(57)【要約】【課題】高光学純度の光学活性１，２−ジオール類を、短時間に、高収率で生産することができる光学活性体の製造方法を提供する。【解決手段】  下記の式（１）【化１】2005333986.tif 000009（式中、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、クロロメチル基、又はヒドロキシエチル基を表す。）で示される化合物のＲ体又はＳ体を資化する能力を有する微生物を該化合物のラセミ体を炭素源として含む培地で培養し、培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を制御する第１工程と；得られる培養物より、上記の残存する光学活性体を回収する第２工程とを含む光学活性体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）
【化１】
2005333986.tif 000008
（式中、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、クロロメチル基、又はヒドロキシエチル基を表す。）
で示される化合物のＲ体又はＳ体を資化する能力を有する微生物を該化合物のラセミ体を炭素源として含む培地で培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を制御して培養する第１工程と、
得られる培養物より、上記の残存する光学活性体を回収する第２工程とを含む
光学活性体の製造方法。
【請求項２】
第１工程において、培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を、上記式（１）で示される化合物の残存する光学活性体の光学純度が９８％ｅ．ｅ．になるまでの時間が１３０時間以内になるように制御する請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
微生物がシュードモナス属 (Pseudomonas sp.)に属する微生物である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を、３〜４０ｐｐｍにする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
式（１）で示される化合物が１，２−プロパンジオールであり、第１工程において培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を３〜１３ｐｐｍとし、第２工程においてＲ体１，２−プロパンジオールを回収する請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
微生物がシュードモナス ニトロレデューセンス(Pseudomonas nitroreducens) ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９３）である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
式（１）で示される化合物が３−クロロ−１，２−プロパンジオールを炭素源とする培地であり、第１工程において培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を３〜４０ｐｐｍとし、第２工程においてＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを回収する請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
微生物がシュードモナス属(Pseudomonas sp.)ＤＳ−ＳＩ−５株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７０８０）である請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
式（１）で表される化合物が３−クロロ−１，２−プロパンジオールであり、工程１において培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を５〜２８ｐｐｍとし、第２工程において、Ｒ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを回収する請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
微生物がシュードモナス属(Pseudomonas sp.)ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９６）である請求項９記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、農薬、生理活性物質などに使用される光学活性化合物またはその中間体の合成において、有用なキラルビルディングブロックとなりうる光学活性ハロゲノヒドリン類を含む光学活性１，２−ジオール類の製造方法に関する。より詳しくは、不斉資化分割による光学活性１，２−ジオール類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性ハロゲノヒドリン類を含む光学活性１，２−ジオールの微生物を利用する生物学的な製法に関しては、シュードモナス属微生物の休止菌体を用いた光学活性１，２−プロパンジオールの製法（特許文献１）やＳ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールの製法（特許文献２）が知られている。
