(57)【要約】【課題】  動物における免疫応答を調節するために、肝臓およびリンパ節中の類洞内皮細胞の表面に位置するＣ型レクチンに結合する化合物の提供。【解決手段】  化合物の使用であって、該化合物は、動物（特にヒトまたは別の哺乳動物）における免疫応答を調節、特に減少させるための組成物の調製において、洞様内皮層の表面上でＣ型レクチンに結合する、使用であって、１つの実施形態において、上記洞様内皮層が肝臓洞様内皮細胞（ＬＳＥＣ）によって構成され、また別の実施形態において、上記洞様内皮層がリンパ節洞様域によって構成される、使用。。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の使用であって、該化合物は、動物（特にヒトまたは別の哺乳動物）における免疫応答を調節、特に減少させるための組成物の調製において、洞様内皮層の表面上でＣ型レクチンに結合する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物における免疫応答を調節するために、肝臓およびリンパ節中の類洞内皮細胞の表面に位置するＣ型レクチンに結合する化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子ＤＣ−ＳＩＧＮは、近年、ＩＣＡＭ−３への高親和性結合を介してＤＣと休止Ｔ細胞との間の相互作用を媒介し、その結果、一次免疫応答の開始を促進する、ＤＣ特異的接着レセプターとして同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、以前に報告されたＩＩ型膜関連Ｃ型レクチンと同一であると示され（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ、Ｔ．Ｂ．ら、２０００、Ｃｅｌｌ  １００：５７５〜５８５）、このＩＩ型膜関連Ｃ型レクチンは、ＣＤ４非依存的様式でＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に結合する。ＤＣ−ＳＩＧＮの親和性は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対するＣＤ４の親和性を超え（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｍ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８３５６−８３６０）、そして、ＨＩＶ−１の捕捉に関して、ＤＣ−ＳＩＧＮはＤＣ自身へのウイルス侵入を促進しそうではなく、むしろｔｒａｎｓでのＴ細胞の感染を増強する（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、２０００、Ｃｅｌｌ  １００：５８７−５９７）。ＤＣ−ＳＩＧＮ関連ＨＩＶ−１は、恐らく、ＤＣによる末梢からリンパ器官へのＨＩＶ−１の輸送の間、ウイルスの感染潜在力に寄与して、長期間わたって感染を残存させる。
【０００３】
Ｙｏｋｏｙａｍａ−ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９９９、Ｇｅｎｅ  ２２８：１６１−１６７）による、ＩＩ型膜タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンについての以前の研究の結果としては、現在はＤＣ−ＳＩＧＮとして既知の分子をコードするｃＤＮＡと相同であるが同一ではない部分的クローンの同定を示した。推定タンパク質生成物は、細胞質ドメイン中に２８アミノ酸の欠失を含み、そして、ＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡに関するＣ型レクチンドメインの全体が欠如していた。
【０００４】
さらに最近、Ｓｏｉｌｌｅｕｘら、（２０００、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：２９３７−２９４２）は、関連する遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列について記述し、これをＳｏｉｌｌｅｕｘらはＤＣ−ＤＩＧＮＲと呼んだ。ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲのゲノム構成が比較され、これは、高度の類似性を示した。胎盤、子宮内膜および刺激されたＫＧ１細胞（骨髄系ＤＣと表現型的に類似する細胞株）における２つの遺伝子の同時発現は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲの発現が子宮内膜および刺激されたＫＧ１細胞の両方において非常に低度ではあるが、観察された。
【０００５】
本発明を導いた研究において、ＣＤ−ＳＩＧＮＲ遺伝子が、単球誘導樹状細胞ではなく、２つの組織（肝臓およびリンパ節）中でのみ顕著に高レベルで発現されるということを、現在見出した。レセプターは「Ｌ−ＳＩＧＮ」と名称を変更された、なぜなら、このレセプターは、肝臓／リンパ節特異的ＩＣＡＭ−３捕獲非インテグリンであるからである。
【０００６】
相同なヒトＣ型レクチンＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、新しい遺伝子複製の生成物でありそうである。対応するタンパク質は、完全に同一のリガンド特異性を共有しないとしても、同一のドメイン構成および重複を共有する。この分子の最も多様な領域は、その細胞質の尾部中に生じる。
【０００７】
ＤＣ−ＳＩＧＮについての遺伝子とＬ−ＳＩＧＮについての遺伝子との間の別の明確な差異は、Ｌ−ＳＩＧＮのエキソン４における反復多型であり、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮに
おいては保存される（表１）。Ｌ−ＳＩＧＮのネックドメインは、３〜９の反復を含み得る一方、ＤＣ−ＳＩＧＮは、試験されたＣａｕｃａｓｉａｎの間で常に７個の反復からなる。６つの反復を含むＬ−ＳＩＧＮ分子または７つの反復を含むＬ−ＳＩＧＮ分子の間で、リガンド結合においても、ＨＩＶ−１捕捉および増強実験においても差異は観察されなかった。
【０００８】
ＳＩＧＮ遺伝子は、それらの進化的歴史を超えて、配列および機能的類似性を保持するが、それらの組織区分を決定する調節エレメントが特有の経路に沿って進化するということが、現在は、本発明に基づいて、驚くほど見出された。ｍＲＮＡ発現のＮｏｒｔｈｅｒｎ分析は、単球誘導ＤＣにおいておよびＤＣが存在する組織において、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現を明らかに示したが、ＤＣにおいてＬ−ＳＩＧＮの発現は、検出不可能であった（図２）。さらに、Ｌ−ＳＩＧＮは、Ｌ−ＳＩＧＮに対して特異的な抗体を使用して、単球誘導ＤＣ上で検出されなかった（図３Ｃ）。従って、リンパ節中の特有の細胞型は、両方のＳＩＧＮ分子でなく１方のＳＩＧＮ分子を発現すること：Ｌ−ＳＩＧＮは、肝臓中で存在する場合は、内皮細胞によって発現される一方、ＤＣ−ＳＩＧＮはリンパ節のＴ細胞領域におけるＤＣによって発現されるということが見出された。発現パターンにおけるこの差異は、配列相同性に基づいて予測され得なかった。
【０００９】
肝臓洞様毛細血管は、内皮内層に接着する在住マクロファージの存在によって特徴付けられる特定の毛細血管である。ＬＳＥＣ白血球の相互作用（これは、細胞表面上での接着分子の発現を必要とする）は、肝臓中の末梢免疫サーベイランスの中心的機構を構成する。マンノースレセプターならびに他の同時刺激レセプター（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）は、ＬＳＥＣ上で発現されること、およびリンパ器官中においてＤＣに類似の様式で、循環からの多くの潜在的抗原性タンパク質のクリアランスを媒介することが知られている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｌ−ＳＩＧＮがＬＳＥＣ上のレセプターのこの分類に適合するということを確立した、なぜならその組織部位およびリガンド結合特性は、抗原クリアランスにおいて、ならびにＬＳＥＣ白血球接着において、このレセプターに対する生理学的役割に強く関係しているからである。アポトーシス細胞上のＩＣＡＭ−３の高発現は、これらの細胞が肝臓中でＬ−ＳＩＧＮ発現細胞によって捕捉され、続いて除去される手段である。
【００１１】
ＤＣ−ＳＩＧＮのように、Ｌ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１感染を増強する膜関連レクチンである。肝臓洞様毛細血管におけるＬ−ＳＩＧＮの発現は、ＬＳＥＣ（通過する白血球と頻繁に接触する）が血液からＨＩＶ−１を捕獲し、そして、Ｔ細胞のｔｒａｎｓ感染を促進するということを示す。
【００１２】
さらに、ＬＳＥＣ自身は、ＨＩＶ−１感染に対して感受性であり得る。従って、Ｌ−ＳＩＧＮがこれらの細胞の感染を促進し、その結果、肝臓洞様毛細血管を通過するＴ白血球を与えるような新しいウイルスの生成のためのレザバーを樹立することが、可能となる。
