(57)【要約】【課題】患者の状態を決定する方法や、このような患者の全生存を予測する方法を提供すること。【解決手段】癌患者、特に悪性血液疾患の患者の治療法であって、患者の遺伝子発現プロファイル及び／または分子マーカーを分析して、患者の状態及び／または予後を決定するステップを含む。本発明はまた、非再発性または非難治性患者がファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、場合によっては他の薬物の治療に対して応答し易いか否かを分析する方法も提供する。この方法は、患者の治療の監視及び治療方法の選択にも有用である。ＦＴＩ治療に応答して調節された遺伝子を得て、これをプロファイルの作成に用いることができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の予後（生存／転帰）を評価する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがＡＭＬの予後を示していることを特徴とする方法。
【請求項２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の状態を決定する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがＡＭＬの状態を示していることを特徴とする方法。
【請求項３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の治療プロトコルを決定する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、治療に対して患者が応答する可能性を十分に示し、医師が適切な治療の程度及び種類を決定することができることを特徴とする方法。
【請求項４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップであって、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、前記患者が治療に応答する可能性を示す、前記ステップと、
（ｃ）前記患者が治療に応答しそうな場合に前記患者をアジュバント療法で治療することを特徴とする方法。
【請求項５】
（５）前記患者が再発性または難治性ＡＭＬであることを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記配列番号が１、５、及び６であることを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項７】
更に、前記サンプル中で恒常的に発現している少なくとも１種類の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項８】
発現パターンの比較をパターン認識法で行うことを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項９】
前記パターン認識法がＣｏｘ比例ハザード分析の使用を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して前記サンプルで少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現であることを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して、転移細胞を有する前記サンプルで少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現であることを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐ値が０．０５未満であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現をマイクロアレイまたは遺伝子チップで測定することを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロアレイがｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロアレイまたは前記遺伝子チップが更に、１または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現を、前記サンプルから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で核酸を増幅して決定することを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＣＲが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＴ‐ＰＣＲが更に、１または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子発現を、その遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出して検出することを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質を、そのタンパク質に特異的な抗体によって検出することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子発現をその遺伝子の特性を測定して検出することを特徴とする請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定した特性が、ＤＮＡ増幅、メチル化、突然変異、及び対立遺伝子変異体からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の予後患者レポートを作成する方法であって、
（ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）前記サンプルの遺伝子発現を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得た結果を用いて前記レポートを作成するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記レポートが、前記患者の転帰の評価及び／または患者集団に対するリスクの可能性を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が再発性または難治性の患者であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３に従った方法で作成した患者レポート。
【請求項２７】
配列番号１‐２２、または表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択される少なくとも１つのプローブセットを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２８】
生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を決定するためのアッセイを行うためのキットであって、
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とするキット。
【請求項２９】
前記配列番号が１、５、及び６であることを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を評価するための製品であって、
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とする製品。
【請求項３３】
前記配列番号が１、５、及び６であることを特徴とする請求項３２に記載の製品。
【請求項３４】
更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする請求項３２に記載の製品。
【請求項３５】
更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする請求項３２に記載の製品。
【請求項３６】
請求項１、２、３、または４の方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップ。
【請求項３７】
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする請求項３６に記載のマイクロアレイ。
【請求項３８】
測定または特徴付けが１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現であることを特徴とする請求項３６に記載のマイクロアレイ。
【請求項３９】
測定により統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする請求項３６に記載のマイクロアレイ。
【請求項４０】
前記ｐ値が０．０５未満である特徴とする請求項３９に記載のマイクロアレイ。
【請求項４１】
ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含むことを特徴とする請求項３６に記載のマイクロアレイ。
【請求項４２】
更に、１または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする請求項３６に記載のマイクロアレイ。
【請求項４３】
診断／予後ポートフォリオであて、
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、
前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする診断／予後ポートフォリオ。
【請求項４４】
測定または特徴付けが１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現であることを特徴とする請求項４３に記載のポートフォリオ。
【請求項４５】
測定により統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする請求項４３に記載のポートフォリオ。
【請求項４６】
前記ｐ値が０．０５未満である特徴とする請求項４５に記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、言及することにより２００４年１２月１７日出願の米国特許出願第６０／６３７，２６５号を包含するものとする。
【０００２】
本発明は、分子マーカーの検出及び／または遺伝子発現の分析に基づいた急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の診断、予後、及び治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在は、核型分析が、予後値を得るのに有効であり、生物学的に異なるＡＭＬのサブタイプを同定するのに有用である。加えて、ＦＬＴ３、ｃ‐ＫＩＴ、ＡＭＬ１、ＧＡＴＡ１、ＣＥＢＰＡ、及びＮ‐ＲＡＳなどの遺伝子の変異は疾患の病因に関与している。ＦＬＴ３及びＣＥＢＰＡの変異のスクリーニングにより再発のリスクが異なる複数の群に階層分類できることが明らかである。有効なリスクの階層分類により、同種幹細胞移植や他のアジュバント療法の適切な使用が可能となる。近年発行された２つの研究論文に、新たに診断された成人ＡＭＬ患者の遺伝子発現のプロファイリングと、このプロファイリングを用いた臨床結果の予測が記載されている（ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）、及びバルク（Valk）ら（２００４年））。これらの研究論文には、遺伝子発現プロファイリングにより如何に臨床結果の予測を改善できるかが示されている。
【０００４】
バルクら（２００４年）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａチップで２８５人の患者の骨髄または末梢血を調べた。これらの患者のサンプルには、様々な細胞遺伝学的異常や分子異常が含まれていた。僅か１６のクラスターが同定され、ＡＭＬが以前に考えらていた程は異種性でないことが示された。複数のクラスターが、細胞遺伝学的及び分子的に決定されたＡＭＬのサブタイプに良く一致するため、これらのクラスターをＷＨＯ分類システムに用いることができる。これらのクラスターはまた、ブリンガーら（２００４年）及び他の既に発行されている研究論文でも見出されている（スコック（Schoch）ら（２００２年）、デベルナルディ（Debernardi）ら（２００３年）、及びコールマン（Kohlmann）ら（２００３年））。驚くべきことではないが、これらのクラスターは、周知の予後の核型に関連しており、予後に相関している。
【０００５】
ブリンガーら（２００４年）は、ｃＤＮＡアレイを用いて１１６人の成人患者（６５の抹消血と５４の骨髄）の発現プロファイルを調べた。バルクら（２００４年）による研究に加えて、ブリンガーらは、全ての細胞遺伝学的リスク群の臨床結果を予測するための１３３遺伝子クラシファイアも開発した。５９サンプルの訓練セットと５７サンプルの検査セットを用いて、ブリンガーらは、１３３の遺伝子で患者を不良な結果の群と良好な結果の群に分けることができることを示した（ｐ＝０．００６ ｌｏｇランク、オッズ比：１０、９５％ ＣＩ、２．６‐２９．３）。
【０００６】
これら両方の研究で同定された遺伝子は、小児白血病で既に同定されている予測遺伝子（predictor gene）と一部が重複することに留意されたい（ヤギ（Yagi）ら（２００３年））。また、ブリンガーら（２００４年）によって同定された予後遺伝子セットと近年同定されたティピファニブ（tipifarnib）に対する応答を予測する３つの遺伝子は重複していない（米国特許出願第１０／８８３，４３６号）。
【０００７】
ファルネシルトランスフェラーゼ酵素（ＦＴａｓｅ）は、カーボンファルネシル部分のＣ末端ＣＡＡＸ（Ｃ：システイン、Ａ：脂肪族残基、Ｘ：任意のアミノ酸）認識モチーフへの共有結合を仲介する（レイス（Reiss）ら（１９９０年））。このようなファルネシル化では、３個の末端アミノ酸（ＡＡＸ）の切断とＣ末端イソプレニル‐システインのメチル化が続く。タンパク質のファルネシル化を阻害すると、タンパク質の作用に必要な正確な細胞内局在化が抑制される。当初は、発癌Ｒａｓタンパク質が、癌生物学におけるＦＴＩｓの増殖抑制効果のターゲットと考えられていた（ロイター（Reuter）ら（２０００年））。しかしながら、Ｒａｓファルネシル化の阻害ではティピファニブ（tipifarnib）の全ての作用を説明できないことが示された。例えば、ＦＴＩｓは、抗腫瘍作用を得るために常に変位Ｒａｓタンパク質を必要とするわけではない（カープ（Karp）ら（２００１年））。実際に、初期の臨床試験は、進行した結腸直腸癌及び膵臓癌などの高頻度のｒａｓ変位の頻度が高い集団に対してデザインされていたが、プラセボと比較した場合に反応率に有意差が見られなかった（ファン・カッツエン（Van Cutsem）ら（２００４年）、ラオ（Rao）ら（２００４年））。
【０００８】
他の複数のファルネシル化タンパク質は、低分子量ＧＴＰ加水分解酵素タンパク質Ｒｈｏ Ｂ、セントロメアタンパク質ＣＥＮＰ‐Ｅ及びＣＥＮＰ‐Ｆ、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰ‐ＣＡＡＸ、及び核膜構造ラミンＡ及びＢ（nuclear membrane structural lamins A and B）を含むＦＴＩｓの腫瘍抑制効果を仲介できる候補ターゲットとして意味付けられた。これらのタンパク質のファルネシル化を阻害すると、ＦＴＩｓの抗増殖効果が起こり、ＴＧＦβＲＩＩ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ２、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＮＦ‐κＢ、及びＶＥＧＦを含む複数の重要なシグナル伝達分子を関節的に調節する（アドナン（Adnane）ら（２０００年）、モーガン（Morgan）ら（２００１年）、ジャン（Jiang）ら（２０００年）、ナ（Na）ら（２００４年）、タカダ（Takada）ら（２００４年）、及びチャン（Zhang）ら（２００２年））。これらのシグナル伝達経路の調節により、細胞の成長、増殖、及びアポトーシスが変更される。従って、ＦＴＩｓは、複数の細胞事象及び細胞経路に対して複雑な抑制効果を有するであろう。
【特許文献１】米国特許第５，２４２，９７４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３８４，２６１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４０５，７８３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４１２，０８７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４２４，１８６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４２９，８０７号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４３６，３２７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【特許文献９】米国特許第５，４７２，６７２号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，５２７，６８１号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，５２９，７５６号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５３２，１２８号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，５４５，５３１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，５５４，５０１号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，５５６，７５２号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，５６１，０７１号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，５７１，６３９号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，５９３，８３９号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，５９９，６９５号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，６２４，７１１号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，６５８，７３４号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，７００，６３７号明細書
【特許文献２３】米国特許第６，００４，７５５号明細書
【特許文献２４】米国特許第６，１３３，３０５号明細書
【特許文献２５】米国特許第６，２１８，１１４号明細書
【特許文献２６】米国特許第６，２１８，１２２号明細書
【特許文献２７】米国特許第６，２７１，００２号明細書
【特許文献２８】米国特許第６，２７１，２１０号明細書
【特許文献２９】米国特許第６，２８４，７６４号明細書
【特許文献３０】米国特許第６，３０６，８９７号明細書
【特許文献３１】欧州特許第４３０，４０２号明細書
【非特許文献１】アドナン（Adnane）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼの阻害によるＴＧＦβＩＩ型受容体の発現の増大及びＴＧＦβに対するヒト癌細胞の応答の促進（Inhibition of farnesyltransferase increases TGFbeta type II receptor expression and enhances the responsiveness of human cancer cells to TGFbeta）」、オンコジーン（Oncogene）、２０００年、１９：５５２５−５５３３
【非特許文献２】アルバートソン（Albertson）著、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO Journal）、１９８４年、３：１２２７−１２３４
【非特許文献３】アルシナ（Alsina）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ＦＴＩ−Ｒ１１５７７７が、認められており、疾患を安定させ、多発性骨髄腫の患者のファルネルシル化及び発癌及び／または腫瘍の生存経路を阻害する（Farnesyltransferase inhibitor FTI-R115777 is well tolerated, induces stabilization of disease, and inhibits farnesylation and oncogenic/tumor survival pathways in patients with advanced multiple myeloma）」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヒーマトロジー（European Journal of Haematology）、２００３年、７０：２６９
