(57)【要約】  【課題】  化学物質によって汚染された汚染土壌又は汚染水を短期間に、かつ効率的に浄化することのできる汚染土壌又は汚染水の浄化方法を提供すること。  【解決手段】  本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法は、バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物とを接触させ、上記媒体表面に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程、及びバイオフィルムが形成された媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含むことを特徴とする。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物とを接触させ、上記媒体表面に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程、及び
バイオフィルムが形成された媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含むことを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項２】
汚染成分を分解し得る微生物を汚染土壌又は汚染水中に分散させる工程、及び
バイオフィルムを付着し得る媒体を、上記汚染土壌又は汚染水と接触させる工程
を含むことを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項３】
上記微生物が、鉱物油を分解することができるシュードモナス（Pseudomonas）属に属する菌株である、請求項１又は２に記載の汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項４】
バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌又は汚染水と接触させ、汚染成分を分解し得る微生物を上記媒体に供給し、上記媒体に上記微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程を含むことを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項５】
上記媒体が、少なくとも１個の孔及び少なくとも１個の突状部を有し、中空形状に形成されたものであり、かつ該媒体に上記微生物、酸素及び栄養物を供給することによりバイオフィルムを形成させる、請求項４に記載の汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項６】
上記媒体に、更にバイオフィルム形成促進物質を供給する、請求項２に記載の汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項７】
上記微生物が、鉱物油を分解することができるシュードモナス（Pseudomonas）属に属する菌株である、請求項４〜６のいずれか１項記載の汚染土壌又は汚染水浄化方法。
【請求項８】
少なくとも１個の孔及び少なくとも１個の突状部を有し、中空形状に形成された、バイオフィルムを付着し得る媒体と、
汚染成分を分解し得る微生物、酸素及び栄養物を上記媒体に供給する供給装置とを備えることを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化装置。
【請求項９】
上記バイオフィルムを付着し得る媒体に、バイオフィルム形成促進物質を供給する装置を更に備える、請求項８に記載の汚染土壌又は汚染水浄化装置。
【請求項１０】
上記バイオフィルムを付着し得る媒体を複数備える、請求項８又は９に記載の汚染土壌又は汚染水浄化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汚染土壌又は汚染水の浄化方法及び汚染土壌又は汚染水の浄化装置に関するものであり、更に詳細には、化学物質によって汚染された汚染土壌又は汚染水を短期間に、かつ効率的に浄化することのできる、汚染土壌又は汚染水浄化方法及び汚染土壌又は汚染水浄化装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の科学技術の発展に伴い、様々な化学物質が利用される一方で、これらの化学物質による環境汚染、特に土壌及び湖や池等の水の汚染が問題となっている。汚染物質としては、例えば鉱物油等の油類、農薬、揮発性有機化合物、重金属等が知られており、これらの汚染物質が環境（土壌又は水）中に廃棄された場合、長期に渡って環境（土壌又は水）中にとどまるものも多く、様々な弊害を引き起こす可能性がある。
現在、土壌が化学物質により汚染され、再利用のために土壌浄化を必要としている工業用跡地は全国で３２万ヶ所以上あるといわれている。汚染された土壌を浄化する方法として、加熱等の物理化学的手段による処理方法が知られているが、その方法は、一般的にコストが高く、大量の土壌を処理するには不向きである。そのため、コストパフォーマンスに優れ、大量の土壌を処理することができる、生物を利用した汚染処理方法（バイオレメディエーション法）の実用化、特に、微生物を利用したバイオレメディエーション法の実用化が求められている。
【０００３】
従来の微生物を用いた汚染土壌の修復工法には、１）ランドファーミング法、２）バイオパイル法、３）バイオスラリー法、４）バイオベンディング法等がある。上記１）〜３）の方法は、いずれも汚染土壌を他所に移し、その汚染土壌に栄養物及び微生物を投入して汚染物質を分解して浄化する方法（移動処理法）である。上記４）の方法は、いわゆる原位置法と呼ばれるものであり、汚染土壌に直接その場で栄養物と微生物を投入するため、汚染土壌の移動や浄化後の復土等のコストがかからないという点で優れている。
【０００４】
化学物質により汚染された土壌を上記４）の方法により浄化する場合には、化学物質を分解する微生物が必要となる。すなわち、微生物を利用したバイオレメディエーションを行なう場合には、目的に合う微生物を用いる必要がある。また、その処理方法、すなわち微生物が機能しやすい（汚染物質を分解しやすい）方法を確立する必要がある。従来の原位置法によりバイオレメディエーションを行なう場合は、汚染土壌に微生物を注入して放置する方法、微生物を注入した後、大型シャベルで撹拌をする方法、又は、汚染土壌にパイルを挿入して通気や栄養物の投入を行う方法があり、処理に９０〜２５０日もかかるという問題を抱えている。少なくとも我が国においては、有効な鉱物油分解微生物は市場に流通しておらず、微生物を用いた有効なバイオレメディエーション法は実用化されていない。
【０００５】
上記問題を解決するため、特開平７−１２４５４３号公報には、土壌汚染物質浄化用の微生物を、高吸水性ポリマーを含む担体に保持させて汚染土壌に投与し、該汚染土壌を浄化することを特徴とする土壌浄化法が開示されている。また、特開平７−９６２８９号公報には、土壌汚染を生じる有害物質を生物学的に分解する方法が開示されている。上記公報に開示された方法は、いずれも微生物が自然界において単独の状態で機能するよりも、集団を形成することによってその生理機能を高いレベルに維持することができるという性質を利用したものである。しかし、上記公報に開示された方法は、連続的に栄養物や酸素を供給することが困難であるという問題がある。特に、好気性微生物の活性を期待する場合、連続的に酸素を供給することが必要であるため、上記問題を完全に解決することはできなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−１２４５４３号公報
