(57)【要約】【課題】従来の抗癌剤の副作用や該抗癌剤に対する薬剤耐性癌細胞の出現により、新規な抗癌剤が要望されている。また、ある種の抗癌剤の副作用として知られている神経障害を軽減する低分子化合物が要望されている。【解決手段】６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇまたは下記式（ＩＩＩ）若しくは（ＩＶ）2005132787.tif 000009［式中、Ｒ１はα−Ｈまたはβ−Ｈを示し、Ｍ１が水素原子でＭ２が水酸基、またはＭ１とＭ２が二重結合を形成し、Ｒ２とＲ３は、ともに水素原子、またはＺ配置の二重結合を示す］で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物、またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする薬剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質をもつ生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎまたはそれらの薬理学上許容される塩。
１）高分解能マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ法により測定した実測値（Ｍ＋Ｎａ）＋＝３９１．２６３４
２）分子式：Ｃ２５Ｈ３６Ｏ２
３）水素核磁気共鳴スペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
９．３１（ｓ，１Ｈ）、６．８４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．０４（ｓ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ）、２．７１（ｍ，１Ｈ）、２．７１（ｍ，１Ｈ）、２．６８（ｍ，１Ｈ）、２．２３（ｍ，１Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、２．０４（ｍ，１Ｈ）、１．９３（ｍ，２Ｈ）、１．７４（ｍ，１Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．６１（ｓ，３Ｈ）、１．６１（ｍ，１Ｈ）、１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ）、１．２５（ｍ，１Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ）、０．９９（ｍ，１Ｈ）、０．９０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、０．８６（Ｓ，３Ｈ）
５）炭素核磁気共鳴スペクトル（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
２０７．４、１９３．０、１７７．５、１５６．９、１４０．４、１３１．６、１３０．２、１２４．４、５１．５、５０．０、４９．０、４５．８、４５．０、４４．６、４３．１、３７．２、３１．８、３１．０、２７．１、２５．７、２５．７、２３．１、１８．６、１７．７、１７．２
【請求項２】
下記の理化学的性質をもつ生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇまたはそれらの薬理学上許容される塩。
１）高分解能マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ法により測定した実測値（Ｍ＋Ｎａ）＋＝３８９．２４６６
２）分子式：Ｃ２５Ｈ３４Ｏ２
３）水素核磁気共鳴スペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
９．２７（ｓ，１Ｈ）、６．７９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．１１（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、６．０３（ｓ，１Ｈ）、６．０１（ｄ，１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、    ５．１２（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．３８（ｂｒｓ，１Ｈ）、２．９２（ｄ，Ｊ＝２０．６Ｈｚ，１Ｈ）、２．６８（ｍ，１Ｈ）、２．６１（ｍ，１Ｈ）、２．５８（ｍ，１Ｈ）、２．２０（ｍ，１Ｈ）、２．０６（ｓ，３Ｈ）、２．０４（ｍ，１Ｈ）、１．９０（ｍ，１Ｈ）、１．８３（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．６８（ｍ，１Ｈ）、１．５３（ｍ，１Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ）、１．３０（ｍ，１Ｈ）、１．１５（ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）、０．９７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、０．８５（ｓ，３Ｈ）
４）炭素核磁気共鳴スペクトル（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
２０７．７、１９３．２、１７７．６、１５８．１、１４０．２、１３６．７、１３５．９、１３０．５、１２４．２、１２０．１、５２．３、５０．２、４９．３、４６．１、４５．６、４４．５、４４．０、３２．９、３１．１、２７．９、２６．７、２３．１、２１．４、１８．２、１７．４
【請求項３】
下記式（Ｉ）
【化１】
2005132787.tif 000006
で表される６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項４】
下記式（ＩＩ）
【化２】
2005132787.tif 000007
で表される６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項５】
下記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）
【化３】
2005132787.tif 000008
［式中、Ｒ１はα−Ｈまたはβ−Ｈを示し、Ｍ１が水素原子でＭ２が水酸基、またはＭ１とＭ２が二重結合を形成し、Ｒ２とＲ３は、ともに水素原子、またはＺ配置の二重結合を示す］で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物、またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする神経細胞突起伸展剤。
