(57)【要約】【課題】  バックグラウンドノイズを抑制できる等温反応におけるテンプレートＤＮＡ分子の増幅法を提供する。【解決手段】  等温増幅可能な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いたテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法であって、高度好熱菌の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を添加して増幅反応を行う。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温増幅可能な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いたテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法であって、
高度好熱菌の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を添加して増幅反応を行うテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法。
【請求項２】
鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが、φ２９ＤＮＡポリメラーゼである請求項１に記載のテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法。
【請求項３】
高度好熱菌がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus ＨＢ８）である請求項１又は２に記載のテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法。
【請求項４】
サーマス・サーモフィラスＳＳＢのタンパク質濃度が０.１〜０.４μｇ／μＬである請求項３に記載のテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等温増幅可能な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いたテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の核酸の指数関数的増幅方法が開発されているが、特にＤＮＡを効率的に増幅する方法としては、概して、反応温度を変動させる熱サイクルを用いるもの、および、反応が等温であるものに分類される。
【０００３】
熱サイクルを用いる方法は，ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ（例えば、非特許文献１）が知られている。ＰＣＲにおいては、標的となるテンプレートＤＮＡ分子の相対する鎖に相補的な塩基配列を有する２つのプライマーを、テンプレートＤＮＡ分子と混合する。そして、テンプレートＤＮＡ分子の変性、プライマーのテンプレートＤＮＡ分子へのアニーリング、及び、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸張（ＤＮＡ複製）を１ラウンドとした通常２０〜３０回のサイクルにより、テンプレートＤＮＡ分子にアニールした２つのプライマーの間に位置するテンプレートＤＮＡ分子の相補鎖の合成が行われる。
この方法では、合成鎖を新たなテンプレートＤＮＡ分子とできるため、同一のプライマーセットを用いた別ラウンドの複製により、テンプレートＤＮＡ分子の指数関数的な増幅が可能となる。
そして、各サイクルでテンプレートＤＮＡ分子を変性するのに必要な高温に耐えるために、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することが必要である。さらに、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は増幅反応が連続的に進行しないので、核酸サンプルであるテンプレートＤＮＡ分子を一連の複数のサイクルに供して行わなければならない。
【０００４】
一方、テンプレートＤＮＡ分子の増幅反応を等温で行う方法として、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、非特許文献２）やローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、非特許文献３）等が知られている。
ＳＤＡ法は、テンプレートＤＮＡ分子に制限酵素でニックを入れ、このニックをもつＤＮＡ断片を順番に置換していくＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ）の作用を用いてＤＮＡを増幅する。一方、ＲＣＡ法は、テンプレートＤＮＡ分子にアニールしたプライマーを基点として合成された伸長鎖の先端で、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼがその前の鎖を置換してハイブリッド形成を行う。そのため、これら方法では標的ＤＮＡ配列の増幅は等温で連続的に行われるため、熱サイクルが不要となる。
このような鎖置換により、等温条件下で連続的にテンプレートＤＮＡ分子の直線的または指数関数的な増幅が可能となる。
従って、例えばＲＣＡ法では、熱サイクルを用いる方法と比べて、テンプレートＤＮＡ分子の増幅過程をより単純にしたため増幅産物の産生量を効率よく増加できる、有効に増幅することができるテンプレートＤＮＡ分子の長さが制限されない、熱サイクルを行う設備が不要となる等の利点を有する。
【０００５】
ここで、テンプレートＤＮＡ分子の増幅反応において、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（single-strand DNA binding protein：以下ＳＳＢと称する）がテンプレートＤＮＡ分子の増幅反応効率等に関与していることが知られている。
【０００６】