【非特許文献４】ブラナー（Brunner）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤：臨床前検査及び臨床検査の結果の概要（Farnesyltransferase inhibitors: an overview of the results of preclinical and clinical investigations）」、カンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００３年、６３：５６５６‐５６６８
【非特許文献５】ブリンガー（Bullinger）ら著、「遺伝子発現プロファイリングを用いた成人急性骨髄性白血病における予後サブクラスの同定（Use of gene-expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloid leukemia）」、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（New England Journal of Medicine）、２００４年、３５０：１６０５‐１６１６
【非特許文献６】カー（Carr）ら著、「両親媒性へリックス結合モチーフを介してｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの調節サブユニットとＲＩＩアンカータンパク質との相互作用が起こる（Interaction of the regulatory subunit (RII) of cAMP-dependent protein kinase with RII-anchoring proteins occurs through an amphipathic helix binding motif）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、１９９１年、２６６：１４１８８‐１４１９２
【非特許文献７】チャン（Chang）ら著、「乳癌患者におけるドセタキセルに対する治療応答の予測のための遺伝子プロファイリング（Gene expression profiling for the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer）」、ランセット（Lancet）、２００３年、３６２：３６２‐３６９
【非特許文献８】チョク（Cheok）ら著、「遺伝子発現の治療特異的変化でヒト白血病細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏ薬物応答を識別する（Treatment-specific changes in gene expression discriminate in vivo drug response in human leukemia cells）」、ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genetics）、２００３年、３４：８５‐９０
【非特許文献９】コーテス（Cortes）ら著、「慢性骨髄性白血病及び他の悪性血液疾患におけるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤Ｒ１１５７７７の効果（Efficacy of the farnesyl transferase inhibitor R115777 in chronic myeloid leukemia and other hematologic malignancies）」、ブラッド（Blood）、２００３年、１０１：１６９２‐１６９７
【非特許文献１０】コックス（Cox）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤：可能性と現実（Farnesyltransferase inhibitors: promises and realities）」、カレント・オピニオン・イン・ファーマコロジー（Current Opinion in Pharmacol.）、２００２年、２：３８８‐３９３
【非特許文献１１】デバルナルディ（Debernardi）ら著、「正常な核型の急性骨髄性白血病のゲノム規模の解析により転座仲介融合事象とは異なるホメオボックス遺伝子発現のユニークなパターンが明らかにされた（Genome-wide analysis of acute myeloid leukemia with normal karyotype reveals a unique pattern of homeobox gene expression distinct from those with translocation-mediated fusion events）」、ジーンズ、クロモソームズ・アンド・カンサー（Genes , Chromosomes and Cancer）、２００３年、３７：１４９‐１５８
【非特許文献１２】エンド（End）ら著、「ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の特徴づけ（Characterization of the antitumor effects of the selective farnesyl protein transferase inhibitor R115777 in vivo and in vitro）」、カンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００１年、６１：１３１‐１３７
【非特許文献１３】エステバ（Esteva）ら著、「ＨＥＲ‐２を過剰発現している転移性乳癌患者に対する毎週のドセタキセル及びハーセプチン（trastuzumab）のフェーズ３試験（Phase III study of weekly docetaxel and trastuzumab for patients with HER-2-overexpressing metastatic breast cancer）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Journal of Clinical Oncology）、２００３年、２０：１８００‐１８０８
【非特許文献１４】フォイスナー（Foisner）ら著、「プレクチン（plectin）とラミンＢ（lamin B）及びビメンチンとのプロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣ調節性相互作用（Protein kinase A-and protein kinase C-regulated interaction of plectin with lamin B and Vimentin）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９９１年、８８：３８１２‐３８１６
【非特許文献１５】ポールＤ．ロビンス（Paul D. Robbins）編集、「遺伝子治療プロトコルズ（Gene Therapy Protocols）」、ニュージャージー州トトワ（Totowa NJ）のヒューマン・プレス（Human press）、１９９６年
【非特許文献１６】アルソー（Harousseau）ら著、「再発性または難治性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者におけるＺａｒｎｅｓｔｒａ（商標）（Ｒ１１５７７７）：多施設フェーズ２試験の結果（ZarnestraTM（R115777）in patients with relapsed or refractory acute myelogenous leukemia （AML）: results of a multicenter phase 2 study）」、ブラッド（Blood）、２００３年、１０２：１７６ａ．アブストラクト６１４
【非特許文献１７】ホフマン（Hofmann）ら著、「チロシンキナーゼ阻害剤ＳＴＩ５７１に対するショウジョウバエ染色体陽性急性リンパ芽球性白血病の耐性と遺伝子発現プロファイルとの関係：遺伝子発現の研究（Relation between resistance of Philadelphia-chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia to the tyrosine kinase inhibitor ST1571 and gene-expression profiles: a gene-expression study）」、ランセット（Lancet）、２００２年、３５９：４８１‐４８６
【非特許文献１８】ジェンセン（Jensen）ら著、「原発性及び再発性乳癌におけるエストロゲン受容体及び増殖マーカー（Estrogen receptors and proliferation markers in primary and recurrent breast cancer）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２００１年、９８：１５１９７‐１５２０２
【非特許文献１９】ジャン（Jiang）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤誘導性アポトーシスの重要な標的としてのホスホイノシチド３‐ＯＨキナーゼ／ＡＫＴ２経路（The phosphoinositide 3-OH kinase/AKT2 pathway as a critical target for farnesyltransferase inhibitor-induced apoptosis）」、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）、２０００年、２０：１３９‐１４８
【非特許文献２０】ジョンストン（Johnston）ら著、「進行した乳癌におけるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤Ｒ１１５７７７の２つの投薬計画の効果及び耐容性のベーズＩＩ試験（Phase II study of the efficacy and tolerability of two dosing regimens of the farnesyltransferase inhibitor , R115777, in advanced breast cancer）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Journal of Clinical Oncology）、２００３年、２１：２４９２‐２４９９
【非特許文献２１】カリオニエミ（Kallioniemi）著、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９９２年、８９：５３２１‐５３２５
【非特許文献２２】カープ（Karp）ら著、「再発性及び難治性急性白血病成人患者におけるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤Ｒ１１５７７７の臨床的及び生物学的活性：フェーズ１臨床検査質相関性試験（Clinical and biologic activity of the farnesyltransferase inhibitor R115777 in adults with refractory and relapsed acute leukemias: a phase 1 clinical-laboratory correlative trial）」、ブラッド（Blood）、２００１年、９７：３３６１‐３３６９
【非特許文献２３】コールマン（Kohlmann）ら著、「マイクロアレイ技術を用いた急性白血病の分子的特徴づけ（Molecular characterization of acute leukemias by use of microarray technology）」、ジーンズ、クロモソーム・アンド・カンサー（Genes, Chromosomes and Cancer）、２００３年、３７：３９６‐４０５
【非特許文献２４】カーズロック（Kurzrock）ら著、「脊髄形成異常症候群におけるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤Ｒ１１５７７７のフェーズ２試験（Phase II study of R115777, a farnesyl transferase inhibitor, in myelodysplastic syndrome）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Journal of Clinical Oncology）、２００４年、２２：１２８７‐１２９２
【非特許文献２５】ランセット（Lancet）ら著、「悪性血液疾患におけるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤：治療における展望（Farnesyltransferase inhibitors in hematologic malignancies: new horizons in therapy）」、ブラッド（Blood）、２００３年、１０２：３８８０‐３８８９
【非特許文献２６】リ（Li）ら著、「造血特異的ＧＴＰ結合タンパク質ＰｈｏＨはＧＴＰ加水分解酵素が不足しており、抑制作用によって他のＲｈｏ ＧＴＰ加水分解酵素の活性を変化させる（The hematopoiesis-specific GTP-binding protein PhoH is GTPase deficient and modulates activities of other Rho GTPases by an inhibitory function）」、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）、２００２年、２２：１１５８‐１１７１
【非特許文献２７】リンチ（Lynch）ら著、「ゲフィニチブ（Gefitinib）に対する非小細胞肺癌の反応性の基礎となる上皮成長因子受容体における変異の活性化（Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small cell lung cancer to Gefitinib）」、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（New England Journal of Medicine）、２００４年、３５０：２１２９‐２１３９
【非特許文献２８】マックリーン（Mclean）ら著、「急性骨髄性白血病患者のイマチニブ（imatinib）での治療における細胞遺伝学的応答の薬理ゲノミクス分析（Pharmacogenomic analysis of cytogenetic response in chronic myeloid leukemia patients treated with imatinib）」、クリニカル・カンサー・リサーチ（Clinical Cancer Research）、２００４年、１０：１５５‐１６５
【非特許文献２９】クー（Choo）編集、「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロトコルズ（In Situ Hybridization Protocols）」、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods in Molecular Biology）、ニュージャージー州トトワ（Totowa , NJ）のヒューマン・プレス（Humana Press）、第３３巻
【非特許文献３０】モーガン（Morgan）ら著、「ＲＡＳシグナル伝達の阻害による骨髄性白血病細胞系のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ−１／２）の細胞周期依存性の活性化及び成長抑制とアポトーシスの誘導（Cell-cycle-dependent activation of mitogen-activated protein kinase kinase （MEK-1/2） in myeloid leukemia cell lines and induction of growth inhibition and apoptosis by inhibitors of RAS signaling）」、ブラッド（Blood）、２００１年、９７：１８２３‐１８３４
【非特許文献３１】ナ（Na）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼの阻害により、ｐ２１（ｒａｓ）依存性ＮＦ‐κＢ活性化が抑制され炎症遺伝子発現が下方制御されコラーゲン誘導関節炎が防止される（Inhibition of farnesyltransferase prevents collagen-induced arthritis by down-regulation of inflammatory gene expression through suppression of p21 (ras)-dependent NF-kappaB activation）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology）、２００４年、１７３：１２７６‐１２８３
【非特許文献３２】オクツ（Okutsu）ら著、「ゲノム規模ｃＤＮＡマイクロアレイ分析によって選択された２８の遺伝子の発現レベルに従った急性骨髄性白血病患者の化学的感受性の推測（Prediction of chemosensitivity for patients with acute myeloid leukemia, according to expression levels of 28 genes selected by genome-wide complementary DNA microarray analysis）」、モレキュラー・カンサー・セラピューティクス（Molecular Cancer Therapeutics）、２００２年、１：１０３５‐１０４２
【非特許文献３３】パエズ（Paez）ら著、「肺癌におけるＥＧＦＲ変異：ゲフィニチブ（Gefitinib）に対する非小細胞肺癌の反応性の基礎となる上皮成長因子受容体における変異を活性化させるゲフィニチブ治療に対する臨床反応の相関性（EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to Gefitinib）」、サイエンス（Science）、２００４年、３０４：１４９７‐１５００
【非特許文献３４】パスクアルッチ（Pasqualucci）ら著、「びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫における複数のプロトオンコジーンの超変異（Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas）」、ネイチャー（Nature）、２００１年、４１２：３４１‐３４６
【非特許文献３５】ピンケル（Pinkel）著、「ヒト染色体特異的ライブラリーを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：トリソミー２１の検出及び染色体４の転座（Fluorescence in situ Hybridization with Human Chromosome-Specific Libraries: Detection of Trisomy 21 and Translocations of Chromosome 4）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９８８年、８５：９１３８‐９１４２
【非特許文献３６】ピンケル（Pinkel）ら著、「マイクロアレイに対する競合ゲノムハイブリダイゼーションを用いたＤＮＡコピー数変動の高解像度分析（High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays）」、ネイチャー・ゲネティクス（Nature Genetics）、１９９８年、２０：２０７‐２１１
【非特許文献３７】ラオ（Rao）ら著、「進行した難治性結腸直腸癌におけるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤Ｒ１１５７７７のフェーズ３二重盲検プラセボ対照試験（Phase III Double-Blind Placebo-Controlled Study of Farnesyl Transferase Inhibitor R115777 in Patients With Refractory Advanced Colorectal Cancer）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Journal of Clinical Oncology）、２００４年、２２：３９５０‐３９５７
