(57)【要約】【課題】  ＥＤＧ−１拮抗活性を有する新規化合物を見出すこと。【解決手段】  下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。【化１】2005132748.tif 000006【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2005132748.tif 000004
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）溶解性：メタノール、アセトンに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ２７Ｈ３４Ｏ１１
４）分子量：５３４（ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＦＡＢマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋は次に示す通りである；
実測値：５７９．１８１４
計算値：５７９．１８１８
６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：２６０  ｎｍ  （ε  ７８００）
７）旋光度：メタノール中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
［α］Ｄ２５：−２２°（ｃ  １．０）
８）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す；
３３７７、２９５８、２９３０、２８７２、１７２６、１６１２、１５９０、１４５８、１４０３、１３８０、１３１６、１２５７、１１７１、１１５２、１１３２、１０７３、１００１
９）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを２．５０  ｐｐｍとして測定した、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである；
０．７６  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝１．１，  ７．１  Ｈｚ）、０．８０  （３Ｈ、  ｔ、  Ｊ＝７．３  Ｈｚ）、１．１５  （２Ｈ、ｍ）、１．２１  （２Ｈ、ｍ）、１．４４  （２Ｈ、  ｍ）、１．４８  （２Ｈ、  ｍ）、２．４１  （２Ｈ、  ｍ）、２．４４  （２Ｈ、  ｍ）、３．３４  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝２．２、９．３  Ｈｚ）、３．４９  （２Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝７．６、９．３  Ｈｚ）、３．８２  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝０．７、２．２  Ｈｚ）、３．９５  （１Ｈ，  ｄ、  Ｊ＝０．７  Ｈｚ）、４．７４（１Ｈ，  ｄ、  Ｊ＝７．６  Ｈｚ）、６．２３  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝１．４  Ｈｚ）、６．３５  （１Ｈ、ｂｒｓ）、６．３９  （１Ｈ，  ｂｒｓ）、６．４３  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝１．４  Ｈｚ）、６．４８  （１Ｈ、  ｂｒｓ）ｐｐｍ
１０）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを３９．５  ｐｐｍとして測定した、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである；
１３．８  （ｑ）、１４．０  （ｑ）、２２．０  （ｔ）、２４．０  （ｔ）、３０．３  （ｔ）、３０．９  （ｔ）、３４．９  （ｔ）、３５．０  （ｔ）、６９．８  （ｄ）、７０．１  （ｄ）、７３．４  （ｄ）、７５．１  （ｄ）、１００．３  （ｄ）、１００．９  （ｄ）、１０６．７  （ｄ）、１０９．５  （ｄ）、１１２．１  （ｄ）、１１２．７  （ｄ）、１１４．０  （ｓ）、１４１．８  （ｓ）、１４４．５  （ｓ）、１５１．５  （ｓ）、１５６．３  （ｓ）、１５８．２  （ｓ）、１５９．６  （ｓ）、１６６．１  （ｓ）、１７０．７  （ｓ），ｐｐｍ
１０）高速液体クロマトグラフィー：
カラム  ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ―３
（直径３．０ｍｍ×長さ７５ｍｍ：野村化学（株）製）
溶    媒：０．０５％ギ酸水：アセトニトリル  ＝  ２：３
流    速：０．３ｍｌ／分
検    出：紫外部吸収  波長λ２６０ｎｍ
保持時間：２．２分。
【請求項３】
下記式（ＩＩ）
【化２】
2005132748.tif 000005
で表される化合物又はその塩。
【請求項４】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）溶解性：メタノール、アセトンに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ２９Ｈ３８Ｏ１１
４）分子量：５６２（ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＦＡＢマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋は次に示す通りである；
実測値：６０７．２１３２
計算値：６０７．２１３１
６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：２６１  ｎｍ  （ε  ９０００）
７）旋光度：メタノール中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
［α］Ｄ２５：−１８°（ｃ  ０．５）
８）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す；
３３７６、２９５６、２９２９、２８７１、２８６０、１７２６、１６１５、１５９０、１４６０、１４０３、１３７９、１３１６、１２５３、１１６９、１１５２、１１３２、１０７２、１００１ｃｍ−１
９）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを２．５０  ｐｐｍとして測定した、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである；
０．８４  （３Ｈ、  ｍ）、０．８５  （３Ｈ、  ｍ）、１．２８  （８Ｈ、  ｍ）、１．５４  （２Ｈ、  ｍ）、１．５５  （２Ｈ、  ｍ）、２．５５  （２Ｈ、  ｍ）、２．５６  （２Ｈ、  ｍ）、３．５２  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝２．３、９．５  Ｈｚ）、３．５７  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝７．３、９．５  Ｈｚ）、３．９７  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝０．６、２．３  Ｈｚ）、４．３６  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝０．６  Ｈｚ）、４．９１  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝７．３  Ｈｚ）、６．３４  （１Ｈ、ｂｒｓ）、６．４５  （１Ｈ、  ｂｒｓ）、６．４６  （１Ｈ、  ｂｒｓ）、６．４７  （１Ｈ、  ｂｒｓ）、  ６．５０  （１Ｈ、  ｂｒｓ）  ｐｐｍ
１０）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを３９．５  ｐｐｍとして測定した、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである；
