(57)【要約】【課題】  繊維等への加工特性に優れた超高分子量のポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を、安価で安全且つ高生産性で生産することが可能な製造方法、およびそれに用いる発現プラスミド、形質転換体の提供。【解決手段】  接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド；該発現プラスミドによって形質転換された形質転換体；該形質転換体を使用した超高分子量ポリエステルの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項２】
発現プラスミドに含有されるベクターがｐＪＲＤ２１５（配列番号１）誘導体である請求項１記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項３】
発現プラスミドに含有されるポリエステル合成酵素遺伝子が、以下の（１）〜（５）のいずれか１つ以上の遺伝子である請求項１または２記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド；
（１）アエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（２）１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（３）１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（４）３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子、
（５）上記（２）から（４）の置換の内、いずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子。
【請求項４】
上記ポリエステル合成酵素遺伝子以外に、β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含有されてなる請求項１〜３のいずれかに記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項５】
ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥである請求項１〜４のいずれかに記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項６】
接合伝達能力の一部または全ての欠失が、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失または変異、及び／又は、ｏｒｉＴ領域の欠失である請求項１〜５のいずれかに記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項７】
さらに、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失した請求項１〜６のいずれかに記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項８】
さらに、ｃｏｓ領域を欠失した請求項１〜７のいずれかに記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミドによって形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
宿主がラルストニア・ユートロファである請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６７６）である請求項９または１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
ポリエステルが、下式（１）
【化１】
2005333933.tif 000005
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、請求項１〜１１のいずれかに記載の発現プラスミドまたは形質転換体を用いた超高分子量ポリエステルの製造方法。
【請求項１３】
ポリエステルの重量平均分子量が３５０万以上である請求項１２記載の超高分子量ポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超高分子量ポリエステル生産用新規発現プラスミド、およびその形質転換体、またそれを用いた超高分子量ポリエステルの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）であり、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。
【０００３】
その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている（特許文献１、２参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特に柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
【０００４】
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされた（特許文献３、４参照）。これら報告のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献１参照）。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリエステルから軟質ポリエステルまで応用可能な幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、本製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリエステル含量３０％とポリエステル生産性は低いものであり、本ポリエステルの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分と言わざるを得なかったため、実用化に向けて更に高い生産性が得られる方法が探索された。
【０００５】
また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行われた（非特許文献２、３参照）。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示され、また、５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリエステル含量が向上したことが報告されている。しかし、ＰＨＡ合成酵素活性を増強させると蓄積されるポリエステルの分子量は低下する傾向が認められている。また、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だポリエステル含量は低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。
【０００６】
Ｔ．Ｆｕｋｕｉ等がラルストニア・ユートロファを宿主としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産したＰＨＡ合成酵素発現プラスミドは、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ  ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子やＤ−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等（特許文献５参照）であった。本菌株の菌体生産量は４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善により菌体生産量４５ｇ／Ｌ、ポリエステル含量６２．５％、３ＨＨ組成８．１％にまで向上したように培養方法に関する研究もなされた（特許文献６参照）。
【０００７】
一方、Ｐ（３ＨＢ）の生産に関してはＰＨＢ合成酵素に加えて３ＨＢの供給系であるラルストニア・ユートロファ由来のｐｈｂＡ（β―ケトチオラーゼ）およびｐｈｂＢ（アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ）を共発現させる方法も開示されている（特許文献７、８、９参照）。
