(57)【要約】【課題】  安全性に優れた細胞培養用担体を提供すること。【解決手段】  低分子量ポリグリシジルエーテルエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）で架橋された海洋生物由来コラーゲンを細胞培養用担体として用いる。コラーゲンをＥＧＤＥで架橋することが好ましい。細胞培養用担体はフィルムなどの形状であり得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋された海洋生物由来コラーゲンを含有する細胞培養用担体。
【請求項２】
前記コラーゲンが予め蛋白質分解酵素で処理されたコラーゲンである、請求項１に記載の細胞培養用担体。
【請求項３】
前記低分子量ポリグリシジルエーテルが、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、およびポリプロピレングリコールジグリシジルエーテルからなる群より選択される、請求項１または２に記載の細胞培養用担体。
【請求項４】
前記担体がフィルムである、請求項１から３のいずれかの項に記載の細胞培養用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用担体に関する。さらに詳しくは、海洋生物由来コラーゲンを用いた細胞培養用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは動物細胞の結合組織を構成する蛋白質であり、生体由来のバイオマテリアルとして、食品、医薬品、化粧品などの様々な分野で用いられている。例えば、コラーゲンをゲル化あるいはフィルム化して、細胞培養担体などとして用いることが試みられている。例えば、特許文献１には、マルチウェルプレート上にコラーゲンなどの細胞接着因子を塗布すること、または架橋剤で架橋することによってプレート上に保持する方法が記載されている。特許文献２には、ゼラチンとポリアニオンをカルボジイミドにより架橋し、ゼラチンの強度を高めて、医療用材料として用いることが記載されている。特許文献３には、哺乳動物由来のタイプＩコラーゲンの架橋度を酵素処理によって低下させ、あるいはＤ−リボース、グルタルアルデヒドなどの架橋剤で架橋度を高め、それによって培養細胞の機能、増殖および形態を任意に制御し得る細胞培養担体が記載されている。
【０００３】
ところで、哺乳動物由来のコラーゲンと海洋生物、特に魚類に由来するコラーゲンは、その性質が大きく異なっている。例えば、サケ皮由来のコラーゲンは、ウシ皮由来のコラーゲンと比べて、ヒドロキシプロリンの含有量が約半分であること、ウシ皮由来のコラーゲンの熱変性温度が３７〜３８℃であるのに対し、サケ皮由来のコラーゲンの熱変性温度は１６〜１８℃と低いことなどの相違がある（非特許文献１）。そこで、細胞培養担体としては、専ら、哺乳動物由来のコラーゲンが使用されている。
【０００４】
しかし、哺乳動物由来のコラーゲンは、アレルギーや海綿状ウシ脳症（ＢＳＥ）、内在性ウイルス感染症など、安全面での問題が指摘されているおり、代替品の開発が早急に求められている。他方で、海洋生物由来コラーゲンは、このような安全面での問題は現在のところない。また、海洋生物由来コラーゲンは、魚類の皮などに多く含まれるが、ほとんど廃棄されており、資源の有効利用という点から、海洋生物由来コラーゲンの利用を図ることが求められている。
【０００５】
海洋生物由来のコラーゲンを魚皮から回収する方法は、例えば特許文献４および特許文献５に記載されており、この方法により異臭もなく風味に優れた食品、化粧品、医療などに用いられるコラーゲンが回収されている。また、非特許文献１および非特許文献２は、海洋生物由来のコラーゲンの膜材料としての可能性を検討するため、海洋生物由来コラーゲンの製膜性について検討している。これらの文献には、海洋生物由来コラーゲンを精製し、グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、水溶性カルボジイミドなどの架橋剤で架橋・製膜したこと、およびグルタルアルデヒドとグリシジルエーテル類とを比較すると、グルタルアルデヒドの反応性がグリシジルエーテル類の反応性よりも高いことから、グルタルアルデヒドが好適であることが記載されている。そして、得られた膜の液体透過性、溶質透過性、気体の透過性などを検討して、センサー膜、包装材料として開発されている。このように非特許文献１および２では製膜性が重視されており、細胞培養については考慮されていないため、架橋剤の毒性についての検討はなされていない。
