(57)【要約】【課題】  Ｓｋｐ−２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを発現することができる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、二本鎖ＲＮＡ発現カセットを含む二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、Ｓｋｐ−２を分子標的とする安全性の高い小細胞肺等の癌特異的治療薬や治療法を提供すること。【解決手段】  Ｓｋｐ−２ｍＲＮＡのタンパク翻訳領域にＲＮＡｉの標的配列を複数個所設定し、ＲＮＡｉ効果を発揮するｄｓＲＮＡであるｓｉＲＮＡの発現形をレンチウイルスベクター上に構築し、組換えウイルスベクターを作製し、各種小細胞肺癌細胞株や小細胞肺癌に感染させ、インビトロでの細胞増殖抑制効果、及びインビボにおける増殖抑制効果を確認する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＫＰ−２遺伝子の発現を抑制することができる、ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
変異ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列が、配列表の配列番号２に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列が、配列表の配列番号３に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項４】
ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列が、１９〜２４ｂｐの塩基配列であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＳＫＰ−２遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現カセット。
【請求項６】
配列表の配列番号４に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項５記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット。
【請求項７】
配列表の配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項５記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項９】
ＨＩＶレンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項８記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするＳＫＰ−２遺伝子の発現抑制剤。
【請求項１１】
以下の（１）と（２）を有効成分とすることを特徴とするＳＫＰ−２遺伝子及び変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制剤。
（１）請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１３】
癌が、ＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進に起因する癌又はＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進を伴う癌であることを特徴とする請求項１２記載の癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１４】
癌が、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項１２記載の癌の予防及び／又は治療剤。
【請求項１５】
以下の（１）と（２）を有効成分として含有することを特徴とする癌の予防及び／又は治療剤。
（１）請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とするＳＫＰ−２遺伝子の発現抑制方法。
【請求項１７】
以下の（１）と（２）を、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とするＳＫＰ−２遺伝子及び変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現抑制方法。
（１）請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法。
【請求項１９】
癌が、ＳＫＰ−２遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌又はＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進を伴う癌であることを特徴とする請求項１５記載の癌の予防及び／又は治療方法。
【請求項２０】
癌が、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項１８記載の癌の予防及び／又は治療方法。
【請求項２１】
以下の（１）と（２）を、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法。
（１）請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉ（RNA interference：ＲＮＡ干渉）法を利用するものであって、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）、二本鎖ＲＮＡを発現することができる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、二本鎖ＲＮＡ発現カセットを含む二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、及び、これらを有効成分とする小細胞肺癌等の癌の予防・治療剤や、これらを投与することからなる小細胞肺癌等の癌の予防・治療方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの悪性腫瘍で見られる細胞周期調節機構の障害は、癌細胞の無制御な増殖に直結している。サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）インヒビターであるｐ２７Kip1は、Ｇ１後期（ＤＮＡ合成準備期間後期）からＳ期（ＤＮＡ合成期）におけるサイクリンＥ／ｃｄｋ２複合体の活性を抑制して、Ｇ１期からＳ期の移行を阻害する（例えば、非特許文献１参照）。胃ガン、乳ガン及び直腸ガンを含む多くの悪性腫瘍において、ｐ２７Kip1の発現低下が、腫瘍の予後不良及び腫瘍の非常に活動的な性質と関連していることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。ｐ２７Kip1タンパク質レベルが、ユビキチン−プロテアソームによるタンパク分解によって主に制御されているので、ｐ２７Kip1の分解の増進は、悪性腫瘍におけるｐ２７Kip1の発現低下の重要な原因であると思われている（例えば、非特許文献３参照）。Ｆ−ｂｏｘタンパク質ファミリーのメンバーであるＳｋｐ−２（S-phase kinase-associated protein 2 (p45)）は、ＳＣＦユビキチン−タンパク質リガーゼ複合体の特異的基質認識サブユニットであり、ｐ２７Kip1の分解に関与している（例えば、非特許文献４参照）。Ｓｋｐ−２の発現上昇は、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）（例えば、非特許文献５参照）、口腔扁平上皮癌（例えば、非特許文献６参照）、リンパ腫（例えば、非特許文献７参照）又は胃ガン（例えば、非特許文献２参照）を含む多くのガンで報告されている。ｐ２７Kip1のレベルは、これらのガンにおいては、逆に低下していた。これらの腫瘍においては、Ｓｋｐ−２の発現上昇が、ｐ２７Kip1タンパク質レベルの減少に関与している可能性が示唆される。ＳＣＬＣの４４％の症例で、５ｐ１１−１領域（amplicon）の遺伝子増幅に伴い、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現上昇が認められ、ｐ２７Kip1の発現低下を伴っていた（例えば、非特許文献５参照）。
【０００３】
生物の発生過程において、細胞は増殖と生死を厳密に制御されながら、様々な形質を持った細胞へと分化していく。また発生後の成体においても、個々の細胞の増殖・分化・細胞死は、個体としての恒常性を保つために厳密に制御されている。つまり、個々の細胞運命は、ホルモン、神経伝達物質、細胞増殖因子、サイトカインなどの細胞外シグナルが細胞膜上の受容体を介して細胞内に正確に伝達することでコントロールされている。細胞外シグナルを細胞内の核に伝達し、遺伝情報の制御に至る機構を細胞内シグナル伝達機構と呼び、この機構での細胞内におけるタンパク間相互作用の連続反応を細胞内シグナル伝達経路という。この細胞内シグナル伝達経路は、上流のシグナルを受けて活性型となり、下流にシグナルを伝達した後に不活性型に戻るということを繰り返しながら、シグナルを伝達している。
【０００４】
細胞内シグナル伝達系の一つであるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は、細胞の増殖・分化シグナルに重要な役割を果たしている。ＭＡＰＫは分子量約４万のタンパク質リン酸化酵素であり、さまざまな真核生物の細胞種でＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）→ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）→ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化カスケードを形成している。このカスケードは、原癌遺伝子ｒａｓの下流で活性化し、細胞増殖シグナルとして働くだけでなく、細胞分化、細胞増殖停止、あるいは細胞運動性亢進を誘導する。また、多くの癌細胞においてはＭＡＰＫ系の恒常的機能亢進が認められるため、その特異的阻害が制癌につながると考えられている。
【０００５】