また、β−酸化経路の酵素である大腸菌由来のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｆａｄＥ（ｙａｆＨともいう））遺伝子を用いたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産研究も行われた。同酵素遺伝子およびアエロモナス・キャビエ由来の（Ｒ）−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及びポリエステル合成酵素遺伝子を導入した大腸菌では、炭素源としてラウリン酸を用いて培養した結果、４８時間で菌体生産量は約１ｇ／Ｌ、ポリエステル含量は約１６％が達成されている（非特許文献４参照）。
更にアエロモナス・ハイドロフィラに大腸菌由来のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した株によるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産も研究されている（非特許文献５参照）。この報告では、ラウリン酸及びグルコースを炭素源とした培養により、４８時間培養で菌体生産量約３ｇ／Ｌ、ポリエステル含量約６０％が達成されている。
【０００８】
ポリエステルを繊維状に加工するには出来るだけ高分子量であることが望ましい。このため超高分子量のＰ（３ＨＢ）生産について研究がなされ、培養時のｐＨ及びグルコース濃度をコントロールすることにより重量平均分子量が１０００万を越える超高分子量Ｐ（３ＨＢ）の生産方法が示された。その中で超高分子量Ｐ（３ＨＢ）では繊維状への加工時に重要な物性（例えば引張り強度や再伸延性）が向上することが明らかにされている（非特許文献６、７、８参照）。また、試験管内でのＰ（３ＨＢ）生産では、ＰＨＢ合成酵素濃度を変化させることにより、３００万〜１２００万の重量平均分子量を有するＰ（３ＨＢ）を生産可能であることも明らかにされた（非特許文献９参照）。更に、誘導性プロモーターにより制御されたｐｈａＣ遺伝子等を有する発現ベクターを用いた大腸菌によるＰ（３ＨＢ）の生産では、誘導剤添加量で発現する酵素量を制御した結果、重量平均分子量を７８万〜４００万でコントロール可能であることが開示されている（特許文献１０参照）。
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産に関しては、比較的高価なオクタン酸を単一炭素源とした培養で重量平均分子量が約３１０万のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が蓄積されたことが示されている（非特許文献１０参照）。しかしながら、安価な植物油脂等を炭素源とした培養での超高分子量のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産に関しての報告は無い。
【０００９】
ところで、ｐＪＲＤ２１５は、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０の誘導体であり、接合伝達性を有している（非特許文献１１参照）。
接合伝達とは、異なる形質を持つ細菌を混合培養した時に起こる現象であり、ある細菌（供与菌）の遺伝子の一部が、他の細菌（受容菌）に移ることを指す。接合伝達能力の強度は、供与体の染色体上あるいは供与体が持つプラスミド上の接合伝達に関与する遺伝子によって決定される。接合伝達に関与する遺伝子には、自己伝達性遺伝子ｔｒａおよび共役伝達性遺伝子ｍｏｂ、そしてｏｒｉＴ配列がある。ｔｒａがコードするタンパク質は、供与菌・受容菌間の相互作用に関与する。ｍｏｂがコードするタンパク質はｏｒｉＴ配列にニックを入れる機能、さらに一本鎖となったＤＮＡを安定に運ぶ機能を有する。ｏｒｉＴ配列は、ニックサイトとニックが入るための認識配列から成る。これら３種が共存してはじめて接合伝達が起こる。
また、ｐＪＲＤ２１５は、接合伝達に関与する遺伝子のうち、ｍｏｂ遺伝子群およびｏｒｉＴ配列を有するため、工業スケールでのポリエステル製造時にｐＪＲＤ２１５を保有する形質転換体が万が一漏洩した場合、例えばＲＰ４のようにｔｒａ遺伝子含有プラスミドを持つ微生物と接触すると、接合伝達が生じる可能性があり、組換え体の封じ込めといった安全面での課題を有していた。
【００１０】
更に、ラルストニア・ユートロファは安全性、高い生産性、安価な炭素源の利用が可能等の観点よりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業的生産に最も適した宿主であると期待されている。しかしながら、柔軟な性質を活かした繊維等への加工に適した超高分子量Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産可能な安全且つ安価な生産系が存在しないため、その生産系開発が望まれていた。
【００１１】
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献３】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献４】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献５】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献６】特開２００１−３４００７８号公報
【特許文献７】米国特許第５６６３０６３号明細書
【特許文献８】米国特許第５６６１０２６号明細書
【特許文献９】米国特許第５７９８２３５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５８１１２７２号明細書
【非特許文献１】Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２８，４８２２−４８２３（１９９５）
【非特許文献２】Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）
【非特許文献３】Ａ．Ａｍａｒａ等  Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ５９，４７７（２００２）
【非特許文献４】Ｘｉａｏｙｕｎ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ．２２１，ｐ９７，（２００３）
【非特許文献５】Ｌｕ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐ４１，（２００４）
【非特許文献６】Ｋｕｓａｋａ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．４７，ｐ１４０，（１９９７）
【非特許文献７】Ｋｕｓａｋａ等、Ｊ．Ｍ．Ｓ．−ＰＵＲＥ  ＡＰＰＬ．ＣＨＥＭ．，ｖｏｌ．Ａ３５、ｐ３１９，（１９９８）
【非特許文献８】Ｋｕｓａｋａ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｖｏｌ．２５，ｐ８７，（１９９９）
【非特許文献９】Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．９２，６２７９，（１９９５）
