(57)【要約】【課題】複数の変性タンパク質をそのサイズによって選別し、選択的に再折りたたみすることができる変性タンパク質活性化構造体を提供する。【解決手段】  複数のメソ細孔を有する多孔質高分子膜を用いて変性タンパク質の再折りたたみを行うことにより、前記変性タンパク質を活性化させる構造体であって、前記多孔質高分子膜が第１の成分と前記第１の成分に共有結合によって結合した第２の成分とから構成され、前記第１の成分は前記多孔質高分子膜を構成する部材であり、前記第２の成分は前記メソ細孔の壁面層を構成し、さらに前記壁面層上に前記変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物が保持されている。【選択図】図１
2005350383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のメソ細孔を有する多孔質高分子膜を用いて変性タンパク質の再折りたたみを行うことにより、前記変性タンパク質を活性化させる構造体であって、前記多孔質高分子膜が第１の成分と前記第１の成分に共有結合によって結合した第２の成分とから構成され、前記第１の成分は前記多孔質高分子膜を構成する部材であり、前記第２の成分は前記メソ細孔の壁面層を構成し、さらに前記壁面層上に前記変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物が保持されていることを特徴とする変性タンパク質活性化構造体。
【請求項２】
前記第２の成分が−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、および−ＣＨＯからなる群より選ばれた極性官能基を有し、前記極性官能基を介して、前記第２の成分と前記化合物とが結合することを特徴とする請求項１に記載の変性タンパク質活性化構造体。
【請求項３】
前記第２の成分と前記化合物とが共有結合により結合していることを特徴とする請求項２に記載の変性タンパク質活性化構造体。
【請求項４】
前記化合物が、少なくとも１つの硫黄原子を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の変性タンパク質活性化構造体。
【請求項５】
前記化合物が、Ｓ−Ｓ結合を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の変性タンパク質活性化構造体。
【請求項６】
複数のメソ細孔を有する多孔質高分子膜を用いて変性タンパク質を活性化させる構造体を製造する方法において、
ブロックポリマーを合成する工程と、      
前記ブロックポリマーの溶液を基板上に塗布し、乾燥、アニーリングを経て、第１の成分と第２の成分とから構成されるミクロ相分離構造体を形成する工程と、
該ミクロ相分離構造体から前記第２の成分をドライエッチング法により選択的に除去してメソ細孔を形成し、前記第２の成分は前記メソ細孔の壁面層となり、前記第１の成分が多孔質高分子膜の部材となる構成を有する多孔体を形成する工程と、
前記メソ細孔の壁面層に前記変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物をカップリングにより固定化する工程と
からなることを特徴とする変性タンパク質活性化構造体の製造方法。
【請求項７】
第１の成分と第２の成分とから構成され、前記第１の成分が多孔質高分子膜の部材となり、前記第２の成分がメソ細孔の壁面層となり、前記壁面層上に変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物を保持してなる多孔質高分子膜を、前記変性タンパク質の溶液に接触させる工程と、
前記多孔質高分子膜のメソ細孔内またはメソ細孔入り口、あるいはその両方において、前記メソ細孔の細孔径に適合した大きさの前記変性タンパク質を選択的に拘束する工程とおよび、
前記拘束した変性タンパク質を再折りたたみさせて、前記変性タンパク質を活性化する工程と
を包含することを特徴とする変性タンパク質の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な構造を有する多孔質高分子構造体及びその製造方法に関し、詳しくは変性したタンパク質を天然の状態に再折りたたみさせうる機能を有する活性化構造体（多孔質高分子構造体）、及びその製造方法、さらに変性タンパク質の活性化方法に関し、より詳しくは複数の変性したタンパク質から特定のタンパク質を選択的に天然の状態に再折りたたみさせうる機能を有する活性化構造体（多孔質高分子構造体）、及びその製造方法、さらに変性タンパク質の活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変性状態にあるタンパク質を、正しい高次構造を有した状態に再度折りたたむ「再折りたたみ」は、タンパク質を産業上利用しようとする上で、非常に重要な技術である。例えば、物質生産のための反応に利用した酵素をいったん加熱または変性剤の添加により変性させて酵素活性を失活させることによりその反応を停止させ、得られた生産物を回収した後、変性した酵素を再び正しい高次構造を有した状態に再折りたたみし、再利用することも可能になる。