ＭＡＰＫ経路は、悪性黒色腫においてもＭＰＫＫＫの一つであるＢＲＡＦの点突然変異が高頻度に検出されており（６６%）、癌化との関連性が示唆されており、変異はすべて、キナーゼドメインの活性化領域内部か隣接するところに見られ、頻出する変異のいくつか（Ｖ５９９Ｅ、Ｌ５９６Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６８Ａ）の解析により、変異によってＢＲＡＦのキナーゼ活性が増し、結果としてＥＲＫが活性化すること、さらに、変異ＢＲＡＦがＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォーメーション能を有することが報告（例えば、非特許文献８参照。）されている。また、多くの悪性黒色腫細胞株や悪性黒色腫組織において、恒常的にＭＡＰＫ活性の亢進が報告（例えば、非特許文献９参照。）されている。これらの報告は、変異ＢＲＡＦが悪性黒色腫の発生に深く関連する癌遺伝子であり、悪性黒色腫治療の分子標的になりうることを示唆する。しかし、上記のアッセイ系においては、生理的発現レベルを遥かに超えた過剰量の変異ＢＲＡＦの機能を検出しているため、内在性の異変ＢＲＡＦがＭＡＰＫに与える影響や癌化との関連性については依然として不明である。
【０００６】
また、Ｓｋｐ−２発現上昇とＢＲＡＦ変異が、肺癌、口腔扁平上皮癌、リンパ腫、胃癌、大腸癌、悪性黒色腫、脳腫瘍、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肉腫、甲状腺癌などの多くの癌に共通に認められることも報告されている（例えば、非特許文献２及び５〜８参照。）。
【０００７】
一方、ある種の生物（線虫：Caenorhabditis elegans）では、二本鎖ＲＮＡ（double-strand RNA：ｄｓ ＲＮＡ）によって遺伝子の発現を特異的に阻害できることが見い出されている（例えば、特許文献１、非特許文献１０参照。）。この現象は、ある遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなるｄｓＲＮＡが、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊するという現象で、ＲＮＡｉ（RNA interference：ＲＮＡ干渉）と呼ばれている。この現象は、その後、種々の動物（例えば、非特許文献１１〜１３参照。）や、植物（例えば、非特許文献１４参照。）を含む下等な真核細胞において見い出されている。
【０００８】
ＲＮＡｉは、発見された当初、哺乳動物細胞においては、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを細胞内へ導入すると、インターフェロン応答の誘導による非特異的な遺伝子発現抑制が生じるために、ＲＮＡｉによる特異的な遺伝子発現阻害が観察されなくなるため、哺乳動物細胞での利用は困難と思われていた。しかし、２０００年にマウス初期胚や哺乳動物培養細胞においてもＲＮＡｉが起こりうることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構そのものは、哺乳動物細胞にも存在することが明らかとなった（例えば、特許文献２、非特許文献１５参照。）。
【０００９】
このようなＲＮＡｉの機能を利用して、哺乳動物においてもある特定の遺伝子又は遺伝子群の発現を阻害することができれば有益であることは明らかである。多くの疾病（癌、内分泌疾患、免疫疾患など）は、哺乳動物の中で、ある特定の遺伝子又は遺伝子群が異常発現することによって起こるので、遺伝子又は遺伝子群の阻害は、これらの疾病を治療するために使用することができる。また、変異型タンパク質の発現に起因して疾病が発症することもあり、このような場合には、変異した対立遺伝子の発現を抑えることで、疾病の治療が可能となる。さらに、このような遺伝子特異的な阻害は、例えば、ＨＩＶなどのレトロウイルス（レトロウイルス中のウイルス遺伝子は、それらの宿主のゲノム中に組み込まれて、発現される。）によって引き起こされるウイルス疾患を治療するためにも使用できるといわれている。
【００１０】
ＲＮＡｉの機能を引き起こすｄｓＲＮＡは、当初、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡの細胞内への導入が必要と考えられていたが、最近、更に短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが明らかになった（例えば、非特許文献１６参照。）。ｓｉＲＮＡは、体細胞の全ての発生段階において遺伝子の発現を抑制する強力な手段として認識されており、進行性の遺伝病等において、発病する前に、病気の原因となる遺伝子の発現を抑制する方法として期待できる。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０１／３６６４６号パンフレット
【非特許文献１】T. Cell, 78 : 67-74, 1994
【非特許文献２】Cancer Res., 62 : 3819-3825, 2002
【非特許文献３】Nature, 396 : 177-180
【非特許文献４】Nature Cell Biol. 1 : 207-214, 1999
【非特許文献５】American J. Pathol. 161 : 207-216, 2002
【非特許文献６】Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98 : 5043-5048, 2001
【非特許文献７】Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98 : 2515-2520, 2001
【非特許文献８】Nature, 417, 949-954, 2002
【非特許文献９】Cancer Research, 63, 756-759, 2003
【非特許文献１０】Nature, 391, 806-811, 1998
【非特許文献１１】Cell, 95, 1017-1026, 1998
【非特許文献１２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14687-14692, 1998
【非特許文献１３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5049-5054, 1999
【非特許文献１４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959-13964, 1998
【非特許文献１５】FEBS Lett, 479, 79-82, 2000
【非特許文献１６】Nature, 411, 494-498, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＲＮＡｉ法を利用して、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡを発現することができる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、二本鎖ＲＮＡ発現カセットを含む二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、Ｓｋｐ−２を分子標的とする安全性の高い小細胞肺癌等の癌特異的治療薬や治療法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
Ｓｋｐ−２は、ｐ２７Kip1、ｐ２１又はｃ−ｍｙｃ等の複数の細胞周期調節因子の分解に関与している。多くのガンにおけるＳｋｐ−２の発現上昇は、細胞周期の調節障害の重要なメカニズムの１つであると考えられている。そこで本発明者らは、ＳＣＬＣの発生におけるＳｋｐ−２の役割を解明し、Ｓｋｐ−２が、ガン治療の優れた分子標的となりうるかどうかを調べる目的で、ウイルスを介したＳｋｐ−２特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を作用させることにより、癌の形質に与える変化の解析を試みた。レンチウイルスを介したＳｋｐ−２特異的ＲＮＡｉは、Ｓｋｐ−２の発現上昇を伴った小細胞肺ガン細胞株であるＡＣＣ−ＬＣ−１７２の内在性Ｓｋｐ−２タンパク質レベルの抑制と同時に、インビトロでの増殖活性を低下させた。ＲＮＡｉを介してのＳｋｐ−２のタンパク質レベルの抑制は、ｐ２７Kip1及びｐ２１の上昇と相関していたが、ｍｙｃ転写活性の不活性化は誘導していなかった。同様にアデノウイルスを介したＳｋｐ−２特異的ＲＮＡｉは、ＡＣＣ−ＬＣ−１７２皮下腫瘍のインビボの増殖を抑制した。これらの結果は、Ｓｋｐ−２のＲＮＡｉは、ガンの遺伝子治療の有用な治療方法となる可能性を示唆している。また、本発明者らは、先にＲＮＡｉ法を利用して、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子等のＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を利用した癌の治療方法を提案（特願２００４−１２４４８５）しており、ＢＲＡＦの変異とＳｋｐ−２の発現上昇を示す悪性黒色腫細胞株に対して、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）特異的ＲＮＡｉとＳｋｐ−２特異的ＲＮＡｉとの同時併用により、各単独使用に比べて、有意に細胞増殖と細胞浸潤能が抑制されることを見い出した。本発明は以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１４】
すなわち本発明は、ＳＫＰ−２遺伝子の発現を抑制することができる、ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ（請求項１）や、変異ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列が、配列表の配列番号２に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項２）や、ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列が、配列表の配列番号３に示される塩基配列に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなることを特徴とする請求項１記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項３）や、ＳＫＰ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列が、１９〜２４ｂｐの塩基配列であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ（請求項４）に関する。