【０００３】
また本発明者らにより、光学活性体を炭素源として資化し増殖する能力を有する微生物を該ラセミ体を単一炭素源とする培地中で培養し、培養終了後に残存する光学活性体を回収する方法（不斉資化分割法）により、１，２−プロパンジオールの光学活性体を製造する方法（特許文献３）や３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学活性体を製造する方法（特許文献４、特許文献５、特許文献６）が開示されている。
【０００４】
しかし、上記文献に記載の不斉資化分割法では、用いる培地の品質やロット、特に培地調製時に使用する水質により、微生物による光学活性体の生産能力が大きく変動することが分かってきた。
ここで、一般にミネラル分としてカルシウムは生体成分として重要な元素の一つであり、Ｃａ2+は多くの生命現象の調節に関与していることが知られている。これまでにも、Ｃａ2+濃度を考慮した工業的な微生物培養としては、例えば不飽和脂肪酸の製造のための培養（特許文献７）やトリクロロエチレンの分解のための培養（特許文献８）、エリスリトールの生産のための培養（特許文献９）等で報告されている。しかし、不斉資化分割法による光学活性体の生産における、Ｃａ2+濃度と光学活性体の生産能力との関係、即ちＣａ2+濃度と反応速度や立体識別性（収率）との関係については全く報告されていない。
【特許文献１】特開平６−３０７９０号公報
【特許文献２】特開平６−２０９７８１号公報
【特許文献３】特開２００２−２５３２９５号公報
【特許文献４】特開平３−１９１７９５号公報
【特許文献５】特開２００１−１４９０９０号公報
【特許文献６】特開平３−１９１７９４号公報
【特許文献７】再表９８／０２９５５８号公報
【特許文献８】特開平１１−４６７５８号公報
【特許文献９】特開平１１−２２１０９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高光学純度の光学活性１，２−ジオール類を、短時間に、高収率で生産することができる光学活性体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、微生物を用いた不斉資化分割法により光学活性１，２−ジオール類を製造するにあたり、培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を特定範囲に制御することにより光学分割反応の速度、及び光学活性体の収率が著しく向上することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記の光学活性体の製造方法を提供する。
【０００８】
項１．下記の式（１）
【０００９】
【化２】
2005333986.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、クロロメチル基、又はヒドロキシエチル基を表す。）
で示される化合物のＲ体又はＳ体を資化する能力を有する微生物を該化合物のラセミ体を炭素源として含む培地で培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を制御して培養する第１工程と、
得られる培養物より、上記の残存する光学活性体を回収する第２工程とを含む
光学活性体の製造方法。
【００１１】
項２．  第１工程において、培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を、上記式（１）で示される化合物の残存する光学活性体の光学純度が９８％ｅ．ｅ．になるまでの時間が１３０時間以内になるように制御する項１記載の製造方法。
【００１２】
項３．  微生物がシュードモナス属 (Pseudomonas sp.)に属する微生物である項１又は２記載の製造方法。
【００１３】
項４．  培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を、３〜４０ｐｐｍにする項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【００１４】
項５．  式（１）で示される化合物が１，２−プロパンジオールであり、第１工程において培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を３〜１３ｐｐｍとし、第２工程においてＲ体１，２−プロパンジオールを回収する項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
項６．  微生物がシュードモナス ニトロレデューセンス(Pseudomonas nitroreducens) ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９３）である項５記載の製造方法。
【００１６】
