(57)【要約】      （修正有）【課題】クルクミンの配糖化に有効に使用できる糖転移酵素及びその遺伝子を提供する。さらに、当該クルクミンの配糖化方法を提供する。【解決手段】下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなる新規糖転移酵素：（ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、（ｂ）特定のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質、及びこれをコードする遺伝子。当該糖供与体の存在下で、上記酵素をクルクミンに反応させることによって、クルクミンの配糖体を調製することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなる新規糖転移酵素：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなる新規糖転移酵素：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
少なくともグルコース転移酵素活性を有するものである、請求項１または２に記載の新規糖転移酵素。
【請求項４】
下記（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載する遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載する組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載する形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から糖転移酵素を採取することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載する新規糖転移酵素の製造方法。
【請求項９】
フェノール性化合物を、糖ヌクレオチドの存在下、請求項１乃至３のいずれかに記載する新規糖転移酵素、請求項７または８に記載する形質転換体、または当該形質転換体の培養物若しくはその処理物と反応させる工程を有する、フェノール性化合物の配糖体の製造方法。
【請求項１０】
フェノール性化合物がcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideである請求項９に記載する配糖体の製造方法。
【請求項１１】
配糖体が、curcumin 4'-O-β-D-glucoside またはcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucosideである請求項１０に記載する配糖体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な糖転移酵素に関する。より詳細には、本発明はニチニチソウに由来する新規な糖転移酵素、特にグルコース転移酵素に関する。また本発明は、当該糖転移酵素の製造方法、並びに当該製造方法に利用される糖転移酵素の遺伝子、この遺伝子を有するベクター及び形質転換体に関する。さらに、本発明は当該糖転移酵素、または上記形質転換体から産生される組み換え糖転移酵素を用いた配糖体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、植物細胞のもつ特定の酵素機能を利用して、外来性の化合物の構造を修飾することを内容とする生物転換（バイオトランスフォーメーション）が、培養植物細胞による有用物質生産の一分野として研究されている。種々の天然・非天然化合物に糖を抱合して配糖体を生産する配糖化も、このようなバイオトランスフォーメーションの重要なターゲットである。配糖化は、しばしば、毒性、不安定性または難溶性ゆえに、有用性が認められながらもその有効利用が図られていない物質について、毒性減少、安定性増大または水溶性の増大のために、従来より試みられている手法である（非特許文献１及び２）。特に、一般的に配糖体を化学的に合成することは困難であるため、植物細胞の糖転移酵素を利用した配糖体の生産は注目されている研究分野である。
【０００３】
これまでに植物化学者らによって、少なくとも70000種もの植物由来の天然配糖体が同定されている（非特許文献３）。それらの配糖体の生合成には、UDP（uridine 5'-diphosphate）によって活性化された糖を低分子基質に転位するUDP-glycosyltransferase（UGTase）が関わっている。当該UGTaseは植物内に多数存在し（例えば、Cazyデータベース参照、[http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/]）、配糖体などの二次代謝産物の生合成、並びに植物ホルモンの放出制御（非特許文献４及び５）や、外来異物の代謝（非特許文献６及び７）など、植物組織の中で多くの役割を担っている。全ゲノム配列が解読されたシロイヌナズナのゲノム中には100を超えるUGTase遺伝子が存在していることが明らかにされているように（非特許文献８）、植物には多種多様のUGTaseが進化の過程で様々な基質特性を獲得していると推察される。UGTaseの基質特異性を決定している機構についても研究が進められているが（非特許文献９及び１０）、未だ未解明な部分が多い。
【０００４】
ところで、化学の発展並びに国民の健康及び天然物指向に伴い、再評価されつつある化合物としてクルクミン（curcumin）がある。クルクミンはショウガ科ウコンの根茎に含まれるジアリルヘプタノイド構造を有する化合物であり、民間薬としてはアルコール性肝障害に用いられており(非特許文献１１)、食品分野では黄色色素として利用されている。また、その抗酸化活性（非特許文献１２及び１３）、抗炎症活性（非特許文献１４）、抗腫瘍活性（非特許文献１５及び１６）、抗リューシュマニア活性（非特許文献１７）、血管新生阻害活性（非特許文献１８）などについても研究されている。さらに、ラットの脳においてamyloid βによって誘導される酸化的障害を抑制することから、アルツハイマー病に対する薬物としての可能性も示唆されている（非特許文献１９）。
【０００５】
しかしながら、クルクミンはその生理活性が注目されながらも水に難溶性であり、しかも光や弱アルカリ条件下で分解され易い性質を有するため（非特許文献２０及び２１）、利用できる範囲が限られるといった問題を有している。
【０００６】
水に難溶性のクルクミンを水溶化する技術として、Tφnnesenらによってイオン性や非イオン性のシクロデキストリンを用いることが提案されている（非特許文献２２）。具体的には、当該文献には11％濃度のメチル化β-シクロデキストリンの添加によってクルクミンの水溶性（30pmol/mL）が26,000倍も上昇することが示されている。
【０００７】
また、クルクミンは配糖化によって水溶性が向上することも知られている（例えば、非特許文献２３及び２４など）。具体的には、非特許文献２３には、ルチンをcyclodextrin glucanotransferaseによって配糖化することによって水溶性が5000倍上昇することが記載されている。また、非特許文献２４には、クルクミンをモノグルコシド体（curcumin 4'-O-glucoside(CG5)）とすることで水溶性が240倍に、さらにジグルコシド体とすることで、curcumin 4'-O-gentiobioside(CG4)は約10,000倍、curcumin 4,4'-O-diglucoside(CG3)は約50,000倍も水溶性が上昇することが記載されている。ラットにクルクミンを食餌すると、クルクミンは腸管壁にてcurcumin glucuronideに変換され、さらに肝臓において硫酸抱合を受けることが知られていることから（非特許文献２５）、クルクミンの配糖体はクルクミンの水溶化だけでなく、クルクミンのプロドラッグとしての可能性を秘めるものである。
【０００８】
クルクミンの配糖化方法としては、上記酵素的な方法の他、クルクミンとα-D-acetyl-bromo-glucoseとの縮合反応を利用した化学合成法が知られている（特許文献１）。しかし、その収率はクルクミンモノグルコサイド（curcumin 4'-O-glucoside(CG5)）については８％、クルクミンジグルコサイド（curcumin 4'-O-gentiobioside(CG4)）については３％と極めて低い。また、磯部らによってvanillin-O-tetraacetylglucosideを利用した効率的化学合成法が提案されているが、それでも収率は、クルクミンモノグルコサイド（CG5）については35％、クルクミンジグルコサイド（CG4）についても21％と、格段に向上したというものでもない（非特許文献２６）。
【非特許文献１】Takahashi T., et al., (1997) Taxol-sialyl conjugate. Bioorg Med Chem Lett. 8, 113-116
【非特許文献２】Kometani T., et al., (1993), Biosci Biotechnol and Biochem. 57, 2192-2193
【非特許文献３】Harborne JB., et al., (1988) in The Flavonoids: Advances in Research science 1980 (Harborne JB. ed) pp.303-328, Chapman and Hall Ltd., London
【非特許文献４】Szerszen JB., et al., (1994) Science 265, 1669-1701
【非特許文献５】Jackson RG., et al., (2001) J Biol Chem. 276, 4350-4356
【非特許文献６】Gaillard C., et al., FEBS Lett. 352, 219-212
【非特許文献７】Jones P., et al., (2001) Planta. 213, 164-174
【非特許文献８】Li Y., et al., (2001) J Biol Chem. 276, 4338-4343
【非特許文献９】Hefner T., et al., (2003) Eur J Biochem., 270, 533-538
【非特許文献１０】Lim EK., et al., (2002), J Biol Chem. 277, 586-592
【非特許文献１１】Nanji AA., (2003), Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G321-327
【非特許文献１２】Reddy AC., et al., (1994) Mol Cell Biochem, 137, 1-8
【非特許文献１３】Das KC., et al., (2002) Biochem Biophys Res Commun, 295, 62-66
【非特許文献１４】Bharti AC., (2003) Blood 101, 1053-1062
【非特許文献１５】Ammon HPT., et al., Planta Med. 57, 1-7
【非特許文献１６】Kawamori T., et al., (1999) Cancer Res. 99, 597-601
【非特許文献１７】Gomes DCF., et al., (2002) Arzeim-Forschh. 52, 695-698
