(57)【要約】  【課題】遺伝物質、薬剤などの薬物を、安全にかつ効率良く病患部もしくは細胞内へ導入できる薬物担体を得る。  【解決手段】請求項１に式（ａ）で規定される特定構造のアミジン誘導体と、式（ｂ）〜（ｄ）で規定される単位からなるサクシニル化ポリグリシドール（SucＰＧ）とを膜構成成分として含む薬物担体。SucＰＧは、サクシニル変性ポリグリシドール単位（ｂ）、長鎖アルキル基含有単位（ｃ）および未変性ポリグリシドール単位（ｄ）を、（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ｂ〜（ｄ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含む。好ましくは、Suc修飾リポソームと、アミジン誘導体修飾リポプレックスとの複合薬物担体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜で形成される担体粒子に薬物を担持した構造体であって、前記膜を構成する成分として下記一般式（ａ）で示されるアミジン誘導体またはその塩と、
【化１】
2005008623.tif 000008
（式（ａ）中、Ａは芳香環であり、Ｒ１およびＲ２ は互いに独立に炭素数１０−２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｘ１ およびＸ２は互いに独立にＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨまたはＮＨＣＯであり、ｍは０または１、ｎは０または１〜６の自然数である。）
下記（ｂ）〜（ｄ）で示される単位を（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ｂ）〜（ｄ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールと、を含む薬物担体。
【化２】
2005008623.tif 000009
【請求項２】
前記薬物担体の粒子径が、０.０２〜２５０μｍである請求項１に記載の薬物担体。
【請求項３】
膜で形成される担体粒子に薬物を担持した構造体であって、前記膜を構成する成分として下記一般式（ａ）で示されるアミジン誘導体またはその塩と、
【化３】
2005008623.tif 000010
（式（ａ）中、Ａは芳香環であり、Ｒ１およびＲ２ は互いに独立に炭素数１０−２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｘ１ およびＸ２は互いに独立にＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨまたはＮＨＣＯであり、ｍは０または１、ｎは０または１〜６の自然数である。）
下記（ｂ）〜（ｄ）で示される単位を（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ｂ）〜（ｄ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールと、
を含み、平均粒子径が０.０５〜０.４μｍである薬物担体。
【化４】
2005008623.tif 000011
【請求項４】
前記薬物担体の平均粒子径が、０.０５〜０.３５μｍである請求項１ないし３のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項５】
前記薬物担体が、脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤から選ばれる他の成分をさらに含む請求項１ないし４のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項６】
前記膜が、前記サクシニル化ポリグリシドールで修飾された脂質と、前記アミジン誘導体またはその塩で修飾された脂質とを含む請求項１ないし５のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項７】
前記薬物担体が、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンからなる群より選ばれる少なくとも１種の形態からなる請求項１ないし６のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項８】
前記薬物が、診断および／または治療のための薬物である請求項１ないし７のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項９】
前記薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項８に記載の薬物担体。
【請求項１０】
前記薬物が、抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項８に記載の薬物担体。
【請求項１１】
前記薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドから選ばれる少なくとも１種である請求項８に記載の薬物担体。
【請求項１２】
前記薬物が、体内診断薬である請求項８に記載の薬物担体。
【請求項１３】
前記薬物担体が、前記アミジン誘導体またはその塩を含む膜で形成される担体粒子に遺伝子を担持したリポプレックスと、サクシニル化ポリグリシドールを膜成分として含むリポソームとの複合体である請求項１ないし１２のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項１４】
前記他の成分の表面修飾剤としてレセプター指向性物質をさらに含む請求項１３に記載の薬物担体。
【請求項１５】
前記サクシニル化ポリグリシドールを膜成分として含むリポソームの分散液と、イオン濃度１００osmol以下の実質的に非電解質条件下で調製した前記アミジン誘導体またはその塩を含む膜で形成される担体粒子に遺伝子を担持してなるリポプレックスの分散液とを混合して複合化する請求項１３に記載の薬物担体の製造方法。
【請求項１６】
前記リポプレックスを複合化前に整粒する請求項１５の薬物担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病巣部位を確実にターゲッティングして、目的病巣部位の細胞内に薬物を安全にかつ効率良く送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用で、特に遺伝子の細胞質伝達・発現にも有用な薬物担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤、ＤＮＡ（遺伝子）、ペプチドあるいはタンパク質などの治療および／または診断のための薬物投与において、薬効を最大限に引き出すためには、癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、薬物を安全にかつ効率良く送達するために、薬物送達の正確なコントロールが望まれる。近年、このようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）における運搬体（担体）として、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの膜性担体粒子を応用しようとする研究が盛んに行われている。
【０００３】
特に細胞内で活性を発現するタンパク質、ＤＮＡ（遺伝子）、アンチセンス分子などの生理活性物質を有効に働かせるためには、これらを細胞質中に導入する必要があるが、細胞膜は、多くの水溶性物質、高分子を透過させないため、薬物を細胞質まで送達するための運搬体（ベクター）を必要とする。遺伝子デリバリーシステムにおいては、ウイルスベクターを用い、感染により遺伝子を細胞内に導入するが、危険性を伴うウイルスベクターに代わる安全な非ウィルスベクター、特に合成ベクターの使用が望まれている。なかでも細胞内への遺伝子導入率が高く、かつ発現率が高く、遺伝子を効率よくトランスフェクションしうる高機能な合成ベクターの開発が切望されている。
【０００４】