【００１５】
また本発明は、請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＳＫＰ−２遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現カセット（請求項５）や、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項５記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット（請求項６）や、配列表の配列番号５に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項５記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット（請求項７）や、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（請求項８）や、ＨＩＶレンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項８記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（請求項９）に関する。
【００１６】
さらに本発明は、請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするＳＫＰ−２遺伝子の発現抑制剤（請求項１０）や、請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする癌の予防及び／又は治療剤（請求項１１）や、癌が、ＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進に起因する癌又はＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進を伴う癌であることを特徴とする請求項１１記載の癌の予防及び／又は治療剤（請求項１２）や、癌が、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項１１記載の癌の予防及び／又は治療剤（請求項１３）や、請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とするＳＫＰ−２遺伝子の発現抑制方法（請求項１４）や、請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法（請求項１５）や、癌が、ＳＫＰ−２遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌又はＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進を伴う癌であることを特徴とする請求項１５記載の癌の予防及び／又は治療方法（請求項１６）や、癌が、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項１５記載の癌の予防及び／又は治療方法（請求項１７）や、請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法（請求項１８）や、癌が、ＳＫＰ−２遺伝子変異又は発現亢進に起因する癌又はＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進を伴う癌であることを特徴とする請求項１５記載の癌の予防及び／又は治療方法（請求項１９）や、癌が、小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）であることを特徴とする請求項１８記載の癌の予防及び／又は治療方法（請求項２０）や、以下の（１）と（２）を、生体、組織又は細胞に導入することを特徴とする癌の予防及び／又は治療方法。
（１）請求項１〜４のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ、請求項５〜７のいずれか記載の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、請求項８若しくは９記載の二本鎖ＲＮＡ発現ベクター
（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター（請求項２１）に関する。
【発明の効果】
【００１７】
実施例の結果からもわかるように、ＲＮＡ干渉法によるＳｋｐ−２発現の特異的抑制は、ｐ２７Kip1の蓄積及びＧ１期における細胞周期の停止を導き、強力な増殖抑制効果をもたらすことが示された。したがって、本発明の癌の予防・治療剤等は、インビトロでの細胞増殖抑制効果、及びインビボにおける増殖抑制効果を有することから、有用な遺伝子治療薬として期待できる。また、本発明のＳｋｐ−２特異的なｓｉＲＮＡは、Ｓｋｐ−２発現レベルの低い細胞(２９３Ｔ細胞、線維芽細胞など)に対しては、増殖抑制効果を殆ど示さなかったことから、癌細胞に選択的に作用する効果が期待できるため、安全性の高い分子標的治療法に用いることが期待できる。また、これらのｓｉＲＮＡは、医療分野への応用のみならず、細胞周期の調節やその障害の基礎研究における道具としても、極めて有用性が高い。さらに、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）特異的ＲＮＡｉとＳｋｐ−２特異的ＲＮＡｉとの同時併用は、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子とＳｋｐ−２遺伝子過剰発現の両者を有する癌に対して安全性の高い分子標的治療法として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の二本鎖ＲＮＡとしては、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現を抑制することができる、Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡであれば特に制限されるものではなく、上記Ｓｋｐ−２遺伝子の由来としては特に限定されないがヒト由来のＳｋｐ−２遺伝子が好ましい。かかるＳｋｐ−２遺伝子としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるＳｋｐ−２遺伝子を例示することができる。
【００１９】
上記Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列とは、Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡの特定の領域の部分配列、好ましくは１9〜２４ｂｐの塩基長の部分配列をいい、かかるＳｋｐ−２ ｍＲＮＡの標的配列としては、Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡに特異的配列であることが好ましい。かかるＳｋｐ−２ ｍＲＮＡの標的配列としては、配列表の配列番号２に示される塩基配列ATCAGATCTCTCTACTTTA（配列番号１に示される塩基配列の949〜967番目の１9mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡや、配列表の配列番号３に示される塩基配列AGGTCTCTGGTGTTTGTAA（配列番号１に示される塩基配列の408〜426番目の１9mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡを具体的に例示することができる。
【００２０】
また、Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとは、例えば上記配列番号２や３に示されるＤＮＡ配列由来のＲＮＡをいい、Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なアンチセンス鎖ＲＮＡとは、上記センス鎖ＲＮＡと相補的ＲＮＡをいい、本発明の二本鎖ＲＮＡは、通常これらセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡ同士が結合したｓｉＲＮＡとして構築されるが、便宜上、センス鎖ＲＮＡ配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された変異センス鎖ＲＮＡ配列と該変異センス鎖ＲＮＡ配列に相補的な変異アンチセンス鎖ＲＮＡ配列とのｓｉＲＮＡとして構築した二本鎖ＲＮＡも本発明の範囲に含まれる。上記「１又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列」とは、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個の任意の数の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列を意味する。
【００２１】
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作製するには、合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖ＤＮＡやアンチセンス鎖ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできるが、Ｓｋｐ−２遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを構築し、該二本鎖ＲＮＡ発現カセットを発現ベクターのプロモーターの下流に連結し、インビボでの発現・構築により所望の二本鎖ＲＮＡを作製することが好ましい。
【００２２】
