(57)【要約】【課題】  生体物質でなる基質を溶解している水溶液中でその基質の加水分解酵素によって上記基質を加水分解するときの、上記加水分解酵素による上記基質の加水分解の活性の測定結果を、高精度に得る。【解決手段】  生体物質でなる基質を溶解している水溶液中でその基質の加水分解酵素によって上記基質を加水分解するときの、上記加水分解酵素による上記基質の加水分解の活性を測定するにつき、上記加水分解を上記水溶液中にｐＨ感受性色素剤を溶解している状態で行い、そのとき上記水溶液中において上記ｐＨ感受性色素剤の吸光度が上記水溶液のpHの変化によって変化するのを、分光光度計によって測定し、その測定結果を以って、上記加水分解酵素による上記基質の加水分解の活性の測定結果を得るようにする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質でなる基質を溶解している水溶液中でその基質の加水分解酵素によって上記基質を加水分解するときの、上記加水分解酵素による上記基質の加水分解の活性を測定するにつき、
上記加水分解を上記水溶液中にｐＨ感受性色素剤を溶解している状態で行い、そのとき上記水溶液中において上記ｐＨ感受性色素剤の吸光度が上記水溶液のpHの変化によって変化するのを、分光光度計によって測定し、その測定結果を以って、上記加水分解酵素による上記基質の加水分解の活性の測定結果を得るようにしたことを特徴とする加水分解酵素の活性測定法。
【請求項２】
請求項1記載の加水分解酵素の活性測定法において、
上記生体物質でなる基質が、タンパク質、アミド、または有機酸エステルでなり、
上記ｐＨ感受性色素剤が、クレゾールレッド、メチルオレンジ、ブロムクロロフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、ブロムフェノールブルー、クロルフェノールレッド、フェノールレッド、またはチモールブルーでなることを特徴とする加水分解酵素の活性測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質でなる基質を溶解している水溶液中でその基質の加水分解酵素によって生体物質でなる基質を加水分解するときの、加水分解酵素による生体物質でなる基質の加水分解の活性を測定する、加水分解酵素の活性測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品を製造、加工するための研究開発などにおいて、生体物質でなる基質(以下簡単のため、単に基質と称す)を溶解している水溶液(以下簡単のため、単に基質溶解水溶液と称す)中でその基質の加水分解酵素によって基質を加水分解することが行われ、そして、この場合、基質溶解水溶液中でその基質の加水分解酵素によって基質を加水分解するときの、加水分解酵素による基質の加水分解の活性を測定する必要が生ずる場合がある。
【０００３】
そのような場合の必要によって、基質溶解水溶液中でその基質の加水分解酵素によって基質を加水分解するときの、加水分解酵素による基質の加水分解の活性を測定するにつき、従来、基質溶解水溶液中でその基質の加水分解酵素によって基質を加水分解するとき、その加水分解に伴い基質溶解水溶液中に電離物質が生成し、それによって基質溶解水溶液のpHが変化することに着目し、そのpHの変化を、pHスタットと通称されているpH測定器によって測定し、その測定結果を以って、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を得るようにする、という加水分解酵素の活性測定法が提案されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した従来の加水分解酵素の活性測定法によれば、基質溶解水溶液中でのその基質の加水分解酵素による基質の加水分解に伴い基質溶解水溶液のpHが変化するので、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を、所望とされる、基質溶解水溶液中でのその基質の加水分解酵素による基質の加水分解に伴い変化する、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を以って得ることができる。
【０００５】
しかしながら、上述した従来の加水分解酵素の活性測定の場合、基質溶解水溶液中でのその基質の加水分解酵素による基質の加水分解に伴い変化する加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を、基質溶解水溶液のpHが変化するのをそのまま直接的にpH測定器を用いて測定した測定結果を以って得るようにしており、そして、この場合、基質溶解水溶液のpHの変化を大にするのは困難であるので、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を高精度に得るのが困難である、という欠点を有していた。
よって、本発明は、上述した欠点のない新規な加水分解酵素の活性測定法を提案せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による加水分解酵素の活性測定法は、基質溶解水溶液中でその基質の加水分解酵素によって基質を加水分解するときの、加水分解酵素による基質の加水分解の活性を測定するにつき、基質溶解水溶液中でのその基質の加水分解酵素による基質の加水分解を、基質溶解水溶液中にｐＨ感受性色素剤を溶解して行い、そのとき基質溶解水溶液中においてｐＨ感受性色素剤の吸光度が基質溶解水溶液のpHの変化によって変化するのを、分光光度計によって測定し、その測定結果を以って、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を得るようにする。
【０００７】
この場合、基質を、ミルクカゼイン、フィブリノーゲン、ゼラチンなどでなるタンパク質とし得、そして、この場合の加水分解酵素従ってプロテアーゼを、ククミシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンなどとし得、また、この場合のｐＨ感受性色素剤を、クレゾールレッド、メチルオレンジ、ブロムクロロフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、ブロムフェノールブルー、クロルフェノールレッド、フェノールレッド、チモールブルーなどとし得る。
