(57)【要約】【課題】G-CSFを医薬品として開発するため、天然型G-CSF 全長cDNAを有する組換えバキュロウイルスを作製し、高純度なG-CSFをカラムクロマト精製方法により調製することが課題である。【解決手段】昆虫細胞により発現・生産、中でもG-CSFに着目し、生理活性を有し、かつ高純度精製品を調製すること目的に、数種のカラムクロマト精製を検討した結果、純度９５％、注射剤として調製可能なG-CSFの精製方法を確立し、かくして本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、昆虫細胞により生産したG-CSFを含む細胞培養上清を用いて、数種のカラムクロマトを用いて検討した結果、カチオン交換担体およびハイドロキシアパタイトカラムの組合わせにより、高純度にG-CSFを調製可能であり、もって注射剤として調製可能なG-CSFを調製することを特徴とする高純度製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子を含む培養上清に界面活性剤を添加し、カチオン交換担体に接触させ、次いでアフィニティークロマト担体に接触させる顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法。
【請求項２】
顆粒球コロニー刺激因子が、ネコまたはイヌ顆粒球コロニー刺激因子であることを特徴とする請求項１記載の顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法。
【請求項３】
カチオン交換担体がスルフォプロピル交換担体であることを特徴とする請求項１または２記載の顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法。
【請求項４】
アフィニティークロマト担体がハイドロキシアパタイト担体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法。
【請求項５】
顆粒球コロニー刺激因子を含む培養上清が、昆虫由来であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法。
【請求項６】
顆粒球コロニー刺激因子が天然型で、純度９５％以上の注射剤として調製可能な請求項１〜５のいずれか１項記載の顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法。
【請求項７】
顆粒球コロニー刺激因子、界面活性剤を含み、純度９５％以上の注射剤１ｍＬとしたとき、粒子径が８から１２μmの不溶性微粒子が６０００個以下であることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子を含む水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術により大量に生産した顆粒球コロニー刺激因子を高純度に調製する方法をして、以って医薬品とする事を目的とした、顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コロニー刺激因子（CSF）は、骨髄において血球前駆細胞に作用し、その分化・増殖を調節する働きを有している。特に顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は、血球前駆細胞から好中球への分化・増殖を行う作用を有している。ヒトG-CSFの構造は204残基のアミノ酸で構成されており、その内30残基のシグナルペプチド、成熟タンパク質としては174残基のアミノ酸からなり、いくつかのO-グリコシレーションを受けた糖タンパク質である。当初G-CSFは、マウスにエンドトキシンを投与し、その肺中の流出液内から分離・精製がなされた（非特許文献１）。ヒトG-CSFは、２つのグループからcDNA クローニングおよび発現の報告がなされた（非特許文献２．３）。最初の報告（非特許文献２）ではヒトG-CSFはmatureタンパク質が177残基のアミノ酸からなるとの報告がなされたが、生物活性が本来の活性の10分の１でしかなかった。次の報告（非特許文献３）では、最初の報告よりも３残基アミノ酸が少ない174残基のG-CSFのcDNAクローニング がなされ、G-CSFが従来有する生物活性を保有していることが判明した。その他、マウスG-CSFおよびラットG-CSFのcDNA クローニングがなされた（非特許文献４，５）。
【０００３】
コンパニオンアニマルであるイヌおよびネコは感染症が多く報告され、イヌではパルボウイルスによる感染が世界で150万頭を超え、その内20%が死に至ると言われている。さらにこのウイルスは、重篤なニュートロペニアを誘発し、２次感染などによってさらに死亡するイヌが多いと報告されている。一方ネコでは、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)による感染が年あたり50万〜100万頭を超えると言われており、このウイルスは約30%のネコにニュートロペニアを誘発させ、易感染症になるとされている。FIV以外にもネコ白血病ウイルス(FeLV)でも同様にニュートロペニアになると言われている。また、最近ではこれらコンパニオンアニマルの腫瘍に対して、ヒトの抗腫瘍薬の投与、放射線療法などによりニュートロペニアを招き、易感染症になると言われている。
