(57)【要約】  【課題】  例えば鮭の鼻軟骨からアルカリ抽出法や酵素法により抽出されたコンドロイチン硫酸ナトリウム抽出液のように、タンパク質等の夾雑物を含む原料組成物から夾雑物を簡便且つ低コストで除去し、高純度で且つ水溶液状態としたときに濁りのない日本薬局方外医薬品規格を満足するようなコンドロイチン硫酸ナトリウムを得る方法を提供する。  【解決手段】  例えば上記原料組成物を精製し、不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３．００重量％であるコンドロイチン硫酸粗体を得、次いで（１）前記粗体が溶解したｐＨ３．０〜６．５の水溶液を調製した後に該水溶液と水溶性有機溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させるか又は（２）固体状の前記粗体から水溶性有機溶媒を用いて生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を抽出除去する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３質量％であるコンドロイチン硫酸粗体を準備する粗体準備工程及び該工程で準備された粗体から生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を、下記方法（１）又は方法（２）により除去する精製工程を含んでなることを特徴とする高純度コンドロイチン硫酸の製造方法。
方法（１）：  前記粗体が溶解したｐＨ３．０〜６．５の水溶液を調製し、次いで該水溶液と水溶性有機溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させる方法。
方法（２）：  固体状の前記粗体から水溶性有機溶媒を用いて生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を抽出除去する方法。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸１００質量部及び生体由来の不純物であって、水溶性不純物と難水溶性又は非水溶性不純物との混合物からなる不純物を、３質量部を超え２００質量部以下含む原料組成物から、前記コンドロイチン硫酸粗体を得る請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物、飼料等の分野において種々の用途が期待されるコンドロイチン硫酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖とは、広義には動物から得られた多糖類を意味し、その原料としては、鮫、鮭等の魚類；鯨、エイ、ナマコ等のその他の水生動物；および牛、豚、鶏、馬等の陸上動物から取り出した骨、軟骨、皮、魚の鱗等が知られている。ムコ多糖の代表的な物質としては、グリコサミノグルカンを挙げることが出来る。グリコサミノグルカンは、一般にコアタンパク質に共有結合したプロテオグルカンとして存在する。グリコサミノグルカンは、繰り返し二糖で構成され、二糖の内のひとつはＤ−グルコサミンまたはＤ−ガラクトサミンのいずれかである。グルコサミノグルカンの例としては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ケタラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸及びデルマタン硫酸等が知られている。
【０００３】
これらのなかでコンドロイチン硫酸は、動物の粘質性分泌液、軟骨等から得られるムコ多糖の一種であり、動物、人体の保水をはかり、これによって新陳代謝を潤滑にし、細胞の賦活機能を果たしていると推定されており、医薬品、化粧品、健康食品として広く用いられている。コンドロイチン硫酸の生理作用としては、細胞外液の容量調節と水分代謝、細胞外液のイオン移動と調節、関節組織の円滑化、脂血清澄作用と血液凝固阻止作用、抗炎症作用、抗ガン作用、角膜透明度維持、感染防止等が知られている。食品、飲料、化粧品または医薬品の有効成分として、これらの生理機能を十分に発揮するために、簡便で安価な高純度コンドロイチン硫酸の製造方法の開発が求められている。
【０００４】
コンドロイチン硫酸は、硫酸エステル基を有しているが、当該硫酸エステル基は中性構造（−OSO3H）または、Na塩（−OSO3Na）、K塩（−OSO3K）、Ca塩（−OSO3Ca）等のイオン性構造またはこれらの混合物であってもよい。またコンドロイチン硫酸はカルボシキル基構造を有しているが、当該カルボキシル基構造は、中性構造（−CO2H）または、Na塩（−CO2Na）、K塩（−CO2K）、Ca塩（−CO2Ca）等のイオン性構造またはこれらの混合物であってもよい。
【０００５】
一般にコンドロイチン硫酸を製造する方法としては、骨、軟骨、皮等の原料をアルカリ液で分解し、ムコ多糖を抽出するアルカリ処理法、中性塩液で抽出する中性塩処理法、プロテアーゼ、プロナーゼ、アロナーゼ等のタンパク質分解酵素で処理する酵素法等の方法が知られている。またこれらの方法を組み合わせた処理法によりコンドロイチン硫酸を得ることもできる。
【０００６】
これらの処理では、コンドロイチン硫酸が共有結合したコアタンパク質を切断することにより原料からコンドロイチン硫酸を取り出す（抽出する）。しかしながら、このような処理により得られる抽出物（コンドロイチン硫酸含有抽出物）中には、タンパク質やその分解物さらには脂質等の不純物が多量に含まれている。コンドロイチン硫酸へのこれら不純物の混在は、特に医薬品、化粧品分野での使用に支障をきたすことがある。例えば、注射薬用医薬剤として用いる場合には、これらタンパク質等が混在するとアレルギー反応を引き起こしやすくなり、化粧品用途では経時的な褐変を生じるなど安定性に問題を生じやすくなる。
【０００７】
そこで、これらの方法で得られたコンドロイチン硫酸含有抽出物からコンタミネーションを除去し、コンドロイチン硫酸の高純度化を図る必要がある。そのための方法としては、エタノール分画処理、イオン交換クロマトグラフィー処理、エタノールによる沈殿回収とイオン交換樹脂処理との組合せ、限外ろ過処理等が知られている。
【０００８】
