(57)【要約】      （修正有）【課題】有用な新規核酸の提供、及び当該核酸の情報を利用して、クラミジア、特に猫クラミジアの感染によって引き起こされる疾患予防用のワクチン、病原性に関する分析を提供する。【解決手段】核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、（ａ）特定の塩基配列からなる核酸、又は、（ｂ）前記塩基配列の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。また該核酸によりコードされる蛋白質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−１１６６２３９で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−１１６６２３９の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項２】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−７５５２で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−７５５２の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項３】
猫クラミジア由来の封入体膜タンパク質。
【請求項４】
猫クラミジア由来の封入体膜タンパク質が、配列表の配列番号３〜６８に示す封入体膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
猫クラミジア由来の外膜タンパク質。
【請求項６】
猫クラミジア由来の外膜タンパク質が、配列表の配列番号６９〜１０５に示す外膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】
猫クラミジア由来の３型分泌系タンパク質。
【請求項８】
猫クラミジア由来の３型分泌系タンパク質が、配列表の配列番号１０６〜１２５に示す外膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
猫クラミジア由来の高抗原タンパク質。
【請求項１０】
猫クラミジア由来の高抗原タンパク質が、配列表の配列番号１２６〜１２９に示す高抗原タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
猫クラミジア由来の病原性タンパク質。
【請求項１２】
猫クラミジア由来の病原性タンパク質が、配列表の配列番号１３０〜１８７に示す高抗原タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項９記載のタンパク質。
【請求項１３】
猫クラミジア由来の熱ショックタンパク質。
【請求項１４】
猫クラミジア由来の熱ショックタンパク質が、配列表の配列番号１８８〜１９５に示す高抗原タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１３記載のタンパク質。
【請求項１５】
猫クラミジア由来であって、肺炎クラミジアに存在しないタンパク質。
【請求項１６】
猫クラミジア由来であって、肺炎クラミジアに存在しないタンパク質が、配列表の配列番号１９６〜３２１に示すタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１５記載のタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１６項に記載の核酸又はタンパク質からなるプローブ。
【請求項１８】
請求項１７記載のプローブを用いたスクリーニング方法。
【請求項１９】
スクリーニングを、核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法、又は全塩基配列決定を用いて行なう請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法が、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、又はサザンハイブリダイゼーション法である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、遺伝子の断裂の有無、欠失や点変異の有無によって、結膜炎、肺炎、気管支炎であるか否かを判断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規核酸及び当該核酸を用いたスクリーニング方法に関し、特に、猫クラミジアに由来する新規核酸及び当該核酸を用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  クラミジアは日本において性感染症の第一原因菌となり、一般市民の耳にもなじみある微生物となった。広く医療従事者においては性感染症や肺炎の原因菌で、一般的な抗生剤が十分有効で致死的な疾病は起こさない感染菌との認識であろう。ところが、肺炎クラミジアの冠状動脈硬化部での著しい増殖や、肺炎クラミジアの動脈硬化や虚血性心疾患に対するオッズ比が喫煙や高血圧、肥満等と疫学的に同様であることが明らかとなり、関心は高まってきている。いまのところ肺炎クラミジアの増殖が動脈硬化の原因かは明らかではないが、成人の６０％が肺炎クラミジアの感染歴を持つことを考慮すれば、早急に対策を講じるべき感染菌であることは間違いない。【０００３】  クラミジアは人などの真核生物の細胞内に寄生することによってのみ増殖が出来る偏性細胞内寄生性細菌である（図２）。