(57)【要約】【課題】検体を変性又は破壊しない温度で試料中から所要の検体を取り出すことができる磁気ビーズと、これを用いた検体の分離方法を提供する。【解決手段】複数種の検体１１，１２，１３を含む試料１４中に、それぞれ異なる特定の磁気相転移温度をもつ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体と特異的に結合又は反応する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を混合する。各検体と各磁気ビーズとをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけつつ、試料と磁気ビーズとの混合体の温度を１の磁気ビーズの磁気相転移温度に調整し、当該１の磁気ビーズを外磁場に凝集させる。そして、この状態で当該１の磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体を取り出す。以下、この過程を必要回数繰り返す。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子と当該磁性粒子の表面に被覆された非磁性の被覆層とからなる磁気ビーズであって、前記磁性粒子が磁気相転移温度をもつ磁性体からなることを特徴とする磁気ビーズ。
【請求項２】
磁性粒子と当該磁性粒子の表面に直接又は他の材料を介して特定の検体と特異的に結合又は反応するプローブを備えている磁気ビーズであって、前記磁性粒子が磁気相転移温度をもつ磁性体からなることを特徴とする磁気ビーズ。
【請求項３】
前記磁性粒子を構成する磁性体が、少なくとも貴金属元素と遷移金属元素とを含む合金からなることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の磁気ビーズ。
【請求項４】
前記磁性粒子を構成する磁性体が、反強磁性と強磁性の間の磁気相転移をする磁性体であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の磁気ビーズ。
【請求項５】
前記被覆層が、シリカ、アルミナ、アパタイト、アミローズ、ポリエチレングリコール及びキトサンより選択されるいずれか１種の物質からなることを特徴とする請求項１に記載の磁気ビーズ。
【請求項６】
前記他の材料が、シリカ、アルミナ、アパタイト、アミローズ、ポリエチレングリコール及びキトサンより選択されるいずれか１種の材料であることを特徴とする請求項２に記載の磁気ビーズ。
【請求項７】
前記プローブが、特定の抗原と特異的に結合又は反応する特異的抗原、特定のホルモンと特異的に結合又は反応するホルモン受容体、特定のハプテンと特異的に結合又は反応する抗ハプテン、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応する相補的ポリヌクレオリド、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応するポリヌクレオリド結合蛋白、特定のビオチンと特異的に結合又は反応するアビジン又はストレプトアビジン、特定の酵素と特異的に結合又は反応する酵素補因子、及び特定のレクチンと特異的に結合又は反応する特異的炭化水素より選択されるいずれか１種の物質からなることを特徴とする請求項２に記載の磁気ビーズ。
【請求項８】
複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる磁気相転移温度をもつ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応する被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズの被覆層とをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけた状態で前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の磁性粒子の各磁気相転移温度の間に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の磁気相転移温度に達するごとに、前記外磁場に凝集する当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すことを特徴とする検体の分離方法。
【請求項９】