ＳＳＢは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対する配列非特異的に親和性が高い。通常、ＤＮＡ複製、組換え、および生物ゲノムの修復にはＳＳＢが必要である。ＳＳＢはその同族ＤＮＡポリメラーゼを特異的に刺激し、ＤＮＡ合成の忠実度を高め、螺旋の不安定化によりＤＮＡポリメラーゼの前進性を改善すると共にＤＮＡポリメラーゼ結合を促進し、複製開始点を組織化および安定化する。つまり、ＳＳＢは複製補助タンパク質として作用することが知られている（特許文献１）。
【０００７】
ＳＳＢは、バクテリオファージから真核生物まで、広く様々な起源から多数のＳＳＢの例が分離されている。例えば、特許文献１には、ビール酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来の複製タンパク質Ａ−１（ｒｐａ−１）、ミトコンドリアタンパク質由来の複製タンパク質（ｒｉｍ−１）、Ｔ７由来の遺伝子２．５タンパク質（ｇｐ２．５）、バクテリオファージφ２９のタンパク質ｐ５（ｐ５）、Ｔ４の遺伝子３２タンパク質（ｇｐ３２）および大腸菌のＳＳＢが開示してある。そして、特許文献１には、テンプレートＤＮＡ分子の増幅効率を改善するためにＳＳＢを等温増幅反応系に添加することが記載してある。
【０００８】
さらに、特許文献２において、テンプレートＤＮＡ分子の鎖置換複製に有用な鎖置換因子として大腸菌由来のＳＳＢが利用されている。つまり、当該鎖置換因子存在下で、鎖置換複製を実行できる鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージ由来φ２９ＤＮＡポリメラーゼ等）によりテンプレートＤＮＡ分子のＲＣＡ増幅を行っている。
【０００９】
これら鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いるテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法は、テンプレートＤＮＡ分子を変性する当該鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換能力に依存している。また、この鎖置換は、複製補助タンパク質や鎖置換因子により促進することができるため、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片を効率よく増幅できる。
【００１０】
【特許文献１】特開平１０−２３４３８９号公報（段落０００７、００１４等参照）
【特許文献２】特表２００２−５２５０７８号公報（段落００５９〜００６２等参照）
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０-１３５４，１９８５
【非特許文献２】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６，１９９２
【非特許文献３】Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５−２３２，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
大腸菌や酵母等由来のＳＳＢを添加して等温増幅反応を行う特許文献１及び２に開示の方法においては、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片が効率よく増幅されるだけでなく、テンプレートＤＮＡ分子に非特異的なＤＮＡ断片も増幅され易いという問題点があった。
この理由の一つとして、等温増幅における温度が通常３０〜６０℃程度であるためプライマーダイマーが形成され易くなり、このプライマーダイマー形成の結果、テンプレートＤＮＡ分子に非特異的なＤＮＡ断片が増幅され易くなるということが考えられる。テンプレートＤＮＡ分子に非特異的なＤＮＡ断片は、増幅産物の精度が低下する要因となり、後の実験に支障を来たすバックグラウンドノイズとなる。
【００１２】
これより、テンプレートＤＮＡ分子の等温増幅方法は、ＰＣＲのように熱サイクルを不要とする等から汎用性の高い技術として期待されているが、上述したバックグラウンドノイズが発生するため、用途が限定される。
【００１３】
従って、本発明の目的は、バックグラウンドノイズを抑制できる等温反応におけるテンプレートＤＮＡ分子の増幅法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するための本発明に係るテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法は等温増幅可能な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いたテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法であって、その第一特徴構成は、高度好熱菌の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を添加して増幅反応を行う点にある。
【００１５】
ＲＣＡ法といったＤＮＡ分子の等温増幅方法においては、ランダムプライマーを使用するため、プライマーダイマーの形成を抑えてバックグラウンドノイズの発生を抑制するのは従来困難であった。
そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、数あるＳＳＢの内、特に高度好熱菌のＳＳＢを等温増幅反応系に添加したところ、後述の実施例１〜２に示したように、テンプレートＤＮＡ分子に特異的な増幅産物が得られ、かつ、バックグラウンドノイズの殆どない、精度の高い増幅産物が得られることが判明した（図１レーン６、図２レーン５等参照）。
【００１６】
ここで、高度好熱菌のＳＳＢは公知ではあるが、本発明のように等温増幅反応系に添加することは従来行われていなかった。さらに、本発明のように等温増幅反応系に添加することで、テンプレートＤＮＡ分子に非特異的なＤＮＡ断片の増幅が抑制されるという優れた効果を奏するという知見は、本発明者らにより初めて認められたものである。
【００１７】
そのため、上記第一特徴構成によるテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法は、用途が限定されることのない、汎用性の高いテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法となる。
