(57)【要約】【課題】  Ｎ−グリコリルノイラミン酸と特異的に結合するレクチンを提供すること。【解決手段】  オオシロカラカサタケ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｍｏｌｙｂｄｉｔｅｓ）を緩衝液で粉砕して得られる抽出液を、イオン交換クロマトグラフィーにて精製した後、更にアフィニティークロマトグラフィーを用いて吸着、分離を行ない、更に透析、限外ろ過、凍結乾燥し、分子量３０ｋＤａ、サブユニット１５ｋＤａのレクチンを分離精製することにより、上記課題を解決した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオシロカラカサタケ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｍｏｌｙｂｄｉｔｅｓ）から抽出されるＮ−グリコリルノイラミン酸と特異的に結合する特徴を有するレクチン。
【請求項２】
オオシロカラカサタケを緩衝液で抽出し、その緩衝液をイオン交換クロマトグラフィーで精製し、更にアフィニティークロマトグラフィーを用いて吸着、分離し精製することを特徴とする請求項１のレクチンの分離精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を特異的に認識し、可逆的に結合するレクチン、およびその精製法に関するもので、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を非還元末端に有する糖鎖の検出に供するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、糖鎖は核酸、タンパクに次ぐ第３の鎖と言われ、生体内で重要な役割を演じていることが明らかになりつつあり、糖鎖の構造と機能の関係解明が重要な研究課題となっている。この糖鎖と特異的、かつ可逆的に結合する糖タンパク質、あるいはタンパク質にレクチンがあり、糖鎖の構造解析や認識に広く利用されている。例えば、ナタ豆から単離されるコンカナバリンＡは、３，４，６−位の水酸基が未置換のα−Ｄ−Ｍａｎを２残基以上含む糖鎖を認識し、アスパラギン結合型糖鎖の２本鎖複合糖、高マンノース型、混成型糖鎖と結合する。ヒイロチャワンタケから単離されるヒイロチャワンタケレクチンは、Ｌ−Ｆｕｃα１−２、Ｌ−Ｆｕｃα１−３、Ｌ−Ｆｕｃα１残基に対して結合する。このようにレクチンは、その種類により結合する糖鎖が異なり、また、その特異性も広いレクチンから狭いレクチンまで多種多様に存在する。そのため、このレクチンの特異性を利用した糖鎖構造の認識が多方面で行なわれている。一方、糖鎖において、その非還元末端の種類が糖鎖の機能に大きな影響を与えることが知られている。ことに、糖鎖の非還元末端に位置するシアル酸は、生物学的に重要な役割を果たしている。赤血球、活性タンパク質の新陳代謝の調節や、分解酵素に対する抵抗性を与えるなど糖鎖の構成成分として極めて重要な機能を果たしている。またインフルエンザウィルスが動物に感染する際にその動物種の持つシアル酸の違いを認識して種特異的に感染することが知られており、異なる動物種間におけるシアル酸分配の差が生物学的に重要な意義を持っている。代表的なシアル酸としてはＮ−アセチルノイラミン酸とＮ−グリコリルノイラミン酸が挙げられるが、通常、ヒトのシアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸である。ところが、ガン化が起るとＮ−グリコリルノイラミン酸に変わることが知られている。したがって、Ｎ−グリコリルノイラミン酸のみを認識するレクチンを見出すことができれば、ガンマーカーなどに利用でき、極めて有用である。そのため、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を認識するレクチンの探索が活発に行なわれ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を認識するレクチンが見出されている。例えば、アメリカカブトガニの血リンパ液より単離したレクチン（特開平４−３３８４００）、日本カブトガニの血リンパ液より単離したレクチン（特開平５−５９１００）、南カブトガニの血リンパ液より単離したレクチン（特開平６−２６３８００）などがＮ−グリコリルノイラミン酸を認識すると報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  しかしながら、アメリカカブトガニ、日本カブトガニ、南カブトガニの血リンパ液より単離したレクチンはいずれもＮ−グリコリルノイラミン酸を認識するが、同時にＮ−アセチルノイラミン酸も認識する。むしろＮ−アセチルノイラミン酸を強く認識し、到底満足できるものではない。Ｎ−アセチルノイラミン酸と結合性を持たず、Ｎ−グリコリルノイラミン酸と結合性を有するレクチンが強く求められている。そこで、発明者らは鋭意研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  すなわち、本発明は、オオシロカラカサタケから抽出、単離、精製される文献未載のレクチン、およびこのレクチンの分離精製法に関するものである。【０００５】本レクチンは下記表【０００６】
【表１】
