(57)【要約】【課題】マラリア原虫を簡便に検出する。【解決手段】  血液中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させた測定用試料を調製し、前記調製した測定用試料に光を照射し、前記光を照射された測定用試料から、第一の散乱光、及び第一の散乱光と散乱の角度が異なる第二の散乱光を検出し、前記検出した第一の散乱光及び第二の散乱光に基づき、測定用試料中のマラリア原虫を検出する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させた測定用試料を調製し、
前記調製した測定用試料に光を照射し、
前記光を照射された測定用試料から、第一の散乱光、及び第一の散乱光と散乱の角度が異なる第二の散乱光を検出し、
前記検出した第一の散乱光及び第二の散乱光に基づき、測定用試料中のマラリア原虫を検出する、マラリア原虫測定方法。
【請求項２】
前記第一の散乱光は前方散乱光であり、前記第二の散乱光は側方散乱光である、請求項１に記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項３】
前記測定用試料の調製において、赤血球を溶血するため血液に溶血剤を添加する、請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項４】
半導体レーザー光源を用いて前記測定用試料に光を照射する、請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項５】
前記半導体レーザー光源は、赤色半導体レーザー光源である、請求項４記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項６】
前記検出した第一の散乱光及び第二の散乱光に基づき、マラリア原虫の成育段階を判別する、請求項１記載のマラリア原虫測定方法。
【請求項７】
血液中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させた測定用試料を調製する測定用試料調製部、
前記調製された測定用試料を流すためのフローセル、
フローセル中を流れる測定用試料に光を照射するための光源、
前記光を照射されたフローセル中の測定用試料から、第一の散乱光を検出する第一の検出器、
前記第一の散乱光とは散乱の角度が異なる第二の散乱光を検出する第二の検出器、
前記第一の検出器が検出した第一の散乱光、及び前記第二の検出器が検出した第二の散乱光に基づき、測定用試料中のマラリア原虫を検出する制御部、
を有するマラリア原虫測定装置。
【請求項８】
前記第一の散乱光は前方散乱光であり、前記第二の散乱光は側方散乱光である、請求項７に記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項９】
前記第一の検出器は、フローセルに入射する光の光軸の延長線方向に散乱した散乱光を検出する、請求項７に記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項１０】
前記第二の検出器は、フローセルに入射する光の光軸と略直角に交わる方向に散乱した散乱光を検出する、請求項７に記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項１１】
前記測定用試料調製部は、血液に溶血剤を添加する溶血剤添加手段を有する、請求項７記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項１２】
前記光源は、半導体レーザー光源である、請求項７記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項１３】
前記半導体レーザー光源は、赤色半導体レーザー光源である、請求項７記載のマラリア原虫測定装置。
【請求項１４】
前記制御部は、第一の散乱光及び第二の散乱光に基づき、マラリア原虫の成育段階を判別する、請求項７記載のマラリア原虫測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、マラリア原虫の測定方法と測定装置に関し、特にマラリア原虫の検出を簡易に行うための測定方法と測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは熱帯、亜熱帯に広く分布する寄生虫感染症であり、ハマダラカと呼ばれる蚊によって媒介される。マラリア原虫を持つハマダラカに吸血されると、ハマダラカの唾液とともにマラリア原虫が人の血液中に注入される。マラリア原虫は肝細胞内に進入し、そこで増殖し、再び血液中に放出される。このときのマラリア原虫の形態をメロゾイト（分裂小体:merozoite）とよぶ。メロゾイトは血液中に放出されると直ちに赤血球内に侵入し、その形態を変化させながら発育していく。この形態変化を生活環と呼び、生活環の各段階（ステージ）はリングフォーム（輪状体:ring form）、トロポゾイト（栄養体:trophozoite）、シゾント（分裂体:schizont）と呼ばれる。シゾントまで発育したマラリア原虫は赤血球を破壊し、再びメロゾイトとなって血液中に放出される。放出されたメロゾイトは赤血球に侵入し、再び生活環を繰り返して増殖を繰り返す。マラリア原虫はこのサイクルを繰り返すことによって増殖し、血液中の赤血球を破壊し続ける。
