(57)【要約】      （修正有）【課題】病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御する活性基質をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】リシルオキシダーゼのアイソフォーム、より好ましくはＬＯＸ（リシルオキシダーゼ）アイソフォームの活性の誘導方法。特に、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／若しくは、ジストロフィー瘢痕の場合の弾性繊維形成を制御する活性基質に有益。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に異常又は病的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御することを目的とした組成物を製造するための、
エラスチン合成の低減又は阻害を誘導する第二の成分と組み合わせた、
配列番号１の配列を有するＬＯＸの、又は、
ＬＯＸの活性及び／若しくは形成を誘導する第一の成分の、
使用。
【請求項２】
異常又は病的な弾性繊維形成は、特に、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、ジストロフィー瘢痕、湿疹、並びに／又は、無秩序及び／若しくは非機能的な弾性組織に関わるガンへのストローマ反応の場合に見られるものであることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
第一の成分と第二の成分が同一であることを特徴とする、請求項１記載の使用。
【請求項４】
第二の成分は、エラスチンの前駆タンパク質である配列番号３の配列を有するトロポエラスチンの合成の低減又は阻害を誘導するものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１に記載の使用。
【請求項５】
第二の成分は：
ｉ）ヒトエラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｒ）のヌクレオチド配列（配列番号４）の少なくとも一部分に結合する領域を含むものであるか、又は、
ｉｉ）ヒトエラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｒ）のヌクレオチド配列（配列番号４）の少なくとも一部分に結合するタンパク質の発現を調節するものであることにより、
トロポエラスチンの合成を低減又は阻害するものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
活性成分は、植物又は合成ポリフェノール、ガレガ又はカルダモンの抽出物、飽和脂肪酸、キシリトール等のポリオール、アドラガント（ａｄｒａｇａｎｔ）ゴム、大麦又は燕麦等の穀物の抽出物からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性成分を、必要に応じて化粧学的に許容される賦形剤と混合して、含有することを特徴とする化粧組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性成分を、必要に応じて食品用に許容される賦形剤と混合して、含有することを特徴とする栄養補助組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性成分を、必要に応じて医薬的に許容される賦形剤と混合して、含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
ＬＯＸの活性及び／若しくは形成を誘導して異常又は病的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御する成分をスクリーニングする方法であって：
−潜在的な活性成分を、好ましくは生存しており、ＬＯＸを発現可能な少なくとも１種の細胞と接触させて、
−特に前記潜在的な活性物質がＬＯＸの発現を誘導するか否かを確認することを目的として、ＬＯＸの発現を分析する
ことからなることを特徴とする方法。
【請求項１１】
当該方法が、潜在的な活性成分を、タンパク質エラスチンを発現可能な少なくとも１種の細胞（この細胞は、ＬＯＸを発現するものと同じであってもよい）と接触させることからなり、特に前記潜在的な活性成分がエラスチン合成の低減又は阻害を誘導するか否かを確認することを目的として、タンパク質エラスチンの発現を分析することからなることを特徴とする、請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
活性成分が：
−タンパク質ＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１部の発現を誘導するか否か、及び／又は、
−タンパク質ＬＯＸの構造中に存在するペプチド配列の発現を誘導するか否か；並びに
−タンパク質エラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１部の発現を阻害するか否か、及び／又は、
−タンパク質エラスチンの構造中に存在するペプチド配列の発現を阻害するか否か
が調べられることを特徴とする、請求項１０又は１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ＬＯＸ及び／又はタンパク質エラスチンの発現の分析が、ＬＯＸをコードする及び／又はトロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の発現の定性的及び／又は定量的分析により行われることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ＬＯＸ及び／又はタンパク質エラスチンの発現の分析が、
ＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するための、ＬＯＸをコードする相補ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用、及び／又は、
トロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するための、トロポエラスチンをコードする相補ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用
を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用するものであることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
当該方法は：
−特にＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズする少なくとも１つのＤＮＡプローブを用いることによる、特にＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、及び／若しくは、例えばトロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズするＤＮＡプローブでの、特にトロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、並びに／又は、
−特にＬＯＸの全体又は一部を認識可能な少なくとも１つの抗体、及び／若しくは、エラスチンの全体又は一部を認識可能な少なくとも１つの抗体を用いることによる、特にＬＯＸをコードするペプチド配列の少なくとも一部の、免疫検出により、
再生皮膚モデル又は生検に対して行われる、ＬＯＸの発現位置を特定する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
免疫検出又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程は、特に上皮組織及び／又は結合組織における、ＬＯＸ及びエラスチンの追跡可能性の調査を可能にするものであり、前記組織は、少なくとも１つの再生皮膚モデル又は生検に由来するものであることを特徴とする、請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
スクリーニング方法は、ＬＯＸの発現と、活性成分を含まないコントロールで発現されたＬＯＸの発現との比較、及び／又は、タンパク質エラスチンの発現と、活性成分を含まないコントロールで発現されたタンパク質エラスチンの発現との比較を含むことを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
細胞は、繊維芽細胞、特に正常なヒト皮膚に由来する繊維芽細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する繊維芽細胞、を含むものであることを特徴とする、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
細胞は、角質細胞のような上皮細胞、特に正常なヒト皮膚に由来する上皮細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する上皮細胞、を含むものであることを特徴とする、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
生細胞は、顔、腹部又は胸部等の特定の部位に由来し、かつ、「光老化」、又は、日光等に「規則的曝露」されたとみなすことができる少なくとも１つの皮膚に由来するものであることを特徴とする、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは繊維芽細胞を含む少なくとも１つの真皮モデル、又は、生検に基づいたモデルを利用することを特徴とする、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは角質細胞を含む少なくとも１つの表皮モデルを利用することを特徴とする、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
活性成分は、植物又は合成ポリフェノール、ガレガ又はカルダモンの抽出物、飽和脂肪酸、キシリトール等のポリオール、アドラガント（ａｄｒａｇａｎｔ）ゴム、大麦又は燕麦等の穀物の抽出物からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１０〜２２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
膠原繊維新生形成及び／又は弾性繊維新生形成の追跡可能性を調査することを目的に、少なくとも１つの再生皮膚モデル又は生検に由来する組織、特に上皮組織及び／又は結合組織、中でのＬＯＸ及び必要に応じてタンパク質エラスチンの発現位置を特定する方法であって、
タンパク質ＬＯＸ及び必要に応じてタンパク質エラスチンの免疫検出の工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１〜６で定義した少なくとも１つの活性成分若しくは１つのタイプの組合せ、又は、請求項７〜９で定義した組成物の有効量を、特に光線弾力線維症、皮膚線条及び／又はジストロフィー瘢痕の場合に、適用することを特徴とする化粧ケア方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リシルオキシダーゼのアイソフォーム、より好ましくはＬＯＸ（リシルオキシダーゼ）アイソフォームの活性の誘導に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や粘膜の抵抗力や弾力性といった特性は、真皮の膠原繊維及びエラスチン繊維によって本質的に決まる。エラスチンは、フィブリリンやＭＡＧＰ（ミクロフィブリル結合糖タンパク質（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））等の他の分子によっても構成される弾性繊維を構成するタンパク質である。
【０００３】
「弾性繊維」は、ミクロフィブリル上に沈着したエラスチンから構成される。エラスチンは、可溶性のトロポエラスチンとして合成され、トロポエラスチンは、リシルオキシダーゼによって分子内及び分子間で架橋してミクロフィブリル上に沈着すると、その物理化学特性（不溶性、弾力性）を呈する。弾性繊維は、これを含む器官（管、肺柔組織、弾性軟骨、皮膚等）に収縮性を与える。弾性繊維は、ミクロフィブリル上に沈着したエラスチンから主に構成される。「エラスチン」の名称は、弾性繊維の無定形の部分を構成し、弾性繊維に弾力性を与えるタンパク質について用いられる。
最近、弾性繊維を構成するこの成分が表皮中に存在することが分かった。
【０００４】
「コラーゲン細繊維」は、コラーゲンの三本鎖から構成される。この膠原繊維もまたリシルオキシダーゼによって架橋している。皮膚や粘膜の加齢は、上記小繊維の網状組織の変性、特に劣化して正確に再生しない弾性繊維の変性と関係がある。同様に、瘢痕の弾性繊維の網状組織も正確な形ではない。ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４の５種のアイソフォームがリシルオキシダーゼ（ＬＯ）ファミリーにおいて知られている（非特許文献１）。ＬＯＸは膠原繊維の架橋に関与していることが分かっている（非特許文献２）。ＬＯＸは細胞ホメオスタシスの維持にも関与しており、ＮＦκＢの制御による細胞ホメオスタシスの維持に必要なレギュレーターと考えられる（非特許文献３）。
【０００５】
コラーゲンの合成は、線維症や光線弾力線維症等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合、及び、あるガンの病状の場合に付随的に調節解除される。コラーゲン及びＬＯＸの発現が、細胞侵入に対する防御機構としてマトリックスの緻密化を伴うのと異なって、ＬＯＸを発現しないコラーゲンの合成は、ガンの場合のように細胞外マトリックスの病的な変化を伴う（非特許文献４）。
【０００６】
エラスチンの合成は、線維症や光線弾力線維症等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合、及び、あるガンの病状の場合に調節解除される。この無秩序なエラスチン合成は、一般に細胞の腫瘍潜在性に好ましいものと考えられている誘導ペプチドの形成につながる（非特許文献５）。
【０００７】
従来の技術では、皮膚・化粧品学上の活性成分が機能性弾性繊維の新たな形成に与える影響を評価できる基準を定められていない。この状況では、調査すべき上記活性成分の与える影響を評価できるような所望の基準を定めることもまた難しい。実際の活性成分のスクリーニング方法は、エラスチンやフィブリリン等の弾性繊維の形成に関与する遺伝子の発現の評価に影響を与える。
【０００８】
また、現在、動物実験は化粧品においてヨーロッパでは禁止されており、人体実験は倫理上異論が唱えられている。このため、本発明者らは、動物や人間を用いたスクリーニングを化粧品の用途に実施できない。
【０００９】
Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ、リヨン、フランス）等の三次元モデルにおいて、角質細胞はトロポエラスチンの合成及びトロポエラスチンのミクロフィブリル上への沈着を誘導する（非特許文献６）。Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）モデルにおいて、細胞外マトリックスは、放射状のコラーゲンとミクロフィブリル上に沈着したエラスチンからなる弾性繊維とを有し、皮膚の超微細構造に似た超微細構造を呈した。このモデルは、リシルオキシダーゼ阻害剤等の特定分子の有効性を試験するためにも使用されている。このモデルを用いることにより、リシルオキシダーゼを阻害すると膠原繊維及びエラスチン繊維の断裂が誘導されるが、最終分化の標識（フィラグリン等）の発現量も減少することから、角質細胞の分化プログラムからの逸脱もまた誘導されることが証明された（特許文献１）。この特許文献においては、異種のＬＯアイソフォーム間の識別はされていない。
【００１０】
これらの研究では、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／又は、ジストロフィー瘢痕、並びに、ガンの病状の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合に、ＬＯＸの発現を誘導し、弾性繊維形成を下方制御する活性成分のスクリーニング方法を開発できなかった。
【００１１】
従って、従来の技術では、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／又は、ジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合に、ＬＯＸの発現を誘導し、弾性繊維形成を下方制御する活性成分を提供することができない。
