(57)【要約】【課題】  ポリペプチドを強固かつ特異的に固定化する方法、及びそのための固体支持体を提供することである。【解決手段】  基板の表面に式I：【化１】2005312425.tif 000013［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドを結合させることにより、ポリペプチドを固定化する方法。【選択図】  図２
2005312425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の表面に式I：
【化１】
2005312425.tif 000009
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドを結合させることにより、ポリペプチドを固定化する方法。
【請求項２】
基板が、さらにカーボン層を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
基板の表面に式I：
【化２】
2005312425.tif 000010
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドが結合されている、ポリペプチド固定化固体支持体。
【請求項４】
基板が、さらにカーボン層を有する請求項３記載のポリペプチド固定化固体支持体。
【請求項５】
オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドに、さらにオリゴヒスチジン配列が導入されている、請求項３又は４記載のポリペプチド固定化固体支持体。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項記載のポリペプチド固定化固体支持体に、試料ポリペプチドを接触させ、固定化されたポリペプチドと試料ポリペプチドの相互作用を検出する方法。
【請求項７】
試料ポリペプチドを標識し、固定化されたポリペプチドと相互作用した試料ポリペプチドに由来する標識を検出することにより相互作用を検出する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
化学発光を用いてポリペプチドの相互作用を検出する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドにオリゴシステイン配列を導入し、オリゴシステイン配列が導入された該ポリペプチドを、基板の表面に式I：
【化３】
2005312425.tif 000011
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する固体支持体上のマレイミド基と反応させ、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドを固体支持体上に結合させることによって、該ポリペプチドを精製する方法。
【請求項１０】
基板が、さらにカーボン層を有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
基板の表面に式I：
【化４】
2005312425.tif 000012
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する、ポリペプチドを固定化するための固体支持体。
【請求項１２】
基板が、さらにカーボン層を有する請求項１１記載の固体支持体。
【請求項１３】
オリゴシステイン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子を作製するベクター。
【請求項１４】
オリゴシステイン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドを固定化する方法、ポリペプチドが固定化されてなる固体支持体、これを用いたポリペプチドの検出方法及び精製方法、ならびにポリペプチドを固定化するための固体支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画の終了に伴い、生物、医学の研究は遺伝子解読からタンパク質解析、即ちプロテオミクスという新たなステップへと踏み出した。遺伝子は、タンパク質を生成するための単なるプログラムコードでしかなく、ほとんど全ての生体活動はそれらのコードをもとに生成された、非常に複雑な構造を持つタンパク質の分子間で行なわれている。ある種のタンパク質が正常に機能しない場合、健康に支障をきたすことが知られている。それゆえに、個々のタンパク質の機能を解明することは、医学の更なる進歩に欠かすことのできないステップであると言える。
【０００３】
従来は、タンパク質の性質、発現状態、構造、活性などの分析には、抽出したタンパク質の混合物を分子量や等電点の違いにより分離し、解析する２次元電気泳動法（２−Ｄ ＰＡＧＥ）が使用されてきた。しかし、２次元電気泳動法は、ハイスループット解析に不向きで、検出感度、およびサンプルの可溶化の面でも問題があった。
【０００４】
一方、今日までに数々のＤＮＡチップが報告されている。それらのＤＮＡチップは、ある表現型や生理状態での遺伝子発現の変化の確認や、発現パターンのデータベースを作ることに有用であった。しかし通常、遺伝子とタンパク質の発現量やパターンは必ずしも正確に相関しないため、ＤＮＡチップはタンパク質の発現レベルの定量化には使用することができない。またタンパク質は翻訳後に、リン酸化、糖鎖付加、切断などの、さまざまな修飾を受けることによってその機能が変化するため、それらの翻訳後修飾の情報をＤＮＡ解析からは得ることができない。
【０００５】
そこでＤＮＡアレイ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発された。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。しかし、強固なＤＮＡ鎖に対し、巧みにアミノ酸が絡み合ってできている非常に不安定な構造をもつタンパク質を基板上に固定化させることは困難であった。