ウイルスとその大きさや増殖携帯が類似することからウイルスとして分類されていたこともあるが、自己の増殖、成長、代謝に関する基本的な遺伝子を持ち、またリボソームＲＮＡの遺伝子配列解析から早い時期に真正細菌から分枝した細菌群であることが分かっている（図３）。細胞内の寄生環境に適合するためかクラミジア特異的な遺伝子群を発達させ、また真核生物から多くの遺伝子を取り込んでいる。このクラミジアの寄生による増殖形態は、その感染症の理解にきわめて重要であり、根治を困難とする原因である。【０００４】  クラミジアの病原性遺伝子はゲノム配列の解析から、ＦＫ５０６結合因子、ペニシリン結合因子、熱ショックタンパク質、宿主細胞接着因子など約５０あげることができる（図６）。また、情報解析からクラミジアに特有な封入体膜蛋白質遺伝子は肺炎クラミジアで８９、猫クラミジアで５７、トラコマティスで３６存在する。感染時の鍵となる外膜蛋白質遺伝子も数多く検出できる。クラミジアは寄生する宿主から代謝産物やエネルギーの享受し、また宿主に異物と認知させなくする。クラミジアのゲノムは多くの真核生物様タンパク質コードし、それらがＩＩＩ型分泌系などにより宿主側に送り込まれクラミジアの寄生環境を維持してると考えられる（図７）。なかでも真核生物のクロマチン活性制御遺伝子や免疫系の発現抑制遺伝子、アポトーシス制御遺伝子、ミオシンに類似する遺伝子などは重要遺伝子を持つ。【０００５】  クラミジアの中でも猫クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ  （Ｃ．ｆｅｌｉｓ））は、ネコに蔓延する結膜炎の原因菌である。日本におけるＣ．ｆｅｌｉｓの感染は血清疫学的に、野良猫の４６％、飼い猫の１７％、一般の人の２％、獣医の９％に及ぶ。この猫クラミジアは、獣医学的にきわめて重要であり、人の感染症の拡大も懸念されている。さらに、猫クラミジアのゲノム情報は肺炎クラミジアの病原性、さらには動脈硬化などの原因を探る鍵になる。【０００６】  猫クラミジア菌と近縁のクラミジア菌での同様な製品化例として、我が国で年間最多の発生率を示している性病の原因菌であるトラコーマ・クラミジア菌（年間のべ感染者数５−２０万人程度）と肺炎やかぜの主要原因菌のひとつであり動脈硬化・心筋梗塞との関連が示唆されている肺炎クラミジア菌（抗体を保有する感染歴を有する日本人は全人口の���５０−６０％、年間のべ感染者数  数百万人）の２つの菌種について、菌体を用いたＥＬＩＳＡテストとして製品化されており、９６テストのＥＬＩＳＡプレートが平成１２年度より販売されている。また、同試薬を用いた診断方法が、平成１４年度より保健診療に認定されている。これらの近縁菌種との感染診断鑑別の上で、Ｃ．ｆｅｌｉｓ菌の感染診断が獣医学の分野では必須であり、医学的にも近い将来必要となることは間違いない。【０００７】  猫クラミジアはネコに蔓延する結膜炎の原因菌である。日本における猫クラミジアの感染は血清疫学的に、野良猫の４６％、飼い猫の１７％、一般の人の２％、獣医の９％に及ぶ。このＣ．ｆｅｌｉｓによる感染はネコだけにとどまらず、犬への感染も多く報告されている。特に犬の動脈硬化部位から高い率で確認されていることは特筆すべき事である。つまり、獣医学的にきわめて重要であり、診断や治療における経済的・社旗衛生的な効果は高い。ヒトにおいてはまれに肺炎や結膜炎の原因となるが、一般人の２％が抗血清を持つことを考慮すれば症例は極めて少なく、つまりヒトに対しては低感染性、低病原性であると考えられる。猫クラミジアのゲノム情報は肺炎クラミジアの病原性、さらには動脈硬化などの原因を探る鍵になる。Ｃ．ｆｅｌｉｓは人に低感染性ではあるが、近年、高齢化やエイズ患者、重篤な疾患の治療に伴う免疫不全者の人口の増加に伴い、コンパニオンアニマルとして大きな位置を占める猫や犬から人へのＣ．ｆｅｌｉｓの感染が社会的問題となる可能性も懸念される。実際に、人の結膜炎、肺炎、腎炎、心内膜炎の患者の患部にその猫クラミジアが確認され、その原因と考えられる症例が報告されている。【０００８】  猫クラミジア菌の個々の遺伝子の配列に関しては、いくつかの報告がなされており、ｏｍｐＡ遺伝子に関しては、全遺伝子配列が報告されている（非特許文献１）。
【非特許文献１】  Ｒ．Ｍ．Ｂｕｓｈ  ＆  Ｋ．Ｄ．Ｅｖｅｒｅｔ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１（Ｐｔ  １），２０３−２２０（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  しかしながら、判明している猫クラミジア菌の多くは遺伝子の部分配列に過ぎない。【００１０】  猫クラミジア（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）はネコに蔓延する結膜炎の原因菌である（図１）。日本における猫クラミジアの感染は血清疫学的に、野良猫の４６％、獣医の９％に及ぶ。この猫クラミジアは、獣医学的にきわめて重要であり、診断や治療における経済的効果は高い。また、人への感染拡大も懸念されている。さらに、猫クラミジアのゲノム情報は人に高い病原性を持つ肺炎クラミジアや性感染症クラミジアの病原性を探る鍵になる。【００１１】  そこで、本発明の目的は、有用な新規核酸の提供、及び当該核酸の情報を利用して、疾患予防用のワクチン、病原性に関する分析を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
