(57)【要約】【課題】  従来の電気泳動法のような操作を行うことなく、標的核酸を特異的、かつ、高収率に回収可能な標的核酸の回収方法を提供することを目的とし、詳細には、ビオチン−アビジン複合体の形成と、新規な方法に基づく前記複合体の解離を利用した標的核酸の特異的、かつ、高収率な回収方法を提供する。【解決手段】  標的核酸の回収方法であって、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸が捕捉された固相担体に、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬を接触させることにより、ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する標的核酸の回収方法。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の回収方法であって、
ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸が捕捉された固相担体に、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体との組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬を接触させることにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する標的核酸の回収方法。
【請求項２】
前記アルコール類は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコール、であり、前記アルコール類とグアニジン誘導体との組み合わせは、イソプロパノールとグアニジン塩酸塩との組み合わせ、イソプロパノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、メルカプトエタノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、である請求項１に記載の標的核酸の回収方法。
【請求項３】
標的核酸の回収方法であって、
試料に含まれるビオチン−アビジン複合体形成能を有する第１のメンバーで標識された標的核酸を、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２メンバーの固相担体への結合、および、前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの結合によるビオチン−アビジン複合体の形成を介して、標的核酸を固相担体に捕捉させる工程と、
前記固相担体に捕捉されなかった遊離核酸を除去する工程と、
前記固相担体にアルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬を接触させることにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する工程とを有する標的核酸の回収方法。
【請求項４】
前記アルコール類は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコール、であり、前記アルコール類とグアニジン誘導体との組み合わせは、イソプロパノールとグアニジン塩酸塩との組み合わせ、イソプロパノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、メルカプトエタノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、である請求項３に記載の標的核酸の回収方法。
【請求項５】
予め、試料中に含まれる標的核酸を、特異的にビオチン−アビジン複合体形成能を有する前記第１のメンバーで標識する工程を有する請求項３又は４に記載の標的核酸の回収方法。
【請求項６】
前記標識工程が、ビオチン−アビジン複合体形成能を有する前記第１のメンバーで標識された標的ＤＮＡ断片の少なくとも一部の配列に相補的な配列を備えるプローブ部と、直鎖状の一本鎖がヘアピン状に折り返される自己相補的な配列を備えるステム・ループ部を有するヘアピン型プローブと、標的核酸との連結により行われる請求項５に記載の標的核酸の回収方法。
【請求項７】
標的核酸をクローニングする方法であって、
請求項１〜６に記載の標的核酸の回収方法によって回収された標的核酸をベクターに組み込む工程と、
前記標的核酸を組み込んだベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、
前記形質転換細胞をスクリーニングする工程とを有する標的核酸をクローニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とする核酸を回収する方法に関し、更に詳細には、アビジン−ビオチン複合体からなる特異的結合対の形成を介して固相担体上に特異的に捕捉された核酸を、該複合体を新規な方法に基づき解離させることにより回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来において、種々の核酸が混在する試料からの目的とする核酸（以下、「標的核酸」とも称する。）、主に、標的ＤＮＡ断片の回収には電気泳動法が用いられてきた。電気泳動法は、ＤＮＡ分子が中性あるいはアルカリ性条件で負に荷電して陽極方向に移動することを利用し、ＤＮＡ分子をゲル中で通過させて、塩基の構成成分に極端な差がない限りＤＮＡ分子の分子量によって夫々のＤＮＡ分子の移動度に差が生じるとの原理を利用するものである。電気泳動によりＤＮＡ断片を分子量によって分画後、蛍光検出のために臭化エチジウムやサイバーグリーンのようなインターカレーターでＤＮＡを染色して紫外線を照射し、標的ＤＮＡ断片を含むゲルブロックを切り出し、ヨウ化ナトリウムによる溶解、ゲル凍結融解等によりゲル組織を破壊し、遠心力による機械的手段を用いてゲルブロックからＤＮＡ断片を抽出することにより標的ＤＮＡ断片を回収する方法が広く行われ、ゲルからのＤＮＡの回収用キットが市販されている（例えば、非特許文献１、２を参照のこと。）。
【０００３】
しかしながら、電気泳動法では、その分子量に基づいて分離するため、標的ＤＮＡ断片と分子量が近似、もしくは、同一のＤＮＡ断片が混在している場合は、標的ＤＮＡ断片を特異的に分離することはできない。また、操作の過程で変異原性を有する臭化エチジウムやサイバーグリーンのようなインターカレーターを使用したり、紫外線照射を必要とするなど、従事者の健康に対して好ましくなく、また、紫外線照射がＤＮＡに損傷を与える恐れがあるという問題点があった。さらに、安定して標的ＤＮＡ断片の分取を行うためには通常２００ｎｇ程度のＤＮＡが必要であり、微小量のＤＮＡ断片を安定して回収することはできなかった。
【０００４】
近年、ビオチン−アビジンを利用した標的ＤＮＡ断片の回収方法として、古典的な分子量依存の電気泳動法による単離を用いないＤＮＡ断片の回収方法が報告されている（例えば、非特許文献３を参照のこと。）。これは、ＤＮＡ断片の末端をビオチン等のハプテンによって標識したハプテン標識ＤＮＡ断片を特異的エンドヌクレアーゼで消化を行った後、アビジン等の標識ハプテンに特異的に結合するタンパク質とインキュベーションを行う。インキュベーション後、核酸に対しては結合能を有しないタンパク質結合メンブランを通過させるものであり、これにより、非消化および一部消化のＤＮＡ断片はメンブラン上に留まる一方で、正確に消化されたＤＮＡ断片のみが選択的に分取されるというものである。しかしながら、エンドヌクレアーゼ消化の差異を利用するものであり、その利用範囲は限られている。また、かかる方法は、ビオチン−アビジンの特異的結合を利用するものであるが、かかる結合は非常に強固であり解離は不可能であるとの前提に立つものである。
【０００５】
ここで、ビオチンとアビジンの結合は、アビジン１分子当り４分子のビオチンが結合する解離定数Ｋｄ＝10-1５Ｍの親和力を示す、生物学的に最も強固で安定な結合の一つとして知られている。この親和力は通常の抗原抗体反応の１００万倍以上も強く, 実質上不可逆的な結合であることから、ビオチン−アビジン間の相互作用は核酸の単離に広範な利用価値を有するものである。しかしながら、核酸の回収においてビオチン−アビジン結合の解離を利用する際に、回収対象となる核酸を破壊してしまう様な過酷な条件を要する等、その解離に関して報告されている例は僅少であり、ビオチン−アビジン間の結合を解離する技術は現在においても開発途上の段階にある。したがって、ビオチン−アビジン間の強固かつ特異的な結合と、その解離を利用することによる標的核酸を高効率で回収可能な核酸回収方法の更なる発展が期待されている。
【０００６】
また、近年、ヘアピン型構造の核酸プローブ分子および、それを利用した核酸検出法、ならびに核酸分子の単離方法が報告されている（例えば、特許文献１、２、非特許文献４等を参照のこと。）。これらの技術は、ヘアピン型構造の核酸プローブ分子と標的核酸間で安定したハイブリッドが形成され、標的核酸を変性や突然変異を伴うことなく単離できることから、有用な技術である。しかしながら、ビオチン−アビジンを用いた応用例が開示されているが、ビオチン−アビジンの結合の解離という観点に関しては何ら開示はなく、これらの技術の更なる発展のためにもビオチン−アビジンの結合の解離方法の確立が期待されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１４６１９０号公報
【特許文献２】特開平１１−２０６３８１号公報
【非特許文献１】BIO CATALOG（タカラバイオ総合カタログ２００４、Ｃ−８７頁、Code 9040:SUPREC−01（商品名））
【非特許文献２】BIO CATALOG（タカラバイオ総合カタログ２００４、Ｃ−８８頁、Code 9410:EASYTRAP Ver.2（商品名））
【非特許文献３】Oistein Ihle, Terje E. Michaelsen、「Efficient purification of DNA fragments using a protein binding membrane.（タンパク結合メンブランを使用するＤＮＡフラグメントの効率的な精製。）」、Nucleic Acids Research、英国、２０００年８月、第２８巻、第１６号、ｅ７６
【非特許文献４】Jun Fujiwara, Michio Oishi、「Direct cloning by covalent attachment of probe DNA to target DNA. （標的ＤＮＡに対するプローブＤＮＡの共有結合性吸着による直接クローニング」、Nucleic Acids Research、英国、１９９８年１２月、第２６巻、第２４号、ｐ５７３４−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題点を有する、従来の電気泳動法のような操作を行うことなく、標的核酸を特異的、かつ、高収率に回収可能な標的核酸の回収方法を提供することを目的とし、詳細には、ビオチン−アビジン複合体の形成と、新規な方法に基づく前記複合体の解離を利用した標的核酸の特異的、かつ、高収率な回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩の作用によりビオチン−アビジン複合体を解離できるとの知見を得、かかる知見を標的核酸の回収に利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するため、本発明は、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸が捕捉された固相担体に、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬を接触させることにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する標的核酸の回収方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、前記アルコール類は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコール、であり、前記アルコール類とグアニジン誘導体との組み合わせは、イソプロパノールとグアニジン塩酸塩との組み合わせ、イソプロパノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、メルカプトエタノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、である。
【００１２】