複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる磁気相転移温度をもつ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応するプローブを直接又は他の材料を介して有する複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズのプローブとをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけた状態で前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の各磁性粒子の磁気相転移温度の間に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の磁気相転移温度に達するごとに、前記外磁場に凝集する当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すことを特徴とする検体の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、蛋白質、核酸、化学物質等の検体の定量、分離、精製及び分析等に有用な磁気ビーズとそれを用いた検体の分離方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の検体を定量、分析又は分画するためには、目的とする検体を他の物質から分離して取り出す必要がある。従来より、目的とする検体を他の物質から分離する手段としては、遠心分離法、カラム分離法及び電気泳動法などが広く用いられているが、これらの手段はいずれも大量の検体を必要とし、かつ目的とする検体の分離に長時間を要するばかりでなく、検体の環境条件を極端に変化させるために検体が変性しやすいという不都合がある。
【０００３】
近年、かかる従来法の短所を克服し得る手法として、超常磁性磁気ビーズを用いる方法が開発され、細胞、蛋白質、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の検体の分離及び分析等に利用されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
超常磁性磁気ビーズは、永久磁性を維持するのに必要な磁区の大きさよりも微細な粒子にした酸化鉄等の磁性体を特定の検体と特異的に結合又は反応する非磁性のビーズ中に分散したもので、外磁場がかかったときのみ強磁性を示す性質を有している。したがって、この超常磁性磁気ビーズを外磁場をかけない状態で目的の検体を含む試料中に投入し、ビーズの表面に目的とする検体を結合させ、しかる後に外磁場を印加して超常磁性磁気ビーズを凝集させることにより、目的とする検体を超常磁性磁気ビーズと共に回収することができる。
【０００５】
また、試料中に含まれる複数の検体を個別に分離する方法として、磁性体のキュリー温度と磁気ビーズの表面に修飾された特定の検体と特異的に結合又は反応する結合パートナーとの組合せが異なる複数種の超常磁性磁気ビーズを複数の検体を含む試料中に投入し、各超常磁性磁気ビーズの表面に目的とする検体を個別に結合させた後、外磁場をかけて全ての超常磁性磁気ビーズを外磁場に凝集させ、しかる後に、試料の温度を１の超常磁性磁気ビーズに含まれる磁性体のキュリー温度に昇温して当該１の超常磁性磁気ビーズの凝集を選択的に解き、当該凝集が解除された１の超常磁性磁気ビーズをこれに結合された検体と共に回収するという過程を必要回数だけ繰り返す方法も提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
この方法によると、試料の温度を各超常磁性磁気ビーズに含まれる磁性体のキュリー温度に段階的に昇温することにより、１の試料中に含まれる複数の検体を順次個別に分離することができるので、１の試料からの目的とする複数の検体の分離を効率的に行うことができる。
【特許文献１】特表平４−５０１９５６号公報
【特許文献２】特開平６−３００７５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかるに、現在知られている磁性体は、いずれもキュリー温度が１００℃以上の高温であるので、例えばある種の抗体については分離の過程でその機能が破壊されてしまうことがあり、適用可能な検体の種類が限定されるという問題点がある。しかも、磁性体の磁化は、キュリー温度にかけて徐々に減少してゆき、また、キュリー温度以上でも外部磁場を印加すると磁化が発生することから、キュリー温度の差により分離を行うことは、分離性能が良好でない。
