(57)【要約】【課題】ダイオキシン分解除去効率が優れているダイオキシン分解菌、ダイオキシン分解方法、及び前記分解方法に用いるのに適した新規廃培地を提供する。【解決手段】前記菌は、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１である。ダイオキシン分解方法では、ダイオキシンの分解能を有し、タコウキン科シュタケ属に属する微生物を用いる。廃培地は、ダイオキシンの分解能を有し、タコウキン科シュタケ属に属する微生物を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１。
【請求項２】
ダイオキシンの分解能を有し、タコウキン科シュタケ属に属する微生物を用いることを特徴とする、ダイオキシンの分解方法。
【請求項３】
前記微生物が、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１である、請求項２に記載の分解方法。
【請求項４】
前記微生物の培養物、前記微生物を担持する担体、又は前記微生物を含む廃培地を用いる、請求項２又は３に記載の分解方法。
【請求項５】
ダイオキシンの分解能を有し、タコウキン科シュタケ属に属する微生物を含有することを特徴とする、廃培地。
【請求項６】
前記微生物が、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１である、請求項５に記載の廃培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイオキシン分解能を有する新規微生物、ダイオキシン分解方法、及び前記分解方法に用いるのに適した新規廃培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ダイオキシンによる環境汚染が問題になってきている。特に廃棄物などの焼却に関する分野では、その排気ガス中に含まれるダイオキシンが野外に放出されることにより、土壌のダイオキシン汚染の原因となったり、あるいは、焼却灰中に混入しているダイオキシンがそのまま焼却灰の最終処分場に運ばれることにより、周辺の土壌や地下水等のダイオキシン汚染の原因となったりしている。
【０００３】
有機塩素化合物の一種であるダイオキシンは、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素によって結び付けられた骨格構造をもつ化合物（ジベンゾフラン又はジベンゾ−ｐ−ダイオキシン）の総称であり、この骨格に塩素が置換することによって、理論的にはそれぞれ１３５種類及び７５種類の異性体が存在する［紙パルプ技協誌４５（８），ｐ８８７，１９９１年（非特許文献１）］。ダイオキシンは、一般に毒性が高く、化学的に安定で、分解されにくいばかりではなく、脂溶性が高いため、生体組織中に蓄積しやすいと言われている。しかし、その毒性は、塩素の置換位置と置換した塩素数により、大きく変化し、毒性が極めて低いダイオキシンも存在する。ダイオキシンの中でも、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）は、最も毒性が高い［ＡＬＰＨＡ，Ｎｏ．５，２，１９９１年（非特許文献２）］。
【０００４】
このようなダイオキシンを分解除去する公知技術として、完全燃焼法（溶融固化処理法）、熱分解処理法（加熱脱塩素化処理法）、ペレット化焼成法、光分解法、各種化学的分解法、及び超臨界水処理法などが報告されている。しかし、最終処分場周辺及び農地などの汚染土壌中あるいは焼却灰などのダイオキシン処理には、その微量で広範囲に分散しているといった特徴から、前記公知技術の適用は困難であるとされている。
【０００５】
このように、環境中に微量で広範囲に分散しているダイオキシンを分解する方法として、微生物利用技術（バイオレメディエーション技術）が報告されてきている。例えば、Ｖａｌｌｉらは、（１）木材腐朽菌の一種であるファネロカエテ・キリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ：以下、ＰＣ菌と略称する）により、ダイオキシンの１種である２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（以下、２，７−ＤＣＤＤと略称する）を分解除去することができること、及び（２）前記ＰＣ菌が産生するリグニン分解に関与する酵素、すなわち、リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）及びマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）が、２，７−ＤＣＤＤの分解に関係していることを示した［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７４（７），ｐ２１３１，１９９２年（非特許文献３）］。
【０００６】
また、リグニン分解に関与する酵素を産生することができる菌、すなわち、ダイオキシン分解菌が、色素レマゾールブリリアントブルーＲ（Ｒｅｍａｚｏｌ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ）を脱色する性質を有することを利用して、野外から３種の菌（５６３菌株、Ｖ１菌株、及びＶ２菌株）を取得し、前記の菌３種と、リグニン分解能を有する木材腐朽菌３種［コリオルス・ベルシコロラ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、及びＰＣ菌］とについて、２，７−ＤＣＤＤ分解能を検討したところ、６種の菌すべてが２，７−ＤＣＤＤ分解能を有することが報告されている［紙パルプ技協誌，５０（１２），ｐ１２２，１９９６年（非特許文献４）］。
