(57)【要約】【課題】    培養開始から５日間を経過した後でも、多分化能と高い増殖能を維持した状態でDlk陽性細胞を培養する方法及びDlk陽性細胞に由来し、内胚葉系の肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能な細胞を提供すること。【解決手段】  Dlk陽性細胞をラミニン上で培養することを含む、Dlk陽性細胞の培養方法を提供した。また、上記本発明の方法により得ることができ、肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能な細胞を提供した。【効果】  本発明の方法によれば、Dlk陽性細胞は培養開始５日間を過ぎても、未分化能を維持したままよく増殖するので、未分化細胞を大量培養することが可能になる。また、本発明の方法により培養されたDlk陽性細胞は、肝細胞と胆管上皮細胞のみならず膵臓細胞へも分化可能であるので、肝臓及び膵臓の再生医療や、これらの臓器の人工臓器の作製に利用可能である。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Dlk陽性細胞をラミニン上で培養することを含む、Dlk陽性細胞の培養方法。
【請求項２】
前記Dlk陽性細胞が、胎児肝臓又は再生中の肝臓由来の細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により得ることができ、肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能な細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝芽細胞のようなDlk陽性細胞の培養方法及びそれにより得られる内胚葉系前駆細胞に関する。本発明の内胚葉系前駆細胞は、肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能であるので、肝臓、胆管又は膵臓の再生医療やこれらの人工臓器の開発に有用である。
【背景技術】
【０００２】
再生医療において、各臓器を再生することが可能な幹細胞等の未分化細胞が盛んに研究されている。本願発明者らは、先に、細胞表面上に発現するDlkタンパク質が肝前駆細胞のマーカーとして利用可能なことを見出し、抗Dlk抗体を用いたMACS（マグネティックセルソーター）により、胎児肝臓組織からDlk陽性細胞を効率良く回収する方法を確立した（特許文献１）。Dlk陽性細胞は、肝臓再生のための再生医療や、人工肝臓の作製のために利用可能な細胞である。特許文献１には、コラーゲンをコートしたプレート上でDlk陽性細胞を培養することが記載されている（特許文献１の実施例７）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開公報WO 02/103033
【非特許文献１】Torenehave, D., Jensen, C. H., Teisner, B., and Larsson L. I. (1996) FA1 immunoreactivity in endocrine tumors and during development of the human fetal pancreas: negative correlation with glucagons expression. Histochem. Cell Biol. 106, 535-542
【非特許文献２】Offield, M. F., Jetton, T. L., Labosky, P. A., Ray, M., Stein, R. W., Magnuson, M. A., Hogan, B. L., and Wright, C. V. (1996) Pdx-1 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duodenum. Development 122, 535-542
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１記載のように、Dlk陽性細胞をコラーゲンコートしたプレート上で培養すると、培養開始から５日間は良く増殖するが、その後増殖能が急速に消失するため、コラーゲンコートしたプレート上でDlk陽性細胞を大量培養することは困難であることがわかった。
【０００５】