１３．８  （ｑ）、１３．９    （ｑ）、２１．８  （ｔ）、２１．９  （ｔ）、３０．２  （ｔ）、３０．５  （ｔ）、３０．８  （ｔ）、３１．１  （ｔ）、３２．３  （ｔ）、３５．０  （ｔ）、６９．７  （ｄ）、６９．８  （ｄ）、７３．０  （ｄ）、７３．８  （ｄ）、９９．８  （ｄ）、１００．０  （ｄ）、１０６．６  （ｄ）、１０９．３  （ｄ）、１１２．１  （ｄ）、１１２．７  （ｄ）、１１３．９  （ｓ）、１４２．２  （ｓ）、１４４．６  （ｓ）、１５１．４  （ｓ）、１５６．０  （ｓ）、１５８．０  （ｓ）、１５９．５  （ｓ）、１６６．０  （ｓ）、１６９．５  （ｓ）  ｐｐｍ
１０）高速液体クロマトグラフィー：
カラム  ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ―３
（直径３．０ｍｍ×長さ７５ｍｍ：野村化学（株）製）
溶    媒：０．０５％ギ酸水：アセトニトリル  ＝  ２：３
流    速：０．３ｍｌ／分
検    出：紫外部吸収  波長λ２６０ｎｍ
保持時間：３．２分。
【請求項５】
アスコトリカ（Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ）属に属する請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物を単離することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物の製造方法。
【請求項６】
アスコトリカ（Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ）属に属する、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物の生産菌が、アスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  ＳＡＮＫ  １４１８６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０６）である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項８】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物又はその塩を有効成分として含有するＥＤＧ−１拮抗剤。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する血管新生阻害剤。
【請求項１０】
アスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  ＳＡＮＫ  １４１８６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＤＧ−１拮抗活性を有する化合物又はその塩、該化合物の製造方法、該化合物を有効成分として含有する医薬、ＥＤＧ−１拮抗剤及び血管新生阻害剤、並びに、該化合物を生産する微生物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜からホスフォリパーゼの働きにより、プロスタグランジン、ロイコトリエン等のエイコサノイド、ＰＡＦ（血小板活性化因子）、リゾフォスファチジン酸（以下ＬＰＡと略記する）等の脂質メディエーターが産生され、様々な生理活性を生じていることが明らかにされている。スフィンゴシン−１−リン酸（以下「ｓｐｈ−１−Ｐ」と略記する）はスフィンゴ脂質の代謝回転を通じて、特に細胞膜の主要構成成分、スフィンゴミエリンの代謝物として生成されるリゾ脂質であり、その生理活性として、平滑筋細胞、メサンギウム細胞、及び癌細胞の増殖や運動の制御、血管の弛緩・収縮、血圧の調節、心拍数の調節、血小板の凝集、脳血管痙攣、脳虚血、肝繊維症、及び免疫調節機能などが知られている。近年、ｓｐｈ−１−Ｐが、Ｇ蛋白質共役の７回膜貫通型受容体（G-protein coupled receptor：以下、「ＧＰＣＲ」と略記する）であるＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅ−１（以下、「ＥＤＧ−１」のように略記する）とその類縁分子であるＥＤＧ−３、ＥＤＧ−５、ＥＤＧ−６、及びＥＤＧ−８（以下、これらを総称して「ＥＤＧ受容体」という）に結合して細胞間メッセンジャーとして働き、血管新生の過程において重要な役割を担っていることがわかってきた。
Ｍｅｎｑ−Ｊｅｒ  Ｌｅｅらはヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cell：以下、「ＨＵＶＥＣ」と略記する）を用いて、ｓｐｈ−１−ＰがＥＤＧ−１及びＥＤＧ−３受容体を介して該細胞のサーバイバル延長作用、接着点形成作用、微小血管形成作用を促すこと、及び、ｓｐｈ−１−Ｐがｉｎ  ｖｉｖｏにおいても血管新生に対して線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と相乗的に効果を示すことを報告している（非特許文献１参照）。また、ＯＫ−Ｈｅｅ  Ｌｅｅらは、ｓｐｈ−１−ＰのＨＵＶＥＣに対するＤＮＡ合成促進作用及び、遊走作用を明らかにし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生に対して、ｓｐｈ−１−Ｐが単独で血管新生を促進することを報告している（非特許文献２参照）。更に、ＥＤＧ−１のノックアウトマウスが血管形成異常で胎生致死になること（非特許文献３参照）から、ｓｐｈ−１−Ｐの血管新生促進作用はＥＤＧ−１を介する可能性が強く示唆されており、ＥＤＧ−１とｓｐｈ−１−Ｐの結合を阻害する化合物は血管新生阻害作用を有することが期待される。しかし、そのような活性を有する化合物は未だ報告されていない。
【非特許文献１】「セル（Cell）」  ９９，(１９９９年），  p.３０１−３１２
【非特許文献２】「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications）」  ２６４，(１９９９年），  p.７４３−７５０
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal  of  Clinical  Investigation）」  １０６，（２０００年）,  p.９５１−９６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、ＥＤＧ−１拮抗作用を有する新規な化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、ＥＤＧ−１拮抗活性を有する物質を見出すため、鋭意探索研究を進めた結果、真菌培養物中に該活性を有する物質が含まれていることを見出し、該化合物を単離、精製し、該化合物のＥＤＧ−１拮抗活性を確認し、本発明を完成した。
本発明は
（１）  下記式（Ｉ）
【０００５】
【化３】
2005132748.tif 000002
【０００６】
で表される化合物又はその塩、
（２）  下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）溶解性：メタノール、アセトンに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ２７Ｈ３４Ｏ１１
４）分子量：５３４（ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＦＡＢマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋は次に示す通りである；
実測値：５７９．１８１４
計算値：５７９．１８１８
６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：２６０  ｎｍ  （ε  ７８００）
７）旋光度：メタノール中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
［α］Ｄ２５：−２２°（ｃ  １．０）
８）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す；
３３７７、２９５８、２９３０、２８７２、１７２６、１６１２、１５９０、１４５８、１４０３、１３８０、１３１６、１２５７、１１７１、１１５２、１１３２、１０７３、１００１ｃｍ−１
９）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを２．５０  ｐｐｍとして測定した、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである；
