(57)【要約】【課題】  酵素耐性を高め、細胞中において酵素により分解されず、また細胞質内に局在化して高い活性を示し、遺伝子医薬として好適に利用し得る新規なｓｉＲＮＡを提供する。【解決手段】  ２本鎖を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に化学修飾塩基が導入されているか、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方が、非末端位置において化学修飾塩基を含むか、２本鎖を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に、二官能性リンカーを介して、核外移行シグナルペプチド又は膜融合ペプチドを導入したものであるか、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方が、非末端位置において、二官能性リンカーを介して、核外移行シグナルペプチド又は膜融合ペプチドを導入したものとする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に化学修飾塩基が導入されていることを特徴とするコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方が、非末端位置において化学修飾塩基を含むことを特徴とするコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
化学修飾塩基がポリアミン分子を結合したものである請求項１又は２記載のコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
２本鎖を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に、二官能性リンカーを介して、核外移行シグナルペプチド又は膜融合ペプチドを導入したものであることを特徴とするコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方が、非末端位置において、二官能性リンカーを介して、核外移行シグナルペプチド又は膜融合ペプチドを導入したものであることを特徴とするコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
二官能性リンカーが、二価の化学修飾塩基残基である請求項４又は５記載のコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素耐性が強化され、細胞中で酵素により分解されにくい新規ｓｉＲＮＡ及び細胞への導入が可能で細胞質に局在化し得る高活性の新規ｓｉＲＮＡに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉はアンチセンスＲＮＡやリボザイムに比べて遥かに強い遺伝子発現制御力を示すことから、遺伝子医薬や遺伝子機能解明のツールとしての期待が高まっている。
しかしながら、ｓｉＲＮＡは細胞への導入が困難な上に、細胞中での分解酵素耐性が低く安定した効果が得られないため、実用化することができない。
【０００３】
一方、遺伝子医薬については、細胞内の細胞核よりも細胞質において、より高い効力を発揮することが知られているので、その細胞質における遺伝子医薬の局在化を実現することが可能であれば、優れた遺伝子医薬が得られることになるが、これまでこのような遺伝子医薬は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような事情のもとで、酵素耐性を高め、細胞中において酵素により分解されず、また細胞質内に局在化して高い活性を示し、遺伝子医薬として好適に利用し得る新規なｓｉＲＮＡを提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはｓｉＲＮＡについて、その細胞中への導入を可能にし、かつ細胞中での酵素耐性を高め、あるいは細胞質への局在化を可能にするために種々研究を重ねた結果、ｓｉＲＮＡに陽イオン性又は脂溶性を付与しうる化学修飾塩基を導入することにより、細胞中への導入を可能にし、かつ細胞中での酵素耐性を高め得ること、及びこの化学修飾塩基を介して核外移行シグナルペプチド（以下ＮＥＳペプチドと略記する）を結合すれば、細胞質に局在化させうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、２本鎖を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に化学修飾塩基が導入されていることを特徴とするコンジュゲート型ｓｉＲＮＡ、及び２本鎖を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に、二官能性リンカーを介して、核外移行シグナルペプチド又は膜融合ペプチドを導入したものであることを特徴とするコンジュゲート型ｓｉＲＮＡを提供するものである。
