(57)【要約】【課題】抗菌作用を有する薬剤の標的となりうるＦＦＲＰを特定し、これを利用した薬剤、特に抗緑膿菌作用を有する薬剤の新たなスクリーニング系を提供すること。【解決手段】細菌のゲノム情報を基に、既知のＦＦＲＰアミノ酸配列と図１に示される対応関係を利用して、該細菌のＦＦＲＰを特定する。特定されたＦＦＲＰまたはＦＦＲＰ会合体に特異的に結合し、その立体構造を変化させる化合物を候補薬剤として選択することにより、抗菌作用を有する薬剤をスクリーニングする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、抗菌作用を有する薬剤の標的蛋白質の特定方法：
１）対象とする細菌のゲノム情報から抽出した全ＯＲＦのアミノ酸配列データより、配列番号９〜３１のいずれか１で示されるＦＦＲＰアミノ酸配列と１次構造上２０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を選択する；
２）工程１で選択されたアミノ酸配列のうち、図１に示されるマルチプルアラインメントに対して、２次構造上対応がとれないアミノ酸配列を排除する；
３）上記工程１および工程２で得られたアミノ酸配列からなる蛋白質を抗菌作用を有する薬剤の標的蛋白質として特定する。
【請求項２】
配列番号９〜１１のいずれか１で示される大腸菌ＦＦＲＰアミノ酸配列との系統関係において、ブートストラップ値が９００／１０００以上のアミノ酸配列を排除する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程１において、
標的とする細菌のゲノム情報から抽出した全ＯＲＦのアミノ酸配列データより、配列番号９〜３１のいずれか１で示されるＦＦＲＰアミノ酸配列と、ＦＡＳＴＡプログラムによるＺスコアが１８０以上の相同性を有するアミノ酸配列を選択することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程２において、
工程１で選択されたアミノ酸配列より、図１に示されるマルチプルアラインメントに対して、３４〜４３、５９〜６６、７０〜８２、１２６〜１３５、および１７０〜１８０の位置に存在する５つのαヘリックス、ならびに９０〜９６、１０９〜１１７、１４２〜１４８、１５４〜１６０、および１９３〜２０５の位置に存在する５つのβストランドに対応する区画が、同様の２次構造を形成することが困難なアミノ酸配列を排除することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって選択された標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
以下のｉ）またはｉｉ）の標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法。
ｉ）  配列番号１〜８に示されるいずれか１のアミノ酸配列からなる蛋白質
ｉｉ）  配列番号１〜８に示されるいずれか１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＦＲＰ活性を有する緑膿菌由来の蛋白質
【請求項７】
配列番号１〜８に示されるいずれか１のアミノ酸配列で特定される標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
配列番号１〜７に示されるいずれか１のアミノ酸配列で特定される標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
図１に示される１１３、１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１６６、１６９、１７３、１７６、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および２０２に対応する標的蛋白質上の３２アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて、候補薬剤を選択することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
図１に示される１１３、１２６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１７６、１７７、１８１、１９６、１９７、１９８、１９９、および２０２の位置に対応する標的蛋白質上の１８アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて、候補薬剤を選択することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
図１に示される１４７、１５４、１６９、１８１、１９９、２００、および２０１の位置に対応する標的蛋白質上の７アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて、候補薬剤を選択することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
図１に示される１４７、１４９、１５４、１６９、１７３、２００、および２０２の位置に対応する標的蛋白質上の７アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて、候補薬剤を選択することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
図１に示される１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１６６、１６９、１７３、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、および２０１に対応する標的蛋白質上の２８アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて、候補薬剤を選択することを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌作用を有する薬剤探索に有用な蛋白質の特定方法、および該蛋白質を利用した薬剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの細菌の代謝、増殖、および環境への適応は、互いによく似た一連の遺伝子群によって制御されている。ＦＦＲＰ（Ｆｅａｓｔ／Ｆａｍｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）と総称されるこの遺伝子群の産物は、ゲノムＤＮＡ上のプロモーター領域に結合し、その下流に存在する遺伝子の転写を巧みに制御する。ＦＦＲＰの名称は発明者らの発案によるが、このグループに含まれる大腸菌のＬｒｐ（Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の機能を総括する「Ｆｅａｓｔ／Ｆａｍｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（饗宴−飢餓制御）」という表現（非特許文献１）に由来する。Ｌｒｐは外界の栄養価の上昇をロイシン濃度によって感知する。その結果、大腸菌は運動を停止し、外界から栄養を積極的に吸収しはじめるとともに、より従属的な代謝モードへと移行し、増殖を開始する。そして、最終的にはその感染性までもが変化する。大腸菌の別の蛋白質、ＡｓｎＣ（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）は、外界の栄養価の上昇をアスパラギン濃度によって感知し、アスパラギン生合成系、さらには増殖等を制御する。ＡｓｎＣ蛋白質のアミノ酸配列はＬｒｐと類似することから、ＡｓｎＣもＬｒｐと同じくＦＦＲＰに分類される。大腸菌にはさらに第３のＦＦＲＰが存在するが、その機能は未解明である。
【０００３】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、抵抗力が低下した弱者（ガンや火傷に苦しむ病人、免疫系に障害を持つ人達等）にしばしば、日和見感染し、敗血症、嚢包性線維病といった深刻な病気を引き起こす。その結果、死に至る場合もある。緑膿菌は多様な抗生物質、消毒剤に対して耐性を獲得し、その多剤耐性故に、発展途上国のみならず、先進国の病院内ですら、深刻な感染を引き起こしている。緑膿菌の感染機構の解明への手がかりを探るべく、国際協力のもとに、緑膿菌標準株（ＰＡＯ１）のゲノム全塩基配列が、決定、公開された（非特許文献２）。しかしながら、現在までに有効な薬剤の開発には至っていない。
【０００４】
他の多くの病原菌が寄生性で、宿主の中でしか生存できないのに対し、緑膿菌は水中、土壌、植物、動物組織といった多様な環境に適応し、増殖する。さらには同種の他細菌とシグナルを介して応答し、一定数を越えて増殖すると、その特性が大きく変化する。クオラム（定足数）センシングと呼ばれるこの機構は、他の細菌にはほとんど見られず、ヒトなどの多細胞性真核生物における細胞間シグナル伝達機構と比較し得る。このような「すぐれた」適応的変化能力と、日和見感染性（弱者だと分かると変化する）、多剤耐性（薬に対応して対抗できるように変化する）は同根であり、その根底には共通して、多数の遺伝子の転写を多様に調節する高度な転写制御機構があると考えられている。
【０００５】
発明者らは、公開されている緑膿菌ゲノム配列をもとに、緑膿菌中に８種のＦＦＲＰが存在する可能性をつきとめた（非特許文献３）。他の多くの寄生性の病原菌にはＦＦＲＰは存在せず、これは、これらの病原菌が栄養を宿主に完全に依存して、自らの代謝を調節しないことを反映していると考えられる。対照的に、８種という緑膿菌が持つＦＦＲＰの数は、今までに調べた真正細菌の中で最も多く、緑膿菌の発達した転写調節機構にこの蛋白質群が関与していることを強く示唆している。現在のところ、緑膿菌のＦＦＲＰが多剤耐性の獲得あるいは日和見感染に直接関与しているという証拠はない。しかしながら、ＦＦＲＰは大腸菌同様に緑膿菌の代謝に深く関係していると考えられ、したがって、ＦＦＲＰはその作用機序にかかわらず、緑膿菌の増殖を阻止、あるいは死滅させる薬剤のターゲットとして期待される。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｃａｌｖｏ，  Ｊ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｒ．  Ｇ．，  １９９４，  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｒｅｖ．，  ５８，  ｐ４６６−４９０
【非特許文献２】
Ｓｔｏｖｅｒ，  Ｃ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０１，  ｐ９５９−９６４
【非特許文献３】
Ｋｏｉｋｅ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｐｒｏｃ．  Ｊａｐａｎ．  Ａｃａｄ．，  ７９Ｂ，  ｐ６３−６９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、抗菌作用を有する薬剤の標的となりうるＦＦＲＰを特定し、これを利用した薬剤、特に抗緑膿菌作用を有する薬剤の新たなスクリーニング系を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＦＦＲＰ蛋白質８種を特定し、そのアミノ酸配列を他細菌のＦＦＲＰと比較・解析することにより、２次構造を考慮したＦＦＲＰアミノ酸配列のマルチプルアラインメント（図１）を完成させた。並行して、古細菌由来のＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）をリガンドと結合した状態で結晶化させ、その立体構造座標を用いて、薬剤が作用する標的部位のアミノ酸側鎖の位置を同定した。そして、これらの知見に基づき、抗緑膿菌作用を持つ薬剤が標的とすべき、緑膿菌ＦＦＲＰ  ８種のアミノ酸残基の位置および種類を特定した。さらに、発明者らは開発される薬剤が生体内の大腸菌と作用する可能性を軽減すべく、各ＦＦＲＰ蛋白質の類緑関係を解析し、大腸菌Ｌｒｐと極めて近い関係にある緑膿菌ＦＦＲＰを特定した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、抗菌作用を有する薬剤の標的蛋白質の特定方法を提供する。