【００１２】
さらに、従来の技術では、特に提供される方法が不正確でありリシルオキシダーゼの各種アイソフォームについて十分に特異的ではなかったために、リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォームの発現領域を正確に特定することができない。
【００１３】
【特許文献１】フランス特許０１  １０４４３
【非特許文献１】Ｃｓｉｓｚａｒ，Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅｓ：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，ｖｏｌ  ７０，ｐ２−２８
【非特許文献２】Ｓｅｖｅら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ（ＬＯＸ）  ｉｎ  ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，４３：６１３−６１９
【非特許文献３】Ｊｅａｙ  Ｓ，Ｐｉａｎｅｔｔｉ  Ｓ，Ｋａｇａｎ  ＨＭ，Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ＧＥ．Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｒａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３：２２５１−６３，２００３
【非特許文献４】Ｄｅｃｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７８，１４３−１５１，１９９８
【非特許文献５】Ｂｒａｓｓａｒｔ  Ｂ，Ｆｕｃｈｓ  Ｐ，Ｈｕｅｔ  Ｅ，Ａｌｉｘ  ＡＪ，Ｗａｌｌａｃｈ  Ｊ，Ｔａｍｂｕｒｒｏ  ＡＭ，Ｄｅｌａｃｏｕｘ  Ｆ，Ｈａｙｅ  Ｂ，Ｅｍｏｎａｒｄ  Ｈ，Ｈｏｒｎｅｂｅｃｋ  Ｗ，Ｄｅｂｅｌｌｅ  Ｌ．  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌａｓｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（７）：５２２２−７，２００１
【非特許文献６】Ｄｕｐｌａｎ−Ｐｅｒｒａｔら，Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｌａｓｔｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ａ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４：３６５−７０，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、主として、上述した技術的課題、特に、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／又は、ジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合における弾性繊維形成を制御するのにＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の発現を誘導する活性成分のスクリーニング方法を提供することを目的とした技術的課題を解決することである。「機能性弾性繊維」という語は、上述した従来の技術において通常の意味で用いるが、特に本発明においては、三次元構造に由来する収縮性を持つ弾性繊維を意味する。
【００１５】
本発明は、特に線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／又は、ジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合における弾性繊維形成を制御するための、リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォームと、タンパク質エラスチンの発現を阻害する活性成分との使用にも関する。よって、得られる効果は相乗的である。
【００１６】
本発明は、特に線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／又は、ジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合における弾性繊維形成を制御するための、リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォームの酵素活性又は発現を誘導する活性成分の使用であって、前記活性成分がタンパク質エラスチンの発現を阻害するものであるか、又は、タンパク質エラスチンの発現を阻害する第二の活性成分と組み合わせたものである使用にも関する。よって、得られる効果は相乗的である。
【００１７】
本発明は、ＬＯＸの発現位置を特定し、この発現を追跡する有効な方法を提供することからなる技術的課題を解決することもできる。
【００１８】
本記載中、本発明者らは、「ＬＯＸ」又は「ｈＬＯＸ」との語によって、配列番号１の配列を有するヒトリシルオキシダーゼタンパク質ＬＯＸのアイソフォームを意味する。
本記載中、本発明者らは、「エラスチン」との語によって、ヒトトロポエラスチンタンパク質、又は、配列番号３の配列を有するエラスチンタンパク質を意味する。
本記載中、本発明者らは、「コラーゲン」との語によって、ヒト皮膚組織に存在する各種コラーゲンを意味する。
【００１９】
本記載中、本発明者らは、「ＬＯＸＬ」又は「ｈＬＯＸＬ」との語によって、配列番号６の配列を有するアイソフォーム様（Ｌ）のヒトリシルオキシダーゼタンパク質ＬＯＸＬを意味する。
本記載中、本発明者らは、「リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォームの発現を誘導」によって、ＬＯＸをコードする遺伝子の発現の誘導、特にＬＯＸをコードするメッセンジャーＲＮＡの合成の誘導だけではなく、このメッセンジャーＲＮＡから合成されるタンパク質ＬＯＸの誘導をも意味する。ＬＯＸのｃＤＮＡは配列番号２の配列を有する。
【００２０】
本記載中、本発明者らは、「タンパク質エラスチンの発現を阻害」によって、タンパク質エラスチンをコードする遺伝子の発現の阻害、特にタンパク質エラスチンをコードするメッセンジャーＲＮＡの合成の阻害だけではなく、このメッセンジャーＲＮＡからのタンパク質エラスチン又はその前駆体であるトロポエラスチンの合成の阻害をも意味する。タンパク質トロポエラスチンのｃＤＮＡは配列番号４の配列を有する。
【００２１】
本記載中、本発明者らは、「コラーゲンＩの発現を誘導」によって、コラーゲンＩアルファ１をコードする遺伝子の発現の誘導、特にコラーゲンＩアルファ１をコードするメッセンジャーＲＮＡの合成の誘導だけではなく、このメッセンジャーＲＮＡからのコラーゲンＩ又はその前駆体であるプロコラーゲンＩの合成の誘導をも意味する。
【００２２】
このＬＯＸの発現の誘導は、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、及び／又は、ジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合における弾性繊維形成の制御に寄与するよう十分に効果的であるように実施されなければならない。ある病状においては、特に光線弾力線維症又は線維症の場合に見られる無秩序な弾性繊維形成を制御するという効果的な作用が得られるようにタンパク質エラスチンの発現を阻害するのが望ましい。
【００２３】
すなわち本発明において、本発明者らは、ＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の発現、あるいは、ＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の酵素活性を誘導すること、及び、タンパク質エラスチンの発現を阻害することを目的とするものである。
「その相同体又は本質的な相同体」によって、ここで定義するＬＯＸＬと同じ又は同程度の活性を有するリシルオキシダーゼのアイソフォームＬＯＸＬの相同体を意味する。
【００２４】
活性成分としては、ＬＯＸの発現及び／又は活性を呈する少なくとも１つの細胞種を含むモデルを当該活性成分と接触させた際に、（活性成分と接触させない）コントロールモデルでのＬＯＸの発現量及び／又は活性量と比較して、ＬＯＸの発現及び／又は活性を約２倍増加させると同時に、エラスチン（Ｅｌｎ）のｍＲＮＡの発現を約０．５倍減少させることができるものが、有効であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、第一の態様によると、ＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の活性及び／若しくは形成を誘導して異常又は病的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御する成分をスクリーニングする方法であって：
−潜在的な活性成分を、好ましくは生存しており、ＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体を発現可能な少なくとも１種の細胞と接触させて、
−特に上記潜在的な活性物質がＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の発現を誘導するか否かを確認することを目的として、ＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の発現を分析する
ことからなることを特徴とする方法に関する。
【００２６】
好適には、上記方法は、上記潜在的な活性成分を、タンパク質エラスチンを発現可能な少なくとも１種の細胞（この細胞は、ＬＯＸを発現するものと同じであってもよい）と接触させることからなり、特に上記潜在的な活性成分がエラスチン合成の低減又は阻害を誘導するか否かを確認することを目的として、タンパク質エラスチンの発現を分析することからなる。
【００２７】
好適には、上記活性成分が：
−タンパク質ＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１部の発現を誘導するか否か、及び／又は、
−タンパク質ＬＯＸの構造中に存在するペプチド配列の発現を誘導するか否か；並びに
−タンパク質エラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１部の発現を阻害するか否か、及び／又は、
−タンパク質エラスチンの構造中に存在するペプチド配列の発現を阻害するか否か
が調べられる。
【００２８】
好適には、ＬＯＸ及び／又はタンパク質エラスチンの発現の分析が、ＬＯＸをコードする及び／又はトロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の発現の定性的及び／又は定量的分析により行われる。
【００２９】
好適には、ＬＯＸ及び／又はタンパク質エラスチンの発現の分析が、
ＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するための、ＬＯＸをコードする相補ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用、及び／又は、
トロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を増幅するための、トロポエラスチンをコードする相補ＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）の少なくとも一部とハイブリダイズするプライマーの使用
を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用するものである。
【００３０】
好適には、上記方法は：
−特にＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズする少なくとも１つのＤＮＡプローブを用いることによる、特にＬＯＸをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、及び／若しくは、例えばトロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイズするＤＮＡプローブでの、特にトロポエラスチンをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、並びに／又は、
−特にＬＯＸの全体又は一部を認識可能な少なくとも１つの抗体、及び／若しくは、エラスチンの全体又は一部を認識可能な少なくとも１つの抗体を用いることによる、特にＬＯＸをコードするペプチド配列の少なくとも一部の、免疫検出により、
再生皮膚モデル又は生検に対して行われる、ＬＯＸの発現位置を特定する工程を更に含む。
【００３１】
好適には、免疫検出又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程は、特に上皮組織及び／又は結合組織における、ＬＯＸ及びエラスチンの追跡可能性の調査を可能にするものであり、上記組織は、少なくとも１つの再生皮膚モデル又は生検に由来するものである。
好適には、スクリーニング方法は、ＬＯＸの発現と、活性成分を含まないコントロールで発現されたＬＯＸの発現との比較、及び／又は、タンパク質エラスチンの発現と、活性成分を含まないコントロールで発現されたタンパク質エラスチンの発現との比較を含む。
好適には、細胞は、繊維芽細胞、特に正常なヒト皮膚に由来する繊維芽細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する繊維芽細胞、を含むものである。
【００３２】
好適には、細胞は、角質細胞のような上皮細胞、特に正常なヒト皮膚に由来する上皮細胞、例えば包皮又は成人被験者の皮膚に由来する上皮細胞、を含むものである。
好適には、生細胞は、顔、腹部又は胸部等の特定の部位に由来し、かつ、「光老化」、又は、日光等への「規則的曝露」されたとみなすことができる少なくとも１つの皮膚に由来するものである。
【００３３】
好適には、スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは繊維芽細胞を含む少なくとも１つの真皮モデル、又は、生検に基づいたモデルを利用する。
好適には、スクリーニング方法は、再生皮膚モデル、好ましくは角質細胞を含む少なくとも１つの表皮モデルを利用する。
使用する皮膚モデルは、好適にはＭｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）再生皮膚モデルであるが、結合性マトリックス、表皮若しくは上皮、又は、再生皮膚若しくは粘膜のモデルであってもよい。
【００３４】
（１）＜三次元結合性マトリックス（真皮又は絨毛膜）培養モデル＞
は、再生真皮又は再生絨毛膜を形成するために、間質細胞を播種した担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン膜若しくはテフロンスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、ＡｎｏｐｏｒｅＴＭ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭＴＭ半透膜、ポリエステル半透膜又はポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群において、例えば、真皮モデルであるＳｋｉｎ２ＴＭｍｏｄｅｌ  ＺＫ１１００、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（Ｒ）及びＴｒａｎｓｃｙｔｅ（Ｒ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる）
−細胞培養処理した樹脂（葉状真皮（ａ  ｄｅｒｍａｌ  ｌｅａｆ）の構造：Ｍｉｃｈｅｌ  Ｍ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ（１９９９）３５：３１８−３２６）
−ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｏｇｒａｆｔ（Ｒ）  ３Ｄ−Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素を基盤とするゲル又は膜（上記群において、例えば、真皮モデルであるＶｉｔｒｉｘ（Ｒ）（オルガノジェネシス）が挙げられる）
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は最終的にはキトサン（ＣＮＲＳのＥＰ０２９６０７８  Ａ１、ＣｏｌｅｔｉｃａのＷＯ０１／９１１８２１及びＷＯ０１／９２３２２）を含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス
