(57)【要約】【課題】使用に際して負荷がなく、長期に渡って食品として安全に摂取することができる組成物により、I型アレルギーの原因となるアレルゲン特異IgEの産生を効果的に抑制すること。あるいはアレルゲン特異IgEの産生を効果的に抑制する方法を提供することを課題とする。【解決手段】乳清タンパク質分離物（WPI）加水分解物と発酵乳および／またはフレッシュチーズからなる組成物を組成物自身あるいは他の食品との混合物として摂取することによりアレルゲン特異IgEの産生を効果的に抑制することが可能となった。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳清タンパク質加水分解物と発酵乳および／又はフレッシュチーズを含有することを特徴とするIgE産生抑制組成物。
【請求項２】
乳清タンパク質が乳清タンパク質分離物（WPI）である請求項１に記載のIgE産生抑制組成物。  
【請求項３】
酵素がトリプシン、アルカラーゼ［登録商標］、ニュートラーゼ［登録商標］から選ばれる少なくとも一つである請求項１から２に記載のIgE産生抑制組成物。  
【請求項４】
発酵乳がLactobacillus bulgaricusとStreptococcus thermophilusをスターターとする乳酸発酵により作られたものであり、フレッシュチーズがクワルクである請求項１から３に記載のIgE産生抑制組成物。
【請求項５】
乳清タンパク質加水分解物が分子量１万の限外濾過膜透過物である請求項１から４に記載のIgE産生抑制組成物。
【請求項６】
請求項１から５に記載のIgE産生抑制組成物を含有することを特徴とし、アレルギーを改善するものである旨の表示を付した飲食品。
【請求項７】
請求項１から５に記載の組成物もしくは該組成物を含む飲食物を食品として摂取することを特徴とする、IgE産生抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IgE産生抑制作用を有し、アレルギー症状を改善することができる乳タンパク質分解物と発酵乳および／又はフレッシュチーズからなる組成物およびそれらを用いたIgE産生抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
通常は無害である食品中や生活環境中に存在するタンパク質（抗原）に応答してIgE抗体を産生した個体が同じ抗原に曝されるとこれらの抗原（以下アレルゲン）に対する特異IgEを介したアレルギー反応が起こる場合がある。近年、このアレルゲン特異IgEを介したアレルギー反応（I型アレルギー反応）によりアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、気管支喘息などのアレルギー症状に悩む人々が年々増加傾向にある。そこで、これらの症状を軽減するためにI型アレルギーの原因となるアレルゲン特異IgEの産生を抑制する方法について多くの検討が行われている。
【０００３】
アレルギーは生活環境の変動や季節等の変動により長期的、継続的に現れる疾患であるため先のアレルゲン特異IgEを抑制する方法はその方法を長期的に行ったとしても使用に際しての負荷が少なくまた安全性も高い方法がより望ましい。そのような意味で食品として摂取することでアレルゲン特異IgEを抑制できる組成物を提供できれば使用に際しての負荷もほとんどなく且つ安全性も高いIgE産生抑制用組成物として理想的なものとなる。
【０００４】
同様の観点から従来より食品としても摂取可能なIgE産生抑制剤として例えばグルコマンナンを含有するものや（特許文献１）やカテキン類やフラボン類からなるものが（特許文献２）既に報告されている。また剤としてのみ用いるが原料が食品由来のものとしてシソ科植物からの抽出物を用いたもの（特許文献３）や乳酸菌の菌体を用いたもの（例えば特許文献４）等が報告されている。またIgE産生を積極的に抑制する訳ではないがIgE抗体の産生を刺激する抗原はタンパク質としてある程度の分子量が必要な為、例えば乳製品中のタンパク質を加水分解し、低分子量として抗原性を低下させることで結果としてアレルゲン性を低下させた食品を提供する方法が既に報告されている。（例えば特許文献５ ）これらタンパク質を低分子化した先行文献中には「抗アレルギー性効果」や「抗アレルギー剤」との記載が認められるが、この場合の「抗アレルギー」とは記載された組成物がIgE産生のトリガーとはなりにくいという予防的な見地からの「抗アレルギー」であり「低アレルギー」と読み替えた方が良い内容のものである。つまりこの方法はアレルゲンとの接触を避けることでその結果アレルギーを抑制するものであって、本質的にアレルギーを抑制したものでは無いので例えばアレルゲン特異IgEが産生される系にそれらの組成物を添加することでアレルゲン特異IgEの産生が抑制されるという結果を示したものではない。