項７．  式（１）で示される化合物が３−クロロ−１，２−プロパンジオールを炭素源とする培地であり、第１工程において培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を３〜４０ｐｐｍとし、第２工程においてＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを回収する項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１７】
項８．  微生物がシュードモナス属(Pseudomonas sp.)ＤＳ−ＳＩ−５株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７０８０）である項７記載の製造方法。
【００１８】
項９．  式（１）で表される化合物が３−クロロ−１，２−プロパンジオールであり、工程１において培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を５〜２８ｐｐｍとし、第２工程において、Ｒ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを回収する項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１９】
項１０．  微生物がシュードモナス属(Pseudomonas sp.)ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９６）である項９記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法により、光学活性ハロゲノヒドリン類を含む光学活性１，２−ジオール類の製造の、安定かつ高い生産能力が達成された。詳述すれば、不斉資化分割反応により光学活性ハロゲノヒドリン類を含む光学活性１，２−ジオール類を製造するにあたり、高収率で短時間に９８％ｅ．ｅ．以上の高光学純度の光学活性体を得ることができるようになった。また、光学活性体の収率及び光学分割反応速度についての生産バッチごとの変動が少なく、安定して大きな生産能力を実現することに成功した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明の光学活性体の製造方法は、下記の式（１）
【００２３】
【化３】
2005333986.tif 000003
【００２４】
（式中、Ｒは、メチル基、エチル基、プロピル基、クロロメチル基、又はヒドロキシエチル基を表す。）
で示される化合物のＲ体又はＳ体を資化する能力を有する微生物を該化合物のラセミ体を炭素源として含む培地で培養する第１工程と、得られる培養物より、上記の残存する光学活性体を回収する第２工程とを含む方法である。即ち本発明方法は、微生物を用いた不斉資化分割反応により式（１）で表される化合物のＳ体又はＲ体を製造する方法である。
また本発明方法では、第１工程において、培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を制御する。このＣａ２＋濃度は、例えば、上記式（１）で示される化合物の残存する光学活性体の光学純度が９８％ｅ．ｅ．になるまでの時間が１３０時間以内になるように制御すればよい。
【００２５】
本発明方法では、基質を一括して加える回分培養、基質を複数回に分けて加える流加培養、又は、基質を含む培地を連続的に供給して生成物を連続的に排出する連続培養のいずれの方法を採用してもよい。９８％ｅ．ｅ．になるまでの「時間」は、回分培養、及び流加培養では、培養時間を指し、連続培養では滞留時間を指す。また、連続培養では、「培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度」は、連続培養開始時の培養槽中のＣａ２＋濃度を指す。また、培養中に供給される培地中のＣａ２＋濃度も制御することが好ましく、例えば、供給培地中のＣａ２＋濃度も、培養開始時の培地中のＣａ２＋の許容濃度範囲内にする等の方法により、９８％ｅ．ｅ．になるまでの滞留時間が１３０時間になるように制御すればよい。
原料化合物
不斉資化分割法による光学活性体製造の原料化合物として上記式（１）で表される化合物のラセミ体を使用する。具体的には、１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、３−クロロ−１，２−プロパンジオール、及び１，２，４−ブタントリオールからなる群より選ばれる化合物のラセミ体を使用する。
【００２６】
これらの化合物は、例えば相当するエポキシドより硫酸酸性下で加水分解することにより製造することができる。エポキシドからジオールを製造する方法は、例えばTetrahedr.Asymm.(1994)Vol.5,No.2,p239-246;及びBull.Soc.Chim.(1926)Vol.39,p699-700に記載されている。
微生物
本発明方法で使用する微生物は、上記式（１）で表される化合物のＲ体又はＳ体を選択的に資化する能力を有する微生物である。微生物は、１種を単独で使用してもよく、原料ラセミ体の目的とする光学活性体のみ資化できる微生物であれば２種以上を混合して使用してもよい。
【００２７】
