(57)【要約】【課題】  ヒト血清アルブミンの生産量をより増大させるヒト血清アルブミンの製造方法を提供すること。【解決手段】  遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）産生性宿主を２１〜２９℃の温度条件下で培養することを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生性宿主を２１〜２９℃の温度条件下で培養することを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作により形質転換された宿主を培養することによるヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡという）の製造方法の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＳＡは、血漿の主要な蛋白構成成分であり、医薬として、例えば大量出血、ショックや熱傷患者あるいは低蛋白血症、胎児性赤芽球症等の治療薬として使用されている。
【０００３】
現在ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。しかし、この製造法では不経済でありかつ原料の血液の供給が困難である。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいるという問題がある。
【０００４】
近年組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種多様の有用なポリペプチドの微生物や細胞による生産が可能となり、ＨＳＡについても遺伝子組換技術による大量生産の研究開発が活発に行われている。しかし、その生産収量は低く、いかに高純度で低コストの工業的生産技術を確立できるかが問題となっている。
【０００５】
遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主を培地で培養するに当たり、従来は特に宿主が酵母の場合３０℃で培養することが通常行われていた（特許文献１、特許文献２）。
【特許文献１】特開平３−８３５９５号公報
【特許文献２】特開平４−２９９９８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる技術的背景の下に、特に培養条件の改良によってＨＳＡの生産量をより増大させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主を培地で培養するに当たり、２１〜２９℃の温度条件下で行うことにより、ＨＳＡ産生性宿主の増殖度およびＨＳＡ産生量が増大するとともにＨＳＡの着色度の抑制が図られることを見出し、本発明を完成するに到った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主を２１〜２９℃のもとで培養することを特徴とするものであり、当該方法によれば、ＨＳＡの産生量およびＨＳＡ産生性宿主の増殖度が増大し、同時にＨＳＡの着色度の低下を図ることができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において用いられる遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製され、かつＨＳＡを産生し得るものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属、ピキア属もしくはクルベロマイセス属が使用されることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さらにまた、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５(his 4) 、クルベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）ＭＷ９８−８Ｃ（α, uraA, arg, lysK + , pKD1°) 等が好適に用いられる。
【００１０】
これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。例えばＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロモーターを用いる方法（特開平６−９０７６８号、特開平４−２９９９８４号公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）などが例示される。
【００１１】
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は、具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで特開平４−２９９９８４号公報に記載の方法に従い、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は合成培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
【００１２】
また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すなわちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報）などが例示される。
【００１３】
さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分とを分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１９８号公報）などが例示される。
【００１４】
形質転換宿主の培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地が使用され、培養条件は一般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基性、弱酸性でよい。好ましくはｐＨ５．７〜６．５である。また、メタノール資化性宿主の場合は、メタノール含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
【００１５】
培養温度に関して、特にＨＳＡの産生量を指標にした場合の好適な範囲は、２１〜２９℃、好ましくは２１〜２８℃、より好ましくは２１〜２５℃、さらに好ましくは２１〜２３℃である。２９℃より高い温度で培養を行う場合は、菌体増殖やＨＳＡ産生が抑制され、さらにＨＳＡ着色度が上昇してしまう等の問題が生じ、また２１℃より低い温度で培養を行う場合も、菌体増殖やＨＳＡ産生が抑制されるなど好ましくない。一方、２１℃程度までは培養温度の低下に従って菌体増殖度及びＨＳＡ産生量が上昇する傾向が見られるものの、培養自体が発熱を伴うことから、２３℃より低い温度で培養を行う場合は冷却装置等が別途必要となる等、温度管理にコストや手間がかかり実際面においては好ましくない。特に発明の企業化を図るに際しては、ＨＳＡの産生量の増大およびＨＳＡ着色度の抑制といった効果と共に、コストや手間等の経済性をも重要なファクターとして勘案する必要がある。そこで、かかる観点から総合的に判断した場合の好適な培養温度は２３〜２８℃であり、より好ましくは２５〜２７℃である。
【００１６】
上記培養温度下で、ＨＳＡ産生性宿主を培養すれば、例えば酵母の場合、従来の３０℃での培養に比べ、ＨＳＡ産生量を１．２〜１．５倍増大させることができるとともに、ＨＳＡの着色度も１０〜３０％低下させることができる。
【００１７】
培養時間は１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃程度、細菌では３７℃程度が好ましい。
【００１８】
かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液または菌体、細胞からそれぞれ公知の分離、精製手段により採取される。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を具体的に説明するため実施例および参考例を示すが、本発明はこれら実施例等によって何ら制限されるものではない。
【００２０】
実施例１
