(57)【要約】【課題】  心筋細胞アポトーシス抑制剤の提供。【解決手段】  ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する心筋細胞アポトーシス抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する心筋細胞アポトーシス抑制剤。
【請求項２】
ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＢｃｌ−２破壊抑制剤。
【請求項３】
ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＴＰ開孔抑制剤。
【請求項４】
ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する心筋障害の予防剤および／または治療剤。
【請求項５】
心筋障害が、心筋梗塞または心不全である請求項４に記載の予防剤および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウルソデオキシコール酸を有効成分として含有する心筋細胞アポトーシス抑制剤、Ｂｃｌ−２破壊抑制剤、ＰＴＰ開孔抑制剤、ならびに心筋障害の予防剤および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血に続く再灌流の結果、Ｃａ２＋過負荷（非特許文献１）、酸素フリーラジカルの形成（非特許文献２）および酸化的リン酸化の抑制が生じ、ＡＴＰ産生の不全およびネクローシスが導かれる。ミトコンドリアは当該事象に重要な役割を担っており、細胞の生存が主としてミトコンドリアの変化に依存していることがよく知られている。その一方、ミトコンドリアを保護する薬剤もまた細胞の生存に重要である。
【０００３】
多くの型の細胞のネクローシスまたはアポトーシスの際には、ミトコンドリア機能、特にミトコンドリア内膜の潜在性非特定孔であるミトコンドリア透過性遷移孔（permeability transition pore; ＰＴＰ）が重要な役割を担うことが広く認識されている。実際、アポトーシスの際には、ミトコンドリア膜内外電位差（ΔΨｍ）の消失、カスパーゼ活性化因子の放出ならびにアポトーシス誘導およびアポトーシス阻害Ｂｃｌ−２（B cell lymphomal leukemia-2）ファミリータンパク質の蓄積が極めて重大な事象のようである。最近の研究によると、虚血に続く再灌流の結果、このＰＴＰが開孔してアポトーシスやネクローシスが生じること、そしてＰＴＰ開孔の抑制が、細胞の生死においてＰＴＰの中心的な役割を裏付ける細胞死を防ぐことが示されている（非特許文献３および４）。これらのことから、再灌流障害に続く膜透過性遷移を制御する薬剤の必要性が示唆される。
【０００４】
ウルソデオキシコール酸（以下、「ＵＤＣＡ」ともいう。）は胆汁鬱滞性肝疾患の有効な治療剤として臨床的に用いられる親水性胆汁酸塩である（非特許文献５、６および７）。ＵＤＣＡは、脂肪肝治療剤として（特許文献１）、また、胆汁鬱滞改善剤として（特許文献２）利用されている。
【０００５】
ＵＤＣＡによるアポトーシス制御の例として、ＵＤＣＡがラット肝癌細胞のアポトーシスを誘導すること（非特許文献８）、培養したラット神経細胞におけるビリルビン誘導アポトーシスが、ケノデオキシコール酸によって促進され、ＵＤＣＡによって抑制されること（非特許文献９）、あるいは、疎水性胆汁酸によって誘導された肝細胞のアポトーシスが、ＵＤＣＡのタウリン抱合体であるタウロウルソデオキシコール酸によって抑制されること（非特許文献１０）などの報告がある。また、最近の研究では、ＵＤＣＡが肝細胞のミトコンドリア膜透過性遷移（mitochondrial membrane permeability transition；ＭＰＴ）を阻害することによってアポトーシスを阻害することが示されている（非特許文献１１および１２）。しかしながら、ＵＤＣＡがＢｃｌ−２破壊抑制作用およびＰＴＰ開孔抑制作用を通じて心筋細胞アポトーシスを抑制することについてはこれまで知られていない。
【０００６】
また、これらの報告、すなわち、ＵＤＣＡという同じ物質であっても、ラット肝癌細胞のアポトーシスは誘導（促進）し、ラット神経細胞におけるアポトーシスは抑制する、あるいは、ＵＤＣＡをタウリン抱合体（タウロウルソデオキシコール酸）に変性すると、肝細胞のアポトーシスを抑制する、などの事実が示すように、ＵＤＣＡのようなアポトーシス制御物質の作用の態様と組織の関係は一様ではなく、特定組織のアポトーシスに対する結果をもって、別の組織に対する影響を予測することには限界がある。
【０００７】
【特許文献１】特許第３０３２３１５号公報
【特許文献２】国際公開第９４／２２８９６号パンフレット
【非特許文献１】Halestrap, A.P., 1999, Biochem. Soc. Symp. 66, 181-203.