【請求項６】
式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物がｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎまたはｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｈである請求項５記載の神経細胞突起伸展剤。
【請求項７】
請求項５または６に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする神経保護剤。
【請求項８】
請求項５または６に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする細胞増殖阻害剤。
【請求項９】
請求項５または６に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする多剤耐性癌細胞増殖阻害剤。
【請求項１０】
請求項５または６に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【請求項１１】
請求項５または６に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
【請求項１２】
Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属に属し、請求項５記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を生産する能力を有する微生物を栄養培地にて培養し、培養物中にｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物の製造法。
【請求項１３】
Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＧＦ−１０（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５６２）株またはその変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属に属する真菌の生産する新規なｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物と、それら及びそれらの類縁物質の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗癌剤としては、非特許文献１に示すように、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、ビンクリスチン等が知られている。しかし、これら抗癌剤は広く臨床で使用されているが、心毒性、骨髄抑制等の副作用や薬剤耐性癌細胞の出現により十分な治療が施せないケースが増加している。また、タキソールやビンクリスチン等は、神経障害の副作用も問題となっている。
【０００３】
一方、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物が、例えば、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ属に属する菌株から得られ、殺線虫作用や抗菌作用等を有することが非特許文献２に記載されている。また、スピロオキソラン構造を有するｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  ＡのＡ−５４９細胞等に対する殺細胞活性及びＬ１２１０細胞に対するアポトーシス誘導能活性が非特許文献２及び非特許文献３に記載されている。しかし、スピロオキソラン構造を持たない他の類縁物質について癌細胞増殖抑制作用は知られておらず、また、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物について神経細胞保護作用は全く知られていない。さらに、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属に属する真菌がｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を生産した文献も知られていない。
【０００４】
【非特許文献１】塚越  茂、癌化学療法の変遷、癌と化学療法、２６巻  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、ｐ．２３−３１（１９９９）
【非特許文献２】Ａｕ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６７，ｐ．７３３−７４２（２０００）
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６，ｐ．４２７−４３１（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の抗癌剤には臨床現場で満足すべきものはなく、新しい抗癌剤が求められている。また、神経細胞に対する既存抗癌剤の副作用としての神経毒性から神経を保護する神経成長因子（ＮＧＦ）と同様な作用を有する低分子化合物が待たれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため微生物の代謝産物について種々検索した結果、糸状菌に属する一菌株が産生する生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ及び６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇを見出し、並びにそれらの類縁物質が有する生理活性作用を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の（１）〜（１３）に関する。
（１）下記の理化学的性質をもつ生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎまたはそれらの薬理学上許容される塩。
１）高分解能マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ法により測定した実測値（Ｍ＋Ｎａ）＋＝３９１．２６３４
２）分子式：Ｃ２５Ｈ３６Ｏ２
３）水素核磁気共鳴スペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