Ｓｋｐ−２遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる上記本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセットとしては、TTCAAGAGAをリンカー配列とした、配列表の配列番号４に示される塩基配列ATCAGATCTCTCTACTTTA TTCAAGAGA TAAAGTAGAGAGATCTGAT tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットや、配列表の配列番号５に示される塩基配列CTCTGGTGTTTGTAATTCAAGAGA TTACAAACACCAGAGACCT tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを具体的に例示することができる。これら二本鎖ＲＮＡ発現カセットは、宿主細胞内で転写されると、センス鎖ＤＮＡに相当するセンス鎖ＲＮＡと、アンチセンス鎖ＤＮＡに相当するアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを形成することができる。
【００２３】
また、二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することができる発現ベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、アデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、アデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有するＨＩＶレンチウイルスベクターや、高いウイルス力価でインビボでの遺伝子導入が可能なアデノウイルスベクターの利用が考えられる。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。これらの発現ベクターへの二本鎖ＲＮＡ発現カセットの導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーター（Ｕ６プロモーター等）の下流に、標的ｍＲＮＡと相補的な配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー配列−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡを挿入することにより本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。
【００２４】
本発明のＳｋｐ−２遺伝子の発現抑制剤や、本発明の癌の予防及び／又は治療剤としては、（１）上記本発明の二本鎖ＲＮＡ、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、また、本発明のＳＫＰ−２遺伝子及び変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子の発現抑制剤や、本発明の癌の予防及び／又は治療剤としては、上記（１）本発明の二本鎖ＲＮＡ、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターと（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、とを有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、これら発現抑制剤や癌の予防・治療剤を哺乳動物の生体、組織、細胞等に投与又は導入するに際しては、この分野で通常用いられる薬学的に許容される担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分とともに用いることができる。該薬学的に許容される担体とともに用いる薬学的組成物は、その投与形態、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）投与、或いは非経口投与（注射剤等）等に合わせて、薬学の分野ではそれ自体周知の製剤形態で製剤化することができる。
【００２５】
また、本発明のＳｋｐ−２遺伝子の発現抑制方法や、本発明の癌の予防及び／又は治療方法としては、（１）上記本発明の二本鎖ＲＮＡ、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターを、哺乳動物の生体、組織又は細胞に導入する方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のＳＫＰ−２遺伝子及び変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子の発現抑制方法や、本発明の癌の予防及び／又は治療方法としては、上記（１）本発としては、上記（１）本発明の二本鎖ＲＮＡ、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、本発明の二本鎖ＲＮＡ発現ベクターと（２）変異ＢＲＡＦ遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、前記二本鎖ＲＮＡを発現することができる、ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、前記二本鎖ＲＮＡ発現カセットがプロモーターの下流に連結されている二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、とを哺乳動物の生体、組織又は細胞に導入する方法であれば特に制限されるものではなく、これら二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ発現カセット、又は、二本鎖ＲＮＡ発現ベクターの哺乳動物の生体、組織又は細胞への導入方法としては、経口的又は非経口的に投与する方法を挙げることができる。例えば、通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。
【００２６】
本発明の癌の予防・治療剤や本発明の癌の予防・治療方法の対象となる癌としては、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現亢進に起因する癌や又はＳＫＰ−２遺伝子の発現亢進を伴う癌を例示することができ、より具体的には、小細胞肺癌の他、悪性黒色腫、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、甲状腺癌等を挙げることができる。また、本発明の癌の予防・治療剤や本発明の癌の予防・治療方法の対象となる癌としては、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現亢進及びＢＲＡＦ遺伝子の変異が共通に認められる癌を例示することができ、より具体的には、肺癌、口腔扁平上皮癌、リンパ腫、胃癌、大腸癌、悪性黒色腫、脳腫瘍、大腸癌、肺癌、卵巣癌、肉腫、甲状腺癌等を挙げることができる。
【００２７】
上記変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子の発現を抑制することができる、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡとしては、ヒト由来の変異ＢＲＡＦ遺伝子が好ましく、かかる変異ＢＲＡＦ遺伝子としては、Ｖ５９９Ｅ、Ｌ５９６Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６８Ａで示される変異ＢＲＡＦの遺伝子ＤＮＡを具体的に例示することができるが、悪性黒色腫の発生に深く関与している配列表の配列番号１０に示される塩基配列からなる変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子（ＢＲＡＦ遺伝子の１８５７番目のＴがＡに置換された変異遺伝子）を特に好適に例示することができる。
【００２８】
上記ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列とは、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの特定の領域の部分配列、好ましくは１９〜２１ｂｐの塩基長の部分配列をいい、かかるＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的配列としては、ＢＲＡＦｍＲＮＡに特異的配列が好ましいが、変異ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列であることが特に好ましい。かかる変異ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの変異部位を含む標的配列として、変異ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）遺伝子の変異部分を含む、配列表の配列番号１１に示される塩基配列GCT ACA GaG AAA TCT CGA T（配列番号１０に示される塩基配列の１８５０〜１８６８番目の１９mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡを具体的に例示することができる。また、変異ＢＲＡＦ遺伝子の変異部位を含む特定配列ではないが、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの発現を抑制することができる標的配列として、配列表の配列番号１２に示される塩基配列GCC ACA ACT GGC TAT TGT TA（配列番号１０に示される塩基配列の１６２４〜１６４３番目の２０mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡや、配列表の配列番号１３に示される塩基配列（配列番号１０に示される塩基配列の１６６９〜１６８９番目の２１mer）に由来するＲＮＡ及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡを具体的に例示することができる。
【００２９】
