(57)【要約】【課題】  試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法の提供。【解決手段】  （Ｉ）アスコルビン酸オキシダーゼ、非イオン性界面活性剤と有機鉄化合物の存在下、金属塩を用いる事、又はｐＨを塩基性側に変化させる事、（ＩＩ）アスペルギウス属の培養抽出物の存在下、金属塩を用いる事、又はｐＨを塩基性側に変化させる事で、直接型ビリルビンの選択性、間接型ビリルビンへの反応性を調節し、それにより、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で定量する測定する事が可能となる方法。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリルビン酸化反応を抑制する方法であって、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物の存在下、非イオン性界面活性剤を作用させる事を特徴とするビリルビン酸化反応抑制方法。
【請求項２】
非イオン性界面活性剤が、オクチルフェニルエーテルである請求項１に記載のビリルビン酸化反応抑制方法。
【請求項３】
ビリルビン酸化反応を促進する方法であって、有機鉄化合物、金属塩及びアスコルビン酸オキシダーゼを作用させる事を特徴とするビリルビン酸化反応促進方法。
【請求項４】
金属塩がガリウム塩である請求項３に記載のビリルビン酸化反応促進方法。
【請求項５】
有機鉄化合物がフェロシアン化物又はフェリシアン化物である請求項３あるいは４に記載のビリルビン酸化反応促進方法。
【請求項６】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法。
【請求項７】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、有機鉄化合物と金属塩を使用する事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項８】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、有機鉄化合物、アスコルビン酸オキシダーゼ及び金属塩を使用する事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項９】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、非イオン性界面活性剤と、有機鉄化合物及び金属塩の存在下、アスコルビン酸オキシダーゼを作用させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項１０】
非イオン性界面活性剤が、オクチルフェニルエーテルである請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
金属塩がガリウム塩である請求項７から１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
有機鉄化合物がフェロシアン化物又はフェリシアン化物である請求項７から１１に記載の測定方法。
【請求項１３】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項１４】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、有機鉄化合物とアスコルビン酸オキシダーゼの存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項１５】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、非イオン性界面活性剤、有機鉄化合物およびアスコルビン酸オキシダーゼの存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項１６】
非イオン性界面活性剤が、オクチルフェニルエーテルである請求項１５に記載の測定方法。
【請求項１７】
有機鉄化合物がフェロシアン化物又はフェリシアン化物である請求項１４から１６に記載の測定方法。
【請求項１８】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、アスペルギウス属の培養抽出物と金属塩を使用する事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項１９】
試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、アスペルギウス属の培養抽出物の存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法。
【請求項２０】
アスペルギウス属の培養抽出物がビリルビンデヒドロゲナーゼある請求項１８あるいは１９に記載の測定方法。
【請求項２１】
金属塩がガリウムイオンである請求項１８に記載の測定方法。
【請求項２２】
少なくとも、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物を含む試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定するビリルビン測定用キット。
【請求項２３】
少なくとも、以下（ａ）〜（ｃ）を含むビリルビン測定用キット。
（ａ）アスコルビン酸オキシダーゼ
（ｂ）非イオン性界面活性剤
（ｃ）有機鉄化合物及び/又は金属塩
【請求項２４】
少なくとも、アスペルギウス属の培養抽出物を含む試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定するビリルビン測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法及びその試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中ビリルビンの多くは赤血球中ヘモグロビンに由来しており、非特許文献１によれば、血清中ビリルビンは他の物質を抱合していない非抱合型ビリルビン、ビリルビン１分子あたり１分子のグルクロン酸を抱合したモノグルクロナイドビリルビン、ビリルビン１分子あたり２分子のグルクロン酸を抱合したジグルクロナイドビリルビン、およびアルブミンと結合したアルブミン結合ビリルビン（δビリルビン）に分画され、それぞれの画分の比率や量は病態により変化する事が知られている（非特許文献２）。かつて血清中ビリルビンは、ジアゾ試薬との反応性の違いから直接型ビリルビンと総ビリルビン（直接型ビリルビンと間接型ビリルビンの総和）に分類され、直接型ビリルビンが抱合型ビリルビン（モノグルクロナイドビリルビン、ジグルクロナイドビリルビン、およびアルブミン結合ビリルビン）、間接型ビリルビンが非抱合型ビリルビンに対応すると考えられていたが、現在では、必ずしもそのように対応しない事が報告されている（非特許文献３）。しかし現在でも、ジアゾ試薬を用いる方法で測定されたそれぞれのビリルビン濃度が、直接型ビリルビンまたは総ビリルビンとして各種肝疾患診断や黄疸鑑別などの診断の基準にされている。
【０００３】
血清中ビリルビンの測定方法は、ビリルビンオキシダーゼなどの酵素を用いる酵素法、ジアゾ試薬などを用いた化学法、そして高速液体クロマトグラフィーを用いる方法に大別される。                                                                          酵素法においては、ビリルビンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ、またはチロシナーゼを用いる方法が報告されており（特許文献１）、例えばビリルビンオキシダーゼを用いる酵素法は、総ビリルビンはビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨで測定し、直接型ビリルビンはビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨ外でしかもいくつかの添加剤を用いる事で間接型ビリルビンへの酵素の基質特異性を下げて測定する方法である（特許文献２、３、４など）。ビリルビンオキシダーゼを用いた測定法は血清中ビリルビンに対する特異性は高いもののビリルビンオキシダーゼの安定性が悪いため測定試薬が不安定という問題があった。そこで、安定化のためにいろいろな添加剤が工夫され（特許文献５、６など）、また、ビリルビンオキシダーゼより安定性の高いアスコルビン酸オキシダーゼを用いる方法も報告されている（特許文献７）。
【０００４】
化学法においては、ジアゾ試薬を用いた方法は、前述のように測定値が各種ビリルビン濃度の基準値となっているものの、血清中に存在するビリルビン以外の物質の影響を受けやすいなどの問題点があった。そこで、ジアゾ試薬を用いる方法との相関が良く、しかも試薬の安定性が高いバナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオンなどの酸化剤を用いる方法が開発された（特許文献８）。この方法で、例えばバナジン酸イオンを用いる方法は、バナジン酸ナトリウムを用いて総ビリルビンを測定し、ヒドラジン類などの反応抑制剤を使用して直接型ビリルビンを測定する測定方法である。
【０００５】
すなわち、従来の酵素法と化学法は安定性などの問題は特に無いが、その測定原理上、同一試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同時に定量する場合、直接型ビリルビン測定用試薬と総ビリルビン測定用試薬を別途用いて、別々の反応槽で測定する必要があった。高速液体クロマトグラフィーを用いる方法は、一度の測定で試料中ビリルビンを精度良く分別定量できるものであるが、専用の装置を用いても多数の試料を同時測定する臨床検査目的には向かない測定方法である。
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１７９９９
【特許文献２】特開平０２−２３８８９７
【特許文献３】特開平１１−７２４９７
【特許文献４】特開２０００−１６６５９５
【特許文献５】特開平０８−６６１９６
【特許文献６】特開平１０−４２８６９
【特許文献７】特開平０９−１７８７５５
【特許文献８】特開平０５−１８９７８
【非特許文献１】ラウフ（Lauff）ら、Separation of bilirubin species in serum and bile by high-performance reversed-phase liquid chromatography、 ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー・Ａ（Journal of Chromatography A）、米国、エルゼビア（ＥＬＳＥＶＩＥＲ）、1981年１２月、 226巻2号、391-402.