【０００３】
従来からマラリア診断のために最も多用されている検査法は、目視による顕微鏡検査である。血液塗抹標本をギムザ染色し、顕微鏡で目視観察することによりマラリア原虫に感染している赤血球を検出して計数する。しかしこの方法は、塗抹標本の作成のために、血液検体の塗抹、固定、染色など煩雑な工程を要する。また正確な検査結果を得るためには、長時間かけて多数の赤血球を顕微鏡観察する必要があり、多数の検体を迅速に処理することが困難である。
【０００４】
一方、マラリア感染の有無を迅速に検査するための方法として、フローサイトメトリー法を応用して血液中のマラリア原虫を検出する方法が研究されている。例えば、溶血剤を含む試薬により血液試料中の赤血球を溶血させて赤血球中のマラリア原虫を遊離させ、核酸染色性色素によりマラリア原虫を蛍光染色することで測定用試料を調製し、測定用試料をフローサイトメータに導入し、シースフロー中を流れる細胞に励起光を照射し、細胞が発する散乱光と蛍光を測定し、散乱光強度と蛍光強度によりマラリア原虫と他の細胞成分を弁別する方法が、特許文献１に開示されている。
【０００５】
また、第一の蛍光色素としてオーラミンO類似体、第二の蛍光色素として特定の縮合ベンゼン誘導体を用い、マラリア感染赤血球を染色して測定用試料を調製し、測定用試料をフローサイトメータに導入し、シースフロー中を流れる細胞に励起光を照射し、細胞が発する前方散乱光と蛍光の強度によりマラリア感染赤血球の検出を行う方法が特許文献２に記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−７５８９２号公報
【特許文献２】特開平６−３００７５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記特許文献１や特許文献２に開示された方法とは異なる光学的情報の組合せを用いた新規な方法により、マラリア原虫の検出を簡易に行うことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、血液中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させた測定用試料を調製し、前記調製した測定用試料に光を照射し、前記光を照射された測定用試料から、第一の散乱光、及び第一の散乱光と散乱の角度が異なる第二の散乱光を検出し、前記検出した第一の散乱光及び第二の散乱光に基づき、測定用試料中のマラリア原虫を検出する、マラリア原虫測定方法を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、血液中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させた測定用試料を調製する測定用試料調製部、前記調製された測定用試料を流すためのフローセル、フローセル中を流れる測定用試料に光を照射するための光源、前記光を照射されたフローセル中の測定用試料から、第一の散乱光を検出する第一の検出器、前記第一の散乱光とは散乱の角度が異なる第二の散乱光を検出する第二の検出器、前記第一の検出器が検出した第一の散乱光、及び前記第二の検出器が検出した第二の散乱光に基づき、測定用試料中のマラリア原虫を検出する制御部、を有するマラリア原虫測定装置を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来技術とは異なる光学的情報の組合せを用いることにより、マラリア原虫の検出を簡易に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施形態にかかるマラリア原虫測定装置による血液検体の測定について説明するが、本発明はこれに限定されるわけではない。
【００１２】
概要
本例のマラリア原虫測定装置は、フローサイトメトリー法を応用したものである。検体としては、ヒトの血液を用いる。マラリア原虫測定装置において、まず所定量の検体と試薬（希釈液及び溶血剤）を混合することにより、測定用試料を調製する。測定用試料の調製においては、溶血剤の作用によって検体中の赤血球が溶血し、赤血球内に寄生しているマラリア原虫が液中に遊離する。次に、測定用試料をフローセルに流し、そのフローセル中を流れる測定用試料にレーザー光を照射する。そして、レーザー光を照射された測定用試料から発せられる散乱光を受光素子により受光・光電変換して電気信号として検出し、検出した電気信号を解析することにより検体中のマラリア原虫を検出、計数する。
【００１３】
試薬
本例のマラリア原虫測定装置において測定用試料を調製するために用いる試薬（溶血剤及び希釈液）は以下のものを用いた。
【００１４】
溶血剤としては、自動血球分析装置用溶血剤として市販されているシスメックス株式会社製ストマトライザ-FB(II)を用いた。この溶血剤には、カチオン系界面活性剤の一種である第四級アンモニウム塩が含まれている。この第四級アンモニウム塩の作用により血液中の赤血球を溶血する。
