(57)【要約】【課題】  組換えウイルスや免疫学的手法を用いることなく、へルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を高感度で迅速かつ簡便に定量解析し、ヘルペスウイルス感染を検出するための方法を提供すること。【解決手段】  蛍光タンパク質とＰＭＬボディ構成タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を用いることにより、簡便かつ高感度にヘルペスウイルス感染を検出することができる。また、本発明の細胞を用いることにより、ヘルペスウイルス感染阻害物質のスクリーニングや感受性検査を行うこともできる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質を発現し、かつへルペスウイルスに対して感染感受性を有する細胞株。
【請求項２】
標識が蛍光標識である請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
ＰＭＬボディ構成タンパク質がＰＭＬタンパク質である請求項１または２に記載の細胞株。
【請求項４】
さらにｐ１８０タンパク質を発現する請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株。
【請求項５】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３１８で表される細胞株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞株にへルペスウイルスを感染後、非イオン性界面活性剤で可溶化処理し、可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質量または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質の残存量を測定することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞株にへルペスウイルスを感染させ、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出する方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種後、非イオン性界面活性剤で可溶化処理し、可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質量または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質の残存量を測定することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、へルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を定性的または定量的に検出するための細胞および方法に関する。また、本発明は、ヘルペスウイルス感染阻害物質のスクリーニング方法及び感受性検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルスは、α、βおよびγヘルペスウイルスの３つの亜科からなるＤＮＡウイルスである。αヘルペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、並びに帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）が、βヘルペスウイルスとしては、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、並びにヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）が、γヘルペスウイルスとしては、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）が知られている。これらのウイルスがヒトに感染するヒトヘルペスウイルスとして報告されている。
【０００３】
ヒトヘルペスウイルスは、様々な病態の原因ウイルスである。多くのヒトヘルペスウイルスは不顕性感染の後に様々な刺激によって再活性化されるために、重篤な疾患を引き起こし得る遍在する日和見病原体となっている。臓器移植患者やエイズ患者のように免疫不全の状態にある患者にはＨＣＭＶに起因する肺炎や網膜炎が多発する。またＨＣＭＶは、先天的に感染した幼児において深刻な病態を引き起こし得る。ＶＺＶは多くの深刻な疾病、例えば水痘、帯状疱疹およびヘルペス後神経痛を引き起こすことが知られている。ＨＳＶ−１は三叉神経節に潜伏感染し、後に再活性化され、角膜炎や口唇ヘルペスを引き起こす。ＨＳＶ−２は、通常、性的接触によって獲得され、生殖器ヘルペスを引き起こす。ＨＨＶ−８はエイズに頻発するカポジ肉腫の原因ウイルスである。
【０００４】
抗ヘルペスウイルス剤としては、ウイルス遺伝子複製過程の選択的な阻害作用を利用する核酸系抗ウイルス剤（例えばガンシクロビル、アシクロビル）が用いられている。しかし、次第にこれら核酸系抗ウイルス剤に対し耐性を示すウイルス株が出現してきているのが現状であり、新規な抗ウイルス剤の開発が常に望まれている。へルペスウイルスの前初期（Immediate early：ＩＥ）遺伝子産物は、感染後にウイルスゲノムＤＮＡから最初に転写される重要なウイルス抗原である。ＨＣＭＶの場合はＩＥ１タンパク質などがウイルス感染のマーカーとして広く利用されている。
【０００５】
現在、ＩＥ１タンパク質の検出にはウエスタンブロット法、蛍光免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法などが用いられている。これらはいずれも煩雑な操作を必要としたり、非特異的反応の問題があるなど、多検体を精度良く検定するには最適な方法とはいえない。非特異的反応は主に免疫学的手法に起因することが多いと考えられる。また、マーカー遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを用いることによりＩＥ１タンパク質を定量解析することも可能である（例えば非特許文献６参照）。しかし、この方法で高感度を得るためには、マーカー遺伝子の脱落を防止するために、組換えウイルスを随時調製することが必要となり、また組換えに使用したウイルスの親株である特定のウイルス株にのみ限局した情報となるという問題がある。
【０００６】
ヘルペスウイルスが細胞へ感染する場合、まず最初にウイルス粒子が細胞表面へ吸着する。この結合は受容体を介しており、低親和性および高親和性受容体が同定されていることから、多段階であることが報告されている。ＨＣＭＶの場合は細胞膜成分であるヘパラン硫酸とＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質が結合することから始まる。未同定であるが高親和性受容体の存在が示唆されており、引き続き細胞膜とエンベロープ膜が融合し、テグメントとカプシドが細胞質に侵入する。その後細胞質へ侵入したカプシドが核膜まで移行し、核膜孔からウイルスゲノムを核内に放出する。核内に入ったウイルスゲノムＤＮＡから、宿主のＲＮＡポリメラ−ゼによって前初期遺伝子が転写される。さらに初期遺伝子、後期遺伝子の順にウイルス遺伝子の転写、翻訳が進み、複雑な過程を経て子孫ウイルス粒子（カプシド）が核内で形成され、成熟ウイルス粒子が作られる（成熟過程）。これらの過程は宿主細胞の機能に大きく依存していることから、ヘルペスウイルスの感染が全ての細胞で成熟過程まで進むわけではないことが知られている。
【０００７】
