(57)【要約】【課題】  新規なヘムオキシゲナーゼ誘導剤または誘導促進剤を提供すること。【解決手段】  一般式（１）2005350364.tif 000033[式中、R1は炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいヘテロ芳香環、または一般式（１ａ）または一般式（１ｂ）を表し、R2は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルコキシル基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を表し、Aは−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−を表す]で示されるプロリン誘導体、およびそれを有効成分として含有するヘムオキシゲナーゼの誘導剤または誘導促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
2005350364.tif 000029
[式中、R1は炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいヘテロ芳香環、または一般式（１ａ）
2005350364.tif 000030
（式中Ｘは−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨ−、または−ＣＨ２−を表し、Ｑは置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいヘテロ芳香環）、または一般式（１ｂ）
2005350364.tif 000031
（式中Ｒａ、Ｒｂは同一または相異なって、ハロゲン原子、炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシル基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を表す）を表し、R2は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルコキシル基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を表し、Aは−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−を表す]で示されるプロリン誘導体。
【請求項２】
一般式（２）
2005350364.tif 000032
[式中、R1は一般式（１）の場合に同じ]で示される請求項１記載のプロリン誘導体。
【請求項３】
請求項１で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する、ヘムオキシゲナーゼの誘導剤または誘導促進剤。
【請求項４】
請求項１で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する急性肺傷害（ALI, ARDS）治療剤。
【請求項５】
請求項１で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する、慢性閉塞性肺疾患（COPD）治療剤。
【請求項６】
請求項１で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する喘息治療剤。
【請求項７】
請求項１で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する移植臓器の保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムオキシゲナーゼの誘導剤または誘導促進剤に関し、詳細には下記一般式（１）
2005350364.tif 000002
で示されるプロリン誘導体およびこれらプロリン誘導体のうち少なくとも一つを有効成分とするヘムオキシゲナーゼの誘導剤または誘導促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘムオキシゲナーゼ（以下 HOと略す）は、ヘムの代謝における第一段階で働く律速酵素であり、細胞内遊離へムを一酸化炭素（CO）、鉄、ビリベルジンに分解する酵素である。ビリベルジンはさらにビリベルジン還元酵素によりビリルビンに変換される。HOにはHO-1、HO-2及びHO-3の３つのアイソザイムが知られている。HO-1は誘導型の酵素であり、酸化ストレス、熱ショック、サイトカイン、金属ポルフィリン、重金属、生体異物、ホルモンなどの広範囲な化合物や病的状態により誘導され、細胞内ヘムの恒常性、ヘム蛋白の維持および鉄の再利用に重要な役割を果たしていると考えられている。また、HO-1は哺乳類の組織に広く存在するが、炎症や虚血再還流時の酸化的ストレス部位で誘導されることが知られている。さらに種々の炎症モデルでの検討から、HO-1の誘導は細胞障害に対する内因性の防御機構の一部と考えられている。HOにより生じたビリベルジン、ビリルビンは抗酸化、抗補体作用を有し、COは細胞内伝達物質として、鉄は遺伝子調節因子としての機能を有することから、これらが防御作用に関与していることが考えられている。
HO-2は非誘導型の酵素であり、特に脳、精巣に多く存在し、グルココルチコイド以外には誘導されることがないとされている。
HO-3は構造的にHO-2と関連するが、詳細については明らかにされていない。触媒としての活性は比較的弱く、ヘム同士の結合に関与すると考えられている。