【０００６】
また、従来開発されたプロテインチップは、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してタンパク質を固定化する方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じるとともに、固定化されたタンパク質を長期間保存することも不可能であった。また、生体物質の非特異的吸着や、タンパク質の機能失活、検出系ＵＶ不透明性等の問題もあった。
【０００７】
このような問題に鑑み、タンパク質を含むポリペプチドを固定化するための支持体として、基板の表面に、表面処理層及び化学修飾層を順次設けてなる固体支持体（例えば、特許文献１）、基板表面の一部又は全部がカーボン層で構成されており、その層上に金属キレートが形成されてなる固体支持体（特許文献２）が開発されている。
【０００８】
しかしながら、前記固体支持体のポリペプチドの固定化量及びポリペプチドの結合強度は、必ずしも充分とはいえず、ポリペプチドの固定化量がより高くポリペプチド結合強度がより高い固体支持体の出現が望まれている。
【０００９】
この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
【特許文献１】特開２００２−３６５２９３号公報
【特許文献２】特開２００４−０２０３２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ポリペプチドを強固かつ特異的に固定化する方法、及びそのための固体支持体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、基板上にアミノ基を介してマレイミド基を導入した固体支持体を用い、ポリペプチドにオリゴシステイン配列を導入することにより、ポリペプチドの固定化量及びポリペプチドの結合強度が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１２】
（１）基板の表面に式I：
【化１】
2005312425.tif 000003
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドを結合させることにより、ポリペプチドを固定化する方法。
【００１３】
（２）基板が、さらにカーボン層を有する（１）記載の方法。
【００１４】
（３）基板の表面に式I：
【化２】
2005312425.tif 000004
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する固体支持体のマレイミド基に、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドが結合されている、ポリペプチド固定化固体支持体。
【００１５】
（４）基板が、さらにカーボン層を有する（３）記載のポリペプチド固定化固体支持体。
（５）オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドに、さらにオリゴヒスチジン配列が導入されている、（３）又は（４）記載のポリペプチド固定化固体支持体。
（６）（３）〜（５）のいずれかに記載のポリペプチド固定化固体支持体に、試料ポリペプチドを接触させ、固定化されたポリペプチドと試料ポリペプチドの相互作用を検出する方法。
（７）試料ポリペプチドを標識し、固定化されたポリペプチドと相互作用した試料ポリペプチドに由来する標識を検出することにより相互作用を検出する、（６）記載の方法。
（８）化学発光を用いてポリペプチドの相互作用を検出する、（７）記載の方法。
【００１６】
（９）ポリペプチドにオリゴシステイン配列を導入し、オリゴシステイン配列が導入された該ポリペプチドを、基板の表面に式I：
【化３】
2005312425.tif 000005
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する固体支持体上のマレイミド基と反応させ、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドを固体支持体上に結合させることによって、該ポリペプチドを精製する方法。
【００１７】
（１０）基板が、さらにカーボン層を有する（９）記載の方法。
【００１８】
（１１）基板の表面に式I：
【化４】
2005312425.tif 000006
［式中、Ｒは鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である］
で表される基を有する、ポリペプチドを固定化するための固体支持体。
【００１９】
（１２）基板が、さらにカーボン層を有する（１１）記載の固体支持体。
（１３）オリゴシステイン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子を作製するベクター。
（１４）オリゴシステイン配列及びオリゴヒスチジン配列が導入されたポリペプチド。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、固体支持体上にポリペプチドを強固かつ特異的に固定化することができる。従って、本発明の固体支持体を用いることにより、検出限界の高いプロテインチップの製造が可能になる。このようなプロテインチップを用い、固定化されたポリペプチドと相互作用するポリペプチドを感度よく検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
固体支持体
本発明において、ポリペプチドを固定化する固体支持体は、基板の表面に化学修飾基が結合した構造を有する。
【００２２】