【非特許文献２】足立ら、Bilirubinの分画測定とその意義、生物試料分析、1986年、9巻3号、33-42．
【非特許文献３】小島ら、ビリルビン分画の測定、検査と技術、1997年1月、25巻1号、13-20．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明により、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法を提供する。その結果、従来法より簡便かつ短時間に試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを定量できる点に効果を奏する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で定量する方法において、（Ｉ）非イオン性界面活性剤、有機鉄化合物およびアスコルビン酸オキシダーゼの存在下、金属塩を作用させる事、又はｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で定量する測定方法、（ＩＩ）アスペルギウス属の培養抽出物の存在下、ガリウムイオンを作用させる事、又はｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で定量する測定方法を見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ビリルビン酸化反応を抑制する方法であって、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物の存在下、非イオン性界面活性剤を作用させる事を特徴とするビリルビン酸化反応抑制方法、
（２）非イオン性界面活性剤が、オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）である上記（１）に記載のビリルビン酸化反応抑制方法、
（３）ビリルビン酸化反応を促進する方法であって、有機鉄化合物、金属塩及びアスコルビン酸オキシダーゼを作用させる事を特徴とするビリルビン酸化反応促進方法、
（４）金属塩がガリウム塩である上記（３）に記載のビリルビン酸化反応促進方法、    （５）有機鉄化合物がフェロシアン化物又はフェリシアン化物である上記（３）あるいは（４）に記載のビリルビン酸化反応促進方法、
（６）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法、
（７）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、有機鉄化合物と金属塩を使用する事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（８）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、有機鉄化合物、アスコルビン酸オキシダーゼ及び金属塩を使用する事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（９）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、非イオン性界面活性剤と、有機鉄化合物及び金属塩の存在下、アスコルビン酸オキシダーゼを作用させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（１０）非イオン性界面活性剤が、オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）である上記（９）に記載の測定方法、
（１１）金属塩がガリウム塩である上記（７）から（１０）に記載の測定方法、
（１２）有機鉄化合物がフェロシアン化物又はフェリシアン化物である上記（７）から（１１）に記載の測定方法、
（１３）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（１４）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、有機鉄化合物とアスコルビン酸オキシダーゼの存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（１５）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、非イオン性界面活性剤、有機鉄化合物およびアスコルビン酸オキシダーゼの存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（１６）非イオン性界面活性剤が、オクチルフェニルエーテルである上記（１５）に記載の測定方法、
（１７）有機鉄化合物がフェロシアン化物又はフェリシアン化物である請求項１４から１６に記載の測定方法、
（１８）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、アスペルギウス属の培養抽出物と金属塩を使用する事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（１９）試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法であって、アスペルギウス属の培養抽出物の存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる事を特徴とする直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定方法、
（２０）アスペルギウス属の培養抽出物がビリルビン類デヒドロゲナーゼある上記（１８）あるいは（１９）に記載の測定方法、
（２１）金属塩がガリウムイオンである上記（１８）に記載の測定方法、
（２２）少なくとも、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物を含む試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定するビリルビン測定用キット、
（２３）少なくとも、以下（ａ）〜（ｃ）を含むビリルビン測定用キット、
（ａ）アスコルビン酸オキシダーゼ
（ｂ）非イオン性界面活性剤
（ｃ）有機鉄化合物及び/又は金属塩
（２４）少なくとも、アスペルギウス属の培養抽出物を含む試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定するビリルビン測定用キット、
（２５）有機鉄化合物がフェリシアン化物である上記（５）に記載のビリルビン酸化反応促進方法、
（２６）有機鉄化合物がフェリシアン化物である上記（１２）に記載の測定方法、