HO-1の誘導と病態との関連性については、幾つかの報告がされている。HO-1誘導剤である鉄プロトポルフィリンによりHO-1を誘導しておくと、カラゲニンによる胸膜炎モデルでは胸水量、胸水中の炎症細胞数増加が抑制される。これに対しHO阻害薬であるスズプロトポルフィリンの投与により炎症反応が増悪することが報告されている（非特許文献１）。オゾン暴露による気道炎症マウスモデルにおいてHO-1の過剰発現は気道への好中球浸潤を抑制し、気道過敏症を改善させることが報告されている（非特許文献２）。また、遺伝的にHO-1の発現能が低いヒトが慢性閉塞性肺疾患(以下COPDと略す)になりやすいという疫学調査結果が報告されている（非特許文献３）。マウスでの喘息モデルではHO-1の誘導により、好酸球数の増加が抑制されることも報告されている（非特許文献４）。更に、高酸素負荷時（非特許文献５）や心臓移植（非特許文献６）、脳血管攣縮時（非特許文献７）においてもHO-1の発現は組織防御的に作用し、生体にとって有利に働いていることが報告されている。
【０００３】
また、近年ヒトでの世界初症例となる先天的HO-1欠損症の報告がなされた（非特許文献８）。患者は２歳ごろより持続する発熱、肝肥大、関節痛、発疹、溶血性貧血、凝固線溶系の異常など多彩な臨床症状を示し、６歳時に高血圧と頭蓋内出血を合併して死亡したと報告されている。一方、PossらはHO-1ノックアウトマウスを作製し解析を行った（非特許文献９）。HO-1ノックアウトマウスでは鉄の再利用障害による貧血、組織への鉄の沈着、成長障害などが認められた。また、このマウスでは胎児死亡率が極めて高く、感染ストレスに対する抵抗性も著明に低下していると考えられた。これらの情報よりHO-1は生体防御に重要な役割を演じており、この欠損は酸化ストレスのみならず生体の防御機構不全を引き起こし、種々の合併症を生じるものと想定されている。
【０００４】
ところでプロリン誘導体がHO-1を誘導するとの報告はこれまでになされていない。HO-1の誘導を示す化合物としてはレミノプラゾール（特許文献１）、ニコチンアミド誘導体（特許文献２）及びプロスタグランジンAやそのアゴニスト、ビタミンB12、ヘミンやそのフラグメントとアナログ（特許文献３）が特許として、ピリジン誘導体及びイミダゾール誘導体が文献として報告されている（非特許文献１０）が、何れも本発明のプロリン誘導体とは構造が異なる。
また、プロリン誘導体としてはトロンビン阻害剤（特許文献４）、セリンプロテアーゼ阻害剤（特許文献５）、Ｂａｘ阻害剤（特許文献６）、駆虫薬（特許文献７）などが知られているが、HO-1の活性化に関する報告は全くなされておらず、本発明構造とは異なる。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１１９１８２
【特許文献２】WO 0168094
【特許文献３】WO 9609038
【特許文献４】WO 2002050056
【特許文献５】WO 2002022575
【特許文献６】WO 2001074769
【特許文献７】WO 2001054498
【非特許文献１】Willis, D, et al : Nature Medicine 2, 87-90(1996)
【非特許文献２】Hisada, T, et al : Eur. J. Pharmacol., 399, 229-234(2000)
【非特許文献３】Yamada, N. et al : Am. J. Hum. Genet., 66, 187-195(2000)
【非特許文献４】Suzuki, M. et al : 呼吸, 19巻, 2号, S37-S38(2000)
【非特許文献５】Otterbein L. E. et al : J. Clin. Invest., 103, 1047-1054(1999)
【非特許文献６】Coito, A. J. et al : Lab. Invest., 82, 61-70(2002)
【非特許文献７】Tunoda, H. et al : 日薬理誌  114, Suppl1, 55-59(1999)
【非特許文献８】Yachie, A. et al : J. Clin. Invest., 103, 129-135(1999)
【非特許文献９】Poss, K. D. et al : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10919-10924(1997)
【非特許文献１０】Kobayashi, Y, et al : Jpn. J. Toxicol. Environ. Health. 42, 468-478(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規なHO誘導剤または誘導促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
１）  一般式（１）
2005350364.tif 000003
[式中、R1は炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいヘテロ芳香環、または一般式（１ａ）
2005350364.tif 000004
（式中Ｘは−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨ−、または−ＣＨ２−を表し、Ｑは置換基を有していてもよいフェニル基または置換基を有していてもよいヘテロ芳香環）、または一般式（１ｂ）
【化３】
2005350364.tif 000005
（式中Ｒａ、Ｒｂは同一または相異なって、ハロゲン原子、炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数１〜４の低級アルコキシル基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を表す）を表し、R2は水素原子、ハロゲン原子、炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルコキシル基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基を表し、Aは−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−を表す]で示されるプロリン誘導体、
