(57)【要約】      （修正有）【課題】SGP-1タンパク質欠損コムギの選抜において上記問題点を解決し、SGP-1タンパク質欠損コムギを迅速かつ簡便に検出する技術を開発し、提供する。【解決手段】本発明は、コムギｗＳＳＩＩ遺伝子の複数の特定のDNA配列において（１）特定の配列のＤＮＡ配列の位置の塩基の欠失及び／又は置換、（２）特定の配列のDNA配列の位置の間への1つ以上の塩基の挿入、又は（３）特定の配列のDNA配列の位置の塩基の欠失を検出する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（３）のコムギWheat Starch Synthase II（wSS II）遺伝子のDNA配列上に生じた変異の1つ以上を検出することによるwSS II遺伝子変異コムギの検出方法：
（１）配列番号１のDNA配列の位置506〜794の塩基の欠失及び／又は置換、
（２）配列番号２のDNA配列の位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基の挿入、又は
（３）配列番号３のDNA配列の位置2355〜2417の塩基の欠失。
【請求項２】
前記コムギwSS II遺伝子のDNA配列上に生じた変異の１つ以上を検出する方法がPCRである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
PCRで使用する試薬が以下のプライマーの少なくとも１つを含む、請求項２記載の方法：
（ａ）変異（１）を検出するためにデザインされたプライマー、
（ｂ）変異（２）を検出するためにデザインされたプライマー、又は
（ｃ）変異（３）を検出するためにデザインされたプライマー。
【請求項４】
PCRで使用する試薬が以下のプライマーの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項３記載の方法：
（ｄ）配列番号４から６のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号７又は８のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、
（ｅ）配列番号９又は１０のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１１又は１２のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、又は
（ｆ）配列番号１３又は１４のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１５のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ。
【請求項５】
以下のプライマーの組み合わせの少なくとも１つを含むwSS II遺伝子変異コムギの検出用PCR試薬：
（ｄ）配列番号４から６のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号７又は８のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、
（ｅ）配列番号９又は１０のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１１又は１２のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、又は
（ｆ）配列番号１３又は１４のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１５のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ。
【請求項６】
以下の（１）から（３）のコムギwSS II遺伝子のDNA配列上に生じた変異のすべてを検出することができる方法によるコムギのwSS II遺伝子タイプの分類方法：
（１）配列番号１のDNA配列の位置506〜794の塩基の欠失及び／又は置換、
（２）配列番号２のDNA配列の位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基の挿入、及び
（３）配列番号３のDNA配列の位置2355〜2417の塩基の欠失。
【請求項７】
前記コムギゲノムDNA配列に生じた変異の１つ以上を検出する方法がPCRである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
PCRで使用する試薬が以下のプライマーの少なくとも１つを含む、請求項７記載の方法：
（ａ）変異（１）を検出するためにデザインされたプライマー、
（ｂ）変異（２）を検出するためにデザインされたプライマー、又は
（ｃ）変異（３）を検出するためにデザインされたプライマー。
【請求項９】
PCRで使用する試薬が以下のプライマーの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項８記載の方法：
（ｄ）配列番号４から６のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号７又は８のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、
（ｅ）配列番号９又は１０のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１１又は１２のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、又は