【特許文献２】特開平７−９６２８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、化学物質によって汚染された汚染土壌又は汚染水を短期間に、かつ効率的に浄化することのできる汚染土壌又は汚染水の浄化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、バイオフィルムを形成させた媒体を用いることにより、汚染土壌又は汚染水を浄化し得るという知見を得た。
【０００９】
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物とを接触させ、上記媒体表面に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程、及びバイオフィルムが形成された媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含むことを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、汚染成分を分解し得る微生物を汚染土壌又は汚染水中に分散させる工程、及びバイオフィルムを付着し得る媒体を、上記汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含むことを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化方法を提供するものである。
上記微生物としては、鉱物油を分解することができるシュードモナス（Pseudomonas）属に属する菌株を用いることができる。バイオフィルムを形成する微生物は、投下する微生物に限定されるものではなく、土壌や汚水中に内在する鉱物油分解能を有する微生物でもよい。
また、本発明は、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌又は汚染水と接触させ、汚染成分を分解し得る微生物を上記媒体に供給し、上記媒体に上記微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程を含むことを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、少なくとも１個の孔及び少なくとも１個の突状部を有し、中空形状に形成された、バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物、酸素及び栄養物を上記媒体に供給する供給装置とを備えることを特徴とする、汚染土壌又は汚染水浄化装置を提供するものである。
上記汚染土壌浄化装置は、上記バイオフィルムを付着し得る媒体に、バイオフィルム形成促進物質を供給する装置を更に備えることが好ましい。
上記汚染土壌浄化装置は、上記バイオフィルムを付着し得る媒体を複数備えることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、化学物質によって汚染された汚染土壌又は汚染水を短期間に、かつ効率的に浄化することのできる汚染土壌又は汚染水の浄化方法が提供される。また、本発明によれば、化学物質によって汚染された汚染土壌又は汚染水を短期間に、かつ効率的に浄化することのできる汚染土壌又は汚染水の浄化装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法について説明する。
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法は、バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物とを接触させ、上記媒体表面に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程、及びバイオフィルムが形成された媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含む。
【００１４】
汚染土壌又は汚染水とは、種々の化学物質によって汚染された土壌又は水を意味し、例えば鉱物油等の油類、農薬、揮発性有機化合物、重金属等の化学物質によって汚染された土壌又は水を意味する。
バイオフィルムとは、固体の表面に微生物が付着し、この固体の表面に付着した微生物が形成する高次構造体のことである。バイオフィルムを付着し得る媒体としてはバイオフィルムを付着し得るものであれば特に制限なく用いることができる。このような材料としては、例えば、プラスチック材料や金属材料等が用いられる。プラスチック材料としては、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスチレン、６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、ポリイミドフィルム等が挙げられる。
また、金属材料としては、例えばニッケル（Ｎｉ）、ニッケル合金、鉄（Ｆｅ）、鉄合金、コバルト（Ｃｏ）、コバルト合金等が挙げられる。
上述したものの他、例えば木くず、けい藻土、ゼオライト等が挙げられる。土壌中にあっては土壌や岩石粒子が媒体となることもあり得る。
なお、媒体の大きさ及び形状に特に制限はなく、どのような形状のものでもよく、大きさも使用しやすい大きさであれば特に制限はない。
【００１５】
また、バイオフィルムを付着し得る媒体としては、低コストのものが好ましく、また土壌中又は水中で用いられるものであるため、生分解性のものが特に好ましい。
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法においては、バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物を接触させ、上記媒体表面に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程を含む。
なお、バイオフィルムとは、上述した媒体が存在する場合、増殖するに従って微生物自身や微生物が分泌した多糖類等を構成する成分によって上記媒体上に形成される層状の構造体のことであり、微生物はバイオフィルムを形成することによって、環境ストレスに、より耐性となり、その生理活性が増強されることによって、汚染土壌又は汚染水を浄化し得ると考えられる。
【００１６】
汚染成分を分解し得る微生物とは、上述した、例えば鉱物油等の油類、農薬、揮発性有機化合物、重金属等の化学物質を分解することのできる微生物を意味する。汚染成分を分解し得る微生物としては、バイオフィルムを形成しやすい微生物が好ましく用いられる。このような微生物としては、公知のものが特に制限なく用いられる。具体例を挙げれば、バチルス（Bacillus）属に属する微生物、バーコルデリア（Burkholderia）属に属する微生物、アエロモナス（Aeromonas）属に属する微生物,アエロバクター（Aerobacter）属に属する微生物、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物、エンテロバクター（Enterobacter）属に属する微生物、エシェリヒア（Escherichia属に属する微生物、ガリオエラ（Gallioela）属に属する微生物、レプトスリックス（Leptothrix）属に属する微生物、クレブジラ（Klebsiella）属に属する微生物、ミクロコッカス（Micrococcus）属に属する微生物、ニトロソモナス（Nitrosomonas）属に属する微生物、サルモネラ（Salmonella）属に属する微生物等が挙げられる。また、本発明者らが単離した鉱物油を分解する微生物である、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する菌株が挙げられる。本発明者らが単離した、Pseudomonas属に属する菌株は、鉱物油を分解する能力を有するとともに、バイオフィルムを形成しやすい微生物であり、本発明者らは、この菌株をＷａｔＧと命名した。ＷａｔＧは、鉱物油を分解することのできる菌株であり、以下、本明細書において「鉱物油分解菌」ともいう。本発明において、鉱物油とは、原油を精製して得られる炭化水素類のことをいい、例えば、ガソリン、灯油、軽油、及び重油等が挙げられる。さらに、原油を精製して得られる炭化水素を主成分とするオイル、例えば、エンジンオイルやディーゼルオイル等も本発明において鉱物油に含まれる。ガソリンは、芳香族炭化水素類を多く含んでおり、灯油、軽油及び重油は、脂肪族炭化水素類を多く含んでいる。上記鉱物油分解菌は、特に、炭素数が８〜２３の脂肪族炭化水素類が多く含まれている鉱物油を効率よく分解することができる。