細胞核内にはサブドメイン構造の１つとしてＰＭＬボディの存在が知られている。これは１つの核内で１０〜３０個の場所に点状に存在している。このＰＭＬボディはＰＭＬタンパク質を含む数十種類のタンパク質から構成されており、ヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスの感染により特異的な構造変化を引き起こすことが近年明らかになっている。例えば、ＨＣＭＶが感染してＩＥ１タンパク質が発現するとＰＭＬボディが壊れＰＭＬタンパク質が核内に拡散することが知られている。（非特許文献１〜３を参照）。さらに拡散したＰＭＬタンパク質は非イオン性界面活性剤に可溶化することが記載されている（非特許文献４を参照）。
【０００８】
【非特許文献１】Wilkinson, G.W. et al., “Journal of General Virology”, 79, 1998, 1233-1245
【非特許文献２】Ahn, J.H. et al., “Journal of Virology”, 71, 1997, 4599-4613
【非特許文献３】Korioth, F. et al., “Experimental Cell Research”, 229, 1996, 155-158
【非特許文献４】Muller, S. et al., “The EMBO Journal” 17, 1998, 61-70
【非特許文献５】Katano, H. et al., “Virology” 286, 2001, 446-445
【非特許文献６】Spaete, R.R. et al., “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 84, 1987, 7213-7217
【非特許文献７】Langley, R. et al., “DNA and Cell Biology” 17, 1998, 449-460
【非特許文献８】Ogawa-Goto, K. et al, “Journal of Virology” 76, 2002, 2350-2362
【特許文献１】国際公開第０１／６４９４７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヘルペスウイルスに対して感染感受性の高い、安定な細胞株を提供することを目的とする。また、本発明は、組換えウイルスや免疫学的手法を用いることなく、へルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を高感度で迅速かつ簡便に定量的解析し、ヘルペスウイルス感染を検出するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、発明者らは、ヘルペスウイルスにより特異的に誘導される宿主細胞の核内の現象を利用して、ヘルペスウイルス感染を検出する方法について検討した。その結果、蛍光タンパク質とＰＭＬボディ構成タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を用いることにより、簡便かつ高感度にヘルペスウイルス感染を検出できることを見い出した。さらにｐ１８０タンパク質を共発現させることにより、標的細胞におけるウイルスの感染感受性を大幅に増加させることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づき完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、標識されたＰＭＬボディ構成タンパク質を発現し、かつへルペスウイルスに対して感染感受性を有する細胞株を提供するものである。
また、本発明は、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３１８で表される細胞株を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、上記細胞株にへルペスウイルスを感染後、非イオン性界面活性剤で可溶化処理し、可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質量または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質の残存量を測定することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の検出方法を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、上記細胞株にへルペスウイルスを感染させ、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、ヘルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出する方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、上記細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種後、非イオン性界面活性剤で可溶化処理し、可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質量または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬボディ構成タンパク質の残存量を測定することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、上記細胞株に、ヘルペスウイルスと試料を接種し、ＰＭＬボディの特異的形態変化を示す細胞を解析することを含む、感染阻害物質のスクリーニング方法または薬剤感受性検査方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明はヘルペスウイルス、例えばＨＳＶ−１またはＨＣＭＶ、好ましくはＨＣＭＶの感染を検出するための細胞および方法に関するものである。
【００１７】
本発明の細胞株はＰＭＬボディを構成するタンパク質を発現する。構成タンパク質の例としては、ＰＭＬ、ＳＰ１００、ＮＤＰ５２、ＮＤＰ５５、ＤＡＸＸ、Ｓｋｉ／Ｓｎｏ、ＣＢＰ、ＨＳＦ２，Ｓｐ１、ｐＲｂ、ＨＰ１、ｅＩＦ−４などを挙げることができるが、ＰＭＬを用いることが好ましい。本発明の細胞株に導入する構成タンパク質遺伝子は、これらと同等の機能を有するタンパク質を発現する限り、１〜１５０塩基、好ましくは１〜１００塩基、より好ましくは１〜５０塩基（例えば１〜数塩基）が欠失、置換、および／または付加されたものでもよい。同等の機能とは、ＤＮＡウイルスの感染によりＰＭＬボディから核内に拡散し、非イオン性界面活性剤処理により可溶化されることをいう。
【００１８】
これら構成タンパク質は、ＰＭＬボディ中でタグ標識された状態で発現する。標識には通常蛍光タンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＢＦＰ２、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰなどが用いられるが、本発明の検出方法に用いることができれば、蛍光標識以外の標識方法を用いることもできる。蛍光以外の標識方法の例としては、β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼなどによる化学発光を用いた方法が挙げられる。
【００１９】
本発明の細胞株はへルペスウイルスに対して感染感受性を有する細胞株である。「感染感受性を有する」とは、ウイルス粒子の細胞への吸着から前初期遺伝子産物の翻訳までに求められる宿主細胞の様々な機能が欠如していない細胞を意味する。したがって、本発明の細胞株にヘルペスウイルスを接種すると前初期遺伝子抗原が十分発現する。
【００２０】