【００１３】  上記目的を達成するために、発明者らは、猫クラミジアについて鋭意研究を重ねた結果、本発明の核酸及び当該核酸を用いたスクリーニング方法法を見出すに至った。【００１４】  本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−１１６６２３９で示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）前記塩基配列番号１−１１６６２３９の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。【００１５】  また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−７５５２で示される塩基配列からなる核酸。又は
（ｂ）前記塩基配列番号１−７５５２の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。【００１６】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の封入体膜タンパク質であることを特徴とする。【００１７】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の封入体膜タンパク質が、配列表の配列番号３〜６８に示す封入体膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００１８】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の外膜タンパク質であることを特徴とする。【００１９】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の外膜タンパク質が、配列表の配列番号６９〜１０５に示す外膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であること事を特徴とする。【００２０】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の３型分泌系タンパク質であることを特徴とする。【００２１】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の３型分泌系タンパク質が、配列表の配列番号１０６〜１２５に示す外膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００２２】  本発明のタンパク質は。猫クラミジア由来の高抗原タンパク質であることを特徴とする。【００２３】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の高抗原タンパク質が、配列表の配列番号１２６〜１２９に示す高抗原タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００２４】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の病原性タンパク質であることを特徴とする。【００２５】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の病原性タンパク質が、配列表の配列番号１３０〜１８７に示す病原性タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００２６】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の熱ショックタンパク質であることを特徴とする。【００２７】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の熱ショックタンパク質が、配列表の配列番号１８８〜１９５に示す高抗原タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００２８】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来であって、肺炎クラミジアに存在しないタンパク質であることを特徴とする。【００２９】  本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来であって、肺炎クラミジアに存在しないタンパク質が、配列表の配列番号１９６〜３２１に示すタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。【００３０】  また、本発明のプローブは、請求項１〜１６項のいずれか１項に記載の核酸からなることを特徴とする。【００３１】  また、本発明のスクリーニング方法は、請求項１７記載のプローブを用いることをと特徴とする。【００３２】  また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、スクリーニングを、核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法、又は全塩基配列決定を用いて行なうこと��特徴とする。【００３３】  また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、前記核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法が、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、又はサザンハイブリダイゼーション法であることを特徴とする。【００３４】  また、本発明の判断方法は、請求項６〜８項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を用いて、遺伝子の断裂の有無、欠失や点変異の有無によって、結膜炎、肺炎、気管支炎であるか否かを判断することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３５】  本発明によれば、猫クラミジアのゲノムＤＮＡ配列情報を利用して、ＰＣＲによるきわめて簡便で迅速な猫クラミジアの検出方法、他のクラミジアからの鑑別方法を作り出せるという有利な効果を奏する。