本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ  Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。本発明においては、シリコン基板を使用するのが好ましい。
【００２３】
本発明においては、この基板上にカーボン層を形成することが望ましい。本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。
【００２４】
カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、及びエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。
【００２５】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００２６】
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。
【００２７】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００２８】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００２９】
本発明において、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地固体支持体の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。
【００３０】
本発明において、固体支持体は、前記のように基板上にカーボン層を形成した構造だけでなく、ダイヤモンドライクカーボンと基板材料との積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドライクカーボンと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００３１】
基板上にダイヤモンドライクカーボン層などのカーボン層を形成することにより、高密度にポリペプチドを固定化でき、高いＳ／Ｎ比が得られるため、感度の高い検出が可能になる。また、繰り返し使用することも可能である。
【００３２】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００３３】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のポリペプチドを高密度で固定化できる点で好都合である。
【００３４】
続いて、上記カーボン層を有する基板に、化学修飾基を導入することにより固体支持体を製造する。化学修飾基の導入は以下のように実施することができる。
【００３５】
まず、上記カーボン層を有する基板にアミノ基を導入する。アミノ基の導入は、基板に塩素ガス中で紫外線を照射することにより表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。あるいはダイヤモンドライクカーボン層を施した基板を、アンモニア雰囲気下でプラズマ法に付すことにより実施できる。ここで、プラズマ法とは、真空条件下、直流あるいは交流による放電にプラズマを発生させ、原料ガスとして例えばベンゼンやメタンを用い、イオン化したガスでバイアスを印加した基板を処理する方法である。
【００３６】
このように形成させたアミノ基と、以下の式II：
【化５】
2005312425.tif 000007
で表される化合物又はその塩を反応させることにより、式I：
【化６】
2005312425.tif 000008
で表されるような化学修飾基をカーボン層上に形成することができる。
【００３７】
式I又はIIにおいて、Ｒは、鎖員１〜１２の２価の炭化水素基である。鎖員１〜１２の２価の炭化水素基としては、鎖員１〜１２、好ましくは鎖員４〜６のアルキレン基、例えばテトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、鎖員１〜１２の２価の脂環式炭化水素基、例えばシクロヘキシレン基、アリーレン基、例えば２，２´−ビフェニレン基、２価の芳香環含有炭化水素基、例えばｏ−キシリレン基等が挙げられる。これらの２価の炭化水素基は、例えばＣ１−１０−アルキル基、アリール基、トリメチルシリル基、アシル基等で置換されていてもよい。
【００３８】
ここで、Ｃ１−１０−アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基が挙げられる。アリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等の芳香族炭化水素基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノリル基、イソキノリル基等の芳香族複素環基が挙げられる。アシル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、ペンタノイル基、ヘキサノイル基等のＣ１−１０−脂肪族アシル基が挙げられる。
【００３９】
Ｒの好ましい具体例としては、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）４−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）４−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）４−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）５−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）５−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）−（ＣＨ２）５−、−Ｃ６Ｈ４−、−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−、−Ｃ６Ｈ４−（ＣＨ２）２−、−Ｃ６Ｈ３（ＣＨ３）−等が挙げられる。
