(57)【要約】【課題】効率的に抗癌剤、具体的にはG2/M阻害剤ならびにDNA修飾剤及び非DNA修飾剤をスクリーニング及び判別する方法を提供することを目的とする。【解決手段】１）健常人由来のB細胞をEBVで形質転換したBリンパ芽球様細胞株、2)このBリンパ芽球様細胞株由来の不死化細胞株、並びに任意で、3)初代培養成人繊維芽細胞株にヒトテロメラーゼ遺伝子、SV40のT抗原遺伝子、及び腫瘍遺伝子Ha-rasを導入した細胞株(TRS#5)を利用することにより、チューブリンの重合又はその他の分子を標的とするG2/M阻害剤を効率的にスクリーニング又は判別することができる。さらに、これらの細胞株の使用によって、DNA修飾剤と非DNA修飾剤をスクリーニング又は判別することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；
(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対する細胞毒性を各々計算する工程；及び
(3)計算された第一細胞株に対する細胞毒性/第二細胞株に対する細胞毒性に基づいて被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程を含む、G2/M阻害剤をスクリーニング又は判別する方法であって、第一細胞株と第二細胞株が同じ細胞株由来である方法。
【請求項２】
工程(1)が下記(a)〜(c)を含む、請求項１記載の方法：
(a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程；
(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程；及び
(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程。
【請求項３】
工程(3)の後に、以下の工程を含む、請求項１又は２記載の方法：
(4)工程(3)において選択された被験化合物存在下で第三細胞株を培養する工程；
(5)被験化合物の第三細胞株に対する細胞毒性を計算する工程；及び
(6)第三細胞株に対する細胞毒性に基づいて被験化合物を制癌剤として選択する工程。
【請求項４】
被験化合物の各細胞株に対する細胞毒性をIC50により計算する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が10以下で、より低い数値を示す被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が3以下で、より低い数値を示す被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
第三細胞株に対するIC50が1.0μM以下の被験化合物を制癌剤として選択する工程を含む、請求項３〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
(1)第二細胞株を不死化した細胞株を第一細胞株；
(2)癌抑制遺伝子p53に変異を持つ細胞株を第一細胞株、及び、持たない細胞株を第二細胞株；
(3)軟寒天ないし類似の担体を用いた培地でのコロニー形成能を持つ細胞株を第一細胞株、及び、持たない細胞株を第二細胞株；又は
(4)核型が四倍体の細胞株を第一細胞株、及び、二倍体の細胞株を第二細胞株
として使用する、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
B細胞株Post6-Col-4Nを第一細胞株として、B細胞株Pre6-2Nを第二細胞株として使用する、請求項１、２、４、５又は６記載の方法。
【請求項１０】
B細胞株Post6-Col-4Nを第一細胞株として、B細胞株Pre6-2Nを第二細胞株として、繊維芽細胞株TRS#5を第三細胞株として使用する、請求項３〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１、２、４、５又は６記載の方法のための、第一細胞株及び第二細胞株を含むキット。
【請求項１２】
請求項３〜７のいずれか一項記載の方法のための、第一細胞株、第二細胞株及び第三細胞株を含むキット。
【請求項１３】
(1)第二細胞株を不死化した細胞株が第一細胞株；
(2)癌抑制遺伝子p53に変異を持つ細胞株が第一細胞株、及び、持たない細胞株が第二細胞株；
(3)軟寒天ないし類似の担体を用いた培地でのコロニー形成能を持つ細胞株が第一細胞株、及び、持たない細胞株が第二細胞株；又は
(4)核型が四倍体の細胞株が第一細胞株、及び、二倍体の細胞株が第二細胞株
である、請求項11又は12記載のキット。
【請求項１４】
第一細胞株がB細胞株Post6-Col-4N、第二細胞株がB細胞株Pre6-2Nである、請求項11記載のキット。
【請求項１５】
第一細胞株がB細胞株Post6-Col-4N、第二細胞株がB細胞株Pre6-2N、第三細胞株が繊維芽細胞株TRS#5である、請求項12記載のキット。
【請求項１６】
(1)被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；
(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対する細胞毒性を各々計算する工程；及び
(3)計算された第一細胞株に対する細胞毒性/第二細胞株に対する細胞毒性に基づいて、被験化合物をDNA修飾剤又は非DNA修飾剤として選択する工程を含む、DNA修飾剤又は非DNA修飾剤をスクリーニング又は判別する方法であって、第一細胞株と第二細胞株が同じ細胞株由来である方法。
【請求項１７】
工程(1)が下記(a)〜(c)を含む、請求項16記載の方法：
(a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程；
(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程；及び
(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程。
【請求項１８】
工程(3)の後に、以下の工程を含む、請求項16又は17記載の方法：
(4)工程(3)において選択された被験化合物存在下で第三細胞株を培養する工程；
(5)被験化合物の第三細胞株に対する細胞毒性を計算する工程；及び
(6)第三細胞株に対する細胞毒性に基づいて被験化合物を制癌剤として選択する工程。
【請求項１９】
被験化合物の各細胞株に対する細胞毒性をIC50により計算する、請求項16〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が1.20未満の値を示す被験化合物を非DNA修飾剤として選択する工程を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が1.20以上の値を示す被験化合物をDNA修飾剤として選択する工程を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
第三細胞株に対するIC50が1.0μM以下の被験化合物を制癌剤として選択する工程を含む、請求項18〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
(1)第二細胞株を不死化した細胞株を第一細胞株；
(2)癌抑制遺伝子p53に変異を持つ細胞株を第一細胞株、及び、持たない細胞株を第二細胞株；
(3)軟寒天ないし類似の担体を用いた培地でのコロニー形成能を持つ細胞株を第一細胞株、及び、持たない細胞株を第二細胞株；又は
(4)核型が四倍体の細胞株を第一細胞株、及び、二倍体の細胞株を第二細胞株
として使用する、請求項16〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
B細胞株Post6-Col-4Nを第一細胞株として、B細胞株Pre6-2Nを第二細胞株として使用する、請求項16、17、19、20又は21記載の方法。
【請求項２５】
B細胞株Post6-Col-4Nを第一細胞株として、B細胞株Pre6-2Nを第二細胞株として、繊維芽細胞株TRS#5を第三細胞株として使用する、請求項18〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
請求項16、17、19、20又は21記載の方法のための、第一細胞株及び第二細胞株を含むキット。
【請求項２７】
請求項18〜22のいずれか一項記載の方法のための、第一細胞株、第二細胞株及び第三細胞株を含むキット。
【請求項２８】
(1)第二細胞株を不死化した細胞株が第一細胞株；
(2)癌抑制遺伝子p53に変異を持つ細胞株が第一細胞株、及び、持たない細胞株が第二細胞株；
(3)軟寒天ないし類似の担体を用いた培地でのコロニー形成能を持つ細胞株が第一細胞株、及び、持たない細胞株が第二細胞株；又は
(4)核型が四倍体の細胞株が第一細胞株、及び、二倍体の細胞株が第二細胞株
である、請求項26又は27記載のキット。
【請求項２９】
第一細胞株がB細胞株Post6-Col-4N、第二細胞株がB細胞株Pre6-2Nである、請求項26記載のキット。
【請求項３０】