このため合成ベクターとして、上記リポソームの利用が具体的に検討されており、たとえば遺伝子を捕捉し、かつ細胞内に高い導入率で取り込ませるために、リポソーム脂質膜成分をカチオン化したカチオン性脂質・ＤＮＡ複合体（リポプレックスとも称す）が知られている（たとえば特許文献１〜４など参照）。リポプレックスのカチオン性脂質として選択できる脂質は限られており、現在のところ、ＤＣ−Chol：3-β-(N-(N',N'- ジメチルアミノエタン) カルバモイル) コレステロール、ＤＯＴＡＰ：1,2-ビス（オレイルオキシ）-3- （トリメチルアンモニオ）プロパンなどが製品として入手できる。しかしながら上記従来のカチオン化脂質技術を用いたリポプレックスによる細胞内への遺伝子導入率は充分とはいえず、このため実用的に応用しうるレベルで遺伝子発現させることが困難である。
【特許文献１】米国特許第４８９７３５５号
【特許文献２】米国特許第５３３４７６１号
【特許文献３】特開平２−２９２２４６号公報
【特許文献４】特開平４−１０８３９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体などの細胞内で薬理作用を示す生理活性物質の細胞へのトランスフェクションを、安全にかつ効率良く行うことができる導入システムの達成に有効な薬物担体、あるいはまた腎ガン、肺ガン、肝ガン、膵ガンなどの癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、病患部もしくは標的細胞内に治療および／または診察するための薬物を安全にかつ効率良く送達するＤＤＳ療法に有用な薬物担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討する過程で、カチオン性脂質として特定構造を有するアミジン誘導体に着目し、これと生体膜と相互作用を示す化合物としてのサクシニル化ポリグリシドール（以下、SucＰＧと称することもある。）とを組合わせて膜成分とすることにより、特にアミジン誘導体を含むカチオン性脂質・ＤＮＡ複合体（リポプレックス）は、従来のＤＣ−CholまたはＤＯＴＡＰを含むリポプレックスに比べ、トータル活性が３倍以上に高いだけでなく、アミジン誘導体とSucＰＧとの組あわせでは、SucＰＧの膜融合性作用をより発現しやすいことを見出した。これは、ＤＣ−Chol、ＤＯＴＡＰなどがカチオン化基としてアミノ基を利用するのに対し、アミジン誘導体ではアミジノ基を利用することにより、構造上もっともSucＰＧリポソームの構造を保ったまま複合体を形成できることが活性に影響を及ぼすためであることがわかった。したがって薬物担体が、膜成分としてアミジン誘導体と、SucＰＧとを含むことにより、特に薬物担体が、アミジン誘導体を含むリポプレックスとSucＰＧリポソームとの複合体の場合には、ＤＤＳ療法に有効で、細胞へのトランスフェクションを、安全にかつ効率良く行うことができる薬物担体が得られるという知見を得た。
【０００７】
また、本発明の薬物担体が特に上記リポプレックスを含む複合体である場合について、その細胞への取り込み効率を高めるべく複合体の小粒子径化について検討し、小粒子径化を達成しうる方法を見出すとともに、最終的な薬物担体（複合体）の平均粒子径を０.４μｍ以下とすれば、細胞へのトランスフェクション効率を著しく改善できることが確認できた。これは平均粒子径が０.４μｍ以下であれば、通常細胞への薬物担体取り込み方法として最も多いとされているエンドサイトーシスにより、薬物担体の細胞内への取り込みに有効な０.３μｍ（３００ｎｍ）以下の粒子が実質的に多く存在するためである。なお従来、カチオン性脂質リポソームとＤＮＡとからリポプレックス（分散液）を調製する際には、リポソームの分散媒には、浸透圧調節物質として生理食塩水やＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などを使用し、またプラスミドＤＮＡの溶媒としてTris−ＨＣ１緩衝液やTris−ＥＤＴＡ緩衝液などを使用するのが一般的であり、この場合に得られるリポプレックスの粒子径は、６００ｎｍから１５００ｎｍ以上のものまでにわたる粒子径の揃わない粒子の混合物として得られ、平均粒子径も８００ｎｍ程度である。したがって、本発明で達成した０.４μｍ以下の平均粒子径をもつ小粒子径のリポプレックスは、それ自身が新規であるといえる。したがって上記のような課題を解決するものとして、以下のような本発明が提供される。
【０００８】
（１）膜で形成される担体粒子に薬物を担持した構造体であって、前記膜の構成成分として少なくとも下記（ａ）で示されるアミジン誘導体またはその塩と、
【化５】
2005008623.tif 000002
（式（ａ）中、Ａは芳香環であり、Ｒ１およびＲ２ は互いに独立に炭素数１０−２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｘ１ およびＸ２は互いに独立にＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨまたはＮＨＣＯであり、ｍは０または１、ｎは０または１〜６の自然数である。）
下記（ｂ）〜（ｄ）で示される単位を（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ｂ）〜（ｄ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールと、を含む薬物担体。
【化６】
2005008623.tif 000003
（２）上記のような本発明の薬物担体の粒子径は、好ましくは０.０２〜２５０μｍ程度である。
【０００９】
（３）膜で形成される担体粒子に薬物を担持した構造体であって、膜を構成する成分として上記一般式（ａ）で示されるアミジン誘導体またはその塩と、上記特定量比の（ｂ）〜（ｄ）単位で特定されるサクシニル化ポリグリシドールとを含み、平均粒子径が０.０５〜０.４μｍである薬物担体。
（４）平均粒子径が０.０５〜０.３５μｍである上記（１）ないし（３）のいずれかの薬物担体。
【００１０】
（５）脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤などの他の成分をさらに含む上記（１）ないし（４）のいずれかの薬物担体。
特に膜構成材料として、上記SucＰＧおよびアミジン誘導体またはその塩とともに脂質を含むことが好ましい。脂質は、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、それらの誘導体であってもよい。具体的には、薬物担体の膜が、上記SucＰＧおよびアミジン誘導体またはその塩で修飾された脂質からなる態様が好ましい。
（６）膜が、前記サクシニル化ポリグリシドールで修飾された脂質と、前記アミジン誘導体またはその塩で修飾された脂質とを含む態様の上記（１）ないし（５）のいずれかの薬物担体。
【００１１】
（７）上記（１）ないし（６）のいずれかの薬物担体において、薬物担体は、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンからなる群より選ばれる少なくとも１種の形態から構成されることが望ましい。
【００１２】
（８）本発明の薬物担体は、通常、診断および／または治療のための薬物を担持する。このような薬物として、細胞内で薬理作用を発現する生理活性物質、薬理的活性物質、診断用薬物が挙げられる。
【００１３】
（９）上記薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種である上記（８）の薬物担体。
【００１４】
（１０）上記薬物が、抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーからなる群より選ばれる少なくとも１種である上記（８）の薬物担体。
【００１５】
（１１）上記薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドから選ばれる少なくとも１種である上記（８）の薬物担体。
（１０）上記薬物が、体内診断薬である上記（８）の薬物担体。体内診断薬としては、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬および核磁気共鳴診断用診断薬などが挙げられる。
【００１６】
（１３）上記（１）ないし（１２）のいずれかの薬物担体の形態例として、上記薬物担体が、前記アミジン誘導体またはその塩を含む膜で形成される担体粒子に遺伝子を担持したリポプレックスと、サクシニル化ポリグリシドールを膜成分として含むリポソームとの複合体が挙げられる。