【非特許文献２】Halestrap, A.P. et.al., 1998, Biochim. Biophys. Acta. 1366, 79-94.
【非特許文献３】Crompton, M., 1999, Biochem. J. 341, 233-249.
【非特許文献４】Zoratti, M, et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta. 1241, 139-176.
【非特許文献５】Poupon, R, et al., 1987, Apr 11, The Lancet. 1 (8537), 834-836.
【非特許文献６】Cirillo, N.W, et al., 1994, Sep., Am J Gastroenterol 89(9), 1447-1552.
【非特許文献７】Bellentani, S., et al., 1993, Nov., J Hepatol. 19(3), 459-464.
【非特許文献８】大山ら著「ラット肝発癌に及ぼすウルソデオキシコール酸の影響」：米子医誌 J Yonago Med Ass ５１，５０−６０，２０００
【非特許文献９】Rui F. M. Silva, et al. Journal of Hepatology 34(2001) 402-408
【非特許文献１０】Benz C, Stiehl A, et al. J. Hepatol. 28(1), 99-106, 1998
【非特許文献１１】Rodrigues, C. M. et al. 1998, Jun 15, J Clin Invest. 101(12), 2790-2799．
【非特許文献１２】Rodrigues, C. M. et al. 1999, Sep. Cell Death Differ. 6(9), 842-854.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、新規な心筋細胞アポトーシス抑制剤、Ｂｃｌ−２破壊抑制剤およびＰＴＰ開孔抑制剤の提供と、そのアポトーシス抑制作用に基づく心筋障害の予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の結果、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）が、Ｂｃｌ−２破壊抑制作用、ＰＴＰ開孔抑制作用を通じて心筋細胞アポトーシスの抑制作用を示すこと、また、そのアポトーシス抑制作用に基づき、心筋障害の予防および／または治療剤として有効に使用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する心筋細胞アポトーシス抑制剤。
〔２〕ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＢｃｌ−２破壊抑制剤。
〔３〕ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＰＴＰ開孔抑制剤。
〔４〕ウルソデオキシコール酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する心筋障害の予防剤および／または治療剤。
〔５〕心筋障害が、心筋梗塞または心不全である上記〔４〕に記載の予防剤および／または治療剤。
【００１１】
本発明者らは、今般、実施例に示すように、ＵＤＣＡが心臓の虚血−再灌流モデルにおいてＢｃｌ−２の破壊を抑制すること、ＰＴＰの開孔を抑制すること、および心筋のアポトーシスを抑制することを確認した。
心臓など個々の器官において虚血状態の持続は細胞死を意味し、再度血流を回復しても種々の障害を残す、あるいは引き起こすこととなることから、心臓の虚血−再灌流モデルの病態は、心筋梗塞、心不全等の心筋障害の病態に対応する。
したがって、ＵＤＣＡが心臓の虚血−再灌流モデルにおいて心筋のアポトーシスを抑制し得たことは、ＵＤＣＡが心筋梗塞、心不全等の心筋障害において心筋のアポトーシスを抑制し、病勢の進行を阻止して治癒に寄与することを意味している。すなわち、ＵＤＣＡは、心筋細胞アポトーシスと関連する各種心臓疾患の予防・治療剤として有効に用いることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の薬剤の有効成分であるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、Ｂｃｌ−２破壊抑制作用、ＰＴＰ開孔抑制作用を通じて心筋のアポトーシス抑制作用を示すことから、本発明の薬剤は、各種原因に由来する心臓疾患において心筋のアポトーシスを抑制し、心筋障害の進行を抑えて治癒に寄与する。したがって、本発明の薬剤は各種心臓疾患に対する新たな作用メカニズムに基づく予防・治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の薬剤が対象とする疾患としては、心筋細胞アポトーシスと関連する各種心筋障害、例えば、心筋梗塞、心不全などが挙げられる。
【００１４】
本発明の薬剤における有効成分は、遊離型のＵＤＣＡ、ＵＤＣＡの薬理学的に許容される塩のいずれであってもよい。