【００１５】
また、希釈液としては、自動血球計数装置用希釈液として市販されているシスメックス株式会社製セルパックを用いた。
【００１６】
マラリア原虫測定装置
図１は、マラリア原虫測定装置１００の外観を示したものである。装置の前面には、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１０１、後述する試料調製部２００を覆うカバー１０２、スタートスイッチ１０３を備えている。図２はマラリア原虫測定装置１００の内部構成を示したものである。装置の右側のスペースには、装置の動作や解析処理を司る制御部４００が備えられている。装置の左下のスペースには、試料液から信号を検出するための検出部３００が備えられている。また残りのスペースに、試料液を調製するための試料調製部２００が備えられている。
【００１７】
以下、試料調製部２００、検出部３００、制御部４００の各部について説明する。
【００１８】
試料調製部２００の構成
図３は試料調製部２００を示す説明図である。試料調製部２００は、手前右側に検体セット部２２１、手前左側に試薬セット部２２２、奥側にインキュベータ２２３を備えている。また分注装置２２４を備えている。操作者が前記図１のカバー１０２を開けることにより、図３に示した試料調製部２００が現れる。試料調製部２００において、検体セット部２２１には、検体の入った検体容器２２５をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３には、反応容器２２６をセットするよう構成されている。また試薬セット部２２２には、溶血剤の入った試薬容器２２７、希釈液が入った試薬容器２３１をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３は、セットされた反応容器２２６の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌するよう構成されている。分注装置２２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって前後・上下・左右に移動可能に構成されている。試料容器２３３は、後述する検出部３００のフローセル３０１と接続されている。
【００１９】
検出部３００の構成
図４は検出部３００の構成を示す説明図である。検出部３００は、試料液を流すためのフローセル３０１を有する。フローセル３０１は、レーザー光が照射される部分であり内部流路が細く絞られているオリフィス部３０２、試料液をオリフィス部に向かって上方へ噴射するノズル３０３、シース液供給口３０４、排液口３０５を有する。また検出部３００は、レーザー光を照射するためのレーザー光源３０６を有する。レーザー光源３０６は、波長６３３ｎｍのレーザー光を出射する赤色半導体レーザー光源である。検出部３００はさらに、レーザー光源から照射されたレーザー光をフローセル３０１へ集光するコンデンサレンズ３０７、レーザー光を照射された試料液から発せられた前方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトダイオード３０８、フォトダイオード３０８へ前方散乱光を集光するためのコレクタレンズ３０９とピンホール３１０、レーザー光を照射された試料液から発せられた側方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトマルチプライヤチューブ３１１、フォトマルチプライヤチューブ３１１へ側方散乱光を集光するためのコレクタレンズ３１２、フィルタ３１３、ピンホール３１４、フォトダイオード３０８やフォトマルチプライヤチューブ３１１から出力された電気信号を増幅し、前方散乱光信号及び側方散乱光信号として制御部４００へ出力するアンプ３１５、３１６を有する。
【００２０】
本例において、前記フォトダイオード３０８は前方散乱光を検出するため、レーザー光源３０６からフローセル３０１に入射するレーザー光の光軸の延長線方向に散乱した散乱光を検出できる位置に配置されている。一方、前記フォトマルチプライヤチューブ３１１は側方散乱光を検出するため、レーザー光源３０６からフローセル３０１に入射するレーザー光の光軸と略直角に交わる方向に散乱した散乱光を検出できる位置に配置されている。前方散乱光は、試料液中に含まれるマラリア原虫や血球といった被検粒子の大きさを反映する。側方散乱光は、被検粒子内部における密度や特定の物質の有無といった内部情報、或いは被検粒子の表面状態を反映する。
【００２１】
制御部４００の構成