【非特許文献３８】レイス（Reiss）ら著、「Ｃｙｓ’ＡＡＸテトラペプチドによる精製されたｐ２１ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの阻害（Inhibition of purified p21ras farnesyl: protein transferase by Cys'AAX tetrapeptides）」、セル（Cell）、１９９０年、６２：８１‐８８
【非特許文献３９】ロイター（Reuter）ら著、「Ｒａｓシグナル伝達経路のターゲッティング：合理的な機構に基づいた悪性血液疾患の治療（Targeting the Ras signaling pathway: a rational, mechanism-based treatment for hematologic malignancies?）」、ブラッド（Blood）、２０００年、９６：１６５５‐１６６９
【非特許文献４０】サハイ（Sahai）ら著、「ＲＨＯ−ＧＴＰ加水分解酵素と癌（RHO-GTPases and cancer）」、ネイチャー・レビュー・カンサー（Nature Reviews Cancer）、２００２年、２：１３３‐１４２
【非特許文献４１】スコッチ（Schoch）ら著、「相互に再編成された急性骨髄性白血病は特殊な遺伝子発現プロファイルで識別できる（Acute myeloid leukemias with reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene expression profiles）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２００２年、９９：１０００８‐１００１３
【非特許文献４２】ステルペッチ（Sterpetti）ら著、「形質転換及びターゲッティングを調節する延長Ｃ末端の切断によるＬｂｃ Ｒｈｏ交換因子プロトオンコジーンの活性化（Activation of the Lbc Rho exchange factor proto-oncogene by truncation of an extended C terminus that regulates transformation and targeting）」、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）、１９９９年、１９：１３３４‐１３４５
【非特許文献４３】スターチャン（Starchan）及びリード（Read）著、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Human Molecular Genetics）、１９９６年
【非特許文献４４】タカダ（Takada）ら著、「タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＳＣＨ６６３３６）が、様々な発癌物質及び炎症刺激によって誘導されるＮＦ‐κＢ活性化を停止し、ＮＦ‐κＢ調節性遺伝子発現が抑制され、アポトーシスが促進される（Protein farnesyltransferase inhibitor (SCH66336) abolishes NF-kappaB activation induced by various carcinogens and inflammatory stimuli leading to suppression of NF-kappaB-regulated gene expression and up-regulation of apoptosis）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、２００４年、２７９：２６２８７‐２６２９９
【非特許文献４５】テスタ（Testa）ら著、「急性白血病におけるインターロイキン３受容体（Interleukin-3 receptor in acute leukemia）」、ルキミーア（Leukemia）、２００４年、１８：２１９‐２２６
【非特許文献４６】トーマス（Thomas）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩ）であるＲ１１５７７７は慢性骨髄性白血病患者に有意な抗白血病活性を有する（R115777, a farnesyl transferase inhibitor（FTI）, has significant anti-leukemia activity in patients with chronic myeloid leukemia （CML））」、ブラッド９８（Blood 98）、２００１年、
【非特許文献４７】ティッセン（Tijssen）著、「生化学及び分子生物学における検査室手技（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」、ハイブリダイゼーション・ウイズ・ニュークリック・アシッド・プローブス（Hybridization With Nucleic Acid Probes）、第２４巻、ニューヨーク州エルスビアー（Elsevier, NY）
【非特許文献４８】トクソズ（Toksoz）ら著、「シグナル伝達産物に対する異なる相同領域の形質移入によって検出された新規のヒトオンコジーンｌｂｃ（Novel human oncogene lbc detected by transfection with distinct homology regions to signal transduction products）」、オンコジーン（Oncogene）、１９９４年、９：６２１‐６２８
【非特許文献４９】バルク（Valk）ら著、「急性骨髄性白血病の予後に有用な遺伝子発現プロファイル（Prognostically useful gene-expression profiles in acute myeloid leukemia）」、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（New England Journal of Medicine）、２００４年、３５０：１６１７‐１６２８
【非特許文献５０】ファン・カッツエン（Van Cutsem）ら著、「進行膵臓癌におけるゲムシタビン（gemcitabine）とプラセボに対するゲムシタビンとティピファニブのフェーズ３試験（Phase III trial of gemcitabine plus tipifarnib compared with gemcitabine plus placebo in advanced pancreatic cancer）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Journal of Clinical Oncology）、２００４年、２２：１４３０‐１４３８
【非特許文献５１】ヤギ（Yagi）ら著、「小児ＡＭＬの予後に関連した遺伝子発現シグネチャの同定（Identification of a gene expression signature associated with pediatric AML prognosis）」、ブラッド（Blood）、２００３年、１０２：１８４９‐１８５６
【非特許文献５２】チャン（Zhang）ら著、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤によるＦａｓ遺伝子発現のＲａｓ仲介阻害の逆転（Farnesyltransferase inhibitors reverse Ras-mediated inhibition of Fas gene expression）」、カンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００２年、６２：４５０‐４５８
【非特許文献５３】チェン（Zheng）ら著、「ｌｂｃオンコジーンの作用における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の直接関与（Direct involvement of the small GTP-binding protein Rho in lbc oncogene function）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、１９９５年、２７０：９０３１‐９０３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在は、このような患者の状態を決定する方法や、このような患者の全生存を予測する方法が存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、急性骨髄性白血病患者の予後の予測に１または複数の遺伝子シグネチャを用いる方法である。このような遺伝子シグネチャは、薬物治療の種類によって単独または組み合わせて用いることができる。
【００１１】
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の予後（生存／転帰）を評価する方法を含む。この方法は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の生体サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルがＡＭＬの予後を示す。
【００１２】
本発明は、ＡＭＬ患者の状態を決定する方法を含む。この方法は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の生体サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルがＡＭＬの状態を示す。
【００１３】
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の治療プロトコルを決定する方法を含む。この方法は、前記患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の生体サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルが、治療に対して患者が応答する可能性を十分に示し、医師が適切な治療の程度及び種類を決定することができる。
【００１４】
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者を治療する方法を含む。この方法は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の生体サンプルにおける発現レベルを測定するステップであって、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルが、患者が治療に応答する可能性を示す、前記ステップと、患者が治療に応答するようであれば、その患者をアジュバント療法で治療するステップとを含む。
【００１５】
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の予後患者レポートを作成する方法を含む。この方法は、患者から生体サンプルを採取するステップ（ａ）と、その生体サンプルの遺伝子発現を測定するステップ（ｂ）と、ステップ（ｂ）の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、ステップ（ｃ）で得た結果を用いてレポートを作成するステップとを含む。
【００１６】
本発明は、配列番号１‐２２、または表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択される少なくとも１つのプローブセットを含む組成物を含む。
【００１７】
本発明は、生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を決定するためのアッセイを行うためのキットを含む。このキットは、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。
【００１８】
本発明は、生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を評価するための製品を含む。この方法は、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。
【００１９】
本発明は、請求項１、２、３、または４の方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップを含む。
【００２０】
このマイクロアレイは、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、この組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分である。
【００２１】
本発明は、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、この組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分である診断／予後ポートフォリオを含む。
【発明の効果】
【００２２】
薬物治療の種類によって単独または組み合わせて用いることができる１または複数の遺伝子シグネチャを用いた、急性骨髄性白血病患者の予後を予測する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
新たに診断されたＡＭＬで予後値を有すると記載した遺伝子のサブセットが、分子標的療法（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（登録商標））で治療される再発性及び難治性のＡＭＬ患者に有用であることをここに示す。現在、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（登録商標）など）に対する応答を予測する方法が存在しない。また、ＡＭＬ患者の予後を理解するための現在の方法は、共に臨床結果を決定するには理想的なマーカーではない組織学的サブタイプ及び核型分析に限られている。現在のシグネチャは、予後リスクの高い患者と低い患者に的確に階層分類できるため、その利用がこれらの従来の技術まで拡大している。
【００２４】
米国特許出願第１０／８８３，４３６号で、３遺伝子クラシファイア（ＡＨＲ、ＡＫＡＰ１３、及びＭＩＮＡ５３を含む）が低い誤差率でティピファニブ（Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（登録商標）、Ｒ１１５７７７）に対する再発性及び難治性ＡＭＬ患者の応答を予測することが実証されている。これは、ＬＯＯＣＶ（leave-five-out cross validation）でも確認された。追加の遺伝子が加えられると誤差率が上昇するため、追加の遺伝子がクラシファイアにノイズを導入したと考えられる。３遺伝子クラシファイアの場合、ＬＯＯＣＶにより、感度が８６％、特異性が７０％、全体の診断精度が７４％であることが示された。カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）でも、予測された応答者群と非応答者群との間で生存に有意差が示された。更に、誤って分類された非応答者群と正確に分類された非応答者群を比較すると、誤って分類された非応答者群の方が全体的に良好な生存が示された。
【００２５】
Ｚａｒｎｅｓｔｒａ（登録商標）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で様々なヒト腫瘍細胞系の増殖を抑制することが分かっている経口投与できる非ペプチド部分競合ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）である（エンド（End）ら（２００１年）、コックス（Cox）ら（２００２年））。ティピファニブのフェーズ１臨床試験で、再発性または難治性急性骨髄性白血病患者で３２％の応答率が実証された（カープ（Karp）ら（２００１年））。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（カーズロック（Kurzrock）ら（２００４年））、多発性骨髄腫（ＭＭ）（アルシナ（Alsina）ら（２００３年））、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（コーテス（Cortes）ら（２００３年））の初期の臨床試験でも作用が確認された。完全な緩解は、骨髄芽細胞が５％未満で、好中球数が１０００／μＬ以上、血小板数が１００，０００／μＬ未満、そして髄外疾患が存在しないと定義する。タンパク質ファルネシル化の阻害によりＦＴＩｓが機能することが明らかであるが、悪性造血疾患におけるティピファニブの抗腫瘍効果にどの遺伝子が関与しているのかが未だ分かっていない。マイクロアレイ技術は、数千の遺伝子の安定状態のｍＲＮＡレベルの同時測定を可能とするため、ＦＴＩ作用に相関する遺伝子の同定及び遺伝子経路の強力なツールである。従って、再発性及び難治性ＡＭＬにおけるティピファニブのフェーズ２臨床試験で全遺伝子発現の監視をして、悪性造血疾患におけるこのＦＴＩに対する応答を予測する遺伝子を同定した。
【００２６】
本発明は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含み、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルがＡＭＬの予後を示す、ＡＭＬ患者の予後（生存／結果）を評価する方法を含む。
【００２７】
本発明は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含み、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルがＡＭＬの状態を示す、ＡＭＬ患者の状態を決定する方法を含む。
【００２８】
本発明は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブのセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップを含み、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルが、患者が治療に応答する可能性を十分に示し、医師が適切な治療の種類及び程度を決定することができる急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の治療プロトコルを決定する方法を含む。
【００２９】
本発明は、患者から生体サンプルを採取するステップと、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブのセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定するステップであって、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い遺伝子発現レベルが患者が治療に応答する可能性を示す、前記ステップと、患者が応答しそうな場合に患者をアジュバント療法で治療する急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者を治療する方法を含む。
【００３０】
上記した方法では、再発性または難治性のＡＭＬ患者、非再発性または非難治性のＡＭＬ患者、治療を受けたまたは治療を受けていないＡＭＬ患者が含まれる。一実施形態では、患者は非再発性または非難治性ＡＭＬ患者であり、この方法により、患者がＦＴＩでの治療に応答するか否かを決定することができる。
【００３１】
上記した方法では、配列番号は、好ましくは配列番号１、５、及び６、または配列番号１である。この方法は更に、サンプルで恒常的に発現する少なくとも１種類の遺伝子の発現レベルの測定を含むことができる。
【００３２】
上記した方法では、発現パターンの比較は、好ましくはＣｏｘ比例ハザード分析を用いてパターン認識法で行うことができる。所定のカットオフレベルは、好ましくは、良性細胞または正常組織に対してサンプルで少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現である。所定のカットオフレベルは、好ましくは、良性細胞または正常組織に対して転移性細胞を有するサンプルで少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現である。好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。
【００３３】