本発明において、ＵＤＣＡの薬理学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム、バリウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、あるいは、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
【００１５】
上記ＵＤＣＡまたはその薬理学的に許容される塩は、水和物あるいは溶媒和物であってもよい。
さらに、上記ＵＤＣＡまたはその薬理学的に許容される塩は、結晶状、非結晶状など、いずれの形態であってもよい。
【００１６】
このようなＵＤＣＡまたはその薬理学的に許容される塩は既知物質であり、自体公知の方法によって製造することができる。
【００１７】
本発明の薬剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、貼付剤、坐剤などの固形製剤、溶液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの液剤のいずれの製剤であってもよい。
本発明の薬剤は、製剤上の必要に応じて、適宜の薬理学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、コーティング剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤などを配合して製剤化される。必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、香味料などの添加剤を配合することもできる。
【００１８】
賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、コーンスターチ、Ｄ−マンニトール、デキストリン、結晶セルロース、アラビアゴム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、プルラン、軽質無水ケイ酸、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる
【００１９】
結合剤としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。
【００２０】
滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００２１】
崩壊剤としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、軽質無水ケイ酸、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
【００２２】
コーティング剤としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン  ８０、プルロニック  Ｆ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネートなどが挙げられる。
【００２３】
溶剤としては、精製水、生理的食塩水、リンゲル液、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、マクロゴールなどの親水性溶剤や、オリーブ油、ラッカセイ油、ゴマ油、ツバキ油、ナタネ油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、高級脂肪酸エステル、流動パラフィンなどの油性溶剤が挙げられる。
【００２４】
溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２５】
懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、アラビアゴム、ベントナイトなどが挙げられる。
【００２６】
乳化剤としては、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、コレステロール，卵黄、ベントナイト、ビーガム、セターノル、モノステアリン酸グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ステアリン酸などが挙げられる。
【００２７】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、フルクトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、サッカロース、グリセリン、尿素などが挙げられる。
【００２８】
防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００２９】
抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００３０】
着色剤としては、タール系色素、カラメル、ベンガラ、二酸化チタン、エリス・アンド・エベラールド社のＦＤ＆Ｃブルー２号ならびにＦＤ＆Ｃレッド４０号などのＦＤ＆Ｃ染料などが挙げられる。
【００３１】
