(57)【要約】    【課題】エシェリヒア属細菌を用いてピルビン酸またはＬ−バリンを効率よく発酵生産する。    【解決手段】ピルビン酸生産能を有し、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を用いてピルビン酸を生産する。また、Ｌ−バリン生産能を有し、リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が欠損または弱化するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を用いてＬ−バリンを生産する。    【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピルビン酸生産能を有し、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することを特徴とする、ピルビン酸の製造方法。
【請求項２】
前記エシェリヒア属細菌が、リボヌクレアーゼGをコードする遺伝子が破壊されたことにより、リボヌクレアーゼGの活性が低下したエシェリヒア属細菌である、請求項１に記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項３】
前記エシェリヒア属細菌が、さらに、cra遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌である、請求項１又は２に記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項４】
前記エシェリヒア属細菌が、さらに、Ｌ−バリン耐性を有するエシェリヒア属細菌である、請求項３に記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項５】
Ｌ−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造方法。
【請求項６】
Ｌ−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造方法。
【請求項７】
前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子の発現が弱化されたエシェリヒア属細菌である、請求項５または６に記載のＬ−バリンの製造方法。
【請求項８】
前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIまたはアセト乳酸シンターゼIIをコードする遺伝子の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＬ−バリンの製造方法。
【請求項９】
リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法によるＬ-バリン又はピルビン酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピルビン酸を発酵生産する微生物としては、コリネバクテリウム属（非特許文献１）、アシネトバクター属（非特許文献２）、カンディダ属（非特許文献３）、またはトルロプシス属・グラブラータ（非特許文献４）等が知られている。また、プロテウス属、キサントモナス属、クリセオバクテリウム属、サイトファガ属、アシネトバクター属、サッカロマイセス属、オガテア属、スポロボロマイセス属、スポリジオバラス属、カンジダ属、ワルトマイセス属、ミコバクテリウム属またはノカルジア属に属する微生物を用いたピルビン酸の製造法も知られている（特許文献１）。エシェリヒア属細菌を用いたピルビン酸の製造法としては、リポ酸要求性株を用いる方法が知られている（特許文献２）。
【０００３】
Ｌ-バリンを発酵生産する微生物として、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、セラチア属（非特許文献５）またはエシェリヒア属（特許文献３）に属するＬ-バリン生産菌が知られている。
【０００４】
一般に、Ｌ-バリンやピルビン酸のような一次代謝産物を効率よく生産させるためには、その生合成経路から分岐する反応を触媒する酵素活性の弱化、代謝調節変異の導入、生成物の分解経路の遮断、目的物質の生合成遺伝子の発現増強等が有効である。生合成遺伝子の発現増強のためには、同遺伝子をプラスミドなどを用いて増幅したり、同遺伝子の発現調節領域を改変したりする方法が一般的に行われている（非特許文献６）。
【０００５】
また、目的とする遺伝子そのものではなく、その遺伝子の発現を調節するDNA結合タンパク質の変異によっても、目的遺伝子の発現増強は達成される。例えば、DNA結合タンパク質であるcraをコードするcra(fruR)遺伝子の欠損株では、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現量が上昇することが報告されている（非特許文献７）。cra遺伝子の欠損により微量ではあるもののL−アミノ酸生産能が向上することも報告されている（特許文献４）。
【０００６】
ところで、生体内においてＤＮＡから転写されたmRNAは、リボヌクレアーゼ（RNase）によって分解される。例えば、エシェリヒア属細菌では、mRNAを分解するRNaseとして、RNase III、RNase E(非特許文献８)、RNase G(非特許文献９)等が知られている。目的の遺伝子産物を安定に発現させるためには、mRNAの転写量を高めるとともに、mRNAの分解を抑制することが好ましい。そのため、RNase活性を抑制することによって目的酵素のｍRNAの分解を抑制することも考えられる。
【０００７】
RNase活性が低下した株としては、RNase G遺伝子に変異が導入された株（非特許文献１０）や、RNase G遺伝子が破壊された株（非特許文献１１）などが知られている。しかしながら、RNaseの基質特異性は完全に明らかにされていないため、RNaseの活性を調節することによって特定のmRNAの分解のみを抑制することは困難であった。そのため、RNase活性が低下した株が代謝産物の生産に使用されることはなかった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９７９号公報
