(57)【要約】【課題】乳酸菌生菌を保護するためのＤＮＡ複合体混合物を提供する。【解決手段】ＤＮＡと、カラギーナン及びゼラチンを含むゲル化剤と、乳酸菌生菌を含む乳化物と、澱粉からなる、乳酸菌生菌を保護するためのＤＮＡ複合体混合物であって、前記ＤＮＡ複合体混合物１００質量％に基づいて、ＤＮＡ２質量％ないし１０質量％、カラギーナン０．６質量％ないし１．２質量％及びゼラチン１０質量％ないし１７質量％を含み、そして前記澱粉／前記乳化物の質量比が１．０ないし２．５であるＤＮＡ複合体混合物。本発明のＤＮＡ複合体混合物は、乳酸菌生菌の腸への送達率が良好であり、乳酸菌生菌の持つ感染防御効果、腸内腐敗防止効果、腸管運動促進効果及び免疫賦活効果を十分に活用することができ、そのまま液状又はゲル状の健康食品に加工し易く、特に飲用又は食用のヨーグルト製品等の発酵乳製品の材料として利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡと、カラギーナン及びゼラチンを含むゲル化剤と、乳酸菌生菌を含む乳化物と、澱粉からなる、乳酸菌生菌を保護するためのＤＮＡ複合体混合物であって、
前記ＤＮＡ複合体混合物１００質量％に基づいて、ＤＮＡ２質量％ないし１０質量％、カラギーナン０．６質量％ないし１．２質量％及びゼラチン１０質量％ないし１７質量％を含み、そして
前記澱粉／前記乳化物の質量比が１．０ないし２．５であることを特徴とするＤＮＡ複合体混合物。
【請求項２】
前記乳化物が、乳酸菌生菌を含む液体を乳化剤と油脂により乳化した乳化物であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ複合体混合物。
【請求項３】
乳酸菌生菌を含む前記液体がヨーグルトであることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ複合体混合物。
【請求項４】
前記ＤＮＡが魚類精巣由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ複合体混合物。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡ複合体混合物を含む健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口摂取した乳酸菌生菌を胃液から保護し、多くの乳酸菌生菌を生きたまま腸に送達することが可能な、乳酸菌生菌を保護するためのＤＮＡ複合体混合物、及び該ＤＮＡ複合体混合物を含む健康食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は人間を含む動物の腸に存在する、健康に有益な菌種として良く知られている。しかしながら、老化、抗生物質等の薬剤の使用、ストレスや胃腸消化システムの不調などが要因となって、腸内に存在する各種の菌叢のバランスが崩れ、有害細菌が優位となることにより、動物の腸内における乳酸菌の有益な作用が低減する。そこで、腸内で有用な乳酸菌を補充するための、ヨーグルトに代表される様々な乳酸菌を含む健康食品が販売されている。
しかし、腸内において有用な乳酸菌の多くは酸性条件下での生存率が低く、乳酸菌生菌を経口摂取した場合、腸に送達される以前に胃において、ｐＨが低い胃液により生菌数が大幅に減少する。従って、多くの乳酸菌を含む健康食品において、腸まで送達される乳酸菌生菌数は、経口摂取した健康食品全体に含まれる乳酸菌生菌数に比較して非常に僅かであり、乳酸菌生菌の腸への送達効率は極めて悪い。
【０００３】
発酵乳等の乳酸菌生菌を含む健康食品を摂取するに際し、腸にできるだけ多くの乳酸菌生菌を送達するため、多くの研究が行われている。
経口摂取において腸にできるだけ多くの乳酸菌生菌を送達するための方策としては以下に示すアプローチが知られている。