【００４０】
式IIで表される化合物の塩としては特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を使用できる。ナトリウム塩を使用するのが好ましい。
【００４１】
具体的には、アミノ基が導入された固体支持体を、バッファー中に通常０．１〜１００ｍＭの濃度で式IIの化合物を含む溶液に浸漬することにより反応させる。バッファーとしては、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、トリエタノールアミンバッファー、ホウ酸ナトリウムバッファー等を使用することができる。ＰＢＳ（ｐＨ６〜９）を使用するのが好ましい。反応温度は、通常１０〜８０℃、好ましくは２５〜３０℃、反応時間は、通常１〜３００分、好ましくは３０〜６０分である。
【００４２】
本発明の固体支持体において、上記のマレイミド基を有する化学修飾基は、共有結合によってカーボン層中の炭素と強固に結合しているため、洗浄や温度変化によっても剥離することがなく、また固体支持体を長期間保存することも可能である。
【００４３】
ポリペプチドの固定化
本発明において、ポリペプチドには、ペプチド断片、オリゴペプチド及びタンパク質が包含される。単純タンパク質、複合タンパク質でもよく、天然のものでも合成のものでもよい。本発明の固体支持体に固定化するポリペプチドのアミノ酸数は、特に制限されないが、通常１０〜３０００、好ましくは５０〜２０００、より好ましくは１００〜１５００である。本発明の固体支持体に固定化できるポリペプチドとしては、特に限定されず、例えば、抗体、酵素、病原性タンパク、ペプチド系ホルモン、レセプター、キナーゼ、糖タンパク質、金属タンパク質、ウイルスタンパク質、誘導タンパク質等のタンパク質を好適に固定化することができる。
【００４４】
また、本発明においてポリペプチドにはペプチド誘導体も包含される。ペプチド誘導体には、１又は数個のアミノ酸が化学反応によって誘導化されたペプチドが含まれる。ペプチド誘導体の例としては、反応性アミノ酸側基、例えば遊離のアミノ基、遊離のカルボキシル基又は遊離のヒドロキシル基が誘導化された分子が挙げられる。アミノ基の誘導体の具体的な例は、スルホン酸又はカルボン酸アミド、チオウレタン誘導体及びアンモニウム塩、例えば塩酸塩である。カルボキシル基誘導体の例は、塩、エステル及びアミドである。ヒドロキシル基誘導体の例は、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体である。更には、１又は数個のアミノ酸が天然に存在するか又は非天然に存在する２０の“標準”アミノ酸のアミノ酸同族体によって置換されたペプチドも含まれる。かかる同族体の例は、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、β−アラニン及び４−アミノ酪酸である。
【００４５】
本発明においては、ポリペプチドにオリゴシステイン配列を導入し、本発明の固体支持体の表面に存在するマレイミド基とシステイン残基のＳＨ基とを反応させることにより共有結合を形成する。マレイミド基は、ＳＨ基に対する選択性が高いことから、オリゴシステイン配列が導入されたポリペプチドを固体支持体上に特異的に結合させることができる。
【００４６】
本発明においてオリゴシステイン配列は、通常少なくとも３個、好ましくは３〜１０個、より好ましくは４〜６個のシステイン残基が連続した配列を意味する。本明細書においては、オリゴシステイン配列をシステインタグと称する場合もある。
【００４７】
本発明においては、標的ポリペプチドに、固定化のためのオリゴシステイン配列に加えて、さらに精製のための標識を導入するのが好ましい。このような標識としては、亜鉛、ニッケル又はコバルトイオンのような金属イオンと特異的に相互作用するオリゴヒスチジン配列（ヒスチジンタグと称され、例えばヘキサヒスチジン配列が挙げられる）、又は、それぞれ、亜鉛若しくは銅と特異的に相互作用する、少なくとも約４個のリシンを含むポリリシン配列若しくは少なくとも４個のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列などが挙げられる。このような標識を導入することにより、標識と特異的に相互作用する試薬やカラムを用いて目的のポリペプチドを翻訳反応物から容易に単離することができる。例えば、オリゴヒスチジン配列に対してはニッケルカラムを用いることができる。
【００４８】
ポリペプチドへのオリゴシステイン配列及びオリゴヒスチジン配列の導入は、当技術分野において通常用いられるＰＣＲと大腸菌を用いた遺伝子クローニングを組み合わせた方法により実施することができる。例えば、あらかじめオリゴシステイン配列とオリゴヒスチジン配列をコードする領域をもつプラスミドベクターを構築し、後で制限酵素部位等を利用して標的ポリペプチドを導入して、得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し、当該形質転換体において融合ポリペプチドを発現させることにより、オリゴシステイン及びオリゴヒスチジン配列を連結したポリペプチドを製造することができる。
【００４９】
または、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をＰＣＲ法などにより増幅する際に、オリゴシステイン配列とオリゴヒスチジン配列をコードするヌクレオチド配列を各々のＤＮＡプライマーに含有させておき、これを用いて標的ポリペプチドのヌクレオチド配列を増幅した後このＤＮＡ断片をベクターに導入し、発現させて両配列と連結された融合ポリペプチドを製造することもできる。
【００５０】