図５は制御部４００の構成、及び制御部４００と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４００は、メモリ４０１、中央演算処理装置（ＣＰＵ）４０２、検出部３００から送られた信号を処理する信号処理回路４０３、マラリア原虫測定装置１００の装置各部の動作を制御するための動作制御回路４０４を有する。メモリ４０１は、試料中に含まれるマラリア原虫や血球等の粒子から得た信号の解析に関する解析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを記憶している。また、信号処理回路４０３により処理されたデータや、解析プログラムによる処理結果を記憶する。ＣＰＵ４０２は、メモリ４０１から読み出された解析プログラムや制御プログラムを実行し、検出部３００において試料液から検出された信号を処理・解析したり、装置各部の動作を制御するための信号を動作制御回路４０４に送ったりする。解析プログラムによる解析結果は、液晶タッチパネル１０１に出力される。
【００２２】
以下、マラリア原虫測定装置１００の動作の詳細につき説明する。図６は、制御プログラムによるマラリア原虫測定装置１の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１０３を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（測定用試料液の調製）、ステップＳ２（粒子信号の検出）、ステップＳ３（粒子信号の解析）が順次実行される。これにより、試料調製部２００、検出部３００、制御部４００の各部が制御され、マラリア原虫測定装置１００の一連の動作が自動的に実行される。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３による装置各部の動作を以下に説明する。
【００２３】
ステップＳ１（測定用試料液の調製）
ステップＳ１では、試料調製部２００が制御され、測定用試料の調製が実行される。ステップＳ１における試料調製部２００の動作を、図３を用いて説明する。まず分注装置２２４は、試薬セット部２２２の試薬容器２２７から５５μＬの溶血剤を吸引し、反応容器２２６に分注する。次に、分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から希釈液を９４５μＬ吸引し、溶血剤の入った反応容器２２６に分注する。次に検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体を２０μＬ吸引し、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・希釈液・溶血剤が入った反応容器２２６内の液温を４０℃に保ったまま１４秒間撹拌し、検体に溶血処理を施す。このようにして調製した測定用試料液を分注装置２２４が吸引し、試料容器２３３に供給する。試料容器２３３に供給された測定用試料液は、検出部３００のフローセル３０１に流される。
【００２４】
ステップＳ２（粒子信号の検出）
ステップＳ２では、検出部３００が制御され、測定用試料液中の粒子から、各粒子の特徴を反映する信号が検出される。ステップＳ２における検出部３００の動作を、図４を用いて説明する。前記の通り試料容器２３３に試料液が供給されると、図示しないポンプやバルブの動作により試料液がノズル３０３へ導かれる。そして試料液がノズル３０３からフローセル３０１に吐出される。それと同時にシース液が、図示しないシース液容器からシース液供給口３０４を介してフローセル３０１に供給される。これによって試料液は、フローセル３０１内でシース液に包まれ、更にオリフィス部３０２で細く絞られて流れる。試料液の流れを細く絞り込むことにより、試料液に含まれるマラリア原虫や血球等の粒子を一列に整列させてオリフィス部３０２に流すことができる。オリフィス部３０２を流れる試料液に対し、レーザー光源３０６から出射されたレーザー光がコンデンサレンズ３０７で絞られて照射される。レーザー光を受けた試料液中の粒子から発せられた前方散乱光はコレクタレンズ３０９により集光される。そしてピンホール３１０を通過した前方散乱光は、フォトダイオード３０８で受光、光電変換されてパルス状の前方散乱光信号となる。レーザー光を受けた試料液中の粒子から発せられた側方散乱光は、コレクタレンズ３１２により集光される。そしてフィルタ３１３、ピンホール３１４を通過した側方散乱光は、フォトマルチプライヤチューブ３１１で受光、光電変換されてパルス状の側方散乱光信号となる。前方散乱光信号及び側方散乱光信号は、各粒子の特徴を反映する粒子信号として、それぞれアンプ３１５・３１６で増幅され、制御部４００へ送られる。
【００２５】
ステップＳ３（粒子信号の解析）
ステップＳ２で検出され制御部４００に送られた粒子信号（前方散乱光信号及び側方散乱光信号）は、制御部４００が有する信号処理回路４０３に入力される。この信号処理回路４０３は、それぞれの粒子信号につき、所定の信号強度を超える部分を粒子検出信号とみなし、信号波形における粒子毎の信号強度のピーク値を算出する。これにより、試料中の各粒子につき、前方散乱光強度と側方散乱光強度が算出される。前方散乱光強度と側方散乱光強度は、粒子毎のデータとしてメモリ４０１に記憶される。
【００２６】
メモリ４０１に記憶された粒子毎の前方散乱光強度及び側方散乱光強度のデータは、メモリ４０１に予め記憶されている解析プログラムにより解析される。ＣＰＵ４０２に読み出されて実行される解析プログラムの各ステップにつき、図７のフローチャートを用いて説明する。
