(57)【要約】【解決手段】乳から脂質及びタンパク質が除去したオリゴ糖画分を活性炭カラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とするシアル酸含有オリゴ糖の製造方法。【効果】本発明のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法は、より簡便で、高純度高収率でシアル酸含有オリゴ糖を得ることができる。また、シアル酸含有オリゴ糖である複数の化合物も容易に分離抽出することが可能であり、純度の高い精製品として各種研究材料や食品等へ応用できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳から脂質及びタンパク質を除去したオリゴ糖画分を活性炭カラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とするシアル酸含有オリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
活性炭カラムクロマトグラフィーが、１〜５０重量％のエチルアルコール水溶液を用いた濃度勾配により溶出するものである請求項１記載のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
活性炭カラムクロマトグラフィーが、１〜５０重量％のエチルアルコール水溶液を用いた濃度勾配により行い、２０〜３０重量％のエチルアルコール水溶液による溶出画分を分取するものである請求項１記載のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
乳が牛、羊又は山羊の初乳である請求項１〜３のいずれか１項記載のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
得られるシアル酸含有オリゴ糖のシアル酸／ヘキソースの重量比が０．５〜０．９６である請求項１〜４のいずれか１項記載のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳から種々の生理活性を有するシアル酸含有オリゴ糖を、高純度で且つ効率よく簡便に分離抽出する製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シアル酸含有オリゴ糖は、オリゴ糖を構成する構成糖であるガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン又はシアル酸自身にシアル酸が結合したものであって、代表的なものとしてはシアリルラクトースやシアリルラクトサミン等が知られている。これらのシアル酸含有オリゴ糖は、基本骨格となる中性糖鎖のガラクトースとシアル酸との結合様式により更に２種類のものが存在することが知られている。
近年、これらのシアル酸が結合したオリゴ糖は、細胞間識別等の生理機能だけではなく、感染防御活性があること、ビスィズス菌増殖因子として作用すること、及び乳幼児の免疫制御機能を有する等種々の生理機能を有することが知られ、このような生理機能の解明を進める研究だけでなく、シアル酸含有オリゴ糖を配合し、種々の生理機能の付与を目的とした飲食品等への利用が期待できる有用な食品素材として注目されるようになってきている。
【０００３】
これまで種々の化学合成によりシアル酸含有オリゴ糖を製造する方法が報告されているが、複雑な合成方法で効率が悪く、簡便で大量に生産できないという問題と同時に、合成時に有毒な化学薬品を使用するため、食品への利用を考慮すると必ずしも好ましい方法とはいえなかった。
【０００４】
一方で、近年、これまで天然界には微量しか存在しないと報告されていたシアル酸含有オリゴ糖が、牛、羊、山羊等の乳中に比較的多く含有されることが明らかにされ、シアル酸を含有するオリゴ糖を製造する方法として、牛乳等の乳を原料とする分離抽出方法が検討されるようになった。例えば、▲１▼シアル酸含有オリゴ糖画分を含む乳原料からタンパク質及び乳糖を除去した後、分離剤としてカチオン交換樹脂を用いた擬似移動床式クロマト分離装置に通液してシアル酸含有オリゴ糖を分離抽出する方法（特許文献１）、▲２▼脱脂粉乳からタンパク質を除去した上澄み液を濃縮した後、乳糖を晶析除去する方法（特許文献２）、及び▲３▼シアル酸化合物を含有する原料溶液中のラクトン体を予め開環処理し、該原料溶液中のシアル酸化合物を分離し、ラクトン化し、陰イオン交換体に通液し、非吸着画分を採取する方法（特許文献３）等が挙げられる。