【００１３】
上記の知見に基づいて、本発明は、動物（特に、ヒトまたは別の哺乳動物）中の免疫応答を調節する（特に減少させる）ための組成物の調製における、洞様毛細血管内皮層の細胞表面上のＣ型レクチンに結合する化合物の使用に関する。洞様毛細血管内皮層の細胞表面上のＣ型レクチンは、特にＬ−ＳＩＧＮである。
【００１４】
洞様毛細血管内皮層の細胞は、肝臓洞様毛細血管内皮の細胞（ＬＳＣＥ）またはリンパ節の洞様毛細血管領域の細胞のいずれかによって構成される。
【００１５】
本発明の組成物は、洞様毛細血管内皮層の細胞（特にＬＳＥＣ）とＩＣＡＭ−２および／またはＩＣＡＭ−３を発現する細胞（特にＴ細胞）との間の１つ以上の相互作用を調節する（特に減少させる）ために使用され得る。より特に、この組成物は、洞様毛細血管内皮層の細胞（特にＬＳＥＣ）とＩＣＡＭ−２および／またはＩＣＡＭ−３を発現する細胞（特にＴ細胞）との間で、特に、ＬＳＥＣの表面上のＣ型レクチンとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭレセプター（特にＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ−２レセプターまたはＩＣＡＭ−３レセプター）との間での接着を調節する（特に減少させる）ために使用される。
【００１６】
本発明に従って調製される組成物は、耐性誘導、免疫治療、免疫抑制、自己免疫疾患の処置、および／またはアレルギーの処置に関して、特異的抗体に対する免疫応答を予防または阻害するために、適用される。
【００１７】
さらなるその局面に従って、本発明は、洞様毛細血管内皮層の細胞（特にＬＳＥＣ）のＨＩＶ感染を阻害するため（特に、ＨＩＶ表面タンパク質（すなわちｇｐ１２０）の洞様毛細血管内皮層の細胞（特にＬＳＥＣ）の表面への接着により、ＨＩＶの上記細胞への侵入を阻害するため）の、組成物の調製における、洞様毛細血管内皮層の細胞（特にＬＳＣＥ）の表面上のＣ型レクチンに結合するか、または結合し得る化合物の使用に関する。
【００１８】
本発明はさらに、洞様毛細血管内皮層の細胞（それ自身を感染させ得るかまたはさせ得ない）（特に、ＬＳＥＣ）由来のＨＩＶの非感染Ｔ細胞への移動を阻害するための組成物の調製において、洞様毛細血管内皮層細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合するか、または結合し得る化合物の使用に関する。
【００１９】
あるいは、本発明は、調節するための組成物の調製において、（特に、上記抗原に対する動物（特に、ヒトまたは他の哺乳動物）における免疫応答を生成、増大、および／または促進する際に、）以下の組合せの使用を提供する：１）洞様内皮層細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し、そしてそれに付着する化合物：２）抗原またはそのフラグメントもしくは一部。好ましくは、この抗原は、Ｃ型レクチンに結合し得る化合物に共有結合されるか、または、融合され得る。この抗原は、例えば、この抗原もしくは感染症に対するワクチンで使用されるような抗原を含むか、または発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を生成するために使用され得る癌抗原から、選択される。
【００２０】
洞様毛細血管内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し得る化合物は、好ましくは、以下からなる群から選択される：マンノース炭水化物（例えば、マンナンおよびＤ−マンノース）；フコース炭水化物（例えば、Ｌ−フコース）；植物レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）；抗生物質（例えば、パラジミシンＡ）；糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびガラクトース）；タンパク質（例えば、ｇｐ１２０およびそのアナログまたはフラグメント）；および洞様毛細血管内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面で発現されるようなＣ型レクチンに対して特異的な抗体、またはその一部、フラグメントもしくはエピトープ。
【００２１】
洞様毛細血管内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面のＣ型レクチンは、好ましくは、図７のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその天然の変異体もしくは等価物である。
【００２２】
あるいは、洞様毛細血管内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面のＣ型レクチンに結合し得る化合物は、モノクローナル抗体、好ましくは、図７のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して特異的であるモノクローナル抗体、またはその天然の変異体もしくは等価物；および／またはその一部、フラグメントもしくはエピトープである。
【００２３】
そのさらなる局面に従って、本発明は、抗体、好ましくは、図７のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して特異的であるモノクローナル抗体、またはその天然の変異体もしくは等価物；および／または、その一部、フラグメントまたはエピトープに関する。この抗体は、好ましくはＡＺＮ−Ｄ３であり、これは、実施例中に記載の方法によって取得可能である。
【００２４】
本発明はさらに、少なくとも１つのこのような抗体、ならびに少なくとも１つのキャリア、賦形剤、アジュバントおよび／または処方物に関する。
【００２５】
本発明の別の局面は、以下の組合せに関する：１）洞様毛細血管内皮層の細胞（特にＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し、；そしてそれに付着する化合物：２）抗原またはそのフラグメントもしくは一部。好ましくは、この抗原は、Ｃ型レクチンに結合し得る化合物に共有結合されるか、またはこれと融合される。
【００２６】
本発明に従う組合せにおいて、抗原は、例えば、この抗原、もしくは感染症に対するワクチンで使用されるような抗原を含むか、または発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を生成するために使用され得る癌抗原から、選択される。
【００２７】
洞様毛細血管内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し得る化合物は、好ましくは、以下からなる群から選択される：マンノース炭水化物（例えば、マンナンおよびＤ−マンノース）；フコース炭水化物（例えば、Ｌ−フコース）；植物レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）；抗生物質（例えば、プラジマイシンＡ）；糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびガラクトース）；タンパク質（例えば、ｇｐ１２０およびそのアナログまたはフラグメント）；および洞様毛細血管内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面で発現されるようなＣ型レクチンに対して特異的な抗体、またはその一部、フラグメントまたはエピトープ。
【００２８】
本発明の抗体はさらに、生物学的サンプルにおける洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の検出、ならびに生物学的サンプルまたは培養培地からの洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の単離、調製および／または精製において、使用され得る。
【００２９】
あるいは、このような抗体は、Ｃ型レクチン（特に、図７のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンまたはその天然変異体もしくは等価物）；および／または生物学的サンプル中のその一部、フラグメントまたはエピトープの、存在および／または発現を決定するためのアッセイにおける用途を見出し得る。
【００３０】
さらに、本発明は、生物学的サンプルまたは培養培地から洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）を生成、単離および／または精製するための方法に関連し、以下の工程：
ａ）生物学的サンプルまたは上記細胞を含む培養培地を、本発明に従う抗体と接触させる工程；
ｂ）上記抗体に結合する細胞を、上記抗体に結合しない細胞、必要に応じて、サンプルまたは培地の任意のさらなる成分から分離する工程；
を包含し、そして、必要に応じて、さらに以下の工程：
ｃ）上記抗体由来の抗体に結合する細胞を分離する工程、を包含する。