【０００８】
また、基質を、4-ニトロフェニル酢酸などでなる有機酸エステルとし得、そして、この場合の加水分解酵素従ってエステラーゼを、ククミシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンなどとし得、また、この場合のｐＨ感受性色素剤を、基質を上述したタンパク質とする場合と同様の、クレゾールレッド、メチルオレンジ、ブロムクロロフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、ブロムフェノールブルー、クロルフェノールレッド、フェノールレッド、チモールブルーなどとし得る。
【０００９】
さらに、基質を、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAなどのアミドとし得、そして、この場合の加水分解酵素従ってアミダ−ゼを、ククミシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシンなどとし得、また、この場合のｐＨ感受性色素剤を、基質を上述したタンパク質とする場合及び基質を有機酸エステルとする場合と同様の、クレゾールレッド、メチルオレンジ、ブロムクロロフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、ブロムフェノールブルー、クロルフェノールレッド、フェノールレッド、チモールブルーなどとし得る。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による加水分解酵素の活性測定法によれば、基質溶解水溶液中でのその基質の加水分解酵素による基質の加水分解に伴い基質溶解水溶液のpHが変化し、そして、そのpHの変化によって、ｐＨ感受性色素剤の吸光度が変化するので、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を、上述した従来の加水分解酵素の活性測定法の場合と同様に、所望とされる、基質溶解水溶液中でのその基質の加水分解酵素による基質の加水分解に伴い変化する、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を以って得ることができる。
【００１１】
しかしながら、本発明による加水分解酵素の活性測定法の場合、基質溶解水溶液中での加水分解酵素による基質の加水分解に伴い変化する、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を、基質溶解水溶液のpHが変化するのをそのまま直接的にpH測定器を用いて測定した測定結果を以って得るのではなく、基質溶解水溶液のpHが変化するのに伴いｐＨ感受性色素剤の吸光度が変化するのを、分光光度計で測定し、その測定結果を以って得るようにしており、そして、この場合、pH感受性色素剤の吸光度の変化を、基質を溶解している基質溶解水溶液のpHの変化の増倍されたものとして得ることができるので、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法の場合にpH測定器で得られる測定結果の増倍された測定結果として、容易に得ることができ、よって、加水分解酵素による基質の加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法の場合に比し、高精度に得ることができる。
【実施例１】
【００１２】
次に、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第１の実施例を述べよう。
本発明による加水分解酵素の活性測定法の第１の実施例においては、(1)タンパク質であるミルクカゼインを生体物質でなる基質とし、その基質としてのミルクカゼインの加水分解酵素従ってプロテアーゼをククミシンとして、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中で、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによって、基質としてのミルクカゼインを加水分解するときの、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性を測定するにつき、(2)(i)加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解を、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中に、ｐＨ感受性色素剤としてのクレゾールレッドを溶解している状態で行い、(ii)そして、そのとき、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中に、基質としてのミルクカゼインのペプチド結合が開裂して電離物質としての水素イオンが生じ、その電離物質としての水素イオンによって、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液のpHが変化し、そのpHの変化に伴い、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中のｐＨ感受性色素剤としてのクレゾールレッドの吸光度が変化することから、そのｐＨ感受性色素剤としてのクレゾールレッドの吸光度が基質溶解水溶液のpHの変化によって変化するのを、それ自体公知の分光光度計によって測定し、その測定結果を以って、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を得るようにした。
【００１３】