１）対象とする細菌のゲノム情報から抽出した全ＯＲＦのアミノ酸配列データより、配列番号９〜３１のいずれか１で示されるＦＦＲＰアミノ酸配列と１次構造上２０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を選択する；
２）工程１で選択されたアミノ酸配列のうち、図１に示されるマルチプルアラインメントに対して、２次構造上対応がとれないアミノ酸配列を排除する；
３）上記工程１および工程２で得られたアミノ酸配列からなる蛋白質を抗菌作用を有する薬剤の標的蛋白質として特定する。
【００１０】
前記方法は、配列番号９〜１１のいずれか１で示される大腸菌ＦＦＲＰアミノ酸配列との系統関係において、ブートストラップ値が９００／１０００以上のアミノ酸配列を排除する工程をさらに含んでいてもよい。
【００１１】
前記工程１において、配列番号９〜３１のいずれか１で示されるＦＦＲＰアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸は、例えば、ＦＡＳＴＡプログラムでＺスコアが１８０以上のアミノ酸配列を選択すればよい。
【００１２】
また、前記工程２において、２次構造を形成することが困難なアミノ酸配列とは、例えば、図１に示されるマルチプルアラインメントに対して、３４〜４３、５９〜６６、７０〜８２、１２６〜１３５、および１７０〜１８０の位置に存在する５つのαヘリックス、ならびに９０〜９６、１０９〜１１７、１４２〜１４８、１５４〜１６０、および１９３〜２０５の位置に存在する５つのβストランドに対応する区画が、同様の２次構造を形成することが困難なアミノ酸配列である。
【００１３】
本発明はまた、上記の方法によって選択された標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
一つの実施態様において、前記方法は、以下のｉ）またはｉｉ）の標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法である。
ｉ）  配列番号１〜８に示されるいずれか１のアミノ酸配列からなる蛋白質
ｉｉ）  配列番号１〜８に示されるいずれか１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＦＲＰ活性を有する緑膿菌由来の蛋白質
【００１５】
あるいは、別な実施態様として、配列番号１〜８に示されるいずれか１のアミノ酸配列で特定される標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、そのあるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法である。
【００１６】
さらにまた、別な実施態様として、配列番号１〜７に示されるいずれか１のアミノ酸配列で特定される標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択する、抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法であってもよい。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法において、候補薬剤は、例えば、図１に示される１１３、１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１６６、１６９、１７３、１７６、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および２０２に対応する標的蛋白質上の３２アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて選択される。
【００１８】
あるいは、図１に示される１１３、１２６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１７６、１７７、１８１、１９６、１９７、１９８、１９９、および２０２の位置に対応する標的蛋白質上の１８アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて選択される。
【００１９】
あるいはまた、図１に示される１４７、１５４、１６９、１８１、１９９、２００、および２０１の位置に対応する標的蛋白質上の７アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて選択される。
あるいはまた、図１に示される１４７、１４９、１５４、１６９、１７３、２００、および２０２の位置に対応する標的蛋白質上の７アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて選択される。
【００２０】
さらにまた、図１に示される１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１６６、１６９、１７３、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、および２０１に対応する標的蛋白質上の２８アミノ酸残基と化合物との相互作用に基づいて選択される。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．ＦＦＲＰ（Ｆｅａｓｔ／Ｆａｍｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）
本発明にかかる「ＦＦＲＰ」は、外界の栄養状態の変化を感知して、細菌の代謝、増殖、感染を制御する蛋白質である。ＦＦＲＰの名称はこのグループに含まれる大腸菌のＬｒｐ（Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の機能を総括する「Ｆｅａｓｔ／Ｆａｍｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（饗宴−飢餓制御）」という表現に由来する。大腸菌では、３種のＦＦＲＰ：Ｌｒｐ、Ａｓｎ  Ｃ、および機能未解明のＦＦＲＰが存在することが確認されている。その他、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属等、多くの細菌でＦＦＲＰの存在が確認されている。
【００２２】
ＦＦＲＰの作用は、その制御下にある遺伝子上流のプロモーター領域にＦＦＲＰが結合し、これら遺伝子の転写を活性化もしくは不活性化することにより発揮される。そして、プロモーター領域へのＦＦＲＰの結合、解離は、外界の栄養状態を反映する何らかの低分子物質がＦＦＲＰの立体構造変化をおこさせ、プロモーターＤＮＡへのＦＦＲＰの結合能を変化させるためと予測されている。本発明は、このＦＦＲＰに特異的に結合し、その立体構造変化を通じて、細菌の代謝、増殖、感染を制御する薬剤のスクリーニング方法や、そのためのＦＦＲＰの特定方法に関する。なお、本発明において、「抗菌作用を有する薬剤」とは、「細菌に作用して、その代謝、増殖、感染のいずれかを制御することで、細菌の増殖を阻止あるいは細菌を死滅させる薬剤」を意味する。特に、本発明では、新たに特定された緑膿菌ＦＦＲＰを利用した抗緑膿菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
２．標的蛋白質（ＦＦＲＰ）の特定方法
本発明は、抗菌作用を有する薬剤の標的となりうるＦＦＲＰ蛋白質の特定方法を提供する。前記方法は、
１）対象とする細菌のゲノム情報から抽出した全ＯＲＦのアミノ酸配列データより、配列番号９〜３１のいずれか１で示されるＦＦＲＰアミノ酸配列と１次構造上２０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を選択する工程；
２）工程１で選択されたアミノ酸配列のうち、図１に示されるマルチプルアラインメントに対して、２次構造上対応がとれないアミノ酸配列を排除する工程；
３）上記工程１および工程２で得られたアミノ酸配列からなる蛋白質を抗菌作用を有する薬剤の標的蛋白質として特定する工程；を含む。
【００２４】
２．１  ホモロジー検索
工程１は、ゲノム情報から既知のＦＦＲＰと相同性を有するアミノ酸配列を選択する工程であり、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のホモロジー検索プログラムを用いて実施できる。同定の合格ラインとする類似性スコアは、比較的低く設定し、あやまってＦＦＲＰを見おとすことがないようにすることが望ましい。例えば、ＦＡＳＴＡを用いる場合であれば、１８０程度の低いＺスコアを同定の合格ラインとする。
【００２５】
２．２  マルチプルアラインメント
工程２は、２次構造の対応から、既知のＦＦＲＰと同様の立体構造をとれないアミノ酸配列を排除する工程であり、発明者らが独自に作製したＦＦＲＰのマルチプルアラインメント（図１）を用いて実施する。
【００２６】
前記図１に示されるマルチプルアラインメントは、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＰＡＭ、ＭｕｌｔＡｌｉｎ等のプログラムで作製したＦＦＲＰアミノ酸配列のマルチプルアラインメントに対し、種々の点から改良を加えて作製されたものである。すなわち、対応づけられる位置を占めるアミノ酸種がなるべく多くのＦＦＲＰ間で同一になるように留意されている。また、各ＦＦＲＰ間で対応する区画が同じ２次構造を形成し、各ＦＦＲＰが同様の立体構造を形成できるよう、以下の点が留意されている。
１）αヘリックスを形成する部位に配置される疎水性残基の位相が極力一致する。
２）各２次構造内に期待される２次構造形成を妨げるアミノ酸残基が頻出しない。
３）各αヘリックスの中央にアミノ酸残基の欠失や挿入が存在しない。
４）プロリン、グリシン、またはトリプトファン残基位置が極力一致する。
【００２７】
蛋白質の理論的同定とは、参照するアミノ酸配列と類似する区画をゲノム配列中に見つけ出す作業である。この際、判定の合格点を高くしすぎると、最終的には合格するものがなくなってしまう。一方で、判定のレベルを下げすぎれば、全てのものが合格してしまう。合格ラインの選定は極めて重要であり、かなり経験的判断に依存する。また、３種以上のアミノ酸配列中の残基位置を１対１に対応させること（マルチプルアラインメント）も難しい。２０種あるアミノ酸配列のいずれが似ているか否かには、「文脈」依存性があり、つまりその部位が持つべき機能を知らねばならないためである。アルギニンとグルタミン酸の側鎖の電荷（＋／−）は逆転していて、両者はこの点で全く異なる。しかしながら、親水性、疎水性という観点からは、この２つはともに親水性で、蛋白質表面に配置されやすい。アルギニン側鎖先端の電荷が他の側鎖との静電的相互作用で中和されると、長い側鎖の「柄」、炭化水素部分は、ロイシン等の疎水性アミノ酸残基と似た挙動をする。このように、図１は、深い研究経験と高い解析能力に基づいてはじめて作製されたものである。
【００２８】
