(57)【要約】【課題】  ＩｇＥの産生抑制を介して、効果的にアレルギーを抑制する物質乃至組成物を提供することを課題とする。それら物質／組成物は、ステロイド剤のような重篤な副作用を示さず、従って、日常的な食事等を通じて、炎症に代表されるアレルギーの諸症状を緩和できる点で有利である。【解決手段】  ＩｇＥの産生を抑制するための組成物であって、該組成物はレンゲ由来の蜂蜜を含むことを特徴とする組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＥの産生を抑制するための組成物であって、該組成物はレンゲ由来の蜂蜜を含むことを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
組成物が、食品の形態である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
抗アレルギーのために用いられる、請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
臨床医学の分野では、多くの疾患が最終的に炎症に至るため、これを効率的に抑えるためにステロイド系の抗炎症剤が用いられてきた。しかしながら、こうしたステロイド系抗炎症剤は、体内のホルモンバランスを変化させるといった副作用の影響が大きいため、その利用に限界がある。特に、アトピー性皮膚炎や気管支喘息といったアレルギー性炎症のように致命的ではないものの、日常的な苦痛を伴う疾患に対しては、副作用の比較的大きなステロイド系抗炎症剤を多用するよりは、むしろ、日常生活における食事等で症状を緩和することが、患者の負担を減少させるための有効な手段と考えられている。
【０００２】
ところで、そのようなアレルギー発症のメカニズムは、多くの研究者によって研究されており、このメカニズムの最初にＩｇＥとよばれる抗体が血中で増加することが知られている。従って、アレルギー発症に関する研究においては、血中でのＩｇＥ動態を知ることが重要であり、とりわけ、アレルギーの抑制においては、当該ＩｇＥの増加を抑制する物質や方法を探ることが重要な課題となる。このような背景から、ＩｇＥ産生を抑制する物質に関し、非特許文献１には、蜂蜜が効果的であることが記載されている。
【０００３】
因みに、前記アレルギー発症に関する研究において、血中でのＩｇＥ動態を知る目的で、ＩｇＥの産生に関与するリンパ球集団を生体外に取り出して、ＩｇＥの産生を誘導させる実験系が構築されている（非特許文献２）。しかしながら、上述の実験系での培養系においては、ＩｇＥの産生が十分ではなく、該培養方法をＩｇＥの安定な産生を必要とする実験系に安定的に用いることに問題があった。これに関して、本発明者らは、先に改良された被験物質のＩｇＥ産生抑制能をアッセイする方法に関して、別途、特許出願を行っている。
【非特許文献１】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９７，  ｖｏｌ．１１４，ｐｐ．３８５−３８８
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３３（２０００）ｐｐ．３３−４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、ＩｇＥの産生抑制を介して、効果的にアレルギーを抑制する物質乃至組成物を提供することを課題とする。それら物質／組成物は、ステロイド剤のような重篤な副作用を示さず、従って、日常的な食事等を通じて、炎症に代表されるアレルギーの諸症状を緩和できる点で有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、ＩｇＥ産生抑制能は、レンゲ由来の蜂蜜において特異的に認められることが明らかとなった。前記非特許文献１においては、単に蜂蜜がＩｇＥ産生抑制に有効であると記載されているのみであり、また、単に蜂蜜といっても、アカシア、ホワイト、レンゲ等各種のものがあるが、そのいずれもが同等の活性を有すると考えるのが一般的である。しかしながら、本発明者らの研究により、特にレンゲ由来の蜂蜜においてのみ顕著なＩｇＥ抑制効果が認められたのであり、そのように由来する蜜源により所定の生理活性が左右されるというのは驚くべき知見である。
【０００６】
したがって、本発明の第一は、ＩｇＥの産生を抑制するための組成物であって、該組成物はレンゲ由来の蜂蜜を含むことを特徴とするものである。
【０００７】
さらに、該組成物は、医薬等の形態となすことも可能であるが、日常生活における簡便な使用の観点からは、食品の形態であることが望ましい。特に、レンゲ由来の蜂蜜は、古来から飲食の用に供されてきているものであるので、そのような食品としての適用に特に有利である。
【０００８】
したがって、本発明の第二は、前記レンゲ由来の蜂蜜を含む組成物が、食品の形態であることを特徴とする。
【０００９】
前述のとおり、ＩｇＥの産生を抑制することにより、アレルギーの予防／治療に効果的であることが知られている。
【００１０】