この場合、(a)上記(2)(i)での「加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解を、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中に、pH感受性色素剤としてのクレゾールレッドを溶解している状態で行い、」を、「基質としてのミルクカゼインを0.01%(w/v)の濃度で含み且つpH感受性色素剤としてのクレゾールレッドを３μmol/Lの濃度で含んでいる水溶液の2mLを、ガラス製のセルにとり、そのセル内に、0.05mol/Lの濃度を有する水酸化ナトリウムの水溶液を加え、それにより、セル内の水溶液のpH及び色をそれぞれ初期のpH値及び赤色とし、次で、セル内の水溶液中に、その水溶液のpH及び色に実質的に影響を与えない窒素ガスを送り込み、それにより、セル内の水溶液中から、それに溶存している、水溶液のpH及び色に影響を与える二酸化炭素をセル外に除去し、次で、セル内に、7.5μmol/Lの濃度を有する、基質としてのミルクカゼインの加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンの30μLを注入し、次で、セルに蓋をした状態にし、」ということで得、また、(b)上記(2)(ii)での「それ自体公知の分光光度計」を、「波長572nmの光を用いたそれ自体公知の分光光度計」とした。
【００１４】
以上が、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例である。
このような本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例によれば、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中での、その基質としてのミルクカゼインの加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解に伴い、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液のpHが変化し、そして、そのpHの変化によって、pH感受性色素剤としてのクレゾールレッドの吸光度が変化するので、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、上述した従来の加水分解酵素の活性測定法の場合に準じて、所望とされる、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中での、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解に伴い変化する、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を以って得ることができる。
【００１５】
しかしながら、本発明による加水分解酵素の活性測定法の場合、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中での、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解に伴い変化する、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液のpHの変化を、そのまま、直接的に、pH測定器を用いて測定した測定結果を以って得る、というのではなく、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液のpHが変化するのに伴い、pH感受性色素剤としてのクレゾールレッドの吸光度が変化するのを、分光光度計で測定し、その測定結果を以って得るようにしており、そして、この場合、pH感受性色素剤としてのクレゾールレッドの吸光度の変化を、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液のpHの変化の増倍されたものとして得ることができるので、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法によってpH測定器で得たとした場合の測定結果の増倍された測定結果として、容易に得ることができ、よって、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法によるとした場合に比し、高精度に得ることができる。
このことは、分光光度計による測定結果が、波長572nmの光の吸光度が毎秒0.0018の値で連続的に減少する測定結果で得られたことからも、検証することができた。
【実施例２】
【００１６】
次に、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第２の実施例を述べよう。
本発明による加水分解酵素の活性測定法の第２の実施例においては、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例において、段落[0012]に記載の「基質としてのミルクカゼインを0.01%(w/v)の濃度で含み」を、「基質としてのミルクカゼインを0.00247〜0.0245%(w/v)の濃度で含み」と読み替えたことを除いて、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様とし、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様の、加水分解酵素としてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を得るようにした。
【００１７】
以上が、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第2の実施例である。
このような本発明による加水分解酵素の活性測定法の第２の実施例によれば、それが、上述した事項を除いて本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様であるので、詳細説明は省略するが、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様に、同様の理由で、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法によってpH測定器で得たとした場合の測定結果の増倍された測定結果として、容易に得ることができ、よって、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法によるとした場合に比し、高精度に得ることができる。