ここで、ダングリングエンドとは、２本鎖を構成するアンチセンス鎖のアンチ鎖と非相補的部分、すなわち１本鎖部分を意味する。
【０００７】
本発明のコンジュゲート型ｓｉＲＮＡは、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方における５´末端又はアンチセンス鎖のダングリングエンド或はその両方に化学修飾塩基が導入されている。
【０００８】
このようなものとしては、例えば、式
５´‐配列表配列番号１‐３´
で表わされるセンス鎖と、式
５´‐配列表配列番号２‐３´
で表わされるアンチセンス鎖とから構成されるコンジュゲート型ｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の５´末端のみに化学修飾塩基が導入されたもの、アンチセンス鎖の５´末端のみに化学修飾塩基が導入されたもの、センス鎖の５´末端とアンチセンス鎖の５´末端の両方に化学修飾塩基が導入されたもの、式
５´‐配列表配列番号１‐３´
で表わされるセンス鎖と、式
５´‐配列表配列番号２‐３´
で表わされるアンチセンス鎖とから構成されるコンジュゲート型ｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の５´末端とアンチセンス鎖のダングリングエンドの両方に化学修飾塩基が導入されたもの、及びアンチセンス鎖のダングリングエンドのみに化学修飾塩基が導入されたものを挙げることができる。
【０００９】
この際に導入される化学修飾塩基としては、例えば一般式
−（Ｏ−Ａ）n−ＮＨ2  （Ｉ）
（式中のＡはアルキレン基、ｎは１以上の整数である）
で表わされるアルキレングリコール又はポリアルキレングリコールとヒドロキシアルキルアミンとのエーテル残基や、一般式
【化１】
2005312397.tif 000002
（式中のＡ及びｎは前記と同じ）
で表わされる環状有機塩基をもつカルボン酸アミドのアルキレンジアミン付加物残基などの水溶性を付加し得る基を挙げることができる。
これらの中で特に好ましいのは、Ａがエチレン基でｎが１又は２の化合物である。
【００１０】
次に、センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方が非末端位置において化学修飾塩基を含むコンジュゲート型ｓｉＲＮＡとしては、例えば式
５´‐配列表配列番号１‐３´
で表わされるセンス鎖と、式
５´‐配列表配列番号２‐３´
で表わされるアンチセンス鎖とから構成されるコンジュゲート型ｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の３´末端から２番目のｔのみが化学修飾塩基に置き換ったもの、アンチセンス鎖のダングリングエンドすなわち３´末端から２番目のｔのみが化学修飾塩基に置き換ったもの、センス鎖の３´末端から２番目のｔとアンチセンス鎖のダングリングエンドすなわち３´末端から２番目のｔがそれぞれ化学修飾塩基に置き換ったもの、センス鎖の５´末端から６番目と１５番目のｕとが化学修飾塩基に置き換ったもの、アンチセンス鎖の３´末端から５番目、７番目、１０番目及び１５番目のｕが化学修飾塩基に置き換ったもの、センス鎖の５´末端から６番目と１５番目のｕとアンチセンス鎖の３´末端から５番目、７番目、１０番目及び１５番目のｕが化学修飾塩基に置き換ったものなどが挙げられる。
【００１１】
これらのセンス鎖やアンチセンス鎖の塩基数やその結合順序には特に制限はなく、これまで知られているｓｉＲＮＡ構造の中から任意に選ぶことができる。また、化学修飾塩基の構造についても特に制限はなく、その大きさ、官能基の種類など任意に選ぶことができる。
【００１２】
このようにして、化学修飾塩基が導入されたｓｉＲＮＡは、細胞中での酵素耐性が強化され、しかも細胞毒性は認められない。
【００１３】
一方、本発明においては、オリゴヌクレオチドにＮＥＳペプチドや膜融合ペプチドをコンジュゲートさせることにより、細胞への導入が可能で、細胞中で酵素に分解されず、かつ細胞質に局在化させることができる高活性ｓｉＲＮＡを得ることができる。
このＮＥＳペプチドや膜融合ペプチドの導入は、二官能性リンカーを介して行われるが、この二官能性リンカーとしては、活性水素含有基と反応して安定な結合を形成し得る官能基２個を有する化合物が用いられる。
【００１４】
このような化合物としては、例えば以下の（イ）ないし（チ）に示す化合物が挙げられる。
（イ）Ｓ‐（２‐ピリジルジチオ）システアミン
【化２】
2005312397.tif 000003
（ロ）Ｎ‐スクシンイミジル＝３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピナート
【化３】
2005312397.tif 000004
（ハ）ヨードアセトキシスクシンイミド
【化４】
2005312397.tif 000005
（ニ）ジチオイソシアナトアルカン
ＳＮＣ−（ＣＨ2）n−ＮＣＳ
（ホ）ジイソシアナトアルカン
ＯＮＣ−（ＣＨ2）n−ＮＣＯ
（ただしｎは１〜１０の整数）
（ヘ）２‐（２‐ピリジルジチオ）エチルイソシアネート