【特許文献２】特開平５−１３７５６８号公報
【特許文献３】国際公開第９６／０６９２６号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３００４９８０３Ａ１明細書
【非特許文献１】嶋村睦夫，吉武寿一：農芸化学会誌 ,44 ,195-201 ,(1970)
【非特許文献２】Agric.Biol. Chem.,46, p2673-2679, (1982)
【非特許文献３】日本農芸化学会大会講演要旨集，129 ,(1975)
【非特許文献４】J.Ferment.Bioeng. 78, 155,(1994)
【非特許文献５】アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年
【非特許文献６】アミノ酸発酵、学会出版センター、３１〜１００頁、１９８６年
【非特許文献７】Journal of Bacteriol. 1996, vol. 178 (1)、p280-283
【非特許文献８】Escherichia coli and Salmonella Vol.1 2nd edition, ASM press, p855
【非特許文献９】Genes Cells, 6, 2001, p403-410
【非特許文献１０】Biochem. Biophys. Res. Commun., 289(5),1301-1306, 2001
【非特許文献１１】Genes Cells. 2001 May;6(5):403-10.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、エシェリヒア属細菌を用いて、ピルビン酸、またはＬ−バリンを効率よく生産することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、RNaseG活性を低下させることによりピルビン酸やＬ-バリンが蓄積することを見出した。さらに、cra遺伝子への変異導入およびＬ−バリン耐性付与を組み合わせることによりさらにピルビン酸やL-バリンの蓄積が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）  ピルビン酸生産能を有し、リボヌクレアーゼ（RNase）Gの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することを特徴とする、ピルビン酸の製造方法。
（２）  前記エシェリヒア属細菌が、RNaseGをコードする遺伝子が破壊されたことにより、RNaseGの活性が低下したエシェリヒア属細菌である、（１）のピルビン酸の製造方法。
（３）  前記エシェリヒア属細菌が、さらに、cra遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌である、（１）又は（２）のピルビン酸の製造方法。
（４）  前記エシェリヒア属細菌が、さらに、Ｌ−バリン耐性を有するエシェリヒア属細菌である、（３）のピルビン酸の製造方法。
（５）  Ｌ−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、リボヌクレアーゼGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造方法。
（６）  Ｌ−バリン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、RNaseGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−バリンを採取することを特徴とする、Ｌ−バリンの製造方法。
（７）前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子の発現が弱化されたエシェリヒア属細菌である、（５）または（６）のＬ−バリンの製造方法。
（８）  前記エシェリヒア属細菌が、さらに、アセト乳酸シンターゼIまたはアセト乳酸シンターゼIIをコードする遺伝子の発現が増強されたエシェリヒア属細菌である、（５）〜（７）のいずれかのＬ−バリンの製造方法。
（９）  RNaseGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、ピルビン酸またはＬ−バリンの発酵収率を向上させることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する
＜１＞ピルビン酸の製造方法
本願第１の発明のピルビン酸の製造方法は、ピルビン酸生産能を有し、RNaseGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することを特徴とする方法である。
【００１３】
ここで、「ピルビン酸生産能」とは、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地又は菌体内にピルビン酸を蓄積する能力をいう。「ピルビン酸生産能」は、遺伝子組換えによってピルビン酸生合成酵素の発現を上昇させたり、通常の変異剤を用いて親株を変異処理し、変異株の中からピルビン酸生産能を有する株を選択したりすることによって取得することができる。なお、RNaseGの活性が低下するように改変することによってピルビン酸生産能を有するようになったものでもよい。
【００１４】
ピルビン酸生産能を有する菌株としては、例えばリポ酸要求株（特開平５−１３７５６８号公報）が挙げられる。具体的には、エシェリヒア・コリ AJ12631 (FERM P-12381)やエシェリヒア・コリW1485 lip2 (ATCC25645)等が挙げられる。リポ酸要求性変異株の取得方法としては、通常の変異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学薬剤処理を施し、変異処理した菌体を寒天平板培地で培養し、リポ酸要求性となったコロニーを分離することによって得られる（J.