また、細胞の種類によっては前初期遺伝子抗原が検出されるものの、その発現量が非常に低いか通常よりも大幅に遅れて発現する場合がある。このようにへルペスウイルスの感染感受性が低い細胞を用いる場合は、さらに感染感受性を上昇させる能力のあるタンパク質と、ＰＭＬまたはＰＭＬボディを構成する他のタンパク質を共発現するような細胞株を用いることができる。感染感受性を上昇させる能力のあるタンパク質としては、ｐ１８０タンパク質が挙げられる。その他、ウイルスの細胞表面への吸着と侵入に寄与する因子あるいは細胞侵入後のウイルスの核移行を促進する因子を用いることができる。ＨＳＶの場合には、前者の例としてＨＶＥＭ、ネクチン−１、ネクチン−３のような高親和性受容体、後者の例として微小管ネットワークを安定化する微小管関連タンパク質などが挙げられる。
【００２１】
ヒトｐ１８０タンパク質は、既に明らかになっているｃＤＮＡ配列の分析から、Ｎ末端に反復配列を有することが知られており、この反復数が５４回、２６回、１４回の少なくとも３種類の分子種が存在することが分かっている（非特許文献７を参照）。本発明の検出方法においては、いずれの反復数を有するｐ１８０タンパク質を用いることもできるが、５４回の反復数が好ましい。
【００２２】
本発明の細胞株の例として、ＣＨＯ細胞由来のＳＥ／１５株（実施例１参照）を挙げることができる（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３１８、受託日：２００３年４月１６日）。上述のように、全ての細胞においてヘルペスウイルス感染が成熟過程まで進行するわけではないが、実施例１（４）から明らかなように、ＳＥ／１５株は、ヒトｐ１８０タンパク質遺伝子を共発現させることにより、ＨＣＭＶの感染効率を大幅に増加させることができるため、有用である。
【００２３】
本発明の細胞株の調製方法を以下に説明する。
細胞中で発現させる遺伝子のクローニングおよび発現細胞の作製は、常法に従って行うことができ、例えば非特許文献５に記載の方法を用いることができる。
【００２４】
まず所望の遺伝子をＰＣＲで増幅後、適当な発現ベクターに組み込む。その際、所望の遺伝子をタグ標識するために連結する遺伝子を、所望の遺伝子産物との融合タンパク質として発現可能なように組み込むことができるが、すでにベクター中に組み込まれたものを用いることが好ましい。発現ベクターとしては、ｐＥＧＦＰ  Ｃ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｖｉｔａｌｉｔｙ  ｈｒＧＦＰレポーターベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ＧＦＰ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴｒａｃｅｒベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などを用いることができる。
【００２５】
組換え発現ベクターは、例えばリポフェクチン法、エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法などの方法により、へルペスウイルスが感染可能な細胞へトランスフェクションする。ヘルペスウイルスが感染可能な細胞としてはＭＲＣ−５、ＨＥＬ、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、Ｒａｍｏｓ３、ＨＳＢ−２、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ−２、Ｋ−１０３４などを挙げることができる。発現ベクターには薬剤耐性遺伝子が組み込まれていることが好ましく、この場合発現ベクターを導入後、薬剤存在下で選択し、耐性細胞株をクローニングすることができる。
【００２６】
ヒトｐ１８０タンパク質をコードするＤＮＡは、例えばヒト胎児肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）のｃＤＮＡを鋳型として、非特許文献７及び８に記載の方法でクローニングすることが可能である。反復配列の反復数が５４回の分子種も上記の方法でクローニング可能であるが、その際は鋳型としてＭＲＣ−５細胞のゲノムＤＮＡを用いた方が望ましい。細胞のゲノムＤＮＡの調製は公知のどのような方法でも可能である。
【００２７】
次に、本発明の細胞株を用いてヘルペスウイルス感染を検出する方法について説明する。
本発明の細胞株にウイルスサンプルを接種した後、前初期遺伝子産物の発現によりＰＭＬボディの特異変化を誘導させる。この特異変化の例としては、ＨＣＭＶ前初期遺伝子産物ＩＥ１の場合はＰＭＬタンパク質の核内への拡散、ＨＳＶ−１の前初期遺伝子産物の場合はＰＭＬタンパク質の消失などが挙げられる。例えばＣＭＶの場合、非感染細胞のＰＭＬタンパク質は小さなドット状のＰＭＬボディとして存在しているが、感染によりＩＥ１が発現するとＰＭＬボディが壊れてＰＭＬタンパク質が核内全体へ拡散し、ドットが大きくなる。両者の大きさは著しく異なっているため、容易に区別することができる。
【００２８】
核内へ拡散したＰＭＬタンパク質は、ＮＰ−４０、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、ＭＥＧＡ−１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５６、Ｂｒｉｊ−５８、Ｂｒｉｊ−７６、Ｂｒｉｊ−９６、Ｂｒｉｊ−９８、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｓｐａｎ２０、Ｓｔｅｒｏｘ  ６７−Ｋ、Ｌｕｂｒｏｌ  ＷＸ、スクロースモノヘキサン酸エステル、スクロースモノラウリン酸エステル、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０などの非イオン性界面活性剤を含む溶出バッファーで可溶化処理し、その後、可溶化したＰＭＬタンパク質量を蛍光光度計で測定する。測定値を比較することで前初期遺伝子産物の発現の有無を迅速に検出することができる。この方法を用いることにより、ＨＣＭＶ感染を検出することができる。または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬタンパク質の残存量を測定することにより、同様にしてＨＣＭＶ感染を検出することもできる。
【００２９】
ＰＭＬタンパク質の核内からの消失は、例えば蛍光標識したＰＭＬタンパク質を直接測定することでモニターできる。この方法を用いることにより、ＨＳＶ−１感染を検出することが可能である。
【００３０】
さらに、ウイルスサンプルの代わりに、ウイルスと試料との混合液を接種するかまたはあらかじめ試料で処理した細胞にウイルスを接種した後、非イオン性界面活性剤で可溶化処理し、可溶性ＰＭＬタンパク質量または細胞内に存在する非可溶性ＰＭＬタンパク質の残存量を測定することで、試料の感染阻害率を算出することができる。ここで、試料とはヘルペスウイルス感染阻害候補物質または感染阻害薬等を意味する。試料の例としては、抗ウイルス剤、中和抗体、ウイルスの細胞への吸着阻害剤、ウイルスの核移行阻害剤を挙げることができる。この方法を用いることにより、感染阻害候補物質のスクリーニングや感染阻害薬の感受性検査が可能となる。また、可溶化処理をせずに直接ＰＭＬボディの特異的形態変化を確認することにより、感染阻害候補物質のスクリーニングや感染阻害薬の感受性検査をすることも可能である。
【００３１】
感染用ウイルスサンプルは実験室用分離株でも臨床分離株でもよく、目的及び検出方法により適宜選択される。また、本発明の検出方法は、組換えウイルスを必要としないという特徴から、ヒトへルペスウイルスの臨床分離株だけでなく、ヒト以外を宿主とするへルペスウイルスにも応用可能である。