０．７６  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝１．１，  ７．１  Ｈｚ）、０．８０  （３Ｈ、  ｔ、  Ｊ＝７．３  Ｈｚ）、１．１５  （２Ｈ、ｍ）、１．２１  （２Ｈ、ｍ）、１．４４  （２Ｈ、  ｍ）、１．４８  （２Ｈ、  ｍ）、２．４１  （２Ｈ、  ｍ）、２．４４  （２Ｈ、  ｍ）、３．３４  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝２．２、９．３  Ｈｚ）、３．４９  （２Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝７．６、９．３  Ｈｚ）、３．８２  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝０．７、２．２  Ｈｚ）、３．９５  （１Ｈ，  ｄ、  Ｊ＝０．７  Ｈｚ）、４．７４（１Ｈ，  ｄ、  Ｊ＝７．６  Ｈｚ）、６．２３  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝１．４  Ｈｚ）、６．３５  （１Ｈ、ｂｒｓ）、６．３９  （１Ｈ，  ｂｒｓ）、６．４３  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝１．４  Ｈｚ）、６．４８  （１Ｈ、  ｂｒｓ）ｐｐｍ
１０）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを３９．５  ｐｐｍとして測定した、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである；
１３．８  （ｑ）、１４．０  （ｑ）、２２．０  （ｔ）、２４．０  （ｔ）、３０．３  （ｔ）、３０．９  （ｔ）、３４．９  （ｔ）、３５．０  （ｔ）、６９．８  （ｄ）、７０．１  （ｄ）、７３．４  （ｄ）、７５．１  （ｄ）、１００．３  （ｄ）、１００．９  （ｄ）、１０６．７  （ｄ）、１０９．５  （ｄ）、１１２．１  （ｄ）、１１２．７  （ｄ）、１１４．０  （ｓ）、１４１．８  （ｓ）、１４４．５  （ｓ）、１５１．５  （ｓ）、１５６．３  （ｓ）、１５８．２  （ｓ）、１５９．６  （ｓ）、１６６．１  （ｓ）、１７０．７  （ｓ），ｐｐｍ
１０）高速液体クロマトグラフィー：
カラム  ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ―３
（直径３．０ｍｍ×長さ７５ｍｍ：野村化学（株）製）
溶    媒：０．０５％ギ酸水：アセトニトリル  ＝  ２：３
流    速：０．３ｍｌ／分
検    出：紫外部吸収  波長λ２６０ｎｍ
保持時間：２．２分、
（３）  下記式（ＩＩ）
【０００７】
【化４】
2005132748.tif 000003
【０００８】
で表される化合物又はその塩、
（４）  下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：無色粉末状物質
２）溶解性：メタノール、アセトンに可溶、水、ノルマルヘキサンに不溶
３）分子式：Ｃ２９Ｈ３８Ｏ１１
４）分子量：５６２（ＦＡＢマススペクトル法により測定）
５）高分解能ＦＡＢマススペクトル法により測定した精密質量、［Ｍ＋２Ｎａ−Ｈ］＋は次に示す通りである；
実測値：６０７．２１３２
計算値：６０７．２１３１
６）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、次に示す極大吸収を示す：２６１  ｎｍ  （ε  ９０００）
７）旋光度：メタノール中で測定した旋光度は、以下に示す値を示す：
［α］Ｄ２５：−１８°（ｃ  ０．５）
８）赤外吸収スペクトル：臭化カリウム（ＫＢｒ）錠剤法で測定した赤外吸収スペクトルは以下に示す極大吸収を示す；
３３７６、２９５６、２９２９、２８７１、２８６０、１７２６、１６１５、１５９０、１４６０、１４０３、１３７９、１３１６、１２５３、１１６９、１１５２、１１３２、１０７２、１００１ｃｍ−１
９）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを２．５０  ｐｐｍとして測定した、１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示す通りである；
０．８４  （３Ｈ、  ｍ）、０．８５  （３Ｈ、  ｍ）、１．２８  （８Ｈ、  ｍ）、１．５４  （２Ｈ、  ｍ）、１．５５  （２Ｈ、  ｍ）、２．５５  （２Ｈ、  ｍ）、２．５６  （２Ｈ、  ｍ）、３．５２  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝２．３、９．５  Ｈｚ）、３．５７  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝７．３、９．５  Ｈｚ）、３．９７  （１Ｈ、  ｄｄ、  Ｊ＝０．６、２．３  Ｈｚ）、４．３６  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝０．６  Ｈｚ）、４．９１  （１Ｈ、  ｄ、  Ｊ＝７．３  Ｈｚ）、６．３４  （１Ｈ、ｂｒｓ）、６．４５  （１Ｈ、  ｂｒｓ）、６．４６  （１Ｈ、  ｂｒｓ）、６．４７  （１Ｈ、  ｂｒｓ）、  ６．５０  （１Ｈ、  ｂｒｓ）  ｐｐｍ
１０）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重ジメチルスルフォキシド中でジメチルスルフォキシドのシグナルを３９．５  ｐｐｍとして測定した、１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルは、以下に示すとおりである；
１３．８  （ｑ）、１３．９    （ｑ）、２１．８  （ｔ）、２１．９  （ｔ）、３０．２  （ｔ）、３０．５  （ｔ）、３０．８  （ｔ）、３１．１  （ｔ）、３２．３  （ｔ）、３５．０  （ｔ）、６９．７  （ｄ）、６９．８  （ｄ）、７３．０  （ｄ）、７３．８  （ｄ）、９９．８  （ｄ）、１００．０  （ｄ）、１０６．６  （ｄ）、１０９．３  （ｄ）、１１２．１  （ｄ）、１１２．７  （ｄ）、１１３．９  （ｓ）、１４２．２  （ｓ）、１４４．６  （ｓ）、１５１．４  （ｓ）、１５６．０  （ｓ）、１５８．０  （ｓ）、１５９．５  （ｓ）、１６６．０  （ｓ）、１６９．５  （ｓ）  ｐｐｍ
１０）高速液体クロマトグラフィー；
カラム  ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ―３
（直径３．０ｍｍ×長さ７５ｍｍ：野村化学（株）製）
溶    媒：０．０５％ギ酸水：アセトニトリル  ＝  ２：３
流    速：０．３ｍｌ／分
検    出：紫外部吸収  波長λ２６０ｎｍ
保持時間：３．２分、
（５）  アスコトリカ（Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ）属に属する、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の化合物を単離することを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれかひとつに記載の化合物の製造方法、
（６）  アスコトリカ（Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ）属に属する、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の化合物の生産菌が、アスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  ＳＡＮＫ  １４１８６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０６）である、（５）に記載の製造方法、
（７）  （１）乃至（４）のいずれか一つに記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬、
（８）  （１）乃至（４）のいずれか一つに記載の化合物又はその塩を有効成分として含有するＥＤＧ−１拮抗剤、
（９）  （１）乃至（４）のいずれか一つに記載の化合物又はその塩を有効成分として含有する血管新生阻害剤、
（１０）  アスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  ＳＡＮＫ  １４１８６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０６）、