【化５】
2005312397.tif 000006
（ト）Ｎ‐（４‐マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
【化６】
2005312397.tif 000007
（チ）Ｎ‐４‐マレイミド酪酸
【化７】
2005312397.tif 000008
【００１５】
この二官能性リンカーを介してｓｉＲＮＡに導入されるＮＥＳペプチドとしては、例えばＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（配列表配列番号３）、ＰＫＩα（配列表配列番号４）、ＭＡＰＫＫ（配列表配列番号５）、Ｄｓｋ−１（配列表配列番号６）、ＴＦＩＩＩＡ（配列表配列番号７）などが挙げられるが、それ以外のＮＥＳペプチドも用いることができる。
【００１６】
また、ＮＥＳペプチド以外のペプチドとしては、ＨＩＶ−１  ｔａｔ  Ｃ−テルミナス（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）膜融合ペプチド（配列表配列番号８）、ｇｐ−４１膜融合ペプチド（配列表配列番号９）、ＳＶ４０  Ｔ  アンティゲン（ａｎｔｉｇｅｎ）核局在化シグナル（配列表配列番号１０）、ＨＩＶ−１  タート（ｔａｔ）核局在化シグナル（配列表配列番号１１）、両親媒性人工デザインペプチドα‐ヘリックス（配列表配列番号１２）、両親媒性人工デザインペプチドβ‐シート（配列表配列番号１３）、両親媒性人工デザインペプチドβ‐シート（配列表配列番号１４）、両親媒性人工デザインペプチドβ‐シート（配列表配列番号１５）などがある。
【００１７】
さらに、スペルミン、スペルミジン、グルコサミン、ガラクトサミンのようなポリアミンを導入することもできる。このようなポリアミンを導入すると、細胞中における酵素耐性が向上する。
【００１８】
二官能性リンカーを介してｓｉＲＮＡに上記のペプチド又はポリアミンを導入するには、先ずｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖に二官能性リンカーを反応させる。これは、固相フラグメント縮合法に従い、先ず多孔性ガラス、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、ポリエチレングリコール／ポリスチレンのような固相担体上にセンス鎖又はアンチセンス鎖を縮合し、その活性水素含有基、例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基と二官能性リンカーとを反応させる。
【００１９】
この際の溶媒としては、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシドのような極性溶媒が好ましい。この際の反応温度は１０〜４０℃、反応時間は反応させる二官能性リンカーの種類、ペプチド又はポリアミンの種類、反応温度などにより変わるが、だいたい２〜１０時間である。また、溶媒中の二官能性リンカーの濃度としては、０．１〜１モル／リットルが適当である。反応終了後、同じ溶媒でよく洗浄し、不純物を除去する。
【００２０】
次に、このようにして得たｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖と二官能性リンカーとの縮合生成物を固相担体上に担持したまま、これにペプチド又はポリアミンを有機溶剤、例えばアセトニトリルやジメチルホルムアミドなどに溶解して加え、１０〜４０℃において２〜１０時間かきまぜることによって反応させる。反応終了後、同じ溶剤で洗浄し、不純物を除くと固相担体に結合したｓｉＲＮＡが得られる。
次いで、アルカリで処理し固相担体から脱離させ、クロマトグラフなどにより精製すれば、所望のコンジュゲート型ｓｉＲＮＡが２〜５０％の収率で得られる。
この際用いるアルカリとしては、濃アンモニア水又は０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００２１】
また、二官能性リンカーとしては、特に前記した一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表わされる化学修飾塩基を導入し得る化合物を用いるのが好ましい。このような化合物としては、例えば式
ＨＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2
で表わされるアミン及び
【化８】
2005312397.tif 000009
で表わされるアミンがある。
【００２２】
このような二官能性リンカーをセンス鎖又はアンチセンス鎖と反応させたのち、各種ペプチド、ポリアミンと反応させると、一般式
【化９】
2005312397.tif 000010
（ただし、Ｒ1はＮＥＳペプチド、膜融合ペプチド、核局在化シグナルペプチドなどのペプチド又はスペルミン、スペルミジン、グルコサミン、ガラクトサミン、トリス（２‐アミノエチル）アミン、トリエチレンテトラミンなどのポリアミンである）