（２７）有機鉄化合物がフェリシアン化物である上記（１７）に記載の測定方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法を提供できる。その結果、従来法より簡便かつ短時間に試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを定量できる点に効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明について、以下具体的に説明する。                                        本明細書において、単に「ビリルビン」と記載した場合は、直接型ビリルビン、間接型ビリルビン、及び総ビリルビンの全てを含む意味である。本発明で表現する試料とは、ビリルビンが混和されるものであればいずれにも限定されないが、生体試料、例えば、血漿、血清、尿などを挙げる事ができる。                                                  ビリルビン酸化反応とは、ビリルビンをその酸化物に変換する反応を指し、ビリルビン酸化活性とは、ビリルビンをその酸化物に変換する反応の触媒作用を指す。「同一反応槽で測定する」とは、連続した異なる複数の反応とその反応過程の測定を全て単一の反応容器で行う事を指し、例えば、自動分析機の単一の反応セル（キュベット）中で該一連の工程からなる連続複数反応の測定などが挙げられる。
【００１２】
本発明の試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法は、例えば第一反応として、水溶液中で試料中のビリルビンのうち直接型ビリルビンのみをその酸化物に変化し、水溶液の吸光度の変化を測定して検量線と比較し定量する。次に第二反応として、水溶液中に反応促進剤などを追加する、又は水溶液のｐＨを変化する事により間接型ビリルビンをその酸化物に変化し、水溶液の吸光度の変化を測定して検量線と比較する事により行われる。                                                            具体的に本願発明者らはまず、本発明の試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法を見出すために、アスコルビン酸オキシダーゼをビリルビンに作用させた場合、直接型ビリルビンは酸化するが、間接型ビリルビンは酸化しない事を見出した。次に、反応促進剤を添加する事で、直接型ビリルビン酸化作用は促進されるが、間接型ビリルビン酸化作用は、直接型ビリルビン酸化作用ほど促進されない事を見出した。さらに、反応促進剤を追加（併用）する事、又は、反応槽のｐＨを塩基性側に変化する事により、直接型ビリルビン酸化作用のみならず、間接型ビリルビン酸化作用も促進させる事ができ、両者の合計である総ビリルビンを測れる事、及び、反応抑制剤を添加する事により、間接型ビリルビン酸化作用は減弱され、直接型ビリルビン酸化作用のみが検出されうる事を見出した。
【００１３】
さらに、アスペルギウス属の培養抽出物を酸性の水溶液中でビリルビンに作用させた場合、直接型ビリルビンは酸化されるが、間接型ビリルビンは酸化されない事を見出した。次に、反応促進剤を追加する事、又は、反応槽のｐＨを塩基性側に変化する事により、直接型ビリルビンのみならず、間接型ビリルビンも酸化する事ができる事を見出した。      これらにより、従来、同一反応槽では測定できなかった、直接型ビリルビンと総ビリルビンを、同一反応槽で測定する事が可能となる事を見出した。                          以下、より具体的に例示する。
【００１４】
試料にアスコルビン酸オキシダーゼ、反応抑制剤、及び必要に応じて反応促進剤を添加する事により、試料中のビリルビンのうち、直接型ビリルビンを選択的に酸化する事が可能となる事を見出した。その後、反応促進剤を追加する事、又は試料のｐＨを塩基性側に変化する事により、直接型ビリルビンのみならず、間接型ビリルビンも酸化する事ができ、両者の合計である総ビリルビンを測れる事を見出した。
【００１５】
試料のｐＨを酸性側に変化させた後、アスペルギウス属の培養抽出物を添加する事により、試料中のビリルビンのうち、直接型ビリルビンを選択的に酸化する事が可能となる事を見出した。その後、反応促進剤を追加する事、又は試料のｐＨを塩基性側に変化する事により、直接型ビリルビンのみならず、間接型ビリルビンも酸化する事ができ、両者の合計である総ビリルビンを測定できる事を見出した。                                    以下、さらに詳しく説明する。
【００１６】
アスコルビン酸オキシダーゼを用いる方法について述べる。反応槽中の試料に、アスコルビン酸オキシダーゼ、必要に応じて、ｐＨを一定にするための緩衝剤、直接型ビリルビンの反応特異性を上げるための反応促進剤、反応阻害剤、及び反応液の濁りを防ぐための界面活性剤等を混和して２０から５０度で０から１５分間、好ましくは、３７度で５分間の反応で直接型ビリルビンを酸化してその変化を測定する。その後、間接型ビリルビンも酸化するための反応促進剤を加え、又は反応槽中のｐＨを塩基性側に変化し、２０から５０度で０から１５分間、好ましくは、３７度で５分間反応してその変化を測定する事で直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定が同一反応槽で達成される。測定方法には例えば直接型（間接型）ビリルビンと、酸化された直接型（間接型）ビリルビン（直接型（間接型）ビリベルジン）の吸収スペクトルの違い、例えば直接型（間接型）ビリルビンの吸収極大である４５０ｎｍ、直接型（間接型）ビリベルジンの吸収極大である６６０ｎｍ、を利用した光学的方法が例示される。
【００１７】
次に、アスペルギウス属の培養抽出物を用いる方法について述べる。反応槽の試料に、アスペルギウス属の培養抽出物、ｐＨを酸性にするための緩衝剤、必要に応じて、直接型ビリルビンの反応特異性を上げるための人工電子受容体などの反応促進剤、反応阻害剤、及び反応液の濁りを防ぐための界面活性剤等を混和して２０から５０度で０から１５分間、好ましくは、３７度で５分間の反応で直接型ビリルビンを酸化してその変化を測定する。測定方法には例えば直接型ビリルビンと、直接ビリベルジンの吸収極大の違いを利用した光学的方法が例示される。その後、間接型ビリルビンも酸化するための反応促進剤を加え、又は反応槽中のｐＨを塩基性側に変化し、２０から５０度で０から１５分間、好ましくは、３７度で５分間反応してその変化を測定する事で直接型ビリルビンと総ビリルビンの測定が同一反応槽で達成される。測定方法には例えば直接型（間接型）ビリルビンと、酸化された直接型（間接型）ビリルビン（直接型（間接型）ビリベルジン）の吸収スペクトルの違いを利用した光学的方法が例示される。
【００１８】
本発明におけるアスコルビン酸オキシダーゼの供与体である生物としては、アスコルビン酸オキシダーゼを生産する微生物であればなんら限定されるものではないが、好ましくはアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ）由来アスコルビン酸オキシダーゼが挙げられる。また、それらアスコルビン酸オキシダーゼの遺伝子を遺伝子操作を用いて、例えばアクレモニウム属等の微生物やその他の微生物に導入した宿主由来のものを用いたり、それらアスコルビン酸オキシダーゼタンパク質を遺伝子的に改変したものを用いる事も好ましい。                                                                      アスコルビン酸オキシダーゼの使用濃度は、試料中のビリルビン濃度や、測定時間によって、適宜調整可能であるが、反応液最終濃度として、例えば、０．１から２０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは、１から１５Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは５から１２Ｕ／ｍｌが挙げられる。