オリゴシステイン配列は、標的ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に導入するのが一般的であるが、固定化の障害とならない限り、導入部位は末端に限定されるものではない。ＳＨ基は、マレイミド基と反応して共有結合を形成するため、標的ポリペプチドは本発明の化学修飾基に強固に結合する。
【００５１】
オリゴヒスチジン配列は、標的ポリペプチドのオリゴシステイン配列を有しない側のＮ末端又はＣ末端、またはオリゴシステイン配列に連結した形で導入するのが一般的であるが、固定化の障害とならない限り、導入部位は末端に限定されるものではない。
【００５２】
オリゴヒスチジンおよびオリゴシステイン配列を有する標的ポリペプチドは、宿主細胞内で発現、抽出後、まずオリゴヒスチジン配列を利用して、ニッケルカラムを用いるなどの通常の方法で精製を行う。
【００５３】
オリゴシステイン配列を導入したポリペプチドをスポッティグ用バッファーに溶解し、本発明の固体支持体上にスポッティングすることにより、ポリペプチドを固定化することができる。
【００５４】
オリゴシステイン配列を導入したポリペプチドを、濃度が通常０．０１〜１００μＭ、好ましくは５〜５０μＭとなるようにスポッティング用バッファーに溶解し、スポッティング用溶液を調製する。スポッティング用バッファーとしては、１〜１００％、好ましくは２０〜５０％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、５０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、純水等を使用することができる。本発明においては、５０％ＰＥＧ溶液を使用するのが好ましい。マレイミド基は加水分解されやすく、ｐＨ７付近で反応効率が最も良い。
【００５５】
調製したスポッティング用溶液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって固体支持体上にスポッティングすることができる。このとき、多種類のポリペプチドを互いに独立したスポットとしてアレイ状に配列することにより、この複数種のポリペプチドの相互作用を検出することができる。
【００５６】
スポッティング後、ポリペプチドが固体支持体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。ポリペプチドの固定化は化学反応による共有結合の生成であるため、反応を確実に進めるべく、スポッティング後速やかにインキュベーションを行うのが好ましい。
【００５７】
インキュベーションは、通常４〜３０℃、好ましくは２５〜３０℃の温度で、通常０．５〜１６時間、好ましくは１〜２時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度５０〜９０％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、固体支持体に結合していないポリペプチドを除去するため、洗浄液（例えば、５０ｍＭ ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００５８】
ペプチド相互作用の検出
本発明はまた、上記のように固体支持体に固定化されたポリペプチドに、これと相互作用する試料ポリペプチドを反応させて、ポリペプチド間の相互作用を検出する方法に関する。ポリペプチド間の相互作用としては、例えば、抗原抗体反応、酵素反応、レセプターとリガンドの反応、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用等が挙げられる。
【００５９】
試料ポリペプチドを標識して、固体支持体上に固定化されたポリペプチドと接触させ、これと相互作用した試料ポリペプチドに由来する標識を読みとることにより、相互作用の有無を検出することができる。試料ポリペプチドの標識は、当技術分野において通常用いられる方法により実施できる。
【００６０】
標識としては、ポリペプチドに取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＧＦＰなど）、放射能標識（α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなど）、酵素標識（ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼなど）が挙げられる。蛍光標識ポリペプチドを用いた場合は、相互作用させた後の固体支持体を蛍光撮影することにより、画像として検出することができる。酵素標識を用いた場合は、相互作用させた後の固体支持体に化学発光試薬（ルミノール、ルシフェリン、ウンベリフェロン、セレンテラジン、ジオキシセタン化合物、Ｄ−ルシフェリンカリウム、シュウ酸ビス（２，４，６−トリクロロフェニル））を作用させることにより検出することができる。
【００６１】
この試料ポリペプチドのサンプルは、濃度が通常０．０１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭとなるようにバッファーに溶解することによって調製する。得られた試料溶液を、上記で調製したポリペプチドが固定化された固体支持体上に滴下し、インキュベーションを行うことにより相互作用させる。
【００６２】
インキュベーションは、通常４〜３０℃、好ましくは２５〜３０℃で、通常０．５〜１６時間、好ましくは１〜４時間行う。相互作用させる工程においても、高湿度雰囲気下でインキュベーションを行うのが好ましい。最後に、固体支持体を洗浄し、乾燥後、標識を読みとることにより検出を行う。
【００６３】
あるいは、相互作用によって形成した複合体の質量分析を行うことにより、固体支持体上のポリペプチドに特異的に相互作用したポリペプチドのアミノ酸配列を解析することができる。また、固体支持体上に固定化されたポリペプチドに相互作用したポリペプチドのみをイオン化して質量分析を行うこともできる。
【００６４】