エタノール分画処理は、本来は広い分子量分布を有するコンドロイチン硫酸組成物の中から特定の分子量範囲のコンドロイチン硫酸を得るための方法であり、分子量によりエタノールに対する溶解性が異なることを利用した方法である。“タンパク質及び／又はその分解物”のエタノールに対する溶解度はコンドロイチン硫酸のそれに比べて有意に高いため、結果としてこの方法によりこれら夾雑物を分離除去することができる。しかしながら、エタノール濃度を変えながら、分画処理する操作は複雑であるためコストが高く、工業生産には適さない。なお、該エタノール分画処理においては、コンドロイチン硫酸の水溶液に単にエタノールを加えてもコンドロイチン硫酸はなかなか析出してこないため、析出を促進する目的で酢酸ナトリウムや酢酸カルシウムなどを僅かに（通常５質量％以下）添加することが行なわれている（非特許文献１参照）。また、エタノールによる沈殿回収とイオン交換樹脂処理との組合せ（特許文献１参照）においては、コンドロイチン硫酸を含む抽出物水溶液にエタノールを添加して沈殿回収されるコンドロイチン硫酸の純度は一般に低いため、更に高純度化を図るためにはイオン交換樹脂を用いた処理を行なうことが必須となっている。更に、限外ろ過処理（特許文献２参照）においては、高価な設備が必要であるという問題点がある。
【０００９】
【非特許文献１】日本生化学会編  新生化学実験講座３  「糖質ＩＩ」，東京化学同人，１９９１年，ｐ．２８
【特許文献１】特開２００１−２３１４９７号公報
【特許文献２】特開２０００−２７３１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、夾雑物を含むコンドロイチン硫酸含有抽出物から夾雑物を簡便且つ低コストで除去し、高純度のコンドロイチン硫酸を得る方法はこれまで知られていない。そこで、本発明は、簡便且つ低コストでコンドロイチン硫酸含有抽出物から夾雑物を除去する方法を開発すべく鋭意検討を行なった。その結果、コンドロイチン硫酸含有抽出物の水溶液に多量の有機カルボン酸塩、食塩等を添加してからエタノールと混合してコンドロイチン硫酸を沈殿させて回収した場合（以下、この方法を“新沈殿回収法”ともいう。）には、従来のエタノール沈殿回収法による場合と比べて回収されたコンドロイチン硫酸の純度が著しく向上することを見出した。しかしながら、該新沈殿回収法で得られた高純度コンドロイチン硫酸について様々な検討を行なったところ、該高純度コンドロイチン硫酸は、そのままでは日本薬局方外医薬品規格（以下、局外規ともいう）を満足しないことが明らかとなった。即ち、上記高純度コンドロイチン硫酸を水溶液とした場合、得られる水溶液には僅かに濁りが生じることが判明した。
【００１１】
そこで、本発明は新沈殿回収法で得られるような“高純度ではあるが水溶液としたときに濁りを生じるコンドロイチン硫酸”から濁りの原因となる不純物を効率よく除去する方法を提供し、コンドロイチン硫酸含有抽出物から簡便且つ低コストで局外規を満足するコンドロイチン硫酸を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決するために水溶液としたときに濁りが発生する機構について検討を行なった。その結果、濁りの原因となるのはコンドロイチン硫酸含有抽出物に含まれる脂質等の生体由来の難水溶性若しくは非水溶性不純物であること、このような不純物が含まれている場合でもアミノ酸やタンパク質等の生体由来の水溶性不純物が比較的多く含まれている場合にはこれらとの相互作用により水溶性の複合体となっているが、水溶性不純物の含有量が少なくなるとその含有量が微量でも濁りの原因となること、新沈殿回収法に限らず従来の高純度化法を用いた場合においても生体由来の水溶性不純物と複合体を形成しにくい状態で存在する生体由来の難水溶性若しくは非水溶性不純物を微量含む固体状のコンドロイチン硫酸においては同様に濁りの問題が発生することが判明した。
【００１３】
そこで、本発明者等は、上記のような固体状のコンドロイチン硫酸から生体由来の難水溶性若しくは非水溶性不純物を効率的に除去する方法を見出すべく更に検討を行なった。その結果、(i)多量の水が共存しない条件下でエタノール等の水溶性有機溶媒に上記固体状のコンドロイチン硫酸を懸濁させてスラリー状態とした後にろ過等の方法で分離したコンドロイチン硫酸は清澄な水溶液を与えること、(ii)上記固体状のコンドロイチン硫酸を一旦水溶液とした後に該水溶液のｐＨを弱酸性に調節してからエタノールを用いて沈殿回収したコンドロイチン硫酸は清澄な水溶液を与えることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３質量％、好ましくは０．５〜２質量％であるコンドロイチン硫酸粗体を準備する粗体準備工程及び該工程で準備された粗体から生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を、（１）前記粗体が溶解したｐＨ３．０〜６．５の水溶液を調製し、次いで該水溶液と水溶性有機溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させる方法又は（２）固体状の前記粗体から水溶性有機溶媒を用いて生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を抽出除去する方法により除去する精製工程を含んでなることを特徴とする高純度コンドロイチン硫酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の製造法によれば、コンドロイチン硫酸含有抽出物から簡便且つ低コストで局外規を満足するコンドロイチン硫酸を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法では、先ず、粗体準備工程において不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３質量％であるコンドロイチン硫酸粗体を準備する。前記したように、コンドロイチン硫酸は、動物の骨、軟骨、皮等の原料から抽出されたコンドロイチン硫酸含有抽出物から製造されるため、本発明においても基礎原料としてコンドロイチン硫酸含有抽出物を使用するのが有利である。
【００１７】
