(57)【要約】【課題】  本発明は、自然免疫系に有効な化合物が作用する標的分子を同定するためのスクリーニング系を提供し、当該化合物を医薬品のリード化合物として効率的に使用するための手法を提供するものである。【解決手段】  本発明は、被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質、及び（３）転写因子又はその制御因子のいずれを標的分子としているかをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物のそれぞれのモデル生物に被検物質を添加して、それぞれの活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法、そのためのモデル生物、及びそのためのキットに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質、及び（３）転写因子又はその制御因子のいずれを標的分子としているかをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物のそれぞれのモデル生物に被検物質を添加して、それぞれの活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法。
【請求項２】
遺伝子を過剰発現のための方法が、プロモーターによるものであり、当該プロモーターが熱刺激蛋白質のプロモーターである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性の変化の測定が、レポーター遺伝子によるものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
モデル生物が、遺伝子組換えショウジョウバエである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
自然免疫における（１）細胞膜受容体がＰＧＲＰ−ＬＣであり、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質がＩｍｄであり、（３）転写因子又はその制御因子がＲｅｌｉｓｈである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法。
【請求項７】
遺伝子を過剰発現のための方法が、プロモーターによるものであり、当該プロモーターが熱刺激蛋白質のプロモーターである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
活性の変化の測定が、レポーター遺伝子によるものである請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
モデル生物が、遺伝子組換えショウジョウバエである請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞膜受容体がＰＧＲＰ−ＬＣである請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
被検物質が自然免疫における（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
遺伝子を過剰発現のための方法が、プロモーターによるものであり、当該プロモーターが熱刺激蛋白質のプロモーターである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
活性の変化の測定が、レポーター遺伝子によるものである請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
モデル生物が、遺伝子組換えショウジョウバエである請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞内シグナル伝達系に関与する物質がＩｍｄである請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
被検物質が自然免疫における（３）転写因子又はその制御因子を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
遺伝子を過剰発現のための方法が、プロモーターによるものであり、当該プロモーターが熱刺激蛋白質のプロモーターである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
活性の変化の測定が、レポーター遺伝子によるものである請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
モデル生物が、遺伝子組換えショウジョウバエである請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
転写因子又はその制御因子がＲｅｌｉｓｈである請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
自然免疫系におけるＰＧＲＰ−ＬＣを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２２】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＰＧＲＰ−ＬＣが発現する遺伝子が組み込まれたものである請求項２１に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２３】
自然免疫系におけるＩｍｄを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２４】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＩｍｄが発現する遺伝子が組み込まれたものである請求項２３に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２５】