固体支持体上に固定化された物質は、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等の手段によりそのまま質量分析を実施することができる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなα又はβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法が好ましい。
【００６５】
本発明はまた、目的とするポリペプチドにオリゴシステイン配列を導入し、これを本発明の固体支持体と接触させ、マレイミド基との共有結合により固体支持体上に結合させることによって、該ポリペプチドを精製する方法に関する。本発明のマレイミド基を有する固体支持体は、ＳＨ基と特異的に結合するため、オリゴシステイン配列を導入したポリペプチドのみを結合して、分離精製することができる。
【００６６】
本発明においては、タンパク質にオリゴシステイン配列を融合した形で発現させるタンパク発現ベクターを構築し、システインが持つＳＨ基に、温和な条件下で特異的に共有結合するマレイミド基を導入した固体支持体を用いてタンパク質を回収することができる。オリゴシステイン配列からなるタンパク質タグを用い、回収システムとして共有結合を利用することは、従来の金属キレートを利用するヒスチジンタグ、酵素と基質間のアフィニティを利用するＧＳＴタグ、特異的抗体を利用するＦＬＡＧタグなどのエピトープタグなどとは全く異なる新しい発想に基づいている。従来のタンパク質タグはタグ付きタンパク質それ自身を精製することに主眼が置かれていたのに対し、本発明におけるシステインタグ（オリゴシステイン配列）は、強固な共有結合で回収することにより、システインタグが導入されたタンパク質とともに分離されてくる結合タンパクの分離回収条件の設定幅を広げることができる。従ってこれまでは回収できなかった結合タンパク質群が釣り上げられて、タンパク質相互作用解析が飛躍的に進歩することが期待できる。加えて共有結合による回収は、システインタグ融合タンパクそれ自身の洗浄精製を容易にし、固体支持体上でプロテアーゼ切断後直接質量分析に供することで、タンパク質の翻訳後修飾を解析する上でも優れたシステムを提供できる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１．マレイミド基を導入した固体支持体の作成
イオン化蒸着法によって、３ｍｍ角に切断したシリコン基板上に、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気でプラズマ法により１０分間アミノ化を実施した。
【００６８】
以下の組成の反応液を調製し、これにアミノ化した固体支持体を浸漬させ、３０分間浸透した。その後、純水で３回洗浄し、１００℃にて３０分間真空乾燥した。ここでスルホ−ＥＭＣＳ（株式会社  同仁化学研究所）は、上記の式IIの化合物において、Ｒが−（ＣＨ２）５−であるナトリウム塩である。
【００６９】
スルホ−ＥＭＣＳ                １２．３ｍｇ［１ｍＭ］
１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）      ３ｍｌ
超純水                          ２７ｍｌ                
合計                            ３０ｍｌ
【００７０】
ｍｉｃｒｏ−ＥＳＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて反応前後の固体支持体表面を解析した。結果を図１に示す。
【００７１】
反応前後の固体支持体表面のＥＳＣＡ解析から、反応後にＯとＮのピーク強度が増加していることがわかった（図１ａ）。また反応後のｎａｒｒｏｗスキャンから約２８９ｅＶ付近に新たなピークが現れていることがわかる（図１ｂ）。Ｏ、Ｎのピークについてはマレイミド基のＯ、Ｎに由来するものであると考えられる。また、２８９ｅＶ付近に新たに出現したピークについてはマレイミドのイミド部分に由来するものであると考えられる。以上から、固体支持体表面には、マレイミド基が導入されていることがわかる。
【００７２】
実施例２．オリゴシステイン配列を導入したＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現及び精製
＜発現させたタンパク質＞
試料１：  ６×Ｈｉｓ（ＧＦＰ遺伝子なしコントロール）
試料２：  ６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ（Ｎ末端に６個のヒスチジンを導入したＥＧＦＰ）
試料３：  ５×Ｃｙｓ−ＥＧＦＰ（Ｎ末端に５個のシステインを導入したＥＧＦＰ）
試料４：  ５×Ｃｙｓ−ＥＧＦＰ−６×Ｈｉｓ（Ｎ末端に５個のシステイン、Ｃ末端に６個のヒスチジンを導入したＥＧＦＰ）
試料５：  ６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−５×Ｃｙｓ（Ｎ末端に６個のヒスチジン、Ｃ末端に５個のシステインを導入したＥＧＦＰ）
試料１〜５に表されるタンパク質の構造を図２に示す。
【００７３】
＜発現ベクターの構築＞
発現ベクターの構築について、概要を図３に示す。まず、Ｈｉｓタグ付タンパク質（Ｎ末端に６個のヒスチジンを導入したタンパク質）の発現プラスミドベクターであるｐＥＴ１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をベースとして、ＰＣＲ法と大腸菌内遺伝子クローニング法により、Ｈｉｓタグ下流に新たなクローニングサイトＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩを導入した（図３、Ｓｔｅｐ１）。同様の方法にて、６個のヒスチジンを５個のシステインに置換した５×Ｃｙｓタンパク質発現ベクターを構築した（図３、Ｓｔｅｐ２）。Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＧＦＰ遺伝子をＰＣＲにより制限酵素サイトＮｄｅＩとＸｈｏＩを付けた形でクローニングし、６×Ｈｉｓおよび５×Ｃｙｓの下流に読み枠をあわせて挿入し、６×Ｈｉｓ−ＧＦＰ及び５×Ｃｙｓ−ＧＦＰ（図３、Ｓｔｅｐ３）タンパク質発現ベクターを構築した。