から選択される。
【００３５】
（２）＜三次元表皮又は上皮培養モデル＞
は、再生上皮又は再生表皮を得るために、まず間質細胞、特に繊維芽細胞を、次に上皮細胞、特に角質細胞を播種した、又は、播種していない担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン膜若しくはテフロンスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群において、再生表皮及び上皮のモデル（Ｓｋｉｎｅｔｈｉｃ（Ｒ））、並びに、ＥｐｉＤｅｒｍ（Ｒ）、ＥｐｉＡｉｒｗａｙ（Ｒ）、ＥｐｉＯｃｃｕｌａｒ（Ｒ）（Ｍａｔｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）といったモデルが挙げられる）
−ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素を基盤とする薄膜又は膜（上記群において、特に、Ｅｐｉｓｋｉｎ（Ｒ）（ロレアル）及びＬａｓｅｒｓｋｉｎ（Ｒ）（Ｆｉｄｉａ  ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）といったモデルが挙げられる）
から選択される。
【００３６】
（３）＜三次元再生皮膚又は粘膜培養モデル＞
は、再生粘膜を得るために上皮細胞を、又は、再生皮膚を得るために角質細胞を播種した（真皮の又は絨毛膜の）マトリックス担体を含む。この担体は好ましくは、
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン膜若しくはテフロンスポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体（上記不活性な担体は間質細胞、特に繊維芽細胞を含む）
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲン及び／又はヒアルロン酸及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素を基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は最終的にはキトサンを含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス（上記多孔性マトリックスは間質細胞、特に繊維芽細胞を統合したものである）
−人間又は動物の、上皮を剥がした真皮又は死んだ真皮
から選択される。
【００３７】
上記群において、Ａｐｌｉｇｒａｆ（Ｒ）（オルガノジェネシス）、ＡＴＳ−２０００（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ｖｅｒｔｒｉｅｂ）、特にはＳｋｉｎ２ＴＭ（ＺＫ１２００−１３００−２０００、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）といったモデルを挙げることができる。
【００３８】
好適には、上記活性成分は、植物又は合成ポリフェノール、ガレガ又はカルダモンの抽出物、飽和脂肪酸、キシリトール等のポリオール、アドラガント（ａｄｒａｇａｎｔ）ゴム、大麦又は燕麦等の穀物の抽出物からなる群より選択されるものである。
【００３９】
第二の態様によると、本発明は、特に異常又は病的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御することを目的とした組成物を製造するための、エラスチン合成の低減又は阻害を誘導する第二の成分と組み合わせた、配列番号１の配列を有するＬＯＸ若しくはその相同体若しくは本質的な相同体の、又は、ＬＯＸの活性及び／若しくは形成を誘導する第一の成分の、使用に関する。この組成物は、好適には、リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォーム又はその相同体若しくは本質的な相同体の酵素活性又は発現を誘導し、タンパク質エラスチンの合成を阻害することを目的とする。
【００４０】
好適には、異常又は病的な弾性繊維形成は、特に、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、ジストロフィー瘢痕、湿疹、並びに／又は、無秩序及び／若しくは非機能的な弾性組織に関わるガンへのストローマ反応の場合に見られるものである。
好適には、第一の成分と第二の成分が同一である。
【００４１】
好適には、上記第二の成分は、エラスチンの前駆タンパク質である配列番号３の配列を有するトロポエラスチン又はその相同体若しくは本質的な相同体の合成の低減又は阻害を誘導するものである。
【００４２】
好適には、上記第二の成分は：
ｉ）ヒトエラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｒ）のヌクレオチド配列（配列番号４）又はその相同体若しくは本質的な相同体の少なくとも一部分に結合する領域を含むものであるか、又は、
ｉｉ）ヒトエラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｒ）のヌクレオチド配列（配列番号４）又はその相同体若しくは本質的な相同体の少なくとも一部分に結合するタンパク質の発現を調節するものであることにより、
トロポエラスチンの合成を低減又は阻害するものである。
【００４３】
好適には、上記活性成分は、植物又は合成ポリフェノール、ガレガ又はカルダモンの抽出物、飽和脂肪酸、キシリトール等のポリオール、アドラガント（ａｄｒａｇａｎｔ）ゴム、大麦又は燕麦等の穀物の抽出物からなる群より選択されるものである。
【００４４】
第三の態様によると、本発明は、上述した活性成分を、必要に応じて化粧学的に許容される賦形剤と混合して、含有することを特徴とする化粧組成物に関する。
第四の態様によると、本発明は、上述した活性成分を、必要に応じて食品用に許容される賦形剤と混合して、含有することを特徴とする栄養補助組成物に関する。
第五の態様によると、本発明は、上述した活性成分を、必要に応じて医薬的に許容される賦形剤と混合して、含有することを特徴とする医薬組成物に関する。
【００４５】
上記活性成分、若しくは、活性成分の組合せ、又は、酵素ＬＯＸ又はその誘導体と、タンパク質エラスチンの合成を阻害する活性成分との組合せは、好適に、人間の体が許容する賦形剤と混合される。例えば、賦形剤は、防腐剤、皮膚軟化剤、乳化剤、界面活性剤、保湿剤、濃化剤、調整剤、つや消し剤、安定剤、抗酸化剤、質感調整剤、増白剤、フィルム化剤（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、可溶化剤、顔料、色素、香料及びソーラーフィルターからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。上記賦形剤は、好ましくは、アミノ酸及びその誘導体、ポリグリセリン、セルロースのエステル、ポリマー及び誘導体、ラノリン誘導体、リン脂質、ラクトフェリン、乳過酸化酵素、スクロース型安定剤、ビタミンＥ及びその誘導体、天然及び合成ワックス、植物油、トリグリセリド、不鹸化物、植物ステロール、植物エステル、シリコーン及びその誘導体、タンパク質加水分解物、ホホバ油及びその誘導体、脂溶性／水溶性エステル、ベタイン、アミン酸化物、植物抽出物、スクロースエステル、二酸化チタン、グリシン、並びに、パラベンからなる群より選択される。より好ましくは、ブチレングリコール、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５ステアリルエーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然トコフェロール、グリセリン、ジヒドロキシセチルナトリウム、イソプロピルヒドロキシセチルエーテル、ステアリン酸グリコール、トリイソノナオイン（ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ）、ヤシ油脂肪酸オクチル、 ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、 プロピレングリコール、グリセリン、ビサボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、香料、ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸塩、トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリル、オクタン酸セテアリル、アジピン酸ジブチル、ブドウ種子油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、キサンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、ミネラルワックス及び鉱物油、イソステアリン酸イソステアリル、ジペラルゴン酸プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｐｅｌａｒｇｏｎａｔｅ）、イソステアリン酸プロピレングリコール、ＰＥＧ−８ミツロウ、硬化パーム核油脂肪酸グリセリド（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｐａｌｍ  ｔｒｅｅ  ｈｅａｒｔ  ｏｉｌ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、硬化パーム油脂肪酸グリセリド（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｐａｌｍ  ｏｉｌ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、ラノリン油、 ゴマ油、乳酸セチル、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、着色剤及び顔料、ラクトース、スクロース、低密度ポリエチレン及び等張食塩水からなる群より選択される。
【００４６】
有利には、上記組成物は、特にビン又はチューブに入れた形での、水性若しくは油性の溶液、水性クリーム、水性ゲル又は油性ゲル、特にボディソープ、シャンプー；乳液；エマルション、マイクロエマルション又はナノエマルション、特に水中油又は油中水又は多相又はシリコーン含有マイクロエマルション又はナノエマルション；ローション、特にガラスビン、プラスチックビン若しくは計量ビンに入れた形の、又は、エアゾール状のローション；アンプル；液体セッケン；皮膚科学的な棒（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｒ）；軟膏；フォーム；無水製品、好ましくは液体、糊状又は固体の無水製品、例えばスティック状、特に口紅；からなる群より選択される形態で処方される。
【００４７】
有利には、上記組成物は十分に液状であれば、特に皮下、目、肺、口又は鼻から投与できる。
【００４８】
有利には、上記糊状又は固体の組成物（ペースト、粉末、タブレット、カプセル、顆粒、坐薬等）は、特に口、舌、鼻又は直腸から体内に導入できる。
【００４９】
有利には、上記組成物の処方において可能であれば、上記組成物は皮膚又は粘膜を通して、特に皮膚又は粘膜に塗布することによって投与する。
【００５０】
有利には、当業者は様々な処方及び投与経路の中から所望の効果に適したものを選択できる。
【００５１】
第六の態様によると、本発明は、上述した少なくとも１つの活性成分若しくは１つのタイプの組合せ、又は、上述した組成物の有効量を、特に光線弾力線維症、皮膚線条及び／又はジストロフィー瘢痕の場合に、適用することを特徴とする、化粧ケア方法に関する。
【００５２】
第七の態様によると、本発明は、膠原繊維新生形成及び／又は弾性繊維新生形成の追跡可能性を調査することを目的に、少なくとも１つの再生皮膚モデル又は生検に基づいたモデルに由来する組織、特に上皮組織及び／又は結合組織、中でのＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体及び必要に応じてタンパク質エラスチンの発現位置を特定する方法であって、
例えば特定の抗体による、タンパク質ＬＯＸ及び必要に応じてタンパク質エラスチンの免疫検出の工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００５３】
本発明はまた、特に弾性繊維新生形成の追跡可能性調査を目的とした、特に上皮組織及び／又は結合組織における、免疫検出又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの工程を含む、リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォーム又はその相同体若しくは本質的な相同体の発現位置を特定する方法にも関する。
【００５４】
本発明はまた、タンパク質リシルオキシダーゼＬＯＸ又はその相同体若しくは本質的な相同体の酵素活性を増進し、タンパク質エラスチンの合成を阻害する、上述した、活性成分を含む組成物、又は、組合せのタイプのひとつを治療学的に有効な量、被験者に投与することを含む、タンパク質リシルオキシダーゼＬＯＸのアイソフォーム又はその相同体若しくは本質的な相同体の酵素活性の欠失の治療にも関する。
【００５５】
好適には、この治療方法は、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条、ジストロフィー瘢痕、湿疹、並びに／又は、無秩序及び／若しくは非機能的な弾性組織に関わるガンへのストローマ反応の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御するのに使用される。
【００５６】
発明の詳細な説明
本発明者らは、意外にも、光線弾力線維症、皮膚線条及び／又はジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御するには、局所的に、リシルオキシダーゼのアイソフォームＬＯＸが十分に誘導されなかったことを証明した。本発明者らは、意外にも、光線弾力線維症、皮膚線条及び／又はジストロフィー瘢痕の場合等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合に、特に皮膚を老化、ＵＶから保護するために、あるいは、湿疹や他の同類の機能不全の場合に、エラスチン（これは、上述の場合に、非機能的に過剰生産され沈殿する傾向がある）の合成を低減させる際にＬＯＸの発現を再誘導できることが必要であることを証明した。
【００５７】
本発明者らは実際に、リシルオキシダーゼ（ＬＯ）ファミリーのこのアイソフォームが、弾性繊維を生成する再生皮膚モデルにおける弾性繊維形成に関与していることを明らかにした。年齢の異なる被験者の皮膚中に、皮膚の変化の過程でこのアイソフォームが存在するかどうかを調べたところ、本発明者らは、このアイソフォームと弾性繊維形成が同時に存在又は不存在であることに気づき、これによって、エラスチンの合成阻害とともに、このＬＯのアイソフォーム（ＬＯＸ）の発現の再活性化が、線維症、光線弾力線維症、皮膚線条及び／又はジストロフィー瘢痕の場合のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御できることが示唆される。
【００５８】
このようにして本発明者らは、このＬＯＸのアイソフォームの発現における増加を視覚化する方法を見い出して、特に植物抽出物又は化学物質の中から、特にＬＯＸをコードするｍＲＮＡの発現を誘導する活性成分、及び、タンパク質エラスチンの発現を同時又は非同時に阻害できる活性成分を探索した。次いで、選択した活性成分、又は、タンパク質エラスチンの発現を阻害する活性成分と酵素ＬＯＸとの組合せを、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成を低減させる用途の化粧用調剤及び皮膚科用調剤に配合した。
【００５９】
本発明者らは、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形に対する特異的抗体を開発し（実施例１及び２参照）、これによって、リシルオキシダーゼのアイソフォームＬＯＸの欠如が、主として、特に病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成での、膠原繊維形成の問題の原因になっていることを証明した。
【００６０】
アイソフォームＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４は、真皮において全く又はほとんど発現しておらず、弾性繊維形成に関与していない（実施例４参照）。ＬＯＸは、（架橋による）コラーゲンの成熟化に関与する酵素であり、このことから、この酵素が間質の緻密化に関与する可能性のあることが分かる。