自然免疫系におけるＲｅｌｉｓｈを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２６】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＲｅｌｉｓｈが発現する遺伝子が組み込まれたものである請求項２５に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２７】
自然免疫における（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物のそれぞれのモデル生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上のモデル生物を含有してなる、被検物質の自然免疫系における標的分子をスクリーニングするためのキット。
【請求項２８】
遺伝子を過剰発現のための方法が、プロモーターによるものであり、当該プロモーターが熱刺激蛋白質のプロモーターである請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
活性の変化の測定が、レポーター遺伝子によるものである請求項２７又は２８に記載のキット。
【請求項３０】
モデル生物が、遺伝子組換えショウジョウバエである請求項２７〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
自然免疫における（１）細胞膜受容体がＰＧＲＰ−ＬＣであり、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質がＩｍｄであり、（３）転写因子又はその制御因子がＲｅｌｉｓｈである請求項２７〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
自然免疫系における（１）ＰＧＲＰ−ＬＣを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、（２）Ｉｍｄを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、及び（３）Ｒｅｌｉｓｈを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエからなる群から選ばれた１種又は２種以上の遺伝子組換えショウジョウバエを含有してなる、被検物質の自然免疫系における標的分子をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然免疫における標的分子を決定するためのスクリーニング方法、そのためのモデル生物に関する。より詳細には、本発明は、被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質、及び（３）転写因子又はその制御因子のいずれを標的分子としているかをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物のそれぞれのモデル生物に被検物質を添加して、それぞれの活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法、そのためのモデル生物、及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトなどの高等脊椎動物が有する免疫機構は、自然免疫（innate immunity）と獲得免疫（acquired immunity）に大別できる。自然免疫は、個体に遺伝的に備えられている免疫系であり、昆虫類はこの自然免疫系のみで身を守っている。地球上に生息している約１２０万種の動物のうち約８０％が昆虫であることを考えると、自然免疫系がいかに効率よく機能するものであるかということを理解することができる。一方、獲得免疫系は異物の侵入によってはじめて獲得される免疫であり、高等脊椎動物のみが有している。この獲得免疫を有する動物は地球上に生息する動物の僅か約４％に過ぎない。
【０００３】
自然免疫は生物が共通に有する感染防御機構であり、反応が素早いことが特徴である。このような素早い反応を可能にしているのが、自然免疫系を制御しているシグナル伝達カスケードである。このカスケードにはＴｏｌｌを中心にしたカスケードと、オーファンレセプターのリガンドになり得る脂質メディエーターによるカスケードがある。これらの二つのシグナル伝達カスケードは、いずれも昆虫、哺乳類などの動物のみならず植物においても普遍的に存在するものであり、自然免疫系は進化の過程においてきわめてよく保存されており、生物にとって極めて有効な免疫系である（非特許文献１参照）。
【０００４】
本発明者は、自然免疫活性化機構を調べるために、自然免疫の活性化を定量できる系を、遺伝子導入したショウジョウバエを用いて構築してきた。菌の感染に伴ってその発現が誘導される抗菌ペプチドであるジプテリシン（diptericin）遺伝子の転写制御領域にβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子をつないだ外来遺伝子を導入したハエでは、菌の感染によりジプテリシン（diptericin）の発現が誘導されると、導入したレポーター遺伝子が発現し、β−ガラクトシダーゼが発現する。この遺伝子導入個体又は遺伝子導入個体から摘出した脂肪体を用いて、導入したレポーター遺伝子が発現量から、自然免疫を活性化する物質をスクリーニングする方法を発表してきた。例えば、グラム陰性菌の構成成分であるＬＰＳ（リポ多糖）を添加すると、高濃度のＬＰＳを必要とするものの、ＬＰＳの用量依存的にβ−ガラクトシダーゼが発現する。このとき、内在性のジプテリシン（diptericin）、ドロソマイシン（drosomycin）、アッタシン（attacin）遺伝子の発現も同様に誘発される（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３参照）。この方法により一応のスクリーニングはできるが、感度が十分でなく、実験誤差も大きく、実用的な方法ではなかった。
また、ショウジョウバエは、自然免疫系として、Ｉｍｄ（immune defiency）経路と呼ばれる細菌防御経路と、Ｔｏｌｌ経路と呼ばれる真菌防御経路の二つの経路を有する。真菌に選択的に働くドロソマイシン（drosomycin）も、幅広い抗菌性を示すアッタシン（attacin）もいずれもＴｏｌｌファミリーにより誘導されるものであり、前記の自然免疫の活性化の手法がどちらの経路によるものであるのかということは確定できなかった。