従って、本発明の目的は、培養開始から５日間を経過した後でも、多分化能と高い増殖能を維持した状態でDlk陽性細胞を培養する方法を提供することである。また、本発明の目的は、Dlk陽性細胞に由来し、内胚葉系の肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能な細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ラミニンをコートしたプレート上でDlk陽性細胞を培養することにより、培養開始から５日間を経過した後でも、Dlk陽性細胞の分化能を維持したまま、高い増殖能を維持することができることを見出した。さらに、この方法により培養されたDlk陽性細胞は、ラミニンレセプターであるインテグリンα６及びインテグリンβ１を発現しており、肝細胞と胆管上皮細胞のみならず、膵臓細胞へも分化可能になることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Dlk陽性細胞をラミニン上で培養することを含む、Dlk陽性細胞の培養方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により得ることができ、肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能な細胞を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、Dlk陽性細胞の分化能を維持したまま、高い増殖能を維持することができる、Dlk陽性細胞の新規な培養方法が提供された。本発明の方法によれば、Dlk陽性細胞は培養開始５日間を過ぎても、未分化能を維持したままよく増殖するので、未分化細胞を大量培養することが可能になる。また、本発明の方法により培養されたDlk陽性細胞は、肝細胞と胆管上皮細胞のみならず膵臓細胞へも分化可能であるので、肝臓及び膵臓の再生医療や、これらの臓器の人工臓器の作製に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上記の通り、本発明の培養方法では、Dlk陽性細胞をラミニン上で培養する。Dlk自体は公知であり、DlkをコードするｃＤＮＡはクローニングされており、その塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列も公知である。例えば、ヒトDlkは、GenBank accession番号U15979およびNM_003836等に示されている。ラットDlkは、GenBank accession番号AB046763およびD84336等に示されている。ウシのDlkは、GenBank accession番号AB009278に示されている。マウスのDlkは、GenBank accession番号U15980及びNM_010052等に示されている。GenBank accession番号NM_003836に記載されている通り、DlkｃＤＮＡには、SNPを有する複数のバリアントが知られており、このようなバリアントもDlkに包含されることは言うまでもない。
【００１０】
Dlk陽性細胞は、胎児肝臓や再生中の肝臓から、抗Dlk抗体を用いた、MACSやFACS（fluorescence activated cell sorting; 蛍光活性化細胞分離）により容易に分離することができる（特許文献１）。抗マウスdlkモノクローナル抗体は公知である（非特許文献１）し、抗ヒトDlkモノクローナル抗体も公知である（非特許文献１）。これらの抗Dlkモノクローナル抗体を用いてMACSやFACSを行うことができる。
【００１１】
本発明の方法に用いられるラミニンは、基底膜の主要構成成分である公知の糖タンパク質である。ラミニンとしては、既に十数種類のものが同定されており、それらのいずれをも用いることができる。また、ラミニンは、必ずしも精製されている必要はなく、ラミニンを主要構成成分として含有する基底膜抽出物等も用いることができる。「ラミニン上で培養する」とは、少なくとも表面にラミニン分子が存在する固相上で培養することを意味し、好ましくは、ラミニンをコートしたプレート上で培養される。ラミニンコートプレートは、動物細胞培養用のプレートとして市販されているので、本発明の方法においてはこれらの市販のラミニンコートプレートを好ましく用いることができる。なお、ラミニンの起源となる動物種は特に限定されないが、培養するDlk陽性細胞の起源と同じ起源の動物種由来のラミニンを用いることが最も好ましい。
【００１２】
