(57)【要約】  【課題】シュードモナス属以外の属に属する新規な微生物を用いてヒポキサンチンを効率的に製造する方法を提供する。  【解決手段】ヒポキサンチンを生成せしめる能力を有するバチルス属に属する微生物、好ましくはバチルス sp. 206-4B（FERM P-20005）を、アデニン添加培地、好ましくはpHを6〜8に調整したアデニン添加最少培地において培養することによりヒポキサンチンを生成蓄積せしめ、これを採取する。この方法により、旨味成分として用いられているイノシン、イノシン酸の前駆物質であるヒポキサンチンを効率よくかつ廉価に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒポキサンチンを生成せしめる能力を有するバチルス属に属する微生物を、アデニン添加培地において培養することによりヒポキサンチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒポキサンチンの製造方法。
【請求項２】
バチルス属に属する微生物が バチルス sp. 206-4B（FERM AP-20005）である請求項１記載のヒポキサンチンの製造方法。
【請求項３】
アデニンを資化する能力を有するバチルス sp. 206-4B（FERM AP-20005）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒポキサンチンの製造方法に関する。更に詳しくは、新規な微生物を用いてヒポキサンチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒポキサンチンは、動物、植物、微生物中などに広く存在する核酸の中間代謝物であって、イノシン、イノシン酸生産の前駆物質である。ヒポキサンチンはまた、DNA、RNA成分の前駆物質としてあるいは食品の旨味成分として用いられているイノシン酸等の塩基部として存在し、多くのプリン系核酸代謝の中核をなす重要な物質でもある。ヒポキサンチンは、アデニンの脱アミノ酵素反応（アデニンデアミナーゼ反応）または亜硝酸によるアデニンの脱アミド反応によって、あるいはヌクレオシドホスホリラーゼによるイノシンの加リン酸分解によって製造されるが、これを多量に製造する場合、脱アミノ酵素を用いる方法では大量のアデニンの脱アミノ酵素が必要であり、また亜硝酸によるアデニンの脱アミド化方法では、反応後の物質の処理を行う必要があるなどの問題点がある。
【０００３】
かかる問題点を解決するため、本発明者は先に、シュードモナス属に属する微生物を、アデニン添加完全培地において培養することによりヒポキサンチンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより、ヒポキサンチンを製造する方法を提案している。
【特許文献１】特許第３４８４９１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、シュードモナス属以外の属に属する新規な微生物を用いてヒポキサンチンを効率的に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる本発明の目的は、ヒポキサンチンを生成せしめる能力を有するバチルス属に属する微生物を、アデニン添加培地、好ましくはpHを6〜8に調整したアデニン添加最少培地において培養することによりヒポキサンチンを生成蓄積せしめ、これを採取することによって達成される。
【発明の効果】
【０００６】
ヒポキサンチンを生成せしめる能力を有するバチルス属に属する新規な微生物により、旨味成分として用いられているイノシン、イノシン酸の前駆物質であるヒポキサンチンを効率よくかつ廉価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ヒポキサンチンを生成せしめる能力を有するバチルス属に属する微生物としては、例えば バチルス sp. 206-4B（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、平成16年4月16日受領、FERM AP-20005）などが用いられる。この微生物は、長野県小谷村の温泉水1mlをL-ブイヨン(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、殺菌前のpH7.0)に約0.005％以上、好ましくは0.05％のアデニンを添加した培地3mlに添加し、40℃で72時間培養することにより採取、分離されたものである。
【０００８】
バチラス sp. 206-4Bは、下記の如き菌学的性質を有する。
Ａ．形態
(１)細胞の形                    桿菌
大きさ                   0.5×1.0μm
(２)運動性                      あり
(３)胞子形成                    なし
(４)グラム染色性                陽性
Ｂ．培地における生育状態
肉汁寒天平板培養                黄白色、滑らか
Ｃ．生理学的性質
(１)硝酸塩の還元                陰性
(２)ＶＰテスト                  陽性
(３)インドールの生成            陰性
(４)硫化水素の生成              陰性
(５)クエン酸の利用              陰性