甘味剤としては、アスパルテーム、アセスルフェームＫならびにタウマチンなどが挙げられる。
【００３２】
香味料としては、ミント、ラスベリー、甘草、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、カラメル、バニラ、チェリーならびにグレープフレーバーおよびその組合せたものが挙げられる。
【００３３】
本発明の薬剤の投与量は、疾患の種類、投与方法、病態、患者の年令などによっても異なるが、通常、成人に対し１日当り、経口で２０〜３０００ｍｇ、好ましくは１００〜１５００ｍｇ、静注で１０〜１２００ｍｇ、好ましくは３０〜６００ｍｇであり、これを１〜６回、好ましくは１〜３回に分割して投与する。
なお、ＵＤＣＡの急性毒性は、ＬＤ５０値として、マウスの場合、経口投与で１０．０ｇ／Ｋｇ以上、静脈内投与で２００ｍｇ／Ｋｇ以上、ラットでは経口投与で５．０ｇ／Ｋｇ以上、静脈内投与で３００ｍｇ／Ｋｇ以上である。
また、本発明の薬剤におけるＵＤＣＡの含有量は、薬剤全体の約０．０１重量％〜１００重量％とすることができる。
【００３４】
本発明の薬剤は、所望する目的に応じて適宜他の医薬と併せて用いることができる。例えば、心筋梗塞、心不全に対して本発明の化合物を用いる場合には、市販の心臓病薬と併せて治療に用いることができる。併用する場合にもその投与量は、併用する医薬の種類や薬効、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより適宜決定される。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３６】
なお、以下の実施例において、全ての結果は平均値±ＳＤとして表した。血液動態学における差異はｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いて算出した。他のパラメータは、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、それに引き続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ多重検定により解析した。０．０５より小さいＰ値を統計学的に有意であると考えた。
【００３７】
実施例１  ＵＤＣＡ前処理による梗塞サイズの低減
（方法）
２２０ｇ〜２５０ｇの体重の雄性ウィスターラット（以下の群１〜７、各群当り１６匹）をフェノバルビタールの腹腔内注射で麻酔し、小型Harvard rodent ventilator（South Natick、米国）を用いて挿管および酸素供給した。これらのラットの全てを左冠状動脈（ＬＣＡ）の閉塞の５分前に全身的にヘパリン化（５００ＩＵ／ｋｇ体重）した。
ラットの左冠状動脈（ＬＣＡ）の閉塞は、以前に述べたごとく行った（Zou, Z. et al. 2002 Nov. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283(5), H1968−1974）。閉塞の３０分後、係蹄を開放し、心筋層の再灌流を視覚的に確認し、１２０分間心臓を再灌流させた。再灌流の最後に、２％のエバンスブルー染色液の注入により危険領域を推定した。危険領域は、該染色液による陰性染色により決定され、梗塞領域は、１％トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色後の危険領域周囲の非染色領域として決定した。梗塞組織および危険帯の領域は“ＩＰ”ラボソフトウェア（Scanalytics, INC, version 3、米国）により決定し、梗塞サイズを全ＬＶのパーセンテージおよび危険領域のパーセンテージとして表した。
群１においては、何らの処置なしで、心臓は３０分の虚血、それに引き続く１２０分の再灌流を受けた。群２においては、動物は、虚血−再灌流を受ける前に溶媒点滴を受けた。群３においては、ラットは、虚血−再灌流前に、３０分間、静脈内点滴としてＵＤＣＡ４０ｍｇ／ｋｇ体重により処置した。群４および５においては、動物は、ＵＤＣＡ処置前に、ＰＴＰ開孔剤であるロニダミン（１０ｍｇ／ｋｇ／ｉｖ）またはアトラクチロサイド（５ｍｇ／ｋｇ／ｉｖ）で処置した。群６および７においては、対照指数虚血に対するＰＴＰ開孔の効果を論証するため、ラットは、ＵＤＣＡ処置なしで、ロニダミンまたはアトラクチロサイド単独で処置した。
【００３８】
実験プロトコール（図１）
各群のうち、６匹のラットは、３０分の虚血後、２４時間再灌流を受け、ウェスタンブロッティングの評価に用いた。
群１：対照群は、なんら処置なしで虚血および再灌流を受けた。
群２：偽処置(sham)群は、ＬＣＡ閉塞前の３０分間、薬剤を溶解するのに用いた溶媒でラットを処置した後に、虚血および再灌流を受けた。
群３：ＵＤＣＡ処置群。ラットは、ＬＣＡ閉塞および再灌流前の３０分間、静脈内注入として、４０ｍｇ／ｋｇのＵＤＣＡで処置した。
群４および５：動物はＵＤＣＡ処置の前に、ロニダミン（１０ｍｇ／ｋｇ体重；群４）あるいはアトラクチロサイド（５ｍｇ／ｋｇ体重；群５）の静脈内注入により処置した。
群６および７：ラットは、静脈内へのロニダミン（１０ｍｇ／ｋｇ体重；群６）またはアトラクチロサイド（５ｍｇ／ｋｇ体重；群７）による処置後、ＵＤＣＡ処置なしで、虚血−再灌流を受けた。