【０００７】
【非特許文献１】「紙パルプ技協誌」，１９９１年，４５（８），ｐ８８７
【非特許文献２】「ＡＬＰＨＡ」，（日本），１９９１年，Ｎｏ．５，２
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）」，（米国），１９９２年，１７４（７），ｐ２１３１
【非特許文献４】「紙パルプ技協誌」，１９９６年，５０（１２），ｐ１２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来報告されている前記ダイオキシン分解菌のダイオキシン分解能は、充分なレベルにまで達しているとは言えず、効率的にダイオキシンを分解するためには、従来公知のダイオキシン分解菌よりも、更にダイオキシン分解除去効率が優れている菌が求められていた。また、ダイオキシン分解能を有する微生物を散布した場合に、分解効率が或るレベルより高くならないことがあった。このような場合に、求められている分解効率を達成するには、大量の微生物を添加する必要があった。従って、本発明の課題は、ダイオキシン分解除去効率が優れているダイオキシン分解菌、ダイオキシン分解方法、及びそのダイオキシン分解方法に用いるのに適した廃培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の課題は、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ（Ｐｙｃｎｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）１によって解決することができる。
また、本発明は、ダイオキシンの分解能を有し、タコウキン科シュタケ属に属する微生物を用いることを特徴とする、ダイオキシンの分解方法にも関する。
本発明のダイオキシン分解方法の好ましい態様においては、前記微生物として、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ（Ｐｙｃｎｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）１を用いる。更にまた、本発明のダイオキシン分解方法の好ましい態様においては、前記微生物の培養物、前記微生物を担持する担体、又は前記微生物を含む廃培地を用いる。
更にまた、本発明は、ダイオキシンの分解能を有し、タコウキン科シュタケ属に属する微生物を含有することを特徴とする、廃培地にも関する。
本発明の廃培地の好ましい態様においては、前記微生物として、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１を用いる。
【００１０】
本明細書において、「ダイオキシン」とは、２個のベンゼン環が２個の酸素を介して縮合した構造を有する３環式化合物であるポリクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、及び２個のベンゼン環が１個の酸素を介して縮合した構造を有する３環式化合物であるポリクロロジベンゾフランを意味する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物は、ダイオキシンを高効率に分解除去することができるので、例えば、ダイオキシンにより汚染された最終処分場周辺及び農地などの土壌及び焼却灰のなどの浄化に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明によるヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）１及びヒラタケ２、並びにヒイロタケ１は、ダイオキシンの分解能を有する。
本発明による前記の各微生物は、例えば、紙パルプ技協誌，５０（１２），ｐ１２２，１９９６年に開示されている以下に示す方法によって、野外から単離することができる。前記単離方法は、リグニン分解に関与する酵素を産生することができる菌、すなわち、ダイオキシン分解菌が、色素レマゾールブリリアントブルーＲ（Ｒｅｍａｚｏｌ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ）を脱色する性質を有することを利用したものである。
すなわち、野外より採取した試料を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を更に希釈したものをスクリーニング用の試料とする。色素レマゾールブリリアントブルーＲを含む寒天培地上に、前記スクリーニング用試料を塗布し、適温（例えば、約２５℃）で培養する。前記色素を脱色した菌を、平板塗抹法により分離し、スラントとして保存する。得られた微生物のダイオキシン分解能を、例えば、ダイオキシンの一種である２，７−ジクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（以下、２，７−ＤＣＤＤと略称する）を用いて評価することにより、本発明の微生物を得ることができる。
【００１３】
本発明者は前記の方法を用いて、キノコ栽培施設内の腐朽された広葉樹より本発明によるヒラタケ１を純粋分離し、広葉樹林の立ち枯れ部より本発明によるヒラタケ２を純粋分離した。これらのヒラタケ１菌株及びヒラタケ２菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はそれぞれＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８、及びＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１９である。更に、本発明者は前記の方法を用いて、広葉樹の枯れ木上より本発明によるヒイロタケ１を純粋分離した。このヒイロタケ１菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１７５２０である。