【０００５】
一方、最近の研究によりショウジョウバエのＩｍｄ経路は、（１）細胞膜受容体における反応、（２）受容体から転写因子への細胞内シグナル伝達系による伝達、そして（３）転写因子あるいは、その制御因子の活性化を経て行われる。ショウジョウバエにおいては、（１）ＰＧＲＰ−ＬＣがレセプターとして機能し、（２）そしてアダプター分子Ｉｍｄを介して伝達され、（３）転写因子Ｒｅｌｉｓｈが活性化される。このＩｍｄを介しての伝達は、Ｉｍｄ→ｄＴＡＫ１→ｄＩＫＫ複合体→Ｒｅｌｉｓｈといった因子群から構成されており、この経路はヒトの自然免疫系であるＴＮＦ経路と共通性を示しており、ヒトのＴＮＦ経路ではそれぞれＲＩＰ→ＴＡＫ１→ＩＫＫ複合体→ＮＦ‐ｋＢに相当することが報告された（非特許文献４参照）。
【０００６】
ところで、これまでの医薬品の開発は、獲得免疫をターゲットとしてきた。ところが近年、自然免疫が感染防御に極めて重要な役割を果たしていることが明らかとなった。したがって、ヒトの自然免疫に作用する物質を探索することは、新たな免疫活性化剤や免疫抑制剤の開発に直結することから、自然免疫に作用する物質を効率よくスクリーニングする系の確立が求められており、ショウジョウバエの抗菌ペプチド遺伝子の転写制御領域の下流側にレポーター遺伝子を導入した外来遺伝子によるスクリーニング系が本発明者らにより初めて開発されてきた（特許文献１、及び非特許文献５参照）。
【０００７】
【特許文献１】特願２００２−２９２９７６号
【非特許文献１】倉田祥一朗、生体の科学、第５１巻３号、第２０２−２０７頁、２０００年
【非特許文献２】日本生化学会  ２０００年１０月１４日  （予稿集第１０３９頁  ３Ｐ−３５５）
【非特許文献３】日本薬学会  ２００１年３月    （予稿集第１４１頁  ２９−ＰＡ−III-０８０）
【非特許文献４】アールエスキュッシュら、トレンドインイムノロジー、第２２巻５号、２６０−２６４、２００１年（R.S.Khush,et al., TRENDS in immunology, 22(5), 260-264 (2001)）
【非特許文献５】マサシヤジマ、ショイチロクラタら、バイオケミカルジャーナル、第３７１巻、２０５−２１０頁、２００３年（M.Yajima, S.Kurata, et al., Biochem. J., 371, 205-210 (2003)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
自然免疫のスクリーニング系は、エンドトキシンで刺激される自然免疫のシグナリング、すなわちＰＧＲＰ−ＬＣがレセプターとして機能し、その後アダプター分子Ｉｍｄを介して転写因子Ｒｅｌｉｓｈが活性化される経路に作用する化合物を同定するものである（図１参照）。従来の自然免疫のスクリーニング系では（特許文献１、及び非特許文献５参照）、この系で同定した化合物が、自然免疫系のレセプターとして機能するＰＧＲＰ−ＬＣに作用するのか、その下流のアダプター分子Ｉｍｄに作用するのか、又は転写因子Ｒｅｌｉｓｈに作用するのかを判別することができず、スクリーニングされてきた化合物を医薬品のリード化合物として効率的に使用することができなかった。自然免疫に対する有効な医薬品などを開発するためには、それらの化合物が作用する標的分子を同定することが不可欠である。
本発明は、自然免疫系に有効な化合物が作用する標的分子を同定するためのスクリーニング系を提供し、当該化合物を医薬品のリード化合物として効率的に使用するための手法を提供するものである。
自然免疫系は生物において極めて高度に保存されており、本発明のスクリーニング方法は、ヒトの自然免疫に作用する新たな免疫活性化剤や免疫抑制剤の開発のために極めて有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
感染防御の要である自然免疫は、生物種間で共通な機構からなる。本発明者らは、これまでに、この自然免疫の共通性を利用し遺伝子組換えショウジョウバエを用いて、自然免疫に作用する物質のスクリーニング系を開発してきた。このスクリーニング系は感度は良かったが、被検物質が自然免疫のどの段階で、即ち自然免疫系に関与しているどの分子を標的としているのかとういことを知ることはできなかった。そして、スクリーニングされてきた物質が自然免疫系のどの分子をターゲットとしているかということが分からなければ、スクリーニングしてきた物質を医薬品のリード化合物として効率的に使用することはできない。
そこで、本発明者らは、自然免疫系に有効な物質をより効率的に見出すためのスクリーニング系の開発を行ってきた。この結果、被検物質の標的となる分子が、（１）細胞膜受容体であるのか、（２）細胞内シグナル伝達系にあるのか、（３）転写因子あるいは、その制御因子であるのかを同定することができるスクリーニング系を見出した。本発明のスクリーニング系を使用することにより、被検物質のターゲット（作用点）を明らかにすることができ、この知見に基づいて各作用点に関する有効な物質を簡便にかつ短時間で見出すことができるだけでなく、各作用点におけるリード化合物を決定することも可能となる。
【００１０】
即ち、本発明は、被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質、及び（３）転写因子又はその制御因子のいずれを標的分子としているかをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物のそれぞれのモデル生物に被検物質を添加して、それぞれの活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法、被検物質が自然免疫における（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法、及び被検物質が自然免疫における（３）転写因子又はその制御因子を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記した本発明のスクリーニング方法に使用するのに好適な自然免疫系におけるＰＧＲＰ−ＬＣを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、自然免疫系におけるＩｍｄを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、及び自然免疫系におけるＲｅｌｉｓｈを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエに関する。