第一細胞株がB細胞株Post6-Col-4N、第二細胞株がB細胞株Pre6-2N、第三細胞株が繊維芽細胞株TRS#5である、請求項27記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤を効率的にスクリーニング及び／又は判別する方法に関する。より具体的には、本発明は、G2/M阻害剤をスクリーニング及び／又は判別する方法に関する。さらに、本発明は、DNA修飾剤及び非DNA修飾剤をスクリーニング及び／又は判別する方法に関する。本発明のスクリーニング及び／又は判別方法には、2種類又は3種類の細胞株が利用される。また、本発明は、このようなG2/M阻害剤、又はDNA修飾剤及び非DNA修飾剤のスクリーニング及び／又は判別において好適に使用することができる、2種類又は3種類の細胞株を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞周期は、第一間期(Gap1;G1期)、G1/S junction期、DNA合成期(DNA synthesis;S期)、第二間期(Gap2;G2期)及び分裂期(Mitosis;M期)に分類される。このいずれの箇所を停止させても分裂・増殖抑制を達成できるが、G2/M期を停止させる薬剤には次のような利点がある。すなわち、分裂に関与するチューブリンないしその周辺の紡錘糸形成過程に作用し、それ以外の、核酸代謝に作用しないし、またDNAに傷をつけることもない。ちなみに、アクチノマイシンＤはRNA代謝を阻害し、5-フルオロウラシルは異常なDNAを作ることになり、ブレオマイシンやカンプトテシンはDNAを切断する。
【０００３】
現在、G2/M期に作用する制癌剤として、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン等が公知である。これらの薬剤は、チューブリンの重合又は安定化に作用し、直接DNAに損害を与えないという制癌剤として好ましい特徴を有する。しかしながら、この範疇の制癌剤は多くが植物由来アルカロイドであり、パクリタキセルに代表されるように難水溶性のものが多い。そこで、化学合成することができ、できれば水に溶けやすく、同様な作用を持つ制癌剤の出現が待たれている。
【０００４】
抗癌剤は、大きく分けるとDNA修飾剤と非DNA修飾剤に分けることができる（非特許文献１）。DNA修飾剤には、DNAに切れ目を入れて鎖を切断することによってDNAを修飾するDNA修飾剤(例えば、カンプトテシン、エトポシド、ブレオマイシン)；DNAをアルキル化することによってDNAを修飾するDNA修飾剤(例えば、メルファラン)；正常なDNA前駆体の代わりにDNA配列に組み込まれることでDNAを修飾するDNA修飾剤(例えば、フルオロウラシル、チオグアニン)；及びインターカレーションにより二本鎖DNAに挿入されることでDNAを修飾するDNA修飾剤(例えば、アクチノマイシンD)などが挙げられる。非DNA修飾剤としては、微小管を含む細胞質成分に作用することによって抗癌活性を有する非DNA修飾剤(例えば、コルヒチン、ビンクリスチン、パクリタキセル)；及びDNA前駆体の合成阻害によって抗癌活性を有する非DNA修飾剤(例えば、メトトレキセート)（非特許文献１）を有するものが挙げられる。
【０００５】
基本的に、既存の制癌剤において、細胞周期の阻害時期（G1/S期、G2/M期）とDNA修飾作用の有無は対応している。具体的には、G2/M阻害剤であれば非DNA修飾剤であり、G1/S阻害剤であればDNA修飾剤であると言える。例えば、コルヒチン、ビンクリスチン及びパクリタキセルは、G2/M阻害剤であると同時に非DNA修飾剤であり、フルオロウラシル、チオグアニン及びメルファランはG1/S阻害剤であると同時にDNA修飾剤である。しかし、メトトレキセートは例外であり、G1/S阻害剤でありながら、非DNA修飾剤である。
【０００６】
制癌剤のスクリーニング方法は大別すると、細胞を使用する方法（非特許文献２;非特許文献３）と標的蛋白質を使用する方法（例えば、チューブリンを標的とする方法：非特許文献４）に大別される。前者の利点は多くの標的分子に対する化合物を選択できることであり、欠点は、その裏返しとして、作用機構解明のために、標的分子を同定する必要があることである。例えば、チューブリンの重合を使用したアッセイ系も知られているが（非特許文献４）、この場合の標的分子はチューブリンに限定されてしまう。その他、マウス乳癌細胞より分離されたcdc2キナーゼの温度感受性変異株tsFT210細胞を利用したG2/M期を標的とするスクリーニング方法も公知である（例えば、特許文献１）。tsFT210細胞は、より高い温度(例えば、39℃)で培養した場合、G2期で細胞周期が停止し、温度を下げると(例えば、32℃)、G1期へと移行することが知られている。そこで、例えば、tsFT210細胞を39℃で培養し、培地中に被験物質を加えた後、培養温度を32℃に下げ、細胞周期がG1期へと移行するかどうかを確認することにより、被験物質に細胞周期を調節する（G2期で停止させる）作用があるかを調べることができる。
【０００７】
【特許文献１】特開平9-59275号公報
【非特許文献１】Skeel, R.T. "Handbook of cancer chemotherapy." Fifth Edition ed. Philadelphia, Baltimore, New York, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokyo: Lippincott Williams & Wilkins; 1999
【非特許文献２】Vassilev, L. T., Kazmer, S., Marks, I. M., Pezzoni, G., Sala, F., Mischke, S. G., Foley, L., and Berthel, S. J. "Cell-based screening approach for antitumor drug leads which exploits sensitivity differences between normal and cancer cells: identification of two novel cell-cycle inhibitors." Anticancer Drug Des.(2001)16:7-17
【非特許文献３】Wu-Wong, J. R., Alder, J. D., Alder, L., Burns, D. J., Han, E. K., Credo, B., Tahir, S. K., Dayton, B. D., Ewing, P. J., and Chiou, W. J. "Identification and characterization of A-105972, an antineoplastic agent." Cancer Res. (2001)61:1486-1492
【非特許文献４】Lopes, N. M., Miller, H. P., Young, N. D., and Bhuyan, B. K. "Assessment of microtubule stabilizers by semiautomated in vitro microtubule protein polymerization and mitotic block assays." Cancer Chemother.Pharmacol.(1997)41:37-47
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
G2/M期のチューブリンの重合又は安定化に作用し、直接DNAに損害を与えず、且つ、化学合成可能な水溶性の化合物は、好ましい制癌剤となると考えられる。従来、チューブリンの重合を使用したアッセイ系が細胞分裂阻害剤のスクリーニングに使用されているが、この場合の標的分子はチューブリンに限定されてしまう。また、マウス乳癌細胞より分離されたcdc2キナーゼの温度感受性変異株tsFT210細胞を利用したG2/M期を標的とするスクリーニング方法は、元となる細胞はマウス由来であり、ヒトに対する制癌剤のスクリーニングに適しているとは言い難い。G2/M期を標的とする制癌剤をより効率的にスクリーニング及び評価するための方法が求められている。
【０００９】
さらに、DNA修飾剤及び非DNA修飾剤の抗癌剤をスクリーニング及び評価するためのツールを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ヒトB細胞はエプシュタイン・バールウイルス(EBV)による形質転換で活発に増殖するBリンパ芽球様細胞になり、安定したリンパ芽球細胞株(lymphoblastoid cell line;LCL)が樹立される（Miller, G. and Lipman, M."Release of infectious Epstein-Barr virus by transformed marmoset leukocytes." Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1973)70:190-194）。従来このようにしてできたLCLは、そのままで不死化されていると考えられていた（Miller, G.,"Epstein-Barr virus biology, pathogenesis and medical aspects." Virology, Fields, B.N. & Knipe, K.M. eds., Raven Press, NY(1990)1921-58;Nilsson, K., Hum. Cell(1992)5:25-41）。しかしながら、本出願人等による研究の結果、以下（１）〜（３）に示すように、この定説は誤りであることが分かった（総説：Sugimoto, M. et al., Cancer Res.(2004)64:3361-3364）。
(1)樹立されたLCLは大部分が正常二倍体の核型を持つ有限寿命細胞であり(pre-immortal LCL; pre-LCL)、培養の継代に伴いテロメア長が短縮し、通常150細胞集団倍加数(PDL)以内で死滅する（Sugimoto, M. et al., Cancer Genet. Cytogent(2004)152:95-100;Tahara, H. et al., Oncogene (1997)15:1911-20）。