(６)色素の生成                  陰性
(７)ウレアーゼの生産            陰性
(８)オキシダーゼ活性            陽性
(９)リジンの分解                陰性
(10)オルニチンの分解            陰性
(11)アルギニンの分解            陰性
(12)生育の範囲                pH5〜8
温度30〜50℃
(13)酸素に対する態度         通性嫌気性
(14)糖類からの酸の生成
D-グルコース                 ＋
D-マンニット                 ＋
アドニット                   −
L-アラビノース               −
イノシット                   −
D-ソルビット                 −
麦 芽 糖                     −
白  糖                       ＋
培地：ペプトン2g、NaCl 5g、K2HPO4 0.3g、炭水化物10g、
ブロムチモールブルー0.08g、寒天15g、蒸留水1000ml
(pH7.1)
添加濃度：1%
【０００９】
以上の菌学的性質に基づいて、この菌を BARGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 第9版により検索した結果、バチルス属に属する菌であることを確認した。そして、糖からの酸生産の点で新規な菌株であることが同定された。
【００１０】
本発明方法を実施する際、アデニン添加培地のpHを6〜8、好ましくは6〜7に調整して用いると、ヒポキサンチンの生産速度が著しく向上する。アデニン添加培地のpHの調整は、水酸化ナトリウム水溶液、塩酸等によって行なわれる。
【００１１】
また、アデニン添加量は培地の0.005％以上、好ましくは0.05％に調整して用いると、ヒポキサンチンの生産速度が著しく向上する。
【実施例】
【００１２】
次に、実施例について本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
バチルス sp. 206-4B（FERM AP-20005）を、L-ブイヨン液体培地50mlで一晩振とう培養することにより前培養を行った。次に、L-ブイヨン液体培地に0.05％アデニンを添加した培養培地500mlに前培養液を全量加え、邪魔板付き回転培養槽を用いて、攪拌回転数350rpm、40℃の条件下で72時間培養することにより本培養を行った。
【００１４】
これら一連の操作を行った後、培養液から遠心機を用いて菌株を抽出除去し、HPLCによって、培養上清中のヒポキサンチン生産量の定量が行われた。カラムとしてはODS-80TMを、また展開溶媒としては0.5M ぎ酸アンモニウムを用い、カラム温度35℃で展開した。そして、検出波長254nmでヒポキサンチン生産量の定量を行ったところ、L-ブイヨン液体培地に0.05%のアデニンを加えた培養液１ml当り約800〜900μgの生産量でヒポキサンチンが生産されることが確認された。
【００１５】
実施例２
実施例1において、HPLCにより、検出波長254nmで培養上清中のアデニン残存量の定量を行ったところ、培養初期にみられたアデニンのピークが消失し、アデニンが完全に資化されることが確認された。
【００１６】
比較例
実施例において、アデニンの添加されない液体培地を用いて同様に培養を行い、場合には、ヒポキサンチンの生成は全くみられなかった。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月2日(2004.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
バチルス属に属する微生物が バチルス sp. 206-4B（FERM P-20005）である請求項１記載のヒポキサンチンの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
アデニンを資化する能力を有するバチルス sp. 206-4B（FERM P-20005）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
ヒポキサンチンを生成せしめる能力を有するバチルス属に属する微生物としては、例えば バチルス sp. 206-4B（FERM P-20005）などが用いられる。この微生物は、長野県小谷村の温泉水1mlをL-ブイヨン(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、殺菌前のpH7.0)に約0.005％以上、好ましくは0.05％のアデニンを添加した培地3mlに添加し、40℃で72時間培養することにより採取、分離されたものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
実施例１
バチルス sp. 206-4B（FERM P-20005）を、L-ブイヨン液体培地50mlで一晩振とう培養することにより前培養を行った。次に、L-ブイヨン液体培地に0.05％アデニンを添加した培養培地500mlに前培養液を全量加え、邪魔板付き回転培養槽を用いて、攪拌回転数350rpm、40℃の条件下で72時間培養することにより本培養を行った。