【非特許文献１８】Gururaj AE., (2002) Molecular Mechamisms of anti-angiogenic effect of curcumin. 297, 934-942
【非特許文献１９】Frauschy SA., et al., (2001), Neurobiol Aging. 22, 993-1005
【非特許文献２０】坂元史歩ら、(1998)、日本食品化学学会誌、5,57-63
【非特許文献２１】Wang YJ., et al., (1997),"Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products" J Pharm Biomed Anal
【非特許文献２２】Tφnnesen HH., et al., (2002) Int J Pharm. 244, 127-135
【非特許文献２３】Suzuki Y., et al., (1991) Agric Biol Chem.55, 181-187
【非特許文献２４】Yasuhisa Kaminaga, et al., (2003) FEBS Letter 555, 311-316
【非特許文献２５】Asai A, et al., (2000) Life Sci. 67, 2785-2793
【非特許文献２６】Mohri K., et al., (2003) Chem Pharm Bull.51, 1268-1272
【特許文献１】ドイツ国特許出願、（2002） DE2337
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規な糖転移酵素及びその遺伝子を提供することである。さらに本発明は、当該糖転移酵素を生産する方法、並びに当該酵素の生産に使用される、糖転移酵素の遺伝子を含む発現ベクターや形質転換体を提供することを目的とする。さらに本発明は、上記糖転移酵素を利用したフェノール性化合物の配糖化方法、特にクルクミンの配糖化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題の解決を目指して日夜研究を進めていたところ、ニチニチソウ培養細胞のcDNAライブラリーからPCRクローニングによって単離した糖転移酵素（UDP-Glycosyltransferase（UGTase））のcDNAの発現生成物が、クルクミン（curcumin）を基質として、curcumin 4'-O-β-D-glucoside、及びcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucosideへと、順次配糖化することを見いだし、当該糖転移酵素を利用することによって、クルクミンを効率よく配糖化でき、クルクミンの水溶化を図ることができることを確認した。また、本発明者らは、当該糖転移酵素は基質特異性が広く、クルクミンだけでなくフェノール性化合物を広く基質として配糖化できることを見いだした。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記項１〜項５に掲げる糖転移酵素である：
項１．  下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなる新規糖転移酵素：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質。
項２．下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなる新規糖転移酵素：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
項３．少なくともグルコース転移酵素活性を有するものである、項１または２に記載の新規糖転移酵素。
項４．ガラクトース転移酵素活性を有する、項１乃至３のいずれかに記載の新規糖転移酵素。
項５．アミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有し、且つcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質からなる項１乃至４のいずれかに記載する新規糖転移酵素。
【００１２】
また、本発明は、下記項６〜項１０に掲げる糖転移酵素の遺伝子である：
項６．下記（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質。
項７．下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡからなる遺伝子：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、curcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
項８．タンパク質が少なくともグルコース転移酵素活性を有するものである、項６または７に記載の遺伝子。
項９．タンパク質がガラクトース転移酵素活性を有するものである、項６乃至８のいずれかに記載の遺伝子。
項１０．アミノ酸配列が、配列番号１に示すアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有し、且つcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideを配糖化する活性を有するタンパク質をコードする項６乃至９のいずれかに記載の遺伝子。
【００１３】
さらに、本発明は下記に掲げる組み換えベクター、並びに当該組み換えベクターを含む形質転換体である：
項１１．項６乃至項１０のいずれかに記載する遺伝子を含有する組み換えベクター。
項１２．項１１に記載する組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【００１４】
また、本発明は下記に掲げる新規糖転移酵素の製造方法である：
項１３．項１２に記載する形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から糖転移酵素を採取することを特徴とする、項１乃至５のいずれかに記載する新規糖転移酵素の製造方法。
項１４．フェノール性化合物を、項１乃至５のいずれかに記載する新規糖転移酵素、項１２に記載する形質転換体の培養物、当該培養物から分離された形質転換体、または当該形質転換体処理物の存在下、糖ヌクレオチドと反応させる工程を有する、フェノール性化合物の配糖体の製造方法。
項１５．フェノール性化合物がcurcumin、curcumin 4'-O-β-D-glucoside、esculetin、scopoletin、p-nitrophenol、またはvanillinである項１４に記載する配糖体の製造方法。
項１６．フェノール性化合物がcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucosideである項１４に記載する配糖体の製造方法。
項１７．配糖体が、curcumin 4'-O-β-D-glucoside またはcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucosideである項１５に記載する配糖体の製造方法。
項１８．糖ヌクレオチドが、UDP-グルコースまたはUDP-ガラクトースである項１４乃至１７のいずれかに記載する配糖体の製造方法。
【００１５】
なお、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さは特に制限されるものではない。従って、本明細書でいう「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）及び該正鎖に対して相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖、逆鎖）、並びに合成ＤＮＡが含まれ、さらに「遺伝子」にはＲＮＡも含まれる。また「遺伝子」または「ＤＮＡ」は、本発明の効果を保有する限りにおいて、コード領域以外に、例えば発現制御領域、シグナル領域、エキソン、イントロンを含むことができる。
【００１６】
また、特に言及しない限り、本発明でいう「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生理学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体または誘導体など、本明細書では「機能的同等物」ともいう）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が含まれる。本明細書では、かかる「遺伝子」または「ＤＮＡ」を、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。かかる「ホモログ」としては、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の相補鎖に対して、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。例えば、同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、本発明の遺伝子の由来生物であるキョウチクトウ科ニチニチソウ（Catharanthus roseus）以外の他の植物や他の生物種に由来する対応の遺伝子を例示することができる。
【００１７】
本発明でいう「酵素」または「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列で示される「酵素」または「タンパク質」だけでなく、これらと同等な生理学的機能を有する「酵素」または「タンパク質」（例えば、同族体、変異体または誘導体などの「機能的同等物」）が含まれる。例えば、同族体（機能的同等物）としては、本発明の「酵素」または「タンパク質」の由来生物であるキョウチクトウ科ニチニチソウ（Catharanthus roseus）以外の他の植物や他の生物種に由来する対応の「酵素」または「タンパク質」を例示することができる。また、変異体（機能的同等物）には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加または挿入等されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が含まれる。なお、かかる同族体や変異体等の「機能的同等物」としては、特定のアミノ酸配列（配列番号１）で特定される酵素またはタンパク質と、アミノ酸配列において少なくとも６５％、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、より更に好ましくは８５％以上、一層好ましくは９０％以上、より一層好ましくは９５％以上相同なものを挙げることができる。
【００１８】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００１９】
（１）糖転移酵素
