(57)【要約】【課題】  ミラー切換えなどの光軸ずれ要因があっても、安定して高精度に分光検出ができる共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】  分光用ダイクロイックミラーユニット３４での分光用ダイクロイック３４ｂから分光用ダイクロイック３４ａへの切り換えにより平面回折格子３６に入射する蛍光の光軸に傾きが発生し、スリット３９上に形成されるスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３に位置ズレが生じることがあっても、予め記憶部４１ａに記憶された補正情報に基づいて平面回折格子３６と折り返しミラー３７の回転を制御し、スリット３９上でのスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の位置ズレを補正する。【選択図】      図１
2005234281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を発生する照明手段と、
前記レーザ光が照射された試料から発せられる検出光を波長ごとに分光する複数の波長選択光学素子を有する検出光分割手段と、
前記分光手段の波長選択光学素子で選択された検出光を波長領域ごとにスペクトル分解するとともに、これら分解されたスペクトル光をスペクトル列方向に移動可能にしたスペクトル分解手段と、
前記スペクトル分解手段の前側または後側に配置され、前記スペクトル分解手段に入射される検出光または前記スペクトル分解手段で分解されたスペクトル光の光路を変更する光路変更手段と、
前記スペクトル分解手段で分解されたスペクトル光の結像位置にあって前記スペクトル分解手段で分解されたスペクトル光から測定すべきスペクトル成分を選択するスペクトル光選択手段と、
前記スペクトル光選択手段で選択されたスペクトル成分を検出する検出手段と、を具備し、
前記スペクトル分解手段および光路変更手段により前記スペクトル光選択手段でのスペクトル光の選択状態を調整可能としたことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
スペクトル光選択手段は、スペクトル分解手段により分解されたスペクトル光の配列方向に移動可能な波長選択スリットと、前記スペクトル光の配列方向に平行に配置される副次回折光シボリを有し、
前記光路変更手段は、前記スペクトル光選択手段に結像されたスペクトル列をスペクトル光の配列方向と直交する方向に移動可能としたことを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記スペクトル分解手段は、回転軸を中心に回転可能に支持された平面回折格子からなり、前記光路変更手段は、前記平面回折格子の回転軸と直交する方向に配置された回転軸を中心に回転可能に支持された折り返しミラーからなることを特徴とする請求項２記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記スペクトル分解手段および光路変更手段は、前記検出光分割手段の波長選択光学素子の切り換えに連動して動作することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
さらに、検出光分割手段の波長選択光学素子の切り換えに関する誤差に応じた補正情報を記憶する記憶手段を有し、前記波長選択光学素子の切換えにより、前記記憶手段に記憶された補正情報に基づいて前記スペクトル分解手段および光路変更手段を制御することを特徴とする請求項４記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に係り、特に、分光検出機能を備えた共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡として、蛍光色素を標識した標本に対し対物レンズを介してレーザ光を照射することで蛍光色素を励起し、この励起により標本から発せられる光（蛍光）を検出してスペクトル分解し、選択された蛍光に基づいて画像を構築したり、任意の波長領域の分光データを検出するものが知られている。
【０００３】
特許文献１は、このような共焦点顕微鏡の一例を示すもので、図４に示すように、標本から発せられる蛍光を矩形の微小開口５１で焦点を結ばせ、この微小開口５１を通過した蛍光を、結像光学系５２Ａ、５２Ｂに挟まれて配置される分光プリズム５３によって分散平面５４上にスポット５５Ａが並んだスペクトル列として生成し、このスペクトル列と垂直なシボリ５６を開閉させることで、任意の波長域の分光データを検出可能にしている。なお、５５Ｂは、副次回折光を示している。