【００１４】
本発明によるダイオキシン分解方法においては、ダイオキシンの分解能を有し、ヒラタケ科ヒラタケ属に属する微生物及び／又はタコウキン科シュタケ属に属する微生物（以下、単にダイオキシン分解微生物と称する）、好ましくはヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ２、及び／又はタコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１、より好ましくはヒラタケ１菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８、ヒラタケ２菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１９及び／又はヒイロタケ１菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５２０を用いること以外は、微生物を利用する公知のダイオキシン分解方法をそのまま利用することができる。
前記のダイオキシン分解微生物を利用して、ダイオキシン汚染物質（例えば、焼却灰）を無害化することができる。この無害化方法を実施するには、例えば、焼却灰に前記のダイオキシン分解微生物を添加することにより、焼却灰中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１５】
また、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、焼却炉からの排気ガスを無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、排気ガスの流路に前記のダイオキシン分解微生物を担持させた担体などを配置し、排気ガス中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１６】
更に、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、水中のダイオキシン（例えば、浸出水等の中のダイオキシン）を無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、浸出水をカラムに通し、その流路に前記のダイオキシン分解微生物を担持させた担体などを配置し、水中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
更に、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、汚泥やヘドロ中のダイオキシン（例えば、最終処分場の汚泥中のダイオキシン）を無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、汚泥やヘドロをリアクター内で土壌と混合してからダイオキシン分解菌と接触させるか、又は汚泥やヘドロをそのままダイオキシン分解菌と接触させて、汚泥やヘドロ中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１７】
更に、前記のダイオキシン分解微生物を利用して、ダイオキシン汚染土壌を無害化することもできる。この無害化方法を実施するには、例えば、前記のダイオキシン分解微生物をそのまま、あるいは、前記のダイオキシン分解微生物を担持させた担体を汚染土壌に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することなどが考えられる。
【００１８】
本発明の好ましいダイオキシン分解方法においては、前記のダイオキシン分解微生物の培養物、前記のダイオキシン分解微生物を担持する担体、又は前記のダイオキシン分解微生物を含む廃培地を、ダイオキシンで汚染されている被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に添加することができる。
【００１９】
本明細書において「ダイオキシン分解微生物の培養物」とは、ダイオキシン分解微生物をそのまま含む液体ないし固体の菌体含有培養物、それらの液体ないし固体培養物中のダイオキシン分解微生物を破砕した（例えば、ホモジナイザーで破砕した）菌体破砕培養物、あるいはそれらの液体ないし固体培養物からダイオキシン分解微生物を除去した（例えば、遠心分離で除去した）菌体除去培養物であることができる。液体培養物の調製には、液体培地、例えば、一般的にキノコの菌糸を増殖させる培地として使用されている培地、例えば、麦芽エキス・寒天（ＭＡ）培地、ジャガイモ・ブドウ糖寒天（ＰＤＡ）培地、エビオス・ブドウ糖培地、ＳＹＭ培地、又はＰＣＭＹ培地等を用いることができ、特にはＫｉｒｋの培地を使用するのが好ましい。前記の液体培地を用いて、ダイオキシン分解微生物を大量に培養することができる。
固体培養物の調製には、例えば、前記液体培地に寒天を加えて調製した固体培地を用いることができる。
【００２０】
