(57)【要約】【課題】  可溶化剤を大量に含む分析物に対するＭＡＬＤＩの弱点を改善し、不溶性タンパク質についてレーザイオン化質量分析を可能にする。【解決手段】  レーザイオン化装置１００は、マトリックスレーザパルス光照射部１１と、可溶化剤レーザパルス光照射部１２と、マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３とを備えている。可溶化剤レーザパルス光照射部１２から、試料台１に配置された試料に、可溶化剤励起用レーザパルス光を照射することにより、試料中の可溶化剤が励起状態になる。さらに、マトリックスレーザパルス光照射部１１から、マトリックス励起用レーザパルス光を照射することで、励起状態のマトリックス化合物と励起状態の可溶化剤とが共存された状態を実現でき、効率的に分析物をイオン化することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともマトリックス化合物、分析物、該マトリックス化合物及び分析物以外の副物質を含む試料中の分析物をイオン化させるためのレーザイオン化装置であって、
上記マトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザを照射する第１レーザ照射手段と、
上記副物質に吸収される副物質励起用レーザを照射する第２レーザ照射手段と、を備えることを特徴とするレーザイオン化装置。
【請求項２】
上記マトリックス励起用レーザ、及び、副物質励起用レーザがパルス状のレーザであることを特徴とする請求項１に記載のレーザイオン化装置。
【請求項３】
上記副物質とは、可溶化剤であることを特徴とする請求項１または２に記載のレーザイオン化装置。
【請求項４】
さらに、上記マトリックス励起用レーザを試料に対して照射する領域と、上記副物質励起用レーザを試料に対して照射する領域とが、少なくとも重なるように、上記第１レーザ照射手段と第２レーザ照射手段とを制御する照射領域制御手段が設けられていることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のレーザイオン化装置。
【請求項５】
上記第２レーザ照射手段から照射されるレーザの波長領域が、中赤外領域であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のレーザイオン化装置。
【請求項６】
さらに、上記第１レーザ照射手段の照射開始時刻と第２レーザ照射手段の照射開始時刻との時間差を調節する第１／第２レーザ照射調節手段が設けられていることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のレーザイオン化装置。
【請求項７】
上記第２レーザ照射手段が、自由電子レーザ光を照射する光照射手段であることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載のレーザイオン化装置。
【請求項８】
上記分析物が、不溶性タンパク質であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載のレーザイオン化装置。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のレーザイオン化装置を備えることを特徴とするレーザイオン化質量分析装置。
【請求項１０】
さらに、上記レーザイオン化装置にてイオン化された分析物分子を加速させるイオン化分析物加速手段と、
上記イオン化分析物加速手段にて加速されたイオン化分析物分子の飛行に要する時間を分析する飛行時間分析手段と、を備えることを特徴とする請求項９に記載のレーザイオン化質量分析装置。
【請求項１１】
少なくともマトリックス化合物、分析物、該マトリックス化合物及び分析物以外の副物質を含む試料中の分析物をイオン化するレーザイオン化方法であって、
上記マトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザを照射するマトリックスレーザ照射工程と、
上記副物質に吸収される副物質励起用レーザを照射する副物質レーザ照射工程と、を有することを特徴とするレーザイオン化方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のレーザイオン化方法と、
上記イオン化方法にてイオン化された分析物分子を加速させるイオン化分析物加速工程と、
上記イオン化分析物加速工程にて加速されたイオン化分析物分子の飛行に要する時間を分析する飛行時間分析工程と、を有することを特徴とする記載のレーザイオン化質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザイオン化質量分析装置及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化法(ＭＡＬＤＩ； Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)は、質量分析法に用いられるイオン生成法の一種である。この方法は、熱的に不安定かつ難揮発性の巨大分子をイオン化する方法として特に優れている。
【０００３】
このようなＭＡＬＤＩの一例としては、例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載の方法が挙げられる。このＭＡＬＤＩについて以下に簡単に説明する。まず、巨大分子の分析物とマトリックス化合物とを、モル比約１：１０００で溶液相にて充分に混合した後、試料台に少量滴下して乾燥させる。これにより、試料台には、分析物分子がドープされたマトリックス化合物の微結晶が、薄膜状に形成される。そして、この微結晶に対して、集光したレーザパルス光を照射する。このとき、マトリックス化合物がレーザパルス光の過剰エネルギーを吸収し、かつ分析物分子間の凝集力を弱めるように作用する。それゆえ、タンパク質等の熱的に不安定な巨大分子も分解することなく、マトリックス化合物分子と共に脱離、イオン化される。イオン化された分析物分子は、プロトン付加イオンまたはアルカリ金属付加イオン（正イオンモード）、あるいは、脱プロトンイオン（負イオンモード）として、気相中に出現する。以上のように、ＭＡＬＤＩでは、難揮発性の巨大分子をイオン化し、気相中の出現させることが可能になる。
【０００４】
このようなＭＡＬＤＩにおいて、マトリックス化合物は、（１）分析物分子間の凝集力を弱める媒質として、（２）光子エネルギーを効率よく熱に変換する光吸収体として、または、（３）プロトン授受反応により分析物分子を帯電させるイオン化剤として重要な役割を担う。マトリックス化合物としては、例えば、照射したレーザパルス光が窒素レーザパルス光である場合、波長３３７ｎｍに大きな吸収性を有する桂皮酸等の有機酸のマトリックス化合物が多用されている。
【０００５】
また、ＭＡＬＤＩを利用した質量分析は、ペプチド、タンパク質、核酸、糖鎖、合成ポリマーなどに適用され、応用例も多岐に及んでいる。
【０００６】
また、非特許文献３には、自由電子レーザとＵＶレーザとを同時に照射するＭＡＬＤＩ法が開示されている。
【０００７】
また、非特許文献４には、赤外自由電子レーザのみを用いたＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法が開示されている。
【０００８】
また、特許文献１には、イオン化された分析物分子の空間的及びエネルギー的ばらつきを減少させ、高い分解能で分析を行なうことが可能なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置が開示されている。