Gen. Microbiol.,53 ,363-381 ,(1968)）。
【００１５】
上記のようなピルビン酸生産能を有する菌株を、RNaseG活性が低下するように改変することによって本発明に用いるエシェリヒア属細菌（本発明のエシェリヒア属細菌ともいう）を得ることができる。なお、本発明のエシェリヒア属細菌の育種において、ピルビン酸生産能の付与とRNaseG活性を低下させる改変は、どちらを先に行ってもよい。
【００１６】
本発明において「RNaseG活性」とは、RNaseGの基質となるRNAを分解する活性を言う。RNaseGの基質となるRNAとしては、例えば、エノラーゼをコードする遺伝子eno（GenBank Accession No.X82400）やアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhE（GenBank Accession No.M33504）などを挙げることができる。活性測定は、例えば、リファンピシンによりRNA合成を抑制した菌株よりRNAを抽出し、エノラーゼをコードする遺伝子eno、またはアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhEなどのmRNAの分解半減期を測定することで、その活性を間接的に知ることができる。また、RNaseGを単離精製し、RNase G切断部位を含むオリゴリボヌクレオチドのような人工基質の切断反応を測定することにより、その活性を知ることもできる。このような活性測定方法は既に開示されている（J. Biol. Chem., 275, 8726-8732, 2000）。
【００１７】
上記のような活性を有するタンパク質としては、例えば、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、上記活性を有する限り、配列番号６のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が置換、欠失、付加された配列を有するタンパク質であってもよい。ここで、数個とは、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜
１０個、特に好ましくは２〜５個を意味する。
【００１８】
「RNaseG活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞抽出液に含まれるRNaseGの比活性が、非改変株、例えば野生型のエシェリヒア属細菌の比活性よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりのRNaseGの分子数が低下した場合や、分子あたりのRNaseG活性が低下した場合等が該当する。尚、「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。対照となる野生型のエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリMG1655株などが挙げられる。
【００１９】
RNaseGの活性の低下は、RNaseGコードする遺伝子（rng）を欠損または変異型に置換させることや、rng遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することによって達成される。より詳しくは、rng遺伝子の部分配列を置換または欠失し、正常に機能するRNaseGを産生しないように改変したrng遺伝子（変異型）を含むＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で相同組換えを起こさせることにより、染色体上のrng遺伝子を変異型とすることが出来る。
【００２０】
rng遺伝子は、GenBankに登録されているエシェリヒア・コリのrng遺伝子（GenBank Accession No. NC-000913の塩基番号3393963〜3395450の相補鎖：配列番号５）の配列に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、エシェリヒア・コリの染色体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングすることができる。また、相同組換えによってrng遺伝子を欠損させる場合には、染色体上のrng遺伝子と一定以上の相同性、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。また、染色体上のrng遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２１】
相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。
欠失型rngを、宿主染色体上のrngと置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と変異型rngとアンピシリン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを含む組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００２２】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するrng配列との組換えを起こし、染色体rngと欠失型rngとの融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なrngが優性であるので、形質転換株は正常なリプレッサーを発現する。
【００２３】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型rngのみを残すために、２個のrngの組換えにより１コピーのrngを、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なrngが染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型rngが切り出される場合と、反対に欠失型rngが染色体ＤＮＡ上に残され、正常なrngが切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のrngは、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型rng