本発明は、新規な糖転移酵素、より詳細には、UDP-glycosyltransferase（以下、「UGTase」という）に関する。糖転移酵素（UGTase）には、グルコースを転移して対象物にグルコース鎖を付加する活性を有するグルコース転移酵素、ガラクトースを転移して対象物にガラクトース鎖を付加する活性を有するガラクトース転移酵素、N-アセチルグルコサミンを転移して対象物にN-アセチルグルコサミン鎖を付加する活性を有するN-アセチルグルコサミン転移酵素、N-アセチルガラクトサミンを転移して対象物にN-アセチルガラクトサミン鎖を付加する活性を有するN-アセチルガラクトサミン転移酵素、またはグルクロン酸を転移して対象物にグルクロン酸基を付加する活性を有するグルクロン酸転移酵素が含まれる。本発明が対象とする糖転移酵素（UGTase）は、好ましくは、少なくとも上記のグルコース転移酵素（UDP-glucose glycosyltransferase）活性を有するものである。また、本発明の糖転移酵素（UGTase）には、上記のグルコース転移酵素（UDP-glucose glycosyltransferase）活性を有し、且つ他の上記糖転移酵素活性、例えばガラクトース転移酵素などを有するものであってもよい。
【００２０】
なお、上記酵素による糖転移には、糖供与体として、ヌクレオチドの結合によって活性化された糖ヌクレオチドが使用される。具体的には、グルコースの供与体してUDP-グルコース（Uridine 5'-diphospho-α-D-glucose）、ガラクトースの供与体してUDP-ガラクトース（Uridine 5'-diphospho-α-D-galactose）、N-アセチルグルコサミンの供与体としてUDP-N-アセチルグルコサミン（Uridine 5'-diphospho-α-D-N-acetylglucosamine）、N-アセチルガラクトサミンの供与体としてUDP-N-アセチルガラクトサミン（Uridine 5'-diphospho-α-D-N-acetylgalactosamine）、グルクロン酸の供与体としてUDP-グルクロン酸を、それぞれ挙げることができる。
【００２１】
本発明が対象とする糖転移酵素は、少なくとも、下式：
【００２２】
【化１】
2005312325.tif 000002
で示されるクルクミンの4'位または4"位のいずれか１つの部位、好ましくは２つの部位に糖鎖を導入する活性（配糖化活性）を有するか、または、下式：
【００２３】
【化２】
2005312325.tif 000003
で示されるcurcumin 4'-O-β-D-glucoside（以下、単に「クルクミンモノグルコサイド」か「CG5」という場合がある）の4"位に糖鎖を導入する活性（配糖化活性）を有するものである。
【００２４】
かかる糖鎖としてグルコースを好適に挙げることができる。なお、本発明の糖転移酵素は、好ましくは上記糖鎖として少なくともグルコースを導入する活性を有するものであればよく、他の糖鎖を導入する活性の有無を特に問うものではない。他の糖鎖としては、ガラクトース、グルクロン酸、またはN-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、好ましくはガラクトースを挙げることができる。
【００２５】
かかる特性を有する本発明の糖転移酵素として、好ましくは配列表：配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、本発明の糖転移酵素は、かかる特定のアミノ酸配列を有するものに制限されず、その機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、少なくとも前述するcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucoside（CG5）に対する配糖化活性を有するタンパク質を挙げることができる。より好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列とアミノ酸配列において６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、一層好ましくは９０％以上、より一層好ましくは９５％以上の同一性を有し、且つcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucoside（CG5）を配糖化する活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２６】
また、本発明の糖転移酵素には、配列表：配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質、並びにその機能的同等物が含まれる。ここで機能的同等物としては、配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ホモログ）によってコードされるタンパク質であって、且つcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucoside（CG5）に対する配糖化活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２７】
なお、ここで配列番号２に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件（いわゆるこれが「ストリンジェントな条件」）として、通常「2×SSC、0.1％SDS、室温」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄しても、上記配列番号２に示される塩基配列の相補鎖とハイブリダイズ状態を維持するものは、上記本発明でいうホモログに含まれる。特に制限されないが、厳しいハイブリダイズ条件として「1×SSC、0.1％SDS、45℃」程度、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.2×SSC、0.1％SDS、60℃」、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。斯くして得られるホモログは、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも６５％、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するものである。
【００２８】
なお、本発明の糖転移酵素は、本発明で開示するアミノ酸配列に基づいて化学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。遺伝子工学的手法による製造方法の詳細については、後述する。また、アミノ酸配列における改変は、当業界において既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法（Current Protocols I molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish, John Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を用いて、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加などの変異を導入することによって行うことができる。
【００２９】
（２）糖転移酵素の遺伝子
本発明はまた、上記糖転移酵素の遺伝子を提供する。なお、ここでいう遺伝子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡならびにＲＮＡが含まれる。
【００３０】
当該遺伝子は、前述する糖転移酵素（タンパク質）をコードする塩基配列を有するものであればよい。具体的には、配列表；配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、並びにそのホモログを挙げることができる。ここでホモログとしては、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質（糖転移酵素）と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。なお、機能的に同等とは、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質（糖転移酵素）と同様に、少なくともcurcuminまたはcurcumin 4'-O-β-D-glucoside（CG5）に対する配糖化活性を有することを意味する。かかるホモログとして、具体的には、配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。ストリンジェント
な条件としては、前述のものを同様に挙げることができる。なお、本発明の遺伝子は、実施例で示すように、ニチニチソウ等の植物やその他の生物から単離取得することもできるが、それ以外の方法として、化学的な合成、または長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの方法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７、植物のＰＣＲ実験プロトコール、1997、秀潤社、p.95-100）などを採用することによって、調製することができる。
【００３１】
（３）組み換えベクター
本発明は、上記糖転移酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターを提供する。当該組み換えベクターは、糖転移酵素をコードする遺伝子を、所望の宿主細胞内で発現可能な状態で含んでおり、当該宿主細胞を形質転換するために使用される。ゆえに、本発明の組み換えベクターは、かかる宿主細胞の形質転換が達成できる形態を有するものであればよく、例えばプラスミド、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンの形態を有するものであってもよい。
【００３２】
本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、宿主として大腸菌や枯草菌などの細菌を使用する場合、一般に、少なくともプロモーター−オペレーター領域（プロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合領域（SD領域）を含む）、開始コドン、本発明の糖転移酵素をコードするＤＮＡ、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を有する。また、酵母等の真菌細胞または動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、一般に、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド及び本発明の糖転移酵素をコードするＤＮＡ、及び終止コドンを有する。また、本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、必要に応じて、エンハンサーなどのシスエレメント、本発明の糖転移酵素をコードするＤＮＡの5'側または3'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、複製可能単位、相同領域、選択マーカーを含むことができる。これらのエレメントは、本発明の糖転移酵素をコードする遺伝子の発現に用いられる宿主に対応したものであれば、特に制限されず、当業界の技術常識に基づいて選択することができる。
【００３３】
なお、選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば遺伝子発現に使用される宿主が細菌の場合は、薬剤抵抗性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子など）、宿主が細菌以外の例えば酵母などの場合は、栄養要求性遺伝子（例えば、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４など）などを始めとする公知の各種選択マーカーを利用することができる。