かくして、図１に示すマルチプルアラインメントに対して、２次構造上対応がとれないアミノ酸配列を排除する。すなわち、対象となるアミノ酸配列が、図１に示される３４〜４３、５９〜６６、７０〜８２、１２６〜１３５、および１７０〜１８０の位置に存在する５つのαヘリックス、ならびに９０〜９６、１０９〜１１７、１４２〜１４８、１５４〜１６０、および１９３〜２０５の位置に存在する５つのβストランドに対応する区画において、同様の２次構造を形成することが困難な場合、そのアミノ酸配列を排除する。
【００２９】
２．３  系統関係
蛋白質の類似には様々な種類がある。例えば、ヒトのヘモグロビンとブタのヘモグロビンは、同じ基本機能をもち、両者が多少異なる理由は、ヒトとブタという生物種の分化に由来する。こうした関係をオーソロガスという。オーソロガスな関係にある蛋白質は、本質的には交換可能である。かなり最近までヒトの治療のためにヒトインシュリンの代わりにブタのインシュリンが投与されており、第２次世界大戦中にはマグロのインシュリンが使われた例もある。一方、ヒトのヘモグロビンとヒトのミオグロビンとの類似はこれとは異なる。両蛋白質の機能は分化していて、交換することは不可能である。こうした関係をパラロガスという。ＦＦＲＰの中にはオーソロガスなものやパラロガスなものが混在している。
【００３０】
そこで、本発明の方法は、さらに、２種以上の細菌が持つＦＦＲＰ群を比較し、これらの細菌が共通に持つＦＦＲＰ分子種を標的蛋白質としてスクリーニングを行うことにより、所望のより幅広い細菌種に作用する薬剤を開発することができる。あるいは、特定の細菌だけが持つＦＦＲＰ分子種を標的蛋白質としてスクリーニングを行うことにより、該細菌種に特異性の高い薬剤を開発することもできる。例えば、人と共生する大腸菌に作用しない薬物開発を考慮した場合、本発明の方法は、大腸菌ＦＦＲＰのアミノ酸配列（配列番号９〜１１）と極めて近い類縁関係にあるアミノ酸配列を排除する工程を含んでいてもよい。
【００３１】
上記のような各ＦＦＲＰ分子種の類縁関係は、系統検定を行うことにより決定することができる。系統検定は、例えば、ＰＨＹＬＩＰパッケージ等の市販のソフトウェアを用いて、図１に示す対応関係を変えることなく固定して実施する。排除すべきアミノ酸配列の基準としては、ブートストラップ値９００／１０００以上程度に設定することが好ましい。
【００３２】
ここで、「ブートストラップ値」とは、一組のデータからある結論を出す場合に、その結論を支持するデータの均一性を判断する指標であり、「類似度の判定に用いるアミノ酸位置に異なる重みをつけて、例えば１０００回ブートストラップした時に、何回同じ分岐が同定されるかを計算した値」を示すものとする。したがって、ブートストラップ値が１０００に近づく程、類緑関係はより近いものと判断される。
【００３３】
３．  緑膿菌由来のＦＦＲＰ
本発明の方法を用いて、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の標準株（ＰＡＯ１）の全ゲノム配列（Ｓｔｏｖｅｒ，  Ｃ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，  ９５９−９６４）より８種のＦＦＲＰ：
Ｐｓ５０４７２７８（配列番号１）、Ｐｓ４４４５４８６（配列番号２）、Ｐｓ２４７２４４２（配列番号３）、Ｐｓ２２９１５８９（配列番号４）、Ｐｓ２２２０２５１（配列番号５）、Ｐｓ２９１４３５８（配列番号６）、Ｐｓ５３７２２６６（配列番号７）、Ｐｓ５９７７６１０（配列番号８）が特定された。
【００３４】
上記ＦＦＲＰのアミノ酸配列は、緑膿菌の標準株（ＰＡＯ１）のゲノム配列を用いて決定されたものであるが、前述のとおり、緑膿菌は容易に突然変異を起こし薬剤耐性を獲得する。その際、対象とするＦＦＲＰにも、当然突然変異が起こることがある。本発明にかかる緑膿菌ＦＦＲＰには、そのような突然変異によって、ＦＦＲＰ活性に影響を与えないような１または数個のアミノ酸の欠失、置換または付加を生じたようなアミノ酸配列からなる緑膿菌ＦＦＲＰも含むものとする。
【００３５】
なお、前記欠失、置換または付加は、前述したＦＦＲＰの立体構造との関係から、図１に示される５つのαヘリックスや、５つのβストランドの形成に影響を与えないような変異でなければならない。また、欠失、置換または付加が生じるアミノ酸位置は、薬剤が作用する標的となるアミノ酸位置、すなわち、図１に示される１１３、１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１６６、１６９、１７３、１７６、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および２０２の位置に対応する位置ではないことが望ましい。
【００３６】
さらに緑膿菌ＦＦＲＰと大腸菌由来ＦＦＲＰとの系統関係を調べた結果、あらゆる観点から、大腸菌ＬｒｐとＰｓ５９７７６１０とはオーソロガスであり、ブートストラップ値９００以上の極めて近い類縁関係にあることが確認された。したがって、人に投与する場合の大腸菌への作用を考慮するならば、Ｐｓ５９７７６１０（配列番号８）は薬剤開発の標的蛋白質からは排除することが望ましい。
【００３７】
４．  抗菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法
ＦＦＲＰによる転写制御には、外界の栄養状態を反映した低分子物質（リガンド）の結合によるＦＦＲＰの立体構造変化と、それによるプロモーター領域への結合能力の変化が関与することが予測されている。つまり、ＦＦＲＰの立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物は、ＦＦＲＰの転写制御を通じて、細菌の代謝、増殖、あるいは感染を変化させる抗菌剤として有用である。
【００３８】
すなわち、本発明は、本発明で特定された標的蛋白質または該蛋白質会合体に特異的に結合し、その立体構造あるいは会合状態を変化させる化合物を候補薬剤として選択することを特徴とする、抗菌作用を有する薬剤のスクリーニング方法を提供する。ここで、「立体構造あるいは会合状態を変化させる」とは、標的蛋白質であるＦＦＲＰの立体構造やＦＦＲＰの会合状態を変化させることを意味する。
【００３９】
本発明のスクリーニング方法は、標的蛋白質にリガンド候補化合物を添加し、その立体構造あるいは会合状態の変化を直接解析する周知のリガンドスクリーニング系（例えば、ゲルろ過分析、沈降係数の測定等）であってもよいし、コンピューターを用いたバーチャルスクリーニング系であってもよい。
【００４０】
４．１  立体構造情報
ＦＦＲＰの立体構造情報については、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓｕｓ由来のＬｒｐ様蛋白質について、リガンドが結合しない状態での結晶構造と２次構造が報告されている（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍ．  Ｌｅｏｎａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｖｏｌ．２０，  Ｎｏ．５，  ｐ９９０−９９７）。しかし、この情報は、分解能が３Å程度、Ｒ因子が３０％以上と精度が悪く、リガンド探索に重要なアミノ酸側鎖の立体配置を与えるものではない。
【００４１】
発明者らは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＯＴ３，  （別名：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，  あるいはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｈｉｎｋａｉｉ、Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  登録番号：  ＪＣＭ  ９９７４）由来のＦＦＲＰ（１４種）の１つ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶化に成功し、Ｘ線回折法によりその立体構造を高い精度で決定した。この立体構造情報は、リガンドと結合した状態で立体構造が解析された唯一のものであり、しかも分解能が１．８Å、Ｒ因子が２１％と精度が高く、リガンドが作用するアミノ酸残基の側鎖の位置が精密に決定された唯一のものである。
【００４２】
表１に発明者らが特定したｐｏｔ１２１６１５１の立体構造座標を示す。この立体構造原子３次元座標や、この座標をもとに作製される立体構造画像や数値情報は、ＦＦＲＰのリガンド探索に必要な様々な立体構造情報を与える。こうした立体構造情報は、ＦＦＲＰ単量体のみならず、それらが会合して生じる会合体の情報も含み、また、リガンドが結合した状態とリガンドが結合していない状態の双方の情報を含む。
【００４３】
本発明の方法においては、前記立体構造情報のなかでも、特にＦＦＲＰの会合によって生じる「すきま部」や「穴部」に関する情報を利用する。ここで、「すきま」とはＦＦＲＰ単量体間に生じた、各原子と原子あるいはアミノ酸とアミノ酸の間の空隙を意味し、「穴」とはＦＦＲＰ会合体を全体としてみたときに、中央に生じた大きい空間を意味する。これらは、いずれもスクリーニング対象である「リガンド」のＦＦＲＰへの結合に重要な立体的特徴にかかわる情報である。
【００４４】
表１の立体構造情報は、図１の各ＦＦＲＰアミノ酸配列の対応関係と結びつけることにより、全てのＦＦＲＰに関する立体構造情報、特にリガンド結合部位であるＦＦＲＰ会合体の「穴部」や「すきま部」位置するアミノ酸に関する情報を与える。かくして、発明者らは、薬剤が標的とすべき各種細菌ＦＦＲＰのアミノ酸位置の候補、合計３２位置：図１に示される１１３、１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１６６、１６９、１７３、１７６、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、および２０２の位置（図３）、を特定した。
【００４５】
上記の位置を、さらに細かく分類すれば、図１に示される１１３、１２６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１７６、１７７、１８１、１９６、１９７、１９８、１９９、および２０２の合計１８位置（図６）は、ｐｏｔ１２１６１５１に結合した未同定の会合促進因子２分子が結合していると考えられるアミノ酸残基の位置である。
【００４６】
また、図１に示される１４７、１５４、１６９、１８１、１９９、２００、および２０１の合計７位置（図７）は、大腸菌Ｌｒｐにおいて、ロイシンが結合する可能性が示唆されるアミノ酸残基の位置である。
【００４７】
さらに、図１に示される１４７、１４９、１５４、１６９、１７３、２００、および２０２の合計７位置（図９）は、ｐｏｔ１２１６１５１において、ロイシンが結合する可能性が示唆されるアミノ酸残基の位置である。
【００４８】
さらに、図１に示される１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１６６、１６９、１７３、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、および２０１の合計２８位置（図１２）は、ｐｏｔ１２１６１５１における「すきま部」に面するアミノ酸残基の位置である。
【００４９】
４．２  バーチャルスクリーニングとドラッグデザイン
本発明においては、上記のようにして得られた立体構造原子座標、またはその派生座標を用いて、薬剤のバーチャルスクリーニングを行うことができる。
【００５０】