【００１８】
本発明に係るテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法の第二特徴構成は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが、φ２９ＤＮＡポリメラーゼであるである点にある。
【００１９】
上記第二特徴構成によれば、入手が容易であると共に取り扱いも容易な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いて等温増幅反応を容易に遂行できるため、好適にバックグラウンドノイズを抑制した増幅産物を得ることができる。
【００２０】
本発明に係るテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法の第三特徴構成は、高度好熱菌がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus ＨＢ８）である点にある。
【００２１】
上記第三特徴構成によれば、入手が容易であると共に取り扱いも容易な高度好熱菌であるため、特別な施設等を必要とせず、等温増幅反応を容易に遂行できるため、好適にバックグラウンドノイズを抑制した増幅産物を得ることができる。
【００２２】
本発明に係るテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法の第四特徴構成は、サーマス・サーモフィラスＳＳＢのタンパク質濃度が０.１〜０.４μｇ／μＬである点にある。
【００２３】
後述の実施例５〜６において、等温増幅反応系において、サーマス・サーモフィラス由来ＳＳＢの望ましい添加量を調べた。
その結果、上記第四特徴構成のように、サーマス・サーモフィラスＳＳＢのタンパク質濃度が０.１〜０.４μｇ／μＬであれば、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片を効率よく得ることができると認められた。
また、上記ＳＳＢの添加量が多いほどテンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片が多く得られる（後述の実施例４参照）が、過剰に添加したＳＳＢが反応効率低下の要因になる虞があること、後の実験に支障を来たす虞やコスト面等を鑑みると上記ＳＳＢの添加上限を０.４μｇ／μＬ程度とするのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法は、等温増幅可能な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いたテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法であり、高度好熱菌の一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を添加して増幅反応を行うことを特徴とする。
【００２５】
鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いるテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法は、テンプレートＤＮＡ分子を変性する当該鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換能力に依存している。また、この鎖置換は、鎖置換因子により促進することができる。
【００２６】
この方法に該当する増幅方法としては、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が好適に例示される。以下に、ＲＣＡ法のテンプレートＤＮＡ分子の等温増幅方法を説明する。
例えば、等温条件下において、テンプレートＤＮＡ分子である環状ＤＮＡにアニールした複数のランダムプライマーを基点にして、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが環状ＤＮＡの相補鎖を伸長する。そして、合成鎖の伸長に伴い、他のランダムプライマーの複製基点に達しても、当該鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性により他の合成鎖を剥がしながら鎖の伸長を継続する（ブランチング）。このとき、剥がされた合成鎖にはランダムプライマーがアニールできる部位が露出する。つまり、環状ＤＮＡだけでなく、この剥がされた合成鎖をもテンプレートＤＮＡ分子として新たなＤＮＡ合成鎖を形成できるため、指数関数的な増幅となる。
このとき、ランダムプライマーは、ランダムヘキサマー等が好適に利用できる。
その他のプライマーの例としては、テンプレートＤＮＡ分子の標的部位に設定温度で特異的にアニールするプライマーを適用できる。このプライマーは、当該プライマー単独、或いは、上記ランダムプライマーと混合した状態で使用することが可能である。
【００２７】
プライマーの設計は、標的となる核酸配列に基づいて所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等により設計されるが、ランダムプライマーの場合、ランダムな配列を有するように設計される。
このように設計されたプライマーは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法を用いて固相合成により化学合成することができ、市販されている自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるプライマーを自動的に合成することも可能である。合成後のプライマーは、必要に応じてＨＰＬＣ等の公知の方法により精製される。
【００２８】
ここで、本発明の等温増幅における「等温」とは、ＰＣＲ法のようにＤＮＡ変性、アニール、鎖伸長の各工程で反応温度を変化させるのに対して、一定温度で制御して増幅反応を行うことを指す。増幅反応を行う一定温度は、好ましくは６０℃未満、より好ましくは４５℃未満、さらに好ましくは３７℃未満である。この温度は、適用する鎖置換ＤＮＡポリメラーゼにより適宜決定する。例えば、後述するバクテリオファージ由来φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、増幅反応を行う好適な温度範囲は２５〜４２℃であり、好ましくは３０〜３７℃、更に好ましくは３０〜３４℃である。
