(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質を活性な状態で表層に提示する大腸菌を提供すること。【解決手段】タンパク質を活性な状態で表層に提示する大腸菌を提供し、該大腸菌は、プロモーター配列、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを有する。該プロモーター配列は、（Ａ）提示した２種の塩基配列、（Ｂ）前項記載の配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列、（Ｃ）前項記載の配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｄ）前項記載の配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列またはその断片であり、該大腸菌において構成的プロモーター活性を呈する。【選択図】図１
2005312426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を活性な状態で表層に提示する大腸菌であって、
該大腸菌が、プロモーター配列、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを有し、そして
該プロモーター配列が、（Ａ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、（Ｂ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列、（Ｃ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｄ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列またはその断片であり、そして該大腸菌において構成的プロモーター活性を呈する、
大腸菌。
【請求項２】
前記ｐｇｓＡが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来である、請求項１に記載の大腸菌。
【請求項３】
前記ｐｇｓＡをコードするＤＮＡが、配列番号３に記載の塩基配列；配列番号３に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列；配列番号３に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列；または、配列番号３に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列である、請求項１または２に記載の大腸菌。
【請求項４】
前記タンパク質が、酵素である、請求項１から３のいずれかの項に記載の大腸菌。
【請求項５】
前記酵素が、α−アミラーゼである、請求項４に記載の大腸菌。
【請求項６】
前記酵素が、リパーゼである、請求項４に記載の大腸菌。
【請求項７】
タンパク質を活性な状態で大腸菌の表層に発現させる方法であって、
（ａ）プロモーター配列、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程であって、該プロモーター配列が、（Ａ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、（Ｂ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列、（Ｃ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｄ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列またはその断片であり、そして該大腸菌において構成的プロモーター活性を呈する、工程；
（ｂ）該組換えＤＮＡで大腸菌を形質転換する工程；および
（ｃ）該形質転換した大腸菌を培養して、該タンパク質を該大腸菌の表層に発現させる工程、
を含む、方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、酵素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかの項に記載の大腸菌の使用方法であって、前記タンパク質と基質とを接触させ、該基質を結合するか、または該基質を他の物質に変換させる工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がα−アミラーゼであり、前記基質がデンプンであり、前記大腸菌を好気的に培養して、乳酸を産生させる工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質がリパーゼであり、前記基質がラセミ体のアルコールおよびエステルであり、前記大腸菌をエステル交換反応の触媒として用いて、エナンチオ選択的にアルコールのエステルを製造する工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項４から６のいずれかの項に記載の大腸菌を含む、酵素剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を活性な状態で表層に提示する大腸菌、ならびに該大腸菌の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵母や細菌の細胞表層に有用なタンパク質を発現させる、細胞表層ディスプレイ技術が注目されている。