コンドロイチン硫酸含有抽出物は、各種原料動物由来の原料物質をアルカリ或いは酵素で処理してムコ多糖であるコンドロイチン硫酸が共有結合したコアタンパク質を切断することにより得ることができる。ここで、上記原料動物としては、鮫、鮭等の魚類；鯨、エイ、ナマコ等のその他の水生動物；又は牛、豚、鶏、馬等の陸上動物等が使用できるが、得られる原料組成物の純度が比較的高く、臭気を少なくすることができることから、水生動物、特に鮭を使用するのが好適である。また、原料物質としては骨、軟骨、皮、魚の鱗等、コンドロイチン硫酸成分を含む組織であれば特に制限されないが、取り扱いが容易で、コンドロイチン硫酸の含量が高いことから特に鼻軟骨等の軟骨を使用するのが好適である。なお、用いる原料物質は、あらかじめ水洗、有機溶媒洗浄等により肉、脂肪等の夾雑物を除去することが好ましい。これら原料を、処理前に切断、粉砕、水を添加し加圧する等の処置により、処理の効率を高めることが通常行われる。
【００１８】
また、原料物質からコンドロイチン硫酸含有抽出物を得る方法としては、従来採用されている方法、即ち、原料物質をアルカリ液で分解し、コンドロイチン硫酸を抽出するアルカリ処理法、原料物質からコンドロイチン硫酸を中性塩液で抽出する中性塩処理法、原料物質にプロテアーゼ、プロナーゼ、アロナーゼ等のタンパク質分解酵素を作用させて分解し、コンドロイチン硫酸を抽出する酵素法、又はこれらの方法の組み合わせが制限なく使用できるが、コンドロイチン硫酸の回収率が高いという理由からこれらの方法の中で、アルカリ処理法及び酵素法による処理が好ましく、特に酵素処理が好ましい。これらの処理により、コンドロイチン硫酸含有抽出物を得ることができる。このような方法で得られるコンドロイチン硫酸含有抽出物は、通常、コンドロイチン硫酸、タンパク質やその分解物（アミノ酸やペプチド）等の生体由来の水溶性成分、並びに脂質等の生体由来の難水溶性又は非水溶性成分の混合物を含む水溶液成分を含んでいる。なお、一般的なコンドロイチン硫酸含有抽出物における生体由来の不純物（水溶性不純物と難水溶性又は非水溶性不純物との混合物）の含有割合はコンドロイチン硫酸１００質量部に対して３質量部を超え２００質量部以下である。なお、コンドロイチン硫酸含有抽出物には、その他の成分として塩類、灰分、無機物等が含まれることもある。これらその他の成分はコンドロイチン硫酸を１００質量部とした場合、通常０〜１００質量部の範囲である。
【００１９】
粗体準備工程では、上記のような処理により得られるコンドロイチン硫酸含有抽出物を含む水溶液成分をそのまま該工程の原料として使用することもできるが、効率の観点から、遠心分離、ろ過等によって不溶物の除去を行い、さらに必要に応じて、ろ過助剤を用いてもよいろ過、抽出物に対して２．５重量％程度の少量の活性炭を用いた活性炭処理等を行うことにより、脱臭、脱色、脱脂等を行ってから原料とするのが好適である。さらに、取扱いの容易性からスプレードライ（噴霧乾燥）、蒸発乾燥、凍結乾燥等の方法で一旦、固化・粉末化してから使用するのが好適である。
【００２０】
粗体準備工程では、上記のようにして得られた、コンドロイチン硫酸含有抽出物等の原料組成物から不純物除去して、“不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３質量％であるコンドロイチン硫酸粗体”を得る。
【００２１】
原料組成物から上記コンドロイチン硫酸粗体を得る方法としては、前記新沈殿回収法の他、例えば従来のエタノール沈殿回収法に代表される水溶性有機溶媒を用いた沈殿回収法を繰り返す方法、エタノール分画処理、イオン交換クロマトグラフィー処理、エタノール等の水溶性有機溶媒を用いた沈殿回収とイオン交換処理との組合せ、限外ろ過処理等が採用できるが、効果の観点から（ａ）新沈殿回収法又は（ｂ）エタノール等の水溶性有機溶媒を用いた沈殿回収法とイオン交換処理を組み合わせた方法を採用するのが好適である。
【００２２】
以下、（ａ）新沈殿回収法について説明する。該方法では、先ず前記原料組成物及び有機カルボン酸塩を含み且つ該有機カルボン酸塩または食塩の濃度が８〜６０質量％である水溶液を調製する（該工程を水溶液調製工程ともいう）。その後、該工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して、コンドロイチン硫酸を選択的に析出させる（該工程を析出工程ともいう）ことにより前記原料組成物から高純度化されたコンドロイチン硫酸を製造する。水溶液状態の原料組成物にエタノール等の水溶性有機溶媒を添加してコンドロイチン硫酸を析出させるという点では、従来のエタノール分画処理法及びエタノールによる沈殿回収法と同じであるが、ムコ多糖の析出を高濃度の有機カルボン酸塩または食塩の共存下で行なうことにより、これら従来法では実現できない効果を得ることが可能となっている。以下、これら工程について説明する。
【００２３】
水溶液調製工程では、前記原料組成物及び有機カルボン酸塩または食塩を含み且つ該有機カルボン酸塩または食塩濃度が８〜６０質量％である水溶液を調製する。水溶液中の有機カルボン酸塩または食塩濃度が８質量％未満の場合には後段の析出工程で析出するコンドロイチン硫酸の純度が高くならない。また、有機カルボン酸塩または食塩の濃度が６０質量％を超えるときには溶解度の問題や攪拌動力に対する負荷、経済性等の観点から効果が低い。経済性、精製効果の観点から水溶液調製工程で調製される水溶液中の有機カルボン酸塩または食塩の濃度は、９〜５０質量％、特に１０〜４０質量％であるのが好適である。なお、該水溶液調製工で調製する水溶液中におけるコンドロイチン硫酸の濃度は特に限定されるものではないが、精製効率の高さの観点から０．２〜６０質量％、特に０．５〜３０質量％であるのが好適である。また、水溶液のｐHは特に制限はないが、精製効率および腐敗防止の観点から、１〜６の範囲（酸性）であるか又は８〜１４（アルカリ性）であるのが好ましい。
【００２４】