【００３１】
好ましくは、この抗体は、カラムもしくはマトリクスに、（常）磁性ビーズに、または同様の固体支持体に連結される。試験される生物学的サンプルは、生物学的流体（例えば、血液、血漿またはリンパ液）であり得る。
【００３２】
最後に、本発明は、上記の方法を介して取得される洞様内皮層の細胞（例えば、ＬＳＥＣ）を提供する。
（項目１）  化合物の使用であって、該化合物は、動物（特にヒトまたは別の哺乳動物）における免疫応答を調節、特に減少させるための組成物の調製において、洞様内皮層の表面上でＣ型レクチンに結合する、使用。
（項目２）  項目１に記載の使用であって、前記洞様内皮層が肝臓洞様内皮細胞（ＬＳＥＣ）によって構成される、使用。
（項目３）  項目１に記載の使用であって、前記洞様内皮層がリンパ節洞様域によって構成される、使用。
（項目４）  項目１および／または項目２に記載の使用であって、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）と、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３を発現する細胞（特にＴ細胞）との間の１種類以上の相互作用を調節、特に減少させるための組成物の調製における、使用。
（項目５）  項目１および／または項目２および／または項目４に記載の使用であって、洞様内皮層の細胞（特にＬＳＥＣ）と、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３を発現する細胞（特にＴ細胞）との間の接着、特に、ＬＳＥＣの表面上のＣ型レクチンと、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３を発現させる細胞（特にＴ細胞）の表面上のＩＣＡＭレセプター（特に、Ｔ細胞の表面上のＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３レセプター）との間の接着を調節、特に減少させるための組成物の調製における、使用。
（項目６）  項目１〜項目５のいずれか１項に記載の使用であって、耐性の誘導、免疫治療、免疫抑制、自己免疫性疾患の処置、および／またはアレルギーの処置のための、特定の抗原に対する免疫応答を防止または阻害するための組成物の調製における、使用。
（項目７）  化合物の使用であって、該化合物は、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合するかまたは結合し得、該使用は、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）のＨＩＶ感染を阻害するため、特に、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面へのＨＩＶ表面タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）の接着を阻害し、それによって該細胞へのＨＩＶの進入を阻害するための組成物）の調製における、使用。
（項目８）  化合物の使用であって、該化合物は、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合するかまたは結合し得、該使用は、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）から非感染Ｔ細胞へのＨＩＶの移動を阻害するための組成物の調製における、使用。
（項目９）  併用の使用であって、該併用は、１）洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し、そしてＣ型レクチンに付着する化合物、および２）抗原あるいはフラグメントまたはそれらの一部の併用であり、該使用は、動物（特に、ヒトまたは他の哺乳動物）における、該抗原に対する免疫応答を調節、特に発生、増大および／または促進するための組成物の調製における、使用。
（項目１０）  項目９に記載の使用であって、前記抗原が、前記Ｃ型レクチンに結合し得る化合物に共有結合されているか、または縮合されている、使用。
（項目１１）  項目９または項目１０に記載の使用であって、前記抗原が癌抗原から選択され、該抗原は、該抗原を含有するかまたは発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を発生するために用いられ得るか、または感染症に対するワクチンにおいて用いられる抗原である、使用。
（項目１２）  項目１〜項目１１のいずれか１項に記載の使用であって、前記化合物が、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し得、該化合物は、マンノース炭水化物（例えば、マンナン、Ｄ−マンノース）、フコース炭水化物（例えば、Ｌ−フコース）、植物レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）、抗生物質（例えば、プラディマイシンＡ）、糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびガラクトース）、タンパク質（例えば、ｇｐ１２０およびそれらのアナログまたはフラグメント）、ならびに、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上において発現されるようなＣ型レクチンに対して指向される抗体、あるいはその一部、フラグメントまたはエピトープからなる群より選択される、使用。
（項目１３）  項目１〜項目１１のいずれか１項に記載の使用であって、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上の前記Ｃ型レクチンが、図７のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいはその天然改変体または等価物である、使用。
（項目１４）  項目１２または項目１３に記載の使用であって、前記化合物が、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し得、該化合物は、モノクローナル抗体（好ましくは、図７のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して指向されるモノクローナル抗体またはその天然改変体もしくは等価物）、ならびに／あるいはその一部、フラグメントまたはエピトープである、使用。
（項目１５）  図７のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンに対して指向される、抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）またはその天然改変体もしくは等価物、および／あるいはその一部、フラグメントまたはエピトープ。
（項目１６）  項目１５に記載の抗体であって、ＡＺＮ−Ｄ３である、抗体。
（項目１７）  薬学的組成物であって、該組成物は、項目１５または項目１６に記載の少なくとも１つの抗体、ならびに少なくとも１つのキャリア、賦形剤、アジュバント、および／または処方剤を含有する、組成物。
（項目１８）  併用であって、１）洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し、そしてＣ型レクチンに付着する化合物、および２）抗原あるいはそのフラグメントまたは一部、の併用。
（項目１９）  項目１８に記載の併用であって、前記抗原が、前記Ｃ型レクチンに結合し得る化合物に共有結合されているか、または縮合されている、併用。
（項目２０）  項目１８または項目１９に記載の併用であって、前記抗原が癌抗原から選択され、該癌抗原が、該抗原を含有もしくは発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を発生するために用いられ得るか、または感染症に対するワクチンにおいて用いられるような抗原である、併用。
（項目２１）  項目１８〜項目２０のいずれか１項に記載の併用であって、前記化合物が、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上のＣ型レクチンに結合し得、該化合物は、マンノース炭水化物（例えば、マンナンおよびＤ−マンノース）、フコース炭水化物（例えば、Ｌ−フコース）、植物レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）、抗生物質（例えば、プラディマイシンＡ）、糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびガラクトース）、タンパク質（例えば、ｇｐ１２０およびそのアナログまたはフラグメント）、ならびに、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の表面上において発現されるようなＣ型レクチンに対して指向された抗生物質、あるいはその一部、フラグメント、またはエピトープから
なる群より選択される、併用。