上記した方法では、遺伝子発現は、限定するものではないが、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含むマイクロアレイまたは遺伝子チップで測定することができる。このようなマイクロアレイまたは遺伝子チップは、１または複数の内部コントロール試薬も含むことができる。遺伝子発現はまた、サンプルから抽出したＲＮＡのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって核酸を増幅して決定することもできる。一実施形態では、ＰＣＲは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）であって、１または複数の内部コントロール試薬も含むことができる。遺伝子発現はまた、目的のタンパク質に特異的な抗体などの遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出して検出することもできる。遺伝子発現は更に、ＤＮＡの増幅、メチル化、突然変異、及び対立遺伝子変異体などの遺伝子の特性を測定して検出することもできる。
【００３４】
本発明は、患者から生体サンプルを採取するステップ（ａ）、そのサンプルの遺伝子発現を測定するステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）の結果に対して再発ハザードスコアを適用するステップ（ｃ）、ステップ（ｃ）で得た結果を用いて患者予後レポートを作成するステップを含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者予後患者レポートを作成する方法を含む。このレポートはまた、患者の転帰の評価及び／または患者集団に対するリスクの可能性を含むことができる。本発明は更に、この方法で作成されたレポートも含む。
【００３５】
このようなレポートは、再発性または難治性のＡＭＬ患者、非再発性または非難治性のＡＭＬ患者、治療を受けたまたは治療を受けていないＡＭＬ患者に対して作成することができる。一実施形態では、患者は、非再発性または非難治性のＡＭＬ患者であり、この方法により、患者がＦＴＩでの治療に応答するか否かを決定することができる。
【００３６】
本発明は、配列番号１‐２２、または表７に示されている配列番号１及び５‐２に一致するｐｓｉｄ番号から選択される少なくとも１つのプローブセットを含む組成物を含む。
【００３７】
本発明は、生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を決定するためのアッセイを行うためのキットを含む。このキットは、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。好ましくは、配列番号１、５、及び６、または配列番号１である。このキットは更に、限定するものではないが、マイクロアレイ分析を行うための取扱説明書、試薬、及び前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイする培地を含む任意の追加物を含むことができる。
【００３８】
本発明は、生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を評価するための製品を含む。この製品は、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含む。好ましくは、配列番号１、５、及び６、または配列番号１である。この製品は更に、限定するものではないが、マイクロアレイ分析を行うための取扱説明書、試薬、及び前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイする培地を含む任意の追加物を含むことができる。
【００３９】
本発明は、本発明に含まれる方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップを含む。このマイクロアレイは、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含む。この組合せは、生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を決定するのに十分である。マイクロアレイは、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現の測定値または特徴を提供するのが好ましい。マイクロアレイは、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現での測定値を提供するのが好ましい。好ましくは、ｐ値は０．０５未満である。マイクロアレイは、限定するものではないが、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含む当分野で周知の任意のマイクロアレイとすることができ、更に他のヌクレオチド配列及び１または複数の内部コントロール試薬を含むことができる。
【００４０】
本発明は、（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の組合せでの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含む診断／予後ポートフォリオを含む。この組合せは、生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を決定するのに十分である。このポートフォリオは、少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現の測定値または特徴を提供するのが好ましい。このポートフォリオは、統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現の測定値を提供するのが好ましい。好ましくは、ｐ値は、０．０５未満である。
【００４１】
タンパク質またはペプチド（遺伝子）を発現する可能性のあるゲノム内の核酸配列の存在だけでは、タンパク質またはペプチドが所定の細胞で発現するか否かを決定できない。タンパク質またはペプチドを発現可能でＲＮＡを転写可能な所定の遺伝子が、実際にタンパク質またはペプチドを発現しＲＮＡを転写するか否か、その場合の発現や転写がどの程度であるかは、様々な複雑な因子によって決まる。しかしながら、遺伝子発現のアッセイにより、薬物や他の治療物質の導入などの所定の刺激に対する細胞内応答についての有用な情報を得ることができる。遺伝子がどの程度活性であるかまたは不活性であるかを、このような遺伝子発現プロファイルで相対的に確認することができる。場合によっては、分子マーカーの存在は、それ自体で、または遺伝子発現情報を用いて、治療の有効性についての有用な情報を得ることができる。本発明の遺伝子発現プロファイル及び遺伝子マーカーを用いてＡＭＬ患者を識別し治療することができる。
【００４２】
悪性造血疾患を含む癌は通常、様々な遺伝子の突然変異から起こる。同じ種類の癌は、同じ種類の癌をもつ別の患者の突然変異に一致するまたは異なる１または複数の突然変異で起こり得る。同じ癌の基礎をなす複数の分子機構が頻繁に存在することが、ある治療がある患者には効くが同じ種類の癌をもつ別の患者には必ずしも効かない患者がいることに一致している事実がある。更に、診断の観点から、転座、欠失、またはＳＮＰｓなどの特定の突然変異の存在は強力な関連性を有し得る。場合によっては、このような分子マーカーは、それ自体が、診断、予後、または治療応答の決定に有用な指標である。これは、特に、分子の突然変異が特定の治療に対する応答に関連し得る場合に事実である。
【００４３】
ＬＢＣオンコジーンまたはＡＫＡＰ１３は、染色体１５ｑのＬＢＣプロトオンコジーン（配列番号１）と染色体７ｑを起源とする非関連配列の融合から得たキメラである。この配列のＣ末端でのプロトオンコジーンの切断で、遺伝子が形質転換する能力を獲得する。この切断は、転座以外の機構からも起こり得る。例えば、異常なスプライシングで、Ｃ末端が切断されたＲＮＡ転写物が得られる。この遺伝子は、ｍＲＮＡやタンパク質などの多数の発現産物を有する。ＬＢＣオンコジーンが機能する正確な仕組みは完全には理解できていないが、ＬＢＣオンコジーンが骨格筋、心臓、肺、前立腺、卵巣、小腸、及び造血細胞を含む広範な組織に存在できることは明らかである。オンコジーンの存在が明らかな組織（存在しなくても良い）を起源とする癌の治療は本発明の範囲内である。
【００４４】
遺伝子が切断により得られる産物であり、かつ遺伝子が認識可能な発現産物を発現するため、本発明のアッセイの形式化には高い柔軟性が存在する。この遺伝子またはその産物の非存在を利用できるだけでなく、この遺伝子の発現の変動も検出することができる。従って、遺伝子発現プロファイルはこの遺伝子を含むことができる。この遺伝子の非存在または発現の変動を、以前に治療を受けた患者及び受けていない患者の予後及び状態の指標として用いるのが好ましい。
【００４５】
任意の好適な検出方法を用いて、分子マーカーとしてＬＢＣオンコジーンを識別することができる。ＬＢＣオンコジーンの存在を検出するのに有用な方法には、限定するものではないが、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型法、化学及び熱変性濃度勾配解析、化学的及び酵素的切断法、質量分析法、ＲＦＬＰ及び対立遺伝子特異的増幅、レシオメトリックＰＣＲ、ビーズ及びマイクロアレイを用いたシステム、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ヘテロデュプレックス分析、マイクロアレイ解析、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｔｅｒｎ、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、抗体を用いた方法、メチル化を用いたＰＣＲ、及びＳＮＰ検出を含め、既知の突然変異遺伝子または配列を検出するための任意の方法が含まれる。
【００４６】
ＬＢＣオンコジーンの存在または非存在を検出するための最も好適な方法はＰＣＲを用いた方法である。この方法では、まず、通常のサンプル調製法に従って患者から細胞を採取する。末梢血サンプルまたは骨髄サンプルが好ましい。次いで、ＲＮＡを一般に受け入れられている方法に従って抽出し、次の要領で増幅する。標的配列を、例えば、２５０ｎＭ プライマーと２５０ｎＭ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）緩衝液で増幅させる。５０℃で２分間、９５℃で１０分間のサーマルサイクルを行い、次いで９５℃で１５分間と６２℃で１分間のサイクルを５０回行った。プライマーとプローブの例を表１に示す。
【００４７】
この方法は、サンプル中に存在するＬＢＣ転写物の量を測定する。測定した量を、同じサンプルを用いてＨＰＲＴなどの内在性コントロール遺伝子を増幅する同様のＲＴ‐ＰＣＲ法で標準化することができる。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
ＬＢＣオンコジーンの存在または非存在の別の決定方法ではＲＮＡ転写物の長さをアッセイする。ＬＢＣオンコジーンは３’転座を有するため、転写長さはＬＢＣプロトオンコジーン転写物よりも短いはずである。転写物のサイズを決定するために、プロトＬＢＣ転写物及びオンコＬＢＣ転写物の両方に対して相同な順方向プライマー（例えば、表１のＡＫＡＰ順方向プライマー）を、ＲＮＡ転写物のユニバーサルポリＡ尾部に相同な逆方向プライマーと共に用いる。好ましくは、初めのｃＤＮＡの合成は、ポリＡ配列の追加の固有の配列タグ３’を含み、ＰＣＲ反応に追加の特異性を付与する。
【００５０】
ゲノムの転座を測定したら、ＬＢＣオンコジーンに特異的なＰＣＲプライマー及び標準的な方法を用いたゲノムＤＮＡを単離することを含む当分野で周知の任意の方法を用いることができる。例えば、オンコＬＢＣジーン及びプロトＬＢＣジーンの両方に対して相同な順方向プライマーを上記したポリＡ配列と共に用いることができる。別法では、逆方向プライマーを３’転座配列に相同とすることができる。読み出しは、オンコジーンの存在がプロトオンコジーンよりも短い産物に一致する場合はアンプリコンのサイズであり、オンコＬＢＣ特異的アンプリコンが存在したり存在しなかったりする。
【００５１】
細胞のＬＢＣオンコジーンの状態のアッセイでも、免疫組織化学法（ＩＨＣ）などの方法を用いて診断のために正常／異常組織の分布を決定することができる。当分野で周知の任意の方法を用いることができ、例えば、ＬＢＣタンパク質の抗体を、ＩＨＣによる検査のために調製した新鮮凍結パラフィン埋没組織ブロック及びホルマリン固定パラフィン埋没組織ブロックの両方と共に用いることができる。それぞれの組織ブロックは、５０ｍｇの残留微粉腫瘍から構成することができる。
【００５２】
簡単に述べると、凍結部分は、室温で小さなプラスチックカプセル内のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結微粉腫瘍５０ｎｇを再水和し、遠心分離して粒子をペレットにし、これらを粘性包埋剤（ＯＣＴ）中で再懸濁し、カプセルを反転させ遠心分離して再びペレットにし、−７０℃のイソペンタン中でスナップ凍結し、プラスチックカプセルを切断して凍結した柱状組織を取り出し、低温マイクロトームチャック上にこの柱状組織を固定し、無傷の腫瘍組織を含む２５〜５０の連続した部分に切断して調製することができる。
【００５３】
永久部分は、同様の方法で調製することができる。具体的には、サンプル５０ｍｇをプラスチック微量遠心管内で再水和し、ペレットにし、４時間の固定ために１０％ホルマリン中で再懸濁し、洗浄してペレットにし、暖かい２．５％寒天内で再懸濁し、ペレットにし、氷水で冷却して寒天を固め、組織／寒天ブロックを微量遠心管から取り出し、そのブロックをパラフィン内に浸潤させて包埋し、最大５０の連続した永久部分に切断する。
【００５４】
ＩＨＣアッセイの場合、これらの部分を、ＰＢＳまたは他の阻害剤に溶けた３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む阻害液で覆う。阻害剤は、非特異的な血清または粉乳を含む。阻害は、室温で１時間行うことができる。抗ＬＢＣタンパク質抗体を、３％ＢＳＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ（商標）‐１００、及びｔ‐オクチルフェノキシポリエトキシエタノールで希釈する（１：１００の比率）。このサンプル部分に抗体溶液を覆って４℃で１６時間放置する。このような時間及び温度条件は、選択した抗体及び検査する物質によって異なる。最適な条件は経験的に決められる。次いで、抗体で処置した部分をＰＢＳ中で各１５分間の洗浄を３回行い、結合しなかった抗体を除去し、１：２０００の希釈で３％ＢＳＡと二次抗体を含むＰＢＳで覆う。この二次抗体は、カラシペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、フルオレセインイソチオシアネート、または他の好適な酵素などの発色酵素に結合することができる。別法では、二次抗体をビオチンに結合させて、これを発色団標識アビジンと共に用いることができる。
【００５５】
遺伝子の存在を検出する他の方法の例には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる方法がある。通常は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、（１）分析する組織または生体構造の固定、（２）標的ＤＮＡにアクセスし易くして非特異的結合を減少させる生体構造のプレハイブリダイゼーション処理、（３）核酸混合物と生体構造または組織中の核酸のハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄、（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出を含む。各ステップで用いる試薬及び用いる条件は適用例によって異なる。
【００５６】
この場合、遺伝子にハイブリダイズ可能な（その染色体座で）少なくとも１種類の検出可能な核酸プローブを含むハイブリダイゼーション溶液を、ハイブリダイゼーション条件下で細胞に接触させる。次いで、全てのハイブリダイゼーションを検出し、正常細胞またはコントロール細胞の所定のハイブリダイゼーションパターンと比較する。プローブはα動原体プローブであるのが好ましい。このようなプローブは、多数の会社（例えば、バイシス社（Visys Inc.）、ドーナーズ・グルーブＩＬ（Downers Grove, IL））が販売している。好適な実施形態では、ハイブリダイゼーション溶液は、キメラを構成する配列の転座に一致する染色体上のある領域（例えば、１５ｑ２４‐２５）に特異的な複数のプローブを含む。
【００５７】
本発明の方法に適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、アルバートソン（ALbertson）（１９８４年）；ピンケル（Pinkel）（１９８８年）；欧州特許第４３０，４０２号；「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Methods in Molecular Biology）」第３３巻；「イン・シツ・ハイブリダイゼーション・プロトコルズ（In Situ Hybridization Protocols）」、クー（Choo）編集、ヒューマナ・プレス（Humana Press）、ニュージャージー州トトワ（Totowa）、（１９９４年）などを参照されたい。好適な一実施形態では、ピンケル（Pinkel）ら（１９８８年）またはカリオニエミ（Kallioniemi）（１９９２年）のハイブリダイゼーションプロトコルが用いられる。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は良く知られている（例えば、ティッセン（Tijssen）著（１９９３年）、「ラボラトリー・テクニックス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」、第２４巻、「核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション（Hybridization With Nucleic Acid Probes）」、ニューヨーク州のエルスビアー（Elsvier））。
【００５８】
好適な実施形態では、背景信号を軽減するために、ハイブリダイゼーションに界面活性剤（例えば、Ｃ‐ＴＡＢ）または遮断剤（例えば、ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、ｃｏｔ‐１ ＤＮＡなど）を用いて非特異的な結合を減少させる。ハイブリダイゼーションは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ（例えば、ｃｏｔ‐１ ＤＮＡ）の存在下で実施するのが好ましい。
【００５９】
プローブは、合成や生物宿主での成長を含め、当分野で周知の任意の方法で調製することができる。合成方法には、限定するものではないが、オリゴヌクレオチド合成、リボプローブ、及びＰＣＲが含まれる。
【００６０】
プローブは、当分野で周知の方法で検出可能なマーカーで標識することができる。プローブを標識する方法には、ランダムプライミング、エンドラベリング、ＰＣＲ、及びニックトランスレーションが含まれる。酵素標識は、核酸ポリメラーゼ、３種類の無標識ヌクレオチド、及び第４のヌクレオチドの存在下で実施する。第４のヌクレオチドには、直接標識が付けられている（標識を取り付けるためのリンカーアームを含む）、或いは標識された結合分子が結合できるハプテンまたは他の分子が取り付けられている。好適な直接標識には、32Ｐ、3Ｈ、及び35Ｓなどの放射線標識や、フルオレセイン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、ルシファーイエロー、及びローダミンなどの蛍光マーカーなどの非放射線標識や、可視光で検出可能なシアニン色素、及び酵素類などが含まれる。標識はまた、亜硫酸水素仲介アミド基転移によってＤＮＡプローブ内に化学的に組み込む、或いはオリゴヌクレオチド合成の際に直接組み込むことができる。
【００６１】
蛍光マーカーは、プローブ内に組み込まれた活性化されたリンカーアームでヌクレオチドに容易に付着させることができる。プローブは、上記した方法で間接的に標識することができる。具体的には、ハプテンまたはビオチンやジゴキシゲニン（digoxygenin）などの他の分子に共有結合したヌクレオチドを組み込み、標識抗体がハプテンまたは他の分子にハイブリダイズするようにサンドイッチハイブリダイゼーションを実施する。ビオチンの場合は、検出可能な標識に結合したアビジンを用いる。抗体及びアビジンは、蛍光マーカーや、アルカリホスファターゼまたはカラシペルオキシダーゼなどの酵素マーカーに結合させて検出可能にできる。結合したアビジンや抗体は、ベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories）（カリフォルニア州バーリンガム）やベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）（インディアナ州インディアナポリス）などの会社が販売している。
【００６２】
酵素は、酵素の基質を用意して比色反応で検出することができる。様々な基質が存在する場合、様々な色が反応で生成され、これらの色を可視化して複数のプローブを別々に検出することができる。当分野で周知の任意の基質を用いることができる。アルカリホスファターゼの好適な基質の例として、５‐ブロモ‐クロロ‐３‐インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を挙げることができる。カラシペルオキシダーゼの好適な基質はジアミノ安息香酸（ＤＡＢ）である。