又は一般式
【化１０】
2005312397.tif 000011
（ただし、Ｒ2はスペルミン、スペルミジン、グルコサミン、ガラクトサミンなどのポリアミンである）
で表わされる化学修飾塩基が導入される。
【００２３】
本発明のコンジュゲート型ｓｉＲＮＡは、以上のようにして製造した化学修飾塩基が導入されたセンス鎖又はアンチセンス鎖あるいはその両方を用いて、常法に従って２本鎖を形成させることによって得ることができる。
【００２４】
この２本鎖の形成は、未修飾のセンス鎖と化学修飾塩基が導入されたアンチセンス鎖、化学修飾塩基が導入されたアンチセンス鎖と未修飾のアンチセンス鎖、あるいは化学修飾塩基が導入されたセンス鎖と化学修飾塩基が導入されたアンチセンス鎖とを、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシドなどの極性有機溶媒中に溶解し、１〜１０時間かきまぜることによって行うことができる。この際、所望ならば反応を促進するために高めた温度、例えば３０〜６０℃に加熱することもできる。
このようにして得られるコンジュゲート型ｓｉＲＮＡは、常法に従い、逆相高速液体クロマトグラフィーなどを用いて精製する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によると、容易に細胞導入することができ、細胞中で酵素により分解されることがなく、また細胞質に局在化する新規な高活性ｓｉＲＮＡが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２７】
製造例１
ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（クルアケム社製、製品名「ＰＳ２５０」）を用い、制御多孔性ガラス（以下ＣＰＧという）上で、常法に従って固相法により、ＲＮＡのセンス鎖（５´‐配列表配列番号１‐３´）（以下ＲＮＡ1という）又はアンチセンス鎖（５´‐配列表配列番号２‐３´）（以下ＲＮＡ2という）の５´末端をアミノ化試薬（グレン・リサーチ社製、製品名「５´‐アミノモディファイア５」）で化学修飾した。
【００２８】
次いで、得られた反応生成物に２８％濃度のアンモニア水を加え、５０℃において６時間かきまぜることにより、固相担体からの化学修飾物の切り出しと同時に、保護基の脱離を行ったのち、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。得られた化学修飾ＲＮＡは質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ）により同定した。このようにして、次に示す末端が化学修飾されたＲＮＡ２種を製造した。
ＲＮＡ3  ５´‐配列表配列番号１６‐３´（センス）
ＲＮＡ4  ５´‐配列表配列番号１７‐３´（アンチセンス）
ただし、塩基配列中のｎ＝−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2
このようにして得たＲＮＡのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを表５に示す。
【００２９】
製造例２
中間位置置換用のアミノ試薬（グレン・リサーチ社製、製品名「アミノモディファイアＣ2ｄＴ」）を用い、製造例１と同様にして塩基配列中の非末端位置にあるｔ又はｕをＸに置換した次に示すＲＮＡ４種を製造した。
ＲＮＡ5  ５´‐配列表配列番号１８‐３´（センス）
ＲＮＡ6  ５´‐配列表配列番号１９‐３´（アンチセンス）
ＲＮＡ7  ５´‐配列表配列番号２０‐３´（センス）
ＲＮＡ8  ５´‐配列表配列番号２１‐３´（アンチセンス）
ただし、Ｘ＝
【化１１】
2005312397.tif 000012
このようにして得たＲＮＡのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを表５に示す。
【００３０】
製造例３
ＲＮＡ1の５´末端を製造例１と同様にして化学修飾したのち、末端アミノ基の保護基であるモノメトキシトリチル基（ＭＭＴ）を３％濃度のトリクロロ酢酸アセトニトリル溶液で１分間処理することにより脱離させた。
次いで、ヘキサメトキシジイソシアネートをアセトニトリルに溶かして調製した０．５モル濃度溶液を加え、２０℃で５時間反応させたのち、生成物を分離し、これにジメチルホルムアミド中で各種ポリアミン、糖類又は各種ペプチドのフリーのアミノ基をもつものを連続的に反応させた。
【００３１】
次に、反応生成物を常法に従って、濃アンモニア水中、５０℃で６時間処理することにより、固相担体からの切り出しと保護基の除去を行ったのち、得られた５´末端コンジュゲートＲＮＡを逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳにより同定した。
このようにして、表１に示す５´‐末端にポリアミン、糖類又はペプチドが導入されたＲＮＡが得られた。
このようにして得たＲＮＡのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを表５に示す。