【０００５】
【特許文献１】
特許第３３６８３８９号明細書
【特許文献２】
特開２００１−２４０５９９号公報
【特許文献３】
特開２００１−２１３８９４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来の方法は、必ずしも好ましい方法とはいえなかった。例えば、特許文献１の方法では、乳中に含まれるシアル酸含有オリゴ糖のみを選択的に分離抽出することはできず、特許文献２の方法では、乳原料からシアル酸が結合したオリゴ糖を抽出することはできるが、ある特定の構造を有するシアル酸含有オリゴ糖だけを選択的に抽出することができない。また、特許文献３の方法では、ラクトン体を形成するシアル酸含有オリゴ糖とラクトン体を形成しないシアル酸含有オリゴ糖を選択的に分離抽出する方法としては、非常に有用であるが、シアル酸含有オリゴ糖を抽出するために、数多くの複雑な工程を行わなければならず、作業効率が悪い。また、シアル酸含有オリゴ糖の中でも構造上ラクトン体を形成し得るものしか分離できないという問題があった。
【０００７】
従って、本発明は、種々の生理機能を有するシアル酸含有オリゴ糖を選択的、高純度に高収率で且つ複雑な工程なしに簡便に分離抽出する製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、乳よりシアル酸含有オリゴ糖を高純度で簡便に分離抽出する製造方法を鋭意検討したところ、乳から脂質及びタンパク質を除去したオリゴ糖画分を特定のカラムクロマトグラフィー処理をすることにより、シアル酸含有オリゴ糖が選択的に抽出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は、乳から脂質及びタンパク質を除去したオリゴ糖画分を活性炭カラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とするシアル酸含有オリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の乳から分離抽出されるシアル酸含有オリゴ糖は、シアル酸としてＮ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸がオリゴ糖を構成する糖の非還元末端に結合したＮ−アセチルノイラミニルラクトース又はＮ−グリコリルノイラミニルラクトースを主成分とするものである。具体的には、α−２，３−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトース、α−２，６−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトース、α−２，３−Ｎ−グリコリル−ノイラミニルラクトース又はα−２，６−Ｎ−グリコリル−ノイラミニルラクトースを主成分とするものである。
【００１１】
本発明で使用する乳は、シアル酸含有のオリゴ糖を含むものであればいかなるものでも使用することができるが、分離抽出されるシアル酸含有オリゴ糖であるα−２，３−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトース、α−２，６−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトース又はα−２，３−Ｎ−グリコリル−ノイラミニルラクトース、α−２，６−Ｎ−グリコリル−ノイラミニルラクトースを多く含有する原料乳が好ましく、特に、牛、羊、山羊等の乳が好ましい。
【００１２】
オリゴ糖を構成する糖の非還元末端にシアル酸としてＮ−アセチルノイラミン酸が結合したα−２，３−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトース又はα−２，６−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトースであるシアル酸含有オリゴ糖を得る場合は、それらを比較的多く含んでいる牛、山羊の乳を原料とすることが好ましく、また、非還元末端にシアル酸としてＮ−グリコリルノイラミン酸が結合したα−２，３−Ｎ−グリコリル−ノイラミニルラクトース又はα−２，６−Ｎ−グリコリル−ノイラミニルラクトースであるシアル酸含有オリゴ糖を得る場合は、それらを比較的多く含んでいる羊の乳を原料とすることが好ましい。