また、上記目的を達成するため、本発明は、試料に含まれる、ビオチン−アビジン複合体形成能を有する第１のメンバーで標識された標的核酸を、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２メンバーの固相担体への結合、および、前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの結合によるビオチン−アビジン複合体の形成を介して、標的核酸を固相担体に捕捉させる工程と、
前記固相担体に捕捉されなかった遊離核酸を除去する工程と、
前記固相担体にアルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬を接触させることにより、前記ビオチン−アビジン複合体を解離させて標的核酸を回収する工程とを有する標的核酸の回収方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、前記アルコール類は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコール、であり、前記アルコール類とグアニジン誘導体との組み合わせは、イソプロパノールとグアニジン塩酸塩との組み合わせ、イソプロパノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、メルカプトエタノールとグアニジンイソチオシアン酸塩との組み合わせ、である。
【００１４】
そして、好ましくは、予め、試料中に含まれる標的核酸を、特異的にビオチン−アビジン複合体形成能を有する前記第１のメンバーで標識する工程を有し、更に好ましくは、前記標識工程が、ビオチン−アビジン複合体形成能を有する前記第１のメンバーで標識された標的ＤＮＡ断片の少なくとも一部の配列に相補的な配列を備えるプローブ部と、直鎖状の一本鎖がヘアピン状に折り返される自己相補的な配列を備えるステム・ループ部を有するヘアピン型プローブと、標的核酸との連結により行われる。
【００１５】
また、上記目的を達成するため、本発明は、上記本発明の標的核酸の回収方法によって回収された標的核酸をベクターに組み込む工程と、
前記標的核酸を組み込んだベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を得る工程と、
前記形質転換細胞をスクリーニングする工程と、を有する標的核酸をクローニングする方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。
【００１７】
本発明は、ビオチン−アビジン複合体の形成と、該ビオチン−アビジン複合体の解離を利用することにより標的核酸の回収を行うものであり、ビオチン−アビジン複合体の解離を、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬の存在下で行うことを特徴とするものである。したがって、本発明によれば、上記問題点を有する、従来の電気泳動法のような操作を必要とせずに、標的核酸を特異的かつ高収率に回収することができる。
【００１８】
ここで、本明細書において「標的核酸」とは、回収対象である核酸を意味し、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ等のＤＮＡ、並びにｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及び合成ＲＮＡ等のＲＮＡ、ペプチド核酸等であり、特に好ましくは、ＤＮＡ断片である。その起源および、長さ、塩基配列に対する制限なく、一本鎖、二本鎖、また、環状、直鎖状を問わず、いかなる核酸であってもよい。また、その構成成分はアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルからなる単純ヌクレオチドのみならず、イノシン、メチルアデノシン等の修飾ヌクレオチドをも含み得る。
【００１９】
標的核酸の具体例としては、当該技術分野で常用されているＤＮＡ自動合成機等を使用して合成されたＤＮＡ断片、ｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡ断片、ＰＣＲ等の増幅技術により増幅されたＤＮＡ断片等の人工的産物、ならびに原核生物および真核生物のあらゆる生物種に由来するＤＮＡ断片等を例示でき、いずれも標的核酸となり得る。
【００２０】
本明細書における「ビオチン−アビジン複合体」について説明する。ビオチン−アビジン複合体とは、ビオチン−アビジン間の特異的な分子間相互作用により形成された特異的結合対を指し、解離定数（１０−１５Ｍ）に近似する解離定数を有する安定した複合体を意味する概念として使用されるものである。したがって、ビオチンとは、ビオチンのみならず、アビジンと上記のような安定した複合体を形成する点でビオチンと実質的に同様の動態を示すビオチン誘導体、ビオチン類縁体等を含む概念として使用され、具体的には、ビオシチン、ビスノルビオチン、デスチオビオチン、オキシビオチン等をも好適に利用できる。一方、「アビジン」とは、ビオチンと上記のような安定した複合体を形成する点でアビジンと同様の動態を示すものであれば、特に制限はなく、卵白から単離したもの、Streptomyces avidiniから単離したストレプトアビジンをも含み、更に、アビジン、ストレプトアビジンの修飾体もしくは断片をも好適に利用できる。また、天然由来、組換え体の別を問わない。
【００２１】
以下、本発明の方法を詳細に説明する。
本発明の第一の実施形態において、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸が捕捉された固相担体に、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬を接触させることより、標的核酸を回収する方法を提供する。つまり、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して固相担体上に非標的分子を排除して特異的に捕捉された標的核酸を、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬の作用によりビオチン−アビジン複合体を解離することにより特異的に回収するものである。
【００２２】
回収の対象となるのは、固相担体上にビオチン−アビジン複合体の形成を介して捕捉された核酸である。ここで、固相担体とは、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸を捕捉するために使用される不溶性担体である。標的核酸は、ビオチン−アビジン複合体を形成可能な第１のメンバーによって標識され、前記第１のメンバーが、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバーと相互作用してビオチン−アビジン複合体を形成すると共に、前記第２のメンバーが固相担体に固定化されることにより、標的核酸が固相担体に捕捉されている。ここで、「ビオチン−アビジン複合体を形成可能な第１のメンバー」とは、ビオチンもしくはアビジンであり、「前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバー」とは、前記第１のメンバーがビオチンであれば、第２のメンバーはアビジンであり、前記第１のメンバーがアビジンであれば、第２のメンバーはビオチンである。本発明の適用に際しては特に前者が好ましい。したがって、好ましくは、“固相担体−アビジン−ビオチン−標的核酸”の形態で標的核酸が固相担体に捕捉される。
【００２３】
したがって、本発明で使用される固相担体としては、アビジン−ビオチン間の相互作用に悪影響を及ぼさないものであれば、その形状、大きさ、材質は特に制限はない。例えば、粒子状、板状あるいは繊維状等いずれでもよく、メンブラン、マイクロタイタープレート、試験管、又はスティック等の形状の不溶性担体を使用できる。また、材質は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ガラス、金属、ラッテクス、ニトロセルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、及びアガロースであることができる。例えば、標的核酸がビオチンで標識される場合には、ミリポア社から提供されるマイクロピュア−ＥＺ等のタンパク吸着フィルター、ダイナル社から入手されるDynabeads Straptavidin M-280等が好適な固相担体として使用できる。
【００２４】
固相担体上に特異的に捕捉された標的核酸を、ビオチン−アビジン複合体の解離により回収する。つまり、ビオチン−アビジン複合体が解離することにより、固相担体上に捕捉されていた標的核酸が固相担体から離れて遊離し、これにより標的核酸が回収される。このとき、標的核酸は標識核酸として遊離される。ここで、ビオチン−アビジン複合体の解離とは、該複合体を構成する分子間結合を弱めて単一の各メンバー、つまり、アビジンとビオチンに分離することを意味するものである。
【００２５】
本発明において、ビオチン−アビジン複合体の解離は、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩の作用により達成される。固相担体へのアルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩の接触は、ビオチン−アビジン間の特異的な親和性結合の解離が十分な程度進行するため、十分な物理化学的条件下で、十分な時間インキュベーションが行われるものとする。
【００２６】
本発明において、好適に使用可能なアルコール類とは、ビオチン−アビジン結合を解離可能な、炭化水素の水素原子を水酸基で置換した化合物であり、特には、鎖式の炭化水素の水素原子を水酸基で置換した脂肪族アルコール類であり、好ましくは、炭素数が３以上である。また、直鎖状、分枝状を問わず、いずれをも使用し得る。なお、本発明におけるアルコール類には、フェノール類を含むものではない。具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、１−へプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、３−オクタノール等から選択される化合物が例示され、これらを２種以上組み合わせてもよく、特に好ましくはイソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコールである。
【００２７】
本発明においてアルコール類との組み合わせより使用可能なグアニジン誘導体とは、グアニジン酸又はその塩類を含み得、具体的には、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩等が例示され、これらの２種以上の組み合わせでもよい。また、アルコール類とグアニジン誘導体を組み合わせる場合、アルコール類を２５〜５０重量％含有するべく構成されることが好ましく、好ましくは５０重量％含有する。具体的な本発明の使用に好適なアルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせとしては、イソプロパノールとグアニジン塩酸塩、メルカプトエタノールとグアニジンイソチオシアン酸塩、イソプロパノールとグアニジンイソチオシアン酸塩、メルカプトエタノールとグアニジン塩酸塩等が例示され、イソプロパノールとグアニジン塩酸塩との組み合わせが好ましく、特には、これらの等量混合物が好ましく使用できる。アルコール類とグアニジン誘導体の固相担体への接触方法は、この２つの成分が同時に作用を発揮しえる方法であれば、これらの混合溶液として接触させる方法、又は、いずれかを先に添加してその後に他方を添加することにより接触させる方法等、のいずれをも採用することができる。また、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせに際して、アルコール類の炭素数が４以上となると水相と混和しにくくなるため、グアニジン誘導体の水溶液との混合ができなくなる。しかしながら、その場合においても、グアニジン誘導体をメタノール、エタノール等に溶解させておくことにより、炭素数４以上のアルコール類との混合が可能となり、本発明の方法に良好に実施可能である。
【００２８】
また、本発明においては、グアニジンイソチオシアン酸塩単独、又は、グアニジン塩酸塩単独でも、上記効果を発揮することができる。
【００２９】
本発明の第二の実施形態は、本発明の第一の実施形態で示した方法を利用した、試料中に含まれる標的核酸を特異的に回収する方法を提供する。
【００３０】
以下、図１、図２を参照して詳細に説明する。具体的には、以下の工程を有する。