【００１７】
ＷａｔＧは、北海道の古い灯油タンク中の水から単離されたものである。ＷａｔＧ株の分離のために、最少塩培地（ＭＳＭ）に１０ｇ／Ｌの割合で鉱物油（灯油）を添加した選択培地を使用した。ＷａｔＧ株は、ＬＢ培地を用いた場合、４℃〜５０℃の範囲の温度で生育でき、最適成長温度は３０℃である。
【００１８】
得られた微生物の菌学的性質を調べ、Pseudomonas属に属する菌株であることを確認した。１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列の分析結果から、ＷａｔＧ株はPseudomonas aeruginosaと１００％の類似性を示し、Pseudomonas aeruginosaの新規株であると同定された。また、ＷａｔＧ株のＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は約７４％であった。
得られた微生物の菌学的性質を調べた。得られた菌学的性質を以下に湿す。
【００１９】
〔１〕形態学的性質
（１）細胞の形：桿状
（２）グラム染色：陰性
〔２〕生育状態
コロニーは円形、凸状である。
【００２０】
〔３〕生理学的性質
（１）生育温度：ＬＢ培地を用いた場合、−１℃及び５５℃で生育できないが、４℃〜５０℃で生育できる。
（２）酸素要求性：好気的
（３）資化性：フルクトース、Ｄ−グルコース、グリセロールを同化するが、Ｌ−アラビノース、ラクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、ラフィノース、スクロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−セロビオース、イヌリンを同化しない。
（４）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は約７４％である。
【００２１】
上記Pseudomonas属に属する菌株は、北海道の古い灯油タンク等から、例えば１０ｇ／Ｌの割合で鉱物油（灯油）を含む最小塩培地（ＭＳＭ）を使用してスクリーニングすることにより単離することができる。灯油を含むＭＳＭは、唯一の炭素源として灯油を含む培地である。
【００２２】
上記鉱物油分解菌を培養するための培地としては、通常、これらの菌株が生育できるものであれば、天然培地であっても合成培地であってもよく、いずれも使用することができる。また、培地は固体培地、液体培地のいずれでもよい。用いられる培地には、炭素源、窒素源及び無機物等が含まれる。炭素源としては、鉱物油を用いてもよく、その他、通常に微生物を培地するために用いられるグルコース等の炭水化物等が用いられる。窒素源としては、例えば酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種アミノ酸等の有機窒素類、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられる。窒素源、炭素源は、いずれも単独で用いてもよく、又は２種以上を混合して用いてもよい。その他の無機物としては、例えばカリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等を必要に応じて適宜使用する。用いられる培地としては、例えば、ＬＢ培地や０．１％酵母エキス含有ＭＳＭ培地等が挙げられる。本発明の鉱物油分解菌の培養方法としては、通常の方法でよく、例えば培養温度は２０〜４０℃が好ましく、２５〜３５℃がさらに好ましい。また、培地のｐＨは６〜８とすることが好ましく、７付近であることがさらに好ましい。また、培養は振盪培養を行うか、又は通気攪拌を行い、好気条件下で行うことが好ましい。
なお、後述する説明においては酸素を供給しながらバイオフィルムを形成させることが効果的であるとの記載があるが、上述したＷａｔＧは硝酸塩の存在下では嫌気的条件下でも生育が可能である。従って、ＷａｔＧを硝酸塩の存在下で用いることにより、酸素を供給しないでもバイオフィルムの形成を促進させることが可能である。
【００２３】
バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物とを接触させ、上記媒体に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムを形成させる方法としては、特に制限はなく、微生物を培地中に分散させ、微生物が分散した培地中に上記媒体を入れて撹拌した後、その微生物が生育可能な範囲の温度に放置することによってバイオフィルムを形成することができる。
なお、バイオフィルムを形成させる際に、上記培地中にバイオフィルム形成促進物質を供給してもよい。このようなバイオフィルム形成促進物質としては、例えばN-(3-oxododecanoyo)homoserine lactone等のいわゆるオートインデューサーと呼ばれる化合物が挙げられる。しかし、オートインデューサーはバイオフィルムを形成する微生物自身が合成するものであり、微生物の密度が高いほどその含量も高くなることから、バイオフィルム形成を促進するには、必要な栄養成分を補うことなどによって、微生物の増殖能を増大させることが効果的である。また、酸素を供給することによっても、バイオフィルムの形成が促進されるので効果的である。また、小さい孔を有する中空形状物を媒体として用い、微生物の栄養物質及び水と接触することにより酸素を発生する化合物を入れ、この中空形状物を土壌中又は水中に配置してもよい。このような中空形状物を土壌中又は水中に配置することにより、化合物の働きによって酸素が発生するので、人工的に空気（酸素）を供給することなく、中空形状物の表面にバイオフィルムが強制される。なお、このような薬物としては、例えば、Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ社製のＯＲＣ等が挙げれらる。
【００２４】
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法においては、上述のようにして得られた、バイオフィルムが形成された媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含む。媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる方法としては特に制限はなく、媒体を汚染土壌又は汚染水中に加え、撹拌することによって実施することができる。
上述した、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法によれば、媒体表面に、汚染成分を分解する微生物を含むバイオフィルムが形成されるので、土壌又は水中の汚染成分が効率よく分解され、短期間で汚染土壌又は汚染水を浄化することができる。
【００２５】
また、本発明の他の実施の形態にかかる汚染土壌又は汚染水浄化方法は、汚染成分を分解し得る微生物を汚染土壌又は汚染水中に分散させる工程、及びバイオフィルムを付着し得る媒体を、汚染土壌又は汚染水と接触させる工程を含む。
汚染成分を分解し得る微生物、バイオフィルムを付着し得る媒体については上述したものと同様である。