また、猫クラミジアのプラスミッドＤＮＡ配列情報を利用して、ＰＣＲによるきわめて高感度で簡便・迅速な猫クラミジアの検出方法、他のクラミジアからの鑑別方法を作り出せる。【００３６】  また、本発明によれば、人に対して低病原性である猫クラミジアを遺伝子工学的にさらに安全な非病原性菌とした後、非病原性菌猫クラミジアの生菌をそのまま使用することによる肺炎、動脈硬化、性感染症、結膜炎、オウム病などの予防のためのワクチンの開発を行える。また、猫クラミジアを感染させた猫の血清から、猫クラミジアのもつ抗原遺伝子を決定しているため、これら遺伝子は、猫クラミジア感染の診断に応用できる上に、免疫のための抗原として使用できる。【００３７】  また、本発明によれば、人に対して低病原性である猫クラミジアを遺伝子工学的にさらに安全な非病原性菌とした後、非病原性菌猫クラミジアを遺伝子治療のためのベクターとして使用する方法の開発を行える。【００３８】  また、本発明によれば、猫クラミジアのゲノムＤＮＡをもちいたマイクロアレーを作成し、猫クラミジアの猫に対する病原性、もしくは人に対する低病原性の解析に応用することが可能であるという有利な効果を奏する（図１２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】  猫クラミジアのゲノムＤＮＡ配列は１，１６６，２３９塩基対から構成され、肺炎クラミジアより５％少なく、トラコマティスより１０％多い。いずれもＧＣ含量は約４０％で、繰り返し配列はほとんど存在しない。クラミジアゲノムは約１０００の蛋白コード遺伝子と１組のリボソームＲＮＡ、２０種のアミノ酸すべてをカバーするわずか３８のｔＲＮＡを構成する（図４）。これらクラミジアのゲノムは大多数の細菌のものより小さく、大腸菌ゲノムと比較するとクラミジアの構成塩基数、遺伝子数ともに約４分の１である。代謝や環境に対応する機構の宿主細胞への依存により不要となる遺伝子を欠落したと考えられる。一方、プラスミッドは７，５５２塩基対から構成され８つの遺伝子をコードしている。（図５）このプラスミッドは猫クラミジアの菌あたり約５コピー含まれている。【００４０】  本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−１１６６２３９で示される塩基配列からなる核酸、又は
（ｂ）前記塩基配列番号１−１１６６２３９の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなる。当該核酸は、猫クラミジアの全ゲノム配列由来のものである。具体的には、１００５のタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。【００４１】  本発明の核酸には、前記塩基配列番号１−１１６６２３９の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸も包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、後述するように、例えば、プローブとして利用することができるからである。なお、欠失、置換もしくは付加されている物であっても、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法もしくはＳＮＰ（一塩基置換多型）解析法に準ずるプライマーを設計することにより、１００％一致するゲノムや遺伝子と同様の検出、区別・鑑別が可能である。【００４２】  特に、強調すべき領域は以下に示すところで病原性（毒素や感染宿主の決定）に深く関わり、鑑別診断や抗生剤・予防薬の開発に重要な領域である。
１）すなわち、遺伝子の欠失によって種による大規模な差異が生じている領域。８４遺伝子を含む４７万塩基目から５７万塩基目までと、２）ゲノムＤＮＡのダイナミックな組み替えに従う遺伝子の生成によって、種による大規模な差異が生じている領域。５遺伝子を含む３３万塩基目から３６万塩基目までと、９１遺伝子を含む７５万塩基目から７８万塩基目までである。これらの領域を利用して、後述するように、鑑別診断等に利用することができる。【００４３】  また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−７５５２で示される塩基配列からなる核酸。又は
（ｂ）前記塩基配列番号１−７５５２の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなる。本発明の核酸には、前記塩基配列番号１−７５５２の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸も包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、後述するように、例えば、プローブとして利用することができるからである。【００４４】  特に、強調すべき鑑別診断への応用に重要な変異が蓄積されている領域は１塩基目から１０００塩基目と５６００塩基目から６３００塩基目の２領域である。この領域を用いることにより、極めて近縁な種のクラミジアをも鑑別が可能であり、プラスミドのコピー数はゲノムの約５倍であることから、菌の高い検出が可能となる。【００４５】  クラミジアのゲノムは非常にコンパクトに設計されており、無駄と思える遺伝子が極めてが少ない。同様に同じ遺伝子がゲノム上に２つ存在することもなく、ゲノムを用いたＰＣＲではその対象となる配列はゲノムあたり１つである。