（ｆ）配列番号１３又は１４のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１５のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ。
【請求項１０】
配列番号１のwSS II-A1遺伝子において、少なくとも位置506〜794の塩基が欠失及び／又は置換したwSS II-A1遺伝子変異体。
【請求項１１】
配列番号１６に記載の配列で表されるDNA配列を含む請求項１０記載のwSS II-A1遺伝子変異体。
【請求項１２】
配列番号１６に記載の配列とホモロジーが90%以上であるDNA配列を含む請求項１０記載のwSS II-A1遺伝子変異体。
【請求項１３】
配列番号２のwSS II-B1遺伝子において、少なくとも位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基が挿入したwSS II-B1遺伝子変異体。
【請求項１４】
配列番号１７に記載の配列で表される請求項１３記載のwSS II-B1遺伝子変異体。
【請求項１５】
配列番号１７に記載の配列とホモロジーが90％以上である請求項１３記載のwSS II-B1遺伝子変異体。
【請求項１６】
配列番号３のwSS II-D1遺伝子において、少なくとも位置2355〜2417の塩基が欠失したwSS II-D1遺伝子変異体。
【請求項１７】
配列番号１８に記載の配列で表される請求項１６記載のwSS II-D1遺伝子変異体。
【請求項１８】
配列番号１８に記載の配列とホモロジーが90％以上である請求項１６記載のwSS II-D1遺伝子変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、wheat Starch Synthase II（wSS II）遺伝子変異コムギの検出方法、コムギのwSS II遺伝子タイプの分類方法およびwSS II遺伝子変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物ではデンプンの合成にはstarch synthase II（SS II）という遺伝子が関与していることが知られている。トウモロコシSS IIにホモロジーの高い遺伝子として同定されたコムギのwSS II遺伝子（wheat starch synthase II（wSS II））は、Zhongyi Liらの報告（非特許文献１）にもあるようにStarh Granule Protein-1（SGP-1）というタンパク質をコードしている。また小麦のゲノム構成はA, B, Dゲノムよりなる異質６倍体であり、wSS IIはそれぞれのゲノムの7番染色体短腕に座乗している（wSS II-A1, wSS II-B1、wSS II-D1）。コムギのデンプンはグルコースがα-1,4結合で直鎖状に連なったアミロースと、α-1,6結合で枝別れ構造をもったアミロペクチンからなっており、アミロースとアミロペクチンが約3:7の割合で含まれている。wSS IIはデンプンの中でも特にアミロペクチンの合成に関与していると考えられている。山守ら（非特許文献２）は、多くのコムギ系統の中から、SGP-1タンパク質（SGP-A1, SGP-B1, SGP-D1）が欠損している系統を選抜し、交配を行うことによって、このタンパク質が３つとも欠損した系統を作出することに成功した。このコムギ系統ではデンプン粒の形状が変化しており、さらには糊化温度が野生型のものでは60〜70度付近であったものが、変異体では明確な温度ピークを持たなかった。加えてアミロペクチン側鎖の鎖長分布が野生型のものとは著しく異なっていることが判明した。以上のことから、山守らは、SGP-1タンパク質はアミロペクチンの側鎖の合成に関与しており、この遺伝子を欠損することによってアミロペクチンの側鎖の鎖長が変化し、デンプン粒の形状と特性が大きく変化するとしている。実際にこのSGP-1タンパク質欠損系統コムギを食品へ応用した例はまだないが、小麦粉となる小麦胚乳部位の約70％をしめるデンプンの性質が大きく変化していることは、これまでとは異なる加工特性をもった小麦粉になる可能性が大きい。
しかしながら、山守らが示したSGP-1タンパク質欠損系統コムギの作出方法は種子からデンプン粒を精製し、それに結合しているタンパク質を二次元電気泳動により解析するという煩雑なものであった。またこの方法では、交配によって結実した種子を解析するためには種子をさらに栽培してその次世代の種子を解析する必要があった。なぜなら、種子に含まれるタンパク質を解析するには種子をすりつぶす必要があり、すりつぶした種子から発芽させることはできないからである。
よって多数の種子のSGP-1タンパク質欠損の有無を判定するには、膨大な労力と時間が必要であった。
【０００３】
【非特許文献１】Zhongyi Li,. Xiusheng Chu, Gregory Mouille, Liuling Yan, Behjat Kosar-Hashemi, Sandra Hey, Johnathan Napier, Peter Shewry, Bryan Clarke, Rudi Appels, Matthew K. Morell, and Sadequr Rahman(1999) Plant Physiology Vol. 120:1147-1155
【非特許文献２】M.Yamamori, S.Fujita, K.Hayakawa, J.Matsuki, T.Yasui(2000)Theor. Appl. Genet 101:21-29
