(57)【要約】【課題】対物レンズを駆動するアクチュエータの正確な変位情報を用いて高精度な３次元像を得ると共に、アクチュエータの変位情報から計算した加速度に基づき振動レベルを制御することにより安定した画像を得ることができる３次元レーザ顕微鏡システムを実現する。【解決手段】  試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、前記ビデオ信号を画像データに変換する画像処理装置と、顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムにおいて、  前記画像処理装置は、前記アクチュエータから出力される変位信号に基づいて前記スライス画像を合成して３次元画像を作成するように構成する。【選択図】                    図１
2005148454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、
前記ビデオ信号を画像データに変換する画像処理装置と、
顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、
このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、
試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記画像処理装置は、前記アクチュエータから出力される変位信号に基づいて前記スライス画像を合成して３次元画像を作成することを特徴とする３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【請求項２】
試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、
前記ビデオ信号を画像データに変換する画像処理装置と、
顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、
このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、
試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記制御手段は、前記アクチュエータから出力される変位信号に基づいて前記アクチュエータが変位したときの加速度を算出し、この加速度が予め設定した値を越えないように制御することを特徴とする３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【請求項３】
前記制御手段は、
前記走査波形信号の波形を計算を用いて求める波形計算装置と、
この走査波形を記憶しておき走査波形発生トリガ信号に同期して発生する任意波形発生器と、
この任意波形発生器から出力される走査波形発生トリガ信号に基づいて前記アクチュエータを駆動するアクチュエータドライバと、
前記ビデオレートカメラのビデオ信号に同期した各トリガ信号を発生して各部に与える信号制御器と、
前記変位信号をＡ／Ｄ変換して変位データを前記画像処理装置および前記波形計算装置に出力するＡ／Ｄコンバータと、
から構成されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【請求項４】
前記制御手段は、算出した加速度が予め設定した値を越えていた場合に、前記アクチュエータの最大変位から最小変位への戻り時間を、前記ビデオ信号に含まれる垂直同期信号周期の整数倍になるように増加させることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【請求項５】
前記走査波形は三角波であって、この三角波の不連続的な変化部分がＳ字制御により生成された波形であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【請求項６】
前記走査波形はステップ波であって、このステップ波の不連続的な変化部分がＳ字制御により生成された波形であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３次元共焦点レーザ顕微鏡システムに関し、詳しくは、対物レンズを光軸方向に移動させるアクチュエータの変位を正確に捉え、高精度で安定した３次元像を得るための改良に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
共焦点顕微鏡は、試料を薄切片にすることなくスライス画像が得られ、そのスライス画像から試料の正確な３次元立体像を構築できるので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−７２１０２号公報
【０００４】
