(57)【要約】【課題】  新規なピロール誘導体【解決手段】  トウガラシ属の植物パプリカから得られる3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオンおよびその誘導体。この化合物は、抗菌作用、澱粉老化防止作用、澱粉糊化促進作用を有し、食品添加物として有用である。2005350370.tif 000010【特許請求の範囲】
【請求項１】
3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオンまたはその誘導体。
【請求項２】
誘導体が5-ヒドロキシメチル基のヒドロキシル基の水素がアシル基に置換されたものである請求項１記載の誘導体。
【請求項３】
誘導体が5-ヒドロキシメチル基が低級アルコキシメチル基に置換されたものである請求項１記載の誘導体。
【請求項４】
請求項1〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分とする抗菌剤。
【請求項５】
請求項1〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分とする澱粉老化抑制剤。
【請求項６】
請求項1〜３のいずれかに記載の化合物を有効成分とする澱粉糊化促進剤。
【請求項７】
トウガラシ属の植物の果実を高極性溶媒で抽出し、活性炭処理、溶媒沈澱法、分配抽出法、吸着クロマト、分配クロマト等を適宜組み合わせて精製を行うことを特徴とする請求項１記載の化合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物  3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオンもしくはその誘導体、その製造法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗菌性物質に関しては多くの報告がある。ピロール誘導体についても医薬品、抗菌剤として多くの化合物が開発され利用されており、多くの抗菌性化合物が知られている。化学物質の生理作用はその構造に依存するところが大きく、なお、利用面に適したより有効な抗菌活性を有する新規化合物が要望されている。
また、澱粉は水とともに加熱して糊化された後に、食されるものであるが、糊化した澱粉は、その直後から経時的に老化と呼ばれる現象が始まる。澱粉の老化によって、食品の食感、食味、アミラーゼによる消化率の低下などが生じる。このため澱粉の老化防止あるいは糊化を促進することが試みられ、その手段として、例えば乳化剤や糖類を添加する方法やアルカリ等の化学的処理を行う方法などが知られている。しかし、それぞれに用途が限定されるなどの問題があり、これらに有効な化合物の開発が要望されている。
本発明者らは、このような化合物の開発を目的として、種々の植物抽出物から抗菌作用、澱粉老化防止、澱粉糊化促進作用を有する化合物の検索を行ったところ、トウガラシ抽出物に澱粉老化防止作用があることを見出した（特許文献１および２）。
【特許文献１】特開2001-178385号公報
【特許文献２】特開 2003-231676号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上述のような事情に鑑みトウガラシ科の植物から、更に新規な、抗菌作用、澱粉老化防止、澱粉糊化促進作用を有し、食品に適用した場合に安全かつ食感を損なわない新規化合物を探索して、このような性質を有する新規化合物を見出した。
従って、本発明は、トウガラシ科の植物から、抗菌作用、澱粉老化防止作用、澱粉糊化促進作用を有し、食品に適用した場合においても安全かつ食感を損なわない新規な化合物、その製造法および用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは前記したように、トウガラシから得た抽出物に澱粉老化防止抑制作用があることを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。また、本抽出物から澱粉老化防止、澱粉の糊化促進、および抗菌作用を有する新規な物質（ピロール誘導体）を見出し、特許出願した（特許文献２）。 更に検討を行ったところ、澱粉老化防止、澱粉の糊化促進、および抗菌作用が特許文献２にくらべて著しく強い物質、3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオンを見出すことに成功し本発明を完成するに至った。
そして、いくつかの誘導体を作成したところ、そのいくつかの誘導体を作成したところ、5-ヒドロキシメチル基の水素原子を低級アルキルあるいはアシル基で置換しても同様の効果をもつことを見出した。
【０００５】
本発明は、このような3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオン及びその誘導体ならびにその製造法に関する。更に本発明は、これらの化合物を有効成分とする抗菌剤、澱粉老化防止剤、澱粉湖化促進剤に関する。
すなわち、本発明は、
(1)次の式(I)で示される 3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオン。
【化１】
2005350370.tif 000002
(2)次の式(II)で示される 3-(5-アシルオキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオン。