(2)一部のpre-LCLは強いテロメラーゼ活性を持つようになり、それに伴い異常な核型を示し、テロメア長が維持されて不死化細胞株(post-immortal LCL;post-LCL)となる（Okubo, M. et al., Cancer Genet. Cytogenet.(2001)129:30-4;Tahara, H. et al., Oncogene(1997)15:1911-20）。
(3)post-LCLの一部は更に、軟寒天でのコロニー形成能及びヌードマウスでの増殖能の獲得、癌抑制遺伝子産物の発現抑制、並びにアポトーシスの抑制等、腫瘍細胞と密接に関連した性質を示すようになる(Satoh, M. et al., Cell Struct. Funct.(2003)28:61-70;Takahashi, T. et al., DNA Cell Biol.(2003)22:727-35)。
【００１１】
pre-LCLは正常二倍体の核型を有する有限寿命細胞であり、その他の性質も抗原刺激でブラスト化した正常細胞に近いと考えられている（Nilsson, K., Hum.Cell(1992)5:25-41）。そこで、本発明者らは、pre-LCLは正常細胞のモデルとし、同じ株由来のpost-LCLを腫瘍細胞のモデルとして使用する制癌剤のスクリーニングシステムを構築することを計画し、本発明を完成した。これら両細胞は、post-LCLが不死化していることを除き、遺伝的背景等を含むほとんどすべての特性を共有している。そのため、post-LCLに対して特異的に毒性を示す化合物は、細胞の不死化を感知して作用していると考えられることから、好適な制癌剤候補となる。
【００１２】
よって、本発明は、(1)被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対する細胞毒性を各々計算する工程；及び(3)計算された第一細胞株に対する細胞毒性/第二細胞株に対する細胞毒性に基づいて被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程を含む、G2/M阻害剤をスクリーニング及び／又は判別する方法を提供するものである。
【００１３】
一態様において、被験化合物の各細胞株に対する細胞毒性を、50％抑制濃度（IC50）により計算することができる。したがって、本発明は、(1)被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程；及び(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が10以下、好ましくは3以下、より好ましくは2以下で、より低い数値を示す被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程を含む、G2/M阻害剤をスクリーニング及び／又は判別する方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、(1)被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対する細胞毒性を各々計算する工程；及び(3)計算された第一細胞株に対する細胞毒性/第二細胞株に対する細胞毒性に基づいて、被験化合物をDNA修飾剤又は非DNA修飾剤として選択する工程を含む、DNA修飾剤又は非DNA修飾剤をスクリーニング及び／又は判別する方法を提供するものである。
【００１５】
一態様において、被験化合物の各細胞株に対する細胞毒性を、50％抑制濃度（IC50）により計算することができる。したがって、本発明は、(1)被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程；及び(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が約1.2未満の値を示す被験化合物を非DNA修飾剤として、計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2以上の値を示す被験化合物をDNA修飾剤として選択する工程を含む、DNA修飾剤又は非DNA修飾剤をスクリーニング及び／又は判別する方法を提供するものである。
【００１６】
これらのスクリーニング方法及び／又は判別方法において使用する第一及び第二細胞株としては、上述のpost-LCL及びpre-LCLを好適に用いることができる。本発明の方法に適するpost-LCL及びpre-LCLの組み合わせとして、Post6-Col-4N及びPre6-2Nの細胞株の組み合わせが挙げられる。この組み合わせは、実施例において使用された。「Post6-Col-4N」は、「Pre6-2N」を不死化した細胞株であり、Post6-Col-4Nは、次の点でPre6-2Nと異なっていた：
(a)軟寒天培地上でのコロニー形成能を有する
(b)染色体が四倍体である（Pre6-2Nは二倍体）
(c)癌抑制遺伝子p53が変異している
【００１７】
本発明はさらに上記第一及び第二細胞株を用いたスクリーニングを補うために、第三の細胞株に対する作用を調べる工程を含むスクリーニング方法を提供するものである。
【００１８】
具体的には、本発明は、(1)  (a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程と、(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程と、(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程とを含む、被験化合物存在下で第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程；(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50が10以下、好ましくは3以下、より好ましくは2以下で、より低い数値を示す被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程；(4)工程(3)において選択された被験化合物存在下で第三細胞株を培養する工程；(5)被験化合物の第三細胞株に対するIC50を計算する工程；及び(6)第三細胞株に対するIC50が1.0μM以下の被験化合物を制癌剤として選択する工程を含む、G2/M阻害剤をスクリーニングする方法及び／又はG2/M阻害剤を判別する方法に関する。
【００１９】
また、具体的には、本発明は、(1)  (a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程と、(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程と、(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程とを含む、被験化合物存在下で第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程；(2)被験化合物の第一細胞株、及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程；(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2未満の値を示す被験化合物を非DNA修飾剤として、計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2以上の値を示す被験化合物をDNA修飾剤として選択する工程；(4)工程(3)において選択された被験化合物存在下で第三細胞株を培養する工程；(5)被験化合物の第三細胞株に対するIC50を計算する工程；及び(6)第三細胞株に対するIC50が1.0μM以下の被験化合物を制癌剤として選択する工程を含む、DNA修飾剤もしくは非DNA修飾剤をスクリーニングする方法及び／又はDNA修飾剤もしくは非DNA修飾剤を判別する方法に関する。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法又は判別方法により選択された制癌剤について、必要に応じ、公知の手法に従い細胞周期阻害解析及びDNA修飾作用解析を行うことができる。細胞周期解析は、例えば、セルソーターを用いて、染色体の状態を調べることができる。また、必要に応じ、市販のキットを用いてチューブリンの重合に対する作用（阻害又は促進）を調べてもよい。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のスクリーニング方法又は判別方法の実施に必要とされる細胞株等を組合せたキットを提供するものである。該キットは、第一、第二及び/又は第三細胞株に加え、スクリーニングの実施の手順を記した説明書、細胞株の培養に必要とされる培地／容器、細胞毒性試験に必要とされる試薬、その他G2/M阻害剤又はDNA修飾剤もしくは非DNA修飾剤のスクリーニング又は判別に必要とされる試薬、用具、装置等を含んでもよい。当然、ハイスループットシステムへの応用も考えられる。
【発明の効果】
【００２２】