【００３２】
以下、ＧＦＰ−ＰＭＬ融合タンパク質を発現する細胞にＨＣＭＶを感染させた場合についてさらに具体的に説明する。
本発明の細胞株をプレートに蒔き、ＨＣＭＶサンプルを接種させる。一定時間培養後、ＩＥ１タンパク質の発現によりＰＭＬボディの形態学的変化を生じさせる。細胞数（細胞／ウェル）は５×１０３〜４×１０５、好ましくは１×１０４〜２×１０５、より好ましくは５×１０４〜１×１０５で行う。培養時間は２〜９６時間、好ましくは１０〜２４時間である。
【００３３】
その後、定量的解析（以下、「Ｓｕｐ法」という。）を行う場合には、例えばＮＰ−４０溶出バッファー（ＮＥＢ）を加え、ＩＥ１タンパク質の発現により核内に拡散したＧＦＰ−ＰＭＬを可溶化する。ＮＰ−４０の濃度は０．５〜０．０３％、好ましくは０．２〜０．０５％、より好ましくは０．１〜０．１５％で行う。ＮＥＢのｐＨは７．０〜８．０、好ましくは７．５である。塩濃度は１０〜１５０ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭで使用する。また、溶出温度は４〜３７℃、好ましくは４〜２０℃、より好ましくは４℃である。溶出時間は１〜２５分、好ましくは５〜２０分、より好ましくは１０〜１５分で行う。次にＮＥＢを回収し、可溶化したＧＦＰ−ＰＭＬ量を蛍光光度計で測定する。この方法を用いることにより、非イオン性界面活性剤で感染細胞に対し可溶化処理する工程のみでへルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を簡便に、精度よく定量的に検出することができる。
【００３４】
またもう１つの定量的解析法としてＤｉｓｈ法が挙げられる。Ｄｉｓｈ法を行う場合は、ＩＥ１タンパク質の発現により核内に拡散したＧＦＰ−ＰＭＬをＮＥＢで溶出・除去し、プレート上の細胞中に残存した非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量を蛍光光度計で測定する。ＧＦＰ−ＰＭＬの溶出条件はＳｕｐ法と同様である。この方法は、免疫学的手法を必要とすることなく、感染細胞を蛍光顕微鏡で観察するのみで経時的にへルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を追跡可能である。したがって、免疫学的手法に伴う非特異的反応を除外することができ、確実な判定をすることができる。
【００３５】
Ｓｕｐ法およびＤｉｓｈ法は共に優れた定量的解析法として、同様の用途で使用することができる。Ｓｕｐ法およびＤｉｓｈ法の実験室レベルにおける用途の具体例として以下の例が挙げられる。種々の抗体で前処理したＳＥ／１５細胞にＨＣＭＶを感染させ、ＮＥＢ処理を行い、溶出した可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量、あるいは非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量をそれぞれ測定し、得られた測定値から感染効率を算出する。これらの方法を用いてＨＣＭＶ感染を阻害する抗体をスクリーニングすることにより、ＨＣＭＶ感染における新規受容体が迅速かつ簡便に検索できる。また臨床レベルの用途の具体例としては、次の例が挙げられる。治療に用いる薬剤あるいは治療の候補となる薬剤でＳＥ／１５細胞を処理し、臨床分離株を感染させる。あるいは臨床分離株を同様の薬剤で処理し、ＳＥ／１５細胞に感染させる。そしてＳｕｐ法またはＤｉｓｈ法を用いて各薬剤の阻害作用を定量的に検出することで、臨床分離株の各々の薬剤に対する感受性を定量的に比較することが可能となる。
【００３６】
また、上述のようにＰＭＬボディの形態は感染前後で明らかに異なるため、ＮＥＢで溶出操作を行うことなく画像解析により定量解析することも可能である。前述の感染細胞及び非感染細胞を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光顕微鏡画像解析システム等を用いて観察した画像を記録する。画像の記録方法は特に限定されるものではない。記録した画像を画像解析ソフトを用いて解析する。画像解析ソフトの例としては、ＮＩＨ ｉｍａｇｅ、Ｗｉｎ  Ｒｏｏｆ（三谷商事）、Ｌｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事）、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｍａｃ Ｓｃｏｐｅ（三谷商事）、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ、ＩｍａｇｅＪなどが挙げられるが、ある一定以上あるいは以下の大きさのドットのみの面積またはドット数を測定できるものであればいかなるソフトを用いてもよい。例えばＮＩＨ ｉｍａｇｅを用いる場合は、閾値（threshold）を設定して一定面積に存在する感染細胞数あるいは非感染細胞数を定量的に検出することが可能である。界面活性剤で溶出操作を行うことなく感染あるいは非感染細胞数をカウントできるため、非常に簡便かつ精度よく定量的に検出することができる。従ってＳｕｐ法、Ｄｉｓｈ法と同様に、画像解析法も感染細胞の検出や、新規抗ウイルス剤開発におけるスクリーニング法、臨床分離株の薬剤感受性検査に非常に有用である。
【００３７】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３８】
（１）ＰＣＲ法によるＰＭＬ遺伝子の増幅及びベクターへの挿入
ＴＹ１細胞由来の１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、以下の方法でＰＭＬ遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡは、1st strand cDNA synthesis kit for RT-PCR（ベーリンガー社製）を用いて調製した。これを鋳型としてＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＰＣＲを行った。プライマーは、
5’-TCTGAATTCATGGAGCCTGCACCCGCCCGA-3’（非特許文献５に記載、配列番号１）及び
5’-GGTGGATCCTCACCACAACGCGTTCCTCTC-3’（非特許文献５に記載、配列番号２）を用いた。
【００３９】
増幅されたＮ末端領域のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで消化後、低融点アガロース電気泳動により約１．７ｋｂｐの断片を分離し、フェノール溶出によりその断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで消化し、低融点アガロース電気泳動で分離回収したｐＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入連結した。このプラスミドを、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株に導入して形質転換し、マーカー遺伝子Ａｍｐｒを利用して、アンピシリン耐性を示す形質転換株を選別した。得られた複数個の単一コロニーを、２ｍｌのＬＢ培地中で３７℃、１６時間振とう培養後、菌体からプラスミドを溶出した。溶出したプラスミド約５００ｎｇを制限酵素ＥｃｏＲ  ＩおよびＢｍＨ  Ｉで消化し、０．７％アガロース電気泳動にかけ、１．７ｋｂｐの断片を生じるクローンをＰＭＬ遺伝子が挿入されているクローンとして選択した。この組換え菌を培養して大量に調製し、アルカリ法によりプラスミドを溶出し、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトランスフェクション用のプラスミドｐＥＧＦＰ−ＰＭＬを単離・分取した。