【０００６】
さらに、例えば、特許文献６には、イカキチンシートに鮭皮などの魚皮コラーゲンをラミネートし、代用皮膚とする試みがなされている。また、特許文献７には、魚類細胞の細胞培養担体として魚類由来のコラーゲンを用いることが記載されている。
【０００７】
このように、海洋生物由来のコラーゲンは種々の用途が検討されているが、熱変性温度が低いという性質上、哺乳動物細胞などの細胞培養担体としての検討はなされていない。
【特許文献１】特開２００１−２５２０６８号公報
【特許文献２】特開平７−１６３８６０号公報
【特許文献３】特開平７−２９８８７５号公報
【特許文献４】特許第２８６４４５９号
【特許文献５】特許第２９３１８１４号
【特許文献６】特開平９−１０２４６号公報
【特許文献７】特開平７−７５５６６号公報
【非特許文献１】平成５年度共同研究報告書「海洋生物コラーゲンを利用した機能性膜の開発」平成６年３月  北海道大学工学部、大同ほくさん（株）、北海道糖業（株）、和弘食品（株）および北海道立食品加工研究センター
【非特許文献２】平成６年度共同研究報告書「海洋生物コラーゲンを利用した機能性膜の開発」平成７年３月  北海道大学工学部、大同ほくさん株式会社、北海道糖業株式会社、和弘食品株式会社および北海道立食品加工研究センター
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、海洋性コラーゲンから、哺乳動物細胞などの培養に用いられ得る細胞培養担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋された海洋生物由来コラーゲンを含有する細胞培養用担体を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様においては、前記コラーゲンが予め蛋白質分解酵素で処理されたコラーゲンである。
【００１１】
また、好ましい実施態様においては、低分子量ポリグリシジルエーテルが、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、およびポリプロピレングリコールジグリシジルエーテルからなる群より選択される。
【００１２】
また、別の好ましい実施態様においては、前記担体がフィルムである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋された細胞培養担体を用いることにより、アレルギーやＢＳＥ、内在性ウイルス感染症などの安全性の問題がなく、動物細胞に対して毒性がなく、かつ、３５〜３７℃の温度でも動物細胞を培養することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の細胞培養用担体は、海洋生物由来のコラーゲンが、低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋されている。
【００１５】
本明細書において、海洋生物とは、魚類、貝類、棘皮動物、藻類などの海棲の生物をいう。本発明においては、魚類が最も好ましく用いられる。魚類としては、特に制限はない。例えば、サケ、マス、タラ、サメ、ホッケ、オヒョウ、マグロ、カツオ、カレイ、ヒラメ、エイなどが挙げられるが、これらは例示である。
【００１６】