【０００４】
イヌやネコの感染症予後、抗腫瘍薬投与後の骨髄抑制などにより誘発されるニュートロペニアに対して、組換えヒトG-CSFが使用されている。ニュートロペニアのイヌに組換えヒトG-CSFを投与した場合、症状の改善があるとの報告（非特許文献６）があり、また放射線療法を施したイヌに対しても同様に改善効果があるとの報告（非特許文献７）がある。しかし、長期投与において、外因性および内因性のG-CSFに対する中和抗体産生がみられ、重篤なニュートロペニアに至るケースがあると報告（非特許文献８）されている。長期投与における中和抗体の発現の原因としては、種の異なるG-CSFの投与が原因であると推察され、イヌやネコにおける深刻な臨床治療の問題の一つであるとされている。
【０００５】
ネコG-CSFは、cDNA クローニングがなされており、昆虫細胞での発現も確認されている（特許文献１）。本報告では、バキュロウイルスを調製し、Sf21AE細胞を用いてネコG-CSFの生産に成功している。また生産されたネコG-CSFは、G-CSFのバイオアッセイの一つであるNFS60細胞の増殖を促進していた。また、作製したネコG-CSFは、遺伝子組換え技術により、その５‘末端にタグ を付加することにより精製の簡便化を図っている（非特許文献９）。一方、イヌG-CSFは、cDNA クローニングがなされており、大腸菌での発現も確認されている（特許文献２）。本報告によると、大腸菌生産イヌG-CSFは、イオン交換担体の組合わせによる精製法が報告されている。
【非特許文献１】ニコラら：ジャーナル・バイオロジー  オブ  ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５８、９０１７（１９８３）
【非特許文献２】ナガタら：エンボ（ＥＭＢＯ）、５，５７５（１９８６）
【非特許文献３】スーチャら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３２，６１（１９８６）
【非特許文献４】チューチヤら：プロナス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）、８３、７６３３（１９８６）
【非特許文献５】ハンら：ジーン（Ｇｅｎｅ）、１７５，１０１（１９９６）
【非特許文献６】ロスロップら：ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７２、１３２４（１９８８）
【非特許文献７】シューニンら：ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７４、１３０８（１９８９）
【非特許文献８】ハモンドら：ジャーナル  クリニカル  インベストメント（Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）、８７，７０４（１９９１）
【非特許文献９】ヤマモトら：ベターナリーイムノロジーイムノパソロジー（Vet .Immunol.Immunopathol）．９０．１６９−１７７（２００２）
【特許文献１】特開平11-196881号公報
【特許文献２】米国特許第 5,606,024号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のヒトG-CSFやネコG-CSFの製法では精製法の開示がない。またイヌG-CSFは２種のイオン交換担体カラムの組合わせによる精製法が記載されているが、純度において不十分である。そこで、G-CSFを医薬品として開発するため、高純度なG-CSFをカラムクロマト精製方法により調製することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、G-CSFの精製法を検討し、カチオン交換担体とアフィニティークロマト担体を組合わせることにより高純度なG-CSFを調製することを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、顆粒球コロニー刺激因子を含む培養上清に界面活性剤を添加し、カチオン交換担体に接触させ、次いでアフィニティークロマト担体に接触させる顆粒球コロニー刺激因子の高純度製造法であり、本方法により、顆粒球コロニー刺激因子、界面活性剤を含み、純度９５％以上の注射剤１ｍＬとしたとき、不溶性微粒子径が１０μm以下のものが６０００個以下であることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子を含む水溶液を得ることが可能になる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、G-CSFを含む培養上清に界面活性剤添加し、カチオン交換担体およびアフィニティークロマト担体の組合わせにより、高純度にG-CSFを調製可能であり、もって不溶性微粒子が少なく、注射剤として調製可能なG-CSFを調製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の製造法で得られるG-CSFとしてはヒトG-CSF、ほ乳類のG-CSFなどがあげられ、特にイヌG-CSFやネコG-CSFの製造に好ましく本発明が適用できる。さらに、ネコG-CSFの製造に好ましく本発明が適用できる。
【００１０】