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の不備を解決するためになされたものであり、その目的は、検体を変性又は破壊しない温度で凝集させることができ、また分離能力の高い磁気ビーズと、これを用いた検体の分離方法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記の課題を解決するため、磁気ビーズについては、第１に、磁性粒子と当該磁性粒子の表面に被覆された非磁性の被覆層とからなる磁気ビーズであって、前記磁性粒子が磁気相転移温度をもつ磁性体からなるという構成にした。
【００１０】
また、第２に、磁性粒子と当該磁性粒子の表面に直接又は他の材料を介して特定の検体と特異的に結合又は反応するプローブを備えている磁気ビーズであって、前記磁性粒子が磁気相転移温度をもつ磁性体からなるという構成にした。
【００１１】
前記磁性体としては、磁気相転移温度を磁性体の組成や熱処理によって制御しやすいことから、貴金属元素−遷移金属元素系の合金を用いることが好ましく、さらには、磁化の温度変化が非常に急激に発生し検体の分離を容易に行えることから、反強磁性と強磁性との間の磁気相転移をする磁性体であることが好ましい。また、前記被覆層又は他の材料としては、プローブを修飾しやすいことから、シリカ、アルミナ、アパタイト、アミローズ、ポリエチレングリコール及びキトサンより選択されるいずれか１種の物質が好ましい。また、前記プローブとしては、例えば特定の抗原と特異的に結合又は反応する特異的抗原、特定のホルモンと特異的に結合又は反応するホルモン受容体、特定のハプテンと特異的に結合又は反応する抗ハプテン、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応する相補的ポリヌクレオリド、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応するポリヌクレオリド結合蛋白、特定のビオチンと特異的に結合又は反応するアビジン又はストレプトアビジン、特定の酵素と特異的に結合又は反応する酵素補因子、及び特定のレクチンと特異的に結合又は反応する特異的炭化水素などを挙げることができる。
【００１２】
一方、磁気ビーズを用いた検体の分離方法としては、第１に、複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる磁気相転移温度をもつ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズの被覆層とをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけた状態で前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の各磁性粒子の磁気相転移温度の間に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の磁気相転移温度に達するごとに、前記外磁場に凝集する当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すという構成にした。
【００１３】
また、第２に、複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる磁気相転移温度をもつ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応するプローブを直接又は他の材料を介して有する複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズのプローブとをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけた状態で前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の各磁性粒子の磁気相転移温度の間に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の磁気相転移温度に達するごとに、前記外磁場に凝集する当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すという構成にした。
【００１４】