当該一定温度になるように設定したインキュベーター等の恒温チャンバーにおいて、サンプルを、４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、更に好ましくは１５〜２４時間程度インキュベートし、テンプレートＤＮＡ分子の増幅反応を行う。
【００２９】
本発明の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ由来φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第5,198,543号および米国特許第5,001、050号、Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．）が好適に例示されるが、これに限られるものではなく、例えば、Bst大断片のＤＮＡポリメラーゼ（Exo(-)Bst（Aliotta等、Genet. Anal.（オランダ国）12:185〜195（1996年））およびExo(-)BcaDNAポリメラーゼ（WalkerおよびLinn, Clinical Chemistry42:1604〜1608(1996年））、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ８４：２４７ （１９８９））、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：８２８７ （１９８７））、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１９６５−１９７５ （１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５：６２３−６２７ （１９７４））、Ｔ５ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９７：１３−１９ （１９９１））、シーケナーゼ（登録商標）（米国バイオケミカルズ社製）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚｈｕ ａｎｄ Ｉｔｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １２１９：２６７−２７６ （１９９４））およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ ａｎｄ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ５：１４９−１５７ （１９９５））等が挙げられる。
【００３０】
本発明のテンプレートＤＮＡ分子は、環状ＤＮＡが好適に例示されるがこれに限られるものではなく、直鎖状ＤＮＡを用いてもよい。ＲＣＡ増幅方法の場合、増幅効率の点から環状ＤＮＡが好ましい。
テンプレートＤＮＡ分子は一本鎖及び二本鎖が適用可能である。また、天然のＤＮＡとしてプラスミドＤＮＡ・真核及び原核生物のゲノムＤＮＡ、及び、人工的に作成したＤＮＡ分子として、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ・ファージミド・コスミド等の種々のＤＮＡ分子がテンプレートＤＮＡ分子となりうる。さらに、オリゴヌクレオチド等の合成ＤＮＡもテンプレートＤＮＡ分子とすることができる。
【００３１】
本発明の高度好熱菌とは、至適生育温度が例えば摂氏４５〜８０℃の高温下で生育可能な細菌であり、例えば、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus ＨＢ８）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticｕs）等が好適に例示されるがこれに限られるものではない。
【００３２】
一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）は、高度好熱菌より抽出したものを用いる。好ましくは、上述した２つの高度好熱菌のうち何れか一方から抽出する。高度好熱菌以外の、例えば大腸菌由来のＳＳＢは、等温増幅反応後の増幅産物においてテンプレートＤＮＡ分子に非特異的なバックグラウンドノイズが認められるため、適さない。
【００３３】
これら高度好熱菌のＳＳＢは、既知の大腸菌等の宿主・発現ベクター系を利用して、容易に精製することができる。例えば、当該ＳＳＢをコードする遺伝子を公知の方法により導入した発現ベクターにより宿主である大腸菌を形質転換して培養し、当該ＳＳＢを発現させる。そして、宿主の大腸菌を破砕して熱処理を行うことにより、当該ＳＳＢ以外の大腸菌由来タンパク質は熱変性して熱凝集するため、遠心分離等により分離除去できる。これにより熱変性しない当該ＳＳＢを可溶画分として大腸菌由来タンパク質と分離し、親和性クロマトグラフィー等を用いて精製できる。
このとき、当該ＳＳＢは高度好熱菌由来であるため室温で構造が安定しており、さらに有機溶剤に対しても高い安定性を有している。そのため、上記精製工程は室温で行うことが可能である。
尚、宿主細胞は大腸菌に限らず、例えば、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）や昆虫（Ｓｆ９細胞）などの真核生物細胞を利用することが可能である。
また、発現ベクターは、プロモーター配列、高度好熱菌のＳＳＢをコードする遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素サイトを有するマルチクローニングサイト等の配列を含み、かつ、上記宿主細胞で発現できるものであれば、何れの発現ベクターを用いることができる。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーターを利用するのが好ましい。