本明細書においては、架橋剤とは、海洋生物由来のコラーゲン中の官能基（水酸基、アミノ基、カルボン酸など）と反応して、コラーゲン分子内でまたはコラーゲン分子間で架橋し得る物質をいう。架橋剤としては、低分子量ポリグリシジルエーテルが用いられる。低分子量ポリグリシジルエーテルとしては、分子量が約２０００以下、好ましくは約１０００以下、より好ましくは、約５００６００以下のものが用いられる。例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテル、１，２−３，４−ジエポキシブタンなどが使用される。中でも、エチレングリコールジグリシジルエーテル（以下、ＥＧＤＥと省略する）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（以下、ＰＧＤＥと省略する）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（以下、ＰＥＧＤＥと省略する）およびポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（以下、ＰＰＧＤＥと省略する）が好ましく用いられる。
【００１７】
以下、海洋生物由来のコラーゲンの調製方法、海洋生物由来コラーゲンの架橋方法、および細胞培養担体について、順に説明する。
【００１８】
（海洋生物由来のコラーゲンの調製方法）
海洋生物由来のコラーゲンの調製方法を、魚類のコラーゲンを例に説明する。魚類のコラーゲンは、結合組織である皮および骨に多く含まれるため、コラーゲン調製のための材料として、魚皮、魚骨が好ましく用いられる。例えば、水産加工場から廃棄物として出される、魚皮、魚骨などが利用される。
【００１９】
魚皮からのコラーゲンの製造方法としては、従来当業者が用いる方法（例えば、特許文献４および５に記載の方法）、あるいは、酢酸、塩酸などの希酸を用いて抽出し、塩析、アルカリ沈澱などで精製する方法がある。以下、本発明で用いた、サケ皮からのコラーゲンの調製方法を説明するが、この方法に限定されない。
【００２０】
本発明で用いるコラーゲンの調製方法は、以下の工程を含む：サケ皮を脱脂する工程；脱脂サケ皮を酸性溶液に浸漬して、コラーゲンを抽出する工程；濾過によりコラーゲンが溶解した溶液（濾液）を回収する工程；必要に応じて、蛋白質分解酵素処理を行う工程；濾液または蛋白質分解酵素処理溶液の塩析を行い、コラーゲンを析出させる工程；析出したコラーゲンを濾過により回収する工程；回収したコラーゲンを再度酸性溶液に溶解させる工程；および、コラーゲン溶解溶液を蒸留水に対して、透析液のｐＨが中性になるまで、透析を行う工程。
【００２１】
なお、上記工程は、コラーゲンの変性を防止するために、１０℃以下の低温で、好ましくは５℃以下の低温で行われることが好ましい。
【００２２】
上記工程のうち、サケ皮を脱脂する工程では、当業者が一般的に用いる脱脂方法が用いられる。例えば、サケ皮を細断（ミンチ）した後、クロロホルム／メタノール／水の混合溶媒系、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル、メタノールなどの溶媒で抽出する。ついで、例えばメタノール、エタノールなどの有機溶媒および水の順で洗浄することによって、脱脂サケ皮を得ることができる。
【００２３】
脱脂サケ皮からコラーゲンを抽出するには、脱脂サケ皮を酸性溶液に浸漬して行う。酸としては、酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、クエン酸などが用いられるが、酢酸が好ましく用いられる。例えば、脱脂サケ皮１質量部あたり、１０〜３０質量部の０．１〜０．５Ｍ  酢酸溶液に浸漬して、１〜数日静置することによって、コラーゲンが抽出される。
【００２４】
必要に応じて、蛋白質分解酵素処理を行う工程においては、酵素は、通常、コラーゲン１００質量部に対して０．５〜２質量％程度となるように添加される。蛋白質分解酵素については、特に制限はないが、酵素としてペプシンを用いた場合は、コラーゲンの抗原性を有するといわれるテロペプチド部分が除去される。テロペプチドの除去により、使用者への安全性がさらに高められる。
【００２５】