【特許文献１】特表２００２−５０２０５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、最近、１つの標本に複数の蛍光色素を標識した多重染色標本が用いられるようになっており、このような多重染色標本について、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出するには、標本からの検出光を各蛍光色素ごとに複数チャンネルに分光し、これらチャンネルごとに検出光を取り込み、スペクトル分解して分光データを得るようにしている。
【０００５】
この場合、標本からの検出光を複数チャンネルに分光するには、光路分割のための切替えミラーが用いられ、これら切替えミラーを蛍光色素による蛍光の波長に対応させて切り替えるようにしている。また、切替えミラーの切り替え手段には、例えば回転ターレットなどが用いられている。
【０００６】
ところが、ターレットは、回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつきなどの様々な誤差が存在しているため、図４に示す微小開口５１の前段に配置される標本と共役関係にある共焦点レンズ（図４には開示されていない。）の集光位置にズレが発生する。このため、ズレを生じた集光位置の微小開口５１を介して生成されるスペクトル列（スペクトル分解された光強度の最も高いスポット５５Ａ及びそのスポットを中心にＸ状に形成される副次回折光５５ｂ）にズレを生じる。この場合、スペクトル列と垂直方向にスポット５５Ａの結像位置がずれてもシボリ５６が形成する開口領域から外れることがないので、この方向のずれは許容される。
【０００７】
ところが、図４の構成では、シボリ５６の開口領域外にあるスポット５５Ａに対応する副次回折光５５ｂがシボリ５６の開口領域内に入り込んでしまうことがある。これは、分光精度の低下を招く。
【０００８】
そこで、例えば図５に示すように、シボリ５６とともに、さらにスペクトル列と平行方向にマスク５８を配置すれば、不要な副次回折光５５ｂを遮断でき、分光性能を高めることが可能となる。
【０００９】
ところが、このようにすると、上述したように光路中のミラーなどの切り換えによってスペクトル列と垂直方向にスポット５５Ａの結像位置が大きくずれると、スポット５５Ａがマスク５８の開口領域を通過できなくなってしまう。
【００１０】
このような場合、マスク５８全体をスペクトル列と直交する方向に動かすことで、スポット５５Ａがマスク５８の開口領域を通過できるようにしてみてもも、予め最適な状態に設定されているマスク５８と検出器（図４には開示されていない。）の位置関係が維持できなくなるので、スペクトル成分情報の安定した分光データを取得できないという問題を生じる。特に、微弱な蛍光を検出するための検出器として多く用いられるホトマルチブライヤは、図６（ａ）に示すように受光面５７の中心部５７ａに対し、Ｘ方向の端部５７ｂ、Ｙ方向の端部５７ｃに向かって光電変換効率が劣化し、同図（ｂ）（ｃ）に示すような出力特性を有することが知られている。このため、同一強度の光を受光しても、受光位置によって出力が異なる、いわゆる受光面の感度ムラが生じ、正確な蛍光画像や分光データが取得できないことがあるという問題があった。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、ミラー切換えなどの光軸ずれ要因があっても、安定して高精度に分光検出ができる共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１記載の発明は、レーザ光を発生する照明手段と、前記レーザ光が照射された試料から発せられる検出光を波長ごとに分光する複数の波長選択光学素子を有する検出光分割手段と、前記分光手段の波長選択光学素子で選択された検出光を波長領域ごとにスペクトル分解するとともに、これら分解されたスペクトル光をスペクトル列方向に移動可能にしたスペクトル分解手段と、前記スペクトル分解手段の前側または後側に配置され、前記スペクトル分解手段に入射される検出光または前記スペクトル分解手段で分解されたスペクトル光の光路を変更する光路変更手段と、前記スペクトル分解手段で分解されたスペクトル光の結像位置にあって前記スペクトル分解手段で分解されたスペクトル光から測定すべきスペクトル成分を選択するスペクトル光選択手段と、前記スペクトル光選択手段で選択されたスペクトル成分を検出する検出手段と、を具備し、前記スペクトル分解手段および光路変更手段により前記スペクトル光選択手段でのスペクトル光の選択状態を調整可能としたことを特徴としている。
【００１３】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、スペクトル光選択手段は、スペクトル分解手段により分解されたスペクトル光の配列方向に移動可能な波長選択スリットと、前記スペクトル光の配列方向に平行に配置される副次回折光シボリを有し、前記光路変更手段は、前記スペクトル光選択手段に結像されたスペクトル列をスペクトル光の配列方向と直交する方向に移動可能としたことを特徴としている。