【００４０】
（２）ＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質のＣＨＯ細胞における発現
ＧＦＰ−ＰＭＬ融合タンパク質を以下の方法を用いて培養細胞中で産生させた。ＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。０．７〜０．８×１０５個の細胞を６穴プレート（ヌンク社製、内径３ｃｍ）に植え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２０〜２２時間培養した。新鮮培地に交換した細胞に、上記（１）で得たｐＥＧＦＰ−ＰＭＬ  １μｇとトランスフェクション用のＦｕｇｅｎｅ試薬（ベーリンガー社製）３μｌを含むＤＭＥＭ  ０．１ｍｌを添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０時間培養した。
【００４１】
細胞を洗浄後、発現させたＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質が、内因性のＰＭＬタンパク質と同様、核内でＰＭＬボディを形成するかどうかを調べた。共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞の観察を行ったところ、ＣＨＯ細胞内で発現させたＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質が核内でＰＭＬボディを構築していることを確認した。
【００４２】
（３）組換えｐ１８０タンパク質を含む真核細胞発現ベクターの構築
ヒトｐ１８０タンパク質遺伝子については、そのＮ末端の反復配列数によりいくつか報告されているが、特許文献１には反復数が２４回の分子種を含む真核細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ−１８０ｆが記載されている。反復数が５４回の分子種の真核細胞発現ベクターを構築するために、非特許文献７に記載の方法にしたがい、ＭＲＣ−５細胞のゲノムＤＮＡから、ｐ１８０−５４Ｒｐ用プライマー：
5’-CAGGATCCAGCCCCCAATGTGAC-3’（特許文献１に記載、配列番号３）及び
5’-GCTCTAGAACATCTGTATTTCTGCCCT-3’（配列番号４）
を用いて５４回の反復配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法にて増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＸｂａ  Ｉで消化後、低融点アガロース電気泳動により約１．８ｋｂｐの断片を分離し、フェノール溶出によりその断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＸｂａ  Ｉで消化し、低融点アガロース電気泳動で分離回収したｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入連結した。このプラスミドを、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株に導入して形質転換し、マーカー遺伝子Ａｍｐｒを利用して、アンピシリン耐性を示す形質転換株を選別した。得られた複数個の単一コロニーを２ｍｌのＬＢ培地中で３７℃、１６時間振とう培養後、菌体からプラスミドを溶出した。溶出したプラスミド約５００ｎｇを制限酵素ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、０．７％アガロース電気泳動にかけ、１．８ｋｂｐの断片を生じるクローンをヒトｐ１８０反復配列遺伝子が挿入されているクローンとして選択し、ｐＥＴ１５−５４Ｒと命名した。
【００４３】
さらにｐｃＤＮＡ−１８０ｆへ組み込むために、ｐＥＴ１５−５４Ｒを制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＳａｃ  Ｉで消化後、得られた１．６ｋｂｐの断片を低融点アガロース電気泳動で分離し、フェノール溶出によりその断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲ  ＩとＳａｃ  Ｉで部分消化したｐｃＤＮＡ−１８０ｆに挿入連結した。このプラスミドを、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株に導入して形質転換し、マーカー遺伝子Ａｍｐｒを利用して、アンピシリン耐性を示す形質転換株を選別した。得られた複数個の単一コロニーを２  ｍｌのＬＢ培地中で３７℃、１６時間振とう培養後、菌体からプラスミドを溶出した。溶出したプラスミド約５００ｎｇを制限酵素ＥｃｏＲ  ＩおよびＭｒｏ  Ｉで消化し、０．７％アガロース電気泳動にかけ、２．３ｋｂｐの断片を生じるクローンを反復数が５４回のｐ１８０タンパク質遺伝子が挿入されているクローンとして選択した。この組換え菌を培養して、大量に調製し、アルカリ法によりプラスミドを溶出し、Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトランスフェクション用のプラスミドｐｃＤＮＡ−１８０／５４Ｒを単離・分取した。
【００４４】
（４）ｐ１８０タンパク質とＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質を共発現する細胞株の樹立
上記（２）で作製した細胞に、ヒトｐ１８０発現プラスミドｐｃＤＮＡ−１８０／５４Ｒを同様の方法で続けてトランスフェクションした。その後４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および４００μｇ／ｍｌ  ｚｅｏｃｉｎ存在下で２日ごとに培地を交換し、１０日間培養後に、Ｇ４１８およびｚｅｏｃｉｎに耐性をもつ細胞株のコロニーを分離し、ＧＦＰ−ＰＭＬとヒトｐ１８０を安定に発現する細胞株ＳＥ／１５細胞を樹立した（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３１８、受託日：２００３年４月１６日）。
【００４５】
ＳＥ／１５細胞の核内でＧＦＰ−ＰＭＬがＰＭＬボディを形成するかどうかを共焦点レーザー顕微鏡を用いて調べたところ、図１ａに示すとおり、ＰＭＬボディを形成することを確認した。
【実施例２】
【００４６】
ＳＥ／１５細胞へのＨＣＭＶ感染
（１）ＳＥ／１５細胞をウイルス接種の２４時間前に１．０×１０５細胞／ウェルとなるよう２４穴プレートに蒔いた。次に、ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−９７７）をｍ．ｏ．ｉ．１になるように各ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ（−）で細胞を２回洗浄し、１００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８、１００μｇ／ｍｌ  ｚｅｏｃｉｎを含む５％ＦＢＳ−Ｆ１２／ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）を５００μｌ加え３７℃で１８時間インキュベーションした。ＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質のみを発現させたＣＨＯ細胞も同様にしてＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株に感染させた。