イヌおよびネコG-CSFをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌやネコの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって、ネコG-CSFをコードする遺伝子を得ることができる。イヌやネコの細胞、例えばエンドトキシンで刺激されたイヌやネコリンパ球などによりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌやネコの細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジ・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（チルインら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８、５２９４（１９７９））バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１１】
イヌやネコリンパ球などより通常の方法、例えば塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば  Ｇｕｂｌｅｒらの方法（ガブラーら：ジーン（Ｇｅｎｅ）．２５，２３６−２６９（１９８３））、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（オカヤマら：モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ），２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，（１９８３））などによりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌG-CSFやネコG-CSFをコードする遺伝子の塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってイヌG-CSFやネコG-CSFをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００１２】
G-CSFの生産は例えば昆虫細胞に感染する組換え核多角体病ウイルスを作製することによって、昆虫細胞発現系を用いて生産することができる。組換え核多角体病ウイルスは、G-CSFの蛋白質をコ-ドするＤＮＡをクローニングベクターに連結して作製した組換え体プラスミドと核多角体病ウイルスＤＮＡとを、昆虫細胞にコトランスフェクションして作製することができる。従って、組換え体ウイルスは、in vivo的な方法で作製することができる。すなわち、G-CSFの蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、ポリヘドリンプロモーターを有する発現用遺伝子ベクターに連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製することができる。この組換え体プラスミドと核多角体病ウイルスＤＮＡ（ホリウチら：アグリカルチャラル  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５１，１５７３-１５８０，（１９８７））とを、文献のような方法で樹立細胞、例えばＢＭ-Ｎ株やSf細胞にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別できる。G-CSFの生産は、前記の組換え核多角体ウイルスをカイコ生体中で増殖させることにより行う。
【００１３】
産生されたG-CSFは非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約20ｋＤである。
【００１４】
G-CSFは、in vitroでNFS-60による細胞増殖活性により生理活性が主に特性化される。
【００１５】
本発明では、G-CSFを含む培養上清に界面活性剤を添加し、カチオン交換担体およびアフィニティークロマト担体を用いることが重要である。両担体を使用することで、高純度のG-CSFを得ることができる。
【００１６】
本発明においてG-CSFの分離・分画に使用されるカチオン交換担体としては、アガロース、セルロース、セファロース、合成ポリマーゲルなどに、親水性のスペーサーを介して、化学的に安定なエーテル結合によってスルフォプロピル基を導入したものが挙げられる。好ましくは、スルフォプロピルセファロースハイパフォーマンス（商標）（アマシャム）などが用いられる。また、アフィニティークロマト担体としては、抗体をリガンドとしてセルロース・アガロース、セファロースなどに結合させ、抗原となる目的タンパク質を分離するものや、糖や糖鎖を認識し結合するレクチン類をセルロース・アガロース、セファロースなどに結合させ精製に供するものが挙げられる。さらに、特定の色素やヘパリンをセルロース・アガロース、セファロースなどに結合させ、生体内に存在する特定のタンパク質が結合することを利用し、目的タンパク質の精製に使用するものも挙げられる。ハイドロキシアパタイトは、リン酸カルシウムの一種で、静電的相互作用により多くのタンパク質や核酸に結合することが知られている。アフィニティークロマト担体としては、結晶性ハイドロキシアパタイトや焼結セラミック化ハイドロキシアパタイトが挙げられる。好ましくはバイオゲルＨＴ（商標）（Bio-Rad社製）などが用いられる。