【非特許文献１】K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, and T. Yoshida: Rapid Commun. Mass Spectrom., Vol, p.151(1988)
【非特許文献２】吉田多見男、他４名，「レーザー脱離ＴＯＦ質量分析法による高質量分子イオンの検出」，質量分析，日本質量分析学会，昭和６３年４月，第３６巻，第２号，ｐ．５９‐６９
【非特許文献３】内藤康秀、粟津邦男，「自由電子レーザーを用いたレーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析」，レーザー研究，社団法人レーザー学会，平成１５年１月，第３１巻，第１号，ｐ．１６‐２０
【非特許文献４】内藤康秀、他３名，「赤外自由電子レーザーによるＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法」，レーザー研究，社団法人レーザー学会，平成１５年３月，第３１巻，第１号，ｐ．２１９‐２２４
【特許文献１】特開平９−３２０５１５号公報（平成９年１２月１２日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上述のＭＡＬＤＩには、不溶性タンパク質の質量分析が困難であるという問題を有している。
【００１０】
すなわち、ＭＡＬＤＩにおける分析物のイオン化効率は、高感度の質量分析のためには必須要素である。このイオン化効率は、分析物とマトリックス化合物との混合相の結晶形成の微視的状態に依存する。つまり、ＭＡＬＤＩにおいて、高感度測定が達成されうるイオン生成量を得るためには、溶液相で分析物とマトリックス化合物とが充分に混合されていることが必須である。
【００１１】
しかしながら、生物の機能上重要なタンパク質には、膜タンパク質に代表されるように不溶性なものも多数存在する。このため、このような不溶性タンパク質の分析物とマトリックス化合物との溶液相を得るためには、高濃度の可溶化剤を必要とする。
【００１２】
この可溶化剤は、マトリックス化合物により吸収される波長のレーザパルス光に対して、全く反応しない。すなわち、不溶性タンパク質を分析物とする場合、分析物及びマトリックス化合物以外に、レーザパルス光には全く反応しない可溶化剤が大量に存在することになる。この場合、レーザパルス光により励起されたマトリックス化合物分子の内部エネルギーは、当該マトリックス化合物分子周辺に存在する可溶化剤分子によって、急速に緩和する。そして、溶液相中で、熱的閉じ込め及び応力閉じ込めによるエネルギー蓄積の機構を実現することができなくなる。このため、分析物分子のイオン化に必要な熱的臨界条件を達成することができなくなり、分析物のイオン化効率が著しく低下する。すなわち、上記ＭＡＬＤＩにおいて、可溶化剤は、分析物分子のイオン化を阻害するように作用する。それゆえ、これまでのＭＡＬＤＩでは、可溶化剤を用いた不溶性タンパク質の高感度の質量分析が困難になるという問題点がある。これは、可溶化剤だけでなく、例えば、マトリックス化合物及び分析物以外に他の副物質が含まれている場合、同様の問題が生じることになる。
【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、マトリックス化合物及び分析物以外に他の副物質（例えば、可溶化剤）を含む試料に対するＭＡＬＤＩの弱点を改善し、試料中にマトリックス化合物及び分析物以外に他の副物質が含まれている場合でも、試料中の分析物を効率よくイオン化することができるレーザイオン化装置及びその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、上記タンパク質の可溶化剤が、中赤外波長領域に分子結合の振動モードに対応した独自の吸収波長特性を有することに着目し、ＭＡＬＤＩに中赤外波長領域のレーザパルス光を併用することにより不溶性タンパク質のイオン化・気化を実現し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明のレーザイオン化装置は、上記の課題を解決するために、少なくともマトリックス化合物、分析物、該マトリックス化合物及び分析物以外の副物質を含む試料中の分析物をイオン化させるためのレーザイオン化装置であって、上記マトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザを照射する第１レーザ照射手段と、上記副物質に吸収される副物質励起用レーザを照射する第２レーザ照射手段と、を備えることを特徴としている。
【００１６】
また、本発明のレーザイオン化装置は、上記マトリックス励起用レーザ、及び、副物質励起用レーザがパルス状のレーザであることが好ましい。
【００１７】
また、上記副物質とは、可溶化剤であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明のレーザイオン化装置は、さらに、上記マトリックス励起用レーザを試料に対して照射する領域と、上記副物質励起用レーザを試料に対して照射する領域とが、少なくとも重なるように、上記第１レーザ照射手段と第２レーザ照射手段とを制御する制御手段が設けられていることが好ましい。
【００１９】
また、本発明のレーザイオン化装置は、上記第２レーザ照射手段から照射されるレーザの波長領域が、中赤外領域であることが好ましい。
【００２０】
また、本発明のレーザイオン化装置は、上記制御手段に、さらに、上記第１レーザ照射手段の照射開始時刻と第２レーザ照射手段の照射開始時刻との時間差を調節する第１／第２レーザ照射調節手段が設けられていることが好ましい。
【００２１】
また、本発明のレーザイオン化装置は、上記第２レーザ照射手段が、自由電子レーザ光を照射する光照射手段であることが好ましい。
【００２２】
また、本発明のレーザイオン化装置は、上記分析物が、不溶性タンパク質であることが好ましい。
【００２３】
さらに、本発明のレーザイオン化質量分析装置は、上記の課題を解決するために、上述のレーザイオン化装置を備えることを特徴としている。
【００２４】
また、本発明のレーザイオン化質量分析装置は、上述のレーザイオン化装置と、当該イオン化装置にてイオン化された分析物分子を加速させるイオン化分析物加速手段と、上記イオン化分析物加速手段にて加速されたイオン化された分析物分子の飛行に要する時間を分析する飛行時間分析手段とを備えることが好ましい。
【００２５】
さらに、本発明のレーザイオン化方法は、上記の課題を解決するために、少なくともマトリックス化合物、分析物、該マトリックス化合物及び分析物以外の副物質を含む試料中の分析物をイオン化するレーザイオン化方法であって、上記マトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザを照射するマトリックスレーザ照射工程と、上記副物質に吸収される副物質励起用レーザを照射する副物質レーザ照射工程と、を有することを特徴としている。
【００２６】