ある種の鉄−ロジウム系合金は、低温状態においては反磁性を示すため自発磁化が０であるが、組成や熱処理の状態に応じたある温度Ｔｔｒｓに達すると強磁性に相転移して急激に自発磁化が発生し、その後、その温度Ｔｔｒｓよりも高温のキュリー温度Ｔｃに至って再び自発磁化が消失する。例えば原子組成比が５０％対５０％の鉄−ロジウム合金（Ｆｅ５０Ｒｈ５０）は、７３゜Ｋで飽和磁化が０ｅｒｇ／ｇを示すが、約３００゜Ｋに達すると飽和磁化が１３０ｅｒｇ／ｇ程度に急増する。この温度Ｔｔｒｓにおける急激な自発磁化の発現は１次の磁気相転移と呼ばれる現象であり、温度Ｔｔｒｓは「磁気相転移温度」と呼ばれる。このように、磁気相転移温度を有する磁性体は、低温相で反強磁性を示し、高温相で強磁性を示すので、磁気相転移温度が異なる複数種の磁気ビーズを試料中に混合した場合、試料の温度がいずれの磁気ビーズの磁気相転移温度以上でないときには、外磁場をかけても全ての磁気ビーズが外磁場に凝集されず、試料の温度を１の磁気ビーズの磁気相転移温度以上で他の磁気ビーズの磁気相転移温度以下に調整したときには、当該１の磁気ビーズを外磁場に凝集させることができる。このような一次の磁気相転移は、キュリー温度のような二次の磁気相転移とは異なり、磁化の温度変化が非常に急激に発生する。この性質により、温度による分離を非常に高い効率で行えると共に、磁気相転移温度を比較的接近させて設定しても、十分な分離性能を発揮できる。
【００１５】
したがって、磁性体の磁気相転移温度と非磁性体又は非磁性体に修飾され得たプローブが特異的に結合又は反応する検体との組合せが異なる複数種の磁気ビーズを複数の検体を含む試料中に投入し、各磁気ビーズに目的とする検体を個別に結合させた後、外磁場をかけた状態で試料の温度を１の磁気ビーズを構成する磁性体の磁気相転移温度以上で他の磁気ビーズの磁気相転移温度以下に昇温して当該１の磁気ビーズのみを外磁場に凝集させ、凝集された磁気ビーズをそれに結合されている検体と共に回収するという過程を必要回数だけ繰り返すことにより、キュリー温度が異なる複数種の超常磁性磁気ビーズを用いる場合に比べて低温で１の試料から複数の目的とする検体を個別に分離することができる。よって、検体に変性や破壊等の不都合が生じにくく、目的の検体を高能率に分離できると共に、磁気ビーズの適用範囲を拡張することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、磁性粒子が磁気相転移温度をもつ磁性体からなるので、試料中から複数の目的とする検体を個別に分離する際に、磁気相転移温度と特異的に結合又は反応する検体との組合せが異なる複数種の磁気ビーズを複数の検体を含む試料中に投入することにより、キュリー温度が異なる複数種の超常磁性磁気ビーズを用いる場合に比べて低温で１の試料から複数の目的とする検体を個別に分離することができ、検体分離の高能率化と磁気ビーズの適用範囲の拡張とを図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
まず、本発明に係る磁気ビーズの実施形態を図１及び図４に基づいて説明する。図１は本発明に係る磁気ビーズの第１例を示す断面図、図２は本発明に係る磁気ビーズの第２例を示す断面図、図３は本発明に係る磁気ビーズに適用可能な磁性体の磁化の温度依存性を示すグラフ図、図４は各種の鉄−ロジウム系合金の磁気相転移温度と磁気相転移温度における磁化の大きさを示す表図である。
【００１８】
第１例に係る磁気ビーズ１Ａは、図１に示すように、磁性粒子２と当該磁性粒子２の表面に被覆された非磁性の被覆層３とからなる。
【００１９】
前記磁性粒子２は、磁気相転移温度Ｔｔｒｓをもつ磁性体をもって形成される。この種の磁性体としては、公知に属する任意のものを用いることができるが、磁気相転移温度が異なる複数種の磁気ビーズを投入したときに、１種の磁気ビーズのみを選択的に外磁場に凝集させ、他種の磁気ビーズとの選別を容易にするため、図３に示すように、磁気相転移温度Ｔｔｒｓ以下の低温状態においては自発磁化が０であり、磁気相転移温度Ｔｔｒｓに達したときに自発磁化が急激に発生するものを用いることが特に好ましい。図４に各種の鉄−ロジウム系合金の組成と磁気相転移温度Ｔｔｒｓと磁気相転移温度における磁化の大きさを示す。この図から明らかなように、Ｆｅ０．４０９Ｒｈ０．５９１Ｐｄ０．０１１合金の磁気相転移温度は９５℃でこの温度を境に飽和磁化が０ｅｒｇ／ｇから５７ｅｒｇ／ｇに急増し、Ｆｅ０．４１２Ｒｈ０．５８８Ｐｄ０．０２４合金の磁気相転移温度は６５℃でこの温度を境に飽和磁化が０ｅｒｇ／ｇから４６ｅｒｇ／ｇに急増し、Ｆｅ０．４１０Ｒｈ０．５９０Ｐｄ０．０３９合金の磁気相転移温度は４５℃でこの温度を境に飽和磁化が０ｅｒｇ／ｇから３９ｅｒｇ／ｇに急増し、Ｆｅ０．４１１Ｒｈ０．５８９合金の磁気相転移温度は１２３℃でこの温度を境に飽和磁化が０ｅｒｇ／ｇから６３ｅｒｇ／ｇに急増する。これに対して、Ｆｅ０．４１５Ｒｈ０．５８５Ｐｄ０．２８３合金は磁気相転移温度を有しない。本発明に適用可能な磁性粒子２のより詳細な構成及び製造方法については、後に説明する。