【非特許文献１０】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｖｏｌ．２５，ｐ６９，（１９９９）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｍ．Ｈｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ等，Ｇｅｎｅ，５１，２７５−２８０（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、繊維等への加工特性に優れた超高分子量のポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を、安価で安全且つ高生産性で生産することが可能な製造方法、およびそれに用いる発現プラスミド、形質転換体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討し、接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用の新規な発現プラスミド、特に、ラルストニア・ユートロファ由来のβ−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）遺伝子とアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）遺伝子、大腸菌由来のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｆａｄＥ（ｙａｆＨともいう））遺伝子、およびアエロモナス・キャビエ由来のポリエステル合成酵素（ｐｈａＣ）遺伝子を含む、新規なポリエステル合成酵素発現プラスミドを構築した。また、当該発現プラスミドをラルストニア・ユートロファに導入した形質転換体を作製し、安価な植物油脂による単一炭素源下で培養した結果、重量平均分子量（Ｍｗ）３５０万以上の超高分子量Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を安全にかつ高生産性にて生産できることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は、繊維等への加工特性に優れた超高分子量のポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造するための、ポリエステル合成酵素発現プラスミド；該発現プラスミドを含む超高分子量ポリエステル合成能を有する形質転換体；該形質転換体を使用した超高分子量ポリエステルの安全且つ安価な製造方法に関する。
【００１５】
つまり、本発明は、接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド；上記超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミドによって形質転換された形質転換体；ポリエステルが、下式（１）
【００１６】
【化１】
2005333933.tif 000002
【００１７】
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、上記発現プラスミドまたは形質転換体を用いた超高分子量ポリエステルの製造方法、に関するものである。
【００１８】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミドは、安全で高い生産性で、超高分子量ポリエステルを生産するために用いられる、ポリエステル合成酵素発現プラスミドである。
つまり、本発明の接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミドとは、接合伝達能力の一部または全てを欠失したベクターに、ポリエステル合成酵素遺伝子が挿入されてなる、超高分子量ポリエステル生産用のポリエステル合成酵素発現プラスミドである。
【００１９】
全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。
なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。また、クローニング宿主としては、特に限定はないが、例えば大腸菌ＤＨ５α株等が挙げられる。
【００２０】
＜発現プラスミドの作製＞
まず、接合伝達性の一部または全てを欠失させることにより安全性を高めたベクターの作製について説明する。
本発明において使用するベクターとしては、広宿主域ベクターであれば特に制限はないが、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ  ３７５３３）の誘導体、特に非接合伝達性に改変したベクターを好ましく使用することができる。ｐＪＲＤ２１５の塩基配列を配列番号１に示す。
【００２１】
ベクターから接合伝達性を低下あるいは欠失させるには、接合伝達性に関与する遺伝子領域を全欠失、部分欠失、塩基挿入、塩基置換等を行うことによって、その機能を低下あるいは欠失させることができる。
【００２２】
例えばｐＪＲＤ２１５であれば、ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ、ｏｒｉＴ配列に対し、全欠失、部分欠失、塩基挿入、塩基置換等を行う。ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ、ｏｒｉＴ配列のうちのどの遺伝子の機能を欠失させてもよいが、特に、可動性に必須であるｍｏｂＡ遺伝子、あるいはニックサイトを含むｏｒｉＴ配列に対して上記の操作を行うことが好ましい。また、機能を低下あるいは欠失させる遺伝子は、１種類でもよいが２種類以上ならばさらに好ましい。
【００２３】
なお、ｐＪＲＤ２１５は、ＲＳＦ１０１０の誘導体であるため、Ｐ．Ｓｃｈｏｌｚ等，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．７５，ｐ２７１（１９８９）でのＲＳＦ１０１０の定義をそのまま引用することができる。すなわち、ｐＪＲＤ２１５のｏｒｉＴ配列は配列番号１の３０８１〜３１６９であり、ニックサイトは３１３８と３１３９の間と定義できる。また、ｍｏｂＡ遺伝子は配列番号１の３２５０〜４４０７、ｍｏｂＢ遺伝子は配列番号１の３９９８〜４４１１と定義することができる。
【００２４】
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失または変異により、接合伝達能力の一部または全てを欠失させたベクターとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５を欠失させたベクター；ｐＪＲＤ２１５の３７３７〜４３７８を欠失させたベクター；ｐＪＲＤ２１５の４０００〜４３７８を欠失させたベクター；ｐＪＲＤ２１５の３３２３のアデニンをチミンへ置換したベクター等が挙げられる。
【００２５】
また、ｏｒｉＴ領域の欠失により、接合伝達能力の一部または全てを欠失させたベクターとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５を欠失させたベクター；ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９を欠失させたベクター等が挙げられる。
【００２６】
さらに、ｍｏｂ遺伝子領域およびｏｒｉＴ領域の欠失により、接合伝達能力の一部または全てを欠失させたベクターとしては、例えば、
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３１３２〜３１４５の欠失であるベクター；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９の欠失であるベクター；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１７８の欠失であるベクター；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３２１４の欠失であるベクター；
ｍｏｂ遺伝子領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５の欠失であり、かつｏｒｉＴ領域の欠失がｐＪＲＤ２１５の３０９５〜３２１４の欠失であるベクター等が挙げられる。
【００２７】
ここで、ｍｏｂ遺伝子領域の欠失は、ｍｏｂ遺伝子部分を含む制限酵素断片の欠失、またはＰＣＲを用いた欠失等により行うことができる。また、ｍｏｂ遺伝子領域の変異は、部位特異的変異導入法等により行うことができる。さらに、ｏｒｉＴ領域の欠失は、上記ｍｏｂ遺伝子領域の欠失の場合と同様に、ｏｒｉＴ部分を含む制限酵素断片の欠失、またはＰＣＲを用いた欠失等により行うことができる。
【００２８】
また、形質転換効率の向上のためにベクターを小型化するには、ポリエステル合成酵素遺伝子の発現およびベクター複製に不要である部分を欠失させることにより行える。例えば、使用するベクターに抗生物質耐性遺伝子が２つ以上あるならば、そのどちらかを欠失させることができる。