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、SGP-1タンパク質欠損コムギの選抜において上記問題点を解決し、SGP-1タンパク質欠損コムギを迅速かつ簡便に検出する技術を開発し、提供することにある。DNAレベルでこのコムギの検出を行うことができれば、育種現場において、この特性を有しかつ実用的な品種を開発するために、この技術は有効な手段となる。さらにはコムギの原料段階から加工段階の全てにおいて、wSS II遺伝子欠損のタイプを判定することによって、測定対象物中に含まれるSGP-1タンパク質欠損コムギの存在の有無を判定することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、SGP-1タンパク質をコードする野生型wSS II遺伝子領域において、配列が大きく異なる変異型配列を取得することができた。コムギ品種の１つであるChinese SpringのAゲノム由来野生型wSS II-A1遺伝子領域に対して変異型wSS II-A1遺伝子領域は、開始コドン周辺領域の配列289塩基対が配列の異なる8塩基に変異していることが分かった。遺伝子の発現において開始コドン周辺領域はDNAからmRNAへの転写、およびmRNAからタンパク質へ翻訳するステップの両方に重要な役割を果たしており、この領域が変異していることは、Aゲノム由来変異体wSS II-A1遺伝子が発現していないことを示唆している。また、Bゲノム由来の野生型wSS II-B1遺伝子領域に対して、変異型wSS II-B1遺伝子領域はC末端領域の175塩基対が挿入された形になっていることが明らかになった。この配列が挿入されたことによって、タンパク質レベルで途中に停止コドンが出現することになり、野生型wSS IIタンパク質に比べて短いタンパク質が合成されることになる。このためこのタンパク質の本来の機能が発揮できなくなることが示唆された。Dゲノム由来の野生型wSS II-D1遺伝子領域に対しての変異型wSS II-D1遺伝子領域は、N末端領域に63塩基対の欠失があることが分かった。欠失した領域は、エクソン、イントロンの境界部分を挟み込む形になっており、この欠失によってスプライシングがうまく起こらず、そのため途中で終止コドンが入ってしまう可能性が高い。また、この領域の近傍には、デンプン合成に基質となるADP-glucoseの結合部位が存在している。欠失が起こったことにより、タンパク質の立体構造に変化が起こり、ADP-glucoseの結合性が低下している可能性もある。いずれにせよ、正常なタンパク質が合成されないことは明らかである。この領域の近傍には、デンプン合成に基質となるADP-glucoseの結合部位が存在している。変異体において63塩基対の欠失が起こったことにより、タンパク質の立体構造に変化が起こり、ADP-glucoseの結合性が低下している可能性がある。
【０００６】
以上に挙げた変異部分の他には大きな変異配列は検出されなかったため、本発明で明らかにできたwSS II遺伝子領域の配列変異によって、山守らが示したSGP-1タンパク質欠損系統コムギに見られるデンプン特性になったことは明らかであった。
よって本発明者らは、明らかにできた野生型と変異型配列の違いをDNAレベルで検出することにより、wSS II遺伝子変異コムギ（SGP-1タンパク質欠損小麦）を簡便に検出する方法を考案した。
本発明は、DNAレベルでwSS II遺伝子領域の野生型もしくは変異型を判定することにより、確実で迅速なwSS II遺伝子変異コムギの検出を行う。すなわち、本発明は、（１）配列番号１のDNA配列の位置506〜794の塩基の欠失及び／又は置換、（２）配列番号２のDNA配列の位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基の挿入、又は（３）配列番号３のDNA配列の位置2355〜2417の塩基の欠失を検出する方法を提供する。
また、本発明は、（１）配列番号１のDNA配列の位置506〜794の塩基の欠失及び／又は置換、（２）配列番号２のDNA配列の位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基の挿入、及び（３）配列番号３のDNA配列の位置2355〜2417の塩基の欠失を検出することによるwSS II遺伝子タイプの分類方法を提供する。
ただし、検出する配列変異は、配列番号1から３に記載される該当配列と必ずしも完全に一致している必要はない。DNAの複製過程において、最終的にタンパク質レベルでの働きになんら影響を与えないような遺伝子配列の置換、挿入、欠失は頻繁に起こり得るからである。実際に配列を解析する過程で、タンパク質レベルでの変化を伴わない配列変異がいくつか確認されている。重要なのは、野生型配列に対して、本研究で明らかにできた配列領域が変異し、その結果wSS II遺伝子由来のタンパク質の発現低下、もしくは機能の低下が起こり、本来の機能が果たせなくなってしまっていることである。