【００１３】
また、牛乳、羊乳又は山羊等の乳の中に含有されるシアル酸含有オリゴ糖は、分娩後、日数を経るほどに減少するため、シアル酸含有オリゴ糖を高収率で得るためには、それらの初乳を原料乳として用いることが好ましく、特に、分娩後２４時間以内に搾乳された初乳を原料乳とすることが好ましい。
【００１４】
本発明方法の第一工程は、乳から脂質及びタンパク質を除去する工程である。
脂質の除去は、高速遠心分離機、クリームセパレーター等を使用して、乳をクリーム層とスキムミルク層に分層し、スキムミルク層を分取することにより行われる。
高速遠心分離機を使用する場合の遠心分離の条件は、特に限定されるものではないが、クリーム層とスキムミルク層を十分に分離することができる条件で行うことが好ましい。例えば、温度が０〜１０℃、更に好ましくは２〜５℃で、回転数が１０００〜１０００００ｒ／ｍｉｎ、更に好ましくは３０００〜１００００ｒ／ｍｉｎで、５〜６０分間、更に１０〜４０分間行うのが好ましい。分層を十分に行うために、必要によりこの操作を繰り返し行ってもよい。分層を行った後、常法によりスキムミルク層を分取すればよい。
【００１５】
次いでスキムミルク層からタンパク質が除去される。タンパク質の除去は、分取したスキムミルク層のｐＨをカゼインの等電点（ｐＨ４．６）近傍に調整してタンパク質を沈殿させた後、常法、例えば高速遠心分離機等を使用して、カゼインの白色沈殿を分離除去することにより行われる。
【００１６】
スキムミルク層よりタンパク質を除いた層（以下ホエーということもある）は、牛、羊等の初乳からこのような工程で処理して得るのが好ましいが、市販されているホエーを使用してもよい。市販されているホエーとしては、脱脂乳から酸でカードを沈殿させてカゼインを製造する際に得られる酸性ホエー、チーズを製造する際に排出されるチーズホエー等が挙げられる。
【００１７】
このようにして得られたホエーは、更に十分にタンパク質を除去するために、ｐＨを７近傍に調整した後、ホエーの総量に対して１〜３重量倍、好ましくは約２重量倍の低級アルコール、アセトン等の溶剤、例えば９９％未変性エチルアルコールを加えて混合し、低温、好ましくは０〜１０℃、特に好ましくは３〜５℃で一晩静置した後高速遠心分離機等を使用して、タンパク質の白色沈殿等を分離して上澄み液を得る。この上澄み液を濃縮し、好ましくは１／５〜１／１０位に濃縮し又は凍結乾燥して、オリゴ糖画分を得る。
【００１８】
ホエーをｐＨ７近傍に調整するのは、低ｐＨ条件下でのシアル酸含有オリゴ糖からシアル酸が解離するのを防ぐためであって、ｐＨを調整する際は、通常ｐＨ調整に使用されるものであればいずれを使用してもよいが、食品として許容されるものであることが好ましく、酢酸や水酸化ナトリウム水溶液等を使用することが好ましい。
また、スキムミルク中のタンパク質を沈殿させるための溶剤としては、アセトン等の溶剤を使用することもできるが、食品へ利用すること及び原料乳から調製したオリゴ糖をエチルアルコールを用いて活性炭カラムクロマトグラフィーに付す工程のことも考慮するとエチルアルコールを用いることが最も好ましい。
【００１９】
このようにして得たオリゴ糖画分は、シアル酸含有オリゴ糖以外の糖やミネラル分を含有しているため、濃縮処理時に不溶性沈殿物が生成する場合がある。そのため、前記操作を繰り返し行い活性炭カラムクロマトグラフィーに付す前にこれらの沈殿物をできるだけ除去しておくことが好ましい。
【００２０】
次に、オリゴ糖画分は、低級アルコール、アセトニトリル等の溶剤を含む水溶液に溶解して活性炭カラムクロマトグラフィーに付した後、常法により溶出液として濃度の異なる溶剤水溶液を順次通液して、シアル酸含有オリゴ糖を含む溶出画分を採取し、後述のシアル酸検出法で、シアル酸含有オリゴ糖溶出画分を検出し、それを分取することにより、シアル酸含有オリゴ糖が得られる。
ここで、使用する溶剤としては、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール、アセトニトリル等が挙げられるが、食用等の食品素材としてシアル酸含有オリゴ糖を製造する場合は、エチルアルコールが最も好ましい。
【００２１】