（２）ＳＥ／１５細胞およびＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質のみを発現させたＣＨＯ細胞のＨＣＭＶに対する感染感受性を評価するために、ＩＥ１抗原陽性の細胞数を蛍光免疫染色法により以下のように計測した。細胞はカバーグラス上でプレートの各ウェル中に培養し、上記（１）と同様にＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株を接種し、１８時間後に４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で室温３０分固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のＰＢＳ溶液で室温３分処理した。ＰＢＳで洗浄後、１００倍に希釈したＩＥ１に対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、ＭＡＢ８１０）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、４００倍に希釈したローダミン標識抗マウスＩｇ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を室温で１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄後、蛍光顕微鏡を用いてＩＥ１抗原陽性の細胞数を測定した。核をＴＯＰＲＯ３で染色して総細胞数を求め、ＩＥ１抗原陽性率を算出した。その結果、ＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質のみを発現させたＣＨＯ細胞ではＩＥ１抗原陽性率は８±２．５％であったのに対し、ＳＥ／１５細胞では８４±３％と感染感受性が上昇していることが判明した。
【００４７】
以上より、ＣＨＯ細胞にｐ１８０を共発現させることで、ヘルペスウイルスの感染感受性が上昇することが示された。
【実施例３】
【００４８】
（１）ＳＥ／１５細胞へのＨＣＭＶ感染とＰＭＬボディの破壊
実施例２（１）と同様にＳＥ／１５細胞にＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株を接種し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞の観察を行ったところ、ＰＭＬボディが破壊されＧＦＰ−ＰＭＬが核内に拡散している様子が観察された（図１ｂ）。その後０．１％ＮＰ−４０を含む溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０）（ＮＥＢ）で２０℃、１０分間処理したところ、拡散したＧＦＰ−ＰＭＬが細胞内から消失した（図１ｄ）。ＨＣＭＶを感染させなかった細胞では、ＰＭＬボディは処理前とほとんど変化がなかった（図１ｃ）。
【００４９】
（２）ＮＥＢにより溶出されたＧＦＰ−ＰＭＬのウェスタンブロット解析
（１）で作製した感染後１８時間後の細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、２４穴プレートの各ウェルにＮＥＢを１５０μｌずつ加えた。そして１、２度揺すり、４℃にて一定時間静置後、上清を回収した。回収した上清５０μｌに２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール、０．０４％ブロモフェノールブルー）を５０μｌ加えた。この画分を以後「ｓｕｐ」とした。また２４穴プレート上に残った細胞に０．１５％ＮＥＢ  １５０μｌを加えてｓｃｒａｐｅし、細胞を回収した。回収後、２×ＳＤＳサンプルバッファー１５０μｌを加え、２７Ｇの注射針で懸濁させた。この画分を以後「ｄｉｓｈ」とした。またＮＥＢ未処理の細胞に対し、０．１５％ＮＥＢ  １５０μｌを加えてｓｃｒａｐｅし、細胞を回収した。回収後２×ＳＤＳサンプルバッファー１５０μｌを加え、２７Ｇの注射針で懸濁させた。この画分を以後「ｔｏｔａｌ」とした。ｓｕｐ、ｄｉｓｈ、ｔｏｔａｌの３つの画分を１００℃で１０分間ボイルし、ウエスタンブロッティングのサンプルとした。６％あるいは１０％のポリアクリルアミドゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、定法に従いＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。その後、ｓｕｐとｄｉｓｈ画分に対し、抗ＰＭＬ抗体、抗ＩＥ１抗体、抗カルネキシン抗体を使用してウェスタンブロット解析を行い、ＧＦＰ−ＰＭＬ、ＩＥ１、カルネキシンタンパク質の検出を行った。
【００５０】
Ｔｏｗｎｅ株（Ｔ）の感染により、ＳＥ／１５細胞内にＩＥ１タンパク質が発現していることを確認した（図２、レーン１、３、５）。Ｔｏｗｎｅ株を感染させた場合、ＧＦＰ−ＰＭＬがｓｕｐ画分から検出された（図２、レーン３）。疑似感染細胞（Ｍ）の上清にはＧＦＰ−ＰＭＬは存在していなかった（図２、レーン４）。カルネキシンタンパク質は各レーンに同程度含まれていることから（図２、レーン１〜４）、電気泳導にかけたタンパク質量に差がないことが確認された。
【００５１】
以上のように、ＨＣＭＶ感染によるＩＥ１の発現によってＳＥ／１５細胞の核内のＰＭＬボディが壊れて核内に拡散し、ＧＦＰ−ＰＭＬがＮＥＢに可溶化したことが示された。
【実施例４】
【００５２】
ＮＥＢ溶出および蛍光測定
溶出過程において、拡散したＧＦＰ−ＰＭＬとＰＭＬボディを形成するＧＦＰ−ＰＭＬがどのような溶出挙動をとるのかを検証した。実施例２と同様に感染後１８時間後の細胞を作製し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、２４穴プレートの各ウェルにＮＰ−４０溶出バッファー（ＮＥＢ）を１５０μｌずつ加えた。ＮＥＢを回収して９６穴プレート（uClear Fluorescence Black Plate with Transparent bottom；Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に移し、蛍光光度計（CytoFluor Multi-Well Plate Reader Series 4000；ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてＧＦＰ−ＰＭＬの溶出量を測定した。Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎは４８５ｎｍで、Ｅｍｉｓｓｉｏｎは５３０ｎｍで行った。図３に示すように、Ｔｏｗｎｅ株を感染させたＳＥ／１５細胞のＮＥＢ処理後の上清「ｓ  ｔｏｗｎｅ」と、疑似感染細胞のＮＥＢ処理後の上清「ｓ  ｍｏｃｋ」の溶出量の差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）は１０分前後でピークとなり、その後減少した。
【実施例５】
【００５３】
溶出温度、ＮＰ−４０濃度、溶出バッファーの至適条件の検討
溶出温度、ＮＰ−４０濃度、溶出時間について至適条件を検討した結果を図４に示す。
溶出温度１０、２０、２８および３７℃では、ｓ  ｔｏｗｎｅとｓ  ｍｏｃｋでＧＦＰ−ＰＭＬの溶出量にほとんど差はなかった（図４ａ）。一方、４℃で溶出した場合、ＧＦＰ−ＰＭＬ溶出量はｓ  ｔｏｗｎｅ、ｓ  ｍｏｃｋともに半分以下に減少していたが、両者の比率に関しては２０℃の場合と同程度であった（図４ａ）。
【００５４】
ＮＰ−４０濃度は、全ＧＦＰ−ＰＭＬ量に対する溶出ＧＦＰ−ＰＭＬ量の割合（ＧＦＰ−ＰＭＬ溶出率）により検討した。その結果、溶出温度２０℃の場合の至適条件は０．１％、４℃においては０．１５％であった（図４ｂ）。
【００５５】
至適回収時間は、４℃で溶出した場合、１０〜１５分で差がピークとなった。至適溶出時間帯は、４℃の方が２０℃に比べて長くなっていた（図４ｃ）。