【０００３】
ドーハティ（Daugherty）らは、人工シャペロンを用いて変性タンパク質の再折りたたみを行う方法を報告している（非特許文献１）。この方法では、タンパク質の凝集を防ぐ役割をする人口シャペロンとして非イオン界面活性剤であるトリトン（Triton）  Ｘ  １００およびアルキル基の鎖長の短いポリオキシエチレン系の界面活性剤を使用して、タンパク質、界面活性剤複合体を形成させた後に、界面活性剤を除去するための物質として低分子環状α−１，４−グルカンであるβシクロデキストリンを添加し、このタンパク質、界面活性剤複合体から徐々に界面活性剤を除去することによって、変性タンパク質を天然の高次構造へと変化させることができる。
【０００４】
Daughertyらの研究により、人工シャペロンの技術は変性タンパク質の活性化方法として非常に有効であることが明白となった。この方法において、変性タンパク質の活性回復の程度は、選択する界面活性剤および界面活性剤を除去するための物質によって大きく影響を受けることがわかっている。しかし、界面活性剤を除去するための物質については、どのような物質に効果が期待できるかについての理解は不十分であり、使用できるタンパク質の種類が少なかった。さらに変性タンパク質を活性化した後、界面活性剤を除去する物質と再折りたたみされたタンパク質を分離する操作が必要であるため工程が複雑である。よって界面活性剤を使用しない、変性タンパク質の活性化方法が求められていた。
【０００５】
近年、藤本らは、サブミクロンサイズの粒子状高分子の表面を利用することによって、界面活性剤を使用することなく、変性タンパク質を効率的に再折りたたみさせる画期的な手法を提案した（非特許文献２）。彼らは、粒子状高分子をさまざまに設計することで、変性タンパク質の活性回復への影響を詳細に調べ、以下のような結論を得ている。
（１）  Ｓ−Ｓ結合を有する粒子状高分子微粒子は、変性タンパク質を選択的に吸着し、その表面で優先的にタンパク質の再折りたたみが進行する。
（２）  サイズの小さい粒子状高分子を使用して比表面積を増大させることによって、大量の変性タンパク質を粒子状高分子表面に固定化することが可能となる。これにより、変性タンパク質同士の凝集を抑制し、再折りたたみの効率化が達成される。
【０００６】
つまり、変性タンパク質と作用する官能基を有する粒子状高分子を使用することによって、変性タンパク質同士の凝集を抑制することが可能になり、その結果、変性タンパク質の再折りたたみを効率化させることが可能となった。
【非特許文献１】J.  Biol．  Chem.，  ２７３，  ３９６１−３３９７１（１９９８）
【非特許文献２】Biotechnology  Prog.，  １６，  ２４８−２５３（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、［背景技術］に記載した変性タンパク質の再折りたたみを制御する技術群では、反応が平坦な表面で起こるため、複数の変性タンパク質の混合溶液から一つのタンパク質のみを選択的に活性化することは不可能であるという問題があった。複数の変性タンパク質の混合溶液から必要な変性タンパク質のみを選択的に活性化することが可能となれば、産業上有益な技術となる。
【０００８】
このような状況のもと、変性タンパク質を再折りたたみさせる高い効果を有し、かつタンパク質選択性を有する変性タンパク質の活性化構造体が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭利研究を重ねた結果、変性タンパク質を効率良く再折りたたみさせるための新しい構造体の形態を見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、複数のメソ細孔を有する多孔質高分子膜を用いて変性タンパク質の再折りたたみを行うことにより、前記変性タンパク質を活性化させる構造体であって、前記多孔質高分子膜が第１の成分と前記第１の成分に共有結合によって結合した第２の成分とから構成され、前記第１の成分は前記多孔質高分子膜を構成する部材であり、前記第２の成分は前記メソ細孔の壁面層を構成し、さらに前記壁面層上に前記変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物が保持されていることを特徴とする。
【００１１】
好ましい態様は以下のとおりである。
【００１２】
さらに、前記第２の成分が−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、および−ＣＨＯからなる群より選ばれた極性官能基を有し、前記極性官能基を介して、前記第２の成分と前記化合物とが結合する。