【００３４】
本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、簡便には、上記本発明の糖転移酵素をコードするＤＮＡを、公知の発現用ベクターに、目的の糖転移酵素が発現可能な状態で導入することによって、具体的にはプロモーターの下流に導入することによって作成することができる。かかる導入は、ＤＮＡ組み換えの一般的な方法、例えばMolecular Cloning. （3rd. ed., 2001）(Cold Spring Harbor Lab.)に記載の方法に従って行うことができる。
【００３５】
発現用ベクターとしては、プラスミドベクターとして、例えばpRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112またはpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター；pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101またはpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター；大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396またはpTrc99AなどのColE系プラスミド；pACYC177またはpACYC184などのp1A系プラスミド；pMW118、pMW119、pMW218またはpMW219などのpSC101系プラスミドなど）；枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5など）を挙げることができる。またファージベクターとして、λファージ（Charon 4A, Charon21A, EMBL4, λgt100, gt11, zap）、ψX174、M13mp18、M13mp19などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしてはTy因子などを挙げることができる。また、融合タンパク質として発現する発現ベクター、例えばpGEXシリーズ（ファルマシア製）、pMALシリーズ（New England Biolabs社製）を使用することもできる。
【００３６】
本発明の実施例では、本発明の糖転移酵素のORF領域を、pMAL-c2X系プラスミドベクター（New England Biolabs社製）（tacプロモーター、MalE遺伝子、マルチプルクローニングサイト、アンピシリン耐性遺伝子、M13オリジン等を含む）のMalE遺伝子の下流域に位置するマルチプルクローニングサイトに導入することによって、本発明の糖転移酵素をマルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質として作成している。当該pMAL-c2X系プラスミドベクターは、pMAL-p2X系プラスミドベクター（New England Biolabs社製）から、MalE signal sequenceを除去したものであり、pMAL-p2X系プラスミドベクターも同様に使用することができる。制限はされないが、これらpMALシリーズ（New England Biolabs社製）によれば、大腸菌中で、外来遺伝子として連結された本発明の糖転移酵素の遺伝子を効率的に転写及び翻訳することができるtacプロモーターが導入されており、またIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)により高発現が可能である。
【００３７】
（４）形質転換体
本発明はまた、宿主細胞に上記組み換えベクターを導入して形質転換されてなる形質転換体を提供する。
【００３８】
組み換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）方法は、特に制限されず、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、コンピテント細胞法（J.Mol.Biol.,53,154,1970）、Kushner法、接合法、プロトプラスト融合（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，X75，1929，1970）、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈澱法(Science, 221, 551, 1983)、DEAEデキストラン法（Science, 215, 166, 1982）、アグロバクテリウム法、ウイルスベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）、ＰＥＧ法、インビトロパッケージング法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，72，581，1975）、マイクロインジェクション法（Exp. Cell. Res., 153, 347, 1984）など、導入する宿主細胞の種類や組み換えベクターの形態に応じて、適宜選択することができる。
【００３９】
宿主細胞としては、大腸菌（E.coli）や枯草菌(Bacillus subtilis)などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、sf9やsf21などの昆虫細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）などの動物細胞、ニチニチソウ、サツマイモやタバコなどの植物細胞を挙げることができる。好ましくは、大腸菌や枯草菌などの細菌、及び酵母である。
【００４０】
なお、発現ベクターの宿主細胞内での存在様式は、特に制限されず、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれてもよいし、またプラスミド状態で存在していてもよい。
【００４１】
（５）新規糖転移酵素の製造方法
斯くして得られた形質転換体は、宿主に応じて適切な培地中で培養されることによって、本発明の新規糖転移酵素を産生することができる。本発明は、かかる形質転換体を利用した新規糖転移酵素の製造方法を提供するものである。当該方法は、具体的には、上記の形質転換体を培地で培養し、得られた培養物から、糖転移酵素を採取することによって実施することができる。
【００４２】
培地には上記形質転換体の生育に必須な炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、薬剤などが含有される。炭素源としてはグルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトースが；窒素源としては硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムなどの無機窒素、並びにカゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン及びビーフ抽出物などの有機窒素源；無機塩としては例えば二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等；ビタミンとしてはビタミンＢ１を始めとする各種のビタミン；薬剤としてはアンピシリン、ネオマイシン、シクロヘキシミド、テトラマイシンなどの各種抗生物質を挙げることができる。なお、これらは一例であり、これらに制限はされない。また、必要に応じて、ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）などの発現誘導物質を用いることもできる。
【００４３】
培地の一例としては、宿主が大腸菌などのグラム陰性菌、または枯草菌などのグラム陽性菌といった細菌の場合は、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（J. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972. p.431)などが；また宿主が酵母の場合、ＹＰＤ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glucose）、ＹＰＧ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Glycerol ）、ＹＰＭ培地（１％ Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Methanol)、ＹＰＤＭ培地（１％Bacto Yeast Extract, ２％ Bacto Peptone, ２％ Dextrose,２％ Methanol)、０．１〜５％メタノールを含有したＹＮＢ液体培地〔０．７％ Yeast NitrogenBase(Difco社）〕、及び０．０１〜５％メタノールを含有したＹＰ培地〔１％ Bacto Yeast Extract(Difco社) , ２％ Poly Peptone(大五栄養社）〕、及びＳＭＭ培地 (２％ Methanol,０．５％ CH 3 COONH 4 -synthetic medium)などが例示される。
【００４４】
培養は、通常１０〜４５℃の温度範囲で数〜３６０時間程度実施され、必要に応じて通気、攪拌を加えることもできる。培養温度は、宿主に応じて設定できるため、特に制限されないが、好ましくは１８〜４２℃、より好ましくは２５〜４０℃の範囲で実施することができる。
【００４５】
本発明の糖転移酵素の製造方法は、さらに、斯くして得られる培養物から目的の糖転移酵素（タンパク質）を採取することによって実施される。目的タンパク質の採取は、培養後、培養上清中または形質転換体（菌体）中に蓄積された、目的のタンパク質を公知の方法で抽出し、また必要に応じて精製することによって行うことができる。分離精製は、例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手法を組み合わせて行うことができる。
【００４６】
（６）配糖体の製造方法
本発明はさらにフェノール性化合物の配糖化方法、言い換えればフェノール性化合物の配糖体の製造方法を提供する。
【００４７】
ここでフェノール性化合物とは、フェノール基を有する化合物を広く意味するものであるが、具体的には、下式で示されるp-nitrophenol：
【００４８】
【化３】
2005312325.tif 000004
vanillin:
【００４９】
【化４】
2005312325.tif 000005
esculetin：
【００５０】
【化５】
2005312325.tif 000006
scopoletin：
【００５１】
【化６】
2005312325.tif 000007
curcumin：
【００５２】
【化７】
2005312325.tif 000008
およびcurcumin 4'-O-β-D-glucoside (CG5)：
【００５３】
【化８】
2005312325.tif 000009
を挙げることができる。
【００５４】