式（１）の化合物の一方の光学活性体を効率よく資化できる微生物として、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)に属する微生物が挙げられる。中でも、シュードモナス・ニトロレデューセンス(Pseudomonas nitroreducens) ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９３）、シュードモナス属  ＤＳ−ＳＩ−５株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７０８０）、又はシュードモナス属  ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９６）が好ましい菌株として挙げられる。
【００２８】
シュードモナス・ニトロレデューセンス  ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株は、１，２−プロパンジオールのＳ体の選択的資化を効率よく行える株である。シュードモナス属  ＤＳ−ＳＩ−５株は、３−クロロ−１，２−プロパンジオールのＲ体の選択的資化を効率よく行える株である。シュードモナス属  ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株は、３−クロロ−１，２−プロパンジオールのＳ体の選択的資化を効率よく行える株である。
【００２９】
なお、１，２−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、及び１，２，４−ブタントリオールも、一方の光学活性体を特異的に資化できる微生物を用い、培養開始時の培地中のＣａ２＋濃度を制御することにより、光学活性体の生産能力を向上させることができる。
培養条件
種培養として微生物を培養する培地は、使用する微生物が増殖できるものであればよく、特に制限されない。例えばペプトン、酵母エキス、グリセリン等を含む微生物培養のための公知の栄養培地を用いることができる。但し、種培養から光学分割反応を行なうための培地へ持ち込まれるＣａ2+を予め定量し、不斉資化分割反応における培地中のＣａ2+濃度が前述した適正範囲になるように考慮する必要がある。
【００３０】
不斉資化分割反応に使用する培地は、培養開始時のＣａ2+濃度を上記範囲に制御できる培地であればよく特に限定されないが、次に示すような最少培地を使用すればＣａ2+濃度の調整が容易である。
【００３１】
Ｃａ2+源としては、Ｃａ2+を生成する水溶性塩を制限なく使用できるが、好ましくは塩化カルシウムを使用すればよい。なお、培地の調製にはイオン交換水を使用することが好ましく、これにより水に含有されるＣａ2+量を考慮しなくてよい。
【００３２】
上記式（１）で示される化合物の残存する光学活性体の光学純度が９８％ｅ．ｅ．になるまでの時間を１３０時間以内にするためには、使用する菌株、原料化合物、培養条件などによって異なるが、培地中のＣａ2+濃度を、通常３〜４０ｐｐｍ程度にすればよい。
【００３３】
シュードモナス・ニトロレデューセンス  ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株を用いて、例えば１，２−プロパンジオールのラセミ体を不斉資化分割してＲ体１，２−プロパンジオールを得る場合は、培養開始時のＣａ2+濃度を３〜１３ｐｐｍ程度とするのが好ましく、９〜１２ｐｐｍ程度とするのがより好ましい。
【００３４】
また、シュードモナス属  ＤＳ−ＳＩ−５株を用いて、例えば３−クロロ−１，２−プロパンジオールのラセミ体を不斉資化分割してＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを得る場合は、培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を３〜４０ｐｐｍ程度とするのが好ましく、７〜３７ｐｐｍ程度とするのがより好ましい。
【００３５】
また、シュードモナス属  ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株を用いて、例えば３−クロロ−１，２−プロパンジオールのラセミ体を不斉資化分割してＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを得る場合は、培養開始時の培地中のＣａ2+濃度を５〜２８ｐｐｍ程度とするのが好ましく、９〜２７ｐｐｍ程度とするのがより好ましい。
【００３６】
上記Ｃａ2+濃度範囲であれば、短時間でかつ収率良く９８％ｅ．ｅ．以上の目的光学活性体が得られる。
【００３７】
本発明において、Ｃａ2+濃度は、ＩＣＰ発光法により測定した値である。
【００３８】
炭素源としては、分割対象となる前記式（１）で示される化合物（以下「基質」ということがある）のラセミ体を使用する。光学分割を効率よく行うために、この基質を単一炭素源とすることが好ましい。
【００３９】
また前述したように、本発明方法では、基質を培養開始時に一括して添加する回分培養を行ってもよく、基質を分割して添加する流加培養を行ってもよい。流加培養法としては、例えば、反応の進行によるｐＨの変動を滴定する酸、アルカリの滴定量、又は反応液中の基質（炭素源）濃度から基質の添加回数及び添加量を判断して、連続的、又は断続的に基質を添加する方法がある（笠井ら著, 生物工学会誌，1997, 75, 255-275）。