【００２０】
前記被覆層３は、特定の検体を特異的に結合又は反応する非磁性体や、リンカー端にあるエポキシ基が特定の官能基、例えばアミノ基やチオール基を有する化学物質を固定するトシル基、水酸基を有する化学物質を固定する活性化カルボキシル基、カルボキシル基を有する化学物質を固定するアミノ基、プロモアセトアミド基を有する化学物質を固定するチオール基に置換された非磁性体をもって形成される。前記特定の検体を特異的に結合又は反応する非磁性体としては、磁性体の凝集を防止する機能が高く、かつプローブの選択的な結合が可能であることから、シリカ、アルミナ、アパタイトアミロース、ポリエチレングリコール又はキトサンなどを用いることができる。
【００２１】
一方、第２例に係る磁気ビーズ１Ｂは、図２に示すように、磁性粒子２と当該磁性粒子２の表面に被覆された非磁性の被覆層３と、当該非磁性の被覆層３に結合されたプローブ４とからなる。プローブ４としては、例えば特定の抗原と特異的に結合又は反応する特異的抗原、特定のホルモンと特異的に結合又は反応するホルモン受容体、特定のハプテンと特異的に結合又は反応する抗ハプテン、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応する相補的ポリヌクレオリド、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応するポリヌクレオリド結合蛋白、特定のビオチンと特異的に結合又は反応するアビジン又はストレプトアビジン、特定の酵素と特異的に結合又は反応する酵素補因子、及び特定のレクチンと特異的に結合又は反応する特異的炭化水素などを挙げることができる。その他については、第１例に係る磁気ビーズ１Ａと同じであるので、説明を省略する。
【００２２】
以下、本発明の磁気ビーズに適用可能な磁性粒子２の組成とその製造方法とについて説明する。
【００２３】
〈磁性粒子２の組成〉
本発明の磁気ビーズに適用可能な磁性粒子２は、鉄とロジウムとを少なくとも構成元素とする鉄−ロジウム系合金からなり、その組成を一般式Ｆｅ１−ｘＲｈｘＭｙ（Ｍはパラジウム、ルテニウム、イリジウム、白金、金、銀、オスミウム、アルミニウム、チタン、シリコン、ホウ素、希土類元素及びその化合物、遷移金属元素から選択される少なくとも１種の元素）で表したとき、ｘが０．４以上０．８未満であり、かつｙが０．００１以上０．１未満であって、粒子サイズは２０ｎｍ〜２００μｍである。
【００２４】
また、前記磁性粒子２は、鉄とロジウムのイオンと添加元素Ｍを含有する水溶液にアルカリ水溶液を混合するか、前記水溶液にアルカリガスを吹き込むことによって鉄とロジウムと添加元素Ｍとを含む沈殿物を作成し、この沈殿物を加熱処理して鉄とロジウムと添加元素Ｍとを含む酸化物を作成し、さらにこの酸化物を加熱還元することによって得られるものである。
【００２５】
本発明では、まず鉄とロジウムと添加元素Ｍとの組成について検討した。その結果、一般式がＦｅ１−ｘＲｈｘＭｙ（Ｍはパラジウム、ルテニウム、イリジウム、白金、金、銀、オスミウム、アルミニウム、チタン、シリコン、ホウ素、希土類元素及びその化合物、遷移金属元素から選択される少なくとも１種の元素）で表わされる鉄−ロジウム系合金においては、ｘが０．４以上０．８未満であることが必要なことが分かった。これは、ｘが０．４未満であると、強磁性を示す鉄の存在比か大きくなるために磁気相転移が観測されにくくなり、ｘが０．８以上であると、磁性を有しない未反応のロジウムの割合が相対的の大きくなって飽和磁化が有意な変化を示さないからである。
【００２６】
また、ｙは０．００１以上０．１未満であることが必要である。添加元素Ｍを添加しない場合の鉄−ロジウム系合金の磁気相転移温度は図４に示すように約１２０℃である。ｙが０．００１以下であると、磁気相転移温度の有意な変化が観察されず、添加元素Ｍによる温度制御の効果が見られない。ｙが０．１以上であると磁気相転移温度の測定が困難になる。これは、添加元素Ｍが磁気相転移温度を低下させる効果を持つ場合には、得られた鉄−ロジウム系合金の磁気相転移温度が低いことに加えて、鉄−ロジウム系合金が温度ヒステリシスを示すために、測定温度範囲内において反強磁性状態になるまで冷却できないためである。一方、添加元素Ｍが磁気相転移温度を上昇させる効果を持つ場合には、磁気相転移温度が測定温度範囲を超えてしまう可能性があるからである。さらに、ｙが０．１以上であると、磁性を有しない未反応のロジウムの割合が相対的に大きくなるため、飽和磁化の有意な変化が減少する傾向も見られる。