本発明の配糖体の製造方法は、具体的には糖供与体の存在下で、上記フェノール性化合物を本発明の糖転移酵素と反応することによって実施することができる。なお、ここで用いる糖転移酵素は、その精製度を問うものではなく、粗精製物であってもよい。粗精製物としては、本発明の糖転移酵素を発現するように調製された前述の形質転換体の培養物、またはその培養物の処理物を挙げることができる。ここで培養物の処理物には、例えば目的の糖転換酵素が培養液中に放出される場合は、形質転換体を培養して得られる培養物を濾過または遠心することによって得られる培養濾液または培養上清（粗酵素溶液）、及び当該培養濾液または培養上清を精製処理して得られる精製酵素もしくは粗精製酵素が含まれる。また、目的の糖転換酵素が形質転換体のペリプラズム及び細胞質内に蓄積する場合は、培養物から当該形質転換体を回収し、当該形質転換体の細胞膜または細胞壁を超音波またはライソザイムなどで処理して得られる処理物が含まれる。また、本発明の製造方法で用いられる糖転移酵素は、例えばアクリルアミド、グラスビーズ、樹脂などに常法により固定化した状態で使用することもできる。
【００５５】
なお、本発明の配糖体の製造方法は、本発明の形質転換体が糖転移酵素を発現し産生する条件であれば、糖供与体の存在下、上記糖転移酵素（粗精製酵素を含む）に代えて、本発明の形質転換体を用いて行うこともできる。
【００５６】
反応に用いる糖供与体としては、糖ヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、グルコースの供与体してUDP-グルコース（Uridine 5'-diphospho-α-D-glucose）、ガラクトースの供与体してUDP-ガラクトース（Uridine 5'-diphospho-α-D-galactose）、N-アセチルグルコサミンの供与体としてUDP-N-アセチルグルコサミン（Uridine 5'-diphospho-α-D-N-acetylglucosamine）、N-アセチルガラクトサミンの供与体としてUDP-N-アセチルガラクトサミン（Uridine 5'-diphospho-α-D-N-acetylgalactosamine）、グルクロン酸の供与体としてUDP-グルクロン酸を、それぞれ挙げることができる。好ましくはUDP-グルコース、及びUDP-ガラクトースであり、より好ましくはUDP-グルコースである。
【００５７】
すなわち、本発明は、糖供与体として、UDP-グルコースまたはUDP-ガラクトースを用いることによって、フェノール性化合物のグルコシル化またはガラクトシル化に好適に使用することができる。言い換えれば、本発明は、フェノール性化合物のグルコース配糖体またはガラクトース配糖体の製造方法として好適に使用することができる。好ましくはフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法である。
【００５８】
例えば、上記フェノール性化合物のグルコース配糖体としては、p-nitrophenolについてはp-nitrophenyl-β-D-glucoside、vanillinについてはglucovanillin、
esculetinについてはesculin、scopoletinについてはscopolin、curcuminについてはcurcumin 4'-O-β-D-glucoside(CG5)及びcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside（CG3）、並びにcurcumin 4'-O-β-D-glucoside (CG5)についてはcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside(CG3)を挙げることができる。
【００５９】
本発明の配糖体の製造方法は、配糖化する対象（基質）のフェノール性化合物を、糖供与体の存在下、本発明の糖転移酵素（または形質転換体）と反応させることにより実施することができる。この反応は、通常、水または緩衝液のような水性媒体の中で実施することができる。当該水性媒体（反応液）のｐＨ、反応温度、反応時間、基質（フェノール性化合物）の濃度などといった各種の反応条件は、配糖化する対象のフェノール性化合物の種類や、反応に使用する糖転移酵素（または形質転換体）の状態などによって変わり得る。一般に、反応は、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９；５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃；０.５〜５０時間、好ましくは０.５〜１０時間程度、を目安として実施することができる。
【００６０】
反応混液中、基質としてのフェノール性化合物の濃度は、制限はされないが、通常0.1〜5 μmol/mlの範囲で適宜調整することができる。また糖供与体である糖ヌクレオチドの濃度は、制限されないが、通常0.6〜2.5 μmol/mlの範囲で適宜調整することができる。
【００６１】
斯くして製造されるフェノール性化合物の配糖体は、さらに上記反応混液から慣用の方法、例えば逆相カラムなどを装着した液体クロマトグラフィーなどを利用して単離し、精製されてもよい。
【発明の効果】
【００６２】
本発明によれば、フェノール性化合物、特にウコンの色素成分（クルクミン）の配糖化に好適に利用することができる、新規な糖転移酵素、並びにその遺伝子を提供することができる。さらに本発明は、その糖転移酵素の工業的な生産を可能とする遺伝子工学的な製造方法を提供することができる。本発明によって提供される糖転移酵素によれば、フェノール性化合物、特に食品や医薬分野において有用でありながらも、難溶性ゆえに用途が限られていたクルクミンを配糖化することができ、それによってその水溶性を増大させることができる。
【００６３】
ゆえに、本発明は、クルクミン配糖体の効率のよい製造方法、言い換えれば水性クルクミンの効率のよい製造方法を提供するものである。
【００６４】
かかる方法で調製されるクルクミンの配糖体（curcumin 4'-O-β-D-glucoside(CG5)及びcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside（CG3））は、水または水溶液に高い溶解度をもって可溶性である。さらに、クルクミンはアルカリ性の条件下で、本来の黄色の色調が赤く変化するという性質を有するものであるが、その配糖体であるcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside（CG3）は、ｐＨに関わらず、安定した色調（黄色）を維持することができる。
【００６５】
かかるクルクミン配糖体を用いることによって、水溶性で、高い色価を有するウコン色素製剤を提供することができる。このため、当該ウコン色素製剤によれば優れた着色力（発色性）を発揮することができる。かかる水性ウコン色素製剤は、例えば水を原料の１つとして用いて調製される飲食物、化粧品、医薬品、医薬部外品及び飼料などといった水性製品の着色料として有効に使用することができる。さらに当該水性ウコン色素製剤は、酸性条件下でも不溶物（濁りや析出物）を生じることなく安定した溶解性を有し、また中でも色素成分としてcurcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside（CG3）を用いる場合は、液性によって色調が変わらず、安定した色調（黄色）を有するため、従来のクルクミンを色素成分とするウコン色素では安定性や色調の点から使用が困難であった酸性やアルカリ性の飲食物、例えば乳酸菌飲料、炭酸飲料、果実飲料、酸性清涼飲料または漬け物などの酸性飲食物の着色にも有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に限定されるものではない。
【００６７】
実施例１  ニチニチソウ由来UDT-glycosyltransferase （UGTase）cDNAのクローニング（図１参照）
いくつかの植物のUGTase（UDT-glycosyltransferase）のアミノ酸配列におけるC末端側部分のアライメントを図２に示す。図２に示すように、植物の第二次代謝関連UGTaseには、よく保存されたドメインである「PSPG-Box」がある（図２の斜線のブロック内が「PSPG-Box」である）。PSPG-Box内でも特に保存されたアミノ酸配列として「HCGWNS」を選択し、これをもとに、degenerate primerとして UGT2mF（5'-TT(T/C)(T/C/G)TI(A/T)(G/C)ICA(T/C)TG(T/C)GGITGGAA：Iはinosine、例えば、（T/C）はTとCの混合物を示す；配列番号３）を設計した。このプライマーとライブラリーベクター〔λZAP IIベクター（Stratagene）〕のinsert 3'-下流側に共通して存在するプライマー（M13 forward プライマー）を用いて、methyl jasmonate（MJ）処理したニチニチソウ培養細胞を用いて作成したcDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行い、UGTase cDNAの3'断片を増幅した。なお、cDNAライブラリーは、MJ処理したニチニチソウ培養細胞から抽出したmRNAを材料として、λZAP-cDNA Synthesis Kit/Gigapack II Gold Packaing Extract (Stratagene)を用いて常法に従って作成した。上記PCRの結果、得られた約500bpの増幅産物（DNA断片）を、pCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen）に、プロトコールに従ってサブクローニングした。次いで得られたクローンのうち、無作為に選択した30個のクローンについてシークエンスを行い、得られた塩基配列についてBlastXを用いたデータベース検索を行った。その結果、30個中８個のクローンが植物由来のUGTaseに近似した塩基配列を有していることが分かった。
【００６８】
それらは、5'末端側の塩基配列に基づいて２つ（CaUGT1、CaUGT2）に分けることができた。解析した８個のクローンのうち１個は5'末端側に「TGGCATT」の塩基配列を有しており、これを「CaUGT1」と、また残りの７個は5'末端側に「GGGTGGA」の塩基配列を有しており、これを「CaUGT2」と命名した。これから、「CaUGT2」がMJ-inducibleなUGTaseであることが示唆された。
【００６９】
CaUGT1及びCaUGT2の塩基配列にそれぞれ特異的なプライマーをreverse primer（CaUGT1, 5'-CCCTGTTGTTCAGCATAGAGT [配列番号４]; CaUGT2 5'-TTGGCCGGAGGATTCAAGGG [配列番号５]）として、またライブラリーベクターのinsert 5'-上流側に存在する共通プライマー（T3プライマー）をforward primer（5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG [配列番号６]）として、PCRを行うことにより、CaUGT1及びCaUGT2の5'側フラグメントを得た。さらに、これらを組み合わせることにより、CaUGT1及びCaUGT2の各々について全長ORFを含むcDNAクローンを単離した。
【００７０】