活性炭カラムクロマトグラフィーによるシアル酸含有オリゴ糖の製造における溶出溶剤濃度は、特に限定されないが、５〜９０重量％濃度勾配により行うのが好ましい。溶剤がエチルアルコールの場合は、１〜５０重量％エチルアルコール水溶液による濃縮勾配により行うのが好ましい。より具体的には、まず、３〜７重量％エチルアルコール水溶液を通液した後、１０〜５０重量％エチルアルコール水溶液を低濃度から順次、段階的に通液する。そして、１５〜３５重量％エチルアルコール水溶液により溶出された画分を分取するのが好ましく、更には、牛乳、山羊乳の場合は、１５〜２５重量％エチルアルコール水溶液、羊乳の場合は２５〜３５重量％エチルアルコール水溶液の溶出画分を分取するのが好ましい。溶剤の通液速度は、シアル酸含有オリゴ糖の製造効率の点から、１〜２０ｍＬ／ｍｉｎ、更に３〜１０ｍＬ／ｍｉｎであるのが好ましい。
【００２２】
本発明の製造方法で得られるシアル酸含有オリゴ糖は、シアル酸／ヘキソースの含有重量比の値が０．５〜０．９６、更には０．６〜０．９６であるのが、中性糖の含有量が低い点で好ましい。
【００２３】
シアル酸の検出定量法は、例えば、過ヨウ素酸レゾルシノール塩酸法が挙げられる。該方法は、試料を蒸留水に溶解し、過ヨウ素酸を加えて反応させ、次いでレゾルシノール溶液を加えて反応させた後、これを冷却し、ｔ−ブタノールを加えて更に混合し、遠心分離機を用いて上澄み液を採取し、分光光度計により６３０ｎｍの吸光度を測定することにより行われる。このとき、６３０ｎｍに吸収が測定された場合には、試料にシアル酸が含有されていることを示し、常法によりその吸光度より含有量が測定される。
【００２４】
ヘキソースの検出定量法は、例えばフェノール硫酸法が挙げられる。該方法は、試料にフェノール試薬を加えて撹拌し、濃硫酸を更に加えて撹拌したものを室温まで冷却し、分光光度計を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定する。このとき４９０ｎｍに吸収が測定された場合には、試料に中性糖（ヘキソース）が含有されていることを示し、常法によりその吸光度より含有量が測定される。
また、標準糖（例えば、グルコースやラクトース等）による検量線と比較することで中性糖の含有量も算出することができる。
【００２５】
本発明のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法において、牛の初乳を原料とした場合に１５〜２５重量％エチルアルコール通液画分において、Ｎ−アセチルノイラミン酸が結合したシアル酸含有オリゴ糖、特にα−２，３−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトースを選択的且つ容易に分離抽出することができる。また、羊の初乳を原料とした場合においてもＮ−グリコリルノイラミン酸を主成分として含むシアル酸含有オリゴ糖を２５〜３５重量％エチルアルコール通液画分において選択的に且つ容易に分離抽出することができる。山羊の初乳を原料とした場合においても、活性炭カラムクロマトグラフィーで１５〜２５重量％エチルアルコール通液を行うことにより、Ｎ−アセチルノイラミン酸が結合したシアル酸含有オリゴ糖を選択的に且つ容易に分離抽出することができる。
【００２６】
本発明のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法によって乳から分離抽出して製造されたシアル酸含有オリゴ糖は、エチルアルコール溶液の状態でそのまま使用してもよく、また、常法に従って濃縮、乾燥して粉末にしてから使用してもよい。
【００２７】
本発明の製造方法により製造されたシアル酸含有オリゴ糖、特にシアル酸／ヘキソースの重量比が０．５〜０．９６のシアル酸含有オリゴ糖は、細胞間識別機能、感染防御活性、ビスィズス菌増殖因子、及び乳幼児の免疫制御機能等種々の生理機能の解明を進める研究素材、生理機能を付与する飲食品等へ利用される。また、飼料、医薬品、化粧品等の素材として利用が可能である。
【００２８】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
（１）牛乳からオリゴ糖画分の製造
乳牛（ホルスタイン種２０頭）から分娩直後に採取した乳約１０００ｍＬを４℃で５０００ｒ／ｍｉｎ、１５分間遠心分離し、脂質画分を除去した。得られた脱脂乳に０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸でｐＨ４．６に調整してカゼインを等電点沈殿させた後、高速遠心分離機を用いて処理を行い、カゼインの白色沈殿を分離し、ホエーを得た。このホエーを更に０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７に調整後、２重量倍量の９９重量％未変性エチルアルコールを加え、４℃で一晩放置した後、遠心分離を行い、生成した不溶性画分を濾過により除去し濾液を濃縮、凍結乾燥してオリゴ糖画分を２４．２ｇ得た。