コラーゲンを含有する抽出液（濾液）、またはこのコラーゲンを蛋白質分解酵素で処理した溶液からのコラーゲンを塩析により回収する工程において、塩の種類には特に制限はないが、一般には、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウムなど、蛋白質の精製に用いられる塩が好ましく用いられる。用いる塩の種類、コラーゲンの濃度などによっても異なるが、塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウムの最終濃度が１〜３Ｍとなるように、添加される。
【００２６】
塩析により回収したコラーゲンを再度、酸性溶液に溶解させる工程において、酸性溶液としては、上記コラーゲンの抽出に用いた酸が用いられる。たとえば、酢酸を用いる場合、０．１〜０．４Ｍの酢酸溶液を用いることが好ましい。
【００２７】
調製されたコラーゲンは、必要に応じて、コラーゲン濃度が調整され、架橋反応に供される。
【００２８】
（架橋コラーゲンの調製）
上記例示の方法により調製されたコラーゲンは、低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋処理される。好ましくは、ＥＧＤＥ、ＰＤＧＥ、ＰＥＧＤＥ、ＰＰＧＤＥなどが用いられる。架橋処理においては、コラーゲンの変性を防止するために、すべての工程における処理は、１０℃以下の低温で、好ましくは５℃以下の低温で行われることが好ましい。
【００２９】
架橋処理は、例えば、フィルムについて行う場合は、以下の工程で行われる：適切な濃度のコラーゲン溶液からフィルムを得る工程；得られたコラーゲンフィルムと低分子量ポリグリシジルエーテルとを接触させることにより反応を行い、架橋コラーゲンフィルムを得る架橋工程；および、得られた架橋コラーゲンフイルムコラーゲンフィルムを室温で洗浄し、回収する工程。
【００３０】
上記コラーゲン溶液からフィルムを得る工程においては、コラーゲン溶液を均一にトレイに流し込み、低温で適切な時間（例えば、４８〜７２時間）、通風乾燥を行うことが好ましい。
【００３１】
また、上記架橋工程においては、反応液は、架橋のために、０．５〜１０質量％の低分子量ポリグリシジルエーテルを含有するとともに、フィルムの溶解を防止するために、適切な濃度の塩（例えば、１〜３ＭのＮａＣｌ）を含有していることが好ましい。架橋反応は、適切な時間（例えば、２〜４８時間）行われる。
【００３２】
架橋反応終了後、得られた架橋コラーゲンフィルムは、水、エタノール等で洗浄される。必要に応じて、さらに、除菌および洗浄のため、５０〜９０％のエタノールで洗浄される。また、得られた架橋コラーゲンフィルムは、必要に応じて、(滅菌)生理食塩水に浸漬して保存される。
【００３３】
（細胞培養用担体）
細胞培養用担体の形状は特に制限されない。例えば、上記方法で調製したフィルムの形状の他に、マルチウェルプレート上で架橋反応を行って製造される架橋コラーゲンで被覆されたマルチウェルプレート、あるいは所望の三次元構造を有する型の中で架橋剤ＥＧＤＥとコラーゲンとを反応させて得られる三次元構造や、スポンジ状、糸状、ビーズ状などの形状の担体が挙げられる。これらの種々の形状を得るための架橋反応は、上記フィルムの製造とほぼ同様である。
【００３４】
得られる細胞培養用担体は、架橋により強度が上昇するとともに、熱変性温度が上昇しており、通常の哺乳動物細胞の培養温度（３５〜３７℃）でも熱変性しない。また、低分子量ポリグリシジルエーテル以外の架橋剤（例えば、蛋白質の架橋剤として広く知られているグルタルアルデヒド、天然の架橋剤で配糖体のゲニピン）を用いると細胞の増殖が阻害されるが、低分子量ポリグリシジルエーテルを用いた場合には、そのような細胞毒性は観察されない。従って、低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋された海洋生物由来コラーゲンは、培養する細胞に対して毒性がなく、また、安全性の面からは使用者に対してアレルギーやＢＳＥ、内在性ウイルス感染症のおそれもないなど、細胞培養用担体として優れている。