１．試料中に存在する標的核酸を、ビオチン−アビジン複合体の形成により特異的に固相担体に捕捉させる工程（以下、「標的核酸の捕捉工程」と略する。）
２．固相担体に捕捉されなかった遊離核酸を除去する工程（以下、「非標的核酸の除去工程」と称する。）
３．ビオチン−アビジン複合体を解離させることにより、標的核酸を固相担体から遊離させて回収する工程（以下、「解離工程」と称する。）
【００３１】
ここで、試料とは、標的核酸を含み得る試料であれば特に制限はなく、例えば、全血、血漿、血清、尿、唾液、糞便、細胞培養物、培養上清等の、核酸を含み得る生物体由来の生物試料、また、必要に応じて生物試料に適当な処理を行った試料をも含み得る。例えば、生体試料に適当な細胞溶解液を添加して核酸を抽出した試料、制限酵素等で酵素処理した試料等が含まれる。また、生体試料から抽出された核酸をＰＣＲ等の増幅技術を用いて取得された増幅産物等も好ましく例示される。
【００３２】
１.標的核酸の捕捉工程
標的核酸の捕捉工程においては、ビオチン−アビジン複合体の形成を介して標的核酸を固相担体上に捕捉する。標的核酸の捕捉は、ビオチン−アビジン複合体形成能を有する第１のメンバーで標識された標的核酸を、前記第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバーの固相担体への固定化、および、前記第１のメンバーと前記２のメンバーの相互作用によるビオチン−アビジン複合体の形成を介して、固相担体上に捕捉される。例えば、標的核酸がビオチンにより標識化され、該標的核酸を標識するビオチンがアビジンと複合体を形成し、アビジンが固相担体に固定化されることにより達成され、その逆も可能である。このとき、該第１のメンバーとの間でビオチン−アビジン複合体形成能を有する第２のメンバーの固相担体への固定化、および、前記第１のメンバーと第２のメンバーの相互作用によるビオチン−アビジン複合体の形成は、いずれが先に行われても、また同時でもよい。
【００３３】
つまり、標的核酸を固相担体に捕捉させるための具体的な方法としては、アビジンで予め被覆処理した固相担体にビオチン標識された標的核酸を接触させる方法、ビオチン標識された標的核酸をアビジンと反応させた後アビジンを固相担体に吸着させる方法等、種々の形態を例示でき、いずれをも使用することができる。この結果、標的核酸は固相担体上に選択的かつ特異的に捕捉される。一方で、標的核酸以外の非標的核酸は固相担体上に捕捉されず試料中に遊離状態で残存する。標的核酸の固相担体への捕捉に際しては、ビオチン−アビジン間の特異的な親和性結合の達成が必要な程度進行するため、十分な物理化学的条件下で、十分な時間インキュベーションが行われるものとする。また、アビジン、もしくは、ビオチンの固相担体への固定化は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法を採用することができる。
【００３４】
本発明の方法においては、標的核酸はビオチン−アビジン複合体からなる特異的結合対を構成する第１のメンバーで標識されており、つまり、ビオチンもしくはアビジンで標識され、好ましくは、ビオチンで標識される。標的核酸が試料中に標識化状態で存在する場合を除いては、試料中に含まれる標的核酸のみを特異的に標識する条件下、つまり、回収対象の核酸以外の非標的核酸の標識化が生じず、標的核酸のみが標識化される条件下で、標的核酸の標識化を行うことが必要となる。好ましくは、配列特異的に標識化することにより標的核酸の特異的な標識化を行うことができる。例えば、試料をビオチンで標識された標的核酸を特異的に認識できるプローブと接触させることにより達成できる。
【００３５】
プローブは、既知の方法によって調製され、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプローブを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プローブは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。
【００３６】
プローブのビオチン標識化は既知の方法に基づいて行うことが可能である。例えば、予めビオチンが導入されているプローブを取得するためには、ＤＮＡ合成の際に、アマシャム社から市販されているBiotin phosphoramidite等のビオチンホスホアミダイドを用いて５´末端にビオチンを導入する方法、ビオチン化試薬、例えば、ライフ  テクノロジー社から市販されているphotobiotin Labeling System等によりビオチン標識を行う方法等が使用可能である。
【００３７】
標的核酸の標識化に用いられるプローブは、回収対象となる標的核酸の所定の領域、好ましくは、標的核酸の末端領域、の配列に相補的になるように選択された配列を有するものであり、標的核酸を配列選択的に捕捉するように構成される。ここで、相補的とは、プローブと標的核酸が塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味し、完全な相補性のみならず、プローブと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。具体的には、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ断片等からなるものが例示され、一本鎖、二本鎖核酸であり得るが、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドである。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、少なくとも１６塩基、更に好ましくは２０〜５０塩基である。
【００３８】
本発明において使用に好適なプローブとして、ヘアピン型プローブが例示される。
ヘアピン型プローブは、好ましくは、その５´末端が標識され、標的ＤＮＡ断片の両末端、もしくは５´もしくは３´末端のいずれかに標識を導入する事ができるように構成される。
【００３９】
以下、ヘアピン型プローブの好ましい一態様を図３を参照して詳細に説明する。図３は、本発明で使用可能なヘアピン型プローブの一例を示す。ヘアピン型プローブは、標的ＤＮＡ断片の少なくとも一部の配列、好ましくは標的ＤＮＡ断片の末端領域の配列に相補的な配列を備えるプローブ部と、直鎖状の一本鎖がヘアピン状に折り返される自己相補的な配列を備えるステム・ループ部を有する。プローブ部は、上記したプローブの調製に準じて設計される。
【００４０】
ステム・ループ部は、直鎖状の一本鎖がヘアピン状に折り返して一部を二本鎖化することにより該プローブを安定化すると共に、例えば、標的ＤＮＡ断片の５´末端側の配列と、該プローブの５´末端側に位置するプローブ部とが、例えばｒｅｃＡのような相同組換えタンパク質の働きにより組み換え中間体を形成した時に、標的ＤＮＡ断片のプローブ部とハイブリダイズを形成する方の鎖の５´末端に、プローブの３´末端を近接させること可能とする。ステム・ループ部の長さは、ヘアピン型プローブの該プローブ部と標的ＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーション形成条件下において、自己相補的配列間でのハイブリダイゼーションの形成を保証する長さであることが必要であり、好ましくは、ステム部は１２〜３０塩基、ループ部は１から１０塩基であり、ステム・ループ部全体では１３〜４０塩基である。
【００４１】
更に、ヘアピン型プローブは、好ましくは、何らかのＤＮＡポリメラーゼにより二重鎖化した時に、プローブ部とステム・ループ部の境界に制限酵素認識部位が形成されるように設計される。このように構成し、適当な制限酵素を用いて切断することにより、固相担体から回収された標的核酸からヘアピン型プローブを完全に除去することが可能となり、また、適当なベクターに組み込み形質転換を行うに当たって適切な目的核酸断片の調製を可能とする。また、ヘアピン型プローブのステム部に制限酵素認識部位が形成されるように設計され得、適切な制限酵素で切断することにより、標的ＤＮＡ断片の末端部位に結合させたヘアピン型プローブをアダプターとして利用することが可能となる。制限酵素としては、PstI、HindIII、NotI等の公知のいずれをも使用でき、目的に応じて適宜選択される。
【００４２】
２．非標的核酸の除去工程
非標的核酸の除去工程においては、固相担体に捕捉されずに遊離状態で存在する非標的核酸が固相担体上から除去される。固相担体に捕捉されずに遊離状態で存在する非標的核酸を除去することにより、試料中からの標的核酸の選択的かつ特異的な分離が達成される。非標的核酸を除去する方法としては、ビオチン−アビジン相互間の特異的結合に影響を与えない限り制限はなく、例えば、標的核酸を捕捉した固相担体の洗浄、ろ過、遠心分離、ふるい、等の公知の手段よって達成される。また、固相担体として、常磁性担体、もしくは磁性担体を使用する場合には、磁石等の磁気的分離方法も好適に利用できる。
【００４３】
３．解離工程
解離工程においては、ビオチン−アビジン複合体の解離により固相担体上に特異的に捕捉された標的核酸が回収される。つまり、ビオチン−アビジン複合体が解離することにより、固相担体上に捕捉されていた標的核酸が固相担体から遊離し、これにより標的核酸が試料中から特異的かつ選択的に回収される。このとき、標的核酸は標識核酸として遊離される。ここで、ビオチン−アビジン複合体の解離とは、該複合体を構成する分子間結合を弱めて単一の各メンバー、つまり、アビジンとビオチンに分離することを意味するものである。
【００４４】
本発明において、アルコール類、アルコール類とグアニジン誘導体の組み合わせ、グアニジンイソチオシアン酸塩、および、グアニジン塩酸塩から選択される少なくとも１の試薬の存在下で達成される。ここで、使用可能な試薬の詳細に関しては、本発明の第一の実施形態と同様である。
【００４５】
以上のように構成することにより、電気泳動法の様な操作を講じずに、核酸の混合物等の試料中から所望の核酸の回収を行うことが可能となる。本発明は、非常に強固な特異的結合対を形成するビオチン−アビジンの相互作用を利用するものであることから、試料中に含まれる標的核酸の濃度が低い場合であって、良好に所望の標的核酸を選択的かつ特異的に回収できる。
【００４６】
更に、本発明の第三の実施形態は、本発明の第一、第二の実施形態に示す方法により回収された核酸を適当なベクターに組み込み、適当な宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞をスクリーニングすることにより、標的核酸をクローニングする方法が提供される。
【００４７】
適当な宿主−ベクター宿主系は公知であり、本発明により回収された核酸を組み込むベクターの種類は特に限定されず、その後の操作の目的に応じて適当なベクターを選択できる。また、組換えベクターにより形質転換された宿主細胞の選択のため、ベクターは、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子等の選択マーカーをコードする配列を含み得る。一般的にはプラスミドベクター 、ファージベクター などが使用でき、これらは多くの業者から市販されている。
【００４８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC13等）、枯草菌由来のプラスミド（pUB110等）、酵母由来プラスミド（yEp13、yCp500等）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
ベクターへの核酸の組み込みは、例えば、本発明により回収された標的核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素認識部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行われる。上記した様な、プローブ部とステム・ループ部の境界に適切な制限酵素認識部位を有するヘアピン型プローブは、所望の制限酵素部位を有する標識核酸の簡便かつ確実な調製をも可能とすることから、本発明の方法に好適に使用可能である。
【００５０】
宿主としては任意の好適な生物体を選択でき、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の宿主としては、Escherichia coli K12等の大腸菌、枯草菌、放線菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられる。真核生物の宿主細胞としては、昆虫または昆虫細胞、動物細胞（マウス細胞、ハムスター細胞、サル細胞、ヒト細胞等）、酵母等の細胞が含まれる。例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ細胞、Saccharomyces cervisiae等のサッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