【００４０】
また、本発明方法では連続培養を採用することもできる。連続培養としては、例えば、流加培養同様に反応の進行によるｐＨの変動を滴定する酸、アルカリの滴定量、又は反応液中の基質（炭素源）濃度から基質の添加量を判断して連続的に基質を含む培地を供給し、連続的に排出される光学活性体を含む培養液を得る方法がある（特開２００４−０４１０７６）。
【００４１】
培地中の基質（炭素源）濃度が余りにも高いと微生物の生育を妨げる場合があり、即ち微生物には基質に対する生育阻害濃度がある。不斉資化分割反応は微生物の生育に伴った反応であり、培養中の培地の基質濃度を微生物の生育を阻害する濃度以下に抑える必要があるが、流加培養法や連続培養法では複数回に分けて基質を添加するため、培養中の培地の基質濃度を生育阻害濃度以下に抑えながら、合計基質投入量を回分培養より多くすることができる。
【００４２】
回分培養の場合は、培養開始時の基質濃度を０．１〜１５ｗ/ｖ％程度とするのが好ましく、１〜５ｗ/ｖ％程度とするのがより好ましい。上記範囲であれば、基質又は光学活性体が微生物の生育を妨げることなく、効率よく光学分割を行える。
【００４３】
また、流加培養や連続培養を行う場合は、基質の合計添加量が培地に対して、好ましくは０．１〜１５ｗ/ｖ％程度、より好ましくは１〜１０ｗ/ｖ％程度となるようにすればよい。また、培養中の培地の基質濃度が好ましくは１〜７ｗ/ｖ％程度、より好ましくは１〜５ｗ/ｖ％程度になるようにすればよい。上記範囲であれば、基質又は光学活性体が微生物の生育を妨げることなく、効率よく光学分割を行える。流加培養の場合、基質は数回程度に分けて添加しても良いが、反応の進行にあわせて適宜添加することにより培養中の基質濃度を上記範囲にすることもできる。反応の進行は、例えばｐＨ、基質濃度、菌体濁度、二酸化炭素排出量等から計量できる。
【００４４】
炭素源以外の成分は特に限定されず、微生物の培養に通常用いる成分を使用すればよい。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩を使用することができる。また、不斉資化分割反応を効果的に進行させるために、無機塩として、燐酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩等を添加してもよい。さらに、必要に応じて各種消泡剤を添加することもできる。
【００４５】
培養中の培地のｐＨは、例えば４〜１０程度、好ましくは５〜９程度とすればよく、通常この範囲内で使用する微生物の至適ｐＨ付近とすればよい。不斉資化分割反応の進行に伴い、培地のｐＨが徐々に低下、あるいは上昇する場合、適当なアルカリ源あるいは酸源を添加して培養液中のｐＨが至適ｐＨ近傍になるようにコントロールすればよい。この添加量は不斉資化分割反応の進行速度に合致するので流加培養を行なう場合、指標にして基質を添加することができる。例えばアルカリ源としては、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ塩水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などの水酸化アルカリ金属塩水溶液；又はアンモニア水溶液等が挙げられる。また酸源としては、塩酸、燐酸などの一般的な酸を用いればよい。培地中のＣａ2+濃度の変動を避けるためにカルシウム塩を用いないことが好ましい。
【００４６】
また培養温度は、通常１５〜４０℃程度、好ましくは２０〜３７℃程度とすればよく、通常この範囲内で使用する微生物の至適温度付近、例えば３０℃程度とすればよい。また、使用菌株により異なるが、通常好気的に培養すればよい。
【００４７】
培養は、目的とする光学活性体の光学純度が通常９８％ｅ．ｅ．以上となるまで行えばよいが、光学活性体の目的に応じてそれより低い光学純度の時点で反応を停止してもよい。基質の種類、濃度、菌株、培養条件などにより異なるが、２４〜１３０時間程度の培養により通常光学純度９８％ｅ．ｅ．以上の光学活性体が得られる。また、余りに長時間培養しても、それ以上は菌が増殖せず、不斉資化分割反応が進行しない、また経済的な生産のためにもこの程度の時間で終了するのがよい。反応の進行に伴う培地ｐＨの変化をモニタリングしたり、目的とする光学活性体の生産量（残存量）や光学純度をガスクロマトグラフィー等により測定して終点を決定するのが好ましい。
光学活性体の回収
この様にして得られた培養液中に残存する光学活性体は一般的な方法で回収すればよい。例えば、培養液から菌体をフィルタープレス、限外ろ過、遠心分離等で除いた後、上清をエバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル、ジエチルエーテル等の溶媒で抽出すればよい。さらに、この抽出液を無水硫酸マグネシウム等を用いて脱水した後、減圧下で溶媒を除去することにより、光学活性体のシロップを得ることができる。さらに蒸留、各種クロマトグラフィーのような常法で精製してもよい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例中の％は特に記載のない限りｗ／ｖ％を示す。