図４は特許文献１に記載の共焦点顕微鏡の構成図である。ビデオレートカメラ１、共焦点スキャナ２、顕微鏡３、アクチュエータ４および対物レンズ５は、同じ光軸上に配置されている。共焦点スキャナ２は、多数のピンホールを持つニポウディスクと、それに対応するマイクロレンズアレイを有するもので、シンプルな光学系から成るニポウディスク方式を採用したコンパクトなアドオンタイプである。
【０００５】
この共焦点スキャナ２は顕微鏡３のカメラポートに取り付けられる。共焦点顕微鏡は、レーザ光を使用して、対物レンズ５、アクチュエータ４および顕微鏡３を経由して、試料の像を共焦点スキャナ２に入力する。共焦点スキャナ２は、試料の共焦点画像を得て、ビデオレートカメラ１に入力する。
【０００６】
図５は、図４の共焦点顕微鏡が取り扱う各種信号のタイムチャートである。ビデオレートカメラ１は、共焦点画像をビデオ信号１０１に変換し、共焦点スキャナ２、同期インターフェイスボックス９の信号入力端子および画像処理装置６の画像入力端子にビデオ信号１０１を入力する。共焦点スキャナ２は、ビデオ信号１０１に同期して、ニポウディスクの回転同期制御を行う。
【０００７】
画像処理装置６にビデオテープデッキを採用する場合、ビデオテープデッキは、画像入力端子から入力されるビデオ信号１０１と、音声入力端子から入力される開始信号１０３を長時間用のビデオテープに同時に記録する。ビデオテープには、リアルタイムに変化する共焦点画像と対物レンズ５の焦点位置の走査開始のタイミングが同時に記録される。
【０００８】
同期インターフェイスボックス９は、ビデオ信号１０１の偶数側パルス列または奇数側パルス列の何れか一方を抽出し、内部Ａ信号を作成する。任意波形発生器７は、Ｈレベルのパルス信号であるトリガ信号１０２を発生し、同期インターフェイスボックス９のトリガ入力端子に入力して、焦点面の走査の開始タイミングに利用する。
【０００９】
同期インターフェイスボックス９は、トリガ信号１０２の立下りに同期して、内部Ｂ信号を作成する。内部Ｂ信号は、Ｈレベルのパルス幅時間が３５ｍｓｅｃ程度であり、ビデオレートカメラ１のビデオレートの時間に比して若干長いパルス信号である。同期インターフェイスボックス９は、内部Ａ信号の反転信号と内部Ｂ信号とを論理積演算することにより、開始信号１０３を発生し、画像処理装置６および任意波形発生器７の同期入力端子に入力する。
【００１０】
画像処理装置６は、同期入力端子からの開始信号１０３の立上りに同期して、ビデオ信号１０１を画像データに変換し記録するキャプチャを開始する。同期インターフェイスボックス９は、信号入力端子からのビデオ信号１０１に基づいて、共焦点スキャナ２によるニポウディスクの回転同期制御、画像処理装置６によるビデオ信号の取得の開始タイミング、および光学制御系による対物レンズの焦点位置の走査開始のタイミングを全て同期させる。
【００１１】
任意波形発生器７は、開始信号１０３の立上りに同期して、光学制御系による対物レンズ５の焦点位置の走査を開始する。任意波形発生器７は、走査信号１０４を発生し、コントローラ８に入力する。走査信号１０４は、ＬレベルからＨレベルまで一定時間で直線的に増加するノコギリ波状の信号である。コントローラ８は、走査信号１０４をアクチュエータ４に入力する。アクチュエータ信号１０５は実際のアクチュエータの位置信号であり、伸びきってから一気に原点に戻ったあとにオーバーシュートがあり、この間は不感帯となる。
【００１２】
アクチュエータ４は、顕微鏡３の対物レンズレボルバーと対物レンズ５との間に取り付けられ、ピエゾ駆動により走査信号１０４のレベルに比例して画像の焦点方向の長さが変化し、対物レンズ５の焦点位置を制御する。共焦点顕微鏡は、走査信号１０４に基づいて、焦点面を走査することにより、試料のスライス画像を取得する。
【００１３】
このような構成によれば、ニポウディスクの回転同期制御、画像処理装置によるビデオ信号の取得の開始タイミングおよび光学制御系によるレンズの焦点位置の走査開始のタイミングが、すべてビデオ信号に同期することにより、共焦点画像の位置精度が向上し、複数のスライス画像を取得する際に個々の取得時間のバラツキがなくなるので、信頼性の高いスライス画像が得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、従来の３次元共焦点レーザ顕微鏡システムでは、対物レンズを光軸方向に移動させるアクチュエータの変位は、アクチュエータに印加される電圧値に基づいた推定値を用いていた。
このため、変位の設定値と実際の値との間で誤差が発生すると、試料の深さ方向の位置情報が正確でなく、構築する３次元画像は正確さに欠けてしまう。
また、アクチュエータが最大変位から最小変位へ戻る場合に最大の加速度が発生し、巨大な加速度は振動となる。例えば、その周波数がアクチュエータ自身や顕微鏡筐体の固有振動数と一致すると共振現象が生じてしまう。つまり、加速度を制御することができなかったため振動により試料面が不安定になって観測できなくなるという問題もあった。