【００３９】
（結果）
ＵＤＣＡ前処理の結果、梗塞サイズが偽処置した心臓と比較して５６％減少した（２２．１％対４６．４％梗塞領域、ＵＤＣＡ処置対偽処置、Ｐ＜０．００１；図２）。ラットをＵＤＣＡ処置前にロニダミンまたはアトラクチロサイドにより処置した結果、梗塞サイズがそれぞれ４８％および４４．６％有意に増加した（ＵＤＣＡ処置と比較してＰ＜０．００１）。ロニダミンまたはアトラクチロサイド投与は、ＵＤＣＡ未処置ラットの梗塞サイズに有意な効果を示さなかった（図２）。
これにより、ＵＤＣＡが心筋梗塞を防止し得ることが示され、心不全にも有効であると考えられる。
【００４０】
実施例２  ＵＤＣＡによるＢａｄのリン酸化とＢｃｌ−２の破壊抑制
（方法）
ミトコンドリアおよび細胞質画分は、以下のように２４時間再灌流後の危険領域から単離した。
組織をプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン  １０μＭ、ペプスタチン  １０μＭ、ロイペプチン  １０μＭおよびＰＭＳＦ  １ｍＭ）を補充した等張ミトコンドリア緩衝液（２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭシュクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５）中でポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。試料を４℃にて５００ｇで５分間遠心分離し、核と未破砕細胞を除去した。得られた上清をさらに４℃にて１０，０００ｇで３０分間遠心分離してミトコンドリアが豊富なペレットを得た。上清をさらに４℃にて１００，０００ｇで１時間遠心分離して軽膜ペレットおよび最終細胞質ゾルを得た。ミトコンドリア画分を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補充したミトコンドリア緩衝液に再懸濁し、両画分のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Sigma chemicals, 日本）を用いて測定し、アッセイまで氷上に保存した。
上記のようにして得た細胞質画分７５μｇおよびミトコンドリア画分５０μｇを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いでＰＶＤＶ膜（ミリポア社製、アメリカ）に転写した。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加したＴＢＳ中の５％脱脂乳により、室温で１時間非特異的部位をブロッキングした後、ＰＶＤＶ膜をＢｃｌ−２（１：１６００、シグマ・ケミカルズ株式会社製、日本）、リン酸化Ｂａｄ（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｂａｄ）（１：１０００、オンコジーン社製、アメリカ）、およびチトクロームＣ（１：１０００、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社製、アメリカ）に対する一次抗体でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（１：１００００、サンタ・クルズ・バイオテクノロジー社製）を二次抗体として用いた。タンパク質に結合した抗体の検出は、ＥＣＬ検出システム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）により、製造会社の取り扱い説明書に従って行った。
【００４１】
（結果）
ＵＤＣＡ前処置によって、Ｂａｄの細胞質への局在がみられ、ミトコンドリアにおけるＢａｄの発現が偽処置群または対照群と比較して低かった（図３Ａ）。このことは、Ｂａｄのリン酸化によりさらに確認した（図３Ｂ）。これらは、ＵＤＣＡ処置群において、再灌流に続くＢｃｌ−２の発現が増加した結果である（図４Ｂ）。更に、ＵＤＣＡは用量依存的にＢｃｌ−２発現を上昇させ、最適用量は４０ｍｇ／ｋｇであることが明らかとなった（図４Ａ）。しかし、ＰＴＰアゴニストであるロニダミンあるいはアトラクチロサイドによるラットの処置は、このＵＤＣＡの保護効果を弱めた。偽処置群では、Ｂａｄのリン酸化が明らかとされず、それゆえＢｃｌ−２発現の減少調節が明らかとなった。更に、ミトコンドリアＢａｄの発現は偽処置群において増加していた。
これにより、ＵＤＣＡがＢｃｌ−２の破壊を抑制することが示された。
【００４２】
実施例３  ＵＤＣＡによるＰＴＰ開孔抑制
（１）ＵＤＣＡによる心筋ＡＴＰ含有量の維持
（方法）
凍結した危険領域の心室組織の試料を破砕し、ｐＨ７．４のＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で細胞を溶解した。ＡＴＰアッセイは、生物発光ルミノメーター（Lumat, LB9501、ドイツ）および商業上利用可能なＡＴＰ生物発光キット（プロメガ社製、日本）を用いて行った（Stanley, P. E. 1978, Methods Enzymol. 57, 3-15）。