【００７４】
さらに、２種類の５×Ｃｙｓ−および６×Ｈｉｓ−ダブルタグ付きＧＦＰ（Ｃｙｓ−ＧＦＰ−ＨｉｓおよびＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｃｙｓ）発現ベクターを構築した。６×Ｈｉｓ−ＧＦＰの下流に５×Ｃｙｓを、５×Ｃｙｓ−ＧＦＰの下流に６×Ｈｉｓを導入して作製した（図３、Ｓｔｅｐ４）。各々のタグ部分の遺伝子配列はＤＮＡシークエンスにより確認した。各々のベクターを用いてタンパク質発現用大腸菌ＢＬ２１株に形質転換し、ＧＦＰ発現のよい株を選択した。５×Ｃｙｓをコードする塩基配列として、はＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴ（配列番号１）およびＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＴ（配列番号２）を用いて比較したが、どちらも同様によく発現したので、前者の塩基配列をもつプラスミドのみを固定化試験に供した。
【００７５】
＜培養＞
各タンパク質をコードするＤＮＡを導入した発現ベクターで形質転換したＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を培養した寒天培地（ＬＢ，Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ５０μｇ／ｍｌ，Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ５０μｇ／ｍｌ）よりシングルコロニーを爪楊枝にてピックアップし、３０ｍｌのＬＢ培地（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ  ５０μｇ／ｍｌ）に懸濁した。ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭになるよう添加して２３℃、１６０ｒｐｍにて２４時間培養した。
【００７６】
＜抽出＞
各培養液を遠心して集菌した（１０００ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）。ＬＢ培地を捨て、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、Ｖｏｒｔｅｘをかけて大腸菌を洗浄し再び集菌した。その後大腸菌の乾燥重量を測定した。タンパク質抽出試薬Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を５ｍｌ／ｇ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を２５Ｕ／ｍｌ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を５ＫＵ／ｍｌになるよう添加して室温で２０分間振とうした。遠心（１０００ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）後、上清を回収し０．２μｍフィルターでろ過した。
【００７７】
＜精製＞
試料１、２、４、５に関してはＨｉｓタグが付いているためＨｉｓ−Ｔｒａｐカラム（アマシャム製）にて精製した。その後マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社製）にて脱塩し、濃縮した。試料３に関してはカラム精製ができないため、脱塩、濃縮のみ行った。
【００７８】
＜確認＞
ＥＧＦＰ発現の確認はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１２．５％）で行った（図４）。また、蛍光の確認はＵＶ照射装置により行った（図５）。
【００７９】
実施例３．マレイミド基を有する固体支持体へのポリペプチドのスポッティング
実施例２で回収した各種タグ付きＥＧＦＰと１００％ＰＥＧを１：１で混合し、スポッティング溶液を１０μｌ調製した。実施例１で製造した固体支持体上にマイクロピペッターを用いて各スポッティング溶液を図６に示す配置で０．５μｌづつスポットを行った。湿箱に入れて室温で１時間インキュベートした。５０ｍＭ  ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後（２５℃，５ｍｉｎ）、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した（２５℃，５ｍｉｎ）。純水洗浄し、乾燥しないように注意してカバーガラスをかけ、ＬＡＳ−１０００（富士写真フイルム社製）にて測定した（露光３０秒）。結果を図７に示す。
【００８０】
実施例４．マレイミド基を有する固体支持体への各種タグ付きＥＧＦＰの浸漬による固定化
ＰＣＲチューブに実施例２で回収した各種タグ付きＥＧＦＰと２×ＰＢＳを１：１で混合し、浸漬用溶液５０μｌを調製した。チューブ中に実施例１で製造した固体支持体を浸漬し、室温で１８時間インキュベートした。ＰＢＳで３０分洗浄後、純水洗浄し乾燥しないように注意してカバーガラスをかけ、ＬＡＳ−１０００（富士写真フイルム社製）にて測定した（露光３０秒）。結果を図８に示す。
【００８１】
実施例３及び４の結果より本発明の固体支持体がヒスチジンタグよりもシステインタグと選択的に結合することが示された。
【００８２】
実施例５．化学発光を用いたポリペプチド相互作用の検出
５−１  パターン付き固体支持体の作成