（１）使用菌株の調製
特開平２−１０４２９０号公報に記載のＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットをもつプラスミドｐＨＳＡ１１３から、ＨＳＡ遺伝子の５’ノンコード領域を除去したＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１を作成した。ｐＰＧＰ１は、正常ＨＳＡのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを有する［正常ＨＳＡのアミノ酸配列および正常ＨＳＡをコードする染色体ＤＮＡ配列は、J. Biol. Chem., 261, 6747-6757(1986)に記載されている］。そして、特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に従い、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域を、ＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＰ１をＮｏｔ１制限酵素で切断して得られる断片で置換して、形質転換体ＰＣ４１３０を得た。この株はＡＯＸ1 遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００２１】
ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５％（寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００２２】
ＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモーター [変異型。天然ＡＯＸ２プロモーター (YEAST, 5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, 1316-1323(1989) 中、開始コドン上流２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特開平４−２９９８４号公報）。
【００２３】
（２）培地組成
前培養には、ＹＰＤ培地（２％バクトペプトン、１％イーストエキストラクト、２％グルコース) を使用した。バッチ培地の組成を表１に、フィード培地の組成を表２に示す。
【００２４】
【表１】
2005312463.tif 000002
【００２５】
【表２】
2005312463.tif 000003
【００２６】
（３）３リットル容ファーメンターを用いた培養方法
＜１＞前培養
凍結ストックバイアルより、１mlをＹＰＤ培地５０mlを含むバッフル付きの３００ml容三角フラスコに植菌し、３０℃、２４時間振盪培養した。培養２４時間後の培養液１４mlをバッチ培地７００mlに植菌した。
＜２＞本培養
バッチ培地７００mlに前培養液１４mlを植菌し、３リットル容ミニジャーファーメンターを用いて通気攪拌培養した。培養温度は、１５、２１、２３、２５、２７、２８、３０℃の各温度に設定した。攪拌速度の下限を２００ｒｐｍ、上限を１０００ｒｐｍに設定した。溶存酸素濃度が飽和濃度の５０％程度を保持するように制御しながら回分培養した。回分培養において培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地の添加を開始した。ｐＨは６．２に定値制御した。消泡は、必要に応じて消泡剤を培地中に適宜添加することで実施した。培養は３６０時間行った。
【００２７】
（４）１２００リットル容ファーメンターを用いた培養方法
＜１＞前々培養
グリセロール凍結ストック菌株１mlを２００mlのＹＰＤ培地を含むバッフル付１，０００ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。
＜２＞前培養
ＹＰＤ培地５リットルを含む１０リットル容ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、３０℃で２４時間通気攪拌培養した。通気は、溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０％程度を保持するように制御した。また、前培養においてはｐＨ制御は行なわなかった。
【００２８】
＜３＞本培養
バッチ培養用培地２５０リットルに前培養液を植菌し、１，２００リットル用ファーメンターを用いて通気攪拌培養を行った。培養温度は２３，２５，２７，２９，３０℃の各温度に設定した。溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持するように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。回分培養において培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地の添加を開始した。ｐＨは５．８５に定値制御した。消泡は、消泡剤を培地中に適宜添加することで実施した。なお、培養は３６０時間行った。
【００２９】
試験例１    菌体濃度の測定
実施例１の各培養温度における培養において、任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で測定時のＯＤ540 値が０．３以下となるよう適当に希釈したのち分光光度計（ＵＶ２００型、島津製）を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。本実験において、吸光度から乾燥菌体量への変換はＯＤ540 値／５．２とした。各培養温度での最大菌体濃度を表３および表４に示す。
【００３０】
試験例２    ＨＳＡ産生量および着色度の評価
実施例１の各培養温度における培養において、任意の培養時間で培養液をサンプリングし、15,000ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清をウルトラフリーＣ３ＨＶにより清澄濾過後、ＨＰＬＣによるゲル濾過分析を実施した。
カラム：東ソー ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷX1
移動相：0.3M NaCl, 50mM Na-Phosphate, 0.1% NaN3, pH6.5
流速：0.7 ml/min.
インジェクション量：50μｌ
検出：Ａ28O 、Ａ350 （２波長）
【００３１】
表３および表４にＨＳＡ産生量ならびに着色度の評価も合わせて示す。産生量は３０℃での培養のＨＳＡ産生総量（ｇ）を１００としたときの各温度での産生総量（ｇ）を％表示した。また、着色度は、培養終了直前時（３５９時間後）にサンプリングした培養液について、350nm 、280nm それぞれの波長での吸光度の比（Ａ350 ／Ａ28O ）にて評価した。
【００３２】
【表３】
2005312463.tif 000004
【００３３】
【表４】
2005312463.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月19日(2005.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生性宿主を２１〜２５℃の温度条件下で培養することを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項２】
遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生性宿主を２１〜２９℃の温度条件下で培養することを特徴とする、着色度（Ａ３５０／Ａ２８０）が最大で０．０９０までであるヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項３】
前記着色度が、０．０７６乃至０．０９０である請求項２のヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項４】
遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生性宿主を２１〜２９℃の温度条件下で培養することを特徴とする、ヒト血清アルブミンの産生量および産生性宿主の増殖度を増大させ、同時にヒト血清アルブミンの着色度を低下させる方法。