に関する。
本発明において、上記（１）に記載の構造式からなる化合物又は（２）に記載の物理化学的性状を有する化合物をＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａと呼び、（３）に記載の構造式からなる化合物又は（４）に記載の物理化学的性状を有する化合物をＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂと呼ぶ。Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａ及びＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂを総称してＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎと呼ぶ。
【０００９】
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、常法に従って塩にすることができる。Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎの塩は、医薬用途又は医薬以外の用途に使用され得る。医薬に使用されるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎの塩としては、薬理学上許容されれば特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。医薬以外の用途（例えば、合成中間体としての用途）に使用されるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎの塩としては、特に限定されるものではないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属の塩、カルシウム塩、バリウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属の塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属の塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及びグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩等を挙げることができる。
【００１０】
また、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、常法に従ってエステルとすることができる。Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎのエステルとしては、例えば、炭素数１乃至６個からなるアルキル基で形成されるエステル等を挙げることができる。そのようなエステルとしては、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル、ｓ−ブチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ペンチルエステル、イソペンチルエステル、ネオペンチルエステル等を例示することができる。
【００１１】
さらに、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体及びこれらの異性体の混合物がすべて単一の式で示される。本発明においては、これらの異性体及びこれらの異性体の混合物をもすべて包含する。
【００１２】
また、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ及びその塩は、溶剤和物となることがある。例えば、大気中での放置又は再結晶等により水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような溶剤和物も本発明に包含される。
【００１３】
さらに、本発明においては、生体内において代謝されてＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎに変換される化合物、いわゆるプロドラッグもすべて含むものである。
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、常法に従って化学合成により製造され得るし、該物質を生産する微生物の培養物から常法に従って単離・精製することも出来る。Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを生産する微生物としては、特に限定されないが、好適には真菌であり、より好適にはアスコトリカ（Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ）属に属する真菌であり、さらにより好適にはアスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）であり、最適にはアスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  ＳＡＮＫ  １４１８６（以下、「ＳＡＮＫ  １４１８６株」という）である。
【００１４】
ＳＡＮＫ  １４１８６株は沖縄県八重山郡竹富町にて採集した土壌より、１９９８年８月に分離された。
【００１５】
以下に、ＳＡＮＫ  １４１８６株の菌学的性状について述べる。
【００１６】
菌の培養に使用した各培地の組成を以下に記載する。
[ＷＳＨ培地（改良ワイツマン  アンド  シルバ−ヒュンター（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｗｅｉｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ−Ｈｕｔｎｅｒ）  培地）]
日食オートミール                                                １０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物                                          １ｇ
リン酸二水素カリウム                                              １ｇ
硝酸ナトリウム                                                    １ｇ
寒天                                                            ２０ｇ
蒸留水                                                      １０００ｍｌ
[ＰＣＡ培地  （ポテトキャロット寒天（Ｐｏｔａｔｏ  Ｃａｒｒｏｔ  Ａｇａｒ  ）培地）]
ジャガイモ                                                      ３０ｇ
ニンジン                                                      ２．５ｇ
寒天                                                            ２０ｇ
蒸留水                                                      １０００ｍｌ
[ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ）培地）]
ニッスイ  ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬（株）製）  ３９ｇ
蒸留水                                                      １０００ｍｌ
以下の記載において、色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー  弟三版（Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ））」  （コーネルップ  アンド  ヴァンシャー  著  （ｅｄ．  Ｋｏｒｎｅｒｕｐ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｗａｎｓｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．）  エリー  メチューン  （Ｅｒｙｅ  Ｍｅｔｈｕｅｎ），  ロンドン、１９７８年）に従った。