【化２】
2005350370.tif 000003
（ただし、式中Rは、水素またはアルキル基を示す。）
(3)次の式（III）で示される 3-(5-アルコキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオン。
【化３】
2005350370.tif 000004
（ただし、式中Rは、低級アルキル基を示す。）
(4)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物を有効成分とする抗菌剤。
(5)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物を有効成分とする澱粉老化抑制剤。
(6)前記(1)〜(3)のいずれかに記載の化合物を有効成分とする澱粉糊化促進剤。
(7)トウガラシ属の植物の果実を高極性溶媒で抽出し、活性炭処理、溶媒沈澱法、分配抽出法、吸着クロマト、分配クロマト等を適宜組み合わせて精製を行うことを特徴とする前記(1)に記載の化合物の製造法。
前記式（II）及び（III）の低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル等を例示することができる。
【０００６】
本発明化合物は、パプリカ、ピーマンなどのトウガラシに属する植物を抽出し、分離精製することによって得ることができる。抽出原料の植物は主にパプリカの果実を利用するのがよく、乾燥したものでも乾燥していないものでもよく、またパプリカ粉末として利用されている材料を用いることも、油性の溶剤で色素成分などを抽出した残渣を利用することもできる。抽出溶剤としては、本発明化合物を溶解できる溶剤であればよく、好適には水、メタノール、エタノールあるいはこれらの混合溶媒等の高極性溶媒を用いる。また、予めヘキサンなどの低極性溶媒で脱脂、脱色処理をし、その後高極性の溶媒で抽出することにより、後の精製処理を容易にすることもできる。抽出温度や抽出時間あるいは溶媒の量などは、特に制限されることはなく、通常は原料の２〜10容量倍程度の溶媒を用いて、常温から溶媒の沸点以下の温度で1〜24時間程度抽出操作を行えばよい。また、回収量を向上させるために、使用する溶媒量や時間を適宜選択したり、溶媒を取り換え繰り返し抽出してもよい。抽出液は、必要に応じて、活性炭などによる脱色処理、濃縮処理などを行い、分離精製処理を行う。分離精製は、その性状を利用した通常の分離手段、例えば、溶媒分配抽出法、吸着クロマト、分配クロマトなど各種のクロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて精製単離する。また、精製工程の途中あるいは精製後にピロール環の5位のヒドロキシメチル基にアセチル基またはアルキル基を導入した誘導体として精製単離することもできる。例えば、アセチル基の導入は、粗精製品をピリジンに溶解し、氷水で冷却しながら無水酢酸を加えて常温で一晩反応させ、その後水を加えて、酢酸エチルのような適当な溶媒で抽出し水で洗浄後、低濃度のメタノールあるいはアセトニトリルを溶離剤としたODSカラムクロマトグラフィーや、クロロフォルム−メタノール等を溶離剤とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって分画単離する。置換基の導入は精製工程のどの段階で行ってもよいが、好ましくはある程度精製された段階で行う。また前記アセチル基以外に、ホルミル、プロピオニル基等を導入してもよい。
また、得られた3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオンの5-ヒドロキシメチル基を5-低級アルコキシメチル基に置換してもよい。この置換は公知の方法で行われる。低級アルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシル基等を例示することができる。
【０００７】
上述のようにして得られる本発明化合物は、酵母、グラム陽性菌、グラム陰性菌に対して抗菌力を有し、また糊化澱粉の老化を抑制する作用や澱粉の糊化を促進する作用があることが見出された。従って、本発明化合物を有効成分とする抗菌剤、澱粉の老化抑制剤あるいは澱粉の糊化促進剤として利用できる。本発明化合物をこれらの有効成分とする場合、これらの有効成分を単独で用いてもよく、また好ましくは水やエタノールなどの溶液として、あるいは糖やデキストリンなどで希釈して用いる。その使用濃度は適用する対象によって適宜決められる。
【０００８】
本発明化合物は、抗菌剤として使用する場合は、種々の食品、例えばハム、ソーセージ類、ハンバーグ等に0.001〜0.1重量％添加することがよく、また澱粉の老化抑制剤あるいは澱粉の糊化促進剤として使用する場合は、澱粉質食品、例えばパン、インスタント麺、あるいは米飯に0.0001〜0.1重量％添加するとよい。これらの添加は製造工程のいかなる段階で行ってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明化合物(I)〜(III)は、新規化合物であって、本発明化合物(I)は従来食されている食品から得られる。これらの化合物はいずれも抗菌作用、澱粉の老化抑制作用および糊化促進作用を兼ね備えている。従って、澱粉含有食品に添加することによって、調理後の保存性を増し、保存後においても美味しく食することができる。また、澱粉含有食品以外の食品に添加してその保存性を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下実施例を挙げて本発明を詳しく説明する。