さらに、この発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。他の公知の塩基配列としては特に限定されず、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、及び、ネオマイシン耐性遺伝子・カナマイシン耐性遺伝子・クロラムフェニコール耐性遺伝子・アンピシリン耐性遺伝子・ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。
このような発現ベクターは、市販の大腸菌用発現ベクター（例えばｐＥＴタンパク質発現システム：ノバジェン社製）を用いることが可能であり、さらに、適宜所望の配列を組み込んだ発現ベクターを作製して使用することが可能である。
【００３４】
高度好熱菌のＳＳＢの等温増幅系に対する添加濃度は、限定されるものではないが、０.１〜０.４μｇ／μＬ程度であれば、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片を効率よく得ることができる。好ましくは０.３〜０.４μｇ／μＬ程度とすれば、テンプレートＤＮＡ分子に非特異的なＤＮＡ断片であるバックグラウンドノイズを抑制した状態で効率よくテンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片を得ることができる濃度となる。
【実施例１】
【００３５】
以下に、図面に基づき、本発明のテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法を説明する。増幅方法は、ＲＣＡ法を例示する。
Templiphi DNA Amplification Kit (アマシャムバイオサイエンス社製)の等温増幅反応系を用いて、以下のサンプル１-１〜１-１４において、鎖置換因子或いは複製補助タンパク質として知られる種々の組換え関連タンパク質（Ｒｅｃ０、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ、Ｔ４  ｇｅｎｅ３２）を何れか１種類添加することによって標的ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した。
【００３６】
サンプル１-１は、ポジティブコントロールとなるコントロール１-１であり、テンプレートＤＮＡ分子として１ｎｇのｐＵＣ１９ＤＮＡを、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとしてφ２９ＤＮＡポリメラーゼを、ランダムプライマーとしてランダムヘキサマーをそれぞれ用い、反応時間を２４時間として製造業者の指示に従ってテンプレートＤＮＡ分子の等温増幅を行った。
サンプル１-２は３μｇの高度好熱菌のThermus thermophilus ＨＢ８（以下Ｔ．ｔｈ．と称する）由来のＲｅｃ０を、
サンプル１-３は、３.０μｇの大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲｅｃＡを、
サンプル１-４は、３.０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡを、
サンプル１-５は、３.０μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢを、
サンプル１-６は、３.０μｇのＴ．ｔｈ．ＳＳＢを、
サンプル１-７は、３.０μｇのＴ４  ｇｅｎｅ３２を、それぞれサンプル１-１の反応系に添加し、反応液を全量が１０μＬになるように調節して増幅反応を行った。
【００３７】
サンプル１-８〜１-１４は、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡを添加しないこと以外はサンプル１-１〜１-７と同様の条件において増幅反応を行った。
【００３８】
増幅反応後、６５℃で１０分間熱変性することによりＲＣＡ反応を停止させ、５μＬの反応液を１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は定法に従って４．５Ｖ/ｃｍで４５分行い、泳動後、エチジウムブロマイド染色を行った結果を図１に示した。図１において、レーン１〜１４は、それぞれサンプル１-１〜１-１４の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００３９】
以上の結果より、コントロール１-１（レーン１）とＴ．ｔｈ．ＳＳＢを添加して増幅反応を行ったサンプル１-６（レーン６）のみ、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅することが判明した。
尚、サンプル１-８（レーン８）、サンプル１-１０〜１-１２（レーン１０〜１２）のようにテンプレートＤＮＡ分子を添加しないで増幅反応を行うことにより認められる増幅産物は、テンプレートＤＮＡ分子に関連しないバックグラウンドノイズである。高度好熱菌のＳＳＢ以外の組換え関連タンパク質を添加したサンプル１-３〜１-５（レーン３〜５）においては、サンプル１-８（レーン８）、サンプル１-１０〜１-１２（レーン１０〜１２）のようにテンプレートＤＮＡ分子を添加しないで増幅反応を行って得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が認められた。これは、例えばプライマーダイマーの形成が原因とされるバックグラウンドノイズであると考えられるため、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片ではない。
従って、高度好熱菌のＳＳＢ以外の組換え関連タンパク質を添加して増幅反応を行ったサンプルでは、テンプレートＤＮＡ分子の増幅阻害が起きていると考えられるが、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを添加して増幅反応を行ったサンプルでは、このような増幅阻害を抑制できるものと考えられる。
【実施例２】
【００４０】
実施例１と同様の反応系を用い、反応時間を１８時間として以下のサンプル２-１〜２-１４においてテンプレートＤＮＡ分子の等温増幅を行った。
サンプル２-１は、コントロール２-１（コントロール１-１と同様）、
サンプル２-２は３.０μｇのＴ．ｔｈ．Ｒｅｃ０を、
サンプル２-３は、３.０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡを、