前記の液体培養基に前記のダイオキシン分解微生物の菌糸を植菌し、こうして得られた前記のダイオキシン分解微生物を含む液体培養物を被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することができる。また、前記の液体培養物を、例えば、ホモジナイザーで処理して菌体を破砕した破砕培養物、あるいは前記の液体培養物を、例えば、遠心処理して菌体を除去した後の液相（菌体除去培養物）を被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することができる。
【００２１】
前記のダイオキシン分解微生物を担持する担体としては、例えば、活性炭や木質物質を用いることができる。木質物質としては、種々の形状の木材（例えば、木粉、又は木材チップ）、又は木質性廃棄物（例えば、藁、又は木くず等）を用いることができる。ダイオキシン分解微生物を担体上に担持させる方法としては、例えば広居らの方法［バイオマス変換計画報告書，Ｎｏ．１，２３−４１（１９８６）］や、Ｙｕｍらの方法［Ｗａｔｅｒ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｒｅｓ．７０（２），２０５−２１３（１９９８）］のように、適切な培地中で、ダイオキシン分解微生物を担体（例えば、木粉や木材チップ等）と共に培養し、前記ダイオキシン分解微生物を前記担体（例えば、木粉や木材チップ等）の上へ担持させた後、それら担体を含む培養液の形で汚染焼却飛灰、汚染土壌又は汚染水中へ添加することができる。
【００２２】
本明細書において「廃培地」とは、前記のダイオキシン分解微生物を培養している培地から発生した子実体の採取を２〜３回程度行った後の培地を意味し、好ましくはキノコの菌床栽培用培地の廃培地を意味する。子実体を採取した後の廃培地には前記のダイオキシン分解菌が繁殖しており、培養物中と同様に高濃度の分解菌を得ることができる。
【００２３】
前記の廃培地は、一般的にキノコ用培地（特に、キノコの菌床栽培用培地）として用いられている培養基から得ることができる。具体的には、例えば、鋸屑（例えば、スギ鋸屑）、米ぬか、及びモミ殻の混合物に、水を加えて含水率５０〜８０％にした培養基を、耐熱性プラスチックフィルム（例えば、ポリプロピレン又はポリエチレンフィルム）の袋に詰める。これを加熱滅菌（例えば、１１５〜１２０℃で２０〜４０分間）する。冷却後、種菌を接種して常温で暗所で２０〜３０日間培養する。菌糸が蔓延した培地を１０〜１５℃の明所におき、キノコ（子実体）を発生させる。ヒラタケの場合、７〜１０日後に収穫することができ、２〜３回程度収穫し終った培地を廃培地として利用することができる。こうして得られた前記のダイオキシン分解微生物を含む廃培地を被処理物（例えば、汚染土壌、又は焼却灰）に散布し、土壌中のダイオキシンを分解することができる。
【００２４】
一般にヒラタケは菌床栽培され、キノコ（子実体）を収穫した後の培地（すなわち廃培地）の処理に困っている。本発明によればこの廃培地をダイオキシン分解剤として利用することができる。また、この廃培地を用いる本発明方法では、ダイオキシン分解微生物の添加量を自由に調節することが可能であり、土壌に大量の菌糸を接種することもできるので、ダイオキシンの分解時間が大幅に短縮され、ダイオキシン類の分解率を大きく向上させることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ヒラタケ１菌株、ヒラタケ２菌株、及びヒイロタケ１菌株の単離及び同定》
キノコ栽培施設内の腐朽された広葉樹、広葉樹林の立ち枯れ部、及び広葉樹の枯れ木上より採取した試料を、２〜３白金耳の量（すなわち、白金耳に２〜３杯の量）で殺菌蒸留水１０ｍｌに懸濁させた。更に、その懸濁液を１０００倍〜１００００倍の範囲で希釈した希釈液をスクリーニング用試料とした。
スクリーニング用の寒天培地プレートとして、下層にＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地（１０ｍｌ）を、上層に１％色素（Ｒｅｍａｚｏｌ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ）と５ｐｐｍベノミールとを含む麦芽−寒天培地（８ｍｌ）を重層することにより調製した寒天培地プレートを使用した。なお、Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地の組成は、例えば、［西山隆造著「図解応用微生物の基礎知識」（１９９２年）オーム社，ｐ１５３］に記載されており、具体的には、スクロース（１０ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（１ｇ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．５ｇ）、ＫＣｌ（０．５ｇ）、ＮａＮＯ3（２．０ｇ）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０１ｇ）、及び寒天（１５ｇ）を蒸留水（１０００ｍｌ）に加えた後に、ｐＨを５．６に調整し、オートクレーブ滅菌したものである。
前記の寒天培地プレート上に、前記スクリーニング用試料（１ｍｌ）を塗布し、暗所で２５℃で培養した。前記色素を脱色した菌を平板塗抹法により分離し、スラントとして保存した。後述する「分解能の評価」に記載の方法に従って、スラントとして保存した各種菌について２，７−ＤＣＤＤ分解能を評価したところ、２，７−ＤＣＤＤ分解能の優れた菌株３種を得ることができた。キノコ栽培施設内の腐朽された広葉樹から採取した菌株をヒラタケ１菌株と命名し、広葉樹林の立ち枯れ部から採取した菌株をヒラタケ２菌株と命名し、そして広葉樹の枯れ木上より採取したヒイロタケ１菌株と命名した。
【００２６】