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【０００７】に従って抽出、単離、精製することができる。これは例示であって、変形可能なことは当業者には明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】  オオシロカラカサタケ由来レクチン（ＣＭＬ）の分離精製法としては、まず、オオシロカラカサタケ子実体を抽出液に加え、これをホモジナイザーを用いて粉砕し、抽出物を得る。抽出液としてはグリシン−塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、生理食塩水、水等が挙げられるが、好ましくはリン酸ナトリウム緩衝液である。抽出物は陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製、次いでアフィニティークロマトグラフィーで精製する。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いず抽出物を直ちにアフィニティークロマトグラフィーにて精製してもよい。固定リガンドとしてはＮ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミンやブタ等の胃粘液、フェツィン、アシアロウシ顎下腺ムチン、アシアロフェツィン、ウシ等の顎下腺ムチンに含まれるシアロ糖タンパク質が挙げられるが、好ましくはウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）である。アフィニティークロマトグラフィーによって得られた吸着画分は、アンモニア水溶液で溶出し、塩酸で中和後、蒸留水に対して透析する。次に限外ろ過を行なった後、乾燥してＣＭＬを得る。以下に参考例として本発明によって得られたＣＭＬの有用性を示すため、赤血球凝集反応阻害試験を示す。これは例示の目的であり、この参考例に限定されるものではない。【０００９】参考例１赤血球凝集反応阻害試験によるＣＭＬの糖結合特異性【００１０】リン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）の調製
ＮａＣｌ４０、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ１４．５ｇ、ＫＣｌ１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇを蒸留水に溶かして１Ｌとし、更に使用時に蒸留水で５倍希釈する。【００１１】赤血球懸濁液の調製
ヒト血液１０ｍｌを保健管理センターにて採血後、３．８％クエン酸ナトリウム溶液２．５ｍｌを加えた試験管内でよく混合し、血液の凝固を阻止した。次に遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ、常温）を行い血漿及び白血球を除去し、赤血球のみとした。これにＰＢＳを赤血球の３倍量加えてよく混合し、同様の条件で遠心分離し上清を取り除いた。これを３回繰り返すことで血漿及び白血球を完全に取り除き、これを洗浄赤血球とした。この洗浄赤血球をＰＢＳで希釈し、３％赤血球懸濁液とした。【００１２】プロナーゼ（アクチナーゼＥ）処理赤血球の調整
洗浄赤血球１ｍｌを５ｍｇのプロナーゼを溶解させた９ｍｌのＰＢＳに懸濁し４５℃で３０分間振とうし、反応させた。反応後、遠心分離（３０００×ｇ、３ｍｉｎ，常温）し、上清を取り除くことで赤血球のみとする洗浄を３回繰り返した。この赤血球をＰＢＳで希釈し、３％プロナーゼ処理赤血球・ＰＢＳ懸濁液とした。【００１３】赤血球凝集活性測定
レクチンの活性測定は以下の通り行った。９６穴マイクロタイタ−Ｕ字プレートに２０μｌのレクチン溶掖の２倍希釈系列を作り、これに３％プロナーゼ処理赤血球浮遊液を２０μｌ加え、室温で１時間インキュベートした後赤血球の凝集を肉眼で確認した。凝集が認められる最大希釈度の逆数を原液の凝集力価とした。【００１４】赤血球凝集反応阻害試験
９６穴Ｕ字マイクロタイタープレートに１０μｌの糖または糖タンパク溶液の２倍希釈系列を作製した。そして、力価４にあらかじめ調節しておいたレクチン溶液をそれぞれの穴に１０μｌずつ加えた。室温にて１時間静置して反応させた後、２０μｌの３％プロナーゼ処理赤血球・ＰＢＳ懸濁液をそれぞれの穴に加え、さらに室温にて静置し、反応させた。１時間後、赤血球の凝集を完全に阻害するサンプル溶液の希釈倍率を肉眼にて判定した。阻害を示す最低濃度を最小阻害濃度とした。この最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する特異性が高いことを示している。【００１５】ＣＭＬの糖および糖タンパク質による赤血球凝集反応を調べた結果を表２に示す。【００１６】
【表２】
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なお、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｌ−フコース、アラビノース、リボース，グルコサミン、ガラクトサミン、ラフィノース、マンノサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルラクトサミン、メチル  α−グルコシド、メチル  β−グルコシド、メチル  α−ガラクトシド、メチル  β−ガラクトシド、メチル  α−マンノシド、メチル−セルロース、ラクト−ス、メリビオース、フラクト−ス、キシロース、ガラクツロン酸、グルクツロン酸、ラクトビオン酸、マルト−ス、セロビオース、サッカロース、ラクツロース、ラムノース、ズルシトール、ソルビトール，ソルボース、マニトール、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、２−デオキシガラクトース、Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→４Ｇｌｕ、Ｇａｌβ１→４（Ｆｕｃａ１→３）Ｇｌｕ、メチル  α−Ｎ−アセチルグルコサミド、メチル  β−Ｎ−アセチルグルコサミド、メチル  β−Ｎ−アセチルガラクトサミド、ｐ−ニトロフェニルβ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニル  β−ガラクトシド、フェニル  β−Ｎ−アセチルグルコサミド、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｎ−アセチルガラクトサミド等はすべて４００ｍＭの濃度まで赤血球凝集は生じなかった。