(57)【要約】  【課題】実用的な２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンの分解には、従来とは別の微生物を用いた分解の速い新規の方法の提供が望まれている。本発明の課題は、ダイオキシン類、特に最も毒性の高い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンの微生物による分解方法を提供することである。  【解決手段】Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）を用いることを特徴とする芳香族化合物の分解方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）を用いることを特徴とする芳香族化合物の分解方法。
【請求項２】
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）由来のカルバゾール分解遺伝子を用いることを特徴とする芳香族化合物の分解方法。
【請求項３】
芳香族化合物が四塩素化ダイオキシンである請求項１または２記載の分解方法。
【請求項４】
芳香族化合物がベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、フルオレン、フルオランテン、キサンテン、フエノキサチインである請求項１または２記載の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物を用いた四塩素化ダイオキシンの分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ダイオキシンに代表されるダイオキシン類は人体に有害な環境汚染物質として知られている。ことに、高度に難分解性であり、しかも最も毒性の高い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンに対しては、物理化学的処理などにより分解することが可能であるが、環境中では低濃度で存在しており、その処理を低コストで効率的に行うための手法としてはバイオレメディエーションによる処理が期待されている。
【０００３】
しかしながら、これまでに見つかっているダイオキシン類を分解する微生物のうち、シュードモナス属（特許文献１）やコリネバクテリウム属（特許文献２）等の細菌類は、その反応処理速度は速いが、毒性のきわめて低い塩素置換数３以下のダイオキシン類を分解する例が報告されているのみである。
メタン生成細菌やアクレモニウム属のカビ（特許文献３）は高塩素のダイオキシン類を脱塩素的に分解するが、それら高塩素化ダイオキシンの脱塩素の結果、より毒性の高いダイオキシン類が生成・蓄積する可能性を否定できない。
担子菌カワラタケ科に属する白色腐朽菌に分類される新規なＭＴ００３によるダイオキシンの分解方法が開示されている（特許文献４）。四塩素化ダイオキシンのみならず、５〜８個の塩素で置換されたダイオキシンを高率で分解するが、本担子菌はキノコであるので、その使用には制限される問題がある。
また、白色腐朽菌に属するカビは高塩素化ダイオキシン類から低塩素化ダイオキシンまで分解することが可能であるが、その反応には１週間以上を要する。
【特許文献１】特開２００２−７５３号公報
【特許文献２】特開２００３−１５３６８６号公報
【特許文献３】特開２００２−５８４７２号公報
【特許文献４】特開２００２−２５３２０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、実用的な２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンの分解には、別の微生物を用いた新規の分解方法の提供が望まれている。本発明の課題は、ダイオキシン類、特に最も毒性の高い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンの微生物による分解方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討の結果、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１株が四塩化ダイオキシン及びその他の芳香族化合物を優れて分解することを見出し、本発明を完成させた
従って、本発明の第一は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）を用いることを特徴とする芳香族化合物の分解方法に関する。
本発明の第二は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）由来のプラスミドｐＣＡＲ３を用いることを特徴とする芳香族化合物の分解方法に関する。
本発明の第三は、芳香族化合物が四塩素化ダイオキシンである第一または第二の発明記載の分解方法に関する。
本発明の第四は、芳香族化合物がベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、フルオレン、フルオランテン、キサンテン、フエノキサチインである第一または第二の発明記載の分解方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、環境中でごく低濃度に存在する四塩素化ダイオキシンを、常温・常圧で、しかも安価に分解することができる。しかも、発現した酵素の性質上、環境中に共存する多塩素化ダイオキシンに作用することにより毒性度の高いダイオキシンを生成する心配が全くない。その結果、環境汚染物質を安全に無害化することが可能となる。さらに、本菌株はダイオキシン以外にも広範な芳香族化合物に対して分解性を有するため、塩素化ダイオキシンと油に同時に汚染された河川水、下水、海水、土壌の処理に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明者により、自然界よりカルバゾール資化菌として単離されたスフィンゴモナス属細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＡ１株が一塩化及び二塩化ジベンゾ−パラ−ダイオキシンを分解することを既に見出されている（Ｈ．Ｈａｂｅ  ｅｔ．ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２１１（２００２）４３−４９）。さらに本発明者らは、当該菌株からカルバゾール分解遺伝子がコードされているプラスミドｐＣＡＲ３を抽出し、そのＤＮＡ配列の詳細な構造を決定することに成功した（野尻  秀昭ら、「Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＫＡ１株のダイオキシン・カルバゾール（ＣＡＲ）分解プラスミドｐＣＡＲの全塩基配列決定」、日本農芸化学会２００４年度大会講演要旨集）。このｐＣＡＲ３が自然に欠落したＫＡ１株の変異株は全くカルバゾールに生育することができず、ｐＣＡＲ３にカルバゾール分解遺伝子がコードされていることを見出した。さらに、本願発明にてこのプラスミドを有したＫＡ１株が２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンを分解することを見出した。