が残った株を選択することによって、rngが破壊された株を取得することができる。
【００２４】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.2 (1989) 等に記載されている。
【００２５】
また、rng遺伝子を変異処理して、低活性のRNaseGをコードする遺伝子を取得することもできる。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adhEの発現はrng遺伝子の機能に依存するため（Biochemical and Biophysical Research Communications 295 (2002) 92-97）、adhEのプロモーターとβガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を結合したプラスミドを細胞内で変異型rng遺伝子と共存させ、βガラクトシダーゼ活性を測定することにより、活性低下型のrng遺伝子をスクリーニングすることもできる。
【００２６】
RNaseGの活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、RNaseGの活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。RNaseG活性が低下した変異株としては、16S rRNAの5'末端の成熟活性は残存しながらmRNAの分解活性のみが低下したような株、例えば、変異株DC430株やGM1430株など（Biochem. Biophys. Res. Commun., 289(5),1301-1306, 2001）が挙げられる。
【００２７】
第１の発明に用いる細菌はさらに、cra遺伝子の発現が低下するように改変されたものであってもよい。cra遺伝子は、fruR遺伝子とも呼ばれ、PEP:fructose phosphotransferase systemをコードする遺伝子のリプレッサーである（Mol Gen Genet. 1991 Apr;226(1-2):332-6）。cra遺伝子として具体的には、GenBank Accession No. X55457に登録されている配列（配列番号７）を有する遺伝子を挙げることができる。cra遺伝子の発現が低下するように改変するためには、例えば、上記のようなcra遺伝子を用いて相同組換えを行うことによって、染色体上のcra遺伝子を変異型や欠失型のcra遺伝子に置換するか、または、変異処理を行ってcra遺伝子の発現が低下した菌株を選択すればよい。相同組換え等は上述したrng遺伝子と同様にして行うことができる。尚、「低下」には発現が完全に消失した場合も含まれる。cra遺伝子が欠損した株としては、例えば、後述する変異株MC1061が挙げられる。
【００２８】
なお、相同組換えによってcra遺伝子を欠損させる場合には、染色体上のcra遺伝子と一定以上の相同性、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。また、染色体上のcra遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２９】
第１の発明に用いる細菌はさらに、L-バリン耐性が付与されたものであってもよい。「L-バリン耐性」とは、例えば、Escherichia coli K-12株などの親株が生育できない濃度のL-バリンを添加した培地において、生育可能なことを言う。親株が生育できない濃度としては、２５μg/ml以上が好ましい。例えば、２５μg/ml以上のL-バリンを含むM9最少培地で生育可能な菌株は、L-バリン耐性を有するということができる。L-バリン耐性を有する株は、菌株を変異処理し、変異株の中から高濃度のL-バリンを含む培地で生育する株を選択することによって取得することができる。L-バリン耐性株は、L-バリンのアナログの耐性株として分離しても良い。L-バリンのアナログとして、α-アミノ酪酸や、２−チア
ゾールアラニンが挙げられる。また、正常型のilvGM遺伝子（GenBank Accession No. X04890）を形質導入することでもL-バリン耐性を付与することができる（Proc Natl Acad Sci USA Vol78,No.2, p922-925参照）。リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたピルビン酸生産菌としては、例えば、実施例に示すようなエシェリヒア・コリB16株を挙げることができる。
【００３０】
上述したような細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することによって、ピルビン酸を製造することができる。
【００３１】
本発明における細菌の培養および培養液からのピルビン酸の採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるピルビン酸の製造法と同様にして行えばよい。ピルビン酸を生産するために使用する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸などの有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては、使用する変異株が利用可能なものであればよく、例えばグルコース、フラクトース、澱粉分解物糖蜜などの糖類が使用され、その他菌株によっては、シュークロース、マルトースや、酢酸、クエン酸等の有機酸類、ノルマルパラフィン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄養素としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが必要である。