【０００３】
例えば、酵母表層には、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを利用して、リパーゼ、アミラーゼ類、セルラーゼ類などの種々の酵素が提示されている（特許文献１および２）。また、酵母においては、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用した、細胞表層ディスプレイ技術も開発されている（特許文献３）。
【０００４】
細菌の表層への発現については、Bacillus sp.由来のポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素の遺伝子を含む発現プラスミドを用いて検討され、グラム陽性菌である乳酸菌やグラム陰性菌である大腸菌の表層に種々のタンパク質を提示できることが知られている（特許文献４）。
【０００５】
大腸菌の表層へのタンパク質の提示については、種々の検討が行われているが、現在のところ、表層に提示可能なタンパク質のサイズに制限があり、比較的分子量が大きなタンパク質の発現は困難であると認識されている（非特許文献１〜３）。例えば、非特許文献３の総説には、表層提示し得るタンパク質サイズの上限は６０〜７０アミノ酸と考えられていたのに対して、２５３アミノ酸のタンパク質を提示できたと記載されている。しかし、より大きな分子を表層に提示すると細胞が生存できなくなるとの記載もある。上記特許文献４に開示されている表層提示された外来タンパク質の中で最大のサイズは、４４２アミノ酸であり、これは表層提示に利用されているポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素とほぼ同じサイズである。これまでに実際に大腸菌の表層に提示された大きな外来タンパク質としては、約４７ｋＤａの酵素がある（非特許文献４）。しかし、この非特許文献４においても、通常の細胞表層ディスプレイ技術においては提示可能なサイズに制限があると記載されている。このように、現在のところ、５０ｋＤａ以上の比較的大きなタンパク質を表層に提示している大腸菌はない。
【０００６】
また、これまで、触媒機能を有した酵素などのタンパク質を大腸菌の細胞表層に提示することは困難であった。そのため、大腸菌における細胞表層提示では、異種ペプチドやフラグメントを表層に提示することが主であった（非特許文献１および４）。すなわち、表層提示のための固定化タンパク質として外膜局在タンパク質を用いて、目的タンパク質の立体構造を適切に保持しかつこのタンパク質の活性を十分に発揮させることができるような細胞表層提示技術が望まれている。
【特許文献１】特開平１１−２９００７８号公報
【特許文献２】国際公開第０１／７９４８３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／０８５９３５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０１４３６０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／８３７８７号パンフレット
【非特許文献１】Samuelson P, Gunneriusson E, Nygren PA, およびStahl S，「Display of proteins on bacteria REVIEW」，Journal of Biotechnology，2002年，96巻，129-154頁
【非特許文献２】Hoischen C, Fritsche C, Gumpert J, Westermann M, Gura K, およびFahnert B，「Novel Bacterial Membrane Surface Display System Using Cell Wall-Less L-Forms of Proteus mirabilis and Escherichia coli」，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2002年2月，525-531頁
【非特許文献３】Benhar I，「Biotechnological applications of phage and cell display」，Biotechnology Advances，2001年2月1日，19巻，1号，1-33頁
【非特許文献４】Lee SY, Choi JH, およびXu Z，「Microbial cell-surface display」，Trends in Biotechnology，2003年1月，21巻，1号，45-52頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、タンパク質を活性な状態で表層に提示する大腸菌を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タンパク質を活性な状態で表層に提示する大腸菌を提供し、
該大腸菌は、プロモーター配列、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを有し、そして