バーチャルスクリーニングでは、まず、表１に示す原子３次元座標をコンピュータに入力し、立体構造画像やその他の数値情報を得る。コンピューターには、表１に記載の情報を全部入力してもよいし、「穴部」や「すきま部」の情報や、図１の５つのαヘリックスと５つのβヘリックスなど、必要な情報のみを入力してもよい。用いる立体構造解析プログラムとしては、例えば、ＣＣＰ４プログラム群、Ｏ（プログラム・オー）、Ｘ−ＰＬＯＲ、ＭｏｌＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｇｒａｓｐ等が挙げられる。ここで、立体構造画像とは、リボンダイアグラム、立体構造モデル、コンピューターグラフィックス等の画像であらわされた情報である。また、数値情報とは、結晶の直径、穴やすきまの幅や深さ等、数値であらされる情報のすべてを含む。
【００５１】
次いで、これらの情報をバーチャル化合物ライブラリーにインプットし、候補薬剤となる化合物の検索を行う。用いるバーチャル化合物ライブラリーは特に限定されず、例えばＤＯＣＫ−４  （Ｋｕｎｔｚ）  などの市販のバーチャルスクリーニングソフトウェアや、ＭＤＤＲ（Ｐｒｏｕｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）などの三次元構造データベースを用いることができる。
【００５２】
上記の立体構造画像や数値情報は、候補薬剤のスクリーニングにとどまらず、コンピュータを利用した種々のモデリングおよびドラッグデザインをも可能にする。モデリングは、結晶解析用ＦＲＯＤＯ、あるいはＯを利用し、またドラッグデザインは、ＱＵＡＮＴＡ、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ等を利用して行えばよい。例えば、ＦＦＲＰの原子座標を分子設計ソフトウェアＱＵＡＮＴＡに入力し、その立体構造をコンピュータグラフィックで確認しながら、穴部やすきま部に結合するようなリガンド化合物をデザインすることができる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例および参考例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例や参考例に限定されるものではない。
【００５４】
〔実施例１〕緑膿菌ＦＦＲＰ蛋白質の同定
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の標準株（ＰＡＯ１）の全ゲノム配列（Ｓｔｏｖｅｒ，  Ｃ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６，  ９５９−９６４）中に形成可能な、全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、形式的にスタートコドンで始まり、ストップコドンで終わり、この間に５０以上のアミノ酸を記録できる区画）を探し、これをアミノ酸配列に翻訳した。大腸菌（大腸菌Ｋ株のゲノム配列：Ｂｌａｔｔｎｅｒ，  Ｆ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，  ２７７，  １４５３−１４７４）、ならびに古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＯＴ３（ＪＣＭ  ９９７４）およびＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍのＦＦＲＰ蛋白質アミノ酸配列（いずれもＳｕｚｕｋｉ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｐｒｏｃ．  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ．  ７９Ｂ，  ｐ９２−９８）をもとに、これに類似する緑膿菌ＯＲＦをＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｓｏｎ，  Ｗ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．  Ｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ２４４４−２４４８）により検索した。１８０程度の低いＺスコアを同定の合格ラインとし、あやまってＦＦＲＰを見おとすことがないよう努めた。
【００５５】
特定された緑膿菌ＦＦＲＰ候補と他細菌種ＦＦＲＰ蛋白質のアミノ酸配列をＰＨＹＬＩＰパッケージ内のＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２，  ４６７３−４６８０）を使って解析し、各残基位置を対応させた表（マルチプルアラインメント）を作成した。
【００５６】
次に、この対応関係を２つの主要な観点から改良した。すなわち、第１の観点として、対応づけられる位置を占めるアミノ酸種はなるべく多くのＦＦＲＰ間で同一にならねばならない（図１のボールド、ただしαヘリックスの外）。また、第２の観点として、各ＦＦＲＰ間で対応する区画は同じ２次構造（例えば、αヘリックス）を形成し、この２次構造が同じ順番で出現し、これにより各ＦＦＲＰが同様の立体構造を形成できなければならない。この観点は、ＣＬＵＳＴＡＬＷのようなプログラムでは全く考慮することができない。
【００５７】
特に、αヘリックスを形成する部位に配置される疎水性残基の位相をがそろっていること（αヘリックス上、３．６残基ごとに同じ面に向き、ここに疎水性残基を配置することにより、他の２次構造と相互作用が形成されて、蛋白質ドメインが安定化する）、各２次構造内にその２次構造の形成を大きく妨げるようなアミノ酸残基を配置しないこと、２次構造要素の中央になるべく欠失や挿入を作らないこと、プロリンやグリシン、トリプトファンといった立体化学的に特徴的な残基がなるべく同じ位置にそろうこと、を考慮した。
【００５８】
以上の結果、緑膿菌のＦＦＲＰ蛋白質８種を同定し、他細菌のＦＦＲＰのアミノ酸残基位置との対応表を完成した（図１）。
【００５９】
〔実施例２〕ＦＦＲＰの系統関係の同定
図１に示す対応関係を変えることなく固定して、ＰＨＹＬＩＰパッケージで解析し、ＦＦＲＰ間の類似度を示す図２を作成した。図２では、より似たＦＦＲＰ同士ほど、両者をつなぐ長さ、すなわち両者が分岐した地点からそれぞれまでの長さの和が短くなるよう表現されている。例えば、大腸菌Ｌｒｐに最も似ているのは、緑膿菌Ｐｓ５９７７６１０である。
【００６０】
さらに図２中の各分岐点に対して、ブートストラップ値を計算した。ブートストラップ値とは、一般に、一組のデータからある結論を出す場合に、その結論を支持するデータの均一性（つまり身勝手に選んだ一部から結論を出していないかどうか）を判断する指標である。ここでは、類似度の判定に用いるアミノ酸位置に異なる重みをつけて（極端な場合には、数ヶ所を解析から除外する、あるいは数ヶ所だけを選抜してこれだけで解析するといった考え方で）、例えば１０００回試行した時に、何回同じ分岐が同定されるかを計算している。ブートストラップ値が１０００に近づく程、モデル中の分岐に反映される類緑関係はより正しいものとなる。
【００６１】
緑膿菌の８種のＦＦＲＰを含む部分（図２中、青または赤で表示）のブートストラップ値は全般に高く、この部分の類縁関係の判定が比較的信頼できることを示している。特に、大腸菌ＬｒｐとＰｓ５９７７６１０との分岐点には９００／１０００以上のブートストラップ値が計算され、両者の類似性には疑問の余地がなかった。大腸菌のＥｃ０４６８０６５に対しては、Ｐｓ２２２０２５１が最も近縁であるが、両者を関係づけるブートストラップ値は高くなかった（図２）。一方、大腸菌のＡｓｎＣ蛋白質に類似する緑膿菌ＦＦＲＰは見つからなかった。
【００６２】
〔実施例３〕リガンド結合部位の特定
図１に示す緑膿菌ＦＦＲＰとｐｏｔ１２１６１５１とのアミノ酸配列の対応、および古細菌ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶構造座標（参考例、および特願２００１−３８４６８３参照）の解析結果から、薬剤が標的とすべき各種細菌ＦＦＲＰのアミノ酸位置の候補、合計３２位置を特定した（図３）。特定に用いたｐｏｔ１２１６１５１結晶構造は、リガンドと結合した状態で立体構造が解析された唯一のものである。またアミノ酸残基の側鎖の位置が精密に決定された唯一のＦＦＲＰ立体構造である。特定は、異なる４つの観点から行った。
【００６３】
ｉ）  ｐｏｔ１２１６１５１の８量体は、ｐｏｔ１２１６１５１を大腸菌を使って人工的に発現した際に、大腸菌細胞から未同定の会合促進因子（リガンド）を２分子とりこんで、複合体として結晶していた（参考例、特願２００１−３８４６８３参照）。リガンド２分子は、結晶学的対称性で関係づけられており、つまりｐｏｔ１２１６１５１内の全く等価な位置２ヶ所に結合している（図４）。リガンドは、中級のアミノ酸、バリン程度の大きさであるため、対応する電子密度に沿って、バリンを配置した（図５）。バリンの炭素、酸素あるいは窒素原子のいずれかから６Å以内に、水素を除くいずれかの原子が位置するＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）のアミノ酸残基、１８を同定した（図６）。これにより一般にＦＦＲＰにおける、１１３、１２６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１７６、１７７、１８１、１９６、１９７、１９８、１９９、２０２の位置（図１における番号）に、リガンドが結合する可能性を持つと結論した（図６）。
【００６４】
ｉｉ）  大腸菌Ｌｒｐを用いた分子遺伝学実験（Ｐｌａｔｋｏ，  Ｊ．  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｃａｌｖｏ，  Ｊ．  Ｍ．，  １９９３，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７５，  １１１０−１１１７）によると、７つの位置での突然変異により大腸菌Ｌｒｐによる転写制御にロイシン依存性が無くなった。したがって、この７ヶ所はロイシンと結合する可能性のある部位の候補である。大腸菌Ｌｒｐ立体構造は知られていないので、図１の対応関係を用いて、ｐｏｔ１２１６１５１上の対応位置７つ（図１における１４７、１５４、１６９、１８１、１９９、２００、２０１）を同定したところ（図７）、いずれもＦＦＲＰ会合体のすきま部に配置していた（図８）。Ｐｏｔ１２１６１５１の７ヶ所のうち、Ｍｅｔ（１９９）だけは、すきまに近いものの、その側鎖はすきまとは反対側（ドメイン内部）を用いていた。残りの６つのうち、Ａｌａ（２０１）は、その主鎖のカルボキシル基が、また他の５つの残基Ｖａｌ（１４７）、Ａｓｐ（１５４）、Ｌｅｕ（１６９）、Ａｒｇ（１８１）、Ｉｌｅ（２００）の側鎖はいずれも、すきまに面していた。以上の７ヶ所をＦＦＲＰ一般にリガンドが結合する可能性を持つと結論した。
【００６５】
ｉｉｉ）  ロイシンは、大腸菌Ｌｒｐ（Ｍａｒａｓｃｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７６，  ５１９７−５２０１  ）だけでなくｐｏｔ１２１６１５１にも作用し（参考例、および特願２００１−３８４６８３参照）、ＦＦＲＰ蛋白質の会合を解く。大腸菌Ｌｒｐでは２量体間のすきまあたりに、最大ロイシン２分子が結合する（Ｍａｒａｓｃｏ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７６，  ５１９７−５２０１  ）。ロイシンがｐｏｔ１２１６１５１に結合した時におこる立体化学的な状況を調べるため、コンピューターにより２量体間のすきまにロイシン２分子を配置するモデルを組んだ。各ロイシン分子は先の７つの残基近辺に配置される。図９は擬似２回対称で、上下各半分に一分子、合計２分子のロイシンが結合する可能性があり、このうちの下半分の１分子のみを表現している。また、図９は、ＦＦＲＰを図１０に示す角度からながめた際の、手前の２つの２量体のみを示した図になっている。このモデルで、ロイシンの側鎖はＶａｌ（１４７）近辺からＬｅｕ（１６９）、Ｉｌｅ（２００）へと、疎水結合を形成しながら伸展し、また、ロイシンのアミドグループはｐｏｔ１２１６１５１のＡｓｐ（１５４）に、またＣα原子はＶａｌ（１４７）に近づき、共に化学結合を形成できる。両分子の全体としての相補性は良いが、ロイシンはｐｏｔ１２１６１５１のＴｙｒ（１４９）、Ａｓｐ（１７３）、Ｉｌｅ（２０２）に衝突し、したがって、両者の静的な結合は不可能である。結合に適切な５つの位置で大腸菌Ｌｒｐもｐｏｔ１２１６１５１と同じあるいは似た種類のアミノ酸を持つ（図１１）。ＦＦＲＰ一般において、以上の７ヶ所にリガンドが結合する可能性があることを結論した。