【００１３】
さらに、前記第２の成分と前記化合物とが共有結合により結合している。
【００１４】
さらに、前記化合物が、少なくとも１つの硫黄原子を含有する。
【００１５】
さらに前記化合物が、Ｓ−Ｓ結合を含有する。
【００１６】
また、本発明は、複数のメソ細孔を有する多孔質高分子膜を用いて変性タンパク質を活性化させる構造体を製造する方法において、
ブロックポリマーを合成する工程と、
前記ブロックポリマーの溶液を基板上に塗布し、乾燥、アニーリングを経て、第１の成分と第２の成分とから構成されるミクロ相分離構造体を形成する工程と、
該ミクロ相分離構造体から前記第２の成分をドライエッチング法により選択的に除去してメソ細孔を形成し、前記第２の成分は前記メソ細孔の壁面層となり、前記第１の成分が多孔質高分子膜の部材となる構成を有する多孔体を形成する工程と、
前記メソ細孔の壁面層に前記変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物をカップリングにより固定化する工程と
からなることを特徴とする。
【００１７】
さらにまた、本発明は、第１の成分と第２の成分とから構成され、前記第１の成分が多孔質高分子膜の部材となり、前記第２の成分がメソ細孔の壁面層となり、前記壁面層上に変性タンパク質の再折りたたみに関与する化合物を保持してなる多孔質高分子膜を、前記変性タンパク質の溶液に接触させる工程と、
前記多孔質高分子膜のメソ細孔内またはメソ細孔入り口、あるいはその両方において、前記メソ細孔の細孔径に適合した大きさの前記変性タンパク質を選択的に拘束する工程とおよび、
前記拘束した変性タンパク質を再折りたたみさせて、前記変性タンパク質を活性化する工程と
を包含することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、複数のメソ細孔内にタンパク質の再折りたたみに関与する化合物が固定化された多孔質高分子膜を提供することができる。さらに、前記多孔質高分子膜と変性タンパク質溶液を接触させることによって、変性タンパク質をそのサイズによって選択し、必要なタンパク質のみを選択的に活性化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る変性タンパク質活性化構造体およびその製造方法、変性タンパク質の活性方法の実施形態を、添付図面を参照して詳細に説明する。
【００２０】
（変性タンパク質活性化構造体の構成）
図１は、本実施形態のタンパク質活性化構造体の一例を示す略式図である。この例は、複数のメソ細孔１２を有する多孔質高分子膜の細孔内に、タンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物１５を固定化した構造体を示している。図において１３が多孔質高分子膜を構成する部材であり、１４は部材１３に共有結合によって結合しているメソ細孔壁面層である。壁面層１４表面には、タンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物１５が固定化されている。
【００２１】
本発明において、メソ細孔とは、ＩＵＰＡＣの分類に基づくもので、細孔径が２ｎｍから５０ｎｍのものをいう。
【００２２】
本発明において、基本的に後述するタンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物としてタンパク質認識部位を有する化合物であればどのようなものでも使用できる。具体的には分子内に、チオール基、Ｓ−Ｓ結合、アミン、カルボキシル基、水酸基、アミド、フェノール基、イミダゾール環、インドール環、フェニル基、アルキル基、分岐アルキル基のいずれかを含む化合物などが挙げられる。この中でも、本発明者らの研究によると特に分子内に少なくとも１つの硫黄原子を含む化合物が後述するタンパク質の再折りたたみに有効であることが示されている。中でも分子内にＳ−Ｓ結合を有する化合物は変性タンパク質を再折りたたみさせる効果が大きい。これは、多くのタンパク質においてその高次構造を安定化させる因子としてＳ−Ｓ結合が関与しているからであると、本発明者らは考察している。ただし、本発明に関わる化合物は、同様の効果が期待できる範囲においてこれらに限定されるわけではない。
【００２３】
また、化合物１５と壁面層１４の結合様式は、化合物１５が壁面層１４に安定に固定化されるものならどのようなものでもよく、例示すると、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水性結合などが挙げられる。中でも結合強度の観点から共有結合が好ましいが、本発明はこれに限定される訳ではない。
【００２４】
この多孔子質高分子膜の部材１３は、どのようなポリマーから構成されてもよい。ただし、タンパク質の非特異吸着が生じるポリマーを使用する場合には、プラズマ処理をはじめとした種々の公知手法によって表面改質を行う場合もある。