有機カルボン酸塩としては、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸、マロン酸等の１価または２価以上の有機カルボン酸塩を制限なく用いることが出来るが、後段の析出工程におけるコンドロイチン硫酸の析出性の観点から、特に酢酸塩を用いるのが好ましい。塩の対イオン（カチオン種）としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン等を用いることが出来るが、精製効率の点で特にナトリウムイオンが好ましい。特に好適な有機カルボン酸塩として、酢酸ナトリウムを挙げることが出来る。また、有機カルボン酸塩は塩の形で水溶液に添加してもよく、有機カルボン酸と塩基を添加して水溶液内で調製してもよい。例えば酢酸ナトリウムは酢酸と水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどと水溶液に添加することにより調製できる。
【００２５】
また水溶液には、必要に応じて、酸、アルカリ、他の塩類、防腐剤を加えることにより、精製効率の向上、菌・カビ等の発生（腐敗）防止を図ることが出来る。例えば、ｐＨを１〜６、好適には２〜６に調製するためには酸を添加するが、このときに使用する酸としては酢酸、クエン酸、酒石酸等の有機カルボン酸、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸を用いることが出来る。これらの中で、特に酢酸が好ましい。
【００２６】
また、ｐＨを８〜１４、好適には８〜１３に調製するためには塩基を添加するが、このときに使用する塩基としてはアルカリを使用するのが好適である。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド等の有機水酸化物等を用いることが出来る。アルカリは単にｐＨを調整する機能だけではなくコンドロイチン硫酸の精製効率を高める効果もあることから、水溶液はアルカリを含有するのが好適である。
【００２７】
他の塩類としては、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸水素カリウム、硫酸マグネシウム等の硫酸塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸１水素ナトリウムとのリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化バリウム等の塩化物塩等を挙げることが出来る。これら他の塩類の添加により、容易に水溶液のイオン強度を調整することが出来る。添加量としては特に制限はないが、一般に水溶液の０．０１〜５質量％である。
【００２８】
防腐剤としては、一般に腐敗防止に用いられているもののなかで、コンドロイチン硫酸、タンパク質やその分解物（アミノ酸やペプチド）を分解・変性しないものであれば制限なく用いることが出来る。例えば、エタノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ポリヘキサメチレン等のグアニジン類、塩化ベンザルコニウム等の逆性石鹸、アルキルポリアミノエチルグリシン等の表面活性剤、次亜塩素酸ナトリウム等のハロゲン系殺菌剤、過酸化水素、過酢酸等の過酸化物等を用いることが出来る。これら防腐剤の使用量は、用いるコンドロイチン硫酸の種類、処理温度等によって適宜調整すればよい。
【００２９】
水溶液調製工程において水溶液を調製する際の各種成分の添加順序は特に制限されず、一度に添加しても数回に分けて添加してもよい。たとえば、粉末状の原料組成物および水を入れた反応釜を攪拌しながら、有機カルボン酸塩または食塩を固体状態で又は水に溶かした状態で添加すると共にその他添加物を同様にして添加して水に溶解させることにより好適に調製できる。得られた水溶液は、精製効率を高めるために４℃〜１００℃、好ましくは２０〜９０℃、特に好ましくは３０〜７０℃で１０分〜１００時間、好ましくは３０分〜５０時間、特に好ましくは３０分〜２４時間攪拌処理し、必要に応じて放冷・放置するのが好適である。またこの段階でろ過等を行い、不溶物を除去することは、精製の観点から有用である。なお、水としては、上水またはイオン交換水を使用するのが好適である。
【００３０】
新沈殿回収法では、析出工程において前記水溶液調製工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒とを混合して、コンドロイチン硫酸を選択的に析出させる。ここで、水溶性有機溶媒とは、２５℃における水への溶解度が水１００ｇ当たり５０ｇ以上の有機溶媒を意味する。コンドロイチン硫酸の回収率を高くすることができるという理由から水溶性有機溶媒としては水と混和する有機溶媒を使用するのが好ましい。好適に使用できる水溶性有機溶媒を例示すれば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール等低級アルコール；エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジオキサン、ジメチルスルホキシド等を挙げることが出来る。これら溶媒の中で精製するコンドロイチン硫酸に応じて適宜選択すればよいが、一般に精製効率の点から、メタノール、エタノールが好ましく、エタノールが特に好ましい。なお、水溶性有機溶媒は、無水のものであっても水を含むものであってもよいが、コンドロイチン硫酸を効率的に析出させる点から、混合する水溶性有機溶媒における水溶性有機溶媒の含有量は８０質量％以上、特に９０質量％以上であるのが好ましい。水溶性有機溶媒がエタノールである場合には、溶媒回収効率と精製効率の点から８５〜９９質量％が好ましく、９２〜９７質量％であることが特に好ましい。
【００３１】
当該析出工程で析出したコンドロイチン硫酸と水溶性有機溶媒を含有する水溶液とを分離した後に分離された水溶液から前記水溶性有機溶媒を回収し、これを再利用することはプロセス上勿論可能であり、こうすることにより製造コストを低減することができる。この場合において、水を含有してもよい水溶性有機溶媒を使用することは、水溶性有機溶媒の回収・精製コストの点でメリットがある。
【００３２】
析出工程で使用する水溶性有機溶媒の量は、コンドロイチン硫酸の析出効率の点から、水溶液調製工程で調製した水溶液及び水溶性有機溶媒（水を含んでいてもよい）の合計重量を基準とした水溶性有機溶媒（水を含まない）の質量％で表して、２０〜８０質量％、特に２５〜７５質量％であるのが好適であり、最も好ましくは３０〜７０質量％である。
【００３３】