第一のアプローチは、健康食品に添加する乳酸菌を増加させることである。しかし、必要以上の乳酸菌の添加は健康食品のコストを高め、また健康食品の味、風味等に影響を与える。
第二のアプローチは、酸に強い乳酸菌を利用することである。このため、例えば耐酸性の高い菌株又は変異株を利用する方法がある（例えば、特開昭５８−２２４６８５号公報及び特開平５−２３６９４５号公報を参照）。しかしながら、このような特殊な乳酸菌は、健康食品の味、風味や口当たりに影響を及ぼすこともあり、また、特殊な培養条件等を必要とすることもある。
第三のアプローチは、健康食品に特殊な物質を添加することにより、経口摂取した場合の胃酸分泌を抑制し、乳酸菌を保護しようとするものである。例えば特開平５−２０７８４６号公報では、発酵乳又は乳酸菌飲料に乳から分離された胃酸分泌抑制作用のあるペプチド画分を添加含有させることによって、胃における胃酸分泌作用を抑制して、乳酸菌を胃で死滅させることなく活性を維持したまま腸に到達させる発酵乳又は乳酸菌飲料を開示している。しかし、このような特別な物質を調製するには、健康食品の製造工程とは別の工程が必要となり、コストがかかる。
第四のアプローチは、乳酸菌菌体粉末を胃液から保護するため、乳酸菌菌体粉末を胃液で溶解しない物質で被覆することである。例えば特開平５−１８６３３６号公報は、乾燥乳酸菌粉末を油脂、賦形剤及び含水アルコール可溶性タンパク質を含有する層と含水アルコール可溶性タンパク質を含有する層で被覆してなる腸溶性造粒物を開示しているが、この造粒物は乳酸菌を乾燥物（粉末）として摂取することが想定されるものであり、粉末以外の形態の乳酸菌に適用することは困難である。
【特許文献１】特開昭５８−２２４６８５号公報
【特許文献２】特開平５−２３６９４５号公報
【特許文献３】特開平５−２０７８４６号公報
【特許文献４】特開平５−１８６３３６号公報
【０００４】
前述の第一ないし第四のアプローチは、何れも問題点を有している。そこで、本発明者らは、油脂と乳化剤を、乳酸菌生菌を含む液体に加えて該液体を乳化させ、得られた乳化物に、胃中では消化され難い、核酸とゲル化剤と水からなる水不溶性の複合体を混合することにより、乳酸菌生菌を胃液から保護することができるという新しい知見に基づき、特開２００３−３３４０６５公報において、乳酸菌生菌を保護するための核酸複合体及び、該核酸複合体と乳化物の混合物である核酸複合体混合物を提案した。
【特許文献５】特開２００３−３３４０６５公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、乳酸菌生菌を胃液から更に効果的に保護すべく鋭意研究を続けた結果、ＤＮＡと、カラギーナン及びゼラチンを含むゲル化剤と、乳酸菌生菌を含む乳化物と、澱粉からなる、乳酸菌生菌を保護するためのＤＮＡ複合体混合物であって、各成分が好適な比率で混合された混合物を見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本請求項１のＤＮＡ複合体混合物は、ＤＮＡと、カラギーナン及びゼラチンを含むゲル化剤と、乳酸菌生菌を含む乳化物と、澱粉からなる、乳酸菌生菌を保護するためのＤＮＡ複合体混合物であって、
前記ＤＮＡ複合体混合物１００質量％に基づいて、ＤＮＡ２質量％ないし１０質量％、カラギーナン０．６質量％ないし１．２質量％及びゼラチン１０質量％ないし１７質量％を含み、そして
前記澱粉／前記乳化物の質量比が１．０ないし２．５であることを特徴とする。
本請求項２のＤＮＡ複合体混合物は、前記乳化物が、乳酸菌生菌を含む液体を乳化剤と油脂により乳化した乳化物であることを特徴とする。
本請求項３のＤＮＡ複合体混合物は、乳酸菌生菌を含む前記液体がヨーグルトであることを特徴とする。
本請求項４のＤＮＡ複合体混合物は、前記ＤＮＡが魚類精巣由来のＤＮＡであることを特徴とする。