前記のヒラタケ１及びヒラタケ２の子実体及び胞子の形態的特徽は以下のとおりである。
子実体は叢生し、カサは直径５〜１５ｃｍ程度であり、まんじゅう形から開いて貝殻形ないし半円形となり、時にじょうご形になる。ヒラタケ１は子実体が小型でかなり硬く、ヒラタケ２は小型で色が薄いという特徴を持つ。表面は始めほぼ黒色ないし灰青色であるが、後にねずみ色、灰褐色、灰白色、又はほとんど白色になる。ひだは柄に長く垂生し、白ないし灰色を呈する。柄の長さは１〜８ｃｍ程度であり、しばしば基部に白毛を密生するが、時にはほとんど無柄である。柄の傘に対する付き方は側生、偏心生、又は中心生などがある。胞子紋は淡ピンクないし淡柴灰色である。胞子は７．５〜１１μｍ×３〜４μｍで円柱形である。
以上の特徴より、ヒラタケ１とヒラタケ２は「Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ」であることが明瞭である。
なお、これらのヒラタケ１菌株及びヒラタケ２菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はそれぞれＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８、及びＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１９である。
【００２７】
前記のヒイロタケ１の子実体及び胞子の形態的特徽は以下のとおりである。
傘は半円形で、鮮やかな朱紅色を呈するが、雨風にさらされると色が褪せる。表面は無毛及び平滑であり、環紋は不明瞭である。肉はコルク質ないし革質であり、断面は濃淡の縞模様をあらわす。傘の下面は濃赤紅色であり、管孔は長さ１〜２ｍｍ程度であり、孔ロは微細で、１ｍｍに６〜８個でやや超肉眼的である。胞子は超楕円形で、無色及び平滑であり、４〜５μｍ×２μｍ程度である。
以上の特徴より、ヒイロタケ１は「Ｐｙｃｎｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ」であることが明瞭である。
なお、これらの株はヒイロタケ１と表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年８月１８日より寄託され、受託番号はそれぞれＦＥＲＭ  Ｐ−１７５２０である。
【００２８】
《分解能の評価》
（１）色素脱色能による評価〔その１〕
前記実施例１に記載のスクリーニング用寒天培地プレートを用いて、色素（Ｒｅｍａｚｏｌ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ）を脱色する能力に関し、以下の表１に記載の各微生物を評価した。評価は、脱色能及び脱色速度に関して以下のとおり３段階で行った。
脱色能：
＋＋＋：強，＋＋：中，＋：弱。
脱色速度：
Ａ：速い，Ｂ：中程度，Ｃ：遅い。
《表１》
供試微生物                          脱色能      脱色速度
ヒラタケ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）            ＋＋＋          Ａ
ヒラタケ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１９）            ＋＋＋          Ａ
ヒイロタケ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５２０）           ＋＋           Ａ
チャナメツムタケ                                    ＋            Ｂ
［Pholiota lubrica(Pers.:Fr.)Sing.］
コムラサキシメジ                                   ＋＋           Ｂ
［Lepista sordida(Schum.:Fr.)Sing.］
マイタケ                                            ＋            Ｃ
［Grifola frondosa(Dicks.:Fr.)S.F.Gray]
ヤナギマツタケ                                     ＋＋           Ｂ
［Agrocybe cylindracea(DC.:Fr.)Maire］
マンネンタケ                                        ＋            Ｃ
［Ganoderma lucidum(Leyss.:Fr.)Karst.］
ナメコ                                              ＋            Ｂ
［Pholiota nameko(T.Ito)S.Ito et Imai in Imai］
ブナハリタケ                                       ＋＋           Ｂ
［Mycoleptodonoides aitchisonii(Berk.)Maas G.］
ベッコウタケ                                       ＋＋           Ｂ
［Fomitella fraxinea(Fr.)Imaz.］
エノキタケ                                         ＋＋           Ｂ
［Flammulina velutipes(Curt.:Fr.)Sing.］