（項目２２）  項目１５または項目１６に記載の抗体の使用であって、生物学的サンプルにおける、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の検出における、使用。
（項目２３）  項目１５または項目１６に記載の抗体の使用であって、生物学的サンプルあるいは培養培地に由来する、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）の単離、調製および／または精製における、使用。
（項目２４）  項目１５または項目１６に記載の抗体の使用であって、生物学的サンプルにおけるＣ型レクチン（特に、図６のアミノ酸配列を有するＣ型レクチンまたはその天然改変体もしくは等価物）、ならびに／あるいはその一部、フラグメントまたはエピトープの、存在および／または発現を決定するためのアッセイにおける、使用。
（項目２５）  生物学的サンプルまたは培養培地に由来する、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）を作製、単離および／または精製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該細胞を含有する生物学的サンプルまたは培養培地を、項目１５または項目１６に記載の抗体と接触させる工程；
ｂ）該抗体に結合しない細胞から、そして必要に応じて、該サンプルまたは該培地のさらなる任意の成分から、該抗体に結合する細胞を分離する工程；
を包含しそして必要に応じて、以下の工程：
ｃ）該抗体から、該抗体に結合する細胞を分離する工程、をさらに包含する、方法。
（項目２６）  項目２５に記載の方法であって、該抗体がカラムまたはマトリクス、（パラ）磁性ビーズあるいは類似の固形支持体に付着している、方法。
（項目２７）  項目２５または項目２６に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、生物学的流体（例えば、血液、血漿またはリンパ液）である、方法。
（項目２８）  項目２５または項目２６の方法によって得られる、洞様内皮層の細胞（特に、ＬＳＥＣ）。
本発明はさらに、続く実施例（そしてこれは、以下の図表に対して言及する）において、例示される。
【実施例】
【００３３】
（材料および方法）
（１．ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡおよびＬＤ２  ｃＤＮＡの特徴付け）
全ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ配列およびＬ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ配列を、それぞれ、登録番号ＡＦ２９０８８６およびＡＦ２９０８８７でＧｅｎＢａｎｋに提出した。Ｌ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ配列は、エキソン４中に６つの繰り返しを含む改変体を表す。転写物の５’末端および３’末端（ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡの３’末端を除く）を、５’ＲＡＣＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって決定した。ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡの３’末端の長さを、ノーザン分析データ（転写物サイズ）、ならびに１．３ｋｂのＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ配列（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｍ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８３５６〜８３６０）に特異的な順方向プライマーおよびＤＣ−ＳＩＧＮの断言的な３’末端の下流にマッピングされたいくつかのＧｅｎＢａｎｋ  ＥＳＴ（例えば、ＡＩ４７２１１１、ＡＡ４５４１７０）に特異的な逆方向プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲデータに基づいて見積もられる。Ｌ−ＳＩＧＮの全コード配列（ｎｔ  ３９〜１１８４、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２９０８８７）を含むｃＤＮＡフラグメントを、ヒト胎盤ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、そして発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＴＯＰＯ（ｐｃＤＮＡ３−Ｌ−ＳＩＧＮ）およびｐＣＤＭ８（ｐＣＤＭ８−Ｌ−ＳＩＧＮ）中にクローン化した。
【００３４】
（２．放射性ハイブリッド（ＲＨ）マッピング）
ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的プライマーおよびＬ−ＳＩＧＮ特異的プライマーを用いたＰＣＲベースのＲＨマッピングを、Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ  ４ＲＨパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて実行した。ＰＣＲの結果を、Ｓａｎｇｅｒセンターの遺伝子マップサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｈｓｅｒｖｅｒ）に提出した。遺伝子に連結されるマーカーの染色体位置を、Ｇｅｎａｔｌａｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｃｉｔｉ２．ｆｒ／ＧＥＮＡＴＬＡＳ）およびＭａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ，ＷＩ，ｈｔｔｐ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／）によって提供されるヒト第１９染色体の遺伝子マップを検索することによって決定した。
【００３５】
（３．Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮエキソン４の遺伝子型分析）
エキソン４中の繰り返し領域を、以下のプライマー対を用いて増幅した：
１）Ｌ−ＳＩＧＮについて、Ｌ２８、ＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣ、およびＬ３２、ＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＴＣ；
２）ＤＣ−ＳＩＧＮについて、ＤＬ２７、ＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣ、およびＤＩ４Ｒ、ＣＣＣＣＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧ。
サイクルの条件は以下のとおりである：９４℃で５秒間、および６８℃で１分間。対立遺伝子を、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって区別した。
【００３６】
（４．ノーザンブロット分析）
培養されたヒト未熟ＤＣ由来の総ＲＮＡ（以下を参照のこと）を、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｈｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて単離した。１０μｇの単離したＲＮＡを、１％アガロースゲル上で電気泳動し、記載されるように（Ｃｈ
ｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．１９９２．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１：１３４〜１３９）、Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂａｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に移し、そして２つのヒト多組織ノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共にノーザン分析に使用した。３つのプローブを、経時的にブロットにハイブリダイズさせた：
１）Ｌ−ＳＩＧＮ特異的プローブ（ｎｔ  １００〜１８３、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２９０８８７）、
２）ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方を認識するプローブ（ｎｔ  １〜１２３３、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ２９０８８６）、ならびに