本請求項５の健康食品は、本請求項１のＤＮＡ複合体混合物を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本請求項１のＤＮＡ複合体混合物は、ＤＮＡ、カラギーナン、ゼラチン及び澱粉を好適な比率で含むため、乳酸菌生菌の腸への送達率が良好であり、乳酸菌生菌の持つ感染防御効果、腸内腐敗防止効果、腸管運動促進効果及び免疫賦活効果を十分に活用することができる。また、本請求項１のＤＮＡ複合体混合物はゲル状であり、そのまま液状又はゲル状の健康食品に加工し易く、特に飲用又は食用のヨーグルト製品等の発酵乳製品の材料として利用することができ、更に他の乳酸菌生菌を利用する健康食品の材料としても使用することができる。
本請求項２のＤＮＡ複合体混合物は、乳酸菌生菌を含む液体を乳化剤と油脂により乳化して乳化物を調製するので、乳酸菌生菌を油脂層により、水性で且つ酸性の胃酸から保護することができる。
本請求項３のＤＮＡ複合体混合物は、乳酸菌生菌を含む液体としてヨーグルトを使用するので、利用し得る乳酸菌生菌の種類が多く、また乳酸菌生菌の入手が容易である。
本請求項４のＤＮＡ複合体混合物は、ＤＮＡの材料として、従来、利用価値に乏しく廃棄されることが多い魚類精巣由来のＤＮＡを利用するので、資源の有効利用の面で好ましい。
本請求項５の健康食品は、製造に際しコストのかかる特別な工程又は材料を必要とせず、種々の食品材料に本請求項１のＤＮＡ複合体混合物を添加又は混合するのみでよく、有
用な乳酸菌生菌を経口摂取により効率的に腸に送達することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
＜ＤＮＡについて＞
胃液中に核酸分解酵素が存在しないので、ＤＮＡは胃中では分解され難い。一本鎖ＤＮＡは多くのリン酸基を有し、ＤＮＡがポリアニオン天然高分子であることが知られているので、ポリカチオン高分子であるゼラチンのようなゲル化剤と反応させることによって、水不溶性のゲル状の複合体を形成する。
本発明のＤＮＡ複合体混合物に使用するＤＮＡは種々の態様のものでよく、例えば、二本鎖、一本鎖又は環状のＤＮＡであってよい。ＤＮＡの供給源は、動物、植物、微生物等の様々な生物である。水産加工上の廃棄物である、魚類特にサケ、ニシン、タラの精巣（白子）は、とりわけＤＮＡを多く含むが、従来、資源として有効に利用されず、多くが廃棄されていた。それ故、廃棄物の資源化という観点から、これらの精巣由来のＤＮＡを利用することは望ましい。また、哺乳動物や鳥類、例えばウシ、ブタ、ニワトリ等の胸腺から得られるＤＮＡを使用することができる。更に、合成ＤＮＡもまた使用することができる。
ＤＮＡ複合体混合物におけるＤＮＡの配合比率は、ＤＮＡ複合体混合物１００質量％に基づいて、２質量％ないし１０重量％、好ましくは３重量％ないし５重量％である。
【０００９】
＜ゲル化剤について＞
本発明のＤＮＡ複合体混合物に使用するゲル化剤は、ＤＮＡと反応して、水不溶性のゲル状の複合体を形成し得るポリカチオン高分子である。ゲル化剤としては、カラギーナン（κ−カラギーナン、ι−カラギーナン及びλ−カラギーナン）とゼラチンの混合物を使用する。カラギーナンのうち、κ−カラギーナンは特に好ましい。
ＤＮＡ複合体混合物におけるカラギーナンの配合比率は、ＤＮＡ複合体混合物１００質量％に基づいて、０．６質量％ないし１．２質量％、好ましくは０．７質量％ないし１．０質量％である。
ＤＮＡ複合体混合物におけるゼラチンの配合比率は、ＤＮＡ複合体混合物１００質量％に基づいて、ゼラチン１０質量％ないし１７質量％、好ましくは１２質量％ないし１６質量％である。
【００１０】
＜乳酸菌について＞
本発明のＤＮＡ複合体混合物に利用する乳酸菌は、一般に腸内で活性のある乳酸菌としてヨーグルト等の発酵乳や乳酸菌飲料等の発酵乳製品に広く用いられている乳酸菌が好ましい。