培養条件は、特に限定されるものではないが、好ましくは、Dlk陽性細胞が由来する動物の体温で培養することが好ましく、また、培養期間も特に限定されないが、未分化状態での大量培養は、通常、２０日間〜６０日間程度行なわれる。また、培養に用いられる培養液としては、特に限定されるものではなく、例えばDMEM培地（10% FCS, 1×ITS(インシュリン／トランスフェリン／セレン), 50μg/mlゲンタマイシン, 10-7 Mデキサメタゾン(Dex), 1×非必須アミノ酸(non essential amino acids)を添加）やDMEM/F12培地(10% FBS, 1XITS, 10mMニコチンアミド、0.1μM Dex及び12.5 mM L-グルタミンを添加)等の哺乳動物細胞の培養に常用される培地を用いることができる。
【００１３】
上記の培養により、Dlk陽性細胞は、ラミニンレセプターであるインテグリンα６及びインテグリンβ１を発現するようになり、肝細胞と胆管上皮細胞のみならず膵臓細胞へも分化可能になる。このような細胞は、新規な細胞であり、本発明は、肝細胞、胆管上皮細胞及び膵臓細胞へ分化可能な新規な内胚葉系前駆細胞(HPPL(Hepatic Progenitor cells Proliferating on Laminin)と命名）をも提供するものである。
【００１４】
HPPLからの肝細胞の分化誘導は、HPPLがコンフルーエントになるまで上記の通り培養し、20 ng/mlのオンコスタチンM(OSM)を培地に添加し、５日間培養後、EHSゲル（Englebreth-Holm-Swarm マウス肉腫由来の基底膜ゲルマトリックス）を細胞上に積層して培養することにより行うことができる。肝細胞への分化誘導が起きたか否かは、肝マーカーであるチロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)及びカルバモイルリン酸シンテセターゼ(carbamoyl-phosphate synthetase, CPS)の発現に基づいて調べることができる。
【００１５】
HPPLからの胆管上皮細胞への分化誘導は、HPPLをコラーゲンゲル中で包埋培養することにより行うことができる。胆管上皮細胞への分化誘導は、胆管上皮細胞マーカーであるサイトケラチン19(CK19)の発現及びコラーゲンゲル中の包埋培養によりチューブ構造を作るか否かに基づいて調べることができる。
【００１６】
HPPLからの膵臓細胞への分化誘導は、DMEM培地からDexとITSを除去し、2μMのレチノイン酸を添加して培養することにより行うことができる。膵臓細胞への分化誘導は、膵臓細胞マーカーであるPdx1(非特許文献２）の発現に基づいて調べることができる。
【００１７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１８】
１．  方法  
(1)  Dlk陽性細胞の培養
Dlk陽性細胞は、特許文献１記載の方法により、胎生１４日のマウス胎児肝臓から分離した。分離したDlk発現細胞を、10% FBS(Gibco BRL社製）, 1XITS(Gibco BRL社製）, 10mMニコチンアミド（和光純薬社製）、0.1μM Dex(Sigma社製）及び12.5 mM L-グルタミン(Gibco BRL社製）を添加したDMEM/F12培地（Sigma社製）に再懸濁した。得られた細胞懸濁液を、50細胞/cm2又は200細胞/cm2の細胞密度でタイプIVコラーゲン（新田ゼラチン）又はラミニン（Becton Dickinson）でコートした６穴プレートに入れ、各20ng/mlの肝細胞増殖因子(HGF)(R&D社製）及び上皮成長因子(EGF) を添加し、３７℃で培養した（以下、培養の温度は、特に断りがない限り全てこの温度で行なった）。5日後、14日後、21日後にコロニー形成を観察し、100個以上の細胞を含む大型コロニーの数を数えた。また、Dlk陽性細胞からの肝細胞および胆管上皮細胞への分化を検討するために、培養開始後5日目のコロニーでの、肝細胞のマーカーであるアルブミンと胆管細胞のマーカーであるサイトケラチン19(CK19)の発現を免疫染色によって調べた。また、インテグリンα6及びインテグリンβ1の発現を、抗インテグリンα6抗体（Pharmingen社より市販）及び抗インテグリンβ1抗体（Pharmingen社より市販）を用いたフローサイトメトリーにより調べた。また、Dlk陽性細胞の胆管上皮細胞への分化を検討するためにコラーゲンゲル内に包埋して培養を行い（方法は、後述するHPPLのコラーゲンゲル内包埋培養と同様）、各種胆管上脾細胞マーカーの発現をRT-PCRにより調べた（方法は、後述するHPPLのコラーゲンゲル内包埋培養後の細胞のRT-PCRと同様）。