さらに、本発明は、自然免疫における（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上のモデル生物を含有してなる、被検物質の自然免疫系における標的分子をスクリーニングするためのキットに関し、より詳細には、本発明は、自然免疫系における（１）ＰＧＲＰ−ＬＣを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、（２）Ｉｍｄを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、及び（３）Ｒｅｌｉｓｈを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエからなる群から選ばれた１種又は２種以上の遺伝子組換えショウジョウバエを含有してなる、被検物質の自然免疫系における標的分子をスクリーニングするためのキットに関する。
【００１２】
自然免疫系は、生体がエンドトキシン（ＬＰＳ（リポ多糖））など外的物質で刺激されることにより、当該外的物質が（１）細胞膜受容体に作用し、（２）細胞内シグナル伝達系により伝達され、そして（３）転写因子又はその制御因子に作用することからなる。この概要を、図１にショウジョウバエにおける自然免疫系のＩｍｄ経路に基づいて示す。Ｉｍｄ経路は、外的物質としてＬＰＳが作用した場合には、まず細胞膜上のＰＧＲＰ−ＬＣがレセプターとして機能し、その後アダプター分子Ｉｍｄを介して転写因子Ｒｅｌｉｓｈが核内に移行する経路（図１参照）によるものである。この経路は、図１に示されるように、（１）ＰＧＲＰ−ＬＣの関与する箇所（図１中の▲印の箇所参照）、（２）Ｉｍｄなどの細胞内シグナル伝達系に関与する箇所（図１中の●印の箇所参照）、及び（３）Ｒｅｌｉｓｈの関与する箇所（図１中の◆印の箇所参照）に分けられる。
【００１３】
そして、例えば、自然免疫におけるＰＧＲＰ−ＬＣの活性化を阻害する化合物は、ＰＧＲＰ−ＬＣよりも下流のシグナル伝達系（図１中の▲印）に作用していることがわかる。また、ＰＧＲＰ−ＬＣの下流に位置するアダプター分子Ｉｍｄを活性化する反応を阻害する化合物は、Ｉｍｄよりも下流のシグナル伝達系（図１中の●印）に作用していることがわかる。さらに、転写因子Ｒｅｌｉｓｈが活性化される反応を阻害する化合物は、Ｒｅｌｉｓｈの核内移行で活性化される経路（図１中の◆印）に作用していることがわかる。
これらの（１）〜（３）における各々の活性化の阻害の程度を測定することにより、被検物質がどの部分に作用しているかを知ることができる。例えば、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣの活性化のみを阻害し、（２）のＩｍｄや（３）の転写因子Ｒｅｌｉｓｈの活性化を阻害しない化合物は、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣに作用していることになる。また、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣの活性化及び（２）のＩｍｄの活性化を阻害し、（３）の転写因子Ｒｅｌｉｓｈの活性化を阻害しない化合物は、（２）のＩｍｄに作用していることになる。さらに、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣ、（２）のＩｍｄ、及び（３）の転写因子Ｒｅｌｉｓｈの全ての活性化を阻害する化合物は、（３）のＲｅｋｉｓｈに作用していることになる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法におけるモデル生物としては、ヒト以外の生物であって、昆虫やほ乳類のような個体であっても、その細胞であってもよい。自然免疫系は生物において高度に保存されていることから、ヒトのモデルとして各種の生物、例えば昆虫や植物などを使用することができるが、このなかで遺伝子操作が比較的簡単なものが好ましい。好ましい生物としては、遺伝子操作が比較的容易であるショウジョウバエが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のスクリーニング方法におけるモデル生物における遺伝子の過剰発現は、前記した自然免疫における（１）〜（３）の経路のそれぞれが活性化される反応を誘起させることができるものでればよい。遺伝子を過剰発現させる方法としては、遺伝子のコピー数を増加させる方法もあるが、スクリーニング系を安定して作動させるためにはプロモーターにより発現が制御できる方法が好ましい。特定の薬剤の存在により作動するプロモーターや、特定の物理的条件により作動するプロモーターを使用することにより、安定した過剰発現を実現することができる。このようなプロモーターとしては、例えば、熱刺激蛋白質のプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。また、恒常的に作動するプロモーターとしては、アクチンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターなどが挙げられる。
本発明の方法における好ましいプロモーターとしては、熱刺激蛋白質（ＨＳＰ（heat shock protein））のプロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１５】
このようなプロモーターを、自然免疫における細胞膜受容体をコードする遺伝子、自然免疫の細胞内シグナル伝達系に関与する物質をコードする遺伝子、又は自然免疫に関与している転写因子又はその制御因子をコードする遺伝子の上流側に導入する、又はこのようなプロモーターの下流側に前記した遺伝子が配置された遺伝子を構築し、これを導入することにより、これらの遺伝子を特定の条件下において過剰発現させることができる。