ＳＡＮＫ  １４１８６株の培養性状は以下のようになる。
【００１７】
ＷＳＨ培地での２３℃、１４日目の菌叢直径は２７−３３  ｍｍに達す。菌叢は短い綿毛状の白色の菌糸からなり、中央から縁辺部にかけて分生子および子のう殻をまばらに形成して、暗緑色（３０Ｆ５−３０Ｆ７）を呈す。縁辺部は白色で、大きく波状となる。裏面中心部は暗緑色（３０Ｆ６）、縁辺部では白色となる。可溶性色素及び浸出液は観察されない。
【００１８】
ＰＣＡ培地での２３℃、１４日目の菌叢直径は２５−３０  ｍｍに達す。菌叢は短い綿毛状の白色の菌糸からなり、中央付近は旺盛に分生子を形成して暗緑色（３０Ｆ３）を呈す。縁辺部は白色で、大きな波状となる。裏面中心部は暗緑色から黄土色（３０Ｆ３−４Ｄ５）、縁辺部は白色となる。菌叢中心部に未熟な子のう殻を形成する。可溶性色素及び浸出液は観察されない。
【００１９】
ＰＤＡ培地での２３℃、１４日目の菌叢直径は２５−３３  ｍｍに達す。菌叢はフェルト状で、白色から灰色（３０Ａ１−３０Ｅ１）を呈す。縁辺部は全縁で白色となる。裏面は白色、中央部でまばらに暗緑色（３０Ｆ５）を呈す。子のう殻、分生子、可溶性色素及び浸出液は観察されない。
ＳＡＮＫ  １４１８６株のＷＳＨ培地での２３℃、１４日目の微細構造は以下のようになる。
【００２０】
子のう殻は亜球形で、幅３３０−３５０  μｍ、高さ４５０−４６０  μｍ、口孔を持ち、暗褐色から黒色となる。頂毛は直生で、基部で幅３−４  μｍ、膝状に屈曲し、しばしば二分枝し、有隔壁で、暗茶色から黒色となり、頂毛の屈曲部に短い無色の不稔性の分枝を生じる。不稔性の分枝は棍棒形で、長さ６．５−１３．６  μｍ、幅２．８−４．０  μｍとなる。側毛は頂毛に類似する。子のうは円筒形で、長さ５２−７２  μｍ、  幅５．８−７．８  μｍ、  ８胞子を含み、薄壁で、子のう胞子が成熟すると消失する。子のう胞子は円盤形で、子のう内に単列し、成熟すると暗茶色から黒色となり、赤道面に明瞭なスリットを有し、長さ７．４−９．２  μｍ、幅５．９−８．３  μｍとなる。
【００２１】
分生子柄は菌糸または頂毛から生じ、幅２．２−４．０  μｍで、有隔壁で、頂毛に類似し、単生または二差分枝し、オリーブ茶色から暗茶色で、頂部に向けて淡茶色から無色となる。分枝した枝では無色の不稔性の枝と分生子形成細胞を形成する枝が不規則に並ぶ。分生子形成細胞は枝の先端部に存在し、長さ５．６−１２．８  μｍ、幅２．４−３．６  μｍ、淡褐色で、上部の約１／３に分生子を形成する。分生子はシンポジオ型で、分生子形成細胞の小突起から形成され、直径４−７  μｍ、不規則な楕円形で、表面は小いぼ状となり、成熟すると淡褐色となる。
以上のような菌学的特徴はホークスワースの文献（「ホークスワース  （１９７１）  ア  リバージョン  オブ  ジーナス  アスコトリカ  バーク．  マイコロジカル  ペーパーズ  １２６：１−２８」  （Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ，  Ｄ．  Ｌ．  （１９７１）Ａ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｕｓ  Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  Ｂｅｒｋ．  Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｐｅｒｓ  １２６：１−２８））の記載したアスコトリカ・チャルタールム  バークレイ（Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  の記載によく一致した。従って、本菌株をアスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）と同定し、アスコトリカ・チャルタールム  バークレイ  （Ａｓｃｏｔｒｉｃｈａ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）  ＳＡＮＫ  １４１８６と命名した。ＳＡＮＫ  １４１８６株は、２００３年１０月６日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０６が付された。
周知の通り、真菌類は自然界において、又は人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明のＳＡＮＫ  １４１８６株もそのような変異を起こし易いと推測される。本発明において、ＳＡＮＫ  １４１８６株は、その全ての変異株を包含する。
【００２２】
また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ち、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを生産するＳＡＮＫ  １４１８６株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は全てＳＡＮＫ  １４１８６株に包含される。
【００２３】
上述の通り、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎは該物質の生産菌を培養することにより製造することができる。Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ生産菌の培養は、通常微生物の二次代謝産物の製造に使用されるような培地を用いて行なうことができる。そのような培地は、微生物が資化出来る炭素源、窒素源及び無機塩を含有する。
【００２４】
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、デンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等が挙げられ、これらは単独又は併用して使用することができる。炭素源の添加量は、通常、培地量の１乃至１０重量％の範囲である。
【００２５】
窒素源としては、通常、蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩が使用される。このような窒素源としては、例えば、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられ、これらは単独または併用して使用することができる。窒素源の添加量は、通常、培地量の０．２乃至１０重量％の範囲である。
【００２６】
栄養無機塩としては、例えば、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン等のイオンを得ることのできる塩類が使用される。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、マグネシウム等の金属を微量含む塩類も使用することができる。
【００２７】
液体培養を行う場合には、必要に応じて、消泡剤を用いることができ、このような消泡剤としては、例えば、シリコン油、植物油、界面活性剤等が使用される。
【００２８】
ＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎはＳＡＮＫ  １４１８６株を好気的培養法で好気的に培養することにより得られる。このような培養法としては、例えば、固体培養法、振盪培養法又は通気撹拌培養法等が用いられる。
【００２９】
小規模な培養は、４乃至３０℃（好適には１７℃乃至３０℃、最適には２３℃）で数日間振盪培養を行うのが好ましい。培養は、三角フラスコ中で一段階または複数段階の種の発育工程により開始する。種培養は、フラスコに滅菌した種培養用培地を加え、ＳＡＮＫ  １４１８６株を接種した後、定温インキュベーター中で数日間または充分に成長するまで振盪することにより行う。得られた種培養液の一部または全部は、次段階の種培養用培地または生産培養用培地に接種するのに使用される。培養は、滅菌した生産培養用培地を含むフラスコに、種培養液を接種し、一定温度で数日間振盪することにより行うことができる。
【００３０】
大量培養は、撹拌機、通気装置を備えた適当なタンクで培養するのが好ましい。培地は、タンクの中で作製することができ、１２１℃に加熱して滅菌後、冷却して使用する。培養は、タンク内の生産培養用培地に種培養液を接種し、４乃至３０℃（好適には１７℃乃至３０℃、最適には２３℃）で通気撹拌して行うことができる。この方法は多量の化合物を得るのに適している。
【００３１】