【００１９】
(2)  Dlk陽性細胞の長期培養
ラミニンコートしたプレート上で1ヶ月以上にわたり増殖を維持する細胞がみられたので、これをトリプシン処理してプレートから回収し、新しいプレートに継代し、上記と同様に培養した。この細胞は継代後も増殖を続けた。この細胞を上記の通りHPPLと名付けた。HPPLは、4日ごとに新しいプレートへ継代することで、長期間維持できた。
【００２０】
(3)  HPPLの分化誘導
肝細胞への分化を誘導するために、HPPLがコンフレントになった後に、20ng/mlのOSMを加えて5日間培養した。その後、EHSgelを細胞に上層してさらに5日間培養した。培養後の細胞からRNAを抽出し、CPS及び TATの発現をノーザンブロット法を用いて解析した。このノーザンブロット法は具体的には次のようにして行なった。10マイクログラムのRNAを1.2%のアガロースゲルで泳動した後、ナイロンメンブレンにトランスファーした。高SDS液でインキュベートした後、一本鎖DNAプローブを含む高SDS液中、３７oCで一晩ハイブリダイゼーションを行った。TATを検出するための一本鎖DNAプローブとしては、GenBank Accession No. NM_146214記載の配列の55-396nt（配列番号２５）、CPSを検出するための一本鎖DNAプローブとしては、GenBank Accession No. XM_129769記載の配列の3951-4405nt（配列番号２６）を用いた。洗浄を行った後、1%ブロッキング液（ロッシュ）でブロッキングし、アルカリフォスファターゼ標識された抗Dig抗体を反応させた。アルカリフォスファターゼの活性をCDPstarを基質として検出した。また、グリコーゲン貯蔵能を調べるために、PAS染色（Zugibe, F. T. (1970) Positive periodic acid-Shiff staining of acid mucopoly saccharide. Histochem. J. 2, 191-197）を行って、細胞内の多糖類の蓄積を検討した。また、アンモニア除去能を調べるために、EHSゲルを除去した後、培地上清に塩化アンモニウムを加えて培養を継続し、アンモニウムイオン濃度の経時的変化を測定した。アンモニウムイオンは、Biochem Biophys Res Commun. 2000 Oct 14;277(1):152-158, Cell density-dependent regulation of hepatic development by a gp130-independent pathway, Kojima N, Kinoshita T, Kamiya A, Nakamura K, Nakashima K, Taga T, Miyajima A.に記載の方法により測定した。
【００２１】
胆管上皮細胞への分化を誘導するために、HPPLをコラーゲンゲル内に包埋して細胞を培養した。この操作は具体的に次のようにして行なった。コラーゲンゲルプレートを作製するために、800μLのコラーゲンタイプI-A（新田ゼラチン）、100μLの10 x DMEM及び100μLの、2.2%炭酸水素ナトリウム及び0.05N NaOH含有200mM HEPES緩衝液から成る1mlのコラーゲン溶液を、６穴プレートの各ウェルに入れ、３７℃で３０分間インキュベートした。1mlのDMEM/F12に再懸濁したHPPL(1 x 105細胞）を、前記1mlのコラーゲンゲル溶液と混合し、コラーゲンの基層上にプレートした。３７℃で３０分間インキュベーション後、20ng/mlのHGFを添加した2mlのDMEMを各ウェルに加え、７日間培養した。コラーゲンから細胞を回収するために、ゲルを3mm角の立方体にナイフで切り、1/50容の1%タイプI-Aコラーゲン(Sigma社製）溶液と混合し、３７℃で３０分間ゆっくりと振とうしながらインキュベートした後、細胞を遠心で集め、Trizol溶液に溶解した。RT-PCRに供するため、RNAを抽出し、それを鋳型として常法によりcDNAを合成した。次に得られたcDNAを鋳型とするPCRによって、膵臓細胞のマーカー遺伝子の発現を検討した。このPCRは、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、サイトケラチン７(CK7)、CK19、インテグリンβ4、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT、肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factor (HNF))1β及びHNF6のcDNAを増幅した。なお、CK7、インテグリンβ4及びGGTは、CK19と同様、胆管上皮細胞のマーカーであり、HNF1β及びHNF1は胆管上皮細胞に強く発現している転写因子である。