例えばｐＪＲＤ２１５の場合、カナマイシン耐性遺伝子あるいはストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが可能であるが、薬剤の有効性の観点からストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが好ましい。
【００２９】
ストレプトマイシン耐性遺伝子領域を欠失させたベクターとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の２０６〜１６９０を欠失させたベクター等が挙げられる。
【００３０】
また、ｐＪＲＤ２１５の場合、ベクターの小型化を目的とし、ベクターの複製に関与しないマルチクローニングサイトやｃｏｓ領域等も欠失させることができる。マルチクローニングサイトおよびラムダファージ由来のｃｏｓ領域は、明確に定義されていないが、Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ等，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．５１，ｐ２７５（１９８７）より、配列番号１の９６８０〜１０１３０付近がマルチクローニングサイトであり、９２６０〜９６６０付近がｃｏｓ領域であるといえる。
【００３１】
ｃｏｓ領域を欠失させたベクターとしては、例えば、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の９２３７〜１０１２７を欠失させたベクター；ｐＪＲＤ２１５の８９１５〜１００５５を欠失させたベクター等が挙げられる。
【００３２】
ストレプトマイシン耐性遺伝子領域の欠失、ｃｏｓ領域の欠失、マルチクローニングサイトの欠失も、上記ｍｏｂ遺伝子領域の欠失と同様にして行うことができる。
【００３３】
また、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したベクターも好適に用いることができる。なお、当該ベクターは、上述の接合伝達能力の一部または全ての欠失およびストレプトマイシン耐性遺伝子の欠失を組み合わせることにより得ることができる。
【００３４】
さらに、ｃｏｓ領域の欠失やマルチクローニングサイトの欠失を組み合わせることもでき、例えば、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したベクター；ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したベクター；接合伝達能力の一部または全てを欠失し、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失し、かつ、ｃｏｓ領域及び／又はマルチクローニングサイトを欠失したベクター等が挙げられる。
【００３５】
次に、本発明におけるポリエステル合成酵素遺伝子について説明する。
当該ポリエステル合成酵素遺伝子としては、アエロモナス・キャビエ由来のものが好ましく、例えば、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２、ＥＥ３２ｄ１３等を用いることができる。
また、Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、あるいはコンピューター上での酵素の立体構造または予想される立体構造を基に有用なアミノ酸変異を特定可能なプログラム等、例えばＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４８３１号公報）により設計された、３５３番目のアミノ酸のフェニルアラニンがスレオニンに置換されたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（Ｆ３５３Ｔ変異体遺伝子）、または、上記置換の内のいずれか２つ以上のアミノ酸置換が組み合わされたアエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子（上記変異を組み合わせた変異体遺伝子）等を好ましく用いることができる。
【００３６】
ポリエステル合成酵素遺伝子としては、構造遺伝子のほかに、プロモーター、ターミネーター等、宿主菌で機能する発現ユニットを有していればよい。なお、ポリエステル合成酵素発現プラスミドには、上記発現ユニットが１個以上複数個存在してもよい。
【００３７】
また、本発明の超高分子量ポリエステル生産用のポリエステル合成酵素発現プラスミドには、上記ポリエステル合成酵素遺伝子以外に、さらにβ−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有させることが好ましい。
これら遺伝子を含有させたポリエステル合成酵素発現プラスミドを用いることにより、分子量のより高いポリエステルを生産することができる。
【００３８】
ラルストニア・ユートロファのポリエステル合成系における基質（３ＨＢ）供給系遺伝子である、β−ケトチオラーゼ（ｐｈｂＡ）遺伝子およびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ｐｈｂＢ）遺伝子は、既にクローニングされており、例えばｐＢＳ−ｐｈｂＡＢＲｅ（Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２））から、制限酵素ＢａｍＨＩ断片として切り出すことが可能である。そのｐｈｂＡＢＲｅ断片をｐＪＲＤ２１５誘導体等の同制限酵素部位に挿入できる。
【００３９】
また、大腸菌の脂肪酸代謝系であるβ−酸化経路における律速酵素とされるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｆａｄＥ）遺伝子も既にクローニングされ、その塩基配列も既知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１８４，ｐ３７５９，（２００２）、ＤＤＢＪ  ＡＦ４８６２６５）。従って、ＰＣＲ等でそのプロモーター配列等を含む遺伝子を増幅させ、適当な制限酵素断片として調製し、ｐＪＲＤ２１５誘導体等に挿入できる。
【００４０】
本発明の接合伝達能力の一部または全てを欠失した超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミドは、上記接合伝達能力の一部または全てを欠失したベクターに、上記ポリエステル合成酵素遺伝子を挿入することにより、作製することができる。これにより、得られる発現プラスミドも、接合伝達性の一部または全てを欠失したものとなる。
一例として、Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ断片として調製し、上記ベクターの同制限酵素部位に挿入して、ポリエステル合成酵素発現プラスミドを構築することができる。
【００４１】
当該発現プラスミドの好ましい具体例としては、例えば、ｏｒｉＴ領域およびｃｏｓ領域を欠失させたベクター、ラルストニア・ユートロファ由来のｐｈｂＡＢＲｅ断片、ポリエステル合成酵素遺伝子であるＤ１７１Ｇ変異体遺伝子断片、大腸菌由来のｆａｄＥ遺伝子断片を用いて作製された、ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥ等が挙げられる。
【００４２】
なお、「超高分子量ポリエステル」における「超高分子量」とは、当該ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）が３５０万以上であることを意味する。好ましくは４００万以上２２００万以下、さらに好ましくは４２０万以上２０００万以下である。
当該重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定することができる。
また、ポリエステルとしては、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が好ましい。
【００４３】
＜形質転換体の作製＞
次に、形質転換体の作製について説明する。
本発明の形質転換体は、上記ポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換されたものである。つまり、本発明の形質転換体は、上記で得られたポリエステル合成酵素発現プラスミドを、当該発現プラスミドに適合する宿主中に導入することにより得られる。
【００４４】