したがって、本発明の第三は、前記組成物が抗アレルギーのために用いられることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ＩｇＥの産生を抑制するための組成物であって、該組成物は、レンゲ由来の蜂蜜であることを特徴とする。レンゲ由来の蜂蜜とは、一般に、レンゲ草（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｓｉｎｉｃｕｓ  Ｌ．）の花を蜜源とした養蜂により得られる蜂蜜であり、産地は国内、海外を問わない。なお、本発明におけるレンゲ由来の蜂蜜とは、主にレンゲ植物を蜜源として得られた蜂蜜を指すことに留意すべきである。すなわち、一般の養蜂においては、蜜源となる植物を厳格に制限することは困難な場合があり、レンゲ類を主要蜜源とした場合にも、他の蜜源植物由来の花蜜を含む場合がある。しかしながら、そのような場合にも、レンゲ類の植物を主要蜜源として意図して採集され、現に当該レンゲ由来の花蜜を主要な成分とする蜂蜜は、本願にいうレンゲ由来の蜂蜜である。更には、当該レンゲ由来の蜂蜜は、採取されたそのままの形態のほか、例えば当業者に公知の殺菌や乾燥、或いは精製、例えば脱蛋白処理を行ったものであっても差し支えない。組成物中のレンゲ由来の蜂蜜の濃度は、適用対象となるアレルギー患者の年齢、性別、症状の重篤度等、および組成物の形態や意図する投与方法に基づいて、個別に決定されるべきものではあるが、一般に、組成物全体に対して１重量％〜１００重量％であることが好ましい。
【００１２】
本発明の組成物は、例えば、医薬や食品の形態として用いることができる。医薬品の場合、そのような組成物は、特に、経口投与に適している。本発明の組成物を医薬組成物として臨床的に用いる場合は、その投与形態にあわせて薬学的に許容される添加剤を加え各種製剤とすることができる。該薬学的に許容される添加剤としては、製剤分野において通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えば、ゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、澱粉、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアガム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられる。これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤；または例えばシロップ剤等の液体製剤が挙げられ、これらは、製剤分野における通常の方法によって調製することができる。また、本発明の組成物は、種々の食品、例えば、固体、液体、ゾル、ゲル状食品等に任意に配合することも可能である。該配合は、当該技術分野で公知の任意の製造方法によって行うことができ、例えば、キャラメル、ビスケット或いはチョコレート等の固体食品；飲料等の液体食品；あずき粥等のレトルト食品等に原料として、あるいは、別途、容易に配合することができる。
【００１３】
又、上記の組成物は、食品添加物の形態で使用することもできる。当該食品添加物は、当業者にとって周知の方法を用いて、例えば、デキストリン、コーンスターチ、乳糖等の各種の賦型剤類や乳化剤等の副原料と共に、本発明のレンゲ由来の蜂蜜を混合またはカプセル化等をすることにより製造することができる。また、所望により、保存料や香料等を添加してもよい。
【００１４】
前記のとおり、本発明のレンゲ由来の蜂蜜が示す優れたＩｇＥ産生抑制効果は、本発明者等が別途出願している、極めて鋭敏なアッセイ方法により明らかとなった。すなわち、本発明にかかるレンゲ由来の蜂蜜のＩｇＥ産生抑制能は、ヒトから分離したリンパ球について当該リンパ球を採取した個体から得た血漿の存在下で培養し、被験物質の存在下で該リンパ球にＩｇＥを産生させ、産生したＩｇＥの量を検出することにより行い、該方法により、ＩｇＥ産生抑制能、ひいては抗アレルギー性炎症活性をアッセイした。
【００１５】
リンパ球は一般的な密度勾配遠心法により分離できるが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  Ｐｌｕｓを分注したチューブに血液を重層して遠心分離した後、血漿をチューブに採取する。次に、リンパ球を採取してチューブに注入し、培地を加えた後に遠心分離する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であるが、ＥＲＤＦ培地を用いるのが好ましい。
【００１６】
その後、上清を吸引除去し、培地を加え、細胞を懸濁後、さらに遠心分離する。本手順に使用しうる培地は動物細胞培養用培地であるが、ＥＲＤＦ培地を用いるのが好ましい。細胞保存液を加えて細胞の密度を調節し、チューブに分注する。
【００１７】
体外免疫は既知の方法で行ってもよいが、以下の手順で行うのが好ましい。すなわち、蜂蜜と培地を混合し、段階希釈法にて数種類の段階希釈液を作製し、各々ろ過滅菌して試料溶液を作製する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であり、ＥＲＤＦが好ましい。ヒト血漿は予め滅菌された穴径０．２ミクロンのフィルタを用いて滅菌するが、不溶物が多い場合は０．４ミクロンのフィルタでろ過した後、０．２ミクロンのフィルタでろ過して使用する。その後、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、抗原、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、所定の培養溶液を混合した物に、上述のヒト血漿が特定の濃度となるように加えて、免疫賦活液を調製する。使用しうる培地は動物細胞培養用培地であり、ＥＲＤＦ培地が好ましい。特定の濃度に調製したリンパ球を遠心分離し培地を加えた後、遠心分離して上清を除去し、さらに培地を加え、該リンパ球を懸濁して特定の濃度になるように該培地を加えて調製し、リンパ球懸濁液を作製する。細胞培養は、既知の方法で行ってもよいが、培養プレートに試料溶液とリンパ球懸濁液を注入し、静置培養するのが好ましい。使用する培養プレートは、一般的な滅菌された組織培養用プレートであり、特に９６ウェル培養プレートが好ましい。静置培養の条件は、一般的な３７℃定温インキュベータで行うが、特に３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒに調整するのが好ましい。細胞の計測は、血球計算盤もしくは、セルカウンターで行えるが、培養後、一部培養液を回収した後の各ウェルにトリパンブルー溶液を加え、生細胞数と死細胞数を計測するのが好ましい。