２）  一般式（２）
2005350364.tif 000006
[式中、R1は一般式（１）に同じ]で示される１）記載のプロリン誘導体、
３）  １）で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する、ヘムオキシゲナーゼの誘導剤または誘導促進剤、
４）  １）で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する急性肺傷害（ALI, ARDS）治療剤、
５）  １）で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する、慢性閉塞性肺疾患（COPD）治療剤、
６）１）で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する喘息治療剤、
７）  １）で示されるプロリン誘導体のうち、少なくとも一種類を有効成分として含有する移植臓器の保護剤、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
一般式（１）
2005350364.tif 000007
[式中、R1, R2, Aは上述の通り]で示される本発明のプロリン誘導体はHO-1 mRNAの誘導を介してHO活性を上昇させていることが判明したので、HOの誘導剤または誘導促進剤として有用であり、様々な疾患の治療剤として、例えば急性肺傷害治療剤、慢性閉塞性肺疾患治療剤、喘息治療剤、移植臓器の保護剤などとして、様々な酸化的ストレスに対する生体防御剤としての有用性が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
一般式（１）において、「置換基を有していてもよいフェニル基」、「置換基を有していてもよいヘテロ芳香環」における「置換基」とは、ハロゲン原子、炭素数1〜４の低級アルキル基、炭素数1〜４の低級アルコキシル基、トリフルオロメチル基またはトリフルオロメトキシ基等が挙げられ、「ハロゲン原子」とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を表し、「炭素数1〜4の低級アルキル基」とは、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基などの直鎖または分枝した炭素数1〜４のアルキル基を表し、「炭素数1〜4の低級アルコキシル基」とは、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソピロポキシ基、ブトキシ基などの直鎖または分枝したアルコキシ基を表し、「ヘテロ芳香環」とは、５員もしくは６員の窒素、酸素または硫黄原子を含む複素環およびその縮合環を表し、たとえばピリジル基、インドリル基、キノリル基等が挙げられる。
本発明で包含される化合物は例えば以下の方法により製造することができる。
【００１０】
＜スキーム１＞
2005350364.tif 000008
スキーム１で構造式（４）
2005350364.tif 000009
で表される化合物は、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル（Ｎ−ＢＯＣ）プロリン（３）とＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンより製造することができる（工程１）。
工程１の反応は、トリエチルアミン、ピリジン等の塩基の存在下、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や１−[３−（ジメチルアミノ）プロピル]−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等の縮合剤を用い、ＤＭＦやＴＨＦなどの有機溶媒中、０℃〜加熱還流、好適には常温にて行うことができる。
スキーム１で構造式（５）
2005350364.tif 000010
で表される化合物は、化合物（４）とフェニルビニルリチウムまたはフェニルビニルマグネシウムブロミド等のビニル化剤により製造することができる（工程２）。
工程２の反応は、βブロモスチレンとブチルリチウムやマグネシウムなどから調製したビニル化剤を、ＴＨＦ、エーテル等の有機溶媒中、−７８℃〜常温、好適には−７８℃で行うことができる。
スキーム１で構造式（６）
2005350364.tif 000011
で表される化合物は、構造式（５）で表される化合物を脱保護することにより製造することができる(工程３)。
工程３の反応は、塩酸やトリフルオロ酢酸などの酸の存在下、塩化メチレンや酢酸エチルなどの有機溶媒中、−２０℃〜加熱還流、好適には常温にて行うことができる。
スキーム１で一般式（１−２）
2005350364.tif 000012
[式中R1は上述の通り]で表される化合物は、化合物（６）で表される化合物と一般式（７）
2005350364.tif 000013
[式中R1は上述の通り]で表される化合物か、または一般式（８）
2005350364.tif 000014
[式中R1は上述の通り]で表される化合物を反応させることにより、製造することができる（工程４）。
工程４の反応は、化合物（７）を用いた場合には、ＤＣＣやＥＤＣなどの縮合剤を用い、塩化メチレンやＴＨＦなどの有機溶媒中、０℃〜加熱還流、好適には常温にて行うことができる。また、化合物（８）を用いた場合には、トリエチルアミンまたはピリジン等の塩基の存在下、塩化メチレンやＴＨＦを溶媒とし、０℃〜加熱還流、好適には常温にて行うことができる。