【００２７】
〈磁性粒子２の製造法〉
本発明に係る磁性粒子２は、原料となる鉄、ロジウム及び添加元素Ｍを少なくとも含む化合物を水溶液に溶解し、アルカリで中和することによりこれらの成分を含んだ沈殿を得る工程、この沈殿を還元性雰囲気中で加熱することにより合金粉末を得る工程、及び必要に応じて行われる熱処理工程を経て製造される。以下、本発明に係る磁性粒子２の製造法を各製造工程ごとに説明する。
【００２８】
（沈殿の作製工程）
少なくとも鉄塩及びロジウム塩と添加元素Ｍを水に溶解し、鉄イオンとロジウムイオンとを少なくとも含有する溶解液を作製する。前記鉄塩としては、硝酸鉄、硫酸鉄、塩化鉄、酢酸鉄などを用いることができ、前記ロジウム塩としては、硝酸ロジウム、塩化ロジウム、酢酸ロジウムなどを用いることができる。また、添加元素Ｍとしては、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、白金、金、銀、オスミウム、アルミニウム、チタン、シリコン、ホウ素、希土類元素及びその化合物、遷移金属元素を用いることができる。なお、添加元素Ｍには、水素気流中還元で鉄及びロジウムに固溶する元素と、水素気流中還元では還元されず、酸化物の状態で残る元素との２種類がある。固溶する元素には、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、白金、金、銀、オスミウムがあり、これらの元素は、磁性粒子２の磁気相転移温度を制御する効果がある。固溶しない元素には、アルミニウム、チタン、シリコン、ホウ素、希土類元素があり、これらの元素は、還元次及びその後の熱処理工程において粒子の成長を妨げるので、主に磁性粒子２を微粒子化する効果がある。前記溶解液にアンモニア水溶液を加えて共沈物を作製し、この共沈物を加熱した後に水洗濾過乾燥して酸化物とする。アルカリとしては、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどを用いても良い。
【００２９】
（還元工程）
前記酸化物を水素気流中で加熱還元して、鉄−ロジウム系合金粉末を得る。次いで、水素ガスを流した状態で室温まで冷却した後、窒素ガスに切り換え、空気中に取り出す。還元温度としては、３００℃から６００℃の範囲が好ましい。この温度より低いと均一な鉄−ロジウム系合金粉末が得られにくく、この温度より高いと焼結を生じて粒子サイズが大きくなるからである。
【００３０】
（熱処理工程）
本発明においては、前記酸化物を還元した後の鉄−ロジウム系合金粉末に、酸化が起こらない条件のもとで熱処理を施すこともできる。熱処理温度としては、３００℃から６００℃の範囲が好ましい。この温度より低いと熱処理の効果が得られにくく、この温度より高いと焼結を生じて粒子サイズが大きくなるからである。
【００３１】
さらに、本願発明者は、還元及び熱処理工程における温度条件について検討した。その結果、還元温度及び熱処理温度は、３００℃から１２００℃が好ましいことが判った。還元若しくは熱処理温度により、磁気特性の温度依存性、特に温度ヒステリシスの幅が変化する。還元温度が３００℃以下では還元が充分に進行せず、１２００℃以上では焼結を生じて温度ヒステリシスが消失する。また、熱処理温度が３００℃以下では温度特性の変化が見られず、１２００℃以上では焼結を生じて温度ヒステリシスが消失し、バルクにおける温度特性と同等のものになる。
【００３２】
本発明に係る磁気ビーズ１Ａは、上記のようにして作製された磁性粒子２の表面に非磁性の被覆層３をコーティングすることによって製造される。また、本発明に係る磁気ビーズ１Ｂは、製造された磁気ビーズ１Ａの被覆層３に特定の検体と特異的に結合又は反応するプローブを修飾することによって製造される。
【００３３】
次に、第２例に係る磁気ビーズ１Ｂを用いる場合を例にとり、試料中から複数の目的とする検体を個別に分離する方法を図５及び図６に基づいて説明する。図５は本発明に係る検体の分離方法の一例を示す説明図、図６は本発明に係る検体の分離方法に適用される磁気ビーズの磁化の温度依存性を示すグラフ図である。
【００３４】