さらに、本発明のレーザイオン化質量分析方法は、上記の課題を解決するために、上記レーザイオン化方法と、上記イオン化方法にてイオン化された分析物分子を加速させるイオン化分析物加速工程と、上記イオン化分析物加速工程にて加速されたイオン化分析物分子の飛行に要する時間を分析する飛行時間分析工程と、を有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のレーザイオン化装置では、副物質を励起状態にする副物質励起用レーザを試料に対して照射するので、試料中に副物質を含む場合、特に大量に含む場合においても、分析物分子を効率的にイオン化することが可能であるという効果を奏する。したがって、本発明のレーザイオン化装置を、様々な質量分析に用いることで、高感度の検出が可能な質量分析を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の実施の一形態についてより具体的に説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこの記載に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００２９】
（１）本発明のレーザイオン化装置
本発明のレーザイオン化装置は、少なくともマトリックス化合物、分析物、該マトリックス化合物及び分析物以外の副物質を含む試料に、当該マトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザと、上記副物質に吸収される副物質励起用レーザとを照射することにより、上記分析物をイオン化するものであればよく、その他の具体的な構成、装備等は特に限定されるものではない。
【００３０】
ここで、「マトリックス化合物」とは、ＭＡＬＤＩに用いられる従来公知の物質であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ＵＶ吸収機能を有する芳香環、タンパク質分子間凝集力を弱める機能を有する極性基、及び、イオン化機能を有する酸をその化学構造に有する化合物を挙げることができる。具体的には、マトリックス化合物としては、例えば、2,5-dihydroxybenzoic acid(DHB)、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)、または、3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid(sinapinic acid)、あるいは、グリセンリンに金属微粒子（例えばコバルト微粒子、粒径約３００Å）等が挙げられる。
【００３１】
「分析物」とは、イオン化する対象の物質をいい、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、糖鎖、合成ポリマーなどが挙げられるが、特にタンパク質が好ましい。
【００３２】
また、上記「副物質」とは、上記マトリックス化合物及び分析物以外に試料中に含まれる物質であれば、特に限定されるものではないが、例えば、可溶化剤やｐＨ緩衝剤等を挙げることができるが、特に可溶化剤が好ましい。
【００３３】
上記「可溶化剤」とは、分析物を可溶化することができる媒質を意味している。特に、上記分析物がタンパク質である場合、可溶化剤としては、タンパク質生化学に用いられる従来公知の可溶化剤を適用することができる。このような可溶化剤としては、例えば、尿素、塩酸グアニジン、リン脂質、界面活性剤（n-octyl-glucoside、ＳＤＳ、等）が挙げられる。また、可溶化剤の濃度も、分析物を溶解するのに必要な従来公知の濃度を適用できる。具体的には、上記分析物がタンパク質である場合、可溶化剤として尿素を用い、その濃度は８Ｍである。
【００３４】
また、本実施の形態に係るレーザイオン化装置は、第１レーザ照射手段と第２レーザ照射手段とを備えている。ここで、「レーザイオン化装置」とは、例えば、上述のＭＡＬＤＩにより分析物の気化とイオン化とを行なう装置のことをいう。すなわち、上記「レーザイオン化装置」とは、マトリックス化合物と、分析物と、副物質（例えば、可溶化剤）とを含む試料に、レーザを照射し、分析物分子をイオン化し、気相中に出現させる装置のことをいう。
【００３５】
ここでいう「イオン化」するとは、マトリックス励起用レーザの照射により、プロトン授受反応を起こし分析物分子を帯電させることを意味する。それゆえ、イオン化された分析物分子は、プロトン付加イオンまたはアルカリ金属付加イオン（正イオンモード）、あるいは、脱プロトンイオン（負イオンモード）として、気相中に出現することになる。
【００３６】
また、「第１レーザ照射手段」は、上記試料中のマトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザを照射するものである。「第２レーザ照射手段」は、上記試料中の副物質（例えば、可溶化剤）に吸収される副物質励起用レーザを照射するものである。
【００３７】
ここで、「吸収される」とは、マトリックス励起用レーザまたは副物質励起用レーザを、マトリックス化合物分子または副物質（例えば、可溶化剤）分子に対して照射することにより、マトリックス化合物分子または副物質（例えば、可溶化剤）分子が励起状態になることを意味する。
【００３８】
「第１レーザ照射手段」が照射するマトリックス励起用レーザとしては、ＭＡＬＤＩに用いられる従来公知のマトリックス化合物に吸収可能なレーザであれば、特に限定されないが、特に、紫外領域の波長のレーザパルス光が好適に用いられる。
【００３９】
また、上記マトリックス化合物とマトリックス励起用レーザとの組み合わせは、分析物分子をイオン化することができれば、特に限定されず、従来公知の上記マトリックス化合物とマトリックス励起用レーザとの組み合わせを適用することができる。例えば、マトリックス励起用レーザがＮ２（窒素）レーザパルス光（波長３３７ｎｍ）である場合、マトリックス化合物としては、2,5-dihydroxybenzoic acid(DHB)、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)、または、3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid(sinapinic acid)、あるいは、グリセンリンに金属微粒子（例えばコバルト微粒子、粒径約３００Å）を添加したものが挙げられる。
【００４０】
また、「第２レーザ照射手段」が照射する副物質励起用レーザとしては、試料中に含まれるマトリックス化合物及び分析物以外の物質に吸収可能なレーザであれば、特に限定されないが、特に、「副物質」が「可溶化剤」である場合、中赤外領域のレーザパルス光であることが好ましい。具体的には、ＣＯ２レーザ、または、Ｅｒ−ＹＡＧレーザが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
上記「中赤外領域」とは、波長が可視光線よりも長く、電波よりも短い０．８μｍ〜１ｍｍの波長範囲（赤外領域）のうち、２〜２５μｍの波長範囲のことをいう。特に、可溶化剤を励起状態にするのに好適な波長範囲は、２〜１５μｍである。
【００４２】
また、本発明のレーザイオン化装置では、上記マトリックス励起用レーザ、及び、副物質励起用レーザがパルス状のレーザであることが好ましい。ここでいう「パルス状のレーザ」とは、所定の周期で間欠的に発光し、発光の時間幅が短いレーザ光のことをいう。本明細書では、この「パルス状のレーザ」を単にレーザパルス光と称する。
【００４３】
上記のような構成を有する本実施の形態に係るレーザイオン化装置によれば、マトリックス化合物に分析物と副物質とが混入されている試料に対して、第１レーザ照射手段からマトリックス励起用レーザを照射することにより、マトリックス化合物は、マトリックス励起用レーザパルス光の過剰エネルギーを吸収し、かつ、試料中に含まれる分析物分子間の凝集力を弱めるように作用する。それゆえ、分析物が、熱的に不安定な物質であっても、分析物は分解されることなく、マトリックス化合物分子とともに脱離・イオン化されることになる。さらに、第２レーザ照射手段が、試料に対して副物質励起レーザを照射するため、副物質（例えば、可溶化剤）分子が選択的に振動励起した状態が形成される。