しかし、プラスミドだけはゲノムあたり５個存在することから、クラミジアの菌体の検出にはゲノムの遺伝子を用いるよりも５倍の感度が得られると考えられる。なお、我々のゲノム解析からクラミジアは進化的に菌体間でプラスミドを交換していることは検出できなかったことから、プラスミドが菌体の鑑別に十分使用可能であることも分かった。【００４６】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の封入体膜タンパク質である。好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の封入体膜タンパク質が、配列表の配列番号３〜６８に示す封入体膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。この一群の蛋白質はクラミジアが増殖する場である封入体の表面に存在することが予想される蛋白質であり、クラミジアの増殖時における宿主との接点をなす因子群であると考えられている。ある種の封入体膜蛋白質は本菌ネコクラミジアのネコへの接種によって高い抗原性を有することが分かっている。ワクチンとしての利用や抗体価測定による感染菌の同定法の開発に応用可能である。さらに我々は一部の封入体膜蛋白質は宿主の細胞死を制御している可能性を示す結果を得ており、生物工学的ツールとしての応用が可能である。【００４７】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の外膜タンパク質である。本発明のタンパク質の好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の外膜タンパク質が、配列表の配列番号６９〜１０５に示す外膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。この一群の蛋白質はクラミジアの細胞自体の表面に存在し、感染時における宿主への接着のキー因子であると考えられている。実際、性感染症クラミジアのある種の外膜蛋白質はワクチンとして機能することが知られている。さらに本菌ネコクラミジアのネコへの接種によって産生される抗体に、この外膜蛋白質に対する物が少なくはなかった。以上より、ワクチンとしての利用や抗体価測定による感染菌の同定法の開発に応用可能である。【００４８】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア��来の３型分泌系タンパク質である。好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の３型分泌系タンパク質が、配列表の配列番号１０６〜１２５に示す外膜タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。この一群の蛋白質はクラミジアの細胞膜上に存在し、増殖時に宿主へ病原性因子や宿主の制御因子を導入する機能を有する。この分泌機構をブロックする化合物の探索は全く新しい機構の抗生剤の開発に繋がると考えられる。また、クラミジアワクチンの開発にはこの分泌系を破壊することによって弱毒株を作ることが考えらる。【００４９】  本発明のタンパク質は。猫クラミジア由来の高抗原タンパク質である。好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の高抗原タンパク質が、配列表の配列番号１２６〜１２９に示す高抗原タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。ワクチンとしての利用や抗体価測定による感染菌の同定法の開発に応用可能である。ワクチンとしての利用や抗体価測定による感染菌の同定法の開発に応用可能である。【００５０】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の病原性タンパク質である。好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の病原性タンパク質が、配列表の配列番号１３０〜１８７に示す病原性タンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。【００５１】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来の熱ショックタンパク質である。好ましい実施態様において、猫クラミジア由来の熱ショックタンパク質が、配列表の配列番号１８８〜１９５に示す熱ショックタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。クラミジアの熱ショック蛋白質は高い抗原性を有し感染時の炎症反応を誘発する原因となる。またその交叉反応として自己免疫疾患の原因となると考えられている。この蛋白質は死菌や弱毒株を用いたワクチン開発の際には遺伝子を改変する必要があり、そのいみでワクチン開発に解析が必須である。【００５２】  本発明のタンパク質は、猫クラミジア由来であって、肺炎クラミジアに存在しないタンパク質である。好ましい実施態様において、猫クラミジア由来であって、肺炎クラミジアに存在しないタンパク質が、配列表の配列番号１９６〜３２１に示すタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。この一群の蛋白質に対する抗体は近縁種である肺炎クラミジアとは交叉せず、ネコクラミジア特異的である。感染菌の同定法の開発に応用可能である。【００５３】  ここで、上述の核酸の精製、単離方法の一例について説明する。上述の核酸は、特に限定されるものではないが、以下の手順で精製、単離することができる。