【００２５】
（変性タンパク質活性化構造体の製造方法）
以下、本実施形態にかかる多孔質高分子膜の製造方法について詳細に説明する。
【００２６】
図２は、上記多孔質高分子膜の製造方法の一実施形態を示す工程である。図２に示す製造方法は、下記の（ａ）から（ｃ）の工程を有する。
【００２７】
（ａ）  複数の成分から構成される多孔質高分子膜前駆体中にミクロ相分離構造を形成させる工程
図２において、Ｃセグメント領域２３から構成される部材中に遷移領域であるＢセグメント領域２２を介して、Ａセグメント領域２１から構成される柱状構造が分散している構造体を例として示す。本発明に係る複数のメソ細孔を有する多孔質高分子膜前駆体の構造は、ブロックポリマーから構成されるミクロ相分離構造体であればどのような構造のものでも適応できる。例示すると、図２に示した柱状構造体の他、球状構造、ラメラ状構造、三次元共連続構造などが適応可能である。また、遷移領域であるＢセグメント領域２２はあってもなくても良い。
【００２８】
本発明で意図するブロックポリマーについて説明する。ブロックポリマーとは、複数のセグメントがブロックとして結合した直鎖ポリマーをいう。ブロックポリマーの代表例は、繰り返し単位Ａを有するＡセグメントと繰り返し単位Ｂを有するＢセグメントとが末端同士で結合した、−（ＡＡ・・ＡＡ）−（ＢＢ・・ＢＢ）−という構造を持つＡ−Ｂ型ジブロックポリマーである。本発明にはジブロックポリマーの他、３成分より構成されるトリブロックポリマー及びそれ以上のブロックから形成されるブロックポリマーでも、目的の構造が得られる範囲において良好に使用可能である。また、ブロックポリマーを構成する各セグメントの結合部位は、図３（ａ）のようにある点において組成が明確に変化している必要はなく、図３（ｂ）のような例えば−（ＡＢ・・ＡＢ）−や−（ＡＡ・・ＢＡ）−のようなランダムな繰り返し単位を有する遷移領域３３を含有しても良い。この遷移領域３３は図２中のＢセグメント領域２２に対応する。
【００２９】
ブロックポリマーを構成するセグメントとして少なくとも一つのセグメントは、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＨＯなどの極性官能基を有することが好ましい。これは、ブロックポリマー合成後に、後述するタンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物を結合させるためである。
【００３０】
ブロックポリマーは種々の重合法で合成できる。最も一般的に用いられる方法はリビング重合法である。リビング重合法として、リビングアニオン重合やリビングカチオン重合、リビングラジカル重合などを用いることができる。これらの重合法を利用することによって、分子量やセグメント長の比を精密に制御することができ、分子量分布の狭いブロックポリマーを合成することができる。ここで、ブロックポリマーの分子量はミクロ相分離構造体のサイズに、セグメント長の比はミクロ相分離構造の形態に、分子量分布はミクロ相分離構造の規則性に大きく影響する。しかし、本発明に用いるブロックポリマーの製法は、上記重合法に限定される訳ではなく、テレケリックポリマーなどのマクロマー同士の反応や、リアクティブプロセッシング法によりｉｎ  ｓｉｔｕでブロックポリマーを合成する方法等も、良好な相分離構造が形成できる範囲において適用することが可能である。
【００３１】
本発明に用いるミクロ相分離構造体（図２（ａ））はさまざまな方法により作製できる。例えば、上記ブロックポリマーを適当な溶媒に溶解し、この溶液を基板上に塗布し乾燥して膜を形成する。この膜を適切な温度（通常はポリマーのガラス転移温度以上の温度が望ましい）でアニールすることによって、良好なミクロ相分離構造体を形成することができる。また、ブロックポリマーを溶融状態にし、ガラス転移温度以上、相転移温度以下の温度でアニールしてミクロ相分離させた後、室温でミクロ相分離構造を固定してもよい。ブロックポリマー溶液をゆっくりとキャスト(cast)することでミクロ相分離構造体とすることもできる。
【００３２】
この時、分子量の異なるブロックポリマーを使用することによって、ミクロ相分離構造体の相サイズを１ｎｍから１００ｎｍの範囲で制御することができる。
【００３３】
（ｂ）  該ミクロ相分離構造体から、Ａセグメント領域２１を除去する工程
ミクロ相分離構造体から１つのセグメント領域を選択的に除去するには、複数のセグメント領域の間での、ドライエッチング速度の差、エネルギー線に対する分解性の差、熱分解性の差、または酸やアルカリ、あるいはその混合物に対する分解性の差を利用することが可能である。例えば、ドライエッチングを用いた方法が幅広い組成の構造体に対して有効に用いられる。特性が未知の化合物においてもセグメントを構成する化合物の組成から容易にエッチング耐性が予測できるという点で簡便である。
【００３４】