【００４３】
（結果）
図５は実験群の危険領域における心筋ＡＴＰ含有量を示す。ＵＤＣＡ群におけるＡＴＰレベルは偽処置ラットのそれよりも有意に高かった（０．７８×１０−８対０．１６×１０−８  ｍｏｌｅ／ｇ湿重量、Ｐ＜０．０３）。ロニダミンあるいはアトラクチロサイドによる前処置は、ＵＤＣＡによる心筋ＡＴＰレベルの上昇を消失させた（０．１４×１０−８対０．１３×１０−８  ｍｏｌｅ／ｇ湿重量）。
【００４４】
（２）ＵＤＣＡによるミトコンドリア膨張およびチトクロームＣ放出の抑制
（方法）
ミトコンドリア膨張およびチトクロームＣ放出アッセイのために、以前述べた様に（Halestrap, A.P. et al. 1990 May 15, Biochem J. 268(1), 153-160）、再灌流後の危険領域からミトコンドリアを単離した。単離したミトコンドリアを２５℃にて、３００ｍＭシュクロース、１０ｍＭ  ＭＯＰＳを含有するｐＨ７．４のＴｒｉｓ緩衝液中でインキュベートした。１分後、１ｍＭ  Ｃａ２＋を加え、ＵＶ−可視スキャニング分光光度計（ファルマシア・バイオテック社製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００）を用い、５２０ｎｍの吸光度の減少によりミトコンドリア膨張を測定した。
【００４５】
（結果）
虚血−再灌流の結果、ミトコンドリアは有意に膨張し、チトクロームＣ放出が上昇した。ここでＵＤＣＡはそれらを抑制した（図６および７Ａ）（Ｐ＜０．０５）。このことは、上記のようにウェスタンブロッティング解析した結果、ミトコンドリアからのチトクロームＣ放出の用量依存的な抑制が示されたことからも明らかであった（図７Ｂ）。また、ＰＴＰアゴニストであるロニダミンまたはアトラクチロサイドの添加は、吸光度の減少により示されるミトコンドリア膨張を誘導し、４１４ｎｍのピークのチトクロームＣの放出を上昇させた。
【００４６】
以上のことにより、ＵＤＣＡがＰＴＰの開孔を抑制することが示された。
【００４７】
実施例４  ＵＤＣＡによる心筋細胞アポトーシスの抑制
（方法）
クライオスタット−凍結切片を、一次抗体として抗１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ；ダコ・ジャパン株式会社製）（Fujita, K. et al., 2000 Jun, J Radiat Res (Tokyo) 41(2), 139-149.）を用いて、アポトーシスの測定のため処理した。免疫組織化学を、ＡＢＣ染色システム（ニチレイ社製、日本）を用いて、製造会社のプロトコールに従って行った。ｓｓＤＮＡ陽性筋細胞核をカウントし、各領域における全筋細胞核のパーセンテージとして表した。
【００４８】
（結果）
ＵＤＣＡはアポトーシスの細胞の頻度を、偽処置群における１１．８％と比較して４．８％に減少させた。ロニダミンまたはアトラクチロサイド処置では、アポトーシス頻度は、それぞれ１１．２％と１１．８％であった。ＵＤＣＡ処置がない場合、または偽処置ラットにおいて、ＰＴＰアゴニストは効果がなかった（図８）。ＵＤＣＡ処理は、３０分の虚血および１２０分の再灌流に引き続くアポトーシス細胞の頻度を有意に減少させた。
これにより、ＵＤＣＡが心筋細胞アポトーシスを抑制することが示され、心不全に有効であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実験プロトコールを示す。図中、ＬＮＤはロニダミン、ＡＴＲはアトラクチロサイドを示す。
【図２】実験群中の心筋梗塞の領域を示すグラフである。梗塞サイズは危険領域の％として表した。平均値±Ｓ．Ｄ．Ｍ．*Ｐ＜０．０１（群１および２から）。**Ｐ＜０．０１（群３から）。
【図３】Ａ：ミトコンドリアにおけるＢａｄの局在化を示す図である。Ｂ：ＵＤＣＡ処置によりＢａｄのリン酸化が促進されたことを示す図である。
【図４】Ａ：ＵＤＣＡによるミトコンドリアＢｃｌ−２発現の用量依存的な上昇を示す図である。Ｂ：ＵＤＣＡによるＢｃｌ−２発現効果がＰＴＰアゴニストによる処置により阻害されたことを示す図である。
【図５】実験群におけるＡＴＰレベルの定量的解析結果を示すグラフである。平均値±Ｓ．Ｄ．Ｍ．*Ｐ＜０．０５（群１および２から）。**Ｐ＜０．０５（群３から）。
【図６】ＵＤＣＡによるミトコンドリア膨張の抑制を示すグラフである。平均値±Ｓ．Ｄ．Ｍ．  *Ｐ＜０．０１（群１および２から）。**Ｐ＜０．０１（群３から）。
【図７】Ａ：実験群におけるチトクロームＣの存在を示す４１４ｎｍのＯＤを示すグラフである。Ｂ：ＵＤＣＡによるミトコンドリア中のチトクロームＣ用量依存的な増加を示す図である。
【図８】ｓｓＤＮＡにより染色したクライオスタット切片の危険領域におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを示すグラフである。平均値±Ｓ．Ｄ．Ｍ．  *Ｐ＜０．０１（群１および２から）。**Ｐ＜０．０１（群３から）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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