実施例に示すように、本発明は、不死化前のB細胞株と不死化後のB細胞株を用い、被験化合物として既存の制癌剤を用いて、G2/M阻害活性を持つ化合物を選択できることを示した。さらに、9000種類の化合物についてのスクリーニングを本発明の方法に従って行った結果、本発明の方法がG2/M阻害活性を持つ化合物の選択に有効であることが示された。同時に、本発明の細胞毒性の測定を基本とした方法が、多数の試料についてのスクリーニング又は判別を行うのにも適した方法であることが示された。さらに、本方法によると、チューブリン重合阻害活性又はチューブリン重合促進活性を持つ化合物のみならず、チューブリン以外の分子を標的とするG2/M阻害剤もスクリーニング又は判別することができ、チューブリンの重合を利用したG2/M阻害剤の選択方法と比べ有利である。
【００２３】
また、本発明は、不死化前のB細胞株と不死化後のB細胞株を用い、既存のDNA修飾剤及び非DNA修飾剤を用いた実験によって、DNA修飾剤と非DNA修飾剤が有効に選択できることを示した。
【００２４】
従って、本発明において、抗癌剤をスクリーニング及び評価するために、不死化前の細胞を活発に増殖している正常リンパ球のモデルとして、不死化細胞をリンパ種細胞のモデルとして使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、細胞に対する毒性を調べることによりG2/M阻害剤を効率的にスクリーニングする方法及び／又は判別する方法に関する。具体的には、本発明のスクリーニング方法及び判別方法は、(1)(a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程、(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程、(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程を含む、被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程、(2)被験化合物の第一細胞株及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程、及び(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値に基づいて、被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程を含む。また、別の態様において本発明のスクリーニング方法及び／又は判別方法は、(1)(a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程、(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程、(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程を含む、被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程、(2)被験化合物の第一細胞株及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程、(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50に基づき被験化合物をG2/M阻害剤として選択する工程、(4)工程(3)において選択された被験化合物存在下で第三細胞株を培養する工程、(5)被験化合物の第三細胞株に対するIC50を計算する工程、及び(6)第三細胞株に対するIC50が1.0μM以下の被験化合物を制癌剤として選択する工程を含む。
【００２６】
ここで、工程(3)における被験化合物の選択では、工程(2)において計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が10以下、好ましくは8以下、より好ましくは6以下、さらに好ましくは4以下、さらに好ましくは3以下、さらにより好ましくは2以下で、より低い数値を示すものを選択することが好ましい。計算されるこのIC50値の比は、実験条件により左右されることから、これらの比の値に特に限定されるものではなく、同一実験内での比の値の相対比較が重要である。例えば、実施例１において示す(表２参照)、既存制癌剤について調べた実験結果では、2以下の数値を示すものを選択することが望ましいことが示された。しかしながら、上述のように、実験条件により計算されるこのIC50値の比は左右されることから、比の値がある一定値以上、又は以下であるという観点に基づいてではなく、同一実験内でより低い数値を示したものを選択するようにする必要がある。従って、実験条件によっては、選択される第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値は、上述の値以外、1.0、1.5、2.5、3.0、3.5、4.5、5.0、5.5、6.5、7.0、7.5、8.5、9.0、9.5以下等様々な数値以下のもの、場合によっては10以上のものを選択する必要がある場合が考えられる。
【００２７】
本発明は、細胞に対する毒性を調べることによりDNA修飾剤及び非DNA修飾剤を効率的にスクリーニングする方法及び／又は判別する方法に関する。具体的には、本発明のスクリーニング方法及び判別方法は、(1)(a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程、(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程、(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程を含む、被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程、(2)被験化合物の第一細胞株及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程、及び(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2未満の値を示す被験化合物を非DNA修飾剤として、計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2以上の値を示す被験化合物をDNA修飾剤として選択する工程を含む。また、別の態様において本発明のスクリーニング方法及び／又は判別方法は、(1)(a)第一細胞株を被験化合物存在下で培養する工程、(b)工程(a)において第一細胞株に対して細胞毒性を示した被験化合物を選択する工程、(c)工程(b)において選択された被験化合物存在下で第二細胞株を培養する工程を含む、被験化合物存在下で、第一細胞株及び第二細胞株をそれぞれ培養する工程、(2)被験化合物の第一細胞株及び第二細胞株に対するIC50を各々計算する工程、(3)計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2未満の値を示す被験化合物を非DNA修飾剤として、計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値が約1.2以上の値を示す被験化合物をDNA修飾剤として選択する工程、(4)工程(3)において選択された被験化合物存在下で第三細胞株を培養する工程、(5)被験化合物の第三細胞株に対するIC50を計算する工程、及び(6)第三細胞株に対するIC50が1.0μM以下の被験化合物を制癌剤として選択する工程を含む。
【００２８】
ここで、工程(3)における非DNA修飾剤の選択では、工程(2)において計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値は、約1.2未満であり、例えば、1.2未満、1.1未満、1.0未満、0.9未満、0.8未満、0.7未満、0.6未満、0.5未満、及び0.4未満であり得る。実施例３(表３参照)において既存の非DNA修飾剤を用いて調べた実験結果では、第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値は0.84〜1.14であった。一方、工程(3)におけるDNA修飾剤の選択では、工程(2)において計算された第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値は約1.2以上であり、例えば、1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、2.0以上、2.5以上、5.0以上、7.5以上、及び10.0以上であり得る。実施例３(表３参照)において、既存のDNA修飾剤を用いて調べた実験結果では、第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値は1.45〜7.46の数値であった。しかしながら、計算されるこのIC50値の比は、実験条件により左右されることから、これらの比の値に特に限定されるものではなく、同一実験内での比の値の相対比較が重要である。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法において試験される被験化合物は特に限定されず、いかなる化合物であってもよい。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー及びランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等のライブラリー中の化合物、抗体、細菌産生物質（分泌物）、微生物細胞抽出液及び培養上清、植物細胞抽出液及び培養上清、動物細胞抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物抽出物、並びに土壌を挙げることができる。本発明の方法は特に多数の化合物について同時に試験するのに適しているため、ライブラリー中の各化合物が被験化合物として好適に用いられる。スクリーニングされた化合物を制癌剤として製剤化することを考えた場合には、化学合成することができる化合物が好ましい。その点からも、合成低分子化合物ライブラリーは、本スクリーニング方法の被験化合物を得るための好ましい材料である。