（ｃ）  該除去工程により得られる高分子多孔体のメソ細孔１２に、タンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物１５を導入し、壁面層１４に結合させる工程
化合物１５を壁面層１４に固定化する手法として、一般的な有機化学反応を利用することができる。ただし、壁面層表面の極性官能基の種類によって反応工程を使い分ける必要がある。例として、分子内Ｓ−Ｓ結合を有するシスタミンと、化合物１’の反応について説明する。シスタミンはアミノ基を分子末端に有していることから、化合物１’のカルボキシル基と公知の手法によって容易にカップリングする。例えば、水溶性カルボジイミドの一つであるＷＳＣの存在下におけるこれら２つの化合物のカップリング反応は、極めて温和な条件で進行する。したがって、例えばシスタミンを表面に壁面層表面に固定化したい場合はカルボキシル基を極性官能基に選択すれば良い。
【００３５】
【化１】
2005350383.tif 000003
【００３６】
【化２】
2005350383.tif 000004
【００３７】
【化３】
2005350383.tif 000005
（変性タンパク質の活性化）
図４は、本実施形態におけるタンパク質活性化方法のメカニズムの一例を示す模式図である。この例では、分子量の小さい変性タンパク質４１と分子量の大きい変性タンパク質４２をメソ細孔１２のサイズによって選別し、メソ細孔１２を有する多孔質高分子膜のメソ細孔内、メソ細孔入り口あるいはその両方において、メソ細孔１２の大きさに適合した変性タンパク質のみを、メソ細孔内の壁面層１４に固定化されたタンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物１５を介して、選択的に活性化させる方法を示している。
【００３８】
本発明において、「変性タンパク質」とは、タンパク質の一次構造が変化せずに、高次構造のみが破壊されて、活性が失われているかまたは活性が低下したすべてのタンパク質を指し、それらは正しい高次構造と異なる高次構造になっているために活性が失われているかまたは低下している。正しい高次構造と異なる高次構造とは、不規則に凝集した状態や解きほぐされた状態の構造を示しても良い。「解きほぐされた状態」とは、タンパク質が天然の状態で有している水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力、Ｓ−Ｓ結合などの結合が破壊されている状態をいう。
【００３９】
凝集した状態にある変性タンパク質の再折りたたみを行う際には、本発明の構造体と接触させる前に、変性剤（例えばグアニジン塩酸や尿素など）を添加して、解きほぐされた状態にして使用することによって効果が増大する場合もある。
【００４０】
本発明の方法によって活性化される変性タンパク質に制限はないが、その再折りたたみの速度や平衡定数は、再折りたたみに関与しうる化合物の組成と目的のタンパク質の構造で決定され、例えば分子内にＳ−Ｓ結合を含む化合物を用いた場合には、天然の状態で分子内Ｓ−Ｓ結合によって安定化されているタンパク質に対して特に効果が大きいことが本発明者らの研究によって明らかになっている。
【００４１】
本明細書において、「変性タンパク質の活性化」とは、変性タンパク質の活性が回復することをいう。例えば、変性タンパク質が変性していない天然の状態で本来有していた少なくとも１つの生理的活性（例えば、酵素活性）を１００％として、変性により活性が低下した場合、変性タンパク質に何らかの操作を加えることによって活性が向上するようにすることをいう。
【００４２】
このような天然の状態、変性状態および活性化状態は、周知の各種の活性化測定方法により活性を測定することによって容易に判断することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（１）  タンパク質活性化構造体の作製
（ブロックポリマーの合成）
ブロックポリマーをリビングカチオン重合により合成した。三方活栓を取り付けたガラス容器内を窒素置換した後、窒素ガス雰囲気下２５０℃で加熱し吸着水を除去した。系を室温に戻した後、化合物１［化１］と酢酸エチル、１−イソブトキシエチルアセテート、およびトルエンを加え、系内温度が０℃に達したところでエチルアルミニウムセスキノクロライドを加えて重合を開始し、ブロックポリマーの第１セグメントを合成した。分子量を時分割に分子ふるいカラムクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いてモニタリングし、第１セグメントの転化率が９５％に到達した時点で、第２セグメントを構成する成分である化合物２［化３］を添加した。重合反応の停止は、系内に０．３質量％のアンモニア／メタノール溶液を加えて行った。反応を終えた混合溶液中にジクロロメタンを加えて希釈し、０．６Ｎの塩酸溶液で３回、次いで蒸留水で３回洗浄し、エバポレーターで濃縮・乾固したものを真空乾燥させて目的物であるブロックポリマーを得た。