また、海洋生物由来コラーゲンを含有する細胞培養用担体は、哺乳動物由来のコラーゲンを含有する細胞培養用担体と比べて、コラゲナーゼで溶解し易いため、細胞の回収が容易であり、回収率も高いという利点を有する。フィルム状の細胞培養用担体は、コラゲナーゼで溶解し易いため、好適である。さらに、低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋されたコラーゲンは、創傷被覆材等の医療材料などにも利用され得る。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明が以下の実施例に制限されることはない。
【００３６】
（サケ皮からのコラーゲンの抽出・精製）
水洗したサケ皮をミンチにかけ、細断し、水洗した。このサケ皮細断物を、クロロホルム／メタノール／水＝１／２／０．８（容量比）の混合溶媒中に入れ、よく攪拌し、１０分間静置した。この静置物に、混合溶媒中のクロロホルム量と同量のクロロホルムを追加し、１分間攪拌・混合して、さらに、添加したクロロホルムと同量の水を加えて、１分間混合し、５分間放置した（最終的にクロロホルム／メタノール／水＝２／２／１．８（容量比））。濾過によりサケ皮を回収し、このサケ皮を、最初の混合溶媒中のクロロホルム量と同量のクロロホルムに５分間浸漬して脂質をさらに除去し、メタノールで洗浄後、さらに水洗して、脱脂サケ皮を得た。
【００３７】
脱脂サケ皮を、脱脂サケ皮１質量部あたり１５質量部の０．２Ｍ酢酸溶液に浸漬し、４℃で３６時間静置した。その後、濾過によりサケ皮を除き、濾液を回収した。この濾液中の固形分蒸発残分を測定し、この固形分蒸発残分に対して１質量％となるようにペプシン（天野エンザイムより購入）を加えて、４℃で２４時間、静置反応を行い、テロペプチド部分を除去した。酵素処理液に等量の４ＭＮａＣｌ溶液を加えて、最終濃度２ＭのＮａＣｌ溶液として、４℃にて２４時間、塩析を行い、析出したコラーゲンを濾過により回収した。回収したコラーゲンを、４℃で、再度０．２Ｍの酢酸溶液に溶解させた。このコラーゲン溶解溶液を透析膜に入れ、蒸留水に対して、透析液のｐＨが中性になるまで、透析を行い、コラーゲン溶液を得た。得られたコラーゲン溶液中のコラーゲン濃度を測定し、１質量％となるように調製した。
【００３８】
（フィルムの調製）
底面が２１×１３．５ｃｍの樹脂トレイを複数枚準備し、上記調製したコラーゲン溶液を、５０ｍｌ、１００ｍｌおよび２００ｍｌ、それぞれに均一に流し込み、４℃で通風乾燥を行った。５０ｍｌ流し込んだトレイは、４８時間、２００ｍｌ流し込んだトレイは、７２時間の乾燥時間を要した。
【００３９】
得られたフィルムを、一辺が４ｃｍの正方形に切り出し、秤量した結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2005312338.tif 000002
【００４１】
この結果が示すように、フィルムの形成に当り、コラーゲンの損失がないこと、使用量に応じてコラーゲン量を調節することが可能であることが示された。以下の実験には、１００ｍｌのコラーゲン溶液で調製されたコラーゲンフィルムを用いた。
【００４２】
（実施例１）
上記調製されたコラーゲンフィルムを、架橋剤であるＥＧＤＥをそれぞれ、０．５、１、３、５および１０質量％の濃度で含み、かつ２ＭのＮａＣｌを含む各反応用溶液中に浸漬し、４℃で、２〜４８時間、架橋反応を行った。反応終了後、フィルムを取り出し、室温の水で洗浄し、除菌および洗浄のために７０％エタノールで洗浄後、生理食塩水で３７℃に加温した。コラーゲンフィルムの溶解の程度を目視観察し、架橋の程度を判断した。結果を表２に示す。
【００４３】
（実施例２）
架橋剤として、ＥＧＤＥの代わりにＰＥＧＤＥ（商品名エピオールＥ−４００（分子量５２６）日本油脂（株）製）を用い、ＰＥＧＤＥ濃度を３、５および１０質量％としたこと以外は実施例１と同様にして、架橋の程度を判断した。結果を表２に示す。
【００４４】
（実施例３）