次に、一般式（１）で表される化合物のうち、R2が水素かつAが-CH2CH2-である一般式（１−３）
2005350364.tif 000015
[式中R1は上述の通り]で表される化合物は、以下の方法で製造することができる。
【００１１】
＜スキーム２＞
2005350364.tif 000016
スキーム２で一般式（１−３）で表される化合物は、上述の一般式（１−２）で表される化合物を還元することによって、製造することができる(工程５)。
工程５の反応は、パラジウム−炭素等の触媒を用い、水素雰囲気下、メタノールや酢酸エチルなどの有機溶媒中、常温〜加熱還流、好適には常温にて行うことができる。
【実施例】
【００１２】
次に本発明を具体例によって説明するがこれらの例によって本発明が限定されるものではない。
【００１３】
＜参考例１＞
（２Ｓ）−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシカルバモイル）ピロリジン
2005350364.tif 000017
Ｎ−BOC-Ｌ−プロリン(1.0 g,  4.65 mmol) をテトラヒドロフラン(30 mL) に溶解し、氷冷した。トリエチルアミン (0.7 mL)、N,O-ジメチルヒドロキシルアミン・塩酸塩  (460 mg, 4.72 mmol)、EDC (910 mg)を加え、室温で3時間撹拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。  硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、濾液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル:メタノール=10:1 v/v) で精製し、無色油状物 の目的物(390 mg, 32 %)を得た。
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.36 (9H, s), 1.72-1.88 (3H, m), 2.18 (1H, s), 3.11 (3H, s), 3.32-3.38 (2H, m), 3.70 (3H, s), 4.58 (1H, d, J = 6.7 Hz)
【００１４】
＜参考例２＞
（２Ｓ）−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−シンナモイルピロリジン
2005350364.tif 000018
アルゴン雰囲気下、β-ブロモスチレン (380 mg, 1.47 mmol) をテトラヒドロフラン(20 mL) に溶解し、-78℃に冷却した。溶液に、1.51 mol/L t-ブチルリチウムのペンタン溶液 (9.7 mL, 14.6 mmol) を加え、-78℃で1時間撹拌した。テトラヒドロフランに溶解した参考例１の化合物(380 mg, 1.47 mmol) を加えさらに-78℃で3時間撹拌した。溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、室温で10分撹拌し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、濾液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル=3:2 v/v) で精製し、黄色油状物 の目的物(310 mg, 70 %) を得た。(回転異性体の混合物)
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.36 (9H, s, major), 1.48 (9H, s, minor), 1.87-1.98 (3H, m), 2.17-2.32 (1H, m), 3.43-3.66 (2H, m), 4.45 (1H, dd, J = 8.6, 4.9 Hz, major), 4.69 (1H, dd, J = 8.6, 3.7 Hz, minor), 6.86 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.37-7.43 (3H, m), 7.52-7.59 (2H, m), 7.69 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.71 (1H, d, J = 15.9 Hz).
【００１５】
＜参考例３＞
（２Ｓ）−２−シンナモイルピロリジン
2005350364.tif 000019
参考例２の化合物 (310 mg, 1.03 mmol) をジクロロメタン (6 mL) に溶解した。  氷冷し、トリフルオロ酢酸 (2.0 mL) を加え、30分撹拌後、室温で４時間撹拌した後、濃縮して目的物を得た。本化合物はそのまま次の反応に用いた。
【００１６】
＜参考例４＞
（２Ｒ）−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メトキシカルバモイル）ピロリジン
【化３７】
2005350364.tif 000020
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−プロリンを用い、参考例１と同様の方法で合成した。
収率 28 %
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.42 (9H, s), 1.46 (9H, s), 1.80-2.02 (4H, m), 2.10-2.26 (2H, m), 3.20 (3H, s), 3.36-3.65 (3H, m), 3.72 (3H, s), 3.79 (3H, s), 4.60 (1H, dd, J = 8.6, 3.7 Hz), 4.71 (1H, dd, J = 8.6, 3.7 Hz).