【００６１】
本発明において、本発明者らはＬＯＸの発現位置を特定する方法を完成した。特にこの特定方法はＬＯＸの免疫検出を含む。タンパク質エラスチンの発現もこの方法によって証明できる。本発明者らの研究から、ＬＯＸはミクロフィブリルと、膠原繊維の形成とに関与していることが証明された（図５）。エラスチンは、同じ緻密な沈着物中、及び、ミクロフィブリル中で検出された。この検出は再生皮膚モデルに対して行われ、特に再生皮膚モデルにおいて角質細胞の沈着後３０日に認められる。ＬＯＸとミクロフィブリル及び膠原繊維との結合はまた、包皮の皮膚中で、特に免疫検出後の電子顕微鏡検査により、確認された。ＬＯＸは、エラスチンをまだ大量に合成している幼い患者（２〜３カ月）から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。ＬＯＸは、成人の真皮、特に首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中では常に発現している。ヒト皮膚の表皮中にもＬＯＸが多く発現しているが、ヒト皮膚が老齢の被験者（９１才）に由来する場合にはこの酵素の発現が徐々に消失していくことが観察された（実施例６参照）。
【００６２】
瘢痕に関しては、瘢痕ができて３カ月後にも５年後にも、ＬＯＸはこれらの部分で認められなかった。これに関して、３カ月の時点で発現しているエラスチンが、瘢痕の形成後５年でこの瘢痕組織にもはや存在していないことは注目すべきである。
【００６３】
このようにして、本発明者らは、膠原繊維及び弾性繊維の形成におけるＬＯＸの作用を、特に再生皮膚モデル又は幼い患者の包皮の真皮を用いて明らかにした。
本発明者らはまた、瘢痕組織部分でのＬＯＸの発現欠失も明らかにした。
【００６４】
本発明者らの研究は全体で、光線弾力線維症のような、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御する活性成分のスクリーニング方法の開発を可能にした。この制御は、特にコラーゲン及びエラスチンの架橋によって現れる。
【００６５】
本発明において、本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法を行い、これによって、特にＬＯＸをコードするメッセンジャーＲＮＡの発現の存在を特定し確認することができた。このｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは特に、ジゴキシゲニン標識二本鎖ＤＮＡプローブを用いて、パラフィンを添加した３５日再生皮膚モデルの断面において行う。このｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行って、トロポエラスチン及びコラーゲンＩα１のメッセンジャーＲＮＡの発現も証明した（実施例７参照）。
【００６６】
ＬＯＸのｍＲＮＡの発現は真皮全体で観察される。表皮では、基底層の細胞はＬＯＸを全く又はほとんど発現しないが、棘状及び顆粒層の細胞はそれを強力に発現する。コラーゲンＩα１のｍＲＮＡの発現は真皮中では特定されるが、表皮中では特定されない。
【００６７】
従って、これの目的は、例えば、線維症又は光線弾力線維症等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を最終的に制御する活性成分の適用後の、再生皮膚モデルでの、ＬＯＸのｍＲＮＡの誘導、そして最終的にはエラスチンのｍＲＮＡの阻害を証明するのに適用されることである。
【００６８】
本発明において、ｈＬＯＸ遺伝子は、再生皮膚モデル、特に再生皮膚モデルＭｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ、リヨン、フランス）に角質細胞を添加することによって活性化された。ＬＯＸのｍＲＮＡの合成誘導はコラーゲンＩα１（ＣＯＬ１  α１）のｍＲＮＡのそれと同時に認められ、特に、真皮と同等物での角質細胞を添加して約６日後に現れる。
【００６９】
ＬＯＸ、エラスチン、ＬＯＸＬをコードする目的遺伝子及びアクチンをコードする遺伝子の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調べた。この方法によれば、一定と考えられるアクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量化できる。これによって、これの遺伝子の発現量、特にＬＯＸをコードする遺伝子及びエラスチンをコードする遺伝子の発現量の制御を定量化することができる。
【００７０】
ＬＯＸｍＲＮＡの合成は、老齢のドナーに由来する繊維芽細胞において、包皮に由来する繊維芽細胞と比較して平均して４０％減少する（実施例８参照）。本発明は、特に繊維芽細胞での、ＬＯＸの発現を定量化できる方法を提供する。本発明は、これらの各種手法を使って、線維症又は光線弾力線維症等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御できる活性成分を同定することを目的とする。
【００７１】
一般に、本発明の方法は、タンパク質ＬＯＸ及びエラスチンの発現、特にＬＯＸをコードするメッセンジャーＲＮＡ及びエラスチンをコードするそれの発現の探索を行う（実施例９参照）。
【００７２】
本発明はまた、ＬＯＸの発現を誘導しタンパク質エラスチンの発現を阻害して、線維症又は光線弾力線維症等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を制御する活性成分にも関する（実施例９〜１１参照）。本発明はまた、化粧又は医薬組成物を調製するためのこれら活性成分の使用にも関する（実施例１２〜１８参照）。
【００７３】
ＬＯＸ及びエラスチンの発現の変動は、遺伝子、メッセンジャーＲＮＡ又はそのタンパク質で直接観測できる。これらの変動は、線維症又は光線弾力線維症等の、病的、無秩序及び／又は非機能的な弾性繊維形成の場合の弾性繊維形成を、特に酵素ＬＯＸによるコラーゲン架橋によって、制御することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、当業者が、以下の実施例を参照した説明を読めば明らかだろう。
【００７５】
実施例は本発明に不可欠な部分を構成するものであり、従来の技術状況に対して、実施例を含めた記載全体から新規と思われる全ての特徴は、その作用及びその一般性において本発明に不可欠な部分を構成するものである。
すなわち各実施例は一般的な範囲にわたる。
【００７６】
また、実施例では、すべての百分率は特に表示のない限り重量基準で表示し、温度は特に表示のない限り摂氏で表し、圧力は特に表示のない限り大気圧である。
【実施例１】
【００７７】
「ＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形の特異的抗体の製造」
本発明はまずＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形の特異的抗体を新規に作った。この抗体は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟領域に対して作った。抗原領域は、他のリシルオキシダーゼ（ＬＯ）アイソフォーム上の対応する領域との類似性が最低限になるように選択した。ペプチドＬＯＸＶ２２８−Ｓ２８０の領域に対して得られた抗体を抗ＬＯＸｍａｔ抗体、同様にペプチドＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８の領域に対して得られた抗体を抗ＬＯＸＬｐｒｏ抗体と称した。
【００７８】
図１：特異的抗体を作るために決定したＬＯの配列の解説：この図は、抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を作るために抗原領域を選択する段階を表わす。
図１（Ａ）：ｈＬＯＸ（ヒトＬＯＸタンパク質）及びｈＬＯＸＬ（ヒトＬＯＸＬタンパク質）の概略図。
【００７９】
ｈＬＯＸ及びｈＬＯＸＬの配列を中抜きの長方形で示し、Ｃ末端領域は点を付して類似性の高い領域を強調している。前領域の切断部位、及び、プロコラーゲンＣプロテイナーゼ（ＰＣＰ）による切断部位の位置を、ｈＬＯＸのＡ２２及びＤ１６９残基上にそれぞれ示す。ＬＯＸＬについては、５６ｋＤａの前駆体のＮ末端成熟部位における前領域の切断部位（Ｑ２６残基の前）、及び、５６ｋＤａのＬＯＸＬ前駆体のＰＣＰによる切断部位の位置を、Ｄ１３５残基の前及びＤ３３８残基の前にそれぞれ示す。対応するＬＯＸＬタンパク質Ｑ２６−Ｓ５７４、Ｄ１３５−Ｓ５７４及びＤ３３８−Ｓ５７４の分子量はそれぞれ約６３ｋＤａ、５４．６ｋＤａ及び２６．７ｋＤａと推定される。抗ＬＯＸ抗体を作るために用いた組み換えペプチドの位置を、抗ＬＯＸｐｒｏ抗体についてはペプチドＧ１２８−Ｌ２１２、抗ＬＯＸｍａｔ抗体についてはペプチドＶ２２８−Ｓ２８０、抗ＬＯＸｃａｔ抗体についてはペプチドＤ３０５−Ｎ３７３のように示す。抗ＬＯＸＬ抗体を作るために用いた組み換えペプチドの位置を、抗ＬＯＸＬｐｒｏ抗体についてはペプチドＲ２３１−Ｇ３６８、抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体についてはペプチドＳ３５５−Ｄ４１５のように示す。
【００８０】
図１（Ｂ）：この表は、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの抗原領域と、ＬＯアイソフォーム上の相当する領域との類似率を示す。
図１（Ｂ）の表中で、ｈＬＯＸＬはヒトＬＯＸＬタンパク質、ｂＬＯＸＬはウシＬＯＸＬタンパク質、ｍＬＯＸＬはマウスＬＯＸＬタンパク質、ｈＬＯＸはヒトＬＯＸタンパク質、ｂＬＯＸはウシＬＯＸタンパク質、ｈＬＯＸＬ２はヒトＬＯＸＬ２タンパク質、ｈＬＯＸＬ３はヒトＬＯＸＬ３タンパク質、ｈＬＯＸＬ４はヒトＬＯＸＬ４タンパク質を表わす。
長さ（ａａ）の欄には、対応する領域に含まれるアミノ酸の数を記載する。
【００８１】
抗体を作るため、決定されているｈＬＯＸＬ又はｈＬＯＸの配列をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の遺伝子と共に発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャムバイオサイエンス社）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入して、キメラ遺伝子を構築した。
【００８２】
センスプライマー５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＴＡＧＧＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ−３’（配列番号１６）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１７）を用いたＰＣＲによって作成したＨＬＯＸＬ（ｈＬＯＸＬ  ｃＤＮＡ）のｃＤＮＡ配列を導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬＳ３５５−Ｄ４１５を構築した。センスプライマー５’−ＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１８）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＧＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣ−３’（配列番号１９）をそれぞれ用いて増幅したｈＬＯＸｃＤＮＡを導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＧ１２８−Ｌ２１２を構築した。センスプライマー５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号２０）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧ−３’（配列番号２１）をそれぞれ用いて増幅したｈＬＯＸ配列を導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９を構築した。センスプライマー５’−ＣＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣ−３’（配列番号２２）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＡＴＣＧＴＴＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２３）をそれぞれ用いて増幅したｈＬＯＸｃＤＮＡを導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＤ３０６−Ｎ３７３を構築した。これらのＰＣＲによる増幅にはすべて、ＴａｑポリメラーゼＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイマン（Ｍｅｙｍａｎ）、フランス）を使用した。
【００８３】
融合タンパク質ＧＳＴ−ＬＯＸ及びＧＳＴ−ＬＯＸＬ、並びに、ウサギポリクローナル抗体を得て、上述の方法で融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬＳ３５５−Ｄ４１５及びＧＳＴ−ＬＯＸＧ１２８−Ｌ２１２の発現に由来する融合タンパク質を精製した（Ｂｏｒｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８９４４−４９、２００１年；Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７８：１４３−１５１、１９９８年）。吸着実験を、免疫検出に先立ってＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（アマシャムバイオサイエンス社）のようなニトロセルロース膜上に吸着させておいた融合タンパク質と共に、抗体を２０℃で３時間インキュベートして行った。
【００８４】
上記の実験を行って、まず最初に、成熟タンパク質の免疫化学上及び生化学上の特性に基づいて、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形を明らかにすることができた（実施例２（図２）参照）。得られた抗体は、従来ＬＯＸＬに対して用いられていた、ＬＯＸＬの成熟形を認識できない抗体とは区別される（Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、７８：１４３−１５１、１９９８年）。本発明では抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体及び抗ＬＯＸｍａｔ抗体を用いたが、これらにより、抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体には認識されるが、抗ＬＯＸｍａｔ抗体には認識されない、ＬＯＸＬの成熟形に相当する３１ｋＤａのタンパク質を明らかにすることができた。これより、先行技術、特に、ＬＯファミリーの遺伝子に由来する全てのタンパク質を記載しながらそれらの特徴については定義していないＣｓｉｓｚａｒらの特許に対して、本発明が事実上進展していることが分かる（ＷＯ０１／８３７０２Ａ２：アミンオキシダーゼファミリーのうちリシルオキシダーゼファミリーに属する新規酵素に関連する出願）。
【実施例２】
【００８５】
「新規抗体、抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体による、筋細胞のＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出」
図２は、下記に示す方法で行った電気泳動の写真である。この電気泳動は、実施例１で明らかにした抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を用いることによって、平滑筋細胞（ＳＭＣ）のＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟タンパク質の特性を明らかにしている。
【００８６】
ラット平滑筋細胞系（Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｌａｍａｚｉｅｒｅ（ボルドー）により開発）の細胞株（Ｌ）及び細胞培地（Ｍ）からタンパク質を抽出し、抗ＬＯＸＬｍａｔ抗体、抗ＬＯＸｍａｔ抗体、抗ＬＯＸＬｐｒｏ抗体及び抗ＬＯＸｐｒｏ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。細胞は、３７℃において５％ＣＯ２雰囲気下、１０％ウシ胎児血清、グルタミン２ｍＭ及びゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ）中で培養した。