ネコクラミジアをネズミから樹立された培養細胞であるＭｃＣｏｙもしくは人の咽頭癌培養細胞ＨＥｐ２に感染させる。【００５４】  ８０時間後、培養細胞を維持する培養液中にネコクラミジア菌体が放出される。その菌体を遠心分離によって培養液から回収する。回収された菌体にはコンタミネーションとして、培養細胞も含まれる。そこでショ糖密度勾配超遠心法により、クラミジア菌体を培養細胞及びそこから漏出したミトコンドリアなどから分離する。人などのゲノムＤＮＡのコンタミネーションの度合いはＰＣＲ法によって確認し、十分な純度でな��れば再度ショ糖密度勾配超遠心を行う。クラミジア菌体はアルカリＳＤＳ法と呼ばれるＤＮＡを精製する一般的な方法で処理し、ゲノムＤＮＡを調製する。【００５５】  なお、ＤＮＡの塩基配列は、当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、ターミネータ法などを用いて塩基配列を決定することができる。【００５６】  また、本発明のプローブは、請求項１〜１６項のいずれか１項に記載の核酸からなる。当該プローブの使用方法としては、上記本発明の核酸を、直接又はＰＣＲ法で増幅し高分子膜へブロットして固定した後、本発明のプローブをハイブリダイズさせればよい。ハイブリダイズの方法は、常法により特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロッティング法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、塩基配列決定法などを挙げることができる。【００５７】  また、本発明のプローブのハイブリダイズに使用される支持体としては、薄膜、粉末、粒状物、ゲル、ビーズ、繊維等の他、分散液、エマルジョン等を挙げることができる。これらを適当なカラムに充填して使用してもよい。これらのうち、薄膜が好ましく、たとえば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜が好ましい。【００５８】  次に、本プローブに使用することが可能な標識について説明する。標識としては、当業者に周知のものを使用することができ、特に限定されないが、例えば、３２Ｐ、３５Ｓなどの放射性原子、ビオチン基、アジピン基、または酵素類、蛍光標識等などのほか、抗原抗体系を利用する場合には、抗原を含んでいても良い。これらも本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００５９】  以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。【００６０】実施例１
まず、猫クラミジアのゲノムＤＮＡ配列の決定を試みた。
約６０年前にヨーロッパを中心にネコに感染するクラミジアについての報告が始まった。菌体の分離技術の未発達さ、分子生物学が存在していなかったこともあり、分離同定には至らなかった。その後、ペットとして飼われている猫から人に感染したとしか考えられない症例がいくつも報告されるにいたり、その菌体の分離同定が必須とする気運が高まった。細胞内寄生菌を特異とする我々が結膜炎を起こしているネコの眼漏液からネコクラミジアを単離した。部分的なゲノム配列決定により、これがクラミジアに属する菌体であることを明らかとした。また、実験ネコへの感染により、この菌体がネコにおける結膜炎の原因菌となることを示した。
クラミジアの増殖には動物細胞を必要とするため、ゲノムＤＮＡの大量調製および完全な宿主ＤＮＡ除去は困難である（図１３）。１０ｃｍシャーレを合計１００以上用いての培養細胞を大量に維持し、大量感染、大規模なＤＮＡ調製をおこなった。得られたＤＮＡは量的には下限いっぱいの１０μｇであったが、クラミジアのゲノムＤＮＡとしては極めて純度が高かった。猫クラミジアのゲノムＤＮＡ配列の決定には、この高純度なＤＮＡを用いて配列決定を開始した。配列決定途中でのコンピューターシュミレーションで困難が予想されていれば方針は変更されていたであろう。【００６１】  このＤＮＡを２段階の超音波処理を行った。軽度の処理後、４〜５千塩基のＤＮＡフラグメントを回収し、さらに処理を施した後、１〜２千塩基のＤＮＡフラグメントを回収した。これらのＤＮＡフラグメントの末端を平滑化する処理の後、ｐＵＣベクターに１−２ｋｂｐと４−  ＫｂｐのゲノムＤＮＡフラグメントを挿入したショットガンライブラリーを構築し、その両端から配列決定を行った。最終的に、２万ＤＮＡフラグメントの両末端のＤＮＡ配列決定を行い、４万配列を得た。この中には精度が十分ではない配列、クラミジアの培養に用いた培養細胞のＤＮＡの配列も含まれており、それらを除外した後、３万の塩基配列を用いて、各塩基配列の結合作業であるアセンブリを行った。用いたソフトウエアはｔｈｅ  Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄである。【００６２】  結果、ゲノムＤＮＡ配列およびプラスミッドＤＮＡ配列は環状化した。わずかに存在した信頼性の低い部分の確認後、猫クラミジアの全ゲノムＤＮＡ配列およびプラスミッドＤＮＡ配列決定は完了した。【００６３】実施例２
次に、猫クラミジアの病原性遺伝子の抽出を試みた。ＧｅｎｏｍｅＧａｍｂｌｅｒやＧｅｎｅＨａｃｋｅｒ  ｐｌｕｓ、Ｇｌｉｍｍｅｒ２．０といったソフトウエアを用いることにより、クラミジア全ゲノム中、プラスミド中に存在することが予想される遺伝子を抽出した。最終的には生物学的最新の情報を取り込むことにより、１００５のタンパク質をコードする遺伝子の抽出を完了した。その１００５の遺伝子の中から病原性因子の抽出にはソフトウエアであるＢＬＡＳＴＰとＦＡＳＴＡ３、膜タンパク質の抽出にはＳＯＳＵＩをもちい、最終的には生物学の情報から病原性因子を決定した（図６）。以下に、クラミジアのもつ病原性の概念と一部の病原性因子群の特徴を記す。【００６４】１）感染とクラミジア細胞膜蛋白質（図２）
