(57)【要約】      （修正有）【課題】gp220 タンパク質を含まないＥＢＶ  gp350 タンパク質の新規な製造方法の提供。【解決手段】ＥＢＶ  gp350 タンパク質をコードする遺伝子のスプライシング部位に変異を導入することにより、スプライシングの発生を防止しgp220 タンパク質の生成を抑制して、gp220 タンパク質を含まない、かつ膜貫通領域を本質的に含まないＥＢＶ gp350 タンパク質を、ＣＨＯ細胞を用いて得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生成物の分泌をもたらす、膜貫通領域中の欠失、又は膜貫通領域と残りのＣ末端の欠失、あるいは更にシグナル断片の欠失、を有するEBV gp350をコードし、且つgp220 mRNA転写物の生成を回避するようにスプライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基に変異を有する単離されたDNA断片において、このスプライス部位もしくはその近傍の変異が、
(1) ドナースプライス部位を含む野生型配列：GAA[Glu]−A|GT[Ser]501におけるGluをコードするコドンからAsn、AspもしくはGlnをコードするコドンへの変更又はSerをコードするコドンからAla、GlyもしくはThrをコードするコドンへの変更；あるいはアクセプタースプライス部位を含む野生型配列：ACA[Thr]−G|GT[Gly]698におけるThrをコードするコドンからAla、GlyもしくはSerをコードするコドンへの変更又はGlyをコードするコドンからSerもしくはThrをコードするコドンへの変更；あるいは
(2) ドナースプライス部位を含む野生型配列：GAA[Glu]−A|GT「Ser]501におけるGAA[Glu]からGAG[Glu]への変更又はAGT[Ser]からTCA[Ser]への変更、あるいはアクセプタースプライス部位を含むACA[Thr]−G|GT[Gly]698のACA[Thr]からACT[Thr]への変更又はGGT[Gly]からGGA[Gly]への変更、
から選択れる１又は複数の変異であることを特徴とするDNA断片。
【請求項２】
スプライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基における前記変異が、ドナースプライス部位又はその近傍における変異である、請求項１に記載のDNA断片。
【請求項３】
スプライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基における前記変異が、アクセプタースプライス部位又はその近傍における変異である、請求項１に記載のDNA断片。
【請求項４】
スプライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基における前記変異が、ドナースプライス部位又はその近傍及びアクセプタースプライス部位又はその近傍の両方における変異である、請求項１に記載のDNA断片。
【請求項５】
生成物が分泌されるように、膜貫通領域中の18〜21個のアミノ酸が除去された短縮形のEVD gp350をコードする請求項１〜４のいずれか１項に記載のDNA断片。
【請求項６】
スプライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基における前記変異が、前記ドナースプライス部位を含むその近傍域における変異である、請求項５に記載のDNA断片。
【請求項７】
スプライス部位もしくはその近傍の１もしくは複数の塩基における前記変異が、前記アクセプタープライス部位を含むその近傍域における変異である、請求項５に記載のDNA断片。
【請求項８】
（ａ）配列番号18：のコドン19〜862；
（ｂ）配列番号：18のコドン１〜862；
（ｃ）配列番号：18のコドン19〜862及び882〜907；並びに
（ｄ）配列番号：18のコドン１〜862及び882〜907；
から成る群から選択された断片と同じアミノ酸配列断片コードする、請求項１に記載のDNA断片。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のDNA断片を含んで成るベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れか１項に記載のDNA断片であって、該DNA断片の複製及び発現を指令することが出来る発現制御断片に作用可能に連結しているDNA断片、により形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
適切な培地中で請求項10に記載の宿主細胞を培養し、そして該細胞から前記gp350タンパク質を単離することを含んで成る、gp350タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
EBV gp350が細胞外ドメインと細胞質ドメインとの融合体として発現されるように膜貫通ドメインにおける欠失を含み、そして非機能的スプライス部位を含むDNA断片によりコードされ、可溶性形でありそしてEBV gp220を伴わない、均一な組換えEBV gp350タンパク質。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインの除去が、配列番号：18におけるVal863からAla881までの除去を含んで成る、請求項12に記載のEBV gp350タンパク質。
【請求項１４】
請求項12に記載の均一な組換えEBV gp350タンパク質を含んで成る、EBV関連疾患又は状態の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項１５】
EBV gp350が細胞外ドメインと細胞質ドメインとの融合体として発現されるように膜貫通ドメインにおける欠失を含み、そして非機能的スプライス部位を含むDNA断片によりコードされたEBV gp350タンパク質を発現し、そしてそれを培地中に分泌する細胞の培地から単離された、可溶性でありそしてEBV gp220を含まない均一な組換えEVB gp350タンパク質を含んで成る、EBV関連疾患又は状態の予防または治療のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）gp220 タンパク質を含まない均一な組換えＥＢＶ gp350 タンパク質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルス属の一種であるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）はヒトにおいて感染性単核球症を引き起こす。この病気は集団の90％以上に感染する。健康分析者は米国におけるこの病気の費用が年100 万ドルであると見積もる。このウイルスは主にウイルスを放出する個体から唾液の交換によって蔓延する。ＥＢＶに感染した子供はほとんど無症状であるかまたはごく弱い症状を有するが、感染した若者と成人は、発熱、咽頭炎およびアデノパシーにより特徴付けられる典型的な感染性単核球症を発病する。感染した人はその後の生涯ずっと抗ＥＢＶ抗体を維持するので、次の感染に対して免疫がある。現在のところ商業的に利用可能なＥＢＶワクチンはない。
【０００３】
その感染性に加えて、ＥＢＶはリンパ球を急速に分裂する細胞に形質転換させることが証明されており、従って、バーキットリンパ腫や口腔毛髪状白斑をはじめとする幾つかの異なるリンパ腫に関係があるとされている。世界的に見て、80,000の鼻咽頭癌症例が存在すると推定され、中国民族に流行している。
【０００４】
ＥＢＶの弱毒化生ワクチンの開発は行われているがまだ問題がある。ＥＢＶに関連する潜在的な腫瘍形成性質のため、研究者らは生ワクチン法を使うのを嫌がっていた。本発明は、潜在的に腫瘍形成性の生存ウイルスの使用を必要としないサブユニットワクチンのための方法および組成物を考案することにより、生ワクチンの開発に関連する問題を回避する。サブユニットワクチンは、免疫応答を惹起しそして免疫を付与するであろうウイルスからの１または複数の抗原性タンパク質を使用する。
【０００５】
より重要な２つの抗原性ＥＢＶタンパク質は、ウイルス膜のエンベロープの部分を構成しており、細胞膜タンパク質CD21と相互作用することによりウイルス粒子がヒト標的細胞に結合しそしてその中に入るのを可能にする、糖タンパク質gp350/300 とgp220/200 である。Nemerow,  J. Virology 61:1416 (1987)（非特許文献１）を参照のこと。それらはサブユニットワクチン候補として選ばれてから久しいが、本来の源から精製された抗原的に活性なタンパク質を得ることの難しさと、組換え生産された源からの収率が低いことが、研究者やワクチン開発者の努力を妨害していた。
【０００６】
文献中には様々な分子量範囲（一方のタンパク質には350 または300 キロダルトン（kD）、他方のタンパク質には220 または200 kD）を使ってそれらのタンパク質が呼称されている。本明細書中ではgp350 または300 タンパク質をgp350 タンパク質と呼び、gp220 または200 タンパク質をgp220 タンパク質と呼ぶ。集合的に、両タンパク質を本明細書中ではgp350/220 タンパク質と呼称する。
【０００７】
択一的にスプライスされる単一の遺伝子がgp350/220 タンパク質をコードし、gp350 mRNA転写物とgp220 mRNA転写物の生成をもたらす。天然に存在するgp350/220 遺伝子スプライス部位変異体は１つも知られていない。該遺伝子は２つの発現産物、即ちgp350 タンパク質とgp220 タンパク質を産生する。gp350/220 ＤＮＡ配列の転写解読枠（ＯＲＦ）は2721塩基対（bp）である。全読み枠は907 アミノ酸のgp350 をコードする。Kieff に発行された米国特許第4,707,358 号（1987）（特許文献１）を参照のこと。転写解読枠のスプライス形は2130塩基を含み、710 アミノ酸配列のgp220 タンパク質に翻訳される。
【０００８】
gp350 タンパク質とgp220 タンパク質の理論分子量はそれぞれ95 kDと70 kD である。発現されたgp350 タンパク質とgp220 タンパク質の測定分子量は異なるけれどもそれぞれ約350 キロダルトンと220キロダルトン（kD）である。推定分子量と実分子量の差の理由は両タンパク質の多大なグリコシル化である。どの細胞でも、gp350 タンパク質とgp220 タンパク質は約6:1 〜1:1 の範囲のモル比で生産される。例えば、ＥＢＶが持続的に感染したB95-8 細胞では、その比は異なるように見えるが時々6:1 の範囲に近づく。Miller, Proc．Natl. Acad. Sci.  69:383 (1972)（非特許文献２） を参照のこと。
【０００９】
同様に、それらの糖タンパク質の組換え生産は、今までは一般に生産させる予定のgp350 タンパク質とgp220 タンパク質の混合物をもたらした。従来、gp350/220 タンパク質はラット下垂体、チャイニーズハムスター卵巣、VERO（アフリカミドリザル腎臓）細胞、並びに酵母細胞中で発現されている。Whang,  J. Virol. 61:1796(1982)（非特許文献３）, Motz, Gene 44:353 (1986)（非特許文献４）および Emini, Virology 166:387 (1988)（非特許文献５）を参照のこと。マウス繊維芽細胞中でgp350/220 タンパク質を生産させるのにウシ乳頭腫ウイルスのウイルス発現系も使われている。Madej,  Vaccine 10:777 (1992) （非特許文献６）を参照のこと。