乳酸菌は、例えば、いわゆるビフィズス菌と称されるビフィドバクテリウム (Bifidobacterium ）属［例えばビフィドバクテリウム  ビフィダム（B. bifidum) ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム  インファンティス(B. infantis) 、ビフィドバクテリウム  アドレセンティス（B. adolesentis）、ビフィドバクテリウム  ロンガム（B. longam ）等］、また、ラクトバチルス（Lactobacillius) 属［例えばラクトバチルス  ブルガリカス（L. Bulgaricus ）ラクトバチルス  アシドフィルス（L. acidophilus) 、ラクトバチルス  カゼイ（L. casei. ）、ラクトバチルス  ブレビス（L. brevis ）  ラクトバチルス  プランタルム(L.plantarum) 、ラクトバチルス  サルバリス（L. salivarius ）、ラクトバチルス  ファーメンタム（L.fermentum ）、ラクトバチルス  ロイテリ（L.reuteri ）等］、ストレプトコッカス（Streptococcus ）属［例えばストレプトコッカス  フェーカリス（S.faecalis）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（S. thermophilus ）、ストレプトコッカス  ラクティス（S. lactis ）等］、エンテロコッカス（Enterococcus）属［例えばエンテロコッカス  フェーカリス(E.feacalis ）等］のようなものであるが、これらには限定されない。
これらの乳酸菌は生菌を含む液体、特に水性溶液にて使用することができる。従って、
菌体をあらかじめ、被覆等にて処理する必要はない。また、乳酸菌生菌を含む液体は、例えばゲル状、液状のヨーグルト、乳酸菌飲料をそのまま利用してよい。
【００１１】
＜乳化物について＞
乳酸菌生菌を含む乳化物は、例えば、乳酸菌生菌を含む液体（例えばヨーグルト）を乳化剤と油脂により乳化した乳化物である。
乳化剤は、例えば、レシチン、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等である。なかでも、レシチンが好ましい。
乳化剤と共に使用する油脂は、カカオ脂、パーム油、ヤシ油、大豆油、菜種油などの植物性油脂又はそれらを硬化させた硬化油等の固体脂や食用ワックス、更には鯨油、豚脂、牛脂等の動物性油脂である。なかでも、カカオ脂はもっとも好ましい。
乳化物中の乳化剤と油脂と乳酸菌生菌を含む液体の好ましい配合比率は、乳化物１００質量％に基づいて、乳酸菌生菌を含む液体２０質量％ないし６０質量％、乳化剤０．０１質量％ないし１０質量％及び油脂２０質量％ないし６０質量％である。
【００１２】
＜澱粉について＞
澱粉は、乳化物（例えば、油脂としてカカオ脂を使用した場合は、固形状態の乳化物）をＤＮＡ複合体混合物中に均一に分散させるために重要な役割を果たす。澱粉は、例えばジャガイモ澱粉、トウモロコシ澱粉等の慣用の澱粉であってよい。
澱粉の配合比率は、乳化物に対する質量比（澱粉／乳化物の質量比）で１．０ないし２．５、好ましくは１．５ないし２．５である。
【００１３】
＜本発明の好ましいＤＮＡ複合体混合物について＞
上述した成分を適宜組み合わせて得られる本発明のＤＮＡ複合体混合物のうち、好ましいものの例は、例えば、乳酸菌生菌を含むヨーグルトを、レシチンを乳化剤として、油脂であるカカオ脂中に乳化し、固化した後、固形乳化物を澱粉と共に粉砕し、得られた粉末を、前記のいずれかのＤＮＡと、カラギーナン及びゼラチンの混合水溶液と混合し、均一に分散することにより調製して得られるＤＮＡ複合体混合物である。
【００１４】
＜本発明のＤＮＡ複合体混合物の好ましい製造方法について＞