【００１４】
請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記スペクトル分解手段は、回転軸を中心に回転可能に支持された平面回折格子からなり、前記光路変更手段は、前記平面回折格子の回転軸と直交する方向に配置された回転軸を中心に回転可能に支持された折り返しミラーからなることを特徴としている。
【００１５】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記スペクトル分解手段および光路変更手段は、前記検出光分割手段の波長選択光学素子の切り換えに連動して動作することを特徴としている。
【００１６】
請求項５の発明は、請求項４記載の発明において、さらに、検出光分割手段の波長選択光学素子の切り換えに関する誤差に応じた補正情報を記憶する記憶手段を有し、前記波長選択光学素子の切換えにより、前記記憶手段に記憶された補正情報に基づいて前記スペクトル分解手段および光路変更手段を制御することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、スペクトル分解手段および光路変更手段によりスペクトル光選択手段でのスペクトル光の選択状態を調整できるので、スペクトル光選択手段での選択条件と検出手段の位置関係を常に一定に保つことができ、ミラー切換えなどの光軸ずれ要因があっても、安定して高精度に分光検出ができる。
【００１８】
また、光路変更手段によりスペクトル光を該スペクトル光の配列方向と直交する方向に移動可能とし、スペクトル光全体を副次回折光シボリの中心に一致させることができるので、ノイズ成分となる副次回折光を排除することが可能となり、高Ｓ／Ｎ比を達成できる。
【００１９】
さらに、スペクトル分解手段および光路変更手段により、測定したい光がスペクトル光選択手段で選択されるように光軸ずれを補正しているので、波長選択スリットおよび副次回折光シボリと検出手段の位置関係を常に一定にできる。これにより、測定する光は、常に検出手段の同じ位置で検出されるので、受光面に感度分布を有する受光素子（例えばＰＭＴ）を使用しても、受光素子の感度ムラなどに影響されない良好な検出を行なうことができる。
【００２０】
さらに、これら一連の動作は、予め記憶手段に記憶された補正情報に基づいて自動的に行なうことができるので、人為的な操作ミスが発生することがないとともに、装置を操作する人間の熟練度に全く影響されることもなくなり、常に安定した検出結果が得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２２】
図１は、本発明の一実施の形態にかかる共焦点顕微鏡の概略構成を示している。
【００２３】
ここでの共焦点顕微鏡は、励起光Ｌｅを試料Ｓに照射するための照明手段１０、試料Ｓを保持するとともに励起光Ｌｅを試料Ｓに集光し、試料Ｓから発せられる蛍光Ｌｆを取り込むための顕微鏡本体２０と、蛍光Ｌｆを複数のスペクトル光（ここでは、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３のみとする）に分解し、この中から任意のスペクトルのみを選択する分光手段３０と、分光手段３０で選択されたスペクトル成分（ここではスペクトル光Ｓ２とする）を受光する検出手段（後述するホトマルチプライア４０）とから構成されている。
【００２４】
照明手段１０は、レーザ光源として、例えば４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴン（Ａｒ）レーザ１１と、５４３ｎｍの波長のレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザ（ＨｅＮｅ・Ｇ）１２を有している。
【００２５】
ヘリウムネオンレーザ１２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー１３が配置されている。また、アルゴンレーザ１１からのレーザ光の光路上には、反射ミラー１３で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー１４が配置されている。ダイクロイックミラー１４は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、アルゴンレーザ１１からのレーザ光を透過し、反射ミラー１３で反射されるヘリウムネオンレーザ１２からのレーザ光を反射するようになっている。ここでのダイクロイックミラー１４は、４８８ｎｍのレーザ光を透過し、５４３ｎｍのレーザ光を反射するような特性を有している。