CK7: 5'-gatgacctccgcaacacc-3'と5'-tccagcagcttgcggtag-3' 
CK19: 5'-gtcctacagattgacaatgc-3'と5'-cacgctctggatctgtgacag-3'
インテグリンβ4: 5'-gacctatgaagaaggtgctc-3'と5'-gctcagatgcgtgccatag-3'
GGT: 5'-atgagctctgagttctacgc-3'と5'-taggtaaaagctggttgtgc-3' 
HNF1β: 5'-gcaaaccgccggaaggaag-3'と5'-ggttctgagattgctgggg-3' 
HNF6: 5'-gaagtaattcagggcagatg-3'と5'-cagccacttccacatcctccg-3'
【００２２】
膵臓細胞への分化を誘導するために、HPPLがコンフレントになった後、DexとITSをDMEM培地より除去し、2μMのレチノイン酸を加えて培養した。7日間培養した後に、RT-PCRに供するため、細胞からRNAを抽出し、それを鋳型として常法によりcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型とするPCRによって、膵臓細胞のマーカー遺伝子の発現を検討した。このPCRは、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、Pdx1、インシュリン、グルカゴン、アミラーゼ、リパーゼ、ソマトスタチンのcDNAを増幅した。
Pdx1： 5'-ttacaagctcgctgggatca-3'と5'-gtcccgctactacgtttctt-3'
インシュリン： 5'-ctgttggtgcacttcctac-3'と5'-gttgcagtagttctccagctg-3'
グルカゴン： 5'-cgactacagcaaatacctcg-3'と5'-cagccagttgatgaagtcc-3'
アミラーゼ： 5'-cgtaccaaggtggctgac-3'と5'-gctctgtcagaaggcacc-3'
リパーゼ： 5'-ctgcaagagtatgtcacgc-3'と5'-cacagtggttgatgccatg-3'
ソマトスタチン： 5'-ctgcatcgtcctggcttg-3'と5'-caggatgtgaatgtcttccag-3'
【００２３】
２．  結果
(1)  Dlk発現細胞の分化能
胎生１４日の肝臓細胞をコラーゲンおよびラミニンでコートしたプレートで培養した。いずれの条件でも、５日後にはアルブミン陽性細胞とサイトケラチン陽性細胞を含んでいた。さらに、２１日目には、CPSやG6Paseといった肝細胞分化マーカーの発現も検出された。一方、コラーゲンゲル内で培養を行うと、２日後にはチューブ様の構造が検出された。さらに一週間後には、CK7, CK19, インテグリンβ4, γグルタミルトランスペプチダーゼなどの胆管上皮細胞マーカーの発現が検出された (図１)。以上の結果から、Dlk陽性細胞画分には２分化能を持った肝芽細胞が濃縮されていることが確認された。
【００２４】
(2)  内胚葉系前駆細胞の確立
Dlk陽性細胞をタイプIVコラーゲン上で培養すると、培養開始後、爆発的な増殖を行った後、培養開始５日以降には、急速に増殖速度が低下する（図２）。一方、ラミニン上で培養を行うと、培養開始後５日までに形成される大型のコロニー数は、コラーゲン上で培養を行った場合に比べて少ないが（図３）、その後も増殖を続けるコロニーがあった。このようにして、ラミニン上で成長を続けたコロニーは、１ヶ月以上にわたって増殖を続けた。さらには、このような細胞は継代が可能であり、継代後も効率の良い増殖を見せた。我々は、この細胞を上記の通りHPPLと名付けた。HPPLの細胞表面には、ラミニンのレセプターであるインテグリンα6およびインテグリンβ1が発現していた（図４）。
【００２５】
(3)   HPPLの肝細胞への分化