本発明のスクリーニング方法における遺伝子を過剰発現するモデル生物における遺伝子としては、例えば、（１）細胞膜受容体としては、ＰＧＲＰ−ＬＣｘ、ＰＧＲＰ-ＬＣａ、ＰＧＲＰ・ＬＣｙ、Ｔｏｌｌなどが挙げられ、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質としては、Ｉｍｄ、ｄＭｙＤ８８などが挙げられ、（３）転写因子又はその制御因子としては、Ｒｅｌｉｓｈ、Ｄｏｒｓａｌ、Ｄｉｆなどが挙げられる。
生物に遺伝子を導入する方法としては、公知の各種の手法を使用することができる。例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法におけるモデル生物における、それぞれの活性の変化を測定する方法としては、ノザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲなどにより遺伝子の発現を検出、定量化して測定することもできる。また、これ以外の方法の本発明における好ましい測定方法としては、レポーター遺伝子による測定方法が挙げられる。このようなレポーター遺伝子は、前記した各遺伝子の転写制御領域の下流側に導入され、レポーター遺伝子の発現量を測定することにより当該遺伝子の活性化を測定することができる。本発明の方法においては、前記したプロモーターの作動により遺伝子が発現されると同時に、導入したレポーター遺伝子も発現し、当該遺伝子に基づく自然免疫の活性化をレポーター遺伝子に依存する酵素活性などとして鋭敏かつ迅速に測定することができる。
本発明の方法におけるレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子やβ−ガラクシトダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子などのレポーター遺伝子を使用することができる。定量化の容易性からβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物のそれぞれのモデル生物に被検物質を添加して、それぞれの活性の変化を測定することが好ましいが、必ずしもこれらの３種のスクリーニング方法を行う必要はなく、これらの各々のスクリーニング方法をそれぞれ独立して行うこともでき、それぞれの系統における活性の阻害を独立してスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、被検物質が自然免疫における（１）細胞膜受容体を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法を提供するものであり、また、本発明は、被検物質が自然免疫における（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法を提供するものであり、さらに、本発明は、被検物質が自然免疫における（３）転写因子又はその制御因子を標的分子としていることをスクリーニングする方法であって、自然免疫系の（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物に被検物質を添加して、その活性の変化を測定することからなる被検物質の標的分子をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、前記してきた本発明のスクリーニング方法を行うためのモデル生物を提供するものである。本発明のモデル生物としては、自然免疫系における（１）細胞膜受容体を過剰発現するモデル生物、（２）細胞内シグナル伝達系に関与する物質を過剰発現するモデル生物、及び（３）転写因子又はその制御因子を過剰発現するモデル生物を提供するものである。これらのモデル生物は、それらの各遺伝子が過剰に発現するだけでなく、前記してきたレポーター遺伝子が同時に発現するものが好ましい。
本発明の好ましいモデル生物としては、自然免疫系におけるＰＧＲＰ−ＬＣを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、自然免疫系におけるＩｍｄを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、自然免疫系におけるＲｅｌｉｓｈを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエなどが挙げられる。より詳細には、熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＰＧＲＰ−ＬＣが発現する遺伝子が組み込まれた遺伝子組換えショウジョウバエ、熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＩｍｄが発現する遺伝子が組み込まれた遺伝子組換えショウジョウバエ、熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＲｅｌｉｓｈが発現する遺伝子が組み込まれたものである請求項２１に記載の遺伝子組換えショウジョウバエなどが挙げられる。
【００１９】
本発明は、前記してきた本発明のスクリーニング方法を行うための材料となるモデル生物からなるキットを提供するものである。本発明のキットは、前記してきた本発明のモデル生物を１種以上含有するものからなる。
本発明の好ましいキットとしては、自然免疫系における（１）ＰＧＲＰ−ＬＣを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、（２）Ｉｍｄを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエ、及び（３）Ｒｅｌｉｓｈを過剰発現する遺伝子組換えショウジョウバエからなる群から選ばれた１種又は２種以上の遺伝子組換えショウジョウバエを含有してなる、被検物質の自然免疫系における標的分子をスクリーニングするためのキットが挙げられる。
また、本発明のキットには、前記してきた本発明のモデル生物のほかに、これらの生物を収納するための容器、これらの生物を生育又は培養するための培地などを含有させることができる。