【００２６】
ダイクロイックミラー１４により合成されたレーザ光の光路上には、ビームエクスパンダ１５が配置されている。このビームエクスパンダ１５は、レーザ光を適切なビーム径に変換するためのものである。ビームエクスパンダ１５を通過した光路上には、励起用ダイクロイックミラーユニット１６が配置されている。励起用ダイクロイックミラーユニット１６は、回転ターレットからなるもので、不図示のモータにより回転軸１７を中心に回転駆動されるようになっている。励起用ダイクロイックミラーユニット１６には、波長選択光学素子としての複数の励起用ダイクロイックミラー１６ａ、１６ｂがターレットの同心円上に配置されており、回転軸１７を中心の回転動作により、励起用ダイクロイックミラー１６ａ、１６ｂを光路に対して選択的に切り換えるようになっている。つまり、これら励起用ダイクロイックミラー１６ａ、１６ｂのいずれか一つを光路上に配置できるようになっている。また、励起用ダイクロイックミラー１６ａ、１６ｂは、ビームエクスパンダ１５を通過してきたレーザ光を励起光Ｌｅとして顕微鏡本体２０の方向に反射させ、顕微鏡本体２０から戻ってくる試料Ｓからの検出光（蛍光Ｌｆ）を分光手段３０へ透過させるもので、ここでは、励起用ダイクロイックミラー１６ａは、波長４８８ｎｍの光を反射し、波長５００〜６２０ｎｍの光を透過する特性を有し、励起用ダイクロイックミラー１６ｂは、波長５４３ｎｍの光を反射し、波長５５５〜６２０ｎｍの光を透過する特性を有するものが用いられている。
【００２７】
励起用ダイクロイックミラー１６ａ（１６ｂ）の反射光路上には、ガルバノスキャナ１８が配置されている。このガルバノスキャナ１８は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー１８ａ、１８ｂを有し、これらのミラー１８ａ、１８ｂによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。
【００２８】
ガルバノスキャナ１８で２次元走査されたレーザ光の光路上には、顕微鏡本体２０が配置されている。顕微鏡本体２０は、鏡体２１、瞳投影レンズ２２、対物レンズ２３、ステージ２４から構成されている。この場合、ガルバノスキャナ１８から顕微鏡本体２０へ導入される励起光Ｌｅとしてのレーザ光は、瞳投影レンズ２２、対物レンズ２３を通り、ステージ２４上に保持された試料Ｓ上に集光され、また、試料Ｓから発せられる蛍光Ｌｆは、対物レンズ２３、瞳投影レンズ２２、ガルバノスキャナ１８を通り、励起用ダイクロイックミラーユニット１６まで戻るようになっている。
【００２９】
励起用ダイクロイックミラー１６ａ（１６ｂ）の透過光路上には、共焦点レンズ３１が配置されている。この共焦点レンズ３１の集光位置には、多角形をした（本実施の形態では矩形状）共焦点ピンホール３２が配置されている。この共焦点ピンホール３２は、共焦点絞り径を対物レンズ２３の瞳径により決まるスポット径に適したものに設定されている。
【００３０】
共焦点ピンホール３２を通過した光路上には、コリメートレンズ３３、検出光分割手段としての分光用ダイクロイックミラーユニット３４が配置されている。
【００３１】
コリメートレンズ３３は、共焦点ピンホール３２を通過した蛍光Ｌｆを再び平行光束とするためのものである。分光用ダイクロイックミラーユニット３４は、上述した励起用ダイクロイックミラーユニット１６と同様に回転ターレットからなるもので、不図示のモータにより回転軸３５を中心に回転駆動されるようになっている。分光用ダイクロイックミラーユニット３４には、波長選択光学素子としての複数の分光用ダイクロイックミラー３４ａ、３４ｂがターレットの同心円上に配置されており、回転軸３５を中心の回転動作により、分光用ダイクロイックミラー３４ａ、３４ｂを光路に対して選択的に切り換えるようになっている。つまり、これら分光用ダイクロイックミラー３４ａ、３４ｂのいずれか一つを蛍光Ｌｆの光路上に配置できるようになっている。また、分光用ダイクロイックミラー３４ａは、例えば中心波長５５０ｎｍより短い中心波長の蛍光を反射し、それより長い中心波長の蛍光を透過する特性を有し、分光用ダイクロイックミラー３４ｂは、例えば中心波長５８０ｎｍより短い中心波長の蛍光を反射し、それより長い中心波長の蛍光を透過する特性を有するものが用いられている。
【００３２】