【００４４】
このため、マトリックス励起用レーザパルス光により励起されたマトリックス化合物分子の内部エネルギーが、周辺に存在する副物質分子により、緩和されることなく、効率的に分析物分子をイオン化することが可能になる。
【００４５】
以下、本実施の形態において、上記副物質が可溶化剤であり、レーザがレーザパルス光であり、上記副物質励起用レーザが可溶化剤励起用レーザパルス光である場合を例に挙げて、本発明のレーザイオン化装置による分析物分子イオン化の原理について、図１を参照して詳細かつ具体的に説明を行なう。
【００４６】
（１−１）本発明のレーザイオン化装置の原理
図１は、本発明のレーザイオン化装置による分析物分子のイオン化の原理を示す図である。図１の右側パネルに示すように、試料台には、マトリックス化合物Ｍに、可溶化剤Ｄと分析物Ａとが混入した試料Ｓが載せられている。周囲は真空状態である。そして、上記試料Ｓの所定の位置に、マトリックス励起用レーザパルス光と可溶化剤励起用レーザパルス光とが照射されている。このとき、マトリックス励起用レーザパルス光は、マトリックス化合物Ｍにより吸収される波長に、可溶化剤励起用レーザパルス光は、可溶化剤Ｄにより吸収される波長に合わされている。
【００４７】
マトリックス励起用レーザパルス光を吸収したマトリックス化合物Ｍは、電子励起状態になり、その内部エネルギーは、マトリックス化合物分子内部で短時間のうちに分子振動モードに緩和される。その結果、極めて高振動励起状態のマトリックス化合物分子が生成される。このマトリックス化合物の励起状態は、周囲に基底状態の可溶化剤分子が存在する場合、熱エネルギーとして急速に散逸してしまう。
【００４８】
しかしながら、本発明のレーザイオン化装置では、さらに、可溶化剤励起用レーザパルス光を、試料に照射している。このため、可溶化剤励起用レーザパルス光を吸収した可溶化剤Ｄは、振動励起状態になる。すなわち、試料中では励起状態の可溶化剤分子と励起状態のマトリックス化合物分子とが共存する状態が実現する。それゆえ、上記のような急速な熱エネルギーの散逸が起きることない。
【００４９】
したがって、本発明のレーザイオン化装置では、マトリックス化合物分子内部へのエネルギーの蓄積が、可溶化剤により阻害されることなく進行し、分析物のイオン化に必要な熱的臨界条件を達成することができる。その結果、図１の左側パネルに示すように、試料中に可溶化剤が大量に存在する条件下でも、効率的に、分析物分子をイオン化することができ、気相中に出現させることが可能になる。
【００５０】
また、マトリックス励起用レーザパルス光、及び、可溶化剤励起用レーザパルス光は、分析物Ａには吸収されない波長であり、レーザパルス光による分析物Ａの分子の破壊は起こらない。
【００５１】
以下、上述の分析物分子イオン化の原理に基づいた、本実施の形態に係るレーザイオン化装置の具体的構成について、図２を参照にして説明する。
【００５２】
（１−２）本発明のレーザイオン化装置の具体的構成
図２に示すように、本発明のレーザイオン化装置１００は、真空室２に設けられ、上記の試料を配置する試料台１と、第１レーザ照射手段として機能するマトリックスレーザパルス光照射部１１と、第２レーザ照射手段として機能する可溶化剤レーザパルス光照射部１２と、第１／第２レーザ照射調節手段として機能するマトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３と、ＣＣＤカメラ１４と、制御部１５と、マトリックス励起用レーザ光軸調整部１６と、可溶化剤励起用レーザ光軸調整部１７と、を備えている。なお、図２中のロードロック室は、真空室２の真空を破ることなく試料台１の出し入れをするために設けられている。
【００５３】
また、上記マトリックスレーザパルス光照射部１１は、マトリックス励起用レーザパルス光源３と、集光レンズ４と、真空窓５とを備えている。一方、可溶化剤レーザパルス光照射部１２は、可溶化剤励起用レーザパルス光源６と、集光レンズ７と、真空窓８とを備えている。
【００５４】
上記マトリックスレーザパルス光照射部１１において、マトリックス励起用レーザパルス光源３から出射したマトリックス励起用レーザパルス光は、集光レンズ４にて集光する。そして、このレーザパルス光は、真空窓５を通過して、試料台１の上面（水平面）に対して所定の角度で入射する。これにより、試料台１に配置された試料中のマトリックス化合物が、マトリックス励起用レーザパルス光を吸収して、励起状態になる。なお、レーザイオン化装置１００では、マトリックス励起用レーザパルス光として、波長範囲が紫外領域、すなわち、波長範囲が２００〜４００ｎｍのレーザパルス光を用いている。
【００５５】
上記集光レンズ４としては、紫外領域のマトリックス励起用レーザパルス光を透過する特性を有するレンズであれば、特に限定されない。石英ガラスは、一般に、紫外から近赤外の広範囲の波長の光に対して十分な透過性を示すことが知られている。それゆえ、集光レンズ４としては、石英ガラスからなるレンズが好適である。また真空窓５も、同様に、石英ガラスからなるものが好適である。
【００５６】
また、上記可溶化剤レーザパルス光照射部１２において、可溶化剤励起用レーザパルス光源６から出射した可溶化剤励起用レーザパルス光は、集光レンズ７にて集光し、真空窓８を通過する。そして、このレーザパルス光は、試料台１の上面（水平面）に対して、所定の角度で入射する。これにより、試料台１に配置された試料中の可溶化剤は、可溶化剤励起用レーザパルス光を吸収して、励起状態になる。なお、レーザイオン化装置１００では、上記可溶化剤励起用レーザパルス光の波長領域は中赤外領域である。
【００５７】
また、本発明のレーザイオン化装置１００では、上記マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対して照射する領域が、上記可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対して照射する領域と、少なくとも重なるように、上記可溶化剤レーザパルス光照射部１２とマトリックスレーザパルス光照射部１１とが制御されている。
【００５８】
上記「試料に対して照射する領域」とは、マトリックスレーザパルス光照射部１１、及び、可溶化剤レーザパルス光照射部１２が、レーザパルス光を出射したときの、試料に照射される領域のことをいう。
【００５９】
また、上記「少なくとも重なる」とは、上記マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域と、上記可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域とが、少なくとも一致する領域が存在することを意味するが、より好適には、略完全に一致することが好ましい。これは、マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域と、上記可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域とが、略完全に一致する場合、同一領域のマトリックス化合物分子と可溶化剤分子とを同時に励起状態にすることができるため、より一層効率的に分析物をイオン化することができるためである。
【００６０】