【００３２】
培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中は、培地のpHを５〜９、温度を20℃〜40℃に制御しつつ、１〜４日間振とう培養または通気撹拌培養することにより培養することが好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。培養液からピルビン酸を採取する方法は公知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。
【００３３】
＜２＞Ｌ−バリンの製造方法
本願第２の発明のＬ−バリンの製造方法は、Ｌ−バリン生産能を有し、かつRNaseGの活性が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌、または、Ｌ−バリン生産能を有し、かつRNaseGの活性が低下し、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたエシェリヒア属細菌を培地中に培養し、該培地又は菌体内にＬ−バリンを生成蓄積させ、該培地又は菌体からＬ−バリンを採取することを特徴とする方法である。
【００３４】
「Ｌ−バリン生産能」とは、細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−バリンを蓄積する能力をいう。Ｌ−バリン生産能は、Ｌ−バリン生合成遺伝子の発現を強化したり、変異処理を行ってL−バリン生産能を獲得した変異株を選択したりすることによって取得することができる。なお、Ｌ−バリン生産能を本来的に有する株や、RNaseG遺伝子やcra遺伝子を改変することによってＬ−バリン生産能を有するようになった株を用いることもできる。
【００３５】
Ｌ-バリン生産能を有する細菌としては、例えばエシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5,658,766）等が挙げられる。また、ＷＯ９６／０６９２６に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異を有
するＬ-バリン生産菌、あるいは、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌も、本発明に好適に使用することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ-バリン及び／又はＬ-イソロイシン及び／又はＬ-ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ-バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（特開平8-47397）。
【００３６】
他のアプローチとして、各々相当するアミノ酸に対する親和性が低下した（Kmが増加した）アミノアシルtRNAシンターゼの変異（ileS or valS）を導入することも有効であると考えられる。また、前記オペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。上記のような、アテニュエーションが解除されるileS17変異を持つエシェリヒア・コリVL1970は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（RussianNational Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、VKPM B-4411の登録番号で寄託されている。
【００３７】
上記のようなＬ−バリン生産能を有する株を、RNaseG活性が低下するように改変することによって、Ｌ−バリンを効率よく生産することのできる菌株を取得することができる。なお、Ｌ−バリン生産能の付与、およびRNaseG活性を低下させるための改変はどちらを先に行ってもよい。
【００３８】
また、上記のようなＬ−バリン生産能を有する株を、RNaseG活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変し、さらに、Ｌ−バリン耐性を付与することによっても、Ｌ−バリンを効率よく生産することのできる菌株を取得することができる。なお、Ｌ−バリン生産能の付与、RNaseG活性を低下させるための改変、cra遺伝子の発現を低下させるための改変、および、Ｌ−バリン耐性の付与はどのような順序で行ってもよい。
【００３９】
RNaseG活性を低下させるための改変、cra遺伝子の発現を低下させるための改変、および、Ｌ−バリン耐性の付与は、第１の発明において記載した方法と同様にして行うことができる。リボヌクレアーゼGの活性が低下し、かつ、cra遺伝子の発現が低下するように改変され、さらに、Ｌ−バリン耐性が付与されたＬ−バリン生産菌としては、例えば、実施例に示すようなエシェリヒア・コリB16株を挙げることができる。
【００４０】
Ｌ−バリンの製造に用いる微生物は、さらに、アセト乳酸シンターゼIII（AHASIII）をコードする遺伝子の発現が弱化したものであってもよい。アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子としては、例えば、ilvIH遺伝子（GenBank Accession No. X01609）を挙げることができる。
【００４１】
アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子の発現を低下させるためには、例えば、ilvIH遺伝子を欠損型または変異型に置換させたり、または、ilvIH遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等発現調節配列を改変したりすればよい。より詳しくは、ilvIH遺伝子の部分配列を置換または欠失し、正常に機能するAHASIIIを産生しないように改変したilvIH遺伝子（変異型）を含むＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のilvIH遺伝子を変異型とすることが出来る。また、大腸菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ilvIH遺伝子の発現が低下した菌株を選択する方法によっても、アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子の発現が低下した菌株を得ることができる