該プロモーター配列は、（Ａ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、（Ｂ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列、（Ｃ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｄ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列またはその断片であり、そして該大腸菌において構成的プロモーター活性を呈する。
【０００９】
好適な実施態様では、上記ｐｇｓＡは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来である。
【００１０】
より好適な実施態様では、上記ｐｇｓＡをコードするＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列；配列番号３に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列；配列番号３に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列；または、配列番号３に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列である。
【００１１】
別の好適な実施態様では、上記タンパク質は、酵素である。
【００１２】
さらに好適な実施態様では、上記酵素は、α−アミラーゼである。
【００１３】
さらに他の好適な実施態様では、上記酵素は、リパーゼである。
【００１４】
本発明はまた、タンパク質を活性な状態で大腸菌の表層に発現させる方法を提供し、該方法は、
（ａ）プロモーター配列、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程であって、該プロモーター配列が、（Ａ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、（Ｂ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列、（Ｃ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｄ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列またはその断片であり、そして該大腸菌において構成的プロモーター活性を呈する、工程；
（ｂ）該組換えＤＮＡで大腸菌を形質転換する工程；および
（ｃ）該形質転換した大腸菌を培養して、該タンパク質を該大腸菌の表層に発現させる工程、を含む。
【００１５】
好適な実施態様では、上記タンパク質は、酵素である。
【００１６】
本発明はさらに、上記いずれかの大腸菌の使用方法を提供し、該方法は、上記タンパク質と基質とを接触させ、該基質を結合するか、または該基質を他の物質に変換させる工程を含む。
【００１７】
好適な実施態様では、上記タンパク質はα−アミラーゼであり、上記基質はデンプンであり、上記大腸菌を好気的に培養して、乳酸を産生させる工程を含む。
【００１８】
別の好適な実施態様では、上記タンパク質はリパーゼであり、上記基質はラセミ体のアルコールおよびエステルであり、上記大腸菌をエステル交換反応の触媒として用いて、エナンチオ選択的にアルコールのエステルを製造する工程を含む。
【００１９】
本発明はまた、上記のいずれかの大腸菌を含む、酵素剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、タンパク質を活性な状態で表層に提示した大腸菌が提供される。また、本発明によれば、従来大腸菌では不可能と思われていた、サイズの大きなタンパク質を効率よく表層に提示した大腸菌が提供される。このような大腸菌は、大量に培養することが可能であり、提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の大腸菌は、タンパク質を活性な状態で表層提示するように形質転換された大腸菌であり、プロモーター配列、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡが、該大腸菌中に組み込まれている。ここで、「活性な状態」とは、タンパク質が表層に提示されているだけでなく、タンパク質が目的の活性を発揮し得ることをいう。本発明の大腸菌において、目的のタンパク質のＮ末端側は、ｐｇｓＡのＣ末端側とのみ連結した融合タンパク質として発現され、タンパク質の両端が表層に繋がれているわけではない。したがって、目的のタンパク質は、比較的安定な立体構造をとることができ、その活性を十分に発揮し得る。
【００２２】
本発明の大腸菌の表層に提示され得るタンパク質は、特に限定されず、本来大腸菌の細胞表層に局在しないタンパク質であって、大腸菌の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、分泌性タンパク質、外来タンパク質（抗体、リガンドなど）などが挙げられる。分泌性タンパク質としては、アミラーゼ類、セルラーゼ類、リパーゼなどが挙げられる。
【００２３】
本明細書において、リパーゼとは、油脂から脂肪酸を遊離し得る活性を有するタンパク質（酵素）をいう。ここで、油脂とは、グリセロールに脂肪酸が結合したものをいう。このような活性を有していれば、リパーゼの起源は特に限定されず、一般に、微生物、植物、および動物（例えば、豚膵臓）由来のリパーゼが用いられる。また、リパーゼは、1,3-特異的であってもよいし、非特異的であってもよい。リパーゼはまた、工業的には、エステル交換反応にも利用されており、このようなリパーゼとしては、例えば、Candida antarctica CBS6678株由来のリパーゼＢ、Rhisopus oryzae由来のリパーゼなどが挙げられる。