それゆえ、レーザイオン化装置１００では、上記マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域と、上記可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域とが同一領域である、または、何れか一方の照射領域が片方の照射領域内に存在した状態であってもよい。このとき、レーザイオン化装置１００では、試料台１に配置されている試料において、励起状態のマトリックス化合物と励起状態の可溶化剤とが共存する領域が存在する。したがって、試料中の分析物分子が効率的にイオン化され、気相中に出現させることが可能になる。
【００６１】
具体的に、このような試料に対する照射領域としては、マトリックス励起用レーザパルス光照射の場合、直径５００μｍの円領域、可溶化剤励起用レーザパルス光照射の場合、直径１００μｍの円領域が挙げられる。そして、マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域が、可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対する照射領域が収まるようになっている。
【００６２】
また、レーザイオン化装置１００では、上述のように、マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対して照射する領域と、可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対して照射する領域とが重なるように、それぞれのレーザパルス光の光軸を検知する検知手段としての機能を有するＣＣＤカメラ１４が設けられている。このＣＣＤカメラ１４により、マトリックス励起用レーザパルス光、及び、可溶化剤励起用レーザパルス光の光軸を観察し、感熱フィルムにて転写することにより、それぞれのレーザパルス光の光軸を検知することが可能になる。このＣＣＤカメラ１４による検知情報は、制御部１５に伝えられる。そして、制御部１５によって、マトリックス励起用レーザ光軸調整部１６、可溶化剤励起用レーザ光軸調整部１７を介して、可溶化剤レーザパルス光照射部１２とマトリックスレーザパルス光照射部１１との光軸が調整され、マトリックス励起用レーザパルス光の試料に対して照射する領域が、可溶化剤励起用レーザパルス光の試料に対して照射する領域と、少なくとも重なるように制御されることになる。つまり、レーザイオン化装置１００では、ＣＣＤカメラ１４と制御部１５とが照射領域制御手段として機能することになる。
【００６３】
さらに、本発明のレーザイオン化装置１００は、第１／第２レーザ照射調節手段として機能するマトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３を備えている。このマトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３は、可溶化剤励起用レーザパルス光照射とマトリックス励起用レーザパルス光照射との同期を得るために、上記マトリックスレーザパルス光照射部１１の照射開始時刻と上記可溶化剤レーザパルス光照射部１２の照射開始時刻との時間差を調節している。
【００６４】
より詳細には、図２に示すように、マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３は、可溶化剤励起用レーザパルス光検出器９と、遅延パルス発生器１０とを備えている。可溶化剤励起用レーザパルス光検出器９は、可溶化剤励起用レーザパルス光を光路の途中で分割し、可溶化剤励起用レーザパルス光のパルスを電気信号に変換する。そして、この電気信号は、遅延パルス発生器１０に入力されて、所定の遅れ時間が加えられた後、マトリックス励起用レーザパルス光源３のトリガーソースとなる。
【００６５】
すなわち、本発明のレーザイオン化装置１００では、マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３は、試料台１に配置された試料に対して、可溶化剤励起用レーザパルス光を照射した後、所定の遅れ時間後に、マトリックス励起用レーザパルス光を照射している。
【００６６】
これにより（１）可溶化剤励起用レーザパルス光の出力安定時における同時照射、および、（２）可溶化剤分子振動状態の蓄積という効果を奏する。
【００６７】
また、上記遅れ時間としては、励起状態の可溶化剤分子と励起状態のマトリックス化合物分子とが共存するのに最適な遅れ時間であれば、特に限定されないが、０〜１０μｓの遅れ時間が好ましく、１〜５μｓの遅れ時間がより好ましい。具体的に、上記遅れ時間としては、５μｓが挙げられる。
【００６８】
また、本実施の形態では、マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３は、可溶化剤励起用レーザパルス光を試料に照射した後に、マトリックス励起用レーザパルス光を照射するように調節している。しかしながら、これに限定されず、マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３は、マトリックス励起用レーザパルス光を試料に照射した後に、可溶化剤励起用レーザパルス光を照射するように調節してもよい。また、マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部１３は、マトリックス励起用レーザパルス光と可溶化剤励起用レーザパルス光を同時に照射するように調節してもよい。
【００６９】
また、レーザイオン化装置１００では、上記可溶化剤レーザパルス光照射部１２が、自由電子レーザ光を照射する自由電子レーザ光照射手段であってもよい。
【００７０】
上記「自由電子レーザ光」とは、相対論的なエネルギーを持つ電子ビームと電磁場との共鳴的な相互作用により発生した、コヒーレントな電磁波のことをいう。この自由電子レーザ光は、通常のレーザ光のように原子、分子、及び、固体の電子のエネルギー準位によるものではなく、磁場中の自由電子をレーザ媒質としたレーザ光である。それゆえ、この自由電子レーザ光は、磁場強度、及び、電子のエネルギーを変えることで発振波長が連続的に変わる。
【００７１】
以下に、自由電子レーザ光照射手段としての自由電子レーザ装置の構成について、図３を参照して、さらに説明する。
【００７２】
図３に示すように、自由電子レーザ装置１０１は、電子加速器１８、アンジュレータ１６、及び、光共振器２０を備えている。また、光共振器２０は、ミラー２１とミラー２２とからなる合わせ鏡で構成されている。
【００７３】
図３に示すように、電子加速器１８においてほぼ光速にまで加速した電子ビームは、アンジュエータ１９内で形成された磁場により蛇行し、シンクロトロン放射光が発生する。そして、このシンクロトロン放射光は、光共振器２０の合わせ鏡ミラー２１・１９内で、電子ビームと何百回も共鳴的な相互作用することにより、レーザ発振する。これにより、自由電子レーザ装置１０１は、発振波長を連続的かつ任意に選択して、レーザ光を出射させることが可能になる。
【００７４】
特に、本発明のレーザイオン化装置１００において、分析物としてタンパク質等の生体分子を用いた場合、生体分子やその可溶化剤に数多く見られる中赤外領域の固有吸収波長に対応するレーザ光源は稀少である。それゆえ、可溶化剤レーザパルス光照射部１２が、上記自由電子レーザ装置１０１である場合、その波長可変性は極めて有効である。
【００７５】