クリタケ                                            ＋            Ｂ
［Naematoloma sublateritium(Fr.)Karst.］
ヌメリスギタケモドキ                                ＋            Ｂ
［Pholiota aurivella(Batsch.:Fr.)Kummer］                             
【００２９】
（２）色素脱色能による評価〔その２〕
前記実施例１に記載のスクリーニング用寒天培地プレートを用いて、色素（Ｒｅｍａｚｏｌ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ）を脱色する能力に関し、本発明によるヒラタケ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）及びヒラタケ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１９）と市販のヒラタケ〔ＫＨ−３，千曲化成（株）〕を評価した。結果を以下の表２に示す。
《表２》
脱色円の直径
接種後２日後       接種後５日後  
ヒラタケ１         ０．５〜１ｃｍ        ６〜７ｃｍ
ヒラタケ２         ０．５〜１ｃｍ        ６〜７ｃｍ
市販ヒラタケ      脱色は認められず     ２．５〜３ｃｍ
【００３０】
（３）ダイオキシン（２，７−ＤＣＤＤ）の分解能の評価
（イ）２，７−ＤＣＤＤの合成
ダイオキシンの分解能評価に用いるダイオキシンの一種である２，７−ＤＣＤＤを、Ａｄｖａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．，１２０，ｐ１２６，１９７３年に記載の方法に従って、下記の手順で合成した。
すなわち、２−ブロモ−４−クロロフェノール（５．１９ｇ）に１Ｎメタノール性ＫＯＨ（２９．５ｍｌ）を加えて溶解した後に、そのまま２時間放置した。その後、前記溶液を減圧濃縮することにより得られた濃縮物に、ベンゼン（２．５ｍｌ）及びヘキサン（５ｍｌ）を加えた。上層を除去した後、減圧乾燥することにより、２−ブロモ−４−クロロフェノールのカリウム塩（６．１４ｇ）を得た。
一方、硫酸銅（５水塩）（７３ｇ）を蒸留水（２８０ｍｌ）に溶かした溶液に、窒素を吹き込みながら、撹拌下に亜鉛末（２３．０ｇ）を０．５ｇずつ加えた。前記混合物を７０℃に加温した後に、吸引ろ過した。残さを５％塩酸で洗浄した後に、蒸留水で中性まで洗浄することにより、銅触媒（１５．８４ｇ）を得た。調製した触媒は、使用前まで冷蔵庫で保存した。
前記のとおりに調製した２−ブロモ−４−クロロフェノールのカリウム塩（３．６６ｇ）に、ビス（２−エトキシエチル）エーテル（５ｍｌ）、エチレンジアセテート（０．０５ｍｌ）、及び前記のとおりに調製した銅触媒（２０ｍｇ）を加え、２００℃で１５時間加熱還流した。冷却した後に、生成物をクロロホルムで抽出した。クロロホルム抽出液を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で抽出し、アルカリ可溶部を除去した後に、硫酸ナトリウム（無水）で乾燥した。その後、減圧濃縮して、反応生成物（４．４５ｇ）を得た。この生成物を１７０℃（２５ｍｍＨｇ下に）で３時間昇華し、白色結晶（３．１８ｇ）を得た。この結晶をメタノールより再結晶することにより、白色結晶として２，７−ＤＣＤＤ（２．９５ｇ）を得た（融点＝２０９〜２１１℃；収率＝３９．２％）。
【００３１】
（ロ）液体培養における分解能の評価方法
本発明のダイオキシン分解菌３種のダイオキシン分解除去効率の評価は、液体中にて実施した。なお、比較用のダイオキシン分解菌としては、前記の市販ヒラタケ〔ＫＨ−３，千曲化成（株）〕、並びにＰＣ菌及びＶ２菌株を用いた。前記Ｖ２菌株は、本発明者の一人である橘らが過去に野外より単離したダイオキシン分解菌３種（５６３菌株、Ｖ１菌株、及びＶ２菌株）の中で、最も２，７−ＤＣＤＤ分解除去効率が高かった菌株である［紙パルプ技協誌，５０（１２），ｐ１２２，１９９６年］。
【００３２】
Ｋｉｒｋら（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１１７，ｐ２７７，１９７８年）のＢａｓａｌ溶液に、２０ｍＭコハク酸ナトリウム、２％グルコース、及び窒素源として１．２ｍＭ酒石酸アンモニウムを加えた後に、ｐＨを４．５に調整した培地を、培養用の液体培地とした。前記液体培地をオートクレーブで滅菌した後に、１００ｍｌの三角フラスコ毎に液体培地（２０ｍｌ）を分注し、この中に供試菌を１白金耳植菌し、フラスコにダブルキャップをして２５℃で静置培養した。なお、毎日１回の頻度で、各培養フラスコに酸素を吹き込んだ。
６日間培養した後に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）に溶解した２，７−ＤＣＤＤ（１．２６ｍｇ）（２，７−ＤＣＤＤ添加濃度＝０．２５ｍＭ）を添加した。２，７−ＤＣＤＤを添加した後に、更に、１５日間又は３０日間培養処理した（比較用のＰＣ菌及びＶ２菌株については３０日間培養のみ）。培養期間中は、毎日１回の頻度で、酸素を吹き込んだ。実験は、各菌株、及び各培養期間について２組ずつ行い、これを２回繰り返して、その平均値をデータとした。
【００３３】