センス鎖  ５´‐配列表配列番号２２‐３´
ただし、塩基配列中のｎ＝−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ1
【００３２】
【表１】
2005312397.tif 000013
【００３３】
製造例４
製造例２と同様にして、非末端位置に化学修飾塩基Ｘを含むセンス鎖を製造し、アミノ化試薬の保護基であるトリフルオロアセチル基をエチレングリコールの２０％濃度アセトニトリル溶液で１分間処理することによって脱離させた。次いで、製造例３と同様にして、先ずヘキサメチレンジイソシアネートをアセトニトリル溶液として反応させ、さらに各種ポリアミンをジメチルホルムアミド溶液として反応させたのち、製造例３と同様に処理することによって、表２に示されるような非末端位置に化学修飾塩基ＹをもつＲＮＡを得た。
このようにして得たＲＮＡのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを表５に示す。
センス鎖＝５´‐配列表配列番号２３‐３´
Ｙ＝
【化１２】
2005312397.tif 000014
【００３４】
【表２】
2005312397.tif 000015
【００３５】
これらのセンス鎖と製造例３で得た非末端位置に化学修飾塩基Ｙをもつアンチセンス鎖とを用いて、コンジュゲートｓｉＲＮＡを製造した。このようにして得られたコンジュゲートｓｉＲＮＡはＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳによって同定された。
【００３６】
製造例５
製造例３及び製造例４とを組み合わせることによりＲＮＡ1の５´末端をｎで化学修飾し、かつ塩基配列の非末端位置にあるｔをＸによって置換することにより、表３に示すＲＮＡを製造した。このようにして得たコンジュゲートＲＮＡのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを表５に示す。
センス鎖＝５´‐配列表配列番号２４‐３´
ただし、塩基配列中のｎ＝−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ1
Ｘ＝
【化１３】
2005312397.tif 000016
【００３７】
【表３】
2005312397.tif 000017
【００３８】
製造例６
製造例５と同様にしてＲＮＡ1の５´‐末端をｎで化学修飾し、かつ塩基配列の非末端位置にある複数のｕ又はｔをＸによって置換することにより、表４に示すＲＮＡを製造した。このようにして得たコンジュゲートＲＮＡのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを表５に示す。
【００３９】
【表４】
2005312397.tif 000018
【００４０】
【表５】
2005312397.tif 000019
【００４１】
実施例１〜１４
センス鎖として、ＲＮＡ9、ＲＮＡ15〜ＲＮＡ27を、アンチセンス鎖としてＲＮＡ2を用いてコンジュゲート型ｓｉＲＮＡを形成させた。
このようにして得たコンジュゲート型ｓｉＲＮＡの１μＭを、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０質量％含むＲＰＭＩ培地中に添加し、３７℃においてインキュベートしたのち、２時間、４時間、６時間、１２時間及び２４時間経過後のコンジュゲートｓｉＲＮＡの分解率を測定した。この測定は、２０質量％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりｓｉＲＮＡを分離し、銀染色法を用いて検出することにより行った。この結果を表６に示す。
なお、対照として化学修飾塩基を導入しないセンス鎖ＲＮＡ1及び化学修飾塩基を導入しないアンチセンス鎖ＲＮＡ2を用いて形成させたｓｉＲＮＡについての分解率も併記した。
【００４２】
【表６】
2005312397.tif 000020
【００４３】
この表から分るように、５´末端に化学修飾塩基を導入したセンス鎖と、また５´末端に化学修飾塩基を導入したアンチセンス鎖を用いたｓｉＲＮＡについては、スペルミンコンジュゲート（ＲＮＡ9）のセンス鎖を用いた場合は、酵素に対する耐性が低いが、それ以外の場合は、明らかにかなりの耐性の向上を示した。特に７個のＬｅｕＡｒｇ又はＬｅｕＬｙｓをコンジュゲートしたセンス鎖を用いたもの（ＲＮＡ26又はＲＮＡ27）は、高い耐性を示した。
【００４４】
実施例１５〜１９
実施例１〜１４と同様にして、非末端に化学修飾塩基を有するセンス鎖と化学修飾塩基を有しないアンチセンス鎖からｓｉＲＮＡを形成させ、その酵素による分解率を測定した。その結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
2005312397.tif 000021
【００４６】
非末端に化学修飾塩基を有するセンス鎖と化学修飾塩基を有しないアンチセンス鎖から形成されたｓｉＲＮＡのほとんどは、２４時間経過しても、その分解率は５０％以下である。