また、可溶化剤レーザパルス光照射部１２による可溶化剤励起用レーザパルス光の照射条件は、上記可溶化剤を励起状態にすることができれば、特に限定されない。特に、分析物がタンパク質である場合、可溶化剤を励起状態にするためには、パルス幅が５０ｆｓ〜１０μｓ、パルス強度が１×１０６〜１×１０１０Ｗ／ｃｍ２、波長領域が２〜１５μｍが好ましく、パルス幅が５ｐｓ〜１０ｎｓ、パルス強度が１×１０８〜１×１０９Ｗ／ｃｍ２、波長領域が５〜１０μｍであるとより好ましい。具体的には、上記可溶化剤が濃度８Ｍの尿素である場合、尿素を励起状態にするために、パルス幅が５０ｆｓ〜１０μｓ、パルス強度が１×１０７〜１×１０１０Ｗ／ｃｍ２、波長領域が２〜１０μｍが好ましく、パルス幅が５ｐｓ〜１０ｎｓ、パルス強度が１×１０８〜１×１０９Ｗ／ｃｍ２、波長領域が５．８〜６．３μｍであるとより好ましい。
【００７６】
以上のように、本発明のレーザイオン化装置１００では、マトリックスレーザパルス光照射部１１によるマトリックス励起用レーザパルス光の照射、及び、可溶化剤レーザパルス光照射部１２による可溶化剤励起用レーザパルス光の照射により、試料台１に配置された試料において、励起状態のマトリックス化合物と励起状態の可溶化剤とが共存した状態を実現することができ、より効率的に試料中の分析物をイオン化し、気相中に出現させることが可能になる。
【００７７】
（２）本発明のレーザイオン化装置の利用
本発明のレーザイオン化装置では、マトリックス化合物を励起させるマトリックス励起用レーザとともに、分析物の可溶化剤を励起状態にする可溶化剤励起用レーザパルス光を試料に照射しているので、試料中に可溶化剤を大量に含む場合においても、分析物分子を効率的にイオン化することが可能である。したがって、本発明のレーザイオン化装置を、様々な質量分析に用いることで、高感度の検出が可能な質量分析を実現することができる。それゆえ、上述のレーザイオン化装置を備えるレーザイオン化質量分析装置も本発明に含まれる。
【００７８】
ここでいう「レーザイオン化質量分析装置」とは、レーザ照射により試料をイオン化して気相中に出現させ、それを質量（ｍ）／電荷数（ｚ）で分離・分析する装置のことをいう。このようなレーザイオン化質量分析装置としては、本発明のレーザイオン化装置にてイオン化された分析物分子を質量（ｍ）／電荷数（ｚ）により、分離・分析できる装置であれば、特に限定されないが、例えば、イオントラップ型質量分析装置、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置が挙げられる。
【００７９】
以下、本発明のレーザイオン化質量分析装置の一例として、飛行時間型質量分析装置を挙げ詳細に説明する。
【００８０】
（２−１）飛行時間型質量分析装置
飛行時間型質量分析装置とは、イオン化された分析物が、電場で加速された後、一定距離を慣性運動する時間の差から、該分析物を分離・分析する装置のことをいう。
【００８１】
本発明のレーザイオン化装置を上記飛行時間型質量分析装置に適用することにより、可溶化剤を大量に含む試料に対しても、効率的に分析物分子をイオン化でき、高感度の検出が可能な質量分析を実現することが可能になる。
【００８２】
すなわち、本発明のレーザイオン化質量分析装置は、上述のレーザイオン化装置と、当該イオン化装置にてイオン化された分析物分子を加速させるイオン化分析物加速手段と、上記イオン化分析物加速手段にて加速されたイオン化分析物分子の飛行に要する時間を分析する飛行時間分析手段とを備えている。
【００８３】
上記イオン化分析物加速手段より加速されたイオン化分析物分子は、その質量電荷比（質量（ｍ）／電荷数（ｚ））ごとに、異なる飛行時間を要する。飛行時間分析手段が、この異なる飛行時間を分析する。すなわち、上記飛行時間分析手段が、この飛行時間に基づいて、分析物分子の質量電荷比を計測することにより、質量スペクトルが得られる。
【００８４】
以下、本発明のレーザイオン化質量分析装置（飛行時間型質量分析装置）の具体的な構成について、図４を参照して説明する。
【００８５】
図４に示すように、本発明のレーザイオン化質量分析装置１０２は、上述のレーザイオン化装置１００と、イオン化分析物加速手段として機能するイオン化分析物加速部２８と、飛行管２５と、飛行時間分析手段として機能する飛行時間分析部２９とを備えている。レーザイオン化装置１００は、上述の説明と同様であるため、同一の部材番号を付し、その説明を省略する。また、図面を明確にするために、図４において、レーザイオン化装置１００の構成である制御部１５を省略している。
【００８６】
上記イオン化分析物加速部２８は、グリット２３とアース電位電極２４とを備えている。上記イオン化分析物加速部２８において、グリット２３に所定の高電圧パルスを与えることにより、レーザイオン化装置１００にてイオン化された分析物分子は、試料面に対して法線方向に加速する。このように加速化されたイオン化分析物分子は、グリット２３とアース電位電極２４との間で再加速され、飛行管２５に導入される。
【００８７】
飛行管２５内は、場が存在しない領域である。それゆえ、飛行管２５に導入されたイオン化分析物分子は、慣性運動する間に質量分離し、飛行時間分析部２９に導入される。飛行時間分析部２９には、ＭＣＰ検出器２６と、リフレクトロンモード操作においてイオンの飛行方向を反転させるイオンミラー電極群２７とが配置されている。飛行時間分析部２９に導入されたイオン化分析物分子は、質量電荷比ごとに異なる時刻にＭＣＰ検出器２６に到達する。そして、ＭＣＰ検出器２６にて、イオン化された分析物分子は、イオン信号として検出される。
【００８８】
その結果、本発明のレーザイオン化質量分析装置１０２では、イオン化された分析物分子の質量電荷比（質量（ｍ）／電荷数（ｚ））ごとに異なる時刻にイオン信号が検出される。このイオン信号の相対強度を時系列的に計測することで、質量スペクトルが得られる。
【００８９】
本発明のレーザイオン化質量分析装置１０２では、レーザイオン化装置１００にて効率よく分析物分子がイオン化されているので、可溶化剤を多く含む試料を用いても高感度の分析を行うことができ、高感度の質量分析を実現できる。
【００９０】
本発明のレーザイオン化質量分析装置の用途としては、特に限定されるものではないが、特に不溶性タンパク質の質量分析のために使用されることが好ましい。上記「不溶性タンパク質」とは、水などの極性溶媒に溶解しないタンパク質のことをいう。
【００９１】
従来のタンパク質の質量分析、特にＭＡＬＤＩを用いた質量分析では、水溶性タンパク質に対して十分な感度で検出可能であった。しかしながら、水溶性でない、すなわち水に不溶性のタンパク質に対しては、そのタンパク質の可溶化剤が、タンパク質のイオン化・気化を阻害するため、十分な検出感度で質量分析を行なうことができなかった。それゆえ、不溶性タンパク質の質量分析は、困難であり、標準化することができなかった。
【００９２】
一方、本発明のレーザイオン化質量分析装置では、上述のように、可溶化剤を励起状態にするために、可溶化剤励起用レーザパルス光を照射しているので、効率的にタンパク質をイオン化・気化することができ、十分な検出感度で質量分析を行なうことが可能になる。
【００９３】
例えば、後述の実施例２に示すように、不溶性タンパク質であるケラチン（可溶化剤として濃度８Ｍの尿素を使用）について、本発明のレーザイオン化質量分析装置で質量分析を行なった結果、ユビキチンの質量電荷比に相当するピークが高感度で検出され、感度の良好な質量スペクトルが得られた。
【００９４】
（３）本発明のレーザイオン化方法
本発明のレーザイオン化方法は、少なくともマトリックス化合物、分析物、該マトリックス化合物及び分析物以外の副物質を含む試料中の分析物をイオン化するレーザイオン化方法であって、上記マトリックス化合物に吸収されるマトリックス励起用レーザを照射するマトリックスレーザ照射工程と、上記副物質に吸収される副物質励起用レーザを照射する副物質レーザ照射工程と、を有することを特徴としている。