【実施例１】
【００１１】
(本発明化合物(I)の製造)
市販の粉末パプリカ3kgにn-ヘキサン15Lを添加して、常温で一晩撹拌しながら抽出した後、ろ過して残った固形物を採取し乾燥させた。この乾燥物に20%エタノールを15L添加して常温で一晩撹拌しながら抽出した後固液分離して抽出液を得た。この抽出液を合成吸着剤HP2MG（三菱化成製）1500mlを充填し20％エタノールで平衡化したカラムに流し、更に20％エタノール9 Lを流して洗浄した。
その後、溶離液として60%エタノール6 Lを流して回収し、40℃で減圧濃縮した。残りに水300mlを添加して溶解し、酢酸エチル1Lで3回抽出し、酢酸エチル層を採取して濃縮乾燥した。
このようにして得られた粗活性成分をシリカゲルを吸着剤としたカラムクロマトグラフィーで目的物質を含む画分を分画した。溶離液としてクロロフォルム−メタノールを用い25:1〜10:1までの直線グラジェントを行い本発明化合物(I)  を含む画分を集めた。この画分を濃縮後、STR ODS-II（信和化工株式会社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（20〜50%メタノール）によって本発明化合物(I)を含む画分を分取し、濃縮乾固した。更に、クロロフォルム−メタノール（93:7）を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い本発明化合物(I)を含む画分80mgを得た（粗精製物1）。更にこの物質を少量の10%アセトニトリルに溶解し、STR ODS-II（信和化工株式会社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（10%アセトニトリル）で精製し、本発明化合物(I) 30 mgを得た。
本発明化合物(I)は下記の物理化学的特性を持ち、3-(5-ヒドロキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオン(I)であることが確認された。
【化４】
2005350370.tif 000005
【００１２】
(1) 外観  淡色粘稠物
(2) 分子量（高分解能質量分析、EI-MS）222.0647
(3) 分子式  C10H10N2O4
(4) 溶剤に対する溶解性：エタノール、メタノールに易溶、酢酸エチル、水に可溶、クロロフォルムに難溶。
(5) 紫外部吸収スペクトル(MeOH)  257, 293nm
(6) 赤外部吸収スペクトルIRνmax (KBr)cm-1: 3420, 1790, 1717, 1655
(7) 1H-NMR(CD3OD)ppm：δ2.82(dd), 3.17(dd), 4.66(d), 4.70(d), 5.72(dd), 6.33(d), 7.13(d), 9.34(s)
(8) 13C-NMR(CD3OD)ppm: δ38.6, 56.7, 56.8, 111.7, 127.6, 133.4, 145.9, 177.40,   177.41, 180.9
【実施例２】
【００１３】
（本発明化合物(II)の製造）
実施例１で得られた本発明化合物(Ｉ)10mgをピリジン0.2mlに溶解し、氷水で冷却しながら無水酢酸0.05mlを添加し、常温で一晩放置した。その後5mlの水を加え、酢酸エチル5mlで5回抽出した。酢酸エチル層は1%の塩酸1mlで洗浄、更に水2mlで3回洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥後、減圧濃縮した。これをクロロフォルム−メタノール(100:0〜95:5)を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分画し、本発明化合物（II）9mgを得た。この化合物は、次の分子量、紫外部吸収スペクトル、NMR等の結果より、本発明化合物（I） のアセチル体、すなわち3-(5-アセトキシメチル-2-フォルミルピロール-1-イル)-ピロリジン-2,5-ジオン(IV)であることが確認された。
この物質2mgをとり常法に従って希アルカリによるエステル加水分解を行い精製して得られた物質は、シリカゲルTLCのRf値、HPLC(ODSカラム)による溶出時間、紫外部吸収スペクトル、1H-NMRスペクトルは原料である本発明化合物（I）と完全に一致したことから、次の式(IV)で示される本発明化合物(I)の
アセチル誘導体であることが確認された。
【化５】
2005350370.tif 000006
【００１４】
(1) 外観  淡色粘稠物
(2) 分子量（EI-MS）  m/z 264[M]+
(3) 分子式  C12H12N2O5
(4) 溶剤に対する溶解性：エタノール、メタノールに易溶、クロロフォルム、水に可溶
(5) 紫外部吸収スペクトル(MeOH)  258, 293nm
(6)  1H-NMR(CDCl3)ppm：δ2.06(s), 2.93(dd), 3.11(dd),5.15(s), 5.35(tr), 6.41(d), 7.05(ｄ), 8.72(s), 9.41(s)
(7) 13C-NMR(CDCl3)ppm: δ20.8, 37.7, 55.3, 56.7, 113.2, 125.7, 132.1, 138.0, 170.1, 173.13, 173.20, 179.6
【実施例３】
【００１５】