架橋剤として、ＥＧＤＥの代わりにＰＰＧＤＥ（商品名エピオールＰ−２００（分子量３０４）日本油脂（株）製）を用い、ＰＰＧＤＥ濃度を０．５、３、５および１０質量％としたこと以外は実施例１と同様にして、架橋の程度を判断した。結果を表２に示す。
【００４５】
（比較例１〜２）
架橋剤として、グルタルアルデヒド（以下、ＧＡ）（比較例１）およびゲニピン（以下、ＧＥ）（比較例２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、それぞれフィルムの架橋程度を評価した。なお、比較例１では、ＧＡの濃度は、０．５および１０質量％のものを用いた。結果を表２に示す。
【００４６】
なお、表２において、○はフィルムが溶解しなかったこと（架橋が良好に行われたこと）、△はフィルムが半分ほど溶解したこと（架橋が行われたが不充分であること）、×はフィルムが溶解したこと（架橋が良好に行われなかったこと）を示す。なお、−は試験していないことを示す。
【００４７】
【表２】
2005312338.tif 000003
【００４８】
表２の結果から、低分子量ポリグリシジルエーテルは、濃度にもよるが、コラーゲンを架橋して不溶化し得ることがわかった。ＥＧＤＥは、０．５〜１質量％の濃度では架橋に約３０時間を要したが、３質量％以上では２４時間で架橋できた。ＰＥＧＤＥ（分子量５２６）では、５質量％以上の濃度で架橋できることがわかった。ＰＰＧＤＥ（分子量３０４）では３質量％以上の濃度で、架橋できることがわかった。これに対して、比較例１のＧＡは比較的低濃度でも架橋反応が速く進行したことがわかる。このＧＡ架橋コラーゲンフィルムは、強度が高いものであった。比較例２のＧＥもまた比較的低濃度で架橋できた。
【００４９】
（実施例４）
実施例１で調製したＥＧＤＥ架橋コラーゲンフィルムのうち、３質量％のＥＧＤＥで２４時間架橋して得られたコラーゲンフィルムを切り出し、直径６０ｍｍのディッシュ上に置いて、この架橋コラーゲンフィルム上で細胞培養を行った。コントロールとしては、コラーゲンフィルムなしでディッシュを用いた。細胞培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を用い、このＤＭＥＭ培地に以下の表３に記載の濃度になるように成長因子、抗生物質などを添加した。
【００５０】
【表３】
2005312338.tif 000004
【００５１】
それぞれの架橋コラーゲンフィルムでコートしたディッシュを、１時間ＵＶにより殺菌し、上記組成の滅菌培地で洗浄した。各ディッシュに、コラゲナーゼ潅流法によって調製した３１．５×１０５個の成熟ラット肝細胞（ラット（種系統F34）肝臓から直接取り出した初代培養細胞）を播種し、３７℃の１５％ＣＯ２／airインキュベーター内で培養した。なお、この細胞はアルブミンを生産する。培養を２０日以上継続し、培地を２〜３日毎に交換しながら、細胞の生育状況を目視で確認するとともに、培地交換時にアルブミンの生産量をＥＬＩＳＡで測定した。
【００５２】
（実施例５〜６）
５質量％のＰＥＧＤＥ、および５質量％のＰＰＧＤＥで、それぞれ２４時間架橋して得られたコラーゲンフィルムを用いたこと（それぞれ、実施例５および実施例６）以外は、実施例４と同様にして、生育を目視で観察し、アルブミン生産量を測定した。
【００５３】
（比較例３および４）
ＥＧＤＥ架橋コラーゲンフィルムの代わりに、３質量％のＧＡ濃度で２４時間架橋して得られたコラーゲンフィルム（比較例３）、および３質量％のＧＥ濃度で２４時間架橋して得られたコラーゲンフィルム（比較例４）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、細胞の生育状況およびアルブミンの生産量を測定した。
【００５４】