３）アクチンコントロールプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。
【００３７】
ハイブリダイゼーション手順を、製造者の仕様書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に沿って実行した。
【００３８】
（５．抗体）
抗ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ２を、前述した（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、２０００ｂ，Ｃｅｌｌ  １００：５７５〜５８５）。ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ３を、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方を染色する能力について、ＴＨＰ−１−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、２０００ａ，Ｃｅｌｌ  １００：５８７〜５９７）で、免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスのハイブリドーマの上清をスクリーニングすることによって得た。抗ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ２はまた、Ｋ５６２−Ｌ−ＳＩＧＮ細胞の染色によって最初に測定されたように（データは示されていない）、Ｌ−ＳＩＧＮと交差反応する。抗Ｌ−ＳＩＧＮウサギ抗血清を、２つのＬ−ＳＩＧＮ特異的ペプチド、ＰＴＴＳＧＩＲＬＦＰＲＤおよびＷＮＤＮＲＣＤＶＤＮＹＷを用いて免疫化することによって作製した（Ｖｅｒｉｔａｓ，Ｉｎｃ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。
【００３９】
（６．細胞）
ＤＣを、５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ４および８００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の存在下で単球から培養した（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，およびＡ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ．１９９４．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１１０９〜１１１８；Ｒｏｍａｎｉ，Ｎ．ら，１９９４，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：８３〜９３）。７日目に、細胞は、高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、αＭβ２（ＣＤ１１ｂ）、αＸβ２（ＣＤ１１ｃ）、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＩＣＡＭ−１、中低度のレベルのＬＦＡ−１およびＣＤ８６、ならびに低レベルのＣＤ１４、を、フローサイトメトリーによって測定されるように発現した。Ｌ−ＳＩＧＮを発現する適切なＫ５６２トランスフェクト体（Ｋ５６２−Ｌ−ＳＩＧＮ）を、電気穿孔法によるｐＣＤＭ８−Ｌ−ＳＩＧＮプラスミドおよびｐＧＫ−ｎｅｏベクターとのＫ５６２の同時ドランスフェクトによって作製した（Ｌｕｂ，Ｍ．ら、１９９７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ８：７１９〜７２８）。適切なＫ５６２−ＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクト体を、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ＤＣ−ＳＩＧＮ（２）を用いて同様の様式で作製した。ＴＨＰ−１−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、前述した（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、２０００ｂ，Ｃｅｌｌ  １００：５７５〜５８５）。
【００４０】
適切なＴＨＰ−１−Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクト体を、ｐｃＤＮＡ３−Ｌ−ＳＩＧＮを用いたＴＨＰ−１細胞の電気穿孔法、Ｇ４１８耐性についての選択、およびｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ３を用いたＬ−ＳＩＧＮ発現についての陽性選別によって作製した。全ての細胞株を、示されたような特異的サイトカインまたは抗生物質要求物に加えて１０％ウシ胎児血清を補充されたＲＰＭＩ培地中で維持した。Ｋ５６２およびＴＨＰ−１は、単球細胞株である。
【００４１】
ＨＥＫ２９３Ｔは、ＳＶ−４０大Ｔ抗原の単一の温度感受性対立遺伝子を含むヒト胚性腎臓細胞である。ＧＨＯＳＴ細胞は、ヒト骨肉腫細胞由来のＨＩＶ−指示細胞である（Ｃｅｃｉｌｉａ，Ｄ．ら、１９９８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：６９８８〜６９９６）。Ｈｕｔ／ＣＣＲ５細胞は、ＣＣＲ５で安定に形質導入される形質転換されたヒトＴ細胞株Ｈｕｔ７８である。
（７．蛍光ビーズ接着アッセイ）
カルボキシレート修飾ＴｒａｎｓＦｌｕｏｒＳｐｈｅｒｅｓ（４８８／６４５ｎｍ、１．０μｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、ＩＣＡＭ−１について前述したように、ＩＣＡＭ−３でコートした（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４：７５４〜７６４）。蛍光ビーズを、以下のようにＭ向性ＨＩＶ−１ＭＮエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０でコートした：ストレプトアビジンでコートした蛍光ビーズを、ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントウサギ抗ヒツジＩｇＧ（６μｇ／ｍｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でインキュベートし、続いてヒツジ抗ｇｐ１２０抗体Ｄ７３２４（Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）と共に４℃で一晩インキュベートした。このビーズを洗浄し、そして２５０ｎｇ／ｍｌの精製したＨＩＶ−１  ｇｐ１２０（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍを介してＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃによって提供される）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【００４２】
蛍光ビーズ接着アッセイを、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら（１９９９，前出）によって記載されるように実行した。手短には、細胞を、５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で接着緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％  ＢＳＡ）に再懸濁した。５０，０００の細胞を、ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）と共に室温で１０分間プレインキュベートした。リガンドでコーティングした蛍光ビーズ（２０ビーズ／細胞）を添加し、そしてその懸濁物を、３７℃で３０分間インキュベートした。接着を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ）上でフローサイトメトリーを用いて、蛍光ビーズに結合した細胞のパーセントを測定することによって、決定した。
【００４３】
（８．１次ヒト肝臓洞様毛細血管内皮細胞（ＬＳＥＣ）におけるＬ−ＳＩＧＮの検出）