ピーマンから本発明化合物(I)を以下のようにして製造した。市場から購入した新鮮なピーマン１kgに40%エタノール1000mlを加えて摩砕抽出し、1800mlの抽出液を得た。この抽出液を200mlまで減圧濃縮し、撹拌しながら95%エタノール2000mlを加えた。充分混合後、発生した沈澱物を遠心分離によって除去し、得られた上清を約100mlまで減圧濃縮した。この濃縮液を撹拌しながら2000ml の95%エタノールを添加しよく混合した。発生した沈澱物を遠心分離によって除去して得られた上清を200mlまで減圧濃縮した。この濃縮液を、予め10%エタノールで平衡化させた200mlのダイヤイオンHP-20を充填したカラムに通液し、10%エタノール1000mlで洗浄後、40%エタノール200mlを流してこの流出液を採取した。この流出液を濃縮し、ODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで10％アセトニトリルを溶媒として分取を行った。更に10%メタノールを溶媒として精製した後、クロロフォルム−メタノール（94:6）を溶離液としたシリカゲルクロマトグラフィーを行い、約１mgの単離物を得た。この物質は、1H-NMR、13C-NMR、MS、紫外部吸収スペクトルによって本発明化合物(I)であることが確認された。
【実施例４】
【００１６】
シシトウから本発明化合物(I)を以下のようにして製造した。市場から購入した新鮮なシシトウ１kgに40%エタノール1000mlを加えて摩砕抽出し、1800mlの抽出液を得た。この抽出液を200mlまで減圧濃縮し、撹拌しながら95%エタノール2000mlを加えた。充分混合後、発生した沈澱物を遠心分離によって除去し、得られた上清を約100mlまで減圧濃縮した。この濃縮液を撹拌しながら2000ml の95%エタノールを添加しよく混合した。発生した沈澱物を遠心分離によって除去して得られた上清を200mlまで減圧濃縮した。この濃縮液を、予め10%エタノールで平衡化させた200mlのダイヤイオンHP-20を充填したカラムに通液し、10%エタノール1000mlで洗浄後、40%エタノール200mlを流してこの流出液を採取した。この流出液を濃縮し、ODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで10％アセトニトリルを溶媒として分取を行った。更に10%メタノールを溶媒として精製した後、クロロフォルム−メタノール（94:6）を溶離液としたシリカゲルクロマトグラフィーを行い、約1.2mgの単離物を得た。この物質は、1H-NMR、13C-NMR、MS、紫外部吸収スペクトルによって本発明化合物(I) であることが確認された。
【実施例５】
【００１７】
（抗菌力試験）
本発明化合物(I)および(II)の抗菌力は、次の試験によって確認した。試験の対象菌には酵母Saccharomyces cerevisiae IFO 0203、グラム陽性菌としてBacillus subtilis IFO 3007、グラム陰性菌としてEscherichia coli K-12 IFO 3301を用いた。抗菌試験は8mm径のペーパーディスクを用いるペーパーディスク法で行い、ペーパーディスクに本発明化合物(I)および(II)を別々に5μgづつ含浸させたときの阻止円径を求めた。なお、Bacillus subtilis、Escherichia coliについては、普通ブイヨン寒天培地で30℃2日間培養後、Saccharomyces cerevisiaeについてはポテトデキストロース寒天培地で25℃５日間培養後、それぞれ判定した。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
2005350370.tif 000007
【００１９】
【実施例６】
【００２０】
（澱粉老化抑制試験）
米160gを洗浄後、水240mlと本発明化合物(I)、本発明化合物(II)および比較例として粗精製物１（実施例１参照）をそれぞれ10μgを加えて炊飯した。同様に本発明化合物を添加しない対照区を調製した。得られた炊飯米を10℃で20時間保存した。保存前後の糊化度をBAP法で測定し、その差を算出して老化度とした。結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
2005350370.tif 000008
【実施例７】
【００２２】
糊化促進試験は、次のよう行った。本発明化合物(I)または(II)10μgを添加した１％の馬鈴薯澱粉溶液50mlを100℃で10分間加熱した。糊化度は600nmにおける透過度を測定した。結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
2005350370.tif 000009
【実施例８】
【００２４】
本発明化合物Ｉを10 mgに、デキストリン250gを加え均一になるまで混合して炊飯添加剤を得た。
【実施例９】
【００２５】
白米320gに実施例８の炊飯添加剤（試験区）もしくはデキストリン（対照区）を2g、水480ccを加え、定法により炊飯して飯米を得た。得られた試験区の飯米は、炊飯添加剤を入れないで炊飯した飯米(対照区)にくらべてその風味において遜色はなかった。炊飯後、BAP法による糊化度は、試験区は97.5であり、対照区は96.5であった。
また、この飯米を常温で保存したところ、試験区は2日保存しても風味は劣化しないのに対し、対照区は2日目にはすっぱい風味が感じられた。