【００１７】
＜参考例５＞
（２Ｒ）−１−ｔ−ブトキシカルボニル−２−シンナモイルピロリジン
2005350364.tif 000021
参考例４の化合物を用い、参考例２と同様の方法で合成した。
収率 22 %
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.36 (9H, s), 1.48 (9H, s), 1.85-1.98 (3H, m), 2.17-2.31 (1H, m), 3.41-3.65 (2H, m), 4.33 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.45 (2H, d, J = 5.5 Hz), 6.56-6.66 (1H, m), 6.86 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.18-7.25 (3H, m), 7.28-7.42 (8H, m), 7.51-7.59 (2H, m), 7.69 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.71 (1H, d, J = 15.9 Hz).
【００１８】
＜参考例６＞
（２Ｒ）−２−シンナモイルピロリジン
2005350364.tif 000022
参考例５の化合物を用い、参考例３と同様の方法で合成した。本化合物はそのまま次の反応に用いた。
【００１９】
＜実施例１＞
（２Ｓ）−２−シンナモイル−１−（２，２−ジフェニルアセチル）ピロリジン
2005350364.tif 000023
ジフェニル酢酸 (300 mg, 1.41 mmol) を塩化チオニル (2.0 mL)に溶解し、触媒量のDMFを加え、室温で15分間撹拌した。過剰の塩化チオニルを減圧下で留去し、残渣をジクロロメタン (10 mL) に溶解した。参考例２の化合物(310mg)から調製した参考例３の化合物 とトリエチルアミン (1.0 mL) を加え、室温で1.5 時間撹拌した。溶液を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を3.0 mol/L塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル=1:1 v/v) で精製し、黄色油状物の目的物 (320 mg, 79 % 2steps)を得た。 （回転異性体の混合物）
高分解能質量分析(EI); 計算値 (C27H25NO2): 395.1885, 実測値: 395.1883
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.86-2.29 (5H, m), 3.59-3.68 (2H, m, major), 3.79 (0.1H, t, J = 7.3 Hz, minor), 4.59 (0.1H, dd, J = 9.2, 3.7 Hz, minor), 4.75 (0.1H, s, minor), 4.96 (1H, dd, J = 9.2, 4.3 Hz, major), 5.16 (1H, s, major), 6.81 (1H, d, J = 16.5 Hz), 7.08-7.45 (13H, m), 7.47-7.55 (2H, m), 7.69 (1H, dd, J = 15.9, 9.2 Hz) 
【００２０】
＜実施例２＞
（２Ｓ）−２−シンナモイル−１−アセチルピロリジン
2005350364.tif 000024
参考例３の化合物 (220 mg, 0.47 mmol) をジクロロメタン (4 mL) に溶解し、アセチルクロライド (100 mg)、 トリエチルアミン (0.6 mL) を加え、室温で2時間撹拌した。水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を 3.0 mol/L塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥、濾過後、濾液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル:メタノール=10:1 v/v) で精製し、ヘキサン-酢酸エチルで再結晶し、白色粉末の目的物 (48 mg,  18 %) を得た。（回転異性体の混合物）
高分解能質量分析(CI); 計算値 (C15H18NO2): 244.1338, 実測値: 244.1333
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.96-2.10 (3H, m), 2.13 (3H, s), 2.44-2.22 (1H, m), 3.56 (1H, dt, J = 9.8, 8.3 Hz), 3.67-3.75 (1H, m), 4.61+4.93  (1H, dd, J = 9.2, 4.3 Hz), 6.84 + 6.86 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.38-7.44 (3H, m), 7.54-7.60 (2H, m), 7.69+7.77  (1H, d, J = 15.9 Hz)   
【００２１】
＜実施例３＞
（２Ｒ）−２−シンナモイル−１−（２，２−ジフェニルアセチル）ピロリジン
2005350364.tif 000025
参考例５の化合物(70mg, 0.23mmol)から調製した参考例６の化合物を用い、実施例１と同様な方法で合成した。
収率 30 %   （2工程）
高分解能質量分析(FAB); 計算値 (C27H26NO2): 396.1964, 実測値: 396.1940
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.90-2.03 (3H, m), 2.12-2.25 (1H, m), 3.62-3.67 (2H, m), 4.96 (1H, dd, J = 8.6, 3.7 Hz), 5.16 (1H, s), 6.81 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.10-7.43 (24H, m), 7.47-7.55 (2H, m), 7.67 (1H, d, J = 15.9 Hz), 7.70 (1H, d, J = 15.9 Hz).