【００１０】
gp350/220 タンパク質を発現させるのにワクシニアウイルスの実験株とワクチン株も使われている。ＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡおよびタンパク質の変異組換え形は当業界で既知である。詳しくは、膜貫通配列を欠いている先端が切り取られたgp350/220 遺伝子の組換え構成物が作製された。そのような構成物はgp350 とgp220 の２つの混合物をまだ生産するが、膜貫通領域の欠如が該タンパク質の分泌を可能にする。Finerty, J. Gen. Virology 73:449 (1992)（非特許文献７）および Madej, Vaccine 10:777 (1992) （非特許文献６）を参照のこと。また、様々なgp350/220 配列を含んで成る組換え生産された様々な制限断片および融合タンパク質が作製されＥ．コリ中で発現されている。1991年７月24日に公開されたＥＰ特許公開0 173 254 （特許文献２）を参照のこと。
【００１１】
従って、gp350/220 に関するＥＢＶ研究は、今まで生来のgp350/220 配列の効率的な発現を得ることか、生来のタンパク質または膜貫通領域欠失タンパク質の２つの択一的スプライス形の混合物を生じる膜貫通領域を欠く変異配列に集中し、あるいはβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質としてのエピトープ断片配列の生産に集中していた。
【００１２】
gp350/220 の部分精製調製物は既知である。 Finerty, J. Gen. Virology 73:449 (1992)（非特許文献７）を参照のこと（組換え生産され、部分精製されたもの）。生来のgp350/220 タンパク質については、ほとんどの場合、精製作業が該タンパク質の抗原性を不活性化してしまい、そのためサブユニットワクチンでの使用が認められなくなる。しかし、生来の（即ち、非組換え）源からの抗原的に活性なgp350 タンパク質の高度精製調製物が科学文献中に報告されている。David, J. Immunol. Methods 108:231 (1988)（非特許文献８）を参照のこと。
【００１３】
ＥＢＶ誘発リンパ腫に対してコットントップタマリン（cottontop tamarin ）を予防接種するのにgp350/220 タンパク質を発現する組換えウイルスワクチンが使われた。Morgan, J. Med. Virology 25:189 (1988)（非特許文献９）, Mackett, EMBO J. 4:3229 (1985)（非特許文献10）および Mackett, VACCINES '86, pp293 (Lerner RA, Chanock RM, Brown F 編, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory)（非特許文献11）を参照のこと。しかしながら、該遺伝子の択一的スプライス形態のうちのいずれか１つだけの発現を可能にし、それによって純粋なgp350 またはgp220 タンパク質の生産を可能にし且つ保証するようにウイルスgp350/220 ＤＮＡ配列が操作されたことはない。また、gp350 またはgp220 タンパク質の一方または他方を発現する組換えまたは変異ウイルスも作製されていない。
【００１４】
一般に、スプライス部位はプレmRNA分子からmRNAへのプロセシングを促進する。ポリオーマウイルスでは、後期mRNAの効率的蓄積のためにスプライス部位が必要とされる。ポリオーマウイルス転写物中の３′および５′スプライス部位の変更はmRNA蓄積を減少させるかまたは完全に妨げる。Treisman, Nature 292:595 (1981) （非特許文献12）を参照のこと。SV40ウイルスでは、切除可能な介在配列が核外へのmRNAの輸送と核中でのmRNAの安定化を促進し、それらのイントロン／エキソン接合配列が小さな核ＲＮＰ粒子の結合を促進するため、事前にスプライスされたmRNAはプロセシング経路と正しく連携することができないだろうと考えられる。エキソン／イントロンスプライス部位のところの点変異は、エキソン／イントロン開裂を低下させ、そしてプレmRNAプロセシング、核輸送および安定性を破壊する可能性がある。Ryu, J. Virology 63:4386 (1989)（非特許文献13）および Gross, Nature 286:634 (1980)（非特許文献14）を参照のこと。
【００１５】
従って、本発明までは、ＥＢＶのgp350/220 配列によりコードされるタンパク質の機能的発現と抗原活性に対するスプライス部位変更の影響は最善の状態では未知であり、且つ予測できない。
【００１６】
追加の背景文献としては次のものが挙げられる。ＥＢＶの生物学と病気はStraus, Annal of Int. Med. 118:45 (1993)（非特許文献15）中に大体概説されている。ＥＢＶのBLLFI 転写解読枠の記載はBaer, Nature 310:207 (1984)（非特許文献16）中に見つかる。エプスタイン−バーウイルスのgp350/220 ＤＮＡおよびアミノ酸配列の記載はBeisel, J. Virology 54:665(1985)（非特許文献17）とBiggin, EMBO J. 3:1083 (1984)（非特許文献18）による文献中並びにKieff他に発行された米国特許第4,707,358 号（1987）（特許文献１）中に見つかる。
【００１７】
エプスタイン−バーウイルスＡ型とＢ型中のgp350/220 をコードするＤＮＡ配列の比較はLees, Virology 195:578 (1993) （非特許文献19）中に開示されている。ＥＢＶのgp350/220 糖タンパク質に対して中和活性を示すモノクローナル抗体はThorley-Lawson, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:5307 (1980)（非特許文献20）中に開示されている。最後に、供与体および受容体スプライス部位についてのスプライス部位共通配列は Mount, Nucl. Acids Res. 10:459 (1982)（非特許文献21）中に開示されている。
【特許文献１】米国特許第4,707,358 号（1987）
【特許文献２】ＥＰ特許公開0 173 254
【非特許文献１】Nemerow,  J. Virology 61:1416 (1987)
【非特許文献２】Miller, Proc．Natl. Acad. Sci.  69:383 (1972)
【非特許文献３】Whang,  J. Virol. 61:1796(1982)
【非特許文献４】Motz, Gene 44:353 (1986)
【非特許文献５】Emini, Virology 166:387 (1988)
【非特許文献６】Madej,  Vaccine 10:777 (1992)
【非特許文献７】Finerty, J. Gen. Virology 73:449 (1992)
【非特許文献８】David, J. Immunol. Methods 108:231 (1988)
【非特許文献９】Morgan, J. Med. Virology 25:189 (1988)
【非特許文献１０】Mackett, EMBO J. 4:3229 (1985)
【非特許文献１１】Mackett, VACCINES '86, pp293 (Lerner RA, Chanock RM, Brown F 編, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory)
【非特許文献１２】Treisman, Nature 292:595 (1981)
【非特許文献１３】Ryu, J. Virology 63:4386 (1989)
【非特許文献１４】Gross, Nature 286:634 (1980)
【非特許文献１５】Straus, Annal of Int. Med. 118:45 (1993)
【非特許文献１６】Baer, Nature 310:207 (1984)
【非特許文献１７】Beisel, J. Virology 54:665(1985)
【非特許文献１８】Biggin, EMBO J. 3:1083 (1984)
【非特許文献１９】Lees, Virology 195:578 (1993)
【非特許文献２０】Thorley-Lawson, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:5307 (1980)
【非特許文献２１】Mount, Nucl. Acids Res. 10:459 (1982)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
一態様によれば、本発明はＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を提供する。本発明のＤＮＡ配列は、均一gp350 タンパク質の発現をコードする単離されたＤＮＡ配列を含むことができる。gp350 タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、供与体および受容体スプライス部位のところの生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換されている図１〜図７の配列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含んで成るもの、およびその断片として特徴づけられる。
【００１９】
このＤＮＡ配列はコード配列に隣接する５′および３′非コード配列を含むことができ、更にアミノ末端シグナル配列を含むことができる。図１〜図７は非コード配列を表し、推定上のシグナル配列の終わりを星印（＊）で示す。しかしながら、本発明のＤＮＡ配列は、それらの隣接配列またはシグナル配列のうちの幾らかまたは全部を除外することもあると解釈される。本発明の非スプライシング変異体ＤＮＡ配列は、図１〜図７のＤＮＡ配列のgp350/220 をコードする遺伝子の供与体および受容体スプライス部位に変異を導入することにより製造される。これはgp220 タンパク質の生産を排除し、その結果gp350 タンパク質だけが生産される。
【００２０】
従って、別の態様では、本発明は、均一gp350 タンパク質、および適当な原核または真核宿主細胞中で適当な発現調節配列の支配下でのＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体の発現により該タンパク質を生産する方法を含んで成る。本明細書中でgp350 タンパク質について用語を使う時、均一とは、gp220 タンパク質を全く含まないかまたは実質的に含まないことを意味する。哺乳類または昆虫細胞において組換え生産された均一gp350 タンパク質は確かに今まで文献中に報告されたことがないと本発明者らは認める。
【００２１】
更に別の態様によれば、分泌生成物をもたらす欠失を更に有する均一gp350 タンパク質が提供される。そのような欠失は、gp350 の膜貫通領域の除去か、膜貫通領域と残りのＣ末端の除去のいずれかを含んで成る。そのような更に変更されたＤＮＡ配列およびそれによりコードされるタンパク質は、本発明のまた別の態様である。
【００２２】