【００２７】
ステップＳ３１：メモリ４０１から、測定用試料中の各粒子に対応した前方散乱光強度及び側方散乱光強度のデータを取得する。
【００２８】
ステップＳ３２：前方散乱光強度及び側方散乱光強度のデータを二次元座標空間に展開し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度をパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成する。
【００２９】
ステップＳ３３：ステップＳ３２で作成した二次元スキャッタグラム上に、マラリア原虫に対応するドットが出現する領域Ｍを設定する。領域Ｍの座標データはメモリ４０１に予め記憶されており、本ステップにおいて解析プログラムによって読み出され、二次元スキャッタグラム上に適用される。なお領域Ｍの位置は、マラリア原虫を含有していることが予め顕微鏡検査等により確認された検体から得た前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づき定めたものである。
【００３０】
上記ステップＳ３３で作成された二次元スキャッタグラムの一例を、図８に示す。この二次元スキャッタグラムは、縦軸に前方散乱光強度を、横軸に側方散乱光強度をとっている。マラリア原虫に対応するドットが出現する領域Ｍが設定されている。前方散乱光強度は、被検粒子の大きさを反映する。また側方散乱光強度は、被検粒子内部における密度や特定の物質の有無といった内部情報、或いは被検粒子の表面状態を反映する。本発明者らは鋭意検討の結果、検体中のマラリア原虫と、それ以外の粒子（例えば溶血していない白血球、溶血した赤血球の残骸など）との間に、検出される前方散乱光強度及び側方散乱光強度に関して差が生じ、蛍光染色を用いずともマラリア原虫の検出が可能であることを見出した。図８において、領域Ｍの左側に出現しているドットの集団は、溶血した赤血球の残骸に対応するドットの集団である。また領域Ｍの上側に出現しているドットの集団は、白血球に対応するドットの集団である。
【００３１】
ステップＳ３４：領域Ｍにつき、領域内に出現しているドット数を計数する。領域Ｍ内に出現したドットの数は、試料液中のマラリア原虫の数を反映している。
【００３２】
ステップＳ３５：前記作成した二次元スキャッタグラム、算出したマラリア原虫数を、解析結果として液晶タッチパネル１０１に出力するためのデータを作成し、そのデータを液晶タッチパネル１０１に出力する。図９に、前記データが液晶タッチパネル１０１に出力された様子を示す。液晶タッチパネル１０１に、二次元スキャッタグラム、マラリア原虫数が、解析結果として表示されている。
【００３３】
測定結果の例
前記図８及び図１０はそれぞれ、上記に説明してきたマラリア原虫測定装置１００を用いて検体１・検体２を測定した結果得られた二次元スキャッタグラムである。検体１はマラリア感染患者から採取した血液である。また検体２は健常者から採取した血液である。検体１を測定した結果得られた図８の二次元スキャッタグラムにおいて、領域Ｍ内にはマラリア原虫に対応するドットの集団が出現している。一方、検体２を測定した結果得られた図１０の二次元スキャッタグラムにおいて、領域Ｍ内にはドットがほとんど出現していない。このことから、マラリア原虫測定装置１００により検体中のマラリア原虫が確実に検出されていることがわかる。なお各二次元スキャッタグラムにおいて、領域Ｍの左側にドットの集団が出現している。これらのドットは、溶血処理により溶血した赤血球の残骸に対応するものである。また領域Ｍの上側に出現しているドットの集団は、白血球に対応するドットの集団である。
【００３４】
マラリア原虫の成育段階の判別
[背景技術]の欄にも説明したように、マラリア原虫は末梢血中でリングフォーム（輪状体:ring form）、トロポゾイト（栄養体:trophozoite）、シゾント（分裂体:schizont）と呼ばれる各成育段階を繰り返しながら増殖していく。以下、測定用試料中に含まれているマラリア原虫の成育段階を判別できるようにしたマラリア原虫測定装置１１０につき説明する。マラリア原虫測定装置１１０のハードウェア的な構成及び動作、使用する試薬の種類や量、測定用試料の調製から粒子信号の検出に至る装置の制御は、マラリア原虫測定装置１００と同様である。よって、以下マラリア原虫測定装置１１０について、粒子信号の解析から解析結果の出力に至る解析プログラムのフローにつき説明する。そのフローチャートを図１１に示す。マラリア原虫測定装置１１０において、マラリア原虫測定装置１００と共通する箇所については、同じ符号を用いて説明する。
【００３５】
ステップＳ４１：メモリ４０１から、測定用試料中の各粒子に対応した前方散乱光強度及び側方散乱光強度のデータを取得する。
【００３６】
ステップＳ４２：前方散乱光強度及び側方散乱光強度のデータを二次元座標空間に展開し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度をパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成する。