【００２０】
本発明は、自然免疫系に関与している３種の異なる遺伝子を導入したモデル生物、好ましくはショウジョウバエを使用することを特徴とするものである。そして、これらの３つの系を用いることで、化合物のターゲットが、（１）細胞膜受容体であるのか、（２）細胞内シグナル伝達系にあるのか、（３）転写内子あるいは、その制御因子であるのかを同定できるようになった。
自然免疫系に作用することが明らかとなった化合物を、医薬品として効率よく開発するためには、その化合物のターゲット分子をいち早く同定して、どのように開発を進めるのか、その戦略を決定する必要がある。本発明により、ターゲットが、（１）細胞膜受容体であるのか、（２）細胞内シグナル伝達系にあるのか、（３）転写因子あるいは、その制御因子であるのかを、簡便に同定できるようになった。これは、医薬品開発に向けて下可欠の枝術であると同時に、ターゲットを絞り込んでのスクリーニング法を可能にしたものである。
【００２１】
以下に、遺伝子組換えショウジョウバエを用いて、ＰＧＲＰ−ＬＣ、Ｉｍｄ、Ｒｅｌｉｓｈをそれぞれ過剰発現させ、エンドトキシンによる自然免疫の活性化がなくとも、それらの遺伝子の下流の経路だけが活性化される系を確立することができたことを具体的に説明するが、以下の説明は本発明の理解を助けるためのものであり、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
まず、Ｐ｛ＵＡＳＴ｝ベクター（:http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/tpmolmap.html?FBtp0000354サイトにより入手）にＰＧＲＰ−ＬＣｘ（ＰＧＲＰ−ＬＣのアイソマーの一つ）を組み込んだ遺伝子を構築し、Ｐ因子を用いたトランスフォーメーションにより、この遺伝子をショウジョウバエに導入した。この遺伝子導入ショウジョウバエと、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下に酵母の転写因子ＧＡＬ４が発現する遺伝子とレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現するようにした遺伝子を導入した系統をかけ合わせ、生まれる３種の外来遺伝子を有する幼虫を培養した。この幼虫のレポーター遺伝子を用いて、自然免疫が活性化するかどうか調べた。その結果を図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）の縦軸はレポーター遺伝子によるレポ−ター活性を示し、横軸は熱刺激（ＨＳ）が無い場合（−）と有る場合（＋）を示す。この結果熱刺激が無い場合（−）に比べて熱刺激が有る場合（＋）に、レポーター遺伝子産物の活性が上昇していることが分かる。このように、本発明のモデル動物により、熱刺激依存に、すなわちＰＧＲＰ−ＬＣの過剰発現依存的に自然免疫が活性化する系を確立することができた。この系で活性化される反応を阻害する化合物は、ＰＧＲＰ−ＬＣよりも下流のシグナル伝達系（図１中の▲印）に作用していることがわかる。
【００２２】
次に、同様にして第二の系としてＰＧＲＰ−ＬＣの下流に位置するアダプター分子Ｉｍｄの過剰発現により、エンドトキシンを加えずとも、自然免疫系が活性化する系を確立した。方法は、ＰＧＲＰ−ＬＣｘの過剰発現と同様の方法を用いた。その結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ｂ）の縦軸はレポーター遺伝子によるレポ−ター活性を示し、横軸は熱刺激（ＨＳ）が無い場合（−）と有る場合（＋）を示す。この結果熱刺激が無い場合（−）に比べて熱刺激が有る場合（＋）に、レポーター遺伝子産物の活性が上昇していることが分かる。このように、本発明のモデル動物により、Ｉｍｄの過剰発現依存に自然免疫が活性化する系を確立することができた。この系で活性化される反応を阻害する化合物は、Ｉｍｄよりも下流のシグナル伝達系（図１中の●印）に作用していることがわかる。
【００２３】
さらに、同様にして、第三の系として、転写因子Ｒｅｌｉｓｈの過剰発現により、エンドトキシンを加えずとも、自然免疫系が活性化する系を確立した。方法は、これまでと同様の方法を用いた。その結果を図２（Ｃ）に示す。図２（Ｃ）の縦軸はレポーター遺伝子によるレポ−ター活性を示し、横軸は熱刺激（ＨＳ）が無い場合（−）と有る場合（＋）を示す。この結果熱刺激が無い場合（−）に比べて熱刺激が有る場合（＋）に、レポーター遺伝子産物の活性が上昇していることが分かる。このように、本発明のモデル動物により、Ｒｅｌｉｓｈの過剰発現依存に自然免疫が活性化する系を確立することができた。この系で活性化される反応を阻害する化合物は、Ｒｅｌｉｓｈの核内移行で活性化される経路（図１中の◆印）に作用していることがわかる。
【００２４】
本発明のスクリーニング系により、自然免疫のスクリーニング系で同定された化合物のターゲットが、自然免疫系の中の（１）ＰＧＲＰ−ＬＣ あるいは、その下流のＩｍｄまでのシグナルを制御する因子、（２）アダプター分子Ｉｍｄより下流の細胞内シグナル伝達系（すでにｄＴＡＫ１、ＩＫＫなどの因子が同定されている）に関連する因子、（３）Ｒｅｌｉｓｈあるいはその核内移行を制御する因子、のいずれかであることを決定できるようになった。
そこで、先の特許出願（特許文献１）時において、具体的な例をして示したデストラキシンのターゲットの同定を試みた。デストラキシンは、昆虫寄生菌が産出するシクロデプシペプチドであり、自然免疫抑制活性を有する（ＩＣ５０：１μＭ）ことが先の特許出願において明らかにされている。この結果を図３に示す。図３の縦軸はレポーター遺伝子によるレポ−ター活性（デストラキシンを培地に加えずに培養した値を１００％とする相対値）を示し、横軸はデストラキシンの濃度（μＭ）を対数で示す。図３中のＨが付された線（原図は青色）はＰＧＲＰ−ＬＣの系の結果を示し、Ｊが付された線（原図は緑色）はＩＭＤの系の結果を示し、Ｆが付された線（原図は赤色）はＲｅｌｉｓｈの系の結果を示す。図３のレポーター活性の値が下がるほどそれぞれの遺伝子の過剰発現によって引き起こされた自然免疫の活性化が抑制されていることを示している。したがって、この結果、デストラキシンはいずれの系においても阻害活性を示し、そのターゲットは、Ｒｅｌｉｓｈ転写因子あるいはその核移行を制御する因子であることが示された。