【００２４】
本発明においては分子量が６０ｋＤａ以上のタンパク質であってもよい。上記のように、サイズが大きなタンパク質を大腸菌の表層に提示することは困難であると考えられていたが、本発明においては、たとえ６０ｋＤａ以上であっても、表層提示は可能である。
【００２５】
本発明で用いられる分子量６０ｋＤａ以上のタンパク質としては、アミラーゼ類（グルコアミラーゼ、α−アミラーゼなど）、セルラーゼ類（エンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなど）などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、アミラーゼ類とは、デンプンを加水分解する酵素をいう。代表的には、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼが挙げられ、さらに他にβ−アミラーゼ、イソアミラーゼなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、グルコアミラーゼとは、デンプンの非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素をいい、通常その分子量は約６５．１ｋＤａである。このような活性を有していれば、その起源は限定されないが、RhizopusおよびAspergillusなどのカビ由来のグルコアミラーゼが好ましい。例えば、植田ら（Appl. Environ. Microbiol. 63:1362-1366(1997)）に記載のように、Rhizopus oryzae由来のグルコアミラーゼが好適に用いられる。
【００２８】
本発明において、α−アミラーゼとは、デンプンのα１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型の酵素をいい、通常その分子量は約７７．３ｋＤａである。この活性を有していればその起源は限定されず、例えば、動物（唾液、膵臓など）、植物（麦芽など）、および微生物由来のα−アミラーゼが用いられる。微生物由来のα−アミラーゼとしては、Bacillus stearothermophilus、Streptococcus bovisなどに由来するものが挙げられる。例えば、無蒸煮デンプンを炭素源とする場合には、Streptococcus bovis由来のα−アミラーゼが好ましい。
【００２９】
本明細書において、セルラーゼ類とは、セルロースを加水分解する酵素をいう。代表的には、エンドグルカナーゼおよびエキソセロビオヒドロラーゼが挙げられ、さらに他にβ−グルコシダーゼなどが挙げられる。
【００３０】
本明細書において、エンドグルカナーゼとは、セルロースのβ１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型の酵素をいい、通常その分子量は約７７．８ｋＤａである。この活性を有していればその起源は限定されず、昆虫（シロアリなど）、カビ由来および微生物由来のエンドグルカナーゼが用いられる。微生物由来のエンドグルカナーゼとしては、Clostridium cellulovorans、Clostridium thermocellumなどに由来するもの、ならびにカビ由来のエンドグルカナーゼとしては、Trichoderma reeseiなどに由来するものが挙げられる。
【００３１】
本発明において、エキソセロビオヒドロラーゼとは、セルロースの非還元末端からセロビオース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素をいい、通常その分子量は約７７．２ｋＤａである。このような活性を有していれば、その起源は限定されず、カビ由来および微生物由来のエキソセロビオヒドロラーゼが用いられるが、カビ由来のエキソセロビオヒドロラーゼが好ましい。例えば、藤田ら（Appl. Environ. Microbiol. 70:1207-1212(2004)）に記載のように、Trichoderma reesei由来のエキソセロビオヒドロラーゼが好適に用いられる。
【００３２】
本明細書において、β−グルコシダーゼとは、セルロースのβ１，４−グルコシド結合の加水分解によって生じたセロオリゴ糖をグルコース単位に加水分解する酵素をいい、通常その分子量は約９１．１ｋＤａである。この活性を有していればその起源は限定されないが、昆虫（シロアリなど）由来、植物（アーモンドなど）由来およびカビ由来のβ−グルコシダーゼが用いられる。カビ由来のβ−グルコシダーゼとしては、Aspergillus aculeatusなどに由来するものが挙げられる。
【００３３】
このような目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、生物から単離する方法；適切なプローブまたはプライマーを用いて、生物のゲノムＤＮＡから選抜する方法；あるいは、既知の配列に基づいて化学合成する方法によって得られ得る。
【００３４】
本発明で使用されるプロモーター配列は、配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に相同なＤＮＡまたはその断片であって、そして上記大腸菌において構成的プロモーター活性を呈する。
【００３５】