【００１５】
本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡システムが有していた問題を解決しようとするものであり、対物レンズを駆動するアクチュエータの正確な変位情報を用いて高精度な３次元像を得ると共に、アクチュエータの変位情報から計算した加速度を制御することにより振動を抑制し、安定した画像を得ることができる３次元レーザ顕微鏡システムを実現することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は次の通りの構成になった３次元共焦点レーザ顕微鏡システムである。
【００１７】
（１）試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、
前記ビデオ信号を画像データに変換する画像処理装置と、
顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、
このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、
試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記画像処理装置は、前記アクチュエータから出力される変位信号に基づいて前記スライス画像を合成して３次元画像を作成することを特徴とする３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【００１８】
（２）試料のスライス像を共焦点画像として取得する共焦点スキャナと、
前記共焦点画像をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、
前記ビデオ信号を画像データに変換する画像処理装置と、
顕微鏡の対物レンズの焦点位置を光軸方向に移動するアクチュエータと、
このアクチュエータを介して前記対物レンズを光軸方向に走査するための走査波形信号を発生する制御手段を備え、
試料の深さ方向のスライス画像を取得することができるように構成した３次元共焦点レーザ顕微鏡システムであって、
前記制御手段は、前記アクチュエータから出力される変位信号に基づいて前記アクチュエータが変位したときの加速度を算出し、この加速度が予め設定した値を越えないように制御することを特徴とする３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【００１９】
（３）前記制御手段は、
前記走査波形信号の波形を計算を用いて求める波形計算装置と、
この走査波形を記憶しておき走査波形発生トリガ信号に同期して発生する任意波形発生器と、
この任意波形発生器から出力される走査波形発生トリガ信号に基づいて前記アクチュエータを駆動するアクチュエータドライバと、
前記ビデオレートカメラのビデオ信号に同期した各トリガ信号を発生して各部に与える信号制御器と、
前記変位信号をＡ／Ｄ変換して変位データを前記画像処理装置および前記波形計算装置に出力するＡ／Ｄコンバータと、
から構成されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【００２０】
（４）前記制御手段は、算出した加速度が予め設定した値を越えていた場合に、前記アクチュエータの最大変位から最小変位への戻り時間を、前記ビデオ信号に含まれる垂直同期信号周期の整数倍になるように増加させることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【００２１】
（５）前記走査波形は三角波であって、この三角波の不連続的な変化部分がＳ字制御により生成された波形であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【００２２】
（６）前記走査波形はステップ波であって、このステップ波の不連続的な変化部分がＳ字制御により生成された波形であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の３次元共焦点レーザ顕微鏡システム。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、以下のような効果がある。
【００２４】
請求項１に記載の発明によれば、対物レンズを光軸方向に移動させるアクチュエータの正確な変位を求めることができ、この変位情報に基づいてスライス画像を合成することにより高精度な次元画像を作成することのできる３次元共焦点レーザ顕微鏡システムを実現することができる。
【００２５】
請求項２記載の発明によれば、アクチュエータから出力される変位信号に基づいて前記アクチュエータの変位時の加速度を算出し、この加速度が予め設定した値を越えないように制御することにより、振動を減少させて安定した画像が得られる３次元共焦点レーザ顕微鏡システムを実現することができる。