以上より、溶出温度、ＮＰ−４０濃度、溶出時間の至適条件は、４℃、０．１５％、１０〜１５分と決定された。
【００５６】
次にｐＨ、塩濃度の影響について検討を行った。ｐＨ８．０（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）、ｐＨ７．４（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）ではＧＦＰ−ＰＭＬは溶出していたが、ｐＨ７．０（ＨＥＰＥＳ）とｐＨ６．５（ＭＯＰＳ）においては溶出されなかった（図５ａ）。またｓ  ｍｏｃｋに関してはｐＨ８．０よりｐＨ７．４の方が低く、ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅには違いがなかった。ｐＨ７．０以下では可溶化されず、ｐＨに関しては７．４と８．０での溶出が良好であった。また、ＮａＣｌ濃度は１５０ｍＭが至適濃度であった。
【実施例６】
【００５７】
ＨＣＭＶ感染時間
ＨＣＭＶ感染時間の至適条件についても検討を行った。Ｔｏｗｎｅ株をＳＥ／１５細胞へ感染後、１２、１５、１８、２３時間後にそれぞれＮＥＢ処理を行い、それぞれのｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅを比較した。感染時間１２、１５、１８時間においてｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅはほぼ同程度の値であったが、２３時間感染させた場合、約６割に減少していた（図５ｂ）。また１２〜１８時間では、わずかではあるが１８時間で最も高いｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅを示していた。
【００５８】
以上より、感染後１２〜１８時間が至適であった。
【実施例７】
【００５９】
Ｄｉｓｈ法の有用性の検証
ＮＥＢ溶出後に核内に残存する非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量は、非感染細胞に比べて感染細胞で減少している。すなわちｄｉｓｈに残った非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量も感染の指標となると予想される。したがって、以下のようにＤｉｓｈ法の有効性を検討した。
【００６０】
ＳＥ／１５細胞を９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）で培養し、実施例２と同様にＴｏｗｎｅ株を感染させた。１８時間後０．１５％ＮＥＢにて４℃、１５分間ＧＦＰ−ＰＭＬを溶出した。溶出後、９６穴プレート上で蛍光光度計を用いてｄｉｓｈに残存するＧＦＰ−ＰＭＬを直接測定した。細胞に残存するＧＦＰ−ＰＭＬも測定可能であった（図６、ｄｉｓｈ）。ｓｕｐとｄｉｓｈのＧＦＰ−ＰＭＬ量の和がｔｏｔａｌ量にほぼ等しいことから、ｄｉｓｈの測定値はｓｕｐに溶出しなかったＰＭＬボディ中のＧＦＰ−ＰＭＬ量を示すことが確認された。
【実施例８】
【００６１】
拡散したＧＦＰ−ＰＭＬ量とＨＣＭＶ感染価の相関性
ＩＥ１発現量とＮＥＢへ溶出した可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量、およびＩＥ１発現量とｄｉｓｈに残存する非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量の間の相関性について検証した。
【００６２】
ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株の１０倍希釈系列を作製し、それぞれを実施例２と同様の感染方法を用いて、１２穴プレートで培養したＳＥ／１５細胞に感染させた。１８時間後、０．１５％ＮＥＢにて４℃で１５分間溶出した。各条件でのＩＥ１発現量はＩＥ１に対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析により検出した（図７ｃ）。ＩＥ１タンパク質は感染価に応じて発現量が減少し、１００倍希釈液の感染細胞まで検出された（図７ｃ、レーン１〜４）。このＩＥ１タンパク質量の減少と相関して、可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量も感染価が１０倍から１００倍に減少するとともに４分の１に低下していた（図７ａ）。１，０００倍希釈液に関しては溶出されたＧＦＰ−ＰＭＬは検出されなかった（図７ａ）。９６穴プレートを用いたＳｕｐ法においても同様の結果が得られた（図７ｂ、左）。このとき感染価の減少とともにｄｉｓｈに残存する非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量も減少していた（図７ｂ、右）。１，０００倍希釈液ではｄｉｓｈからＧＦＰ−ＰＭＬが検出されなかった。
【００６３】
以上のことから、拡散した可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量およびｄｉｓｈに残存する非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量と、ＨＣＭＶ感染価は相関性があることが示された。
【実施例９】
【００６４】
ＨＣＭＶの中和抗体または細胞への吸着阻害剤の効果の検出
ＨＣＭＶ感染を阻害することが知られている中和抗体または細胞への吸着阻害剤の効果が本検出法により検出されるかどうか、Ｓｕｐ法およびＤｉｓｈ法の両方で検討を行った。阻害剤は抗ｇＢ抗体、抗ｇＨ抗体、ヘパリンの３種類を使用した。
【００６５】
初めに２４穴プレートのスケールで実験を行い、ｓｕｐについてＨＣＭＶ感染効率を測定した。ここでいう「感染」とは、ＨＣＭＶがＳＥ／１５に感染しＩＥ１を発現することによりＧＦＰ−ＰＭＬが核内へ拡散することを意味し、「感染効率」とはウェル中の全細胞数に対する感染細胞数の割合を意味する。
【００６６】
２５μｇ／ｍｌの抗ｇＢ抗体でＨＣＭＶの感染を阻害した場合、ＧＦＰ−ＰＭＬ量は対照とほとんど違いはなかったが、１００μｇ／ｍｌでは感染効率は対照の６０％に減少していた（図８ａ、●）。抗ｇＨ抗体の場合、１００μｇ／ｍｌでは対照の３０％まで、２５μｇ／ｍｌでは７０％に感染効率が減少し、濃度依存的に阻害作用が検出された（図８ａ、■）。ヘパリンの場合、１００μｇ／ｍｌでは対照の１３％まで、２５μｇ／ｍｌでは３０％に感染効率が減少し、抗ｇＨ抗体よりもさらに強い阻害作用があった（図８ａ、□）。
【００６７】
９６穴プレートのスケールでｓｕｐについて測定した場合も同様の結果となった（図８ｂ）。さらにｄｉｓｈを測定したところ、２５μｇ／ｍｌヘパリンでは感染効率が４０％に、１００μｇ／ｍｌでは３０％に減少していた（図８ｃ）。
【００６８】
以上のことから、２４穴プレートまたは９６穴プレートを用いたＳｕｐ法および９６穴プレートを用いたＤｉｓｈ法は、ＨＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株の感染阻害効果を精度よく検出できることが判明した。
【実施例１０】
【００６９】
ＳＥ／１５細胞へのＨＣＭＶ臨床分離株の感染及び定量的検出