【００２２】
＜実施例４＞
（２Ｓ）−２−（３−フェニルプロピオニル）−１−（２，２−ジフェニルアセチル）ピロリジン
2005350364.tif 000026
実施例１の化合物 (62 mg, 0.18 mmol) を酢酸エチルに溶解し、10% Pd/C (10 mg) を加え、水素雰囲気下、常圧、室温で5時間撹拌した。反応終了後、触媒をセライトを通して濾過し、濾液を濃縮した。 シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル=3:2 v/v)を用いて精製し、淡黄色油状物の目的物 (45 mg, 72 %) を得た。
高分解能質量分析(FAB); 計算値 (C27H28NO2): 398.2120, 実測値: 398.2120
1H-NMR (400MHz; CDCl3) δ: 1.62-1.71 (1H, m), 1.79-1.93 (2H, m), 1.94-2.07 (1H, m), 2.75-2.96 (4H, m), 3.48-3.59 (2H, m), 4.62 (1H, dd, J = 8.6, 4.9 Hz), 5.11 (1H, s), 7.10-7.34 (15H, m).
【００２３】
＜実験例１＞  ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）におけるHO活性の測定
HUVECは、2% ウシ胎児血清（FCS） を含むEB-2培地にて継代培養し、6〜9代のものを実験に使用した。HUVEC (1×105 cell/mL)  4.5mLを、コラーゲンタイプIコート6cmディッシュに播種しDMSOに溶解し、培地にて100倍希釈した試験化合物を0.5ml添加した。37℃ CO2インキュベーターにて3、8および24時間インキュベートした後、細胞を回収した。凍結融解により細胞を破壊し、蛋白定量を行い、60〜100μgをサンプルとした。
HO活性の測定はTaylor,JLらの方法（Am.J.Physiol. 274, L582-L590, 1998）に準じて行った。サンプルにラット肝上澄蛋白を2 mg、20 μM ヘミン、2mM グルコース6-ホスフェート、0.016 U/μL グルコース6-ホスフェート デハイドロゲナーゼ、0.8 mM ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド ホスフェート(NADPH)を含む反応液450μLを加え、攪拌した後、1時間反応させた。クロロホルムを700μL加え、良く攪拌した後、9000rpm、4℃にて5分間遠心し、下層（クロロホルム層）の吸光度（453nmおよび530nm）を測定した。453nmと530nmの吸光度差より、生成したビリルビン量を算出し、HO活性とした。
【００２４】
活性化比率は下記の計算式を用いて算出した。
【数１】
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実施例１の化合物の活性化比率は７．９３であった。
以上のように、一般式（１）で表される本発明の化合物はHO-1活性化作用を持つことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
一般式（１）
2005350364.tif 000028
[式中、R1, R2, Aは上述の通り]で示される本発明のプロリン誘導体は実験例１に示したようにヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた実験により、HOの誘導または誘導促進作用を有することは明らかになった。即ち、一般式（１）で示されるプロリン誘導体がHO-1のmRNAを上昇させることを示し、HO-1 mRNAの誘導を介してHO活性を上昇させていることが判明した。
従って本発明のプロリン誘導体はHOの誘導剤または誘導促進剤として有用であり、様々な疾患の治療剤として、例えば急性肺傷害治療剤、慢性閉塞性肺疾患治療剤、喘息治療剤、移植臓器の保護剤などとして、様々な酸化的ストレスに対する生体防御剤としての提供することができる。