Ｎ−アセチルノイラミン酸は４０ｍＭの濃度まで赤血球凝集は生じなかった。マンナン、アルブミン（ウシ）、アルブミン（鶏卵）、トランスフェリン（ヒト）、コロミン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ヘパリン、ポリ（ｐ−アクロイルアミノフェニル−β  Ｎ−アセチルグルコサミン）、ポリ  （ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）、ポリ  （ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−Ｇａｌβ１→６Ｇｌｃ）、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｇｌｃα１→４Ｇｌｃ）は１ｍｇ／ｍｌまで赤血球凝集は生じなかった。【００１７】  上表の結果、赤血球凝集の最小阻害濃度はＮ−グリコリルノイラミン酸が０．６３ｍＭであるのに対し、Ｎ−アセチルノイラミン酸は４０ｍＭでも阻害されなかった。Ｎ−アセチルノイラミン酸をこれ以上の濃度で赤血球凝集反応阻害試験を行うと酸性が強くなり、赤血球細胞が溶血を起こす。従って、４０ｍＭはＮ−アセチルノイラミン酸を用いる最大濃度であり、ＣＭＬはＮ−アセチルノイラミン酸により赤血球凝集反応を全く阻害しないと言える。従って、ＣＭＬは同じシアル酸でありながらＮ−グリコリルノイラミン酸を強く認識し、Ｎ−アセチルノイラミン酸には全く認識しないという極めて新規性の高い糖特異性を示している。また、ＣＭＬは、糖タンパクではアシアロウシ顎下腺ムチンにもっとも強く、次いでブタ胃粘液、以下アシアロフェツィン、フェツィン、ウシ顎下腺ムチン、α１−酸性糖タンパク質の順に強い親和性を示した。糖タンパクにおける阻害試験の結果は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を多く含むブタ胃粘液に強い特異性を示し、Ｎ−アセチルノイラミン酸を最も多く含むウシ顎下腺ムチンに関しては、その末端シアル酸を除去したアシアロウシ顎下腺ムチンのほうにより強い結合を示している。【００１８】参考例２毒性試験
精製したＣＭＬの毒性試験をマウスＤＤＹ（雄）５匹ずつ用いて行った。ＣＭＬを１ｍｇ／ｍｌ生理的食塩水（１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、その０．５ｍｌをマウスに腹腔内投与し、また、ネガティブコントロールは生理的食塩水を同量ずつ投与し、３時間、２４時間、４８時間、７２時間、ごとに体重を測定し、その症状をみた。【００１９】  得られた体重変化を図１に示す。マウスの体重変化はコントロールと変わらず、ＣＭＬの毒性は見られなかった。【００２０】  なお、ＣＭＬの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣを用いて検討したところ約１５ｋＤａのサブユニットを持つ２量体である。
【発明の効果】
【００２１】  オオシロカラカサタケを緩衝液で抽出し、その抽出液をイオン交換クロマトグラフィーにて精製した後、更にアフィニティークロマトグラフィーを用いて吸着、分離を行ない、更に透析、限外ろ過、凍結乾燥等の精製法によってＣＭＬを単離、精製できた。ＣＭＬは、一般の単糖やオリゴ糖、アミノ糖、デオキシ糖、糖アルコール、グリコシド、Ｎ−アセチルノイラミン酸等では赤血球凝集活性が阻害されないが、Ｎ−グリコリルノイラミン酸では活性が大きく阻害されるため、特徴ある糖鎖結合特異性があると言え、また、かくして得られるＣＭＬは、マウスに対する顕著な毒性は認められない。本発明のレクチンは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を強く認識することから、Ｎ−グリコリルノイラミン酸を非還元末端に有する糖鎖への結合特異性を利用した検出薬やガンマーカーの開発等、産業への貢献が期待できる。
【実施例】
【００２２】  以下に本発明に係る実施例を記載するが、これは例示の目的であり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲内では変形が可能な事は当業者には明らかであろう。【００２３】  オオシロカラカサタケ子実体５０ｇに１０ｍｌＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、ホモジナイズし、１０分間遠心分離後、上清をイオン交換樹脂（ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ５５０Ｃ）でクロマトグラフィーを行ない、非吸着物質を流出させた。流出液はアフィニティークロマトグラフィー（ＢＳＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ）にかけ吸着物質を０．５Ｍアンモニア液で溶出させた。溶出液を１．０Ｎ塩酸で中和し、透析後、限外ろ過し、凍結乾燥してＣＭＬ０．５ｍｇを得た。【００２４】  得られたＣＭＬ０．５ｍｇの凝集力価は、赤血球凝集活性測定により求めた結果４０９６であった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＣＭＬの毒性について、マウス（ＤＤＹ）（雄）に腹腔内投与を行なって調べたものである。
【図１】
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