ベクターＤＮＡと均一gp350 タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮＡ分子も提供される。該ＤＮＡ分子は、選ばれた宿主細胞中での均一gp350 の複製と発現を指令することができる適当な調節配列と作用可能に連結したgp350 配列を提供する。組換え均一gp350 タンパク質を発現させる際に使われるそのようなＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞も、本発明により提供される。
【００２３】
本発明のＤＮＡ分子および形質転換された宿主細胞は、本発明の別の態様である組換え均一gp350 タンパク質またはその断片の新規生産方法において使われる。この方法では、均一gp350 タンパク質の発現を調節することができる適当な調節配列または発現調節配列と作用可能に連結した均一gp350 タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ配列によって形質転換された細胞系を、組換えＤＮＡの発現を可能にする適当な条件下で培養する。次いで発現されたタンパク質を適当な常用手段により宿主細胞からまたは培地から収得する。この方法は宿主細胞として多数の既知の細胞を使うことができるが、現在のところ好ましいのは哺乳類細胞と昆虫細胞である。
【００２４】
本発明のＤＮＡ配列およびタンパク質は、ＥＢＶ抗原決定基を有する治療化合物および免疫原性化合物の製造に有用である。そのような化合物はＥＢＶ関連疾患、例えば単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌の予防処置のためのサブユニットワクチンに利用される。従って、別の態様によれば、本発明は、感染性単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌のようなヒトのＥＢＶ関連状態や疾患を予防または治療するための治療および／または免疫原性医薬組成物を含んで成る。
【００２５】
そのような治療および／または免疫原性医薬組成物は、医薬上許容される担体、例えば当業界で知られるような水酸化アルミニウム、塩溶液およびリン酸塩緩衝化塩溶液と共に、免疫原的誘発有効量の本発明の１または複数の均一gp350 タンパク質を含んで成る。「免疫原的誘発」量とは、哺乳類においてＥＢＶに対する抗体の産生を刺激するのに十分な量を意味する。あるいは、活性成分はリポソーム含有凝集物の形で投与してもよい。予防用途には、そのような医薬組成物はヒトの患者への投与のためのサブユニットワクチンとして処方することができる。患者の抗体形成を刺激するのに十分な用量で患者に予防接種し；そして６か月〜１年後に再接種することができる。
【００２６】
従って、本発明の更なる態様は、適当な医薬担体中の免疫原的誘発治療有効量の均一gp350 タンパク質を患者に（特にヒト患者に）投与することにより、ＥＢＶ関連疾患および状態を治療する方法である。本発明の更に別の態様は、適当な医薬賦形剤中の免疫原的誘発有効量の均一gp350 タンパク質を患者に投与することにより、ＥＢＶに対する免疫応答を刺激する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
gp350 タンパク質の非スプライシング変異体をコードするクローン化されたＥＢＶのＤＮＡ配列を含んで成る組成物および方法が開示される。既に指摘した通り、そのような非スプライシング変異体は本明細書中では均一gp350タンパク質と呼称される。通常、gp350/220 遺伝子が哺乳類細胞中で発現されると、該遺伝子のＲＮＡスプライシングのためにgp350 とgp220 という２つの遺伝子産物が生じる。本発明は１つの遺伝子産物gp350 だけが生産されるようにする。本発明はgp350 遺伝子中のＲＮＡスプライス部位シグナルの一部または全部を除去し、そして適当な宿主細胞中で該遺伝子を発現させることを含む。
【００２８】
哺乳類細胞中でgp350/220 遺伝子が発現される時に該タンパク質の220 kD形態の生産を防止するためにgp350/220 遺伝子中に変異が導入された。結果として、gp350 のみをコードするmRNA転写物が生産される。gp350/220 遺伝子の非スプライシング変異体を使うことによるgp220 発現の除去は、gp220 に比較して増加したgp350 の生産を引き起こすだろう。gp350 はgp220 上に見られる潜在的な抗原部位を全て含むので、gp220 の生産は効果的な抗ＥＢＶワクチンの製造にとって不可欠なものではない。
【００２９】
従って、本発明の一態様は、アミノ酸501 をコードする供与体スプライス部位コドンとアミノ酸698 をコードする受容体スプライス部位コドンが、生来でないヌクレオチドによる生来のヌクレオチドの置換によって変更されていること以外、gp350 と実質的に同じポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、アミノ酸配列が同じままであるように、生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換される。詳しくは、一例として、供与体スプライス部位のところの生来のヌクレオチドＡＡＧＴ（ヌクレオチド1500〜1504）と、ＧＧ受容体スプライス部位に隣接する生来のヌクレオチドＡ＆Ｔ（ヌクレオチド2091〜2094）が、それぞれＧＴＣＡとＴ＆Ａにより置換された。
【００３０】
従って、供与部位におけるこの置換の結果として、アミノ酸500 位のグルタミンと501 位のセリンは同じままであった。同様に、受容部位におけるこの置換の結果として、アミノ酸697 位のスレオニンと698 位のグリシンは同じままであった。
【００３１】
同様にして、下記に更に詳述するように、当業者はそれらの明確に例示したもの以外の置換も容易に実施することができよう。
【００３２】
従って、本発明は一態様によれば、均一gp350 タンパク質に関する。均一gp350 タンパク質は、アミノ酸１から907 まで、アミノ酸１から862 まで、またはアミノ酸１から907までで且つアミノ酸863 から881 までを欠く図１〜図７に示されるのと実質的に同じアミノ酸配列を有し、各々Ｎ末端の18アミノ酸のシグナル配列を持つかまたは持たないことにより更に特徴づけられる。加えて、均一gp350 タンパク質の類似体が提供される。それらとしては、抗原活性を保持しており、且つ均一gp350 タンパク質の対応領域と好ましくは少なくとも80％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％の相同性を有する、アミノ酸配列中に変更がある変異体が挙げられる。例としては、図１〜図７のアミノ酸配列からの少数のアミノ酸変更、特に保存的アミノ酸置換、を有するタンパク質およびポリペプチドが挙げられる。保存的置換は、それらの側鎖が類似している（同族の）アミノ酸ファミリー内で起こるものである。
【００３３】
遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に４つのファミリーに分類される：(1)酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；(2)塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)非荷電で極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時々芳香族アミノ酸として一緒に分類される。例えば、ロイシンの孤立置換または構造的に同族のアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換が抗原活性または機能性に対して重大な影響がないだろうと予想することは筋が通っている。
【００３４】
本発明はgp350 の簡単な精製という利点を提供する。gp350 とgp220 は同様な生化学的性質を有するため、gp220 はしばしばgp350 の調製物中に一緒に精製される。gp350/220 遺伝子の非スプライシング変異体のみを発現する細胞はタンパク質精製を平易にする。これはgp350の生産費用を減少させるであろう。本発明はまた、gp350 精製のための出発材料の生化学的特徴づけを一層容易にする。１つの種だけが存在するため、第二の種の存在理由を説明することなく、タンパク質含量分析とアミノ酸配列分析を行うことができる。
【００３５】
本発明はその上、増加されたgp350 生産という利点を提供する。gp350 遺伝子のスプライシングの防止は、細胞をgp350 とgp220 の二元生産からgp350 の単独生産に移し変えるだろう。ある細胞では、gp220 の濃度はgp350 濃度の30％〜100 ％であると推定されている。遺伝子スプライシングが除去されると、gp220 生産の欠如によってgp350 生産が増加されるだろう。
【００３６】
gp350/220 遺伝子のＤＮＡ配列はBeisel, J. Virology 54:665 (1985)およびBiggin, EMBO J. 3:1083 (1984) により記載されており、それは図１〜図７に描写される。該遺伝子は907 アミノ酸をコードしそして約95 kD の一次翻訳産物を指定する2721塩基の転写解読枠（ＯＲＦ）である。推定値と実測値の間の差は、該タンパク質の多大なグリコシル化を表している。591 塩基（197 アミノ酸をコードする）がスプライシングにより除去されるとgp220を生じる。gp350/220 遺伝子産物の見かけ分子量は、使用する測定方法の種類、異なる細胞系中のグリコシル化部位の利用状態、翻訳後プロセシングの差または選択的な遺伝子変異によって異なり得る。
【００３７】
gp350/220 遺伝子スプライス部位変異体の生産物についての測定値は異なるが、「均一gp350 タンパク質」という語は、場合により追加の欠失または変異、例えば本明細書中で開示されるＣ末端欠失および／または膜貫通領域変更を有することがある、非スプライシング変異体の遺伝子産物を包含する。「gp220 タンパク質」という語は、約220 kDの分子量を有する択一的にスプライスされたgp350/220 遺伝子産物を指す。gp350/220 遺伝子中のスプライス部位は、他の遺伝子（主に真核生物からのもの）を基にした共通の供与体および受容体スプライス配列とgp350/220 遺伝子との比較により同定された。他の遺伝子中のスプライス部位を調べることから Mount, Nucleic Acids Res. 10:459 (1982)により発見された共通配列は、下記のものである：
【００３８】
【表１】
2005333990.tif 000002
右肩に星印を付けた塩基は全スプライス部位の100 ％に現れる塩基を表す（高度に保存された塩基）。２塩基または１塩基を有する位置は保存された位置を表す（強調してない位置）。スラッシュ（／）は実際のスプライシング部位を示す。
【００３９】
gp350/220 遺伝子中では、gp350/220 遺伝子のＤＮＡ配列決定〔Biggin, EMBO J. 3:1083 (1984) 〕により示されたように、供与体スプライス部位はヌクレオチド1501の後ろにあり、そして受容体スプライス部位はヌクレオチド2092の後にある。（ここと図１〜図７中で使用した番号付け法はBigginの番号付け法に従う）。スプライス部位はＥＢＶのＢ型株の対応する遺伝子領域中に存在する（供与体スプライス部位はＡ1501の後、そして受容体スプライス部位はＧ2029の後）。本発明は、gp350/220 遺伝子から単一種のmRNAを生産させるのにＡもしくはＢ株または別のＥＢＶ株のスプライス部位のいずれかを使って製造した組成物を包含する。
【００４０】