【００３０】
（２）シアル酸含有オリゴ糖の製造
活性炭（和光純薬製，クロマトグラフィー用）を充填したガラスカラム（φ５．０×２３．０ｃｍ、４５０ｍＬ）に（１）で得られた牛乳のオリゴ糖画分６ｇを５重量％エチルアルコール水溶液に溶解して付した。次いで、流速５ｍＬ／ｍｉｎにおいて５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％及び５０重量％の５種類のエチルアルコール水溶液を順次通液し、１００ｍＬずつ分画してフェノール硫酸法及び過ヨウ素酸レゾルシノール塩酸法によりヘキソース及びシアル酸の検出を行った。その結果を図１に示す。
【００３１】
図１より、２０重量％エチルアルコール水溶液で溶出した画分において、シアル酸含有オリゴ糖が選択的に溶出していることが認められた。また、この２０重量％エチルアルコール水溶液で溶出された画分の収量は、２８０ｍｇであった。
また、シアル酸／ヘキソースの含有重量比は０．９２であった。
【００３２】
シアル酸含有オリゴ糖の検出
２０重量％エチルアルコール水溶液で溶出した画分１０ｍｇを計り取り、蒸留水に溶解したものを下記の条件でＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に付し、シアル酸含有オリゴ糖を精製した。その結果を図２に示す。
ＨＰＬＣ：ＴＳＫ  Ａｍｉｄｅ  ８０カラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍ）
流速  １ｍＬ／ｍｉｎ
溶出液
ａ液：アセトニトリル／１５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）＝８０：２０
ｂ液：アセトニトリル／１５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）＝５０：５０
【００３３】
図２より、２０重量％エチルアルコール水溶液で溶出したシアル酸含有オリゴ糖は、α−２，３−Ｎ−アセチル−ノイラミニルラクトースであることが認められた。
【００３４】
実施例２
（１）羊乳からオリゴ糖画分の製造
羊（４頭）から分娩直後に採取した乳約４４０ｍＬを用いて実施例１（１）と同様の方法によりオリゴ糖画分を６．８ｇ得た。
【００３５】
（２）シアル酸含有オリゴ糖の製造
（１）で得られた羊乳のオリゴ糖画分２５ｍＬを実施例１（２）と同様に５重量％エチルアルコール水溶液に溶解して付した。次いで、流速５ｍＬ／ｍｉｎにおいて５重量％、２０重量％、３０重量％及び５０重量％の４種類のエチルアルコール水溶液を順次通液し、１００ｍＬづつ分画してフェノール硫酸法及び過ヨウ素酸レゾルシノール塩酸法によりヘキソース及びシアル酸の検出を行った。その結果を図３に示す。
【００３６】
図３より、３０重量％エチルアルコール水溶液で溶出した画分において、シアル酸含有オリゴ糖が選択的に溶出していることが認められた。また、この３０重量％エチルアルコール水溶液で溶出されたシアル酸含有オリゴ糖画分の収量は、６４．３ｍｇであった。
また、シアル酸／ヘキソースの含有重量比は、０．８５であった。
【００３７】
【発明の効果】
本発明のシアル酸含有オリゴ糖の製造方法は、より簡便で、高純度高収率でシアル酸含有オリゴ糖を得ることができる。また、シアル酸含有オリゴ糖である複数の化合物も容易に分離抽出することが可能であり、純度の高い精製品として各種研究材料や食品等へ応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】活性炭カラムクロマトグラフィー法におけるシアル酸含有オリゴ糖の溶出を示す図である。
【図２】シアル酸含有オリゴ糖溶出画分のＨＰＬＣ測定結果を示す図である。
【図３】活性炭カラムクロマトグラフィー法におけるシアル酸含有オリゴ糖の溶出を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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