ＢＲＡＦ遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる上記二本鎖ＲＮＡ発現カセットとしては、TTCAAGAGAをリンカー配列とした、配列表の配列番号１４に示される塩基配列GCT ACA GaG AAA TCT CGA T TTCAAGAGA ATC GAG ATT TCt CTG TAG C tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットや、配列表の配列番号１５に示される塩基配列GCC ACA ACT GGC TAT TGT TA TTCAAGAGA TA ACA ATA GCC AGT TGT GGC tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットや、配列表の配列番号１６に示される塩基配列GTA TCA CCA TCT CCA TAT CAT TTCAAGAGA ATG ATA TGG AGA TGG TGA TAC tttttからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを具体的に例示することができる。これら二本鎖ＲＮＡ発現カセットは、宿主細胞内で転写されると、センス鎖ＤＮＡに相当するセンス鎖ＲＮＡと、アンチセンス鎖ＤＮＡに相当するアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを形成することができる。
【００３０】
その他、ＢＲＡＦ ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡの意味するところは、前記Ｓｋｐ−２における場合と同様である。また、ＢＲＡＦ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の作製方法や、二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することができる発現ベクターの作製方法については、前記Ｓｋｐ−２における場合と同様である。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、全ての統計学的分析を、unpaired Student-t testに従って行った。
【実施例１】
【００３２】
[細胞株]
日本人の小細胞肺ガン患者より樹立したＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞株（愛知ガンセンター研究所、高橋博士より供与）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Sigma社製）内で維持した。２９３Ｔ細胞及び８種類の悪性黒色腫細胞株（Ｓｋｍｅｌ２３，Ａ３７５，８８８，３９７，５２６，６２４，９２８，１３６３）は、American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）から購入し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（Sigma社製）内で維持した。
【実施例２】
【００３３】
［ＨＩＶベクター］
ｓｉＲＮＡ発現用のＨＩＶベクターは、文献（J. Gene Med., 2004）記載の通り、ＨＩＶ−Ｕ６ｉ−ＧＦＰプラスミドを基として構築された。簡潔に言うと、ＨＩＶ−Ｕ６ｉ−ＧＦＰは、２つの発現ユニットを有する。１つは、ｓｉＲＮＡ発現カセットであり、ショートヘアピンＲＮＡがヒトＵ６プロモーターから転写される発現ユニットであり、２つ目は、ＧＦＰ発現カセットであり、ＧＦＰ遺伝子がＣＭＶプロモーターから転写される発現ユニットである。ｓｉＲＮＡを発現するために、ターゲット配列用にインビトロでアニールした相補オリゴヌクレオチドを、ヒトＵ６プロモーターの２つのＢｓｐＭＩサイトに挿入した。
【００３４】
（Ｓｋｐ−２を標的とするｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクター）
Ｓｋｐ−２ｍＲＮＡ上に、ｓｉＲＮＡターゲット配列を２箇所選択した；（Ｓ２）ATCAGATCTCTCTACTTTA及び（Ｓ５）AGGTCTCTGGTGTTTGTAAである。２つの相補オリゴヌクレオチドcacc-(target sense)-TTCAAGAGA-(target antisense)-TTTT及びgcatAAAAA-(target sense)-TCTCTTGAA-(target antisense) を、各ターゲット配列用に合成し、インビトロでアニールした。この二本鎖(ds)オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−Ｕ６ｉ−ＧＦＰプラスミド内のU6プロモーター下流に存在する２つのＢｓｐＭＩサイトに対し相補的な５’突出末端を有しており、これにより、容易にＨＩＶ−Ｕ６ｉ−ＧＦＰ内のｓｉＲＮＡ発現カセット内に挿入が可能である。コントロールベクターのＧＬ３ＢｓｉＲＮＡ（蛍ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）ＨＩＶベクターも、ターゲット配列GTGCGCTGCTGGTGCCAAC（配列番号６）で構築した。黒色腫で頻繁に変異するＢＲＡＦのｍＲＮＡ（Ｓｋｐ−２）用の突然変異特異的抗ＢＲＡＦｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクター（ターゲット；GCTACAGAGAAATCTCGATGG；配列番号７）は、レポーターアッセイでコントロールとして用いた。これらのＨＩＶベクターからは、センス鎖とアンチセンス鎖が、リンカー配列（TTCAAGAGA）の箇所でループ構造を形成して、ショートヘアピン ＲＮＡを形成した後、Dicerによりリンカーが除去されて、ｓｉＲＮＡが形成される。HIVベクターの作製に当たっては、２９３Ｔ細胞に対して、ＨＩＶプラスミドベクター、 pMD.G（VSV-G env 発現プラスミド）、pMDLg/p.RRE（第３世代パッケージングプラスミド）及びpRSV Rev（Rev発現プラスミド）（後述の２つのプラスミドは、Cell  Genesysから提供された）を、リン酸カルシウム法により、トランスフェクションを行い、４８時間後の培養上清を回収後、濃縮してウイルスベクターとして用いた。ウイルス力価は、２９３Ｔ細胞を感染させて測定し、ＧＦＰ発現によって算出した。
【００３５】
（ＢＲＡＦを標的とするｓｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクター）
ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）ＲＮＡ上に、Ｖ５９９Ｅ変異個所を含み、８番目の塩基がＴからＡに変異している配列を標的にしているｓｉＲＮＡターゲット配列（＃１’）GCTACAGAGA AATCTCGAT（配列番号１１）を選択した。Ｓｋｐ−２の場合と同様に、Ｕ６プロモーターの下流のBspMIサイトに、標的ｍＲＮＡ配列と相同な１９〜２１塩基長のｃＤＮＡ（センス鎖）、リンカー配列、センス鎖と相補的なｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）、転写終結シグナルのＴＴＴＴＴからなる合成ヌクレオチドを挿入し、Ｕ６プロモーターから標的ｍＲＮＡ配列と相同なセンス鎖−リンカー−アンチセンス鎖ＲＮＡが発現できるユニットを作製した。このＲＮＡは、細胞内で転写された後、リンカー部分でループを形成して、センス鎖とアンチセンス鎖の間でステム構造を取り、細胞質内でDicerによりリンカー部分が切断された後ｓｉＲＮＡになる。これらのＨＩＶベクターからは、センス鎖とアンチセンス鎖が、リンカー配列（TTCAAGAGA）の箇所でループ構造を形成して、ショートヘアピン ＲＮＡを形成した後、Dicerによりリンカーが除去されて、ｓｉＲＮＡが形成される。HIVベクターの作製に当たっては、２９３Ｔ細胞に対して、ＨＩＶプラスミドベクター、 pMD.G（VSV-G env 発現プラスミド）、pMDLg/p.RRE（第３世代パッケージングプラスミド）及びpRSV Rev（Rev発現プラスミド）を、リン酸カルシウム法により、トランスフェクションを行い、48時間後の培養上清を回収後、濃縮してウイルスベクターとして用いた。ウイルス力価は、２９３Ｔ細胞を感染させて測定し、ＧＦＰ発現によって算出した。
【実施例３】
【００３６】
［インビトロにおける増殖阻害アッセイ］
１０万個のＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞に対して、Ｓｋｐ−２（Ｓ２又はＳ５）又は蛍ルシフェラーゼ（ＧＬ３Ｂ）特異的ｓｉＲＮＡ  ＨＩＶベクターを、１００ＭＯＩ（multiplicity of infection）で、感染させた。９日目までの細胞数を、３日毎にトリパンブルー色素排除（trypan blue dye exclusion）法で計測した。３万個の２９３Ｔ細胞に、コントロールＧＬ３Ｂ又はＳｋｐ−２（Ｓ５）特異的ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターを、１００ＭＯＩで感染し、９日目までの細胞数を３日毎に定量した。また、各５×１０4個の３種類の悪性黒色腫細胞株（６２４ｍｅｌ，Ａ３７５ｍｅｌ，５２６ｍｅｌ）に対して、コントロールＧＬ３Ｂ，  ＢＲＡＦ ｓｉＲＮＡ＃１’， Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡ  Ｓ５またはＢＲＡＦ／Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡの四種類のＨＩＶレンチウイルスベクターを１００  ＭＯＩで感染させ、３日毎に細胞数をトリパンブルー色素排除法で、６日後又は９日後まで計測した（ｎ＝３）。
【実施例４】
【００３７】
［ウェスタンブロット分析］
ウェスタンブロットに用いるタンパク質は、インビトロ増殖阻害アッセイで９日目の培養細胞を、以下の組成のタンパク溶解液を用いて抽出した（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２．５ｍＭβ  グリセロリン酸、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ベンズアミド、１％ＮＰ−４０、プロテアーゼ阻害剤カクテル（complete、ＥＤＴＡ-free（Roche社製）、１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4）。なお、タンパク抽出前に、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ発現が処理群間で同等であることを確認し、遺伝子導入効率の比較性が保たれていることを確認した。タンパク質濃度は、DC protein assay kit（Bio-Rad社製）で定量した。一次抗体として、抗ｐ４５Skp-2抗体（Zymed Laboratories社製）、抗アクチン抗体（Sigma社製）、抗ｐ２７Kip1抗体（BD Transduction社製）、抗Ｒｂ抗体（Cell Signaling社製）、抗ｐ２１抗体（Santa Cruz社製）、抗ＢＲＡＦ抗体（……社製）、抗ＥＲＫ２抗体（……社製）、抗ｐｐＥＲＫ２抗体（……社製）を用いた。二次抗体は、ＨＲＰ共役抗ＩｇＧ抗体を用いて、酵素反応はSuper Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Pierce社製）で検出した。