肝臓組織を、書面による同意を受けた後に、肝臓手術を受けた患者から入手した。１次ヒト肝臓細胞の単離を、前述のように行った（Ｈｅｇｅｎｂａｒｔｈ，Ｓ．ら、２０００，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：４８１〜４８６）。細胞を、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地を補充されたコラーゲンＩ型コーティング組織培養プレート上で培養した（Ｈｉｌｄ，Ｍ．ら、１９９８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２６００〜２６０６）。単離の後日、肝臓細胞を、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識オボアルブミン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共に２時間インキュベートし、そして穏やかなトリプシン処理によってマトリクスから分離した。細胞を、ウサギ抗−Ｌ−ＳＩＧＮ抗血清、続いてヤギ−抗ウサギＩｇ  ＦＩＴＣ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。オボアルブミン摂取は、共焦点顕微鏡を用いた、内皮細胞特異的マーカー（アセチル化ＬＤＬ）とオボアルブミン陽性細胞との共染色によって立証されるように、ＬＳＥＣのみの特徴であり、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の特徴ではない。
【００４４】
（９．ＨＩＶ−１  感染アッセイ）
感染アッセイを、以前に記載されるように（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ、２０００ａ、前出；Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ  ２０００ｂ、前出）行った。偽型ＨＩＶ−１ストックを、
ホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子を含有するプロウイルスベクタープラスミドＮＬ−Ｌｕｃ−Ｅ−Ｒ−（Ｃｏｎｎｏｒ，Ｒ．Ｉ．ら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０６：９３５−９４４）、および、ＡＤＡまたはＪＲＦＬいずれかのｇｐ１６０エンベロープについての発現プラスミドを有する、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のカルシウム−リン酸トランスフェクションによって産生した。ウイルス性ストックを、ＧＨＯＳＴ  ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５細胞および２９３Ｔ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞に対する限界希釈によって評価した。
【００４５】
ＨＩＶ−１細胞捕捉アッセイにおいて、ＴＨＰ−１トランスフェクト体（２５０，０００細胞）を発現するＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮを、偽型ＨＩＶ−１（標的細胞濃度に関して約０．１の感染多重度）とともに、０．５ｍｌの総体積で３時間プレインキュベートして、ウイルスを細胞吸収させた。３時間のインキュベーションの後、２容積のＰＢＳで細胞を洗浄し、そして、１ｍｌの細胞培養培地中の１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、Ｈｕｔ／ＣＣＲ５標的（１００，０００細胞）とともにＴＨＰ−１トランスフェクト体を共培養した。３日後に細胞溶解物を得、そしてルシフェラーゼ活性について分析した。
【００４６】
対照的に、最適以下のウイルス濃度（代表的には、０．０５ｍ．ｏ．ｉ．未満）を用いて、洗浄工程なしでＨＩＶ−１増強アッセイを行った。簡単に述べると、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮトランスフェクト体（５０，０００細胞）を、同一のウイルス濃度（偽型ＨＩＶ−１または複製コンピテントＭ指向性株ＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦ）でインキュベートし、そして２時間後、活性化されたＴ細胞（１００，０００細胞）を添加した。数日後に細胞溶解物を得、そしてルシフェラーゼ活性またはｐ２４抗原レベルのいずれかについて分析した。ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で２日間、Ｔ細胞を培養することによって、Ｔ細胞を活性化した。
【００４７】
（１０．免疫組織化学的分析）
以前に記載されたように（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ、２０００ｂ、前出）、組織凍結切片の染色を行った。組織の凍結切片（８μ）を、１００％アセトン中で固定し（１０分間）、ＰＢＳで洗浄し、そして１次抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＣ−ＰＯ／ＡＢＣ−ＡＰ  Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って最終的な染色を行った。ヘマトキシリンを用いて、核の染色を行った。
【００４８】
（結果）
（１．ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮのゲノムマップ）
ヒトＢＡＣクローンＣＴＤ−２１０２Ｆ１９配列（現在、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＣ００８８１２）において利用可能である）（図１）からの情報を用いて、ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ遺伝子座の細密なマップを決定した。ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、１５．７ｋｂ離れて、ヘッドを向かい合わせた（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｈｅａｄ）方向で位置付けられる。ＲＨマッピングは、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮが、よりテロメア方向に位置付けられたＤＣ−ＳＩＧＨを有するマーカーＤ１９Ｓ９１２（１１．１を超えるロッドスコア値）の近くの染色体１９ｐ１３．２−３に位置付けられていることを示した。ＲＨデータと一致して、Ｄ１９Ｓ９１２マーカーは、ＢＡＣ配列におけるＬ−ＳＩＧＮに対して、約３７ｋｂ動原体方向の距離で見出される。
【００４９】
（２．Ｌ−ＳＩＧＮのエキソン４における多型性）
ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方のエキソン４は、２３アミノ酸の繰り返し単位をコードする６９ｂｐの反復を含有する。これらの反復は、糖質認識ドメインとＳＩＧＮ分子の膜貫通ドメインとの間にネックを形成する。胎盤ｍＲＮＡから単離されたＬ−Ｓ
ＩＧＮ  ｃＤＮＡクローンは、遺伝子のコード領域全体を含有したが、Ｓｏｉｌｌｅｕｘら（２０００、前出）によって報告されたｃＤＮＡにおいて同定された７つの総反復と対照的に、エキソン４に対応する配列において６つのみの総反復しか存在しなかった。このことは、Ｌ−ＳＩＧＮの反復領域が多型性であることを示した。３５０人の白人個体におけるエキソン４の分析は、反復の数（３〜９の範囲にわたる）に基づく７つの対立遺伝子の存在が示し、これらの対立遺伝子のうちの最も共通するものは、７つの反復（表１）を含有する対立遺伝子であった。１５０人の白人におけるＤＣ−ＳＩＧＮエキソン４の分析からは、いかなる変動も示さなかった。
【００５０】
（３．ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮのノーザン分析）
Ｌ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡは、コード領域全体にわたって、ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡに対して約９０％の類似性を示すが、これらの遺伝子のエキソン２配列の間には５３％のみの類似性しか存在しない。従って、エキソン２配列を用いて、ノーザン分析においてＬ−ＳＩＧＮ特異性であったプローブ（８４ｎｔ）を産生した。このプローブは、肝臓およびリンパ節において、約１．９ｋｂ、２．６ｋｂおよび４．２ｋｂのサイズのｍＲＮＡにハイブリダイズし、そして胸腺において、弱い１．９ｋｂのバンドが検出された（図２Ａ）。この１．９ｋｂのバンドは、リンパ節および胎児肝臓において顕著であり、Ｌ−ＳＩＧＮの予測サイズに対応する。上側のバンド（このうちの１つ（２．６ｋｂ）は、成体肝臓において顕著である）は、選択的転写であるようであるが、ＲＡＣＥ技術およびＲＴ−ＰＣＲ技術は、長さが変化する非翻訳領域の存在も、選択的スプライス改変体の存在も示していない。
【００５１】