【００１８】
ＩｇＥ量は、酵素抗体法で測定するが、特にＥＬＩＳＡによる測定が好ましい。すなわち、炭酸ナトリウム緩衝液に特定の抗体を混合した溶液を特定の濃度になるようにＥＬＩＳＡプレートに注入する。使用しうる抗体は抗ＩｇＥ抗体であるが、ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体が好ましい。一定時間放置した後、プレートの溶液を廃棄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて数回洗浄操作を繰り返す。
【００１９】
検量線作成は以下の手順で行う。標準ＩｇＥについて標準希釈系列を作製したものをプレートに加えて静置した後、ウェル溶液を廃棄して、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で数回洗浄する。その後、ＢＳＡ／ＰＢＳと酵素標識抗ＩｇＥ抗体を混合してプレートに加えて静置し、ウェルの溶液を廃棄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で数回洗浄し、酵素基質を加え、その所定時間後に吸光度を測定する。各培養上清のＩｇＥ量は標準ＩｇＥをプロットした検量線から求める。
【００２０】
以下に、本発明の実施例を例示するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
試料
本実施例で用いた試料は、中国産レンゲ由来の蜂蜜（秋田屋本店）、脱臭脱色蜜（秋田屋本店）、中国産アカシア蜜（秋田屋本店）、中国産ソバ蜜（秋田屋本店）、カリフォル二ア産オレンジ蜜（秋田屋本店）、ニュージーランド産クローバー蜜（秋田屋本店）、メキシコ産オレンジ蜜（秋田屋本店）、中国産ホワイト蜜（秋田屋本店）である。
【００２２】
リンパ球の分離
１５ｍｌコニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ２１９６）にＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃１７−１４４０−０２）を４ｍｌずつ分注し、５ｍｌの血液をその上に静かに重層し、４００×ｇにて常温で３０分間遠心分離（トミー精工  ＬＣ−１２０）した。上から血漿、リンパ球、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ、赤血球の層が存在することを確認して、オートピペット（ドラモンド  ＰＡ−３００）を用いて血漿をチューブに採取し、−２０℃に保存した。次に、オートピペットを用いて、Ｆｉｃｏｌｌを採取しないように血漿側からリンパ球を採取し、各チューブとも最大で１０ｍｌ程度になるように５０ｍｌチューブ（ＢＤ社  ３５−２０７０）に注入した。ＥＲＤＦ培地（極東製薬  ＃２６５００）を１７．７ｇ、ＮａＨＣＯ３（和光純薬  １９１−０１３０５）を１．３ｇ、超純水１０００ｍｌに溶解し０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＧＰＢ  ５０１０）にてろ過滅菌して調整したＥＲＤＦ培地を、全容積が４５ｍｌになるように加え、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。その後、上清を吸引除去し、１０ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、細胞を懸濁後、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。細胞の密度が１〜３×１０７細胞／ｍｌになるように予め調製しておいた細胞保存液（１０％ＤＭＳＯ／２０％ＦＢＳ／７０％ＥＲＤＦ培地（ＦＢＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＤＭＳＯ：Ｗａｋｏ））に懸濁し、クライオチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３０２８９）に分注し、−８０℃で保存した。
【００２３】
体外免疫
体外免疫は以下の手順で行った。
Ａ．２％試料液の作製
各蜂蜜４００μｌと１９．６ｍｌのＥＲＤＦ培地を混合し、０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＧＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いて、ろ過滅菌した。以下、段階希釈法にて、上記混合液から２ｍｌ採取したものを１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合し、ろ過滅菌したものを０．２％試料溶液とし、この混合液から２ｍｌ採取し、同様に１８ｍｌのＥＲＤＦ培地と混合してろ過滅菌して０．０２％の試料溶液を各々作製した。
【００２４】
Ｂ．免疫賦活液の調製