CaUGT1について得られたcDNA塩基配列（配列番号７）とそのORFによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号８）を図３に示す。図３中、四角で囲んだ領域がPSPG-box中の「HCGWNS」である。図３に示すように、CaUGT1は全長1669 bpの塩基配列を有し、480個のアミノ酸からなる蛋白質をコードするORFを含んでいた。推定分子量は54 kDであった。また、CaUGT2について得られたcDNA塩基配列（配列番号２）とそのORFによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１）を図４に示す。図４中、四角で囲んだ領域がPSPG-box中の「HCGWNS」である。図４に示すように、CaUGT2は全長1720 bpの塩基配列を有し、487個のアミノ酸からなる蛋白質をコードするORFを含んでいた。推定分子量は55 kDであった。CaUGT1とCaUGT2とは、アミノ酸配列において、27％の同一性を有していた。ホモロジー検索の結果、CaUGT1は、アミノ酸配列において、タバコ由来のUGTase(NYGT3)と56％の同一性を示し、またタバコ由来の2つのUGTase(NTGTlaとNTGTlb)と55%の同一性を示した(Taguchi G., et al., (2001) Eur J Biochem. 268, 4086-4094) のを始め、広範な基質特異性を有し、外来性異物に対するGulucose抱合に関与すると考えられている一連のUGTaseと高い相同性を示した。一方、CaUGT2は、アミノ酸配列において、タバコ由来のサリチル酸誘導性UGTase(IS5a)及びフェニルプロパノイドUGTaseと、それぞれ62%の同一性を示した(Frassinet-Tachet L., et al., (1998) FEBS Lett. 437, 319-323;  Horvath D., et al.,(1996) Plants Mol. Biol, 31, 1061-1072)。さらにCaUGT2は、アミノ酸配列において、ゲンチアナのanthocyanin 3'-glucosyltransferaseと61%の同一性を示した (Fukuchi-Mizutani, M., Okuhara, H., Fukui, Y., Nakao, M., Katsumoto, Y., Yonekura-Sakakibara, K., Kasumi, T., Hase, T. and Tanaka, Y. (2003) Plant Physiol. 132, 1652-1663.)。
【００７１】
これらのことから、ニチニチソウから単離されたCaUGT1とCaUGT2は、いずれも従来公知のUGTaseとは異なり、新規なUGTaseであることがわかった。
【００７２】
実施例２  植物由来UGT分子系統樹解析
高等植物UGTの分子系統樹では、各酵素が触媒する反応の性質と分子系統樹での位置が比較的よく一致していることが知られている(Vogt T. et al., (2000) Trends Plant Sci. 5, 380-386)。そこで実施例１で単離したCaUGT1およびCaUGT2、並びにいくつかの植物二次代謝に関連する他のUGTaseについて、その分子系統樹を構築した。なお、分子系統樹の構築には、Clastal X（http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html）及びPHYLIP解析ソフト（http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html）を用いた。
【００７３】
構築した分子系統樹を図５に示す。その結果、CaUGT1はタバコ(N.tabacum)由来のUGT1a(NtUGT1a)やUGT1b(NtUGT1b)(Taguchi G., et al., Eur J Biochem. 268, 4086-4094)、およびインドジャボク由来のarbutin synthase (Arend J., (2000)Phytochemistry. 53, 187-193)とクラスターを形成した。これらの酵素はhydroquinoneやnaphtol等の外来性異物の配糖化を触媒し、比較的広い基質特異性を有している。一方、CaUGT2の属するクラスターには、コガネバナ（Scutellaria baicalensis）由来のflavonoid 7-O-glucosyltransferase(F7GT)(Hirotani M.，et al., (2000) Planta. 210, 1006-1013)やリビングストンデージー(Dorotheanthus bellidiformis)由来のbetanidin 5-O-glucosyltransferase (B5GT) (Vogt T., et al., (1997) Planta. 203, 349-361)など比較的雑多な酵素で構成されていた。さらにこのクラスターにはkaempferol 3-O-rhamnosideやquercetin 3-O-rhamnosideを基質として7位にglucoseを抱合するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のUGT73C6も属していた。
【００７４】
以上のことから、CaUGT1はクルクミンをmonoglucosideに変換する反応を触媒し、またCaUGT2はクルクミンをdiglucosideに変換する反応を触媒するのではないかと推測された。
【００７５】
実施例３    Methyl jasmonate(MJ)で処理したニチニチソウ培養細胞のRNA解析
ニチニチソウ培養細胞におけるCaUGT1及びCaUGT2の発現が、当該細胞へのMethyl jasmonate(MJ)の添加によって誘導されるか否かを検討した。なお、CaUGT2のmRNAレベルはノーザンハイブリダイゼーションで測定した。一方、CaUGT1の mRNAレベルは、CaUGT2と比較して非常に低く、ノーザンハイブリダイゼーションでは検出できなかったので、RT-PCRを用いて解析した。
【００７６】
RNA濃度は、GeneQuant II (Pharmacia Biotech)を用いてUV260nmでの吸光度を測定して算出した。ノーザンハイブリダイゼーションは、TRIzol Reagent（Invitrogen）を用いて調製したTotal RNA（10μgあるいは30μg）を、0.66Ｍ ホルムアルデヒドを含む1.25％アガロースゲル電気泳動で分離し、Hybond-N+膜（Amersham）にブロッティングして行った。RT-PCRは、total RNA（500ng）を鋳型として、ReverTra Ace (TOYOBO)のキットを用いてプロトコールに従って行った。対照には、ニチニチソウ由来のHMG-CoA還元酵素遺伝子を利用した（Maldonado-Mendoza IE., et al., (1992) Plant Physiol.,100, 1613-1614）。
【００７７】
結果を図６に示す。図６（ａ）は、MJ添加ニチニチソウ培養細胞におけるCaUGT1のmRNA量の発現変化（RT-PCR）を、MJ添加直後（0時間）から、4時間後、8時間後、24時間後、及び48時間に亘り示したものである。コントロールとして、HMG-CoR（3-hydroxy-3-methylgltaryl CoA reductase)を用いた。図６（ｂ）は、MJ添加ニチニチソウ培養細胞におけるCaUGT2のmRNA量の発現変化（ノーザンハイブリダイゼーション）を、MJ添加直後（0時間）から、4時間後、8時間後、24時間後、及び48時間に亘り示したものである。
【００７８】
その結果、CaUGT1は、MJ添加前には発現していなかったが、MJ添加後4時間後には誘導され、8 時間後にほぼ最大に達し、その後48時間後まで発現量はほぼ一定であった。一方、CaUGT2 のmRNAはMJ添加前から検出されたものの、MJ添加後4 時間で急激に増加した。これらのことは、CaUGT1、及びCaUGT2のいずれもがMJ誘導性の遺伝子であることを示している。
【００７９】
実施例４    CaUGT1およびCaUGT2の大腸菌での発現
CaUGT1およびCaUGT2がクルクミンの配糖化反応を触媒するかどうかを明らかにするために、これらCaUGT1およびCaUGT2のORF領域のcDNAをpMAL-c2xベクター（New England Biolabs社製）にサブクローニングした。なお、pMAL-c2xベクターは、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードするmalE遺伝子を有しているベクターであるため、当該遺伝子の下流に目的遺伝子を導入することによってMBPとの融合タンパク質を発現することができる。さらに、pMAL-c2xベクターは、malE signal sequenceを欠いているため、生じた融合タンパク質（可溶性タンパク質）は細胞質内に発現される。
【００８０】
サブクローニングにあたり、CaUGT1はEcoRI及びHindIIIで、CaUGT2はBamHI及びSalIで切断した。シークエンスで配列を決定した後、大腸菌JM109株に導入した。斯くして調製した、組み換えE.coli- CaUGT1（MBP-CaUGT1融合タンパク質）及び組み換えE.coli-CaUGT2（MBP-CaUGT2融合タンパク質）、並びにpMAL-c2xベクターのみを導入したE.coli（コントロール）（E.coli-MBP）は、それぞれ２組ずつ準備して、carbenicillinを添加した2.5mL MMI培地にて37℃で18時間振盪培養し、さらにcarbenicillinを添加した100mL LB培地にて37℃で80分間振盪培養した。次いで、２組のうち１組の培地に、1 mMのIPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を添加し、さらに30℃で18時間振盪培養を行い、遺伝子発現を誘導した。IPTG添加によって遺伝子発現を誘導したもの（＋）と誘導しないもの（−）を、それぞれ電気泳動にかけた。なお、電気泳動は下記のようにして行った。
【００８１】
＜SDS-PAGE＞
(1) 試料の調製
上記の培養後、菌液を3500rpmで20分間遠心分離し、沈澱物をTE buffer 2mLで洗浄し、ボルテックスした後3500rpmで20分間遠心分離した。沈殿物は液体窒素で急冷し、使用するまで-75℃で保存した。使用時に、各菌体をTE buffer 1mLに懸濁後、液体窒素で凍結し、さらに37℃水溶中で融解し、かかる凍結と融解を２回繰り返した。その後、卵白由来lysozyme（和光純薬）を、終濃度200μg/mlとなるように添加して37℃で15分間インキュべーションした。これを、Hand Sonic UR-20P(Tomy Seiko)を用いて超音波破砕した（Sonication 15秒間＋氷冷15秒間のサイクルを８回）。これを10,000gで20分間遠心分離して、得られた上清を粗酵素液として、使用時まで４℃にて保存した。
【００８２】
(2) SDS-PAGE
SDS-PAGEは、Laemmliらの方法（Laemmli UK (1970), Nature. 227, 127-135）に従って行った。上記粗酵素液80mLをサンプル緩衝液20mLに溶解して、10分間95℃で煮沸後、SDS-PAGEに供し、パワーサプライ（ATTO社製AE-3113）を用いて電気泳動を行った（泳動条件：10%T ポリアクリルアミドゲル、C．V．150Voltage，1hr）。電気泳動後、ゲルをクマーシーブルー染色した。O/N脱色後、３時間乾燥して電気泳動像を撮影した。なお、サイズマーカーとして、SDS-PAGE MOLECULAR WEIGHT STANDARDS Low range (BIO-RAD)を用いた。