【００１９】
本発明におけるアスペルギウス属の培養抽出物としては、アスペルギウス属の培養抽出物であればなんら限定されるものではないが、好ましくはアスペルギウス・オクラセウスＩＢ３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３５）の培養抽出物が挙げられる（特開２００２−１１２７６６を参照）。また、そのアスペルギウス属は、紫外線、Ｘ線、あるいは放射線等の照射、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅなどの化学物質、あるいは自然育種により変異した株であってもよい。なお、アスペルギルス・オクラセウスＩＢ３−（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０３５）株は茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在する通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１２年９月１３日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０３５として寄託されており、何人も入手可能である。        アスペルギウス属の培養抽出物としては、アスペルギウス属の培養上清、アスペルギウス属の菌体からの抽出物等が挙げられるが、その他、アスペルギウス属の菌体から得られるものであればいずれにも限定されない。又、アスペルギウス属の培養抽出物はビリルビン酸化活性を指標に部分的に、あるいは完全に精製したものであっても良い。            アスペルギウス属の培養抽出物の使用濃度は、試料中のビリルビン濃度や、測定時間によって、適宜調整可能であるが、反応液最終濃度における下限値としては、０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましく、０．５重量％以上がさらに好ましく、２重量％以上が特に好ましく、５重量％以上が最も好ましい。また、反応液最終濃度における上限値としては、９０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましく、１０重量％以下がさらに好ましく、７重量％以下が最も好ましい。
【００２０】
緩衝剤としては公知のいずれの緩衝液も使用されうる。本発明のアスコルビン酸オキシダーゼを使用した場合のビリルビン測定には好ましくはｐＨ２．０からｐＨ４．５の緩衝液が用いられ、例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。又、アスペルギウス属の培養抽出物を使用した場合のビリルビン測定にはｐＨ１．０からｐＨ６．９、好ましくは、ｐＨ２．０から６．０、更に好ましくはｐＨ４．０から５．０が挙げられ、例えば、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。                        本発明で反応促進剤は、直接型ビリルビンを測定する場合は必要に応じて一種類以上を使用してもよい。間接型ビリルビンを測定する場合においては、直接型ビリルビンを測定する際に反応促進剤を使用していない場合は、一種以上使用し、直接型ビリルビンを測定する際に反応促進剤を使用した場合は、さらにもう一種類以上を追加して使用する。
【００２１】
反応促進剤としては有機鉄化合物と金属塩を挙げる事ができる。
有機鉄化合物は、ヘキサシアノ鉄酸塩が好ましく、例えば、フェロシアン化物、フェリシアン化物が好適な例として挙げられ、フェリシアン化物が特に好ましい。フェロシアン化物としては、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、フェロシアン化マグネシウム、フェロシアン化アンモニウム等が好ましい例として挙げられる。フェリシアン化物としては、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェリシアン化マグネシウム、フェリシアン化アンモニウム等が好ましい例として挙げられる。有機鉄化合物としては、フェロシアン化カリウム、フェリシアン化カリウムが好ましく、フェリシアン化カリウムが特に好ましい。                                                      金属塩としてはガリウム塩が好ましく、例えば、臭化ガリウム、フッ化ガリウム、硝酸ガリウム、ヨウ化ガリウム、リン化ガリウム、硫酸ガリウム、硫化ガリウムなどが挙げられ、塩化ガリウムが特に好ましい。                                                  反応液中の反応促進剤の使用濃度は使用される反応阻害剤濃度によって異なるが、反応液最終濃度における下限値としては、０Ｍ以上が好ましく、０．１ｍＭ以上がより好ましく、１ｍＭ以上がさらに好ましく、５ｍＭ以上が特に好ましく、１０ｍＭ以上が最も好ましい。また、反応液最終濃度における上限値としては、１０Ｍ以下が好ましく、１Ｍ以下がより好ましく、０．５Ｍ以下がさらに好ましく、０．１Ｍ以下が特に好ましく、５０ｍＭ以下が最も好ましい。
【００２２】
反応阻害剤としては非イオン性界面活性剤、例えばドデシルエーテル、テトラドデシルエーテル、ステアリルエーテル、オレイルエーテル、アセチルステアリルエーテル、ノニルフェニルエーテル、オクチルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノ酸ソルビタンなどが挙げられ、好ましくはオクチルフェニルエーテル（商品名トリトンＸ−１００（ＴＸ−１００））を挙げる事ができる。反応阻害剤の濃度は、反応液最終濃度における下限値としては、０重量％以上が好ましく、０．００１重量％以上がより好ましく、０．０１重量％以上がさらに好ましく、０．０５重量％以上が特に好ましく、０．０７５重量％以上が最も好ましい。また、反応液最終濃度における上限値としては、５重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましく、０．５重量％以下がさらに好ましく、０．１重量％以下が特に好ましく、０．０７５重量％以下が最も好ましい。
【００２３】