なお、本実施の形態においては、土壌又は水中に、バイオフィルム形成促進物質を混合してもよく、又はバイオフィルムを付着し得る媒体に、予めバイオフィルム形成促進物質を塗布しておいてもよい。また、酸素を供給することによって、バイオフィルムの形成が促進されるので効果的である。また、バイオフィルムを付着し得る媒体として、小さい孔を有する中空形状物を媒体として用い、上述した、微生物の栄養物質及び水と接触することにより酸素を発生する化合物を入れ、この中空形状物を土壌中又は水中に配置してもよい。
【００２６】
本実施の形態においては、汚染成分を分解し得る微生物を汚染土壌又は汚染水に分散させた後に、バイオフィルムを付着し得る媒体を接触させている。このように、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌又は汚染水と接触させることにより、媒体表面に汚染成分を分解し得る微生物を含むバイオフィルムが形成されるので、汚染土壌又は汚染水を浄化する効率が上昇する。すなわち、媒体表面に、汚染成分を分離する微生物を含むバイオフィルムが形成されるので、土壌又は水中の汚染成分が効率よく分解され、短期間で汚染土壌又は汚染水を浄化することができる。
【００２７】
また、本発明を汚染土壌の浄化に用いる場合、バイオフィルムを付着し得る媒体と土壌との接触は例えば以下のように行うこともできる。
汚染成分を分解し得る微生物を汚染土壌に分散させた後、汚染土壌にボーリング孔を掘削し、このボーリング孔にバイオフィルムを付着し得る可塑性素材を注入する。可塑性素材の注入は、ノズルやパイプ等を用いて行ってもよい。ボーリング孔に、ノズルやパイプを挿入し、圧力をかけて可塑性素材を注入する。用いられる可塑性素材としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブテン、オクテン等の重合体やＥＶＡ、ＥＥＡ等の共重合体を含むオレフィン系樹脂、スチレン、アクリル酸エステルの重合体やその共重合体、スチレンアクリロニトリル、スチレンアクリロニトリルブタジエン等の共重合体を含むスチレン系樹脂、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリアミド等の樹脂が挙げられる。本発明においては生分解性のものが好ましく用いられる。ボーリング孔に注入された可塑性素材は固化して植物の根のような広がりを有する形態となる。土壌中に分散している微生物は、固化した可塑性素材の表面にバイオフィルムを形成し、土壌中の汚染成分を分解する。
なお、必要に応じて、汚染成分を分解し得る微生物を土壌中、又は固化した可塑性素材の付近に追加注入してもよい。
【００２８】
次に、他の実施の形態にかかる汚染土壌又は汚染水浄化方法について説明する。
本発明の汚染土壌浄化方法は、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌と接触させ、汚染成分を分解し得る微生物を上記媒体に供給し、上記媒体に上記微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程を含むことを特徴とする。
本発明の汚染土壌浄化方法においては、まず、汚染土壌に、バイオフィルムを付着し得る媒体を接触させる。
バイオフィルムを付着し得る媒体としては、上述したものが挙げられ、また、少なくとも１個の孔及び少なくとも１個の突状部を有し、中空形状に形成されたものが好ましく用いられる。本実施の形態においては、上記媒体に、汚染成分を分解し得る微生物を供給し、更に酸素及び栄養物を供給することが好ましいが、孔を形成することにより、酸素を供給し、供給された酸素が媒体中を通り、土壌中に抜けていき、媒体の周辺が好気条件になるので好ましい。また、供給された栄養物が媒体の周辺に拡散するので、媒体の表面が栄養豊富となり、バイオフィルムが形成されやすくなる。また、突状部が設けられることにより、媒体の表面積が大きくなり、バイオフィルムが形成される部位の面積が大きくなるので好ましい。突状部の形態はどのような形態であってもよく、例えば針状の形態が挙げられる。
【００２９】
本実施の形態における汚染土壌又は汚染水浄化方法においては、上述した媒体に、汚染成分を分解し得る微生物を供給する。汚染成分を分解し得る微生物としては、上述したものと同様である。
本発明の汚染土壌又は水浄化方法においては、上記媒体に、上記微生物、酸素及び栄養物を供給することによりバイオフィルムを形成することが好ましい。バイオフィルムは、土壌中に生息している微生物（常在菌）によって自然に形成されるが、バイオフィルムの形成を促進するためには、バイオフィルムを形成しやすい、汚染成分を分解し得る微生物、酸素及び栄養物を供給することが好ましい。バイオフィルムは単一の微生物種で形成されることは稀であり、従って媒体に供給した微生物と、土壌中に生息微生物とが一緒になり、微生物群集体となってバイオフィルムが形成されると考えられる。
【００３０】
上記微生物の媒体への供給量に特に制限はなく、バイオフィルムが形成されるのに十分な量を供給すればよい。また、微生物は、一時的に供給するのみであってもよいが、バイオフィルムが形成されるまでの間、何度かに分けて供給してもよい。
【００３１】
また、酸素及び栄養物の供給量についても特に制限はなく、バイオフィルムの形成を促進するのに十分な量を供給すればよい。酸素及び栄養物を供給することにより、媒体の周辺が好気条件になり、栄養豊富になり、バイオフィルムの形成が促進されると共に、土壌中の汚染成分の分解が促進されるので、酸素及び栄養物は間断なく供給することが好ましい。なお、上述した、微生物の栄養物質及び水と接触することにより酸素を発生する化合物を用いることにより、酸素が間断なく発生するので、このような化合物を用いると効果的である。
【００３２】
また、本実施の形態にかかる汚染土壌又は汚染水浄化方法においては、媒体に更にバイオフィルム形成促進物質を供給することが好ましい。バイオフィルム形成促進物質としては上述したものが用いられる。バイオフィルム形成促進物質は微生物自身が産生するものであり、必ずしも供給する必要はないが、供給する場合は、微量でよいと考えられる。
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法は、後述する、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置により実施することができる。
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化方法によれば、媒体表面に、汚染成分を分解する微生物を含むバイオフィルムが形成されるので、土壌又は水中の汚染成分が効率よく分解され、短期間で汚染土壌又は汚染水を浄化することができる。
【００３３】
次に、他の実施の形態にかかる汚染土壌又は汚染水浄化方法について、土壌を浄化する場合について説明する。本実施の形態は、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌と接触させ、汚染成分を分解し得る微生物を上記媒体に供給し、上記媒体に上記微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程を含むことを特徴とし、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌との接触を以下のようにして行う。
【００３４】