B95-8 株からのウイルスＡ型のＤＮＡ配列を実施例で使ったが、Ｂ型株のＤＮＡ配列も同様に使うことができただろう。何故なら、Ａ型株とＢ型株の遺伝子翻訳産物は98％同じであるからである。Ｂ株はアミノ酸507 〜520 と570 〜576 を欠いている。Ａ型株はgp350 抗原部位を全て含むため、Ａ型株を使った。あるいは、本明細書の教示に従って株特異的配列を有するＥＢＶ gp350/220を使って、特定株に特異的な免疫原性を有し、従って株特異的ＥＢＶ関連疾患の予防または治療用の免疫原性および／または治療組成物において有用である、ＥＢＶ株特異的均一gp350 タンパク質を生産させることができる。表２は、供与体および受容体スプライス部位の野性型ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
【００４１】
gp350/220 遺伝子のＲＮＡスプライシングを防止するために、gp350/220 遺伝子中に核酸配列を導入してＲＮＡスプライス部位の関連塩基対を置換した。スプライス部位を非機能的にするためには、好ましくは供与部位または受容部位を構成する２つの高度に保存された塩基群の中から少なくとも１個の塩基を非保存的塩基で置換すべきであり、より好ましくは少なくとも２個の高度に保存された塩基を非保存的塩基に変異させるべきである。別の保存的塩基であるスプライス部位から離れた２個以上の塩基を非保存的スプライス部位塩基により置換して、スプライス部位の認識を更に弱くすることもできる。
【００４２】
供与部位と受容部位の両方を変更してスプライシング機構を傷つけることができる。好ましくは、供与体と受容体が両方とも、４箇所の高度に保存されたスプライス部位塩基位置のうちの１箇所に各々少なくとも１個の変更を含み、より好ましくは４箇所の高度に保存されたスプライス部位塩基位置のうちの２箇所に少なくとも２個の変化を含む。一方のスプライス部位が野性型アミノ酸配列を維持するために変異できないならば、他方のスプライス部位に少なくとも２つの変異を導入することが好ましい。
【００４３】
gp350/220 スプライス部位のところの変異が、その後発現されるgp350 タンパク質のアミノ酸配列中に変化を導入してもよい。好ましくは、そのような変化は保存的アミノ酸置換であるべきである。アミノ酸配列中の保存的置換は、アミノ酸配列中の非保存的変化とは反対に、抗原部位の保存を助けるだろう。保存的アミノ酸変化は、塩基変化（または複数塩基変化）が不変の供与体／受容体塩基中に適当な変化を引き起こす限りにおいて行うことができる。例えば、供与体スプライス部位では、ＧＧＵ以外のどのGly 特異的コドンを使ってもSer501をGly に置換することができる（ＧＧＵの使用はＧヌクレオチドを保存し、スプライスシグナル中に所望のＧＴ置換を引き起こさないだろう）。
【００４４】
同様に、受容体スプライス部位では、Gly698からAla への変化は保存的置換であろうが、全てのAla コドンは高度に保存されるＧヌクレオチドで始まるので、これは所望の置換を引き起こさないだろう。プロリンも保存的アミノ酸変化であるかもしれないが、プロリンはタンパク質の三次構造の変更を引き起こし、それによって１または複数のgp350 抗原部位を隠蔽してしまうので、プロリンは野性型アミノ酸を置換するのに使われないだろう。表２は、野性型配列中の許容される保存的アミノ酸置換を示す。表２の一番下は、保存的アミノ酸置換を伴う変異の例である。
【００４５】
【表２】
2005333990.tif 000003
本発明の一態様はgp350/220 の非スプライシング変異体を含んで成るけれども、gp350/220 コード配列の追加の変異も望ましいかもしれない。可溶性均一gp350 タンパク質（「可溶性タンパク質」は溶液中で遊離形態であるか、または膜会合形態であるが膜統合形態でない）を生産するために、例えば、統合型膜タンパク質としての全長gp350 の発現によって生じる細胞毒性問題を回避するために、gp350をコードするＤＮＡ配列の全部または部分の削除によりgp350 の膜貫通領域（経膜領域としても知られる）が変更される。
【００４６】
gp350/220 の膜貫通領域はアミノ酸861（メチオニン）から881（アラニン）までを含んで成る。Beisel, J. Virology 54:665 (1985) を参照のこと。好ましくは、膜貫通領域の少なくとも８アミノ酸が削除され、より好ましくは少なくとも12アミノ酸が削除され、最も好ましくは18〜21アミノ酸が削除される。従って、別の態様では、本発明は、可溶性均一gp350 タンパク質の発現をもたらすgp350/220 ＤＮＡおよび／またはgp350 均一タンパク質の膜貫通領域中に少なくとも一つの削除を更に含んで成るgp350/220 ＤＮＡおよび／またはgp350 均一タンパク質の非スプライシング変異体を提供する。
【００４７】
非スプライシングgp350/220 変異体の膜貫通領域の全部または一部分を削除することに加えて、本発明に従って、本明細書に記載の通り、膜貫通領域の後ろのアミノ酸881 〜907 を含んで成るＣ末端配列を完全にまたは部分的に削除することもできる。よって、別の態様では、本発明は、gp350/220 の膜貫通領域をコードするＤＮＡおよび／または該膜貫通領域を含んで成るアミノ酸配列の全部もしくは一部分の削除により更に変更されており、その上gp350/220 の残りのＣ末端ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の削除により更に変更されている、gp350/220 ＤＮＡおよび／または均一タンパク質の非スプライシング変異体に関する。
【００４８】
従って、別の態様では、本発明は、本発明の均一 gp350タンパク質をコードする非スプライシング変異体ＤＮＡ配列に関する。そのようなＤＮＡ配列は、アミノ酸１〜907 をコードする図１〜図７のＤＮＡ配列を含んで成り、そして供与体および受容体スプライス部位を除去するように本明細書中に教示したヌクレオチド置換を更に含んで成る。そのようなＤＮＡ配列は、所望により、アミノ酸861 〜907 を含んで成る膜貫通領域とＣ末端の全部または一部分をコードするヌクレオチドが削除されている端が切り取られたＤＮＡ配列、およびアミノ酸861 〜881 を含んで成る膜貫通領域の全部または一部分をコードするヌクレオチドが削除されている欠失変異体を含んで成る。
【００４９】
均一gp350 タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ配列は、適当な緊縮条件下で図１〜図７の単離ＤＮＡ配列にハイブリダイスすることができるＤＮＡを含んでもよく、または遺伝暗号の縮重がなければそのような条件下で図１〜図７の単離ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるだろうＤＮＡを含んでもよい。従って、本発明のＤＮＡ配列は、対立遺伝子変異、種変異または計画的変更に基づいて、非コード配列、シグナル配列またはコード配列中に変更を含むことができる。
【００５０】
本明細書中で開示されるそれらの非スプライシング変異体gp350/220 ＤＮＡ配列は、当業界で公知の方法を使って作製することができる。本発明の変異ＤＮＡ配列を、同様に既知の方法を使って組換え的に発現させ、本発明の均一gp350 タンパク質を製造することができる。そのような組換えタンパク質を精製し、ＥＢＶ関連疾患の予防処置と防止のための医薬組成物中に配合することができる。
【００５１】
本発明のgp350/220 ＤＮＡの非スプライシング変異体は、当業界で既知であるようにして適当な発現調節配列を使って様々な種類の細胞中で組換え発現させることができる。当業界で既知であり且つ入手可能である適当な細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母細胞、Ｅ．コリ（E.  coli）やバシラス・サチリス（Bacillus  subtilis）のような細菌細胞、並びにGH3, CHO, NSO, MDCK およびC-127 細胞のような哺乳類細胞が挙げられる。細胞型と共に使われるベクターは、細胞型との適合性および使用する発現調節系に基づいて選択される。gp350/220 遺伝子の分泌産物の発現を考慮に入れた細胞とベクターが好ましい。
【００５２】
典型的には、例えば、Ｃ末端および／または膜貫通領域をコードする配列と共にまたは伴わずに、所望のタンパク質（この場合ＥＢＶ gp350の非スプライシング変異体配列）の発現のためのDNA 配列を含むように常用技術を使って変更されているpBR322の誘導体を使ってＥ．コリが形質転換される。pBR322はアンピシリンとテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、これをマーカーとして使うことができる。Bolivar,  Gene 2:95 (1977)を参照のこと。
【００５３】
常用される発現調節配列、即ち転写開始のためのプロモーターおよび場合によりオペレーターまたはエンハンサーとしては、β−ラクタマーゼおよびlac プロモーター系〔Chang, Nature 198:1056 (1977)を参照のこと〕、トリプトファンプロモーター系〔Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)を参照のこと〕、およびラムダ由来ＰＬプロモーターとＮ遺伝子リボソーム結合部位〔Shimatake,  Nature 292:128 (1981)を参照のこと〕が挙げられる。しかしながら、原核宿主細胞と適合できるいずれの入手可能なプロモーター系または発現調節系も使うことができる。他の典型的な宿主細胞、プラスミドおよび発現ビヒクルは、Itakura(1982) に発行された米国特許第4,356,270 号、Riggs に発行された同第4,431,739 号およびRutter1984）に発行された同第4,440,859 号に開示されている。
【００５４】
昆虫細胞発現系を使用する宿主細胞として昆虫細胞を使ってもよい。昆虫細胞での発現の場合、発現系の構成要素としては一般に、バキュロウイルスゲノムの断片と発現させようとする１または複数の異種遺伝子の挿入のための便利な制限部位の両方を含有する伝達ベクター、通常は細菌プラスミド；前記伝達ベクター中のバキュロウイルス特異的断片と相同の配列を有する野性型バキュロウイルス（これはバキュロウイルスゲノム中への異種遺伝子の相同組換えを考慮に入れる）；並びに適当な昆虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。
【００５５】
現在、AcNPV 中に外来遺伝子を導入するために最もよく使われる伝達ベクターはpAc373である。当業者が知るところの多数の他のベクターもデザインされている。それらとしては、例えばpVL985が挙げられる（これはポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴへ変更し、そして該ＡＴＴから32塩基対下流にBamHI クローニング部位を導入する；Luckowおよび Summers, Virology (1989) 17:31 を参照のこと）。
【００５６】
該プラスミドは普通、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル〔Miller他 (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177〕並びにＥ．コリの選択と繁殖のための原核生物のアンピシリン耐性（amp ）遺伝子および複製開始点も含有する。
【００５７】