【００６３】
本発明のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に使用するのに適した蛍光標識プローブは、１５０〜５００ヌクレオチドの範囲の長さであるのが好ましい。プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができるが、ＤＮＡが好ましい。
【００６４】
検出可能なプローブと細胞のハイブリダイゼーションは、０．１ｎｇ／μｌ〜５００ｎｇ／μｌ、好ましくは５ｎｇ／μｌ〜２５０ｎｇ／μｌの濃度のプローブで実施する。ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドなどの変性剤を含むのが好ましい。一般に、ハイブリダイゼーションは、２５℃〜４５℃、好ましくは３２℃〜４０℃、最も好ましくは３７℃〜３８℃で実施する。ハイブリダイゼーションに必要な時間は、約０．２５時間〜９６時間、より好ましくは１時間〜７２時間、最も好ましくは４時間〜２４時間である。ハイブリダイゼーション時間は、ｈｎＲＮＰ結合タンパク質、トリアルキルアンモニウム塩、及びラクタムなどの促進物質を含むことができるハイブリダイゼーション溶液成分及びプローブの濃度によって異なる。次いで、スライドガラスを、ホルムアミドなどの変性剤を含み塩化ナトリウムの濃度を下げる溶液、または結合していないプローブまたは不適正塩基対を成したプローブを除去する任意の溶液で洗浄する。
【００６５】
塩の温度及び濃度は、所望のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって異なる。例えば、高いストリンジェンシーの洗浄は４２℃〜６８℃で実施し、中程度のストリンジェンシーの洗浄は３７℃〜５５℃で実施し、低いストリンジェンシーの洗浄は３０℃〜３７℃で実施することができる。高いストリンジェンシーの洗浄の塩濃度は、０．５〜１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、中程度のストリンジェンシーの洗浄の塩濃度は、１〜４×ＳＳＣ、低いストリンジェンシーの洗浄の塩濃度は、２〜６×ＳＳＣとすることができる。
【００６６】
必要な場合は、検出のためのインキュベーションは、２３℃〜４２℃、より好ましくは２５℃〜３８℃、最も好ましくは３７℃〜３８℃の湿室で行うのが好ましい。標識した試薬は、ＢＳＡなどの遮断試薬及び脱脂粉乳などを含む溶液で希釈するのが好ましい。希釈の程度は、１：１０〜１：１０，０００、より好ましくは１：５０〜１：５，０００、最も好ましくは１：１００〜１：１，０００である。スライドガラスまたは他の固体支持物は、各インキュベーションステップの間に洗浄して過剰な試薬を除去する。
【００６７】
次いで、可視検出マーカーの場合は、スライドガラスを顕微鏡に取り付けて分析し、放射線マーカーの場合は、スライドガラスをオートラジオグラフフィルムにさらして分析する。蛍光マーカーの場合は、スライドガラスを、退色防止試薬を含む溶液内に取り付け、蛍光顕微鏡で分析するのが好ましい。検出精度を上げるために、複数の核を検査することができる。
【００６８】
加えて、ＬＢＣオンコジーンの発現産物のアッセイを用いて、ＬＢＣオンコジーンの突然変異が起こったか否かを決定することができる。このようなアッセイは、最も好ましくはイムノアッセイである。最も単純で直感的なイムノアッセイは結合アッセイである。ある好適なイムノアッセイは、当分野で周知の様々なタイプの酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡｓ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。組織部分を用いるＩＨＣ検出も、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びエンザイムイムノアッセイに特に有用である。
【００６９】
例示的なＥＬＩＳＡでは、タンパク質特異的抗体を、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウエルなどのタンパク質親和性を有する選択された表面に固定する。次いで、臨床サンプルなどの所望の抗原を含む検査組成物をウエルに添加する。結合した後に洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去し、結合した抗原を検出することができる。検出は通常、検出可能な標識に結合した所望の抗原に特異的な別の抗体を添加して行うことができる。このタイプのＥＬＩＳＡは単に「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、所望の抗原に特異的な第２の抗体を添加し、次いで第２の抗体に結合親和性を有する検出可能な標識に結合した第３の抗体を添加して行うことができる。
【００７０】
様々なＥＬＩＳＡ法が知られている。このようなある変更例では、所望の抗原を含むサンプルをウエルの表面に固定してから本発明の抗体に接触させる。結合した後に適切に洗浄し、結合した免疫複合体を検出する。初めの抗原特異的抗体が検出可能な標識に結合した場合は、免疫複合体を直接検出することができる。ここでも、免疫複合体は、第１の抗原に特異的な抗体に結合親和性を有する、検出可能な標識に結合された第２の抗体を用いて検出することができる。
【００７１】
ＡＭＬの予後または状態を決定するために遺伝子発現を検出する本発明の一実施形態では、遺伝子発現のポートフォリオを使用するのが最も好ましい。遺伝子のポートフォリオは、グループ分けされた遺伝子のセットであって、これらについて得た発現情報が、診断、予後、または治療の選択などの臨床的に適切な判断を下す基礎となる。このような場合、遺伝子発現ポートフォリオは、ＡＭＬ患者の治療の判断に役立つように作成することができる。
【００７２】
遺伝子発現プロファイル（適切な生物学的経路の詳細に説明できる方法を含む）を作成するための好適な方法では、タンパク質またはペプチドをコードする或いはＲＮＡを転写することができる遺伝子によって産生されたＲＮＡの量を決定する。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）、競合的ＲＴ‐ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ、ディファレンシャル・ディスプレイＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、及び他の関連した試験で行うのが最も好ましい。このような方法は個々のＰＣＲ反応を用いて行うことが可能であるが、ｍＲＮＡから得たコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはコピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅させ、これをマイクロアレイで分析するのが好ましい。様々な異なったアレイの構造及び製造方法が当業者に周知であり、米国特許第５，４４５，９３４号、同第５，５３２，１２８号、同第５，５５６，７５２号、同第５，２４２，９７４号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４７２，６７２号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５２９，７５６号、同第５，５４５，５３１号、同第５，５５４，５０１号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５７１，６３９号、同第５．５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６５８，７３４号、及び同第５，７００，６３７号などの米国特許に開示されている。
【００７３】
マイクロアレイ法は、同時に数千の遺伝子の安定状態のｍＲＮＡレベルを測定できるため、ＡＭＬ患者の遺伝子発現プロファイルを確認するための強力なツールである。２つのマイクロアレイ法が現在広く用いられている。１つはｃＤＮＡアレイであり、もう１つはオリゴヌクレオチドアレイである。このようなチップの構造には違いがあるが、実質的に全ての下方制御データ解析及びアウトプットは同じである。このような分析結果は通常、マイクロアレイの既知の位置にある核酸配列にハイブリダイズするサンプルのｃＤＮＡ配列の検出に用いる標識プローブから受け取る信号の強度の測定値である。通常は、信号強度は、ｃＤＮＡの量、従ってサンプルの細胞で発現したｍＲＮＡの量に比例する。このような多数の有用な方法を利用することができる。好適な方法は、米国特許第６，２７１，００２号、同第６，２１８，１２２号、同第６，２１８，１１４号、及び同第６，００４，７５５号に開示されている。
【００７４】
発現レベルの分析は、このような強度を比較して行う。これは、コントロールサンプルにおける遺伝子の発現強度に対する検査サンプルの遺伝子の発現強度の比率マトリックスを作成して行うのが最も好ましい。例えば、薬物で処理した組織の遺伝子発現強度を、薬物で処理していない同じ組織から得られた発現強度と比較することができる。このような発現強度の比率は、検査サンプルとコントロールサンプルの遺伝子発現の倍変化を示す。
【００７５】
遺伝子発現プロファイルは、様々な方式で表示することができる。一般的な方法では、列が検査サンプルを示し、行が遺伝子を示すグラフィックデンドグラム（graphical dendogram）に比率マトリックスを配置する。データは、類似の発現プロファイルを有する遺伝子が互いに近接するように配置する。各遺伝子の発現比率を色で示すことができる。例えば、１未満の比率（下方制御を示す）は、スペクトルの青い部分で現れ、１を超える比率（上方制御を示す）はスペクトルの赤い部分の色で現れるようにすることができる。シリコン・ジェネティックス社（Silicon Genetics, Inc.）が販売する「ＧＥＮＳＰＲＩＮＴ」及びパーテック社（Partek, Inc.）が販売する「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」及び「ＩＮＦＥＲ」を含む市販のコンピュータソフトウエアプログラムを用いてこのようなデータを表示することができる。
【００７６】
差次的に発現する遺伝子は、上記した遺伝子発現の評価によって導出されるように、病変細胞における上方制御または下方制御される。上方制御及び下方制御は、遺伝子の発現量において、あるベースラインに対して検出可能な差異（測定に用いるシステムのノイズの影響を超える）が見られることを意味する相対的な用語である。このような場合、このベースラインは、正常細胞で測定された遺伝子発現である。次いで、病変細胞における目的の遺伝子がベースラインレベルに対して上方制御されたか或いは下方制御されたかを同じ測定方法で測定する。上方制御及び下方制御のレベルは、ハイブリダイズしたマイクロアレイプローブの強度測定値の倍変化に基づいて区別されるのが好ましい。このような区別には１．５倍の差が好ましい。すなわち、未処理の病変細胞に対して処理した病変細胞で遺伝子が異なって発現する前に、処理した細胞が未処理の細胞よりも少なくとも１．５倍を超える強度、または１．５分の１未満の強度を発生させることが確認された。遺伝子発現の測定値における差は、より好ましくは１．７倍であり、最も好ましくは２．０倍以上である。
【００７７】
本発明のある方法では、様々な遺伝子の遺伝子発現プロファイルを比較して、患者が治療薬に応答しそうであるか否かを決定する。応答者と非応答者を区別する遺伝子発現プロファイルを確立したら、この各遺伝子発現プロファイルを後述するコンピュータ読み取り可能媒体などの媒体に保存する。次いで、病変細胞（ＡＭＬの場合は造血芽細胞など）を含む患者のサンプルを採取する。最も好ましくは、サンプルは骨髄であって、通常の方法に従って患者の胸骨または腸骨稜から採取する。好ましくは、通常の方法で骨髄突刺液を処理して白血病芽細胞を増殖する。次いで、サンプルのＲＮＡを患者の病変細胞から抽出して増幅し、好ましくはマイクロアレイを用いて（好適な遺伝子ポートフォリオの場合）、好適なポートフォリオの遺伝子を得るために遺伝子発現プロファイルを作成する。次いで、このサンプルの発現プロファイルを、予後結果のために既に分析したものと比較する。３遺伝子プロファイルを用いる場合のようにポートフォリオに少数の遺伝子を用いる場合、遺伝子調節を測定する最も好ましい方法は、単純に核酸を増幅して検出する方法である。このような場合、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル、ＬＣＲ、及び当業者に周知の他の増幅方法を用いることができるが、ＰＣＲが最も好ましい。ポートフォリオが多数の遺伝子を含む場合または他の多数の遺伝子の発現を測定するのが好ましい場合は、上記したようにマイクロアレイの強度測定に基づいて発現パターンを評価するのが好ましい。
【００７８】
同様の要領で、遺伝子発現プロファイル分析を行って治療の応答を監視することができる。この方法の一態様では、上記したような遺伝子発現分析を、治療期間の任意の期間に任意の好適な治療を受けた患者に対して行う。遺伝子発現パターンが肯定的な結果と一致した場合は患者の治療を継続する。そうでない場合は、患者の治療方法を別の治療法に変更する、用量を変更する、または現在の治療を中止する。このような分析により、検出可能な臨床的な徴候の前、或いはあいまいな臨床的な徴候に直面した際に介入及び治療の変更が可能となる。
【００７９】
本発明の分子マーカーについて述べると、診断目的のために多数の他の形態や手法を利用することができる。ゲノム領域のメチル化は、遺伝子発現レベルに影響を与え得る。例えば、遺伝子のプロモータ領域の過度のメチル化は遺伝子発現を恒常的に下方制御し、過少のメチル化は安定状態のｍＲＮＡレベルを増大させ得る。従って、薬物の反応、予後、または状態を予測する遺伝子に関連したメチル化領域の検出を、遺伝子発現レベルを診断する別の方法として用いることができる。このような方法は当業者には周知である。別法では、プロモータ領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰｓ）も遺伝子の転写活性に影響を及ぼし得る。従って、当業者に周知の方法でのこのようなＳＮＰの検出を、予後結果によって異なって発現する遺伝子を検出するための診断として用いることもできる。
【００８０】
本発明の製品は、治療、診断、予後、病期、及び他の疾患の評価に有用な遺伝子発現プロファイルの表現である。好ましくは、このような表現は、コンピュータ読み取り可能媒体（磁気式及び光学式など）などの自動的に読み取ることができる媒体に圧縮することができる。本製品は、このような媒体に記録された遺伝子発現プロファイルを評価するための取扱説明も含み得る。例えば、本製品は、上記した遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ命令を有するＣＤ‐ＲＯＭを含むことができる。本製品はまた、患者のサンプルから得た遺伝子発現データと比較できるように内部にデジタル形式で記録された遺伝子発現プロファイルも含み得る。別法では、このようなプロファイルは、異なった表現形式で記録することができる。パーテック社（Partek, Inc.）が販売する「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」や「ＩＮＦＥＲ」ソフトウエアに組み込まれているようなクラスターアルゴリズムは、このようなデータの視覚化に最も役立つであろう。
【００８１】
本発明に従った別の製品は、上記したアッセイを実施するためのキットである。このようなキットはそれぞれ、人間または機械が読むことができる取扱説明書及び上記したアッセイに一般的な試薬を含むのが好ましい。このキットはまた、例えば、本発明の遺伝子発現プロファイルを識別できるように構成された上記したような核酸アレイ（例えば、ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイ）を含むことができる。このようなキットはまた、核酸の増幅及び検出を行うために用いる試薬を含むことができる。このような試薬の例として、逆転写酵素、逆転写酵素プライマー、対応するＰＣＲプライマーセット、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼや、限定するものではないが、スコーピオンプローブ（scorpion probe）、蛍光プローブアッセイ用のプローブ、分子標識プローブ、またはエチジウムブロマイドなどの二本鎖ＤＮＡに特異的な１つの染色プライマーまたは蛍光色素などの好適な検出試薬を挙げることができる。表面抗原を検出するためのキットは、染色物質を含む、或いは緩衝液、抗抗原性抗体（anti-antigenic antibody）、検出酵素、及びカラシペルオキシダーゼやビオチン‐アビジン系試薬などの基質などの成分を含む抗体系である。芽細胞を検出するためのキットには通常、フローサイトメトリー、芽細胞接着アッセイ、及び他の一般的な芽細胞アッセイを行うための試薬が含まれている。
【００８２】
従来の抗癌剤には、限定するものではないが、チロシンキナーゼ阻害剤、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、Ｐ１３Ｋキナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アポトーシス調節物質、及びこれらの組合せが含まれる。これらの抗癌剤の中で最も好ましい代表的な薬物として、ノバーティス社（Novartis）の「ＧＬＥＥＶＥＣ」チロシンキナーゼ阻害剤、Ｕ‐０１２６ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ‐０９８０５９ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＳＢ‐２０３５８０ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アンチセンスリボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｂｃｌ‐ＸＬ、及び抗アポトーシスを挙げることができる。他の有用な薬物の例として、限定するものではないが、米国特許第６，３０６，８９７号のカラノライド（calanolides）、米国特許第６，２８４，７６４号の置換二重環（substituted bicyclcs）、米国特許第６，１３３，３０５号のインドリン（indolines）、米国特許第６，２７１，２１０号のアンチセンスオリゴヌクレオチド、シスプラチンやカルボプラチンなどの白金製剤、パクリタキセル及びドセタキセルなどのタキサン製剤、イリノテカンやトポテカンなどのカンプトセシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンなどの抗腫瘍ビンカアルカロイド、５‐フルオロウラシル、ゲムシタビン（gemcitabine）、またはカペシタビンなどの抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、シクロフォスファミド、クロラムブシル、カルムスチン、またはロムスチンなどのニトロジェンマスタードまたはニトロソウレア・アルキル化剤、ダウノルビシン、ドキソルビシン、またはイダルビシンなどの抗腫瘍アントラサイクリン誘導体、トラスツマブ（trastzumab）などのＨＥＲ２抗体、エトポシドやテニポシド（teniposide）などの抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体、及び抗エストロゲン薬を挙げることができる。抗エストロゲン薬には、トレミフェン、ドロロキシフェン（droloxifene）、ファスロデックス（faslodex）、及びラロキシフェンなどで好ましくはテモキシフェン（temoxifen）であるエストロゲン受容体拮抗薬すなわち選択的エストロゲン受容体調節物質、またはエキセメスタン（exemestane）、アナストロゾール（anastrozole）、レトラゾール（letrazole）、及びボロゾール（vorozole）などのアロマターゼ阻害剤が含まれる。
【００８３】
抗癌剤には、遺伝子治療、アンチセンス治療、またはＲＮＡ干渉に用いられる治療物質も含まれ得る。このような治療物質には、限定するものではないが、細胞内に導入してｍＲＮＡの転写を阻害してそのｍＲＮＡをコードする遺伝子の機能を阻害することができるｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。オリゴヌクレオチドを使用した遺伝子発現の阻害は、例えば、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティックス（Human Molecular Genetics）（ストラチャン（Strachan）及びリード（Read）著、１９９６年）に記載されている。このようなアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートやメチルホスホン酸などのＤＮＡの安定誘導体、２’‐Ｏ‐アルキルＲＮＡなどのＲＮＡの安定誘導体、または他のアンチセンスオリゴヌクレオチド類似物とすることができる。アンチセンス分子は、微量注入、リポソームカプセル化、またはアンチセンス配列を含むベクターからの発現によって細胞内に導入することができる。