培養時間は、通常、１５０時間乃至２００時間でＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎの生産量は最高値に達する。
【００３２】
培養終了後、得られた培養物、その中に含まれる菌体及び／又はその培養上清から、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを抽出することができる。菌体及びその他の固形分と培養上清とを分離するためには、遠心分離法又は珪藻土をろ過助剤とするろ過法を使用することができる。
【００３３】
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎの抽出には該化合物の物理化学的性状を利用することができる。培養ろ液又は培養上清中に存在するＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、酸性又は中性条件下で水と混和しない有機溶剤、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレン、ブタノール、それら２つ以上の混合溶媒等により抽出することができる。菌体内に存在するＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、５０乃至９０％の含水アセトン又は含水メタノールを用いて菌体から抽出し、有機溶媒を留去した後、培養ろ液又は培養上清中に存在する場合と同様に抽出することができる。全培養物中に存在するＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、全培養物にアセトン又はメタノールを２０乃至８０％、好適には４０乃至６０％、より好適には５０％添加し、抽出することができる。抽出終了後、珪藻土をろ過助剤としてろ過し、得られた可溶物から、培養ろ液又は培養上清中に存在する場合と同様に抽出することができる。
【００３４】
上述の抽出物からＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを単離するための精製は、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の精製手段を用いて、常法に従い行なうことができる。
【００３５】
吸着クロマトグラフィーは、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを含む上述の抽出液を吸着剤と接触させ、夾雑物を吸着させて取り除くか、又はＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを吸着剤に吸着させて夾雑物を除去した後、該吸着剤からＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを溶出させることにより行なうことができる。吸着剤としては、例えば、活性炭、アンバーライトＸＡＤ−２、同ＸＡＤ−４（以上、ローム・アンド・ハース社製）、ダイアイオンＨＰ−１０、同ＨＰ−２０、同ＣＨＰ−２０Ｐ、同ＨＰ−５０、セパビーズＳＰ−２０７（以上、三菱化学（株）製）等を挙げることができる。吸着させたＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎの溶出に使用する溶媒としては、例えば、メタノール水、アセトン水、ブタノ−ル水等を挙げることができる。
【００３６】
イオン交換クロマトグラフィーは、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎが酸性物質として挙動することを利用して行なう。すなわち、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを含む上述の抽出液を陰イオン交換担体と接触させてＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを該担体に吸着させ、夾雑物を除去した後、溶媒系のイオン強度、ｐＨ等を変化させることによりＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを溶出させることができる。陰イオン交換担体としては、ＤＥＡＥ−セルロース（ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファロース、ＱＡＥ−セファデックス（以上、ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−トヨパールＣ（東ソー（株）製）、デュオライト  Ａ−２（ダイアモンド・シャムロック・ケミカル社製）、アンバーライト  ＩＲＡ−６８（ローム・アンド・ハース社製）、ダウエックス１×４、同２１Ｋ、同ＳＢＲ−Ｐ（以上、ダウ・ケミカル社製）等を挙げることができる。
【００３７】
分配クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、シリカゲル、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー（株）製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を挙げることができる。
【００３８】
逆相クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、コスモシール１４０Ｃ１８（ナカライテスク（株）製）等を挙げることができる。
【００３９】
ＨＰＬＣに使用するカラムとしては、例えば、ショウデックスアサヒパックＣ８Ｐ５０−４Ｅ（昭和電工（株）製）、ＹＭＣパックＯＤＳ−ＡＭ（ワイエムシィ（株）製）、カプセルパックＵＧ１２０（資生堂（株）製）、デベロシルＯＤＳ−ＵＧ５、ＯＤＳ−ＭＧ５、Ｃ３０−ＵＧ５（以上、野村化学（株）製）の如き逆層カラム等を挙げることができる。
【００４０】
これらの精製手段を単独で、又は適宜組み合わせることにより、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを単離・精製することができる。必要なら同じ精製手段を反復してもよい。各精製手段の実施には、カラムクロマトグラフィー法、バッチクロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法等、精製に適した方法を選択することができる。このような方法により製造されるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎも、本発明に含まれる。
この様にして精製されたＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、ＥＤＧ−１拮抗活性を有する。
【００４１】
本発明において、「ＥＤＧ−１拮抗活性」とは、ｓｐｈ−１−ＰとＥＤＧ−１の結合を拮抗的に阻害し、該結合を介した細胞内シグナル伝達を阻害する活性をいう。該結合を介した細胞内シグナル伝達により引き起こされる病理現象としては様々なものが考えられ、ＥＤＧ−１拮抗活性を有するＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎは、該病理現象に起因するあらゆる疾患を治療又は予防する活性を有する。該病理現象の主なものとして血管新生が挙げられる。病態における血管新生とは、炎症細胞や癌細胞等からのシグナルに応答して血管が形成されることにより、患部への栄養供給が促進され、炎症又は癌の拡大、増悪、転移を促進する現象である。このような血管新生が関与する疾患の具体例としては、炎症疾患（例えば免疫及び、非免疫性疾患、慢性関節リウマチ、乾癬）、異常な血管新生を伴う疾患（例えば再狭窄、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、後水晶体繊維増殖症、アテローム性動脈硬化症プラークの毛細血管増殖、甲状腺過形成（バセドウ病を含む）、肺炎症、ネフローゼ症候群、及び骨粗しょう症）、脳血管痙攣、脳虚血、癌関連疾患（例えば固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫）、脳梗塞、心筋梗塞症、腎炎、肺炎、免疫性疾患、クローン病、大腸炎、慢性下痢等を挙げることができる。上記した固形腫の中には、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、卵胞膜細胞腫、男性胚腫、頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、骨肉腫、膵臓癌、尿路癌、甲状腺癌、脳腫瘍などが含まれる。