【００２５】
このデストラキシンの例では、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣの系の結果、（２）のＩｍｄの系の結果、及び（３）のＲｅｌｉｓｈの系の結果のいずれもレポーター活性が変化して、そのターゲットがＲｅｌｉｓｈ転写因子あるいはその核移行を制御する因子であることが示された。一方、仮に、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣの系の結果、及び（２）のＩｍｄの系の結果のレポーター活性のみが変化し、（３）のＲｅｌｉｓｈの系の結果は変化しない（即ち、被検物質を培地に加えずに培養した値と変わらない）場合には、この被検物質のターゲットは、（２）のＩｍｄ系であることが示されることになる。また、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣの系の結果のレポーター活性のみが変化し、（２）のＩｍｄの系の結果、及び（３）のＲｅｌｉｓｈの系の結果のレポーター活性は変化しない場合には、その被検物質のターゲットは、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣ系であることがわかる。
より簡便には、例えば、（３）のＲｅｌｉｓｈの系の結果のみを測定して、そのレポーター活性が変化しない場合には、当該被検物質のターゲットは、（１）のＰＧＲＰ−ＬＣの系か、又は（２）のＩｍｄの系であることがわかる。また、このレポーター活性が変化した場合には、そのターゲットは（３）のＲｅｌｉｓｈの系であると推測することができる。同様に他の系のレポーター活性のみを測定することによって、そのターゲットをある程度推測することが可能となる。
このように、本発明のスクリーニング系によれば、被検物質が自然免疫系におけるどの系をターゲットにしているかということを知ることができ、係る知見に基づいて自然免疫に対する有効な物質を効率的に検索することが可能となる。
【発明の効果】
【００２６】
近年の生活環境の変化に伴う各種アレルギー疾患の増加、重篤な疾患への臓器移植による治療機会の増大、再興感染症の増加、あるいは、特に発展途上国で深刻なエイズなどの免疫不全症の多発などにより、免疫抑制剤や免疫活性化剤といった、免疫系を人為的に制御できる医薬品の需要が世界的に増大している。これまでの、これら医薬品の開発は、獲得免疫をターゲットにしたものであり、感染防御の要として機能する自然免疫をターゲットとしたものは皆無であった。
本発明は、自然免疫系に作用する物質を高感度かつ効率的、高信頼性でスクリーニングすることができる実用的な方法を提供するだけでなく、その作用点を決定することが可能となり、本発明の方法により自然免疫に対する有効な医薬品や農薬を簡便にかつ短時間での開発が可能となるばかりでなく、スクリーニングされてきた物質が自然免疫系のどの分子をターゲットとしているかということを知ることができ、スクリーニングしてきた物質を医薬品のリード化合物として、より有効性の高い医薬品や農薬を効率的に開発することができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＰＧＲＰ−ＬＣｘを発現する遺伝子の構築とそれによる遺伝子組換えショウジョウバエの製造。
Ｐ｛ＵＡＳＴ｝ベクター（http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/tpmolmap.html?FBtp0000354サイトから入手できる。）にＰＧＲＰ−ＬＣｘ遺伝子を組み込み、Ｐ因子を用いたトランスフォーメーションにより、遺伝子をショウジョウバエに導入した。なお、ここで使用したＰＧＲＰ−ＬＣｘ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示しておく。そして、この遺伝子導入ショウジョウバエと、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下に酵母の転写因子ＧＡＬ４が発現する遺伝子とレポーター遺伝子を導入した系統をかけ合わせ、生まれる３種の外来遺伝子を有する幼虫を製造した。このようにして得られたショウジョウバエ幼虫は、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下にＰＧＲＰ-ＬＣｘを過剰発現できる遺伝子とレポーター遺伝子を導入したショウジョウバエ幼虫である。
【実施例２】
【００２９】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＰＧＲＰ−ＬＣｘを発現する遺伝子が導入された遺伝子組換えショウジョウバエを用いた自然免疫系の活性化。
実施例１で製造された遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を、２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地を用いて２５℃で試験管内で培養した。
この幼虫に３７℃、３０分の熱刺激を与え、さらに２５℃で１８時間の培養した後、培養した幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。
結果を図２（Ａ）に示す。
【実施例３】
【００３０】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＩｍｄを発現する遺伝子の構築とそれによる遺伝子組換えショウジョウバエの製造。
実施例１と同様にして、Ｐ｛ＵＡＳＴ｝ベクターにＩｍｄのｃＤＮＡを組み込み、Ｐ因子を用いたトランスフォーメーションにより、遺伝子をショウジョウバエに導入した。この遺伝子導入ショウジョウバエと、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下に酵母の転写因子GAL4が発現する遺伝子とレポーター遺伝子を導入した系統をかけ合わせ、生まれる３種の外来遺伝子を有する幼虫を製造した。このようにして得られたショウジョウバエ幼虫は、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下にＩｍｄを過剰発現できる遺伝子とレポーター遺伝子を導入したショウジョウバエ幼虫である。