まず、図５（ａ）及び図６に示すように、磁気相転移温度がＴｔｒｓ１の磁性粒子２ａと第１のプローブ４ａとを有する磁気ビーズ１Ｂ１と、磁気相転移温度がＴｔｒｓ２の磁性粒子２ｂと第２のプローブ４ｂとを有する磁気ビーズ１Ｂ２と、磁気相転移温度がＴｔｒｓ３の磁性粒子２ｃと第３のプローブ４ｃとを有する磁気ビーズ１Ｂ３とを用意する。各プローブ４ａ，４ｂ，４ｃは、それぞれ検体１１，１２，１３に特異的に結合又は反応するものを用いる。また、各磁性粒子２ａ，２ｂ，２ｃの磁気相転移温度Ｔｔｒｓ１，Ｔｔｒｓ２，Ｔｔｒｓ３は、Ｔｔｒｓ１＜Ｔｔｒｓ２＜Ｔｔｒｓ３となるように調整した。
【００３５】
次に、図５（ｂ）に示すように、これらの磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を、少なくとも３種の検体１１，１２，１３が含まれる試料１４中に投入し、良く攪拌して第１乃至第３のプローブ４ａ，４ｂ，４ｃのそれぞれに各検体１１，１２，１３を個別に結合させる。検体１１，１２，１３としては、細胞、蛋白質、核酸その他の化学物質を当てることができる。また、試料１４は、液相、気相及び気相流体のいずれでも良い。
【００３６】
次に、図５（ｃ）に示すように、磁石１５を用いて試料１４に外磁場をかけつつ、調温器１６を用いて試料１４の温度を磁性粒子２ａの磁気相転移温度であるＴｔｒｓ１とＴｔｒｓ２の間になるように調整する。これにより、自発磁化が発現した磁気ビーズ１Ｂ１のみが選択的に磁石１５に凝集され、自発磁化が発現していない磁気ビーズ１Ｂ２，１Ｂ３は試料１４の底に沈殿する。なお、前記磁石１５としては、電磁石を用いることもできるし、永久磁石を用いることもできる。また、前記調温器１６としては、ペルチェ素子などを用いることができる。
【００３７】
したがって、図５（ｄ）に示すように、磁石１５に凝集された磁気ビーズ１Ｂ１のみを試料１４から取り出し、別の容器に収納することによって、磁気ビーズ１Ｂ１とこれに結合された検体１１とを単独で取り出すことができる。
【００３８】
次いで、図５（ｅ）に示すように、磁石１５を用いて試料１４に外磁場をかけつつ、調温器１６を用いて試料１４の温度を磁性粒子２ｂの磁気相転移温度であるＴｔｒｓ２とＴｔｒｓ３の間になるように調整する。これにより、自発磁化が発現した磁気ビーズ１Ｂ２のみが選択的に磁石１５に凝集され、自発磁化が発現していない磁気ビーズ１Ｂ３は試料１４の底に沈殿する。
【００３９】
したがって、図５（ｆ）に示すように、磁石１５に凝集された磁気ビーズ１Ｂ２のみを試料１４から取り出し、別の容器に収納することによって、磁気ビーズ１Ｂ２とこれに結合された検体１２とを単独で取り出すことができる。
【００４０】
最後に、図５（ｇ）に示すように、磁石１５を用いて試料１４に外磁場をかけつつ、調温器１６を用いて試料１４の温度を磁性粒子２ｃの磁気相転移温度であるＴｔｒｓ３以上に調整する。これにより、自発磁化が発現した磁気ビーズ１Ｂ３が磁石１５に凝集される。
【００４１】
したがって、図５（ｈ）に示すように、磁石１５に凝集された磁気ビーズ１Ｂ３を試料１４から取り出し、別の容器に収納することによって、磁気ビーズ１Ｂ３とこれに結合された検体１３とを単独で取り出すことができる。
【００４２】
前記したように、磁性体の磁気相転移温度はキュリー温度に比べて低温であるので、本発明に係る磁気ビーズ１Ｂを用い、上記の方法で１の試料から複数の検体を個別に分離すると、検体に変性や破壊等の不都合が生じにくく、目的の検体を高能率に分離できると共に、磁気ビーズの適用範囲を拡張することができる。
【００４３】
また、磁気相転移温度をもつ磁性体は、図３及び図６から明らかなように、磁気相転移温度を境に急激に自発磁化が発現するので、試料１４中に複数の磁気ビーズ１Ｂを投入したときに各磁気ビーズ１Ｂを個別に取り出しやすく、この点からも目的の検体を高能率に分離することができる。
【００４４】
なお、前記においては、プローブ４ａ，４ｂ，４ｃを有する磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を用いたが、プローブ４ａ，４ｂ，４ｃを有しない磁気ビーズ１Ａを用いた場合にも、同様の方法で検体の分離を行うことができる。シリカが表面に被覆された磁気ビーズを用いてＤＮＡ又はＲＮＡの分離を行う場合には、シリカの表面にある特異なＤＮＡプローブ或いはＲＮＡプローブを修飾し、ハイブリダイゼーションに用いても良い。また、ｍＲＮＡを単離、精製する場合には、２０個から３０個のデオキシチミジル酸を５′リンカーを介して磁気ビーズの表面に共有結合させたものを用いることができる。
【００４５】