【００１７】
本発明の方法では、G-CSFおよび界面活性剤を含む溶液をカチオン交換担体に接触させ、担体への吸着物を溶出剤で溶出させ、次いでハイドロキシアパタイト担体に接触させる方法が採用される。
【００１８】
カチオン交換担体からの溶出は、塩濃度を徐々に増加させリガンドであるスルフォプロピル基とのイオン性の相互作用を打ち消し、かつ吸着したタンパクのイオン性の違いによって分離・分画することができる。G-CSFを各種生産系で生産した場合、培養液由来成分や生産系由来成分などが混在する。これら成分の中には等電点値など、タンパク質としての性質が非常に類似しているものがあるため、カラムクロマト担体への吸着挙動が類似しており、各成分それぞれを完全に分離することは容易でないと考えられる。本発明で使用されるカチオン交換担体は、溶出剤の濃度の差により、これらG-CSFと性質が非常に類似した複数のタンパク質を分離・分画できる。次に、アフィニティークロマト担体と接触させる。たとえば、ハイドロキシアパタイト担体では、タンパク質表面のアミン基とハイドロキキシアパタイトのリン酸基との間で静電的相互作用が、タンパク質表面のカルボキシル基とハイドロキキシアパタイトのカルシウムとの間でカルシウム複合体が形成される。ハイドロキシアパタイト担体からの溶出は、塩濃度を徐々に増加させ吸着したタンパクのイオン性の違いによって分離・分画することができる。カチオン交換担体で溶出したG-CSFを含む溶液中には培養液由来成分や生産系由来成分が残存し、これら成分の中には等電点値など、タンパク質としての性質が非常に類似しているものがあるため、カラムクロマト担体への吸着挙動が類似しており、各成分それぞれを完全に分離することは容易でないと考えられる。本発明で使用されるハイドロキシアパタイト担体によれば、pH操作を加えることによりG-CSFを他の複数のタンパク質から分離・分画できる。
【００１９】
なお、カチオン交換担体およびアフィニティークロマト担体を用いた精製操作における、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるものではなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、有用タンパク質各成分の量、およびカラムの寸法などに応じて適宜決定される。
【００２０】
本発明に使用される界面活性剤としては、イオン系および非イオン系界面活性剤であり中でも非イオン系界面活性剤が適しており、G-CSFは鉱油系のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（HCO60）が最適である。また、培養上清やカラムに添加する界面活性剤の添加量としては、１％〜0.005%の範囲で添加することにより高純度化が可能であり、G-CSFについては、添加量が0.5％〜0.05%濃度が最適である。
【００２１】
また、昆虫細胞で生産したG-CSFは、昆虫型の糖鎖が結合している。天然型のG-CSFはO型糖鎖の修飾を受けており、糖鎖のないG-CSFに比べてタンパク質の安定性が高いことから、昆虫で作製したG-CSFは糖鎖付加を受けない大腸菌で作製したものに比較し物質安定性が良い。
【００２２】
注射剤は、エンドトキシン試験、不溶性異物検査、不溶性微粒子試験、ガラス容器試験等が規定されている。注射剤中に生じるエンドトキシンや微粒子などは製造工程中を含め、バイアル瓶や蓋などからも混入の恐れはある。特に微粒子はタンパク質製剤では、タンパク質の溶液内での凝固によっても生じることが知られている。また本発明の精製法を用いることにより、不溶性微粒子の少ないG-CSFを含む水溶液を得ることができる。本発明は、顆粒球コロニー刺激因子、界面活性剤を含み、純度９５％以上の注射剤１ｍＬとしたとき、粒子径が８から１２μmの不溶性微粒子が６０００個以下であることを特徴とする顆粒球コロニー刺激因子を含む水溶液である。さらに好ましくは、粒子径が２０から３０μmの不溶性微粒子が６００個以下の水溶液である。不溶性微粒子測定は、いくつか測定法（第１４改訂日本薬局方）はあるが、本発明では顕微鏡による測定を行う。操作は清浄な設備内にて行う。フィルターホルダーに測定用メンブランフィルターを取り付け、微粒子試験用精製水を200mLを１分間20〜30mLの速度で吸引濾過する。次にメンブランフィルターをペトリ皿にとり、５０℃以下にて十分乾燥し、ペトリ皿を顕微鏡にセットし、不溶性微粒子の測定を行う。測定用G-CSFを含む試料についても同様に５０ｍＬに希釈し、フィルターホルダーに測定用メンブランフィルターを取り付け、微粒子試験用精製水を200mLを１分間20〜30mLの速度で吸引濾過する。次にメンブランフィルターをペトリ皿にとり、５０℃以下にて十分乾燥し、ペトリ皿を顕微鏡にセットし、不溶性微粒子数の計測を行う。得られた数値を希釈した倍率を掛け合わせることにより不溶性微粒子数を算出する。本発明によれば、エンドトキシン、不溶性異物、不溶性微粒子などが少ないG-CSFを含む水溶液を得ることができる。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１  ネコG-CSF遺伝子の取得
（１）ネコｃＤＮＡの調製