また、本発明は、配列番号１のwSS II-A1遺伝子において、少なくとも位置506〜794の塩基が欠失及び／又は置換したwSS II-A1遺伝子変異体、配列番号２のwSS II-B1遺伝子において、少なくとも位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基が挿入したwSS II-B1遺伝子変異体及び配列番号３のwSS II-D1遺伝子において、少なくとも位置2355〜2417の塩基が欠失したwSS II-D1遺伝子変異体を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、コムギの育種において、ＤＮＡレベルで、wSS II遺伝子変異コムギを早期に識別・選択することができるようになる。つまり交配に用いるコムギ系統の選抜および交配によって生じた後代の種子の選抜に利用でき、育種の大幅な効率化、迅速化が期待できる。また、食品の原料段階から加工段階のいかなる段階でもwSS II遺伝子変異コムギの存在を検出することができる。さらには、変異型の組み合わせ（欠損するSGP-1タンパク質の組み合わせ）のタイプによっても特性が大きく異なることが考えられる。本発明を利用することにより、このようなコムギの作出が容易になるばかりでなく、タイプごとの用途を見出せることができれば、その用途に用いることのできる小麦もしくはその加工品を簡便に判定することが可能になる。例えば、パン用の原料として用いる場合、SGP-A1、B1、D1の3つのタンパク質が欠損したものでは不適であっても、A1のみが欠損したものであれば、優れた加工性を与える可能性が考えられる。このような場合に本発明を用いることで、Aゲノムのみ変異型になったwSS II遺伝子タイプを判定することでこの用途に適したコムギ若しくはその加工品を選別し、利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のwSS II遺伝子変異コムギの検出方法は、（１）配列番号１のDNA配列の位置506〜794の塩基の欠失及び／又は置換、（２）配列番号２のDNA配列の位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基の挿入、又は（３）配列番号３のDNA配列の位置2355〜2417の塩基の欠失の１つ以上を検出することによって行われる。
本発明の検出方法に用いる測定対象物は、原材料であっても、加工段階のいずれかであっても、加工後の食品であってもよい。食品は、ヒトの食品のみならず動物用の食品（飼料）を含む。また、測定対象物は、DNAレベルで測定することができるものであればいかなるものでもよく、植物の、特に生育段階のすべてのコムギを測定対象物とすることが出来、種子、種苗、苗、成体、およびこれらの一部であっても全部であってもよい。コムギは野生型、変異種のいずれでもよく、コムギと他の植物との交配雑種でもよい。
【０００９】
上記（１）から（３）の遺伝子配列の変異を検出する方法は、上記（１）から（３）の遺伝子配列の変異を検出することができる方法であれば、当業者に知られた何れの方法であってもよく、例えばPCR法、LAMP法、NASBA法、LCR法、SDA法、RCR法、TMA法等が挙げられる。
PCR法は、特に限定されず、公知である種々の改良方法を用いることができるが、一例を挙げれば、プライマーのペアー、鋳型（被検）DNAの他にTris-HCl、KCl、MgCl2、各dNTP、TaqDNAポリメラーゼ等の試薬類を混合してPCR反応液とする。PCRの1サイクルは、熱変性、プライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによるDNA合成反応の3つのステップからなっている。各ステップはそれぞれ異なった反応温度と反応時間を必要とするので増幅しようとするDNA領域の塩基配列とその長さによって適切な範囲とする。このような操作のためのthermal cyclerが市販されている。TaqDNAポリメラーゼ、MgCl2の濃度や反応サイクル数等好適なPCR条件の検討、あるいはnestedPCRを用いれば、さらに検出感度を向上させることができる。
PCR反応物は、免疫反応を用いて同定しても、どのように同定してもよいが、電気泳動させて、必要な場合は陽性コントロールや、陰性コントロールを用いて電気泳動像で明瞭なバンドが認められれば、被検物質（食品）中に検出物質（wSS II遺伝子変異コムギ）が存在することが確認できる。
【００１０】
上記（１）から（３）の遺伝子配列の変異を検出する方法としてはPCR法以外にLAMP法、LCR法、SDA法、RCR法、TMA法等が挙げられる。本遺伝子配列の変異を検出できる方法であればどのような方法を用いても良いが、一例としてLAMP法を挙げれば、Notomiらの報告（Notomi et. al., Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 12, e63）にある方法を参考にプライマーを設計する。この時検出したい配列が（１）の配列であれば、配列番号１６の位置106から113を挟み込む領域を検出領域としてプライマーを設計すれば良い。また検出したい配列が（２）の配列であれば配列番号１７の位置5900から6074までの配列の一部を検出領域としてプライマーを設計すれば良い。また検出したい配列が（３）の配列であれば配列番号１８の2354から2355を挟み込む領域を検出領域としてプライマーを設計すれば良い。設計したプライマーに加えて反応に必要な鋳型DNA溶液、dNTP、BstDNApolymerase、およびその他反応に必要な試薬を加えて６５度で反応を行い、産物を適当な方法で検出することで、wSS II遺伝子変異コムギの検出、もしくはコムギのwSS II遺伝子タイプの判定を行うことができる。その他の方法でも同様にマニュアルに従って検出系をくみ上げることで同様の検出、判定を行うことが可能である。
【００１１】
ＰＣＲで使用するプライマーとしては、上記（１）から（３）の遺伝子配列の変異を検出できるものであれば、どのようなものでも使用できる。
（１）の遺伝子配列の変異を検出できるプライマーとしては、例えば、