宿主としては、特に制限はないが、天然から単離された微生物や、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物等を使用できる。具体的には、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類のポリエステル非生産菌を使用することができる。安全性及び生産性の観点から、好ましくはラルストニア属であり、より好ましくはラルストニア・ユートロファである。
【００４５】
微生物へのポリエステル合成酵素発現プラスミドの導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）や、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））等を用いることができる。
【００４６】
本発明に用いる好ましい形質転換体としては、例えば、宿主としてのラルストニア・ユートロファに、上記ポリエステル合成酵素発現プラスミドを導入した形質転換体等が挙げられる。
具体的には、ラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に、発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥを導入した形質転換体である、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥ（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７６７、受託日平成１６年３月３１日）が挙げられる。なお、この形質転換体は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４７】
＜ポリエステル生産＞
次に、ポリエステルの生産について説明する。
本発明のポリエステルの製造方法は、上記発現プラスミドの形質転換体を用い、下式（１）
【００４８】
【化２】
2005333933.tif 000003
【００４９】
（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる超高分子量の共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造する方法である。
【００５０】
ポリエステルの生産においては、糖、油脂または脂肪酸を炭素源として与え、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、上記形質転換体を培養することができる。
【００５１】
例えば、ラルストニア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属またはシュードモナス属に属する微生物等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地として、微生物が資化し得る炭素源を与え、場合によっては、窒素源、無機塩類および有機栄養源のうちのいずれかを制限した培地、例えば窒素源を０．０１〜０．１％に制限した培地等を用いることができる。
【００５２】
糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００５３】
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
また、培養液中に、発現プラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
その後、得られた該培養菌体からポリエステルを回収すればよい。
【００５４】
本発明において、菌体からのポリエステルの回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収する。
【００５５】
ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。
【００５６】
上記製造方法により得られた、超高分子量の共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは３５０万以上、より好ましくは４００万以上２２００万以下、さらに好ましくは４２０万以上２０００万以下である。
当該重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により測定することができる。
【００５７】
また、上記製造方法により得られた、超高分子量の共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成は、好ましくは１〜２０ｍｏｌ％、より好ましくは２〜１０ｍｏｌ％である。
当該３ＨＨ組成の分析は、例えば、ガスクロマトグラフィー法により行うことができる。
【００５８】
＜接合伝達能の評価＞
次に、接合伝達能の評価について説明する。
作製した発現プラスミドの接合伝達能は、以下の方法で評価することができるが、この方法に限定されるものではない。
【００５９】
まず、評価する発現プラスミドをｔｒａ遺伝子を持つ細菌に形質転換し、これを供与菌とする。ｔｒａ遺伝子を持つ細菌としては、例えば大腸菌Ｓ１７−１株等を用いることができる。受容菌としては、供与菌と共存培養でき、かつ、評価する発現プラスミドがその細胞内で自律複製できる細菌であればどのようなものでも用いることができるが、混合培養後に供与菌と分離できるよう、供与菌とは異なる抗生物質耐性を持つものが望ましい。
【００６０】
次に、供与菌と受容菌それぞれを、あらかじめ適当な培地で培養して増やし、それぞれを混合した後、適当な培地に接種することにより混合培養を行う。
この時用いる培地としては、固体、液体のどちらを用いてもよく、抗生物質は添加しない。混合培養の培養温度は、供与菌、受容菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間には特に制限はないが、５時間から２０時間が好ましい。
【００６１】
接合伝達能の評価は、受容菌あたりの接合伝達頻度を算出することにより行うが、この方法に限定されるものではない。接合伝達頻度の算出方法は、以下の実施例に詳しく記載する。
【発明の効果】
【００６２】
新規ポリエステル合成酵素発現プラスミドによるラルストニア・ユートロファの形質転換体を用いることにより、繊維等への加工特性に優れた超高分子量のポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を、安価な植物油脂等の単一炭素源下での培養においても安全且つ高生産性で生産することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
【００６４】
（参考例１）  ｍｏｂＡ，ｍｏｂＢ遺伝子部分欠失
ベクターｐＪＲＤ２１５を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断することにより、ｍｏｂＡおよびＢ遺伝子の一部分を欠失させた約９．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（宝酒造（株）製）を用いて自己連結させ、ｐＪＲＤｄｍを得た（図１）。当該ベクターｐＪＲＤｄｍは、ｐＪＲＤ２１５の３２１５〜４０７５を欠失させたものである。
【００６５】
（参考例２）  ｃｏｓ領域欠失およびｏｒｉＴ領域欠失
ベクターｐＪＲＤ２１５を制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。これをｐＪＲＤｄｃとする（図２）。当該ｐＪＲＤｄｃは、ｐＪＲＤ２１５の８９１５〜１００５５を欠失させたものである。
【００６６】
次に、ｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号５と配列番号７で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔ（宝酒造（株）製）を用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様にＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断しておいた上記のｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄＴｃを得た（図２）。当該ベクターｐＪＲＤｄＴｃは、ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１６９を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域等（８９１５〜１００５５）を欠失させたものである。