ネコ末梢血リンパ球をエンドトキシンで４時間、37℃下で刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２５】
（２）ネコG-CSF遺伝子の取得
ネコG-CSFのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（特開平11-196881号公報）をもとに、
配列番号２と配列番号３の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のネコ末梢血リンパ球より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約500ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００２６】
このＤＮＡ断片をＮｏｖａｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がネコG-CSFをコードする配列であることを確認した（配列番号１）。
【００２７】
実施例３  Sf21によるネコG-CSFの発現
（１）発現用遺伝子ベクターへのネコG-CSF遺伝子の組込み
配列番号１に示したネコG-CSFのＮ末側およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号４ と配列番号５の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。実施例１（２）で得られたネコG-CSFcDNAを鋳型とし、PCRによるる遺伝子の増幅を行った。すなわち、０．５ｍｌのミクロ遠心チューブにネコG-CSFcDNA２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約500ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００２８】
このＤＮＡ断片をＮｏｖａｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がネコG-CSFをコードする配列であることを確認した。
【００２９】
Sf21発現用遺伝子ベクターpVL1392(Pharmingen社製)及び上記で調製したネコG-CSF遺伝子をEcoRＩ、Bgl II処理する。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgeneclean II kit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit ver II（宝酒造（株）社製）により16℃、30分の条件下pVL1392とネコG-CSF遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をDH5αコンピテントセル(TOYOBO社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりネコG-CSF遺伝子断片を含むSf21発現用遺伝子ベクターDNAを調製する。
【００３０】
（２）Sf21でのネコG-CSFの生産
Sf21発現用遺伝子ベクターDNAおよびバキュロウイルスDNA(AcNPV)を用いて、組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ  ＣａＣｌ2、核多角体病ウイルスAcＮＰＶＤＮＡ１０μｇ、Sf21発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ-１０培地中、１０ｃｍ2のDishで平面培養した約1×１０7個の昆虫細胞であるSf21細胞の培養基に加え、Sf21細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに27℃下、5日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したSf21細胞の培養基に添加し１時間培養後、最終濃度0.1mg/mL X-galを含む1%アガロースゲルを添加し、さらに27℃下、５日間培養を行った。次に最終濃度0.1mg/mL X-galを含む1%アガロースゲルを重層し、27℃下、５日間培養を行った。組換えウイルスである青色のプラークを拾い、TMN-FH insect medium5mLに終夜処理した（プラークアッセイ法）。再度その上清を希釈して平面に培養したSf21細胞の培養基に添加し１時間培養後、最終濃度0.1mg/mL X-galを含む1%アガロースゲルを添加し、さらに27℃下、５日間培養を行い、プラークアッセイを３回繰りかえし、組換えウイルスの純化を行った。
【００３１】
ここで作製したネコG-CSFをコードするＤＮＡ（配列番号1）を含む組換えウイルスをrAcNPV-FeG-CSFとした。
【００３２】
（３）昆虫細胞Sf21でのネコG-CSFの発現
上記（２）で得られた組換えウイルスを27℃下培養したSf21に感染させた。27℃下５日間培養し、培養上清を回収した後2,000G,10分遠心しその上清を回収した。
【００３３】
実施例４  ネコG-CSFの検出
実施例３で得られたネコG-CSFをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトG-CSFポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約20ｋＤのバンドを検出した。ネコG-CSFの推定分子量がおよそ20kDaであることから、実施例３の培養上清中にネコG-CSFが発現したものと考えられる。