ここで、「プロモーター配列」とは、転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類似の領域の配列をいい、この配列以外に、発現調節のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な配列を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明で使用されるプロモーター配列は、特許文献５に開示されているように、Bacillus sp. SK-1株由来のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのＯＲＦの上流に局在し、そして構成的であるため、誘導物質による遺伝子発現誘導を行わなくても、目的の遺伝子を効率的に発現させ得る。具体的には、プロモーター配列は、（Ａ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列、（Ｂ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列、（Ｃ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｄ）配列番号１または配列番号２に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列である。宿主の大腸菌において構成的プロモーター活性を呈するのであれば、上記ＤＮＡの断片であってもよい。
【００３７】
ここで、「ストリンジェント条件」とは、例えば、以下の条件をいう。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、５×Denhard't（0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400）、および100μg/mLサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、50℃にて一晩保温する条件が挙げられる。
【００３８】
「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド間の残基の配列類似性をいい、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較することにより決定され得る。配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いで、この適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出され得る。最適なアラインメントおよびホモロジーを得るためのアルゴリズムは、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。核酸間の配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウエア（例えば、BLASTN、FASTAなど）を用いて測定される。
【００３９】
ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素（ｐｇｓＢＣＡ）は、納豆の糸であるポリ−γ−グルタミン酸の合成に関与する細胞膜タンパク質であり、３９３アミノ酸のｐｇｓＢ、１４９アミノ酸のｐｇｓＣ、および３８０アミノ酸のｐｇｓＡからなる酵素複合体である。それぞれの機能は未だ解明されていないが、ｐｇｓＡは、Ｎ末端およびＣ末端に親水性アミノ酸配列を有しており、これは、細胞内膜の通過に際して、分泌シグナル、ターゲティングシグナル、および付着シグナルとして作用すると考えられている。
【００４０】
このｐｇｓＡをコードするＤＮＡを有する発現ベクターを用いて、大腸菌の表面に比較的サイズが小さいタンパク質を発現できることが知られている（特許文献４）。本発明においては、より大きなサイズのタンパク質を細胞表層に提示するために、このｐｇｓＡをコードするＤＮＡを利用する。
【００４１】
本発明においては、上記ｐｇｓＡは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来であることが好ましい。より好ましくは、ｐｇｓＡをコードするＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列；配列番号３に記載の塩基配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有する塩基配列；配列番号３に記載の塩基配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列；または、配列番号３に記載の塩基配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する塩基配列である。ここで、ストリンジェント条件および配列同一性とは、上記のとおりである。
【００４２】
上記のプロモーター配列、ｐｇｓＡをコードするＤＮＡ、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡは、発現ベクターの形態で宿主に導入されてもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。組換えＤＮＡ中、ｐｇｓＡをコードするＤＮＡおよび目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、ｐｇｓＡのＣ末端側と目的のタンパク質のＮ末端側が連結した融合タンパク質として発現されるように配置される。ｐｇｓＡと目的のタンパク質とは、直接連結されてもよく、あるいは数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介して連結されてもよい。このような融合タンパク質をコードするＤＮＡは、上記プロモーターの制御下に配置される。これらの各種ＤＮＡおよび組換えＤＮＡの合成、結合、および発現ベクターへの挿入は、当業者が通常用い得る技法で行われ得る。