本発明のアスペルギウス属の培養としては、通常の培養方法であればいずれにも限定されないが、培養の形態は、液体培養でも固体培養でもよく、工業的にはアスペルギウス属の細胞をその生産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行うのが有利である。アスペルギウス属を培養するための培地組成は、微生物特にアスペルギルス属菌の培養に通常用いられるものが広く使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、コーンスティープ・リカー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、酵母エキスおよび種々の肉エキス等が好適な例として挙げられる。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば糖蜜、グルコース、シュークロースおよびデキストリン等が好適な例として挙げられる。その他バレイショエキスも好適な培地成分であり、また、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムおよび硫酸マグネシウム等の種々の無機塩等も必要に応じて使用する事ができる。培養温度は、アスペルギウス属が生育する範囲内で適宜変更しうるが、２０〜３７℃、好ましくは２５〜３０℃、特に２８℃±１℃である。培養時間は、条件によって多少異なるが、通常２〜８日、特に４日程度が好ましい。培養終了後、該培養物より本発明に使用できる抽出物を採取するには通常の酵素採取手段を用いる事ができる。
【００２４】
本発明に使用できる抽出物は主としてその菌体膜画分に含有、蓄積されており、その菌体膜から抽出すればよい。その抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分離などによって分離し、菌体を膜可溶化用の界面活性剤（ＴＸ−１００等）を含むリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、超音波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗抽出液として回収する。このようにして得られた粗抽出液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理する事もできる。例えばアセトンまたはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて本発明に使用できる抽出物を得る事ができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて凍結乾燥させてもよい。
【００２５】
ビリルビン酸化反応を促進するにあたっては、有機鉄化合物、金属塩及びアスコルビン酸オキシダーゼを組み合わせればよい。また、有機鉄化合物とアスコルビン酸オキシダーゼの存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる手法も好ましい。また、別の態様としては、アスペルギウス属の培養抽出物の存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる手法も好ましい。有機鉄化合物とアスコルビン酸オキシダーゼ、及び金属塩の存在下、ｐＨを塩基性側に変化させる手法も場合によっては好ましい。反応液が濁る場合は、副波長で濁り成分の吸光値を差し引いて測定するなど、通常行われる「濁り」の回避方法を組み合わせればよい。    ビリルビン酸化反応を抑制するにあたっては、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物の存在下、非イオン性界面活性剤を作用させればよい。
【００２６】
本発明の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する試薬に、人工電子受容体を必要に応じて添加する事ができる。人工電子受容体としては、フェナジンメトサルフェイト（ＰＭＳ）、フェナジンエトサルフェイト（ＰＥＳ）、メトキサチン、１、４−ベンゾキノン（ＢＱ）、２、３−ジメトキシ−５−メチル−１、４−ベンゾキノン（Ｑｏ）、２、６−ジメチル−１、４−ベンゾキノン（２、６−ＤＭＢＱ）、２、６−ジクロロ−１、４−ベンゾキノン（２、６−ＤＣＢＱ）、１、２−ナフトキノン（ＮＱ）、１、２−ナフトキノン−４−スルホン酸（ＮＱ−４−スルホン酸）、Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンおよびＮ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンジハイドロクロライド（ＴＭＰＤ）などが挙げられる。人工電子受容体としては、ＰＭＳ、ＰＥＳ、メトキサンチンまたはＢＱが好ましく、ＢＱが特に好ましい。
【００２７】
本発明の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する試薬としては、
（Ｉ）少なくとも、以下（ａ）〜（ｃ）を含むビリルビン測定用キット、
（ａ）アスコルビン酸オキシダーゼ
（ｂ）非イオン性界面活性剤
（ｃ）金属塩、
（ＩＩ）少なくとも、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物を含むビリルビン測定用キット、
（ＩＩＩ）少なくとも、アスペルギウス属の培養抽出物を含むビリルビン測定用キットを例示する事ができる。
【００２８】
これらのキットは第一反応で直接型ビリルビンを酸化する試薬、第二反応で間接型ビリルビンを酸化する試薬として構成するのが好ましい。                                  直接型ビリルビンを酸化する試薬としては、アスコルビン酸オキシダーゼと有機鉄化合物を含有する試薬、アスペルギウス属の培養抽出物を含有する酸性の試薬が挙げられる。  アスコルビン酸オキシダーゼを含む試薬を構成する際は、アスコルビン酸オキシダーゼと直接型ビリルビンに対する反応性を促進する反応促進剤は予め混和しておく事が望ましい。
【００２９】
間接型ビリルビンを酸化する試薬としては、間接型ビリルビンを酸化するための金属塩を含有する、又は、直接型ビリルビンを酸化する試薬を塩基性に変化するための物質を含む試薬が挙げられる。                                                              これらの試薬やキットは液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品が好ましく、液状品、液状品の凍結乾燥品がより好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。さらに別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。            
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれらにより限定されるものではない。なお、実施例中、実験に使用した試薬類は特に指摘しない限り、和光純薬工業株式会社より購入したものである。
〔実施例１〕
【００３１】
１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８を１００μｌ、１７．５Ｕ／ｍｌのアスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社）を２０μｌ、及び表１に示す反応促進剤を表１中に示した反応液中濃度になるように加え、蒸留水で総量０．５ｍｌになるように調製した。この反応液を３７度で５分間予備加温してこのときの波長６６０ｎｍでの吸光度をＡ０とした。次に、ビリルビン検体として国際試薬（株）の干渉チェックＡビリルビンＣ（以下、直接型ビリルビン）又はビリルビンＦ（以下、間接型ビリルビン）を０．９％ＮａＣｌで１６０ｍｇ／ｄｌに調製したものを２０μｌ添加し３７度で５分後の６６０ｎｍでの吸光度をＡ１としＡ１−Ａ０を測定し、その結果をまとめて表１に示した。本実施例の条件下、反応促進剤を用いないときにアスコルビン酸オキシダーゼで直接型ビリルビンを酸化でき、さらに反応促進剤で直接型ビリルビンの変化を促進できる事がわかる。また、本実施例の条件下、反応促進剤の有無に関わらずアスコルビン酸オキシダーゼで間接型ビリルビンを変化しない事が分かる。