ＤＣ−ＳＩＧＮのコード領域全体を含有する１．２ｋｂのフラグメント（このフラグメントは、ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡとＬ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡとの両方を、それらの高い類似性に起因して認識する）を用いて、ノーザンブロットを再プローブした（図２Ｂ）。再び、肝臓、リンパ節および胎児肝臓において、Ｌ−ＳＩＧＮ転写を表すバンドが観察された。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮを表す４．３ｋｂの転写物を、単球由来ＤＣおよびリンパ節において検出し、胎盤、脾臓、胸腺、およびおそらく肝臓において、より低い量で検出した。
【００５２】
Ｌ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡはまた、より高感度のＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、胎盤およびＤＣにおいて検出されたが、これらの組織における発現レベルはあまりにも低すぎて、ノーザンハイブリダイゼーションにより検出できない。同じ程度の感度で、ＤＣ−ＳＩＧＮ転写物とＬ−ＳＩＧＮ転写物の両方を認識するプローブは、明らかに、２つの遺伝子産物の示差的組織分布を示した：Ｌ−ＳＩＧＮは主に肝臓およびリンパ節において転写され、それに対しＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣおよびＤＣに適応する組織において特異的に発現される（図２）。Ｌ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡは、ＤＣ、末梢血リンパ球、または脾臓のいずれにおけるノーザン分析によっても検出されない（図２）。
【００５３】
（４．Ｌ−ＳＩＧＮは、ヒトＬＳＥＣによって発現され、そしてＤＣによっては発現されない）
インビボでＬ−ＳＩＧＮ分子を発現する細胞を同定するために、１対の抗ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＡｂ（このうちの一方（ＡＺＮ−Ｄ３）はＬ−ＳＩＧＮと交差反応し、それに対して他方（ＡＺＮ−Ｄ１）は、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的であった）を用いて免疫組織化学的分析を行った（図３Ａ）。ノーザン分析から推測されるように、肝臓組織の弱い染色が、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ１を用いて観察され（図３Ｂ）、そしてこの抗体を用いて検出される希な細胞は、おそらく肝臓に存在するＤＣである。対照的に、ｍＡｂ
ＡＺＮ−Ｄ３は、肝臓の類洞に沿った細胞を明るく染色した（図３Ｂ）。
【００５４】
内皮細胞特異的マーカーＣＤ３１に対するモノクローナル抗体は、肝臓の連続切片にお
いて類似の染色パターンを呈し（データは示さず）、Ｌ−ＳＩＧＮがＬＳＥＣによって発現されることを示した。この考察を支持するために、一次ヒトＬＳＥＣを、オブアルブミンの取り込み（これは、ＬＳＥＣに特有の性質である）によって他の肝臓細胞と区別し、そしてＬ−ＳＩＧＮの発現について直接試験した。ポリクローナル抗Ｌ−ＳＩＧＮ抗体でのＬＳＥＣの染色は、Ｌ−ＳＩＧＮが、肝臓内のこれらの細胞によって排他的に発現されることを示した（図３Ｃ）。
【００５５】
ＡＺＮ−Ｄ１およびＡＺＮ−Ｄ３はともに、リンパ節を同程度によく染色した（データは示さず）。しかし本発明者らは、Ｌ−ＳＩＧＮ特異的ポリクローナル抗体を用いて、Ｌ−ＳＩＧＮが単球由来のＤＣによっては発現されないことを見出した（図３Ｄ）。このことは、ノーザン分析からの結論を支持する。ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、リンパ節において、異なる型の細胞によって発現される。
【００５６】
（５．Ｌ−ＳＩＧＮは、ＩＣＡＭ−３およびＨＩＶ−１  ｇｐ１２０を結合させる）
ＩＣＡＭ−３およびＨＩＶ−１ＭＮ  ｇｐ１２０はともに、Ｃａ２＋依存様式で、高い親和性でＤＣ−ＳＩＧＮに結合することが示されている。フローサイトメトリーベースの接着アッセイ（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ、１９９９、前出）を用いて、Ｌ−ＳＩＧＮを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞は、高い親和性でＩＣＡＭ−３に結合することを示した（図４Ａ）。このＬ−ＳＩＧＮ媒介結合は、ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ特異的ｍＡｂ（ＡＺＮ−Ｄ２およびＡＺＮ−Ｄ３）、マンナン、またはＥＧＴＡによって阻害されたが、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的ｍＡｂ（ＡＺＮ−Ｄ１）によっては阻害されなかった。このことは、Ｌ−ＳＩＧＮがＩＣＡＭ−３に対して高い親和性を有する、マンノース結合Ｃ型レクチンとして機能することを実証する。Ｌ−ＳＩＧＮはまた、ＨＩＶ−１ＭＮ  ｇｐ１２０にも結合し得た（図４Ｂ）。偽性トランスフェクト細胞は、ＩＣＡＭ−３にもＨＩＶ−１ＭＮ  ｇｐ−１２０にも結合しなかった（データは示さず）。
【００５７】
（６．Ｌ−ＳＩＮＧはＨＩＶ−１感染を増強する）
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０への、Ｌ−ＳＩＧＮの高親和性結合は、Ｌ−ＳＩＧＮが感染性ＨＩＶ−１と結合し得、そしてイントランスでの標的細胞の感染を増強し得る可能性を挙げた。ＨＩＶ−１感染におけるトランスレセプターとしてのＬ−ＳＩＧＮの役割を試験するために、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮのいずれかを発現するＴＨＰ−１細胞を、Ｍ指向性ＨＩＶ−１ＪＲＦＬエンベロープ糖タンパク質で偽型化された、単回感染性ＨＩＶ−ルシフェラーゼを用いてパルスし、洗浄して未結合のウイルスを除去し、そしてＨＩＶ−１感染に対して許容的である標的細胞とともにインキュベートした。３日後に、感染を評価した。Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクト化ＴＨＰ−１細胞およびＤＣ−ＳＩＧＮトランスフェクト化ＴＨＰ−１細胞はともに、感染性ＨＩＶ−１を捕捉し、そしてウイルスを標的細胞に透過させたが、偽性トランスフェクト化ＴＨＰ−１細胞は透過させなかった（図５Ａ）。
【００５８】
次に、Ｌ−ＳＩＧＮが限界濃度のＨＩＶ−１を補足し得るか否か、および、感染を促進する許容細胞に対してウイルスが有効に存在するか否かを調査した。ＤＣ−ＳＩＧＮあるいはＬ−ＳＩＧＮ、または偽性トランスフェクト化細胞を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＨＩＶ−１ＡＤＡエンベロープ糖タンパク質を用いて偽型化された、低力価のＨＩＶ−ルシフェラーゼとともにインキュベートした。次いで、未洗浄の細胞を、活性化Ｔ細胞とともに共培養した。ＨＩＶ−１でパルスされた、偽性トランスフェクト化ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、標的細胞の最小感染を観察した（図５Ｂ）。しかし、Ｌ−ＳＩＧＮを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、イントランスでのＴ細胞のＨＩＶ−１感染を増強した（図５Ｂ）。ＤＣ−ＳＩＧＮ媒介増強は、交差反応性ＡＺＮ−Ｄ２抗体で阻害されたが、Ｌ−ＳＩＧＮについては部分的な阻害が観察された。マンナンは、両方のＳＩＧＮ分子による増強を有効に阻害した。
【００５９】
Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を増強するＬ−ＳＩＧＮの能力を評価するための類似の実験を、複製コンピテントウイルスを用いて行った。Ｌ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび空のベクターを用いてトランスフェクトされたＫ５６２細胞を、Ｍ指向性ＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦ株とともに、低ウイルス濃度で２時間インキュベートし、次いで、活性化Ｔ細胞とともに共培養した（図５Ｃ）。ウイルス複製は、偽性トランスフェクト化Ｋ５６２細胞を用いて、観察されなかったが、Ｌ−ＳＩＧＮトランスフェクト体は、ＨＩＶ−１を標的細胞に透過させ、ウイルス複製を生じた。ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ特異的抗体であるＡＺＮ−Ｄ２を用いるＨＩＶ−１複製の殆ど完全な阻害は、ＨＩＶ−１感染を増強するこれらのレセプターの特異性を示した。従って、肝臓内で、おそらくリンパ節内でも、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する非ＤＣ系列細胞はまた、ＨＩＶ−１を捕捉し、リンパ球に透過させる能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ遺伝子マップの略図。物理学的距離および遺伝子配向は、ＢＡＣクローンＣＴＤ−２１０２Ｆ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣ００８８１２）から提供される配列に基づく。