宿主細胞に組換えベクターを導入する方法は当業者に公知の方法を使用することができ具体的には、高い形質転換効率を有するコンピテント細胞を用いる方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション法等を適宜使用できる。形質転換体の選択は、組換えベクターに関係する選択マーカー、例えば、薬剤耐性活性を有する細胞を選択する等、公知の方法に従って行うことができる。
【実施例】
【００５２】
以下に、具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の趣旨を逸脱しない限り、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１：タンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後にグアニジン塩酸塩−イソプロパノール処理で標的ＤＮＡ断片を回収
グアニジン塩酸塩−イソプロパノールの作用によりビオチン−アビジン複合体を解離できることを示すと共に、これを利用するビオチン−アビジン複合体の形成と解離とに基づいて標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることを確認するため、以下に掲げる実験を行った。
【００５４】
<実験材料>
実施例１において、回収対象となる標的核酸としてHindIII切断したλＤＮＡのうちの２．３ｋｂの断片を標的ＤＮＡ断片（λ／HindIII断片）を用いた。
【００５５】
プローブとしては、標的ＤＮＡ断片と相補的な配列からなるプローブ部と、直鎖状の一本鎖がヘアピン状に折り返されるステムループ部を有する、ヘアピン型ＤＮＡプローブを用いた。該プローブは５´末端がビオチンにより標識されている。具体的には、本実施例において「L-Bhind23-5」と称するＤＮＡプローブ（配列認識番号１）、および、本実施例において「L-Bhind23-3」と称するＤＮＡプローブ（配列認識番号２）を用いた。L-Bhind23-5は、標的ＤＮＡ断片の５´末端のリーディング鎖の配列と相補的な配列を有するプローブ部を備え、L-Bhind23-3は、標的ＤＮＡ断片の３´末端のラギング鎖の配列と相補的な配列を有するプローブ部を備える。構造を図３に示す。
【００５６】
前記２種類のヘアピン型プローブは、当業者に周知の化学合成法により作成し、当業者に周知の方法により５´末端に標識物質としてビオチンを付加することにより作成し、ＨＰＬＣ精製により精製を行なったものを使用した。
【００５７】
<実験方法>
（１）ＲｅｃＡ−プローブ複合体の形成
相同組換え酵素として、市販のＲｅｃＡタンパク質を使用して、ＲｅｃＡ−プローブ複合体を形成するために反応液Ａを以下のように調製した。
反応液Ａ：
１０ｘ緩衝液Ａ                                            １μｌ
５０ｍＭ  ＡＴＰγＳ（ロシュ社製）                        １μｌ
L-Bhind23-5（１０ｎｇ／μｌ）                         ０．５μｌ
L-Bhind23-3（１０ｎｇ／μｌ）                         ０．５μｌ
ＲｅｃＡ（２．５８μｇ／μｌ、Promega社製）         ０．３９μｌ
蒸留水                                              ６．６１μｌ
計                                                    １０μｌ
【００５８】
ここで、１０ｘ緩衝液Ａの組成は以下の通りである。
１０ｘ緩衝液Ａ：
３００ｍＭ  トリス・酢酸（ｐＨ７．２）／２５ｍＭ  酢酸マグネシウム
上記反応液Ａを３７℃にて１５分間反応させてＲｅｃＡ−プローブ複合体を形成した。
【００５９】
（２）鎖交換反応
鎖交換反応を行なうために反応液Ｂを以下のように調製した。
反応液Ｂ：
１０ｘ緩衝液Ｂ                                            １．５μｌ
５０ｍＭ  ＡＴＰγＳ（ロッシュ社製）                      １．５μｌ
２００ｎｇ／μｌ標的ＤＮＡ                                １．５μｌ
ＥｘｏＩ（２０unit/μｌ、エピセンターテクノロジー社製）   １．５μｌ
蒸留水                                                        ９μｌ
計                                                        １５μｌ
【００６０】
ここで、１０ｘ緩衝液Ｂの組成は以下の通りである。
１０ｘ緩衝液Ｂ：
３００ｍＭ  トリス・酢酸（ｐＨ７．２）／２２５ｍＭ  酢酸マグネシウム
【００６１】
上記反応液Ｂを３７℃にて数分間インキュベーションした後、１０μｌの該反応液Ｂを
上記（１）の工程後の反応液Ａに添加し、混合し、３７℃にて３０分間反応させることにより鎖交換反応を行った。
【００６２】
（３）プローブの標的ＤＮＡへのライゲーション
標的ＤＮＡの末端に鎖交換したプローブを、標的ＤＮＡ末端に連結させるライゲーション反応を行うためにライゲーション反応液を以下のように調製した。
【００６３】
２ｘライゲーション反応液：
１０ｘリアクションバッファー（エピセンターテクノロジー社製）  １０μｌ
Ampligase ＤＮＡ ligase（１００unit/μｌ、エピセンターテクノロジー社製）                                                                  ０．２５μｌ
蒸留水                                                  ３９．７５μｌ
計                                                          ５０μｌ
【００６４】
上記ライゲーション反応液を３７℃にて数分間インキュベーションした後、上記（２）において鎖交換反応を行ったサンプルにライゲーション反応液を２０μl添加し、混合し、６５℃にて１５分間ライゲーション反応を行なった。その後、ＰＢ  Buffer（キアゲン社製）を１０μｌずつ添加して酵素を失活させることにより、反応を停止した。
【００６５】
（４）未反応の遊離プローブの除去と脱塩
上記（３）のライゲーション反応後のサンプルを、Sephacryl  Ｓ−４００スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に適用し、３，０００rpmにて２分間の遠心分離よってゲルろ過を行い、未反応の遊離プローブの除去および脱塩を行った。続いて、エタノール沈殿を行い、７０％エタノールによるＤＮＡペレットのリンス後、ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液５０μｌに溶解した。
【００６６】
ここで、ＴＥ緩衝液の組成は以下の通りである。
ＴＥ緩衝液：
１０ｍＭ  トリス・塩酸（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）
【００６７】
（５）ビオチン−ストレプトアビジン複合体の形成
上記（４）の精製後のサンプルに、ストレプトアビジン溶液（Promega社製）を１０μｌ添加し、混合した後、室温にて１０分間静置し、標識ビオチンをストレプトアビジンと複合体を形成させた。ストレプトアビジン溶液は、ストレプトアビジンを１ｍｇ／μｌの濃度になるように１０ｍＭ  トリス・塩酸（ｐＨ８．０）/１ｍＭ  ＥＤＴＡ/５０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解したものを使用した。
【００６８】
（６）固相への標的ＤＮＡ断片の捕捉
ストレプトアビジンのタンパク吸着性フィルターへの吸着を利用して、標的ＤＮＡ断片を固相に捕捉し、標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去を行なった。
固相として、マイクロピュア（登録商標）−ＥＺ（ミリポア社製）フィルターを使用した。マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに上記（５）で得られたサンプルを入れ、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行って、フィルターにストレプトアビジンを介して標的ＤＮＡを捕捉させた。続いて、１００μｌのＴＥ緩衝液をフィルターカップに入れ、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行ってフィルターを洗浄し、フィルターカップ内およびフィルターに付着している、標的ＤＮＡ断片とは無関係な非標的ＤＮＡを除去した。このステップを５回繰り返して洗浄した。
【００６９】
また、マイクロピュア−ＥＺを素通りしたサンプル液と一次洗浄液はフィルターに結合しなかったＤＮＡサンプルとして回収し、常法に従いエタノール沈殿を行った後、ＴＥ緩衝液に溶解させ、後の電気泳動工程において泳動サンプルとしてゲルにアプライした。
【００７０】
（７）標的ＤＮＡ断片の回収
マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに５０μｌのＰＢ  Buffer（キアゲン社製）とＴＥ緩衝液の等量混合液を添加して１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。この操作を２回行い、該フィルターに捕捉されている標的ＤＮＡ断片を回収した。
【００７１】
ここで、ＰＢ  Bufferの組成は、製造業者のＭＳＤＳによると、以下の通りである。
ＰＢ  Buffer：
グアニジン塩酸塩    ２５−５０％
イソプロパノール    ２５−５０％
【００７２】
（８）電気泳動サンプルの調製
後述する電気泳動にて標的ＤＮＡ断片の回収を確認するため、工程（８）で得られた標的ＤＮＡ断片を定法にしたがってエタノール沈殿を行い、ＴＥ緩衝液１２μｌに標的ＤＮＡ断片を溶解してＢＰＢ色素液３μlと混合した。
【００７３】
ここで、ＢＰＢ色素液の組成は以下の通りである。
ＢＰＢ色素液：
０．２５％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）／４０％シュークロース
【００７４】
（９）電気泳動
０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（サイバーグリーンＩ）でバンドを可視化した後、分離パターンを写真に撮影し、標的ＤＮＡ断片の回収を確認した。
【００７５】
また、コントロールとしてビオチンにより標識されていない未標識プローブを使用して、上記λ／HindIII断片について同様に実験を行った。
【００７６】
<結果>
結果を図４に示す。レーン３およびレーン４はビオチンによって標識されたλ／HindIIIの結果を示すものであり、レーン３は素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、レーン４はフィルターからの溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）の電気泳動パターンを示す。レーン１およびレーン２はビオチンによって標識されなかったλ／HindIII断片の結果を示し、レーン１は素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、レーン２はフィルターからの溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）の電気泳動パターンを示す。また、レーンＭはサイズマーカーである。
【００７７】
図４の電気泳動染色像より、レーン４は標的ＤＮＡ断片の単一バンドのみが確認されたのに対して、レーン１およびレーン３は多数のバンドが確認された。以上の結果より、ビオチンアビジン複合体形成を介してタンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後にグアニジン塩酸塩とイソプロパノールとで処理を行うことにより、非標的分子を除外して標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることが判明した。また、標的ＤＮＡ断片の量は９．６ｎｇと推定され、このように少量のＤＮＡでも効率よく回収できることが判明した。