【００８７】
細胞株タンパク質を、ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、２時間かけて４℃においてゆっくりと撹拌しながら、溶解バッファー（１６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）、０．５％ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートミニ、ロシュ・ダイアグノスティックス社）、及び、尿素６Ｍ）中で抽出した。溶解物を、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートミニ、ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイラン（Ｍｅｙｌａｎ）、フランス）を含む１６ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）の２倍量で希釈し、１５０００ｇで２０分間遠心分離した。可溶性タンパク質を１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて沈殿させ、電気泳動を行った。血清を添加せずに４８時間培養した細胞の培地から培養物のタンパク質を、１０％ＴＣＡ又は５０％飽和硫酸アンモニウムを加えて回収し、沈殿させた。
【００８８】
免疫検出を行うために、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離した。このタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（イモビロンＰＳＱ、ミリポア社）上に転写し、上述のように免疫検出した（Ｂｏｒｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６：４８９４４−４９，２００１年）。
【００８９】
このように、上記で作った抗体を用いることによって、生体組織中におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの成熟形及び未成熟形を特徴付けて確認することができる。
【実施例３】
【００９０】
「弾性繊維の形成におけるＬＯＸの作用の実証」
本発明者らは、ＬＯＸ及びＬＯＸＬタンパク質が再生皮膚モデルにおける真皮中の結合組織の形成に関与している可能性があることを、免疫組織化学的手法によって明らかにした（図３）。このことは、２種の酵素（ＬＯＸ及びＬＯＸＬ）の酵素前駆体領域及び成熟領域に対する抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を用いることによって明瞭となった。
【００９１】
図３：再生皮膚（ＲＳ）及び正常な人間の皮膚中におけるＬＯＸＬ及びＬＯＸの免疫組織学的検出の結果を示すものである。
−１６日後（Ａ）、３５日後（Ｃ）及び４５日後（Ｅ）の再生皮膚のＬＯＸＬ（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）の免疫検出を、抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ）、又は、免疫検出する前に対応するペプチドＧＳＴ−ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８と吸着させた抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体（Ｇ）を用いて行ったものを示す。
−１６日後（Ｂ）、３５日後（Ｄ）及び４５日後（Ｆ）の再生皮膚のＬＯＸ（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）の免疫検出を、抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ）、又は、免疫検出する前に対応するペプチドＧＳＴ−ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９と吸着させた抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体（Ｈ）を用いて行ったものを示す。
−抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体（Ｉ）及び抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体（Ｊ）を用いた、人間の包皮皮膚中のＬＯＸＬ（Ｉ）及びＬＯＸ（Ｊ）の免疫検出。真皮と表皮の境界部を白抜きの矢印で、真皮の基質を矢印で、１６日後の角質細胞の位置を矢印の先端で示す。
【００９２】
再生皮膚（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）を、ブアン固定液（ＬＯＸ、ＬＯＸＬ、エラスチン）、又は、１０％ホルマリン溶液（エラスチン用）中で調製し、その後パラフィンで包埋した。厚さ６μｍの断面からパラフィンを除去し、グリシンの塩酸溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）中で漂白した。抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体は上記のものである。
【００９３】
抗体は次のように希釈して使用した：５００倍（抗ＬＯＸＬＲ２３１−Ｇ３６８抗体）、１００倍（抗ＬＯＸＶ２２８−Ｓ２７９抗体、抗ＬＯＸＬＳ３５５−Ｄ４１６抗体）。免疫複合体を、ペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧウサギ（ヤギ）抗体（ダコ社、トラップ、フランス）により、基質としてジアミノベンジジン（ダコ社）を用いて検出した。
【００９４】
上記より、ＬＯＸ及びＬＯＸＬは、再生皮膚モデル（特にＭｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）等）における弾性繊維の形成に関与している可能性がある。
【実施例４】
【００９５】
「弾性繊維の形成におけるＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４の作用の実証」
本発明はまた、新規の抗ＬＯＸＬ２抗体２種も作ったが、これらのうち１種は、理論上はＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４も認識する。これを用いることによって、これらの酵素が、再生皮膚モデルにおける真皮中でエラスチンと共に発現するかどうかを明らかにすることができた。上記２種の抗ＬＯＸＬ２抗体を用いて免疫組織化学的に調べたところ、これらの抗原、並びに、抗原性の関連する２種のタンパク質ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４が真皮中に全くあるいはほとんど発現せず、従って弾性繊維の形成に関与していないことが実際に分かった。
【００９６】
図４：再生皮膚（１６、３５及び４５日後）及び人間の包皮皮膚の断面における、抗ＬＯＸＬ２５１７−５８１抗体（左欄）、及び、理論的にＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を認識する抗ＬＯＸＬ２６６４−７２０抗体（右欄）を用いて行った免疫検出の結果を示す。抗ＬＯＸＬ２抗体を、融合ペプチドＧＳＴ−ＬＯＸＬ２に対して上述のようにして得た（Ｄｅｃｉｔｒｅら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７８、１４３−１５１、１９９８年）。融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬ２５１７−５８１を、ヒトＬＯＸＬ２遺伝子（ｈＬＯＸＬ２）配列の１５４３〜１７４７をプラスミドに導入して、上述のように構築した。
【００９７】
この断片は、ＰＣＲにより、センスプライマー５−ＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＡＣＴＧＣＣ−３’（配列番号３２）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号３３）を用いて作成した。
【００９８】
センスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号３４）、及び、アンチセンスプライマー５’−ＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号３５）を用いて、対応するｈＬＯＸＬ２配列を導入することにより、融合遺伝子ＧＳＴ−ＬＯＸＬ２６６４−７２０を構築した。
【００９９】
上記タンパク質に対して作成した融合タンパク質及び抗ウサギ抗体を、上述のようにして作った。５１７−５８０ペプチドに対する抗体を、この領域がＬＯＸＬ２に特有の領域であることから抗ＬＯＸＬ２抗体と称した。
【０１００】
６６４−７３４ペプチドに対する抗体を、ＬＯＸＬ２のこの領域がＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４と高い類似性を持つことから（それぞれ、約７４．６％及び６０．５％）、抗ＬＯＸＬ−Ｒ（「関連する」の意）抗体と称した。
【０１０１】
１６日後（ＲＳ−Ｄ１６）、３５日後（ＲＳ−Ｄ３５）及び４５日後（ＲＳ−Ｄ４５）の再生皮膚（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）、及び、人間の包皮皮膚について、上述のように免疫組織化学的手法により、抗ＬＯＸＬ２−Ｒ抗体及び抗ＬＯＸＬ２抗体を用いて調べた。抗ＬＯＸＬ２抗体により、ＬＯＸＬ２が表皮中に発現していて真皮中には発現していないことが分かった。一方、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４に共通するＣ末端領域に対する抗体により、これらの酵素が表皮中に発現していることが確認でき、またこれらの酵素が、真皮中に少し発現しているが、弾性繊維を形成する部位に相当する部分には発現していないことが分かった。
【０１０２】
ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４は、弾性繊維の形成には関与していない。
【実施例５】
【０１０３】
「弾性繊維の形成におけるＬＯＸの作用の実証」
ＬＯＸＬ及びＬＯＸと、弾性繊維又はミクロフィブリルとの結合が、透過型電子顕微鏡を用いて本発明により明らかに示された。
【０１０４】
ミクロフィブリルに結合したＬＯＸＬ及びＬＯＸは、エラスチンが沈着する足場を構成するが、ＬＯＸのみが膠原繊維の形成と関連している（図５参照）。
【０１０５】
図５：４５日後の再生皮膚、及び、正常な人間の皮膚の真皮部分において透過型電子顕微鏡検査を用いて行ったＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンの免疫検出の結果を示す。
【０１０６】
組織を４℃において３時間、ＰＢＳバッファー（０．１％グルタルアルデヒド含有）に溶解した４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、リン酸バッファー（０．４Ｍスクロース−カコジル酸、及び、０．２Ｍリシン含有）中で洗浄した後、エタノール溶液中で脱水し、ＬＲホワイト（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ社、フランス）で包埋した。検出は、トリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．２）で５０倍に希釈した一次抗体に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたものを用いて行った。４０倍に希釈した金コロイド粒子（１０〜２０ｎｍ）標識抗ＩｇＧウサギ抗体（Ｂｉｏｃｅｌｌ社、トゥブュ（Ｔｅｂｕ）、フランス）を用いて、免疫複合体を検出した。試料を３％酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色して、日本電子製１２００ＥＸ透過型電子顕微鏡で調べた。この免疫検出は再生皮膚（Ａ〜Ｄ）及び人間の包皮皮膚（Ｆ〜Ｉ）について行った。
【０１０７】
再生皮膚においては以下の抗体を用いて行った：抗ＬＯＸＬ抗体（Ａ、Ｂ）、抗ＬＯＸ抗体（Ｃ）、抗エラスチン抗体（Ｅｌｍ）（Ｄ）、及び、ネガティブコントロールとして、真皮中の一次抗体を含まないもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｅ）。人間の包皮皮膚においては二重標識を行った（Ｆ〜Ｉ）。
【０１０８】
「Ａ〜Ｄ」：ＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンの、４５日後の再生皮膚の真皮部分における電子顕微鏡を用いた免疫検出。
「Ｅ」：４５日後、すなわち角質細胞を添加して３０日後の再生皮膚の真皮中における、抗エラスチン抗体及び抗コラーゲンＩ抗体を用いたポジティブコントロール。
「Ｆ〜Ｉ」：ＬＯＸＬ、ＬＯＸ、エラスチン及びコラーゲンの、人間の包皮の真皮部分における電子顕微鏡を用いた二重免疫検出。
「Ｇ〜Ｈ」：抗ＬＯＸＬウサギ抗体（抗ＩｇＧウサギ抗体は１０ｎｍの金粒子で標識）、及び、抗エラスチンマウス抗体（抗ＩｇＧマウス抗体は２０ｎｍの金粒子で標識）を用いた、人間の包皮の真皮部分における二重標識。
図中の記号：ｍ；ミクロフィブリル、ｃ；膠原繊維、ｅ；無定形のエラスチン。縮尺の棒：５００ｎｍ。
【０１０９】
ＬＯＸＬ（Ａ、Ｂ）は、高密度の沈着物と結合して、又は、ミクロフィブリル上に検出されたが、上記断面上に白色で現れている膠原繊維と結合しては検出されなかった。ＬＯＸ（Ｃ）の標識については、金粒子が高密度の沈着物、ミクロフィブリル及びコラーゲンと結合してわずかに観察されたが、標識は薄かった。抗エラスチン抗体によって同様に、高密度の沈着物及びミクロフィブリルが検出された（Ｄ）。再生皮膚モデルにおける観察と同様に、ＬＯＸＬは膠原繊維とは結合しておらず、ＬＯＸ（膠原繊維と共に多く存在し、ミクロフィブリル上にはほとんど存在しない）とは正反対である。抗原ＬＯＸＬは、ミクロフィブリルと結合していて、人間の包皮皮膚の弾性繊維周辺で検出された。
ＬＯＸの標識は弾性繊維では観察されなかったが、膠原繊維及び皮膚のミクロフィブリルと結合していた（Ｉ）。
【実施例６】
【０１１０】
「ＬＯＸの発現と弾性繊維形成との関係の実証」
ＬＯＸＬ及びＬＯＸは、まだ高いエラスチン合成力を持つ幼い患者（数か月児）から採取した包皮皮膚の真皮中に発現している。ＬＯＸＬは首、胸、腹又は顔の皮膚の真皮中には発現していないのに対して、ＬＯＸは真皮において常に発現している（図６）。
【０１１１】
図６：人間の皮膚中における各種位置でのＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出の結果を示す。
抗ＬＯＸ抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）及び抗ＬＯＸＬ抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を用いて、エドアール・エリオ病院（リヨン、フランス）の組織バンク提供の包皮（Ａ、Ｂ）、首（Ｃ、Ｄ）、胸（Ｅ、Ｆ）及び腹（Ｇ、Ｈ）の皮膚の試料中におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述した免疫検出と同様にして免疫検出を行った。
【０１１２】
図７：年齢の異なる人間から採取した腹部の皮膚におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出の結果を示す。
抗ＬＯＸ抗体（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）及び抗ＬＯＸＬ抗体（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）を用いて、エドアール・エリオ病院の組織バンク提供の１．５歳（Ａ、Ｂ）、３５歳（Ｃ、Ｄ）、６０歳（Ｅ、Ｆ）及び９１歳（Ｇ、Ｈ）の人から採取した腹の皮膚の試料中におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述のように免疫検出を行った。
【０１１３】
この実験において、人間の皮膚表皮中にＬＯＸ及びＬＯＸＬが多く発現していること、これら２種の酵素の発現は非常に長く続くことが観察された（９１歳）（図７）。
【０１１４】
図８：ＬＯＸ及びＬＯＸＬの、治療後の経過期間の異なる瘢痕組織の皮膚中における免疫検出の結果を示す。