【図２】ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮのノーザンブロット分析。４．３ｋｂ（黒いヘッドを有する矢印）および１．９ｋｂ（白ぬきのヘッドを有する矢印）のサイズの位置は、左に記される。（Ａ）Ｌ−ＳＩＧＮ特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、肝臓、リンパ節における遺伝子の発現、および胸腺における遺伝子の弱い発現を示す。（Ｂ）両方の遺伝子を認識するプローブとのハイブリダイゼーション。４．３ｋｂのバンドは、ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡを表す。Ｌ−ＳＩＧＮ特異的プローブ（図３Ａ）を用いる肝臓およびリンパ節において明白な明るい上部のバンド（約４．２ｋｂ）は、プローブの特異性、強度パターン、およびサイズにおけるわずかな差異に起因してＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡ（４．３ｋｂ）と異なる。（Ｃ）β−アクチンｃＤＮＡコントロールプローブを用いたブロットの再プローブ化。
【図３Ａ】Ｌ−ＳＩＧＮは、ＬＳＥＣ上で発現され、そして単球由来のＤＣ上で発現されない。（Ａ）抗体ＡＺＮ−Ｄ１は、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的であるが、ＡＺＮ−Ｄ３は、Ｌ−ＳＩＧＮと交差反応する。適切なＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮ  Ｋ５６２トランスフェクト体を、ＡＺＮ−Ｄ１またはＡＺＮ−Ｄ３のいずれかで染色した。
【図３Ｂ】Ｌ−ＳＩＧＮは、ＬＳＥＣ上で発現され、そして単球由来のＤＣ上で発現されない。（Ｂ）ヒト肝臓におけるＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮ発現の免疫組織化学的分析。一連の区分を、ＡＺＮ−Ｄ１（ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的）またはＡＺＮ−Ｄ３（ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮの両方を検出する）のいずれかを用いて染色した。ＡＺＮ−Ｄ１は、ＤＣ（矢印）であり得る細胞を余り染色しないが、ＡＺＮ−Ｄ３は、シヌソイドを描く細胞を染色する。
【図３Ｃ】Ｌ−ＳＩＧＮは、ＬＳＥＣ上で発現され、そして単球由来のＤＣ上で発現されない。（Ｃ）肝臓中のＬ−ＳＩＧＮの発現は、ＬＳＥＣに制限される。単離の１日後、１次ヒト肝臓細胞を、蛍光色素標識オボアルブミンと共にインキュベートした。Ｌ−ＳＩＧＮ発現を、Ｌ−ＳＩＧＮ特異的ポリクローナル抗体を用いて間接的な免疫蛍光によって決定した。オボアルブミンを摂取した細胞（ＬＳＥＣ）およびオボアルブミンを摂取しなかった細胞（肝細胞および他のレジデント肝細胞）は、それぞれ実線および破線によって表され、それぞれの細胞集団にゲーティングすることによって表される。２×１０５細胞を分析した。
【図３Ｄ】Ｌ−ＳＩＧＮは、ＬＳＥＣ上で発現され、そして単球由来のＤＣ上で発現されない。（Ｄ）Ｌ−ＳＩＧＮは、単球由来のＤＣによって発現されない。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で単球から培養された、未熟ＤＣは、ＦＡＣＳｃａｎ分析によって決定されるように、抗Ｌ−ＳＩＧＮポリクローナル抗体で染色されない。実線は、抗Ｌ−ＳＩＧＮポリクローナル血清を用いた染色を示すが、点線（実線の下に隠れる）は、ウサギ前免疫血清を用いた染色を表す。
【図４】Ｌ−ＳＩＧＮは、ＩＣＡＭ−３（Ａ）およびＨＩＶ−１  ｇｐ１２０（Ｂ）に結合する。Ｋ５６２−Ｌ−ＳＩＧＮ細胞およびＫ５６２−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞へのＩＣＡＭ−３およびｇｐ１２０の接着を、蛍光ビーズ接着アッセイ（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４：７５４〜７６４）を用いて測定した。ｙ軸は、リガンドでコーティングされた蛍光ビーズと結合する細胞のパーセントを表す。Ｌ−ＳＩＧＮ交差反応ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ２（２０μｇ／ｍｌ）およびＡＺＮ−Ｄ３（２０μｇ／ｍｌ）は、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的ｍＡｂ  ＡＺＮ−Ｄ１（２０μｇ／ｍｌ）と対照的に、Ｌ−ＳＩＧＮに対するＩＣＡＭ−３およびｇｐ１２０の接着を阻害する。Ｋ５６２トランスフェクト体に対するＩＣＡＭ−３およびｇｐ１２０両方の接着はまた、マンナン（２０μｇ／ｍｌ）またはＥＧＴＡ（５ｍＭ）のいずれかによって阻害される。ｍｏｃｋトランスフェクト体に対する両方のリガンドの接着は、５％未満であった。３つのうち１つの代表的な実験が示される（ＳＤ＜５％）。
【図５Ａ】Ｌ−ＳＩＧＮは、輸送中のＴ細胞を捕獲し、そしてＴ細胞とＨＩＶ−１との感染を増強する。（Ａ）Ｌ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ−１を捕獲し、そしてこれを標的細胞へ伝達する。適切なＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮ発現ＴＨＰ−１トランスフェクト体を、ＨＩＶ−ｌｕｃ／ＪＲＦＬシュードビリオンと共にプレインキュベートして、ウイルスの捕獲を可能にした。細胞を洗浄し、そしてＴＨＰ−１トランスフェクト体を、Ｈｕｔ／ＣＣＲ５標的細胞と共に同時培養した。細胞溶解物を、３日後に入手し、そしてルシフェラーゼ活性について分析した。用いられた各同時培養条件について、ｍｏｃｋ感染コントロールは、活性において一様に１００計測数／秒未満であった。各データセットは、感染細胞の４つの別々のウェルの平均を表す。２つのうち１つの代表的な実験が示される。
【図５Ｂ】Ｌ−ＳＩＧＮは、輸送中のＴ細胞を捕獲し、そしてＴ細胞とＨＩＶ−１との感染を増強する。（Ｂ）Ｌ−ＳＩＧＮは、シュード型のＨＩＶ−１によってＴ細胞の感染を増強する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｃＤＮＡをコードするＤＣ−ＳＩＧＮ、Ｌ−ＳＩＧＮまたは空のベクターで過渡的にトランスフェクトした。コントロール細胞を、ＡＺＮ−Ｄ２（２０μｇ／ｍｌ）またはマンナン（２０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。少量のシュード型ＨＩＶ−１ＡＤＡを、前記のような活性化Ｔ細胞と一緒に添加した（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、２０００，Ｃｅｌｌ  １００：５８７〜５９７）。感染性を、ルシフェラーゼ活性を測定することによって２日後に決定した。実行された２つのうち１つの代表的な実験が示される。各実験を、３連のウェルで実行した。
【図５Ｃ】Ｌ−ＳＩＧＮは、輸送中のＴ細胞を捕獲し、そしてＴ細胞とＨＩＶ−１との感染を増強する。（Ｃ）Ｌ−ＳＩＧＮは、複製コンピテントＨＩＶ−１によってＴ細胞の感染を増強する。Ｌ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮ両方の適切なＫ５６２トランスフェクト体を、低ウイルス濃度の複製コンピテントＭ向性株ＨＩＶ−１ＪＲ−ＣＳＦ（ＴＣＩＤ５０  １００／ｍｌ）と共にインキュベートした。特異性を決定するために、細胞を、ＡＺＮ−Ｄ２（２０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。２時間後、活性化Ｔ細胞を、上記のように添加した（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．ら、２０００，Ｃｅｌｌ  １００：５７５〜５８５）。培養上清を、Ｋ５６２−Ｔ細胞同時培養の１４日後に収集し、そしてＨＩＶ−１産生性をＥＬＩＳＡを用いて測定してｐ２４抗原レベルを決定した。コントロール実験において、同じ量のウイルスを、Ｔ細胞に直接添加した。３つのうち１つの代表的な実験が示される。各データセットは、感染細胞の３つの別々のウェルの平均を表す。
【図６】Ｌ−ＳＩＧＮのコードＤＮＡ配列。
【図７】Ｌ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図３Ｂ】
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