クラミジアは宿主細胞外に存在する時、感染形態であるＥＢは宿主の感染免疫の攻撃を回避しつつ、宿主細胞表面に吸着・結合する事をうかがう。外膜蛋白質は病原性や免疫応答に重要な関連を想起させるため、生化学や免疫学的研究が進んだ。結果、いくつものＥＢ外膜の構成蛋白質（ｏｍｐ，ｐｍｐ）が同定され、感染や宿主の免疫に重要な役割を担う事が分かった。ゲノム解析からは、ｐｍｐ遺伝子はゲノム上で多重遺伝子ファミリーを形成し、クラミジアの表面抗原の多様化を産み出していると考えられる。【００６５】
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細胞内に取り込まれたＥＢを含む貪食胞は、通常起こるべきリソソーム融合やｐＨ低下を起こさない。ＥＢは増殖形態であるＲＢに変化し、貪食胞は封入体に発達する。ＲＢはその封入体中で１０回前後の分裂の後、ＥＢに形態変化する。この間、クラミジアは貪食胞を制御し、封入体を宿主に異物と認知させず、宿主から代謝産物やエネルギーの供給を受ける。クラミジアはＩＩＩ型分泌系により様々な蛋白質を宿主細胞へ導入し、宿主を制御している
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に重要だと考えている。また、これらの因子の宿主細胞質側への輸送にはＩＩＩ型分泌系が関与していると考える。【００６６】３）ＩＩＩ型分泌系（図７）
ＩＩＩ型分泌系はエルシニアやサルモネラなどにみられる宿主細胞に蛋白質を注入する機構である。その遺伝子群がクラミジアにも存在し、電子顕微鏡で観察される封入体膜に突き刺さるニードル状構造がＩＩＩ型分泌系と考えられている。一般的にＩＩＩ型分泌系遺伝子群はゲノムかプラスミドの１カ所に集中し、ゲノムの他の部分と異なるＧＣ含量を示す。クラミジアではゲノムの３領域に分散し、ＧＣ含量の偏りは見られない。実験的にはクラミジアのＩＩＩ型分泌系の機能や基質蛋白質は未同定である。【００６７】４）クラミジア封入体膜蛋白質
クラミジアの増殖環境を宿主細胞質とすると、クラミジアのゲノムは封入体膜、外膜そして内膜の３重の膜に被われていることになる。Ｉｎｃ蛋白質群は封入体膜に局在し、他の生物には極めてまれな２回膜を貫通すると考えられる約５０残基の疎水性領域を持つ。その疎水性領域をもつ条件ではＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅには約５０個のＩｎｃ蛋白質群存在することになるが、種内種間ともにアミノ酸配列の相同性は低い。一部のＩｎｃ蛋白質は真核生物の細胞骨格蛋白質と類似している。【００６８】５）真核生物様遺伝子（図７）
クラミジアの全遺伝の約５％が真核生物の遺伝子とよく類似する。真核生物のクロマチン活性制御遺伝子や蛋白質リン酸化酵素遺伝子の類似遺伝子、免疫系の発現抑制に関わる蛋白質分解酵素や宿主のアポトーシス制御に関わる因子の遺伝子を挙げる事ができる。さらに、細胞骨格関係のミオシンやキネシンなどに類似する遺伝子があり、宿主から代謝産物やエネルギーの供給を受ける輸送機構を形成している可能性がある。【００６９】実施例３
次に、猫クラミジアの抗原遺伝子の決定を試みた。日本のネコ結膜炎スワブ由来株Ｆｅ／Ｃ−５６株の抗原発現遺伝子のクローニングおよび性状の解析を行った。猫クラミジアのゲノムＤＮＡを以上と同様の方法で５μｇ調製した。超音波で破砕の後、３−６千塩基のＤＮＡフラグメントを抽出し、遺伝子発現用ラムダファージを用いて、ゲノムライブラリーを構築した。【００７０】  ゲノムを調製したのと同じ猫クラミジアで実験ネコ１０匹を免疫し、感染前、感染確立期、発症時、快復期のネコ血清を調製した。遺伝子発現用ゲノムライブラリーをプレイトに拡散、増殖させ、ＰＶＤＦ膜にブロットしたものに対して、この血清を用いてプラークハイブリダイゼーションを行った。結果、得られた多くのポジティブクロンを回収し、さらにウエスタンブロッティングによって確認した。最終的に抗原は１２のグループに分かれ、これらの多くは発症極期（感染後１０日）から回復期（感染後１４および２１日）の血清と反応した。また、いずれもウエスタンブロッティングによっては他のクラミジア株免疫血清との交差反応は認められなかった。【００７１】  抗原遺伝子を含むゲノムライブラリーからのクローンのＤＮＡ配列を決定し、抗原遺伝子の特定を行った。さらに、抗原遺伝子をｐＧＥＸベクターにクローニングすることにより、抗原蛋白質をＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた。部分的に精製したＧＳＴ融合抗原蛋白質はネコからの血清と特異的に反応することを確認した。【００７２】実施例４
次に、猫クラミジアの猫や人からの検出を試みた。【００７３】ａ．ＰＣＲ法
猫クラミジアの猫や人からの検出には簡便でかつ高感度であり、特異性や客観性の点でも優れるＰＣＲ法を用いた。猫クラミジアはプラスミドを保有し、プラスミドを標的配列とすることによりさらに高感度を得た。ＰＣＲ法の利点として、柔軟なプライマー設計が可能であり、標的配列の変更が容易である事も挙げられる。多型性領域を標的配列として、種や株の同定・診断に応用可能である。【００７４】ｂ．蛍光抗体染色法