分光用ダイクロイックミラー３４ａ（３４ｂ）の反射光路上には、スペクトル分解手段としての平面回折格子３６が配置されている。平面回折格子３６は、分光用ダイクロイックミラー３４ａ（３４ｂ）より反射される蛍光Ｌｆを波長領域ごとの蛍光、例えばスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３に分解するためのものである。また、平面回折格子３６は、不図示のモータにより駆動される回転軸３６ａを中心に回転可能に支持されている。この場合、回転軸３６ａは、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の配列方向と直交する方向に配置され、平面回折格子３６を図示ａ方向に回転させることで、分解したスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を、これらの配列方向に沿って移動可能にしている。
【００３３】
平面回折格子３６の反射光路には、光路変更手段としての折り返しミラー３７が配置されている。この折り返しミラー３７は、平面回折格子３６により分解されたスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の光路を折り返すようにしている。折り返しミラー３７は、不図示のモータにより駆動される回転軸３７ａを中心に回転可能に支持されている。この場合、回転軸３７ａは、平面回折格子３６の回転軸３６ａと直交する方向に配置され、折り返しミラー３７を図示ｂ方向に回転させることで、折り返しミラー３７で折り返されたスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を、これらの配列方向と直交する方向に移動可能にしている。
【００３４】
なお、折り返しミラー３７は、平面回折格子３６の前側の分光用ダイクロイックミラーユニット３４との間の光路に挿入するようにしてもよい。
【００３５】
折り返しミラー３７による折り返し光路上には、結像レンズ３８が配置されている。結像レンズ３８は、平面回折格子３６の回転中心に前側焦点位置がくるように配置されている。
【００３６】
結像レンズ３８の結像位置には、スペクトル光選択手段としてのスリット３９が配置されている。このスリット３９は、図２に示すように平面回折格子３６により分解されたスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の配列方向に移動可能な波長選択スリット３９ａと、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の配列方向に平行に配置される副次回折光シボリ３９ｂが設けられている。
【００３７】
スリット３９の後方には、検出手段としてのホトマルチプライヤ４０が配置されている。ホトマルチプライヤ４０は、スリット３９を透過した微弱な光を受光できる位置に配置されている。
【００３８】
励起用ダイクロイックミラーユニット１６の回転軸１７を駆動する不図示のモータ、分光用ダイクロイックミラーユニット３４の回転軸１７を駆動する不図示のモータ、平面回折格子３６の回転軸３６ａを駆動する不図示のモータおよび折り返しミラー３７の回転軸３７ａを駆動する不図示のモータには、制御部４１が接続されている。この制御部４１は、励起用ダイクロイックミラーユニット１６および分光用ダイクロイックミラーユニット３４のそれぞれのターレットの切り換えを制御するとともに、平面回折格子３６および折り返しミラー３７の回転（傾き量）を制御するようにしている。
【００３９】
この場合、制御部４１は、励起用ダイクロイックミラーユニット１６および分光用ダイクロイックミラーユニット３４の切り換え時のターレットの回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつき、各ダイクロイックミラーの角度誤差などに原因するスリット３９に対するスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の結像位置の位置ずれを補正するための補正情報を記憶手段としての記憶部４１ａに記憶している。記憶部４１ａは、励起用ダイクロイックミラーユニット１６および分光用ダイクロイックミラーユニット３４の切り換えに応じて、対応する補正情報が読み出され、制御部４１により平面回折格子３６および折り返しミラー３７の傾き量が制御されるようになっている。
【００４０】
この場合、記憶部４１ａに記憶される補正情報は、励起用ダイクロイックミラーユニット１６の励起用ダイクロイックミラー１６ａ、１６ｂおよび分光用ダイクロイックミラーユニット３４の分光用ダイクロイックミラー３４ａ、３４ｂのすべての組合せに対して用意され、それぞれの補正情報を記憶部４１ａに記憶させることで、いずれのダイクロイックミラーが光路上に選択されても、スリット３９に対するスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の位置ずれを補正できるようにしている。
【００４１】
次に、このように構成した実施の形態の作用を説明する。
【００４２】