【実施例５】
【００３８】
［細胞周期アッセイ］
インビトロの増殖阻害アッセイで用いた細胞を９日目に回収し、CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson 社製)を用いて、染色した。染色した細胞を、FACS Calibur（Becton Dickinson社製）で分析後、細胞周期の状態を、ModFit software（Becton Dickinson社製）で分析した。
【実施例６】
【００３９】
［ｈＴＥＲＴレポーターの構築］
０．４ｋｂのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーター配列を、ゲノムＰＣＲで、以下のプライマーセットを用いて増幅した；フォーワードプライマーCGCTGGGGCCCTCGCTGGCGTCCCT（ｎｔｓ−３２４から−３００、翻訳開始部位に対しての番号；配列番号８）；リバースプライマーCAGCGGCAGCACCTCGCGGTAGTGG（ｎｔｓ＋４８から＋７２；配列番号９）。反応条件は、９５℃で４分間の変性後、９５℃で１分間の変性、７０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を２７サイクル繰返し、続いて７２℃で７分間で完了した。次に、ＰＣＲ産物を、TA Cloning  Kit（Invitrogen社製）のpCRIIベクター内にサブクローニングした。正しい配列を確認した後、QuickChange site-directed mutagenesis kit （STRATAGENE社製）を用いて、翻訳開始コドンをＡＴＧからＴＴＧに変異させた。最後に、ｈＴＥＲＴプロモーターを、pGL3-basic vector（Promega社製）内にサブクローニングした(pGL3-hTERT)。pGL3-hTERTは、０．４ｋｂのｈＴＥＲＴプロモーターの制御下で、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を発現する。
【実施例７】
【００４０】
［レポーターアッセイ］
ＨＩＶベクター感染により、Ｓｋｐ−２（Ｓ５）又はＢＲＡＦ特異的ｓｉＲＮＡを恒常的に発現させたＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞５０万個に対して、１μｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドpRL-SV40（Promega社製）及びpGL3-hTERT、 pGL3-Basic、 pGL3-control（Promega社製）のいずれか１つの蛍ルシフェラーゼ発現プラスミド１μｇとともに、リポフェクタミン（Invitrogen社製）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をDual-Glo Luciferase Assay System （Promega社製）及びBerthold luminometerで分析した。各蛍ルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性にノーマライズした。
【実施例８】
【００４１】
［ｓｉＲＮＡ用アデノウイルス］
Ａｄ５／３５キメラファイバータンパク質（Gene, 285 : 69-77, 2002）を含むアデノウイルスベクターを用いた。ベクタープラスミドpAdHM34及びシャトルベクタープラスミドpHMCMV-GHP1は、文献（Cancer Res., 61 : 7913-7919, 2001）に記載されている。pHMCMV-GFP1は、ＣＭＶプロモーター、pEGFP-N1（Clontech社製）由来のＧＦＰ遺伝子及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）poly(A)シグナルを含む。ヒトU６プロモーター及び２つのBspMIクローニングサイトを含むｓｉＲＮＡ発現ユニットを、HIV-U６i-GFPプラスミドからEcoRI処理により切り出し、pHMCMV-GHP1内のＢGH poly(A)シグナルの下流に局在するEcoRIサイトにサブクローニングした。このベクターをpHMCMV-GFP-U6 iと命名した。ショートヘアピンＲＮＡ特異的dsオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−Ｕ６ｉ−ＧＦＰと同様、pHMCMV-GFP-U6 iのBspMIサイトに、直接サブクローニングすることができる。その結果、Ｓｋｐ−２（Ｓ５）又はＧＬＢ３特異的dsオリゴヌクレオチドを含むシャトルベクタープラスミドができた。AdF35-Ｓｋｐ‐２ ｓｉＲＮＡ Ｓ５及びAdF35‐ＧＬ３Ｂのアデノウイルスベクターを、文献（Hum. Gene Ther., 9 : 2577-2583, 1998）記載の通り、インビトロライゲーション法で構築した。両方のアデノウイルスベクターを、２９３細胞で増幅し、ウイルス力価を、Adeno-X Rpaid Titer Kit（Clontech社製）で測定した。
【実施例９】
【００４２】
［動物実験］
６週齢のオスＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Japan Clea社製）に、５×１０６ＡＣＣ−ＬＣ１７２細胞を皮下接種した。移植約１週間後、腫瘍の最大径が約３〜４ｍｍに達した時点で、腫瘍内に、１×１０８ｉｆｕ(infectious unit)のＡｄF35‐Ｓｋｐ‐２  ｓｉＲＮＡ  Ｓ５又はＡｄF35‐ＧＬ３Ｂを注入した（０日目）。アデノウイルスの注入は、２日毎にさらに２度繰り返した。腫瘍の大きさ（最大直径×垂直方向の直径×高さ）を、２〜３日ごとに、１３日目まで測定した。動物実験プロトコ−ルは、慶應義塾大学医学部の動物実験委員会によって承認された。マウスは、慶應義塾大学動物実験委員会によるガイドラインに従って処理した。
【実施例１０】
【００４３】
［Ｓｋｐ−２遺伝子が高発現している小細胞肺癌細胞株に対する、ＨＩＶベクターを介したＳｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡ発現は、インビトロにおける細胞増殖抑制効果を誘導した。］
本発明者らは、Ｓｋｐ−２ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ発現ＨＩＶベクターを作製し、Ｓｋｐ−２遺伝子の発現上昇を有する小細胞肺癌細胞株ＡＣＣ−ＬＣ−１７２に感染させた後、Ｓｋｐ−２タンパク質レベルをウェスタンブロットで解析することにより、ＲＮＡｉ効果を評価した。これらのｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターの中から、Ｓｋｐ−２ＲＮＡｉ効果の優れた２つのＨＩＶベクター、Ｓ２及びＳ５を以下の研究に利用した。これらのＨＩＶベクターと蛍ルシフェラーゼ（ＧＬ３Ｂ）特異的コントロールｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターとをＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞に感染させ、Ｓｋｐ−２ＲＮＡｉ効果とインビトロでの細胞増殖の相関を分析した。ＧＦＰによってモニターされた遺伝子導入効率は、処理群間で同程度だった（９８．７〜９９．９％）。Ｓ５ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターで感染したＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞は、ＧＬ３Ｂ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターで感染した細胞と比べると、インビトロにおける細胞増殖速度が著しく低下することを見い出した（ｐ＜０．０００１）（図１ａ）。Ｓ２ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターで感染したＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞のインビトロにおける細胞増殖速度は、Ｓ５より早いが、ＧＬＢ３よりも有意に遅かった（ｐ＝０．００５）（図１ａ）。感染後９日目に回収したＳｋｐ−２タンパク質のウェスタンブロット分析により、Ｓｋｐ−２タンパク質レベルの低下の程度が、インビトロにおける細胞増殖の阻害効果と相関していることが明らかになった（図１ａ及び１ｂ）。一方、ｐ２７Kip1タンパク質レベルは、Ｓ２及びＳ５ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクター感染細胞で上昇していた。興味深いことに、ｐ２７Kip1の上昇は、インビトロでの細胞増殖速度および、Ｓｋｐ−２タンパク質レベルと逆相関していた（図１ｂ）。他のｃｄｋインヒビターであるｐ２１も、Ｓ２及びＳ５ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクター感染細胞で、ｐ２７Kip1と同様のパターンで上昇していた（図１ｂ）。ｐ５７Kip2タンパク質は、この細胞株における、検出限界以下であった。Ｒｂタンパク質レベルは、これらの細胞間で同等であった。感染後９日目に行った細胞周期分析では、Ｓ及びＧ２／Ｍ期の比率は、ＧＬＢ３ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターで感染した細胞（５７．１％）に比較し、Ｓ５ ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターで感染した細胞（４４．６％）で減少が見られた。以上のようにＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞において、Ｓｋｐ−２ ＲＮＡｉは、ｐ２７Kip1及びｐ２１両方のタンパク質レベルの上昇を誘導し、分裂細胞集団の減少とインビトロでの細胞増殖の阻害を誘導した。