【００８４】
遺伝子治療では、目的の遺伝子を、レシピエント宿主細胞の感染によって治療用ＤＮＡの導入を仲介するウイルスベクターに結合することができる。好適なウイルスベクターの例として、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びポリオウイルスなどを挙げることができる。別法では、治療用ＤＮＡを、リガンド／ＤＮＡ複合体またはアデノウイルス／リガンド／ＤＮＡ複合体を用いた受容体仲介標的ＤＮＡの導入、リポフェクション膜融合、または直接微量注入を含め、ウイルスを用いずに細胞内に導入して遺伝子治療することができる。このような方法及びその変更例は、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療に適している。遺伝子と共に使用するのに適した遺伝子治療の分子方法論のプロトコルが、「遺伝子治療プロトコル（Gene Therapy Protocols）」、ポールＤロビンス（Paul D. Robbins）編集、ニュージャージー州トトワ（Totowa）のヒューマン・プレス（Human Press）、１９９６年に記載されている。
【００８５】
ここに開示した方法に従って特定した化合物は、あらゆる毒性の可能性を最小にすると共に最適な阻害または活性を得るために、通常の試験で決定した適当な用量で単独で使用することができる。加えて、他の薬物との同時投与または連続的な投与も望ましいであろう。
【００８６】
本発明は、次の限定目的でない例を用いて詳細に説明する。ここに記載した全ての参照文献は言及することを持って本明細書の一部とする。
【００８７】
例１
臨床評価及び応答の定義
この検査は、再発性または難治性ＡＭＬ患者を各２８日サイクルの最初の２１日間の開始経口投与量６００ｍｇでティピファニブで治療する、非盲検多施設非競合フェーズ２臨床試験（アルソー（Harousseau）ら（２００３年））の一部である。患者は、再発性ＡＭＬ患者群と難治性ＡＭＬ患者群の２つの群に分けた。合計で２５２人の患者（再発性１３５人、難治性１１７人）を治療した。８０人の患者を選択して、個々にインフォームドコンセントが必要な骨髄サンプルをＲＮＡマイクロアレイ分析のために採取した。この検査では全体の応答率が比較的低かった。従って、遺伝子発現プロファイリングのために、患者をティピファニブに対する応答に対して、病理によって決定される客観的応答のある患者（完全な緩解（ＣＲ）、血小板の回復が不完全な完全な緩解（ＣＲｐ）、または部分的な緩解（ＰＲ））、臨床部位によって決定される血液学的応答のある患者（骨髄の白血病芽細胞の５０％を超える減少）、または病理及び臨床部位の両方によって決定される安定疾患の患者（血液学的応答はないが疾患が進行していない）に分けた。血小板の回復が不完全な完全な緩解は、輸血を必要としない１００，０００／μＬ未満の血小板数を除いて同様に定義する。部分的な緩解は、骨髄芽細胞が少なくとも５０％減少し、好中球（＞５００／μＬ）及び血小板数（＞５０，０００／μＬ）が部分的に回復した状態と定義する。応答は、初めの記録から少なくとも４週間後に確認しなければならない。
【００８８】
サンプルの採取及びマイクロアレイ処理
骨髄サンプルを、ティピファニブで治療する前に患者から採取し、このサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ‐ｄｉａｒｉｚｏａｔｅで遠心分離した（１．０７７ｇ／ｍＬ）。この白血球をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁し、直後に−８０℃で保存した。この細胞を解凍し、ＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Qiagen））で全ＲＮＡをこの細胞サンプルから抽出した。ＲＮＡの質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（電気泳動装置）で検査した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州クララのサンタ社（Snata））プロトコルに従ってｃＤＮＡ及びｃＲＮＡの合成を行った。
【００８９】
マイクロアレイ処理
１回の増幅では複数のサンプルのＲＮＡ収量がチップハイブリダイゼーションに用いる十分な標識ｃＲＮＡを得るのに不十分であるため２回の線形増幅を行った。ハイブリダイゼーションのために、１１μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．１、１００ｍＭ 酢酸カリウム、及び３０ｍＭ 酢酸マグネシウムで３５分間、９４℃でインキュベートしてランダムに断片化した。断片化したｃＲＮＡを、６０ｒｐｍにセットしたローティッセ・オーブン（rotisserie oven）で１６時間、４５℃でＵ１３３Ａアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、このアレイを６×ＳＳＰＥ及びＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（０．００５％）を含む０．５×ＳＳＰＥで洗浄し、次いで、ストレプトアビジン‐フィコエリトリン（ＳＡＰＥ：オレゴン州ユージーン（Eugene）の分子プローブ（Molecular Probes））で染色した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５００Ａ ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（カリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies））を用いて結合した標識プローブを定量した。
【００９０】
それぞれのアレイの合計蛍光強度を一定値６００に対して調整した。チップの性能を、ＳＮ比（生の平均信号／ノイズ）を計算して定量化した。ＳＮ比が５未満のチップは次の解析から除外した。チップの少なくとも１０％に存在した場合に遺伝子を次の解析に含めた。１１，７２３のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットがこのカットオフの後に残った。遺伝子発現データの質は更に、主成分分析に基づいたアウトライアーの設定及び遺伝子強度の正規分布の解析（Ｐｒｔｅｋ Ｐｒｏ、Ｖ５．１）によって調節した。
【００９１】
統計分析
高い感度の応答が予測される遺伝子を同定するためにパーセンタイル解析を利用した。非応答者の少なくとも４０％に比べて応答者の１００％で上方制御または下方制御された遺伝子を同定した。カイ二乗検定及びスチューデントｔ−検定を用いて、ｒａｓ突然変異状態及び遺伝子発現を含む患者の応答性と患者の共変量との相関性の有意性を調べた。自動ｋ平均法及び階層クラスタリングをＯｍｎｉｖｉｚで行った。次いで、選択された遺伝子の予測値を、Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ及びＬｅａｖｅ‐ｆｉｖｅ‐ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法で解析した。ここで、データセットから１つ（または５つ）のサンプルから取り出し、マーカーを１１，７２３の遺伝子から再選択した。次いで、この遺伝子の予測値を、線形判別分析を用いて残りのサンプルに対して調べた。感度を、検査で検出された真陽性の数を真陽性と偽陰性の合計数で除して求めた。特異性は、検査で検出された真陰性の数を真陰性と偽陽性との合計数で除して求めた。陽性の予測値は、真陽性の数を真陽性と偽陽性の合計数で除して求めた。陰性の予測値は、真陰性の数を真陰性と偽陰性の合計数で除して求めた。治療に応答する患者の陽性の尤度比は、感度を１から特性を減じたもので除して得られる。受信者動作曲線（ＲＯＣ）を用いて、１００％の感度を必要とする各クラシファイアの適切な閾値を選択した。このＲＯＣにより、診断のためにそれぞれのパラメータの感度及び特異性を計算することができる。
【００９２】
リアルタイムＰＴ‐ＰＣＲバリデーション
ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＴ‐ＰＣＲを用いてＡＨＲ遺伝子及びＡＫＡＰ１３遺伝子のマイクロアレイの結果を検証した。各１μｇのサンプルの増幅したＲＮＡから、製造者（インビトロジェン社（Invitrogen））の取扱説明書に従ってＴ７オリゴ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。ＡＫＡＰ１３遺伝子及びコントロール遺伝子ＰＢＧＤのプライマー及びＭＧＢプローブをＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems））を用いてデザインし、ＡＨＲ遺伝子及びコントロール遺伝子ＨＰＲＴのプライマー及びプローブは、ＡＢＩがＡｓｓａｙｓ‐ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄとして販売している。ＡＫＡＰ１３のプライマー／プローブの配列は、ＡＫＡＰ１３順方向プライマー：５’ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＡＡ３’、ＡＫＡＰ１３逆方向プライマー：５’ＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＡＴＣ‐３’、ＡＫＡＰ１３プローブ：６ＦＡＭ‐ＴＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡ‐３’である。全てのプライマー及びプローブは、９０％を超える最適な増幅効率であるかについて検査した。相対検量線は、ＨｅＬａ ｃＤＮＡ（大抵の場合は、２５ｎｇ〜２．５ｐｇの範囲）の５つの希釈液（それぞれ１０倍）から構成されている。ＲＴ‐ＰＣＲ増幅混合物（２５μＬ）には、１００ｎｇの鋳型ｃＤＮＡ、２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（１２．５μＬ：アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems））、５００ｎＭ 順方向プライマー及び逆方向プライマー、及び２５０ｎＭ プローブを含む。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（アプライド・バイオシステムズ社）上で反応させた。サイクル条件は、５０℃での２分間のＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧの活性化、９５℃での１０分間のポリメラーゼの活性化、９５℃で１５秒間とアニーリング温度（５９℃または６０℃）で６０秒間のサイクルを５０回である。それぞれのアッセイでは、目的の遺伝子及びコントロール遺伝子に対して検量線、非鋳型コントロール、及び鋳型ｃＤＮＡが３つずつ含まれている。それぞれの遺伝子の相対的な量は、検量線に基づいて算出し、コントロール遺伝子の量で標準化した。３つの同じサンプルの平均変動率（算出した量に基づいた）は８％であった。ストックから個々に希釈した鋳型を用いた反復実験間の相関性が０．９５を超えていた。同じＴａｑＭａｎ（登録商標）実験が再現性のある結果を示した場合は、サンプルを単にマイクロアレイデータと比較した。
【００９３】
細胞系の培養及びＡＫＡＰ１３の過剰発現アッセイ
ＡＫＡＰ１３ベクター、オンコＬＢＣ、プロトＬＢＣ、及びベクターコントロール（ｐＳＲａｌｐｈａ−ｎｅｏ）を、ドクター・デニズ・トクソ（Dr. Deniz Toksoz）から入手した（チェン（Zheng）ら（１９９５年））。ＨＬ６０細胞系を米国組織培養機関（American Tissue Culture Collection）から入手して、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０で増殖させた。細胞は、製造者の取扱説明書に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（キアゲン社）を用いてそれぞれのベクターで一過性に形質移入し、Ｇ４１８（６００μｇ／ｍＬ）で７日間保存した。次いで、ティピファニブを様々な濃度（０、１．５、３．１、６．３、１３、２５、５０、１００、２００、１０００、及び１０，０００ｎＭ）で同じ培養液（１．５×１０5細胞／ｍＬ）に添加した。細胞数を６日目にカウントした。細胞数を薬物を含まない培養液に対して標準化してコントロール生細胞のパーセントを得た。
【００９４】
結果
再発性及び難治性ＡＭＬの発現プロファイリング
ＦＴＩｓはもともと、ファルネシルトランスフェラーゼ酵素（ＦＴａｓｅ）活性を特異的に阻害して発癌遺伝子ｒａｓ経路を遮断するようにデザインされている。従って、ｒａｓ変異の活性化について、再発性または難治性ＡＭＬ患者８０人の骨髄からのＤＮＡをまず分析し、ｒａｓ変異とティピファニブに対する応答との考えられる相関性を調べた。ＡＭＬサンプルの２６％がＮ‐ｒａｓ変異を含み、変異状態は客観的応答や全生存と相関していなかった（アルソー（Harousseau）ら（２００３年））。従って、ＦＴＩティピファニブに対する応答の予測に用いることができる新規のシグネチャを特定するために遺伝子発現プロファイリングを行った。ティピファニブで治療する前に８０人の患者から遺伝子発現分析のために骨髄サンプルを採取した。表２に、患者の情報が示されている。
【００９５】
【表２−１】
2005333987.tif 000004
【表２−２】
2005333987.tif 000005
【００９６】
８０サンプルの内の５８サンプルが、ＲＮＡの質及びチップの性能を含む品質管理基準をパスした。年齢、性別、ＡＭＬの種類（再発性、難治性）、細胞発生リスク因子、基準芽細胞数、応答、及びこれらの５８人の患者と臨床試験の残りの患者（表３ではＮ＝１９４）との間の全生存には有意差がなかった。
【００９７】
【表３】
2005333987.tif 000006
【００９８】
高い感度で応答者と非応答者とを区別できる遺伝子を同定するために、遺伝子発現データを臨床情報と統合してレトロスペクティブ分析をした。差次的に発現する遺伝子を同定する前に、これらのデータを複数回フィルタリングした。まず、少なくとも１０％のサンプルで発現していない遺伝子は排除した。これにより、遺伝子の数が約２２，０００から１１，７２３に減少した。自動分析の場合、データベース全体で発現の変動を殆ど示さない遺伝子（変動率がサンプル全体で４５％未満）も排除し、残りの５，７２８の遺伝子を四分標準化（quantile normalization）した。この段階で、自動ｋ‐平均クラスタリング分析を実施して、全遺伝子発現プロファイルに基づいて患者間の全ての差を確認した。この方法で、患者の６つの主なクラスターを同定した。応答者と非応答者との間には差が観察されなかった（図１）。ほんの一部の遺伝子がＦＴＩｓの抗腫瘍効果に関連していると考えられる。例えば、ＦＴＩ生物学に関与する１つの遺伝子の差次的な発現が臨床応答に影響を与えるが、他の１１，７２２の遺伝子からのノイズによってこの影響が隠されてしまう可能性がある。
【００９９】
例２
応答者と非応答者の間で差次的に発現する遺伝子の同定
次に、全ての応答者と少なくとも４０％の非応答者との間で差次的に発現する遺伝子を同定するために遺伝子発現データを用いて管理下で解析を行った。このような基準は、可能な最高レベルの感度でティピファニブに対する応答を予測できる遺伝子を同定するために選択した。応答者と非応答者とを分類でき（表５）、ｔ‐検定で有意なｐ値（ｐ＜０．０５）が得られる合計１９の遺伝子（表４）を１１，７２３の遺伝子から同定した。シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、発癌、及び場合によってはＦＴＩ生物学に関与する遺伝子も含まれている（ＡＲＨＨ、ＡＫＡＰ１３、ＩＬ３ＲＡ）
【０１００】
【表４】
2005333987.tif 000007
【表５】
2005333987.tif 000008
【０１０１】
遺伝子マーカーのリアルタイムＲＴ‐ＰＣＲバリデーション
マイクロアレイ遺伝子発現データを検証するために、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いる標識標的ｃＲＮＡの作製に用いたｃＤＮＡに対してＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを実施した。遺伝子発現データを検証するために２つの遺伝子を選択した。ＡＨＲ遺伝子及びＡＫＡＰ１３遺伝子が、応答者に対して最高レベルの特異性が得られたため選択した。相関率は、ＡＨＲが０．７４、ＡＫＡＰ１３が０．９４であり、マイクロアレイ遺伝子発現データがＰＣＲによって認証されたことを意味する（図２）。
【０１０２】
耐性マーカーとしてのＡＫＡＰ１３遺伝子の同定
ＡＫＡＰ１３が、ティピファニブに対して耐性のある患者で過剰発現した。この遺伝子の予測値を、Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法（ＬＯＯＣＶ、図３のＡ）で５８のサンプルについて計算した。ＡＫＡＰ１３遺伝子の発現は、９６％の負の予測値（ＮＰＶ）の非応答、４３％の正の予測値（ＰＰＶ）の低発現レベル仲介応答を予測した（ｘ2＝１３．７、Ｐ＝０．００２２）。全体的な診断精度は６９％であり、応答の正の尤度比が２．４であった。従って、ＡＫＡＰ１３遺伝子の発現に基づいたこの患者集団の分類により、応答率が全群の２４％（１４／５８）から遺伝子発現率の低い患者群の４３％（１３／３０）に増大した。各患者におけるＡＫＡＰ１３遺伝子の発現の値が図３のＢに示されている。生存をカプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）で分析すると、この遺伝子の発現が低い患者の平均生存期間は発現レベルが高い患者よりも９０日長かった（Ｐ＝０．００８、図３のＣ）。
【０１０３】
３つの遺伝子マーカーの最小セットの同定
ＡＫＡＰ１３単独よりも優れた精度でティピファニブに対する応答を予測できる遺伝子マーカーの候補のセットを同定するためにＬＯＯＣＶを用いた。クラシファイアを、ｔ‐検定のＰ値に基づいた遺伝子数の増大を用いて作成し、このようなクラシファイアの誤差率をＬＯＯＣＶで計算し、予測する応答感度を１００％に維持する（図４のＡ）。３遺伝子クラシファイアは、低い誤差率で応答を予測できる（図４のＡ）。これは、Ｌｅａｖｅ‐ｆｉｖｅ‐ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎを実施した時に確認された。遺伝子を追加すると誤差率が上昇するため、追加の遺伝子がクラシファイアにノイズを付与することを示している。３遺伝子クラシファイアの場合、ＬＯＯＣＶにより、ＮＰＶが９４％、ＰＰＶが４８％、全体的な診断精度が７４％、正の尤度比が２．９であることが実証された（図４のＢ）。各患者における３遺伝子の発現値の組合せが図４のＣに示されている。従って、この遺伝子シグネチャをもつ患者群の場合、ティピファニブに対する応答率が、この患者集団における２４％（１４／５８）に対して４８％（１２／２５）であった。
【０１０４】
３遺伝子シグネチャ（ＡＨＲ、ＡＫＡＰ１３、及びＭＩＮＡ５３）を用いることにより、カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）で予測された応答者群と非応答者群との間に生存の有意差が示された（図４のＤ）。応答者として誤って分類された１３人の患者は、比応答者として正しく分類された３１人の患者よりも生存期間が長かった。興味深いことに、非応答者として誤って分類された２人の患者が、血液学的改善のみを示し、全生存期間が比較的短かった（７１日と８７日）。
【０１０５】
ＡＫＡＰ１３の過剰発現によりＡＭＬのティピファニブに対する耐性が増大する
ＡＫＡＰ１３遺伝子は、ティピファニブに対する耐性の最も強力なマーカーである。従って、ＨＬ６０細胞系でこの遺伝子のオンコＬＢＣ変異体変異体及びプロトＬＢＣ変異体を過剰発現させてＦＴＩ生物学におけるその関与を調べた。次いで、一過性形質移入体をティピファニブに対する感度について検査した。このＡＭＬ細胞系モデルにおける両方のＡＫＡＰ１３変異体の過剰発現により、コントロール細胞に比べティピファニブに対する耐性が約２０倍増大した（図３）。ＬＢＣオンコジーンとＬＢＣプロトオンコジーンの両方が、ティピファニブに対する耐性を同程度に増大させたのが、コントロールに比べて２以上のｌｏｇ単位、死滅曲線の右方向へ平行移動していることで分かる。
【０１０６】
考察