土壌にボーリング孔を掘削し、このボーリング孔にバイオフィルムを付着し得る可塑性素材を注入する。可塑性素材の注入は、ノズルやパイプ等を用いて行ってもよい。ボーリング孔に、ノズルやパイプを挿入し、圧力をかけて可塑性素材を注入する。用いられる可塑性素材としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブテン、オクテン等の重合体やＥＶＡ、ＥＥＡ等の共重合体を含むオレフィン系樹脂、スチレン、アクリル酸エステルの重合体やその共重合体、スチレンアクリロニトリル、スチレンアクリロニトリルブタジエン等の共重合体を含むスチレン系樹脂、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリアミド等の樹脂が挙げられる。本発明においては生分解性のものが好ましく用いられる。ボーリング孔に注入された可塑性素材は固化して植物の根のような広がりを有する形態となる。次いで、汚染成分を分解し得る微生物を、上記固化した可塑性素材に供給する。上記可塑性素材としては、バイオフィルムを形成し得るものであり、上記微生物のバイオフィルムが形成され、土壌中の汚染成分が分解される。
【００３５】
次に、他の実施の形態にかかる汚染土壌又は汚染水浄化方法について、土壌を浄化する場合について説明する。本実施の形態は、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌と接触させ、汚染成分を分解し得る微生物を上記媒体に供給し、上記媒体に上記微生物を含むバイオフィルムを形成させる工程を含むことを特徴とし、バイオフィルムを付着し得る媒体を汚染土壌との接触を以下のようにして行う。
【００３６】
土壌にボーリング孔を掘削し、このボーリング孔に、透水性の高い、バイオフィルムを付着し得る媒体を充填する。このような媒体としては、例えば、木材チップ、貝殻、炭、ゼオライト、米ぬか、稲モミ等が挙げられる。次いで、汚染成分を分解し得る微生物をボーリング孔の付近に供給し、媒体表面にバイオフィルムを形成させる。
このような透水性の高い媒体を充填することにより、地上からの雨水や散水などによる水によって土壌中の鉱物油が洗い流され、浸透性の違いから、その水がボーリング孔に集まる。媒体表面に形成されたバイオフィルムにより、土壌中の鉱物油が分解される。
【００３７】
次に、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置について説明する。
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置は、少なくとも１個の孔及び少なくとも１個の突状部を有し、中空形状に形成された、バイオフィルムを付着し得る媒体と、汚染成分を分解し得る微生物、酸素及び栄養物を該媒体に供給する供給装置とを備えることを特徴とする。
【００３８】
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置について図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置の一例を示す図である。
図１に示す汚染土壌又は汚染水浄化装置１０は、バイオフィルムを付着し得る媒体であるバイオフィルム付着部材１８と、このバイオフィルム付着部材１８に、汚染成分を分解し得る微生物、酸素及び栄養物を供給する供給装置（図示せず）を備えている。また、バイオフィルム付着部材１８は複数設けられている。
【００３９】
供給装置には、バイオフィルム付着部材１８に微生物を供給するための微生物供給管１２、酸素を供給するための酸素供給管１４、及び栄養物を供給するための栄養物供給管１６が備えられている。
【００４０】
微生物供給管１２には、図示しない微生物保存タンクが接続されており、微生物保存タンクに保存された微生物が、微生物供給管１２を通り、バイオフィルム付着部材１８に供給される。微生物としては、土壌中の汚染成分を分解し得るものが用いられ、例えば上述した、鉱物油を分解することができるPseudomonas属に属する菌株等を用いることができる。
【００４１】
酸素供給管１４には、図示しないエアブロアが接続されており、エアブロアから出る酸素が酸素供給管１４を通り、バイオフィルム付着部材１８に供給される。酸素供給管１４からバイオフィルムに供給される酸素としては、通常の空気であってもよいが、酸素ガス、高圧圧縮空気等を用いてもよい。
【００４２】
栄養物供給管１６には、図示しない栄養物貯蔵タンクが接続されており、栄養物貯蔵タンクに保存された栄養物が、栄養物供給管１６を通り、バイオフィルム付着部材１８に供給される。栄養物としては、微生物が成育するうえで必要な炭素源、窒素源及び無機物を含む物が好ましい。例えば、炭素源としては、グルコース等の糖類が挙げられ、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種のアミノ酸等の有機窒素類、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられ、またその他の無機物としては、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等が挙げられる。これらの栄養物は、通常は水に溶解又は懸濁してバイオフィルム付着部材１８に供給される。
微生物、酸素及び栄養物をバイオフィルム付着部材１８に供給するタイミングや量は、供給装置によって制御することができ、自動的に制御することもできる。
【００４３】
また、図には示していないが、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置には、バイオフィルム付着部材１８に、バイオフィルム形成促進物質を供給するようにしてもよい。バイオフィルム形成促進物質としては上述したものが挙げられる。バイオフィルム形成促進物質をバイオフィルム付着部材１８に供給するタイミングや量は、微生物、酸素及び栄養物と同様、供給装置によって制御することができるようにすることが好ましい。
【００４４】
次に、バイオフィルム付着部材１８について図面を参照しつつ説明する。図２は、バイオフィルム付着部材の拡大図を示す図である。
図２に示すように、バイオフィルム付着部材１８は、多数の孔３２を有する中空部材３０からなり、中空部材３０には多数の突状部３４が設けられている。本発明の汚染土壌浄化装置においては、先ず微生物がバイオフィルム付着部材１８に供給され、次いで、酸素及び栄養物がバイオフィルム付着部材１８に供給される。バイオフィルム付着部材１８に供給された微生物は、酸素及び栄養物によって成育し、土壌中に生息していた微生物と共にバイオフィルムとなる。バイオフィルムは、バイオフィルム付着部材１８の表面に形成される。バイオフィルムは、最初に中空部材３０の内側に形成されるが、徐々に大きくなり、孔３２から外側にバイオフィルムは形成され、次いで、突状部３４にも形成される。突状部３４が設けられているため、バイオフィルムの形成される面積が大きくなり、汚染土壌又は汚染水浄化効果が向上すると思われる。
【００４５】
バイオフィルム付着部材１８の大きさには特に制限はないが、通常、直径が４〜３０ｍｍ程度であり、好ましくは８〜２０ｍｍ程度であり、長さは、通常、２０〜３００ｃｍであり、好ましくは３０〜２００ｃｍである。また、孔３２の大きさにも特に制限はないが、通常は０．５〜１０ｍｍ程度であり、好ましくは１〜６ｍｍ程度である。図２に示すバイオフィルム付着部材１８においては、突状部３４は針状部材であるが、この形状に限定されず、どのような形状であってもよい。突状部３４が針状部材である場合、その大きさは特に制限はないが、通常は直径が０．２〜４ｍｍ程度であり、好ましくは０．４〜２ｍｍ程度であり、長さは、通常は２〜３０ｍｍ程度であり、好ましくは４〜２０ｍｍ程度である。
【００４６】
また、バイオフィルム付着部材の材料としては、例えば、プラスチック材料や金属材料等が用いられる。プラスチック材料としては、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスチレン、６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、ポリイミドフィルム等が挙げられる。
また、金属材料としては、例えばニッケル（Ｎｉ）、ニッケル合金、鉄（Ｆｅ）、鉄合金、コバルト（Ｃｏ）、コバルト合金等が挙げられる。
上述したものの他、例えば木くず、けい藻土、ゼオライト等が挙げられる。