ＨＣＭＶ臨床分離株について、上記と同様の実験を行った。ＨＣＭＶ臨床分離株（８６３１株）は、国立感染症研究所においてＨＣＭＶ患者から分離後、凍結保存されていたものを使用した。定法に従いＨＥＬ細胞（ヒト胎児肺線維芽細胞）に８６３１株を感染後、継代を繰り返し、８６３１株感染ＨＥＬ細胞を調製した。調製した８６３１株感染ＨＥＬ細胞（１×１０５細胞）とＳＥ／１５細胞（１×１０５細胞）をチューブ内で混合し、４℃で１，０００ｒｐｍ、５分間、低速遠心した。遠心後、上清を除き、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を加えて２４穴プレートに蒔いた。そして４８時間、５％、ＣＯ２存在下、３７℃で共培養した。その後、実施例４の方法に従ってＮＥＢで可溶化処理し、蛍光量を測定した。図９に示すように、８６３１株を感染させたＳＥ／１５細胞のＮＥＢ処理後の上清「ｓ８６３１」と、擬似感染細胞のＮＥＢ処理後の上清「ｓ  ｍｏｃｋ」の溶出量の差「ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ」が測定可能であった。以上のことから、ＨＣＭＶ臨床分離株の感染を定量的に検出することが可能であることが示された。
【００７０】
ＨＣＭＶ臨床分離株は感染の進行速度が実験室株に比べて遅く、ウイルス力価測定をプラーク減少法で行うと非常に時間がかかるという欠点がある。本発明の検出系は感染前初期で発現する遺伝子を検出するため、プラーク形成を待たずに臨床分離株の感染を迅速に検出することが可能であり、また定量的に検出できるため、株間の比較も可能である。
【実施例１１】
【００７１】
ＨＣＭＶ臨床分離株の薬剤感受性検査
８６３１株に感染したＨＥＬ細胞を７２時間培養し、８６３１株感染ＨＥＬ細胞を調製した。抗ウイルス剤はガンシクロビル（ＧＣＶ）、ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）の２種類をそれぞれ４００、４０、１０、１μｍｏｌ／Ｌの濃度で使用した。抗ウイルス剤存在下で調製した８６３１株感染ＨＥＬ細胞（１×１０５細胞）とＳＥ／１５（１×１０５細胞）をチューブ内で混合し、４℃で１，０００ｒｐｍ、５分間、低速遠心した。上清除去後、同様の抗ウイルス剤存在下において８６３１株感染ＨＥＬ細胞とＳＥ／１５を２４穴プレートにて共培養した。４８時間後、実施例４の方法に従ってＮＥＢで可溶化処理し、蛍光量を測定した。得られた各「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ」から各種抗ウイルス剤の阻害効率を算出しグラフ化した（図１０）。この実験により、本法を用いてＨＣＭＶ臨床分離株の薬剤感受性を定量的に検出できることが判明した。
【実施例１２】
【００７２】
実施例２（１）と同様の方法を用いて、ＳＥ／１５細胞へＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株を感染させた。２０時間後、蛍光顕微鏡画像解析システム（顕微鏡：オリンパス ＩＸ７１、デジタルカメラ：ＤＰ５０、画像取り込みソフト：ＶｉｅｗＦｉｎｄｅｒ Ｌｉｔｅ、接眼レンズ２０倍）を用いて細胞の蛍光画像を記録した。記録した画像を画像解析ソフトであるＮＩＨＩｍａｇｅを用いて解析した。ＰＭＬボディからなる面積の小さなドットはカウントの範囲外となるようＴｈｒｅｓｈｏｌｄ処理を行い（パラメータＭｉｎ値を５０に設定変更）、Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ操作により、拡散したＰＭＬタンパク質からなるドットのみをカウントした。図１１に示すように、非感染細胞を撮影した画像からはドットはほとんどカウントされなかったが、感染細胞を撮影した画像では１２０近いドットがカウントされた。以上のことから、画像解析法を用いて感染細胞を定量的に検出することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の方法を用いることにより、簡便で迅速かつ定量的にへルペスウイルス前初期遺伝子産物の発現を検出し、ウイルス感染価、中和抗体価、感染阻害率を算出することができる。さらに、本発明の検出方法は組換えウイルスを必要としないため、ヒトへルペスウイルスの臨床分離株、ヒト以外を宿主とするへルペスウイルスにも応用可能であり、感染阻害物質のスクリーニングや感受性検査にも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＨＣＭＶをＳＥ／１５細胞に感染させたことによるＰＭＬボディの形態変化およびＮＥＢで溶出後のＧＦＰ−ＰＭＬタンパク質の局在を示す図である。（ａ）はＰＭＬボディの形成を示す。（ｂ）はＧＦＰ−ＰＭＬの核内への拡散を示す。（ｃ）はＨＣＭＶ非感染細胞をＮＥＢで可溶化処理後のＰＭＬボディを示す。（ｄ）はＨＣＭＶ感染細胞をＮＥＢで可溶化処理後のＧＦＰ−ＰＭＬの消失を示す。
【図２】ＨＣＭＶをＳＥ／１５細胞に感染後、ＮＥＢで可溶化処理し、ＮＥＢに溶出された可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬをウエスタンブロットで解析した図である。
【図３】ｔｏｗｎｅ株感染細胞の上清（ｓ  ｔｏｗｎｅ）および疑似感染細胞の上清（ｓ  ｍｏｃｋ）における可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量の、ＮＥＢ処理時間による変化を示すグラフである。
【図４】ＮＥＢ処理による可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬの溶出条件を検討したグラフである。（ａ）は溶出温度を、（ｂ）はＮＥＢ中のＮＰ−４０濃度を、（ｃ）はＮＥＢ処理時間を検討している。
【図５】ＮＥＢ処理による可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬの溶出条件を検討したグラフである。（ａ）は溶出バッファーのｐＨ及び塩濃度を、（ｂ）はウイルス感染時間を検討している。
【図６】Ｄｉｓｈ法の有用性について検討したグラフである。
【図７】可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量とＨＣＭＶ感染価との相関性について検討したグラフである。（ａ）は１２穴プレートを用いた解析において、ＨＣＭＶ感染細胞をＮＥＢで可溶化処理したときｓｕｐ中に溶出される可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量の割合を示し、（ｂ）は９６穴プレートを用いた解析において、ＨＣＭＶ感染細胞をＮＥＢで可溶化処理したときｓｕｐ中に溶出される可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量の割合（左）及びｄｉｓｈ中に残存する非可溶性ＧＦＰ−ＰＭＬ量の割合（右）を示し、（ｃ）はＩＥ１発現量をウエスタンブロットで解析した図である。
【図８】感染阻害剤の阻害効果の検出における有用性について検討したグラフである。（ａ）は２４穴プレートを用いて感染阻害剤の阻害効果をＳｕｐ法で検出した結果であり、（ｂ）は９６穴プレートを用いてヘパリンの阻害効果をＳｕｐ法で検出した結果であり、（ｃ）は９６穴プレートを用いてヘパリンの阻害効果をＤｉｓｈ法で検出した結果を示している。
【図９】８６３１株感染ＨＥＬ細胞とＳＥ／１５を共培養後、ＮＥＢで可溶化処理し、溶出されたＧＦＰ−ＰＭＬの蛍光量を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】抗ウイルス剤ガンシクロビル（ＧＣＶ）及びホスホノ酢酸（ＰＡＡ）に対する８６３１株の感受性について検討したグラフである。
【図１１】ＳＥ／１５細胞へＨＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ株を感染させ、２０時間後に細胞を画像解析し、特定の大きさ以上のドット数をカウントした結果を示すグラフである。
【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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