【０００５】
本発明者らは従来より乳清タンパク質加水分解物と発酵乳由来のタンパク質を含む栄養組成物にTNFαなどの炎症性サイトカインの産生抑制作用があることを見出し、それにレシチンやパラチノースを組み合わせることで主に肝疾患患者の栄養管理に有用な栄養組成物について報告している。（特許文献６）これは脂質代謝改善作用のあるレシチンとインスリン節約作用のあるパラチノースを組み合わせることで比較的重篤な病態患者に対して有用な作用を示す栄養組成物としての使用を想定したものであり、アレルギー疾患に乳清タンパク質加水分解物と発酵乳由来タンパク質からなる組成物が有効性を示すことを提示したものではなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開2003-055233号公報
【特許文献２】特開2003-002811号公報
【特許文献３】特開2003-286182号公報
【特許文献４】特開平09-002959号公報
【特許文献５】特開平05-017368号公報
【特許文献６】特開2004-995631号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、通常の食品に用いられており、使用に当たっての負荷がなく長期に渡る使用にも安全性になんらの問題がない組成物を用いてI 型アレルギーの原因物質であるアレルゲン特異IgEの産生を抑制することができる組成物の提供およびアレルゲン特異IgEの産生を抑制する方法の提供を目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは先の目的を達成すべく食物アレルゲンである卵白アルブミン（以下OVA）を接種したマウスに対する各種組成物について検討を加えた結果、乳清タンパク質加水分解物と発酵乳および／又はフレッシュチーズからなる組成物を加えた飼料を摂取させたマウスはその血中におけるOVA特異IgE、総IgEの量が本願組成物を加えていない飼料を摂取させたマウスに比べて明確に抑制されていることを確認し、本発明を完成させた。
【０００９】
その抑制の程度は乳清タンパク質加水分解物単独でも有意なものであったが発酵乳及び／またはフレッシュチーズを組み合わせた場合に、より抑制されたものとなった。得られたデータから効果の主体は乳清タンパク質加水分解物にあるものと考えられたがその効果が食品として摂取した場合の味や風味を調整することができる発酵乳やフレッシュチーズを組み合わせることで効果的に増強されるという事実を見出したことは本発明の目的に合致しており本発明の完成度をさらに高めることとなった。
【００１０】
本発明の乳清タンパク質加水分解物の原料タンパク質としては、乳清タンパク質分離物（WPI）を挙げることができるがWPI中の代表的なタンパク質であるα-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリン、ラクトフェリン等を単独であるいは組み合わせて用いることもできる。これらのタンパク質を加水分解する際に用いられる酵素はトリプシン、アルカラーゼ［登録商標］、ニュートラーゼ［登録商標］から選ばれる少なくとも一つから選んで用いることができる。用いる酵素によってあるいは原料タンパク質やその配合割合によって、各タンパク質から切り出される加水分解物は当然異なってくるがこれまでの検討から先の３種類の酵素を用いて得られた加水分解物はいずれも後述するアレルゲン特異IgEの産生を抑制する効果を示した。
【００１１】
先の効果の主体は明かとなっていないが加水分解物中に含まれる各種のペプチドにアレルゲン特異IgEの産生を抑制する作用があるものと考えられる。しかしながら、本発明の実施態様においてはそれらのペプチドを単離する必要はなく、発酵乳等と組み合わせることで分解物の状態で効果的にIgE産生抑制作用を示すことができる。今回の検討にあたり、これらの分解物は分画分子量が１万である限外濾過膜を通過する画分（パーミュエイト）を用いて評価した。
【００１２】
本発明に用いるフレッシュチーズとしてはクリームチーズ、カッテージ、フレッシュモッツアレラ、マスカルポーネ、クワルク等を挙げることができる。中でもクワルクは脂肪含量が他のフレッシュチーズに比べて少ないため取り扱い易く本発明に特に好適に用いることができる。またここで用いているクワルクはLactbacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilusを用いて製造される通常のクワルクを用いることができる。