。さらに、第２の発明に用いる菌株は、cra遺伝子及び／又はrng遺伝子を改変することにより、ilvIH遺伝子の発現が低下したものや、MC1061株のようにilvIH遺伝子が本来的に欠失したものであってもよい。
【００４２】
Ｌ−バリンの製造に用いる微生物はまた、アセト乳酸シンターゼI（AHASI）またはアセト乳酸シンターゼI（AHASII）をコードする遺伝子の発現が増強されたものであってもよい。アセト乳酸シンターゼIをコードする遺伝子としては、ilvBN遺伝子（GenBank Accession No. X02541）を挙げることができる。また、AHAS活性を有するタンパク質をコードする限り、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
アセト乳酸シンターゼIIをコードする遺伝子としては、ilvGM遺伝子（GenBank Accession No. X04890）を挙げることができる。また、AHAS活性を有するタンパク質をコードする限り、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００４３】
AHASI遺伝子の発現を増強するためには、例えば、AHASI遺伝子を含むＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これをエシェリヒア属細菌に導入すればよい。エシェリヒア属細菌で機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア属細菌において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。
【００４４】
組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）や、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。
【００４５】
さらに、AHASI遺伝子の発現量を高めることは、AHASI遺伝子をエシェリヒア属細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にAHASI遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、AHASI遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００４６】
プラスミドや相同組換えにより、AHASI遺伝子を導入する際には、強力なプロモーターの下流に該遺伝子を連結して導入してもよい。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、完全長のAHASI遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変により正常型AHASI遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。なお、AHASII遺伝子の発現増強も、AHASI遺伝子と同様に行うことができる。
【００４７】
上述したようなエシェリヒア属細菌を培地に培養し、該培地中にＬ-バリンを生成蓄積させ、該培地よりＬ-バリンを採取することにより、Ｌ-バリンを製造することができる。
【００４８】
本発明における細菌の培養および培養液からのＬ-バリンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００４９】
培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０℃が好ましく、３０〜３８℃がより好ましい。培地のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中に目的とするＬ-バリンが蓄積する。
【００５０】
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によって目的とするＬ-バリンを採取、精製することができる。
【００５１】
[実施例]
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下のものには限定されない。
【実施例１】
【００５２】
＜rng遺伝子欠損株の構築＞
rng（以下、cafAともいう）欠損株を、以下のように構築した。pXX557をBamHIとHindIIIで処理して得られる１．３ｋｂのcat（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子カセットを、T4 DNAポリメラーゼの処理によりその付着末端を平滑末端にした後、rng(=cafA)を含むプラスミドpMEL1（Journal of Bacteriology (1987) 169:4935-4940）上のrng遺伝子内のユニークBglII部位に挿入した。なお、pXX557は、pACYC184(ニッポンジーン)をHaeIIで処理して得られる1.3kbのcat遺伝子断片を、pUC9（German Collection of Microorganisms and Cell CulturesにDSM No.3421として登録されている）のHincII部位に挿入して得られたプラスミドである。得られたプラスミドpMEL1-cafA::catから、rng::catとその隣接領域を含む７．８ｋｂのSalI断片をアガロース・ゲル電気泳動後に単離した。