（１４）上記（１３）の薬物担体が、他の成分の表面修飾剤としてトランスフェリンをさらに含む態様は好ましい。
【００１７】
（１５）本発明では、上記（１３）の態様の薬物担体の製造方法の一つとして、サクシニル化ポリグリシドールを膜成分として含むリポソームの分散液と、イオン濃度１００osmol以下の実質的に非電解質条件下で調製した前記アミジン誘導体またはその塩を含む膜で形成される担体粒子に遺伝子を担持してなるリポプレックスの分散液とを混合して複合化して、薬物担体の製造方法も提供される。
（１６）上記（１５）において、リポプレックスを複合化前に整粒することが好ましい。  （１７）上記（１５）または（１６）の薬物担体の製造方法において、上記複合化前のリポプレックスにおける電荷比（＋／−）が１.５である態様は好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る薬物担体は、ｐＨ５〜７の病巣部位に集積し、かつ該部位で膜融合性を発現することができ、病患部もしくは細胞内への薬物導入を効率よくかつ安全に行うことができる。後述の実施例に示すように、特に遺伝子を高効率に細胞内にトランスフェクションすることができる。
また本発明に係る薬物担体が、リポプレックスを含む複合体の形態である場合には、その粒子径を小粒子径に制御することにより、粒子径を制御しないものに比べ細胞への導入効率が極めて高くなる。具体的には、粒子径が０．０５〜０．３５μｍ（５０〜３５０ｎｍ）に制御された本発明の好ましい薬物担体（複合体）は、従来の粒子径制御されてなく、平均でも８００ｎｍ以上の粒子径をもつ複合体に比較してトータル活性が５倍以上高いことが確かめられた。
このような特徴から、本発明に係る薬物担体は、薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入させた本発明の薬物担体は、治療および診断という目的に対して非常に効果的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の薬物担体は、膜で構成される担体粒子に薬物を担持した構造体であって、該膜の構成成分として少なくとも以下に式（ａ）で示される特定構造のアミジン誘導体またはその塩と、式（ｂ）〜（ｄ）で示される単位からなるサクシニル化ポリグリシドールとを含む。すなわち本発明の薬物担体は、それ単独で、膜に埋め込まれたときに、生理的ｐＨ付近から酸性条件下では膜に正電荷を与える塩基性化合物としての特定構造のアミジン誘導体またはその塩と、ｐＨ感受性の高分子化合物であって、それ単独で膜に埋め込まれたときに弱酸性下で膜融合性を発現するサクシニル化ポリグリシドール（SucＰＧ）とを含む。このような本発明の薬物担体は、ｐＨ５〜７の病巣部位に集積し、かつ該部位で膜融合性を発現する。
【００２０】
ここで、生理的ｐＨ条件とは、生体内のｐＨ、すなわち７.４前後、概ね７.２から７.６の範囲である。生理的ｐＨ付近より酸性側とは、ｐＨ７.４付近より酸性側、弱酸性とは概ねｐＨ５〜７の範囲を指す。
【００２１】
本発明の薬物担体を構成するアミジン誘導体は、下記式（ａ）で示される。
【化７】
2005008623.tif 000004
（式（ａ）中、Ａは芳香環であり、Ｒ１およびＲ２ は互いに独立に炭素数１０−２５のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｘ１ およびＸ２は互いに独立にＯ、Ｓ、ＣＯＯ、ＯＣＯ、ＣＯＮＨまたはＮＨＣＯであり、ｍは０または１、ｎは０または１〜６の自然数である。）
【００２２】
上記構造のアミジン誘導体として、具体的には3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン、3,5-ジヘキサデシロキシベンズアミジン、3,5-ジオクタデシロキシベンズアミジン、3,5-ジデシロキシベンズアミジン、3,4-ジデシロキシベンズアミジンなどを例示することができる。本発明では、アミジン誘導体は、塩酸塩、スルホン酸塩などの塩の形態で使用することもできる。以下、「アミジン誘導体」の語は塩の形態も含めた意味で使用されることがある。
【００２３】
上記アミジン誘導体は、たとえば下記式（ａ’）で示される化合物から誘導することができる。
【化８】
2005008623.tif 000005
式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ２ 、Ｘ１ 、Ｘ２ ｎは、目的化合物に対応する上記式（ａ）中のそれらと同様であり、Ｚは、ハロゲンまたは−ＣＮである。
上記化合物中のＺ部位がハロゲンのときはチオ尿素を導入することにより、またＺ部位が−ＣＮのときはこれをアミジノ基に変換することによって得ることができる。
【００２４】
上記で得られるアミジン誘導体は、クロマトグラフィー、再結晶などの手段により単離、精製することができる。なおアミジン誘導体の製造方法および精製方法は、上記に限定されるものではない。
【００２５】
またサクシニル化ポリグリシドール（SucＰＧ）は、具体的に、下記で示されるサクシニル変性ポリグリシドール単位（ｂ）を必須成分として含み、好ましくは該単位（ｂ）とともに長鎖アルキル基含有単位（ｃ）を含む。さらにはこれら（ｂ）および（ｃ）とともに未変性ポリグリシドール単位（ｄ）を含んでいてもよい。
【化９】
2005008623.tif 000006
【００２６】
SucＰＧは、上記（ｂ）〜（ｄ）各単位の合計を１００モル％とするとき、具体的に、サクシニル変性ポリグリシドール単位（ｂ）を４０〜９５モル％、好ましくは７０〜９０モル％の量で含む。長鎖アルキル基含有単位（ｃ）を０〜３０モル％、好ましくは５〜３０モル％、より好ましくは５〜１５モル％の量で含むことが望ましい。また未変性ポリグリシドール単位（ｄ）の含有量は、通常０〜３０モル％であり、好ましくは０〜１０モル％である。
【００２７】
SucＰＧは、このような構成により、ｐＨ感受性の膜融合能をもち、弱酸性下で膜融合能を発現する。このSucＰＧを膜成分とすることにより、細胞内への遺伝子導入を促進することができる。つまりSucＰＧをリポプレックスの膜成分として含ませることにより、SucＰＧの細胞膜あるいはライソゾーム膜との融合により、リポプレックスに捕捉されていた遺伝子は効率よく細胞質内に移行することができる。
通常生体のｐＨは７以上であるが、細胞内のライソゾーム内では酸性条件になるため、SucＰＧリポソームは膜融合性を示す。その作用機序は、次のように説明される。SucＰＧリポソームがエンドサイトーシスで細胞に取り込まれた場合、ライソゾーム内で細胞内消化が始まり、プロトンポンプの作用でｐＨが低下する。そのときSucＰＧリポソームは、膜融合性を発揮してライソゾーム膜と融合し、その結果内包する物質が細胞質内へ放出される。
【００２８】
SucＰＧは、上記構成とすることができれば、SucＰＧの製法は特に限定されないが、たとえばポリグリシドールのサクシニル化変性、さらには該サクシニル残基の部分アルキル化によって得られる。
上記ポリグリシドールは、たとえばコーエン, H.L.：J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 13,1993-2003(1975) の方法に準拠してポリエピクロロヒドリンの転化により合成することができる。これにより得られるポリグリシドールの分子量は、高速液体クロマトグラフィー（Asahipak GS-510 カラム）により、ポリエチレングリコール換算分子量で、通常７６００にピークをもつ分子量として測定される。
【００２９】
ポリグリシドールのサクシニル化、さらにサクシニル残基の部分アルキル化は、たとえばBiochim Biophys Acta 1994;1193:1-9に記載された方法により調製することができる。具体的には、カルボキシル（サクシニル）変性ポリグリシドールは、ポリグリシドールと無水コハク酸とを、N,N-ジメチルホルムアミド中、６０℃で３時間反応させることにより得ることができ、カルボキシル変性量は、無水コハク酸の使用量を変化させることにより調製することができる。
導入したサクシニル残基は、ｐＨメーター（堀場製作所社製Ｍ−８）を使用して、電位差滴定により決定することができる。
カルボキシル変性ポリグリシドールは、そのカルボキシル基の一部と、n-デシルアミンなどの上記（ｄ）中のＲに対応するアルキルアミンとの結合により、長鎖アルキル基をもたせることができる。