９．３１（ｓ，１Ｈ）、６．８４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ）、６．０４（ｓ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ）、２．７１（ｍ，１Ｈ）、２．７１（ｍ，１Ｈ）、２．６８（ｍ，１Ｈ）、２．２３（ｍ，１Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、２．０４（ｍ，１Ｈ）、１．９３（ｍ，２Ｈ）、１．７４（ｍ，１Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．６１（ｓ，３Ｈ）、１．６１（ｍ，１Ｈ）、１．５１（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ）、１．４３（ｍ，１Ｈ）、１．２５（ｍ，１Ｈ）、１．１６（ｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ）、０．９９（ｍ，１Ｈ）、０．９０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、０．８６（Ｓ，３Ｈ）
５）炭素核磁気共鳴スペクトル（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
２０７．４、１９３．０、１７７．５、１５６．９、１４０．４、１３１．６、１３０．２、１２４．４、５１．５、５０．０、４９．０、４５．８、４５．０、４４．６、４３．１、３７．２、３１．８、３１．０、２７．１、２５．７、２５．７、２３．１、１８．６、１７．７、１７．２
【０００８】
（２）下記の理化学的性質をもつ生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇまたはそれらの薬理学上許容される塩。
１）高分解能マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ法により測定した実測値（Ｍ＋Ｎａ）＋＝３８９．２４６６
２）分子式：Ｃ２５Ｈ３４Ｏ２
３）水素核磁気共鳴スペクトル（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
９．２７（ｓ，１Ｈ）、６．７９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．１１（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、６．０３（ｓ，１Ｈ）、６．０１（ｄ，１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、    ５．１２（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．３８（ｂｒｓ，１Ｈ）、２．９２（ｄ，Ｊ＝２０．６Ｈｚ，１Ｈ）、２．６８（ｍ，１Ｈ）、２．６１（ｍ，１Ｈ）、２．５８（ｍ，１Ｈ）、２．２０（ｍ，１Ｈ）、２．０６（ｓ，３Ｈ）、２．０４（ｍ，１Ｈ）、１．９０（ｍ，１Ｈ）、１．８３（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｓ，３Ｈ）、１．６８（ｍ，１Ｈ）、１．５３（ｍ，１Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ）、１．３０（ｍ，１Ｈ）、１．１５（ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）、０．９７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、０．８５（ｓ，３Ｈ）
４）炭素核磁気共鳴スペクトル（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）、δ  （ｐｐｍ）
２０７．７、１９３．２、１７７．６、１５８．１、１４０．２、１３６．７、１３５．９、１３０．５、１２４．２、１２０．１、５２．３、５０．２、４９．３、４６．１、４５．６、４４．５、４４．０、３２．９、３１．１、２７．９、２６．７、２３．１、２１．４、１８．２、１７．４
【０００９】
（３）下記式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
2005132787.tif 000002
【００１１】
で表される６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎまたはその薬理学上許容される塩。
（４）下記式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
2005132787.tif 000003
【００１３】
で表される６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇまたはその薬理学上許容される塩。
（５）下記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）
【００１４】
【化３】
2005132787.tif 000004
【００１５】
［式中、Ｒ１はα−Ｈまたはβ−Ｈを示し、Ｍ１が水素原子でＭ２が水酸基、またはＭ１とＭ２が二重結合を形成し、Ｒ２とＲ３は、ともに水素原子、またはＺ配置の二重結合を示す］で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物、またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする神経細胞突起伸展剤。
【００１６】
（６）式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物がｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎまたはｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｈである上記（５）記載の神経細胞突起伸展剤。
（７）上記（５）または（６）に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする神経保護剤。
【００１７】
（８）上記（５）または（６）に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする細胞増殖阻害剤。
（９）上記（５）または（６）に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする多剤耐性癌細胞増殖阻害剤。
（１０）上記（５）または（６）に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