HPPLをOSMの存在下で５日間培養した後、EHS-gelを重層してさらに５日間培養した。その結果、肝分化マーカーであるTATおよびCPSの発現が誘導された（図５）。この時の細胞は、細胞質が発達し、円形の核がみられるという分化した肝細胞の形態を示していた。さらに、肝臓の代謝機能が誘導されているかを調べるために、細胞内の多糖類の蓄積とアンモニア除去能を検討した。PAS染色を行ったところ、肝分化誘導前と比較して、著しくグリコーゲンを含む多糖類が細胞内に蓄積していることがわかった。また、培地に２ｍMの塩化アンモニウムを加えると、その後の４８時間の間に約７５％のアンモニウムイオンが除去されることがわかった (図６)。
【００２６】
(4)  HPPLの胆管上皮細胞への分化
HPPLをコラーゲンゲル内で培養すると、チューブ様構造をとることがわかった。また、胆管上皮細胞マーカーも強く発現していることがわかった (図７)。ただし、これら胆管上皮細胞マーカーはゲル内での培養の前にすでに発現していた。
【００２７】
(5)   HPPLの膵臓細胞への分化
HPPLをDexとITS非存在下で培養するとPdx1が誘導されることがわかった。さらに、レチノイン酸を加えることで、Pdx1の発現が増強された。そこで、DexおよびITS非存在下で、さらにレチノイン酸を加えた条件で培養を行い、膵臓細胞のマーカーの発現を調べた。その結果、Pdx1の他に、インシュリン、グルカゴン、リパーゼなどが誘導されることがわかった（図８)。
【００２８】
考察
肝芽細胞の増殖・分化におけるコラーゲンとラミニンの違いを検討したところ、いずれのマトリックス成分をプレートのコーティングに使用しても、Dlk陽性細胞は２分化能を示した。一方、増殖には大きな違いが見られた。コラーゲンは、Dlk陽性細胞の短期間での効率よい増殖を促すのに対して、ラミニンは、長期間にわたって肝芽細胞の増殖を支持することがわかった。我々は、ラミニン上で増殖を続ける細胞をHPPLと名付けた。HPPLの細胞表面には、ラミニンのレセプターであるインテグリンα6とインテグリンβ1が発現していたことから、HPPLの長期間の増殖には、ラミニンからの刺激が必要であることが推測された。
【００２９】
HPPLは、肝細胞および胆管上皮細胞への分化を誘導できる。特に、肝細胞への分化を誘導した場合、グリコーゲン蓄積やアンモニア代謝能も誘導されており、機能を持った肝細胞を誘導できることがわかった。さらに、HPPLは膵臓細胞へも分化誘導できた。
【００３０】
以上のように、本願発明者らは、肝芽細胞をラミニン上で長期培養することで、肝細胞、胆管上皮細胞さらには膵臓細胞へと分化可能である内胚葉系の前駆細胞を得る方法を確立した。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】胎生１４日のマウス胎児肝臓から分離したDlk陽性細胞をコラーゲンゲル内で７日間培養した細胞中の、各種胆管上皮細胞マーカーのmRNAのRT-PCRの結果を示すゲル電気泳動写真である。対照は、培養前のDlk陽性細胞である。
【図２】Dlk陽性細胞をタイプIVコラーゲン上で培養した場合の培養期間と大型コロニー数との関係を示す図である。
【図３】Dlk陽性細胞をラミニン上で培養した場合の培養期間と大型コロニー数との関係を示す図である。各調査日において新たに出現していた大型コロニーの数は、それぞれ異なる濃さの表示で示す。
【図４】ラミニンレセプターであるインテグリンβ1及びインテグリンα6を指標として用いた、HPPLのフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５】HPPLをオンコスタチンＭ存在下で培養した細胞について、肝細胞マーカーであるTAT及びCPSの発現をノーザンブロット法により調べた結果を示す図である。
【図６】HPPLをオンコスタチンＭ存在下で培養した細胞を、アンモニウムイオンの存在下で培養した場合の培養時間とアンモニウムイオン濃度との関係を示す図である。
【図７】HPPLをコラーゲンゲル内で１週間培養した細胞中の、各種胆管上皮細胞マーカーのmRNAのRT-PCRの結果を示すゲル電気泳動写真である。対照は、培養前のHPPLである。
【図８】HPPLをDexとITSの非存在下、かつ、レチノイン酸の存在下で培養して得られた細胞中の、各種膵臓細胞マーカーのmRNAのRT-PCRの結果を示すゲル電気泳動写真である。対照は、培養前のHPPLである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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