【００３０】
上記で使用するポリエピクロロヒドリンおよびN,N-ジメチルホルムアミドは、使用前に、蒸留精製することが望ましい。
上記J. Polym. Sci.およびBiochim Biophys Actaの各記載は、これを引用することにより本明細書中にも記載されているものとするが、本発明におけるSucＰＧの製造方法は、これら方法に限定されるものではない。
【００３１】
本発明の薬物担体は、膜で形成される担体粒子に薬物を担持する構造体の形態を形成できるものであれば、上記アミジン誘導体およびSucＰＧを含むこと以外に特にその膜構成成分は制限されないが、脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤などの他の成分をさらに含むことができる。
特に膜構成材料として、脂質を含むことが好ましい。脂質は、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、それらの誘導体であってもよい。
【００３２】
リン脂質としては、フォスファチジルコリン（＝レシチン）、フォスファジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらの常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。
【００３３】
安定化剤としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。コトフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
【００３４】
表面修飾剤としては、SucＰＧ以外の親水性高分子、グルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体、トランスフェリン、ＲＧＤ（Arg-Gly-Asp）ペプチドなどのレセプター指向性物質などが挙げられる。
本発明の薬物担体が、薬物として特に薬物として遺伝子を担持する場合には、膜構成成分にトランスフェリンを結合させ、薬物担体をトランスフェリンレセプターとの特異的な結合を介して細胞に取り込ませれば、優れた遺伝子導入活性を発現することができる。
【００３５】
上記他の親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著である。
【００３６】
また上記親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物を結合させた誘導体として用いることができ、これら疎水性化合物部位を、薬物担体（たとえばリポシーム）の膜中へ安定に挿入することができる。そのことにより、薬物担体表面に親水性高分子を存在させることができる。親水性高分子誘導体としてはポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等を好ましく使用することができる。
【００３７】
本発明の薬物担体は、診断および／または治療の目的に応じて薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質および／または診断用物質を担持する。
治療のための薬剤の種類としては、薬物担体の形成および安定性を損ねない限り特に制限されないが、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドなどの生理活性的物質；抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ（Advanced glycation endproducts）阻害剤およびラジカルスカベンジャーの薬理的活性物質が挙げられる。
【００３８】
抗癌剤の例としては、シクロフォスファミド、イフォスファミド、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、チオテパ、ブルスファン、カルボコン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、メルファラン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、シタラビン、シタラビンオクスファート、エノシタビン、メルカプトプリン、チオイノシン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、テガフール、メトトレキサート、カルモフール、ヒドロキシカルバミド、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、クロモマイシンＡ３、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アラクルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ダクチノマイシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ネオカルノスタチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトンミトプロニトール、デキストラン硫酸ナトリウム、酢酸オクトレオチド、シスプラチン、カルボプラチン、クエン酸タモキシフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリンなどが挙げられる。
【００３９】
抗生物質の例としては、ベンジルペニシリンカリウム、ベンジルペニシ  リンベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、クロキサシリンナトリウム、フルクロキサシリンナトリウム、アンピシリン、トシル酸スルタミシリン、塩酸バカンピシリン、塩酸タランピシリン、レナンピシリン、ヘタシリンカリウム、シクラシリン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、アスポキシシリン、カルベニシリンナトリウム、カリンダシリンナトリウム、スルベニシリンナトリウム、チカルシリンナトリウム、ピペラシリンナトリウム、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファゾリンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、セファレキシン、セファトリジンプロピレングリコール、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、塩酸セフォチアム、塩酸セフォチアムヘキセチル、セフロキシムナトリウム、セフロキシムアキセチル、セファマンドールナトリウム、セフジニル、塩酸セフェタメトピポキシル、セフチプテン、セフメタゾールナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフォテタンナトリウム、セフミノクスナトリウム、セフプペラゾンナトリウム、セフピラミドナトリウム、セフスロジンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、塩酸セフメノキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフピミゾールナトリウム、セフィキシム、セフテラムピポキシル、セフゾナムナトリウム、セフポドキシプロキセチル、セフォジジム、硫酸セフピロム、ラタモキセフナトリウム、フロモキセフナトリウム、イミペネム、シラスタチンナトリウム、アズトレオナム、カルモナムナトリウム、硫酸ステレプトマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ペカナマイシン、硫酸リポスタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミスロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン、エリスロマイシン、キタサマイシン、アセチルキタサマイシン、リン酸オレアンドマイシン、ジョサマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、酢酸ミデカマイシン、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、メタリン酸テトラサイクリン、塩酸デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、パルミチン酸クロラムフェニコール、チアンフェニコール、塩酸アミノ酢酸チアンフェニコール、硫酸コリスチン、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンＢ、バシトラシン、塩酸バンコマイシン、塩酸リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸スペクチノマイシン、フォスフォマイシンナトリウム、フォスフォマイシンカルシウムなどが挙げられる。