【００６７】
また同様に、ｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号４と配列番号８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、同様にｐＪＲＤｄｃを鋳型として、配列番号５と配列番号９で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られた２断片に重複部分があることを利用して、オーバーラップＰＣＲ法を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。このオーバーラップＰＣＲ法により得られた約２．８ｋｂの断片を制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様に制限酵素ＥｃｏＯ１０９ＩとＡｆｌＩＩＩで切断したｐＪＲＤｄｃと連結させた。これにより、ｐＪＲＤｄｎｃを得た（図２）。当該ベクターｐＪＲＤｄｎｃは、ｐＪＲＤ２１５の３１３２〜３１４５を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域等（８９１５〜１００５５）を欠失させたものである。
【００６８】
（参考例３）  ｐＪＲＤｄｍからｃｏｓ領域欠失およびｍｏｂ遺伝子領域欠失あるいは変異導入
ベクターｐＪＲＤｄｍを制限酵素ＳｐｅＩとＢｇｌＩＩで切断したものを、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、自己連結させた。これをｐＪＲＤｄｃｍとする（図３）。
【００６９】
次に、ｐＪＲＤｄｃｍを鋳型とし、配列番号５と配列番号１０で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｖａｎ９１ＩとＡｆｌＩＩＩで切断し、同様に制限酵素Ｖａｎ９１ＩとＡｆｌＩＩＩで切断したｐＪＲＤｄｃｍに連結し、ベクターｐＪＲＤｄｃｍ４３８０を得た（図３）。
【００７０】
一方、ｐＪＲＤ２１５を鋳型として、配列番号１１と１２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断し、制限酵素ＸｈｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＳＴＶ２８ベクター（宝酒造（株）社製使用）に挿入し、ｐＳＴＶｍｏｂを作成した。次に、ｐＳＴＶｍｏｂ中のＶａｎ９１Ｉサイト３つあるうちの２番目のＶａｎ９１Ｉサイトを欠失するため、ＰＣＲプライマーとして配列番号１３と配列番号１４を用いてｐＳＴＶｍｏｂを増幅した。ポリメラーゼとしてはＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。ＰＣＲ反応後、制限酵素ＤｐｎＩを加え鋳型としたベクターを切断し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換体よりＶａｎ９１Ｉサイトを１つ欠失したｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを得た（図４）。
【００７１】
次に、鋳型としてｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを用い、プライマーとして配列番号１５と配列番号１６を用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。増幅した断片を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断し、Ｖａｎ９１Ｉ処理したｐＪＲＤｄｃｍ４３８０と連結することにより、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３を得た（図４）。当該ベクターｐＪＲＤｄｃｍ１６３は、ｐＪＲＤ２１５の３７３７〜４３７８を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域等（８９１５〜１００５５）を欠失させたものである。
【００７２】
同様に、鋳型としてｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを用い、プライマーとして配列番号１５と配列番号１７を用いてＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔを用いた。増幅した断片を制限酵素Ｖａｎ９１Ｉで切断し、Ｖａｎ９１Ｉ処理したｐＪＲＤｄｃｍ４３８０と連結することにより、ｐＪＲＤｄｃｍＢを得た（図４）。当該ベクターｐＪＲＤｄｃｍＢは、ｐＪＲＤ２１５の４０００〜４３７８を欠失させ、かつ、ｃｏｓ領域等（８９１５〜１００５５）を欠失させたものである。
【００７３】
次に、ｐＪＲＤ２１５（配列番号１）の３３２３のアデニンをチミンに置換するために、すなわちｍｏｂＡ遺伝子の２５番目のアミノ酸残基をチロシンからフェニルアラニンに置換するために、以下の作業を行った。ｐＳＴＶｍｏｂ−ｄｅｌＶａｎを鋳型とし、ＰＣＲプライマーとして配列番号１８と配列番号１９を用いて増幅した。ポリメラーゼとしてはＰｆｕを用いた。ＰＣＲ反応後、制限酵素ＤｐｎＩを加え鋳型としたプラスミドを切断し、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、形質転換体よりｐＳＴＶｍｏｂ２５ＹＦを得た（図５）。ｐＳＴＶｍｏｂ２５ＹＦをＶａｎ９１Ｉ処理して得られた約０．９ｋｂの断片を、Ｖａｎ９１Ｉで切断したｐＪＲＤｄｃに連結し、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを得た（図５）。当該ベクターｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦは、ｐＪＲＤ２１５の３３２３のアデニンをチミンへ置換し、かつ、ｃｏｓ領域等（８９１５〜１００５５）を欠失させたものである。
【００７４】
（参考例４）  ストレプトマイシン耐性遺伝子欠失
ｐＪＲＤ２１５および参考例１〜３で得たベクターｐＪＲＤｄｍ、ｐＪＲＤｄＴｃ、ｐＪＲＤｄｎｃ、ｐＪＲＤｄｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｃｍ２５ＹＦを、制限酵素ＥｃｏＩＣＲＩとＰｓｈＡＩで切断することにより、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ｓｔｒＡおよびｓｔｒＢ遺伝子）のうち約１．５ｋｂを欠失させ、平滑末端となった約８．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを自己連結させ、ベクターｐＪＲＤｄｓ、ｐＪＲＤｄｍｓ、ｐＪＲＤｄＴｃｓ、ｐＪＲＤｄｎｃｓ、ｐＪＲＤｄｓｃｍ１６３、ｐＪＲＤｄｓｃｍＢ、ｐＪＲＤｄｓｃｍ２５ＹＦを得た（図１）。これらは用いたベクターから、さらにｐＪＲＤ２１５の２０６〜１６９０を欠失させたものである。
【００７５】
（参考例５）  ｐＪＲＤｄｍｓからｃｏｓ領域およびマルチクローニングサイト欠失
参考例４で得られたベクターｐＪＲＤｄｍｓを制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断したものを、配列番号２（順鎖）および配列番号３（逆鎖）に示す合成ＤＮＡ配列と連結させた。このことにより、ｃｏｓ配列およびマルチクローニングサイトを含む約０．９ｋｂを、合成ＤＮＡ４５ｂｐと置き換えることにより完全に欠失させ、約７．１ｋｂのベクターｐＪＲＤｄｍｓｃを得た（図１）。
【００７６】
（参考例６）  ｍｏｂ領域およびｏｒｉＴ領域欠失ベクター作製
次に、配列番号２０と配列番号２１で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｂｅｓｔを用いた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、ベクターｐＪＲＤｄｍＴ１およびｐＪＲＤｄｍｓＴ１を得た（図６）。