まず、励起光に５４３ｎｍのレーザ光を使用する場合を例に説明する。この場合、制御部４１により励起用ダイクロイックミラーユニット１６の励起用ダイクロイックミラー１６ｂと分光用ダイクロイックミラーユニット３４の分光用ダイクロイックミラー３４ｂを光路上に切り換え、照明手段１０のヘリウムネオンレーザ１２から５４３ｎｍの波長の光を発振させる。
【００４３】
ヘリウムネオンレーザ１２から出射されたレーザ光は、反射ミラー１３およびダイクロイックミラー１４で反射した後、ビームエクスパンダ１５で適切なビーム径に変換される。そして、励起用ダイクロイックミラー１６ｂに入射する。励起用ダイクロイックミラー１６ｂに入射した５４３ｎｍの波長のレーザ光は、ここで反射され、ガルバノスキャナ１８のミラー１８ａ、１８ｂにより２次元に走査され、瞳投影レンズ２２、対物レンズ２３を通って、励起光Ｌｅとしてステージ２４上の試料Ｓに集光される。これにより、蛍光試薬で染色された試料Ｓは、励起される。
【００４４】
この励起により試料Ｓから発せられる例えば５００ｎｍ〜６００ｎｍの蛍光Ｌｆは、対物レンズ２３、瞳投影レンズ２２、ガルバノスキャナ１８を通り、励起用ダイクロイックミラー１６ｂまで戻り、励起用ダイクロイックミラー１６ｂを透過し、共焦点レンズ３１を透過し、共焦点レンズ３１の集光位置に配置された共焦点ピンホール３２上にスポットを形成する。
【００４５】
共焦点ピンホール３２では、試料Ｓから発せられた蛍光のうち、共焦点ピンホール３２と非共役関係の位置から発生した光をカットする。共焦点ピンホール３２でカットを免れた蛍光は、コリメートレンズ３３によって平行光束に変換され、分光用ダイクロイックミラー３４ｂに入射する。
【００４６】
分光用ダイクロイックミラー３４ｂに入射した蛍光は、選択された波長域（この場合、中心波長５８０ｎｍより短い中心波長の蛍光）のみが平面回折格子３６に入射する。平面回折格子３６に入射した蛍光は、複数のスペクトル（図示例ではスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）に分解され、光路折り返しミラー３７で反射した後、結像レンズ３８に入射される。これにより、結像レンズ３８の結像位置に配置されたスリット３９の波長選択スリット３９ａと副次回折光シボリ３９ｂが構成する平面上にスペクトル列が形成される。
【００４７】
この場合、図２に示すようにスリット３９上には、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３が一例に並び、このうち光強度の最も高いスポット（スペクトル光Ｓ２）を中心にＸ状に副次回折光Ｓ０が配列されるが、副次回折光シボリ３９ｂにより副次回折光Ｓ０が遮断され、波長選択スリット３９ａのスペクトル配列方向の移動でスリット幅を変えることで、検出するスペクトルが選択される（図示例では、波長選択スリット３９ａの中心に位置されるスペクトル成分（スペクトル光Ｓ２）が選択されている。）。
【００４８】
スリット３９を透過した蛍光は、ホトマルチプライヤ４０に入射される。この場合、ホトマルチプライヤ４０には、スリット３９の波長選択スリット３９ａと副次回折光シボリ３９ｂを通過してきた蛍光のみが受光される。
【００４９】
なお、この状態で平面回折格子３６を回転軸３６ａを中心に回転させると、スリット３９上に形成されたスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３が、配列方向に沿って移動するので、所望する波長域の中心波長をホトマルチプライヤ４０で受光することができる。
【００５０】
次に、制御部４１により分光用ダイクロイックミラーユニット３４のターレットを回転させ、分光用ダイクロイックミラー３４ｂを分光用ダイクロイックミラー３４ａに切り換えた場合を説明する。
【００５１】
この場合、分光用ダイクロイックミラーユニット３４のターレットを回転させると、回転中心軸のぶれ、位置決めのためのクリック位置精度のばらつきなどの様々な誤差により平面回折格子３６に入射する蛍光の光軸に傾きが発生する。ここで、図３に示すように、平面回折格子３６で分解されるスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３のそれぞれの光軸がｘ、ｙ軸に対し、θｘ、θｙだけ変化したものとすると、折り返しミラー３７及び結像レンズ３８を介してスリット３９上に形成されるスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３は、結像レンズ３８の焦点距離をｆとしたとき、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の配列方向と垂直な方向にｆ×ｔａｎ（θｘ）、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の配列方向にｆ×ｔａｎ（θｙ）だけ移動して位置ズレを生じることになる。