抗ＬＯＸ抗体（Ａ、Ｄ、Ｇ）、抗エラスチン抗体（Ｂ、Ｅ、Ｈ）及び抗ＬＯＸＬ抗体（Ｃ、Ｆ、Ｉ）を用いて、１７歳患者の首皮膚の瘢痕周辺（「正常な」部分、Ａ〜Ｃ）、治療から３か月経過後（Ｄ〜Ｆ）及び５年経過後（Ｇ、Ｈ）の試料におけるＬＯＸ、エラスチン及びＬＯＸＬの発現を検出した。これらの組織はブアン試薬で固定し、パラフィンで包埋して、上述のように免疫検出を行った。
【０１１５】
瘢痕においては、瘢痕の形成３カ月後、及び、瘢痕の形成５年後で、ＬＯＸＬもＬＯＸも瘢痕組織領域では観察することができなかった。これらの瘢痕において、エラスチンが３カ月の時点で免疫検出され、５年の時点で消失していたことに注目されたい（図８）。
【０１１６】
本発明のこの実施例によって、瘢痕において、（ｉ）組織の形成にＬＯＸが間違いなく関与している（しかし様々な年齢の再構成では関与していない）が、（ｉｉ）ＬＯＸの発現が紛れもなく欠損していることが証明される。この実施例は、ＬＯＸが弾性繊維の形成部位に存在するが、機能性弾性繊維の形成能力を失った再構築瘢痕組織領域では欠損していることを証明する。
【実施例７】
【０１１７】
「再生皮膚モデルにおける角質細胞の導入によるＬＯＸの活性化の実証」
ＬＯＸをコードする遺伝子の発現を、ＬＯＸのメッセンジャーＲＮＡとジゴキシゲニン標識二本鎖ＤＮＡプローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションをパラフィンで包埋した断面において行うことによって検出した。
３５日後の皮膚モデル断面（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ））を示す図９において、
（Ａ）ＬＯＸＬの発現は、真皮深層及び表皮全体に渉って陽性である。
（Ｂ）ＬＯＸの発現は、真皮全体で観察される。表皮では、基底層の細胞はＬＯＸを発現しないが、棘状及び顆粒層の細胞は強力に発現する。
（Ｃ）トロポエラスチン（ＴＥ）の発現は、真皮の繊維芽細胞及び表皮において見られる。
（Ｄ）遺伝子ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲンＩα１）の発現は、真皮で検出され、表皮では検出されていない。
（Ｅ）プローブのないコントロール。
ＤＥＪを白抜きの矢印で、多孔性の真皮基質を矢印で、陽性細胞を矢印の先端で示す。
【０１１８】
二本鎖ＤＮＡプローブはＰＣＲによって作成した。以下のプライマーをそれぞれ使用した。
Ｉα１コラーゲンの遺伝子にはセンス５’−ＧＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＴＧＧＡＴＴＧ−３’（配列番号１４）及びアンチセンス５’−ＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号１５）を、トロポエラスチンにはセンス５’−ＧＴＡＴＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１０）及びアンチセンス５’−ＣＧＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１１）を、ｈＬＯＸにはセンス５’−ＧＧＴＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号１２）及びアンチセンス５’−ＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＴＣＴＧＧＴＡＧＣＣＡＴＡＧＴＣ−３’（配列番号１３）を、ｈＬＯＸＬにはセンス５’−ＧＡＣＡＴＡＡＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号８）及びアンチセンス５’−ＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号９）を用いた。
【０１１９】
Ｔａｑポリメラーゼ（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）、及び、標識ヌクレオチドとしてＤｉｇ−１１−ｄＵＴＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社、メイラン（Ｍｅｙｌａｎ）、フランス）を用いてＤＮＡを増幅した。次にアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ抽出キット（キアゲン社、クルタブーフ（Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ）、フランス）を用いてＤＮＡを精製した。その後、パラフィンで包埋した断面においてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。試料からパラフィンを除去し、２μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ロシュ社）で１５分間２０℃において処理した。内因性のペルオキシダーゼを、ＴＳＡ＋増幅キット（ＮＥＮ社、ボストン、アメリカ）の指示通りに阻害した。プレハイブリダイゼーションを、３７℃において２時間、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）（５０％脱イオン化ホルムアミド、２ＸＳＳＣ（クエン酸ナトリウム）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、２．５Ｘデンハート溶液、２００μｇ／ｍｌ変性ニシンＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌサケ精液ＤＮＡ、及び、ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む）中で行った。ハイブリダイゼーションを、３７℃において１６時間、２０ｍＭリン酸バッファー（５０％脱イオン化ホルムアミド、２ＸＳＳＣ、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、２．５Ｘデンハート溶液、２００μｇ／ｍｌ変性ニシン精液ＤＮＡ、１０％硫酸デキストランを含む）中で行った。上記変性プローブは、沸騰湯浴中で５分間処理したものと処理しないものを用いた。ハイブリダイゼーション後、２０℃（コラーゲンについては３７℃）において、２ＸＳＳＣ／５０％ホルムアミド、１ＸＳＳＣ／５０％ホルムアミド、１ＸＳＳＣ、及び、０．５ＸＳＳＣ中で断面を洗浄した。乾燥させた後、ジゴキシゲニン標識ハイブリッドを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ロシュ社）を用いて検出した。そしてこの複合体をＴＳＡ＋増幅キット（ＮＥＮ社）を用いて最終的に検出した。陽性シグナルは、アルカリホスファターゼの活性に相当する。この活性は、ＴＳＡキットの増幅手順に基づいて室温において２時間経過後の活性とし、テトラゾリウム塩（ニトロブルーテトラゾリウム／ブロモクロロインドリルリン酸（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を基質として使用）の沈殿によって分かる。
【０１２０】
本発明において、ｍＲＮＡの発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって追跡した結果、ＬＯＸＬ遺伝子とＬＯＸ遺伝子が、再生皮膚モデル（Ｍｉｍｅｓｋｉｎ（Ｒ）、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、リヨン、フランス）中に角質細胞を添加することによって活性化される可能性があることが分かる。（図９）。
【０１２１】
またＬＯＸ遺伝子も、角質細胞を添加した後、コラーゲンＩα１遺伝子（Ｃｏｌ１α１）と同時に活性化されている。
【実施例８】
【０１２２】
「老齢成人の繊維芽細胞中におけるＬＯＸ遺伝子の発現量低下の実証」
本発明者らは、包皮由来の繊維芽細胞（ＦＦ）（幼児由来）５株、及び、腹部の形成外科手術の際に採取した成人の繊維芽細胞（ＡＦ）６株（このうち３人の平均年齢は２０歳で、残りの３人の平均年齢は６０歳である）を用いた。目的の上記３種の遺伝子及びアクチンの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、図１０）によって調べた。この方法によれば、（一定とされる）アクチンの発現と比較して遺伝子の発現を正確に定量できる。従って、この遺伝子の量の制御を定量できる。
【０１２３】
図１０：図１０は、加齢によるエラスチン、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの遺伝子発現量の変化を表す。これらの結果は、包皮及び成人の繊維芽細胞でＬＯＸ、ＬＯＸＬ及びエラスチンの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析することにより得た。この結果は、ＦＦ５株及びＡＦ６株での各遺伝子の平均発現量を表す。調べた遺伝子は、ｈＬＯＸＬ、ｈＬＯＸ及びヒトエラスチン遺伝子である。ＲＴ−ＰＣＲの数値をアクチンの増幅と比較する。エラスチンの遺伝子の発現が加齢により阻害されないように見える場合、ＬＯＸ遺伝子のそれは２０才と比較して４０％減少することに注目すべきである。このデータはエラスチンに関する文献と一致する：弾性組織が劣化し置き替わらない場合、それはエラスチン遺伝子の活性の阻害によるものではないと思われる。
【０１２４】
全ＲＮＡを「ＳＶ９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」キット（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）を用いて精製した。精製したＲＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（プロメガ社、シャルボニエール、フランス）１００μｌに溶解して測定後、プレートに分注した（９６ウェル、各１０μｌ（ＰＣＲによる全ＲＮＡ：５ｎｇ／μｌ））。この実験に用いたプライマーは下記表Ｉの通りである。
【０１２５】
【表１】
2005350436.tif 000002
【０１２６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ｍＲＮＡを含むウェルに対し「Ｑｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ」キット（キアゲン社、フランス）を用いて、増幅サイクルを行うＯＰＴＩＣＯＮ社製サーマルサイクラー内で行った。５０℃において３０分間逆転写（ＲＴ）反応を行った後、９５℃において１５分間保つことによって、逆転写酵素を阻害し、ポリメラーゼを活性化して、得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を変性させた。その後、連鎖重合（ＰＣＲ）を５０サイクル行った（９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）。１サイクル終了毎に、増幅断片数に比例する蛍光量を読み取った。発現量は、アクチンに対する各遺伝子の発現量の比率で示した。
【０１２７】
上記実施例は、ＬＯＸＬ遺伝子及びＬＯＸ遺伝子による生成物の合成が、遺伝子レベルで活性化される可能性があることを示すものである。ＬＯＸをコードする遺伝子の活性化は架橋膠原繊維の形成を可能にする。活性成分をスクリーニングすることによって、架橋コラーゲンの合成を誘導し、これと同時にエラスチンの無定形沈殿物の形成を回避するために、及び、病的組織で標準組織の発現を再誘導する目的で、ＬＯＸの発現増加及びエラスチンの発現減少を同時に又は非同時に誘導できる化合物を同定することが可能になる。
【実施例９】
【０１２８】
「ＬＯＸ及び／又はエラスチンのメッセンジャーＲＮＡの発現の（例えば、活性を試験する活性成分と接触させて、又は、接触させずに行う定性ＲＴ−ＰＣＲによる）分析」
活性成分を、１％（ｖ／ｖ）の濃度で、正常な人間の皮膚（健康な「老齢」成人由来）の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、２４ウェル培養プレート中に単層で、既知組成無血清培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、ドイツ）中で行った。細胞を、例えば１ｃｍ２当たり４０，０００個播種した。コンフルエントになった時点で、細胞を活性成分と有利には２４時間接触させた。有利には、並行して、無処理コントロール１種（培地のみ）及びポジティブコントロール３種（１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１α、及び、２％（ｖ／ｖ）のＰｈｙｔｏｋｉｎｅ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、フランス））についても、例えば同一の培養プレート中で試験した。
【０１２９】
あらかじめ１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、及び、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１αについて試験し、エラスチンｍＲＮＡ合成の刺激がこの濃度の２種のサイトカインに誘導されることを、ｍＲＮＡ解析、例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＴＧＦ−βについて１０回、ＩＬ−１αについて６回）によって確認した。活性成分を細胞と接触させた後（例えばその２４時間後）に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で洗浄して−８０℃において凍結乾燥して保存した。全ＲＮＡを（例えばシリカカラムを有する９６ウェル抽出キットを用いて）抽出し、９６ウェル分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した（純度の指標：２８０ｎｍにおけるタンパク質の測定）。ＲＮＡを、例えば５ｎｇ／μｌに希釈する。ワンステップ定性ＲＴ−ＰＣＲを、アクチン遺伝子、エラスチン遺伝子及びＬＯＸ遺伝子について、例えば初期ＲＮＡ５０ｎｇを用いて９６ウェルプレート中で行った。各遺伝子の特異的プライマーは、例えば０．５μＭで用いた。
【０１３０】
−センスエラスチン遺伝子：１Ｅｌａ  ５’−ＧＴＡ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＴＧ−３’（配列番号２６）；
−アンチセンスエラスチン遺伝子：２Ｅｌａ  ５’−ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＡＧ−３’（配列番号２７）；
−センスＬＯＸ遺伝子：Ｏｘ６４  ５’−ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＣ−３’（配列番号２４）；
−アンチセンスＬＯＸ遺伝子：Ｏｘ６５  ５’−ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号２５）；
−センスアクチン遺伝子：アクチン  Ｕ  ５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３（配列番号３０）；
−アンチセンスアクチン遺伝子：Ｄ  ５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号３１）
【０１３１】
有利には、増幅パラメーターは下記の通りであった。４８℃、３０分間：９４℃、２分間：（９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；６８℃、３０秒間）をアクチンについて２８サイクル、ＬＯＸについて３２サイクル、及び、エラスチンについて３４サイクル：６８℃、１０分間：１４℃、無限。増幅後、産物を、例えば（アクチン増幅産物３μｌ＋エラスチン遺伝子増幅産物５μｌ＋ＬＯＸ遺伝子増幅産物５μｌ）の割合で混合した。ローディングバッファー（２μｌ）を加え、全量（２０μｌ）を、あらかじめ充填しておいたアガロースゲル（例えば２％）に載せた。本発明者らは、当業者に公知の方法で発現量を可視化した（例えば、泳動後の試料のバンドを暗室において紫外線下で視覚化し（１５分間）、デジタル撮影した）。ゲルの写真を画像解析し、バンドの濃さを定量した（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ１Ｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ、Ｎｏｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、米国）。エラスチン遺伝子及びＬＯＸ遺伝子の発現量を、ネガティブコントロール（無処理）における値に対する百分率で示した。
【０１３２】
＜結果の説明＞