本発明のＤＮＡ複合体混合物の好ましい製造方法は、例えば、乳化剤としてのレシチンと油脂としてのココア脂とを３０℃ないし４０℃、好ましくは３５℃で混合し、この温度にて、攪拌している混合液に乳酸菌生菌を含む液体としてのヨーグルトを徐々に滴下して、ヨーグルト乳液を調製し、この乳液を２℃ないし１０℃、好ましくは４℃付近まで冷却して固化する。得られた固体を増粘剤としての澱粉と一緒にすり鉢で粉砕し、得られた粉末を、ＤＮＡ、カラギーナン、ゼラチン及び蒸留水により調製した複合体混合液に攪拌しながら添加し、均一に分散して核酸複合体混合物とする方法である。
【００１５】
＜本発明のＤＮＡ複合体混合物を含む健康食品について＞
本発明のＤＮＡ複合体混合物は、ゲル状の物質であるので、そのまま又は他の慣用の調味剤、風味剤、甘味剤、果物等の混合物を添加することにより又は各種の発酵乳製品と更にブレンドすることにより、所望の形態の発酵乳製品、特に飲用又は食用のヨーグルト製品として利用することができる。また、口当たりや流動性を変更・調整することにより、更に乳酸菌生菌を利用する発酵健康食品用材料として、例えば、種々な乳酸菌発酵飲料やフローズンヨーグルト、アイスクリーム、ゼリー、キャンディー、グミ等を含む健康食品に適用することができる。
【実施例】
【００１６】
以下に示す実施例において、本発明を更に詳細に説明する。
Ａ．材料及び試験方法
Ｉ．材料
ＤＮＡ−Ｎa ［一本鎖ＤＮＡ、重量平均分子量（Ｍw ）約１０００００］を日本化学食品社より購入した。本研究に使用した飲むヨーグルトは、乳酸菌二菌株ラクトバシラス  ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)２０３８及びストレプトコッカス  サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)１１３１からなる、明治乳業社の製品である。カカオ脂は、メルクホエイ社（Merck Hoei) から購入した。ゼラチン、κ−カラギーナン、レシチン（大豆よりのレシチン）及びジャガイモ澱粉は、ワコー社から購入した。
擬似胃液として使用したペプシン溶液は、ペプシン（ワコー社製）３．２ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）２．０ｇ及び塩酸（ＨＣｌ）７ｍＬを蒸留水に溶解し、１０００ｍＬ（ｐＨ１．２）に調節して調製した。膵液である擬似腸液は、燐酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）６．９ｇ、パンクレアチン（ワコー社製）１０．０ｇ及び０．２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液１９０ｍＬを蒸留水に溶解し、１０００ｍＬ（ｐＨ７．５）に調節して調製した。
【００１７】
II．ＤＮＡとゼラチンの複合体の形成に対するｐＨの影響
ＤＮＡとゼラチンの間の複合体形成へのｐＨの影響を調べるために、５質量％ＤＮＡ溶液を、様々なｐＨ値の５質量％ゼラチン燐酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）緩衝溶液と混合した。各々の溶液の吸光度を５７０ｎｍで測定した。
【００１８】
III ．胃液への浸出抑制に関するＤＮＡ、ゼラチン及びκ−カラギーナンの相乗効果
ＤＮＡ、ゼラチン及びκ−カラギーナンの組み合わせの相乗効果を、モデル化合物であるメチルオレンジの、ＤＮＡ／ゼラチンゲル、ゼラチン／κ−カラギーナンゲル及びＤＮＡ／ゼラチン／κ−カラギーナンゲルからの放出量を測定することにより調べた。ゲルからのメチルオレンジの放出量は、１ｇのゲルを５００ｍＬの擬似胃液に加え、適当な保温時間にて溶液の５０９ｎｍでの吸光度の経時変化を測定することにより調べた。
【００１９】
IV．複合ゲルの調製及び最適化