保存しておいたヒト血漿を３７℃のウォーターバスで解凍した後、４００×ｇで常温で５分間遠心分離した。その後、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＳＬＨＶＲ  ２５  ＬＳ）を用いてろ過した。ろ過したヒト血漿１ｍｌに、０．１ｍｌのＩＬ−２（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２２０２）、０．１ｍｌのＩＬ−４（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２００４）、０．１ｍｌのＩＬ−６（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，２００６）、０．１ｍｌのＭＤＰ（ｓｔｏｃｋ  １ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＲ００４）、抗原としてＣｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ（ｓｔｏｃｋ  １μｇ／ｍｌ）（ＬＳＬ  ＬＧ  ５２２９）、０．５ｍｌのＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．５ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、全量を２．５ｍｌとした。
【００２５】
Ｃ．リンパ球懸濁液の作製
−８０℃に保存しておいたリンパ球（１×１０７細胞）を３７℃培養器（アステック社  ＡＣ−１６５）にて解凍した後に５０ｍｌチューブに移し、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地を加えた後、４００×ｇにて常温で５分間遠心分離した。上清を除去した後、２．５ｍｌのＥＲＤＦ培地を加え、リンパ球を懸濁し、４×１０６細胞／ｍｌとなるように調製した。
【００２６】
Ｄ．細胞培養の条件
９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３０７２）に、Ａ．で調製した試料溶液を１００μｌ、Ｂ．で調製した免疫賦活液を５０μｌ、Ｃで調製したリンパ球懸濁液を５０μｌ注入し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒに調整した培養器（アステック社  ＡＣＩ−１６５）内で、１０日間培養した。
【００２７】
細胞回収
上記の９６ウェルプレートの各ウェルからピペットマン（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｐ−２００）を用いて１００μｌずつ培養液を回収した。培養液を回収した後の各ウェルに５０μｌのトリパンブルー溶液を加え、血球計算盤（ミナトメディカル  ＫＡ−１１５  ビルケンチュルク型）にて生細胞数と死細胞数をカウンター（ライオン事務機  ２２７−０１）を用いて計測した。
【００２８】
ＩｇＥ量のＥＬＩＳＡによる測定
１０ｍｌの１５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．６）、５μｌのヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（バイオソース・インターナショナル  ＡＨＩ−１８０１）、５μｌのヤギ抗ヒトλ鎖ポリクローナル抗体（バイオソース・インターナショナル  ＡＨＩ−１９０１）を混合したものを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌ／ウェルになるよう加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、３００μｌ／ウェルとなるようにＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。その後、３００μｌ／ウェルとなるように１％  ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を３００μｌ／ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。１０００ｎｇ／ｍｌの標準ＩｇＥ溶液から３倍希釈した標準希釈系列（３３３、１１１、３７．０、１２．３、４．１２、１．３７、０．４６、０．１５２ｎｇ／ｍｌ）を作成し、標準希釈系列または回収した培養上清を各々５０μｌ／ウェルになるようにウェルに加え、室温で２時間静置した後、ウェル溶液を廃棄した。その後、３００μｌ／ウェルとなるようにＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。次に、１０ｍｌの１％  ＢＳＡ／ＰＢＳと５μｌのＨＲＰ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＥポリクローナル抗体（バイオソース・インターナショナル  ＡＨＩ  ０５０４）を混合し、１００μｌ／ウェルになるよう各々のウェルに加え、室温で２時間静置した後、ウェルの溶液を廃棄した。その後、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を３００μｌ／ウェルになるように加えた後にウェルの溶液を廃棄する操作を３回繰り返した。そして４．５ｍｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ  ４．０）（０．１Ｍクエン酸、０．００６％Ｈ２Ｏ２）に０．５０ｍｇのＡＢＴＳ（Ｗａｋｏ  ０１８  １０３１１）を溶解して作製した液を１００μｌ／ウェルになるように加えた後、プレートリーダー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ．  ＮＪ２３００）にて４１９ｎｍ（Ｓｕｂ．４９０ｎｍ）の吸光度を１５分後、３０分後、４５分後に測定した。各培養上清からのＩｇＥは標準ＩｇＥをプロットした検量線から求めた。生細胞の割合から、ＩｇＥ量の補正を行った。結果を表１に示した。
【００２９】
【表１】
2005041822.tif 000002
注）蜂蜜無添加の時のＩｇＥ産生量を１．００とした。
【００３０】
表１により、中国産レンゲ由来の蜂蜜のＩｇＥ抗体産生抑制効果は試験した他の蜂蜜よりも高いことが認められた。