サンプル２-４は、３.０μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡを、
サンプル２-５は、３.０μｇのＴ．ｔｈ．ＳＳＢを、
サンプル２-６は、３.０μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢを、
サンプル２-７は、３.０μｇのＴ４  ｇｅｎｅ３２を、それぞれサンプル２-１の反応系に添加し、反応液を全量が１０μＬになるように調節して増幅反応を行った。
サンプル２-８〜２-１４は、テンプレートＤＮＡ分子を添加しないこと以外はサンプル２-１〜２-７と同様の条件において増幅反応を行った。
【００４１】
増幅反応後、実施例１と同様の方法で１％アガロース電気泳動を行い、結果を図２に示した。図２において、レーン１〜１４は、それぞれサンプル２-１〜２-１４の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００４２】
以上の結果より、実施例１と同様に、コントロール２-１（レーン１）とＴ．ｔｈ．ＳＳＢを添加して増幅反応を行ったサンプル２-５（レーン５）のみ、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅することが判明した。
尚、サンプル２-３、２-４、２-６（レーン３、４、６）においては、サンプル２-１０、２-１１、２-１３（レーン１０、１１、１３）のようにテンプレートＤＮＡ分子を添加しないで増幅反応を行って得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が認められた。これは、プライマーダイマー等が原因とされるバックグラウンドノイズと考えられるため、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片ではない。
実施例１〜２より、反応時間が変化しても同様の結果が得られたことより、反応時間の変化によりＴ．ｔｈ．ＳＳＢの作用に変化は認められないと考えられる。
【実施例３】
【００４３】
実施例２で使用した等温増幅後のサンプル２-１〜２-１４について、増幅反応液５μＬを供し、制限酵素（EcoRI）処理を行った（サンプル３-１〜３-１４）。制限酵素処理は１０ユニットの制限酵素を使用し、３７℃で２時間反応させた。
【００４４】
制限酵素処理後、制限酵素処理液５μＬを１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は、実施例１と同様の方法により行った。結果を図３に示した。図３において、レーン１〜１４は、それぞれサンプル３-１〜３-１４の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００４５】
この結果、サンプル３-１、３-３〜３-６において、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が含まれていると認められた（レーン１、３〜６参照）。
しかし、サンプル３-３（Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ）においては、テンプレートＤＮＡ分子を添加しないで増幅反応を行ったサンプル３-１０（Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ）の結果より、増幅反応によりテンプレートＤＮＡ分子に非特異的なＤＮＡ断片が含まれることが確認された。
さらに、図３におけるレーン３（サンプル３-３）のアガロースゲルのウェルには、制限酵素EcoRIで切断されないＤＮＡ分子が確認された。これは、テンプレートＤＮＡ分子に対して非特異的な増幅が行われた結果生じたＤＮＡ断片であると考えられる。
尚、サンプル３-４（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ）、３-６（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ）においても同様である。
【００４６】
以上の結果より、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを添加したサンプルのみがテンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制できることが判明した。（サンプル３-５、３-１２参照）。
【実施例４】
【００４７】
等温増幅反応系において、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢの添加量が増幅産物量に及ぼす影響を調べた（サンプル４-１〜４-７）。
サンプル４-１は、実施例１で用いたサンプル１-１と同様とした。
サンプル４-２は３.０μｇ（０.３μｇ／μＬ）、サンプル４-３は１.５μｇ（０.１５μｇ／μＬ）、サンプル４-４は０.８μｇ（０.０８μｇ／μＬ）、サンプル４-５は０.４μｇ（０.０４μｇ／μＬ）、サンプル４-６は０.２μｇ（０.０２μｇ／μＬ）のＴ．ｔｈ．ＳＳＢをそれぞれサンプル１-１の反応系に添加し、サンプル４-７はＴ．ｔｈ．ＳＳＢ可溶化液のみ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  ＫＣｌ、１.０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロール：Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ無し）をサンプル１-１の反応系に添加し、それぞれ反応液の全量が１０μＬになるように調節して増幅反応を行った。増幅反応は、実施例１に準じて行った。
【００４８】
増幅反応後、反応液５μＬを１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は、実施例１と同様の方法により行った。結果を図４（ａ）に示した。図４（ａ）において、レーン１〜７は、それぞれサンプル４-１〜４-７の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００４９】