ダイオキシン分解効率は、以下の方法で評価した。すなわち、前記条件にて培養した後に、培養液を希塩酸でｐＨを２．０に調整し、これに酢酸エチル（４０ｍｌ）を加え、激しく撹拌した。その後、吸引ろ過し、培養ろ液を取り、酢酸エチル層と水層とを分離した。水層は、更に、酢酸エチルで２回抽出（各４０ｍｌ）した。この抽出液と前記酢酸エチル層とを合併し、飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄後、硫酸ナトリウム（無水）で乾燥し、その後、減圧濃縮により代謝物を得た。この代謝物（１．０ｍｇ）にＮ，Ｏ−ビス−トリメチルシリルアセトアミド（４０μｌ）、トリメチルクロロシラン（２０μｌ）、及びピリジン（４０μｌ）を加え、加温（８０℃、１０分間）することにより、トリメチルシリル（ＴＭＳ）化したものをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）用試料とした。
【００３４】
この試料をＧＣに注入し、予め作成しておいた検量線より、２，７−ＤＣＤＤを定量した。ＧＣの条件は、以下のとおりである。
（１）カラム：ＴＣ−１（０．２５ｍｍ×３０ｍ）
（２）温度：１００℃で１分間保持した後に１０℃／分で２９５℃まで昇温し、２９５℃で２０分間保持
（３）検出器：ＦＩＤ
（４）注入口温度：２５０℃
（５）検出器温度：２５０℃
（６）キャリアーガス：ヘリウム（３ｋｇ／ｃｍ2）、エアー（１．１ｋｇ／ｃｍ2）、スプリット比：１：３０
【００３５】
２，７−ＤＣＤＤの分解除去率は、培養開始時の２，７−ＤＣＤＤの添加量と培養後の代謝物中の２，７−ＤＣＤＤの量とから求めた。実験の結果を表３に示す。
【００３６】
《表３》
分解除去率（％）
使用した菌株                  １５日間      ３０日間  
ヒラタケ１菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）      ６８          ９６
ヒラタケ２菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１９）      ６４          ９２
ヒイロタケ１菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５２０）    ６９          ８２
ＰＣ菌                                         −           ７８
Ｖ２菌                                         −           ８１
市販ヒラタケ                                  ３８          ４５    
表３の「−」は「実施せず」の意味である。
【００３７】
（４）ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）分解能の評価
本発明のダイオキシン分解菌ヒラタケ１のダイオキシン分解除去効率の評価を、液体中に溶解した２，３，７，８−ＴＣＤＤを用いて実施した。なお、比較用のダイオキシン分解菌としては、前記の市販ヒラタケ〔ＫＨ−３、千曲化成（株）〕を用いた。
前記のＢａｓａｌ溶液を培養用の液体培地として、オートクレーブ滅菌した後に、１００ｍｌの三角フラスコ毎に液体培地（２０ｍｌ）を分注し、この中に供試菌を１白金耳植菌し、フラスコにダブルキャップをして２５℃暗所で静置培養した。なお、毎日１回の頻度で、各培養フラスコに酸素を吹き込んだ。
６日間培養した後に、酢酸エチル（１００μｌ）に溶解した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１ｎｇ）を添加した。２，３，７，８−ＴＣＤＤを添加した後に、更に１５日間又は３０日間培養処理した。培養期間中は、毎日１回の頻度で、酸素を吹き込んだ。
【００３８】
ダイオキシン分解効率は、以下の方法で評価した。すなわち前記条件にて培養した後に、培養液を分液ロートに移し、フラスコの洗浄液も同様に分液ロートに加えた。これに、Ｃ13でラベル化した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１０ｎｇ）を加えた。その後、濃硫酸（２０ｍｌ）を添加して菌体を完全に溶解してから抽出した。すなわち、ｎ−ヘキサン１５ｍｌで抽出した後、再び２０ｍｌのｎ−ヘキサンで抽出した（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，６２，ｐ４３２３，１９９６年）。フラスコの壁面に付着していて分液ロートに洗い込めなかった試料は、フラスコにアセトン１０ｍｌを加えて、超音波処理にかけて抽出した。その後、アセトン５ｍｌとヘキサン５ｍｌとの混合液をヘキサン１０ｍｌで抽出し、これらの抽出液と分液ロートで抽出したヘキサン溶液を一緒にしてから濃縮した。濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して分析試料とした。
この、試料をＧＣ−ＭＳ（ＳＩＭ法）によって分析し、予め作成しておいた検量線より、２，３，７，８−ＴＣＤＤを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は以下の通りである。
（１）カラム：ＨＰ−１（０．３２μｍ×３０ｍ）
（２）温度：７０℃で１分間保持した後、１８０℃まで１０℃／分で昇温し、その後１８０℃から２５２℃まで４℃／分で昇温した。
（３）注入口温度：２５０℃、スプリットレス
２，３，７，８−ＴＣＤＤの分解除去率は、培養開始時の２，３，７，８−ＴＣＤＤの添加量と培養後の代謝物中の２，３，７，８−ＴＣＤＤの量とから求めた。実験結果を表４に示す。
【００３９】
《表４》
分解除去率（％）
使用した菌株                  １５日間      ３０日間  