バキュロウイルス伝達ベクターは通常バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合することができ且つコード配列（例えば構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流（５′→３′）転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは通常コード配列の５′末端の近位に置かれる転写開始領域を有するだろう。この転写開始領域は典型的にはＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含む。バキュロウイルス伝達ベクターは、存在するなら普通は構造遺伝子に対して遠位である、エンハンサーと呼ばれる第二の領域を有することもできる。発現は調節的か構成的のいずれであってもよい。昆虫細胞発現技術については、ＥＰ特許公開155 476 を参照のこと。
【００５８】
酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主細胞として使ってもよい。様々な株が入手可能でありそして利用可能である。同様に、酵母発現に適当なプラスミドベクターは既知であり、プロモーターや発現調節系も知られている。例えば、Myanohara,  Proc. Natl. Acad. Sci. 80:1 (1983)（PHO5プロモーター）、ＥＰ特許公開012 873 （リーダー配列）、Kurtz, Mol. Cell Biol. 6:142 (1986)、Ito, J. Bacteriol. 153:163 (1983)およびHinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 75:1929 (1979)（形質転換方法および適当なベクター）を参照のこと。
【００５９】
多細胞生物からの真核細胞ももちろん、着目のタンパク質およびポリペプチドをコードする遺伝子の発現のための宿主細胞として使うことができる。有用な宿主細胞系としてはVEROおよびHeLa細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞が挙げられる。そのような細胞と適合する発現ベクターも入手可能であり、それらは典型的にはプロモーターおよび発現調節配列、例えばSV40からの初期および後期プロモーター〔Fiers, Nature 273:113 (1978) 参照〕、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルスまたはトリ肉腫ウイルスからのプロモーターを含む。
【００６０】
典型的な宿主細胞、プロモーター、選択マーカーおよび技術は、Mather(1992)に発行された米国特許第5,122,469 号、Axel(1983)に発行された同第4,399,216 号、Axel(1987)に発行された同第4,634,665号、Levinson(1987)に発行された同第4,713,339 号、Ringold(1987) に発行された同第4,656,134 号、Kellems(1989) に発行された同第4,822,736 号およびFiers(1989) に発行された同第4,874,702 号を参照のこと。
【００６１】
適当な宿主細胞の形質転換は、そのような細胞に適当な標準技術、例えば Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110 (1972) に開示されたような原核生物用のCaCl2 処理や、Graham, Virology 52:546 (1978)中に開示されたような哺乳類細胞用のCaPO4処理を使って達成される。酵母形質転換は、Hsiao, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:3829 (1979) 中に記載されたようにまたは Klebe, Gene 25:333 (1983)中に記載されたように行うことができる。
【００６２】
非スプライシング変異体gp350 配列（Ｃ末端領域および／または膜貫通領域の削除を引き起こすような本明細書中に開示された追加の変異を有するかまたは有さない）を含有する適当なベクターの作製は、当業界で現在周知である常用の連結および制限技術を使って行われる。部位特異的ＤＮＡ開裂は標準条件下で１または複数の適当な制限酵素で処理することにより行われ、その詳細は典型的には制限酵素製造業者により明記されている。標準技術を使って開裂された断片をサイズ分離するためにポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を実施することができ、そして４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でＥ．コリのポリメラーゼＩクレノウ断片での処理により該断片を平滑末端にすることができる。
【００６３】
Ｓ１ヌクレアーゼでの処理はいずれの一本鎖部分も加水分解する。例えば当業界で既知のジエチルホスホアミダイト法を使って、合成オリゴヌクレオチドを製造することができる。米国特許第4,415,732号（1983）を参照のこと。標準条件および温度の下でT4 DNAリガーゼを使って連結を実施し、そして連結混合物を用いてＥ．コリまたはＣＯＳ細胞を形質転換させることにより正しい連結を確認することができる。好結果の形質転換体はアンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の抗生物質耐性により、または当業界で既知であるような別のマーカーを使って選択される。
【００６４】
そのような組換えＤＮＡ技術は文献中に詳しく説明されている。例えば、Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2DED.(1989) ; DNA CLONING, I & II 巻 (DN Glover 編 1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (MJ Gait編 1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (BD Hames 編 1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSLA-TION (BD Hames編 1984)；ANIMAL CELL CULTURE (RI Freshney編 1986) ；B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984)；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (JH Miller編 1987 Cold Spring Harbor Laboratory)；Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE,第２版 (1987 Springer-Verlag NY)；およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY Ｉ〜IV巻（DM Weired 1986）を参照のこと。本明細書中に言及される全ての刊行物はそれらが開示するものの内容についての参照のため組み込まれる。
【００６５】
従って別の態様では、本発明はgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を含有するベクターと宿主細胞を含んで成り、また均一gp350 タンパク質の発現を可能にする培養条件下で、発現調節配列に作用可能に連結されたgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を担持しているベクターを含む前記宿主細胞を培養することによりgp350/220 タンパク質の非スプライシング変異体を生産する方法を更に含んで成る。
【００６６】
従来の糖タンパク質精製技術を使って、例えば非限定的に、当業界で既知である限外濾過、フリーフロー電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、SDS-PAGE、分別NH4SO4沈澱、レクチンカラム、イオン交換カラムおよび疎水性カラムを使って、細胞および培地成分から、発現された均一gp350 が精製される。gp350 の小規模分析用調製物はSDS-PAGEまたはレクチンアフィニティーカラムを使って最も容易に精製され、そして予防接種または免疫応答実験用のそのような小規模調製物は液体クロマトグラフィーを使って最も容易に精製される。ワクチン組成物に使われる商業的に有意な量のgp350 の大規模生産には、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換および疎水的相互作用クロマトグラフィーの組合せが好ましい。
【００６７】
本発明の精製された均一のgp350 タンパク質は、感染性単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌のようなＥＢＶ関連状態および疾患を予防または治療するための治療および／または免疫原性組成物に使うことができる。そのような医薬組成物は、医薬上許容される担体、例えばアジュバント／抗原提示系、例えばミョウバンと共に、免疫原的誘発有効量の１または複数の本発明の均一gp350 タンパク質を含んで成る。他のアジュバント／抗原提示系、例えばMF59(Chiron Corp.), QS-21 (Cambridge Biotech Corp.), 3-DMPL（３−デアシルモノホスホリルリピドＡ）（RibiImmunoChem Research,Inc.），臨床用不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ），フゾゲニックリポソーム，水溶性ポリマーまたはIscoms（免疫刺激複合体）を使ってもよい。
【００６８】
他の典型的な医薬上許容される担体または溶液は水酸化アルミニウム、食塩水およびリン酸塩緩衝化食塩水である。該組成物は全身投与することができ、好ましくは許容される皮下または筋内溶液の形で皮下または筋内に投与することができる。また表面乱切によりまたは体腔の接種により接種を行うことができる。ｐＨ、等張性、安定性などに十分な注意をしたそのような溶液の調製は、当業者の技術の範囲内である。投薬法は、薬の作用を変えることが知られている様々な要因、例えば健康状態、体重、性別、食事、症状の重さ、投与の期間および他の臨床的要因を考慮して担当医により決定されるだろう。典型的な用量範囲は約１μｇから約1000μg のタンパク質を含んで成る。
【００６９】
本発明の処置方法を実施する場合、免疫学的誘発有効量の均一gp350 タンパク質が治療または予防処置の必要なヒト患者に投与される。本発明の組成物の免疫学的誘発有効量は、投与１回分あたり約１μｇ〜約１mgの範囲内であると予想される。投与量の数字は上述した要因によって異なるだろう。本発明を次の実施例において更に説明するが、本発明の範囲を限定するのではなく本発明を例証することを意図したものである。
【実施例】
【００７０】
実施例１．pDTMおよびpSTOP を作製するためのgp350/220 の膜貫通領域および膜貫通領域からＣ末端までの削除
ＥＢＶ B95-8株（Miller他, 1972）からのgp350/220 遺伝子は、BLLF1 と呼ばれる転写解読枠としてBamHI ライブラリーにおいて入手可能である（Baer, Nature 310:207, 1984）。所望の構成物（図９に略図として示される）を作製するため、gp350/220 遺伝子を２部分においてクローニングした：(1) 2.3 kb HindIII ／Bfa Ｉ３′断片であるBLSH1 および(2)337 bp BanＩ／HindIII ５′断片であるBLSH2 （図８）。