【００１３】
本発明に用いる発酵乳としてはLactbacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilusをスターターとして用いる発酵乳を用いることができる。また他の乳酸菌を用いて製造された発酵乳も本発明の乳清タンパク質分解物と用いることで乳清タンパク質分解物単独の場合に比べてIgE産生をより効果的に抑制できるという結果を与える発酵乳であれば本発明に用いることができる。重要なことは、発酵乳あるいはフレッシュチーズというそれ自身が日常的に摂取することが普通に行われている食品であり、また組成物の食品としての性状を整えることができる食品を組み合わせた結果、乳清タンパク質加水分解物のアレルゲン特異IgE産生抑制作用という有用な作用を分解物を単独に用いた場合に比べて効果的に増強することができるという事実を見出したことである。このことによりアレルゲン特異IgEを抑制する組成物として、本発明の目的である使用に当たっての負荷がなく、且つ長期に渡って摂取しても安全性になんらの問題がない組成物を提供するという課題を理想的な形で実現することができたのである。
【００１４】
本発明の乳清タンパク質分解物と発酵乳および／またはフレッシュチーズからなる組成物は通常の食品と同様に調製することができる。ただし乳清タンパク質分解物の配合割合はその効果と乳清タンパク質分解物には独特の苦みがあるため、添加対象食品の食品としての風味のバランス、摂取可能量を考慮して決定する必要がある。
【００１５】
例えば組成物そのものを発酵乳として摂取することも可能であるがその場合、発酵乳100ｇあたりに含まれる乳清タンパク質分解物の添加量は味や発酵乳製造への影響を考慮すると上限値が３％（wt%）程度となる。本発明品の効果を考慮した分解物量の１日あたりの摂取量は1gから10g程度が適当量であるので２％程度の添加量とした場合、アレルゲン特異IgE産生抑制を目的とした一日に摂取すべき発酵乳の量は50gから500g程度となる。先の上限添加量は分解物の味をマスキングする効果のある各種フレーバーや他の食品の添加等によりさらに上げることも可能である。例えば、ゴマ味は分解物の苦みをマスキングする効果があり、グレープフルーツ味は苦みをグレープフルーツ風味の一部に置換する効果がある。
【００１６】
本発明組成物としての発酵乳の製造に当たっては原料の乳や脱脂乳中に分解物を予め添加しておき後は公知の発酵乳の製造法を用いて製造した発酵乳を用いれば良い。あるいは、分解物を別途殺菌処理しておき、香料等の添加物を加えるタイミングで発酵乳に添加しても良い。乳酸菌飲料等の場合には発酵乳と同様の方法で予め分解物を添加した脱脂乳を用いても良いが、発酵後、クエン酸や酒石酸を添加し、生じたカードを破砕、均質化した段階で予め殺菌しておいた果汁や香料等の添加物を加える際に分解物を添加する方が調製し易い。クワルク等のフレッシュチーズに分解物を添加する場合も、通常のクワルクの調製工程に後述する発酵乳の場合を参考に分解物を添加すればよい。あるいは別途殺菌処理した分解物を後から添加しても良い。
【発明の効果】
【００１７】
以上述べたように、本発明は使用に当たっての負荷がなく、長期的に用いても安全であり食品としてきわめて自然に摂取することができる組成物により、アレルゲン特異IgEの産生を効果的に抑制するという従来ない特性を有する組成物とそれ自身あるいは他の食品に該組成物を添加した飲食品を摂取することによりアレルゲン特異IgEの産生を抑制する方法を提供するという効果を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明法を実施例を元にさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
（実施例１）
乳清タンパク質加水分解物の調製