（ｉ）その3'末端が配列番号１のwSS II-A1遺伝子領域の位置506よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号１のwSS II-A1遺伝子領域の位置794よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（ii）その3'末端が配列番号１のwSS II-A1遺伝子領域の位置794よりも下流に欠失部分506〜794を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号１のSS II-A1遺伝子領域の位置794よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、及び
（iii）その3'末端が配列番号１のwSS II-A1遺伝子領域の位置506よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号１のwSS IIa-A1遺伝子領域の位置506よりも上流に欠失部分506〜794を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーとの組み合わせが挙げられる。
さらに上記（ｉ）、（ii）、（iii）のプライマーはwSS II-A1遺伝子領域を特異的に検出できるように設計することが望ましい。具体的には、他のゲノム由来のwSS II遺伝子領域（wSS II-B1、wSS II-D1）と完全マッチしない領域に設計したプライマーである。
【００１２】
（２）の遺伝子配列の変異を検出できるプライマーとしては、例えば、
（ｉ）その3'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5900よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5901よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（ii）その3'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5900〜5901の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5901よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（iii）その3'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5900よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5900〜5901の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、及び
（iv）その3'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5900〜5901の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号２のwSS II-B1遺伝子領域の位置5900〜5901の間に挿入された塩基にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせが挙げられる。
さらに上記（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）のプライマーはSS II-B1遺伝子領域を特異的に検出できるように設計することが望ましい。具体的には、他のゲノム由来のSS II遺伝子領域（wSS II-A1、wSS II-D1）と完全マッチしない領域に設計したプライマーである。
【００１３】
（３）の遺伝子配列の変異を検出できるプライマーとしては、例えば、
（ｉ）その3'末端が配列番号３のwSS II-D1遺伝子領域の位置2355よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３のwSS IIa-D1遺伝子領域の位置2417よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、
（ii）その3'末端が配列番号３のwSS II-D1遺伝子領域の位置2417よりも下流に欠失部分2355〜2417を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３のwSS II-D1遺伝子領域の位置2417よりも下流にハイブリダイズするプライマーとの組み合わせ、及び
（iii）その3'末端が配列番号３のwSS II-D1遺伝子領域の位置2355よりも上流にハイブリダイズするプライマーと、その5'末端が配列番号３のwSS II-D1遺伝子領域の位置2355よりも上流に欠失部分2355〜2417を跨ぐ様にしてハイブリダイズするプライマーとの組み合わせが挙げられる。
さらに上記（ｉ）、（ii）、（iii）のプライマーはwSS II-D1遺伝子領域を特異的に検出できるように設計することが望ましい。具体的には、他のゲノム由来のwSS II遺伝子領域（wSS II-A1、wSS II-B1）と完全マッチしない領域に設計したプライマーである。
【００１４】