【００３２】
【表１】
2005333978.tif 000002
〔実施例２〕
【００３３】
１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８を５０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌの旭化成ファーマ株式会社製アクレモニウム属由来アスコルビン酸オキシダーゼ、又は１ｍｇ／ｍｌのロシュ・ダイアグノスティック株式会社製カボチャ由来アスコルビン酸オキシダーゼを２０μｌ、及び表２に示す反応促進剤を反応液中で表２中に示した濃度になるように加え、蒸留水で総量０．５ｍｌになるように調製した。この反応液を３７度で５分間予備加温してこのときの波長６６０ｎｍでの吸光度をＡ０とした。次にビリルビン検体として直接型ビリルビンを０．９％ＮａＣｌで１６０ｍｇ／ｄｌに調製したものを２０μｌ添加し３７度で５分後の６６０ｎｍでの吸光度をＡ１としＡ１−Ａ０を測定し、その結果をまとめて表２に示した。本実施例の条件下、アスコルビン酸オキシダーゼの由来にかかわらず、直接型ビリルビンを酸化でき、さらにフェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウムで直接型ビリルビンの変化を促進できる事がわかる。
【００３４】
【表２】
2005333978.tif 000003
〔実施例３〕
【００３５】
直接型ビリルビンを０．９％ＮａＣｌ水で希釈し１から１０ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。０．２５ｍｌの、５０μＭのフェロシアン化カリウムを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８に各直接型ビリルビン検量線用標準液を２０μｌ添加して３７度で５分後間予備加温した（このときの波長６６０ｎｍでの吸光度をＡ０とした）。次に、フェロシアン化カリウム５０μＭとアスコルビン酸オキシダーゼ４０Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８を０．２５ｍｌ添加して３７度で５分後の６６０ｎｍでの吸光度をＡ１とし、Ａ１−Ａ０を測定しその結果を図１に示した。ビリルビン濃度と波長６６０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９８５１で直線状にプロットされ、波長６６０ｎｍでの吸光度変化測定で直接型ビリルビンを定量できる。
〔実施例４〕
【００３６】
直接型ビリルビンを０．９％ＮａＣｌ水で希釈し１、２、３、４、５ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。０．２５ｍｌの１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ３．０に各直接型ビリルビン検量線用標準液を２０μｌ添加して３７度で５分後間予備加温した（このときの波長４５０ｎｍでの吸光度をＡ０とした）。次に、フェロシアン化カリウム１００μＭとアスコルビン酸オキシダーゼ１５Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ３．０を０．２５ｍｌ添加して３７度で５分後の４５０ｎｍでの吸光度をＡ１とし、Ａ０−Ａ１を測定しその結果を図２に示した。ビリルビン濃度と波長４５０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９８６６で直線状にプロットされ、波長４５０ｎｍでの吸光度変化測定で直接型ビリルビンを定量できる。
〔実施例５〕
【００３７】
間接型ビリルビンを０．９％ＮａＣｌ水で希釈し１、２、３、４ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。０．２５ｍｌの１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８に各間接型ビリルビン検量線用標準液を２０μｌ添加して３７度で５分後間予備加温した（このときの波長６６０ｎｍでの吸光度をＡ０とした）。次に、フェロシアン化カリウム１００μＭ、０．６ｍＭ塩化ガリウム及びアスコルビン酸オキシダーゼ２０Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８を０．２５ｍｌ添加して３７度で５分後の６６０ｎｍでの吸光度をＡ１とし、Ａ１−Ａ０を測定しその結果を図３に示した。ビリルビン濃度と波長６６０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９９１８で直線状にプロットされ、波長６６０ｎｍでの吸光度変化測定で間接型ビリルビンを定量できる。
〔実施例６〕
【００３８】
間接型ビリルビンを０．９％ＮａＣｌ水で希釈し１から１０ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。０．２５ｍｌの１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ３．０に各間接型ビリルビン検量線用標準液を２０μｌ添加して３７度で５分後間予備加温した（このときの波長４５０ｎｍでの吸光度をＡ０とした）。次に、のフェロシアン化カリウム１００μＭ、８ｍＭ塩化ガリウム及びアスコルビン酸オキシダーゼ２０Ｕ／ｍｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液ｐＨ３．０を０．２５ｍｌ添加して３７度で５分後の４５０ｎｍでの吸光度をＡ１とし、Ａ０−Ａ１を測定しその結果を図４に示した。ビリルビン濃度と波長４５０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９９８０で直線状にプロットされ、波長４５０ｎｍでの吸光度変化測定で間接型ビリルビンを定量できる。
〔実施例７〕
【００３９】
１０ｍｇ／ｄｌの直接型ビリルビンと１０ｍｇ／ｄｌの間接型ビリルビンを１：１で混合しサンプルとした（このサンプル中の直接型ビリルビンと間接型ビリルビンの濃度はそれぞれ５ｍｇ／ｄｌになる）。このサンプル中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する事を目的として次の組成の試薬を調製した。Ｒ１試薬：１００ｍＭ  グリシン塩酸緩衝液ｐＨ３．１、４０μＭ  フェロシアン化カリウム、７．５Ｕ／ｍｌ  アスコルビン酸オキシダーゼ。Ｒ２試薬：４００ｍＭ  塩化ガリウム（ｐＨ未調整（ｐＨは約１．９））又は蒸留水。測定は日立７１５０形自動分析器を使用し、そのケミストリーパラメーターは次のようである。Ｓａｍｐｌｅ  ８μｌ、Ｒ１  ２５０μｌ、Ｒ２  ３μｌ、測定主波長  ４５０ｎｍ、測定温度３７度。図５はその反応経時変化を示す。図５中●はＲ２試薬として４００ｍＭ  塩化ガリウムを使用した場合、○はＲ２試薬として蒸留水を使用した場合である。図５中●と○は、第一反応（測光ポイント１から２４、１ポイントの間隔は約１２秒）が完全に停止しておらず、また図５の第二反応（測光ポイント２５から５０）中の○と●は、本条件下でＲ１試薬が直接型ビリルビンのみならず間接型ビリルビンも変化している可能性を示唆している。