【００４０】
酵素剤の例としては、キモトリプシン、結晶トリプシン、ストレプトキ  ナーゼ・ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、ナサルプラーゼ、アルテプラーゼ、塩化リゾチーム、セミアルカリプロティナーゼ、セラペプターゼ、チソキナーゼ、デュテプラーゼ、バトロキソビン、プロナーゼ、プロメラインなどが挙げられる。
【００４１】
抗酸化剤の例としては、トコフェロール、アスコルビン酸、尿酸などが挙げられる。
【００４２】
抗炎症剤の例としては、サリチル酸コリン、サザピリン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、ジフルニサル、フルフェナム酸、メフェナム酸、フロクタフェニン、トルフェナム酸、ジクロフェナクナトリム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、フェルビナクエチル、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ケトプロフェン、ナプロキセン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、フェニルブタゾン、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸ベンジダミン、エピリゾール、エルモファゾンなどが挙げられる。
【００４３】
ステロイド剤の例としては酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン（リン酸エステル、酢酸塩）、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、プレドニゾロン（アセテート、サクシネート、第三級ブチル酢酸エステル、リン酸エステル）、メチルプレドニゾロン（アセテート）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド（酢酸トリアムシノロン）、デキサメタゾン（リン酸エステル、酢酸塩、リン酸ナトリウム塩、硫酸エステル）、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメタゾン（リン酸塩、２ナトリウム塩）、酢酸パラメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸ハロプレドン、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、酢酸コルチゾンなどが挙げられる。
【００４４】
アンジオテンシン変換酵素阻害剤の例としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリルなどが挙げられる。
【００４５】
血管拡張剤の例としては、テオフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリン、プロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体、アルプロスタジルアルファデクス、アルプロスタジル、リマプロストアルファデクス、パパベリン、シクランデラート、シンナリジン、フマル酸ベンシクラン、マレイン酸シネパジド、塩酸ジラゼプ、トラピジル、塩酸ジフェニドール、ニコチン酸、イノシトールヘキサニコチネート、クエン酸ニカメタート、酒石酸ニコチニックアルコール、ニコチン酸トコフェロール、ヘプロニカート、塩酸イソクスプリン、硫酸バメタン、塩酸トラリゾン、メシル酸ジヒドロエルゴトキシン、酒石酸イフェンプロジル、塩酸モキシシリト、ニセルゴリン、塩酸ニカルジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、塩酸ベニジピン、塩酸ジルチアゼム、ニソルジピン、ニトレンジピン、塩酸マニジピン、塩酸バルニジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸トリメタジジン、カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、塩酸ベナゼプリル、塩酸ヒドララジン、塩酸トドララジン、ブドララジン、カドララジン、インダパミド、塩酸カルボクロメン、エフロキサート、塩酸エタフェノン塩酸オキシフェドリン、ニコランジル、亜硝酸アミル、硝酸イソソルビドなどが挙げられる。
【００４６】
平滑筋細胞遊走・増殖抑制剤の例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸などが挙げられる。
【００４７】
血小板凝集阻害剤の例としては、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルプグレラート、バトロキソビン、ジピリダモールなどが挙げられる。
【００４８】
抗凝固剤の例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム（低分子ヘパリン）、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸、ワルファリンカリウム、アルガトロバンなどが挙げられる。
【００４９】
ケミカルメディエーター遊離抑制剤の例としては、トラニラスト、フマル酸ケトフェチン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、アンレキサノクス、レピリナストなどが挙げられる。
【００５０】
免疫抑制剤の例としては、シクロスポリンなどが挙げられる。
抗ウイルス剤の例としては、アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ソリブジン、ビダラビンなどが挙げられる。
【００５１】
また診断の薬剤としては、薬物担体の形成を損ねないかぎり特に限定されないが、たとえばＸ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などの体内診断薬挙げられる。Ｘ線造影剤の例としては、アミドトリゾ酸メグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、ガストログラフィン、ヨーダミドメグルミン、リピオドールウルトラフルイド、アジピオドンメグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオポダートナトリウム、イオメプロール、イソペーク、ヨードキサム酸などが挙げられる。
【００５２】
本発明において、薬物担体としては様々な形態が考えられ、したがって「担持」は、その形態により、内包、封入、相互作用などを広く意味する。薬物担体の形態は、膜で形成される担体粒子に薬物が担持された構造体であればその形態は特に制限されないが、たとえば、薬物を、膜で形成された閉鎖空間内に内包した形態、膜間に内包した形態、膜内に包含した形態などが挙げられ、これらの組合せによる形態であってもよい。具体的には、特に制限されないが、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちより選ばれる少なくとも一種以上からなることが望ましい。これらのうち、膜で形成される閉鎖小胞の形態を含む場合には、その内部に薬物を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する。
【００５３】