具体的には、（ｄ）配列番号４から６のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号７又は８のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、（ｅ）配列番号９又は１０のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１１又は１２のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせ、又は（ｆ）配列番号１３又は１４のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーと、配列番号１５のいずれか１つに記載の配列を含むプライマーとの組み合わせが挙げられる。本発明の方法で使用するプライマーとしては、上記プライマーの少なくとも1つの組み合わせを含むものが好ましい。
【００１５】
本発明の検出方法で検出されるwSS II遺伝子変異コムギは、配列番号１のwSS II-A1遺伝子において、少なくとも位置506〜794の塩基が欠失及び／又は置換したwSS II-A1遺伝子変異体、配列番号２のwSS II-B1遺伝子において、少なくとも位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基が挿入したwSS II-B1遺伝子変異体、及び配列番号３のwSS II-D1遺伝子において、少なくとも位置2355〜2417の塩基が欠失したwSS II-D1遺伝子変異体の少なくとも１つを含む。
wSS II-A1遺伝子変異体の例としては、配列番号１６に記載の配列で表されるDNA配列又は配列番号１６に記載の配列とホモロジーが90%以上であるDNA配列を含むwSS II-A1遺伝子変異体が挙げられる。
wSS II-B1遺伝子変異体の例としては、配列番号１７に記載の配列で表されるwSS II-B1遺伝子変異体又は配列番号１７に記載の配列とホモロジーが90％以上であるwSS II-B1遺伝子変異体が挙げられる。
wSS II-D1遺伝子変異体の例としては、配列番号１８に記載の配列で表されるwSS II-D1遺伝子変異体又は配列番号１８に記載の配列とホモロジーが90％以上であるwSS II-D1遺伝子変異体が挙げられる。
また、コムギが有する上記遺伝子変異体の組み合わせにより、前記コムギのwSS II遺伝子タイプを分類することができる。これにより多様なデンプン特性を有するコムギを作出することができる。
従って、本発明のｗSS II遺伝子タイプの分類方法は、（１）配列番号１のDNA配列の位置506〜794の塩基の欠失及び／又は置換、（２）配列番号２のDNA配列の位置5900〜5901の間への1つ以上の塩基の挿入、及び（３）配列番号３のDNA配列の位置2355〜2417の塩基の欠失のすべての変異を検出することによって行われる。
【００１６】
測定対象物は限定されないが、本発明方法は、一粒系コムギ、二粒系コムギ、普通コムギ、チモフェービ系コムギの測定に用いれば高い再現性で検出できる。
DNAは熱に安定であり加工食品中でも微量で検出できる。また、食品の原料段階から加工段階のいかなる段階でも用いることができるので、原料のみならず、食品類の製造工程の各段階でも本発明の方法でSS II遺伝子変異体小麦が検出できる。
【実施例】
【００１７】
１．wSS II遺伝子変異体コムギ作出のためのマーカーの評価
（Ａ）サンプル
サンプル１：Chinese Spring（野生型品種）
サンプル２：N7AT7D（Chinese Springの7A染色体を7D染色体に置き換えたものであり、7番染色体に関してゲノム構成はB、D、Dとなる。）
サンプル３：N7BT7D（Chinese Springの7B染色体を7D染色体に置き換えたものであり、7番染色体に関してゲノム構成はA、D、Dとなる。）
サンプル４：N7DT7B（Chinese Springの7D染色体を7B染色体に置き換えたものであり、7番染色体に関してゲノム構成はA、B、Bとなる。）
サンプル５：文献（M.Yamamori, S.Fujita, K.Hayakawa, J.Matsuki, T.Yasui(2000)Theor. Appl. Genet 101:21-29）に記載された方法を参考にして作出したｗSS II遺伝子変異コムギ（ｗSS II遺伝子はA、B、D全て変異型）。
上記サンプルの種子を発芽させ、幼葉からゲノムDNAを下記の通り抽出してPCRに供した。
【００１８】
（Ｂ）抽出方法
幼葉からのゲノムDNAの抽出はキアゲン社製DNeasy plant miniキットを用いて行った。操作はマニュアルに従った。発芽した種子の幼葉を100 mgとり、液体窒素中でパウダー状になるまですりつぶした。すりつぶしたサンプルを1.5 ml容チューブに移し、その後キットに添付のバッファーAP1とRNase solutionを加えて65度で10分間加熱した。次にバッファーAP2を加えて氷上で5分間放置した後、析出した沈殿物を遠心操作により取り除いた。上澄み液にバッファーAP3を加えて混合した後、全量をmini spin columnに供し、遠心操作を行いDNAをメンブランに吸着させた。バッファーAWによる洗浄を2回行った後、バッファーＡＥを加えて5分間放置し、遠心によりDNA溶液を回収した。
【００１９】
（Ｃ）コムギのｗSS II-A1遺伝子変異体の検出
ＰＣＲ反応液は以下のように調整した。反応にはLA Taq（TaKaRa社）を用いた。プライマーはFASMAC社製のものを用いた。
2005333832.tif 000002
【００２０】
PCR増幅装置にはGeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。
2005333832.tif 000003
PCR増幅反応液は3％アガロースゲルによる電気泳動に供した後、エチジウムブロマイド染色を行い、各プライマーによる至適サイズのDNA増幅バンドを確認することによってサンプル中の野生型及び変異型遺伝子の有無を判定した。
【００２１】