【００４５】
さらに、合成したブロックポリマーをアルカリまたは酸触媒存在下で加水分解し、図３（ｂ）に示したような第１セグメントと第２セグメントの結合部位にＡＢ遷移領域３３を有するブロックポリマーを合成した。本実施例では、第１セグメントは化合物１’［化２］のみから構成され、第２セグメントは化合物２［化３］のみから構成される。ＡＢ遷移領域３３は化合物１’［化２］と化合物２［化３］がランダムに繰り返された構造を有する。
【００４６】
本実施例では、仕込みモノマー量を変化させることによって２種類のブロックポリマー（１）とブロックポリマー（２）を合成した。ブロックポリマー（１）の数平均分子量Ｍｎは８９６００ｇ／ｍｏｌであり、分子量分布は１．１２であった。ブロックポリマー（１）を構成する各セグメント領域の分子量は、化合物１’［化２］から構成されるセグメントが２２４００ｇ／ｍｏｌ、化合物２から構成されるセグメントが６７２００ｇ／ｍｏｌであった。ブロックポリマー（２）の数平均分子量Ｍｎは２８５００ｇ／ｍｏｌであり、分子量分布は１．０９であった。ブロックポリマー（２）を構成する各セグメント領域の分子量は、化合物１’［化２］から構成されるセグメントが７２００ｇ／ｍｏｌ、化合物２から構成されるセグメントが２１３００ｇ／ｍｏｌであった。
【００４７】
（多孔質高分子膜の作製）
合成したブロックポリマーをクロロホルムに２質量％となるように溶解し、この溶液をろ過した後、ＳｉＯ基板上に２５００ｒｐｍでスピンコートした。基板を減圧乾燥して溶媒を気化させた。その後、基板を真空オーブンに入れ、５０℃で４８時間アニールを行った。アニールによって膜が平坦化されてスピンコート後の履歴を消し去ることができ、ブロックポリマーの相分離が進行してミクロ相分離構造体が形成した。
【００４８】
これらの試料に対して、ＣＦ４、０．０１ｔｏｒｒ、進行波１５０Ｗ、反射波３０Ｗの条件でドライエッチングを行った。ポリマー相のドライエッチング速度は、モノマー単位のＮ／（Ｎｃ−Ｎｏ）の値（ここでＮはモノマー単位の総原子数、Ｎｃはモノマー単位の炭素原子数、Ｎｏはモノマー単位の酸素原子数）により決定される（特開２００１−１５１８３４）。本実施例のエッチング条件では、化合物１’［化２］から構成されるセグメント領域が選択的にエッチングされて多孔質構造体が形成される。この時、エッチング時間を最適に制御することによって各セグメントの結合部位に存在する遷移領域の残存割合が変化する。本実施例では、ブロックポリマー（１）とブロックポリマー（２）から、それぞれ細孔径が２０ｎｍと７ｎｍの高分子多孔体を作製した。
【００４９】
高分子多孔体の細孔壁には、遷移領域を構成する化合物１’［化２］由来のカルボキシル基が存在する。そこで、このカルボキシル基と分子内Ｓ−Ｓ結合を有する化合物であるシスタミンをＷＳＣ存在下でカップリングさせることによって細孔壁にＳ−Ｓ結合を固定化した。細孔壁へのシスタミンの固定化は、ＸＰＳによる表面元素分析によって確認した。以下、本実施例では、細孔径２０ｎｍの多孔質高分子膜を活性化構造体Ｄ２０、細孔径７ｎｍの多孔質高分子膜を活性化構造体Ｄ０７と記載する。
【００５０】
（２）タンパク質活性化構造体を用いた変性タンパク質の活性化
以下に示す実施例においては、モデルタンパク質としてリボヌクレアーゼＡ（以下、ＲＮａｓｅ  Ａという）とトリプシンインヒビターを使用した。これらのタンパク質は、その高次構造が分子内Ｓ−Ｓ結合によって安定化されており、それぞれ約１４０００  Ｄａと６０００  Ｄａの分子量を有している。
【００５１】
（変性ＲＮａｓｅ  Ａの活性化）
以下では、変性ＲＮａｓｅ  Ａ溶液の調整方法について説明する。０．１４Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）と６Ｍ  塩酸グアニジン（以下、ＧｄｎＨＣｌという。）を含む０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）にウシ脾臓ＲＮａｓｅ  Ａを溶解させ、室温で一晩放置することによってＲＮａｓｅ  Ａを還元・変性させた。その後、変性ＲＮａｓｅ  Ａ溶液からＤＴＴを除去し、さらにＧｄｎＨＣｌ濃度を６Ｍから１Ｍに下げるために、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と１Ｍ  ＧｄｎＨＣｌを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．７）で平衡化させたセファデックス（Sephadex）  Ｇ−２５充填カラムを用いてゲルろ過を行った。
【００５２】