【００９５】
ここでいう「レーザイオン化方法」とは、上述のレーザイオン化装置を用いて、分析物分子を気化しイオン化する方法のことをいう。
【００９６】
上記マトリックスレーザ照射工程にて、試料にマトリックス励起用レーザを照射するのに加え、本発明では、上記副物質レーザ照射工程にて、副物質励起用レーザパルス光を試料に照射している。
【００９７】
これにより、試料内部で励起状態のマトリックス化合物と励起状態の副物質とが共存した状態を実現することができる。それゆえ、マトリックス化合物分子内部へのエネルギーの蓄積が、副物質により阻害されることなく進行し、分析物のイオン化に必要な熱的臨界条件を達成する。その結果、副物質が大量に存在する条件下でも、効率的に、分析物分子をイオン化することができ、気相中に出現させることが可能になる。
【００９８】
（４）本発明のレーザイオン化質量分析方法
本発明のレーザイオン化質量分析方法は、上記レーザイオン化方法と、上記イオン化方法にてイオン化された分析物分子を加速させるイオン化分析物加速工程と、上記イオン化分析物加速工程にて加速されたイオン化された分析物分子の飛行に要する時間を分析する飛行時間分析工程とを有することを特徴としている。
【００９９】
ここでいう「レーザイオン化質量分析方法」とは、レーザ照射により試料をイオン化して気相中に出現させ、それを質量（ｍ）／電荷数（ｚ）で分離・分析する方法のことをいう。
【０１００】
上記イオン化分析物加速過程で、上述のレーザイオン化方法にてイオン化された分析物分子を加速させる。そして、上記飛行時間分析工程で、加速されたイオン化された分析物分子の飛行時間を分析する。すなわち、上記飛行時間分析工程で、この飛行時間に基づいて、分析物分子の質量電荷比を計測することにより、質量スペクトルが得られる。
【０１０１】
これにより、副物質を大量に含む試料に対しても、効率的に分析物分子をイオン化でき、高感度の検出が可能な質量分析を実現することが可能になる。
【０１０２】
また、本発明のレーザイオン化質量分析方法に適用しうる分析物としては、特に限定されない。例えば、レーザイオン化装置の欄でも説明したように、ペプチド、タンパク質、核酸、糖鎖等の生体分子、または、合成ポリマーが挙げられる。特に、分析物として、不溶性タンパク質が好適である。
【０１０３】
生物の染色体上の遺伝子がコードするタンパク質の中には、水などの極性溶媒に対して不溶性を示すタンパク質が数多く存在する。このような水不溶性のタンパク質は、染色体上の遺伝子がコードするタンパク質の約１／３を占めることが知られている。
【０１０４】
また、このような水不溶性のタンパク質の中には、細胞膜タンパク質、疾病原因に関わるタンパク質、情報伝達に関わるタンパク質などの、生命上重要な機能を有するタンパク質が存在する。
【０１０５】
本発明のレーザイオン化質量分析方法では、不溶性タンパク質が可溶化剤にて溶解された場合であっても、効率的にタンパク質分子をイオン化でき、高感度の検出が可能な質量分析を実現することが可能になる。それゆえ、本発明のレーザイオン化方法で、このような不溶性タンパク質の質量分析を行なうことは、生物学的に非常に有用な知見が得られると期待できる。また、本発明のレーザイオン化質量分析方法は、上記のような学術的な用途に限られず、例えば、創薬産業においても利用することができる。
【０１０６】
また、本発明のレーザイオン化質量分析方法には、２種類のレーザパルス光の照射により試料から引き出されたイオンの質量を求める方法であって、上記試料は、不溶性タンパク質と、マトリックス励起用レーザパルス光を吸収するマトリックス化合物と、可溶化剤励起用レーザパルス光を吸収する可溶化剤とを含み、マトリックス励起用レーザパルス光と可溶化剤励起用レーザパルス光とを試料の同一領域に照射するものが含まれてもよい。
【０１０７】
また、その際、上記マトリックス励起用レーザパルス光は、紫外レーザであることが好ましい。上記可溶化剤励起用レーザパルス光は、中赤外レーザであることが好ましい。また、上記マトリックス励起用レーザパルス光の照射開始時刻と、上記可溶化剤励起用レーザパルス光の照射開始時刻との間の時間差を調節できることが好ましい。
【０１０８】
また、本発明のレーザイオン化質量分析装置には、上述のレーザイオン化装置と分析部とを備えたレーザイオン化質量分析装置であって、上記分析部が、飛行時間型分光部であるものも含まれてもよい。
【０１０９】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１０】
〔実施例１〕
本実施例では、本発明のレーザイオン化装置を用いて、水溶性タンパク質であるユビキチンの質量分析を行なった。
【０１１１】
まず、本実施例で用いるレーザイオン化質量分析装置について、説明する。本実施例では、レーザイオン化質量分析装置として、Applied Biosystem社製のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ(Voyager DE Pro)を改造したものを用いた。具体的には、図４に記載の構成のレーザイオン化質量分析装置を用いた。
【０１１２】
なお、本実施例では、図４のレーザイオン化質量分析装置のマトリックスレーザパルス光照射部１１において、マトリックス励起用レーザパルス光源３としてはＵＶレーザ装置である窒素レーザを、集光レンズ４としては石英レンズを、真空窓５としては石英真空窓を用いた。また、可溶化剤レーザパルス光照射部１２においては、可溶化剤励起用レーザパルス光源６として自由自由電子レーザ装置（ＦＥＬ）を用いて、波長を波長領域５．５〜７．０μｍの間の可変波長とした。また、集光レンズ７としてＺｎＳｅレンズを、真空窓８としてＣａＦ２真空窓を用いた。
【０１１３】
さらに、可溶化剤励起用レーザパルス光は、試料台１の水平面に対して４５°の入射角で照射した。そして、試料表面での可溶化剤励起用レーザパルス光の照射スポット（照射領域）は、直径約５００μｍであり、パルス照射強度は４．５×１０８Ｗ／ｃｍ２である。
【０１１４】
また、マトリックス励起用レーザパルス光は、試料台１の水平面に対して入射角４５°、可溶化剤励起用レーザパルス光に対して方位角９０°の方向から照射した。そして、試料表面でのマトリックス剤励起用レーザパルス光の照射スポット（照射領域）は、直径約１００μｍであり、パルス照射強度は５．０×１０８Ｗ／ｃｍ２である。
【０１１５】
マトリックス励起用レーザパルス光の照射スポットが、可溶化剤励起用レーザパルス光の照射スポットの中に収まるように、ＣＣＤカメラ１４による観察及び感熱フィルムにより光軸を調整した。また、可溶化剤励起用レーザパルス光の照射とマトリックス励起用レーザパルス光の照射の同期を得るために、可溶化剤励起用レーザパルス光を光路の途中で分割し、ＭＣＴ赤外検出器（Vigo System社製、R005）で、可溶化剤励起用レーザパルス光のパルスを電気信号に変換し、これを遅延パルス発生器（Stanford Research Systems社製、ＤＧ535）１０に入力して、５μｓの遅れ時間を加えた後、マトリックス励起用レーザパルス光源３のトリガーソースとした。
【０１１６】
イオン化された分析物分子の引き出しは、図４のレーザイオン化質量分析装置において、試料台１と、当該試料台１からＭＣＰ検出器２６側に約２ｍｍに配置されたグリット２３との間に、所定の高電圧パルスを付与することにより行なった。試料台１とグリット２３との間に、マトリックス励起用レーザパルス光照射後１００〜１０００ｎｓ遅れて、約１８ｋＶの電圧を印加し、試料台１の法線方向にイオン化された分析物分子を加速させた。