【００４７】
実施例２０〜３２
実施例１〜１４と同様にして、５´末端と非末端に化学修飾塩基を同時に導入したセンス鎖と化学修飾塩基を有しないアンチセンス鎖からｓｉＲＮＡを形成させ、その酵素による分解率を測定した。その結果を表８に示す。
【００４８】
【表８】
2005312397.tif 000022
【００４９】
この表から明らかなように、５´末端と非末端に化学修飾塩基を同時に導入したセンス鎖を用いたｓｉＲＮＡについては、ＰＫＩα核外移行シグナルペプチド（ＲＮＡ37）、Ｄｓｋ−１核外移行シグナルペプチド（ＲＮＡ39）、ＳＶ４０  Ｔ  抗原核局在化シグナルペプチド（ＲＮＡ42）、人工ペプチド（ＲＮＡ43）、人工ペプチド（ＲＮＡ44）をコンジュゲートした場合は、特に高い酵素分解耐性を示す。
【００５０】
また、５´末端、複数の非末端が同時にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡについては、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ核外移行シグナルペプチド（ＲＮＡ45）、ＰＫＩα核外移行シグナルペプチド（ＲＮＡ46）及びＭＡＰＫＫ核外移行シグナルペプチド（ＲＮＡ47）をコンジュゲートしたものは、いずれも分解率５％以下という高い耐性を示す。
【００５１】
参考例１
実施例１〜３２で得たｓｉＲＮＡ１００μｍＭに、白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ：０．５×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）を加え、１０質量％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中、５体積％ＣＯ2を含む雰囲気中において、３７℃で４８時間インキュベートしたのち、細胞毒性をセル・バイアビリティ・キット（プロメガ社製）を用いて測定した。
その結果、実施例２１及び実施例２６で得たｓｉＲＮＡについては、４８時間後の細胞生存率が９０％とわずかな毒性が認められたが、それ以外のものについては、ほとんど毒性は認められなかった。
【００５２】
参考例２
蛍光ラベル化したコンジュゲートｓｉＲＮＡ（１μＭ）を白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ：１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）へ加え、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、共焦点レーザ蛍光顕微鏡で細胞導入性及び細胞内局在化を観察した。
その結果、センス鎖５´‐末端に各種ペプチドをコンジュゲートした実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例９、実施例１０、実施例１１、実施例１３で得たｓｉＲＮＡのすべてにおいて細胞への取り込みが著しく促進された（共焦点レーザー励起蛍光顕微鏡の観察による）。
また、核外移行シグナルペプチドをコンジュゲートした実施例２、実施例３、実施例４、実施例５で得たｓｉＲＮＡと人工ペプチドをコンジュゲートした実施例１１で得たｓｉＲＮＡは細胞質に、核外移行シグナルペプチドをコンジュゲートした実施例９、実施例１０と人工ペプチドをコンジュゲートした実施例１３で得たｓｉＲＮＡは核内にそれぞれ局在化していることが分った。
【００５３】
コンジュゲートｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）を白血病細胞（Ｋ−５６２：１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）へ添加し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、プロテイン・チロシンキナーゼ・アッセイ法によりチロシンキナーゼ阻害活性を測定し、百分率で表わした。
その結果、天然型ｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ1／ＲＮＡ2）においては、６％の阻害効果しか認められなかったのに対して，コンジュゲートｓｉＲＮＡでは９０％以上という高い阻害効果が見られた。特に，センス鎖５´‐末端と３´‐末端近傍を同時にＨＩＶ−１  Ｒｅｖ核外移行シグナルペプチドでコンジュゲートした実施例２１で得たｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ36／ＲＮＡ2）ではほぼ１００％の阻害効果を達成した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、遺伝子医薬の効力を向上させることができるので、医薬分野においての利用性が高い。
【配列表】
2005312397000001.app