【００８３】
結果を図７に示す。図７からわかるように、組み換えE.coli-CaUGT1（図中、CaUGT1で示す）、組み換えE.coli- CaUGT2（図中、CaUGT2で示す）、及びコントロール（図中、MBPで示す）についてはいずれも、IPTG誘導（＋）によって予想された分子サイズを有する蛋白質が発現していることを確認した（図７中、矢印）。
【００８４】
実施例５    CaUGT1およびCaUGT2の組換え酵素（粗酵素液）によるクルクミンの配糖化反応
実施例４において、CaUGT1またはCaUGT2を発現させた大腸菌（組み換えE.coli-CaUGT1、組み換えE.coli-CaUGT2）から調製した粗酵素液について、UDP-glucose存在下で、クルクミンおよびクルクミンモノグルコサイドを基質として配糖化活性を調べた。具体的には、5mMの基質（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド）、4mMのUDP-glucose及び粗酵素液（タンパクとして20μg）を含む1M Tris-HCl (pH7.5) 100μlを、30℃で30分間反応させて、その後にメタノール200μl入れて反応を停止し、12,000gで10分間遠心分離して得た上清を、下記条件のHPLCにかけて、反応液中の反応生成物の量を、各標準品（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイド）を用いて作成した検量線から算出した。
【００８５】
＜ＨＰＬＣ条件＞
(1)クルクミン及びその配糖体
固定相：COSMOSIL 5C18-ARII column 4.6 x 150mm (ナカライテスク)
移動相：0-14min：40-79% MeOH, 14-15min：79-100% MeOH, 15-20min：100% MeOH 
流速：1.0 mL/min
測定波長：UV 423nm
Rt: クルクミン−15.8min、CG3−7.4min、CG5−11.8min。
【００８６】
結果を図８に示す。図８中、（ａ）は標準品（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイド）のクロマトグラム、（ｂ)及び（ｃ）は組み換えE.coli- CaUGT1から調製した粗酵素液（CaUGT1）を用いてそれぞれクルクミン及びクルクミンモノグルコサイドと反応させた反応液のクロマトグラム、（ｄ)及び（ｅ）は組み換えE.coli- CaUGT2から調製した粗酵素液（CaUGT2）を用いてそれぞれクルクミン及びクルクミンモノグルコサイドと反応させた反応液のクロマトグラムを示す。これからわかるように、CaUGT1による反応では、それらの配糖化産物（クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイドと）はほとんど検出されなかった(図８（ｂ）、（ｃ）)。一方、CaUGT2による反応では、クルクミンを基質とした場合は、30℃で60 minの反応でクルクミンモノグルコサイド（curcumin 4'-O-β-D-gulucoside [CG5]）および少量のクルクミンジグルコサイド（curcumin 4',4"-O-β-D-digulucoside [CG3]）の生成が認められ(図８（ｃ）)、またクルクミンモノグルコサイドを基質とした場合は、クルクミンジグルコサイド（CG3）の生成が認められた（(図８（ｄ））。このことから、CaUGT2はクルクミンに対して配糖化活性を有すると同時に、クルクミンモノグルコサイドに対しても配糖化活性を有していることがわかった。
【００８７】
そこでCaUGT2によるクルクミンの配糖化反応を経時的にさらに詳細に観察した。その結果を図９に示す。これによると、反応開始10 分後では主要な生成物はクルクミンモノグルコサイド（CG5）であったが、すでにクルクミンジグルコサイド（CG3）の生成も認められた。反応開始60分で基質であるクルクミンはほぼ消失し、クルクミンモノグルコサイド（CG5）とクルクミンジグルコサイド（CG3）が生成した。さらに120分後にはクルクミンジグルコサイド（CG3）の生成量がさらに増加し、これに対応してクルクミンモノグルコサイド（CG5）の量が減少していた。このことは、CaUGT2は、クルクミンを基質として、これをクルクミンモノグルコサイド（CG5）、及びクルクミンジグルコサイド（CG3）へと順次配糖化していることを示していた。なお、以上の試験から、クルクミン（１μmol）を基質としたCaUGT2の配糖化反応（1mLスケール）によって、クルクミンの74％が配糖化（最終的にはCG3にまで）されることが分かった。
【００８８】
なお、本実験では、CaUGT1およびCaUGT2には、グルコースの水酸基にさらに糖を抱合するgentiobiosideの生産活性は認められなかった。
【００８９】
実施例６   CaUGT2の基質特異性の検討
CaUGT2の基質特異性をより詳しく検討した。基質として種々のフェノール化合物（curcumin、curcumin monoglucoside（CG5）、esculetin、scopoletin、p-nitrophenol、vanillin）を、クルクミンを基質として用いた実施例５と同一の条件下で反応させ、反応液を実施例５と同様に処理して、下記条件のHPLCにかけ、反応液中に生成した各反応産物の量を、各標準品を用いて作成した検量線から算出した。
【００９０】
＜ＨＰＬＣ条件＞
(1) curcumin及びその配糖体（curcumin monoglucoside（CG5）、curcumin diglucoside（CG3））
固定相：COSMOSIL 5C18-ARII column 4.6 x 150mm (ナカライテスク)
移動相：0-14min：40-79% MeOH, 14-15min：79-100% MeOH, 15-20min：100% MeOH流速：1.0 mL/min
測定波長：UV 423nm
Rt: クルクミン−15.8min、CG3−7.4min、CG5−11.8min。
【００９１】
(2) esculetin、scopoletin及びそれらの配糖体（esculin、scopolin）
固定相：COSMOSIL 5C18-ARII column 4.6 x 150mm (ナカライテスク)
移動相：0-8min：0-35% MeOH, 8-9min：35-55% MeOH, 9-12min：55-100% MeOH, 12-13min：100% MeOH 
流速：1.0 mL/min
測定波長：UV 280nm
Rt: esculetin−11.0min、esculin−9.2min、scopoletin−8.4min、scopolin−5.1min。
【００９２】
(3) p-nitrophenol、vanillin 及びそれらの配糖体（p-nitrophenyl-β-D-glucoside、glucovanillin）
固定相：COSMOSIL 5C18-ARII column 4.6 x 150mm (ナカライテスク)
移動相：0-8min：20-55% MeOH, 8-9min：55-100% MeOH, 9-12min：100% MeOH
流速：1.0 mL/min
測定波長：UV 280nm
Rt: p-nitrophenol−10.1min、p-nitrophenyl-β-D-glucoside−5.4min、vanillin −6.0min、glucovanillin−4.3min。
【００９３】
各反応産物量を、クルクミンの反応産物量を100とした相対値で示した結果を図１０に示す。curcumin monoglucoside（CG5）を基質とした時の糖転移酵素活性は、クルクミンを基質としたときの約41％であった。また、単純なフェノール性物質である、esculetinは190％と、curcuminを基質とした場合の２倍近い活性を示した。また、その生成物は6位の水酸基のみが配糖化されたesculinのみであった。このことはクルクミンの2つの水酸基を順次配糖化するというCaUGT2の特性はクルクミンの特性に依存することを示している。さらにesculetinと構造が類似するscopoletinに対する活性はクルクミンの約84%と高く、p-nitorophenolが約38%、vanillinが約27%と続いた。
【００９４】
次に、CaUGT2の糖に対する基質特異性を検討する為に、実施例５の試験中、UDP-glucoseの代わりにUDP-galactoseを用いて、実施例５と同様にしてクルクミン（基質）の配糖化反応を試みた。結果を図１１に示す。この結果からわかるように、UDP-galactose を使用した場合も、UDP-glucoseを用いた場合(この場合の反応生成物量を100とする)に対して、約63％の生成物が生じることを確認した。このことから、CaUGT2によれば、クルクミンのgalactosideも生産可能であることが明らかになった(図１１)。
【００９５】
これらのことからCaUGT2は、クルクミンのみを配糖化するのではなく、フェノール性化合物について、比較的広い基質特異性を有することがわかる。
【００９６】
参考例１  クルクミン配糖体の水溶性評価
図１１に示すクルクミンとその各種配糖体（curcumin 4'-O-β-D-glucoside [CG5], curcumin 4'-O-β-D-gentiobioside [CG4], curcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside [CG3], curcumin 4'-O-β-D- gentiobioside 4"-O-β-D- glucoside [CG2], curcumin 4',4"-O-β-D-digentiobioside [CG1]）の、室温における飽和水溶液濃度を比較した。具体的には、クルクミンと上記CG1〜CG5の各クルクミン配糖体を、少量の水とともに24時間、暗黒下、25℃で振盪した後、12,000g×15分間遠心し、得られた上清を下記条件のHPLCに供して、上記化合物について室温における飽和水溶液濃度を換算した。
【００９７】
＜ＨＰＬＣ条件＞
固定相：COSMOSIL 5C18-ARII column 4.6 x 150mm (ナカライテスク)
移動相：0-14min：40-79% MeOH, 14-15min：79-100% MeOH, 15-20min：100% MeOH,流速：1.0 mL/min
測定波長：UV 423nm
Rt: クルクミン−15.8min、CG1−4.9min、CG2−6.0min、CG3−7.4min、CG4−10.2min、CG5−11.8min。
【００９８】
結果を表１に示す。なお、表中「水溶性」には、各化合物の水溶液中における飽和濃度を示す。また本試験ではクルクミンの飽和水溶液濃度が検出限界以下で測定できなかったので、表１にはクルクミンの飽和水溶液濃度として文献値を記載する（Tφnnessen H., et al., (2002) Int.J. pharma. 244, 127-135）
【００９９】
【表１】
2005312325.tif 000010
これからわかるように、クルクミンにグルコースが１分子結合したCG5は、クルクミンより約230倍も高い水溶性を有しており、グルコースが２分子結合したCG4及びCG3は、それぞれクルクミンより約240万倍及び1200万倍も高い水溶性を備えていた。またクルクミンにグルコースが３つまたは４つ結合したCG2及びCG1は、それぞれクルクミンより約1500万倍及び2200万倍も高い水溶性を備えていた。このことは、クルクミンの配糖化がクルクミンの水溶化に、極めて有効な手段であることを示している。