【００７１】
Ｃ末端の細胞質および／または膜貫通コード領域の削除を行えるようにそれらの断片を足場（staging）ベクター中にクローニングした。BfaＩ部位はgp350 膜貫通（ＴＭ）領域をコードする領域の５′末端に存在するので、それを使ってＴＭ領域欠失体および近隣のＣ末端欠失を含むＴＭ領域欠失体を作製した。BfaＩを使って、ＴＭ領域の２アミノ酸だけを保持している欠失体を作製することができた。
1.  pSTG1 とpSTG3 からのpDTMの作製
プラスミドpDTMは、完全なＴＭコード領域を欠くgp350/220 核酸配列から構成される。この構成物は２つの足場ベクターpSTG1 とpSTG3 を使って作製した。BLLF1 クローン標的配列を使って、ＴＭ領域の３′末端のところに BfaＩ部位を導入する450 bpのＰＣＲ生成物SYCTを作製した（図８および図９）。使用したＰＣＲプライマーは次の通りである：
【００７２】
【表３】
2005333990.tif 000004
プライマー１のBfaＩ部位を使ってSCYTのBfaI／XmaI断片をpSTG1 中にクローニングした。プライマー１の残部はクローンBLLF1 によりコードされるアミノ酸配列に相当する。プライマー２は、gp350/220 転写解読枠の外側の該遺伝子の３′側の領域に相当する。SCYT  ＰＣＲ断片をBfaIとXmaIで切断して136 塩基対の断片を得、それを第二の断片であるBLSH1 HindIII ／BfaI断片と一緒にpMT11 ベクター（SpaeteおよびMocarski, 1985）中にクローニングしてpSTG1 を作製した。
【００７３】
BfaI部位を横切る配列分析は、アミノ酸Met とLeu を除くＴＭアミノ酸コード領域の全てが削除されたことを示した（表２を参照のこと）。第三のBLLF1 断片であるBLSH2 をpMT11 中にクローニングしてpSTG3 を作製した。gp350/220 遺伝子コード配列の外側の16塩基対のBanI／XbaIオリゴヌクレオチドリンカーを使って、BLSH2 BanI／HindIII 断片をpSTG3 中にクローニングした。2.4 kbのHindIII ／XmaI pSTG1断片を0.3 kbのXbaI／HindIII  pSTG3断片と一緒にpEE14 ベクター（Celltech, 英国）中にクローニングし、pDTM構成物を完成させた。
2.  ベクターpSTG2 とpSTG3 を使ったpSTOP の作製
プラスミドpSTOP は、ＴＭ領域とＴＭ領域に隣接したＣ末端細胞質領域を欠くgp350/220 遺伝子を含んで成る。この構成物を作製するために、下記に示すようにBfaI粘着末端の後の３フレームに終止コドン（下線を引いた部分）を有する16塩基対のBfaI／EcoRI オリゴヌクレオチドリンカーを作った。
【００７４】
【表４】
2005333990.tif 000005
上側の配列の５′突出部（TA）はBfaI制限部位のための粘着末端であり、そして下側の配列の５′突出部（TTAA）はEcoRI 粘着末端である。この16塩基対リンカーを使って、BLSH1 HindIII ／BfaI断片をpMT11 中にクローニングしてpSTG2 を作製した。pSTG2の 2.3 kb HindIII ／EcoRI 断片とpSTG3 の 0.3 kb XbaI／HindIII 断片をpEE14 中にクローニングしてpSTOP を作製した。
3.  野性型、pDTMおよびpSTOP 配列のＴＭ領域のところの比較
野性型、pSTOP およびpDTMのgp350 ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の３′末端のオリゴヌクレオチド配列と翻訳されるアミノ酸配列を下の表５に示す。矢印は野性型の膜貫通領域（ＴＭ）の始まりと終わりを示す。膜貫通領域からの２つのアミノ酸、Met861とLeu862だけがpDTMとpSTOP 中に保持される（図１〜図７も参照のこと）。pSTOP 中ではLeu862の直後に終止コドンがあることに注目されたい。pDTM中では、削除された膜貫通領域より先の位置が「ΔＴＭ」と記されている。（この表では、生来のアミノ酸が示される。）
【００７５】
【表５】
2005333990.tif 000006
実施例２．pMDTM およびpMSTOPを作製するためのgp350/220 遺伝子の供与体および受容体スプライス部位の除去
gp350 タンパク質の均一生産を得るために、gp350/220 遺伝子スプライス部位の高度に保存された塩基と保存された塩基を変更した。全スプライス部位の100 ％に存在する高度に保存されたＧＴ対を含む、供与体スプライス部位中の４塩基を変更した。２つの保存された供与体部位塩基ＡＡをＧＴで置き換えた。２つの高度に保存された（不変の）供与体スプライス部位塩基をＧＴからＣＡに変更した。受容体スプライス部位では、アミノ酸配列を維持するために高度に保存された受容体スプライス部位塩基のうちの１つだけを変更した。第二の保存された受容体スプライス部位塩基は表６に指摘されるように変更した。表３はgp350/220 遺伝子の供与体および受容体スプライス部位の中の変更された塩基を要約する。
【００７６】
【表６】
2005333990.tif 000007
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発により変更された塩基は変異体配列中に星印が付けられている。スプライシングの実際部位は矢印により示され、コードされるアミノ酸が記載されている。ヌクレオチド置換の結果としてアミノ酸配列が変わらないことに注目のこと。
【００７７】
野性型gp350/220 供与体スプライス部位と受容体スプライス部位ＤＮＡ配列に対するそれらのヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を使って達成された。変異ファージベクターM13TACを使ってZoller, M.E.および Smith, M. (1983) Methods of Enzymol. 100:468に記載のようにして変異を導入した。Asp718とXhoI粘着末端を含む19 bp オリゴヌクレオチドリンカーと組み合わせて、ポリリンカー上のAsp718制限部位とBamHI 制限部位を使ってプラスミドM13TACのポリリンカー中にgp350/220 ヌクレオチド配列の BamHI／XhoI断片をクローニングした。実施例１のプラスミドM13DTMとM13STOP（図９）を突然変異誘発に使った。
【００７８】
突然変異誘発に使用するために２つの42マーオリゴヌクレオチドPrDonor1とPrAcceptor1 を作製した。各々、供与体または受容体スプライス部位のいずれかの中心を占めるgp350/220 遺伝子配列に相補的であるようにデザインした。gp350/220 遺伝子に相補的でない該オリゴヌクレオチドの唯一の領域は所望の変異を示す塩基であった。突然変異誘発オリゴヌクレオチドは次のものから成った：
【００７９】
【表７】
2005333990.tif 000008
突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列は「プライマー」と標示され、一方でgp350/220 遺伝子スプライス部位を含むＤＮＡ配列は「ＥＢＶ」と標示されている。突然変異誘発の結果として変更された塩基は星印が付けられている。点線はスプライスの位置を示している。
【００８０】
オリゴヌクレオチドPrDonor1とPrAcceptor1をM13-DTMとM13-STOPの一本鎖クローンにハイブリダイズさせた。T4 DNAポリメラーゼホロ酵素を使って二本鎖のM13 ＤＮＡを製造し、その二本鎖ＤＮＡを使ってＥ．コリを形質転換せしめた。ベクターM13TACを使って、所望の変異を含まないいずれのクローンも、X-gal とイソチオプロピルガラクテートの存在下で白から青への色の変化により同定することができた。青色プラークを取り、増殖させ、そしてスプライス接合部にまたがるＤＮＡ配列決定を使って、M13-MDTMおよびM13-MSTOPと命名された変異体クローンを最終同定した。
【００８１】
所望の変異を含むクローンを同定した後、M13-MDTMとM13-MSTOPから BamHI／XhoI断片を切り取り、それらをpDTMまたはpSTOP 骨格中に連結し直してそれぞれpMDTM とpMSTOPを作製した。それらの構成物をCHO 細胞中にトランスフェクションし、実施例３に記載のように非スプライシング変異体gp350/220 ＤＮＡ配列を発現させた。
【００８２】
実施例３．CHO 細胞中でのgp350 の発現
1.  gp350/220 遺伝子構成物のトランスフェクション
哺乳類細胞からの本発明の均一gp350 タンパク質を高レベルで生産する１つの方法は、多重コピーの異種gp350 ＤＮＡ配列を含む細胞の作製を必要とする。異種ＤＮＡ配列は増幅可能なマーカー（この実施例では、細胞をメチオニンスルホキシミンを使って増幅させることができるグルタミンシンセターゼ遺伝子）に作用可能に連結される。
【００８３】
実施例２において作製したpMDTM およびpMSTOPベクターを、Crockett, Bio/Technology 8:662 (1990) の手順に従って且つグルタミンシンセターゼ遺伝子増幅系についてのCelltech Instruction Manual (1992) に記載の通りに、後述のごとくCHO 細胞中にトランスフェクションせしめた。
【００８４】
CHO-K1細胞（ATCC CCR61）を、10％ウシ胎児血清、100 単位／mlのペニシリン、100 mg／mlのストレプトマイシン、ＭＥＭ（改良イーグル培地）非必須アミノ酸および１mMピルビン酸ナトリウム（全てJRH Biosciences から）が補足されたグルタミン不含有ＥＭＥＭ（イーグル最少必須培地）中に維持した。該培地に60mg／mlのグルタミン酸、60 mg／mlのアスパラギン、７mg／mlのアデノシン、７mg／mlのグアノシン、７mg／mlのシチジン、７mg／mlのウリジンおよび2.4 mg／mlのチミジン（全てSigma から）も補足した。この培地調製物をトランスフェクションの間終始使用するが、指摘されるようなこの処方箋からの変化を伴う。
【００８５】
トランスフェクションの１日前に、10cm皿に３×106 個のCHO-K1細胞を接種した。トランスフェクションの当日、細胞を皿あたり10mlの無血清培地で洗った。常用技術を使ったCaPO4 沈澱により、プラスミドＤＮＡ（pMDTM, pMSTOP プラスミドから）を適用した。10μg の各プラスミドＤＮＡ沈澱物をCHO-K1細胞と２mlの無血清培地と共に37℃で4.5 時間インキュベートした。４回のプラスミドＤＮＡトランスフェクションの各々に３つの複製物を作った。次いでHEPES 緩衝化食塩水中の15％グリセロールを使って細胞を1.5 分間刺激した。無血清培地で洗浄した後、細胞に血清含有培地を再び与えて24時間インキュベートした。
【００８６】
翌日、10％透析済ウシ胎児血清（JRH Biosciences）を含むように培地を交換し、25μＭメチオニンスルホキシミン（Sigma）の添加により増幅させた。増幅したクローンが採集に十分な位大きくなるまで（約13〜14日後）３〜５日毎に細胞にメチオニンスルホキシミン含有培地を再供給した。無菌の200 μｌピペットマンチップを使って皿からコロニーを掻き取ることによりクローンを採集し、メチオニンスルホキシミン不含有培地の入った96ウエルプレートの１つのウエルに移した。１〜２日後、その培地を培地＋25μＭメチオニンスルホキシミンと交換した。４日後、培養上清を取り、後述するようなELISA アッセイにおいてタンパク質産物についてアッセイした。