【００３０】
本発明のスクリーニングにおいて使用する細胞株の由来及び種類は特に限定されず、第一細胞株が第二細胞株を不死化したものであれば良い。細胞株の由来としては、哺乳動物由来の細胞を挙げることができるが、ヒトに対する制癌剤のスクリーニングを目的とする場合には、ヒト由来の細胞株を用いることが好ましい。ここで、細胞株には初代培養、及び細胞系からの培養系統が包含される。また、「不死化」とは細胞が無限に増殖できる能力を持つことを意味するが、このことを実験的に証明することはできない。そこで、 LCLの場合は、強いテロメラーゼ活性を持ち、染色体が異数体で、180PDLを越えた細胞株は、不死化しているとみなせる（Sugimoto, M. et al., Cancer Research, (2004)64:3361-3364）。
【００３１】
好ましい第一及び第二細胞株の組合せとして、EBVで形質転換した不死化後のヒト由来B細胞株（post-LCL）、及び、第一細胞株と同一由来のEBVで形質転換した不死化前のB細胞株ヒト(pre-LCL)の組合せが挙げられる。好ましい組合せとしては、Post6-Col-4N及びPre6-2Nが例示される。しかしながら、本発明の細胞株はこれらに限定されるものではなく、これらの細胞と共通した性質を有する細胞もまた、本発明のスクリーニングにおいて望ましい細胞株となると期待される。例えば、Post6-Col-4Nの(a)軟寒天培地上でのコロニー形成能を有する、(b)染色体が四倍体である、及び(c)癌抑制遺伝子p53が変異している等の特性のうち少なくともいずれか一つを示す細胞を第一細胞株として、第二細胞株としてその反対(a)軟寒天培地上でのコロニー形成能を有さない、(b)染色体が二倍体である、及び(c)正常なp53遺伝子を持つ等の特性のうち少なくともいずれか一つを示す細胞を第二細胞株として利用することができる。これらの性質のうち、コロニー形成能については、軟寒天上でのコロニー形成能に依存せず、その他の足場依存性増殖の判定に使用される培地上でのコロニー形成能を元に本発明の細胞株として適するかどうかを判定してもよい。例えば、寒天の代わりにメチルセルロース等の培地であってもよい。その他、Post6-Col-4Nは核型が四倍体であったのに対し、Pre6-2Nの核型は二倍体であった。今回のスクリーニングは、このような核型の差により成功した可能性もある。そこで、第一細胞株が第二細胞株を不死化した細胞株であり、第一細胞株が四倍体で、第二細胞株が二倍体である細胞株の組合せを本発明のスクリーニングにおいて使用することもできる。
【００３２】
一方、好ましい第三細胞株としては、不死化繊維芽細胞株TRS#5を挙げることができる。ここで、スクリーニングを補うために使用した繊維芽細胞TRS#5は、初代培養成人繊維芽細胞株にヒトテロメラーゼ遺伝子であるhTERT、SV40のT抗原遺伝子及び腫瘍抗原Ha-rasを導入して作製した不死化細胞株であり（Hahn et al.,Nature(1999)400:464-8）、ゲル培地上でのコロニー形成能を有する。
【００３３】
本発明の方法において、第一細胞株と第二細胞株の好ましい組み合わせであるPost6-Col-4N及びPre6-2N、ならびに好ましい第三細胞株であるTRS#5の各性質を表１にまとめる。
【表１】
2005312437.tif 000002
＊p53の機能は導入されているSV40T抗原により抑制されている。
【００３４】
本発明のスクリーニングにおける細胞毒性試験のための培地は、使用する細胞株の培養に適したものであればよく、特に限定されない。例えば、血球系細胞株の培養にはRPMI-1640を、繊維芽細胞株、及び接着系癌細胞の培養にはDMEMを用いることができる。必要に応じ、非働化仔ウシ血清等の血清を培地中に添加してもよい。細胞株の培養は、前記適当な培地を加えた適当な容器中で行うことができる。複数の化合物の細胞毒性について試験する場合には、複数のウェルを持つプレートを使用することが好ましいが、個別の試験管、シャーレ、プレート等を適宜用いることができる。
【００３５】
化合物の細胞毒性の判定は、該化合物存在下で細胞を培養した場合の生細胞数の変化を指標として判定することができる。生細胞の変化は、例えば、50％抑制濃度（IC50）の値として数値化することができる。種々の細胞毒性試験が公知であり、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。例えば、実施例において示すように、培養液中の生細胞数を測定するために、WST-8（（2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)- 5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム一ナトリウム塩）分析を行うことができる。WST-8分析は、適当なテトラゾリウム塩を生細胞に接触させた場合、生細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素によりテトラゾリウム塩が還元されてホルマザンが生成し、該生成されたホルマザンの量が生細胞数と比例することを利用した方法である。即ち、細胞を含む培養液にテトラゾリウム塩を含む溶液を添加し、インキュベートすることにより呈色反応を進め、吸光度を測定することにより生細胞数を測定することができる。WST-8以外に、WST-1、MTT、MTS、XTT等のテトラゾリウム塩も公知であり、本発明の細胞毒性の判定、即ち生細胞数の計測に使用することができる。これらの各種テトラゾリウム塩を含む、種々の生細胞数測定試薬が市販されており、本発明においても使用することができる。操作の簡便性、再現性及び感度の良さ等から特にWST-8を用いた方法は好ましい。
【００３６】
テトラゾリウム塩を用いる以外の生細胞数を測定する方法としては、(1)血球計算盤を用いる方法、(2)セルカウンターによる方法、(3)[3H]チミジン等の放射性同位体の取り込みを利用した方法、(4)ニュートラルレッド（生細胞リソゾームに蓄積）を用いる方法、(5)乳酸脱水素酵素(LDH)法、(6)クリスタルバイオレットを用いた方法、(7)細胞へ取り込まれた場合に蛍光を発する色素(Calcein AM等)の細胞への取り込みを利用した蛍光測定法、(8)細胞内ATPを検出する方法（例えば、ルシフェラーゼ等の酵素を利用）、(9)DNA結合色素が生細胞と死細胞とで透過性が異なる性質を利用した方法(例えば、アネキシンV利用)等が知られている。本発明のスクリーニングにおける細胞毒性の判定は、これらいずれの方法を利用して行ってもよい。
【００３７】
実施例において、Post6-Col-4N、Pre6-2N及びTRS#5を第一乃至第三細胞株として使用して本発明の方法に従ってG2/M阻害剤をスクリーニングする方法を例示する（図１参照）。まず、第一ステップでは、不死化B細胞株Posr6-Col-4Nを用いて、10μMの濃度で化合物ライブラリーをスクリーニングする。被験物質として使用した化合物ライブラリー中の化合物の約1〜2％に候補化合物が絞られるよう、より強い活性を示した化合物から順に候補化合物を選択し、次のステップにおける被験化合物とする。第二ステップでは、第一ステップで選択された被験化合物について、不死化前後のB細胞株Pre6-2N及びPost6-Col-4Nに対するIC50を8点の濃度を振って求める。出発化合物の約0.05〜0.1％に候補化合物が絞られるように、次の手順に従って選択する。１）Post6-Col-4Nに対するIC50が低いもの順に配列する。２）この中から、第一細胞株に対するIC50/第二細胞株に対するIC50の値の値が低いもの順に（通常2以下）選択する。次に、第三ステップでは、第二ステップで選択した化合物について、繊維芽細胞株TRS#5に対するIC50を求めるため8点濃度を振って細胞毒性を調べる。毒性の強さにより、出発化合物の約0.01〜0.05％に制癌剤候補となる化合物を絞る。
【００３８】
本発明の制癌剤のスクリーニングは以上の方法により行うことができるが、本方法によりスクリーニングされた化合物の作用をさらに公知の方法により調査してもよい。例えば、実施例において示すように、化合物の細胞周期に対する作用を調べ（細胞周期阻害解析）、実際にG2/M阻害剤であるかどうかを確認することができる。細胞周期に対する作用は、例えば、フローサイトメトリー（FCM）によって行うことができる。FCMでは、例えば、(1)細胞核DNA量の測定、(2)ブロモデオキシウリジン(BrdU)/DNA二重染色による解析、(3)細胞周期関連抗原Ki-67の染色、及び(4)細胞周期に一致して生成/分解されるサイクリン等の測定により細胞周期を解析する方法が知られており、本発明においても利用することができる。DNA量のFCMにおいては、一般的にDNAに結合する蛍光色素(プロピジウムイオダイド(PI)、7-アクチノマイシンD(7AAD)、ヘキスト33342、4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、TO-PRO(登録商標)-3等)が使用される。どのようなDNA結合性色素を使用した場合でも、細胞集団を構成する各細胞の細胞周期を反映した特徴的なパターンが得られるので、どのような蛍光色素を用いてもよい。ヘキスト33342等の生細胞のDNAを染色できる色素以外の色素を使用する場合には、染色前に細胞膜の透化処理を行う。透化処理は、例えば、界面活性剤処理、低張透圧処理、有機溶媒(エタノール等)による固定によって行うことができる。