【００３４】
実施例５  昆虫細胞生産ネコG-CSFの精製
実施例３で得られた昆虫細胞生産ネコG-CSFを含む細胞培養上清を、限外ろ過法により、脱塩およびHCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)にバッファー置換を行った。次に、HCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)で平衡化したカチオン交換担体であるスルフォプロピルセファロース（アマシャム社製）を用意し、ネコG-CSFを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、100mMNaClを含む溶液により溶出を行った。ネコG-CSFを含む溶出液を限外ろ過法により、脱塩およびHCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)にバッファー置換を行った。次に、HCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)で平衡化したバイオゲルＨＴ（バイオラッド社製）を用意し、ネコG-CSFを含む溶液を導入した。フロースルー画分および20mM酢酸緩衝液に洗浄した画分を回収し、最後に脱塩操作を行った。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色によるゲル染色を行い、ネコG-CSFの単一化を確認した。さらにイメージアナライザー（Bio-Rad社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９５％の純度を確認することができた。また、エンドトキシン含量は0.9ng/mg蛋白量であった。
【００３５】
実施例６  ネコG-CSFの活性測定
実施例５で生産されたネコG-CSFの活性測定はNFS-60細胞（ATCCより入手）を用いて以下のようにして行った。NFS-60をRPMI1640/10%FBS培地に懸濁し、2.2×105cells/mLに調製し、96穴microplateに100μL添加した。さらにネコG-CSFサンプル10μLを添加し、５％CO2、37℃条件下、24時間培養し、cell counting kit-8を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、kitのWST-8を各穴２μＬずつ添加し、2.5時間培養後、ELISA Plate reader(pharmacia社製)によりA450を測定した。その結果を図１に示す。サンプル量の増加に従ってNFS-60細胞の有意な増殖が認められたことから、ネコG-CSFの活性が確認された。
【００３６】
実施例７  精製ネコG-CSFの糖鎖修飾
実施例５で精製されたネコG-CSFを50mM酢酸緩衝液下O-グリコシダーゼを添加し、３７℃で一晩処理後、SDS-PAGEを行った結果、分子量の低下を確認することができた。すなわち、昆虫型O型糖鎖の修飾をうけたものと考えられる。
【００３７】
実施例８  精製ネコG-CSF水溶液の不溶性微粒子
実施例５で精製されたネコG-CSFを用いて製剤化検討を行った。ネコG-CSFを20mMクエン酸緩衝液(pH7.0)、0.15MNaClを含む溶液にHCO60を添加したものとしていないものを用いて限外ろか法により脱塩し、最終濃度が１％になるようにアラビアゴムを添加した。すなわち、界面活性剤HCO60を添加または添加しない製剤を用意し、ガラスバイアルにそれぞれ１ｍＬになるように調合し、４℃、１週間溶液状態で保存した場合のネコG-CSFの残存活性を実施例６に示す方法に従って比較した。同時に不溶性微粒子測定を行った。その結果、HCO60を添加した場合、残存活性は９０％以上であったのに対し、無添加の場合は残存活性が検出限界以下であった。また不溶性微粒子については、HCO60を添加した場合、粒子径８から１２μmの不溶性微粒子が６０００個以下であったのに対し、無添加の場合は粒子径８から１２μmの不溶性微粒子が１０００００個存在した。
【００３８】
実施例９  マウスを用いた急性毒性試験
実施例８で調製したネコG-CSFの急性毒性試験を実施した。Crj:CD-1(ICR)マウス１群５匹（メス）に対して、皮下投与を行った。用量は1μg/頭、10μg/頭、100μg/頭、１mg/頭、10mg/頭  の５用量を設定し、投与した。投与後から投与１４日間一般状態観察、体重測定は週１回、１４日後に剖検を行ったところ、異常を示す症状は見られなかった。
【００３９】
実施例１０  イヌG-CSF遺伝子の取得
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ末梢血リンパ球をエンドトキシンで４時間、37℃下で刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００４０】
（２）イヌG-CSF遺伝子の取得