油中水の乳液をハチェック（Hatschek）蒸散法により調製した。ヨーグルトを噴射空気と共に３５℃で細いノズルを通過させることにより、カカオ脂４９質量％及びレシチン２質量％を含む油相に徐々に滴下した。得られた水性乳液を冷却後４℃で固化し、固化した乳化物２ｇをジャガイモ澱粉３ｇと共に粉砕した。この混合物を次に、蒸留水１００ｍＬ中ＤＮＡ５ｇ、ゼラチン１２ｇ及びκ−カラギーナン０．８ｇからなるゲル溶液に３５℃で分散させた。調製したゲルを１０℃で冷蔵庫内に保存した。調製したゲルにおける乳酸菌生菌の増殖能力を、擬似胃液処理の前後で測定した。
ゲルの保護能力を高めるため、κ−カラギーナン、ゼラチン及びＤＮＡについて、最適な配合量を求めた。ゲル組成物中のκ−カラギーナン、ゼラチン及びＤＮＡの最適な配合量の指標として、擬似胃液における菌の生存率（％）を使用した。まず、κ−カラギーナンの量を様々に変化させ、蒸留水１００ｍＬ中、乳液６．７ｇ、澱粉１０ｇ、ＤＮＡ５ｇ及びゼラチン１２ｇを用いてゲルを調製した。最適化したκ−カラギーナンの配合量を、次に、乳化物、澱粉、ＤＮＡ及び水の配合量を固定したままゼラチンの配合量を最適化するために使用した。乳酸菌生菌の生存率を、様々な配合量のゼラチンを用いて調製したゲルにおいて測定した。最後に、乳化物、澱粉及び水の配合量、並びに最適化したゼラチン及びκ‐カラギーナンの配合量を固定することにより、最適なＤＮＡの配合量を求めた。乳酸菌生菌の生存率を、様々な配合量のＤＮＡを用いて調整したゲルにおいて測定した。
更に、乳酸菌生菌の生存率に対するの澱粉の影響を調べた。最適化した配合量のκ‐カラギーナン、ゼラチン及びＤＮＡ並びに水１００ｇからなり、乳液の澱粉に対する割合が、１：０、１：０．５、１：１、１：１．５、１：２及び１：２．５であるゲルを調製し、擬似胃液における乳酸菌生菌の生存率を測定した。
【００２０】
乳酸菌生菌の増殖能力及び乳酸菌生菌の生存率の算出
擬似胃腸液における菌の生存率の試験管内での検討は、１５０ｍＬの擬似胃液（ｐＨ１．２）内で複合ゲルのキューブ（１．５×１．５×２ｃｍ3 ）を３７±２℃で２時間保温することにより行った。次に、保温を、１５０ｍＬの擬似腸液（ｐＨ７．５）内で３７±２℃で６時間延長して行った。複合ゲルのサンプリングは、保温前、擬似胃液内保温２時間後、及び擬似腸液内保温６時間後に行った。
ゲル内での乳酸菌生菌の増殖能力は、生菌算出法（viable count technique）により測定した。ゲルの無菌サンプリングを、擬似胃腸液条件下で保温の前後に行った。ゲル（１ｇ）を９ｍＬの正常食塩水緩衝液（０．８５質量％ＮａＣｌ溶液）に再懸濁し、続いてストマッカー（Stomacher 80 Biomaster；オルガノ社製）にて、２３０ｒｐｍで５分間均質化した。均質化した溶液を正常食塩水に懸濁し、逐次希釈した。０．１ｍＬの適切な希釈液をＭＲＳ寒天［商標名オキソイド(Oxoid) 、英国のハンプシャー(Hampshire) 社製］に塗布し、その後、嫌気条件下３７℃にて４８時間保温した。乳酸菌生菌の生存能力は、コロニー形成ユニット（ＣＰＵ）／ゲル１ｇ／ヨーグルト１ｍＬとして記録した。また乳酸菌生菌の生存率は、下記の方程式を用いて算出した。
生存率（％）＝（Ｖi ／Ｖ0 ）×１００
（式中、Ｖ0 及びＶi は、それぞれ擬似胃液内での処理の前後の複合ゲルにおける乳酸菌生菌の生存能力である。）
【００２１】
乳酸菌の形態学的特徴付け
５ｋＶ及び１０ｋＶの加速電圧で操作する日立Ｓ−２３８０Ｎ電子顕微鏡を用いて、走査顕微鏡検査（ＳＥＭ）を行った。観察に先立ち、日立Ｅ−１０３０イオンスパッターを用いて試験片のＰｔ／Ｐｄスパッターを行った。
【００２２】
Ｂ．結果及び検討
Ｉ．ＤＮＡとゼラチンの複合体の形成に関するｐＨの影響