（１１）上記（５）または（６）に記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
【００１８】
（１２）Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属に属し、上記（５）記載のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を生産する能力を有する微生物を栄養培地にて培養し、培養物中にｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物の製造法。
（１３）Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＧＦ−１０（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５６２）株またはその変異株。
【発明の効果】
【００１９】
６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ若しくはそれらの類縁物質、またはそれらの薬理学上許容される塩は、癌細胞に対してアポトーシスを誘導し、細胞増殖抑制作用を示し、抗癌剤、特に多剤耐性能を示す癌に対する化学療法剤等として有用である。また、該化合物は神経細胞保護作用を有し、例えば、抗癌剤の副作用でもある神経障害に対する保護剤または予防剤としても利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎは上記の物理化学的性質を有し、上記式（Ｉ）で表される。ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法とは、数ＫｅＶに加速したキセノンやアルゴン等の中性原子を試料に衝突させて生成したイオンを測定する質量分析法であり、粘凋性の化合物（マトリックス）に混合・融解させた試料を金属板等に塗布し、電気的に加速した中性原子を衝突させて分子イオンを生成させ、例えば、磁場中での質量による移動の違いをイオン検出器で検出することによって測定する。多くの場合、プロトン化分子もしくはＮａイオンが付加したイオンピークが得られ、分子量の推定に用いられる。高分解能ＦＡＢ−ＭＳで測定した精密質量から分子式が推定され、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎの上記実測値は、計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋＝３９１．２６１３とよい一致を示した。
核磁気共鳴スペクトルは、ＣＤＣｌ３を溶媒としてＴＭＳ（テトラメチルシラン）を内部標準として測定した。
【００２１】
また、本発明の６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇは上記の物理化学的性質を有し、上記式（ＩＩ）で表される。６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇの高分解能ＦＡＢ−ＭＳによる上記実測値は、計算値（Ｍ＋Ｎａ）＋＝３８９．２４５６とよい一致を示した。
また、核磁気共鳴スペクトルはＣＤＣｌ３を溶媒としてＴＭＳ（テトラメチルシラン）を内部標準として測定した。
【００２２】
本発明の６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、及び本発明に用いられるそれらの類縁物質であるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物の生産菌としては、例えば、海底より分離された真菌  Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＧＦ−１０株が挙げられる。以下に、本菌株の菌学的性状を示す。
【００２３】
１）培養的・形態的性質
本菌株はポテトデキストロース寒天平板培地及び麦芽エキス寒天平板培地上で広く広がり、多数の子のう果を伴って良好に生育する。子のう果は表在性で、球形から亜球形、長径１５〜２５μｍのヒュ−レ細胞に包まれる。子のう果自体は孔口の無い閉子のう殻で、球形から亜球形、大きさは１０〜１５μｍ×８〜１０μｍで、帯紫褐色を呈する。殻壁は単層で褐色を呈する。子のうは楕円形、大きさは１２〜１５μｍ×８〜１０μｍで、子のう内に８個の子のう胞子を生じる。子のう膜は熟成に伴い消失する。子のう胞子は赤褐色、レンズ形で、本体の大きさは３．５〜４．５μｍ×２．５〜３．０μｍである。子のう胞子赤道面に顕著なヒダを伴った１対２枚の帯状隆起を生じ、ヒダは星状に裂ける。帯状隆起の高さは２．５〜３．０μｍである。アナモルフは観察されない。
【００２４】
上記の性質より本菌株は、ホークスワース（Ｄ．Ｌ．Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）、サットン（Ｂ．Ｃ．Ｓｕｔｔｏｎ）、エーンズワース（Ｇ．Ｃ．Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ）編、「エーンズワース・アンド・ビスビーズ・ディクショナリー・オブ・ザ・ファンジャイ第７版（Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，７ｔｈ  ｅｄ．（１９８３））」に従い、真菌門  子のう菌亜門  不整子のう菌綱  エメリセラ属菌に分類されることが判明した。さらに子のう胞子の帯状隆起のヒダが深く切れ込んでいる点に着目し種レベルの検索を行ったところ、エメリセラ  バリエカラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ）に極めて近縁であることが推察された。
【００２５】
２）化学分類学的性質
本菌株のＩＴＳ１，５．８Ｓ，ＩＴＳ２領域の塩基配列を決定し、ホモロジ−検索を行ったところ、遺伝子データベースであるＧｅｎＢａｎｋに登録のあったエメリセラ  バリエカラ  アイエムアイ  ３４３５２２株（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＩＭＩ  ３４３５２２）と９８．６２９％の高い相同性を示した。
【００２６】
以上の結果から本菌株をエメリセラ  バリエカラ  バーケレイ  アンド  ブルーム（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ＆  Ｂｒｏｏｍｅ）と同定し、エメリセラ  バリエカラ  ジーエフ−１０（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＧＦ−１０）と命名した。なお、該菌株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５６２として寄託されている。