老齢細胞が、若年細胞で測定されたものとほぼ同等量の、エラスチンをコードするｍＲＮＡを発現する一方、ＬＯＸをコードするｍＲＮＡの場合にはきわめて強く減少（−４０％）することが分かる。従って、この老齢細胞におけるＬＯＸの発現の減少を逆に上昇させることが可能であるため、活性成分をスクリーニングした。
【０１３３】
『活性成分のスクリーニング』
各試験におけるｃＤＮＡ量をアクチンのｃＤＮＡ量と比較し、続いてネガティブコントロール（活性成分を含まない）と比較した。予備実験から、ＬＯＸｍＲＮＡを約２倍増加させ、エラスチン（Ｅｌｎ）ｍＲＮＡを約０．５倍増加させるものが重要であると考えられる。試験した９００種以上の分子又は活性抽出物のうち、８種の活性成分が試験した濃度において、かつ、規定した条件下でこの基準を満たしていた。これらの活性成分は、下記表ＩＩの通りである。
【０１３４】
【表２】
2005350436.tif 000003
【０１３５】
植物を２〜５％（ｗ／ｗ）の割合で、濃度１００／０〜０／１００の水／（アルコール、グリコール又はポリオール）混合物（エタノール、グリセリン、ブチレングリコール等のグリコール類、キシリトール等）に浸漬して植物抽出物を得た。得られた抽出物をろ過又は蒸留して可溶性画分を回収し、さらに無菌状態でろ過した。化学物質はシグマ社（セントルイス、アメリカ）提供のもので、アルコール又はグリコールで濃度１％に希釈又は分散させて用いた。
【０１３６】
＜結論＞
活性成分９６０種のうち８種が、試験条件下で、「老齢」成人の腹部の繊維芽細胞において、ＬＯＸをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成量を著しく活性化し、エラスチンを減少させることができた。
【実施例１０】
【０１３７】
「化粧品用又は皮膚医薬用活性成分の有効性に関する（例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる）研究」
スクリーニングの第一段階で選択した活性成分を、０．００１％〜５％（ｖ／ｖ）の範囲で濃度を変えて、正常な人間（成人）の皮膚の繊維芽細胞に対して試験した。培養は、例えば、２４ウェルプレート中に単層で、既知組成無血清培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、ドイツ）中で行った。細胞を、例えば１ｃｍ２当たり４０，０００個播種した。活性成分を細胞と接触させた後（２４時間後）に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で洗浄して−８０℃において凍結乾燥して保存した。試験後、エラスチン、ＬＯＸ及びアクチンのｍＲＮＡ量をｍＲＮＡ解析、例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。この評価を行うために、これら遺伝子に特有の断片を増幅できるプライマー対として上記のものを用いた（実施例９）。
【０１３８】
ＲＮＡは、（例えばシリカカラムを有する９６ウェル抽出キットを用いて）抽出して９６ウェル分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した後、希釈した（例えば５ｎｇ／μｌ）。ＲＴ−ＰＣＲ反応（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を、「Ｏｐｔｉｃｏｎ」システム（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）を用いた定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって行った。有利には、ウェルに添加した反応混合液（５０μｌ）は、各試料について下記の通りであった：
−濃度５ｎｇ／μｌのＲＮＡ  １０μｌ、
−様々に標識した所望の特異的プライマー、
−反応混合液（キアゲン社、２Ｘ「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ」（ＭｇＣｌ２５ｍＭ含有）２５μｌ＋「ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＲＴｍｉｘ」０．５μｌ）、標識ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを伸長過程においてＤＮＡ２本鎖に挿入した。
【０１３９】
「有利には、ＲＴ−ＰＣＲは下記の条件で行った」
逆転写：５０℃で３０分間、その後、９５℃で１５分間。
ＰＣＲ反応：（９４℃、１５秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、３０秒間）を５０サイクル。
コンタミネーションがないことの確認、及び、増幅産物の純度の確認は、例えば、増幅ＰＣＲ産物の融解曲線によって行った。ダブルピーク又は異常な融解温度を示す産物は除去した。
【０１４０】
「分析及び計算方法」
増幅されたＤＮＡの中に組み込まれた蛍光の量を、ＰＣＲサイクルを行う間連続的に測定した。これにより、ＰＣＲサイクル数に対する蛍光量の曲線が得られ、増幅されたＤＮＡの相対量を調べることができた。
【０１４１】
細胞数を考慮するために、上記の結果を全て、ハウスキーピング遺伝子として用いた≪アクチン≫シグナルと比較した。実験から、Ｃ（Ｔ）の測定閾値（＝サイクル閾値）はＴ＝０．０５〜０．０１の間に固定され、任意の測定単位は、各遺伝子について以下の式により計算した。
Ｓｇｅｎｅ≪ｘ≫＝１０７Ｘ（１／２）Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ≪ｘ≫
Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ≪ｘ≫は、ｇｅｎｅ≪ｘ≫の蛍光閾値が０．０１〜０．０５となるために必要なサイクル数を表わす。
調べたい遺伝子についてのこの値を、以下の比率により≪アクチン≫シグナルと比較した。
Ｒ＝Ｓｇｅｎｅ≪ｘ≫／Ｓアクチン
この比率を、処理した試料と未処理の試料とで比較した。≪ｘ≫はＬＯＸ遺伝子又はエラスチン遺伝子である。
【０１４２】
＜結果＞
選択した活性成分のうち２種についての結果を例として表ＩＩＩに示す。
【０１４３】
【表３】
2005350436.tif 000004
【０１４４】
＜結論＞
カルダモンの抽出物はすべての濃度でＬＯＸを著しく誘導し、すべての濃度でエラスチン（Ｅｌｎ）を著しく阻害する。燕麦の抽出物は０．１％及び１％でＬＯＸを著しく誘導し、５％でエラスチン（Ｅｌｎ）を著しく阻害する。
【実施例１１】
【０１４５】
「ＬＯＸ及び／又はエラスチンのメッセンジャーＲＮＡの発現の（例えば、瘢痕組織領域由来の細胞において、活性を試験する活性成分と接触させて、又は、接触させずに行う定性ＲＴ−ＰＣＲによる）分析」
活性成分を、早期継代（５回未満の継代）の、ヒト瘢痕組織皮膚の繊維芽細胞（帝王切開後の肥大瘢痕の外科的摘出）において試験した。培養は、例えば、２４ウェル培養プレート中に単層で、既知組成無血清培地（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社、ドイツ）中で行った。細胞を、例えば１ｃｍ２当たり４０，０００個播種した。コンフルエントになった時点で、細胞を活性成分と有利には２４時間接触させた。有利には、並行して、無処理コントロール１種（培地のみ）及びポジティブコントロール３種（１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１α、及び、２％（ｖ／ｖ）のＰｈｙｔｏｋｉｎｅ（Ｒ）（Ｃｏｌｅｔｉｃａ社、フランス））についても、例えば同一の培養プレート中で試験した。あらかじめ１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β、及び、５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１αについて試験し、エラスチンｍＲＮＡ合成の刺激がこの濃度の２種のサイトカインに誘導されることを、ｍＲＮＡ解析、例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＴＧＦ−βについて１０回、ＩＬ−１αについて６回）によって確認した。活性成分を細胞と接触させた後（例えばその２４時間後）に培地を除去し、細胞を、例えばリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で洗浄して−８０℃において凍結乾燥して保存した。全ＲＮＡを（例えばシリカカラムを有する９６ウェル抽出キットを用いて）抽出し、９６ウェル分光光度計で２６０ｎｍにおいて測定した（純度の指標：２８０ｎｍにおけるタンパク質の測定）。ＲＮＡを、例えば５ｎｇ／μｌに希釈する。ワンステップ定性ＲＴ−ＰＣＲを、アクチン遺伝子、コラーゲンＩα１遺伝子及びＬＯＸ遺伝子について、例えば初期ＲＮＡ５０ｎｇを用いて９６ウェルプレート中で行った。各遺伝子の特異的プライマーは、例えば０．５μＭで用いた。
【０１４６】
ＣＯＬＬ１センス  ５’−ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＡＧＡ−３’（配列番号３６）ＣＯＬＬ１アンチセンス  ５’−ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  Ｃ−３’（配列番号３７）ＬＯＸセンス  ５’−ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＣ−３’（配列番号２４）ＬＯＸアンチセンス  ５’−ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号２５）アクチンセンス  ５’−ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号３０）アクチンアンチセンス  ５’−ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＣ−３’（配列番号３１）
【０１４７】
有利には、増幅パラメーターは下記の通りであった。５０℃、３０分間：９４℃、２分間：（９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；６８℃、３０秒間）をアクチンについて２８サイクル、ＣＯＬＬ１について２６サイクル、ＬＯＸについて３２サイクル：７２℃、１０分間：１４℃、無限。増幅後、産物を、例えば（アクチン増幅産物３μｌ＋コラーゲンＩ遺伝子増幅産物５μｌ＋ＬＯＸ遺伝子増幅産物５μｌ）の割合で混合した。ローディングバッファー（２μｌ）を加え、全量（２０μｌ）を、あらかじめ充填しておいたアガロースゲル（例えば２％）に載せた。本発明者らは、当業者に公知の方法で発現量を可視化した（例えば、泳動後の試料のバンドを暗室において紫外線下で視覚化し（１５分間）、デジタル撮影した）。ゲルの写真を画像解析し、バンドの濃さを定量した。コラーゲンＩ遺伝子及びＬＯＸ遺伝子の発現量を、ネガティブコントロール（無処理）における値に対する百分率で示し、ポジティブコントロールで得られた結果と比較した。
【０１４８】
選択した活性成分はＬＯＸｍＲＮＡを約２倍増加させ、ＣＯＬ１ｍＲＮＡの発現を標準的に又は減少させる。調べた９００を超える活性化合物又は抽出物のうち、燕麦の抽出物が特に決定的にこれらの基準を満たす。
【０１４９】
実施例１２〜１６について：当業者は、本明細書に記載した組成物（処方）を変化させた組成物を作る際に、これらの実施例を見れば適切な方法が分かるであろう。
【実施例１２】
【０１５０】
＜処方１２ａ＞
「水中油エマルション型の化粧品又は医薬品の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      水                                              ｑｓｐ１００
ブチレングリコール                              ２
グリセリン                                      ３
ジヒドロキシセチルリン酸ナトリウム、            ２
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル
Ｂ      ステアリン酸グリコールＳＥ                    １４
トリイソノナオイン                              ５
（ｔｒｉｉｓｏｎｏｎａｏｉｎｅ）
ヤシ油脂肪酸オクチル                            ６
Ｃ     ｐＨ５．５に調節した                            ２
ブチレングリコール、
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
Ｄ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【０１５１】
＜処方１２ｂ＞
Ａ      水                                              ｑｓｐ１００
ブチレングリコール                              ２
グリセリン                                      ３
ポリアクリルアミド、                            ２．８
イソパラフィン、ラウレス−７
Ｂ      ブチレングリコール、                            ２
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン；
２
フェノキシエタノール、
メチルパラベン、
プロピルパラベン、
ブチルパラベン、
エチルパラベン                                  ０．５
ブチレングリコール
Ｄ     本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【０１５２】
＜処方１２ｃ＞
Ａ      カルボマー                                      ０．５０
プロピレングリコール                            ３
グリセリン                                      ５
水                                              ｑｓｐ１００
Ｂ      ヤシ油脂肪酸オクチル                            ５
ビサボロール                                    ０．３０
ジメチコン                                      ０．３０
Ｃ      水酸化ナトリウム                                １．６０
Ｄ      フェノキシエタノール、                          ０．５０
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｅ      香料                                            ０．３０
Ｆ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１３】
【０１５３】
「油中水型の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      ＰＥＧ３０−ジポリヒドロキシステアリン酸        ３
カプリン酸トリグリセリド                        ３
オクタン酸セテアリル                            ４
アジピン酸ジブチル                              ３
ブドウ種子油                                    １．５
ホホバ油                                        １．５
フェノキシエタノール、                          ０．５
メチルパラベン、プロピルパラベン、
ブチルパラベン、エチルパラベン
Ｂ      グリセリン                                      ３
ブチレングリコール                              ３
硫酸マグネシウム                                ０．５
ＥＤＴＡ                                        ０．０５
水                                              ｑｓｐ１００
Ｃ      シクロメチコン                                  １
ジメチコン                                      １