【００８７】
CHO 細胞をpEE14 対照ベクターだけ（ＥＢＶ配列を全く含まない）でトランスフェクションし、同様にCHO-pEE14 の24クローンを採集し、プレートに移して対照とした。（対照クローンはメチオニンスルホキシミン中での生存に基づいて同定された。）
2.  ELISA アッセイ
トランスフェクション後、241 クローンのCHO-pMDTM と158 クローンのCHO-pMSTOPを採取し、増殖させた。それらのクローンからの上清をgp350 タンパク質生産について試験した。96ウエルプレートを、50 mM ホウ酸ナトリウム緩衝液, pH 9中に1:2000希釈されたアフィニティー精製済ウサギ抗gp350/220 抗体（抗体MDP1；Andrew Morgan氏より）でコーティングした。プレートを37℃で３〜４時間インキュベートし、そしてNunc Immuno Washerを使ってＰＢＳ＋0.05％Tween 20で３回洗浄した。ブロッティング乾燥後、ＰＢＳ＋0.01％Thimerosal中の２％ＢＳＡと共に37℃で0.5 時間インキュベートすることによりプレートをブロックし、次いで再び洗浄した。
【００８８】
トランスフェクションされた細胞と対照細胞からの上清を該ウエルに添加し、37℃で２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ洗浄緩衝液中に希釈された１mg／mlの一次検出抗体、即ちgp350/220 に対するマウスモノクローナル抗体（抗体#C65221M ; Biodesign International）と共にプレートを37℃で１時間インキュベートした。洗浄後、該プレートをＰＢＳ＋0.05％ＢＳＡ＋0.01％Thimerosal中0.7 mg／mlの二次抗体、即ちマウス免疫グロブリンに対して向けられた西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギＦ(ab)2 断片（ヒトIg吸着精製済；Biosource International）と共に37℃で１時間インキュベートした。
【００８９】
プレート洗浄後、Stable Peroxide Substrate Buffer (Pierce Chemicals) 中に溶かしたABTS (Pierce Chemicals）を使って室温で0.5 時間発色させた。１％ＳＤＳを使って反応を停止させ、Molecular Devices ELISA プレートリーダーを使って405 nmと650 nmの波長でプレートを読んだ。24個のpMDTM クローンと18個のpMSTOPクローンが分泌型gp350 について陽性であった。最大のELISA シグナルを示すクローンをスケールアップのため24ウエルプレートに移し、ウエスタンブロットと放射線免疫沈澱アッセイにおいて更に試験した。
3.  ウエスタンブロットおよび放射線免疫沈澱アッセイ
最初のスクリーニングでは、ウエスタンブロットを使ってpMDTM トランスフェクションからの組織培養上清を活性についてアッセイした。CHO 細胞上清を５％SDS-PAGEゲル上で精製し、ニトロセルロースに一晩移行させ、そして抗gp350 抗体を使って探査した。このウエスタンブロット分析において７個のpMDTM クローンがgp350 陽性であるとわかった。
【００９０】
ウエスタンブロットで陽性であったpMDTM クローンを更にgp220 の存在について放射線免疫沈澱法により試験した。選択された形質転換されたpMDTM 細胞、pEE14 対照細胞および GH3Δ19対照細胞（後述）を、実験の日に約3/4 周密的であるように６ウエルプレート上で一晩増殖させた。各ウエルは5 ×106 細胞を含んだ。標識のため、各ウエルから培地を取り除き、0.7 mlのメチオニン不含有ＭＥＭ（10％ウシ胎児血清）＋100 μCiの35Ｓ−メチオニンで置き換えた。細胞を37℃で5.5 時間インキュベートし、次いで4000 rpmで５分間遠心した。
【００９１】
50％スラリーでの10μｌのセファロース−プロテインＡ（Sigma）と20μｌのモノクローナル抗gp350/220 抗体（抗体#C65221M, 100 mg／ml ; Biodesign International）の添加により、４℃で一晩揺り動かしながら、上清中の均一gp350 タンパク質を免疫沈澱せしめた。次いで超遠心機中で2000 rpm, 室温で２分間混合物をペレットにし、数倍容のリン酸塩緩衝化食塩水で４回洗浄した。最終洗浄後、ペレットから全ての液体を除去し、50μｌのタンパク質ゲル試料緩衝液で置換した。沈澱した免疫複合体を含む試料を５分間煮沸し、５％SDS-PAGE上で泳動した。免疫沈澱物を、タンパク質試料緩衝液と１：１で混合した組織培養上清のゲル試料と比較した。ゲルを乾燥し、次いでHyperfilm β-Max (Amersham)を使ってオートラジオグラフィーを行った。
【００９２】
図10は、放射線免疫沈澱のSDS-PAGE分析のオートラジオグラフ結果を示す。陽性対照として使った細胞系は GH3Δ19（Elliot Keiffより提供；Whang 他, 1987）であった。 GH3Δ19細胞は、膜貫通領域とＣ末端細胞質領域を欠いている端が切り取られた形のgp350/220 タンパク質を分泌する。陰性対照として使用するために、pMDTM トランスフェクションと並行して、CHO 細胞をpEE14 ベクターのみでトランスフェクションしそしてメチオニンスルホキシミンにより選択した。
【００９３】
図10には、偶数のレーンに示された免疫沈澱物（「Ｉｐ」）と互い違いに、奇数のレーンに上清（「Ｓ」）が示される。対照レーン２において、 GH3Δ19対照細胞からの沈澱物は約220 kDと350 kDのところに２本の強いタンパク質バンドを生じ、端が切り取られたスプライス変異体gp350 およびgp220 タンパク質の約１：１の比での生産を証明する。予想通り、免疫沈澱させたそれらのバンドはレーン１の放射能標識した組織培養上清（免疫沈澱させてない試料）に関して濃縮される。また、予想通り、pEE14 ベクターはgp350/220 構成物のいずれも含まないので、陰性対照（レーン４）には全くバンドが観察されない。
【００９４】
レーン６，８および10におけるpMDTM クローンの上清からの免疫沈澱のSDS-PAGE分析は、約350 kDのところに一本の強いバンドを生じる。この分子量は GH3Δ19対照レーン２の大きい方の分子量の種と同じである。しかしながら、 GH3Δ19対照レーンとは異なり、レーン６，８および10には約220 kDのところに追加の強いバンドが見られない。ただし、レーン８には、わずかに小さい分子量で移動するごく弱いバンドが観察される。これは、欠失した供与体および受容体スプライス部位を生来のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列に戻す変異現象または誤翻訳から生じる少量のgp220 タンパク質、分解産物、または共沈した細胞産物を表す可能性がある。約350 kDのところの強い一本のバンドは試験した他の５つのMDTM複製物にも観察された（データは示してない）。
【００９５】
レーン６とレーン10における220 kDのバンドの完全な欠失は、MDTM上清からの不完全な沈澱のためではないようである。何故なら、35Ｓ−標識 GH3Δ19対照レーン２には220 kDのバンドが容易に認められるからである。また、野性型スプライス部位を含む実施例１のpDTM構成物を使った追加の分析は、350 kDと220 kDのところに２つの強いバンドを生じた。従って、それらの結果は、スプライス部位の欠失がgp220 タンパク質生産の不在下でのgp350 タンパク質生産を引き起こすことを証明する。
【００９６】
CHO 細胞系、または他の哺乳類もしくは非哺乳類細胞系中で発現されたこの均一gp350 タンパク質を更にスケールアップすることができ、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、逆相HPLC、FPLC、ゲル濾過等といった技術をはじめとする当業者によく知られた方法を使って、該細胞系からの順化培地より精製することができる。 David, J. Immunol. Methods 108:231 (1988)および Madej, Vaccine 10:777 (1992) を参照のこと。
4.  pMDTM タンパク質のノーザンブロット分析
この実験では、MDTM-1細胞がgp350 RNA を生産しgp220 RNA を生産してないことをノーザンブロットにより証明し、スプライス部位の変異がgp220 生産を防ぐという別の段階での確証を提供する。
【００９７】
gp350 に相補的なＤＮＡプローブをpDTMから作製した。実施例１を参照のこと。464 bpのXhoI／PstI pDTM 断片としてgp350/220 プローブ鋳型XP464 を単離した。XP464 はgp350 とgp220 の両方を認識する。gp350 特異的プローブAN537 を作製するために、pDTMをNcoIとNdeIで切断し、２つの重複する580 b.p.断片を単離し、そして１つの混入断片を除去するためにXmnIと、gp350/220 スプライス部位の内部の537 b.p. AluI ／NdeI断片を得るためにAluIで該混合物を切断した。AN537 はgp220 からスプライシングで除去される領域に特異的であり、従ってgp350 情報に特異的である。ＤＮＡ断片XP464 とAN537 を使ってＤＮＡプローブを32P-dCTPニックトランスレーション（Amersham）により標識した。
【００９８】
全細胞ＲＮＡは、ChomczyunskiおよびSacchi, Anal. Biochem., 162:156-59 (1987) の方法に本質的に従って調製した。CHO-pEE14（陰性対照細胞系、実施例１参照）、CHO-MDTM-1およびCHO-DTM-7 細胞（90％集密的）の各々２本ずつのT-250 フラスコから培地を吸引し、細胞を溶解させ、そして変性緩衝液（10mlの４Ｍグアニジンチオシアネート，25mMクエン酸ナトリウム，pH 7.0，0.5 ％サルコシル，100mM ２−メルカプトエタノール）中で削り落とした。
【００９９】
各10mlの溶解物に１mlの２Ｍ酢酸ナトリウム（pH 4）、10mlの飽和フェノール（pH 4.5）および２mlのクロロホルム／イソアミルアルコールを補足し；該溶解物を氷上で15分間インキュベートし、４℃にて10000 ×g で20分間遠心し、そして上側の水相を取り出した。この水相から１容のイソプロパノールの添加により20℃で１時間ＲＮＡを沈澱させ、４℃でペレット化し、変性緩衝液中に再懸濁し、そして再沈澱させた。ＲＮＡペレットを70％エタノール中で１回洗浄し、Speed-Vac 中で乾燥し、そしてDEPC処理した水に再懸濁した。
【０１００】
DTM-7 およびMDTM-1全細胞ＲＮＡを15％ホルムアミドと６％ホルムアルデヒド中で65℃にて15分間変性させ、１％アガロース／6.6 ％ホルムアルデヒドゲル上で泳動し、次いで毛管作用によりニトロセルロースに移行させ、そして標識したXP464 とAN537 を使って探査した。５分間煮沸することによってこれらのＤＮＡプローブを変性させ、５×ＳＳＰＥ中で65℃にて一晩ハイブリダイズさせ、そしてニトロセルロースを高緊縮条件下で洗浄した。Bio-Rad Phosphor-imagerを使ってオートラジオグラフィーを行った。
【０１０１】