〔実施例８〕
【００４０】
１０ｍｇ／ｄｌの直接型ビリルビンと１０ｍｇ／ｄｌの間接型ビリルビンを１：１で混合しサンプルとした。このサンプル中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する事を目的として次の組成の試薬を調製した。Ｒ１試薬：１００ｍＭ  グリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８、８０μＭ  フェロシアン化カリウム、１５Ｕ／ｍｌ  アスコルビン酸オキシダーゼ、０．０２％  ＴＸ−１００。Ｒ２試薬：２Ｍ  塩化ガリウム（ｐＨ未調整）又は蒸留水。測定は日立７１５０形自動分析器を使用し、そのケミストリーパラメーターは次のようである。Ｓａｍｐｌｅ  ５μｌ、Ｒ１  ２５０μｌ、Ｒ２  ３μｌ、測定主波長  ４５０ｎｍ、測定温度３７度。図６中●はＲ２試薬として２Ｍ  塩化ガリウム（ｐＨ未調整（ｐＨは約１．９））を使用した場合、○はＲ２試薬として蒸留水を使用した場合である。Ｒ１試薬及びＲ２試薬の反応液組成を実施例７から本実施例のように変更した結果、図６中●と○のように第一反応は終末端に達して一定になっており、ＴＸ−１００がＲ１試薬の直接型ビリルビンに対する特異性を向上している事が分かる。また、図６の第二反応中の●は、本条件下のＲ２試薬が間接型ビリルビンを変化している事を示している。すなわち、本実施例により試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定できる。
〔実施例９〕
【００４１】
１０ｍｇ／ｄｌの直接型ビリルビンと１０ｍｇ／ｄｌの間接型ビリルビンを１：１で混合したものを０．９％ＮａＣｌで希釈し、直接型ビリルビンと間接型ビリルビンのそれぞれの濃度が０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５ｍｇ／ｄｌの検量線用標準液を調製した。この検量線用標準液中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する事を目的として次の組成の試薬を調製した。Ｒ１試薬：１００ｍＭ  グリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８、８０μＭ  フェロシアン化カリウム、１５Ｕ／ｍｌ  アスコルビン酸オキシダーゼ、０．０２％  ＴＸ−１００。Ｒ２試薬：２Ｍ  塩化ガリウム（ｐＨ未調整（ｐＨは約１．９））。測定は日立７１５０形自動分析器を使用し、そのケミストリーパラメーターは次のようである。Ｓａｍｐｌｅ  ５μｌ、Ｒ１  ２５０μｌ、Ｒ２  ３μｌ、測定主波長  ４５０ｎｍ、測定温度３７度。各検量線用標準液を測定した場合の、第一反応の２ポイント目と２４ポイント目の吸光度差をＡ１、第二反応の２５ポイント目と５０ポイント目の吸光度差をＡ２、直接型ビリルビンと間接型ビリルビンの濃度が０ｍｇ／ｄｌのときの吸光度差をＡ０として、Ａ１−Ａ０を図７に、Ａ２−Ａ０を図８に示した。直接型ビリルビン濃度と波長４５０ｎｍでの吸光度の変化量はＲ２＝０．９８０８で、総ビリルビン濃度と波長４５０ｎｍでの吸光度の変化量は直線状にＲ２＝０．９９４０でプロットされ試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で定量する事ができる。
〔実施例１０〕
【００４２】
１０ｍｇ／ｄｌの直接型ビリルビンと１０ｍｇ／ｄｌの間接型ビリルビンを１：１で混合しサンプルとした。このサンプル中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する事を目的として次の組成の試薬を調製した。Ｒ１試薬：２０ｍＭ  グリシン塩酸緩衝液ｐＨ２．８、８０μＭ  フェリシアン化カリウム、１５Ｕ／ｍｌ  アスコルビン酸オキシダーゼ、０．０２％  ＴＸ−１００。Ｒ２試薬：１Ｍ  トリス（ｐＨ未調整（ｐＨは約１０．８））。測定は日立７１５０形自動分析器を使用し、そのケミストリーパラメーターは次のようである。ＳＡＭＰＬＥ  ５μｌ、Ｒ１  ２５０μｌ、Ｒ２  ２５μｌ、測定主波長  ４５０ｎｍ、測定副波長  ７００ｎｍ、測定温度３７度。図９はその反応経時変化を示す。図９で示されるように、本条件下、第一反応で直接型ビリルビン、第二反応で間接型ビリルビンを変化している事を示している。すなわち、本実施例により第一反応と第二反応のｐＨを変化する事で、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定できる。
〔実施例１１〕
【００４３】
５％のグルコース、０．５％のポリペプトン、０．１％の酵母エキス、０．１％のＫＨ２ＰＯ４、０．１％のＫ２ＨＰＯ４、０．１％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む液体培地（ｐＨ６）１００ｍｌを分注した５００ｍｌ三角フラスコ２０本を、１２１℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにアスペルギルス・オクラセウスＩＢ−３株をスラントから１白金耳かき取り移植し、振盪させながら、２８℃で７２時間培養した。培養液２Ｌをペーパーフィルターにてろ過して得られた菌体を１Ｌの０．１％のトリトンＸ−１００を含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ガラスビーズを用いた菌体破砕装置ダイノミル（ＷＩＬＬＹ  Ａ．ＢＡＣＨＯＦＥＮ社製）を用いて菌体破砕を行い、４℃で２４時間攪拌した後、１５０００ｒｐｍ、６０分間、遠心分離し、アスペルギウス属の培養抽出物を得た。
〔実施例１２〕
【００４４】
アスペルギウス属の培養抽出物の直接型ビリルビンと間接型ビリルビンに対する至適ｐＨの検討結果を図１０に示す。使用した反応液は、５０ｍＭの各緩衝液、０．１ｍＭのベンゾキノン、０．０５％のＳＤＳから成る。この反応液１ｍｌを３７℃で１．５分間加温した後、０．０２ｍｌの実施例１１で得たアスペルギウス属の培養抽出物を添加し、５分後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。ブランクとしてアスペルギウス属の培養抽出物のかわりに０．０２ｍｌの精製水を添加し、５分後の４５０ｎｍの吸光度（Ｂ）を測定した。この吸光度（Ａ）と（Ｂ）の吸光度差（Ｂ）−（Ａ）の相対値（直接型ビリルビンと間接型ビリルビンそれぞれの最大変化を１００％として）を図１０の縦軸に表した。緩衝液は、ｐＨ４〜６がクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（□は直接型ビリルビン、■は間接型ビリルビン）、ｐＨ５〜６が酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（○は直接型ビリルビン、●は間接型ビリルビン）、ｐＨ６．５〜８．５はトリス−塩酸緩衝液（△は直接型ビリルビン、▲は間接型ビリルビン）、ｐＨ８．５〜１０．５がグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（×は直接型ビリルビン、＋は間接型ビリルビン）を使用した。図１０で示されるようにアスペルギウス属の培養抽出物は酸性側で直接型ビリルビンのみを、塩基性側で直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを酸化し、アスペルギウス属の培養抽出物を用いれば第一反応として酸性側で直接型ビリルビンのみを酸化して、第二反応で反応液ｐＨを塩基性側に変化する事により間接ビリルビンも酸化する事ができるようになり、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で定量する事が可能である事が分かる。