以下では、変性ＲＮａｓｅ  Ａの活性化方法について説明する。（１）で作製したタンパク質活性化構造体を再生緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１  Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０））に浸漬させた。この溶液にゲルろ過後の変性ＲＮａｓｅ  Ａを添加して、３０℃で所定時間インキュベートした。反応終了後、得られた反応液を前処理として０．２μｍのポアサイズのセルロースアセテートフィルターに通すことによって反応液中の凝集物を除去し、ろ液を得た。
【００５３】
以下では、ＲＮａｓｅ  Ａの活性測定法について説明する。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）にＲＮａｓｅ  Ａの基質であるｃＣＭＰを溶解させて反応液１を調整した。反応液１に上記ろ液を加えて、ＲＮａｓｅ  Ａ活性測定溶液を調整した。この溶液の２５℃における２８７ｎｍの吸光度を分光光度計によって測定し、測定値からＲＮａｓｅ  Ａの活性回復率を算出した。本実施例における活性回復率は、未変性ＲＮａｓｅ  Ａを上記ＲＮａｓｅ  Ａ活性測定溶液と同濃度となるように反応液１で希釈し、この溶液を測定して得られるＲＮａｓｅ  Ａ活性を１００％として算出した。
【００５４】
以下では、再折りたたみ１００時間後における変性ＲＮａｓｅ  Ａ活性化の結果について述べる。変性ＲＮａｓｅ  Ａの活性は、変性ＲＮａｓｅ  Ａ溶液を活性化構造体Ｄ２０と混合することにより９０％以上回復した。この活性回復率は、活性化構造体Ｄ２０を添加しない場合の約４倍の効率であった。一方、活性化構造体Ｄ０７で活性化した場合の活性回復率は３０％程度であった。これらの結果は以下のことを示している。活性化構造体Ｄ２０を用いた場合、変性ＲＮａｓｅ  Ａは、そのメソ細孔内に取り込まれ、細孔壁に固定化されたＳ−Ｓ結合を介して再折りたたみする。これに対して活性化構造体Ｄ０７を用いた場合、細孔径小さいため、ＲＮａｓｅ  Ａはメソ細孔内に取り込まれず、再折りたたみが起こりにくい。
【００５５】
・変性トリプシンインヒビターの活性化
以下では、変性トリプシンインヒビター溶液の調整方法について説明する。０．１４Ｍ  ＤＴＴと６Ｍ  ＧｄｎＨＣｌを含む０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）１ｍＬにウシ脾臓トリプシンインヒビターを溶解させ、室温で一晩放置することによってトリプシンインヒビターを変性させた。その後、変性トリプシンインヒビター溶液からＤＴＴを除去し、さらにＧｄｎＨＣｌ濃度を６Ｍから１Ｍに下げるために、１ｍＭ  ＥＤＴＡと１Ｍ  ＧｄｎＨＣｌを含む０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．７）で平衡化させたセファデックス（Sephadex）  Ｇ−２５充填カラムを用いてゲルろ過を行った。
【００５６】
以下では、変性トリプシンインヒビターの活性化方法について説明する。（１）で作製したタンパク質活性化構造体を再生緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１  Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０））に浸漬させた。この溶液にゲルろ過後の変性トリプシンインヒビターを添加して、３０℃で所定時間インキュベートした。反応終了後、得られた反応液を前処理として０．２μｍのポアサイズのセルロースアセテートフィルターに通すことによって反応液中の凝集物を除去し、ろ液を得た。
【００５７】
以下では、トリプシンインヒビターの活性測定法について説明する。０．０６Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２）にトリプシンを溶解させて反応液２を調整した。反応液２に上記ろ液を加え、さらにこの溶液にトリプシンの合成基質であるα−Ｎ−ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｌｉｄｅ（ＢＡＰＡ）を添加してトリプシンインヒビター活性測定用溶液を調整した。この溶液の２５℃における４１０ｎｍの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、測定値から酵素活性を阻害されたトリプシン量を算出した。ここで算出された値をもとに、酵素活性を阻害されたトリプシン量からトリプシンインヒビターのトリプシン阻害活性を算出した。本実施例における活性回復率は、未変性トリプシンインヒビターを上記トリプシンインヒビター活性測定溶液と同濃度となるように反応液２で希釈し、この溶液を測定して得られるトリプシンインヒビター活性を１００％として算出した。
【００５８】