ＤＮＡとゼラチンの複合体の形成が起きた場合、不溶性の複合体粒子により生じる光の散乱のために５７０ｎｍでの吸光度が増加する。図２に、様々なｐＨ値（横軸）でのＮａ2 ＨＰＯ4 緩衝液における保温後の、ＤＮＡ溶液（白四角）、ゼラチン溶液（白丸）及びＤＮＡ／ゼラチン溶液（黒菱形）の５７０ｎｍにおける吸光度（縦軸）を示す。図２から明らかなように、ＤＮＡ／ゼラチン溶液は、ｐＨ値４以下において、ＤＮＡ溶液の吸光度とゼラチン溶液の吸光度の合計値よりも高い、５７０ｎｍにおける吸光度を示す。この結果は、ＤＮＡとゼラチンの複合体の形成が、ｐＨ値４以下にて起こることを示している。
【００２３】
II．胃酸に対するＤＮＡ、ゼラチン及びκ−カラギーナンの相乗効果
図３に、各種ゲルから放出されたメチルオレンジのプロフィルを示す。図３の縦軸は、擬似胃液内で処理された場合のＤＮＡ／ゼラチンゲル（白三角）、ゼラチン／κ−カラギーナンゲル（白丸）、及びＤＮＡ／ゼラチン／κ−カラギーナンゲル（黒四角）から放出されたメチルオレンジの質量％を示し、図３の横軸は、経過時間（時間）を示す。
図３から明らかなように、ＤＮＡ／ゼラチンゲルでは、メチルオレンジの殆ど全てが３０分未満で放出され、ゼラチン／κ−カラギーナンゲルでは、約３０分で放出されたが、ＤＮＡ／ゼラチン／κ−カラギーナンゲルでは、約２時間後でも、メチルオレンジの放出率は７０質量％未満であった。
前記の結果は、ＤＮＡ、ゼラチン及びκ−カラギーナンゲルのうち２成分から作られたゲルの各々は、３成分全てを用いて作られたゲルに比較して、酸性の擬似胃液に抗して、メチルオレンジをゲル内に保持する能力が劣ることを示している。この結果は、ＤＮＡ、ゼラチン及びκ−カラギーナンからなるゲルが、該ゲル内に保持した物質が擬似胃液に浸出することを抑制する効果に関し、相乗効果を有することを示している。
【００２４】
III ．ゲルの形態
ヒドロゲル形成時のＤＮＡの役割を、走査電子顕微鏡を使用して以下の通り調べた。ＤＮＡの非存在下及び存在下における複合ゲルの状態を、複合ゲルの擬似胃液内での保温の前後に走査電子顕微鏡で観察した。複合ゲル内にＤＮＡが存在する場合は、ＤＮＡ非存在のゲルと比較してより鮮明なネットワーク状構造が観察された。従って、ＤＮＡは複合体形成において重要であることが推察される。
【００２５】
IV．ゲルの最適化及び擬似胃腸液内での乳酸菌生菌の生存率
図１は、ゲル中の各成分（κ−カラギーナン、ゼラチン及びＤＮＡ）の濃度を変化させた場合の、乳酸菌生菌の生存率に対する影響を示す。試料数は３〜７であり、図１中の各データを平均±標準偏差で示す。
図１（ａ）はゲル中のκ−カラギーナンの濃度を変化させた場合の、図１（ｂ）はゲル中のゼラチンの濃度を変化させた場合の、そして図１（ｃ）はゲル中のＤＮＡの濃度を変化させた場合の、乳酸菌生菌の生存率に対する影響を示す。
図１（ａ）において、ゲルは、乳液６．７ｇ、澱粉１０ｇ、ＤＮＡ５ｇ、ゼラチン１２ｇ及び水１００ｇを用い、κ−カラギーナンの量は変化させて調製した。図１（ａ）に示すように、κ‐カラギーナン０．９質量％が含まれる場合、ゲルは、擬似胃液内の乳酸菌生菌に対し最も高い保護能力を示した。κ−カラギーナンが存在しないと、ゲルは擬似胃液中に殆ど完全に溶解した。
κ−カラギーナンの最適量を、ゼラチン濃度の乳酸菌生菌の生存率への影響を調べるために使用した。ゲル中のＤＮＡ、乳化物、澱粉及び水の量も固定した。図１（ｂ）において、ゲルは、乳液６．７ｇ、澱粉１０ｇ、ＤＮＡ５ｇ、κ−カラギーナン０．９ｇ及び水１００ｇを用い、ゼラチンの量は変化させて調製した。１３質量％のゼラチンが、ゲル中の乳酸菌生菌の生存率を高めるために最も効果的だった。
最後に、乳化物、澱粉、水並びにκ−カラギーナン及びゼラチンの量を固定して、ゲル中の乳酸菌生菌の生存率に対するＤＮＡ濃度の影響を調べた。図１（ｃ）において、ゲルは、乳液６．７ｇ、澱粉１０ｇ、ゼラチン１３ｇ、κ−カラギーナン０．９ｇ及び水１００ｇを用い、ＤＮＡの量は変化させて調製した。４質量％のＤＮＡが、ゲル中の乳酸菌生菌の生存率を高めるために最も効果的だった。
【００２６】
Ｖ．ゲル中での乳酸菌生菌の生存率への澱粉の影響
ゲル中での乳酸菌生菌の生存率への澱粉の影響を調べた結果を下記表１に示す。