大腸菌 (Escherichia coli) K-12 recD 突然変異体株FS1576（国立遺伝学研究所にME9019として登録されている）を、上記の単離された線状DNAで形質転換させ、そして上記のrng::catを含有する線状DNAと染色体rng領域の間の相同的組換えにより形成されたクロラムフェニコール耐性コロニーを単離した。この株では、染色体上の野生型rng遺伝子がrng::catに置換されている。この株にP1ファージを感染させ、ファージライゼートを調製した後、これをMC1061株(E.coli Genetic Stock CenterにCGSC#: 6649として登録されている)またはMG1655株（国立遺伝学研究所にME9044として登録されている）に感染させた。クロラムフェニコール耐性を指標として形質導入体を選択し、取得したMC1061 rng::cat株およびMG1655 rng::cat株をそれぞれGM11株、GG11株と命名した。なお、MC1061株は、cra遺伝子が欠損している株である（Biochimical and Biophysical Research Communications 295 (2002) 92-97）。
【実施例２】
【００５３】
＜rng遺伝子欠損株の細胞内ピルビン酸の定量＞
実施例１で構築したGG11株、GM11株およびその親株を0.2%のグルコースと100μg/mlのL-ロイシンを含むM9最少培地(Na2HPO4・7H2O 12.8g, NH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4 2mM, CaCl2 0.1mMを1Lに含む)にそれぞれ接種し、30℃で振とう培養した。培養開始後４時間後に培養液を分取し、遠心分離により菌体を回収した後、22%の過塩素酸で菌体内ピルビン酸を抽出した。得られた抽出液を炭酸ナトリウムで中和した後、ピルビン酸を協和メディックス社のピルビン酸測定試薬デタミナーPAを用いて測定した。具体的には、界面活性剤を含むリン酸緩衝液にパーオキシダーゼ６．５単位/ｍｌ及びアスコルビン酸オキシダーゼ４．５単位/ｍｌを溶解し、これに中和済みの抽出液を適量加えて、５分間３７℃で恒温した。恒温した反応溶液にピルビン酸オキシダーゼ及びビス[３-ビス（４-クロロフェニル）メチル-４-ジメチル‐アミノフェニル]アミンを加え、５分間３７℃で反応させ、７５０nmの吸光度を測定した。この測定値とピルビン酸の標準液により作成した検量線と比較することで培養液中のピルビン酸濃度を定量した。抽出されたピルビン酸は、抽出時の培養液のOD660で除することにより細胞内のピルビン酸濃度に換算した。表１に示すように、rng遺伝子欠損株では細胞内ピルビン酸濃度が上昇していることが示された。
【００５４】
【表１】
2005333855.tif 000002
【実施例３】
【００５５】
＜GM11株からの生育改善株の分離＞
実施例１で構築したGM11株を0.2％のグルコースを含むM9最少培地にL-ロイシンを100μg/ml添加した培地にて培養を実施したところ、著しい生育の遅延が認められた。そこで、本発明者らは、検討した結果、L-スレオニンまたはL-イソロイシンを添加することで生育が回復することを見出した。この結果から、GM11株ではcra変異に加えて、rng変異が導入されることにより細胞内のL-バリン濃度が上昇し、その結果L-イソロイシンの生合成が抑制されることにより最少培地での生育遅延が認められると推測した。例えば、アセト乳酸合成酵素IをコードするilvBN、アセト乳酸合成酵素IIIをコードするilvIHはL-バリンでフィードバックインヒビションを受けることが知られている。そこで、次に発明者らは、最少培地でGM11株の成育改善株を分離すれば、L-イソロイシンの生合成経路のL-バリンによるフィードバックインヒビションが解除された株が分離でき、生育の遅延を解消できると考え、生育改善株の分離を試みた。具体的には、0.2%のグルコースおよびL-ロイシン100μg/mlを含むM9プレート上にGM11株を約２×107cellsとなるように希釈して塗布、30℃で３日間培養し、自然突然変異で出現した良好に生育するコロニーを３株分離した。この生育改善株のうち1株をB6株と命名した。
【実施例４】
【００５６】
＜B6株のバリン感受性の確認＞
実施例３で取得したB6株のL−バリンの感受性を、0.2%のグリセロールおよび100μg/mlのL-ロイシンを含む、M9最少培地に各所定量のL-バリンを添加したプレートでの生育を指標に確認した。その結果、親株であるMC1061ならびにそのrng変異株であるGM11では6.25μg/mlのL-バリンを含む培地では生育できなかったのに対し、B6株では100μg/mlのL-バリンを含む培地でも生育可能であった（図１）。したがって、GM11株の生育改善株として取得されたB6株は、L-バリン耐性が付与された株であることが明らかとなった。
なお、MC１０６１株を0.2%のグルコースおよびLeu 100μg/ml, Val 10μg/mlを含むM9プレートに2×107cellsとなるように希釈して塗布、３０℃で４日培養後、自然突然変異により生育してきた４クローンを分離した。そのうち３クローンは25μg/ml以上のL-バリン存在下でも生育した。これらの株にrng変異を導入したところ、B6株同様にM9最少培地にロイシンのみを添加した培地で生育可能であることが確認できた。このように、常法に従ってL-バリン耐性株を分離し、それにrng変異を導入してもB6株と同様の生育改善株を得ることができる。
【実施例５】
【００５７】
＜rng遺伝子欠損株によるピルビン酸の蓄積＞
実施例３で取得したB6株およびその親株であるMC1061株を、0.2％のグルコースおよび100μg/mlのL-ロイシンを含むM9最少培地にそれぞれ接種し30℃で培養した。培養開始後16時間目の培養液を分取し、培養液中のピルビン酸を協和メディックス社のピルビン酸測定試薬デタミナーPAを用いて測定した。界面活性剤を含むリン酸緩衝液にパーオキシダーゼ６．５単位/ｍｌ及びアスコルビン酸オキシダーゼ４．５単位/ｍｌを溶解し、これに培養液を遠心分離して得た遠心上清を適量加えて、５分間３７℃で恒温した。恒温した反応溶液にピルビン酸オキシダーゼ及びビス[３-ビス（４-クロロフェニル）メチル-４-ジメチル‐アミノフェニル]アミンを加え、５分間３７℃で反応させ、７５０nmの吸光度を測定した。この測定値とピルビン酸の標準液により作成した検量線と比較することで培養液中のピルビン酸濃度を定量した。表２に示すように、MC1061株に比しB6株ではピルビン酸蓄積量が約１１倍に向上していることが示された。このデータと表１のデータを合わせて考えると、L−バリン耐性の付与によりさらにピルビン酸蓄積が向上したことがわかった。