【実施例４】
【００３１】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＩｍｄを発現する遺伝子が導入された遺伝子組換えショウジョウバエを用いた自然免疫系の活性化。
実施例３で製造された遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を、２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地を用いて２５℃で試験管内で培養した。
この幼虫に３７℃、３０分の熱刺激を与え、さらに２５℃で１８時間の培養した後、培養した幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。
結果を図２（Ｂ）に示す。
【実施例５】
【００３２】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＲｅｌｉｓｈを発現する遺伝子の構築とそれによる遺伝子組換えショウジョウバエの製造。
実施例１と同様にして、Ｐ｛ＵＡＳＴ｝ベクターにＲｅｌｉｓｈのｃＤＮＡを組み込み、Ｐ因子を用いたトランスフォーメーションにより、遺伝子をショウジョウバエに導入した。この遺伝子導入ショウジョウバエと、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下に酵母の転写因子GAL4が発現する遺伝子とレポーター遺伝子を導入した系統をかけ合わせ、生まれる３種の外来遺伝子を有する幼虫を製造した。このようにして得られたショウジョウバエ幼虫は、熱刺激蛋白質プロモーターの制御下にＲｅｌｉｓｈを過剰発現できる遺伝子とレポーター遺伝子を導入したショウジョウバエ幼虫である。
【実施例６】
【００３３】
熱刺激蛋白質のプロモーターの制御下にＲｅｌｉｓｈを発現する遺伝子が導入された遺伝子組換えショウジョウバエを用いた自然免疫系の活性化。
実施例５で製造された遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を、２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地を用いて２５℃で試験管内で培養した。
この幼虫に３７℃、３０分の熱刺激を与え、さらに２５℃で１８時間の培養した後、培養した幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。
結果を図２（Ｃ）に示す。
【実施例７】
【００３４】
デストラキシンによるＰＧＲＰ−ＬＣ、Ｉｍｄ、及びＲｅｌｉｓｈの過剰発現による自然免疫系の活性化の阻害試験。
実施例１で製造した（１）熱刺激蛋白質プロモーターの制御下にＰＧＲＰ-ＬＣｘを過剰発現できる遺伝子とレポーター遺伝子を導入したショウジョウバエ幼虫、実施例３で製造した（２）熱刺激蛋白質プロモーターの制御下にＩｍｄを過剰発現できる遺伝子とレポーター遺伝子を導入したショウジョウバエ幼虫、及び実施例５で製造した（３）熱刺激蛋白質プロモーターの制御下にＲｅｌｉｓｈを過剰発現できる遺伝子とレポーター遺伝子を導入したショウジョウバエ幼虫を、それぞれ２０％ウシ胎児血清並びに抗生物質を含むシュナイダーショウジョウバエ液体培地を用いて試験管内で２５℃で３時間培養した。その後、図３の横軸に示した各種の濃度のデストラキシンを培地に加え、３７℃、３０分の熱刺激を与えた後、２５℃で１８時間、培養した。培養したそれぞれの幼虫をリン酸バッファーからなる反応液中でホモジネートし遠心上清のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を測定した。デストラキシンを培地に加えずに培養したレポーター活性との比較により、阻害効果を判定した。
結果を図３に示す。レポーター活性の値が下がるほどそれぞれの遺伝子の過剰発現によって引き起こされた自然免疫の活性化が抑制されていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
感染防御の要である自然免疫は、生物種間で高度に保存されており生物間で共通な機構からなり、本発明の方法によりスクリーニングされる物質は、ショウジョウバエのような昆虫類だけでなく、ほ乳類や植物ばどの自然免疫系にも共通して作用する物質であり、ヒトや家畜などの哺乳類及び植物の自然免疫系の医薬品や農薬などとして有用となる。
本発明はこのような有用な製品を簡便かつ容易に開発することができる手法及びそのための材料を提供するものであり産業上有用なものであり、利用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ショウジョウバエにおける自然免疫系のＩｍｄ経路の概要を示したものである。
【図２】図２は、本発明の遺伝子組み換えショウジョウバエを用いたＰＧＲＰ-ＬＣｘ遺伝子（図２（Ａ））、Ｉｍｄ遺伝子（図２（Ｂ））、Ｒｅｌｉｓｈ遺伝子（図２（Ｃ））のそれぞれの過剰発現により自然免疫活性化が引き起こされていることを試験した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の遺伝子組み換えショウジョウバエを用いて、デストラキシンによるＰＧＲＰ−ＬＣ遺伝子（図３中のＨ）、Ｉｍｄ遺伝子（図３中のＪ）、及びＲｅｌｉｓｈ遺伝子（図３中のＦ）の過剰発現による自然免疫系の活性化の阻害試験を行った結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
配列番号１：本発明で使用したＰＧＲＰ−ＬＣｘを発現する遺伝子の塩基配列。
配列番号２：本発明で使用したＩｍｄを発現する遺伝子の塩基配列。
配列番号３：本発明で使用したＲｅｌｉｓｈを発現する遺伝子の塩基配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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