【００７８】
実施例２：回収した標的ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込み大腸菌を形質転換
標的ＤＮＡ断片の回収ためグアニジン塩酸塩とイソプロパノールの組み合わせを、固相としてタンパク吸着フィルターを用いた本発明の方法によって回収された標的ＤＮＡ断片を、ベクターＤＮＡに組み込み大腸菌を形質転換することによりクローニングを行うことが可能であることを示すため、以下に掲げる実験を行った。
【００７９】
<実験材料>
標的ＤＮＡ断片、およびヘアピン型プローブは実施例１と同様に調製したものを使用した。
【００８０】
<実験方法>
（１）ＲｅｃＡ−プローブ複合体の形成
ＲｅｃＡ−プローブ複合体を形成するために反応液を以下のように調製した。
反応液Ａ：
１０ｘ緩衝液Ａ                                            １μｌ
５０ｍＭ  ＡＴＰγＳ（ロッシュ社製）                      １μｌ
L-Bhind23-5（１０ｎｇ／μｌ）                         ０．５μｌ
L-Bhind23-3（１０ｎｇ／μｌ）                         ０．５μｌ
ＲｅｃＡ（ ２．５８μｇ／μｌ、Promega社製）        ０．３９μｌ
蒸留水                                              ６．６１μｌ
計                                                    １０μｌ
１０ｘ緩衝液Ａは実施例１と同様に調製したものを用いた。
上記反応液Ａを３７℃にて１５分間反応させてＲｅｃＡ−プローブ複合体を形成した。
【００８１】
（２）鎖交換反応
鎖交換反応を行なうために反応液Ｂを以下のように調製した。
反応液Ｂ：
１０ｘ緩衝液Ｂ                                            １．５μｌ
５０ｍＭ  ＡＴＰγＳ（ロッシュ社製）                      １．５μｌ
２００ｎｇ／μｌ標的ＤＮＡ                                １．５μｌ
ＥｘｏＩ（２０unit/μｌ、エピセンターテクノロジー社製）   １．５μｌ
蒸留水                                                        ９μｌ
計                                                        １５μｌ
ここで、１０ｘ緩衝液Ｂは実施例１と同様に調製したものを用いた。
【００８２】
上記反応液Ｂを３７℃にて数分間インキュベーションした後、１０μｌの該反応液Ｂを上記（１）の工程後の反応液に添加し、混合し、３７℃にて３０分間反応させることにより鎖交換反応を行った。
【００８３】
（３）プローブの標的ＤＮＡへのライゲーション
標的ＤＮＡの末端に鎖交換したプローブを、標的ＤＮＡ末端に連結させるライゲーション反応を行うためにライゲーション反応液を以下のように調製した。
【００８４】
２ｘライゲーション反応液：
１０ｘリアクションバッファー（エピセンターテクノロジー社製） １０μｌ
Ampligase ＤＮＡ ligase（１００unit/μｌ、エピセンターテクノロジー社製）                                                                 ０．２５μｌ
蒸留水                                                 ３９．７５μｌ
計                                                         ５０μｌ
【００８５】
上記ライゲーション反応液を３７℃にて数分間インキュベーションした後、上記（２）において鎖交換反応を行ったサンプルにライゲーション反応液を20μl添加し、混合し、６５℃にて１５分間ライゲーション反応を行なった。その後、ＰＢ  Buffer（キアゲン社製）を１０μｌずつ添加して酵素を失活させることにより、反応を停止した。
【００８６】
（４）未反応の遊離プローブの除去と脱塩
上記（３）のライゲーション反応後のサンプルを、Sephacryl  Ｓ−４００スピンカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に適用し、３，０００ｒｐｍにて２分間の遠心分離よってゲルろ過を行い、未反応の遊離プローブの除去および脱塩を行った。続いて、エタノール沈殿を行い、７０％エタノールによるＤＮＡペレットのリンス後、ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液４０μｌに溶解した。
ここで、ＴＥ緩衝液は実施例１と同様に調製したものを用いた。
【００８７】
（５）ヘアピン型プローブのフィルイン
ヘアピン型プローブの標的ＤＮＡとハイブリッドを形成しているプローブ部を二重鎖化するフィルインを行うため、上記（４）の精製後のサンプルに、
１０ｘ  EcoPol buffer（ニューイングランドバイオラブス社製） ５μｌ、
ｄＮＴＰｓ（タカラ社製：各２．５ｍＭ）                      ４μｌ、
Klenow（ニューイングランドバイオラブス社製：５units/μｌ）  １μｌ、
を添加して混合し、３７℃にて３０分間インキュベートした。
【００８８】
（６）サンプルの精製
ＰＢ  Bufferを１０μｌ添加して、上記（５）の工程で得られたサンプルと混合することにより、Klenowを失活させた後、２０ｍｇ／ｍｌのGlycogen（ロシュ社製）を１μｌ添加してエタノール沈殿を行った後、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールでリンスした。続いて、ＤＮＡペレットを乾燥させた後、乾燥ペレットに５０μｌのＴＥ緩衝液を添加して溶解した。
【００８９】
（７）ビオチン−ストレプトアビジン複合体の形成
上記（６）の精製後のサンプルに、ストレプトアビジン溶液（Promega社製）を１０μｌ添加し、混合した後、室温にて１０分間静置し、標識ビオチンをストレプトアビジンと複合体を形成させた。ストレプトアビジン溶液は、実施例１と同様にして調製したものを用いた。
【００９０】
（８）固相への標的ＤＮＡ断片の捕捉
ストレプトアビジンのタンパク吸着性フィルターへの吸着を利用して、標的ＤＮＡ断片を固相に捕捉して、標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去を行なった。
固相として、マイクロピュア（登録商標）−ＥＺ（ミリポア社製）フィルターを使用した。マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに上記（７）で得られたサンプルを入れ、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行って、フィルターにストレプトアビジンを介して標的ＤＮＡを固定化した。続いて、１００μlのＴＥ緩衝液をフィルターカップに入れ、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行ってフィルターを洗浄し、フィルターカップ内およびフィルターに付着している、標的ＤＮＡ断片とは無関係な非標的ＤＮＡを除去した。このステップを５回繰り返して洗浄した。
また、マイクロピュア−ＥＺを素通りしたサンプル液と一次洗浄液はフィルターに結合しなかったＤＮＡサンプルとして回収し、常法に従いエタノール沈殿を行い１２μｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、後の電気泳動工程において泳動サンプルとしてゲルにアプライした。
【００９１】
（９）標的ＤＮＡ断片の回収
マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに５０μｌのＰＢ  Buffer（キアゲン社製）とＴＥ緩衝液の等量混合液を添加して１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。この操作を２回行って、該フィルターに捕捉されている標的ＤＮＡ断片を回収した。
ここで、ＰＢ  Bufferの組成は、実施例１で示したものと同様であり、具体的には、グアニジン塩酸塩とイソプロパノールの混合溶液である。
【００９２】
（１０）サンプルの精製
上記（９）の工程で得られたサンプルに、２０ｍｇ／ｍｌのGlycogen（ロシュ社製）を１μｌ添加してエタノール沈殿を行った後、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールでリンスした。続いて、ＤＮＡペレットを乾燥させた後、乾燥ペレットに１７μｌの蒸留水を添加して溶解した。
【００９３】
（１１）ヘアピン型プローブの除去
上記（１０）の工程により精製された標的ＤＮＡ断片を含有するサンプルに、１０ｘ ＮＥ緩衝液２（ニューイングランドバイオラブス社製）を２μl、１２units/μlの HindIII（タカラバイオ社製）を１μl添加し、３７℃にて６０分間インキュベートした。ここで用いたプローブは図３に示すようにHindIII認識部位が形成されるように設計されていることから、HindIIIにより回収された標的ＤＮＡ断片からヘアピン型プローブの除去し、標的ＤＮＡ断片のみを切り出すことができる。
【００９４】
（１２）ベクターＤＮＡへの組み込み
上記（１１）の工程後の標的ＤＮＡ断片に、１μｌのHindIIIで切断したＣＩＰ処理済みのベクターＤＮＡ（ｐＺＥｒＯ−１：インビトロジェン、２５ｎｇ／μｌ）１μｌを添加し、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出を行い、エタノール沈殿を行った。得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールでのリンス後、乾燥し、４μｌの蒸留水および０．５μｌの１０ｘ Ｔ４ ＤＮＡ ligase緩衝液（ニューイングランドバイオラブス社製）に溶解させた。十分に溶解させた後、４００units／μｌのＴ４ ＤＮＡ ligase（ニューイングランドバイオラブス社製）を０．５μｌ添加し、混合して、１６℃にて２時間ライゲーション反応を行い、該標的ＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組み込んだ。
【００９５】
（１３）形質転換
１００μlの凍結コンピテントセルEpicurian Coli XL-1 Blue Supert Competent Cells（ストラタジーン社製）を氷上で解凍し、製造業者の指示に従い形質転換を行い、ＳＯＣ培地を添加して１ｍｌとし、３７℃にて６０分間振とうした。
【００９６】
（１４）コロニーの形成
上記（１３）の工程において形質転換された大腸菌液、１μl、１０μｌ、１００μｌを、夫々寒天ＬＢ培地に接種して３７℃にて1晩培養を行った。ＬＢ培地としては、薬剤耐性マーカーとして５０μｇ／μｌのZeocin（インビトロジェン社製）および誘導物質として１ｍＭのＩＰＴＧ（ロシュ社製）が添加されたものを使用した。培養後、コロニーの観察を行い、大腸菌液１μlのプレートは１０コロニー、１０μｌのプレートは４６コロニー、100μlのプレートは５６１のコロニーが観察された。
【００９７】
（１５）解析
上記（１４）の工程で観察されたコロニーをランダムに２０個採取し、夫々１mlの減塩ＬＢ倍地（５０μｇ／μｌ  Zeocin、１ｍＭのＩＰＴＧを含有。）に接種し、３７℃にて1晩培養を行った後、プラスミド自動分離装置を（ＰＩ−１００Σ、クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、電気泳動を行った。更に、HindIIIでインサートを切り出して確認した。
【００９８】
<結果>
結果を図５に示す。図５（Ａ）はランダムに選択した２０コロニーの大腸菌から抽出したプラスミドＤＮＡの電気泳動パターンを示し、レーンＭ１はサイズマーカー（λ／HindIII）であり、レーンＭ２はサイズマーカー（pBluescript SK(-)）であり、各レーン番号は各クローン番号に対応している。また、図５（Ｂ）は、上記プラスミドＤＮＡをHindIIIで切り出したインサートの電気泳動パターンを示し、レーンＭ１はサイズマーカー（λ／HindIII）であり、各レーン番号は各クローン番号に対応している。
【００９９】