本発明の薬物担体は、粒子径が通常０.０２〜２５０μｍであり、このうちでもとりわけ０.０５〜０.４μｍが好ましく、特に０.０５〜０.３５μｍ（５０〜３５０ｎｍ）の大きさが好ましい。なお本明細書において、特にことわりのない限り、粒子径とは平均粒子径を意味する。平均粒子径は粒度分布測定装置で測定することができる。
細胞への薬物担体の取り込みは、ファゴサイトーシス、またはエンドサイトーシスによるが、多くの細胞ではエンドサイトーシスと言われている。エンドサイトーシスで取り込むことができる大きさは、最大約３００ｎｍ程度でそれ以上になると極端に取り込み量が減少することが知られている。
本発明において、粒子径０.４μｍ以下の薬物担体は、後述する実施例にも示すように特に細胞内への遺伝子導入活性が著しく高いが、これは平均粒子径が０.４μｍ以下であれば、薬物担体の実質的に０.２〜０.３μｍ（２００〜３００ｎｍ）の小粒子が多く存在するため、薬物担体はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれやすいためと考えられる。
【００５４】
次に、本発明の薬物担体の好ましい実施態様例を挙げて説明すれば、たとえばSucＰＧで修飾された脂質からなる膜で形成されるSucＰＧ修飾リポソームと、アミジン誘導体修飾によるカチオン性脂質膜で形成される担体粒子に、診断および／または治療ための薬物を内包した薬物担持カチオン性リポソームとの複合体が挙げられる。
【００５５】
上記SucＰＧで修飾される脂質としては、リン脂質を好ましく挙げることができる。またカチオン性リポソームが、遺伝子を内包するリポプレックスは、好ましい態様である。すなわち本発明の薬物担体の好ましい態様例として、SucＰＧ修飾リポソーム・アミジンカチオン性リポプレックス複合体が好ましく例示される。
【００５６】
このような複合形態の薬物担体の粒子径を、本発明の好ましい薬物担体の粒子径のうちでも特に５０〜３５０ｎｍに制御すれば、細胞へのトランスフェクション効率を著しく高めることができ、従来の粒子径制御されてなく、かつ平均でも８００ｎｍ以上の粒子径をもつ複合体に比較してトータル活性が５倍以上高いことが明らかになった。なお従来のリポプレックスを含む薬物担体の粒子径を測定したところ、大小さまざまな粒子の混合物で平均粒子径があり、エンドサイトーシスで取り込まれる３００ｎｍ以下の粒子は多くはなかった。
具体的にフローサイトメトリーで検討したところ、遺伝子発現している細胞の割合が、粒子径８００ｎｍ以上の薬物担体（複合体）では、全細胞の３０％程度であったのに対し、５０〜３５０ｎｍの小粒子径化により９０％以上と大幅に上昇した。また安全性も高く、細胞のバイアビリティは８０〜９０％を示した。
本発明の上記複合形態の薬物担体が、細胞内取込みに特に高い活性を示すのは、粒子径を微小化し、３５０ｎｍ以下にすることで、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれる複合体の量が増えるとともに、エンドソーム膜とSucPGリポソームとの相互作用により、細胞質に放出されるリポプレックスの量が増加する相乗効果と考えられる。
【００５７】
上記のような複合形態の薬物担体においてSucＰＧ修飾リポソーム単独での大きさは、通常粒子径５０ｎｍ程度であり、一般的なリポソームよりもかなり小さい。このため、上記のような複合体では、大径のリポプレックス粒子の外周表面にSucＰＧ修飾リポソームが担持されているような複合構造が考えられる。
この場合、SucＰＧリポソームの有するマイナスチャージと、リポプレックスとが双方の構造を保ったまま穏やかにチャージで結合するような比で複合体が形成され、かつ病巣部位を確実にターゲッティングし、細胞内への高い薬物導入率を発現することができるような電荷比で、アミジンカチオン性リポプレックスとSucＰＧ修飾リポソームとの複合体を構成することが望ましい。この際、アミジン誘導体とSucＰＧとの複合体構成比は、複合体成分のリポプレックスの電荷比によっても異なり一概にはいえないが、ＤＮＡを基準にアミジンカチオン性リポプレックスおよびSucＰＧ修飾リポソームの電荷比を設定することができる。
【００５８】
具体的に、粒子径を特に制御しない場合、たとえばアミジンカチオン性リポソームとＤＮＡとから作製されるリポプレックスの電荷比（＋／−）＝２の場合には、これとSucＰＧ修飾リポソームとの最終的複合体のSucＰＧ／ＤＮＡ（unit／unit）＝１であるものがもっとも活性が強く好ましい。これから、複合体成分として、電荷比（＋／−）＝２のリポプレックスを含む場合には、アミジン誘導体とSucＰＧとの比は、２：１が好ましいといえる。また上記リポプレックスの電荷比（＋／−）＝６の場合には、これとSucＰＧ修飾リポソームとの最終的複合体のSucＰＧ／ＤＮＡ（unit／unit）＝４であるものがもっとも活性が強く好ましい。これから、複合体成分として、電荷比（＋／−）＝６のリポプレックスを含む場合には、アミジン誘導体とSucＰＧとの比は、３：２が好ましいといえる。
粒子径を制御しない場合では、リポプレックスの電荷比、SucＰＧ修飾リポソーム／ＤＮＡ（unit／unit）比より、最適なものを選択し、最大活性をとったときの値は３３（×１０−3ｇ luciferase／ｍｇ protein）が確認できた。
【００５９】
粒子径を制御した場合、たとえば上記リポプレックスの電荷比（＋／−）＝１.５の場合には、複合体成分としてアミジン誘導体とSucＰＧとの比は１：１が最も導入効率が高く、好ましいといえる。また、同様に、上記リポプレックスの電荷比（＋／−）＝４の場合には、複合体成分としてアミジン誘導体とSucＰＧとの比は２：１が最も導入効率が高く、好ましいといえる。
特に粒子径を４００ｎｍ以下に制御した場合では、リポプレックスの電荷比、SucＰＧ修飾リポソーム／ＤＮＡ（unit／unit）比より、最適なものを選択し、最大活性をとったときの値は１７０（×１０−3ｇ luciferase／ｍｇ protein）となった。制御した場合は制御しなかった場合にくらべ５倍以上の高い導入効率を示した。
【００６０】
上記のような複合体としての薬物担体の調製例をより具体的に以下に示す。
まず、フラスコ内に、リン脂質等の担体膜構成材料を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次にSucＰＧのメタノール溶液を加え、有機溶媒を留去後、真空乾燥させることによりフラスコ内壁に脂質−SucＰＧ混合薄膜を形成させる。当該フラスコ内に、ＰＢＳを加え、激しく撹拌することにより、SucＰＧ修飾リポソームを形成する。
SucＰＧ修飾リポソームは、上記方法以外にも上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型入乳化機により高圧吐出させる方法によっても得ることができる。
【００６１】
一方、別のフラスコ内に、アミジン誘導体およびリン脂質等の他の担体膜構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に脂質の薄膜を形成させる。当該フラスコ内に、薬物溶液を加え、激しく撹拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし、封入されなかった薬物を除去することにより、薬物封入カチオン性リポソームを薬物担体の分散液として得ることができる。
薬物封入カチオン性リポソームは、上記方法以外にも、上記各構成成分を混合し、高圧吐出型入乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。
【００６２】
このようにして得られた、SucＰＧ修飾リポソームと薬物封入カチオン性リポソームとを混合し、複合化することによりし、複合化薬物担体、すなわちSucＰＧ修飾リポソーム・薬物封入カチオン性リポソーム複合体を得ることができる。
上記において、カチオン性リポソームに遺伝子を担持させた場合にはリポプレックスが形成される。
【００６３】