【００２６】
請求項３に記載の発明によれば、Ａ／Ｄコンバータによりアクチュエータの変位データを生成し、この変位データを用いることにより、画像処理装置では高精度な３次元画像を得ることができると共に、アクチュエータの変位に伴う加速度を所定値以内に抑えることができるため振動を抑制し安定した画像を得ることができる。
【００２７】
請求項４に記載の発明によれば、アクチュエータが最大変位から最小変位へ移動するときに発生する加速度を所定値内に抑えることができ、振動を軽減し安定した画像を得ることができる。
また、アクチュエータの最大変位から最小変位への戻り時間を、垂直同期信号周期の整数倍にすることでカメラのフレームの更新時間を有効に利用した戻り時間が設定できる。
【００２８】
請求項５および請求項６に記載の発明によれば、走査波形の不連続的な変化部分をＳ字制御により生成することにより、その部分の加速度を小さくすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係る３次元共焦点レーザ顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。なお、図１において図４と同等部分には同一符号を付し、その説明は省略する。
【００３０】
図１において、１０は信号制御器、１１は波形計算装置、１２はアクチュエータドライバ、１３はＡ／Ｄコンバータ、２０は試料である。
信号制御器１０は、ビデオレートカメラ（以下単にカメラという）１から出力されるビデオ信号を受けて、そのビデオ信号をそのまま出力すると共に、ビデオ信号から垂直同期信号を抽出しこれを基に各種のトリガ信号を生成する。
任意波形発生器７ａは、信号制御器１０からの走査波形発生トリガ信号を受信すると、あらかじめ波形計算装置１１から送られ記憶した走査波形を発生して、アクチュエータドライバ１２へ送る。
【００３１】
波形計算装置１１は、試料２０を観察する際の対物レンズ５の走査周期と光軸方向の走査距離から、三角波またはステップ波を計算によって求め、それを走査波形として任意波形発生器７ａに出力する。
アクチュエータドライバ１２は、任意波形発生器７ａから出力される走査波形信号に基づいて、アクチュエータ４を駆動するための駆動信号を発生する。
アクチュエータ４は、任意波形発生器７ａの出力波形に従って対物レンズ５を光軸方向に走査し、それに同期して画像処理装置６ａで観察試料の断面スライス像を連続的に取得する。
【００３２】
また、アクチュエータ４には、自身の変位をセンシングする変位センサ（図示せず）が設けられている。この変位センサが変位信号を出力してアクチュエータドライバ１２にフィードバックすることにより、アクチュエータ４の位置制御が行われる。このとき、目標としている位置（推定位置）と実際の位置との間に誤差が生じる場合がある。
【００３３】
アクチュエータドライバ１２は、取得した変位信号をＡ／Ｄコンバータ１３に出力する。Ａ／Ｄコンバータ１３は、画像取り込みトリガに同期して、変位信号をＡ／Ｄ変換することによりアクチュエータ４の変位、つまり対物レンズ５の光軸方向の変位を示す変位データを生成する。
画像処理装置６ａは、この変位データから正確なスライス像の光軸方向の位置を求め、スライス画像を合成して３次元画像を生成する。これにより、高精度な３次元画像が得られる。
なお、ここでは、波形計算装置１１、任意波形発生器７ａ、アクチュエータドライバ１２、信号制御器１０、Ａ／Ｄコンバータ１３から構成される部分を制御手段と呼ぶ。
【００３４】
このような構成の動作を、図２に示す各信号のタイムチャートを参照して次に説明する。
カメラ１から制御信号器１０に図２（ａ）に示すビデオ信号（垂直同期信号が含まれる）が送られると、信号制御器１０では、そのビデオ信号をそのまま画像処理装置６ａへ送ると同時に、ビデオ信号から垂直同期信号を抽出して、共焦点スキャナ２へ同期信号を送ると共に、各種トリガ信号すなわち走査波形発生トリガ信号［図２（ｃ）］、画像取込トリガ信号［図２（ｅ）］を生成する。
【００３５】
信号制御器１０では、図２（ｂ）に示す画像取込スタート信号を受信すると、画像取込スタート信号がLOWになった後の最初の垂直同期信号を走査波形発生トリガ信号［図２（ｃ）］として任意波形発生器７ａへ送ると共に、垂直同期信号を図２（ｅ）に示す画像取込トリガ信号として画像処理装置６ａへ送る。なお、画像取込スタート信号［図２（ｂ）］は、操作者が上位コントローラ例えばパーソナルコンピュータから、任意のタイミングに信号制御器に入力する信号であり、そのパルス幅はビデオ信号の垂直同期信号の周期の２倍以上である。
【００３６】
任意波形発生器７ａでは、信号制御器１０から走査波形発生トリガ信号を受信すると、あらかじめ波形計算装置１１から入力され記憶してある図２（ｄ）に示すステップ波を発生し、これをアクチュエータドライバ１２に送る。