等温増幅後のサンプル４-１〜４-７について、制限酵素（EcoRI）処理を行った（サンプル４-８〜４-１４）。反応液の組成は、実施例３の制限酵素処理で示したものと同様とした。
制限酵素処理後、制限酵素処理液５μＬを１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は、実施例１と同様の方法により行った。結果を図４（ｂ）に示した。図４（ｂ）において、レーン８〜１４は、それぞれサンプル４-８〜４-１４の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００５０】
以上の結果より、増幅反応系に０.０２〜０.３μｇ／μＬのＴ．ｔｈ．ＳＳＢを添加したところ、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢの添加量が多い程、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が多くなり、増幅効率が向上することが判明した。
【実施例５】
【００５１】
等温増幅反応系において、望ましいＴ．ｔｈ．ＳＳＢの添加量を調べた（サンプル５-１〜５-１６）。
サンプル５-１は、実施例１で用いたサンプル１-１と同様とした。
サンプル５-２は１.０μｇ（０.１μｇ／μＬ）、サンプル５-３は２.０μｇ（０.２μｇ／μＬ）、サンプル５-４は３.０μｇ（０.３μｇ／μＬ）、サンプル５-５は４.０μｇ（０.４μｇ／μＬ）のＴ．ｔｈ．ＳＳＢをそれぞれ添加し、サンプル５-６はＴ．ｔｈ．ＳＳＢ可溶化液のみ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  ＫＣｌ、１.０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロール：Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ無し）をサンプル１-１の反応系に添加し、それぞれ反応液の全量が１０μＬになるように調節して増幅反応を行った。
サンプル５-７〜５-１２は、テンプレートＤＮＡ分子を添加しないこと以外はサンプル５-１〜５-６と同様の条件において増幅反応を行ったものである。
増幅反応は、増幅時間を１８時間としたこと以外は実施例１に準じて行った。
【００５２】
さらに、サンプル５-１３〜５-１６は、増幅時間を１４時間としたこと以外はサンプル５-１、５-４、５-７、５-１０とそれぞれ同様の条件において増幅反応を行ったものである。
【００５３】
増幅反応後、反応液８μＬを１.２％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は、実施例１と同様の方法により行った。結果を図５（ａ）〜（ｂ）に示した。図５（ａ）〜（ｂ）において、レーン１〜１６は、それぞれサンプル５-１〜５-１６の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００５４】
以上の結果より、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを０.１〜０.４μｇ／μＬ添加することにより、サンプル５-２〜５-５（図５（ａ）レーン２〜５参照）には、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片を効率よく増幅できることが認められた。
ここで、実施例３に記載したように、電気泳動の結果、アガロースゲルのウェルにＤＮＡ分子が確認されることがあるが、これは、テンプレートＤＮＡ分子に対して非特異的な増幅が行われた結果、生じたＤＮＡ断片であると考えられる。
上述したように、本発明は、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを添加することによりテンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制できるが、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを０.３〜０.４μｇ／μＬ添加し、かつ、テンプレートＤＮＡ分子を添加しないサンプル５-１０〜５-１１（図５（ａ）レーン１０〜１１参照）では、アガロースゲルのウェルにＤＮＡ分子が殆ど確認されない。このため、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを好ましくは０.３〜０.４μｇ／μＬ添加することにより、バックグラウンドノイズを更に抑制した状態でテンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が得られることが判明した。
【００５５】
また、図５（ｂ）の結果より、サンプル５-１、５-４、５-７、５-１０に関して増幅反応時間が変化してもほぼ同様の結果が得られていることにより、反応時間の変化によりＴ．ｔｈ．ＳＳＢの作用に変化は認められないと考えられる。
【実施例６】
【００５６】
サザンハイブリダイゼーションにより実施例５における増幅ＤＮＡ断片の特異性の確認を行った。
実施例５におけるサンプル５-１〜５-７、５-１０の増幅反応液１.５μＬをナイロンメンブレン（バイオダインＢメンブレン：日本ポール社製）にスポットし、それぞれサンプル６-１〜６-７とした。
プローブは、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製）を用いて１００ｎｇのｐＵＣ１９ＤＮＡを３２Ｐ標識したものを用いた。ハイブリダイゼーションは、２ｘ Prehybridization/Hybridization Solution (GibcoBRL社製)を用い、増幅反応液をスポットした前記メンブレンと標識化プローブとを接触させ、製造業者の指示に従ってハイブリダイゼーション反応を行った。
反応後、０.１ｘＳＳＣ、０.５％ＳＤＳの洗浄液を用いて６８℃で３０分間の洗浄を２回行った。次に、イメージアナライザーＢＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて製造業者の指示に従いシグナルを検出することにより解析を行った。サザンハイブリダイゼーションの結果を図６（ａ）に、シグナル強度測定結果を図６（ｂ）に示した。
【００５７】