【００４３】
上記の組換えＤＮＡが挿入される発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクターなどが挙げられる。プラスミドベクターとしては、pUC18、pUC19、pBluescript、pETなどが挙げられる。また、ファージベクターとしては、λgt10、λgt11などのλファージベクターなどが挙げられる。
【００４４】
このような発現ベクターは、複製起点を有しており、また、例えば、大腸菌の選択マーカーを有することが好ましい。選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられる。また、タンパク質の構造遺伝子を効率よく発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列をさらに含むことが望ましい。
【００４５】
本発明の大腸菌は、上記組換えＤＮＡまたは発現ベクターを導入することにより得られる。ＤＮＡの導入とは、大腸菌の中にＤＮＡを導入し、発現させることを意味する。ＤＮＡの導入の方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショック法などの方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。
【００４６】
本発明において宿主として用いられる大腸菌は、その種類は、特に限定されないが、非病原性の株であることが好ましく、遺伝子工学の分野で通常使用されている市販の株がより好ましい。例えば、Escherichia coli K-12株系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、DH10B株、XL-1BlueMRF'株、TOP10F株などが挙げられる。
【００４７】
組換えＤＮＡが導入された大腸菌は、適切な培地中で培養して選択マーカーで選択され、発現されたタンパク質の活性を測定することにより選択される。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、抗タンパク質抗体とFITC標識抗IgG抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。
【００４８】
上記のようにして得られた本発明の大腸菌は、細胞表層に提示された目的のタンパク質を基質と接触させ、この基質を結合するか、またはこの基質を他の物質に変換させる目的で使用され得る。例えば、α−アミラーゼが表層提示されている場合、この大腸菌をデンプンを含む培地中で嫌気的に培養することにより、デンプンを液化および糖化できる。培地中のデンプンを十分に糖化させた後、この大腸菌を好気的に培養することによって乳酸発酵が行われ得る。あるいは、例えば、リパーゼが表層提示されている場合、この大腸菌細胞をエステル交換反応の生体触媒（whole-cell biocatalyst）として用いることができる。
【００４９】
本発明の大腸菌は、タンパク質が酵素である場合、酵素を表層提示する大腸菌を含む酵素剤として、提供されてもよい。具体的には、本発明の酵素剤としては、本発明の大腸菌および該大腸菌を維持し得る培地を含む懸濁液、あるいは本発明の大腸菌が凍結保存あるいは凍結乾燥、さらには低温乾燥されたものが挙げられる。
【００５０】
さらに、本発明の大腸菌は、ランダムに変異を導入した種々のタンパク質（酵素、抗体、リガンドなど）をそれぞれ別の大腸菌の表層に提示させ、コンビナトリアルライブラリーとして使用することもできる。このようなライブラリーから、目的に応じた最適な性質を有するクローンを迅速かつ簡便に選択することも可能である。ここでいうコンビナトリアルライブラリーとは、遺伝子レベルでランダムに変異を導入し、タンパク質の多様性を人為的に拡大した種々の変異体の集合をいう。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１：α−アミラーゼを細胞表層に提示する大腸菌の作成）
（１）大腸菌の細胞表層へのアミラーゼ提示用ベクターの構築（図１を参照のこと）
まず、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素の１つであるｐｇｓＡの遺伝子（配列番号３）を含むプラスミドpHCE1LB-pgaBCA（Bioleaders Corporationより入手）を鋳型とし、配列番号４および５の各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素PvuIIおよびHindIIIで消化し、PvuII-HindIII断片を得た。
【００５３】
このｐｇｓＡ遺伝子のPvuII-HindIII断片をプラスミドpHCE1LB（Bioleaders Corporationより入手）の制限酵素EcoRVおよびHindIIIの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、表層提示プラスミドpHLAを得た。