近年、２つのグループが、臨床結果の予測に有用な新たに診断された成人ＡＭＬ患者の遺伝子発現プロファイルを確認した（ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）、バルク（Valk）ら（２００４年））。これらのプロファイルは、核型分析などの現在用いられている診断マーカーよりも強力なようである。更に、発現プロファイルで、標準的な化学療法薬（チャン（Chang）ら（２００３年）、オクツ（Okutsu）ら（２００２年）、及びチョク（Chok）ら（２００３年））及び新規の選択抗癌剤を含む抗癌剤に対する応答性を予測できることが分かった（ホフマン（Hofmann）ら（２００４年）、マックリーン（McLean）ら（２００４年））。同様に、遺伝薬理学的プロファイルが、チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ（gefitinib）に対する患者の応答に相関することが分かった（パエズ（Paez）ら（２００４年）及びリンク（Lynch）ら（２００４年））。この研究で、非小細胞肺癌患者の亜群が、標的治療に対する臨床応答に相関する標的上皮細胞成長因子受容体内で変異を起こしていることが分かった。
【０１０７】
再発性及び難治性ＡＭＬ患者のフェーズ２試験で、新規のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であるティピファニブに対する応答を予測する遺伝子発現プロファイルを確認した。この種の化合物は、悪性血液疾患（カープ（Karp）ら（２００１年）、カーズロック（Kurzrock）ら（２００４年）、アルシナ（Alsina）ら（２００３年）、コーテス（Cortes）ら（２００３年）、トーマス（Thomas）ら（２００１年））、及び乳癌（ジョンストン（Johnston）ら（２００３年））や再発性神経膠腫（ブラナー（Brunner）ら（２００３年））などの充実性腫瘍の治療に有望であることを示されている。しかしながら、臨床応答は実証されているが、薬物に対して最も応答しそうな患者（このため治療の最適な候補者となる）を特定する患者に合った治療の要望が大きくなっている。更に、ｒａｓがこの種の薬物の主な標的と見なされているが、複数の臨床試験により、このような薬物がｒａｓ変異の頻度が高い集団に必ずしも有効ではないことが示された（ファン・カッツエン（Van Cutsem）ら（２００４年）及びラオ（Rao）ら（２００４年））。
【０１０８】
複数の遺伝子マーカーがティピファニブに対する応答を予測する可能性があることが確認された。このようなマーカーのサブセットは、薬物応答を予測でき、かつＦＴＩ生物学に関与する可能性もある。マイクロアレイの実験により見出された上位候補の１つがリンパ芽細胞発症癌遺伝子（lymphoid blast crisis oncogene）（オンコＬＢＣまたはＡＫＡＰ１３）である。この遺伝子は、Ｒｈｏタンパク質のグアニンヌクレオチド交換因子（チェン（Zheng）ら（１９９５年））として機能し、かつプロテインキナーゼＡアンカータンパク質として機能する（カー（Carr）ら（１９９１年））。ＡＫＡＰ１３は、ラミンＢ（ｌａｍｉｎＢ）と相互作用することが知られているαヘリカルドメインに相同な領域を含む（フォイスナー（Foisner）ら（１９９１年））。これに関連して、ラミンＢがプロテインキナーゼＡによって活性化され、これにより分裂活性が増大する。ＲｈｏＢとラミンＢは共に、ファルネシル化され、ＦＴＩｓの候補標的である。ＡＫＡＰ１３は、その３’末端の喪失により細胞の形質転換を引き起こすためプロトオンコジーンである（ステルペッチ（Sterpetti）ら（１９９９年））。これは慢性骨髄性白血病の患者で初めに確認されたが、その発現はＡＭＬでは実証されていない。
【０１０９】
ＦＴＩ生物学に関与している可能性がある複数の遺伝子（ＡＲＨＨ、ＡＫＡＰ１３、ＩＬ３ＲＡ）の同定により、複数の経路の相互作用がこのＡＭＬ患者集団でＦＴＩがどのよう機能するかに影響を与え得るという考えが支持される（図７）。これらの遺伝子は、ｒａｓ、ｒｈｏ、及び場合によってはラミンＢを含む複数のファルネシル化タンパク質と相互作用する。Ｒｈｏタンパク質は、ＦＴＩｓの重要な抗腫瘍形成標的の可能性がある（サハイ（Sahai）ら（２００２年）及びランセット（Lancet）ら（２００３年））。ＲｈｏＢ、ＲｈｏＡ、及びＲｈｏＣは、複数の種類の癌で過剰発現することが分かっている（サハイ（Sahai）ら（２００２年））。加えて、ＲｈｏＨ（ＡＲＨＨ）が骨髄起源の腫瘍で頻繁に再編成され、これにより過剰発現することがある（パスクアルッチ（Pasqualucci）ら（２００１年））。これらＲｈｏタンパク質の殆どがゲラニルゲラニル化（geranygeranylated）するが、互いに密接に相互作用し、ファルネシル化したｒａｓ、ＲｈｏＥ、及びＲｈｏＢ低分子量ＧＴＰ加水分解酵素とも相互作用する（サハイ（Sahai）ら（２００２年）及びリ（Li）ら（２００２年））。更に、ＲｈｏＨ、ＲｈｏＢ、及びＲｈｏＥが、ＲｈｏＡ及びＲｈｏＧの形質転換能力に対して拮抗するように作用し得る（リ（Li）ら（２００２年））。ＲｈｏＡ及び場合によっては関連する低分子量ＧＴＰ加水分解酵素の活性が、グアニンヌクレオチド交換因子リンパ芽細胞発症癌遺伝子（ＡＫＡＰ１３）によって増大する（ステルペッチ（Sterpetti）ら（１９９９年）及びトクソズ（Toksoz）ら（１９９４年））。加えて、ＡＫＡＰ１３は、プロテインキナーゼＡによるラミンＢの活性化によって分裂活性が増大し得る（フォイスナー（Foisner）ら（１９９１年））。ＩＬ３受容体がｒａｓ経路を活性化させることも良く知られている（テスタ（Testa）ら（２００４年））。従って、図７に示されているように、ＩＬ３ＲＡ及びＡＫＡＰ１３の活性の増大とＲｈｏＨの発現の減少により、形質転換の細胞プロファイルが増大し得る。これにより、白血病芽細胞が、代償性経路によってＦＴＩｓの抗腫瘍形成効果に打ち勝つことができる。これとは対照的に、ＩＬ３ＲＡ及びＡＫＡＰ１３の発現が過少になると、ＲｈｏＨ活性が増大し、ＦＴＩｓがより効率的にこのよう経路を遮断できる。
【０１１０】
最後に、ＡＫＡＰ１３（オンコＬＢＣ変異体とプロトＬＢＣ変異体の両方）の過剰発現によりＨＬ６０ ＡＭＬ細胞系のＩＣ50が約２０倍増大することを実証した。これは、ＡＫＡＰ１３の過剰発現が、耐性の適切なマーカーであり、ティピファニブに耐性のある患者の有用な代替薬物標的となり得ることを示唆している。
【０１１１】
全体的にみて、我々の発見により、ティピファニブに応答しそうな患者を識別する遺伝子発現を用いた診断アッセイを開発することが可能である。この情報を用いて、適切な患者集団をより直接的に治療することができる。生存をゴールドスタンダードとして用い、遺伝子シグネチャにより、従来の臨床の応答基準では予測できなかった治療に対する応答のレベルを予測することができる。これにより、ＦＴＩ治療に対する応答を予測するための遺伝子シグネチャがＦＴＩ療法に関係なく予後値を有するか否かの問題が起こる。従って、従来の化学療法で治療した新たに診断されたＡＭＬ患者で既に同定された予後シグネチャを評価した（ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年））。このシグネチャは現在の患者集団に有用性を示したが、我々の３遺伝子シグネチャでは不良な予後群と良好な予後群に更に階層分類することができ、この３遺伝子シグネチャがＦＴＩｓに対する応答の予測要素であることを示している。
【０１１２】
例３
ＡＭＬ予後遺伝子シグネチャの分析
この３遺伝子シグネチャは、薬物治療の種類に関係なく予後を予測することができる。これを確認するために、まず従来の化学療法で治療した新たに診断されたＡＭＬ患者で最近同定された遺伝子発現シグネチャを評価した（ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年））。このシグネチャは、ｃＤＮＡアレイを用いて定義した。従って、まずこれらの遺伝子をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ上のプローブに一致させた。ブリンガー（Bullinger）らによって同定された１３３の予測遺伝子の内、１６７のプローブセット（１０３個の遺伝子に対応する）がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａチップに一致した。我々の分析で同定したこの３つの遺伝子は、ブリンガー（Bullinger）らの１３３遺伝子リスト（配列番号２３‐１８９）に含まれていない。これらの１６７のプローブセットを用いて階層クラスタリングにより２つの主要な患者群に分類した（図８のＡ）。カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）により、これらのクラスターを良好な予後の患者と不良な予後の患者に明確に階層分類した（図８のＢ、Ｐ＝０．００００２１９）。従って、我々のデータが、ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）によって同定された１３３遺伝子予後シグネチャのサブセットを患者の再発性及び難治性の集団に使用できることを示している。従って、これが、予後遺伝子プロファイルが様々なマイクロアレイプラットフォーム及び様々な種類のＡＭＬに対して驚くほど強力であることを示している。
【０１１３】
予後遺伝子シグネチャによって決定されたクラスターは何れも、それ程多くの応答者を有していない。しかしながら、ティピファニブの３遺伝子シグネチャを用いて良好な予後群と不良な予後群に分ける場合、ティピファニブに応答した患者を両方の予後群から更に階層分類することができる（図８のＣ）。従って、３遺伝子シグネチャは、予後シグネチャとは別の有用性を有し、この患者集団のＦＴＩ治療に対して特定の意味を持つ。
【０１１４】
例４
臨床評価及び応答の定義
現在の試験は、ＡＭＬにおける各２８日サイクルの最初の２１日間の開始経口投与量６００ｍｇ（１日２回）で単一薬剤としてティピファニブが投与されたファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の有効性及び安全性について調べる非盲検多施設非競合フェーズ２試験である。患者は、再発性ＡＭＬと難治性ＡＭＬの２つの集団に分けた。合計で２５２人の患者（再発性１３５人、難治性１１７人）を治療した。遺伝子発現プロファイリングのために、ティピファニブに対する応答を、事後の任意の時点で病理または臨床部位によって、客観的応答（上記したＣＲ、ＣＲｐ、またはＰＲ）のある患者、安定疾患であると確認された患者、または血液学的応答（白血病芽細胞の５０％を超える減少）のある患者に分けた。
【０１１５】
サンプルの採取及びマイクロアレイ処理
全てのサンプルを、前述の処理及び分析に同意した患者から採取した。骨髄サンプルを、ティピファニブで治療する前に患者から採取し、このサンプルをＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ‐ｄｉａｒｉｚｏａｔｅで遠心分離した（１．０７７ｇ／ｍＬ）。この白血球をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＤＭＳＯを含むＦＢＳに再懸濁し、直後に−８０℃で保存した。この細胞を解凍し、ＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Qiagen））で全ＲＮＡをこの細胞サンプルから抽出した。ＲＮＡの質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで検査した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（カリフォルニア州クララのサンタ社（Snata））プロトコルに従ってｃＤＮＡ及びｃＲＮＡの合成を行った。１回の増幅では複数のサンプルのＲＮＡ収量がチップハイブリダイゼーションに用いる十分な標識ｃＲＮＡを得るのに不十分であるため２回の線形増幅を行った。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションのために、１１μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．１、１０ｍＭ 酢酸カリウム、及び３０ｍＭ 酢酸マグネシウムで３５分間、９４℃でインキュベートしてランダムに断片化した。断片化したｃＲＮＡを、６０ｒｐｍにセットしたローティッセ・オーブン（rotisserie oven）で１６時間、４５℃でＵ１３３Ａアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、このアレイを６×ＳＳＰＥ及びＴｒｉｔｏｎＸ‐１００（０．００５％）を含む０．５×ＳＳＰＥで洗浄し、次いで、ストレプトアビジン‐フィコエリトリン（ＳＡＰＥ：オレゴン州ユージーン社（Eugene）の分子プローブ（Molecular Probes））で染色した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５００Ａ ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（カリフォルニア州パロアルトのアジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies））を用いて結合した標識プローブを定量した。
【０１１７】
それぞれのアレイの合計蛍光強度を一定値６００に対して調整した。チップの性能を、ＳＮ比（生の平均信号／ノイズ）を計算して定量化した。ＳＮ比が５未満のチップは次の解析から除外した。チップの少なくとも１０％に存在した場合に遺伝子を次の解析に含めた。薬１２，０００のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットがこのカットオフの後に残った。遺伝子発現データの質は更に、主成分分析に基づいたアウトライアーの設定及び遺伝子強度の正規分布の解析（Ｐｒｔｅｋ Ｐｒｏ、Ｖ５．１）によって調節した。
【０１１８】
統計分析
自動階層クラスタリング及びクラスタリングをＯｍｎｉｖｉｚで実施した。Ｓ‐Ｐｌｕｓを用いてカプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）を実施した。
【０１１９】
例５
新たなＡＭＬで同定した予後シグネチャは再発性及び難治性の患者に有用である
近年発行された２つの研究論文に、新たに診断された成人ＡＭＬ患者の遺伝子発現のプロファイリング、及びこのプロファイリングの臨床結果の予測への使用が記載されている（ブリンガー（Bullinger）ら著（２００４年）及びバルク（Valk）ら著（２００４年））。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ遺伝子チップを用いて再発性及び難治性のＡＭＬ患者５８人のプロファイリングを行った。ブリンガー（Bullinger）らによって同定された１３３の予測遺伝子の内、１６７のプローブセット（１０３個の遺伝子に対応する）がＵ１３３Ａチップで同定された（図９）。この１６７のプローブセットを配列表に記載し、配列番号２３‐１８９を付した。
【０１２０】
これらの１６７のプローブセットを用いて階層クラスタリングにより患者を２つの主要な群に分類した（図１０のＡ）。カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）により、これらのクラスターを良好な予後の患者と不良な予後の患者に明確に階層分類した（図１０のＢ、Ｐ＝０．００００２１９）。従って、我々のデータが、ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）によって同定された１３３遺伝子予後シグネチャの１０３個の遺伝子のサブセットを患者の再発性及び難治性の集団に使用できることを示している（表６）。従って、これが、予後遺伝子プロファイルが様々なマイクロアレイプラットフォーム、様々な種類のＡＭＬ、及び様々な治療方法に対して驚くほど強力であることを示している。
【０１２１】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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予後シグネチャは、ティピファニブに対する応答性を予測する３遺伝子シグネチャとは無関係である。
【０１２２】
我々は以前に、再発性及び難治性のＡＭＬ患者においてティピファニブに対する応答を予測する３遺伝子シグネチャ（ＡＨＲ、ＡＫＡＰ１３、ＭＩＮＡ５３）を同定した。これらの遺伝子は、良好な予後結果群と不良な予後結果群に患者を階層分類できる（図１１のＢ、ｐ＝０．００２）。この遺伝子シグネチャがＦＴＩ治療に対する応答を予測するのか或いは単に概ね良好な予後の患者を識別するだけなのかという問題が起こる。この３遺伝子シグネチャを用いて良好な予後群及び不良な予後群に分ける場合、応答者を予後群から更に階層分類することができる（図１１のＣ、ｐ＝０．０００００３）。両方の遺伝子シグネチャを適用すると、ティピファニブに応答せず、かつ治療の種類に関係なく予後が不良な患者群を明確に階層分類することができる（図１１のＤ、ｐ＝０．００００００５）。従って、３遺伝子シグネチャは、この患者集団におけるＦＴＩ治療に特異的で既に同定された予後シグネチャに関係ないようである。従って、患者の治療のより良い管理のために、予後シグネチャを薬物特異的シグネチャ（ティピファニブ予測プロファイルなど）と共に使用することを提案する。
【０１２３】
例６
応答者と非応答者（安定疾患の患者は含まない）との間で差次的に発現する遺伝子の同定
４人の患者が安定疾患であると分類されたが、これらの患者は応答者または非応答者に明確に区別できないため分析から除外した。安定疾患の患者を分析に含めると、薬物治療に関係なく予後に関連した遺伝子選択の分析が偏ってしまう恐れがある。従って、１０人の応答者を４４人の非応答者と比較することになった。選択される遺伝子は、４０％の特異性を有し、最小の平均の変化が２倍である必要がある。このような基準は、可能な限り高レベルの感度でティピファニブに対する応答を予測できる遺伝子を同定するために選択した。１１，７２３の遺伝子から、応答者と非応答者とを階層分類でき、かつｔ‐検定で有効なＰ値（Ｐ＜０．０５）が得られた合計８個の遺伝子を同定した（表６‐５）。これらの遺伝子の中には、シグナル伝達、アポトーシス、細胞増殖、発癌、及び場合によってはＦＴＩ生物学に関与する遺伝子が含まれている。
【０１２４】
ＡＫＡＰ１３は最も強力なマーカーである
次に、８つの選択された遺伝子から最適な診断精度が得られる最小の遺伝子のセットを同定する。クラシファイアは、受信者動作曲線（ＲＯＣ）解析で得たＡＵＣ値に基づいて遺伝子の増大数を用いて作成し、応答を予測する感度を１００％に維持したまま、これらのクラシファイアの誤差率をＬＯＯＣＶを用いて計算した（図１２のＡ）。ＡＫＡＰ１３遺伝子は、４０％未満の最低の誤差率で応答を予測することができる（図１２のＡ）。３つ以上の遺伝子をクラシファイアに用いる場合、誤差率が５０％超に増大する。ＡＫＡＰ１３の場合、ＬＯＯＣＶにより、ＮＰＶが９３％、ＰＰＶが３１％、全診断精度が６３％、陽性の可能性の比率が２．０であることが示された（図１２のＢ）。各患者におけるＡＫＡＰ１３の発現の値が図１２のＣに示されている。従って、ＡＫＡＰ１３の発現率が低い患者群の場合、ティピファニブに対する応答率は、現在の患者集団の１８％（１０／５４）に対して３１％（８／２６）である。ＡＫＡＰ１３遺伝子を用いると、カプラン‐マイヤー分析（Kaplan-Meier analysis）により、予測された応答者群と予測された非応答者群の生存に有意差が示された（図１２のＤ）。
【表６−５】
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ＡＵＣは、ＲＯＣ解析の曲線の下側の領域であり、全診断精度を示す。
【０１２５】
例７
抗体（予言的）
ポリクローナル抗体の作製のために、ＬＢＣオンコジーン由来ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシニアンに結合し、これを用いてウサギを免疫化した。この血清が対応するペプチドに対して反応するかをＥＬＩＳＡで検査し、陽性のバッチを親和精製した。精製した抗体は、組織部分にエピトープを有するペプチドを特異的に検出する。これは、抗体と対応するペプチドが同時に添加された場合に信号が完全に消滅することで確認できる。ＩＨＣで良く機能するこのポリクローナル抗体に加えて、自然の折りたたみ状態のタンパク質を検出できるモノクローナル抗体も作製した。モノクローナル抗体を作製するために、自然の折りたたみ及び翻訳後修飾が確実となるように哺乳動物細胞で産生された精製ｓれた抗原を作製した。この抗原、すなわちＬＢＣオンコプロテイン‐ＩｇＧ定常部分融合タンパク質をマウス骨髄腫細胞で発現させ、このタンパク質をおとり（bait）としてＦｃ部分を用いて精製した。この精製された抗原を、Ｃ末端ポリクローナル抗体によりウエスタンブロットで確認した。この抗原を用いて、ＩｇＧ定常部分ではなくＬＢＣペプチドに対して作用する抗体を産生する陽性クローンから選択してＬＢＣペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を得た。ＬＢＣオンコジーンを臨床で同定するためのキットを、これらの抗体または類似の抗体を用いて容易に作製することができる。このようなキットは、ＬＢＣペプチド（従ってＬＢＣオンコジーン）同定用の抗体、適切な標識試薬（例えば、酵素及びラベルなど）、並びにこのようなキットの臨床用途に有用な、希釈用緩衝液、安定剤、及びこのようなアッセイに一般的に用いられる他の物質などの他の試薬（オプション）を含むことができる。