図５（Ｂ）中、クローン４、１６、２０は、標的ＤＮＡ断片のインサートを観察することができなかった。また、クローン９、１３は片側のHindIII認識配列が破壊されているようであった。しかしながら、残りの１５クローンに関しては、標識ＤＮＡ断片のインサートを観察することができた。
【０１００】
以上の結果より、高率に標的ＤＮＡ断片を保持したクローンが取得でき、標的ＤＮＡ断片が効率的にクローニングできることが認められた。したがって、本発明の方法によって、標的ＤＮＡ断片を、簡便かつ効率的に単離し、クローニングすることができることが判明した。
【０１０１】
実施例３：タンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後に、グアニジンイソチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩−β−メルカプトエタノール処理で標的ＤＮＡを回収
グアニジンイソチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩−β−メルカプトエタノール処理により、実施例１に示したグアニジン塩酸塩−イソプロパノール処理と同様、ビオチン−アビジン複合体を解離できることを示すと共に、これを利用することによりビオチン−アビジン複合体の形成と解離とに基づいて標的ＤＮＡを含有するサンプルから該標的ＤＮＡを特異的に単離することが可能であることを示すため、以下に掲げる実験を行った。
【０１０２】
<実験材料>
標的ＤＮＡ断片としてビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII、即ち、HindIIIで切断して直鎖状にしたpBluescript SK(-)の末端にKlenow exo- でビオチン標識したｄＡＴＰ（ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）を取り込ませて両末端を標識し、Sephadex G-50スピンカラムで精製したものを使用した。
【０１０３】
また、回収の際に使用した試薬は以下の通りである。
・グアニジンイソチオシアン酸塩液：
４Ｍ  グアニジンイソチオシアン酸塩
１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）
・グアニジンイソチオシアン酸塩−β−メルカプトエタノール液：
４Ｍ  グアニジンイソチオシアン酸塩
１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）
１％  β−メルカプトエタノール
【０１０４】
<実験方法>
（１）ビオチン−ストレプトアビジン複合体の形成
標的ＤＮＡを標識するビオチンとストレプトアビジン間で複合体を形成させるため、以下の通りにサンプルを調製した。
２００ｎｇ／μｌの標的ＤＮＡ（ビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII）                                                                       １μｌ
ストレプトアビジン溶液（Promega社製）                      １０μｌ
蒸留水                                                     ４９μｌ
全量                                                     ６０μｌ
【０１０５】
上記サンプルを混合後、室温にて１０分間静置し、標識ビオチンをストレプトアビジンと複合体を形成させた。ストレプトアビジン溶液は、１ｍｇ／μｌの濃度になるように実施例１と同様に調製されたものを使用した。
【０１０６】
（２）固相への標的ＤＮＡ断片の捕捉
ストレプトアビジンのタンパク吸着性フィルターへの吸着を利用して、標的ＤＮＡ断片を固相に固定化し、標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去を行なった。
固相として、マイクロピュア（登録商標）−ＥＺ（ミリポア社製）フィルターを使用した。マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに上記（１）で得られたサンプルを入れ、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行って、フィルターにストレプトアビジンを介して標的ＤＮＡを捕捉させた。続いて、１００μｌのＴＥ緩衝液をフィルターカップに入れ、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ってフィルターを洗浄し、フィルターカップ内およびフィルターに付着している、標的ＤＮＡ断片とは無関係な非標的ＤＮＡを除去した。このステップを５回繰り返して洗浄した。ここで、ＴＥ緩衝液は実施例１と同様に調製されたものを使用した。
【０１０７】
また、マイクロピュア−ＥＺを素通りしたサンプル溶液と一次洗浄液はフィルターに結合しなかったＤＮＡサンプルとして回収し、常法に従ってエタノール沈殿を行い１２μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた後、後の電気泳動工程において電気泳動サンプルとしてゲルにアプライした。
【０１０８】
（３）標的ＤＮＡ断片の回収
マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに５０μｌのグアニジンイソチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩−メルカプトエタノール混合溶液、夫々を添加して１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、該フィルターに捕捉されている標的ＤＮＡ断片を回収した。該フィルターから遊離された標的ＤＮＡ断片を含有する溶出液を回収した。このステップを２回繰り返した。更に、ＴＥ緩衝液をフィルターカップに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上記溶出液と混合した。また、ＰＢ  Buffer（キアゲン社製）をポジティブコントロールとして、ＴＥ緩衝液同様に実験を行った。
【０１０９】
ここで、ＰＢ  Bufferの組成は、実施例１で示したものと同様であり、具体的には、グアニジン塩酸塩とイソプロパノールの混合溶液である。
【０１１０】
（４）電気泳動サンプルの調製
後述する電気泳動にて標的ＤＮＡ断片の回収を確認するため、工程（３）で得られた標的ＤＮＡ断片を２０ｍｇ／ｍｌのGlycogen（ロシュ）を１μｌ添加した後、エタノール沈殿（−８０℃）を行った。続いて、１５,０００ｒｐｍで遠心分離を行い、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールでリンスした後、乾燥させた。乾燥後のＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液１２μｌに標的ＤＮＡ断片を溶解してＢＰＢ色素液３μlと混合した。ここで、ＢＰＢ色素液の組成は実施例１と同様に調製した。
【０１１１】
（５）電気泳動
０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、サイバーグリーンＩでバンドを可視化した後、分離パターンを写真に撮影し、標的ＤＮＡ断片の回収を確認した。
【０１１２】
<結果>
結果を図６に示す。レーン４はグアニジンイソチオシアン酸塩よる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン３は素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン５はグアニジンイソチオシアン酸塩−メルカプトエタノールよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン６は素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン８はＰＢ  Bufferよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン７は素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示す。また、レーン１は、pBluescript SK（−）／HindIII  １００ｎｇ、レーン２は、ビオチン標識pBluescript SK（−）／HindIII  ２００ｎｇであり、レーンＭはサイズマーカー（λ／HindIII）２００ｎｇである。
【０１１３】
図６の電気泳動染色像により、グアニジンイソチオシアン酸塩−メルカプトエタノール処理により、ＰＢ  Bufferと同程度の標的ＤＮＡ回収効果が達成されることが認められた（レーン６とレーン８の比較。）。また、グアニジンイソチオシアン酸塩は、ＰＢ  Bufferよりも標的ＤＮＡ断片の回収率は低かったが、実用可能な標的ＤＮＡ回収効果が得られることが認められた（レーン４とレーン８の比較。）。また、用いたＤＮＡ量が多量であったため、半分程度のＤＮＡがフィルターに捕捉されずに溶出されているが、すべてのサンプルにおいて標的ＤＮＡ断片の特異的な回収が認められた。
以上の結果より、ビオチンアビジン複合体形成を介してタンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後にグアニジンイソチオシアン酸塩−メルカプトエタノール、並びに、グアニジンイソチオシアン酸塩で処理を行うことにより、非標的分子を除外して標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることが判明した。
【０１１４】
実施例４：タンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後に、アルコール類での処理により標的ＤＮＡを回収
アルコール類の作用によりビオチン−アビジン複合体を解離できることを示すと共に、これを利用するビオチン−アビジン複合体の形成と解離とに基づいて標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることを確認するため、以下に掲げる実験を行った。
【０１１５】
<実験材料>
標的ＤＮＡ断片としてビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII、即ち、HindIIIで切断して直鎖状にしたpBluescript SK(-)の末端にKlenow exo- でビオチン標識したｄＡＴＰ（ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）を取り込ませて両末端を標識し、Sephadex G-50スピンカラムで精製したものを使用した。
【０１１６】
また、回収の際に使用したアルコール類は以下の通りである。
メタノール、エタノール、イソプロパノール、２−ブタノール、イソアミルアルコール
【０１１７】
<実験方法>
（１）ビオチン−ストレプトアビジン複合体の形成
標的ＤＮＡを標識するビオチンとストレプトアビジン間で複合体を形成させるため、以下の通りにサンプルを調製した。サンプルは７本調製し、２本をコントロール用として使用した。
２００ｎｇ／μｌの標的ＤＮＡ（ビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII）                                                                      １μｌ
ストレプトアビジン溶液（Promega社製）                     １０μｌ
蒸留水                                                    ４９μｌ
全量                                                    ６０μｌ
【０１１８】
上記サンプルを混合後、室温にて１０分間静置し、標識ビオチンをストレプトアビジンと複合体を形成させた。ストレプトアビジン溶液は、１ｍｇ／μｌの濃度になるように実施例１と同様に調製されたものを使用した。
【０１１９】
（２）固相への標的ＤＮＡ断片の捕捉
ストレプトアビジンのタンパク吸着性フィルターへの吸着を利用して、標的ＤＮＡ断片を固相に固定化し、標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去を行なった。