また、前記においては、磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を検体の分離に用いたが、プライマーを磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３と結合させることで、効果的かつ効率的にＰＣＲを行い分離することも可能である。
【００４６】
以下、本発明に係る磁気ビーズの他の例を列挙する。
【００４７】
（１）検体である抗原の結合パートナーをモノクロラール抗体とする。
【００４８】
（２）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチド分子が１個以上のものとする。
【００４９】
（３）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドが５′−アミノ基を介して磁性ビーズに共有結合しているものとする。
【００５０】
（４）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドが１２〜２００塩基の範囲の鎖長を有しているものとする。
【００５１】
（５）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドがぽりｄＴであるものとする。
【００５２】
（６）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドが標的核酸のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に特異的に結合するものとする。
【００５３】
（７）検体である抗原の結合パートナーを表面にアミノ結合を行えるアミノ基を有するものとする。
【００５４】
（８）検体である抗原の結合パートナーを表面にアミノ基を与えるためにアミノアルキル化ポリマーよりなるものとする。
【００５５】
（９）検体である抗原の結合パートナーを表面にアミノ結合を行えるカルボキシル基を有するものとする。
【００５６】
（１０）検体である抗原の結合パートナーを表面にカルボキシル基を与えるためにアクリル酸のポリマー或いはコポリマーよりなるものとする。
【００５７】
（１１）検体である抗原の結合パートナーを表面にカルボキシル基を与えるためにメタクリル酸のポリマー或いはコポリマーよりなるものとする。
【００５８】
（１２）検体である抗原の結合パートナーをアミノ結合を行えるアルデヒド基を有するものとする。
【００５９】
（１３）検体である抗原の結合パートナーを表面に共有結合を行えるヒドロキシル基を有するものとする。
【００６０】
（１４）検体である抗原の結合パートナーを表面にヒドロキシル基を与えるためにポリグリコールを伴うポリウレタンよりなるものとする。
【００６１】
（１５）検体である抗原の結合パートナーを表面にヒドロキシル基を与えるためにセルロース誘導体よりなるものとする。
【００６２】
（１６）検体である抗原の結合パートナーを表面にシラン結合を行えるシラン基を有するものとする。
【００６３】
その他、前記検体の分離方法においては、複数種の磁気ビーズを試料中に投入する方法について説明したが、本発明に係る磁気ビーズは、かかる使用方法に限定されるものではなく、従来の超常磁性磁気ビーズと同様に、単独で検体の分離に適用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明に係る磁気ビーズの第１例を示す断面図である。
【図２】本発明に係る磁気ビーズの第２例を示す断面図である。
【図３】本発明に係る磁気ビーズに適用可能な磁性体の磁化の温度依存性を示すグラフ図である。
【図４】各種の鉄−ロジウム系合金の磁気相転移温度と磁気相転移温度における磁化の大きさを示す表図である。
【図５】本発明に係る検体の分離方法の一例を示す説明図である。
【図６】本発明に係る検体の分離方法に適用される磁気ビーズの磁化の温度依存性を示すグラフ図である。
【符号の説明】
【００６５】
１Ａ，１Ｂ    磁気ビーズ
２    磁性粒子
３    被覆層
４    プローブ
１１，１２，１３    検体
１４    試料
１５    磁石（外磁場）
１６    調温器
【図１】
2005312353.tif 000003
【図２】
2005312353.tif 000004
【図３】
2005312353.tif 000005
【図４】
2005312353.tif 000006
【図５】
2005312353.tif 000007
【図６】
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