【００４４】
他方、Ｓｋｐ−２発現上昇を伴わない２９３Ｔ細胞は、Ｓｋｐ−２（Ｓ５）特異的ｓｉＲＮＡ ＨＩＶベクターによるインビトロでの細胞増殖阻害効果に対し、より耐性を示した（ｐ＝０．１８３５）（図２ａ）。Ｓｋｐ−２及びｐ２７Kip1タンパク質のウェスタンブロット分析は、２９３Ｔ細胞とＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞とで同様の結果を示したが、２９３Ｔ細胞の方が顕著でなかった（図２ｂ）。Ｓｋｐ−２タンパク質の基礎レベルは、ＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞より、２９３Ｔ細胞の方が低く（図２ｃ）、それはＳｋｐ−２ ＲＮＡｉによる増殖阻害に対する２９３Ｔ細胞の耐性の原因となっている可能性が示唆される。
【実施例１１】
【００４５】
［ｍｙｃ転写活性は、Ｓｋｐ−２  ＲＮＡｉによるＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞の細胞増殖抑制効果には関与していない。］
最近の報告によると、Ｓｋｐ−２はｐ２７Kip1以外にも、ｍｙｃタンパク質のユビキチン化を媒介すると同時に、ｃ−ｍｙｃの転写補助因子として作用することが示唆されている（Mol. Cell, 11 : 1177-1188, 2003、Cell, 11 : 1189-1200, 2003）。Ｍｙｃは、サイクリンＥ−ｃｄｋ２及びサイクリンＤ−ｃｄｋ４の活性化を媒介し、Ｇ１／Ｓ転移を促進する作用があることから、本発明者らは、Ｓｋｐ−２  ＲＮＡｉによる細胞増殖抑制効果に、ｍｙｃの転写活性抑制が関与している可能性を検討した。多くのＳＣＬＣでｍｙｃｍＲＮＡの過剰発現が報告されているが（Lung Cancer 34 : S43-46, 2001）、ＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞でもｃ−ｍｙｃコピー数の軽度の上昇が見られた（２．０３倍）。ｈＴＥＲＴプロモーター（ｍｙｃ結合配列Ｅ−ｂｏｘ (CACGTG)を２カ所含む）を上流に持つ蛍ルシフェラーゼ発現ベクター(pGL3-hTERT)をＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞株にトランスフェクションさせた時、ウミホタルルシフェラーゼ活性で補正した蛍ルシフェラーゼ活性は、コントロールのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの活性より、わずかに上昇を認めるのみであり（１．１−２．７倍）、該細胞株において、ｍｙｃ転写活性は比較的弱いことが示された（図３）。Ｓ５ベクターでＳｋｐ−２をノックダウンしたＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞におけるpGL3-hTERTによる蛍ルシフェラーゼ活性の低下は認められず、Ｓｋｐ−２ＲＮＡｉによる増殖阻害効果には、ｍｙｃの転写活性は関与していないことが示された。
【実施例１２】
【００４６】
［Ｓｋｐ−２特異的ＳｉＲＮＡを発現するアデノウイルスベクター］
アデノウイルスベクターは、ＨＩＶベクターと比較して、容易に高力価ウイルスの調整が可能であること、およびインビボでの遺伝子導入効率が優れていることから、Ｓｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡ発現アデノウイルスベクターを作製した。アデノウイルスベクターＡｄF35−Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡ Ｓ５を、５ＭＯＩで感染させたＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞のＳｋｐ−２タンパク質レベルは、コントロールＡｄF35−ＧＬ３Ｂ感染細胞と比べて、著しく低下しており（図４）、インビトロでの細胞増殖の阻害も伴った。
【実施例１３】
【００４７】
［アデノウイルスを介したＳｋｐ−２ＲＮＡｉは、ＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞のインビボの腫瘍形成能を低下させた。］
次に、アデノウイルスベクターを介したＳｋｐ−２特異的ＲＮＡｉが、インビボでＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞の増殖を抑制することが可能かどうか調べた。ＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスに作製した移植皮下腫瘍に、Ｓｋｐ−２（Ｓ５）又はコントロールＧＬ３Ｂ特異的ｓｉＲＮＡアデノウイルスベクターを２日毎に３回接種した後、腫瘍サイズを経時的に測定した。腫瘍内にウイルスを注入開始１３日後、Ｓ５で感染したＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞では、ＧＬ３Ｂで感染した場合と比べて、腫瘍の増殖が著しく阻害された（図４ｂ）（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、Ｓｋｐ−２が、Ｓｋｐ−２発現レベルの上昇を伴うガン治療に対する優れたターゲットであることを示唆した。
【実施例１４】
【００４８】
［悪性黒色腫細胞株におけるＳｋｐ−２タンパク発現の解析］
８種類の悪性黒色腫細胞株（Ｓｋｍｅｌ２３，Ａ３７５，８８８，３９７，５２６，６２４，９２８，１３６３）及び対照としてのＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞よりタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット法でＳｋｐ−２タンパクの発現を解析した。Ｓｋｍｅｌ２３，  Ａ３７５ｍｅｌ，６２４ｍｅｌの３種類の悪性黒色腫細胞株でＳｋｐ−２の高い発現を認めた。ＡＣＣ−ＬＣ−１７２は、Ｓｋｐ−２高発現を持つ肺小細胞癌株であり、陽性コントロールとして用いた。アクチンは、タンパク質量のloading controlとしてブロットした。結果を、ＢＲＡＦ点突然変異（Ｖ５９９Ｅ）の有無と、タンパク質抽出時点の細胞周期（％Ｓ＋Ｇ２／Ｍ期の比率）と共に図５に示す。
【実施例１５】
【００４９】
［悪性黒色腫細胞株のＢＲＡＦ及びＳｋｐ−２同時ＲＮＡｉの増殖抑制効果とｐ２７Kip1タンパクに与える影響］
ＢＲＡＦｓｉＲＮＡ＃１’は、Ｖ５９９Ｅ変異陽性ＢＲＡＦを発現していない２９３Ｔ細胞やＶ５９９Ｅ変異のないＳｋｍｅｌ２３では増殖抑制効果を有しないが、変異陽性ＢＲＡＦをもつＡ３７５ｍｅｌ細胞株などに対しては、著明な増殖抑制効果を有することから、Ｖ５９９Ｅ変異陽性ＢＲＡＦの発現を特異的に抑制する（特願２００４−１２４４８５参照）。ＢＲＡＦ点突然変異（Ｖ５９９Ｅ）を有し、実施例１４でＳｋｐ−２の高発現が認められた２つの悪性黒色腫細胞株（６２４ｍｅｌ，Ａ３７５ｍｅｌ）と、Ｓｋｐ−２の高発現が認められなかった悪性黒色腫細胞株（５２６ｍｅｌ）に対して、コントロールＧＬ３Ｂ，ＢＲＡＦｓｉＲＮＡ＃１’，Ｓｋｐ−２ｓｉＲＮＡ  Ｓ５又はＢＲＡＦ／Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡの四種類のＨＩＶレンチウイルスベクターを１００ＭＯＩで感染させ、３日毎に細胞数をトリパンブルー色素排除法で、６日後又は９日後まで計測した（ｎ＝３）。結果を図６に示す。図６から、ＢＲＡＦ点突然変異（Ｖ５９９Ｅ）を有し、Ｓｋｐ−２の高発現が認められた２つの悪性黒色腫細胞株（６２４ｍｅｌ，Ａ３７５ｍｅｌ）においては、ＲＮＡｉによりＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）とＳｋｐ−２の発現を同時に抑制すると、細胞増殖と細胞浸潤能が抑制されることがわかる。
【００５０】
図６（ｂ），（ｄ），（ｆ）はウエスタンブロット分析の結果を示し、図（ａ），（ｃ），（ｅ）にそれぞれ対応する最終観察時点で抽出したタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示している。ＢＲＡＦ＃１’，Ｓｋｐ−２ Ｓ５により、それぞれリン酸化ＥＲＫとＳｋｐ−２の抑制を認めた。６２４ｍｅｌとＡ３７５ｍｅｌにおいては、ＢＲＡＦ／Ｓｋｐ−２同時抑制群ではその両者が観察され、各単独抑制群に比べてより強いｐ２７Kip1の発現上昇を認めた。ｐ２７Kip1の発現レベルは、ＢＲＡＦ−ＭＡＰＫ経路と、Ｓｋｐ−２−ユビキチン−プロテアソーム経路で、独立に制御されていると考えられるが、異なる作用点を同時にノックダウンしたときに、単独より更に強力なｐ２７Kip1の発現回復が見られ、結果としてより強力な細胞増殖抑制効果が得られることがわかる。ＢＲＡＦ ＲＮＡｉとＳｋｐ−２ ＲＮＡｉはいずれもその異常を持つ癌細胞にのみ選択的に作用することから、特異性を保ちながらより強力な治療法になる可能性を有する。
【実施例１６】
【００５１】
［Ａ３７５ｍｅｌ細胞株におけるmatrigel invasion assay］
実施例１５と同様に、４種類のＨＩＶレンチウイルスベクターで感染させた２５，０００個のＡ３７５ｍｅｌ細胞を、matrigel invasion chamber (Bekton-Dickinson)上に蒔き、２２時間後にchamberの裏側に移動した細胞数を計測した。結果を図７に示す。図７から、６２４ｍｅｌの増殖抑制効果は、ＢＲＡＦ ＲＮＡｉ単独、Ｓｋｐ−２ ＲＮＡｉ単独ではかなり限定されていたものが、ＢＲＡＦ ＲＮＡｉとＳｋｐ−２ ＲＮＡｉとの併用で劇的に効果が強まることがわかる。
【実施例１７】
【００５２】
［考察］
ウイルスを介したＲＮＡｉによる、Ｓｋｐ−２の発現上昇を伴う肺小細胞癌細胞株におけるＳｋｐ−２のノックダウンを試みたところ、Ｓｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡの持続的発現は、Ｓｋｐ−２の発現をほぼ完全に抑制し、ｐ２７Kip1の上昇及びインビトロでの増殖低下を誘導した。従って、この細胞株においては、Ｓｋｐ−２発現上昇が、ｐ２７Kip1の分解亢進による、細胞周期の調節障害（過剰増殖）に関連していた可能性が示唆される。以上の観察事実から、Skp-2は、遺伝子治療及び／又は分子標的療法の新しいターゲット候補となる可能性が示唆される。重要なことは、２９３Ｔ細胞のようにＳｋｐ−２のレベルが低い細胞の増殖はＳｋｐ−２ＲＮＡｉにより、ほとんど影響されず、Ｓｋｐ−２の不活性化は、Ｓｋｐ−２過剰発現を持つ癌に対する、安全な選択的治療法となる可能性が示唆される。