【０１１７】
さらに、グリット２３とアース電位電極２４との間で、イオン化された分析物分子は再加速する。そして、このイオン化された分析物分子は、２０ｋＶの併進運動エネルギーを得て、飛行管２５に導入される。そして、飛行時間分析部２９に到達する。
【０１１８】
飛行時間分析部２９には、ＭＣＰ検出器２６が配置されている。ＭＣＰ検出器２６によるイオン信号の記録及び解析には、Applied Biosystems社製のデータシステムを用いた。
【０１１９】
上述のレーザイオン化質量分析装置を用いて、水溶性タンパク質であるユビキチンの質量分析を行なった。なお、ユビキチンを分析物とし、可溶化剤である濃度８Ｍの尿素を敢えて、マトリックス化合物のα-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)と混合させたものを試料とした。図５に、本発明のレーザイオン化装置を用いて、ユビキチンの質量分析を行なった結果得られた質量スペクトルを示す。図５（ａ）が、ＵＶレーザのみを用いる従来のレーザイオン化質量分析装置で、質量分析を行なった場合の質量スペクトルである。また、図５（ｂ）は、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いて、質量分析を行なった場合の質量スペクトルである。
【０１２０】
なお、本実施例では、試料台１におけるレーザパルス光の照射位置に依存した質量スペクトルの変動の影響を受けないように、質量分析は、同一の照射位置に対して、従来のレーザイオン化質量分析、本発明のレーザイオン化質量分析の順で行なった。
【０１２１】
図５に示すように、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いることにより、可溶化剤である８Ｍ尿素の阻害作用が抑えられ、ユビキチンの検出感度が顕著に改善できた。尿素の吸収波長帯にあたる６．３μｍの波長において、従来のレーザイオン化質量分析装置を用いた場合に比べ、約４００倍の信号雑音比を達成できた。
〔実施例２〕
本実施例では、上記実施例１と同様の条件で、不溶性タンパク質であるケラチンの質量分析を行なった。ケラチンに濃度８Ｍの尿素を加えて可溶化し、マトリックス化合物の3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acidと混合させたものを試料とした。その結果を図６に示す。図６（ａ）が、ＵＶレーザのみを用いる従来のレーザイオン化質量分析装置で、質量分析を行なった場合の質量スペクトルである。また、図６（ｂ）は、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いて、質量分析を行なった場合の質量スペクトルである。
【０１２２】
図６に示すように、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いることにより、可溶化剤である８Ｍ尿素の阻害作用が抑えられ、ケラチンの検出感度が顕著に改善できた。尿素の吸収波長帯にあたる５．８μｍの波長において、従来のレーザイオン化質量分析装置を用いた場合に比べ、約１，０００倍の信号雑音比を達成できた。
〔実施例３〕
本実施例では、上記実施例１と同様の条件で、水溶性タンパク質であるアルブミンの質量分析を行なった。アルブミンに濃度８Ｍの尿素を敢えて加え、マトリックス化合物の3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acidと混合させたものを試料とした。その結果を図７に示す。図７（ａ）が、ＵＶレーザのみを用いる従来のレーザイオン化質量分析装置で、質量分析を行なった場合の質量スペクトルである。また、図７（ｂ）は、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いて、質量分析を行なった場合の質量スペクトルである。
【０１２３】
図７に示すように、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いることにより、可溶化剤である８Ｍ尿素の阻害作用が抑えられ、アルブミンの検出感度が顕著に改善できた。尿素の吸収波長帯にあたる６．１μｍの波長において、従来のレーザイオン化質量分析装置を用いた場合に比べ、約１００倍の信号雑音比を達成できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明のレーザイオン化装置は、不溶性タンパク質が可溶化剤にて溶解された場合であっても、効率的にタンパク質分子を気化、イオン化できるという利点を有している。それゆえ、本発明のレーザイオン化装置を質量分析装置に適用することにより、高感度の検出が可能な質量分析を実現する。したがって、本発明のレーザイオン化装置は、生物学、タンパク質化学等の学術的分野のみならず、創薬産業に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、本発明のレーザイオン化装置による分析物分子のイオン化の原理を示す説明図である。
【図２】本発明のレーザイオン化装置の概略構成を示す模式図である。
【図３】自由電子レーザ装置の概略構成を示す斜視図である。
【図４】本発明のレーザイオン化質量分析装置の概略構成を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明のレーザイオン化装置を用いて、ユビキチンの質量分析を行なった結果得られた質量スペクトルを示すグラフであり、（ａ）が、ＵＶレーザのみを用いる従来のレーザイオン化質量分析装置で、質量分析を行なった場合、（ｂ）は、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いて、質量分析を行なった場合である。
【図６】図６は、本発明のレーザイオン化装置を用いて、ケラチンの質量分析を行なった結果得られた質量スペクトルを示すグラフであり、（ａ）が、ＵＶレーザのみを用いる従来のレーザイオン化質量分析装置で、質量分析を行なった場合、（ｂ）は、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いて、質量分析を行なった場合である。
【図７】図７は、本発明のレーザイオン化装置を用いて、アルブミンの質量分析を行なった結果得られた質量スペクトルを示すグラフであり、（ａ）が、ＵＶレーザのみを用いる従来のレーザイオン化質量分析装置で、質量分析を行なった場合、（ｂ）は、本発明のレーザイオン化質量分析装置を用いて、質量分析を行なった場合である。
【符号の説明】
【０１２６】
１１    マトリックスレーザパルス光照射部（第１レーザ照射手段）
１２    可溶化剤レーザパルス光照射部（第２レーザ照射手段）
１３    マトリックス／可溶化剤レーザパルス光照射調節部（第１／第２レーザ照射調節手段）
１４    ＣＣＤカメラ（照射領域制御手段）
１５    制御部（照射領域制御手段）
２５    飛行管
２８    イオン化分析物加速部（イオン化分析物加速手段）
２９    飛行時間分析部（飛行時間分析手段）
１００  レーザイオン化装置
１０１  自由電子レーザ装置（自由電子レーザ光照射手段）
１０２  レーザイオン化質量分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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