【００６６】
ｉｖ）    ｐｏｔ１２１６１５１立体構造を基に、２量体間のすきまを形成するアミノ酸残基位置２８を同定し、これをリガンドが作用する候補として特定した。すなわち、半径５．０Åの架空の球を蛋白質表面に沿って転がしたとき、この球には全く接触できないものの、半径１．４Åの球であれば、入り込んである程度接触できるアミノ酸残基をすきま部を形成する残基とした。半径１．４Åの球が接触できる面積が、同種のアミノ酸残基を２つのグリシン残基の間に挟んで完全に進展したときの露出面積の５％以上であるときに、接触可能と判定した。結晶構造中には結晶学的に独立な４個のすきまが形成されており、このうち２個以上においてすきまを形成すると判定された２８残基を特定した（図１２）。これらは図１における１１６、１１９、１２０、１２６、１４４、１４５、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１６６、１６９、１７３、１７７、１８１、１８３、１８５、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、および２０１の位置に該当する。
【００６７】
ｉ）〜ｉｖ）の合計が図３に示す３２位置である。解析結果は、全体として、２つの半独立した、しかしながら互いに重なり合うリガンド結合位置があると解釈することも可能である（図１３の右側４位置を中心）。図３に示す位置の中からｉｖ）でのみ同定された１０ヶ所、１１６、１１９、１２０、１４４、１４５、１６６、１８３、１８５、１９３、１９５を除く、２２位置は、図１３のようになる。この中でｉ）あるいはｉ）とｉｖ）だけで判定された位置（図１３左側１２位置）を中心に大腸菌未同定会合促進因子は結合し、ｉｉ）、ｉｉｉ）あるいはこれらのいずれかとｉｖ）で同定された図１３右側４位置を中心に解離因子ロイシンは結合する。この中間の６位置では両リガンドが競合する可能性がある。
【００６８】
〔実施例４〕開発する薬剤が大腸菌と相互作用しないための緑膿菌ＦＦＲＰの選定
リガンド結合全体を通して、大腸菌Ｌｒｐと緑膿菌Ｐｓ５９７７６１０はよく似たアミノ酸種を持つ。例えば、図１で大腸菌Ｌｒｐと緑膿菌Ｐｓ５９７７６１０とはほとんど同じで、これは両者が同じリガンド、おそらくはロイシンを含むことにより、同じように制御されることを示す。大腸菌ＡｓｎＣと似ているものは見つからなかった。大腸菌Ｅｃ０４６８０６５に対してはＰｓ２２２５２５１が最も似ているが、両者の類似度は高くない。他の６種の緑膿菌ＦＦＦＲＰの中では特にＰｓ２９１４３５８とＰｓ５３７２２６６が３つの大腸菌ＦＦＲＰのいずれにも類似していなかった。
【００６９】
一般に、ＦＦＲＰ蛋白質のＮ端側に形成される３つのαヘリックスのうちの３番目がＤＮＡの塩基配列の識別に重要で、また第３αヘリックス上の３つのアミノ酸位置は主として疎水的なアミノ酸が占め、蛋白質ドメイン内へと向いていて、塩基の識別には使われないことが議論されている（Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｐｒｏｃ．  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ．  ７９Ｂ，  ９２−９８）。図１に示す配列の対応を用いて、緑膿菌ＦＦＲＰ各種の第３αヘリックスを構成するアミノ酸を同定し、さらにＤＮＡ塩基を識別する位置１２を特定した（図１４）。大腸菌ＬｒｐとＰｓ５９７７６１０はやはりきわめて類似するアミノ酸残基を持ち、同じＤＮＡ配列を認識することが結論される。Ｅｃ０４６８０６５とＰｓ２２２５２５１は１２位置中４つが同じである。Ｐｓ２９１４３５８とＰｓ５３７２２６６は３つの大腸菌ＦＦＲＰいずれからも最も遠く、いずれの緑膿菌ＦＦＲＰも大腸菌ＡｓｎＣと３つ以上で一致することはなかった。これはリガンド結合部位の解析による結論、また、アミノ酸全配列の比較による結論と同じであった。
【００７０】
〔参考例１〕ＦＦＲＰの結晶化
（１）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の発現ベクターの構築
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＯＴ３（ＪＣＭ  ９９７４）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）遺伝子配列を持つＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは、変性９４℃、アニーリング５５℃、伸長反応７２℃、３０サイクル、（宝酒造株式会社ＬＡ  Ｔａｑ、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００使用）の条件で２０μｌ行った。
【００７１】
増幅したＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造株式会社製）とＢａｍＨＩ（宝酒造株式会社製）で切断し、この断片をアガロース電気泳動で分離した。得られたＤＮＡ断片（ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）遺伝子配列を持つ）は、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断した発現ベクターｐＥＴ３（ノバゲン社製）に連結し［１０μｌの反応溶液（６６０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）、６６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）中、１６℃で一晩Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）により反応］、ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）発現ベクター（ｐＥＴ３−ＬＲＰＳ０１）を構築した。
プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧ−３’（配列番号３２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＣＴＡＴＣＡＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号３３）
【００７２】
（２）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の大腸菌での発現
ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）発現ベクター（ｐＥＴ３−ＬＲＰＳ０１）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバゲン社製）に導入した。この大腸菌株を５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地８ｍｌ中３７℃で一晩培養した後、８リットルの同じ培地に接種し、６００ｎｍでの吸収が０．７５付近になるまで生育させた。次いで２ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えて、ＦＦＲＰの発現を誘導した。さらに４時間培養を続けた後、遠心分離（ベックマンＡｖａｎｔｉ  Ｊ−２５、７，５００ｒｐｍで５分）により菌体を回収した。
【００７３】
（３）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の精製
１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液２５０ｍｌ（１ｍＭのＥＤＴＡを含む）にＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）を発現した菌体を懸濁し、フレンチプレス（ＳＬＭ社製）で破砕後、３０分間の遠心分離を行った［ベックマン社製の遠心分離機（Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２５、ローターＪＡ−２５．５）を使用、４℃  ２５，０００ｒｐｍ］。上澄みを回収し、７５℃で１時間の熱処理後、再度、４℃  ２５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上澄みを３０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液に透析した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲルろ過をそれぞれ２回行って精製した。
【００７４】
上澄みを３０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液で予め平衡化した陰イオン交換カラム［１．６  ｘ  １８ｃｍ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（ファルマシア社製）］に注ぎ、さらに同じ緩衝液でカラムを洗浄した。次に、緩衝液中の塩化ナトリウムの濃度を０から２Ｍまで直線的に上昇する勾配で変化させながらカラムに通し、蛋白質を溶出させた。カラムはＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を使用し、流速を毎分２ｍｌとした。カラムから溶出された溶液を４ｍｌずつ分取し、ＳＤＳ電気泳動法によりＦＦＲＰを含む画分を確認後、保存した。
【００７５】
保存した蛋白質溶液を、１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）に対して透析した後、ゲルろ過を行った。１００ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ  ７．０）緩衝液で予め平衡化したカラム［２．６  ｘ  ６０ｃｍ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（ファルマシア社製）］に蛋白質溶液を注入後、同緩衝液を毎分１ｍｌで注入した［ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を使用］。カラムからの流出液を２ｍｌずつ分取し、ＳＤＳ電気泳動法によりＦＦＲＰを含む画分を確認して保存した。以上の陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過の過程を交互に２回繰り返し、最終的にＳＤＳ電気泳動法により単一のバンドが観察される程度に精製した。
【００７６】
（４）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶化