表１：ゲル中での乳酸菌生菌の生存率への澱粉の影響
────────────────────────────
澱粉／乳化物の質量比                生存率（％）
────────────────────────────
０                                  ＿＿＿a 
０．５                              ０．０７±０．０４
１．０                              １．０５±０．０５
１．５                              ５．７７±０．１１
２．０                              ５．８９±０．０４
２．５                              ２．４８±０．３８
────────────────────────────
各数値は、３回の試験の平均±標準偏差である。
ａ）固化した乳化物は粉砕することができず、ゲル中に均一に分散させることができなかった。それ故、生存率は測定しなかった。
澱粉は、ゲルを調製する際の粉砕工程において、固化した乳化物をゲル中に均一に分散させるうえで重要な役割を果たす。澱粉が存在しないと、乳化物をゲル中に均一に分散させることができなかった。澱粉／乳化物の２／１の質量比が、擬似胃液中での試験におい
て乳酸菌生菌の生存率を高めるうえで最も効果的であった。
【００２７】
VI．本発明のＤＮＡ複合体混合物中での乳酸菌生菌の生存数
本発明のＤＮＡ複合体混合物を調製し、擬似胃腸液中で試験した。対照として、ヨーグルトについても同様に試験した。すなわち、保温前、擬似胃液（ｐＨ１．２）中での保温２時間後及び擬似腸液（ｐＨ７．５）内での６時間の延長された保温後に、乳酸菌生菌の生存数を調べた。結果を表２に示す。
表２：擬似胃液中及び擬似腸液中での試験後における、本発明のＤＮＡ複合体混合物及びヨーグルト中に存在する乳酸菌生菌の数
【表１】
2005312392.tif 000003
表２中の乳酸菌生菌の数は、３回の試験の平均値±標準偏差である。
ａ）擬似胃液（ＳＧＪ）内での保温条件：ｐＨ１．２で３７±２℃にて２時間。
ｂ）擬似腸液（ＳＩＪ）内での延長した保温条件：ｐＨ７．５で３７±２℃にて６時間。ｃ）５ｍＬのヨーグルトを２０ｍＬのペプシン溶液内で培養し、２時間培養後に、菌の生存数を調べた。
ｄ）生菌の数を検出することができなかった（検出限界：１０3 ＣＦＵ/ ｍＬ）。
ｅ）試験を行なわなかった。
【００２８】
表２に示すように、本発明のＤＮＡ複合体混合物においては、処理前のゲル内のものと比較して、擬似胃液内での培養後５．８１％の乳酸菌の生存率が確認された。これに対して、同一の培養条件下でのヨーグルトにおいては、生存している乳酸菌生菌を検出することができなかった。更に、擬似胃液内にて生存した乳酸菌は擬似腸液内で成長し、菌の数を増やすことができた。従って、本発明のＤＮＡ複合体混合物は、腸内に有用な乳酸菌を送達するために有用であることが判る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ゲル中の各成分（κ−カラギーナン、ゼラチン及びＤＮＡ）の濃度を変化させた場合の、乳酸菌生菌の生存率に対する影響を示す図である。
【図２】図２は、様々なｐＨ値でのＮａ2 ＨＰＯ4 緩衝液における保温後の、ＤＮＡ溶液、ゼラチン溶液及びＤＮＡ／ゼラチン溶液の５７０ｎｍにおける吸光度を示す図である。
【図３】図３は、各種ゲルから放出されたメチルオレンジの質量％の経時変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
2005312392.tif 000005
【図３】
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