【００３９】
また、さらに、スクリーニングされた化合物のチューブリンに対する作用を必要に応じ調べることもできる。例えば、スクリーニングされた化合物がチューブリン重合を阻害する活性を有するのか、又は促進する活性を有するのかを調べることができる。それにより、本発明の方法により選択されたG2/M阻害剤化合物を、さらにチューブリン重合阻害剤、チューブリン重合促進剤、及びチューブリン以外を標的とする化合物のグループに分類することができる。チューブリンの重合に関与しないと判定された化合物は、新規なターゲットを持つG2/M阻害剤である可能性が高く特に有用である。チューブリンに対する化合物の作用は公知の方法により行うことができる。例えば、チューブリンの重合度を簡便に測定するためのキットが市販されており、本発明において用いることができる。その他、チューブリン重合阻害の測定系としては、チューブリンにMAP蛋白質を添加し、MAP蛋白質を介した阻害効果を見る系も市販されており使用可能である。
【００４０】
以上説明したように、本発明の方法は、G2/M阻害剤をスクリーニング及び判別することができるが、本方法のスクリーニングシステムの流れ(図1参照)に従って種々の細胞株の組合せを試験することにより、細胞周期阻害剤のスクリーニング及び判別に適した細胞株を選択することもできる。即ち、図１のPost6-Col-4N、Pre6-2N及びTRS#5に代えて、別の適当な細胞株を用いて試験を行い、Post6-Col-4N、Pre6-2N及びTRS#5と同様の結果を与える細胞株を選択することにより、G2/M阻害剤のスクリーニング及び判別に適した細胞株を選択することができる。
【００４１】
さらに、実施例において、Post6-Col-4N及びPre6-2Nの細胞株の組み合わせを使用し、本発明の方法に従ってDNA修飾剤と非DNA修飾剤をスクリーニング及び判別できることが示された。細胞株Post6-Col-4N及びPre6-2Nを用いて、既知の11種類の抗癌剤について試験したところ、DNA修飾剤では全てPost6-Col-4NよりPre-6-2Nにおいて強い細胞傷害性を示したが(即ち、Post6-Col-4NのIC50／Pre6-2NのIC50、1.2以上）、非DNA修飾剤は全てPre-6-2N及びPost6-Col-4Nにおいてほぼ同じ細胞傷害性を示した(即ち、Post6-Col-4NのIC50／Pre6-2NのIC50、約1)。したがって、上記の細胞株を使用して、計算された細胞毒性の比に基づき、被験化合物をDNA修飾剤又は非DNA修飾剤として選択することができる。選択された化合物は、公知の技術を用いてDNA修飾に対する作用を調べることができる。
【００４２】
本発明の方法によりスクリーニングされた化合物は、制癌剤の好適な候補化合物である。必要に応じ慣用の方法により製剤化し、動物試験等により制癌剤としての作用を調べることができる。化合物の製剤化は、スクリーニングされた化合物の特性・構造等を勘案し、適宜決定することができる。スクリーニングされた化合物を元に、さらに類似した化合物のライブラリーを作製し、このライブラリーについて再度本発明のスクリーニングを行い、より望ましい活性を持つ化合物を選択することもできる。また、本発明の方法によりスクリーニングされた化合物を、公知の制癌剤・癌治療法と組合せて使用することもできる。
【００４３】
本発明のスクリーニング及び判別方法には、96-穴のプレートを使用し、自動分注機を用いて細胞及び試薬の分注を行い細胞毒性をアッセイすることで、ハイスループットスクリーニングとすることもできる（非特許文献２参照）。
【００４４】
本発明はさらに、G2/M阻害剤のスクリーニング及び／もしくは判別、ならびにDNA修飾剤及び非DNA修飾剤のスクリーニング及び／もしくは判別に使用することができる細胞株等を含むキットに関する。本発明のG2/M阻害剤をスクリーニングするためのキットは、好ましくは、第一細胞株又は/及び第二細胞株を含むものである。必要に応じ第三の細胞株を含んでもよい。これらの細胞株は、本発明のスクリーニング方法に従って使用した場合に、効率的なG2/M阻害剤の選択、又はDNA修飾剤及び非DNA修飾剤の選択を可能にするものである。本発明のキットは、上記細胞株を適当な密閉容器中に封入した形で含む。密閉容器としては、ガラス製、プラスチック製、樹脂製等のビン、チューブ及びアンプル型の容器が例示されるが、特にこれらに限定されるものでなく、細胞株を安全に保存できればよい。
【００４５】
本発明のキットは、さらに必要に応じ細胞毒性を試験するための試薬、細胞株を培養するための培地／容器、被験化合物を希釈するための緩衝液、対照物質を含んでもよい。その他、本発明のスクリーニング方法に必要とされるあらゆる試薬、容器、装置、器具、機械を組合せて本発明のキットとすることができる。もちろん、ハイスループットスクリーニングに必要とされるマルチウェルプレート等を含んでもよい、本キットに含まれる細胞株、及びこれらの試薬等は、個別の形でキットとしてもよいが、一つのパッケージにまとめた形体を取ることもできる。さらに好ましくは、本発明のキットは、その使用方法を解説した説明書を含むものである。説明書は、本キットのパッケージ上に印刷されていてもよく、また、パンフレットの形でキットに含まれてもよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
【００４７】
材料と方法
（１）細胞株
(1)-1．Pre-6-2N及びPost-6-Col-4Nの作製
EBVで健常人由来の末梢血液細胞をトランスフォームした細胞株Pre-6-2Nを樹立した。この細胞株を700PDL以上の長期にわたり継代培養した結果、不死化した細胞株Post-6-Col-4Nが得られた。
この細胞株Post-6-Col-4Nは、文献記載のN0005株（Tahara, H. et al., Oncogene(1997) 15:1911-20;Okubo, M. et al., Cancer Genet. Cytogenet.(2001)129:30-4;Takahashi, T. et al., DNA Cell Biol.(2003)22:727-35）由来の細胞株である。スクリーニングに使用するために、N0005株を大量培養後に小分け（分注）し、細胞株Post-6-Col-4Nとして改めて命名したものである。同様に、pre-N0005を大量培養し、分注後Pre-6-2Nとして改めて命名した。改めて命名したのは、従来研究用に使用していた細胞株と、スクリーニング用にロット管理をした細胞を区別するためである。
【００４８】
(1)-2．TRS#5の作製
初代培養成人繊維芽細胞由来の細胞を癌化するため、正常繊維芽細胞 TIG-112に癌ウイルスであるSV40のT抗原DNAを導入した。導入した細胞は、G418(500μg/ml)の薬剤で選択してSV40 T 抗原 DNA が導入された細胞のみを選択した。薬剤選択で生き残ってきた細胞は、ヘテロな細胞形態を示すものばかりであった。この細胞集団に、Ha-ras がん遺伝子及びhTERT遺伝子をレトロウイルス法によって導入しピューロマイシンによって選択を行った。薬剤選択後、生き残ったコロニーのうちもり上がっているコロニーのみをクローニングした。これらのクローンを培養を行い、増殖性の良いものを５つTRS #1,TRS #2,TRS #3,TRS #5,TRS #10を選択した。
TRS #1,TRS #2,TRS #3,TRS #5,TRS #10の５つのクローン、T112、TIG-112、大腸ガン細胞株RKOについて、メジュームゲル中での増殖能を調べた。10000個の細胞を2ｍｌのメジュームゲルに混ぜて35mmディシュにまいた。メジュームゲルは室温以上になると硬化して固まる性質を持っておりソフトアガーなどよりも堅い性質を持っている。メジューメゲルと混ぜた細胞を室温で１分程度置いた後、10%牛胎児血清を含んだDMEM培地を２ml重層してCO2インキュベーターにて２週間培養を行った。２週間後のコロニー形成を顕微鏡にて観察したところ、ポジティブコントロールの大腸がん細胞株RKOでは、きれいな球形のコロニーが多数形成されていたが、正常繊維芽細胞TIG-112及びhTERTのみを導入したT112細胞では全くコロニーの形成は見られなかった。一方、TRS #1,TRS #2,TRS #3,TRS #5,TRS #10のうち、TRS #5は、RKOと同等あるいはそれ以上のコロニー形成が見られた。TRS #2及びTRS #10も小さくごくわずかなコロニーが見られたが、コロニー形成はほとんどしていないものと判断した。TRS #1及びTRS #3は、全くコロニー形成は見られなかった。以上の結果から、ガン細胞としての表現形の一つである足場非依存性増殖を起こせる細胞は、TRS #5 のみであることが明らかになった。
TRS #1,TRS #2,TRS #3,TRS #5,TRS #10について、RT-PCR法によって導入した遺伝子SV40 T 抗原 の産物であるSV40 large T 抗原、small T 抗原の発現を調べた。いずれのクローンにおいても強い発現が見られた。Ha-rasの発現についても同様にRT-PCR法によって確認したが、正常細胞のTIG-112に比べてすべてのクローンで高かった。また、hTERT遺伝子も、すべてのクローンで強い発現が見られた。TIG-112細胞では、全く発現が見られなかった。以上の手法は、基本的にはHahn, W.C. et al.,Nature(1999)400: 464-8によった。
【００４９】