【００４７】
バイオフィルム付着部材に、汚染物質を分解する微生物を含むバイオフィルムが形成され、バイオフィルム中の微生物の働きにより、バイオフィルム付着部材の周辺の汚染物質が分解される。図２に示したバイオフィルム付着部材は、孔３２を有しており、供給装置から供給された酸素によってバイオフィルム付着部材の周辺が好気条件になり、また栄養物がバイオフィルム付着部材の周辺に広がるので、バイオフィルム付着部材周辺における微生物を活性化することができ、連続的に汚染物質を分解することができる。
【００４８】
なお、バイオフィルム付着部材としては、図２に示すものに限定されず、例えば図３に示すようなものであってもよい。図３は、他の実施形態にかかる汚染土壌浄化装置の有するバイオフィルム付着部材の断面図である。図３に示すバイオフィルム付着部材においては、突状部２０が中空形状に形成されている。このような形状とすることにより、バイオフィルム付着部材の表面積は更に大きくなるので、バイオフィルムの形成量が更に大きくなる。
【００４９】
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置は、上述した構成を有するが、装置全体の大きさは、目的に合わせて適宜設計することができる。使用時に汚染土壌まで輸送することを考慮すると、汚染土壌浄化装置は輸送可能な大きさとすることが好ましい。図１に示す汚染土壌又は汚染水浄化装置１０を例にして説明すると、供給装置の大きさは一辺の長さが５０〜２００ｃｍ程度であり、厚みが１０〜３０ｃｍ程度である。この程度の大きさであれば、輸送が容易である。ただし、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置は上述の大きさのものには限定されない。本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置は、必要な場所まで部材を輸送した後に組み立てて一体化してもよい。
【００５０】
本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置の処理能力は、その大きさによって決定されるものであり、浄化しようとする土壌の面積によって決定すればよい。また、広い面積の土壌又は池や湖等を浄化する場合、本発明の汚染土壌又は汚染水浄化装置を複数用意して使用することもできる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
【００５２】
＜鉱物油分解菌の単離＞
北海道の古い灯油タンク中から採取した水から鉱物油分解菌を単離した。まず初めに、採取した水１ｍｌを、０．１質量％の酵母エキスを添加した最少塩培地（ＭＳＭ培地）が１０ｍｌ入った５０ｍｌフラスコに移した。次に、このフラスコを旋回シェーカーを用いて振盪し、３０℃で２週間培養した。得られた培養液を、ＭＳＭ培地で１０−１、１０−２、１０−３の濃度に希釈した。これらの希釈液から鉱物油分解菌を単離するために、選択培地としてＭＳＭ培地に１０ｇ／Ｌの割合で灯油を添加した寒天培地を使用した。使用したＭＳＭ培地には、塩として、ＮＨ４ＮＯ３が０．４質量％、ＫＨ２ＰＯ４が０．４７質量％、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．０１１９質量％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが０．００１質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが０．１質量％、及びＦｅＳＯ４が０．００１５質量％含まれている。また、単離するために用いられた寒天培地中に含まれる唯一の炭素原は、添加した灯油のみである。この選択培地の上に希釈液を希釈し、コロニーが観察されるまで３０℃の温度で培養した。成長した個々のコロニーを、選択培地にストリーキングを行い、この継代培養を数回繰り返すことにより鉱物油分解菌の単離及び精製を行った。得られた鉱物油分解菌を、ＷａｔＧと命名した。
また、ＷａｔＧ株はＬＢ培地を用いた場合、４℃〜５０℃の範囲で生育でき、最適生育温度は３０℃であった。
【００５３】
実施例２
微生物の同定
ＷａｔＧを、一般の生化学的方法及び分子系統学的分析方法により同定した。
分子系統学的分析については、１６ＳリボソームのＤＮＡを、ＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ法では、テンプレートとして菌の完全ＤＮＡと、フォワードとしてそのオリゴヌクレオチドである配列番号１（ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴ）で表わされる塩基配列を有するもの及び配列番号２（ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ）で表される塩基配列を有するリバースプライマーとを用いた。ＰＣＲ増幅の熱的条件は、プレヒートは９４℃で５分間、次いで、９４℃で１分間の変性を行い、５５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１．５分間の伸長を３０サイクル繰り返した。ＰＣＲ生成物は、精製した後、配列決定した。得られた配列は、データベースから引用した関連細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンスに照らし合わせた。
その結果、ＷａｔＧの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Pseudomonas aeruginosaのものと１００％一致した。
【００５４】
実施例３
形態学的特性
ＷａｔＧのグラム染色を行い、顕微鏡により観察を行った。結果は、グラム陰性の桿菌であった。また、コロニーは円形、凸状であった。コロニーの生育は４℃及び４０℃では観察されなかった。
【００５５】
実施例４
生化学的特徴
炭素源の同化試験を常法に従って行ったところ、ＷａｔＧ株はフルクトース、グルコース、グリセロール、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グリシン及びＬ−プロリンは同化したが、Ｌ−アラビノース、ラクトース、マルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、スクロース、キシロース、ソルビトール、ラムノース、セロビオース、イヌリン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−スレオニンは同化しなかった。
また、ＷａｔＧは好気性の菌株であった。
【００５６】
実施例５
１６S−ｒＤＮＡ及びＤＮＡ塩基組成の解析
培養した菌株を集菌し、標準手段（Sambrook J,他(1989) Molecular Cloning:a laboratory Manual, 2nd edn. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory）によって染色体ＤＮＡを精製した。すなわち、細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（最終濃度：２ｍｇ／ｍＬ）及びドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度：０．５％）に溶解し、細菌細胞を溶菌させた。溶菌液からフェノール−クロロホルム抽出によってＤＮＡを回収し、ＲＮａｓｅ処理、ＣＴＡＢ処理及びエタノール沈殿を行い、精製ＤＮＡを得た。なお、エタノール沈殿は２度行った。