CHO-MDTM細胞からの全細胞ＲＮＡのノーザンブロットは、gp220 特異的ＲＮＡ生産を抑制することに対するスプライス変異の有効性を示す。gp350 特異的プローブであるAN537 は、gp350 特異的プローブに予想される通り、MDTM-1細胞とDMT-7 細胞中の１種類のＲＮＡだけに結合した（図11，レーン１と２）。スプライス変異がMDTM-1中でgp220 情報の生産を抑制しているとすれば予想通り、gp350 ＲＮＡとgp220 ＲＮＡの両方に特異的であるXP464プローブはDTM-7 では２つの種を認識し、MDTM-1では一本の大きい方の分子量バンドを認識した（図11，レーン４と３）。MDTM-1レーンはgp350 特異的ＲＮＡに対して過負荷であるにもかかわらず、明瞭なgp220 ＲＮＡは全く検出不可能であった。
【０１０２】
MDTM-1とDTM-7 レーンにおいてgp350 情報の見かけ移動度に差がある理由は明らかでない。MDTM-1種はDTM-7 に比較して過負荷であるので、それがゲル上での移動に影響したのかもしれない。また、gp350 情報はゲル上で大きなリボソームＲＮＡバンドに接近して移動するため、それが見かけ分子量をゆがめるのかもしれない。いずれにせよ、gp350 ＤＮＡ配列に相補的な単一種の存在は、このシグナルがgp350 mRNAを表すことを示唆する。よって、ノーザンブロットから判断すると、供与体および受容体スプライス部位における突然変異はgp220 情報の生産を抑制するのに有効である。この結果は、gp350/220 に特異的なモノクローナル抗体を使った放射線免疫沈澱により並びにMDTM-1上清とDTM-7 上清のウエスタンブロットにより更に確証される。
【０１０３】
実施例４．免疫原性活性についての均一gp350 タンパク質の試験
精製した均一gp350 タンパク質を次のようにして投与に適当な賦形剤中に配合しそしてマウスに投与する。
【０１０４】
David,  J. Immunol. Methods 108:213 (1988)および Allison, J. Immunol. Methods 95:157 (1986) の手順に従って、Pluronic L121 とスクアランを（Thr1）MDP と共にリン酸塩緩衝化食塩水中の0.4 ％(v/v) Tween 80中で混合することにより、２×アジュバント−賦形剤濃縮物を調製する。
【０１０５】
投与用組成物は、同容量のタンパク質とアジュバント−賦形剤の添加により投与日に調製する。タンパク質含量は用量あたり５μｇ〜50μｇの範囲内であるべきである。
【０１０６】
０，21および42日目の３回の0.1 ml筋肉内注射によりBALB/cマウスを免疫する。後眼窩洞から免疫前の血液と各注射の10日後に採血した血液を得る。
【０１０７】
実施例３に記載の手順に従ったELISA により血清抗体価を測定する。血清中のＥＢＶ中和抗体は、Moss, J. Gen. Viol. 17:233 (1972)および De Schryver, Int. J. Cancer 13:353 (1974)の方法に従って、試験管内でＥＢＶによる胎児臍帯血リンパ球の形質転換を阻害するそれらの能力により定量する。
【０１０８】
あるいは、前述のアジュバント中に乳化させたタンパク質の０，21，42，63および84日目の５回の筋肉内投与によりニュージーランド白ウサギに接種する。用量は接種１回あたり約５μｇ〜50μｇの範囲内である。最後の投与の二週間後に血清を得、抗原に対する抗体価について、B95-8 細胞からのウイルスgp350/220 に対する交差反応性抗体について、および Emini, Virology 166:387 (1988) の方法に従った試験管内ＥＢＶ中和活性について試験する。
【０１０９】
ＥＢＶのgp350/220 タンパク質は既に確立されているＥＢＶ感染の動物モデル〔Epstein, Clin. Exp. Immunol. 63:485 (1986) を参照のこと〕において防御免疫を誘導することができるので、均一gp350 タンパク質組成物の投与からも同様な良性結果が期待される。
【０１１０】
本明細書中に指定した全ての刊行物の開示は本明細書中に組み込まれる。本発明の範囲内での変更は当業者にとって明白であろうから、上述の詳細な説明は理解の明確化のために与えられるのであって、そこから無用な制限が解釈されたり推測されたりしてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図２】図２はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。星印（＊）は推定上のシグナル配列の終わりを表す。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図３】図３はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図４】図４はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。供与体スプライス部位が指示される。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図５】図５はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。受容体スプライス部位が指示される。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図６】図６はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。膜貫通領域は横の矢印で輪郭が描かれる。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図７】図７はgp350/220 のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel, J. Virology 54:665 (1985) より〕。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は配列の下に示される。
【図８】図８は、gp350 の欠失および部位特異的変異体の作製を表す。およそ一定のスケールで下のコードクローンBLLF1 と共にgp350 タンパク質の直鎖状モデルが示される。タンパク質上にはＮ末端シグナル配列（ＳＳ）と膜貫通領域（ＴＭ）が示され、遺伝子地図上には重要な制限部位が示されている。gp350 遺伝子はHindIII ／BfaＩBLSH1 断片と BanＩ／HindIII  BLSH2断片の２部分においてクローニングした。SCYTは指摘されたBLLF1 の領域からポリメラーゼ連鎖反応を使って作製した。
【図９】図９は、gp350 の欠失および部位特異的変異体の作製を表す。pMDTM およびpMSTOPと表示されたプラスミド地図は本発明の非スプライシングgp350/220 変異体を例示する。pDTM, pSTOP, pMDTMおよびpMSTOPのクローニングスキームが描写されている（プラスミドは一定のスケールではない）。クローニングの詳細は実施例１と２に記載される。プラスミド地図には、関連する制限部位、使用したクローニングベクター、およびgp350 遺伝子断片が標示されている。pMDTM とpMSTOP中のスプライス部位の変異は星印により示される。
【図１０】図10は、SDS-PAGEにより分析した時のpMDTM クローンからの均一gp350 タンパク質の免疫沈澱の結果を表す。gp350/220 タンパク質の端が切り取られた形を分泌する陽性対照（GH3Δ19）細胞、陰性対照（pEE14）細胞および幾つかのpMDTM クローンを、5.5 時間35Ｓ−メチオニンで代謝的に標識し；得られた組織培養上清から均一gp350 タンパク質を免疫沈澱させた。各細胞型について、標識された組織培養上清（Ｓ）とgp350/220 沈澱物（Ｉｐ）の試料を５％ SDS-PAGE （ポリアクリルアミドゲル電気泳動）上で電気泳動した。分子量マーカーの位置が左側に示されている。
【図１１】図11は、実施例3.4 に記載されるような、ＣＨＯ細胞中で発現されたpMDTM クローンからのタンパク質のノーザンブロット分析の結果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月4日(2005.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)宿主細胞での発現によって得られた均一かつ分泌型の組換えエプスタイン-バーウイルス（EBV） gp350タンパク質であって、可溶性形であること、そのアミノ酸配列において膜貫通領域を本質的に含まないこと、並びに、EBV gp220タンパク質を含有しないこと、を特徴とする前記タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、下記の方法、すなわち、
gp220 mRNA転写物の生成を回避するように、EBV野生型gp350/220 DNA配列において、スプライス部位もしくはその近傍に少なくとも１つの塩基の変異を含みかつ膜貫通領域をコードする塩基の欠失を含むDNA断片を調製すること、ここで、前記変異は、ドナースプライス部位GAA[Glu]−AGT[Ser]501におけるGAA及びAGTを、GAG[Glu]-TCA[Ser]501に変更すること、および/またはアクセプタースプライス部位ACA[Thr]−GGT[Gly]698におけるACA及びGGTを、ACT[Thr]-GGA[Gly]698に変更することを含む；
前記DNA断片を含む発現ベクターを調製すること；
前記発現ベクターで安定に形質転換もしくはトランスフェクションされたCHO宿主細胞を調製すること；
前記CHO宿主細胞を適当な培養培地にて培養し、培養液中に前記組換えEBV gp350タンパク質を生成及び分泌させること；並びに、
前記組換えEBV gp350タンパク質を前記培地から回収すること；
を含む方法によって製造されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記DNA断片がさらに、膜貫通領域と残りのＣ末端領域をコードする塩基の欠失を含むことを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記膜貫通領域の欠失が、配列番号18のMet861からAla881までのアミノ酸配列において、連続する18〜21アミノ酸の欠失を含むことを特徴とする請求項２または３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記膜貫通領域の欠失が、配列番号18のVal863からAla881までのアミノ酸の欠失を含む、請求項２〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記DNA断片が、
（ａ）配列番号18のコドンThr19〜Leu862；
（ｂ）配列番号18のコドンMet１〜Leu862；
（ｃ）配列番号18のコドンThr19〜Leu862及びAsp882〜Val907；及び、
（ｄ）配列番号18のコドンMet１〜Leu862及びAsp882〜Val907；
から成る群から選択された断片と同じアミノ酸断片をコードする、請求項２〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
EBV関連疾患又は状態の予防又は治療のための医薬組成物であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の均一かつ分泌型の組換えEBV gp350タンパク質を含むことを特徴とする前記組成物。