【００５８】
【表２】
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【実施例６】
【００５９】
B6株のL-バリン生産能の確認
MC1061株およびB6株を0.2%のグルコースを含むM9培地にL-ロイシンおよびL-イソロイシンをそれぞれ100μg/mlとなるように添加した培地にて30℃で培養した。菌を接種後24時間目の培養液を分取し、適当に希釈した後、日立アミノ酸アナライザーL-8500を用いてL-バリンの生成量を分析した。表３に示すように、MC1061株では約40mg/LのL-バリンを蓄積したのに対し、B6株では約90mg/LのL-バリンを蓄積した。このことから、B6株では顕著にL-バリン生産能が向上していることが示された。
【００６０】
【表３】
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【実施例７】
【００６１】
GM11株のL-イソロイシン要求性のcra遺伝子による相補
上述したように、MC1061株ではcra遺伝子が欠損しているため、本発明者らは、cra変異がL-バリン生合成に影響を与えている可能性を考えた。そうであれば、cra遺伝子を導入することにより、GM11株で認められた最少培地での生育の遅延が相補されるはずである。これを確認するためにまずcra遺伝子のクローニングを行った。GW10株（Molecular and General Genetics 253(1997)515-519）より常法により染色体DNAを抽出し、この染色体DNAを鋳型として、配列表配列番号１、２に示す合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行い、cra遺伝子を含む1.1ｋｂの増幅断片を得た。このプライマーには制限酵素BamHIの認識部位が付加されているため、この増幅産物をBamHIで完全分解し、pMW218（日本ジーン）のBamHI部位に挿入し、目的の構成のプラスミドをpCRA1とした。次に、このプラスミドでGM11株を形質転換し、Km耐性を指標に形質転換体を取得した。得られた形質転換体GM11/pCRA1をM9プレートにスポットしたところ、図２に示すようにL-スレオニンまたはL-イソロイシンの栄養要求性は消失していた。GM11で認められたL-スレオニンまたはL-イソロイシンの要求性は、rng変異とcra欠損の組み合わせにより生じる表現型であることが示された。
【実施例８】
【００６２】
cra遺伝子欠損によるilvBN遺伝子過剰発現の確認
GM11株およびGM11/pCRA1株よりRNAを抽出し、ilvBN遺伝子断片をプローブとしてノーザンハイブリザイゼーションを行ったところ、GM11/pCRA1株ではilvBN mRNAの発現量が顕著に抑制されていた（図３）。なお、プローブには、MG1655の染色体DNAを鋳型として、配列番号３および配列番号４に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い調製したilvBN遺伝子断片を用いた。このことからcra変異の効果はilvBN遺伝子（アセト乳酸合成酵素I）の過剰発現によるL-バリン合成の亢進にあるといえる。
【実施例９】
【００６３】
MC1061株におけるilvIH周辺領域の欠損の確認
Biochimical and Biophysical Research Communications 295(2002) 92-97で記載されているように、MC1061株ではcra遺伝子の一部が欠失しているが、cra遺伝子とilvIH遺伝子は染色体上近傍に位置する（図４）。一方、MC1061はaraD-leuCの領域が欠損しているとされていたが（非特許文献：Journal of Molecular Biology  138(1980)179-207）、本発明者らはMC1061株ではaraD-craまでが欠損しているのが正しいと推測した。そこで、MC1061より抽出した染色体をEcoRI、またはEcoRIとSpeIで完全分解し、サザンハイブリダイゼーションを行った（図５）。なお、プローブには、MG1655の染色体を鋳型として、配列番号１、配列番号２に示す合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、cra遺伝子の部分配列を含むDNA断片を用いた。その結果、MC1061株では、leuO遺伝子に存在しているはずのSpeI部位が存在しないことが示された（図５）。この結果ならびにMC1061で認められているcra遺伝子の部分欠失から、MC1061株ではaraD-craまでが連続して欠損しており、ilvIH遺
伝子も欠損していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の細菌を用いることにより、ピルビン酸またはＬ−バリンを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】サプレッサー変異株のバリン耐性度を示す図（写真）。Glyはグリセロールを意味する。
【図２】GM11株のIle、Thr添加またはcra導入による生育回復を示す図（写真）。Glcはグルコースを意味する。
【図３】craによるilvBN遺伝子発現の抑制を示す図（写真）。
【図４】MC1061株の染色体上ilvIH周辺領域を示す図。
【図５】MC1061株のilvIH周辺領域のサザンハイブリダイゼーションによる解析を示す図（写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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