〔実施例１３〕
【００４５】
アスペルギウス属の培養抽出物の人工電子受容体に対する特異性を表３に示した。使用した反応液は、５０ｍＭの酢酸−水酸化ナトリウム緩衝液  ｐＨ４．０、０．１ｍＭの各人工電子受容体、０．０５％のＳＤＳ、０．８ｍｇ／ｍｌ  直接型ビリルビンから成る。この反応液１ｍｌを３７℃で１．５分間予備加温した後、０．０２ｍｌの実施例１１で得たアスペルギウス属の培養抽出物を添加し、５分後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。ブランクとしてアスペルギウス属の培養抽出物のかわりに０．０２ｍｌの精製水を添加し、５分後の４５０ｎｍの吸光度（Ｂ）を測定した。この吸光度（Ａ）と（Ｂ）の吸光度差（Ｂ）−（Ａ）の相対値（人工電子受容体がない場合１００％として）を示した。表３で示されるようにアスペルギウス属の培養抽出物によるビリルビンの酸化反応に人工電子受容体は必須ではないが、人工電子受容体添加によりアスペルギウス属の培養抽出物のビリルビン酸化反応促進効果がある事が分かる。
【００４６】
【表３】
2005333978.tif 000004
〔実施例１４〕
【００４７】
直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する事を目的として次の組成の試薬を調製した。Ｒ１試薬：２０ｍＭ  クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ４．６、１ｍＭ  ベンゾキノン、１％  ＳＤＳ、６％の実施例１１で得たアスペルギウス属の培養抽出物。Ｒ２試薬：４００ｍＭ  塩化ガリウム（ｐＨ未調整（ｐＨは約１．９））。ブランクとしてアスペルギウス属の培養抽出物のかわりに精製水を使用したＲ１Ｂｌａｎｋ試薬を作成した。測定は日立７１５０形自動分析器を使用し、そのケミストリーパラメーターは次のようである。ＳＡＭＰＬＥ  ５μｌ、Ｒ１  ２５０μｌ、Ｒ２  ２５μｌ、測定主波長  ４５０ｎｍ、測定副波長  ７００ｎｍ、測定温度３７度。Ｒ１試薬とＲ１Ｂｌａｎｋ試薬を使用した場合の吸光変化の差を表４に示した。本実施例の条件下、第一反応で直接型ビリルビンのみを選択的に酸化できる事が分かった。第二反応で反応液は濁って吸光変化を測定する事ができなかったが、いずれの場合も反応槽中のビリルビン由来の黄色は第二反応終了時には消失しており、第二反応で直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを酸化している事が確認できた。すなわち、本実施例により試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定できる。
【００４８】
【表４】
2005333978.tif 000005
〔実施例１５〕
【００４９】
直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する事を目的として次の組成の試薬を調製した。Ｒ１試薬：２０ｍＭ  クエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ４．６、１ｍＭ  ベンゾキノン、１％  ＳＤＳ、６％の実施例１１で得たアスペルギウス属の培養抽出物。Ｒ２試薬：１Ｍ  トリス（ｐＨ未調整（約１０．３））。ブランクとしてアスペルギウス属の培養抽出物のかわりに精製水を使用したＲ１Ｂｌａｎｋ試薬を作成した。測定は日立７１５０形自動分析器を使用し、そのケミストリーパラメーターは次のようである。ＳＡＭＰＬＥ  ５μｌ、Ｒ１  ２５０μｌ、Ｒ２  ２５μｌ、測定主波長  ４５０ｎｍ、測定副波長  ７００ｎｍ、測定温度３７度。Ｒ１試薬とＲ１Ｂｌａｎｋ試薬を使用した場合の吸光変化の差を表５に示した。本実施例の条件下、第一反応で直接型ビリルビンのみを選択的に酸化でき、第二反応で直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを酸化できる事が分かった。すなわち、本実施例により試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定できる。
【００５０】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、試料中の直接型ビリルビンと総ビリルビンを同一反応槽で測定する方法を提供できた。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】直接型ビリルビンを波長６６０ｎｍの吸光度変化で測定した検量線
【図２】直接型ビリルビンを波長４５０ｎｍの吸光度変化で測定した検量線
【図３】間接型ビリルビンを波長６６０ｎｍの吸光度変化で測定した検量線
【図４】間接型ビリルビンを波長４５０ｎｍの吸光度変化で測定した検量線
【図５】直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを混合したサンプルを実施例７に記載した反応試薬を用いて測定した場合の波長４５０ｎｍの吸光度経時変化
【図６】直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを混合したサンプルを実施例８に記載した反応試薬を用いて測定した場合の波長４５０ｎｍの吸光度経時変化
【図７】直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを混合したサンプルを実施例９に記載した反応試薬を用いて測定した場合の直接型ビリルビンの検量線（波長４５０ｎｍの吸光度変化で測定）
【図８】直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを混合したサンプルを実施例９に記載した反応試薬を用いて測定した場合の総ビリルビンの検量線（波長４５０ｎｍの吸光度変化で測定）
【図９】直接型ビリルビンと間接型ビリルビンを混合したサンプルを実施例１０に記載した反応試薬を用いて測定した場合の波長４５０ｎｍの吸光度経時変化
【図１０】アスペルギウス属の培養抽出物の至適ｐＨ曲線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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