水溶液調製工程で得られた水溶液と水溶性有機溶媒との混合する方法には特に制限はなく、例えばバッチ式処理にて該水溶液中に水溶性有機溶媒を添加する方法、逆に水溶性有機溶媒中に水溶液を添加する方法、フロー式処理にて、該水溶液と水溶性有機溶媒を別々のラインから流し、反応槽又はライン中で混合する方法等が好適に採用できる。これらの中でも、処理工程の容易さの点からバッチ式処理が好ましく、主な不純物であるタンパク質やその分解物（アミノ酸やペプチド）の除去効率が高い点から、水溶液中に水溶性有機溶媒を添加する方法が特に好ましい。
【００３４】
水溶液調製工程で得られた水溶液中に水溶性有機溶媒を添加する場合には、反応槽に該水溶液を入れ、温度調整を行いながら攪拌し、水溶性有機溶媒を添加し、さらに攪拌を継続し析出を完了させる。新沈殿回収法において、混合液の温度、攪拌条件および水溶性有機溶媒の添加速度は析出物の純度、取り扱い性に大きな影響を与える。高純度でろ過性の良い析出物を得るためには、攪拌および水溶性有機溶媒を添加する際の温度は、４℃〜６０℃、特に２０〜４０℃とするのが好適である。また攪拌は、剪断速度が０．５〜１００（ｍ／秒）であることが好ましく、０．７〜５０（ｍ／秒）であることが特に好ましい。水溶性有機溶媒の添加速度に関しては、０．００００１〜５００（ｌ／分）、特に０．０００１〜４００（ｌ／分）であるのが好ましい。また水溶性有機溶媒を添加し終わった後の攪拌時間は、液温によっても変わってくるが通常３０分から１２時間であり、腐敗防止の観点から３時間以内であることが好ましい。このような条件を採用して析出を行うことにより原料組成物中に含まれるコンドロイチン硫酸を回収率９５％以上で一度に析出させることができる。
【００３５】
新沈殿回収法で析出したコンドロイチン硫酸は、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等の通常の分離方法によって、液成分と分離し、回収することが出来る。このようにして回収された固体状のコンドロイチン硫酸粗体は、不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３質量％である。新沈殿回収法は必要に応じて複数回行なってもよい。
【００３６】
前記、新沈殿回収法により得られた沈殿は、水分量が０〜２０質量％以下であるエタノール水溶液により洗浄するとよい。該エタノール水溶液の使用量としては、コンドロイチン硫酸１００質量部に対して、通常１０〜５００質量部の中から適宜選択すればよく、洗浄回数も１〜１０回の中から適宜選択すると良い。
【００３７】
該処理により得られたコンドロイチン硫酸の沈殿は、湿体のまま次工程に供してもよく、公知の乾燥処理により乾燥を施してから次工程に供してもよい。乾燥方法としては、例えば、減圧乾燥、温風乾燥、調湿乾燥、風乾、棚段乾燥が挙げられ、棚式で乾燥してもよく、コニカルドライヤーのように回転させて乾燥させてもよい。乾燥温度は、あまり低いと乾燥時間が長期化し、高すぎるとコンドロイチン硫酸が変性するため、通常−１０〜１２０℃、好ましくは０〜１１０℃、さらに好ましくは１０〜１００℃の範囲から適宜選択すればよい。また、噴霧乾燥（スプレードライ）により固体を取り出してもよい。
【００３８】
次に（ｂ）エタノール等の水溶性有機溶媒を用いた沈殿回収法とイオン交換処理を組み合わせた方法について説明する。該方法では、まず、前記新沈殿回収法において、原料水溶液と水溶性有機溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させる際における有機カルボン酸塩または食塩の濃度を０〜５％以下とする他は前記新沈殿法と同様の処理を施し沈殿を得る。その後、得られた該沈殿をさらに水に溶解させて、腐敗防止の観点から前述の防腐剤を必要に応じて添加した状態で、イオン交換処理を行う。イオン交換処理前の沈殿回収法、又はイオン交換樹脂処理は必要に応じて数回繰り返してもよく、沈殿回収法とイオン交換処理のセットを複数回繰り返してもよい。
【００３９】
上記イオン交換処理は、通常イオン交換樹脂を用いて行なわれるが、このとき使用するイオン交換樹脂としては精製効率の観点からカチオン交換樹脂、特に強酸性樹脂が好ましい。好適に使用できるカチオン交換樹脂としては、ダウエックスX５０，アンバーライトIR１２０、ＰＫ２１６、ＰＫ２０８等が挙げられる。カチオン交換樹脂との接触により、沈殿回収法で回収されたコンドロイチン硫酸に含まれる生体由来の不純物の除去、塩、必要であるならば重金属の除去を行うことが出来る。金属イオンおよび生体由来の不純物は、プロトン型の交換体樹脂に結合し、遊離のコンドロイチン硫酸はろ液又は溶離液中に存在する。イオン交換処理は、一般に０〜５０℃で行われるが、精製効率、樹脂再生、腐敗防止等の観点から、１０〜２５℃で行なうのが好ましい。溶液とイオン交換樹脂との接触時間は腐敗および精製の観点から０〜２４時間の範囲から適宜選択すればよい。イオン交換処理方式としては、イオン交換樹脂との攪拌による接触を施すバッチ方式、あるいは連続式カラム法、又は不連続式カラム法で行うことが出来る。なお、連続式カラム法、または不連続カラム法によりイオン交換処理をする場合、イオン交換処理に供される水溶液中のコンドロイチン硫酸濃度は、０．１〜３０質量％、特に０．５〜２５質量％とするのが好適である。また、イオン交換処理で使用するイオン交換樹脂の量は、バッチ処理、カラム処理の両方において、処理されるコンドロイチン硫酸の乾燥質量１００質量部に対して、通常は１〜１００質量部であり、好ましくは２〜９０質部である。
【００４０】
このような処理を行なうことにより、不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３重量％であるコンドロイチン硫酸粗体を含む水溶液を得ることができる。該水溶液からエタノール沈殿法等によりコンドロイチン硫酸粗体を回収し、必要に応じて洗浄・乾燥処理を行ない次工程の精製工程に供すればよい。なお、精製工程として方法（１）を採用する場合には得られた水溶液をそのまま使用することもできる。但し、イオン交換処理後の水溶液のｐＨは３以下となっているため、長時間該状態にコンドロイチン硫酸を維持すると劣化を生じることがある。このため水溶液状態で長期間保存する場合には、アルカリ添加してを用いて水溶液のｐＨを３．０〜６．５に調整するのが好適である｛このようなｐＨ調整は、後述の精製工程の方法（１）にも該当する｝。ｐＨ調整に使用するアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド等の有機水酸化物等を用いることが出来る。