浸漬によるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の固定化及び化学発光が確認しやすいように、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層およびアミノ基およびマレイミド基をパターン状に形成させものを作成した（図９）。
【００８３】
シリコン基板上にスピンコーターでレジストを塗布した。次に、図９に示すようなパターンを有するマスクを被せて露光し、現像した。そして、実施例１と同様の方法で、ＤＬＣ層の形成およびアミノ基の導入を実施した。得られた基板を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１ｍＭ  スルホ−ＥＭＣＳ試薬に、室温にて１時間浸漬し、ＰＢＳ（１０分）および超純水（１０分×２）で洗浄後、乾燥させた。
【００８４】
続いて、エタノールを用いてレジストを剥離し、エタノールを洗浄した。エアブロー後、１００℃にて１時間真空乾燥させた。
【００８５】
５−２  ＥＧＦＰの固定化および化学発光による相互作用の検出
実施例２と同様の方法で作成した６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ−５×Ｃｙｓ（Ｎ末端に６個のヒスチジン、Ｃ末端に５個のシステインを導入したＥＧＦＰ）または６×Ｈｉｓ−ＥＧＦＰ（Ｎ末端に６個のヒスチジンを導入したＥＧＦＰ）をバッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  イミダゾール）に溶解し、それぞれにつき、１００ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、０．１ｎｇ／μｌ、０．０１ｎｇ／μｌのタンパク質溶液を作成した。これらの溶液に、５−１で作成した固体支持体を浸漬し、遮光して室温で１時間放置した。その後、５０ｍＭ  ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５分×３回洗浄した。さらに超純水で５分洗浄し、ＬＡＳ−１０００（富士写真フィルム社製）にて蛍光を測定した（図１０）。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて室温で１時間ブロッキングした。得られた固体支持体を１／１００００に希釈した一次抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＳＩＧＭＡ））と反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳで１０分、続いて２０分洗浄した。そして１／１００００に希釈したＨＲＰ標識二次抗体（ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ））と反応させた（室温、１時間）。ＰＢＳで１０分→２０分→１０分洗浄した。化学発光試薬としてＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ピアス社）を用いて化学発光させ、ＬＡＳ−１０００（富士写真フィルム社製）にて化学発光を測定した（図１１）。
【００８６】
以上の結果より、オリゴシステイン配列の存在によりポリペプチドを選択的に固体支持体に結合できることが明らかとなった。また、化学修飾基を導入したパターン形成部分のみにＧＦＰが結合していることから、本発明により非特異的吸着を効果的に防止できることが明らかとなった。
【００８７】
さらに、３．７ｆｍｏｌ／μｌという低濃度のポリペプチド溶液に固体支持体を浸漬することにより、ポリペプチドを固体支持体上に固定化できること、また化学発光によりポリペプチドの相互作用を高感度で検出できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】実施例１で作成した本発明の固体支持体の表面をＥＳＣＡ解析した結果を表す。
【図２】実施例２で発現させた５種類のタンパク質の構造を示す。
【図３】実施例２における発現ベクター構築の概要を示す。
【図４】ＥＧＦＰの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示す。
【図５】蛍光の確認をＵＶ照射装置により行った結果を示す。
【図６】実施例３における各種ポリペプチドのスポッティング位置を示す。
【図７】実施例３において、マレイミド基を有する固体支持体に、各種ポリペプチドをスポッティングによって固定化した結果を示す。
【図８】実施例４において、各種ポリペプチドを含む溶液にマレイミド基を有する固体支持体を浸漬して固定化した結果を示す。
【図９】実施例５において、シリコン基板上に、ＤＬＣ層の形成、アミノ基およびマレイミド基の導入を行った部分のパターンを表す図である。
【図１０】実施例５において、固体支持体を各濃度のＥＧＦＰ溶液に浸漬してＥＧＦＰを固定化し、蛍光を測定した結果を表す図である。
【図１１】実施例５において、ＧＦＰ固定化後、一次抗体および二次抗体を反応させ、化学発光で検出した結果を表す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１〜２  合成ＤＮＡ
配列番号３〜１３  合成ペプチド
【図１】
2005312425.tif 000014
【図２】
2005312425.tif 000015
【図３】
2005312425.tif 000016
【図４】
2005312425.tif 000017
【図５】
2005312425.tif 000018
【図６】
2005312425.tif 000019
【図７】
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【図８】
2005312425.tif 000021
【図９】
2005312425.tif 000022
【図１０】
2005312425.tif 000023
【図１１】
2005312425.tif 000024
【配列表】
2005312425000001.app