図６（ａ）の結果より、テンプレートＤＮＡ分子無添加のサンプル６-７及び６-８からはシグナルは検出されない。また、テンプレートＤＮＡ分子を添加し、かつ、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを添加したサンプル６-２〜６-５のシグナルは、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ無添加のサンプル６-１及び６-６に比べて、テンプレートＤＮＡ分子であるｐＵＣ１９ＤＮＡの量が増大していると認められるため、増幅効率が向上するものと認められた。
特に、シグナル強度を測定した図６（ｂ）の結果より、サンプル６-４〜６-５（Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ濃度０.３〜０.４μｇ／μＬ）のシグナルは、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ無添加のサンプル６-１及び６-６のシグナルに比べてシグナル強度が２倍程度であることが判明した。そのため、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ濃度が０.３〜０.４μｇ／μＬの範囲であれば、バックグラウンドノイズを極力抑制した状態で、増幅効率を向上できると認められた。これにより、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ添加濃度の最適化ができた。
【実施例７】
【００５８】
実施例２におけるＴ．ｔｈ．ＳＳＢ添加サンプル２-５を用い、更に詳細な反応時間の検討を行った（サンプル７-１〜７-３）。等温増幅反応時間は、サンプル７-１を１５時間、サンプル７-２を１７時間、サンプル７-３を２１時間とした。等温増幅反応時間以外の条件は実施例１と同様とした。
増幅反応後、実施例１と同様の方法で１％アガロース電気泳動を行い、結果を図７（ａ）に示した。図７（ａ）において、レーン１〜３は、それぞれサンプル７-１〜７-３の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００５９】
実施例４におけるＴ．ｔｈ．ＳＳＢ不添加サンプル４-７を用い、更に詳細な反応時間の検討を行った（サンプル７-４〜７-６）。等温増幅反応時間は、サンプル７-４を１５時間、サンプル７-５を１７時間、サンプル７-６を２１時間とした。等温増幅反応時間以外の条件は実施例１と同様とした。
増幅反応後、実施例１と同様の方法で１％アガロース電気泳動を行い、結果を図７（ｂ）に示した。図７（ｂ）において、レーン４〜６は、それぞれサンプル７-４〜７-６の反応液を電気泳動したものに対応する。
【００６０】
以上の結果より、反応時間が変化してもほぼ同程度のテンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片が得られていることにより、反応時間の変化によりＴ．ｔｈ．ＳＳＢの作用に変化は認められないと考えられる。
ここで、図７（ｂ）（Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢ不添加サンプル）には、アガロースゲルのウェルにＤＮＡ分子が確認された。これは、テンプレートＤＮＡ分子に対して非特異的な増幅が行われた結果生じたＤＮＡ断片であると考えられる。
一方、図７（ａ）には、このようなＤＮＡ分子はアガロースゲルのウェルにおいて殆ど確認されない。これは、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢを等温増幅反応系に添加することにより、鎖置換が好適に行われてＤＮＡポリメラーゼの鎖伸長作用の阻害が生じ難くなり、テンプレートＤＮＡ分子に対して特異的なＤＮＡ断片の増幅が促進されたためであると考えられる。
【００６１】
本発明のテンプレートＤＮＡ分子の増幅方法は、テンプレートＤＮＡ分子に対して特異的なＤＮＡ断片の増幅ができると共に、バックグラウンドノイズを抑制できる方法であるため、一般的な分子生物学の方法、例えば、遺伝子型分析のために、環境中より採収した微量の微生物から抽出した少量の試料から大量のＤＮＡを調製する有用な方法として、或いは、ＤＮＡシークエンシングのためのＤＮＡの調製方法として、有用である。さらに、動物或いは植物細胞から抽出した少量の試料からＤＮＡチップ固定用ＤＮＡを調製する等、種々の用途に適用できる汎用性の高いＤＮＡの調製方法となる。
〔別実施の形態〕
【００６２】
上述した実施形態では、等温増幅系としてＲＣＡ法に高度好熱菌のＳＳＢを添加した例を示したが、これに限られるものではなく、例えば鎖置換増幅（ＳＤＡ）法に高度好熱菌のＳＳＢを添加することが可能である。
この場合、図４に示したように、当該ＳＳＢの添加量が多い程、テンプレートＤＮＡ分子に特異的なＤＮＡ断片が多くなり、増幅効率が向上することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】鎖置換因子として知られる種々のタンパク質を何れか１種類添加することによって等温増幅反応を２４時間行い、目的のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した図
【図２】鎖置換因子として知られる種々のタンパク質を何れか１種類添加することによって等温増幅反応を１８時間行い、目的のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した図
【図３】実施例２で使用したサンプルを制限酵素処理し、電気泳動を行った図
【図４】等温増幅反応において、Ｔ．ｔｈ．ＳＳＢの添加量が与える影響を調べた図
【図５】望ましいＴ．ｔｈ．ＳＳＢの添加量を調べた図
【図６】サザンハイブリダイゼーションにより実施例５における増幅ＤＮＡ断片の特異性の確認を行った図  （ａ）サザンハイブリダイゼーションの結果  （ｂ）シグナル強度測定結果
【図７】等温増幅反応において、詳細な反応時間の検討を行った図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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