【００４１】
本発明の製造方法では、上記粗体準備工程で準備された粗体から生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を、（１）前記粗体が溶解したｐＨ３．０〜６．５の水溶液を調製し、次いで該水溶液と水溶性有機溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させる方法、又は（２）固体状の前記粗体から水溶性有機溶媒を用いて生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を抽出除去する方法により除去する（精製工程）。
【００４２】
粗体準備工程で得られた粗体は、生体由来の不純物の総含有量は０．０１〜３重量％と低いものの生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物が含まれているため、水溶液とすると濁りが発生してしまい局外規を満足する製品として使用することができない。これらの濁りは、水溶液を０．２０μｍ以下のポアサイズの精密フィルターを用いて濾過することにより除去することもできるが、この場合過性が悪いため、大量の精密フィルターと長時間を要すため工業化プロセスとしては適さない。本発明の製造方法では、上記した（１）または（２）といった簡便な方法で濁りとなる成分を除去できることが最大の特徴である。以下、方法（１）及び（２）について説明する。
【００４３】
前記方法（１）では、先ず、前記粗体が溶解したｐＨ３．０〜６．５の水溶液を調製する。粗体が沈殿回収法により得られた湿体または乾燥体のような固体状である場合には、これに水を加え水溶液とする際、酸を用いてｐＨを３．０〜６．５に調整すればよい。このとき酸としては、酢酸、クエン酸、酒石酸等の有機カルボン酸、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸を用いることが出来る。また、粗体が前記方法（ｂ）で得られるｐＨ３以下の水溶液上である場合には、前記したようにアルカリ等を添加してｐＨを３．０〜６．５に調整すればよい。なお、ｐＨ調製に際して、水溶液中のコンドロイチン硫酸濃度は０．０１〜１０質量％とするのが好適である。ｐＨ調整はｐＨメーターを用いて行なえばよく、このときの液温は−２０℃〜１００℃、特に０〜７０℃とするのが好適である。また、ｐＨ調製に際して水溶液は攪拌するのが好ましい、ｐＨ調節後、１分〜１００時間、好ましくは分〜２４時間攪拌すると濁り成分が溶解し、無色透明または淡黄色澄明の溶液となる。
【００４４】
方法（１）では、このようにして無色透明または淡黄色澄明となった水溶液と水溶性有機溶媒とを混合してコンドロイチン硫酸を析出させる。このとき使用できる水溶液有機溶媒を例示すると、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール等低級アルコール；エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジオキサン、ジメチルスルホキシド等を挙げることが出来る。これら溶媒は複数種類を混合して使用してもよい。これら水溶性溶媒の中でも精製効率の点から、メタノール及び／又はエタノールを使用するのが好ましく、エタノールを使用するのが特に好ましい。なお、水溶性有機溶媒は、無水のものであっても水を含むものであってもよいが、コンドロイチン硫酸を効率的に析出させる点から、混合する水溶性有機溶媒における水溶性有機溶媒の含有量は８０質量％以上、特に９０質量％以上であるのが好ましい。水溶性有機溶媒がエタノールである場合には、溶媒回収効率と精製効率の点から８５〜９９質量％が好ましく、９２〜９７質量％であることが特に好ましい。ｐＨ調製された水溶液と水溶性有機溶媒とを混合するときには、液温を０〜３０℃とするのが好適である。両者を混合することにより高純度のコンドロイチン硫酸が析出してくる。このとき濁りの原因となる成分は溶液中に溶解しているので、回収された析出物は局外規を満足することになる。
【００４５】
析出したコンドロイチン硫酸は、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等の通常の分離操作によって、液成分と分離し、単離することが出来る。単離されたコンドロイチン硫酸は、水分量が０〜２０質量％以下であるエタノール水溶液により洗浄するとよい。該エタノール水溶液の使用量としては、コンドロイチン硫酸１００質量部に対して、通常１０〜５００質量部の中から適宜選択すればよく、洗浄回数も１〜１０回の中から適宜選択するとよい。必要に応じてこのような方法により洗浄されたコンドロイチン硫酸の沈殿は、減圧乾燥、温風乾燥、調湿乾燥、風乾、棚段乾燥等の方法により乾燥される。
【００４６】
前記方法（２）では、固体状の前記粗体から水溶性有機溶媒を用いて生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を抽出除去する。該方法では前記粗体として固体状のものを使用する必要がある。固体状の粗体としては前記粗体準備工程における方法（ａ）又は（ｂ）において回収された湿体又は乾燥体が使用できる。該方法では、固体状の粗体の濃度が０．０１〜７０質量％となるように水溶性有機溶媒を添加し、混合攪拌することにより両者を接触させ、粗体中の生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を抽出除去する。
【００４７】
水溶液有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、イソブチルアルコール等低級アルコール；エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ジオキサン、ジメチルスルホキシド等が使用できる。これら溶媒の中でもメタノール及び／又はエタノールをしようするのが好ましく、エタノールを使用するのが特に好ましい。なお、水溶性有機溶媒は、無水のものであっても水を含むものであってもよいが、コンドロイチン硫酸を効率的に析出させる点から、混合する水溶性有機溶媒における水溶性有機溶媒の含有量は８０質量％以上、特に９０質量％以上であるのが好ましい。水溶性有機溶媒がエタノールである場合には、溶媒回収効率と精製効率の点から８５〜９９質量％が好ましく、９２〜９７質量％であることが特に好ましい。