精製したＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）を、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）中２０ｍｇ／ｍｌとなるよう調整して結晶化用の試料とした。結晶化は２４穴結晶化プレート（ハンプトンリサーチ社製）を用いて蒸気拡散法によるシッティング・ドロップ法で行った。すなわち、結晶化試料とリザーバー液［１０％（重量）ＰＥＧ  ６０００、１．０Ｍ  塩化リチウム、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）］を４μｌずつ混合した溶液を母液とし、０．８ｍｌのリザーバー液に対して５℃の恒温下で蒸気拡散させ、約１週間で０．２ｍｍ程度の六角錐状の結晶を得た。
【００７７】
〔参考例２〕ＦＦＲＰの立体構造解析
（１）  Ｘ線回折法
参考例１で得られたＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶は、重原子同形置換法を用いて立体構造決定を行うため、１０ｍＭ  シアン化白金（Ｋ２［Ｐｔ（ＣＮ）６］）または０．１ｍＭ  塩化金（Ｋ［ＡｕＣｌ４］）を含む保存液を５℃で約２日間浸透させた。
測定は、１）実験室用回転対陰極型Ｘ線源と２）放射光Ｘ線源の２条件で、もともとのＦＦＲＰの結晶２組と２種類の重原子（白金および金）誘導体各１組の合計４組について測定した。
【００７８】
１）  実験室用回転対陰極型Ｘ線源による測定
もともとのＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶１組と２種類の重原子（白金および金）誘導体各１組について、実験室用の回転対陰極型Ｘ線源を用いて室温で測定した。それぞれの結晶は石英製の細管（直径１．５ｍｍ、ＴＯＨＯ株式会社製）に入れ、余分な溶液を取り除いた後、細管の両端をワックスで封じて、Ｘ線回折装置に取り付けた。Ｘ線源（理学電機社製、ＵｌｔｒａＸ  １８）を５０ｋＶ，  １００ｍＡで運転し、回折データを、回折装置（理学電機社製、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶ）を用いて記録した。
【００７９】
２）  放射光Ｘ線源による測定
より高分解能のデータを得るため、もともとのＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶を凍結した状態で放射光Ｘ線源を用いて測定した。放射光Ｘ線源は、放射光施設ＳＰｒｉｎｇ８の兵庫県ビームラインＢＬ２４ＸＵを用いた。結晶は、凍結用の保存液［２０％（重量）グリセロール、１４％（重量）ＰＥＧ  ６０００、１．０Ｍ  塩化リチウム、１００ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）］に数分間、浸透後、結晶凍結用の０．２ｍｍのマウントループ（クライオループ、ハンプトン・リサーチ社製）にとりつけ、液体窒素中（−１９６℃）で凍結させた。測定中も、冷気吹き付け型結晶凍結装置（理学電機社製）を用いて、結晶の温度を−１７３℃に保った。０．８３４Åの放射光Ｘ線を用い、回折装置（理学電機社製、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＶ）を用いて回折を記録した。
【００８０】
（２）  データの解析
回折装置付属のプログラムおよびＣＣＰ４プログラム群［Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ５０，  ７６０−７６３  （１９９４）］を用いて回折データを処理した。その結果、この結晶は空間群Ｐ３２２１またはＰ３１２１に属し、単位格子の各辺の長さはａ  ＝  ｂ  ＝  ９６．３Å、ｃ  ＝  ９７．１Åであることが判明した。この単位格子の大きさから、結晶の非対称単位には、３から６分子のＦＦＲＰが含まれていることが推測された。
【００８１】
（３）  初期モデルのデザイン
ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）および２種類の重原子（白金および金）誘導体結晶の回折データを、ＣＣＰ４プログラム群を用いて統合し、以後の計算処理に用いた。重原子誘導体結晶中の重原子の位置を、差パターソンマップを用いて決定した。金および白金の誘導体結晶の非対称単位中には、それぞれ２個および３個の金属原子が存在することが判明した。これら重原子の個数、位置および占有度をＣＣＰ４内のＭＬＰＨＡＲＥプログラムを用いて精密化した。この位相のオーバーオール・フィギュア・オブ・メリット（ｏｖｅｒａｌｌ  ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔ）は３．０Åで０．４３であった。
【００８２】
この位相を用いて重原子同型置換電子密度マップを計算し、ＣＣＰ４内のＤＭプログラムを用いて溶媒平滑化とヒストグラム・マッチィングにより位相を改良した。改良した位相を用いて作成した電子密度マップでは、非対称単位に４分子と空間群Ｐ３２２１を仮定した場合にのみ、右巻きのヘリックスの電子密度が適切に観察された。この電子密度マップに最も良く適合するように各分子７２残基のアラニンからなる４分子のモデルをプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ  Ｔ．  Ａ．，  Ｚｏｕ  Ｊ．  Ｙ．，  Ｃｏｗａｎ  Ｓ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｋｊｅｌｄｇａａｒｄ  Ｍ．，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍａｐｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｒｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ａ４７，  １１０−１１９  （１９９１））を用いてデザインした。
【００８３】
（４）  モデルの精密化
構築したモデルを、実験から得た回折データおよび蛋白質立体構造が共通に持つパラメーター（Ｅｎｇｈ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ）に適合するようにＸ−ＰＬＯＲＥプログラム［Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ａ．  Ｘ−ＰＬＯＲＥ  ｖ３．１  Ｍａｎｕａｌ（エール大学出版、ニューヘブン、１９９２）］を用いて精密化した。さらに、プログラムＯを用いてモデルと電子密度マップが大きく異なる部分を修正した。この時点では、非対称単位中の４つの分子は全く同じになるように制限している。この時点で、実験データとモデルとの違いを示すＲ因子の値は３９．１％であった。
【００８４】
さらに高精度の構造を得るために、放射光施設ＳＰｒｉｎｇ８  ＢＬ２４ＸＵで測定した高分解能のデータを用いてモデルの精密化と修正を行った。３．０Åまでのデータを対象としてＸ−ＰＬＯＲＥプログラムにより先のアラニンモデルを精密化後、２．０Åまでの高分解能のデータを使い、ｗＡＲＰプログラム［Ｐｅｒｒａｋｉｓ，  Ａ．，  Ｓｉｘｍａ，  Ｔ．  Ｋ．，  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｋ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌａｍｚｉｎ，  Ｖ．  Ｓ．，  ｗＡＲＰ：  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｐｈａｓｅｓ  ｂｙ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｆｉｎｅｄ  ｄｕｍｍｙ  ａｔｏｍｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ５３，  ４４８−４５５  （１９９７）］を用いてその位相を改良した。この改良した位相を用いて電子密度マップを作成し、側鎖を含め蛋白質を構成するほとんどの原子に対応する電子密度を明瞭に同定することができた。この電子密度マップを元に、側鎖まで含めたＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の立体構造モデルを作成することに成功した。
【００８５】
さらなる精密化を行い、分解能１．８Åの段階で、蛋白質の原子では解釈できない明瞭な電子密度を溶媒分子としてモデルに加えた（これについては後にさらに議論する）。精密化の最終段階では、４分子が全く同じ立体構造をとるという制限は外した。
【００８６】
（５）  最終モデルの決定
最終的なモデル（図８）には、Ｎ末端の第１番目のアミノ酸、メチオニンを除く全ての残基から構成される４つのＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）が含まれている。２０から１．８Åまでの実験データと最終モデルとの整合性を評価するＲ因子は２１．２％であり、高い精度で立体構造が決定されたことが示された。ＣＣＰ４内のＰＲＯＣＨＥＣＫプログラムを用いて、ラマチャンドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ）プロットを作成したところ、全残基の９８．５％がエネルギー的に安定なコンホメーションをとり、したがって、蛋白質立体構造を一般的に律する法則からみても問題がないことが明らかになった。平均の温度因子（Ｂ−ｆａｃｔｏｒ）は１７．３で、蛋白質の表面に位置しているために本来揺らいでいて決定できない側鎖以外は、全ての原子の位置が明瞭に決定されたことが明らかであった。
【００８７】
〔参考例３〕ＦＦＲＰのゲルろ過分析
大腸菌をはじめとする微生物由来のＦＦＲＰが、溶液中で２量体あるいは４量体を形成するとの報告がなされている。そこで、大腸菌で発現したＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）を、ゲルろ過（溶液中の分子の見かけの大きさを反映する）によって分析した。
【００８８】
すなわち、結晶化用に精製したＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）を  ３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、最終濃度が約１００μＭになるように調整した。ゲル（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｋ  １２５、７．８  ｘ  ３００ｍｍ）を用いて、同じ緩衝液を使用して、毎分１ｍｌの流速でろ過を実施し（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＬＣ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｉ  ｐｌｕｓシステムを使用）、時間とともに流出する蛋白質の状況を蛋白質の２２０ｎｍの光吸収で観測した。
【００８９】
その結果、複数のピークが確認された（図１６、精製１）一般に、ゲルろ過では、溶液中の見かけの大きさが大きいものから順に流出されるので、最初のピーク（図１６のピーク１）がＦＦＲＰ８量体に対応し、より遅く流出するピークはより低い会合状態に対応するものと考えられる。したがって、条件によって、８量体に至るまでの種々の会合体をＦＦＲＰは形成し、８量体を形成した時のＦＦＲＰの機能と、より低い会合状態にある時のＦＦＲＰの機能は異なると考えられた。
【００９０】
〔参考例４〕ＦＦＲＰを構成する原子の３次元座標の解析
（１）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）を構成する原子の３次元座標
ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）立体構造の原子３次元座標をプロテインデータバンク（ＰＤＢ）フォーマットで記載したものを〔表１〕に示す。該座標から、ＦＦＲＰが４分子（Ａ〜Ｄ）、および１９６個の水分子が非対称単位内に存在することがわかる。表１の１〜７行はこの非対称単位を結晶中と同様に繰り返すための情報である。８行目以降の各行では、左より、（１）原子の通し番号（１〜２５５６）、（２）原子の種類、つまり元素（ただしアミノ残基内での位置、すなわち化学結合に関する情報をも含み、同じ炭素、ＣでもＣＡやＣＢというように区別される）、（３）各原子が属するアミノ酸残基の種類（２０種類ある各アミノ酸を三文字で表記、例えばＶＡＬ、水分子の場合はＨＯＨと表記）と原子が属する分子の区別（例えばＦＦＲＰの場合Ａ〜Ｄのどれか、水分子の場合にはＷ）、（４）各単量体中でＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号（水分子の場合は１〜１９６の通し番号）、（５）Ｘ座標（オングストローム単位）、（６）Ｙ座標（オングストローム単位）、（７）Ｚ座標（オングストローム単位）、（８）占有率（その位置をその原子が占めている確率）、（９）等方性温度因子（熱運動による原子座標のゆらぎの示標、（１０）周期律表上の元素番号（６はＣ、７はＮ、８はＯ等）、（１１）再度、元素の種類（Ｃ、Ｏ、Ｎ等）を示している。
原子名はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法に従っているが、（２）においてはα、β、γ、δ、ε、ζ、およびηの代わりに、Ａ  、Ｂ  、Ｃ  、Ｄ  、Ｅ  、Ｚ  、およびＨを用い（ＣＡやＣＢ）、Ｃ末端の余分な酸素原子をＯＸＴ（ＯＴ）で表した。
【００９１】
（２）  ３次元座標の解析
１）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）会合体の形成
表１のデータを解析することにより、ＦＦＲＰ単量体は、４本鎖からなるβストランドと２本のαヘリックスから構成されることがわかった（図１５）。２つの単量体のβストランド各４鎖、合計８鎖は単一のβストランドを形成して２量体を形成する（図１５）。結晶中では、４つのこのような２量体がさらに会合して、円盤状の８量体を形成している（図３）。８量体円盤の直径は約６０Å、厚みは約４０Åであった。
【００９２】
２）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）立体構造の特徴
円盤状のＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）８量体の中央には、ちょうど５０円硬貨の中央のように、穴が貫通していた。この中央の穴から、各２量体間のすき間（４つ）へと十字型に空間が広がっている（図８）。この空間の形状、および、これをとりまくアミノ酸側鎖の種類とその立体的な配置は、ＦＦＲＰに作用するリガンドをスクリーニングするための重要な立体構造情報である。
【００９３】
中央の穴は、直径が約１２Å、貫通する長さが約３０Åのシリンダー状で、その広さは、アミノ酸２ヶを充填して多少余裕が残る程度であった。この穴に、会合体中の８つのＦＦＲＰのそれぞれから合計８組のアミノ酸側鎖群、９番のバリン、３７番のグルタミン酸、３８番のチロシン、６８番のメチオニン、７０番のセリンが面していた（９、３７、３８等の番号はＦＦＲＰ単量体の中でＮ末端から数えた該アミノ酸残基の番号、表１参照）。このうち３７番、３８番、６８番は２量体間のすき間へと連なる境界ともなっていた。
【００９４】
各２量体間のすき間（４つある）は、アミノ酸２ヶ程度を何とか充填できる、あるいは充填することによりすき間が押し広げられる程度の大きさであった。このすき間を、２個のＦＦＲＰのアミノ酸側鎖群、１５番のグルタミン酸、３３番のバリン、３５番のチロシン、３９番のアスパラギン酸、４９番のロイシン、５３番のアスパラギン酸、５６番のイソロイシン、５７番のトレオニン、６１番のアルギニン、６９番、７１番のトレオニン、７３番、７５番のイソロイシンがとり囲んでいた。
【００９５】
３）  リガンドをスクリーニングへの応用
会合体の穴からすき間へと広がる空間にリガンドが結合した場合、もしそのリガンドが空間の一部に完全に相補的で、これを埋めることができれば、８量体を安定化させ、８量体としてのＦＦＲＰの機能を発現することができる。一方、もしそのリガンドが空間よりも大きく、しかしながらＦＦＲＰへの高い結合定数を持つ場合には、二量体間の空間を拡張することにより８量体を解離させ、８量体としてのＦＦＲＰの機能を阻止する、あるいはより低い会合状態としてのＦＦＲＰの機能を発現させると予想された。そして、この部分が自然界に存在するリガンドの相互作用部位である可能性が極めて高いと考えられた。
【００９６】
このように、表１に示す３次元座標から作成されたＦＦＲＰの立体構造画像および／または数値情報は、穴からすき間へと広がる空間の形状を記述し、これに面する疎水性、親水性の様々な原子団の配置を定めるものである。したがって、これらの情報は、ＦＦＲＰに作用するリガンドをスクリーニングするためのきわめて有用な母体と考えられた。
【００９７】
〔参考例５〕ＦＦＲＰ結晶内にとりこまれた自然界のリガンドの位置
（１）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）結晶内への自然界のリガンドの取り込み
参考例１で得た結晶が自然界のリガンドが結合した状態であることを以下のようにして確認した。
１）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の精製（参考例１と異なる方法による精製）
参考例１の精製法に硫安による分画と疎水性カラムクロマトグラフィーを追加し、より厳しい条件で精製を行った。すなわち、熱処理後の遠心分離して得た上澄みに、４０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えて溶解した後、４℃  １８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その上澄みに再度、硫酸アンモニウムを加えて最終濃度が８０％飽和にした後、４℃  １８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した沈澱を以後の精製に用いた。沈澱は、３０ｍｌの３０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液に溶解した後、３０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液に対して透析した。また参考例１の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲルろ過の後に疎水性カラムクロマトグラフィーを加えた。すなわち、ゲルろ過により精製した蛋白質溶液に硫酸アンモニウムを１．６Ｍになるように加えた後、予め平衡化した［１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液を使用］、疎水性カラム［１．６  ｘ  １８ｃｍ（東ソー株式会社製、ＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ）］に注入後、同じ緩衝液でカラムを洗浄した。次に緩衝液中の硫酸アンモニウムの濃度を変化させながら（１．５から０Ｍまで直線的に下降する勾配）、カラムに通し、蛋白質を溶出させた。この間、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を使用して、流速を毎分２ｍｌとした。カラムからの流出液を４ｍｌずつ分取し、ＳＤＳ電気泳動法によりＦＦＲＰを含む画分を確認して保存した。
【００９８】
２）  会合状態の変化
電気泳動の結果、溶液中でのＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の見かけの分子量、つまり会合状態が変化していることが確認された（図１６、精製２）。これは参考例１の精製法に比べて、本精製法が蛋白質の変性を起こし易い条件であるため、大腸菌から取り込まれＦＦＲＰの会合を促進していたリガンドが解離し、８量体形成ができなかったものと考えられた。以上より、大腸菌細胞内にＦＦＲＰの会合を助けるような自然界のリガンドが存在し、参考例１の結晶は、これをだき込んでＦＦＲＰが結晶化したものと考えられた。
【００９９】
（２）  ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）蛋白質結晶内にとりこまれた自然界のリガンドの位置
ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の立体構造の最終モデルに含まれる蛋白質以外の部分（１９６個の水分子とされた部分）をさらに詳細に解析した。その結果、リガンドの可能性がある電子密度が２ヶ所、どちらも２量体の会合面上のすき間に同定された（図４）。
【０１００】
すでに記述したように、Ｘ線回折法によって実験的に得られるものは電子密度分布図であり、最終的に得られる立体座標はこの分布図に最も良く合うようにデザインされたモデルである。結晶中には多数の水分子が含まれているが水分子の様に小さい分子の位置を電子密度の中に同定することはきわめて困難である。水分子を構成する原子のうち、水素原子のＸ線回折能は極めて低いので（つまりＸ線では見えない）、実際には遊離した酸素原子１個を電子密度分布図に同定することになる。現在のモデルには、ＦＦＲＰに由来すると考えられる以外に電子密度があり、これを１９６個分の水分子、より正確には１９６個の酸素原子と同定している。もし大腸菌細胞に由来する、自然界のリガンドが結晶内にとりこまれているなら、このいずれかの電子密度に対応するはずである。
【０１０１】
リガンドの可能性を持つ電子密度を同定するために、まず、電子密度があまり高くない部分に対応する水分子（該蛋白質８量体の穴の中にある水分子６６個を含む）を削除した。これは、これらの原子がモデルの他の部分に影響して電子密度を歪めるのを防ぐためである。この改良モデルを用いて、立体構造の精密化をさらに数サイクル行い、電子密度分布との差（差フーリエマップと呼ぶ）を計算した。もしリガンドが存在するならこの差フーリエマップ上にその密度が観測されるはずである。差フーリエマップ上に、新たに観測された電子密度（カウンターレベルが３以上の、すなわち電子密度が強いもののみ）を、厳しい基準で検討し、周りに他の水分子（酸素原子）が存在せず、単独の水分子として蛋白質に非共有結合的に結合すると考えられるという箇所のみに、新たに水分子をモデルに加えた。この様にして判定を続けた結果、電子密度が水分子以上に連続していて、したがって、本来はより大きな分子を構成する可能性のある箇所が、非対称単位あたりに１ヶ所、該ＦＦＲＰ８量体あたりに２ヶ所同定された（図４）。リガンドに対応する可能性が高い２つの部位は、どちらも、２量体間のすき間部に位置する。それぞれの電子密度に水分子にして少なくとも４つ以上が対応し、全体としては、それぞれが中程度のアミノ酸（バリン、イソロイシン等）に対応する大きさであった。
【０１０２】
〔参考例６〕溶液中のＦＦＲＰと自然界に存在するリガンドの相互作用
各種アミノ酸や代謝の中間産物等の生体分子が、自然界に存在するリガンドとしてＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）会合体に作用することを確認した。
（１）  アミノ酸による結晶構造の変化