封入体中の菌体数が増殖の段階や環境によってまちまちであるため、ＰＣＲ法では封入体数の定量化はできない。そのため蛍光抗体法による顕微鏡下の観察・定量化を行なった。外膜タンパクに対する種特異的抗体やＬＰＳに対する属特異的抗体が市販されている。当研究室では直接蛍光抗体法にはデンカ生研（株）クラミジアＦＡ試薬「生研」（ウイルス検査試薬として販売）などを使用している。間接蛍光抗体法による観察には自作の抗ＩｎｃＡ蛋白質抗体やＤＡＫＯ（株）のＲＲ４０２などを使用していた。宿主の核をＤＡＰＩ染色して対照とすることにより鑑別は容易になる。【００７５】  猫クラミジアの持つ遺伝子レパートリーと他のクラミジアの遺伝子レパートリーを比較することにより、各クラミジアの特徴が見えてくる（図８）。たとえば、猫クラミジアと肺炎クラミジア、トラコマティスでの顕著な遺伝子
構成の違いはトリプトプァン合成酵素群の有無である。本発明者らはその点に注目し、トリプトファンの異化促進剤であるインターフェロン・ガンマに対するクラミジアの感受性がトリプトプァン合成酵素群の有無と相関していることを実験的に証明した（図９）。【００７６】  猫クラミジアを感染させた猫の血清により、猫クラミジアのもつ抗原遺伝子を５つ決定している。これら遺伝子は、猫クラミジア感染の診断に応用できる上に、免疫のための抗原として使用できる。また、真に猫クラミジアが人に対して低病原性であり広くクラミジアに対する免疫を付与する時には、より病原性の高いクラミジアに対する免疫のための弱毒株として使用できる。本発明者等が同定した猫クラミジアに対する猫抗原エピトープ領域は、迅速に診断薬、ワクチンの開発につながるものであることが判明した（図１０）。【００７７】  なお、ワクチンとしての使用については、一般的にはエピトープを動物、人に注射しても効率よく抗体は産生されないので、その場合、アジュバンドと呼ばれる免疫刺激物質と混合し、エマルジョンとしたのち注射して行なうことができる。【００７８】  日本では一般の人の２％、獣医の９％が抗血清を持つ。症例こそ少ないが潜在的罹患者はきわめて多いと考えられる。肺炎クラミジアと同様に心疾患の患部より検出されており、現在原因不明の心疾患の原因である可能性があり、肺炎クラミジアと同様に診断に応用できることも判明した。【００７９】  また、ヒトに対して比較的低病原性である考えられる本菌のゲノムと、動脈硬化などの原因とされる肺炎クラミジアのゲノムを比較解析することにより、動脈硬化などの原因につながる可能性がある。つまり、肺炎クラミジアの遺伝子と類似する猫クラミジアの遺伝子は、ＳＮＰ解析的な意義を持つ事がわかった。【００８０】  本菌に対するワクチンの開発は重要であると考えられる。臨床から得られるネコおよびヒト、さらに本菌を接種したネコの抗血清から主要抗原タンパク質を検出し、ゲノム情報学的解析して、これを、医学、獣医学的に十分な信頼を確保する人さらに猫に対するワクチンの開発に発展させることは、十分可能であることが判明した。【００８１】  また、猫クラミジアのゲノムＤＮＡ配列情報を利用して、ネコクラミジアに特異的な抗体の生産が可能であり、その抗体を用いて特殊な装置などを必要としない猫クラミジアの検出鑑別方法に応用できる事がわかった（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００８２】  猫クラミジア菌の感染防御ワクチン、診断試薬とそれを利用した診断法に関して、従来技術・従来製品は皆無である。猫クラミジア菌の近縁菌種では上記の診断試薬が商品化されているが、それらの従来の技術・従来製品が菌体やごく一部の遺伝子産物を用いて作製されているのに対して、我々の検出する抗原エピトープ情報は、実際の全ゲノムおよび全遺伝子塩基配列に基づいて網羅的解析結果から得られたものであり、それを基盤とした遺伝子組み換えタンパクやペプチドを用いた診断試薬は、従来には全くない先進の製品化への期待ができる。【００８３】  さらに猫クラミジア菌の全遺伝子配列に基づいた抗原エピトープ情報は、猫クラミジア菌だけでなく近縁の菌種を含めた感染防御ワクチンの開発や商品化において従来にない新しい手法を与えるもので、猫クラミジア菌を含めたトラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）菌や肺炎クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）など、近縁菌の共通アミノ酸配列タンパクを利用した感染防御ワクチン製品化への必須な情報となる。従って、本発明者等が同定した猫クラミジアに対する猫抗原エピトープ領域は、迅速に診断薬、ワクチンの開発につながるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】  猫クラミジアにより結膜炎を発症した猫の眼の状態と、猫クラミジアに起因する疾患の特徴をまとめた図である。
【図２】  クラミジアの感染増殖サイクルを示す図である。
【図３】  クラミジアの系統における、猫クラミジアの系統位置を示す図である。
【図４】  猫クラミジアの全ゲノム上の遺伝子地図を示す図である。
【図５】  猫クラミジアのプラスミッド上の遺伝子地図と遺伝子機能を示す図である。
【図６】  猫クラミジアの病原性因子を示す図である。
【図７】  猫クラミジアの真核生物型因子とその分泌に関わるタイプＩＩＩ型分泌装置を示す図である。
【図８】  猫クラミジア特異遺伝子とクラミジア共通・非共通遺伝子を示す図である。
【図９】  トリプトファン遺伝子とＩＦＮ−ｇａｍｍａを示す図である。
【図１０】  実験的に同定された抗原原性遺伝子を示す図である。
【図１１】  猫クラミジアゲノムＤＮＡのマイクロアレー解析への応用の一例を示す図である。
【図１２】  猫クラミジアの抗体作成法の一例を示す図である。
【図１３】  猫クラミジアのゲノムＤＮＡ調製法の概略を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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