【００４８】
接触温度は−２０℃〜１００℃、好ましくは−１０〜９０℃、特に好ましくは０〜７０℃とし、攪拌時間は１分〜１００時間、好ましくは２分〜５０時間、特に好ましくは３分〜２４時間攪拌とすればよい。
【００４９】
このような抽出処理後、不溶成分であるコンドロイチン硫酸は、遠心分離ろ過、過圧ろ過、減圧濾過、デカンテーション、フィルタープレス等の公知の固液分離方法によって、液成分と分離し、単離することが出来る。単離された高純度コンドロイチン硫酸は、方法（１）における場合と同様に必要に応じてエタノール等を用いて洗浄し、乾燥すればよい。
【００５０】
このようにして回収された固体状のコンドロイチン硫酸粗体は、不純物として生体由来の難水溶性又は非水溶性不純物を少なくとも含み、且つ生体由来の不純物の総含有量が０．０１〜３質量％であるとともに、再度水に溶解させても無色透明から淡黄色澄明液となるため局外規品として使用できるばかりでなく、各種経口薬、注射薬などにも使用できる。
【００５１】
なお、粗体準備工程で得られた粗体或いは精製工程後に得られら精製体中に含まれるコンドロイチン硫酸の量及び生体由来の不純物の量は、プロトン核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）、ゲルパーミエイトクロマトグラフィー（ＧＰＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、アミノ酸自動分析ニンヒドリン法（ＡＡＡＡＮ）により測定することができる。また、局外規を満足するか否かは、溶状試験（局外規試験）を行なうことにより確認することができる。該試験では、コンドロイチン硫酸の１質量％水溶液を作製し、紫外吸光スペクトル（ＵＶ）の５００ｎｍにおける吸光度測定及び／又は目視により溶液の清澄度（澄んでいるか濁っているか）を確認する。
【００５２】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
製造例１  コンドロイチン硫酸原料組成物の調製
鮭頭部より鼻軟骨を採取し、粉砕した。次いで固形分に対して、２倍量のイオン交換水を加えｐＨを中性付近に調製し、０．２重量％のタンパク質分解酵素（アルカリ性プロテアーゼ）を加えて、５０℃前後で１〜２時間処理した後、９０℃に加熱し酵素を失活させた。冷却後、遠心分離して、活性炭を０．２重量％添加し、攪拌した。次いでろ過助剤（ケイソウ土、ラヂオライト３００）を入れてろ過した後、ろ液をスプレードライヤを用いて乾燥させ、微黄色粉末を得た。得られたムコ多糖類を含む組成物を分析したところ、コンドロイチン硫酸純度は、約４３％、タンパク質及び／又はその分解物は、ケルダール分析法にて約５５％であることが判った。
【００５４】
実施例１
（１）粗体準備工程
１｛リットル（ｌ）｝四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水４００（ｍｌ）、製造例１で得られたコンドロイチン硫酸原料組成物５０．０ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４３質量％（２１．５ｇ）、タンパク質５５質量％（２７．５ｇ）、食塩２質量％（１．０ｇ）、ＮＭＲ純度４３％）を加え、４０℃で攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら溶解させた。さらに、酢酸ナトリウム３２．８ｇを加え、５０℃で溶解させる（この時点での酢酸ナトリウムの濃度は１１．６重量％）。その後、４重量％水酸化ナトリウム水溶液２２．０ｇ（水酸化ナトリウム０．０８ｇ、イオン交換水２１．９２ｇ）を加え、５０℃で２時間攪拌した。次に、２２℃まで冷却し、酢酸１．３２ｇを加え、さらに酢酸ナトリウム４０．０ｇを加え、２２℃で溶解させた（この時点での酢酸ナトリウムの濃度は２１．０重量％）。溶解後、９５重量％エタノール１０２７ｇ（エタノール９７５．６ｇ、イオン交換水５１．４ｇ）を２時間かけ、３０℃以下で激しく攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら滴下した。滴下後、１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。得られた湿体は９０．３ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体２５．３ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム２１．３ｇ、生体由来不純物０．４ｇであった。ＮＭＲによる純度、局外規試験の結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2005350564.tif 000002
【００５６】
（２）精製工程
粗体準備工程で得られた、コンドロイチン硫酸の乾燥体２５．３ｇに１００％エタノール１００ｇを加え、２５℃で２時間攪拌後、固液分離、棚段式減圧乾燥を行なった。得られた乾燥体は１８．９ｇであった。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム１８．９ｇ、生体由来不純物０．０ｇであった。ＮＭＲによる純度、局外規試験の結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
2005350564.tif 000003
【００５８】
実施例２
実施例１の粗体準備工程で得られた、コンドロイチン硫酸の乾燥体２５．３ｇをイオン交換水２００ｇに溶解させた。このとき、溶液は白濁していた。さらに酢酸０．５ｇでｐＨ＝５．５に調整後、９５％エタノール５１３．５ｇ（水２５．７ｇ含有）を１０℃以下で１００分かけて滴下した。滴下後１時間攪拌した後、固液分離後、得られた沈殿を９５％エタノール３０ｇで２回洗浄し、エバポレータ−で回転させながら減圧乾燥させた。得られた乾燥体は１８．９ｇであった。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム１８．９ｇ、生体由来不純物０．０ｇであった。ＮＭＲによる純度、局外規試験の結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