【００１８】
このことは、分光光度計による測定結果から、加水分解酵素としてのククミシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解の速度（１分間当りの基質としてのミルクカゼイン加水分解量）を算出し、その速度の逆数をｙ軸に、基質としてのミルクカゼインの濃度の逆数をｘ軸にとったプロットにより、ラインウエーバー・バークプロットグラフを作成し、そのラインウエーバー・バークプロットグラフのｘ軸とｙ軸との交点から、加水分解酵素としてのククミシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解の速度パラメーター及び最大速度を求めたところ、それら速度パラメーター及び最大速度がそれぞれ0.0083%及び1.4(nmol/L/min)であったことからも、検証することができた。
【実施例３】
【００１９】
次に、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第３の実施例を述べよう。
本発明による加水分解酵素の活性測定法の第３の実施例においては、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例において、「ククミシン」を「トリプシン」と読み替え、段落[0012]に記載の「7.5μmol/Lの濃度を有する加水分解酵素としてのククミシン」を「4.0μmol/Lの濃度を有する加水分解酵素としてのトリプシン」と読み替えたことを除いて、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様とし、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様の、加水分解酵素としてのククミシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を得るようにした。
【００２０】
以上が、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第３の実施例である。
このような本発明による加水分解酵素の活性測定法の第３の実施例によれば、それが、上述した事項を除いて本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様であるので、詳細説明は省略するが、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合に準じて、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのトリプシンよる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、従来の加水分解酵素の活性測定法によってpH測定器で得たとした場合の測定結果の増倍された測定結果として、容易に得ることができ、よって、加水分解酵素従ってプロテアーゼとしてのトリプシンによる、基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性の測定結果を、本発明による加水分解酵素の活性測定法の第1の実施例の場合と同様に、従来の加水分解酵素の活性測定法によるとした場合に比し、高精度に得ることができる。
【００２１】
このことは、加水分解酵素としてのトリプシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解を、基質としてのミルクカゼインを溶解している基質溶解水溶液中にｐＨ感受性色素剤としてのクレゾールレッドを溶解している状態で行うに当たり、そのような状態を得てから、基質溶解水溶液中に、4μmol/Lの濃度を有する大豆トリプシンインヒビターの30μLを添加したところ、分光光度計での測定結果から、加水分解酵素としてのトリプシンによる基質としてのミルクカゼインの加水分解の活性が阻止されていることが明らかになったことからも、検証することができた。
【００２２】
なお、上述においては、本発明による加水分解酵素の活性測定法の僅かな実施例を述べたに過ぎず、上述した本発明による加水分解酵素の活性測定法の実施例において、基質を、ミルクカゼインに代え、タンパク質であるフィブリノーゲン、ゼラチンなどとすることもでき、また、上述した本発明による加水分解酵素の活性測定法の実施例において、基質を、タンパク質に代え、4-ニトロフェニル酢酸などでなる有機酸エステルとし、これに応じ加水分解酵素を、有機酸エステルの、ククミシン、プラスミン、ウロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシンなどのエステラーゼとすることもでき、さらに、上述した本発明による加水分解酵素の活性測定法の実施例において、基質を、タンパク質に代え、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNAなどのアミドとし、これに応じ加水分解酵素を、アミドの、ククミシン、プラスミン、ウロキナーゼ、トリプシン、キモトリプシンなどのアミダーゼとすることもでき、さらに、上述した本発明による加水分解酵素の活性測定法の実施例において、pH感受性色素剤を、クレゾールレッドに代え、メチルオレンジ、ブロムクロロフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、ブロムフェノールブルー、クロルフェノールレッド、フェノールレッド、チモールブルーとすることもでき、その他、本発明の精神を脱することなしに、種々の変形変更をなし得ることは明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明による加水分解酵素の活性測定法は、食品を製造、加工するための研究開発などにおいて、広く利用し得る。
【配列表】
2005312447000001.app