【００５３】
ｐ２１レベルの制御は、主に、転写制御のメカニズムによって達成される。しかし、Ｓｋｐ−２を介したユビキチン化と連続したタンパク分解の崩壊も、ｐ２１レベルの制御に関与することが報告されている（J. Biol. Chem, 278 : 25752-25757, 2003）。本発明者らも、Ｓｋｐ−２ＲＮＡｉが行われた後に、ｐ２１レベルが上昇することを見い出しており、上記報告と矛盾していない。ｐ２１の上昇は、ｐ２７Kip1レベルの上昇ほどは急激でなかったが、調節障害された細胞周期の制御に関連していると考えられる。
【００５４】
さらに、Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡアデノウイルスベクターの腫瘍内注入を用いた、インビボ治療動物モデルを作製し、in vivoでの治療効果を証明した。以上より、Ｓｋｐ−２を標的としたｓｉＲＮＡベクターによる遺伝子治療の可能性が示唆される。
【００５５】
一方、ＭＡＰＫ経路の活性化は、ｐ２７Kip1の核から細胞質への移行を促進し、間接的に細胞質のプロテアーゼによるｐ２７Kip1の分解を促進する結果、細胞増殖に繋がることが既に報告されている。本発明者らは、ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）変異に伴うＭＡＰＫ経路の活性化を持つ癌細胞株（悪性黒色腫細胞株）  に対して、ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）特異的ＲＮＡｉの増殖・浸潤能の抑制効果を報告しているが、この方法はｐ２７Kip1の発現回復にも働いている。そこで、ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）変異を持つ悪性黒色腫細胞株の中で、Ｓｋｐ−２の発現亢進を同時に伴う細胞株に対して、ＢＲＡＦ（Ｖ５９９Ｅ）とＳｋｐ−２に対するｓｉＲＮＡを同時に発現するＨＩＶベクターを作製し、両者の発現を同時に抑制した影響を、各々単独抑制群と比較検討した。２種類の株に対して、再現性を持って、同時抑制群は各単独抑制群よりも有意に細胞増殖と細胞浸潤能が抑制されていた（ｐ２７Kip1は、ＲｈｏＡシグナル伝達経路に干渉して、細胞運動を亢進させる機能が知られている）。そして、ｐ２７Kip1の発現は、各単独抑制群に比べてより強く認められたことから、より強いｐ２７Kip1の発現回復を介して、悪性形質の改善効果が見られたと考えられる。ＢＲＡＦの変異とＳｋｐ−２の発現上昇は、多くの癌に共通に見られる遺伝子異常であることから、両者を同時に抑制する技術は、これらの変異を同時に持つ癌に対して、より強力な癌治療効果を示すことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｓｋｐ−２発現上昇を伴う小細胞肺ガン細胞株への、Ｓｋｐ−２siRNAの遺伝子導入が、インビトロの細胞増殖の阻害及びｐ２７Kip1及びｐ２１タンパク質の上昇を誘導することを示す図である。（ａ）インビトロ細胞増殖アッセイ。１0万個のＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞に対して、コントロール蛍ルシフェラーゼ特異的siRNA HIVベクター（ＧＬ３Ｂ）又はＳｋｐ−２ｍＲＮＡ特異的ｓｉＲＮＡ  ＨＩＶベクター（Ｓ２及びＳ５）で、１００ＭＯＩで０日目に感染を行い、生細胞数を、トリパンブルー色素排除方法で３日目、６日目及び９日目に計測した。縦のバーは３回の実験の標準偏差を示し（＊；ｐ＝０．０００５、＊＊；ｐ＜０．０００１）。同様の結果を示した３回の実験の１つの代表例である。（ｂ）ウェスタンブロット分析。タンパク質は、ｓｉＲＮＡ  ＨＩＶベクター感染細胞から、感染後９日目に抽出した。タンパク質抽出時点におけＧＦＰの発現レベルは、３グループ間で同程度であった（９８．７〜９９．９％）。Ｓ２及びＳ５感染群のＳｋｐ−２タンパク質レベルは、ＧＬ３Ｂ群に比べ、著しく低下を認めた。反対にｐ２７Kip1及びｐ２１タンパク質レベルは、Ｓ２及びＳ５感染群で上昇した。ｐ２７Kip1及びｐ２１タンパク質レベルは、Ｓｋｐ−２タンパク質レベルと逆相関していた。
【図２】Sｋｐ−２発現上昇を伴わない２９３T細胞へのｓｉＲＮＡ導入は、インビトロ細胞増殖に殆ど影響しなかったことを示す図である。（ａ）インビトロ増殖アッセイ。３０００0個の２９３Ｔ細胞に対して、コントロールＧＬＢ３又はS5ベクターで、１００ＭＯＩで０日目に感染を行い、細胞数を図１（ａ）と同様に計測した。縦のバーは３回の実験の標準偏差を示す（＊；ｐ＝０．１８３５）。同様の結果を示した３回の実験の１つの代表例である。（ｂ）ウェスタンブロット分析。タンパク質は、図１（ｂ）と同様に調製した。タンパク抽出時点のＧＦＰの発現レベルは、２つのグループ間で同等であった（ＧＬ３Ｂ；９５．４％、Ｓ５；１００．０％）。S５感染群のＳｋｐ−２タンパク質レベルは、ＧＬ３Ｂ群に比べ、低下を認めた。一方、ｐ２７Kip1タンパク質レベルは、S5感染群においてGL3B感染群より上昇を示すが、ＡＣＣ−ＬＣ１７２細胞における変化に比べるとその程度は弱い。（ｃ）２９３Ｔ及びＡＣ    Ｃ−ＬＣ−１７２間のＳｋｐ−２タンパク質レベルの比較。Ｓｋｐ−２タンパク質は、ＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞より2９３Ｔ細胞の方がかなり低かった。タンパク質抽出時点における、２９３Ｔ細胞及びＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞のＳ＋Ｇ２／Ｍの割合は、それぞれ７４．０％及び５８．４％であった。
【図３】Ｓｋｐ−２タンパク質の上昇は、ＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞のｍｙｃ転写活性能の増強には影響していなかったことを示す図である。Ｓｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ Ｓ５）または、BRAF特異的siRNAを恒常的に発現するＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞に対して、１μｇのpRL-SV40（ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド）及び１μｇのpGL3-hTERT、pGL3-Basic又は pGL3-control（異なるプロモーターに導かれる蛍ルシフェラーゼ発現プラスミド）を、リポフェクタミンを用いてトランフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に細胞を回収し、ウミシイタケ及び蛍ルシフェラーゼ両方の活性を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性化で標準化した各蛍ルシフェラーゼ活性を算出した。pGL3-hTERTをトランスフェクトした細胞の蛍ルシフェラーゼ活性は、pGL3-Basicをトランスフェクトした細胞の1.6倍に上昇を認めたが、Ｓｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡの発現下で、その活性の抑制は認めなかった。各バーは、３度のアッセイの平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。同様の結果を示した３回の実験の１つの代表例である。
【図４】Ｓｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡアデノウイルスベクターの腫瘍内注入によるin vivo治療効果を示す図である。（ａ）Ｓｋｐ−２特異的ｓｉＲＮＡアデノウイルスベクターによる、Ｓｋｐ−２タンパクの抑制効果。ＡｄF35−Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡ Ｓ５又はＡｄF35−ＧＬ３Ｂを、１又は５ＭＯＩで感染させたACC-LC-172細胞から抽出したタンパク質を用いて、Ｓｋｐ−２タンパク質レベルを定量した。Ｓｋｐ−２のレベルはＡｄF35−Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡ Ｓ５を５ＭＯＩで感染した場合に、著しく阻害された。（ｂ）アデノウイルスベクターを介したＳｋｐ−２ siRNA導入のインビボにおける腫瘍増殖抑制効果。NOD/SCIDマウス上に皮下移植したＡＣＣ−ＬＣ−１７２細胞に対して、２日毎に３回、１×１０8 ｉｆｕのＡｄ F35−Ｓｋｐ−２ ｓｉＲＮＡ Ｓ５（ｎ＝５）又はＡｄF35−ＧＬ３Ｂ（コントロール）（ｎ＝４）を腫瘍内注入した後、経時的に２つのグループ間で腫瘍の大きさを比較した。＊；ｐ＜０．０５、縦のバーは標準偏差を示す。
【図５】８種類の悪性黒色腫細胞株におけるＳｋｐ−２タンパク発現の解析結果を示す図である。
【図６】悪性黒色腫細胞株のＢＲＡＦ及びＳｋｐ−２同時ＲＮＡｉの増殖抑制効果とｐ２７Kip1タンパクに与える影響を示す図である。（ａ）６２４ｍｅｌにおける＊はｐ＝０．００２４，＊＊はｐ＝０．０００５，＊＊＊はｐ＝０．０００２（コントロールＧＬ３Ｂとの比較）を、★はｐ＝０．００２５，★★はｐ＝０．００４９を示し、（ｃ）Ａ３７５ｍｅｌにおける＊はｐ＝０．０００５，＊＊はｐ＝０．０００８，＊＊＊ｐ＜  ０．０００１  （コントロールＧＬ３Ｂとの比較）を、★はｐ＝０．０３７５，★★はｐ＝０．０００２を示し、（ｅ）５２６ｍｅｌにおける＊はｐ＝０．００７２，＊＊はｐ＝０．００７５を示す（すべてunpaired student t-test）。最終観察時点におけるＧＦＰ陽性率で見た導入効率には、各群間で差を認めなかった。各実験は、それぞれ２〜３回繰り返し、再現性を確認している。（ｂ），（ｄ），（ｆ）は、（ａ），（ｃ），（ｅ）にそれぞれ対応する最終観察時点で抽出したタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図７】Ａ３７５ｍｅｌ細胞株におけるmatrigel invasion assayの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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