【００５２】
この状態で、制御部４１は、このときの分光用ダイクロイックミラーユニット３４の分光用ダイクロイックミラー３４ａへの切り換えに応じて記憶部４１ａに記憶されている補正情報を読み出す。そして、この補正情報に基づいて、平面回折格子３６を回転軸３６ａを中心に回転させるとともに、折り返しミラー３７を回転軸３７ａを中心に回転させることにより、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の位置ズレを補正する。
【００５３】
この場合、補正情報による位置ズレの補正は、ｃｏｓα／（ｃｏｓα−ｃｏｓβ）×θｙ（ここで、αは平面回折格子３６への入射光と平面回折格子３６の法線とのなす角、βは平面回折格子３６での回折光と平面回折格子３６の法線とのなす角）だけ平面回折格子３６を回転し、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を配列方向に移動して、波長選択スリット３９ａの中心にスペクトルＳ２を移動させる。同時に、θｘ／２だけ折り返しミラー３７を回転し、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を配列方向と垂直方向に移動して、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３全体を副次回折光シボリ３９ｂの中心へ移動させる。
【００５４】
これにより、分光用ダイクロイックミラー３４ｂから分光用ダイクロイックミラー３４ａへ切り換えが行なわれた場合も、スリット３９上でのスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の位置ズレが自動的に補正され、分光用ダイクロイックミラー３４ｂを用いたときと全く同じ条件で、スリット３９を透過した蛍光をホトマルチプライヤ４０に入射させることができ、スリット３９とホトマルチプライヤ４０の位置関係を常に一定に保つことができるので、スペクトル成分情報の安定した分光データを取得することができる。
【００５５】
なお、上述では、分光用ダイクロイックミラーユニット３４の分光用ダイクロイックミラー３４ｂから分光用ダイクロイック３４ａへ切り換えについて述べたが、これと逆の分光用ダイクロイックミラー３４ａから分光用ダイクロイック３４ｂへ切り換えについても上述したと同様にして実現できる。また、励起用ダイクロイックミラーユニット１６での励起用ダイクロイックミラー１６ｂと励起用ダイクロイックミラー１６ａの切り換えにより発生するスリット３９上でのスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の位置ズレについても、上述したと同様にして補正することができる。
【００５６】
従って、このようにすれば、分光用ダイクロイックミラーユニット３４での分光用ダイクロイック３４ｂから分光用ダイクロイック３４ａへの切り換えにより平面回折格子３６に入射する蛍光の光軸に傾きが発生し、スリット３９上に形成されるスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３に位置ズレが生じることがあっても、予め記憶部４１ａに記憶された補正情報に基づいて平面回折格子３６と折り返しミラー３７の回転が制御され、スリット３９上でのスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の位置ズレが自動的に補正され、分光用ダイクロイック３４ｂを用いたときと全く同じ条件で、スリット３９を透過した蛍光をホトマルチプライヤ４０に入射させることができる。これにより、スリット３９の波長選択スリット３９ａ及び副次回折光シボリ３９ｂと、ホトマルチプライヤ４０の位置関係を常に一定に保つことができるので、光軸ずれ要因があっても、安定して高精度に分光検出ができる。
【００５７】
また、折り返しミラー３７の回転制御により、スリット３９上でのスペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３を配列方向と垂直方向に移動して、スペクトル光Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３全体を副次回折光シボリ３９ｂの中心へ移動させることができるので、副次回折光シボリ３９ｂにより検出のノイズ成分となる副次回折光を排除することが可能となり、高Ｓ／Ｎ比を達成できる。
【００５８】
さらに、スリット３９の波長選択スリット３９ａおよび副次回折光シボリ３９ｂと、ホトマルチプライヤ４０の位置関係を常に一定に保つことができるので、ホトマルチプライヤ４０に受光感度ムラに影響されない良好な検出を行なうことができる。