また上記において、粒子径を制御する場合には、SucＰＧ修飾リポソームおよびリポプレックスをそれぞれ複合化前にエクストルーダなどを使用して整粒処理する。この際、リポプレックスをエクストルーダで単に整粒しても、凝集して小粒子に制御された粒子を得ることは困難である。本発明では、特にこれに制限されるものではないが、たとえばアミジン誘導体を膜成分として使用してリポプレックスを調製する工程を、イオン濃度１００osmol以下、好ましくは５０osmol以下、より好ましくは５osmol以下の実質的に非電解質条件下で行うことにより、０.０５〜０.４μｍ、好ましくは０.０５〜０.３５μｍの粒径に制御したリポプレックスを得ることができる。このような非電解質条件に適合するものとしては、純水、グルコース等の糖類またはその誘導体の水溶液が挙げられ、後者の場合、濃度は制限されない。
このような小さい粒径のリポプレックス（カチオン性脂質・ＤＮＡ複合体）そのものは知られておらず、本発明では、これを提供することもできる。
本発明で調製されたリポプレックスは、SucＰＧ修飾リポソームとの複合後も安定に小粒径を保持することができる。
【実施例】
【００６４】
次に実施例および試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例に限定されるものではない。
以下の実施例において、粒子径および表面電位は、粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems 社製  型式NICOMP 380ZSL）にて測定した。
【００６５】
（実施例１）
下記１）〜３）の工程により、薬物担体として、SucＰＧ修飾リポソーム・カチオン性リポプレックス複合体を調製した。
１）SucＰＧ修飾リポソームの調製
卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）（１０ｍｇ／ｍＬ）のクロロホルム溶液７００μＬをナス型フラスコに装入し、クロロホルムをロータリーエバポレーターで減圧留去してＥＹＰＣの薄膜を形成させた。
これにSucＰＧ（サクシニル変性ポリグリシドール単位（ｂ）：８０モル％、長鎖アルキル基含有単位（Ｒ＝Ｃ１０）（ｃ）：１２モル％、未変性ポリグリシドール単位（ｄ）：８モル％で含むサクシニル化ポリグリシードル）のメタノール溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＬ加え、再び溶媒を減圧留去し、脂質−SucＰＧ混合薄膜を形成させた。
これを約２時間真空乾燥した後、ＰＢＳを２ｍＬ加え、バス型超音波照射装置を用いて３０秒間超音波照射して脂質−SucＰＧ混合膜を分散させた。この分散液のｐＨを７に調整した後、凍結−融解を３回行って、SucＰＧ修飾リポソームを形成した。さらに、エクストルーダーを用いて孔径５０ｎｍのポリカーボネート膜を通して、リポソームの粒子径を揃えた。
【００６６】
上記で得られたSucＰＧ修飾リポソーム分散液のｐＨを６に調整し、４℃においてサクシニル化単位に対して０.３当量のＥＤＣ（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を加えて２時間反応させた後、トランスフェリン水溶液（トランスフェリン３μｇを水５０μＬに溶解させ、５００ｍＭクエン酸鉄（III）溶液５μＬを加えたもの）を加え、４℃で一晩反応させた。
その後、SucＰＧ修飾リポソームの分散液のｐＨを７.４に調整し、セファロース４Ｂカラムを用いて遊離トランスフェリンを除去し、さらに、この分散液をろ過滅菌して、SucＰＧ修飾リポソームにトランスフェリンを結合させた。
【００６７】
２）リポプレックスの調製
２−１）カチオン性リポソームの調製
リポプレックス調製のためのカオチン化脂質として、アミジン誘導体、ＤＣ−CholまたはＤＯＴＡＰを用いて３種のカオチン性リポソームを調製した。
（Ａ）アミジンリポソーム
【化７】
2005008623.tif 000007
上記で示される3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（１５７μｇ）、ＤＬＰＣ(ジラウロイルフォスファチジルコリン)（１６５μｇ）および中性脂質ＤＯＰＥ（ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン）（３８４μｇ）をクロロホルム（０.２５ｍＬ）に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去して混合脂質の薄膜を形成させた。これにＰＢＳ（２ｍＬ）を加え、バス型超音波照射装置で２分間分散させてアミジンリポソーム分散液を得た。
（Ｂ）ＤＣ−Cholリポソーム
ＤＣ−Chol（１６５μｇ）およびＤＯＰＥ（３００μｇ）をクロロホルム（０.３２ｍＬ）に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去して混合脂質の薄膜を形成させた。そして、これにＰＢＳ（２.５ｍＬ）を加え、バス型超音波照射装置で２分間分散させてＤＣ−Cholリポソーム分散液を得た。
（Ｃ）ＤＯＴＡＰリポソーム
ＤＯＴＡＰ（１７１μｇ）およびＤＯＰＥ（１９２μｇ）をクロロホルム（０.４５ｍＬ）に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去して混合脂質の薄膜を形成させた。そして、これにＰＢＳ（２ｍＬ）を加え、バス型超音波照射装置で２分間分散させてＤＯＴＡＰリポソーム分散液を得た。
【００６８】
２−２）リポプレックスの調製
プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を２０ｍＭ  Tris−ＥＤＴＡ溶液（５０μＬ）に溶解した溶液と、該溶液のＤＮＡ（−）に対するカチオン化脂質（＋）の電荷比（＋／−）が６になるように量を調整した上記２−１）で調製されたカオチン性リポソームの各分散液とを混合し、氷冷下で１０分間放置することによって各リポプレックス（（Ａ）アミジンリポプレックス、（Ｂ）ＤＣ−Cholリポプレックス、（Ｃ）ＤＯＴＡＰリポプレックス）の分散液を調製した。
【００６９】
３）SucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の調製
上記２−２）で得られた（Ａ）〜（Ｃ）各リポプレックス分散液に、１）で得られたSucＰＧ修飾リポソーム分散液（ＥＹＰＣ濃度：０.２ｍＭ）を種々の複合比（SucＰＧ／ＤＮＡ（unit／unit）＝４，７，１０）で加え、氷冷下で１０分間放置して、SucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体を得た。
【００７０】
（試験例１）
上記で得られたSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体、およびコントロールとして複合化前の各リポプレックス（Ａ）〜（Ｃ）を用いて遺伝子導入試験を行った。
＜細胞の調製とトランスフェクション＞
ＨｅＬａ細胞を２４穴ディッシュに１穴当たり５万個撒き、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）１ｍＬを加えて、３７℃で一晩培養した。その後ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１ｍＬ加えた後、１穴当たり１μｇのプラスミドＤＮＡを含むSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体またはリポプレックスを加え、１２時間インキュベーションした。その後、再びＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＭＤＥＭを１ｍＬ加えて１２時間培養した。
【００７１】
＜ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価＞
遺伝子導入した細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり５０μＬの溶解剤を加えて細胞を溶解させた。得られた細胞溶解液を遠心チューブに回収し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して不溶成分を除去した。
細胞溶解液１０μＬを用いて、タンパク質の定量を行った。タンパク質の定量はcoomassie Protein Assay Reagent (Pierce)を用いた。
また、細胞溶解液２０μＬを用いて、ルシフェラーゼ活性を評価した。ルシフェラーゼは、ピッカジーン（東洋インキ）により定量した。結果を図１にグラフで示す。