WPI（タンパク質含量90%、ダビスコ社製）、β-Lg（β-Lg含量90 %、ダビスコ社製）、α-La(α-La含量90%、ダビスコ社製)、ウシラクトフェリン(タツア社製)をリン酸緩衝液に100mg/mlの濃度で溶解した。対照として、カゼインナトリウム（純度95%以上、和光純薬）を同濃度でリン酸緩衝液に溶解した。タンパク1 g当たりトリプシン（ブタ膵臓由来、活性：25 USPキモトリプシンUnits/mg以下、和光純薬）50 mgを添加し、37℃で6時間反応させた。反応後、20,000×g、10分間遠心して不溶性成分を沈殿除去した後、分画分子量10,000のUF膜処理（ミリポア社ウルトラフリー-MC）した。透過画分（パーミエイト）は0.22μmのMF膜（ミリポア社マイレックス-GV）処理後タンパク質含量８０%以上、平均分子量（MN）990の分離物として比較試験に供した。また、アルカラーゼ［登録商標］（ノボザイムズとニュートラーゼ［登録商標］（ノボザイムズ）を用いた分解物（以下A/N分解物と記載）の調製はタンパク質1ｇに対してアルカラーゼ［登録商標］10mgとニュートラーゼ［登録商標］20mgの割合で酵素を添加し、特表平11-509727に記載された方法で乳清タンパク質加水分解物を調製し、タンパク質含量８０％以上、平均分子量(MN)1000の分離物（A/N分解物）として比較試験に供した。
【００２０】
（実施例２）
乳清タンパク質分解物含有発酵乳の調製
L. bulgaricus JCM 1002T、S. thermophilus ATCC 19258をそれぞれ１０%脱脂粉乳培地に１％宛て接種し、３７℃で１５時間培養してバルクスターターを調製した。WPIトリプシン分解物２．０％、牛乳８０％、脱脂粉乳２％、水１４．０％を調合し、６５℃で１５０kg/cm2の圧力で均質化した。このミックスを９５℃、５分間殺菌後、４０℃まで冷却し、各バルクスターターを１％宛て接種した後、滅菌済みの容器に無菌充填した。４０℃で４時間発酵させ、発酵終了後は５℃で冷却を行ない乳清タンパク質分解物含有発酵乳を調製した。A/N分解物の取り扱いもトリプシン分解物と同様に行った。
【００２１】
以下に本発明組成物のIgE産生抑制作用について試験した結果を示す。
【００２２】
［試験例１］  
WPIトリプシン分解物とクワルクからなる組成物の摂取によるOVA特異IgE及び総IgE産生抑制作用の検討及び各分解物単独のOVA特異IgE及び総IgE産生抑制作用の検討。
実験動物は3週齡BALB/cマウスを日本SLC（株）より購入し、1群8匹で6群に体重で群分けした。飼育開始後７日目と21日目にマウス1匹当たり水酸化アルミニウム(PIERCE)4mgとEgg Albumin(生化学工業)10μgを混合した溶液を皮下に投与した。その後31日目まで飼育した。水と飼料は自由摂取とした。最終日に眼窩採血を行い、血中のOVA特異IgE、総IgEをELISA法にて測定した。実験群及び飼料組成は表1に示した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
最終日の血中OVA特異IgE及び総IgEを測定した結果を図1、2に示した。この結果から、乳清タンパク質トリプシン分解物及びA/N分解物にOVA特異IgE及び総IgE産生を抑制する効果が明らかになった。また、乳清タンパク質トリプシン分解物にクワルクを加える事により、分解物単独よりも顕著なOVA特異IgE産生抑制効果が得られた。
OVA特異IgEの測定は以下の通り行った。
Falcon社製ELISAプレートを10μg/mlの濃度で0.15M PBS(pH7.4)に溶解した1次抗体(ラット抗マウスIgEモノクローナル抗体（ヤマサ製No.7627）)でコーテイングした。1.5%ゼラチンを加えた0.15M PBS(pH7.4)でブロッキングした後、0.15M PBS(pH7.4)-0.05%  Tween20で希釈した血清を100μlずつ加え、4℃で一晩処理した。翌日、0.1μg/mlに希釈したビオチン標識OVA(自家調製)を100μl加え、室温で２時間反応し、0.15M PBS(pH7.4)-0.05%Tween20で3000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ-Streptavidin (ZYMED社：43-4322)100μl加え、室温、遮光で２時間反応した。4-ニトロフェニルリン酸（東京化成工業：NO241）をジエタノールアミンBufferで1mg/mlに溶解し、100μl 加え、遮光して30分間室温で発色した。5N-NaOHを25μl 加え反応を停止し、405nmと495nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。
Total IgE のELISA法は以下の通り行った。上記と同様の方法でラット抗マウスIgE プレートを作成し、0.15M PBS(pH7.4)-0.05%Tweenで希釈した血清及びstandard(生化学270710:モノクローナルマウスIgE Anti-DNP)を100μlずつ加え、室温で2hr処理した。1000倍希釈したパーオキシダーゼ標識モノクローナル抗マウスIgE抗体(明治乳業:500-70X)を100μl加え、室温で２時間反応後、TMB基質液を100μl添加し、室温、遮光で20分反応し発色した。O.1M 硫酸100μlで反応を停止し、450nm-550nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。