＜使用菌株＞
下記の実施例で使用したシュードモナス・ニトロレデューセンス(Pseudomonas nitroreducens) ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７７９３）、シュードモナス属(Pseudomonas sp.) ＤＳ−ＳＩ−５株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７０８０）、及びシュードモナス属(Pseudomonas sp.) ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株（国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９６）は、既に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
＜Ｃａ２＋濃度測定方法＞
ＩＣＰ発光分析装置（日本ジャーレルアッシュ社製ＩＣＡＰ−５７５マークII）を用いてＩＣＰ発光法で測定した。装置条件は、出力１．２ｋｗ、トーチ＋１．０ｃｍとした。積分条件は、短波長３秒、メイン波長３秒、長波長３秒の３回の積分で１測定とした。
【実施例１】
【００４８】
Ｒ体１，２−プロパンジオールの生産
１２１℃で１５分間加圧蒸気滅菌した、２％酵母エキス、１％グリセリンを含む栄養培地（ｐＨ７．２）１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに、あらかじめ、同組成の寒天栄養培地で培養したシュードモナス・ニトロレデューセンス(Pseudomonas nitroreducens) ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株を白金耳にて少量植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培養液を得た。
【００４９】
【表１】
2005333986.tif 000004
【００５０】
次に、前掲の表１に示す組成の無機成分水溶液２．１Ｌをイオン交換水で調製し、さらに塩化カルシウムを用いてＣａ2+濃度を調整し、５Ｌ容の培養槽に入れ、ラセミ体１，２−プロパンジオールを１００ｇ添加し、１２１℃で１５分間加圧蒸気滅菌してラセミ体１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする最少培地を作製した。このようにして、培養開始時にＣａ2+濃度がそれぞれ３ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１２ｐｐｍ、及び１５ｐｐｍになるように調整した４種の最少培地を調製した。これらの最少培地のＣａ2+濃度のうち、種培養からの持込み量は１ｐｐｍである。
【００５１】
これに前述の最少培地１００ｍｌを加え、温度３０℃、通気量０．２５Ｌ／分、回転数５００ｒｐｍの条件で７２〜１２０時間反応（培養）を行なった。培地ｐＨの測定および制御はｐＨコントローラーを用いて行ない、２５％(ｗ/ｗ)の水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．９になるように制御した。培養液中の１，２−プロパンジオールの濃度が上記菌株の生育阻害濃度である５％を超えない様に、反応の進行とともにラセミ体１，２−プロパンジオールを段階的に添加していき、合計２００ｇのラセミ体を添加した。ガスクロマトグラフィーによる光学純度分析の結果、残存するＲ体１，２−プロパンジオールが９９．０％ｅ．ｅ．以上になった時点で反応終了とした。
【００５２】
Ｃａ2+濃度と反応時間、及び収率との関係を後掲の表２に示す。収率は、初期基質（炭素源）濃度に対して残存する光学活性体の割合を示す。表２から明らかなように、Ｃａ2+濃度が３〜１２ｐｐｍの場合、残存するＲ体１，２−プロパンジオールの光学純度が９９％ｅ．ｅ．を超え、特に９ｐｐｍの場合に反応時間が速かった。３ｐｐｍの場合、不斉資化分割反応が遅くなり、収率すなわち立体選択性がやや低下したが実用可能な範囲であった。また１５ｐｐｍの場合、不斉資化分割反応が阻害され、光学純度が９８％ｅ．ｅ．以上に到達しなかった。
【００５３】
【表２】
2005333986.tif 000005
【００５４】
培養終了後、菌体を遠心分離で除き、上清をエバポレーターにより濃縮し、ジエチルエーテルで抽出した。ついで、抽出液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し１，２−プロパンジオールのシロップを得た。
【００５５】
この１，２−プロパンジオールを、ジクロロメタン中で無水トリフルオロ酢酸を用いてトリフルオロ化した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（０．２５ｍｍ（ＩＤ）×３０ｍ（長さ））を用いたガスクロマトグラフィーにより光学純度を測定した。分析条件は以下の通りである。
カラム温度：６０℃
検出器温度：２００℃
キャリアーガス：窒素
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：２００／１