(1)-3．その他の細胞株
上記細胞株の他に、T細胞白血病細胞株Molt-4、ヒト胎児肺に由来する線維芽細胞TIG-3、及びHeLa細胞を参照として使用した。
【００５０】
（２）細胞毒性試験
細胞毒性試験には以下の材料を用いた。
培地：<血球系>                  ・RPMI-1640（SIGMA）＋10％非働化FBS
<繊維芽細胞、接着系癌細胞>・DMEM（SIGMA）＋10％非働化FBS
マイクロプレート：96ウェル平底プレート(FALCON)
WST-8アッセイ：生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク株式会社）
吸光度測定機器：Wallac1420 ARVO MXマルチラベルカウンタ(パーキンエルマ−ライフ  サイエンス  ジャパン株式会社)
【００５１】
細胞毒性試験においては、細胞は、播種する日の3日前に培地交換を行っておき、細胞の播種濃度は、あらかじめ細胞の成長曲線を作成し、それをもとに設定した。播種濃度は、Pre6-2N及びPost-Col4Nで、それぞれ5.0 X 105細胞／ml及び2.5 x 105細胞／mlであった。設定した濃度になるよう各細胞溶液を調製し、96ウェルのマイクロプレートに100μl/ウェル分注した。マイクロプレートを37℃、5.0％(B細胞以外)又は7.5%(B細胞)CO2下でインキュベートした。翌日、各化合物溶液(ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解)を培地で段階希釈し、8点の濃度の希釈溶液を作り、各10μl/ウェルずつマイクロプレートに加えた。通常の８点の希釈濃度は、０μMと40μMの間に設定し、不具合が生じたときには、設定しなおして測定した。37℃、5.0％又は7.5%CO2下で48時間インキュベートした後、WST-8アッセイ試薬を添加し、3〜4時間後に450nmの波長で吸光度を測定した。
【００５２】
（３）フローサイトメトリー(FCM)
FCMには、以下の材料を使用した。
試薬：PI（ヨウ化プロピジウム）（SIGMA）
PI溶液（PI 500μg/mlをPBSに溶解）
RNase（SIGMA）
RNase溶液（RNase 10mg/mlをPBSに溶解）
フローサイトメーター：EPICS XL(ベックマンコールター株式会社)
【００５３】
細胞を被験化合物4μMで12時間処理した。次に、細胞をPBSで2回洗浄後、70％エタノールで4℃、1時間固定した。さらに、PBSで洗浄した後、2×106細胞浮遊液1mlに対してRNase溶液を25μl加え、37℃で30分インキュベーションした。PI溶液を最終濃度50μg/mlになるよう加え、4℃で30分以上暗所に放置後、フローサイトメーターにて細胞周期の分布を測定した。
【００５４】
（５）統計解析
2つの異なる群(Pre6-2N及びPost6-Col-4N、Pre6-2N及びMolt-4、ならびにTIG-3及びHeLa)のIC50値に対して、スチューデントt検定を行った。
【００５５】
（６）チューブリンの重合阻害
チューブリンの重合阻害は、チューブリン重合アッセイキット（CytoDTNAMIX Screen 03,Cytoskelton Inc.,Denver）を用いて行った。まず、チューブリン重合用緩衝液（tublin polymerization buffer;TPB）を調製した。TPBの組成は以下の通りである：
80ｍM PIPES buffer
2.0mM MgCl2
0.5mM EGTA
1.0mM GTP
5%(v/v) グリセロール
調製したTPBを氷で冷やし、各被験化合物をTPBにより10倍に希釈し、氷で冷やした。次に、Half area 96-well plateのウェルに希釈した化合物を5μlずつ入れ、37℃で10分間インキュベートした。1mgチューブリンを310μl TPBに溶解し、氷で冷やし、チューブリン溶液を調製した。50μlチューブリン溶液を、化合物の入った各ウェルに添加し、340nmにおける吸光度を経時的に測定した。化合物無添加のウェルを対照として用いた。
【００５６】
実施例１．既存の制癌剤の細胞毒性試験
細胞株Pre-6-2N及びPost6-Col-4Nを、既存の抗癌剤として以下の15種類の化合物、メルファラン、セムスチン、チオグアニン、フルオロウラシル、シタラビン、メトトレキセート、イダルビシン、アクチノマイシンD、ブレオマイシン、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、カンプトテシン、及びシスプラチン（Sigma Chemical Co.,Ltd, St.Louis, Missouri)それぞれで処理した。各種細胞株に対する既存の制癌剤の細胞毒性試験の結果を表２に示す。
【表２】
2005312437.tif 000003
＊ＩＣ50を示す。単位、μＭ
＊＊post/preの値が2以下で、TRS＃5でのIC50が500nM以下のものを○と判定した。この条件に当てはまらないものは×。
＊＊＊文献及び実測に基づく細胞周期に対する作用。G1/S、G2/Mはそれぞれセルソーターで判定する細胞周期を示す。
"−"は実測不能又は判定不能を示す。
【００５７】
表２は、既存制癌剤15種類の不死化前後のB細胞株(Pre6-2N及びPost-Col-4N)、並びに不死化繊維芽細胞株(TRS#5)に対する細胞毒性を、IC50(単位:μM)で表示したものである。この中で、セムスチン及びシスプラチンはいずれの細胞株に対しても、IC50が35μM以上と、強い毒性を示さなかったので、以後の解析から除外した。B細胞株のIC50の比post/preの値を見ると、シタラビン、コルヒチン、ピンクリスチン、ピンデシンの4種が、2以下であり、それ以外の制癌剤では2.8〜>36(平均>10.7)であった。post/pre値が2以下の4種のうちシタラビンを除く3種はチューブリン重合阻害剤であり、セルソーターを用いた解析ではG2/M阻害を示すものである。また、TRS#5に対する毒性に着目すると、これら3種のチューブリン重合阻害剤はいずれもIC50が0.1μMを遥かに下回る強い毒性を示すが、シタラビンのIC50は8.4μMと毒性が弱かった。B細胞株におけるpost/pre値が2以下で、TRS＃5に対するIC50が0.2μM以下の化合物は全てG2/M阻害を示す化合物であった。
【００５８】
実施例２．抗癌剤の細胞周期阻害効果
Post6-Col-4Nに、被験化合物としてS期阻害剤カンプトテシン、G1期阻害剤アクチノマイシンD、M期阻害剤のコルヒチン及びパクリタキセル、及び図１のフローチャートによるスクリーニングから得られたヒット化合物IMA8885をそれぞれ処理した。フローサイトメトリーにて細胞周期の分布を測定した（図２）。
ヒット化合物IMA8885のスクリーニングに関しては、下記の実施例５に詳細に記載する。IMA8885は、コルヒチン及びパクリタキセルと同様のG2/M阻害のパターンを示した。
【００５９】
実施例３．Post6-Col-4N細胞又はPre-6-2N細胞に対する抗癌剤の細胞傷害効果
細胞株Post6-Col-4N又はPre-6-2Nに、被験化合物としてメルファラン、チオグアニン、フルオロウラシル、メトトレキセート、アクチノマイシンD、ブレオマイシン、コルヒチン、ビンクリスチン、エトポシド、カンプトテシン、パクリタキセル(Sigma Chemical Co.,Ltd, St.Louis, Missouri)をそれぞれ処理した。これらの11種類の被験化合物のうち、3種類（コルヒチン、ビンクリスチン及びパクリタキセル）は、G2/M阻害剤かつ非DNA修飾剤であり；7種類（フルオロウラシル、チオグアニン、メルファラン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD、カンプトテシン及びエトポシド）は、G1/S阻害剤かつDNA修飾剤であり；1種類（メトトレキセート）のみがG1/S阻害剤でありながら、非DNA修飾剤であった。
表３は図３の値をまとめたものであり、IC50比(post-[細胞株]／pre-[細胞株])を示す。1を超えるIC50比は、化合物のPre-6-2Nにおける細胞傷害性がPost6-Col-4Nにおける細胞傷害性より強いことを意味し、約1のIC50比は、Pre-6-2N及びPost6-Col-4Nにおける化合物の毒性がほぼ同じであることを意味する。
【００６０】
【表３】
2005312437.tif 000004
a）μM
b）標準偏差
c）Post6-Col-4NのIC50／Pre-6-2NのIC50
d）Molt4のIC50／Pre-6-2NのIC50
"−"は実測不能又は判定不能を示す。
＊統計学的に有意ではない。
＊＊Pre-6-2N及びPost6-Col-4N、又はPre-6-2N及びMolt-4の間で、統計学的に有意である（p<0.001）。
【００６１】
3種類のG2/M阻害剤(コルヒチン、ビンクリスチン、及びパクリタキセル)及び1種類のG1/S阻害剤(メトトレキセート)がPre-6-2N及びPost6-Col-4Nにおいてほぼ同じレベルの細胞傷害性が示された(図３Ａ〜Ｄ)。しかし、7種類のG1/S阻害剤(フルオロウラシル、チオグアニン、メルファラン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD、カンプトテシン、及びエトポシド)のPre-6-2Nにおける細胞傷害性は、Post6-Col-4Nにおける細胞傷害性より著しく強かった(図３Ｅ〜Ｋ)。Pre-6-2NとPost6-Col-4Nの違いは統計的に有意であった(p<0.001)(表３)。特に著しいものは、ブレオマイシンのPre-6-2Nにおける効果とPost6-Col-4N細胞における効果の違いであった。メトトレキセート及び3種類のG2/M阻害剤はDNA鎖を直接修飾しないが、残りの7種類のG1/S阻害剤はDNA鎖を直接修飾する。従って、これらの11種類の抗癌剤について、DNA修飾剤は全てPost6-Col-4NよりPre-6-2Nにおいて強い細胞傷害性を示したが(1.2以上のIC50比）、非DNA修飾剤は全てPre-6-2N及びPost6-Col-4Nにおいてほぼ同じ細胞傷害性を示した(約1のIC50比)。