【０１２６】
例８
免疫組織化学（予言的）
ＬＢＣオンコジーンのＣ末端ペプチドに対する親和精製されたポリクローナル抗体をＩＨＣの検出及びＬＢＣオンコジーンの局在化に用いた。ホルマリン固定してパラフィンに埋め込んだ正常及び腫瘍組織から得た４μｍの切片を、３‐アミノプロピル‐トリエトキシ‐シラン（ＡＰＥＳ、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Sigma））がコーティングされたスライドガラスに載せた。これらの切片を、段階的濃度のエタノールで脱パラフィン化して再水和し、室温で３０分間、メタノールペルオキシド（methanolic peroxide）（絶対メタノールに溶かした０．５％過酸化水素）で処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。抗原の回収は、電子レンジで５分間（６５０Ｗ）、２回行った。Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、カリフォルニア州バーリンガムのベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories））を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色を行った。ＬＢＣペプチド抗体は、１：２０００の最適な希釈で使用した。ビオチン標識二次抗体及びペルオキシダーゼ標識アビジン‐ビオチン複合体の両方を切片上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈液を作製し、全てのインキュベーションを室温の湿室で行った。ある染色ステップと別の染色ステップの間にスライドガラスをＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ染色は、３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール（3-amino-9-etylcarbazole）（シグマ（Sigma））溶液（０．０３％過酸化水素を含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液中に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度、ｐＨ５．０）を用いて室温で１５分間、見えるようにした。最後に、切片を、マイヤーのヘマトキシリンで軽く後染色し、水溶性封入剤（Ａｑｕａｍｏｕｎｔ、ＢＤＨ）で封入した。コントロール実験では、一次抗体を正常なウサギの血清のＩｇＧ断片で置換する、或いは一次抗体をＬＢＣペプチドで予め吸収する。このような染色は、細胞のサブセットにＬＢＣオンコジーンが存在することを示している。
【０１２７】
本発明をより良く理解できるように図及び例を用いて詳細に説明したが、このような説明及び例は本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２８】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【０１２９】
本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の予後（生存／転帰）を評価する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがＡＭＬの予後を示していることを特徴とする方法。
（２）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の状態を決定する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルがＡＭＬの状態を示していることを特徴とする方法。
（３）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の治療プロトコルを決定する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップとを含み、
所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、治療に対して患者が応答する可能性を十分に示し、医師が適切な治療の程度及び種類を決定することができることを特徴とする方法。
（４）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者を治療する方法であって、
（ａ）前記患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）（ｉ）配列番号１または５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１または５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の前記サンプルにおける発現レベルを測定するステップであって、所定のカットオフレベルよりも高いまたは低い前記遺伝子発現レベルが、前記患者が治療に応答する可能性を示す、前記ステップと、
（ｃ）前記患者が治療に応答しそうな場合に前記患者をアジュバント療法で治療することを特徴とする方法。
（５）前記患者が再発性または難治性ＡＭＬであることを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
【０１３０】
（６）前記配列番号が１、５、及び６であることを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（７）更に、前記サンプル中で恒常的に発現している少なくとも１種類の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含むことを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（８）発現パターンの比較をパターン認識法で行うことを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（９）前記パターン認識法がＣｏｘ比例ハザード分析の使用を含むことを特徴とする実施態様（８）に記載の方法。
（１０）前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して前記サンプルで少なくとも１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現であることを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
【０１３１】
（１１）前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に対して、転移細胞を有する前記サンプルで少なくとも統計的に有意なｐ値の過剰発現であることを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（１２）前記ｐ値が０．０５未満であることを特徴とする実施態様（１１）に記載の方法。
（１３）前記遺伝子発現をマイクロアレイまたは遺伝子チップで測定することを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（１４）前記マイクロアレイがｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイであることを特徴とする実施態様（１３）に記載の方法。
（１５）前記マイクロアレイまたは前記遺伝子チップが更に、１または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする実施態様（１３）に記載の方法。
【０１３２】
（１６）遺伝子発現を、前記サンプルから抽出したＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で核酸を増幅して決定することを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（１７）前記ＰＣＲが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）であることを特徴とする実施態様（１６）に記載の方法。
（１８）前記ＲＴ‐ＰＣＲが更に、１または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする実施態様（１７）に記載の方法。
（１９）遺伝子発現を、その遺伝子によってコードされるタンパク質を測定または検出して検出することを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（２０）前記タンパク質を、そのタンパク質に特異的な抗体によって検出することを特徴とする実施態様（１９）に記載の方法。
【０１３３】
（２１）遺伝子発現をその遺伝子の特性を測定して検出することを特徴とする実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）に記載の方法。
（２２）前記測定した特性が、ＤＮＡ増幅、メチル化、突然変異、及び対立遺伝子変異体からなる群から選択されることを特徴とする実施態様（２１）に記載の方法。
（２３）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の予後患者レポートを作成する方法であって、
（ａ）患者から生体サンプルを採取するステップと、
（ｂ）前記サンプルの遺伝子発現を測定するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の結果に再発ハザードスコアを適用するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）で得た結果を用いて前記レポートを作成するステップとを含むことを特徴とする方法。
（２４）前記レポートが、前記患者の転帰の評価及び／または患者集団に対するリスクの可能性を含むことを特徴とする実施態様（２３）に記載の方法。
（２５）前記患者が再発性または難治性の患者であることを特徴とする実施態様（２３）に記載の方法。
【０１３４】
（２６）実施態様（２３）に従った方法で作成した患者レポート。
（２７）配列番号１‐２２、または表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択される少なくとも１つのプローブセットを含むことを特徴とする組成物。
（２８）生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を決定するためのアッセイを行うためのキットであって、
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とするキット。
（２９）前記配列番号が１、５、及び６であることを特徴とする実施態様（２８）に記載のキット。
（３０）更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする実施態様（２９）に記載のキット。
【０１３５】
（３１）更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする実施態様（２８）に記載のキット。
（３２）生体サンプルで急性骨髄性白血病の予後を評価するための製品であって、
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を検出するための物質を含むことを特徴とする製品。
（３３）前記配列番号が１、５、及び６であることを特徴とする実施態様（３２）に記載の製品。
（３４）更に、マイクロアレイ分析を実施するための試薬を含むことを特徴とする実施態様（３２）に記載の製品。
（３５）更に、前記核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部をアッセイするための培地を含むことを特徴とする実施態様（３２）に記載の製品。
【０１３６】
（３６）実施態様（１）、（２）、（３）、または（４）の方法を実施するためのマイクロアレイまたは遺伝子チップ。
（３７）（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする実施態様（３６）に記載のマイクロアレイ。
（３８）測定または特徴付けが１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現であることを特徴とする実施態様（３６）に記載のマイクロアレイ。
（３９）測定により統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする実施態様（３６）に記載のマイクロアレイ。
（４０）前記ｐ値が０．０５未満である特徴とする実施態様（３９）に記載のマイクロアレイ。
【０１３７】
（４１）ｃＤＮＡアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイを含むことを特徴とする実施態様（３６）に記載のマイクロアレイ。
（４２）更に、１または複数の内部コントロール試薬を含むことを特徴とする実施態様（３６）に記載のマイクロアレイ。
（４３）診断／予後ポートフォリオであて、
（ｉ）配列番号１及び５‐２２に一致する、または（ｉｉ）表７に示されている配列番号１及び５‐２２に一致するｐｓｉｄ番号からなる群から選択されるプローブセットによって認識される、ｍＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される遺伝子の組合せの単離された核酸配列、それらの相補体、またはそれらの一部を含み、
前記組合せが生体サンプルで急性骨髄性白血病の状態または予後を特徴付けるのに十分であることを特徴とする診断／予後ポートフォリオ。
（４４）測定または特徴付けが１．５倍の過剰発現または１．５分の１の過少発現であることを特徴とする実施態様（４３）に記載のポートフォリオ。
（４５）測定により統計的に有意なｐ値の過剰発現または過少発現が得られることを特徴とする実施態様（４３）に記載のポートフォリオ。
【０１３８】
（４６）前記ｐ値が０．０５未満である特徴とする実施態様（４５）に記載のマイクロアレイ。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】再発性及び難治性ＡＭＬ患者の自動クラスタリングを示す図である。このデンドグラム（dendogram）は、５８人の再発性及び難治性ＡＭＬ患者の自動ｋ‐平均クラスタリングを示している。各列は患者を表し、各行は遺伝子を表している。各遺伝子の発現率は、患者のその遺伝子の発現レベルを他の全患者の平均で除して求めた。カラーバーは、倍変化（ｌｏｇ2）を示している。赤色は上方制御を示し、青色は下方制御を示している。白色は変化がないことを示している。６つの主なラスターの存在が示されている。
【図２】２つの遺伝子のリアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを示す図である。ＡＨＲ及びＡＫＡＰ１３をリアルタイムＲＴ‐ＰＣＲで測定した。ＨＰＲＴまたはＰＢＧＤコントロール遺伝子を用いて遺伝子発現値を標準化した。エラーバーは標準偏差である。得られた値を、対応するマイクロアレイデータに対してプロットし、線形回帰分析を行った。
【図３】ＡＫＡＰ１３遺伝子の予測値を示す図である。パネルＡは、応答者（Ｒ）及び非応答者（ＮＲ）に対するクラシファイアとしてＡＫＡＰ１３の発現を用いて行ったＬＯＯＣＶから作成した２×２テーブルを示している。パネルＢは、同じ５８人の患者のＡＫＡＰ１３の発現値を示している。Ｐ値は、各応答群の平均値間の遺伝子発現の有意差を示している。パネルＣは、応答者及び非応答者であるとＡＫＡＰ１３遺伝子によって分類された患者から作成したカプラン‐マイヤー曲線を示している。
【図４】予測マーカーの最小セットを示す図である。パネルＡでは、１００％の感度を用いてＬＯＯＣＶを行った。１〜１９の遺伝子を含む個々のクラシファイアを検査した。得られた誤差率をプロットした。パネルＢは、応答者（Ｒ）及び非応答者（ＮＲ）に対するクラシファイアとして３遺伝子シグネチャを用いて行ったＬＯＯＣＶから作成した２×２テーブルを示している。パネルＣは、３遺伝子クラシファイアから作成したスコアを示している。ｐ値は、応答群間の遺伝子発現の有意差を示している。パネルＤは、３遺伝子シグネチャによって応答者及び非応答者に分類された患者から作成したカプラン‐マイヤー曲線を示している。平均生存期間も示している。
【図５】３遺伝子シグネチャによって応答者及び非応答者に分類された患者に対して行ったカプラン‐マイヤー分析を示す図である。臨床では非応答者であると決定されたが３遺伝子シグネチャでは応答者であると分類された患者の生存曲線を示している。平均生存期間も示している。
【図６】ＡＭＬ細胞系でのＡＫＡＰ１３の過剰発現を示す図である。細胞数は、コントロールの百分率を得るために薬物を含まない培地（−１２ ｌｏｇ単位として示している）に対して標準化した。エラーバーは平均の標準誤差を示している。中が開いたデータ点は、高い濃度の薬物を試す第２の実験結果を示している。
【図７】再発性または難治性ＡＭＬにおけるＦＴＩ作用のモデルを示す図である。Ａでは、応答者でＩＬ３ＲＡ遺伝子及びＡＫＡＰ１３遺伝子がゆっくり発現し、ｒａｓ、ＲｈｏＡ、及びラミンＢの経路の下方制御が可能である。ＲｈｏＨの上方制御により、細胞内形質転換経路の阻害が大きくなる。これにより、ＦＴＩ抗腫瘍形成の効果が増大する。Ｂでは、非応答者で反対の遺伝子発現プロファイルが見られ代償経路の発生が可能である。
【図８】Ｚａｒｎｅｓｔｒａ予測遺伝子シグネチャが単独の予後遺伝子シグネチャよりも有用であることを示す図である。パネルＡでは、列が再発性または難治性患者からのＡＭＬサンプルを表し、行は、階層クラスタリングによって順番が決められたブリンガー（Bullinger）らによって同定された１３３の予後遺伝子の内の１０３に一致する１６７のプローブセットを表している。パネルＢは、クラスターで決定された患者群のカプラン‐マイヤー生存推定を示している。パネルＣでは、３遺伝子クラシファイアを用いて、ティピファニブの応答者をブリンガーシグネチャ（Bullinger signature）によって決まる良好な予後群と不良な予後群に区別した。カプラン‐マイヤー生存曲線は、良好（Ｚｎ＋．クラスター１）な予後群及び不良（Ｚｎ＋．クラスター２）な予後群のティピファニブに対する応答者に区別された患者を示している。各群の平均生存期間も示している。
【図９】ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）の遺伝子をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａチップ上の１６７のプローブセット（１０３個の遺伝子）にどのように一致させるかを示すフローチャートである。
【図１０】再発性または難治性ＡＭＬ患者における１６７のプローブセットの有用性を示す図である。パネルＡでは、列が再発性または難治性患者からのＡＭＬサンプルを表し、行は、階層クラスタリングによって順番が決められたブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）によって同定された１３３の予後遺伝子の内の１０３に一致する１６７のプローブセットを表している。パネルＢは、クラスターで決定された患者群のカプラン‐マイヤー生存推定を示している。
【図１１】予後遺伝子シグネチャとＺａｒｎｅｓｔｒａ予測遺伝子シグネチャとの比較を示す図である。パネルＡは、ブリンガー（Bullinger）ら（２００４年）の１０３の遺伝子のサブセットによって決められた良好な予後クラスターと不良な予後クラスターのカプラン‐マイヤー生存曲線を示している。パネルＢは、Ｚａｒｎｅｓｔｒａに対する応答を予測する３遺伝子シグネチャによって決められた良好な予後クラスターと不良な予後クラスターのカプラン‐マイヤー生存曲線を示している。パネルＣは、３遺伝子Ｚａｒｎｅｓｔｒａシグネチャによって更に階層分類されたパネルＡの良好な予後クラスターと不良な予後クラスターのカプラン‐マイヤー生存曲線を示している。パネルＤは、残りの患者に対する予後が不良でＺａｒｎｅｓｔｒａに応答しない患者のカプラン‐マイヤー生存曲線を示している。
【図１２】予測マーカーの最小セットの決定を示す図である。パネルＡは、感度が１００％、特異性が４０％、変化が２倍を超える遺伝子を選択するためにＬＯＯＣＶを実施し、ＡＵＩによって順位が付けられた１〜８の遺伝子を含む個々のクラシファイアを検査し、得られた誤差率のプロットを示している。パネルＢは、クラシファイアとしてＡＫＡＰ１３を用いて応答者（Ｒ）及び非応答者（ＮＲ）に対して行ったＬＯＯＣＶから作成した２×２テーブルを示している。パネルＣは、ＡＫＡＰ１３の遺伝子発現値を示している。Ｐ値は、応答群間の遺伝子発現における有意差を示している。パネルＤは、ＡＫＡＰ１３によって応答者及び非応答者に分類された患者から作成したカプラン‐マイヤー曲線を示している。平均生存期間も示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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