【００３７】
ステップＳ４３：ステップＳ４２で作成した二次元スキャッタグラム上に、マラリア原虫のうちリングフォームに対応するドットが出現する領域Ｒ、トロポゾイトに対応するドットが出現する領域Ｔ、シゾントに対応するドットが出現する領域Ｓを設定する。領域Ｒ、Ｔ、Ｓの各座標データはメモリ４０１に予め記憶されており、本ステップにおいて解析プログラムによって読み出され、二次元スキャッタグラム上に適用される。なお領域Ｒ、Ｔ、Ｓの位置は、それぞれリングフォームを含有している検体、トロポゾイトを含有している検体、トロポゾイトを含有している検体から得た前方散乱光強度及び側方散乱光強度に基づき定めたものである。
【００３８】
上記ステップＳ４３で作成された二次元スキャッタグラムの一例を、図１２に示す。この二次元スキャッタグラムは、縦軸に前方散乱光強度を、横軸に側方散乱光強度をとっている。マラリア原虫の各成育段階に対応するドットが出現する領域Ｒ、Ｔ、Ｓが設定されている。前記の通り、前方散乱光強度は、被検粒子の大きさを反映する。また側方散乱光強度は、被検粒子内部における密度や特定の物質の有無といった内部情報、或いは被検粒子の表面状態を反映する。本発明者らは鋭意検討の結果、マラリア原虫における各成育ステージ毎に、検出される前方散乱光強度及び側方散乱光強度に関して差が生じ、蛍光染色を用いずにマラリア原虫の成育段階の判断が可能であることを見出した。
【００３９】
ステップＳ４４：領域Ｒ、Ｔ、Ｓにつき、各領域内に出現しているドット数を計数し、各成育段階のマラリア原虫を計数する。また領域Ｒ、Ｔ、Ｓ内に出現したドット数の合計を算出し、総マラリア原虫数を算出する。
【００４０】
ステップＳ４５：前記作成した二次元スキャッタグラム、算出した各成育段階のマラリア原虫数、及び総マラリア原虫数を解析結果として液晶タッチパネル１０１に出力するためのデータを作成し、そのデータを液晶タッチパネル１０１に出力する。図１３に、前記データが液晶タッチパネル１０１に出力された様子を示す。液晶タッチパネル１０１に、二次元スキャッタグラム、各成育段階（リングフォーム、トロポゾイト、シゾント）のマラリア原虫数、及び総マラリア原虫数が、解析結果として表示されている。
【００４１】
測定結果の例
前記図１２、図１４及び図１５はそれぞれ、上記に説明してきたマラリア原虫測定装置１１０を用いて検体３、検体４、検体５を測定した結果得られた二次元スキャッタグラムである。検体３は健常者から採取した血液に、培養したマラリア原虫を添加したものである。検体４は、健常者から採取した血液に、培養したマラリア原虫（但しリングフォームのみ）を添加したものである。検体５は、健常者から採取した血液である。検体３を測定した結果得られた図１２の二次元スキャッタグラムにおいて、領域Ｒ、Ｔ、Ｓのそれぞれにドットが出現している。検体４を測定した結果得られた図１４の二次元スキャッタグラムにおいては、領域Ｒ内にはリングフォームに対応するドットの集団が出現している。しかし領域Ｔ、領域Ｓ内にはほとんどドットが出現していない。検体５を測定した結果得られた図１５の二次元スキャッタグラムにおいて、領域Ｒ、Ｔ、Ｓ内にはほとんどドットが出現していない。このことから、上記に説明したマラリア原虫測定装置１１０は、検体中のマラリア原虫を確実に検出するとともに、特定の成育段階のマラリア原虫（上記例の場合はリングフォーム）を確実に検出していることがわかる。
【００４２】
上記各例のマラリア原虫測定装置では、前方散乱光及び側方散乱光の二種類の散乱光に基づき測定用試料中のマラリア原虫の検出を行っており、蛍光の検出は行っていない。そのため上記で用いた測定用試薬は、赤血球を溶血するための溶血剤を含んでいるが、検体中の物質を蛍光染色するための蛍光色素は含んでいない。すなわち上記各例では蛍光色素を含む染色液が不要なので、測定に必要な試薬の種類の低減、測定用試料の調製にかかる手間や時間の低減が可能になる。また従来、蛍光を検出する際は微弱な光を検出するための高感度な検出器が必要であったが、上記各例のマラリア原虫測定装置においてはそのような検出器が必要なくなる。また従来、自動測定装置において、測定に用いた蛍光色素が装置内の流体系に残存すると、次回の測定の結果に影響を及ぼす場合あるため、流体系の洗浄を充分に行う必要があったが、上記各例のマラリア原虫測定装置においては蛍光色素の使用を必須としないため、装置内の洗浄作業をより簡易なものとすることができ、ランニングコストの削減、装置構成の簡素化を図ることができる。なお、マラリア原虫と併せて別の測定対象物質を検出したり、或いはマラリア原虫の検出の精度を高める目的で、散乱光とは別の情報を併せて測定用試料から検出し、解析に用いてもよい。この場合には、蛍光色素を含む染色液により検体に蛍光染色処理を施し、測定用試料液から二種類の散乱光と併せて蛍光を検出するようにしてもよい。
【００４３】