【００６２】
表３に参照として、不死化後T細胞白血病株であるMolt-4における各薬剤のIC50も示す。Pre6-2N及びPost-6-Col-4Nで得られた結果は、Pre6-2N及びMolt-4では得られなかった。例えば、Post-6-Col-4Nでは細胞傷害性がほとんど無かったブレオマイシンは、Pre6-2N及びMolt-4においてほぼ同じレベルの細胞傷害性を示した。
【００６３】
実施例４．TIG-3細胞及びHeLa細胞における抗癌剤の細胞傷害効果
表４は、TIG-3細胞及びHeLa細胞における11種類の抗癌剤の細胞傷害効果をまとめたものである。これらの細胞株における抗癌剤の作用機序は、Pre6-2N細胞及びPost-6-Col-4N細胞において見られたものと異なる。TIG-3細胞及びHeLa細胞におけるメトトレキセート及びフルオロウラシルの効果は弱かった。TIG-3細胞及びHeLa細胞におけるDNA修飾剤及び非DNA修飾剤の効果は明らかな一定の違いを示さなかった。
【００６４】
【表４】
2005312437.tif 000005
a）μM
b）標準偏差
c）HeLaのIC50／TG-3のIC50
"−"は実測不能又は判定不能を示す。
＊統計学的に有意ではない。
＊＊TG-3細胞及びHeLa細胞の間で、統計学的に有意である（p<0.001）。
【００６５】
実施例５．化合物ライブラリーの抗癌剤のスクリーニング
図１に示したフローチャートに従って、9000化合物からなるライブラリーをスクリーニングした。まず、B細胞Post6-Col-4Nに対して10μMの化合物を添加し、細胞毒性の強い化合物から上位80種の化合物を選んだ(第一ステップ)。これら80種の化合物について、不死化前後のPre6-2N及びPost6-Col-4Nを用い、8点の濃度でIC50を決め、Pre6-2Nに対するIC50とPost6-Col-4Nに対するIC50の比をpost/pre値として求めた（第二ステップ）。偶然にも上位10種の化合物では、post/pre値はいずれも1以下であった（表５）。続いて、繊維芽細胞株TRS#5でのIC50を調べたところ、上位5種の化合物ではその値は0.2μM以下であった。さらにセルソーターによる解析の結果、post/preが1以下の上位15種の化合物は、コルヒチン及びパクリタキセルと同様にG2/M阻害剤であることが裏付けられた(図２にヒット化合物の一つIMA8885についての解析の結果を示す)。また、post/pre値が2.7〜4.4と高かったヒット化合物IMA5728及びIMA3831について解析したところ、これら化合物は、カンプトテシン又はアクチノマイシンDに見られるようなG1/S阻害パターンを示した。また、post/preの値が1.3のIMA4841は、WST-8アッセイで、細胞毒性を示さずにOD値を示す特殊な細胞株であり、検討対象から除外すべきと思われる。また、post/preの値が1.53を示すIMA1107は、細胞周期のどこを阻害しているか判定不能であった。総合すると、このシリーズのアッセイに関する限り、post/preが1以下の化合物は例外なくG2/M阻害剤であり、１以上の化合物はG1/S阻害剤かそれ以外に分類され、少なくともG2/M阻害剤ではなかった。さらに、G2/M阻害活性を示す上位15種の化合物について、チューブリン重合阻害活性をキットにより解析した（表５）。その結果、これらの化合物の中8化合物が明瞭なチューブリン重合阻害活性、すなわち、対照の重合速度を１として、0.6以下の活性、を示した。強い細胞毒性とG2/M阻害活性を示したが、0.8〜0.9のチューブリン重合速度を示したIMA8885やIMA8331のような化合物は、直接的なチューブリン重合阻害活性を解さずに細胞毒性、G2/M阻害活性をもたらしている可能性がある。
【００６６】
既存の制癌剤以外の化合物を用いた細胞毒性試験、FCM、及びチューブリン重合阻害試験の結果を表５にまとめる。
【００６７】
【表５】
2005312437.tif 000006
【００６８】
IMA4453は細胞毒性、又はチューブリンの重合阻害による判定でも、極めて明瞭なG2/M阻害剤であった。そこで、IMA4453のチューブリン重合速度への影響をさらに調べた。比較のため、重合促進剤としてパクリタキセルを、重合抑制剤としてコルヒチンを用いた。結果を表６に示す。
【表６】
2005312437.tif 000007
＊対照を1とする。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明により、多数の試料から抗癌剤を効率的にスクリーニングする方法、及び該方法の実施に有用なキットが提供された。具体的には、本発明により、G2/M阻害活性を示す化合物をスクリーニングすることができる。本方法により、又は本キットを用いて選択される化合物は、チューブリン又はその他の分子を標的としたG2/M阻害剤であり、有望な制癌剤候補となり得る。さらに、本発明により、DNA修飾剤及び非DNA修飾剤をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】Post6-Col-４N、Pre6-2N及びTRS#5を細胞株として利用したG2/M阻害剤のスクリーニング方法をフローチャートにより示す。
【図２】セルソーターにより各化合物が阻害する細胞周期を解析した結果を示す。カンプトテシンはS期阻害剤、アクチノマイシンDはG1期阻害剤、コルヒチン及びパクリタキセツはM期阻害剤である。縦軸は細胞数、横軸は相対的なDNA量を示す。
【図３Ａ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するコルヒチンの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｂ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するビンクリスチンの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｃ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するパクリタキセルの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｄ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するメトトレキセートの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｅ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するフルオロウラシルの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｆ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するチオグアニンの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｇ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するメルファランの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｈ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するブレオマイシンの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｉ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するアクチノマイシンDの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｊ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するカンプトテシンの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図３Ｋ】Pre-6-2N細胞とPost6-Col-4N細胞に対するエトポシドの効果を示すグラフである。黒菱形はPre-6-2N細胞の結果を示し、黒四角はPost6-Col-4N細胞の結果を示す。
【図１】
2005312437.tif 000008
【図２】
2005312437.tif 000009
【図３Ａ】
2005312437.tif 000010
【図３Ｂ】
2005312437.tif 000011
【図３Ｃ】
2005312437.tif 000012
【図３Ｄ】
2005312437.tif 000013
【図３Ｅ】
2005312437.tif 000014
【図３Ｆ】
2005312437.tif 000015
【図３Ｇ】
2005312437.tif 000016
【図３Ｈ】
2005312437.tif 000017
【図３Ｉ】
2005312437.tif 000018
【図３Ｊ】
2005312437.tif 000019
【図３Ｋ】
2005312437.tif 000020