本発明に関わるプラスミドは、常法により分離が可能であるが、ＱＩＡＧＥＮ社のｌａｒｇｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｋｉｔを用い、キットの示すａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａの方法を用いると比較的簡便である。
【０００８】
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンを分解する微生物としては、スフィンゴモナス属細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＡ１株を使用するのが好ましいが，プラスミドｐＣＡＲ３を他の微生物，例えば根粒菌等に導入することにより、土壌中の四塩素化ダイオキシンの分解に適宜利用することができる。
ＫＡ１株により、ダイオキシンは水酸基が２つ付加した、水溶性の高い、低毒性のジオール体に変換、分解されるので、環境浄化に好適であり、ＫＡ１株の利用価値は高い。
また、本発明者らはＫＡ１株が石油等に含まれる分解困難な芳香族化合物を分解することを見出した。具体的には、べンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、フルオレン、フルオランテン、キサンテン、フエノキサチインなどの様々な単環、複環、ヘテロ環芳香族化合物をＫＡ１株は分解した。従って、本発明のもう一つの側面は、スフィンゴモナス属細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＡ１株を用いて、ダイオキシンとともに、芳香族化合物を分解する方法である。芳香族化合物として、べンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、フルオレン、フルオランテン、キサンテン、フエノキサチインなどの様々な単環、複環、ヘテロ環芳香族化合物が好ましいが、化合物の種類に特に限定はない。
芳香族化合物はＫＡ１株により、水酸基が２つ付加した、水溶性の高いジオール体に変換、分解されるので、環境浄化に好適である。
なお、スフィンゴモナス属細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＡ１株は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４である。
以下、本発明を実施例により説明する。
【実施例１】
【０００９】
ダイオキシンの分解様式
５００ｍｌ容坂口フラスコに無機培地（１リットル当りＮａ２ＨＰＯ４  ２．２ｇ，  ＫＨ２ＰＯ４  ０．８ｇ，  ＮＨ４ＮＯ３  ３．０ｇ，  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ，  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ５０ｍｇ，  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ）１００ｍｌとカルバゾール０．１gを入れ、スフィンゴモナス属細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＡ１株菌体（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）一白金耳接種し、３０℃で３０時間、振盪培養を行った。得られた菌体を、遠心集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄後、同緩衝液にＯＤ600＝１．５となるよう懸濁した。このように調整したＫＡ１株懸濁液５ｍｌに、ジベンゾ−パラ−ダイオキシンを５０μｇ添加、３０℃にて１８時間振盪後、酢酸エチル５ｍｌにて抽出した。この５μｌにＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を５μｌ添加し、７０℃で２０分間保持し、生成物のトリメチルシリル化を行い、この１μｌをガスクロマトグラフィー質量分析機を用いて下記の条件で分析したところ、２，２，３−トリヒドロキシジフェニルエーテルトリメチルシリル化誘導体の生成が確認された。この結果よりジベンゾ−パラ−ダイオキシンが２，２，３−トリヒドロキシジフェニルエーテルに変換されることが確認できた。
カラム：ＤＢ−５、カラム長１５ｍ、カラム直径０．２５ｍｍ  ガスクロマトグラフイー質量分析ＪＭＳＡＭ１５０（ＪＥＯＬ社製）
試料導入温度：２５０℃  カラム温度  昇温条件８０℃×２分、１６℃／分×１３３分
このように、本発明に係る微生物は、ジベンゾ−パラ−ダイオキシンすなわちダイオキシン骨格を破壊する能力を有することがわかる。
【実施例２】
【００１０】
四塩素化ダイオキシンに対する分解性
上記のように調製した菌体に２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシンを１ｎｇ添加、３０℃にて１８時間振とうした。コントロールとしては、ＫＡ１株を、ＬＢ培地で継代培養することにより、自然出現したカルバゾール資化能欠損株（ＫＡ１Ｗ株）を用いた。これらのサンプルは残存基質を抽出・定量し分解率１３％という結果を得た。
このように、細菌に四塩素化ダイオキシンを作用させ、その分解を検出した例は他になく、本菌株が既に知られている他の細菌と比較して極めて高いダイオキシン分解能力を有することがわかる。
【実施例３】
【００１１】
芳香族化合物の分解性  
実施例１と同様に調製した菌体にべンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、フルオレン、フルオランテン、キサンテン、フエノキサチインなどの様々な単環、複環、ヘテロ環芳香族化合物をそれぞれ５０μｇ添加し、実施例１と同様な方法で反応させ、生成物を抽出、分析した。その結果、ジベンゾフラン及びジベンゾチオフェンを除くこれらの化合物はそれぞれのジヒドロジオール体へ変換され、ジベンゾフランはトリヒドロキシビフェニルとジベンゾフランジヒドロジオール、ジベンゾチオフェンはジベンゾチオフェンジヒドロジオールおよびジベンゾチオフェン−５−オキサイドへ変換された。従って、本菌株はダイオキシン以外にも幅広い化合物に対して分解能力を有することがわかる。