【００２７】
Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＧＦ−１０株を、例えば、紫外線、エックス線または薬品等により変異したどの様な変異株であっても、生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ及び／または６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ及び／またはそれらの類縁物質であるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物の生産能を有するものは、全て本発明に含まれ、該生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ及び／または６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ及び／またはそれらの類縁物質であるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物の製造に使用する事ができる。
【００２８】
本発明には、生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ及び／または６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ及び／またはそれらの類縁物質であるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属に属するそれらの生産菌を培養し、該化合物を生成せしめ、この培養物よりｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を採取する製造法も含まれる。生産菌の培養は、糸状菌が利用し得る栄養源を含有する培地で好気的に行われる。
【００２９】
栄養源としては、米、麦、大豆、トウモロコシを用いることが有効であるが、従来から糸状菌の培養に利用されている公知のものが使用でき、炭素源としては、例えば、グルコース、グリセリン、ガラクトース、水飴、デキストリン、シュクロース、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を単独かまたは組み合わせて使用できる。また、窒素源としては、例えば、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーンスティープ・リカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等を単独かまたは組み合わせて用いることができる。その他必要に応じ、ナトリウム、コバルト、塩素、硫酸、燐酸及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することは有効である。
【００３０】
培養法としては固体培養法もしくは液体培養法が適している。培養に適当な温度は１８〜３９℃であるが、好ましくは２５〜３０℃付近である。生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎや６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ等の生産は培地や培養条件により異なるが、通常１〜１４日の間でその蓄積が最高に達する。培養物中の生理活性物質６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎや６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ等の蓄積量が最高になった時に、培養を停止し培養液から目的物質を分離する。
【００３１】
上述の方法に加え、通常物質の採取に用いられる方法、例えば、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは必要に応じてそれらを繰り返すことによって６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、またはそれらの類縁物質を各々純粋に単離することができる。
【００３２】
なお、公知のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物、例えば、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｈ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ等は非特許文献２や非特許文献３、またはそれらに引用されている文献記載の物理化学的データと比較し同定した。
【００３３】
上記の公知のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物の構造を、上記式（ＩＩＩ）に基づき以下に示す。
2005132787.tif 000005
ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｈは上記式（ＩＶ）で表される。なお、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  ＧのＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，３２，ｐ．７７８−７８２（１９８４）に記載の構造式は誤りであり、Ｒ１はβ−Ｈである。
【００３４】
上記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物またはその薬理学上許容される塩を有効成分とする神経細胞突起伸展剤、神経保護剤、細胞増殖阻害剤、多剤耐性癌細胞増殖阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤等の医薬も本発明に含まれる。
【００３５】
アポトーシスとは、細胞内情報伝達に制御された、細胞及び核の凝集を特徴とする細胞死であり、アポトーシスによる制御機構を正常に作動させることで、例えば、細胞の異常増殖が抑制される。アポトーシス機構に異常が起こり、細胞増殖が制御不能になった状態が癌細胞と考えられることから、癌細胞にアポトーシスを誘導する物質は化学療法剤として使用可能であると考えられる。
【００３６】
抗癌剤としての使用とは、例えば、胃癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、肝癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、白血病等に対する治療剤である。