蛋白質の立体構造を変化させるリガンドを蛋白質の結晶内へと浸透させると、蛋白質の構造変化から結晶の規則性が維持できなくなり、結晶性が失われる場合があることが古くから知られている。そこでＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶に、２０種のアミノ酸のそれぞれを１０ｍＭ濃度で浸透させたところ、イソロイシン、バリン、メチオニン、ロイシンの場合にのみ、数時間後に、結晶の偏光性、結晶性が失われた。これ以外のアミノ酸を浸透させた時には、このような効果は観測されなかった。ただし、先の４つのアミノ酸によってひきおこされた変化が全て同じである保証はなく、また、変化が観測されなかったアミノ酸は、実際には結晶内に浸透できなかった可能性もあると考えられた。
【０１０３】
（２）  ゲルろ過分析
アミノ酸や代謝の中間産物との相互作用による、溶液中でのＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の会合状態の変化を、ゲルろ過を用いて解析した。
１）  試験方法
ゲル（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐａｋ  １２５、７．８  ｘ  ３００ｍｍ）を用い、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液を毎分１ｍｌで流し、蛋白質の流出を蛋白質による２２０ｎｍの吸光により観測した（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＬＣ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｉ  ｐｌｕｓシステムを使用）。ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）を厳しい精製２により調整し、２００  ｍＭ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液、２００ｍＭ塩化ナトリウム中に溶解し、本実験に使用するまで−８０℃で保存した。この試料を、各種低分子物質と３００  ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液で１０倍に希釈後、室温（約２５℃）で３０分間以上放置してから、ゲルろ過を行った。ゲルろ過を開始する時点では、ＦＦＲＰの濃度は単量体にして、約１００μＭ、天然型Ｌ体のアミノ酸２０種類の濃度は各１ｍＭ、代謝の中間産物である５種類の化合物、リンゴ酸、２‐オキソグルタル酸、オキサロ酢酸、ピルビン酸、３‐ホスホグリセリン酸の濃度は１０ｍＭである。
【０１０４】
２）  結果
イソロイシンを加えた試料では２番目のピークの量が増え、バリンを加えた試料では３番目のピークが増えた（図１７ａ）。６種類のアミノ酸（メチオニン、アルギニン、ロイシン、フェニルアラニン、アラニン、スレオニン）のいずれかを加えた場合には４番目のピークが増えた（図１７ｂ）。残りの１２種類のアミノ酸では、ゲルろ過の結果に大きな影響は見られなかった。炭素原子を４つ以上持つ３種の代謝中間産物（リンゴ酸、２‐オキソグルタル酸、オキサロ酢酸）を加えた場合には、３番目のピークが増え（図１７ｃ）、炭素原子を３つしか持たない２種の代謝中間産物（ピルビン酸、３‐ホスホグリセリン酸）では、ほとんど影響が見られなかった。
【０１０５】
ゲルろ過から早く流出されるＦＦＲＰほど会合度が高いと考えられることから、イソロイシンは会合度を上げる効果、６種類のアミノ酸（メチオニン、アルギニン、ロイシン、フェニルアラニン、アラニン、スレオニン）は会合度を下げる効果、バリン、および３種の代謝中間物（リンゴ酸、２‐オキソグルタル酸、オキサロ酢酸）は、中間的な会合度の状態を安定化する効果を持つと結論された。
【０１０６】
【表１】
ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）立体構造の原子３次元座標
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【０１０７】
【発明の効果】
本発明によれば、細菌の代謝や増殖、感染等を制御するＦＦＲＰを正確、かつ効率的に特定することができる。特定されたＦＦＲＰは、周知のリガンドスクリーニング法により、あるいは立体構造情報を利用したバーチャルスクリーニング法により、抗菌作用を有する化合物の探索を可能にする。
【０１０８】
【配列表】
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【０１０９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１  −配列の説明：Ｐｓ５０４７２７８
配列番号２  −配列の説明：Ｐｓ４４４５４８６
配列番号３  −配列の説明：Ｐｓ２４７２４４２
配列番号４  −配列の説明：Ｐｓ２２９１５８９
配列番号５  −配列の説明：Ｐｓ２２２０２５１
配列番号６  −配列の説明：Ｐｓ２９１４３５８
配列番号７  −配列の説明：Ｐｓ５３７２２６６
配列番号８  −配列の説明：Ｐｓ５９７７６１０
配列番号９  −配列の説明：Ｅｃ１０９３２３１２［Ｌｒｐ］
配列番号１０−配列の説明：Ｅｃ１３９２４１７３［ＡｓｎＣ］
配列番号１１−配列の説明：Ｅｃ１０４６８０６５
配列番号１２−配列の説明：ｐｏｔ０３００６４６
配列番号１３−配列の説明：ｐｏｔ１２１６１５１
配列番号１４−配列の説明：ｐｏｔ０１７５３３０
配列番号１５−配列の説明：ｐｏｔ１６６４６７９
配列番号１６−配列の説明：ｐｏｔ１６１３３６８
配列番号１７−配列の説明：ｐｏｔ０８３６６９６
配列番号１８−配列の説明：ｐｏｔ０８２８５６４
配列番号１９−配列の説明：ｐｏｔ０００８８２４
配列番号２０−配列の説明：ｐｏｔ０８６８４７７
配列番号２１−配列の説明：ｐｏｔ１７３５６５９
配列番号２２−配列の説明：ｐｏｔ０３０１５８３
配列番号２３−配列の説明：ｐｏｔ０４３４０１７
配列番号２４−配列の説明：ｐｏｔ０１２３００２
配列番号２５−配列の説明：ｐｏｔ０３７７０９０
配列番号２６−配列の説明：ＴＶＧ０３０７５８６
配列番号２７−配列の説明：ＴＶＧ０３６８２７４
配列番号２８−配列の説明：ＴＶＧ１２５４１３１
配列番号２９−配列の説明：ＴＶＧ１４０９４４４
配列番号３０−配列の説明：ＴＶＧ１１７９７４９
配列番号３１−配列の説明：ＴＶＧ０６５１５６４
配列番号３２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３３−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は各種細菌のＦＦＲＰのアミノ酸配列の対応関係（マルチプルアラインメント）を示す。図中、αヘリックス内の疎水性の位相を＊で示し、この位相上にあるイソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンを太字で示す。αヘリックス以外の部分では、各位置で最も頻繁に出現するアミノ酸種を太字で示す。
【図２】図２は、ＦＦＲＰ分子の系統を示す図である。図中、ブートストラップ値が５００以上のものの分岐点を赤丸で、３５０以上５００未満のものを黒丸で示す。４つのデミＦＦＲＰを緑で、緑膿菌のＦＦＲＰ８種が含まれる２つのサブグループを赤、青で示す。
【図３】図３は、ＦＦＲＰに作用する薬剤が標的とすべきアミノ酸３２位置を示す図である。図中、「▲３▼ロイシン結合のモデリング」では、ｐｏｔ１２１６１５１に沿うようにロイシンをモデルした時（図９）にうまく結合（○）、あるいはぶつかる（×）残基を示す。
【図４】図４は、古細菌（Ｐ．  ＯＴ３）のＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）の結晶構造を針金モデルで表現した図である。図中、ＦＦＲＰ結晶中に同定された大腸菌由来の未同定リガンドの電子密度を赤で示す。
【図５】図５は、図４のリガンド電子密度を拡大し、この電子密度にあわせてバリン分子を配置した図である。図中、バリン分子は針金状に表現され、赤は酸素原子、青は窒素原子、黄色は炭素原子を示す。水素原子は省略。
【図６】図６は、ｐｏｔ１２１６１５１において大腸菌由来の未同定会合促進因子と６Å以内にある残基、およびこの位置に対応する他のＦＦＲＰ分子の残基を示す。図中、赤は大腸菌Ｌｒｐとは共通するが、Ｅｃ０４６８０６５とは異なる残基種；青はＥｃ０４６８０６５とは共通するが、大腸菌Ｌｒｐとは異なる残基種；緑は両者と共通する残基種を示す。
【図７】図７は、大腸菌Ｌｒｐのロイシン結合に関与する可能性を持つ位置、およびこれに対応する古細菌ＦＦＲＰの残基種を示す。図中、赤は大腸菌Ｌｒｐとは共通するが、Ｅｃ０４６８０６５とは異なる残基種；青はＥｃ０４６８０６５とは共通するが、大腸菌Ｌｒｐとは異なる残基種；緑は両者と共通する残基種を示す。
【図８】図８は、大腸菌Ｌｒｐのロイシン結合に関与する可能性を持つ７ヶ所に対応するｐｏｔ１２１６１５１の位置（青）を示すリボンダイアグラムである。
【図９】図９は、ｐｏｔ１２１６１５１へのロイシン（黄色）の結合のモデルを示すリボンダイアグラムである。図９では、図１０を矢印から観たときの、矢印側の２つの２量体とロイシン１分子のみを図示する。モデルの上半分では、図８の青色の位置を青で、これ以外に２量体間のすきまを形成している残基を緑で示す。モデルの下半分では、モデルしたロイシン分子とうまく結合している残基を青で、またぶつかっている３残基を赤で示す。
【図１０】図１０は、ｐｏｔ１２１６１５１へのロイシンの結合のモデルを示すリボンダイアグラムである。
【図１１】図１１は、ｐｏｔ１２１６１５１に沿ってロイシンをモデルすると接近する位置、あるいはこれと対応する他ＦＦＲＰ分子の残基を示す。図中、赤は大腸菌Ｌｒｐとは共通するが、Ｅｃ０４６８０６５とは異なる残基種；青はＥｃ０４６８０６５とは共通するが、大腸菌Ｌｒｐとは異なる残基種；緑は両者と共通する残基種を示す。
【図１２】図１２は、ｐｏｔ１２１６１５１において、２量体間のすきまに側鎖が面する残基、および他のＦＦＲＰにおいてこれに対応する残基を示す。図中、赤は大腸菌Ｌｒｐとは共通するが、Ｅｃ０４６８０６５とは異なる残基種；青はＥｃ０４６８０６５とは共通するが、大腸菌Ｌｒｐとは異なる残基種；緑は両者と共通する残基種を示す。
【図１３】図１３は、図３に示す３２位置の一部を並べかえたものである。
【図１４】図１４は、ＤＮＡ認識に関与すると同定したＦＦＲＰの部位を示す。図中、赤は大腸菌Ｌｒｐとは共通するが、Ｅｃ０４６８０６５とは異なる残基種；青はＥｃ０４６８０６５とは共通するが、大腸菌Ｌｒｐとは異なる残基種；緑は両者と共通する残基種を示す。
【図１５】図１５は、ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）２量体の立体構造のリボンダイアグラムを示す。
【図１６】図１６は、ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）のゲルろ過を示す（精製１：実施例の条件［黒］、精製２：より厳しい条件［赤］）。
【図１７】図１７は、ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）蛋白質のゲルろ過分析の結果を示す。図中、ＦＦＲＰ（ｐｏｔ１２１６１５１）蛋白質を［黒］で示す。ａおよびｂは、各アミノ酸存在下でのゲルろ過分析結果；ｃはリンゴ酸［赤］、２−オキソグルタル酸［緑］、オキサロ酢酸［青］存在下でのゲルろ過分析結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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