとの間、ならびに単斜晶系および六方晶系結晶における分子Ｂの間のずれを、それぞれ黒色および灰色でプロットした。
（Ｂ）重ね合わせられた３つの構造のステレオ図；単斜晶系結晶における分子Ａ（黒色）およびＢ（灰色）、ならびに六方晶系結晶（青色）。
（Ｃ）単斜晶系結晶における分子Ａの疎水性キャビティーの形成に関与する残基の（シグマＡ−で重みをつけた）Ｆｏ−Ｆｃオミットマップ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｆｏ−Ｆｃ  ｏｍｉｔ  ｍａｐ）を、３．０σレベルで、青色メッシュとして示す。これらの残基をマップの計算から排除した。この図は、図２Ａにおけるものと同じである。
（Ｄ）六方晶系結晶における疎水性キャビティーの形成に関与する残基の（シグマＡ−で重みをつけた）Ｆｏ−Ｆｃオミットマップを、３．０σレベルで、青色メッシュとして示す。有望なＰＥＧＭＭＥ２０００分子のＡ−強調Ｆｏ−Ｆｃオミットマップもまた、２．５σレベルで、赤色メッシュとして示す。これらのマップは、別々に計算され、重ね合わせられた。
【図６】ＬｏｌＢの疎水性キャビティー
（Ａ）六方晶系結晶におけるＬｏｌＢの分子表面が示される。芳香族残基（Ｐｈｅ，  ＴｒｐおよびＴｙｒ）を青色で、また他の疎水性残基（Ａｌａ，  Ｉｌｅ，  Ｌｅｕ，  Ｍｅｔ，  ＰｒｏおよびＶａｌ）を明青色として示した。α−ヘリックスを管として表す。観測された電子密度から構成されるＰＥＧＭＭＥ２０００分子の１２個の原子を、ＣＰＫモデルとして、橙色で示す。リポタンパク質へ結合するＣ１８アシル鎖を視覚化するために、ベージュ色で示されるさらなる６個の原子（Ｃ１３−１８）を、このＰＥＧＭＭＥ２０００分子にモデリングした。
（ＢおよびＣ）単斜晶系結晶における分子Ａの内部疎水性キャビティーの側面および上面図。探査（ｐｒｏｂｅ）半径は１．４Åである。内部キャビティーを塞ぐことに関与する残基（Ｌｅｕ６４，  Ｌｅｕ７３およびＭｅｔ１０７）の側鎖を赤色で示した。
（ＤおよびＥ）単斜晶系結晶における分子Ｂの疎水性キャビティーの側面図および上面図。孔（ｐｏｒｅ）の入口を、Ｅ中の矢印によって示す。
（ＦおよびＧ）六方晶系型の内部疎水性キャビティーの側面および上面図。キャビティーの表面を透明に描いた。ＰＥＧＭＭＥ２０００分子をＣＰＫモデルとして示す。
【図７】Ｌｏｌシステムによって媒介されるリポタンパク質の外膜局在化の概略図。
Ｉ．Ｌ．は、２位にＡｓｐを有する内膜リポタンパク質を示す。Ｏ．Ｌ．は、２位にＡｓｐ以外の残基を有する外膜リポタンパク質を示す。
【図８】ＬｏｌＡとＬｏｌＢのアシル基結合部位の構成残基を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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