下記の3組のプライマーセットを用いて、上記の条件で各サンプルのPCRを行い得られたPCR断片が野生型か変異型かを決定した。結果を図１〜３に示す。
2005333832.tif 000004
【００２２】
サンプル１、３及び４はAゲノム由来の野生型ｗSS II-A1遺伝子を持っているため、バンドは野生型の位置に出現した。しかし、サンプル２は、7A染色体が7D染色体に置き換わっており、Aゲノム由来のｗSS II遺伝子を持たないため、バンドは出現しなかった。サンプル５のバンドは、変異型の位置に出現した。以上のことから、使用しているプライマーセットはAゲノムのｗSS II-A1遺伝子を特異的に増幅しており、野生型と変異型の違いを見分けることができた。
【００２３】
（Ｄ）コムギのｗSS II-B1遺伝子変異体の検出
PCR反応液は以下のように調整した。反応にはLA Taq（TaKaRa社）を用いた。プライマーはFASMAC社製のものを用いた。
2005333832.tif 000005
【００２４】
PCR増幅装置にはGeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。
プライマーセットIV及びＶについて
2005333832.tif 000006
プライマーセットVIについて
2005333832.tif 000007
PCR増幅反応液は3％アガロースゲルによる電気泳動に供した後、エチジウムブロマイド染色を行い、各プライマーによる至適サイズのDNA増幅バンドを確認することによってサンプル中の野生型及び変異型遺伝子の有無を判定した。
【００２５】
下記の3組のプライマーセットを用いて、上記の条件で各サンプルのPCRを行い得られたPCR断片が野生型か変異型かを電気泳動により決定した。結果を図４〜６に示す。
2005333832.tif 000008
【００２６】
サンプル１、２及び４はBゲノム由来の野生型ｗSS II-B1遺伝子を持っているため、バンドは野生型の位置に出現した。しかし、サンプル３は、7B染色体が7D染色体に置き換わっており、Bゲノム由来のｗSS II-B1遺伝子を持たないため、バンドは出現しなかった。サンプル５のバンドは、変異型の位置に出現した。以上のことから、使用しているプライマーセットはBゲノムのｗSS II-B1遺伝子を特異的に増幅していることがわかる。
【００２７】
（Ｅ）コムギのｗSS II-D1遺伝子変異体の検出
PCR反応液は以下のように調整した。反応にはLA Taq（TaKaRa社）を用いた。プライマーはFASMAC社製のものを用いた。
2005333832.tif 000009
【００２８】
PCR増幅装置にはGeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。
2005333832.tif 000010
PCR増幅反応液は3％アガロースゲルによる電気泳動に供した後、エチジウムブロマイド染色を行い、各プライマーによる至適サイズのDNA増幅バンドを確認することによってサンプル中の野生型及び変異型遺伝子の有無を判定した。
【００２９】
下記の3組のプライマーセットを用いて、上記の条件で各サンプルのPCRを行い得られたPCR断片が野生型か変異型かを電気泳動により決定した。結果を図７及び８に示す。
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【００３０】
サンプル１〜３は野生型のDゲノム由来のSS IIa遺伝子を持っているため、バンドは野生型の位置に出現した。しかし、サンプル４は、7D染色体が7B染色体に置き換わっているためDゲノム由来のｗSS II-D1遺伝子を持たないため、バンドは出現しなかった。サンプル５のバンドは、変異型の位置に出現した。以上のことから、使用しているプライマーセットはDゲノムのｗSS II-D1遺伝子を特異的に増幅していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】電気泳動によって得られた、プライマーセットＩによるAゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図２】電気泳動によって得られた、プライマーセットIIによるAゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図３】電気泳動によって得られた、プライマーセットIIIによるAゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図４】電気泳動によって得られた、プライマーセットIVによるBゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図５】電気泳動によって得られた、プライマーセットＶによるBゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図６】電気泳動によって得られた、プライマーセットVIによるBゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図７】電気泳動によって得られた、プライマーセットVIIによるDゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図８】電気泳動によって得られた、プライマーセットVIIIによるDゲノム由来の増幅産物の電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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