更に、免疫及び非免疫疾患の中には、全身性エリトマトーデス、多発性筋炎、皮膚筋炎、血管炎症群、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫、強皮症、ベーチェット病、ぶどう膜炎、特発性間質性肺炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、サルコイドーシス、アレルギー性肉芽腫性血管炎、気管支喘息、心筋炎、心筋症、心肥大、大動脈炎症候群、心筋梗塞後症候群、原発性肺高血圧症、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、肺線維症、間質性肺炎、慢性肝炎、肝硬変、閉塞性動脈硬化症、閉塞性血栓血管炎、バージャー病、糖尿病性ニューロパチーの末梢動脈疾患、敗血症、劇症肝炎、ウイルス性肝炎、微小変化型ネフローゼ、膜性腎症、慢性腎不全、腎糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、多発性硬化症、浮腫性疾患、動脈硬化症、痔核、裂肛、痔ろうなどの静脈瘤、解離性動脈瘤、狭心症、ＤＩＣ、胸膜炎、うっ血性心不全、多臓器不全、とこずれ、火傷、クローン病、重症筋無力症、炎症性ニューロパチー、自己免疫性水疱症、尋常性乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性光線性皮膚炎、脳梗塞、創傷、ＧＶＨＤ、各種臓器移植での拒絶反応などが含まれる。すなわち、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ又はその塩を有効成分として含有する医薬は、ＥＤＧ−１拮抗剤、血管新生阻害剤、又は上述のような血管新生が関与する各種疾患の治療又は予防剤として用いることができる。
【００４２】
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ若しくはその塩を医薬として用いる場合、種々の形態で投与され得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。
【００４３】
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ又はその塩を有効成分として含有する各種製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。
【００４４】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を挙げることができる。錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。
【００４５】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤を挙げることができる。
【００４６】
注射剤として調製される場合、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤として当該分野において公知のものを広く使用でき、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。等張を維持するために充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有せしめてもよい。溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有せしめてもよい。
【００４７】
なお、注射剤を静脈内投与する場合、単独で、ブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、又は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等とのエマルジョンとして投与される。
【００４８】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００４９】
上述の医薬製剤に含有せしめるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ又はその塩の量は、特に限定されないが、好適には１乃至７０重量％であり、より好適には１乃至３０重量％である。
【００５０】
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ又はその塩を含有する医薬製剤の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり投与されるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ又はその塩の量は、好適には０．００１乃至２０００ｍｇであり、より好適には０．０１乃至２００ｍｇであり、さらにより好適には０．１乃至２０ｍｇである。
【００５１】
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎを含有する医薬製剤の投与回数は、数日に１回、１日１回、又は１日複数回である。
【発明の効果】
【００５２】
本発明により、ＥＤＧ−１拮抗活性を有する化合物が提供される。本発明の化合物を有効成分として含有する医薬は、ＥＤＧ−１拮抗剤又は血管新生を伴う疾患の治療又は予防剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
次に、実施例、試験例及び製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００５４】
[実施例１]  ＳＡＮＫ  １４１８６株の培養
下記の表１で示される種培養培地を３０ｍｌずつ１００ｍｌ容三角フラスコ１本に入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。フラスコの培地にＳＡＮＫ  １４１８６株を一白金耳接種し、回転振盪培養機で、２１０ｒｐｍ、２３℃で７日間培養し種培養液とした。
【００５５】
[表１]  種培養培地
可溶性デンプン                                  ２％
グリセリン                                      ３％
グルコース                                      ３％
ゼラチン                                  ０．２５％
大豆粉                                          １％
イーストエキス                            ０．２５％
硝酸アンモニウム                          ０．２５％
寒天末                                      ０．３％
ＣＢ−４４２（消泡剤）                    ０．０１％
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＊水道水を用いて調製した。滅菌前はｐＨ６．５であった。
下記の表２で示される本培養培地を８０ｍｌずつ５００ｍｌ容三角フラスコ５本に入れ１２１℃で２０分間加熱滅菌した。この培地を室温で２３℃に冷却した後、上記の種培養液２ｍｌを接種し、回転振盪培養機で、２１０ｒｐｍ、２３℃で７日間培養した。
【００５６】
[表２]  本培養培地
可溶性デンプン                                  ２％
グリセリン                                      ３％
グルコース                                      ３％
ゼラチン                                  ０．２５％
大豆粉                                          １％
イーストエキス                            ０．２５％
硝酸アンモニウム                          ０．２５％
ＣＢ−４４２（消泡剤）                    ０．０１％
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
＊水道水を用いて調製した。滅菌前はｐＨ６．５であった。
[実施例２]  Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  ＡおよびＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂの単離