固相として、マイクロピュア（登録商標）−ＥＺ（ミリポア社製）フィルターを使用した。マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに上記（１）で得られたサンプルを入れ、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行って、フィルターにストレプトアビジンを介して標的ＤＮＡを捕捉させた。続いて、１００μｌのＴＥ緩衝液をフィルターカップに入れ、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ってフィルターを洗浄し、フィルターカップ内およびフィルターに付着している、標的ＤＮＡ断片とは無関係な非標的ＤＮＡを除去した。このステップを５回繰り返して洗浄した。ここで、ＴＥ緩衝液は実施例１と同様に調製されたものを使用した。
【０１２０】
また、マイクロピュア−ＥＺを素通りしたサンプル溶液と一次洗浄液はフィルターに結合しなかったＤＮＡサンプルとして回収し、エタノール沈殿を行い１２μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた後、後の電気泳動工程において電気泳動サンプルとしてゲルにアプライした。
【０１２１】
（３）標的ＤＮＡ断片の回収
マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに５０μｌの上記各アルコールを、夫々、添加して１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、該フィルターから遊離された標的ＤＮＡ断片を含有する溶出液を回収した。このステップを２回繰り返した。更に、ＴＥ緩衝液をフィルターカップに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上記溶出液と混合した。
なお、２−ブタノール及びイソアミルアルコールは水相に混和しないことから、標的ＤＮＡの抽出後、ＴＥ緩衝液で上記の通りフィルターカップを洗浄した後、全体をエタノール沈殿を行うことにより標的ＤＮＡを回収した。
【０１２２】
（４）電気泳動サンプルの調製
後述する電気泳動にて標的ＤＮＡ断片の回収を確認するため、工程（３）で得られた標的ＤＮＡ断片を２０ｍｇ／ｍｌのGlycogen（ロシュ）を１μｌ添加した後、エタノール沈殿（−８０℃）を行った。続いて、１５,０００ｒｐｍで遠心分離を行い、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールでリンスした後、乾燥させた。乾燥後のＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液１２μｌに標的ＤＮＡ断片を溶解してＢＰＢ色素液３μlと混合した。ここで、ＢＰＢ色素液の組成は実施例１と同様に調製した。
【０１２３】
（５）電気泳動
０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、サイバーグリーンIでバンドを可視化した後、分離パターンを写真に撮影し、標的ＤＮＡ断片の回収を確認した。
【０１２４】
また、ストレプトアビジンを添加せずＴＥ緩衝液１０μｌを添加して上記と同様の操作（イソプロパノール抽出）を行ったサンプルをコントロール１とした。また、上記（３）の工程において、ＴＥ緩衝液を用いて溶出した以外は、上記と同様の操作を行ったサンプルをコントロール２とした。
【０１２５】
<結果>
結果を図７に示す。レーン２はメタノールよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン１はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン４はエタノールよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン３はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン６はイソプロパノールによる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン５はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン８は２−ブタノールよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン７はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン１０はイソアミルアルコールよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン９はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示す。また、レーン１１、１２はコントロール１、レーン１３，１４はコントロール２の、夫々、その素通り画分および洗浄液、溶出液の電気泳動パターンである。レーン２は、レーンＭはサイズマーカー（λ／HindIII）２００ｎｇである。
【０１２６】
図７の電気泳動染色像により、メタノール以外のアルコールにより標的ＤＮＡ回収が可能であることが認められた（レーン４、レーン６、レーン８、レーン１０。）。特に、イソプロパノールより炭素数の多いアルコールにおいて、その回収率が高かった。回収率が低かったメタノールに関しては、マイクロピュアのフィルターカップに添加すると、フィルターの目詰まりが発生し、これが回収率の低さと関係しているように思われた。したがって、かかる結果によりメタノールのビオチン−アビジン複合体を解離できず本発明の方法の使用に適しないとの結論を導くものではなく、固相の種類の変更等によってメタノールをも好適に利用できる可能性はあるものと考えられる。
【０１２７】
また、コントロール２（レーン１４）において、ＤＮＡの薄いバンドが確認されたが、これはマイクロピュアのフィルターカップの内壁やフィルターに非特異的に吸着していたDNAに由来するものと考えられ、ＴＥ緩衝液によりアビジン−ビオチンの特異的結合を解離することにDNAの回収ができるとの結論を導くものではない。
【０１２８】
以上の結果より、ビオチンアビジン複合体形成を介してタンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後にアルコール類で処理を行うことにより、非標的分子を除外して標的ＤＮＡ断片を特異的に回収でき、特にその効果は炭素数３以上のアルコール類での処理により顕著に観察されることが判明した。
【０１２９】
実施例５：タンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後に、フィルターから標的ＤＮＡ断片の回収を行うに際してのイソプロパノールの効果
上記実施例において示したように、アルコール類、特に、イソプロパノールの作用ならびにグアニジン塩酸塩との組み合わせの作用によりビオチン−アビジン複合体を解離でき、これを利用するビオチン−アビジン複合体の形成と解離とに基づいて標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることが確認されたことから、これを更に発展させるべく、以下に掲げる実験を行った。
【０１３０】
<実験材料>
標的ＤＮＡ断片としてビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII、即ち、HindIIIで切断して直鎖状にしたpBluescript SK(-)の末端にKlenow exo- でビオチン標識したｄＡＴＰ（ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）を取り込ませて両末端を標識し、Sephadex G-50スピンカラムで精製したものを使用した。
【０１３１】
また、回収の際に使用した抽出液は以下の通りである。
グアニジン塩酸塩液、グアニジン塩酸塩液−イソプロパノール液、イソプロパノール、グアニジンイソチオシアン酸塩液、グアニジンイソチオシアン酸塩−イソプロパノール液
【０１３２】
各溶液の組成は以下の通りである。
・グアニジン塩酸塩液：
５Ｍグアニジン塩酸塩／１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）
・グアニジン塩酸塩液−イソプロパノール液：
５Ｍグアニジン塩酸塩／５０％イソプロパノール／１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
・グアニジンイソチオシアン酸塩液：
４Ｍグアニジンイソチオシアン酸塩／１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）
・グアニジンイソチオシアン酸塩−イソプロパノール液：
４Ｍグアニジンイソチオシアン酸塩／２５％イソプロパノール／１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）
【０１３３】
<実験方法>
（１）ビオチン−ストレプトアビジン複合体の形成
標的ＤＮＡを標識するビオチンとストレプトアビジン間で複合体を形成させるため、以下の通りにサンプルを調製した。サンプルは６本調製し、１本はコントロール用として使用した。
２００ｎｇ／μｌの標的ＤＮＡ（ビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII）                                                                    １μｌ
ストレプトアビジン溶液（Promega社製）                   １０μｌ
蒸留水                                                  ４９μｌ
全量                                                  ６０μｌ
【０１３４】
上記サンプルを混合後、室温にて１０分間静置し、標識ビオチンをストレプトアビジンと複合体を形成させた。ストレプトアビジン溶液は、１ｍｇ／μｌの濃度になるように実施例１と同様に調製されたものを使用した。
【０１３５】
（２）固相への標的ＤＮＡ断片の捕捉
ストレプトアビジンのタンパク吸着性フィルターへの吸着を利用して、標的ＤＮＡ断片を固相に固定化し、標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去を行なった。
固相として、マイクロピュア（登録商標）−ＥＺ（ミリポア社製）フィルターを使用した。マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに上記（１）で得られたサンプルを入れ、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行って、フィルターにストレプトアビジンを介して標的ＤＮＡを捕捉させた。続いて、１００μｌのＴＥ緩衝液をフィルターカップに入れ、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行ってフィルターを洗浄し、フィルターカップ内およびフィルターに付着している、標的ＤＮＡ断片とは無関係な非標的ＤＮＡを除去した。このステップを５回繰り返して洗浄した。ここで、ＴＥ緩衝液は実施例１と同様に調製されたものを使用した。
【０１３６】
また、マイクロピュア−ＥＺを素通りしたサンプル溶液と一次洗浄液はフィルターに結合しなかったＤＮＡサンプルとして回収し、常法に従いエタノール沈殿を行い１２μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた後、後の電気泳動工程において電気泳動サンプルとしてゲルにアプライした。
【０１３７】
（３）標的ＤＮＡ断片の回収
マイクロピュア−ＥＺのフィルターカップに５０μｌの上記で調製した各溶液を、夫々を添加して１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、該フィルターから遊離された標的ＤＮＡ断片を含有する溶出液を回収した。このステップを２回繰り返した。更に、ＴＥ緩衝液をフィルターカップに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上記溶出液と混合した。
【０１３８】
（４）電気泳動サンプルの調製