【００５４】
次いで、プラスミドpQE31（キアゲン社）にStreptococcus bovis 148株由来のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＡ；配列番号６）（E.Satohら、Appl. Environ. Microbiol. 63:4593-4596 (1997)）が挿入されたプラスミドpQE31-amyAを鋳型とし、配列番号７および８の各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素BamHIおよびHindIIIで消化し、BamHI-HindIII断片を得た。
【００５５】
このａｍｙＡ遺伝子のBamHI-HindIII断片を、プラスミドpHLAの制限酵素BamHIおよびHindIIIの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、ｐｇｓＡ−ａｍｙＡをこの順で有する、目的のアミラーゼ提示用ベクターpHLAαAFを得た。このベクターを、制限酵素BamHIおよびHindIIIで消化し、ａｍｙＡ遺伝子の導入を確認し、ABI PRISM(登録商標)310 Genetic Analyzer（Applide Biosystems社製）を用いて、その塩基配列を確認した。
【００５６】
（２）細胞表層にα−アミラーゼを提示する大腸菌の作成
上記（１）で得たベクターpHLAαAFを、大腸菌NovaBlue（Novagen社）コンピテントセルにヒートショック法によって形質転換した。得られた形質転換体を、100μg/mLのアンピシリンおよび0.25w/v％レマゾールブリリアントブルーデンプン（ナカライテスク社）を含むLuria-Bertani（以下、ＬＢ）寒天培地（ペプトン１w/v％、イーストエキストラクト0.5w/v％、塩化ナトリウム0.5w/v％、および寒天1.5w/v％）上に塗布し、37℃にて24時間培養した。コロニーの周囲のレマゾールブリリアントブルーデンプンが分解されて生じるハロを確認した株を選択した。
【００５７】
次いで、選択した形質転換体を、可溶性デンプン20g/Lを含むLB培地中で微生物培養装置BMJ-PI（エイブル株式会社および株式会社バイオット製）を用いて、37℃にて培養し、48時間まで経時的にサンプリングした。培養培地を遠心分離により培地と菌体とに分離して、それぞれのα−アミラーゼ活性を測定した。コントロールとして、大腸菌NovaBlueを用いた。α−アミラーゼ活性は、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン株式会社製）を用いて、プロトコルに従って行った。
【００５８】
形質転換した大腸菌は、α−アミラーゼ活性を有していた。図２に示すように、培養後48時間で、最も高い活性を示した。図２において、α−アミラーゼ活性の１Ｕは、１分間にＮ３−Ｇ５−β−ＣＮＰ（合成基質2-クロロ-4-ニトロフェニル65-アジド-65-デオキシ-β-マルトペンタオシド）から１μmolのＣＮＰ（2-クロロ-4-ニトロフェノール）を遊離する力価を表す。一方、形質転換体の培養上清中には、α−アミラーゼ活性はほとんど認められなかった。
【００５９】
（実施例２：リパーゼを細胞表層に提示する大腸菌の作成）
（１−１）大腸菌の細胞表層へのリパーゼ提示用ベクターの構築
まず、Candida antarctica CBS6678株由来のリパーゼＢの遺伝子（ＣＡＬＢ；配列番号９）を含むプラスミドpWIFS-CALBを鋳型とし、配列番号１０および１１の各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素SalIおよびXhoIで消化し、SalI-XhoI断片を得た。
【００６０】
このＣＡＬＢ遺伝子のSalI-XhoI断片を、プラスミドpHLAの制限酵素SalIおよびXhoIの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、ｐｇｓＡ−ＣＡＬＢをこの順で有する、目的のリパーゼ提示用ベクターpHLACALBを得た。このベクターを、制限酵素SalIおよびXhoIで消化し、ＣＡＬＢ遺伝子の導入を確認し、ABI PRISM(登録商標)310 Genetic Analyzer（Applide Biosystems社製）を用いて、その塩基配列を確認した。
【００６１】
（１−２）大腸菌の細胞表層へのROL提示用ベクターの構築
まず、Rhizopus oryzae由来のリパーゼの遺伝子（ROL；配列番号１２）を含むプラスミドpWIFSProROL（T. Matsumotoら、Appl. Environ. Microbiol. 68: 4517-4522 (2002)）を鋳型とし、配列番号１３および１４の各プライマーを用いて、PCRを行った。得られた断片を制限酵素BamHIおよびSalIで消化し、BamHI-SalI断片を得た。
【００６２】
このROL遺伝子のBamHI-SalI断片を、プラスミドpHLAの制限酵素BamHIおよびSalI切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、pgsA-ROLをこの順で有する、目的のリパーゼ提示用ベクターpHLAROLを得た。このベクターを、制限酵素BamHIおよびSalIで消化し、ROL遺伝子の導入を確認し、ABI PRISM(登録商標)310 Genetic Analyzer (Applide Biosystems 社製)を用いて、その塩基配列を確認した。