１，２−プロパンジオールのリテンションタイム：Ｒ体が１１．４分、
Ｓ体が１７．６分
【実施例２】
【００５６】
Ｓ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの生産
微生物はシュードモナス属(Pseudomonas sp.)ＤＳ−ＳＩ−５株を用いた。種培養液は、ペプトン、酵母エキス、及びグリセリンの各１％を含む培地、又は２％酵母エキス、１％グリセリンを含む培地を用いた他は、実施例１と同様にして調製した。
【００５７】
次に、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを６３ｇ添加したこと、および培養開始時（種培養を接種した後）の培地のＣａ２＋濃度がそれぞれ７ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、３７ｐｐｍ、及び４３ｐｐｍになるように調整したこと以外は実施例１と同様にして６種の最少培地を調製した。培養開始時の培地のＣａ２＋濃度のうち、種培養からの持込み量は３ｐｐｍ又は７ｐｐｍである。
【００５８】
これに前述の種培養液１００ｍｌを加え、温度３０℃、通気量０．２５Ｌ／分、回転数５１０ｒｐｍの条件で７０時間反応（培養）を行なった。ｐＨの測定および制御はｐＨコントローラーを用いて行ない、脱クロル化反応によるｐＨの低下を２５％(ｗ／ｗ)の水酸化ナトリウム水溶液により滴定し、ｐＨ６．９になるように制御した。
【００５９】
滴定により添加された水酸化ナトリウムのモル数の１．８倍の割合でラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールをｐＨコントローラーを用いて連続的に添加し、合計２００ｇのラセミ体を添加したところで添加を停止した（笠井ら著, 生物工学会誌，1997, 75巻, 255-275）（但し、Ｃａ２＋濃度４３ｐｐｍの場合はラセミ体の合計添加量は１４８ｇ）。培養中のラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの濃度は使用菌株の生育阻害濃度である５％を超えなかった。ガスクロマトグラフィーによる光学純度分析の結果、残存するＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールが９９．０％ｅ．ｅ．以上となった時点で反応終了とした。
【００６０】
Ｃａ2+濃度と反応時間、及び収率との関係を後掲の表３に示す。表３から明らかなように、Ｃａ2+濃度が７〜３７ｐｐｍの場合、残存するＳ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度が９９％ｅ．ｅ．を超え、特に３７ｐｐｍの場合、反応時間が速かった。また、４３ｐｐｍの場合、菌の活性が低下したため、ラセミ体基質（炭素源）を１４８ｇしか流加できず、また培養途中で菌が失活したため、光学純度が９８％ｅ．ｅ．以上にはならなかった。
【００６１】
【表３】
2005333986.tif 000006
【００６２】
培養終了後、菌体を遠心分離で除き、上清をエバポレーターにより濃縮し、ジエチルエーテルで抽出した。次いで、抽出液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し３−クロロ−１，２−プロパンジオールのシロップを得た。
【００６３】
この３−クロロ−１，２−プロパンジオールを２−プロパノールに溶解させ、１２．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でグリシドールに変換後、アステック社製のキャピラリーカラムＡ−ＰＨ（０．２５ｍｍ（ＩＤ）×３０ｍ（長さ））を用いたガスクロマトグラフィーにより光学純度を測定した。測定条件は以下の通りである。
カラム温度：４５℃
検出器温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＦＩＤ
スプリット比：１００／１
グリシドールのリテンションタイム：
Ｒ体が３３．８分、Ｓ体が３５．２分
【実施例３】
【００６４】
Ｒ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの生産
微生物としてシュードモナス属(Pseudomonas sp.)ＤＳ−Ｋ−２Ｄ１株を用いた。種培養液は、ペプトン、酵母エキス、及びグリセリンを各１％を含む培地を用いた他は、実施例１と同様にして調製した。
【００６５】
次に、ラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを６３ｇ添加したこと、および培養開始時の培地のＣａ２＋濃度がそれぞれ３ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、及び２７ｐｐｍになるように調整したこと以外は実施例１と同様にして４種の最少培地を調製した。培養開始時の培地のＣａ２＋濃度のうち、種培養からの持込み量は３ｐｐｍである。
【００６６】
これに前述の種培養液１００ｍｌを加え、温度３０℃、通気量０．２５Ｌ／分、回転数４５０ｒｐｍの条件で７０時間反応（培養）を行なった。ｐＨの測定および制御はｐＨコントローラーを用いて行ない、脱クロル化反応によるｐＨの低下を２５％(ｗ／ｗ)の水酸化ナトリウム水溶液により滴定し、ｐＨ６．９になるように制御した。