2005350564.tif 000004
【００６０】
実施例３
（１）粗体準備工程
１（ｌ）四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水４００ｍｌ、製造例１で得られたコンドロイチン硫酸原料組成物５０．０ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４３重量％（２１．５ｇ）、タンパク質５５重量％（２７．５ｇ）、食塩２重量％（１．０ｇ）、ＮＭＲ純度４３％）を加え、４０℃で攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら溶解させた。次に、２２℃まで冷却し、９５重量％エタノール１０２７ｇ（エタノール９７５．６ｇ、イオン交換水５１．４ｇ）を２時間かけ、３０℃以下で激しく攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら滴下した。滴下後、１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。得られた湿体は９０．３ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体２５．６ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム２１．６ｇ、生体由来不純物０．７ｇであった。この乾燥体２５．６ｇを４００ｍｌのイオン交換水に溶解させたところ白濁していた。
【００６１】
次に、三菱化学社製カチオン交換樹脂ＰＫ２１６を１．５ｃｍＸ２０ｃｍのカラムに１００ｍｌ添加し１時間かけて前述の白濁液をカラム処理した。さらに、２０ｍｌで樹脂を洗浄した。得られた水溶液は洗浄液とあわせて４５０ｇであり、これを４つ口５０００ｍｌフラスコに移液した。このフラスコにスリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、１Ｎ−水酸化ナトリウム０．３８ｇを加えてｐＨ＝５．０とした。さらに酢酸ナトリウム２ｇを添加し溶解させたところ、ｐＨが７．５となったが、水溶液はわずかに白濁していた。
【００６２】
（２）精製工程
上記水溶液に酢酸０．４ｇを加え再度ｐＨ＝５．０に調整したところ無色透明になった。その後、温度を５℃に冷却し、せん断速度を０．７ｍ／秒とした後、９５重量％エタノール１０００ｇ（エタノール９５０ｇ、イオン交換水５０ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間熟成後、減圧濾過により沈殿を分離した。さらに、９５重量％エタノール５０ｇ（エタノール４７．５ｇ、イオン交換水２．５ｇ）で２回洗浄した。得られた乾燥体は１８．９ｇであった。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム１８．９ｇ、生体由来不純物０．０ｇであった。ＮＭＲによる純度、局外規試験の結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
2005350564.tif 000005
【００６４】
比較例１
１（ｌ）四つ口フラスコに、スリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着した。これに、イオン交換水４００ｍｌ、製造例１で得られたコンドロイチン硫酸原料組成物５０．０ｇ（コンドロイチン硫酸ナトリウム４３重量％（２１．５ｇ）、タンパク質５５重量％（２７．５ｇ）、食塩２重量％（１．０ｇ）、ＮＭＲ純度４３％）を加え、４０℃で攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら溶解させた。次に、２２℃まで冷却し、９５重量％エタノール１０２７ｇ（エタノール９７５．６ｇ、イオン交換水５１．４ｇ）を２時間かけ、３０℃以下で激しく攪拌（せん断速度２ｍ／秒）しながら滴下した。滴下後、１時間さらに攪拌して、減圧ろ過により、沈殿を分離した。得られた湿体は９０．３ｇであり、５０℃で棚段式減圧乾燥を行ったところ、乾燥体２５．６ｇを得た。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム２１．６ｇ、生体由来不純物０．７ｇであった。この乾燥体２５．６ｇを４００ｍｌのイオン交換水に溶解させようとしたが、白濁していた。
【００６５】
次に、三菱化学社製カチオン交換樹脂ＰＫ２１６を１．５ｃｍＸ２０ｃｍのカラムに１００ｍｌ添加し１時間かけて前述の白濁液をカラム処理した。さらに、２０ｍｌで樹脂を洗浄した。得られた水溶液は洗浄液とあわせて４５０ｇであり、これを４つ口５０００ｍｌフラスコに移液した。このフラスコにスリーワンモーター（３５ｗ）を連結した半月板攪拌翼（半径５ｃｍ）、温度計、コンデンサーを装着し、１Ｎ−水酸化ナトリウム０．３８ｇを加えてｐＨ＝５．０とした。さらに酢酸ナトリウム２ｇを添加し溶解させたところ、ｐＨが７．５となり、水溶液はわずかに白濁していたがこのまま次処理へ移行した。その後、温度を５℃に冷却し、せん断速度を０．７ｍ／秒とした後、９５重量％エタノール１０００ｇ（エタノール９５０ｇ、イオン交換水５０ｇ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間熟成後、減圧濾過により沈殿を分離した。さらに、９５重量％エタノール５０ｇ（エタノール４７．５ｇ、イオン交換水２．５ｇ）で２回洗浄した。得られた乾燥体は１８．９ｇであった。ＧＰＣ、ＩＥＣ、ＡＡＡＡＮの結果、コンドロイチン硫酸ナトリウム１８．９ｇ、生体由来不純物０．０ｇであった。ＮＭＲによる純度、局外規試験の結果を表５に示す。イオン交換樹脂処理により高純度のものが単離できたが、濁り成分は除去できなかった。
【００６６】
【表５】
2005350564.tif 000006