【００３７】
神経突起伸展剤とは、ＮＧＦと同様に神経細胞の分化誘導に関する活性を有し、神経細胞の存在または生存を維持させるものである。神経細胞が抗癌剤により障害を受けた際、神経突起を伸展させる活性を有する神経保護剤は、そうした障害を予防または軽減したり、障害を受けた状態から回復せしめたりする効果を有するので、抗癌剤の副作用として知られる神経障害の予防・治療に使用しうる。さらに、その他の内的または外的要因による神経障害、例えば、結核菌静菌薬、抗てんかん薬等の医薬品やヒ素等の化合物による神経障害、癌、感染、アンギノパシイ、シェーグレン症候群、アルツハイマー病、遺伝性疾患等の疾患や老化により直接的または間接的に誘導される神経障害、及び脳挫傷、脳梗塞、頭蓋内出血、脳虚血等の物理的要因により引き起こされる神経障害に対しても使用し得る。
【００３８】
本発明において薬理学上許容される塩とは、通常取り得る塩であれば特に限定されないが、例えば、アルカリ金属との塩、即ち、ナトリウム塩、カリウム塩等、または酸との塩、即ち、塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩等が好ましい。
【００３９】
医薬品として使用する場合の製剤化及び投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。即ち、投与方法としては例えば注射、経口または直腸投与等が可能である。製剤形態としては、例えば注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、座剤またはカプセル剤等の形態を取り得る。
製剤化の際には生理活性に影響を与えない限り、医薬用に用いられる種々の医薬用添加剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等を使用してもよい。
【００４０】
製剤において、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ等の上記式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表されるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物、またはそれらの薬理学上許容される塩の含量は、製剤形態等により広範囲に変えることが可能であり、一般には０．０１〜１００％（重量）、好ましくは０．１〜７０％（重量）である。その投与量は適応症、症状、投与方法等により異なるが、成人１人１日あたり０．０１〜８００ｍｇ程度である。
【００４１】
試験例
以下に６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、及びそれらの類縁物質であるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ等の生理活性について記載する。
【００４２】
神経突起伸展作用
１０％牛胎児血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変ＭＥＭ培地を用いて、マウス神経芽細胞Ｎｅｕｒｏ  Ａ２を、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。この細胞を２４穴プレートへ播種し、１日間培養した後、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、またはそれらの類縁物質であるｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を添加した。薬剤処理は２日間行い、検鏡により神経突起の伸展が認められる細胞の割合を求め、その結果を表１に示す。
【００４３】
結果
表１  ＮｅｕｒｏＡ２細胞に対する神経突起の伸展作用（０．３μｇ／ｍＬ処理）
化合物                                  神経突起伸展細胞割合
培地のみ                                      １２％
６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ            ２７％
６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ            ２５％
ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ                      ２８％
ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ                      ３０％
ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ                      ２５％
ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｈ                      ２３％
６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ            ２６％
６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ            ２４％
以上の結果から明らかな様に、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物は神経細胞の突起を伸展させるＮＧＦ様活性を示した。
【００４４】
細胞増殖抑制作用１
神経突起伸展作用を示した試験と同様の試験系を用い、さらに高濃度、即ち３及び１μｇ／ｍＬの該化合物を添加し、２日間培養した後の細胞の形態を観察し、細胞が障害を受けているかを判定した。
【００４５】
結果
前記神経突起伸展作用の試験例に使用された８種のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物は、１μｇ／ｍＬ以上において明らかにアポトーシスを誘導し、細胞増殖を阻害する作用が観察された。
【００４６】
細胞増殖抑制作用２
さらに細胞増殖阻害活性を詳細に検討するため、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋを用いて各種癌細胞に対する増殖阻害活性を試験した。
【００４７】