ＤＮＡ塩基組成、すなわちグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量は、Kumagai, M.(1980) J.Mol. Biol 16, 111-120に記載された方法に従って高速液体クロマトグラフィーにより測定した。Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株についても、同様にグアニン＋シトシン含量を測定した。
ＷａｔＧのグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量は、７３．６％であり、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株は６７．２％であった。
【００５７】
実施例６
＜ＷａｔＧによる、鉱物油の分解＞
ディーゼルオイルの分解
ＷａｔＧは、ＬＢ培地を用いて、３０℃で１晩前培養を行った。５０ｍＬのスクリューキャップフラスコ中で、鉱物油としてディーゼルオイルを１％（体積比）添加したＭＳＭ培地に、ＷａｔＧを接種し、この試料を２０℃（平均的な日本の土壌温度は２０℃前後である。）で２週間振盪培養を行った。培養終了後、培養液から残留鉱物油を、内部標準として３ｍｇ／ｍＬのｎ−ドデカン（Ｃ１２）（関東化学（株）製）を含有するジクロロメタン（和光化学（株）製）（培養液と等量）を用いて抽出し、水素炎イオン化検出器とキャピラリーカラム（ＴＣ−１、３０ｍ×０．２５ｍｍ、ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ３５３Ｂ、ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）によって分析した。キャリアガスとしてはヘリウムを用いた。なお、カラム温度は、最初５０℃に設定し、その後５℃／ｍｉｎの速度で２７０℃まで上昇させた。また、検出器の温度は２９０℃に設定した。培養前及び培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図４に示す。図４において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図４から明らかなように、ディーゼルオイルに由来するＣ１１〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークは、培養後の培地にはほとんど認められず、ＷａｔＧによってディーゼルオイルが分解されたことが示された。
鉱物油の分解率は、培養前の試料から検出されたＣ１１〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークの合計と、培養後の試料から検出された対応するピークの合計との差を分解された鉱物油の量として算出した。結果を表１に示す。
【００５８】
実施例７
エンジンオイルの分解
ディーゼルオイルに代えてエンジンオイルを用いた以外は実施例６と同様にして培養を行った。また、実施例６と同様にして培養液の残留鉱物油の分析を行った。鉱物油の分解率については、Ｃ１３〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークを対象に算出した。結果を表１に示す。
【００５９】
実施例８
重油の分解
ディーゼルオイルに代え、Ａ重油を用いた以外は実施例６と同様にして培養を行った。また、実施例６と同様にして培養液の残留鉱物油の分析を行った。培養前及び培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図５に示す。図５において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図５から明らかなように、重油に由来するＣ１１〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークが、培養後ほとんど見られず、ＷａｔＧによって重油が分解されたことが分かる。鉱物油の分解率については、Ｃ１３〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークを対象に算出した。結果を表１に示す。
【００６０】
比較例１
ＷａｔＧに代え、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を用いた以外は実施例６と同様にして、分解試験を行った。培養前と培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図６に示す。図６において、（Ａ）はPseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を接種しないで２週間振盪培養した結果であり、（Ｂ）はPseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を接種して行った結果である。図６から、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株はディーゼルオイルを分解する能力を有していないことが分かる。
【００６１】
【表１】
2005313159.tif 000002
【００６２】
実施例９
土壌中でのディーゼルオイルの分解
土壌２ｇに、ディーゼルオイルを１質量％濃度になるように添加した。この土壌に、ＷａｔＧを接種し、２０℃で１週間静置培養した。培養後、土壌中の残留鉱物油は、内部標準として３ｍｇ／ｍＬのｎ−ドデカン（Ｃ１２）（関東化学（株）製）を土壌に対して６iＬを加えた後、２ｍＬのジクロロメタン（和光化学（株）製）を用いて抽出した。抽出物は、実施例６と同様の条件でガスクロマトグラフによる分析を行った。培養前と培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図７に示す。図７において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図７から明らかなように、ディーゼルオイルに由来するＣ１０〜Ｃ２２（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークが、培養後にはかなり小さくなっており、ＷａｔＧが土壌中の条件においてもディーゼルオイルを分解したことが分かる。鉱物油の分解率については、Ｃ１０〜Ｃ２２（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークを対象に算出した。分解率は２０〜４０％であった。
【００６３】
実施例１０
＜バイオフィルム形成試験＞
土壌２ｇを試験管に入れ、この土壌に対して２質量％となるようにディーゼルオイルを添加した。次いで、媒体として、木炭粉（ドド松炭、商品名「もりの木太郎」：（株）サポートオーティー製）、燃料用炭（通常に市販されているもの）又はゼオライト（（株）共成レンテム製、商品名「とかちゼオライト」）を、土壌２ｇに対して１０ｍｇの割合で土壌に加えた。なお、木炭粉、燃料用炭及びゼオライトは、いずれも１〜２ｍｍ×１〜２ｍｍ×３〜５ｍｍのサイズのものを用いた。
【００６４】
一方、Pseudomonas aeruginosa WatGをLB培地で３０℃で１６時間培養して得られた培養液を、土壌の質量に対して１０質量％となるように加えた。次いで、２０℃の温度で２週間培養を行った。２週間培養を行った後、土壌中の全油分を２ｍＬのジクロロメタン−エタノール（１：１）で抽出し、土壌中のディーゼルオイルの分析を実施例６と同様にしてガスクロマトグラフィにより行った。また、コントロールとして、媒体及びWatGを添加しなかったもの、及び媒体を添加せず、WatGを添加したものについても同様にして試験を行った。なお、試験は４本の試験管を用いて行い、その平均を求めた。
ディーゼルオイルの分析結果を表２に示す。表中の数字は、ディーゼルオイルの分解率（質量％）であり、最初に添加したディーゼルオイルの質量に対し、減少したディーゼルオイルの質量の割合（質量％）を表す。
【００６５】
【表２】