上記各例のマラリア原虫測定装置では、カチオン系界面活性剤である第四級アンモニウム塩を含有する溶血剤を用いた。しかし使用可能な溶血剤は必ずしもこれに限られない。赤血球を溶血させる作用のある物質として溶血剤に含まれるものとしては、上記各例で用いた第四級アンモニウム塩以外でも、カチオン系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、或いはアニオン系界面活性剤といった各種の界面活性剤から選択して用いることができる。これらの物質は、溶血処理時の濃度において、血液検体中の赤血球を充分に溶血させるものであり、且つ遊離したマラリア原虫に過度のダメージを与えないものであればよい。また上記各例のマラリア原虫測定装置においては、マラリア原虫測定用の試薬として溶血剤と希釈液を別々の液として用意し、測定用試料を調製する段階でそれらを混合している。このように、マラリア原虫測定用試薬を、複数の液からなる試薬キットとして構成してもよい。しかし本発明の装置や方法に用いる試薬の構成は必ずしもこれに限られず、溶血剤と希釈液を予め混合しておき、一液からなるマラリア原虫測定用試薬としてもよい。
【００４４】
上記各例のマラリア原虫測定装置では、測定用試料液を照射するための光源として半導体レーザー光源を用いているが、本発明においてはこれに限らず、アルゴンイオンレーザー光源に代表される気体レーザー光源を用いることも可能である。
【００４５】
上記各例のマラリア原虫測定装置では、前方散乱光として、レーザー光源３０６からフローセル３０１に入射するレーザー光の光軸の延長線方向に散乱した散乱光を検出している。しかし前方散乱光としては、必ずしもフローセル３０１に入射するレーザー光の光軸の延長線方向に散乱した散乱光に限らず、被検粒子の大きさを反映するものであれば他の角度に散乱した散乱光でもよい。また上記各例のマラリア原虫測定装置では、側方散乱光として、レーザー光源３０６からフローセル３０１に入射するレーザー光の光軸と略直角に交わる方向に散乱した散乱光を検出している。しかし側方散乱光としては、必ずしもフローセル３０１に入射するレーザー光の光軸と略直角に交わる方向に散乱した散乱光に限らず、被検粒子の内部情報、或いは表面状態を反映するものであれば他の角度に散乱した散乱光でもよい。例えば、前記光軸から略直角に交わる方向でなくとも、前記前方散乱光より大きな角度で散乱する散乱光を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の外観を説明する図である。
【図２】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の内部構成を説明する図である。
【図３】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の試料調製部を説明する図である。
【図４】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の検出部を説明する図である。
【図５】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の制御部を説明する図である。
【図６】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の全体制御を説明するフローチャートである。
【図７】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により実行される解析プログラムの各ステップを説明するフローチャートである。
【図８】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。
【図９】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の液晶タッチパネルに、解析の結果が表示された様子を示す図である。
【図１０】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。
【図１１】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により実行される解析プログラムの各ステップを説明するフローチャートである。
【図１２】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。
【図１３】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置の液晶タッチパネルに、解析の結果が表示された様子を示す図である。
【図１４】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。
【図１５】この発明の一実施形態であるマラリア原虫測定装置により作成された二次元スキャッタグラムの一例を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
１００  マラリア原虫測定装置
２００  試料調製部
３００  検出部
４００  制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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