１０％牛胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（イワキ社製）を用いて、ヒト腎癌細胞ＡＣＨＮ、ヒト乳癌細胞Ｔ−４７Ｄ、ヒト大腸癌細胞ＤＬＤ−１、ヒト肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ４６０、マウス白血病由来癌細胞Ｐ３８８またはＰ３８８細胞アドリアマイシン耐性株Ｐ３８８／ＡＤＲを、を３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。これらの細胞を９６穴プレートへ播種し、１日間培養した後、種々の濃度のｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋを添加した。また対照としてシスプラチンを添加した。
Ｐ３８８またはＰ３８８／ＡＤＲはさらに２日間培養した後、ＷＳＴ−１  ０．１６ｍｇ／ｍＬ及び１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ３．３μｇ／ｍＬを培養液に加え、４時間培養したのち吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度から６６０ｎｍの吸光度を減じた値を求めた。
その他の細胞は、薬剤添加後さらに３日間培養し、細胞をメタノールで固定してメチレンブルー色素を用いて染色した。染色後色素を０．３％塩酸水にて抽出し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。
増殖阻害活性は、化合物を添加しない細胞の吸光度に対する化合物添加群の吸光度の減少率で表し、用量−反応曲線からＩＣ５０値を求め、その値を表２に示した。
【００４８】
結果
表２  ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ及びシスプラチンの細胞増殖抑制作用
細胞名                                    ＩＣ５０（μＭ）
ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ          シスプラチン
ＡＣＨＮ                      ０．２６８                    １．１６
Ｔ−４７Ｄ                    ０．３５２                    ６．４２
ＮＣＩ−Ｈ４６０              ０．５７２                    ０．６７２
ＤＬＤ−１                    ０．２２８                    ２．８６
Ｐ３８８                      ０．５０８                    ０．０６５
Ｐ３８８／ＡＤＲ              ０．３６２                    ０．３４３
以上の結果から明らかな様に、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋは多種類のヒトの癌細胞に対し、シスプラチンと比較して、より強力な細胞増殖抑制作用を有する。また、シスプラチンでは多剤耐性癌細胞（Ｐ３８８／ＡＤＲ）に対する５０％細胞増殖抑制作用濃度が、感受性細胞（Ｐ３８８）のそれに比し５倍以上になるが、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋではほぼ同程度であり、このことは、現在、臨床上問題となっている多剤耐性癌細胞に対しても有用な治療剤と成り得ることを示している。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例示であって本発明を限定するものではなく、種々の変法が可能である。
６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、及びそれらの類縁物質の製造法
（１）種培養
２％グルコース、２％麦芽エキス及び０．１％バクトペプトンを含む人口海水アクアマリン（八洲薬品社製）培地（ＭＧ培地）８ｍＬにＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｖａｒｉｅｃｏｌｏｒ  ＧＦ−１０株を接種し、３０℃で３〜７日間振とう培養したのち、５００ｍＬ容三角フラスコ中の２００ｍＬのＭＧ培地に移して３０℃で７日間静置培養とした。
【００５０】
（２）本培養
本培養は固体培養、液体培養のいずれも有効であった。
・固体培養
５００ｍＬ容三角フラスコに、玄米２５ｇと人口海水アクアマリン（八洲薬品社製）５０ｍＬをいれ、１２０℃、２０分間オートクレーブ滅菌した培地に、上記種培養液の２ｍＬを移植し、３０℃、２週間の静置培養を行った。
・液体培養
１ＬのＭＧ培地に、上記種培養液を移植し、３０℃、２週間の静置培養を行った。
【００５１】
（３）精製
固体培養からはメタノール及びメタノール−アセトン−酢酸エチル（４：２：１）混液にて抽出し、あわせて溶媒を溜去して残渣を得る。液体培養からは２−ブタノンにて抽出し、抽出液を水洗後、溶媒を溜去して抽出物を得る。得られた抽出物を９０％メタノールとｎ−ヘキサンを加えて分配し、下層（９０％メタノール層）を分液し濃縮・乾固し残渣を得る。
これらの残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに供し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１〜１：１で段階的に溶出して、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を含む分画を得た。得られたｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ類化合物を含む分画を、ＨＰＬＣ逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ（コスモテック社製）、１０ｘ２５０ｍｍ）を用い、メタノール：水＝８５：１５にて精製し、さらにアセトニトリル：水＝７５：２５により精製して、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｎ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｇ、ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｈ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｃ、６−ｅｐｉｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ  Ｋを得た。