(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩＶ複製に対して影響及ぼすヌクレオチド変異およびペプチド変異の位置を同定し、ＨＩＶ感染者の治療に有効な、ＲＮＡｉや遺伝子治療および薬剤開発等を可能とする新しいＨＩＶ−１由来ポリヌクレオチドとポリペプチドを提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有するＨＩＶ−１由来のポリヌクレオチド、およびその配列において１以上の特定の塩基置換を有するポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、およびＨＩＶ−１複製を制御する構造遺伝子中のアミノ酸変異を伴わない塩基置換。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を有するＨＩＶ−１由来のポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列において、以下の塩基置換（ａ）を有するＨＩＶ−１由来のポリヌクレオチド：
（ａ）第７５位ａがｇ；
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１由来のポリペプチド。
【請求項４】
ＨＩＶ−１複製を制御する構造遺伝子中のアミノ酸変異を伴わない塩基置換。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この出願の発明は、ＨＩＶ−１由来のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関するものである。さらに詳しくは、ＨＩＶ−１複製を制御可能なＨＩＶ−１のヌクレオチド置換位置を同定し、かつそのヌクレオチド置換がアミノ酸置換の伴わない同義変異であってもＨＩＶ−１複製を制御する。
【背景技術】
【０００２】  ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は主として異性間感染と母子感染により世界中に蔓延し続け、２００３年のＵＮＡＩＤＳおよびＷＨＯの報告書によれば、世界中で３００万人以上が命を落とし、５００万人が新たにＨＩＶに感染し、約４０００万人がＨＩＶ／ＡＩＤＳと共に生きていると推計された。特にサハラ以南の南部アフリカ地域における感染者数は約２６６０万人で全世界の約６５％を占める。また、南・東南アジアにおいても感染拡大は衰えておらず約８００万人の感染者数が推計されている。特に中国の感染拡大は著しく２００３年末には感染者が１００万人を上回った。日本においても新規感染者数は毎年約６００人以上を記録し、献血者数に占めるＨＩＶ陽性者の割合も年々増加している。このように不幸にもＨＩＶに感染してしまった患者には、先進国であればＡＺＴを始めとした抗レトロウイルス薬の投与により、病状の進行およびＡＩＤＳの発症が抑えられ延命が期待できるが、完全にウイルスを排除するような治療薬は無く継続的な投与を行う必要性がある。また、薬の副作用による影響も大きい。このような事を踏まえ２００３年日本でＨＩＶ感染患者一人一人に感染しているウイルスを検査し、患者自身のＨＬＡを調べ、免疫力を高めＨＩＶ抑制を目的としたテーラーメイド遺伝子治療治験が開始されたが、アフリカを始めとする発展途上国においては、コストの面で同様の抗レトロウイルス薬を用いた治療やテーラーメイド遺伝子治療を行う事は困難である。このような遺伝子治療の他にも、合成ＲＮＡを用いたＨＩＶ−１複製を直接制御可能（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）な技術が報告された（Ｂｒｉｓｉｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊａｃｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）が、そのターゲットとなる遺伝子部位の選定（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＲＮＡ長等様々な問題も残されている（Ｂｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。【０００３】  しかし、このような治療薬や治療方法の開発が急がれる中、ＨＩＶ−１自身の解析は未だ多くのブラックボックスを残している。次世代の治療方法や予防／治療ワクチンおよび薬剤開発のターゲット部位の決定にも解析が急務である。現在エイズワクチンのターゲットとして利用されているｇａｇ遺伝子にも様々な機能が報告されている。Ｇａｇ遺伝子は、ＨＩＶ−１のコアーを形成するカプシドタンパク質（ｐ２４）、外膜とカプシドタンパク質との間に存在するマトリックスタンパク質（ｐ１７）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｐ１５）等のコアーに関連した構造タンパク質をコードしている（Ｆｒｅｅｄ  １９９８）。特にｐ１７部位は、ウイルスａｓｓｅｍｂｌｙ、ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ、ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ、ｅａｒｌｙｐｏｓｔｅｎｔｒｙ  ｓｔｅｐ、ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ等に対して重要な役割を持つ事が報告されている（Ｆｒｅｅｄ  １９９８）。また、ｐ１７の特定のアミノ酸置換により感染性モレキュラークローンの感染性制御も報告されている（Ｃａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。また、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｍａｎｇｅａｔ  ｅ���  ａｌ．，２００３，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）やＡＩＤ（Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３））の様なホスト側の要因も１本鎖のＤＮＡに対して直接作用し細胞複製に対して抑制する事が報告されている。【０００４】
【文献】
Ｂｏｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７，１１５３１−１１５３５，２００３．
Ｂｒｉｓｉｂｅ  ｅｔ  ａｌ，，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１，３０６−３１１，２００３．
Ｃａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，３４７４−３４８３，１９９７．
Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８２０９−８２１２，１９９６．
Ｆｒｅｅｄ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１，１−１５，１９９８．
Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２４，２１−２２，２００３．
ＨＩＶ−１  ｄａｔａｂａｓｅ；ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ．
Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，６，１３０１−１３１１，２００２．
Ｊａｃｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１８，４３５−４３８，２００２．
Ｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０９，１３６−１４６，１９９５．
Ｍａｎｇｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２４，９９−１０３，２００３．
Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，４８３０−４８３５，２００２．
Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２４，１０３−１０７，２００３．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，９，１６５７−１６６１，２００３．
Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，６３８７−６３９４，１９９３．
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４２４，９４−９８，２００３．
Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，２５５６−２５５９，１９９４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  ＨＩＶ−１の感染によるＡＩＤＳが世界的規模で急速に拡大しつつあり、その対策が強く求められている。特にＡＩＤＳの予防や治療の観点からは有効なワクチン、遺伝子治療および薬剤の開発が急務であるが、ＨＩＶ−１のゲノムＲＮＡやその発現タンパク質は急激かつ多様に変異するため、それぞれに決定的なターゲットとなるＨＩＶ遺伝子は未だ見出されていない。またウイルスおよびホストである人側の因子との相互作用についても完全に解明されておらず両サイドからの解析がそれぞれ必要である。【０００６】  この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＨＩＶ−１遺伝子の未解明の機能を明らかにする事によりＨＩＶ−１の制御を可能にし、ＨＩＶ−１治療に有効な薬剤開発を可能とする新しいＨＩＶ−１由来ポリヌクレオチドとポリペプチドを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  この出願の発明は、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
（１）  配列番号１の塩基配列を有するＨＩＶ−１由来のポリヌクレオチド。
（２）  配列番号１の塩基配列において、以下の塩基置換（ａ）を有するＨＩＶ−１由来のポリヌクレオチド：
（ａ）  第７５位ａがｇ；
（３）  配列番号２のアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１由来のポリペプチド。
（４）  ＨＩＶ−１複製を制御する構造遺伝子中のアミノ酸変異を伴わない塩基置換。【０００８】  我々は、１９９２年、ＷＨＯによりタイで採取、分離されたＨＩＶ−１  ＣＲＦ０１＿ＡＥ、９２ＴＨ０２２を感染させたｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｂｌａｓｔｅｄ（ＰＨＡ−ｂ）ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）のｐｒｏｖｉｒｕｓから感染性モレキュラークローンの構築に成功した。このモレキュラークローンとＣｏｒｎｅｌｉｓｓｅらが公表したｇａｇ  ｐ１７  ｒｅｇｉｏｎのシークエンスを比較検討した所、公表されたシークエンスのｇａｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７５の塩基はＧであった（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｔ．１９９６，ＨＩＶ−１  ｄａｔａｂａｓｅ；  ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ，  ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ  Ｕ８６５７８）が、我々が新規に構築した感染性モレキュラークローンは同位置がＡであった。また、同位置は、塩基性アミノ酸が多く存在するドメイン（ｇａｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ５１〜９３）に含まれ、細胞膜結合に関連している（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。更に、感染性モレキュラークローン作成に使用したｗｉｌｄ−ｔｙｐｅのウィルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感染性が弱く、ウイルス増殖が困難であった。また、既に公表されている他のｓｕｂｔｙｐｅのシークエンスおよびコンセンサスシークエンスにおいても同位置はＡ（ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｆを除く）であり、ｓｕｂｔｙｐｅを超えて配列が非常に良く保存されている事が判明した。以上の事に注目し、感染性モレキュラークローンのｇａｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７５をＡ（配列番号１の塩基配列）からＧ（配列番号３の塩基配列）に置換した（表１）モレキュラークローンミュータントを作成した。このモレキュラークローンミュータントはアミノ酸置換を伴わない同義変位にも関わらずウイルス複製機能を喪失した。このようにウイルスは従来考えられたようなアミノ酸レベルでの機能制御（Ｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）の他に核酸レベルで調整を行っている事を見いだした。【０００９】
【表１】
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【００１０】  この出願の前記発明（１）〜（４）は以上のとおりの新規な知見に基づくものである。【００１１】  以下、この発明の実施形態について詳しく説明する。なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が複数個結合したＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を言い、「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって直線的配列で互いに結合した複数個のアミノ酸残基の直線的配列から構成された分子を意味する。また、この発明を実施するために使用する遺伝子工学および分子生物学的技術は、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５）等に基づいて当該技術分野において通常の知識を有する者にとっては容易に実施可能なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  この発明（１）のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列を有することを特徴としている。また発明（２）は、配列番号１の塩基配列において、表１に示した（ａ）の塩基置換を有するポリヌクレオチド（配列番号３）である。【００１３】  また、塩基置換配列は、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ）法、ＴＭＡ（  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。【００１４】  前記の発明（１）および（２）のポリヌクレオチドは、アミノ酸変異の伴わない同義変異であるｇａｇ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７５の変異がＨＩＶ−１複製を制御しており、これらのポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１複製に対して影響している事から、このポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１複製を制御し、ＨＩＶ−１感染者の治療用薬剤のターゲット遺伝子として極めて有用である。