本実施例におけるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎの挙動は、以下に示す条件のＨＰＬＣによりモニターした。
カラム  ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ―３
（直径３．０ｍｍ×長さ７５ｍｍ：野村化学（株）製）
溶    媒：０．０５％ギ酸水：アセトニトリル  ＝  ２：３
流    速：０．３ｍｌ／分
検    出：紫外部吸収  波長λ２６０ｎｍ
保持時間：２．２分（Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａ）
３．２分（Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂ）
実施例１において得られた培養物４００ｍｌに、ギ酸０．５ｍｌ、アセトン２５０ｍｌ、酢酸エチル２５０ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した後、吸引濾過により固形物を除去し、抽出液９００ｍｌを得た。得られた抽出液に酢酸エチル１００ｍｌを添加した後、分配した。得られた有機層を飽和食塩水２００ｍｌで洗浄した後、無水硫酸ナトリウム１０ｇで乾燥した。有機層中の不溶物を濾紙及びロートを用いて濾過し、得られた濾液を減圧濃縮後、凍結乾燥を行うことでＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを含む粗粉末１．８６ｇを得た。
【００５７】
この粗粉末全量を、０．０５％ギ酸を含む６０％アセトニトリル水溶液２０ｍｌに溶解し、このうち１０ｍｌを以下の精製に供した。
【００５８】
該アセトニトリル溶液１ｍｌを予め０．０５％ギ酸を含む６０％アセトニトリル水で平衡化したＨＰＬＣカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＭＧ−５（直径２０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：野村化学（株）製）に供与し、平衡化に用いた溶媒系により、流速１０．０ｍｌ／分で展開した。活性画分の紫外部吸収を波長λ２６０ｎｍにて検出し、保持時間６．５分に溶出されるピークをＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａ画分として、１０．６分に溶出されるピークをＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂ画分としてそれぞれ分取した。
【００５９】
このようなＨＰＬＣ分取操作を１０回繰り返し、得られた溶出画分を合併し、減圧濃縮して得られたＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａ及びＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂの懸濁液それぞれ２０ｍｌを凍結乾燥し、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａの粉末を１１５．３ｍｇ、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂの粉末を４８．８ｍｇ、それぞれ得た。
[試験例１]  細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）濃度変化測定試験
ＥＤＧ−１発現細胞をｓｐｈ−１−Ｐで刺激した際に生じる細胞内ｃＡＭＰの濃度変化に対する被験化合物の作用について、以下のように試験した。
【００６０】
ヒトＥＤＧ−１（核酸配列：GenBank Accession No. NP_001391）を強制発現させたＣＨＯ細胞を作成し（Science (1998) vol.279, p.1552-1555）、該細胞を９６穴プレート（コーニング社製）に４×１０４個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した。翌日、培地を無血清培地に交換して３７℃、５％ＣＯ２存在下で１５分間培養し、次いで１ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む培地に交換して３７℃、５分間前処理した後、１ｍＭのＩＢＭＸ、３０μＭのフォルスコリン、１００ｎＭのｓｐｈ−１−Ｐ、及び被検化合物（ＤＭＳＯにより、所望の濃度になるよう溶解済み）またはＤＭＳＯを含む培地に交換して３７℃で１５分間刺激した。培地を除去後、１％トライトンＸ−１００溶液を添加して細胞を溶解し、ｃＡＭＰｋｉｔ（日本シェーリング社製）を用いて溶液中のｃＡＭＰ濃度を測定した。本試験系におけるＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  ＡのＩＣ５０値は８．２μＭ、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  ＢのＩＣ５０値は１．８μＭであった。
［試験例２］  Ｓｐｈ−１−ＰとＥＤＧ−１の結合阻害試験
ＥＤＧ−１とｓｐｈ−１−Ｐの結合に対する被験化合物の作用について下記のように試験した。
【００６１】
試験例1と同様に作製したＥＤＧ−１発現ＣＨＯ細胞を１２穴プレート（コーニング社）に７．４×１０５個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養した後、プレートを氷上に移し、氷冷した無血清培地に交換した。ＤＭＳＯまたは１５μｇ／ｍｌの被験化合物を加えた後、［３２Ｐ］ｓｐｈ−１−Ｐを添加して１時間氷上に静置した。細胞を氷冷したＰＢＳで３回洗浄し、１Ｎ  水酸化ナトリウム溶液で溶解し、該溶解液の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳ  ６５００、ベックマン社）で測定した。その結果、結合阻害活性は、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａが１７％、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂが３８％であった。
［試験例３］  ＨＵＶＥＣ遊走阻害試験
ＨＵＶＥＣ遊走試験に対する被験化合物の作用について、以下のように測定した。
【００６２】
９６穴ケモタキシスチャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製）の下層に１００ｎＭのｓｐｈ−１−Ｐを含む無血清培地を入れ、０．５ｍｇ／ｍｌマトリゲル溶液（ベクトンディッキンソン社）に浸して室温で１時間放置した８μｍ孔のフィルター（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製）をセットした。ＨＵＶＥＣを無血清培地に懸濁し、ＤＭＳＯまたは被検化合物を加えた後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１０分間培養して調製したＨＵＶＥＣ懸濁液（８×１０４個）を該チャンバーの上層に加え、同条件下で４時間培養した。フィルターをディフ・クイック（国際試薬社）で染色し、非遊走細胞を除去した後、スペクトラレインボーサーモ（テカンジャパン社）でＯＤ５９５を測定した。その結果、被験化合物のＨＵＶＥＣ遊走阻害活性は、７．５μｇ／ｍｌの濃度において、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａが９％、Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ｂが４５％であった。血管新生は血管内皮細胞の遊走を伴う生理現象であるため、この結果により、被験化合物が血管新生抑制活性を有することが示された。
[製剤例１]  経口用カプセル剤
以下にＡｓｃｏｔｒｉｃｉｎを有効成分として含有する経口用カプセル製剤の配合の一例を示す。
Ａｓｃｏｔｒｉｃｉｎ  Ａ            ３０ｍｇ
乳糖                              １７０ｍｇ
トウモロコシ澱粉                  １５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              ２ｍｇ
―――――――――――――――――――――――――――
全量                              ３５２ｍｇ