イヌG-CSFのＮ末端およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号７と配列番号８の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ末梢血リンパ球より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約500ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００４１】
このＤＮＡ断片をＮｏｖａｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌG-CSFをコードする配列であることを確認した（配列番号６）。
【００４２】
実施例１１  Sf21によるイヌG-CSFの発現
（１）発現用遺伝子ベクターへのイヌG-CSF遺伝子の組込み
配列番号６に示したイヌG-CSFのＮ末側およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号９ と配列番号１０の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。実施例１０（２）で得られたイヌG-CSFcDNAを鋳型とし、PCRによるる遺伝子の増幅を行った。すなわち、０．５ｍｌのミクロ遠心チューブにイヌG-CSFcDNA２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約500ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００４３】
このＤＮＡ断片をＮｏｖａｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌG-CSFをコードする配列であることを確認した。
【００４４】
Sf21発現用遺伝子ベクターpVL1392(Pharmingen社製)及び上記で調製したイヌG-CSF遺伝子をEcoRＩ、Bgl II処理する。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片をgeneclean II kit（フナコシ社製）により抽出し、DNA ligation kit ver II（宝酒造（株）社製）により16℃、30分の条件下pVL1392とイヌG-CSF遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をDH5αコンピテントセル(TOYOBO社製)に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌG-CSF遺伝子断片を含むSf21発現用遺伝子ベクターDNAを調製する。
【００４５】
（２）Sf21でのイヌG-CSFの生産
Sf21発現用遺伝子ベクターDNAおよびバキュロウイルスDNA(AcNPV)を用いて、組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ  ＣａＣｌ2、核多角体病ウイルスAcＮＰＶＤＮＡ１０μｇ、Sf21発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ-１０培地中、１０ｃｍ2のDishで平面培養した約1×１０7個の昆虫細胞であるSf21細胞の培養基に加え、Sf21細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに27℃下、5日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したSf21細胞の培養基に添加し１時間培養後、最終濃度0.1mg/mL X-galを含む1%アガロースゲルを添加し、さらに27℃下、５日間培養を行った。次に最終濃度0.1mg/mL X-galを含む1%アガロースゲルを重層し、27℃下、５日間培養を行った。組換えウイルスである青色のプラークを拾い、TMN-FH insect medium5mLに終夜処理した（プラークアッセイ法）。再度その上清を希釈して平面に培養したSf21細胞の培養基に添加し１時間培養後、最終濃度0.1mg/mL X-galを含む1%アガロースゲルを添加し、さらに27℃下、５日間培養を行い、プラークアッセイを３回繰りかえし、組換えウイルスの純化を行った。
【００４６】
ここで作製したイヌG-CSFをコードするＤＮＡ（配列番号６）を含む組換えウイルスをrAcNPV-CaG-CSFとした。
【００４７】
（３）昆虫細胞Sf21でのイヌG-CSFの発現
上記（２）で得られた組換えウイルスを27℃下培養したSf21に感染させた。27℃下５日間培養し、培養上清を回収した後2,000G,10分遠心しその上清を回収した。
【００４８】
実施例１２  イヌG-CSFの検出
実施例１１で得られたイヌG-CSFをウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトG-CSFポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約20ｋＤのバンドを検出した。イヌG-CSFの推定分子量がおよそ20kDaであることから、実施例１１の培養上清中にイヌG-CSFが発現したものと考えられる。
【００４９】
実施例１３  昆虫細胞生産イヌG-CSFの精製