後述する電気泳動にて標的ＤＮＡ断片の回収を確認するため、工程（３）で得られた標的ＤＮＡ断片を２０ｍｇ／ｍｌのGlycogen（ロシュ）を１μｌ添加した後、エタノール沈殿（−８０℃）を行った。続いて、１５,０００ｒｐｍで遠心分離を行い、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールでリンスした後、乾燥させた。乾燥後のＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液１２μｌに標的ＤＮＡ断片を溶解してＢＰＢ色素液３μlと混合した。ここで、ＢＰＢ色素液の組成は実施例１と同様に調製した。
【０１３９】
（５）電気泳動
０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、サイバーグリーンIでバンドを可視化した後、分離パターンを写真に撮影し、標的ＤＮＡ断片の回収を確認した。
【０１４０】
また、上記回収液の代わりにＴＥ緩衝液を添加して上記と同様の操作を行い、これをコントロールとした。
【０１４１】
<結果>
結果を図８に示す。レーン４はグアニジン塩酸塩液よる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン３はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン６はグアニジン塩酸塩−イソプロパノール液よる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン５はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン８はイソプロパノールよる溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン７はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン１０はグアニジンイソチオシアン酸塩液による溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン８はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン１２はグアニジンイソチオシアン酸塩−イソプロパノール液による溶出液（フィルターに結合したＤＮＡ断片）、レーン１１はその素通り画分および洗浄液（フィルターに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示す。また、レーン１、２はコントロールの、その素通り画分および洗浄液、溶出液の電気泳動パターンである。レーンＭはサイズマーカー（λ／HindIII）２００ｎｇである。
【０１４２】
図８の電気泳動染色像により、グアニジン塩酸塩単独よりも、イソプロパノールとの混合液の方が、標的ＤＮＡ断片の回収率が高いことが認められた（レーン４、レーン６の比較。）。一方、グアニジンイソチオシアン酸塩の場合は、イソプロパノールとの混合液の方が単独の場合よりも有意に高い標的ＤＮＡ断片の回収率は認められなかった（レーン１０、レーン１２の比較。）。これは、グアニジンイソチオシアン酸塩がグアニジン塩酸塩に比べて蒸留水に溶解しにくかったために５０％濃度でのイソプロパノールの使用ができず、添加イソプロパノール量が少ないことに起因しているように思われる。
以上の結果より、ビオチン−アビジン複合体形成を介してタンパク質吸着性フィルターに標的ＤＮＡ断片を捕捉後にグアニジン塩酸塩、若しくは、グアニジンイソチオシアン酸塩にイソプロパノールを混合して添加することにより、非標的分子を除外して標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることが判明した。
【０１４３】
実施例６：ストレプトアビジンコーティングビーズに標的ＤＮＡ断片を捕捉後、アルコール類処理で標的ＤＮＡを回収
上記実施例４に示したように、アルコール類の作用によりビオチン−アビジン複合体を解離でき、これを利用するビオチン−アビジン複合体の形成と解離とに基づいて標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることが確認されたことから、これを更に発展させるべく、以下に掲げる実験を行った。特にメタノールの作用について確認を行った。
【０１４４】
<実験材料>
標的ＤＮＡ断片としてビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII、即ち、HindIIIで切断して直鎖状にしたpBluescript SK(-)の末端にKlenow（ＮＥＢ社製）でビオチン標識したｄＡＴＰ（ビオチン−１４−ｄＡＴＰ）を取り込ませて両末端を標識し、Sephadex G-50スピンカラムで精製したものを使用した。
【０１４５】
また、回収の際に使用したアルコール類は以下の通りである。
メタノール、エタノール、イソプロパノール
【０１４６】
<実験方法>
（１）ビオチン・ストレプトアビジン複合体の形成を介する標的ＤＮＡ断片の固相への捕捉
ビオチンのストレプトアビジンに対する親和力を利用して、標的ＤＮＡ断片を固相に捕捉した。固相として、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズ（Dynabeads Straptavidin M-280：ダイナル社製）を使用した。あらかじめ、１００μlのＴＥ緩衝液にて２回洗浄を施した５０μｌ分のストレプトアビジンコーティング磁性ビーズに、下記の通り調製したサンプルを添加して、磁性ビーズを該サンプルに懸濁させた。サンプルは４本調製し、１本をコントロールとして使用した。
【０１４７】
Binding Buffer（Kilo base binder：ダイナル社製）      ５０μｌ
ＴＥ緩衝液                                            ４９μｌ
２００ｎｇ／μｌの標的ＤＮＡ（ビオチン標識pBluescript SK(-)／HindIII）                                                                  １μｌ
計                                                １００μｌ
【０１４８】
懸濁後、室温にて４０分間静置し、磁性ビーズに標的ＤＮＡ断片を捕捉させた。この間、１０分毎に、磁性ビーズの沈殿を防止するため、サンプルをマイクロピペットで混合することによって磁性ビーズをサンプル液中に再懸濁させた。
【０１４９】
（２）標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去
固相に固定された標的ＤＮＡ断片以外の非標的ＤＮＡの除去を行った。磁気スタンドを用いて、上記（１）の工程後のサンプル中の磁性ビーズを一箇所に集めた後、溶液を除去した。続いて、１００μｌのＴＥ緩衝液に磁性ビーズを懸濁させた後、上記と同様にしてＴＥ緩衝液を除去した。このステップを５回繰り返すことにより、非標的ＤＮＡを十分に除去した。
また、上記で回収されたサンプル液と一次洗浄液は磁性ビーズに結合しなかったＤＮＡサンプルとして回収して、常法に従いエタノール沈殿を行い１２μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた後、後の電気泳動工程において泳動サンプルとしてゲルにアプライした。
【０１５０】
（３）標的ＤＮＡ断片の回収
上記（２）の工程後の磁性ビーズに、上記各回収用アルコール類５０μｌを夫々添加し、ミキサーを用いて２分間攪拌し、標的ＤＮＡ断片を磁性ビーズから遊離させた。十分な攪拌後、磁気スタンドを用いて、サンプル中の磁性ビーズを一箇所に集めて上清を回収した。この工程を更にもう一回繰り返し、得られた回収液を混合し１００μｌとした。更に、磁性ビーズに１００μｌのＴＥ緩衝液を添加して、ミキサーを用いて２分間攪拌後、上清を回収して上記回収液と混合（合計、２００μｌ）し、標的DNA含有サンプルとして下記の電気泳動工程に供した。
【０１５１】
（４）電気泳動サンプルの調製
後述する電気泳動にて標的ＤＮＡ断片の回収を確認するため、工程（３）で得られた標的ＤＮＡ断片含有サンプルを２０ｍｇ／ｍｌのGlycogen（ロシュ）を１μｌ添加してエタノール沈殿（−８０℃）を行った後、１５,０００ｒｐｍで遠心分離を行い、７０％エタノールでＤＮＡペレットをリンスし乾燥させた。乾燥後のＤＮＡペレットに、ＴＥ緩衝液１２μｌを添加し混合して溶解させ、ＢＰＢ色素液３μlと混合した。ここで、ＢＰＢ色素液の組成は実施例１と同様に調製した。
【０１５２】
（５）電気泳動
０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、サイバーグリーンIでバンドを可視化した後、分離パターンを写真に撮影した。
また、アルコール類の代わりにＴＥ緩衝液を添加して上記と同様の操作を行い、これをコントロールとした。
【０１５３】
<結果>
結果を図９に示す。レーン４はメタノールよる溶出液（ビーズに結合したＤＮＡ断片）、レーン３はその素通り画分および洗浄液（ビーズに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン６はエタノールよる回収液（ビーズに結合したＤＮＡ断片）、レーン５はその素通り画分および洗浄液（ビーズに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示し、レーン８はイソプロパノールよる回収液（ビーズに結合したＤＮＡ断片）、レーン７はその素通り画分および洗浄液（ビーズに結合しなかったＤＮＡ断片）、の電気泳動パターンを示す。また、レーン１、２はコントロールの、その素通り画分および洗浄液、溶出液の電気泳動パターンである。レーンＭはサイズマーカー（λ／HindIII）２００ｎｇである。
【０１５４】
図９の電気泳動染色像により、メタノール、エタノール、イソプロパノールのいずれで回収処理を行うことによっても、標的ＤＮＡ断片が回収できることが認められた（レーン４、レーン６、レーン８。）。実施例４のタンパク吸着フィルターの実験結果と比較した場合に、本実施例の磁性ビーズによる場合には、若干の回収率の低下が認められたが、この回収率の低下は、実施例において使用した標的ＤＮＡ断片は３ｋｂであることから、磁性ビーズを固相として用いたことによって標的ＤＮＡ断片のビーズへの吸着の際、高次構造障害が生じたことが要因として考えられ、アビジン−ビオチンの解離に基づく本願の発明の効果を阻害するものではない。しかしながら、上記の通りフィルターの場合に比べて若干の回収率の低下が認められるものの、良好に標的ＤＮＡ断片の回収が達成された。
以上の本実施例の結果および実施例４の結果より、アルコール類は、アビジン−ビオチン複合体を解離でき、それを利用することにより非標的分子を除外して標的ＤＮＡ断片を特異的に回収できることが判明した。更に、固相担体として、フィルター、ビーズをも本発明の方法に良好に適応できることが判明した。
【０１５５】
(効果)
本発明の方法を用いれば、核酸が混在する試料から所望の核酸以外の核酸を除外して、特異的に所望の核酸のみを高い回収率で回収することができる。また、本発明の方法は、電気泳動法の実施を必要としないことから、回収対象となる核酸を損傷することなく、かつ、低濃度の核酸をも高い回収率で回収可能であることから、安定した標的核酸の回収を達成することができると共に、従事者の健康を脅かすことのない実用価値の高い方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】固相担体としてタンパク吸着性フィルターを使用した場合の本発明の方法を模式的に示す図
【図２】固相担体として磁性ビーズを使用した場合の本発明の方法を模式的に示す図
【図３】本発明の方法において使用可能なヘアピン型プローブの一例を示す図
【図４】本発明の方法により標的核酸が回収可能であることを示す、実施例１のグアニジン塩酸塩とイソプロパノールの回収結果の電気泳動後の染色像
【図５】本発明の方法により標的核酸がクローニング可能であることを示す、実施例２の結果の電気泳動後の染色像
【図６】本発明の方法により標的核酸が回収可能であることを示す、実施例３のグアニジンイソチオシアン酸塩での回収結果の電気泳動後の染色像
【図７】本発明の方法により標的核酸が回収可能であることを示す、実施例４のアルコール類での回収結果の電気泳動後の染色像
【図８】本発明の方法により標的核酸が回収可能であることを示す、実施例５のイソプロパノールとグアニジン誘導体での回収結果の電気泳動後の染色像
【図９】本発明の方法により標的核酸が回収可能であることを示す、実施例６のアルコール類での回収結果の電気泳動後の染色像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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