【００６７】
実施例２と同様に、滴定した水酸化ナトリウムのモル数の１．３５倍の割合でラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールを連続的に添加していき、合計１６０ｇのラセミ体を添加したところで添加を停止した（但し、Ｃａ2+濃度３ｐｐｍの培地では１３９ｇ）。培養中のラセミ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの濃度は使用菌株の生育阻害濃度である５％を超えなかった。ガスクロマトグラフィーによる光学純度分析の結果、残存するＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールが９９．０％ｅ．ｅ．以上になった時点で反応終了とした。
【００６８】
Ｃａ2+濃度と反応時間、及び収率との関係を後掲の表４に示す。
【００６９】
表４から明らかなように、Ｃａ2+濃度が９〜２７ｐｐｍの場合、残存するＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度が９９％ｅ．ｅ．を超え、特に、９ｐｐｍの場合、反応時間が速かった。また、３ｐｐｍの場合は、培養開始後４５時間以降、基質の分解に伴い生成するクロルイオンと中和に要する水酸化ナトリウムとのモル比率が一定せずに変動し、効果的な流加反応ができなかった。そのため、反応途中で残存基質の光学純度が９９％ｅ．ｅ．になり、炭素源が不足し、所定のラセミ体基質を流加添加して光学分割することができずに反応が停止した。結果的に１３９ｇ（当初予定の１６０ｇの８７％）しか分割できなかった。また、流加する基質の水酸化ナトリウムに対するモル比を上げた場合には、反応副生成物であるグリシドール（T.Suzuki et al, Appl.Microbiol.Biotechnol., 1993, 40, 273-278）の濃度が上昇し、菌体の生育、及び不斉資化分割反応を阻害した。Ｃａ2+濃度と反応結果を表４に示す。
【００７０】
【表４】
2005333986.tif 000007
【００７１】
培養液中のＲ体３−クロロ−１，２−プロパンジオールの光学純度は、実施例２のＲ体の場合と同様にして測定した。
【実施例４】
【００７２】
連続培養
１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌したグリセリン１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌを含む液体培地１００ｍｌ(ｐＨ７．２)を入れた５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたシュードモナスｓｐ．ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株の菌体を１白金耳分植菌し、３０℃で２４時間培養を行ない種培養液を得た。
【００７３】
実施例１の表１に示す無機成分水溶液１Ｌ（ｐＨ６．９）をイオン交換水で調製し、さらに塩化カルシウムを用いてＣａ２＋濃度を１０ｐｐｍに調製し、さらに単一炭素源としてラセミ体１，２−プロパンジオールを４０ｇ添加した最少培地を入れた２Ｌ容の培養槽を１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌した。これに、実施例１と同様にして調整した種培養液４０ｍｌを加え、温度３０℃、通気量０.１Ｌ／分、回転数５００ｒｐｍの条件で１５時間、回分培養を行ったところ、１５時間後の時点で菌体濁度は８.６ＯＤ(６６０ｎｍでの濁度)で、その時の１，２−プロパンジオール濃度は２.２％ であった。なお、ｐＨ の測定および制御は連動させたｐＨ コントローラーを用いて行い、３ Ｎ の水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６.９に制御した。
【００７４】
次に連続培養に移り、上記に示す１０ｐｐｍのＣａ２＋を含む無機成分水溶液１Ｌ（ｐＨ６.９）を入れた２Ｌ容の培養槽を１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌後、一槽目と接続した。一槽目、二槽目とも、温度、通気量、ｐＨ等の条件は回分培養時と同じ条件で行った。さらに、上記に示す１０ｐｐｍのＣａ２＋を含む無機成分水溶液と同じ水溶液に単一炭素源としてラセミ体１，２−プロパンジオールを１００ｇ／Ｌ加え、連続培養時の供給培地とした。1槽目の菌体濁度を１１ＯＤ(６６０ｎｍでの濁度)に保つように培地供給流量を調節して連続培養を行った。結果として、培地供給量０.０１５９Ｌ／時間で定常状態となった。このときの滞留時間は１２６時間であった。一槽目の１，２−プロパンジオール濃度は６.８％、比増殖速度μは０．０１５９(時間−１)、比基質消費速度νは０．０４８(ｇ／ＯＤ・時間・Ｌ)に維持された。このとき、二槽目の菌体濁度は１４ＯＤ(６６０ｎｍでの濁度)、１，２−プロパンジオール濃度は３.８％であった。実施例１と同様の方法で二槽目から流出する培養液中の１，２−プロパンジオールの光学純度を測定したところ、９８％ｅ．ｅ．以上のＲ体１，２−プロパンジオールであった。