2005313159.tif 000003
【００６６】
表２から明らかなように、媒体もPseudomonas aeruginosa WatGも添加しなかったものについては、分解率は２８．５質量％であった。これは、微生物が添加されていないので、実際に分解されたのではなく、ディーゼルオイルが自然に蒸発して減少したものと思われる。
Pseudomonas aeruginosa WatGを加え、媒体を加えなかったものについては、分解率は５５．８質量％であった。また、媒体として、木炭粉、燃料用炭又はゼオライトを添加したものは、分解率は、それぞれ、６５．１質量％、６５．８質量％及び６１．０質量％であった。媒体として、木炭粉、燃料用炭又はゼオライトを加えた場合、媒体を加えない場合と比較してディーゼルオイルの分解率が向上していることがわかる。この結果より、バイオフィルムを形成し得る媒体をＷａｔＧと共存させることにより、鉱物油の分解活性が上昇していることが明らかである。この結果は、土壌中に存在する、バイオフィルムを形成し得る媒体にバイオフィルムが形成され、バイオフィルムが形成されたことにより、鉱物油の分解活性が向上したものと考えられる。以下の実施例において、バイオフィルムの形成の有無について試験を行った。
【００６７】
実施例１１
実施例１０で培養を行った土壌を２ｇ回収し、その土壌の４ｍＬのリン酸緩衝液（１３０ｍM NaClを含む10 mM リン酸ナトリウム：pH 7.2）と混合し、３０秒間ボルテックス処理し、次いで30秒間超音波処理を行った。１０分間放置した後、上層の液体１ｍＬを回収して10,000 x gで１０分間、遠心処理を行った。上層を取り除き、沈殿物を上記リン酸緩衝液（０．５ｍＬ）に再懸濁した。これを再度10,000 x gで１０分間遠心して得られた沈殿をバイオフィルム画分とした。P. aeruginosaWatG単独の液体培養液を用いた場合は、遠心により培地を除いた後、同様の処理をした。
【００６８】
次いで、上述のようにして得られたバイオフィルム画分をリン酸緩衝液に溶解した4％パラフォルムアルデヒド中で4℃、４〜８時間処理することにより固定した。固定の後、バイオフィルム画分または細胞はパラフォルムアルデヒドを除くために、４℃に冷却したリン酸緩衝液により洗浄を行った。固定された試料を、１００μＬのリン酸緩衝液-エタノール（１：１）中で−２０℃で保存した。
【００６９】
In situハイブリダイゼーション法により、バイオフィルム形成の有無を確認した。上述のようにして得られたバイオフィルム画分を氷上で溶解し、遠心処理（１０,０００ x g、１０分間）によって液体を取り除いた。得られた沈殿を適量のリン酸緩衝液−エタノール（7：3）に再懸濁した。８μＬの試料をスライドグラスにのせ、４６℃の温度で10分間乾燥した。この試料に50, 80, 98%のエタノールを連続的に加えて脱水し、最終的に室温で風乾した。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション緩衝液（0.9 M NaCl, 20 mM Tris塩酸 [pH 7.2], 0.01% ドデシル硫酸ナトリウム, 20% フォルムアミド）中で46℃、16時間の条件で行った。細菌を標識する蛍光プローブとしては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したEub338（Amann et al. 文献名J. Bacteriol. 172:762-770, 1990）を用いた。ＦＩＴＣの励起光及び蛍光波長はそれぞれ490及び520 nmである。プローブは大腸菌rRNA遺伝子の338-355の配列に相当する5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’（配列番号：３）を用いた。プローブの終濃度は5 ng μl/Lとした。また、洗浄は予め４８℃に温めた洗浄溶液（20 mM Tris-塩酸[pH 7.2], 0.01% ドデシル硫酸ナトリウム, 0.225 mM NaCl）で48℃、20分間処理することにより行った。スライドグラスを脱イオン水に10秒間浸すことにより洗浄したあと、SlowFade light antifade kit (Molecular Probes, Eugene, Oreg. USA)を用いて標本とした。
【００７０】
得られた標本について、励起光波長４８８ｎｍ（Arレーザー）及び５４３ｎｍ（He-Neレーザー）を有する共焦点レーザー顕微鏡（モデルLSM 510: Zeiss社製）を用いて顕微鏡観察を行った。画像処理及び分析はZeiss社より提供されている標準ソフトウエアを用いて行った。処理画像はAdobe Photoshop 3.0J (Adobe Systems Incorporated, Mountain View, Calif. USA)を用いて行った。
【００７１】
顕微鏡観察の結果を図８に示す。図８は、In situハイブリダイゼーションを行った結果を表す写真であり、図８Ａは、媒体として木炭粉を加えて培養を行った場合の結果、図８Ｂは、媒体として燃料用炭を加えて培養を行った場合の結果、図８Ｃは、ゼオライトを加えて培養を行った場合の結果、図８Ｄは、媒体を加えずに培養を行った場合の結果を表す。また、図８Ｅは、媒体として木炭粉を加えた土壌について、プローブを加えずに行った結果であり、蛍光が観察されない陰性コントロールである。
【００７２】
図８Ａ、Ｂから明らかなように、木炭粉及び燃料用炭を用いた場合は高い強度の蛍光が観察されたことから、堅調なバイオフィルムが形成されていることが確認された。また、図８Ｃにおいては、蛍光強度は大きいが比較的小さなサイズを持った領域で蛍光が観察されたことから、ゼオライトを用いた場合は、バイオフィルムの形成は認められるが、木炭粉、燃料用炭を用いた場合と、バイオフィルムの構造が異なっていることがわかった。また、図８Ｄから明らかなように、媒体を加えなかった場合は、蛍光強度が非常に弱く、蛍光を示す構造体の範囲が明らかでなく、バイオフィルムが形成されていないことがわかる。図１Ｅは陰性コントロールであり、蛍光は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の汚染土壌浄化装置の一例を示す図である。
【図２】バイオフィルム付着部材の部分拡大図を示す図である。
【図３】他の実施形態にかかる汚染土壌浄化装置の有するバイオフィルム付着部材の断面図である。
【図４】ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図５】重油を含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図６】対照としたP. aeruginosa JCM5962Tを用いた時の、ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図７】ディーゼルオイルを含有する土壌の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図８】図８は、In situハイブリダイゼーションを行った結果を表す写真である。
【符号の説明】
【００７４】
１０  汚染土壌浄化装置
１２  微生物供給管
１４  酸素供給管
１６  栄養物供給管
１８  バイオフィルム付着部材
３０  中空部材
３２  孔
３４  突状部
【図１】
2005313159.tif 000004
【図２】
2005313159.tif 000005
【図３】
2005313159.tif 000006
【図４】
2005313159.tif 000007
【図５】
2005313159.tif 000008
【図６】
2005313159.tif 000009
【図７】
2005313159.tif 000010
【図８】
2005313159.tif 000011
【配列表】
2005313159000001.app