【００５９】
さらに、これらの一連の動作は、予め記憶部４１ａに記憶された補正情報に基づいて自動的に行なうことができるので、人為的な操作ミスが発生することがないとともに、装置を操作する人間の熟練度に全く影響されることもなくなり、常に安定した測定結果が得ることもできる。
【００６０】
さらに、平面回折格子３６とホトマルチプライヤ４０の間に折り返しミラー３７を配置したことで、装置のサイズに応じて任意の方向に光路を設定することが容易となる。
【００６１】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述では、平面回折格子３６及び折り返しミラー３７のそれぞれの回転制御を自動的に行なうようにしたが、作業員による手動操作により行なうこともできる。この場合、分光用ダイクロイックミラーユニット３４のターレットの動作に連動させて、平面回折格子３６と光路折り返しミラー３７をそれぞれ予め設定された角度だけ回転できるような構成としておけば、人為的な操作ミスが発生しないこと、装置を操作する人間の熟練度に全く影響されないなどの理由から、常に安定した測定結果を得ることができる。
【００６２】
また、分光用ダイクロイックミラーユニット３４は、必ずしもコリメートレンズ３３の後側に配置する必要はなく、共焦点レンズ３１の前側に配置してもよい。この場合、共焦点レンズ３１の光軸方向の色収差を厳密に補正する必要がなくなるため、光学設計が非常に容易となるといった効果がある。
【００６３】
さらに、励起用ダイクロイックミラーユニット１６、分光用ダイクロイックミラーユニット３４は、回転式のものである必要はなく、装置のサイズに応じて、スライド式を採用してもよい。この場合、ターレット方式よりも各種ダイクロイックミラーの切り替え時に発生する反射光軸の位置ズレ及び角度ズレを抑えられるといった効果がある。
【００６４】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６５】
なお、上述した実施の形態には、以下の発明も含まれる。
【００６６】
（１）試料へ光を照射する手段と、
光が照射された試料が発する検出光を共焦点検出するための多角形ピンホールと、
検出光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、
スペクトル分解された光から測定すべきスペクトル成分を選択するスペクトル選択手段と、
前記多角形ピンホールにより形成される副次回折光を遮断する副次回折光シボリと、
スペクトル選択手段及び副次回折光シボリによって抽出された光を検出する検出手段と、
検出光の光路に挿脱可能な光学素子と、
前記光学素子の挿脱に起因するスペクトルの配列方向と直交する方向へのスペクトルの結像位置の位置ずれを補正するように検出光の光軸を調整可能な光軸ずれ補正手段と
を具備したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の一実施の形態にかかる共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】一実施の形態に用いられるスリットの概略構成を示す図。
【図３】一実施の形態の平面回折格子への蛍光の光軸の傾きを説明する図。
【図４】従来の共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。
【図５】共焦点の分光検出を説明する図。
【図６】共焦点顕微鏡に多く用いられるホトマルチプライヤを説明する図。
【符号の説明】
【００６８】
１０…照明手段、１１…アルゴンレーザ
１２…ヘリウムネオンレーザ、１３…反射ミラー
１４…ダイクロイックミラー、１５…ビームエクスパンダ
１６…励起用ダイクロイックミラーユニット
１６ａ．１６ｂ…励起用ダイクロイックミラー
１７…回転軸、１８…ガルバノスキャナ、１８ａ．１８ｂ…ミラー
２０…顕微鏡本体、２１…鏡体、２２…瞳投影レンズ
２３…対物レンズ、２４…ステージ、３０…分光手段
３１…共焦点レンズ、３２…共焦点ピンホール
３３…コリメートレンズ、３４…分光用ダイクロイックミラーユニット
３４ａ．３４ｂ…分光用ダイクロイックミラー、３５…回転軸
３６…平面回折格子、３６ａ…回転軸、３７…折り返しミラー
３７ａ…回転軸、３８…結像レンズ、３９…スリット
３９ａ…波長選択スリット、３９ｂ…副次回折光シボリ
４０…ホトマルチプライヤ、４１…制御部、４１ａ…記憶部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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