【０１００】
参考例２
クルクミンは、アルカリ条件下では、光吸収スペクトルが長波長側に移動する結果、色調が黄色から赤色に変化する。そこで、クルクミンの配糖体（curcumin monoglucoside（CG5）、curcumin diglucoside（CG3））について、アルカリ条件下での色調の変化を検討し、クルクミンの配糖化による安定化効果を評価した。具体的には、クルクミン、クルクミンモノグルコサイド（CG5）及びクルクミンジグルコサイド（CG3）について、中性条件（pH7）とNaOHを添加したアルカリ条件（pH10）で、色調とUVスペクトルを観察した。結果を図１２に示す。その結果、クルクミンモノグルコサイド（CG5）はクルクミンと同様に、アルカリ条件下で、光吸収スペクトルが長波長側に移動して色調が黄色から赤色に変化したが、クルクミンジグルコサイド（CG3）は、アルカリ条件下で光吸収スペクトルの移動はなく、色調も変化しなかった。このことから、クルクミンの4'位と4"位の両方を配糖化させることによって、アルカリ条件でも色調が変わることなく安定化させることができることがわかった。
【０１０１】
参考例３    ウコン色素（粉末）の調製方法
４０ｇのウコン根茎粉末に１２０ｍＬのアセトンを加え、４０℃で３０分攪拌し、ろ過を行い、抽出液を得た。得られた抽出液をロータリーエバポレーターにて４０℃で減圧濃縮し、続いて６５℃で一晩減圧乾燥後、粉砕し、ウコン色素の粉末１.１ｇを得た。
【０１０２】
実施例１  パイナップルシャーベット
（１）パイナップルシャーベットの調製
クルクミン配糖体（CG3）を用いて、パイナップルシャーベット（本発明シャーベット）を作った。
＜パイナップルシャーベットの処方＞
砂糖                               １５．０(ｇ)
粉末水飴                             ７．５
硬化ヤシ油                           １．０
脱脂粉乳                             １．０
１／５濃縮パイナップル果汁           ４．０
パイナップルフレーバー               ０．１
クルクミン配糖体（CG3）              ０．００４
水                                 ７１．４      
合  計                           １００．０ｇ。
【０１０３】
比較のパイナップルシャーベットとして、上記と同様にして、クルクミン配糖体（CG3）の代わりに、参考例３の方法に従って調製したウコン色素の粉末０．００２ｇを用いて、パイナップルシャーベット（比較シャーベット）を調製した。
【０１０４】
（２）シャーベットの外観
上記のパイナップルシャーベット（本発明シャーベット、比較シャーベット）を、４℃で１時間保存した後、外観（色相、着色の均一性）を肉眼観察し両者を比較した。結果を表２に示す。
【０１０５】
【表２】
2005312325.tif 000011
クルクミン配糖体（CG3）を使用して調製したパイナップルシャーベット（本発明シャーベット）は、ウコン色素の粉末（参考例３）を使用して調製したパイナップルシャーベット（比較シャーベット）に比べて、鮮明な黄色を呈し発色に優れ、また均一に着色されていた。
【０１０６】
実施例２  フルーツゼリー
（１）フルーツゼリーの調製
クルクミン配糖体（CG3）を用いてフルーツゼリーを調製した。具体的には、下記処方に示す材料を配合し、８０℃１０分間で加熱溶解した後、カップに充填し、５℃で１時間冷却しフルーツゼリー（本発明ゼリー）を作った。
【０１０７】
＜フルーツゼリー[パイナップルゼリー]の処方＞
果糖ブドウ糖液糖（７５％）         ２０．０（ｇ）
１／５濃縮パイナップル果汁           ４．０
カラギーナン                         １．０
クエン酸                             ０．２
パイナップルエッセンス               ０．１
クルクミン配糖体（CG3）              ０．００２
水                                 ７４．７      
合  計                         １００．０ ｇ。
【０１０８】
比較のフルーツゼリーとして、上記と同様にして、 クルクミン配糖体（CG3）の代わりに参考例３の方法に従って調製したウコン色素の粉末０．００１ｇを用いて、フルーツゼリー（比較ゼリー）を調製した。
【０１０９】
（２）フルーツゼリーの外観
上記のフルーツゼリー（本発明ゼリー、比較ゼリー）を４℃で７日間保存し、次いで外観（色相、濁りの有無及び程度）を肉眼観察し、両者を比較した。結果を表３に示す。
【０１１０】
【表３】
2005312325.tif 000012
表３からわかるように、クルクミン配糖体（CG3）を使用して調製したフルーツゼリーは、 ウコン色素の粉末（参考例３）に比べて、鮮明な黄色を呈し発色性に優れており、かつ濁り及び浮遊物がなかった。
【０１１１】
実施例３
（１）たくわんの調製
クルクミン配糖体（CG3）を用いて、下記の処方に従って鰹風味のたくわん（本発明たくわん）を作った。
（鰹風味のたくわんの処方）
果糖ブドウ糖液糖                 １５．０（ｇ）
食塩                               ９．０
カツオエキス                       １．０
クルクミン配糖体（CG3）            ０．００４
水                               ６４．５
大根                             １０．０      
合計                           １００．０  ｇ。
【０１１２】
比較のたくわんとして、上記と同様にして、 クルクミン配糖体（CG3）の代わりに参考例３の方法に従って調製したウコン色素の粉末０．００２ｇを用いて、たくわん（比較たくわん）を調製した。
【０１１３】
（２）たくわんの外観
上記のたくわん（本発明たくわん、比較たくわん）を２５℃で７日間保存し、次いで外観（たくわん表面の色相、着色の均一性）及び色素浸透性を肉眼観察し、両者を比較した。なお、色素浸透性は、着色したたくわんを切断して、当該切断面について、色素の内部への浸透性を肉眼で観察することによって評価した。
【０１１４】
結果を表４に示す。
【０１１５】
【表４】
2005312325.tif 000013
表４からわかるように、クルクミン配糖体（CG3）を使用して調製したたくわん（本発明たくわん）は、 ウコン色素の粉末（参考例３）を使用して調製したたくわん（比較たくわん）に比べて、表面の色が若干薄かったものの、鮮明で均一な黄色を呈した。また、 ウコン色素の粉末（参考例３）を使用して調製したたくわん（比較たくわん）の着色は表面のみで内部まで色が浸透していなかったのに対し、クルクミン配糖体（ＣＧ３）を使用して調製したたくわん（本発明たくわん）は内部まで深く色素が浸透して均一に着色していた。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ニチニチソウ由来UGTaseのcDNAのクローニング方法（実施例１）のアウトラインを示す図である。
【図２】いくつかの植物のUGTaseのアミノ酸配列におけるC末端側部分のアライメントを示す図である。斜線のブロック内がPSPG-boxである。
【図３】CaUGT1のcDNAの塩基配列とそのORFによってコードされる推定アミノ酸配列を示す図である。四角で囲んだ領域は、PSPG-box内の「HCGWNS」である。
【図４】CaUGT2のcDNAの塩基配列とそのORFによってコードされる推定アミノ酸配列を示す図である。四角で囲んだ領域は、PSPG-box内の「HCGWNS」である。
【図５】実施例２において構築した植物UGTaseの分子系統樹を示す。
【図６】実施例３で行った、MJ添加ニチニチソウ培養細胞におけるCaUGT1（図(a)）及びCaUGT2（図(b)）のmRNA量の発現変化を示す図である（実施例３）。CaUGT1はRT-PCR、CaUGT2はノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す。RT-PCRでは、3-hydroxy-3-methylgltaryl CoA reductase（HMGCoA）をコントロールとして用いた。
【図７】実施例４において、CaUGT1（実際はMBP-CaUGT1融合タンパク質）およびCaUGT2（実際はMBP-CaUGT2融合タンパク質）の大腸菌における発現を調べた結果を示すSDS-PAGE画像である。図中、「MBP」（Maltose Binding Protein）はpMAL-c2xベクターのみを導入した大腸菌（コントロール）の結果を示す。「＋」はIPTG添加によって遺伝子発現を誘導したもの、「−」はIPTG添加せず遺伝子発現を誘導しないものである。
【図８】CaUGT1及びCaUGT2の組み換え酵素（粗酵素）によるクルクミンの配糖化反応を調べたHPLCのクロマトグラムである（実施例５）。（ａ）は標準品（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイド）のクロマトグラム、（ｂ)及び（ｃ）は組み換えE.coli- CaUGT1から調製した粗酵素液（CaUGT1）を用いてそれぞれクルクミン及びクルクミンモノグルコサイドと反応させた反応液のクロマトグラム、（ｄ)及び（ｅ）は組み換えE.coli- CaUGT2から調製した粗酵素液（CaUGT2）を用いてそれぞれクルクミン及びクルクミンモノグルコサイドと反応させた反応液のクロマトグラムを示す。
【図９】クルクミンを基質としたCaUGT2による酵素反応における生成物を、経時的に示すHPLCクロマトグラムである。
【図１０】CaUGT2の基質特異性を調べた実施例６の結果を示す図である。基質として、curcumin、curcumin monoglucoside（CG5）、esculetin、p-nitrophenol、及びvanillinを用いて、CaUGT2によって生成した配糖体の量を、クルクミンの配糖体生成量を100とした相対値（%）で示す。
【図１１】クルクミンとその配糖体（curcumin 4'-O-β-D-glucoside [CG5], curcumin 4'-O-β-D-gentiobioside [CG4], curcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside [CG3], curcumin 4'-O-β-D- gentiobioside 4"-O-β-D- glucoside [CG2], curcumin 4',4"-O-β-D-digentiobioside [CG1]）の構造を示す図である。
【図１２】クルクミン（Ａ）、curcumin 4'-O-β-D-glucoside [CG5]（Ｂ）、curcumin 4',4"-O-β-D-diglucoside [CG3]（Ｃ）について、中性条件とアルカリ条件(＋NaOH）におけるＵＶスペクトルを比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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