【００６３】
（２）細胞表層にリパーゼＢを提示する大腸菌の作成
上記（１−１）および（１−２）で得たベクターpHLACALBおよびpHLAROLを、大腸菌NovaBlue（Novagen社）コンピテントセルにそれぞれヒートショック法によって形質転換した。得られた形質転換体を、100μg/mLのアンピシリン、１w/v％のGall powder（胆汁粉：Sigma社）、および１v/v％のトリ-n-ブチリンを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、37℃にて24〜48時間培養した。コロニーの周囲にハロを確認した株を選択した。
【００６４】
次いで、選択した形質転換体を、ＬＢ液体培地中で37℃にて培養し、48時間まで経時的にサンプリングした。培養培地を遠心分離により培地と菌体とに分離して、菌体を洗浄し、−80℃で凍結させた後、真空乾燥機を用いて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥菌体を破砕し、それぞれのリパーゼ活性を測定した。コントロールとして、大腸菌NovaBlueを用いた。リパーゼ活性は、リパーゼキットＳ（マルコ製薬株式会社製）を用いて、プロトコルに従って行った。
【００６５】
形質転換した大腸菌は、リパーゼ活性を有していた。図３Ａに示すように、ＣＡＬＢは培養後４８時間まで活性が増大した。また、図３Ｂに示すように、ＲＯＬは培養後４８時間まで高い活性を保持した。図３において、リパーゼ活性の１IUは、30℃で１分間に基質から１μmolのSH基を遊離する力価と定義する。一方、この形質転換体の培養上清中には、リパーゼ活性はほとんど認められなかった。
【００６６】
（実施例３：リパーゼを細胞表層に提示する大腸菌による光学分割反応の検討）
ＣＡＬＢは、有機化合物（特に、医薬中間体など）の合成に比較的頻繁に利用されるリパーゼであるため、光学分割反応について以下のように検討を行った。上記実施例２で得たリパーゼＢを提示する大腸菌（ＣＡＬＢ表層提示大腸菌）を、ＬＢ液体培地中で37℃にて24時間培養した。培養培地を遠心分離して菌体を分離・洗浄し、−80℃で凍結させた後、真空乾燥機を用いて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥菌体を破砕し、光学分割反応における全細胞生体触媒（whole-cell biocatalyst）として用いた。
【００６７】
本実施例における光学分割反応を、以下の式に示す。すなわち、（ＲＳ）−１−フェニルエタノール（ＲＳ−１−ＰＥ）と酢酸ビニルモノマー（ＶＡ）とから、リパーゼによるエステル交換反応によって、（Ｒ）−１−フェニルエチルアセテート（Ｒ−ＰＥＡ）を得る反応である。
【００６８】
【化１】
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【００６９】
５mLのｎ−ヘキサン中、50mgの（ＲＳ）−１−フェニルエタノール、35.3mgの酢酸ビニルモノマー、0.5gのモレキュラーシーブ4Aビーズ（ナカライテスク株式会社製）、および50mgの破砕した凍結乾燥菌体を含む反応液を、150rpmで振盪しながら37℃にてインキュベートした。なお、反応液中のＲＳ−１−ＰＥおよびＶＡの濃度は、80mMであった。25時間まで経時的にサンプリングして、Ｒ体およびＳ体の１−フェニルエチルアセテートの生成量（収率）をＨＰＬＣにて測定した。
【００７０】
結果を図４に示す。図４に示すように、ＣＡＬＢ表層提示大腸菌は、光学分割反応を触媒し、25時間目において、Ｒ−ＰＥＡの収率は７６．３％そしてエナンチオ過剰率は９８．２％に達した。ＣＡＬＢは、酵母の表層では発現しにくいリパーゼであるが、本実施例により、大腸菌においては実用可能なレベルの活性で表層に発現可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、タンパク質を活性な状態で表層に提示した大腸菌が提供される。また、本発明によれば、従来大腸菌では不可能と思われていた、サイズの大きな外来タンパク質を表層に提示した大腸菌が提供される。このような大腸菌は、大量に培養することが可能であり、提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。特に、活性な状態でタンパク質が表層提示されているため、例えば、タンパク質がリパーゼである場合は、医薬品原料化合物の製造における光学分割の触媒として、非常に有効に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】大腸菌の細胞表層へのアミラーゼ提示用ベクターの構築の模式図である。
【図２】形質転換した大腸菌のα−アミラーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図３Ａ】ＣＡＬＢを表層提示した大腸菌のリパーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図３Ｂ】ＲＯＬを表層提示した大腸菌のリパーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図４】ＣＡＬＢを細胞表層に提示した大腸菌を用いた光学分割反応の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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