【００７７】
同様に、配列番号２０と配列番号２２で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、ベクターｐＪＲＤｄｍＴ２およびｐＪＲＤｄｍｓＴ２を得た（図６）。
【００７８】
さらに同様に、配列番号２０と配列番号２３で示されるプライマーを用いてｐＪＲＤ２１５を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、約１ｋｂのＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断した後、同じく制限酵素ＳｆｉＩとＶａｎ９１Ｉで切断したｐＪＲＤｄｍおよびｐＪＲＤｄｍｓとそれぞれ連結し、ベクターｐＪＲＤｄｍＴ３およびｐＪＲＤｄｍｓＴ３を得た（図６）。
【００７９】
（実施例１）  発現プラスミドの構築
超高分子量ポリエステル生産用の発現プラスミドは以下のようにして構築した。参考例２で作製したｐＪＲＤｄＴｃをＥｃｏＲＩで切断し、クローニング部位を付与するため同部位に配列番号２４および２５からなる合成ＤＮＡを挿入し、ｐＪＲＤｄＴｃＥＳを得た。ラルストニア・ユートロファ由来のｐｈｂＡＢＲｅ断片は既にクローニングされており、ｐＢＳ−ｐｈｂＡＢＲｅ（Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２））から制限酵素ＢａｍＨＩ断片として調製した。ｐＪＲＤｄＴｃＥＳのＢａｍＨＩ部位にｐｈｂＡＢＲｅ断片を挿入して、ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢを構築した（図７）。
【００８０】
ポリエステル合成酵素遺伝子であるＤ１７１Ｇ変異体遺伝子断片は、ＰＣＲ法により作成した。Ｄ１７１Ｇ変異はアエロモナス・キャビエ由来ＰＨＡ合成酵素の１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換されている。従って、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているアエロモナス・キャビエ由来の遺伝子断片ＥＥ３２ｄ１３を、一旦ｐＵＣ１９（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしておき、配列番号２６と配列番号２７で示される合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を用いた。制限酵素ＥｃｏＲＩで切断してＤ１７１Ｇ断片を調製し、ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢを同酵素で切断した部位に挿入してｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧを作製した（図７）。
【００８１】
次に、大腸菌ｆａｄＥ遺伝子は、大腸菌Ｋ−１２株の染色体遺伝子を鋳型とし、配列番号２８および２９をプライマーとしてＰＣＲを行ってそのプロモーター領域を含む構造遺伝子の前半部分を増幅させ、さらに配列番号３０および３１をプライマーとしてＰＣＲを行ってその構造遺伝子の後半部分を含む断片を増幅させた。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で１分、（４）６８℃で３分、（２）から（４）を３０サイクル、（５）６８℃で１０分であり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ  ｐｌｕｓ−ポリメラーゼ（東洋紡製）を用いた。その後、それぞれの断片をＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。そこからＮｈｅＩ断片としてｆａｄＥ遺伝子断片を調製し、ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧのＮｈｅＩ部位に挿入して、発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥを完成した（図８）。
【００８２】
（実施例２）  形質転換体の作製
実施例１で作製した発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥを含む、ラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株の形質転換体を、電気パルス法により作製した。つまり、遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現プラスミド２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥを取得した。
この形質転換体（ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７６７、受託日平成１６年３月３１日）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００８３】
（実施例３）  形質転換体の選択
実施例２で得られた形質転換体を、Ｎｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩  ９ｇ、リン酸２水素カリウム  １．５ｇ、塩化アンモニウム  ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩  ０．０２ｇ、フルクトース  ０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩  ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩  １６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩  １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩  ０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩  ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ  ０．５ｍｇ、寒天  １５ｇ／１Ｌ）に播種し、３０℃で１週間培養した。その結果、コロニーが赤変したことから菌体内にポリエステルが蓄積していることを確認し、そのコロニーを選択してポリエステルの生産を行った。
【００８４】
（実施例４）  ポリエステルの生産および精製
種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、５×１０−６ｗ／ｖ％カナマイシンとした。
【００８５】
ポリエステル生産培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％Ｎａ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン製）、５×１０−６ｗ／ｖ％カナマイシンとした。
炭素源は、パーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）−１×（ｈ）−１となるように流加した。
【００８６】
実施例２で得られた形質転換体ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥのグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して、２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製、ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら、２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【００８７】
ポリエステル生産培養は、６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製、ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した結果、１２６．４ｇ／Ｌであった。
【００８８】