実施例１１で得られた昆虫細胞生産イヌG-CSFを含む細胞培養上清を、限外ろ過法により、脱塩およびHCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)にバッファー置換を行った。次に、20mM酢酸緩衝液(pH5)で平衡化したカチオン交換担体であるスルフォプロピルセファロース（アマシャム社製）を用意し、イヌG-CSFを含む溶液を導入した。十分にカラムの洗浄を行った後、100mMNaClを含む溶液により溶出を行った。イヌG-CSFを含む溶出液を限外ろ過法により、脱塩およびHCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)にバッファー置換を行った。次に、HCO60を含む20mM酢酸緩衝液(pH5)で平衡化したバイオゲルＨＴ（バイオラッド社製）を用意し、イヌG-CSFを含む溶液を導入した。フロースルー画分および20mM酢酸緩衝液に洗浄した画分を回収し、最後に脱塩操作を行った。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色によるゲル染色を行い、イヌG-CSFの単一化を確認した。さらにイメージアナライザー（Bio-Rad社製）により染色したゲルを用いた純度検定を行った結果、９５％の純度を確認することができた。また、エンドトキシン含量は0.9ng/mg蛋白量であった。
【００５０】
実施例１４  イヌG-CSFの活性測定
実施例１３で生産されたイヌG-CSFの活性測定はNFS-60細胞（ATCCより入手）を用いて以下のようにして行った。NFS-60をRPMI1640/10%FBS培地に懸濁し、2.2×105cells/mLに調製し、96穴microplateに100μL添加した。さらにイヌG-CSFサンプル10μLを添加し、５％CO2、37℃条件下、24時間培養し、cell counting kit-8を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、kitのWST-8を各穴２μＬずつ添加し、2.5時間培養後、ELISA Plate reader(pharmacia社製)によりA450を測定した。その結果を図２に示す。サンプル量の増加に従ってNFS-60細胞の有意な増殖が認められたことから、イヌG-CSFの活性が確認された。
【００５１】
実施例１５  精製イヌG-CSFの糖鎖修飾
実施例１３で精製されたイヌG-CSFを50mM酢酸緩衝液下O-グリコシダーゼを添加し、３７℃で一晩処理後、SDS-PAGEを行った結果、分子量の低下を確認することができた。すなわち、昆虫型O型糖鎖の修飾をうけたものと考えられる。
【００５２】
実施例１６  精製イヌG-CSF水溶液の不溶性微粒子
実施例１３で精製されたイヌG-CSFを用いて製剤化検討を行った。イヌG-CSFを20mMクエン酸緩衝液(pH7.0)、0.15MNaClを含む溶液にHCO60を添加したものとしていないものを用いて限外ろか法により脱塩し、最終濃度が１％になるようにアラビアゴムを添加した。すなわち、界面活性剤HCO60を添加または添加しない製剤を用意しガラスバイアルにそれぞれ１ｍＬになるように調合し、４℃、１週間溶液状態で保存した場合のイヌG-CSFの残存活性を実施例１４に示す方法に従って比較した。同時に不溶性微粒子測定を行った。その結果、HCO60を添加した場合、残存活性は９０％以上であったのに対し、無添加の場合は残存活性が検出限界以下であった。また不溶性微粒子については、HCO60を添加した場合、粒子径８から１２μmの不溶性微粒子が６０００個以下であったのに対し、無添加の場合は粒子径８から１２μmの不溶性微粒子が９００００個存在した。
【００５３】
実施例１７  マウスを用いた急性毒性試験
実施例１６で調製したイヌG-CSFの急性毒性試験を実施した。Crj:CD-1(ICR)マウス１群５匹（メス）に対して、皮下投与を行った。用量は1μg/頭、10μg/頭、100μg/頭、１mg/頭、10mg/頭  の５用量を設定し、投与した。投与後から投与１４日間一般状態観察、体重測定は週１回、１４日後に剖検を行ったところ、異常を示す症状は見られなかった。
【００５４】
実施例１８  イヌを用いた毒性試験
実施例１６で調製したイヌG-CSFをイヌに投与し毒性試験を実施した。ビーグル犬3頭に対して、皮下投与を行った。用量は5μg/頭、25μg/頭を設定し、週2回１カ月投与した。投与1回目前後および投与最終回直後に採血を実施し、白血球数および好中球の増減、その他一般状態観察を実施した。その結果、G-CSFの薬効である白血球数および好中球の増加を確認し、一般状態は全く異常は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本願の発明によれば、G-CSF活性を有するタンパク質を高純度に製造することが可能になり、注射剤等の医薬品を提供可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例６で昆虫細胞で発現させたネコG-CSFについて、マウスNFS-60細胞を用いた細胞増殖能を測定した結果を示す図である。
【図２】実施例１４で昆虫細胞で発現させたイヌG-CSFについて、マウスNFS-60細胞を用いた細胞増殖能を測定した結果を示す図である。
【図１】
2005312434.tif 000002
【図２】
2005312434.tif 000003
【配列表】
2005312434000001.app