【００２５】
［試験例２］
WPIトリプシン分解物とヨーグルトからなる組成物の摂取によるOVA特異IgE及び総IgE産生抑制作用の検討。
【００２６】
実験動物は3週齡BALB/cマウスを日本SLC（株）より購入し、1群7匹で4群に体重で群分けした。飼育開始後9日目と21日目に水酸化アルミニウム(PIERCE)4mgとEgg Albumin(生化学工業)10μgを混合した溶液を皮下に投与した。その後、32日目まで飼育した。水と飼料は自由摂取とした。最終日に眼窩採血を行い、試験例１同様ELISA法により血中のOVA特異IgE、総IgEを測定した。実験群及び飼料組成は表２の通りである。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実験期間中の体重増加、飼料の摂取量には群間に有意差は認められなかった。総IgEの継時的変化を図3に示した。OVA投与後に総IgE値は増加し始め、1回目よりも、2回目以降に飼料の違いが顕著に認められた。最終日の総IgE値はカゼイン群に比べ、ヨーグルト単独で低下傾向を示し、ヨーグルト＋分解物で有意に低い値を示した。最終日のOVA特異IgE産生の結果を図4に示した。OVA特異IgE値も総IgE値同様の傾向を示したが特にヨーグルト（発酵有）＋分解物で有意に低い値を示した。以上のようにヨーグルト単独でも総IgE、OVA特異IgEともに産生が抑制される傾向が認められたが、乳清タンパク質分解物を同時に添加すると有意な総IgE、OVA特異IgE産生抑制作用を示した。
［試験例３］
WPIのA/N分解物とクワルクからなる組成物の摂取によるOVA特異IgE産生抑制作用の検討
【００２９】
実験動物は３週齢BALB/cマウスを日本SLC（株）より購入し、１群６匹で３群に体重で群分けした。飼育開始日と１４日目にマウス１匹あたり水酸化アルミニウム(PIERCE)4mgとEgg Albumin（生化学工業）10μgを混合した溶液を皮下に投与した。その後２８日目まで飼育した。水と試料は自由摂取とした。最終日に眼窩採血を行い、血中のOVA特異IgEを試験例１と同様にELISA法にて測定した。実験群及び試料組成は表３に示した。
【００３０】
【表３】
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【００３１】
最終日の血中OVA特異IgEを測定した結果を図5に示した。これまでに試験例１でWPIのA/N分解物について、OVA特異IgE産生抑制効果があることはすでに示した。今回は新たにWPIのA/N分解物とクワルクを同時に摂取した場合の効果について検討した。カゼインに対し、タンパク質を全量クワルク由来に変えた場合にOVA特異IgE産生抑制効果が認められたが、クワルク量を半分にして、A/N分解物を添加した場合に最も顕著なOVA特異IgE産生抑制効果が得られた。A/N分解物とクワルクを同時に含有することが最もIgE産生抑制に効果的であった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】WPIトリプシン分解物とクワルクからなる組成物の摂取によるOVA特異IgE産生抑制作用を検討した結果を示す図である。平均±SE(＊＊：ｐ＜0.01、＊：ｐ＜0.05、検定法：Mann-Whitney検定)
【図２】WPIトリプシン分解物とクワルクからなる組成物の摂取による総IgE産生抑制作用を検討した結果を示す図である。平均±SE（異なる文字間に有意差があることを示す：ｐ＜0.05)
【図３】WPIトリプシン分解物と発酵乳からなる組成物の摂取によるOVA特異IgE産生抑制作用を検討した結果を示す図である。平均±SE(＊：ｐ＜0.05、検定法：Mann-Whitney検定)
【図４】WPIトリプシン分解物と発酵乳からなる組成物の摂取による総IgE産生抑制作用を検討した結果を示す図である。平均±SE(＊：ｐ＜0.05、検定法：Mann-Whitney検定)
【図５】WPIのA/N分解物とクワルクからなる組成物の摂取によるOVA特異IgE産生抑制作用を検討した結果を示す図である。平均±SE(Mann-Whitney検定)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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