その結果、低分子量ポリグリシジルエーテルで架橋した実施例４〜６の架橋コラーゲンフィルムを細胞培養用担体とした場合、いずれも、細胞の増殖が認められ、アルブミンを生成した。ＥＧＤＥ架橋コラーゲンフィルムを細胞培養用担体とした場合（実施例４）の成熟ラット肝細胞の増殖およびアルブミン生成量を図１に示す。図１に示すように成熟ラット肝細胞は増殖し、アルブミンを生成した。これに対して、ＧＡ架橋コラーゲンフィルムにおいては、細胞の生育が悪く、アルブミンの生産は認められなかった。また、ＧＥ架橋コラーゲンフィルムにおいては、細胞が生育しなかった。これは、ＧＡまたはＧＥに細胞毒性があるためと考えらえれる。なお、コントロールとして用いた、架橋処理していないコラーゲンフィルムは３７℃で溶解したために培養には用いることができなかった。
【００５５】
（実施例７）
３５ｍｍディッシュの培養面を、上記方法で調製したサケ皮由来の、１質量％のコラーゲンを含む溶液０．１ｍｌ（固形分１ｍｇ）で被覆し、風乾後、３質量％のＥＧＤＥを含む反応用溶液を用いて、実施例１と同様の方法で、２４時間架橋反応行った。反応終了後、架橋フィルムを室温の水で洗浄し、ついで、７０％エタノールで除菌および洗浄を行った。  他方、凍結ラット小型肝臓細胞を融解し、実施例４と同様のコラゲナーゼ潅流法によってラット小型肝臓細胞を調製した。これを各ディッシュに１．５×１０３コロニーの割合で播種した。実施例４における細胞培養に用いたと同じＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃の１５％ＣＯ２／airインキュベーター内で２日間培養した。  
【００５６】
次いでＤＭＥＭ培地を用いて洗浄し、培養面を観察したところ、いずれのディッシュにおいても９×１０２コロニー（播種した細胞の約６０％）の生着細胞が認められた。ディッシュに、３７℃に加温したＨａｎｋｓ（ＳＩＧＭＡ）−２２．５％コラゲナーゼ（ヤクルト）溶液を添加し、コラーゲンの溶解反応を開始した。溶解反応は３７℃で行った。コラーゲンの溶解に伴う細胞の剥離を目視で観測し、反応開始から剥離が見られなくなるまでの溶解所要時間、および剥離細胞数を計測した。
【００５７】
（比較例５）
常法で調製したラット尾コラーゲンを用いたこと以外は実施例７と同様にして、溶解所要時間および剥離細胞数を計測した。
【００５８】
実施例７におけるサケ皮由来架橋コラーゲンの溶解所要時間は３６分であったのに対し、比較例５のラット尾由来架橋コラーゲンの溶解所要時間は８０分であった。コラーゲン溶解反応を開始してから３６分後の回収細胞は、サケ皮由来架橋コラーゲンを用いた場合は、２．４×１０２コロニー、ラット尾由来架橋コラーゲンを用いた場合は、１．１×１０２コロニーであり、細胞回収率を比較すると、サケ皮由来架橋コラーゲンを用いた場合の細胞回収率は、ラット尾由来架橋コラーゲンを用いた場合の約２．２倍であった。さらに、サケ皮由来架橋コラーゲンの溶解後（溶解反応開始から３６分後）の細胞回収率は、ラット尾由来架橋コラーゲンの溶解後（溶解反応開始から８０分後）の細胞回収率の約１．７倍（サケ皮由来架橋コラーゲンを用いた場合は、２．４×１０２コロニー、ラット尾由来架橋コラーゲンを用いた場合は、１．４×１０２コロニー）であった。
【００５９】
これらのことから、海洋生物由来コラーゲンを含有する細胞培養用担体は、哺乳動物由来のコラーゲンを含有する細胞培養用担体と比べて、コラゲナーゼで溶解し易いため、細胞の回収が容易であり、細胞回収率も高いという利点を有することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
熱変性温度の低い海洋生物由来のコラーゲンを低分子量ポリグリシジルエーテルＥＧＤＥで架橋して得られるＥＧＤＥ架橋コラーゲンフィルムは、比較的高温での細胞培養にも適しており、アレルギーやＢＳＥ、内在性ウイルス感染症などの問題がなく安全性に優れていることから、動物細胞培養用担体として広く用いられ得る。また、この海洋生物由来のコラーゲンは、海洋生物、特に魚類の廃棄物から回収されることから、廃棄物の有効利用という面からも、利用価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の細胞培養用担体を用いたときの成熟ラット肝細胞によるアルブミン生成量の経時持変化を示す図である。
【図１】
2005312338.tif 000005