Ｄ      香料                                            ０．３
Ｅ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１４】
【０１５４】
「シャンプー又はボディソープ状の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      キサンタンガム                                  ０．８
水                                              ｑｓｐ１００
Ｂ      ブチレングリコール、                            ０．５
メチルパラベン、
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、                          ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｃ      クエン酸                                        ０．８
Ｄ      ラウレス硫酸ナトリウム                        ４０．０
Ｅ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１５】
【０１５５】
「口紅等の無水製品状の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      ミネラルワックス                              １７．０
イソステアリン酸イソステアリル                ３１．５
プロピレングリコールジペラルゴン                ２．６
（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉｐｅｌａｒｇｏｎａｔｅ）
イソステアリン酸プロピレングリコール            １．７
ＰＥＧ−８ミツロウ                              ３．０
水添パーム核脂肪酸グリセリド、                  ３．４
水添パーム油脂肪酸グリセリド      
ラノリン油                                      ３．４
ゴマ油                                          １．７
乳酸セチル                                      １．７
鉱物油、ラノリンアルコール                      ３．０
Ｂ      ヒマシ油                                        ｑｓｐ１００
二酸化チタン                                    ３．９
ＣＩ  １５８５０：１                            ０．６１６
ＣＩ  ４５４１０：１                            ０．２５６
ＣＩ  １９１４０：１                            ０．０４８
ＣＩ  ７７４９１                                ２．０４８
本発明の生成物                                  ０．０１〜５％
【実施例１６】
【０１５６】
「水性ゲル（アイライナー、痩身剤等）の処方における本発明の生成物の使用」
Ａ      水                                              ｑｓｐ１００
カルボマー                                      ０．５
ブチレングリコール                            １５
フェノキシエタノール、                          ０．５
メチルパラベン、
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
Ｂ      本発明の生成物                                  ０．０１〜１０％
【実施例１７】
【０１５７】
「ＬＯＸＬを含有する医薬品の処方の調製」
＜処方１７ａ＞錠剤の調製
Ａ      賦形剤                                          ｇ単位、１錠あたり
乳糖                                            ０．３５９
スクロース                                      ０．２４０
Ｂ      ＬＯＸＬ抽出物＊                                ０．００１〜０．１
（ＬＯＸＬ抽出物＊は、例えば実施例２に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。）
【０１５８】
＜処方１７ｂ＞軟膏の調製
Ａ      賦形剤
低密度ポリエチレン                              ５．５
流動パラフィン                                  ｑｓｐ１００
Ｂ      ＬＯＸＬ抽出物＊                                ０．００１〜０．１
（ＬＯＸＬ抽出物＊は、例えば実施例２に記載したように抽出し、その後必要に応じて乾燥させることによって得られる。）
【０１５９】
＜処方１７ｃ＞注射剤の処方の調製
Ａ      賦形剤
等張食塩水                                      ５ｍｌ
Ｂ     ＬＯＸＬ抽出物＊                                ０．００１〜０．１ｇ
（ＬＯＸＬ抽出物＊は、例えば実施例２に記載したように抽出し、その後乾燥させることによって得られる。）
Ａ相とＢ相は別々にアンプルで包み、使用前に混合する。
【実施例１８】
【０１６０】
「本発明の生成物を含む製剤の化粧品としての許容性の評価」
実施例９〜１１で得られた化合物を１０％の割合で０．５％キサンタンガムに混合したものの毒性を、ウサギにおける眼刺激試験、ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験、及び、モルモットにおける感作性試験によって調べた。
【０１６１】
『ウサギの皮膚における一次刺激の評価』
上記製剤を、ウサギ３匹の皮膚に、≪皮膚に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関するＯＥＣＤ推奨の方法に従って、希釈せずに０．５ｍｌずつ投与した。
【０１６２】
生成物を、１９８２年２月２１日のフランス共和国の公式機関紙（“ＪＯＲＦ”）で公表された、１９８２年２月１日の決議の中で定義された基準に従って分類した。
【０１６３】
上記試験結果から、実施例１１で得られた物質を含有する製剤は、皮膚に対して刺激がないものとして分類されることが分かる。
【０１６４】
「ウサギにおける眼刺激試験」
上記製剤を純粋な状態で、≪眼に対する急性刺激／腐食性≫の研究に関して１９８７年２月２４日にＯＥＣＤ指令書４０５番によって公式に推奨されている方法に従い、０．１ｍｌを１回でウサギ３匹の眼中に滴下した。
この試験の結果から、これらの製剤は、純粋な状態で又は希釈せずに使用した場合、９１／３２６のＥＥＣの意味において、眼に対して刺激がないものとして考えられる。
【０１６５】
「ラットに１回経口投与した際に異常毒性がないことの確認試験」
上記製剤を、１９８７年２月２４日のＯＥＣＤ指令書４０１番から着想して化粧品に適用したプロトコールに従って、雄ラット５匹及び雌ラット５匹に、５ｇ／体重１ｋｇの量を１回で経口投与した。
ＬＤ０及びＬＤ５０は、５０００ｍｇ／ｋｇ以上であることが分かっている。従って、試験した製剤は、経口摂取が危険な製剤には分類されない。
【０１６６】
『モルモットにおける潜在的皮膚感作性試験』
上記製剤に対して、ＯＥＣＤ４０６番の指令書に従ったプロトコールであるＭａｇｎｕｓｓｏｎ−Ｋｌｉｇｍａｎｎ極大試験を行った。
これらの製剤は、皮膚との接触において感作性がないものとして分類される。
【０１６７】
記載した配列の解説
配列番号１：ヒトタンパク質ＬＯＸのペプチド配列である。
配列番号２：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号３：ヒトタンパク質トロポエラスチンのペプチド配列である。
配列番号４：ヒトエラスチンタンパク質をコードするヒト遺伝子のプロモーター（ＡＴＧから上流の−２１７１からの塩基対）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号５：配列番号３に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号６：ヒトタンパク質ＬＯＸＬのペプチド配列である。
配列番号７：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【０１６８】
二本鎖ＤＮＡプローブに関しては
配列番号８：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号９：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１０：配列番号３に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１１：配列番号３に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１２：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１３：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１４：ヒトタンパク質コラーゲンＩα１ＬをコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１５：ヒトタンパク質コラーゲンＩα１ＬをコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
【０１６９】
ＧＳＴ融合遺伝子に関しては
配列番号１６：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｓ３５５−Ｄ４１５のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１７：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｓ３５５−Ｄ４１５のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号１８：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｇ１２８−Ｌ２１２のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号１９：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｇ１２８−Ｌ２１２のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号２０：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｖ２２８−Ｓ２７９のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号２１：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｖ２２８−Ｓ２７９のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号２２：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｄ３０６−Ｎ３７３のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号２３：融合遺伝子ＧＳＴ  Ｄ３０６−Ｎ３７３のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
【０１７０】
ＰＣＲプライマーに関しては
配列番号２４：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号２５：配列番号１に記載したヒトタンパク質ＬＯＸをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアンチセンスプライマーである。
配列番号２６：配列番号３に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号２７：配列番号３に記載したヒトタンパク質トロポエラスチンをコードするｍＲＮＡの配列のＲＴ−ＰＣＲアンチセンスプライマーである。
配列番号２８：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号２９：配列番号６に記載したヒトタンパク質ＬＯＸＬをコードするｍＲＮＡの配列のアンチセンスプライマーである。
配列番号３０：ヒトタンパク質アクチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲセンスプライマーである。
配列番号３１：ヒトタンパク質アクチンをコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアンチセンスプライマーである。
【０１７１】
配列番号３２：融合遺伝子ＧＳＴ  ５１７−５８１のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号３３：融合遺伝子ＧＳＴ  ５１７−５８１のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号３４：融合遺伝子ＧＳＴ  ６６４−７２０のＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号３５：融合遺伝子ＧＳＴ  ６６４−７２０のＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
配列番号３６：コラーゲンＩα１遺伝子をコードするＤＮＡのセンスプライマーである。
配列番号３７：コラーゲンＩα１遺伝子をコードするＤＮＡのアンチセンスプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】特異的抗体を作るために決定したＬＯの配列の解説。図１（Ａ）：ｈＬＯＸ（ヒトＬＯＸタンパク質）及びｈＬＯＸＬ（ヒトＬＯＸＬタンパク質）の概略図。図１（Ｂ）：ＬＯＸ及びＬＯＸＬの抗原領域と、ＬＯアイソフォーム上の相当する領域との類似率を示す。
【図２】抗ＬＯＸ抗体及び抗ＬＯＸＬ抗体を用いて平滑筋細胞（ＳＭＣ）について行った電気泳動の写真。
【図３】再生皮膚（ＲＳ）及び正常な人間の皮膚中におけるＬＯＸＬ及びＬＯＸの免疫組織学的検出。
【図４】再生皮膚（１６、３５及び４５日後）及び人間の包皮皮膚の断面における、抗ＬＯＸＬ２５１７−５８１抗体（左欄）、及び、理論的にＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３及びＬＯＸＬ４を認識する抗ＬＯＸＬ２６６４−７２０抗体（右欄）を用いて行った免疫検出。
【図５】４５日後の再生皮膚、及び、正常な人間の皮膚の真皮部分において透過型電子顕微鏡検査を用いて行ったＬＯＸＬ、ＬＯＸ及びエラスチンの免疫検出。
【図６】ＬＯＸ及びＬＯＸＬの人間の皮膚中における免疫検出。
【図７】年齢の異なる人間から採取した腹部の皮膚におけるＬＯＸ及びＬＯＸＬの免疫検出。
【図８】ＬＯＸ及びＬＯＸＬの、治療後の経過期間の異なる瘢痕組織の皮膚中における免疫検出。
【図９】３５日後の皮膚モデル断面において行ったｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる、ＬＯＸＬをコードする遺伝子の発現の検出。
【図１０】加齢によるエラスチン、ＬＯＸ及びＬＯＸＬの遺伝子発現量の変化。
【図１】
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【図２】
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【図１０】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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