得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、菌体内のポリエステル含量を算出した。その結果、形質転換体ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥによるポリエステル含量は、６４時間培養後で７３．６（ｗｔ％）という高含量であった。
【００８９】
（実施例５）  ポリエステルの３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）分析
形質転換体ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥにより生産されたポリエステルの３ＨＨ組成は、以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。
乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに、２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することで、ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、６４時間培養終了時のポリエステルの３ＨＨ組成は２．５（ｍｏｌ％）であった。
【００９０】
（実施例６）  ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）分析
ポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）分析はゲルパーミエーションクロマトグラフィー法により行った。抽出したポリエステル約１５ｍｇを１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、０．２μｍのフィルターで濾過して測定用サンプルとし、その０．０５ｍｌを用いて分析した。測定システムはＳＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）、カラムはＳｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  Ｋ−８０６Ｌ（昭和電工製）を２本直列に接続し、４０℃で測定した。移動層は１．０ｍｌ／分のクロロホルムとし、ＲＩ検出器（ＲＩＤ−１０Ａ、島津製作所製）を用いた。標準品としては同様に処理したポリスチレン（昭和電工製、重量平均分子量：約７００万、約１０７万、１５万、３万）を用い、検量線によりポリエステルの重量平均分子量を算出した。その結果、形質転換体ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥにより生産されたポリエステルの重量平均分子量（Ｍｗ）は、約４２０万と超高分子量であった。
【００９１】
（実施例７）  形質転換体の接合伝達能評価
実施例１に記載した発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥの接合伝達能評価を行った。陽性対照にはベクターｐＪＲＤ２１５を用いた。
これらでそれぞれ形質転換された大腸菌Ｓ１７−１株を供与菌とし、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株を受容菌とした。供与菌、受容菌それぞれをＴＢ培地に植菌し、３７℃で１晩培養した。ＬＢプレート上に滅菌済のニトロセルロースフィルターを載せ、それぞれの培養液、供与菌１０μｌと受容菌１０μｌを混合させ、ニトロセルロースフィルター上に接種した。３７℃で１８時間培養した後、ニトロセルロースフィルターを生理食塩水１ｍｌの入ったチューブに移し、十分懸濁してニトロセルロースフィルター上の菌を浮遊させた。
【００９２】
こうして得られた混合菌の懸濁液を１００〜１０７倍希釈し、カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール（Ｃｍ）２０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート（Ｋｍ＋Ｃｍ）、およびクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌのみを含むＬＢプレートに、それぞれ１００μｌずつプレーティングし、３７℃で１晩培養した。培養後、それぞれの出現コロニー数を数えたところ、表１に示す結果となった。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
大腸菌Ｓ１７−１株はＣｍ感受性かつＫｍ感受性である。一方、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株は、Ｃｍ耐性かつＫｍ感受性である。大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換に用いた発現プラスミドとベクターはＫｍ耐性遺伝子を含むので、発現プラスミドまたはベクターを保持する菌はＫｍ耐性となる。したがって、Ｃｍ２０μｇ／ｍｌのみを含むＬＢプレートでは、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄの総菌数を検出でき、Ｋｍ５０μｇ／ｍｌとＣｍ２０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートでは、発現プラスミドまたはベクターが接合伝達された結果の大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ菌が検出できる。
そこで、受容菌あたりの接合伝達頻度は、細胞懸濁液１００μｌ中に含まれる、接合伝達により発現プラスミドまたはベクターが伝達された大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株数を、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株の総数で割ることにより算出した。以下に実際の算出値を示す。
【００９５】
表１の結果より、発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥがｔｒａ遺伝子と共存した場合の受容菌あたりの接合伝達頻度は、１４／１６２×１０４＝８．６４×１０−６であった。同様に、ｐＪＲＤ２１５の接合伝達頻度を算出すると、１５３×１０１／９１×１０４＝１．６８×１０−３であった。よって、ｐＪＲＤｄＴｃＥＳ＋ｐｈｂＡＢ＋１７１ＤＧ＋ｆａｄＥは、ｐＪＲＤ２１５よりも１／２００倍程度に接合伝達頻度が低下していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
新規ポリエステル合成酵素発現プラスミドによるラルストニア・ユートロファの形質転換体を用いることにより、繊維等への加工特性に優れた超高分子量のポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を、安価な植物油脂等の単一炭素源下での培養においても安全且つ高生産性で生産することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ｍｏｂ領域欠失ベクターおよびストレプトマイシン耐性遺伝子欠失ベクター構築図である。
【図２】ｃｏｓ領域ｏｒｉＴ領域欠失ベクター構築図である。
【図３】ｍｏｂ遺伝子領域部分欠失ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
【図４】ｍｏｂ遺伝子領域部分欠失ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
【図５】ｍｏｂＡ遺伝子変異ｃｏｓ領域欠失ベクター構築図である。
【図６】ｍｏｂ領域およびｏｒｉＴ領域欠失ベクター構築図である。
【図７】超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド構築図である。
【図８】超高分子量ポリエステル生産用発現プラスミド構築図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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