【００１５】  発明（３）のポリペプチドは、配列番号２、４のアミノ酸配列に基づいて化学合成する方法や、前記のポリヌクレオチドをインビトロ転写翻訳系または宿主−ベクター系で発現させる方法によって製造することができる。例えば、ポリペプチドをインビトロ転写翻訳で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、ポリペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡｌ、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  ｌ８、ｐＴ７／３  ｌ９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。また、ポリペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組込んで発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、ポリペプチドを発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のポリペプチドを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、ポリペプチドを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内に導入すれば、目的のポリペプチドを発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡｌ、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。【００１６】  以上のとおりこのポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１複製に対して影響している事から、このポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１複製を制御し、ＨＩＶ−１感染者の治療用薬剤のターゲット遺伝子として極めて有用である。【００１７】  以下、この発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの特定について行った実験的研究について詳しく説明する。
１．方法
１−１．ＤＮＡ−ＰＣＲとシークエンス解析
ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、シークエンス解析を行った。ｇａｇ  ｐ１７遺伝子を先ず以下のプライマーセット：
ＪＡ１５２（５’−ＡＴＣＴＣＴＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧ：配列番号５）；および
ＪＡ１５５（５’−ＣＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴ：配列番号６）、
を用いて増幅し、次いで以下のプライマーセット：
ＪＡ１５３（５’−ＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴ：配列番号７）；および
ＪＡ１５４（５’−ＣＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＡＧＧＴＧＡ：配列番号８）、
を用いてネステッドＰＣＲを行った（Ｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。【００１８】  増幅したフラグメントはＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて生成し、自動ＤＮＡシークエンスサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）により、ＡＢＩＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、直接シークエンス解析を行った。
１−２．モレキュラークローン解析
ＰＣＲにより増幅した全長の９２ＴＨ０２２ゲノム（約９ｋｂ）をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）にクローニングした（Ｇ５型）。このプラスミドを用い図１に示すように３段階のクローニングによりｐ１７領域を置換したプラスミドＧ６（配列番号３に置換）を構築した。２μｇ／μｌに調整されたプラスミドをＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を用いて５０ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌ（６穴）のＭＡＧ１Ｃ５細胞（ＣＤ４、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５発現継代細胞）にトランスフェクションし発現したウイルスを１０４細胞／ｗｅｌｌ（９６穴）ＭＡＧ１Ｃ５細胞および１０６細胞／ｗｅｌｌ（４８穴）、ＰＨＡ−ｂ  ＰＢＭＣを標的細胞として感染実験を行った。発現したウイルスの標的細胞への感染性およびウイルスの発現評価としてｇａｇｐ１７をＤＮＡ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ法を用い、また培地中のＨＩＶ−１  ｐ２４  ＨＩＶ−１抗原をＨＩＶ−１  ｐ２４  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＥＬＩＺＡ  ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＯＵＬＴＥＲ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）を用いて評価した。
２．結果と考察
２−１．モレキュラークローンによる遺伝子機能の解析
ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ１７  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７５置換のウイルス増殖、感染性等への影響を調べる為に、９２ＴＨ０２２（Ｇ５）を元にｇａｇ  ｐ１７領域を遺伝子操作したモレキュラークローン（Ｇ６）を作成し、ＭＡＧ１Ｃ５細胞およびＰＨＡ−ｂ  ＰＢＭＣを標的として評価を行った。Ｇ５およびＧ６のＭＡＧ１Ｃ５細胞ゲノムへの挿入およびｍＲＮＡ発現が確認された［図２（ａ）］。一方、ＰＨＡ−ｂ  ＰＢＭＣでは同様に両モレキュラークローンのゲノムへの挿入が確認されたが、ｍＲＮＡ発現は確認されなかった［図２（ｂ）］。しかし、培地中のｐ２４  ＨＩＶ−１抗原は、ＭＡＧ１Ｃ５細胞のＧ５のみで検出された（表２）。以上から、ターゲットにしたＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｐ１７  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７５は、ＨＩＶ−１遺伝子のゲノムへの挿入、挿入された遺伝子の発現およびウイルスの分泌および成熟性に影響を及ぼしている事が示唆され、これをターゲットにした、薬剤開発にこの遺伝子配列が重要である事が示唆された。【００１９】
【表２】
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【発明の効果】
【００２０】
【００２１】  以上詳しく説明したとおり、この出願によって、アミノ酸変異を伴わない遺伝子変異が、ＨＩＶ−１複製に影響を及ぼす事を提供した。これによりＨＩＶ感染者の治療に有効な薬剤開発を可能とする新しいＨＩＶ−１由来ポリヌクレオチドとポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミド作成方法を示す。
【図２】  モレキュラークローンのＭＡＧ１Ｃ５継代細胞およびＰＨＡ−ｂ  ＰＢＭＣへの感染評価図である。
【図１】
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【図２】
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