図１は、アミジン化リポプレックス（電荷比／ＤＮＡ＝６）のSucＰＧ修飾リポソームとの各複合比（SucＰＧ／ＤＮＡ）におけるルシフェラーゼ活性（タンパク質ｍｇ当たりのルシフェラーゼ量１０−８ｇ）を、従来のカチオン化剤（ＤＣ−Chol、ＤＯＴＡＰ）による場合との比較で示す。
【００７２】
（実施例２）
実施例１の工程２）リポプレックスの調製で使用される溶媒ＰＢＳまたはTris−ＥＤＴＡ溶液に代えて、ＰＢＳまたは５％グルコース溶液（２ｍＬ）のいずれかを使用し、カチオン／ＤＮＡの電荷比＝２で調製したリポプレックス分散液に、さらに整粒工程を加えて細粒化した以外は実施例１と同様にして、SucＰＧ修飾リポソーム・カチオン性リポプレックス複合体を調製した。これを下記１）〜３）に示す。
【００７３】
１）SucＰＧ修飾リポソームの調製
実施例１の工程１）と同様にして、トランスフェリンを結合したSucＰＧ修飾リポソームを調製した。
【００７４】
２）リポプレックスの調製
２−１）アミジンリポソームの調製
3,5-ジペンタデシロキシベンズアミジン塩酸塩（１５７μｇ）、ＤＬＰＣ（１６５μｇ）および中性脂質ＤＯＰＥ（３８４μｇ）をクロロホルム（０.２５ｍＬ）に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去して混合脂質の薄膜を形成させた。これにＰＢＳまたは５％グルコース溶液を２ｍＬを加え、７０℃に加温後、バス型超音波照射装置で２分間分散させてアミジンリポソームのＰＢＳ分散液または５％グルコース分散液を得た。
【００７５】
２−２）リポプレックスの調製
プラスミドＤＮＡ（１μｇ）をＰＢＳまたは５％グルコース溶液（５０μＬ）に溶解した溶液と、該溶液のＤＮＡ（−）に対するカチオン化脂質（＋）の電荷比（＋／−）が２になる量の上記で調製された各アミジンリポソーム分解液とを、同一分散媒のもの同士で混合し、氷冷下で１０分間放置して、リポレックスのＰＢＳ分散液または５％グルコース分散液を調製した。
その後、バス型超音波照射装置で１０秒間分散させる整粒工程を加え、リポレックスを細粒化した。
【００７６】
３）SucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の調製
上記２−２）で得られた各リポプレックス分散液に、１）で作製したSucＰＧ修飾リポソーム分散液（ＥＹＰＣ濃度：０.２ｍＭ）を種々の量（SucＰＧ／ＤＮＡ（unit／unit）の複合比＝１，２，３，４）で加え、氷冷下で１０分間放置して、SucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体を得た。
【００７７】
（粒子径の測定）
上記で作製されたSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の各粒子径（平均粒子径）を粒度分布・ゼータ電位測定装置（Particle Sizing Systems 社製  型式NICOMP 380ZSL）にて測定した。結果を図２にグラフで示す。
図２に示す各複合比（SucＰＧ／ＤＮＡ）における粒子径から算出される平均粒子径は、ＰＢＳで分散したリポプレックスから作製した複合体の場合は９３０ｎｍであり、５％グルコースで分散したリポプレックスから作製した複合体の場合は２８０ｎｍであった。
リポプレックスを調製する際の分散液としてグルコース（非電解質溶液）を使用すれば、小粒子径のSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体を得ることができることが確認できた。
【００７８】
（試験例２）
＜細胞の調製とトランスフェクション＞
ＰＢＳで作製した複合体（粒子径９３０ｎｍ）と、５％グルコースで作製した複合体（粒子径２８０ｎｍ）とを用い、培養時間が異なる以外は、実施例１の試験例１と同様の操作を行った。すなわち、ＨｅＬａ細胞を２４穴ディッシュに１穴当たり５万個撒き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１ｍＬを加えて、３７℃で一晩培養した。その後ＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを１ｍＬ加えた後、１穴当たり１μｇのプラスミドＤＮＡを含むSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体またはリポプレックスを加え、４時間インキュベーションした。その後、再びＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＭＤＥＭを１ｍＬ加えて４０時間培養した。
【００７９】
＜ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価＞
実施例１の試験例１と同様にして、ルシフェラーゼ活性を評価した。すなわち、遺伝子導入した細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり５０μＬの溶解剤を加えて細胞を溶解させた。得られた細胞溶解液を遠心チューブに回収し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して不溶成分を除去した。細胞溶解液１０μＬを用いて、タンパク質の定量を行った。また、細胞溶解液２０μＬを用いて、ルシフェラーゼ活性を評価した。結果を図３にグラフで示す。
粒子径３００ｎｍ以下のSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体は、高いルシフェラーゼ（遺伝子導入）活性を示すことが確認された。
【００８０】
＜細胞導入活性の評価＞
フローサイトメーターによる細胞導入活性の違いを評価した。
遺伝子導入を行い、２４時間インキュベートした細胞を、ＰＢＳ（＋）で２回、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。その後、アスピレーターを用いてＰＢＳ（−）を取り除き、６穴ディッシュの１穴につき０.０２５％のトリプシン水溶液を約１ｍＬ加え、３７℃で約２分間インキュベートし、全ての細胞をディッシュからはがし、回収した。回収した細胞分散液をよく撹拌し、フローサイトメーターによって導入率を評価した。
評価の方法については、まずコントロールとして、何も処理を施していない細胞をフローさせ、細胞のみの蛍光を測定した。その後、種々のベクターを用いて遺伝子導入を行った細胞をフローさせ、その蛍光と数を調べた。そして、未処理の細胞よりも大きな蛍光を持つ細胞を計測することによって、細胞の導入効率を求めた。結果を図４にグラフで示す。
図から、粒子径３００ｎｍ以下のSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の高い細胞導入効率が確認された。
【００８１】
上述の試験例に示されように、担体の膜構成成分として、アミジン誘導体とサクシニル化ポリグリシドール誘導体とを含む本発明の薬物担体は、従来の薬物担体に比べ遺伝子の細胞での導入効率がきわめて高いことが明らかとなった。
さらに、このような構成の薬物担体において、その製造工程で粒子径を制御するが可能であり、粒子径を小さくすることにより、細胞への導入効率を極めて高くすることができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の薬物担体および従来の薬物担体による遺伝子導入試験のための実施例の評価をグラフで示す図である。
【図２】本発明におけるリポプレックス調製溶媒と、最終SucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の粒子径との関係をグラフで示す図である。
【図３】本発明におけるSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の遺伝子導入活性（各粒子径での）を複合比との関係で示す図である。
【図４】本発明におけるSucＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体の粒子径による細胞導入活性の相違を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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