以下では、再折りたたみ１００時間後における変性トリプシンインヒビター活性化の結果について述べる。変性トリプシンインヒビターの活性は、変性トリプシンインヒビター溶液を活性化構造体Ｄ２０と混合することにより９０％以上回復した。同様に、活性化構造体Ｄ０７を用いることによっても、その活性は９０％以上回復した。この活性回復率は、活性化構造体を添加しない場合の約４倍の効率であった。これらの結果は以下のことを示している。変性トリプシンインヒビターは、活性化構造体Ｄ２０あるいは活性化構造体Ｄ０７の細孔径と比較してサイズが十分小さいため、それらのメソ細孔に取り込まれ、細孔壁に固定化されたＳ−Ｓ結合を介して再折りたたみが進行する。
【００５９】
（３）  ２種類の変性タンパク質を混合した溶液からのタンパク質活性化
以下では、変性タンパク質混合溶液の活性化方法について説明する。（２）で説明した方法により調整した変性ＲＮａｓｅ  Ａ溶液と変性トリプシンインヒビター溶液を１：１で混合して変性タンパク質混合液を調整した。（１）で作製したタンパク質活性化構造体を再生緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１  Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０））に浸漬させた。この溶液に上記タンパク質混合液を添加して、３０℃で所定時間インキュベートした。反応終了後、得られた反応液を前処理として０．２μｍのポアサイズのセルロースアセテートフィルターに通すことにより、反応液中の凝集物を除去し、ろ液を得た。このろ液について、（２）で説明したタンパク質活性測定法により、ＲＮａｓｅ  Ａとトリプシンインヒビターの活性回復率をそれぞれ測定した。
【００６０】
以下では、２種類の変性タンパク質溶液からのタンパク質活性化について結果を述べる。以下に記載する活性回復率は、再折りたたみ１００時間後における値である。変性タンパク質混合液を活性化構造体Ｄ２０と混合することにより、変性ＲＮａｓｅ  Ａと変性トリプシンインヒビターの活性は、ともに９０％以上回復した。一方、変性タンパク質溶液を活性化構造体Ｄ０７と混合した場合、変性ＲＮａｓｅ  Ａの活性は２５％回復した。これに対してトリプシンインヒビターの活性は９０％以上回復した。これらの結果は以下のことを示している。（１）で作製したタンパク質活性化構造体を利用して変性タンパク質の再折りたたみを行う場合、タンパク質の活性回復率にサイズ選択性が現れる。変性タンパク質サイズが細孔径と比較して十分小さい場合には効率的に再折りたたみが進行するのに対し、細孔径が所定タンパク質を取り込むのに十分なサイズを有していない場合、再折りたたみは十分に進行しない。これらの結果から、本発明で提案した多孔質高分子膜が、複数の変性タンパク質が混合された変性タンパク質溶液から、所望の変性タンパク質をそのサイズによって選択し、必要なタンパク質のみを選択的に活性化できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
変性状態にあるタンパク質を、正しい高次構造を有した状態に再度折りたたむ「再折りたたみ」は、タンパク質を産業上利用しようとする上で、非常に重要な技術である。例えば、物質生産のための反応に利用した酵素をいったん加熱または変性剤の添加により変性させて酵素活性を失活させることによりその反応を停止させ、得られた生産物を回収した後、変性した酵素を再び正しい高次構造を有した状態に再折りたたみし、再利用することも可能になる。
【００６２】
また、異種タンパク質を大腸菌宿主内で生産した場合、多くのタンパク質は、しばしば、インクルージョンボディと呼ばれる、不活性な状態となることがある。しかし、再折りたたみが可能であれば、このような不活性タンパク質を尿素、グアニジン塩基などの変性剤で可溶化した後、正しい高次構造を有した状態に再折りたたみして活性化することも可能となる。
【００６３】
さらに、複数の変性タンパク質が混合した溶液から、所定のタンパク質のみを選択的に再折りたたみさせることができれば、タンパク質を産業上利用しようとする上で、非常に有用な技術となる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】多孔質高分子膜の模式図
【図２】多孔質高分子膜の作製工程
【図３】ブロックポリマーの概略図
【図４】変性タンパク質の再折りたたみ工程概略
【符号の説明】
【００６５】
１１    基板
１２    メソ細孔
１３    多孔質高分子膜を構成する部材
１４    壁面層
１５    タンパク質の再折りたたみに関与しうる化合物
２１    Ａセグメント領域
２２    Ｂセグメント領域
２３    Ｃセグメント領域
３１    Ａセグメント
３２    Ｂセグメント
３３    ＡＢ遷移領域
４１    分子量の小さい変性タンパク質
４２    分子量の大きい変性タンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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