なお、図２（ｄ）では時間の経過に伴い段階的に電圧が増加していき所定の電圧値で基点の電圧に戻るステップ波を走査波形信号としているが、この走査波形は三角波であってもよい。
【００３７】
アクチュエータ４はアクチュエータドライバ１２からの駆動信号によって駆動され、図２（ｄ）の波形に従って対物レンズ５を光軸方向に走査する。画像処理装置６ａでは、これに同期して試料２０の画像を取得する。
【００３８】
以上の一連の動作において、アクチュエータ４に設けられた変位センサがステップ波の各段（Ｚ１,Ｚ２,・・・,Ｚｎ）の変位信号を出力し、これをＡ／Ｄコンバータ１３でＡ／Ｄ変換して変位データを生成する。この変位データを用いて観測試料に対するスライス画像の実際の位置を求め３次元画像を合成する。これにより、高精度な３次元画像が得られる。
【００３９】
次に、アクチュエータを変位させたときの加速度の制御について説明する。
波形計算装置１１は、Ａ／Ｄコンバータ１３が出力した変位データから走査波形の１周期における加速度の絶対値を計算し、予め設定された値を越えた場合に、加速度の絶対値が設定値以下になるように制御する。
【００４０】
加速度は以下の式により計算する。
速度Ｖ＝変位の１次微分＝ｄｚ／ｄｔ  
加速度ａ＝速度の１次微分＝ｄｖ／ｄｔ
ここで、ｚは変位、ｔは時間である。
【００４１】
このような構成の動作を、図３に示す各信号のタイムチャートを参照して説明する。図３は、アクチュエータの加速度を制御する様子を示したタイムチャートである。
図３において、図３（ａ）は、カメラ１から制御信号器１０に送られる垂直同期信号（ビデオ信号）である。図３（ｂ）は、波形計算装置１１で計算したステップ状の走査波形を示している。
【００４２】
垂直同期信号の立下りに同期してステップ波形が変化していく。この不連続的な変化部分では、加速度を小さくするためにＳ字制御が行われている。このため、この部分の加速度は一定となり図３（ｃ）に示すように矩形で変化する。図３（ｃ）は、変位データと時間から加速度を求めたものである。
【００４３】
Ｓ字制御における速度、加速度の関係は以下の式により示される。
変位ｚ＝（１／２）・Ａ・ｔ２
速度ｖ＝変位ｚの１次微分＝Ａ・ｔ
加速度ａ＝速度ｖの１次微分＝Ａ
ここで、ｔは時間、Ａ＜（２πｆ）２である。
【００４４】
計算した加速度の絶対値が、予め設定しておいた値を越えた場合に、その絶対値を小さくするための制御を行う。具体的にはアクチュエータ４が最大変位から最小変位へ戻る時に最大の加速度になるので、図３（ｄ）に示すように、加速度の絶対値が設定値を越えないようにアクチュエータ４の戻り時間を増加させる。このとき、カメラの１フレームの撮像中に最小変位に戻しても次のフレームの撮像開始まで待たなくてはならない。従って、最大変位から最小変位へ戻る時間を垂直同期信号周期の整数倍（図３（ｄ）では２倍）にすれば、フレームの更新時間を有効に利用した戻り時間が設定できる。
【００４５】
なお、図３（ｂ）では時間の経過に伴い段階的に電圧が増加していき所定の電圧値（最大変位）で基点の電圧（最小変位）に戻るステップ波を走査波形としているが、この走査波形は三角波であってもよい。この場合、三角波の不連続的な変化部分（折返し点）ではこの部分の加速度を小さくするためにＳ字制御が行われる。
【００４６】
以上により、図３（ｅ）に示すように加速度、即ち振動を急激に減少させることができ、安定した画像を取得することができる。  
【００４７】
なお、前出の画像処理装置６ａ,波形計算装置１１は、パーソナルコンピュータにより実現しても良い。
また、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明に係る３次元共焦点レーザ顕微鏡システムの一実施例を示す構成図である。
【図２】本発明に係る各信号のタイムチャートである。
【図３】アクチュエータの加速度を制御する様子を示したタイムチャートである。
【図４】従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成図である。
【図５】図４の共焦点顕微鏡が取り扱う各信号のタイムチャートである。
【符号の説明】
【００４９】
１  ビデオレートカメラ
２  共焦点スキャナ
３  顕微鏡
４  アクチュエータ
５  対物レンズ
６ａ  画像処理装置
７ａ  任意波形発生器
１０  信号制御器
１１  波形計算装置
１２  アクチュエータドライバ
１３  Ａ／Ｄコンバータ
２０  試料
【図１】
2005148454.tif 000003
【図２】
2005148454.tif 000004
【図３】
2005148454.tif 000005
【図４】
2005148454.tif 000006
【図５】
2005148454.tif 000007