ヒラタケ１菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）      ３０          ６０
市販ヒラタケ                                  １３          ２１    
【００４０】
《廃培地を用いたバイオレメディエーション》
本発明のダイオキシン分解菌の廃培地を用いて、土壌中ダイオキシンのバイオレメディエーションを実施した。
（１）廃培地の作成
ナラのチップに栄養剤としてＮ源を添加した培養基を含水率６５％に調整した後、１２０℃で４５分間のオートクレーブ処理を行って滅菌した。その後、予めナラのチップに蔓延させた種菌〔ヒラタケ１菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）〕を接種し、２５℃で静置した。その後、１５日間から２０日間培養させると、菌糸が全体に蔓延した。子実体の採取を２回実施した後の培地を、以下の実験で廃培地として使用した。
【００４１】
（２）模擬汚染土壌中の２，３，７，８−ＴＣＤＤのバイオレメディエーション  通常の非汚染土壌に、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．１％を含む蒸留水５０ｍｌに溶解した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１ｎｇ）を添加し、模擬汚染土壌を作製した。この模擬汚染土壌に、前記（１）で調製した廃培地を乾燥重量比（土壌：廃培地）３：１で混合した。１０日間２５℃の条件で暗所で前培養した後に、更に１５日間又は３０日間培養処理した。
前記の培養期間の終了後に、土壌３０ｇ（乾燥重量）を秤量し、５００ｍｌのコニカルビーカーに入れ、２Ｎエタノール性ＫＯＨ（２００ｍｌ）を加え５分間撹拌混合してから一晩室温の条件で暗所で放置し、菌体を溶解させた。
その後、前記コニカルビーカーの内容物をブフナーロートでろ過し、残渣とろ液に分けた。残渣を少量のエタノールで４〜５回洗浄した後、すべての残渣についてスツクスレー抽出を行った。抽出液は濃縮後にｎ−ヘキサンで転溶した。一方、ろ液はｎ−ヘキサンで抽出し、ｎ−ヘキサンで転溶した溶液と合併した。
上記のｎ−ヘキサン溶液に、Ｃ13でラベル化した２，３，７，８−ＴＣＤＤ（１０ｎｇ）を加えた。その後、濃硫酸（３０ｍｌ）を添加してから濃縮した。濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。回収した試料はアルミナカラムクロマトグラフィーで再度精製し、回収した溶液を分析試料とした。
この試料をＧＣ−ＭＳ（ＳＩＭ法）によって分析し、予め作成しておいた検量線より、２，３，７，８−ＴＣＤＤを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は、前記の「ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）の分解能の評価」で記載した条件と同じである。
２，３，７，８−ＴＣＤＤの分解除去率は、処理開始時の２，３，７，８−ＴＣＤＤの添加量と処理後の土壌中の２，３，７，８−ＴＣＤＤの量とから求めた。実験結果を表５に示す。
【００４２】
《表５》
分解除去率（％）
使用した菌株                  １５日間      ３０日間  
ヒラタケ１菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）      ２７          ４６    
【００４３】
（３）ダイオキシン汚染土壌中のダイオキシンのバイオレメディエーション
水田から採取したダイオキシン汚染土壌に前記（１）で調製した廃培地を乾燥重量比（土壌：廃培地）３：１で混合した。１０日間２５℃の条件下で暗所で前培養した後に、更に１５日間又は３０日間培養処理した。
前記の培養期間の終了後に、土壌３０ｇ（乾燥重量）を秤量し、５００ｍｌのコニカルビーカーに入れ、２Ｎエタノール性ＫＯＨ（２００ｍｌ）を加え５分間撹拌混合してから一晩室温の条件下で暗所で放置し、菌体を溶解させた。その後、前記コニカルビーカーの内容物をブフナーロートでろ過し、残渣とろ液に分けた。残渣を少量のエタノールで４〜５回洗浄した後、すべての残渣についてスックスレー抽出を行った。抽出液は濃縮後ｎ−ヘキサンで転溶した。一方、ろ液はｎ−ヘキサンで抽出し、ｎ−ヘキサンで転溶した溶液と合併した。
濃縮物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー並びにアルミナカラムクロマトグラフィーで精製後、ＧＣ−ＭＳによってダイオキシンを定量した。
ダイオキシンの分解除去能は、各異性体の濃度に毒性等価係数（ＴＥＦ）をかけた毒性等量（ＴＥＱ）で比較し、処理開始時のＴＥＱと処理後の土壌中のＴＥＱとから求めた。実験結果を表６に示す。
【００４４】
《表６》
ＴＥＱ減少率（％）
使用した菌株                  １５日間      ３０日間  
ヒラタケ１菌（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１８）      ７７          ８９    
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の微生物は、ダイオキシンを高効率に分解除去することができるので、例えば、ダイオキシンにより汚染された最終処分場周辺及び農地などの土壌及び焼却灰のなどの浄化に利用することができる。